技術紹介

株式会社 LSIメディエンス

検査偽陽性の評価方法
5-メチルシトシンの脱アミノ化に由来する偽陽性の評価方法

島 津

光 伸，野 上祥 平

が あ る か を 調 べ て い る こ と に な る． 初 発 鋳 型 量 が

1 は じ め に
肺がんにおけるEpidermal Growth Factor Receptor（EGFR）

10000 ケの場合と比べると，1/100 の感度で調べたことになる．PCR 法の検査で検査陰性になった場合は，

T790M 変異は，チロシンキナーゼインヒビター（TKI）

検査材料中に検出できる量の検査対象物がなかったと考治療により誘発される薬剤耐性変異である．本変異は，えるべきである．したがって，適切な検体量を用いるこACG から ATG へのミスセンス変異，CpG シトシンかとは検査感度を維持する上で重要である．

らチミンへの変異である．本変異を有する患者に有効な検査材料の質の問題としては，塩基の化学修飾が挙げ治療薬が開発され本変異の高感度検出が望まれている

られる．核酸塩基の化学修飾は生体内で起こる現象であが，TKI 未投与の患者から採取した組織を凍結保存しるが，遺伝子変異の火種であり，ホルマリン過固定やた場合と FFPE とした場合で T790M 変異の検出率が大

FFPE 作製後の保管期間，FFPE から DNA を抽出する

きく異なる例も報告されており，FFPE 検体における際の脱アミノ化工程などで発生する可能性がある．核酸

アーチファクトの可能性が示唆されている1）2）．今回，塩基配列中のシトシン塩基の 4 位アミノ基が加水分解

CpG シトシンに由来するアーチファクトの量を推定す的脱アミノ化を受けるとウラシルに変換される．また，例と共に本法を紹介する．

ンと並ぶ配列）は，ほとんどがメチル化され，5-メチルる新たな方法を構築したので．EGFR T790M 変異検出

2 背

生体内の CpG シトシン（5′ 末端からシトシン，グアニシトシンとなっており，これが脱アミノ化されるとチミ

景がん

近年，保険診療の一つとして肺癌や大腸癌における分ンへと変換される4）～6）．さらに，この反応は Shen らの研究によって，シトシンより 5-メチルシトシンの方が子標的薬の効果予測する遺伝子変異検出検査が増加して2～4 倍速いことが報告されている7）．この脱アミノ化

きた．肺癌や大腸癌など固形がんの検査では病理検査がを受けたシトシンを含む DNA を鋳型として PCR 等に一般的である．固形がんの遺伝子検査では正常部位とがよる核酸増幅を行った場合，元来シトシンであった塩基ん部位を区別し特定することやがん細胞の存在率を確認は最終的にチミンとなり検出される．あらかじめ，このする必要があることから，病理検査と共通するホルマリ

化学修飾が強く疑われる検体であれば，PCR の前にウン固定パラフィン包埋切片（FFPE）を検査材料とする

ラシル DNA グリコシラーゼ（UDG）処理を行い，ウことが多い．FFPE を検査材料とする PCR 法など核酸ラシルを含む鋳型 DNA を切断し，PCR 等で増幅がで増幅法では，検査材料の量と質が大きな問題となる（図1）．量の問題とは，検査材料に含まれる増幅可能な核酸の量である．遺伝子検査に適した FFPE を作製法については，日本病理学会よりガイドライン3）が示されており，ホルマリン固定法としては，10 ％ 中性緩衝ホルマリンで 6 時間から 48 時間が適切とされている．さらに，生検のような小さい材料はサイズに応じて短時間する必要がある．このホルマリン固定が過剰になると DNA の分解や塩基の化学修飾が進行することが示されている3）．DNA 分解が進行すると増幅可能な DNA 量が減少する．例えば，PCR 検査における検体量（初発鋳型量）が 100 ケであれば，どんなに増幅しても調べている範囲は 100 ケであり，100 ケの中に目的とする変異
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図1

