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浦上財団研究報告書

Vol.16（2008）＜平成18年度＞

特異的抗体の飼料添加によるサルモネラ食中毒の制圧
笹井和美（大阪府立大学大学院生命環境科学研究科教授）

1. 緒

言などのリンパ組織での免疫動態の研究，また，正常産卵鶏の生殖器における免疫細胞の動態に関す

Salmonella Enteritidis（SE）は，サルモネラ食る研究（Winthanage G.S.K., 1997），および，サ中毒事例で最も検出頻度が高く，鶏卵・鶏肉が感

ルモネラ感染時の生殖器における免疫細胞の動態染の主要な原因食材であると報告されている。

（Winthanage G.S.K., 1998），特に，T 細胞とマクSE の鶏に対する病原性は弱く，人を含めたホ乳ロファージの動態（Winthanage G.S.K., 2003）等類で強い病原性を示すため，キャリアとなった鶏である。さらに，鶏のモノクローナル抗体系を用から自然界への SE の排出が起こり，サルモネラいて鶏消化管寄生原虫に対するモノクローナル抗食中毒が発生する。したがって，人のサルモネラ体を作製してきた実績があり，新たに備品を購入

由来食中毒を抑制するためには感染源である鶏のす る こ と な く， 研 究 を 遂 行 で き る（Sasai K.,

サルモネラ感染およびサルモネラの野外環境への1998）。また，世界各地のサルモネラ由来食中毒排出を抑制することが重要である。

において，SE が他のサルモネラ血清型に比較し現在，鶏に対するサルモネラ予防ワクチンは，てその原因菌となる可能性の高いことから，サル日本国内では予防効果の低い不活化ワクチンが，モネラの血清型と鶏卵・鶏肉への汚染の原因を究

また，海外では弱毒生ワクチンが使用されている明する目的で，サルモネラの腸管への定着の血清が，弱毒化したサルモネラの野外での強毒化等の型による違い（Okamura M., 2001a），および，危険性が高く，ワクチンの使用には限界がある。

サルモネラの鶏生殖器への定着の違い（Okamura

そこで，抗体による経口受動免疫に着目し，予M., 2001b），を検討し，SE が鶏消化管や生殖器防効果の高い抗体の作製を試みた。
人のサルモネラ食中毒の最大の汚染源である鶏に親和性が高いことを証明した。更に，サルモネ
ラ繊毛に対する鶏免疫系の感受性（Mizumoto N.,

は，卵や糞便中へ長期にサルモネラを排泄するが， 2004）が自然感染と不活化ワクチン接種で異なる
鶏自身は不顕性感染状態で，臨床症状を示さず，ことを証明した。そこで，抗体による経口受動免長期にわたり環境を汚染する。そこで申請者のグ疫に着目し，予防効果の高い抗体の作製を試みた。

ループは，サルモネラ感染時（特に，SalmonellaEnteritidis，以下 SE）におけるの鶏のサルモネ

2. 材料と方法

ラ防御機構を中心に解析を行ってきた。その内訳

従来の研究結果をふまえ，図による研究計画をは，SE 感 染 鶏 の 脾 臓 と 胸 腺 の 役 割（Sasai K.

実施した。即ち，（1）サルモネラの鶏への免疫，1997.）および，鶏に特異的な腸管リンパ節であ（2）免疫したニワトリのサルモネラに対する抗体

る盲腸扁桃における免疫の役割（Sasai K. 2000）

価の測定（3）サルモネラに感作されたニワトリ

特異的抗体の飼料添加によるサルモネラ食中毒の制圧

145を用いた抗体産生ハイブリドーマの作製，（4）体

１） ハイブリドーマの作製法

産生ハイブリドーマの選別，（5）（1）から（4）White Leghorn 種 鶏，20 日 齢， 雄 に 1 × 106の過程，および，既に申請者の研究室にて作製しCFU の phage4 型 SE Y-24 株を経口投与し，さた抗体産生ハイブリドーマの抗体可変領域をコーらにその 13 日後に 1 × 109CFU の同菌株を経口ドする cDNA の単離，（6）抗体の重鎖および軽投与した。その 3 日後に鶏の脾臓を摘出し，得ら鎖を連結させた一本鎖可変領域（scFv）DNA のれた脾臓細胞と鶏のミエローマ細胞株 R27H4 株作製，
（7）抗サルモネラ組換え抗体発現プラスミを融合させた。

ドの調整，（8）組換え抗体の大腸菌で作製までの２） 限界希釈法によるクローニング行程を実施した。申請では（9）〜（10）までの行融合後，培養細胞を HAT 添加した 10％ FCS程を更に実施し，最終的には食物，あるいは飼料を含む Iscove s modiﬁed Dulbecco （s IMDM-10）への抗体の添加によりサルモネラにより発生する中に懸濁し，96 穴のマイクロプレート中に細胞 1

