技術紹介

ジーエルサイエンス株式会社

スピンカラムを用いた簡便迅速試料前処理
MonoSpin のアプリケーションと使用方法のコツのご紹介

太 田

1 は じ め に
各種クロマトグラフィーで分析を行う際，気体，固茂 徳，古 庄

義 明長と，アプリケーション，使用方法のコツについて紹介する．

体，液体問わず，適切な試料前処理を実施した後に，機2 MonoSpin の特長

器へ試料を導入する必要がある．近年は分析機器，特にシリカモノリスディスクを分離媒体として使用してい質量分析計の感度の向上に伴い，より簡便な試料の前処

るスピンカラム MonoSpin は，サンプリングの量が限ら理法が求められている．生体試料分析時において，試料れている生体試料などの前処理を迅速，簡便に処理するに有機溶媒を適量添加することよって実施する除タンパための固相抽出カラムとして開発された．シリカモノリ

ク法や，ミニカラムを用いた精製手法の一つである固相スの特長である，高速通液時においても優れた分離，保抽出においても，ターゲット化合物を固相充填剤へ吸着持性能を有する点を生かし，高速通液においても，対象後に，溶出する手法ではなく，ターゲット化合物を素通成分を安定に保持できるようにデザインされている．シ

りさせる，クリーンアップによる簡便な前処理を採用す

リカモノリスディスクを用いることで，スピンカラムをるケースも増えている．また，クロマトグラフィーにお作製する際，充填剤をフリットで挟み込む必要がなくなける分析時間の短縮に伴い，前処理に対しても迅速性，り，より微量サンプルを処理する際に問題となるデット

微量，微小容量，多検体サンプルへの適応といった，新ボリュームを減らすことが可能になっている．使用してしい要望を受けるケースが増えている．一方で，質量分いるシリカモノリスディスクの体積は約 20 μL 程度で析計を検出器として用いる場合においては，上記簡便なあり，回収時の溶出液量も少なく抑えることが可能であ

前処理では排除がされないサンプルマトリックスがターる（図 2）．そして，固相抽出の工程を全て短時間の遠ゲット化合物と共溶出することによるイオンサプレッ心分離により実施することが可能である（図 3）．

ションが，分析精度に影響を与える場合が報告されてい1）

シリカモノリスの表面は通常のシリカゲル同様にシラる ．そのため，これまでの前処理用製品，固相抽出製ンカップリング剤での修飾が可能であり，逆相用の官能品とは異なる，新たなツールが望まれている．

基である C18 や，イオン交換基，アフィニティ担体なジーエルサイエンスではこれまでに，シリカモノリス

ど様々な官能基が修飾された 17 種類のラインナップをを用いた試料前処理，HPLC 用カラムの開発を行って有している．これまで MonoSpin を用いた様々な前処理きた．シリカモノリスはシリカの骨格と細孔が一体化さが開発されており2）～6），今回その一部を紹介する．

れた構造を有し，それぞれの構造を独立して制御することが可能であり，これまで分析化学の分野において様々応用が検討されてきた（図 1）．
本技術紹介ではその中でも，微量サンプルを簡便に前処理可能な固相抽出スピンカラムである MonoSpin の特コンディ 吸着
ショニング
図 1 シリカモノリスディスクの構造24

図2MonoSpin の構造

洗浄

溶出

遠心操作による処理

図 3 MonoSpin 遠心での使用
ぶんせき 2022 1

表13 MonoSpin の使用方法例
3･1 ペプチドサンプルの脱塩

MonoSpin C18 を用いたペプチドの回収例

工程

溶液

コンディショニング

プロテオミクス解析において調製されるタンパク質の液量

アセトニトリル

200 μL

0.1％ TFA 水溶液

200 μL～ 800 μL

消化物には，処理に用いている高濃度の塩や，変性剤，アプライ還元剤が含まれている．これらが入った状態のまま LC/洗浄

0.1％ TFA 水溶液

200 μL

溶出60％ アセトニトリル

200 μL

MonoSpin C18 を用いることで，これらの塩を効果的に遠心力 2300 × g，遠心時間 1 min

MS へ試料を導入することは避けなければならない．
除去し，ペプチドを回収することが可能である．
使用方法は表 1 に記載している内容を参考に実施する．
図 4 は MonoSpin C18 により BSA 消化物を脱塩した際のクロマトグラムを示す．上段のクロマトグラムでは，タンパク質の還元アルキル化に使用した高濃度の塩が確認されるが，MonoSpin C18 により脱塩を行うことで，塩を除きつつ，ペプチドが回収されていることが分かる．
対象分子量としては，1 万以下が主な対象となるが，比較的高分子量のタンパク質に対しても適応することは可 能 で あ る． 負 荷 量 の 参 考 と し て は 消 化 物 と し て500 μg 程度のペプチドを回収，精製することが可能であ る． 高 分 子 量 の タ ン パ ク 質（ 例 え ば BSA 等 ） は30 μg 程度までと，負荷量が異なるため，適用する試料に応じて確認することを推奨する．

