●がん転移研究の新しい展開―分子研究から臨床へ―［ I ］転移関連分子研究から創薬へ

3．低分子量 G 蛋白質 Rho と転移・浸潤
成宮

周＊

転移・浸潤はがんの転帰を決定する最も大きな因子である．細胞はがん化に伴い増殖コントロールの異常とともに細胞間接着能を消失し，運動性を亢進する．がん細胞のこの生物学的特徴が，がんの原発巣よりの離脱を惹起し浸潤・転移を起こす．このことは増殖と運動の情報伝達経路が細胞内で密接にリンクしていることを意味する．
このリンクとして働いているのが Rho である．
Rho は細胞の細胞外基質や血管内皮への接着を制御している分子で，細胞はこの接着を支点にしてアクチン細胞骨格を制御して組織内を遊走，細胞間隙を通り抜ける．Rho は生理状態では刺激依存性に働くが，Ras による悪性化細胞では強く活性化され，細胞の悪性化に寄与する．Rho は活性化体の GTP 結合型が下流のエフェクター分子に働いてその作用を発揮する．このエフェクターの一つが Rho 結合キナーゼ（ROCK）であり，myosin や Na＋ H＋交換体，LIM キナーゼ―コフィリン系に働き，アクトミオシン系の形成とこれを介した収縮に働く．Rho 経路のがんの転移・浸潤への関与は，まず in vitro の浸潤モデル系で Rhoの不活化酵素 C3 を用いて示唆されたが，ついで ROCK の特異的阻害薬 Y-27632 がin vitro のみならず数種の in vivo のモデル系で転移・浸潤を有意に抑制することが示された．また，転移・浸潤の帰趨を決定する血管内皮や腹膜中皮などの細胞層の通り抜けにおいて，ROCK はがん細胞の接着，運動を亢進するだけでなく，ホストの細胞層のタイトジャンクションを開いて，転移・浸潤に寄与する可能性も報告されている．さらに臨床例や高転移性がん細胞株で，Rho の一つ RhoC が選択的に高発現していることも報告されている．以上の所見は臨床がんの転移抑制の標的として RhoROCK 経路の重要性を示唆するものである．

Small GTPase Rho in tumor metastasis and invasion
SHUH NARUMIYA Department of Pharmacology, Kyoto University Faculty of Medicine
なるみや・しゅう：京都大学大学
院医学研究科神経・細胞薬理学教授．昭和54年京都大学大学院医学研究科卒業．昭和61年京都大学医学部第１薬理学助手．昭和63年同助教授．平成４年現職．主研究領
域／薬理学，生化学，細胞生物学（Rho の機能，生理的意義と情報伝達，プロスタノイド受容体の病態的意義）．
＊

18 第 119 回日本医学会シンポジウム

Key words

Rho 蛋白質
細胞接着細胞移動
転移浸潤

活性化された LIM キナーゼは，ついでアクチ

1．低分子量 G 蛋白質 Rho の作用と情報伝達ン結合蛋白質コフィリンをリン酸化し不活化する．これによりコフィリンのアクチン脱重合活性は抑制され，繊維化アクチンの増加が

Rho は Ras 類似の低分子量 G 蛋 白 質 の 一惹起される．また，一つは 1 型 Na+ H＋交換体

つ で，不 活 性 の GDP 結 合 型 と 活 性 化 型 のに対する作用で，ROCK はこれをリン酸化しGTP 結合型の間を往復して細胞反応の分子活性化する．この活性化は交換体と ERM 蛋スイッチとして働く．その作用は細胞基質間白質の結合を誘導し，これがアクチンの細胞接着，細胞移動，神経突起の退縮，細胞質分膜への結合に寄与するものと考えられてい裂，細胞周期の G1→S 期進行などさまざまでる．このような ROCK の作用は，相まって細ある．この一見多彩な作用の多くは，アクチ胞膜に結合したアクトミオシン束の形成を引ン細胞骨格の時間空間特異的な再編成によっき起こすものと考えられる（図 1，B）．て発揮されている．たとえば細胞基質間接着

