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食品中の抗酸化物質がもつ様々な活性ラジカル消去能の評価法の構築＜平成 21 年度助成＞

食品中の抗酸化物質がもつ様々な活性ラジカル消去能の評価法の構築
末石芳巳（岡山大学大学院自然科学研究科）

1.

緒

ラップ法を用いた ORAC-EPR 法を提案した 2)。

言

抗酸化物質の働きは酸素中心ラジカル（RO •）だけ

抗酸化物質は、一般に、活性酸素を消去する物でなく、一酸化窒素（NO）、アルキルラジカル（R •）質として知られており、高い関心がもたれている。などの消去もおこなうことはよく知られている。

体内で過剰の活性酸素は、体内消去システムや食しかしながら、酸素中心ラジカルの他の活性ラジ品中の抗酸化物質によって消去され、健康が維持カル（例えば、NO およびメチルラジカル ( アルされている。しかしながら、ストレス、紫外線、キルラジカルの一種 )）に対する消去能の評価（定など様々な要因によって人体はダメージを受けて量化）法についての報告は未だなされていない。

おり、過剰の活性酸素が糖尿病等の疾患発生の原

本研究では、EPR スピントラップ法を用い、様々因となっている。これらを予防するためには野菜な活性ラジカルに対する抗酸化物質によるラジカや果物中のビタミンなどの抗酸化物質を含む食品

ル消去能を定量化し、抗酸化物質の活性ラジカルを摂取することが重要となるが、その食品にどの消去能プロファイルの構築をおこなった。

程度の抗酸化能力があるのか分からない場合が殆どである。抗酸化能力が食品にどれだけ含まれているのかを測定する方法として、近年、米国を中

2.

実験方法

2.1

試

薬

心に話題になっている測定法が ORAC（Oxygen

水溶性および疎水性の様々な抗酸化物質は東Radical Absorbance Capacity）であり、酸素中心

京化成株式会社、和光純薬、およびナカライ社

ラジカル消去能により抗酸化能力を分析する基準

製 の も の を 用 い た： ト ロ ロ ッ ク ス（trolox）、グ1）

として、世界的で用いられるようになっている 。

ル タ チ オ ン（reduced glutathione）、コーヒー酸さらに、米国では、ORAC 値を表記した食品が（3,4-dihydroxy- cinnamic acid (caffeic acid)）、アセ販売され、消費者に抗酸化力の程度を具体的な数チルシステイン（N - acetylcysteine (NAC)）、ゲニ

値で表し、健康志向が高まっている。今後、日本ステイン（genistein）、尿酸（uric acid）、カテキンにおいても、普及してくるものと思われる。これ（catechin (CA)）
、エピカテキン（epicatechin (EC)）
、まで用いられている ORAC 測定法は、蛍光プロー

エ ピ カ テ キ ン ギ ャ レ ッ ト（epicatechin gallate

ブによる蛍光の遅延現象の解析によるものであ(EGCg)）、ケルセチン（quercetin (QR)）
、ケンフェる。その方法は煩雑であり、測定時間も要するとロール（kaempferol (KAP)）、ミリセチン（myricetinいういくつかの欠点をもっている。それらの欠点(MYR)）、レスベラトロール（resveratrol (RESV)）、の克服のため、我々は最近、ラジカルの反応性をアスタキサンチン（astaxanthin (ASX)）。

直接追跡する簡便、迅速な ORAC 決定法として、

一 酸 化 窒 素（NO）は ジ エ チ ル ノ ノ エ イ ト

抗酸化物質とスピントラップ剤との競争スピント（NONOate sodium salt (NONOate)）の熱分解、メ

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浦上財団研究報告書

チルラジカルはアセトキシトリメチル鉛の光分解

Vol.18（2011）のように表される。

から発生させた。測定溶媒としては 100 mM のリ

PTIO + NO → PTI + NO2 ,kPTIOン酸緩衝液（pH = 7.4）を用いた。メチルラジカル

AOx + NO → EPR silent product,kAOxの捕捉には、スピントラップ剤としてよく知られNO の捕捉相対速度は次式で与えられる。て い る 5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide (DMPO)(1)（東京化成社製）を用いたが、DMPO のようなニトロソ化合物では NO の捕捉はできない。NO の

