33

糖脂質摂取によるプレバイオティクス作用の評価＜平成 21 年度助成＞

糖脂質摂取によるプレバイオティクス作用の評価
菅

原

達

也

（京都大学大学院農学研究科）

1.

緒

やかに吸収される 4 ) 。このとき生じた脱アシル化

言物であるガラクトシルグリセロールは門脈血から

海苔は 17 世紀後半の江戸時代から養殖されて全く検出されず、盲腸や大腸などの下部消化管まおり、古くから日本人に親しまれてきた食品であで到達することが示唆されている 5 ）。またグリセる。現在、年間約 100 億枚が生産されており、海ロ糖脂質を含む植物糖脂質画分を摂取したマウス

苔養殖業は水産業の中でも極めて重要である。養では、盲腸当たりのプロピオン酸、酪酸、総短鎖

殖されている海苔の 90 %以上はアマノリ属スサビ

脂肪酸量が増加することが報告されている 6 ）。短ノリ（Porphyra yezoensis）であり、ほとんどの焼海

鎖脂肪酸は、腸内細菌によって難消化性物質が発1）

苔や乾海苔はスサビノリを原料としている 。海酵されて生じることから、腸管内で生じたガラク

苔にはタンパク質を始め、ビタミン、ミネラル、

トシルグリセロールが腸内細菌に利用されたもの

食物繊維が多く含まれており、特にタンパク質はと考えられ、グリセロ糖脂質はプレバイオティク

乾燥重量の約 40 ％にまで達する。一方、脂質含ス作用を有することが推測される。

量は少なく、生化学的にも利用加工の面からもこれまでにあまり重視されていない。
植物の主要な脂質の一つである糖脂質は、その現在、規格外品の海苔が大量に廃棄されており、その有効利用法を見出すことが強く望まれている。そこで本研究では、EPA を多く含有する骨格構造からグリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、モノガラクトシルジアシルグリセロール（MGDG)

ステロール糖脂質に大別される。主要なグリセロ
糖脂質としては、モノガラクトシルジアシルグリ
セロール（MGDG）やジガラクトシルジアシルグ
リセロール（DGDG）などが挙げられる。グリセ
ロ糖脂質は、葉緑体チラコイド膜を構成する主要な脂質成分であり、海藻や微細藻を含む植物に広ジガラクトシルジアシルグリセロール（DGDG)

く分布し、光合成における重要な役割を担っている 2 ）。MGDG 及び DGDG は、ガラクトースがグ
リセロールにβ結合した骨格を有し（図 1）、構成脂肪酸として陸上植物ではリノレン酸が主体であるが、スサビノリでは EPA 含有量が極めて高いことが特徴である 3 ）。
経口摂取されたグリセロ糖脂質は、消化管内でアシル基が加水分解され、生じた遊離脂肪酸は速（R1, R2 は脂肪酸）

図1

グリセロ糖脂質（MGDG, DGDG）の化学構造

34

浦上財団研究報告書

Vol.19（2012）

海苔由来グリセロ糖脂質に着目し、その経口摂取

験材料株式会社）を 24 ℃、明暗周期 12 時間（7：が腸内細菌叢に与える影響を調べることでプレバ

00 ～ 19：00）に設定された動物飼育装置内で飼イオティクス作用を評価した。さらに海苔由来グ育した。予備飼育期間中は、1 ケージにつき 6 – 7

リセロ糖脂質の EPA 供給源としての可能性につ匹ずつ飼育し、MF 固形飼料と蒸留水を自由摂食

いても調べた。

させた。
１週間の予備飼育終了後、Control 群、0.2 ％

2.

