ヒト人工染色体を利用した機能性成分評価細胞の樹立
Development of Recombinant Cells for a Food Evaluation System Using Human Artificial Chromosome Vector..

髙橋祐介・有福一郎・梅林志浩・野口 誠
Yusuke Takahashi, Ichiro Arifuku, Yukihiro Umebayashi, and Makoto Noguchi

外部からの刺激により蛍光強度を増減させ、食品の評価に応用できる遺伝子組換え細胞を、ヒト人工染色体ベクターを利用して作製した。この細胞はビタミン D3 に対して応答性を持つチャイニーズハムスター卵巣由来 CHO 細胞と、同じくビタミン D3 に応答して遺伝子の発現が増強することが知られているオステオカルシン遺伝子を用いた。オステオカルシン遺伝子のプロモーター部位を EGFP 遺伝子の上流に連結したレポーター遺伝子を作製し、レポーター遺伝子を人工染色体に挿入することにより組換え細胞を樹立した。作製した細胞はビタミン D3 に応答して蛍光強度を増加させること、導入したレポーター遺伝子のコピー数増加により、より感度良く EGFP の増加が検出できることを示した。

Using the human artificial chromosome vector, we developed recombinant cells that have responsibility to foodcomponents and alter EGFP fluorescence. These cells were delivered from a Chinese hamster ovary CHO cell, and thehuman osteocalcin gene promoter region, both the CHO cell and osteocalcin gene can be induced by vitaminD3. The
osteocalcin promoter region was placed upstream of the EGFP gene, and the osteocalcin-EGFP

reporter gene

integrated a human artificial chromosome vector using the Cre-loxP system. Established cells showed strong response tovitaminD3 and we confirmed that these recombinant cells have responsibility to vitaminD3 and that the EGFP
fluorescence paralleled the copy number of the integrated reporter gene.

1. はじめにバックグラウンドと正確な応答性を兼ねた新しい機
能性評価用細胞を作製することが可能である。

機能性食品の開発のために食品成分の持つ生理活性について簡便に評価ができるシステムが求められこの研究ではヒト人工染色体（Human Artificialている。培養細胞を用いた機能性評価手法として、

Chromosome: HAC）を利用して機能性食品素材を簡レポーター遺伝子を培養細胞に導入して安定した形便に評価できる細胞を作製し、食品成分の機能性、質転換体を得る方法があるが、この方法は宿主細胞安全性についての知見を得ることを目的とする。得のもつ遺伝子との相互作用が問題となり、正確な測られた知見を基に新しい機能性素材、機能性食品の定ができない可能性がある。しかし、ヒト染色体ベ開発を行う。本事業を基にして機能性の評価、機能

1）

では宿主染色体とは独性メカニズムの解明、安全性の確認を行うことで製立して存在する染色体ベクターにレポーター遺伝子品化を視野に入れた食品素材の開発、選別を行うこを導入するために宿主細胞との相互作用がなく、正とができる。

クターを用いた形質転換体

確な情報を得ることができる。このため、安定した骨組織は人体の支持、カルシウム貯蔵といった役

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割をもつ重要な組織であり、Ⅰ型コラーゲンを主とを MG63 細胞内で HAC に導入したが、作製した遺する骨基質蛋白質（有機骨基質）にミネラル（無機伝子組換え細胞内の EGFP 発現レベルは低く、遺伝骨基質）が結合した構造を持つ。骨組織は骨基質蛋子発現誘導に対する応答も確認できなかったために白質を産生し、骨の成長を促進する「骨芽細胞」と感度増加が課題となった。

骨基質を分解、吸収する「破骨細胞」の働きによりこの報告では OCp-EGFP レポーター遺伝子導入細吸収と再生を繰り返している 2‑7)。骨粗鬆症は加齢、胞の感度向上と OC 遺伝子発現誘導による EGFP 蛍

ホルモンバランスの変化等により骨吸収作用が亢進光強度の増加を検出することを目的として多コピーするために引き起こされる骨基質（骨密度）減少を

OCpEGFP 遺伝子を導入した細胞を作製し、骨誘導作特徴とする疾患である。

用が知られている活性化ビタミン D3 による EGFP 蛍

これまでに我々は、骨粗鬆症の予防に効果的な成光強度の変化について検討を行ったので、これを報分の探索を行うための機能性評価細胞を作製するこ告する。とを目的として、骨由来細胞の骨マーカー蛋白質の発現状況を調べた。その結果、MG63 細胞（骨肉腫2. 方法と材料細胞由来）で骨分化の後期マーカーであるオステオ

