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浦 上 財 団研 究報 告書VoLll(2003)

健 康食 品 として注 目され る北 方系 小 果樹 の育種 に関す る研 究大澤勝次

・鈴木卓 ・三 上哲夫(北海道大学大学院農学研究科)

北方系 小果樹 に は,果 実 にア ン トシ アニ ン等 のポ リフェノー ル類や アス コル ビン酸 とい った機能を定着 させ,新しい果樹 産業 と して発 展 させ てゆくには,優 良個体 を選抜 し効率 的な栄 養繁殖 法に性 成分 を多量 に含 むものが少 な くない。例 えば,よ り種苗 の増殖 を図 るとと もに,大 粒 果実 を着生

北米原 産の アロニ ア(バ ラ科)の 果実 には,ブ ルす る倍数性 品種 の育種が急 務 である。 そ こで,こーベ リーの2倍 以上 のア ン トシ アニ ンが含 まれ る

れら機能性 に優 れた北方 系小果樹 を材 料 に,茎 頂ほか,カ ロチ ノイ ド系 色素(β 一カロチ ン とβ一培 養を利 用 した種 苗の大 量繁殖技 術の 確立 な らび

ク リプ トキサ ンチ ン)の 含有 量 も目立 って多い。に倍数体作 出 を目指 し,研 究 を行っ た。

また,北 海道 に 自生 するハ スカ ップ(ス イカズ ラ科)の 果実 もア ン トシアニ ン とアスコ ルビ ン酸 に

1.茎 頂培 養 による種苗 の効率 的な栄 養繁殖
富 んでお り,30年 程前 か ら栽培 化 が進 め られ て

ハス カップ について は,当 研 究室で 既 に茎 頂培きた。現 在で は,北 海道の特 産品 と してハ ス カッ

養 に より組 織培養 系 を確 立 し,種 苗 を増殖す る こ

プの菓子 や ワイ ンなどが生 産 され てい る。 ところとに成功 して いる。そ こで,ま だ培養 系が確 立でが,ハ スカ ップ果実 の需要 は多い に もか かわ らず,きてい ないア ロニア につ いて,茎 頂培 養 による優近年北 海道 におけ る栽 培面積 と生 産量 は減 少傾 向良個 体の 効率的 な栄養繁 殖の可 能性 を検討 した。に ある。 果 実が 小 さい た め,収 穫 に手 間(コ ス1.1初ト)が 掛 り過 ぎるの が最大 の原因 とい ってよい。

北 海道 立林業試 験場(北 海道 美唄市)に 栽 植 さ

ア ロニアにつ いて も,果 実 が小 さいこ とが 栽培上代培 養れて いる10年 生 アロ ニア か ら1998年3月10日の難点 とな ってい る。 機能性 食品 の素材 と して大に採 取 した休眠枝 の腋生 葉芽か ら茎頂(横 径 約1

きな将 来性 を秘めた,こ れ ら北方系 小果樹 の栽培mm,葉図1ア

原 基4個 を もつ)を 無菌 的に取 り出 し,ロニアの茎頂培養(初 代培養)に おけるシュー ト形成に及ぼす培地中のBA濃 度 の影響 ならびにその経時的変化。 シュー ト形成率
は,生 存 した茎頂に対するシュー トを形成 した茎頂の割合(%)の平均 値で示 し,シ ュー ト数および最長シュー ト長は,シ ュートを形成 した茎頂当たりの平均値で表 した。

健康食品として注 目される北方系小果樹の育種に関する研究25

初 代 培 養 を 行 っ た。 培 養 に は,Murashige&性 が異 なる ことが明 らかに なった。 シュー ト形 成Skoog培 地 の無機塩 お よび ビタ ミン類 の濃度 を,はBA濃不シュ ー ト形 成率 は,BA1μMお変,1/2,1/4,1/8おBAO.2,1およよ び5μM,シを添 加 し,pH5.7にび1/16とし,

ョ糖30g/1,寒天7g/1

調 整 した もの を用い た。初 代

培養 で は,C'!μMおよ び1μM添加 区に お度 の影響 を受 け,培 養60日 後 にお ける
よび5μM添加区で90%以上の 極めて 高い値 となった(図2)。

