日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 92, 77-82, 2018

ラット正中口蓋縫合拡大時における骨基質タンパク遺伝子発現の加齢変化
本

田

知

久1

馬谷原

琴
1

2

枝 1,2

本

吉

満 1,2

清

水

典

佳1

日本大学歯学部歯科矯正学講座

日本大学歯学部総合歯学研究所臨床研究部門

要旨：上顎骨の幅径が狭窄している症例に，急速拡大装置を用いて正中口蓋縫合を拡大し歯列弓幅径を増大させる矯正治療を行っている。この急速拡大が適応となる年齢は臨床上思春期成長がある時期までとされているが，この治療が可能である時期については明瞭にされていない。本研究では急速拡大による正中口蓋縫合の骨形成機序とその加齢による変化を明らかにすることを目的とし，思春期（6 週齢），若年成熟期（15 週齢）ラットを用い正中口蓋
縫合急速拡大を行い，縫合部の骨基質タンパク（type I collagen, osteopontin および osteocalcin）の遺伝子発現について検討した。ラットの上顎切歯間に金属リングを挿入し正中口蓋縫合を急速拡大後，上顎骨の前頭断切片を作製し，縫合部の骨基質タンパクの遺伝子発現を in situ hybridization 法により観察した。その結果 type I collagen
は両週齢において拡大後 1，5 日で強度な発現を示した。Osteopontin は，拡大後 1 日では，6 週齢は中軽度な発現，
15 週齢は軽度な発現を示した。拡大後 5 日では，6 週齢は軽度な発現へと減少し，15 週齢は中軽度な発現へと増加した。Osteocalcin は，拡大後 1 日では 6, 15 週齢ともに発現はほとんどなく，拡大後 5 日では，6 週齢は強度な発現を示し 15 週齢は軽度な発現を示した。
これらの所見から，正中口蓋縫合部の拡大時には，type I collagen と osteopontin は骨形成初期，osteocalcin は骨形成中期に発現することが示唆された。また思春期ラットで拡大刺激に対する反応が強く励起されるが，若年成熟期ラットでは劣ることが示唆された。
キーワード：正中口蓋縫合，急速拡大，骨基質タンパク，遺伝子発現，加齢変化

緒

合の辺縁に沿って発現することを，報告している 3,4）。

言

骨には type I collagen（COLI）と数種の非コラーゲン

矯正治療において，上顎骨の幅径が顕著に狭窄してい性タンパクの存在が認められており，osteopontin（OPN）

る症例では上顎急速拡大装置を用いて正中口蓋縫合部をや osteocalcin（OCN）は骨形成や石灰化に密接に関与し拡大し，歯列弓幅径の拡大をはかる治療が行われている。

ていると考えられている。また，これらのタンパクは組

一般的に急速拡大装置は成長期の子供に適用するが，正織形成，細胞増殖や分化，細胞接着，石灰化の促進，抑中口蓋縫合の膜内骨化は 30 歳以前に骨結合することは制または調節などの様々な機能を果たしていると考えら少ないといわれているため 1），急速拡大装置適の適用可れている 5-7）。歯胚の発生過程や，下顎骨形成過程におけ

能年齢については明瞭な報告は少なく術者の判断によるる，COLI, OPN, OCN の分布を in situ hybridization 法

ものが大きい。上顎骨正中縫合部拡大に適した年齢や拡を用いて検討した報告 6,8）や，骨折治療過程でこれらのタ

大時の骨形成機序を解明することができれば，患者に最ンパク発現を検討した報告がある 9）が，正中口蓋縫合拡

適な条件で装置を使用でき，予知性の高い治療が可能に

大時にそれらの発現を検討した報告は少ない。さらに，なると考えられる。正中口蓋縫合部は，膜内骨化により

正中口蓋縫合拡大時の細胞応答についての加齢による相成長するが，強制的に縫合部を拡大した場合の縫合部骨異についての検討も十分には行われていない。そこで今

形成関連因子発現の詳細な報告はない。我々は週齢の異回，週齢の異なった 2 種の Wistar 系ラットの正中口蓋なるラットの正中口蓋縫合を急速拡大し，骨生体染色を

縫 合 部 急 速 拡 大 後 1 お よ び 5 日 の 細 胞 応 答 に つ い て，

用いた histomorphometry 法を用いて骨形成量を検討しCOLI, OPN, OCN の遺伝子発現の局在性や経日的変化た結果，6 および 15 週齢では縫合部が顕著に拡大し骨形を，in situ hybridization 法を用いて比較検討した。

