●アンチセンス核酸の分子設計
つくば研究所 応用研究部 内多 潔

ス核酸の分子設計とは、あるmRNAと効果的に2重鎖を形成できるような核酸分子の塩基配列を決めることと言える。

1 はじめにこのアンチセンス核酸法の特徴は次のようにまとめること

試行錯誤を主な手段とした生物学研究の時代は，終わりつができる。

つあるのではなかろうか。それは、生命体の根源である遺伝①負の遺伝子制御法である。

1)2)子の解析がすさまじい勢いで進んでいるからである 。例え②任意の遺伝子に対して適用可能である。

ば、30億塩基対と言われるヒト遺伝子の全塩基配列が2005年③特異性が高い。例えばヒトに対するアンチセンス核酸とし3)までに決定できる見込みとなっている 。このような状況から、て17量体以上のオリゴ核酸を用いれば、特定遺伝子の発現の今後の生物学・医学の研究は遺伝子の情報をどれだけ上手く活用できるかにかかっている。
さて、ここで紹介するアンチセンス核酸は、遺伝子の働きを阻害する物質として、生物学や医学の分野でその有用性が4)-11)注目されている。すなわち、後でも述べるように、ある特定遺伝子に対し、その遺伝情報を基にアンチセンス核酸を設計し、人工的に合成する。そしてそれを生体内に入れ、その遺伝子の作用のみを抑えるのである。それ故、ある遺伝子の図1 アンチセンス核酸の作用機構機能を調べたり、病気の原因となる特定蛋白質の生産を阻害するのに利用できる。言うまでもなく、前者では生化学や分みを抑制することが統計的には可能である。
（核酸を構成する子生物学の研究に利用され、後者では医薬開発へとつながっ塩基は4種であるので、17塩基からなるオリゴ核酸ではていく。特にアンチセンス核酸医薬は遺伝子治療薬などとと417=1.7×1010種の異なった分子種が含まれる。これは、ヒト遺もに、21世紀の新しいタイプの医薬として期待されている。

）
伝子の全塩基数（30億の2倍、すなわち2×3×109）を超える。

このレポートでは、アンチセンス核酸の分子設計について④mRNAの塩基配列をもとに論理的アプローチが可能である。

述べる。現時点では、「このように設計すれば特定遺伝子の働すなわち、標的遺伝子の塩基配列が既知ならば、原理的にはきだけを阻害する効果が確実に期待できる」と明言することアンチセンス核酸の論理的な設計ができる。

はできない。しかし、設計の際に考慮すべき因子については、医薬開発の方法としてこれらの特徴を眺めたとき、④は従アンチセンス核酸研究者の間で合意が形成されつつある。そ来の医薬が主に試行錯誤で開発されてきたのとは対照的であこで、筆者らの最近の研究成果を織り込んでアンチセンス核る。アンチセンス核酸法の最大の利点がこの点にあると筆者

酸分子設計の概要を説明したい。分子設計についての理解をは考える。すなわち、アンチセンス核酸分子の論理的な設計容易にするために、まずアンチセンス核酸を用いる方法の原法が確立されれば医薬開発の方法やスピードにも影響するで理などを簡単に紹介する。

あろう。 また生化学や分子生物学における本方法の利用は、遺伝子解析の成果と共にさらに広がることが予想される。

2 アンチセンス核酸法について

3 mRNAのどこを狙うか

生物体の遺伝情報の源は、2重鎖が螺旋構造をとっているDNAに蓄えられている。そしてその情報は、1本鎖のメッセ

アンチセンス核酸法は、塩基配列が既知ならば論理的アプンジャーRNA（mRNA ）を経て最終的には酵素などの蛋白質ローチが原理的には可能であると上で述べた。これは、遺伝となって現われる。この中間段階で出現するmRNAの一部の子であるmRNAの任意の部位をアタックすればよいというこ領域に対して強く結合する、相補的な塩基配列を持つ核酸をとではない。その理由は生体内においてmRNAは、1本鎖が単アンチセンス核酸という。そして、このアンチセンス核酸を純に伸びた状態で存在しているのではないからである。すな用いてmRNAの働きを抑えるのがアンチセンス核酸法である

わち、mRNAは部分的に2重鎖などの自己構造を形成し（図2）、（図1）。すなわち、DNAのような2重鎖構造を部分的に作り、さらには蛋白質とも相互作用しうる。従って、アンチセンスmRNAに蓋をしてその機能を阻害するのである。アンチセン核酸の標的として、mRNAの中から適当な部位を選び出す必東亞合成研究年報52

