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食の安全安心のためのオンサイト診断技術の開発＜平成 22 年度助成＞

食の安全安心のためのオンサイト診断技術の開発
山中啓一郎・民谷栄一（大阪大学大学院工学研究科）

1.

緒言

者個人レベルでの理由を含めた食品制限があるた
め、表示されている成分が正しいのかどうか、ま今日、わが国における食生活は、その多くを輸た表示以外の内容物が含まれていないかどうかを入に頼っていることや調理済み食材が広く利用さ評価することもまた、消費者の食品への安心を確れていることなどにより生産、流通、消費のそれ保する上で重要である。これらの成分の評価方法

ぞれの段階で食品を取り巻く環境は以前より複雑としては、上述した遺伝子検査の他に HPLC や化してきている。このような複雑化する食環境のELISA などのタンパク質解析が挙げられる。し中で、食品の安全性を事前に評価、管理し消費者かしながら、これらの方法は特に加熱処理済み加へ提示することは食に対する安心を確保すること

工食品の場合、タンパク質が構造的に不可逆的ににつながり、またそれはわが国だけでなく国際的変性しているため検出が難しい。よって、細菌検なニーズでもある。

査と同様に DNA 検査は、成分解析においても有食品の衛生的な安全性を評価する指標の一つと効な手段である。

して、大腸菌群の検査が行なわれている。大腸菌

このような PCR などの特異的遺伝子検出法がはヒトや動物の糞便や下水に多く存在するだけで日常的な食品検査に用いられるためには、特別ななく、自然界にも広く分布しているため、生産、検査所での解析だけでなく、現場レベルでの検査流通段階での衛生管理を評価するために利用されが可能になることが求められる。そこで、要求さている。現在では、この大腸菌の検査は食品サンれるのは、遺伝子検査の迅速化、簡便化、低コスプルからの培養、増殖によりその有無を評価してト化、及び装置の小型化及び可搬性などが挙げらいる。しかし、この方法は時間がかかるためそのれる。

場での判断が困難である。一方、PCR などを用

そこで、本研究ではこの PCR 法を利用した迅

いた遺伝子検査は臨床診断、感染症診断など医療速な大腸菌検出を目的とし、PCR 後の DNA 増幅現場を中心として環境検査や食品検査にも利用さ検出を電気化学測定を用いて検討した。PCR にれはじめている。PCR 法は、微量の DNA サンプ

よる目的配列の増幅検出は通常、電気泳動か蛍光ルから目的とする遺伝子配列領域を人工的に大量検出が用いられるが、電気泳動は 30 分程度時間に増幅する技術で、その特徴は高感度と高い選択が必要であり、また蛍光検出はリアルタイム測性にあり、また 1 – 2 時間ほどで検査が可能である

定及び定量評価が可能であるが、その蛍光試薬という点である。

や probe DNA への標識が必要かつ小型化が難し

また、加工食品が広く利用されている現状では、い蛍光検出部位が必要となるためランニングコスアレルギーや狂牛病などの食品由来の疾患や特にトや可搬性の問題がある。一方、DNA の電気化

食肉の場合は宗教上の理由（ハラル）、などの消費学測定は迅速な測定が可能であり、また高感度な

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DNA 測定法として注目されており、SNP の測定容易である。また、膨大な量の増幅産物は電気化や微量測定などがおこなわれている。しかしなが学測定にとってその測定原理上から有利である。

ら、その主なものは精製された DNA を用いている。ここでは迅速で簡便な検出を目的として、酵2.

