Glycative Stress Research
Online edition : ISSN 2188-3610
Print edition : ISSN 2188-3602
Received : October 11, 2023
Accepted : November 2, 2023
Published online : December 31, 2023
doi:10.24659/gsr.10.4_171

Original article

Protein cross-linking inhibition effects induced by glycative stress of
black galangal, Kaempferia parviflora Wall. Ex. Baker (Zingiberaceae)
Masayuki Yagi, Kayoko Inoue, Yasuo Sato, Chieko Sakiyama, Yoshikazu Yonei
1) Anti-Aging Medical Research Center and Glycative Stress Research Center,
Graduate School of Life and Medical Sciences, Doshisha University, Kyoto, Japan.
2) Rene Co. Ltd., Osaka, Japan
Glycative Stress Research 2023; 10 (4): 171-176(c) Society for Glycative Stress Research（原著論文：日本語翻訳版）

黒ガリンガルによる糖化蛋白の架橋抑制作用
八木雅之 1) 、井上佳如子 2) 、佐藤恭男 2) 、﨑山智恵子 1) 、米井嘉一 1)
1) 同志社大学大学院生命医科学研究科アンチエイジングリサーチセンター／糖化ストレス研究センター
2) 株式会社レーネ

抄録
糖化ストレスによる終末糖化産物（advanced glycation endproducts; AGEs）の生体内蓄積は、蛋白の架橋形

成による組織硬化や生理的機能低下につながり、老化や生活習慣病の進展要因の一つとなる。糖化ストレスの抑制には食後高血糖の抑制、糖化反応の抑制、AGEs の分解排泄などがある。蛍光性 AGEs には架橋性と非架橋性の AGEs が 含まれ、蛍光性 AGEs 生成抑制作用は、さまざまな植物素材において報告されている。
ショウガ科植物である黒ガリンガル（ Kaempferia parviflora Wall. Ex. Baker; KP ）もその一 つで、この作用には親水性成分やポリメトキシフラボノイド（ polymethoxy flavonoid; PMF ）が 関与している。一方糖化蛋白の架橋構造にはいくつかの種類があり、α ジケトン（α diketone）もその一 つ である。α ジケトンの切断作用
は AGEs 架橋切断作用と呼ばれ、フェニルプロパンジオン（ 1-phenyl-1, 2-propanedione; PPD ）が 架橋モデ

ル物質として使用され、遊離安息香酸の生成率から AGEs 架橋切断率が評価されている。KP の根茎も AGEs

架橋切断作用が 報告されている。これまで糖化による蛋白架橋に対する AGEs 生成抑制作用、AGEs 架橋切断作用の影響を検証した報告は僅かである。本研究では蛍光性 AGEs 生成抑制作用とAGEs 架橋切断作用を有する KP 抽出液の糖化蛋白の架橋形成抑制作用（ inhibition of glycated-protein cross-linking; IGPC ）と糖化蛋白架橋切断作用（ cleavage of glycated-protein cross-linking; CGPC）を検証した。

連絡先： 客員教授 八木雅之
同志社大学大学院生命医科学研究科アンチエイジングリサーチセンター／
糖化ストレス研究センター〒 610 - 0394 京都府京田辺市多々羅都谷 1- 3
TEL & FAX：0774 -65-6394 e -mail：myagi@mail.doshisha.ac.jp
共著者：井上佳如子 tmkayoko@miracle.ocn.ne.jp; 佐藤恭男 ceo.gran@gmail.com;
﨑山智恵子 csakiyam@mail.doshisha.ac.jp; 米井嘉一 yyonei@mail.doshisha.ac.jp（ 1 ）Glycative Stress Research 2023; 10 (4): 171-176
本論文を引用する際はこちらを引用してください。
(c) Society for Glycative Stress ResearchGlycative Stress Research

KEY WORDS : AGEs 生成抑制、AGEs 架橋切断、糖化蛋白架橋形成抑制、糖化蛋白架橋切断

はじめに

方法

糖 化 ストレスによる終末糖化産物（ advanced glycation

endproducts; AGEs）の生体内蓄積は蛋白の架橋形成による組織硬化や生理的機能低下に繋がり、老化や生活習慣病の進展要因のひとつとなる。体の糖化ストレス抑制は抗糖化や糖化ケアと呼ばれ、食後高血糖の抑制、糖化反応の抑制、AGEs の分解排泄などがある1, 2)。糖化反応抑制作用の指標の一つである蛍光性 AGEs 生成抑制作用が野菜やハーブなどさまざまな植物素材において既に報告されている 3, 4)。
この作用はショウガ 科植物（ Zingiberaceae）の一 種 である
黒ガリンガル（black galangal ; Kaempferia parviflora Wall.

