Japan Bioanalysis Forum

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DG2017-28

9th JBF Symposium

1Japan Bioanalysis Forum

DG2017-28 メンバー
石井 琢帆（サンプラネット）

保坂 信哉（科研製薬）

小野 敬太（大鵬薬品）

真弓 剛（全星薬品工業）

Keita Ono

Tsuyoshi Mayumi

栗山 早織（日本新薬）

安田 穣（TRC）

Saori Kuriyama

Yutaka Yasuda

中井 直子（第一三共）

山川 達也（富士フィルム）

Naoko Nakai

Tatsuya Yamakawa

Shinya Hosaka

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Takuho Ishii

丹羽 誠（日本化薬）
Makoto Niwa

9th JBF Symposium, 20182

背景と取り組みの意義

9th JBF Symposium, 2018

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Japan Bioanalysis Forum

3

Japan Bioanalysis Forum• 生体試料中薬物濃度分析法のバリデーション[a-c]において一般に精度15%以内（LLOQにおいて20%以内）、真度85%から115%（LLOQにおいて80%から120%）という基準（クロマトグラフィー法の場合）が設けられているがその設定根拠まではガイドライン・ガイダンス等に明示されていない。
• 本邦のガイドライン[a]で柔軟な対応を考慮することが示されており特別な分析方法を用いる場合や得られた濃度情報の使用目的により真度及び精度の基準を再考することが含まれると考えられるが、判断基準の設定方法についてコンセン
サスには至っていない。
• 真度及び精度の基準の設定方法について考えてみることは意味があると考え
本DGのテーマに設定した。

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背景[a] 厚生労働省医薬食品局審査管理課長通知：「医薬品開発における生体試料中薬物濃度分析法のバリデーションに関するガイドライン」について、平成25年7月11日 薬食審査発0711第1号[b] Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food andDrug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER),Center for Veterinary Medicine (CVM), May 2001.
[c] Guideline on bioanalytical method validation. 21 July 2011, EMEA / CHMP / EWP /192217 /2009 Rev. 1 Corr. 2
Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP).
9th JBF Symposium, 2018

4

Japan Bioanalysis Forum• 用いる分析法（最終分析法ではない）の真度及び精度の基準の設定根拠について検討した。
• ICH-M3対象となるか否かの10%ルールを例に、どの程度の真度及び精度があれば試験結果が信頼できるかを考察した。

【ICH-M3】
ヒトでみられた代謝物を非臨床試験で特徴づける 必要があるのは、その代謝物の臨床での暴露量が、投与薬物に関連する総ての物質の暴露量の10％を超え、かつ、ヒトにおける暴露量が毒性試験での 最大暴露量よりも明らかに高い場合のみである。

9th JBF Symposium, 2018

http://bioanalysisforum.jp/• 今回、未解決の課題として「フルバリデートしていない代謝物の分析で生じる分析法の取り扱い」を想定した。（標準物質がある前提）

5

Japan Bioanalysis Forum

試験ごと目的に応じる基準
統計的関係付け

代謝物を題材にどの程度のブレ幅が判断を誤らせるか考察

統計の専門家による検討のみ実施されてきていた領域

経験上20%幅にしても害がない試験目的に応じた設定（LCでも20%幅）が可能では

過去の実績から
LC：15%幅、LBA：20%幅で管理できるこの領域を考える「きっかけ」にもしたい

一律に使える基準
9th JBF Symposium, 2018

経験に基づく判断

DG2017-28

Tiered Approach
FFP Validation※

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今回の取り組みの角度

Crystal City I ～”Regulatory” BMV※ FFP(Fit For Purpose)

目的に応じた適切な分析方法を検証しようという考え方。

6

Japan Bioanalysis Forum

今回の取り組みの角度
最終的には科学的正当化という向きへの推進力に寄与したい
進む方向

一律に
使える基準

水を後ろへ押し出す

科学的信頼性が高く効率的な試験の実施
DG2017-28

統計的関係づけによる基準

経験に
基づく基準

試験ごと
目的に応じる基準（逆を向いている羽根は回すことで推進力を生む）
9th JBF Symposium, 2018

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科学的正当化7

Japan Bioanalysis Forum

参考文献(精度基準の変遷)② Crystal City 2：LBAのQCサンプルは25%
 Shah VP et al., 2000, Pharm. Res. 17(12), 1551-1557
2. FDAガイダンス（2001）でLC法のQCサンプルが15%幅となる
3. Crystal City 3でLBAの検量線が規定されQCサンプルが20%幅となる
 Viswanathan CT et al., 2007, AAPS J. 9 (1), Article 4.
4. Scientific Validation の文献（LC法も目的により20%～25%幅を提案）
 Timmerman P et al., 2016,
Bioanalysis 7 (18), 2387-2398.

