不安定な分析対象物質
DG2020-46

第12回JBFシンポジウム（2021年3月）ではDGポスターの現地発表が出来なかったため、メールでご質問・ご意見をお寄せいただければDGにてメールベースで検討し回答するようにします（2022年3月まで）。ご質問・ご意見はメールでmak.niwa@po.nippon-shinyaku.co.jpにお願いします。

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum1

Japan Bioanalysis Forum

メンバーリスト
氏名

よみ

近藤 綾香

こんどう

あやか

塩野義製薬株式会社

澁谷

映美

しぶたに

えみ

キョーリンリメディオ株式会社

島田

英一

しまだ

えいいち

小野薬品工業株式会社

鶴田 敦

つるた

あつし

EAファーマ株式会社

西田 裕

にしだ

ひろし

グラクソ・スミスクライン株式会社

丹羽 誠

にわ

平田 沙綾

ひらた

さあや

日本新薬株式会社

藤野 直子

ふじの

なおこ

大鵬薬品工業株式会社

丸山 詩央

まるやま

八木 遼太郎 やぎ
吉松 宏倫

まこと

しお

りょうたろうよしまつ ひろみち

備考

日本新薬株式会社

田辺三菱製薬株式会社リーダー※

http://bioanalysisforum.jp/

所属

東レ株式会社
科研製薬株式会社※ご質問はメールでmak.niwa@po.nippon-shinyaku.co.jpにお願いします。
12th JBF Symposium, 2021

2

Japan Bioanalysis Forum背景– 安定化手法が出そろってきた。急速冷却、急速凍結、酵素阻害剤添加、pH調整、DBS、誘導体化、など。
– そろそろ、網羅的なまとめが欲しくなっている。

– 後発品についても（だからこそ）安定性の関心が高まっている。
– ICH-M10ドラフトで開発品の個別相談の位置づけが高まり、ベストプラクティス探求と個別案件の利害を切り離し可能になった。

http://bioanalysisforum.jp/• 血中で不安定な分析対象物質（薬物・代謝物を想定）について
最近の環境変化で議論する意義が高まってきた。

不安定な分析対象物質に対する、現在の安定化方
法を総合的に考察、ベストプラクティスを探求する。
12th JBF Symposium, 2021

3

Japan Bioanalysis Forum

スコープ・アプローチ• スコープ：規制下における、低分子薬物（代謝物）濃度測定（クロマトグラフィ法）。先発・後発医薬品とも。低分子、クロマ
トグラフィー法。
• アプローチ方法：① 公知情報を収集、整理することで現在までの技術動向をつかむ。
② JBFパートナーをエキスパートパネルとみなしてアンケート
実施、その調査結果を活用し、総合的に考察する。
12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/• 大きなテーマ：不安定な分析対象物質への対処について、ベ
ストプラクティス確立（提案）を目指す。

4

Japan Bioanalysis Forum

活動状況と今回報告内容

予備討議
（全体）

• 公知情報確認• 深堀する課題（重点課題）の抽出• マトリックス選択、溶血影響、安定化剤選択の3グ
ループに分離サブグループ• それぞれ公知情報追加調査・アンケート調査実施
検討

全体検討・
今回報告

• DG全体での検討、資料作成• 今回シンポジウム報告

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/• 2020年7月から活動→今回2021年3月報告

5Japan Bioanalysis Forum

公知情報の整理(instability×bioanalysis)
データベース検索結果 65
65
タイトル・要旨を検討
33
全文検討用 46
Review 8
Editorial 7
Original 7
重点課題*用追加 19
Review 2
Original 17* 次ページに説明

32

バイオアナリシスが主題でない
概要・概念のみの言及
分析対象でなく分析法の不安定さ「不安定性は認められなかった」の文言のヒット

13

メンバー他からの文献・情報持ち寄り

http://bioanalysisforum.jp/• ①文献データベースの検索– PubMed、Web of Science 使用• ②メンバー他からの情報提供による追加

19
検討に使用
12th JBF Symposium, 2021

6

Japan Bioanalysis Forum

重点課題の抽出– 1) 分析対象物質の不安定性のためにマトリック
ス選択に配慮することがあるか調査する。
– 2) 分析対象物質が溶血時に特に不安定となる場
合、その検出や対策への配慮をまとめる。
– 3) 安定化剤の1種であるエステラーゼ阻害剤の選択・使用方法について体系的にまとめる。

http://bioanalysisforum.jp/• 文献情報の整理後、DGで討議を行い、以下３つの重点検討テーマを設定した。

• それぞれ、追加の公知情報の取得、アンケー
ト調査を実施した。
12th JBF Symposium, 2021

7

Japan Bioanalysis Forum

検討・実行状況まとめ【重点項目】
1) 不安定性に関係したマトリックス選択への配慮
2) 溶血時に特に不安定となる場合の検出や対策
3) エステラーゼ阻害剤の選択・使用方法【アプローチ方法】重点項目ごとに
1)公知情報を収集、整理することで現在までの技術動向をつかむ。
2) JBFパートナーをエキスパートパネルとみなしてアンケート実施、その調査結果を活用し、総合的に考察する。

http://bioanalysisforum.jp/【目標】不安定な分析対象物質に対する、現在の安定化方
法を総合的に考察、ベストプラクティスを探求する。

【結論】重点項目ごとに推奨できる取り組みを設定（ポスター末尾の全体まとめ参照）
12th JBF Symposium, 20218

マトリックス選択

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

9

Japan Bioanalysis Forum

不安定な分析対象物質とマトリックス選択

安定性に配慮してマトリックスを選択することがあるのか？

①公知情報、メンバー経験からマトリックスが不安定な分析対象物質に及ぼすインパクトを考察。
②マトリックス選択に影響を与える要素も考察。
③JBFパートナーにアンケート実施し、Expert Opinion
を収集、更に考察。
12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

EDTA血漿で不安定（酸添加が無効）だが血清で安定であるとする文献があった（1件のみ）。

10

公知情報・DG内検討

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

11

Japan Bioanalysis Forum

マトリックスが不安定な分析対象物質に及ぼすインパクト

L Du, DG Musson, AQ Wang. J Pharm Biomed Anal . 2006 Nov 16;42(5):556-64.

文献中ではフィブリノーゲンが関係する可能性を考察● フィブリノーゲンは血漿中に2～6mg/mL存在し無視は出来ないが、その影響がありそうとの理由づけはメンバーではできなかった。
HJ Kim, MR Kim, EJ So, CW Kim. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 2007, 70, 619-625.

●「血清の方が血漿より安定な場合がある」というFindingを一般化できるか、メンバーで検討した。

http://bioanalysisforum.jp/● Vorinostat（右図）について
・EDTA血漿で不安定・酸添加が無効・血清で安定 であるとする文献があった。

血清の方が血漿より安定である経験はなかった。
アンケートでも確認する。
12th JBF Symposium, 2021

12

Japan Bioanalysis Forum

一般にマトリックス選択に影響を与える要素● 安定性について：・ 安定性からしても、基本的には冷やして血球から離したいので血漿を使いたい。
● 安定性以外の要素について：
・ 薬理試験とマトリックスを共用する場合、薬理試験に合わせる場合がある。
1) 抗凝固剤が炎症マーカー IL-1、IL-6、TNF-αに影響する
エンドトキシンで汚染したヘパリンは回避すべき。
P Riches et al., J Immunological Methods 1992. 153, 125-131.
2) 抗凝固剤が血清ホルモンに影響する[Arg8]-Vasopressin Peptide はEDTA血漿以外で不安定。冷却は重要。
MJ Evans et al., Clin Biochem 2001, 34, 107-112.
12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/● アンケートに反映するため、マトリックス選択に影響する要素をメンバーで
検討した。

13

アンケート調査

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

14

Japan Bioanalysis Forum

•

課題意識：

•

マトリックス選択時に、分析対象物質の安定性に配慮することがあるのか？（配慮したほうがいいのか？）– 血清の方が安定な事例があったため•

実際、どのマトリックスがどのような考え方で選ばれているのか？

• Webアンケート実施– 対象：JBFパートナー（n=48）– 時期：2020年10月29日～11月13日– 回答数21（回答率44%）

http://bioanalysisforum.jp/

マトリックス選択についてのアンケート15

http://bioanalysisforum.jp/

マトリックス選択（実績）
使用経験・血漿選択理由

Japan Bioanalysis Forum

その他 （血漿を選択した理由）
分析CROのため委託者指定(2名)。
血清に比べて多く回収できる。
扱いやすい(2名)。 調製が容易。
第一選択が血漿(3名)。 Discovery で血漿を使用し、特に問題がなければそのまま使用。
12th JBF Symposium, 202116

http://bioanalysisforum.jp/

マトリックス選択（実績）
血清・全血選択理由

Japan Bioanalysis Forum

その他（血清を選択した理由）
分析CROのため委託者指定(2名)。
市販測定キットで血清が推奨。
低分子では稀だが、血清を使用することもある。

その他 （全血を選択した理由）
委託者が全血での安定性の確認を指示
血漿（血液）中で不安定なため採血直後に安定化剤を添加・有機溶媒で失活処理(2名)