2.1 材料、試薬、及び機器カルシン（OC）遺伝子が発現し、ビタミン D3 によ

実験には以下の材料、試薬、及び機器を使用した。

る OC 遺伝子の誘導刺激に応答して発現が増加する

牛胎児血清(JRH Biosciences),ダルベッコ変法イーグ

ことが分かった。OC 遺伝子を骨芽細胞活性化の指ル培地（ニッスイ）, FuGene6 (Roche), ジェネティ

標とすることとし、オステオカルシン遺伝子制御領シン(Gibco), PCR Master (Roche), 1,25(OH)2 ビタミン域（OCp）約 550 bp と緑色蛍光タンパク質（EGFP）

D3 (Calbiochem), DMSO（和光純薬）, DNA シーケン

遺伝子または発光（ルシフェラーゼ）遺伝子を融合

サー:CEQ2000XL (Beckmancoulter), フローサイトメ

したレポーター遺伝子（OCp-EGFP または OCp-Luci）

ーター:CyAn (Dako Japan).

を作製した。MG63 細胞内でレポーター遺伝子の発2.2 OC レポーター遺伝子およびプラスミド

現と、
ビタミン D3 への応答性とを確認し、OCp-EGFP

2.2.1 OC レポーター遺伝子

図１ OCプロモーター領域
PCRによりクローニングした領域を示す。上段はPCR産物の塩基配列、下段はOC遺伝子制御領域を示す。矢印部分は塩基の欠失または変異のあった場所を示す。四角は転写因子の結合領域（AP-1、1/2VDRE、OSE）。

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OCp550 bp はヒトゲノム DNA を鋳型とし、特異的遺伝子導入は FuGene6 を用いて行った。６well プなプライマーおよび PCR Master を用いた PCR によレート上に培養した細胞に対し、１μg のレポータり増幅した。得られた PCR 産物を EGFP 遺伝子の上ープラスミドと 0.1 μg の Cre 発現プラスミドを共流に挿入し、OCpEGFP レポーター遺伝子とした。増導入した。遺伝子導入より 24 時間後に 750 mg/ml の幅した範囲の塩基配列は DNA シーケンサーによりジェネティシンを含む培地を用いて選択培養を１週確認した。

間行い、組換え細胞を選別した。薬剤による選別期

2.2.2 プラスミド

間中は３日おきに薬剤入り培地を交換した。

pHAC プラスミドは鳥取大学医学部生命科学科、2.5 遺伝子解析

細胞工学研究室より供与されたものを使用した。こ

各クローンより抽出したゲノム DNA 50 ng を鋳型のプラスミドはサイトメガロウイルスプロモーターとして pHAC プラスミド上の CMVp と、HAC 上の(CMVp)により強制発現されるジェネティシン耐性

3’Neo 上に位置し、loxP 組換え部位を挟んだプライ遺伝子(Neo)の 5’部分(CMV-5’Neo)と 5’Neo 配列内にマー（Neo-CMV primer）、導入したプラスミド DNA

loxP 配列、およびレポーター遺伝子挿入部位の上流、に特異的なプライマー（OC-GFP primer）、および PCR下流にニワトリオブアルブミン遺伝子由来インスレ

Master を用いて PCR を行った。PCR 後にポリアクリーター配列を有する。

PCR 産物を確認した。
ルアミドゲル電気泳動を行い、作製した OCpEGFP レポーター遺伝子を pHAC プ

2.6 顕微鏡観察

ラスミドに挿入し、pHACOCpEGFP を作製した。ま１〜３コピーのレポーター遺伝子をもつ CHO 細

た、レポーター遺伝子を１〜３個連結したプラスミ胞について、ビタミン D3 添加時の EGFP 蛍光の変化ドである pHACOCpEGFP-x1, -x2, -x3 を作製した。

を蛍光顕微鏡により確認した。50nM ビタミン D3 添

loxP 部位特異的な遺伝子組換えを行うバクテリオ

加培地により 24 時間培養を行ったものをビタミン

ファージ由来遺伝子組換え酵素 Cre Recombinase を

D3 処理群、溶媒として DMSO のみを添加したものを発現する Cre 発現プラスミドは鳥取大学医学部生命Vehicle 群として蛍光顕微鏡を用いて細胞の画像を取科学科、分子生物学研究室より供与されたものを使得し、両者の比較を行った。

用した。

2.7 フローサイトメトリー(FCM)
各クローンについて６well plate にて培養を行い、2.3 細胞

コンフルエントとなった時点で 10 nM ビタミン D3

ヒト 21 番染色体に由来し、セントロメア、テロメア部分を除く部位を欠失させた 21ΔpqHAC（HAC）を保持するチャイニーズハムスター卵巣由来 CHO細胞(CHO-HAC)は鳥取大学医学部生命科学科、細胞工学研究室より供与されたものを使用した。HAC 内にはブラストシジン耐性遺伝子(Bsd) および Neo 遺伝子の 3’部分(3’Neo)と、3’Neo 配列内に loxP 配列を有する。
CHO-HAC および組換え細胞は 10％の牛胎児血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地を用いて培養を行った。
2.4 遺伝子導入および組換え細胞の選別

