［III］組織・器官幹細胞：臨床応用への基盤開発（2）●幹細胞と細胞療法

3．ヒト血液キメラブタの樹立とその応用
中内啓光＊，藤木豊＊＊

近年，再生医学への期待が高まるなか，ES 細胞や種々の臓器に存在する幹細胞が注目され，臓器再生の可能性が議論されている．続々と見つかってくる臓器特異的な幹細胞のなかでも，全ての血液系細胞が由来するとされる造血幹細胞は最も古くから研究されてきた幹細胞であり，現実に幹細胞移植という形で臓器再生が実用化されている数少ない幹細胞の 1 つである．我々はマウス骨髄中の造血幹細胞を純化し，わずか一個の造血幹細胞が 1 年以上にわたり全ての血球細胞を供給できることを示し，造血幹細胞の多能性と高い自己複製能を実験的に証明した．ところが， in vitro で「多能性」を保ったまま造血幹細胞を「自己複製」させることは未だに困難であり，臨床応用への期待に答えることはできていない．そこで我々は免疫系が未発達なブタ胎仔に経子宮的にヒト造血幹細胞を移植することにより， in vivo でヒト造血幹細胞を増幅することを試みた．
臍帯血から造血幹細胞を含むと思われる分画を濃縮し，全身麻酔を施した妊娠ブタ（妊娠期間 114 日）に超音波ガイド下で胎仔腹腔内へ穿刺注入した．生後，新生仔の末梢血，骨髄，あるいは造血系組織の細胞を採取し，FACS，PCR 法を用いてヒト細胞の同定を行った．妊娠ブタ 37 匹を実験に供し，胎齢 31〜78 日の合計 96 匹の胎仔に移植を行ったところ，妊娠 52 日以前に移植を行った 18 例でヒト血液の存在が確認された．キメリズムは全例 1％ 未満であったが，FACS による解析では T 細胞を除くほぼ全てのヒト血液細胞が確認された．また，新生仔骨髄細胞中に存在するヒト CD 34

陽性細胞をソーティングし，NOD SCID マウスに二次移植したところ 5 週間にわたり生着が認められたことから，ブタ骨髄中でヒト造血前駆細胞が増殖しえることが強く示唆された．
ヒト血液キメラブタはヒト造血幹細胞のアッセイ系や増殖系としてだけでなく，ヒト細胞に対して免疫寛容が誘導されている可能性が高いことから，ヒト臓器のリザバーとしても利用できる可能性がある．将来的に，幹細胞からのヒト臓器の再生にあたっては免疫系が未発達の異種動物胎仔への移植が有用かもしれない．

In utero transplantation of human cord blood stem cells into a preimmune pig fetus
HIROMITSU NAKAUCHI Department of Immunology, Institute of Basic Medical Science, University of Tsukuba
なかうち ひろみつ：筑波大学基礎医学系免疫学教授．昭和58
年東京大学大学院医学系研究科修了．昭和59年順天堂大学医学部講師．昭和62年理化学研究所研究員．平成５年現職．主研究領域／幹細胞の生物学，臓器再生医学．
＊＊
ふじき・ゆたか：筑波大学基礎医学系免疫学．
＊Key words

造血幹細胞in utero transplantation
血液キメラ動物幹細胞と細胞療法 991．背景近年，再生医学への期待が高まるなか，ES細胞や種々の臓器に存在する幹細胞が注目され，臓器再生の可能性が議論されている．
続々と見つかってくる臓器特異的な幹細胞の中でも，全ての血液細胞が由来するとされる造血幹細胞は最も古くから研究されてきた幹細胞であり，現実に幹細胞移植という形で臓器再生が実用化している数少ない幹細胞のひとつである．我々はマウス骨髄中の造血幹細胞を純化し，わずか一個の造血幹細胞が 1 年以上にわたり全ての血球細胞を供給できることを示し，造血幹細胞の多能性と高い自己複製能を実験的に証明した1）．ところが in vitro で「多能性」を保ったまま造血幹細胞を「自己複製」させることは未だに困難であり，臨床応用への期待に応えることはできていない．一方ヒト造血幹細胞については，未だ in vivoにおける適切な実験系が存在せず，その表面抗原すらコンセンサスが得られていないのが現状である．

