Glycative Stress Research
Online edition : ISSN 2188-3610
Print edition : ISSN 2188-3602
Received : July 22, 2020
Accepted : August 20, 2020
Published online : September 30, 2020
doi:10.24659/gsr.7. 3_211

Original article

A rapid pretreatment method for the determination of pentosidine inhuman plasma by high performance liquid chromatography
Chieko Sakiyama 1), Masayuki Yagi 1), Shota Miyazaki 2), Atsushi Sato 2), Kaori Ishizaki 1),
Yoshikazu Yonei 1)
1) Anti-Aging Medical Research Center and Glycative Stress Research Center, Faculty of Life and Medical Sciences,
Doshisha University, Kyoto, Japan
2) GL Sceiences Inc., Tokyo, Japan

Glycative Stress Research 2020; 7 (3): 211-219(c) Society for Glycative Stress Research（原著論文：日本語翻訳版）

高速液体クロマトグラフィーによるヒト血中ペントシジン測定のための迅速な前処理法
﨑山智恵子 1)、八木雅之 1)、宮﨑将太 2)、佐藤 睦 2)、石崎 香 1)、米井嘉一 1)
1) 同志社大学大学院生命医科学研究科アンチエイジングリサーチセンター・糖化ストレス研究センター、京都府京田辺市
2) ジーエルサイエンス株式会社、東京都新宿区

抄録［目的］血中ペントシジンの HPLC- 蛍光測定において、多検体測定には検体前処理の煩雑さや測定時間といった課題がある。本研究では検体処理の簡便化を目的とし、スピンカラムを用いた検体前処理法を検証した。

［方法］血液試料（検体）は 20 ～ 100 歳未満の健康な男女から提供を受けた血漿を用いた。検体の前処理法の検証には 50 ～ 80 歳代の男女 40 名から提供を受けた血漿を混合し、均一化後使用した。検体は 6 N 塩酸下で加水分解後、陽イオン交換基と疎水性基の混合基を担体として有するスピンカラム（Monospin AG）に添加し溶出した。ペントシジンは逆相カラムを用いて HPLC にて蛍光検出した。血漿中ペントシジンは 20 ～ 80 歳代男女
72 名の被験者を対象とし、年齢および加齢マーカーとの相関性を検証した。本研究は同志社大学および、一般

社団法人糖化ストレス研究会の「人を対象とする研究」に関する倫理審査委員会の審議・承認のもと実施した。

連絡先： 教授 八木雅之
同志社大学大学院生命医科学研究科アンチエイジングリサーチセンター／
糖化ストレス研究センター〒610 -0321 京都府京田辺市多々羅都谷 1- 3
TEL＆FAX：07 74 - 65-639 4 e-mail：myagi@mail.doshisha.ac.jp
共著者：﨑山智恵子, csakiyam@mail.doshisha.ac.jp; 宮﨑将太 , s-miyazaki@gls.co.jp;
小椋真理 m-ogura@po.kbu.ac.jp; 寺阪剛 t-terasaka@kyouwa-r.com ;佐藤 睦, a.sato@gls.co.jp; 石崎 香, ko-sei12@mail.doshisha.ac.j p;
米井嘉一, yyonei@mail.doshisha.ac.jp（ 1 ）Glycative Stress Research 2020; 7 (3): 211-219
本論文を引用する際はこちらを引用してください。
(c) Society for Glycative Stress ResearchGlycative Stress Research［結果］本前処理法による検体中のペントシジンの添加回収率は平均 116 % であった。加水分解後の前処理に要する時間は 10 分以内であった。測定した被験者の血漿中のペントシジン値と年齢とは正の相関性が認められ、HbA1c とは弱い正の相関性が認められた。皮膚 AGEs の蓄積量と血漿中のペントシジン値に関しては、AGE
Reader mu による測定値とは正の相関性が認められ、AGEs Sensor による測定値とは弱い正の相関性が認められた。

