75

アブラナ科野菜成分の発がん抑制酵素誘導活性ア ブラナ科 野菜 成分 の発 が ん抑制 酵素 誘導 活性

宇

1.は

田

靖

・ 小 沢

好 夫*(宇都宮大学農学部教授,群馬女子短期大学教授*)
る知見 を得 よ うと考 えた。

じめ に

NQO1は

種 々の親 電 子性 化 合物 な どが 体 内 に

1980年 以 降,わ が国 の死亡病 因の第 一位 はがん

取 り込 まれ た時 に肝臓 な どの器官 の細 胞 においてで あ り,そ の原 因の約40%は 動 物性脂 肪摂取 量の誘導 され る酵 素で あ り,キ ノン類 の2電 子還 元 を

増加 な ど食生 活に 負 うと推定 され て いるi)。こ う

触媒 する ことに よりキ ノンラジ カルや活性酸 素のした食生活 面 におけ るがんの予 防対策 として 野菜,

細胞 内生成 を防止 し,こ れ によ って細 胞の 酸化 ス

果実 な ど植 物性食 品の有 効性 が疫 学 的に も立証 さ

トレスの緩和,細 胞 毒性の消 去,細 胞内 レ ドック

れ つつ あ り2>,米国国 立が ん研 究所 が中心 に な っスサ イクル の正常 な機能の保 持な どを発揮 する こて いわゆ るデザ イナー フー ズ計 画が進 行中で あ る。

とか ら発が ん抑制機構 に関与 す る第 二相薬 物代謝

この 研究 プロ ジェク トには野菜 の発 がん予防効 果

酵素 と考 え られ てい る8)。したが って野 菜成 分 にの評価,有 効成分 の特定,そ れ らの野 菜あ るいは

よ る本 酵素活 性の誘 導能 を比 較検討 す るこ とは野有効 成分 を利用 した食 品の開発 な どが主要 目的 と菜 の生 体防御 機能及 び活性成 分の食 品加工 への応して含 まれて い る3,4)。
このデザ イ ナー フ ー ズ計

用 の観 点か ら重要 であ ると考 え られ る。本 研究で画で も発が ん予防 効果 が期待 されて いるア ブラナ

は,誘 導モ デル としてマ ウスの肝臓 がん細 胞で あ科野 菜類 は共通 して グルコ シノレー トと呼 ばれ る

るHepalclc7と芥子 油配糖体 を含 有 し,そ の分 解生成 物で ある芥BPrC1(ベ

子油 類に は発が ん予防 の可能性 があ る ことが 指摘されて い る3,4)。
これ まで,芥 子油 の 内,ベ ン ジ
ル芥 子油 は ラッ トにお ける発 がん抑 制効 果5)が確

皿.NQO1誘NQO1のその変 異 株で あ るHepalclc7

ン ゾピレン耐性 株)を 用い た。
導条件 の検討

誘 導能 はマ ウス肝 由来 細胞,Hepal

認 されて お り,ま た,そ の他 の芥子油 に も,が ん

clc7と そ のベ ン ゾ ピレ ン耐性 変異 細 胞,Hepal

細胞 の増 殖抑制 作用6),発 がん抑 制酵 素 であ る第clc7BPrC1(い二相 薬 物代 謝酵 素 の誘 導 能7,8)などが報 告 され て

Research,NorwichLaboratory,UKよい る。ア ブラナ科 野菜 はわが 国の年間 野菜生 産量さ れ た もの)を 用 い て 検 討 した。 これ ら は,の約40%を 占め る主要野 菜で あ り,生 食,煮 物のNQO1誘ほか,漬 け物 な どの加工 品の形 で消費 されて い る。

ば しば使 用 され てい る細胞 で あ る9・1°)。
また,陽そ こで,本 研 究で は,い くつ かのア ブラナ科 野菜

性誘 導因 子 と して,a一 ナ フ トフラボ ン(BNF)

類 について,第 二 相薬物 代謝酵 素の一 つで あるキ

及 びtert一ブチル ヒ ドロキ ノン(BHQ)を

ノ ン レ ダ ク タ ー ゼ(NAD(P)H:(quinone

た。 まず,誘 導の最 適条件 を検討 する 目的で培地

acceptor)oxidoreductase:以下,NQO1)活性の誘導 能 を検 討 し,こ れ らの野 菜の有 用性 に関すず れ もlnstituteofFood
り分譲

導能 が 高 くか つ安 定 して い るた め,し使用 し

中 の牛胎 児血 清濃 度 と活性 炭処 理 がNQO1誘導活性 に及ぼ す影響,次 い で誘 導因子 と細胞 との接76

浦 上財 団研 究 報告 書Vol.6(1998)

触時 間がNQO1誘導 活性 に及 ぼす 影響 を検 討 しって行 った。す なわ ち,各 細 胞 を含 むマ イクロ プ
レー トか ら培 地 を除去 し,PBSで

た。
(1)細

胞 の前培 養 と薬 剤処理 法

Hepalclc7及

いず れ

ータ リーシ ェーカー にて撹拝 す るこ とに よ り細胞

ペ ニシ リンを破壊 した。 各20μ1ずつ を別 の プレー トに移 し,ス ト レ プ トマ イ シ ン を 含 む

BCA法11)に よ り蛋 白質濃度 を測定 す る一 方,残びHepalclc7BPrC1はも5.0〜10%牛 胎 児血清,100U/mlのG,100μg/mlのMEM培

