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メイラード反応を阻害する成分の探索＜平成 24 年度助成＞

メイラード反応を阻害する成分の探索
渡

辺寛

人

（明治大学農学部生命科学科）

緒言
わが国の糖尿病患者は年々増加する傾向にあり、網膜症、腎症など、患者の QOL を著しく低for AGE）との相互作用を介して細胞機能を障害し、網膜症、腎症、動脈硬化症をはじめとするさまざまな合併症をひきおこすことなどが明らかにされてきた 3 - 5）。

下させる糖尿病合併症の予防・治療法開発が重要な課題となっている。糖尿病合併症の発症にはさまざまな因子の関与が示唆されているが、近年の研究により生体内でおきるメイラード反応（アミノカルボニル反応）生成物による細胞機能障害が大きく関与することが明らかとなってきた。
メイラード反応は、アミノ基の非共有電子対が

図１

本研究で対象とした AGE の構造·ƴ ĄŁŋ-Ïſ.!( AGE 2ċƏ

カルボニル炭素を求核攻撃することによりはじま（A）ƱBƲNnPrT`p
ペントシジン （B）グルコースパンƱAƲep[RSpる。その後、脱水によりイミン（シッフ塩基）がこのような背景からメイラード反応を阻害する生成し、さらに分子内転位が起きて、アマドリ化

因子は、糖尿病合併症の予防・治療薬となると期合物が生成する。その後、これにさらにアミノ待され、多くの薬剤が研究されている 6 ）。しかし化合物やカルボニル化合物が反応し、またアマながら、既存の阻害剤はカルボニル化合物の捕捉

ドリ化合物から反応性の高いジカルボニル化合物を作用点とするものが多く、これらは副作用が強が生成するなどして複雑な反応がおき、反応のいという問題があった。一方、われわれは、副後期段階では糖化反応後期段階生成物（advanced

作用のないメイラード反応阻害剤を食品・生体glycation end products; AGE）が生成する。

由来の因子から見出すことを目的として研究をAGE はタンパク質のリジンやアルギニンなど行ってきた。その結果、これまでに FAD（flavinの側鎖をグルコースなどの糖、あるいは糖由来のadenine dinucleotide）が「アマドリ化合物を分解カルボニル化合物が修飾して形成された多様な構する」という新たな機序によりメイラード反応を造の総称である。これまでにカルボキシメチルリ阻害しうることを見出した。アマドリ化合物は、

εジ ン（ N - carboxymethyllysine）、 ペ ン ト シ ジ ン

メイラード反応前期段階における重要中間体であ（pentosidine）1）、グルコースパン（glucosepane）2 ）り、その分解はメイラード反応の阻害ならびに（ 図 1）など数多くの構造が同定されている。AGE

AGE の生成抑制につながると考えられた。しかに関する研究は近年急速に進展し、多様な構造のしながら、FAD が実際に AGE 形成を抑制できる

AGE が生体内においても生成し、蓄積すること、かどうかは明らかになっておらず、その作用機構

また AGE がその受容体である RAGE（Receptorの詳細は不明であった。本研究は、FAD および

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浦上財団研究報告書

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新たな阻害因子として解析対象としたリボフラビ

sazone を合成し、さらにこれをもとに合成したン関連化合物の作用機序を詳細に解明することにD-glucosone をシリカゲルカラム（Silica gel 100

より、安全な糖尿病合併症予防・軽減食品の開発（0.063-0.200）, Merck）により精製し、HPLC 分析のための基礎的知見を得ることを目的としたもののための標品とした。

である。

（3） リボフラビン類によるアマドリ化合物分解反応の解析

方法（1） fructose-p-toluidine の合成
Hashiba の方法 7） および O’Brien と Morrissey
8）

各 濃 度 の FAD あ る い は リ ボ フ ラ ビ ン と、1 mM ア マ ド リ 化 合 物（fructose- p -toluidine）とを、10 mM リ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 緩 衝 液（pH 7.4）を一部改良することにより、モデルとし中、37 ℃で反応させ、これを逆相 HPLC カラムて UV 吸収により検出が可能な p -toluidine のア（Inertsil ODS-3, GL Sciences）に供した。50％メマドリ化合物（fructose- p -toluidine）を合成、精製

