iPS 細胞分離剤の開発
栗
丸
林
伊

原
山
藤

高
政
博

桃＊ 1
廣＊ 2
浩＊ 3
之＊ 3

Development of Separation Resin for Human Induced Pluripotent Stem Cells andits Application.
Momo KURIHARA
Takahiro MARUYAMA
Masahiro HAYASHI
Hiroyuki ITOH

In regenerative medicine using human iPS cells (hiPSCs), tumor formation caused by undifferentiatedcells remaining in hiPSC-derived cell therapy products is an important issue, and to ensure safety, remaining
undifferentiated cells must be removed in the manufacturing process of cell therapy products. It is also important
to maintain the quality of hiPSCs in order to stably produce cell therapy products derived from hiPSCs. It is known
that some hiPSCs spontaneously change their morphology and lose their pluripotency during culture. Such cells arereferred to as cells deviated from the undifferentiated state (deviated cells), and their expression of undifferentiatedmarkers is lower than that of hiPSCs. However, a method to selectively remove deviated cells and purify high-quality
hiPSCs has not yet been established.
To solve these problems, we focused on BC2LCN lectin, which binds to carbohydrate chains on the surfaceof hiPSCs, and developed a BC2LCN lectin column in which BC2LCN lectin is immobilized on a carrier. Using a
mixture of human mesenchymal stem cells (hMSCs) and hiPSCs as a model for hiPSC-derived cell therapy products,
we treated these cell mixtures with BC2LCN lectin columns and found that almost all hiPSCs were removed within
15 minutes, suggesting that the column is very effective for removing hiPSCs in a short time by a simple operation.
Furthermore, the results showed that treatment of model cells that deviated from the undifferentiated state withBC2LCN lectin columns, followed by washing with L-fucose-containing buffer and desorption of adsorbed cells on
the columns, resulted in higher undifferentiated hiPSCs than those before column treatment, suggesting that thismethod is also very effective in obtaining high-quality hiPSCs.
Our BC2LCN lectin column is expected to be a useful technology for the production of hiPSCs-derived cell therapy
products and high-quality hiPSCs.

1． 背景
＊1
＊2
＊3

法務・特許部 特許室（本社）
法務・特許部 特許室（東研）
ライフサイエンス研究所 バイオマテリアルグループ

人工多能性幹細胞（iPS 細胞）は、体を構成する全ての細胞種へと分化できる多能性を持つことから、「万27

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）

能細胞」とも言われ、京都大学の山中伸弥教授らのグ1）ループが 2006 年にマウス iPS 細胞 、2007 年にヒト
iPS 細胞2）の樹立に世界で初めて成功した。その後、

ヒト iPS 細胞の再生医療への応用が期待され、2014 年

安 定 化 BC2LCN レ ク チ ン の 作 製 と 生 産、 安 定 化
BC2LCN レクチンが固定化された iPS 細胞分離剤の作製、および iPS 細胞分離剤充填カラム（BC2LCN レク
チンカラム）の性能評価について報告する。

に滲出型加齢黄斑変性の患者に、患者自身の iPS 細胞

なお本開発品は、再生医療に用いる高品質な細胞の由来網膜色素上皮細胞シートを移植する臨床手術が世製造技術が確立されていないという社会課題に対し、界に先駆けて行われた。以降、パーキンソン病、脊椎ヒト iPS 細胞由来の治療用分化細胞およびヒト iPS 細損傷等、様々な疾患を対象にして、世界中でヒト iPS

胞の製造において、高品質な細胞を簡便で効率的に製細胞由来の分化細胞や組織を用いた臨床研究が進めら造可能な技術を提供することで、ヒト iPS 細胞を用いれており、今後、iPS 細胞由来の細胞や組織を用いたた再生医療の実用化に貢献することを目指す。

3）

再生医療市場の拡大が予想されている 。
ヒト iPS 細胞は全ての細胞種に分化できる能力を有している反面、治療用分化細胞の中に多能性を維持し

2．方法

た未分化状態の iPS 細胞（未分化 iPS 細胞）が残存し［1］BC2LCN レクチンの分子改良

た場合、未分化 iPS 細胞が移植部位で腫瘍を形成する（1）生産性が向上した低分子量化 BC2LCN レクチン

危険性があることが分かっており、ヒト iPS 細胞を用

の作製

4）

いた再生医療の実用化の大きな課題となっていた 。

天 然 型 BC2LCN レ ク チ ン は、 グ ラ ム 陰 性 細 菌

従来技術のフローサイトメトリーを用いて分化細胞と（Burkholderia cenocepacia ）が産生する BC2L − C レク

未分化 iPS 細胞を選別することは可能だが、フローサチン（272 アミノ酸残基）の N 末端ドメインに由来す

イトメトリーは処理能力が低いため、大量の細胞を選る 156 アミノ酸残基からなるタンパク質である 8）。我々

別するには、長時間を要するというデメリットがある。

は BC2LCN レクチンの大腸菌での発現量を向上させそのため、大量の分化細胞から未分化 iPS 細胞を効率るため、天然型 BC2LCN レクチンの低分子量化を試的に除去する技術の確立が急務である。

