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浦上財団研究報告書

Vol.16（2008）＜平成18年度＞

新奇標的分子に着目したニンニクの抗がん作用機序の解明と香辛料成分の機能評価
関飯塚泰一郎 ・ 細野裕司 ・ 嶌本崇 ・ 細野（深尾） 友美 ・ 稲田麻衣子 ・ 有賀薫 ・ 田中理江

豊彦
（日本大学生物資源科学部）

1. 緒

言

強力で，分子中に硫黄を 3 つ有することが重要であ っ た。 詳 細 な 分 子 細 胞 生 物 学 的 解 析 に よ り

ニンニクは古来より食用に供されてきた。ニン

DATS は大腸がん細胞の細胞周期を M 期で停止

ニクは他の植物に比べて硫黄含量が高く，通常こさせ，カスパーゼ -3 の活性化を介してアポトー

れらの硫黄は S-allyl cysteine などのアミノ酸とシスを誘導することが明らかになった。DATSして貯蔵されている。調理などによるニンニク組は細胞骨格タンパク質 b-チューブリン分子中の織の損傷により，S-allyl cysteine と異なる細胞に特定のシステイン残基（Cys12 と Cys354）のチオ局在するアリイナーゼが作用してアリシンが生成

ール基を酸化的に S-allyl 修飾し，チューブリンする。さらにこれらの分子が非酵素的に反応し，の機能を阻害することが考えられた 3，4）。

ニンニク特有の香気成分であるアリルスルフィド類を生成する 1, 2）。

本研究では，これらの知見に基づいて，DATSの標的分子の一つであるチューブリンに着目し，ニンニクやタマネギなどの Allium 属植物や十タ マ ネ ギ 中 に 見 出 さ れ る dipropyl trisulﬁde

字架植物のがん予防効果について疫学研究が実施（DPTS）をはじめ，各種アルキル，アルケニルされており，これらの植物の摂取はある種のがん基を有するトリスルフィドを調製し，これらのスの罹患率を低下させると評価されている。また，

ルフィドの構造と機能の関係について明らかにし多くの動物モデル，in vitro での研究結果から生ようとした。

体内での発がん物質の代謝活性化の抑制，解毒・排泄促進による遺伝子毒性の低減，突然変異の予2. 実験材料および方法

防，がん細胞の細胞周期の停止とアポトーシス誘

2. 1

導などが含硫成分の抗がん作用メカニズムである９種類のアルキル，アルケニルトリスルフィドと考えられる２）。

スルフィドの調製（dimethyl trisulfide, diethyl trisulfide, DPTS,ニンニクのホモジネートを水蒸気蒸留して得ら

dibutyl trisulfide, dipentyl trisulfide, DATS,れるニンニクオイルを各種株化がん細胞に添加しdibutenyl trisulfide, dipentenyl trisulfide, allylて培養すると，細胞増殖は抑制され，未熟な血液methyl trisulﬁde）は Milligan らの方法を改良し腫瘍細胞では成熟細胞への分化やアポトーシスがた方法により合成後，Inertsil ODS-3 カラム（GL誘導される。ヒト大腸がん細胞を用いてアリルスScience）を用いた高速液体クロマトグラフィー

ルフィドの細胞増殖抑制効果について調べたとこにより精製し，純度 99％以上の標品を実験に供ろ，diallyl trisulﬁde（DATS）の効果がもっともした（図 1）。

新奇標的分子に着目したニンニクの抗がん作用機序の解明と香辛料成分の機能評価

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HT-29 は I 型コラーゲンをコートしたスライド
グ ラ ス 上 で 48 時 間 前 培 養 し， そ の 後 終 濃 度
10nM の DATS とともに 12 時間培養した。スラ
イドグラスを 2 回 PBS で洗浄後，アセトン：メタノール（1：1）で 2 分間，室温で固定した。
PBS で洗浄後，抗 b-チューブリンモノクローナル抗体（TUB2.1, Sigma-Aldrich）と 30 分間，さら に AlexaFluo488 標 識 ヤ ギ 抗 マ ウ ス IgG 抗 体（Invitrogen）と 30 分間反応させ，共焦点レーザー顕微鏡（FLUOVIEW FV300, OLYMPUS）を用いて観察した。
図1