洗浄 後,0.8%

ジギ トニ ン溶 液 を75μ1ずつ加 えて 室温 下20分 ロ

地 中 で3〜4日

間,5%炭

酸 ガ ス中,りの細 胞破壊 物 に発色 試薬(メ ナ ジオ ン,MTT,

37°Cにて 培 養 後,そ の10,000cells/180μ1ず っ を

NADPH,FAD,グ

96穴 マ イク ロプ レー トに播種 した。BNF(最Cl緩 衝 液及 びグ ルコー スー6一リン酸 デ ヒ ドロゲ ナ

濃 度:0.05〜0.4μM)及
2.5〜10。0μM)は(DMSO)にびBHQ(最終終 濃 度:ジ メチ ル スル フ ォ キシ ド

溶 解 し,プ レ ー ト内 培 地 中 の

DMSOの

最 終濃度 が0.1%以 下に なる ように上 記

培 地 に て希 釈 し て20μ1ずっ 添 加 した。活 性 炭(Sigma社

細胞 培 養試 験 用)処 理 は市 販牛 胎 児血清(Gibco社)に1%(w/v)にな るよ うに添ル コー スー6一リン酸,Tris‑

ーゼ の混合 液)200μ1ず つを加 え,室 温下5分 後に0.3mMジ

クマ ロー ルを加 えて反 応 を停止 させ,

直 ちにマイ クロプ レー トリーダ ー(590nm)にて発色 した青色 を測定 した。 この青色 は基質 であ る
メ ナジオ ンが誘 導 され たNQO1によ りメナ ジ オ

ー ルに還 元 され る反 応 に連 動 してMTTがフォ

ルマザ ン色素 に酸化 され る結果 として生 じる。従加後,室 温 下90分撹 拝 した。 これを無菌 濾過 し,って,こ の青色 を比 較 す る ことに よ りNQO1活

上記培 地組成 となる ように使用 した。

性 を比較 で きる。以 上 のNQO1活(2)細胞 の増殖 に及 ぼす牛胎 児血清 の濃度
及 び活性炭 処理 の影響

性 測 定原 理 を模式 的にFig.1に 示 す。
(5)結果 及び考 察活 性 炭処 理 また は非 処 理 の牛 胎 児 血 清 を5.0

細胞 の増殖 に及 ぼす牛胎 児血清濃 度及 び活性炭

〜10 .0%含 有す るよ うに添 加 した培地 にお ける細処理 の影響 につい て検討 した結果 をFig.2に 示 す。

胞の 増殖 を比 較す るた めに,各 細 胞 を5日 間培 養

Hepalclc7はし,24時 間 毎に細 胞を ク リス タルバ イオ レッ トにで も十 分 に増 殖 し,10%血

よ り染 色 し た。細 胞 を リ ン酸緩 衝 液(PBS)には見 られ なかった が,活 性 炭処理 した血清 で は10て洗 浄後,50%エ%含 有 培地 におい て活性炭 未処理 区の増殖 に比 べを610nmでタ ノールで抽 出 され る色素濃 度測定 した9)。

(3)NQO1誘及 び薬剤 処理時 間の影響

よるNQO1活で は活性炭 処理 区,

非処 理区 とも,野 生株 で あるHepalclc7の増殖性の 誘導及 び

よりその速度 は野生 株の半 分程度 であ り,増 殖 に間)に よ る時 間 を 要 す る こ とが 明 ら か に な っ た。次 に,細胞 との接 触時 間(1〜48時

NQO1誘

導 活 性 を比 較 し た。播種 細 胞 数,前 培

養条 件 は上 述の通 りで ある。

NQO1誘

良好 な生育 が認め られた。 これ に対 して,変 異細胞 であ るHepalclc7BPrC1株

BNFと(4)NQO1誘度

清の場 合 と大 きな差異

ると約 半分程 度の細 胞数 に しか増殖 しない もの の導 に及 ぼす血清 の活性炭 処理

活 性炭処 理及 び非処理 の牛胎 児血清10%を 含 む
培地 を用 い,BNFに

活 性炭 非 処理 の血清 で は5%濃陽 性誘 導 因子 と した時 のHepalclc7に

お け るNQO1誘

導 活1生の測定法

導 活 性 はProchaskaら8)のBNFを導 に及 ぼす薬 剤処 理時 間 の影響をFig.3に 示す。 図 に見 られ る よ うに,BNFと方法に従細胞 との接触 時間 が12時 間以下 では誘導 レベ ルは

%!

アブラナ科野菜成分の発がん抑制酵素誘導活性Fig.lPrincipleofQuinonereductase(QR)‑assa}一

G‑6‑Pi:Glucose‑6‑phosphate;6‑PiG:6‑Phosphogluconate;
G6PDH:Glucose‑6‑phosphatedehy‑drogense.

Fig2EffectsofCharcol‑treatmentontheGrowthofHepalcic7andHepalclc7PPrC1(A),Growthinmediumcontainingnon‑charcol‑treatedfetalcalfserum(FCS).
(B),Growthinmediumcontainingcharcol‑treatedfetalcalfserum(FCS).
Symbols:△,5%FCS;:,7.5%FCS;○,10%FCS;forHepaIclc7;×,10%FCS;forHepalclc7BPrCl

誘導 レベル に はほとん ど差 異が見 られ なか った。
この こ とか ら,NQO1誘導実 験 に 当た っ ては試料 と細胞 との接触 時間 を少 な くと も12時間以上 とす る必要 が ある。一 方,Fig.4に

示 す よう に,牛胎 児血 清の 活性炭 処理 の有 無 に よるNQOI誘導の 差異 を見 る と,活 性炭 処 理 区 にお いてNQOl
活性 の誘導 が コン トロー ル(誘 導因子 を含 まない試験 区)に 比べ て明 らか に高 いレベル にな っており,活 性炭 非処理 の血清 を含有 す る培地 で は,上Fig.3EffectofBNF‑TreatingTimeontheNQOI‑induction
Treatingtime:O,lh;D,3h;十,6h;,12h;O,24h;▽,48h,
Medium:Containing10%Charcol‑treatedfetalcalf

述 の ように増殖 はすみや か且つ 高い レベル まで進む がNQO1の誘導 は低 い ことがわ かる。 これ は,cerum.

