［IV］細胞治療●幹細胞と細胞療法

1．神経幹細胞の同定・分離法の確立と神経再生への挑戦
岡野栄之＊

従来，損傷を受けた成体の中枢神経系は，ニューロン自身に分裂能がないために機能再生は不可能であると考えられていた．哺乳類の脳発生過程において，ニューロン産生は主に胎生期に集中している．しかし，げっ歯類では adult（成体）になっても嗅球と海馬・歯状回ではニューロンが新しく作り続けられていることは以前から知られており，最近，ヒトの成体の中枢神経系においても実際に海馬歯状回においてニューロン新生が起こっていることが明らかになった．このことは，成体の中枢神経系においても，神経幹細胞もしくは，神経前駆細胞が存在し続けていることを示唆している．
神経幹細胞は，増殖し継代を繰り返すことができる（自己複製能）と同時に，ニューロン，アストロサイト，オリゴデンドロサイトという中枢神経系を構成する 3 種類の細胞を作り出すことができる（多分化能）未分化な細胞として定義される．この多分化能と自己複製能をもつ神経幹細胞が，近年，胎生期のみならず成体からも分離培養，増殖することができるようになり，中枢神経系の再生，再構築への治療に繋がる可能性があると注目されるようになってきた．
従来，神経幹細胞の同定は neurosphere 法などの培養技術によって，retrospectiveに行うことのみが可能であった＜即ち，培養開始時には同定できない＞．そこで我々は，神経幹細胞の prpspective な同定を可能にするために，神経幹細胞に選択性の高い発現を誘導する Nestin 遺伝子のエンハンサーの制御下に，Enhanced Green Fluorecent Protein（EGFP）を発現させる Nestin―EGFP 遺伝子を有するトランスジェニックマウスを作製し，同マウス由来の神経組織を用いてセルソーター（FACS）により，神経幹細胞を効率よく分離する方法を確立した．同マウスにおいては，EGFPは胎生期神経管の脳室周囲領域，成体マウスの海馬歯状回の subgranular layer と側脳室周囲の上衣細胞層，脳室下帯などの神経幹細胞が豊富に存在すると考えられてきた領域に特異的に発現していた．FACS により分離した EGFP―強陽性を示す細胞は，高率に neurosphere を形成し，高い自己複製能力と多分化能を示し，神経幹細胞のprospective な同定が可能となった．また，米国 Cornell 大学医学部神経内科の Goldman 教授と共同にて，同 Nestin―EGFP 遺伝子と FACS 法を用い，ヒト胎児脳，成人脳海馬歯状回から神経幹細胞を分離することにも成功した．さらに我々は，同様の手法を用いて，多分化能を持つ神経幹細胞だけではなく，ニューロンだけを作る中間の前駆細胞（神経前駆細胞），すべてのニューロン，特定のニューロンを FACS にて調整する方法を開発しつつある．この方法により，生きた状態での primary（新鮮）な神経幹細胞，中間前駆細胞やその他の特定の細胞を中枢神経系内のさまざまな部位から分離することが可能となり，継代を続けた株化細胞にとって代わり，種々の神経疾患に対応した移植医療のための重要な source を得ることができるものと期待できる．
本講演においては，脊髄損傷動物モデルの神経幹細胞移植による機能回復に関する最新の data を紹介する予定である．さらに我々の研究成果に加え，神経幹細胞を用いた神経再生医療の展望についても論じたいと考える．

Isolation and selection of neural stem cells
HIDEYUKI OKANO Division of Neuroanaotomy（D 12），Department of Neuroscience, Osaka University Graduate School of Medicine
おかの・ひでゆき：大阪大学大学
院医学系研究科神経機能解剖学教授．昭和58年慶應義塾大学医学部卒業．平成６年筑波大学基礎医学系分子神経生物学教授．平成９年
現職．主研 究 領 域／神 経 系 の 発
生・分化と再生．
＊120 第 117 回日本医学会シンポジウム

Key words

神経幹細胞
神経再生
セルソーター培養この海馬におけるニューロン新生が，生後に「好ましい環境」を経験することで高まること

1．神経幹細胞とは？

が 報 告 さ れ て い る4）．ま た ソ ー ク 研 究 所 の神経幹細胞は，増殖し継代を繰り返すこと

Gage 博士らのグループは， 臨床診断目的に，ができる（自己複製能）と同時に，ニューロBrdU（bromodeoxyuridine，増殖中の細胞に取ン，アストロサイト，オリゴデンドロサイト

