日大歯学 , 94（2）, 73-78, 2020

原著

ラット下顎角骨欠損モデルにおける
fibroblast growth factor-2 添加コラーゲンメンブレンの骨造成に及ぼす影響
古 畑 光 昭1
小 澤 康 正2

髙尾
1

山崎

忠
愛妹佐尾
藤一
秀輝1
一 2,4

山

本崇申2

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻応用口腔科学分野
2

日本大学歯学部歯科保存学第Ⅲ講座
3

4

裕 2,4
美 3,5

日本大学歯学部衛生学講座

日本大学歯学部総合歯学研究所高度先端医療研究部門
5

日本大学歯学部総合歯学研究所機能形態部門

要旨：骨再生誘導（guided bone regeneration；GBR）法を骨欠損エリアに対して臨床応用することは多くの臨床研究によって裏付けられた実用性のある術式として認識されている。今回，GBR 法に用いられるコラーゲン膜に成長因子である線維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor；FGF）-2 を添加した新規骨再生システムを開発するた
めに，ラット下顎角骨欠損モデルを用いて骨造成に及ぼす影響について検討した。実験には，10 週齢の雄性近交系
ラット （F344/jcl）を用い，その下顎角に内径 4.0 mm のトレファインバーを用いて，下顎角骨欠損モデルを作製した。欠損のみ（control 群），欠損をコラーゲン膜で被覆（collagen membrane；CM 群），CM に FGF-2 を 0.5μg もしくは 2.0μg 添加（FGF-2 群）し，欠損を被覆した。術後 6 週において，実験動物用 3 D マイクロ CT（マイクロCT）によるエックス線学的観察および H.E. 染色による蛍光顕微鏡下で組織学的観察を行った。マイクロ CT 像から
control 群および CM 群と比較し，FGF-2 群で骨欠損部に骨様組織の造成を認めた。また，組織学的観察から
FGF-2 群では，骨芽細胞，破骨細胞および血管新生が確認された。以上のことから，ラット下顎角骨欠損モデルにおいて FGF-2 添加コラーゲン膜は骨造成を顕著に促すことが示唆された。
キーワード：FGF-2，骨造成，コラーゲン膜，ラット下顎角骨欠損モデル

A collagen membrane with adjunct fibroblast growth factor-2 accelerates boneregeneration in rat mandibular bone defects
Mitsuaki Furuhata1, Tadahiro Takayama2,3*, Motoki Senoo1, Takanobu Yamamoto2,
Yasumasa Ozawa2, Manami Ozaki4,5, and Shuichi Sato2,31Division of Applied Oral Sciences，Nihon University Graduate School of Dentistry，Tokyo，Japan2

3Department of Periodontology，Nihon University School of Dentistry，Tokyo，Japan

Division of Advanced Dental Treatment，Dental Research Center，Nihon University School of Dentistry，Tokyo Japan
45Department of Oral Health Sciences，Nihon University School of Dentistry，Tokyo，Japan

Division of Functional Morphology，Dental Research Center，Nihon University School of Dentistry，Tokyo，Japan

Abstract: Purpose: Guided bone regeneration using a collagen membrane (CM) with grafting materials iscommonly performed to increase the bone volume of the alveolar ridge in areas with insufficient bone.
Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) is known to regulate the proliferation and differentiation of osteoblasts,
resulting in the promotion of bone formation. This study aimed to investigate the effects of bone healing inrat mandibular bone defects with CM with adjunct FGF-2 (CM/FGF-2).
Methods: We used 10 rats that received surgery in both sides of the mandible, and created the total 20
defects which were divided into 4 groups: Group 1；no treatment, as a control, Group 2；CM alone, Group 3；
CM containing low dose 0.5 µg of FGF-2, and Group 4；CM containing high dose 2.0 µg of FGF-2. Newly
formed bone was evaluated by micro computed tomography (micro-CT) and histological analyses at 6 weeks
postoperatively. In quantitative and qualitative micro-CT analyses of the volume of new bone formation,（受付：令和 2 年 8 月 12 日）
責任著者連絡先：髙山忠裕
日本大学歯学部歯科保存学第Ⅲ講座〒 101‒8310 東京都千代田区神田駿河台 1‒8‒13

