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中枢神経系の健康に貢献する食品機能性成分の評価＜平成 26 年度助成＞

中枢神経系の健康に貢献する食品機能性成分の評価
友永省 三 1) ・ 北 口公 司 2)

（ 1) 京都大学大学院 農学研究科、 2) 岐阜大学 応用生物科学部）

緒あると考えた。

言

アルツハイマー病、ハンチントン病およびうつ病

材料および方法などの神経疾患の作用機構において、脳内の免疫担当細胞（ミクログリアやマクロファージ）が活性化

実験１）マウスミクログリア細胞株 MG6 をカルノされて産生される炎症性サイトカインやキノリン酸シン（5 mM）存在下で 6 時間培養した後、LPS も（トリプトファン代謝のキヌレニン経路代謝物）のしくは IFN-γで刺激した。刺激から 6 時間後の Total関与が示唆されている 。本研究では、これに着目

RNA を回収し、リアルタイム定量 PCR 法を用いて、した「中枢神経系の健康に貢献する食品機能性成分IDO1、 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン（IL-1β、IL-6 お よ びの評価系の確立」を試みた。更に、立ち上げた評価TNF-α）、ケモカイン（MIP-2α）および誘導型一酸系を用いて、カルノシンの評価を行った。詳細は以化窒素合成酵素（iNOS）の発現量を測定した。また、下に述べる。

培養上清中の IL-6 濃度を ELISA 法により測定した。

1)

ミクログリア培養細胞において、IFN-γやリポ多更に、培養上清中の低分子代謝物濃度をガスクロマ糖（LPS）による活性化は、炎症性サイトカインのトグラフ質量分析計（GC/MS）による低分子代謝物産生を誘導し、キヌレニン経路の律速酵素であるの網羅的半定量解析系（メタボローム解析）を用いIDO1 発現を誘導してキノリン酸を産生することがて調べた。

報告されている 2)。そこで、これらを指標として用実験２）C57BL/6 系統雄マウスに LPS を腹腔内投いることを検討した。

与し、24 時間後の全脳および血漿を採取した。体LPS を腹腔内投与したマウスは、脳内の炎症性サ重および摂食量も確認した。全脳内および血漿中のイトカインの産生を促進し、投与から 24 時間後のキノリン酸分析（GC/MS の NCI 法、Smythe らの方うつ様行動を増加させることからうつモデルとして法 6) を一部改変）を行った。

用いられている 3, 4)。更に、本モデルで誘導されるう

実験３）C57BL/6 系統雄マウスにカルノシン（1.5つ様行動には、脳内キノリン酸の増加が関与するこおよび 3.0 mmol/kg b.w.）を経口投与し、1 時間後とが示唆されている 4)。そこで、この脳内キノリンに LPS を腹腔内投与した。LPS 投与から 24 時間後酸の増加を指標として用いることを検討した。の全脳、血漿および肝臓を採取した。全脳および肝これら評価系を用いて、食肉に多く含まれるジペ臓の低分子代謝物濃度を GC/MS によるメタボロープチドであるカルノシンの評価を行った。研究代表者

ム解析を用いて調べた。更に、血漿中のキノリン酸の友永は、カルノシンの単回投与が健常ラットにおの分析も実験２と同様の方法で行った。全脳内のキいて抗うつ様行動を誘導することを報告している 。

ノリン酸の分析も試みたが、分析時のトラブルによ

そこで、作用機構の妥当性により優れた今回の評価り定量することができなかった。

5)系を次の段階として用いて、詳細に取り組む意義が2

結浦上財団研究報告書

Vol.29（2022）

果実験１）IFN-γは IDO1 の mRNA 発現を誘導したが、カルノシンの影響は認められなかった（図 1）。また、
LPS に よ り 誘 導 さ れ た IL-1β、TNF-α お よ び iNOSの mRNA 発現にもカルノシンは影響を及ぼさなかった。一方、LPS により誘導された IL-6 および MIP-2αの mRNA 発現は、カルノシンによって有意に抑制された。更に、LPS 刺激後の培養上清中 IL-6 濃度もカルノシン投与により有意に低下した。培養上清における低分子の網羅的半定量解析系では、低分子代謝物は 167 成分検出され、11 成分にカルノシンの影

図1IFN-γにより活性化されたミクログリア細胞株におけるカルノシンの添加が IDO1mRNA 発現量に及ぼす影響
平均値±標準誤差、各 n=3、異符号間で有意（P<0.05)