12th JBF Symposium, 202117

http://bioanalysisforum.jp/

マトリックス選択（実績）
血清・全血選択理由

Japan Bioanalysis Forum

あった（優先した理由）
データの蓄積があったため。

不具合でマトリックス変更（どのような不具合か）
保存安定性が取れない。
バックグラウンドノイズ。
血漿を調製する間にも分解が進む（全血に変更）。
12th JBF Symposium, 202118

その他（気づいたタイミング、きっかけ）
実試料（投与後試料）の再注入。
ベンチトップ安定性予備検討（遮光の有無）。
エステルなどは当初から構造でわかっている。

【マトリックス選択・実績 小括】●マトリックス選択：
・ プロジェクト・委託元で決まっている実態がある。
・ 血漿が基本という見解多い。
・ 血漿は調製の容易性・すぐ冷やせる・多く回収できる点が評価されている。
・ 全血は血球分配が高いときに 選択されている。採血直後に安定化剤を添加・直ちに失活処理する場合にも選択される。
●問題の検出・対処
・ 分析法の開発過程で気づくことが多い。

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

マトリックス選択（実績）
不安定性の認識時期・小括Japan Bioanalysis Forum

19その他 （マトリックス選択の考え方）
薬物の有効性、安全性を評価するために必要なマトリックスを選択している。
分析法開発や実施量測定で問題が懸念された場合、バーシャルバリデーションを実施し、適切なマトリックスを選択する（3名）。
経験上、血漿と血清の分析・測定で違いは出たことがないため、マトリックス選択のための比較検討は必要ないと考え、その他の事情で選択してもよいと考える。
採血後の処理や回収量の多さなどを考慮し、安定性に問題がない限り血漿を第一選択とする（2名）。
分析CROのため委託者指定。
12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

マトリックス選択（意見）
全体的な考え方Japan Bioanalysis Forum20http://bioanalysisforum.jp/

マトリックス選択（意見）
血漿を選択すべき理由

Japan Bioanalysis Forum

その他 （血漿を選択すべき理由）
ハンドリングの容易さ、回収量、凝固成分を含有していること、また、開発初期における不安定な
代謝物に対する情報の少なさと言った面から血漿を第一選択とすべきだと考える（10名）。
12th JBF Symposium, 2021

21

http://bioanalysisforum.jp/

マトリックス選択（意見）
血清を選択すべき理由

Japan Bioanalysis Forum

その他 （血清を選択すべき理由）
血漿で問題がある場合に選択（4名）。
測定対象により検討する。
臨床現場環境によっては血清の方がハンドリングが容易な場合がある。ただし、安定性・吸着性などへの考慮が必要。
12th JBF Symposium, 202122

http://bioanalysisforum.jp/

マトリックス選択（意見）
全血を選択すべき理由

Japan Bioanalysis Forum

その他 （全血を選択すべき理由）
安定化剤などの添加が必要な場合や、血漿分離時に分解してしまう化合物を扱う際に選択する（2名）。
クリアランスの議論では血流量との比較が必要となるため、全血中濃度基準のクリアランス算出が必要となる。全血-血漿（血清）中薬物濃度比の測定をせずに直接議論できる全血での測定の有用性もあると考える（2名）。
血球分配がある程度高くても、タンパク結合率と同様にPK/PDの補正解析は可能と考える。血漿／血清の方が正確な量をハンドリングしやすく、分析の知見も多いので、通常、血液を対象マトリックスにはしない。（社内には異なる意
見もある）
12th JBF Symposium, 202123

http://bioanalysisforum.jp/

マトリックス選択（意見）
安定性との関係

Japan Bioanalysis Forumある（安定性によるマトリックス選択の想定）
作業時間を含めて安定性を考慮し、マトリックス選択する場合。
ただし、安定化剤の添加や操作手順の工夫でマトリックス変ある（血清を優先使用する想定）
更を回避する場合もある（3名）。
分析結果に影響がある場合。
採血直後から冷却したい場合は血漿を選択する（2名）。
血漿に比べ血清の方がよりきれいであり、後の長期迅速に安定化剤を添加する必要がある場合、より安定なマト臨床試験の際に検体の取り扱い（液体ハンドリングロ
リックスを選択する。
ボット等）がより楽である場合があると思う。
血漿・血清処理段階で代謝が進んでしまう場合は全血を選択し、速やかに失活処理する。
12th JBF Symposium, 2021

24

マトリックス選択（意見）小括Japan Bioanalysis Forum●マトリックスごとの選択理由：
・ 1st choiceは血漿・ 血漿で不具合があったとき血清を検討することがある
・ 全血は血球移行性が高いときに考慮する●血清の優先可能性
・ 血漿優先・ PDのマトリックスを兼ねる時は血清も考慮される・ 安定性から血清を選択する考え（公知文献事例）を支持する意見はなかった

http://bioanalysisforum.jp/【マトリックス選択・意見 小括】●マトリックス選択と安定性
・ 安定性によって選択することはありうる
・ 冷却の必要性（血漿）、安定化剤添加に適しているか

12th JBF Symposium, 202125

その他（抗凝固剤使用実績）
クエン酸（ナトリウム）（4名）
フッ化ナトリウム（2名）

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

抗凝固剤選択（実績）
非臨床・使用実績

Japan Bioanalysis Forum26

その他（ヘパリンを選択した理由）
汎用性が高い委託者の指定添加量の少なさ
pHへの影響の低さ参考にした文献に倣った
特に懸念点が無ければヘパリンが一
般的

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

抗凝固剤選択（実績）
非臨床・ヘパリン選択理由

Japan Bioanalysis Forum27

その他 （EDTAを選択した理由）
ヘパリンはフィブリンが多いので避けた（3名）
文献情報などから採用（2名）
酵素阻害を期待他の測定項目との兼ね合い、委託者の指定臨床試験に合わせた12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

抗凝固剤選択（実績）
非臨床・EDTA選択理由

Japan Bioanalysis Forum28抗凝固剤選択（実績）
臨床・使用実績

その他（抗凝固剤使用実績）
クエン酸（ナトリウム）（6名）
ACD (クエン酸含有液)（1名）
フッ化ナトリウム（3名）

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

29

Japan Bioanalysis Forum

http://bioanalysisforum.jp/

抗凝固剤選択（実績）
臨床・ヘパリン/EDTA選択理由

その他
他に添加する安定剤との兼ね合いで決定
汎用性が高い、委託者の指定
非臨床と合わせた参考にした文献に倣った組織の習慣で使用していたが現在はEDTAに統一

その他
他の測定項目との兼ね合い、委託者の指定
海外CROで臨床試験を行う際EDTAが第一選択で使用されていたため参考にした文献に倣った

12th JBF Symposium, 2021

30

Japan Bioanalysis Forum

抗凝固剤選択（実績）
使用経験のある抗凝固剤【抗凝固剤・実績 小括】●非臨床の方が臨床よりやや
ヘパリン使用が多い。
●非臨床のヘパリンは使いやすさ（液体）が、EDTAはキレート効果が評価されている。

「ある」場合の事例
クエン酸（ナトリウム）（7名）、ACD（1名）、フッ化ナトリウ
ム（4名）：フッ化ナトリウムを代謝阻害剤として薬理試験にて血漿中のパラメータ測定のための採血にて使用されており、その血漿の一部を濃度測定試験に使用した
まれだが実績はあり（詳細な理由は不明）●各社で1st Choiceが決まっている印象。上手くいかないときに別のものにする。

http://bioanalysisforum.jp/●ヘパリンがややEDTAより多い。

●クエン酸、NaFも使用経験ありとの回答が多かった。

12th JBF Symposium, 202131

http://bioanalysisforum.jp/

抗凝固剤選択（意見）選択方法

Japan Bioanalysis Forum

その他
必要な場合はパーシャルバリデーションをして変更する。
海外などで用意できない場合もあった。ヘパリンNaを一般的に使用しているが塩も要注意。
12th JBF Symposium, 202132

http://bioanalysisforum.jp/

抗凝固剤選択（意見）ヘパリン/EDTA選択理由

Japan Bioanalysis Forum

その他
汎用性が高い（2名）
EDTAやクエン酸等が測定対象あるいは同時にモ
ニタする血液パラメータに影響する場合。（2名）

その他
ヘパリンでは測定対象あるいは同時にモニタする血液パラメー
タに影響する場合。（2名）
採血管の入手容易性．特に海外や臨床。（3名）
血漿のpHを考慮する必要がある場合。
EDTAは添加量を決める必要がある点に留意する。また、溶液での添加の場合は希釈も考慮する。

