Glycative Stress Research
Online edition : ISSN 2188-3610
Print edition : ISSN 2188-3602
Received : August 22, 2022
Accepted : September 14, 2022
Published online : September 30, 2022
doi:10.24659/gsr.9.3_175

Original article

Antiglycative effect of extract and phenolic compounds from holy basil(Ocimum tenuiflorum)
Kento Kunihiro 1, 2), Tai Kaneshima 3), Takao Myoda 3)
1) Graduate School of Bioindustry, Tokyo University of Agriculture, Hokkaido, Japan
2) Albion Co. Ltd., Tokyo, Japan
3) Department of Food, Aroma and Cosmetic Chemistry, Tokyo University of Agriculture, Hokkaido, Japan

Glycative Stress Research 2022; 9 (3): 175-185(c) Society for Glycative Stress Research（原著論文：日本語翻訳版）

ホーリーバジル（Ocimum tenuiflorum ）の抽出物とフェノール化合物の抗糖化作用
國廣 建斗 1, 2) 、金嶋 泰 3) 、妙田 貴生 3)1) 東京農業大学大学院 生物産業学研究科
2) 株式会社アルビオン
3) 東京農業大学 生物産業学部 食香粧化学科

抄録［目的］糖化反応は、蛋白質のアミノ基に糖が結合し、糖化中間体を介して終末糖化産物（advanced glycation

end products: AGEs）を形成する。AGEs は炎症や蛋白質の機能異常を誘発し、糖尿病や皮膚の老化の原因となる。本研究の目的は、ホーリーバジル（Ocimum tenuiflorum）葉エキスの抗糖化作用を評価し、これらの作用に関与する化合物を同定することである。

［方法］ホーリーバジルの乾燥葉を熱水抽出することにより、粗抽出物を得た。粗抽出液の総ポリフェノール
量、総フラボノイド量、抗酸化活性を測定した。また、粗抽出物から各種クロマトグラフィーを用いてフェノール化合物を単離した。蛍光 性 AGEs, N ε-(carboxymethyl) lysine (CML), 3- deoxyglucosone (3-DG ), glyoxal(GO) および methylglyoxal (MGO) の生成に対する粗抽出物と単離化合物の影 響について検 討した。

［結果］ホーリーバジルの粗抽出物は、ポリフェノールを豊富に含んでおり、そのほとんどがフラボノイドであった。粗抽出物から単離された luteolin 5-O-glucoside (1), luteolin 7-O-glucuronide (2), (−)-rabdosiin (3),apigenin 7-O-glucuronide (4), rosmarinic acid (5), globoidnan A (6 ), salvianolic acid A (7 ) は、蛍光性 AGEs,
CML, 3-DG, GO, MGOの生成を阻害することが 確認された。特に、化合物 3, 5, 6, 7 は強力な抗糖化活性を有する化合物であった。また、粗抽出物は高い抗酸化活性を示した。

連絡先：金嶋 泰
東京農業大学 生物産業学部 食香粧化学科〒099 -2493 北海道網走市八坂 196
TEL：0152-48-3871 FAX：0152-48-2531
e -mail：tk203897@nodai.ac.jp
共著者：國廣建斗, k_kunihiro@albion.co.jp;
妙田貴生, t1myouda@nodai.ac.jp

Glycative Stress Research 2022; 9 (3): 175-185
本論文を引用する際はこちらを引用してください。
(c) Society for Glycative Stress Research（ 1 ）Glycative Stress Research［結論］ホーリーバジルのフェノール化合物は、抗糖化作用を有する活性成分であることが示された。これらのポリフェノールの抗糖化作用の機 序の一つは、ホーリーバジルの抗酸化作用と関連している可能性がある。

KEY WORDS : 抗糖化作用、終末糖化産物（AGEs）、ホーリーバジル（Ocimum tenuiflorum）、

		

ポリフェノール

はじめに

材料と方法

糖化は、蛋白質、脂質、核酸中の還元糖とアミノ基との非酵素的反応であり、終末糖化産物（advanced glycation- carboxymethyl）
end products: AGEs）を生 成 する 1)。 N ε（lysine（CML）などの AGEs の真皮組織 へ の蓄積は、皮膚における糖化ストレスに影響を及ぼす。AGEs はまた、コラーゲン蛋白質と結合して皮膚に一部蓄積される。コラー

ゲン中のアミノ酸であるリジンとアルギニンが AGEs に糖化修飾を受け、糖化したコラーゲン間で架橋を形成する可1) 化学物質および試薬

没 食 子 酸（ gallic acid ）、 メ タノ ール（MeOH）、 Folin（NaOH）、(+) - カテキン、
Ciocalteu 試薬、水 酸化ナトリウム

亜硝酸ナトリウム、三塩化アルミニウム、酢酸、酢酸ナトリ

ウム三水和物、メタノール - d 4（MeOD）、過硫酸カリウム、

アセトニトリル、ギ 酸、ロスマリン酸（rosmarinic acid ）、
サルビアノリン酸 A（salvianolic acid A）、グルコース、リン酸
水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、アミノグアニジン

能性が 示 唆されており、コラーゲンの糖化は、皮膚の弾力（aminoguanidine）、2, 3- ブタンジオン（ 2, 3-butanedione）、化は、酸化ストレスに関連した老化現象であり、糖尿病合（ 2, 3-diaminonaphthalene）、酢酸エチル、グリオキサール性の低下やシワの形成など、皮膚の老化を誘発する2)。糖併症、動脈硬化、神経障害、アルツハイマー病とも関連がある 3, 4) 。さらに、生体内の糖化反応が引き起こす疾患は、活性酸素による酸化ストレスや 炎症ストレスに起因し、蛋白質の構造・機能変化、細胞機能障害、アポトーシス、臓器傷害などを誘発する 5)。このように、糖 化は様々な疾患や老化と関連している。したがって、糖化を抑制すること
は、老化防止や恒常性維持 のために重要である。

