●アレルギー・アトピー性疾患――［ I ］アレルギー・アトピー性疾患と遺伝子

2．アレルギー・アトピー性疾患におけるトランスクリプトーム解析
斎藤博久＊

現在，軽症のものを含めるとアレルギー疾患罹患率は日本で約 3 割と推定され，その背景となるスギやダニなどに対する普遍的なアレルゲンに対する感作率も増加している．環境に応答するゲノムの機能的役割を理解するためのトランスクリプトーム解
析は，マイクロアレイ技術の急速な開発に伴い，約 5 万種類の遺伝子の発現レベルを同時測定することも可能となり，本来の意味である網羅的解析がほぼ実現している．
マイクロアレイ技術の最大の利点は，通常の手法では予期できない新規病態分子の発見が可能な点にある．これが機能未報告の分子であれば，知的財産となる可能性がある．また，機能が知られていても，従来の学説を覆すような細胞に発現していることが判明する場合もある（例：マスト細胞における major basic protein の発見）．網羅的に各種臓器・細胞を比較解析することにより，細胞特異的に発現する分子を同定することも可能になる．
われわれは，アレルギー炎症に関係する細胞にのみ発現し，他の細胞には発現せず，さらに炎症反応制御および創薬上，重要な G 蛋白共役型受容体（GPCR）やイオンチャンネルを絞り込むことに成功している．このように，マイクロアレイによって得られたデータベースを解析することにより，アレルギー炎症に関与するが他の生理的に重要な臓器に発現していない，すなわち副作用の考えられない創薬標的分子を絞り込むことが可能である．将来的には，網羅的な分子解析によりコンピューター内での細胞機能のシミュレーションが可能になっていくと予想される．われわれは，すでにマウスのマスト細胞とヒトマスト細胞のトランスクリプトーム比較解析を発表しているが，将来マウスによる実験結果を，ヒトの細胞をもちいた結果としてシミュレーションすることも夢ではない．

Transcriptome analysis of allergic diseases
HIROHISA SAITO Department of Allergy and Immunology, National Research Institute for Child Healthand Development

さいとう・ひろひさ：国立成育医療センター研究所免疫アレルギー研究部長．昭和52年東京慈恵会医科大学卒業．昭和61年ジョンズホプキンス大学免疫学フェロー．平
成６年国立相模原病院小児科医長．
平成８年国立小児病院小児医
療研究センター免疫アレルギー研究部長．
平成14年現職．
主研究領域／
ゲノム医学．
マスト細胞生物学．
＊

Key words

マイクロアレイ
オルトログ遺伝子
マスト細胞
トランスクリプトーム

アレルギー・アトピー性疾患 13

所横浜研究所などとの多くの施設との共同研

1．トランスクリプトーム解析とは究であるミレニアムプロジェクトにおいて，喘息等アレルギー疾患関連遺伝子探索，特にヒトのもつすべての遺伝情報（ゲノム）が病態に応じて発現の変動する遺伝子，分子の記号（配列）として完全に解読されたことにゲノムワイドな探索を行ってきた．病態関連より，ゲノムの示している意味を知るための発現遺伝子探索の目的は，疾患発症予測を確さまざまな手段（プローブ・機器）が急速に立することではなく，新たな診断方法の確立整備されつつある．アレルギー疾患病態に関や薬剤標的分子の発見ということである．

しても，それらの手段を応用して，一塩基多2003 年に終了した前者のプロジェクトでは，型 SNP（Single Nucleotide Polymorphism）な

すでに 770 の新規アレルギー関連遺伝子をどゲノム配列の個人差により疾患発症予測を発見し，特許を申請している．
重症アレルギー行うことを目的とした遺伝子多様性解析研究

疾患患者由来の T 細胞や単球で著しく発現や，病態に応じて発現変動する分子を根こそ変動する既知遺伝子としては，ケモカイン受ぎ同定するためのトランスクリプトーム（網容体 CCR4 や Toll-like receptor 2，4，6（以上羅的遺伝子発現）解析研究などが広く行われ増加），IL-12，インターフェロン γ（以上減少）て い る．従 来，遺 伝 子 発 現 解 析 手 法 に はなど見いだしている．また，インターフェロ