特 に,小葉 の 密 生 し た 長 い シ ュ ー ト(平 均35mm)が多数(培 養 体当 た り平均9本)形成さいて は,培 養60日 後 まで生 存 した茎 頂の 半数 にれた,無 機塩 お よび ビ タ ミン類 の濃 度が不 変 のシ ュー ト形 成が 認 め られたが,BA5μM添

BA5μM添加区

加区 は,シ ュ ー トの効率 的 な増殖 にでは,茎 頂 生存率 が極 めて低 く,シ ュー ト形成 は適 してい る と考え られ る(図3,図4)。

認め られな か った(図1)。

BA低μM添 加 区 で02μM添シュ ー ト数 は,BA1

加 区 よ り多 か っ た。 ま一方,濃 度添加 区で形 成 された シュー トは,大 葉が少数 着生 した形状 を呈 した 。

た,生 存率 は,無 機塩お よび ビタ ミン類 の濃度 が1.3発

1/4お よび1/8の 区に おいて,90%以継代培 養で得 られ たシュー ト(図4)を,試上 と高か った。

根験

管に詰 め殺菌 した用土(バ ー ミキュ ライ ト:鹿 沼

1.2継代培 養

継代 培養 は,初 代培養 で得 られた シュー トの節土;1:1)へ無菌的 に挿木 した ところ,90%以上が良 好に発根 した(図5)。

部切 片を外 植体 と し,上 記 と同様 の培養 基を用 い1.4鉢て行 った。 継代培 養で は,培 地組 成 にかかわ らず

発根 した シュー トを試験管 か ら取 出し,市 販 の上 げお よび馴化

全て の培養 体が生存 し,初 代培養 と比べ て培養特

園芸用 土へ移植 し馴化 した。幼 植物体 は,一 度落

図2ア

ロニアのシュー ト節部切片培養(継 代培養)に おけるシュー ト形成に及ぼす培地中のBA濃 度の影響な らびにその経時的変化。 シュー ト形成率 は,生 存 した外植体に対するシュー トを形成 した外植体の割合(%)の 平均値で示 し,シ ュー ト数および最長 シュー ト
長 は,シ ュー トを形成した外植体当た りの平均 値で表 した。

図3ア

ロニアの シュー ト節部切片培養(継 代培養)に おけるシュー ト形成外植体当た りの葉 数お よび最大葉の葉長に及ぼす培地 中の無機塩,ビ タミン類およびBA濃 度の影響。培養60日 後の調査結果を示す。垂直線はSEを 表す。

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浦 上財 団研 究 報告 書VoLll(2003)

2.無菌培養 系 を利 用 したコル ヒチ ン処 理 による倍 数体作 出

2.1ハス カ ップ培 養体か らの倍 数体作 出ハ ス カップ培養 体を用 いて,倍 数体 を作出す る
た めの コル ヒチ ン処理の適 条件 を検討 した。
図4アロニアの初代培養において形成 された シュー トの形 状。
MS培 地(不 変〉にBA5μMを添加した区の写真を示す。

[材料 お よび方法]継代 培養 に より無菌的 に維持 ・増殖 しているハ ス カ ップinvitro培 養体 シュー トか ら切 り出 した節 部切 片(長 さ約5mm,1節 を もつ)を 材料 と した。 培養 は,MS培

地 の無機 塩 お よび ビ タ ミ ン類 の 濃 度 を1/2と し,BAlμM,GA31μM,ショ糖30g/1お よび寒 天7g/1を添 加 し,pH5.7に℃,1日16時mol/m2/s)の
図5ア

ロニア シュー トからの発根。A,試 験管内に詰めた用土(バー ミキュラ イトと鹿沼土 を等量ずつ混合したもの)に 無菌的に挿木 された培養体シュー ト;B.発 根の様子(処 理2か 月後)。

