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食品に含まれるカロリー制限シグナル因子評価法の構築と利用＜平成 22 年度助成＞

食品に含まれるカロリー制限シグナル因子評価法の構築と利用
岩崎崇（鳥取大学農学部）

1.になってカロリー制限による寿命延長は DAF-16

研究目的と SIR2.1 の複合体形成によって誘導されること

カロリー制限は多くの生物種において寿命が明らかとなった 3)。

を 延 長 し、 老 化 関 連 疾 患 の 進 行 を 遅 ら せ る こ

本研究では DAF-16 : : GFP を恒常的に発現してとがよく知られている。モデル生物である線虫

い る 変 異 株「TJ356」4) に 対 し て、Sir2.1::mRFP

Caenorhabditis elegans も同様に、様々なストレ遺伝子を導入することで、DAF-16 : : GFP およびスに曝されることで寿命延長を誘導することがSIR2.1::mRFP を恒常的に発現する新たな変異株知られている。この現象は、種々のストレス認を作製する。このような遺伝子組換え線虫では、識により転写調節因子である DAF-16（哺乳動物

カロリー制限シグナルによって DAF-16 : : GFP とでは FOXO）が核内に移行し、転写調節を行う

SIR2.1 : : mRFP が複合体を形成することが期待さ1)

ことに起因している 。飢餓ストレスであるカロれる。その際に GFP（Donor）と mRFP（Acceptor）

リー制限も DAF-16 核内移行を誘導し、線虫のの間で FRET 現象が発生すると予想される。我々寿命延長を誘導することが報告されている。一方は、この FRET 現象を指標とすることで、寿命で、カロリー制限は細胞内の NAD 濃度を上昇さ延長を誘導するカロリー制限シグナルを検出するせ、結果として NAD 依存的脱アセチル化酵素でことができると考えた（図 1）。本研究では、カロある SIR2.1 を活性化し、これが寿命延長に繋がリー制限によって誘導される SIR2.1 と DAF-16

るとも考えられている 2)。上記二つの寿命延長機の複合体形成を指標とした、新しいカロリー制限構は別々のものであると考えられてきたが、近年シグナル因子の評価・探索系の構築を目指す。

図1

本研究の戦略70

浦上財団研究報告書

Genomic PCR には、サーマルサイクラーとし研究手法

2.
2.1.

Vol.19（2012）て Applied Biosystems 2720 サーマルサイクラー（Applied Biosystems 社 ）、 酵 素 と し て KOD-

遺伝子組み換え線虫の作製

線虫からゲノム DNA の調製を行い、ゲノムpolymerase（TOYOBO 社 ）を 使 用 し た。 得 ら

DNA を 鋳 型 と し た Genomic PCR に よ り Sir2.1

れた PCR 産物の末端をそれぞれ制限酵素 SalI、遺伝子のクローニングを行った。まず、線虫から

SmaI で 処 理 し、同 様 に 制 限 酵 素 処 理 を 施 し たのゲノム DNA の調製には、Wizard SV Genomic

pHKmRFP ベクター（図 2）に導入した。ライゲー

DNA Purification System（Promega 社 ）を 使 用

シ ョ ン 反 応 に は Ligation high ver.2（TOYOBOした。得られたゲノム DNA を鋳型とし、以下社 ）を 使 用 し た。 こ れ に よ り、SIR2.1 の C 末の primer を用いて Genomic PCR を行うことで、

端 に 赤 色 蛍 光 タ ン パ ク 質 mRFP を 融 合 し た

Sir2.1 遺伝子を調製した。

『SIR2.1::mRFP』を発現するプラスミドを構築しSIR2.1 primer

た。得られた発現プラスミドを、大腸菌 DH5α

SIR2.1-FW [5’-TATGTCGACGACTAGTCCTTGATTTAGTGCC-3’]

Competent cell（TaKaRa 社）に導入し、LBA 寒制限酵素による切断を可能にするために、5’末端に Sal I 配列を付加した。

天培地（NaCl 10.0 g, Bacto tryptone 10.0 g, Yeast1L）に塗布することで発現プラスミドを有する大SIR2.1-RV [5’-AATCCCGGGGATACGCATTTCTTCACAC-3’]

制限酵素による切断を可能にするために、5’末端に Sma I 配列を付加した。

図2

extract 5.0 g, Agar 15g, Ampicillin 50 mg, D.W.
腸菌のコロニーを得た。その後、前述の SIR2.1
primer と HybriPol DNA polymerase（BIOLINEpHKmRFP ベクター

