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ウコンの肝保護作用の分子基盤解明＜平成 22 年度助成＞

ウコンの肝保護作用の分子基盤解明
小

嶋

聡

一

（（独）理化学研究所基幹研究所・分子リガンド生物研究チーム）【要

約】

二日酔い対策、肝機能保護成分として “ウコン” が市場を賑わしているが、その有効成分とされているクルクミンがどのように働くから肝臓に良いのか？という、病態形成機構に立脚した科学的な作用分子機構は不明なところがある。

本研究では、ウコンの肝保護作用について、これまでの研究実績に基づき、（１）“ TGF -β活性化反応を介する肝硬変促進機構 ”、ならびに（２）“ トランスグルタミナーゼを介する肝障害誘導機構 ”の各ステップに及ぼすクルクミンの影響を調べた。

その結果、クルクミンは、（１）については、影響を与えないことがわかった。これに対して、（２）については、エタノール肝障害時に誘導されるトランスグルタミナーゼ依存肝細胞死のキーポイント

である肝細胞におけるトランスグルタミナーゼの核局在を抑制することを示唆する結果を得た。トラ
ンスグルタミナーゼ核局在の分子機構はよくわかっていなかったので、その機構を研究したところ、
a. トランスグルタミナーゼは細胞質と核の間をシャトリングしていること、

b. 抗癌剤の一種である非環式レチノイド処理により肝癌細胞に誘導されるトランスグルタミ

ナーゼの核局在は、トランスグルタミナーゼの核外移行を司る核外移行キャリアタンパク質であるエクスポーチン１の発現が非環式レチノイド刺激により抑制されるために起こること、

c. これに対して、エタノールや遊離脂肪酸処理による肝細胞におけるトランスグルタミナーゼの核局在は、核外移行シグナルを欠損したショートフォームトランスグルタミナーゼ（TG2-S）の産生がエタノールや遊離脂肪酸処理によって誘導されることによることがわかった。現在、このエタノールや遊離脂肪酸による TG2-S 誘導に与えるクルクミンの影響を調べているところである。

キーワード：肝障害、トランスグルタミナーゼ、核局在、TGF- β、クルクミン序化反応の副生成物である LAP 断片の切断面を認論：識する抗体（LAP 断片をサロゲートマーカーとし

二日酔い対策、肝機能保護成分として“ウコン”て TGF-β活性化反応が起こったことを間接的に（ハウス食品ほか）が市場を賑わしているが、その検出する抗体）2 ) や、LAP のプロテアーゼ切断配有効成分とされているクルクミンがどのように働列に結合することによりプロテアーゼ依存 TGF-

くから肝臓に良いのかという、病態形成機構に立

β活性化反応を阻害する抗体 3 ) を作製した。一方、脚した科学的な作用分子機構には不明な点が残っ

アルコール性脂肪性肝炎（ASH）ならびに非アルている。

コール性脂肪性肝炎（NASH）の病態形成過程で、報告者は、肝線維化因子 TGF-βの活性化反応
1)

タンパク質架橋酵素トランスグルタミナーゼが細とプロテアーゼにより切断胞の核に局在し、転写因子 Sp1 を架橋不活性化す

さ れ る TGF-βプ ロ ペ プ チ ド latency associated

る結果、肝細胞の生存に必須な肝細胞増殖因子

protein（LAP）中の配列を同定し 2 )、TGF-β活性

HGF の受容体 c-Met の発現が低下し、肝細胞がに働くプロテアーゼ

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浦上財団研究報告書

死に至るという新しい肝細胞死経路を解明し 4, 5 ）、架橋された Sp1 を特異的に認識する抗体を作製4)した 。
本研究では、ウコンの肝保護作用の作用機序を

Vol.20（2013）

GFP タグ付 TG2 変異体のコンストラクション
GFP（Green fluorescent protein）タグ付きフル
サイズ TG2（TG2 Full）とＤドメイン欠損変異体（TG2ΔD）の発現ベクターは、TG2 の哺乳類細明らかにする目的で胞用発現ベクターである TG2-pSG5 ベクターを（１）“TGF-β活性化反応を介する肝硬変促進機

鋳型として PCR により作製し、GFP 融合タンパ

構”、ならびに（２）“トランスグルタミナーゼを介する肝障害誘導機構”

ク質用ベクターの pEGFP-C1 ベクター（Clontech
Laboratories, Inc.; CA）にクローニングした。

に及ぼす影響を検討した。これまでの研究成果に

L59 LAP 断片の作製と ELISA（Enzyme-linked
immunosorbent assays)

基づき、（１）（２）の各ステップに及ぼすウコン

Ｎ末端に L59 を有する LAP 断片（L59 LAP 断の活性成分であるクルクミンの影響を、培養肝星片）を特異的に認識する抗体、ならびに本抗体と細胞ならびに肝細胞を用いて調べた。

抗 LAPβ1 抗体（R&D Systems, MAB2463）とを

方
材

法：
料

組み合わせた L59 LAP 断片定量用のサンドイッ
チ ELISA は、文献２に叙述したように作製した。
細胞培養とトランスフェクション

クルクミンは Sigma Aldrich, Inc.（St. Louis, MO）

ヒト肝細胞株の Hc 細胞は、Applied Cell Biology

より購入した。シスタミンとアミノグアジニンは、Research Institute（Kirkland, WA）か ら 購 入 し、Sigma Aldrich, Inc.（St. Louis, MO）より購入した。ビオ

10 % ウ シ 胎 児 血 清（Equitech-Bio, Inc., Kerrville,

チン化ペンチルアミン（5-（biotinamido）pentylamine:

