1

総数 1,061件

被害者 13,018名

細菌・ウイルスが原因の事例
603件
11,770名
消費者にとって脅威
食品工場では食中毒は致命的
食中毒発生 → 営業停止3日間+社会的信用の失墜例）25億円以上の損失＠中大手（年売上350億）2食品衛生検査指針・微生物編
公定法，およびそれに準ずる標準試験法
平板菌数測定標準法：寒天培地を用いたコロニー計数
簡便法：各種細菌に対応した乾式フィルム培地

寒天培地

乾式フィルム培地

培養（1～2日間）を要するため判定には数日以上
日常的な自主管理において非培養系の迅速な検出法の開発は喫緊の課題
3

培養法

構成・培養設備

PCR法
・検出器・試薬キット
・クリーンベンチ

IC法
・チップ（+培養設備）

測定範囲
（細菌）

〇
1細胞～

〇
1-107 細胞▲105 細胞＜

検査時間

×
1日以上

〇
3時間以上

▲
15分（+数時間）

ランニング〇～1000円

×2000円＜〇
500～1000円/回

その他

×設備
×多工程×人件費

×装置・設備
×多工程
×人件費

（×設備）
（×多工程）（×人件費）

4イムノクロマト（IC）法

万能な検査法はない

Influenza virus＆ SARS-CoV-2
Pregnancy test
Food poisoning etc.

・操作が簡単・特殊装置が不要

・低コスト
・ある程度の感度や選択性など，どの現場でも望まれている。

新たな検出技術の開発
・検出法の選択肢を増やす
迅速（15分）⇔ 低感度（>105 cells/mL）

・現場に合った検査を実現
5

標的物質

RED

BLUE

Colorimetric detection
6

J. Electrochem. Soc. 2013, 160, H630
J. Electrochem. Soc. 2011, 158, D689
J. Electrochem. Soc. 2009, 156, D558
J. Electrochem. Soc. 2007, 154, D462
Electroanalysis 2005, 17, 2224

7

分散凝集1D

2D

3D8

電子顕微鏡像

1 nm

2 nm

30 nm

60 nm

100 nm

粒径の異なる金ナノ粒子分散液
金ナノ粒子の光散乱

光散乱スペクトル

凝集によって散乱光色が異なる

金ナノ粒子の暗視野像

波長が異なる→色が異なる
Analyst 2022, 147, 23559

電子顕微鏡像

ラズベリー状ナノ構造体
粒径100 nm

金ナノ粒子の光散乱

光散乱スペクトル

凝集によって散乱光色が変わらない

Chem. Commun. 2006, 4288
Chem. Commun. 2009, 3615
Chem. Commun. 2014, 50, 6252

金ナノ粒子の暗視野像

波長が同じ→色が同じ

令和元～3年度 JST-START・プロジェクト支援型「高感度標識による細菌及びウイルスの迅速検出」

10

散乱光の・強さ（強度）・色（波長）が分散状態に依存しない光学標識として機能標識の光散乱を利用しAnal. Chem. 2022, 94, 10984
た細菌の迅速検出

令和3年度 JST-SCORE「金属ナノ粒子の光学特性を活用した迅速微生物検出法の開発」

11標識の光信号のみならず電気信号に着目

令和元～3年度 JST-START・プロジェクト支援型「高感度標識による細菌及びウイルスの迅速検出」

12

Acetyl-CoA

CitrateOxaloacetate

Isocitrate
NAD+NADH,H+NADH + H+

クエン酸回路NAD++CO2細胞活性の電気計測

α-ketoglutarate

MalateNAD+Fumarate
Succinyl-CoA
FADH2

Succinate
FAD+NADH + H++ H-SCoA ＋CO2

GDP

H-SCoA + GTP

細胞内の電子伝達に着目
13

MTT＋Formazan

従来のアッセイ

NADHによるMTTの還元反応に着目

細菌活性を比色によって評価
14

菌液滴下

310 K

ろ過

振盪培養
～１ h
0.1 mM MTT(グルコース含有培地)

菌種：E.coli K129.8×108 CFU mL-1

上清吸光度測定

細菌懸濁液沈殿物
顕微鏡観察15赤いロッド状の散乱光で生細胞中にフォルマザン結晶が生成していることを確認

Anal. Chem. 2018, 90, 10903

手順
2 細胞内へのMTTの取り込み（1時間）（MTTがホルマザンへ還元される）
3 ITO電極への微生物の塗布＋ドライヤーで熱乾燥
4 そのままボルタンメトリー（吸着）肥養液
10 mM MTT 50 µL
培地 950 µL
37℃, 1.5 時間 培養

