6.3.2 γ線連続照射マウス血清中の生理活性物質量の変化を検出する方法の開発
Measuring of Physiological Activities of Substances in Serum from Chronic
Gamma-Ray-Irradiated Mice
杉原 崇, 田中 公夫
生物影響研究部

Takashi SUGIHARA, Kimio TANAKA
Department of Radiobiology
Abstract
In previous experiments, we observed p53-dependent decrease of numbers of white blood cells inmice irradiated with gamma-rays at medium-dose-rate (MDR) (400 mGy/22h/day (18.2 mGy/h)). However,the biological effects of secreted molecules in serum from mice irradiated with low-dose-rate (LDR) orMDR gamma-rays were not well investigated. Serum samples from mice irradiated with LDR or MDR
gamma-rays were characterized by cell-based-assay using mouse embryonic fibroblasts (MEFs), which is a
new method for measuring physiological activity of substances in serum. Genes having two-fold higher
expressions levels in MDR-irradiated mice to compare with those in non-irradiated mice were analyzed bygene-expression profiles. Moreover, the serum samples from LDR-irradiated mice ((20 mGy/22h/day (0.91mGy/h) for 400 days in total) were also used for the analysis. Numbers of identified genes in mice irradiatedwith MDR gamma-rays for 10 and 20 days were 613 and 1202, respectively. These results are indicating thatthe method is applicable for quantitative measurements of bio-activity.

Activity of secreted molecules inserum induced by chronic gamma ray irradiations will need further qualitative analysis.
1. 目的リンパ腫の早期発生の出現時期を調べる。本テーマ

平成 7 年度から 15 年度にかけて行った環境研でのは病理診断の結果、悪性リンパ腫と診断されたマウ寿命試験では、低線量率（20 mGy/22h/日）γ線のスの血清中の生理活性物質の変化量を調べ、それを8Gy までの長期連続γ線照射で早期腫瘍死による寿指標とすることにより、低線量率放射線照射により命短縮が認められ、腫瘍の早期発症による早期の腫悪性リンパ腫が早期に発生することを確認する事を瘍死が引き起こされることが示された。人の健康診目的とした。本年度はまず生体への放射線影響が顕断では採取の簡便さと得られる情報量が多いことか著に見られる中線量率（400 mGy/22h/日）γ線を照ら血液検査が用いられている。そのため、我々は放射したマウスの血清タンパク質を用い、低線量率連射線照射マウス血清中のタンパク質を用いることで、続放射線照射の影響を調べる方法として有効な手法

寿命試験で得られたマウスの低線量率放射線影響をであるかどうかについて検討した。

調べることが可能ではないかと考えた。本調査ではマウスへの低線量率（20 mGy/22h/日）γ 線の照射開2. 方法

始後から 100 日ごとに経時的な解剖を行い、病理学本実験方法が有効な手法であるかどうかを検討す的解析や血清等のマーカーを用いることにより悪性るため、10 日間と 20 日間（集積線量がそれぞれ 4 Gy

と 8 Gy）の中線量率（400 mGy/22h/日）137Cs-γ線照ことが確認された。中線量率（400 mGy/22h/日）の射で放射線影響が、以前の実験において顕著に見らγ 線を照射した群で非照射群と比べて遺伝子発現量れたC3H/HeNマウス（連続照射した群、及びそれら変 化 が 2 倍 以 上 あ っ た 70 個 の 遺 伝 子 の う ちの群と同日齢の非照射群：照射 10 日間の非照射対照

Lipocalin2 (Lcn2)に注目した。この遺伝子に着目した群は 5 匹、照射 20 日間の非照射対照群は 7 匹）の心理由は、Roudkenar 等によって、高線量率 γ 線を 8.5臓から血液を採取した。それぞれの個体から採取しGy 照射 24 時間後に C3H/HeX マウスの肝臓、腎臓、た血清 30 μlを 2 mlの無血清培地中に加えて、その後心臓で Lcn2 遺伝子の発現が上昇することが報告さ

