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クルクミンのアミロイド結合性とその応用に関する研究＜平成 21 年度助成＞

クルクミンのアミロイド結合性とその応用に関する研究
中

山

裕

之

（東京大学大学院農学生命科学研究科獣医病理学研究室）

要

約

クルクミン染色に陽性を示した。クルクミンの染
色性はギ酸前処理により失われた。また、ヒトの本研究では、様々な老齢動物の老人斑や脳血管

PHF-tau 陽性、ガリヤス銀染色陽性の NFT もク

アミロイドに対するクルクミンの染色性を検討しルクミンで染色された。コンゴレッド染色陰性のた。加えて、アルツハイマー病（AD）脳に出現すびまん斑がクルクミンで染色されたことから、クる NFT に対するクルクミンの染色性も調べた。

ルクミンはコンゴレッドより鋭敏に、凝集した A

AD 患者、老齢のニホンザル、イヌ、ネコ、フタβ と結合すると考えられた。またギ酸前処理に

コブラクダ、キツツキの一種アカゲラ、アメリよりこの染色性が失われたことから、クルクミン

カクロクマおよびヒト APP トランスジェニック

分子は A β 分子の立体構造を認識して結合する（Tg）マウス（APP23）の脳について抗 βアミロイ

ことが示唆された。加えてクルクミンは NFT もド（A β）1 - 40 抗体、抗 A β 1 - 42 抗体を用いた免染色することが確認された。さらに、クルクミン

疫染色、アルカリ・コンゴレッド染色、PAM 染色、

染色は AA アミロイド（AA、ウシの肝・腎・副腎）、クルクミン染色（0.009％クルクミン溶液）を行っ

AL アミロイド（AL、イヌの皮膚・舌腫瘤）、ア

た。またギ酸前処理による染色性の変化も検討しミロイド産生性歯原性腫瘍のアミロイド（APOT、た。さらに、AD 患者の NFT についてはガリヤ

イヌ）、老齢性心アミロイド（SCA、イヌ）も染色

ス銀染色、抗 PHF-tau 抗体を用いた免疫染色をすることが明らかになった。

行い、クルクミン染色の結果と比較した。A β免
疫染色により老人斑はアカゲラ以外、脳血管アミ

1.

はじめに

ロイドはラクダ以外で確認された。ヒト、イヌ、

ヒトのアルツハイマー型認知症（AD）におけるネコ、ラクダ、クマでは A β 42 陽性の老人斑が、特徴的な病理組織学的変化として、老人斑、脳A β 40 陽性の老人斑より多く認められた。サル、

血管アミロイド、神経原線維変化（NFT）がある。

Tg マウスでは A β 40 陽性の老人斑と A β 42 陽

老人斑と脳血管アミロイドは A βの異常沈着巣性の老人斑数に差は認められなかった。コンゴ

で、アルカリ・コンゴレッド染色、過ヨウ素酸メ

レッド染色では成熟斑は陽性、びまん斑は陰性でセナミン銀（PAM）染色で検出できる。老人斑は、あった。これに対しクルクミン染色では、ヒト、

形態的にびまん斑と成熟斑に分類される。びまん

サル、クマおよび Tg マウスの成熟斑、びまん斑

斑は、最も初期的な老人斑と考えられており、コは陽性、イヌの成熟斑は陽性、びまん斑は陰性でンゴレッド染色に陰性である。成熟斑は、A β のあった。また、成熟斑がみられなかったラクダの凝集が進んだ段階と考えられており、コンゴレッ

