寄生虫アニサキスに起因する食物アレルギーに関する基礎的検討

1〈平成14年度〉

寄生虫アニサキスに起因する食物アレルギーに関する基礎的検討
川中正憲

・杉山

広（国立感染症研究所寄生動物部）

1. は じ め に利用する事を試みた。
ところで，海産魚介類の生食といった食習慣が食事をとることでアレルギー症状が引き起こさ我国ほど盛んではないと見られるスペインにおいれる「食物アレルギー」は，近年患者が増加の傾て，1995年以後150例以上ものアニサキス・アレル

向にあり大きな社会問題になってきた。その原因

ギーが報告されている６）。これらの症例報告の特食物としては，卵，牛乳，大豆などの農畜産物が徴は，加熱や冷凍による寄生虫の殺滅処理を施さ有名であるが，我が国では魚介類の消費量が多いれた海産魚の摂食や取り扱い作業によってアニサことから魚介類が卵に次ぐ主要な食物アレルギー

キス・アレルギー症が発生していることである。の原因となっている。しかし，この魚介類アレル

しかも，スペインで報告されている症例には関節ギーは，魚介類そのものがアレルゲンになってい炎，皮膚炎，喘息あるいは結膜炎といったわが国るのではなく，魚介類に寄生するアニサキス幼虫では報告されていない様々な病態のものがある。

を原因とする場合が圧倒的に多いということが最この彼我の相違は，一体何に基づくものなのか，近の研究結果から分かってきた１，２）。

極めて興味ある問題であると思われる。そこで生きたアニサキスが関与するアニサキス症は，我々は，この原因が「アニサキス」そのものの相海産魚介類を食材の中心とする寿司，刺身といっ違にある可能性を想定し，分子生物学的な手法でた日本人の日常食に起因しており，我が国では，スペイン産と日本産との虫体の比較を試みた。

年間に少なくとも2,000〜3,000名のアニサキス幼実施した実験の報告に入る前に，アニサキスと虫による急性胃腸炎患者が出ていると推定されてそれが引き起こす病気について若干の解説を述べいる３）。しかしながら，生きた虫体が直接的にはる。

関与しないアニサキス・アレルギー症の実態に関1. 1 アニサキスとはしては，必ずしも研究が進展していない。粕谷らアニサキスは本来ヒトの寄生虫ではなく，そのはアニサキスのアレルゲンを，加熱によって不活

成虫がクジラなどの海産哺乳類の胃に寄生する回化されるものと耐熱性（100℃，15分）のものに分虫の仲間である。成虫によって生み出された虫卵

けているが４），後者についてはShimakuraらが分は，糞便とともに海中に放出されて孵化幼虫とな子量21,000のタンパク質として精製し，DNAの塩り，オキアミなどの甲殻類に捕食されて第三期幼基配列をも決定したのはごく最近である５）。そこ虫に発育する。オキアミと共に体内に潜む幼虫がで我々は，このアレルゲンにつきマルトース結合小魚に摂食されると，新しい宿主の体内で同じ第性タンパク質とのリコンビナントタンパク質とし三期幼虫のまま留まって寄生を続ける。こうしてて大腸菌で多量に産生させ，診断用の試薬として自然界の「食う・食われる」という関係で，イワ浦上財団研究報告書 Vol.14（2006）

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シなどの小魚からタラやサケなどの大きな魚やイるものは，特異的IgEの上昇と局所の高度な好酸カなどへと伝播してゆく。このときの第三期幼虫球の浸潤を特徴とするアレルギー症を意味していは十分に肉眼で見える大きさ（10−40mm）である。ここで，我が国における典型的な激症型のアり，わが国の近海産の魚とイカを調査したとこ