3･2 カテコールアミンの精製
生体試料中のカテコールアミンの濃度は非常に低濃度
きょうざつでありかつ，多くの夾雑成分を含む状態からの検出が求められる．検出器としては，UV の他，高感度検出が可能である電気化学検出器や，近年では質量分析計も用いられている．カテコールアミンは構造にシス型ジオールを有している．フェニルホウ酸基が修飾された MonoSpin PBA はシス型ジオールを有する化合物を選択的に保持させることが可能であるため，カテコールアミンの精製に効果的である．使用方法は表 2 を参考に実施する．
図 5 には MonoSpin PBA を用いたカテコールアミンの精製結果について記載する．上段のクロマトグラムは未精製の尿サンプルを電気化学検出器で検出した結果を示す．比較的選択性の高い電気化学検出器ではあるが，多数の夾雑成分が確認される．MonoSpin PBA を用いることでカテコールアミン類のみを保持，精製することが可能である．その際，サンプルのアプライ量と，溶出液量を調製することで，サンプルを濃縮しながら回収することが可能である．カテコールアミンのような分解性が懸念される化合物は濃縮乾固などの操作を繰り返すこと

図4

MonoSpin C18 を用いたペプチドの脱塩は望ましくない．MonoSpin を用いることで，濃縮乾固を行うことなく，対象成分を濃縮することが可能である．
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表2

MonoSpin PBA を用いたカテコールアミンの精製例
溶液

液量

コンディショニング 1．1％酢酸水溶液

工程

200 μL

2．100 mM リン酸緩衝液（pH8）200 μLアプライ

尿または血清200 μL

洗浄

100 mM リン酸緩衝液（pH8） 200 μL

溶出1％酢酸水溶液＋1 M リン酸緩衝液（pH8） 50 μL

200 μL遠心力 10000 × g，遠心時間 1 min

表3

MonoSpin ProL を用いた低分子抗体の精製例

工程

溶液

液量

コンディショニング 50 mM リン酸ナトリウム緩 500 μL
衝液＋150 mM NaCl（pH7.0）
アプライ

試料（pH7 付近に調整）

洗浄

50 mM リン酸ナトリウム緩 500 μL
衝液＋1 M NaCl（pH7.0）

500 μL

溶出

100 mM グリシン─ HCl 緩衝 500 μL液（pH2.5）

遠心力 2300 × g，遠心時間 1 min

図6MonoSpin ProL を用いた低分子抗体の精製には上記メソッドを実施するのに必要な溶媒類が同梱されている．溶出時には回収用チューブにあらかじめ中和用バッファーとして 1M Tris ─ HCl（pH8.5）を溶出液の
図 5 尿中カテコールアミンの前処理例

1/10 量入れておくことで，酸により回収された抗体を瞬時に中和することが可能である．酸に対して耐性の低い抗体についても変性のリスクを軽減することが可能で3･3 ProteinL 固定化カラムによる低分子抗体の精製

抗体精製用のリガンドとして ProteinA や ProteinG を修飾した MonoSpin ProA，MonoSpin ProG は抗体を迅速精製するためのスピンカラムとして利用されている．
MonoSpin のコンセプトである微量溶出も可能であるこある．
図 6 には MonoSpin ProL を用いて低分子抗体を精製した結果を記載する．
培養液中に含まれる Fab 抗体は左のクロマトグラムの通り，多量の夾雑成分を含むことが分かる．Mono-とから，精製後の濃縮が難しい抗体サンプルを濃縮しなSpin ProL を用いることで，これらの夾雑成分を排除しがら精製を行うことが可能であり，特に抗体濃度が薄いつつ，抗体濃度を下げることなく，回収することが可能場合や，微量な場合の処理に効果的である．今回新たである．に，ProteinL を精製用リガンドとして開発した Mono-Spin ProL を紹介する．MonoSpin ProL には㈱カネカか4 MonoSpin の上手な使い方

