日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 92, 83-87, 2018

口腔扁平上皮癌における脈管侵襲の組織学的検討
西原安那1大木秀郎 1, 3尾曲大輔 2, 3

1 日本大学歯学部口腔外科学講座，2 日本大学歯学部病理学講座
3

日本大学歯学部総合歯学研究所生体防御部門

要旨：口腔領域における癌の発生は著しい QOL の低下を伴う。口腔における早期癌の 5 年生存率は 90％と良好であるのに対し，進行癌では依然として予後不良の転帰をとることが多い。さらに，その予後は他部位に発生した悪性腫瘍と同様に発生部位や転移になどに左右される。癌の転移は，脈管を侵襲し，遠隔臓器の脈管壁への着床および浸潤・増殖することで成立する。脈管は CD34 などの血管内皮マーカーを用いて免疫組織学的に評価されるが，主に用いられるヘマトキシリンによる対比染色では，脈管侵襲の評価に苦慮することが少なくない。そこで本研究では，口腔粘膜標本を用いて，血管内皮マーカーである CD34 の免疫組織学的同定と対比染色の組合せを検討した。
口腔癌切除材料を対象として，CD34 の免疫染色を行った。CD34 の発色には HRP および ALP を用い，対比染色には，一般的に用いられるヘマトキシリン以外の色素を用いて評価した。その結果，HE 染色との共染色では，CD34 と HE 染色から得られる情報が 1 枚の標本から採取でき，判定に苦慮することが少なかった。また，CD34の発色と反対色で染めた組合せにおいても脈管の状態が詳細に観察することができたが，リンパ球の浸潤の程度や充血，浮腫などの結合組織から得られる情報量が HE 染色に比べ乏しく，さらなる検討の必要性が示唆された。
キーワード：口腔扁平上皮癌，脈管，免疫染色，CD34

緒

服に免疫組織学的な手法は有用である。脈管の客観的評

言価 に は， 内 皮 細 胞 の マ ー カ ー で あ る CD31 や CD34，

口腔は豊かな人間生活を営む上で重要な器官であり，podoplanin，第Ⅷ因子関連抗原などを用いた免疫組織化

歯を含む複雑な構造を有している。口腔領域における癌学的検索が行われる。これは当該分子の存在を DAB なの発生は著しい QOL の低下を伴う。口腔は，歯以外をどの試薬を用いて発色させるが，その際，対比染色とし重層扁平上皮からなる粘膜に被覆された器官であり，口てヘマトキシリンが用いられることが多い。しかし，実腔粘膜に発生する悪性腫瘍の 90％以上が病理組織学的に際の病理診断の現場においては，ヘマトキシリンによる扁平上皮癌である。口腔における早期癌では 5 年生存率

核染色では腫瘍細胞の存在が明瞭に判定できず脈管侵襲が 90％以上と良好な結果を得ている 1,2）のに対し，進行の判定に苦慮する場合が少なくない。

癌では依然として予後不良な転帰を経るのが現状であそ こ で 本 研 究 で は， 血 管 内 皮 細 胞 マ ー カ ー で あ るる 3,4）。口腔癌の予後は，他部位に発生した悪性腫瘍と同CD34 の免疫組織学的同定において，一般的に用いられ様に，その発生部位，大きさ，深達度，リンパ節転移のるヘマトキシリン以外の色素を用いることにより，脈管有無などによって大きく左右される。癌の転移にリンパ侵襲をより明瞭に判定する方法がないかという点に着目

行性転移と血行性転移があり，これらはリンパ管，血管し検討を加えた。

を侵襲し，遠隔臓器の脈管壁への着床および浸潤・増殖材料および方法することによって成立する 5）。口腔癌取扱い規約 6）では，病理所見の記載項目として，リンパ管侵襲（ly）と静脈侵1.

資料襲（v）が挙げられている。一般的にこれらの記載事項は，日本大学歯学部付属歯科病院口腔外科で治療目的に外HE 染色標本を用いて病理医によって判定されており，

科 的 に 切 除 さ れ， 病 理 診 断 科 に お い て squamous cell

その記載内容に基づいて臨床医は治療方針を決定していcarcinoma の診断がなされた症例を無作為に抽出し，対る。しかし，脈管侵襲の有無やその程度の判定に，病理象症例とした。なお資料の採取は，日本大学歯学部倫理医間での相違が見られ，臨床上きわめて重大な問題とな委員会（承認番号：2015-11）の規定に基づいて行った。

ることがある。その要因として，HE 染色標本のみを用2.

