2019.6

No.

62

酵素処理米ぬかの血圧降下作用と新規ペプチド Leu-Arg-Ala(LRA)の降下メカニズムの検討
正箱尚久

京都大学大学院 農学研究科 食品生理機能学分野

大日向耕作【米ぬかとペプチド研究の歴史】
米は世界三大穀物の 1 つであり、世界人口の半数が主食として消費している。現代では果皮・胚芽部分である米ぬか（図 1）を取り除いた白米を食することが多いが、胚芽（米ぬか）

平安時代から江戸時代にかけては玄米のほうが主流だったようである 1）。米ぬか研
究の歴史は長く、例えば、1940 年代、鈴木梅太郎が脚気を治療する成分として米ぬ胚乳（白米）かからオリザニンを単離し、Funk C. も同様に抽出した抗脚気成分をビタミンと命名している。1950 年代には金子および土田らによりオリザノールが単離・同定された。

果皮（米ぬか）

このように、1940-50 年代は米ぬかが研究対象として脚光を浴びていたのである 2）-3）。
今日では多彩な機能性を示す生理活性ペプチドが様々な食品タンパク質の酵素消

図 1. 玄米の構造と米ぬか .

化物から発見されている。1979 年、Brantl V. らによって牛乳カゼインの酵素消化物よりオピオイドペプチドが同定され 4）、また同じく 1979 年、岡本源一郎によってアンジオテンシン -I 変換酵素（ACE）阻害ペプチドがゼラチン酵素消化物より同定された 5）。これ以降、食品由来の機能性ペプチド研究が注目され始めた。これまで多くの食品由来の ACE 阻害ペプチドが実用化されているが、牛乳カゼインなど動物性タンパク質の酵素消化によって得られたものが多く、Ile-Pro-Pro, Val-Pro-Pro6）や Met-Lys-Pro7）など、機能性表示食品や特定保健用食品として商品化もされているものもある。一方、米ぬかもタンパク質を豊富に含んでいるものの動物性タンパク質と比べて殆ど活用されておらず、年間に 30 万トンも廃棄されているという報告もある。そこで、我々は米ぬかタンパクをプロテアーゼの一種である thermolysin（グラム陽性菌 Bacillus thermoproteolyticus）で消化し、新規の素材 “酵素処理米ぬか（HBT）” を開発し、その降圧作用を検討するとともに、血圧降下作用に寄与する成分の同定を試みた。
【酵素処理米ぬかの血圧降下作用】240

週 間 継 続 的 に 経 口 投 与 し た 結 果、用 量 依
存的な血圧降下作用を示すことが明らかとに含まれるぺプチドを HPLC（液体クロマ
ト グ ラ フ ィ ー）で 分 画 し、ACE 阻 害 活 性を指標に探索したところ、新規のペプチド

収縮期血圧（mmHg）な っ た（図 2A）。さ ら に 我 々 は、HBT 中

230*

220210収縮期血圧の降下（mmHg）

（B）
（A）

100-10-20**

Control

**

（C）

10*

*
*

-30-40収縮期血圧の降下（mmHg）

高 血 圧 モ デ ル 動 物 SHR/Izm に HBT を 424時間

HBTLRA*0Control*

680-10200-20
Leu-Arg-Ala(LRA) を 同 定 し た。F-moc 法*50mg/kgHBT-30Control-40（ペプチド固相合成法）によって LRA を化学
LRA500mg/kgHBT190-50161713141500.10.25
合成し、これを SHR/Izm に経口投与したと週齢（week）
投与量（mg/kg）
ころ、HBT と同様に投与後 4 時間において、 図 2. 酵素処理米ぬか（HBT）と同定されたペプチドLRAの血圧降下作用.（A）酵素処理米ぬかを最も強い血圧降下作用を示し、その作用は投与 6 時間後まで持続することが判明した（図SHRに4週間投与した結果（B）酵素処理米ぬか（50 mg/kg）およびLRA（1mg/kg）をSHRに単回投与した結果（C）SHRへのLRAの投与量と、投与4時間後収縮期血圧変化量の関係.いずれの血圧も平均値±SEMで示されている. * p<0.05 vs control群.（A）N=8,（B）N=9-10,（C）N=5.（Shobako et al., Mol Nutr Food Res. 2018;(4).doi:10.1002/mnfr.201700732.）2B）。また、LRA の最小有効濃度は 0.25 mg/kg であり、米由来の降圧ペプチドの中では最も強い降圧作用を持つことが明らかとなった（図 2 C）。一方、
LRA の ACE 阻害活性を in vitro 試験で測定し、IC50＝62 µM という値が得られたが、LRA の強力な血圧降下作用を説明するのに十分なものでは無かった。