9th JBF Symposium, 2018

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1. BMV黎明期の文献① Crystal City 1:検量線管理幅15%（LLOQは20%）QCサンプルは20%
 Shah VP et al., 1992, J. Pharm. Sci. 81(3), 309-312.

8

Japan Bioanalysis Forum

1. 4-6-20ルールの妥当性検討
Causey AG et al., 1990, “Evaluationof criteria for the acceptance of
bioanalytical data” J. Pharm.
Biomed. Anal. 8(8–12), 625-628.
Kringle RO, 1994, “An assessment of
the 4-6-20 rule for acceptance ofanalytical runs in bioavailability,
bioequivalence, and pharmacokinetic
studies.” Pharm. Res. 11(4):556-60.

2. BMVに統計的方法を加味し検討した論文


【4-6-20 rule】
This procedure requires that
quality control specimens at three
concentrations (low, medium,and high) be assayed in duplicate
in each run. For run acceptance,at least four of the six assay
values must be within ±20% of
their respective nominal
concentrations, and at least oneof the two values at eachconcentration must be withinthese limits.

Wieling J et al., 1996, “Rational experimental design forbioanalytical methods validation. Illustration using an assay
method for total captopril in plasma.” J Chromatogr A. 730(12):381-94.
E. Rozet, 2011, “Advances in validation, risk and uncertainty
assessment of bioanalytical methods.” Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis 55: 848–858.
9th JBF Symposium, 2018

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参考文献(統計的検討)

9Japan Bioanalysis Forum

3. ISR評価への分析法のブレを考察した論文（高分子） Thway T. M. et al., 2011, "Assessment of incurred sample
reanalysis for macromolecules to evaluate bioanalyticalmethod robustness: Effects from imprecision."
AAPS Journal 13(2): 291-298.
4. 統計的方法の利用とシミュレーション検証
 Hoffman D. et al., 2007, "A total error approach for thevalidation of quantitative analytical methods."
Pharmaceutical Research 24(6): 1157-1164.

9th JBF Symposium, 2018

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参考文献(統計的検討)

10

課題へのアプローチ方法

9th JBF Symposium, 2018

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Japan Bioanalysis Forum

11

検討課題

代謝物の定量精度がどの程度であれば10%ルールの判断（ MIST/ICH-M3対象となるか否か）が可能か？
代謝物の暴露が10%を超えているか否かを検討したい
測定法の精度はどの程度必要か
前提：測定にはLC/MS-MSを使用
測定対象の標準物質は存在する場合を想定

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Japan Bioanalysis Forum（考察の出発点として「検量線なし」は議論が難しい）
9th JBF Symposium, 201812

Japan Bioanalysis Forum

MIST/ICH-M3とは？

MISTガイダンス： 2008年2月 FDA（アメリカ食品医薬品局）から発出「Guidance for Industry – Safety Testing of Drug Metabolites」

代謝物の安全性評価についての考え方が示されている。

ヒトで検出された代謝物のうち非臨床試験において評価する必要があるのは、定常状態における血漿中暴露（血漿中濃度ー時間曲線下面積：AUC）が親化合物（未変化体）の10%を超えて生成する代謝物、かつヒト血漿における生成量がいずれの非臨床評価動物より不均衡（disproportionately）に高い代謝物である。

ICH M3(R2)： 2009年6月 ICH（日米EU医薬品規制調和国際会議）が上記を改定｢医薬品の臨床試験及び製造販売承認申請のための非臨床安全性試験の実施についてのガイダンス｣ (薬食審査発0219第4号）

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適用範囲：低分子化合物（ただし抗がん剤のようにリスクーベネフィットを考慮すべき化合物は除外対象）

ヒトでみられた代謝物を非臨床試験で特徴づける 必要があるのは、その代謝物の臨床での暴露量が、投与薬物に関連する総ての物質の暴露量の10％ を超え、かつ、ヒトにおける暴露量が毒性試験での 最大暴露量よりも明らかに高い場合のみである。
9th JBF Symposium, 201813

Japan Bioanalysis Forum

検討手法「精度の粗い分析法」しか用意できなかった場合でも・・・→ 「代謝物の暴露が10%を超えるか？」 という課題に対して「超えそうもない」 or 「超えるかもしれない」というアプローチは可能と考えた。

