In situ hybridyzation to polytene chromosomes of Drosophilafrom E. Wimmer, 杉山改変

950404

これはできる限り簡略化したプロトコールですが、きれいな標本ができます。飼育の部分が最も重要で、大きな染色体をもつ大きな幼虫を育てることが肝心です。

Culture (すべて１８℃で飼育。)↓ Dry yeastを振った牛乳びんで１日採卵↓ ２ー３日して幼虫が肉眼で見えるようになったら、小薬匙で1掻き（５０ー１００匹）すくって新しい牛乳瓶に移す。その牛乳瓶にはあらかじめ中薬匙の小さい匙一杯のglucoseを入れてエサをこねておき、その上に中薬匙の大きい匙一杯のdry yeastを振る。
↓ ２ー３日したらdry yeastを少し振り、エサをまぜかえす。
↓ 幼虫が瓶の壁を登り始めた日にその瓶を使う。瓶のなかの湿度が高い場合は壁に登った幼虫でも使えるが、乾燥している場合はエサの上を這っている幼虫を使う。

Squashes↓ 大きく、太っていて、動きがまだいい幼虫を選び、PBSでエサなどを洗いおとす。
気管がすでに反転したものは不可。
↓ ペーパータオルでPBSを吸い取り、シリコン処理したスライドグラス上の数滴分の４０％酢酸中で解剖する。鈍った５型ピンセットで胴体をおさえ、研いだ５型ピンセッ
ト（チタン製がいい）で黒色の頭部内骨格を押さえるようにして引っ張る。
↓ 唾腺は大きく、葡萄のふさのように細胞の輪郭が丸く膨らんだものがいい。唾腺がつるつるのものや細胞の核が白くはっきり見えるものは遅すぎる。脂肪体をできるだけ除き、唾腺の先端１／３を切りとる。
↓ シリコン処理し、キムワイプで磨いた１８ｘ１８ｍｍのカバーグラス上の１滴の４０％酢酸に唾腺の先端部を移し、１０分固定する。１つのカバーグラスに３対の唾腺。
↓ EtOHで綺麗に磨いたスライドグラスをカバーにのせて唾腺をつぶす。このとき、カバーグラスがスライドの先端近くにくるようにすると後の溶液の量が少なくすむ。
↓ カバーを下にしてペーパータオルに載せ、一度強く押して、余分な固定液を吸い取る。
唾腺の遺伝型をスライドの曇り部分に鉛筆で書く。
↓ カバーを上にして、４枚重ねのペーパータオルの上に置き、カバーの端を指で強く押さえ、づれないようにしながら、鉛筆の裏の消しゴムでカバーを軽くたたく。中心部から渦巻き状に外側へ約１分たたく。
↓ またカバーを下にしてペーパータオルに載せ、強く押して、余分な固定液を吸い取る。
↓ 対物ｘ１０の位相差で観察する。もし細胞の形が残っているようだったらたたき足りない。もし溶液が流れていたら、たたきと押しが足りないか、気管等のつぶれない構造やゴミが挟まれているからである。もし染色体が広がっていなかったら、スライドの縁でテーブルに強くたたくことにより、カバーをわずかにづらす。または鉛筆の先端でカバー上を数回スキャンするようになぞる。
↓ 液体窒素で急冷凍-1-

↓ 剃刀でカバーをすばやくはがし、凍っているあいだにエタノール酢酸（３：１）に１０分入れる。
↓ エタノールに１０分いれる。
↓ 空気中で乾燥させる。この状態で数カ月以上保存できる。この段階で顕微鏡で観察し、良い標本を選択する。対物ｘ１０で点線状のバンドまでみえるはず。

Pretreatment（変性処理）
１）↓ ２ｘＳＳＣの入った染色瓶を流水waterbathにつけ、瓶の中に温度計をたてて ６８℃にする。（waterbathを７０℃に設定するとちょうど良い。）↓ 標本をこれに３０分間つけて変性させる。
↓ 冷たい（室温可）２ｘＳＳＣの入った染色瓶に標本を移し、２分間つける。
（以後、乾燥まで１つの染色瓶で液交換）↓ ７０％EtOH ５分間 ｘ２回↓ ９５％EtOH ５分間 ｘ１回↓ 空気中で乾燥させる。
２）↓ 新しく用意した0.07 N NaOH (pH 12.5) に室温で３分間つけてさらに変性させる。（10M NaOH 350ul + 水50 ml)（以後、乾燥まで１つの染色瓶で液交換）↓ ２ｘＳＳＣ ５分間 ｘ３回↓ ７０％EtOH ５分間 ｘ２回↓ ９５％EtOH ５分間 ｘ１回↓ 空気中で乾燥させる。
染色体の欠落がないことを顕微鏡下で確認する。

