●血管新生の基礎と臨床!!［II］血管新生と腫瘍

7．内因性血管新生抑制因子としてのコンドロモジュリン-I
祐司＊

開

組織への新生血管網の侵入と発達は，胎生初期に血管内皮細胞の分化と組織化によって開始され，通常，血管形成と臓器形成とが同時に進行する．近年，血管新生誘導シグナルのみならず，逆に組織への血管侵入を抑制する内因性血管新生抑制因子が同定されるにいたって，「組織血管化」の現象が組織と血管網との相互作用としてとらえられるようになってきた．
軟骨は血管侵入に対して強い抵抗性を示す組織として知られるので，軟骨内骨化の過程は，組織血管化と器官形成が密接に関連する典型的なモデルとなっている．われ
われが軟骨に見いだした血管新生抑制因子コンドロモジュリン-I を軸に，まず，軟骨性骨原基における組織の血管化スイッチについて考察する．また，血管化スイッチン
グの異常からみた腫瘍血管新生と，これに対するヒト組換えコンドロモジュリン-Iの抗腫瘍効果についても検討する．
さらに，最近われわれはコンドロモジュリン-I の血管新生抑制ドメインを含む新規な蛋白質を見いだして，テノモジュリンと命名した．テノモジュリン遺伝子の発現局在を紹介するとともに，新生血管侵入障壁の成立について最近の知見を述べる．

Chondromodulin-I as an endogenous inhibitor of angiogenesis
YUJI HIRAKI Department of Molecular Interaction and Tissue Engineering, Institute for Frontier MedicalSciences, Kyoto University

ひらき・ゆうじ：京都大学再生医科学研究所生体分子設計学教授．
昭和50年大阪大学理学部卒業．昭和56年大阪大学歯学部生化学助
手．平成３年同講師．平成６年同助教授．平成10年現職．主研究領域／細胞生物学，軟骨・骨の形成と再生．
＊50 第 120 回日本医学会シンポジウム

Key words

コンドロモジュリン-I
テノモジュリン
腫瘍血管新生
血管侵入障壁はじめに

kDa の糖蛋白質である．マウスやヒト で は334 アミノ酸残基からなる膜貫通型前駆タン

硝子軟骨はふつう関節表面にみられる支持パク質の C 末端部分 120 残基として生合成組織で，骨や歯とともに硬組織に分類される．

され，糖鎖修飾・プロセシングシグナル部位

しかし，軟骨の「硬さ」
は骨や歯のような無機での切断を経て細胞外に分泌される2,3）（図質の硬さではなく，独特の粘弾性によってい1）．
ChM-I 前駆体蛋白質のアミノ酸配列は，哺る．これはコラーゲン線維（II 型，IX，XI 型コ

乳動物，鳥類，魚類などの種間でもよく保存

ラーゲンなど）と，プロテオグリカンを主成分されている4〜6）．とくにプロセシングシグナとする多量の細胞外マトリックスの物性に起ル部位に続く成熟型 ChM-I のアミノ酸配列因している．通常，軟骨の生理機能は，こののうち，種間による違いが最も集中していた細胞外マトリックスの力学特性と結びついてのは糖鎖修飾部位を含む N 端側約 40 アミノ論じられる．
しかし，「血管生物学」の分野で軟酸残基の親水性ドメインであった．ただし，骨に関心がよせられるのは，これが典型的なN-結合型糖鎖付加部位が存在する点は，比較無血管組織であり，周囲からの血管侵入に対した全ての種で共通していた．
これに対して，しても強い抵抗性を示す事実によっている．

8 個のシステイン残基を含む C 末端から約80 アミノ酸残基で構成される疎水性ドメイ

1．コンドロモジュリン-!

ンは，異なる生物種間で極めてよく保存されていた．

軟骨細胞の増殖と分化成熟は，オートクリ

成熟型 ChM-I の生物活性には，含まれる 8ン!
パラクリンに作用する多様な増殖分化因個のシステイン残基が所定の位置でジスル子によって制御されている．FGF（線維芽細胞フィド結合を作っている必要がある．CHO成長因子）
は軟骨細胞やその前駆細胞の増殖細胞に ChM-I 前駆体 cDNA を発 現 さ せ て 培維持に作用するし，軟骨分化の進展には BMP

地に回収される ChM-I は，いったん還元した（骨形成因子）などの TGF-β（トランスフォー後，ゆっくりと再酸化させて分子内ジスルミング成長因子）
ファミリーなどが関与する．