TX）と 1%抗生物質（Sigma Aldrich, Inc., St. Louis,

5BAPA）5BAPA; EZ-Link Pentylamine-Biotin は、MO）を含むダルベッコ改変培地（DMEM) で培養

Pierce 社 よ り 購 入 し た。TRITC-Streptavidin は、した。

Jackson ImmunoResearch Laboratories 社 よ り 購

Hc 細胞のアルコール / アセトアルデヒド、遊離入した。非環式レチノイドは興和株式会社より供脂肪酸（80 mM オレイン酸 / パルミチン酸 / ステ

与いただいた。スプライソスタチンＡならびにそ

アリン酸 / リノレン酸の混合物）による処理は以前の不活性化体のアセチル化スプライソスタチン

5）の論文に叙述したように行った 。トランスフェ

Ａは理化学研究所の吉田稔先生から供与いただ

クションは UNIFECTOR リポフェクション試薬

いた 6 ）。

（B-Bridge International, Inc.; CA）を用いて行った。

抗 TG2 モノクローナル 抗 体（TGase II , Ab-1）

試験管内 TG2 活性の測定

は Lab Vision（Fremont, CA）か ら 購 入 し た。 ラ

96 プレートにコートしたジメチルカゼインにミンＢならびにグリセルアルデヒド-3-リン酸

TG2 を含む検体とビオチン化ペンチルアミン（5-デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ（Glyceraldehyde 3 - phosphate（biotinamido）pentylamine: 5BAPA）と を 添 加、

dehydrogenase: GAPDH）に 対 す る 抗 体 は、Santa

37 ℃で１時間インキュベーションし、TG2 の作

Cruz Biotechnology（Santa Cruz, CA）と Chemicon

用でカゼインのグルタミン残基に架橋・取り込まInternational（Temecula, CA）か ら そ れ ぞ れ 購 入

れたビオチン化ペンチルアミンの量を、アルカした。

リフォスファターゼ標識抗ビオチン抗体（Sigma
Aldrich, Inc., St. Louis, MO）とその基質である p-

ウコンの肝保護作用の分子基盤解明

85

ニトロフェニルリン酸（Sigma Aldrich, Inc., St.

網膜症、心筋梗塞、嚢胞性線維症、強皮症などにLouis, MO）との組み合わせにより 405 nm の吸光伴う各種組織の線維症、硬化性疾患は、コラーゲ度から定量した。

ンを主とする細胞外基質（extracellular matrix :細胞内 TG2 活性の測定

ECM）の組織への過剰な蓄積によって起こる。肝カバーガラス入りの 24 穴培養プレートにまい線維症は、B 型肝炎ウイルス（HBV）感染、C 型

た Hc 細胞を 0.5 % 50 mM ビオチン化ペンチルア

肝炎ウイルス（HCV）感染、アルコールの過剰摂

ミン, 1.5μl 200 mM アミノグアニジン（Sigma；

取、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、原発

アミンオキシダーゼ阻害剤）、並びに検体（0.1 〜性胆汁性肝硬変（PBC）、自己免疫性肝炎などを

1 mM アセトアルデヒド、1 mM シスタミン、0.1

原因として引き起こされ、肝硬変や肝がんへ進

μM クルクミン）入りの培地中で一晩インキュ

展しうる病態である。これら線維化の反応は、ベーションした後に 10 % ホルマリン、室温 10 分

Transforming growth factor（TGF）-βに よ っ て

で固定化、0.2 %トリトン X-100/, 室温 10 分で浸強力に誘導される 8 )。

透化、2.5 % BSA と室温で１時間インキュベー

TGF-βは、細胞の生存、アポトーシス、分化、ションしてブロッキングした。各操作の間は PBS

遊走、接着や、血管新生、上皮‐間葉転換（EMT）

で３回ずつ洗浄した。PBS-0.1 % Tween 20 に溶など、数多くの生理的・病理的現象に深く関わる多かした TRITC 標識ストレプトアビジン（Jackson

機能性サイトカインである。正常な組織修復過程でImmunoResearch Laboratories, 1 : 500）と 室 温 では、TGF-βの産生は一過性でほどなく停止するが、１時間インキュベーションした後に PBS - 0.1 %障害刺激が繰返されると TGF-βは持続的に産生さTween 20 で 洗 浄 し た。 最 後 に PBS に 溶 か しれるようになり、組織線維症を引き起こす 8 )。

た ヘ キ ス ト 33258（Calbiochem- Novabiochem,

TGF-βは高分子潜在型複合体として産生され

1 : 5,000）と イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し 核 を 染 色 した後に標的細胞周囲で活性化反応を経て活性型た。カバーガラスをスライドグラス上に写し、TGF-βとなる。TGF-β1 の場合、390 アミノ酸か

TRITC（赤）で検出される In-situ TG2 活性、並びらなる前駆体ポリペプチドの R 278 - A279 間が furinにヘキスト 33258 で検出される核の量を In Cell

様プロテアーゼにより切断されると、112 アミノ

Analyzer 2000（GE ヘルスケア）を用いて撮像、In酸からなる C末ポリペプチドが 2 か所のS-S 結合

Cell Analyzer 2000 の解析ソフトを用いてサイト

により 2 量体を形成し、活性型 TGF-β 1 となる 9 )。

ゾルの TG2 活性と細胞核の TG2 活性を定量した。

一 方、Latency associated protein（LAP）と 呼 ば

サイトゾル / 核画分の調製とウエスタンブロット

れる N 末プロペプチドも S-S 結合により 2 量体とサイトゾル / 核画分の調製とウエスタンブロッ

なり、R 278 - A279 間切断後に疎水結合により TGF-

トは以前の論文の叙述したように行った 4 , 5 , 7 )。

β 1 分子と会合し、受容体に結合できない潜在型

TG2 抗 体 は 1:1,000、ラ ミ ン Ｂ 抗 体 は 1 : 10,000、複合体を形成する。トロンボスポンジンやインテ

GAPDH 抗体は 1 : 10,000 に希釈して用いた。

グリン、セリンプロテアーゼ、MMP 等によって、背景と結果：（１）クルクミンは TGF-β活性化反応には影響しない
慢性肝炎、慢性膵炎、腎炎、肺線維症、増殖性LAP と活性型 TGF-βの会合が損なわれることにより、潜在型複合体から活性型 TGF-βが遊離する（これを TGF-βの活性化という）（図 1）10 )。
活性型 TGF-βが細胞表面の TGF-βⅡ型受容体に結合すると、Ⅰ型受容体と会合して、TGF-