本研究で使用したアルキル，アルケニルスルフィドの構造
A, アルキルトリスルフィド；B, アルケニルトリスルフィ
ド；C, アルキル，アルケニル混合型トリスルフィド

2. 2細胞培養

3. 結果と考察
これまでに著者らはニンニクの香気成分である

ヒト大腸がん細胞 HT-29 は 10％ウシ胎児血清

DATS がヒト大腸がん細胞の増殖を強力に抑制を添加した McCoy s 5A 培地を用いて 37℃ , 5％すること，アポトーシスを誘導すること，この原CO2/95％気下で継代培養した。実験には 10％ウ因としてチューブリン分子中の特定のシステイン

シ胎児血清添加 McCoy s 5A 培地で 48 時間前培残基の酸化的修飾による機能異常の関与の可能性養した HT-29 を用いた。各種スルフィドはジメを明らかにしてきた 3, 4）。

チルスルフォキシド（DMSO）中に５ mM にな本研究では，ニンニクに見出される DATS にるように溶解し，終濃度が 10 nM になるように加えて，タマネギに見出される DPTS をはじめ，培養系に添加し，0.2％ DMSO を添加した培養系

側鎖の異なる 9 種類のアルキル，アルケニルトリを対照とした。

スルフィドを調製し，構造と機能の関係について2. 3

細胞周期の測定検討した（図 1）５）。

各種スルフィドが HT-29 の細胞周期に及ぼす細胞増殖の抑制については，これまでの知見に影響は，フローサイトメトリーにより解析した。

基づき細胞周期を指標に検討を行った（図 1A）。

スルフィド存在下で培養した細胞は氷冷した

10 nM の各種アルキル，アルケニルスルフィド

phosphate buffered saline（PBS）で 2 回洗浄後， を添加して 12 時間培養後 FACS により細胞周期トリプシンを用いて培養器から回収した。回収しの分布を解析した。被検試料非添加の Vechicle

た細胞は 70％エタノール中で− 20℃で 18 時間冷群では，G1 期 47％，S 期 44％，G2/M 期 13％であっ却して固定した。PBS で 2 回洗浄後 500 ng/mLた（結果は示していない）。Dimethyl trisulﬁde,RNaseA，25 ng/mL propidium iodide を添加しdiethyl trisulfide, DPTS, dibutyl trisulfide,て室温で 20 分静置した。細胞周期は FACS Cant

dipentyl trisulﬁde などのアルキルトリスルフィ（BD Bioscience），FlowJo software （Treeドは細胞周期の分布にはほとんど影響を及ぼさず，Star）により解析した。

13−16％の細胞が G2/M 期に存在した。一方，

2. 4

チューブリンの蛍光免疫染色による観察

dipentenyl trisulfide，DATS，dibutenyl

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浦上財団研究報告書

Vol.16（2008）

trisulﬁde などのアルケニルトリスルフィドは，細胞周期の分布に影響し，G2/M 期の細胞が顕著に増加した。分子内にアルキル基，アルケニル基の 両 者 を 有 す る 非 対 称 の 分 子 allyl methyl
trisulﬁde は G2/M 期の細胞の分布には影響を及ぼさなかった（図 2）。
次に，上記実験で用いた 10 nM スルフィドの影響について，タイムコース実験を実施した。
Dipentyl trisulﬁde, DATS, dibutenyl trisulﬁde な
どのアルケニルトリスルフィドによる細胞周期の抑制効果は，24 時間までの実験時間内で大きく異なった。DATS による G2/M 期の増加は，8 〜12 時 間 で 最 大 効 果 を 示 し， 以 降 減 少 し た。
Dipentyl trisulﬁde, dibutenyl trisulﬁde により増加した G2/M 期は処理後 16 時間でピークを示し，図3あること，細胞内にスルフィドをクリアランスす各種アルキル，アルケニルスルフィドが HT-29 の細胞周期に及ぼす影響
各種アルキル（上図）アルケニル（下図）スルフィドが細胞周期の進行に及ぼす影響について，処理後 24 時間まで経時的に測定し，G2/M 期の細胞の割合を表示した。データは 3回の異なる実験の平均値を示す。