12th JBF Symposium, 2021

33

Japan Bioanalysis Forum

http://bioanalysisforum.jp/

抗凝固剤選択（意見）
抗凝固剤の種類/カウンターイオン

ある (使いたいものとその理由)
クエン酸等の酸による安定化（5名）
フッ化ナトリウム、化合物により選択安定性等，定量に影響する懸念がある場合（2名）
一般的な抗凝固剤の注意点，使用法を参考に使用．

意見がある (詳細)
EDTAのカウンターイオンにより血漿pHが変わる点に注意（2名）
イオン交換系の固相使用時などは緩衝液の作用具合がヘパリン血漿と異なる恐れがある．
代謝物としてアシルグルクロナイドがある場合にはpH低下効果のあるEDTA2Naを使用．

12th JBF Symposium, 202134

抗凝固剤選択（意見）
安定性への配慮/小括【抗凝固剤・意見 小括】● PDとの共用、プロジェクト内
一貫性は重要● pHへの配慮が必要（弱酸性が安定な場合等、カウンターイ
オンにも注意）● ヘパリン：使い勝手が良い、
キレート剤を避ける時に選ばれる● EDTA：キレート効果を期待、採血管の入手容易性で優れている

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forumある (想定事例)
EDTAのキレート効果による分析対象物質の安定化（3名）
pHのコントロールが必要な場合はヘパリンを推奨．
代謝物安定化のためクエン酸（粉末）を添加したく、これを満たす採血管の抗凝固剤がEDTAに限られた．
代謝物としてアシルグルクロナイドがある場合にはpH低下効果のあるEDTA2Naを使用．
12th JBF Symposium, 2021

35

マトリックス

血漿血清

総括のアイデア Pros / Consをまとめる
使用実績*
高
低
汎用性*

全血

極めて低

高（多くの回答でfirst choiceと 低（血漿で問題があった場合）

低（血球移行性高い、即時された）安定化剤や酵素失活処理を行いたい場合）

Pros

・回収量が多い・調製が容易・冷却可能・取り扱いが容易
・抗凝固剤EDTAが安定剤を兼ねる場合がある・データの蓄積がある
・血漿中濃度が一般的・血漿でPK/PD補正解析は可能・長期保存時はフィブリンがない
分、前処理装置の詰まりの面で有利と考えられる・臨床の現場とあわせる場合有用・キットなどで推奨される場合有用・回収量多い（血液そのもの）・冷却が可能・調製操作の必要がない
・即時の安定剤添加・失活
処理が可能
・血球分配を含んでの量的把握が可能
・体内動態は本当は全血基
準、その有用性はあるCons・極めて不安定な化合物の場
合、処理中にも分解してしまう・回収量が少ない
・調製に時間がかかる・冷却不可能・安定剤の使用は基本的に不可・取り扱いが難しい（粘度高）
・夾雑物が複雑

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート結果のまとめ
各マトリックスの利点・欠点

Japan Bioanalysis Forum* アンケート実施時に非臨床・臨床の区別はしなかった。
12th JBF Symposium, 2021

36

アンケート結果のまとめ
各抗凝固剤の利点・欠点

Japan Bioanalysis Forum

抗凝固剤

ヘパリン

EDTA

クエン酸

使用実績

高

高

低
（使用経験は多数）

汎用性

高

高

低

低

（非臨床）

（汎用性，慣習，参考文献）（委託者指定，慣習，他の測定との兼ね合い）

汎用性

高

高

低

低

（臨床）

（慣習）

（キレート効果の期待，入手
の容易さ）

Pros

・液体のため使いやすい・添加量が少ない
・pHの影響が低い
・キレート剤を避ける場合に使用

・キレート効果による安定性の向上
・酵素阻害効果・採血管手配の容易性
・pHの調整が可能（アシル
グルクロナイド等の安定
性）

・酸による
安定性の向
上

・代謝阻害
剤として使
用

Cons

・フィブリンの生成が多い
・脂質を増加させる
・高分子

・添加量，pHの考慮が必要（カウンターイオン）－－

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/（臨床／非臨床）NaF

37

Japan Bioanalysis Forum

マトリックス選択・総括
分析対象物質の不安定性と関係したマトリックス選択について、以下が推奨できる取り組みとして挙げられる。
分析対象物質の不安定性

不安定性が見られた場合分析法開発時の検討

不安定性の程度
を検討
安定化方法

推奨できる安定化方法検討の例
・・・カウンターイオン選択によるpH調整：
代謝物アシルグルクロナイドがある場合EDTA-2Na優先pH調整
・・・抗凝固剤としてクエン酸の使用を含む
マトリックスの再検討 ・・・全血で直ちに安定化剤添加・失活処理することを含む
EDTAの優先的使用

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

化学構造から推察（エステル等）・分析法開発時に検出することを考慮

38

溶血の影響http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

39

Japan Bioanalysis Forum【Bioanalysisに対する溶血の影響】【DGの疑問】①マトリックス効果①と②はよく議論されており公知情報も②血球移行性豊富であるが、③はどうなのか？

③分析対象物質の安定性

重点検討テーマ2
分析対象物質が溶血時に特に不安定となる場合、その検出や対策への配慮をまとめる

http://bioanalysisforum.jp/

経緯

公知情報の整理及びアンケートを行い、議論した
12th JBF Symposium, 2021

40

Japan Bioanalysis Forum

アンケート調査の実施
アンケートの実施

実施対象
JBFパートナー
アンケート内容(1) 安定性面から溶血に配慮されることがありうるか(2) 溶血による安定性影響の予見方法、評価方法は設定可能か

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

実施期間
2020年11月17日～2020年11月27日

41

Japan Bioanalysis Forum

溶血が原因となる分析対象物質の不安定性
溶血と安定性に関連した文献検索
該当文献数：11報(DG調べ)

2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)
11)

ER Bérubé, MP Taillon, M Furtado, F Garofolo. Bioanalysis. 2011;3(18):2097-2105.
ER Bérubé, MC Lacasse, M Furtado, F Garofolo. Bioanalysis. 2013;
5(12):1491-1499.
Z Miao, M Tan, E Wells, S Unger. Bioanalysis. 2019; 11(23):21332144.
S Summerfield, M Barfield, N Spooner, S White. Bioanalysis
2016; 8(24):2595-2604.
A Tan, S Gagné, IA Lévesque, S Lachance, N Boudreau, A Lévesque.
J Chromatgr B. 2012; 901:79-84.
LK Sørensen, JB Hasselstrøm. J Anal Toxicol. 2019; 43(6):482-488.
D Tang, E Thomas. Bioanalysis. 2012; 4(22):2715-2724.
J Zhao, Q Kan, J Wen, Y Li, Y Sheng, L Yang, et al. J Bioequiv Availab.
2012; 4(6):082-085.
Y Wang, Y Wang, Y Sun. Biomed Chromatogr. 2020; 34(1):e4696.
DS Fisher, SJ Partridge, SA Handley, RJ Flanagan. Forensic Sci Int
Genet. 2013; 229(1-3): 151-156.
D Goswami, A Saha, S Gurule, A Khuroo, T Monif, P Vats. J
Chromatgr B. 2012; 902:132-136.

http://bioanalysisforum.jp/

1)

Q2にて、「懸念を持ったことがある」の回答
者がいなかったため、Q3の結果を省略した。

該当する文献数が少なく、「懸念を持ったことはない」というアンケート結果と一致していた
12th JBF Symposium, 2021

42

Japan Bioanalysis Forum＜検討が必要＞ 3名• 血球中代謝酵素、血球成分との吸着/結合＜検討が不要＞ 13名• 経験なし、理論/根拠が不明 8名• 全血中安定性から推察できる 3名• 実サンプルでの結果から検出できる 2名• 溶血サンプルでの安定性結果の実サンプルへの外挿が困難 2名• 規制なし 2名

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

溶血時安定性を検討する必要性

43

Japan Bioanalysis Forum

溶血時安定性を検討する必要性
Q5 前問がYes（必要）の方は、検討が必要と考える理由を、No（不要）の方は、検討が不要と考える理由をご記載ください。（意見）Yes：検討が必要と考える理由• 溶血によるマトリックス成分の変化が安定性に影響する可能性はあるため。
• 血球成分などの影響がゼロとは言えないから• 血球移行性の高い化合物などは場合によっては必要と考える
Q4の回答はNoだが、Yes寄りの意見• 血球移行率が高い物質は要注意。また、比較的不安定な物質や吸着性の強い物質についても、マトリックスの状態が変化することによる影響の有無は否定できない。

