LBAの失敗 &トラブル事例と解決策
Failure & Trouble Cases and their Solutions of LBA

10th JBF Symposium, DG2018-39

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Japan Bioanalysis Forum1

Japan Bioanalysis Forum

DG members
NameCompany

早⽥ 洋平
Yohei Hayata

株式会社新⽇本科学
Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd.

元⽊ 章裕
Akihiro Motoki

株式会社東レリサーチセンター
Toray Research Center, Inc.

奥島 綾夏
Ayaka Okushima

株式会社新⽇本科学
Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd.

⼤岡 ⾹織
Kaori Ooka

株式会社住化分析センター
Sumika Chemical Analysis Service, Ltd.

⿑藤 哲
Tetsu Saito

アステラス製薬株式会社
Astellas Pharma Inc.

⼭本 卓
Takashi Yamamoto

積⽔メディカル株式会社
SEKISUI MEDICAL CO., LTD.

※アドバイザー︓ 中村

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構成メンバー

隆広（株式会社新⽇本科学）

10th JBF Symposium, DG2018-392

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活動の内容
 2018年 5⽉ May 2018
 2018年 7⽉12⽇ Jul 12 2018
 キックオフ会議 (DG2018-38、DG2018-39の合同会議)
Kick off meeting with DG2018-38 and DG2018-39
 2018年 8⽉〜2019年 1⽉ Aug 2018 to Jan 2019
 Web会議 (平均⽉2回) 及びメールによる議論
Twice a month teleconferences and e-mail conversations
 DGサポーターへアンケート配信 Survey DG supporters

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 DGサポーターからDGメンバー募集 Member recruitment

 2018年 12⽉〜2019年1⽉ Dec 2018 to Jan 2019
 議論のまとめ及びシンポジウム発表準備
Summary of discussion and poster preparation
10th JBF Symposium, DG2018-39

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LBAは古くから⽤いられた測定法であるが、バイオ医薬品や核酸医薬品等の⾼分⼦医薬品の開発が活発化されている近年、LBAの需要性が⾼まり、未経験者が実験を⾏う機会も多い。
LBAは複数の抗原抗体反応を⽤いた測定法であるため、操作が煩雑となる上、時間や温度の影響を受けやすい。また、⾼度なハンドリングが求められ、経験が浅いサイエンティストのみならず熟練者でもトラブルへの対応が困難と感じることがある。
本DGでは、LBAにおける様々なトラブル事例を収集し、それらの対応を提案し、バイオアナリシス分野におけるLBAの普及の⼀助としたい。

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背景・目的

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Backgroud and objective
Ligand binding assay (LBA) is widely used in bioanalysis for development of
LBA is commonly based on the plural antigen-antibody reactions, and analysts
often face various troubles because： 1) operation of LBA is complicated andskillful handling is needed, and 2) the results of LBA are highly influenced byexperimental conditions such as temperature and reaction time. The purpose ofthis discussion group (DG) is to help the analysts to solve problems around
LBA in bioanalysis, collecting the various cases of trouble and sharing how tosolve them.

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macromolecular pharmaceuticals such as proteins.

In this open discussion, we will present our discussion and recommendation of
the “Knowledge to prevent failure” in LBA.

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DG2018-39のdiscussion

・DGメンバーから収集した事例と第1回アンケートで得られた事例を集約、原因や対応策について議論
・DGで判断するのが難しい事例、複数選択肢がある事例についての調査を第2回アンケートで実施

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・LBAで課題が⽣じそうな作業をDGで6項⽬に分類

・本DGでの議論と共に以前のDGでの議論内容も加味して内容をまとめたポスターを作製
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Japan Bioanalysis Forum○失敗やトラブルとその対処には⾊々な側⾯がありますが、当DG内の議論のみではどうしてもカバーしきれない部分や正しく現象をとらえられていない部分、異なった解釈が考えられる点が出てきます。
○このDGのポスター発表を⾒ていただき、上記のような点でお気づきの部分が出てくることも多いと予想しております。
○ポスター付近に付箋紙を⽤意しておりますので、どこでもポスターの気になる部分にコメントを残していただければ嬉しいです。

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DG2018-39の発表に際して○ポスターを最終化する際にできるだけ追加でいただいたコメントを含める形でまとめることを考えておりますので宜しくお願いいたします︕
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Japan Bioanalysis Forum

回答者のプロフィール アンケート①より

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Q: 所属について教えてください

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Japan Bioanalysis Forum

Q: LBA分野に従事して何年くらいになりますか

Q: LBAの実施頻度について教えてください10th JBF Symposium, DG2018-39

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回答者のプロフィール アンケート①より

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回答者のプロフィール アンケート②より

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Q: 所属について教えてください

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Q: LBA分野に従事して何年くらいになりますか

Q: LBAの実施頻度について教えてください10th JBF Symposium, DG2018-39

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回答者のプロフィール アンケート②より

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トラブル事例のカテゴリー

 機器に関して
 キットに関して マトリックスに関して
 測定法に関して

測定準備

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測定系の選択、構築

測定中
測定結果
data解析
全般的(その他)
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機器に関して (測定系の選択、構築)

考えうる要因・対応策
・おおよそ化学発光値が100万を超えた場合に顕著なクロストークが起きる可能性がある。
・クロストーク有無の判断基準をどのように設ければよいか
悩ましいが、シングルウェル測定の場合はReplicate測定のCV値で判断できるかもしれない。また複数ウェル測定の場合もプレートレイアウトを⼯夫 (Replicate測定) すればCV値で判断が可能。(測定ブロックをまたいでReplicate測定をするなど)

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事例
ECLのクロストーク対策を考慮し実施すべきでしょうか。
シングル測定ができるSQ120を使⽤することで対策となるとなりますか。

DGからの⼀⾔
バリデーション時の希釈直線性と⼀緒にクロストークを確認してみてはどうでしょう。
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Japan Bioanalysis Forum

機器に関して(測定系の選択、構築)

考えうる要因・対応策
・現状、海外臨床でGyrolabを使えるところが少ない状況。
・技術移管を想定している場合にはCRO選択が限定される。
・⾃動測定機器を選ぶメリットとしては実験者間差をなくすことに優れているという点がある。
・感度を優先する場合はECLが優れているケースが多く、スループッ
トや省⼒化を優先する場合はGyrolabなどの⾃動測定機器が優れているケースが多い。

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事例
PK系の構築開始をどのプラットフォームで⾏うか迷います。
ECLで⾏うかGyrolabで⾏うか・・・

DGからの⼀⾔
感度・コスト・機器使⽤率などの観点から優先順位をつけましょう。
ADA、バイオマーカーのプラットフォーム選択についてのアンケート結果もご参照ください。
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Japan Bioanalysis Forum

測定法に関して (測定系の選択、構築)アンケート

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Q: LBAでPK測定系を構築するとき主に使⽤しているのはどの系ですか︖ (複数選択)

DGからの⼀⾔
材料が揃いやすいELISAが最も多いと思われたが、ECLがもっとも多い結果になりました。各社とも⾃社開発時の機器のファースト
チョイスを決めているように思えます。
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Japan Bioanalysis Forum

測定法に関して (測定系の選択、構築)アンケート

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Q: 抗抗体検出系を構築する際に主に使⽤しているのはどの系ですか︖ (複数選択)