フィド結合を再構築させてはじめて活性型とプレイオトロフィンや Wnt ファミリーの因なる2）．これに対して N 末端側の親水性ドメ子なども軟骨形成に作用するが，いずれも血インは，プロセスされた ChM-I 分子の溶解性管新生に促進的に作用すると考えられていに大きく影響するが，糖鎖修飾そのものは生る．それにも関わらず，軟骨組織は無血管に物活性に関わっていない．ChM-I 遺伝子は 7保たれるのであるから，これらの血管新生促個のエクソンからなっており，マウス 14 番進シグナルをカウンターバランスする強力な染色体に（ヒトでは 13 番染色体）マップされ内因性の血管新生抑制因子が存在しなければた（図 1）．糖鎖結合部位を持つ親水性ドメイならない．

ンは第 6 エクソンに，生物活性に必須な疎水筆者らは，ウシ胎仔軟骨組織抽出物に含まれる血管内皮細胞増殖阻害活性をアッセイす性ドメインはちょうど第 7 エクソンに対応していることが明らかとなっている．

ることによって精製し，これがコンドロモ
ジ ュ リ ン-I（ChM-I）
で あ る と 同 定 し た1）．
ChM-I は 1990 年に筆者らが培養軟骨細胞に対する増殖促進活性として見いだした約 25

2．軟骨組織の血管化スイッチング
胎生期における軟骨内骨化では，予定軟骨血管新生の基礎と臨床 51

マウス14番染色体
ChM-¿遺伝子;;;;;;;

1 2

5'

3456

1 kb

73'

ChM-¿前駆体蛋白

N-C

膜貫通領域

C

プロセシングシグナル＊

TeM 蛋白マウスX染色体
TeM遺伝子

5'

図1

N-CC

TATAボックス＊

成熟（分泌）型ChM-¿（120アミノ酸残基）＊
CC

CCCCCCC C 334アミノ酸残基

CCCCCCCC 317アミノ酸残基

3'12システイン残基（C）34
5 67
N-結合糖鎖修飾部位（＊）

コンドロモジュリン-I 前駆体とテノモジュリンの構造比較

コンドロモジュリン-!前駆体とテノモジュリンは，いずれも"型膜貫通蛋白質として 7 個のエクソンに分かれてコードされている．第 7 エクソンにコードされるドメインは互いに相同で，8 個のシステインを含む（血管新生抑制）活性ドメインを構成している．

形成領域が決まると，まずこの間充織を栄養軟骨性骨原基とする血管網の縮退が起こる．続いて未分化な間充織細胞の凝集を経て軟骨分化が誘導され，軟骨性の骨原基が形成される．軟骨性の骨原基には血管網が存在しないが，軟骨細胞が肥大化して X 型コラーゲンを産生するよ

うになると，細胞外基質は石灰化する．すると，骨原基周囲の軟骨膜から肥大化・石灰化制御因子の発現

静止軟骨層

増殖軟骨層 ;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;
石灰化軟骨層 ;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;
肥大化軟骨層 ;;;;;;;;;

ChM-I FGF-2 VEGF
OFF（＋）（＋）（−）
ON（−）（＋）（＋）
血管侵入ON（−）（＋）（＋）

OFF（＋）（＋）（−）

軟骨細胞層へ血管が侵入する（図 2）．侵入血管に付随して骨原基に破軟骨細胞と骨芽細胞血管化スイッチが持ち込まれるので，軟骨組織が骨に置換される．軟骨内骨化のプロセスが進行するにつれて，間充織は血管侵入許容性から（軟骨分化図2

軟骨性骨原基への血管侵入と血管化制御スイッチとともに）血管侵入抵抗性に変化し，再び血管軟骨性骨原基内の各軟骨細胞層での血管新生因子お侵入許容性に転換することになる．

よび制御因子の発現を示す．血管侵入に先立って，軟FGF-2 は強い血管新生促進活性を示すこと

骨組織の血管化スイッチは OFF から ON に変わる．

が知られている．ところが，軟骨は脳や骨と並んでもっとも FGF-2 含量の高い組織であ担っている．事実，軟骨形成の『場』となる硬る．また，間充織における血管網の発達には節や 肢 芽 で は，血 管 新 生 を 促 進 す る VEGF

