106

浦上財団研究報告書

Vol.21（2014）＜平成 24 年度助成＞

エネルギー代謝変化をもたらす香辛料成分の探索とそのメカニズム解明
川端二功

九州大学高等研究院（前 安田女子大学家政学部）

緒

デヒドを受容する 7）。我々はこれまでにカプシエ

言

イトのみならず、AITC やシンナムアルデヒドも我々のエネルギー代謝は、生体の恒常性が保持体熱産生を亢進することを明らかにしており 8）、されるように巧妙に調節されている。しかしながTRPV1 のみならず TRPA1 アゴニストもエネルら過剰のカロリー摂取や運動不足等によりエネルギー代謝調節作用をもつと推察される。

ギー出納のバランスが崩壊すると、生活習慣病の本研究では TRPV1 及び TRPA1 を活性化するリスクファクターとなる肥満を引き起こすことがことが報告されている香辛料成分に着目し、それ問題となっている。このような肥満の予防・改善らがエネルギー代謝に与える影響を呼気ガス分析のために、香辛料成分によるエネルギー代謝調節装置で解析するとともに、マウスとニワトリの作用が着目されてきた。トウガラシの辛味成分でTRPV1 を比較することでエネルギー代謝調節にあるカプサイシンにはエネルギー代謝を亢進さ関与する TRPV1 の分子進化についても考察する

1）

せ、体脂肪を減少させる作用がある 。また、辛味のほとんどないトウガラシである CH19 甘の成分であるカプシエイトはカプサイシンと構造が類似しており、辛くないにも関わらず体脂肪蓄積をことを目的とした。
方法

1.

実験動物

2）

抑制する 。辛くないカプシエイトは摂取の容易

C57BL/6J マウス、オス、4 週齢（日本チャー

さ及び安全性から、サプリメントとしての応用がルズリバー、横浜）を１週間の予備飼育後に呼気可能となった。

ガス分析に供した。また、ホワイトレグホン種のカプサイシン及びカプシエイトのエネルギー

ニワトリヒナ、オス、1 日齢（村田孵化場、福岡）

代 謝 調 節 作 用 の 作 用 点 は、transient receptor

を 1 週間の予備飼育後に呼気ガス分析に供した。

potential vanilloid 1（TRPV1）という温度感受性

本研究は九州大学動物実験委員会の承認を得て実を有するカルシウム透過性の高い非選択的陽イ施した。

オンチャネルである3, 4）。TRPV1 はカプサイシ

2.

試

薬ンやカプシエイトだけでなく、黒コショウの成試薬は AITC（ChromaDex, CA）、ジアリルジ分であるピペリン 5）やクローブの成分であるオイスルフィド（DADS）（Sigma-Aldrich, MO）、オイゲノール 6）も受容する。また、TRPV1 と同様にゲノール（和光純薬工業、大阪）、ピペリン（Alfa

温度感受性 TRP チャネルファミリーの一つであAesar, Heysham, UK）を用いた。

る TRPA1 は、17 ℃以下の冷たい温度だけでな

3.

マウス呼気ガス分析

く、わさびの成分であるアリルイソチオシアネー

予備飼育後のマウスを呼気ガス分析用のチャント（AITC）やシナモンの成分であるシンナムアルバー（ 幅 120 ×高さ 150 ×奥行 240 mm）に投与エネルギー代謝変化をもたらす香辛料成分の探索とそのメカニズム解明

107

3 時間前に個別に入れた。AITC, DADS , オイゲ

細 胞 内 液 は 140 mM KCl, 5 mM EGTA, 10 mM

ノール、ピペリン、及び vehicle 投与前後の呼気

HEPES , pH 7.4（with KOH）とした。ホールセル

ガスを採取し、酸素消費量（VO 2 ）と二酸化炭素

電流記録は HEKA 社のアンプ及びソフトウェア排出量（VCO 2 ）を分析した。ガス分析は質量分析を用いて記録した（HEKA PC -10 amplifier with

計に直接接続された代謝ガス分析システムを用い

HEKA Patchmaster software, HEKA Elektronik,た（Arco2000、アルコシステム、柏）。チャンバー

Lambrecht/Pfalz, Germany）。膜電位は− 60 mV

内の気体（空気）は 0.3 L/min の割合で吸い取っに固定した。全ての実験は室温で行った。

た。採取した気体は乾燥した薄い綿のカラムを通して乾燥させ、質量分析計で O 2 /CO 2 分析を行った。VO 2 及び VCO 2 より呼吸商を算出した。
4.

