（2023/8/30）

無花粉スギの原因遺伝⼦を新たに特定－花粉症対策を加速－

ポイント
・花粉症対策に光明︕スギ花粉の⽣産に関わる遺伝⼦を新たに特定
・この遺伝⼦のたった 1 塩基の変異で花粉ゼロ
・無花粉スギの苗⽊⽣産の増⼤につながる成果
概要
国⽴研究開発法⼈森林研究・整備機構森林総合研究所、新潟⼤学、東京⼤学⼤学院新領域創成科学研究科、基礎⽣物学研究所、新潟県森林研究所の研究グループは、無花粉スギの原因遺伝⼦MS4を特定しました。⼈⼯交配によって作製したスギ集団を⽤いた遺伝分析とスギ参照ゲノム配列を活⽤して候補となる遺伝⼦を絞り込みました。得られた候補遺伝⼦が花粉⽣産に関わることをモデル植物のシロイヌナズナを⽤いて検証することに成功しました。MS4は、花粉壁の⽣成に関わる酵素（TKPR1）を合成する遺伝⼦であり、この遺伝⼦のわずか1つの塩基が変異することで無花粉になることが明らかになりました。現在、無花粉スギは、MS4とは別の遺伝⼦が変異した無花粉ス
ギの雌花に有花粉のスギをかけあわせて無花粉スギの種⼦を得て苗⽊を⽣産していますが、この⽅法においてMS4を使⽤する選択肢が得られたことで無花粉スギの新たな育種や⽣産の増⼤につながると想定され、花粉症対策への貢献が⾒込まれます。
本研究成果は、2023年8⽉8⽇にPNAS Nexus誌でオンライン公開されました。

背景
スギ花粉症は、我が国の深刻な社会問題となっています。スギ花粉症患者は年々増加し、⽇本⼈の約４割が罹患しているとする調査結果もあります。林業分野におけるスギ花粉症対策の１つは花粉発⽣源を減少させることです。政府は、花粉発⽣源対策として、スギ⼈⼯林を減少させるとともに、無花粉スギ（⽤語解説 1）を含む花粉の少ないスギ苗⽊への植え替えを促進するなどして、30 年後に花粉発⽣量を半減させる⽬標を掲げています。特に無花粉スギへの植え替えは、森林のCO2 吸収機能を維持しつつ花粉を⾶散させずに⽊材資源を確保できる⾮常に有効な策であると⾔えます。近年無花粉スギの原因遺伝⼦のひとつである MS1（⽤語解説 2）が特定され、無花粉スギと有花粉のスギをかけあわせて得られる無花粉スギの種⼦を使った苗⽊の⽣産（⽤語解説 3）に活⽤されています。無花粉スギの遺伝⼦は MS1 以外にも 3 つの遺伝⼦（MS2、MS3 および MS4）の存在が知られており、MS1 やこれらの遺伝⼦を活⽤することで、無花粉スギの苗⽊の⽣産効率を- 1 -さらに⾼めることができますが、これまで MS1 以外の遺伝⼦の正体は不明でした。
内容
今回研究グループは、花粉が成熟する直前に異常が⽣じて無花粉になるタイプ（MS4）に着⽬しました。このタイプの無花粉スギの雄花断⾯を観察すると、ごく少量の花粉しか確認できず、電⼦顕微鏡で詳細に観察すると、異常な形の花粉が観察されるとともに、花粉外壁の外層構造が不完全であることがわかりました（図１）。すなわち MS4 タイプの無花粉スギは、花粉を作らない MS1タイプとは異なり、機能が不全かつ⾶散しにくい花粉を作ることがわかりました。
次に、MS4 の原因遺伝⼦を特定するために、⼈⼯交配による遺伝分析と 2023 年に森林総合研究所を中⼼とするグループが解読を完了して公開したスギの参照ゲノム配列（⽤語解説 4）を利⽤して、MS4 遺伝⼦が存在する領域を第 4 染⾊体の 765 万塩基対の範囲に絞り込みました。この範囲に、スギの雄花で活発に働く遺伝⼦が 1 つだけ発⾒されました。その遺伝⼦の塩基配列を解読したところ、花粉壁の形成に関わる酵素（TKPR1、⽤語解説 5）を合成すると予想されました。興味深いことに無花粉スギの TKPR1 遺伝⼦は、DNA たった１塩基の置換に由来するアミノ酸変異（82番⽬のアミノ酸のシステイン（C）がアルギニン（R）に置換する変異であることから C82R と呼ばれます）を持つことがわかり、この変異が TKPR1 遺伝⼦の機能に影響する可能性が考えられました（図２）。
TKPR1 遺伝⼦は多くの植物で働いていることが知られています。そこで、この 1 塩基の変異が花粉⽣産の有無を決めるかどうかを確かめるためにモデル植物のシロイヌナズナ（⽤語解説 6）の突然変異体を⽤いて実験しました。TKPR1 が⽋損した無花粉のシロイヌナズナに正常なスギのTKPR1 遺伝⼦を導⼊すると花粉が⽣産された⼀⽅で、C82R の変異を持つ TKPR1 遺伝⼦を導⼊しても正常な花粉は⽣産されませんでした（図３）。このことから TKPR1 がわずか１つの塩基置換により機能を喪失することが初めて証明されました。そして、MS4 の原因遺伝⼦は TKPR1 遺伝⼦であることが証明されました。