響が認められた。その中には、カルノシンの構成アミノ酸であるβ-アラニンの増加が認められた（図 2）。
培養上清においてキノリン酸は検出されたが、LPSによる増加は認められなかった。
実験２）LPS は、マウスの摂食量や増体重量を減少させた。また、脳内および血漿中キノリン酸濃度を増加させた（図 3）。
実験３）LPS は、実験２と同様に摂食量および増体重量を減少させたがカルノシンによる影響は認められなかった。また、LPS は血漿中キノリン酸濃度を増加させたがカルノシンの影響は認められなかった（図 4）。低分子代謝物は、脳では 56 成分、肝臓では 62 成分同定されたが、カルノシンによる影響は

図 2 LPS により活性化されたミクログリア細胞株におけるカルノシンの添加が培養上清中β-アラニン濃度に及ぼす影響
平均値±標準誤差、培地は n=1、他は各 n=3、*LPS 群に対して有意（P<0.05)

認められなかった。

図 3 マウスにおける LPS の腹腔内投与が脳内および血漿中キノリン酸濃度に及ぼす影響
A) 全脳、B) 血漿、平均値±標準誤差、各 n=6-9、* 対照群に対して有意（P<0.05)

中枢神経系の健康に貢献する食品機能性成分の評価

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複数の抑制性神経伝達物質受容体に働くが、ミクログリアには様々な神経伝達物質受容体が存在することから、カルノシンによる効果がβ-アラニンを介した作用なのかは今後検討の余地がある。また、もうひとつの構成アミノ酸であるヒスチジンにも着目する価値がある。なぜなら、ミクログリアは、ヒスチジンからヒスチジン脱炭酸酵素を介してヒスタミンを産生し、ヒスタミン受容体も存在することが報告されているからである。したがって、カルノシン自身だけでなく、両構成アミノ酸の作用も考慮した研
図 4 マウスにおける LPS の腹腔内投与が血漿中キノリン酸濃度に及ぼす影響平均値±標準誤差、各 n=6究を行う必要がある。以上より、少なくともカルノシンには、活性化ミクログリアにおける炎症性サイトカインやケモカインの発現を一部抑制することが考明らかとなった。これは、カルノシンの神経保護効

察果として新たな作用機構である可能性があることか
実験１の結果から、カルノシンはミクログリアのら、今後、更なる研究を行う必要がある。

活性化時における炎症性サイトカインの発現や産生

実験２において、LPS の腹腔内投与が、先行研究を一部抑制することが示唆された。一方で、IFN-γと同様に 24 時間後の脳内および血中のキノリン酸により誘導された IDO1 の発現には影響を及ぼさな濃度を増加させることを確認した。従って、脳内キかった。今回、キヌレニン経路の重要な律速酵素のノリン酸の蓄積に及ぼす影響の評価系として用いるひとつである IDO1 発現に影響を及ぼさなかったたことができることが示唆された。

め、キノリン酸濃度に及ぼす影響までは確認しな

実験３では、LPS により血中のキノリン酸濃度はかった。しかしながら、下流にあるキヌレニン経路増加したが、カルノシンはこの増加に影響を及ぼさの他酵素を制御する可能性も残されていることかなかった。本実験では、前述したように脳内キノリら、今後他酵素に着目した実験とキノリン酸濃度にン酸含量が分析できなかったことが悔やまれる。今及ぼす影響を確認する必要があるかもしれない。一後、同様の実験を行い脳サンプルの分析を行う予定

方、LPS の投与により培養上清中キノリン酸が増加である。また、血中キノリン酸濃度に影響を及ぼさと異なる結果となっなかったことや、全脳や肝臓のメタボローム解析結た。これは、今回用いたミクログリアは、参考とし果から LPS による影響が緩和された低分子代謝物がと種類が異なることなど幾つかの実験見出されなかったことから、全身におけるキノリン条件の違いが影響しているのかもしれない。また、酸合成促進を緩和する効果は認められなかった可能

LPS 投与による細胞上清において、幾つかの代謝物性が考えられる。実験１の結果から考えると、ミクがカルノシンによる影響を受けたことは、今後の展ログリアのみを採取して各種分析を行うことが有用開を考える上で有意義な情報だと考えられる。中でかもしれない。また、投与量や投与回数が異なる条も、カルノシンの構成アミノ酸のひとつであるβ-ア件での実験も視野に入れていきたい。