VEGF
（血管内皮成長因子）が中心的な役割をが発現している．間充織での軟骨分化に先52 第 120 回日本医学会シンポジウム

立って血管網は縮退し，これに伴って VEGF

IIやIIIの軟骨肉腫では発現が見られなかった．の発現も低下するらしい．
その一方で，
ChM-I

そこで，ヒト軟骨肉腫細胞株 OUMS-27 にの発現が誘導される．
続いて，軟骨分化によっよる異種移植腫瘍モデルを使って，腫瘍血管て骨原基が で き る と，ChM-I は 無 血 管 軟 骨新生に対するヒト組換え ChM-I の作用を検ゾーンに特異的に発現する（図 2）．やがて，討した．OUMS-27 はヌードマウスの背部皮下血管侵入予定部位である後期肥大化・石灰化に移植すると軟骨肉腫（グ レ ー ド II）を形成

1,3）軟骨層で，ChM-I の発現は消失する．すな

し，やがて腫瘍血管新生に伴って腫瘍組織はわち骨原基が成熟すると，血管侵入抵抗性を急速に増大する．この細胞でも II 型コラーゲ

失った石灰化軟骨層が骨原基を囲む骨の鞘にンやアグリカンなどの軟骨マトリックスを旺接触し，この部位から血管が侵入することに盛に産生するが，ChM-I の発現は消失していなる．一方，軟骨形成の開始に伴っていった

た．OUMS-27 細胞をヌードマウスに移植しん発現が低下した VEGF は，血管侵入の直前て，腫瘍体積が約 45 mm3 になった時点から 5に再び肥大化軟骨細胞で発現するようになる

日間連続で組換えヒト ChM-I を局所投与し（図 2）．これと同時に，軟骨膜で VEGF 受容体た．するとその後の腫瘍体積の急速な増大がの発現が検出され，軟骨膜に存在する血管内著明に抑制された．実験 28 日目の腫瘍体積皮細胞や破骨細胞や破軟骨細胞が活性化されは 5〜10 倍も違っていた（図 3）．ChM-I 投与ることで，軟骨組織の血管化が進行すると考群では，肉眼的にも組織学的にも明らかに腫えられる．このように，血管侵入に対する組瘍血管の侵入が阻害されていた．ChM-I の抗織形質のスイッチングは，血管新生促進因子腫瘍効果はヒト大腸腺がん HT-29 細胞株をと抑制因子の協調的な発現変化によって作動用いた腫瘍モデルでも観察された．このようすると考えられるようになってきた．

な新生血管侵入障壁の病的な破綻は，生理的な「障壁」構成要素の発現低下や欠失によって起こっている可能性が示唆されるし，逆に

3．血管侵入障壁の破綻

これを人為的に補うことによって回復させる

生理的には無血管である軟骨でも，腫瘍やことも可能となるだろう．

炎症性疾患などの病的状況下では，血管新生が認められる．軟骨肉腫は，30〜60 歳に好発する軟骨形成性の骨悪性腫瘍で，通常，骨内4．腱・靭帯に発現するテノモジュリンに発生して血行性転移をすることもある．興

最近，ChM-I に関連した新たな遺伝子（テノ味深いことに，ChM-I 遺伝子の発現レベルは，

モ ジ ュ リ ン；TeM）を 見 い だ し た．TeM は最も高分化型（グレード I）の軟骨肉腫であっ

ChM-I 前駆体と同様に 7 個のエクソンによっても，正常関節軟骨や内軟骨腫あるいは外骨てコードされている膜貫通型蛋白質である腫のような良性腫瘍に比べて数百分の一〜数が，第 7 エクソンに相当する新生抑制機能ド千分の一に低下していた．軟骨肉腫においてメインだけがアミノ酸配列の上で ChM-I とは，免疫組織染色を行っても，ChM-I 蛋白の発高い相同性を示した9）（図 1）．8 個のシステ7）

現分泌は検出できなかった ．病理診断上，IIイン残基を含むこの部分が，血管新生抑制活型コラーゲンやアグリカン遺伝子の発現が認性を示すことも分かってきた．興味深いことめられる高分化型の軟骨肉腫は良性の軟骨腫に，TeM 遺伝子は，軟骨と並んで毛細血管網7,8）と鑑別が極めて難しい．もちろんグレードに乏しい腱（筋外膜等も含む）や靭帯に特異的血管新生の基礎と臨床 53

