97

香辛料の薬味としての“さわやかさ”に関与する香気生成と維持に関する研究＜平成 22 年度助成＞

香辛料の薬味としての さわやかさ に関与する香気生成と維持に関する研究
飯

島陽

子

（神奈川工科大学応用バイオ科学部栄養生命科学科）

1.

緒

citral などの香気寄与成分は不安定であるため、

言ショウガの新鮮な香りの維持は難しいとされてい香辛料は、他の食品のにおいのマスキングや香る。また、ショウガの種類や成熟度、倍数体によっりの付加、それにともなう食欲増進作用、食品のても香気組成が異なり、その組成がショウガの品防腐効果など、様々な目的で料理に利用されてき質に与える影響も大きい 2 - 4)。

た。世界的には、その手軽さから乾燥して使用さこのような背景から、本研究ではショウガの主れることが多いが、日本を中心としたアジア諸国

要香気成分である citral を中心にした香気の生成

では、香辛料を生のまま、時には野菜として扱うおよびその制御について解明することを目的としこともよくある。そのような香辛野菜の中で、日ている。そのために、まず citral の生成に着目し、本ではショウガは最もポピュラーな香辛野菜といcitral および関連する geraniol 類縁成分との生体える。ショウガのさわやかな香りとシャープな辛内変換により、新鮮ショウガ根茎ではどのように味は、日本では古来から魚料理や寿司などの口直香気成分組成のバランスが保たれているのかを調しや臭いのマスキングの目的で使用されてきた。

べ、今回 citral 生合成酵素遺伝子およびその特性

ショウガのさわやかな香気の主要成分は、citralについて詳細に調べたので報告する。

を中心としたモノテルペン類であることが分っている1)（ 図 1）。一方、辛味成分は、6 – gingerol が主要成分であり、乾燥保存により 6 – shogaol が生

2.

研究方法成することが知られている。加熱や調理加工に2.1. 安定同位体ラベル geraniol を用いたショウガ
根茎への取り込み実験による変換成分の分析

対して、辛味成分は比較的安定であるのに対し、重水素ラベルした geraniol は、geranic acid よ

図1

ショウガの主要な香気寄与成分

98

浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）

り 合 成 し た。LiAlD 4（5 g）を 脱 水 THF（130 ml）

10mM NaCl, 1mM EDTA, 5mM mercaptoethanol,に溶かし冷却後、11 g / 20 ml THF の geranic acid

Complete protease inhibitor カクテル）5 ml を加を滴下しながら加え、氷中で 4 hr 攪拌し、そのえて 4 ℃でホモジナイズ、遠心分離後、上清を粗後室温で 3 hr 攪拌した。TLC で生成物を確認し、酵素液とした。タンパク量を測定し、3 0μg タン

セライトでろ過後、脱水し、濃縮した。濃縮物にパク量相当を各酵素活性に用いた。粗酵素系に

22

は [1, 1- H2] - geraniol および [1, 1- H2] - nerol が混在

おける geraniol 類縁成分の相互変換についての反していることを GC-MS で確認した。その後、分応測定は以下のように行った。各反応後（23 ℃ ,取 HPLC により [1, 1-2H2] - geraniol を精製し、取り4hr）、それぞれ 300μl の MTBE（methyl t-butyl

込み実験に用いた。

ether）で抽出し、GC-MS 分析した。

市販の金時ショウガの根茎（未熟根茎）を葉がゲラニオール脱水素酵素活性測定：ついたまま、8 ～ 10 株ずつサンプルに用いた。

1 mM geraniol および 1 mM NADP を含む 50 mM

1.95 mM の [1, 1-2H2] - geraniol を 加 え た 0.6 mg/

Glycine - NaOH バッファ（pH 9.0）に粗酵素をml Tween 80 を 含 む 水 溶 液（200 ml）を 調 製 し、加えて反応させた。

サンプルを 24hr 浸漬した。コントロールとし
2

ゲラニオールアセチル変換酵素活性測定：て は、[1, 1- H2] - geraniol を 除 去 し た 水 溶 液 を 用

1 mM geraniol お よ び 0.2 mM Acetyl CoA をい、同様に浸漬した。その後、根茎のみを十分水含む 50 mM Tris - HCl バッファ（pH 7.0）に粗で洗浄後、表皮をむいてから液体窒素中で粉砕酵素を加えて反応させた。

