［ I ］幹細胞生物学●幹細胞と細胞療法

3．未分化細胞を用いて臓器形成はどこまで可能か
浅島誠＊

私達ヒトを含めて動物の体は様々な臓器から構成されている．それらの臓器が発生過程でどのような遺伝子のカスケードのもとに形成されてくるのか．またそれらの臓器の集合体としての個体はどのようなメカニズムで統一された形づくりをするのか．
このような問題をツメガエルやイモリ卵を使って試験管で証明してきた．
胞胚期のアニマルキャップ（未分化細胞塊）にアクチビンを処理すると濃度依存的に様々な器官や組織を分化誘導する．低濃度では血球や体腔内上皮，中濃度は筋肉，高濃度では脊索を分化誘導する．さらに高濃度にすると拍動する心臓や小腸，肝臓といった内胚葉性器官も分化誘導する．このような時，試験管内でつくられた心臓は単に拍動するという生理的機能のみならず，電顕で見ると介在板もはっきり見られるし，心筋に特異的遺伝子の発現も確認された．また試験管内でアクチビン（10 ng ml ）とレチノイン酸（10−4M）との混合により，原腎管（腎臓）を 100％ 分化誘導することができる．この系をつかって新規の腎形成に関与する遺伝子もクローニングされ，解析されている．
次に試験管内でつくった原腎管を腎臓予定域を除去した胚に移植した．その結果，コントロール胚では 9 日以内に水腫をおこして全滅するが，処理した移植胚では 1ヵ月以上生存が可能となった．また形づくりについては頭部構造や胴尾部構造も試験管内で行うことが可能となっている．そこで，それらの神経形成や胴尾部形成に関与している遺伝子とそこに働く他の因子との相互関係などもしだいに明らかになってきている．また目や耳といった感覚器官の形成も in vitro で可能になってきている．それでは現状ではどこまで試験管内で臓器形成が可能であるのか，そして，また，それらを通して将来的にどこまで再生科学として可能かについても探ってみたい．

Control of organogenesis in vitro in animal development
MAKOTO ASASHIMA Department of Life Science（Biology) , The University of Tokyo
あさしま・まこと：東京大学大学
院総合文化研究科生命環境系教授・評議員．昭和47年東京大学大学院理学系研究科修了．昭和60
年横浜市立大学文理学部教授．平成５年東京大学教養学部教授．平
成８年現職．主研究領域／発生生
物学，器官形成学，分子生物学，分化と再生．
＊

24 第 117 回日本医学会シンポジウム

Key words

臓器形成移植遺伝子発現細胞分化

私達の体である個体を全体とするならば各ている．そして新しい発生，再生科学の展開

組織や器官（臓器）は部分ということになる．

が始ま っ て い る．特 に 1998 年 に ヒ ト の ES

この器官形成について最近，新しい展開がみ細胞（embryonic stem cell：胚性幹細胞）やマられている．それは試験管内での器官形成まウスやヒトの生体の組織や器官の中に未分化

たは臓器形成という古くて新しい問題についな幹細胞（stem cell）が存在することがわかってアプローチが可能になってきたことであて，急に生命科学の中で新しいテーマとしてり，その基礎研究と応用研究とが盛んになっ扱われるようになった．しかしながら，この図1

未分化細胞（アニマルキャップ）にアクチビンを与えたとき，濃度依存的に異なった組織や器官が分化する．

幹細胞と細胞療法 25

問題は古くから多くの人達によって取り組ま体発生を分子（物理と化学の物質におきかえれてきていたものでもある．ここでは私達のる）の言葉で理解しようとするものである．

研究室で行われた研究を中心に，臓器形成と形づくりについて概説してみたい．

約 10 年前，そのオーガナイザーの本体の物質の一つがアクチビンという蛋白質である

私達も含めて生物の形ははじめから決まっことを私達が初めて，世界に先がけて発表しているものではなく，一個の細胞である受精た．そのことによって，この分野にも分子生卵が発生を進めながら次第に形づくりをして物者もどっと堰をきったように入ってきて，いく．そのようなとき，発生過程の原腸胚の大きな進展がみられた．ともいうべき

