日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 90, 39-44, 2016

ラット頭頂骨 GBA モデルにおける骨髄穿通孔の大きさが骨増生および血管新生に及ぼす影響佐藤暢亮

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻（指導：佐藤 秀一 教授）

要旨：ラット頭頂骨 guided bone augmentation（GBA）モデルを用いて，骨髄穿通孔の大きさが骨外側方向への骨増生および血管新生に及ぼす影響をエックス線学的および組織学的に検討した。ラットの頭頂骨を露出し，トレファインバーを用いて左右対称に外周溝を形成した。骨髄穿通孔は，大きな孔 1 ヶ所の 1 S 群と小さい孔 7 ヶ所の7 M 群（両群とも骨髄穿通率：およそ 29%）とし，規格化したプラスチックキャップを外周溝に嵌合させ固定した。
キャップ内の血管新生と骨増生を，術後 14 と 28 日にマイクロ CT および組織切片を用いて解析した。血管新生は両群ともに，骨髄穿通部から骨外側方向に分布領域が広がっていた。術後 14 日において，1 S 群は 7 M 群と比較し新生血管量が有意に増加した。術後 28 日の 1 S 群は，7 M 群と比較して増生骨量が有意に増加した。以上のことか
ら骨髄穿通率を同一にし，骨髄穿通孔を大きくすると早期により多くの新生血管が形成され，その後，骨外側方向の骨増生が促進することが示された。
キーワード：ラット頭頂骨，骨髄穿通，血管新生，骨増生

緒外側方向への骨増生および血管新生に及ぼす影響をエッ言

クス線学的および組織学的に検討した。

歯周病や外傷が原因で抜歯された部位にインプラント材料および方法を 埋 入 す る 場 合， 骨 再 生 誘 導（GBR：guided boneregeneration）法を用いた骨再生が必要となる症例が多1． 実験動物い 1）。しかし，GBR 法を行っても骨外側方向に常に十分

実 験 に は，Fischer ラ ッ ト 40 頭（ 雄 性 8 週 齢， 体 重2, 3）。そこ

170-200 g，日本クレア）を用いた。ラットは，恒温恒湿で著者が所属する講座では，guided bone augmentation（23±2℃，55±5%），午前 7 時点灯，12 時間明暗サイク（GBA）動物モデルを用いて骨外側方向への効果的な骨増ルの飼育室で飼育した。また，実験に先立って前述の条生を検討するために，組織再生に必要な細胞，足場およ件下で 2 週間予備飼育した。飼育期間中，ラット・マウ

び成長因子を変化させての検討が行われてきた 4-7）。

ス用 MF 固形飼料（オリエンタル酵母工業）と水道水を自な骨量と良好な骨質を獲得することは難しい

骨髄穿通は既存骨をラウンドバーで穿通し，骨髄から由に摂取させた。実験プロトコールは，日本大学動物実細胞や成長因子などを溢出することによって骨外側方向

験 委 員 会 の 承 認（AP12 D011）の 下 で， 動 物 実 験 指 針 にの骨増生を促進させる5, 8）

従って行うとともに，動物の苦痛軽減および使用動物数。また，骨髄穿通時の実験母地に対する穿通孔の面積の割合（骨髄穿通率）を同一にすの低減に努めた。

ると，穿通孔を大きくした方が早期に骨増生量が増加す

2． ラット GBA モデル作製ることが報告されている 9）。

ラットにイソフルランによる吸入麻酔後，3 種混合麻骨再生には，細胞や栄養供給を担うために血管新生が酔薬（塩酸メデトミジン 0.15 mg/kg，ミダゾラム 2.0 mg/必要であり，再生骨は血管からの細胞や栄養供給によっkg，酒石酸ブトルファノール 2.5 mg/kg）を腹腔内投与10-13）。さらに，骨再生時の血管新生は骨再生し，全身麻酔を行った。手術野の頭頂部を剃毛し，塩酸量や再生骨の骨質を調節している可能性が示されていリドカイン（1/80,000 エピネフリン含有 2% キシロカイる 14）。しかし，骨外側方向の骨増生時の血管新生の動態

ン，デンツプライ三金）0.5 ml を局所麻酔した。矢状縫合は不明であり，骨外側方向の骨増生のメカニズムを解明に沿って切開し，筋層および骨膜を剥離した。その後，するためには骨増生時の血管新生の動態観察が必要であ

頭頂骨を露出し，トレファインバー（直径 5.0 mm，マイる。そこで本研究では，ラット頭頂骨 GBA モデルを用ロック）を用いて滅菌生理食塩水で洗浄しながら正中縫いて骨髄穿通率を同一にし，穿通孔の大きさの違いが骨合を避け左右対称に外周溝を形成し，それぞれを実験母て形成する（受付：平成 27 年 12 月 14 日）〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 1339撮像条件は，管電圧 90 kV，管電流 88μA，照射時間 17 秒，地とした。実験母地の一方は，トレファインバー（直径2.7 mm，マイロック）を用いて中央に 1 孔，他方はラウvoxel size 30×30×30μm とした。撮像時はキャップ底ンドバー（#2，直径 1.0 mm，マニー）を用いて小孔 7 孔面が基準平面（水平面）と平行になるように，ラット頭部の骨髄穿通を行った。骨髄穿通率 9）は両群ともにおよその固定方向を調整した。