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浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）

β2 量体 1 分子に対しⅠ型受容体 /Ⅱ型受容体 2

TGF-β活性化反応には、トロンボスポンジン

分子ずつからなるヘテロ 4 量体を形成し、Ⅰ型受やインテグリンなどの細胞接着分子が、それぞれ

11 )。リン酸化されたⅠ型

LAP の 54 LSKL 57 や 244 RGD 246 に結合し立体構造

受容体は細胞内タンパク質である Smad3 の C 末が変化することにより引き起こされる接着型活性端をリン酸化する。Smad3 は、Smad2、Smad4化反応 13 ) と、セリンプロテアーゼ、MMP 等のプとともに 3 量体を形成した後、核内へ移行し、コ

ロテアーゼによるLAP 切断を介する活性化反応がラーゲンをはじめとする ECM タンパク質の転写ある。報告者らは肝線維化動物モデルにセリンプロを活性化することにより組織線維症を進行させテアーゼ阻害剤（camostat mesilate）を投与するとる。活性型 TGF-βは肝星細胞を線維芽細胞様に線維症が抑制されることから、プラスミン（PLN）

形質転換（肝星細胞の活性化）させる働きを持っや血漿カリクレイン（PLK）による切断活性化が肝ている。連続的な TGF-β刺激により、肝星細胞線維症に関与することを見出した 1, 15 )。さらに、の ECM の産生及び ECM 分解酵素である matrix

PLN は TGF-β1 LAP の 56 番目のリシンと 57 番

metalloproteinases（MMPs）の 阻 害 因 子 で あ る

目のロイシン（K 56-L 57）の間を、PLK は 58 番目のtissue inhibitor of metalloproteinase（TIMPs）-1、

アルギニンと 59 番目のロイシン（R 58 - L 59）の間を-2 の分泌が促進されるのに加え、MMP の分泌が切断することを明らかにした 2 )。

容体がリン酸化される

抑制されることにより線維症が進行する 12 )。さら

昨年、潜在型 TGF-β1 分子の結晶構造が解かに、活性化された肝星細胞ではオートクラインにれ、LAP の 46IEAIRGQILSKL 57 のαヘリックス

より、より多くの TGF-βの産生や分泌が引き起構造と 59 番目のロイシンが疎水結合による TGFβ1 との会合に重要であることが報告された 16 )。

8)

こされる 。

図1

プロテアーゼ依存 TGF- β活性化反応

最も強力な線維形成促進能を持つサイトカインである TGF -βは、黒色の遺伝子からコードされる
プロペプチド LAP (Latency associated protein) ＋活性型 TGF -β（赤い部分）が２量体を形成した
後に、青色の遺伝子からコードされる LTBP (Latent TGF -β binding protein) と S-S 結合した潜在型高分子複合体（いわゆる潜在型 TGF -β）として産生される。LTBP はマトリックスタンパク質のﬁbrillin の仲間なので、潜在型 TGF -β複合体は LTBP を介して細胞外マトリックス (ECM) にプールされている。刺激を受けると、肝星細胞表面に存在する血漿カリクレイン（Plasma kallikrein: PLK）
によって、活性型 TGF -βを保持するのに大事な働きをしている LAP 中の L59 と R58 の間が切断されるために、複合体から活性型 TGF -βが遊離、すなわち活性化され、Ser/Thr キナーゼ型受容体に結合し、Smad リン酸化シグナルを介して、コラーゲンをはじめとする標的遺伝子の発現を異常促進させることにより肝線維化が進行する。L59 抗体は、活性化の過程で生成する L59 をＮ末に持つ
LAP 断片を特異的に検出するため、L59 LAP 断片を PLK 依存 TGF -β活性化反応のサロゲートマー
カーとして用いる肝線維化活動度の測定・診断に有用である。( 文献２より一部改変 )ウコンの肝保護作用の分子基盤解明

87

PLN や PLK による K 56 - L 57 や R 58 - L 59 の切断に死亡原因となっている。脂肪肝の状態から、肝細より、α へリックス立体構造が変化し、疎水結合

胞死、炎症、線維化を伴う肝障害、肝硬変、肝癌が失われ潜在型複合体から活性型 TGF-β1 が遊と移行する。その分子機構として、活性酸素の上離するものと予想される。

昇や多数のシグナル伝達の変化が報告されている報告者らはセリンプロテアーゼ阻害剤のメシルが、肝細胞死の分子機構は未だ不明な点が多い。

酸カモスタットが線維化抑制に有効であることを肝細胞にアルコールを処理すると、タンパク質架

報告した

15 )

。 さ ら に、TGF-β1 LAP の R - L

59

橋酵素トランスグルタミナーゼ（TG2）の活性が切断により生じる R 58 を C末に持つ N 末側 LAP

上昇することが報告されていたが 17 )、この酵素

断片（R 58 LAP 断片）と L 59 を N 末に持つ C 末側がどのように細胞死を引き起こすのかについては

LAP 断片（L 59 LAP 断片）を認識する 2 種の特異分かっていなかった。

58

抗体（R 58、L 59 抗体）を作製し、これらの抗体をTG2 は、タンパク質の Gln-Lys 残基間に共有結用いた肝線維症診断法を開発した 2 )。この方法を合を形成する翻訳後架橋修飾酵素群のうち一番ユ