代謝物の暴露が何%のときに、精度が何%であれば、どの程度の確からしさで「10%は超えない」といえるかを検討する。

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データの統計的性質からアプローチすることを考える

簡単にするため、真度は良好（偏りなし）なケースから開始し段階的に複雑化する方向で進める。
9th JBF Symposium, 201814

Japan Bioanalysis Forum

統計的方法を使う前提• 推計統計学を実験科学に拡張した立場をとった
 真値（知りたい真実）があるとする
 実験値を出すという行為は、誤差を含むので、ばらつくとする
 実験値から真値を推定、その信頼度と共に判断に用いる
実験・測定
真値
（仮想的）
信頼度と共に推定

実験誤差（ばらつき）を含む
実験値

http://bioanalysisforum.jp/• バイオアナリシスの本質（生物実験の一部）も考慮

推定・判断
9th JBF Symposium, 201815

Japan Bioanalysis Forum

実験値を出す事の位置づけ
母平均に一致ココ

実験による一般的なばらつき発生しうる実験値
（仮想的）

現実

実際に実験

母集団に一致そのときに得られた具体的なデータ得られた実験値
(実際)

広がり全体

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統計の仮想的な部分

真値
（仮想的）

標本に一致

9th JBF Symposium, 201816

MIST対策について

9th JBF Symposium, 2018

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Japan Bioanalysis Forum

17

Japan Bioanalysis Forum

イメージされる試験とその流れ

分析法のばらつき評価

代謝物比率のばらつき評価（個体差）

1.

Pre-study validation：真度及び精度の検討

2.

In-study validation：実試料測定時のQC試料

3. 個体別に代謝物比率 [(代謝物AUC／未変化体AUC※)×100] を求める
※本DGでは、代謝物比率の計算式で、未変化体AUCを分母に用いる。

未変化体AUC＜総AUCであるため、総AUCを用いる場合よりも厳しい評価となる。

ばらつきを
考慮した
信頼区間での評価

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First In Human study：代謝物の測定を実施。
得られた結果より代謝物測定（MIST対応）の必要性を判断する。

4. 「代謝物比率」の平均値から、信頼区間を算出する。
5.

MIST判断9th JBF Symposium, 201818

Japan Bioanalysis Forum「10%超」評価の考え方（情報の使い方）
Pre-study and/or In-study validationで情報取得分析法の真度△％（当初検討では省略）

実測定（In-study）
で情報取得

代謝物比率
○％

精度を加味して・・・
代謝物比率の真値の推定値はひとまず○％と考えられるが・・・

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分析法の精度CV □％代謝物比率の真値の信頼区間は何％から何％

その幅で真値は「10％ではない」と判断できるか
9th JBF Symposium, 201819

Japan Bioanalysis Forum「10%超」評価へのアプローチ（実験への落とし込み）
真度・精度（誤差，ばらつき）の大きさを確認

Pre-study Validationを省略する考え方あり（In-studyの情報で十分と考えるとき）

In-study validationの真度・精度

In-study validationの真度・精度

・In-study Validationから真度・精度を確認

・Pre-study Validation時の真度・精度と比較
・QCサンプルのずれ具合の確認

ばらつきの程度の評価
真度はプラス傾向か？
マイナス傾向か？

ばらつきで分類中小

代謝物比率を求める

サンプル
測定結果
10%を十分に下回るのであれば、
どのばらつきでもMIST 対象外

代謝物比率の信頼区間を計算する

10%未満か否かで判定

約10%の場合
信頼区間の上限が10%を超えなければ10%未満と判断
9th JBF Symposium, 2018

大（今回検討内容）

濃度、N数の影響有り「ばらつき」の結果への影響度を考える

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Pre-study Fit-For-Propose
Validationの真度・精度

10%を十分に上回るのであれば、
どのばらつきでもMIST 対象

10%を超えた場合精度が高い測定法を構築しPOC時期等にて再度評価

20

統計分布を利用したテスト計算

9th JBF Symposium, 2018

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Japan Bioanalysis Forum

21

Japan Bioanalysis Forum

使用した統計的方法
実験値

分布の性質から
様々な推定

統計分布

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近似又は変数変換

1) 正規分布の性質を使う方法– 統計の基本となる方法*
2) ｔ分布の性質を使う方法– 実用性の高い方法** 次頁以降に解説

いずれもパラメトリック法（統計量の性質）を用いる
9th JBF Symposium, 201822

Japan Bioanalysis Forum【解説】正規分布 代謝物比率は偶然誤差によりばらつく 誤差には統計的な規則性がある 多数回測定してみると代謝物比率は分布を示す⇒正規分布
 サンプル（代謝物比率）の分布についてみると、

