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浦上財団研究報告書

Vol.24（2017）＜平成 24 年度助成＞

高脂肪摂取と脳ベータアミロイド沈着との関連性に関する実験病理学的研究
チェンバーズジェームズ（東京大学大学院農学生命科学研究科）

緒言

脂肪食を別の AD モデルマウス（ 3XTgAD）に投与した研究では、加齢性に記憶力が低下したが、現在、世界中で 475 万人が認知症を罹患していAβの沈着量に変化は認められなかった [ Knight

る [ 世界保健機構調査 ]。認知症の罹患率は、地域

EM 2014 ] 。すなわち、高脂肪食の摂取が AD のによらず 80 歳で 10 %、90 歳で 40 %程度である。

病理発生に与える影響については一定の見解が得

そのため、先進国のみならず新興国の高齢化が進られていない。また、マウスの認知機能評価とヒむなかで、急速に患者数が増加することが予想さ

トの認知機能評価の方法が異なるため、AD の病れる。認知症の 50 - 80 %をアルツハイマー型認知態を客観的にあらわす指標を用いて評価すること症（AD）が、20 - 30 %を血管型認知症（VD）が占が望まれている。

めており、この 2 つの疾患が認知症の 90%以上をAβ沈着や認知機能の低下は健常老人において占めている。AD と VD に共通する病態として脳も認められるが、AD の患者の脳では健常老人のにβアミロイド（Aβ）が沈着することから、Aβ脳と比べて Aβの N 末端が切断されたサブタイプの沈着を抑制あるいは除去することが認知症の予（AβN3）が優位に沈着することがわかっている

防と治療に重要であると考えられている。しかし[ Piccini A 2005 ] 。また、筆者らはヒト以外の動ながら、現時点で有効な治療法は開発されておら物の脳においてもプラークの中心部（コア）や血管ず、発症リスク因子を除去することによって発症壁に AβN3 が沈着することを確認しており、Aβを予防あるいは遅らせることが期待されているの N 末端の切断はヒト以外の動物においても共通[ Gandy S. 2011 ] 。

して起こる現象である [ Chambers JK 2011 ] 。Aβ

大規模な疫学調査において、高脂肪食の摂取やの C 末端サブタイプについては、AD 患者の脳に糖尿病と認知症の発症とのあいだに関連性が示さおいて AβN3 の沈着部位と一致して AβC43 のれている [ Kalmijn S 1997 ; Arvanitakis Z 2004 ] 。

沈着がみられている [ Saito T 2011 ] 。そこで本

高脂肪食の摂取については、特に中年期における研究では、これらの Aβのサブタイプに着目し、脂肪摂取が認知機能低下に影響するといわれていAD モデルマウス（5XFAD）を用いて中年期の高る [ Eskelinen MH 2008 ]。また、スタチン（高コ脂肪食摂取の影響を評価した。

レステロール治療薬）を摂取している老人は認知症の発症率が低いことが報告されている [ Jick H2000 ]。実験動物を用いた研究では、AD モデルマ

材料と方法（1）動物ウス（Tg2576）に高脂肪食を投与して糖尿病を誘AD モ デ ル ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク（ Tg ）マ ウ ス

発することにより Aβの産生と沈着が促進される（Tg (APPSwFlLon, PSEN1 *M146L*L286V)

ことが報告されている [ Ho L 2004 ]。一方で、高6799Vas）を Jackson Laboratory から購入、当研高脂肪摂取と脳ベータアミロイド沈着との関連性に関する実験病理学的研究

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究室で維持繁殖し、実験に供した。このマウスは、

ゼを不活化した。抗原賦活化処理として組織切片

家族性アルツハイマー病の変異遺伝子を導入してを 98 %ギ酸に 5 分間浸漬し、TBS（Tris - Buffered

おり、変異型 APP および変異型 PSEN を産生すSaline）で洗浄後に一次抗体と 4 ℃で一晩反応させることにより早期にヒト型 Aβが脳に蓄積する。

た。一次抗体として以下を使用した：マウス抗 Aβ

マウスの尾組織から抽出した DNA を以下のプラ

C42 抗体（ clone 12F4, Millipore, Temecula CA,イマーを使用して増幅し、ジェノタイピングをUSA）、マウス 抗 AβC40 抗 体（clone 11A5 -B10,行 っ た（C1000 Touch Thermal Cycler, Bio-Rad,Millipore, Temecula CA, USA）
、ウサギ抗 AβC43Hercules, CA, USA）。

