ハエ神経系の固定、包埋、染色
ITO Kei, 1990 March** 基本操作**【標本の移動】
小さな標本は、ピペットマンのチップの先を剃刀で切って太くして、液ごとそれに吸いこんで移動する。
ある程度大きな標本は、ピンセットの先を微妙に広げて支え、標本を軽くはさむようにすくい上げる。２本の先端の間に烏口のように液がたまり、その中に標本を保持して移動する。先に力を入れると、簡単に破壊してしまうので注意。
【液の交換】
液を替えるときは、チューブを立てて少し置き、標本が沈んだら液を静かにピペットマンで吸う。
１令、２令幼虫の脳は小さく、なかなか沈まないので、小型エッペンドルフスタンド（宝酒造の粗品スタンドなど）に40cm 程の紐をつけ、中におもりを入れたものを作る（粗品スタンドは紙製なので軽すぎて、そのままではうまく振り回せない）。チューブをこの「遠心機」にのせて、水平に振り回すと、20 秒くらいですぐに沈む。（ふつうの遠心機を使うと、Ｇが強すぎて標本が潰れてしまう。）【標本の整形】
微小メスや虹彩剪刀で標本の一部を切るときは、取り除きたい方をピンセットでつまみ、切断する。とって置きたい方をつまむと、必ずや破壊する。
** 固定液**【ホルマリンＰＢＳ】
10 ％ホルマリン（＝４％ホルムアルデヒド）
売っているホルマリン液は、37 ％程度なので、10 ％混ぜると正味４％程度になる。
ハエの場合、室温で数時間か、４ﾟＣでＯ／Ｎ。
12 時間以上置くと、抗体の付きが悪くなる。
水性なので、油分の多いものは固定液をはじく。固定前に70 ％エタノールで軽く洗う。
固定後は水orＰＢＳで洗う。
【カルノア液（Carnoy）】
60 ％エタノール
30 ％クロロホルム
10 ％酢酸強力な激しい固定液。
室温で15 〜30 分が標準。１時間を越すと表面の収縮が激しく、良くない。
アルコール性なので、油分の多いものもすぐ固定可能。
固定後はエタノールで洗う。
** 標準的な固定法**【中枢神経系（ＣＮＳ）のみを取り出す場合。（ホールマウント用）】
脳の取り出し方は、「解剖提要」参照。
脳をエッペンドルフチューブに入れ、カルノア液を400〜500 μl加える。
チューブを横倒しにして、ゆっくり振とう。室温・30 分。
95 ％、90 ％、70 ％エタノールに、各５分、ゆっくり振とう。
0.3 ％Triton X／ＰＢＳ中で、４ﾟＣ保存。
【体全体を固定する場合。（切片用）】
昆虫のクチクラは固定液を全く通さないので、物理的に穴をあけ、内部に固定液を入れる必要がある。実際は、切片にしたいところ（頭部など）以外を切断し、断面から固定液を入れるようにするのがよい。しかし昆虫の内部組織は体に固定されておらず、余りぎりぎりに切ると、切断時の圧力で位置関係がおかしくなる。
-1 -昆虫の体表面はワックスが分泌されているので、ホルマリン固定の場合は、固定前に70 ％程度のエタノールで油分を落とす。解剖するさいＰＢＳ中にエタノールを入れておくと良い（50 ％程度）。