母平均（真値）は（サンプル平均）±1.96×（母集団SD）の範囲に95%の確率で含まれる（95%信頼区間）

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正規分布の性質という性質が知られる

9th JBF Symposium, 201823

Japan Bioanalysis Forum 正規分布の運用上の課題→ Nが少ないとき母標準偏差/母分散の推定が難しい
Nが少ないとサンプル標準偏差は
母標準偏差より小さくなる傾向（⇒自由度で補正可能）
母標準偏差/母分散の推定精度自体が低い
実際には制限があるが、正規分布の考え方を利用したテスト計算も行った

http://bioanalysisforum.jp/【解説】正規分布アプローチ 1正規分布の性質を利用するため、標準化した正規分布（標準正規分布）を考える（母平均を０、母分散を１に標準化）
9th JBF Symposium, 201824

Japan Bioanalysis Forum【解説】ｔ分布→ t分布を使用する方法
t＝[（サンプル平均）-（母平均）]/√[(不偏分散)/n]

実用性の高い方法としてｔ分布の考え方を利用したテスト計算も行ったアプローチ 2Pre-study Validationの
QC試料の本数（n）を推定に使用するアプローチ 3

実測定データの被験者数（n）を推定に使用する

http://bioanalysisforum.jp/

 サンプル標準偏差（⇒不偏分散）を使用できる方法
利点→ nが少ないときでも母標準偏差/母分散の推定が可能

少ない数（n≦30）で母平均の値を知りたいときに利用する
9th JBF Symposium, 201825

Japan Bioanalysis Forum 全体像をつかむため、モデル的に正規分布の性質を利用して考える。
 真度は100%と仮定する。
 代謝物比率何%のときに、定量精度がどの程度であれば、10%ルールの判断が可能かを検討する。

前提条件

・代謝物比率は偶然誤差により正規分布する・SDを求めるため、十分多数回の測定を行う
・実測定の回数はn=1とする
・信頼水準は両側95%とする

 「信頼水準95%で、信頼区間の上限を推定」し、信頼区間の上限が10%以下となれば代謝物比率は10%を超えないと判別可能とする
9th JBF Symposium, 2018

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アプローチ 1 条件（正規分布）

26

Japan Bioanalysis Forumアプローチ 1 検討結果（正規分布）
代謝物比率の平均値とCVを設定し、各条件における代謝物比率の信頼区間を算出。
CV（％）※

SD※※

1.96×SD/n

15
20
25
30
15
20
25
30
15
20
25
30
15
20
25
30
15
20
25
30

0.75
1.00
1.25
1.50
0.90
1.20
1.50
1.80
1.05
1.40
1.75
2.10
1.20
1.60
2.00
2.40
1.35
1.80
2.25
2.70

1.470
1.960
2.450
2.940
1.764
2.352
2.940
3.528
2.058
2.744
3.430
4.116
2.352
3.136
3.920
4.704
2.646
3.528
4.410
5.292

SD=CV/100×代謝物比率

信頼区間
下限
3.530
3.040
2.550
2.060
4.236
3.648
3.060
2.472
4.942
4.256
3.570
2.884
5.648
4.864
4.080
3.296
6.354
5.472
4.590
3.708

信頼区間
上限
6.470
6.960
7.450
7.940
7.764
8.352
8.940
9.528
9.058
9.744
10.43011.11610.352
11.13611.92012.704
11.64612.52813.41014.292

判定
OK
OK
OK
OK
OK
OK
OK
OK
OK
OK
NG
NG
NG
NG
NG
NG
NG
NG
NG
NG

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代謝物比率
（％）
5
5
5
5
6
6
6
6
7
7
7
7
8
8
8
8
9
9
9
9

※ 変動係数（Coefficient of Variation） ＝ 標準偏差(SD)÷平均値※※

標準偏差(standard deviation)＝分散の正の平方根

27

Japan Bioanalysis Forum 代謝物比率が6%以下のとき、CV値が30%であっても信頼区間の上限が10%を下回る
 代謝物比率が7%のとき、CV値の大きさにより、信頼区間の上限が10%を超える場合がある
 代謝物比率が8%以上のとき、CV値が15%であっても信頼区間の上限が10%を超える