抗 体（ IBL, Gunma, Japan）、ウ サ ギ 抗 AβN1

APP : fw AGGACTGACCACTCGACCAG ;抗 体（ IBL, Gunma, Japan）、 ウ サ ギ 抗 AβN3

rev CGGGGGTCTAGTTCTGCAT抗体（ IBL, Gunma, Japan）。TBS で洗浄後、HRP

PSEN : fw AATAGAGAACGGCAGGAGCA ;標 識 二 次 抗 体 ポ リ マ ー 試 薬（EnVision+, Dako,rev GCCATGAGGGCACTAATCATTokyo, Japan）と 37 ℃ で 40 分 間 反 応 さ せ た。

Control : fw CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT ;TBS 洗 浄 後、0.03 % 過 酸 化 水 素 0.05 % 3 ’
3-rev GTAGGTGGAAATTCTAGCATCA TCC。

diaminobenzidine Tris - HC l 緩 衝 液 と 反 応 さ せ、

（2）実験計画

抗原抗体複合物を可視化した。最後に、ヘマトキ

雄の Tg マウス 10 頭を用い、高脂肪食（ High Fat
Diet : HFD）給餌群（n = 5）および通常食（Normalシリンで対比染色を行った。
（4）画像解析

Diet : ND）給餌群（n=5）を設けた。それぞれの群は免疫染色を実施した標本を顕微鏡（Olympus

30 日 齢 で 離 乳 し、離 乳 後 か ら HFD 群 に は 高 脂

BX50, Olympus, Tokyo, Japan）で観察し、海馬肪飼料（ High Fat Diet 32、CLEA Japan, Tokyo,領 域 の 写 真 を 撮 影 し た。Nikon DS-Ri1 カメラJapan）を、ND 群 に は 標 準 飼 料（ MF、Oriental（Nikon, Tokyo, Japan）で 1280×720 画素の JPEG

Yeast, Tokyo, Japan ）を給餌した。動物は、明暗画像を取得し、画像解析ソフト Image J で解析周期および室温が管理された部屋で、自由に飲水した。HSB カラーモデルで陽性領域を抽出（Hueおよび摂餌できる環境で飼育し、本学動物実験委

0-45 ; Saturation 25-255 ; Brightness 100-255）、員会の承認のもと実験が実施された。10 日ごとに

8 - bit グレースケールに変換し、2 値化した。選択体重を測定、330 日齢で安楽死し、病理解剖を行っ領域の面積（μm 2 ）を測定した。

た。全血、大脳および全身諸臓器を採取した。全（5）血清学的解析

血は凝固後に 3,000 rpm で 10 分間遠心し、分離しMouse ApoE ELISA Kit（MyBioSource, Sanた血清を - 80℃で保管した。大脳の半球を - 80℃

Diego, CA, USA）を用いて、血清中のアポリポ蛋で凍結保存し、残りの大脳半球とその他臓器を白質 E（ApoE）濃度を測定した。iMark マイクロ10%中性緩衝ホルマリンで固定した。

プレートリーダー（ Bio-Rad, Hercules, CA, USA）

（3）病理組織学的解析を用いて、450 nm 波長で吸光度を測定した。

固定した大脳半球を冠状断し、常法に従いパラ（6）統計学的解析

フィン包埋、4 μm 厚の連続切片を作製、HE 染

上記の解析で得られた数値について、２群間色および免疫染色を実施した。免疫染色では、組（ND 群、HFD 群）でスチューデントの t 検定（下織切片を脱パラフィン後に 0.1 %過酸化水素メタ限 5 %危険率）を実施した。p < 0.05 を有意とした。

ノール液に 15 分間浸漬し、内因性ペルオキシダー

14結浦上財団研究報告書

Vol.24（2017）（2）大脳の Aβ沈着

果両方の群で大脳皮質および海馬において、びま（1）体重の変化ん性に Aβが斑状に沈着し、境界不明瞭なプラー実験開始時（30 日齢）には、それぞれの群の平クを形成していた。Aβの C 末端サブタイプの均体重に有意差は認められなかった（図 1）。その沈着パターンを比較すると、AβC40 および Aβ

後、両方の群で平均体重が増加し、150 日齢以降C42 が主にプラークを形成しており、AβC43 はは HFD 群の平均体重が ND の平均体重と比べてプラークの中心部に限局してドット状に沈着して有意に大きかった（図 1）。