活性 炭非処 理 区では血清 中の何 らか の因子 によ り
低 く,最 大誘導 活性 の35〜50%程 度 しか誘 導 され

コン トロール 区の誘導 その ものが起 こって お り,ない。 また24時 間処理 区 と48時間処 理区 にお ける

このた め,試 料添 加区 との差異 が小 さ くな ったた

78

浦 上財 団研 究 報告 書VoL6(1998)

を誘 導 で き るが,Hepalclc7BPrC1はAh一

レ

セ プ ター欠損 株 であ るた め,Monofunctional誘導 因子 によ って しかNQO1を

誘 導で きな い12・13}。

そこで,本 実験で 使用す る両細胞 がそ れぞれ正 常に誘 導因子 に応答 で きるか どうかを確認 す る必 要が あった。
(1)実

験 方法

NQO1の

誘 導 活性 は,上 記 設 定条 件 に よ り測

定 し た。 陽 性 誘 導 因 子 に はBNF(0.05〜0.4
Fig.4EffectofCharcol‑treatingoffetalcalfserumontheμM)及¥QCII‑inrinrtinninHPanlrlr%
Media:びBHQ(2.5〜10.O,uM)を

Hepalclc7は,10%charcol‑non‑treatedFCS;O,10%

charcol‑treatedFCS

使 用 し た。

約10,000cells/well(200μ1),

Hepalclc7BPrC1は約25000cells/wel1(200めであ る。 これ らの結 果か ら,培 地 に添加 する牛μ1)と した。 変異 株 の播 種細 胞 数 を大 き くした

胎 児血清 は活性 炭処理 に より誘 導 を検 出 しやす く

理 由は この細 胞が上 述の よ うに増 殖速度 が遅 いたなる ことが明 らかに なった。 そ こで以 下の実験 でめ,試 料 との接触24時 間でHepalclc7とは血清 は全て活性 炭処 理 し,培 地中 の濃度 は10%,等 な細 胞数 にな るよ うに配 慮 したためで あ る。

ほ ぼ同

試 料 との接 触時 間は実験 の都合 上12時 間の場 合 と(2)結差 が見 られな かった24時 間 とする条件 を使用 す る

得 られ た結 果 をFig.5に 示す。 ここに見 られ る

こ とに した。

果 及び考 察ようにHepalclc7ではMonofunctiona1誘

子 で あ るBHQとBifunctiona1誘皿.Hepalclc7細胞 とHepalclc7BPrC1

BNFの
細 胞 に お け るNQO1誘

両 方 に よ りNQO1が誘 導 さ れ る が,導 パ タ ー ンの 確 認

Hepalclc7BPrC1で
NQO1の

導因

導因子である誘導 因子 には,Monofunctional及

び

NQO1が

はBHQに

よっ て の み

誘 導 され る こ とが 観 察 され た。 これ ら

Bifunctional誘 導 因子 の 二 つの タ イ プが知 られの結 果か ら,本 研 究で使用 す る両細 胞 は正 常 に機て い る11)。前 者 は直接 的 にNQO1遺能 し,試 料 中の誘 導因子 のタイ プの区別 にお いて伝子のプロ

モ ー タ ー 領 域 に存 在 す るARE(Antioxidant
responsibleelement)に利用 可能で ある ことが確認 で きた。

作用 してNQOI遺伝子を発 現 させて酵 素を誘 導す る もの でBHQのほか】V.野 菜抽 出物,芥 子油類 及び フラボ ノイ ド
類 のNQO1誘芥子 油類 もそれ に含 まれる と考 え られ てい る。 こ
れ に対 して後者 は細胞 内のAhレ

セプ ター を介 し導活性の 比較検 討

以上 の検討 に基 づ き,比 較的消費 量の高 い ダイて代 表的 な第一 相薬物代 謝酵素 であ るP‑450遺 伝

コン(根),キ子 を発現 させ,誘 導 されたP‑450に よる代謝 を経

そ れ らの メタ ノー ル抽 出物 を調 製 し,そ れ らのて 形 成 され る代 謝物 がAREに

NQO1誘

作 用 し てNQO1

ャベ ツ(葉),カ

ブ(根)を

用 いて,

導 活性 を比 較 す る とと もに,ア ブラ ナ

遺 伝子 を発 現 させ る もの とされ て い る。上 述 の科 野菜 の特 有成 分成 分 で ある芥 子 油類 を用 い て

BNFは

NQO1酵

そ の代 表 的化 合 物 で あ る。Hepalclc7

はいず れ の タイ プの誘 導 因子 に よ って もNQO1

素誘 導 活性 を比 較 した。 また これ らの野菜 には ケルセチ ンな どフラボ ノール類 も含 まれ

79

アブラナ科野菜成分の発がん抑制酵素誘導活性Fig.5NQOI‑inductionwithBNFandBHQinHepalcic%()andHepalclc7BPrC1(+)

る こ とか ら,関 連 フ ラ ボ ノ イ ドに つ い て も

DMSO2.Omlを

NQOI誘

導 活 【生を検討 した。

分 離(15000rpm,10分

菜試 料の調 製

れ た上清 をNQO1誘(1)野野菜 はマー ケ ッ トか ら購入 し,直 ちに,(1)新鮮 野菜 をその まま液体 窒素 中に浸 して凍結後,粉砕 して凍 結乾燥,(2)新鮮野 菜に ご く少量 の水 を

(2)芥

.