みた。具体的には、156 アミノ酸残基からなる天然型

また、大量の治療用分化細胞を得るには、増殖速度

BC2LCN レクチンのアミノ酸配列のうち、ヒト iPS 細の速いヒト iPS 細胞を大量に得たのち、目的の細胞に胞の表面に存在する糖鎖と結合する部位 8）から離れた分化させることが一般的であるが 5）、iPS 細胞の未分C 末端領域の 29 アミノ酸残基を欠失させた低分子量化維持培養において、未分化状態を逸脱した細胞、す化 BC2LCN レクチンをコードする遺伝子を作製した

なわち、本来のヒト iPS 細胞が有する多能性を失った

のち、遺伝子組換え発現用プラスミドベクターに挿入

6）細胞が偶発的に発生することが知られている 。ヒト

し、大腸菌（BL21（DE3）株）を形質転換することで、iPS 細胞を用いた再生医療の実用化には、多能性を有低分子量化 BC2LCN レクチン発現用遺伝子組換え大する高い未分化度を維持した高品質な iPS 細胞を大量

腸 菌 を 作 製 し た。 発 現 ベ ク タ ー に は pET − 28a を 用

且つ安定的に提供することが必要であり、近年の培地

い、lac プロモーターの下流にシグナルペプチド遺伝や培養基質の開発により、未分化状態を逸脱した細胞子、ポリヒスチジン遺伝子、BC2LCN レクチン遺伝子、の発生は抑えられつつあるが、iPS 細胞の製造で発生固定化用タグ遺伝子の順に挿入した。なお、BC2L − Cする未分化状態を逸脱した細胞を除去し、高い未分化

レクチンおよび BC2LCN レクチンのアミノ酸配列は、度を維持した高品質な iPS 細胞を精製する技術の確立

例えば NCBI などの公的データベースで公開されていも必須と考えられている。

る 9）。

そこで我々は、ヒト iPS 細胞の表面に特異的に存在作製した遺伝子組換え大腸菌を培養し、菌体を回収する糖鎖に対して選択的に結合するタンパク質である

後、界面活性剤や酵素を含む抽出液による BC2LCN

BC2LCN レクチン

7）を担体に固定化したヒト iPS 細レクチンの抽出と、ニッケルキレートクロマトグラ

胞分離剤を開発し、ヒト iPS 細胞由来の分化細胞に残フ ィ ー（Merck Millipore 製、His･Bind Resin） に よ

存する未分化 iPS 細胞の除去（腫瘍形成の抑制）と、る精製の各操作を順次行うことにより、低分子量化

ヒト iPS 細胞の大量製造における高品質な iPS 細胞の

BC2LCN レクチンを精製した。同様に、同一条件で天精製（多能性が失われた iPS 細胞の除去）に有効であ然型 BC2LCN レクチンを精製したのち、精製収量とることを確認した。

ヒト iPS 細胞表面に存在する H タイプ 3 型糖鎖に対

本 報 告 で は、iPS 細 胞 分 離 剤 の 開 発 結 果 と し て、
28する結合親和性を比較した 10）。H タイプ 3 型糖鎖に対東ソー研究・技術報告

する結合親和性測定は、表面プラズモン共鳴法による分子間相互作用解析装置（GE ヘルスケア製、Biacore

第 66 巻（2022）（3）クロマトグラフィーによる精製
培養した大腸菌を回収後、デオキシコール酸などのT100）を用いた。

動物由来原料を含まない当社独自組成の抽出液を用い（2）安定化 BC2LCN レクチンの作製て大腸菌内に発現した安定化 BC2LCN レクチンを抽

前記（1）で作製した低分子量化 BC2LCN レクチンの出したのち、TOYOPEARL GigaCap®CM−650M（東ソー

安定性を向上させるため、ランダム遺伝子変異導入に製）を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーにより、よる安定化 BC2LCN レクチンの作製を試みた。具体

安定化 BC2LCN レクチンを精製した 12）。精製した安的には、細胞表面に BC2LCN レクチンが結合性を有定化 BC2LCN レクチンの純度を SDS − PAGE とサイ

11）

する L −フコース含有糖鎖が存在する PC − 9 細胞 （ヒズ排除クロマトグラフィー（SEC）で分析するととも

ト肺腺癌由来細胞、ECACC 株番号：9007、ケー・エー・に、リムルスカラー KY テストワコー（富士フイルム

シーより分譲）への結合性を指標として、低分子量

和光純薬製）を用いて、大腸菌由来の毒素であるエン

化 BC2LCN レクチンをコードする遺伝子に変異を導ドトキシン濃度を測定した。

入した変異ライブラリーから、85℃での加熱処理後のPC − 9 細胞への残存結合活性が向上した BC2LCN レ
クチン発現株を取得し、安定性向上に効果的な変異を［3］iPS 細胞分離剤および BC2LCN レクチンカラムの作製

