ODS(C18)以外のカラムを用いた
バイオアナリシス

DG2022-55
Bioanalysis Using Columns Other
than ODS

14 th JBF Symposium, 2023

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum1

Japan Bioanalysis Forum

メンバーリスト所属（Company）

備考

八木 遼太郎

東レ株式会社

リーダー※

Ryotaro Yagi

Toray Industries, Inc.

野口 美里

EAファーマ株式会社

Misato Noguchi

EA Pharma Co., Ltd.

水落 正慶

シミックファーマサイエンス株式会社

Masayoshi Mizuochi

CMIC Pharma Science Co., Ltd.

宮脇 史織

株式会社新日本科学

Shiori Miyawaki

Shin Nippon Biomedical
Laboratories, Ltd.

新井 浩司
Kouji Arai

株式会社ＬＳＩメディエンス
LSI Medience Corporation

http://bioanalysisforum.jp/

氏名 (Name)

オブザーバー※本ポスターに関するご質問はメールでryotaro.yagi.u8@mail.torayにお願いします。

14 th JBF Symposium, 2023

2

Japan Bioanalysis Forum

2022
6月

7月

8月

TC
6/30

TC
7/19

TC
8/9
8/30

9月

10月

11月

12月

TC
10/27

TC
11/11

TC
12/22

第1回
アンケート
9/1630
推進
委員会
8/24

2023
1月
TC
1/11
1/26

2月

3月

TC
2/16

JBF
シンポ
3/1-3

第2回
アンケート
11/2412/8
推進
委員会
10/1

推進
委員会
12/2

推進
委員会
2/15

http://bioanalysisforum.jp/

活動実績⚫ Teamsによる電話会議（TC)を合計10回実施した。
⚫ DG推進委員会により定期進捗報告を行った。
⚫ データファイルはBOXを利用し、メールでコミュニケーションをとった。

14 th JBF Symposium, 2023

3

Japan Bioanalysis Forum背景⚫ 近年、医薬品のモダリティーが多様化し、低分子だけでなく、中分子から高分子にまで対応した分析法構築が求められている。
⚫ バイオアナリシスにおけるLC-MS（/MS）分析では、理論段数の高さや化合物の応用範囲の広さなどからODS（C18）カラムが汎用されており、それ以外のカラムについては情報が少ない状況であった。
DG2022-55で議論⚫ バイオアナリシスにおけるODS（C18）以外のカラムを用いた分析法に焦点を当て、カラム選択時のガイドになるものの作成を目指して議論を行った。
DG2022-55の目的⚫ LC-MS（/MS）を用いた分析で、各種カラムの利用・認知状況やカラム選択において重視する点、対象となる化合物種、分析法構築において苦労した点、課題の解決方法などについて、2回のアンケート調査を実施。

http://bioanalysisforum.jp/

背景及び目的※国内で活動している製薬企業・CROの中から、JBFの諸活動への協力に賛同いただけた方々（DGサポーター、272名）に対してアンケート送付※本アンケートでは、回答者の情報（所属企業名など）と回答内容が紐づけ出来ない形で集計を実施。

⚫ 本発表では、アンケート結果、議論内容を紹介し、DGからの提案を共有する。
14 th JBF Symposium, 2023

4

アンケート調査

14 th JBF Symposium, 2023

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

5

Japan Bioanalysis Forum＜1回目＞• 時期：2022年9月16日～30日• 方法：SurveyMonkeyによるWeb上の収集• 配信先：DGサポーター
3• 回答数：49名
6％
11
23％

所属先を確認したアンケートQ1より、製薬メーカー35名、CRO14名からの回答が得られた。

内資新薬メーカー
外資新薬メーカー
内資CRO
外資CRO

14 th JBF Symposium, 2023

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート実施状況

34
69％

1, 2％

6

Japan Bioanalysis Forum

1-1．担当されている業務についてお知らせください。

LC-MS/MSを用いたバイオアナリシス担当（非臨床段階）94%

LC-MS/MSを用いたバイオアナリシス担当（臨床段階）

53%

LBAを用いたバイオアナリシス担当（非臨床段階）

28%

LBAを用いたバイオアナリシス担当（臨床段階）

13%25%

14 th JBF Symposium, 2023

50%

75%

http://bioanalysisforum.jp/

0%

回答比率
100%

回答者数：47名

7

Japan Bioanalysis Forum

1-2．これまでのLC-MS/MS分析歴についてお知らせください。
25年以上

5年未満

5名(11%)

3名(6%) 5年以上10年未満

20年以上25年未満
8名(17%)

10年以上15年未満
15年以上20年未満

10名(22%)

16名(35%)平均：15.0年
中央値：15.3年

http://bioanalysisforum.jp/

4名(9%)

分析歴は、15年以上20年未満の中堅・ベテラン層が最多で、10年未満の若年層が少ない傾向であった。
14 th JBF Symposium, 2023

8

Japan Bioanalysis Forum

CRO
（13名）

製薬
（35名）

46%

51%

23%

37%

15%

6%

ODS（C18）カラムを製作している 11
メーカーが多く、選択肢が多い

8%3%

その他（具体的に：自由記載） 11

8%3%

CRO（13名）

製薬（35名）
回答数

広範囲の化合物に適応できる

使用経験が多い

6
3

18
13

部署内で入手しやすい 2 2

http://bioanalysisforum.jp/

1-3．ODS（C18）カラムを選択する1番の理由について選択してください。

ODSカラムの選択理由は、広範囲の化合物に適応できるが最多で、業種の違いによる選択理由の差異は見られなかった。
14 th JBF Symposium, 2023

9

Japan Bioanalysis Forum

1-3．ODS（C18）カラムを選択する1番の理由について選択してください。

「その他」で上げられた回答➢ 逆相モードでの理論段数が高く、安定した品質でコントロールされた製品が入手できる。

14 th JBF Symposium, 2023

http://bioanalysisforum.jp/➢ 再現性が良い。

10

Japan Bioanalysis ForumCRO（13名）

製薬（35名）

回答数

CRO
（13名）

製薬
（35名）

低分子化合物（未変化体）

13

35

100%

100%

低分子化合物（代謝物）

11

35

85%

100%

ペプチド（M.W. < 10000）

9

13

ペプチド

69%

37%

核酸

9

7

核酸

69%

20%

脂質

6

9

脂質

46%

26%

31%

20%

23%

6%

8%

3%

0%

0%

アミノ酸 4 7
タンパク (抗体を含む、M.W. > 10000) 3 2
糖 11
その他 (具体的に：自由記載)

http://bioanalysisforum.jp/

1-4．ODS（C18）カラムを使用した場合の測定対象についてお知らせください。

• 全てについてCROと製薬から回答が得られたため、分析対象については差がない
ことが分かった。
• 中分子や脂質などの比較的新しい分析対象についてCROの方が回答率が高い。
14 th JBF Symposium, 2023

11

Japan Bioanalysis Forum

1-5．ODS（C18）カラムを選択する際に重視する点についてお知らせください。
耐久性

製薬（35名）

12

回答数

21

CRO
（13名）
92%

製薬
（35名）
60%

31%

60%

39%

46%

39%

34%

46%

23%

分離の改善

4

社内での購入/使用実績

5

構造類似化合物との分離能

512

在庫（納期）

6

8

文献情報等

5

9

39%

26%

高極性化合物の保持

5

9

39%

26%

価格

4

9

31%

26%

メーカー

2

15%

26%

0%

0%

15%

6%

21
16

9

溶出パターンの変更

その他 (具体的に：自由記載)

•

22

在庫

分離

http://bioanalysisforum.jp/

CRO（13名）

CROでは『在庫』を、製薬では『分離』を優先する回答が多く、業種間の差が見られた。
CROではデータ納期にシビアなことが、製薬では可能な限り未知の物質の影響を減らすために分離を優先していることがうかがえた。
14 th JBF Symposium, 2023

12

Japan Bioanalysis Forum

1-5．ODS（C18）カラムを選択する際に重視する点についてお知らせください。

「その他」で上げられた回答➢ 疎水性相互作用以外の反応が制御されているカラム（無いという意味ではない）。
これが不十分だとロット間差や再現性に影響する。逆相モードでの理論段数が高く、安定した品質でコントロールされた製品が入手できる。
➢ 再現性。
＜製薬＞

http://bioanalysisforum.jp/＜CRO＞➢ ピークのシャープさ（テーリングしない）。
➢ 広範囲な分析に対応できること、低吸着性。

14 th JBF Symposium, 2023

13

Japan Bioanalysis Forum

1-6．カラムの使用経験・認知状況についてお知らせください。（逆相モード）
Phenyl / フェニル基
C8 / オクチル基
C18 / オクタデシル基
PFP / ペンタフルオロフェニルプロピル基
C22以上 / ドコシル、ヘプタコシル基等
NH2 / アミノプロピル基
アダマンチル / アダマンチル基
Phenylhexyl / フェニルヘキシル基
Biphenyl / ビフェニル基
Ph / アルキルフェニル基（フェネチル基）
Cyano (CN) / シアノプロピル基
C4 / ブチル基
PBr / ペンタブロモベンジル基
Cholester / コレステリル基
C1 / トリメチルシリル基
NAP / ナフチルエチル基

