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浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）＜平成 20 年度助成＞

カボチャでアルツハイマー病改善－ニコチアナミンによる記憶改善とその作用解明－高田晃（弘前大学農学生命科学部）

1.

本研究ではカボチャに含まれる ACE 阻害物質をはじめに特定するとともに、その記憶改善効果を調べた。

高齢化が進行するわが国において高齢者医療費

また構造活性相関研究により、天然物より高活性の 3 割強を占める高血圧症の克服は大きな研究課

な ACE 阻害剤を見出すことができたので報告し題である。また、高齢化に伴い顕在化した認知症、たい。

特にアルツハイマー型認知症の予防や治療への注目も増している。最近、脳関門透過型アンジオテ

2.

カボチャに含まれる ACE 阻害物質の同定

ンシン I 変換酵素（ACE）阻害剤がアルツハイマー

カ ボ チ ャ（2.0 kgFW、FW： 生 重 ）を 粉 砕 後、型認知症の発症を有意に低下させる1）との報告が

遠心分離し、得られた上清画分を陰イオン交換なされた。これを裏付けるように、ACE 阻害剤

クロマトグラフィーにて分離した。0.3 M HClaq

2, 3）

や

で溶出された画分を陽イオン交換クロマトグラ

高血圧症患者でのノンコンプライアンス（薬の飲フィー、ゲルろ過クロマトグラフィーにて順次

み忘れ）の改善 4）に関する報告もある。よって、分離すると、ACE 阻害活性画分 0.20 g を得るこ

脳関門透過型 ACE 阻害物質あるいはそれを多くとができた。最後に本活性画分 32 mg（カボチャ含む食材には高血圧症とアルツハイマー型認知症

0.30 kgFW 相当）を、TSK-SAX カラムを用いたを同時に改善させる可能性が期待される。

HPLC にて精製すると、ACE 阻害物質 4.5 mg をによるラットやマウスの記憶保持増強効果

ACE はアンジオテンシン I から強力な血圧上単離することができた（Table 1）。得られた ACE

昇作用を有するアンジオテンシン II への変換を阻害活性物質は各種 NMR スペクトル、MS スペ

促進する酵素であり、血圧調節機構における重要クトルの解析によりニコチアナミンであることが性とともに、その作用機構もよく調べられている。
一方、記憶保持との関わりについては、1）脳関門
透過型 ACE 阻害剤のみが記憶改善効果を示すこと、2）脳内 ACE が記憶保持に関わる脳内ペプチ

Figure 1

ニコチアナミンの構造

Table 1

ニコチアナミンの精製

ド、LVV- ヘモルフィン -7 の分解を触媒する5）ことから、脳内 ACE の阻害が記憶保持増強に関係

separation

weight/g

IC50 (µg/mL)

recovery (%)

180

310

100

AG 1-X8

2.0

3.5

98

Dowex 50W-X4

0.95

1.7

96

それには脳関門透過型 ACE 阻害物質が含まれてSephadex G-25

0.20

1.0

34

いることが示唆された。以上のような背景から、

TSK-SAX0.00450.15

17していると考えられている。最近、早狩らはカボチャ抽出物から得られた ACE 阻害活性画分の血圧降下作用と記憶保持増強効果を見出しており、

25

カボチャでアルツハイマー病改善－ニコチアナミンによる記憶改善とその作用解明－
6.0

性試験は早狩らの方法 6）に従い、ACE はラット

5.0Area / 104判明した。なお、分離の指標とした ACE 阻害活
脳より調製したものを用いた。
ニコチアナミン

7-10）はその代謝産物であるムギ

ネ酸 11-13）とともに植物体内における金属イオン

4.0
3.0
2.0
1.0
0.0

輸送に関わる物質であるが、ACE 阻害活性も報告されている

y=0.0267x+0.0529
R2 =0.9977

0

50

100

150

200

ニコチアナミン /ng

14）。また、ニコチアナミンは腸かFigure 2

ら吸収された後、血圧降下作用を示すことが高血Calibration curve of nicotianamine

圧症モデルラットやマウス15）を用いた実験から

親水性カラム Cosmosil Ⓡ -Hilic をプレカラムとし明らかになっている。本物質が早狩らが明らかにて利用すると、効果的に夾雑物を分離でき、定量したカボチャエキスの作用の活性本体であることが可能であることが判明した。

が考えられる。しかし、精製後のニコチアナミン

定量実験には陽イオン交換クロマトグラフィーの回収率は 17%と低く、結論付けるためにはカボ

後の ACE 阻害活性画分を用いた。溶媒はアセト

チャ粗抽出液にその活性を説明するに足る量のニ

ニトリル ‐ 水 ‐ ギ酸（60:40:0.1）を使用した。そのコチアナミンが含まれているのか定量しなければ結果、カボチャエキスのニコチアナミン定量値ならない。また、ニコチアナミンが記憶改善に関は 104 mg/kgFW であった。これはカボチャエ

与するのかどうかについても不明である。そこで、キスの ACE 阻害活性がニコチアナミンに起因す

以下の節ではニコチアナミンの定量とその記憶改ると仮定したときのニコチアナミン量（128 mg/

善効果について検討した。

kgFW、ニコチアナミンの IC 50=1.7 μ M）と良い

3.