一 方，mDia は 細 胞 の 極 性 に 関 係 す る

は，間期線維芽細胞では細胞接着斑とストレFormin 蛋白質の一つで，N 端の Rho 結合領スファイバーの形成としてみられるが，スト域に加え，Formin 蛋白質群で保存度の高いレスファイバーは接着斑にアンカーするアクFH 1，FH 2，FH 3 という領域を持つ（図 1，A）．

トミオシン線維の束であり，Rho はこれら構

このうち FH 1 は poly-proline 配列に富み，こ造の形成にあずかる．またストレスファイ

れを介してアクチン結合蛋白質プロフィリン

バーは分裂期で消失するが，Rho は分裂期でを結合する．これにより線維化アクチンの増は分裂面にアクトミオシン束よりなる収縮環加を引き起こす．また，FH 2 領域は微小管のを形成して細胞質分裂を開始，遂行する．す配向に関与する．これらの結果から，mDia

なわち Rho は細胞周期に応じて異なった場

は細胞内の微小管とアクチン骨格の二つを統所で特異的なアクチン細胞骨格を誘導する．

合し，これにより細胞内でのアクチン束のこのような Rho の機能は，活性型 Rho が下Rho 依存性の配列を決定するものと考えられ流のエフェクター分子に働くことにより発揮

る2）（図 1，B）．

される．主なエフェクター分子は，蛋白質リン酸化酵素 ROCK
（Rho 結合キナーゼ）とアダプター分子 mDia である（図 1，A）．ROCK は，N 端にキナーゼドメインを，中央にコイル2．細胞の接着・移動と Rho ファミリー
G 蛋白質

ド・コイル形成領域を，C 端に膜結合ドメイ細胞の移動は進行方向への糸状突起（フィンを持つ分子量 160 K のセリン・スレオニンロポディア），膜状突起（ラメリポディア）の進リン酸化酵素である．この酵素の働きは種々展と先端部での細胞外基質への接着，これをの 変 異 体 や ROCK 特 異 的 阻 害 薬 Y-27632 を支点にしての胞体の牽引と尾部の脱離が繰り用いて解析され，いくつかの経路でアクチン返されて行われる．これらの運動はアクチン

1）骨格を制御することがわかった ．一つはミ骨格の時空間的編成によって行われている．

オシン脱リン酸化酵素の不活化およびミオシ

フィロポディア，ラメリポディアはいずれもン軽鎖に対する直接リン酸化で，ミオシンをアクチンよりなる構造であるし，牽引はアク活性化しアクトミオシンの収縮力を惹起すトミオシンの収縮力で行われる．
Rho は，このる． また， 一つは LIM キナーゼの活性化で，うち牽引の過程に働いている．この牽引は，がん転移研究の新しい展開―分子研究から臨床へ― 19;;;;;;;;
AROCK（¿&À）;;;;;;;; ;;;;;;;;;;;;;;;;PH;;;;;;;;;;;;;;;; ;;;;;;;;