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要がある。標的としては、mRNAが生体内で1本鎖状態になっが他の箇所（mRNA内で2重鎖を形成している部位など）より12）13）。ているところが適当と考えられているも速度論的かつ熱力学的に容易に起こるはずである。そこで、特定のアンチセンス核酸を用いるかわりに、各塩基の位置に4種すべての塩基を持つオリゴ核酸の混合物であるランダムオリゴ（オリゴ核酸が20量体からなる場合、420種類の分子種を含む）を用いて行った。なお、この方法はランダムオリゴを用いることから、ランダムスクリーニングと呼んでいる。

図2 mRNAの構造模式図

3.1

経験則

さて問題は、1本鎖状態をとっている部分をどのようにして見つけるかである。アンチセンス核酸標的部位の選択方法について、これまでにいくつかの提案がなされてきている。簡便さからよく利用されるのは、蛋白質の生合成が開始される
14)15）部分（翻訳開始部位）を選ぶという「経験則」である。いくつかの例では、確かにこのようなところを選んで成功している。しかし、逆にそのような箇所をターゲットにしたからといって、それほど高い確率で効果が期待できるのではないようだ。また、他の部位や領域をターゲットとする提案もあるが、的中する確率はあまり変わらないように思う。
3.2

mRNA2次構造予測の利用

第2の方法は、mRNAの2次構造を計算で予測し、それに基図3 ランダムスクリーニング法の原理

9）づいて選ぶ方法である 。先の方法より論理的であるが、必ずしも決定的な予測ができるわけではない。 その原因の第1は、方法の概略を図3に示す。まず、目的のmRNAを単離し、そ現状ではmRNAの2次構造予測自体が厳密に正確なものではの一端を放射性同位元素で標識する。これを上述のランダムないからであろう。これは2次構造を計算予測するのに必要なオリゴおよびRNaseH存在下、生理的条件で保つ。ここで基礎データがまだ十分には集積されていないのが大きな理由

RNaseHはRNAを切断する酵素で、DNAとの2重鎖を形成してである。第2として、たとえそれが正確であったとしても、細いる箇所でのみ作用する。したがって、mRNAはランダムオ胞中でのmRNAの実際の姿をどれほど反映できているかの問

リゴが結合した箇所でのみ切断される。反応時間を変えて実題がある。従って、アンチセンス核酸の標的部位選出に2次構験を行い、その生成物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳造予測を用いる際にはその適用の仕方や限界を十分にわきま動にかけ、それをオートラジオグラフィーで分析する。最初えた上で用いることが肝要である。に切断される部位は、mRNA自身が本来的に最も切れやすいところと考えられるので、ここをアンチセンス核酸の標的部

3.3

ランダムスクリーニング法

位として選ぶ。

第3の方法として最近開発された、実験による効率的な探松田らは、血管内皮細胞増殖因子（VEGF、別名を血管透索方法を紹介しよう。この方法については米・欧の研究室か過性因子（VPF））のmRNAを用いて上述の実験を行った。そ16）-19）

らも報告されているが、ここではつくば研究所で松田らの結果、翻訳終止の部分より約40塩基上流で最も切断されや

20）-22）が行った結果を基に紹介する。

すいことがわかった（図4の←印、＃507付近）。これは、アンチセンス核酸の標的部位を予測することは、先にも述mRNAの2次さらには高次の構造を反映した結果と考えられべたように、1本鎖状態をとっているmRNAの部分を探し出する。なお、無細胞転写翻訳系におけるアンチセンス核酸効果ことである。その箇所では、アンチセンス核酸との2重鎖形成の結果と比較すると、ランダムスクリーニングで示された箇東亞合成研究年報

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所は、アンチセンス核酸効果の最も顕著な領域であることが能性は、①形成される2重鎖が長いほど（厳密に言えば、生成22）わかった 。すなわち、このような方法で、効率的にアンチの自由エネルギーが大きいほど）、また、②2重鎖を形成するセンス核酸の標的部位を予測できることが示唆されたわけで部分同士のmRNA内での距離が、可能な範囲で近いほど大きある。同様な結果が、欧米の研究者らによっても報告されていとする。これをすべての塩基について行う。そしてそれらおり、この方法の有用性が確立しつつあると言えよう。のうちで2重鎖を形成する可能性が低い部分を標的部位候補とし、その中から標的部位を選び出すのである。
この方法を上で述べたVEGFの遺伝子に適用した結果を図5に示す（この図では各塩基が2重鎖を形成する可能性の和を連続する20量体について加算し、その対数をプロットしてある）。この結果より、塩基番号500番目付近は、2重鎖を形成する可能性が際立って低いことがわかる。この領域はランダムスクリーニングで最も切断されやすかった部位であり、またアンチセンス効果で最も顕著な効果が見られた箇所である。
この他の多数の遺伝子に関して、国内のアンチセンス核酸研究者のご協力を得て、この方法の予測能を試している。これまでのところ、複数の研究者から有用であるとの評価をいただいている。