用いて、クルクミンが TGF-β1 活性化反応に及

ビキタスに発現するメンバーである 18 )。ヒトでぼす影響を調べたところ、メシル酸カモスタット

は 9 種類の TG 遺伝子が同定されている。Ca 2+ 結が用量依存的に L 59 LAP 断片の生成を阻害する合部位や活性中心部位など一次配列上相同領域をのに対して、クルクミンは、阻害効果を示さず、有しているが、それぞれ独自の組織発現パターン

むしろ非生理的な高濃度では、15%ほど TGF-β1を示す。この酵素群が多種多様な基質分子内、分活性化反応を高める結果を得た（図 2）。

子間で架橋反応を行うことにより、基質タンパ
クは新しい機能を得て生理的に働いたり、機能を失い病気の原因となっている。Lys 残基の代わり

15に 1 級アミンが Gln 残基に架橋されるポリアミン

LAP- 56nM)

修飾反応や、水分子が反応することによって起こる Gln 残基の脱アミド反応を通しても様々な生物

10活性を発現することが知られている 18 )。例えば、欧米に多いセリアック病は、小麦に含まれる植物性タンパクのグルテンの一分画であるグリアジン

5由来ペプチドが、十二指腸粘膜下組織内で TG2により脱アミノ化され、抗原となり、自己抗体が
0



5

50

500

eTh2NfUXZ\
(nM)

図2

20

産生されることが原因となっている 18 )。古くか

OhOdj
(µM)

ら細胞死に組織トランスグルタミナーゼ（TG2）2クルクミンが PLK 依存 TGF -β活性化反応に及ぼす影響

組換え TGF -β1 LAP と PLK を反応させる際に PLK の阻害剤であるメシル酸カモスタット（終濃度 5, 50, 500 nM）もしくはクルク
ミン（終濃度 2, 20μM）を添加し、活性化反応の結果生成する L59
LAP 断片を L59 抗体を用いた ELISA にて定量した。

（２）クルクミンはトランスグルタミナーゼの核局在を抑制する
アルコール過剰摂取は全世界で年間 200 万人のが関わっていることが報告されてきた 19 )。TG2は生体構造の構築や安定化を行う一方、細胞の増殖・分化、アポトーシスに働き、多様な生命現象、さらには動脈硬化、肝疾患、脳神経変性疾患など、様々な病態形成に深く関係している。肝臓では、マロリーデンクボディーの形成への関与が報告されていた 20 )。

88

浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）

TG2 はβサンドウィッチ、コアドメイン（架橋る遺伝子を網羅的に調べたところ、肝細胞増殖因活性部位）、2 つのβバレル（樽状）ドメインから子受容体 c - Met の発現が顕著に低下していること

な り、 活 性 中 心 の Cys

277

, His

335

, Asp

358

が空間

が分かった。c - Met は肝細胞の生存シグナルに大

)
図 3）
。
的に近い配置をとり、架橋反応を司る 21（

変重要な役割を担っており 22 )、その遺伝子発現

TG2 は架橋活性以外にも GTPase 活性（G タンパ

は転写因子 Sp1 により調節されている 23 )。そこで、

ク複合体の構成成分である Gαh として働く）、タ

Sp1 が TG 2 により影響（修飾）を受けるかどうか

ンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性やリン酸について調べたところ、Sp1 は TG 2 の作用で架化活性、インテグリン細胞接着活性など数多く橋され、高分子量の不活性型 Sp1 を産生した。この活性を有する多機能酵素である。通常の低濃の機能を失った Sp1 架橋体を特異的に認識する抗度（10 〜 20 nM）Ca 2+ 存在下では GTPase 活性を体を作製し、同抗体を用いて、アルコール処理し示すが、細胞が障害を受けて高濃度（700 〜 800

た肝細胞では TG 2 の活性上昇や核局在が起こるnM）Ca 2+ 存在下になると、Ca 2+ がβバレル 1 にと共に、Sp1 架橋体が生成し、Sp1 の活性喪失と結合することにより立体構造が変化し、βバレル

相関して c - Met の発現が低下し、肝細胞が死に至1 の一部が外れ、架橋結合活性の活性中心が露出し、ることを見出した（図 4）4 )。この細胞死経路はカ架橋酵素として働くようになると言われている。

スパーゼ阻害剤の zDEVD で抑制されないことか

報告者らは、野生型マウスと TG 2 遺伝子欠損

ら、カスパーゼ非依存経路であると考えられた。

マウスから単離した肝細胞をアルコール処理した劇症肝炎モデルマウスおよびアルコール性脂肪ところ、野生型の肝細胞では細胞死が誘導された性肝炎モデルマウスの肝組織、さらにアルコールが、TG2 遺伝子欠損マウスでは細胞死が誘導され性脂肪性肝炎患者の肝組織では、正常肝組織と比ないことを見出し、その分子機構を解析した。ア

して TG 2 が細胞核に発現し、Sp1 架橋体の生成

ルコール処理により肝細胞において発現が変化すが検出され（ 図 4 右下写真）、TG 2 阻害剤を投与

A β‐Sj]MZY
1

RL460 472

139 147(A)β‐`ih1(B)β‐`ih2583 591

(C)

687

(D)

",TP^hfYkb (466‐479)
 ",TP^hfYkb(657‐664)