抗体および試薬いた判定であり，血管内皮細胞やリンパ管の同定が難し

一 次 抗 体 と し て 抗 CD34 抗 体（Dako， ク ロ ー ン：

く，ly と v の判定には病理医個々の力量や主観的判断にQBEnd10，mouse monoclonal）を用いた。二次抗体につよるところが多いことが考えられる。こうした問題の克いては，envision system anti-mouse and rabbit（Dako），（受付：平成 30 年 7 月 3 日）
〒 101‒8310 東京都千代田区神田駿河台 1‒8‒1383ヒストファインシンプルステイン AP（M）（ ニチレイ）を内皮細胞やリンパ管内皮細胞に陽性となるので著者のう用いた。HE 染色用試薬として mayer’s haematoxylin

ちの 2 人が行い，CD34 に陽性を示し管腔構造が明瞭なsolution（和光），1％ eosin Y solution（和光），対比染色

ものはそのまま脈管として計測し，CD34 に陽性を示す

用 の 試 薬 と し て，light green SFY （ 和 光 ），metanil

が管腔構造が不明瞭なものは 2 個以上の細胞からなるもyellow（和光），を用いた。のを脈管として計測した。

3.

HE 染色

結病変部を含む任意に抽出した舌の一部（ホルマリン固定後のパラフィン切片）を 4μm に薄切し，通法による

1.

果HE 染色HE 染色を行った。まず，キシレンを用いてパラフィンHE 染色像では，被覆上皮に連続して生じた高分化型除去操作を行った。次に純エタノールを通してキシレン

扁平上皮癌を認めた（図 1 a）。強拡大において腫瘍胞巣をエタノールに置換し，更に低濃度のエタノールを通しの周囲に複数の毛細血管やリンパ管を確認することがでて最後に水洗いをした。次に核染色を行うため，ヘマトき，管腔内に赤血球をいれた微小な脈管についても比較キシリン溶液を用いた。標本をヘマトキシリン溶液に 5的観察は容易であった。また，管腔内に腫瘍が乳頭状に分浸漬した後，水洗した。対比染色としてエオジン溶液浸潤する像も観察された（図 1 b）。

を用いて行い，5 分程浸漬した後，水洗した。水洗後に2.

免疫染色は脱水，透徹操作を行った。まず標本の水分をエタノー通法による CD34 の免疫染色像では腫瘍間質におけるルにて取り除くため，80％エタノール，95％エタノール，拡張した脈管の観察は容易であった。さらに，HE 染色

無水エタノールの順番に標本を馴染ませ，水分をエタでは確認できなかった微小な脈管や artifact との鑑別がノールに置換した。次にキシレンを用いて標本を透徹し，困難であったのに対し，CD34 の DAB 発色（CD34-HRP）

封入操作を行った。

や ALP 基質発色（CD34-ALP）による脈管の観察は容易4.

であった。腫瘍に近接した空胞状構造物が脈管であり，免疫染色脈管を取り囲むように浸潤していることも観察できた

HE 染色と同様に，キシレン，純アルコールで脱パラフィン処理後，0.3％ H2O2 メタノールに 20 分間，室温に（図 2, 3）。て浸漬し，内因性ペルオキシダーゼ活性の不活化を行っ

3.

