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酵素および装置フリーな 16S rRNA 検出法に基づく「その場」食品細菌検査法の開発＜令和元年度助成＞

酵素および装置フリーな 16S rRNA 検出法に基づく「その場」食品細菌検査法の開発

大石基（筑波大学 数理物質系 物質工学域）

も十分ではなく（疑陰性を生じる）、時間（6 ～ 8 時

背景と目的間：汚染の拡大）・手間（16S rDNA の単離）がかか
食中毒の発生は、細菌に汚染された食品類を喫食るため、食品加工などの現場において実施するのはすることが主な原因である。近年、食品類がどれだ困難である。一方、食品加工現場において細菌を「そけ細菌に汚染されているかを検査し、安全性を確認の場」かつ「迅速」に高感度で検出できれば、細菌する食品細菌検査の重要性が高まっている。しかし、による食品汚染を未然に防げると同時に出荷の延滞

現行の食品細菌検査では細菌培養法を用いているた（PCR 法による検査時間待ち）による生産性低下もめ、培養に時間（1 ～ 3 日）が必要となり、検査結防げることからも、食品加工現場において細菌を簡果の報告まで 2 ～ 7 日かかってしまう。したがっ便かつ迅速に検出できる食品細菌検査法の確立が求て、この検査の間にも食中毒および食品汚染が広められている。

が る リ スクが存在する。一方、酵素を用いた PCR

本研究ではヘアピン型 DNA とポリエイチレング（Polymerase Chain Reaction）法を利用した 16S リリコール（PEG）を共固定化させた DNA/PEG 化金ボソーム RNA（16S rRNA）の系統解析による食品ナノ粒子を調製し、ナノ粒子界面での足場介在型細菌検査も行われている。この 16S rRNA とは細菌

DNA 鎖交換反応（酵素不要かつ室温での反応）を素のリボソームを構成する RNA の 1 つであり、すべ反応とした DNA サーキットによりシグナルを増幅ての細菌が保有している。また、その塩基配列の一させることで、酵素および装置を一切用いず、かつ部は細菌ごとに異なっていることが知られている。

食品類の前処理（16S rRNA 遺伝子の単離）するこ

したがって、PCR 法により 16S rRNA 遺伝子（16Sとなく標的 16S rRNA を「その場」で検出することrDNA）を増幅・検出することにより、細菌を培養すを目的としている。

ることなく比較的短い時間（6 ～ 8 時間）で細菌を検出することができる。しかしながら、食品類には結果と考察

PCR で用いる酵素（ポリメラーゼ）に対する阻害物質が含まれているため、PCR 法では手間および時間本研究での DNA サーキットにおいて鍵となるののかかる前処理（16S rDNA の単離）が必要となる。

は、足場介在型 DNA 鎖交換反応である（図 1）。こまた、16S rDNA は細菌 1 つあたり数コピーしか存の足場介在型 DNA 鎖交換反応とは、二本鎖を形成在しないことから、PCR 法では細菌数の少ない食品している DNA（A/B）から突き出ている DNA（A）類（1 g あたり 10 個以下の細菌）からの検出が困難の一本鎖の部分を足場として別の一本鎖 DNA（C）

であるため、たとえ細菌に汚染された食品類であっが足場と塩基対を形成し DNA 鎖（B）と（C）が置ても陰性となる場合がある。さらに、PCR 法では増き換わり新しい二本鎖 DNA（A/C）を形成する反応

幅・検出には特別な装置も必要となる。したがって、である。この反応において DNA（B）よりも DNA（C）

既存の PCR 法は特別な装置が必要であり、検出感度の方が長い（塩基数が多い）ため、二本鎖 DNA の5

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浦上財団研究報告書

図1Vol.29（2022）

足場介在型 DNA 鎖交換反応の概略

安定性は DNA（A/B）よりも DNA（A/C）の方が高金ナノ粒子を調製する。この際、H1-DNA はヘアピいため反応が一方方向に進行する。また、この反応

ン構造を形成しているため、蛍光色素である FAM

は、様々な生体物質が共存する環境下においても室は金ナノ粒子近傍に存在する。この近接している状

温かつ酵素フリーで進行することが明らかになって態では、FAM から金ナノ粒子への蛍光共鳴エネルいる。

ギー移動（FRET：Förster Resonance Energy Transfer）

本研究における DNA サーキットの原理を図２にが起こるため、FMA が発光することはできない。ま示す。具体的には、金ナノ粒子（平均粒径：40 nm）た、この H1-DNA/PEG 化金ナノ粒子の溶液に別のヘ表面に末端に正電荷アミノ基（－ NH3 ：⊕）を有アピン型 DNA（H2：燃料）を加える。一方、混合する PEG と末端に蛍光色素（Ⓕ：FAM）を有するヘした際にヘアピン構造を有する H1 と H2 の間で足アピン型 DNA（H1）を共固定した H1-DNA/PEG 化場介在型 DNA 鎖交換反応を起こすことはない。次＋

図2

金ナノ粒子界面における DNA サーキットによる標的 RNA の「その場」検出の原理

酵素および装置フリーな 16S rRNA 検出法に基づく「その場」食品細菌検査法の開発

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いで、標的 RNA（T）を含む検体を加えると、粒子表面の H1 の足場を介して T との足場介在型 DNA 鎖交換反応①が起こり、ヘアピン構造が直鎖構造に変化（開環）する。さらに、粒子表面の H1/T は、足場を介して H2 と足場介在型 DNA 鎖交換反応②を起こし、同時に T がリリースされる。このリリースされた T は、PEG 末端の正電荷（⊕）と T（核酸）自身の負電荷（⊖）との静電相互作用により同じ粒子