質量分析を利用したニコチアナミンの定量一致を示した（Table 3）。以上の結果、ニコチア
ナミンがカボチャの ACE 阻害活性本体であると

ニ コ チ ア ナ ミ ン の 定 量 法 に 関 し て HPLC・

結論付けることができた。ニコチアナミンは多く

16-18）ESIMS を利用した方法が複数報告されているの植物に存在することが知られている8, 9）。そこが、いずれも Dansyl 化や Fmoc 化といった誘導で、約 30 種の食材の ACE 阻害活性を調べたとこ化を必要としている。本研究では誘導化をするころ、カボチャ以外にダイズ、ナス、トマトのエキとなく定量する方法を検討した。

スに ACE 阻害活性を見出した（Table 2）。さらに、ニコチアナミンは両性イオン性であるため、上述の方法でニコチアナミン量を定量したとこ

ESIMS による検出感度が高いことが予測できた。

ろ、いずれも活性から予測される値と良い一致を

そこで、ニコチアナミンの質量分析を行い、分子示した。このように今回の研究で調べた限りにおイオンピーク [m/z 304.15 (M+H) ] のイオンピー

いては、ACE 阻害活性を示す食材の活性本体はク面積とニコチアナミン量に一次相関があるこ

すべてニコチアナミンであることが分かった。ニとを確認した（Figure 2）。その検出限界は 2 ng、コチアナミンは食経験豊富な食材にすでに含まれ定量限界は 6 ng であった。しかし、ニコチアナていることから、その安全性は高いと考えられた。

+

ミンは極性が高く、汎用担体である ODS では保持ができないため、夾雑物が多い粗精製エキスで

4.

ニコチアナミンの長期記憶改善効果

そのまま定量実験をすると、定量精度が下がって前述のように、早狩らはモーリス水迷路法によしまう。そこで、種々の分離条件を検討した結果、りカボチャの ACE 阻害活性画分の長期記憶保持26

浦上財団研究報告書
Table 2

Vol.18（2011）

各種食材エキス (0.02gFW/mL）の ACE 阻害活性

阻害活性（％）

阻害活性（％）

阻害活性（％）

カボチャ

82

オクラ

2

サツマイモ

6

ナス

86

ゴーヤ

1

シイタケ

2

トマト

83

ニンジン

1

マイタケ

1

ダイズ

90

ダイコン

9

ブナシメジ

8

タマネギ

26

葉ダイコン

3

ナメコ

1

リョクトウ

9

ナガイモ

13

エノキ

20

ツルムラサキ

3

バレイショ

13

リンゴ

8

ピーマン

2

キャベツ

3

ナシ

8

ブロッコリー

10

ミズナ

3

ブドウ

14

アスパラガス

4

コマツナ

10

プルーン

3

モロヘイヤ

1

Table 3

各種食材のニコチアナミン定量結果

食材

定量値 a (mg/kgFW)

予測値 b (mg/kgFW)

カボチャ

104

128

ダイズ

65

69

ナス

25

トマト

31

a

ESIMS から算出したニコチアナミン量b

ACE 阻害活性から算出したニコチアナミン量

Table 4ニコチアナミンによる長期記憶保持増強効果

Days
1

2

3

4

非投与区

48±15.1

44±12.2

26.3±10.8

18.5±11.7

22

1 mg 投与区

51±11.6

19±13.3

12.3±4.0

10.7±10.835

5 mg 投与区

45±9.27.5±4.1

10±4.49.5±7.6* ゴールまでの時間 /sec

増強効果を明らかにしている。そこで、カボチャ

般に脂溶性が高いほうが脳関門を通過しやすいとより精製したニコチアナミンをマウス（SD, 10 週

考えられているため、カルボキシル基やアミノ基

齢、雄、各試験区 3 匹）に自由摂食させ、長期記といった極性官能基を複数具えているニコチアナ

憶改善効果を 4 日間測定した。なお、記憶保持のミンが本当に脳関門を通過しているのか興味が持

解析はモーリス水迷路法にて行い、標的へ到達時たれる。今後、放射ラベル化ニコチアナミンを利間で評価した。飼料の調製は粉餌 125 g にニコチ用した透過性実験を行う必要があろう。

アナミン 1 mg または 5 mg を含むように蒸留水とともに混合し、適当な大きさに裁断したものを乾燥させてから用いた。

5.