ニサキス症患者の例を紹介する。彼女は自ら調理ろ，165種以上のものから実際に見出されている。

した酢サバを食べ，２時間後に寒気，四肢の脱力，そして，これらのオキアミ類と魚介類（運搬宿主

咳，呼吸困難，心悸亢進などアナフィラキシー様という）が，幼虫とともに本来の終宿主であるク症状を示した後，全身の蕁麻疹を経験した。そのジラなどに摂食されると，幼虫は発育して胃の中後受診してアニサキス症が疑われ，胃の内視鏡検で成虫となって虫卵を生み出すようになり生活環査が実施されて虫体が摘出され急性腹症は治まっは完結する。ところが図１で示すように，ヒトがた。後日，この患者の血清からは高いレベルのアこれらの海産魚やイカを生食すると，幼虫は通常ニサキスに対する特異的IgEが検出されたが，サとは違った運命をたどることになる。ヒトは本来バなど当夜食された食品に対するIgEは陰性であの終宿主でも運搬宿主でもないので，ヒトの体内った。この我が国での典型的な症例は，アニサキで成虫にまで発育したり，幼虫が長期間発育せず

ス幼虫が胃に侵入することによって，疼痛や悪に生き続けるということはない。生きた幼虫が摂心，嘔吐といった消化器症状を起こすのみなら取されると胃壁や腸壁に迷入し，ときに激しい腹ず，アナフィラキシーや蕁麻疹といった激烈なア痛などを引き起こして死滅することになる。

レルギー症状を引き起こす事を示している。

1. 2 アニサキス症とアニサキス・アレルギー症

他方で，スペインで報告されているアニサキ

ヒトに生きたまま摂取されたアニサキス幼虫

ス・アレルギーの症例には，関節炎，皮膚炎，喘が，胃や腸から組織に侵入した時にアニサキス症

息あるいは結膜炎といったわが国では報告されてが起きる。しかし，その後の経過は必ずしも一様いないものが多くある。まず，1995年にスペイン

ではなく，その症状の強さによって激症型と軽症北部において，ヘイク（タラの一種）を加熱調理型がある。殆ど症状示さない軽症で終るものと極した料理で，アナフィラキシーを繰り返す患者がめて激烈な症状を引き起こすものとの相違は，Ⅰ「アニサキスの耐熱性アレルゲン」
出た７）。また，型アレルギー（即時型過敏症）を伴うものであるに起因すると思われる蕁麻疹や血管性浮腫といっかどうかで説明される。つまり，激症型と呼ばれた症状を起こした多くの患者が見出され８），海産魚の加熱調理や冷凍処理ではアニサキス・アレルギーを防ぐ事が出来ないことが示された９）。更に
は，海産魚との接触によるアニサキス・アレルギーとしての皮膚炎，魚粉工場におけるアニサキス・アレルギーとしての喘息や，冷凍魚を取り扱ったことを原因とする蕁麻疹と喘息の発生などが次々と報告された。他に，結膜炎や関節痛／関節炎などもアニサキス・アレルギーの具体的な症状として示されている。このように，アレルギーと図１

アニサキスの生活環しての病態が異なるように見える日本とスペイン

寄生虫アニサキスに起因する食物アレルギーに関する基礎的検討

3の「アニサキス」は，本当に同一のものなのか，2. 3 リコンビナント・タンパク質の作製という疑問がわいてくる。

アニサキスの21kDaアレルゲン（Shimakura .）を大腸菌で産生した。先ずアニサキス虫体か2. 実 験 方 法

らMicro-FastTrack（インビトロジェン）を用い
2. 1 アニサキス幼虫てPoly（A）＋RNAを 抽 出 し，One Step RNA PCR

アニサキス幼虫を入手するために，その宿主でKit（宝酒造）でPCR産物を得た。プライマーには，あることが知られていて，かつ日本の市場で，欧アニサキスの21kDaアレルゲンの配列（嶋倉ら，米産のものが入手可能な魚種としてアンコウを選2004）を参照して作製した21AlgFEco（フォワー択しその胃から虫体を採取した。日本産，スペイド，5 - TTGA GAATTC TCAACAATGGCTTCン産と米国産（大西洋）の３つの産地由来のアン

