－論文－●ラミニンレセプターのラミニン結合部位を基にした抗菌ペプチド設計方法─────────────────────────────────────────────────────

先端科学研究所

バイオインフォマティックスグループ

小林 菜穂子

吉田 徹彦

細胞接着性糖タンパク質であるラミニンは、細胞の接着、増殖、転移、分化、および神経突起伸長などの様々な生物活性に関与している。多くの細菌は、ラミニンと相互作用するラミニンレセプターに類似したタンパク質を有し、感染の初期段階において細胞接着相互作用を利用することが知られている。本研究では、ラミニンとラミニンレセプターの接着相互作用に着目し、これらのタンパク質の結合部位を基に抗菌ペプチドを分子設計および合成し、その抗菌活性評価を行った。その結果、細菌が有するラミニンレセプターへ相互作用が期待されるラミニンを基にしたペプチドではなく、ラミニンレセプターを基にしたペプチドが非常に優れた抗菌機能を有することが明らかとなった。本研究は、タンパク質のリガンドとレセプターの関係を基本とした従来の創薬研究に対し、レセプターに対しレセプターの相互作用を想定した新しい抗菌ペプチドの設計方法を提案するものである。

１

緒

言

いに作用しあう結合部位を基にした抗菌ペプチドも設計した。
設計したペプチドを化学合成し、それらの抗菌機能を検討す

ラミニンは細胞の外膜に存在する糖タンパク質の一種である為に最小発育阻止濃度(Minimum inhibitory concentration,り、細胞間の接着、細胞増殖、転移、分化および神経突起伸MIC)の評価を行った。その結果、興味深いことに細菌が有長などの様々な生物活性に関与している。ラミニンに特異的するラミニンレセプターへ相互作用が期待されるラミニンやに結合するラミニンレセプターが正常細胞や癌細胞の細胞表細胞性プリオンタンパク質の結合部位を基にしたペプチドで面に存在しており、ラミニンとの相互作用が強力な細胞接着はなく、ラミニンレセプターのラミニンや細胞性プリオンタ

1)を仲介していることが知られている 。例えば、癌細胞が転ンパク質への結合部位を基にしたペプチドが、非常に優れた移する場合、ラミニンレセプターを通して基底膜へ接着する抗菌機能を有することが明らかとなった。ラミニンレセプタ1,2)。また、ラミニンレセーを有する細菌に対し、他生物由来のラミニンレセプターをプターは、細胞膜の糖タンパク質である細胞性プリオンタン基にしたペプチドに抗菌機能が確認されたのである。現在、パク質のレセプターとしても機能する3)。細胞性プリオンタ

創薬研究において、タンパク質のリガンドとレセプターの関ンパク質のエンドサイトーシス過程において、クラスリン被係を利用して様々な分子標的薬剤の探索が行われているが、覆ピットにより細胞質の内部へ移行する際、ラミニンレセプ

それに対して、本研究のレセプターに対しレセプターの相互ターが細胞膜表面に固着された細胞性プリオンタンパク質と作用を想定して用いた抗菌ペプチド11)は、従来にない新しいクラスリンとの連結を取り持っているのである。エンドサイ薬剤の設計方法としての可能性を示唆するものである。

ことで様々な臓器へ浸潤していく

トーシス経路内におけるエンドソームやリソソーム、エンド２リソソーム等の過程中に発生する細胞性プリオンタンパク質

実験の病原性異性化(異常プリオンタンパク質)においてもラミニンレセプターが関与していると考えられている4)。

２.１ ペプチド合成

ラミニンレセプターファミリーは酵母から脊椎動物まで真ペプチド合成は、9-fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc)固相合

核生物において非常によく保存されたタンパク質ファミリー成法を用いて行った。Rink amide resin上にアミノ酸を伸長しである5)。多くの細菌は、自身の細胞膜表面に真核生物のラた後、Trifluoroacetic acid(TFA)カクテル(80％ TFA、12％ミニンレセプターに類似したラミニンレセプターを有す

thioanisole、６％ 1, 2-ethandithiol、および２％ m-clesol)にる5-8）。そして、それらの細菌は、感染の初期段階に、ラミよる側鎖の脱保護処理を３時間行った。その後、冷ジエチル

ニンとラミニンレセプターによる細胞接着相互作用をうまくエーテルによりペプチドを沈殿させ、遠心(2000rpm、５分)利用して宿主細胞へ感染するのである6-10)に よ り 回 収 し た 。 High performance liquid chromatography。本研究では、細(HPLC)を用いてODSカラムにより純度>95％に精製した。