加 えて 溶解 させ,不 溶物 を遠心間)に よ り除 去 して得 ら
導活性 の測 定に用 いた。

子油 の調製使 用 した 芥 子 油(Fig.6)は,3一
BITC),4一

ペ ンテニ ル(4PITC),3一

ブ テ ニ ル(3メチ ルチ オ

加 えて ミキサー にて ホモ ジネー トとし,そ の まま

プ ロ ピ ル(3MTP),4一

室温 下で2時 間 放置 して 自己消化後,凍 結乾 燥,MTB),5一の2種 類 の処理 を行 った。各 凍結乾燥 物 は電 動 ミ

ジル(BzITC),2一ル で微粉末 とし,使 用 時 まで一80℃ にて保存 した。

の7種 類 の合成14)品とダ イコ ンか ら調 製15)した4

乾燥 微粉末 試料 の0.5gを25mlの80%メ

一メ チル チオー3一ブテ ニル芥 子油(MTBI)の

タ ノール

メ チ ル チ オ ブ チ ル(4メチ ルチ オペ ンチ ル(5MTP),ベ
フェネ チル(PEITC)芥

ン
子油

計

にて3時 間,室 温抽出 し,ガ ラス フィル ターで濾8種 類で ある。 これ らは広 くア ブラナ科 野菜 に分

過 し,次 いで濾液 をロータ リーエバ ボ レー ター に布 する芥子 油 として知 られてい る14)。これ らはシて メ タ ノール を除去 後,凍 結 乾 燥 した。 ここ に

リカゲル カラム クロマ トグラ フィー15)によ り純度

F5g.6StructuresofFlavonoidsandIsothiocyanatesUsedinThisStud}一

80

浦 上財 団研 究 報 告書VoL6(1998)

97%以Hepalclc7に

上に精 製 した。

(3)フ

(5,7,4'‑trihydroxyflavone),ケ

ラ ン

自己消化 させ ない場合 よ り著 し く上昇 し,ダ イ コ
ン組織 の破壊 に伴い,酵 素的 に誘導 因子が生 成す

ンフ ェ ロ ー ル

る ことが示唆 された。 これ に対 し,カ ブで は自己ル セ チ ン

消化の有 無に よる誘導 活性 の上 昇 におけ る差 異 は

リセ チ

ほ とん ど見 られ なか った。 キャベ ツは組織 の破壊(3,5,7,4'‑tetrahydroxyflavone),ケ(3,5,7,3',4'‑pentahydroxyflavone),ミに より内在す る芥子油 配糖体 分解酵素 であ る ミロン(3,5,7,3',4',5'‑hexahydroxyflavone),

シナ ーゼ に よ り,ア リル芥 子 油 の他 に3‑MTP

タ キ シ フ ォ リ ン(3,5,7,3',4'‑pentahy‑droxyflavanone),(十)一及び4MTBの2種

カ テ キ ン(2R,3S‑3,5,

7,3',4'‑penta‑hydroxyflavane),(一)一

エ ピ カ

ち,ア

び ケ ル セ チ ン の3位

一配 糖 体,すビ キ ュ ラ リ ン(quercetin‑3一arabinofuranoside),ケ

な わ

α 一L‑

ソ ケ ル シ ト リ ン(quercetin‑

3‑glucoside),ハイ パ

galactoside),ルリ ン(quercetin‑3一
チβ一

び
類 を用 いた 。 これ ら の 内,最後 の2種

製16)し,純上 に 精 製 した 。 これ ら 以 外 は

度90%以はタ マネ ギか ら調

全 て市販品 を用 いた。
(4)NQO1活
NQO1活

(5)結
Table1にTablei結 乾 燥 物0.5g当

あ り,こ れ 以 外のを考 慮 して芥子 油 のNQO1誘導 活性 を比 較 検討した。 その結果 をTable2に

示 す。 ここに見 られ

び5‑MTPのω一 メチ ル チオ アル キ ル芥 子 油がいず れ も他の 芥子 油 よ り高 いNQO1誘した。 また,ダ

イコ ンの主辛 味成 分で あ る

MTBIもPEITCとほぼ同等 の比較 的高い誘 導能

導 活 性

ブ の主 要芥 子 油 で ある3‑BITC及び4‑PITCのた りで比較 した。

果及 び考察Table2EffectsofIsothiocyanatesontheNQOI‑induction

野 菜試 料 の 自 己消 化 の有 無 に よる

¥QOI‑inducibilityofCruciferousVegetablesin
Hepalcic7a)ExpressedastheratiosbetweelltheNQOIspecificacti‑
vitiesofthesamplesandthatofcontrol.
Thespecificactivit}‑ofthecontrolrangedfromO.56to
O.64μmol/mg/min.
a)ExpressedastheratiooffiQplspecificactivity‑bets°een
thesamplesandcontrol.