結
1.

ニワトリヒナ呼気ガス分析

果
ピペリン、オイゲノール、DADS がマウスのエネルギー代謝に与える影響

予備飼育後のニワトリヒナを呼気ガスチャン

TRPV1 アゴニストであるピペリンがマウスのバーに入れ、マウスと同様の方法で AITC 及びエネルギー代謝に与える影響を呼気ガス分析装置

vehicle 投 与 前 後 の 呼 気 ガ ス を 採 取 し VO 2 及 びにて解析したところ、1, 5, 20 mg/kg のいずれのVCO 2 を分析した。解析方法はマウスと同様に投与量においても酸素消費量の上昇は見られなした。

かった（Fig. 1a, c, e）。20 mg/kg の投与量ではむ

5.

ホールセルパッチクランプ
ヒ ト 胎 児 腎 臓 由 来 細 胞 HEK293T を、10 %FBS（Hyclone, Thermo Fisher Scientific Inc.,

しろ酸素消費量の有意な低下が観察された（Fig.
1e）。呼吸商にはいずれの投与量においても変化が見られなかった（Fig. 1b, d, f ）。

MA）, 100 units·mL -1 penicillin（ 和 光 純 薬 工 業 ）,同様に TRPV1 アゴニストであるオイゲノール

100 mg · mL -1 streptomycin（和光純薬工業）を含において、50 mg/kg の投与量では酸素消費量及む Dulbecco’s modified Eagle’s medium（ 高グルび呼吸商の変化は見られなかった（Fig. 2a, b）。

コ ー ス DMEM, 和 光 純 薬 工 業 ）中 で 37 ℃、5 %一方で、TRPA1 及び TRPV1 の両方のアゴニス

CO 2 濃度で培養した。ホールセルパッチクラン

トである DADS 9）においては、50 mg/kg の投与プによる電流応答解析のために、1μg のマウス量で呼吸商が投与直後から投与後 90 分の間で上TRPV1 発現ベクター又はニワトリ TRPV1 発現昇し、投与後 90 分から投与後 240 分においてはベクター（いずれも岡崎統合バイオサイエンスセ低下した（Fig. 3b）。DADS は投与後 150 分以降

ンター富永真琴先生より供与）を 0.1μg の蛍光に酸素消費量を低下させる傾向がみられたもの

タンパク質 EGFP 発現ベクター（ 群馬大学柴崎の、2 群間で有意な差は観察されなかった（Fig.

貢志先生より供与）とともに HEK293T 細胞に3a）。

ScreenFect A（和光純薬工業）を用いてトランス2.

フェクションし、35 mm ディッシュで 24 - 48 時間培養した。

AITC がマウス及びニワトリヒナのエネルギー代謝に与える影響
TRPA1 及び TRPV1 の両方のアゴニストであカバースリップ上の HEK293T 細胞を灌流チャる AITC 10）がマウスのエネルギー代謝に与えるンバーの上にマウントし、140 mM NaCl , 5 mM

影響を呼気ガス分析装置にて解析したところ、

KCl , 2 mM MgCl 2 , 2 mM CaCl 2 , 10 mM HEPES ,50 mg/kg の 投 与 量 に お い て 呼 吸 商 が 投 与 直 後

10 mM glucose, pH 7.4 の バ ス 溶 液 で 灌 流 し た。

から投与後 90 分の間で一過性に有意に上昇した

108

浦上財団研究報告書

Vol.21（2014）（Fig. 4b）。一方で酸素消費量には大きな影響をスで観察されたような呼吸商の一過性の上昇は観与えなかった（Fig. 4a）。これらの結果は Mori ら察されなかった（Fig. 5b, d, f ）。一方で酸素消費が既に報告している結果と一致していた