大腸菌 PCR 及び電気化学測定

素タンパクや塩、primer など電気化学測定にお

電気化学測定原理は、DNA 結合性の電気化学いて夾雑物となりうる成分が含まれた PCR 溶液メディエータを利用した方法で、これを直接 PCRから増幅 DNA を精製せず直接測定する方法、条溶液と混合して測定する。PCR により DNA が増件について検討を行った。また、測定は安価に大幅するとメディエータが結合するため、その増幅量生産が可能かつディスポーザブルな小型カー

DNA 量に応じて電気化学活性を有するフリーなボン印刷電極（DEP-chip）を作製、また、USB 電状態のメディエータが減少することになるため、源から直接接続できる Hand-held な Potentiostat

電流値が減少する（Fig. 1）。この電流値の減少量（BDT ministat）を用いて、大腸菌 PCR による特を測定することで増幅の検出が可能である。特徴

異的遺伝子増幅を定量的に測定した。また、我々としては、測定時間が約 20 秒程で完了するためは Microfluidic chip を用いた迅速な PCR につい迅速な測定が可能であることと、電極表面への固ても検討を行ってきており、将来的に統合デバイ定化や修飾 DNA プローブなど特別な操作や試薬ス構築を目的として大腸菌をターゲットにした迅を必要とせず PCR 溶液と混合するだけなので簡速 PCR ついても併せて検討を行った。

易な方法であるという点が挙げられる。本研究でま た、PCR と同 様 の 遺 伝 子 増 幅 技 術 の 一 つは、DNA 結合性電気化学メディエータとしてベで あ る、Loop-mediated isothermal amplification

ンズイミダゾール化合物などを用いた。また、使（LAMP）法を用いた食肉の遺伝子検出（ブタ、ト用した印刷電極及び小型 Potentiostat を Fig. 2 にリ、ウシ）についても検討した。LAMP 法は、そ示す。の特徴として、等温での増幅反応が可能であるこ大腸菌株を LB 液体培地へ植菌し、37 ℃、48 hとと、PCR と比較しその増幅戦略から特異性が高振とう培養した。滅菌蒸留水で 10 倍希釈した培

くまた増幅産物の量も多い。よって、通常 PCR で養液 50μL をコンラージ棒で LB 寒天培地に平用いるサーマルサイクラーを必要とせず簡易的な板上に展開し 37 ℃、24 h 培養し、生育コロニーヒーターで増幅反応が可能なため装置の小型化が数をカウントして培養液中の大腸菌数を求めた。

5

作用極面積 3.04 mm 2 対 極
作用極
参照極
絶縁層
12.5 mm

コネクター
接続部分
4 mm

Fig. 1 電気化学測定原理

Fig. 2 小型ポテンショスタットと印刷電極

DNA 合成量に対応してピーク電流値が減少する。

USB 接続により外部電源を必要としない名刺サイズのポテンショスタット。測定に必要な溶液量が約 10 μ L の小型な印刷電極。

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大腸菌および DNA の精製は行わず、大腸菌培養増幅は、E. coli 菌体数 1 個からでも可能であり、液を加熱処理したものを直接 PCR サンプルとしまた、テンプレートとなる菌体数に対応した特異た。PCR は、E. coli 特 異 的 16srRNA 遺 伝 子 を的遺伝子増幅量による メディエータの電流値（酸タ ー ゲ ッ ト と し た プ ラ イ マ ー 、ECA75F:化電位約 400 mV）の減少が測定された。この結

5’-GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC-3’及び果から、PCR のエンドポイントでの電気化学測ECA619R : 5-AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA-3’

定によって定量的評価が可能であることが示されTM（300 nM each）を用いた。SeedSTAR

HS DNAた。また、Micro flow 型 PCR チップによる大腸

polymerase kit（TAKARA BIO. Inc.）を 使 用 し、菌遺伝子の迅速増幅についても検討した。マイクテンプレートは、培養液希釈列をそれぞれ 1μLロチャネル内に反応溶液を送液する Flow 型 PCRを PCR 溶 液 に 加 え、95 ℃ 30 sec 後 95 ℃ 5 sec,