29% とし，それぞれを 1 S 群と 7 M 群とした（第 1 A 図）。

4． 造影マイクロ CT

さらに，円柱状のプラスチックキャップ（ハイコフレッ

ラットに全身麻酔を行い，Udagawa ら 14）の方法に準クススリムハウジングパターン 4031 用，ニッシン：高じて，術後 14 および 28 日に還流固定に準じた方法で脱さ 1.5 mm 内径 4.4 mm）を外周溝に嵌合させ（第 1 B 図），血した。固定後，自動注入器（シリンジポンプ，アズワン）

キャップの上部には光重合型コンポジットレジン（エスを用いて造影剤イオパミドール（イオミパロン 370，バイテライトフロークイック，トクヤマデンタル）を用いてエル薬品）を 2 ml/min で 20 ml を心臓から注入しマイク

マイクロ CT 撮像時の参照点とした（第 1 B 図）。その後，

ロ CT を前述の方法と同様に撮像した。

骨膜でキャップを可能な限り被覆して，筋膜および皮膚5． マイクロ CT 断層像の観察と解析を復位した。

血管新生と骨増生は i-VIEW（モリタ）を用いて 3 軸方

3． マイクロ CT 撮像

向を観察した。関心領域内の増生骨量と新生血管量はオ

前述と同様の方法でラットに全身麻酔を行い，0，14リジナルソフト（北千住ラジスト歯科）を用いて定量した

お よ び 28 日 に 実 験 動 物 用 3 D マ イ ク ロ CT（ マ イ ク ロ（第 2 図）。新生血管量は血管造影前後の CT データ（差CT，R̲mCT，リガク）を用いてラット頭部を撮像した。

分）をもとに，関心領域の新生血管量の割合（%）を算出し第1図

ラット頭頂骨 GBA モデル
A：1 S 群は実験母地の中央に大きな穿通孔 1 孔，7 S 群では小さな穿通孔を 7 孔形成した
B：外周溝にプラスチックキャップを嵌合させ固定した

第2図

マイクロ CT 解析における関心領域の模式図

40

GBA モデルにおける骨髄穿通孔の影響た。また，増生骨量は断層撮像から得られたヒストグラ

また，新生組織中の毛細血管断面像は倍率 400 倍の条件

ムから周囲軟組織および既存骨の放射線吸収度のピークで標本中の全ての断面像をカウントした。計測は 1 標本値を求め，その中間値を増生骨の放射線吸収度の下限と3 回行い，その平均値をもって標本の値とした。

した。この値をリファレンスとして，各群の関心領域の7． 統計学的分析
術後 14 および 28 日の 1 S 群と 7 M 群の血管新生量お増生骨量を測定した。

よび骨増生量の比較には Wilcoxon signed-rank test を6． 組織標本の作製と解析用いて，それぞれ危険率 5％で統計処理を行った。

術後 14 および 28 日の血管造影後，キャップを含む頭頂骨を周囲軟組織とともに一塊として取り出し，10% 中結性 緩 衝 ホ ル マ リ ン 溶 液 に 3 週 間 浸 漬 し た。 そ の 後，Morse の脱灰液で 24 時間脱灰後，通法に従いパラフィ果

1． マイクロ CT 所見

ンに包埋し，厚さ 5μm で矢状縫合に平行に切片を作製

増生骨は術後 14 日では両群ともほとんど観察されなし，ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色を行い，キャッかった。術後 28 日の 1 S 群では線状の増生骨が観察されプ内の組織像を 600 dpi のデジタル画像として得た。組たが，7 M 群の増生骨はわずかであった（第 3 図）。

織像に基づく形態計測では，光学顕微鏡（AHI BS-514，造影マイクロ CT によって観察された血管は，両群とオリンパス）下で，画像解析ソフト（Adobe Photoshop

もに脳動脈から分岐し，骨髄穿通部に達し，骨外側方向Elements 8.0，アドビシステム）の自動選択ツールを用いに分布領域が拡大していた。また，1 S 群は 7 M 群と比て，組織学的な形態や色調を指標として増生骨のピクセ

較してプラスチックキャップ内で血管がより広範囲に分ル数を測定し，キャップ内の増生骨の割合（%）を求めた。

布していた（第 4 図）。

第3図

マイクロ CT 像による増生骨の観察像

第4図

造影マイクロ CT による新生血管の観察像
Y：血管撮像後の矢状断画像，X：血管撮像後の水平断画像

41

学的に観察した。その結果，骨外側方向の骨増生時にお2． 組織学的所見
術後 14 日の両群で穿通部から増生した血管を含んだける血管新生は骨髄穿通部から骨外側方向に分布してい結合組織が観察されたが，増生骨はほとんど認められなた。また，穿通孔の大きさをより大きくすると多量の血かった。術後 28 日になると両群ともに増生骨が認めら