B

MAEELVLERC DLELETNGRD
HHTADLCREKLVVRRGQPFWLTLHFEGRNY LTLHFEGRNY
11MAEELVLERCDLELETNGRD
HHTADLCREKLVVRRGQPFW≈
451 EEREAFTRAN
EEREAFTRAN HLNKLAEKEE
TGMAMRTGMAMRIRVG
I RVG QSMNMGSDFD
VFAH I TNNTA451
HLNKLAEKEE
QSMNMGSDFD
VFAHITNNTA≈
651 RMDLLPLHMG
RMDLLPLHMG LHKLVVNFESDKLKAVKGFRNV I I GPA NVIIGPA651
LHKLVVNFESDKLKAVKGFR
図3TG2 のドメイン構造と予想される核内移行シグナル , 核外移行シグナル配列

タンパク質架橋酵素 TG2 を構成する４つのドメイン構造と予想される核内移行シグナル（Nuclear localization signal: NLS）、 核 外 移 行 シ グ ナ ル（Nuclear exporting signal:NES）の場所 (A) とそのアミノ酸配列 (B)。（文献 27 より一部改変）

ウコンの肝保護作用の分子基盤解明したマウスや、TG 2 遺伝子欠損マウスでは、肝障4)89

で ヒ ッ ト し て き た（1E, 4E）-1, 5-Diphenyl-penta-

害になりにくいという結果を得た 。これらの結

1, 4-dien-3-one は、 終 濃 度 20μM で 約 70 % の果は細胞レベルで見られた一連の現象が、生体内TG2 活性阻害を示した（図 5B）。

でも起こっていることを示唆する結果である。

次にクルクミンが培養肝細胞の TG 2 活性に与肝保護作用が報告されているクルクミンがえる影響を調べた。ヒト肝細胞株 Hc 細胞を終濃

TG2 を介する肝障害誘導機構に与える影響を調度 0.1 〜 1 mM のアセトアルデヒドで一晩処理しべるために、まずクルクミンが直接 TG 2 架橋活た後に、肝細胞の TG 2 活性をサイトゾルと核に性に与える影響を調べたところ、EDTA（TG 2 が分けて定量したところ、すでに報告したようにア

活性発現するのに必須のカルシウムをキレート

ルコール / アセトアルデヒド処理により TG 2 のする）存在下における値をベースとして、既存のde novo 合成が亢進するため 4 )、両画分においてTG2 阻害剤であるシスタミンが終濃度 100μM

アセトアルデヒド濃度依存的に架橋活性の上昇がで TG2 活性を約 70% 阻害したのに対し、クルクみられた（図 6A, サイトゾル；図 6B, 核）。面白い

ミンは、終濃度 2μM、20μM という高濃度におことに、このとき終濃度 0.1μM のクルクミンをいても架橋活性に影響を与えなかった（ 図 5A）。

共存させておくと、サイトゾルの TG 2 活性は一

ちなみに、同時に実施した理研天然化合物バンク

定量増加する（図 6A）のに対して、核ではほぼ同からの TG2 活性抑制剤の化合物スクリーニング

量の TG2 活性の減少が観察され（図 6B）、クルク

図 4 核内 TG2 を介する肝細胞死
肝細胞が過剰のアルコール刺激や遊離脂肪酸刺激を受けると、通常細胞質に存在する TG2 が核内に局在し、転写因子 Sp1を架橋不活性化することにより肝細胞が生存するのに必須の肝細胞増殖因子 HGF の受容体である c-Met の発現量が低下し、細胞死に至る。架橋不活性化された Sp1を特異的に検出する抗体や TG2 に対する抗体を用いると、アルコール性脂肪性肝炎（Alcoholic
Steatohepatitis: ASH）の患者肝臓の核において架橋不活性化 Sp1 や TG2 の誘導を検出することができる。正常な肝臓ではこれらの生成はみられない（右下挿入写真）。( 文献７より一部改変 )90

浦上財団研究報告書

A 15

B

15

TG2K6+m
TG2K6+m

Vol.20（2013）

CurcuminCurcumin

10
10

55

00




22

20
20

OhOdj
OhOdj
(µM)
(µM)
図5

クルクミンが試験管内 TG2 活性に与える影響(A) 96 穴プレートを用いて 500 mM EDTA, 100μM シスタミン , 2 もしくは 20μM クル
クミン存在下で TG2 活性を測定し、結果を吸光度の変化に換算してプロットした。
(B) 実験に用いたクルクミンと（1E,4E）-1,5-Diphenyl- penta-1,4-dien-3-one の化学構造。

ミンが TG2 依存肝障害の鍵となる TG2 の核局在、すなわちアルコール / アセトアルデヒド処理によA

45+0.1μMクルクミン

40
35

り引き起こされる TG 2 のサイトゾルから核への3025移行を阻害するらしいことが示唆された。これに2015

対して、シスタミン（終濃度 1μM）は、両画分に+1 mMシスタミン

105おいて強力に TG 2 活性を阻害した（ 図 6A・B）。

0

クルクミンによる核 TG 2 活性の減少効果の濃度変化を調べたところ、終濃度 1μM までは濃度依存的に核 TG2 活性を減少させるが、それ以上のB

25+0.1μMクルクミン

20
15
10

+1 mM シ ス タ ミ ン

5
0

0

200

25

C

400

600

800

1000

アセトアルデヒド (μM)

2015

ることが予想された。クルクミンのヒト血中濃度

10は、30 mg/kg 体重とかなり多めのクルクミンを5投与した場合でも、Cmax 1.8 ng/ml（≒ 0.0048μ0M）であると報告されており 24 )、実際に終濃度 1により引き起こされる TG 2 の核局在を抑えるこ

1000

アセトアルデヒド (μM)