カルノア液の場合は、そのまますぐに固定液に入れて差し支えない。
幼虫 ：・ＰＢＳ中で、尾部をピンセットでちょっとかぎ裂きにする。（切断してしまわない）。
・ＰＢＳを入れたエッペンドルフチューブに集める。
・70 ％エタノールを入れ、数分おく。
・ホルマリンを入れ、室温１時間程度、横倒しでゆっくり振とう。
・標本をＰＢＳ中に取り出し、虹彩剪刀で、体の中央あたりで切断。
・エッペンドルフに入れ、再び固定（ホルマリン室温数時間）
・ＰＢＳで洗う。
※幼虫の体をいきなり切断すると、表皮が収縮して内臓が出てしまい、内部の位置関係がぐちゃぐちゃになる。
蛹前期：蛹クチクラの出来る前（蛹化後12 時間程度まで）は、幼虫に準ずる。
蛹中期：内部構造のまだ出来上がる前（蛹化後３日程度まで）。
・ＰＢＳ中で、囲蛹殻（puparium）をピンセットでつまみ、前後に引っ張って取る。
・腹部にピンセットでかぎ裂きをつける。
・ＰＢＳを入れたエッペンドルフチューブに集める。
・70 ％エタノールを入れ、数分おく。
・ホルマリンで室温１時間程度、横倒しでゆっくり振とう。
・幼虫同様、軽く固定してから、虹彩剪刀で胸部を切断する。
・再び固定、ＰＢＳで洗う。
※蛹の中は内部組織が崩壊しているので、いきなり切断すると、圧力で内部のものが出てしまう。
蛹末期：蛹内で翅や毛などがはっきり確認できる場合（蛹化後３日後半から）。
・エタノール入りＰＢＳ中で、囲蛹殻（puparium）をピンセットでつまみ、前後に引っ張って取る。
・胸の後半、または腹部との境界で切断。
・翅、脚（たたまれている）をピンセットでつまみ、根元を虹彩剪刀で切断。こうすると固定液の入りが良くなる上、突起がなくて包埋のさい扱いやすい。
・胸部の切断部をつかみ、他方のピンセットで触覚の上付近を軽くつまむ。そして前方へ引っ張ると、胸・頭部をおおっていた透明な蛹クチクラが取れる。首のところがぐっと引っ張られて変形するが、クチクラが取れたら元に戻るのでＯＫ。
・出来たら、口器をピンセットで引っ張り、切断する。固定液の入りが良くなる。
・ＰＢＳを入れたエッペンドルフチューブに集める。
・標本が液になかなか沈まなければ、液を除いて70 ％エタノールを入れ、数分おく。
・ホルマリンを入れて、横倒しで室温、数時間振とう。
・ＰＢＳで洗う。
成虫 ：・エタノール入りＰＢＳ中で、胸の後半、または腹部との境界を虹彩剪刀で切断。
（エタノールを入れていないと、解剖中に目覚めたハエがどんどん飛んでいってしまう。）
・翅、脚をピンセットでつまみ、根元を虹彩剪刀で切断。こうすると固定液の入りが良くなる上、突起がなくて包埋のさい扱いやすい。
・出来たら、口器をピンセットで引っ張り、切断する。固定液の入りが良くなる。
・ＰＢＳを入れたエッペンドルフチューブに集める。
・標本が液になかなか沈まなければ、液を除いて70 ％エタノールを入れ、数分おく。
・ホルマリンを入れて、横倒しで室温、数時間振とう。
・ＰＢＳで洗う。
※成虫は筋肉がしっかりしており、すぐに切断しても差し支えない。