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

全回答 18名＜検討が必要＞ 3名+1名(Yes寄りの意見)• 血球中代謝酵素、血球成分との吸着/結合44

Japan Bioanalysis Forum

溶血時安定性を検討する必要性

•
•
•
•
•
•
•
•

•

これまでに経験したことが無いことと、バリデーション試験の実施項目数が多くなりすぎるか
ら
国内の臨床試験の検体では、問題があると懸念される経験がないため。
影響のある事例は少ない
血球内の酵素が薬物代謝に影響するという知見を得ていないため．
明確に不要とまでは言いづらいが，懸念を持ったことがないため，必要とまでは言えないと考える。
通常血漿で安定で、溶血血漿で不安定となるという懸念がどのような科学的根拠に基づいているかわからないから。
これまでの各国ガイドラインで、特に推奨していなかったことと、溶血により化合物が不安定となる理論、根拠が乏しい。
溶血が安定性に影響するとの報告は極少数であり，仮に極端な溶血条件で安定性を評価しても実試料の測定値への影響を考察できない（実試料の溶血は多様なバリエーションがあり，また溶血の程度を試料毎にグレーディングすることは現実的に無理であることから，各試料の測定値にどのように影響しているか把握できない）。また，規制要件にもなっていない。
実試料の溶血度合いがそれぞれに異なるため

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

No：検討が不要と考える理由＜検討が不要＞ 13名• 経験なし、理論/根拠が不明 8名• 溶血サンプルでの安定性結果の実サンプルへの外挿が困難 2名• 規制なし 2名

45

Japan Bioanalysis Forum

溶血時安定性を検討する必要性

•
•
•
•

•

全血中の安定性評価から推定可能と考えられるため。
血液中での安定性に懸念のある化合物については，必要に応じて血液中安定性評価を実施するため。
候補化合物が絞られてくるまでに何度か血漿中濃度測定を実施する機会があり，試料の中には溶血しているものもあります。安定性に問題があれば，その段階で（問題）を検出できると考えており，その場合には検討が必要ですが，そうでなければ検討は不要と考えます。
必要に応じて確認が必要になる場面はあるかもしれませんが、そういう時にはISR（ISS）を利用することも考えられます。（ただし、当局の見解はわかりません）血球成分が薬物に影響するかどうかがポイントだと思いますが、常に（どの化合物/分析法でも）実施する必要はない
かと思います。溶血は主にマトリックス効果（イオン化）等に影響し，安定性への影響は限定的と考えているため．血液中安定性で推察できるのではと思います．また異常があれば、実サンプルの測定結果で判断できる可能性があると思います．溶血の定義があいまい．明ら
かに溶血した試料のデータは採用を検討するので不要．低分子対象のLC/MS/MS分析において，溶血が原因でanalyteが安定性に問題が出た経験がない．低分子で保存安定性で基準をクリアできない場合，その原因は化学的あるいは酵素的な分解・代謝や，容器への吸着である場合が多いと考えられ，特に溶血時にフォーカスした検討が必要とは思われない（通常の血漿中あるいは全血中安定性の確認し，必要な安定化策を採れば十分）
基本的には必要はないが、ケースバイケース。未変化体、構造既知の代謝物の構造により判断する
12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

No：検討が不要と考える理由 （続き）

＜検討が不要＞ 13名• 全血中安定性から推察できる 3名• 実サンプルでの結果から検出できる 2名

46

Japan Bioanalysis Forum

http://bioanalysisforum.jp/

溶血時安定性を検討する必要性

Q6にて、「いつも検討している」又は「検討したことがある」の回答者がいなかったため、Q7の結果を省略した。

Q8にて、「溶血で安定性が変化したと結論したことがある」の回答者がいなかったためQ9及びQ10の結果を省略した。
12th JBF Symposium, 2021

47

Japan Bioanalysis Forum

Q11の回答

Q12の回答Yes1：測定前に除外し バリデーション試験で溶血試料の精度・ている再現性が基準外になった場合には、濃度測定試験で溶血試料を測定していない。
実際に除外した経験はない。
Yes2：測定するが解析 溶血サンプル（血液を2%混ぜる）を比較から除外している
対象として、見た目の色で判断する。

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

溶血試料の測定及び解析における取り扱い

48

Japan Bioanalysis Forum

http://bioanalysisforum.jp/

分析対象物質の安定性又は血球移行性と溶血評価

Q13にて、「Yes:厳しくすることがある」の回答者がいなかったため、Q14の結果を省略した。

Q15にて、「Yes:厳しくすることがある」の回答者がいなかったため、Q16の結果を省略した。

12th JBF Symposium, 2021

49

Japan Bioanalysis Forum

全回答 22名• 血球移行が高い 6名• 血球中の代謝酵素で代謝 10名• 血球成分との吸着、結合 3名• 全血中で不安定 2名

血球移行が高い場合
血球中の代謝酵素で代謝される場合 （4名）
血球成分（血球由来の酵素を含む）と相互作用する場合
全血中で不安定な場合
血球移行率が高い場合。血球中に存在する酵素による代謝が懸念される場合 （2名）
血球中の成分により代謝を受ける，あるいは血球中の成分と結合するなど考えられる場合。
血球移行率が高い物質、吸着性が高い物質、不安定な物質
血球への移行が高い、血球成分で代謝、血球成分と特異的に結合する場合。「溶血時の安定性」というより、血液中の安定性に懸念があれば溶血時の安定性にも懸念を持つ
9. 血漿よりも全血での安定性が低い場合（すなわち、血球中の酵素で代謝される可能性が否定できない場合）
10. 溶血成分により代謝や分解といった影響を受けることが考えられる場合。
血球移行性が著しく高く，かつ血球中の代謝酵素で分解するような場合．一方だけでは安定性に懸念を持たない．
血球中の代謝酵素で代謝される場合は気になりますが，PK測定の前に知見が得られているかと思います．
Analyteが血球中酵素で代謝を受ける場合
11. 無回答 （8名）
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

溶血時安定性に対する懸念と化合物プロファイル

50

Japan Bioanalysis Forum

化合物

条件

原因

対策

Morphine1)

溶血血漿にて不安
定(pH10、65時間)

メトヘモグロビンによるフェノール基のラジカル
酸化分解

フェノール基のpKa未満のpHとする

Raloxifene1)

溶血血漿にて不安
定(pH10、65時間)

メトヘモグロビンによるフェノール基のラジカル
酸化分解

フェノール基のpKa未満のpHとする

Ndesethyloxybutynin2)

溶血血漿にて不安定(-20℃22時間)

ヘム触媒酸化-70℃保存又は抗酸化剤アスコルビン酸を添加する

Buprenorphine3)
Norbuprenorphine

凍結全血にて不安定(-20℃、20週間)

溶血成分による影響-80℃保存又は抗酸化剤アスコルビン酸を添加する

Artemisinin4)～1.4%溶血血漿にて不安定(室温、30分)

溶血血漿中の鉄による過酸化物架橋の切断

酸性条件でメトヘモグロ
ビン形成剤の亜硝酸ナトリウムを添加する

1)
2)
3)
4)

http://bioanalysisforum.jp/

溶血により不安定となる化合物(文献情報)

ER Bérubé, MC Lacasse, M Furtado, F Garofolo. Bioanalysis. 2013; 5(12):1491-1499.
Z Miao, M Tan, E Wells, S Unger. Bioanalysis. 2019; 11(23):2133-2144.
LK Sørensen, JB Hasselstrøm. J Anal Toxicol. 2019; 43(6):482-488.
Y Wang, Y Wang, Y Sun. Biomed Chromatogr. 2020; 34(1):e4696.

12th JBF Symposium, 2021

51

Japan Bioanalysis Forum

溶血時安定性の検討方法＜評価化合物を添加するタイミング 全8名＞
・血液に評価化合物を添加後に溶血させる。 2名
・溶血マトリクスを調整後に評価化合物を添加する。 5名
・溶血成分による安定性を確認するために評価化合物を添加するタイミングを変える。 1名＜溶血マトリックスの調製法 全7名＞
・血漿/血清に溶血血液を添加 5名
・マトリックスに血液を添加 2名＜溶血血液の調製法＞
1. 凍結融解 7名
2. シリンジでホモジナイズ 1名
3. ボルテックス 1名
4. 超音波破砕 1名

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

全22人 (内無回答7名)

52

Japan Bioanalysis Forum＜評価化合物を添加するタイミング 全8名＞
・血液に評価化合物を添加後に溶血させる。 2名
1. 血液に添加後に血液を凍結融解により溶血させる。
2. フレッシュな溶血のない血液を使用し（一部遠心分離して血漿から溶血の有無や程度を確認），
血液に化合物を添加した後溶血させる。溶血方法については何が適切か難しい。
・溶血マトリクスを調整後に評価化合物を添加する。 5名
1. 血漿に血液を添加して凍結融解により溶血血漿を調製後にスパイクして調製。
2. 一定割合の溶血マトリックスを作成後に標準品を添加する。血球をシリンジでホモジナイズさせた試料を血漿と一定量混和させ，そこに標準溶液を添加する。溶血血液を血漿に添加，そこに標準溶液を添加する。全血を凍結融解・超音波破砕などで最大限溶血させた試料中にanalyteを添加して安定性を評価し，明確な影響があるかを確認する（実施したことはない）
3. 血漿に溶血血液を2-5%添加したマトリックスにAnalyteを添加して安定性試料を調製し評価する。
4. 安定性のみに着目するのであれば，溶血させた血液に後添加でも問題無いように思います。溶血方法は，ボルテックスや凍結融解等いくつか考えられると思いますが，どの程度溶血させる必要があるのかによって，採用する方法は変わってくるかと思います。
5. 溶血試料と全血試料を区別して評価したい場合、血液を溶血させて、血漿にそれを添加してから薬物を添加する。
12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