びまん斑は陽性、ネコのびまん斑は陰性であった。

ド染色に陽性で、神経突起の腫大、変性を伴う。

全動物で脳血管アミロイドはコンゴレッド染色と一方、NFT は、微小管結合蛋白である tau 蛋白

74

浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）がリン酸化などの修飾を受け線維化、凝集して形

ラクダ、キツツキの一種アカゲラ、アメリカクロ

成される神経細胞の異常構造で、ガリヤス銀染色

クマ、およびヒト APP トランスジェニック（Tg）

により明瞭に染色される。

マウス（APP23）の大脳皮質について調べた。用

老人斑、脳血管アミロイド、NFT は、ヒト以外のいた動物の年齢、性別、品種は Table 1 に示す。

動物でも確認されている。老人斑はサル 1，2，3，4）、脳組織は 10%緩衝ホルマリンで固定し、パラフィ

12）

、クズリ

ン切片（4 - 6μm）にした。加えて、AA アミロイ

1 , 2 , 3）、イ

ド（AA, ウシの肝・腎・副腎）、AL アミロイド（AL,ヌ 5,6,7）、ネコ 8）、ラクダ 9）、クマ 10,11）、クズリ 12）、

イヌの皮膚・舌腫瘤）、アミロイド産生性歯原性

キツツキ13）などで報告されている。これに対し、腫瘍（APOT, イヌ）、老齢性心アミロイド（SCA,

14）

イヌ）の各組織についても同様にパラフィン切片

イヌ

4, 5, 6,7）

8）

9）

、ネコ 、ラクダ 、クマ

10,11）などで、また、脳血管アミロイドはサル

NFT は、チンパンジー
クズリ

12）

、ヒツジ

15）

、クマ

10）

、

などで報告されているものの、その詳細は明らかではない。

を作製した。
老人斑と脳血管アミロイドを検出するために、

一方、クルクミンはカレーの材料であるウコン

アルカリ・コンゴレッド染色、過ヨウ素酸メセナの主成分である黄色色素で、抗腫瘍、抗酸化、抗ミン銀（PAM）染色を行った。さらに、NFT を検炎症などの生理作用を有する

16）。クルクミンは出するために改良ガリヤス ･ ブラーク法

A β と結合しやすく、その摂取によって老人斑

る銀染色を行った。

の形成が減少すること 17,18,19,20）から、日常的に

2-2.

22）

によ

免疫染色法

摂取すれば A β の沈着が抑制され、アルツハイ

上 述 し た 脳 組 織 切 片 に つ い て、 一 次 抗 体

マー病の発症または進行を抑制できるのではないと し て 抗 A β 1 - 42（BC05；Amyloid β -Protein

かと期待されている。近年 AD モデルマウスに

Immunohistostain Kit, Wako）抗体、抗 A β 1 - 40

おいてクルクミンが老人斑、脳血管アミロイドを（BA27；Amyloid β -Protein Immunohistostain

19）

染色すること、またヒトでは、クルクミンが21）

Kit, Wako）抗 体、 抗 Paired helical filament-tau。し（PHF-tau）（AT8；10μg/ml, Thermo）抗体を用

かし、マウスとヒト以外の動物ではクルクミン

いた免疫染色を行った。脱パラフィンした組織切の A β との結合性については明らかにされてい片を抗原性の賦活化のために 10 ｍ M のクエン酸ない。

バッファーで、120 度 10 分オートクレーブした。

NFT を染色するということが確認された

本研究では、様々な老齢動物の脳を用いてクル

組織切片は、Tris-buffered-saline（TBS）で 3 回洗っクミンが老人斑、脳血管アミロイド、NFT と結たあと、内因性のペルオキシダーゼ活性を抑える

合するかどうかを調べた。また、クルクミンが Aβのために、1 %過酸化水素を加えたメタノールに 3

どの段階の凝集状態と結合するかについても検討

分間ひたした。その後、非特異的な反応を抑えるした。さらに、 β アミロイド以外のアミロイドにために、8 %スキムミルクを加えた TBS に 37℃

対するクルクミンの染色性についても様々な動物

30 分インキュベートした。その後上述した一次抗のアミロイド症の組織標本を用いて検討した。

体をのせ、4℃で一晩インキュベートした。TBS

材料と方法

2.
2-1.

組織切片の作製と染色

AD 患者、ニホンザル、イヌ、ネコ、フタコブで 3 回洗った後、組織切片はビオチン化した抗マウス抗体をのせて 37℃ 60 分インキュベートした。
次いで、ストレプトアビジン - ビオチン抗体法で
標 識 し、 最 後 に 0.05 % 3-3’-diaminobenzidine とクルクミンのアミロイド結合性とその応用に関する研究

75

0.03 %の過酸化水素で発色させた。ヘマトキシリ

ける操作を加えた。さらに過マンガン酸カリウム

ンで核を染色し、脱水、透徹、封入したのち光学（KMnO4 ）前処理による染色性の変化も検討した。

顕微鏡で観察した。

2-4.