10）。

同様の実験をニワトリヒナで実施したところ、量は 25, 50 mg/kg の投与量において有意に低下した（Fig. 5c, e ）。

(a)(b)

80

1.00
0.956040

piperine 1 mg/kg
vehicle200-3003060(c)90Respiratory quotient

Oxygen consumption(ml/min/kg body weight)

5, 25, 50 mg/kg のいずれの投与量においてもマウ

0.85
0.80

0.70

120 150 180 210 240

Time (min)-3003060(d)90

120 150 180 210 240

Time (min)1.00
0.956040

piperine 5 mg/kgvehicle

200-3003060(e)90Respiratory quotient

Oxygen consumption(ml/min/kg body weight)

piperine 1 mg/kgvehicle

0.7580piperine 5 mg/kg
vehicle

0.85
0.80

0.70

120 150 180 210 240

Time (min)-3003060(f)90

120 150 180 210 240

Time (min)

1.00

** **

**

40

piperine 20 mg/kg
vehicle20-30

0306090

120 150 180 210 240

Time (min)Respiratory quotient

0.95

*

60

00.90

0.7580

Oxygen consumption(ml/min/kg body weight)

0.90

0.90

piperine 20 mg/kg
vehicle

0.85
0.80
0.75
0.70

-30

0306090

120 150 180 210 240

Time (min)Fig 1. Oxygen
consumption
and respiratory
quotient
afterintragastricintragastric administrationof of piperine
Fig. 1 Oxygen
consumption
and respiratory
quotient
after
administration
piperine or a vehicle in mice. Each value is the*mean ± SEM. *Significantly different
or a vehicle in frommice.
value
meanANOVA± SEM.
theEachvehicle
groupisbythe
two-wayandSignificantly
unpaired t-test,different
p < 0.05 ( nfrom= 4 -10the) vehicle
group by two-way ANOVA and unpaired t-test, p < 0.05 (n = 4-10).

109(a)

(b)

80

1.00
0.95

60

Respiratory quotient

Oxygen consumption(ml/min/kg body weight)

エネルギー代謝変化をもたらす香辛料成分の探索とそのメカニズム解明

4020eugenol 50 mg/kg
vehicle0-30030Fig. 26090

eugenol 50 mg/kg
vehicle0.900.850.800.750.70

120 150 180 210 240

Time (min)-300306090

120 150 180 210 240

Time (min)Oxygen consumption and respiratory quotient after intragastric administration

(a)

(b)

80

0.90

600.854020DADS 50 mg/kg
vehicle0-300Fig. 3306090

Respiratory quotient

Oxygen consumption(ml/min/kg body weight)of eugenol
or a vehicle
mice. Each value
is theafter
meanintragastric± SEM ( n = 12).
Fig. 2 Oxygen
consumption
andinrespiratory
quotient
administration
ofeugenol or a vehicle in mice. Each value is the mean ± SEM (n = 12).

**0.800.75

0.70

120 150 180 210 240*Time (min)DADS 50 mg/kg
vehicle
-30

03060

90

120 150 180 210 240

Time (min)Oxygen consumption and respiratory quotient after intragastric administration ofFig. 3 Oxygen
consumption
respiratory
quotient
after± intragastricadministrationofDADSor a vehicle andin mice.
Each value
is the meanSEM. *Significantly
different
from the invehicle
groupby value
two-wayand±unpairedp < 0.05 ( ndifferent= 12 )DADS or a vehicle
mice.
Eachis ANOVA
the mean
SEM. *t-test,Significantly
fromthe vehicle group by two-way ANOVA and unpaired t-test, p < 0.05 (n = 12).

(a)

(b)

80

1.0060Respiratory quotient

Oxygen consumption(ml/min/kg body weight)*0.95

40200AITC 50 mg/kg
vehicle-300306090

120 150 180 210 240

Time (min)0.90

AITC 50 mg/kg
vehicle

0.85

*0.80
0.75
0.70

-30

0306090

120 150 180 210 240

Time (min)Fig. 4 Oxygen consumption and respiratory quotient
afterintragastricintragastric administrationof of AITC
9 afterFig. 4 Oxygen
consumption and respiratory quotient
administration
AITC or a vehicle in mice. Each value is the mean ± SEM. *Significantly different*or a vehicle in frommice.
value
meanANOVA± SEM.
theEachvehicle
groupisbythe
two-way
andSignificantlyunpaired t-test,different
p < 0.05 ( nfrom= 6 ) the vehicle
group by two-way ANOVA and unpaired t-test, p < 0.05 (n = 6).