Labiatae 科に属する Ocimum 属は、30 種 以上からなり、熱帯・亜熱帯地域に分布している。ホーリーバジル（別名：カミメボウキ、神目箒、学名 : Ocimum tenuiflorum）は、インドやスリランカで伝統的に様々な病気の治療に使われてきた。この植物は、ハーブティーや乾燥粉末が、風邪、頭痛、咳、心 臓病、皮膚病などに対する民間療法として用いられている6)。先行研究では、ホーリーバジル葉から得た
7)

精油が強力な抗酸化活性を示すことが 示 唆されている 。
また、ホーリーバジルはサポニン、フラボノイド、タンニンなどの 多くの不揮発性化合物を含む 8)。 Zhaoらは、プ ロト

シアニジン、縮合型タンニン、フラボノイドなどのポリフェノールが抗糖化活性に重要な役割を果たすことを示した 9)。
ホ ー リ ー バ ジ ル は、 ル テ オリン（luteolin）、 アピ ゲ ニ ン、オリエンチン（orientin）、オイゲノール（eugenol）、（apigenin）
コーヒー酸（caffeic acid）、ロスマリン酸（rosmarinic acid）などのフェノール化合物が主な生理活性成分として報告されていることから、高い糖化抑制効果が期待できる10, 11)。
本研究では、ホーリーバジル葉抽出物の抗糖化作用を評価

し、フェノール化合物の定量、抗酸化活性、蛍光性 AGEs、
CML、糖化中間体の生成について検討することとした。

過塩素酸、炭酸水素ナトリウム、2, 3- ジアミノナフタレン（ glyoxal: GO ）、 メチルグリオキサール（ methylglyoxal :MGO）および エタノール（ EtOH ）は富士フィルム和光純
薬（大阪）から購入した。 1, 1-Diphenyl - 2-picrylhydrazyl（DPPH）、2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic（ABTS）、 bovine serum albumin（ BSA ）は Sigmaacid ）
Aldrich（ St. Louis, USA）より、 3 - デ オ キ シ グル コ ソ ン
より、（3-deoxyglucosone: 3-DG）は同仁化学研究所（熊本）
ルテオリン 5 -O- グルコシド（luteolin 5-O-glucoside）、ル
テオリン 7-O- グルクロニド（luteolin 7-O-glucronide）、ア
ピゲニン 7-O- グルクロニド（apigenin 7-O-glucronide）はナミキ商事（東京）より、(− ) - rabdosiinは MedChemExpress（ NJ, USA）より入手した。

2) 実験方法U V ス ペ クトル は Jasco V- 570 UV/Vis spectrometer（ Jasco、東京）で解析した。1 H NMR および 13 C NMR ス
ペ クトルは、ECZ- 600 スペ クトロメーター（日本電子、東京）で、それぞれ 600 MHz および 12 5 MHz で 記録した。
ケミカルシフトは ppm、カップリングコンスタントは Hz で記載した。比旋光度は、Jasco P-1030 装置を用いて測定した。 HPLC は MD-2010 フォトダイオード アレイ検出 器とAtlantis T 3 カラム（ 3 μm, 150 mm × 4.6 mm i.d., Waters,
Milford, MA, USA）を備えた Jasco LC-2000 Plus HPLCシステムを使用して、アセトニトリル - 水 - ギ酸溶媒系で分析 を 行った。 マス ス ペ クト ル は、 Agilent 1200 Infinity
HPLC および Agilent 6540 Agilent Ultra-High-Definition
Accurate-Mass Q-TOF LC/MS 装置を組み合わせた LC-（ 2 ）ホーリーバジル抽出物の抗糖化物質

TOF-MSを用いて測定を行った。なお、マススペクトルは、ネガティブエレクトロスプレーイオン化（ESI ）モード で記 録した。分 取 HPLC は、LC -8A ポンプ（島津製作所、
京都）、 Jasco UV- 4570 検出器、 Inertsil ODS-4カラム（ 3μm, 250 mm × 20 mm i.d., GL サイエンス、東京）を用いて実施した。移動相として、0.1% 酢酸を含む 20 % 〜 27%
アセトニトリルを使用し、6.0 mL/min の流速で溶 出した。
なお、検出波長は 280 nm とした。

pH 5.5）を加え、ここに EtOH で調製した 0. 5 mM DPPH •溶液（20 μL）を加えた。反応混合物を攪拌し、30 ℃ の暗所
で 30 分間反応させた後、マイクロプレートリーダーを用いて
517 nm（A 517）における吸光度を測定した。DPPH ラジカル

3) 植物材料と抽出

IC 50 値（50 % 阻害濃度）は、試料濃度に対する減少率から算出した。測定は 3 連で行った。没食子酸とアスコルビ

ホーリーバジル（Ocimum tenuiflorum）の生葉は、スリラ消去活性は、以下の式で算出した。

DPPHラジカル消去活性（%）＝［（A 517（対照）− A 517（試料））／ A 517（対照）］× 100

ンカ伝統植物研究所（Negombo, Sri Lanka）で採取された。

ン酸は陽性対照として使用した。

（Peradeniya, Sri Lanka）から購入し、Industrial Technology

7) 2, 2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline- 6sulfonic acid) (ABTS) ラジカル消去活性

苗は、現地の農業省傘下である Department of Agriculture

Institute（Colombo, Sri Lanka）にて種の同定を行った。その後、少なくとも 6 ヶ月間栽培した。採取した葉は洗浄し、25 ℃ 、 湿度 50 % 〜 70 % の条件で 2 週間乾燥した。ホーリーバジルの乾燥葉（50 g ）を蒸留水（500 mL）で 100 ℃、
1 時間抽出した後、抽出液をろ過、濃縮、凍結乾燥し、粗抽出物（11. 6 g ）を得た。

4) 総ポリフェノール含量の測定

総ポリフェノール量は、Folin-Ciocalte 法を用いて測定した 12)。粗抽出物を50 % MeOH で 0. 5 mg/mL に調製し、試料溶液とした。試料溶液（20 μL）に 1 N Folin-Ciocalteu 試薬（40 μL）を混合した。次に、1N NaOH（100 μL）を加え、
15 分間反応させた後、20,000 × g 、4 ℃ で 5 分間遠心分離を行った。上清を 96 ウェルプレートに分注し、マイクロプ
レートリーダー（SpectraMax i3x, Molecular Devices, CA,USA）を用いて 734 nm の吸光度を測 定した。 総 ポリフェ
ノール量は、mg gallic acid equivalents/g sample として表した。測定は 3 連で 行った。