実験方法

2.1

スサビノリ由来グリセロ糖脂質の調製

DGDG 含有食群、2 ％ DGDG 含有食群（n=6）に分け、1 ケージに 1 匹ずつ表 1 に示した飼料で 15

ミルミキサーで粉末状に粉砕した乾海苔 5 kg

日間個別飼育した。Control 群の飼料には AIN-

からクロロホルム / メタノール（2：1, v/v）で総93 G（オリエンタル酵母工業株式会社）を用い、脂質を抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラ

0.2 ％および 2％ DGDG 含有食群の飼料では AIN-

フィーを用いて、ジガラクトシルジアシルグリセ

93 G の大豆油を DGDG に置換した。

ロール（DGDG）を精製した。1 回目のカラムクロ

試験期間終了後、マウスをイソフルラン（エスマトグラフィーではクロロホルムで洗浄後、アセカイン吸入麻酔液）麻酔下で開腹し、後大静脈よトンを用いて DGDG を溶出させた。不純物が多り採血後、各臓器を摘出した。得られた臓器は速く含まれていたため、さらに２回目のカラムクロ

やかに重量を測定し、液体窒素で瞬時に凍結した

マトグラフィーに供し、クロロホルム / アセトン

後、－ 80 ℃で保存した。盲腸内容物は 1.5 ml チューを用いた段階溶出を行い、DGDG を含む画分を集ブに採取し、－ 80 ℃で保存した。得られた血液

めた（クロロホルム / アセトン（4：6 ～ 0：10, v/

を速やかに遠心分離後（ 2500 rpm, 15 min, 4 ℃）、v））。得られた DGDG の純度を HPLC-ELSD で確血漿を回収し、－ 80 ℃で保存した。

認し、脂肪酸組成について GC-MS で分析した。

2.3

2.2

盲腸内容物中の腸内細菌叢の分析

腸内細菌叢を解析するために、菌属特異的 16S

動物実験

動物実験は全て京都大学動物実験に関する指針

rRNA の DNA 配列をターゲットにしたリアルに従って行った。7 週齢の ICR 雄マウス（清水実

タイム PCR を行った（ 表 2）7 - 9 ）。QIAamp DNA

表1

飼料成分

飼料組成

コントロール群

0.2%DGDG 食群

2%DGDG 食群

β- コーンスターチ

39.7486

39.7486

39.7486

カゼイン

20.0

20.0

20.0

α- コーンスターチ

13.2

13.2

13.2

スクロース

10.0

10.0

10.0

精製大豆油

7.0

6.8

5.0

セルロース

5.0

5.0

5.0

AIN-93 ミネラルミックス

3.5

3.5

3.5

AIN-93 ビタミンミックス

1.0

1.0

1.0

L- シスチン

0.3

0.3

0.3

重酒石酸コリン

0.25

0.25

0.25

第 3 ブチルヒドロキノン

0.00140.00140.0014

DGDG

0.0

0.2

2.0

%

total

100

100

100

35

糖脂質摂取によるプレバイオティクス作用の評価

Stool Mini Kit（50）（Qiagen, Germany）を用いて、ラム温度 40 ～ 130 ℃（昇温 10 ℃ / 分）で短鎖脂

約 50 mg の盲腸内容物から DNA を抽出し、テン肪酸を定量した。

プレートとして表 2 に示した菌属特異的プライマ

2.5

脂肪酸組成の分析ーを用いてリアルタイム PCR を行った。検量線

肝臓および脾臓からクロロホルム－メタノールにはそれぞれの菌体由来 PCR 産物をテンプレー（2：1）を用いて脂質を抽出し、5 ％塩酸 – メタ

トとして用い、Ct 値からそれぞれの菌属の DNA

ノール溶液にて 95 ℃ 3 時間加熱することで、メコピー数を定量した。

チルエステル化した。反応後、脂肪酸メチルエ

2.4

ステルをヘキサンで抽出し、GC-MS へ供した。

盲腸内容物中の短鎖脂肪酸の定量

盲腸内容物に 5 倍量の蒸留水を加え、ボルテッ

カ ラ ム に CP-SIL 88（60 m × 0.25µm × 0.2 mm,

クスミキサーで激しく混和することによって 6 倍

VARIAN）を用い、インジェクターおよび検出器

希釈溶液を調製した。この希釈溶液 100μl に 20

250 ℃、カラム温度 170 ℃〜 225 ℃（昇温 4 ℃ / 分）

mM 2 －エチル酪酸（内部標準物質）、35％塩酸で脂肪酸組成を分析した。

をそれぞれ 5μl ずつ加え、激しく混和した。ジ

2.6

統計処理

エチルエーテル 100μl を加えて激しく混和した

統計処理ソフト Stat View を用いた。分散分析

後、遠心分離し（1500 × g, 20 min, 4 ℃）、得られを行い、群間の比較には Fisher ’s PLSD を用いた。

たジエチルエーテル層をガスクロマトグラフィーに 供 し た。 分 析 カ ラ ム に は DB-FFAP（15 m ×

3.