110Vol.21（2014）

(a)

(b)

50

1.00
0.95403020

AITC 5 mg/kgvehicle

100

Respiratory quotient

Oxygen consumption(ml/min/kg body weight)

浦上財団研究報告書-300306090

Time (min)-3003060(d)90

120 150 180 210 240

Time (min)

1.00
0.95

4030

**

20

AITC 25 mg/kgvehicle

100-3003060(e)90Respiratory quotient

Oxygen consumption(ml/min/kg body weight)

0.80

0.70

120 150 180 210 240

50

AITC 25 mg/kgvehicle

0.90
0.85
0.80
0.75
0.70

120 150 180 210 240

Time (min)-3003060(f)5090

120 150 180 210 240

Time (min)

1.00
0.95

403020** ***** **AITC 50 mg/kg
vehicle10-30

0306090

Respiratory quotient

Oxygen consumption(ml/min/kg body weight)

0.85

0.75(c)0AITC 5 mg/kgvehicle

0.90

AITC 50 mg/kgvehicle

0.90
0.85
0.80
0.75
0.70

120 150 180 210 240

Time (min)-300306090

120 150 180 210 240

Time (min)Fig. 5 Oxygen consumption and respiratory quotient after intragastric administration ofFig. 5 Oxygen
consumption
and respiratory quotient after intragastric administration of AITC or aAITC or a vehicle in chickens. Each value is the mean ± SEM. *Significantly different*Significantly different from the vehicle
vehicle in chickens.
valuegroupis the± SEM.
fromEachthe vehicle
bymeantwo-way
ANOVA andunpaired t-test, p < 0.05 ( n = 11-12 )group by two-way ANOVA and unpaired t-test, p < 0.05 (n = 11-12).

3.

mTRPV1 及 び hTRPV1 に 対 す る オイゲ
ノールの反応性

4.

m TRPV1 及び cTRPV1 に対する AITC の反応性

HEK293T 細胞に hTRPV1 又は mTRPV1 を一HEK293T 細胞に mTRPV1 を一過性に強制発過性に強制発現させ、1 mM のオイゲノールを作現させ、1 mM のAITC を作用させたところ、内用させたところ、それぞれ内向きの活性化電流が向きの活性化電流が観察された（Fig. 7a）。一方観察された（Fig. 6a, b）。

12で cTRPV1 に 5 mM のAITC を作用させてもそのエネルギー代謝変化をもたらす香辛料成分の探索とそのメカニズム解明

Fig. 6

Eugenol activated human (a) and mouse (b) TRPV1.

Fig. 7AITC activated mouse TRPV1 (a). However, chicken
TRPV1 was not activated by AITC (b).

ような活性化電流は観察されなかった（Fig. 7b）。
考察
本研究では温度感受性 TRP チャネルに作用し111果と一致している。本研究ではむしろ、高用量のピペリン投与では酸素消費量の有意な低下が観察されており、これらは辛味や痛みによる行動量の低下によるものと推察している。てエネルギー代謝を調節する可能性のある香辛料

オイゲノールに関してはこれまでに報告の成分を探索した。TRPV1 を活性化することが知あったラットだけではなく 6）、ヒト及びマウスられている香辛料成分であるピペリン及びオイゲの TRPV1 も活性化することが本研究で明らかにノールの単回投与は、マウスの酸素消費量を上昇なった。マウスの TRPV1 をオイゲノールは活性させることはなかった。これらのことから、ピペ化するものの、単回投与ではエネルギー代謝に影リンやオイゲノールといった成分は、TRPV1 を響を与えるほどの活性はもっていないと推察され活性化して辛味や痛みを感じさせるものの、本実た。Fig. 6b で示したように、1 mM オイゲノー

