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浦上 財 団研 究報 告書VoLl1(2003)

大 豆食 品 に よる環境 ホ ルモ ン毒 性 の予 防 と緩 和進正志(長 崎大学大学院医歯薬学総合研究科)

な らびに緩和効 果が あるか否 か を検 討す る 目的 で
1.はじ め に本研究 を遂行 した。
近 年,「 内分泌 撹乱 物質」 あ るい は 「環 境 ホルモ ン」 とい う言葉 が大 きな社会 的関心 を集め ている。 食品 と内分泌撹 乱物 質 との 関係で は,食 品容

2.実

験 方 法

2.1動器や 食器か らの溶 出物や 残留農薬 等の 人工的 に化物お よびエ ス トロゲ ン様物 質投与 プ ロ
トコル

学合 成 され た物 質の影響 につい ての関心 が高 いが,今 回の研究 では,化 学合成 され た内分泌 撹乱物

日常摂 取 してい る食品 中に本来含 まれ ている成 分

質 としてはエ ス トロゲ ン活性 を強 く示す こ とが知に もホルモ ン様物 質があ るこ とが 分か って きていられて いる ジエチル スチルベ ス トロール(DES)る1)。そ の ような物質 の中 で近年特 に注 目 されてを,天 然の植物 性エ ス トロゲ ンとしては大 豆 に含きて いるの が植物 エス トロゲ ン(Phytoestrogen)

まれ るゲニ ステイ ン(GE)をと総称 され るエ ス トロ ゲンに化学 構造 が類似 した物質群 であ り,我 々が 日常 口 にす る食 品でい えば,(1)DES単用い た。

独投 与ICRマ ウ ス(雄,6週齢)に5%エタノー ル/

大豆 お よび,そ の加 工品 に多 く含 まれ るイ ソフラ

コー ンオ イル に溶解 したDESをlng/kg体

ボ ン類 等が これ に属 して いる。

10ng/kg体

重,100ng/kg体

重,1μg/kg体

重,イソフ ラボ ン類 の作用 につい ては,骨 粗霧症 を10μg/kg体

重,100μg/kg体

重,1mg/kg体重,改善 す る とい った プ ラスの 効果2)と 共 に 女性 の10mg/kg体

重,20mg/kg体

重,100mg/kg体

ホ ルモ ンバ ラ ンスに影響 を与 えて月経周 期 を変 え

重の種 々の量 で5日 ご とに4回 皮下投 与 した。対る とい っ たマ イナ スの 効果3)も 報 告 され てお り,

照群 に は溶媒 の みを投 与 した。 初 回投与 か ら20

その有 効性 と有害性 につ いて は議 論の ある ところ

日 目に エー テ ル麻酔 下 に精 巣 を摘 出 し,4%パであ る。 しか しなが ら,イ ソ フラボ ン類 の多 い大

ラホ ルムア ルデ ヒ ド/PBSで豆 を常 食 にして いる 日本 を含む東 南 アジア地域 で,てパ ラフ ィン包埋ブ ロ ックを作成 した。試 料の一エス トロゲ ンに よって増殖 が誘導 され る乳ガ ンの部は 電顕用 試料 とす る ため に2.5%グ ル タール ア発生率 が,欧 米 と比 較 して有意 に少 ないとい う疫

ルデ ヒ ドで 固定 し,エ ポ ン812に 包埋 した。パ ラ

学 的調査 結 果4)か ら,イ ソ フラボ ン類 が エス ト

フ ィ ンブ ロ ック よ り5μm厚ロゲ ンに対 する アン タゴニス トと して働 き,そ のシ ラン処 理 スライ ドグラス に拾 い,ヘ マ トキ シリ影響 を抑制 して いる可能性 が考 えられ る。