DGからの⼀⾔
予想どおり通常のBridgingがもっとも多い結果となりましたが、酸処理を⽤いている例も多く妨害物質等の影響を減らす作業も広く⽤いられているようです。
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Japan Bioanalysis Forum

測定法に関して (測定系の選択、構築)アンケート

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Q: バイオマーカー測定系を構築するときに使⽤しているのはどの系ですか︖ (複数選択)

DGからの⼀⾔
全体的な傾向はPK構築の際と同様になりました。Digital ELISAが20〜30%あることから、BM測定において⾼感度化が求められていることが分かります。
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キットに関して (測定系の選択、構築)

考えうる要因・キットがLBAガイドラインの許容基準に適合しないことがある。
・種々の原因でデータシートが再現されない経験あり。
・QC設定がないキットもある。
・メーカーによりQCの設定や許容基準が異なるケースあり。
DGからの⼀⾔論⽂等で実績のあるものを使⽤するのがよいかもしれません。
キットをそのまま使⽤するのではなく、別途標準品を購⼊してバリデーションを実施することも検討してはどうでしょうか。
スクリーニングレベルでも再現性や添加回収のみ等の簡易なバリ
デーションを実施することが好ましいと考えます。
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事例
市販キットを⽤いて濃度測定をしたが申請レベルでは使えない
データが得られました。

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キット使用の応用例 (測定系の選択、構築)

考えうる要因・対応策
DG内では以下のような意⾒があった。
・キット付属のツールはそのまま使⽤してELISA→ECL等へ変
更して感度を向上させた経験あり。
・内因性物質を除外するために複数のキットの結果を使って数値を出すケースも。
昨年のDG (DG2017-34) の結果も是⾮ご参照を︕

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事例
キットそのままだと感度や信頼性、使い勝⼿などが不⾜していた。なんとかいいやり⽅は無いですか︖

DGからの⼀⾔・キットを改変しても良いか(知財等)調査はしっかりしてから試しましょう。
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Japan Bioanalysis Forum

LBAキットでの失敗・トラブル例 DG＆アンケート

・違うキットで同じsampleを測ったら数値が全然違う。
→標準物質(recombinant)の違いやツール抗体の性質等が影響しているかも。
相対的な変化を使うと割り切るのもあり。
他にもいろいろな事例が昨年のDG2017-34に詳しく紹介してありますので是⾮JBFのHPからご確認ください︕

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・キットの試薬が⾜りない(無い)ことに後から気づいた︕→まずは中⾝を確認してから実験しましょう。

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マトリックスに関して (測定系の選択、構築)

考えうる要因・対応策
・固相化タンパク質、アナライトに結合する物質の存在など、⾊々な要因が考えられる。
・影響を受けない希釈条件の検討 (MRDを変更する)。
・抽出処理等の前処理をしてマトリックス成分の影響を減らすことが効果的なケースも。
・ADA測定の場合は，酸処理などの検討を。
・Bufferの組成で改善するケースもある。

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事例
マトリックス中に測定に影響する物質が⼊っている場合の測定系をどう設定するか迷います。

DGからの⼀⾔
基本的にマトリックスの希釈を検討することを優先して良いと思いますが、アナライトに結合する妨害物質の場合は前処理やTotal
体の測定を検討しても良いかもしれません。
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Japan Bioanalysis Forum

測定法に関して(測定系の選択、構築)

考えうる要因・対応策
・抗マウス抗体を使うと内在性のIgGが原因でバックグラウン
ド値が上昇することが多い。
・DGで固相、検出ともにに抗原を使⽤すると改善するケースのコメントがあったが、⾼感度化が難しい印象。
・競合法を採⽤する選択肢もある。
・測定系の変更(ツール抗体の変更など)により、マトリックス
効果を軽減できるケースあり。

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事例
例えばマウスにマウス抗体を投与したPK試験をどのように設計するか悩みます。

DGからの⼀⾔
感度の問題もありますが、予備的な試験としてLC/MSを使⽤することもありかと思われます。
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測定法に関して (測定系の選択、構築)

考えうる要因・対応策
・ハンドリングの問題で実験者の好みで選ぶこともある。
・384wellプレートは少量サンプリングのためばらつきが⼤きくなることもあり使⽤例は少ないが、申請⽤試験で使⽤したという例もある。条件検討の際には有⽤と考えられる。
・384 wellプレートはある程度の熟練度を要する印象があり、
96 wellプレートの⽅が幅広い実験者に適応できる印象。

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事例
測定プレートは96-well︖384-well︖どちらを採⽤されているでしょうか。

DGからの⼀⾔
384 wellプレートはハンドリングの問題から使⽤例がやはり少ないです。⾃動化と組み合わせられれば、より有⽤になると思われます。
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トラブル事例のカテゴリー
測定系の選択、構築 試薬について 温度について バリデーションについて
 メソッド開発について

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測定準備

測定中
測定結果
data解析
全般的(その他)
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試薬について①(測定準備)

考えうる要因・対応策
バックグラウンドレベルが測定に問題となるようなら…
・タンパクの種類 (阻害強度︓ゼラチン＞カゼイン>BSA)
・⼆次抗体由来動物の⾎清の添加や塩濃度、タンパク濃度を変える。
ただ強度が⾼すぎるとシグナルも低下するので選択性や再現性を確認して選択する。

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事例
Blocking溶液でバックグラウンドレベルが異なるケースが⾒られたのですが、種類や選ぶ基準は何かありますか︖

DGからの⼀⾔
アンケートではBSAを第⼀選択とする回答が多かったです。測定に影響があるならバックグラウンドと感度を考慮して複数の試薬を試して選択してみてはどうでしょうか。
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試薬について①(測定準備)アンケート

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Q: Blocking溶液の第⼀優先は何ですか︖

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試薬について②(測定準備)

考えうる要因・対応策
PBS○︓⽣体毒性が少ない。標識時に使⽤されることが多い。
×︓リン酸が影響する反応 (アルカリフォスファターゼ、リン酸化タンパク、Ca2+を含むsampleの測定など) には使⽤しない⽅がいい。
TBS○︓PBSと⽐べ、⽣体中の成分との反応性が低い。
×︓温度によりpH変化が起こる (25℃: pH7.4、4℃ : pH8) 。
⼀級アミンを構造に含んでいるのでラベル化など、⼀級アミンが影響する反応には使⽤しない⽅がいい。

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事例
緩衝液の種類が結果に影響することはありますか︖

DGからの⼀⾔
アンケートではPBSを使⽤する回答が多かったです。まずは測定
対象の特性を考慮して緩衝液を選択した⽅がいいですね。
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試薬について②(測定準備)アンケート

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Q: 好んで使う緩衝液の種類は︖

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試薬について③(測定準備)

考えうる要因・対応策
アンケートより (多い意⾒から)
洗浄buffer︓①冷蔵 (2W~6M)②常温 (1W~6M)③常温＋防腐剤 (1W)、冷蔵＋防腐剤 (1M)
希釈buffer︓①冷蔵 (1W~3M)②冷蔵＋防腐剤 (1M~3M)③常温 (⽤時調製)

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事例
カビなどが気になるのですが、試薬の保存⽅法のお勧めはありますか︖

DGからの⼀⾔
保存条件や期間は各施設それぞれでした。カビやコンタミに気を付けて保存した⽅がいいですね。使⽤時の温度むらにも注意。
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試薬について③(測定準備)アンケート
Q: (洗浄に使う)bufferの保存⽅法は︖