TEL：03-3219-8107
FAX：03-3219-8394
E-mail：takayama.tadahiro@nihon-u.ac.jp

73

日大歯学

第 94 巻第 2 号

bone density, and percentage of new bone area was evaluated.
Results: CM/FGF-2 significantly increased and accelerated bone volume, bone mineral density, andpercentage of new bone area compared to CM alone and control at 6 weeks after surgery. Besides, wefound osteoblasts, osteoclasts, and blood vessels within the newly formed bone in CM/FGF-2 groups.
Conclusion: Based on the results of the present study, it could be concluded that CM/FGF-2 leads tosignificantly new bone formation compared with the CM alone and control groups after 6 weeks of healing.
Keywords: FGF-2, bone regeneration, collagen membrane, rat mandibular bone defect model緒

臨界骨欠損を作製し，CM に osteogenic protein-1（OP-1）

言2.0μg を添加（CM/OP-1）し，その効果を実験動物用マイ

歯の欠損部位に対する予知性の高い治療方法として，

クロ CT（マイクロ CT）によって新生骨の体積，骨密度，歯科インプラント治療の選択が日常臨床において広く受割合および組織学的分析によって評価している。術後 8け入れられている。機能的ならびに審美的に適切な位置

週において CM/OP-1 群が CM 群と比較して，新生骨量，にインプラントを埋入する場合に，その部位に十分な骨骨密度，新生骨の割合において有意な増加を認めた。ま幅や骨の高さが不足しており骨形態の改善が必要となた，マイクロ CT 像では CM/OP-1 群において顕著な骨る。 そ の 際 に 応 用 さ れ る 骨 再 生 誘 導（guided bone造成を認めた。さらに，新生骨に関して組織学的解析を

regeneration；GBR）法 1,2）は，保護膜（バリアメンブレン）行った結果，既存骨と類似した構造を有する組織像としを使用し，欠損部位への軟組織の侵入を防ぐことで再生て観察された。そのため，CM/OP-1 は骨再生に有用なするスペースを確保する，いわゆるスペースメイキングユニットとなる可能性を示唆している。
その他にも，Takayama ら 7）は，stromal cell-derivedの役割を担い，歯槽骨形成に関与する細胞を選択的に誘導する方法である。

factor-1（SDF-1）添加コラーゲンメンブレン（CM/SDF-1）

バリアメンブレンの主要構成成分として，Ⅰ型コラーの効果を in vitro および in vivo にて検討した。その結ゲンを応用したものが日常臨床で頻用されている。コ

果，in vitro において CM 群と比較し，CM/SDF-1 群はラーゲンは，歯肉結合組織や骨組織の構成成分の一つで細胞増殖，ALP 活性，骨形成関連遺伝（I 型コラーゲン，あることから組織構造の恒常性を維持する要素として主Runx2，オステオポンチン，MSX2，Dlx5）の発現を有意な役割があり，組織の伸展性や安定性に寄与している 3）。に増加した。In vivo においてマイクロ CT によるエッまた，細胞遊走，細胞の増殖や分化，形態発生あるいはクス線学的検討を行ったところ，CM 群と比較し CM/創傷治癒時の組織リモデリングを調節している 3）。さらSDF-1 群において著明な骨造成が確認された。に，血餅保持や血管形成をサポートし，創傷部位へ線維そこで，著者らは骨造成量の更なる改善や骨造成に要芽細胞を遊走し治癒を促進することが知られている 4）。

する期間の短縮を実現するために，生体為害性のない新臨床面においては，加工成形しやすく取り扱いに優れて規成長因子の候補として，線維芽細胞増殖因子（fibroblast

いる点，生体内で吸収されることから膜除去のための二growth factor；FGF）-2 に着目した。FGF-2 は，血管形次手術の必要がなく，患者に対する外科的侵襲が軽減さ成の誘導および骨形成の促進作用を有する 8）。また，多れるという利点がある。また，近年ではコラーゲンメン

くの動物実験から FGF-2 が骨癒合を増進する能力があるブレン（collagen membrane；CM）やコラーゲンスポンことについて報告されており，正常および糖尿病誘発ジをスキャホールドとして，様々な成長因子と組み合わ

ラ ッ ト に お い て， 大 腿 骨 に 作 成 し た 骨 欠 損 に 対 し てせることにより新規骨再生ユニットを開発し，さらに効FGF-2 の 応 用 に よ り 治 癒 の 促 進 を 示 し た 9）。 さ ら に，率的な再生療法を検討する研究が数多く行われていFGF-2 は線維芽細胞のみならず創傷治癒に関連する血管る 5-7）。

