28

飼料研究報告 Vol. 34 (2009)3

飼料中のオキソリン酸及びフルメキンの液体クロマトグラフによる同時定量法
杉本 泰俊 *，野村 昌代 *，鷲尾 和也 *Determination of Oxolinic acid and Flumequine in Feeds by LC
Yasutoshi SUGIMOTO * Masayo NOMURA * and Kazuya WASHIO *( * Food and Agricultural Materials Inspection Center, Fukuoka Regional Center)
An analytical method for determination of oxolinic acid and flumequine in feeds using
liquid chromatography (LC) was developed.

Oxolinic acid and flumequine were extracted with

0.2 % metaphosphoric acid solution-acetonitrile (3:2).
to 200 mL with the extracting solvent.

The extracts were filtered and topped up

Sample solutions were purified by C18 cartridge (GLScience, InertSep Slim-J C18-B) and graphitized carbon cartridge (GL Science, InertSep GC), andsubjected to LC for determination of oxolinic acid and flumequine.

A recovery test was

conducted using two kinds of formula feed and fish meal spiked with 5, 1, 0.5 and 0.3 mg/kg ofoxolinic acid and flumequine.

The mean recoveries of oxolinic acid and flumequine were71.1~94.4 % and 71.5~90.5 %, and the relative standard deviations (RSD) were within 12 % and
16 %, respectively.

A collaborative study was conducted in eight laboratories using a formula

feed for layer and a fish meal spiked with 3 mg/kg of oxolinic acid and flumequine.

The meanrecovery of oxolinic acid in the formula feed for layers was 88.7 %, and repeatability andreproducibility in terms of the relative standard deviations (RSDr and RSDR) and HorRat were
5.9 %, 6.6 % and 0.48 respectively.
6.1 %, 9.5 % and 0.68.

For the fish meal, these respective values were 83.0 %,The mean recoveries of flumequine in the formula feed for layers was

87.7 %, RSDr, RSDR and HorRat were 5.5 %, 6.9 % and 0.50 respectively.

For the fish meal,

these respective values were 82.0 %, 4.1 %, 8.3 % and 0.59.
Key words: オキソリン酸 oxolinic acid ; フルメキン flumequine ; 合成抗菌剤 synthetic
antibacterial ; 液体クロマトグラフ liquid chromatograph (LC) ; 飼料 feed; 魚粉 fishmeal ; 共同試験 collaborative study
1緒言オキソリン酸は 1966 年に発見されたキノロン系抗菌剤である．キノロン系抗菌剤としてもっとも古いのは，1962 年に合成されたナリジクス酸であり，それ以降類似抗菌剤が数種開発され，動物用としてはピロミド酸及びオキソリン酸などが臨床的に用いられている．近年更に抗菌力を強力にしたニューキノロン系抗菌剤が多数開発されている 1)．また，オキソリン酸は農業用殺菌剤としても用いられている．
フルメキンは，1973 年に開発されたキノロン系抗菌剤の一つであり，水産用医薬品としてブ*

独立行政法人農林水産消費安全技術センター福岡センター

29

飼料中のオキソリン酸及びフルメキンの液体クロマトグラフによる同時定量法

リ，マダイ等の類結節病の予防に使用されていた．しかし，平成 17 年に許可が取り消され，現在は国内での使用はできなくなっている 1)．
オキソリン酸及びフルメキンは，いずれも飼料添加物として指定されていない抗菌性物質であり，飼料安全法に基づく成分規格では飼料に含んではならないこととされているが，輸入魚粉への残留が懸念されている．このため，魚粉及び魚粉を含む配合飼料中のオキソリン酸及びフルメキンの分析法の開発が必要となっている．
オキソリン酸及びフルメキンの分析法としては，厚生労働省より食品中の分析法としてキノロン
系合成抗菌剤 10 物質の同時分析法及び HPLC による動物用医薬品等の一斉試験法 I（畜水産）の適用が示されている 2)．
筆 者 ら は ， 財 団 法 人 日本食品分析センターが「平成 19 年度飼料中の有害物質等残留基準を設定するための分析法開発及び家畜等への移行調査委託事業」において開 発 し た 飼 料 中 の オ キ ソ リ
ン 酸 及 び フ ル メ キ ン の 分 析 法 1) （以下「分析センター法」という．）を 基 に ， 飼 料 分 析 基 準 3 )へ の 適 用 の 可 否 に つ い て 検 討 を 行 っ た ので，その概要を報告する．
なお，オキソリン酸及びフルメキンの構造式を Fig. 1 に示した．