Amphipathic α Helix

Kinase domain

RBD

Cys-richregion

mDia

RBD

FH3

FH1（Polyproline）

FH2

Y-27632

B

RhoROCKmDia
FH2
FH1

LIMキナーゼ

ミオシン脱リン酸化酵素（抑制）プロフィリン

cofilinP

ミオシン軽鎖

アクチン重合促進 アクチン脱重合抑制

微小管配向

ERM蛋白質との結合（リン酸化亢進）

（不活化）

未同定
パートナー蛋白質

Na＋/H＋交換体

アクトミオシン
収縮性の亢進インテグリン・アクチン結合の促進（?）

繊維化アクチンの増加

細胞接着斑とストレスファイバー形成

図1

Rho エフェクター，ROCK と mDia, の構造（A）とストレスファイバー形成に至る情報伝達経路（B）

無刺激の細胞でランダムに細胞を横切って存る．おそらく細胞の進展縁で活性化された在していたストレスファイバーと同様の構造

mDia は微小管を前後方向に配向し，それにが，移動細胞では前後方向に配列して発揮さ沿ったようにアクトミオシン束を配列するもれると解されている．このことは移動細胞にのと思われる．Y-27632 で移動細胞を処理すおいて前後軸という極性を決める機構が存在ると一定方向への移動が制御されることかすることを示唆するが，これまでの研究からら，前後方向に配列したアクトミオシンはこの極性の形成には微小管が重要であることROCK 依存性に収縮力を発揮して細胞移動にが明らかになっている．
いくつかの実験から，働くものと考えられる．このような Rho の働

前項で述べた mDia による微小管の配向決定

きに加え，フィロポディアとラメリポディアは，この場で働いていることが示唆されていが各々 Cdc42 と Rac の活性化によって誘導

20 第 119 回日本医学会シンポジウム

は，単層培養した宿主細胞上にがん細胞を添
フィロポディアの突出

CDC42加し，細胞層下の侵入を観察することで invitro で再現できる．このような in vitro の細胞接着斑実験系を用いて，Rho ファミリーの G 蛋白質
ラメリポディアの伸展と接着ががん浸潤に重要であることが示された．オRac

ランダの Collard らは，これを用いて Rac の活性化因子である TIAM-1 が浸潤促進をおこ細胞体の牽引すことを示したし3），明渡らは，Rho がここで接着の解除と牽引Rho必須の役割を果たすことを明らかにした4）．
明渡らの実験系は，宿主細胞層に腹膜中皮細1ステップ前進胞を，がん細胞に MM 1 肝がん細胞を用いたもので，彼らはこれを用いて MM 1 細胞の浸潤には血清中のリゾホスファチジン酸（LPA）

図2

細胞移動の模式図と各ステップでのRho ファミリー蛋白質の関与が必要なことを見いだし，ついで LPA が Rhoの強い活性化刺激であることから Rho の関与を疑い，C3 酵素を用いてこれを明らかにしされることから，細胞移動は Rho ファミリーた．さらにこの実験系を用いて，この過程でG 蛋白質が順番に活性化されて進行すると考の Rho エフェクターの関与も解析され，Rhoえられている（図 2）．このように細胞の移動の 下 流 でROCKが，ま たROCKの 下 流 でNa＋

では，Rho ファミリーの各々の蛋白が空間特H＋交換体が関与していることが，特異的阻害異的に段階を追って活性化されることが必要

薬物 Y-27632 とアミロライドを用いて確かめで，一つの蛋白だけの強い活性化は移動につら れ た．こ の 結 果 は LPA か ら Rho，ROCKいてはマイナスに働くとされる．たとえば細を介する経路が細胞層の通り抜けに重要な役胞移動の解析に頻用される単層培養を用いた割を果たすことを示唆するものであった．

in vitro の wound healing assay では，Rho の過度の活性化も完全な不活化もどちらも細胞の移動を阻害することが示されている．

2）臨床がんと in vivo 転移モデルにおける Rho 遺伝子発現の検討
上述の in vitro の研究に鑑みて，臨床がんにおける Rho 遺伝子発現が転移との関連で3．Rho とがんの転移・浸潤調べられている．Suwa らは，33 の膵管がん症例においてがん組織，転移巣における RhoA，

1）in vitro の解析B，C の遺伝子の発現を正常膵組織と比較し，がん細胞は原発巣からの離脱，基底膜の破がん組織では RhoC の発現が 有 為 に 高 い こ

壊，組織内遊走と組織外（血管，リンパ管，胸と，また転移巣では原発巣に比べて発現が強腹腔）への脱出，そして標的臓器の宿主細胞バ

く，転移浸潤を示すがんはそうでないものにリヤーへの接着と通り抜けにより，転移浸潤対して高発現であること，RhoC の発現が高をおこす．この中で血管やリンパ管の内皮，いものは低い群に比べ予後が悪いことを報告