9th JBF Symposium, 2018

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アプローチ 1 検討結果（正規分布）

28

Japan Bioanalysis Forumアプローチ 2 条件（t分布－Validation）

Pre-study validation は実測定を完全に模したものと捉え（pre-sutdy validation の n を推定に使用する）という立場をとる

前提条件
•
•
•
•

代謝物比率は偶然誤差により正規分布するt分布を使用しn=5のpre-study validationで分析法の能力を判断する
真の値（＝母平均）の推定に関心があるとする
信頼水準は両側95%とする
自由度(n-1)=4におけるt値 2.776を計算に使用

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Pre-study validationのデータで分析法の能力を判断する 「信頼水準95%で、信頼区間の上限を推定」し、信頼区間の上限が10%以下となれば代謝物比率は10%を超えないと判別可能とする
9th JBF Symposium, 201829

Japan Bioanalysis Forum

代謝物比率
（％）

CV（％）

SD

t*SD/√n

信頼区間
下限

信頼区間
上限

判定

5

15

0.75

0.931

4.069

5.931

OK

5

20

1.00

1.242

3.758

6.242

OK

5

25

1.25

1.552

3.448

6.552

OK

5

30

1.50

1.862

3.138

6.862

OK

6

15

0.90

1.117

4.883

7.117

OK

6

20

1.20

1.490

4.510

7.490

OK

6

25

1.50

1.862

4.138

7.862

OK

6

30

1.80

2.235

3.765

8.235

OK

7

15

1.05

1.304

5.696

8.304

OK

7

20

1.40

1.738

5.262

8.738

OK

7

25

1.75

2.173

4.827

9.173

OK

7

30

2.10

2.607

4.393

9.607

OK

8

15

1.20

1.490

6.510

9.490

OK

8

20

1.60

1.987

6.013

9.987

OK

8

25

2.00

2.483

5.517

10.483

NG

8

30

2.40

2.980

5.020

10.980

NG

9

15

1.35

1.676

7.324

10.676

NG

9

20

1.80

2.235

6.765

11.235

NG

9

25

2.25

2.794

6.206

11.794

NG

9

30

2.70

3.352

5.648

12.352NG※

9th JBF Symposium, 2018

※ n=5, t=2.776

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アプローチ 2 検討結果（t分布－V）30

Japan Bioanalysis Forum

代謝物比率が7%以下のとき、CV値が30％であっても、信頼区間の上限が10%を下回る
代謝物比率が8%以上のとき、QC試料のばらつ
きにより、信頼区間の上限が10%を超える場合がある

9th JBF Symposium, 2018

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アプローチ 2 検討結果（t分布－V）31

Japan Bioanalysis Forum 実測定データ（被験者の個人差を含むデータ）を用い、被験者数（n）を解析に使用する
前提条件• 代謝物比率は偶然誤差により正規分布する• t分布を使用し、被験者の代謝物比率平均値とばらつきから真の値（母平均）を推定する。
• 信頼水準は両側95%とする
今回は被験者数(n)=3として自由度(n-1)=2におけるt値 4.303を計算に使用

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アプローチ 3 条件（t分布－実測） 「信頼水準95%で、信頼区間の上限を推定」し、信頼区間の上限が10%以下となれば代謝物比率は10%を超えないと判別可能とする
9th JBF Symposium, 201832

Japan Bioanalysis Forum

代謝物比率
（％）

CV（％）

SD

t*SD/√n ※

信頼区間
下限

信頼区間
上限

判定

5

15

0.75

1.863

3.137

6.863

OK

5

20

1.00

2.484

2.516

7.484

OK

5

25

1.25

3.105

1.895

8.105

OK

5

30

1.50

3.726

1.274

8.726

OK

6

15

0.90

2.236

3.764

8.236

OK

6

20

1.20

2.981

3.019

8.981

OK

6

25

1.50

3.726

2.274

9.726

OK

6

30

1.80

4.471

1.529

10.471

NG

7

15

1.05

2.608

4.392

9.608

OK

7

20

1.40

3.478

3.522

10.478

NG

7

25

1.75

4.347

2.653

11.347

NG

7

30

2.10

5.217

1.783

12.217

NG

8

15

1.20

2.981

5.019

10.981

NG

8

20

1.60

3.975

4.025

11.975

NG

8

25

2.00

4.968

3.032

12.968

NG

8

30

2.40

5.962

2.038

13.962

NG

9

15

1.35

3.354

5.646

12.354

NG

9

20

1.80

4.471

4.529

13.471

NG

9

25

2.25

5.589

3.411

14.589

NG

9

30

2.70

6.707

2.293

15.707NG

9th JBF Symposium, 2018

※ n=3, t=4.303

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アプローチ 3 検討結果（t分布－実測）33

Japan Bioanalysis Forum

代謝物比率が5%以下のとき、CV値が30%であっても、信頼区間の上限が10%を下回る
代謝物比率が6%以上のとき、代謝物比率の
被験者間のばらつきにより、信頼区間の上限が10%を超える場合がある

9th JBF Symposium, 2018

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アプローチ 3 検討結果（t分布－実測）

34

推奨測定フローと判断方法

9th JBF Symposium, 2018

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Japan Bioanalysis Forum

35

Japan Bioanalysis Forum

イメージされる試験とその流れ

分析法のばらつき評価

代謝物比率のばらつき評価（個体差）

1.

