細胞増殖制御技術による光合成的芳香族生産
神戸大学

先端バイオ工学研究センター
教授 蓮沼 誠久
2024年3月7日

1

藻類によるバイオものづくりへの挑戦

藻類は理想的なバイオマス
Arthrospiraplatensis（タンパク質生産）

Synechocystis sp.
PCC6803（コハク酸生産、D- 乳酸生産）

太陽光エネルギー

Synechococcus sp.
PCC7002（プラスチック生産）➢神戸大で培養の最適化実績有

CO
CO
22
生物学的炭酸固定

Pavlova sp.
（フコキサンチン生産）
Chlamydomonas sp.
（オイル、デンプン生産）

利点１．CO2から直接モノづくりができる➢ 陸生バイオマスを原料とする問題（発酵前処理の必要性，収穫時期の制約，耕作地との競合）を回避できる

利点２．淡水資源が不要✓ 機能性素材（色素など）✓ バイオベース化学品✓ バイオ燃料

藻類スマートセル2開発されてきた藻株
Calipatria, California,
USA

Fucoxanthin

Pavlova sp. OPMS30543
Kanamoto et al. (2021) Marine Biotechnol. 23, 331
Yoshida et al. (2023) Algal Res. 72, 103144

Astaxanthin

Oil (TAG)

Biodegradable
plastic
Chlamydomonas
sp. JSC4Synechococcus sp. PCC7002
Hasunuma et al. (2019) ACS Synth. Biol. 8, 2701-2709

1 um

200 nmOutdoor cultivation (50 m2)

バイオマスエネルギー技術研究開発／
戦略的次世代バイオマスエネルギー利用技術開発
事業／海洋性緑藻の油脂生産技術の研究開発
受託期間；H24-27
研究代表者；蓮沼誠久（神戸大学）
1 um
200 nmKato et al. (2021) Commun. Biol. 4, 450

3

パブロバの商用大規模生産設備

Tube-type Photobioreactor (8 ton) @ Okinawa, JAPANhttps://pavlova.jp/photobioreactor/4

従来技術とその問題点
光エネルギーを利用したCO2からの直接物質生産が可能
アルコール
代謝改変

有機酸

脂肪族化合物

脂肪酸CO2CO2ラン藻ProductTiter

Productivity

Ethanol

2.3 g/L

11 mg/L/h

Isopropanol

0.2 g/L

0.6 mg/L/h

1,3-PDO

0.3 g/L

0.9 mg/L/h

Isobutanol

0.6 g/L

2.9 mg/L/h

2,3-BDO

3.0 g/L

13 mg/L/h

Lactate1.1 g/L

11 mg/L/h

3-HP

0.8 g/L

5.8 mg/L/h

Fatty acids

0.13 g/L

0.3 mg/L/h

Limonene

0.004 g/L

0.04 mg/L/h

Caffeic acid

0.0007 g/L

0.01 mg/L/h

Oliver et al., 2016 Curr. Opin. Chem. Biol.

イソプレノイド

なぜ生産量が上がらないのか？
⇒生産が対数増殖期のみで起こるため
5

新技術の特徴➢ 「物質生産特化型」ラン藻の開発による光合成的芳香族生産
ラン藻S. elongatus

増殖に伴う自己遮蔽により細胞の受光量が低下
CO2
分裂制御なし細胞数

細胞増殖

遺伝子発現誘導(ppGpp蓄積)

分裂制御あり時間
細胞分裂制御技術
対数増殖期で細胞分裂を止める一方、光合成による炭素同化と代謝を止めずに芳香族アミノ酸を生産する (特開2020-191851)

物質生産

物質生産特化型ラン藻
CO2

物質生産

✓ 光エネルギーとCO2を物質生産のみに使う✓ 自己遮蔽効果が小さい密度を維持する➢ 光合成微生物では、ppGpp蓄積が細胞増殖を停止させるメカニズム、光合成に及ぼす影響、代謝に及ぼす影響、などは不明であった
6

