乳酸菌と硝酸還元菌の添加による生もと系酒母製造の安定化
Control of Moto (Sake Starter) Prepared by Traditional Method
by Addition of Lactic Acid Bacteria and Nitrate Reducing Bactertia

西尾昭・茂一孝

Akira Nishio and Kazutaka Shigeru

生もと系酒母製造の安定化のため、乳酸菌等を分離し、それらを培養・添加する方法について検討した。
微生物として、仕込水から硝酸還元菌を、酒母から乳酸菌を分離し、それぞれ Pseudomonas sp.、Lactobacillus
sakei と推定した。これらを添加して山廃もと小仕込試験を行ったところ、成分的および微生物的にも順調な経過をたどり、この方法により生もと系酒母が安定して製造できることが示唆された。

1.

酵 母 の 検 出 に は YPD 培 地 （ 1%Yeast extract,

はじめに

現在の酒母造りはあらかじめ乳酸を添加する「速2%Peptone, 2%Glucose，100 unit/ml Penicillin, 10 γ

醸系酒母」が主流であるが、近年、個性的な純米酒/ml Streptomycin, 5%EtOH, 1.5%Agar）を使用した。

造りを目指して昔ながらの「生もと系酒母」取り組

2.2

硝酸還元菌の分離みへの要望がある。生もと系酒母とは、天然の２種硝酸還元菌の分離源として仕込水と麹を用いた。

類の微生物（乳酸菌と硝酸還元菌）を活用して雑菌麹汁（ﾎﾞｰﾒ 3, pH 6, 0.1%KNO3）10 ml に仕込水 1を淘汰し酵母を純粋に育成する方法であるが、従来ml または麹 10 〜 20 粒加え、7 ℃で 1 週間培養後、は微生物が自然に混入してくることに頼っていたた亜硝酸反応試薬（1%α-Naphthylamine, 10%Sulfanilic

め安定性に乏しく、新たに取り組むには敷居が高かacid, 89%Tartaric acid）を 0.05 g/10 ml 添加し、70った。

〜 80 ℃で２分間反応させ濃赤色を呈した培養液をそこで、自然界から乳酸菌と硝酸還元菌をスクリ希釈して PN プレートに塗布し、15 ℃で培養してーニングし、それらを培養して添加することにより、出現したコロニーから硝酸還元菌を単離した。（１安定した「生もと系酒母」の製造が可能かどうか検次選抜）
次に、それらを PN 液体培地で培養し、10 μ l を討を加えたので報告する。

PNG25 培地（0.1%Peptone, 0.1%KNO3, 25%Glucose,2.

実験方法

pH5.5）に添加して 15 ℃で培養し、増殖が見られな2.1使用培地かったものを選抜した。（２次選抜）
それらを使用して総米 100 g の小仕込試験（仕込乳酸菌の培養には MRSbroth 培地（Difco）、検出には MRSagar 培地（Difco）（0.5%CaCO3 添加）を配合：α米 70 g、乾燥麹 30使用した。

（KNO3100 ppm 含む））を行い、対照の Pseudomonas

g、蒸留水 130ml

硝酸還元菌の培養には PN 培地（0.1%Peptone,（黄桜酒造（株）若井氏より譲渡）と同程度の亜硝0.1%KNO3）を用い、検出には標準寒天培地（ニッ酸反応が観察されたものを選抜し（３次選抜）、同ス イ ） に 亜 硝 酸 発 色 培 地 （ 0.05%KNO3,定試験に供した。

0.01%α菌株の同定は、ID32GN アピ（日本ビオメリュー）-Naphthylamine, 0.1%Sulfanilic acid, 0.89%Tartaricを使用して行った。

acid, 1.5%Agar）を重層することにより行った。

55

2.3

乳酸菌の分離酵母は、協会７号を使用した。

乳酸菌の分離源として麹と生もと系酒母を用い成分分析は、遠心分離（8,000た。

rpm, 20 分）後の上清を試料とし、ボーメは重ボーメ度浮ひょう、Brix

細菌酸度測定用培地（日本醸造協会、以下 YAS

は Brix 計（ATC-1E，アタゴ）を使用し、酸度、ア培地）10 ml に麹 10 〜 20 粒または滅菌水で希釈しミノ酸度およびアルコールは国税庁所定分析法注解

た酒母を添加し 28 ℃で一週間培養した後、酸度が２）2に従って分析した。

ml 以上のものを生酸菌が存在しているとして選抜した。（１次選抜）
そ れ ら を MRS 培 地 （ MRSagar,10 ppm

3.