図 1 経子宮的ヒト造血幹細胞移植の方法
A）超音波ガイドを用いたブタ胎仔への経子宮的ヒト造血幹細胞移植
B）ブタ胎仔（黒矢）と穿刺針先端部（白矢）従来よりヒト造血幹細胞は，メチルセル
ロース培地中で各種サイトカイン存在下にコがある．

ロニーを形成する細胞（CFC ; colony forming

これに対し Zanjani らは，ヒツジ胎仔をヒcells）や，ストローマ細胞と長期共培養するこト細胞のレシピエントとして用いる方法を開とでコロニー形成能が維持される細胞（LTC-発した5，6）．免疫不全を持つ実験大動物は存IC ; long term culture-initiating cells）として，在しないため，免疫系の未発達なヒツジ胎仔

in vitro のアッセイ系で評価されてきた．最にヒト造血幹細胞を移植することで，大動物

近では免疫不全マウスである SCID マウスやでのヒト造血幹細胞のアッセイを行う方法で

NOD SCID マウスを用いて，これにヒト造血ある．この実験系に習い，我々は免疫系が未幹細胞を移植することで， in vivo での検討

発達なブタ胎仔に経子宮的にヒト造血幹細胞も行われるようになってきている

2〜4）．しかしこれらのアッセイ法には，コロニーを形成を移植することにより， in vivo でヒト造血系を再構築することを試みた．

したり，SCID マウスの骨髄に生着する能力を持つ細胞が，70 年以上の寿命を持つヒトの骨髄を長期にわたり再構築する能力を持つかどうかを明らかにすることは難しいという限界
100 第 117 回日本医学会シンポジウム

2．方法
ヒト造血幹細胞の供給源としては，満期正常分娩で得られたヒト臍帯血を用いた．比重遠心法により有核血球を濃縮した後，造血幹生着率(%)

細胞を含む分画をモノクローナル抗体により100標識し，全有核細胞，T 細胞除去有核細胞，CD34 陽性細胞を磁気ビーズ等により得た．妊娠31〜78 日の妊娠ブタに全身麻酔を施して固7550

定し，経皮的に超音波ガイド下に胎仔腹腔内へ細胞を穿刺注入することで造血幹細胞移植

25を行った（図 1）．生後新生仔の末梢血，骨髄，（フローサイトメトリー）および PCR 法を用

029-32
33-36
37-40
41-44
45-48
49-52
53-56
57-60
61-64
65-68
69-72
73-76
77-80

あるいは造血系組織の細胞を採取し，FACSいてブタ体内に定着したヒト細胞の同定を移植を実施した胎齢 (日)行った．

図 2 移植時胎齢と生着の関係
妊娠 33〜52 日の移植のみで移植が成立した．
（生着率＝血液キメラ 移植胎仔数（％））

3．結果
1）ヒト血液細胞の生着
当初我々は妊娠ブタを麻酔下に開腹し，子宮を直視下に胎仔へのヒト造血幹細胞移植を生着は妊娠 33〜52 日までの移植のみで確認行った．しかしこの方法では 5 7 例（71.4％）

された．妊娠 32 日以前の移植は胎仔が小さが術後感染によると思われる流産に至った．

く技術的に困難であった（図 2）．この期間でそこで，更に非侵襲的な方法をとることとし，の移植成立の頻度は 40 移植中 22 匹，55.0％

超音波ガイド下でのブタ胎仔へのヒト造血幹であった．

細胞移植を行った．37 妊娠の 96 胎仔へヒト3）移植成立例の検討

造血幹細胞移植を行った．しかしうち 10 妊

ヒト血球はブタ胎仔のさまざまな臓器で確娠，44 胎仔は術後流産もしくは子宮内胎仔死認され，最長では移植後 315 日間にわたりヒ亡となり，これらは解析することができなト細胞が確認できた（表 1）．一方ブタ血液中かった．2 妊娠は解析のため帝王切開より妊に 占 め る ヒ ト 細 胞 の 頻 度 は 低 く，多 く は娠を中断し，移植してあった 3 胎仔全て（100FACS 検出感度未満で，PCR にて検出された．