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図１

正常なスギ（左側）と MS4 タイプの無花粉スギ（右側）の雄花および花粉の形態⽐較

スギの雄花の房（左上）から雄花を１つ取りナイフで切断しました。正常なスギでは⾮常に多く粉状の花粉が確認できますが（A)、無花粉スギではそれを確認できません（B）。花粉を電⼦顕微鏡で観察すると、正常なスギは楕円体にパピラと呼ばれる突起（⾚い⽮印の部分）のついた特徴的な形の花粉の粒⼦が観察されますが（C)、無花粉スギでは粒⼦がつぶれており、⾶散する能⼒がないと考えられます（D)。また正常な花粉の表⾯にはオービクルと呼ばれる粒⼦状の構造（⽩い⽮印）が全体的に多く観察できますが（C）、無花粉スギでは数が少なく形も異常でした（D）。さらに花粉の切断⾯を電⼦顕微鏡で観察してみると正常なスギでは花粉外壁の外層（Ec）が⼗分に発達している（E）⼀⽅で、無花粉スギでは未発達（dEc）であることがわかりました（F）。なお
花粉症の原因となる物質（「抗原」と呼びます）は花粉外壁の外層（Ec）やオービクル等に存在することが知られています。

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図2

MS4 の遺伝⼦構造

MS4 の構造を表す模式図です。⻑⽅形の部分がタンパク質を合成する部分を、⻑⽅形と⻑⽅形を結ぶ線分がイントロン（遺伝⼦内に存在し、タンパク質を合成せず、RNA 合成時に取り除かれる領域）と呼ばれる部分を表します。MS4 は 5 つのイントロンで分断されています。図では左端に開始コドン、右端に終⽌コドンを⽰し、3,323 塩基対（bp）、333 アミノ酸残基に対応する部分を⽰しています。MS4 が合成するタンパク質は花粉外壁の主要な成分である脂質の⽣合成に必要な酵素（TKPR1）と予想されました。無花粉スギでは TKPR1 の 82 番⽬のアミノ酸のシステイン（C）がアルギニン（R）に置換する変異（C82R）が存在し、この変異は酵素の機能に影響する有害な変異であると予想されました。

