［II］組織・器官幹細胞：臨床応用への基盤開発（1）●幹細胞と細胞療法

2．マウス中枢神経系の細胞系譜制御に関わるサイトカインシグナリング
田賀哲也＊

中枢神経系を構成するニューロン，アストロサイト，オリゴデンドロサイトなどの細胞は神経幹細胞から分化成熟するが，その細胞系譜の制御は細胞内在性のプログラムや細胞外来性のサイトカインシグナルなどにより担われている．本研究は胎生期マウス終脳神経上皮細胞の初代培養系を用いて，サイトカインシグナルによる神経幹細胞の分化制御機構を明らかにする目的で行われた．Interleukin-6（IL-6）ファミリー
サイトカインと bone morphogenetic protein（BMP）ファミリーサイトカインは全く異なるシグナル伝達様式をたどるサイトカインファミリーである．これら 2 つのファミリーそれぞれのメンバー leukemia inhibitory factor（LIF）と BMP 2 とがマウス神経上皮細胞に相乗的に作用しアストロサイトへの分化を誘導した．アストロサ
イトのマーカー蛋白 glial fibrillary acidic protein（GFAP）の遺伝子プロモーターの活 性 化 に は，LIF と BMP 2 の 下 流 の 転 写 因 子 signal transducer and activator oftranscription 3（STAT 3）と Smad 群の双方の活性化が必須であった．転写補助因子
p 300 の媒介により，STAT 3 と Smad 1 はサイトカイン刺激依存的に複合体を形成した．p 300 を神経上皮細胞に強制発現させると，LIF と BMP 2 による相乗的な GFAP遺伝子プロモーター活性化が増強されることなどから，STAT 3 p 300 Smad 1 の複合体形成により 2 種類のシグナル伝達経路が核内で統合され，相乗的なアストロサイトの分化が誘導されるものと考察される．

Cytokine signalings involved in the regulation of cell fate modulation in the developing mouse brain
TETSUYA TAGA Department of Cell Fate Modulation, Institute of Molecular Embryology and Genetics, Kumamoto University
たが・てつや：熊本大学発生医学研究センター転写制御分野教授．
昭和63年大阪大学大学院医学研究科修了．平成８年東京医科歯科
大学難治疾患研究所分子細胞生物学分野教授．平成12年現職．主研
究領域／細胞生物学，分子生物学，幹細胞制御．
＊50 第 117 回日本医学会シンポジウム

Key words

神経幹細胞
STAT 3
Smadp 300

Self renewal

Neural Stem Cell

Differentiation

NeuronAstrocyte

Oligodendrocyte

図 1 神経幹細胞から各細胞系譜への分化
ニューロン，アストロサイト，オリゴデンドロサイトなど中枢神経系を構成する細胞は神経幹細胞から分化成熟するが，その制御機構の一端をサイトカインは担っている．本研究ではサイトカインシグナルによるアストロサイトの分化機構に焦点をあてる．

tin M（OSM）は IL-6 ファミリーサイトカイン

1．LIF と BMP 2 による相乗的な神経上皮細胞からのアストロサイト分化に属しており，いずれもそれぞれの受容体複合体中に膜蛋白 gp 130 をシグナル伝達に必須のコンポーネントとして共有している．各ニューロン，アストロサイト，オリゴデン

サイトカインはそれぞれに特異的な結合鎖とドロサイトは中枢神経系を構成する主要な細の結合に伴い，gp 130 同士 の ホ モ 2 量 体 化胞種であるが，これら 3 つの細胞系譜はいず（IL-6，IL-11）あるいは gp 130 と構造的に類1）

れも神経幹細胞から分化する（図 1）．神経似な受容体コンポーネントとのヘテロ 2 量幹細胞はこれらの細胞系譜への分化能力を保体化を誘導する（LIF，CNTF，CT-1，OSM）．

持しながら自己複製するとともに，様々な要

この 2 量体化により，gp 130 の細胞内領域に因により分化の運命付けが行われ，各系列へ

構 成 的 に 会 合 し て い る Janus kinase（JAK）の分化が進行する．サイトカインはそのようファミリーに属するチロシンキナーゼが活性な細胞系譜制御の一翼を担っていると考えら化される．JAK キナーゼ活性化が引き金となれ る．本 研 究 で は，LIF と BMP 2 と い う 2り，転写因子 STAT 3 がチロシンリン酸化を種類の異なるサイトカインの下流のシグナル受け，ホモ 2 量体化して核へ移行し標的遺伝の協調作用によるアストロサイト分化機構に2）子の転写を制御する（図 2，右パネル）．