5) 総フラボノイド含量の測定
総フラボノイド含量は、塩化アルミニウム比色分析法を用いて測定した 13)。粗抽出物を 50 % MeOH で 0.5 mg/mL に調製し、試料溶液とした。試料溶液（125 μL）に 5 % 亜硝酸を加えて混合し、ナトリウム（40 μL）および蒸留水（625 μL）

5 分間反応させた。次に、10 % 塩化アルミニウム（250 μL）
を添加し、6 分間反応させた後、1 N NaOH（250 μL）および蒸留水（140 μL）を添加した。混合物をボルテックスで攪拌し、マイクロプレートリーダーを用いて 510 nm における吸光度を測定した。総フラボノイド量は、mg (+)-catechin
equivalents/ g sample として表した。測定は 3 連で行った。

6 ) 1, 1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl（ DPPH）
ラジカル消去活性

ABTSラジカル消去活性は、既報の通り測定した 7)。7 mM
ABTS • 溶液 10 mL と14 0 mM 過硫酸カリウム176 μL を混合し、25 ℃ の暗所で 12 ～ 16 時間静置した後、EtOH で 30倍に希釈し、このABTS • 溶液の 734 nm における吸光度が 約 0. 700 であることを確認した。
粗抽出物を50 % MeOH で 1〜 200 μg/mL に調製し、試料溶液とした。試料溶液（20 μL）に ABTS • 溶液（200 μL）を添加した。混合物を攪拌し、37 ℃ で 4 分間反応させた後、マイクロプレートリーダーを用いて 734 nm（A 734 ）における吸光度を測定した。ABTS ラジカル消去活性は、以下の式で算出した。

ABTS ラジカル消去活性（%）＝［（A734（対照）− A734（試料））／ A 734（対照）］× 100
IC 50 値は、試料濃度に対する減少率から算出した。測定は 3 連で 行った。没食子酸とアスコルビン酸は陽性対照として使用した。

8) スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）様活性

SOD 様活性は、SOD Assay Kit-WST（同仁化学研究所）

を用いて、プロトコルにしたがって評価した。粗抽出物を50 % MeOH で 1 〜 50 μg/mL に調製し、試料溶液とした。試とenzyme料溶液（20 μL）にWST working solution（200 μL）
working solution（20 μL）を混合した。混合液は攪拌し、37℃ で 20 分間反応させた後、マイクロプレートリーダーを用いて 450 nm（A 450 ）における吸光度を測定した。SOD 様
活性は、以下の式で算出した。
阻害率（%）＝［（A 450（対照）− A 450（試料））／ A 450（対照）］× 10 0

DPPH ラジカル消去活性は、既報の通り測定した 7)。粗抽出 物を 50 % MeOH で 1 〜 100 μg/mL に 調 製 し、試料溶液に100 mM 酢酸バッファー（40 μL,とした。試料溶液（40 μL）

IC 50 値は、試料濃度に対する減少率から算出した。測定は 3 連で行った。没食子酸とアスコルビン酸は陽性対照として使用した。

（ 3 ）Glycative Stress Research9) フェノール化合物の単離粗抽出物（8.0 g ）を少量の蒸留水に溶解後、平衡化済みの
DIAION HP-20 カラム（三菱ケミカル、東京 ; 35 g ; 330 mm
× 30 mm i.d.）に供し、H2O-MeOH 溶媒系（300 mL）で順次、50 % MeOH Fr.（1.84 g）、100 %溶出し、H2O Fr.（5.40 g）
MeOH Fr.（0. 50 g ）の 3 つの画分を得た。50 % MeOH Fr.
（1.0 g ）は、 H2 O-MeOH 混合液（100：0 、75：25 、50：50 、25：75、0：100 v/v；200 mL）を用いてSephadex LH-20 カラム（Cytiva Sweden AB, Upsala, Sweden；25 g；300 mm ×
30 mm i.d. ）によりさらに分離した。得られた 25 〜 100 %MeOH Fr. を 20 % 〜 27% アセトニトリルに溶解し、可溶部を分 取 HPLC に供して、7 種類のフェノール化合物を単離した。化合物 1（6.1 mg）は 75 % MeOH Fr. から、 化 合 物 2（66.3 mg）
、 3（7.1 mg）、4（6.8 mg）および 5（23.8 mg ）は25% MeOH Fr. から、化合物 6（6.2 mg）および 7（3.5 mg）
は100 % MeOH Fr. から単離した。単離した各化合物の純度は HPLC で確認した。粗抽出物から得られた化合物 1 〜 7（Fig. 1）の構造を LC-TOF-MS および NMR スペ クトル で推 定し、極大吸収および比旋光度を測定した。また、単離化合物と標準物質の HPLC クロマトグラムを比較することで同定とした。

10) 糖化蛋白質の調製

糖化蛋白質の調製は、既報の方法に従って行った 14)。BSA-

グルコース糖化モデルを用いて、ホーリーバジルの粗抽出物

CML /N ε-(carboxymethyl) lysine ELISA Kit（医学生物学研

究 所、東京）を用いて、プロトコルに従って定量を行った。
試料溶液は、反応液を 0.1 M PBS で 250 倍に希釈したものを使用した。CML 含量は、試料無添加の対照と比較した
CML 生成率で示した。