AATGC-3 ）お よ び21AlgRXba（リ バ ー ス，5コウの内臓からアニサキス虫体が採取された。採CCG TCTAGA TTTGGCATCTTCAGGG-3 ）を取虫体はその形態を光学顕微鏡で詳細に観察し，用いた。これらプライマーは，その配列を少し改いずれもアニサキスⅠ型（広義の

変 さ せ て，EcoRI（GAATTC）あ る い はXbaI）の特徴を持つことを確認した。

（TCTAGA）のサイトを夫々挿入し，プラスミ

2. 2 遺伝子解析

ド・ベクター（pMal-c2，NEB）への強制クロー

アニサキス虫体からDNAを抽出し， PCR法でニングが可能となるように工夫した。次に，遺伝リボゾームDNAのITS領域を増幅させ，塩基配列子断片が挿入されたベクターを大腸菌（JB109）を 決 定 し た。ま ず ア ニ サ キ ス 虫 体 か らDNeasyにトランスフェクションさせ，IPTGでインダク

Tissue Kit（キアゲン）を用いてDNAを抽出し，ションをかけて，マルトース結合性蛋白とのリコPCR用のテンプレートとした。ITS-1領域の増幅

ンビナントの形で21kDaのアレルゲンを産生しにはNC5（フォワード，5 -GTAGGTGAACCTGCた。更にリコンビナント蛋白をFactorXaで切断

GGAAGGATCATT-3 ）およびNC13R（リバース，し，アニサキスの21kDaアレルゲンだけをクロマ

5 -GCTGCGTTCTTCATCGAT-3 ）を，ITS-2領トグラフイーで精製することにより回収した。

域の増幅にはNC13（フォワード，5 -ATCGATGAAGAACGCAGC-3 ）およびNC2（リバース，5 -2. 4 ウエスタン・ブロット（WB）によるアレ
ルギー患者血清との反応

TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3 ）を各々用い，ウエスタン・ブロット法は常法に準拠して実施

DNAポリメラーゼにはZ-taq（宝酒造）を選んだ。

した。得られたリコンビナント・タンパク質を２得られた増幅産物をアガロースゲル電気泳動し，−ME存在下で煮沸還元し，SDS存在下，25 mAのエチジウムブロマイド染色した。その後にゲルか条件で12.5％ポリアクリルアミド中を泳動させらターゲットとなるバンドを切出して精製し，た。泳動終了後，ニトロセルロース膜に40 mAでBigDye Terminator Cycle Sequencing Reaction

90分転写し，得られた転写膜を３mm幅のスリッKit（アプライド・バイオ・システムズ）を用いトとして抗原抗体反応に用いた。反応条件は，て，前述の各プライマーとシークエンス反応させ各々 45分間の被検血清との一次反応，ならびに二た。配列はABI自動シークエンサー・モデル310

次 反 応（抗 ヒ トIgG［H＋L］HRP Conjugate（アプライド・バイオ・システムズ）で解読し，［Cappel］或 い は 抗 ヒ トIgE HRP Conjugate

主にFastaを用いて解析した。

［Biosource］）の後，DABで５分間発色を行った。

浦上財団研究報告書 Vol.14（2006）

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3. 2 アレルゲン遺伝子の配列に基づく種の比3. 結果と考察

較・解析の試み
3. 1 アニサキス・アレルゲンの発現と性状解析・診断への応用

アニサキス・アレルギーの病態像がスペインとわが国で大きく異なるのは，両国産のアニサキス

リコンビナント・タンパク質から調整されるア
レルゲンは，アニサキス・アレルギー患者の血清（ ）の産生アレルゲンが異なることによる可能性が考えられる。

診断への応用が期待されることから，精製アレル

そこで，まず「21kDaのアレルゲン」遺伝子にゲンの大量生産を試みた。既に何種類かのタンパ着目し，その遺伝子配列を解読して比較検討するク質がアレルゲンの候補として報告されている事にした。日本産の虫体からは３クローン（鎖長が，本研究では，日本産の からクロー1,598〜1,609bp）を得てそれらのシークエンスをニングされた「21kDaのアレルゲン」（いわゆる解読したが，いずれも相互に僅かに違う配列を持Ani s 1 famiy, Shimakura ., 2004） をターゲつ事が確認された。さらにスペイン産の虫体からットとした。