N

O

N
OH

O
O

O

O

O

Oxolinic acid

Flumequine(5-ethyl-5,8-dihydro-8-oxo-1,3-dioxolo(4,5-(9-fluoro-6,7-dihydro-5-methyl-1-oxo-1H,5H-g)quinoline-7-carboxylic acid)benzo[ij]quinolizine-2-carboxylic acid)

C13H11NO5

C14H12 FNO3

MW: 261.2

CAS No.: 14698-29-4
Fig. 1

試

MW: 261.3

CAS No.: 42835-25-6
Chemical structures of oxolinic acid and flumequine
2

2.1

OH

F

実験方法

料

市販の配 合 飼 料 （ 成 鶏 飼 育 用 ， 肉 豚 肥 育 用 ， ま だ い 育 成 用 ） 及 び 飼 料 原 料 （ 国 産 魚 粉 ，
ペルー産魚粉，エクアドル産魚粉，チキンミール，フェザーミール，ポークチキンミール ） を そ れ ぞ れ 1 mm の網ふるいを通過するまで粉砕して用いた．
なお，検討に用いた配合飼料の配合割合を Table 1 に示した．

30

飼料研究報告 Vol. 34 (2009)

Table 1
Compositions of the formula feed used in this study
Formula feed
Ingredients
Proportion
Ingredients
types
types
(%)
For layer
Grains54 Corn, Polished rice
Oil meal
28 Corn gluten meal, Soybean meal, Rapeseed meal
Animal by-products
6 Fish meal, Poultry by-product
Others12 Calcium carbonate, Animal fat
Salt, Paprika extract, Feed additives
74 Corn, Milo, Cleaned rice
For finishing Grainspig
Oil meal
21 Soybean meal, Rapeseed meal
Animal by-products
1 Fish meal
Brans
1 Corn gluten feed
Others3 Animal fat, Molasses, Calcium carbonate
Calcium phosphate, Salt, Vegetable oil, Feed additives
Animal by-products
64 Fish meal, Antarctic krill meal
For red sea
bream
Grains17 Wheat flour
Oil meal
6 Soybean meal, Corn gluten meal
Brans
5 Rice bran, Wheat bran
Others8 Refined fish oil, Animal fat, Calcium phosphate, Seaweed
powder, Banana powder, Feed yeast, Feed additives
2.2
1)

試

薬

オキソリン酸標準原液
オキソリン酸標準品（関東化学製，純度 99.5 %）10 mg を正確に量り，100 mL の全量フラスコに入れ，水酸化ナトリウム溶液（0.1 mol/L）1 mL 及びメタノールを加え，超音波処理して溶かし，更に標線までメタノールを加えてオキソリン酸標準原液を調製した（この液 1 mL
はオキソリン酸として 0.1 mg（f=0.995）を含有する．）．

2)

フルメキン標準原液
フルメキン標準品（関東化学製，純度 99.5 %）10 mg を正確に量って 100 mL の全量フラス
コに入れ，メタノール を加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えてフルメキン標準原液を調製した（この液 1 mL はフルメキンとして 0.1 mg（f=0.995）を含有する．）．

3)

混合標準液
使用に際して，オキソリン酸標準原液及びフルメキン標準原液の一定量を混合し，水－メタ
ノール（7+3）で正確に希釈し，1 mL 中にオキソリン酸及びフルメキンとしてそれぞれ 0.01，
0.25，0.05，0.1，0.25，0.5，1 及び 5 µg を含有する各混合標準液を調製した．