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図２ HAC遺伝子組換え
OCpEGFPプラスミド、人工染色体（21 pqHAC）を上段に示す。
下段にはCre遺伝子組換え酵素により部位特異的遺伝子組換えが起こった組換えHACを示す。
OCp: オステオカルシン遺伝子制御領域、EGFP: 緑色蛍光タンパ
ク遺伝子、3’Neo,5’Neo: 分断されたNeo耐性遺伝子、Bsd: Bsd耐性遺伝子、CMVp: CMVプロモーター、Insulatorx3: インスレーター、loxP:
部位特異的遺伝子組換え標的配列

ためにレポーター部分を２または３つ連結したもの
または DMSO を添加し、レポーター遺伝子の発現誘を作製した（図２）。

導を行った。

図２上段に示すとおり、レポーター遺伝子部分は処理開始から 24 時間後に細胞をトリプシン処理インスレーター配列に挟まれており、上流、下流のにより単離し、４％パラホルムアルデヒド固定を行遺伝子発現制御配列から独立した転写活性を示す。

った。固定後の細胞をフローサイトメーターによりまた、Cre 組換え酵素により組み換えられた人工染解析を行った。

色体は pHAC レポータープラスミドの CMV‑5’Neo10nM ビタミン D3 添加培地により 24 時間培養を行部位とベクター部分の 3’Neo 部位の融合が起こり、ったものをビタミン D3 処理群、DMSO のみを添加し機能的な Neo 遺伝子が発現し、ジェネティシン耐性たものを Vehicle 群として各細胞群の EGFP 蛍光強度を獲得する（図２下段）。これにより適当な濃度のジを測定し、Vehicle 群に対するビタミン D3 処理群のェネティシンを培地に添加することで目的の遺伝子EGFP 蛍光誘導率を算出した。

組換え体を選別することが可能となる。
3.2 遺伝子導入と組換え体の選別

3. 結果および考察

作 製 し た EGFP レ ポ ー タ ー プ ラ ス ミ ド 、

3.1 レポーター遺伝子、プラスミドの作製

pHACOCpEGFP-x1, -x2, -x3 を HAC ベクターに挿入

OC 遺伝子の変動を検出するために、OCp 約 550 bpするために Cre 発現プラスミドと共に CHO-HAC 細（図１）を EGFP 遺伝子に挿入したプラスミドを作胞に遺伝子導入を行った。遺伝子導入は６well プレ製した。この領域には AP-1 結合配列（AP-1）、ビタート上に培養した細胞に対し、1 µg のレポータープ、OSF 結合配列（OSE）
ミン D3 応答配列（1/2VDRE）

ラスミドと 0.1 µg の Cre 発現プラスミドを共導入しを持ち３〜５）、外部からの刺激による遺伝子発現誘導た。遺伝子導入より 24 時間後に 750 mg/ml のジェネが可能であると考えられる。また、検出感度向上のティシンを含む培地を用いて選択培養を開始した。

図３ CHO-HAC由来遺伝子組換え細胞
上段 PCR解析 各クローンより抽出したゲノムDNAを鋳型としてloxP組換え部位検出プライマー（Neo-CMV）、レポーター遺伝子検出プライマー（OC-GFP）を用いてPCRを行った。
下段 ビタミンD3応答解析 遺伝子組換えCHO細胞のビタミンD3への応答を顕微鏡にて確認した。Vehicle（0nM）と50nMビタミ
ンD3添加培地により24時間培養後、蛍光顕微鏡を用いて細胞の画像を取得した。

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選択培養開始から１週間後に各プラスミドを導入し（図３下段）。

た細胞から 12 クローンのジェネティシン耐性細胞

この結果により、HAC 上での遺伝子組換えが正常を得た。に行われ、ジェネティシン耐性を獲得すると共に、3.3 薬剤耐性細胞の遺伝子解析

レポーターである EGFP 遺伝子を正常に発現するこCre 発現プラスミドとの遺伝子導入後に 12 クローとができる細胞株が分離できたと考えられる。

ンのジェネティシン耐性細胞を得た。これらの細胞3.4 遺伝子組換え細胞の緑色蛍光確認について PCR による遺伝子の組換え確認を行った各クローンについて６well plate にて培養を行い、ところ、Neo-CMV プライマーでの増幅（300 bp）、コンフルエントとなった時点でビタミン D3 を添加

OC-GFP プライマーでの増幅（650 bp）が見られ、した。DMSO のみを添加したものを Vehicle 群としHAC 上での遺伝子組み換えがあったことが示されて両者の比較を行った。ビタミン D3 または DMSO