新技術の特徴
光合成微生物

Synechococcus elongatus PCC7942

⚫
⚫
⚫
⚫

高い増殖速度（4.9 h Doubling time)
遺伝子組換え可モデル生物としての知見が集積
発現誘導の調節が容易

Ptrc

ppGpp合成遺伝子5’-NSI

Synechococcus 7942 Genome3’-NSI

Cell number

ppGpp

0.15

2.5E+09
2.5

IPTG(+)

0.10

IPTG(-)(109 cells/mL)

GDP + ATP(μmol/g-DCW)

ppGpp
2.0E+092
1.5E+091.5
1.0E+09
10.05

IPTG(-)

IPTG(+)

0.5
5.0E+08
0.0E+00

004896144

Time (h)19224004896

144192240Time (h)ppGpp合成遺伝子の誘導により、ppGppを蓄積させ、細胞分裂を停止させることに成功
7新技術の特徴
IPTG(-)RuBP

IPTG(+)

13CO
23PGA

13C fraction (%)

10080

IPTG(+)
IPTG(-)

60

5 μm4020

CO2固定が継続し、細胞サイズが増大することを発見した特徴① 分裂停止後も代謝活動は継続する

0960 1026 108
12 11418 12024Time (h)Phenylalanine

Tyrosine
30IPTG(+)

21IPTG(-)

0(mg/L)(mg/L)

43

IPTG(+)

特徴② 芳香族アミノ酸（特にチロシン）を多く細胞外に放出することを発見した

IPTG(-)→ 芳香族バイオプラスチック原料の生産に適している

20
10072

5 μm

96120 144 168

Time (h)7296 120 144 168
Time (h)8新技術の特徴
研究の狙い：ppGppによる制御メカニズムの理解を深め、「物質生産特化型」ラン藻を構築し、芳香族化合物（特にチロシンとp-クマル酸）を生産する

ppGppによる分裂制御
CO2

チロシン
p-クマル酸物質生産特化型ラン藻✓ 対数増殖期で細胞分裂を停止させる✓ 光エネルギーとCO2を物質生産のみに使う

様々な芳香族
バイオプラスチック原料

スチレン

ヒドロキシスチレン アミノ安息香酸

ヒドロキシ安息香酸

ムコン酸

テレフタル酸本研究のゲームチェンジング性
ラン藻の細胞周期、細胞増殖の理解と制御に基づく物質生産能力の向上（従来、物質生産は代謝経路や代謝制御の改変に依存してきた）
9新技術の特徴p-クマル酸は有用芳香族生産におけるハブ化合物
10新技術の特徴
細胞分裂が停止している期間
p-Coumaric acid (mg/L)

140

ppGpp合成酵素遺伝子(+)+ TcXAL(+)

120
100

分裂停止後も、p-クマル酸は生産され続ける

80601mM
IPTG

402000124248372496

5120Time (h)6144716881929216

光独立培養で世界最高レベルのp-クマル酸生産に成功した（最大392.3mg/L）

TcXAL遺伝子の導入によりチロシンからp-クマル酸を合成できることを見出し、分裂停止細胞においてp-クマル酸を生産することに成功した
ムコン酸、ヒドロキシスチレン、フェルラ酸も世界最高値を達成した11新技術の特徴✓ ppGppの蓄積誘導によりグリコーゲン蓄積が促進することを見出した

CO2

Glycogen
3PGARuBP

CBBcycle
E4P

PEP

IPTG(+)

50

IPTG(-)

IPTG(+)

グリコーゲン粒(%)

40F6P30

IPTG(-)

2010072120168

500 nm

500 nm216

Time (h)Tyr Phe Trp【課題】 炭素リソースが芳香族生産以外に多く使用されている➢ グリコーゲン蓄積を解消することで芳香族アミノ酸生産が向上するか検証した
ΔglgC

Wild type60

200 nmGlycogen content (%)

グリコーゲン粒

Wild type5040302010ΔglgC

200 nm00246810Time (d)12新技術の特徴
細胞分裂制御の応用①（さらなる高生産、他の分子種への拡張）
Tyrosine

Phenylalanine(mg/L)

15105002468103ΔglgC2(mg/L)(mg/L)

ΔglgC

105046Time (d)468100281087654321046810Time (d)Phenylalanine

2021Time (d)Tyrosine

01.500251520.5Time (d)ppGpp合成酵素遺伝子
(-)