見聞きあり
36
33
39
29

17
15
14
15
9
10
12
6
5
4
4
3

回答数
7
9
1
5

11
12
10
9
15
14
11
16

10
11
9
9

回答者数（44名）に占める使用経験ありの比率
Phenyl
82%
C8
75%
C18
89%
66%
39%
34%
32%
34%
20%
23%
27%
14%
11%
9%
9%
7%

http://bioanalysisforum.jp/

使用経験ありカラムの認知度では『Phenyl/フェニル基』カラムが1位であったが、使用経験では『C18/オクタデシル基』カラムが上回り１位であった。
14 th JBF Symposium, 2023

14

Japan Bioanalysis Forum

1-7．カラムの使用経験・認知状況についてお知らせください。（HILICモード、イオン交換、その他）
見聞きあり

回答者数（42名）に回答数 占める使用経験ありの比率

陰イオン交換（ミックスモード）

13

22

31%

陽イオン交換（ミックスモード）

16

19

38%

陰イオン交換

15

17

36%

陽イオン交換

15

17

36%

Amide / カルバモイル基

24

シリカ / 未修飾

21

6
7

57%

Amide

50%

シリカ

38%

NH2

NH2 / アミノプロピル基

16

多孔性グラファイトカーボン

13

11

31%

ジオール / ジオール基（ジヒドロキシプロピル基）

15

9

36%

Cyano (CN) / シアノプロピル基

12

ベタイン / スルホベタイン・ホスホリルコリン基

3

10

11

11

陽イオン

http://bioanalysisforum.jp/

使用経験あり29%
7%

カラムの認知度では『陰イオン交換（ミックスモード）』カラムが1位であったが、使用経験では『Amide/カルバモイル基』カラムが上回り１位であった。
14 th JBF Symposium, 2023

15

Japan Bioanalysis Forum

1-8．カラムの使用頻度についてお知らせください。
（逆相モード）カラム
C18 / オクタデシル基C8 / オクチル基
Phenyl / フェニル基
PFP / ペンタフルオロフェニルプロピル基
アダマンチル / アダマンチル基
C22以上 / ドコシル、ヘプタコシル基等
Phenylhexyl / フェニルヘキシル基
NH2 / アミノプロピル基
C4 / ブチル基
Cyano (CN) / シアノプロピル基
PBr / ペンタブロモベンジル基
Biphenyl / ビフェニル基
C1 / トリメチルシリル基
Ph / アルキルフェニル基（フェネチル基）
NAP / ナフチルエチル基
Cholester / コレステリル基
使用頻度の高いカラムなし

1位
34
0
3
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

2位
0
12
10
10
1
1
1
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0

3位
0
12
6
4
5
0
2
1
0
1
1
0
0
0
0
0
1

4位
0
5
3
2
3
3
1
1
0
1
0
1
0
0
0
0
1

5位
1
0
2
2
0
2
0
3
2
1
0
0
0
0
0
0
2

ポイント計
171
94
81
68
25
12
12
8
6
6
3
2
0
0
0
0
―

http://bioanalysisforum.jp/

上位から順に5ポイント、4ポイントと振って集計を行った。

C18カラムが最も使用頻度が高く、次いでC8カラム、フェニルカラムで高かった。
14 th JBF Symposium, 2023

16

Japan Bioanalysis Forum

1-9．カラムの使用頻度についてお知らせください。
（HILICモード、イオン交換、その他）
カラム

1位

2位

3位

4位

5位

ポイント計

Amide / カルバモイル基

7

4

4

1

1

66

シリカ / 未修飾

9

3

1

1

2

64

NH2 / アミノプロピル基

4

1

1

2

0

31

ジオール / ジオール基（ジヒドロキシプロピル基）

0

6

2

0

0

30

陽イオン交換（ミックスモード）

3

1

2

2

1

30

陰イオン交換（ミックスモード）

0

3

2

4

0

26

多孔性グラファイトカーボン

2

1

2

2

2

26

Cyano (CN) / シアノプロピル基

0

1

3

0

0

13

陽イオン交換

0

1

1

1

2

11

陰イオン交換

0

0

2

1

1

9

ベタイン / スルホベタイン・ホスホリルコリン基

1

0

0

0

0

5

使用頻度の高いカラムなし

11

2

0

0

2

―

http://bioanalysisforum.jp/

上位から順に5ポイント、4ポイントと振って集計を行った。

※その他：Zwitter ion （ベタインと同じ）シリカやAmideカラムの使用頻度が高かった一方、ODS以外は使用経験のない方も一定数いることが見受けられた。
14 th JBF Symposium, 2023

17

Japan Bioanalysis ForumCRO（9名）製薬（29名）

回答数

CRO
(9名）

製薬
（29名）

低分子化合物（未変化体）

6

19

67％

66％

低分子化合物（代謝物）

6

18

67％

62％

アミノ酸

4

アミノ酸

44％

38％

脂質

4

6

脂質

44％

21％

ペプチド

5

5

ペプチド

56％

17％

22％

24％

22％

21％

11％

10％

０％

０％

11

核酸

2

7

糖

2

6

測定経験ありタンパク（抗体含む） 1 3
その他

０

http://bioanalysisforum.jp/

1-10．ODS以外のカラムを使用した場合の測定対象についてお知らせください。

➢ CRO、製薬共に低分子化合物（未変化体、代謝物）が上位であった。
➢ CROではアミノ酸、脂質、ペプチドを測定対象とした使用も4~5割であった。
➢ 核酸、糖、タンパクを測定対象とした場合はCRO、製薬共に１~2割と低い傾向。
14 th JBF Symposium, 2023

18

Japan Bioanalysis Forum～カラム種別比較～
測定対象についてお知らせください。
0%

ODS以外
20%

40%

低分子化合物 (未変化体)

核酸
脂質
アミノ酸
タンパク (抗体を含む、
M.W. > 10000)
糖

60%

66%

低分子化合物 (代謝物)ペプチド (M.W. < 10000)

回答比率

63%

80%

100%

100%
96%

46%

26%
33%

24%

31%

26%
23%

39%

10%

•

ODS/ODS以外ともに低分子の分析に使用する割合が最も高かった。

•

アミノ酸や糖の分析にはODS以外のカラムを使用する割合が高かった。

•

糖の分析には8人中7人がODS以外のカラムをファーストチョイスに用いていた。

11%

4%

21%

14 th JBF Symposium, 2023

http://bioanalysisforum.jp/

ODS

19

Japan Bioanalysis Forum

高極性化合物の保持

9

22

CRO
(9名）
100％

分離の改善

9

21

100％

72％

溶出パターンの変更

7

78％

62％

構造類似化合物との分離能

6

67％

38％

耐久性

4

44％

35％

文献情報等

3

7

33％

24％

在庫・納期

5

4

56％

14％

価格

3

0％

10％

社内の購入・使用実績

21

22％

3％

メーカー 1

11％

0％

その他 1

0％

3％

CRO（9名）製薬（29名）

回答数

18
11
10

測定経験あり

製薬
（29名）
76％

http://bioanalysisforum.jp/

1-11．ODS（C18)以外のカラム選択時に重視する点についてお知らせください。

高極性化合物の保持、分離の改善、溶出パターンが上位であり、次いで、構造類似化合物との分離やカラムの耐久性が重視されていた。
14 th JBF Symposium, 2023

20

Japan Bioanalysis Forum～カラム種別比較～
カラム選択時に重視する点についてお知らせください。
0%

20%

耐久性
文献情報等
在庫（納期）
社内での購入/使用実績価格
メーカー
その他 (具体的に：自由記載)

60%

回答比率
80% 100%

82%
52%

分離の改善

構造類似化合物との分離能

40%

29%

高極性化合物の保持

溶出パターンの変更

ODS以外

0%

79%
66%

35%
45%
37%
29%
26%
29%
24%
44%
8%
27%
8%
23%
3%
8%
3%

69%

14 th JBF Symposium, 2023

●重視するポイント＜ODS＞
・「耐久性」
・「分離の改善」
・「社内での購入/使用実績」＜ODS以外＞
・「高極性化合物の保持」
・「分離の改善」
・「溶出パターンの変更」

http://bioanalysisforum.jp/

ODS

21

Japan Bioanalysis Forum

移動相検討（水相）

9

28

CRO
(9名）
100％

有機溶媒組成検討

8

28

89％

93％

移動相検討（有機相）

8

25

89％

83％

酸・塩基の使用

9

22

100％

73％

試料前処理法

7

15

78％

50％

文献情報等

6

14

67％

47％

カラム長の延長

6

13

67％

43％

22％

53％

44％

17％

22％

13％

11％

0％

CRO（9名）製薬（30名）

カラムメーカーの変更

2

イオンペア試薬の使用

4

充填剤の径を変更

2 4

回答数

16
5

その他 1

製薬
（30名）
93％

http://bioanalysisforum.jp/

1-13．ODS(C18)カラムを断念するまでに実施する検討項目について教えてください。

検討項目の優先順位はCRO、製薬共に同傾向を示した。
①移動相の塩や有機溶媒の種類、組成の検討②試料の前処理方法の検討③カラムの長さ、径、メーカー、イオンペア試薬の必要性
14 th JBF Symposium, 2023