チップは、溶液自体が各温度に固定したヒーター

65 ℃ 15 sec（40cycles）で 行 っ た。PCR 後 の 溶 液上を通過するため、温度の上げ下げの制御に時間1μL を直接 40μM メディエータ溶液 10μL に混がかかる通常のサーマルサイクラー装置よりも迅合した。これをカーボン印刷電極上にドロップ速化することが可能である。このような Flow 型し、BDT ministat を 用 い て LSV（Linear Sweep

デバイスでは、遺伝子増幅後の溶液はデバイス

Voltammetry: from 0 to 700 mV, step potential,の outlet からそのまま送液されてくるため、検50 mV/sec）で測定した。

出デバイスとの連結性に優れると言う点もある。

結果、Fig. 3 に示すように、PCR による遺伝子A

Polydimethylsiloxane（PDMS）樹脂を用いた PCR

B

10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 0.1 NTC

Fig. 3 大腸菌 PCR の電気化学測定。(A) 大腸菌サンプル (Template) の 10 倍希釈列をそれぞれPCR 後、ヘキスト溶液と混合して LSV 測定した Voltammograms。insets : 電気泳動像(B) ピーク電流値のプロット。大腸菌量に応じて電流値が減少し、PCR のエンドポイントでの定量的評価が可能。*Molecular size maker, **Non-template control

Fig. 4 マイクロフロー型 PCR チップ作製手順

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マイクロ流路チップの作製手順を Fig. 4 に示す。の精製が必要なく培養液から直接増幅し PCR 後シリコン基板上にフォトレジスト（SU-8）をスピすぐに測定が行えることを示した。これにより、ンコートした後、流路パターンを描いたマスク

大腸菌１個からでも検出できる高感度な迅速食品

フィルムをレジスト上に接触させ、UV を照射し検査の可能性を示した。今後、Microfluidic PCRてパターンを転写する。余分なレジストを洗いchip による高速な PCR との連結による、さらに流した後ベークして鋳型とした。熱硬化樹脂で迅速、小型化によって現場ですぐに検出可能なシある PDMS を流し込み 120 ℃でベークして流路ステムへの応用を検討する。

パターンを PDMS に転写し、これをガラス基板と酸素プラズマを用いて貼り合わせる。Inlet とoutlet 部位を成型して PDMS マイクロフローチッ

3.

ブタ、トリ、ウシ遺伝子の LAMP 及び電気化学測定プ と し た。Fig. 5（A）に 作 製 し た 6 チ ャ ネ ル 型

等温増幅が可能な LAMP 法の原理を以下に記

Microfluidic PCR chip を 示 す。PCR チ ッ プ は、述 す る。65 ℃ 付 近 の 温 度 条 件 で は DNA 2 本 鎖

流路サイズ 50 × 50μm の 6 つの独立したチャネは、動的に平衡状態にあり完全に融解はしないがル、及び独自技術である気泡発生を抑制するため部分的に 1 本鎖状態と 2 本鎖状態を繰り返していのプレッシャーチャネル部（20 × 50μm）を一枚る。この部位に Template DNA のターゲットとのチップに集積させたものを作製した。温度固定なる領域上の 6 つの配列を認識するように設計さ型ヒーター（95 ℃、65 ℃）上に Flow チップを設れた 4 種類の異なる Primer がアニールすること

置後、シリンジポンプで PCR 溶液を送液して大になる。鎖置換活性を持つ Bst DNA polymerase

腸菌遺伝子を増幅した。Outlet から溶液を回収が、primer と結合した部分的 2 本鎖部位を認識し、後 メディエータ溶液と混合して電気化学測定をtemplate 上の融解していない 2 本鎖部分を剥し行った結果を Fig. 5（B）に示す。結果、約 20 分ながら新しい DNA 鎖を合成する。こうして作ら（50 cycles）で PCR が可能であり、その増幅有無れた DNA には自身の末端配列部位と相補的な配を電気化学測定することが可能であった。