その一つは未分化細胞塊（アニマルキャッ形成体（オーガナイザー）ができ，その誘導プ）にアクチビンを与えると，濃度依存的に作用によって次々と誘導連鎖が起きて，様々様々な器官を試験管内で誘導した．アクチビな器官が定位置にできて，次第に各々の種ンは低濃度では血球，中濃度では筋肉，高濃（species）に固有の形づくりがなされていく．

度では脊索を分化誘導した．これは形づくり

それは時間の変化とともに細胞数，細胞の質に重要な勾配の概念を証明する物質でもあるの変化（細胞分化），形態形成運動，組織間相（図 1）．

一部に形づくりのセンター互作用，胚誘導など様々な現象が結びついて，発生のプログラムを進めていき，統一のとれた個体

そ れ で は，未 分 化 細 胞 で あ る ア ニ マ ル

としての形づくりがなされるのでキャップを用いてどこまで試験管の中で器官ある．現代の生命科学の一つはこのような個などがつくれるのかを調べてみると，筋肉な図2

試験管内で未分化細胞（アニマルキャップ）を用いて，アクチビンやレチノイン酸，Con. A などで処理することによって，さまざまな組織や器官をつくることができる．試験管内で分化誘導された組織や器官は，今，私達の研究室では 14種類が可能となっている．

26 第 117 回日本医学会シンポジウム

どの中胚葉性組織だけでなく，さらに濃度を述べたが，処理後に時間を追って遺伝子を解上げていくと拍動する心臓，腸，肝臓など内析していくと，正常胚と同じように規則正し胚葉性組織や器官を作ることも可能となってく遺伝子が発現していくことがわかる．このきた．リズミカルに拍動する心臓を顕微鏡のような方法で見つかった遺伝子は単にカエル下で見たときには，驚きというよりも生命のやイモリ胚だけに発現しているのではなく，美しさ，奥深さを肌で感じ，それはまさに科マウスやヒトなどの哺乳動物の初期発生で腎学と芸術の世界であった．またアクチビンと形成に関与していることが明らかになった．

レチノイン酸というビタミン A の誘導体を

その 1 つの例として，ヒトの胎児の中で生ま混合して未分化細胞に与えると，前腎管（腎れてくるとき重篤な腎疾患をもつ患者さんが臓のもと）や膵臓も作られることがわかった．

いる．その原因遺伝子は sal（サル）遺伝子で他に植物性のレクチンであるコンカナバリンあることがつい最近明らかになったが，それA とレチノイン酸で，目や耳などの感覚器官と似た遺伝子を私達もこの方法でクローニンも試験管内でできることを見つけた．未分化

グし，明らかにしている．他の器官や組織に細胞から特定の物質を用いて耳や目を試験管ついても同様である．個体発生というマクロ内で作ることができれば，この分野への新しな現象を，発生のプログラムというミクロないアプローチも可能になると考えられる．私

分子の言葉で表すことが少しずつ可能になっ達の研究室では世界に先がけて，試験管内でている．

生体とほぼ同じ臓器や組織を 14 種類つくることに成功している（図 2）．

ところで，このような試験管内で作った器官や組織を，本当に生きた幼生に移植したと1．個体発生のプログラムを分子の言葉で理解しうるのかきに機能するのであろうか．私達は先に述べたような方法で作った前腎管を予定前腎管域を除去した胚に移植すると，機能することを上記のように，未分化細胞にアクチビンな明らかにした．予定前腎域を除去した胚は胚どを処理することによって，様々な器官や組体内の代謝物を排出できないので，水腫（水織を作ることができたが，それらは正常のもぶくれ）を起こして 9 日以内で全滅するが，のと同じであろうか．答えはイエスで，ほと処理片を移植した胚は 1 ヵ月以上も生きてんど正常胚の各組織と同じ構造と機能をもっおり，機能したことが初めて明らかとなったていることがわかった．そうすれば，卵や胚（図 3）．今後の臓器移植への基礎的研究と考という全体を見ていたのではなかなか解析がえられる．