溶血時安定性の検討方法

53Japan Bioanalysis Forum＜評価化合物を添加するタイミング 全8名＞(続き)・溶血成分による安定性を確認するために評価化合物を添加するタイミングを変える。 1名
1. 溶血成分による安定性を確認するためには、溶血した血漿に標品を添加する。血球移行による安定性を確認するためには，血液に添加後溶血させ、初期値との比較とする。
＜溶血マトリックスの調製法 全7名＞
・血漿/血清に溶血血液を添加 5名
1. 血液を凍結融解して溶血血液を調製し，血漿等のマトリックス（QC試料）に所定量（最大5%まで，
実際に経験する試料からすると2%で十分）添加する。経験的に凍結融解が完全に溶血させやすいと思う。
2. 凍結融解後の全血２％を血漿、もしくは血清に添加する。
3. 血液を凍結融解等で溶血させ、その一部を血漿に添加したものをマトリックスとして用いる。
4. 血漿に溶血血液を添加したものをマトリックスとする。
5. 2%の割合で溶血血液を血漿/血清に添加した試料でLLQ-QCを調製後、n=6で前処理。これを3バッチ行う。血漿/血清で調製したLLQ-QC結果と比較する。
・マトリックスに血液を添加 2名
1. 血液を一定量添加し、その割合をいくつか設定し、添加率による差の有無を確認する。
2. 現実的にはマトリックスに血液を添加後の状態を溶血マトリックスとする。
12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

溶血時安定性の検討方法

54

Japan Bioanalysis Forum

溶血による不安定性に関する評価の実例
溶血法及び不安定性の評価法

総説（EBFの推奨事項）1)

全血を複数回凍結融解させることを推奨

溶血血漿中におけるフェノール含有化合物の安定性2)3)

Freshな血液を凍結融解し、総血漿量の7.5%をブランク血漿に添加。その後、溶血血漿に低及び高QC濃度となるように分析物を添加。各QCレベルで溶血サンプルn=3と通常血漿サンプ
ルn=3で比較評価。

室温、凍結(-20, -50, -60, -70, -80℃)保存および凍結融解条件おけるNdesethyloxybutyninの溶血血漿中の安定性評価4)

血漿に全血をスパイクし、混和及び2時間以上の凍結により溶血血漿を作製。その後、N-desethyloxybutyninを添加混合後、評価。

血漿中の分析化合物(*)濃度に対する溶血の影響5)

Freshな全血に分析化合物を添加し、3分間最大出力でボルテックス。30分間氷上でインキュベート後、遠心分離により溶
血血漿(約2%、目視評価)を得る。その後、分析化合物の濃度を評価。

*Amlodipine, Budesonide, Capecitabine, Dodecyl
Maltoside, Fexofenadine, Fluticasone, Indapamide,
Methazolamide, Metoprolol
1)
2)
3)
4)
5)

http://bioanalysisforum.jp/

論文コンテンツ

Benno Ingelse, Begona Barroso, et al. Bioanalysis. 2014; 6(23), 3113-3120.
ER Bérubé, MC Lacasse, M Furtado, F Garofolo. Bioanalysis. 2013; 5(12):1491-1499
LK Sørensen, JB Hasselstrøm. J Anal Toxicol. 2019; 43(6):482-488.
Z Miao, M Tan, E Wells, S Unger. Bioanalysis. 2019; 11(23):2133-2144.
A Tan, S Gagne, I. A. Levesque, S Lachance, N Boudreau, A Levesque. J Chromatogr. B. 901 (2012) 79-84

55

Japan Bioanalysis Forum

留意点
・測定に用いるマトリックス
・Vivoを反映しているか

・血液の新鮮さ
・有機溶媒比率・平衡化時間・温度•••

血球移行の平衡化の影響を考えると測定は全血試料で行うことが良いのかもしれない。
血球移行、血球親和性の高い化合物は基本的に全血をもちいて定量を行っている
血球移行の平衡化が遅い化合物については，十分なインキュベーション時間を置いたり，血漿分離せずに全血で測定することがあります。

•

添加方法、血球移行の平衡化、評価時間は予備試験で検討しておくこと。評価試料中の有機溶媒比率を抑える（2%以下）．血球・血漿間で平衡に達するまでの時間を確保する．特別な留意点はなし．臨床試験で実際に採血して保存する流れに準じて評価．in vivo試験でのサンプリ
ング時に極力近い条件で評価すべき（血球移行性の評価結果；analyte濃度，時間，温度依存性なども考慮）．評価に事前採取あるいは購入した新鮮血を使う場合，完全に溶血を防ぐことは難しいが，それはPK/TK実測試料サンプリングにおいても同じことなので，少々の溶血込みの評価となることは問題ないと思う
12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

血液中安定性の評価方法に関する留意点

56

Japan Bioanalysis Forum

•
•

•

•
•
•
•
•

血球移行の平衡化は30分程度は必要
全血中で37℃における血球移行の平衡化時点の検討が必要，水分の蒸発に留意，酸素濃度，
pHなどvivoを反映した系であるかに留意，新鮮血の確保が大変．全血を凍結すると溶血するので避けられない．
温度をどうするか。実試料に近づけるならプレインキュベーションと薬物添加後の平衡化は37度、保存期間は室温もしくは氷冷。しかし、実際には温度の影響で平衡がくずれ、おかしなデー
タになることも多いので、プレインキュベーションから保存期間まで同じ温度にすることが多い。
血液の新鮮さも大事と思う。
有機溶媒の添加量はなるべく減らす。問題があればAnalyteを血漿に溶解し，Analyte含有血漿を全血に添加することで溶血を回避。平衡化はAnalyte次第。評価時間は医療機関での作業時間を想定して設定。
血球移行の平衡化時間、添加する有機溶媒量。
一定の方法を持ち、実施するのであれば統一した方法とすべき濃度の設定に注意。
無回答（9/22）
12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

血液中安定性の評価方法に関する留意点

57

Japan Bioanalysis Forum••

添加及び評価については、血漿と違いなく調製、処理しています。血球移行の平衡時間も考慮
していません。試料を調製する際に、有機溶媒を添加するため、血液中の安定性としては、その時点で血球の崩壊がある=溶血しているかは懸念点と思いますし、溶血中の評価になっている可能性もあると思います。但し、血球移行性が高い薬物の、血漿中薬物濃度を評価する際には、溶血自体を考慮する必要があるかと思いますが、血液中の薬物濃度評価であれば、血漿中の安定性が悪くない場合、溶血の安定性の評価は考慮しなくても良いように思います
血液中安定性を評価する際，血液と血漿の両面から安定性を評価しています。軽く溶血してしまうことは多々あり（凍結させた血液を血漿に2％添加した場合よりかなり薄くはありますが），完全に溶血を避けられているとは言い難いです。

http://bioanalysisforum.jp/

血液中安定性の評価方法に関する留意点

血液中安定性評価時に溶血は避けられない
12th JBF Symposium, 2021

58

Japan Bioanalysis Forum

全血中安定性で溶血時安定性をカバーできる理由
・安定性に影響する原因(血球成分)が同じため 3名・全血も一部溶血しているため 2名

全血中安定性で溶血時安定性をカバーできない理由
・マトリックスが異なるため 4名・異なる観察のため 2名・溶血度合いが異なるため 2名・評価項目(時間)が異なるため 1名

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

溶血時安定性と全血中安定性59

Japan Bioanalysis Forum

Q20の回答 Yes：カバーできる(全回答：8名)
•
•
•
•
•
•

全血中安定性で溶血時安定性をカバーできる理由
・安定性に影響する原因(血球成分)が同じため 3名・全血も一部溶血しているため 2名

全血でも実際には一部溶血しているのでカバーできる可能性がある。(2名)
全血中安定性実施の上、一時点の溶血の有無で評価を実施すればよい。(1名)
全血の成分と溶血の成分は（濃度は異なるが）基本的に同じだから。(1名)
溶血が安定性に影響する原因は血球由来成分と想定されるため、溶血で不安定ならば全血中でも不安定である可能性がある。(1名)
全血と溶血血漿で異なるケースがあれば知りたい。そこまで考慮して対応していない。不安定
な場合、よほどだと思うので阻害剤などで対応すると考える。(1名)
血球内成分と触れることになるので、代謝や分解を「ある程度は」評価できると考えられる。
低分子で保存安定性で基準をクリアできない場合、その原因は化学的あるいは酵素的な分解・代謝や、容器への吸着である場合が多いと考えられるため、「溶血時安定性を評価しない
限り不安定であることが顕在化しない」ということは考えにくい（血球中酵素で著しい代謝を受けるが、全く血球に移行しないような場合は気付かないが、そのようなケースはレアであろう）。
安定性に問題のあることが判明すれば、代謝酵素阻害剤や有機溶媒を添加する・すぐに凍結保存する・吸着しにくい容器を使用する等の対応策を採れるため、結果的に溶血中安定性を評価しなくても実害はないのではないか。(1名)
12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