ン/エ オシ ン染 色並 びに種 々の分子組 織細 胞化学

そ こで,食 事の取 り方 によ り内分泌撹 乱物質 の重,固定 し,定 法 に従 っの 切 片 を薄切 し,的検討 に用い た。

生体へ の影響 を抑制 で きるので はないか と考 え,(2)ゲ

イ ソフラボ ン類 に内分泌撹 乱物質毒 性 の予防効 果

ICRマ ウ ス(雄,6週

ニ ステイ ン単独投 与齢)に5%エ

タノー ル/

大豆食品による環境ホルモン毒性の予防と緩和

33

コー ンオ イ ル に溶解 した ゲニ ステ イ ンlmg/kg

箱内 で特異抗 体 との反応 を行った。 続い て,特 異体 重お よび3mg/kg体同様 の抗体 に対 す るHRP標

識二次抗 体 を用 いて特 異抗方 法で投与 して試料 を作成 し,種 々の検討 に用い体 を検 出 し,DAB反

応 に よって アポ トー シス 関た。

連分子 の存在 部位 を可視化 した。 また,必 要 に応(3)ゲ重 を上記(1)とニ ステイ ン+DES投

ICRマ ウス(雄,6週

与じて オー トク レー プに よる前 処理や メチ ルグ リー

齢)に5%エタノール/ンに よる対比 染色 を行った 。

コー ン オ イ ルに 溶解 した ゲ ニス テ イ ンlmg+

2.4ス

DES100ng/kg体

重,ゲ ニ ステイ ンlmg+DES

エ ス トロゲ ン作用 を持つ とされ る内分泌撹 乱物

重,ゲ ニ ス テ イ ン3mg+DES100

質は エス ロ トゲ ン受 容体 を介 して作 用 している可20mg/kg体

テ ロイ ドホ ルモ ン受容 体の発現 検索

ng/kg体 重,ゲ ニス テ イ ン3mg+DES20mg/能性が あ るので,エ ス トロゲ ン受容 体の発現 を検kg体 重 を上 記(1)と索す る ため に,エ ス トロ ゲ ン受 容体 α(ERα)

同様 の方 法 で投与 して試料 を作成 し,種 々の検討 に用 いた。
2.2ア

お よび β(ERβ)に

ター ミナルデ オキ シヌク レオチ ジル トランス フェラ ーゼ(TdT)よる ビオチ ン16dUTPの込 みに よ りDNAの二本鎖切 断部 位 を視 覚化 する

TUNEL法取 り

3.結果 と考 察

3.lDESおを用 いて,ア ポ トー シス細胞 を検 出 しよ びゲニス テイ ンの 精子形 成細胞

アポ トーシス に対 す る影響た。 トル エ ン ・エ タノール系列 で脱パ ラフ ィン し(1)DES単た組 織切 片 を,プ ロ テナー ゼK(0.1μg/ml)でこれまで,mg/kg体

37℃,15分

間処理 を行 っ たの ち,TdTバー で 前 処 理 を 行 っ た。 続 い て,恒TUNEL反ッフ ァ
温器 内で応液(1×TdTbuffer,0.1mMDTT,独投 与 の影響
重 レベ ルのDES投与により精 子形 成細 胞 アポ トー シス が増加 し,20mg/kg体 重の投 与 で ピー クを持つ こ とを報 告 して いるが,今 回,DESの1.5mMCoCl2,20μMdATP,5μMbiotin‑16‑
dUTP,o.iunit/μ1TdT)と37℃,90分

つ いて市 販の 特異抗 体 を用いて,免 疫組 織化学 的に検索 した。

ポ トー シス細胞 の検出

精 子形 成細 胞 アポ トー シ スに対 す る影響 を よ り詳細 に検討 す るため,lng/間,反kg体 重 〜100mg/kg体

重 の 広い 範 囲 でのDES

応 を行 っ た。 西 洋 ワ サ ビペ ル オ キ シ ダ ー ゼ投与 実験 を行 った。 各実 験群 か らの組織 切 片 を(HRP)標

terminaldeoxynucleotidyltransferase‑mediated

識抗 ビオ チ ン抗 体 を用 いて,免 疫組 織化 学 的にbiotin‑16‑dUTPの付加 され た部位 を検出 し,ニ ッケ ル ・コバル ト増感DAB反応に よって可 視化 した。
2.3ア

dUTPnickend‑labeling(TUNEL)法TUNEL陽性 細胞 数 を計 数 した。そ の結果,こ れ

ポ トー シス関連分 子の検 索まで 知 られ て い た高濃 度 でのTUNEL陽アポ トー シ ス に関 連 した分 子 で あ る,Fas,数の 増加 に加 え,低 濃 度100ng/kg体