食中毒を経口受動免疫を用いた手法により制圧す

個 / ウェルで培養した。数日後，ウェルの培養細ることを試みるとともに，本研究から得た知見を胞をとり，ELISA 法によるスクリーニングでハ他の病原微生物による食中毒制圧の基礎的研究のイブリドーマ上清の抗体産生の有無を確認し，陽一助とする性のハイブリドーマを再度クローニングした。

既存設備を用いて行い。抗体作製は笹井が中心

ELISA 法でスクリーニング後細胞が確認されたとなり，分子生物学的実験は谷が，感染実験は松ウェルの HAT 上清が全て陽性であるとクローン林が中心となり研究を遂行する。

化されたとし，モノクローナル抗体産生ハイブリ

2. 1

供試菌株についてドーマを選択した。これらのモノクローナル抗体

大阪府立公衆衛生研究所から分与された，SE， のアイソタイプは全て IgG であった。
SHa，SM，SI，SHe の 5 血清型を用いた。
2. 2

供試モノクローナル抗体について

2. 3

スクリーニング

再クローニングしたモノクローナル抗体のスク146

浦上財団研究報告書

リーニングは免疫蛍光染色法で行った。

Vol.16（2008）

bromophenol blue，50mM dithiotheitol：DTT１） 菌液を加えて調整）を 1：99 の希釈濃度で加え，攪拌供試菌を 20ml のトリプトソイブイヨン（ニッ後蛋白を変性させるため，10 分室温でインキュスイ）で 37C，20 時間静止培養した後，PBS でベートした。

3 回，15 分間の遠心（4,528 × g，HITACHI）洗（２） サンプルの膨潤と一次元目の泳動浄し，10％ホルマリンを加えた。その後 3 回洗浄調製したサンプルをフォーカシングトレイの電し た 後，20ml の PBS に 懸 濁 し，1010CFU/ml の極 線 内 に 入 れ， − 20 ℃ に 冷 凍 し て い た Ready菌液とした。

Strip（3/10）（Bio-Rad）のカバーをはがし，ゲ２） 免疫蛍光染色によるスクリーニング

ル面をバッファーに均一に浸らせフォーカシング

20nl の 菌 液 を ス ラ イ ド ガ ラ ス 上 で 乾 燥 し，トレイのレーンの中に置いた。ストリップ全体が50nl のモノクローナル抗体と 30 分反応させた。

バッファーで均一に濡れたら乾燥防止のためミネ

その後，PBS で 3 回 5 分間洗浄した後，二次抗ラルオイルで静かに重層し，フォーカシングトレ

体 と し て 50nl の 150 倍 希 釈 し た ﬂuorescein

イにカバーを被せて PROTEAN IEF Cell（Bio-isothiocyanate（FITC）標 識 抗 鶏 IgG（Sigma）Rad）の本体にセットし，以下の条件を本体に記と 30 分間反応させた。その後，同様に洗浄した憶させ，2 日間かけて定電圧泳動を行った。
（初後，無蛍光のグリセリンを滴下し，カバーグラスめに 12 時間の膨潤終了後，ステップ 1： 250V をを の せ， 蛍 光 顕 微 鏡（OPTIPHOT，Nikon） に20 分，ステップ 2：4,000V を 2 時間，ステップて鏡検した。なお，陰性コントロールには一次抗3：1,500V で 10,000Vhr に な る ま で， ス テ ッ プ

体 の 代 わ り に normal chicken IgG（10ng/ml）

4：500V24 時間）

を 含 む IMDM-10（ 以 下 IMDM-10-Neg） を 用 い，（３） SDS 平衡化と二次元目の泳動

陽性コントロールには一次抗体としてサルモネラ

Laemmili 法に基づいて 1.0mm 厚のガラスプレ

O4，O7，O8，O9 群 抗 血 清（ デ ン カ 生 研 ） のートで二次元目の SDS-PAGE 用のゲルを作製し100 倍希釈液を，二次抗体として FITC 標識抗ウた（Laemmli, UK. 1970）。1 レーン当たり 1ml のサギ IgG（Sigma）を用いた。なお，免疫蛍光染平衡化バッファー（6MUREA，2％ SDS，0.375M

色は同一の手技を 3 回繰り返し行うことで再現性

Tris-HCl・pH6.8，20 ％ グ リ セ ロ ー ル，を確認した。

130mMDTT）の入った膨潤トレイに一次元目の二 次 元 電 気 泳 動（2 -dimensional泳動が終わったストリップのミネラルオイルを拭

electrophoresis：2-DE）による抗原解析

き取り，ゲル面を上にして静かに沈め，振とうし１） 等電点電気泳動（iso electric focusing：ながら 8 分の平衡化を 2 回行った。その後，同様