導活性を示 し,ベ ンジル芥子油 も比較 的高 い誘導活性 を示を有 する ことが認 められた 。 これ らに対 して,カ性 の測定
性 は 上 述 の 条 件 で 測 定 し,誘は 便 宜 上,凍す る芥子 油 は大 半 がMTBIでる よう に,芥 子 油の 中 では3‑MTP,4‑MTB及ン(quercetin‑3‑

rutinoside),quercetin‑3,4‑diglucoside及quercetin‑4'‑monogulucosideの8種

びPEITCの3種 が主 に生 成す る14)。一方,ダ イコ ンに生成

芥子油 は量的 に きわ めて少 ない'8)。これ らの こと

ル シ ト リ ン(quercetin‑

3‑rhamnoside),イの ω一メチ ルチオ アルキ ル芥子

油が主成 分 として生成 す るこ とが知 られ てい る17)。
カ ブ の場 合 は,3‑BITC,4‑PITC及テ キ ン(2R,3R‑3,5,7,3',4'‑pentahydroxy‑flavane)及導 結 果 を 示 す。

ピゲ ニ ン

使 用 し た フ ラ ボ ノ イ ド類(Fig.6)は,ガギ ン(3,5,7‑trihydroxyflavone),ア(±)一

お け るNQO1誘

ダイ コン とキ ャベツで は自己消 化後 の誘 導活 性がラ ボ ノ イ ドの 調 製b)Doseoftheisothiocyanates,andthevaluesdenotetheir
finalconcentrationinthewells.

アブラナ科野菜成分の発がん抑制酵素誘導活性NQO1誘導活 性 は低 か った。 これ まで プロ ッ コ

81

リコンの中 では,特 にガ ランギ ン,ケ ン フェロー

リー に含 まれ る4一メ チルス ル フィニ ル ブチ ル芥ル,ケ ル セチ ンの3つ が高 いNQO1誘

子 油 は強 いNQO1誘示 した。 この うち,前2者

導 活性 を有 す る ことが報 告

導 活性 を

は5μMの 濃 度で コ ン

され てい る19)が,こ の こ とと上述 の結果 とを考 え

トロールの2倍 程度 まで誘導 活性 を上昇 させたが,合 わせ る とメ チルチ オ基 を有 する芥子 油 は本 酵素

ケル セチ ンは7.5μM以 下 では ほとん ど誘 導せ ず,の誘 導能 が他の芥 子油 よ り高 い ことが強 く示 唆 さ

10μM以 上の濃 度で急 激に活性 が上昇 する誘 導パ

れ る。ベ ン ジル芥 子油 の誘導能 は高 いに もか かわ

ター ンを示 した。 また,8種

らず,こ の芥子 油 はクレ ソンな どを除 いて わが国

ルセ チ ンー4'一モノ グル コシ ドの みが誘 導活性 を有の配糖 体の中 ではケ

で消 費 される アブ ラナ科野菜 にはほ とん ど含 有 さし,こ れ以 外の配糖体 は ほとん ど誘 導能 を示さな

れ な い。以 上 の結果 か ら,カ ブ のNQO1誘

か った。 これ らの結 果か ら,フ ラボノイ ド類の う

導活性が 低か った理 由 はおそ らく,主 要芥 子油が 誘導

ち,3位に水 酸基 を持た ない(ア ピゲニ ン)か2

活 性 の低 い3‑BITCと4‑PITCで位,3位間 の結合が 飽和型 のフ ラバ ノ ン(タ キ シ

あ る こ とに加えて,こ れ らの 自己消 化に よ り生成 した濃度 も誘フ ォ リン)ま た はフラバ ノール(カ テキ ン及びエ導 する には低す ぎた こ とが考 え られ る。キ ャベ ツ

ピ カテ キ ン)に はNQOI誘

及 びダ イ コン にお い て,自 己消化 後 のNQO1誘て もきわめ て弱い こ とが明 らか になった。 また,

導活 性が著 しく上 昇 したの は,自 己消 化過程 で誘3位 に糖 を結 合 した3一配糖体 も全 て誘導能 を消失

導活 【
生は無 いか あ っ

導能 が高 くかつ これ らの野菜 の主要芥 子油 であ る

してい た こ とか ら3位 の水 酸基 の存 在 がNQOl

3‑MTPと4‑MTBあ誘導 におい て最 も重 要な役割 を演 じてい る ことがるい はMTBIが生成したことに起 因す るもの と思われ る。
次 に,こ れ らの野菜 に含 まれるケ ルセチ ン とその類 縁化 合物で あ るフラボ ノール,フ ラバ ノール,・
強 く示唆 された。
V.芥

フラバ ン及 び各種 ケ ルセチ ン配 糖体 の誘導活 性 を
比較 検討 した。結 果 はFig.7に 示 す通 りで ある。
両 図に見 られ ように,7種の フラボ ノイ ドのア グ

子 油 とフラボ ノイ ドのNQO1誘導におけ る相 乗的作用
上 記 の 検 討 に よ り,ア ブ ラ ナ 科 野 菜 中 の
NQO1誘

導 活性 因子 は芥 子 油類 とケル セチ ンな

Fig.7:VQOIInducibilityofFlavonoids(A)andQuercetinglucosides(B).
(A)▽Kaempferol口GalanginOQuercetin△Apigenin
田Myhcetin国Taxifolin十Catechin‑,;;Epicatechin(B)OQuercetin‑4'‑glucoside△Quercetin‑3,4‑glucoside▽Quercetin‑3‑galactoside◇Quercetin‑3'‑rhamnoside
口Quercetin‑3‑91ucoside田Quercetin‑3‑arabinoside+Quercetin‑3‑rutinoside

82

浦 上財 団研 究 報告 書Vol.6(1998)