2-3.

クルクミン染色

画像解析法

画像解析ソフトウェアとして、Image J（NIH）

脱パラフィンした切片を 80 % エタノールにを用いた。組織切片の大脳皮質領域内において無

つ け た 後、0.3 % ト リ ト ン X100 、3 % Bovine

作為に 5 か所を選択し、200 倍視野で写真をとっ

Serum Albumin（BSA）と 0.5 % Tween20 を 含た。それぞれの写真において、抗体陽性を示した

む 0.1M TBS にそれぞれ 10 分つけた。3 % BSA、

老人斑、脳血管アミロイドの面積を Image J を用

0.5 % Tween20 を 含 む 0.1M TBS に 0.0245 μM

いて測定した。測定したデータは t 検定を用いての ク ル ク ミ ン（Cayman Chemical, USA）を 溶 か分析した。

してクルクミン溶液（クルクミン濃度 0.009 %）を作った。このクルクミン溶液に切片を 37℃ 1 時

結

3.

果

βアミロイド間つけた。TBS で 3 回洗って DW に浸し、無蛍

3-1.

光封入剤で封入した後、共焦点レーザースキャ

3-1-1. 免疫染色

ン顕微鏡（LSM510, Zeiss）を使って観察した。さ抗 A β 1 - 42 抗体、および抗 A β 1 - 40 抗体を用らに、組織切片でギ酸前処理 17）を行いアミロイ

いた免疫染色により、老人斑がアカゲラ以外の動ドの立体構造を破壊した後のクルクミンの染色性物の脳に確認された。老人斑の面積を image J でを調べた。ギ酸処理を行う際には、脱パラフィン

画像解析した結果を、Fig. 1 に示した。ヒト、サ後に 99 ％ギ酸（WAKO, Osaka, Japan）に 5 分つル、ラクダ、クマでは、コットンウール状の老人

Fig. 1 老人斑の免疫染色
AD 患者、b. イヌ No.9、c. ネコ、d.Tg マウスの大脳皮質。左が Aβ40、右が Aβ42の免疫染色。グラフは、切片の任意の場所 5 か所（200 倍視野）における老人斑の面積を、
image J を使って画像解析した結果。

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浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）

斑が観察され、APP Tg マウスでは、花びら状の脳で確認された（Table 1）。脳血管アミロイドは老人斑が観察された。またイヌ、ネコでは、境界

髄膜血管壁、実質の中小および毛細血管壁に認め不明瞭な老人斑が観察された。ヒト、イヌ、クマられた。脳血管アミロイドの面積を image J で画では A β 42 陽性の老人斑が、A β 40 陽性の老人像解析した結果を Fig. 2 に示す。ヒト、サル、ネコ、斑より多かった。ラクダとネコの老人斑は全て A

Tg マウスでは A β 40 陽性の脳血管壁面積は A ββ 42 陽性で、A β 40 陽性老人斑は認められなかっ42 陽性のそれより多かった。クマでは A β 42 陽

た。サル、Tg マウスでは A β 40 陽性の老人斑

性の脳血管アミロイドのみ認められた。キツツキと A β 42 陽性の老人斑の面積に差は認められなでは、A β 40 陽性の脳血管壁面積は A β 42 陽性

かった。

のそれとほぼ同等であった。また PHF-tau の免抗 A β 1 - 42 抗体、抗 A β 1 - 40 抗体を用いた免疫染色により、ヒトのみで NFT が確認された。
（Table 1）

疫染色により、脳血管アミロイドがラクダ以外のTable 1 調べた動物の脳病変
SP は老人斑、DP はびまん斑、MP は成熟斑、CAA は脳血管アミロイド、
NFT は神経原線維変化を示す。y:years, m:months , ND: データ不明

