摂食制御に関わる遺伝子ネットワーク解析による食欲制御の分子機構の解明

9〈平成15年度〉

摂食制御に関わる遺伝子ネットワーク解析による食欲制御の分子機構の解明
喜田聡（東京農業大学応用生物科学部バイオサイエンス学科）

1. 摂食行動制御に関する背景に，ラットを48時間絶食させて，ノザンブロット
解析を用いて視床下部におけるこれらペプチド群

ラット脳の破壊実験の結果，視床下部の外側野の発現レベルを摂食時と絶食時との間で比較したは摂食誘導に働く中枢（摂食中枢），腹内側核は摂ところ，NPY，Orexin２），Agouti-related protein

食抑制に働く中枢（満腹中枢）であることが明ら（Agrp）３）， Melanin concentrating hormone

かにされ，視床下部が摂食制御の中枢であること（MCH）４），Ghrelin５）など摂食行動を誘導するペが明らかになった。一方，半世紀以上にわたって

プチド群は絶食時に発現量が増加し，逆に食欲を動物の摂食行動を制御する中心的なパラメーター

抑 制 す るPOMC６），Cocaine-and amphetamine-を同定する実験が行われてきた。しかし，これら

regulated transcript（CART）７） は絶食時に発現の研究から明らかになったことは，食行動制御に量が減少することが明らかとなった（図１）。

はグルコース，ホルモン群（インスリンなど），胃従って，過去の知見及び我々の解析結果から，の拡張度など様々な制御要因が存在するものの，視床下部では体内の摂食状態に応じて神経ペプチ

摂食行動は一つのパラメーターのみによる絶対的ド群の発現量が制御され，この発現変動を介してな制御を受けているわけではないということであ摂食行動が制御されているのではないかと考察しる。従って，栄養状態から精神状態までを含めたた。そこで，視床下部における遺伝子発現制御機多様なパラメーターからの刺激を受け止めて，最構の視点から，摂食行動制御機構を解明すること終的なアウトプットである摂食量を決定するシスを本研究の目的とした。

テムが視床下部に存在し，摂食行動が複雑に制御されていると考えられる。

2. 摂食行動制御に関わる遺伝子群の単離とその発現解析

最近の研究から視床下部の摂食行動制御領域には，Neuropeptide Y（NPY），Orexin，Proopiome-１.のような背景から，摂食行動制御のメカニズ

lanocortin（POMC），Galanin，Attractinな ど 十

ムの解明には，視床下部における遺伝子発現制御種類以上の神経ペプチドを産生する多様な特異的機構の解析が重要であると考えられる。そこで，ニューロンが存在しており，これら神経ペプチド

本研究では，まず，視床下部に発現し，摂食状態群を脳内に注入すると摂食行動が正あるいは負にに応じてその発現レベルが変動する新規摂食制御制御されることであることが明らかにされた１）。

神経ペプチドやその発現制御に関わる新規細胞内

特に，これら神経ペプチド群に関して重要な点因子を同定することを目的として，ディファレン

は，ペプチド群の遺伝子発現レベルが，摂食状態シャル・ディスプレイを用いて摂食状態に応じての変化に応じて制御されていることである。実際発現制御を受ける新規遺伝子群を検索した。

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図１ 絶食と通常摂食時の視床下部における摂食行動制御神経ペプチド群の発現の比較
摂食抑制に働く神経ペプチドは絶食時に発現が低下し，逆に，摂食亢進に働く神経ペプチドは絶食時に発現が上昇する。

７週齢のWister系雄ラットを，水のみを与えた絶食区と，餌と水を与えた自由摂取区に分けて飼

3. 摂食状態の変化に対応した視床下部におけるGP，AK3の発現制御機構の解析育し，48時間後に視床下部よりtotal RNAを調整し，ディファレンシャル・ディスプレイ法を用い摂食状態の変化に対応したGP及びAK3の発現て絶食区と自由摂取区の間で発現量に差を示す遺制御機構を解析するために，絶食させたラットの伝子をスクリーニングした。その結果，視床下部再給餌後の発現変動を解析した。ラットを48時間において絶食にすると発現量が増加する遺伝子と絶食にした後に，再給餌し，０，２，４，８，16，して，Glycogen phosphorylase（GP）とAdenylate