どのフ ラボ ノイ ドで ある ことが明 らかに なった。

性 を誘 導 し本 芥子 油が上 述 したMonofunctiona1

そこで,次 に芥 子油 とフ ラボノイ ドが共存 した条

誘 導因子 であ るこ とが確 認 された。一 方,ケ ルセ

件 でNQO1の誘 導 能が どの よ うに なる のか を明

チ ン は最終 濃度7.5,uMで 野 生株 で の弱 い誘導 がらかにす るた めの検討 を行 った。通 常,こ れ らの見 られ たが,変 異 株で はほ とん ど誘導 が認 め られ

成 分は 同時 に摂 取 され る ことか ら本検 討 は重 要でなか った。 ここには示 してい ないが ケルセ チン濃

ある と考 え られた。 そ こで,以 下で は芥子 油 とし

度 を最終20uM間て水存在 下で も安定性 が高 い2一フェネチ ル芥子油

お け る誘 導活 性 の上 昇 は30%程 度(野 生 株 で は(PEITC)と200%)で

代 表的 な フラ ボ ノイ ドで あ るケル

で増大 させた場 合で も変異株 にあった こ とか らケル セチ ンは ど ちらか

セチ ンを用い て各種濃 度の組 み合わ せ条件 下におと言 えばBNFとけるNQO1誘ある可能性 が示 された。 次 に両 化合物 の1:1混(1)試

導 活性 を検討 した。
料 の調製 と組み合 わせ

PEITC,ケ

合 物 によ るNQO1誘同様 にbi‑function誘 導 因子 で

ルセ チン はいず れ もDMSOに

導活 性 を各化 合物 単 独 のそ溶解

れ と比較 した結果 をFig.8に 示 す。両化 合物 の共し,最 終 濃度 が0.1〜7.5μMに な るよ うに細 胞 に存 条件下 では野生 株 において有 意 に誘 導活性 の上

作 用 させ た。 また,両 者の1:1混

昇 が見 られ,芥 子油 とフ ラボ ノイ ドは相 乗的 に

合物 も調製 し

た。

NQO1の

(2)NQO1誘NQO1活BPrC1の導活性 の測定性 は,Hepalclc7及びHepalclc7

両細胞 を使 用 して上 記 方法 によ り測定

相 乗的作 用は見 られ なかっ た。 上述 した ように,
変 異株 はBifunnctional誘 導因子 に とって必 須の
Ahレ

した。
(3)結

誘 導 活性 を増 大 させ る作 用 を有 す る ことが示唆 され た。 しか し,変 異 株で は この よ うな

果 及び考察セプ ター を欠損 して いる。 この ため,変 異

株 で はBifunnctional誘 導 因子 と思わ れる ケルセ

まず,両 細 胞 にお けるPEITCとケルセ チン のチンが機 能せず,芥 子 油の みの誘導作 用 になって誘 導パ ター ンを確認 した。両 化合物 は異 なる誘導

し まってい ると考 えられる。 これ に対 して,野 生

パ タ ー ンを示 した。 す なわ ち,PEITCは

株 で は両 タイ プの誘導 因子が機 能す るため,相 乗

で あ るHepalclc7細野 生株

胞 と変 異 株 のHepa

lclc7BPrC1の 両 方 において ほぼ 同等 にNQO1活的に誘 導活性 の上昇が起 こった もの と思わ れる。
哺 乳 類 の 臓 器 に お け るNQO1遺Fig.BSynergisticEffectofPhenethylIsothiocyanateandQuercetinontheInductionofNQOl
inHepalcic7andHepalclc7BPrC1.
v,SoledoseofPEITC;,soledoseofQuercetin;O,mixture(1:1)(A):ResponseinHepalcic7;(B):responseinHepalclc7BPrC1.

伝子発現 には83

アブラナ科野菜成分の発がん抑制酵素誘導活性Ahレ

セ プ ター が備 わ っ てい る と考 え られ ている2°)ことか ら芥子 油 とフラボ ノイ ドの相 乗的誘 導作用 は有 用な知見 と言 える。
VI.ダ

ンー2一
チオ キソ ピロ リジン(MMTP),メ

メ チ ル チ オ ー3一
ブテニルジチオカーバメー ト(MBDTC)及

イコ ン芥 子油 の反応生成 物のNQO1

チ ル4一

DTC)に

び そ の 飽 和 型(MB(sat)

変 換 さ れ る こ とが 明 ら か に され て い

る21,22)。
上記 の ダ イ コン 自己 消化 後 のNQOI誘誘導活 性

導活 性の 上昇 は生 成す るMTBIにダイ コンの芥子 油(MTBI)は水存在下 で すみ

え られ るが,同 時 にMTBIの起 因 す ると考水 存在 下で の上 記

やか にFig.9に 示 す よ うに3一ヒ ドロ キシー2一チオ反応生成 物 による可能 性 も考 え られ た。そ こで,

キ ソピロ リジ ン(HMTP),3一

これ らの 反応 生成物 のNQO1誘

メ チルチ オメ チレ

導活 性 を確か め

るた めの検討 を行 った。
(1)MTBIからの 反応生成 物の調 製

ダ イ コンか ら調 製 したMTBIを

既報22)に従 って緩衝 液中 で反応 させ,純 度98%以 上 のHMTP,(E,Z)‑MMTP(E:Z=2.8:1.0)及び(E,Z)‑MBDTC(E:Z=1.7:1.0)を
ら を最 終 濃 度2.5〜20μMに得 た。 こ れな る よ うにDMSOに溶解 し,供 試 した。
(2)NQO1誘NQO1誘導活性 の測定