食品に含まれるカロリー制限シグナル因子評価法の構築と利用71社）を用いてコロニー PCR を行い、挿入 DNA 断

Streptomycin 8.75μl, 1,000,000 U/ml Penicillin片（ Sir2.1 遺伝子）の確認を行った。次いで、High17.5 μl, L-15 medium 35.0 ml）中 で 遠 心 洗 浄 を

pure plasmid Isolation kit（Roche 社）を用いたプ行い、5.0μm 孔径の PVDF filter で濾過し、細ラ ス ミ ド 調 製 を 行 い、Didoxy 法 を 用 い て 挿 入

胞 以 外 の 夾 雑 物 を 除 い た。50 % Peanut lectin

DNA 断片（ Sir2.1 遺伝子）の塩基配列分析を行っ（Sigma-Aldrich 社 ）で コ ー テ ィ ン グ し た マ ル チた。塩基配列分析には、BigDye Terminator v3.1

ウ ェ ル ガ ラ ス ボ ト ム ディッシュ（MATSUNAMICycle Sequencing Kit（Applied biosystems 社 ）を社）に、得られた細胞を 2.0 x 10 5 cells/cm 2 になる

用い、Applied Biosystems 3130 xl ジェネティクス

ように播種し、20 ℃で培養した。

アナライザ（Applied Biosystems 社）を用いて分析を行った。得られたデータを GENETIX-SV/2.3.

遺伝子組み換え線虫および初代培養細胞における蛍光挙動の観察

RC を用いて解析した。塩基配列確認後、精製さ遺伝子組み換え線虫および初代培養細胞の観れた発現プラスミドをマイクロインジェクション

察には、微分干渉蛍光顕微鏡 OLYMPUS IX-71

法により、変異株線虫「TJ356」（『DAF-16 : : GFP』

（OLYMPUS 社）および共焦点レーザー走査型顕を恒常的に発現している線虫株）の生殖巣に注入

微鏡 OLYMPUS FLUOVIEW FV10i（OLYMPUSすることにより、『SIR2.1 : : mRFP』および『DAF-社 ）を 用 い た。『SIR2.1 : : mRFP』お よ び『DAF-16::GFP』を 共 発 現 す る 遺 伝 子 組 み 換 え 線 虫

16 : : GFP』の複合体形成、即ちカロリー制限シグナ「TJ356::SIR2.1 : : mRFP」の作製を行った。

ルを観察するために、既知の寿命延長因子であり、遺伝子組み換え線虫由来初代培養細胞の作製

カロリー制限シグナルを誘導するレスベラトロール

先行研究により報告されている手法に従い、遺を用いて、初代培養細胞を処理した。マルチウェル

伝子組み換え線虫「TJ356 : : SIR2.1 : : mRFP」の卵

ガラスボトムディッシュに播種後、24 時間培養したから、初代培養細胞の調製を行った 5)。大量培養

初代培養細胞に対して、終濃度 100μM となるようした遺伝子組み換え線虫「TJ356::SIR2.1::mRFP」にレスベラトロール（ 1 % DMSO 溶解）を添加し、を、M9 培地（NaCl 5.0 g, KH 2 PO 4 3.0 g, Na 2 HPO 420 ℃で 24 時間培養した。その後、『SIR2.1 : : mRFP』

6.0 g, D.W. 1L）中で遠心回収し、得られた線虫および『DAF-16 : : GFP』が複合体を形成しているに M9 培地とアルカリブリーチ溶液（0.5N KOH,かを調べるために、共焦点レーザー顕微鏡を用い10 % 漂白剤の混合液）を等量加え、室温にて 10て、mRFP と GFP 間における FRET 現象の有無

分 間 処 理 す る こ と で、 線 虫 の 外 皮 を 溶 解 さ せを調べた。具体的な方法としては、まず『DAF-た。次いで、23 G の注射針で吸引・吐出を繰り

16 : : GFP』の蛍光強度を測定し、その後 GFP に対返し、線虫の体を破砕した。破砕液を 50μm 孔する励起レーザー強度を最小限まで落とし、反対径のナイロンメッシュ（セミテック社）で濾過に mRFP に対する励起レーザー強度を最大限まし、卵を回収した。得られた卵に 5 ～ 10 倍量ので上げ、初代培養細胞を 20 分間照射することで、