るメカニズムがあることを示している。一方，細胞周期にほとんど影響を及ぼさなかった（図dimethyl trisulfide, diethyl trisulfide, DPTS,3）。著者らはこれまでに DATS による細胞周期

dibutyl trisulﬁde, dipentenyl trisulﬁde な どの アの阻害が紡錘糸形成の障害によること，DATS

ルキルトリスルフィドは 24 時間までの測定ではが b-チューブリン分子のシステイン残基を酸化その後僅かに減少した。G2/M 期の減少，すなわ
ち細胞周期の回復はスルフィドの効果が可逆的で的に修飾することにより脱重合を促進することを明らかにしている。そこで，DATS 処理細胞で微小管構造に異常があるか，また，システインの共処理により細胞周期の阻害や微小管構造の異常が キ ャ ン セ ル さ れ る か 検 討 し た。 そ の 結 果，L-cysteine の処理により細胞周期の阻害はキャンセルされた（図 4）。また，微小管の形態に関しては，control 細胞では，細胞質に張り巡らされたチューブリンのネットワーク形成が観察されるが，DATS の処理によりチューブリンのネット
図2

各種アルキル，アルケニルスルフィドが HT-29 の細胞周期に及ぼす影響
各種スルフィドが細胞増殖に及ぼす影響について，G2/M 期の細胞の割合を指標に検討を行った。10 nM のスルフィド存在下で 12 時間培養した HT-29 の細胞周期の分布についてフローサイトメトリーにより検討を行った。データは 3 回の異なる実験の平均± S.E. を示す。**P ＜ 0.01 vs. vehicle

ワークの崩壊が観察された。さらに L-cysteineの処理によりこれらのチューブリンのネットワークの崩壊は阻止された（図 4）。これらの結果は，アルケニルトリスルフィドがチューブリンのシス新奇標的分子に着目したニンニクの抗がん作用機序の解明と香辛料成分の機能評価

図473

DATS による細胞周期の阻害と微小管の破壊に及ぼすシステインの影響
HT-29 細胞を 2 mM L-cysteine を含む培養液で 2 時間前培養後，10nM DATS を添加，非添加でさらに 12 時間培養し，細胞周期の分布をフローサイトメトリーで解析した（左図）。データは異なる 3 回の実 験 の 平 均 値 ± S.E. を 示 し， 異 な る ア ル フ ァ ベ ッ ト は 統 計 的 な 有 意 差 を 示 す（P ＜ 0.01, TukeyKramer s multiple comparison test）。また，これらの細胞の微小管の構造について抗 b- チューブリンモノクローナル抗体を用いて染色した（右図緑）。細胞核は propidium iodide で対比染色した（マゼンダ）。矢頭は異常な微小管構造を指す。

テイン残基を修飾することを引き金として細胞周期を阻害することを強く示唆している。

文献

Z-ajoene, S-allyl mercaptocysteine などのアル

１） Ariga T, Seki T. Functional Foods from Garlic andケニル構造を有する他の硫黄化合物も微小管構造

Onion, pp433-490, In: Asian Functional Foods（Editors,に影響を及ぼす 6, 7）。トリスルフィドの側鎖の構John Shi, Chi-Tang Ho, Fereidoon Shahidi）, CRC Press,
New York, USA. 2005.

