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浦上財団研究報告書

Vol.30（2023）＜平成 30 年度助成＞

ビタミン B 12 欠乏により蓄積する異常な代謝産物が生殖機能に及ぼす影響

美藤友博（鳥取大学 農学部）

1．背景と目的ど多くの生殖機能が評価できる、③生殖腺内へのDNA プラスミド溶液のマイクロインジェクションがライフスタイルの変化により高齢出産・不妊治療多用されている、④ヒトを含む哺乳動物同様に、生が増加している我が国では、少子化問題の解決の糸育に B12 を要求するため B12 欠乏モデルとして利用口となる『健全な子の発育』に関する研究の推進がができる 3) 点が挙げられる。

必要不可欠である。

本研究では、中高齢者で急増する B12 欠乏症が不ビタミン B12（B12）は深紅の水溶性ビタミンであ妊症の要因の 1 つであるかどうか検討するために、り、我が国の食事摂取基準では推奨量 2.4 µg/ 日とB12 欠乏で蓄積するメチルマロン酸ならびにホモシ極めて微量で有効である。B12 欠乏症は不妊症、成ステインをマイクロインジェクション技術で線虫の長遅延や神経障害などの発症が報告されるが、その生殖腺に注入し、線虫の生殖機能に及ぼす影響を解詳細な発症メカニズムに不明点が多い。また、一般析した。

的に B12 欠乏症は動物性食品を摂取しない厳格な菜食主義者が呈しやすいことは知られているが、近年

2．方法

では胃の機能が低下した中高年（食事性 B12 吸収不良症）での罹患率の増加が報告されている 1)。

2．
1．線虫の調製法

B12 は生体内において、分岐鎖アミノ酸や奇数鎖B12 供給（コントロール）、B12 欠乏線虫は B12 添加

脂肪酸の異化代謝に関与するメチルマロニル CoA ム培地（B12 濃度：100 µg/L）ならびに B12 無添加培

ターゼならびにホモシステインと 5’- メチルテトラ地を用いて継代的に調製した 4)。回復線虫は B12 欠ヒドロ葉酸からメチオニンの生成を触媒するメチオ乏線虫を B12 添加培地で 3 世代継代的に生育させ調ニンシンターゼの補酵素として機能している。B12製した 4)。また、B12 欠乏で蓄積する異常な代謝産物欠乏症を呈すると両酵素活性の低下に伴い、メチルの影響を解析するために 3 日齢のコントロールの生マロン酸およびホモシステインが細胞内に蓄積し、殖腺にメチルマロン酸（25 µM、0.2 µL）またはホその後尿中へと移行し排泄される。しかし、これらモシステイン（30 µM、0.2 µL）を注入した（図 1）。

B12 欠乏で蓄積する異常な代謝産物（メチルマロン酸ならびにホモシステイン）の生体内への影響を詳細に解析した研究は極めて少ない。

2．
2．生殖機能の解析
線虫の生殖機能として総産卵数、孵化数、産卵期

これまでに B12 欠乏症の詳細な発症機構をモデル間（線虫が産卵を始めてから産卵を終了するまでの生物である線虫（Caenorhabditis elegans ）を用いて期間）を評価した。生殖機能の解析にはビデオカメ解析してきた 。線虫の特徴は、①自家受精を行うラを装着した顕微鏡（ECLIPSE Ts2-FL、株式会社ニため基本的にモノクローンであり個体差が極めて小コン）を用いた。

2)

さい、②雌雄同体のため 1 個体で精子・卵・受精なビタミン B 12 欠乏により蓄積する異常な代謝産物が生殖機能に及ぼす影響

図125

線虫へのマイクロインジェクションの様子

2．
3．B 12 欠乏で発現変動を示す生殖関連遺伝

3．結果

子の探索
コントロールおよび B12 欠乏線虫から RNA を抽出

3．
1．B 12 欠乏ならびに異常な代謝産物の蓄積し、mRNA 精製キットを用いて mRNA を精製した。

が線虫の生殖機能に及ぼす影響

次世代シークエンサーによるトランスクリプトーム

コントロール線虫と B12 欠乏線虫を比較し、総産解析を行った。コントロールと比較し、5 倍以上も卵数ならびに孵化数に大きな変動を示さなかった

しくは 1/5 倍以下の遺伝子発現量を示す遺伝子を（図 2）。孵化率においても、両線虫ともに約 90％とB12 欠乏で発現変動を示す遺伝子と設定した。

変化は見られなかった。また、メチルマロン酸ならびにホモシステインを注入した線虫においても、総産卵数、孵化数ならびに孵化率に有意な変動を示さなかった。これらの結果から、B12 欠乏ならびに B12

図2

B12 欠乏ならびに異常な代謝産物の蓄積が産卵数、孵化数、孵化率に及ぼす影響

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浦上財団研究報告書

Vol.30（2023）

欠乏で蓄積するメチルマロン酸ならびにホモシステは線虫の産卵期間を延長させると共に、その要因のインは線虫の総産卵数や孵化数に影響を及ぼさない

1 つにメチルマロン酸の体内への蓄積が考えられた。

ことが考えられた。
一方、線虫の産卵期間に関しては、コントロール線虫と比較し、B12 欠乏線虫では産卵期間の延長が3．
2．B 12 欠乏で発現変動を示す生殖関連遺伝子について確認された（図 3）。コントロールは産卵開始時よりトランスクリプトーム解析の結果、B12 欠乏で発1 日（24h）の間で総産卵数の内の約 65％を産卵し、現変動を示す 75 遺伝子を見出した（図 4）。その内産卵開始から 2 日間（48h）でほぼ産卵を終えた。