胞同士の接着に重要な役割を担っているタンパク質の相互作用に着目し、ラミニンとラミニンレセプターが互いに作用しあう各々の結合部位のアミノ酸配列を基に抗菌ペプチドを設計した。また、同様に、プリオンとラミニンレセプターが互東亞合成グループ研究年報

2TREND 2009第12号

２.２ 抗菌活性評価
２.２.１ バクテリア

チド(LR)、およびプリオンペプチド(Pr)と呼ぶ。ラミニン

グラム陽性菌は、Staphylococcus aureus NBRC 12732およペプチドはブタオザル(Macca nemestrina)由来の配列であり、びmethicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) COLを哺乳類においてよく保存されたアミノ酸配列領域である12)。

用いた。グラム陰性菌は、Escherichia coli NBRC 3972および(Table 1)ラミニンレセプターペプチドは、ヒトの67-kDaラPseudomonas aeruginosa ATCC 10145を用いた。

ミニンレセプター由来の配列を基に酵母などを含む６種類のそれぞれラミニンペプチド(Ln）、ラミニンレセプターペプ

真核生物の配列のラミニン結合部位を用いた。67-kDaラミ

２.２.２ バクテリア懸濁液の調製

ニンレセプターのラミニン結合部位は161～180番目のアミノ各菌株は、Luria-Bertani (LB) broth[1.0％(w/v)tryptone、酸領域であることが報告されている5)。この領域上の６アミ0.5％(w/v)yeast extract、および0.5％(w/v)NaCl、pH7.0]をノ酸残基「LMWWML」は、特に他の生物との相同性が高く、用いて37℃下で18時間前培養を行った。その後、Mueller-

酵母から脊椎動物まで種を越えて非常によく保存された結合

Hinton broth(MHB、Difco)を用いてバクテリア細胞数が約ドメインである5)。このドメインは、細胞性プリオンタンパ

2.0×106 cells/mLとなるよう希釈した。調製したバクテリア

ク質の結合部位としても報告されている。(Table 1)プリオ懸濁液は氷中で保存し、１時間以内に使用した。

ンペプチドは、細胞性プリオンタンパク質の144～179番目のアミノ酸領域に由来しており、この領域はラミニンレセプタ

２.２.３ 最小発育阻止濃度(Minimum inhibitoryconcentration, MIC)測定

ーの161～179番目のアミノ酸配列と相互作用があることが確

液体培地希釈法によりMIC測定評価を行った。96穴プレー

プチドは疎水性が著しく高く抗菌評価を行うのが困難である

ト上にMHB培地を用いてペプチドの２倍希釈系列を作製し、ため、親水性を高めることを目的に核内移行性シグナル

6

そこにバクテリア懸濁液を10 cell/mLとなるよう混合した（Nuclear localization signal, NLS）をペプチドN末端あるいは(全量300μL)そして、37℃下で24時間培養した後、目視にC末端に連結した。NLSは、Arg残基やLys残基を多く含有すよりMIC値の判定を行った。

る親水性の高い配列であり、既に我々が報告した核移行性シ

認されている3)。（Table 3）これらの結合部位を基にしたペグナルを基にした抗菌ペプチド設計方法13)において用いてい３

結果および考察る。本研究では、NLS1 (p54): RIRKKLR, NLS2 (SV40 Large T
antigen): PKKKRKV, およびNLS3 (Pax-QNR): LKRKLQRの３
種類のNLS14)を用いた。

ラミニンのラミニンレセプターへの結合部位、ラミニンレセプターのラミニンへの結合部位、および細胞性プリオンタ

ラミニンペプチドとラミニンレセプターペプチドを基にしンパク質のラミニンレセプターへの結合部位を、本論文では、た 抗 菌 ペ プ チ ド の S . a u r e u s 、 M R S A 、 E . c o li 、 お よ び

Table 1.

Sequences of Laminin Peptides and Laminin Receptor Peptides.

Peptidea

Sequence

Organism of origin

Laminin peptide (Laminin receptor-binding site on laminin)
Ln1

YIGSR

Macaca nemesterina

Ln2

RGD

Macaca nemesterina

Laminin receptor peptide (Laminin-binding site on laminin receptor)
LR1

LMWWML

Homo sapiens

LR2

LIWYLL

Saccharomyces cerevisiae (mt)bLR3

FFYMVI

Acanthamoeba castellanii (mt)

LR4VVYWLL

Haloarcula marismortui

LR5

CLFWLL

Arabidopsis thaliana

LR6LMWWLL

Drosophila melanogastera Ln1 and Ln2: the laminin peptides (Laminin receptor-binding site on laminin) 12), LR1: the laminin receptor peptide(Laminin-binding site on 67-kDa laminin receptor). LR2-6: homology region of LR1 in various eukaryotes 5).
b mt, mitochondrial protein.