22

Japan Bioanalysis ForumCRO（9名）製薬（30名）

回答数

CRO
(9名）

製薬
（30名）

目的とする分離が得られない

9

24

100％

80％

ピーク形状が悪いまたは改善しない

9

23

100％

77％

選択性、マトリックス効果が改善しない

7

78％

33％

22％

20％

33％

10％

感度不足
カラム内のキャリーオーバーが解消されない

2

10

6

3 3

測定経験あり

その他

4

0％

13％

イオンペア試薬の使用をやめたい

3

0％

10％

キャリーオーバーが解消しない

０

0％

0％

http://bioanalysisforum.jp/

1-14．ODS(C18)カラムでの検討を諦めた理由・事象を教えてください。

ODS（C18）カラムを諦めた理由の約8割は、目的とする分離やピーク形状の改善が認められない場合であった。
14 th JBF Symposium, 2023

23

Japan Bioanalysis Forum

1-15．ODS(C18)以外のカラムを選択する判断基準をお知らせください。

測定経験あり

基準なし（個人の経験）, 89.7%

回答者数：39名

http://bioanalysisforum.jp/

基準あり, 10.3%

ODS(C18)以外のカラムを選択する「判断基準あり」の回答は、約1割
カラム選択には、測定対象やマトリックスなど多くの要素が関係するため、個人の経験によるものが大きい事がうかがえる結果であった。
14 th JBF Symposium, 2023

24

Japan Bioanalysis Forum

1-16．探索ステージ
測定法構築時にカラム選択で重視する点は何ですか？
ODS（C18）以外

ピーク形状、保持時間

22

21

カラムの耐久性

2512汎用性の高いカラムであること

26

4

夾雑物質との分離、キャリーオーバー

13

16

使用経験なし8

9 測定経験あり価格

95

同ロットの確保、納期

7 2

メーカー

42

その他

０

ODSの上位3項目①汎用性②耐久性③ピーク形状、保持時間
ODS以外の上位3項目①ピーク形状、保持時間②分離、キャリーオーバー③耐久性

http://bioanalysisforum.jp/

ODS（C18）

回答者数（39名）

探索ステージでは、汎用性や耐久性が重視される傾向があった。
ODS（C18）以外のカラムでは、ODS（C18）で重視された汎用性よりもカラム性能が重視されていた。
14 th JBF Symposium, 2023

25

Japan Bioanalysis Forum

1-17．開発ステージ
測定法構築時にカラム選択で重視する点は何ですか？

回答者数（39名）
ODS（C18）以外

ピーク形状、保持時間32

夾雑物質との分離、キャリーオーバー

26

25

カラムの耐久性

2920

汎用性の高いカラムであること

24

同ロットの確保、納期

15

使用経験なし

45

メーカー

42

27

8
14

測定経験ありODSの上位3項目①ピーク形状、保持時間②耐久性③分離、キャリーオーバー
ODS以外の上位3項目①ピーク形状、保持時間②分離、キャリーオーバー
③耐久性

価格 22
その他

http://bioanalysisforum.jp/

ODS（C18）０

汎用性、耐久性、カラム性能が重視される傾向は探索ステージと同様であっ
たが、開発ステージではロットの確保や納期を重視している傾向が多かった。
14 th JBF Symposium, 2023

26

Japan Bioanalysis Forum～ステージ別比較（ODS）～
測定法構築時にカラム選択で重視する点は何ですか？
0%20%

開発（35名）
40%

60%
71%

ピーク形状、保持時間

91%
81%
83%

カラムの耐久性42%

夾雑物質との分離、キャリーオーバー
汎用性の高いカラムであること
同ロットの確保、納期

回答比率
80%
100%

74%
69%

23%

84%

43%

13%
メーカー 11%価格••

http://bioanalysisforum.jp/

探索（31名）29%6%「夾雑物質との分離、キャリーオーバー」、「同ロットの確保、納期」は、探索ステージより開発ステージでよりケアする人の割合が多い。
「価格」は、開発ステージより探索ステージで重視する人が多い。
14 th JBF Symposium, 2023

27

Japan Bioanalysis Forum～ステージ別比較（ODS以外）～
測定法構築時にカラム選択で重視する点は何ですか？
0%

20%

40%

60%
70%

ピーク形状、保持時間
53%

夾雑物質との分離、キャリーオーバー
40%

カラムの耐久性
同ロットの確保、納期
汎用性の高いカラムであること

7%

回答比率

開発（35名）
80%

100%

79%

74%

59%

41%

13%
24%

価格

17%
6%

メーカー

7%
6%

http://bioanalysisforum.jp/

探索（31名）「ロットの確保、納期」探索ステージより開発ステージでよりケアする人の割合が多い。
14 th JBF Symposium, 2023

28

Japan Bioanalysis Forum

1-18．ODS（C18）以外のカラム
ロットスクリーニングとその頻度について
ロットスクリーニング実施の有無
ロットスクリーニングの頻度

平均 2.1 回

24%

測定経験あり実施しない,
76%

回答者数：38名

http://bioanalysisforum.jp/

実施する,

ODS（C18）以外のカラムにおいて、ロットスクリーニングの実施は3割弱であった。
14 th JBF Symposium, 2023

29

Japan Bioanalysis Forum

1-19．ODS（C18）以外のカラムを用いて測定法構築を行った際、困った事、問題解決に時間がかかった事はありますか？

製薬

ロット間差がある

7（保持時間、分離パターンなどの再現性）
平衡化に時間がかかる、
ベースラインが安定しない

カラムの安定供給

回答数
14

3

11

測定経験あり5（同ロットの確保、納期など）
選択肢が少ない（粒子径、内径、カラム長、メーカー）
その他 (具体的に：自由記載)

2
2

9
11

http://bioanalysisforum.jp/

CRO5

14 th JBF Symposium, 2023

30

Japan Bioanalysis Forum

1-19．ODS（C18）以外のカラムを用いて測定法構築を行った際、困った事、問題解決に時間がかかった事はありますか？

「その他」で上げられた回答
い。
➢ 検討のパラメータが良く理解できていないことがある。メタノール、アセトニトリル、塩の種類
や濃度についての役割や作用機序がC18と異なる場合は難しい。
測定経験あり➢ 海外メーカーのカラムで、ロット間差で全く使用できないものがあった。緊急を要する試験のみ使用可能なロットで乗り切ったが、それ以降は代替となるカラムを検討した。

➢ 分離条件の設定が難しい。
➢ 文献や公開情報の分析条件と結果が再現できない。

http://bioanalysisforum.jp/➢ ピークの再現性不良、カラムの耐久性への影響、自在な分離の調製が難しいケースが多➢ 複数化合物の分離の良しあしがロットによって異なった。
➢ 耐久性が良くない、ピーク形状が良くない。

14 th JBF Symposium, 2023

31

Japan Bioanalysis Forum

1-20．カラム選択にあたり参考にする情報は何ですか？

ご自身の経験

9

メーカーのカタログ情報

8

社内の蓄積されたデータ

5

JBFの情報7その他 (具体的に：自由記載)

5

製薬

回答数
25
http://bioanalysisforum.jp/

CRO

22
11

測定経験ありその他の回答では文献情報やカラムメーカーの営業からの情報が挙げられていた。
14 th JBF Symposium, 2023

32

Japan Bioanalysis Forum

1-21．カラム選択にあたり、あれば便利な情報や役に立つと考える事がありましたら教えてください。
➢ バイオアナリシスでの耐久性情報や分離情報（アプリケーションデータは、ほぼReference分離のみや標準溶液の多数注入の結果のみ）生体試料共存下でのデータがあれば貴重。あとは、真のキャリーオーバー情報。
➢ 啓蒙書や実務に即した研修資格。（HPLCはLC-MSの普及により入門の敷居は低くなりましたが、使えた様な気になって、勘違いしている人が増えている気がします。）➢ 業界内で推奨のファーストチョイスのカラム（メーカー、商品）。メーカーがテーリングが無いと言っていてもテーリングすることが多い。C18カラムもメーカーや種類が多く、選ぶのが大変。ユーザーの評判がよいカラムや測定対象成分に対してゴールデンスタンダードなカラムが紹介されているとよい。

測定経験あり➢ 高極性、強塩基、強酸化合物などの分析について、どのようなカラム（具体的な製品名）を各製薬企業
やCROが使っているか、に関する情報。入手、公開が難しいとは思いますが。
➢ ODS以外の実施例が少ないため、もっとあるとよい。
➢ 難しいとは思いますが、カラム選択ガイドがあればぜひ利用したい。

http://bioanalysisforum.jp/➢ 生体試料の測定アプリケーションが少ないので、より充実したデータがあれば助かる。

➢ 各メーカーのカラムの温度、耐圧、既存薬での保持情報が載っているデータベース。
➢ カラムを使ってみないとわからない事もあり、各社のカラムのお試しやカラムレンタルが気軽にできるシステムがあると便利だと思っています。
➢ 使用実績。
14 th JBF Symposium, 2023