成を誘導できたが，6 週齢に比べ 15 週齢では石灰化骨量

材料および方法が少なく，さらに 52 週齢では縫合部の新生骨が形成されないことを報告した 2）。また，6 週齢ラット縫合部の1． 動物

拡大後 1 日で fibroblast growth factor，transforming

本研究では 6 週，15 週齢の Wistar 系雄性ラット各 12

growth factor- β（TGF-β）のタンパク発現が正中口蓋縫頭，合計 24 頭（日本クレア，東京）を用いた。思春期（6（受付：平成 30 年 6 月 22 日）〒 101‒8310 東京都千代田区神田駿河台 1‒8‒1377

週 齢，200 g ± 5 g）， 若 年 成 熟 期（15 週 齢，300 g ±埋し，正中口蓋縫合部の切歯唇側縁最前点から口蓋裂隙

10 g）については，購入後 1 週間予備飼育したものを用い

最前点の距離を 2 等分する位置（図 1：破線 X）にて，臼た。ラットは実験期間を通じ日本大学歯学部実験セン

歯咬合平面に垂直に厚さ 5μm の前顎断連続切片を作製

ターにて温度 23℃，湿度 60%，1 日 12 時間の人工照明

し，リジンコーティングされたスライドガラスにマウンのもと固形試料と水道水を自由に摂取させ飼育した。まトした。

た実験による健康状態への影響を検討するため，実験期

4． ラット CLOI, OPN, OCN の RNA プローブの調整

間中毎日体重測定を行った。実験プロトコールは，日本

COLI RNA プローブの調整には 367 bp COLI cDNA

大学動物実験委員会の承認を得（K05-21），動物実験指針

断 片（nucleotide 807-1173） を 含 む pGEM-3 Zf（+）

に従って行った。

（Promega）を鋳型として用いた 10）。制限酵素を用いてプ

2． 急速拡大法

ラ ス ミ ド の 直 鎖 化 を 行 っ た 後，digoxigenin-uridine

ペントバルビタールナトリウム 50 mg/ 体 kg（ダイナ5’-triphosphate（DIG-UTP；Roche Diagnostics GmbH）

ボット社）による腹腔内麻酔下で，上顎左右切歯の歯肉

存 在 下 で，T7 ま た は SP6 RNA ポ リ メ ラ ー ゼ（Roche

縁直上側面を，フィシャーバー（直径 0.5 mm，松風）をDiagnostics GmbH）を用い，RNA アンチセンスフロー

用い注水下で近遠心的に穿孔した。Kanekawa ら の報

ブおよびセンスプローブの合成を行い，hybridization の告に従い正中口蓋縫合部の拡大のために左右切歯間に幅有無の確認を行った 11）。

2）

1.5 mm の厚さに調節した金属リングを挿入し，矯正用

OPN RNA プローブの調整に用いた DNA 鋳型には，

結紮線（0.07 mm，トミーインターナショナル）にて結紮

Oldberg ら 12）の 報 告 を も と に 作 製 さ れ た ラ ッ ト OPN固定した（図 1）。両週齢ラットは，拡大期間 1 日，5 日と，

cDNA（産業技術融合領域研究所，バイオニックデザイン

偽手術（切歯穿孔と結紮線による結紮）のみを行い非拡大

グループ，上村壽公博士より供与）に由来する 781 bp 断とした対照群の各 4 頭とした。

片（制限酵素 EcoR I と BamH I により切り出した核酸残3． 標本の作製

基 253-1033 部）を用いた。この鋳型を pGEM-3 Zf（+）プ

拡大後，1，5 日後及び対照群 5 日後のラットにペント

ラスミドにサブクローニングした後，EcoR I あるいはバルビタールナトリウム腹腔内麻酔を行い，0.1 M カコ

BamH I にて切断することによりプラスミドの直鎖化を

ジ ル 酸 で 緩 衝 し た 4％ パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド 混 合 液

行った 6）。

（pH 7.3）を用いて，通法に従って灌流固定を行った。正

OCN RNA プローブの調整には 480 bp OC cDNA 断

中 口 蓋 縫 合 部 を 含 ん だ 上 顎 骨 を 採 取 し，片を含む pGEM-3 Zf（+）を鋳型として用いた。制限酵素

diethylpyrocarbonate 添加による RNase free の 0.1 Mを用いてプラスミドの直鎖化を行った後，DIG-UTP 存

カコジル酸で緩衝した 4％パラホルムアルデヒド混合液