13) AGEs中間体の測定

AGEs の中間 体 と し て 3-DG, GO, MGOを 既 報 の 通 り
HPLC-UV システムで 測 定し た 16)。反応混合物50 μL に 5
μg/mL 2, 3-butanedione 6 μLを内部標準として加え、ここに蒸留水 75 μLを加えた。混合物をボルテックスした後、125μL の 6.0 % 過塩素酸を加え、12,000 × g で10 分間遠心分離した。上清に125 μL の飽和炭酸水素 ナトリウムと12. 5 μLの 1 mg/mL 2, 3-diaminonaphthalene を添 加 し た。こ の 反
応液を 4 ℃ で 一 晩 インキュベ ートした。 翌日、反応液に酢酸エチル 0. 5 mL を加えて液液分配し、1,000 × g で 10 分
間遠心分離した。上清を 1.5 mL エッペンチューブに分注し、窒素下で濃縮した。その後、100 μLのMeOH を加え、分析に供した。3-DG, GO, MGO は、 Inertsil ODS-3 カラム（ 5 μm, 150 mm × 4.6 mm i.d., GL サイエンス）を用いた
HPLC で分析した。グラジエント条件は、溶離液 A に精 製
水を、溶離液 B に 100 %アセトニトリルを使 用し、55 分間
で 10 % 〜 41.4 % アセトニトリル濃度となるように設定した。流速は 1.0 mL/min、検出波長は 268 nmとした。

とそこから単離された化合物の糖化への影響を検討した。

0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS, pH 7.2）で100 mg/mLに調製したグルコース溶液に最終濃度 10 mg/mL になるよ
うに BSAを添 加し、60 ℃ で 7日間インキュベートした（溶液A）。リファレンスは、グルコースを含まない 10 mg/mL BSA溶液とした（ B 液）。粗抽出物および単離化合物の効果を明らかにするため、グルコース存在下または非存在下で、各濃度に調製した試料を反応混合物に添加した（それぞれ C 液および D 液）。反応混合物は分析に使用するまで −20 ℃ に保存した。なお、アミノグアニジンは陽性対照として用いた。

11) 蛍光性 AGE の測定

AGE 生成は、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、励起波長 370 nm、発光波長 440 nm で測定した 15)。粗抽出物、単離化合物、アミノグアニジンの蛍光 AGE 生成に対する阻害活性は以下の式で算出し、試料濃度に対する阻害活性から IC 50 値を求めた。

すべての統計解析は GraphPad Prism 5 for Windows（GraphPad Software, San Diego, CA）を用いて行った。数値は平均値 ± 標準偏差（SD）で表した。統計解析は、グループ間の統計的比較のために一元配置分散分析に続いて Tukey

試験を用いて行い、p < 0.05 の値は有意であることを示した。

結果
総ポリフェノール量および 総フラボノイド量
総 ポリフェノール量および 総フラボノイド量は、それぞれ214.5 ± 8.0 mg gallic acid equivalents/g extract および 146.6± 4.6 mg catechin equivalents/g extract であった。この結果から、ホーリーバジル粗抽出物中のポリフェノールの約70 % はフラボノイドであることが 示された。

蛍光 AGE 生成抑制活性（ % ）＝｛（溶液 A- 溶液 B ）−（溶液 C - 溶液 D ）の蛍光度｝／（溶液 A- 溶液 B）の蛍光度 × 100

12) CML の測定

統計解析

抗酸化活性

CML は非蛍光性 AGE であり、糖化反応の最も豊富な生成物の一つである。反応混合物中の CML は、CircuLex

粗抽出物の抗酸化作用を Table 1 に示した。粗抽出物はDPPH ラジカル消去活性、ABTSラジカル 消去活性、SOD様活性を示し、IC 50 値はそれぞれ 36.6 ± 0.2 μg/mL, 172.1± 6.5 μg/mL, 39.5 ± 3.6 μg/mLであった。粗抽出物とアス（ 4 ）ホーリーバジル抽出物の抗糖化物質

Luteolin 5-O-glucoside (1)Luteolin 7-O-glucronide (2)(−)-Rabdosiin (3)Apigenin 7-O-glucronide (4)Rosmarinic acid (5)Globoidnan A (6)Fig. 1. Chemical structures of the phenolic compounds isolated from holy basil.
Fig. 1. Chemical structures of the phenolic compounds isolated from holy basil.
Salvianolic acid A (7)Fig. 1. Chemical structures of the phenolic compounds isolated from holy basil.
Fig. 1. Chemical structures of the phenolic compounds isolated from holy basil.
Fig. 1. Chemical structures of the phenolic compounds isolated from holy basil.

（ 5 ）Glycative Stress Research

Table 1. Antioxidant activity of the crude extract of holy basil.
DPPH radical scavenging activity(IC 50 ; μg/mL)

ABTS radical cation scavenging activity(IC 50 ; μg/mL)

SOD-like activity(IC 50 ; μg/mL)

Crude extract

36.6 ± 0. 2 c

172.1 ± 6. 5 c

39.5 ± 3.6 c

Gallic acid

3. 5 ± 0.6 a

12. 4 ± 0.2 a

0. 6 ± 0. 3 a

Ascorbic acid11.8 ± 1.0 b

61.8 ± 9.5 b

179.0 ± 1. 9 b

SampleValues represent mean ± SD from three independent experiments, and means within columns with the same superscript letters are not significantly different( p < 0.05). DPPH,1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl; ABTS, 2, 2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid); SOD, superoxide dismutase; IC 50, 50 %inhibitory concentration; SD, standard deviation.

コルビン酸の抗酸化活性を比較すると、DPPH および ABTS体が生成していることが確認された。粗抽出物および単離倍高い値であった。

特に、化合物 3, 5, 6, 7 は AGE 中間体の生成を有意に抑制

ラジカル消去活性のIC 50 値は約1/ 3で、SOD 様活性は約4. 5化合物は、いずれも 3-DG, GO, MGO の生成を抑制した。
した。粗抽出物は 3-D G 生成に対して約 30 % の阻害活性

単離化合物の構造解析
ホーリーバジルの粗抽出物を DIAION HP-20 カラムおよび Sephadex LH-20 カラムクロマトグラフィーにより分画し、分取 HPLC による分離精製で luteolin 5-O-glucoside(1), luteolin 7-O-glucuronide (2), (−)-rabdosiin (3), apigenin
7-O-glucuronide (4), rosmarinic acid (5), globoidnan A (6),salvianolic acid A (7) を単離した（Fig. 2）。これらの化合物

