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浦上財団研究報告書

Vol.24（2017）＜平成 26 年度助成＞

食の香りを評価するための嗅覚センサ酵母の創出
浴俊彦（豊橋技術科学大学大学院工学研究科環境・生命工学専攻）

1.

研究の背景と目的されたラット嗅覚受容体が結合する化学物質を認識できると期待される。たとえば、約 1000 種類

食 の 香 り や 風 味 は、 食 品 由 来 の 化 学 物 質 群のラット嗅覚受容体をそれぞれ導入した 1000 種が、ヒトや動物の嗅覚器官（鼻）によって検知さ類の細胞群を作製し、それぞれのリガンドに対すれ、認識・判別されている。香りや匂いの原因とる応答性を定量的に分析できれば、それは一種なる化学成分は複雑、かつ各成分濃度もばらばらの「鼻」としての機能を持つと考えられる。我々である。匂いの検知については、1991 年の Buck

は、取り扱いや遺伝子操作が容易な単細胞真核と Axel による嗅覚受容体遺伝子の発見に端を発生物である出芽酵母（イースト、Saccharomycesして研究が進み、生物の持つ嗅覚（化学物質の検cerevisiae）に着目し、将来的に多数の嗅覚受容知）の分子機構が以下のように明らかにされてい体を持った組換え酵母群を利用した「匂い」判別る。すなわち、ヒトなど高等動物の鼻の嗅上皮にシステムの開発を目指している。本研究では、

は、匂い検知に関与する神経細胞（嗅細胞）が多Radhika らの報告 2 ）も参考に、酵母に嗅覚受容体数存在し、各嗅細胞には、化学物質（リガンド）を含めた 5 種類のラット嗅覚受容遺伝子と、リガと結合する G タンパク質共役受容体（嗅覚受容体）ンド刺激によって上昇した cAMP 濃度を検出するが 1 種類発現している。嗅覚受容体が香り成分のためのレポーターシステムを導入することで、化化学物質と結合すると、三量体 G タンパク質を介学物質検出用の組換えレポーター酵母を作製し、してアデニル酸シクラーゼが活性化され、細胞内その応答特性を評価することを目的とした。

サイクリックAMP（cAMP）濃度が上昇する結果、cAMP 応答性イオンチャネルが開口することで膜2.

研究材料と方法の脱分極による興奮性シグナルが生じ、それが軸酵母株：実験には、一倍体酵母 YPH499 株（ MATa

索を経由して脳へ伝わる。脳では、検出特性を異ura3-52 lys2-801_amber ade2-101_ochre trp1-Δ63にする多数の嗅細胞から送られた興奮性シグナル

his3-Δ200 leu2-Δ1）（Stratagene 社）を主に用いた。のパターンを特定の「香り」や「匂い」として認知ほかに W303-1A 株、二倍体株 YPH501（YPH499する。嗅覚受容体の数は、ヒトで約 400 個、ラッの二倍体株）と CEN-PK2 株を用いた。

トなどの齧歯類では約 1000 種類存在しており、酵母の培養と形質転換： 栄養培地として YPD 培

食品の風味などの複雑な化学成分は、多数の嗅覚地、プラスミドを導入した組換え酵母の選択培受容体によって検知され、微妙な香りとして分別・養 に は、 栄 養 マーカー に 対 応 し た SD 選 択 培 地1）

認識されている 。

（Formedium 社）を用いた。液体培養は振盪し、以上の背景より、ラットの嗅覚受容システムを寒天培地は静置にて、30 度インキュベーター内で異種の細胞で再構成できれば、その細胞は、導入行った。GAL プロモーターの発現には、通常の食の香りを評価するための嗅覚センサ酵母の創出

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2 %グルコースを含む SD 培地の代わりに 2 %ガラ洋紡）により合成した cDNA を鋳型に、KOD FXクトースを含む SG 培地を用いた。酵母の形質転換

Neo（東洋紡）を用いて、熱変性後、98 度 10 秒、は、酢酸リチウム法により行い、栄養選択用の寒天

62 度 1 分、68 度 45 秒のサイクルを 25 回繰り返し培地に播いて、形質転換コロニーを形成させた。

た。PCR 産物は 2 %アガロースゲル電気泳動法にcDNA の調製とクローニング：酵母の発現ベクターより分析した。

として、ガラクトース添加による導入遺伝子の発現誘導が可能な 4 種類の pESC プラスミド DNA（Stratagene 社）を用いた。cDNA は、鋳型 DNA

3.