％）にヒト細胞の生着を認めた．また早産にW 549 の仔はその骨髄中にヒト血球が 0.58％より生直後に死亡した 3 妊娠では 5 移植胎の頻度で存在した．生着したヒト血球（CD仔中 3 匹（60.0％）にヒト細胞の生着を認め45 陽性細胞）に占める分化抗原の解析では，た．22 妊娠が満期分娩となり，44 移植胎仔のそ の 6.5％ が CD 19 陽 性（B 細 胞 系）
，96.5

うち 18 仔（40.9％）にヒト細胞の生着を認め％が骨髄球系（CD 13，14，33＋）であり，Tた．

細胞は存在していなかった．ヒト造血前駆細2）ヒト造血幹細胞移植成立への移植時期の関与

胞のマーカーである CD 34 は 21.0％ に発現しており，ブタ骨髄中でヒト造血幹細胞が生ヒト造血幹細胞の子宮内移植成立に適切な着，増殖していることが確認できた．
更に我々時期を検討した．その結果，ヒト血液細胞のはブタ骨髄中に存在する CD 34 陽性細胞の幹細胞と細胞療法 101

表１

＃

移植時
胎齢

移植細胞

移植細胞数D3585.1
D3433
D3585.2
W941
W502.1
W393
D3476
D3584
D3571
W1048
W549
D3735
D3585.3
W903
D3461
W502.2454544354245464342373552
35334345

T-depleteT-depleteT-depleteT-depleteT-deplete
CD34 ＋
CD34 ＋
CD34 ＋
CD34 ＋
CD34 ＋
CD34 ＋
CD34 ＋
CD34 ＋
CD34 ＋
MNCs
MNCs

3.0 × 107
2.4 × 108
1.0 × 108
1.0 × 107
4.4 × 107
1.0 × 106
1.5 × 106
3.9 × 105
6.0 × 105
1.1 × 106
7.0 × 105
1.0 × 106
4.0 × 106
1.6 × 106
3.5 × 107
4.0 × 107

移植成立例のまとめ

purity ＊CD34（%） CD3（%）
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
57.2
76.9
95.4
94.2
87.4
81.3
N.D.
48.1
50.7
0.4
0.5

11.1
14.7
11.1
20.4
28.1
2.6
0.8
N.D.
N.D.
0.8
0.8
N.D.
2.0
0.9
32.5
24.9

生着期間

キメリズム（陽性組織）

388111082821111233155747142
103
9085
6285

5.1%（L）
PCR（BM，S，L，T，PB）
PCR（BM）
PCR（BM）
PCR（BM）
PCR（BM，L，S）
PCR（BM，PB）
PCR（BM，PB）
PCR（BM，S，L，T）
0.04%（BM，S，L，T，PB）
0.58%（BM，S，L，T，PB）
PCR（PB，BM）
0.14%（BM，PB）
PCR（BM，PB）
PCR（S）
PCR（S）

T-deplete; T 細胞部分除去有核細胞，MNCs; 全有核細胞，PCR; ヒト細胞は PCR のみにて検出可能
L; 肝臓，BM; 骨髄，S; 脾臓，T; 胸腺，PB; 末梢血，N.D.; not done＊
移植細胞に含まれる CD34 および CD3 陽性細胞の頻度機能解析を行った．CD 45+CD 34＋細胞をブタ

in situ hybridization で判定しているため，生骨髄から FACS ソーティングにより回収し，着した細胞の phenotype や機能を解析 で き