胸腹膜の中皮細胞などの宿主細胞バリヤーへしている5）（図 3）．この Suwa らの結論は，実の接着と通り抜けは転移に特徴的で，またそ験動物を用いた包括的なゲノム解析によっての成立に決定的なステップである．この過程も裏付けられた．Clark らは，ヌードマウスにがん転移研究の新しい展開―分子研究から臨床へ― 21ABrhoC＊21100NTCM＊＊210PD＊2rhoC＊＊21

Negative

Positive

Perineural invasion

図30Negative

Positive

Lymph node metastasis

膵管がんにおける RhoC 遺伝子発現の亢進

A：腫瘍（T）と正常組織（N）， B：原発巣（P）と転移巣（M），C：神経組織への浸潤の有無，
および D：リンパ節への転移の有無の各々で RhoC の発現を定量的 RT-PCR 法で比較した（文献 5 より）
* : p<0.001，** : p<0.05

ヒトやマウスのメラノーマ細胞を移植し，こ転移性細胞にトランスフェクトしたところ，れにより生じた肺転移巣から細胞を回収，こRhoC発現は転移能を誘導したと報告している．

れを in vitro で培養するという操作を繰 り

さて，特異的 ROCK 阻害薬 Y-27632 の発見返すことにより，原株に比べて強い転移能をにより，Rho-ROCK 経路の転移浸潤での役割もつ亜株を樹立した．ついでこれと元株の細を in vivo の個体レベルで解析することが可胞の間で microarray 解析を行い，転移能強化能になった．これまで 3 つのモデル系でそのに伴う遺伝子発現を検索した6）．その結果，効果が検討されている．
Itoh らは，ラット肝が高転移株でフィブロネクチンやコラーゲンなん MMI 細胞を syngenetic 系ラットの腹腔内どの細胞外基質蛋白質に加えて，RhoC の高へ注入する腹膜播種モデルを用い Y-27632 のい発現が認められた．また彼らは RhoC を低効果を検討した7）．この実験では，腫瘍細胞

22 第 119 回日本医学会シンポジウム

control

図4

Y-27632

ラット肝がん細胞の腹膜播種モデルでの ROCK 阻害薬 Y-27632 の作用Y-27632 はミニ浸透圧ポンプで持続投与を行った．投与ラット（b）では対照ラット（a）に比し腫瘍の播種，腫瘤形成が強く抑制されている（文献 7 より）注入後 11 日後に腹膜への広範な播種と腫瘍未発表）．これらの結果は，in vivo の転移・形成，腹水貯留がみられる．
このとき，Y-27632

浸潤過程における Rho-ROCK 経路の重要性の持続注入は腹水の発現，貯留量の減少とととY-27632の有効性を示唆する所見といえよう．

もに腹膜播種・腫瘤形成も有意に減少した

3）Rho-ROCK 経路とバリヤー機能（図 4）．また Takamura らは，ヒト肝がん細胞さて，がんの宿主細胞層通り抜けには二つを SCID マウス肝の奬膜下に注入する肝内転の要素がある．一つはがん細胞の接着能と運移 モ デ ル に よ り Y-27632 の 効 果 を 検 討 し動性であり，他は宿主細胞層のバリアー機能

8）た ．この系は 6〜7 週の間に肝各 葉 に 腫 瘍である．前者における Rho-ROCK 経路の重要塞栓や転移巣を形成することから，肝内転移性は述べてきた通りであるが，後者でもこののモデルと考えられる．このとき，Y-27632経路が大きな働きをしていることが最近明らの腹腔内への持続注入をすると肝内転移の発かになった．これらの細胞は細胞間結合に生頻度は減少し，注入場所における腫瘍細胞よって外部からの分子の通過を防いでいるの肝類洞への浸潤も抑制された．さらに Ha-が，このようなバリアー機能を担うのがタイnaki らは，膵がん細胞をマウス脾内へ注入トジャンクションである．タイトジャンク