いた（図 2）。Aβの N 末端サブタイプの沈着パター

図1

通常食群（ND）と高脂肪食群（HFD）の平均体重。実験開始時（Day30）の平均体重に差は認められない。Day150 および Day300 において、HFD の平均体重が有意に大きい（ p < 0.01）。

図2

通常食群（ND）と高脂肪食群（HFD）、Aβの C 末端に対する免疫染色。両方の群で海馬領域に
AβC40、AβC42、AβC43 が沈着し、プラークを形成する。主に AβC40 および AβC42が沈着し、AβC43 の沈着は軽度。ND 群と比べて HFD 群の方が、沈着程度が大きい。

高脂肪摂取と脳ベータアミロイド沈着との関連性に関する実験病理学的研究

15ンを比較すると、AβN1 が主にプラークを形成したところ、AβC40 および AβC42 の沈着面積がており、AβN3 はプラークの中心部に限局してHFD 群において ND 群よりも有意に大きかったドット状に沈着していた（図 3）。海馬領域におい（図 5）。AβC43 の沈着面積については、２群間てプラークを構成する Aβのサブタイプの割合をで差は認められなかった。AβN1 および AβN3

図 4 に示した。Aβの C 末端サブタイプについての沈着面積については、HFD 群において ND 群は、Aβ42 の割が最も大きく、Aβ43 の割合は小よりも大きい傾向を示したが、統計学的な有意差さかった。また、HFD の摂取により Aβ40 の割は認められなかった（図 5）。

合が増大する傾向を認めた。Aβの N 末端サブタ（3）血清 ApoE 濃度

イプについては、AβN1 が主体であり、HFD 摂採取した血清の色調は HFD 群において白濁し取により AβN3 の割合が軽度に増大する傾向をていた。ELISA を用いて血清中の ApoE 濃度を認めた。

測定した結果、HFD 群の方が ND 群よりも平均海馬領域における Aβの C 末端および N 末端サブタイプの沈着面積を ND 群と HFD 群で比較し値が大きいが、2 群間で統計学的な有意差は認められなかった（図 6）。

図3

通常食群（ND）と高脂肪食群（HFD）、Aβの N 末端に対する免疫染色。両方の群において海馬領域に AβN1、AβN3 が沈着し、プラークを形成する。主に AβN1 が沈着し、AβN3 の沈着は軽度。ND 群と比べて HFD 群の方が、沈着程度が大きい。

図4

通常食群（ND）と高脂肪食群（HFD）の海馬領域に沈着した Aβの C 末端および N 末端サブタイプの割合。C 末端サブタイプについては、Aβ42 の沈着割合が最も大きい。
HFD 群では Aβ40 の沈着割合が軽度に増大する。16

浦上財団研究報告書

図5Vol.24（2017）

通常食群（ND）と高脂肪食群（HFD）の海馬領域における Aβ沈着面積（μm 2 ）。HFD 群は、ND 群と比較して AβC40 と AβC42 の沈着面積が有意に大きい（ p < 0.05）。AβC43 の沈着面積は、ND 群と HFD 群で同程度（ p = 0.281）。HFD 群は、ND 群と比較して AβN1 とAβN3 の沈着面積が大きいが、統計学的有意差は認められない（ p = 0.398 ; p = 0.143）。

本研究で使用した AD モデルマウス（5XFAD）は、5 種類の家族性 AD の遺伝子変異が導入されており、早期に Aβが脳に沈着することから AD 研究で汎用されている。しかしながら、本マウスの脳における AβN3 および AβC43 の沈着についてはあまり解析されていなかった。本研究の結果から、5XFAD マウスにおいても AβN3 およびAβC43 サブタイプが大脳に沈着するが、その割図6

考通 常 食 群（ND）と 高 脂 肪 食 群（HFD）の 血 清 ApoE 濃 度。
HFD 群の血清 ApoE 濃度の方が、ND 群の血清 ApoE 濃度よりも高いが、統計学的有意差は認められない（ p = 0.439）。

察合は他のサブタイプと比べて小さく、プラークの中心部（コア）にドット状に観察された。
HFD 群は 150 日齢、300 日齢において有意に体重が大きく、採取した血清が白濁していたことから、HFD 群は肥満と高脂血症の状態であったと

本研究では、Aβの N 末端および C 末端に着目考えた。海馬は認知機能を司る主要な領域であるし、長期間の高脂肪食（HFD）摂取による AD 病ため、AD 研究において Aβの沈着量の評価に用理への影響を解析した。Aβは、その前駆蛋白質