Fasリ ガ ン ド(FasL),Bcl‑2,Baxにに よ り染色 し,横 断 された精 細管 について精 細管 あた りの性 細胞
重 のDES

つ いて それ投与 で も,TUNEL陽性 細胞が 有意 に増加 して いぞ れに対す る特異抗 体 を用い て,免 疫組 織化 学的た(図1,図2a,b,c)。

す な わ ちDESにに検 索 した。組織切 片 を,ト ルエ ン ・エ タノール

ア ポ トー シ ス 誘 導 作 用 は100ng/kg体

系列 で脱パ ラ フィ ンしたのち,内 因性 ペル オキ シmg/kg体

ダーゼ活性 お よび非特異 的反応 の阻害 を行い,湿す ことが明 らか となった。 この ことは,内 分泌撹よる

重 と20重 の二 ヶ所 で ピー クを持 つ二 峰性 を示

34

浦 上財 団 研究 報告 書VoL11(2003)

図1ゲニステインおよびDES投 与によるTUNEL陽り,5日性細胞数の変化

分 で は約1mg/kg体

重 に相 当す る。 これ よ り,マ ウ ス へ の ゲ ニ ス テ イ ン投 与 量 をlmg/kg体

重 お よびそ の3倍 量の3mg/kg体

設定 した。TUNEL染た りのTUNEL陽重に色後,横 断され た精細 管あ性 細 胞 数 を計 数 し,ア ポ トー

シス細 胞の 頻度 を計 算 した。 その結 果,TUNEL
陽性細 胞数 は ゲニ ステ イ ン1mg/kg体
3mg/kg体
図2DESおよびゲニステイン投与の精子形成細胞アポ トー シスに対す る影響(a)対 照群,(b)DES100ng/kg体
重投与群,(c)DES20mg/kg体 重投与群,(d)対 照群,(e>GElmg/kg体
重+DES100ng/kg体 重 投与群,(f)GE3mg/kg体
重+DES20mg/kg体重投与群。スケールは50μm。

重お よ び

重投 与 群共 に コ ン トロ ール群 との 間に有 意な差 は認 め られ なか った(図1)。

この結果 より,通 常摂 取 している量 お よびその数 倍の ゲ
ニス テイ ンを摂 取 した としても,少 な くとも男性の精子 形成能力 に影響 を及 ぼす可能性 は低 い と考乱物 質の作 用が必 ず しも濃 度依存 的で な く,物 質え られ る。に よって は低濃度 の暴露 に よって も影響 を受 ける(3)DESの可能 性が ある ことを示唆 してお り,個 々の内分 泌撹乱 物質 の影響 について 広い濃 度範囲 で詳細 に検討す る必要 があ るこ とを示 して いる。
(2)ゲア ポ トー シス誘 導作 用 に対 す る

ゲニ ステ インの抑制効 果
DESのアポ トー シ ス誘導 作用 に 対す る ゲニ ス

テ イ ン の影 響 を調 べ る た め にゲ ニ ス テ イ ン とニス テイ ンの 影響

DESの

ゲニス テイ ン単 体の雄性 生殖細 胞 に対 す る影響

同時投 与 を行 った。 前記 実験 結 果 よ りゲニ ス テ イ ンの 投 与 量 はlmg/kg体mg/kg体

ウス精巣 でのア ポ トー シス細胞 の頻度 を計測 した。

導作 用 の ピー クであ る100ng/kg体

日本人 の 一 日あ た りのゲ ニス テ イ ン摂 取 量 は約mg/kg体

重 と し た。パ ラ フ ィ ン切 片 を 用 い て13.5mgでTUNEL染色を行 い,精 細 管あ た りのTUNEL陽あ り5),成 人 男子(18〜29才)の均 体重 が約65kgで平あ るの で6),一 日の ゲニ ステ