は、文献値 17-23) と比較することにより同定した。また、単離化合物の実測値は、Supplemental data に記載した。化合物 1, 2, 3, 4, 5 は様々な植物から発見されているが、化合物 6, 7 はホーリーバジル から初めて報告された。

を示し、化合物 1, 2, 4 では約 50 % 、化合物 3, 5, 6, 7 では

約 70 % の高い阻害活性であった。GO と MGO においては、

粗抽出物および化合物 1, 2, 4 は 40 % 〜 50 %の阻害活性を、化合物 3, 5, 6, 7 は 60 % 〜 70 %と強 力なAGE 中間体生成

阻害活性を示した。

考察
生体内の糖化ストレスは老化や生活習慣病の原因の一つであり、糖化によるAGEs 生成は酸化反応と関連している。アミノグアニジンは AGEs 生成を抑制するが、摂取する

蛍光性 AGEs の生成に対する阻害活性

蛍光性 AGEs の生成に対するホーリーバジルの粗抽出物と単離化合物の阻害活性をTable 2 に示した。粗抽出物およことで貧血、肝障害、ビタミン B6 欠乏などの副作用が 生じる24)。そこで、薬草から luteolin、cyanidin 3-O-galactoside、

rhodanthenone B などの新しい抗 糖化成分が単離されてきび単離化合物は、いずれも蛍光性 AGEs の生成を阻害した。

た 25-27)。

ンより強いものであった。特に、化合物 3, 5, 6, 7 は、蛍光

「アーユルヴェーダにおける自然界の母なる薬草」とも呼ばこれらの阻害活性は陽性対照として用いたアミノグアニジ
性 AGEs の生成を顕著に抑制した。

ホーリーバジルは、「ハ ーブの女王」、「比 類なきもの」、
れ、伝統医薬において重要なハーブである 28)。ホーリーバ

ジルは、インドやスリランカでは薬用植物として 3000 年以

CML および AGE 中間体生成に対する阻害活性

非蛍光性AGEsの生成に対する阻害活性を調べるために、
AGEs の一つであるCML 量をELISA 法で測定した。Fig. 3に示すように、ホーリーバジルの粗抽出物と単離化合物は、

CML の生成を抑制した。粗抽出物、化合物 1, 2, 4 におけるCML 生成の阻害率は 10 % 〜 20 % 程度であった。一方、化合物 3, 5, 6, 7 は、粗抽出物や化合物 1, 2, 4 以上の強力なCML 形成阻害活性を示した。
次に、ホーリーバジルの粗抽出物と単離化合物のAGE 中間体形成に対する影響を評価した（ Fig. 4 ）。HPLC-UV分
析から、糖化反応により 3-DG, GO, MGO の 3 種類の中間

上の歴史があり、潜在的に機能性を有するハーブである。
本研究では、抗糖化作用を指標に、ホーリーバジルの生理機能を評価した。ホーリーバジルの熱水抽出物は強い抗糖化活性を示し、この抽出物には、luteolin 5-O-glucoside(1), luteolin 7-O-glucuronide (2), (−)-rabdosiin (3), apigenin
7-O-glucronide (4), rosmarinic acid (5), globoidnan A (6),salvianolic acid A (7) といったポリフェノールが含まれていた。なお、化合物 6, 7 はホーリーバジルから初めて単離、同定された。これらの成分は、いずれも抗糖化効果の活性成分であることが確認された。特に、化合物 3, 5, 6, 7 は、化合物 1, 2, 4 といった配糖体より強い抗糖化活性を示した。

（ 6 ）ホーリーバジル抽出物の抗糖化物質

16Fig. 2.chromatogram
HPLC chromatogramof the phenolic
compounds
from
theextract
crude extract
holy basil.
Fig. 2. HPLCof the phenolic
compounds
isolatedisolated
from thecrudeof holyof
basil.

Detection:
PDAPDAdetector(280 nm);condition: condition:
5% ~ 100 % 5%acetonitrile
containing
0.1% containing
formic acid. 0.1%
1: Luteolin
Detection:
detector(280gradientnm); gradient~ 100%
acetonitrile
formic acid. 1:
5-O-glucoside (1), 2: Luteolin 7-O-glucronide (2), 3: (-)-Rabdosiin (3), 4: Apigenin 7-O-glucronide (4), 5: Rosmarinic acid (5),6:Luteolin
Globoidnan5-O-glucoside
A (6), 7: Salvianolic
A (7). HPLC,
high-performance(2),liquidphotodiodearray.
(1),acid
2: Luteolin
7-O-glucronide
3: chromatography;(-)-Rabdosiin PDA,(3), 4:
Apigenin
7-O-glucronide (4), 5:

Rosmarinic acid (5), 6: Globoidnan A (6), 7: Salvianolic acid A (7). HPLC, high-performance liquid
chromatography; PDA, photodiode array.

Supplementary data
Spectroscopic data of compounds 1– 7
Luteolin 5-O-glucoside (1): yellow amorphous powder; UV (MeOH) λ max = 248, 346 nm; HR-ESI-MS m/z 447.0945 [MH] -, calcd. for C 21H20 O11, 448.1018; 1H NMR (600 MHz, MeOD): δ 7.37 (dd, 1H, J = 7.6, 2.0 Hz, H-6'), 7.35 (brs, 1H,H-2'), 6.89 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H-5'), 6.81 (d, 1H, J = 2.0 Hz, H-6), 6.69 (d, 1H, J = 2.0 Hz, H-8), 6.52 (s, 1H, H-3), 4.83
(d, 1H, J = 7.6 Hz, H-1''), 3.94 (dd, 1H, J = 12.0, 1.4 Hz, H-6''α), 3.75 (dd, 1H, J = 12.0, 5.5 Hz, H-6''β), 3.58 – 3.60 (m,1H, H-2''), 3.42 – 3.50 (m, 3H, H-3'', H-4'', H-5''); 13 C NMR (125 MHz, MeOD): δ 180.4 (C-4), 165.3 (C-7), 164.4 (C-2),
160.7 (C-9), 160.1 (C-5), 150.8 (C-4'), 147.0 (C-3'), 123.5 (C-1'), 120.1 (C-6'), 116.8 (C-5'), 114.0 (C-2'), 109.2 (C-10),
106.5 (C-3), 105.1 (C-1''), 104.9 (C-6), 99.3 (C-8), 78.6 (C-5''), 77.3 (C-3''), 74.7 (C-2''), 71.2 (C-4''), 62.5 (C-6''). The
above data were in consistency with the reported values of Luteolin 5-O-glucoside (Sevindik et al., 2015).