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Q: (希釈などに使う)bufferの保存⽅法は︖

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試薬について③(測定準備)アンケート
Q:溶液類 (不含タンパク質) (PBS、PBSTなど) の使⽤期限は︖
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Q:溶液類(含タンパク質) (BSA含有PBSTなど) の使⽤期限は︖

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温度について (測定準備)

考えうる要因・対応策
第⼀選択として-80℃で保存する。
無理な場合、委託者から指⽰された温度あるいは検体採取施設に合わせた温度で保存する。または検体採取施設で保存(例︓-20℃)後、速やかに測定施設へ搬送し保存(例︓-80℃)する。
安定性として・各施設の温度条件の安定性をそれぞれとる。
・検体採取施設の保存条件に合わせた安定性をとる。
・並⾏保存QC試料を⽤いて確認する。

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事例
検体の保存温度をどうするか悩みます。 (-80℃、-20℃︖)

DGからの⼀⾔
DG内では検体採取施設での保存条件に合わせた保存を⾏うという意⾒が多かったです。
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バリデーションについて (測定準備)

考えうる要因・対応策
重要試薬、キットLot変更のPV項⽬ (アンケート上位3項⽬)①再現性 (真度、精度)
②検量線
③選択性
安定性以外すべての項⽬という意⾒もあり。
※標準物質のLot変更の場合(検量線の新旧⽐較→旧検量線で解析し新検量線を真度で評価
︓±20%以内)

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事例
重要試薬、キットのLot変更のパーシャルバリデーション (PV)をどの項⽬まで確認するべきですか。

DGからの⼀⾔
DG内では試験担当者変更も含めて検量線と⽇内再現性で確認する
意⾒が多かったです。DG2014-12 (LBAを⽤いる定量) も是⾮ご参
照ください。
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バリデーションについて(測定準備)アンケート

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Q:重要試薬やキットのLot変更の際のパーシャルバリデーションの項目は？(複数選択)

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メソッド開発について①(測定準備)

考えうる要因・対応策
・サンプル添加量が少なくて済む測定機器に変更する。
・プレート変更 (ハーフプレート、384-wellなど) によりサンプル
添加量を少なくする。
・系の最適化により感度を上げ、MRDを下げない条件を検討する。
・検討や規制外、参考データとして測定する場合、シングルで測定する場合もある。
・動物数を増やして検体量を増やすように最初に計画する。

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事例
感度向上のためMRD(希釈倍率)を下げたいがsample量が厳しい…。

DGからの⼀⾔
可能な⼿段でまずは検討してみてはどうでしょうか。
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メソッド開発について②(測定準備)

考えうる要因・対応策①MRDを低倍率〜⾼倍率にかけて振ってみて、s/n⽐を⽐較して選ぶ。
②感度及び個体別のシグナルのバラつき (選択性) のバランスを確認する。
③求められる感度が得られる希釈倍率から、倍率を⼤きくすることが望ましい。
④キットの説明書、論⽂を参考にする。
DGからの⼀⾔
MRDが低いと⾼感度が得られますが、⼀⽅でマトリックスの影響を受けやすいです。
バランスを⾒ながら最適なMRDを決定するのが良いかもしれません。
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事例
MRDの設定判断に迷います。

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Japan Bioanalysis Forum

メソッド開発について③(測定準備)

考えうる要因・対応策
代替マトリックス
タンパク (BSA、カゼイン、⼆次抗体由来動物の⾎清など) 含
有バッファー・界⾯活性剤 (例︓Tween)、キレート剤 (例︓EDTA)、
有機溶媒 (例︓DMSO) 等を添加するケースあり
・NaCl/Na2CO3等の濃度を調整する ケースあり
測定法開発段階ではマトリックス効果の低減を志向したアプ
ローチを再現性 (添加回収) などで⾏い、実マトリックスとの差が±20%になるようにMRDや溶液組成などを検討する。

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事例
バッファー検量線の場合、代替マトリックスとして何を⽤いていますか。測定法開発段階でどんな対応をしていますか。

DGからの⼀⾔
過去のDGでもアプローチ法が取り上げられているので参考にしてください。 (DG2015-15 内因性物質の定量(2))
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Japan Bioanalysis Forum

メソッド開発について④(測定準備)

考えうる要因・対応策論⽂などで使⽤実績を確認したうえで市販のELISA⽤抗体ペアがあれば選択する。余裕があれば複数抗体を購⼊し、感度を確認する。ペプチドはエピトープの範囲が狭いので認識部位は購⼊前に確認する。
抗体の⽤途 (ELISA⽤、WB⽤など) は要確認。

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事例
ツール抗体によって⼤きく結果が異なってしまった。ツール抗体の選び⽅は︖

DGからの⼀⾔
抗体は使⽤実績があり、安定供給できるメーカーより購⼊している施設が多いようです。キット・ツール抗体を購⼊するときのメーカーの決め⽅について記載いただいたアンケート結果を次のポスターに列挙いたしました。
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Japan Bioanalysis Forum

価格、安定供給
購⼊、使⽤実績
経験から信頼のあるメーカーに決める。
怪しいメーカーであっても⼊⼿可能なメーカーは順次試す。
使⽤実績ならびにCoAの内容
信頼性
使⽤経験
安定的な供給、試験で使⽤実績あり
使⽤経験があり、過去に特にトラブルのなかったメーカーから基本的に選択する。
経験上信頼性の⾼いメーカーを優先する。
使⽤実績があるメーカー
第⼀選択はXXXX
知名度、⼝コミ
過去の経験、情報の豊富さ
論⽂など公知情報、過去の経験
社内の使⽤実績を参考にして選択複数種類購⼊して最も良いものを選ぶ
納期、価格
有名どころ
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キット、抗体を購入するときのメーカーの決め方は？アンケート39

Japan Bioanalysis Forum

メソッド開発について⑤(測定準備)

考えうる要因・対応策①中性buffer (PBS、TBS)②炭酸buffer (pH9)IgGの等電点付近のbufferを選択すると固相化しやすい傾向があるが、固相化するタンパクの種類によっては変性し、⾼バックグラウンドの原因になるケースもある。使⽤するプレートの性質にも依存するため、ケースバイケースで⽐較検討す
ると良いと考える。

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事例
抗体を固相化する際のbufferはどのように選択する︖

DGからの⼀⾔
DG内では基本は中性buffer (PBS、TBS) で固相化し、委託者指定や問題がある場合にpHが⾼いbuffer (炭酸buffer) を⽤いるケースが多かったです。
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Japan Bioanalysis Forum

メソッド開発について⑥(測定準備)

考えうる要因・対応策
DG内では可能であれば10 μLという意⾒が多かった。
アンケートでは①5 μL、②10 μL、③2 μL (最少量は0.5 μL)という意⾒が出ていた。
分取時の誤差も考慮して余裕があれば10 μLを設定し、使⽤量を抑えたい場合は2 or 5 μLまでに抑える⽅が好ましい。

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事例
溶液の微量分取の下限はどうしてますか︖測定の再現性などが気になるのです。

DGからの⼀⾔分取量が少なすぎると初⼼者と熟練者で差が出やすいのでばらつかない量を設定した⽅がいいですね。
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Japan Bioanalysis Forum