調 整 し た培 養 基 を用 い,25間 照 明(白色 蛍 光 灯,約60μ条件下 で行 った。培 養基 は,100m1

容 三 角 フ ラス コに20m1ず

つ 分注 後,1.IKg/cm2,120℃で10分 間滅 菌 した。 コルヒチ ン処理 は,以下 の3つ 方 法 によ り行 っ た(図7)。

①培 養前 処葉 した後,移 植2週 後か ら新 しい 葉を展 開 し始 め,

理:材 料 を,フ ィル タ ー除 菌 した1,5お移植4か 月 後 には草丈50cmで25mMコな植物 体に 成長 した(図6)。

副梢 を有す る完全

ル ヒチ ン溶 液 に1,6,24およびよび72時

間浸漬後,上 記 の培養基 に植 え込ん だ。②培 養中
コル ヒチ ン溶液 上層 添加:継 代 培養20日 後 の培

図6発根したアロニア培養体の鉢 上げ ・馴化 の様子,A,園 芸用土へ移植している様子:B.移 植半月後の幼植物体(落 葉後新しい葉が展開);C.移 植1か 月後;D.移 植4か 月後(右):E,発 根の様子(Dの 植物体を掘 り出した もの)。

健康食品として注 目される北方系小果樹の育種に関する研究

1,培 養前処理

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2.培 養中コルヒチン溶液上層添加処理

3.コ ルヒチン添加培地での培養

図7本

研究で検討したコルヒチ ン処理法の模式図

養 体 を載せ た 寒天 培 地 に,フ ィ ル ター除 菌 した葉(2〜3枚)の1,5,10おザー(Partec社

よ び25mMコル ヒチ ン溶 液5mlを上層 添加 し,そ のま ま培 養 を継 続 した。③ コルヒチ ン添加培 地 を用 いた培 養:基 本培地 をオー トク

倍数性 を,プ ロ イデ ィアナ ライ製,PA型)を[結果 および考 察]培

用 いて調査 した。

養前 処理 におけ る外 植片の生存 率(培 養1か 月後)お よび シュー ト形 成率

レープ後,寒 天 が固化 する前 に予め フィル ター除(培養2か 月後,生 存外植 片当 た り)は 各 々30〜

菌 した コルヒチ ン溶液 を添加 ・撹絆 し,培 地 中の86%(対照 区100%)おコル ヒチ ン濃 度 が0.5,1,5お94%)の値 を示 し,ど ち らもコル ヒチ ン濃度 が高

よ び10mMとなよび17〜100%(対照区

る ように作 製 した培養基 を用 いて培養 した。1処く処理 時問が 長い程低 い傾 向を示 した。 カルス形

理 区当 た りの外植 片数 は何 れ も18と した。 コル成率(培 養3か 月後,生 存外 植片 当た り)は,25

ヒチ ン処 理 開始 か ら1,2お〜72%(対よび3か 月 後 に,外照 区9%)とコル ヒチ ン処理 区 で高植 片の生存(緑 色 を呈 し,何 らかの成 長が認 め らか った(図8)。

れ た も の),カ培養1か 月後 では コルヒチ ン処理 区で著 し く小 さ3mm以ル ス形 成,シ ュ ー ト形 成(長 さ再 生 シュー トの 数お よび長 さ は,上 に伸 長 した もの),シ ュー ト数お よびシかっ たが,培 養2〜3か月後 には対 照区 とほぼ同ュ ー ト長 につい て調査 した。 また,培 養4か 月後等の 値 とな った(図9)。

コル ヒチ ン処 理後 に得には,形 成され たシュ ー トを切 り出 し節部切 片をられ た シュー トの倍数性 を調 査 した結果,25mM

継代 培養す る とと もに,節 部 に着生 してい た展 開

コル ヒチ ン溶 液1時 間処理 区で2倍 性お よび4倍

図8外植片の生存,シ ュー ト形成お よびカルス形成に及ぼす培養前 コルヒチ ン処理の影響。対照区は,コ ルヒチン処理を行わずに通常の継代培 養を行 った区を示す。垂直線 はSEを 表す。

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図9再浦 上 財 団研 究報 告書Vol.11(2003)

生 シュー トの成長に及ぼす培養前 コルヒチン処理の影響。培養60日 後迄にシュートを形成 した外植体についての継時的な調査結果を示す。

コルヒチン処理後に再生したハスカップシュー トプロイディアナライザーの概観
図10コ

ルヒチン処理後のハスカ ップ培 養体後代に認め られた倍数性の変異。A.2倍 性 二B.2倍性+4倍性 ピーク をもつ キメラ シュー ト1本 が確 認 された

これ らの シュー トの倍数性 を調査 した結 果,培(図10‑B)。
次 に,培 養中 コル ヒチ ン溶液上 層添加 処理 におけ る生 存 率 は67〜83%,シ〜100%で(表1)ュ ー ト形 成率 は58,コ ル ヒチ ン添 加培 地 で培 養した場 合の 生存 率 は80〜100%,シ率 は67〜100%と性;C.4倍 性。