した。得られたパウダー 10 g を内部標準として

Geranyl acetate esterase 活性：

methyl decanoate 0.2 mg を含むジエチルエーテ

1 mM geranyl acetate を含む 50 mM Tris - HClル（50ml）で二回抽出し、脱水濃縮後、GC-MS 分バッファ（pH 7.0）に粗酵素を加えて反応させた。

析に供した。
GC-MS 条件は以下の通りである。
GC-MS 装置： Agilent Technologies 7890A - 5975C
カラム：
流速：

2.3.

ショウガ 根茎における EST データベース
からの酵素遺伝子のスクリーニング

シ ョ ウ ガ の ゲ ノ ム 情 報 と し て、 す で に EST

HP-5MS, 30 m x 0.25 mm（I.D.）x（Expression Sequence Tags）データベース が公開

0.25 um（film thickness）されている（Ginger and Turmeric EST database,

1.0 ml / min

http://www.agcol.arizona.edu/cgi-bin/pave/

注入口温度： 250℃

GT/index.cgi）。本データベースより配列既知のイオン源温度：230℃

alcohol dehydrogenase, alcohol acetyltransferase,

四重極温度： 150℃

esterase を用いて BLAST サーチを行い、候補と昇温条件：50℃（2 min hold）,5℃ /min（180℃なる遺伝子断片を探索した。

まで）,15℃ /min（250 ℃まで）,

2.4.

250℃（4 min hold）
2.2.

粗酵素系におけるゲラニオール類縁成分の相互変換における酵素活性測定による生成物の確認

ショウガにおけるゲラニオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（GeDH）のクローニングと機能同定

2.3. の結果から、alcohol dehydrogenase とアノテーションされた 1 遺伝子について、詳細に調べ

ショウガ根茎（未熟根茎）1 g に酵素抽出用バッた。ショウガ根茎から抽出した RNA より cDNA

ファ（ 5 0 mM Tris - HCl（pH8.0）, 1 0 % glycerol,を調製した。EST データベースにおける配列か香辛料の薬味としての“さわやかさ”に関与する香気生成と維持に関する研究

99

らプライマーを作成し、RACE 法により完全長geraniol 処理後のショウガ根茎中の geraniol のマ

cDNA を 得 た。 配 列 を 確 認 後（1104bp）、pETスクロマトグラムを示した。[1, 1- 2 H 2] - geraniol 処

28a ベクターにクローニングし、大腸菌 Rosetta

理すると、m/z 154 と m/z 156 のイオンが検出さ（DE3）pLys S を用いて、タンパク誘導を行った

れたことより、内在性の geraniol とともに重水素（0.5mM IPTG, 18℃, 18 hr）。超音波による可溶ラベルした geraniol が蓄積していることが分かる。

化を行い、遠心分離後、上清について活性を確認

マ ス ス ペ ク ト ル に お け る 同 位 体 検 出 か ら、した。さらに、ニッケルキレートカラムにより精geraniol 以外のモノテルペン成分を解析すると、製し、酵素の各種性質を調べた。

[1, 1- 2 H 2] - geraniol 処 理 に よ り、citral, geranyl

ショウガにおける GeDH 遺伝子の発現

acetate, citronellol で 安 定 同 位 体 比 率 が コ ン ト

ショウガ植物体において、葉、茎 1（上部）、茎ロールに比べて変動することから、これらの化２（下部）、未熟根茎、親根茎、根の 6 部位をそれ合物に [1, 1- 2 H 2] - geraniol が代謝されることが分ぞれ分離し、各部位から RNA を調製し、cDNAかった。重水素同位体を示すマスクロマトグラム

2.5.