検査材料の問題（量と質）

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表1

プライマー・プローブ配列

プライマー及びプロープ

塩基配列

EGFR T790M F-Primer5′-GCCTCACCTCCACCGTGC-3′

EGFR T790M R-Primcr

5′-TGTTCCCGGACATAGTCCAG-3′

EGFR T790M ddPCR Wild Probe

5′-HEX/AG＋C TG＋C G＋TG A＋TG/BHQ1-3′

EGFR T790M ddPCR Mutant Probe

5′-FAM/AG＋C TG＋C ＋A＋TG ATG AG/BHQ1-3′

EGFR F795F ddPCR Wild Probe

5′-HEX/AGG CAG C＋CG AAG GG/BHQ1-3′

EGFR F795F ddPCR Mutant Probe

5′-FAM/AGG CAG C＋C＋A AAG GG/BHQ1-3′

LNA の位置は＋で表記した

きないようにして防ぐことができる6）．しかしながら，
T790M 変異点のような CpG の配列を有するシトシンは，DNA メチルトランスフェラーゼによるメチル化修飾を受け，5-メチルシトシンとなっている．5-メチルシトシンは，通常のシトシンと同様に脱アミノ化を受ける

C1000 TouchTM サーマルサイクラー（バイオラッド社）
を 用 い て 核 酸 増 幅 反 応 を 行 っ た． そ の 後，QX200TM

Droplet Reader（ バ イ オ ラ ッ ド 社 ） を 用 い て 測 定 し，QuantaSoftTM Software による解析を行った．解析時のThreshold については T790M FAM（変異型検出プローが，ウラシルではなくチミンに変換されるため，UDGブ）を 4000，HEX（野生型検出プローブ）を 3500 と処理の効果が得られない．したがって，患者組織中に本し，F795F の 場 合 は FAM を 3000，HEX を 3000 に来あった遺伝子変異であるのか，検体採取から測定まで設定した．変異型＋野生型－（Ch1＋，Ch2－）のドロの間に生じたアーチファクトかを区別できなかった．

プレットが 2 ケ以上の場合に変異陽性とし，変異割合筆者らは，様々な組織 DNA を用い EGFR T790M 近は変異陽性の場合のみ算出した．

傍の CpG シトシンのメチル化を調べ，ほぼすべてがメ4 検 討 結 果由来するアーチファクトは，がん細胞における遺伝子変4･1 アーチファクトを用いた検討異と異なり，広範に誘発されると考えられることから，加熱した健常人末梢血ゲノム DNA の ddPCR で測定チル化されていることを確認した．5-メチルシトシンに目的とする遺伝子変異点（例えば T790M）と異なる部した結果を図 2 に示した．未処理のゲノム DNA サンプ

告のないメチル化シトシンからチミンへの変化（例えばなかったが，70 ℃ で加熱したサンプルからは両方の変F795F）を定量的に測定し，両者の変異割合を比較す異が検出され，変異の割合は加熱時間と共に上昇し，変ることで，アーチファクトの存在量を推定する新たな方

異割合も略同じであることが判明した．人為的に誘発さ位の CpG シトシンであり，これまでに変異，多型の報8）法を開発した ．

3 材料調製と方法
3･1 加熱処理による加水分解的脱アミノ反応によるアーチファクトの導入
健常人末梢血ゲノム DNA を 10 ng/μL に調整後 50μL を分取し，ライトミネラルオイルを重層して，PCR

ルからは，T790M 変異および F795F 変異は検出されせた脱アミノ化は，ゲノム DNA において広範囲に一定の割合で誘発されていることが推定された．目的とする

5-メ チ ル シ ト シ ン の 変 異 で あ る EGFR T790M（c.
2369C＞T）変異と変異や多型の報告が無い他の 5-メチルシトシンである EGFR F795F（c. 2385C＞T）変異の割合を比較することで，がん細胞中で誘発された変異（真の変異）と検体採取後に誘発されたアーチファク機を利用し 70 ℃ で，1 日，4 日，7 日加温した．加温後は測定まで－20 ℃ で保管した．

3･2 ドロプレットデジタル PCR（ddPCR）法による測定
加熱処理前のゲノム DNA（10 ng/μL 冷蔵 4 ℃ 保管）と上記加熱処理した DNA 及び検査残検体 DNA を鋳型に，表 1 に示す EGFR T790M プライマー，プローブを 使 用 し，EGFR exon20 T790M（c. 2369 C＞T） 変異および EGFR exon20 F795F（c. 2385 C＞T）変異検出用の反応液をそれぞれ調製した．各反応液を分注した