【新規降圧ペプチド LRA の降圧メカニズムの検討】
そこで、次に我々は LRA の血管弛緩作用に注目した。SHR/Izm の腸管膜動脈を螺旋状に切開した血管標本の弛緩をマグヌス法により評価した。その結果、LRA に血管弛緩作用があることが示され、EC50 濃度は（A）中では最も強い血管弛緩作用である。

（B）

*100

血管弛緩活性（%）

0.1 µM と非常に強い作用であることが判明した（図 3A）。この値は、穀物由来のペプチドの***50NoneL-NAME*

A779

LRA の血管弛緩作用は NO 産生酵素（NOS）
Wortmannin
阻 害 剤 で あ る L-NG-Nitroarginine Methyl Ester
HOE1400（L-NAME）および血管平滑筋中に存在するグ
0.010.1
110050100
LRA（µM）
血管弛緩度（%）
アニル酸シクラーゼの阻害剤である 1H-[1,2,4] （C）（D）+ECNoneオ キ サ ジ ア ゾ ロ [4,3-a] キ ノ キ サ リ ン -1- オ ン（ODQ）によって阻害された（図 3 B, C）。また、 ODQ-EC***
血管内皮を除去した血管標本でも LRA の血管501000050100
血管弛緩度（%）
血管弛緩度（%）
弛緩作用は阻害された（図 3D）。しかし、PI3Kの阻害剤である wortmannin やブラジキン B2 受 図 3. LRAの血管弛緩作用（A）各濃度のLRAが示した血管弛緩活性（N=3-6）.（B）血管内皮に作用する各阻害剤がLRAの血管弛緩活性に与えた影響（N=4-8）（C）
血管平滑筋に作用する阻害剤がLRAの血管弛緩活性に与えた影響（N=4-8）（D）
容体、MAS 受容体の阻害剤である HOE140 や血管内皮を除去した標本（-EC）での検討（N=）いずれも平均値±SEMで示されている. * p<0.05 vs 水添加群（A）, None群（B, C）, +EC群（D）.（Shobako et al.,A779 では LRA の血管弛緩作用は阻害されなJ. Agric. Food Chem., 2019;67:1437 より改編）かった（図 3B）。また、血管内皮のモデル細胞である HUVEC において、LRA は eNOS のリン酸化は （A）eNOSリン酸化（B）Aktリン酸化促進したものの、Akt のリン酸化は促進しなかった（図pAktpeNOS4）。これらのことから、LRA は血管内皮に局在型 NOS total eNOStAkt（eNOS）のリン酸化を介して血管弛緩作用を示している
β-actinβ-actin
ことが明らかとなった。また、その上流はブラジキニン

2*peNOS/eNOSペプチドとは異なる可能性も示された。このように、食品由来の外因性ペ収縮期血圧の変化（mmHg）

プチドの研究を通Control
LRA
LRA＋L-NAME
L-NAME40

じて、未知の情報伝達経路の存在が20明らかになったことはとても興味深010Control

LRA10Control*

最後に、LRA の血圧降下作用における血管弛緩作用の寄与を検討した。LRA の血管弛緩作用は NOS 阻害剤の L-NAME で阻害されること

0142

時間164

図 5. L-NAMEがLRAの血圧降下作用に与えた影響.
血圧は平均値±SEMで示されている.
（N=8-10）. *p<0.05 vs control群（Shobako etal., J. Agric. Food Chem., 2019;67:1437）

から同じ阻害剤を用いて in vivo における評価を実施した。その結果、

LRA の降圧作用は L-NAME によって完全に阻害され（図 5）、LRA のNO を介した血管弛緩作用が血圧降下作用の主要な作用機序であることが明らかとなった。
参考1）下田吉人 玄米食の科学 . 家事と衛生 1943, 19（4）, 2-13.
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文

献angiotensin i-converting enzyme in digests of gelatin by bacterialcollagenase. 1979, 566, 128-137.
6）Nakamura, Y., et al., Antihypertensive effect of sour milk andpeptides isolated from it that are inhibitors to angiotensin I-converting enzyme. Journal of Dairy Science 1995, 78（6）, 1253-1257.
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inhibitory peptide derived from bovine casein. Food Chem. 2013,
141（4）, 3781-3789.

ht t p: //www. dm c r a. c om /事務局

LRA

図 4. HUVEC細胞における（A）eNOSおよび（B）Aktのリン酸化. グラフ
は平均値±SEM で示されている（N=3）. *p<0.05 vs control群.
（Shobako et al., J. Agric. Food Chem., 2019;67:1437）

い。

-20-40pAkt/Aktやアンジオテンシン（- 1-7）など既知の内因性血管弛緩生産管理部