24時間後の視床下部におけるGP，AK3 mRNA発kinase 3（AK3）が同定され，ノザンブロット分析により，絶食にするとmRNA発現量がそれぞれ1.4倍，1.3倍有意に上昇することが明らかとなった。また，マウス脳におけるGP mRNAの発現分布を in situ hybridizationを用いて解析したところ，視床下部，海馬，大脳皮質など脳の広範囲で発現することが明らかとなった。特に，視床下部では，GP mRNAは摂食促進に関わる視床下部弓状核（Arc），背内側核（DMH），外側野（LHA）において高発現していたのに対し，摂食抑制に関わる腹内側核（VMH）ではほとんど発現しておらず，GPは摂食亢進と密接に関与することが示唆された（図２）。

図 ２ in situ hybridizationに よ る 脳 視 床 下 部 に お け るGlycogenphosphorylase（GP）の発現分布解析
GP mRNAは摂食促進に関わる視床下部弓状核（Arcuate nucleus;Arc），背内側核（Dorsomedial hypothalamic Nucleus; DMH）
，外側野（Lateral hypothalamus; LHA）において高発現していたのに対し，摂 食 抑 制 に 関 わ る 腹 内 側 核（Ventromedial hypothalamicNucleus; VMH）ではほとんど発現していなかった。

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図３ 視床下部における摂食状態に応答したGPとAK3遺伝子の発現変動
絶食と再給餌に応答した視床下部におけるGP，AK3，オレキシン（orexin），ニューロペプチドY（NPY）の mRNAの発現変動をノザンブロット分析により解析した。

現変化をノザンブロット分析を用いて解析したと遺伝子であることが明らかとなった。特に，GPころ，絶食に伴い増加したGP，AK3 のmRNA発遺伝子は摂食促進に関わるArc，DMHで高発現す現レベルは再給餌後８時間で自由摂食区の発現レることが観察されたことから，GPの発現レベルベルにまで速やかに減少することが観察されたの上昇は摂食促進と密接に関連することが示唆さ（図３）。また，視床下部以外の脳領域，及び肝臓れた。GPはグルコース産性促進，また，AK3はでは，GP，AK3 mRNAの摂食状態の変化に対応ATP，GTP産性促進に関わる遺伝子群であり，どした発現変動は観察されなかったことから，GP，ちらも細胞に対するエネルギーを供給することに

AK3は摂食状態の変化に応答して視床下部特異働く酵素群である。従って，GP，AK3が視床下部的に発現制御を受けることが明らかとなった。

における摂食促進に働く領域で主に発現し，絶食さらに，摂食状態の変化に対するGP，AK3の発状態になると発現上昇することから，絶食状態で現レベルの変化を，既知の摂食調節に働く神経ペ摂食行動の促進が必要となった際にGP，AK3のプチド群の発現レベルの変化と比較した。その結発現が誘導され，エネルギーを供給することによ

果，絶食にした場合のGP，AK3 mRNAの発現量ってこの領域のニューロンを活性化し，摂食行動の上昇率はNPY，Orexinなどと同程度であるも促進に働く神経ペプチド群の産性や放出を誘導しのの，再給餌後は，GP，AK3のmRNA量は，こているのではないかと考察した。

れら神経ペプチド群よりも速やかに減少することが明らかとなった。従って，GP，AK3は神経ペプ

4. 脳視床下部における摂食状態の変化に応じた遺伝子発現制御機構の解析

チド群よりも摂食状態の変化により速やかに応答して発現変動を受けることが明らかとなった。

ニューロンの主要な情報伝達経路は，Ca２＋ や以上の実験結果より，GP，AK3は視床下部におcAMPをセカンドメッセンジャーとする情報伝達いて摂食状態に応答して発現レベルが制御される経路であるため，これらの情報伝達経路の下流に

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12存在する転写調節因子群がニューロン活性化に関わる遺伝子発現に寄与すると考えられている。転写 調 節 因 子cAMP responsive element binding
protein（CREB）はcAMPあるいはCa２＋の濃度上昇によって活性化されるＡキナーゼやカルモジュ
リン依存性キナーゼによって133番目のセリンをリン酸化され，リン酸化依存的に転写促進する。
このCREBによるリン酸化依存的な転写活性化は記憶学習をはじめとする様々な脳機能に必要な転写調節に関与することが知られている８）。また，
ゲノムデータベースを用いた解析から，ヒトGP
遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー 領 域 に は，cAMP
responsive element（CRE）と推定される配列が複数存在することが明らかとなった。
そこで，脳凍結切片を用いた免疫染色法を用い