メソッド開発について⑥(測定準備)アンケート
Q:試薬微量分取の下限量は︖

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分取下限量 （μL）

10

5

2

1

0.5

0

10

20

30

40

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50

60
%

42

Japan Bioanalysis Forum

メソッド開発について⑦(測定準備)

考えうる要因・対応策
アンケートでは最低保存量として10 μLの回答が多かった。溶液の微量分取の下限の主な回答が5 μLであったので妥当な設定だと考えられる。
保存容器は500 μL PPチューブ (PCRチューブ含む) に保存する
回答が多かった。
保存時の蒸発防⽌のためパラフィルムを巻く回答は少数であった。

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事例
重要試薬の⼩分け量はどのくらいが適切ですか︖
また保存容器はどうしていますか︖

DGからの⼀⾔
DG内で⼩分け量は、7 μL : 1、10 μL : 3、13 μL : 1という回答でした。
10th JBF Symposium, DG2018-39

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Japan Bioanalysis Forum

メソッド開発について⑦(測定準備)アンケート
Q:重要試薬の⼩分け時の最低保存量は︖

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最低保存量 （μL）

15

12

10

5

0

10

20

30

40

50
%

DGからの⼀⾔他回答として1、20、30、50 μLが挙げられていました。
10th JBF Symposium, DG2018-39

44

Japan Bioanalysis Forum

メソッド開発について⑧(測定準備)
考えうる要因・対応策①MRDの変更、検量線レンジを変更する。
②シグナルが低いのであれば結合試薬を変更する。
③結合試薬が内在性因⼦への交差性を持つと感度が出ない。サンドイッチの組み合わせを変更する。
④バックグラウンドが⾼いのであればバッファー組成などを変更する。
⑤インキュベーションの温度を上げる。
⑥インキュベーション時間を⻑くすることでツール抗体とアナライトが接触する確率が上がる。

DGからの⼀⾔

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事例
必要な感度が得られません。

③について、DG内で次のような測定法の変更で改善したという意⾒がありました。
抗原固相-drug-抗イディオタイプ抗体 (ビオチン) でバックグラウンドが⾼値であったのが、アビジンプレート-抗イディオタイプ抗体 (ビオチン)drug-抗原 (ルテニウム) にしたらバックグラウンドが下がった。
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Japan Bioanalysis Forum

メソッド開発について⑨(測定準備)

考えうる要因・対応策
・陽性対照の交差性除去が不⼗分である。
・標識部位の問題等でdrugの抗原性(抗抗体への反応性)が失われている。
・ブリッジング阻害する内在性因⼦がある。

DGからの⼀⾔
ブリッジング法が不可能ならば、ステップワイズのサンドイッチにすると改善するかもしれません。

10th JBF Symposium, DG2018-39

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事例
ADAのブリッジングアッセイが構築できません。

46

Japan Bioanalysis Forum・Tweenの保存や作成頻度どうしてますか︖(プラ容器で⻑期保存すると割れる)→ガラス瓶で保存、⻑期保存しない。
・バッファーのコンタミ防⽌に防腐剤を⼊れてもいいですか︖→防腐剤の毒物としての取り扱いが厳しくなってきた事もあり、防腐剤は添加せずに、冷蔵で短期間 (1W〜2W程度) で使⽤する事例が多い。
・ブランクマトリックスの凍結融解を許容していますか︖→DG内では測定対象が含まれていないことが前提なので凍結融解を許容しているとのコメント。

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その他事例1 (測定準備)

・検量線試料は低分⼦測定のように標準溶液を作成してマトリックスに添加していますか︖→LBAの検量線試料は低分⼦測定と異なり⽤時調製なので、標準溶液を作成せずマトリックスや希釈したマトリックスで段階希釈にて検量線試料を作成するケースが多い。
10th JBF Symposium, DG2018-39

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Japan Bioanalysis Forum・分析法を外部へ技術移管する際に問題が起こります。
検量線のカーブが寝た形になってしまう、測定機器が違う。
→定量範囲を変える。
⼿技や環境が違う (添加、混合具合、室温など)。
→現場に⾏って状況確認、技術指導など
・タンパク質のラベル化効率が⾮常に悪いです。
→buffer中に阻害要因がある可能性がある。
→ラベル体のモル⽐をあげる。
→脱塩カラムで被標識体のバッファー置換をする (被標識体のpHなど⾄適条
件に合わせる)。
→ビオチン標識率測定のためHABA-Avidinと混合すると凝集して標識率が⾒た⽬⾼くなるケースもある。

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その他事例2 (測定準備)48

Japan Bioanalysis Forum

トラブル事例のカテゴリー
測定系の選択、構築

測定中 マトリックス干渉について
 測定のヒト間差について
 反応条件について
 洗浄について 抗体のロット変更について シグナル異常について(ADA Titering assay)

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測定準備

測定結果
data解析
全般的(その他)
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Japan Bioanalysis Forum

マトリックス干渉について(測定中)考えうる要因・対応策
マトリックス中のタンパク質や脂質等による⼲渉に対する対応として、DG内では以下のような意⾒が出された。
・MRDを上げる。
・⾮特異的吸着が起こらないように希釈液を⼯夫する。(界⾯活性剤の濃度を上げる。塩濃度を上げる等。)

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事例
マトリックス⼲渉を避けるための有効な⽅法はありますか︖

DGからの⼀⾔・MRDを上げられるような測定系を構築することが重要かもしれません。マトリックスを含む溶液の中で何が起こっているのか、系統的な検討が出来ると良いのですが・・・
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Japan Bioanalysis Forum

測定のヒト間差(ピペッティング)について(測定中)考えうる要因・対応策
ピペッティングに個⼈差がでることが原因の⼀つ。
DGでは以下のような意⾒が出された。
・SOPで基本となるピペッティング法を定めている。
・試験内でピペッティング法を統⼀している。
・操作内容によってピペッティング法を統⼀している (プレート添加はリピート法等) 。
DGからの⼀⾔
試験内でピペッティング法を統⼀することで個⼈差をある程度抑えることができると考えます。よく⽤いられるピペッティング法
をアンケートで回答していただきました。DG2014-12 (LBAを⽤いる定量) でのピペッティングの議論もご参照ください。
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事例
測定値に個⼈差があり、プレートへの添加量の差が原因と考えられます。何かよい解決策はないでしょうか︖

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Japan Bioanalysis Forum

ピペッティング方法について (測定中)アンケート
Q: プレート全⾯添加
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Q: 検量線やQC溶液調製

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Japan Bioanalysis Forum

測定のヒト間差(その他)について(測定中)考えうる要因・対応策
・⼿技、時間、環境の違い①洗浄後試薬を添加するまでの時間やウォッシャーから実験台までの距離を統⼀する。
②試薬添加スピードやプレートの撹拌状況が⼤きく異ならないか確認。
③洗浄後のパッティングの⼒加減や回数を統⼀する。
④実験台位置の違いによる温度差がないか確認。
DGからの⼀⾔
・細部まで分析者間で操作や条件を合わせる⼯夫をしてみましょう。
・LBAは誤差の出やすい測定系のため、基準の範囲内であれば問題無いと考えます。
・ヒト間差低減のための⾃動化も今後進んでいくかもしれません。
・dataのヒト間差についての意⾒を付箋紙等でコメントをお願いします︕
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事例・分析者によりベースラインに差が出ることがあります。
・判定基準の範囲内であるが、ヒト間のばらつきが懸念される
結果が得られました。