33

Japan Bioanalysis Forum

小括（１）１回目のアンケートより

ODS（C18）

ODS以外

選択理由

広範囲の化合物に対応可能

回答者数の9割が「カラム選択の判断基準なし」と回答

測定対象①低分子（未変化体）②低分子（代謝物）③ペプチド（M.W.<1000）①低分子（未変化体）②低分子（代謝物）③アミノ酸

カラム選択時に重視する点①耐久性 測定経験あり
②分離改善
③使用実績

ODS（C18）を断念するまでの検討項目①移動相②試料の前処理方法③カラムの長さ、径、メーカー

ODS（C18）を諦めた理由・事象①目的とする分離が得られない②ピーク形状が改善しない③選択性が改善しない

14 th JBF Symposium, 2023

①高極性化合物の保持②分離の改善③溶出パターンの変更

http://bioanalysisforum.jp/⚫ ODS（C18）、ODS（C18）以外のカラムについて
ODS（C18）カラムは広範囲の化合物に使用されており、カラムの第1選択であった。
また、高極性化合物には、ODS（C18）以外のカラムの使用が多かった。

34

Japan Bioanalysis Forum

Summary (1) from First Survey

ODS (C18)

Other than ODS

Reasons forselection

Compatible with a wide range ofcompounds

90% of respondents answered that there
are no judgment criteria for column
selection

Targets formeasurement① Low molecular weight compound① Low molecular weight(unchanged)
compound (unchanged)② Low molecular weight compound② Low molecular weight
測定経験あり(metabolite)
compound (metabolite)③ Peptide (M.W.<1000)③ Amino acid

Column selection
considerations① Durability② Separation improvement③ Usage record

Considerations
before moving fromODS (C18) columns① Mobile phase② Sample pretreatment method③ Column length, diameter,
manufacturer

Reasons to not use
ODS (C18) column① Desired separation is not obtained② No improvement in peak shape③ No improvement
selectivity
th JBF
14in
Symposium, 2023

① Retention of highly polar compounds② Improved separation③ Change in elution pattern

http://bioanalysisforum.jp/⚫ Regarding ODS (C18) columns and those other than ODS
The ODS (C18) column has been used for a wide range of compounds and was the column of first
choice. In addition, columns other than ODS (C18) were often used for highly polar compounds.

35

Japan Bioanalysis Forum

小括（２）１回目のアンケートより

使用頻度（）内：集計ポイント

逆相モード

HILICモード、イオン交換①C18/オクタデシル基(171)②C8/オクチル基(94)③Phenyl/フェニル基(81)①Amide/カルバモイル基(66)②シリカ/未修飾(64)③NH2/アミノプロピル基(31)⚫ 探索及び開発ステージにおける比較測定経験あり
ベスト３は共通していたが、開発ステージでは「ロットの確保、納期」が4番目に多い回答であった。
ODS（C18)

ODS以外

カラム選択時探索ステージで重視する点

①汎用性
②耐久性
③ピーク形状、保持時間①ピーク形状、保持時間②分離、キャリーオーバー③耐久性

カラム選択時開発ステージで重視する点①ピーク形状、保持時間②耐久性③分離、キャリーオーバー①ピーク形状、保持時間②分離、キャリーオーバー③耐久性

14 th JBF Symposium, 2023

http://bioanalysisforum.jp/⚫ カラムの使用頻度圧倒的にODS（C18）カラムの使用頻度が高かった。
HILICモードのシリカやamideカラムの使用頻度が高かった一方、
ODS以外は使用経験が無いという回答も一定数見受けられた。

36

Japan Bioanalysis Forum

Summary (2) from First Survey

Frequency of use(tally points)

Reversed-phase

HILIC, ion exchange① C18/octadecyl (171)② C8/octyl (94)
③ Phenyl (81)

① Amide/carbamoyl (66)
② Silica/unqualified (64)
③ NH2/aminopropyl (31)⚫ Comparison of exploration and development
測定経験ありstages
The top 3 responses were common, but in the development stage, the 4th
most common response was "securing lot, delivery date".
ODS (C18)

Other than ODS

Column selection points tofocus on in the explorationstage① Versatility② Durability③ Peak shape and retention time

① Peak shape and retention time
② Separation, carryover③ Durability

Column selection points tofocus on during thedevelopment stage① Peak shape and retention time
② Durability③ Separation, carryover① Peak shape and retention time
② Separation, carryover③ Durability

14 th JBF Symposium, 2023

http://bioanalysisforum.jp/⚫ Column usage frequency
ODS (C18) columns were used most frequently. While HILIC-mode silica andamide columns were frequently used, some respondents said that they had noexperience using anything other than ODS.

37

Japan Bioanalysis Forum

アンケート実施状況

http://bioanalysisforum.jp/

1回目のアンケート結果を基に、さらなる疑問点に対してよりフォーカスした内容で2回目のアンケートを実施した。
＜2回目＞• 時期：2022年11月25日～12月5日• 方法：クエスタント（Questant）によるWeb上の収集• 配信先：DGサポーター（配信時にはメール連絡と合わせて、サポーターの関係部署へのアンケート協力を求めた）• 回答数：25名

2

所属先を確認したアンケートQ1より、製薬メーカー14名、CRO9名、その他2名からの回答が得られた。
自由回答が多い、難しいアンケートであったが25名の協力が得られた。

8%

製薬メーカーCRO
その他（内資化学メー
カー、化学メーカー）

14 th JBF Symposium, 2023

9
36%

14
56%

38

Japan Bioanalysis Forum2-1．下記カラムを用いてこれまでに測定したことのある
対象物質について教えてください。

カラムの種類回答者数

C1/トリメチルシリル基

5

C4/ブチル基

6

NAP/ナフチルエチル基

5Cholester/コレステリル基

5

PBr/ペンタブロモベンジル基

6

回答
１
蛋白結合率の高い
化合物
長鎖脂肪酸

回答
２

回答
３

―

―

高分子化合物（タンパク、ペプチドなど）

核酸

―

―

―

―

低分子化合物の代謝物との同時分析（セカンドチョイスとして）：
PFPとあまり変わらない―

ベンゼン環、複素環、共役平面のある化合物
低分子化合物の代謝物との同時分析（セカンドチョイスとして）カテコールアミン

http://bioanalysisforum.jp/

1回目アンケートの結果として、逆相モードで使用頻度の低いカラムとして下記の5つが挙げられた。これらのカラムを用いてこれまでに測定したことのある対象
物質についてアンケートを実施した。

企業秘密との兼ね合いにより回答しにくいところ、いくつかの回答がいただけた。
測定対象物質の構造や特性を理解した使用が求められることが分かった。
14 th JBF Symposium, 2023

39

Japan Bioanalysis ForumNo.

測定対象の具体例

123

親水性化合物
有機ポリマー、分子量の大きな有機化合物の異性体の分離
ビオチン

4

低分子化合物の代謝物との同時分析（セカンドチョイスとして）フェニルやベンゼン環とのππスタッキングを期待して等のうたい文句はあるが、実質は、Fのローンペアのマイナ
ス電子との電気的相互作用による保持時間の適度な維持が主目的での採用。

5
6
7
8

高極性でアミノ酸に類似した構造
多環構造を含む塩基性化合物
経験ありますが回答できません。
強塩基でCLogPがマイナスの化合物

http://bioanalysisforum.jp/

2-2．PFP（ペンタフルオロフェニルプロピル基）カラムを使用した際の測定対象物質を具体的に教えてください。

ODS以外のカラムでは比較的メジャーなカラムであるPFPについては多くの経験や意見をいただいた。基本的には高極性化合物やπ-πスタッキングを狙った用途が多いが、それ以外にも高分子などへの応用も見られそれぞれがknow-howを持っていることがうかがえた。
14 th JBF Symposium, 2023

40

Japan Bioanalysis Forum

2-3．PFP（ペンタフルオロフェニルプロピル基）カラムの使用モードについてお伺いします。
回答数

逆相モードで使用
逆相および

2

HILICモードで使用
HILICモードで使用
本カラムの使用経験なし1

12

http://bioanalysisforum.jp/

7

回答数に対して約5割の方が使用経験を持っていることから、ODS以外のカラムの中では使用頻度が高いことが分かった。
HILICモード（順相モードか意見が分かれる）と逆相モードの両方で使いこなしているユーザーがいることがとても興味深い。
14 th JBF Symposium, 2023

41

Japan Bioanalysis Forum2-4．1回目アンケートより選ばれた使用頻度の高いカラムについて使用する（検討する）順に上位1～5位を選択してください。

カラム

1位 2位 3位 4位 5位 ポイント計

C18/オクタデシル基
Phenyl/フェニル基
C8/オクチル基
PFP/ペンタフルオロフェニル基
Amide/カルバモイル基（HILICモード）
シリカ/未修飾（HILICモード）
アダマンチル/アダマンチル基
陽イオン交換（ミックスモード）
ジオール/ジオール基（ジヒドロキシプロピル基）（HILICモード）
NH2/アミノプロピル基（HILICモード）
未回答

24
0
0
0
0
1
0
0

0
6
6
3
1
2
3
2

0
5
3
2
4
2
2
1

0
1
0
4
4
1
1
2

0
2
2
2
1
1
1
1

120
43
35
28
25
22
21
16

0

0

1

4

1

12

0
0

0
2

1
4

2
6

1
13

8
―

http://bioanalysisforum.jp/

上位から順に5ポイント、4ポイントと振って集計を行った。

C18、Phenyl、C8の逆相カラム以降はほぼ横並びの使用頻度であることが分かった。また、2位以降から順位選択されていることからODS（C18）のみを使用するユーザーがいることもうかがえた。
14 th JBF Symposium, 2023