No of
Cases
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

SpeciesSex

Human
AD patient Female
Japanese macaque
ND
Dog
Miniture dax Female
Dog
BeagleMale
Dog
Mongrel
Male
Dog
NR
ND
Dog
NR
ND
Dog
MalteseND
Dog
MongrelFemaleCat
MonglelFemaleBactrian camel
FemaleGreat spotted woodpecker Male
American black bear
FemaleMouse
APP23Tg
Female

Age
73y
>26y
13y
14y
14y
14y
18y
18y
20y
20y
>20y
>16y
>20y
30m

DP

SPs
MP

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
−
+
+

+
+
−
−
+
+
+
−
−
−
−
−
+
+

CAA

NFT

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
−
+
+
+

+
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−

Fig. 2 脳血管アミロイドの免疫染色
a. AD 患者、b. ニホンザル、c. アカゲラの大脳皮質。左が A β 40、右が A β 42 の免疫染色。
グラフは、切片の任意の場所 5 か所（200 倍視野）における脳血管アミロイドの面積を、
image J を使って画像解析した結果。

クルクミンのアミロイド結合性とその応用に関する研究

3-1-2. クルクミン染色i)

77

ド陽性の脳血管アミロイドが確認さ老人斑（Fig. 3 ）れ、これらはすべてクルクミンで明ヒト、サル、クマ、APP Tgマ

瞭 に 染 色 さ れ た 。ま た 、ア カ ゲ ラ で は 、

ウスでは、コンゴレッド染色陽性、毛細血管の周りに Aβが放射状に沈PAM染色陽性の MP、また、コンゴ

着する変化が観察され、これもコン

レッド陰性、PAM陽性の DPの両方

ゴレッドとクルクミンで染色された。

が確認された。クルクミンは PAM染（Fig. 4 - h ）色で染色された同一の老人班を染色i i i ) 神経原線維変化（ N F T ）（Fig. 5 ）した。全てのイヌで、コンゴレッド

抗 PHF-tau抗体の免疫染色により、陰性、PAM陽性の DPが確認され、ヒ ト の み で N F T が 確認された。他の動イヌ NO5, 6, 7では、コンゴレッド陽

物では NFT は確認されなかった。ヒトの性、PAM陽性の MPも少数確認され

抗 PHF-tau 抗体陽性、ガリヤス銀染色陽た 。イ ヌ の M P は 全 て ク ル ク ミ ン で 染

性の NFT は、クルクミンでも染色された

色されたが、DPはクルクミンで染色が、クルクミン染色よりガリヤス銀染色

されなかった。ラクダでは、コンゴの方がより鋭敏に NFT を染色した。

レッド陰性、PAM陽性の DPのみがiv) ギ酸前処置（Fig. 6）

見られたが、これらはクルクミン陽

組織切片にギ酸前処理を施し、アミロイ性であった。ネコの老人斑は、コンドの構造を破壊した後にクルクミン染色

ゴレッド、PAM、クルクミンのいずを行ったところ、いずれの動物の老人斑、れでも染色されなかった。

脳血管アミロイドも染色されなかった。

i i ) 脳血管アミロイド（Fig. 4 ）3-2. 他のアミロイド

ヒ ト 、サ ル 、イ ヌ 、ネ コ 、ア カ ゲ ラ 、

ア ル カ リ・ コ ン ゴ レ ッ ド 染 色 で、AA、AL、

ク マ 、A P P T g マ ウ ス で は コ ン ゴ レ ッ

APOT は 明 瞭 に、SCA は 弱 く 染 色 さ れ た。 ク

Fig. 3 様々な動物の老人斑のコンゴレッド染色、PAM 染色、クルクミン染色の比較
a: ヒト、b: サル、c: イヌ、d: ラクダ、e: クマ、f: APP Tg マウス、それぞれ左から順にコンゴレッド染色、PAM 染色、クルクミン染色。

78

浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）

Fig. 4 様々な動物の脳血管アミロイドのアルカリ ･ コンゴレッド染色とクルクミン染色の比較
a: ヒト、b: サル、c: イヌ、d: ネコ e: クマ f: Tg マウス、g: アカゲラ。それぞれ左がコンゴレッド
染色、右がクルクミン染色を示す。h：アカゲラの脳血管アミロイド重度沈着部位、クルクミン染色。