験条件ではエネルギー代謝を亢進させないことがルの活性化電流は 1μM カプサイシンの活性化電示唆された。Gregersen らは、ピペリンを含む黒流より小さく、その活性はカプサイシンの 1000

コショウの単回摂取はヒトの食事性体熱産生を上分の 1 以下であることから、TRPV1 に対する活昇させないことを報告しており 11）、本研究の結性が弱いことからエネルギー代謝に影響を与えな

112

浦上財団研究報告書かったと考えられる。

Vol.21（2014）を投与したところ、マウスで観察されたような糖本研究において、ニンニクの成分である DADS質酸化量の増大作用は見られなかった。これらのが一時的な糖質酸化量亢進作用を有することが明ことから、ニワトリにおいては TRPV1 が AITCらかとなった。DADS は TRPV1 及び TRPA1 をを受容しないためにマウスで見られたような糖質活性化することが報告されている 9）。また、わさ酸化量の増大が観察されないと推察された。しかび の 成 分 で あ る AITC も TRPV1 及 び TRPA1 をしながら、ニワトリにおいては AITC によって活性化するが、TRPV1 を活性化することで糖質酸素消費量が低下していたことから、AITC によ酸化量が増大することがわかっている 10）。従っる辛味や痛みについては TRPV1 以外の受容体でて、本研究で観察された DADS による糖質酸化受容されている可能性が考えられた。Saito らは量の増大も TRPV1 を介した作用である可能性が最近、ニワトリの TRPA1 を AITC が活性化する考えられる。AITCとDADS の構造は似通っていことを報告しておりるため、それらの化学的特徴が糖質酸化量の増大

素消費量の低下には TRPA1 を介した痛みによるに深く関与している可能性が考えられる。同じく行動量の低下が関わっているかもしれない。ニワ

TRPV1 を活性化するカプサイシンやカプシエイ

トリは元来高血糖であることが知られているが、トには AITC のような糖質酸化量増大活性はない

その一因に TRPV1 を介した糖質酸化量の調節メため、何らかの未知のファクターがこれらの作用カニズムの欠損が関与している可能性が考えられに関与していると推察される。

る。哺乳類は進化の過程で TRPV1 を介した糖質

DADS は投与後に糖質酸化量を増大させた後、ベースラインよりも低下させる作用があることが12）、本研究で観察された酸制御機構を獲得したと推察されるが、その臨床的意義については今後検討する必要がある。

示唆された。一過性に糖質酸化量が増大したこと要約すると、本研究では新たにニンニクの成に対する代償作用であると考えられるが、このよ分である DADS にAITC と同様の糖質酸化量増

うな糖質酸化量の調節作用は、生活習慣病の一因大作用があることが示唆された。また、AITC にである食後の高血糖の解消に貢献できる可能性もよる TRPV1 を介した糖質酸化量の増大作用は鳥あるため、今後の詳細な検討が期待される。

類では見出されず、哺乳類に特徴的な生理作用でな

本研究において、Mori らが報告しているようあることが示唆された。その原因として鳥類の10）

TRPV1 は AITC によって活性化されないことが、AITC 投与によるマウスの糖質酸化量増大作用の再現性が確認できた。AITC においても関与していると推察された。

一過性の糖質酸化量の増大の後、若干の糖質酸化量の有意な低下が見られており、この点は DADS謝辞の結果と一致している。しかしながら DADS と比本研究の遂行にあたって貴重な研究助成を賜りべてその活性は非常に大きなものであることがわました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団及かった。

びその関係者の皆様に心より御礼申し上げます。

そ の よ う な AITC に よ る 糖 質 酸 化 量 増 大 作用の種特異性を調べるために、ニワトリにおけ文る AITC 活 性 を 検 証 し た と こ ろ、 ニ ワ ト リ のTRPV1 は AITC に対して応答性を示さないこと

1) Kawada, T., Hagihara, K.-I. & Iwai, K. Effects of capsaicinon lipid metabolism in rats fed a high fat diet. J. Nutr. 116,
1272–1278 (1986).