42

Japan Bioanalysis Forum

2-5．普段、よく使うカラムの長さ、粒子径、内径についてお聞かせください。
内径

5 cm

10 cm

粒子径

15 cm

sub 2 µm
1

約 1 mm

約 2 mm1

約 3 µm4%

約 5 µm

4%
7

4

28%

17%
17
68%

6
25%

14

22

58%

96%

http://bioanalysisforum.jp/

長さ

上段の数字は回答数を示す

バイオアナリシスの分野においては、内径2 mm、粒子径2 µm以下のカラムが多用されることが分かった。また、長さは基本Run Time重視で5 cmがファーストチョイスとして使用されている。
14 th JBF Symposium, 2023

43

Japan Bioanalysis Forum

2-6．ODS（C18）以外のカラムを使用して上手くいかな
かった分析系はどのように解決しましたか？（1/3）

PFP

アダマンチル（ADME）
カラム

課題となったこと解決方法

高極性のためC18に保持しない

PFPのカラムにすることで保持が改善

ロット間差が大きい

都度LC最適化、場合によっては再購入

適度な保持時間を維持しつつ、逆相モード
代謝物の分離でISなどが未で分離系も決定できる利点はある。ただし、変化体側にしかない場合、ロット間差や保持時間が安定しない等の欠測定経験ありあまり離れず保持時間を維点はある（複雑な系での保持時間のため、持したいが、逆相ではかなり使用時間やなじませ時間等で微妙にずれ差がある場合のチョイス
る）
測定対象物質の十分な保持、分離が得られなかった

http://bioanalysisforum.jp/

使用した
カラム種

カラム長の延長で対応した
イオンペア試薬を使用した

14 th JBF Symposium, 2023

44

Japan Bioanalysis Forum

使用した
カラム種
HILIC

Amide

課題となったこと解決方法

ピーク形状不良、キャリーオーバー

酢酸アンモニウムやギ酸アンモニウムなどの最適な塩濃度を検討

保持時間が安定しない

移動相のpHとグラジエント勾配の検討

グラディエントモードでのピーク再現性の不良

アイソクラティックモードで実施

HILIC
耐久性、再現性（ミックスモード）

測定経験あり1バッチ毎に使い捨てにした

HILICモードでの分離による解消。
ただし、実質は難しい。HILICモードは選択
HILIC Amide 高極性物質（糖や核酸、の幅が狭く、上手くいく可能性が低い上に、もしくはAmino 糖脂質など）の保持・分
そこまで保持できるわけでは無い。C18の次
カラム
離に何をと迫られれば、HILICや他の官能基のチョイスが次に来る。
14 th JBF Symposium, 2023

http://bioanalysisforum.jp/

2-6．ODS（C18）以外のカラムを使用して上手くいかな
かった分析系はどのように解決しましたか？（2/3）

45Japan Bioanalysis Forum

2-6．ODS（C18）以外のカラムを使用して上手くいかな
かった分析系はどのように解決しましたか？（3/3）

ミックスモード
カラム

PFPなど
-

解決方法

液性（pHなど）を変える、もしくはイオン交換カラムで分析した。

HILICでも他の官能基でも無理なため、ミックスモードでのみ可能となった。ただし、ピーク
極性低分子形状の維持に塩濃度が必要なため、質量分析系への影響は大きく、バルブでのセレクションなどの工夫は必要。
測定経験あり構造類似体を分離できな
PFPなどで分析した。
かった場合高極性で測定できなかった
HILICモードで分析した。
場合

http://bioanalysisforum.jp/

使用した
課題となったこと
カラム種
イオン交換カラム 塩基性や極性が強く測定＋α
できなかった場合

ODS（C18）でうまくいかなかった場合はそれ以外のカラムも選択されるが、検討方法にこれといった正攻法があるわけではなくトライ＆エラーが要求されることが考えらえれた。
14 th JBF Symposium, 2023

46

Japan Bioanalysis Forum

2-7．ODS（C18）での検討を断念し、ODS以外の逆相系のカラムを選択する理由についてお聞かせください。

大まかな内容ODSでは保持が弱い、もしくは保持が強すぎる時類縁物質や夾雑成分との分離が上手くいかない時
マトリックス効果を解消するため
ピーク形状を改善するため代謝物との同時測定や極性化合物の分析のため
測定経験ありLC-MSでの分析条件で、有機溶媒の含有率を30%以上にしたい時

件数
10
8
2
2
1
1

• ODSで保持が弱かったり、強かったりした時と分離が不十分な時にODS以外の逆相系を使う回答が多かった。

http://bioanalysisforum.jp/

回答数20、無回答5• 保持が強すぎる場合に保持の弱い逆相系を使う理由として、ランタイムを短くしたいからという意見と有機溶媒リッチでないとスプレーが安定しないためという意見があった。
14 th JBF Symposium, 2023

47

Japan Bioanalysis Forum➢ ODSカラムでの保持が困難な場合。
➢ 分析対象物質が親水性化合物で特徴的な官能基があるとき。
➢ 保持や分離が上手く行かない場合。
➢ 保持が強すぎる、分離不良、保持が弱い。
➢ ピーク形状、分離を改善するために、結合相の変更を行い、最適化を行います。
➢ 市販の血漿を用いてODSカラムにてバリデーションを実施し、良好な結果であったが患者血漿を分析した結果、強いイオンサプレッションが観測された。前処理を変更す
測定経験ありる時間的余裕がなかったためPFPカラムを変更することで解決できた。
➢ 極性化合物（代謝物）との同時測定、極性化合物の測定（糖や核酸など）の分析に必要だから。
➢ 保持力が強すぎてなかなか溶出されない。最適な溶出条件だと有機溶媒が多すぎてスプレーが安定しない（LC-MS）。配管や接合部への吸着に対して溶解度の高い移動相が選べない。

14 th JBF Symposium, 2023

http://bioanalysisforum.jp/

2-8．ODS（C18）での検討を断念し、ODS以外の逆相系のカラムを選択する理由についてお聞かせください。（1/2）

48

Japan Bioanalysis Forum➢ 高極性化合物の保持させるため。
➢ ピークの分離が不十分な時、保持が不十分な時等。
➢ 分離が出来ない。
➢ C18では保持しないまたは溶出しない場合。
➢ C18では保持が強く分析時間が長くなる場合。
➢ LC-MSでの分析条件で、有機溶媒の含有率を30%以上で確保できないときに保持を強くする目的で使用する。
測定経験あり➢ 類縁物質や夾雑成分との分離が不十分だったため。
➢ 分離がうまくいかないため。
➢ マトリックス効果解消のため。
➢ 高極性分子を分析する際にC18では保持されなかったため。
➢ 分離不良。
➢ C18でうまく保持できない。
14 th JBF Symposium, 2023

http://bioanalysisforum.jp/

2-8．ODS（C18）での検討を断念し、ODS以外の逆相系のカラムを選択する理由についてお聞かせください。（2/2）

49

Japan Bioanalysis Forum

2-9．ODS（C18）での検討を断念し、HILICやイオン
交換系のカラムを選択する理由について教えてください。

大まかな内容ODSカラムでは保持できない高極性化合物を測定するため水溶性が高い代謝物と物性が異なる化合物を同時定量したい時
分離が良くないとき
有機溶媒比率を上げて、感度を稼ぎたい時
前処理法とのモードを変更したい時
測定経験あり• 基本的には高極性化合物への対応として使用が検討されている。

件数
10
1
3
2
1

• 逆相系の選択と比較して、感度を上げるためにHILICを使うという意見や前処理
で逆相系固相抽出を使うため、モードを変えたいという意見が傾向として異なった。

http://bioanalysisforum.jp/

回答数17、無回答8

高極性で保持できない化合物への適応がメインなのだと感じた。どの程度まで逆相系での検討を頑張っているのか（割とすぐにHILIC系を使うのか）が気になった。
14 th JBF Symposium, 2023

50

Japan Bioanalysis Forum➢ ODSカラムでの保持が困難な場合。
➢ 分析対象物質が親水性化合物でかつpKa情報があるとき。
➢ ODSカラムでは保持できないような高極性化合物の場合。
➢ 高極性化合物でODSに保持しない、もしくは保持が弱く移動相の有機溶媒濃度が上げられず、感度が不足している場合に選択する。
➢ 親水性が高すぎて逆相に向かない（保持しない）。
➢ イオン交換系カラムは使用しておりませんが、HILICを選択する理由は、逆相カラム
測定経験ありにて保持されなかったり、保持が弱い極性化合物の分析を目的としています。
➢ 極性化合物の測定（糖や核酸など）の分析に必要だから。
➢ 分子量が低い場合や、水溶性が高い化合物で、保持時間が短い時 ・グルクロン酸抱合体等含め水溶性が高い代謝物と物性が異なる化合物等を同時定量したい場合。