ΔglgC

2.5Tryptophan
32.5(mg/L)(mg/L)

ppGpp合成酵素遺伝子
(+)

ΔglgC

20876543210(mg/L)

25Tryptophan

ΔglgC2ΔglgC

1.5
10.500246Time (d)8100246810Time (d)✓ グリコーゲン欠損により、アミノ酸の放出が向上した（ppGpp誘導の有無に限らず）✓ グルタミン酸は著量生産した(特開2024-008564、Kato et al. Commun. Biol. in press)13新技術の特徴
細胞分裂制御の応用②（細胞の巨大化）
FtsZ

FtsZ-LAAが細胞を巨大人為的細胞分裂制御に向けて ー コ ン スト ラ ク ト化させることを発見した(Ghigo et al.
Mol. Microbiol. 1999)

厳密に発現制御する ための分解タ グ
Ptrc
NS2ftsZ
NS2

NSII::Ptrc_ftsZ_LAA
IPTG

AANDENYSENYALAA(ssrA： 分解タ グ )+0 3 24 0 3 24 (h)1501007510IPTG
FtsZ_LAA
FtsZ

OD750

15037-

巨大細胞は速やかに沈殿した
0.1+

0.01-242472120

168

Time (h)→ 培養液からの細胞回収を容易にする技術を開発した（特開2023-111439）

216

264

α-FtsZ
FtsZ: 40.6 kDa
FtsZ_LAA: 42.2 kDa
14

新技術の特徴
芳香族回収技術の検討
3304 mg/L（膜抽出あり）

1045 mg/L（膜抽出なし）培養液から生産物を連続抽出

膜抽出システムを用いることで、微生物培養液から毒性のある化合物を連続抽出する技術を開発。
酵母によるバイオフェノール生産量を3倍向上させることに成功15

想定される用途• CO2を原料とした物質生産• バイオマス、糖質、脂質をフィードストッ
クとしない物質生産• プラスチック原料、エンプラ原料、ナイロン原料、高機能性素材原料の市場への供給• バイオものづくりは地球規模課題の解決と経済発展の共存に貢献する
16実用化に向けた課題• 物質生産特化型細胞の構築には成功。
• 代謝改変を利用した生産経路の最適化によるターゲット物質の生産量の更なる向上を行う段階にきた。
• 今後、実験データを充実させることで、生産特化状態を長時間持続させる培養条件の検討が必要。
• 実用化に向けて、スケールアップ技術を確立する必要もあり。
17

企業への期待• 実用化に向けた、培養検討、スケールアップ試験のデータ取得。
• 培養技術を有する企業との連携を希望。
• CO2からのモノマー生産を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。

18

本技術に関する知的財産権
••
•
•

発明の名称
出願番号
出願人
発明者

：芳香族化合物を生産する方法：特願2019-101419：神戸大学：蓮沼誠久、蘆田弘樹、大林龍胆

•
••
•

発明の名称
出願番号
出願人
発明者

：環境負荷の低い物質生産方法：特願2022-13299：神戸大学：蓮沼誠久、蘆田弘樹、大林龍胆、秀瀬涼太、稲邊宏輔•
•
•
•

発明の名称
出願番号
出願人
発明者

：アミノ酸および／または有機酸を製造する方法：特願2022-110536：神戸大学、静岡大学：蓮沼誠久、加藤悠一、秀瀬涼太、蘆田弘樹、大林龍胆
19産学連携の経歴• 2011年-2014年 JSTさきがけ事業に採択• 2012年-2016年 NEDOバイオマスエネルギー技術開発事業に採択• 2016年-2019年 内閣府ImPACT事業に採択• 2016年-2021年 NEDOスマートセルプロジェクトに採択• 2016年-2020年 ASTEPシーズ育成タイプに採択• 2019年- JST未来社会創造事業に採択• 2023年- JST革新的GX技術創出事業に採択（分担）20

お問い合わせ先
神戸大学
研究推進部連携推進課知財グループ
ＴＥＬ ０７８ - ８０３ – ５９４５
ＦＡＸ ０７８ - ８０３ – ５３８９e-mail ksui-chizai@office.kobe-u.ac.jp

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