Northern hybridization， Differential Display，ンなどの Th1 サイトカイン遺伝子発現を抑SAGE（Serial analysis of gene expression）など制するシグナル伝達分子である SOCS3（Sup-が比較的よく用いられていた．
しかしながら，pressor of cytokine signaling 3）遺伝子の発現網羅的な解析としてはどの方法も不十分でが，重症アトピー性皮膚炎および重症気管支あった．一方，マイクロアレイは 1 回の実験

喘息患者において発現上昇していることを見で 1 万種類以上の遺伝子の発現量を定量でいだしている1）．これらの分子の発見は，詳きることから，網羅的な遺伝子発現解析ツー細なアレルギー疾患病態解析や遺伝子多様性ルとして最も注目されている．本稿では，わ解析の新規候補遺伝子の対象として有用であれわれがいままでに行ってきた DNA チップる．

をもちいたアレルギー疾患関連のトランスク

ヒトのマスト細胞などアレルギー炎症細胞リプトーム解析を中心に，他施設からの報告特異的遺伝子群を同定する目的で各種細胞のも交え，以下に 2 つの研究手法の違いを強調

トランスクリプトームをオリゴヌクレオチして解説する．

ド・マイクロアレイ（アフィメトリックス社の GeneChip）をもちいて比較したところ，今2．アレルギー疾患関連遺伝子探索まで好酸球特異的と考えられてきた強い組織傷害性を有する MBP（major basic protein）がトランスクリプトーム解析により，アレルマスト細胞にも強く発現していることが判明

ギー病態に深く関与する新規分子，いままで2）した（図 1）．数年前までアレルギー疾患治のその機能が知られていなかった分子などが療開発の最大の標的と考えられていた好酸球発見されている．に代わって，マスト細胞の重要性が注目され国立成育医療センター（旧・国立小児病院）ていることは周知の通りである．

では，1996 年よりジェノックス創薬研究所と喘息モデル動物の肺組織や喘息患者気管支の共同研究を，また 2000 年より理化学研究

組織において arginase が増加しており，それ14 第 126 回日本医学会シンポジウム

図1

ヒト・マスト細胞における major basic protein（MBP）の発見

GeneChip による各種細胞網羅的遺伝子発現解析の結果，偶然，マスト細胞が MBP を高発現していることを発見し，共焦点レーザー顕微鏡にて蛋白質としても存在することを確認した（上：位相差，下抗 MBP 抗体染色）．

が気道過敏性等にかかわることも GeneChipをもちいて同定されている3）．さらに，GeneChip をもちいることにより，樹状細胞特異的3．システムバイオロジーへの貢献

発現遺伝子として同定され，機能解析により，網羅的解析の本来の意義は，いままで数種IL-10 により発現増加し，樹状細胞のさらなる類しか定量できなかったものが，数万種類定活性化を抑制する免疫調節分子であることが量できるようになったということではない．

判明した thrombospondin の発見も注目され全ての情報を知るという点が重要である．ト4）

ランスクリプトーム解析により，新規疾患関これらのトランスクリプトーム解析研究の連単一分子を探索する研究のほかに，ある薬多くは，学問的な新事実の発見とともに知的剤の細胞や臓器，個体に与える影響を総合的財産権の取得や新規薬剤開発にかかわるシーに評価する報告も散見されるようになっていズの発見に貢献してきた．特にオリゴヌクレ

る．

る ．

オチド・アレイは測定精度も上がり，臨床応用の段階に入っている．

Toll-like receptor を活性化し，アレルギー疾患治療薬として実用段階に入っている
CpG モチーフ，あるいは LPS をもちいて，ヒアレルギー・アトピー性疾患 15図2

網羅的遺伝子・分子発現解析による副作用の予知

従来の検査法では，一部の情報により，全体の大まかな評価が行われていた（上図）．しかし，網羅的解析を行うことにより，従来予期し得なかった副作用を検知することが可能になると期待される（下図．薬剤投与により左端の木が枯れていることに注意）．

ト末梢血単核細胞を刺激しトランスクリプかかわる分子としては，G 蛋白質結合受容体

トーム解析を行うと，CpG は Th1 細胞関連分（GPCR）やカルシウムチャンネルなどのイオ子を強く誘導するが，炎症関連分子や調節性ンチャンネルが最も重要である．現在使用さT 細胞関連分子の誘導は弱く，LPS では炎症れているすべての薬剤の標的となっている遺関連分子誘導能が非常に強いことがわかっ