14 th JBF Symposium, 2023

http://bioanalysisforum.jp/

2-10．ODS（C18）での検討を断念し、HILICやイオン交換系のカラムを選択する理由について教えてください。（1/2）

51

Japan Bioanalysis Forum➢ HILICが流行りだったころ、新規性につられて試してみた。
高極性、極低分子でODSではほとんど保持が見込めなかった。
➢ 有機溶媒リッチでの保持が出来ない。
➢ C18やPFPでも保持しない場合。
➢ C18では十分な保持が得られない極性化合物を分析する場合。
➢ LC-MSでの検出感度を上げるため。
➢ ODSで保持しない場合。
測定経験あり➢ 分離がうまくいかないため。前処理法とのモードを変えたいため。
（固相抽出であればイオン交換カラムを利用するなど）➢ 妨害ピークとの分離度を上げるため。
➢ 分離不良。

14 th JBF Symposium, 2023

http://bioanalysisforum.jp/

2-10．ODS（C18）での検討を断念し、HILICやイオン交換系のカラムを選択する理由について教えてください。（2/2）

52

Japan Bioanalysis Forum

2-11．グラファイトカーボンカラムを使用して生体試料分析がうまくいったご経験がありましたら、概要をお聞かせください。

1

炭素1原子しか含まない低分子化合物の分析において、逆相系カラムでは保持が困難であったが、グラファイトカーボンカラムの利用で分離分析が出来たことがあった。

2

ODSで分析できるものは、基本的にグラファイトカーボンでも分析できる。（ただし、理論段数は低い印象）

3

ヌクレオチド分析ではある程度意味があった（いくつか論文がある）。何でも吸着するので使っているう ちにカラム状態が変わり再現性に難があった印象。

4

Uracilのみ完壁な形での成功はある。それ以外は何割かは確実に出てこなくなるか、
測定経験あり全く出てこなくなる。 保持が強すぎてコントロールが極端に難しい。Uracilほど保持しない化合部であれば、ピーク形状も良好で適度な保持時間で溶出可能。

• 一定の割合で需要があることが分かった。ただし、使用は難しいまたは局面が限られ、広く使用されているカラムでは無い印象であった。

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回答数6件、うち経験なし2件• 限定的な使用用途の意見が多い一方、「ODSで分析できるものは、基本的にグラファイトカーボンでも分析できる」と真逆なコメントもあった。
14 th JBF Symposium, 2023

53

Japan Bioanalysis Forum⚫ JBFのホームページや学会の発表資料⚫ 各カラムメーカーのホームページやカタログ、アプリケーション検索（島津、Waters、GLサイ
エンス、OSAKA SODAなど）、個々のカラム情報記載のページ⚫ https://www.waters.com/nextgen/jp/ja/education/primers.html（Waters，LC-MS 分析法およびツールのハウツーガイド）⚫ https://www.gls.co.jp/technique/technique_data/lc/usage_of_hplc /（GLサイエンス，HPLCの上手な使い方）⚫ https://www.nacalai.co.jp/cosmosil/data/csmosrchtop.cfm（ナカライテスク，COSMOSIL アプリケーション問い合わせ）⚫ http://chromanik.co.jp/tech.html測定経験あり（クロマニックテクノロジーズ，技術情報）⚫ https://solutions.shimadzu.co.jp/solnavi/solnavi.htm（島津製作所，会員制ナビゲーションサイト）⚫ 論文で、分析対象物かそれに近い構造の化合物の分析実績は必ず調査する⚫ マニアックな論文をPubMedのキーワード検索で探す⚫ アプリケーションデータや参考となる論文⚫ 虎の巻シリーズや中村洋先生の著作⚫ アジレントのLCハンドブック
多数の方がメーカーのホームページを参考にされている。

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2-12．普段、参考にされるWebページや本があればお聞かせください。

分析に携わる人が誰でも読む教科書は無いのだろうか。
14 th JBF Symposium, 2023

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Japan Bioanalysis Forum

2-13．カラム購入後、カタログやアプリケーション情報からはわからなかった事象が起きた経験はありますか？ （1/3）
カラム購入後、カタログやアプリケーション
情報からはわからなかった事象

2

3

4
5

カラムの耐久性は使ってみないと分からない。最近のカラムは（昔に比べると）丈夫になった印象。

カラムの耐久性。それと、分析とは直接関係ないが、珍しいカラムだと納期が極端 カラムを切り替える。
に遅い場合など。
違うカラムに切り替える。判断の参考とす
測定経験ありるため、予め噂を集めておく、メーカー営業
だんだんテーリングが大きくなるの話から予めカラムケミストリーや表面処
理を深読みしておく。
カタログやアプリケーションには標準溶液の情報が掲載されているので、生体試料の 社内のノウハウで対応する。
情報を事前に得る事は難しい。
各メーカーアミノカラム．耐久性をうたう
測定本数の制限
カラムが多い中、ほぼ耐久性は無い。
14 th JBF Symposium, 2023

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耐久性
1（持続性、耐酸性、耐アルカリ性など）

対応方法

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Japan Bioanalysis Forum

カラム購入後、カタログやアプリケーション
対応方法
情報からはわからなかった事象
ハイブリッドタイプのエチレン架橋のC18カラ（アルカリ性よりで使用することにより他の
ム：カラムが詰まりやすい（アルカリ性より見えないタンパクなどがはがれやすくなり、
6 で使用することにより他の見えないタンパク
結果的に詰まりやすくなっているかもしれまなどがはがれやすくなり、結果的に詰まりやせん）わかって使うしかない。
すくなっているかもしれません）
水系100%で使用できると謳われていた
カラムを酢酸アンモニウム溶液100%の状測定経験あり7
カラムを変更しました。
態で送液を止めていたら、大きく劣化が進んだ。
HILICとか特殊な官能基のカラムでは、再現性と耐久性には細心の注意が必要。
ただし、そもそも、目的物質の溶出時間を 個人の知識、ノウハウで対応。メーカーにも8 特定するのに時間がかかる場合もあった。 相談。カラムを作った人がカラムの性能やサンプルを溶かす溶媒によっても溶出位置 限界は一番よく知っている。
やピーク形状に影響が表れるカラムも以外と多い。
14 th JBF Symposium, 2023

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2-13．カラム購入後、カタログやアプリケーション情報からはわからなかった事象が起きた経験はありますか？ （2/3）

56Japan Bioanalysis Forum

2-13．カラム購入後、カタログやアプリケーション情報からはわからなかった事象が起きた経験はありますか？ （3/3）
対応方法

ピークライナーカラム：吸着が無いとのうた
特殊なコーティングや表面加工された
9 い文句だが、吸着はある（恐らくどうにもな
カラム等へ切り替えらないフリット等の吸着が原因）
カラム内のフィルター吸着からの溶出であっ使用し始めてからしばらくすると生じる10たことから、グラディエントモードにより洗浄
ゴーストピーク
工程を増やす測定経験あり11 耐温度
取りあえず使用してみた。
12

カラムのロット間差（対象化合物の保持ー時間が大きく異なる）

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カラム購入後、カタログやアプリケーション
情報からはわからなかった事象

・ピークライナーカラムへの意見は同じ見解。
経験的にピークカラムは脂溶性物質が吸着しやすいと感じている。
・耐温度はどこかに書いてあるイメージであった。
書いてないのも一定数存在するのだろうか。
14 th JBF Symposium, 2023

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Japan Bioanalysis Forum

大まかな内容生体試料の測定データ
UV検出ではなく、LC/MSでの測定を前提とした分析結果
測定試料の組成、調製方法
再現性
他社製品との比較データ
ロット間差
測定経験ありカーボンコンテンツ
化合物の吸着性（おそらく、キャリーオーバー）

件数
5
4
2
1
1
1
1
1

生体試料の分析結果やリン酸塩などの不揮発性移動相を使わない分析結果がほしいという意見が多かった。

http://bioanalysisforum.jp/

2-14．カラムメーカーのアプリケーションデータに追加して欲しい情報がありましたらお聞かせください。

バイオアナリシスの分野はまだまだシェアが小さいことを感じた。
14 th JBF Symposium, 2023

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Japan Bioanalysis Forum

2-14．カラムメーカーのアプリケーションデータに追加して欲しい情報がありましたらお聞かせください。
➢ 他社製品との（正直な）比較データ。

（全回答一覧）➢ 化合物の吸着性。（次分析への持ち越しの有無）➢ 血清／血漿中の測定データ。LC/MSの測定データ。
➢ マトリックス中での試料の測定結果（バイオアナリシスデータ）、質量分析計でのデータ、C（カーボンコンテンツ：エチレン架橋のカラム等では参考にならないが、保持時間の目安となる重要な指標となる）。
➢ 生体マトリックスにスパイクされた試料の分析結果が情報としてほしい。
測定経験あり➢ ピークの再現性（朝、夜、1週間後）、カラムロット間差。
➢ LC-MS測定では使用できないような移動相を用いたアプリケーションを多く目にするので、LC-MS測定前提の移動相を用いたアプリケーションも記載して欲しい。
➢ UV検出による結果が多く移動相にリン酸塩が使用されているため、LC/MSを想定した移動相での分析結果。

http://bioanalysisforum.jp/➢ 目安で良いので定量下限、生体試料の場合のクロマトグラム➢ 試料や試薬溶液の詳細な調製方法。
➢ 測定試料の組成。
➢ マトリックスを含む試料の測定結果。
14 th JBF Symposium, 2023