を調製した。GeDH 遺伝子の発現について、定量的リアルタイム P C R により調べた。また同時に、各部位から香気成分を抽出し、GC-MS 分析を行い、各部位の citral 含量と GeDH 遺伝子発現の相関について調べた。
研究結果および考察

3.
3.1.

ショウガ根茎生体内での安定同位体ラベル
ゲラニオールの変換

ショウガ根茎に [1, 1-2H2] - geraniol 処理した際の取り込み量について、コントロールとの同位体比率の比較から求めた。図 2 にコントロールでの geraniol の マ ス ク ロ マ ト グ ラ ム と、[1, 1-2H2] 図2

図3

ショウガ根茎における重水素ラベルゲラニオールの検出

重水素 geraniol 処理したショウガ根茎において検出された重水素ラベル成分（geraniol および citronellol については、2 つの水素が重水素であるもの（156 および158）と、１つの水素が重水素であるもの（155 および 157）が検出された。

100

浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）

により定量を行った結果を図 3 に示す。その蓄積geraniol dehydrogenase）の働きで還元し、[1- 2H] -量 は、geraniol、citral で 0.035-0.040μmol /g と 多citronellol（m/z 157）が検出すると考えられた。

かった。一方、geranyl acetate や citronellol も量は少ないものの、[1, 1- 2 H 2] - geraniol から生成することが確認された。特に geraniol と citronellol で223.2.

粗酵素系における geraniol 代謝酵素の活性確認

3.1. の安定同位体ラベル geraniol の代謝を確認

は、[1, 1- H 2] - geraniol および [1, 1- H 2] - citronellol

したことから、推定代謝経路に基づく粗酵素系だけではなく、１か所だけ重水素ラベルされたにおける酵素活性を調べた。Geraniol を基質とし[1- 2 H] - geraniol お よ び [1- 2H] - citronellol も 検 出

た geraniol acetyltransferase（GeAT）、geraniol

さ れ た。特 に、citronellol に つ い て は、そ の ほ とdehydrogenase（GeDH）、geraniol double bond

2んどが [1- H] -citronellol であると考えられた。こreductase（GeDBR）、geranyl acetate を 基 質 とれらの化合物の推定変換スキームについて 図 4した geranyl acetate esterase（GeAcH）についてに示す。まず、[1, 1- H 2 ] - geraniol（m/z 156）から、調べた。生成物の検出結果について 図 5 に示す。

geraniol dehydrogenase（GeDH ）の 作 用 で citral

GeDBR 以外の酵素活性測定において活性を確認（m/z 153）が生成する。しかし、この反応は可でき、予想される生成物が検出された。以上の逆的であり、生成した citral の一部は還元的な反結果から、geraniol からの citral および geranyl

応によりgeraniol に還元し、[1- 2 H] - geraniol（m/zacetate の 生 成 機 序、geranyl acetate か ら の155）が蓄積すると考えた。同様に、citronellol にgeraniol への酵素的加水分解が確認できたので、

つ い て は、お そ ら く citral の 段 階 で citronellal

それらに関与する酵素遺伝子のクローニングを進にgeraniol double bond reductase（DBR）が 作 用めることにした。

2し、そ の 後 citronellol dehydrogenase（ ま た は

図 4 GC-MS の結果から推定したショウガにおける geraniol を中心とした変換スキームとそれに関与すると考えられる酵素系(GeAT : geraniol acetyltransferase, GeDH : geraniol dehydrogenase,GeDBR : geraniol double bond reductase, GeAcH:geranyl acetateesterase))+-<)<- -;<-:);- -+haKcȉo^FƯŏƨjżçǜŷhaKcē  hǄYF-# ÊĝjȧǗƓŊƝħhNKcƓŊǃȇdQEÀŌW|{ƯŏƨPżçW|^FÊ¸jǜŷOyE/-:)6174 Oyj+1<:)4 Nxm /-:)6A4)+-<)<- jƯŏƂĻE/-:)6A4)+-<)<- Oyj /-:)6174 njȧǗƷïƋèǿPǃ
香辛料の薬味としての“さわやかさ”に関与する香気生成と維持に関する研究101ȇdQ^jdE\|yhȰ»Y{ȧǗȣÎĢj³¶´ȟu{UehX^F