東亞合成グループ研究年報

3

TREND 2009第12号

Table 2.

MICs for the laminin and laminin receptor peptides linked to NLS.
MIC (μg/mL)
Sequence

Compositiona

S. aureus

S. aureus

E. coliP. aeruginosa

NBRC12732

COL (MRSA)bNBRC3972

ATCC10145

RIRKKLR

NLS1>100>100>100>100

PKKKRKV

NLS2>100>100>100>100

LKRKLQR

NLS3>100>100>100>100RIRKKLR YIGSRNLS1 + Ln1>100>100>100>100RIRKKLR RGD

NLS1 + Ln2>100>100>100>100RIRKKLR LMWWML

NLS1 + LR112.5

12.5

256.3

PKKKRKV LMWWML

NLS2 + LR112.55012.56.3

LKRKLQR LMWWML

NLS3 + LR13.16.3

6.3

6.3

LKRKLQR LIWYLL

NLS3 + LR26.312.512.525

LKRKLQR FFYMVINLS3 + LR33.12512.550

LKRKLQR VVYWLL

NLS3 + LR43.16.3

10.76.3

LKRKLQR CLFWLL

NLS3 + LR56.3505050

LKRKLQR LMWWLL

NLS3 + LR63.1

6.3

22.350LMWWML RIRKKLR

LR1 + NLS1

3.1

12.5

6.3

6.3

a NLS1, NLS2, and NLS3 are derived from p54, SV40 Large T antigen, and Pax-QNR respectively 14).
b MRSA, methicillin-resistant S. aureus.

Table 3.

MICs for the prion peptide linked to NLS.
MIC (μg/mL)
CompositionaSequence

PKKKRKVDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDC

S. aureus

E. coli

NBRC12732

NBRC3972>280>280

NLS2 + Pr

a Pr; the prion peptide (LR-binding site of cellular prion protein144-179) 3). NLS2 (SV40 Large T antigen): PKKKRKV 14).

P. aeruginosa に対するMIC評価結果をTable 2に示す。評価/mL と 非 常 に 高 い 抗 菌 活 性 を 示 し た 。 ま た 、 LR1+NLS1 はしたペプチドは、次の４タイプに分類される。ⅰ）NLSペプ

NLS1+LR1と同等の抗菌活性を示したことから、NLSの連結はチド(NLS）、ⅱ）NLSをN末端に連結したラミニンペプチド

N末端側、C末端側のどちらに対しても有効であることが確(NLS+Ln）、ⅲ）NLSをN末端に連結したラミニンレセプター認された。また、NLS2+LR1 およびNLS3+LR1 がNLS1+LR1 と同ペプチド(NLS+LR）、ⅳ）NLSをC末端に連結したラミニンレ等の抗菌活性を示したことから、異なるNLSの連結も有効でセプターペプチド(LR+NLS)である。NLSは、評価した３種あることが確認された。更に、ヒト67-kDaラミニンレセプ

類すべてそれ単体では100μg/mLでもすべての菌株に対してターのラミニン結合部位「LMWWML」相同領域を基にした抗菌活性を示さなかった。また、同様に、NLSを連結したラ様々な真核生物由来のラミニンレセプターペプチド５種類にミニンペプチドNLS1+Ln1とNLS1+Ln2の両方もMIC値は>100μgついても評価を行った。その結果、NLS3+LR2 、NLS3+LR3 、/mLと抗菌活性を示さなかった。一方、ヒト由来ラミニンレ

NLS3+LR4 、NLS3+LR5 、NLS3+LR6 すべてヒト由来ラミニンレ

セプターペプチドLMWWMLのN末端側にNLSを連結したセプターペプチドの場合と同様すべての菌株に対して高い抗NLS1+LR1は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、あるいは耐性菌菌活性(MIC値は3.1～50μg/mL)を示した。これより、ラミに関わらず評価したすべての菌株に対してMIC値6.3～25μg

ニンレセプターペプチドには、生物種に関わらず共通して非東亞合成グループ研究年報

4TREND 2009第12号

常に優れた抗菌機能が内在していることが見出された。通常

３) Hundt, C., Peyrin, J.-M., Haïk, S., Gauczynski, S., Leucht,

ならば、タンパク質のリガンドとレセプターの関係が「鍵とC., Rieger, R., Riley, M. L., Deslys, J.-P., Dormont, D.,

鍵穴の関係」に例えられる様に、ラミニンペプチドが細菌のLasmézas, C. I. and Weiss, S., EMBO J., 20, 5876-5886

ラミニンレセプターに相互作用し抗菌活性を示すことが期待(2001).