Pre-study validation：真度及び精度の検討

2.

In-study validation：実試料測定時のQC試料

3. 個体別に代謝物比率 [(代謝物AUC／未変化体AUC※)×100] を求める
※本DGでは、代謝物比率の計算式で、未変化体AUCを分母に用いる。

未変化体AUC＜総AUCであるため、総AUCを用いる場合よりも厳しい評価となる。

ばらつきを
考慮した
信頼区間での評価

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First In Human study：代謝物の測定を実施。
得られた結果より代謝物測定（MIST対応）の必要性を判断する。

4. 「代謝物比率」の平均値から、信頼区間を算出する。
5.

MIST判断9th JBF Symposium, 201836

Japan Bioanalysis Forum

測定シナリオ -推奨測定フローと判断方法ルート1

ルート2

濃度依存性があった
場合の解釈は困難⇒測定法再検討

Pre study Vali. は省略！
分析法が持つ真度及び精度を確認
濃度に依存して真度及び精度が変化しているかどうか
Pre-study validationを実施せず、あたり付け程度に代謝物情報を収集する場合。
も確認。真度・精度は15/20%以内が理想だが、代謝物の推定生成量*が少ない場合は、より緩い基準(20/25%～)で問題ないと考える。 *代謝物プロファイルを事前に収集【ポイント】 代謝物比率が10%を超えないと判断できれば
必ずしも15%ルールを満たす必要はない

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1. Pre-study (Fit for purpose) validation：真度及び精度の検討【DGメンバーの意見】• 明確なクライテリアは設定しない。
• 真度が甘すぎると何を測定しているか分からなくなるので15%にするべき。
• 一方、精度については、暴露量が低いと予測されるケースでは甘くしてよい。
9th JBF Symposium, 201837

Japan Bioanalysis Forum

測定シナリオ -推奨測定フローと判断方法-

QC試料を同時に分析することにより実測定の環境下において分析法が持つ・真度（QC試料分析値のずれ・濃度に対するトレンド）・精度（QC試料の全体的なばらつき・濃度依存性あれば濃度に対するトレンド）
を確認する【DGメンバーの意見】• Pre-study validation での真度、CVを基にすると、分析法の状態が再現していれば、真度±CVの範囲内にQCの4/6（同濃度QCのいずれか）程度は
含まれるはず。
9th JBF Symposium, 2018

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2. 実試料測定時のQC試料の測定
In-study (Fit for purpose) validation：真度および精度検討

38

Japan Bioanalysis Forum

測定シナリオ -推奨測定フローと判断方法群平均AUCから算出した代謝物比率が10%を超える場合はMIST評価の対象となる可能性がある【ポイント】

 代謝物比率の計算式で、未変化体AUCを分母に用いているが、未変化体AUC＜総AUCであるため、総AUCを用いる場合よりも厳しい評価となる。
 実測値に変動があっても、測定法の評価（前頁）が出来ていれば、実測値の変動が個体差によるものなのか解釈が可能となる。

【DGメンバーの意見】• サンプルプール法でAUC値を算出すれば、MS測定による誤差の影響を小さくできる可能性がある。
• Powerモデル等で線形領域であることが確認できれば、異なる用量群の代謝物比率をひとまとめにして評価することも可能ではないか。
（n数を増やすことで信頼区間の幅を縮める効果）
9th JBF Symposium, 2018

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3. 個体別に代謝物比率 [(代謝物AUC／未変化体AUC) ×100] を求める

39

Japan Bioanalysis Forum

測定シナリオ -推奨測定フローと判断方法4. 「代謝物比率」の平均値から、信頼区間を算出する。

代謝物比率の平均値±tn-1×SD/√n
信頼区間を算出に用いるSDとして、以下の5パターンが考えられる。(次頁以降に詳細)
分析法視点① Pre-studyのCVを基にSDを算出② In-studyのCVを基にSDを算出③ Pre-studyとIn-studyの両方のCVを基にSDを算出

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信頼区間の算出にはt分布を用いる.