Chitinase 溶液（Chitinase 42.0 mg, NaCl 0.69 g,細胞中の mRFP を褪色させた。次いで、mRFP

KCl 0.36 g, MgSO 4 0.04 g, CaCl 2 0.03 g, HEPESと GFP の励起レーザー強度を初期値に戻し、再buffer 100 ml）を 加 え、 室 温 で 40 ～ 60 分 間 処

び『DAF-16 : : GFP』の蛍光強度を測定した。

理することで卵殻を溶解させ、細胞を分散させ『SIR2.1 : : mRFP』と『DAF-16::GFP』が 複 合 体た。分散した細胞を、細胞培地（150 mM Sucroseを形成している場合、励起された GFP のエネル

3 . 5 ml, Fatal Calf Serum 3 . 5 ml, 2 0 0 mg /ml

ギーは近傍の mRFP に転移し、mRFP 由来の赤2.2.

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浦上財団研究報告書

Vol.19（2012）

色蛍光として検出される。しかし、mRFP を褪色確認された。一方で、『DAF-16 : : GFP』は頭部・尾させることで、励起された GFP のエネルギーは部ともにユビキタスに発現しており、細胞内ではmRFP には転移しなくなり、GFP 由来の緑色蛍細胞質（核外）に局在していることが確認された。

光として検出される。この現象を利用し、mRFP『SIR2.1 : : mRFP』と『DAF-16::GFP』の共局在を観の褪色前と褪色後で、GFP 由来の緑色蛍光強度が察すると、咽頭から腸管にかけて一部の同一細胞増強したか否かを調べることで、『SIR2.1::mRFP』

内において、細胞質に共局在していることが確認と『DAF-16::GFP』間で FRET 現象が発生していされた。これらの結果から、同一細胞内におけるたか、即ち両者が複合体を形成していたかを調べ『SIR2.1 : : mRFP』と『DAF-16 : : GFP』の複合体形ることができる（Acceptor bleaching 法）。

成を検出できる可能性が示唆された（図 3）。そこ
で、遺伝子組み換え線虫「TJ356 : : SIR2.1 : : mRFP」

研究結果

3.
3.1.

を、既知の寿命延長因子であるレスベラトロールに遺伝子組み換え線虫における DAF-16、SIR2.1 の挙動『SIR2.1 : : mRFP』と『DAF-16 : :GFP』
よって処理し、の複合体形成を、FRET 現象（GFP 励起時におけ前述の手法により作製された遺伝子組み換える mRFP の赤色蛍光強度の増強）の検出によって線 虫「TJ356::SIR2.1 : : mRFP」の 4 齢 幼 虫 を 用明らかにしようと試みた。しかし、100μM レス

いて、線虫体内における『SIR2.1 : : mRFP』およベラトロール（ 1 % DMSO 溶解）で 24 時間処理

び『DAF-16::GFP』の発現部位を共焦点レーザーした遺伝子組み換え線虫体内において、明確な顕微鏡により観察した。『SIR2.1 : : mRFP』は、頭FRET 現象を検出することはできなかった。その部においては咽頭付近に強い発現が認められ、尾理由として、『SIR2.1 : : mRFP』と『DAF-16 ::GFP』

部では腸管に沿って点在して発現していることがが複合体を形成した際に、mRFP と GFP の間の図3

遺伝子組み換え線虫における『SIR2.1::mRFP』および『DAF-16::GFP』の局在分布

食品に含まれるカロリー制限シグナル因子評価法の構築と利用

距 離 が 離 れ す ぎ て い た た め、 弱 い FRET 現 象しか発生しなかった可能性が考えられた。そこで、微弱な FRET 現象も検出することができる

73

16::GFP』の複合体形成を検出することを試みた。
3.2.