結

果

0.530 mm × 0.50μm, Agilent Technologies） を

HPLC-ELSD 分析の結果、調製した試料からは用い、インジェクター 145 ℃、検出器 175 ℃、カDGDG のピークのみが検出された（ 図 2）。今回

表2

菌属特異的 16S rRNA 配列に対するプライマーの塩基配列

菌属

プライマーの配列

増幅産物のサイズ

Eubacteria

forwardreverseATGGCTGTCGTCAGCTACGGGCGGTGTGTAC

337

Bacteroides spp.

forwardreverseGTCAGTTGTGAAAGTTTGC
CAATCGGAGTTCTTCGTG

127

Clostridium coccoides groupforwardreverseAAATGACGGTACCTGACTAA
CTTTGAGTTTCATTCTTGCGAA

440

Lactobacillus spp.

forwardreverseTGGAAACACRTGCTAATACCGGTCCATTGTGGAAGATTCCC

232

Bifidobacterium spp.

forwardreverseAGGGTTCGATTCTGGCTCAGCATCCGGCATTACCACCC

156

DGDG

図2

海苔抽出物の HPLC-ELSD クロマトグラム

36

浦上財団研究報告書

Vol.19（2012）の調製では、海苔 5 kg から 11.86 g の精製 DGDG

期間を通して体重および摂餌量における群間のが 得 ら れ た。 脂 肪 酸 組 成 は、C16 : 0 が 48 . 4 ％、

有意な差は認められなかった（図 3）。試験終了後

C20 : 5（EPA）が 37.8 ％ と 大 部 分 を 占 め、 そ れの組織重量においても群間で有意な差は認めら

以 外 の 脂 肪 酸 と し て は C18 : 0、C18 : 1、C18 : 2、れなかった（表 4）。盲腸内容物重量では、有意差

C20 : 1、C20 : 2、C20 : 3、C20 : 4 が検出された（表 3）。

は認められなかったものの 2 ％ DGDG 含有食群

DGDG を摂食させたマウスの試験では、試験は Control 群と比較して増加する傾向が示された

表3

海苔由来 DGDG の脂肪酸組成

脂肪酸（p<0.10）。
盲腸内容物の腸内細菌叢の解析結果を表 5 に示組成%し た。 総 真 正 細 菌、Bacteroides spp.、Lactobacillus