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Japan Bioanalysis Forum

フロアからのご意見を募集します！

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dataのヒト間差について、ご意⾒よろしくお願いします。

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Japan Bioanalysis Forum

反応条件について (測定中)考えうる要因・対応策
DGでは以下のような意⾒が出された。
・室温、1〜2時間で⾏うことが多い。
・冷蔵、終夜で反応させることもある。
・場合によっては37℃、1〜2時間で⾏うこともある。

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事例
LBAで反応時の温度や時間をどうするかで迷っています。

DGからの⼀⾔
室温、1〜2時間を基本として必要に応じて冷蔵、終夜や37℃、1〜2時間を採⽤してみては如何でしょうか。
アンケート結果でも室温、1〜2時間が基本となっているようです。
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Japan Bioanalysis Forum

反応条件について(測定中)アンケート

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Q︓ELISAやECL測定時のアナライトの反応温度、時間の基本は︖

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Japan Bioanalysis Forum

反応中の撹拌について (測定中)考えうる要因・対応策
DGでは以下のような意⾒が出された。
・ウェルに200μL⼊れたあとの撹拌でプレートシールまで溶液
がべったり来てしまったことがある。溶液量が多い時は低速を推奨する。
・incubation中の撹拌でwellの中⼼部の反応が低くなったという話は聞いたことがある。いずれにしても撹拌速度には注意。

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事例
反応中の撹拌で多少ばらつきが抑えられるケースがありますが、撹拌し続けることでなにか悪いことはありますか︖

DGからの⼀⾔
統⼀性がないと再現性に問題がでる可能性があります。撹拌する
しないは予め決めておきましょう。
反応中の撹拌操作についてアンケートでご回答いただきました。
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Japan Bioanalysis Forum

反応中の撹拌について(測定中)アンケート

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Q: 反応中の撹拌操作の基本は︖

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Japan Bioanalysis Forum

洗浄頻度について(測定中)考えうる要因・対応策
DGでは以下のような意⾒が出された。
・ツール抗体を変更する等頑健性の⾼い測定系を再構築する。
・洗浄回数、洗浄後のwait時間を最適化する。
・洗浄⽅法を変更する (ウォッシャー、⼿動洗浄等)。

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事例
洗浄頻度が低いとバックグラウンドが上がり、⾼いとsignal値の低下が起きてしまいます。

DGからの⼀⾔
アナライトとツール抗体の特異性が⾼く、結合が強いときは余り気にする必要がない印象です。頑健性の強い測定系の構築が重要だと考えます。洗浄⽅法についてアンケートで調査しました。
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Japan Bioanalysis Forum

洗浄頻度について(測定中)アンケート

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Q: プレートの洗浄⽅法は︖

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Japan Bioanalysis Forum

洗浄液の劣化について(測定中)考えうる要因・対応策
・洗浄液に菌またはカビが繁殖した。
DG内では対策としては以下のような意⾒が出された。
・洗浄液の保存温度、使⽤期限に注意を払う。
・ウォッシャーのノズルを直接保存ビンにつけない。
・防腐剤を加える。

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事例
洗浄液が⽩濁してしまいました。

DGからの⼀⾔
保存温度、使⽤期限が重要だと考えます。
(測定準備 試薬について③ アンケート参照)
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Japan Bioanalysis Forum

抗体ロットの変更について (測定中)考えうる要因・対応策
・抗体のlotにより反応性が異なる(特にpolyclonal抗体)。
対策としては以下のような意⾒が出された。
・lotが切り替わらないように⼿配する。
・新しいlotで再現性をとってやり直す。
・よいlotの抗体があればストックしておく。

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事例
市販の抗体のlotが変わったらバックグラウンドやsignalの出⽅が変わってしまいました。

DGからの⼀⾔・抗体lotの変更によりsignal等が変化したことはDG内でもかなりの⼈が経験しています。lotの変更がないように⼿配しておくことが安全だということになりました。
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Japan Bioanalysis Forum

シグナル異常について(ADA Titering assay) (測定中)考えうる要因・対応策
DGでは以下のような意⾒が出た。
・希釈でシグナルが増加することはしばしばある。⼒価が得られなかった場合希釈段階を伸ばして再分析する。
・シグナルがプラトーになることはよく経験する。
・drugがまだ存在しているが、ADAの量が多いことで陽性になっている状況かもしれない。希釈するとADAが薬物から解離しやすくなることが要因かも。

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事例
ADA Titer assayにおいて内在薬物の影響で希釈倍率に対応した
シグナル推移が得られませんでした (シグナルの異常推移)。

DGからの⼀⾔
希釈倍率を伸ばしていくことで内在性薬物の影響を軽減できる可能性があります。
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Japan Bioanalysis Forum

トラブル事例のカテゴリー
測定系の選択、構築
測定準備

測定結果
 二重測定のバラつき プレート内のバラつき プレート間のバラつき 測定結果全般に関するトラブル

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測定中

data解析
全般的(その他)
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Japan Bioanalysis Forum

二重測定のバラつき(測定結果)

考えうる要因・対応策①結合が外れやすい測定系である (例︓ペプチド等)。
→コーティング⽅法を⼯夫する (例︓ペプチドをアルコール溶媒に溶かして乾燥させる。)②固相化抗体のコーティングが上⼿くできていない。
→撹拌操作でwell内に均⼀に伸ばす。
→ECLスタンダードプレートは伸びにくい。(バッファーでのプレウェットで改善する。)③酸処理の場合、pHにムラがある。
→混液が均⼀になるようにしっかり撹拌する。
④添加時間や添加順番に差がある。
→常に同じ⽅向に添加する。
(例︓8連⼜は12連ピペットの使⽤をどちらかに固定する。)→測定機器の測定順序に従って添加する。
(例︓ECLは左下部から中⼼にかけてとぐろを巻くように添加する。)⑤ピペット操作→添加量の正確性よりも⼀定さを重視する。(リピート法で添加する。)

10th JBF Symposium, DG2018-39

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事例
デュプリケートがバラつきます。

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Japan Bioanalysis Forum(続き)⑥洗浄⽅法にムラがある。(例︓特にHRP添加後の洗浄で顕著)→ ウォッシャーを使⽤する。
⑦ほこりや繊維などのごみ→ パッティング⽅法を⼯夫する。ほこりの出にくいタオル (例︓キムテックス)を使⽤する。
⑧検量線が寝ている。シグナルから濃度に回帰した時に⼤きな差となる。
→CVの評価⽅法は濃度でなく、シグナルで評価する。
⑨特定のwellが異常の場合、ウォッシャーのノズルが詰まってる。
→ ウォッシャーのメンテナンスをする。
⑩解析時にブランク補正をする。
⑪プレート⾃体の不良 (例︓アビジンのコーティング不良、電極のはずれ)⑫多重測定数を増やし、棄却検定する。(⾮規制下)

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二重測定のバラつき(測定結果)

DGからの⼀⾔
⼆重測定のバラつきの原因や対応策は測定法の各ステップに多くあります。ピペット操作など⼿技だけでなく、視野を広げて考察してみてはどうでしょうか。
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Japan Bioanalysis Forum

事例
・Gyrolabによる測定の際にバラつきが⼤きかったので、n数を可能な限り増やして対応しました。
・CVが⼤きくなってしまい、解決法が⾒当たりません・・・
・はね値が出た時の対処⽅法はどうしていますか︖