し，肝への転移をみるという膵がんの肝転移ションは炎症刺激で leaky になることが知らモデルにおいても Y-27632 の有効性を見いだ

れ，何らかの制御機構があると想定されていしている．このときには薬物の経口投与でもた．最近 Hirase らは，刺激に伴うタイトジャ効果が認められたという（花木，有井，今村，ンクションの開放機構に Rho-ROCK 経路ががん転移研究の新しい展開―分子研究から臨床へ― 23関与していることを明らかにした9）．彼らによると，LPA 刺激により Rho-ROCK 経路が活性化され，ROCK はタイトジャンクションの構成分子の一つであるオクルージンのリン酸化を行い，これによりジャンクションの開放を行うという．これまでのところ，がん細胞浸潤における Rho-ROCK が寄与するタイトジャンクション機能の変化をみた研究はない
が，がん細胞の宿主細胞層への接着は何らかのシグナルを宿主細胞層に惹起すると十分考えられ，その時に Rho-ROCK 経路が活性化されタイトジャンクションの開放に向かう可能性は高い．
そうだとすると，
Rho-ROCK 経路はadenocarcinoma of the pancreas. Br J Cancer 1998 ;
77 : 147―152.
6） Clark EA, Goulb TR, Lander ES, et al. : Genomic anaysis of metastasis reveals an essential role for RhoC .
Nature 2000 ; 406 : 532―535.
7） Itoh K, Yoshioka K, Akedo H, et al. : An essntial partfor Rho-associated kinase in the transcellular invasioof tumor cells. Nature Medicine 1999 ; 5 : 221―225.
8） Takamura M, Sakamoto M, Genda T, et al. : Inhibitionof intrahepatic metastasis of human hepatocellular
carcinoma by Rho-associated protein kinase inhibitor
Y-27632. Hepatology 2001 ; 33 : 577―581.
9） Hirase T, Kaeashima S, Wong EYM, et al. : Regulationof tight junction permeability and occludin phosphorylation by RhoA-p 160 ROCK-dependent anadindependent mechanisms. J Biol Chem 2001 ; 276 :10423―10431.

がん細胞側と宿主細胞側の両方で通り抜け過程に働いており，ROCK 阻害薬はこの過程を二重に抑制することになる．

質

おわりに
以上，本稿では Rho-ROCK 経路が細胞の移動や接着で果たしている基本的な役割を述べ，この阻害ががん細胞の転移・浸潤の抑制

疑応

答

座長
（成宮） それではご質問，ご討議をお願いいたします．
野田亮（京都大） RhoC の話が出ましたに有効と考えられる根拠を論じた．すでに動が，ROCK に関して，RhoC も同じように働く物実験ではこの戦略の有効性が実証されておのかということと，転移性のがんで RhoC がり，今後の臨床例での検討が待たれる．

とくに出てきた理由というのは何か考えられますでしょうか．

〔文献〕
1） Maekawa M, Ishizaki T, Boku S, et al . : Signaling from
Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases
and LIM-kinase. Science 1999 ; 285 : 895―898.
2） Ishizaki T, Morishima Y, Okamoto M, et al. : Coordination of microtubules and the actin cytoskeleton by theRho effector mDia 1. Nature Cell Biol 2001 ; 3 : 8―14.
3） Habets GGM , Scholtes EHM , Zuydgeest D , et al. :Identification of an invasion-inducing gene , Tiam-1,
that encodes a protein with homology to GDP-GTP exchangers for Rho-like proteins. Cell 1994 ; 77 : 537―549.
4） Yoshioka K, Imamura F, Shinkai K, et al. : Participation of rhop 21 in serum-dependent invasion by rat ascites hepatoma cells. FEBS Lett 1995 ; 372 : 25―28.
5） Suwa H, Ohshio G, Imamura T, et al. : Overexpressionof the rhoC gene correlates with progression of ductal
24 第 119 回日本医学会シンポジウム