96 穴プレートをバイオラッド社製 Automated Droplet

Generator（AutoDGTM）によりドロプレットを作製し，
194

図2

アーチファクト量の評価
ぶんせき 2022 5

かい りトを区別でき，高精度且つ高感度に検出できる可能性を性判定となった（表 2）．判定が乖離した 6 検体は何れ示すことができた．

もコバスⓇ EGFR 変異検査キット v2.0（Cobas）で検査したものであった．本キットの T790M 最小検出感度

4･2 FFPE 由来 DNA を用いた検討は 2～3 ％ とされていることから乖離の原因は感度不足

臨床検査で T790M 陰性となった 9 検体，T790M 陽によるものと考えられた．

性となった 2 検体について，同様の方法で T790M と検体 7 はオンコマイン Dx Target マルチ CDx システ

F795F の変異割合を調べた．T790M 陽性の判定は臨ム（Oncomine）で検査した結果である．Oncomine は次床データ等に基づいて決定すべきであるが，便宜的に世代シークエンサーを用いる診断薬である．シークエン

T790M と F795F の変異割合が 2 倍以上の場合にアースデータの判定法と T790M の最小検出感度は，明確チファクトを上回る量の変異が存在すると仮定し，陽性な記載は無く不明であるが検出例から推察すると 2～3判定基準を設定した．本法を用いる判定では，陽性の 2％ と思われる．このことから，検体 7 の Oncomine で検体の判定は一致したが，陰性 9 検体の内，6 検体が陽表2の判定は感度以下による陰性，本法ではアーチファクトddPCR 反応条件

反応液粗成

反応条件

試薬名

液量温度

時間

サイクル数

Biorad 2X Supermix for Probe（No dUTP）

11 μL

95 ℃

10 分間

1回

50 μmol/L EGFR T790M F-Primer

0.5 μL

94 ℃

30 秒間

50 μmol/L EGFR T790M R-Primer

0.5 μL

60 ℃

1 分間

10 μmol/L T790M ddPCR Wild Probe
もしくは F795F ddPCR Wild Probe

0.7 μL

98 ℃

10 分間

1回4℃30 分間

1回10 μmol/L T790M ddPCR Mutant Probe
もしくは F795F ddPCR Mutant Probe

0.7 μL

Nuclease Free Water

3.6 μL

Sample DNA

40 回5 μL
表 3 FFPE 由来検査残 DNA を用いた検証

サン
プル

123456

変異部位
T790M

変異割合（％）

臨床検査結果0.69 Cobas
ドライバー変異陰性

F795F

0.24 T790M 陰性

T790M

0.55 Cobas
ドライバー変異陰性

F795F

0.05 T790M 陰性

T790M

0.36 Cobas
ドライバー変異陰性

F795F

0.08 T790M 陰性

T790M

0.54 Cobas
ドライバー変異陰性

F795F

0.09 T790M 陰性

T790M

0.63 Cobas

F795F

0.02 T790M 陰性

T790M

0.22 Cobas

F795F

0.06 T790M 陰性

ドライバー変異陰性

ドライバー変異陰性

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本法による判定結果

T790M 陽性790＞2×795

T790M 陽性790＞2×795

T790M 陽性790＞2×795

T790M 陽性790＞2×795

T790M 陽性790＞2×795

サンプル

7

変異部位

変異割合（％）

T790M

0.27

F795F

8910110.37

T790M 30.30
F795F

検出
せず

T790M

0.58

F795F

検出せず

T790M

0.10

臨床検査結果Oncomine
ドライバー変異陽性
L858R

本法による判定結果

T790M 陰性790＜2×795

T790M 陰性PNA-LNA Clamp
ドライバー変異陽性

19del.
T790M 陽性

T790M 陽性

PNA-LNA Clamp
ドライバー変異陽性

19del.
T790M 陽性
NA-LNA Clamp
ドライバー変異陽性L858R

F795F

0.06

T790M

0.11 PNA-LNA Clamp

F795F

0.08 T790M 陰性

T790M 陽性

T790M 陰性790＜2×795

T790M 陰性

ドライバー変異陰性

T790M 陰性790＜2×795

T790M 陽性790＞2×795

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判定により陰性となったことで判定が一致したと考えら

れば，アーチファクトの存在を推定できると考えられれる．

る．本法は，精度を維持しつつ，感度を一段階向上させ

PNA-LNA Clamp PCR（Peptide Nucleic Acid-Locked

Nucleic Acid Clamp PCR）検査は，PNA で野生型の増幅ることができることから，高感度が要求される遺伝子変異検出に有用な方法と思われる．
本稿で使用した健常人末梢血 DNA はインフォームドを抑制し，LNA で変異型を高感度に検出する方法であ9）る ．本法で 0.1 ％ 程度の T790M 変異が検出された 2コンセントが得られたボランティアの血液より抽出しは T790M 陰性判定となり，判定が一致した．本法のついては，社内倫理審査委員会の審査を経て使用した．