Ex. Baker; KP）にも認められ 5, 6)、ポリメトキシフラボ
ノイド（ polymethoxy flavonoid; PMF ）や親水性成分の関与 が 報 告されて いる 7) 。蛍光 性 AGEs には 非架橋性のア
ルグピリミジン（argpyrimidine）、架 橋 性 の ベ スパ リジン（vesperlysine）、クロスリン（crossline）など 様々な物質がある 8) 。

AGE s 分解作用の指 標の一つとして 糖化蛋白の架橋構造の一種である α ジケトンの切断作用が評価される 9, 10, 11)。
この作用は AGEs 架橋切断作用と呼ばれる。AGEs 架橋切断作用の評価にはフェニルプロパンジオン（1- phenyl-1, 2 propanedione ; PPD）が 架橋モデル物質として用いられ、被験物質によって α ジケトンが 切断されて遊離する安息香酸の生成率から AGEs 架橋切断率が算出される。
AGEs 架橋切断作用を有する物質には N - フェナシルチ

ア ゾ リ ウ ム ブ ロ ミド（ N - phenacylthiazolium bromide ;P TB）9)、ロスマリン酸（rosmarinic acid）12)、エラジタンニ
ン類（ellagitannin ） 、フラボノイド（ flavonoid ） が 報 告
10)

11)

されている。KPの根茎にもこの 作用が 報告されている 。
13)1 ）試 薬使用した試薬は以下のメーカーから購入して使用した。

N- フェナシルチアゾリウムブロミド（ N- phenacylthiazolium
bromide; PTB）は Sigma-Aldrich Japan（東京都目黒区）。リゾ
チーム塩酸塩（卵白由来）、アミノグアニジン（aminoguanidinehydrochloride ; AG）は富 士フィルム和光 純 薬工業（大 阪市 ）。 4 - 20 % Mini-Protean TGX Precast gel は Bio-Rad( Hercules, California, USA ）。その他の試薬は特級のものを富士フィルム和光純薬工業またはナカライテスク（京都市）から購入して使用した。

2 ）Kaempferia parviflora（ KP）の根茎試料と抽出条件

試 料 には日本国内でサプリメント製品として販売されている K P 根茎の乾燥粉末を使用した。KP 粉末は株式会

社レーネから提供を受 けた。乾燥粉末試料は 40 mL の精
製水と粉末 2 g を混合して抽出した。熱水抽出条件は混合液を 80 ℃ に設定したウォーターバス中で 60 分間インキュ
ベ ートとした。得られた抽出液は 2, 500 rpm（ 800 × g ）で10 分間遠心分離した後、さらに濾過して得られた溶液をKP 抽出液（ Kaempferia parviflora extract; KPE ）として検証に使用した。KP E の固形分濃度は、5 mL をアルミトレ
イに入れた 後、120 ℃ で 2 時間乾燥蒸発させた後、蒸発残分を秤量して算出した。

3 ）糖化蛋白架橋形成抑制作用（ inhibition ofglycated - protein cross-linking；IGPC ）一方、AGEs 生成抑制作用を有する成分の蛋白架橋形成

糖化蛋白架橋形成抑制作用は既報 16, 17) を参考に、リゾ
チーム - グルコース糖化蛋白架橋モデルを使用した。反応液

化蛋白の架橋切断作用に対する影 響を検証した報告は僅

mol/L リン 酸 緩 衝液（ pH 7.4 ）中に試 料 溶 液を 1/ 10 量添抑制作用、並びに AGEs 架 橋切断 作用を有する成 分 の糖かである

14, 15)。

本研究では蛍光性 AGEs 生成抑制作用、AGEs 架橋切断作用を有する KP が 糖化による蛋白の架橋形成に及ぼす影響を評 価することを目的に、糖化蛋白架橋形成抑制作用（ inhibition of glycated-protein cross-linking；IGPC ）、糖化蛋白架橋切断作用（ cleavage of glycated-protein cross-linking；CGPC ）を検証した。

は 5 mg/mL リゾチームと 0. 5 mol/L グルコースを含む 0.1

加して作成した。反応液はリン酸緩衝液、リゾチーム溶液、

グルコース溶液、試 料 溶 液の全てを添加した溶液； (A)、A のグルコース溶液の代わりに精製水を添加した溶液；(B)、A の 試 料 溶 液の代わりに試料溶解液を添加した溶液； (C )、C のグルコース溶液の代わりに精製水を添加した溶液；( D) を作成し、60 ℃ で 40 時間インキュベ ートした。反応終了後の反応液は 3kD a の限外 ろ過膜（Amicon（ 2 ）黒ガリンガルの糖化架橋抑制作用