焦点をあてる．

BMP 2 は transforming growth factor-β

LIF，IL-6，IL-11，ciliary neurotrophic fac-（TGF-β）スーパーファミリーのサブファミ

tor（CNTF），cardiotrophin-1（CT-1），oncosta-

リーである BMP ファミリーに属するサイト
幹細胞と細胞療法 51

図2

LIF と BMP 2 に よ る 相 乗 的 な ア ス ト ロ サ イ ト の 分 化 誘 導 な ら び に LIF とBMP 2 の細胞内シグナル伝達機構（左パネル）胎生 14.5 日目マウス終脳の未分化神経上皮細胞に LIF と BMP 2 を図に示した組み合わせで添加して 2 日間培養したのち，抗 GFAP 抗体による蛍光免疫染色とヘキスト 33258 による核染色を行った．明るい星状の細胞がアストロサイトを，また暗いドットは核の存在を示す．
（右パネル）LIF と BMP 2 は異なるシグナル伝達経路を活性化する．詳細は本文参照．

カインである．
セリン スレオニンキナーゼド

養系に添加して 2 日間培養した．アストロサ

メインを細胞内領域に有するタイプ I およびイトへの分化の程度を，その典型的なマータイプ II 受容体各 2 分子ずつのヘテロ 4 量

カー蛋白 GFAP の発現ならびに細胞の形態体を介して，細胞内にシグナルを伝達する．

を指標に検討した．図 2（左パネル）に示すよBMP 2 の結合によって活性化された受容体

うに LIF および BMP 2 それぞれを単独で添

は転写因子 Smad 1，Smad 5，Smad 8 のセリ加した場合には，アストロサイトの出現が検ン残基をリン酸化する．セリンリン酸化され出限界以下であるのに対し，それら 2 つのサ

たそれらの Smad は，Smad 4 とヘテロオリゴ

イトカインの同時添加によって劇的にアストマーを形成後，核へ移行し特異的遺伝子の転ロ サ イ ト が 出 現 し た．こ の こ と は，LIF と3）写を誘導する（図 2，右パネル）．

BMP 2 という異なる 2 種類のサイトカイン

このように，LIF と BMP 2 は全く異なる受のシグナルが相乗的に作用して，神経上皮細容体システムを介して，それぞれに特異的な胞からアストロサイトへ分化誘導させること転写因子を活性化することにより，生物活性を示している．

を発揮するサイト カ イ ン で あ る．こ れ ら 2種類の異質なサイトカインを，神経幹細胞を含有するマウス胎仔未分化神経上皮細胞の培
52 第 117 回日本医学会シンポジウム

図 3 転写補助因子 p 300 を介した LIF と BMP 2 シグナルの核内融合
LIF と BMP 2 がそれぞれの受容体に結合することで下流の転写因子 STAT 3 と Smad 1 が活性化されて核に移行し，転写補助因子 p 300 を介して複合体を形成する．この核内複合体形成が LIF と BMP 2 による相乗的な標的遺伝子の活性化をもたらすものと考察される．

ナルに対し抑制性の Smad 6 または Smad 75）

2．LIF と BMP 2 の相乗作用における転写因子 STAT 3 と Smad 群の関与を発現させると，いずれの場合も LIF と BMP2 の同時刺激による相乗的なプロモーターの活性化が抑制された．これらにより，LIF とアストロサイト分化における LIF と BMP

BMP 2 による相乗効果にはそれぞれのシグ2 の相乗作用に，それぞれの下流の転写因子

ナル伝達の下流で活性化される転写因子

STAT 3 と Smad 群が関与するかどうかを検STAT 3 お よ び Smad 群 の 関 与 が 明 ら か と討 し た．ア ス ト ロ サ イ ト の マ ー カ ー GFAPなった．

遺伝子のプロモーター領域をルシフェラーゼ遺伝子の上流につないだコンストラクトを神経上皮細胞にトランスフェクトすると，免疫染色の結果と一致して LIF と BMP 2 による