ここで、S 0 , S a , および S b はそれぞれ PTIO のみ、検出には下記の反応を利用した 2-phenyl-4,4,5,5-PTIO ＋ NO，PTIO ＋ NO ＋抗酸化物質の場合

tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-oxide (PTIO)（ 東の EPR スペクトルの積分値を表す。また、抗酸3）化物質 (AOx) と PTIO の濃度から生成速度比は

京化成社製）を使用した 。

次のように表すことができる。
(2)
PTI

PTIO
Scheme 1

2.2

EPR 測定抗酸化物質による NO およびメチルラジカル

ここで、αは定数である。右辺の { [AOx] 0 -α(S bS a ) } /αS b に対する左辺のプロットの傾きから、
PTIO と抗酸化物質の NO 消去反応の速度定数比を見積もることができる。の消去能の評価（定量化）はラジカル捕捉剤とのメチルラジカルの抗酸化物質と DMPO との競競争反応から見積もった。NO の場合は、抗酸化争反応も同様に次のように表される。

物質と PTIO、メチルラジカルは抗酸化物質とDMPO + • CH 3 → DMPO-CH 3 ,kDMPODMPO との競争である。

AOx + • CH 3 → EPR silent product,kAOx

NO の消去能の定量化においては、PTIO と抗DMPO スピンアダクトの EPR スペクトル強度と酸化物質を溶解した溶液に NONOate を加え、そ初濃度比 ( [ AOx] 0 / [DMPO ] 0 ) との解析から、次の EPR スペクトルを測定した。PTIO と PTI の式に従い、容易にラジカル消去能を見積もること

2 種類のラジカル種を含んだ溶液の EPR スペクができる2）。

トルは付属のソフトを用い、シミュレーション(3)

し、PTIO と PTI のスペクトル強度の比から 2 種のラジカル種の濃度比を見積もった。メチルラ

こ こ で、I は ア ダ ク ト の EPR ス ペ ク ト ル 強 度、ジカルの消去に関しては、トリメチル鉛化合物、[ ] 0 は DMPO および抗酸化物質の初濃度である。

DMPO、および抗酸化物質を含んだ溶液に紫外線

この場合は、[AOx] 0 /[DMPO] 0 に対する ( I 0 - I ) /Iを照射し、メチルラジカルを発生させ、DMPOのプロットの傾きから速度定数比が求められる。

－メチルアダクトの生成量から、DMPO と抗酸化物質の反応速度比を見積もった。NO およびメ
チルラジカル消去能の見積り方法の詳細は次に示す。
2.3

速度論的解析

NO の PTIO と抗酸化物質との消去競争反応は次

3.

結果と考察

3.1

水溶性抗酸化物質による NO の消去能

Fig. 1a には PTIO の EPR スペクトルを示した。
NONOate の熱分解より NO を発生させた場合、NO と PTIO との反応により PTI が生成し、そ食品中の抗酸化物質がもつ様々な活性ラジカル消去能の評価法の構築

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れら 2 種類のラジカル種が観測できる（Fig. 1b）。
抗酸化物質を添加した溶液でおこなうと、PTIの生成が明らかに減少し (Fig. 1c)、抗酸化物質（ trolox）と PTIO との競争が伺える。Fig. 2 には、
式 (2) に従った trolox/PTIO 系でのプロットを示した。原点を通る直線が得られており、式 (2) による見積りが妥当であることを示唆している。そのプロットの傾きより PTIO と様々な抗酸化物質との相対的反応速度定数（ kAOx/kPTIO ）を見積もった（Table 1）。通常、ORAC 値はトロロックスの値を基準にして表される。Table 1 には NO の消去能力（trolox 比）を ORAC 値とともに列挙し、棒グラフにより ORAC 値との比較を Fig. 3 に示した。本研究において用いた水溶性抗酸化物質の中では、尿酸が最も高い NO の消去能力を示している。グルタチオンと NAC においては、NO のFig. 1 (a) EPR spectrum of PTIO (AN = 0.82 mT) before
mixing NONOate. (b) EPR spectrum obtained
after mixing NONOate (1 min incubation period).
PTI (AN = 0.98 and 0.43 mT). (c) EPR spectrum
obtained after mixing trolox and NONOate.