ニコチアナミンの構造活性相関研究
カプトプリルなど ACE の基質結合部位へ結合

その結果、試験開始２日目以降、ニコチアナミする阻害剤の作用機構については X 線解析など

ン投与区では非投与区に比べ、濃度依存的に長によりすでに詳しく調べられているが、ニコチア

期記憶保持の増強効果が認められた（Table 4）。

ナミンによる阻害機構についてはよく分かっていよって、カボチャエキスの長期記憶保持増強効果ない。ニコチアナミンは植物体内においてキレーはニコチアナミンによる作用であることが明らか

タとして働き、金属イオンの輸送に重要な役割をとなった。脳関門透過型 ACE 阻害剤のみがアル担っていることが知られている10, 19）。このため、ツハイマー病発症を抑制するとの報告 1）を考慮す

代表的なキレータである EDTA と同様に、ニコ

ると、ニコチアナミンは脳関門透過型 ACE 阻害

チアナミンの亜鉛イオン（ACE の中心金属原子）

物質として機能している可能性が示唆された。一への配位が阻害メカニズムの本質であると考えらカボチャでアルツハイマー病改善－ニコチアナミンによる記憶改善とその作用解明－27れていた。しかし、ニコチアナミンによる ACE

予測できるものの、環状構造の必要性については

阻害活性は高濃度金属イオン存在下においても抑疑問であった。また、2- カルボキシアゼチジンが制されず、ニコチアナミンは同じく亜鉛イオンを高価であることも、その誘導体調製や今後の研究

活性中心部位に有する leucine aminopeptidaze や展開の障害になると考えられたので、本研究ではalkaline phosphatase の阻害を全くしないことな

アゼチジン環部位に的を絞った構造活性相関を調

どから、上述の機構は疑わしい。また、速度論実べることとした。具体的には、2- カルボキシアゼ

験でもニコチアナミンによる ACE 阻害形式は従

チジンを最も単純なアミノ酸であるグリシンに変来の阻害物質のような競合阻害ではなく混合阻害

換した 7b、ニコチアナミン結合部位の周辺環境であることも指摘されている20）。これらのことはに関する知見を得るために異なる化学的性質の側ニコチアナミンが ACE と基質結合部位とは異な鎖を有するアミノ酸（プロリン、フェニルアラニる部位に結合してその酵素活性を阻害するアロス

ン、グルタミン酸、ロイシン）に変換した各種類

テリック阻害剤であることを示唆しているが、結縁体 7c-7f を合成した（Scheme 1）。また、阻害活

合部位や結合によりどのような構造変化が起きて性発現に 3 量体構造が必須であるかを調べるため

いるかなど、その詳細は不明である。

に、ホモセリン部位を一つ減らした 2 量体類縁体

著者はニコチアナミンの作用機構を調べること

5a-5f も合成した。なお、ニコチアナミンあるいが、従来の ACE 阻害剤とは異なるタイプの阻害は類縁化合物であるムギネ酸の合成研究はすでに剤開発につながると考え、構造活性相関研究を複数例知られている行った。ニコチアナミンは非ペプチド性のアミノ

22-24）

らの合成方法が、今回の実験では大船

21）を参考にした。

酸 3 量体であるが、極性官能基であるα - アミノ

合成した各種類縁体の ACE 阻害活性試験の結酸部位は ACE との水素結合による相互作用に重果を Table 5 にまとめた。6 種類の 2 量体類縁体要であろうと予想した。一方、2- カルボキシア

5a-5f はいずれも阻害活性を全く示さず（IC 50 >50

ゼチジン部のカルボン酸部の相互作用の必要性はmg/L）、阻害活性発現にはアミノ酸ユニットがScheme 1

ニコチアナミン類緑化合物の合成

28

浦上財団研究報告書

3 つ以上必要であることが示された。グリシン類縁体 7b とプロリン類縁体 7c の阻害活性（IC 50 =Vol.18（2011）

6.

