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浦上財団研究報告書

Vol.29（2022）＜令和元年度助成＞

乳酸菌由来新奇抗菌ペプチド・抗菌タンパク質の探索と構造・機能の解析

善藤

威史（九州大学大学院 農学研究院）

背景

菌から、特性の異なる様々な新奇バクテリオシン・バクテリオリシンの探索をさらに進め、その構造と食品の保存には様々な保存料が用いられている特性を明らかにすることを目的とした。

が、従来用いられてきた保存料には健康への影響が懸念されており、生物由来の天然の保存料の利用に方法大きな期待が寄せられている。中でも、安全な微生物である乳酸菌が生産する抗菌ペプチド・バクテリオシンは、ヒトに対する毒性がなく、体内や環境中

１． バ ク テ リ オ シ ン・ バ ク テ リ オ リ シ ン 生 産
乳酸菌の分離において分解されやすく、耐性菌が出現しにくいと発酵食品や植物をはじめとする様々な分離源かいった特性を有している。乳酸菌バクテリオシンは、ら、集積培養を経て、寒天培地上で酸生成株として人体や環境に優しく安心して使用できる抗菌物質と乳酸菌を分離した。分離した乳酸菌の抗菌活性は、して注目され、食品保存料や食品と同様に高い安全

Spot-on-lawn 法による抗菌活性試験で評価した。抗性が求められる様々な用途への利用が期待されてい菌活性を示した乳酸菌については、糖類資化性試験る。実際に、乳酸菌 Lactococcus lactis の一部の菌や 16S rRNA 遺伝子配列解析等により、菌種を同定株が生産するナイシン A は、広い抗菌スペクトルとした。

強力な抗菌活性を有する優れたバクテリオシンで、日本を含む世界 50 ヶ国以上で食品保存料として実用されている。一方で、ある種の微生物に対しては

２． バ ク テ リ オ シ ン・ バ ク テ リ オ リ シ ン の 抗菌スペクトル等の特性の解析

ナイシン A よりも優れた効果を発揮するバクテリオ

分離した乳酸菌の培養液上清を試料として、乳酸シンや、バクテリオシンよりもやや分子量の大きな菌が生産する抗菌物質の抗菌スペクトルや pH 依存バクテリオリシンと総称される抗菌タンパク質も報性、酵素感受性等の諸特性を解析した。また、抗菌告されている。

物質の作用機構を明らかにするために、比濁法によ

これまでに、我々も抗菌スペクトルと分子量を指標とした迅速スクリーニング法を構築し、新奇乳酸る抗菌活性試験を行った。必要に応じて、精製した抗菌物質を用いて、同様の解析を行った。

菌バクテリオシン・バクテリオリシンを見出してきた 1)。特性の異なる様々なバクテリオシンやバクテリオリシンの中から、対象とする食品や微生物に応

３． バ ク テ リ オ シ ン・ バ ク テ リ オ リ シ ン の 精製と構造解析じて、最適な特性をもつものを選択することができ抗菌スペクトル等の諸特性の解析により、新奇性れば、残留による耐性菌の出現を防ぎつつ、さらにが高いと判断されたバクテリオシン・バクテリオリ

安全かつ効果的な微生物制御の実現が期待できる。

シンについて、その精製と構造解析を試みた。乳酸

そこで本研究では、様々な分離源から得られる乳酸菌の培養液上清に含まれる抗菌物質を陽イオン交換

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乳酸菌由来新奇抗菌ペプチド・抗菌タンパク質の探索と構造・機能の解析が明らかとなった。

や逆相クロマトグラフィーを用いて精製した。抗菌活性を示す精製物について、質量分析やエドマン分解を行い、その構造を解析した。必要に応じて、液２． バ ク テ リ オ シ ン・ バ ク テ リ オ リ シ ン の 抗体クロマトグラフ質量分析計（LC/MS）で培養液上菌スペクトル等の特性の解析
A ～ D の 4 株の培養液上清の抗菌スペクトルを清を直接分析することで、バクテリオシンの検出とSpot-on-lawn 法で調べた（表 1）。その結果、A 株は同定を試みた 。
2)

抗 菌 物 質 の ア ミ ノ 酸 配 列 情 報 を も と に、PCR・広い抗菌スペクトルと強い抗菌活性を示した。B 株

DNA シーケンス解析によって、バクテリオシン・バと C 株は、A 株よりもやや弱い活性を示したものの、クテリオリシン前駆体遺伝子および周辺領域の塩基

Lactobacillus sakei には比較的強い抗菌活性を示し配列を解析した。また、乳酸菌の全ゲノムのドラフた。D 株は、狭い抗菌スペクトルを有し、Enterococcus

