技術レポート

鳥取県産業技術センター研究報告 No.16 (2013)

細胞内小胞輸送経路を利用した脂質代謝評価法の開発
Evaluation of intracellular lipid metabolism by utilizing vesicle trafficking systems

中村優子
Yuko Nakamura-Sugimoto
食品開発研究所 バイオ技術科

体内への脂質蓄積を低減させる食品素材が近年注目されており、その機能性評価法への要望が高まっている。本研究では、従来法より迅速で簡便に脂質代謝を評価する手法として、培養細胞が脂質を代謝する経路を遮断し、食事性の脂質吸収のみを評価する系を開発した。

1.

はじめに（CHO 細胞）を用いた。CHO 細胞の培養は、10％食事により摂取されたコレステロールや中性脂子牛血清を含む Ham’s F-12 培地で行った。通常のコ肪などの脂質は、肝臓で各種リポ蛋白に封入され、レステロールやトリグリセリドの蓄積抑制の評価に血流により体内を循環し、必要な組織へと再分配さは、ヒト肝ガン細胞株である HapG2 細胞を用いた。

れる。過剰に摂取された脂質は体脂肪として蓄積さHepG2 細胞は、10％子牛血清を含む D-MEM（低グれるだけではなく、酸化された過剰なリポ蛋白は動ルコース）で行った。

脈硬化などの要因となりえる。そのため、普段の食生活から脂質蓄積を低減させることが期待できる食2.2

品素材が注目され、特定保健用食品の「コレステロ細胞にコレステロールを蓄積させるために、細胞ール」や「体脂肪」の軽減を図るカテゴリーの食品は、整腸効果に次ぐ売上高を誇るコレステロールの蓄積抑制効果を

１）3 β -(2-Diethylaminoethoxy)androst-5-en-17-one

ため、体内への(U18666A)を含む培地で一晩培養した。この際に、脂質吸収を抑制する効果を示す素材の探索に対する食品素材ならびに、陽性対照としてコレステロール要望が高まっており、培養細胞でその効果を簡易に吸収阻害効果が実証されている茶カテキンを同時スクリーニングする系が必要と考えた。に投与し、コレステロール蓄積を阻害するかを調べ

培養細胞では培地中の脂質を、細胞内小胞輸送経た。この評価には、蛍光染色法と定量法を用いた。

路で運搬することが明らかとなっており、その輸送

蛍光染色法には、遊離型コレステロールを特異的を遮断することで、細胞にとっての「食事性」脂質に認識し、自家蛍光を発するカビ毒素である filipinの蓄積状態を作りだせることが明らかとなっているを用いた。細胞をホルマリン固定後、nonidet P-402）。本研究では、この作用を利用し、細胞の脂質蓄で 透過 性処理 を行 い、 リン 酸緩 衝液に 溶解 した積を解消できる食品素材を評価する系を確立するこ

filipin で細胞を処理後に、蛍光顕微鏡で観察した。とを目的とした。

定量法は、和光純薬の総コレステロール測定キットにより、手順に準じて測定を行った。この際３回

2.

実験方法

2.1

細胞培養の独立した試験の結果を統計し、結果を算出した。

評価系の確立のため、細胞内コレステロールの含2.3

小胞の分解阻害による蓄積脂質の解析

分解小胞であるライソゾームの機能を阻害する有量が少ない細胞株として、ハムスター卵巣細胞36

ために、クロロキンを含む培地で 3 日間培養した。とが難しいコレステロールの含有量にも大きな差がこの際に、食品素材ならびに、陽性対照として、コ出てくるのではないかと考えた。

レステロールと同様に中性脂質の吸収阻害効果が実試験系の確立のため、まず細胞内コレステロール証されている茶カテキンを同時に投与し、コレステ含量が少ない CHO 細胞に U18666A 処理を行い、未ロール蓄積を阻害するかを調べた。この評価には、処理群との差が明らかになるかを確認した。

脂肪滴染色法と定量法を用いた。

U18666A 処理後、遊離型コレステロールを特異的に脂肪の染色には、オイルレッド O を用いた。細胞染色する手法である、filipin 染色を実施したところ、をホルマリン処理後、イソプロパノールで洗浄し、薬剤処理により優位にコレステロールの蓄積が確認

イソプロパノールに溶解したオイルレッド O 染色液された（図２）。この時の細胞内コレステロールを定で処理し、光学顕微鏡で観察した。

量したところ、処理の有無により有意に差が見られ定量法は、和光純薬のリン脂質測定キットにより、た（図３）。
医薬品

手順に準じて測定を行った。この際３回の独立した細胞膜や試験の結果を統計し、結果を算出した。

HDL へ

3.