まとめ

0.15 mg/L）は意外なことに、天然物であるニコ

本研究では、LC-ESIMS を利用した定量によりチアナミンの活性（IC 50 = 0.50 mg/L）より約 3 倍

カボチャに含まれる ACE 阻害活性本体がニコチ強いことが示された。ニコチアナミンのアゼチジアナミンであることを示した。また、モーリス水

ン環は歪みの大きな 4 員環構造であるため、7b-c

迷路法によりニコチアナミンの長期記憶改善効果のような鎖状構造や 5 員環構造に比べ、O=C-C-N

についても明らかにした。ニコチアナミンはカボの角度が約 5°大きい（Figure 3）。これがカルボ

チャ、ダイズなど食経験豊富な食材に多く含まれキシル基と ACE 側鎖との水素結合相互作用にわるため、安全性が高いことが予想される。また、

ずかなミスマッチを生じさせたのかもしれない。

熱安定性が高いため、加熱調理による分解もない。

フェニルアラニン類縁体 7d の ACE 阻害活性（IC 50

高齢化社会の進行に伴って高血圧症あるいは認知= 0.05 mg/L）はニコチアナミンの活性より 10 倍症患者が増加傾向にあることを考慮すると、ニコ

強く、カプトプリルに匹敵するほどであった。7d

チアナミンあるいはそれを多く含んだ食品素材ののベンゼン環がニコチアナミンの結合部位付近にニーズは今後益々高まると期待される。

存在する芳香族性残基と付加的な相互作用が生じニコチアナミンの作用機構は従来の ACE 阻害たためと考えられた。一方、グルタミン酸類縁剤とは異なることが指摘されている。そこで各種

体 7e、ロイシン類縁体 7f はいずれもニコチアナ

類縁体を化学合成し、構造活性相関研究を行った。

ミンより約 4 倍、グリシン類縁体と比較するとその結果、2- カルボキシアゼチジン環部分をフェ

約 10 倍活性が低下していた。アニオン性側鎖やニルアラニンに変換することで、活性が約 10 倍

脂肪族性側鎖の存在が ACE との相互作用を低下

上昇することを見出した。これにより各種アルツさせたためであろう。このように、各種類縁体のハイマー病モデルマウスへのニコチアナミン投与

ACE 阻害活性を調べることで、未知のニコチアを通じて長期記憶改善効果の科学的根拠を知るた

ナミン結合部位の化学的環境に関する情報を得る

めの量的供給が容易になった。今後、ラベル化ニことができた。今後、これらの知見をもとにニコ

コチアナミンを供給し、結合部位特定や脳関門透チアナミン結合部位の特定を目指したい。

過性を調べていきたいと考えている。
謝

辞
本研究に対し多大なご助成を賜りました浦上食品・食文化振興財団に心から感謝いたしますととFigure 3
Table 5ニコチアナミン誘導体の ACE 阻害活性

IC 50 (mg/L)

IC 50 (mg/L)
カプトプリル

0.035

もに、貴財団の益々のご発展を祈念申し上げます。
また、本研究を遂行するにあたり ACE をご供与
いただきました弘前大学医学部の早狩誠教授に深ニコチアナミン

0.50

5a

>50

5b

>50

7b

0.15

5c

>50

7c

0.15

文

5d

>50

7d

0.050

5e

>50

7e

2.0

5f

>50

7f

2.0

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く感謝いたします。
献カボチャでアルツハイマー病改善－ニコチアナミンによる記憶改善とその作用解明－
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浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）

Memory Improvement Effect of Nicotianamine
and Its ACE Inhibitory Mechanism
Noboru Takada
Faculty of Agriculture and Life Science, Hirosaki University
Hypertension and Alzheimer’s disease are the serious issues on our health. The
angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitors have been considered to be one of themost important hypertensive drugs, since ACE catalyzes the hydrolysis of angiotensin I
to generate angiotensin II, a potent vasoconstrictor. Recently, it was reported that brain
penetrating ACE inhibitors such as captopril can reduce the incidence of Alzheimer’s
disease in elderly hypertensive patients. These evidences indicate that brain penetrating
ACE inhibitors can prevent both hypertension and Alzheimer’s disease. In this report, we
describe the identification of an ACE inhibitor (nicotianamine) from pumpkin which can
improve hypertension and long-term-memory function.
Nicotianamine (4.5 mg) was isolated from 2.0 kgFW of pumpkin in the guidance of invitro ACE inhibitory assay. We developed a quantification method employing LC-ESIMS
system and Cosmosil® HILIC column and then identified that nicotianamine is the mostavailable ACE inhibitor from vegetable sources such as pumpkin and soybean.
It was showed with Morris water maze test in mice that treatment of nicotianamine
improved long-term-memory function in dose-dependent manner. Taking the memory
improvement effect by brain penetrating ACE inhibitor into account, nicotianamine wassuggested to have a potential to penetrate blood-brain-barrier.
Although it has been well-known the antihypertensive effect of nicotianamine, its
detail ACE inhibitory mechanism has not been identified. Nicotianamine does not haveenough potential to chelate zinc ion and cannot inhibit Zn containing enzymes, except for
ACE. Furthermore, its inhibition pattern for ACE is that of mixed inhibition, different fromother inhibitors which show competitive pattern. To examine its inhibitory mechanism
more, we prepared 11 nicotianamine derivatives (5a-5f, 7b-7f) and then carried out thestructure-relationship study. As the results, it was found that azetidine ring moiety is notnecessary for exhibiting the activity and that phenyl group in 7d enhances the activity
because of additional π-π interaction with ACE residue. These results gave an importantclue for clarifying the inhibitory mechanism of nicotianamine for ACE.