図3

H1-DNA/PEG 化金ナノ粒子の構造表面に隣接する H1 と足場介在型 DNA 鎖交換反応①ピン型 DNA（H1）を共固定することで行った（図 3）。

を起こす。すなわち、再生した T は、同一粒子上でまた、1 粒子あたりの H1 の本数は、120 ± 5 本 /足場介在型 DNA 鎖交換反応①および②の触媒とし粒子であった。さらに、市販の金ナノ粒子、T20 化て働くことになる。最終的には、金ナノ粒子と蛍光金ナノ粒子（T20 のみを固定化）および PEG 化金ナ

色素である FAM との距離が離れることで FRET が解ノ粒子（PEG のみを固定化）の粒径から、金ナノ粒消され FMA が発光できるようになる。したがって、子界面における T20（スペーサ部分）および PEG の理論上 1 分子の標的 RNA（T）が存在しさえすれば、鎖長を計算した。その結果、鎖長は T20（6.5 nm）検体を前処理することなく、かつ装置および酵素を> PEG（5.8 nm）の順となり、これらの値はこれま一切用いず迅速に発光させることが可能となり、「食での報告と近い値であった。すなわち、H1 の足場品加工現場」において細菌を簡便かつ迅速に検出で部分の DNA は PEG 層からは突き出た構造となってきることになる。

おり（PEG 層に埋もれていない）、足場介在型 DNA

H1-DNA/PEG 化金ナノ粒子の調製は、市販の金ナ鎖交換反応がスムースに進行することが期待される。

ノ粒子（平均粒径：40 nm）表面に末端にチオール

様々な標的 RNA 濃度（0 M ～ 10 nM）における（SH）基を有する PEG（分子量：5000）と末端にチH1-DNA/PEG 化金ナノ粒子および H2 を用いた DNAオール（SH）基と蛍光色素（Ⓕ：FAM）およびス

サーキットの時間に対する規格化した蛍光強度（F ）ペーサ部分に T20（チミンの 20 量体）を有するヘアの変化を図 4a に示す。標的 RNA の非存在下（0 M）

図4a) 様々な標的 RNA 濃度における H1-DNA/PEG 化金ナノ粒子および H2 を用いた DNA サーキットの時間に対する規格化した蛍光強度（F ）の変化。b) 様々な標的 RNA 濃度における各検出時間と規格化した蛍光強度（F ）の関係。

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浦上財団研究報告書においては、蛍光強度の変化はほとんど認められなVol.29（2022）結論かった。一方、標的 RNA の存在下においては、標的RNA 濃度および時間に依存して蛍光強度が増加して本研究では足場介在型 DNA 鎖交換反応（酵素不いることが確認された。これらのことから、標的要の反応）を素反応とした蛍光シグナル増幅機能をRNA を触媒とした DNA サーキット（蛍光シグナル有する DNA サーキットを金ナノ粒子界面においての増幅）が金ナノ粒子界面においても成立している構築することに成功した。この DNA サーキットシことが明らかとなった。また、様々な標的 RNA 濃度

ステムは、蛍光シグナルを容易に増幅可能であるたにおける、各検出時間（30，60，120，180，240 分）め、高感度（LOD = 4.0 pM）で標的 RNA を検出すと蛍光強度（normalized F ）の関係を図 4b に示す。

ることが可能であった。また、この DNA サーキッ

全ての検出時間において、標的 RNA 濃度の蛍光強度

トは、室温かつ酵素および特別な装置を一切使用しの関係は良い直線性が認められた。これら標的 RNAないため、食品類を前処理（16S rRNA の単離）す

濃度と蛍光強度の直線性は、標的 RNA 濃度に対してることなく、標的細菌由来の 16S rRNA の「その場」

pM レベル～ nM レベルの範囲で確認できることか検出が可能と思われる。今後、実際に食品サンプルら、3 桁ほどの広い定量範囲を有していることが明および菌体を用いて標的細菌由来の 16S rRNA の検らかとなった。さらに、検出限界濃度（LOD：Limit出を行っていく予定である。

of Detection）は、検出時間が長くなるにつれて低くなることが確認された。すなわち、検出時間 30 分

謝辞において LOD = 24 pM（pM：10-12 M）および検出

本研究を遂行するにあたり、多大なご援助を賜り

時間 240 分において LOD = 4.0 pM をそれぞれ達成ました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に厚することができた。

く御礼申し上げます。

Development of an “in situ” Food Bacteria Testing Method Based on an Enzymeand Instrument-free Detection System for 16S rRNA

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Development of an “in situ” Food Bacteria Testing Method Based onan Enzyme- and Instrument-free Detection System for 16S rRNA
Motoi OISHIDivision of Materials Science, Faculty of Pure and Applied Sciences,
University of Tsukuba
In this study, I designed and prepared an “in situ” bacteria testing method
based on an enzyme- and instrument-free detection system for 16S rRNA, which
relies on the creation of a simple diffusion limited nano-interface on gold
nanoparticles (DNA/PEG-GNP) co-modiﬁed with ﬂuorescence-labeled hairpin
DNA and poly (ethylene glycol) (PEG) containing a positively charged aminogroup at one end. The proposed testing method is driven by an enzyme-free
DNA circuit mechanism through cascading toehold mediated DNA displacement
reactions, using fuel hairpin DNAs in response to a target RNA. The proposed
testing method was able to detect the target RNA with high sensitivity (limit ofdetection = 4.0 pM) because the fluorescent signals could be easily amplified.
In addition, since the proposed testing method is performed at room
temperature and without any enzymes or special equipment, it appears to bepossible to detect 16S rRNA from target bacteria “in situ” without pretreatmentof food products.