遺伝子組み換え線虫由来初代培養細胞における DAF-16、SIR2.1 の挙動

Acceptor bleaching 法を用いて、遺伝子組み換え前述の手法により調製した遺伝子組み換え線虫

線虫体内において FRET 現象を観察しようと試由来初代培養細胞に対して、Acceptor bleaching

みた。Acceptor bleaching 法は、標的部位に高い法 を 用 い る こ と で、『SIR2.1 : : mRFP』と『DAF-レーザー強度で励起光を長時間照射し、FRET 現

16 : : GFP』の複合体形成を検出することを試みた。

象におけるエネルギーの受け手の蛍光タンパク質

まず、コントロールとして 1 % DMSO で 24 時間（Acceptor）を褪色させて、FRET 現象によるエ処理した初代培養細胞に対して、高いレーザー強ネルギー転移を強制的に阻害する手法である。し度の mRFP 励起光を 20 分間照射し、mRFP を褪かし、生きた線虫は動くため、狙った標的部位に色させた。次いで、mRFP 褪色前の GFP 蛍光強長時間励起光を照射することは困難であった。そ度と mRFP 褪色後の GFP 蛍光強度を比較して、こで、遺伝子組み換え線虫から初代培養細胞を単GFP 蛍光強度の変化を調べた。その結果、mRFP離・調製し、『SIR2.1 : : mRFP』と『DAF-16 : : GFP』

褪色後の GFP 蛍光強度の増強（FRET 現象の検を共発現した細胞に対して Acceptor bleaching出）は認められなかった（図 4）。一方で、既知の法 を 用 い る こ と で、『SIR2.1::mRFP』と『DAF-

寿命延長因子であるレスベラトロール（終濃度『DAF-16::GFP』間における FRET 現象（コントロール）
図 4 『SIR2.1::mRFP』

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浦上財団研究報告書

Vol.19（2012）『DAF-16::GFP』間における FRET 現象（Resveratrol 処理）
図 5 『SIR2.1::mRFP』

100μM、1 % DMSO 溶解）によって 24 時間処理

16 : : GFP』を発現する遺伝子組み換え線虫由来初した初代培養細胞に対して、Acceptor bleaching

代培養細胞に対して、Acceptor bleaching 法を用法を行った結果、一部の細胞において、mRFP 褪いることで、レスベラトロールによって誘導され色前と比較して mRFP 褪色後の GFP 蛍光強度がるカロリー制限シグナル（SIR2.1 と DAF-16 の複約 1.3 倍増強していることが確認された（ 図 5）。

合体形成）を FRET 現象として検出することがでこのことから、レスベラトロール処理によってきた。このことは、本研究においてカロリー制限『SIR2.1::mRFP』と『DAF-16 : : GFP』の 複 合 体 形

シグナルを検出する技術基盤が構築されたことを成が誘導され、これによって FRET 現象が発生意味している。

した可能性が示唆された。また、レスベラトロー

しかし、本研究で構築された評価系にはいく

ルが『SIR2.1::mRFP』と『DAF-16 : : GFP』の挙動つかの問題点も残されている。その中でも大きに与える影響を、Acceptor bleaching 法を用いるな問題点は、①本研究で用いた初代培養細胞はことで、微弱ではあるが検出可能であることが示

一週間ほどで細胞寿命を迎えてしまうため、実験された。の度に用時調製する必要があるという点、そして4．考察と今後の展開
本 研 究 に お い て、『SIR2.1 : : mRFP』と『DAF-②『SIR2.1 : : mRFP』と『DAF-16 : : GFP』を共発現している細胞数が少ないという点である。この二点を克服するために、今後は『SIR2.1 : : mRFP』

食品に含まれるカロリー制限シグナル因子評価法の構築と利用

75と『DAF-16::GFP』を 共 発 現 す る 線 虫 細 胞 株 の養時間をより長く設定する必要があるかもしれな樹立を計画している。具体的な方法としては、

い。この点についても、今後の要検討事項である

mRFP および GFP の二重蛍光を指標として、セと考えている。

ルソーターにより両蛍光タンパク質を強く発現し本研究において開発されたカロリー制限シグナている細胞を選択的に回収する。次いで、それらル検出系が抱える問題点は決して少なくない。しの初代培養細胞に対して、不死化遺伝子（例えばかし、これら問題点を改善することで、より正確テロメラーゼ遺伝子）の導入や、増殖異常を示すで安定したカロリー制限シグナル検出系を構築し変異株線虫由来の細胞と細胞融合を行うことで、ていきたいと考えている。

無限増殖能を有した線虫細胞株を樹立することを予定している。これにより、より簡便なカロリー謝制限シグナル検出系を構築することができると考えている。
また、上記以外の問題点として、遺伝子組み換え線虫体内の細胞と初代培養細胞における辞本研究課題に対し、多大なる御支援を賜りました浦上食品・食文化振興財団に心より御礼申し上げますとともに、貴財団の益々の御発展を祈念申し上げます。

『SIR2.1::mRFP 』お よ び『 DAF-16 : : GFP』の 細胞内局在が異なっているという点が挙げられる。

文

線 虫 体 内 の 細 胞 で は『SIR2.1 : : mRFP』お よ び

1) Lin K, Hsin H, Libina N, Kenyon C. (2001) Regulation of the
Caenorhabditis elegans longevity protein DAF-16 by insulin/IGF-1 and germline signaling. Nat Genet. 28: 139-145.