Ultra - 0. 5 mL centrifugal filters Ultracel-3K ; Merck,
Darmstadt, Deutschland ）を用いて遠心ろ過し、低分子物質を除去した。その後、反応液は 4 - 20 % ポリアクリルアミド
ゲル 電 気 泳動（ polyacrylamide gel electrophoresis: SDSPAGE ）に供した。泳動後のゲルは CBB Stain One（ナカライテスク、京都市中京区）で染色し、泳動像を Pharos FX
System（ Bio-Rad ）で 画 像 化 後、 リ ゾ チ ームの 単 量 体（monomer ）（12.4 kDA）、 二量体（dimer）（25.8 kDa ）、三量体（ trimer ）（40.5 kDa）のバンドの強度を ImageJ（ NIH,
Maryland, USA）で 解 析した。糖化蛋白架橋形成抑制作用のポジティブコントロール 物質は AG を使用した。
蛋白架橋形成抑制率は既報 14) と同様に、以下の式に基づいて算出した。

蛋白架橋形成抑制率 (%) = {1 − (A − B) / (C − D) } × 100

A - D ; 各反応液 SDS-PAGE ゲル染色像 のリゾチーム
二量体または三量体のバンド 強度4 ）糖化蛋白架橋切断作用（ cleavage of glycated糖化蛋白架橋切断作用は既報

測定値の比較にはテューキーの多重比較検定を用いた。統計解析結果は危険率 5 % 未満を有意とした。

結果
糖化蛋白架橋形成抑制作用（ IGPC ）IGPC は二量体、三量体の形成抑制において KPE（ 0.097～ 0.87 mg/mL）、 AG（ 0.10 ～ 1.00 mg/mL ）ともに濃度
依 存 性 が 認 め ら れ た（ Table 1 ）。 IGPC の IC 50 は AG がKPE よりも二量体で 3.7 倍 小さく、三量体 で 30.9 倍 小さ
く、AG が 強い作用を示した。三量体と二量体の IGPC を比較するとKPE 、AG ともに二量体と比べて三量体の形成抑制に強い作用を示した。SDS - PAGE の泳動像は KPE 、
AG ともに、グルコースを添加して反応させた試料の単量体のバンドが、グルコース無添加の試料と比べ てバンド サイ

protein cross-linking；CGPC ）14)

IC 50 ; mg/mL ）あるいは 50 % 効果濃度 （ 50 % effective
concentration; EC50 ; mg/mL ）を算出した 19, 20)。IC 50 ある
いは EC 50 は値が小さいほど作用が強いことを示している。

を参考に糖化リゾチーム

ズが 陰極側にやや大きかった（ Fig. 1 ）。

（ glycated lysozyme）を作成し、試 料によるリゾチーム二量糖化蛋白架橋切断作用（CGPC ）チームと 0.2 mol/L グルコースを含む 0.1 mol/L リン酸緩衝に おいて 濃度依存性が 認 められた（ Table 2）。 CGPC の体の分解率を測定した。糖化リゾ チームは 1 mg/mL リゾ液（pH 7.4）を 37 ℃ で反応させた後、限外ろ過（3 kDa ）により低分子物質を除去して作成した。反応液は 0. 5 mg/mL
糖化リゾチームを含む 0. 05 mmol/L リン酸緩衝液中に試料溶液を 1/ 2 量添加した溶液 （; A ）、A の試料溶液の代わりに試料溶解液を添加した溶液 ;（ B ）を作成した。反応液は

37 ℃ でインキュベ ート後、反応液を限外ろ過 膜（ 3 kDa）

CGPCはKPE（ 0.1～ 1 mg/mL）、PTB（1. 4 ～ 5.7 mg/mL）

EC50 は KPE（1.65 mg/mL）が P TB（ 2.65 mg/mL）よりも1.6 倍 小さく、強い作用を示した。Ref（水添加）の二量体
形 成 率 は 10. 3 ～ 11. 9 % で、三 量 体の形 成は認 められな
か った（ Fig. 2）。

で遠 心 ろ過し、低分子物質を除去した。反応液を前項と考察画像化した後、反応液中リゾ チーム単量体と二量体のバン

KPE の IGPC

同様の方法で SDS-PAGE に供し、泳動後のゲルを染色し、ド強度を解析した。糖化蛋白架橋切断作用のポジティブコ
ントロール物質は P TB を使用した。

蛋白架橋切断率は既報 18) と同様に以下の式に基づいて算出した 。
糖化蛋白架橋切断率 (%) = [1 − {( D S / MS) / (D R / M R)}] × 100