-2 -【固定後の保存】
ＰＢＳで洗ったら、70 ％、90 ％のエタノールを通して、90 ％エタノール中で４ﾟＣ保存。
カルノアの場合は、100％エタノールで洗い、95 ％、90 ％のエタノールを通して、90 ％エタノール中で４ﾟＣ保存。
この状態で数週間は保存可能。
** パラフィンへの包埋法**
・前日に、60 ﾟＣの恒温器をセットしておく。当日、温度の安定していることを確認。
・必要量のパラプラストを中に入れておき、融かしておく。
（50ml のディスポーザブル試験管で融かすと便利。）
・当日脱水開始前に、パラフィンディスペンサーのヒーターをつけておく。温度設定を確認する。
【脱水＋透徹】
エタノール系列で脱水してから、キシレンで透徹するのが一般的だが、ここではクチクラを切りやすくするという噂のあるブタノール透徹法を用いている（「顕微鏡標本の作り方」p.55）。
90 ％エタノール中で保存してある場合、以下の液を順番に入れる。横倒しにして指定時間振とう。
35 ％正ブタノール、50 ％エタノール／水15 分

55 ％正ブタノール、40 ％エタノール／水15 分

75 ％正ブタノール、25 ％エタノール／水15 分

100 ％正ブタノール

15 分

100 ％正ブタノール

１時間以上【浸透の準備】（脱水・透徹中に行なう）
浸透液：
60 ﾟＣ恒温器内に、３つのシャーレを準備する。
シャーレ１ パラフィンを入れ、ブタノールを適当量加える。
シャーレ２ パラフィンのみを入れる。
シャーレ３ パラフィンのみを入れる。
舟：
白い陶器製のパラフィン型（舟）を、必要数キシレンでよく拭く。
アルコールグリセリンを塗る。
（70 ％エタノールとグリセリンを等量ずつ混ぜたもの。これを塗っておかないと、あとでパラフィンが陶器に貼り付いてはがれない。）
60 ﾟＣ恒温器に入れ、暖めておく。
メッシュ：
金網（メッシュ）を長方形に切り、４周を折り返して、パラフィン型（舟）と同型の箱型にする。舟にちょうど納まる形にしておくと便利。
新品は、石鹸で洗う。再利用品は、前の標本の残っていないことを確認。
【パラフィン浸透】
先を切ったピペットマンで、ブタノール中の標本をすべて吸い、メッシュの箱に入れる。
以下のように、メッシュを移してゆく。
シャーレ１（パラフィン＋ブタノール）に入れ、15 分。
シャーレ２（第１パラフィン）に入れ、15 分。
シャーレ３（第２パラフィン）に入れ、15 分。
時間は適当でもよいが、長く置きすぎると収縮が強くなりすぎる。
多数の標本を同時に包埋する場合、ラベルは浸透時にはがれてしまうことが多いので、信用しない。明らかに見分けのつく標本（蛹と幼虫など）を組み合わせて１回に２、３種程度を包埋し、それが包埋段階に入ったら次の組を浸透に回すと良い。
同時にたくさん処理しても、包埋の位置合わせ時に時間がかかるので、時間がかかりすぎてしまう。その意味でも、１回には２、３種が妥当。

-3 -【包埋の準備】（浸透中に行なう）
パラフィン融かし用ハンダごて（先に平たい銅板を付けたもの）を、スライダックにつなぎ、60 〜70 Ｖにする。100 Ｖにじかにつなぐと、恒温すぎてパラフィンが蒸発し、部屋がパラフィン蒸気でモウモウとしてしまうので注意。