4)

溶出溶媒
アセトニトリル－トルエン（3+1）1,000 mL にギ酸 2 mL を加えてギ酸含有アセトニトリル－トルエン混液を調製した．

5)

試薬等
アセトニトリル，メタノール，トルエン，蒸留水は液体クロマトグラフ用試薬を用いた．ギ酸は Merck 製分析用 GR（純度 98 %以上）を用いた．メタリン酸については塊状、HPO3 とし

飼料中のオキソリン酸及びフルメキンの液体クロマトグラフによる同時定量法

31て 37 %以上のものを用いた．
2.3

装置及び器具1)

液体クロマトグラフ：Agilent Technologies 製

2)

振とう機：タイテック製

3)

ロータリーエバポレーター：柴田科学機械工業製

4)

C18 ミニカラム：ジーエルサイエンス製

5)

グラファイトカーボンミニカラム：ジーエルサイエンス製

6)

メンブランフィルター：東洋濾紙製

2.4
1)1100 シリーズ

レシプロシェーカーSR-2W
R-114

InertSep Slim-J C18-B（充填量 500 mg）
InertSep GC（充填量 250 mg）

DISMIC-13HP（孔径 0.45 µm、PTFE）

定量方法
抽

出

分析試料 10.0 g を量って 200 mL の共栓三角フラスコに入れ，水 20 mL を加えた後，30 分間静置した．更に 0.2 %メタリン酸溶液－アセトニトリル（3+2）100 mL を加え，30 分間振り
混ぜて抽出した．200 mL の全量フラスコをブフナー漏斗の下に置き，抽出液をろ紙（5 種B）で吸引ろ過した後，先の三角フラスコ及び残さを順次 0.2 %メタリン酸溶液－アセトニト
リル（3+2）50 mL で洗浄し，同様に吸引ろ過した．更に全量フラスコの標線まで 0.2 %メタリン酸溶液－アセトニトリル（3+2）を加えた．この液 4 mL を 100 mL のなす形フラスコに正確に入れ，水 10 mL を加え，カラム処理に供する試料溶液とした．
2)

カラム処理
C18 ミニカラムにリザーバーを連結し，アセトニトリル 5 mL 及び水 5 mL で洗浄した．試料溶液をミニカラムに入れ，圧注して液面が充てん剤の上端に達するまで流出させた．
次に C18 ミニカラムの下にあらかじめアセトニトリル 5 mL 及び水 5 mL で洗浄したグラファイトカーボンミニカラムを連結した．試料溶液の入っていたなす形フラスコを 0.2 v/v%ギ酸
溶液－アセトニトリル（1+1）5 mL ずつで 3 回洗浄し，洗液を順次 C18 ミニカラムに加え，圧注して液面が充てん剤の上端に達するまで流下させ，オキソリン酸及びフルメキンをグラファ
イトカーボンミニカラムに移行させた．
次に C18 ミニカラムをはずし，50 mL のなし形フラスコをグラファイトカーボンミニカラムの下に置き，溶出溶媒 15 mL をグラファイトカーボンミニカラムに加えてオキソリン酸及びフルメキンを溶出させた．溶出液を 40 °C 以下の水浴で 1 mL まで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．水－メタノール（7+3）2 mL を正確に加えて残留物を溶かし，メンブラン
フィルターでろ過し，液体クロマトグラフィーに供する試料溶液とした．

3)

液体クロマトグラフィー
試料溶液及び各混合標準液各 10 µL を液体クロマトグラフに注入し，Table 2 の測定条件に従ってクロマトグラムを得た．
Table 2

Operating conditions for LC for analysing oxolinic acid and flumequine

ColumnMobile phase
Detector
Flow rate
Column temp.