な発現局在を示した．TeM には，ChM-I 前駆グナル配列がないので，膜蛋白質として腱細体に認められたような完全なプロセシングシ胞表面を覆う形式で機能していると想像される．実際，TeM cDNA を COS 細胞などに発現させても，どこかで切断を受けている証拠は得られなかった．その他，TeM は眼組織の強腫瘍体積（mm3）800

膜や角膜，あるいはレンズ上皮などに発現が700認められた．一方，ChM-I は硝子体や網膜色600

素上皮での発現が認められている10）．さらに

500

ChM-I は毛様体での発現も著明で，眼房水のリン酸緩衝液のみ

400

成分としての生理機能にも興味が持たれる．

300

組織の光透過性を維持するために，眼組織に200は複雑で堅固な血管侵入障壁が存在してい100＋コンドロモジュリン-¿る．その機能成分として，これら生理的な血15 20 25
移植日数

管新生抑制因子が大きな役割をしているので

00

図35103035（日）はないかと想像される．

おわりにヒト組換えコンドロモジュリン-I の抗腫瘍活性

ChM-I!
TeM を中心に，想定される新生血管

OUMS-27 ヒト軟骨肉腫細胞を，4 週齢ヌードマウス皮下に移植した．腫瘍体積が約 45

侵入障壁の構築様式を図 4 にまとめてみた．

mm3 に達した時点からヒト組換えコンドロ

まず，十分に架橋成熟したコラーゲンなどのモジュリン-!
（5µg!
マウス!
日）を腫瘍周囲に細胞外マトリックスは，それ自身で侵入血管5 日間注射した（↑で示した）． 対照群には，には障壁となることが容易に想像される（タリン酸緩衝液のみを注射した（1 群＝5 匹）．

;;;;
コンドロモジュリン-¿

切断

タイプ3

胸腺
軟骨

タイプ1

タイプ2結合型の障壁
物理的な障壁

細胞外マトリックス（コラーゲン線維など）

腱／靱帯

タイプ4

細胞表面の障壁＊＊＊＊

テノモジュリン

図4

54 第 120 回日本医学会シンポジウム

新生血管侵入障壁の概念図

MMP

眼

新生血管侵入＊＊＊＊ 可溶性成分による障壁

VEGF
FGF
etc.

イプ 1 の障壁）
．次に，軟骨のように比較的柔らかいマトリックスには ChM-I が結合する形のものが考えられるし（タイプ 2 の障壁）
，眼房水のように ChM-I が組織を洗う形式もある（タイプ 3 の障壁）．
これに対して TeM は，腱細胞間に強靭なコラーゲン線維が発達するまで，細胞近傍を無血管に保っているのではないかと考えられている（タイプ 4 の障壁）．
Quality of Lifeを考えると，副作用の少ない抗がん薬の開発が強く望まれている．血管新生阻害薬には副作用が少なく，耐性も生じにくい．さらに，新生血管を標的にしているので，腫瘍細胞の性質を問わずに用いることができるという利点がある．無血管組織に備わった生理的な血管侵入抵抗性の解析を通して，腫瘍血管新生の抑制につながる医療技

profile in the notochord and chondrogenic regions
during cartilage morphogenesis . Mech Dev 2001 ;105 : 157―162.
7）Hayami T, Shukunami C, Mitsui K, et al. : Specific lossof chondromodulin-I gene expression in chondrosarcoma and the suppression of tumor angiogenesis andgrowth by its recombinant protein in vivo. FEBS Lett
1999 ; 458 : 436―440.
8）Kusafuka K, Hiraki Y, Shukunami C, et al. : Cartilagespecific matrix protein chondromodulin-I is associatedwith chondroid formation in salivary pleomorphic adenomas : Immunohistochemical analysis. Am J Pathol
2001 ; 158 : 1465―1472.
9）Shukunami C, Oshima Y, Hiraki Y : Molecular cloningof tenomodulin , a novel chondromodulin-I relatedgene. Biochem Biophys Res Commun 2001 ; 280 :1323―1327.
10）Funaki H, Sawaguchi S, Yaoeda K, et al. : Expression
and localization of angiogenic inhibitory factor ,chondromodulin-I, in adult rat eye. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001 ; 42 : 1193―1200.