導 活 性 は上 述 の 方法 に よ り,Hepa

lclc7を 用 いて測定 した。
Fig.9FormationofHMTP,MMTPandMBDTCfrom(3)結果及 び考察MTBI

ダイ コン芥子油 か ら水 の存在下 で生成 す るチ オ

Fig.10NQOIInducibibleActivitiesoftheReactionProducts
fromRadishIsothiocyanate(MTBI)

84

浦 上 財団 研究 報 告書Vo1.6(1998)

キ ソピ ロ リジン類(HMTP,MMTP)及びジチ

シナーゼ に より加 水分解 され て生成 する。従 って,オカーバ メー ト類(MBDTC,MB(sat)DTC)

これ らの野菜の塩 漬 け加 工や大 根お ろ しな ど組織のNQO1誘を破壊 した形態 での摂 取は誘 導因子 であ る芥 子油

導 活性 を検討 した 結果 をFig.10に 示

す。図 に見 ら れ る よ う に,主 要 生 成 物 で あ るを体内 に取 り込 む もの と言 える。 しか し,生 体 内,

HMTPは20μMま特 に消化 管 において果 た して これ らの芥子 油が首での濃 度 で はほ とん ど本 酵素の誘導 活性 を示 さなか ったが,HMTPの3一

ヒド

尾良 く吸収 されて ターゲ ッ トの臓器 細胞 に到達 し,ロ キシ メチ レン基 が3一メチル チオ メチ レ ン基 に

NQO1のな って い るMMTPで検討 に待た なけれ ばな らな い。 また,フ ラボ ノイ

は2.5μM以 上で コン トロ

誘導 に寄 与 してい るか どうか は今 後 のール の2倍 近 い誘導 活性 の上昇 が認め られた。 まド類 のNQO1誘た,両 ジチ オカーバ メー トは著 し く誘導 活性 を上し,誘 導活性 と構造 の相関 に関す る知見 を得 るこ

昇 させ る こ とが明 らか になった。 これ らの化合 物とが できた。加 えて,本 研 究に よ り,フ ラボ ノイは,ダ イ コンお ろしな どに生成 する ことか ら,ダドの 一 種,ケ

イ コンの 自己消化成 分 に も含 まれ,同 じ く誘導 活

NQO1の性 が 認 め ら れ た 芥 子 油(MTBI)と導性 に は構 造 に よる差 異が 存在

ル セ チ ン と芥 子 油 が 相 乗 的 に

誘 導活 性 を上昇 させ る ことが 見出 されと もにた ことは,食 事成分 に よる協 同的 な有用 な作用 が有 力 な誘 導因 子 とな り得 る こ とが強 く

期待 で きるこ とを明 らか に した点 で意義 があ るも示唆 された 。ダ イコ ン辛 味成分 とその関 連化合 物の と考 え られ,こ の点 をさ らに他 の成分 との組 みに よ るNQO1誘

合わせ おい て検証 する ことが重要 であ る と思わ れ

NQO1の導 に関 する知 見 は本研 究 が最 初で ある ことを付記 した い。

る。最 後 に,本 研究 の助成 を賜 った浦上食 品 ・食文化振 興財 団に対 し,心 か ら御礼 申 し上 げ ます 。

V皿.ま

と

め

発 が ん抑 制第 二 相薬 物代 謝酵 素 で あ るNQOlの誘 導活性 を アブラナ科 野菜及 びそれ らに含 まれ

文献1)G.R.WilliamsD.M.:in"FoodandCancerPrevention:
ChemicalandBiologicalAspects",ed.byK.W.Wal‑る芥 子油,フ ラボノ イ ドを用 いて検討 した。 本研
究 で使 用 した マ ウス肝 臓 が ん細 胞 で あ るHepa
lclc7と その 変 異株,Hepalclc7BPrは品 中のNQO1誘各種食導 因子 の一 次ス ク リーニ ン グ にdron,1.T.Johnson&G.R.Fenwick,P.3‑11,Royal
SocietyofChemistry,Cambridge,1993.
2)VV.C.Willett&D.Trichopoulos:CancerCauseCon‑
trol,7,178(1996)
3)A.B.Caragay:FoofTechnol.April,65(1992)

有 用で ある こと,そ の場 合,培 養条件 として牛胎

4)大児血 清 を活 性炭処 理す る ことによ り検 出感度 が増大 する ことが明 らか にな った。 さらに,芥 子 油類
はいず れ もNQO1の誘 導活 性 を有 す るが,特 に

澤 俊 彦:栄養と健 康 の ラ イ フ サ イ エ ン ス,1(4),32(1996)
5)L.W.Wattenberg:CancerRes.45,1(1985)
6)福

家 洋 子,大石 芳 江,岩下 恵 子,小日 食 工 誌,41,709(1994)

ω一メチル チオ アル キル(ア ル ケニ ル)芥 子 油で
あ る3MTP,4MTB,5MTP,MTBIは高い誘

導能 を有 す るこ とが確 認 され た。 これ らの芥 子油

7)P.Talalay,M.J.DeLong&H.J.Prochaska:Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,85,8261(1988)
8)1.T.Johnson,G.Williamson&S.R.R.Musk:Nutr.
Res.Reviews,7,175(1994)

を主成分 として含有す るキ ャベツや ダイ コンは本
酵 素活性 の誘導 能 を有 す る。 芥子油 の生成機 構 は
芥 子油葉 糖体 であ るグル コシノ レー トが酵 素 ミロ

9)H.J.Prochaska&A.B.Santamaria:Anal.Biochem.,
169,328(1988)
10)N.Tawfiq,S.Wanigatunga,R.K.Heaney,S.R.R.