イ ン摂 取 量 は体 重lkgあた り約0,2mgとな

重 と し,DES投

重 お よ び3を調 べ るために,ゲ ニ ステ インのみ を投 与 したマ

与量 は アポ トー シス誘
重 お よび20性細 胞 数 を計測 した。そ の結 果,DES単の場合 と比較 してGElmg+DES100ng/kg体

独 投与大豆食品による環境ホルモン毒性の予防と緩和
重投与 群お よびGE3mg+DESlOOng/kg体
投与 群 で はTUNEL陽重35

核 な らびに細胞 質が電子 密度 の高い小 さな凝 集院

性 細胞 数 に増 加 は見 られと して 分断化 され ネクロー シスに類似 した形態 をず,対 照 群 に対 す る有 意差 も認 め られ なか っ た

示 すlatestageが あ ると報告 され てい るが81,今(図1,図2d,e)。

回の実験 で も同様の アポ トー シス像が 認め られた

mg/kg体一 方,GElmg+DES20

重 お よ びGE3mg+DES20mg/kg

体 重 投 与 群 で は,DES単(図3)。
3.3ア

ポ トー シス関連 因子の発 現性細 胞数 の増加 は見 られ なか ったが,DESによっ て誘 導 される 精子 形成 細胞 ア ポ ト

TUNEL陽独投与の場合ほどの対照群 と比 較すれ ば有意 に増加 していた(図1,ーシ スの分子 機構 を解析す るた めに,Fas,FasL

図2d,f)。

この こ とか ら,ゲ ニス タ イ ンは低濃

お よびBcl‑2,Baxに度DESによる精 子形 成細胞 アポ トー シ ス誘導作

つ いて 免疫 組織 化学 的 にその発現 を検索 した。 対照群 のマ ウス精巣 ではFas

用 に対 して抑 制効 果 を持 つ こ と,ま た,高 濃 度

はラ イデ ィッ ヒ細 胞にFasLはDESに現 してい た(図4a,c)。

よ るアポ トー シ ス誘導 作用 に対 して も不セ ル トリ細胞 に発また,低 濃 度DES投

与十分 なが ら抑 制 してい る可 能性が ある ことが示 唆群 お よ び ゲニ ス テ イ ン投 与 群 で はFasおされ た。通 常環境 中に存在 する内 分泌撹 乱物質 のFasLの 発 現 は対照 群 と同様で あ ったが,高 濃 度

量 は,ppbののDES投

レベ ルであ るこ とが多 いの で,大 豆よび

与群 では精 子形 成細 胞 にFasの 発現 が成分 の摂 取 に よって微量 で作用す るエス トロ ゲ ン

見 られ た(図4b)。

様物 質の影響 を緩和 す るこ とが 出来る可 能性が 示

血 ・再 灌流精 巣で も報告 されてお り,Fas系

唆 された。

巣が急性 の重大 な障害 を受 けた ときに速やか に多3.2電数の配 偶子 を除去す るための機 構 として働 いてい子顕 微鏡 観察 に よるアポ トー シス細 胞の同定

生殖 細胞 でのFasの 発現 は虚る と考 え られて いるが9),高 濃 度DESには精

アポ トー シス は本 来電子 顕微鏡 観察 によ り形 態的 に定義 された細 胞死 の過程 であ るので7),本 実

よって引 き起 こ され る生殖細 胞死の場 合 も,同 様 の機構が働 くこ とが示 唆 された。

験で 観察 された精子 形成細 胞死が アポ トー シスでBcl‑2は す べ ての実験 群 で精 母細 胞や 精子 細胞

あ るかを形 態的 に確 認す るため に電顕観 察 を行 っに発現 が見 られ,実 験群 問 に著 明 な差は見 られ なた。 電顕観 察に よる精子形 成細胞 での アポ トーシかった(図5a,b,c)。

ス像 は,ク ロマチ ンの凝集 が著 明だけれ ど も細 胞
質 部分 に は変化 を認 め ないearlystage,細胞内小器 官が集積 しクロマチ ンが凝集 した核 部分 と対峙 してい る ような形 態 を示 すintermediatestage,