そのコロニー形成能と SCID マウス骨髄再建ていないことなどさまざまな問題点があり，能を確認した．その結果，この細胞は赤血球ヒツジを除いては満足いくデータは得られて系，骨髄球系のいずれのコロニーも形成するいなかった．我々の結果でもその多くはキメ能力を持ち，また亜致死線量放射線照射したリズムが PCR で検出される，いわゆるミクロNOD SCID マウスの骨髄に，少なくとも移植キメリズムであったが，移植時期が妊娠 35

後 5 週間にわたり生着する（末梢血キメリズ

日 以 前 の 数 例 に お い て は，長 期 に わ た り

ム：0.17±0.23％）ことを確認した（図 3）．

FACS で解析可能な程度のヒト細胞の生着を達成できた．

4．考察

血液キメラ動物を作製する技術は，今後多様な応用を展開することの基礎となる．たと

ブタ胎仔に，経子宮的にヒト造血幹細胞をえば，さまざまな血液画分を移植することで，移植することで，出産したブタをヒト血液キどの画分に長期にわたりヒト血液を供給できメラ動物とすることに成功した．従来用様のる造血幹細胞が含まれているかを同定した手法で，齧歯類7），イヌ8），ヤギ，ヒツジ，サり，遺伝子導入を行った血液細胞を移植する

ル9）などでキメラを作製したとする報告があことで，長期的な遺伝子発現の解析が可能とるが，これらの報告は実験に用いている動物なる．また，ブタのように生体で 300 kg を超数が少ないこと，血液キメラを PCR もしくはえる動物でヒト血液が増幅されれば，それを102 第 117 回日本医学会シンポジウム

B0.1

CD33CD34A0.4CD45CD45

図 3A）ブタ骨髄中の CD 45＋CD 34＋ヒト造血前駆細胞を FACS ソーティングにより回収後，NOD SCID マウスへの移植ならびに in vitro のコロニーアッセイを行った結果．
B）NOD SCID マウスに移植後，5 週後の末梢血の解析．0.5％ ほどであるが CD 45 陽性細胞が存在する．
C，D）14 日後に形成されたヒト由来骨髄球系（C），赤血球系（D）のコロニー．

回収し，ヒトへの移植源として利用可能かもして利用する試みがなされているが，この技しれない．また，キメラ動物はそのドナー組術を用いることで，臓器不全患者の臓器幹細織にたいして免疫寛容が誘導されることがさ

胞をキメラブタ中で臓器再生後，再び患者にまざまな報告により確認されている10〜12）．

移植する，自己の組織での移植治療が行われたとえば血液キメラマウスは，そのドナーでるようになるかもしれない．

ある動物の皮膚移植を拒絶しない．血液キメ

これまでのところ，ブタ血液中に占めるヒ

ラブタはドナーのヒト組織についても同様に

ト血球の頻度は 1％ 未満と低い．今後は移植免疫寛容が誘導されている可能性が高い．最造血幹細胞画分の工夫，移植時期と移植部位，近相次いで発見されているヒト臓器幹細胞移植細胞数の最適化などによりヒト細胞のキ（肝幹細胞や神経幹細胞など）をこのブタに移メリズムを数％にまで上昇させ，生着期間を植することで，臓器再生の場としても利用可延長させることが目標となる．またレシピエ能となる可能性がある．従来ブタのような大ントであるブタの改良やブタに対するヒトサ動物の臓器をヒト臓器不全に対する移植源とイトカインの投与，抗ブタ抗体の投与など，幹細胞と細胞療法 103

1999 ; 5 : 1292―1299.