L-column ODS (4.6 mm i.d.×150 mm; 5 µm)
0.2 v/v% Formic acid solution-methanol (7:3)→20 min→(6:4)
Fluorescence detector (Ex: 325 nm, Em: 365 nm)
1.0 mL/min
40 °C

32

飼料研究報告 Vol. 34 (2009)

4)

計

算

得られたクロマトグラムからピーク面積又は高さを求めて検量線を作成し，試料中のオキソ
リン酸量及びフルメキン量を算出した．
なお，定量法の概要を Scheme 1 に示した．
Sample 10.0 g
add 20 mL of water
leave standing for 30 minutes
add 100 mL of 0.2 % metaphosphoric acid solution-acetonitrile (3:2)
shake for 30 minutes
filtrate under suction filter (No.5B)
wash with 50 mL of 0.2 % metaphosphoric acid solution-acetonitrile (3:2)
top up to 200 mL with 0.2 % metaphosphoric acid solution-acetonitrile (3:2)
4 mL of sample solution
add 10 mL of water
C18 cartridge (prewash with 5 mL of acetonitrile and 5 mL of water)
apply sample solution
connect graphitized carbon cartridge (prewash with 5 mL of acetonitrile and 5 mL of water)
under the C18 cartridge
wash with 5 mL of 0.2 v/v% formic acid-acetonitrile (1:1) three times
remove C18 cartridge
elute with 15 mL of acetonitrile-toluene (3:1)(containing 0.2 v/v% of formic acid)evaporate to dryness under 40 °C
dissolve in 2 mL of water-methanol (7:3)
filtrate with a membrane filter (pore size 0.45 µm)
LC-FL(10 μL)

Scheme 1

Analytical procedure for oxolinic acid and flumequine in feeds by using LC

3
3.1

結果及び考察検量線
調製した 0.01，0.25，0.05，0.1，0.25，0.5，1 及び 5 µg/mL のオキソリン酸及びフルメキン標

準液各 10 µL を液体クロマトグラフに注入し，得られたクロマトグラムのピーク面積及び高さを求めて検量線を作成した．
その結果，検量線は Fig. 2-1 及び Fig. 2-2 のとおり，オキソリン酸及びフルメキンともに
0.1~50 ng の範囲で直線性を示した．

飼料中のオキソリン酸及びフルメキンの液体クロマトグラフによる同時定量法

(A)

2

(B)

(A)

Calibration curves of oxolinic acid by peak area (A) and peak height (B)2

R =0.9999

Fig. 2-2
3.2

2

R =0.9999

R =1.0000

Fig. 2-1

33

(B)

2

R =0.9999

Calibration curves of flumequine by peak area (A) and peak height (B)オキソリン酸の安定性の検討
オキソリン酸は，水中光分解半減期が約 4 日 1) であることから，最終試料溶液での経時変化を確認した．
国産魚粉にオキソリン酸及びフルメキンとしてそれぞれ 5 mg/kg 相当量を添加し，本法により操作した直後の最終試料溶液を 0 時間とし、最終試料溶液を実験室の蛍光灯を点灯した状態の下で経時的に 2，4，8，24 時間後の定量値の変化を確認した．また同時に最終試料溶液を遮光バイアルに入れ遮光状態でも 0 及び 24 時間後の定量値の変化を確認した．
その結果 Fig. 3 のとおり時間が経過するに従い定量値は低下した．一方，遮光条件では定量値の低下は見られなかった．

飼料研究報告 Vol. 34 (2009)

Relative Intensity/ %34Time elapsed since preparation/ hFig. 3
3.3

Results of stability test for oxolinic acid

C18 ミニカラムの検討
C18 ミニカラム処理によるオキソリン酸及びフルメキンの溶出画分の確認を行った．
国産魚粉を 2.4 の 1)により抽出した液に，オキソリン酸及びフルメキンとしてそれぞれ 5

mg/kg 相当量を添加し，C18 ミニカラム処理を行い，溶出画分の回収率を確認した．
その結果 Table 3 のとおり，0~15 mL に溶出し 15 mL 以上の画分には溶出されなかったため，
C18 ミニカラムからの溶出液量は 15 mL で十分と考えられた．
Table 3Results of recovery test for oxolinic acid and flumequine
(%)