図4DES投図3精子 形 成 細 胞 アポ トー シ ス の 電顕 像(a)intermediatetolatestage,(b)latestage。
μm。

ス ケ ー ル は2

与 に よ る精 子 形 成 細 胞 でのFasお(a)Fas,対照 群,(b)Fas,DES20mg/kg体
Fast,対照 群,(d)FasL,DES20mg/kg体は50μm。

よ びFasLの発現

重投 与 群,(c)重投与群。スケール36

浦 上財 団研 究報 告 書VoL11(2003)に影響 を及 ぼ し,ア ポ トー シス誘導 作用 に対 して抑制作 用を示 して いる可能性 が示唆 され た。
3。4エス トロゲ ン受 容体の発 現

今 回用 いたDESのよう なエス トロ ゲ ン作 用 を有す る内分泌撹 乱物 質の精 巣への 直接的影 響 を解
析す る上で,作 用点 と してその受容 体で あるエ ス
トロゲ ン受容 体 を介 した もので あるか否 かを検 討
図5DES投与 に よ る 精 子形 成 細 胞 で のBcl‑2およ びBaxの(a)Bcl‑2,対照 群,(b)Bcl‑2,DES100ng/kg体(c)Bcl‑2,GElmg/kg体
重+DESlOOng/kg体Bax,対照 群,(e)Bax,DES100ng/kg体

GElmg/kg体発現

重 投 与 群,重 投 与 群,(d)重 投 与 群,(f)Bax,

重+DES!OOng/kg体

重 投 与 群 。 ス ケ ー ル は50μ

す る必要が ある と考 え,エ ス トロゲ ン受容 体の 発
現動態 を免疫 染色 によ り検 討 した。
市 販抗体 を用 い て,ERαところ,ERαm,Baxも すべ て の実 験 群 で精 母細 胞 や精 子細 胞の免 疫染 色 を行 ったは ライデ ィ ッヒ細 胞の 核 に発現 が認 め られ,実 験群 問で発現 パ ター ンに差 は認 め らに発 現が見 られ,そ の殆 どの細 胞で細 胞質 の一部

れ なか っ た(デ ー タ未 掲 載)。 この た め,ERα分 に限局 して存 在 して いた。 しか し,一 部 に細胞が 内分泌撹乱 物質 によ るアポ トーシス誘 導に 関与

全体 が強 陽性 に染 まる細胞 が見 られ,TUNEL陽している可 能性 は低 い と考 え られる。

性 細胞 が多 い 実験 群で こ のBax強加 して いた(図5d,e,f)。
TUNEL染陽性細 胞 も増ミラー切 片を用 いて色 とBaxの 免 疫 染色 を行 い検 討 したと ころ,TUNEL陽性細 胞 とBax強 陽 性細 胞 は

高 い割 合で 一致 して お り(図6),生殖 細胞 の ア

ポ トーシ ス誘 導 にBaxの 発 現変 化が 密接 な 関わERβについ て も解 析 を試み たが,使 用 した 数

種 の市販抗体 で は特 異的 な染色が 得 られ ず,ア ポトーシス誘 導に関与 して いるか否 かは明 らか にできなかっ た。今後 と も検討 を継続 して い く必要 があ る と考 えてい る。
4.おわり にりを持 ってい るこ とが示 唆 された。
以上の結 果 よ り,ア ポ トーシスの 誘導機構 として は高 濃 度 のDESではFas/Fasリ

ガ ン ド系 とBcl‑2/Bax系 が,低 濃 度 の場合 はBcl‑2/Bax系 が働 いてい る可能 性が考 え られた。 また,ゲ ニス テ
イ ンの 同時 投与 に よ り,低 濃 度DESによ るアポ

トー シス誘導作 用が 阻害 された ことか ら,ゲ ニス
テイ ンは何 らか のメ カニ ズ ムに よ りBaxの 発現

食品中 に本来含 まれ る有効成分 に よって内分 泌撹乱 物質の 生体へ の影響 を抑制 で きる可 能性が あるか否か を探 る 目的で本研 究 を遂 行 した。
精 子形 成細 胞死 に及 ぼすDESの影 響 を詳細 に