HE 染色との共染色た。Phosphate buffered saline（PBS）にて洗浄後，98℃

CD34-HRP と HE 染色の共染色の場合，脈管の DABのクエン酸 buffer にて 20 分間の抗原賦活化処理し，1％による茶色とエオジンによる線維性間質の赤色が重な

牛血清アルブミン追加 PBS（1％ BSA-PBS）で室温にて 1り，赤茶色として観察することができた。拡張した毛細時間，blocking を行った。その後，抗 CD34 抗体を PBS

血管では，内皮細胞の観察もしやすく脈管の鑑別は容易にて 100 倍希釈し，1 次抗体として 4℃，overnight で反であり，一部の脈管内に腫瘍集塊も観察できた。微小な応させた。0.1％ Tween20 添加 PBS（0.1％ PBST）による脈管においては赤茶色の塊のようにもみえた。しかし，洗浄後，2 次抗体は，envision system anti-mouse andエオジンによる周囲組織の赤色との鑑別は比較的容易で

rabbit（Dako）あるいはヒストファインシンプルステインあった（図 4）。

AP（M）（ ニ チ レ イ ）を 用 い て， 室 温 に て 1 時 間 静 置，4.

light green との共染色0.1％ PBST で 洗 浄 後 に 発 色 を 前 者 に つ い て は

CD34-HRP および CD34-ALP と light green との共染

3.3- d i a m i n o b e n z i d i n e t e t r a h y d r o c h o r i d e（D A B ,色においては，大小不同のさまざまな脈管の観察は比較SIGMA）発 色 基 質（PBS，0.01％ 過 酸 化 水 素，0.02％的容易であった。しかし，脈管が分布する結合組織の像DAB），後者はヒストファインアルカリフォスファターが不明瞭になってしまい観察が難しく，リンパ管と血管ゼ基質キットを用いてそれぞれ 15 分間反応させ，発色の鑑別は困難であり，また周囲の腫瘍実質も不明瞭でさせた。水洗後にヘマトキシリン溶液による核染色を 5あった（図 5, 6）。

分間行い，水洗後に脱水，透徹，封入を行った。

5.

5.

Metanil yellow との共染色CD34-HRP および CD34-ALP と metanil yellow との共染色CD34 の免疫染色は，4. と同様に発色まで行った。発共染色においては，大きく拡張した脈管の観察は比較的色後に水洗を行い，核染色の代わりとして，HE 染色や容易であった。しかし，脈管が分布する結合組織の像が0.2％ light green 溶液（light green SFY，0.5％酢酸水溶不明瞭という点において light green との共染色と同様液），0.2％ metanil yellow 溶液に 10 ～ 20 分間の浸漬をの結果であり，リンパ管と血管の鑑別や腫瘍実質の形態行った。その後に水洗を行い，脱水，透徹，封入を行った。

について不明瞭であった（図 7, 8）。

6.

脈管の判定
脈管の判定については，免疫組織学的に CD34 は血管84

口腔癌における脈管侵襲の組織学的検討

図1a

重層扁平上皮癌 （HE 染色）  被覆上皮に連続する高分化型の扁平上皮癌をみる。

図1b重層扁平上皮癌 （HE 染色）  管腔内への乳頭状の浸潤像を認める（矢印）。

図2

CD34-HRP ＋ヘマトキシリン染色
DAB 発色により CD34 陽性細胞からなる微小な脈管の存在も確認できる（矢印）。

図3

CD34-ALP ＋ヘマトキシリン染色
図 2 同様に ALP 発色基質により CD34 陽性細胞からなる微小な脈管の存在も確認できる（矢印）。

図4

CD34-HRP ＋ HE 染色
脈管内に腫瘍集塊をみる（矢印）。

図5

CD34-HRP ＋ light green 染色
DAB 発色で相対的に茶色にされた脈管の観察は容易である
が、腫瘍実質と間質が不明瞭であった。

85

図6

CD34-ALP ＋ light green 染色
ALP 発色基質により相対的に黒色を示す脈管の観察は容易であるが、腫瘍実質と間質が不明瞭であった。

図7

CD34-HRP ＋ Metanil yellow 染色
DAB 発色で茶色に染色された脈管の観察は容易であるが、腫瘍実質と間質が不明瞭であった。

リンパ節転移の有無を考慮するという報告もある 10）。大腸癌の浸潤先端部分の間質においてはしばしば細胞 1 個または数個程度の小さな島状癌細胞集塊が観察される。
これは budding と呼ばれ，これが高頻度に見られる症例
では低頻度な症例に比べ予後が有意に悪いことが明らかになり，新しい悪性度規定因子として最近注目されている。それは少数の細胞からなる集塊が，腫瘍間質に存在するのか腫瘍塞栓のように脈管内に存在するのかの違いで，予後に大きな影響を与えると考えられるためである。
そこで，我々は，脈管を確実に判別するため，CD34 による免疫染色を行い，同一標本内での HE 染色やそれ以外の対比染色を行った。その結果は，CD34 の発色色素とその周囲間質を反対色で染色することが観察しやすい
図8