り込まれる）を投与された癌患者の海馬組織という中枢神経系を構成する 3 種類の細胞を調べて，ヒト成人の海馬でも実際にニューを作り出すことができる（多分化能）未分化

ロン新生が起きていることを示した5）．しかな細胞として定義される．神経幹細胞の選択し，そのニューロン新生の源となる神経前駆的培養法およびアッセイシステムの進歩によ細胞あるいは神経系前駆細胞を生きた状態でり，この研究分野は急速な展開を示しつつあprospective に分離することは上記の理由かり，思わぬ時期と場所に神経幹細胞が見つら困難であった．

かったり，思わぬ性質が明らかにされるなど我々は種々の疾患で手術的に摘出されたヒの衝撃的な報告が最近になって相次いでいト成人の海馬を用い，神経前駆細胞の分離をる．神経幹細胞は増殖因子を加えた浮遊培養

試 み た2）．神 経 前 駆 細 胞 に 発 現 す る Tα 1系である neuroaphere 法により未分化な状態

チューブリン遺伝子のプロモーターの制御下1）を保ちつつ増殖させることはできるが ，こに GFP を発現させるプラスミドを作製し，ここで形成される球形の細胞塊である neuro-のレポーター遺伝子を，海馬組織から調整しsphere 中のどの細胞が神経幹細胞であるのた細胞にリポフェクション法を用いて遺伝子かという prospective な同定は出来なかった．

導入した．GFP を発現する細胞を蛍光強度に

この disadvantage を 克 服 す る た め の い く

より FACS を用いて分取し培養したところ，つかの技術開発が行われている．神経幹細胞分裂して複数のニューロンを作り出した．生

特異的な表面抗原の同定の試みもその一つでじた細胞は βIII チューブリン，MAP―2 といっあるが，我々は，GFP（green fluorescent pro-

た分化したニューロンのマーカーが陽性であtein）
をレポーターとして，FACS（fluorescentり電気生理的にも成熟したニューロンであるactivated cell sorting）を用いた分離法の開発ことが証明された．本法によりヒト成人の中を行った（図 1）．

枢神経系から，神経前駆細胞の prospectiveな同定が初めて可能となった．

2．ヒト成人の脳から神経系前駆細胞を分離する

さらに我々は，より未分化な，神経幹細胞に選択性の高い発現を誘導するネスチン遺伝子のエンハンサーの制御下に GFP を発現さ

我々は，Cornell 大学の Goldman 博士らとせるレポーター遺伝子を作成し，同様の方法の共同研究により，GFP レポーターと FACSを用いて遺伝子導入を行った．FACS によりを用いてヒト成人の海馬および脳室周囲か分離された GFP 陽性細胞は，同じ培養条件下ら，神経前駆細胞あるいは神経系前駆細胞をで分裂し分化したニューロンを作り出した．

生きた状態で分離することに成功した2,3）．

この細胞がニューロンだけでなくグリアも作分裂能をもつ神経系の前駆細胞が哺乳類成体の海馬に存在することは，げっ歯類では以前から報告されてきた．げっ歯類においてはりうる，幅広い分化能力を持つ細胞であるかどうかは現在解析中である．
また脳室周囲領域には成体においても神経幹細胞と細胞療法 121

神経幹細胞特異的GFPレポーター遺伝子を導入した神経組織（トランスジェニック,トランスフェクション,ウイルスベクターなど）

脳組織
分離

GFPを強発現する神経幹細胞（あるいは神経前駆細胞）

FACS
生きている神経幹細胞（あるいは神経前駆細胞）のソーティング
GFP＋細胞GFP−細胞

生物学的アッセイ（Neurosphereの形成,移植など）

図1

GFP レポーター遺伝子と FACS を用いた神経幹細胞の分離（Neurosci News 9）より転載）

幹細胞が存在していることがげっ歯類で証明
4）直結する遺伝子導入効率の問題のみならず，されている ．これらのレポーター遺伝子を導入されたレポーター遺伝子の発現が一過性用いて，ヒト成人の脳室周囲由来の細胞へもであること，さらに GFP の蛍光強度は各々の同様の方法を用い遺伝子導入し，FACS を用細胞へ導入された遺伝子のコピー数に影響さいて神経前駆細胞あるいは神経系前駆細胞もれるため，レポーターとしての GFP の蛍光強

分離された

2,3）

．

度の程度と，各細胞におけるプロモーター エンハンサーの活性が相関しないといった，い3．神経幹細胞としての性質を可視化する

くつかの問題点を抱えている．
そこで我々はここで用いたレポーター遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを作