考えうる要因・対応策①Alexaラベル体の凝集 →遠⼼操作をする。
②ニードルの詰まり →測定前の洗浄と測定後のアルカリ洗浄を実施する。きつめのデタージェントを使⽤する。

DGからの⼀⾔参考としてViewer等で視覚的に確認するといいでしょう。個別に棄却する
かの判断材料になります。(⾮規制下)
DG2015-19での「Gyrolabにおける分析法構築」もご確認ください。

10th JBF Symposium, DG2018-39

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二重測定のバラつき(Gyrolab)(測定結果)

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Japan Bioanalysis Forum

二重測定のバラつき(測定結果)アンケート
Q: 測定結果に跳ね値が出た時の対応 (⾮規制下)
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Q: 測定結果のバラつきが⼤きかった場合の対応 (⾮規制下)

10th JBF Symposium, DG2018-39

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Japan Bioanalysis Forum・濃度測定の定量下限未満、またはADA測定におけるcut point以下の検体において⼆重測定のCVが外れた場合、どのような対応をしますか︖→①濃度測定︓未希釈試料がBLOQの場合はCVが外れてもBLOQで採⽤する。
ADA測定︓個別シグナルの両⽅ともcut point未満で外れてもNegativeとして採⽤する。
→②LLOQ以下はCVの判定基準を緩くする。
→③検量線にブランクを回帰しない。
・定量下限でバラつきます。検量線範囲を適正化すると良かったのですが時間がなくそのまま実測定してしまいました。
→①測定の⽬的による。研究の初期段階はシビアに判定基準を設ける必要はないと考える。
→②下限をアンカーポイントにして、参考値にする。

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二重測定のバラつきに関するトラブル具体例

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Japan Bioanalysis Forum

プレート内のバラつき(測定結果)

考えうる要因・対応策
プレート内で添加時間の差が⼤きくなったり、プレートが乾燥することでたんぱく質が変性する可能性がある。
①プレートウォッシャーのニードルのaspiration positionを上げる。
②洗浄してから添加までプレートシールを貼って置く。
③湿ったワイパーを⼊れたタッパーに⼊れておく。
④素早く添加する。8連や12連ピペットの使⽤する。

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事例・ドリフトの克服⽅法を教えてください・・・・プレートの左側に置いたQCサンプルに⽐べて右側に置いた
QCサンプルでは、signalが半分程度でした。

DGからの⼀⾔
乾燥が原因のドリフトは冬場に起こりやすいです。
またプレートの端は乾燥しやすいので注意が必要です。
DG2015-18での「トラブルシューティング」でも触れていますのでご確認ください。
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Japan Bioanalysis Forum

プレート内のバラつき(測定結果)

考えうる要因・対応策①乾燥 (ドリフトの項⽬参照)②温度。冷たい試薬溶液を添加することでプレートが冷える。プレートの中⼼部では温度が戻りにくい。
②への対応策・添加試薬は常温までしっかり戻す。2時間くらい前から室温に戻す。容器に移すときに⼤きい容器へ移す。
・冷えた抗原や抗体などのストックを少量とり常温のバッファーで希釈する。
・プレートシールを貼り温度ムラを解消する。

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事例
エッジ効果が起きてプレート内でバラつきます。

DGからの⼀⾔ELISAで起こりやすいです。乾燥に加えて温度に注意しましょう。
インキュベーション中の温度だけでなく添加試薬の温度がカギです。
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Japan Bioanalysis Forum

プレート間のバラつき(測定結果)

考えうる要因・対応策①プレートや試薬のロット差②試薬の劣化③固相化が⼗分でない
DGからの⼀⾔
バリデーション実施時で、6回のうち1回おかしいならば、1回だけ再分析するという意⾒がありました。
またSignal ratioで評価してもいいでしょう。

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事例
ADAにおける⽇間のシグナルがバラつき再現性が得られません。

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Japan Bioanalysis Forum・バリデーションでは担当者間の差はなかったが、実試料分析で明らかに差が認められた。
→①バリデーション時と実測定時の気候の違いで、⼿技による影響が出てきます。
→②単純に慣れの問題の可能性もあります。
・測定ごとに検量線の吸光度が変わる (最⾼濃度の吸光度がAbsで1.2〜3.0) ことがあった。 QC試料は毎回基準内であったので結果は採⽤したが、室温、液温などはそれほど⼤きく違わないため原因がわからないままであった。
→温度に加えて、乾燥にも気を付けていた⽅がいいです。
ドリフトの項⽬をご参照ください。

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プレート間のバラつきに関するトラブル具体例

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Japan Bioanalysis Forum

測定結果全般に関するトラブル(測定結果)

考えうる要因・対応策
・投与後に抗原濃度が上昇し、その抗原が遊離型で多価の場
合抗抗体のように振舞うケースがある。実際に臨床試験でこの様な現象が報告されている。
・CDRが異なる抗体などを⽤いて特異性を確認するような⼿法も考えられる。
DGからの⼀⾔
通常のブリッジング法だけでは評価は難しいです。例えば固相化にFab、検出に投与した種の抗Fc抗体を⽤いた系を使うのはいかがでしょうか。
バリデーション内で抗原共存の影響を確認する場合もあります。または測定系構築の段階で予め確認しておくと良いかもしれません。
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事例
ADA測定で投与直後ポイントの測定値が上昇しました。
投与直後では抗抗体は検出しないと思うのですが・・・

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Japan Bioanalysis Forum

測定結果全般に関するトラブル具体例

・全⾃動ELISA装置を使⽤した測定系で、マトリックスの影響を検討したところBuffer条件と⾎漿条件の検量線レスポンスに乖離が⾒られた。乖離の程度の再現性が悪く、測定を重ねるごとにBuffer条件と⾎漿条件のレスポンスの乖離は⼩さくなり、最終的に重なった。
→原因として、ニードルや流路へのマトリックス成分の吸着が飽和した可能性が考えられます。

10th JBF Symposium, DG2018-39

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・予想外の相互作⽤が起こった。(例︓ヘパリン結合ドメイン)→どのような物質を扱っているかを理解しておくことが鍵です。

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Japan Bioanalysis Forum

トラブル事例のカテゴリー
測定系の選択、構築
測定準備

測定結果

data解析
 アンカーポイントの設定
 回帰式の選択
 重みづけの選択
 ブランク補正 その他

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測定中

全般的(その他)
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Japan Bioanalysis Forum

アンカーポイントの設定 (data解析)

考えうる要因・対応策
アンカーポイントは検量線のカーブフィッティングを向上させる⽬的で設ける。
シグモイダルカーブの端で傾きが⼩さくなり、回帰が安定しないようなケースに有効。

DGからの⼀⾔
除外基準については、アンカーポイント⾃体には基準を設けない
が、アンカーポイントが⾼値または低値を⽰したことにより検量
線の他のポイントが外れた場合は、アンカーポイントを除外して再解析する、などが考えられます。
10th JBF Symposium, DG2018-39

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事例
アンカーポイントの有効性や設定の仕⽅、除外基準をどのように考えればいいでしょうか︖

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Japan Bioanalysis Forum

アンカーポイントの設定 (data解析)アンケート

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Q: アンカーポイントの基本的な設定の仕⽅は︖

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Japan Bioanalysis Forum

回帰式の選択 (data解析)