［結論］血液検体の前処理時間は、陽イオン交換基と疎水性基の混合基を担体とするスピンカラムを用いること
で、イオンペア -HPLC 法の約 12 時間から約 10 分に短縮された。さらに本前処理により夾雑物を軽減したことによって HPLC 測定時間はクエン酸 -HPLC 法の 1/ 3 に短縮することができた。本法は血中ペントシジンの多検体測定法として有用であることが検証された。

KEY WORDS : 血中ペントシジン、HPLC、糖化ストレス

はじめに官能基として陽イオン交換基と疎水性基（オクタデシル基）を有するスピンカラムを用いた血液検体の前処理法の適用

生 体 中 の 蛋 白 質 と グ ル コ ー ス 等 の 還 元 糖 が 非酵素的に 反 応 す る と、 組 織 内 に は 糖 化 最 終 生 成 物（advanced

glycation end products: AGEs）が生成する 1)。AGEs の生

体内への蓄積は、糖尿病合併症、動脈硬化、骨粗鬆症等の発症や進展に関与する。このような糖化による生体への影
響は糖化ストレスとよばれる 2)。

ペ ントシジンは AGEs の一種で、1989 年にヒト脳硬膜

コラーゲン中から単離された 3)。ペントシジン分子はリジンとアルギニン側鎖のアミノ基間をペントースが架橋した
イミダゾピリジニウム環を有し、蛍光性かつ蛋白架橋性を 有 す る。 生 体 に お い て ペ ン ト シ ジ ン は ヒ ト の 滑 膜 や
軟骨 4, 5)、皮膚コラーゲン 6, 7) などに存在し、加齢に伴い組織中の蓄積量が進行することが知られている。骨コラーゲ
ン中ペントシジンの蓄積は骨質を低下させ、骨折リスクと関連する 8)。また高濃度の血中ペントシジンは冠動脈疾患性を検証した。

方法
試薬
血漿の加水分解には 35 % 無鉄塩酸（hydrochloric Acid
(35 %), Fe free；ナカライテスク、京都府京都市）を使用した。アセトニトリル（acetonitril : ACN）は HPLC 用（富士フィルム和光純薬、大阪府大阪市）を使用した。その他の試薬は特級グレードのものを富士フィルム和光純薬（大阪府大阪市）または シグマアルドリッチジャパン（東京都目黒区）より購入した。

装置
測 定 に は HPLC シ ス テ ム（3-line degasser : DG-980-

9)の発症や進行につながると考えられている 。さらに糖尿
病患者

10)

、慢性腎不全患者

11, 12)、関節リウマチ患者

13, 14)、

統合失調症患者 15) などで血中 ペントシジン濃度が高値を示すことが報告されている。このように血中 ペントシジン
量は、種々の疾病のバイオマーカーとなる可能性がある。

血中ペントシジンの測定法には、酵素免疫測定法（ELISA法）16)、HPLC - 蛍光 法（イオンペア -HPLC 法 17,18,19）、ク

エン酸 -HPLC 法 20, 21) ）などが報告されている。これまでの ペントシジンの HPLC 測定法では多検体測定への応用に課題があった。血液検体を塩酸加水分解後カラムクロマ
トグラフィーによる吸着溶出、試料の乾固といった前処理

50, Ternary gradient unit : LG-1580-02, Intelligent HPLC
pump : PU-980, Intelligent sampler : AS-2057-Plus,
Fluorescence detector : FP-4020, Column oven : CO4020 ）および ChromNAV データ解析システム（日本分光、
東京八王子）を使用した。蛍光測定には Varioscan flash
マイクロプレートリーダー（ Thermo Scientific, 東京都港区）を用いた。

ペントシジン標準品
ペントシジン標準品はペプチド研究所（大阪府茨木市）

操作の煩雑さ、さらに HPLC 測定時間等が課題であった。

の ペントシジン―トリフルオロ酢酸塩（ pentosidine-TFAションなどの濃縮・乾固操作をすることなく、遠心操作にに溶解し、添付文書に記載のペントシジン含有量に基づ

スピンカラムは生体試料などの微量サンプルをエバポレー
よる迅速な濃縮・精製が可能な試料の前処理用の固相抽出

カラムである。本研究では血中ペントシジンの HPLC 測定
における前処理方法を簡便化することを目的とし、担体のsalt）を 購 入 し た。Pentosidine-TFA salt を 適 量 の 蒸 留 水