在 下 で，T7 ま た は SP6 RNA ポ リ メ ラ ー ゼ を 用 い，（pH 7.3）で 4℃，24 時間浸漬固定した。その後，これら

RNA アンチセンスフローブおよびセンスプローブの合の試料を冷 0.1 M カコジル酸緩衝液（pH 7.3）で十分に洗成を行った。

浄し，PBS 緩衝 20％ ethylenediaminetetraacetic acid

合成した 3 種のプローブはスポット法で DIG 標識効率

（EDTA）脱灰溶液（pH 7.5）に 4℃で 2 週間浸漬し脱灰しを確認するとともにドットブロット法によりた後，PBS にて十分に洗浄した。これらの試料はエタノー

hybridization の有無の確認を行った 8）。

ル系列を用いて脱水，その後通法に従ってパラフィン包5． in situ hybridization 法
組織切片を脱パラフィンした後に phosphate bufferedsaline（PBS）で洗浄した。塩基性タンパクの除去を行う
ために 0.2 N HCl 水溶液で室温 10 分反応させ，その後PBS で 洗 浄 し た。 プ ロ ー ブ の 浸 透 性 を 高 め る た め に
2μg/Ml の proteinase K（Gibco）を 含 む PBS で 37℃，
30 分間処理し，引き続き 4% パラホルムアルデヒドを含む PBS で室温，10 分間，再固定を行った。PBS で十分洗浄した後，切片に残存するフリーのアルデヒド基を除去するために，さらに 2 mg/ml のグリシンを含む PBS
で 室 温，15 分 間，2 回 浸 漬 さ せ，PBS で 洗 浄 後，60 ～
100％のエタノール系列で切片を脱水し，乾燥させた。

図1

その後，切片を hybridization 溶液［50％ホルムアミド，

上顎口蓋正中縫合拡大模式図
X 線（破線）：正中口蓋縫合を切歯最前方点から口蓋裂隙最前方点までの距離の 2 等分線

10 mM Tris-HCl（pH 7.6），0.2 mg/ml yeast tRNA（Roche Diadnostics GmbH），600 mM NaCl，0.25%

78ラット正中口蓋縫合拡大における加齢変化

SDS，1 × Denhart’s solution，10% dextran sulfate］を

2． OPN 遺伝子発現

用いて，室温で，1 時間 prehybridization を行った後，6 週齢において，拡大後 1 日では縫合部辺縁の主に骨さらに DIG 標識 RNA プローブをそれぞれの濃度に調整

芽細胞に中軽度な発現（図 3 A）を示し，拡大後 5 日ではし た hybridization 溶 液 で 48℃，16 時 間 反 応 さ せ た。

軽度な発現（図 3 B）に減少した。15 週齢において，拡大

Hybridization 終了後，2 × saline-sodium citrate（SSC），

後 1 日では軽度な発現（図 3 C）を示し，拡大後 5 日では

50% ホルムアミド溶液で 48℃，30 分間洗浄し，非特異

中軽度な発現（図 3 D）に増加した。非拡大群において，的な発色を抑えるために 20μm/ml の RNase A（Roche

発現は見られなかった（図 3 E）。

Diagnostics GmbH）を含む TNE 溶液（10 mM Tris-HCl,

3． OCN 遺伝子発現500 mM NaCl, 1 mM EDTA，pH7.6）で 37℃，30 分間

6 週齢において，拡大後 1 日では OCN の発現はほと反応させた。切片を TNE 溶液で洗浄後，2 × SSC，1 ×

んどなかったが（図 4 A），拡大後 5 日では主に骨芽細胞

SSC，0.2 × SSC にそれぞれ 48℃，30 分間，2 回ずつ浸で強度な発現が見られた（図 4 B）。15 週齢においても，漬し，非特異的に結合したプローブの洗浄を行った。切拡大後 1 日では OCN の発現はほとんどなく（図 4 C），拡

片を DIG buffer 1（100 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，

大後 5 日では軽度な発現（図 4 D）を示した。非拡大群にpH7.6）で室温，5 分間処理した。非特異的な抗体の反応

おいて，発現は見られなかった（図 4 E）。

の 結 合 を 防 止 す る た め に， 切 片 を DIG buffer2［1.5%考blocking reagent（Roche Diagnostics GmbH）お よ び