大きめのタライ、アイスボックスなどに、水道水を汲む。
タッパーウエアに湯沸かし器の熱湯（65 ﾟＣくらい）をいっぱいにし、密閉する。これを、パラフィン保温用の簡易恒温機として使用する。
実体顕微鏡の鏡筒を高くして、タッパーウエア上面にピントがあうようにする。
【包埋】
パラフィン型（舟）に、パラフィンディスペンサーで、一杯にパラフィンを入れる。
（ディスペンサーを使わないときは、恒温機の中の融けたパラフィンを注ぐ。）
舟と、標本の入ったシャーレ３を、タッパーウエアに載せる。
（タッパーウエアの蓋は柔らかいので、裏返して底を上にすると扱いやすい。）
舟の外側側面に、標本のラベルをつける（細く切ったビニールテープが便利）。
ピンセットの先でハンダごての先をつまみ、十分熱する。熱くなったら、標本をつまみ、ひとつづつ舟に移す。
（ピペットマンで吸うと、吸った途端に冷えて固まってしまうのでダメ。）（ピンセットが冷えてきたら、またハンダごてをつまんで暖める。シャーレ、舟のパラフィンが冷えて、膜が張ってきたら、ハンダごての先を突っ込んで暖める。こてのロウが溶けて少しパラフィンに色が付くが、まあ気にしない。）
全部移したら、実体顕微鏡でのぞきながら、先を熱したピンセットまたは針で、向き、配置を整える。通常の舟で、ショウジョウバエを包埋する場合、一つに付き3列5ケの 15 ケくらい並べて良い。
配置が崩れないようにそっと水の上に運ぶ。
舟の下を水につけ、上から息でふうふう吹く。
表面が冷えて薄い膜が張ったら、そっと水中に沈める。一気に冷えて固まる。
（ゆっくり冷やすと、ざくざくした結晶が出来やすい。）
そのまま30 分程度おく。
【包埋後の後始末】
パラフィンディスペンサー、ハンダごての電気を切る。
シャーレ３は、そのまま恒温機に戻す。
メッシュは、標本が残っていないことを確認し、恒温機の中に敷いたキムタオルの上に並べておく。パラフィンが融けて、キムタオルに吸われ、きれいになる。
タッパーウエアは、お湯を捨てる前にこぼれたパラフィンを拭いておく。
シャーレ１はブタノールが蒸発するので、密栓できる容器に移す。移すときは、標本が混入しないよう、ろ紙でろ過する。
シャーレ２、シャーレ３はそのままでも良い。シャーレ２にはブタノールが相当混入しているので、絶対にシャーレ３と混ぜない。
当分実験しないときは、恒温機を切っても良いが、しばらく包埋が続くときはそのままでよい。
【舟からの取り出し】
パラフィンが十分冷えたら、水から取り出す。
針で、４周を少しづつけずる。
４周に十分溝がついたら、片側の長片にそって深く針をさし、パラフィンを持ち上げる。
うまく行けば、パカっとパラフィンがとれる。
失敗して割れてしまったら、落胆せず、出来るだけうまく舟から取り出し、まぎれないように互いに張り付けておく。
舟の側面のラベルをはがし、取りだしたパラフィンに貼っておく。
舟に残ったパラフィンをキシレンでよく拭いておく。
包埋のすんだ標本は、通常の染色法に関しては、数十年は保存可能。