き ペ ント シ ジ ン 濃 度（pmol/mL）を 算 出 し た（ 分 子 量：
378.43）。ペントシジン溶液は分注し、使用前まで -20 ℃
にて保管した。

（ 2 ）ヒト血中 ペ ントシジン測定 のための迅速な前処理法

血漿の加水分解溶液の調製

ストレス研究センターの研究に関係する人で、予め開催し加水分解処理中のペントシジン生成を防ぐため、あらかた本試験に関する試験説明会に参加し、本試験への参加をじめ水素化ホウ素ナトリウム溶液で血漿サンプルを還元し文書で同意した。

溶液（ pH 9.2 ）を 50 μL 添加し、室温にて 30 分以上静置

80 歳代の男女 4 0 名から提供を受けた血漿を各 1 mL 混合た 21)。血漿 50 μL に 200 mmol/L 水素化ホウ素ナトリウムした。還元後、6 N 無鉄塩酸を 100 μL 添加し、ブロックイ

ンキュベーターを用いて 105 ℃ で 18 時間加温し、加水分解を行った。

加水分解後、1.5 mol/Lトリスヒドロキシメチルアミノ

メタン（ Tris (hydroxymethyl) amino-methane : Tris）溶液

を 200 μL 添加し、溶液中の塩酸を希釈した。加水分解溶

液中の沈殿物は遠心ろ過フィルター（セントリカット超ミ
ニ W-MR ( PTFE 膜孔径 0.45 μm)、クラボウ社、大阪市中

血中ペントシジンの前処理法の検証においては、50 ～

し、均一化後使用した。血中ペントシジン濃度と糖化ストレス指標との相関性の検証においては、20 ～ 80 歳代の男

女 72 名（男性 13 名、女性 59 名）の被験者を対象とし、平均年齢は 48.3 ± 18.6 歳（平均値 ± 標準偏差）であった。

血液検査
本試験では被験者から静脈採血した血液試料を用いて血液生化学検査を行った。検査項目は白血球数（WBC）、赤央区）を用いて遠心分離（5,000 × g 、1 分、4 ℃ ）により、ヘモグロビン（ Hb）、ヘマトクリット（ Ht）、血球数（RBC）

血漿へのペントシジン標品の添加回収試験では、10 μ L の

平均赤血球血色素濃度（MCHC）、血小板（TP）、血液像取り除いた。

平均赤血球容積（MCV）、平均赤血球血色素量（MCH ）、

ペントシジン標準液を加水分解後の塩酸希釈溶液（4 00（好中球：NEUTRO、リンパ球：LYMPHO 、単球：MoC 、

スピンカラムによるペントシジン HPLC 測定前処理法

コレステロール（ TC ）、HDL- コレステロール（HDL-C）、
LDL - コレステロール（LDL-C）、血清尿素窒素（BUN）、
ク レ ア チ ニ ン（CRE）、 尿 酸（ UA ）、 ヘ モ グ ロ ビ ン A1c（HbA1c/NGSP）とした。 被験者採血は随時行われたため、μL）に添加して用いた。

スピンカラムによる HPLC 測定前処理には Monospin

AG カラム（GL サイエンス社、東京都新宿区）を用いて行った。Monospin AG カラムはシリカモノリス（シリカ骨格に細孔を持つ表面積の大きい高純度シリカゲル）に陽イオ
ン交換基と疎水性基（オクタデシル基）の混合基が結合した担体を有するのが特徴である。前処理操作の各ステップ
は Monospin AG カラムに溶液を添加し、遠心分離（5,000