内皮細胞や骨芽細胞の増殖 10）や，骨髄間葉系細胞を骨形

Jo ら 5）は，ラット頭頂骨に直径 8.0 mm の円形骨欠損成能を有する細胞へと分化誘導すること 11,12）も知られてを作製し，CM に bone morphogenic protein（BMP）-2いる。本邦においては，FGF-2 を使用した歯周組織再生や BMP-2 と BMP-7 を組み合わせて添加した際の骨再生剤が開発され，歯周病による骨内欠損に対して臨床応用に対する効果を術後 2，8 週の新生骨量の割合と組織学されている 13）。

的観察によって検討を行った。その結果，骨欠損に対し以上の背景を踏まえ，CM と FGF-2 を組み合わせるこて CM のみで処置を行った群（CM 群）と比較して BMP-2とで新たな骨再生ユニットを作製し，これが骨造成に効や BMP-7 を添加した CM 群で，統計学的に有意な骨造果的に働くのではないかと考えた。そこで，本研究では成を認めたことを報告している。

FGF-2 添加コラーゲンメンブレン（CM/FGF-2）がラット

Ozaki ら 6）は，ラット下顎角部に直径 4.0 mm の円形の下顎角骨欠損モデルにおける骨造成に及ぼす影響につい74

FGF-2 添加コラーゲン膜の骨造成の影響

れぞれの撮像データ画像と 0 日の撮像データ画像とを重てエックス線学的および組織学的解析により評価した。

ね合わせることで得られる差分（voxel 数）を骨体積の変材料および方法
1.

令和 2 年 12 月化量として計測した。骨欠損閉鎖率は，画像処理ソフト
ウェア ImageJ ver.1.51（National Institutes of Health,

実験動物

Bethesda, MD, USA）を用いて解析した。

本実験には，10 週齢の雄性近交系ラット 10 匹（F344/4.

jcl，日本クレア，東京）を使用し，ラット飼育環境は温組織学的解析

度 23℃，湿度 60%，12 時間の人工照明明暗サイクルのマイクロ CT 撮影を術後 6 週に行った後，骨欠損部位もと飼育を行った。飼育期間中ラット用 CA-1 粉末飼料と周囲組織を含む一塊として切り出し，10% 中性緩衝ホ（CLEA，日本クレア，東京）と水分摂取が自由にできるルマリン溶液にて固定した。その後，通法に従いパラフィ環境下で飼育を行った。また，実験前に 1 週間の予備飼

ン 包 埋 し， 厚 さ 5μm の 切 片 を 作 製 し，Hematoxylin育を行い全身状態が健康である事を確認した。実験プロ

Eosin（H.E.） 染 色 お よ び Tartrate-Resistant Acid

トコールは，日本大学歯学部動物実験委員会の承認（承Phosphatase（TRAP）染色を行い，蛍光顕微鏡下にて観認 番 号 AP14 DEN035，AP19 DEN013-2）の 下 で， 同 委察を行った。

員会のガイドラインに沿って行い，実験動物の苦痛軽減

5.

2.

統計学的分析
データは平均値と標準誤差で示した。ANOVA にて分および使用動物数の低減に努めた。

散性の検定を行った後，Tukey’sTest 法により群間比較ラット下顎角骨欠損モデル作製方法を行った。p 値が 0.05 未満のときに有意差ありとした。

ラットにイソフルランによる吸入麻酔を行った後，3種混合麻酔を腹腔内注射し全身麻酔を施した。出血のコ結ントロールと追加の局所麻酔として 1/80,000 希釈リドカインを 0.5 ml 注射した。手術野の下顎骨相当部を剃毛し

1.

果

臨床所見

無菌的に実験が行えるよう準備した。口角部から下顎角すべてのラットの施術部位に感染や炎症は認めず，術に至る皮膚切開を行い，咬筋を切断，翻転後に下顎骨骨後の経過は良好であった。また，飼育中の成長による体面が露出するように剥離した。下顎角，下顎後縁，下顎重変化は，いずれの群においても顕著な差を認めなかっ

下縁に囲まれた骨が厚い部位に内径 4.0 mm のトレファた。

インバーを用いて骨欠損を両側に作製した。BioMend（コ2.