3 1 =  ; {   A R X T k d （A:^Uh eB: GeAcH,¶ C: !
 !  !  ¥±§¦GeAT,GeDH,
図@
5 粗酵素系において得た反応物のガスクロマトグラム
A 上段：標品 , 中段：粗酵素＋ geraniol ＋アセチル CoA の反応物 , 下段：失活酵素＋ n  ¼  ~  qgeraniol
¼¥± § ¸ #!)'%(&¸ O Y \ j ( A {    o  ¼   ± § ¸ #!)'%(&＋アセチル CoA の反応物
上段：標品 , 中段：粗酵素＋ geranyl acetate の反応物 , 下段：失活酵素＋ geranyl¸ O Y \ j ( AB{
acetate の反応物

粗酵素＋＋ NADP !++!の反応物 , 下段：粗酵素＋geraniol n  ¼  ~  q C上段
¼ :¥± §geraniol¸ #!)'-&A{ oの反応物
 ¼   ± § ¸ #!)'-& !++!

A{

が見られないもの、ストップコドンの存在によ3.3.
ショウガ遺伝子のクローニングと n ¥ ±GeDH§ ¸ #!)'%(&¸ A {    o  ¼ ¥ ± § ¸ #!)'%(& A {  り全長が得られないものも多く、現在のところ、GeDH の酵素的キャラクタリゼーション
ショウガ根茎から作成した ESTデータベースに

GeDH 様遺伝子（ZoGeDH）および DBR 様遺伝子
W g P R ! ° t  A T k m al U ? ! A ± § S f h T [ i Z m W g l5）
対して、他の植物で単離された GeAT（バラ花弁 ）、 （ZoDBR1, ZoDBR2）が全長として得られている。 ®źǯOyÒŏX^ $% ¶¥¶hĬXcEÇjŻƨdöȶW|^ -%  ¯ǭľ E-
これらの遺伝子から大腸菌においてタンパク誘導GeDH（ バ ジル 葉 6））、DBR（raspberry ketone/
 ±ǳ E# Ɇ:);8*-::A 7）3-<76-B16/-:76- ;A6<0);-,¯¥°¶ɇɇE-;<-:);- +-<A4)25)4)6
zingerone synthase, ラ ズ ベ リ ー ）、esteraseを試みた。ZoGeDH については、His tag タンパ

（Acetylajmalan esterase, Rauvolﬁa verticillata8））

ク質として、可溶性画分に得ることができたが、の配列を用いて BLAST 検索を行い、相同性のZoDBR1, ZoDBR2 については、タンパク発現は高い EST 断片についてスクリーニングを行っ確認できたものの、可溶化することができず、現た。次に、それぞれの遺伝子断片からプライマー在も検討中である。