される。しかし、驚くべきことに、細菌のラミニンレセプタ

４) Gauczynski, S.; Hundt, C.; Leucht, C.; Weiss, S.

ーに対し、ラミニンペプチドではなく、ラミニンレセプター“Advances in protein chemistry, vol. 57, Prion Proteins”

ペプチドが抗菌ペプチドとして有効であることが見出された(Caughey, B., E. M. Richards, and D. S. Eisenberg, Ed).のである。これは、リガンドとレセプタ－の関係にコペルニ

pp.229-272. Academic Press, San Diego (2001).

クス的転回を迫るものであり、たとえレセプターとレセプタ

５) Ardini, E., Pesole, G., Tagliabue, E., Magnifico, A.,ーの関係であっても、その部位の動的な立体構造の変化によCastronovo, V., Sobel, M. E., Colnaghi, M. I. and Ménard,り相互作用を行う可能性を示唆するものであると考える。ラ

S., Mol. Biol. Evol., 15, 1017-1025 (1998).

ミニンレセプター由来ペプチドの抗菌活性はこの相互作用に

６) Carneiro, W. R. C., Postol, E., Nomizo, R., Reis, L. F. L.
and Brentani, R. R., Microbes Infect., 6, 604-608 (2004).

起因するのかもしれない。
ラミニンレセプターは細胞性プリオンタンパク質のレセプ

７) Świtalski, M. L., Speziale, P., Höök, M., Wadström, T. and3)

Timpl, R., J. Biol. Chem., 259, 3734-3738 (1984).

ターとしても機能することが知られている 。ラミニンレセ
プターの細胞性プリオンタンパク質への結合部位は、ラミニ

８) Wahid, M. R., Yoshinaga, M., Nishi, M., Maeno, N.,ンへの結合部位と同じ「LMWWML」ドメインである 4) 。そSarantuya, J., Ohkawa, T., Jalil, A. M., Kobayashi, K. andこで、細胞性プリオンタンパク質のラミニンレセプターへのMiyata, K., Pediatrics International, 47, 196-202 (2005).

結合部位を基にしたアミノ酸配列であるプリオンペプチドへ

９) Bandyopadhyay, K., Karmakar, S., Ghosh, A. and Das, P.
K., Eur. J. Biochem., 269, 1622-1629 (2002).

もそのN末端へNLSを連結し、抗菌活性評価を行った。その結果、ラミニンペプチドの場合と同様、抗菌活性を示さなか

10) Ghosh, A., Bandyopadhyay, K., Kole, L. and Das, P. K.,

った(MIC値は>280μg/mL）。（Table 3）

Biochem. J., 337, 551-558 (1999).
11) Kobayashi, N. and Yoshida, T, Protein Pept. L., 14, 33-36

以上の結果をまとめると、評価したペプチド５種類(NLS、NLS+Ln、NLS+LR、LR+NLS、NLS＋Pr)のうち、ラミニンレ(2007).

セプターペプチドに関するもの(NLS+LR、LR+NLS)のみが抗12) Chambers, J. B., Klein, N. W., Conrad, S. H., Ruppenthal,

菌機能を有することが示された。その機能はグラム陽性菌おG. C., Sackett, G. P., Weeks, B. S. and Kleinman, H. K.,

よびグラム陰性菌両方に対して有効であり、更には薬剤感受Proc. Natl. Acad. Sci., 92, 6818-6822 (1995).
13) Kobayashi, N., Yamada, Y. and Yoshida, T., Antimicrob.

性黄色ブドウ球菌と薬剤耐性黄色ブドウ球菌に対しても差異

Agent Chemother. 50, 1118-1119 (2006).

がないことから、従来の耐性化機構とは異なる抗菌作用点を持っていると考えられる。従来、創薬研究において、タンパ

14) Rost, B., Nair, R. and Cokol, M. PredictNLS server.

ク質のリガンドとレセプターの相互作用を基本とした分子標(prediction and analysis of nuclear localization signals)的薬剤を探索する方法が中心的に行われてきている。類似すColumbia University Bioinformatics Center, New York.

るレセプター同士の相互作用を想定した本研究の抗菌ペプチ[Online.]http://cubic.bioc.columbia.edu/predictNLS/,(2000).

ド設計方法は、新たなペプチド系抗生物質の開発に繫がる可能性があると考えられる。

謝辞

本研究で用いた菌株は、徳島大学高麗研究室より提供いた
だきました。

引用文献
１) Mecham P. R., FASEB J., 5, 2538-2546 (1991).
２) Castronovo, V., Taraboletti, G. and Sobel, M. E., J. Biol.

Chem., 266, 20440-20446 (1991).

東亞合成グループ研究年報

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