3．転 写 補 助 因 子 p 300 を 媒 介 と し た
STAT 3 と Smad 1 の複合体形成相乗的なプロモーターの活性化が見られた．

LIF と BMP 2 による相 乗 的 な ア ス ト ロ サ

この系に，活性化に必須なチロシン残基をイトの分化誘導に，それぞれの下流で活性化フェニルアラニンに置換することによって，される転写因子 STAT 3 と Smad 群の関与が細胞内在性の STAT 3 の活性化を阻害する優明らかとなったが，この 2 つの転写因子の物

4）性抑制型 STAT 3 変異体 あるいは BMP シグ理的会合は検出できなかった．そこで種々の幹細胞と細胞療法 53

転写因子と会合して転写活性化を促す転写補6〜8）

助因子 p 300に着目して検討したところ，

COS 7 細胞を用いた強制発現系で STAT 3 p



300 複合体および Smad 1 p 300 複合体 が サ
イトカイン刺激に応じて核内で形成されることが示唆された．さらにサイトカイン刺激に

依 存 し て STAT 3 p 300 Smad 1 複 合 体 が 形成された．この複合体形成に伴う核内シグナルの統合が LIF と BMP 2 刺激による相乗的なアストロサイトの分化誘導を導くものと考9）えられる（図 3）．

転写補助因子 p 300 の細胞内における発現レベルはそれほど高くなく，一般的に遺伝子の転写活性化の際の限定要因となっていることが示唆されているため，このモデルが正しければ遺伝子導入により p 300 の細胞内発現量を増加させれば，サイトカイン刺激によるGFAP プロモーターの活性化が増強されるはずである．実際にこの推測を裏付ける実験結果が得られており，LIF と BMP 2 という異なる 2 種類のサイトカインの下流で活性化される転写因子 STAT 3 と Smad 1 が，p 300 を介して複合体を形成することが転写活性化を〔文献〕
1）McKay R : Stem cells in the central nervous system.
Science 1997 ; 276 : 66―71.
2）Taga T, Kishimoto T : Gp 130 and the interleukin-6
family of cytokines . Annu Rev Immuol 1997 ; 15 :797―819.
3）Heldin CH, Miyazono K, ten Dijke P : TGF-beta signalling from cell membrane to nucleus through SMAD
proteins. Nature 1997 ; 390 : 465―471.
4）Minami M, Inoue M, Wei S, et al. : STAT 3 activation isa critical step in gp 130-mediated terminal differentiation and growth arrest of a myeloid cell line. Proc Natl
Acad Sci USA 1996 ; 93 : 3963―3966.
5）Imamura T, Takase M, Nishihara A, et al. : Smad 6 inhibits signalling by the TGF-beta superfamily. Nature
1997 ; 389 : 622―626.
6）Kamei Y, Xu L, Heinzel T, et al. : A CBP integrator
complex mediates transcriptional activation and AP―1
inhibition by nuclear receptors. Cell 1996 ; 85 : 403―414.
7）Nishihara A, Hanai JI, Okamoto N, et al. : Role of p300, a transcriptional coactivator, in signalling of TGFbeta. Genes Cells 1998 ; 3 : 613―623.
8）Bhattacharya S, Eckner R, Grossman S, et al. : Cooperation of Stat 2 and p 300 CBP in signalling induced
by interferon-alpha. Nature 1996 ; 383 : 344―347.
9）Nakashima K, Yanagisawa M, Arakawa H, et al. : Syn-ergistic signaling in fetal brain by STAT 3-Smad 1
complex bridged by p 300. Science 1999 ; 284 : 479―482.

相乗的に促進する上で重要であることが明らかとなった．

おわりに質疑応答

生体内にはさまざまな種類のサイトカインや増殖分化因子が混在することを考慮すれ（平井） どうもありがとうございまし座長

ば，本研究で示した転写補助因子 p 300 を介た．
まず最初に私から一つおうかがいします．

した異種サイトカインシグナルの核内クロス

確 か に GFAP の 転 写 に は STAT complex

トークのメカニズムは，重要な概念と考えらと，Smad complex の両方が必要であるとい

れる．転写補助因子 p 300 は STAT 3 や Smadうことは非常にきれいに示されました．そこだけでなく，種々の転写因子と会合する能力で一体 Smad が会合することによ っ て 何 をを有しているため，この概念は LIF と BMPやっているのか，というところがよくわから2 によるアストロサイトの分化誘導という一ないのです．