試みる価値のある課題は未だ多い．

〔文献〕
1）Osawa M, Hanada K, Hamada H, et al. : Long-term
lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34low negative hematopoietic stem cell. Science 1996 ;273 : 242―245.
2）Miyoshi H, Smith KA, Mosier DE, et al. : Transductionof human CD 34+ cells that mediate long-term engraftment of NOD SCID mice by HIV vectors . Science
1999 ; 283 : 682―686.
3）Kim DK, Fujiki Y, Fukushima T, et al. : Comparison ofhematopoietic activities of human bone marrow andumbilical cord blood CD 34 positive and negative cells.
Stem Cells 1999 ; 17 : 286―294.
4）Fujiki Y, Onodera M, Yamaguchi T, et al. : Dominant
expansion of human T cells in non-obese diabetic severe combined immunodeficiency mice implantedwith human bone fragments［In Process Citation］．
Exp Hematol 2000 ; 28 : 792―801.
5）Zanjani ED, Pallavicini MG, Carrison MR, et al. : Successful stable xenograft of human fetal hemopoietic
cells in preimmune fetal sheep. Trans Assoc Am Physicians 1991 ; 104 : 181―186.
6）Zanjian ED, Pallavicini MG, Ascensao JL, et al. : Engrafment and long-term expression of human fetal hemopoietic stem cells in sheep following transplantation in utero. J Clin Invest 1992 ; 89 : 1178―1188.
7） Pallavicini MG , Flake AW , Madden D , et al . : Hemopoietic chimerism in rodents transplanted in utero
with fetal human hemopoietic cells. Transplant Proc
1992 ; 24 : 542―543.
8）Omori F, Lutzko C, Abrams-Ogg A, et al. : Adoptive
transfer of genetically modified human hematopoietic
stem cells into preimmune canine fetuses. Exp Hematol 1999 ; 27 : 242―249.
9）Tarantal AF, Goldstein O, Barley F, et al. : Transplantation of human peripheral blood stem cells into fetalrhesus monkeys（Macaca mulatta）. Transplantation
2000 ; 69 : 1818―1823.
10）Morita H, Sugiura K, Inaba M, et al. : A strategy for organ allografts without using immunosuppressants orirradiation . Proc Natl Acad Sci USA 1998 ; 96 :6947―6952.
11）Taniguchi H, Abe M, Shirai T, et al. : Reconstitution
ratio is critical for alloreactive T cell deletion and skingraft survival in mixed bone marrow chimeras. J Immunol 1995 ; 155 : 5631―5636.
12）Ko S, Deiwick A, Jager MD, et al. : The functional relevance of passenger leukocytes and microchimerism
for heart allograft acceptance in the rat . Nat Med

104 第 117 回日本医学会シンポジウム

質疑応

答

座長（秦） ありがとうございました．それではディスカッションをお願いいたします．
平井久丸（東京大） 余計な心配かもしれませんが，造血幹細胞に必要で，分化して行く過程で必要な factor は，ヒトとブタでは完全にクロスするのでしょうか．
中内

それほどしっかりと調べられたわけではありませんが，かなりのところクロスすると考えています．といいますのは，例えば

NOD SCID マウスでも，半年あるいは 10 ヵ
月以上ヒトの血球細胞が生着しているという報告もありますので，ヒトの stem cell の生着，あるいは増殖に必要な factor が，マウスレベルでもヒトとクロスすると一応考えられます．したがって，ブタでも多分クロスするであろうと考えています．
平井

成熟した顆粒球や赤血球は，一応確認できていますか．
中内

できています．

峯石真（国立がんセンター） 今のお話は非常に面白かったのですが，臨床の方からやられているデータでは，まず T-cell がつくということが，比較的安定した混合キメラでは重要であるということが定説になっていて，T-cell がない場合は，シアトルのデータなどでもだんだん拒絶されるというようになっていますので，その話とは逆でちょっと面白いと思ったのですが．
中内

時間の関係で T-cell の話はしません

でしたが，実は移植後のブタ胎仔を殺して胸腺を調べた例があるのですが，そこには CD
3 陽 性 の ヒ ト の T-cell が 一 応 存 在 す る の です．しかしなぜか末梢には出てこなくて，胸腺の中にとどまっています．ヒツジの例ではのだろうと思いますが，今のお話からすると，ヒトの T-cell が末梢に出てくるという報告もその実験はまだできていないということでありますので，先生がおっしゃるように，ヒしょうか．

トの T-cell が生着やキメリズムを上げるのに中内大事かもしれませんので，ドナーの成熟 Tcell を加えるということも可能 だ と 思 い ま
徹（大阪大） 今行われているヒツジの移植に比べて，正直なところ，メリット，デメリットはどうなのでしょうか．
中内と CD 34 negative を一緒に打つことです．
加藤