-4 -** 切片の作成**【パラフィンの切り出し】
剃刀でパラフィンの塊の周囲の余分なところを除く。
透過光のもとで、実体顕微鏡でのぞきながら、大まかにひとつづつの標本に分ける。
切片の方向を考え、切片の面と平行な面（上面と下面）を、剃刀できれいに仕上げる。
上面は、わりと標本ぎりぎりにする。下面はかなり長めに残す（数ミリ）。
側面になる部分は、大きめに残しておく。
切りだした標本は、なくならないように箱にまとめておく。舟が便利である。
パラフィンのくずは、集めて、恒温機の中のろ紙に入れる。ろ紙の下に試験管を置いておくと、融けたパラフィンがろ過されて試験管にたまる。包埋には使い古したパラフィンの方がなじみがよいらしいので、これを再利用する。
【台木への取り付け】
パラフィン融かし用ハンダごて（先に平たい銅板を付けたもの）を、スライダックにつなぎ、60 〜70 Ｖにする。100 Ｖにじかにつなぐと、高温すぎてパラフィンが蒸発し、部屋がパラフィン蒸気でモウモウとしてしまうので注意。
台木の表面にパラフィンをのせ（すでについていることが多い）、ハンダごてで融かす。
十分熱して、パラフィンがさらさらになったら、切り出した標本を、実体顕微鏡で向きを確認して載せる。
載せただけだと、標本の周囲がきちんと台のパラフィンとなじまないので、ハンダごてを軽く周囲に当てがい、互いのパラフィンを良くなじませる。当てがいすぎると標本が融けてしまうので注意。
固まる前に、標本が傾いていないかチェックする。
良く冷やす。水につけても良い（逆さまにして水面に浮かべる）。
【トリミング】
実体顕微鏡で、標本の向きを見る。ファイバー照明を真横から当てると、標本がパラフィンの中に浮かび上がって見やすい。
側面を少しづつけずり、標本の周囲１〜２ミリをきれいに長方形に残す。余り大きく残す必要はない。小さいほど、１枚のスライドグラスにたくさん載せられるので便利である。
ミクロとーむの刃に平行な２片は、特に十分平行にする。垂直な２片は、切片の境界を分かりやすくするため、少し非平行にしておいても良い。
トリミングのさい、パラフィンを一度に大きく削ると、負荷がかかってせっかく取り付けたのが折れてしまいやすい。
カンナのように少しづつけずる。
【スライドグラスの準備】
伸展台のスイッチを入れ、温度を40 ﾟＣくらいに設定する。
スライドグラスを95 〜100％エタノールで拭く。
乾いたキムワイプでよく拭く。
切片のりをほんのちょっとたらし、薬指で塗り広げる。
25mg/ml 卵アルブミン