C16 : 048.40

C18 : 0

1.06

spp.、Bifidobacterium spp および Clostridium coccoides

C18 : 1

6.00

group の DNA コピー数について、群間で有意なC18 : 2

2.90

C20 : 10.64

差は認められなかった。

C20 : 20.65

短鎖脂肪酸分析の結果、0.2 ％ DGDG 含有食群

C20 : 3

1.25

C20 : 41.33の盲腸内容物重量当たりおよび盲腸当たりの酢酸

C20 : 537.77

は、Control 群および 2 ％ DGDG 含有食群と比較

A. 飼育日数に伴うマウスの体重の変化

B. 飼育日数に伴うマウスの摂餌量の変化

図3

試験飼育期間中のマウスの体重及び摂餌量の変化
Means ± SD, n=6

表4

飼育試験終了時の組織重量および盲腸内容物重量

組織

Control 群

0.2%DGDG 群

2%DGDG 群

脳

0.45±0.03

0.46±0.04

0.47±0.02

肝臓1.70±0.18

1.77±0.23

1.75±0.18脾臓

0.14±0.02

0.13±0.04

0.12±0.01

腎臓

0.61±0.08

0.64±0.09

0.61±0.05

小腸1.33±0.17

1.29±0.17

1.25±0.15

大腸

0.30±0.03

0.28±0.07

0.31±0.07

盲腸組織

0.08±0.02

0.07±0.02

0.07±0.01

盲腸内容物

0.21±0.10

0.26±0.06

0.29±0.05

精巣上体脂肪

1.50±0.47

1.12±0.39

1.17±0.22

腎周囲脂肪0.47±0.18

0.35±0.21

0.45±0.21

腸管膜脂肪

0.73±0.17

0.65±0.39

0.49±0.16g

Means±SD, n=6

37

糖脂質摂取によるプレバイオティクス作用の評価

表5菌属

マウス盲腸内容物中の腸内細菌コピー数

Control 群

0.2%DGDG 群

2%DGDG 群

log 10 number of copy

Eubacteria
Bacteroides spp.
Lactobacillus spp.
Bifidobacaterium spp.

12.44±0.3512.30±0.36
10.24±0.41
10.39±0.2312.47±0.26
12.20±0.18
10.29±0.25
10.59±0.41

12.41±0.1012.33±0.1210.30±0.18
10.43±0.17

Clostridium coccoides group

11.34±0.42

11.39±0.30

11.39±0.20
Means±SD, n=6

図 4 マウス盲腸内容物中の短鎖脂肪酸
Means ± SD, n=6 異なる記号間に有意差あり（p<0.05）

して有意に高い値を示した（図 4）。このとき、プえられている 9 ) 。Bifidobacterium や Lactobacillus な

ロピオン酸、酪酸、総短鎖脂肪酸量は群間で有意

どの乳酸菌は有用菌の一種であり、プロバイオな差が認められなかったが、盲腸当たりの総短

ティクスとして用いられている。乳酸菌は感染症

鎖脂肪酸量について、0.2 ％ DGDG 含有食群ではに対する抵抗性や免疫賦活作用、抗腫瘍作用のよControl 群と比較して増加する傾向が認められた

うな宿主にとって有益な作用をもたらすことが報（p<0.10）。

告されている 10 - 12 ）。また Bacteroides の 1 種であ肝臓脂肪酸組成については、Control 群と比較る Bacteroides fragilis は、宿主の免疫機能を調節す

して 2 ％ DGDG 含有食群で、アラキドン酸が有ることや炎症性腸疾患を防ぐ作用を有することが意 に 減 少 し、EPA と DHA は 有 意 に 増 加 し た。

報告されている 13 ）。一方、Clostridium のある種はまた、n - 3 /n - 6 比についても、2 ％ DGDG 含有食

宿主に疾患をもたらし、有害菌として認識されて。脾臓の脂肪酸
群で有意に高い値を示した（表 6）

いる 14 ) 。

組成についても DHA 以外は、ほぼ同様の結果であった（表 7）。
4．考察

腸内細菌は、下部腸管に到達した難消化性多糖類などを資化することによって短鎖脂肪酸を産生する。腸管内で生じる短鎖脂肪酸は主として酢酸、プロピオン酸、酪酸である。特に近年注目を集め

腸内細菌は宿主の健康維持に重要な役割を担っている酪酸は、大腸細胞の主なエネルギー源であており、有用な細菌を優勢に、かつ悪影響を及ぼり、抗腫瘍作用や酸化ストレスの抑制、満腹感を生す細菌を劣勢にコントロールすることが重要と考じさせるなど様々な機能が報告されている 15 , 16 ）。