S ; 試 料添加時のリゾチ ームのバンド 強度
R ; 試料溶解液のみを添 加した 時 のリゾ チームのKP E には AGEs（蛍光性 AGEs、ペントシジン、CML）、
糖化反応中間体（ 3DG 、GO、MGO）生成抑制作用が 認
められている 13)。これらの作用には KPE の親水性成分が関与している 7)。架橋性を有するAGEs には argpyrimidine、
vesperlysine、crossline などがある 8)。これらは蛍光性 AGEs
（励起波長 370 nm、蛍光波長 440 nm ）として測定される。
また ペントシジンは蛍光 性（励起波長 335 nm、蛍光波長385 nm）と架 橋 性を有する 21)。さらに 3DG、GO、MGOなどの糖化反応中間体は アル デヒドの 一 種 であり、架橋性 AGEs の生成に関与する 22, 23)。これらのことから KP のバ ンド 強度

M ; リゾ チームの単量体 バ ンド
D ; リゾ チームの 二量体 バ ンド

熱水抽出液である KPE の IGPC は KPE の AGEs と糖化反応中間体の生成抑制作用が関与していると推定された。糖化による蛋白架橋形成はジスルフィド結合やリジルオキシ

ダーゼ（ lysyl oxidase）による生理的な架橋形成（善玉架

統計解析橋）と異なり、無秩序な架橋を形成することから悪玉架橋

測定値は平均値 ± 標準偏差で示した。また試料 3 濃度の作用結果から50 % 阻害濃度（50 % inhibition concentration;（pathological cross-linking）と言われる。皮膚や骨コラー
ゲンの糖化による悪玉架橋の形成は、皮膚弾力の低下、骨質の低下による骨折の要因と考えられている 24, 25)。KPE（ 3 ）Glycative Stress Research

Table 1. Inhibitory effects of KPE and AG on cross-linking formation in the lysozyme-glucose reaction model.
SampleInhibition ratio on cross-linking formation (%)

Conc.
(mg/mL)

IC50 (mg/mL)

Dimer

Trimer

0.097- 3. 4 ± 4.7

0.29

9.7 ± 3. 1

0.87

45.6 ± 3. 9

76. 8 ± 1. 6

0.10

30.1 ± 4.3

72. 9 ± 3. 8

0.30

49.2 ± 3.6

1.00

65.9 ± 1.6

KPE

AG

IC50 (mg/mL)- 31.7 ± 10. 8

*

*

1. 26

21. 8 ± 0.6

1)88.7 ± 2. 8

0.34

*

0. 51

*

0. 011

98. 1 ± 3. 3

1) Extrapolated value, mean ± SD, n = 3; * p < 0.05, Tukey's multiple comparison test; KPE, incubation with Kaempferia parviflora
rhizome hot water extract; AG, incubation with aminoguanidine; IC 50, 50 % inhibition concentration; SD, standard deviation.

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Fig. 1.D,<(&'(&)*+,#,-./0&%11%2-3&.1&456&"*7&89&.*&2/.33:$,*;,*<&1./="-,.*&,*&-+%&
Inhibitory effects of KPE and AG on cross-linking formation in the lysozyme-glucose reaction model.

5 mg/mL lysozyme were incubated at 60 ℃ for 40 hours. SDS-PAGE was conducted using 4 - 20 % acrylamide gels. M, molecular$03.>0=%:<$?2.3%&/%"2-,.*&=.7%$(
weight markers; Ref, incubation with water; KPE, incubation with Kaempferia parviflora rhizome hot water extract; AG, incubation<#1MQ1R#+?A*J?1,#G,',#B2C/F(&,-#(&#S:T#I*'#U:#H*/'A;#343VEKL$#G(A#C*2-/C&,-#
with aminoguanidine; (+), incubation with 0.5 mol/L glucose; (−), incubation without glucose.
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G(&,'7#DE$0#B2C/F(&B*2#GB&H#!"#$%&#'(")%"'*(&+,'" 'HBJ*1,#H*&#G(&,'#,%&'(C&7#KL0#
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GB&H*/&#M+/C*A,;
Table 2. Cleavage effects of KPE and PTB on lysozyme dimer in the glycated lysozyme.