図４ 視床下部における摂食状態に応じたCREBリン酸化量の比較
絶食にすると弓状核（Arc），背内側核（DMH）ではCREBリン酸化レベルが有意に上昇し，逆に腹内側核（VMH）では低下する。て，ラット視床下部におけるリン酸化CREBの量を絶食区と自由摂取区の間で比較した。その結ド群がCREBによる発現制御を受けるのではない

果，Arc，DMH，VMHにおいて，CREBの発現量かと考え，この仮説を検討した。

（total CREB）は絶食区と自由摂取区の間で差が神経ペプチドの一つニューロペプチドY（NPY）なかったのに対し，リン酸化CREBの量（phospho-は視床下部弓状核（Arc）に高発現する神経ペプ

CREB）は，絶食にすると摂食行動を促進するチドであり，脳内に微量注入すると摂食行動が促

Arc，DMHでは有意に上昇し，摂食行動を抑制す進されることから，摂食誘導因子あると考えられ

るVMHでは逆に有意に減少していた（図４）。こている。また，ゲノムデータベースで公開されての結果は，摂食状態を反映して活性化される中枢

いるNPY遺伝子のプロモーター領域には，複数のにおいてリン酸化CREBの量が高くなることを意推定CRE様配列が存在しており，この遺伝子の転味しており，摂食行動を正負に調節するための遺写がCREBによって活性化されることが示唆され伝子発現制御に対してCREBが重要な役割を果たる。そこで，我々は，NPYプロモーターがCREBしていることを示唆するものである。特に，ヒトによって転写制御を受けるかを培養細胞を用いてGPプロモーター上にCREの存在が示唆され，GP解析した。ヒトNPY遺伝子のプロモーター領域の発現が上昇する絶食時の摂食中枢においてリンをPolymerase Chain Reaction（PCR）によって取酸化CREBの量が多いことから，GPの発現制御機得し，ルシフェラーゼ遺伝子を連結したレポータ構にCREBが関与することが示唆された。

ー遺伝子を構築した。このレポーター遺伝子を神5. CREBによる摂食制御神経ペプチド群の発現制御経様細胞として知られるPC12細胞に導入して，プロモーター活性を解析した。細胞内cAMP濃度上昇を誘導させるフォルスコリン（FSK）添加，4.の結果から，摂食行動を制御する神経ペプチあるいは，転写因子CREBの共発現により，NPY

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近にNerve Growth Factor（NGF）応答領域が存在することが示唆された。今後も継続して，これらプロモーターの転写活性調節機構の解析を行い，プロモーター活性制御の観点から，摂食行動制御機構の解析を行う予定である。
6. マウス遺伝学的手法を用いた摂食制御時のCREB活性のモニタリングの試み
4.，5.においてCREBの摂食行動制御に対する重要性が強く示唆されたため，摂食状態に応じたCREBを介する転写活性をモニタリングすることで，CREBによる摂食行動制御機構の解明を試み
図５ CREBによるヒトNPYプロモーターの転写活性制御
PC12細胞におけるNPYプロモーターの転写活性は，細胞培養培地へのフォルスコリンの添加あるいはCREBの過剰発現により上昇し，フォルスコリン添加とCREB過剰発現を同時に行うことで相乗的に上昇する。

た。
まず，


におけるCREBによる転写活性化を視覚的にモニターする系の確立を目指して，CRE依存的プロモーターの下流に，EGFP及び，プロモーター活性の上昇が観察され，さらに，フβ―ガラクトシダーゼ遺伝子を連結したレポータォルスコリン添加と，CREB共発現を同時に行っー遺伝子を作製した。このレポーター遺伝子を神た場合には，NPYプロモーター活性の相乗的な上経系の培養細胞であるPC12にトランスフェクシ昇が観察された（図５）。この相乗的な活性上昇はョンし，細胞内cAMP濃度上昇を引き起こすフォ

CREB依存的プロモーターに見られる典型的な特ルスコリンを細胞上清に添加したところ，レポー徴であり，NPYプロモーターの転写活性がCREB

タータンパク質であるEGFPの発現誘導が観察さによって調節されることが強く示唆された。さられた。従って，このレポーター遺伝子がCREB活に，NPYプロモーターの欠失変異体を用いた解析性のモニターに有効であることが示された。