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Japan Bioanalysis Forum

2-15．LCやLC/MSに関する資格をご存知またはお持ちでしょうか。
回答数
LC分析士

9

LC/MS分析士LC/MS分析士

10

1
6

日本医用マススペクトル学会 1
日本医用マススペクトル学会…
医用質量分析認定士
知っている 測定経験あり
保有している
LC/MS分析士保有者段数（6名中）
初段：3名
3段：2名
不明：1名

http://bioanalysisforum.jp/

LC分析士

日本分析化学会のLC/MS、LC分析士の認知度は比較高いことが分かった。
14 th JBF Symposium, 2023

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Japan Bioanalysis Forum

話し合いたいテーマ
興味がある ➢ HILICカラムについて、コンディショニングや洗浄方法、耐久性、メーカーによる違い等➢ HILICカラムで本当に使えるものはどれか
9➢ 非常に興味はあるが、メーカー主催などでは有用な情報は少ない
15➢ LC条件の出し方、MS条件の出し方の手順（個人のこだわり、注意点など）➢ 最近のトレンドがどうなっているのか聞いてみたい
興味がない
測定経験あり➢ カラムの粒子の組成によって何が違うのか知りたい➢ カラムの洗浄方法・保存方法について• 以前、Zoomミーティングに参加した際は発言する方が限られてしまったので、開催方
法は工夫が必要。

http://bioanalysisforum.jp/

2-16．バイオアナリシスに携わる方とのカラムに関する情報交換に興味はありますか？

• カラムを使う際に推奨されている方法はあるが、実際に使っている人がどうしているのかを聞きたいという方が多かった。
• 「興味がない」と回答した人の中には、交換できる情報がないと考えている場合もあるのではないか。
14 th JBF Symposium, 2023
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Japan Bioanalysis Forum

小括（３）2回目のアンケートより⚫ 使用頻度の低いカラムについて（C1、C4、NAP、Cholester、PBr）
測定対象物質の構造や特性を理解し、カラムを選択していた。
測定経験あり⚫ PFPカラムについて
ODS以外のカラムの中では使用頻度が高いカラム。
逆相モード、HILICモードの両方で使いこなしている回答あり。
測定対象としては、高極性化合物や-スタッキングを狙った用途が多かった。
また、高分子化合物にも使用されており、各企業がノウハウを持っている事がうかがえた。

http://bioanalysisforum.jp/⚫ 使用頻度の高いカラムについて
ODS、phenyl、C8の逆相カラムの使用が多かったが、ODSのみを使用しているユーザーの存在も伺える結果であった。
その他、PFP（逆相）、amide（HILIC）、シリカ（HILIC）、アダマンチル（逆相）の使用状況は横並びであった。

⚫ グラファイトカーボンカラムについて
ヌクレオチドやウラシルの測定事例、保持が強く、コントロールが難しかったというコメントをいただいた。
14 th JBF Symposium, 2023

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Summary (3) from Second Survey⚫ Infrequently used columns (C1, C4, NAP, Cholester, PBr)
Users selected columns based on their understanding of the structure and properties ofthe substances to be measured.
⚫ PFP columns
測定経験ありMost frequently used columns other than ODS.
A few respondents had mastered both reversed-phase and HILIC mode.
There are cases specifically aimed at measuring high polarity compounds or those that
implement - stacking between those and the column utilizing PFP column characteristics.
They are also used for large molecule compounds, which infers that each company may
have its own in house skill set.

http://bioanalysisforum.jp/⚫ Frequently used columns
ODS, phenyl, and C8 reversed-phase columns were often used, but the results suggestthat there are users who use only ODS.
The use of PFP (reversed phase), amide (HILIC), silica (HILIC), and adamantyl (reversed
phase) was evenly distributed among respondents.

⚫ Graphite carbon columns
We received comments that the retention of nucleotides and uracil was strong and control
was difficult.
14 th JBF Symposium, 2023

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Japan Bioanalysis Forum

まとめ（１）⚫ 各種カラムの利用・認知状況は、ODS（C18）カラムが第1位であった。

⚫ ODS（C18）の他に、phenyl、C8カラムの使用をはじめ、PFP、amide（HILIC）、シリカ（HILIC）、アダマンチル等、多様なカラムを使用している実態があり、分析法
構築過程でカラム選択を検討している事がうかがえた。
測定経験あり⚫ 各種カラムを用いた検討事項、判断タイミングなど、各企業の方針、分析担当者の苦労や分析に対する拘りが設問の自由記載コメントからうかがえ、大変興味深かった。
⚫ カラム購入にあたり利用するカタログやアプリケーション情報に追加して欲しい情報では、
生体試料に関する情報、LC-MS測定を前提とした情報が求めるコメントが多かった。

http://bioanalysisforum.jp/⚫ 測定対象の構造や特性からODS以外のカラムを第１選択とする場合もあるが、やはり、低分子化合物の第１選択カラムはODS（C18）カラムであった。

⚫ 高極性化合物（糖、水溶性ビタミンなど）や親油性化合物（コレステロール）を測定す
る際は、ODS以外のカラムが選択肢として挙げられる。
14 th JBF Symposium, 2023

64

Japan Bioanalysis Forum

Conclusion (１)⚫ Columns other than ODS may be the first choice depending on the structure and propertiesof the compounds to be measured, but the first choice column for low-molecular-weightcompounds was the ODS (C18) column.
⚫ We deduced that in addition to ODS (C18), various columns such as phenyl, C8, PFP, amide(HILIC), silica (HILIC), and adamantyl, etc. are used in the process of developing analyticalmethods.

測定経験あり⚫ It was very interesting to see from the free-form comments in the questions about thematters to be considered using various columns, the timing of decisions, the policies of eachcompany, the difficulties of the analysts, and their commitment to analysis.
⚫ Many comments indicated the desire for more information to be included
in product catalogs or regarding the application of their products in relation to biological
specimen types and LC-MS measurement when looking to purchase columns.

http://bioanalysisforum.jp/⚫ Among the various columns, the ODS (C18) column was the most commonly used andrecognized.

⚫ Columns other than ODS are an option when measuring highly polar compounds (sugars,
water-soluble vitamins, etc.) and lipophilic compounds (cholesterol).
14 th JBF Symposium, 2023

65

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まとめ（２）カラムの種類と代表的な測定対象
特徴
•
•
C1 /
トリメチルシリル基•C4 / ブチル基•

C8 / オクチル基•
C18 /オクタデシル基

代表的な測定対象

ジステアロイルホスファチジルコリン（脂質二重膜成分）
リポオキシトシン-1
エトドラク製剤（非ステロイド性鎮痛・抗炎症剤）
チザニジン（筋緊張緩和剤）
トリメタジジン（血管拡張薬）
ステアリン酸、イソステアリン酸
水溶性ビタミン（PABA, Vitamin H, Vitamin B2,
Vitamin B12）の分離
短いアルキル鎖（C4/ブチル基）を結合 • Vitamine K1、K2
させた充填剤は疎水性相互作用が弱い • モノクローナル抗体（アレムツズマブ alemtuzumab)
ため、疎水性の高い化合物の分析に適 • 抗体の逆相分析• 核酸医薬における高疎水性オリゴ核酸の分離している。
測定経験あり基本的にC18と同じ溶出挙動のまま保持が弱いので、保持が強すぎる物質の分析時間を短縮するために使用。立体選• ロサルタンカリウムとヒドロクロロチアジド配合剤の分析例
択性がC18カラムより低いため、あえてピークを分離したくない場合にも使用できる。
低分子から高分子まで幅広く活用され、• 低分子逆相分析の第一選択。各社、エンド
キャッピング、耐酸性、耐アルカリ性、炭 • ペプチド、アミノ酸（誘導体化）
素含有率、水系100％で使用可能など • 有機酸、脂肪酸、芳香族カルボン酸、核酸など
複数種類を取り揃えている。
タンパク結合率の高い化合物。
ODSカラムとは異なる分離選択性を示
し、ODSカラムで溶出しにくい脂溶性化
合物の分析に適している。逆に親水性化合物を水系溶離液で分離するときな
どにODSとの使い分けで有効な場面も
ある。

•
•
•
•
•
•
•

14 th JBF Symposium, 2023

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カラムの種類66

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まとめ（２）カラムの種類と代表的な測定対象
特徴

代表的な測定対象●C30（トリアコンチル基）• トリアコンチル基の優れた構造認識能は同 ●C30(トリアコンチル基)：同族体分析• カテロイド（α, β）
族体分析に最適。
• 脂溶性ビタミン（K, A, D, E etc.）• ビタミンE（α, β, γ, δ）●C27（ヘプタコシル基）
C22以上 /
• 水系100％移動相にて安定した測定が ●C27（ヘプタコシル基）
ドコシル、可能であり、高極性化合物の保持・分離 • 核酸塩基（シトシン、ウラシル、チアミン、アデニン）
ヘプタコシル基等が良好。
●C22（ドコシル基）• カテコールアミン（Norepinephrine(NE),●C22（ドコシル基）
Epinephrine(EP), DHBA, Dopamine(DA)）• 水比率の高い移動相で、C18よりさらに• 直鎖カルボン酸（Oxalic acid, Tartaric acid etc.）
高分離・高保持能が得られる。
• フェニル固定相は各社によって結合様式が • エストロゲン（エストリオール、エストラジオール、エチニルエスト
Ph /異なるが、共通する構造はフェニル基が結ラジオール、ジエチルスチルベストロール、ジエネストロール）
アルキルフェニル基•合している事と官能基が有するπ電子の0-, m-, p-toluidineの異性体分離データ（フェネチル基）相互作用が溶質との間に働く事。
• シリカゲルに直接フェニル基を結合させたダイレクトフェニル基結合タイプのため、ODS• 芳香族化合物
カラムの分離と大きく異なり分離改善が期• 甘味料（サッカリン，アセスルファムカリウム）
Phenyl / フェニル基待できる。アルキルフェニル基結合カラムに• カテキン類
比べて芳香族化合物の電子状態の差をより大きく認識する特性を有している。