消去能力は観測できなかった。抗酸化物質による RO • ラジカルの消去能（ORAC）と比較すると、尿酸が最も高い消去能を示すことは NO の消去能の結果と一致しているが、グルタチオンおよびNAC はわずかながらでも酸素中心ラジカルを消去するが、NO は消去されないことがわかる。
抗酸化物質によるラジカル消去反応の反応機構としては，抗酸化物質からの水素引き抜き反応または電子移動反応により進行すると提案されている 4）。抗酸化物質と NO との反応の機構を明らかにするため、抗酸化物質の酸化電位を測定し、Fig. 2 A plot of (S b -S a ) / (S0-Sb ) against { [ AOx]0-α(SbS a ) } / α Sb according Eq. 2.

NO の消去能との比較をおこなった。得られた酸
Table 1 Relative NO radical scavenging ability of hydrophilic antioxidants

RO • (ORAC) aNOAntioxidant

kAOx/kPTIO

vs. trolox

vs. trolox

E ox / mV

Uric acid25.6 ± 0.6

3.5 ± 0.2

2.2

470

Caffeic acid

8.8 ± 0.4

1.2 ± 0.1

1.6310Trolox7.3 ± 0.3

1.01.0230

Genistein

1.4 ± 0.2

0.19 ± 0.03

0.43

195

Glutathione~0~00.57-10NAC~0~00.40< -10a) Alkoxyl radical generated from the AAPH decomposition.2)

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浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）

Eox / mV
Fig. 4 The relationship between trolox-equivalent NOscavenging capacities and oxidation potentials ofhydrophilic antioxidants.

本研究においても、CD による可溶化、つまり、包接化合物の NO 消去能を ORAC-EPR 法によりFig. 3 Bar graphs for NO-scavenging capacity ofhydrophilic antioxidants.

決定した。様々なシクロデキストリンが市販され化電位 ( Eox ) は Table 1 に示し、Fig. 4 には酸化ているが、ここでは、比較的大きな分子である抗電位と NO 消去能との関係を示した。抗酸化物質

酸化物質の包接に適し、また、水への溶解性が高の酸化電位の増加とともに明らかに NO の消去能められた修飾シクロデキストリン（ heptakis (2,6-も増加しており、酸化電位が約 200 mV 以上の抗

di-O-methyl ）-β-cyclodextrin (DM- β-CD)）を 使酸化物質により NO が消去されるという興味深い用した。PTIO の約 40 倍過剰の DM-β-CD を溶結果を得た。酸化電位の測定値との良い相関だけ液に添加することにより、すべての抗酸化物質はで、反応機構の厳密な議論はできないけれども、包接化合物として溶解し、また、すべての PTIONO と抗酸化物質との反応は、電子移動をともなは包接化合物として溶液中に存在することを確認

う酸化還元反応から進行するものと思われる。

した。脂溶性抗酸化物質の NO 消去能の決定は、脂溶性抗酸化物質による NO の消去

CD を加え、抗酸化物質を溶解したのち、前項と3.2

通常、ORAC 値の測定は水溶液中でおこなわ同様に、包接された PTIO と様々な包接抗酸化物れている。カテキン、フラボノイドなどの脂溶性質との NO 消去速度の比を式 (2) に従い求めるこの抗酸化物質の測定に際しては、シクロデキストとができる。得られた速度定数比およびトロロッリン（CD）の包接現象を利用し、水溶液に可溶にクスの NO 消去速度に対する相対値を Table 2 に5）まとめた。また、Fig. 5 にはそれらの結果を棒グし ORAC 値を測定する方法が提案されている 。