は、高濃度クルクミンによる細胞毒性の結果であ

変弱いながらアルコール / アセトアルデヒド処理

800

30

上のクルクミン処理では、細胞数の減少がみら

たがって、生理的な濃度では、クルクミンは、大

600

35

まうことが観察された（ 図 6C）。終濃度１μM 以

μM 以上の高濃度になることは考えられない。し

400

40

させ、終濃度 5μM でほぼ元のレベルに戻してし性が 1μM 以上のクルクミンで再び上昇する理由

200

45

高濃度では再び濃度依存的に核 TG 2 活性を上昇れることから、この一旦押さえられた核 TG 2 活

0+1 mM シスタミン
100μM
0

1

アセトアルデヒド存在下
2

3

4

5

クルクミン (μM)

図6クルクミンが細胞内 TG2 活性に与える影響(A)(B) 96 穴プレートにまいた Hc 細胞を 0 〜 1 mM アセトアルデ
ヒドで処理した。このとき 0.1μM クルクミンを処理した細胞と 1 mM シスタミンで処理した細胞も用意した。処理後に実験方法に詳細を記載したプロトコールに従い細胞内 TG2 活性をサイトゾル（A）と核（B）に分けて定量した。
(C)
0 〜 5μM クルクミンもしくは 1 mM シスタミン存在下で100μM アセトアルデヒドで Hc 細胞を処理後に実験方法に詳細を記載したプロトコールに従い核 TG2 活性を定量した。

ウコンの肝保護作用の分子基盤解明

91とで肝細胞障害を引き起こす核 TG 2 活性を抑えタンパク質としてはインポーチンαが働いている

る方向に働いているものと予想された。

こともわかった。また、同時に Dドメインを欠損（３）アルコール処理により引き起こされるTG2 の核局在誘導機構

する TG 2 は、非環式レチノイドで処理しなくとも TG 2 が核に局在する（ 図 7A）ことから詳しく

クルクミンの肝保護作用の１つの標的であるこ

調べたところ、Ｄドメインに核外移行シグナル（いとが示唆された TG 2 核局在の分子機構はよくわ

わゆる NES : Nuclear exporting signal）が存在し、かっていなかったので、同機構を研究した。ま定常状態では TG2 はサイトゾルと核の間をシャず、TG2 を構成する４つのドメインを１つずつトリングしており、何かの刺激でこのバランスが欠損する GFP ラベル TG 2 変異体を作製して肝細くずれると TG 2 が核に溜まる、すなわち核に局胞癌細胞株 JHH に強制発現し、同細胞に TG 2 の在することがわかった（ 図 7B）。非環式レチノイ

核局在とそれによる Sp1 架橋不活性化に基づくド処理した JHH 細胞では、核外移行の輸送タン

細胞死を誘導する非環式レチノイド 25 ) を作用さパク質として働くエクスポーチン 1 の発現量が減せ、どのドメインに核内移行シグナル（いわゆる少しており、したがって、非環式レチノイド処理

NLS : Nuclear localization signal）が存在しているを続けると、エクスポーチン 1 の発現量低下に従かを調べた。その結果、今まで予想されていた D

い徐々に TG 2 が核に局在することがわかった 27 )。

ドメイン 26 ) ではなく、Cドメインに TG 2 の NLS

この現象は肝細胞癌細胞株のみで観察され、正常が存在していることがわかった。同様な方法を用

肝細胞株である Hc 細胞に非環式レチノイドを処

いて NLS 配列を絞り込んだところ、現在までに理しても同様な変化は見られなかった。

466A 〜 479V の 14 ア ミ ノ 酸 に NLS が 存 在 し てで は、 ア ル コ ー ル 性 脂 肪 性 肝 炎（ い わ ゆ る

いることを見出した。さらにこの核内移行の輸送

ASH）、すなわちアルコール刺激した正常肝細胞エ

図7

TG2 の核外移行の発見とシャトリング(A) Hc 細胞に GFP 標識したフルサイズの TG2（GFP-TG2 Full）もしくはＤドメイン欠損 TG2ミュータント（GFP-TG2 Δ D）を強制発現させた後にヘキスト 33258 によって核染色をし、蛍光顕微鏡下でヘキスト 33258（H33258; 青色）による核と GFP（緑色）による TG2 細胞
内局在を観察した。
(B) TG2 のサイトゾル ‒ 核間シャトリング模式図
これまで通常サイトゾルに存在し刺激を受けたときのみ核に移行すると考えられていた TG2が、実はサイトゾル - 核間をシャトリングしており、刺激を受けてそのバランスがくずれると核に局在することがわかった。( 文献７より一部改変 )92

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Vol.20（2013）

で見られる TG2 核局在の機構はどうだろうか？

画分とを混ぜて 37 ℃で１時間インキュベーショ

答えはやはりノーであった。アルコール / アセト

ンしてもフルサイズ TG 2（TG2-L）と TG 2-S の比アルデヒド処理 Hc 細胞ではエクスポーチン 1 発が変わらないことから、核で TG 2-L が分解され現量は変化していなかった。さらに、非アルコーて TG 2-S が生成するのではなく、最初から短い

ル性脂肪性肝炎（いわゆる NASH）、すなわち遊フォームが産生されたものと考えられた。TG2-S

離脂肪酸処理した正常肝細胞でもエクスポーチン

はアルツハイマー病の患者脳の神経細胞で見出1 発現量は変化していなかった。ASH はレチノイされており 28 )、アルコール処理した Hc 細胞でもドシグナルを介して、また NASH は小胞体スト生成するが、非環式レチノイド処理した Hc 細胞