しかしこのリポフェクションによる遺伝子成し解析を行った．ネスチンエンハンサーの導入法は，FACS により分離される細胞数に制御下に GFP を発現するマウスの中枢神経

122 第 117 回日本医学会シンポジウム

系由来の細胞を，FACS および細胞培養を用る．これらの問題を解決するため，神経幹細いて解析し， GFP の蛍光強度と， 多分化能，胞から効果的にドーパミン作動性ニューロン自己複製能という神経幹細胞としての性質がを誘導させ，移植治療に用いる方法が研究さ相関することを示した6）．このことは神経幹れている7）（図 2）．

細胞としての性質が GFP により可視化されまた，成人脳において，神経幹細胞が少量たことを示しており，今後の神経幹細胞の生ながら存在することから，移植を行わずに内物学的解析に幅広く有用な素材を提供するも在性の神経幹細胞を増幅し，活性化して神経のと考えられる．

再生を起こさせようという考え方もある．事

4．臨床応用に向けて神経幹細胞またはES細胞神経幹細胞が自己複製能力と多分化能を有することから，「脳損傷や神経変性疾患の機能修復を目指した治療へと応用できるのではないか？」という図式がクローズアップされている．成人脳において，損傷時あるいは神経変性疾患に伴い自己修復的な有効な神経再生誘導が起きない（例えば，脊髄損傷時には神経幹細胞は増殖するもののグリア細胞しか作らない）のは，神経幹細胞の数の不足のみならず，ドーパミン作動性ニューロン神経の新生に対して抑制的な脳内の微小環境によると考えられ，神経幹細胞の移植により単に数を補えばよいということにはならない．そこで，神経の新生そのもの，および新生したニューロンの生存と維持のために，神経 栄 養 因 子 の 遺 伝 子 な ど を ex vivo 法 に より，神経幹細胞へと導入すること，神経幹細胞の調整法あるいは， in vitro の操作へ工夫を加えることにより，特定の細胞（ニューロン）を作るように誘導してから移植するなどのストラテジーが必要になってくるであろう．
例えば，ドーパミン作動性ニューロンの変性，脱落に起因するパーキンソン病に対して，現在欧米ではドーパミンを補充する目的で胎パーキンソンモデルラットへの移植

児の中脳の細胞を用いた移植治療が行われ，一定の効果をあげている．しかし胎児中脳を用いた移植治療は倫理的問題のみならず，ドナーの絶対数の不足という問題を抱えてい

図2

神経幹細胞（または ES 細胞）からのドーパミン作動性ニューロンの誘導とパーキンソン病モデル動物の実験的治療

幹細胞と細胞療法 123

実，EGF を adult の マ ウ ス の 脳 室 内 へ infu-るというのは，分裂のtime courseとか，EGFPsion することにより，脳室上衣下のネスチンの半減期とかから考えますと，非常に不思議

8）陽性細胞の増殖が増加する という報告もある．
しかしながら，この infusion 法は非生理的だという印象を持ったのですが．
岡野

これは 24 時間たってから見ていまな濃度の成長因子の暴露により脳腫瘍を引きして，その間ずっと経過観察をしているわけ

起こす可能性と，神経幹細胞 神経系前駆細胞

ではありません．われわれは，あの時はまだが増えても効果的にニューロンを作るかどう

15 分おきにとれる time lapse を持って い まかという問題が残されている．

せんでしたので，翌日シャーレから取り出して，シャーレの底に傷をつけて，見て探していたのです．そして非対称分裂をしているこ〔文献〕
1）Reynolds BA, Weiss S : Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian
central nervous system. Science 1992 ; 255 : 1707―1710.
2）Roy NS, Wang S, Jiang L, et al. : In vitro neurogenesis
by neural progenitor cells isolated from the adult human hippocampus. Nat Med 2000 ; 6 : 271―278.
3） Roy NS , Benraiss A , Wang S , et al . : Promotertargeted selection and isolation of neural progenitor
cells from the adult human ventricular zone. J Neurosci Res 2000 ; 59 : 321―331.
4）Kempermann G, Gage FH : New nerve cells for theadult brain. Sci Am 1999 ; 280 : 48―53.
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6）Kawaguchi A, et al. : Mol Cell Neurosci（in press）
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midbrain dopaminergic phenotype in Nurr 1―overexpressing neural stem cells by type 1 astrocytes. Nat
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8）Craig CG, Tropepe V, Morshead CM, et al. : In vivo
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9）Okano H, Goldman SA : Identification and selection ofneural progenitor cells. Neurosci News 2000（in press）とを見 て い る わ け で，要 す る に cytokinesisをしている時に，EGFP が片方だけ運ばれるというようなことは私は決していっておりません．翌日になると，神経幹細胞の方で転写が盛んで，neuron の方では落ちてくるわけですが，相対的にこのように非常に弱くなります．それで，neuron の方ではどのような分解系があるかわかりません．一応それで説明できます．それから，現在は EGFP のもっと degradetion の早い，半減期の短いものを使っていますので，よりシャープになると思います．
仲野