× g 、1 分、4 ℃ ）にて通液した。溶液条件は次の 6 ステッ
プとした；①コンディショニング（ 0.1 mol/L クエン酸 /ACN (990 /10) 溶液 200 μL）、②平衡化（ 0.1 mol / L クエ
ン酸溶液 400 μL）、③試料の添加（150 μL）、④洗浄（ 0.1
mol/ L クエン酸溶液 500 μL）、⑤溶出 1（ 1 mol/ L ギ 酸アンモニウム溶液 75 μL）、⑥溶出 2（1 mol/ L ギ 酸アンモニ
ウム /ACN (50/50) 溶液 75 μL）。⑤と⑥ のステップで得た溶出液を均一に混合し、測定試料とした。

好酸球：EOSINO、好塩基球：BASO）、総蛋白（TP）、総血糖およびインスリンの測定は除外した。血液生化学検査
は株式会社 LS I メディエンス（東京都千代田区）に依頼して測定した。

皮膚 AGEs 測定

皮 膚 AGEs の蓄積量は非侵襲測定を行い、測定機器は

AGE Reader mu（ Diagn Optics, Groningen, Nederland）
AGEs Sensor（Sharp, Osaka, Japan）の 2 機種を使用した。
測定部位は AGE Reader mu が右前腕、AGEs Sensor が 左
手中指とした。

統計解析
各測定データは基本統計量（平均値、標準偏差）を算出した。 統計解析には統計解析ソフト BellCurve for Excel（社会情報サービス、東京都新宿区）を使用した。血漿中のHPLC によるペントシジン測定条件

HPLC 測定には逆相シリカゲルカラム InertSustain AG

ペントシジン量との相関性はピアソンの積率相関係数を用いて評価した。 相関係数（ r ）が 0.4 < | r| ≦ 1.0 を相関性

（ 3 μm, 100 mm × 4.5 mm ID）（ GL サイエンス社、東 京

あり、0. 2 < |r| ≦ 0. 4 を弱い相関性ありとした。統計解析℃、溶離液；A 液：0.1% (v/v) ギ 酸 水溶液、B 液：100 %ACN、溶出条件；0 % B (0 -10 min), 50 % B (10 -12 min),
0 % B (12 -18 min)、流速；1.0 mL/min、検出；蛍光（励起波長 325 nm、検出波長 385 nm）、サンプル注入量；20μL とした。

傾向ありとした。

都新宿区）を用いた。HPLC 測定条件は、カラム温度 ; 20

結果は危険率（ p value）5 % 未満を有意とし、10 % 未満を倫理審査

本研究は、ヘルシンキ宣言（ 2013 年 WMAフォルタレ

ザ総会で修正）および人を対象とする医学系研究に関する倫理指針（文部科学省、厚生労働省告示）を遵守し実施し被験者

本研究において検体は 20 歳以上 100 歳未満の健康な男

女から提供を受けた血漿を用いた。被験者は同志社大学生
命医科学研究科アンチエイジングリサーチセンター／糖化た。試験の倫理性および妥当性については同志社大学（申請番号 : 180003 ）、一般社団法人糖化ストレス研究会（承認番号：糖ス倫 2018 第 003 号）の「人を対象とする研究」

に関する倫理審査委員会にて審議・承認された。

（ 3 ）Glycative Stress Research3）は 0.02 pmol/mL で あった。ピーク面積値の変動係数

結果（ coefficient of variation; CV）は 0.26 ～ 7.93 pmol/ml に

血漿中ペントシジン HPLC 前処理法の検証

おいて 10 %以下であり、 0.08 pmol/mL では 11.8 % であっ

0.1 mol/L クエン酸溶液で調製した 26.4 pmol/mL ペン
トシジン溶液を用いて、スピンカラム（Monospin AG）

た。0.08 ～ 7.93 pmol/mL の濃度範囲に対してペントシジ

ンのピーク面積値と濃度は良好な直線性（ y = 423,054 x+ 55,131, r = 0.9998, p < 0.001）を示した。0.08 pmol/mL の面積値（61,954 μV*sec ）は y 切片の面積値（56,150
μV*sec）より高く、定量下限値は 0.08 pmol/mL とした。
各濃度 4 回測定における保持時間の平均値は 7.28 ± 0.15
分（平均値 ± 標準偏差）、CV は 2.1 %であった。
検体は 50 ～ 80 歳代の男女 40 名から提供を受けた血漿からの ペントシジンの回収率を求めた。ペントシジンの回収率は添加溶液に対するカラム溶出液の蛍光強度（励起波長 325 nm, 測定波長 385 nm ）の比に 100 を乗じて算出した。 Monospin AG カラムからの ペントシジンの回収率は 97 % であった。