１クローン（1,584bp），米国産の虫体からも１ク５）日本産虫体が発現するアレルゲンを，マルトーローン（1,599bp）が得られたので，これらを日本ス結合性タンパク質とのリコンビナントの形で，産虫体由来の３クローンの配列と比較した。その大腸菌で産生させ，更にリコンビナント・タンパ

結果，日本産とスペイン産との虫体由来のクローク質からアレルゲンを切り出した後に精製し，診ンの相同性は95.9〜96.7％，日本産と米国産とは断用「21kDaのアレルゲン」とした。

96.1〜97.3％ と高い値を示した。しかし，スペイアレルギー患者血清13検体を用いて，WB法により「21kDaのアレルゲン」との反応性を見た。そン産と米国産の相同性は98.0％となり，日本産との相同性よりもさらに高い値を示した。の結果，IgEとIgGが共にアニサキス・アレルゲン

以上の解析結果から，日本，スペイン，米国のと反応する血清が１検体，IgEのみが反応する血３つの産地由来の虫体から得られた「21kDaのア清が１検体，いずれにも反応しない血清が11検体

レルゲン」の遺伝子配列は，産地ごとの相同性はであった。この陽性パターンを，図２に示す。

高いものの，各々わずかに異なる事が示された。
この違いが，タンパク質としてのアレルゲンに反映されることが示されれば，アニサキス・アレルギーの病態像の違いを解明する糸口となりうると考え，この点を明らかにする為に，メッセンジャー RNA（mRNA）を出発材料として以下の検討を進めた。
3. 3 配列に基づくアニサキス・アレルゲンの比較・解析
保存条件が悪くスペイン産虫体からのRNA抽出が困難であったため，スペイン産虫体の代替と図２ リコンビナントアレルゲンを用いたWB反応
症例Ａ：1,4 IgGとIgEが陽性反応
症例Ｂ：2,5 IgEのみが陽性
症例Ｃ：3,6 IgGとIgEが陰性

して，アレルゲン遺伝子のゲノム配列が最も近似する米国産虫体を用いて，以下の検討を進めた。

寄生虫アニサキスに起因する食物アレルギーに関する基礎的検討

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日 本 産 と 米 国 産 の 虫 体 か らmRNAを 調 整 し，し，幼虫では形態学的な特徴に乏しく別種として「21kDaのアレルゲン」の為のプライマー・セッの区分ができないものであっても，遺伝子配列のトを用いて，RT-PCRにより増幅産物を得た。こ相違から分別される同胞種（sibling species）の関の産物をベクターにクローニングし，配列を解読係にある可能性も考えられる。そこで各グループした。の虫体を出発材料とし，リボソームDNAのITS-1

その結果，日本産虫体から得られた４クローン領域とITS-2領域の配列を解読・比較した。この２（517bp）は，３クローンが同一配列であり，残つの領域は，寄生蠕虫を遺伝子分類する際に，しり１クローンは１塩基だけが異なることを確認しばしば用いられている重要なマーカー配列であた。これら４クローンについて，塩基配列をアミる。