脈管の CD34-ALP ＋ Metanil yellow 染色
ALP 発色基質で赤色に染色された脈管の観察は容易である
が、腫瘍実質と間質が不明瞭であった。

考ということであり，単純な色相環での色の組み合わせによるものであった。しかしながら，今回選択した lightgreen および metanil yellow から腫瘍実質・間質について得られる情報は乏しいものであった。CD34 はグリコ察シル化した膜貫通型タンパク質であり細胞膜が染色され口腔がんは口腔領域に発生する悪性腫瘍の総称である。対比染色に用いる溶液によっては，組織の挫滅やスる。口腔は歯以外が扁平上皮からなる粘膜で被覆されてライドガラスからの組織片の剥がれなどで生じる組織片おり，病理組織学的に口腔がんの 90％以上は扁平上皮癌の亀裂などの artifact と脈管の鑑別がなお困難となり，である。口腔癌取扱い規約には病理診断項目として脈管外科病理のルーチンワークで行うにはあまり適さないと侵襲が定められているが，その判定は難しいと思われる。

思われる。また，同一切片上で，CD34 と elastica 染色

それは，リンパ管侵襲（ly 因子），血管侵襲（v 因子）を記による 2 重染色で脈管侵襲の判定を行った報告がある

載するとあるが実際の判定基準については記載されていが，1 か所でもリンパ管侵襲および脈管侵襲を認めた場ないためである 6）。さらに，HE 染色において形態学的合に陽性，まったく認めない場合を陰性とすることを基

特徴のみでの判定をルーチンワークで行い，リンパ管の準とした場合，ly と v は予後因子としてはリンパ節転移内皮細胞の同定や内腔がほとんど確認できない脈管の同を凌駕しえない因子であるが，4 個以上の静脈侵襲所見定が困難だからである。このことは口腔扁平上皮癌に限にはリンパ節転移とは独立性を有する臨床意義があるとらず，大腸癌など他部位で発生したものについても同様している 10）。今回，CD34 免疫染色と種々の対比染色をである行い，脈管について観察を行った。同一標本上での反対。また，大腸癌の場合は，脈管侵襲の判定に

7-11）

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口腔癌における脈管侵襲の組織学的検討

Hepatol 23, 633-641.
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2016. http://www.cancer.org/acs/groups/content/@
research/documents/document/ acspc-047079.pdf. （2017年 11 月 27 日アクセス）.
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北川昌伸，仁木利郎，医学書院，東京，259-261．
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7）池上雅博，劉 鉄成，山下伸子，羽野 寛（2001）大腸 sm 癌における転移と脈管侵襲との関係および脈管侵襲の病理組織診断上の問題点．早期大腸癌 5，449-457．
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10）佐藤太一，神藤英二，橋口陽二郎，上野秀樹，望月秀隆（2006）
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義，日臨外会誌 70, 1262-1270．

色による詳細な脈管の同定は，脈管侵襲の病理医間による判定の相違や，標本作製に際し複数枚を作製することで発生する組織像の相違の軽減につながり，このことが患者の予後に大いに関わると考えられる。ただし，反対色の追及のみに従事してしまうと，核や細胞質，細胞膜の染色がもう一方の染色によって不明瞭になり脈管の判定が困難になるため，さらなる検討が必要であると思われる。
稿を終えるにあたり，その機会と格別なるご指導ご鞭撻を頂いた日本大学歯学部病理学講座浅野正岳教授に謹んで感謝申し上げます。なお，本論文に関して開示すべき利益相反はありません。
文献1）Siegel R, Naishadham D, Jemal A (2012) Cancer statistics,
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3）L a m b e r t R , S a u v a g e t C , d e C a m a r g o C a n c e l a M ,Sankaranarayanan R (2011) Epidemiology of cancer fromthe oral cavity and oropharynx. Eur J Gastroenterol87