Hybridization（プローブはあらかじめ用意すること）↓ プローブを１０分間煮沸し、液体窒素で急冷する。
↓ 標本に変性したプローブ３０ul のせ、２２ｘ２２ｍｍのカバーグラスをする。
それを、水を底にひたしたチップラック（yellow tip 用）にいれて、気温５３℃（設定５５℃）のオーブンにいれ、１２ー１６時間ハイブリさせる。
（以下、１つの染色瓶で液交換）↓ ５３℃の２ｘＳＳＣ １５分間
↓ ＰＢＴ ５分間 ｘ３回

ｘ２回

Detection↓ anti-DIG抗体 0.5 ulをＰＢＴ 100ulで希釈し（1/200）標本にのせ、２４ｘ４５ｍｍのカバーグラスをかぶせ、水を底にひたしたチップラック中で１時間反応させる。
（以下、１つの染色瓶で液交換）-2-↓ ＰＢＴ ３分間 ｘ３回↓ AP buffer ３分間 ｘ３回↓ 4.5ul NBT, 3.5 ul X phosphateをAP buffer 200ulで希釈し標本にのせ、２４ｘ４５ｍｍのカバーグラスをかぶせ、水を底にひたしたチップラック中で反応させる。発色を時々顕微鏡下で確認する。１５分から２４時間と様々。標本によって、それぞれ違うので１つ１つ確認すること。光に反応するのでできるだけ暗くしておく。NBTは発ガン性なので手袋を使用すること。
↓ 水 ３分間 ｘ３回↓ 新しく用意したGiemsa で２分間染色 （Giemsa 原液５ｍｌ+ＰＢＳ ４５ｍｌ）↓ 流れるイオン交換水で２分間脱洗↓ 濡れたまま顕微鏡で染色を確認し、必要ならさらにGiemsa で染色。
標本によって、それぞれ違うので１つ１つ確認すること。

↓ 空気中で乾燥↓ 先端を切ったyellow tipでDiatex (Permountなどの)封入材を30ulのせ、２４ｘ４５ｍｍのカバーグラスをかぶせ、重石をする。

Observation
通常の光学系で観察、シグナルが見つからない場合は位相差光学系でみるとわかりやすい。油浸は封入材が充分固まるまで（１日？）使わない。

DIG Probeの作成 (5-6時間かかる)↓ エッペン・チューブに９ul H20 + 200 ng insert DNA。
↓ クリップ・ロックして１０分煮沸。
↓ 液体窒素で急冷、軽くspin down。
↓ 氷上で次のものをたす。
2.0 ul10x LB （以下参照）
6.0ul
10 mg/ml hexamer soln. (Pharmacia #27-2166-01)
2.0ul
labelling mix (DIG+dNTPs) Boehringer Genius kit より
一度 mixする
1.0ul
5 unit/ul Klenow (酵素、すぐ失活する)
またmixする↓ １５℃で１時間 （Waterbath に float）ここでprimer annealing↓ 室温で３時間 （O.N.も可）↓ EtOH 沈殿 （取り込まれなかったDIGラベルを除く、省略可。）
3 ul

1 M NaCl

60 ul

Cold EtOH

0.5 ul20 mg/ml tRNA↓mix well,↓-70℃ 30 分、-3-↓

14,000 rpm 4℃ 20分↓

丁寧に上清を除く
150 ul

70% EtOH↓mix↓

14,000 rpm 4℃ 5分↓

丁寧に上清を除く↓

Speedvac 5分↓ 200 ul hybridization soln.
↓ 使用直前にクリップ・ロックして１０分煮沸して変性させる。忘れるな！
↓ 液体窒素で急冷、軽くspin down、mixして３０ul 使用。

Media10x LB(store -20 ℃)

475 ul1M Pipes pH 6.6

25 ul

1M MgCL2

3.3 ulbeta mercaptoethanol

PBS

pH 6.9 に調整
140 mM NaCL
7mM

Na2HPO43mM

KH2PO4PBT

AP buffer

PBS+0.1% Tween 20

100mM

Tris pH 9.5

100mM

NaCL

50mM

MgCl2
add 0.1% Tween 20 before use

Hybridization soln.

(store -20 ℃)

50%formamide

5xSSC

50ul/ml

heparin

0.1%Tween 20
add100ug/ml denatured fish sperm DNA before use

20x SSC (1000ml)
175.3 g

NaCl

88.2g

Na-citrate 2H20-4-