各個体の血清入培地を用いてICR系マウスの胎仔線れているためである（Roudkenar et al., 2007)。Lcn2維芽（ICR-MEFs）細胞を 37℃、5％CO2下で、一日は腎機能の保護作用、腎分化誘導作用をもつ分泌蛋間培養した。培養後、それぞれのICR-MEFs細胞にト白で、腎不全の新規バイオマーカーとして注目されリゾール液を加え、RNAを抽出し、マイクロアレイている。また、鉄イオンと結合したバクテリアのシ（Agilent社）解析及び、リアルタイムPCR解析法にデロフォアを取り込み、バクテリアの増殖を抑えるより遺伝子発現解析を行った。

機能も持つことが知られている。中線量率（400mGy/22h/日）γ 線の 10 日間及び 20 日間照射マウス

3. 成果の概要

から採取した血清を培地に加えて培養した中線量率（400 mGy/22h/日）γ 線を 10 日間と 20ICR-MEFs 細胞における Lcn2 遺伝子の発現量変化を日間連続照射した群と同日齢の非照射群マウスからリアルタイム PCR 法で確認したところ、マイクロア採取した血清入培養液を ICR-MEFs に加え 1 日間培

レイ遺伝子解析の結果と同様に遺伝子発現量が上昇

養後にこれらの細胞から RNA を抽出後、照射群及していた（Fig. 1 下）。今後、今回開発した実験方法

び非照射群の血清を添加した ICR-MEFs 細胞間で遺を低線量率 γ 線長期連続照射によって生じる悪性リ伝子発現量に大きな違いが見られる遺伝子を検出しンパ腫の腫瘍マーカーを探索することに応用する計た。検出する遺伝子は 4 Gy、8 Gy のそれぞれの線量画である。

において照射群と非照射群間で遺伝子発現量の差が2 倍以上あり、かつ照射群と非照射群を比較して有引用文献意差が p<0.01 レベルのものとした。その結果、10Sugihara, T. et al. (2011) Radiat. Res., 175, 328-335.

日間の照射（集積線量 4 Gy）では 613 個の遺伝子を、

Roudkenar MH. et al. (2007) J. Radiat. Res., 48, 39-44.

20 日間の照射（集積線量 8 Gy）では 1202 個の遺伝子を検出した。また、10 日間と 20 日間のγ線連続照射で共通して有意差が検出された遺伝子数は 38個であった。10 日間と 20 日間のγ線連続照射で発現量の差が 2 倍以上あるすべての遺伝子群リストをIPA ソフトウエアのバイオマーカー解析にかけたところ、バイオマーカー候補として 70 個の遺伝子が抽出された。中線量率γ線連続照射マウスの生体内で増加した生理活性物質を含む培地を添加することにより、検知用のマウス培養細胞の遺伝子発現量が 2倍以上の変化を有することが観察された（Fig.1 上）。
この現象は、生体内の生理活性物質を同定しなくても、これらの遺伝子発現量の変動を指標とすることで生体内物質の増加を予測できる有用な方法である

Microarray analysis for a gene expression of Lcn220 days

10 days

IRCIRCReal Time PCR data
Lcn2/Gapdh

120CIR

1008060
40
2001020(days)

Fig. 1 Gene expressions of lipocalin2 (Lcn2) detected by a microarray method at medium-dose-rate(400mGy/22h/day) γ-ray irradiation (Up). The expression of Lcn2 in the irradiated micegroup was higher than that in the non-irradiated group. Gene expressions of Lcn2 weredetected by real-time PCR (Low). The gene expression of Lcn2 by real-time PCR wasconfirmed by the microarray results. Quantity of Lcn2 expression was divided by that ofGapdh expression to obtain the relative ratio (Lcn2/Gapdh). C: Non-irradiation, IR:
Medium-dose-rate irradiation.