ペントシジン濃度 0.08, 0.26, 0.79, 2.64, 7.93 pmol/mLに お け る ピ ー ク 面 積 値 、 signal/noise（ S/N）比、 お よ びを均一化して用いた。前処理を行った検体のクロマトグ

保 持 時 間 を Table 1 に 示 し た。 0.08 pmol/mL の S/N 比

ラフを Fig. 1 に示した。前処理により夾雑物が軽減され、（11.7）より見積もったペントシジンの検出限界値（S/N 比：ペントシジンピークの分離状態は良好であった。

Table 1. Pentosidine peak parameters measured by HPLC.
Concentration(pmol/mL)

Peak area(μV*sec)

CV
(%)

7.93

3,394,888 ± 194,212
1,217,602 ± 48,717

5.7

2.64

4.0

403,746 ± 15,842
154,947 ± 10,491

0.79

0.26
0.08

Retention time(min)

768.8 ± 71.0
271.1 ± 19.7

7.29 ± 0.19
7.29 ± 0.16

87.7 ± 4.2
32.0 ± 1.8

3.9

6.8

61,954 ± 7,282

S/ N

7.28 ± 0.19
7.25 ± 0.17

11.7 ± 0.9

11.8

7.27 ± 0.14

Parameters are expressed as mean ± standard deviation, n = 4. HPLC was performed as follows: column, InertSustain AG (3 μm, 100 × 4.6 mm I.D.); eluent, A
solution : 0.1% (v/v) formic acid, B solution: 100% ACN; elution condition, 0%B (0-10 min), 50%B (10-12 min), 0%B (12-18 min); column temperature, 20 ℃;
flow rate, 1.0 mL/min; detection, Ex 325 nm/Em 385 nm; injection volume, 20μL. ACN, acetonitrile; CV, coefficient of variation; S/N, signal to noise ratio; HPLC,
high performance liquid chromatography; Ex, excitation wavelength; Em, emission wavelength.

200000

Fluorescence Intensity (μV)

180000160000140000120000100000
80000
60000
40000
20000
0
- 20000
0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Retention time / minFig. 1. The chromatograph of human plasma pretreated by spin column (Monospin AG).

50 μL plasma was hydrolyzed and pretreated by spin column (Monospin AG). The arrow showes the pentosidine peak.
HPLC was performed as follows: column, InertSustain AG (3μm, 100 mm × 4.6 mm ID); flow rate, 1.0 mL/min;detection, Ex 325 nm/Em 385 nm; eluent, A solution : 0.1% (v/v) formic acid, B solution: 100% ACN; elution condition,
0%B (0-10 min), 50%B (10-12 min), 0%B (12-18 min); column temperature, 20°C; injection volume 20 μL. ACN,
acetonitrile; HPLC, high performance liquid chromatography; Ex, excitation wavelength; Em, emission wavelength.

（ 4 ）ヒト血中 ペ ントシジン測定 のための迅速な前処理法

本前処理法による検体中の ペントシジンの添加回収率

HbA1C（糖代謝指標）、および皮膚 AGEs 蓄積量（糖化スを求めた（Table 2）。HPLC 分析試料注入量（ 20 μL ）あ

トレス指標）との関係性を検証した。本試験の被験者 72 名

る回収率はそれぞれ 113 % 、105 % 、131% であり、平均査医学会の共用基準範囲外 22）、かつ人間ドック学会判定たりの ペントシジン添加量 19.8、39.6 、 79.3 fmol に対す
値は 116 % であった。

は、血液生化学検査において全ての検査項目が日本臨床検区分 D（要治療）23) に該当せず、全て健康な成人であった（Table 3 ）。血中ペントシジン値は年齢に対して正の相関性