図3MS4 の遺伝⼦機能証明実験におけるシロイヌナズナ雄しべの顕微鏡写真

シロイヌナズナの TKPR1 機能⽋損変異体（TKPR1 が機能せず無花粉の変異体）に正常なスギのTKPR1 遺伝⼦を導⼊すると花粉が⽣産され稔性が回復します（左図）。図では染⾊液により花粉は⾚紫⾊に染まっています（⽮印）。⼀⽅で、同じシロイヌナズナ変異体に、C82R の変異を持つ変異型 TKPR1 遺伝⼦（正常なスギの TKPR1 遺伝⼦とは 1 塩基だけ異なる塩基配列）を導⼊しても無花粉のままでした（右図）。このことにより無花粉スギの MS4 の正体は TKPR1 遺伝⼦であり、この遺伝⼦のわずか 1 塩基の違いが花粉⽣産の有無を決定することが明らかになりました。

今後の展開
本研究により、MS4 タイプの無花粉スギの原因遺伝⼦が TKPR1 であること、そして TKPR1 遺伝⼦のわずか１塩基の違いが花粉の⽣産を決定することが明らかになりました。現在無花粉スギの苗⽊を⽣産するには MS1 と呼ばれる遺伝⼦が実際に活⽤されています。MS1 をホモ接合で保有するスギとヘテロ接合で保有するスギをかけあわせて得られる種⼦から育てた苗⽊を無花粉スギとして出荷しています。無花粉スギの育種や⽣産に際して MS1 に加えて MS4 も利⽤することで、苗⽊の⽣産の増⼤が⾒込まれます。さらに TKPR1 遺伝⼦は花粉を作る植物が共通して有する遺伝⼦であるため、今後 TKPR1 遺伝⼦を利⽤することでスギ以外のさまざまな植物で花粉症対策を⾏えることも期待されます。

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⽤語解説
*1 無花粉スギ
花粉の形成に異常があり正常な花粉ができないため花粉を⾶散せず、林業⽤に植栽するスギを林業⽤語で無花粉スギと呼んでいます。科学⽤語では雄性不稔スギと呼びますが、雄性不稔には様々なタイプがあり、今回の MS4 タイプは花粉の粒⼦が観察できる雄性不稔です。花粉が⾶散しないため花粉症対策として活⽤できます。
*2

MS1無花粉スギの原因遺伝⼦の 1 つで、最初に⾒つかった遺伝⼦であるため MS1 と命名されています。雄性不稔を意味する英語（male sterility）の頭⽂字に由来します。MS1 は脂質を輸送する機能があると推定されています（http://www.ffpri.affrc.go.jp/pubs/seikasenshu/2021/documents/p38-39.pdf）。
*3

無花粉スギの種⼦を使った苗⽊の⽣産
現在、無花粉スギの種⼦は付図 1 で⽰すような⼈⼯交配により⽣産されています。この図では正常な（野⽣型の）MS1 遺伝⼦を「A」、変異型の MS1 遺伝⼦を「a」で表しています。無花粉ス
ギは変異型の遺伝⼦を 2 つ持っています（aa のホモ接合と呼びます）。無花粉スギでも雌花は正常に咲くので種⼦親になれます。花粉親には野⽣型遺伝⼦ A と変異型遺伝⼦ a を 1 つずつ持っている（Aa のヘテロ接合と呼びます）スギを選びます。変異型遺伝⼦ a を持っていてもヘテロ接合の場合は花粉ができるので花粉親になれます。そしてこの Aa の花粉親と aa の無花粉スギの種⼦親との交配によりできた種⼦には、無花粉スギ（aa）と有花粉スギ（Aa）がほぼ等量ずつ含まれ、約 50％が無花粉スギ（aa）の苗⽊となります。

付図 1

無花粉スギの種⼦による苗⽊の⽣産*4参照ゲノム配列
種を代表するゲノム配列で、この配列を基準にして近縁種間で配列を⽐較したり、種内の品種間の配列を⽐較したりするなどの⾼度な解析を統⼀的に⾏うことができます。スギの参照ゲノム配- 5 -列は近年の分析技術の進歩により解読され（https://www.ffpri.affrc.go.jp/press/2023/20230301/index.
html）、今回の MS4 遺伝⼦の同定で活⽤されました。
*5