もう一つは脊髄損傷の時に，中枢側と末梢側は，おおまかにつながれば機能的に何とかなるようなものですか．
岡野

結局こう長いものの，ほんの少しが曲がらなくても動かなくなるということは十分あり得ると思います．これは若干 polysynaptic interneuron によって中継されても，かなり機能的に回復し得るものと思われます．
下行性の錐体路に関しては，明らかに脊髄，赤核脊髄路，網様体脊髄路のような polysynaptic なものに関して，compensation がかかるということはかなりよく知られた話です．

質疑応

答

座長

非対称の分裂だけですと，stem cellが neurosphere を作る細胞は増えないわけで座長（溝口） 何かご質問がありますでしょ

岡野うか．
仲野

すか．対称性ももちろんあるわけですね．

徹（大阪大）

もちろんそうです．neurosphere を非対称分裂の時に，作る時は，メインに Nestin-EGFP，これは共用

EGFP であれだけきれいに非対称性が見られ性 細 胞 か ら 1,000 個 の 細 胞 が Nestin 共 用 性

124 第 117 回日本医学会シンポジウム

ですが，これは対称的に分裂しているわけでので，数を稼ぐのがなかなか大変ですが，やっす．これは細胞と細胞がくっついて，互いにています．
それで確かに回復傾向はあります．

分化の抑制をし合うような，要するにに関しこれは脊髄損傷と，さらに中脳の腹側部からて分化を抑制し合うような状態で大きくなる

とった Nestin-EGFP 陽性細胞を用い，パーキのですが，あれは single cell でやりますので，ンソン病モデルへの導入実験をやっています

未分化状態を保たないようにわざわざやってが，これは数を数えるのがなかなか大変で，いるわけです．回りからの細胞があって未分今のところまだ出ていませんが，間もなく出化状態を保てるわけですが，あれは 1 個の細せると思っています．

胞しかありませんから，どんどん分化させよも う 一 方 は，こ れ は Nestin-EGFP sorting

うという培養系でありまして，そうしますと，したものではなくて，単に neurosphere を入おそらく細胞自身が持っている polarity にしれているわけで，in vitro で expand できる細たがって，何らかの物質的分配があれば証明

胞によって rescue 可能ということで，ドナーできるというようなことですが，それがあっと対象などの意義もありますので，こういったとすれば，片方が neuron になって，片方がた実験をしています．

stem cell になります．

高久史麿（日本医学会副会長） 最初の炎症

また，neurotransmitter の染色は，今検討しの時のサイトカインの産生や機能を抑えれているところです．
ただあれは，シナプトファ

ば，その場で自己の幹細胞が回復するというイシン陽性ですので，electorical シナプスで可能性はあるわけですね．

はなく，化学的シナプスと思われます．さら岡野

それは非常に重要な点だと思いまに免疫電顕をやりますと，明らかに synapticす．ですから，キャスペース inhibitor，あるいvesicle が見られますので，形態だけではわかは IL-6 に 対 す る humanized antibody と い っらないのですが，おそらくはあれは化学シナたものが，therapeutic な可能性があるかもし

プスを作っていると，少なくとも形態学的にれません．しかしこういうことは 24 時間とはそう判断しています．

いう非常に short period で起こるわけで，そ松崎有未（Harvard Medical School） 先生はの間にそのような regent が，一般病院ですべ

いつも Nestin 陽性細胞を sorting して，neu-てやれるかどうかということは，理論的にはrosphere を作らせてから移植しておられま

可能かもしれませんが，なかなかむずかしいすが，neurosphere を作らせる段階は必要なところがあると思います．
practical には，修復のでしょうか．それとも Nestin 陽性細胞を機能になってからの移植の方は，かなり fea-sorting して移植しても，生着するのでしょう

sible ではないかと考えています．確かにそのか．

可能性は検討しなければいけない問題だと

岡野

それはやっているのですが，Nestin-EGFP だけの移植では，fresh に sorting して思っています．
座長

どうもありがとうございました．

きたものでなければ実験の意味がありません

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