ABML2011

O2-1

2011年11月3日-5日 東京（芝浦工業大学））

病態細胞イメージングへの適用を目指した
バイオハイブリッド型蛍光プローブの開発
Development of bio-hybrid fluorescence probe
for pathological cell imaging○ 嶋村美来 1, 小林浩規 1, 西尾忠 1, 金澤秀子 1, 岡野光夫 2

1. 慶應義塾大学薬学部, 2. 東京女子医科大学 先端生命医科学研究所○Mirai SHIMAMURA1, Hiroki KOBAYASHI1, Tadashi NISHIO1, Hideko KANAZAWA1 and Teruo OKANO2
1. Faculty of Pharmacy, Keio University
2. Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women’s Medical University
Abstract:

Recently, bio-imaging and its related techniques have been actively investigating in life science field. In this research,
we developed “bio-hybrid fluorescent probe” based on temperature-responsive polymer, which is called as poly-N-isopropylacrylamide(PNIPAAm). PNIPAAm has phase transition temperature at 32oC and shows reversible hydrophilic (<32oC)-hydrophobic (>32oC)
change in the aqueous solution. First, we synthesized fluorescent polymer by introduction fluorescent molecule, such as fluorescein,coumarin, rhodamine or dansyl derivative into PNIPAAm. Fluorescent polymer showed environment (temperature or pH)-dependent
fluorescence intensity change. Next, we prepared bio-hybrid fluorescent probe by conjugation fluorescent polymer and biomolecules(lipid or protein). Cellular uptake of this prove was controlled by incubation temperature.
Key words: Bio-hybrid fluorescent probe, Poly-N-isopropylacrylamide (PNIPAAm)

1. はじめに
近年, 生体中の病変部位の確定を目的とする生体イメージング研究が精力的に行われている. このうち蛍光プロー
ブを用いた手法では, 細胞中で対象分子の時空間的挙動が高感度に観察可能であり, 病変細胞を検出することが期待できる. 我々は, 機能性蛍光高分子を基盤として, 温度やpH 変化を感知し, その蛍光強度が変化するバイオハイブリッド型蛍光プローブの研究を行っている. 正常とは異なる病態細胞内の pH, 温度を感知し, 選択的に発光させることで疾患の早期発見に繋がることが期待される.

CHCH2nSCH2CH2CO2H

CH2NH
H3C

CH

PNIPAAm

CH3Reversible

LCST; 32oC

2. 目的
Poly-N-isopropylacrylamide (PNIPAAm) は 外 部温 度刺激に応答し, 下限臨界溶解温度 (LCST; 32oC) を境に低温で親水性，高温で疎水性変化を起こし, 構造を可逆的かつ鋭敏に変化させる性質を有する (Fig. 1). 我々はこの高分子に pH 応答性などを有する蛍光団を導入して, 外部からのpH や温度刺激により蛍光強度が大きく変化する新規蛍光プローブの開発と, これを用いた細胞蛍光イメージング法への応用を目指した. この目的達成のため, 今回 4 種類のそれぞれ性質の異なる蛍光性高分子を開発した. さらに細胞膜透過性を高めるために膜融合性脂質を結合させたバイオハイブリッド型蛍光プローブを作製し, 細胞イメージン
グへの適用を検討した (Fig. 2).

< LCST
Water soluble> LCST
Water insoluble

Fig. 1. Temperature-responsive polymer; PNIPAAm.
我々は, NIPAAm と重合性官能基を有する 4 種の蛍光試薬,fluorescein o-acrylate (FL), 7-(4-trifluoromethyl)coumarinacrylamide (CO), methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodami
ne B (RH) 又は dansyl aminoethylacrylamide (DA)を用い，
NIPAAm と共重合させて P(NIPAAm-co-FL) (1)，P(NIPAAm-co-CO) (2)，P(NIPAAm-co-RH) (3)，P(NIPAAm-co-DA)(4) をそれぞれ合成した. これらの水溶液における温度及び pH 変化に伴う蛍光強度の測定を行い, 環境応答性を評価した (Fig. 3).

3. 実験
3-1. 蛍光性高分子
温度応答性ポリマー, PNIPAAm はモノマーである N-isopropylacrylamide (NIPAAm) をラジカル重合して得られる.