TKPR1
テトラケチドα-ピロンリダクターゼ 1（Tetraketide alpha-pyrone reductase 1）は葯の内側にあるタペートと呼ばれる組織で働く酵素で、花粉外壁の主要な成分である脂質の⽣合成に関与します。
合成された脂質は花粉外壁の外層に蓄積します。本⽂ではローマン体で統⼀していますが、論⽂中では遺伝⼦名（TKPRI1：イタリック体）とその産物の酵素タンパク質（TKPR1：ローマン体）を区別して書いています。
*6

シロイヌナズナ
⼩型の草本植物でモデル⽣物として科学研究で広く使われています。世代期間が短いために遺伝学的な研究もしやすく、遺伝⼦を⼈為的に操作する「形質転換」などの技術を容易に⾏うことができます。

論⽂
タイトル A single-nucleotide substitution of CjTKPR1 determines pollen production in thegymnosperm plant Cryptomeria japonica
著者
Hiroyuki Kakui, Tokuko Ujino-Ihara, Yoichi Hasegawa, Eriko Tsurisaki, Norihiro Futamura,
Junji Iwai, Yuumi Higuchi, Takeshi Fujino, Yutaka Suzuki, Masahiro Kasahara, Katsushi
Yamaguchi, Shuji Shigenobu, Masahiro Otani, Masaru Nakano, Masaaki Nameta, Shinsuke
Shibata, Saneyoshi Ueno, Yoshinari Moriguchi
掲載誌
PNAS Nexus
論⽂ URL https://doi.org/10.1093/pnasnexus/pgad236研究費
森林総合研究所交付⾦プロジェクト「有⽤遺伝⼦の特定に向けたスギ全ゲノム⾛査（201421）」、「スギの基盤遺伝情報の⾼精度化と有⽤遺伝⼦の機能解明（201906）」、
農林⽔産省 農林⽔産業・⾷品産業科学技術研究推進事業および⽣研⽀援センター
イノベーション創出強化研究推進事業（JPJ007097）「無花粉スギの普及拡⼤に向けた DNA マーカー育種技術と効率的な苗⽊⽣産技術の開発（Project ID 28013B）」、
⽂部科学省科学研究費補助⾦「花粉数を制御する遺伝⼦ネットワークの解明と作物への応⽤（19K05976）、植物の巨⼤なゲノムを解読・解析する⼿法（20H03239）」、「植物の巨⼤なゲノムを解読・解析する⼿法（20H03239）」、「林⽊初のピラミッ
ディング育種技術の⾼度化と実⽤化に向けた検証（21K05666）」、「稔性が回復する雄性不稔遺伝⼦の同定と⽣理⽣態（23H02263）」、基礎⽣物学研究所共同利⽤研
究「スギの全ゲノム配列の解読（16-403, 17-405, 18-408）」

共同研究機関森林総合研究所、新潟⼤学、東京⼤学、基礎⽣物学研究所、新潟県森林研究所
報道機関関係者の⽅々へのお願い
本研究に興味を持っていただきありがとうございます。本研究成果を取り上げる際には、読者や聞き⼿が研究の詳細を知り、結果の背景を正確に理解することのできるよう原典の論⽂を引⽤していただきますようお願い致します。特にウェブサイト版での記事や SNS（Twitter や Facebook、YouTube 等）等での情報発信の際には、こちらの論⽂ URL（https://doi.org/10.1093/pnasnexus/pgad236）を付けていただくことを検討いただければ幸いです。また、このお願いにつきまして⽣物科学学会- 6 -連合から提出されました「研究成果をメディアへ報道する際のお願い」（https://seikaren.org/wp/wpcontent/uploads/2023/02/to-media.pdf （外部サイトへリンク））も併せてご覧いただければ幸いです。
また英⽂によるプレスリリースも掲載誌（PNAS Nexus）から⾏われていることを申し添えます（https://www.eurekalert.org/news-releases/997816）。

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