難しかった個体の中での様々な変化を各器官や組織を，部分としてとらえ，それらを解析することが可能になったのである．各器官が2．生物の形づくりを考える

いったいどのような遺伝子をどこ時期に発現

アクチビン処理した未分化細胞塊をすぐにしてくるのかということを解析することがで未分化細胞塊でサンドウィッチのような方法きるのである．全体を知るにはまずそれを構で包むと，きれいな胴尾部ができてくる．つ成する部分を理解することである．例えば先まりヒトでいえば首から下の下半身ができた程，私達が作った未分化細胞にアクチビンとのである．一方，処理片をしばらく生理塩類

レチノイン酸で処理すると前腎管ができると溶液においた後，同じように未分化細胞でサ幹細胞と細胞療法 27図3

試験管内で未分化細胞にアクチビンとレチノイン酸で処理してできた前腎管（B）．
そのような前腎管を生体内に移植して機能するかどうかを試みる実験の模式図（A）．
コントロール胚では予定腎臓域を除去し，そこにアニマルキャップのみ移植する（C および D）と，腎管はまったくできなく（C），移植片は表皮に分化する（D）．
一方，アニマルキャップ（未分化細胞）をアクチビンとレチノイン酸で処理して移植すると，予定腎臓域に立派な腎臓ができる（E および F）．予定腎臓域を除去したものは水腫をおこして，9 日目で全滅するが，人工腎臓を移植したもの（H の矢印のグリーン）は機能して 1 ヵ月以上生存する．

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図4

アクチビンを未分化細胞を処理した後，前処理を短時間（1〜3 時間）し，未分化細胞でサンドウィッチ法で包んで培養すると胴尾部構造（B および D ; E）ができ前処理時間が長時間（8〜10 時間）の後，サンドウィッチ法をすると頭部ができる．アクチビンと未分化細胞だけで体の部域をつくることができるのである

ンドウィッチすると目や鼻，前脳をもった頭部ができてくる．つまり，アクチビンと未分化細胞のみで時間差を作ることによって，頭部または胴尾部という体の部域を作ることが3．基礎研究から応用研究へと広がる再生科学できたのである．しかも，その各部域の中にこのようにして私達は，色々な体の部域やは正常胚と同じような組織や器官が規則正し器官を未分化細胞とアクチビンなどの分子でくきちんと配置されているのである（図 4）．

作ることができ，それらを用いての発生のプ

これもまた，生物の形づくりに大きな示唆を

ログラムを少しずつ明らかにしている．この与えると思われる．

ような研究に大きなインパクトを与えたの幹細胞と細胞療法 29

は，1998 年 の 暮 れ に 発 表 さ れ た ヒ ト の ES細胞を用い，ネズミの皮下に移植して骨や筋肉，神経などが分化したことであろう．ヒト

224―227.
10）Hayata T, Kuroda H, Eisaki A, et al. : Expression ofXenopus T-box transcription factor, Tbx 2 in Xenopus
embryo. Dev Genes Evol 1999 ; 209 : 625―628.

胚から ES 細胞を用いたりするクローン人間に結びつく研究は世界的にも厳しく規制されているが，むしろ ES 細胞や幹細胞を使って質の臓器（器官）形成の研究は今，非常な勢い疑応答