トシーケンス解析を行い、バクテリオシン・バクテ

faecalis には比較的強い抗菌活性を、他の 2 種の検リオリシン前駆体遺伝子および生合成遺伝子群を探

定菌には微弱な抗菌活性を示した。

索した。前駆体をコードする遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列およびその理論分子量と、精製物から得られた構造情報を比較し、バクテリオ

３． バ ク テ リ オ シ ン・ バ ク テ リ オ リ シ ン の 精製と構造解析
A 株が生産する抗菌物質は、培養液上清の LC/MSシン・バクテリオリシンの構造決定を試みた。

解析の結果、これまでに L. lactis から多数の報告例

結があるバクテリオシンで、ナイシン A の類縁体であ果るナイシン Z 2) と同定された（図 1）。B 株が生産する抗菌物質は、精製・構造解析の結果、Enterococcus

１． バ ク テ リ オ シ ン・ バ ク テ リ オ リ シ ン 生 産

mundtii からの生産が報告されているバクテリオシン、乳酸菌の分離
様々な分離源より、46 株の乳酸菌が単離され、そmundticin 2, 3) であることが明らかとなった（図 1）。のうち A ～ D の 4 株がバクテリオシン様の抗菌活性C 株が生産する抗菌物質は、他のバクテリオシンとを 示 し た。A 株 と D 株 は い ず れ も 乳 酸 菌 で あ る同様の方法では精製が困難で、構造決定には至らな

Lactococcus lactis 、Weissella minor と そ れ ぞ れ 同かった。

定された。B 株と C 株は、種の同定には至らなかっ

D 株からは、種々のクロマトグラフィーを経て、たものの、Enterococcus 属乳酸菌に分類されること2 種の抗菌タンパク質が精製された。質量分析とア

表1分離株の抗菌スペクトル

抗菌活性検定菌ABCD

Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 19435＋＋＋－

Lactobacillus sakei subsp. sakei JCM 1157＋＋＋＋＋＋＋－

Lactobacillus dextrinicus JCM 5887＋＋＋＋＋－Pediococcus pentosaceus JCM 5885＋＋＋＋－Enterococcus faecalis JCM 5803＋＋＋＋＋

Bacillus coagulans JCM 2257＋＋＋＋＋＋

Kocuria rhizophila NBRC 12708＋＋＋－Listeria innocua ATCC 33090T＋＋＋＋TTTTT58

浦上財団研究報告書Vol.29（2022）

図 1 ナイシン Z と mundticin の構造
ナイシン Z（上）は翻訳後修飾によって生じる異常アミノ酸（灰色）とモノスルフィド結合（-S-）を有している。Mundticin は抗リステリアバクテリオシンに共通して見られる保存配列（白抜き）とジスルフィド結合（-S-S-）を有している。

ミノ酸配列解析の結果、いずれも新奇の抗菌タンパ

溶菌酵素に類似した領域が 2 ヶ所ずつ見出され、そク質、バクテリオリシンであることが明らかとなっのうちの 1 つは両者間できわめて類似していたことた。D 株のドラフトゲノム解析の結果、2 つの新奇から、2 つの新奇バクテリオリシンは作用機構の類バクテリオリシンをコードする遺伝子が見出され、似した溶菌作用を示すことが予想された。そこで、いずれも約 30 kDa の新奇バクテリオリシンの一次D 株が生産する 2 つの新奇バクテリオリシンの混合構造を決定することができた。また、隣接して存在物について、比濁法によって作用機構を解析した。

する 2 つの新奇バクテリオリシンの遺伝子周辺には、その結果、添加後に顕著な濁度の低下が認められ、これらの生合成への関与が予想される遺伝子群が見

2 つの新奇バクテリオリシンは溶菌作用を示すこと出された。

が明らかとなった（図 2）。また、精製バクテリオシ

D 株が生産する 2 つの新奇バクテリオリシンには、ンについても同様の結果が得られ、添加後速やかな図 2 D 株が生産する新奇バクテリオリシンの作用機構
検定菌 Weissella paramesenteroides JCM 9890T の培養液に粗精製バクテリオリシンを添加したところ、660 nm の濁度の速やかな低下が見られた。