エックス線学的観察所見

ラーゲン膜，白鵬，東京）を 5 mm × 15 mm サイズに調術 後 6 週 に お い て，control 群，CM 群 と 比 較 し，整し，fibroblast growth factor-2（FGF-2，バイオテック・FGF-2 群において骨欠損部に骨様組織の造成が認められラボ，東京）を実験直前に添加した。骨欠損作製後，術た。また，FGF-2［L］群に比べ，FGF-2［H］群において，野を生理食塩水にて洗浄し，欠損のみ（control 群），欠損をコラーゲン膜で被覆（collagen membrane；CM 群），
CM に FGF-2 を 低 用 量（low；L）0.5μg 添 加（FGF-2［L］群），FGF-2 を高用量（high；H）2.0μg 添加（FGF-2［H］群）の 4 群に分け，術野を被覆した。欠損部施術後，咬筋および皮膚を 5-0 吸収生縫合糸のオペポリックスにて縫合し，手術日を 0 日とし 6 週まで飼育した（図 1）。
3.

エックス線学的観察
ラットにイソフルランによる吸入麻酔を施し，術直後と 術 後 6 週 に 実 験 動 物 用 3 D マ イ ク ロ CT（ マ イ ク ロCT，R_mCT，リガク，東京）を用いて下顎骨欠損部位の 撮 影 を 行 っ た。 撮 影 条 件 は， 管 電 圧 90 kV， 管 電 流100μA，照射時間 17 秒，voxel size 30 × 30 × 30μmとした。得られたデータは，i-View-R（リガク，東京）を用いて 3 次元画像の構築および定量的評価を行った。骨
体積は，周囲組織および明らかな硬組織（既存骨）の放射線吸収度のピーク値をそれぞれ求め，その中間値が再生骨の放射線吸収度の下限であるとして定量した。実際の定量操作では，骨体積測定ソフトウェア（I-view imagecenter，北千住ラジスト歯科，東京）を用いて，8 週のそ

図175

ラット下顎角骨欠損モデルの作製方法

日大歯学

第 94 巻第 2 号

control 群と FGF-2 群にも有意な骨密度の増加が確認さ顕著な骨欠損の改善を認めた（図 2）。
新生骨量は，CM 群と比較し，FGF-2［H］群においてれた（図 4）。骨欠損閉鎖率については，CM 群と比較し，有意な新生骨の増加を認めた（p ＜ 0.05）。また，FGF-2［L］

FGF-2 群において有意な骨欠損閉鎖率を示した。また，群に比べ，FGF-2［H］群において新生骨の増加傾向を認

FGF-2［L］群と比較して FGF-2［H］群において顕著な差めた（図 3）。骨密度に関しては，CM 群と FGF-2［H］群（p ＜ 0.05）を認めた（図 5）。に お い て 統 計 学 的 有 意 差（p ＜ 0.05）を 認 め た。 さ ら に，

3.

組織学的所見
H.E 染色像では，FGF-2 群において，新生骨内に骨細胞を認めるとともに，新生骨周囲に骨芽細胞，前駆骨芽細胞，破骨細胞，新生血管が観察された（図 6）。また，
TRAP 染色では，FGF-2 群において破骨細胞の存在を認めた（図 7）。

図2マイクロ CT 像（bar ＝ 1 mm）

図4

骨密度

図3

新生骨量

図5

骨欠損閉鎖率76

FGF-2 添加コラーゲン膜の骨造成の影響

考

令和 2 年 12 月

研究は，Zellin と Linde14）や Hong ら 15）の頭蓋冠骨欠損

察モデルと比較し，下顎角骨欠損モデルを使用したため，

本研究では，ラット下顎角骨欠損モデルとしてラット骨形態や筋肉の走行など解剖学的側面は実際の歯科臨床

下顎骨に直径 4.0 mm の円形骨欠損を作製し，control 群，と類似した環境での FGF-2 の効果を検討することができ

CM 群，CM に FGF-2 を低用量として 0.5μg（FGF-2［L］た。また，骨欠損の大きさや部位は異なるが，本研究に群），高用量として 2.0μg（FGF-2［H］群）を添加し，術後おいても FGF-2［H］群において骨欠損部の完全な閉鎖を6 週後の骨造成の効果を検討した。その結果，マイクロ認めたことから FGF-2 投与量は至適用量であったと考え

CT 像から control 群および CM 群と比べ，FGF-2［L］群られる。

および FGF-2［H］群において骨様組織の増加を認め，新FGF-2 の骨形成に関する作用は，骨形成タンパク質が生骨量においても有意な増加を認めた。また，FGF-2［H］