局面だけでなく，広範な生物学的現象に適用

田賀

確かに転写を上げる時に，Smad が可能な普遍的なメカニズムとなる可能性をあった方がよりよく行きます．biological な培もっている．

養実験をして GFAP を染めた場合，Smad の54 第 117 回日本医学会シンポジウム

活性化がなければあのように劇的には行かなで上がるようなプロモーターを用いますと，いので，何かしているというわけです．そこ

その細胞を BMP で刺激すると逆に落ちてしで 考 え ら れ る モ デ ル と し て は，STAT-3 とまいます．ですからクロストークして上がる

p 300 だけでは完全な GFAP のプロモーターのではなくて逆に落ちており，細胞の系もしへの結合もしくは基本転写因子との会合が行

くは遺伝子の系で違う結果が出ているというわれないために Smad を呼んできているのでことも確かです．

はないかと想像されます．Conformation を変（東京大） もともとは同じ origin
渡部徹郎

えてより転写活性を上げるということと，もの細胞が，BMP のあるなしによって neuron

う一つは，プロモーター上に強固に接着すると astrocyte に分かれて行くというお話でした め に 足 場 が STAT-3 だ け で は 弱 い の でたが，同じ precursor cell がそのように BMP

Smad もリクルートしてくる必要があると考のシグナルを受けたり，受けなかったりする察されます．

時の，BMP のシグナルを受けなくなるためのこれが GFAP の活性化についての Smad のメカニズムは receptor level なのか，もしくは役割です．本日はあまりお話ししませんでしligand がなくなるのか，ということはおわかたが，分化の過程で GFAP の活性化というのりでしょうか．

は astrocyte に至る最終段階です．
もう少し前

田賀

多分 receptor は今日お 話 し し た 分の段階で BMP-2 の役割を見てみますと，as-化過程でそこにあるのですが，おそらくクロtrocyte に向かう分化の決定づけは BMP-2 でマチン構造が変わっていて信号を受けられな

行 わ れ て，そ の 後 の GFAP の 活 性 化 は LIFいのではないかということです．今見ていまと BMP-2 の両方に依ります．同じ BMP-2 のすのは，methylation 状況がどうなっている

信号についても，分化の最初と最後で役割がか，acetylation がどうなっているかというこ少し違うような気がします．今日は reporterとです．BMP-2 の信号でメチル化がどう変化の availability か ら GFAP だ け の お 話 を し まするかも見ています．確かに変わっているとしたが，前者についてのシグナルのクロス

い う preliminary な デ ー タ が 出 て い ま す．

トークも今取り組んでいますので，また別のBMP-2 の運命づけの一つの手法はクロマチ機会にお話しできると思います．

ン構造を変えていることで，それが細胞があ座長そうしますと，その系は多分 GFAPるサイトカインによって反応するかどうかをに特異的で，例えば p 300 が活性化する転写決めています．BMP-2 によるクロマチン構造因子はたくさんありますね．それで Smad にの変化が，STAT-3 の結合性を制御している

結合するというのは必ずしも Smad がそれをというモデルを，今私どもは作りつつありま

さらに regulate するわけではないのですね．

す．

田賀

STAT-3 により転写が上がる遺伝子

渡部

先程の笹井先生のお話とも関連しについては，Smad は必ずしも必要としないて，BMP のシグナルが neurogenesis に nega-のです．逆に STAT-3 だけで十分なプロモーtive に働くとしますと，どちらかというと，ターの構造を持っているものについては，astrocyte への分化の時に，それまで BMP のSmad の 活 性 化 が 行 わ れ ま す と p 300 はシグナルがあってもそれを受けられなかった

STAT-3 側からこちらに移動してしまいます

ものが，BMP のシグナルに対する sensitivityので，むしろ抑制するという結果が出ます．といいますか，シグナルを受けられるように実際に先生がご指摘のように，STAT-3 だけなっていると考えてよろしいのでしょうか．
幹細胞と細胞療法 55

田賀precursor の若い段階で BMP-2 の信neurobiologist は皆反省し始めています．その号を受けるとわれわれは考えています．それ場合も，colloid plexus が BMP や，それからおを受けると neurogenesis を抑制しますが，in

