［ I ］幹細胞生物学●幹細胞と細胞療法

1．ショウジョウバエ神経幹細胞の非対称分裂とグリア・ニュ−ロン分化―glial cells missing（ gcm）遺伝子の機能の解析―
堀田凱樹＊

分子発生生物学と遺伝学の技法を高度に応用できるショウジョウバエを用いることにより，神経系の細胞分化における神経幹細胞の非対称分裂とその遺伝子機構を詳細に解析することができる．本講演では最近われわれが明らかにしたニューロンとグリアとが共通の幹細胞から分岐する分子機構について報告する．
ショウジョウバエのニューロンとグリアとはいずれも神経幹細胞から形成される．
われわれが発見した gcm（glial cells missing）突然変異体ではすべてのグリアがニューロンとなり，反対に遺伝子導入法によって神経幹細胞でこの遺伝子を強制発現させると，すべてのニューロンがグリア細胞となる．したがって gcm はニューロンとグリアとの間の分化運命を決定するスイッチ遺伝子である．gcm の産物 GCM は既知のタンパク質とのホモロジーはなく，ATGCGGG（T C）の 8 塩基と特異的に結合す
る DNA 結合領域（gcm モチーフ）がその C 末に存在する新しいタイプの転写調節因子である．実際，gcm で活性化される repo 遺伝子の上流にはこの標的配列が 10 個タンデムに存在する．ある特定の神経幹細胞がグリアをつくる細胞とニューロンをつくる細胞とに非対称分裂する時点を解析したところ，この gcm 遺伝子は，まず分裂前の幹細胞内で mRNA が合成され，分裂に先だって細胞質の片側に偏在するようになり，その結果分裂後片側の娘細胞に局在するようになる．その細胞では GCM が合成され，その子孫はすべてグリア細胞となることが示された．幹細胞の分化は非対称分裂を必ずともなうと考えられ，この例はその分子レベルでの詳細を解き明かしたものである．
また gcm と相同性の高い gcm 2 もショウジョウバエで見いだされており，ショウジョウバエ GCM 遺伝子ファミリーは神経系および血球分化にも働いているらしいことが最近分かってきた．gcm モチーフは進化的にも良く保存されており，ヒト・マウス・ニワトリ・ゼブラフィッシュ・プラナリアなどにも gcm ファミリー遺伝子が見いだされている．哺乳類の神経系や血球産生系も共通の幹細胞に由来することが知られているから， gcm と同じような機能をする遺伝子がヒトやマウスにも存在する可能性は高い．マウスの gcm ホモログがそのような遺伝子であるか否かは現在検討中である．

Glia vs. neuronal cell fate switching in Drosophila neural stem cells―analysis of glial cells missing（gcm）gene
YOSHIKI HOTTA National Institute of Genetics
ほった・よしき：国立遺伝学研究所所長，総合研究大学院大学遺伝学専攻教授．昭和43年東京大学大学院医学系研究科修了．昭和61年同理学部物理学科教授．平成９年現職．主研究領域／ショウジョウバエ行動制御系の分子発生遺伝学的研究．
＊

8 第 117 回日本医学会シンポジウム

Key words

グリアニューロン細胞運命決定
ショウジョウバエ
gcm 遺伝子

ニューロンとグリアとが同一の前駆細胞にら神経系のすべての細胞が生まれることが分由来するという説が Ramon y Cajal によってかって い る．そ の 初 期 発 生 過 程 で は Notch



唱えられて以来，一個の幹細胞由来の子孫細と Delta Serrate と い う 遺 伝 子 と 一 群 の胞中に両者が存在することが in vitro で はneurogenic 遺伝子群が重要であることが知示されている．哺乳類では，グリアの分化がられている1）．30 個の神経幹細胞はその位置ニューロンよりも遅いことから，幹細胞の後と分化順序とによって個別に識別されて番号期分裂によってグリアが生じると考えられてづけされている．これまでに神経発生初期にいる．しかし，特定の幹細胞を in vivo で追跡発現する約 20 個の遺伝子について，その発して調べる技術がないために，その細胞系譜現の有無が個々の神経幹細胞についてカタロの詳細はまだ完全には証明されていない．わグされている．その結果だけを見ても，すべ