が明らかとなった。また、ニワトリヒナに AITC

2) Ohnuki, K. et al. Administration of capsiate, a non-献エネルギー代謝変化をもたらす香辛料成分の探索とそのメカニズム解明
pungent capsaicin analog, promotes energy metabolism
and suppresses body fat accumulation in mice. Biosci.
Biotechnol. Biochem. 65, 2735–2740 (2001).
3） Caterina, M. J. et al. The capsaicin receptor : a heatactivated ion channel in the pain pathway. 389, (1997).
4) Iida, T. et al. TRPV1 activation and induction of nociceptive
response by a non-pungent capsaicin-like compound,capsiate. Neuropharmacology 44, 958–967 (2003).
5) McNamara, F. N., Randall, A. & Gunthorpe, M. J. Effectsof piperine, the pungent component of black pepper, at thehuman vanilloid receptor (TRPV1). Br. J. Pharmacol. 144,781–90 (2005).
6) Yang, B. H. et al. Activation of vanilloid receptor 1 ( VR1 )by eugenol. J. Dent. Res. 82, 781–785 (2003).
7) Bandell, M. et al. Noxious cold ion channel TRPA1 isactivated by pungent compounds and bradykinin. Neuron
41, 849–57 (2004).
8) Masamoto, Y., Kawabata, F. & Fushiki, T. Intragastric113

administration of TRPV1, TRPV3, TRPM8, and TRPA1
agonists modulates autonomic thermoregulation in different
manners in mice. Biosci. Biotechnol. Biochem. 73, 1021–1027 (2009).
9) Koizumi, K. et al. Diallyl sulfides in garlic activate both
TRPA1 and TRPV1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382,545–8 (2009).
10) Mori, N. et al. Intragastric administration of allyl
isothiocyanate increases carbohydrate oxidation via TRPV1
but not TRPA1 in mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp.
Physiol. 300, R1494–R1505 (2011).
11) Gregersen, N. T. et al. Acute effects of mustard, horseradish,black pepper and ginger on energy expenditure, appetite, adlibitum energy intake and energy balance in human subjects.
Br. J. Nutr. 109, 556–563 (2013).
12) Saito, S. et al. Heat and noxious chemical sensor, chicken
TRPA1, as a target of bird repellents and identificationof its structural determinants by multispecies functionalcomparison. Mol. Biol. Evol. (in press).

114

浦上財団研究報告書

Vol.21（2014）

Searching of spice ingredients that modulate energy metabolism,and the mechanisms of these modulations
Fuminori Kawabata
Institute for Advanced Study, Kyushu UniversityAbstract
We searched spice ingredients that modulate energy metabolism such as capsaicin andcapsiate. Capsaicin and capsiate are spice ingredients and agonists of transient receptor
potential vanilloid 1 (TRPV1). It is well known that these compounds accelerate energy
expenditure via TRPV1. In the present study, we examined whether other spice ingredientssuch as piperine, eugenol, diallyl disulfide (DADS), and allyl isothiocyanate (AITC),
that are TRPV1 agonists, modulate energy metabolisms like capsaicin and capsiate byusing respiratory gas analysis system. Piperine, eugenol, DADS, and AITC are foundin black pepper, clove, garlic, and wasabi, respectively. Intragastric administration ofpiperine decreased oxygen consumption and did not affect respiratory quotient in mice.
Intragastric administration of eugenol did not affect both of oxygen consumption andrespiratory quotient in mice. On the other hand, DADS and AITC transiently accelerate
respiratory quotient without changing oxygen consumption in mice. These results suggestthat DADS and AITC transiently enhance carbohydrate oxidation in mice. Furthermore, toelucidate the molecular evolution of TRPV1, we compared mouse to chicken TRPV1 byusing whole cell patch-clamp technic. We found that chicken TRPV1 is not activated byAITC. Moreover, intragastric administration of AITC did not change respiratory quotientin chickens. However, oxygen consumption was decreased by AITC administration inchickens. These results suggest that AITC-induced carbohydrate oxidation enhancement isspecific in mammals. The decrease of oxygen consumption in chickens may be induced bypain sensation via TRPA1 because chicken TRPA1 is activated by AITC.
This work was supported by Research Grant from the Urakami Foundation, Tokyo, Japan.