タノールにより溶出を行い、240 nm の吸光度にした。具体的には D-Glucose 0.5 mol、p -toluidine

より fructose- p -toluidine あるいはその分解物で0.1 mol、 メ タ 重 亜 硫 酸 ナ ト リ ウ ム 10 mg に 水ある p -toluidine の検出を行った。

10 ml を加え、沸騰水中 25 分間攪拌した。その（4） AGE（グルコースパン）形成抑制作用の解析

後、水に溶解して陽イオン交換樹脂 Dowex 50 W

低分子モデル反応系における AGE 形成の抑制

X-8（ H + form, 100-200 mesh ; Dow Chemistry

作用を解析するため、生体中に多く形成される架Company）に供し、非吸着画分を水で洗浄した後、橋型の AGE として知られるグルコースパン構造

0.3 M トリクロロ酢酸でアマドリ化合物を溶出さの形成におよぼすリボフラビンの作用を解析しせた。NBT（nitro blue tetrazolium）陽 性 画 分 よた。glucose とε- aminocaproic acid からアマドリりジエチルエーテルによりトリクロロ酢酸を除去

化 合 物 fructose - aminocaproic acid を 合 成 し た。

した後、凍結乾燥した。さらにエタノールを用い

これと N α- acetyl - L -arginine を 100μM リボフラた再結晶により精製を行い、fructose- p -toluidine

ビンの存在下、あるいは非存在下で 37℃、7 日を得た。

間反応させた後、反応物を Pegasil ODS（Sensyu（2） α - ジ カ ル ボ ニ ル 化 合 物 の 解 析 9） お よ びPak）により分離し、252 nm の吸光度によりグルの方法

D-glucosone の合成コースパンの検出を行った。グルコースパンにはD-glucosone をはじめとするα- ジカルボニル異性体が存在するため、それぞれの形成につい化 合 物 の 分 析 に は、2, 3 - diaminonaphthalene にて合成したグルコースパン標品を用いて定量をよる誘導体化法を用いた。試料に等量の 1 mM行った。

2, 3-diaminonaphthalene 水溶液を加え、50 ℃で 1時間反応させることによりα- ジカルボニル化合（5） タンパク質に形成されたアマドリ構造に対する作用の解析

物を安定な benzo [g] quinoxaline 誘導体に変換しタンパク質に形成されたアマドリ構造に対してた。誘導体化後の試料を逆相 HPLC（Puresil C18,リボフラビン類が作用しうるか、すでに糖によりWaters）に供し、268 nm の吸光度により検出を修飾されたタンパク質とのリボフラビン類との行った。ジカルボニル化合物誘導体化反応の内部反応について検討を行った。具体的には、10 mg/標準としては 1, 2-cyclonexanedione を用いた。

ml ウシ血清アルブミン（BSA）をあらかじめ 1 M

また D-glucose より D-arabino-hexose phenylo-D-glucose と 40 mM リ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 緩 衝 液

メイラード反応を阻害する成分の探索（pH 7.4）中、37 ℃で 7 日間滅菌状態のもと反応させた。透析により未反応の glucose などを除去し、糖化タンパク質試料とした。反応によりアマドリ構造が BSA に形成されていることを NBT 試
験により確認した。

結73

果（1） FAD およびリボフラビンによるアマドリ化合物分解反応の解析
FAD およびリボフラビンのアマドリ化合物分

10 mg/ml の 糖 化 タ ン パ ク 質 試 料 を そ れ ぞ れ

解作用を解析するために、アマドリ化合物モデル

100μM の FAD、FMN（flavin mononucleotide）、と し て fructose- p -toluidine を 合 成 し、 こ れ を 基

リ ボ フ ラ ビ ン の 存 在 下、 あ る い は 非 存 在 下 で質とした。リボフラビン類と fructose- p -toluidine

40 mM リ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 緩 衝 液（pH 7.4）中、を 24 時間反応させ、反応溶液を逆相 HPLC によ

37 ℃ で さ ら に 7 日 間 反 応 さ せ る こ と に よ り、り分離し、240 nm の吸光度により分解産物を検AGE を 形 成 さ せ た。 反 応 後 の 試 料 を Sephadex

出 し た。 そ の 結 果、FAD お よ び リ ボ フ ラ ビ ンG-25 によるゲルろ過クロマトグラフィーに供し、は、濃度依存的に fructose-p -toluidine を減少させタンパク質画分を得た。これを乾固した後、6Nた（ 図 2）。われわれが既にアマドリ分解作用をHCl により加水分解し、Sep-Pak C18（Waters）見出している FAD と比較して、リボフラビンはにて吸着する不純物を除去した。その後、逆相高いアマドリ化合物分解活性をもつことが明らHPLC（Inertsil ODS-3）により分離し、蛍光（Ex.