ノ酸に置換して比較しところ，いずれも172アミ

これらの領域をダイレクト・シーケンシングにノ酸残基から成る同一のタンパク質をコードするより解読した結果，ITS-2領域（465bp）の配列は，事が分かった。

３つのグループで完全に一致した。一方，ITS-1

米国産虫体からは３クローン（517bp）が得ら領域（421bp）は，日本産以外の２つのグループれ，このうち１クローンが日本産虫体由来のクロで完全に一致し，日本産のみが他のグループと２ーンと同一の塩基配列を示し，コードするタンパ塩基異なった。このITS-1領域の配列に認められク質のアミノ酸配列も同一であった。以上の結果た塩基の相違を，当初我々は種内の変異と捉えてから，日本産虫体と米国産虫体とが，同一のアレいたが，その後，この多型の内の一箇所が，制限ルゲンを発現している事が確認された。

酵素（I）による切断部位に相当する事が判

更に，日本産虫体に由来する配列を用いて，明した。D Amelio（2000）ら10） によれば，この「21kDaア レ ル ゲ ン」遺 伝 子 の ゲ ノ ム 配 列 と制 限 酵 素 に よ る 切 断 の 可 否 に よ り，従 来mRNAの配列との比較を行った。その結果，５個
と一括されていた虫体を「




」とのエクソンがスプライシングを受けてメッセージ「狭義の」とに分類しうるとされておとなり，タンパク質発現する事が示された。

り，その説に従えば，今回我々が解析した日本産以上の結果から，産地の異なるアニサキスにお虫体は「狭義の
 」に相当し，他のグルーいては「21kDaアレルゲン」遺伝子の配列にわずプは総てと分類された。このD Amelioかな違いが認められたものの，コードするタンパによって提唱されている種分類は，未だ広く受けク質は同一であることが確認された。したがって入れられている訳ではないが，今回の結果から，「21kDaアレルゲン」遺伝子の相違は，アニサキ日本とスペインでの病態像の差異を，種差を以っス・アレルギーの病態の相違とは関連しないことて説明できる可能性が考えられた。今後のアニサが示された。

キスの分類に関する研究の進展が期待される。

3. 4 リボソームDNAの配列に基づく種の比

4. まとめ較・解析
日本産，スペイン産，米国産（大西洋）の３つ

アニサキス・アレルギーの診断のためにリコンの産地のアンコウ由来のアニサキスは，何れも
 ビナント・タンパク質を作製し，アレルギー患者

complexと同定され，形態学的な手技によ血清との反応性を調べた結果，IgEとIgGが共にっては別種であることを証明し得なかった。しか反応するもの，IgEだけが反応するもの，反応が6

浦上財団研究報告書 Vol.14（2006）

図３ 日本産（AsJ）とスペイン産（AsS）のITS1領域塩基配列の比較確認し難いものに分かれた。今後，反応感度を増は否定できないと考えられた。

強すると共に，このような差を利用することでアニサキス・アレルギー症の解析を進めることが出謝来ると思われる。

本研究を遂行するにあたり，研究助成金を賜り

辞次に，アニサキス・アレルギーの病態の相違をました浦上食品・食文化振興財団並びに関係各位探るために，日本産，米国産，（そして恐らくスペに心から感謝を申し上げます。それと共に，貴財イン産も）のアニサキスに共通のアミノ酸配列を団の将来にわたる益々のご発展をお祈り申し上げ持つ「21kDaのアレルゲン」について配列を確認ます。

したところ，遺伝子配列にはわずかな相違が認められたものの，コードされるタンパク質は同一のものであることが確認され，「21kDaのアレルゲン」に関しては病態の相違には関与していない可能性が示唆された。
新たに提唱されている  の分類は，ITS-1領域の制限酵素（I）による切断の可否によって従来  と一括されていた虫体を文献１） Kasuya S, Hamano H, Izumi S: Mackerel-inducedurticaria and Anisakis. Lancet 335（8690）,665, 1990.
２） 木村聡，寄生虫アニサキスとアレルギー，臨床検査

44，443-445，2000．
３） 川中正憲，荒木潤，アニサキス症―発生状況と予防―，

食品衛生研究 56，17-22，2006．
４） 粕谷志郎，古賀香理，Anisakis関連疾患における特異IgE測定の意義，アレルギー，41，106-110，1992．