前処理法による血中 ペントシジン濃度と年齢および糖化ストレス指標との関係性（ y = 0.631 x + 33.851, r = 0.458, p < 0.01 ）が認められ

本 法 に よ る 血 中 ペ ント シ ジ ン 値（ pmol /mL ）と年 齢、た（ Fig. 2）。HbA1c に対しては弱い正の相関性（HbA1c；

y = 15.250 x - 20.971, r = 0.330, p < 0.01）が認められTable 2. Recovery of pentosidine in plasma sample.
Added amount per
injection volume(fmol)

Measured amount per
injection volume(fmol)

Recovery(%)

0.0

116 ± 9-19.8

139 ± 179.3

220 ± 8439.6

158 ± 12113 ± 5105 ± 30131 ± 8The values are expressed as mean ± standard deviation, n = 3. The
added volume of pentosidine was 10 μL. HPLC was performed asfollows: column, InertSustain AG (3 μm, 100 × 4.6 mm I.D.);
eluent, A solution : 0.1% (v/v) formic acid, B solution: 100% ACN;
elution condition, 0%B (0-10 min), 50%B (10-12 min), 0%B (12-18min); column temperature, 20℃; flow rate, 1.0 mL/min; detection,
Ex 325 nm/Em 385 nm; injection volume, 20 μL. ACN, acetonitrile;
HPLC, high performance liquid chromatography; Ex, excitation
wavelength; Em, emission wavelength.

Table 3. Results of blood biochemistry and hemogram.
Items

Unit

Reference interval 1)

TP
BUN

g/dL
mg/dL

6.6 - 8.1
8 - 20

CRE

mg/dL

UA

mg/dL

HbA1c [NGSP]
TC

%
mg/dL

TG

mg/dL

HDL-C

mg/dL

LDL-C

mg/dL

RBC

10 6 /μ L

MCV
MCH
MCHC

fL
pg
%

Hb

g/dL

Ht

%

WBC
NeutroLymphoMono
EosinoBaso
PLT

10 3/μ L%%%%%
10 4 /μ L

male: 0.65 - 1.07
female: 0.46 - 0.79
male: 3.7 - 7.8
female: 2.6 - 5.5
4.9 - 6.0
142 - 248

male: 40 - 234
female: 30 - 117

male: 38 - 90
female: 48 - 103
65 - 143

male: 4.35 - 5.55
female: 3.86 - 4.92
83.6 - 98.2
27.5 - 33.2
31.7 - 35.3

male: 13.7 - 16.8
female: 11.6 - 14.8

male: 4 0.7 - 50.1
female: 35.1 - 44.4
3.3 - 8.6
−
−
−
−
−

15.8 - 34.8

1) Guideline JSLM2018 of a clinical laboratory test. See text for abbreviations.

（ 5 ）Mean ± SD
7.3
14.0
0.85
0.63
5.2
4.2
5.6
202
107
75
72
80
103
4.54
4.41
91.0
29.8
32.8
14.2
13.0
44.0
39.4
5.1
58.9
32.3
5. 2
2.9
0.7
26.0

± 0.4
± 3.9
± 0.22± 0.09
± 0.9
± 0.8
± 0.6
± 38
± 69
± 35
± 24
± 15
± 30
± 0.41± 0.36
± 6.7
± 2.3
± 1.4
± 1.7
± 1. 3± 3. 3± 3.4± 1.6± 8. 5
± 7.9
± 1.6
± 2.0
± 0. 5± 5.9

Glycative Stress Research

た（Fig. 3 ）。血中 ペントシジン値と皮膚 AGEs 蓄積量は、

AGE Reader mu の 測 定 値 に 対 し て は 正 の 相 関 性（ y =23. 586 x + 10.095, r = 0.435, p < 0.01）が認められ（Fig.
4 ）、AGEs Sensor の測定値に対しては弱い正の相関性（ y= 67.639 x + 31.753, r = 0.254, p < 0.05）が 認められた（Fig. 5 ）。皮膚AGEs 蓄積量の測定値は AGE Reader mu とAGEs Sensor で相関性は認められなかった。

Plasma pentosidine (pmol/mL)

200

150

100

50

0
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Age (years)

Fig. 2. Correlation between age and the plasma pentosidine concentration.