そらく何らかの GP 130 の ligand を作っていvivo で は BMP の 信 号 が そ れ 程 た く さ ん なるだろう，そしてそれに面している近傍のく，デフォルトは neuron の方へ行って，たくsubependymal の細胞が GFAP positive で，そさんある環境から astrocyte の発生が進むとの状態からニューロンを作る時，一体何が起考えます．
マウスの場合は astrocyte の発生はきているかということは，想像をたくましく後期にしか出てきませんので，そういう状況できますが，遺伝子発現のレベルではいかが下では，デフォルトが neurogenesis であったでしょうか．

ものが運命づけが BMP-2 の信号で gliogene-田賀

それは非常に興味がありまして，sis に変わり，そこから先へ進めるのが STAT-GFAP 陽 性 の 細 胞 を conversion さ せ て，3 の信号で，その時は両方なければ行かない

GFAP negative に し て neuron に し よ う と いというわけです．運命づけの時に Smad が関う実験をしています．材料的にたくさん手にわっているのか，Smad とは別に，BMP-2 での入る胎生後期のマウスの脳から GFAP 陽性

TAK-1 P 38 の kinase の活性化が関わっていの細胞を採ってきてスフェアを作らせます

るのか，それぞれの pathway が，運命づけのと，GFAP の発現が減ってきます．その後，培時と，astrocyte の最終分化のどちらに働く

養 を 続 け て neurotrophic factor を 入 れ る とか， 非常に複雑な pathway がありますので，MAP-2 陽性の細胞が出てきますので，実験室それを今解明しているところです．

レベルでは，私どものラボでも GFAP 陽性の

（大阪 大） adult brain の GFAP の岡野栄之

細胞集団を neuron に変換することはできた

expression の regulation も，同様の signal cas-のではないかと思っています．おそらく adultcade によって担われているとお考えですか．

でもそういったことが行われていると思いま

そしてそれを示唆するようなデータはお持ちす．

でしょうか．
田賀

岡野

そこで質問ですが，スフェアを作る

今回はすべて胎生期のものを用いま時に，EGF でも FGF でもよいのですが，RAS，した．話を一般化するためには adult の材料

MAP kinase signal は，JAK，STAT 系などを si-を用いてやらなければいけないと思っていま

lencing しているから GFAP の発現が落ちてすが，今はそういった実験をしていませんのきて，しかも self-renewality が上がるというで，何もお答えできない状況です．ただ予想ことでしょうか．

としては同じプロモーターを使っていますの田賀

その silencing というのは報告されで，最 後 の 遺 伝 子 の 発 現 に つ い て は 同 じていますので，EGF，FGF で STAT-3 を抑える

pathway が 行 き ま す．例 え ば 損 傷 を 受 け てことで……．

gliogenesis が 盛 ん に な る 時 に，果 た し て

岡野

BMP-2 と LIF の両方が必要かどうかについですか．ては，解決しなければいけない問題だとは思っています．
岡野

これは私の考えですが，要 す る に

田賀

ただ GFAP を落と し て い る だ け ではなくて，GFAP を落とすことが脱分化ではなくて，まだ見えていない信号があると思う

adult brain の 場 合，GFAP は 必 ず し も astro-のです．

cyte の exclusive marker ではないと，最近は

岡野

56 第 117 回日本医学会シンポジウムだから GFAP が落 ち る と い う こ と

脱 分 化 の 一 つ の 指 標 と し て GFAP

があるというお考えですね．
田賀を抑制するから GFAP が落ちるのではなくGFAP は単なるマーカーなので，私て，確かに GFAP 陽性の astrocyte が減ってはあまり気にしないという考え方なのですいるので，そのマーカーとしてわれわれは見が．ているのです．

岡野

GFAP 陽性状態から negative 状態というのは，脱分化の一指標として考えることができて，それは RAS signal によって抑制がかかって，未分化状態に行くというものの一環ということでよろしいでしょうか．
田賀

STAT の silencing が 完 全 に GFAP

岡野

そうすると区別はむずかしいですね．
田賀

むずかしいといえばむずかしいですね．
座長

他にご質問はありませんか．それでは田賀先生，ありがとうございました．

幹細胞と細胞療法 57