『DAF-16::GFP』は細胞質に局在していたのに対して（ 図 3）、初代培養細胞では『SIR2.1 : : mRFP』
および『DAF-16 : : GFP』は核を含む細胞全体に分布が認められた（図 4）。この理由として、生体外に細胞を摘出したことにより、物理的なストレスが初代培養細胞に加わり、これによって両タンパク質の細胞内局在が変わってしまった可能性も考えられる。本研究では、細胞の生存率を優先するため、線虫体内から初代培養細胞を摘出して 24時間培養を行った後に、試薬処理・顕微鏡観察を行った。しかし、細胞調製時の物理的ストレスの影響を完全に排除するためには、細胞調製後の培献

2) Viswanathan M, Kim SK, Berdichevsky A, Guarente L.
(2005) A role for SIR-2.1 regulation of ER stress response
genes in determining C. elegans life span. Dev Cell. 9: 605615.
3) Berdichevsky A, Viswanathan M, Horvitz HR, Guarente L.
(2006) C. elegans SIR-2.1 interacts with 14-3-3 proteins toactivate DAF-16 and extend life span. Cell. 125: 1165-1177.
4) Henderson ST, Johnson TE. (2001) daf-16 integrates
developmental and environmental inputs to mediate aging in
the nematode Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 11:19751980.
5) Christensen M, Estevez A, Yin X, Fox R, Morrison R,McDonnell M, Gleason C. (2002) A primary culture system
for functional analysis of C. elegans neurons and muscle
cells. Neuron. 33: 503-514.

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浦上財団研究報告書

Vol.19（2012）

Development of novel detecting system forcaloric restriction signal factor
Takashi Iwasaki
Faculty of Agriculture, Tottori University
Caenorhabditis elegans is known to extend-lifespan by exposing various external
stresses, for example physiological stress, heat stress and starvation stress. The caloric
restriction, a kind of starvation stress, also evokes the extended-lifespan of C. elegans by
inducing protein complex formation between DAF-16 and SIR2.1 in the nematode cell.
Here, we aimed to develop novel detecting system for extended-lifespan factor (i.e., caloric
restriction signal factor), and we focused on the interaction between DAF-16 and SIR2.1 asan intracellular indexical event to detect the caloric restriction signal.
In this study, we created transgenic nematode co-expressing DAF-16::GFP (greenfluorescent protein) and SIR2.1::mRFP (red fluorescent protein) in whole body, andused primary culture derived from the transgenic nematode to observed the intracellularinteraction of DAF-16::GFP and SIR2.1::mRFP. The protein complex formation between
DAF-16::GFP and SIR2.1::mRFP was evaluated by detecting GFP-mRFP FRET
(fluorescence resonance energy transfer) with acceptor bleaching method. Confocal laser
scanning microscopic analysis showed that the primary culture treated with 1% DMSO
(dimethyl sulfoxide) exhibited no FRET after acceptor bleaching. On the other hand,
weak FRET (1.3-fold increase of GFP fluorescent intensity after acceptor bleaching) wasobserved in the primary culture treated with 100 μM resveratrol; well-known chemicalcompound induces extended-lifespan of C. elegans by working as caloric restriction signal,dissolved in 1% DMSO. These results suggest that DAF-16::GFP and SIR2.1::mRFP form
the protein complex in the nematode primary culture treated with the resveratrol; typicalcaloric restriction factor. Our study also implies the primary culture derived from thetransgenic nematode co-expressing DAF-16::GFP and SIR2.1::mRFP is useful detecting
system for screening of caloric restriction factor, namely extended-lifespan factor. We will
improve this detecting system to carry out screening for novel extended-lifespan factors inthe future.
This work was supported by Research Grant from the Urakami Foundation for Foodand Food Culture Promotion, Tokyo, Japan.