結果と考察

3.1

レポーターコンストラクトの作製から高正確 PCR によって増幅、アガロースゲル

本研究では、ラットの嗅覚受容系を構成する電気泳動で分画・精製し、ベクターへの挿入は

5 つ の 遺 伝 子（ 嗅 覚 受 容 体 I7、 三 量 体 G タンパ

In Fusion クローニング法によって行った。自動ク質 Golf, Gβ2 , Gγ5 、III 型 アデニル 酸 シクラー

シークエンサー ABI3130 を用いたジデオキシ法にゼ ACIII）、およびリガンド刺激で増加する細胞より、作製したコンストラクトの塩基配列を解析

内 cAMP 濃 度 を 検 知 す る た め の 2 遺 伝 子（ ヒトした。

CREB 、クラゲ GFPuv ）の合計 7 遺伝子を酵母内光学測定： 酵母の増殖度を評価するための菌液に導入する必要がある。本系を組み込んだ組換えの 光 学 密 度（OD 600）は、分 光 光 度 計 Biowave II

酵母では、I7 のリガンドであるオクタナールを暴（biochrom）に よ り 測 定 し た。蛍 光 強 度 測 定 は、露することによって ACIII が活性化され、細胞内バックラウンド蛍光成分を除去するため、滅菌水cAMP 濃度が上昇する。その結果、活性化されにて懸濁・遠心を 2 回繰り返して酵母を洗浄し、た内在性のプロテインキナーゼ A（PKA）により滅菌水で OD 600 を 1.0 に調整した菌液 200μL を用

cAMP 応答配列結合タンパク質（CREB）がリン酸いて、GFP 蛍光測定用モジュール（Fluorescent化され、GFP レポーターの CRE プロモーターが活Module Blue）を取り付けた GloMax 20/20 ルミノ性化されることで GFP が発現すると考えられるメーター（Promega 社）によって行った。蛍光スペ（図 1）。図 1 に示した組換え酵母の作製に必要なクトル分析は、蛍光光度計（日本分光 FP8300）を以下の 4 種類のコンストラクト（図 2）を作製した。

用い、390 nm の光で励起し、400 〜 700 nm の波（1）cAMP 応答性レポーターコンストラクトpESC-長帯を走査して行った。

HISΔGAL1-CREB-CRE-GFP の作製は、pESC-HIS

蛍光顕微鏡観察： 滅菌水で洗浄した酵母をスライ

DNA より GAL1 プロモーターを制限酵素処理とドグラスに 載 せ、 蛍 光 倒 立 顕 微 鏡（ オリンパス

自己環化により除去後、4 コピーの CREB（cAMPIX71）により位相差像と GFP 蛍光像の観察と画

response element binging protein）認識配列（CRE ）像 データ 取 得 を 行 っ た（ 倍 率 400 倍、 励 起 波 長断片と連結した GFPuv 遺伝子を挿入した。さら460 〜 495 nm、蛍光波長 510 nm あるいは 510 〜に GAL10 プロモーター下流にヒト CREB cDNA550 nm）。

（1064 bp）を挿入した。本コンストラクトを導入

RT-PCR 法による mRNA の検出： 酵母をガラスした酵母は、ガラクトース添加により、CREB をビーズで振盪破砕し、TRIzol 試薬を加え、核酸発現し、リガンド刺激による細胞内 cAMP 濃度沈殿を回収、DNase による DNA 分解とフェノーの上昇によって、GFP を発現すると考えられる。

ル・クロロホルム抽出を経て、エタノール沈殿に（2）Gβ, Gγサブユニット共発現プラスミドpESC-より全 RNA を回収した。ReverTra Ace キット（東LEU-Gβ2 - Gγ5 の 作 製 は、pESC-LEU プラスミド

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浦上財団研究報告書

Vol.24（2017）

I7(ACIII)

ATPG(Golf, G 2, G 5)

cAMPPKA

GFP

CREB
CREB
GFP

図1

図2

嗅覚系を再構成した組換え酵母の仕組みの GAL1 および GAL10 プロモーター下流に、そ3.2

4 種類のコンストラクト

組換え酵母における GFP 蛍光発現の評価

れ ぞ れ ラットGβ（2 市 販 の cDNA よ り 増 幅 し た

前節で作製したコンストラクトDNA を順次、,DNA 断片, 1100 bp）と Gγ（人工合成遺伝子断片
5

酵母 YPH499 株へ導入して、4 種類のプラスミド

243 bp）の cDNA を In Fusion クローニング法によを持つ形質転換酵母を作製した。導入した 6 つり組み込むことで行った。（3）Golf サブユニットの 外 来 性 タンパク質（I7, Golf, Gβ2 , Gγ5 , ACIII,と ACIII 共発現プラスミド pESC-TRP-Golf-ACIII