3-2. バイオハイブリッド型蛍光プローブ
蛍光性高分子の末端カルボキシ基を活性エステル化後,膜融合性脂質の phosphatidyl ethanolamine, dioleoyl (DOPE)を脱水縮合させ, バイオハイブリッド型蛍光プローブを作
O2-1-1製した. 更に RAW264.7 細胞を用いて細胞実験を行った.共焦点レーザー顕微鏡で観察し, 細胞膜透過能を評価した.
評価内容として, DOPE の有無によるプローブの細胞透過性の比較及び細胞培養温度の違いによるプローブの取り込み効率の検討を行った (Fig. 4).
Fluorescentmolecule

Ligand5. 今後の展望
今回, 蛍光性高分子の末端に膜透過性脂質 (DOPE) を修飾することにより, 細胞膜透過性が亢進することが確認された. 今後, DOPE を各種疾患細胞が発現するレセプター特異的なリガンドに変更することで, 標的細胞選択的な細胞イメージングを目指したいと考えている. また, 細胞培養温度を変えることで, LCST を境に蛍光プローブの細胞取り込みが制御可能であることが確認された. 開発した蛍光プローブは, 細胞導入の際, 従来からのマイクロインジェクション法等を用いることなく, 温度制御のみで導入できることが特長の一つである. 今後, この利点を活かし,蛍光性高分子に抗体等を結合させ, PNIPAAm による温度制御能と抗体によるターゲティング能を併せ持つ蛍光プローブの作製も行っていく予定である.

Target cell
Fluorescentimaging

PNIPAAm

BioBio-hybrid
fluorescent probe

Targetting

Temperature-,
pH-responsibility

Cell permeabilityFig. 2. Concept of bio-hybrid fluorescent probe
and cellular imaging.

4. 結果合成した蛍光性高分子 (1)～(4) はいずれも温度応答性を有し, LCST を 30oC 付近に有していた. このうち, (1)～(3) は低温側 (<LCST)―発蛍光, 高温側 (>LCST)―消光という性質を有し, (4) はこれらと逆の性質を有していた.
さらに(1) は FL 由来の pH 応答性も有していた [低 pH (<pH6.5)-弱発光, 高 pH (pH>6.5)-強発光]. これらの結果から,
温度, PH の両環境に応答する蛍光性高分子の開発に成功した. 元来, FL, CO 及び RH は極性溶媒中で強く蛍光を発し, DA はこれとは逆に低極性溶媒中で発光する性質を有することを考慮すると, これらの高分子の蛍光特性は, 共重合させた蛍光団の性質と, 温度制御により親水-疎水変化する高分子の性質の組合せに由来すると考えられた.
次いで, 蛍光性高分子 (2) と DOPE からなるバイオハイブリッド型蛍光プローブを作製し, その物理化学的性質を評価したが, 本プローブは, 蛍光性高分子 (2) の性質を維持していることを確認した (LCST を境に,低温側―発蛍光,高温側―消光). これを用いた細胞実験では, プローブ添加
後 5 h で細胞内にプローブ由来の蛍光が確認され, 細胞膜透過性が確認された. また, DOPE の有無による細胞取り込み効率を比較した. この結果, DOPE を有するプローブは,それを有さない蛍光性高分子より, 細胞取り込みが促進されることを確認した. さらに, 培養温度の違いによる, プローブの細胞取り込み効率を比較した. LCST より高温に設定して培養した場合, 低温で培養したものと比べて, 細胞取り込みが亢進していることが確認された. この結果
は, 高温培養時, プローブ中のポリマーは疎水性を示すため, 細胞膜との親和性が高くなったためと考えられる.

O
H3C

H3C

OOOO
CF3

(3) RHO

Et2N(4) DAO

NEt2

NMe2

= RHHO2CSNHOO

SO2-NH

77OOOOPOON CCH2CH2S CH2CH
CH2CHmn
HC OC ONHHNCH
H3C
CH36. 参考文献
H. Kobayashi, M. Nishikawa, C. Sakamoto, T. Nishio,
H. Kanazawa, T. Okano, Anal. Sci., 25 1043-1047 (2009).

HNOOFig. 4. Structure of bio-hybrid fluorescent probe.

(2) COHO7 OO

CF3O
HO CCH2CH2S CH2CH
CH2CH
mnC O
C ONH
FluorophoreCH
H3C
CH3(1) FL7HNFig. 3. Temperature- and pH-responsivefluorescent polymers.
O2-1-2O