図5 2重鎖形成能を計算予測した結果の例

4 アンチセンス核酸分子設計で考慮すべき因子
アンチセンス核酸の標的として、mRNA上でどのような部分が候補となるかについては3でおわかりいただけたと思う。
これ以外についても考慮すべき点があり、それらをまとめると次のようになる。
①アンチセンス核酸の標的部位として、mRNAで1本鎖状態をとっている可能性の高い部分を選ぶ（選び方は、3で述べた通り）。

図4 ランダムスクリーニングで得られた断片のゲル電気泳動の結果②アンチセンス核酸が自己構造をとったり2量体を形成し3.4 検索と計算による新しい予測法の試みないように設計する。アンチセンス核酸の核酸分解酵素安定

次に筆者が開発中の検索と計算による予測方法について紹性を高めるために積極的に自己構造をとらせる場合がある

23）

介したい 。先にmRNAの2次構造を基にする標的部位予測にが、通常は、mRNAとの結合を容易にするために、アンチセついて述べたが、筆者の方法ではいわゆる2次構造予測を行ンス核酸自身はその構造をとらないようにする。このようなわない。その理由は、目的とするmRNAの中で、1本鎖状態で構造をとるかどうかの可能性は、最近接塩基対モデルに基づ存在する部分を高い確率で予測できればよいからである。こく2次構造計算予測により調べることができる。 ホスホロチのような考えを基に以下に述べる方法を開発した。

オエート型のオリゴマーについては実験結果が十分ではない
24）25）

まずmRNAの各塩基について、mRNA中の他の塩基と2重鎖ので天然型についての結果をもとに評価するの2次構造予測のかわりに、3.4で述べた方法と類似の方法をを形成する可能性があるかどうかを調べる。2重鎖形成の可東亞合成研究年報。また、こ54

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用いることもできる。

参考文献③mRNAの標的部位に強く結合できるような（ハイブリッド形成エネルギーが大きい）アンチセンス核酸を選ぶ。この

1) バートランド・ジョーダン（美宅成樹訳）， ヒトゲノム

目的のためにも、最近接塩基対モデルに基づいて計算するの計画とは何か ，講談社 (1995).

が手軽である。ただし、ホスホロチオエート型のオリゴマー

2) 松原謙一，中村桂子， ゲノムを読む ，紀伊国屋書店を用いた実験値がないので、天然型オリゴデオキシリボヌク(1996).

26）

レオチドとRNAとが結合するときの値で代用する 。どの程3) 大久保公策，遺伝子医学，1，53 (1997).

度の値を目安にすればよいかは今のところ明確でないが、相4) 村上章，牧野圭祐，有機合成化学，48，180 (1990).

対的に大きな値のものを選ぶほうがよいと予想される。もし

5) E. Uhlmann,A. Peyman, Chem. Rev. ,90, 543(1990).

20量体のアンチセンス核酸で、mRNAとの結合形成のエネル

6) C. Héle｀ne, J.-J. Toulme, Biochim.Biophys. Acta, 1049,
99 (1990).

ギーが不足なら、22や25量体と長くするのが一つの解決法で

7) S. T. Crooke,B. Lebleu 編 "Antisense Research andある。但し、長くなるに従って、②で述べた自己構造の形成

Applications," CRC Press,Boca Raton (1993).

が問題となりやすい。

8) 村上章，岩瀬礼子，化学と生物，34，454 (1996).

④蛋白質等との特異的な相互作用が報告されている配列は避ける。例えば、CG配列を含むものは、免疫系B細胞表面の9) 杉本直己，内多潔，医薬ジャーナル，32，1035 (1996).

レセプターに結合し、B細胞を活性化することが明らかにさ

10) S．T．Crooke, "Therapeutic Application of27）-29）

れている。また、G4 配列についても、蛋白質との相互作

Oligonucleotides." R. G. Landes Company, Austin (1995).