れた。

な り(表2),何ュー ト形 成
れ もコル ヒチ

養中 上層 添加(1および10mM区)で1倍性 と2倍 性 のキ メラシュ ー ト2本 お よび2倍 性 と4倍性 の キ メ ラシ ュー ト1本,コ(1,5おル ヒチ ン添 加培 地よび10mM区)で1倍性 と2倍 性 の キ

メラ シュー ト6本 お よび2倍 性 と4倍 性の キメ ラ

ン処理 期間 が長い に もか かわ らず 高い値 を示 した。

シュ ー ト4本 が形成 され た(表3)。

シュー トは,生 存外 植片 当た り1〜1.7本

1倍 性 お よび4倍 性 のピー クを もつ キメ ラシュー

表1培

形成 さ

養中コルヒチ ン溶液上層添加処理における外植体の生存お よび成長に及ぼすコルヒチ ン濃度の影響

培養60日後に調査。対照区は,コ ルヒチン溶液上層添加を行わず に培養 した区を示す。 シ
ュー ト本数は,シ ュー ト形成外植体当 りの平均値 を表す。z生存外植体数/供試外植体数 ×100。yカルス形成外植体数/生存外植体数×100。Sシi一 ト形成外植体数/生存外植体数 ×1000

対 照 区で は健康食品として注 目される北方系小果樹の育種に関する研究
表2外29

植体の生存および成長に及ぼす寒天培地中のコルヒチ ン濃度の影響

培養60日後に調査。対照区は.コ ルヒチ ン無添加培 地で培養 した区を示す。
シュー ト本数は,シ ュー ト形成外植体当りの平均値 を表す、Z生存外植体数供 試外植体数×100。}カルス形成外植体数'生存外植体数 ×100=エシュー ト形成外植体数!生存外植体数X100

表3再生 シュー トの倍数性 に及ぼす コルヒチン処理の影響

シュ ー トの 倍 数性 は,プ ロ イ デ ィ ア ナ ラ イザ ー を 用 い て 調 査 した 。
ZX,1倍 性;2X,2倍性;4X,4倍性。

トの形成 が確 認 され なか った ので(図10‑A),

2.2ア

これ らの シュー トの形成 に もコル ヒチ ン処理 が影

継代 培養 によ り無 菌的 に維 持 ・増 殖 している ア

ロニ ア培 養体 か らの倍 数体作 出

ロニ アinvitro培 養体 シ ュー トか ら切 り出した節

響 した もの と考 え られ る。
以 上の結 果,生 存お よび再生 率が高 く,4倍シュー トの出現 数 が最 も多 か った10mMコ

性部組 織片 を材 料 とし,倍 数 体作 出を試み た。ハ ス

ルヒ

カ ップの結 果を参考 に,ア ロニ アについ て もコル

チ ン添加培 地で の培養 が,倍 数体作 出に適 していヒチ ン添加培 地 を用 いて実験 を行 った。継代 用 のると考 えられ る。 この処 理区 で得 られた2倍 性お培地 に コルヒチ ン濃 度が0.5,1,5および4倍 性 キ メラ シュー トの形 状 を,図llによ び10mM示す。 なお,こ れ らの キメラ シュー トを継代培 養 し,そ の後代 シュー トの倍 数性 をプロ イデ ィアナラ イ
ザ ーを用 いて調べ た ところ,4倍性 の ピー クのみを有す る シュ ー トの 分離 に 成功 した(図10‑C)。
これ らの シュー トは,さ らに継 代 ・増 殖 し,発 根処 理お よ び鉢 上 げ ・馴 化後,40個体 を 圃場 に定植 した。 今後 は,こ れ らの再 生個体 につい て染色体 レベ ルでの倍 数性の確 認お よび形 態調査 を行 う
予 定であ る。

図11コル ヒチ ン10mM添 加培地で得 られた2倍 性および4倍 性
キメラシュー トの形状(ハ スカップ)、浦上 財 団研 究報 告書VoLll(2003)