列を有した構造があるため、自己アニールにより以上の結果より、ポータブル型ポテンショス両末端に対称的なループを持つダンベル様構造のタット及び小型印刷電極を用いて大腸菌 PCR の1 本鎖増幅中間体ができることになる。この構造検出が可能であり、また大腸菌や PCR 後の DNA体が爆発的な増幅の起点となり、同一鎖上に互いFig. 5 Microfluidic PCR. (A) PDMS 製 6 チャネル PCR チップ。チャネルサイズは、サーマルサ
イクル部 50 × 50μm, プレッシャーチャネル部 50 × 20μm. (B) Microfluidic PCR の電気化学測定。Inset : 電気泳動像。NTC : Non-template control, PC: Positive control

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155に相補的な配列を繰り返す増幅産物が様々なサイprimer により特異的な検出が可能かどうか検討

ズでできることになる。このように LAMP 法は、するために、トリ肉及びブタ肉から DNA を抽出等温での増幅反応が可能でありまた 4 種類の異なし各比率で混合し、ブタ検出用 primer set 及びトる Primer を用いることで PCR と比較し特異性がリ検出用 primer set を用いてそれぞれ LAMP を高く増幅産物量も多い。

行い電気化学測定を行った。結果として、Fig. 6

本研究では、ブタ、トリ、ウシを LAMP 法で特に示すように目的としない DNA が混合されてい異的に検出するために、それぞれのターゲットにても交差反応は起きずに特異的な増幅が可能であ

対して４種類の Primer を設計した（Table 1）。

ること、またこれは加工混合食品などから目的とFIP, BIP primer それぞれ 32μM、F3, B3 primer

するトリ、ブタ肉の検出が可能であることを示し

そ れ ぞ れ 2 μM、Bst DNA polymerase を 16 U、ている。次に、検出感度の検討を Fig. 7 に示す。

dNTPs を 0.4 mM、10×Thermopol buffer、MgSO4 ,Template のトリ、ブタ、ウシ DNA を 3、3 × 10、

3 mM、Betaine, 0.64 M、total volume, 25 μL と し

3 × 10 2、3 × 10 3、3 × 10 4 copies/reaction に なて 63 ℃で 1 時間反応させた。反応後の LAMP 溶るように希釈し LAMP を行い電気化学測定した液を 4 倍希釈したものを、メディエータ溶液と混結果、検出感度は、ブタ DNA の場合は 3 × 10 4、合（20μM）し電気化学測定した。まず、作製した

ト リ DNA で は 3 × 10 2、ウ シ DNA で は 3 × 10

Table 1 設計した LAMP 用の primer 配列。P-pork, B-bovine, C-chicken の特異的遺伝子検出用 primer

Fig. 6 トリ、ブタ DNA 混合サンプルの LAMP 電気化学測定。(A) ブタ遺伝子検出 primer。
(B) ト リ 遺 伝 子 検 出 primer。 ブ タ DNA : ト リ DNA % 1, 0 :100. 2, 20 : 80.
3, 40 : 60. 4, 60 : 40. 5, 80 : 20. 6,100 : 0. 7, control ブタ DNA. 8, control トリ
DNA. 9, non-template control

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Fig. 7 LAMP による特異的遺伝子増幅の電気化学測定検出感度。(A) ブタ遺伝子増幅測定。
(B) ウシ遺伝子増幅測定。(C) トリ遺伝子増幅測定。Template となるそれぞれの抽出
DNA のコピー数を 3 から 3×10 4 まで 10 倍希釈段階を作成し LAMP 後、電気化学測定した。

copies/reaction 以上で可能であった。
以上の結果から、新しく設計した LAMP primer

応と同時に電気化学測定を行う方法の検討および定量的な評価への応用を検討する。

によって 3 種類の食肉の特異的増幅が可能であり、また電気化学測定によりその増幅を迅速に検出す

謝 辞ることが可能であった。LAMP 法は高価なサーマ

本研究を遂行するにあたり、多大なご援助を賜

ルサイクラーを必要とせず恒温槽など簡易的なヒりました公益財団法人浦上食品・食文化振興財団ーターで可能であり装置の小型化が容易である。に厚く御礼申し上げます。

今後はさらに簡易的な検出を目的とし、LAMP 反Development of on-site detection system for food safety

Development of on-site detection system for food safety
Kiichiro Yamanaka, Eiichi Tamiya
Department of applied physics, Osaka University