から，転写開始点から約70bp上流にほぼコンセン続いて，このCRE- レポーター遺伝子をマイクサス配列に近いCREが存在することが示唆されロインジェクション法によりC57BL/6系統のマウた。以上の解析結果から，NPYプロモーターの転ス受精卵に導入し，CREレポーター・トランスジ写活性がCREBによって制御を受けることが明らェニックラインを計６ライン確立した。

かとなった。今後，ゲルシフトアッセイ等を用いて，CREの同定が必要であろう。

６ラインのCREレポーターマウスからそれぞれ脳，心臓，腎臓，小腸，肝臓，肺，骨格筋，膵

さらに，ゲノムライブラリーのスクリーニング

臓，脾臓，胃，精巣，子宮を摘出し，RNA抽出をから，orexin，orexin receptor，AGRPの転写開始行い，ノザンブロッティング，RT-PCR法によっ点を含んだ遺伝子断片を取得し，プロモーターのてレポーター遺伝子の発現を解析した。その結機能解析を試みた。現在までの解析では，これら果，ノザンブロット分析では，精巣で，RT-PCR法のプロモーター領域にはCREは観察されなかっでは，脳，骨格筋，精巣でレポーター遺伝子の発た。しかし，orexinプロモーターの転写開始点付

現が観察された。脳及び精巣はCREBの活性が高浦上財団研究報告書 Vol.14（2006）

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い組織として知られているため，組織内のCREBhybridization法の条件改良を試みている。さら活性の高さに応じてレポーター遺伝子の発現が観に，CREレポーターマウスの新たなラインを確立察されたものと考えられた。

し，レポーター遺伝子が視床下部において明確にトランスジェニックマウス脳内におけるレポー
タ ー 遺 伝 子 の 発 現 分 布 をRT-PCR法，
hybridization法により解析した結果，海馬，大脳発現するマウスのスクリーニングを試みている。
7. マウス遺伝学的手法を用いた視床下部特異的CREB変異体過剰発現マウスの作製皮質において発現が確認された。海馬，大脳皮質はCREBの活性が強い領域であるため，この解析

視床下部におけるCREBの摂食行動制御に対すでもCREB活性の高い領域でレポーター遺伝子がる役割を明確にするために，視床下部特異的にド高発現することが示唆された。また，このCREレ

ミ ナ ン ト ネ ガ テ ィ ブ 型 変 異 体CREB（CREBポーターマウスと，我々が既に作製していた恒常S133A）を高発現するトランスジェニックマウス

的活性型変異体CREB DIEDMLを前脳領域特異の作製も試みた。5.において単離されたマウス

的に高発現するマウスとを交配させたダブルトラ

orexinプ ロ モ ー タ ー 約3.8kbにCREB S133A変 異ンスジェニックマウスを作製した。このダブルト体cDNAを連結した外来遺伝子を構築し，この外ランスジェニックマウスにおけるレポーター遺伝

来遺伝子をマイクロインジェクション法により子発現量を
hybridization法を用いて解析しC57BL/6系統のマウス受精卵に導入し，orexin-たところ，CREB 活性型変異体の発現によって，dnCREBマウスの作製を試みた。現在までに，海馬におけるレポーター遺伝子の発現が増加して600個以上の健全な受精卵に外来遺伝子を導入し，いた（図６）。従って，このCREレポーターマウス

トランスジェニックラインの確立を試みたが，ラがin vivoにおけるCREBの活性をモニターするたインは得られなかった。他のグループは同様のめの有効なツールとなることが示唆された。

orexinプロモーターを用いてトランスジェニック

一方，視床下部におけるレポーター遺伝子の発マウスの作製に成功しているため，ラインが確立

現は微弱であったため，レポーター遺伝子発現のできなかった原因として，orexinプロモーターに

検 出 感 度 を よ り 高 め る よ う に，

よるCREB 変異体の発現が発生期に重大な障害を

CRE-Reporter miceCRE-Reporter/active CREB mice

図６ CREレポーターマウスの発現解析
CREレポーターマウスをCREB活性化型変異体（CREB DIEDML）過剰発現マウスと交配したダブルトランスジェニックマウスと交配し，hybridization法により脳海馬領域のレポーター遺伝子の発現を解析した。

摂食制御に関わる遺伝子ネットワーク解析による食欲制御の分子機構の解明もたらしたためではないかと考察している。

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ことが，摂食制御機構を解明するアプローチとしOrexinプロモーター以外には，視床下部で機能て十分意義があることを示すことができたと考えするプロモーターはほとんど報告されていないたている。さらに，今後，それぞれの摂食制御因子