ら販売されている KANEKA KanCap L に使用されていMonoSpin に使用されているシリカモノリスのスルーるリガンドが固定化されており，MonoSpin のコンセプ

ポアは，迅速に前処理を行うことを目的に，一般的に使トである微量溶出も可能な低分子抗体精製用のスピンカ用される固相抽出カラムに使用しているゲルに比べて，ラムになっている．使用方法は表 3 を参考に実施する．

粒子径にあたる骨格径を小さく設計している．そのた同製品（抗体精製用の MonoSpin ProA, ProG, ProL）

め，通液性の高いシリカモノリスではあるが，固形物を26

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有している試料をそのまま処理するのは困難である．そのため，固形物を有するサンプルや，粘性の高いサンプルを処理する場合には，アプライ時に適宜希釈もしくはフィルトレーション後の試料を用いることを推奨している．フィルトレーションが難しい場合には，試料をあらかじめ 10000×g で 1 分間遠心した上清を用いることで，良好なサンプル処理を行うことが可能になる．特にけっしょう

血漿や血清などの試料においては，見た目に固形物や浮遊物が見えなくても，遠心処理を行ったサンプルを用いることで，処理効率の改善が期待できる．
また，スピンカラムにはふたがついているが，使用時にふたを閉めてしまうと，遠心時にカラム内が陰圧になってしまうため，スムーズな通液ができない場合があ

文献

1） M. Villagrasa, M. Guillamón, E. Eljarrat, D. Barceló : J. Chromatogr. A, 1157, 108（2007）.
2） A. Namera, A. Nakamoto, M. Nishida, T. Saito, I. Kishiyama,

S. Miyazaki, M. Yahata, M. Yashiki, M. Nagao : J Chromatogr.
A., 1208, 71（2008）.
3） T. Saito, R. Yamamoto, S. Inoue, I. Kishiyama, S. Miyazaki, A.
Nakamoto, M. Nishida, A. Namera, S. Inokuchi : J Chromatogr
B Analyt Technol Biomed Life Sci., 867, 99（2008）.
4） S. Miyazaki, T. Yamada, S. Ota, T. Saito, A. Namera, M. Ohira : BUNSEKI KAGAKU, 59, 213（2010）.
5） M. Tsunoda, C. Aoyama, S. Ota, T. Tamura, T : Funatsu Analytical Methods, 3, 582（2011）.
6） S. Ota, Y. Yui, T. Sato, N. Yoshimoto, S. Yamamoto : Analytical Sciences, 37, 985（2021）.
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太田茂徳（Shigenori Ota）

る．そのため，すべての工程において，遠心時にはふたジーエルサイエンス株式会社（〒 358 ─を閉めずに使用することが推奨される．

0032 埼玉県入間市狭山ケ原 237 ─ 2）．
山口大学大学院創成科学研究科．修了．

使用方法に関しては，Web の動画でも確認すること

博士（生命科学）．《現在の研究テーマ》ができるため，初めて使用される際は是非確認すること

各種生体試料の簡便前処理法の確立．《趣を推奨する．

味》サッカー．
E-mail : sig-ota@gls.co.jp

5 まとめと展望
本稿ではクロマトグラフィーの前処理として，簡便に使用できるスピンカラム型固相抽出カラム

古庄義明（Yoshiaki Furusho）

MonoSpin

ジーエルサイエンス株式会社（〒 163 ─を紹介した．これまで固相抽出を用いたことがない場合

1130

東 京 都 新 宿 区 西 新 宿 6 ─ 22 ─ 1）．

においても，再現性高くサンプルを処理することが可能

岡山大学大学院自然科学研究科修了．博である．処理可能な分離モードも様々ラインナップして士（理学）．《現在の研究テーマ》高選択いるため，用途に応じて選択いただきたい．

分離剤を用いた微量元素分析手法と評価．
《趣味》英語原書読書，字幕無英語ドラマ鑑賞，ゴルフ．
E-mail : furusho@gls.co.jp

会社ホームページ URL：
ジーエルサイエンス株式会社ホームページ
https://www.gls.co.jp/
関連製品ページ URL：

MonoSpin 使用方法（動画付）https://www.gls.co.jp/technique/lifescience/monospin/index.html

MonoSpin 使用方法例

https://www.gls.co.jp/technique/lifescience/monospin/application/index.html

ぶんせき 2022 1

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