Regression line: y = 0.631 x + 33.851, r = 0.458, n = 72, p < 0.01. Pearson's product moment correlation coefficient wasused for statistical analysis.

200

Plasma pentosidine (pmol/mL)

180
160
140
120
100
80
60
40
20
0

4

5

6

7

8

9

10

HbA1C/NGSP (%)

Fig. 3. Correlation between HbA1c and the plasma pentosidine concentration.

Regression line: y = 15.250 x – 20.971, r = 0.330, n = 72, p < 0.01. Pearson's product moment correlation coefficient
was used for statistical analysis.

（ 6 ）ヒト血中 ペ ントシジン測定 のための迅速な前処理法

Plasma pentosidine (pmol/mL)

200

150

100

50

0

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

Skin AGEs (AGE Reader mu)

Fig. 4. Correlation between skin AGEs content measured by AGE Reader mu and the plasma pentosidine concentration.

Regression line: y = 23.586 x + 10.095, r = 0.435, n = 72, p < 0.01. Pearson's product moment correlation coefficient was used for statisticalanalysis. AGEs, advanced glycation end products.

Plasma pentosidine (pmol/mL)

200

150

100

50

0
0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

Skin AGEs (AGEs sensor)

Fig. 5. Correlation between skin AGEs content measured by AGEs Sensor and the plasma pentosidine concentration.

Regression line: y = 67.639 x + 31.753, r = 0.254, n = 72, p < 0.05. Pearson's product moment correlation coefficient was used for statisticalanalysis. AGEs, advanced glycation end products.

考察

ントシジンの検査基準値は ELISA 法においては 0.00915

血中ペントシジン HPLC 測定における Monospin
AG カラムを用いた前処理法の適用性る。本法により検査基準値上限量（ 2.13 pmol）を処理す～ 0.0431 μg/mL（ 24.2 ～ 113.9 pmol/mL）と 示 さ れ て い

本 法 で 前 処 理 に 用 い た Monospin AG カラムに 26.4

pmol/mL ペ ントシジン 標準液を 150 μL（3.96 pmol）添
加したところ、回収率は 97 % であった。血漿 50 μL は加水分解過程で希釈（ 8 倍希釈）され、Monospin AG カラムの添加量（150 μL）中の血漿量は 18.75 μL である。血中ペるには十 分 に 保 持 可 能 で あ る と 考 え ら れ る。 ま た 本 法

では 1 mol/L ギ 酸 ア ン モ ニ ウ ム 溶 液 を 75 μL で溶出後、1 mol/L ギ 酸アンモニウム /AC N (50/50) 溶液 75 μL で溶

出し、両溶出液を混合したところ良好な回収率が得られた。血漿中のペントシジンの添加回収試験においても添加回収率の平均値は 116 % と良好であった。しかしペントシ（ 7 ）Glycative Stress Research

ジンを 79.3 fmol 添加した条件では回収率が他の濃度より高値（131 %）となった。わずかにみられる前後の夾雑物のピークがペントシジンのピーク面積値に影響した可能性がある。HPLC 測定におけるペントシジンの分離条件についてはさらに最適化の余地がある。

AGEs Sensor: 指先）により、違い（AGE Reader mu: 前腕、測定意義が異なると考えられている24)。本研究において測定意義を明らかにはできなかったが、血中ペントシジンは両機種それぞれの測定意義と相関する可能性がある。

ペントシジン標品中のトリフルオロ酢酸量の影響

ペントシジン HPLC 前処理法の処理時間

本研究で用いた ペントシジン標品の元素分析結果は、炭

本法では塩酸加水分解後、時間を要する遠心濃縮器等での塩酸除去を行わず、1.5 mol/L Tris 溶液添加により塩酸を希釈するだけでスピンカラムによる前処理過程に進めた。このため前処理に要する時間を大幅に削減することができた。また塩酸除去のための特別な設備は不要となった。