造については，allyl methyl trisulﬁde がほとんど

２） 関 泰一郎，有賀豊彦 ネギ属植物の生理機能性とそのメ影響を及ぼさないことから，アルケニル基を 2 つカニズム バイオサイエンスとインダストリー , 64（11）,有することが細胞周期の阻害やチューブリンのネットワークの崩壊に重要であることが明らかになった。
食用植物由来の硫黄化合物は多彩な機能性を示すが，水溶性，脂溶性のさまざまな含硫化合物が609-613, 2006.
３） Hosono T, Fukao T, Ogihara J, Ito Y, Shiba H, Seki T,Ariga T. Diallyl trisulﬁde suppresses the proliferation andinduces apoptosis of human colon cancer cells throughoxidative modiﬁcation of beta-tubulin. J Biol Chem. 2005
Dec 16；280（50）：41487-93.
４） Seki T, Hosono T, Hosono-Fukao T, Inada K, Tanaka

それぞれ異なる機能性を発揮すると考えられる。

R, Ogihara J, Ariga T. Anticancer effects of diallyl

これらの分子の生体内での代謝など明らかにされtrisulﬁde derived from garlic. Asia Pac J Clin Nutr 2008；ていない点も多い。調理や加工法と生成する機能

17（S1）：249-252.

性含硫化合物の分子種，生成量，加工食品中の含５） Hosono T, Hosono-Fukao T, Inada K, Tanaka R, SekiT, Hasegawa I, Ariga T. Alkenyl group is responsible for

有量との関係，さらには硫黄化合物の体内動態を

the disruption of microtubule network formation in

含め機能性を評価することが重要である。今後，

human colon cancer cell line HT-29 cells. Carcinogenesis.

本研究で得られた知見に基づき，トリスルフィド化合物をリード化合物とした新規生理活性物質の2008 Jul；29（7）：1400-6.
６） Xiao D, Pinto JT, Soh JW, Deguchi A, Gundersen GG,
Palazzo AF, Yoon JT, Shirin H, Weinstein IB. Induction of創製，チューブリンをはじめとした標的分子へのapoptosis by the garlic-derived compound S-allyl

親和性を指標とした各種食用植物の抗がん作用のmercaptocysteine（SAMC）is associated with microtubule

評価などへの応用が期待される。

depolymerization and c-Jun NH（2）-terminal kinase 1

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浦上財団研究報告書

Vol.16（2008）

activation. Cancer Res. 2003 Oct 15；63（20）：6825-37

Z-ajoene, a natural compound purified from garlic:

７） Li M, Ciu JR, Ye Y, Min JM, Zhang LH, Wang K, Gares

antimitotic and microtubule-interaction properties.

M, Cros J, Wright M, Leung-Tack J. Antitumor activity ofCarcinogenesis. 2002 Apr；23（4）：573-9.

Elucidation of anticancer effects of garlic, focusing on the novel target molecule

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Elucidation of anticancer effects of garlic, focusing on the novel target moleculeTaiichiro Seki, Takashi Hosono, Tomomi Hosono-Fukao, Kahoru Inada, Rie Tanaka,
Yuji Iitsuka, Maiko Shimamoto and Toyohiko Ariga（Department of Agricultural and Biological Chemistry, College of Bioresource Sciences, Nihon University）

Alk（en）
yl trisulfides are organosulfur compounds produced by crushed garlic andother Allium vegetables. We found that these compounds exhibit potent anticancer effects
through the reaction with microtubules, causing cell cycle arrest. Nine alk（en）yl trisulﬁdesincluding dimethyl trisulfide, diethyl trisulfide, dipropyl trisulfide （DPTS）, dibutyltrisulfide, dipentyl trisulfide, diallyl trisulfide（DATS）, dibutenyl trisulfide, dipentenyl
trisulfide and allyl methyl trisulfide were synthesized and added to cultures of HT-29
human colon cancer cells at a concentration of 10 nM. The trisulﬁdes with alkenyl groups
such as DATS, but not those with alkyl groups, induced cell cycle arrest at 12 h after thetreatment. Both DATS-induced microtubule disassembly and the cell cycle arrest werecancelled by the simultaneous treatment of the cancer cells with 2 mM L-cysteine,glutathione. These results indicate that alk（en）yl trisulﬁde react with sulfhydryl groups incysteine residues of cellular proteins such as microtubule proteins. Thus, the present study
provides evidence that trisulﬁdes with alkenyl groups have potent anticancer activities, atleast in part, directed toward microtubules. These ﬁndings suggest that alkenyl trisulﬁdesand their structurally related compounds may provide novel and effective anticancer agents.