Table 2 Relative NO radical scavenging ability of lipophilic antioxidants in the presence of DM-β-CDRO • (ORAC) aNOAntioxidant

kAOx/kPTIOvs. troloxvs. trolox

RESV-CD

4.29 ± 0.21

26.8 ± 1.30.64

CA-CD

1.41 ± 0.07

8.8 ± 0.40.96

MYR-CD

1.16 ± 0.06

7.3 ± 0.4

3.16

EC-CD

0.55 ± 0.03

3.4 ± 0.20.94

EGCg-CD

0.34 ± 0.02

2.1 ± 0.1

1.29

KAP-CD

0.19 ± 0.01

1.2 ± 0.1

0.37

Trolox-CD

0.16 ± 0.01

1.01.0a) Alkoxyl radical generated from the AAPH decomposition.6)

NO-scavenging capacity (vs. trolox)

食品中の抗酸化物質がもつ様々な活性ラジカル消去能の評価法の構築

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DMPO によるメチルラジカルを捕捉したラジカ

26.8

ル種のみのであることがわかる（AN = 1.64 mT, AH= 2.35 mT）。抗酸化物質（例えば、trolox）を添加した溶液でおこなった場合、スピンアダクトの生成量は減少し、抗酸化物質と DMPO がメチルラジカルと競争的に反応していることがわかる。ス
ピンアダクトの減少量（DMPO によるメチルラジカルの捕捉量）から式 (3) に従い、種々の水溶性抗酸化物質によるメチルラジカル消去能の定量化を

Fig. 5 Bar graphs for NO-scavenging capacity oflipophilic antioxidants.

おこなった（解析の詳細は文献 2 参照）。種々の水溶性抗酸化物質によるメチルラジカル消去速度とラフで示した。脂溶性の抗酸化物質においては、

DMPO による捕捉速度の比を見積り、それらのカテキン類、フラボノイド類いずれの抗酸化物質結果を用い、ラジカル消去能比（k AOx/k DMPO）をもトロロックスの NO 消去能より高く、RO • ラジ見積もった。さらに、ORAC 値との比較のため、カルの消去能との相関は良くないという結果を得トロロックスによるメチルラジカル消去速度を基た。特に、レスベラトロールは非常に高い NO 消準に表した速度定数比（消去能 k AOx/k trolox）を算出去能を示している。ラジカル消去能の評価（定量した。得られた結果は、Fig. 7 に ORAC 値とと化）に対する CD 包接の効果の検討が充分にはな

もに棒グラフで示した。

されていないので、今後さらなる検討が必要であるが、現時点においても、重要な結果が得られている。脂溶性抗酸化物質は、老化および疾患発生の原因である活性酸素（酸素中心ラジカル）等の消去能も高いが、生体機能性因子である NO の消去能も高いため、脂溶性抗酸化物質の摂取においては注意が必要である。
3.3

水溶性抗酸化物質によるメチルラジカルの消去能

アセトキシトリメチル鉛の光照射によりメチルラジカルを発生させ、ラジカル捕捉剤である

Fig. 7 Bar graphs for . CH 3 -scavenging capacity ofhydrophilic antioxidants.

DMPO に捕捉させたスピンアダクトの EPR スペ

ここでの研究に用いた水溶性抗酸化物質の中でクトルを Fig. 6 に示した。得られたスペクトルはは、メチルラジカルの消去にゲニステインが最もFig. 6 EPR spectra of DMPO-CH 3 . adduct.

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浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）

有効であることがわかった。また、全体的には、ORAC 値の測定に用いる酸素中心ラジカル（RO •）と同程度の消去能を有しているが、両者の消去能の間に相関はないことも重要な結果である。いずれのラジカルも抗酸化物質からの水素引き抜き反応によりラジカルが消去されるものと思われるが、得られた結果に対するラジカル種による違いは、立体障害等のラジカルの反応性の違いによるものであろう。
3.4

脂溶性抗酸化物質によるメチルラジカルの消去能

Fig. 8 Bar graphs for . CH 3 -scavenging capacity oflipophilic antioxidants.