め，今後，AGRPやNPYプロモーターを利用して群の発現制御を担う情報伝達経路を同定すること新規トランスジェニックマウスを作製することもで，栄養状態から精神状態までの多様な食欲制御試みる予定である。

パラメーター群が摂食行動に影響を与えるメカニ

8. Glycogen phosphorylase（GP）遺 伝 子 破壊マウスの作製

ズムが明らかになってくると思われる。
しかし，CREレポーターマウス，視床下部特異的CREB変異体発現マウスに関しては，今後。ラ

摂食状態に極めて鋭敏に反応してその発現量がイン数の増加，あるいは，外来遺伝子の改良が必制御されるGlycogen phosphorylase（GP）は，絶要である。また，GPノックアウトマウスに関し食時に高発現し，エネルギー源となるグルコースては，作製を継続する。

を供給することで摂食促進ニューロン群の活性を高めているのではないかと予想される。
そこで，摂食制御に対するGPの役割を解析することを目的としてGP遺伝子を破壊したノック

文献１） Flier J. S., Maratos-Flier E.: Obesity and thehypothalamus: novel peptides for new pathways. Cell. 92,437-40, 1998.

アウトマウスの作製を試みた。5.で記したよう

２） Sakurai T., Amemiya A., Ishii M., Matsuzaki I., Chemelliに，genomicライブラリーをスクリーニングする

R. M., Tanaka H., Williams S. C., Richardson J. A.,

ことによって，転写開始点を含む約23kbの遺伝子

Kozlowski G. P., Wilson S., Arch J. R., Buckingham R. E.,

断片を取得した。制限酵素マップを作製し，開始

Haynes A. C., Carr S. A. , Annan R. S., McNulty D. E., LiuW. S., Terrett J. A., Elshourbagy N. A., Bergsma D. J.,

コドンを中心とした約５kbの塩基配列を決定し，

Yanagisawa M.: Orexins and orexin receptors: a family of

その配列をもとにしてターゲティングベクターを

hypothalamic neuropeptides and構築した。このターゲッティング・ベクターをES

G protein-coupled

receptors that regulate feeding behavior. Cell. 92, 573-85,
1998.

細胞に導入し，片方のアレルのGP遺伝子が破壊

３） Ollmann MM, Wilson BD, Yang YK, Kerns JA, Chen Y,されたES細胞株のスクリーニングを行っている。

Gantz I, Barsh GS..: Antagonism of central melanocortin
receptors in vitro and in vivo by agouti-related protein.

おわりにScience. 278, 135-8, 1997.
４） Qu D, Ludwig DS, Gammeltoft S,

本研究において，視床下部において摂食状態をPiper M,Pelleymounter MA, Cullen MJ, Mathes WF, Przypek R,

反映した遺伝子発現制御に関して研究を進め，発Kanarek R, Maratos-Flier E.: A

現制御を受けるGPとAK3遺伝子を同定した。まconcentrating hormone in the central regulation of feeding

た，摂食状態を反映する視床下部における遺伝子

role for melanin-behaviour. Nature. 380, 243-7, 1996.
５） Nakazato M., Murakami N, Date Y, Kojima M, Matsuo

発現調節には転写因子CREBが関与すること，実H, Kangawa K, Matsukura S.: A role for ghrelin in the

際に視床下部で発現する摂食制御ペプチドである

central regulation of feeding. Nature. 409, 194-8, 2001.

NPYのプロモーターはCREBによる活性調節を受

６） Kristensen P., Judge M. E., Thim L., Ribel U.,
Christjansen K. N., Wulff B. S., Clausen J. T., Jensen P. B.,

けることを明らかにした。従って，視床下部におMadsen O. D., Vrang N., Larsen P. J., Hastrup S.:

ける摂食状態に応じた遺伝子発現制御を解析する

Hypothalamic CART is a new anorectic peptide regulated

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浦上財団研究報告書 Vol.14（2006）

by leptin. Nature. 393, 72-6, 1998.

leptin or insulin. Endocrinology. 140, 4551-7, 1999.