かになった。またアマドリ化合物の減少にとも335 nm/Em. 385 nm）によりペントシジンを検出・ない、メイラード反応前のアミノ化合物である定量した。

p -toluidine が増大することが示された。とくにリ

またリボフラビン類のアマドリ構造分解にともボフラビンは濃度依存的に p -toluidine を生成さなって糖化タンパク質試料より生成すると考えらせ、その生成量は FAD によるものよりも顕著にれる glucosone を定量するため、Sephadex G-25大きかった。これらのことから、リボフラビンはによるゲルろ過クロマトグラフィーの低分子量画アマドリ化合物である fructose- p -toluidine に作用分を用い、上述のように 2, 3-diaminonaphthaleneし、これを分解して p -toluidine を生成させる、すによる誘導体化による解析を行った。

なわちアミノ基を再生させることが確認できた。

図 2 FAD およびリボフラビンによるアマドリ化合物（fructose-p -toluidine）の分解とp-toluidineƲ2ŵ.D·Ƶ FAD <5mfclap1<?Dg\m£¬īƱfructoseアミノ化合物（ p -toluidine）の再生<0.05 vs control.
h_£¬īƱ*pp-toluidineƲ2Į *p<0.05 vs control.

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またその作用は FAD よりも大きいことが明らか

ＡおよびピークＢとして表すが、リボフラビンをになった。

反応系に共存させることにより、両異性体の形成

FAD は ア マ ド リ 化 合 物 を 分 解 し、 糖 に 由 来量を有意に減少させた（ 図 4）

す る 構 造 と し て glucosone を 生 成 さ せ る こ と がわれわれの研究により明らかになっている。そこ で リ ボ フ ラ ビ ン に よ る glucosone の 生 成 を2, 3-diaminonaphthalene を用いた誘導体化によって解析した。その結果、リボフラビンはアマドリ化合物の分解にともなって glucosone を生成させること、その生成量は FAD によるものよりも大きいことが確認された（ 図 3）。
4 低分子モデル反応系を用いたグルコースパン形成に·Ʒ 図ÄkZn¦ßŏCİ(NnPrT`pØå1Ï#?mfclap2æİ

対するリボフラビンの抑制作用brMƹ<5 b r M ƺ 3 & @ ' @ N n P r T ` p 2 ĵ á  C ņ #  Ƴ p<0.05 vscontrol.

ピークＡおよびピークＢはそれぞれグルコースパンの異性体を示す。* p <0.05 vs control.

（3） タンパク質に形成されたアマドリ構造に対するリボフラビン類の作用の解析
低分子モデル反応系において、リボフラビンが AGE 形成を抑制することが確認されたことか
ら、次にタンパク質に形成されたアマドリ構造に対してリボフラビン類が分解作用を示すか解析を行った。ここでは、FAD とリボフラビンに加え、FMN の作用についても検討した。

リボフラビンによるアマドリ化合物分解にともなう
図 3mfclap1<?Dg\m£¬īŵ1.:0·ƶ
glucosone 2Įå
glucosone の生成
BSA と glucose を 37 ℃で 7 日間反応させるこƳp<0.05 vs control.
* p <0.05 vs control.とによりタンパク質アミノ酸残基にアマドリ構造（2） リボフラビンによるグルコースパン形成抑制作用の解析を形成させた。アマドリ構造の形成は NBT 試験

リボフラビンがメイラード反応の重要中間生化タンパク質試料に FAD、FMN、およびリボ成物であるアマドリ化合物を分解してアミノ基フラビンを添加してさらに 37 ℃で 7 日間反応さを再生させる作用を有することから、これがメせ、AGE を形成させた。塩酸加水分解した後にイラード反応の後期段階で形成される AGE を抑HPLC にて架橋型 AGE であるペントシジン（ 図制しうるか検討を行った。具体的には生体内で1）の形成量を解析したところ、FAD、FMN、お多量に蓄積することが知られている glucose 由

よびリボフラビンはペントシジンの形成を有意に

来 の 架 橋 型 AGE グ ル コ ー ス パ ン（ 図 1）の 形 成抑制した。とくにリボフラビンの抑制作用が最もに つ い て、glucose、ε-aminocaproic acid、お よ び高いことが示された（ 図 5）。