考えうる要因・対応策
基本は4-parameterで良いと考える。
4-parameterは点対称なシグモイダルカーブ、5-parameterは⾮対称なシグモイダルカーブに適している。
また、4-parameterは5点以上、5-parameterは6点以上が必要である。
シグモイダルカーブ⾮対称な場合は、固相化タンパク質の不⾜が原因のケースがある。

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事例
検量線のCurve fittingに⽤いる主な回帰式は何を使えばよいでしょうか︖4-parameter、5-parameterの選択⽅法はどうしていますか︖

DGからの⼀⾔
検量線の形により適切なものは変わると考えられますが、
DG内、アンケート結果いずれも4-parameterを主に利⽤しているケースが多いようでした。
10th JBF Symposium, DG2018-39

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Japan Bioanalysis Forum

回帰式の選択 (data解析)アンケート

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Q: 検量線のCurve fittingに⽤いる主な回帰式は︖

4-parameterが圧倒的に多い結果となりました。
10th JBF Symposium, DG2018-39

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Japan Bioanalysis Forum

重みづけの選択法(data解析)

考えうる要因・対応策
LBAでは検量線のレンジが広く、シグナルのダイナミックレン
ジも広いことが多いため (特にECL)、重みづけをしないと低濃度側が外れやすい印象がある。
重み付けに関しては
http://www2u.biglobe.ne.jp/~SATORU/A1data.pdf (現場の濃度分析技術者のためのデータ解析の基礎知識)が参考になる。

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事例
検量線の重み付け (Weighting factor) の定め⽅に⼀律の⽅法はありますか︖

DGからの⼀⾔
DG内では1/Y2の決め打ちや、いろいろ試して良いものを選ぶなど様々でした。
複数試す場合は、検量線の各点のREの絶対値の和の少ない条件を選択するやり⽅があります。
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Japan Bioanalysis Forum

重みづけの選択法(data解析)アンケート

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Q: 主に⽤いる重みづけ⽅法は︖

約半数が1/y2と回答しました。
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Japan Bioanalysis Forum

ブランク補正(data解析)

考えうる要因・対応策
内因性物質の測定など、ブランクが⾼いシグナルを持つ場合
はブランク補正を考慮する。
ただしマトリックス中の総量を測っていないことになる点に注意が必要。
ブランク補正する場合の基準はCV20%やDiffrence30%など他の試料と同等。

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事例
ブランク補正をする/しないの線引きをどう考えればよいですか︖また補正する場合のブランク試料の⼆重測定の基準は︖

DGからの⼀⾔
DG内では通常ブランク補正する︓2、しない︓4と分かれました。

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Japan Bioanalysis Forum

ブランク補正(data解析)アンケート

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Q: ELISA、ECLでブランクはどのように扱っているか︖

過半数が参考値とする⼀⽅、3割ほどの⽅は検量線の補正に⽤いていました。
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Japan Bioanalysis Forum

解析ソフトのバリデーション(data解析)

考えうる要因・対応策
・定期的にダミーデータを解析し、いつも通りの結果が得られることを確認する。
・導⼊時にCSVを取るがその後の確認は⾏わない、など。

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事例
メーカー保証等がない場合にソフトの解析パフォーマンスに問題がないか確認する⽅法はどうすればよいですか︖

DGからの⼀⾔
定期的確認でも導⼊時確認でも、どちらでも構わないと考えられます。ただし解析結果の妥当性を確認していることが望ましいとされているようです。
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Japan Bioanalysis Forum

data解析に関するトラブル具体例

・ CROと解析ソフトが異なる 。
→同様の解析結果が出れば問題ないと考える。
・検量線とQCの反応性が違ってクライテリアを満たさない。
→調製法や調製⼿技を検証する。
・マトリックス抽出物とリコンビナントペプチド (配列は同じ) のFitting
curveが異なる。
→測定対象物の状態に合わせた検量線が望ましい。

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・クライアントからの指⽰で、LLOQの吸光度未満の外挿値を測定値として報告したが、不適切であったと思う。
→外挿値は報告するとしても参考値扱い。

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Japan Bioanalysis Forum

トラブル事例のカテゴリー
測定系の選択、構築
測定準備

測定結果
data解析

全般的(その他)
 LBAでのsinglicate測定について
 LBAとLC/MSの使い分けについて 自動化について
 規制下試験での測定者数
 その他
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測定中

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Japan Bioanalysis Forum

LBAでのsinglicate測定について(全般的)考えうる要因・対応策
DG内で出た意⾒は・検体が貴重なとき⾮規制下で実施するケースもある。
・基本duplicateだが、ADAのTiterのみsinglicateを検討。
・ singlicateは検討の対象から外れている。
・dataが跳ねたり、ばらつきが⼤きい測定系でのリスクが⼤きい印象。
・LC/MSをやっている⽅からはsinglicateに違和感が無いというコメントも。

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事例
LBAでのPK測定をduplicateではなく、singlicateで⾏う事ってどうなんでしょう・・・。

DGからの⼀⾔・ EBFではLBAもsinglicateを推奨するという発表があったようです。今後の状況に注⽬しておいた⽅が良いかもしれません。
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Japan Bioanalysis Forum

LBAとLC/MSの使い分けについて(全般的)考えうる要因・対応策
・本質的には、LC/MSは物質そのものの量を測定しているのと⽐べて、LBAは結合活性を数値に変えて測定しているという違いがある。
・特に抗原固相で、抗体の活性を利⽤してLBAを⽤いる場合
は、freeの抗体(に近い)量を測定していると考えるとよいかもしれない。
・抗体の濃度はLBAを使って測定されることが多いが、各測定の特徴を⽣かした選択があっても良いと考える。

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事例
LC/MSに⽐べて、LBAは複雑だし、⼿作業が多く、感度の問題
以外でどういう時にLBAを使えばいいか悩みます・・・。

DGからの⼀⾔・低分⼦に⽐べて、抗体は⾮常に親和性が⾼いので、測定の⽬的に応じてfreeとtotalの違いを意識した⽅がよいかもしれません。
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Japan Bioanalysis Forum

LBA

LC/MS(⾼分⼦)

⽐較的⾼感度

⾼感度化難しい※free drug○×

total drug

○

○

系構築期間

時間がかかることも多い(〜数か⽉)

⽐較的短期間(〜数週間)

系構築難易度

対象に依存する

⽐較的容易

測定原理

結合量

物質そのもの(部分的)マトリックスの影響

受けやすい

受けにくい

×

○

習得度による差

⼤きい

⼩さい

スループット

⾼い

低い

測定コスト

⾼い

安い

感度

IS

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LBAとLC/MSの長所、短所(全般的)※前処理に免疫化学的⼿法を⽤いたHybrid MSでの⾼感度化は可能。
(DGでは難易度やスループットの点から実際の測定における使⽤頻度は⾼くないのではとのコメントあり)

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90

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自動化について(全般的)アンケート
Q: LBAの⾃動化においてどのような装置を使⽤しているか︖ (複数選択)
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Q: LBAで⾃動化(分注ロボット、ウォッシャー、Gyrolabなどの測定装置を含む)はどのくらい進んでいるか︖

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自動化について(全般的)アンケート
Q: バリデーションをマニュアルで実施
し、検体測定を⾃動化装置で⾏いたい場
合のパーシャルバリデーションの項⽬は︖ (複数選択)http://bioanalysisforum.jp/