結果と考察

3.1

硝酸還元菌の分離

Cycloheximide，10 ppm Sodium Azide，0.5%CaCO3）

１次選抜において、仕込水 9 点から 7 点、麹 38で混釈培養し、30 ℃で 2 日後にハローを形成した点から 3 点に亜硝酸反応が見られ、PN プレートにものを選抜した。（２次選抜）

出現したコロニーからそれぞれ 25 株と 11 株の計

再度 YAS 培地で生酸性を確認した後、顕微鏡観36 株の硝酸還元菌を単離した。

察、火落菌検出培地（SI 培地）を用いた培養試験

それらを PNG25 培地で培養したところ、33 株でを行った。その後、アルコール感受性試験に供した。

生育が観察されなかった。硝酸還元菌のうち、高濃即ち、エタノール 10%を含む麹汁培地（pH5）に度 の 糖 分 （ 直 糖 16%以 上 ） で も 良 く 生 育 す る

供試菌の MRS 培養液を 10 μ l 添加し、０、２、４Enterobacter は、亜硝酸をさらに還元して消失させ日目に MRS プレート（0.5%CaCO3）に混釈培養し、早湧きの危険性があるため望ましくない菌とされ、菌数の変化を観察した。一連の試験により、桿菌で高濃度の糖分では生育が阻害される Pseudomonas

火落菌ではないアルコール感受性の菌株を選抜しが望ましい菌とされている３）。従って、この生育がた。（３次選抜）阻害された 33 株を望ましい菌である Pseudomonas

菌株の同定は、16 ＳｒＲＮＡの配列解析によりとして選抜した。（２次選抜）

行 っ た 。 乳 酸 菌 か ら の ゲ ノ ム ＤＮ Ａの 抽 出 は 、最後に、総米 100 g の小仕込試験を行い、7 ℃でISOPLANT Ⅱ（ニッポンジーン）を使用して行っ１週間後（Brix23%, ﾎﾞｰﾒ 12.7）、12 日後（Brix25%,１）

ﾎﾞｰﾒ 13.8）の亜硝酸反応が対照株（黄桜）と同程に従い、サーマルサイクラー（GeneAmp PCR System

度のものを選抜したが、得られたのは１株のみであ2400, Applied Biosystems 社製）を用いて増幅させたった。（３次選抜）た。16 ＳｒＲＮＡ領域のＤＮＡは、篠田らの方法

後、ＤＮＡシーケンサ（CEQ 2000XL, Beckman coulter

同定試験の結果、選抜した株は対照株と同じ資化社製）によりその配列を決定した。得られた遺伝子性を示し、そのパターンより Pseudomonas

配列は、ＤＤＢＪのデータベースを活用して解析し定された。

た。

3.22.4

山廃もと小仕込み試験

sp.と推乳酸菌の分離

YAS 培地で培養を行った結果、酸度 2 ml 以上を分 離 し た 硝 酸 還 元 菌 及 び 乳 酸菌 を用 い 、 総 米示したのは、麹 38 点から 7 点、県内酒造メーカー1,000 g（α米 650 g, 乾燥麹 350 g, 汲水 1,250 mlの生もと系酒母 2 点で、それらには生産菌が生息す(100ppmKNO3 含有)）の小仕込み試験を行った。硝るとして選抜した。（１次選抜）

酸還元菌は 10 /ml、乳酸菌は 10 /ml となるようにそ
54

次に、それらを MRS 混釈培養したところ、麹 5れぞれ仕込時に添加した。

点、酒母 2 点にハローの形成が観察され、それぞれ対照として速醸もとの小仕込み試験を行った。
56

表１乳酸菌および硝酸還元菌を添加した山廃もとの経過

日順

品温(℃)
操作
1 水麹・仕込
7234567891011 酵母添加
12131415 酵母添加
16171819分け
2077778910111114141515151515151515

ボーメ

Ｂｒｉｘ(%)

20.8

0.2+

12.2

22.0

0.3

+++

12.6

23.4

1.7

1.7

+++

13.8

25.4

3.2

3.1

+++

14.3

26.6

4.3

3.9

++

14.7

5.4

4.4

++

15.0

6.1

4.8

+

0.6

13.6

7.6

4.2

±

2.6

9.3
6.9

9.1
9.3

2.9
2.7-7.910.5a) 亜硝酸： +++ 濃赤色

++ 赤色

表２日順

品温(℃)
操作
水麹・仕込
114234567891011分け812121313141415158

酸度(ml) ｱﾐﾉ酸度(ml) 亜硝酸a) ｱﾙｺｰﾙ(%)