3.4

Fraction volume (mL)

0~15

15~20

Total

Oxolinic acid
Flumequine

96
98

0
0

96
98

グラファイトカーボンミニカラムの検討
グラファイトカーボンミニカラム処理によるオキソリン酸及びフルメキンの溶出画分の確認を行った．
国産魚粉を 2.4 の 1)により抽出した液に，オキソリン酸及びフルメキンとしてそれぞれ 5
mg/kg 相当量を添加し，C18 ミニカラムで処理した後に，グラファイトカーボンミニカラムによる処理を行い，溶出画分の回収率を確認した．
その結果 Table 4 のとおり，0~15 mL に溶出し 15 mL 以上の画分には溶出されなかったため，
グラファイトカーボンミニカラムからの溶出液量は 15 mL で十分と考えられた．

飼料中のオキソリン酸及びフルメキンの液体クロマトグラフによる同時定量法

Table 4

3.5

35

Results of recovery test for oxolinic acid and flumequine(%)
Fraction volume (mL)
0~15
15~20
Total
Oxolinic acid98
098
Flumequine99099

妨害物質の検討
配合飼料（成鶏飼育用，肉豚肥育用，まだい育成用）及び飼料原料（国産魚粉，ペルー産魚

粉，エクアドル産魚粉，チキンミール，フェザーミール，ポークチキンミール）について，本法に従ってクロマトグラムを作成し，オキソリン酸及びフルメキンの定量を妨害するピークの有無を検討した．その結果，オキソリン酸及びフルメキンの定量を妨害するピークは認められなかった．

(B)

Fluorescence intensity/ arb. units(A)

Fluorescence intensity/ arb. units

なお，妨害物質の検討で得られたクロマトグラムの一例を Fig. 4 に示した．

Oxolinic acid

0

4

8
12
Retention time/ min

Oxolinic acid0

4

Flumequine

16

Flumequine

8
12
Retention time/ min16

Fig. 4Chromatograms of each sample solution(A) Sample solution of formula feed for layer(B) Sample solution of fish meal
3.6

添加回収試験
本法による回収率及び繰返し精度を確認するために添加回収試験を実施した．
Table 1 の成鶏飼育用配合飼料，まだい育成用配合飼料及 び 魚 粉 （ 国 産 魚 粉 ， ペ ル ー 産 魚

粉 ， エ ク ア ド ル 産 魚 粉 ） にオキソリン酸及びフルメキンとして 1 mg/kg 及び 5 mg/kg 相当量を添加した試料を用いて,本法に従って 3 点併行分析を行い,その回収率及び繰返し精度を求めた．
その結果，Table 5 及び 6 のとおり，オキソリン酸については，平均回収率は 71.1~94.4 %，そ36

飼料研究報告 Vol. 34 (2009)の繰返し精度は相対標準偏差（RSD）として 11 %以下，フルメキンについては，平均回収率は71.5~90.5 %，その繰返し精度は RSD として 16 %以下の結果が得られた．
なお，添加回収試験で得られたクロマトグラムの一例を Fig. 5 に示した．
Table 5Results of recovery test for oxolinic acid(%)

Formula feed
Spikedfor layer
level(mg/kg) Recoverya) RSD b)
5
1

94.4
81.8

( 2.2)( 7.3)a)

Mean recovery (n=3)b)

Relative standard deviation

Formula feed forred sea bream
a)

Rec.
71.1
74.5

Table 6

b)

RSD
(11 )
( 2.4)Fish meal(domestic)
a)

Rec.
90.8
76.3

Fish meal(Peru)b)

RSD( 3.8)
(10 )

a)

Rec.
71.8
83.3

Fish meal(Ecuador)b)

RSD( 1.7)( 5.7)

a)

Rec.
80.3
78.2

b)

RSD
( 3.6)( 1.5)