αにより行った（データ省略）。糖を除去した後、糖N -acetyl- L -arginine を用いた低分子モデル反応

また、アマドリ構造の分解によって生成する系を用いて解析を行った。グルコースパンには異glucosone の定量を行ったところ、FAD、FMN、性体が存在するため、本研究ではそれらをピーク

およびリボフラビンとの反応により、糖化タンパ

メイラード反応を阻害する成分の探索

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FAD を補酵素として低分子アマドリ化合物の分解作用を示すことが明らかとなっている。しかしながら、この酵素がタンパク質に形成されたアマドリ構造を分解できるとの報告はない。本研究では、あらかじめ glucose と反応させることにより形成されたタンパク質中のアマドリ構造をリボフラビン類が分解できるか検討を行った。分解作用を glucose 由来架橋型 AGE であるペントシジ
図5

タンパク質反応系におけるペントシジン形成に対するİ
リボフラビン類の抑制作用
Ƴp<0.05 vs control.
·Ƹ Vp`MƂ¦ßŏ1?ep[RSpØå1Ï#?mfclapƪ2æ

* p <0.05 vs control.

ンの形成抑制作用により評価したところ、FAD、FMN、およびリボフラビンがペントシジンの形成を有意に抑制することが確認された。このこと

ク質試料より glucosone が生成することが確認さからこれらリボフラビン類は、タンパク質に形成れた（データ省略）。さらにリボフラビン類によるされたアマドリ構造をも分解できると考えられ

glucosone 生成量は、ペントシジン形成抑制作用た。データには示していないが、リボフラビン類の強さに相関したものであった。との反応により glucosone が生成したこともこれ考察を支持するものと考えられる。また FAD に比較して高いアマドリ化合物分解作用をもつリボフラ

既にわれわれは FAD がアマドリ化合物を酸化

ビンは、高いペントシジン形成抑制作用を示した。

的に分解してアミノ基を再生させることを示してこれらのことから、本研究で示したリボフラビ

いるが、本研究によりリボフラビンが同様の分解ンのアマドリ化合物分解作用は、AGE の形成抑作用を示すこと、さらにその作用は FAD よりも制に寄与するものであり、タンパク質のメイラー高いことが明らかとなった。アマドリ化合物はメド反応においても AGE 形成を抑制しうることがイラード反応の重要中間体であり、これを分解し推定された。今後は低容量のカルボニル捕捉剤をて元のアミノ基が再生させることは、メイラード併用することにより、生じたオソンを捕捉するこ反応の抑制において効果的であると考えられる。ともメイラード反応の抑制、AGE の形成抑制に一方、リボフラビンあるいは FAD によるア有効であると考えられる。

マドリ化合物分解にともなって、ジカルボニル

われわれのこれまでの研究では、アマドリ化合化合物であるオソン（グルコース由来のアマドリ物分解作用をもつ FAD が実際に AGE 形成を抑化合物の場合は glucosone）が生じるため、生成制するかどうかは不明であった。FAD あるいはしたオソンがメイラード反応を促進してしまうリボフラビンがペントシジンの形成を有意に抑制ことも推測される。しかしながら、glucose と、することが示された点で、本研究で得られた知見

ε-aminocaproic acid および N α- acetyl - L -arginine

はこれら因子のメイラード反応抑制作用解析におの低分子モデル反応系において生じる架橋型いて大きな意義があると考えられる。

AGE 構造であるグルコースパンの形成をリボフラビンが有意に抑制することが確認された。

これまでに報告されたメイラード反応抑制剤
は、その抑制機構にカルボニル捕捉作用が関わ微生物にはアマドリ構造を分解する酵素るものが多く、これらはピリドキサールなど生（amadoriase）が存在することが知られており10) 、体に必要なカルボニル化合物とも反応してしまう