検 討す るた めに,広 範 囲の 濃度 のDES投与実 験を行った結 果,高 濃 度で の精子形 成細胞 アポ トー
シス誘導作 用に加 えて,環 境ホ ルモ ンと して の作用 濃度 と考 え られ るkg体 重 あ た りngの レベ ル
で もアポ トー シス誘導作 用 を持 つこ とが 示 された。
この低濃度 での アポ トーシス誘 導作用 はゲニ ステ
インの同時 投与 によ り抑 制す るこ とが で き,大 豆

図6TUNEL陽性細胞 とBax陽 性細胞の一致
DES100ng/kg体重投 与群か らの ミラー切片 を用いてTUNEL染色(a)とBaxの免疫組織化学染色(b)を 行 った。両者 の陽性細胞はかな りの割合で一致 していた。

関 連食品 の摂取 によ り,あ る種 の内分泌 撹乱物 質による生殖 能力 の低下 を防止で きる可能 性が示 され た。 また,環 境 ホル モ ンに よる生殖細 胞死誘 導大豆食品による環境ホルモン毒性の予防と緩和の 分子機構 を検 討す ると ともに,ゲ ニステ イ ンによる抑制 効 果の作 用機 序 を解析す るた め,Fas,

37

Nutr.1997:17:353‑381.
2)MorabitoN,CrisafulliA,VergaraCetal..Effectsof
genisteinandhormone‑replacementtherapyonboneloss

FasLおよびBcl‑2,Baxの発現 に関 して免疫 組織化 学 的に検 討 した結果,Fasはmg/kg体
す よ うな高 濃度DES投

重 を越与 の場 合の よ うな劇 的 な精 巣障害 時に,積 極的 に配偶子 を死滅 させ,排 除

inearlypostmenopausalwomen:arandomizeddouble‑
blindplacebo‑controlledstudy.JBoneMinerRes.2002;17(10):1904‑1912.
3)CassidyA,BinghamS,SetchellKD.Biologicaleffectsof
adietofsoyproteinrichinisoflavonesonthemenstrual

す るため の機構 として 働いて いる ことが示唆 された。一 方,Baxは低 濃 度DES投

与 によ る細 胞死

誘 導時 にもア ポ トー シス細胞 に強発現 して いた ことか ら,内 分泌 撹乱物 質に よる生殖細 胞死誘 導 に

cycleofpremenopausalwomen.AmJCIinNutr.1994;60(3):333‑340.
4)DhomG.Epidemiologyofhormone‑dependenttumors.
In:VoightKD,KnabbeC(eds)Endocrine‑Dependent
tumors.RavenPress.NewYork.1992:pp1‑42.

普 遍的 に関与 してい る可能性 が示唆 された。 また,
ゲニ ステ イ ンはBaxのに よ り,DESに発現 に影 響 を与 える こ とよるア ポ トー シス誘 導作 用 に対5)NakamuraY,TsujiS,TonogaiY.Determinationofthe
levelsofisoflavonoidsinsoybeansandsoy‑derivedfoods
andestimationofisoflavonoidsintheJapanesedaily
intake.JAOACInt.2000;83(3):635‑650.

して抑制 効果 を示 している可 能性が示 唆 された。
この ようなエ ス トロ ゲ ン作用 を持つ 内分泌掩 乱物
質 の影響 がエ ス トロ ゲ ン受容体 を介 する ものなのか 否か は重要 な問題で あ るが,今 回の実験 では特6)年

齢 区 分 別 体 位 基 準 値,厚生 統 計 要 覧,厚toukei/youran/datal3/2‑03‑1.htm).
7)KerrJF,WyllieAH,CurrieAR.Apoptosis:abasic
biologicalphenomenonwithwide‑rangingimplicationsin

定 す ることが で きなか った ため今後 の検討 が必要であ る。

tissuekinetics.BrJCancer.1972;26(4):239‑257.
8)KojiT,WangRA.Malegermcelldeathinmousetestes.In:YamadaT,HashimotoY(eds)Apoptosis:itsroleandmechanism.BusinessCenterforAcademic

最後 に,本 研 究 を遂 行す るにあ た り,貴 重な研societiesJapan,Tokyo,1998:pp85‑96.