れわれは，ショウジョウバエの分子発生生物ての神経幹細胞がそれぞれユニークな遺伝子学技術を駆使して，その中枢神経系の形態異の組合せを発現していることが分かる．各神

常や神経回路異常をおこす突然変異を探索す

経幹細胞は不等分裂を繰り返しながらニューる過程で， glial cells missing（gcm）と名づロンを生み出す．その細胞系譜はかなり詳し

けた遺伝子を発見した．この遺伝子の突然変く解析されており，特定幹細胞の特定の分裂異では，すべてのグリア細胞がニューロンと段階でグリア細胞が形成されることも分かっなり，一方，すべての神経幹細胞で gcm を強ている．胚神経系が完成したとき，半体節あ制発現させるとすべてのニューロンがグリアたり約 300 個の神経細胞と約 30 個のグリアとなるという際だった性質を持つ遺伝子であ細胞があり，それらのうち初期に分化する細る．この事実から明らかになったことは，す胞についてはその細胞系譜がほぼ完全に明ら

なわち，ニューロンとグリアの前駆細胞は等かにされており，すべて identified cells とし価（equivalent）であり，gcm 遺伝子がそのいて番号づけされている．さらに個々のニューずれに分化するかを決定する 2 進法的マス

ロンやグリア細胞における遺伝子発現パタータースイッチとして働いているということでンの解析が進行中である1）．哺乳類の場合にある

1〜3）．本講演では， gcm 突然変異体の症は一般には神経幹細胞の個性がそれほど明確状の詳細な解析から結論される神経系構築やに規定されているとは考えられていないよう回路網形成におけるグリアの役割について論であるが，それは単に個々の細胞を同定してじ，また gcm 遺伝子産物が DNA 結合能を持その運命を追跡する手段がないからにすぎなつ転写調節因子であるという最近のデータいという可能性が考えられる．ヒトの脳細胞と，ヒトやマウスにも同じ構造の遺伝子があが個別にどこまで個性的であるかは今後の研り，神経系あるいは他の細胞分化過程で分化究に待たねばならないが，このようなショウスイッチ遺伝子として働いているらしいといジョウバエの研究は，現在考えられている以う最近の研究結果について報告したい．

上にニューロンやグリアの個性が遺伝的に決定されている可能性を示唆している．

1．ショウジョウバエ胚神経系の形成
ショウジョウバエの胚は（ヒトと同様に）体節構造をしており，一つの体節の片側（半体節と呼ぶ）に約 30 個存在する神経幹細胞か

2．脳神経系の細胞分化──ニューロンとグリアの分化
われわれはトランスポソン挿入突然変異法
幹細胞と細胞療法 9（エンハンサートラップ法）により，ショウし，［5′（A G）CCCGCAT 3′］の 8 塩基列を認

ジョウバエ神経系のグリア細胞分化の初期段識して結合することを明らかにした．この標階でごく短時間 発 現 す る 遺 伝 子 gcm（glia的認識は，通常の転写因子で言われているcells missing）を発見した2, 3）．その欠損突然DNA 結合の特異性よりもはるかに特異性の変異では，すべてのグリアがニューロンと高いユニークなもので，一塩基の違いを許しなって軸索を伸ばすようになる．また遺伝子て結合することはあるがそれ以上の誤りはお導入法によってすべての神経幹細胞でこの遺こさない正確なものであることも分かった．

伝 子 を 強 制 発 現 さ せ る と，ほ ぼ す べ て の

しかもこの配列が gcm の標的遺伝子と考えニューロンがグリア細胞型の遺伝子発現をすられる repo 遺伝子の上流に約 10 個タンデるようになった．したがって gcm はニューロムに存在する．この結果から，GCM タンパクンとグリア間の分化運命を決定する binary

質は転写調節因子であると結論された5）．

switch 遺伝子である．ちょうど鉄道線路の分岐点における転轍機が列車の行き先を決める
ように，この遺伝子の発現の有無によって幹細胞の子孫細胞がグリア方向に分化するの

4．軸索走行路の形成とシナップス標的認識におけるグリア細胞の役割か，ニューロン方向に分化するのかを決定さ

gcm 突然変異体の中枢神経系においては，れるのである．すなわち，gcm 遺伝子は単に大部分のグリア細胞がニュ−ロンに分化してグリア細胞の分化に必要な遺伝子というものいるため，グリアが存在しない．そのようなではなく，分化方向を決定するマスタース環境における各ニューロンの軸索走行路を解イッチともいうべき遺伝子であるといえよ析すれば，ニューロンの走行 路 決 定（Pathう．この遺伝子をクローニングした結果，こfinding）におけるグリア細胞の役割についての遺伝子産物（GCM）は明確な核移行シグナも興味深い知見を得ることができる．われわ