で全世界で広がっている．それはヒトの臓器移植と直結している可能性を含んでいるからである．新しい治療である再生医療も含めた科学の発展へとつながっている．

（須田） どうもありがとうございまし座長

た．それではご質問をどうぞ．
（熊本大） organogenesis を考える
栗原裕基

場合に，臓器の一義的な特異性の決定という〔文献〕
1）Asashima M, Nakano H, Uchiyama H, et al. : Presenceof activin（Erythroid Differentiation Factor）in unfertilized eggs and blastulae of Xenopus laevis. Proc Nat
Acad Sci USA 1991 ; 88 : 6511―6514.
2）Ariizumi T, Sawamura K, Uchiyama H, et al. : Doseand time-development mesoderm induction and outgrowth formation by activin A in Xenopus laevis. Int J
Devolop Biol 1991 ; 35 : 407―414.
3） Moriya N , Uchiyama H , Asashima M : Induction ofpronephric tubles by activin and retinoic acid in presumptive ectoderm of Xenopus laevis . Develop
Growth & Differ 1993 ; 35 : 123―128.
4）Ariizumi T, Asashima M : Head and trunk-tain organizing effects of the gastrula ectoderm of Cynops pyrrhogaster after treatment with activin A. Roux ’ Archives Develop Biol 1995 ; 204 : 427―435.
5）Kinoshita K, Asashima M : Effect of activin and lithium
on isolated Xenopus animal blastomeres and response
alteration at the midblastula transition. Development
1995 ; 121 : 1581―1589.
6）Miyanaga Y, Shiurba R, Nagata S, et al. : Induction ofblood cells in Xenopus embryo explants . Develop
Genes and Evolution 1998 ; 207 : 417―426.
7）Asashima M, Kinoshita K, Ariizumi T, et al. : Role ofActivin and Other Peptide Growth Factors in Body
Patterning in the Early Amphibian Embryo. International Review of Cytology 1999 ; 191 : 1―52.
8）Kuroda H, Sakumoto H, Kinoshita K, et al. : Changes
in the adhesive properties of dissociated and reaggregated Xenopus laevis embryo cells. Develop GrowthDiffer 1999 ; 41 : 283―291.
9）Chan T, Ariizumi T, Asashima M : A Model system for
Organ Engineering : Transplantation of in vitro Induced Pronephros. Natur Wissenschaften 1999 ; 86 :

ことと，それから臓器の中での細胞の heterogeneity の決定という二つの factor があると思います．アクチビンの各濃度でいろいろな臓器ができる場合に，アクチビンによって一義的に決まるということと，その中で細胞にいろいろな heterogeneity が起こってくると思うのですが，その二つのことを考えた場合に，アクチビンの direct なターゲットは何でしょうか．それからもう一つは，そこからどのような形で heterogeneity が生まれてくるのか，この 2 点について教えていただけませんか．
浅島heterogeneity の問 題 で 申 し あ げ ま

すと，例えば腎管を作る時に，私は 100％ 腎管を作るといいましたが，この場合は細胞数を 500 個にしています．1,000 個にしますと腎管の他に周囲に筋肉ができてきます．そういう意味でいいますと，細胞数と heterogeneity ということとは関連しますので，分化の方向はより広範になってきます．
もう一つの問題は，ツメガエルでは，実際はアニマルキャップは内部と外部の細胞のheterogeneity がすでにあります．そ れ か ら
dorsal 側と ventral 側とではアクチビンに対する反応能が異なるので，少なくとも 4 種類の heterogeneity の細胞を含んでいます．
イモ
リの場合はむしろ単層で，均一になっていま

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すが，そういう意味でいいますと，カエルで臓器はアニマルキャップからできあがります

作りやすい臓器と，イモリで作りやすい臓器が，それが例えば ES 細胞で simplify して，同があります．それ故カエルでやっている場合様のことが起こるかどうかということをうかには臓器は比較的よくできてきます．ですかがいたく思います．質問の背景は同様のこと

ら先生のご質問にお答えしますと，heteroge-になりますが，アニマルキャップの中で，今neity というものが，細胞の最初のシグナルは日お話しされたいろいろなコンビネーション

全部 inner cell の細胞表面の方に行きますのの受け手側がいろいろあって，そこから出てで，そこでの反応系と，それが次の outer layer

いるのか，本当に一つの細胞が運命づけを変に行く細胞のシグナルの違いによって，あるえられてそのようになったのか，いかがでいは細胞数によって，そういうものは決まっしょうか．てくるだろうと思っています．
栗原