しなかったことは、先行研究
た先行研究

2)

2)

ラニンがカルノシンの投与により増加していること

以上より、ミクログリア細胞株においてカルノシは興味深い。これは、培地に含まれている血清中にンの神経保護効果における作用機構の手がかりを得多く含まれている可能性が高いカルノシン分解酵素ることができた。LPS をマウスに単回投与することが働いたことによるかもしれない。β-アラニンは、により、キノリン酸の蓄積に着目した評価系として

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浦上財団研究報告書Vol.29（2022）用いることができる可能性が示唆された。今後、今参考文献

回得られた結果を基に、評価系の更なる検討とカル

1) Schwarcz R, Bruno JP, Muchowski PJ, Wu HQ.
Kynurenines in the mammalian brain: when
physiology meets pathology. Nat Rev Neurosci.
13(7):465-77. 2012.
2) Wang Y, Lawson MA, Dantzer R, Kelley KW. LPSinduced indoleamine 2,3-dioxygenase is regulated in
an interferon-gamma-independent manner by a JNK
signaling pathway in primary murine microglia.
Brain Behav Immun. 24(2):201-9. 2010.
3) Dantzer R, O'Connor JC, Freund GG, Johnson RW,Kelley KW. From inflammation to sickness anddepression: when the immune system subjugates thebrain. Nat Rev Neurosci. 9(1):46-56. 2008.
4) Walker AK, Budac DP, Bisulco S, Lee AW, Smith RA,Beenders B, Kelley KW, Dantzer R. NMDA receptor
blockade by ketamine abrogates lipopolysaccharideinduced depressive-like behavior in C57BL/6J mice.
Neuropsychopharmacology. 38(9):1609-16. 2013.
5) Tomonaga S, Yamane H, Onitsuka E, Yamada S, Sato
M, Takahata Y, Morimatsu F, Furuse M. Carnosineinduced ant idepressant-like act ivity in rats.
Pharmacol Biochem Behav. 89(4):627-32. 2008.
6) Smythe GA, Braga O, Brew BJ, Grant RS, Guillemin
GJ, Kerr SJ, Walker DW. Concurrent quantification ofquinolinic, picolinic, and nicotinic acids using
electron-capture negative-ion gas chromatographymass spectrometry. Anal Biochem. 301(1):21-6.
2002.

ノシンの作用機構解明に着手していきたい。
謝

辞本研究を行うにあたり、多大なる研究助成金を賜りました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に厚く御礼申し上げます。

Evaluation of functional foods for improving brain health

Evaluation of functional foods for improving brain health
Shozo TOMONAGA1), and Kohji KITAGUCHI2)
Graduate School of Agriculture, Kyoto University2)
Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University1)

In the pathophysiologies of psychiatric disorders such as Alzheimer disease,
Huntington disease, and depression, inflammatory cytokines and quinolinicacid, which is one of the metabolites of the kynurenine pathway of tryptophan
metabolism, released from activated microglia play important roles. In thepresent study, we attempted to establish methods focused on these species toevaluate functional foods that contribute to brain health. Then, we attempted toevaluate the bioactive dipeptide, carnosine using these methods. In the mousemicroglial cell line MG6, carnosine was unable to attenuate the IFNγ-inducedmRNA expression of ID O1, which is an important limit ing enzyme of thekynurenine pathway. On the other hand, carnosine attenuated the LPS-inducedmRNA expression of IL-6 and MIP-2α in the microglia. Under the appliede x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s , β- a l a n i n e , w h i c h i s o n e o f t h e c o n s t i t u e n t s o fcarnosine, was increased in the medium by carnosine administration,suggesting that carnosine had been degraded. Therefore, not only carnosine,
but also its constituents may be involved in the observed effects. The
intraperitoneal injection of LPS increases brain and plasma quinolinic acidlevels in mice. Therefore, we attempted to evaluate the effects of carnosine onthese mice. The oral administration of carnosine was unable to influence theplasma quinolinic acid levels induced by LPS. However, in the present study, wewere unable to confirm the effects on brain quinolinic acid levels, due toanalytical troubles. These results suggest that while further improvements will
be needed, we were able to establish two methods to evaluate functional foods
that could contribute to brain health. Furthermore, the effects of carnosine
found in the present study are important, and should thus be investigated indetail in future study.

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