野 晴 寛,篠原 和 毅:

85

アブラナ科野菜成分の発がん抑制酵素誘導活性Musk,G.Williamson&G.R.Fenwick:Euro.J.Cancer17)近Prevet.3,285(1994)18)A.Kjear,J.O.Madsen,Y.Maeda,Y.Ozawa&Y.

11)H.J.Prochaska&P.Talalay:CancerRes.,48,

崎 浩:農化 誌,60,815(1986)

19)Y.Zhang,P.Talalay,C‑G.Cho&G.H.Posner:Proc.
Natl.Acd.Sci.USA.,89,2399(1992)

Chem.,258,3523(1983)20)A.M.Benson,ChemicaScripta,27A,67(1981)

13)R.J.Riley&P.Workman:Biochem.Phermacol.,43,

21)Y.Uda,Y.Ozawa,T.Ohshima&S.Kawakishi,

167(1992)
田 安 彦,小内 実,野Uda,Agric.Biol.Chem.,42,1715(1978)

X776(1988)
12)A.G.Miller,D.Israel&J.P・Whitlock,Jr.:J.Biol.

14)前藤 弘 清,山Agric.Biol.Chem.,54,613(1990)
沢 好 夫,宇田靖:農化 誌,53,261(1979)15)Y.Ozawa,Y.Uda,T.Ohshima,K.Saito&Y.Maeda,

Yoneyama&Y.Uda,Biosci.Biotechnol.Biochem.,61,

Agric.Biol.Chem.,54,605(1990)16)T.Tsushida&M.Suzuki:日22)H.Matsuoka,Y.Toda,K.Yanagi,A.Takahashi,K.

2109(1997)
食 工 誌,43,642(1996)

86

URAKAMIFOUNDATIONMEMOIRSVol.6(1998)

InducibilityofACancer‑ProtectivePhaseIIEnzyme,QuinoneReductase
inCruciferousVegetables
YasushiUdaandYoshioOzawa*(LaboratoryofFoodChemistry,DepartmentofBioproductiveSciences,UtsunomiyaUniversityand
LaboratoryofFoodScience,DepartmentofFoodandNutrition,GunmaWomen'sJuniorCollege*)Inducibilityofacancer‑protectivephaseIIenzyme,quinonereductase(NQO1)was
studiedusingsomecruciferousvegetablesandtheircharacteristiccomponents,isoth‑
iocyanatesandflavonoids.TheNQO1‑inductionwasdetectedinmousehepatomacells,
Hepalcic7andAh‑receptor‑defectivestrain,Hepalclc7BPrC1.Sensitivityinthe
NQO1‑inductionincreasedbyusingcharcoal‑treatedfetalcalfserumataconcentrationof
10%inminimumessentialmedium.Hepalcic7cellscouldresponsetobothmono‑functionalandbi‑functionalinducers,suchasR‑naphthoflavon(BNF)andtert‑butylhydroquinone(BHQ),buttheAh‑receptor‑defectivecellscouldinduceNQOIonly
withmono‑functionalinducer(BHQ).Thus,bothcell‑lineswerebeneficialfora
primaryscreeningofNQO1‑inducersinfoodsystems.
Amongthevegetablesexamined,radishandcabbageinducedNQOIwhenthevegeta‑
bleswereautolyzedfor2hours,butnotwiththeirnon‑autolyzedextracts.Theseresults
suggestedthattheircharacteristiccomponents,isothiocyanatesthatshouldbegenerated
throughanenzymaticdegradationofglucosinolateswereinvolvedintheNQO1‑induction.
Then,eightdifferentisothiocyanateswerestudiedfortheNQO1‑inducibility.Itwasfoundthatω

一methylthioalk(en)ylisothiocyanates,suchas3‑methylthiopropyl,4‑methylth‑iobutyl,5‑methylthiopentyland4‑methylthio‑3‑butenylisothiocyanatesshowedahigher
NQO1‑induction.Theseisothiocyanatesareknowntobecontainedincabbageandradish.
Thus,theywereundoubtedlyinvolvedintheNQO1‑inducibilityofthevegetables.
Ontheotherhand,flavonoids,suchasquercetinanditsglycosidesareknowntobe
componentsofthevegetables.Hence,weinvestigatedtheirNQO1‑inducibilities.Astheresults,galangin,kaempferolandquercetinweregoodinducersofNQOIataconcentra‑
tionbelow20,uM.Amongsevenglycosidesofquercetin,however,only4'‑monoglucoside
couldbeaNQO1‑inducer.NootherglycosidecouldinducedNQOI.Astructure‑inducibilityrelationshipwasobserved:3‑hydroxygroupintheflavonoidskeletonplayed
asanessentialroletoinduceNQOI.Inaddition,somereactionproductsthatshouldbe
producedfromtheradishpungentprinciple,4‑methylthio‑3‑butenylisothiocyanate,inthe
presenceofwaterwerefoundtohaveaNQO1‑inducibility.Amongthem,methyl4‑
methylthio‑3‑butenyldithiocarbamateanditssaturatedcompoundwerethemosteffective

InducibilityofACancer‑ProtectivePhaseIIEnzyme,QuinoneReductaseinCruciferousVegetables87
inducer,wherethecompoundsinducedNQOIatalevelof4‑‑6foldsthanthatofcontrol.
Inconclusion,cruciferousvegetablescanbeactasagoodNQOI‑induciblefood,andboth
isothiocyanatesandflavonoidscanalsoplayasinducersofthecancer‑protectivephaseII
enzyme,NQOI.