２種に分類するものである。これによれば今回分

５） Shimakura K, Miura H, Ikeda K, Ishizaki S, Nagashima

離した日本産の虫体とスペイン産・米国産の虫体

Y, Shirai T, Kasuya S, Shiomi K. Purification and molecularは，別種（タイプ）である可能性が示唆され，そcloning of a major allergen from 





. Mol

Biochem Parasitol. May; 135（1）:69-75. 2004.の種の違いよる「21kDaのアレルゲン」以外のアレルゲンが病態の違いとなっている更なる可能性

６） Audicana MT, Ansotegui IJ, Corres, LE, Kennedy MW:: dangerous- dead and alive? Trend in寄生虫アニサキスに起因する食物アレルギーに関する基礎的検討

7９） Audicana L, Audicana MT, Fernandez de Corres L,Parasitol. 18, 20-25, 2002.
７） Audicana MT, Fernandez de Corres L, Munoz D,Kennedy MW: Cooking and freezing may not protect

Fernandez E, Navarro JA, del Pozo MD.: Recurrent

against allergenic reactions to ingested 






anaphylaxis caused by 








antigens in humans. Vet Rec. 140（9）: 235. 1997.

parasitizing fish J

Allergy Clin Immunol. 96（4）:558-60. 1995.

10） D Amelio S, Mathiopoulos KD, Santos CP, Pugachev

８） Fernandez de Corres L, Audicana M, Del Pozo MD,ON, Webb SO, Picanco M, Paggi L. Genetic markers inMunoz D, Fernandez E, Navarro JA, Garcia M, Diez J.:

ribosomal DNA for the identification of members of the







induces not only anisakiasis: report on 28

genus Anisakis（Nematoda: ascaridoidea）defined bycases of allergy caused by this nematode. Investig Allergol

polymerase-chain- reaction-based restriction fragment

Clin Immunol. 6（5）:315-9. 1996.

length polymorphism. Int J Parasitol. 30（2）:223-6. 2000.

URAKAMI FOUNDATION MEMOIRS Vol.14（2006）

8Food allergy induced by the parasite Anisakis
Masanori Kawanaka and Hiromu Sugiyama（Department of Parasitology, National Institute of Infectious Diseases）

There has recently been an increase in patients with food allergy, which is becoming amajor social problem worldwide. Eggs, milk, and soybeans are the major causes of foodallergy. In Japan, fish is the second most important cause of allergy next to eggs because
consumption of fish is high. However, recent studies have clarified that most cases of foodallergy caused by fish are actually caused by Anisakis larvae parasitizing fish, not by fish
itself. In this study, we constructed a serodiagnostic method for accurate differentiation oftrue fish allergy and Anisakis allergy, and investigated background factors of the allergy
development.
1. Establishment of diagnostic method of Anisakis allergy
1） Sera of patients with fish allergy have been obtained, expecting that sera of patientswith Anisakis allergy were included.
2） Primers have been designed based on the Anisakis gene sequences（21kDa allergen by.） registered in the database, and RNA prepared from Anisakis larvae wereShimakura 
amplified by RT-PCR. The PCR products were inserted into vectors, and expressed asrecombinant proteins.
3） Western Blot（WB）have been performed using sera from patients with Anisakisallergy, and a recombinant allergen appropriate for diagnosis of Anisakis allergy wereselected. Using this recombinant allergen, a highly sensitive and specific WB method will beestablished.
2. Investigation of background factors of allergy development.
1） Many cases of Anisakis allergy have reported from Spain. While the main symptom isanaphylaxis and urticaria from Japan, bronchial asthma, arthritis, conjunctivitis, dermatitis
and/or conjunctivitis develop from Spain.
2） Anisakis larvae obtained from Spain, and the morphology and gene sequences havebeen extensively investigated to identify the species and compare the findings with Anisakis
larvae in Japan.