溶血時安定性と全血中安定性60

Japan Bioanalysis Forum

Q20の回答 No：カバーできない(全回答：14名)

•
•
•
•

•

•
•
•

全血中安定性で溶血時安定性をカバーできない理由
・マトリックスが異なるため 4名・異なる観察のため 2名・溶血度合いが異なるため 2名・評価項目(時間)が異なるため 1名

マトリックスの状態が異なるので、必ずしもカバーできるとは限らない。(4名)異なる観察のためカバーできない。(2名)必要とされる溶血の度合いが，必ずしも全血評価時と同じとは限らないから。(1名)
実験条件としてコントロールされていない（溶血の程度が”成り行き”である）ため，実際の影響が判断できない。(1名)
実試験においてサンプルがどの状態にあるかを想定して安定性を確認するので、もし実施す
るなら、それぞれ別物として扱うことが望ましい。分解の生じるコンパートメント数やコンパート
メント内の代謝酵素濃度が変わるため、一方の結果から他方の結果を推察することはできない。(1名)
全血中安定性と溶血時安定性では評価項目に違いがあるので、全てをカバーできない。(1名)
Q19でご説明したように、血漿に対して凍結血液を2%添加したものよりも薄い状況ではあるので、溶血の程度としては軽い。十分にカバーできているとは言い難いのではないか。(1名)
血液（血球）中の安定性と溶血時安定性は異なるかもしれない（検討したことが無いので判断できない）。(1名)
12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

溶血時安定性と全血中安定性61

Japan Bioanalysis Forum

Q20の回答 No：カバーできない(全回答：14名) (続き)
• 安定ときは溶血の影響はないと考えられるが、不安定なときに溶血の影響で不安定であることが判断が出来ない。(1名)• 全血中安定性と血漿の保存安定性は評価する時間が異なるから（全血安定性は数時間、血漿の保存安定性は数日以上）。(1名)

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

溶血時安定性と全血中安定性62

Japan Bioanalysis Forum

アンケートのまとめ
分析対象物質の安定性に対する溶血の影響
溶血時安定性を検討する必要性✓検討不要✓血球成分の影響を受ける場合に懸念あり✓全血中安定性から一部推察できる可能性あり

http://bioanalysisforum.jp/✓経験なし

溶血時安定性について積極的な検討の必要性を感じていない。
12th JBF Symposium, 2021

63

Japan Bioanalysis Forum

公知情報のまとめ
溶血の影響事例化合物✓フェノール基を有する化合物✓第1級アミン、第2級アミンを有する化合物

原因✓メトヘモグロビンなどの血球成分による酸化✓血球代謝酵素による分解✓ヘム鉄による分解

http://bioanalysisforum.jp/✓文献数11報✓ほとんど影響する事例はない

安定化方法✓安定化剤の添加(抗酸化剤など)✓-70℃以下での保存
12th JBF Symposium, 2021

64

Japan Bioanalysis Forum

溶血・総括

評価対象物は...
全血中で不安定な化合物である
溶血による不安定性を懸念する化合物である
例)フェノール基、第1級アミン、第2級アミン、過酸化物を含む化合物

No

検討不要

Yes
溶血時安定性を検討する
1. 血液の凍結融解を繰り返し完全に溶血させる
2. 溶血成分が2%になるよう血漿/血清で希釈する
3. 評価対象物を溶血マトリックスに添加する(溶血QC試料)
4. 血漿/血清試料の長期保存安定性と同条件にて、溶血QC試料を保存し評価する判断基準：溶血QC試料における平均濃度が理論値±15%以内

Yes

No

溶血時においても安定である

安定化方法を検討する
例) -70℃以下で保存and/or安定化剤を添加
12th JBF Symposium, 2021

全血中安定性の結果から対策をとる
場合

http://bioanalysisforum.jp/

溶血が原因となる安定性の問題を生じる頻度は低いとされており確認は必須ではないと考えられるが、必要に応じて配慮することが望ましい。
溶血による分析対象物質の不安定性に対して、推奨できる取り組みを以下に示す。

65

エステラーゼ阻害剤

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum66

Japan Bioanalysis Forum

血漿などの生体試料中には各種エステラーゼ酵素が存在し、エステル結合などを有する化合物によっては、生体試料中で分解してしまい、バイオアナリシスに影響を及ぼす。その対応策の一つとしてエステラーゼ阻害剤を安定化剤として添加する方法がある。
しかし、エステラーゼ阻害剤の使用に関して体系的にまとめられたものは少ない。そこで、論文等の公知情報やアンケート調査により各社の公開可能な情報をまとめ、エステラーゼ阻害剤の使用に関して総合的にまとめる。
酵素による加水分解

http://bioanalysisforum.jp/

背景及び目的エステラーゼ阻害剤の選択/使用は？

12th JBF Symposium, 2021

67

Japan Bioanalysis Forum• 阻害剤の種類• 選定方法• 使用方法• 問題点• 阻害剤の検討を考慮する時期

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

エステラーゼ阻害剤に関する議論の内容

68

公知情報

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum69

Japan Bioanalysis Forum

各種エステラーゼ阻害剤について
ホスホ
アセチルコ カルボキ ヒトブチリ ヒト血液ア
セリンヒド セリンエス
非特異的 ジエステ ロラーゼ テラーゼ リンエステ シエステ ルコリンエ リルエステ
ラーゼ
ラーゼ
ラーゼ ステラーゼ ラーゼ

ジクロロボス
パラオクソン

〇
〇

NaF

〇

〇

〇

〇

不明

〇

〇

〇

〇

〇

〇

〇

〇

〇

〇

不明

アセチルコリン〇

不明

eserine

〇

不明

TTFA

ethopropazine

〇

〇

PMSF
BNPP

〇

不明

12th JBF Symposium, 2021

〇

不明

〇

〇

http://bioanalysisforum.jp/

〇

DFP

〇

70

Japan Bioanalysis Forum

エステラーゼ阻害剤の主な使用方法
臨床測定での使用例

阻害剤
選定

DFP、PMSF、Paraoxon、Eserine：ヒト血液（抗凝固剤：ヘパリン）で各10mMとなるよう調製し、化合物を添加後4時間室温で放置。
化合物の残存率の結果より、安定剤としてDFPを選択。

対象種

ヒト血漿及び血液方法

20 mMのDFPとなるように市販の6 mL容K2EDTA（固形形体）含有真空
採血管に注射器でDFPを21 μL注入し、-30˚Cで使用時まで保管。使用時は30分以上室温に戻した後、使用。注入したDFPは3ヵ月間安定。
（なお、K3EDTAでは水系を含むためDFPの安定性に懸念。）
約6mLの血液を採取し、氷上で1時間放置後、4˚C、1000 gで15分間遠心し、血漿を分離。
DFPにより血漿蛋白変性やマトリックス効果に影響があったため、0.1
N塩酸とmethyl-tert-butyl etherを添加し、液液抽出し、有機層を分離することでDFPの影響を軽減。

http://bioanalysisforum.jp/

ヒト全血中での半減期が54分の化合物

Zeng J, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007 Jun 1;852(1-2):77-84.
12th JBF Symposium, 2021

71

Japan Bioanalysis Forum

エステラーゼ阻害剤の主な使用方法
ヒト測定に向けた検討例
NaF：水に溶解させ1、0.1、0.01 Mを調製
阻害剤
選定

PMSF、Dichlorvos、Eserine、Paraoxon：
DMSOに溶解させ1、0.1、0.01 Mを調製

上記各溶液でのヒト血漿中での安定性検討及び使用上の安全性の観点からNaFを選択。
対象種

ヒト血漿及び血液方法

K2EDTA処理したチューブに1 μLの1 MのNaF溶液と2 μLの2.5 Mのクエン酸を添加し、そこへ氷上で0.1 mLの血液を採取（NaFの終濃度10mM、pH弱酸性）。4˚C、4000 rpmで10分間遠心し、血漿を分離。
-80˚Cで1ヵ月、4˚Cで4時間まで安定であることを確認。

http://bioanalysisforum.jp/

ラット血漿で4˚C、4時間後に1.5%未満しか残存しない化合物

Tai T, J Pharm Biomed Anal. 2020 Feb 179:112955.
12th JBF Symposium, 2021

72

Japan Bioanalysis Forum

エステラーゼ阻害剤の主な使用方法
非臨床測定での使用例

阻害剤

Dichlorvos

対象種

ラット血液

方法

Dichlorvosを生理食塩液に溶解させ8 mg/mLのDichlorvos溶液を調製。
ヘパリン処理したチューブに2.5 μLのDichlorvos溶液を添加し、そこへ
室温で0.1 mLの血液を採取［Dichlorvos終濃度0.2 mg/mL（約1 mM）］。
6000 rpmで5分間遠心し、血漿を分離。
-80˚Cで2週間まで安定であることを確認。

http://bioanalysisforum.jp/

ラット血漿中での半減期が10分のエステルプロドラッグ

Chang Q, Biomed Chromatogr. 2009 Aug;23(8):852-7.