30

図12コ

ルヒチ ン添加培地で培養後,継 代3代 目に認められたキメラシュー トの形状(ア ロニア)。葉の一部がキメラ状 を呈 している。これらの シュー トは,何 れもプロイデ ィアナライザー分析に より2倍性 および4倍 性のピークを示 した。となるよ うに添加 した ものを培養 基 として用い た。

培 養 を繰 り返 した ところ,継 代3代 目以降 に2倍1処 理 区当 た りの外 植片数 は何れ も18と した。

性 お よび4倍 性 のキ メラ シュー トの発生 を確認 し

アロニア培 養体 は,ハ スカ ップの場合 とは異 なた。 これ らの シュー トに着生 して いる葉 は形態 的り,コ ル ヒチ ン10μM添加区 で生存 個体 は得 られず,コ ル ヒチ ン5μM添

加 区に おけ る生 存 率も低 かった 。 コル ヒチ ン0.5お よび1μM添にキ メラ状 を呈 してお り(図12),プロイ デ ィア

ナ ライザー分析 の結果 を裏付 けて いた。

加区

現在,こ れ らの シュー トをさ らに継代培 養 し,にお ける生存 率 は80%以 上 と比 較的高 かっ た(デ単独の 倍数性 ピー クを示す シュー トの分離 を検討ー タ未掲 載)。 これ らの生 存個体 か ら得 られ た,して いる。今 後は,倍 数性 シュー トが発生 する機

再生 シュー トの倍 数性 をプロ イディア ナラ イザ ー

構 を明 らか にするた め,継 代3代 目に発生 した キを用 いて調 査 したところ,何 れ も明確 なピー クをメ ラシュー トを組織化 学的方 法 を用 いて調 査す る

示 さなかっ た。そ こで,こ れ らのシュ ー トを,新と ともに,こ れ らの シュー トか ら再 生個体 を得 て,しい継 代培 地(コ ル ヒチ ン無添加)に 移 植 し継 代

染色体 レベ ルでの倍 数性調査 を行 う予定で ある。

Polyploidybreedingoffunctionalnorthernsmallfruittreesbyutilizing
31

invitroculturestreatedwithcolchicine

Polyploidybreedingoffunctionalnorthernsmallfruittreesbyutilizing
invitroculturestreatedwithcolchicine

KatsujiOosawa,TakashiSuzukiandTetsuoMikami(GraduateSchoolofAgriculture.HokkaidoUniversity)

Blackchokeberry(Aroniamelanocarpa)andblueberriedhoneysuckle(1,0niceracaerulea
L.var.emphyllocaryxNakai)areoneofthemostrespectablenorthernsmallfruittreesin
Japan,becausethefruitsofthosespeciesarerichinmanyfunctionalelements,suchas
anthocyanins,carotenoidsandascorbicacid.However,thefruitsaretoosmallfor
commercialcultivation.Thus,inordertobreedcultivarsthatbearlargerfruits,polyploid
breedinghasbeenadoptedforinvitroculturesofthesetwoplants.Theresultsaresummarizedasfollows:
1.Theprimarycultureofblackchokeberryshootapiceswassuccessfulonmedia
containing1/4strengthofMurashige&SkooglsingredientssupplementedwithO.2‑1μM
benzyladenine(BA).Theshootsobtainedbyprimaryculturewereproliferatedeffectively
onthenormalstrengthofMSmediumsupplementedwith5,uMBA.Cuttingsoftheshootrootedeasily(90%)invermiculite.
2.Theculturingoncolchicine‑supplementedmediaofblueberriedhoneysuckleexplants
wasthemosteffectiveforobtainingpolyploidyshootsamongthreecolchicinetreatments
examined(immersionincolchicinesolutionbeforeculturing,additionofcolchicinesolution
onsubcultures,andculturingonmediasupplementedwithcolchicine).
3.Ploidyanalyzer(atypeofcellsorter)analysisshowedthatchimerictissueofdiploid
andtetraploidhadoccurredfirstfromcolchicine‑treatedexplantsofbothblueberried
honeysuckleandblackchokeberry,andthentetraploidyshootscouldbeseparatedfromthe
chimericshootsduringseveralsubculturerepetitions.Thetetraploidyplantsofblueberried
honeysucklethathadformedrootsweretransplantedtosoilinthegreenhouseandthento
thefield.