Fig. 5 ヒト AD 患者の大脳皮質における神経原線維変化（NFT）

Fig. 6 ギ酸処理によるクルクミンの染色性の変化

a：PHF-tau 免疫染色、b：Gallyas 銀染色、c,d：クルクミン染色。

a,b：AD 患者の老人斑、c,d：ニホンザルの脳血管アミロイド
a,c：ギ酸未処理コントロール、b,d：ギ酸処理

ル ク ミ ン 染 色 で は、AA、AL、APOT、SCA のAPOT の染色性は失われなかった。一方、クル

いずれもがアルカリ・コンゴレッド陽性部位にクミン染色では KMnO4 の前処理により AA と一致して陽性であった（Figs. 7 and 8）。アルカ

SCA に加えて AL の染色性も失われたが、APOT

リ・コンゴレッド染色では、KMnO4 の前処理にの染色性は失われなかった。

より AA と SCA の染色性が失われたが、AL とクルクミンのアミロイド結合性とその応用に関する研究

各種アミロイドの染色 (1)上：アルカリ・コンゴレッド染色、下：クルクミン染色。左：AA アミロイド、ネコの腎臓、右：AL アミロイド、イヌの直腸。

Fig. 74.

考察

今回の研究は、動物の各種アミロイドのクルク
ミン染色について初めて検討したものである。

Fig. 879

各種アミロイドのクルクミン染色 (2)上左：エナメル上皮関連アミロイド、イヌ口腔内エナメル上皮腫。上右：心臓血管アミロイド、イヌ心臓。下左：AA ア
ミロイド、ヤギ脾臓。下右：AA アミロイド、ウシ腎臓。

し、イヌ、ネコのびまん斑は、クルクミンで染色されなかった。またネコの老人斑は、コンゴレッ
ド染色、PAM 染色にも陰性であった。これらの老人斑は形態学的には他の動物種の老人斑に比べて、老人斑は形態的に、コンゴレッド染色に陽性で境界不明瞭であった。犬では老人斑のほとんどが腫大した神経突起をもつ成熟斑 23）とコンゴレッ

びまん斑である 7）。ネコの老人斑は 18 才以上でし

ド染色陰性のびまん斑 24）に分けられる。びまん

か見られず、PAM 染色陰性であることから、び斑は老人斑形成過程の初期段階であると考えられ

まん斑以前のものと考えられている 8）。以上のこている。全ての老人斑は PAM 染色もしくは、Aβとから、犬、猫の老人斑はヒトやサルの老人斑に免疫染色によって検出される 24, 25）。今回、コン

比べ A β の凝集性が低いのではないかと考えられ

ゴレッド染色、PAM 染色、A β 免疫染色を行う

た。さらに、犬、猫の老人斑にクルクミンが結合ことによって、アカゲラ以外の動物にびまん斑がしなかったことから、クルクミンはある程度 A β

存在し、ヒト、サル、一部のイヌ、クマ、Tg マの凝集が進んだ老人斑に結合すると推察された。

ウスには成熟斑も存在することが示された。

ギ酸前処理後のクルクミン染色では、老人斑、Tg マウスの老人斑の形態は他の動物種と異な

脳血管アミロイド、NFT 全てにおいて、染色性

り花びら様であった。これは APP を人為的に過が失われた。ギ酸の前処理は A β 免疫染色を行剰発現させたことにより、その凝集度も高くなっう際の前処理として用いられているが、A β の免たためと考えられた。今回の Tg マウスでみられ疫反応性を回復ないし増強させる効果をもつことた老人斑は、他の動物の老人斑と比較して最もクが明らかにされている 27）。これは、ギ酸がアミロ

ルクミンの染色性が強かった。このことから、凝イド β の立体構造を破壊し、抗体と反応しやす

集性の高い老人斑ほどクルクミンが結合しやすくくするためと考えられている。立体構造を失ったなり、染色性が高くなると考えられた。これに対A β はコンゴレッドやクルクミンとはもはや結合