in 50 ％グリセリン※卵白グリセリンを使うと、抗体反応でバックが出やすいので、アルブミンを使う。
【ミクロトームの調整】（American Optics 社のミクロトームの場合）
ミクロトームの蓋をあけ、蓋の裏の写真に描いてあるとおりに、注油する。
ハンドルのストッパーをはずし、なめらかに回ることを確認する。
粗動ハンドルは、左奥。これを回して台木取り付け部を前後させる。
１回転ごとの送り出し量＝切片の厚さは、右後面のノブを回して調整。
パラフィン切片で快適に切れるのは、上記の標本作成でハエを切る場合、７μ程度がよい。
刃は使い捨てなので、右端から順番に使っていき、左端まで使いきったら新しい刃に替える。使った部分はマジックなどで塗っておくと、あとから分かりやすい。
※左の方を使っているとき、右端がホルダーから出っぱり、危ないので、ビニールテープで刃の部分を覆っておくと安全。
刃の角度は、ホルダー基部のネジを回すと変えられる。普通はいじる必要はない。

-5 -【標本の取り付け】
台木をセットする。
Ｚライトかファイバー照明を真横から当て、標本を見やすくする。
取り付け部の３本のネジの締め加減を調整し、向きを決める。
※３本のネジはどれも締め込んだ状態になっていること。向きを変えるときは、どれかのネジをゆるめ、ほかのネジをしめて、ゆるみをなくす。
左右方向は、刃と合わせる。
上下方向は、取り付け部基部と標本の表面が平行になるようにする。刃は斜めになっているので、当てにしない。
【切片の作成】
切片のりを塗ったスライドグラスを１枚取り、伸展台の上に置く。
水をスライドグラスにたらす。表面張力を利用して盛り上げる。台にこぼれないように注意。
面相筆２本、ピンセット、剃刀を用意しておく。
粗動ハンドル（左）で、標本を刃先ぎりぎりまで持ってくる。
ハンドル（右）をなめらかに回して、切片を切る。１回転１秒強が良い。
切れ初めは、左右にクルクル巻いてしまう。これは標本が微妙に斜めで、一部しか切れていないためなので、気にしない。
しばらく切り続け、全体が切れるようになっても、左右に曲がってしまうときは、以下のように修正する。
１）標本が刃に対して傾いていないか確認する。
刃に対して傾いていると、曲がってしまう。
２）切片の上下片が平行か確認する。
実体顕微鏡できちんと平行にしたつもりでも、台木に近い方は斜めになっていることもある。剃刀できれいに平行にする。
３）１、２がＯＫなのに曲がるときは、刃の切れ味が不均等なためである。刃を左右にずらして、切り直してみる。切れないところや、うまく切れるところを見つけたら、印をつけておくと良い。
４）１、２を逆用して、わざと標本を傾けたり、上下片を斜めにしたりして、うまくまっすぐ切れるようにしても良い。
切片がリボン状にならず、パラパラになってしまうときは、温度が低いためであることが多い。ガンガンストーブを焚くか、Ｚライトで暖める。
【切片のリボンの、スライドグラスへの貼り付け】
リボンがある程度の長さになったら、剃刀で刃先の１つ下の切片の境界で切る。
（刃先についている切片は残しておく。でないと次の切片がうまく切れない。）
面相筆の先を水で軽く濡らし、リボンの上端をすくい上げる。
もう１本の面相筆で下端を支え、スライドグラスに運ぶ。
下端から、そっと水の上に置く。表面（上側）に水がつかないよう注意。
並べる範囲は、スライドグラスでなく、使うカバーグラスの大きさに合わせる。カバーグラスより数ミリ小さい範囲に並べる。リボンは、伸展台で数割伸びるので、その分も見込んでおく。
隣のリボンに対して斜めになってしまったら、ピンセットで修正する。位置のずれたときも同様。
リボンの間の隙間が空きすぎたときは、リボン間の水の表面にピペットマンの先を当て、表面を吸うと、左右のリボンが寄ってくる。水を吸うのでなく、表面を吸うのがポイント。うまくやれば、隙間なくぴったりとくっつけられる。
貼り付けたリボンが、全体としてスライドグラスの片側に寄ってしまったときは、ピペットマンで空いた側の水を吸い、狭くなった側に移すと、中央に直る。
１枚貼り終わったら、針か剃刀でスライドグラスを押しながら、伸展台の端に移動して並べてゆく。指などで押すと、水と伸展台が触れ、水が台にこぼれてしまう。
リボンがずれないようにときどき見ながら、水が乾くまで置いておく。
乾いたら伸展台の電気を切り、室温でそのまま半日以上乾燥させる。
乾燥されたスライドグラスは安定だが、ほこりが付きやすいので蓋をかぶせて置く。
【ミクロトームの後かたづけ】
台木を取り外す。
粗動ハンドルで、台木取付部を引っ込めておく。｀-6 -ハンドルの回転が滑らかなことを再確認しておく。
ハンドルのロックをかける。
こぼれたパラフィンくずを掃除する。
ビニールをかけておく。
【染色の方法】
ホールマウント標本
エッペンドルフに標本を入れ、液を入れる(400-1000 μl)。
エッペンドルフを横倒しにして、ゆるく振とうする。
（標本が底に固まっていないことを確かめる。）
切片
液が少量しかないor貴重なとき蓋をできる平たい箱（菓子箱など）の底にペーパータオルを敷き詰める。
水でビシャビシャにする。
スノコ上のもの（フリージングボックスの中仕切が便利）を置く。
上にスライドグラスを水平に並べる。
液をのせ、表面張力で盛り上げる。（スライドグラス全面で〜300μlくらい）
反応中はときどき中を見て、液が蒸発or流れてしまっていないことを確認。
※スライドグラスの裏面が濡れていると、スノコに液が流れやすい。並べる前に裏側はよく拭いておく。
※液をスライドグラスの一部分だけにのせればいいときは、ＰＡＰペンかクレヨンを、のせたいところの境界に塗る。これが液をはじき、他の部分に流れない。
液が大量にあるときor安いとき
染色壺に液を入れる。
小型 ： スライドグラス５枚 液50ml
大型 ： スライドグラス15 枚 液150mlが標準。