脂溶性抗酸化物質のメチルラジカル消去能の測定に際しては、3.2 章と同様、DM-β-CD による（ORAC 値）とメチルラジカルの消去能との間に包接現象を利用し、水溶液に溶解し、種々の脂相関はみられないが、全体的に、本研究で用いた溶性抗酸化物質のメチルラジカル消去能を評価

脂溶性抗酸化物質はメチルラジカル（アルキルラした。スピンアダクトの EPR スペクトルから、ジカル）に対して非常に高い消去能を有している

DMPO 濃度の約 80 倍過剰の DM-β-CD を添加すことがわかる。

ることにより、溶液中の DMPO メチルアダクトはすべてシクロデキストリンに包接されることが4.

おわりにわかった。その結果に基づき、ここでは DMPO食品中に含まれる抗酸化物質による活性ラジカの約 80 倍過剰のシクロデキストリンを添加し、3.3

ル消去能については、現在、酸素中心ラジカルの章の水溶性抗酸化物質のメチルラジカル消去能評一種類（RO •）に関してのみ評価され、あたかもそ価法と同様に、式 (3) に従い、抗酸化物質によるの数値が抗酸化物質による様々な活性ラジカル消メチルラジカル消去速度定数と DMPO による捕去能であるとされていることを初めに述べた。本捉速度定数の比（k AOx/k DMPO）を見積もった。得ら研究では、抗酸化物質による一酸化窒素およびアれた結果より、トロロックスによるメチルラジカルキルラジカル（メチルラジカル）の消去能の評

ル消去速度を基準に種々の脂溶性抗酸化物質によ価法を構築し、また、ラジカル種の違いにより抗るメチルラジカル消去能を見積り、ORAC 値と酸化物質との反応性（消去能）に明らかな違いがの比較を示した（Fig. 8）。なお、メチルラジカルあることを示すことができた。酸素中心ラジカルの捕捉には非常に有効な CYPMPO を用いるようの消去能だけで抗酸化物質のラジカル消去能を議実験条件の設定を試みたが、CD 存在下での脂溶論できないことは明らかである。今後、抗酸化物性抗酸化物質の評価における満足な条件が設定で質のラジカル消去能の評価（定量化）には、さらきなかったため、ここでは、ラジカル捕捉剤としに様々なラジカル種の消去能を調べ、総合的な評て DMPO を用いることとした。

価法の構築をおこなう必要がある。

アスタキサンチンが非常に高いメチルラジカルの消去能を示している。ここに用いた脂溶性抗酸化物質による酸素中心ラジカル（RO •）の消去能謝辞
本研究を遂行するにあたり、多大な研究助成金

食品中の抗酸化物質がもつ様々な活性ラジカル消去能の評価法の構築を賜りました財団法人浦上食品・食文化振興財団に心より感謝申し上げます。
文献1) Prior, R.L., Cao, G., Measurement of oxygen radicalabsorbance capacity in biological samples. Methods
Enzymol, 299, 50-62 (1999).
2) Kohri, S., Fujii, H., Oowada, S., Endo, N., Sueishi, Y.,Kusakabe, M., Shimmei, M., Kotake, Y., An oxygen radicalabsorbance capacity-like assay that directly quantifies theantioxidant's scavenging capacity against AAPH-derived
free radicals. Analytical Biochemistry, 386, 167-171(2009).
3) Akaike, T., Yoshida, M., Miyamoto, Y., Sato, K., Kohno,
M., Sasamoto, K., Miyazaki, K., Ueda, S., Maeda, H.,
Antagonistic action of imidazoline-oxyl N-oxides against