乳酸菌由来新奇抗菌ペプチド・抗菌タンパク質の探索と構造・機能の解析

添加直前

10 分後

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60 分後

図 3 精製バクテリオリシンの溶菌作用
検定菌 Weissella paramesenteroides JCM 9890T の培養液に精製バクテリオリシンを添加した。対照とした非添加の場合には変化が見られなかったが（左）、添加した場合には濁度が速やかに低下し、溶菌作用が認められた（右）。

濁度の低下が観察された（図 3）。

謝辞
本研究の遂行にあたり、研究助成を賜りました公考察

益財団法人 浦上食品・食文化振興財団と財団関係者の皆様に厚く御礼申し上げます。また、本研究の遂

様々な分離源より得られた乳酸菌のうち、4 株に行にご協力いただきました、九州大学大学院生物資

バクテリオシン様の抗菌活性が認められ、そのうち源環境科学府・微生物工学研究室の野見山泰成氏にの 3 株が生産する抗菌物質の構造を決定することが感謝申し上げます。

できた。A 株と B 株では、それぞれすでに構造が報告されているナイシン Z と mundticin の生産が確認

参考文献された。C 株からは一般的な精製方法ではバクテリ

1) 善藤威史，石橋直樹，園元謙二．乳酸菌バクテリオシンの探索と利用．日本乳酸菌学会誌，25(1), 24-33(2014).
2) Zendo, T., Nakayama, J., Fujita, K., Sonomoto, K.
Bacteriocin detection by liquid chromatography/mass spectrometry for rapid identification. Journalof Applied Microbiology, 104(2), 499-507 (2008).
3) Zendo, T., Eungruttanagorn, N., Fujioka, S., Tashiro, Y.,
Nomura, K., Sera, Y., Kobayashi, G., Nakayama, J.,
Ishizaki, A., Sonomoto, K. Ident ificat ion andproduction of a bacteriocin from Enterococcus
mundtii QU 2 isolated from soybean. Journal ofApplied Microbiology, 99(5), 1181-1190 (2005).

オシンが精製されなかったことから、性質の異なる新しい抗菌物質が生産されていることが予想される。一方で、D 株からは抗菌タンパク質であるバクテリオリシンの生産が認められ、精製された 2 つのバクテリオリシンはいずれも新しい構造をもつことが明らかとなった。また、これらのバクテリオリシンは狭い抗菌スペクトルと溶菌作用を示した。この特異的な抗菌作用の解明に向けて、今後、作用機構の詳細の解析が望まれる。抗菌スペクトルの狭いバ
クテリオシンやバクテリオリシンは、有用な微生物には影響せずに有害菌のみを抑制する選択的な微生物制御に有効であり、将来の食品保存料などへの利用が期待される。

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Vol.29（2022）

Screening and characterization of novel antimicrobial peptides
and proteins from lactic acid bacteria
Takeshi ZENDO
Faculty of Agriculture, Kyushu University
Due to their properties and safety, antimicrobial peptides and proteinsproduced by lactic acid bacteria (LAB) are expected to be applied as foodpreservatives and pharmaceutical agents. The purpose of this study was tosearch for LAB isolates that produce antimicrobial peptides or proteins withnew properties, and to clarify the structures and properties of the produced
antimicrobial substances. LAB isolates were obtained from various sources
through enrichment cultures and subsequent cultivation on agar plates. The
resulting isolates were then evaluated for antimicrobial activity, and four
isolates, identified as LAB such as Lactococcus and Weissella , were found to
exhibit bacteriocin-like inhibitory activity against some of the tested indicator
bacteria. The culture supernatants of isolates A and B were analyzed todetermine the structures of the produced antimicrobial substances, indicatingthat they produced antibacterial peptides, bacteriocins identical to previously
reported nisin Z and mundticin, respectively. From the culture supernatant ofisolate C, which displayed high antimicrobial activity, no bacteriocin waspurified, probably due to having characterist ics that differ from generalbacteriocins. These three isolates showed broad-spectrum antimicrobial activity
against Gram-positive indicator bacteria, whereas isolate D displayed a narrow
antimicrobial spectrum. Two antimicrobial substances were purified from theculture supernatant of isolate D, and a structural analysis by mass spectrometry
and Edman degradation indicated they were novel antimicrobial proteins.
Subsequently, draft genome analysis on isolate D identified the genes and thewhole primary structures of the two novel antimicrobial proteins. Both a crude
preparation and the purified proteins showed quick lytic activity on anindicator bacterium.