ボーメ＋ ピンク色± 淡いピンク色− 無色

速醸もとの経過Ｂｒｉｘ(%)

27.3

酸度(ml) ｱﾐﾉ酸度(ml)

亜硝酸

5.6-

13.76.1-

11.2

6.60.5-9.0

7.10.7-6.4

7.40.9-ｱﾙｺｰﾙ(%)

11.4

中心に行った。

18 株、12 株のコロニーを選抜した。（２次選抜）
選抜した株を再度 YAS 培地で培養したところ、30次に、火落菌検出培地（SI 培地）での培養試験

株中 27 株が酸度 2 ml 以上の生酸性株であった。そに供したところ、全ての株において増殖は見られず、れらを顕微鏡観察したところ、球菌 10 株、桿菌 17火落菌、腐造性乳酸菌ではないと思われたが、アル株であった。

コール感受性試験においては、2 株を除く 25 株は生もと系酒母に関与する乳酸菌のうち、球菌は菌数の減少が見られず、アルコール耐性株と思われLeuconostoc と考えられ、低温で生育しやすく、栄た。従って、アルコール感受性である桿菌 2 株を選養分が少なくても生育できることから、主に初期段抜し、同定試験に供した。（３次選抜）階で出現する菌とされている。しかし、乳酸酸性下

16 ＳｒＲＮＡ配列を用いた同定試験の結果、選で亜硝酸耐性が低いことから、次第に亜硝酸耐性が抜された 2 株は Lactobacillus sakei であると推定さ高く、乳酸生成能の強い桿菌である Lactobacillus にれた。

４）遷移すると言われている 。従って、選抜は桿菌を57

ell/ml000

定どおりの経過となり、この方法により生もと系酒母が安定して製造できることが示された。

000000000

4.

000(1)硝酸還元菌を仕込水から、乳酸菌を酒母から分000おわりに離し、それぞれ Pseudomonas sp.、Lactobacillus
硝酸還元菌

000sakei と推定した。

乳酸菌100(2)それらを添加して小仕込試験を行ったところ、

酵母

10

成分的および微生物的にも順調な経過をたどっ

1
135791113151719日た。

図１ 微生物の変遷(3)以上の結果、乳酸菌および硝酸還元菌を添加することにより、安定した「生もと系酒母」製造が3.3

山廃もと小仕込み試験可能であることが分かった。

山廃もとおよび速醸もとの小仕込試験の温度経過と成分値を表１、２に示す。

謝

α米、乾燥麹という条件のためか蒸米の溶解が良辞
本研究を行うにあたり、貴重な菌株を御譲渡いくなかったが、山廃もとは予定どおりの経過で推移

ただきました黄桜酒造（株）若井芳則氏に深謝いし、速醸もとに比べ酸度、アミノ酸度が高く、特徴たします。

が良く現れていた。亜硝酸反応は 9 日目くらいまで強く見られ、11 日目くらいから弱まっていき、19文日目には消失した。それに伴って酵母のアルコール献

1)篠田吉史他;島津評論,57,p.121-132(2000)

発酵も進み、アルコール分も予定どおり生成した。

2)第四回改正国税庁所定分析法注解(1993)

次に微生物の変遷を図１に示す。

3)原昌道;温故知新,37,p.1-16(2000)

硝酸還元菌の菌数は 5 日目に最大となったが、既

4)芦沢長他;醸協,61(11),p.1033-1036(1966)

報どおり糖度が増加し、酸度が 1 ml を越えた 7 日目には死滅した。その後は乳酸菌が順調に増殖していき、それにつれて酸度も上昇した。今回は野生酵母が観察されなかったが、既報によると、亜硝酸と乳酸の相乗効果により野生酵母が淘汰される。
11 日目に酵母を添加したが、まだ亜硝酸が残存していたため生育が阻害され、15 日目に再度添加したところ、順調に増殖・発酵し、アルコールも順調に生成した。そのアルコールによって乳酸菌が淘汰され、既報どおりアルコール分が 5 ％を越えた 19日目頃に乳酸菌の死滅が確認された。
以上の結果、山廃もとの最終段階では、硝酸還元菌、乳酸菌が淘汰され、酵母のみが純粋に生育することが確認された。成分的にも微生物的にもほぼ予58