、水素（ H ）、窒素（ N ）比は 38.47 % 、4.10 %、12.00 %素（ C）であった（試 薬メーカーの添付資料に記載）。ペントシジ

ンはトリフルオロ酢酸（ TFA ）塩として精製後乾固されるため、標品の固形物にはペントシジンと TFA が含まれる。

元素分析結果の C 、H 、N のモル比とペントシジンの 分子

さらに Monospin AG カラムにより 1 ステップ 1 分間の遠式から本研究で使用したペントシジンには 2.7 分子の TFA

ショニングからペントシジン溶出までの操作は 6 ステップであるが 2.7 分子の TFA が結合した TFA 塩では分子量は心分離操作で通液が可能である。スピンカラムのコンディであった。

これまでイオンペア - HPLC 法の前処理ではカラムクロ

マトグラフィーによる試料の溶出および乾固等の操作に

より約 12 時間を要する 。クエン酸 -HPLC 法では前処理
18)は不要であるが、加水分解後の塩酸除去に約 4 時間を要す
る

21)。またクエン酸 -H PLC 法では HPLC 測定時間は試料の溶出、カラム洗浄および平衡化に 1 検体当たり 60 分を要する。本法は血漿の塩酸加水分解反応終了後から HPLC

測定試料を調製するまでの操作が 10 分以内に終了した。

本法は操作が簡便なため 24 検体を同時に処理することが可能であった。また HPLC によるペントシジン測定時間はが含まれることになる。ペントシジンの分子量は 378.43

686.28 となり、ペントシジン含量は 55.1 % となる。本研
究では 1 バイアル全量を溶解し、この値に基づいてペント

シジン濃度を決定した。ペントシジン濃度は物質量濃度やモル濃度等、論文ごとに表記が異なるが、互いの測定値を比較する際には標品としたペントシジンの TFA 分子の結合数の違いを検証する必要がある。

結語
陽イオン交換基と疎水性基を有するスピンカラムを用い

1 検体当たり18 分であり、1 日（ 24 時間）当たり約 80 検体

た前処理法は血中ペントシジン HPLC 測定において前処理

ジン HPLC 測定における前処理操作を簡便化し、操作時間化と時間短縮を可能にした。

を測定することが可能であった。本法により血漿ペントシおよび測定時間を短縮し、多検体測定における操作の簡便の短縮化を推し進めることが可能になったと考える。

本法による血中ペントシジン値と加齢変化との関連性
これまでに血中 ペントシジン量は年齢、糖化ストレス指標である皮膚 AGEs 蓄積量、および糖代謝指標となる

利益相反申告本研究の遂行にあたり、ジーエルサイエンス株式会社

HbA1c 値との相関性が報告されている 。本法により測定した血漿ペントシジン値との相関性を検証したところ、20～ 80 歳代の健康な男女 72 名の被験者に対して、血漿ペン
トシジン値と年齢および皮膚 AGEs 蓄積量（AGE Readermu）とは正の相関性があり、HbA1c 値とは弱い正の相関性が認められた。年齢 53 歳から 88 歳の 4 名の被験者に血漿（東京都新宿区）より研究支援を受けた。

められた。今回の血液生化学検査ではその理由は明らかで

年 9 月 25 ～ 27 日、東京）にて発表した。

21)

ペントシジン値と各項目との回帰直線から乖離した値が認はなかったが、血糖は生活習慣により影響を受け変動する

謝辞
本研究の一部は第 18 回糖化 ストレス研究会（ 2019 年 8月 31 日、京都）および第 20 回日本抗加齢医学会総会（2020

ことが報告されている2)。これらが血漿ペントシジンの高値化となる要因になった可能性がある。

血漿ペントシジン値と皮膚 AGEs 蓄積量の相関性は 2 機

種の測定値に対して検証した。AGE Reader mu の測定値とは正の相関性が認められ、AGEs Sensor の測定値とは弱い正の相関性が認められた。これまでに AGE Reader muと AGEs Sensor の皮膚 AGEs 蓄積量の測定値には相関性が認められないことが報告されており、両機種の測定部位の（ 8 ）ヒト血中 ペ ントシジン測定 のための迅速な前処理法

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