38

浦上財団研究報告書
表6Vol.19（2012）

肝臓の脂肪酸組成

肝臓脂肪酸

Control 群

0.2%DGDG 群

C14 : 00.40±0.07

0.33±0.11

2%DGDG 群%a

0.34±0.10b26.85±1.39 ab

C16 : 028.11±1.72

C16 : 12.52±1.07

2.02±1.44

2.39±0.64

C18 : 07.76±0.99

8.25±1.36

7.85±1.20

C18 : 1

20.62±5.45

17.23±4.89

17.88±2.70

C18 : 219.14±2.98

23.08±4.51

21.65±1.98

C18 : 30.61±0.12

0.79±0.31

0.84±0.31

C20 : 00.16±0.05

0.21±0.06

0.21±0.06

C20 : 10.41±0.04

0.35±0.09

0.38±0.14

C20 : 30.85±0.14

1.03±0.23

1.07±0.18

C20 : 49.97±1.33 a

10.33±2.37 a

6.71±1.63 b

C20 : 50.20±0.03 a

0.37±0.12 a

1.85±0.48 b

C22 : 00.37±0.06

0.41±0.09

0.35±0.06

C22 : 65.89±0.45 a

6.95±1.43 ab

8.20±1.67 b

C24 : 00.18±0.03

0.17±0.06

0.19±0.05

C24 : 10.16±0.08

0.15±0.06

0.16±0.05

others

2.66±0.97

2.92±0.49

3.11±0.18

n-3/n-60.23±0.03 a

0.25±0.03 a

0.38±0.05 b

25.41±1.25

Means±SD, n=6. 異なる記号間に有意差あり（p<0.05)

表7

脾臓脂肪酸

Control 群

脾臓の脂肪酸組成

0.2%DGDG 群

2%DGDG 群%
C14 : 00.78±0.47

0.54±0.40

C14 : 13.84±0.26

3.51±1.12

0.55±0.19
3.03±1.00

C16 : 025.05±1.5424.30±2.32

24.89±1.75

C16 : 12.02±0.61

2.09±0.67

2.80±0.39

C18 : 013.05±2.08

12.78±2.77

11.55±2.74

C18 : 1

11.67±2.2813.35±5.21

15.46±5.16

C18 : 29.76±2.76

12.48±5.41

14.21±4.26

C18 : 30.35±0.33

0.44±0.35

0.52±0.33

C20 : 00.32±0.04

0.36±0.12

0.27±0.11

C20 : 10.39±0.11

0.35±0.17

0.34±0.17

C20 : 20.79±0.12

0.78±0.22

0.63±0.18

C20 : 31.06±0.32

1.02±0.39

1.03±0.42

C20 : 414.90±2.22 a

12.95±4.68 ab

9.48±3.82 b

C20 : 50.28±0.29 a

0.47±0.36 a

1.44±0.60 b

C22 : 00.76±0.18aab

0.51±0.18 b

C22 : 10.60±0.48

0.27±0.13

0.26±0.07

C22 : 64.42±1.11

3.98±1.38

4.24±1.59

C24 : 00.54±0.12

0.48±0.15

0.52±0.24

C24 : 11.04±0.19

0.87±0.34

1.21±0.55

aothers

7.75±1.40

an-3/n-60.21±0.03 ab

unidentiﬁed

0.69±0.23

0.96±0.44

1.62±0.58a3.67±1.48 b

6.90±1.59a3.95±0.74 b

0.19±0.04 a

0.27±0.09 b

Means±SD, n=6. 異なる記号間に有意差あり（p<0.05）

糖脂質摂取によるプレバイオティクス作用の評価

本 研 究 の 結 果 か ら、 盲 腸 内 容 物 重 量 が 2 ％39

与え、抗炎症作用が発揮されることが期待された。

DGDG 含有食群で Control 群に対して増加する傾向が認められ、DGDG の消化によって腸管内で生謝辞じたガラクトシルグリセロールが腸内細菌に影響

本研究を遂行するにあたり、多大な助成を賜りを与えることが期待された。しかしながら、定量ました財団法人浦上食品・食文化振興財団ならび的 PCR の結果から、腸内総細菌数および腸内細に関係者各位に厚く御礼申し上げます。

菌組成に有意な変化は認められず、DGDG 摂取が腸内細菌に及ぼす影響は確認できなかった。また、

文

0.2 ％ DGDG 含有食群では Control 群に対して盲

1) 大房剛 , 図説 海苔産業の現状と将来 , 成山堂書店 (2001)