80

浦上財団研究報告書しなくなると考えられる。コンゴレッドはクルク

Vol.18（2011）

謝

ミンと化学構造が似ていることが明らかにされて
17）

辞本研究の遂行にあたり、研究助成を賜った浦上。以上のことから、クルクミンはコンゴレッ

食品・食文化振興財団に心より御礼申し上げる。

ドと同様に、A β の立体構造を認識して結合する

また、貴重な材料を提供いただいた国立さいがた

ことが示唆された。

病院・巻渕隆夫博士、理化学研究所脳科学研究セいる

一般的に、老人斑に沈着する A β は A β 42 が主体、脳血管アミロイドは A β 40 が主体と考え

ンター・高島明彦博士、帯広畜産大学・松井高峰
博士に深く感謝する。

られている。また、ヒトとイヌのびまん斑では A
β 42 が主体で、成熟斑は A β 40 が主体であるこ文とが明らかにされている 5）。本研究の結果、ヒト、

1) Nakamura S, Tamaoka A, Sawamura N, Shoji S, Nakayama
H, Ono F, Sakakibara I, Yoshikawa Y, Mori H, Goto N,
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イヌ、ラクダ、クマ、ネコでは、A β 42 を主体とした老人斑、サル、Tg マウスでは Aβ40、Aβ
42 両方から構成される老人斑がみられた。また、
ヒト、サル、ネコ、Tg マウス、アカゲラでは、A β 40、A β 42 から構成される脳血管アミロイ
ドが（A β 40 の方がやや優勢）、クマ、イヌでは、A β 42 主体の脳血管アミロイドが多く存在する
ことが示された。クルクミンは A β 42 主体で構成される老人斑と脳血管アミロイド、A β 40 で構成される老人斑と脳血管アミロイドをともに染色した。今回クルクミンは A β 40、A β 42 どち
らの A β にも結合したことから、C 末端の立体構造の違いは識別しないと考えられた。
今回、NFT はヒトでのみ認められ、クルクミ
ンで染色された。これは過去の研究結果と一致した 21）。しかし、クルクミン染色よりガリヤス銀染色のほうが NFT をより明瞭に染色したことから、クルクミンは、NFT の検出マーカーとしては、あまり有用ではないと考えられた。以上のことから、クルクミンは A β だけでなく異常 tau 蛋白とも結合するものの、その結合性は A β に対する結合性より弱いと考えられた。
以上のようにクルクミンは各種アミロイドの鋭敏な染色試薬として使用できることが判明した。
本研究の成果は、アルツハイマー病や難病指定されているアミロイド症の研究に大いに貢献すると考えられた。

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浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）“Binding property of curcumin to various amyloid
proteins of animals”
Hiroyuki Nakayama
Department of Veterinary Pathology
Graduate School of Agricultural and Life Sciences
The University of Tokyo
Curcumin, a phenol derivative included in turmeric, binds to amyloid beta protein(A beta) as well as amyloid A (AA), amyloid L (AL), amyloid produced by odontogenic
tumors (APOT) and senile cardiac amyloid (SCA). Brain samples from an Alzheimer’s
patient, aged Japanese monkeys, dogs, cats, a two-humped camel, a great spotted wood
pecker, an American black bear and an APP transgenic mouse (APP23) were incubatedwith 0.009 % curcumine solution and observed with a confocal laser microscope, as well as
were stained with alkaline Congo red and observed with a light microscope.
Curcumin stained senile plaques and cerebral amyloid angiopathy in the aged
brain of some animal species. Formic acid pretreatment diminished the intensity of
curcumine stain. Curcumine also stained neurofibrillary tangles (NFT) seen in the brain of
Alzheimer’s patients.
Curcumine further stained other types of amyloid proteins including AA, AL, APOT
and SCA. Pretreatment of KMnO4 diminished the curcumin stain intensity of AA, AL and
SCA, but not that of APOT.
It is revealed that curcumine specifically binds to not only various types of amyloid
proteins but PHF-tau protein included in NFT, and can detect such amyloids and NFT
through its autofluorescence. The structure of the curcumin binding site in an amyloid
molecule may be changed by the pretreatment of formic acid or KMnO 4, because theintensity of curcumine stain was lost by these pretreatments. Conclusively, curcumin morestrongly binds to amyloid proteins than Congo red, and is used as a more sensitive staining
reagent for amyloids.