結果と考察

3.1

コレステロールの蓄積抑制効果

合成
小胞体
ライソゾーム培養細胞のコレステロールの供給源は、血清中のLDLLDL(低密度リポ蛋白)から取り入れる外因性コレステロールと、アセチル CoA から合成する内因性のコ食品（トクホなど）レステロールの主に２つがある。これらの供給源を遮断することで過剰なコレステロールの吸収を抑制

図１ コレステロールの細胞内循環するが、コレステロール合成の阻害は医薬品が、外因性コレステロールの吸収阻害は特定保健用食品などの食品素材がそのターゲットとなっている（図１）。
LDL から供給されるコレステロールは細胞内小胞輸送経路に乗り、細胞内の分解器官であるライソゾームへと運搬され遊離型のコレステロールに変換されることで、細胞膜として利用されるか、HDL（低未処理密度リポ蛋白）に封入され体内循環を行う。LDL コ

U18666A 処理

図２ U18666A 投与時の filipin 染色（CHO 細胞）

レステロールをライソゾームから運搬する細胞内小胞は、プロゲステロンのアナログである U18666A で特異的に阻害されるものであるため、この薬剤で細胞を処理するとライソゾームに遊離型コレステロー
ルが選択的に蓄積することが明らかとなっている 3）。
細胞内に外因性コレステロール蓄積させる過程で、コレステロールの吸収阻害を起こす食品成分を投与すれば、蓄積を止めるだけではなく、恒常的に代謝される経路があるために吸収阻害の効果を調べるこ

図３ U18666A 投与時のコレステロール量（CHO 細胞）

37

次に、コレステロールが盛んに代謝されている肝ような脂質が蓄積するかを確かめた。クロロキンをガン細胞 HepG2 において、コレステロール吸収阻害

肝ガン細胞 HepG2 に投与したところ、オイルレッドを示す茶カテキンが U18666A によるコレステロー

O 陽性の脂肪滴が多数観察された（図６）。そのため、ル蓄積作用を阻害するかどうかを調べた。U18666A

クロロキン投与により中性脂質が蓄積することが予投与により細胞内コレステロール量が増加したが、想されたが、この細胞にはリン脂質も蓄積し、カテカテキンを同時に投与したものではコレステローキンの投与によりリン脂質量が投与前のレベルまでル量の減少が有意に見られた（図４）。filipin 染色に下がることが分かった（図７）。以上のことから、ク

よるコレステロールの観察では、カテキン投与によロロキン投与による脂質蓄積モデルにより、リン脂りコレステロールが減少している様子が確認でき質と中性脂質の複合蓄積を引き起こし、肝細胞におた（図５）。以上のことから、従来法では有意差をいては脂肪肝のモデルとして利用できることが示唆出すのが難しいとされていたコレステロール吸収された。

阻害効果について、顕微鏡像と定量の２つの側面から確実に、且つ迅速に評価する系が確立できた。
＊

＊

未処理

クロロキン処理

図６ クロロキン投与時のオイルレッド O 染色＊

図４ U18666A と茶カテキンの投与時の細胞内コレステロール量＊（*:p＜0.05）

U18666A 処理

U18666A+茶カテキン

図５ U18666A 投与における茶カテキンの効果（filipin 染色）

図７

クロロキンと茶カテキン投与時の細胞内リン脂質量（*:p＜0.05）

3.2

リン脂質の蓄積抑制効果

4.

細胞内の脂質輸送には、 U18666A が阻害する経おわりに路以外にも多くの小胞輸送が関与している。
そこで、本研究は、各脂質に特有の細胞内運搬小胞を特異小胞の最終目的地であるライソゾームの pH を上昇的に阻害する薬剤を用いて細胞内に脂質を蓄積させさせることで分解機能を破壊するクロロキンを細胞る手法を、脂質吸収阻害作用を持つ素材の効果を視に投与し、多くの小胞輸送を停止させた場合にどの覚的に、且つ、定量的に評価する系へと発展させた。

38

文献

従来法での脂質吸収効果の評価は脂肪細胞や肝細胞に、単に素材を投与し、細胞内の脂質を定量す

1) 日本健康・栄養食品協会；トクホ市場調査 (2011),

るものであったため、細胞内で恒常的に代謝回転しhttp://www.jhnfa.org/tokuho2011.pdfている脂質では素材の効果を調べることが非常に難
2) Sugimoto, Y. et,al. ；Accumulation of cholera toxin

しかった。本法は、外因性の脂質のフローを止める

and GM1 ganglioside in the early endosome of

ことで、１）脂質含量の少ない細胞であってもそのNiemann-Pick C1-deficient cells. Proc. Natl. Acad.

差を優位に確認できる、２）蛍光等を用いた染色にSci. USA, 129(6), p.875-80(2001)

より蓄積個所が見やすくなるため、視覚的な評価がしやすい、
３）
代謝回転が非常に早い脂質であれば、

3) Liscam, L. et,al. ；The intracellular transport of low

非常に短い時間でのアッセイを可能にする点で優れdensity lipoprotein-derived cholesterol is inhibited inた手法であると言える。

Chinese

今回は、コレステロールと中性脂質、リン脂質のhamsterovarycells

culturedwith

3-beta-[2-(diethylamino)ethoxy]androst-5-en-17-one.

評価法を確立したが、他の輸送阻害薬を用いること

J Biol Chem, 264(20), p.11796-806(1989)

で、脂質だけではなく様々な基質の代謝の吸収阻害や促進の効果を評価できる系へと発展させたい。

39