65

endothelium-derived relaxing factor/. NO (nitric oxide)
through a radical reaction. Biochemistry, 32, 827-832(1993).
4) Huang, D., Ou, B., Prior, R. L., The chemistry behindantioxidants capacity assays. Journal Agricultural and FoodChemistry, 53, 1841-1856 (2005).
5) Huang, D., Ou, B., Hampsch-Woodill, M., Flanagan, J.
A., Deemer, E. K., Development and validation of oxygen
radical absorbance capacity assay for lipophilic antioxidants
using randomly methylated β-cyclodextrin as the solubility
enhancer. Journal Agricultural and Food Chemistry, 50,
1815-1921 (2002).
6) Sueishi, Y., Ishikawa, M., Yoshioka, D., Endohb, N.,
Oowada, S., Shimmei, M., Fujii, H., Kotake, Y., Oxygen
radical absorption capacity (ORAC) of cyclodextrinsolubilized flavonoids, resveratrol, and astaxanthin as
measured with the ORAC-EPR method. Journal of Clinical
Biochemistry and Nutrition, (2011) to be submitted.

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浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）

Evaluation of radical scavenging capacity of hydrophilic andlipophilic antioxidants in foods
Yoshimi Sueishi
Department of Chemistry, Faculty of Science, Okayama University
Nitric oxide (NO)-scavenging capacities of hydrophilic and lipophilic antioxidants
were determined by using a competitive NO-scavenging method with PTIO (2-phenyl4,4,5,5-tetra-methylimidazoline-1-oxyl 3-oxide). NO was thermally produced fromchemical precursors and the decrease of NO level by the presence of antioxidants wasquantified. NO-scavenging rate constants of the antioxidants were in the order of: uricacid > caffeic acid > trolox > genistein > glutathione ≈ N-acetylcysteine for hydrophilic
antioxidants and RESV > CA > MYR > EC > EGCg > KAP > trolox for lipophilic
antioxidants which were solubilized by modified β-cyclodextrin in aqueous solution.
For the sake of comparison to oxygen radical scavenging capacity or oxygen radical
absorption capacity (ORAC) of these compounds, NO scavenging capacity is expressedin trolox equivalent unit that has been customarily used in the ORAC method. For
hydrophilic antioxidants, uric acid has been shown to have highest ORAC value among
these hydrophilic antioxidants, but the order including other antioxidants was: uric acid> caffeic acid > trolox > glutathione > genistein ≈ N-acetylcysteine, indicating that theagreement to NO-scavenging capacity was only fair. Among the lipophilic antioxidants
tested, RESV showed the highest NO-scavenging capacity and trolox showed the lowest.
The oxygen radical scavenging capacity of lipophilic antioxidants does not correlate with
NO-scavenging capacity. We assumed that NO scavenging reactions by the phenolicantioxidants are via redox reactions but not free radical mechanism. We measured
oxidation potentials of hydrophilic antioxidants in aqueous solution and the result indicatesthat the order of oxidation potential was exactly the same as NO-scavenging capacity, e.g.,uric acid showed the highest oxidation potential (470 mV).
Recently, we proposed an oxygen radical absorption capacity method (ORAC-EPR)
that directly quantifies the antioxidant's scavenging capacity against free radicals andevaluated ORAC values for antioxidant compounds. In this study, using ORAC-EPR
method, we determined the methyl radical scavenging capacity of well-known hydrophilic
and lipophilic antioxidants. Lipophilic antioxidants were solubilized by modified β-cyclodextrin in water. The results indicated that the agreement between methyl radicalscavenging capacity and ORAC-EPR values was not fair. The methyl radical scavenging
capacities of lipophilic antioxidants are large compared with those of hydrophilic
antioxidants. Typical ORAC-EPR values (in trolox equivalent unit) for lipophilic
antioxidants are: catechin 26.4; epicatechin 22.0; epigallocatechin gallate 2.5; kaempferol
28.0; quercetin 8.4; myricetin 10.1; resveratrol 11.9; and astaxanthin 305, indicating that
astaxanthin possesses the highest antioxidant capacity among the compounds tested.
Keywords: Electron paramagnetic resonance (EPR); Antioxidants; Radical scavenging
capacity; Spin trapping; ORAC; Kinetics.