それから，tolerance が実際にできたかどうかということを，in vitro で assay すす．
仲野

今考えているのは，ストローマ細胞るシステムで何かチェックしておられますか．
中内

一応ドナーがわかっているものに関私どもにとって一番のメリットは，しては，一部 MLR をやってありまして，pre-自分たちの手ですべて実験ができるというこ

liminary なところでは，ある程度の toleranceとですね．実はヒツジのグループのところには誘導されているようです．あと何例かやっ細胞を持って行って，いろいろな実験をしまてみなければはっきりしたことはいえません

したが，細胞は持って行くけれども，最終的が．

な read out は向こうが行うことになります．
しかしこういう系では，すべて自分のところ加藤のは，MLR が抑えられているのですか．

でできて，実験データも quality control がで中内きるということが，私にとっては一番大事なせん．

ことです．
キメリズムに関しても，いろいろな論文をチェックして行くと，それほど大きな差はないようです．やはり 1％ かもう少しぐ ら い先生がおっしゃる tolerance という加藤そうです．third party は抑えていま
MLR がなかなかクリアに出ないのが悩みという気がするのですが．
中内

あまりきれいなデータではありませんが，一応そういうデータが得られています．の，比較的低いキメリズムで行っており，そ堀田凱樹（国立遺伝研） たいへん面白かっういう点では同じです．ブタを使用するメたのですが，ヒトからブタだから chimerism

リットとしては，胎児の数が多いということが低いのですか．ブタからブタであれば高いと，動物自体が大きいということで，expan-のですか．

sion の系としてはこちらの方が優れていま

中内なかなか鋭い質問ですが，実はブタす．それからブタというのは大きいですが，同士を区別するマーカーがなかったものです

食用に広く用いられているので入手しやすいから，あまりくわしくはやっていません．共メリットもあるのではないかと思います．

同研究をやっている獣医の先生方が非常に苦

加藤俊一（東海大） 二つ質問させていただ

労して，PCR を考えてくれまして，デューきたいと思います．まず，先生が入れられたロックとホワイトと 2 系統を区別できる系のは，臍帯血の CD 34 positive の細胞ですね．

を立ち上げてくれましたので，今度そういう中内CD 34 positive 細胞だけでなく，total実験を詳しくやってみたいと思っています．

も，それから T-depleted もやりました．しか一度やった結果では，特にブタだから非常にし今のところ一応よい結果が得られているのつきやすいということはなかったようです．

は CD 34 positive の細胞を入れたものです．

それは多分技術的な問題だと思うので，今行

加藤

将来は CD 34 negative にも進まれる

えば，かなりのレベルのキメリズムができる幹細胞と細胞療法 105

のではないかと考えています．ぜひやってみています．しかし transgenic はまだよいのでたいと思っています．

すが，ノックアウトになりますと，核移植の笹井芳樹（京都大） 中型動物でも，ノック技術を使いませんと，時間がかかりすぎて非アウト的なことができるような可能性は今見

常に困難な の で す．
（注：2000 年 9 月 7 日 号

えてきているわけですが，ヌードブタを作るの『Nature』で，核移植によるクローンブタのに比べてどうなのでしょうか．の作製が報告されました）

中内

もし本当にキメリズムが十分に高く

先 ほ ど も い い ま し た よ う に，conditionalて，私が考えているようにヒトの肝臓などをに造血系がノックアウトできるようなブタを再生するとしますと，血管内皮などはブタの作ってしまえば，selective advantage が与え細胞とのキメラになっていると予想されるわられますから，全部ヒトの血球で再構築されけで，最終的にヒトに移す時にブタの細胞をたブタが作れると思いますので，そういうア除く必要があります．できれば自殺遺伝子をプローチは非常に面白いと思います．

組み込んだ transgenic ブタを作りたいと思っ

106 第 117 回日本医学会シンポジウム

座長

どうもありがとうございました．