検体は F795F 変異も同程度検出され，上記判定基準でた．臨床検査結果及び臨床検査終了後の残検体 DNA に

最小検出感度は 0.5 ％ に設定されていることから，判定の乖離が無かったものと考えられる．
今回検討した 11 検体におけるアーチファクトの最大推定量は 0.37 ％ であり，70 ℃ 7 日間加熱し，アーチファクトを誘発した場合のアーチファクト量は 0.5 ％未満であった．したがって，0.5 ％ より低い量の変異を検出する場合にはアーチファクトの存在を考慮する必要があり，本法は低頻度の変異を精度良く，高感度に検出する際に有用と考えられる．

5 ま と め現在遺伝子検査で使用される体外診断薬の変異検出感度は，およそ 2～5 ％ である．この感度で十分であるか

文寺 崎 浩 司， 島 津 光 伸： 分 析 化 学（BUNSEKI KAGAKU）,の判断は非常に難しい．検査材料におけるがん細胞の量が十分であれば，2～5 ％ の検出感度で満足できるが，手術や生検が困難な患者さんに対して行われるリキッド

71, 59（2022）．

9） Y. Nagai, H. Miyazawa, H. Tanaka, K. Udagawa, M. Kato, S.
Fukuyama, A. Yokote, K. Kobayashi, M. Kanazawa, K. Hagiwara :Cancer Res., 65, 7276（2005）.

バイオプシー（血漿中遊離核酸）検体では不足感がある．また，常に適切な検査材料が採取できるかの問題もあり，変異検出の高感度化が望まれている．しかしながら，高感度変異検出法は，本来患者検体に存在しない変異をアーチファクトとして検出する危険性も有している．

献1） X. Ye, ZZ. Zhu, L. Zhong, Y. Lu, Y. Sun, X. Yin, Z. Yang,G.Zhu, Q. Ji : J Thorac Oncol., 8, 1118（2013）.
2） X. Wang, X. Li, H. Guo, L. Zhu, Z. Peng, J. Wang, F. Yang,
Y. Guo : Onco Targets and Therapy., 13, 10621（2020）.
3） ゲ ノ ム 診 療 用 病 理 組 織 検 体 取 扱 い 規 程: 日 本 病 理 学 会（2018 年）.
4） N. Quach, M.F. Goodman, D. Shibata : BMC clinical pathology.,
4, 1（2004）.
5） Ruiz MI. Gallegos, K. Floor, F. Rijmen, K. Grunberg, JA.
Rodriguez, G. Giaccone : Cellular oncology., 29, 257（2007）.
6） H. Do, A. Dobrovic : Oncotarget, 3, 546（2012）.
7） JC. Shen, WM. Rideout 3rd, PA. Jones : Nucleic Acids Res., 22,972（1994）.
8） 野上祥平，吉岡 進，細川由貴，望月美希，若松宏武，●●

島津光伸（Mitsunobu Shimadzu）
株式会社 LSI メディエンスメディカルソ

リューション本部 技術顧問（〒 174─8555
東京都板橋区志村三丁目 30 番 1 号）．東京理科大学応用生物科学科．医学博士．

今回新たに構築した方法は，5-メチルシトシン由来するアーチファクトを定量的に推定できる．現在筆者らは，臨床検査で T790M 陰性となった検査残 DNA を用いて解析を継続している．解析中ではあるが，ほとんどの検体で 0.1 ％ 程度の T790M 変異と F795F 変異が共に検出され，本法の有用性を確認している．また，次世代シークエンサーを用いる検査では，多くの変異点を解読 し て い る こ と か ら， ゲ ノ ム DNA に 散 在 し て い る
CpG 配列を調べることができる．Oncomine 検査で得られたデータを用いて独自に再解析すると散在する CpG
シトシンの変異が同程度検出された（データ未掲載）．

野上祥平（Shohei Nogami）
株式会社 LSI メディエンスメディカルソリューション本部遺伝子解析研究部（〒 174─8555 東京都板橋区志村三丁目

30 番 1 号）．東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科医歯理工学専攻．修士（医科学），臨床検査技師．≪現在の研究テー
マ≫がん遺伝子の高感度検出，リキッドバイオプシー．≪趣味≫Sports．
E─mail : nogami.shouhei@ma.medience.co.jp

本法を次世代シークエンスの解析アルゴリズムに利用す会社ホームページ URL：

https://www.medience.co.jp

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