究 助成 を賜 りま した浦 上食 品 ・食文化 振興 財団お9)KojiT,HishikawaY,AndoH,NakanishiY,Kobayashi

よび関係 各位 に心 より感謝 いた します と共 に,貴N.ExpressionofFasandFasligandinnormaland

財 団の益 々の ご発展 をお祈 り申 し上 げます 。

ischemia‑reperfusiontestes:involvementoftheFas
systemintheinductionofgermcellapoptosisinthe
damagedmousetestis.BiolReprod.2001;64(3):946‑954.

参 考文献1)KurzerMS,XuX.Dietaryphytoestrogens.AnnuRev

生労働 省統 計

表 デ ー タ ベ ー ス シ ス テ ム(http://wwwdbtkmhlw.gojp・「38URAKAMIFOUNDATIONMEMOIRSVol.11(2003)

PreventiveEffectofGenisteinonDiethylstilbestrolInducedSpermatogenic
CellApoptosis

MasashiShin(DepartmentofHistologyandCellBiology,NagasakiUniversityGraduateSchoolofBiomedicalSciences)

Tounderstandtheeffectofdiethylstilbestrol(DES)andgenistein(GE)onmammalianspermatogenesis,weinvestigatedtheeffectofwiderangesofDESonspermatogeniccell
apoptosisinadultmicetestisandwhetherGEpreventstheeffectofDESongermcell
apoptosisornot.MiceweresubcutaneouslyadministeredDESorGEormixtureofGEand
DESatvariousdosesevery5daysandkilled20daysafterthefirstinjection.Thetestes
werefixedin4%paraformaldehydeinPBSandembeddedinparaffin.Thefrequencyof
germcellapoptosiswasdeterminedbyterminaldeoxynucleotidyltransferase‑mediateddUTPnickend‑labeling(TUNEL)stainingandshownasthenumberofTUNEL‑positive
cellsperseminiferoustubuleineachexperimentalgroup.Asaresult,intheDES‑injectedgroups,thenumberofTUNELpositivegermcellswasincreasedandhadtwopeaksat
dosesof100ng/kgbodyweight(bw)and20mg/kgbw.Ontheotherhand,thenumberof
TUNELpositivecellsdidnotincreasein100ng/kgbwofDESwithlor3mg/kgbwofGE
injectedgroupsascomparedtocontrolgroup.ItwassuggestedthatGEmightprevent
germcellapoptosisinducedbylowdoseofDES.Foranalyzingthemolecularmechanismof
germcellapoptosisinducedbyDESandpreventiveeffectbyGE,theexpressionofFas/Fas
ligand(Fast)andBcl‑2/Baxwereexaminedbyimmunohistochemistry.Asaresult,Fas
wasexpressedingermcellsofhighdosesofDESinjectedmicetestes,butitwasnot
expressedingermcellsatcontrolandlowdoseofDESinjectedgroups.Theseresults
suggestthattherolesoftheFas/Fastsystemingermcellapoptosismaybelimitedtothe
testiswhichwasdamagedcriticallybyseveretreatmentsuchashighdosesofDES
injectionandthattheBcl‑2/Baxsystemmaybegenerallyimplicatedintheinductionof
germcellapoptosis.Also,wefoundthatthestrongexpressionofBaxingermcellswas
tightlyassociatedwithTUNELpositivecellinallexperimentalgroups.Sinceestrogenic
compoundsareassumedtoaffectcellsthroughestrogenreceptor(ER),weexaminedtheirexpressionimmunohistochemically.ThoughERawasexpressedinLeydigcellnucleiand
expressionpatterndidnltchangeamongexperimentalgroups,ERαseemedtobeunrelated
totheDESinducedgermcellapoptosis.ThespecificstainingofERQdidnotdetectedinmousetestis,thereforeitisnotclearwhetherER/3isconcernedwithgermcellapoptosis
inducedbyDES.Inthisstudy,itwassuggestedthatintakesoffoodsmadefromsoybean
maypreventthereproductivetoxicityofsomekindanddoseofestrogenicendocrine
disruptors.