12th JBF Symposium, 2021

73

Japan Bioanalysis Forum

エステラーゼ阻害剤の主な使用方法

ウサギ血漿中で室温1時間後に4%未満しか残存しない
エステル含有添加剤
阻害剤

DFP

対象種

ウサギ血液

方法

DFPをヘパリンNa注射液に1vol%添加したDFP溶液を調製。
採血チューブに予めDFP溶液を採血量に対して約2vol%添加し、そこへ氷上で血液を採取（DFP終濃度約1 mM）。4˚C、4000 rpmで10分間遠心し、血漿を分離。
-20˚Cで3週間、氷上で7時間まで安定であることを確認。

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

非臨床測定での使用例

74

Japan Bioanalysis Forum

エステラーゼ阻害剤の主な使用方法
探索スクリーニングでの阻害剤選定例
ラット全血中での半減期が5分未満のエステルプロドラッグ

PMSF：DMSOに溶解させ1 Mを調製
阻害剤

Paraoxon、Ach：DMSOに溶解させ0.5 Mを調製
BNPP、Eserine：DMSOに溶解させ0.2 Mを調製
NaF：水に溶解させ1 Mを調製
上記各ストック溶液をイソプロパノールで希釈し各0.01、0.1 Mを調製

対象種

ラット、ヒト血漿及び血液方法

各血漿、血液に各阻害剤を終濃度0.1、1、10 mMとなるよう添加。
有効であった阻害剤を数種選択。
保管温度とpH［無処置とpH5に調整（1 Mクエン酸水溶液を終濃度20mMとなるように添加）］について検討し、条件を最適化。

http://bioanalysisforum.jp/

DFP、Dichlorvos：イソプロパノールに溶解させ1 Mを調製

10 mMのDFP、Dichlorvos、Paraoxonでのラット全血（pH5）の溶血の程度はnot excessive
Fung EN, Bioanalysis. 2010 Apr;2(4):733-43.
12th JBF Symposium, 2021

75

Japan Bioanalysis Forum

エステラーゼ阻害剤の使用方法
マトリックス中濃度（mM）
DFP

論文② 論文③ 論文④ 論文⑤ 論文① 論文② 論文④

0.1~10→×

Dichlorvos

20

20

1～5

10

Paraoxon

0.1~10→×

PMSF

0.1

10

BNPP

0.1~1

10

NaF

0.1~1010アセチルコリン0.1~10エゼリン

0.1~10

1～5

4
5

10

20

1～5

10

20

1～5

5

1/5

1～5

5

10 / 100

1～5

5

http://bioanalysisforum.jp/

論文①

添加量（%）

4
4

1～5
10

TTFA

10

EDTA・２Na

10

NaFとBNPP混合

5&5

20

1～5

20

4

4
20

①Effective screening approach to select esterase inhibitors used for stabilizing ester-containing prodrug analyzed by LC-MS/MS②Stabilization of zeylenone in rat plasma by the presence of esterase inhibitors and its LC-MS/MS assay for pharmacokinetic study③Simultaneous determination of a selective adenosine 2A agonist, BMS-068645,
and its acid metabolite in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry-evaluation of the esterase inhibitor,diisopropyl fluorophosphate,in the stabilization of a labile ester-containing drug
④Esterase inhibitors as ester-containing drug stabilizers and their hydrolytic products : potential contributors to the matrix effects on bioanalysis by liquid chromatography/tandem mass spectrometry⑤Improving the ex vivo stability of drug ester compounds in rat and dog serum : inhibition of the specific esterase and implications on their identity
12th JBF Symposium, 2021

×：論文事例で無効だったことを示す

76

Japan Bioanalysis Forum

エステラーゼ阻害剤の使用方法
論文②

DFP

DMSO

Dichlorvos

DMSO

Paraoxon

DMSO

PMSF

DMSO

alcohol

BNPP

DMSO

water

NaF

DMSO

water

アセチルコリン

DMSO

エゼリン

DMSO

補足情報
論文④
stock solution
0.5M in IPA

water

0.5M in DMSO

DMSO

0.5M in EtOH

DMSO

0.5M in DMSO

論文④

water

TTFA

alcohol

EDTA・２Na

water

NaFとBNPP混合

water～70%enhancement～10%suppression

http://bioanalysisforum.jp/

論文①

溶媒
論文③
（ヒト）
water

1.0M in DMSO

12th JBF Symposium, 2021

77

Japan Bioanalysis Forum

DFP
法規制
(国内)
入手のし
易さ
(国内)
危険性
(GHS分
類)

Dichlorvos Paraoxon

PMSF

BNPP

NaF

Acetylcholi
neEserine

消防法

非該当

非該当

非該当

非該当

非該当

非該当

非該当

情報なし

毒劇法

非該当

劇物

非該当

非該当

非該当

非該当

非該当

非該当

市販品と
して購入

購入可能

購入可能

購入可能

購入可能

購入可能

購入可能

購入可能

購入可能

採血管の
販売

なし

なし

なし

なし

なし

あり

なし

なし

急性毒性
(経口/
経皮)

区分1
/区分2

区分2/
区分2

区分1/
区分1

区分3/
非該当

区分2/
非該当

区分3/
非該当

非該当

区分2

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

臨床施設における扱い易さ

78アンケート調査

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum79

Japan Bioanalysis Forum

所属組織について

割合

6.3
12.5
内資新薬メーカー
外資新薬メーカー

81.3

内資CRO

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Q：ご所属されている組織の業態に関して（16社回答）

80

Japan Bioanalysis Forum

使用経験のある阻害剤について（非臨床/臨床）
Q：使用経験のある阻害剤について以下の選択肢から複数選択(非臨床)（16社回答）

50%
40%
30%
20%

非臨床

10%

臨床

0%

http://bioanalysisforum.jp/

使用経験のある阻害剤について

この回答のうち，非臨床，臨床共に使用経験が最も多い阻害剤は，NaFであった．
その他として，市販の阻害剤カクテル等が挙がっていた．
12th JBF Symposium, 2021

81

Japan Bioanalysis Forum阻害剤としての最終濃度ついて（非臨床/臨床）
Q：最も使用経験のある阻害剤について、阻害剤としての最終濃度（非臨床/臨床）（回答は一つ）。 （15社回答）
45%
40%
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%

非臨床
臨床

http://bioanalysisforum.jp/

阻害剤としての最終濃度

12th JBF Symposium, 2020
1～20mMが阻害剤の最終濃度として多い傾向にあった．

12th JBF Symposium, 2021

82

Japan Bioanalysis Forum

添加溶媒ついて（非臨床/臨床）
Q：最も使用経験のある阻害剤について、最も頻度の高い添加溶媒（非臨床/臨床）（回答は一つ）。 （16社回答）

45%
40%
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%

非臨床
臨床

http://bioanalysisforum.jp/

最も頻度の高い添加溶媒

添加溶媒について，水が多い傾向にあった．

12th JBF Symposium, 2021

83

Japan Bioanalysis Forum

添加溶媒の最終添加量について

実施経験ありと回答中選択された項目(非臨床11社、臨床4社)
臨床

5%以上

非臨床
2～4%

1%

1%未満

風乾による
除去を含む

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

http://bioanalysisforum.jp/

Q：添加溶媒を添加する際の最終添加量ついて以下の選択肢から選択して下さい。（非臨床は16社、臨床は15社回答）

50.0

非臨床の使用においては1%、臨床においては1%未満での使用実績が最も多かった。
最終添加量は1%以下としている施設が多い結果であるが、5%以上での使用実績もあることから、添加溶媒種により許容性が異なると思われる。
12th JBF Symposium, 2021

84

Japan Bioanalysis Forum

適用経験のあるマトリックスについて
Q：最も使用経験のある阻害剤で適用経験のあるマトリックス
ついて以下の選択肢から選択して下さい。（非臨床は21社、臨床は15社回答）
臨床

CSF

非臨床
尿

血清
血漿
血液
0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

http://bioanalysisforum.jp/

その他

非臨床、臨床共に、血漿、血液への適用経験が大部分であり、エステラーゼによる分解が課題となるマトリックスは血漿がメインであることが改めて確認された。但し、非臨床において、尿やCSFへの適応例も確認されている。
12th JBF Symposium, 2021