浅島

そのために私どもは，今の時期は全その場合に，例えば mesoderm に誘部アニマルキャップというシートでやってい導されるような細胞から，何かまた新たに，ますが，最近やっていますことは，inner cell

例えば placode を誘導するような factor が，だけの細胞を集めて，なおかつできるだけ濃度によっていろいろな違った形で決定されhomogeneous な cell にして，それでアクチビてくるというメカニズムを考えているというンで処理します．そうすると濃度は 1 10 かことでしょうか．

ら 1 20 で済むわけです．非常に感度よく，例浅島そうです．もう一つは，カエルの場

えば脊索を作ってゆきますし，あるいは血球合ではレセプターは type 2 の方には 4 種類を作ってゆきます．ですから細胞を homoge-ありますし，type 1 は 2 種類と，計 6 種類があneous にすることは，一つは感受性が高くなりますが，例えば低濃度で与えた場合には，るということがあります．あるいはバラバラ

high affinity のレセプターが動き，高濃度を与にしたことが影響しているのかもしれません

えれば low affinity のレセプターが働くだろが．

うということです．

したがって今後の問題としては，ES 細胞の私どもが最近採っているのは，high affinity

ような場合であっても，アクチビンそのものや low affinity というものを，細胞内ドメインが，両生類胚で行った結果とヒトの場合と同につくいろいろな factor を採って行くわけ

じとは思いませんが，シグナル分子という有です．そうしますとそれぞれが違うのです．

効なものが見つかれば，そしてそれが何か方ということは，アクチビンなどがレセプター

向づけができれば，基本的には同じようなシに つ な い だ 後，細 胞 内 情 報 伝 達 系 の 中 でステムで動く可能性はあると思っています．

Smad が中心になって働きます．その時，いろ一つの例としていいますと，例えばクローいろな他の因子の結びつき方やリン酸化などンのカエルを作った時に，これは水掻きの細によって，遺伝子の活性化振りがそれぞれ違胞から採って，バラバラにして培養して，har-うのではないかと思っています．そのあたり

vest にしてクローンカエルを作ったわけでのレセプターの種類と，細胞内ドメインのす．クローン羊「ドリー」を乳腺から作った

factor と，Smad との関係をさらに明らかにすprinciple もこれとほぼ同じです．そこにはもることが必要だろうとは思っています．

ちろん培養液や与える時間，技術などが違い（熊本大） 栗原先生と似たような
田賀哲也

ましたが，多分原理原則は，ES 細胞であって質問ですが，今日お話しになったいろいろなも，今後それをいかに多量に増やしてゆき，幹細胞と細胞療法 31

なおかつ未分化の状態を保つかということ

胞 を 維 持 し て い る わ け で す が，ア ニ マ ルが，そういうものを可能にするのではないか

キャップは，ある面でいえば mass として存と思っています．

在して，なおかつ自分の中に少し栄養分を田賀

一つ簡単な質問ですが，ア ニ マ ル持っていると思っています．他に ES 細胞か

キャップはマウスやヒトではどういうところ

らは生殖細胞も作れる全能性細胞ですが，アに相当するのですか．

ニマルキャップの細胞は生殖質を含まないの

浅島

inner cell mass に 相 当 す る の で すが，質的にもう少し細胞の中に栄養を持っている，つまりわれわれの場合でいえば，未分で，生殖細胞をつくることができない多能性の未分化細胞ということができます．
座長

まだご質問はあると思いますが，次化ではあるけれども，培養液は生理食塩水のの仲野先生のご講演のあとで，もう一度ご質中にあるわけです．
ES 細胞は外から形質の中問を受けますので，ここではこれで終わりまへ栄養を与えてやらなければなりませんし，す．どうもありがとうございました．

LIF なら LIF のようなものを与えて未分化細32 第 117 回日本医学会シンポジウム