ルを持っているが既知のタンパク質とのホモれは gcm 突然変異体の中枢神経系においてロジーはなかった．
さらに興味深いことには，

多数の identified neuron の軸索走行を解析す

gcm 突然変異によって本来グリアとなるべることができた2, 11）．その結果，発生初期に分きなのにニューロン化した細胞は体節ごとに化 す る い わ ゆ る pioneer neuron は グ リ ア の繰り返して個々にユニークなパターンで軸索存在しない環境でも正しく軸索路を発見できを伸ばした．これは，神経細胞の個性と多様るが，それに続いて分化する一般のニューロ性を規定する遺伝子セットと同じものがグリン（follower neuron）の軸索は多くの場合正しアの個性と多様性をも規定しているという興い路を発見できないことを見いだした．した2）

味深い可能性を示唆している ．

がって，pioneer neuron がまずグリアの助けを借りずに軸索走行経路を発見し，そのあと

3．gcm 遺 伝 子 産 物 タ ン パ ク 質（GCM）は 8 塩基のターゲットを正確に認識するでグリアが「道路舗装」をしてハイウェイを完成すると，後続の軸索がその上をたどるという経過で正しい神経回路が形成されるらしい．follower neuron のための道路標識となる大腸菌に合成 さ せ た GCM の DNA 結 合 特

グリアも上述のように個性と特異性を持って性を解析した結果，その N 末近傍に特異性のいるから，グリアとニューロン間の相互認識高い DNA 結合部位（gcm モチーフ）が存在によって各軸索が正しい経路を見出していく

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のであろう．そのための標識分子については

果，NB 6―4A の子孫はすべて GB となることまだそのごく一部が明らかにされているに過も 証 明 で き た．さ ら に GCM タ ン パ ク 質 は4）

ぎない ．軸索路を指定する標識分子のこのNGB では翻訳されず，その娘細胞のうち GB解析の過程で，われわれはいわゆる拡散性ののみにおいて翻訳される結果，NB には GCM誘引性分子（attractant）と考えられているタンパクも存在しないことを明らかとなっ

Netrin の作用機構について，「分泌・拡散するた7〜9）．この研究は細胞分化の分岐点での分Netrin を軸索の成長円錐上の受容体である化マスタースイッチ遺伝子の発現パターンをFrazzled が認識する」という従来考えられて詳細に解析し，その mRNA 不等分配とそのタいた説が，少なくともショウジョウバエ神経ンパク産物の不等合成が細胞分化の分岐点で系では正しくないことを証明したが，本講演おきていることを明確に示したものである．

では触れられないので興味のある方は原著論

このような詳細な研究はショウジョウバエの10）文を参照されたい ．

分子発生生物学の技術を駆使して初めて可能となったものである．

5．gcm の時間的・空間的発現パターンとグリア・ニュ−ロン分化
gcm 遺伝子の性質から，この遺伝子は神経6．ショウジョウバエの神経系以外における gcm 遺伝子の効果

グリア幹細胞（NGB）から次世代神経幹細胞

gcm 遺伝子は上に述べたような強力な細（NB）とグリア母細胞（GB）とが分岐す る

胞分化スイッチ機能が神経系において証明さ不等分裂 に際して GB の側でのみ発現してれた．そこで神経系以外で gcm を発現させたいることが期待される．そこでわれわれは抗効果を調べるために GAL 4-UAS システムをGCM 抗体を作成して， in situ ハイブリダイ利用して上皮細胞および中胚葉性の筋細胞でゼーション法を組み合わせることにより特定gcm を強制的に発現する実験を行った．そのの神経幹細胞の特定の細胞分裂時における結果，いずれにおいても repo の発現が誘導

gcm 遺伝子発現と GB 分岐との関連を解析すされ，上皮特異的あるいは筋特異的な遺伝子る実験を行った．たとえば，胸部体節の神経（fasciclin III, myosin など）の発現が抑制さグリア幹細胞である NB6-4T の第一分裂におれることを証明した．この事実から， gcm

いて，gcm mRNA は NB6-4T ですでに産生さ遺伝子は神経系以外でも強い細胞運命転換機れているが，その分裂に先立ち細胞の正中線能を持つことが明らかとなった6）．

側に局在するようになり，その結果，分裂しさらに正常発生過程における神経系以外でて生まれるより正中線に近い娘細胞であるの gcm 遺伝子の発現を詳細に解析したとこ

GB にのみ分配され，もう一つの娘細胞であろ，ショウジョウバエの発生初期中胚葉の血る NB には引き渡されないことが証 明 で き球産生系でも一過性に発現しており，血球系た．その結果，前者からはグリアが生じ，後の細胞分化に関しても gcm が関与している者からは 4 個以上のニューロンが分化する可能性が示唆されており，現在その詳細を検ことを追跡して証明できた7〜9）．しかもこの討中である（未発表）．