Q: LBAの⾃動化においてどの⼯程を⾃動化(⼀部⾃動化を含む)しているか︖ (複数選択)

ほとんどの回答者が検量線＋真度および精度の組み合わせを選択していました。
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自動化について(全般的)アンケート

必要・経験はないが必要だと考えます。測定結果に影響を及ぼす操作であるからです。
・必要、プレートウォッシャーでは洗浄具合が強すぎて、⼿動と異なるかもしれないため (最初から再現性6ランのうち3ランずつにわければよいのでは︖)
・QCと検量線の基準を満たせばよいと思う。
・必要と考える。⼿動洗浄とプレートウォッ
シャーではsignalの出⽅が変わるため。
・影響を受けそうであれば実施。
・必要。検体測定とバリは洗浄を含め同じ⽅法で実施すべき。

不必要

必要

0

20

40

60

80
%

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洗浄⽅法変更のPV実施可否

Q: バリデーションで⼿動で洗浄をしていたが、検体測定でプレートウォッシャ
ーを使⽤したい場合、パーシャルバリデーションは必要か︖

不必要
・洗浄操作に厳密な精度を求めないため。念のため結果を確認するが、⽂書化は不要と考えています。

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規制下試験での測定者数 (全般的)アンケート

複数⼈で実施する場合、各⼈がバリデーション項⽬を実施確認

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Q: 規制下のそれぞれの試験について測定者は︖

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その他の意見 DG＆アンケート

・デュプリケートの試験での添加の順番は気にしているの︖→DG内では各社で添加の順番(向き)は異なるようでしたが、順番⾃体は決めているという意⾒でした。
・固相化したプレートの保存期間→DG内ではほぼ1晩以内で使⽤するとの事でしたが、⻑期保存の場合は問題ないことを確認するという意⾒でした。2週間保存は聞いたことがあるという話も。
・検量線の各ポイントは①公⽐を遵守して設定 (1，3，9，27...) ②キリが良いように
設定 (1，3，10，30...) ︖→DG内では公⽐派が優勢でしたが、実験のやり易さを重視すると公⽐順守派、有効数字などdataの扱いやすさを重視する場合はキリよく設定派のようでした。

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・実験⼿技を習う場が欲しい (講義形式ではなく、実技で)→ピペッティング操作であればEppendorf、ELISAであればサーモフィッシャーで⾏われていそうです。

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Q1:重要試薬の⼩分け分注について、assay系構築の際も⼩分け使い切りにした⽅が良いのか︖また使⽤期限は︖
A1:冷蔵で安定な物はその限りではないと考える。使⽤期限は各試薬で反応性が異なり決められないので、各社で取り扱いを決めるしかない。
Q2:マウスにマウス抗体を投与した際のPK測定系でBGが上昇する理由は︖
A2:マウス中の⼤量のマウスIgGが少しでも⾮特異的吸着すると、検出に抗マウスIgGを使った場合に、その⾮特異的吸着したマウスIgGに反応してしまうから。
Q3:キットのlot変更などでpartial validationは必要か︖
A3:⾮規制下では必ずしも必要ないと思われるが、変更前後のdataを直接⽐較する場合は、同等性の確認をした⽅が良いと考える。

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シンポジウム当日のポスター会場でのQ&A

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シンポジウム当日のポスター会場でのQ&A

Q5:キットに含まれていた固相化抗体がワークしていなかった。⾮特異的に結合したタンパク質が特異的な抗体で検出されていた。どのような系変更の対処法があるか。direct ELISAはありか︖
A5:通常direct ELISAは⾏わない。状態の異なるマトリックス中に存在する対象物質が、必ずしもその濃度依存的に反応するとは限らない。競合
ELISAや新たな市販抗体を⽤いることなどが対処として考えられる。
Q6:初⼼者の⽅が酸変性のADA測定系でばらつく。原因は︖
A6:混合不⾜や添加時のもたつきによるプレート内の反応むらが例として挙げられる。(密度などが)異なるbuffer系の溶液同⼠を混合する際は、通常
よりもむらが⽣じやすい印象である。

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Q4:キットを信頼性基準下で使⽤するのはどのようなケース︖
A4:例えば、内在性のタンパク質を薬物として使⽤する場合、そのPKをキットで測定するケースなどが考えられる。

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Q7:シェイキングの有無で何が変わる︖撹拌の速度は⼤体どのくらい︖
A7:シェイキングによって感度を上げ、ばらつきを抑える。速度は5001000rpmほどが適切だそうです。またシェイカーで機器⾃体に熱を持つものもあるらしく、測定値にムラが⽣じたそうです。
Q8:希少マトリクスの場合、代替マトリクスはどこまで使うか︖
A8:希少マトリクスをどう使うか、MRD後の調製で使⽤量を抑えるなど
も含め、いろいろな⽅法が考えられる。代替マトリックスの選択と妥当性について⼗分検討されていれば積極的に使⽤しても問題ない。
Q9:標識体は被標識体（例えばADA分析⽤の標準物質）のロットが変わった際に作製し直すべきか︖作り直した場合、反応性の確認は何を確認するか︖
A9:実績としては、作り直す場合も作り直さない場合もある。作り直した場
合、シグナルが2倍くらい上昇した経験がある。作製時のボリューム の差異で得られる標識体の質に違いが出ることの印象がある。作り直した
場合の確認は再現性を1回だけなど。
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Q10:Gyrolabの⻑所及び短所を教えてください。
A10:⻑所︓実験に要する時間が短く、短期間でたくさんのサンプル測定が可能。LBAはヒト間差に悩まされるので、Gyrolabだと懸念する必要がない。
（例）サンプル調製に約3時間、CD1枚あたり約1時間の測定時間、CD1
枚は112サンプルなのでデュプリで56サンプル、1回の実験で2枚分の処理で、やろうと思えば1⽇3回（朝、昼、⼣⽅）できる。
ただし違う測定メソッドの場合はコンディショニングに時間を要する
ため2回が限度。
短所︓試薬にコストがかかる。
Q11:結合試薬が内在性因⼦への交差性を持つと感度がでないため、サンド
イッチの組み合わせを変更すると改善されるのはどうしてですか︖
A11:交差性を持つと⾮特異的な吸着によってバックグラウンドが上昇してしまうことで、s/n⽐が⼩さくなり感度が出ないことになります。
サンドイッチの順を変えることで、ツール抗体の親和性の良し悪しによってバックグラウンド値が変化し得るためです。
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シンポジウム当日のポスター会場でのQ&A

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Q12:検量線の各ポイントは①公⽐を遵守して設定 (1，3，9，27...) か、②キリが良いように設定 (1，3，10，30...) かどちらがいいですか︖公⽐で設定した⽅がシグモイドがきれいに描けると思っています。
A12:どちらでも問題ない。
Q13:⼆重測定精度の評価⽅法は乖離度（30%以内）とCV（20%以内）とどちらがいいですか︖
A13:意⾒が分かれるところであり、答えはない。実際のところ乖離度30%とCV20%では差はあまりみられないのでどちらを採⽤しても問題ないと考えている。
Q14:QCサンプルはプレートの端に配置しているが、頭（左端にワンセット）に配置するのとどちらがいいのか︖
A14:どちらでも問題ない。エッジ効果やドリフトなどバラつきのあるメソッドの場合、両端配置のほうが測定に問題ないかどうかを保証する材料になり得る。
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