座長

最初の RhoA，B，C が下流の effec-tor に対して選択性があるかどうかというご質問ですが，現在のところ，実験的には RhoC
は RhoA と同様に同じ程度の affinity で ROCKに結合します．また，今までに同定されている effector で，RhoA，B，C の間を区別するものは，知られていないと申しあげてよいと思います．
それからどうして RhoC なのかということですが，これはなかなかむずかしいのです．
まずその背景に RhoA， B， C というものが，それぞれ異なった役割があるのか，あるいはredundant に働いているのかどうか，という問題があります．細胞内分布では，RhoA，B，C のうち，RhoB は細胞の中の小胞系にあり，ということを調べた報告は，私の知るかぎりendocytosis に関係しているということがいありません．私どもも扱っておりますのは大われていますが，RhoA と RhoC には，明確な半の場合 RhoA でして，とくに RhoC の機能差はないということになっています．またを調べたことがありませんので，ご質問の点

RhoA と同様に RhoC も活性化体を発現させはこれからの研究テーマとして残っているとますと stress fiber を形成します．このことか考えています．

ら，RhoA と RhoC は comparative な 作 用 を

北川雄光（慶應大） 臨床からのち ょ っ と持っているだろうといわれています．それでcrude な質問で申しわけないのですが，細胞はどうしてがんで RhoA ではなくて RhoC な骨格との転移の関係を考えた場合に，最初ののかということですが，これはわかりません．

ステップとして，たとえば肺の毛細管に白血

Rho 遺伝子の制御に関する promotor 領域は球と同じようにがん細胞が行きますと，当然調べられていませんので，ひょっとすると，細胞のほうが径が大きいわけですから，そこ

RhoC 遺 伝 子 の promoter に 何 ら か の onco-

でメカニカルなストレスを受けると思うのでgene が発現した時に働くような element がす．その場合に，こういう細胞骨格に逆にメ乗っているという可能性もあるだろうと考えカニカルストレスが起こった時にどう反応すます．

るかという観点で，この Rho との関係は何か

釜井隆男（獨協医大） 私どもも Rho の A，B，C の primer を設定して，RT-PCR 法を行っわかっておりますでしょうか．
座長

メカニカルストレスとの関係では，て泌尿器科の種々のがんをいろいろ調べまし心筋細胞を用いた実験があります．心筋細胞た．それで，たとえば精巣腫瘍では早期の段を elastic な基質の上に培養して，基質を引っ階にリンパ行性にリンパ節に転移するのです

張るとメカニカルストレスが生じますね．そが，これを調べたところ Rho の A しか発現しういう時に Rho が活性化されるという報告ていないのです．B と C は発現していま せがあります．次の点は，血管の内皮と結合しん．一方早期に血行性に転移するものとして接着が始まった時に Rho が活性化されるか腎細胞がんが多いのですが，こちらは A，B，ということです．Rho の活性化は LPA のようC すべて発現するのですが，どうもやはり Cな soluble なファクターと同時に，細胞外基が多いようなのです．先ほどの先生と同じよ質に接着し，それからシグナルが入ることにうな質問になるかと思いますが，転移というよって活性化されることもあるのです．細胞場合には，血行性あるいはリンパ行性が考え外基質によって活性化されて，その Rho がまられると思いますが，やはりその A，B，Cた基質への接着を亢進するといった増幅反応の機能，あるいは分布というものに何か dif-が起こるようです．
つまり，先生がおっしゃっferenceがあるのかどうか伺いたいと思います．

たような状況下では二つのことが考えられる

座長

ただ今も申しましたように，Rho のと思います．一つはストレッチによ る Rho

研究者は結構多いのですが，やっていますの活性化と，もう一つは細胞間同士の間での情はほとんどが RhoA でありまして，RhoA と報のやりとりによる活性化があると考えられRhoC で，本当に何か差異があるのかどうかるかと思います．

がん転移研究の新しい展開―分子研究から臨床へ― 25