（ 7 ）Glycative Stress Research

Luteolin 7-O-glucronide (2): yellow amorphous powder; UV (MeOH) λ max = 253, 266, 347 nm; HR-ESI-MS m/z 461.0729[M-H]-, calcd. for C 21H18O12, 462.0798; 1 H NMR (600 MHz, MeOD): δ 7.43 (d, 1H, J = 7.6 Hz, H-6'), 7.41 (s, 1H,H-2'), 6.90 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H-5'), 6.82 (d, 1H, J = 2.1 Hz, H-8), 6.60 (s, 1H, H-3), 6.49 (d, 1H, J = 2.1 Hz, H-6), 5.10
(d, 1H, J = 7.6 Hz, H-1''), 3.93 (d, 1H, J = 9.0 Hz, H-5''), 3.53 – 3.57 (m, 3H, H-2'', H-3'', H-4''); 13 C NMR (125 MHz,
MeOD): δ 184.1 (C-3), 175.0 (C-6''), 166.9 (C-2), 164.9 (C-7), 162.8 (C-5), 159.0 (C-9), 151.2 (C- 4'), 147.1 (C-3'),
123.5 (C-1'), 120.5 (C-6'), 116.8 (C-5'), 114.3 (C-2'), 107.2 (C-10), 104.1 (C-3), 101.6 (C-1''), 101.4 (C- 6), 96.1 (C8), 77.5 (C-3''), 76.6 (C-5''), 74. 5 (C-2''), 73.3 (C- 4''). The above data were in consistency with the reported values ofluteolin 7-O-glucronide (Bhatarrai et al., 2019).
(−)-Rabdosiin (3): light brown amorphous powder; UV (MeOH) λ max = 255, 285, 345 nm; [α]D = -37.6 (c = 0.50, MeOH),
HR-ESI-MS m/z 717.1475 [M-H]-, calcd. for C 36 H 30 O 16, 718.1549; 1 H NMR (600 MHz, MeOD): δ 7.58 (s, 1H, H-4),
6.79 (s, 1H, H-5), 6.74 (d, 1H, J = 2.1 Hz, H-2''), 6.68 (d, 1H, J = 1.4 Hz, H-2'''), 6.66 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H-5'''), 6.64 (d,1H, J = 7.6 Hz, H-5''), 6.60 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H-5'), 6.55 (d, 1H, J = 7.6 Hz, H-6''), 6.50 (d, 1H, J = 8.0 Hz, H-6'''), 6.49
(s, 1H, H-8), 6.35 (d, 1H, J = 8.2, 2.0 Hz, H-6'), 6.33 (d, 1H, J = 2.0 Hz, H-2'), 5.04 (dd, 1H, J = 7.9, 4.8 Hz, H-8'''), 4.97
(dd, 1H, J = 6.9, 4.8 Hz, H-8''), 4.44 (brs, 1H, H-1), 3.88 (d, 1H, J = 1.5 Hz, H-2), 3.03 (dd, 1H, J = 14.5, 4.1 Hz, H-7'''),
2.98 (dd, 1H, J = 13.8, 3.8 Hz, H-7'''), 2.91–2.96 (m, 2H, H-7''); 13 C NMR (125 MHz, MeOD): δ 174.3 (C-9'''), 173.7(2-COO-), 173. 5 (C-9'') , 168.0 (3-COO-), 149.1 (C-7), 146.1 (C-3''), 146.0 (C-3'''), 145.9 (C-4'''), 145.4 (C-6), 145.1(C-4''), 145.1 (C-3'), 144.8 (C-4'), 140.9 (C-4), 136.8 (C-1'), 131.4 (C-9), 129.6 (C-1''), 129.5 (C-1'''), 124.7 (C-10),
122.0 (C-6'''), 121.4 (C-6''), 120.5 (C-3), 119.9 (C-6'), 117.7 (C-2'''), 117.6 (C-2''), 117.5 (C-8), 117.3 (C-5), 116.4 (C5''), 116.3 (C-5'''), 116.3 (C-5'), 115.6 (C-2'), 75.7 (C-8''), 75.7 (C-8'''), 49.9 (C-2), 46.1 (C-1), 38.1 (C-7''), 37.7 (C7'''). The above data were in consistency with the reported values of (−)-rabdosiin (Ozgen et al., 2010).
Apigenin 7-O-glucronide (4): yellow amorphous powder; UV (MeOH) λ max = 235, 265, 340 nm; HR-ESI-MS m/z
445.0765 [M-H]-, calcd. for C21 H18 O11 , 446.0841; 1 H NMR (600 MHz, MeOD): δ 7.87 (d, 2H, J = 7.6 Hz, H-2', H-6'),
6.92 (d, 2H, J = 8. 3 Hz, H-3', H-5'), 6.81 (d, 1H, J = 1.8 Hz, H-8), 6.64 (s, 1H, H-3), 6.48 (d, 1H, J = 1.4 Hz, H-6), 5.13
(d, 1H, J = 7.6 Hz, H-1''), 4.03 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H-5''), 3.53 – 3.60 (m, 3H, H-2'', H-3'', H- 4''); 13 C NMR (125 MHz,
MeOD): δ 184.1 (C-4), 175.6 (C- 6''), 166.8 (C-2), 164.6 (C-7), 162.9 (C-5), 162.9 (C-4'), 159.0 (C-9), 129.7 (C-2'),
129.7 (C-6'), 123.1 (C-1'), 117.0 (C-3'), 117.0 (C-5'), 107.2 (C-10), 104.1 (C-3), 101.4 (C-1''), 101.2 (C-6), 96.0 (C8), 77.3 (C-3''), 76.6 (C-5''), 74.4 (C-2''), 73.1 (C-4''). The above data were in consistency with the reported values of
apigenin 7-O-glucronide (Moussaoui et al., 2010).
Rosmarinic acid (5): brown amorphous solid; UV (MeOH) λ max = 235 and 330 nm; HR-ESI-MS m/z 359.0776 [M-H]-,
calcd. for C18 H16 O8 , 360.0845; 1 H NMR (600 MHz, MeOD): δ 7.54 (d, 1H, J = 15.8 Hz, H-7), 7.03 (d, 1H, J = 2.1 Hz,
H-2), 6.95 (dd, 1H, J = 8.3, 2.0 Hz, H-6), 6.77 (d, 1H, J = 7.6 Hz, H-5), 6.74 (d, 1H, J = 1.5 Hz, H-2'), 6.68 (d, 1H, J = 7.6
Hz, H-5'), 6.61 (dd, 1H, J = 8.2, 2.1 Hz, H-6'), 6.26 (d, 1H, J = 16.5 Hz, H-8), 5.17 (dd, 1H, J = 8.3, 4.1 Hz, H-8'), 3.09
(dd, 1H, J = 14.5, 4.1 Hz, H-7'α), 2.99 (dd, 1H, J = 14.5, 8.3 Hz, H-7'β); 13 C NMR (125 MHz, MeOD): δ 173.7 (C-9'),168. 5 (C-9), 149.7 (C- 4), 147.7 (C-7), 146.8 (C-3), 146.1 (C-3'), 145.2 (C-4'), 129.4 (C-1'), 127.2 (C-1), 123.1 (C-6),
121.8 (C-6'), 117.6 (C-2'), 116. 5 (C-5), 116.3 (C-5'), 115.2 (C-2), 114.5 (C-8), 74.8 (C- 8'), 37.9 (C-7'). The above data
were in consistency with the reported values of rosmarinic acid (Sevindik et al., 2015).
Globoidan A (6). light brown amorphous powder; UV (MeOH) λ max = 261 and 318 nm; HR-ESI-MS m/z 491.0987 [M-H]-,
calcd. for C 26 H 20 O10 , 492.1062; 1 H NMR (600 MHz, MeOD): δ 8.24 (brs, 1H, H-4), 7.62 (d, 1H, J = 1.4 Hz, H-2), 7.26
(s, 1H, H-8), 7.24 (s, 1H, H-5), 6.87 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H-5'), 6.86 (d, 1H, J = 2.0 Hz, H-2'), 6.79 (d, 1H, J = 2.0 Hz,
H-2''), 6.75 (dd, 1H, J = 8.2, 2.0 Hz, H-6'), 6.68 (dd, 1H, J = 8.2, 2.0 Hz, H-6''), 6.65 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H-5''), 5.24 (dd,
1H, J = 9.6, 3.4 Hz, H-8''), 3.16 (dd, 1H, J = 13.4, 3.4 Hz, H-7''), 3.05 (dd, 1H, J = 14.5, 9.6 Hz, H-7''); 13 C NMR (125MHz, MeOD): δ 174.2 (C-9''), 168.4 (C-9), 150.2 (C-7), 148.3 (C-6), 146.2 (C-4'), 146.1 (C-3'), 145.9 ( C-3''), 145.2(C- 4''), 140.0 (C-1), 133.8 (C-1'), 131.9 (C-8a), 130.3 (C-1''), 129.8 (C- 4a), 129.4 (C-4), 125.1 (C-3), 124.4 (C-2),
122.4 (C- 6'), 121.9 (C- 6''), 118.0 (C-2'), 117.6 (C-2''), 116.4 (C-5''), 116.3 (C-5'), 112.4 (C-5), 109.4 (C-8), 76.0 (C8''), 38.2 (C-7''). The above data were in consistency with the reported values of globoidan A (D’Urso et al).