-7 -【 渡銀法 I 】（ボディアン−ホルメス、ブレスト、大塚：Ito 改変）
The Atras of the Insect Brain ： pp.188 、組織学研究法 ： pp.358↓固定 （ブアン、カルノア、ＡＡＦ）↓ブアン ＝／70%エタノールで洗う。

カルノア、ＡＡＦ ＝95%エタノールで洗う。

↓パラフィン包埋↓切片↓脱パラフィン、hydrate、水洗
↓侵銀

37 ﾟC

20% 硝酸銀（sodium nitrate）

2-3（or 3-5 ）時間

暗所●太い神経の集まるところが、褐色になる↓蒸留水で水洗 １分
硝酸銀・緩衝液（pH 8.2±0.4 ）

↓渡銀

0.11Ｍ
0.0225Ｍホウ酸（boric acid）
ホウ砂（borax ）以上の混合液を37 ﾟC 暗所

10-20時間

原液

6.80 g/l
8.58 g /l
50ml

25ml

8ml

20%

硝酸銀

250-500 μl

125-250 μl

40-80μlピリジン（pyridine ）

2-6ml

1-3ml

320-960 μl

水

250ml

125ml

40ml

total

300ml

150ml

48ml

水洗しない
↓還元55 ﾟC

ヒドロキノン・亜硫酸ナトリウム3-7 分

or25-30ﾟC

5-10分 （バックの汚れ少）●黄褐色になる
ヒドロキノン（hydroquinone）

3g

1g

無水亜硫酸ナトリウム（sodium sulphite Na 2SO 3）

30g

10g

in 水

300ml

100ml

↓水洗

流水→蒸留水↓渡金

塩化金・酢酸

塩化金

1%

酢酸

1%

25 ﾟC

10-15分

●灰〜灰黒色になる
↓水洗

蒸留水

↓着色

2% 蓚酸 （oxalic acid） 20-25ﾟC

10-30 分●黒紫色になる
増感するとき ↓増感液

1-2分

ヒドロキノン0.3g

クエン酸

0.3g

in 水115ml

使用時に20% 硝酸銀を5ml（1/23 vol. ）加える
↓塗金

1% 塩化金・酢酸

1分↓着色2% 蓚酸3分

↓水洗

流水

↓定着

5% チオ硫酸ナトリウム

3-15分

↓水洗
↓ 必要に応じて対染色↓脱水、透徹、封入-8 -【 渡銀法 II 】（ボディアン−ホルメス、ブレスト、ハイゼンベルグ）
Drosophila

A LABORATORY MANUAL (M. Ashburner) : PP.277、試薬組成はPP.329

硝酸銀以外の試薬は、すべて毎回新しく作る。
硝酸銀は、暗所で数カ月保存可↓固定 （カルノア）↓95%エタノールで洗う。
↓パラフィン包埋↓切片↓脱パラフィン（キシレン110 分×44）↓hydrate（エタノール 100%→90% →70%→50%→30% 各55 分）、水洗（蒸留水 5 分）
↓渡銀
硝酸銀・緩衝液（pH 8.4）

37 ﾟC 暗所

10-20 時間

原液

211mM ホウ酸(boric acid)

20ml

15ml

5ml

13.08g/l H 3BO3

43.25mM ホウ砂(borax, Na borate)

20ml

15ml

5ml

16.48g/l Na 2B 4O7･10H 2O

20% 硝酸銀

385μl

289μl

96 μl

ピリジン（pyridine ）

1.5ml

1.125ml

375μl

in 水

200ml

150ml

50ml

total

↓水洗しない↓還元

ヒドロキノン・亜硫酸ナトリウム25-30ﾟCor55 ﾟC

7-9 分

5-10分 （バックの汚れ少）●黄褐色になる
ヒドロキノン（hydroquinone）

3g

1g

無水亜硫酸ナトリウム（sodium sulphite Na 2SO 3）

30g

10g

in 水

300ml

100ml

3分→蒸留水↓水洗流水↓渡金

1% 塩化金

1分20 分（明光下）

室温●灰〜灰黒色になる2分×22↓水洗蒸留水↓着色2% 蓚酸 （oxalic acid） 室温

10 分●黒紫色になる
2分×22↓水洗蒸留水↓定着

5% チオ硫酸ナトリウム5分↓水洗↓ 必要に応じて対染色↓脱水（エタノール 30%→50%→70%→90%→100%↓透徹（キシレン各55分）

10 分×22）→封入-9 -【酵素抗体法によるBrdUの検出】
ファルマシア社の細胞増殖検出キット(Cat. No. RPN20) が便利である。
↓ ２％過酸化水素／メタノール

室温

ゆるく振とう

２０分↓ ２Ｎ塩酸／ＰＢＳ＋0.3%Triton-X 室温

ゆるく振とう

２０分

内在性ペルオキシダーゼをつぶす。
↓ＰＢＳで洗う

４分×３回

核酸の二重鎖を分解↓

ＰＢＳで洗う

４分×３回↓ １次抗体 室温 ゆるく振とう スライド1〜2時間↓

ＰＢＳで洗うホールマウント2〜数時間

４分×３回↓ ２次抗体 室温 ゆるく振とう スライド0.5〜1時間 ホールマウント1〜数時間↓

ＰＢＳで洗う↓ ＤＡＢ＋増感剤

４分×３回
室温 ゆるく振とう 発色を見ながら5〜20 分

ペルオキシダーゼによってDAB が発色する。
ホール： リン酸緩衝液500μl＋ＤＡＢ液２μl、増感液１μl
切片 ： リン酸緩衝液50ml↓

水で洗う＋ＤＡＢ液１ｍl、増感液4.3 μl

４分×３回↓ 対染色（切片のみ） エオシンＹを用いて、染色20 分↓ 脱水（エタノール系列 すばやくやらないと、エオシンが溶けてしまう。）
70%､90%､95%、100% エタノール↓ 透徹（キシレン＋クレオソート）、封入（カナダバルサム）- 10 -ショウジョウバエ後胚発生の基本常識
ITO Kei