30）-31）用が報告されている

11) S. Agrawal, Trends in Biotechnology, 14, 376 (1996).

。従って、アンチセンス核酸中にCG

12) 内多潔，杉本直己，Antisense，1，6 (1997).

やG4 配列は含まれないようにするのが賢明である。
⑤選んだ配列が他の遺伝子と強固に結合する可能性につい

13) 内多潔，化学と工業，50，1758 (1997).て調べる。20量体程度のアンチセンス核酸では、他の遺伝子

14) 武内恒成，池上司郎，井ノ口馨，渡辺和忠，実験医学，
14，573 (1996).とミスマッチなく完全に結合する確率は少ないであろうが、部分的な結合を形成する可能性はある。どの程度までなら許

15) 金田安史，分子生物学的アプローチによる癌研究

容かについては一概には言えないが、ミスマッチを含んだプロトコール（実験医学別冊，横田淳，山本雅 編），各々の場合について、③で述べたエネルギーを計算し、あるp142 (1995).

程度の判断をすることは出来る。一般に、ミスマッチの数が16) S.P.Ho, D.H.O.Britton, B.A.Stone,

D.L.Behrens,

多くなるに従ってその効果は大きくなる。また、アンチセン

L.M.Leffet, F.W.Hobbs, J.A.Miller, G.L.Trainor,

ス核酸の真中付近でミスマッチが生じる場合は、末端付近のNucleic Acids Res., 24,1901 (1996).

場合に較べてミスマッチの効果が大きい。その効果が大きい

17) W.F.Lima, V.B-Driver, M. Fox, R. Hanecak,

ときは、目的の遺伝子に対する阻害にくらべ、他遺伝子へのT.W. Bruice, J. Biol. Chem.,272, 626 (1997).
18) K.R.Birikh, Y.A.Berlin, H.Soreq, F.Eckstein,阻害効果は小さいと予想できる。

RNA, 3, 429 (1977) .

5 最後に

19) B.L.Frank J.Goodchild, Methods in Molecular Biology,
74, 37 (1997)

筆者は、3と4で述べたことを考慮して、アンチセンス核酸の設計を行っている。はじめにも述べたように、その方法は

20) 松田陽子，内多潔，特開平9-154579 (1997).

まだ確立されたものではなく、改良すべき点が含まれている。

21) 松田陽子，内多潔，第6回アンチセンスシンポジウム，
O1-18，つくば (1996).

しかし、そのようなレベルではあっても無作為にアンチセン

22) 松田陽子，神谷欽也，内多潔，第12回生体成分の分析

ス核酸の標的部位を選ぶよりはこのような方法を用いた方が化学シンポジウム，22C18，広島 (1997).

当たる確率は高くなると考えられる。実際に、アンチセンス
核酸研究を計画している生化学や分子生物学の研究者から部23) 内多潔，特許出願中.

位予測の依頼がしばしばあり、この方法で実験がうまくいっ

24) J.SantaLucia, Jr., H.T.Allawi, P.A.Seneviratne,

Biochemistry, 35, 3555 (1996).

たとの報告もいただいている。

25) N.Sugimoto, S. Nakano, M.Yoneyama,

今後は、4で述べた①〜④または⑤の条件間の重要性を考K.Honda, Nucleic Acids Res., 24, 4501 (1996).

慮に入れ、より確度の高い予測法にしていきたい。

26) N.Sugimoto, S.Nakano, M.Katoh, A.Matsumura,
H.Nakamuta, T.Ohmichi, M.Yoneyama, M.Sasaki,

Biochemistry, 34, 1211. (1995).

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27) E.Kuramoto, O.Yano, Y.Kimura, M.Baba, T.Makino,
S.Yamamoto, T.Yamamoto, T.Kataoka,T.Tokunaga, Jpn. J. Cancer Res., 83, 1128 (1992).
28) C.A.Stein, A.M. Krieg, Antisense Res.,

Dev., 4, 67 (1994).
29) A.M.Krieg, A.-K.Yi, S.Matson, T.J.
Waldschmidt, G.A.Bishop, R.Teasdale, G.A.
Koretzky, D.M. Klinman, Nature, 374, 546 (1995).
30) C.A.Stein, Nature Medicine, 1, 1119(1995)
31) J.R.Wyatt, T.A.Vickers, J.L.Roberson, R.W.
Buckheit,Jr., T.Klimkait, E.DeBaets, P.W.Davis,B.Rayner, J.L.Imbach, D.J.Ecker, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 91, 1356 (1994).

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