【助成 40 - 49】

殺菌レーザーとバクテリオファージを融合した狙撃分子の創成

研究者

徳島文理大学薬学部 准教授 阪口 義彦

共同研究者 北里大学医学部 助教 武 晃
岡山大学学術研究院保健学域 准教授 後藤和義
岡山大学学術研究院医歯薬学域 教授 阪口政清
藤田医科大学 教授 大宮直木
東京慈恵会医科大学医学部 教授 岩瀬忠行
東京慈恵会医科大学医学部 准教授 光永眞人
京都産業大学総合生命科学部 教授 津下英明

〔研究の概要〕Clostridioides difficile 感染症（CDI）は、C. difficile が原因で引き起こされる難治性の下痢症・腸炎である。
我々は、C. difficile を特異的に殺菌する手法として、バクテリオファージ（ファージ）および蛍光プローブ IR700 に着目した。ファージは、特定の細菌にのみ結合する特徴を有する。一方、IR700 は、近赤外光を殺菌レーザーに変換することで、様々な病原体に強い殺菌活性を示す。そこで、我々は、これらの分子を融合させた新しい狙撃分子を考案した。本研究において、まずは、推定したファージ由来結合分子（CDPX、CDPY）を発現・精製した。これらの分子は、C. difficile に対して結合が認められたが、菌株間の特異性が認められなかった。その特異性には、複数のタンパク質が関わっていることが示唆された。

請者らが着目した蛍光プローブ IR700 は、近赤外光〔研究経過および成果〕
Clostridioides difficile 感 染 症 （ CDI ） は 、 C.

を殺菌レーザーに変換することで、様々な病原体にdifficile が原因で引き起こされる難治性の下痢症・腸強い殺菌活性を示す。そこで、我々は、これらを融合炎である 1 。CDI の治療には抗菌薬が用いられるが、させた新しい狙撃分子を考案した。本研究テーマで再発を繰り返し治療が難渋することがある。抗菌薬では、まずは、C. difficile に特異的な結合分子を同定

は、C. difficile のみを特異的に死滅させることは困難することとした。

であり、腸内の有益な細菌までも死滅させる。そこで、C. difficile に特異的に感染するファージ A のゲ

我々は、C. difficile のみ特異的に殺菌する手法を開ノム解析から、他のファージのゲノム上の遺伝子との発するために、バクテリオファージ（ファージ）に着目相同性およびタンパク質機能予測解析により 2, 3、2 個した。ファージは、特定の細菌にのみ結合する特徴をの遺伝子（cdpX および cdpY）がファージ尾部の結合有する。その特異性は、菌株を認識することができる分子をコードしていると推察した。そこで、これらの遺ファージ尾部が重要な役割を担っている。一方で、申伝子を人工合成し、大腸菌に組換えタンパク質として102発現し、アフィニティーカラムにより可溶性タンパク質に特異的な結合分子を同定するため、隠れマルコフとして精製することができた。

モデルを用いた遺伝子機能予測解析を行うと、C.

精製 His-CDPX と His-CDPY について、C.

difficile ファージ A のゲノム上には、新たに細菌の結difficile ま た は 粗 細 胞 壁 に 対 す る 結 合 性 を合に関与する遺伝子群が推定された。今後、これら

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay（ELISA）およの遺伝子を個々に発現・精製し、C. difficile への結合びウエスタンブロット法により解析した。両タンパク質性を調べる必要がある。C. difficile に対して特異的なともに C. difficile PCR-リボタイプ（RT）027 株に対して結合分子を同定した後、本結合分子との IR700 の連濃度依存的および時間依存的に結合が認められた。

結を検討し、近赤外光による C. difficile への殺菌活

また、ウエスタンブロット法による解析では、性を検証する。今回実施した研究成果から得られた

His-CDPX は、C. difficile RT 027 またはその粗細胞問題点を解決することにより、C. difficile 感染症の原壁に対して結合することが判明した。一方で因となる C. difficile を特異的に殺菌する狙撃分子のHis-CDPY は、C. difficile RT 027 に対して結合性を創出が期待される。

示したが、粗細胞壁においては、上清および沈渣ともにシグナルが検出されなかった。同様に、2 種類の結〔参考文献〕

合タンパク質について C. difficile の他の菌株（RT 001、1.

RT 017、RT 018、RT 027、RT 060）に対する結合性も調べたが、いずれも株間に対する結合の有意差が認められなかった（図 1）。このことは、Bacillus subtilis ファージおよび Lactococcus lactis ファージで報告されている尾部の 3 次元構造解析から、ファージの尾部2.

先端は複数のタンパク質で構成することで特異性を示すことが予想され、1 種類のタンパク質では特異性が低いことが推察される 5, 6。そこで、さらに C. difficile

3.

10.90.8

OD4500.70.64.

0.50.40.30.20.10RT001
001: CDPX 62.5 ng: CDPX 125 ng

RT017017
62.5ng

RT018018125ng

250ng

RT027027500ng

5.

RT無毒060: CDPX 250 ng: CDPX 500 ng

図 1 ELISA による結合分子の C. difficile に対する結合性103

Gotoh, K., Sakaguchi, Y., Kato, H., Osaki, H.,Jodai, Y., Wakuda, M., Také, A., Hayashi, S.,
Morita, E., Sugie, T., Ito, Y., Ohmiya, N., Fecal
microbiota transplantation as therapy forrecurrent Clostridioides difficile infection isassociated with amelioration of delirium andaccompanied by changes in fecal microbiota andthe metabolome. Anaerobe, 73, 102502, 2022.
Oliva, M. A., Martin-Galiano, A. J., Sakaguchi, Y.,Andreu, J. M., Tubulin homolog TubZ in aphage-encoded partition system. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 109(20), 7711−7716, 2012.
Sakaguchi, Y., Hayashi, T., Kurokawa, K.,
Nakayama, K., Oshima, K., Fujinaga, Y., Ohnishi,M., Ohtsubo, E., Hattori, M., Ogma, K., The
genome sequence of Clostridium botulinum typeC neurotoxin-converting phage and the molecularmechanisms of unstable lysogeny. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 102(48), 17472−17477, 2005.
Farley, M. M., Tu J, Kearns, D. B., Molineux, I. J.,
Liu, J., Ultrastructural analysis of bacteriophageΦ29 during infection of Bacillus subtilis, J. Struct.
Biol., 197(2), 163−171, 2017.
Spinelli, S., Veesler, D., Bebeacua, C., Cambillau,C., Structures and host-adhesion mechanisms oflactococcal siphophages, Front. Microbiol., 5(3),1−13, 2014.