CREB）を発現させ、オクタナール暴露の効果をは、pESC-TRP ベクター の GAL1 お よ び GAL10検証するため、上記の組換え酵母を用いた蛍光測プロモーター下流に、それぞれラット Golf サブ定実験を行った。組換え酵母を、表 1 に示す 5 通ユニット cDNA（1352 bp）と ACIII cDNA（3435りの実験群に分け、前培養（24 時間）、本培養（36bp）を In Fusion クローニング法により組み込んで時間）を行い、各処理（滅菌水、0.7% DMSO、0.5作製した。Golf とACIII cDNA は、それぞれのラッmM オクタナール /0.7% DMSO 添加）を施しながトcDNA を組み込んだプラスミドより PCR によっら本培養用培地にて 24 時間培養した。各実験群て増幅して調製した。（4）嗅覚受容体 I7 発現プラの酵母の GFP 蛍光強度は蛍光測定用モジュール付

スミドpESC-URA-I7 は、pESC-URA ベクター のきルミノメーターで測定した。しかしながら、当GAL10 プロモーター下流に、ラット I7 cDNA を研究室で作製した DNA 傷害性検出用酵母 3 ）を 50クローン化したプラスミドより PCR 増幅して調製

mM ヒドロキシウレア（複製阻害剤）で発現誘導しし た DNA（995 bp）を In Fusion クローニング 法

た正対照群（表 1 の実験群 5）以外、非処理群と比により組み込んで作製した。

較して、いずれの実験群でも明確な蛍光強度の増表1オクタナール添加実験で設定した実験群

食の香りを評価するための嗅覚センサ酵母の創出

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加は観察されなかった（data not shown）。以上の発現が起こることが報告されているが 4 ）、上記組結果を検証するため、0.5 mM オクタナール処理

換え酵母では CdCl 2 処理によっても顕著な GFPした組換え酵母の蛍光スペクトル分析を行った。

発現は観察されなかった（data not shown）。

その結果、正対照の GFP 発現酵母では GFP に対3.3RT-PCR 法による遺伝子発現解析

応した 509 nm の蛍光ピークが検出されたが、オ以上の GFP 発現解析実験から、4 種のコンスクタナール処理酵母では、非処理群と同じく 509

トラクトを導入した組換え酵母において、オクタnm の蛍光は検出されなかった（ 図 3）。YPH499

ナール処理によるレポーター遺伝子の発現誘導が株以外の 3 種の酵母株を用いた追試でも同様の結起こっていないことが示された。その原因とし果であった。さらに、蛍光スペクトル分析を行って、導入した異種遺伝子が酵母内で発現していた酵母の蛍光顕微鏡観察を行った。酵母の自家蛍ない可能性が考えられた。そこで、ガラクトース光が観察されない条件で（負対照群の蛍光像を参添加培養条件での導入遺伝子 mRNA の発現につ照）、正対照群の酵母では大半の酵母で強い GFPいて、RNA 試料に DNA の混入がないことを確認

発現が観察できたが、オクタナール処理した組換後、RT-PCR 法により解析した（ 図 5）。解析の対え酵母での GFP 発現は、非添加組換え酵母と同程照遺伝子として、恒常的発現遺伝子 ACT1 とガラ度の低いものであった（図 4）。本レポーター系でクトース誘導性遺伝子 GAL1 を用いた。発現誘導は重金属処理による cAMP 濃度上昇により GFP条件下で 6 つの導入遺伝子の転写産物を確認でき

図3

図4

組換え酵母の蛍光スペクトル分析（ガラクトース添加条件）

組換え酵母の蛍光顕微鏡観察（ガラクトース添加条件）

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浦上財団研究報告書

たが、GAL10 プロモーターと連結した遺伝子に関しては発現レベルが低いことが判明した（図 5 のVol.24（2017）

4.