The food sanitation control is important for consumer protection. Escherichia coli (E. coli)
bacteria have been utilized as one of the indicator organisms for food safety. Usually, culturalprocedure is used for identification of E. coli, however it is time-consume method because of thebacterial growth require over a day. Therefore, the development of on-site bacteria detection system(which with rapid, simple, low cost and portable but high sensitive) is beneficial in the food safety
testing. On the other hand, DNA analysis with polymerase chain reaction (PCR) has become routine
part of medical diagnosis, for the sensitive, rapid and specific detection of virus and/or bacteria.
The detection of genes amplified by PCR is commonly accomplished by gel electrophoresis and/or fluorescence observation based on Taqman chemistry. In particular, fluorescence-based detection
is highly sensitive and makes quantitative real-time PCR possible. However, the optical detection
apparatus for fluorescence intensity measurement is not amenable to miniaturization which makes
it unsuitable for the construction of portable system. We have been currently investigating thedevelopment of electrochemical sensor for nucleic acid, and electrochemical based DNA detection
is a relatively simple technique and is high amenable to miniaturization as it offers label-free, rapid
measurement (about 20 seconds) with low power consumption. In this study, Hoechst was used
as a reporting element for electrochemical detection. Hoechst is an electro-active molecule withhigh affinity towards nucleic acid and it can intercalate into double helix. The binding of Hoechst
molecules to the amplified DNA cause the decrease of the peak current due to the slow diffusion of
Hoechst-amplified DNA complex to electrode surface.
Here we proposed that the electrochemical method for E. coli detection without the purificationof DNA using the hand-held potentiostat and the small-sized disposable electrical printed chip (DEPchip). The bacteria cultures of various concentrations of E. coli were directly added in PCR solutions,and 2-step PCR (95, 65 °C for 40 cycles) were carried out. After PCR, the solutions were directly
mixed into the Hoechst solutions, and dropped onto the DEP chip. Electrochemical signals (linearsweep voltammogram) were recorded by the portable potentiostat. As the results, the oxidation peakcurrent of Hoechst were decreased depending on the number of the added E. coli, moreover, fromonly one bacteria per reaction could be detected.
Identification of meat species is also crucial for the detection of adulteration in processed foods
to safeguard the consumers against the presence of unknown or less desirable species from healthperspectives or religious. In this study, we have tried to determine meat species-specificity using
a combination of loop mediated isothermal amplification (LAMP) followed by electrochemicaldetection. LAMP is a newly invented method for amplifying DNA, where the amplification
reaction proceeds at a constant temperature (~ 65 °C) by using the strand displacement typed
DNA polymerase. Those reactions enable to amplify the target sequence with high sensitivity
because of the recognition of the target sequence by four different primers designed to anneal
six distinct sequences during the reaction. Therefore, it is easy to miniaturize the equipments for
DNA amplification in comparison with the commonly used thermal cycler for PCR. To produce
species-specific loop amplicons, specific primers for bovine, chicken and pork were newly designed
respectively. In order to confirm the specificity of designed primers for LAMP, pork-chicken mixturesat different ratios were amplified using pork specific primer set or chicken specific primer set. AfterLAMP, the solutions were mixed with Hoechst, and measured the current signals by same procedure
as described above. As the result, the presence of the target specific amplicon were confirmed by theelectrochemical signal without cross-reactivity, and it indicated that precise detection of meat species
in mixed samples could be performed.
As described above, the developed electrochemical measurement technique by using DEP chipand hand-held potensiostat has possibility for applying to the quantitative detection of E. coli andmeat species, and can be extended to be the on-site detection system for food safety testing.

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