不等分配は胸部体節ではおきるが，腹部体節の 同 じ 幹 細 胞 NB 6―4 A で は 分 裂 に 際 し てmRNA が両方の娘細胞に等分配され，その結幹細胞と細胞療法 11

7．ショウジョウバエ以外の生物種における gcm ホモログの解析
以上に述べたように gcm 遺伝子はきわめてユニークな細胞分化分岐点でのスイッチ遺伝子である．またこれまでに知られていない新しい構造の転写調節因子であることから，われわれはショウジョウバエ以外の生物に類似の転写調節因子が存在する可能性を検討した．その結果，GCM タンパク質の N 末の約150 アミノ酸残基からなる gcm モチーフとホモロジーの高い構造を持つ遺伝子が，ショウジョウバエ以外にも，ヒト・マウス5）・ゼブラフィッシュおよびプラナリアなど，広範囲の動物種に多数存在することを明らかにした．それらの gcm ホモログの発現パターンをRT-PCR 法および in situ ハイブリダイゼーション法によって解析した予備的データによると，マウスの gcm ホモログの一部は胚神経系特定領域の（おそらく）特定の細胞種で発現していることをが証明できた．これまでのところ，マウスではショウジョウバエと異なり，gcm ホモログが一般的にすべてのグリアとニューロンの分化を支配しているという考えには，必ずしも肯定的な結果は得られていdetermination in Drosophila. Cell 1995 ; 82 : 1025―1036.
3）細谷俊彦，秋山康子，滝沢一永，他：ニューロン・グリア間の分化決定スイッチ glial cells missing．実験
医学増刊，発生・神経研究の最前線 96- 97，上野直人ら編，1996 ; 14 : 134―140.
4）Chiba A, Snow P, Hotta Y, et al. : Fasciclin III as a synaptic target recognition molecule in Drosophila. Nature 1995 ; 374 : 166―168.
5）Akiyama Y, Hosoya T, Poole A, et al. : The gcm-motif ;A novel DNA binding motif conserved in Drosophilaand mammals. Proc Natl Acad Sci USA 1996 ; 93 :14912―14916.
6）Akiyama-Oda Y, Hosoya T, Hotta Y : Alteration of cellfate by ectopic expression of Drosophila glial cells
missing in non-neuronal cells. Dev Genes & Evol1998 ; 208 : 578―585.
7）Akiyama-Oda Y, Hosoya T, Hotta Y : Asymmetric cell
division of thoracic neuroblast 6-4 to bifurcate glial
and neuronal lineage in Drosophila . Development
1999 ; 126 : 1967―1974.
8）Akiyama-Oda Y, Hotta Y, Tsukita S, et al. : Distinct
mechanisms of triggering glial differentiation in Drosophila thoracic and abdominal neuroblast 6-4. Dev
Biol 2000 ; 222 : 429―439.
9）Akiyama-Oda Y, Hotta Y, Tsukita S, et al. : Mechanism
glia-neuron cell fate switch in the Drosophila thoracic
and neuroblast 6-4. Development 2000 ; 127 : 3513―3522.
10）Hiramoto M, Hiromi Y, Hotta Y : The Drosophila Netrin receptor Frazzled, guides axons by controlling Netrin distribution. Nature 2000 ; 406 : 886―889.
11）Takizawa K, Hotta Y : Pathfinding analysis in a glialess mutant of Drosophila. Dev Genes & Evol 2000．
（in press）

ない．むしろ一部の神経細胞やグリア細胞などの分化分岐点でのスイッチとして働いている可能性が高い．また，神経系以外の組織（たとえば腎臓，血球産生系）でも一部の細胞種質疑応答で発現しており，gcm ホモログは単なるグリア・ニューロンの分化因子にとどまらず，さまざまな細胞分化のスイッチとして働いている可能性が示唆されている（発表準備中）．

座長（須田） どうもありがとうございました．それではご質問をお願いします．
溝口秀昭（女子医大） stem cell の性質として，造 血 細 胞 が 考 え ら れ て い る の は self-［文献］
1）細谷俊彦，堀田凱樹：中枢神経系における細胞運命の決定機構．実験医学 1996 ; 14：38―44．
2）Hosoya T, Takizawa K, Hotta Y , et al . : glial cells
missing : A binary switch between neuronal and glial
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renewal と differentiation だと思うのです．多くの場合，かつては非対称の分裂が stem cellにあるのではないかと考えられていました
が，血液の方では，stem cell も対称ではない