3M社ペトリフィルム™
生菌数測定用プレート

37℃, 24時間 培養

大腸菌を肥養液に添加・測定
検査培養法

本開発

時間/hour

241.5

結果/cells mL-1

4.9±0.2×104

5.0±0.2×104
16

懸濁液

ΔIIc：細菌のMTT取込み量

Anal. Chem. 2023, 95, 12358

電流応答も吸光度も時間の経過と共に減少

残存MTTに起因

残存MTTの電流応答の変化量（減少量）から生菌計測が可能

17

本法（1 h）

E.coli K12実サンプル（●）（♦） ：腐敗鶏肉分散液

1.08±0.02×106 CFU mL-1
コロニー計数法（24 h）

1.17±0.03×106 CFU mL-1
MTTの膜透過性，細胞の増殖速度

E.coli K12 ≒

実サンプル
（内訳）
一般生菌 87％
乳酸菌
13％Anal. Chem. 2023, 95, 12358

18細菌活性の定量的評価のための方法論の開発
細胞の機能計測の対象

references

酵素活性

酸化還元物質Anal. Chem., 2018, 90, 10903
Anal. Chem., 2023, 95, 12358

呼吸

酸素消費量

Anal. Chem., 2019, 91, 12793

生成物

細胞外高分子物質（EPS），電子

Anal. Chem., 2018, 90, 4098
Anal. Chem., 2019, 91, 14401

どのように計測するか分光学的? 光学的? 電気化学的?
どれがベスト?

Anal. Chem. 2019, 91, 12793

19万能な検査法の開発は困難

・操作が簡単・特殊装置が不要

どの現場でも望まれている。

・低コスト
・ある程度の感度や選択性

20新たな検出技術の開発
・検出法の選択肢を増やす
・現場に合った検査法について共同開発

開発に要する期間や金額など開発に対する熱量が同じ
21

・特願2023-111023「細胞活性の測定装置，その測定方法およびその測定用キット」
発明人：椎木 弘他，出願人：公立大学法人大阪・特願2022-103822(PCT/JP2023/16896)「生菌センサ」
発明人：椎木 弘他，出願人：公立大学法人大阪・特願2021-032552(PCT/JP2021/048534)「細菌および／またはウイルスを検出する検出装置，検出方法および標識キット」
発明人：椎木 弘，出願人：公立大学法人大阪・第6358610号（特願2013-174694）「被検出微生物を検出する検出方法」,
発明人：椎木 弘，長岡 勉，出願人：公立大学法人大阪222001～現在

医療機器，家電，材料，繊維，半導体，化粧品など計30社以上と共同研究実施

2005～2008 NEDO産業技術研究助成事業助成「ワンステップナノめっき法によるプラスチックビーズの導電化技術の開発」

2008～2009 JST大学発ベンチャー創出推進事業「低環境負荷ナノめっき法を用いた高密度実装材料の開発」GreenChem株式会社
2009

JST シーズ発掘試験A（発掘型）「金属ナノ粒子を用いたフレキシブル導電性パターンのワンステップ作製技術の開発」

2011～2012 JST A-STEP FS シーズ顕在化タイプ「バイオフリー技術により作製するコレステロールセンサとその実用化の研究」
2012～2013 JST A-STEP FS シーズ顕在化タイプ「金属ナノ粒子を用いる新規電子回路形成法の開発」
2012～2013 JST A-STEP FS

探索タイプ「導電性磁性マイクロビーズを用いたワンステップ免疫検査法の開発」

2013～2015 農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業「細菌鋳型の迅速作製技術を応用する食品分析リアルタイムセンサの開発」
2013～2015 戦略的基盤技術高度化支援事業「電力品質の高安定化を実現する省スペース型・高機能扁平メタセラ抵抗体の研究開発」
2015～2016 JSTマッチングプランナープログラム・探索試験「微量細菌のワンステップ検査を実現する超高感度マイクロプレートの開発」
2017～2019 戦略的基盤技術高度化支援事業「縫製及び洗濯耐久性に優れたスマートテキスタイル向けセンサ用並びに配線用導電性縫い糸の開発」

2019～2021 JST-START・プロジェクト支援型「高感度標識による細菌及びウイルスの迅速検出」
2021

JST-SCORE 「金属ナノ粒子の光学特性を活用した迅速微生物検出法の開発」

2021

NEDO先導プロ・エネ環 「バイオ分離・還元ナノ粒子化技術による貴金属回収・高付加価値化の研究開発」

23

大阪公立大学
学術研究推進本部URAセンター 井端雅一
TEL072－254－ 9128
FAX
072－254－ 7475
e-mail gr-knky-uracenter＠omu.ac.jp
研究グループHP：
https://www.omu.ac.jp/eng/apchem_10/24