管新生が早く起こり，その後，骨増生が促進することがれたが，1 S 群の方が 7 M 群に比較して骨増生が顕著で示された。

あった（第 5 図）。

血管新生は脳動脈から骨髄穿通部に進展し，そこから3． 定量的評価

骨外側方向に分布領域が拡大していた。ラット頭頂骨の増生骨量は術後 14 日では有意差が認められなかった

骨再生は膜性骨化によって生じるため，骨再生時の血管が， 術 後 28 日 で 有 意 差 が 認 め ら れ た（ 第 6 図 ）。 一 方，新生は周囲組織の既存血管から始まると考えられていマイクロ CT で定量したキャップ内の血管占有率は術後る 15）。Udagawa ら 14）は，本研究と同様の方法を用いて14 日において 1 S 群で 7 M 群と比較して有意に増加し内側性骨欠損に対する骨再生時の血管新生の動態を観察た。しかし，術後 28 日では有意差が認められなかった（第した。その結果，新生血管が脳動脈から既存骨辺縁部に7 図）。

向かって進展し，さらに，骨欠損部で骨再生とともに広組織標本による評価では，増生骨面積割合は術後 28がることを報告した。ウサギ頭頂骨の GBA モデルを用日において 1 S 群で有意に増加した（第 8 図）。一方，結いた組織学的観察でも，血管は骨髄穿通部から骨外側方合組織中の血管断面出現数は術後 14 日で 1 S 群で有意に向に進展していることが観察されている 16-18）。
Schwarz ら 19）は，イヌの裂開状骨欠損に物質透過性の増加していたが，術後 28 日では有意差は認められなかった（第 9 図）。

異なる遮蔽膜を用いて骨再生量を評価した結果，物質透考過性の低い遮断膜は物質透過性の高い遮断膜と比較して察再生骨量が減少したと報告した。このことから，骨外側ラット頭頂骨 GBA モデルを用いて骨髄穿通率を同一方向の骨増生を促進させるためには物質透過性の高い遮とし，穿通孔の大きさの違いが骨外側方向への骨増生お蔽膜を使用し，骨膜や周囲組織から血管新生を促すことよび血管新生に及ぼす影響をエックス線学的および組織が有効な方法であると考えられた。

第5図

組織学的観察標本

42GBA モデルにおける骨髄穿通孔の影響

第6図

マイクロ CT 像による増生骨量の定量的評価

第8図

組織形態計測における増生骨の面積の割合

第7図

造影マイクロ CT 像による血管新生量の定量的評価

第9図

組織形態計測による結合組織中の血管断面出現数

結両群の増生骨は，術後 14 日ではほとんど観察されな論かったが，術後 28 日になると観察されるようになった。

ラット頭頂骨 GBA モデルを用いて骨髄穿通率を同一

このことから，骨外側方向の骨増生では骨内欠損におけにし，穿通孔の大きさを変えて骨外側方向への骨増生時る骨再生と同様に 14），骨増生に先行して血管新生が生じの血管新生に及ぼす影響をエックス線学的および組織学

17, 18）

的に観察した結果，以下の結論を得た。

増生骨量は，術後 28 日で 1 S 群の方が 7 M 群よりも1． ラット GBA モデルにおける両群の骨外側方向の骨有意に増加したが，術後 14 日では両群で有意差は認め

増生時の血管新生は，脳動脈から分岐し骨髄穿通部られなかった。に達し，そこから骨外側方向に分布領域が拡大してることが確認された。

いた。

新 生 血 管 量 は 両 群 で， 術 後 14 日 で 1 S 群 の 方 が 7 M群よりも有意に増加した。両群の骨髄穿通率は同一に設

2． 骨髄穿通率が同じ場合，1 S 群は 7 M 群に比較して定されているところから，穿通孔を大きくすると，新生術後 14 日で血管新生量が有意に増加し，術後 28 日血管が早期に多く形成されることが示された。また，こで増生骨量が有意に増加した。の理由としては，穿通孔を大きくすると穿通部から血管本研究の遂行にあたり，格別たるご指導ご鞭撻を賜りました，
日本大学歯学部歯科保存学第Ⅲ講座 佐藤秀一教授に謹んで心より感謝申し上げます。
また，研究を通じ多大なるご協力とご助言をいただきました，
日本大学特任教授 新井嘉則教授ならびに歯科保存学第Ⅲ講座の皆様に深く感謝します。

新生に必要な細胞や栄養成分が流入しやすくなるためと考えられた。したがって，骨外側方向の骨増生では，穿通孔を大きくすると早期に血管新生が増加し，その後，増生骨が増加することが判明した。

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