代謝物比率視点④ 代謝物比率のSDを算出
分析法視点＋代謝物比率視点⑤ 分析法と代謝物比率の両方を基にSDを算出
9th JBF Symposium, 201840

Japan Bioanalysis Forum

測定シナリオ –SDの選択方法① Pre-studyのCVを基にSDを算出

代謝物比率の平均値±tn-1×SD/√nPre-study validationで設定したSDを採用する
In-studyではQCサンプルを4/6判定に用いるが、SDは算出しない【DGメンバーの意見】• In-studyのQCはプール血漿で調製するため、Pre-studyと同等と判断する• FFPの観点から、過度に保守的になる必要はない② In-studyのCVを基にSDを算出
In-study validationで算出したSDを採用する（In-study では全バッチ分、4/6で除外したQC試料も含めてSDを算出）

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分析法視点【DGメンバーの意見】• 実測定環境下での分析法の真度・精度を確認できる• リソースの削減の観点から、Pre-studyの実施自体を省略することも可能• 測定本数の多いIn-studyのほうが測定法を正確に評価できる（汚れの蓄積による精度↓or MSの「こなれ」による精度↑etc）
9th JBF Symposium, 201841

Japan Bioanalysis Forum

測定シナリオ –SDの選択方法③ Pre-studyとIn-studyの両方のCVを基にSDを算出

代謝物比率の平均値±tn-1×SD/√n Pre-studyが15%以内 かつ In-studyが15%以内 ⇒ CVは15%を採用
 Pre-studyが15%以内 で In-studyが25%以内 ⇒ 要判断（CVは25%を採用 or 分析法の再検討）
 Pre-studyが25%以内 かつ In-studyが25%以内 ⇒ CVは25%を採用
 Pre-studyが25%以内 で In-studyが15%以内 ⇒ CVは25%を採用
In-studyの真度・精度がPre-studyに比べて明らかに悪い場合、
QC濃度間で真度のズレにトレンドがある場合などは、分析法の再検討に進むか、CVを設定してそのまま評価を継続するかは会社判断。

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Pre 及び In-study validationで算出したCVを比較し、より大きいCVを採用する。
（In-study では全バッチ分、4/6で除外したQC試料も含めてCVを算出）【DGメンバーの意見】• 代謝物比率のばらつきを最大限考慮するため、
Pre-studyとIn-studyの大きい方のCV（SD）を採用
9th JBF Symposium, 201842

Japan Bioanalysis Forum

測定シナリオ –SDの選択方法④ 代謝物比率のSDを算出
代謝物比率のSDを採用する

代謝物比率の平均値±tn-1×SD/√n【DGメンバーの意見】• 代謝物比率の算出に用いる個々の測定値は分析法のばらつきを含んでいるため、総合的に評価できるのではないか
分析法視点＋代謝物比率視点⑤ 分析法と代謝物比率の両方を基にSDを算出
分析法と代謝物比率のSDを比較し、より大きい方のSDを採用する

http://bioanalysisforum.jp/

代謝物比率視点【DGメンバーの意見】• 分析法SDに比べて個体変動がかなり大きい（代謝物比率SDが大）場合、そのまま分析法SDを適用すると、代謝物比率の信頼区間を過小評価する危険性がある• 代謝物比率のばらつきを偶発的に過小評価しているリスクを勘案し、代謝物比率のSDがPre-studyにおける同時再現性評価のSDより小さいときは、Pre-studyのSDを当てはめ信頼区間を求めたほうがよいのではないか
43
9th JBF Symposium, 2018

Japan Bioanalysis Forum

測定シナリオ -推奨測定フローと判断方法MIST判断

分析法の基準から (1,2を経て5へ）
検量線・QCが現在の15%ルールの基準内代謝物比率を算出

基準外測定結果から
（1,2を経ず5へ)
測定結果
余裕で10%を超える

0-10％ギリギリ

代謝物比率の平均値とSD（1つを選択）から信頼区間を算出

10％は超えないと予測可能

10％を超えてしまう（可能性あり）

その後の試験で当該代謝物の測定は不要

分析法改良後その後の試験で対応
9th JBF Symposium, 2018

基準外

本DG発表
アプローチ1から3の計算結果 参照

0-10％ギリギリ

http://bioanalysisforum.jp/

5.