レスの PERK 経路と下流の NF-κB を介して、そでは生成しないことがわかった（図 10）。さらに、

れぞれ TG 2 の核内局在を誘導することを明らか

スプライシング阻害剤のスプライソスタチンＡ

5)にしていたが（図 8） 、TG 2 核局在の詳しい分子（SSA）により TG 2-S の生成が抑えられることか

機構はわかっていなかったので、いろいろと検討

ら、TG 2-S は、オルタナティブスプライシングにを重ねた。

より生成してくるらしいことがわかった（図 11）。

その結果、遊離脂肪酸処理 Hc 細胞では、細胞TG 2-S は、Cドメインの一部とＤドメインを欠損

核に特異的に 55 kD の短い TG 2（TG 2-S）が誘導しており、したがって NLS は持っているが NESされる（正確には若干存在していた量が増える）

は持っておらず、一方架橋活性ドメインはフルサことに気が付いた（ 図 9）。サイトゾル画分と核イズと同様有しているので、生成すると核の中に

l03*(2mlLhRkhm)U\iU)U\iU

iY_M]
lF=FTP^hm
EAκ>

4LhRkh*('lE=GCm

5HB<

LhRkh*('l=GCm



'#)
図8

アルコール性脂肪性肝炎 (ASH) と非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）における核 TG2 を介する肝細胞死誘導経路

ASH ではレチノイドシグナル、NASH では小胞体ストレスの PERK 経路を介して核 TG2 が誘導され、Sp1の架橋不活性化を介して肝細胞死を引き起こす。したがって、ASH ではレチノイドアンタ
ゴニストの CD2665 が、NASH では PERK 経路阻害剤の salubrinal や下流の NF -κB 阻害剤の
Bay117085 が、それぞれの経路において核 TG2 の誘導を阻害する。( 文献７より一部改変 )ウコンの肝保護作用の分子基盤解明

図9

肝細胞におけるショートフォーム TG2（TG2-S）の生成(A) フルサイズ TG2（TG2-L）とショートフォーム TG2 (TG2-S) の模式図
(B) Hc 細胞３ディッシュを遊離脂肪酸で 18 時間処理後、サイトゾル画分（C）と核画分（N）を調製し、電気泳動後 TG2 抗体でウエスタンブロットを行った。さらに両画分を混ぜ
37 ℃で１時間インキュベーションした後に同様のウエスタンブロットを行った（C+N）。

図 10

TG2-S はエタノール処理、遊離脂肪酸処理で誘導されるが、非環式レチノイド処理では誘導されない

0-200 mM エタノール (E, レーン 1-3), 100-200μM 遊離脂肪酸 (F, レーン 4 と 5), 0-15μM 非環式レチノイド ( 溶媒 , 0.1%エタノール ) (ACR, レーン 6-9) で 18 時間処理した Hc
細胞から核画分を調製し、ウエスタンブロットにより TG2 (TG2-L と TG2-S の両方 ) ならびに核画分の内部標準としてラミンＢを半定量した。

図 11

TG2-S はオルタナティブスプライシングの結果生成するらしい

Hc 細胞をスプライシング阻害剤のスプライソスタチンＡ (SSA) もしくはその不活性化
体のアセチル化スプライソスタチンＡ (AcSSA) の存在下で100 µM 遊離脂肪酸で18時間処理した後に細胞のサイトゾル画分（レーン1-3）ならびに核画分（レーン 4-6）を調製し、TG2（TG2-L と TG2-S の両方）と核画分の内部標準としてラミンＢをサイト
ゾル画分の内部標準として GAPDH をウエスタンブロットにより半定量した。

93

94

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Vol.20（2013）

入ることができても核から外にでることできない

クッパー細胞をはじめとする炎症細胞が活性化さために核に溜まっていく、すなわち核に局在し、れ、TNF-αをはじめとする炎症性サイトカイン

Sp1 を架橋不活性化して肝障害を引き起こすらしが産生される。炎症性サイトカインが肝星細胞にいことがわかってきた（ 図 12）。現在、エタノー

働くと TGF-βの産生を誘起し、肝星細胞を活性ルや遊離脂肪酸による TG 2-S 誘導に与えるクル

化してコラーゲン線維の過剰産生を引き起こすとクミンの影響を調べているところである。

同時に肝細胞の再生機能を抑え、その結果、障害考で傷ついた肝臓が回復できない状況下でコラーゲ

察：

ンを始めとする ECM タンパク質が肝臓内に蓄積

肝疾患の基礎は炎症反応である。行き過ぎた炎

し、肝硬変になっていく 1 )。一方、肝障害時に起症反応、もしくは長期にわたる炎症反応が起こる

こる肝細胞死では、細胞核においてタンパク質架と、本来生体防御のために働く因子が、逆に病橋酵素 TG 2 が暴れ出し、肝細胞が生きていく上気を引き起こしてしまう。様々な原因（アルコー

で大事な転写因子 Sp1 をガチガチに糊付けしてル、ウイルス、自己免疫反応など）によって肝臓働けなくしてしまうために肝障害が引き起こさに炎症が起こると、肝臓のマクロファージである

れる 4 )。

図 12

アルコール / 遊離脂肪酸と非環式レチノイドは異なる分子機構により
TG2 の核局在を誘導し、Sp1 架橋不活性化、細胞増殖因子受容体の発現量低下を引き起こして肝細胞死を招く