察

1.5% BSA（生化学工業）含有 DIG buffer1］に室温，1 時

これまで我々はラットの上顎正中縫合拡大による骨形間浸漬し，引き続き DIG buffer 2 で 500 倍に希釈した成の加齢変化について検討を行い，急速拡大による上顎alkaline phosphatase 標識抗体（Fab fragment of sheep

正中口蓋縫合部骨新生は加齢により減少することを明ら

anti DIG，Roche Diagnostics GmbH）に室温，30 分間

かにした 2）。そこで本研究では急速拡大による正中口蓋浸漬させた切片を DIG buffer 1 で十分に洗浄し，DIG

縫合部の骨新生機序を明らかにすることを目的に，急速

buffer 3（50 mM MgCl2，100 mM Tris-HCl, 100 mM

拡大後の正中口蓋縫合部の骨基質タンパクの発現とそのNaCl，pH 9.5）で 室 温，3 分 間 処 理 し た。nitro blue

加齢変化について検討を行った。

tetrazolium chloride（NBT），5-bromo-4-chloro-3-indolyl

COLI は，3 本鎖からなる triple helix 構造を有し 7），

phosphate, toluidine salt（BCIP）からなる NBT/BCIP

骨基質蛋白のなかで最も多く全基質蛋白の 90% を占め

stock solution（Roche Diagnostics GmbH）を DIG buffer
3 で 50 倍に希釈し，作成した発色溶液中に，室温，遮光下で，16 時間発色処理を行った。シグナル検出後，TE

表1

正中口蓋縫合拡大後の縫合部骨基質タンパクの遺伝子発現

図2type I collagen（COLI）遺伝子発現
A：15 週齢ラット，拡大後 5 日（矢頭：線維芽細胞），B：15
週齢ラット，非拡大 5 日

buffer（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 7.6）により発色を停止し，水溶性封入剤（Daido Sangyo）で封入した。
コントロールとしてアンチセンスプローブの代わりに
センスプローブを用いて hybridization を行った。
6． 組織標本の染色評価
切片の反応評価は関連がない 5 名の評価者により審査
し，染色反応の強さにより，反応の強さを半定量的に強度 strong（+++），中軽度 moderate（++），軽度 weak（+），
微弱 very weak（±）の 4 段階に分類した。全ての評価で4 名以上の同意があった。

結果拡大，非拡大で体重の有意差は無かった。各種タンパ
クの遺伝子発現を表 1 に示す。センスプローブを用いたものでは，特異的な染色反応は見られなかった。
1． COLI 遺伝子発現
COLI は，6 および 15 週齢のいずれも拡大後 1，5 日の正中口蓋縫合部において（図 2 A），非拡大群（図 2 B）と比較し，縫合部辺縁の骨芽細胞に強い発現があり，縫合部内の線維芽細胞（矢頭）にもわずかな発現が見られた。

79

図3

図4

osteopontin（OPN）遺伝子発現
A：6 週齢，拡大後 1 日 B：6 週齢，拡大後 5 日
拡大後 5 日 E：15 週齢，非拡大 5 日

C：15 週齢，拡大後 1 日

D：15 週齢

osteocalcin（OCN）遺伝子発現
A：6 週齢，拡大後 1 日 B：6 週齢，拡大後 5 日
大後 5 日 E：15 週齢，非拡大 5 日

C：15 週齢，拡大後 1 日

D：15 週齢拡る 12）。 今 回 の 実 験 結 果 で は， 拡 大 後 1 日，5 日 後 に，伝子発現が確認されたことから，縫合部内の COLI タン

COLI の強い発現を認めた。ラット臼歯部拡大時の正中パクは主に骨芽細胞によって合成されている可能性が示

口蓋縫合部 type Ⅰ，Ⅱ，Ⅹ collagen の免疫組織学的観唆された。一方，我々の以前の研究 3）で，急速拡大によ察で，拡大後 3 日に COLI の発現を認めたと報告されてり口蓋縫合部の TGF-βが強く発現することを報告しており，COLI は侵入血管とともに移動してきた未分化いる。TGF-βは骨芽細胞における COLI の合成を誘導し間葉細胞や骨芽細胞により合成されることも報告されて骨形成に重要な役割を果たすことから 14），少なくとも拡いる