を設計し、金時ショウガ根茎から調製した total

次に、大腸菌より得られた ZoGeDH についてRNA を逆転写後鋳型として用い、RACE 法によ精製後、活性測定を行い、その特徴を調べた。

り各遺伝子の全長 c D NA の作成を試みた。増幅結 果 を 図 6 に 示 す。pH 9.5 に お い て、geraniol

102

浦上財団研究報告書

図6Vol.20（2013）

ZoGeDH 酵素のキャラクタリゼーションを 基 質 と し て 補 酵 素 NADP を 添 加 す る と citral

らの結果から、ZoGeDH が 発 現 citral 生成に相関（geranial + neral）が 検 出 さ れ た。 一 方、NADPがあることが考察できた。しかし、古根茎につい非 存 在 下、 ま た は NAD 存 在 下 で は citral 生 成ては、citral が多いにもかかわらず、ZoGeDH のは見られなかった。基質特異性を確認したとこ発現は小さかった。これはおそらく、根茎が未熟ろ、ZoGeDH は、geraniol お よ び nerol に 対 しであった状態で citral が生成し、根茎が成熟、老て ほ ぼ 同 等 の 活 性 を 示 し た が、 そ れ 以 外 に も化していく過程で ZoGeDH は発現しなくなるもcinnamylalcohol などにも活性を示し、基質特異のの、すでに生成した citral がずっと貯蔵蓄積さ性はあまり強くないことが分かった。この結果れているからであろうと考えられた。通常、ショは、スイートバジルから単離された GeDH の性ウガの根茎は未熟な状態で収穫され（新ショウ質と同様であった 6)。また、geraniol, nerol およびガ）、貯蔵により成熟して市場に出回ることが多NADP に対する Km 値はそれぞれ 61μM, 93μM,い（ひねショウガ）。そして、ひねショウガのほう142μM であり、Kcat/Km は、0.09, 0.05, 0.035 でが新ショウガより citral が多い傾向にあるが、今あった。

回の ZoGeDH の発現挙動の結果から、成熟中にまた、ショウガ植物体の部位別における citralcitral が生成が進み、ZoGeDH の発現がなくなる

含 量 と ZoGeDH の 発 現 に つ い て 比 較 し た。 葉、と同時に citral 生成が止まり、それまでに生成し茎上部、茎下部、新根茎、古根茎、根についてた citral が長期間組織内に蓄積するものと考えら

total RNA および citral を抽出し、分析を行った。

れる。今後、貯蔵中の経時的な成分変動の要因にCitral は根茎のみならず葉や茎においても含まついても調べていきたいと考えている。

れており、これらの部位においても ZoGeDH の発現がみられた。しかしながら、アントシアニ

4．ま と めンを多く蓄積する茎下部では ZoGeDH の発現は

本研究では、ショウガ根茎における citral を中小さかった。根においては、citral は存在せず、心とした geraniol 関連成分の相互変換、挙動にZoGeDH の発現もほとんどみられなかった。これ

ついて、化学的見地、分子生物学的見地から調香辛料の薬味としての“さわやかさ”に関与する香気生成と維持に関する研究べた。その結果、geraniol を中心とし、geranylacetate、citral、citronellol 間 に お い て 内 在 性 酵素の関わりにより変化することが分かり、その性質を同定できた。特に geraniol、citral 間では、geraniol dehydrogenase が 関 与 す る こ と が 分 かり、その責任遺伝子の単離に成功した。
謝

辞本研究を遂行するにあたり、貴重な研究助成を賜りました（公財）浦上食品・食文化振興財団および関係者の皆様に心より感謝申し上げます。貴財団の益々のご発展をお祈りいたします。
文献1) Nishimura O., Identification of the Characteristic Odorants
in Fresh Rhizomes of Ginger (Zingiber officinale Roscoe)
Using Aroma Extract Dilution Analysis and Modified
Multidimensional Gas Chromatography-Mass Spectroscopy.,
J. Agric. Food Chem., 43, 2941–2945 (1995)
2) 「ショウガ」香り百科事典 , 日本香料協会 , 朝倉書店 ,pp267-270（2006）