1989.4.26＜基本知識＞
１．ショウジョウバエの成長
卵（24 時間）→１令幼虫（24 時間）→２令幼虫（24 時間）→３令幼虫（48 時間）→蛹（96 時間）→成虫
２．ショウジョウバエの神経系 （幼虫）
昆虫の神経系は梯子状神経系と呼ばれ、各体節ごとに神経節がある。ショウジョウバエは胸部３体節、腹部８体節を持つが、各体節の神経節はバラバラでなく、一つに融合して、胸の前の方にコンパクトにまとまっている。
頭には大きく２つの神経節がある。食道の下に食道下神経節（Suboesophagial Ganglion）があり、そこから上方に食道の両側に、球状の食道上神経節（Supraoesophagial Ganglion ）（または脳 brain とも言う）がある。食道下神経節は、後ろの胸部、腹部神経節と一体化して舌状になっている。
脊椎動物では、中枢神経では神経細胞本体が内側にあり、軸索やシナプスはその外側をとりまいている（ヒトなどの大脳は例外）。昆虫などの節足動物では逆で、外側に細胞本体があり、内側に軸索などがある。その点では、位相的にはヒトの大脳と同じ関係である。
３．ショウジョウバエの神経系（成虫）
幼虫には、目と呼べるものはない。しかし蛹の間に複眼ができ、それと同時に複眼からの情報を処理するためのOpticLobe が形成される。幼虫の食道上神経節の球の外側半分づつが大きく成長し、同時に神経節の前にあった複眼のもと（複眼の成虫原基＝eye disc ）が複眼の形になりながら脳の両側に来る。これらがつながって、成虫の複眼と、それにつながる脳を形成する。
また、幼虫はずん胴だが、成虫は首がある。首の形成にともない、初めは一体に見えた食道下神経節と胸部神経節の間にくびれが入る。
結果として、成虫では中枢神経系は、頭部にある食道上、下両神経節と、胸部にある胸部、腹部神経節のふたつに大きく分かれる。
４．ヒストロジー（組織学）
I 固定

fixation

生物の中にはいろいろな活性をもつ酵素がある。これらは生物が死ぬと、制御が利かなくなって勝手に働いてしまう。
いわゆる死後変化というやつである。このため、タンパク質や核酸が分解されてしまうこともある。
これを防ぐため（他にもいろいろな理由があるが）、殺したらすぐにタンパク質などを変性させてしまう必要がある。
これが固定（fixation ）である。
II rehydration 、dehydration
ある種の固定液は油性である。しかし酵素反応や染色を行うには、水性でないと困る。そこで組織を「水に戻す」必要がある。95%,90%,70%のエタノールに組織を次々に数分づつひたし、徐々に水分を増やしていく。70%の次に、水に浸せば、組織は水に戻る。これがrehydrationである。
一方、切片を作ったり、プレパラートに封入するには、油性の方がよい。水分があると油である切片作成用パラフィンや封入剤をはじいてしまう。そこで先と逆の順序で、水から油に持って行く。95% の次に２回ほど100%エタノールに浸すと、出来上りである。これがdehydrationである。
III 透徹clearize

固定された組織は、ふつう白く濁っている（変性されたタンパクは、焼肉と同様白くなる）。これでは組織が観察できないので、透明にする必要がある。これが透徹である（素直に透明化と訳せば良いものを、、、）。 dehydrateした組織をキシレンにしばらく浸せば、なぜか知らないが透明になる。
IV ホールマウントwhole mount

正統的には、組織はパラフィンなどの柔らかい固体に埋め込み（包埋）、10 ミクロンくらいに薄く切って切片にする。
これは高倍率で詳しく観察できるが、なにせ面倒なので多くのサンプルを見るには面倒である。そこで小さくて透明になるようなサンプルの場合には、切片にしないでそのままプレパラートに入れて見てもよい。カナダバルサムという樹脂を使って、スライドグラスをカバーグラスの間を密封する。これがホールマウントである。

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