測定法の基準・得られたAUC値
どちら側から攻めてもOK！と考えた場合・・・・「このどちらかになった時に、どのように考えるか」に、統計学を使っていくイメージ
測定系のCVが大きくなってしまった場合でものジャッジが出来るように。

44

Japan Bioanalysis Forum

ご意見をおきかせください
Q: 代謝物測定系のSD（CV）として、どの値を採用するべきと考えますか？

4.代謝物比率のSD

2.In-studyのSD

3.Pre と In-studyのSDの大きいほう

5.分析法と代謝物比率のSDの大きいほう

9th JBF Symposium, 2018

http://bioanalysisforum.jp/

1.Pre-studyのSD

45

Japan Bioanalysis Forum

まとめ
代謝物比率の検討を想定し、データの質（平均・標準偏差）を仮定して統計的に検討した結果、代謝物比率が一定以下の場合においては分析法の精度によらず10%ルールの判断が可能と考えられた。
この検討結果を踏まえて、代謝物測定の推奨ワークフローを作成した。

http://bioanalysisforum.jp/

結論

合意の得られていない項目も多数あります。
是非ご意見をお寄せください。
9th JBF Symposium, 2018

ご意見をお寄せください46http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

検討中の課題

9th JBF Symposium, 201847

Japan Bioanalysis Forum

真度の影響

例）

代謝物比率の平均値±tn-1×SD/√n（代謝物比率の平均値+真度補正）±tn-1×SD/√n

精度・真度の関係をスマートに示せるか検討中

9th JBF Symposium, 2018

http://bioanalysisforum.jp/

考え方：真度のズレを補正する

48

Japan Bioanalysis Forum

個体差と分析法の変動の分離

2つの「変動要因」の片方だけを考慮しても片手落ちになる危険性あり。両方を考慮して代謝物比率と分析法、両方のCVを重ね合わせて信頼区間を算出するのが適切か？
「代謝物比率」の平均値と標準偏差から信頼区間を算出↓「代謝物比率」の信頼区間上限値に対して、更に分析法CVで信頼区間を算出する
両方の誤差を考慮すると、測定誤差が二重に掛かる事になる？
【代謝物比率】
代謝物比率
信頼区間上限確率密度関数

代謝物比率が10%を超えるかの判断に使用

http://bioanalysisforum.jp/

1)個体間変動
2)個体内変動（測定法による定量誤差を含む）

分析法CV15%

95%信頼区間

9th JBF Symposium, 201849

15％ルールについてJapan Bioanalysis Forum

現在、早期探索試験やフィージビリティーにおいて、フルバリデーション対象試験の過剰な拡大解釈が多く見受けられる。
FFPの概念はこれを防ぎ、また開発早期段階の試験を柔軟に運用することで、
医薬品開発の効率化に役立つものと考えられている。

これを踏まえて、15%ルールについて何処まで必要なのか、実際に影響を及ぼす範囲はどのくらいなのか、設定根拠が不明確なルールについて改めて検証・議論する必要があると考える。
9th JBF Symposium, 2018

http://bioanalysisforum.jp/【現在の15％ルールについて】
今回はMISTを題材にし、データの質を仮定して統計的に検討した結果、まとめの通り分析法の精度が絶対値の推定・判断に及ぼす影響は小さいことが示唆された。

50

Japan Bioanalysis Forum

AUCへの測定精度の影響
AUCの誤差

1)個体間変動
2)個体内変動ex)測定法による定量値の誤差 → AUCの誤差 → 代謝物比率の誤差
定量精度「のみ」が結果に及ぼす影響を正確に把握することは難しい。
個体差を考慮するために
PPK等のシミュレーションが有効か？
低濃度における測定誤差がAUCに与える影響は少ない

被験者A

Conc.

個体内変動
母集団平均推移
被験者B

Time

Conc.

Duration of action
低濃度QCのCVが大きくてもCmax
AUCに与える影響は小さい
15%↓
Pre-studyで濃度間で真度・精度に偏りがあった場合も
AUC
In-studyに進む判断が可能？
Onset Tmax
Time
ただし高濃度サンプルを希釈測定する場合
timeについては、十分な考慮が必要

9th JBF Symposium, 2018

個体間変動

http://bioanalysisforum.jp/

AUC平均推移からの「ずれ」には複数の原因あり

Therapeutic
Range

15%

51

Japan Bioanalysis Forum

ご意見

http://bioanalysisforum.jp/

Q. 「これはこう考えるべき」などご意見を下さい。

9th JBF Symposium, 201852

Japan Bioanalysis Forum

http://bioanalysisforum.jp/

参考 （t分布表）

7th JBF Symposium, 201653