（ 8 ）ホーリーバジル抽出物の抗糖化物質

Salvianolic acid A (7): yellow amorphous powder; UV (MeOH) λ ma = 227 and 287 nm; HR-ESI-MS m/z 493.1147 [M-H] -,calcd. for C26 H22 O10 , 494.1220; 1 H NMR (600 MHz, MeOD): δ 8.02 (d, 1H, J = 15.8 Hz, H-7'), 7.12 (d, 1H, J = 16.5
Hz, H-8), 7.10 (d, 1H, J = 8.9 Hz, H-6'), 7.03 (d, 1H, J = 2.0 Hz, H-2), 6.86 (dd, 1H, J = 8.3, 2.0 Hz, H-6), 6.74 (d, 1H,
J = 7.6 Hz, H-5'), 6.73 (d, 1H, J = 7.6 Hz, H-5), 6.71 (d, 1H, J = 2.1 Hz, H-2''), 6.65 (d, 1H, J = 15.8 Hz, H-7), 6.62 (d,1H, J = 8.3 Hz, H-5''), 6.54 (dd, 1H, J = 8.3, 1.4 Hz, H-6''), 6.29 (d, 1H, J = 15.8 Hz, H-8'), 5.12 (dd, 1H, J = 8.3, 2.7
Hz, H-8''), 3.06 (dd, 1H, J = 14. 5, 3.4 Hz, H-7''), 2.92 (dd, 1H, J = 13.8, 9.0 Hz, H-7''); 13 C NMR (125 MHz, MeOD): δ
175. 5 (C-9''), 168.9 (C-9'), 148.2 (C- 4'), 146.9 (C-7'), 146.7 (C-4), 146.4 (C-3), 146.0 (C-3''), 145.0 (C-4''), 144.4 (C3'), 137.8 (C-7), 131.4 (C-1), 130.0 (C-1''), 128.2 (C-2'), 126.2 (C-1'), 122.0 (C-6''), 120.6 (C-8), 120.4 (C-6), 120.1(C-6'), 117.3 (C-2''), 116. 5 (C-5''), 116.3 (C-5), 116.1 (C-8'), 114.7 (C-5'), 114.0 (C-2), 76.3 (C-8''), 38.2 (C-7''). The
above data were in consistency with the reported values of salvianolic acid A (Zhou et al., 2014).