アルコール / アセトアルデヒドや遊離脂肪酸処理した肝細胞、ならびに非環式レチノイド処理した肝癌細胞では、TG2 の核局在が誘導される。TG2 はサイトゾルと核の間をシャトリング
しており、非環式レチノイドが核外移行輸送タンパク質エクスポーチン１の発現を抑えることでフルサイズ TG2 の核局在を誘導するのに対して、アルコール / アセトアルデヒドや遊離脂肪酸は核外移行シグナルを欠損した TG2-S の産生、したがって核局在を誘導することがわかった。TG2-S は架橋活性を有しているので、Sp1を架橋不活性化し、細胞増殖因子受容体の発現量低下を引き起こして肝細胞死を招く。架橋不活性化された Sp1を特異的に検出する抗体
や TG2 に対する抗体を用いると、ASH や NASH の患者肝臓の核において架橋不活性化 Sp1
や TG2 の誘導を検出することができる。正常な肝臓ではこれらの生成はみられない（右下挿入写真）。( 文献７より一部改変 )ウコンの肝保護作用の分子基盤解明

炎症性サイトカインや TG 2 の遺伝子発現を司る転写因子が NF-κB である。クルクミンは NFκB の活性を阻害するので、肝障害や肝硬変に抑制的に働くと言われてきた 29 )。

956) Kaida D. et al.: Nat. Chem. Biol., 3: 576-583, 2007.
7) Kuo, T.-F. et al.: J. Gastro. Hepatol., 27 (suppl 2): 52-57,
2012.
8) Border, W.A. and Noble, N.A.: New Engl. J. Med., 331:
1286-1292, 1994.

今回の研究では、これに加えて、クルクミンが9) Walton, K.L. et al.: J. Biol. Chem., 285: 17029-17037, 2010.

アルコール / アセトアルデヒドにより誘導され

10) 原詳子、小嶋聡一 : 医学のあゆみ 234：977-982, 2010.

る TG2 の核局在を抑える効果があるらしいこと

11) Groppe, J. et al.: Mol. Cell., 29: 157-168, 2008.

がわかった。さらに、アルコールは TG 2-S の生

12) Hayashi, H. and Sakai, T.: Front. Physiol., 3: 12, 2012.

成を誘導することを見出した。クルクミンは、恐

13) Ribeiro, S.M. et al.: J. Biol. Chem., 274: 13586-13593, 1999.

らく TG 2-S の生成を抑えているのではないかと

14) Yang, Z. et al.: J. Cell. Biol., 176: 787–793, 2007.

予想され、現在、この作業仮説の証明に取り組
むと共に、ウコンを始め幾つかの食品素材から、TGF-βの生成や核 TG 2 の働きを抑える成分の精製を試みている。

15) Okuno, M. et al.: Gastroenterology, 120: 1784–1800, 2001.
16) Shi, M. et al.: Nature, 474: 343-351, 2011.
17) Wu, J. et al.: J. Biol. Chem., 275: 22213-22219, 2000.
18) Lorand, L. and Graham R.M.: Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 4:140-156, 2003.
19) Fesus, L. et al.: FEBS Lett., 224: 104-108, 1987.

謝辞
本研究は、一部（公財）浦上食品・食文化振興財

団の資金提供の下に行われたものであり、この場を借りて深謝します。

20) Strnad, P. et al.: Gastroenterology, 132: 1515-1526, 2007.
21) Fesus, L. and Piacentini, M.: Trends Biochem. Sci., 27: 534539, 2002.
22) Huh, C.G. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 44774482, 2004.
23) Liu, Y. : Gene, 215: 159-169, 1998.

文献1) Akita, K. et al.: Gastroenterology 123: 352-364, 2002
2) 小嶋聡一、他 ｢TGF –β活性化制御領域の切断面を認識する抗体」US 7,803,553; US 8,198,412; JP 4653660

24) Sasaki, H. et al.: Biol. Pharm. Bull. 34: 660 – 665 (2011)25) Tatsukawa, H. et al.: Molecular Cancer 10:4 (11pages),
2011.
26) Peng, X. et al.: FEBS. Lett. 446: 35-39, 1999.

3) 助永義和、他 「アイソフォーム特異的 TGF –β活性化反応を抑制する抗体」JP2011/053559

27) Kuo, T. -F. et al.: FEBS J. 278：4756-4767, 2011.

4) Tatsukawa, H. et al.: Gastroenterology 136:1783-1795,
2009.

29) Chen, A. and Zheng, S.: Br. J. Pharmacol. 153: 557-67,
2008.

5) Kuo, T.-F. et al.: J. Cell. Physiol., 227:1130-1137, 2012.

28) Tee, A.E. et al.: J. Biol. Chem. 285: 3561-3567, 2010.

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浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）

Studies on Molecular Basis of The Hepatoprotective
Effect of Turmeric
Soichi Kojima
Molecular Ligand Biology Research TeamRIEN Advanced Science Institute, Japan
Turmeric is popular by means of its ability to alleviate a hangover and its
hepatoprotective functions. However, underlying molecular mechanisms based uponmolecular pathogenesis, especially how an active component, curcumin works remain to beelucidated.
Here, I examined the effect of curcumin on(1) Proteolytic activation of latent TGF-β responsible for liver fibrosis, and(2) A novel liver injury axis mediated by nuclear transglutaminase (TG2),and found that curcumin does not affect the proteolytic activation of latent TGF-β, whereas
curcumin appears to suppress nuclear localization of TG2 in ethanol (acetaldehyde)-treatedhepatic cells.
Since molecular mechanisms of nuclear localization of TG2 was unclear, weinvestigated it and founda. TG2 is shuttling between the cytosol and nucleus milieus.
b. An anti-cancer reagent, acyclic retinoid suppresses the expression of exportin-1 serving
as a carrier responsible for nuclear export of TG2, thereby allowing its accumulation in
the nucleus, whereasc. both ethanol and free fatty acids induce formation of an alternative spliced variant ofTG2, which is defect in the C-terminus D domain containing TG2’s nuclear export
signal, thereby allowing nuclear accumulation of the short form (TG2-S).
I am now under investigation to see the effect of curcumin on formation of the TG2-S
in ethanol and free fatty acids-treated hepatic cells.