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浦上財団研究報告書

Vol.28（2021）＜平成 30 年度助成＞

腸内細菌が産生するビタミンが宿主の免疫系制御に与える影響の解析

細野朗（日本大学 生物資源科学部 食品生命学科）

目

的ち、本研究では腸管免疫系細胞と上記のビタミンを共培養した際の IgA 抗体産生に与える影響を検討し、腸内に共生する腸内細菌は腸内環境の恒常性維持

さらに B 細胞の IgA クラススイッチを誘導する細胞はもちろんのこと、消化吸収や免疫系を通して宿主条件下におけるビタミン添加における影響を調べの生体応答に強く関与している。特に免疫系についた。その上で、無菌マウスにおいては腸内に共生すては、腸管関連リンパ組織の形成や感染防御反応、る腸内細菌が存在しないことから、腸内細菌が産生および炎症制御に関わる免疫防御反応に対して、腸するビタミンの影響を排除した上でビタミン欠乏状内細菌の存在が極めて重要な役割を担っている。ま態を食餌条件で制御することによって、真性のビタた、腸内細菌の中にはビタミン類の合成の役割をミン欠乏モデルマウスを作出し、ビタミン欠乏によ担っているものがあり、腸内環境だけでなく宿主のる腸管免疫系応答に与える影響の解析をめざした。

生理作用に寄与していることが知られている。本研
究は、これら腸内細菌が産生するビタミン類に注目

方法

し、特に、リボフラビン（VB2）、パントテン酸、ピリドキシン（VB6）、ビオチン、葉酸、シアノコバラ

１）腸管関連リンパ組織の細胞とビタミン とミン（VB12）、フィロキノン（VK1）、メナキノン（VK2）の共培養による IgA 産生応答についてについて、これらのビタミンが腸管免疫系細胞応答

8 ～ 10 週齢の雌性の BALB/c マウスから採取したに与える影響を解析することを目的に実施した。こパイエル板（PP）、盲腸リンパ節（CeP）、結腸リンれまでに食品成分が免疫性細胞応答に与える影響にパ節（CoP）の細胞懸濁液を RPMI 1640 培地にて調注目した報告はあるが、腸内細菌が産生するビタミ製し、各細胞にマウス腸内細菌由来の Bacteroidesンに注目した免疫修飾作用についてはその詳細な報

acidifaciens type A43 の加熱死菌体（BA）（0, 10 µg/告がないことから、本研究が腸内細菌の新たな機能mL）、および水溶性ビタミン（リボフラビン、パン性を明らかにする上でもその重要性は高いと考えら

トテン酸、ピリドキシン、ビオチン、葉酸、シアノれる。そこで、腸管免疫系の代表的な粘膜免疫応答コバラミン）、脂溶性ビタミン（フィロキノン、メである免疫グロブリン（IgA）産生は粘膜におけるナキノン）をそれぞれの添加条件（0，0.01，0.1，1，

感染防御応答に重要な役割を担っており、まず、上10，100，1000，2500 nM）で 1 週間共培養した。

記の腸内細菌が産生に関与しているビタミンのう

その後、培養上清を回収し、培養上清中の総 IgA 量

ち、どのビタミンが腸管免疫系の IgA 産生に作用すを ELISA により定量した。

るのかを ex vivo での細胞応答に与える影響について解析を行った。さらに、無菌マウスにおける腸内２）ナイーブ B 細胞の IgA クラススイッチに細菌環境を制御した条件でのビタミンの免疫修飾作

対するビタミン添加による影響の検討用についても明らかにすることをめざした。すなわ

BALB/c マウスから脾臓を採取して脾臓細胞懸濁腸内細菌が産生するビタミンが宿主の免疫系制御に与える影響の解析液を調製した。そして、得られた脾臓細胞懸濁液を結27

果mouse B cell isolation カクテルと抗 CD43 抗体、抗IgA 抗体を用いて磁気ビーズによるネガティブセレ

１）腸管関連リンパ組織の細胞とビタミン とクションで単離し、ナイーブ B 細胞として調製した。の共培養による IgA 産生応答について得られた細胞画分に TLR4 リガンドとして LPS（E.