有する骨誘導能はなく，適切な環境下において血管新生群では，骨欠損部は骨様組織によって完全に閉鎖しておの誘導や骨芽細胞の増殖に寄与し，骨形成の促進因子とり，FGF-2［L］群より骨造成を促進することが確認されしての役割を果たしている 16）。一方，FGF-2 の至適量をた。また，それは FGF-2 の用量依存的に増加する傾向が越える使用は，骨格外側方向への過剰な骨形成を引き起示された。さらに，CM/FGF-2 によって造成した新生骨こす副作用があることが報告されている 17）。本研究におは，組織学的に既存骨と類似した構造を示した。

いては，FGF-2［L］群，FGF-2［H］群の施術部位においてZellin らは，ラット下顎角部にラウンドバーで直径外側方向への過剰な骨造成は認められなかった。さらに，5.0 mm の円形骨欠損を作製し，吸収性コラーゲンスポ実験期間中におけるラットの体重変化はいずれの群におンジに FGF-2（10 ng，100 ng，1μg）添加 後に，非吸収いても有意差は認めなかった。このことから，本研究で性の e-PTFE 膜にて被覆し FGF-2 適用による骨再生の用いた FGF-2 の用量は妥当な範囲内と考えられる。

14）

影響について術後 12 および 24 日における骨欠損治癒状

次に，FGF-2 群における新生骨の組織学的特徴につい態に関してエックス線学的ならびに組織学的に評価をて蛍光顕微鏡下で観察した。H.E. 染色および TRAP 染行った。その結果，術後 24 日において FGF-2 添加群で色を行った結果，骨芽細胞，前駆骨芽細胞，破骨細胞お著明な骨造成を認めたが，新生骨量は高濃度に比較してよび成熟した骨組織内には骨細胞が認められたことか低濃度で有意であったと報告している。Hong ら 15）は，ら，正常な骨リモデリングが行われていることが示唆さラット頭蓋冠に直径 5 mm の骨欠損を作製し，コラーゲれた。また，FGF-2 の作用と考えられる新生血管形成もンとナノバイオアクティブガラスで合成した新規ハイブ確認することができた。骨形成や恒常性に血管の存在はリッドメンブレンに FGF-2（50μg/ml）を添加し，骨欠損必須であり 18），FGF-2 の作用と思われる血管形成が確認の回復に及ぼす影響を術後 3 週において組織形態学的観されたことは，骨欠損内の骨造成にポジティブな影響を察を行った。その結果，欠損のみのコントロール群にお与えた可能性が示唆される。

ける新生骨量は 4%，骨欠損閉鎖率は 20% であったのに以上のことから，エックス線学的および組織学的に，対して，FGF-2 添加群では，それぞれ 20% および 90%

CM/FGF-2 は control 群や CM 群に比較して骨造成を促を示したことから，この新規ハイブリッドメンブレンと進し，FGF-2［H］群において有意差を認め，また FGF-2

FGF-2 の相乗的効果により骨再生が促進したと結論付けの用量依存的に骨造成を促すことが示された。このことている。また，新生骨にはハバース管を有する成熟したから，CM/FGF-2 は今後新たな骨再生誘導法として臨床典型的な骨組織像が認められたことを報告している。本応用が期待される。

図6

図7H. E. 染色像（bar ＝ 50μm）
Ob：骨芽細胞 C：前駆骨芽細胞
O：骨細胞 BV：新生血管

OC：破骨細胞77

TRAP 染色像（bar ＝ 50μm）
黒矢印：破骨細胞

日大歯学

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論

ラット下顎角骨欠損モデルにおける CM/FGF-2 の骨造成の影響についてエックス線学的および組織学的に検討し，以下の結論を得た。
1.

CM/FGF-2 群 は，control 群 や CM 群 と 比 較 し て，骨様組織や新生骨量の増加を認め，組織学的に既存骨と類似した構造を示した。

2.

FGF-2［H］群が FGF-2［L］群より骨造成を促す傾向を示した。

なお，本研究は JSPS 科研費基盤研究（C）（ 一般）JP19 K10134
および平成 30 年度日本大学歯学部総合歯学研究所研究費（B）の助成によってなされました。
本研究に関して，開示すべき利益相反はありません。
文第 94 巻第 2 号

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