2. 4IEF）に 平 衡 化 バ ッ フ ァ ー II（6MUREA，2 ％ SDS，

（１） サンプル調製（可溶化）0.375M Tris-HCl・pH6.8，20 ％ グ リ セ ロ ー ル，

ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動（SDS-135mM ヨードアセトアミド）中にゲル面を上にPAGE）で行ったサンプルと同様に処置後，−して静かに沈め，振とうしながら 8 分の平衡化を80℃で冷凍していたサンプルを溶解し，一次元膨２回行った。作製しておいた１％アガロース含泳

潤 / サ ン プ ル バ ッ フ ァ ー（UREA8M，Bio-動バッファー（１％ローメルトアガロース（Bio-L y t e 3 / 1 0 （ 0 . 2 ％ ）， 2 ％ C H A P S ， 0 . 0 0 1 ％Rad）， 泳 動 バ ッ フ ァ ー 5ml，0.001 ％147

特異的抗体の飼料添加によるサルモネラ食中毒の制圧

bromophenol blue）をゲルのウェルに入れた後，作製，（7）抗サルモネラ組換え抗体発現プラスミ

両端を 5mm ずつカットしたストリップを入れ，ドの調整，（8）組換え抗体の大腸菌で作製までの10 分間アガロースを固めた。凝固後，レディー行程を実施した。

ゲ ル に セ ッ ト し， 泳 動 バ ッ フ ァ ー を 満 た し

実験（1）〜（4）までの結果を下記に示す。

Protein Standard をアプライし，プレランとして（１） 限界希釈法による再クローニング

限界

20V20 分泳動後，200V, 45 分泳動した。

希釈法による再クローニングを行い，ハイブ２） 二次元泳動後の Western blotting

リドーマのクローン化を行った。ELISA 法PVDF メンブレンへの蛋白の転写はポリアクによる一次スクリーニングと免疫蛍光染色法

リドアミドゲル電気泳動後の Western blottingによる二次スクリーニングにより発色した 3と同様の方法で行った。転写後よく乾燥させたメ種類のモノクローナル抗体を選び出した。

ンブレンに供試モノクローナル抗体を 2ml 室温（２） 二次元電気泳動，Western blotting 法にで 1 時間インキュベートし，0.05％ tween-20 添

よる抗原蛋白の性状解析選抜したモノクロ

加 PBS で 3 回洗浄した。二次抗体にビオチン標ー ナ ル 抗 体 を 用 い て 二 次 元 電 気 泳 動，

識抗鶏 IgG 抗体（Sigma）を 2ml（1％ BSA-PBS

Western blotting 法より抗原を解析した結果，で 2,000 倍に希釈）室温で 1 時間インキュベート

モノクローナル抗体 A1 と A3 はどの抗原ス

し，0.05％ tween-20 添加 PBS で 2 回洗浄した。

ポットも認識しなかったが，A2 は pH5.9，その後，10,000 倍希釈したアビジンペルオキシダ

約 88kDa の特異的なスポットを認識した。

ーゼ（Sigma）を 2ml 室温で 1 時間インキュベー

その後，2 次元電気泳動法にて抗原解析をトし，0.05％ tween-20 添加 PBS で 2 回洗浄した。

実施した抗体について，モノクローナル抗体

発 色 試 薬 diaminobenzidine（DAB：Sigma） をを産生する鶏ハイブリドーマの抗体可変領域調製し，メンブレンを試薬の中に入れ，室温で遮をコードすると思われる部分遺伝子を増幅後光し，20 分間反応させた。検出されたスポットは，（VH と VL），増幅した VH と VL をリンカ

molecular standard と比較し，分子量の測定を行ーで結合した cDNA を作製し，EK1 認定宿った。

主プラスミドベクター系を用いて大腸菌にて発現を試みたが，可変領域をコードする遺伝3. 結果と考察子の導入がうまくゆかず，最終的な抗体の産生には至らなかった。

本研究において実験（1）〜（8）までを実施して下記の結果を得た。
（1）サルモネラの鶏への免疫，（2）免疫したニワトリのサルモネラに対する抗体

文

価の測定（3）サルモネラに感作されたニワトリ

１） Survey of Japanese layer farms for Salmonellaを用いた抗体産生ハイブリドーマの作製，（4）体

enteritidis with vaccination- and infection-speciﬁc antigens

産生ハイブリドーマの選別，（5）（1）から（4）の過程，および，既に申請者の研究室にて作製した抗体産生ハイブリドーマの抗体可変領域をコードする cDNA の単離，（6）抗体の重鎖および軽鎖を連結させた一本鎖可変領域（scFv）DNA の献

for egg yolk antibodies. Mizumoto N, Toyota-Hanatani Y,
Sasai K, Tani H, Ekawa T, Ohta H, Baba E. J Food Prot.
2006 69（1）：17-21.
２） Differential responses of macrophages to Salmonella
enterica serovars Enteritidis and Typhimurium. Okamura
M, Lillehoj HS, Raybourne RB, Babu US, Heckert RA,