PP 細胞においては、BA 菌体無添加条件でビオチ

coli 由来）3 µg/mL、および 0 もしくは 1 µM のビン、パントテン酸が同ビタミンの無添加時よりもオチンをそれぞれ添加して、さらに、TGF-β（2 ng/IgA 産生量が高まる傾向がみられた。BA 添加条件にmL）、IL-4（3 ng/mL）、IL-5（3 ng/mL） を そ れ ぞ

おいては、ビオチン、パントテン酸、葉酸とのそれれ添加して 48 well（2.5 × 10 cells/well）プレー

ぞれの共培養条件では同ビタミンの添加によって総トで 5 日間の培養を行い、細胞を回収した。ナイー

IgA 産生は増加する傾向がみられた。しかし、いずブ B 細胞において IgM から IgA クラススイッチが起れも独立した実験を十分に繰り返し行ってもバラツこる際には、Activation induced cytidine deaminase

キが大きく、検討したビタミンの添加による有意な（AID）という酵素および IµCα分子が誘導される特影響は認められなかった（図 1）。また、大腸部位の徴があることから、それぞれの培養条件での回収し腸管関連リンパ組織である CeP、CoP 細胞においてた細胞より総 RNA を抽出し、cDNA を合成後、AID

は、PP 細胞において比較的作用がみられたビオチン、mRNA、および IµCα mRNA の発現を real-time PCRパントテン酸の二種を添加し測定したが、相対値でで解析した。なお、添加するビタミンのうちビオチ数値を出した場合でも顕著な上昇が見られず、PP とンの影響を検討するために、ビオチンフリーの培地比較して大腸部位の CeP および CoP 細胞のビタミと し て Eagle’s MEM、 ビ オ チ ン フ リ ー の 血 清ンによる修飾作用は影響が少ないと考えられた。

6（streptavidin agarose resin 処理済ウシ胎仔血清）を用いた培養系で解析した。

２）ナイーブ B 細胞の IgA クラススイッチに対するビタミン添加による影響の検討

３）無菌マウスを用 いた真性 のビオ チン欠乏

脾臓細胞から IgM を高発現しているナイーブ B 細による腸管免役系応答に及ぼす影響の解胞を調製し、この細胞培養系に微生物菌体成分で刺析（現在継続して実施中）激することにより、IgM から IgA へのクラススイッ

8-12 週齢の無菌 BALB/c マウス、通常 BALB/c マチを誘導する実験を行った。このとき、ビオチン添ウスに対してビオチン含有食またはビオチン欠乏食加濃度を 0 または 1µM で添加した際に IgA のクラ（AIN-93）
を 8 週間給餌した飼育を行っている。今後、ススイッチによって誘導される AID および IµCαの脾臓、腸間膜リンパ節、パイエル板、結腸リンパ節

mRNA 発現に注目したトランスクリプトーム解析をを採取し、各リンパ節を除去した小腸および結腸組行った。それぞれの遺伝子発現は Hprt 遺伝子の発織も採取する。脾臓および各リンパ節は定法に従っ現を測定してその相対値として示した。その結果、て細胞懸濁液を調製し、フローサイトメトリーによビオチンの添加によって IgA クラススイッチの誘導る T 細胞フェノタイプの解析（CD4，CD69，CD44，によってみられる IµCαの mRNA 発現が高まる可能