かという考えがかなり優勢な感じがするので在しているとしか思えないのです．ですからす．それはともかくとして，先生の場合に，必ず enhancer promotor 領域をきちんと調べ

GCM が 出 る と グ リ ア に な る と い う こ と がて行けば，そういう結論になると思うのですdifferentiation で，もう一つの GCM が出ないが．

方が stem cell ですが，その stem cell は selfrenewal する可能性はあるのでしょうか．
堀田

self-renewal という意味は，まったく岡野

確 認 で す が，NB 64 で は prosperoと Num は挙動をともにするわけですね．その場合，PNS の lineage とはまったく逆にな同じようにはいえないかもしれませんが，何りますね．この context dependent というの度か分裂をして，ある分裂ではグリアを作るは面白いですね．

けれども，もう一方は次のステップでまた堀田

そうです．ただ非常に複雑で，話をニューロンを作る，stem cell が stem cell を産すっきりさせるのがむずかしいという段階でんでいるという意味では self-renewal です．

す．もしかしたら非常にすっきりするような溝口

グリアから元の細胞に戻れますか．

堀田

それは戻れませんね．

段階がその上にあるのかもしれません．
座長

GCM は血球分化にもかなり重要で岡野栄之（大阪大） GCM の regulation が，あることがわかってきましたが，血球分化に場合によって違うというのはたいへん面白い

おける運命決定という時と，神経分化の運命と思いました．先生は三つの例を示されまし

決定の仕方に何か違いはあるのでしょうか．

たが，CNS では，glioblast ができる時を考えま

例えばニューロン・グリアというのはかなりすと，lateral inhibition によって，Notch が最数がきちんと規定されていて，一方で，ショも activation が か か っ て い な い 細 胞 で GCM

ウジョウバエの血球といえどもかなり揺らぎが発現し続けますね．PNS ではむしろニューがあってもよいようなところがありますが，ロ ン に な ら な い linea に お い て，そ ち ら でそのあたりはいかがでしょうか．

Notch の activation が起きて GCM が発現し，堀田血球の方も調べてはいますが，ショグリアの instruction が起きて，今度は NB 64

ウ ジ ョ ウ バ エ の 神 経 系 の よ う に identified

を見 ま す と prospero-dependent だ と い う こ

cell でやるという形ではないものですから，とです．そうしますと，どれもまったく違う非常にむずかしいのです．今のようにすかっregulation になると思うのです．そこで質問とした形での statement はできません．です

としては，GCM のプロモーター領域に関しから，同じか，違うか，ということも，正確て，例えば prospero-dependent，さらに Notchな意味ではわかりません．

dependent，さらにそうでない要素と，どの程座長

グリア・ニューロンの分化は，非常度 characterize されているのでしょうか．三に強く規定されますね．でもショウジョウバ

つ全部がこれほど違うと非常に面白いと思い

エ の 血 球 で crystal cell あ る い は マ ク ロますが．

ファージの 2 種類の細胞ですと，別に確率で

堀田

それについては本当に調べたいので決まってもよいような要素も出てくるのではすが，まったく未完成といいますか，手がつないかと思うのですが，いかがでしょうか．

いていないといってもよいくらいです．本当堀田

そうです．ですから分裂の瞬間をきに GCM の regulation のところ，おそらく一段ちんと見て，分子がどのように分配されてい上だと思うのですが，そこのところに notchるかを調べなければわかりません．それが確関係のものと，prospero 関係のものとが，混率的に行っていることになると思いますが，幹細胞と細胞療法 13これはまったく答えがないといいますか，ど型的な方向に運ばれるわけです．そうするとうやってそれを確立したらよいか，実験系とこれはまったく偶発的に決まるというよりしてよくわかりません．

も，むしろ何らかの法に則って，いわゆる de-座長規定しにくいですか．

terminant に相当するものが決まりますが，
こ堀田

そうですね．の場合かなり instructive ではないかと，私は岡野

もし須田先生のいわれるように，最近はそのように思っているのです．

stochastic でしたら，ショウジョウバエの発生過程でニューロンとかグリアができる時にcell death がかなり見られるはずですが，そうい う も の は な い の で す．そ れ と，必 ず fate

堀田

神経系の場合には？

岡野

少なくともショウジョウバエの神経系の場合にはそう思っています．
座長

時間の関係もありますので，ここでを決めているといわれている Num の蛋白質終わらせていただきます．どうもありがとうはボディープランの AP 軸，それから必ず定ございました．

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