た（図３上段）。

添加より 24 時間後に細胞をトリプシン処理によりまた、これらの細胞についてビタミン D3 への応答単離し、４％パラホルムアルデヒド固定を行った。

性を確認したところ、50 nM ビタミン D3 存在下で固定後の細胞についてフローサイトメーター解析を

EGFP 蛍光の増加を顕微鏡による観察で確認できた行い、各細胞群の EGFP 蛍光強度を測定した。
フローサイトメーター解析を行ったところ、CHO
細胞にレポーター遺伝子を導入したクローンでEGFP 蛍光の検出が可能であること、複数のレポーター遺伝子を搭載した細胞ではレポーター遺伝子のコピー数に応じて蛍光強度が増加する事が確認できた（図４）。蛍光強度の測定値は、１コピー導入細胞に対して２コピー導入細胞が約 1.8 倍、３コピー導入細胞は約 4.1 倍であり、導入したレポーター遺伝子のコピー数に応じて EGFP 蛍光強度が上昇するこ

図４ レポーター遺伝子の重複効果
OCpEGFPレポーター遺伝子を１〜３コピー搭載した遺伝子組換
えCHO-HAC細胞に対しトリプシン処理を行い、ホルムアルデヒド固定後に蛍光強度を測定した。
EGFP蛍光強度はフローサイトメーターを用いて測定した。蛍光強度の中央値を点線で示す。
蛍光強度(0nM)

蛍光強度(10nM)とが分かった(図４)。
CHO 細胞、OC 遺伝子は共にビタミン D3 に応答することが知られているが、CHO 細胞に OC 遺伝子を導入したものであってもビタミン D3 に対し良く応VD+/VD-答する（図５）ため、食品中のビタミン D3、および350160300140250120

類似化学物質のもつ生理活性の検出にこの細胞が利用できるものと思われる。

100200801506010040502004. おわりに作製した遺伝子組換え細胞を評価用細胞として利0x1x2x3用するために、外部刺激からの応答を示すレポータ

図５ レポーター遺伝子応答の平均値とレポーター誘導率測定したクローン間の蛍光強度の平均値と、ビタミンD3による誘導率を求めた。棒グラフはフローサイトメーターによる蛍光強度（左軸）を表し、折れ線グラフは10 nMビタミンD3による蛍光強度の誘導率（％）を表す（右軸）。

ー細胞を作製する点を検討した。EGFP 蛍光強度を感度良く検出するためにレポーター部分を複数搭載したところ、組み換え細胞はレポーターである EGFP30の蛍光応答の増加を示した。各 12 クローンの細胞を(PTH分離し、PCR による遺伝子確認を行ったところ、全transcription, Endocrinology, 138, p.3085-3092(1997).てのクローンで遺伝子の組み換えが確認できた。ま6) Bodine, P.V.N., et al., Estrogen receptor-a is

た、蛍光顕微鏡下で EGFP の蛍光強度増加が認めら

developmentally

れたため、フローサイトメーターによる蛍光強度のdifferentiation and contributes to selective responsiveness.

確認を行った。その結果、コピー数に応じてビタミ

Endocrinology, 139, p.2048-2057(1998).

ン D3 への刺激が増加する事を確認した。この応答は

7) Mizuno, M., et al., Type F collagen-induced

クローン間で上下はあるものの、ほぼ一定の割合をosteoblastic示した。レポーター遺伝子が完成したため、この組

mediated by collagen-a2b1 integrin interaction. J. Cell.

換え人工染色体をもつ骨肉腫細胞の樹立が今後の目

Physiol., 184, p.207-213(2000).

標となる。

謝 辞
本研究を行うにあたり、プラスミドの提供、並びに研究をご指導いただきました鳥取大学医学部生命科学科教授佐藤建三氏に感謝いたします。また、
HAC 保持細胞並びに HAC 組み換え用プラスミドを提供いただきました鳥取大学大学院遺伝子機能工学分野教授押村光雄氏に感謝いたします。
本研究は平成 18 年度〜20 年度、文部科学省都市エリア産学官連携促進事業により実施しました。

文 献1) Katoh, M., et al. Construction of a novel humanartificial chromosome vector for gene delivery. Biochem.
Biophys. Res. Commun., 321, p.280-290(2004).
2) Schüle, R., et al. Jun-Fos and receptors for vitamins Aand D recognise a common response element in thehuman osteocalcin gene. Cell, 61, p.497-504(1990).
3) Carpio, L., et al. Induction of osteoblast differentiationindexes by PTHrP in MG-63 cells involves multiple
signaling pathways. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab.,281, p.489-499(2001).
4) Valta, M.P., et al. Reegulation of osteoblast
differentiation: a novel function for fibroblast growth
factor 8. Endocrinology, 147, p.2171-2182(2006).
5) Yu, X.P., and Chandrasekhar, S., Parathyroid hormone

311-34)

regulationofrat

regulateddifferentiation

osteocalcin

duringofgene

osteoblastbone-marrowcells