Results of recovery test for flumequine(%)
Formula feed
Spikedfor layer
level(mg/kg) Recoverya) RSD b)
5
1

90.5
83.3

( 2.5)( 1.7)a)

Mean recovery (n=3)b)

Relative standard deviation

Formula feed forred sea bream
Rec.a)
74.7
74.2

RSD b)(12 )( 2.6)Fish meal(domestic)
Rec.a) RSD b)
86.7 ( 1.9)
71.5 ( 1.4)

Fish meal(Peru)
Rec.a)
73.3
85.3

RSD b)(11 )(16 )Fish meal(Ecuador)
Rec.a) RSD b)
80.5 ( 5.2)
82.0 ( 2.7)

(A)Fluorescence intensity/ arb. units

飼料中のオキソリン酸及びフルメキンの液体クロマトグラフによる同時定量法
Flumequine
Oxolinic acid

0

4

16

Flumequine
Oxolinic acid0

4

Fig. 5

3.7

8
12
Retention time/ min

Fluorescence intensity/ arb. units

(B)

37

8
12
Retention time/ min

16

Chromatograms of standard solution and sample solution(A)

Standard solution of oxolinic acid and flumequine (500 ng/mL)(B)

Sample solution of formula feed for layer (spiked with oxolinic acid and flumequine at 5 mg/kg)

検出下限
本法の検出下限を確認するため，添加回収試験により得られるピークの SN 比並びに回収率及び繰返し精度を求めた．
成鶏飼育用配合飼料及び国産魚粉にオキソリン酸として 0.5 mg/kg，フルメキンとして 0.5 及び 0.3 mg/kg 相当量添加した試料について 3 点併行分析を行った．その結果，平均回収率及び繰返し精度は Table 7 及び 8 のとおりであった．また，オキソリン酸のピークの SN 比が 10 となる
濃度は 0.5 mg/kg，フルメキンは 0.3 mg/kg であった．
以上の結果から，本法は試料中のオキソリン酸を 0.5 mg/kg，フルメキンを 0.3 mg/kg まで検出可能と考えられた．
Table 7

Results of recovery test at the concentration of detection limit for oxolinic acid(%)
Formula feed for layer
Domestic fish meal
Spiked level
a)
b)
a)
b)
(mg/kg)Recovery
RSD
Recovery
RSD

0.5

72.6

a)

Mean recovery (n=3)b)

Relative standard deviation (RSD)( 3.5)

77.7

(12 )

38

飼料研究報告 Vol. 34 (2009)

Table 8Results of recovery test at the concentration of detection limit for flumequine(%)
Formula feed for layer
Domestic fish meal
Spiked levela)b)(mg/kg)Recovery
RSD
Recoverya)
RSD b)

0.5
0.3

3.8

78.9
89.3

a)

Mean recovery (n=3)b)

Relative standard deviation (RSD)( 6.8)
(12 )

72.2
77.5

( 7.5)(11 )共同試験
本法の再現精度を調査するため，共通試料による共同試験を実施した．
魚粉及び成鶏飼育用配合飼料にオキソリン酸及びフルメキンとして各 3 mg/kg 相当量をそれぞれ添加した試料を用い，財団法人日本食品分析センター多摩研究所，社団法人日本科学飼料協会
科学飼料研究センター，JA 東日本くみあい飼料株式会社本社分析センター，独立行政法人農林水産消費安全技術センター肥飼料安全検査部，同札幌センター，同仙台センター，同名古屋セン
ター及び同福岡センターの 8 試験室で共同分析を実施した．
オキソリン酸についての結果は Table 9 のとおりであり，魚粉では，平均回収率は 83.0 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度はそれぞれ相対標準偏差（RSDr 及び RSDR）として 6.1 %及び 9.5 %であり，HorRat は 0.68 であった．
また，成鶏飼育用配合飼料では，平均回収率は 88.7 %，RSDr 及び RSDR はそれぞれ 5.9 %及び6.6 %であり，HorRat は 0.48 であった．
フルメキンについての結果は Table 10 のとおりであり，魚粉では，平均回収率は 82.0 %，RSDr
及び RSDR はそれぞれ 4.1 %及び 8.3 %であり，HorRat は 0.59 であった．
また，成鶏飼育用配合飼料では，平均回収率は 87.7 %，RSDr 及び RSDR はそれぞれ 5.5 %及び6.9 %であり，HorRat は 0.50 であった．
なお，参考のため，各試験室で使用した液体クロマトグラフの機種等を Table 11 に示した．