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カラムの種類67

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まとめ（２）カラムの種類と代表的な測定対象

Biphenyl /ビフェニル基Phenylhexyl /フェニルヘキシル基

NAP /ナフチルエチル基

特徴

代表的な測定対象• ΠーΠ相互作用を期待したい、かつ通常のフェニルカラムと分離を変えたい時に選択。
• アルキル鎖固定相と異なる選択性、芳香族化合物の保持向上、LC/MS(/MS)分• ステロイド、テトラサイクリン、不飽和結合を含む化合物
析の感度および選択性向上に最適。
• ビフェニル基の二つのベンゼン環は約45度
ねじれており、ビフェニル基は単独のフェニル基とは異なる分離挙動を示す。
• Butylbenzene, 0-Terphenyl, Amylbenzene,
Triphenylene• 14種の有機酸分離法（Lactic acid, Succinic acid,• フェニル基結合カラムは、π電子相互作用
Glutaric acid, Quinic acid, Isocitric acid, Citricが働くため C18 カラムとは異なる分離パacid, Fumaric acid, Maleic acid, Ascorbic acid,
ターンが得られる。C18 カラムで分離が不Adipic acid, Shikimic acid, Trans-aconitic acid,
充分な時に選択するカラムとして有効。芳
Cis-aconitic acid, Tartaric acid, Malic acid）•
香族化合物に対し特に選択性をもっていクロロベンゼン（クロロベンゼン、1,2-ジクロロベンゼン、1,4る。旧来のフェニル基に比べ、より安定でジクロロベンゼン、1,2,3-トリクロロベンゼン、1,3,5-トリクロロ
再現性が優れる。
ベンゼン、1,2,3,4-テトラクロロベンゼン）• Acidic compounds（p-Hydroxybenzoic acid、
Sorbic acid、Benzoic acid、Salicylic acid、p-Toluicacid）• ナフチルエチル基結合型。フェニルカラムより • ビタミンEの同族体、副腎皮質ホルモン（prednisone,
も強いπ-π相互作用によってC18型カラム
cortisone, prednisolone, hydrocortisone）
で分離できない構造類似化合物の分離 • シスプラチンのmono-chloro体、水和錯体、OH-ダイマーに威力を発揮する。
の分離
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カラムの種類68

Japan Bioanalysis Forum

まとめ（２）カラムの種類と代表的な測定対象
特徴

PFP / ペンタフルオロ
フェニルプロピル基• 疎水性相互作用、双極子－双極子相
互作用、π電子相互作用など様々な相互作用が働くため、ODSカラムやフェニルカ
ラムとは異なる独特の分離挙動を示し、立体構造の認識性能に優れている。

アダマンチル /アダマンチル基

Cholester /コレステリル基

代表的な測定対象• フッ素化合物に対して特異的な保持を示す• カテコールアミン・セロトニン類• 平面芳香族化合物、位置異性体、ハロゲン化化合物、極性化合物分析に対する選択性• キサンチン類• トリプトファン代謝物（キヌレニン経路）の一斉分析• 核酸関連化合物の分析例（ATP、AMPなど）• Cpd118（FBPase inhibitor, 2型糖尿病, イヌPKプロ
ファイル）• isoniazid (INH), rifampicin (RIF), ethambutol• アダマンチル基を導入したカラムであり、大(EMB), and pyrazinamide (PZA), rifabutin
きな表面極性により高極性化合物を大き(RFB), rifaく保持する。
pentine (RFP), and other first-line anti-TB drugs
as well as four secondline anti-tuberculosis drugs, including
protionamide (PTO), ethionamide (ETH), thiosemicarbazone (THS), andclofazimine (CFZ)• コレステロール基が逆相系でODSカラムと同等の疎水性を提供し、特異的な立体構造により疎水性化合物に対して強力な • 天然物，構造類似化合物
立体選択性を示す。他のODSカラムで使 • ポリフェノール、カテキン、脂溶性ビタミン、フラボン用されるのと同じ分析条件で独自の分離パターンを示す。
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カラムの種類69

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まとめ（２）カラムの種類と代表的な測定対象
PBr / ペンタブロモ
ベンジル基

特徴

代表的な測定対象• 親水性化合物を逆相クロマトグラフィーで ••分離。
• 高有機移動相（>80% アセトニトリル）と組み合わせて使用することで、高極 •シリカ / 未修飾
性分析種を保持。 HILIC の分離メカニ（HILIC）
ズムにより、従来のクロマトグラフィー逆相ア •プローチに対して直交する分析種の選択 •性が得られる。
• カルバモイル基を化学修飾させており、高•極性化合物全般で大きな保持を示す•
Amide / カルバモ
HILICカラム。
•
イル基（HILIC）• アミド基（カルバモイル基）結合型のため、
HILICカラム中でも保持が強いタイプ。
• アルキル鎖の炭素上に隣接して2個、水酸基を導入した固定相が一般的に使用される（ジオール）。ジオール基の高い極ジオール / ジオール性によりHILICモードで分析が可能である。
基（ジヒドロキシプ
各メーカーにより、ジオールの根元のスペー •ロピル基）
サーの鎖長は異なる。中性であるため、特 •（HILIC）
異的な吸着が少なく水100%で洗浄することができるタイプも多い。未修飾シリカゲ
ルタイプのHILICカラムに比べて耐久性が高い。

親水性化合物
ヌクレオチド、ペプチド、カテコールアミン、オリゴ糖など
栄養素（Nicotinamide, Nicotinic acid, Thiamine）の分離
カテコールアミン（NE, EP, DA）の分離
神経伝達物質物質（Acetylcholine, Choline）
メラミン類（シアヌル酸、メラミン）
アスコルビン酸
グライコミクスにおける糖鎖（2-AB化N型糖鎖（ヒト
IgG））

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カラムの種類

核酸塩基・ヌクレオシド（HILICカラムの選択性比較）
水溶性ビタミン10成分の分離

14 th JBF Symposium, 2023

70

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まとめ（２）カラムの種類と代表的な測定対象
特徴

代表的な測定対象• 多くは試料が極性の高い低分子化合物
Cyano (CN) / シの場合は順相モードで、極性の低い試料
アノプロピル基（逆の場合は逆相モードで用いられている。
• シアノ基の三重結合により、フェニルカラム
相＆HILIC）
等と同様にπ電子相互作用が働く。

NH2 / アミノプロピ
ル基（順相＆HILIC）• ステロイド、第四級アンモニウム塩、アルコール、アルデヒド• 6種ヌクレオチド（AMP, UMP, ADP, UDP, ATP, UTP）の分離
• 糖/セルロース系加水分解物（Xylose, Furctose,
Mannose, Glucose, Sucrose, Cellobiose,
Melezitose, Raffinose, Maltotriose,
Maltopentaose, Maltohexaose, Maltoheptaose）の一斉分析• 幅広い極性、構造部位、pKaに渡る極性• モノアミン神経伝達物質（DA, 5-HT, EP, NE）
分析物の分離を可能にする。
• 単糖類および二糖類（Arabinose and Xylose;
Fructose, Mannose, Galactose and Glucose;
Sucrose, Lactose and Maltose）の分離• 糖アルコール類（Glycerol, meso-erythritol, Xylitol,
Sorbitol, Mannitol, myo-inositol, Maltitol,
Lactitol, Palatinitol）• ペプチドホルモン（オキシトシン、Oxytocin）

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カラムの種類71

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まとめ（２）カラムの種類と代表的な測定対象
特徴

代表的な測定対象

スルホベタイン型の両生イオン官能基の導入• 正（第4級アンモニウム）負（スルホン酸）の基が１：１で存在するため、表面電荷がゼロ。相殺された静電力により、検体との2次静電相互作用が弱まるため、 • スルホベタイン型：エドロホニウム、ネオスチグミン、ピリドスチ
ベタイン / スルホベ
移動相ｐHの最適化を行う必要あり。
グミン
タイン・ホスホリルコリ• ホスホリルコリン基：Naphthalene, Thymine, Adenine,
ン基（HILIC）
ホスホリルコリン基導入
Cytosine• 親水性相互作用により逆相モードとは逆の順序でサンプルが保持され、極性化合物の保持能に優れている。
多孔性グラファイトカーボン• 卓越した高極性化合物の保持力、構造• ビタミンD類的に関連性のある物質の分離、pH 0 ～• アミノ酸等の高極性化合物
14 で優れた安定性。
• 糖ペプチドやリン酸化ペプチド• 高温用途に最適。

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カラムの種類72