1033) Sekiwa-Iijima Y., Aizawa Y. and Kubota K., Geraniol
Dehydrogenase Activity Related to Aroma Formation inGinger (Zingiber officinale Roscoe)., J. Agric. Food Chem.,
49, 5902–5906 (2001)
4) Wohlmuth H., Smith M.K., Brooks L.O., Myers S.P. andLeach D.N., Essential oil composition of diploid andtetraploid clones of ginger (Zingiber officinale Roscoe) grownin Australia., J Agric. Food Chem.,54, 1414-1419 (2006)
5) Shalit M., Guterman I., Volpin H., Bar E., Tamari T., Menda
N., Adam Z., Zamir D., Vainstein A., Weiss D., Pichersky
E. and Lewinsohn E., Volatile ester formation in roses.
Identification of an acetyl-coenzyme A. Geraniol/Citronellol
acetyltransferase in developing rose petals., Plant Physiol.,
131, 1868-1876 (2003)
6) Iijima Y., Wang G., Fridman E. and Pichersky E., Analysisof the enzymatic formation of citral in the glands of sweetbasil., Arch. Biochem. Biophys., 448, 141-149 (2006)
7) Koeduka T., Watanabe B., Suzuki S., Hiratake J., ManoJ. and Yazaki K., Characterization of raspberry ketone/zingerone synthase, catalyzing the alpha, beta-hydrogenationof phenylbutenones in raspberry fruits., Biochem. Biophys.
Res. Commun., 412, 104-108 (2011)8) Ruppert M., Woll J., Giritch A., Genady E., Ma X. andStöckigt J., Functional expression of an ajmaline pathwayspecific esterase from Rauvolfia in a novel plant-virus
expression system., Planta. 222, 888-898 (2005)

104

浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）

Generation of acylic monoterpenoids responsible
for pleasant aroma in ginger rhizome
Yoko Iijima
Department of Nutrition and life science, Kanagawa Institute of Technology
The characteristics of fresh ginger rhizome is pleasant citrus aroma with its pungentflavor. Although volatiles (or essential oil) of ginger rhizome include various monoterpenes,
sesquiterpenes and phenyl propanoids, the key compounds contributing to ginger aroma areoccupied by some monoterpenoids and eugenol. In these compounds, geraniol derivatives,
such as citral, geranyl acetate and citronellol, are quantitatively and qualitatively
responsible for fresh citrus and floral aroma of ginger. Furthermore, their composition ischangeable and different by cultivars, storage of rhizome and harvest place. However, it
is unclear how their compositional balance is regulated in ginger rhizome. In this study,
we confirmed enzymatic inter-conversion of geraniol derivatives by isotope incorporation
experiment and crude enzymatic assay. Furthermore, we isolated and characterized a cDNA
encoding geraniol dehydrogenase (ZoGeDH), which catalyzed NADP-dependent redox
reaction between geraniol and citral.
At first we synthesized D 2 -geraniol to use for the experiment. The detected m/zvalues representing these labeled compounds shifted to +2 as comparing with endogenouscompounds. In the case of citral, dehydrogenation of D 2 -geraniol gave +1 shift of m/z value from endogenous citral. In all geraniol derivatives in ginger rhizome, D-labeled
compounds were detected, indicating that these are biosynthesized from geraniol bycontinuous reactions. In particular, in geraniol and citronellol, D 1-labeled compounds werealso detected. This suggests that both of oxidation and reduction occurs between alcoholand aldehyde. Furthermore, our data suggested that double bond reduction from geraniol
to citronellol is done by two routes, direct reduction or via reduction of citral. Crude
enzyme extract was prepared from young ginger rhizome. Enzymatic assays for geraniol
acetyltransferase (GeAT), geranylacetate hydrolase (GeAcH) and geraniol dehydrogenase(GeDH) were performed using appropriate substrates. GeDH catalyzed geraniol oxidation
to produce citral under reaction with NADP. Furthermore, it was suggested that the relation
between geraniol and geranyl acetate is dependent on the activities of GeAT and GeAcH.
Next, we screened responsible genes involved in these metabolic reaction, using
opened EST databases for ginger. After full length cDNA of each candidate was obtained,
we induced protein from each cDNA and analyzed their enzymatic characteristics. Amongthem, we isolated and confirmed geraniol dehydrogenase (ZoGeDH) responsible for thereaction between geraniol and citral. Comparative quantitative real-time PCR analysis andcitral content analysis in ginger plant tissues, indicated that the expression of ZoGeDH iscorrelated with the content of citral.