39

飼料中のオキソリン酸及びフルメキンの液体クロマトグラフによる同時定量法

Table 9Collaborative study results of oxolinic acid(mg/kg)SampleLab.No.

Fish meal

Formula feed for layer

1

2.22

2.42

2.47

2.73

2

2.42

2.33

2.43

2.78

3

2.49

2.19

2.27

2.53

4

2.17

2.41

2.72

2.87

5

2.73

2.66

2.78

2.51

6

2.74

2.96

2.75

2.88

7

2.80

2.48

2.66

2.68

8

2.32

2.47

2.84

2.68

Spiked level

3.00

3.00

Mean valuea)

2.49

2.66

Recovery (%)

83.0

88.7

b)

(%)

6.1

5.9

RSDRc) (%)

9.5

6.6

PRSDRd) (%)

14

14

0.68

0.48

RSDr

HorRata) n=16b) Relative standard deviations of repeatability within laboratoryc)

Relative standard deviations of reproducibility between laboratoriesd)Predicted relative standard deviations of reproducibility between laboratories calculated fromthe modified Horwitz equation

40

飼料研究報告 Vol. 34 (2009)

Table 10

Collaborative study results of flumequine(mg/kg)SampleLab.No.

Fish meal

Formula feed for layer

1

2.31

2.43

2.51

2.71

2

2.47

2.47

2.43

2.57

3

2.33

2.15

2.23

2.61

4

2.13

2.38

2.83

2.96

5

2.59

2.62

2.57

2.50

6

2.69

2.86

2.70

2.79

7

2.68

2.54

2.50

2.79

8

2.32

2.38

2.75

2.63

Spiked level

3.00

3.00

Mean valuea)

2.46

2.63

Recovery (%)

82.0

87.7

b)

(%)

4.1

5.5

RSDRc) (%)

8.3

6.9

PRSDRd) (%)

14

14

0.59

0.50

RSDr

HorRata) n=16b) Relative standard deviations of repeatability within laboratoryc)

Relative standard deviations of reproducibility between laboratoriesd)Predicted relative standard deviations of reproducibility between laboratories calculated fromthe modified Horwitz equation

飼料中のオキソリン酸及びフルメキンの液体クロマトグラフによる同時定量法

41

Table 11

Lab.No.
1234Instruments used in the collaborative study
LC column
LC system(i.d.×length, particle size)
Shiseido, CAPCELL PAK C18 UG120
Agilent Technologies, LC-1100 Series(4.6 mm×150 mm, 5 µm)
Agilent Technologies, Eclipse XDB-C18
Agilent Technologies, LC-1100 Series(4.6 mm×150 mm, 5 µm)
Shiseido, CAPCELL PAK C18
Agilent Technologies, LC-1100 Series(4.6 mm×150 mm, 5 µm)
JASCO, Pump PU-980
Auto sampler AS-950
Showa Denko, Shodex C18M4E(4.6 mm×250 mm, 5 µm)
Column oven CO-965
Detector FP-2025 Plus
Chemicals Evaluation and Research Institute,

5

Agilent Technologies, LC-1100 Series

L-column ODS(4.6 mm×150 mm, 5 µm)

67

Shiseido, NANOSPACE SI-2

Tosoh Bioscience, TSKgel ODS-80TM

Detector NANOSPACE SI-2 3013
Agilent Technologies, LC-1100 Series
Shimadzu, Pump LC-20A
System controller CBM-20A