85

Japan Bioanalysis Forum

阻害剤の選定について
Q：阻害剤を選定する際の第一選択の基準について以下の選択肢から優先順位を付けて選択して下さい。（12社回答）

社内での実績

17%33%

構造式から判断
取り扱い易さ

25%
8%

17%

複数種から適切な阻害剤を選択http://bioanalysisforum.jp/

選択された項目

優先順位が1番であった項目

その他

阻害剤選定の第一選択は社内での使用実績や構造式を優先して判断する施設が半数であった。一方、複数種から選択することを選択された回答が多く、第一選択の阻害剤に拘らず、同時に複数種から適切な阻害剤を選択する考えも多かった。
12th JBF Symposium, 2021

86

Japan Bioanalysis Forum

検討する阻害剤の数について
Q：検討する阻害剤の数について選択してください。（15社回答）

0%18%

特定の1種で固定
2～4種の中から選定

82%

5種以上の中から選定

http://bioanalysisforum.jp/

実施経験ありと回答中選択された項目(11社回答)検討する阻害剤の数は、2～4種との回答が8割以上であった。

12th JBF Symposium, 2021

87

Japan Bioanalysis Forum

阻害剤の許容終濃度について

0%0.1mMまで

11%

1mMまで
5mMまで

22%

10mMまで

56%

20mMまで

11%

0%
0%

50mM
特に定めていない

http://bioanalysisforum.jp/

Q：阻害剤選定を検討する際の阻害剤の許容終濃度について選択してください。（12社回答）
実施経験ありと回答中選択された項目(9社回答)

許容終濃度は半数以上の施設において特に定められていなかった。許容濃度を設定している施設では5mMまでとの回答が多かった。
12th JBF Symposium, 2021

88

Japan Bioanalysis Forum

安定性評価の検討項目について
Q：阻害剤選定時における室温での安定性評価時間に関して（15社回答）

実施経験あり12社回答中
16%

1時間

4時間
8時間

17%

24時間

0%
50%

http://bioanalysisforum.jp/

17%

自由記載
 室温で安定性が得られない場合は氷上も考慮する。4時間程度の安定性が確保できないと実用的ではない。
 非臨床ではすぐ氷冷可能なため、未評価とする可能性あり。臨床では少なくとも1時間は必要と考えられる。

室温では不安定のため評価不可室温での評価時間としては、分析操作過程において実用的となる4時間を目安とするのが一番多く、担保できない場合は室温以外での方法を検討するという施設が多かった。
12th JBF Symposium, 2021

89

Japan Bioanalysis Forum

安定性評価の検討項目について
Q：阻害剤添加しても室温で不安定であった場合の追加検討項目について以下の選択肢から優先順位を付けて選択（14社回答）
実施経験あり11社回答中優先順位が1番であった項目

18%
0%

73%

-80℃付近での
超低温保存-20℃付近での
冷凍保存
4℃付近（氷上）での保存pHの最適化
前記以外の対応

http://bioanalysisforum.jp/

9% 0%

実施経験あり11社回答中選択された項目-80℃付近での超低温
保存-20℃付近での冷凍保存4℃付近（氷上）での保存

pHの最適化
前記以外の対応
0% 20% 40% 60% 80% 100%

選択した会社/11社中まずは分析操作において安定性に問題なく測定できるかを確認する目的で優先順位的に高い項目としては4℃付近（氷上）での検討が多かった。また、半数程度の施設においてpHの最適化検討も実施している傾向にあった。
12th JBF Symposium, 2021

90

Japan Bioanalysis Forum

阻害剤選定時に評価する選定項目について
Q：阻害剤選定において、安定性効果以外で評価する選定項目について以下の選択肢
から複数選択。（15社回答）
非臨床試験時
実施経験あり12社回答中

http://bioanalysisforum.jp/

臨床試験時実施経験あり8社回答中

分析系への影響

非臨床
臨床

溶血性
安全性
入手のし易さ使用時のハンドリング
コスト
安定性以外なし
0%

20%

40%

60%

80%

100%

非臨床、臨床試験共に選定項目の評価として「分析系への影響」「使用時のハンドリング」が多く、「安全性」「溶血性」も選定評価項目に取り入れている施設は多い傾向にあった。
12th JBF Symposium, 2021

91

Japan Bioanalysis Forum阻害剤使用時に直面した問題点について
Q：阻害剤の使用で、安定性以外に直面する頻度が高い問題について以下の選択肢から複数選択。（14社回答）

Q：阻害剤使用時における臨床測定での弊害について。（15社回答）

実施経験あり11社回答中

回答自体を避ける
経験あり

分析系への影響
0%20% 40% 60% 80% 100%

経験ありにおける記載コメント

溶血性使用時のハンドリング

問題に遭遇した経験がない
0% 20% 40% 60% 80% 100%

 使用時のハンドリング。
 臨床施設で使用が許可されない。特別な対応が必要など。
 クエン酸とNaFが入った注射筒がアメリカで入手しにくい。

http://bioanalysisforum.jp/

特になし

直面した問題点については阻害剤選定時の選定項目評価と同様に「分析系への影響」「使用時のハンドリング」が多く、臨床使用時の弊害としても使用に際してのハンドリング
が挙げられている状況にあった。
12th JBF Symposium, 2021

92

Japan Bioanalysis Forum

阻害剤の使用を検討する時期について
Q：プロドラッグ以外で阻害剤の使用を検討する時期について以下の選択肢から優先順位を付けて選択（14社回答）
実施経験あり11社回答中優先順位が1番であった項目
18%

73%

構造で懸念がある時構造で懸念がある時

In vitro探索段階評価で懸念があった時（血漿タンパク結合評
価など）
In vivo評価で懸念があった時

http://bioanalysisforum.jp/

9%0%

実施経験あり11社回答中選択された項目In vitro探索段階評価で懸念があった時（血漿タンパク結合評価など）
In vivo評価で懸念があった
時

バリデーション検討時の安定性 バリデーション検討時の安定性で懸念があった時で懸念があった時

0% 20% 40% 60% 80% 100%

選択した会社/11社中阻害剤の使用を検討する時期については、in vitro探索段階評価で懸念があった時が多く、基本的には不安定性の懸念が確認された段階で検討するという施設が多かった。
12th JBF Symposium, 2021

93

Japan Bioanalysis Forum

エステラーゼ阻害剤のまとめ
1. 探索段階での評価（in vitroなど）で懸念があった時2. 構造で懸念がある時
不安定性の懸念が確認された段階で検討

候補
阻害剤

選定
項目

NaF

Dichlorvos

DFP

PMSF

AEBSF

BNPP

EserineParaoxon

PPACK II
1.
2.
3.
4.

安定性効果
分析系への影響
使用時のハンドリング
添加時の溶血性、使用時の安全性

http://bioanalysisforum.jp/

使用
検討
時期

臨床試験時での使用では阻害剤によっては
 臨床施設で使用が許可されない。特別な対応が必要。
 国によっては入手し難いこともある。

94

Japan Bioanalysis Forum

阻害剤の選定/使用方法のまとめ

20 mM付近まで（文献/アンケート結果で多かった最大濃度）
許容 ［10 mMのDFP、Dichlorvos、Paraoxonでの溶血の程度はnot
終濃度 excessive（文献情報）］

添加
溶媒

NaFなど該当阻害剤が水に溶解する場合は水が多いが、困難な場合、有機溶媒（MeCN、DMSOなど）も使用。最終添加量としては、1%程度が多い傾向。粉末の場合、使用せず。

1.
安定性 2.
評価 3.

http://bioanalysisforum.jp/

第一選択• 複数種の使用実績のある候補阻害剤を選択• 対象化合物の構造から候補阻害剤を選択
2～4種の阻害剤を選択し、選定評価

室温又は氷上での安定性（概ね4時間を目安）評価
1.で不安定であった場合、pH調整（弱酸性等）も実施
各選定項目に対して許容できるか判断し阻害剤を選定
95

Japan Bioanalysis Forum

不安定な分析対象物質・全体まとめ– 溶血影響：積極的に検討する必要性は乏しく、化学構造（血球成分による酸化・分解）や実験的に全血中安定性に懸念があった場合に検討することが適切– エステラーゼ阻害剤：不安定性の懸念が確認された段階で、化合物の構造から適切な阻害剤を複数選定、実績のある条件で実験的に検討し阻害剤選択することが適切• 実務では、詳細な技術的留意点（各サブパートに記載）に沿って配慮・検討することが望まれる。

http://bioanalysisforum.jp/• 公知情報調査、JBFパートナーに対するアンケートから得た使用実態、必要性調査の結果から、以下の結論を得た。
– マトリックス選択：血漿を第一選択とすることが適切（EDTA血漿がより推奨される）• 今後、DG2020-46の調査・議論活動は終了し、成果物作成（論文化）に進む予定。
12th JBF Symposium, 2021

96