65 遺伝子は精子に関連する遺伝子であり、そのほ一方、B12 欠乏線虫は産卵開始時より 1 日の間で総とんどがアップレギュレートしていた。また、精子産卵数の約 20％程度しか産卵を行わず、産卵開始 2および卵関連遺伝子として、卵母細胞の細胞外マト日目で産卵のピーク（総産卵数の内の約 50％を産卵）リックス透明帯への接着に関与するゾナドヘシン遺を迎え、その後も産卵開始 5 日目まで産卵を続けた。

伝子や産卵活動を制御するセロトニンの体内濃度維

また、回復線虫はコントロール線虫と同様の産卵パ持に関連する遺伝子が顕著にダウンレギュレートすターンを示したため、B12 欠乏線虫で確認された産ることが明らかになった。

卵期間の延長は B12 欠乏症による影響であることが推察される。非常に興味深いことに、ホモシステイ

4．考察と今後の展開

ンを注入した線虫はコントロールと同様の産卵パターンを示したのに対して、メチルマロン酸を注入

本研究において、B12 欠乏で蓄積するメチルマロした線虫は B12 欠乏線虫と似た産卵パターンを示すン酸は線虫の産卵期間を延長させることが示唆されことが明らかになった。これらの結果より、B12 欠乏

た。メチルマロン酸は TCA 回路の主要酵素であるコ

図3

B12 欠乏ならびに異常な代謝産物の蓄積が産卵期間に及ぼす影響

ビタミン B 12 欠乏により蓄積する異常な代謝産物が生殖機能に及ぼす影響

図427

B12 欠乏が生殖機能関連遺伝子の遺伝子発現に及ぼす影響

ハク酸デヒドロゲナーゼの酵素阻害剤として機能す体内メチル基供与体である S - アデノシルメチオニン

ることが報告されている 5)。B12 欠乏症で報告されるが減少することでポリアミン代謝が抑制されること

成長遅延の要因はこの TCA 回路の阻害が関与するとを見出したと共に、そのポリアミン代謝異常が線虫考えられているが、本研究で得られた産卵期間の延の寿命に影響を及ぼすことを明らかにした 6)。

長にどのように影響しているのかは不明である。

セロトニンは線虫の陰門（産卵口）の開閉を担う線虫は幼虫期に 300 個弱の精子を作り、成虫期に陰門筋の動きを制御する伝達物質である。今後は卵を形成し、貯精嚢に貯めた精子を使って自家受精

B12 欠乏におけるセロトニン濃度の変動を確かめ、を行う。本研究では成虫期の精子形成を終えた線虫

B12 欠乏で蓄積する異常な代謝産物がどのように関にメチルマロン酸とホモシステインを注入したた与するのか検討したいと考えている。また、本研究

め、精子形成への影響はないと考えられる。これは成果をきっかけに B12 欠乏で誘発される不妊症の発孵化数・孵化率のデータからも推察される。また、症メカニズムを分子レベルで解明し、治療法・予防卵母細胞への精子接着に関与する遺伝子が B12 欠乏法の開発に役立てたいと考えている。

で著しい遺伝子発現の低下を示していたことにより、精子と卵の受精効率が低下していることが考えられる。
また本研究を遂行するにあたり、B12 欠乏では生28

謝浦上財団研究報告書

辞本研究を遂行するにあたり、多大なるご支援を賜りました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に心より御礼申し上げますと共に、貴財団の益々の御発展を祈念申し上げます。

Vol.30（2023）

参考文献

1) Bito T. et al. (2013) J Agric Food Chem , 61, 38523858.
2) Bito T. et al. (2017) Redox Biol , 11, 21-29.
3) Bito T. and Watanabe F. (2016) Exp Biol Med , 241,1663-1668.
4) Bito T. et al. (2013) FEBS Open Bio , 3, 112-117.
5) Toyoshima S. et al. (1995) J Nutr , 125, 2846-2850.
6) Bito T. et al. (2019) Metabolites , 9, 192.

Effect of abnormal metabolites on reproductive function during vitamin B 12 deficiency

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Effect of abnormal metabolites on reproductive function duringvitamin B12 deficiency
Tomohiro BITOFaculty of Agriculture, Tottori University
Developed countries have the problem of an aging population and low birthrate. In Japan, late child-bearing and receiving infertility treatment is increasing
with the change of our lifestyle. Therefore, it is very important for studies to be
carried out on the birth and growth of healthy children.
Vitamin B 12 (B 12), commonly known as the red-colored vitamin, has the largest
molecular mass and the most complex structure of all vitamins. People withatrophic gastritis who develop low stomach acid output frequently present
food protein-bound B 12 malabsorption, which prevails in middle-aged andelderly people. Thus, these individuals are at an increased risk of developing
B 12 deficiency. B 12 deficiency induces various diseases, such as megaloblastic
anemia, developmental disorders, growth retardation, and infertility. However,
the mechanisms that are involved remain poorly understood.
In mammals, B 12 functions as a coenzyme for methylmalonyl-CoA mutase andmethionine synthase, respectively. In B 12 deficiency, methylmalonic acid andhomocysteine both accumulate, with a decrease in their enzymatic activities.
The results of our previous study indicated that Caenorhabdit is eleg ans
developed severe B 12 deficiency associated with infertility, growth retardation,and reduced lifespan when grown under B 12 -deficient conditions, suggestingthat C . eleg ans may be a suitable mo del for clarify ing the physiolog ical
functions of B 12 , and the mechanisms underlying the symptoms caused by B 12deficiency.
When worms were grown under B 12 -deficient conditions, and injected withmethylmalonic acid, respect ively, the egg-lay ing perio d was extended. In
addition, the expression of genes involved in fertilization between sperm andeggs was decreased in B 12 -deficient worms. These results indicated that theaccumulation of methylmalonic acid due to B 12 deficiency may be the cause of
the decrease in fertilization efficiency.