8(4.6 mm×150 mm, 5 µm)
Shiseido, CAPCELL PAK C18(4.6 mm×150 mm, 5 µm)

GL Science, Inertsil ODS-3(4.6 mm×150 mm, 5 µm)

Auto sampler SIL-20AC
Column oven CTO-20A
Detector RF-10AXL

4まとめ飼料中のオキソリン酸及びフルメキンについて，分析センター法を基に，液体クロマトグラフを用いた定量法の飼料分析基準への適用の可否について検討し，次の結果を得た．
1)

オキソリン酸及びフルメキンの検量線は 0.1~50 ng の範囲で直線性を示した．

2)

C18 ミニカラム及びグラファイトカーボンミニカラム処理の溶出画分の確認を行ったところ溶出液の必要量はそれぞれ 15 mL で十分であった．

3)

最終試料溶液中でのオキソリン酸の安定性を確認したところ，遮光しない場合、経時的に定量値が減少することから，遮光バイアルを用いる必要があると考えられた．

4)

3 種類の配合飼料及 び 6 種 類 の 飼 料 原 料 に つ い て ， 本 法 に 従 っ て ク ロ マ ト グ ラ ム を 作 成 した と こ ろ ， オキソリン酸及びフルメキンの定量を妨害するピークは認められなかった．

5)

2 種類の配合飼料及 び 3 種 類 の 魚 粉 を用いて，オキソリン酸及びフルメキンとして 1 mg/kg 及
び 5 mg/kg 相当量添加し，添加回収試験を実施した結果，オキソリン酸については，平均回収率
は 71.1~94.4 %，その繰返し精度は相対標準偏差（RSD）として 11 %以下，フルメキンについて
は，平均回収率は 71.5~90.5 %，その繰返し精度は RSD として 16 %以下の結果が得られた．

6)

本法は試料中のオキソリン酸を 0.5 mg/kg，フルメキンを 0.3 mg/kg で検出可能であった．

7)

魚粉及び成鶏飼育用配合飼料にオキソリン酸及びフルメキンとして各 3 mg/kg 相当量をそれぞ42

飼料研究報告 Vol. 34 (2009)

れ添加した試料を用いて，8 試験室で本法による共同分析を実施した．その結果，オキソリン酸について，魚粉では，平均回収率は 83.0 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度はそれぞれ
相対標準偏差（RSDr 及び RSDR）として 6.1 %及び 9.5 %であり，HorRat は 0.68 であった．また，成鶏飼育用配合飼料では，平均回収率は 88.7 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度はそれ
ぞれ RSDr 及び RSDR として 5.9 %及び 6.6 %であり，HorRat は 0.48 であった．フルメキンについて，魚粉では，平均回収率は 82.0 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度はそれぞれ相対
標準偏差（RSDr 及び RSDR）として 4.1 %及び 8.3 %であり，HorRat は 0.59 であった．また，成鶏飼育用配合飼料では，平均回収率は 87.7 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度はそれぞれ RSDr 及び RSDR として 5.5 %及び 6.9 %であり，HorRat は 0.50 であった．
なお，本法は，平成 21 年 5 月 1 日付けで飼料分析基準に収載された．
謝

辞

共同試験にご協力頂いた財団法人日本食品分析センター多摩研究所，社団法人日本科学飼料協会
科学飼料研究センター，JA 東日本くみあい飼料株式会社本社分析センターの試験室の各位に感謝の意を表します．
文1)

献財団法人日本食品分析センター：平成 19 年度飼料中の有害物質等残留基準を設定するための分析法開発及び家畜等への移行調査委託事業飼料中の有害物質等の分析法の開発 (2008).

2)

厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知：“食品に残留する農薬，飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法”，平成 17 年 1 月 24 日付け食安発第 0124001 号 (2005).

3)

農林水産省消費・安全局長通知：“飼料分析基準の制定について”，平成 20 年 4 月 1 日，19
消安第 14729 号 (2008).