148

浦上財団研究報告書

Vol.16（2008）

Tani H, Sasai K, Baba E, Lillehoj EP., Vet Immunol

isolates from humans and animals in Japan using theImmunopathol. 2005 107（3-4）：327-35.

60-kDa glycoprotein gene sequences. Abe N,

３） Increased lymphocyte subpopulations andMatsubayashi M, Kimata I, Iseki M. Parasitol Res. 2006 99

macrophages in the ovaries and oviducts of laying hens（3）：303-5.

infected Specific adhesion and invasion of Salmonella

８） The detection of a novel type of Cr yptosporidium

Enteritidis in the vagina of laying hens. Withanage GS,

andersoni oocyst in cattle in Japan. Matsubayashi M,

Sasai K, Fukata T, Miyamoto T, Lillehoj HS, Baba E. Vet

Kimata I, Abe N, Tani H, Sasai K. Parasitol Res. 2004 93

Microbiol. 2005 111（1-2）：99-105.

（6）：504-6.

４） Proliferative responses to canine thyroglobulin of９） Cross-reactivities with Cryptosporidium spp. by chicken

peripheral blood mononuclear cells from hypothyroid

monoclonal antibodies that recognize avian Eimeria spp.

dogs. Tani H, Nabetani T, Sasai K, Baba E. J Vet Med Sci.

Matsubayashi M, Kimata I, Iseki M, Lillehoj HS, Matsuda

2005 Apr;67（4）：363-8.

H, Nakanishi T, Tani H, Sasai K, Baba E. Vet Parasitol.

５） Recognition pattern of thyroglobulin autoantibody

2005 128（1-2）：47-57.

from hypothyroid dogs to tryptic peptides of canine

10） Laemmli, UK. 1970. Cleavage of structural proteins

thyroglobulin. Tani H, Shimizu R, Sasai K, Baba E. J Vet

during the assembly of the head of bacteriophage T4.

Med Sci. 2003 65（10）：1049-56.

Nature. 227：680-5.

６） Infectivity of a novel type of Cryptosporidium andersoni

11） Towbin H., Staehelin T., Gordon J. 1979.

to laboratory mice. Matsubayashi M, Kimata I, Iseki M,

Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamideHajiri T, Tani H, Sasai K, Baba E. Vet Parasitol. 2005 129

gels to nitrocellulose sheets： procedure and some（1-2）：165-8.

applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76（9）：4350-4.

７） Subgenotype analysis of Cr yptosporidium parvum

Speciﬁc antibody therapy for Salmonella food poisoning

149

Speciﬁc antibody therapy for Salmonella food poisoning
Kazumi Sasai（Laboratory of Veterinary Internal Medicine, Department of Veterinary Sciences,
Graduate School of Life & Environmental Sciences, Osaka Prefecture University）

In Japan, inactivation vaccine with lower the protective efﬁcacy is used as Salmonella
prevention vaccine for the chicken now.
However attenuated live vaccine is used abroad, the Salmonella vaccine stock which weattenuated is at great risk of making it virulent in the outdoors, and there is limit for use of
the vaccine. Therefore we paid our attention to oral passive immunity by the antibody andtried the manufacture of the antibody of the high-protective efﬁcacy.
At first, we performed a re-cloning by the limiting dilution methods and cloned thehybridoma. We picked three kinds of monoclonal antibodies according to the data of Elisaand IFA. As a result of two dimensional electrophoresis, property analysis of the antigen
protein by Western blotting method, we selected three kinds of monoclonal antibodies. As aresult of having analyzed an antigen than two dimensional electrophoresis, Western blotting
method, no antigen spot recognized monoclonal antibody A1 and A3, but A2 recognized aspeciﬁc spot of about 88kDa, pH 5.9.
Using the antibody which performed antigen analysis by two-dimensional
electrophoresis, we amplified the part gene that it seemed that we encoded an antibody
variable region of the chicken hybridoma which produced a monoclonal antibody
afterwards. We made the cDNA which connected VH and VL which we amplified in alinker and tried manifestation in E. coli using EK1 plasmid vector system, but were carelessfor the production of a deﬁnitive antibody without succeeding in genetic induction to encode
a variable region.