腸内容物重量当たりおよび盲腸当たりの酢酸含有

2) Ohta, H., Awai, K., Takamiya K., Glyceroglycolipids
of photosynthetic organisms: Their biosynthesis andevolutionary origin, Trends Glycosci. Glycotechnol. 12,
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量が有意に増加していたが、2 ％ DGDG 含有食群では有意な差は認められなかった。グリセロ糖脂質を含む植物糖脂質画分の摂食により、盲腸当たりの短鎖脂肪酸が増加することが以前に見出されており 6 ）、DGDG のプレバイオティクス作用が推測されるが、少なくとも今回の実験条件では確認されなかった。DGDG がプレバイオティクス作用を発揮するには、さらに大量の摂食もしくはより長期間の摂取が必要と考えられた。
一 方、 肝 臓 と 脾 臓 の 脂 肪 酸 組 成 で は、2 ％DGDG 含有食群で EPA が有意に増加し、アラキドン酸が有意に減少した。さらに肝臓では DHAの有意な増加も認められた。n - 6 系脂肪酸である
アラキドン酸は生体にとって必要な脂肪酸の一つであり、早期の胸腺組織および細胞の発達に必要である。さらに、リンパ球など免疫担当細胞の膜脂質に含まれているアラキドン酸は、免疫応答を促進する方向に働き掛ける。一方、n - 3 系脂肪酸である EPA は免疫抑制性の機能を有することがよく知られている。したがって、生体内におけるn - 6 と n - 3 脂肪酸のバランスが重要であり、n - 3 /n-6 比を高めることは炎症性疾患やアトピー性疾患の抑制につながると考えられている

17 ）

。本研

究成果から、海苔由来 DGDG の摂取により、肝臓と脾臓の n - 3 /n - 6 比が有意に増加することが明らかとなった。したがって、DGDG 摂食によって効率的に EPA が供給され、宿主免疫系に影響を献

3) 海藻の生化学と利用 , 恒星社厚生閣 (1983)
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浦上財団研究報告書

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Evaluation of prebiotic effect of dietary glycolipids

Evaluation of prebiotic effect of dietary glycolipids
Tatsuya Sugawara
Graduate School of Agriculture
Kyoto University
Glyceroglycolipids, particularly monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) anddigalactosyldiacylglycerol (DGDG), are major lipid components in the thylakoid
membranes of chloroplasts within plant leaves and are also present in algae, grains, roots
and fruits. Marine red algae of the genus Porphyra are abundantly cultivated in eastern
Asia. Nori prepared from Phorphyra spp., generally P. yezoensis, is widely consumed
as a familiar daily food in Japan. Glyceroglycolipids in Phorphyra spp. consist of
polyunsaturated fatty acids, especially eicosapentaenoic acid (EPA), as acyl component.
Orally ingested glyceroglycolipids are rapidly hydrolyzed into constituent fatty acids andhydrophilic galactosylglycerols. The hydrophilic backbone galactosylglycerols are notabsorbed from intestine or degraded into galactose and glycerol in the intestinal tract.
In the present study, to explore the beneficial effect of dietary DGDG from P. yezoensis
on the lower digestive tract environment, male mice were fed a 0.2 or 2% DGDG dietor the standard AIN diet, respectively, for 15 days. DGDG prepared from dried Nori inthis study contained 48.4% of palmitic acid and 37.8% of EPA. During the experimental
period, food intake and body weight change were not different among the groups. The
cecal content in the 2% DGDG group tended to be lower than the control group. A realtime PCR assay using bacterial-specific 16S rRNA gene primers was performed toquantify Eubacteria, Lactobacilli, Bifidobacteria, Bacteroides, and Clostridium coccoides
in the cecum. The profile of bacterial flora was not significantly changed by dietary
glyceroglycolipids. The amount of acetic acid in the cecum of the 0.2% DGDG group, but
not the 2% DGDG group, was significantly higher than in the control group. The fatty acidcompositions of liver and spleen were altered and the proportion of EPA was increased
by dietary DGDG. The present results indicated that DGDG from P. yezoensis would be
efficient as a dietary source of EPA.

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