まとめ

CREB など）。この結果は、GAL1 プロモーターが本研究において、ラットの嗅覚受容システム、GAL10 の約 4 倍強いプロモーター活性を持つとおよび嗅覚受容シグナルを伝達する cAMP 依存いう報告とも一致する。導入遺伝子の発現を確認

性 GFP レポーターを導入した組換え酵母を作製できたので、レポーターに関わる遺伝子（CREBした。RT-PCR 解析から、導入した遺伝子の発現と GFP ）転写産物についてさらに検証を行った。

は確認されたが、嗅覚受容体リガンドであるオクガラクトース添加、CdCl 2 処理やオクタナール処タナール添加による有意な GFP 発現誘導は観察理を行った組換え酵母でのレポーター遺伝子発現できなかった。その原因として、（1）ガラクトー応答を RT-PCR 実験により検証した結果、ガラクス添加による CREB の発現誘導が不十分であった

トース非存在下でも弱い CREB や GFP mRNA のため、cAMP 応答性レポーターがうまく機能しな発現が見られ、ガラクトース添加による発現上昇かった、（2）受容体発現を含めたシグナル伝達シも顕著ではなかった（図 6）。重金属やオクタナーステムの上流が機能していないために、十分なシルの添加による GFP 遺伝子発現の上昇は殆ど見グナル伝達が起こらなかった、2 つの可能性が考られず、GFP 発現実験の結果を裏付ける結果とえられる。前者については、改めて強力な GAL1なった（図 6 の lane 10 と lane 14）。

プロモーターに CREB 遺伝子を連結したプラスミ

図5RT-PCR 法による導入遺伝子の発現評価（ガラクトース添加条件）

図 6 組換え酵母の RT-PCR 解析

食の香りを評価するための嗅覚センサ酵母の創出

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ドを作製し、再評価を進めている。後者について

文は、嗅覚受容体が正しく細胞膜上に局在している

1) Maria, S. D. and Ngai, J. (2010) The cell biologyof smell. J.
Cell. Biol., 191, 443-452.

か、GFP 融合 I7 受容体を用いて検証を進めている。今後、本系の検証と改良を継続することで、酵母におけるラット嗅覚システムの再構成を目指してゆきたい。
謝辞
本研究を遂行するにあたり、多大なる研究助成を賜りました公益財団法人浦上食品・食文化振興財団ならびに関係者の皆様に心から御礼を申し上げます。

献2) Radhika, V., Proikas-Cezanne, T., Jayaraman, M., Onesime,D., Ha, J. H., and Dhanasekaran, D. N.: (2007) Chemicalsensing of DNT by engineered olfactory yeast strain. Nat.
Chem. Biol., 3, 325-330.
3) 浴 俊彦（2014）遺伝子組換え酵母による DNA 損傷センシング、バイオセンサの先端科学技術と新製品への応用開発、技術情報協会、pp.121-127.
4) Radhika, V., Milkevitch, M., Audige, V., ProikasCezanne, T., and Dhanasekaran, D. N. (2005) Engineered
Saccharomyces cerevisiae strain BioS-1, for the detection ofwater-borne toxic metal contaminants. Biotechnol. Bioeng.,
90, 29-35.

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浦上財団研究報告書

Vol.24（2017）

Development and evaluation of the recombinant yeast strainfor odor sensing
Toshihiko Eki
Molecular Genetics Laboratory, Department of Environmental and Life Sciences
Toyohashi University of TechnologyFor sensing smells, mammals such as humans have olfactory apparatus (i.e., nose).
Molecular mechanism of olfaction is as follows: the ligand binding to the corresponding
olfactory receptor causes the increased concentrations of intracellular cAMP via the trimetric
G protein-mediated activation of type III adenylate cyclase (ACIII), and then this triggers adepolarization of a neuronal cell and the stimulus is transmitted to the brain to sense “odor”.
In this study, I tried to establish a novel bio-sensing system using the recombinant
yeast expressing five rat olfactory proteins (olfactory receptor I7, Golf, Gβ2, Gγ5, andACIII) for olfactory signal transduction and two proteins (CREB and GFP) for a cAMPdependent GFP reporter system. First, I have successfully prepared three constructs forexpressing rat olfactory proteins and a pESC-HIS construct for expression of CREB and aCRE-driven GFP reporter. Since the recombinant yeast cells with 4 recombinant plasmids
are assumed to express GFP after the exposure to an I7 ligand (octanal) in a galactosedependent manner, I have examined GFP expression in the yeasts cultured in the presenceof 2% galactose and 0.5 mM octanal by the measurements in fluorometer and fluorescence
spectrometer as well as observations under the fluorescence microscope. However, any
significant induction of GFP was not detected in the recombinant yeast cells in theseexperiments. Although RT-PCR analyses showed the expression of all exogenous genes inthe yeast, a galactose-dependent induction of CREB mRNA synthesis was poorly observed.
These data may suggest that limited amount of CREB may cause insufficient expressionsof GFP.