７） Mizuno T. M., Makimura H., Silverstein J., Roberts J. L.,

８） Kida S., Josselyn S., Peｎa de Ortiz S. J. Kogan J.,

Lopingco T., Mobbs C. V.,: Fasting regulates hypothalamic

Masushige S., Silva A . J.: CREB required for the stability ofneuropeptide Y, agouti-related peptide, and proopiome-new and reactivated fear memory. Nature Neuroscience, 5,lanocortin in diabetic mice independent of changes in348-355 2002.

Analyses of molecular mechanisms for the control of feeding behavior through gene
expression regulation

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Analyses of molecular mechanisms for the control of feeding behavior
through gene expression regulation
Satoshi Kida
（Department of Bioscience, Faculty of Applied Bioscience, Tokyo University of Agriculture）

Hypothalamus has been shown to play central roles in the regulation of feeding behavior.
Importantly, the feeding condition regulates the expression of various types of neuropeptides
in hypothalamus, whose infusion into hypothalamus dramatically affects feeding behavior.
These findings raise the possibility that gene expression regulation plays essential roles incontrolling feeding behavior. Therefore, we have examined this hypothesis using rodents tounderstand molecular mechanisms for the regulation of feeding behavior.
（1）Identification of new genes whose expression is regulated by feeding condition.
We have tried to isolate and identify genes whose expression is changed by feeding
condition in hypothalamus using Differential Display Method（D.D.M）. We found that fastingcauses the up-regulation of Glycogen Phosphorylase（GP）and Adenylate Kinase 3（AK3）mRNA in hypothalamus. In situ hybridization analyses showed that GP mRNA is highly
expressed in regions including arcuate nucleus（Arc）, dorsomedial hypothalamic nucleus（DMH）and lateral hypothalamus（LHA）that are known to induce feeding behavior, but
not in the region including ventromedial hypothalamic nucleus（VMH）that is known to inhibit
it. More importantly, in response to change in feeding status mRNA levels of GP and AK3 are
more quickly changed than those of neuro-peptides. Because up-regulation of GP and AK3
have known to supply glucose, and ATP and GTP, respectively, these observations raise thepossibility that increase in GP and AK3 levels activates the brain region inducing feeding
behavior, thereby resulting in increase in feeding behavior. We are now trying to generatemutant mice having a disruption of gene encoding GP.
（2）Analyses of roles of transcription factor CREB in feeding behavior.
We observed abundant putative cAMP responsive elements（CREs）in the promoter
regions of genes encoding neuro-peptides, whose expression is changed in hypothalamus inresponse to change in feeding status. These findings suggest important roles of CREB incontrolling in feeding behavior. To understand them, we first examined level of thephosphorylation of CREB at Serine 133（S133）that has been known to be an essential process
for the activation of CREB-mediated transcription. Analyses of immmunocytochemistry using
anti phospho-CREB antibody indicated that the fasting leads to increase in phospho-CREB
level in Arc and DMH and in contrast, decrease in VMH, suggesting that CREB-dependent

URAKAMI FOUNDATION MEMOIRS Vol.14（2006）18

transcription plays important roles in expression regulation of hypothalamus in response tofeeding condition.
We next tried to monitor the activity of CRE-mediated transcription in hypothalamus bygenerating transgenic mice having a CRE-reporter gene, whose transcription activity isregulated by CRE-dependent promoter. Analyses of RT-PCR and in situ hybridization
indicated that reporter gene is expressed in testis and brain regions including hippocampus
and cortex. Additionally, these reporter mice crossed with mutant mice expressing dominant
active CREB mutant showed the up-regulation of reporter mRNA, indicating that theexpression of the reporter gene is regulated in a CREB-dependent manner. We are now
trying to monitor the changes in transcription activity of this reporter gene in response tochange in feeding status.
Finally, we have examined the roles of CREB in regulation of the promoter activity ofneuro-peptides using the transient transfection into PC12 cells. We showed that activity ofNPY promoter is regulated by CREB and found a CRE in the NPY promoter. We next
isolated and characterized the mouse orexin（mOrexin）promoter. We isolated a 22 kb
genomic clone containing the 5' flanking region of the mouse Orexin promoter. We
determined that the transcription start site（+1）is located 96 nucleotides upstream of theinitiation codon. The start site region contains consensus sequences corresponding to thetranscription initiator and TATA box. Analysis of promoter activity using PC12 cells showedthat regions between −118 and +112 and between −1868 and −780 contains an NGFresponsive positive regulatory element and a negative regulatory element, respectively
although putative CREs have not been identified.