伝子はわずか 500 種類である．これらは受容5）

た ．こ の よ う に CpG モ チ ー フ な ど の 薬 効体などの開発しやすいものがほとんどであを，抗アレルギー効果とともに，生体に好まる．これらの創薬標的となり得る遺伝子の数しくない副作用をも含めて総合的に理解するは，多く見積もっても全ゲノムの中の 5％ 程ことも可能になってきた（図 2）．

度，つまり 2,000 程度であろうと推定されて

好中球，好酸球，好塩基球の 3 種類の顆粒

いる6）．われわれは，各血球分画のトランス球とマスト細胞は炎症刺激により顆粒内のメクリプトームを解析し，データベースを構築

ディエーター等を放出し，感染防御に作用すしている（図 3）が，これら創薬標的遺伝子のる．その中で，好中球以外の 3 種類の細胞は，中で，アレルギー炎症に関与する好酸球，好寄生虫感染防御やアレルギー反応に重要な役塩基球，マスト細胞のみに発現し，感染防御割を演じている．したがって，これらの細胞等に関与する好中球やリンパ球あるいは心臓のみを特異的に標的とした薬剤開発は，副作や脳などの重要臓器に発現していない遺伝子用回避という面で重要である．脱顆粒反応にを同定している7）．これらの分子に対する薬16 第 126 回日本医学会シンポジウム

マスト細胞 好酸球 好塩基球 好中球 リンパ球 肺組織 脳神経 心臓
遺伝子A
遺伝子B
遺伝子C

ゲノム上の全遺伝子アレルギー炎症細胞特異的創薬標的遺伝子

図3

アレルギー炎症細胞特異的遺伝子アレルギー炎症細胞特異的創薬標的遺伝子の絞り込み

各種血球・臓器網羅的遺伝子発現データベースよりマスト細胞，好酸球，好塩基球にのみ発現するものを絞り込んだ（上図，遺伝子 C が相当）
．そして，さらに，これらの遺伝子を GPCRなどの創薬標的遺伝子の情報にて絞り込むことに成功した（下図）
．

1,000

1,000

Tryptase
MIP-1α4-1BB4-1BB

100

100
MCP-110
MIP-1β¿-309

1MCP-1
Mouse

Mouse

Tryptase
MIP-1α¿-309

10MIP-1β1MBP＜0.1＜0.1110Human

100

1,000

MBP＜0.1＜0.11

刺激前図410Human1001,000

刺激後ヒトとマウスのオルトログ遺伝子発現比較解析

ヒトおよびマウスのマスト細胞を IgE 受容体を介した刺激を行い，前後で網羅的遺伝子発現解析を行った．I-309 などの CC ケモカイン遺伝子発現調節はヒトとマウスでよく保存されていたが，MBP 遺伝子はヒト・マスト細胞のみで発現していた．

剤はアレルギー炎症のみを選択的に抑制し，のように，ゲノム配列情報により，トランス他の生理的機能を抑制しないと予想されるのクリプトーム解析が可能になり，それらの情で，副作用のない薬剤開発が期待される．こ報をもちいた効率的な薬剤開発が可能になっアレルギー・アトピー性疾患 17

ている．

ある．また，これらの情報を利用することにマウスとヒトのマスト細胞の配列相同性より，将来的に動物実験による病態関連分子（オルトログ）遺伝子の発現パターンの異同をの動態をヒトのオルトログ遺伝子の発現パ総合的に探索することも行われている．マウ

ターンに合わせて補正し，ヒトの病態のシス実験喘息モデルにおいては，好酸球を標的ミュレーション・データベースに登録することした抗 IL-5 療法が有効であったが，ヒトでとも将来的に可能になると期待される．
いずは著効を示さなかった．マウスは古くからヒれにしても，このような試みが進行していくト疾患モデルとして使用され，医学の発展にと将来的には，細胞に含まれる全分子の働き大いに貢献してきた．マウスで有効であったをコンピューター内に再構築することが可能

アレルギー治療薬剤がヒトで無効である例はになり，それらをシミュレートすることによ後を絶たない．このような状況において，ヒり疾患治療薬や発症予防法の選択が行われトとマウスの共通点と相違点を整理することるようになるであろうと予測されている．