術が展開できるかもしれない．
〔文献〕
1）Hiraki Y, Inoue H, Iyama K, et al. : Identification ofchondromodulin-I as a novel endothelial cell growth
inhibitor. Purification and its localization in the avascular zone of epiphyseal cartilage. J Biol Chem 1997 ;272 : 32419―32426.
2）Hiraki Y, Mitsui K, Endo N, et al. : Molecular cloning of
human chondromodulin-I, a cartilage-derived growthmodulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. Eur J Biochem 1999 ; 260 : 869 ―878.
3）Shukunami C, Iyama K-i, Inoue H, et al. : Spatiotemporal pattern of the mouse chondromodulin-I gene expression and its regulatory role in vascular in vasion
into cartilage during endochondral bone formation. IntJ Dev Biol 1999 ; 43 : 39―49.
4）Shukunami C, Yamamoto S, Tanabe T, et al. : Generation of multiple transcripts from the chicken chondromodulin-I gene and their expression during embryonic development. FEBS Lett 1999 ; 456 : 165―170.
5）Dietz UH, Ziegelmeier G, Bittner K , et al. : Spatiotemporal distribution of chondromodulin-I mRNA inthe chicken embryo : expression during cartilage development and formation of the heart and eye. Dev
Dyn 1999 ; 216 : 233―243.
6）Sachdev SW, Dietz UH, Oshima Y, et al. : Sequence
analysis of zebrafish chondromodulin-I and expression

質疑応答

座長
（澁谷） どうもありがとうございました．それではご質問，ご討論をお願いいたします．
土田嘉昭（群馬県立小児医療センター） 先生の今日のお話の前半のところで，ヒトの tumor を in vivo の系に移して コンドロモジュ
リン をお使いになりましたね．そこでお使いになったのは，スライドを拝見しますと，recombinant の human のコンドロ モ ジ ュ リ ン
ですが，しかしこの実験の血管系はマウスの血管系だと思うのですが，コンドロモジュリ
ン-I に関してはマウス型でもヒト型でも，あまり大きな違いはないという具合に解釈してよいのでしょうか．
開あの活性 domain は，ほとんど sequen-ce が同じですので，活性はどちらにも効きます．
Bioassay の時も，実はウシのものを精製しな が ら，assay は ウ シ で 行 っ た り ネ ズ ミ で血管新生の基礎と臨床 55

行ったりしましたが，どちらでも効きます．ということはわかっていると思いますが，先奥田諭吉（筑波大） 非常に興味深いお話を生が考えていらっしゃるバリアのほうのバラありがとうございました．軟骨の分化とともンスが崩れているというような情報は何かごにコンドロモジュリンが発現するということざいますでしょうか．

で，普通血管新生は低酸素やコバルトなどが開

今のところお話しできる情報はありま発現因子ですが，発現の因子となるものは何せんが，興味を持っておりまして今ちょっとかということであります．サメなどではがん調べています．それで hypoxia の状況がこのが少ないと言われていますが，それの発現に遺伝子の発現にどのような影響をおよぼすか何かありますでしょうか．ということを今調べている最中で，まだ結果開転写因子がピッタリしたものが見つかれば面白いのですが，いま解析していますがは出ていません．
座長

私からも一つだけ伺いたいのです

これがというものがまだ見つかっていませが，コンドロモジュリン-I で，血管新生もできん．ただ軟骨分化に depend していることはないし，migration などもかなり下がるという確かで，軟骨分化に関係がありそうな factor，お話もありましたが，receptor とかそのあた

たとえば SOX などいくつかのものがありまりはだいぶわかってきたのでしょうか．

す．そういうものが活性化されて軟骨ができ開

そこが一番痛い質問でありまして，まれば，結果的にこれも出ますが，ここの do-だまだわかっておりません．今日はお話ししmain で特異的なものはまだ見つけておりまませんでしたが，いろいろなところで発現させん．

せ ま す と，不 思 議 と 本 来 あ る べ き 場 所 に奥田

それから小児で，発達期のオスグッシューッと蛋白が行ってしまうのです．ですト病という，骨端軟骨が痛がる病気がありまから，もう一つ体内動態と分布を決めている

すが，それは先生は検討しておられますか．

別の仕掛けが，あの molecule の中にあるはず開柴田

そうですか．わかりません．

なので，それと receptor の binding とを bio-

洋（山之内製薬） 分布のお話は非常

chemical に dissection するということを今しに興味深かったのですが，私は眼のほうでおかけようと思っているのですが，まだなかな伺いしたいと思います．糖尿病性の網膜症なかうまく行っていません．

どは VEGF のほうのバランスが崩れている

56 第 120 回日本医学会シンポジウム

座長

どうもありがとうございました．