Sample

KPE

PTB

Conc.
(mg/mL)

Cleavage(%)

0.1

22.6 ± 7.9

0.3

34. 5 ± 6.7

1

4 4.8 ± 4. 0

1.4

42.8 ± 6. 5

2.8

51.1 ± 9. 1

5.7

58. 4 ± 5. 6EC50(mg/mL)*

1. 65 1)*

2.65

1) Extrapolated value, mean ± SD, n = 3, * p < 0.05, Tukey's multiple comparison test; KPE, incubation with
Kaempferia parviflora rhizome hot water extract; P TB, incubation with N-phenacylthiazolium bromide;
EC 50, 50 % effective concentration; SD, standard deviation.

（ 4 ）

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黒ガリンガルの糖化架橋抑制作用!"# $%&'%()-./01213 1245">? $%&'%()

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Fig. 2. Cleavage effects of KPE and PTB on lysozyme dimer in the glycated lysozyme.

0.5 mg/mL glycated lysozyme were incubated at 37 ℃ for 16 hours. SDS-PAGE was conducted using 4 - 20 % acrylamide gels.
D,<(&@(&A$%"B"<%&%11%2-3&.1&456&"*7&5!C&.*&$03.>0=%&7,=%/&,*&-+%&<$02"-%7&$03.>0=%(M, molecular weight markers; Ref, incubation with water; KPE, incubation with Kaempferia parviflora rhizome hot water extract;!#1MQ1R#M+?C(&,-#+?A*J?1,#G,',#B2C/F(&,-#(&#6^T#I*'#!S#H*/'A;#343VEKL$#G(A#PTB, incubation with N-phenacylthiazolium bromide.
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B2C/F(&B*2#GB&H#<11*+QR#`V)H,2(C?+&HB(J*+B/1 F'*1B-,;の IGP C は蛋白の架橋形成による硬化や機能低下を防ぎ、身体の老化抑制に機能する可能性がある。

IGPC の SDS-PAGE 像において単量体のバンド 幅はグ
ルコース添加（ + ）試料がグルコース無添加（ − ）と比べて陰極側に大きかった（ Fig. 1 ）。アルデヒドで AGEs 化した

BSAの native-PAGE 泳動像は陽局側にシフトし、その要因

CGPC は糖化によって架橋した蛋白の修復的作用に関与する可能性がある。一方、CGPC が 作用する架橋構造は明確になっていない。特に蛋白の生理的架橋に対する影響は検証が必要である。

として、蛋白表面の荷電が相対的に陰性に変化したことが結語

中和していること、バンドのシフトが 陰極側であったこと

KPE が 糖化による蛋白の架橋形成に及ぼす影響を検証した結果、IGPC と CGP C が 共に認められた。IGP C では
KPE の架橋性 AGEs およびアルデヒド 生成抑制作用の関与が推定された。CGPC では KPE の α ジケトン切断作用とともに、α ジケトン以外の架橋切断作用も関与している可能性が推定された。KPE は糖化による蛋白架橋形成を抑推定されている26)。SDS-PAGE では SDS が 蛋白の荷電をから、グルコース（ + ）の単量体バンドの違いは蛋白の荷電変化と異なる要 因が 推定された。リゾ チームとグルコースの糖化反応では架橋性 AGEs だけでなく、CM L など非架橋 性 AGEs も生成する。このため単量体のバンドシフトは

リゾチームの非架橋性 AGEsの生成が 要因のひとつになっている可能 性が 考えられた。

制し、硬化や機能低下を防ぎ、身体の老化抑制に機能する可能性がある。

KPE の CGPC

蛋白の糖化による架橋形成には α ジケトン、グルコスパン、
lysine-dihydropyridinium-lysine（K2P）27, 28) の関与が 報告されている。PTBを親水性化した alagebrium（3-phenacyl4, 5 - dimethylthiazolium chloride）は α ジケトンの切断作用が あることからAGE Breaker と呼 ば れている 29, 30)。KPEには α ジケトン切断作用が 報告されている。しかし KPEと P TB の α ジケトン切 断 作用を 1.4 2 mg/mL で 比 較 した
とき KPE は PT B の 1/5 程度で弱かった 13)。KPE の CGPCは P T Bよりも1.6 倍強く、α ジケトン切断作用の評価結果と異なった。この差異の要因には糖化リゾ チームの蛋白架

橋に α ジケトン以外の架橋が多く含まれ、KPE の蛋白架
橋切断作用が α ジケトン以外の架橋切断に強く作用した可利益相反申告本 研 究の実 施にあたり株式会社レーネより研究費の支援を受けた。

謝辞
本研究結果の一部は第 27 回糖化 ストレス研究会（2023

年 9 月 9 日、京都）で発表した。

能性が 推 定された。

糖化によって架橋形成した蛋白はプロテアーゼによる分解を受けにくいため、新陳代謝されにくい 31)。このため（ 5 ）Glycative Stress Research

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