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浦上財団研究報告書など、その副作用が問題視されている。本研究で研究対象としたリボフラビン類は、アマドリ化合物分解作用という新たな作用点をもつメイラード反応阻害剤であること、また過剰摂取による問題がないと考えられることから、糖尿病合併症予防食品への応用が期待される。今後は糖尿病モデル動物を用いた検討を行うなどして、生体内におけるリボフラビン類の AGE 蓄積抑制作用、さらには糖尿病合併症予防作用を解析することが課題でVol.21（2014）Relationship with diabetes, J. Biol. Chem., 280, 1231012315 (2005)
3) Ahmed N., Advanced glycation endproducts—role inpathology of diabetic complications, Diabetes Res. Clin.
Pract., 67, 3-21 (2005)
4) Yan, S.F., Ramasamy, R., and Schmidt, A.M., Mechanismsof disease: advanced glycation end-products and theirreceptor in inflammation and diabetes complications, Nature
Clin. Pract. Endocrinol. Metab., 4, 285-293 (2008)
5） Ramasamy, R., Yan, S.F., and Schmidt, A.M., Advanced
glycation endproducts: from precursors to RAGE: round andround we go, Amino Acids, 42, 1151-1161 (2012)

ある。

6) Reddy, V.P. and Beyaz, A., Inhibitors of the Maillard
reaction and AGE breakers as therapeutics for multiple
diseases, Drug Discov. Today, 11, 646-654 (2006)

謝7) Hashiba, H., Participation of Amadori rearrangement products
and carbonyl compounds in oxygen-dependent browning ofsoy sauce, J. Agric. Food. Chem., 24, 70-73 (1976)

辞本研究を行うにあたり、多大な研究助成を賜りました（公財）浦上食品・食文化振興財団、ならびに関係の皆様に厚く御礼申し上げます。
文献1) Sell, D.R. and Monnier, V.M., Structure elucidation of asenescence cross-link from human extracellular matrix.
Implication of pentoses in the aging process, J. Biol. Chem.,
264, 21597-21602 (1989)
2) Sell, D.R., Biemel, K.M., Reihl, O., Lederer, M.O., Strauch,C.M., and Monnier, V.M., Glucosepane is a major protein
cross-link of the senescent human extracellular matrix.

8) O’Brien, J. and Morrissey, P.A., Metal ion complexation byproducts of the Maillard reaction, Food Chem., 58, 17-27(1997)
9) Usui, T., Yanagisawa, S., Ohguchi, M., Yoshino, M.,
Kawabata, R., Kishimoto, J., Arai, Y., Aida, K., Watanabe,H., and Hayase, F., Identification and determination of alphadicarbonyl compounds formed in the degradation of sugars,Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 2465-2472 (2007)
10) Takahashil, M., Pischetsrieder, M., and Monnier, V.M.,
Isolation, purification, and characterization of amadoriase
isoenzymes (fructosyl amine-oxygen oxidoreductase EC 1.5.3)
from Aspergillus sp., J. Biol. Chem., 272, 3437-3443 (1997)

Analysis of novel food-derived inhibitors of Maillard reaction

Analysis of novel food-derived inhibitors of Maillard reaction
Hirohito Watanabe
Faculty of Agriculture, Meiji University

Glycation, a process that is also known as Maillard reaction, is a post-translational
modification of proteins by reducing sugars such as glucose. Reducing sugars react withamino groups in proteins to form the Amadori compounds, which can undergo chemical
modifications and form advanced glycation end products (AGE) in tissue proteins. AGE,
which is accumulated in diabetes as a result of chronic hyperglycemia, has been implicatedin the pathogenesis of diabetic complications such as nephropathy and neuropathy.
Therefore, inhibition of AGE formation is thought be a promising target for therapeuticintervention in the AGE-related disorders such as diabetic complications. Because Amadori
compounds are important precursors for AGE in glycation, Amadori compound-degrading
factors could effectively inhibit the formation of AGE. We have found that flavin adenine
dinucleotide (FAD) catalyses the degradation of Amadori compounds. In this study, we
analyzed Amadori-degrading activity of riboflavin, as a novel inhibitor of glycation. A
model amadori compound (fructose-p-toluidine) derived from glucose and p-toluidine
was incubated with riboflavin, and Amadori-degrading activity of fructose-p-toluidine
was determined by reversed phase-HPLC. Riboflavin efficiently degraded fructose-ptoluidine and generated p-toluidine. These results indicate that riboflavin regenerates aminogroups from Amadori compounds and inhibits glycation. Indeed, we found that riboflavinsuppressed AGE formation in the reaction of amino acid with glucose. Furthermore,riboflavin suppressed formation of pentosidine, an AGE cross-link in proteins. Our results
indicate that the riboflavin-related compounds could be beneficial in preventing theprogression of diabetic complications by attenuating AGE accumulation.

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