CD45RB，Foxp3，PD-1，CXCR5 など）および IgA性がみられた（図 2）。

産生を誘導する刺激として BA 加熱死菌体と共培養し、培養上清中の総 IgA 産生量を測定する。さらに、

３）無菌マウスを用いた真性のビオチン欠 乏

パイエル板除去後の小腸組織、および結腸リンパ節による腸管免疫系応答に及ぼす影響の解除去後の結腸組織をホモジナイズして腸管組織粘膜

析

中の総 IgA 量を定量する。

BALB/c マウスの無菌マウスおよび SPF マウスを

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図1

図2

Vol.28（2021）

PP 細胞培養系にビタミンを添加した際の IgA 産生応答に与える影響

ナイーブ B 細胞に対して菌体刺激で IgA 産生誘導を行ったときの IgA クラススイッチに関連した分子の mRNA 発現への影響

それぞれ無菌アイソレーターおよび通常の飼育環境

考察下においてビオチン欠乏食（AIN-93）、およびビオチン含有標準食（AIN-93）にて飼育中であり、腸内本研究で実施した腸管免疫系細胞の培養 IgA 産生細菌を制御した真性のビオチン欠乏条件における免応答の評価系における各種ビタミン添加実験におい疫系への影響を継続して検討中である。ては、総 IgA 産生応答に与える影響は限定的で、ビオチンやパントテン酸が IgA 産生を誘導する可能性があるかもしれないが、ビタミンがこの細胞応答に顕著に与える影響をうまく評価することができなかった。その理由として、RPMI 1640 培地にはある腸内細菌が産生するビタミンが宿主の免疫系制御に与える影響の解析29程度のビタミンが存在しており、IgA 産生応答に作

なお、本研究で得られる知見は、免疫系が未発達用するビタミン濃度の閾値が低い可能性が考えられな乳幼児および免疫系の機能低下によるリスクを抱た。そのため、上記の実験において比較的細胞応答える生物個体に対し、免疫調節作用を有するプロバが高い傾向がみられたビオチンに注目し、培地中のイオティクスなどの機能性食品の開発に対して、抗ビオチン濃度を下げた条件で検討を行う必要がある

感染作用に重要な IgA 産生を制御する生体応答を誘と考えられた。実際に、培養実験に使用する培地中導するためのプロバイオティクス等の機能性開発にのビオチン濃度をアビジン処理して低下させることとって有用な情報となることが期待される。そして、によって、ビオチンの添加による細胞応答への影響

この知見をもとに、機能性食品分子による免疫調節は IL-6 産生などにおいて変化することが確認されて作用を介した応用性を検討し、腸共生系を標的としおり、解析条件におけるビオチン濃度は大きな影響た機能性食品の設計をめざしてまいりたい。

を与えていることが明らかとなった。今後、ex vivo
実験においても厳密なビオチン濃度を管理するこ謝

辞と、さらに in vivo 実験においては腸内細菌が産生す

本研究の遂行にあたり、研究助成を賜りました公るビオチン濃度も考慮した真性のビオチン欠乏条件

益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に厚く御礼をでの解析が、本研究目的を達成するためには重要な申し上げます。

ポイントとなる。

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Vol.28（2021）

Analysis of the effects of vitamins produced by intestinal commensal
bacteria on regulation of the host immune system
Akira HOSONO
Department of Food Bioscience and Biotechnology, College of Bioresource Sciences,
Nihon University
In the immune system, the commensal bacteria in the intestine play an
extremely important role in the development of gut-associated lymphoid tissue,
defense against infection, and immunoregulation of inflammation. This study
focuses on the vitamins produced by these commensal bacteria, particularly
riboflavin, pantothenic acid, pyridoxine, biotin, folic acid, cyanocobalamin,phylloquinone, and menaquinone. The purpose of this study was to analyze theeffects of these vitamins on the intestinal immune system.
Among the vitamins produced by intestinal bacteria, which of these act on
IgA production in the intestinal immune system was analyzed with respect tothe effects on ex vivo cellular responses. Upon co-culture with a vitamin andPeyer’s patch cells from the small intestine, biotin and pantothenic acid tended
to result in higher IgA production, relative to cells without stimulation by thev i t a m i n . H o w e v e r, e v e n w h e n i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s w e r e r e p e a t e dsufficiently, no significant effect on IgA pro duct ion was observed due toaddition of the vitamins. Naive B cells displaying high expression levels of IgM
were prepared from spleen cells, and the resulting culture system wasstimulated with microbial components to induce class switching from IgM toIgA. As a result, it was found that the expression of IµCα mRNA, which wasobserved via the induction of an IgA class switch, might be increased by theaddition of biotin. Furthermore, in current work, germ-free mice or SPF mice
are ingesting a biotin-deficient diet or biotin-containing standard diet,respectively. We are currently investigating the effects on the immune system
under the condition of a biotin deficiency, which regulates immune responses
in vivo .