いられる。HFD 群と ND 群の海馬における Aβの（APP : amyloid precursor protein）が切断される沈着面積を比較すると、AβC40 および AβC42ことにより産生されるが、切断される部位によりの沈着面積が HFD 群で有意に大きかったことか

N 末端および C 末端の様々なサブタイプが生じる。

ら、5XFAD マウスでは長期的な高脂肪食摂取に高脂肪摂取と脳ベータアミロイド沈着との関連性に関する実験病理学的研究

17より AβC40 とAβC42 の沈着量が増加すると考文えられた。AβC43 については、2 群間でほとん

1) Arvanitakis Z, Wilson RS, Bienias JL, Evans DA, Bennett
DA. Diabetes mellitus and risk of Alzheimer disease
and decline in cognitive function. Arch Neurol. 2004
May ; 61 (5) : 661-6.

ど違いがみられなかった。AβN 末端サブタイプについては、AβN1 および AβN3 の両方が HFD群において沈着面積が増加する傾向がみられた
が、統計学的な有意差は認められなかった。このことから、高脂肪食摂取により増加する Aβのサブタイプ は Aβ1 - 40、Aβ1 - 42、Aβ3 - 40、Aβ3 - 42 が主体であるが、その他の N 末端サブタイプ
AβX - 40、AβX - 42 が含まれる可能性が示唆された。
ApoE 蛋白質は肝臓やマクロファージ、星状膠細胞で産生され、脂質の輸送に関与している。ヒトでは ApoE4 遺伝子型が高脂血症および AD のリスク因子であり、マウスでは ApoE 遺伝子をノックアウトすることで Aβ沈着量が減少することが報告されている [ Fagan AM 2002 ; Kim J
2011 ]。本研究では、HFD 群で血清中の ApoE 濃度が高値を示したが、ND 群と比較して統計学的な有意差は認められなかった。HFD 群においてAβ沈着が増大したことと血清 ApoE の高値の関連性については、脳内の ApoE 濃度等について検討する必要があると思われる。
本研究は、大脳に沈着する Aβの N 末端および C 末端サブタイプに着目して、高脂肪食の AD病理に与える影響を解析したはじめての研究である。5XFAD マウスでは中年期の高脂肪食摂取により海馬における AβC40 および AβC42 の沈着量が増加するが、AβC43 や AβN3 の沈着および血中 ApoE 濃度に対する作用が比較的小さいことから、高脂肪食摂取の AD 病理への影響は限定的なものであると考えられた。
謝辞
本研究は、公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団の支援のもと実施されました、この場をお借りして厚くお礼申し上げます。

献2) Chambers JK, Mutsuga M, Uchida K, Nakayama H.
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浦上財団研究報告書

Vol.24（2017）

Experimental-pathological study on relation between
high fat intake and cerebral beta-amyloid deposition
James K. Chambers
Graduate School of Agricultural and Life Sciences
The University of TokyoAs the global population is getting older, number of dementia patients is increasing.
Alzheimer’s disease and vascular dementia accounts for more than 90% of dementia cases.
Because β-amyloid (Aβ) is involved in the pathogenesis of both Alzheimer’s disease andvascular dementia, the main strategy for preventing and/or curing the diseases is to decrease
cerebral Aβ deposition. Several epidemiological studies have suggested high fat intake asrisk factor for developing dementia. In the present study, we examined the effect of high fat
diet on Aβ deposition in a mouse model of AD. Mice that were fed with high fat diet for
300 days showed significantly higher AβC40 and AβC42 deposition in the hippocampal
area compared to mice that were fed with normal diet. However, AβC43 deposition level
was the same among the two groups. In respect of the N-terminus of Aβ, AβN1 wasdominant compared to AβN3 in both high fat diet group and normal diet group. Both Aβ
N1 and AβN3 deposition tended to increase in the high fat group, although the differenceswere not statistically significant. Also, serum Apolipoprotein E level tended to increasein the high fat group, although differences were not statistically significant. The abovefindings may indicate increase of other N-terminal subtypes of Aβ (i.e. Aβx-40 and Aβx-42) by feeding high fat diet to AD model mouse. In addition, since AβN3, the dominant
subtype that is deposited in AD brains, did not significantly increase by high fat diet, theeffect of high fat intake is modest in AD pathology.