大により誘導された TGF-βが COLI 発現を促進してい13）。本研究では正中口蓋縫合辺縁に強い COLI の遺

12）

80

ラット正中口蓋縫合拡大における加齢変化

る可能性が示唆された。

結OPN 発現について，6 週齢ラットにおいては，拡大後論

1 日で最も顕著に増加し拡大後 5 日にはその発現はやや

本研究において週齢の異なったラット上顎正中口蓋縫減少した。一方 15 週齢ラットにおいては拡大後 1 日よ合骨拡大過程における，COLI, OPN, OCN の遺伝子発現

りも拡大後 5 に強い発現が見られ，加齢に伴い反応が遅の経日的変化を in situ hybridization 法により比較検討

延することが示唆された。OCN 発現について，6 週齢及した結果，以下の結論を得た。

び 15 週齢ラットではともに拡大後 1 日より 5 日に発現1． 拡 大 後 の 縫 合 部 骨 基 質 タ ン パ ク 遺 伝 子 発 現 は，が増加していたがその発現は 6 週齢ラットのほうが顕著

COLI，OPN，OCN の順であり，COLI 発現は実験に強かった。これらの結果から，急速拡大は正中口蓋縫期間中維持された。

合骨部の非コラーゲン性タンパク発現を増加させ，また2． COLI，OPN，OCN の発現部位は主に口蓋骨辺縁部

その影響は 5 日以上継続すること，そしてその反応は骨芽細胞であり COLI は縫合部内の線維芽細胞にもラットの週齢により発現時期や発現強度に違いがみられ

軽度の発現があった。

たことがわかった。

3． 拡 大 刺 激 に 対 す る OPN と OCN の 発 現 時 期 は，15

ラット切歯拡大による切歯部正中口蓋縫合部の骨化は週齢に比べ 6 週齢が早かった。

膜内骨化であり，間葉系細胞から分化した骨芽細胞によ以上のことから，上顎骨拡大過程で拡大部辺縁の骨芽り，基質小胞性石灰化が起こり，骨組織が作られる 15）。

細胞のコラーゲン，非コラーゲンタンパクの分泌が盛ん

一方骨芽細胞は分化段階によって異なる骨基質を産生に起こり，骨新生が促進したことが示唆され，さらにそし，分化を伴って，OPN 次いで OCN が遺伝子およびタの促進は加齢により減少することが分かった。

ンパクレベルで発現すると報告されている 16）。COLI は稿を終えるにあたり，本研究に際し懇切なるご指導・ご鞭撻をいただきました日本大学名誉教授高城 稔先生，日本大学解剖学
第 I 講座元助手神谷直子先生をはじめ日本大学歯学部歯科矯正学
講座，解剖学第 I 講座の皆様に深く感謝いたします。
本研究に関して，利益相反はありません。

比較的広い分化段階で発現していることも報告されている 。また膜内骨化には，bone morphogenetic protein
7）（BMP）や fibroblast growth factor（FGF）を始めとしたさまざまな成長因子の関与が報告されており 7），BMP 発
現は Runt-related transcription factor 2（Runx2）を誘導し，また Runx2 は骨基質タンパクである COLI, OPN,

文献

OCN な ど の 発 現 を 誘 導 す る こ と も 明 ら か に な っ て い

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る 7）。OPN は，骨シアロタンパクの一つで 17），骨では骨芽細胞および破骨細胞によって合成され，骨芽細胞の初期分化促進や骨への接着促進，また，破骨細胞の骨表面への接着や骨吸収促進を促すことが知られている 16-18）。
OPN は骨芽細胞前駆細胞が幼若骨芽細胞まで分化すると産生し始め 18），integrin と結合し，mitogen-activatedprotein kinase カスケードを活性化し，骨芽細胞の初期分化過程に大きな影響を与えていると考えられている 18）。OCN は，骨に特有のタンパク質であり，骨芽細胞において豊富に産生され，ハイドロキシアパタイトとの結合能が高く，その Ca 結合性から石灰化に関与していると考えられ骨形成マーカーとして利用されている。
OCN は成熟骨芽細胞によって特異的に産生，分泌，合成され 16-18），骨芽細胞前駆細胞が幼若骨芽細胞まで分化した後，成熟骨芽細胞に分化するにつれて，産生を始める 16）。野村ら 19）は，マウス形成期後肢長骨一次骨髄腔に存在する未熟骨骨芽細胞は OCN mRNA を発現するように な る と OPN mRNA の 発 現 を 失 う と 報 告 し て お り，
OPN 発現が OCN 発現よりも早期に現れた今回の実験結果に一致していた。これらの結果は，正中口蓋縫合拡大時の骨修復が一般的な骨形成過程と類似することを示し
ていた。

81

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