Table 2. Inhibitory activity against fluorescent AGE formation.
IC 50 value (mg/mL)

IC 50 value (mM)

Crude extract

0.37 ± 0.02 b-

Luteolin 5-O-glucoside (1)0.22 ± 0.02 c

0.49 ± 0.05 b

SampleLuteolin 7-O-glucronide (2)0.25 ± 0.01 c

0. 55 ± 0.01 b

0.23 ± 0.01 c

0. 52 ± 0.02 b

0.15 ± 0.01d(-)-Rabdosiin (3)Apigenin 7-O-glucronide (4)Rosmarinic acid (5)0.07 ± 0.01 e

0.20 ± 0.04 c

0.09 ± 0.01 e

0.18 ± 0.03 c

0.08 ± 0.01 e

Globoidnan A (6)Salvianolic acid A (7)0.49 ± 0.04 a

Aminoguanidine

0. 21 ± 0.02 c

0.16 ± 0.02 c

6.74 ± 0.58 a

Values represent mean ± SD from three independent experiments, and means within columns with the same superscript
letters are not significantly different ( p < 0.05). AGE, advanced glycation end product; SD, standard deviation.

a
100

b

b

b

b

b

d

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e

(6
)

(7

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n
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luc

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e

Co

ud
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(1
)

0

te

Fig. 3. Effects of the crude extract of holy basil andthe phenolic compounds isolated from it on theformation of CML.

Extract and isolated compounds with indicated percentages
were introduced into the BSA-glucose model and incubated at
60 °C for seven days. CML was quantified using ELISA. Data
were calculated as the percentage of CML formation comparedto that of controls without sample addition and are presented asmean ± SD (n = 8). Bar with different letters ( a - e) differ ( p< 0.05). CML, N ε-(carboxymethyl) lysine; ELISA, enzymelinked immuno sorbent assay; SD, standard deviation.

50

Lu

Percentage of CML formation

150

（ 9 ）

Glycative Stress Research

150

150

150

c

b
c

c

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O

n

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a

100

te

b

100

Lu

100

a

Lu

a

Percentage of MGO formation(C )Percentage of GO formation( B)

Percentage of 3-DG formation(A)

Fig. 4. Effects of the crude extract of holy basil and the phenolic compound isolated from it on the formation of
AGE intermediate.

Extract and isolated compounds with indicated percentages were introduced into the BSA-glucose model and incubated at 60 °C forseven days. The AGE intermediates were detected using a HPLC-UV system: (A) 3-DG, (B) GO, and (C) MGO. Data were calculated
as the percentage of AGE intermediate formation compared to that of controls without sample addition and are presented as mean ± SD
(n = 3). Different letters ( a - e ) for the same method represent statistically significant differences between samples ( p < 0.05). AGE,
advanced glycation end product; BSA, bovine serum albumin; HPLC, high-performance liquid chromatography; UV, ultra violet; 3-DG,
3-deoxyglucosone; GO, glyoxal; MGO, methylglyoxal; SD, standard deviation.

Yangらは 29)、BSA-グルコースモデルにおいて、kaempferol
が kaempferol 配糖体よりも強い 糖化阻害活性を示すと報告しており、我々の結果と一致する。生体内における糖化のメカニズムとして、GO, 3-DG, MGO などのジカル

結論
本稿では、
ホーリーバジルの抽出物およびそこから単離されたフェノール化合物の BSA- グルコース系に対する抗糖化作

ボニル誘導体の代謝によるAGEs の蓄積が挙げられる3, 30)。

用について報告した。ホーリーバジルの粗抽出物はポリフェと Schiff 塩基やAmadori 化合物の酸化的開裂によって生成(1), luteolin 7-O-glucuronide (2), (−) -rabdosiin (3), apigenin
7-O-glucuronide (4), rosmarinic acid (5), globoidnan A (6),salvianolic acid A (7) は蛍光 AGEs、CML および 糖化反応

AGEs のうち、GO を前駆体とする分子内 Cannizzaro 反 応するCML は、糖尿病や高い酸化ストレスを有する患者で検出されている31)。そこで、ホーリーバ ジルの粗抽出物と単離化合物の糖化反応に対する影響を調べたところ、GOの生成は有意に抑制されることが確認された。この結果は、GO 形成の阻害がその後の代謝を妨げることにより、CML
蓄積の抑制につながったことを示唆するものであった。

先行研究では、抗糖化機構としてフリーラジカル消去作

ノールを豊富に含み、その中に含まれるluteolin 5-O-glucoside

中間体の生成を顕著に抑制することが 示された。特に、化合物 3, 5, 6, 7 が ホーリーバジルの強力な抗糖化活性成分

として特定できた。このようなホーリーバジルの機能特性は、化粧品、サプリメント、医薬品の開発などに有益である可能性が示唆された。

用の関与が提案されている 32)。ホーリーバジルの粗抽出物

は、DPPH および ABTS ラジカルを消去し、また SOD 様活性を示した。これらの結果は、ホーリーバジルの抗酸化作用がAGEs 生成抑制に有用であることを示唆している。一方、酸化ストレスは、生体内におけるAGE の形成・蓄積のメカニズムにおいて重要な役割を担っており、いくつかの疾患の進行の重要な要因として関与すると考えられている。
組織内に酸化ストレスが 存 在すると、糖化反応が 加 速さ

謝辞
本研究を支援してくださった金 城 綾乃氏に謝 意を表する。本研究の発表にあたり、公益財団法人 医食同源生薬研究財団（東京都中央区）より支援を受けた（IDF#221001）。

れて、老化が促進する33)。強力な抗酸化活 性を有するホーリーバジルの抽出物が、加齢に伴う糖化を抑制する有効な成分になる可能 性が 示 唆されたが、生体内での抗糖化機

利益相反申告著者らは、本論文の内容に直接関連する利益相反はない。

構を解明するためにはさらなる研究が必要である。

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ホーリーバジル抽出物の抗糖化物質

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