は急務であると思われる．
そこでわれわれは，ヒトおよびマウスのマスト細胞を IgE で感作後，抗 IgE 抗体あるいは抗原で刺激し，遺伝子発現の変動を網羅的に検討した．その結果，IgE 抗体を介した刺激によりマスト細胞はケミカルメディエーターやサイトカインのみならず CC ケモカインを産生し，アレルギーの炎症部位へ種々の免疫細胞を集積させる機構
は，マウスとヒトにおいて非常によく保存されていることが判明したが，多くの遺伝子がヒトあるいはマウスのいずれか一方のマスト細胞のみに発現していた（図 4）．なお，MBPはマウスのマスト細胞には存在しなかった8）．
これらの研究は，アレルギー病態に重要と思われる一分子を同定することが目的ではな
く，CpG などの薬剤やマスト細胞という細胞の総合的な働きを理解することを目的としている．それらを理解することにより，今までは予期できなかった副作用を予測できるようになる等のメリットが期待されている．ヒトとマウスのオルトログ遺伝子比較発現解析研
究に関しては，ヒト疾患組織等を探索して発見された創薬標的遺伝子の機能解析を，マウス疾患モデルを用いた実験により確認できるかどうか予測するというような応用が可能で

18 第 126 回日本医学会シンポジウム〔文献〕
1）Seki Y, Inoue H, Nagata N, et al : SOCS-3 regulates
onset and maintenance of TH2-mediated allergic responses. Nat Med 2003 ; 9 : 1047―1054.
2）Nakajima T, Matsumoto K, Suto H, et al : Gene expression screening of human mast cells and eosinophils using high-density oligonucleotide probearrays :Abundant expression of major basic protein in mastcells. Blood 2001 ; 98 : 1127―1134.
3）Zimmermann N, King NE, Laporte J, et al : Dissectionof experimental asthma with DNA microarray analysis
identifies arginase in asthma pathogenesis. J Clin Invest 2003 ; 111 : 1863―1874
4）Doyen V, Rubio M, Braun D, et al : Thrombospondin 1
is an autocrine negative regulator of human dendritic
cell activation. J Exp Med 2003 ; 198 : 1277―1283.
5）Kato A, Homma T, Batchelor J, et al : Interferon-α!βreceptor-mediated selective induction of a gene cluster by CpG oligodeoxynucleotide 2006. BMC Immunol 2003 ; 4 : 8（On-line issue）
6）Zambrowicz BP, Sands AT : Knockouts model the 100
best-selling drugs. Will they model the next 100? Nat
Rev Drug Discov 2003 ; 2 : 38―51.
7）Nakajima T, Iikura M, Okayama Y, et al : Identificationof granulocyte subtype-selective receptors and ionchannels by using a high-density oligonucleotide
probe array . J Allergy Clin Immunol 2004 ; 133 :528―535.
8）Nakajima T, Inagaki N, Tanaka H, et al : Marked increase in CC chemokine gene expression in both human and mouse mast cell transcriptomes following
Fce receptor I cross-linking : An interspecies comparison. Blood 2002 ; 100 : 3861―3868.

などが実際にこれらの情報から推測できるか

質疑応答ということでしょうか．これはデータベースがかなり揃ってきまして，8 割がたは大丈夫

座長（奥村） どうもありがとうございましになってきているようです．私は実際にみてた．
先生は小児科の患者を診ておられますか．

いないのですが，下の先生に聞いたところで

斎藤

今は休止しています．

はそのように言っていました．そしてそのソ

福井裕行（徳島大） ranscriptome で多くのフトもかなり使いやすいものができてきまし

遺伝子産物が上がったり下がったりしますて，この分野は進歩が非常に速いですから，が，それがある一つのまとまりとして，さらあと 2〜3 年もすれば，ボタンを一つ押すと，にそれを統括する生理活性物質により調節す

このパターンから，ここに関係している転写る遺伝子などいくつかのグループに分けるこ

因子は何かということがすぐに出るようになとは可能なのでしょうか．また，そういったるのではないかと考えています．

研究はあるのでしょうか．
斎藤

bioinformatic として，それらを統括座長

斎藤先生，大変面白いお話をありがとうございました．

する転写因子や，クロマチンのリモデリングアレルギー・アトピー性疾患 19