組み合わせることで、さらに安定性が向上した安定化

TOYOPEARL®HW − 40EC（ 東 ソ ー 製、 粒 径 100 ～BC2LCN レクチンをコードする遺伝子を作製した。そ300 µm、 排 除 限 界 分 子 量 10,000） を 粒 径 150 ～ 250の後、作製した安定化 BC2LCN レクチン遺伝子を基µm に分級したのち、固定化用官能基としてマレイミに、前記（1）と同様の方法により、安定化 BC2LCN

ド基を導入した固定化用ゲルを作製し、中性条件でレクチンを精製し、変性中点温度測定（熱安定性の評

安定化 BC2LCN レクチンと反応させることで、iPS価）と、H タイプ 3 型糖鎖に対する結合親和性測定

細胞分離剤を作製した 12）。次いで、作製した iPS 細を行った 10）。変性中点温度測定は、示差走査型熱量

胞分離剤 1mL を当社で設計したポリプロピレン製

計（マルバーン・パナテリティカル製、MicroCalVP −細胞分離用カラム（プロトラブズ社で作製）に充填

Capillary DSC）を用いた。

し、BC2LCN レクチンカラムを作製した（Fig. １）。
また、安定化 BC2LCN レクチンを固定化していない［2］安定化 BC2LCN レクチンの生産

TOYOPEARL®HW − 40EC（粒径 150 ～ 250 µm に分級）

（1）生産用遺伝子組換え大腸菌の作製

1mL を細胞分離用カラムに充填し、性能評価におけ

［1］
の
（2）
で作製した安定化 BC2LCN レクチンをコーる陰性対照カラムも作製した。

ドする遺伝子配列を遺伝子組換え発現用プラスミドベ
クターに挿入し、大腸菌（W3110 株）を形質転換することで、生産用遺伝子組換え大腸菌を作製した 12）。
（2）大腸菌の高密度培養
病原体の混入などの安全性の観点から、再生医療等製品の製造で使用される培地や細胞培養基材などの製Soaking solution

品は、動物由来原料を使用しないことが好ましいとされている 13）。そこで、動物由来原料を含まない当社
独自組成の培地を用いた高密度培養法により、10L 培
養槽（エイブル製、BMS − 10 型）を用いて［2］の（1）で作製した生産用遺伝子組換え大腸菌を培養した

FilterBC2LCN immobilized resin（1 mL）

12）。

具体的には、培養液中の溶存酸素濃度により追加培地量を制御する方法で、大腸菌を高密度に増殖させたのち、
イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（IPTG、

Switching valve
End cap

富士フイルム和光純薬製）を用いた発現誘導により、安定化 BC2LCN を生産した。

Fig.１

Image of BC2LCN lectin column

29

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）［4］細胞の調製

hbMSC を回収し、以下の実験に使用した。

（1）ヒト iPS 細胞の培養
ヒ ト iPS 細 胞（hiPSC：human induced pluripotent［5］BC2LCN レクチンカラムを用いた分化細胞中のstem cell）の 201B7 株、253G1 株および 1231A3 株（ラhiPSC 除去イセンス契約と MTA を締結後、京都大学 iPS 細胞研（1）細胞のカラム処理

究 所 よ り 分 譲 ） を、Easy iMatrix − 511･silk（ ニ ッ ピ

BC2LCN レクチンカラムおよび陰性対照カラムを Y製）をコートした直径 10 cm の接着培養用ディッシュ− 27632 含有 MACS 緩衝液で平衡化したのち、各カラ（Corning 製）に播種し、37℃、CO2 濃度 5％の条件

ムに hiPSC 1.0 × 106 cells と Cell Tracker Orange で染下で培養した。培地として StemFit AK02N（味の素ヘ

色した hbMSC 1.0 × 106 cells を含む細胞混合液を添

ルシーサプライ製）を用いた。培養終了後、細胞をリ加した。同カラムに Y − 27632 含有 MACS 緩衝液をさ

ン酸緩衝生理食塩水（PBS（−）
、富士フイルム和光純

らに添加し、カラムより流出した細胞を回収した。

薬製）で洗浄し、TrypLE Select ／ Versene（いずれ（2）生細胞数の計測も Thermo Fisher Scientific 製）の 1:1（v ／ v）混合液

細 胞 数 計 測 用 の 内 部 標 準 で あ る、CountBrightに ROCK 阻害剤 Y − 27632（富士フイルム和光純薬製）

Absolute Counting Beads（Thermo Fisher Scientificを添加した細胞剥離液を加えて 37℃で 5 分間静置し製 ） と、 細 胞 生 死 判 定 用 試 薬 と し て 7 − AAD（BD

た後、新たに培地を加えてピペッティングを行い剥離Biosciences 製）を用いて、添加細胞と流出細胞の各した細胞を回収した。回収した細胞を含む液を遠心分

生細胞数をセルソーター（BD 製、FACS Aria）で計

離し上清を除去した後、細胞を Y − 27632 含有 MACS

測 し た。hbMSC は Cell Tracker Orange（ 励 起 ／ 蛍

緩衝液（ミルテニーバイオテク製）に懸濁させて以下

光＝ 541 ／ 565 nm）で染色されているため、染色さの実験に使用した。なお、本報告において特に明記がれている細胞は hbMSC、染色されていない細胞は

無い場合は、hiPSC の 201B7 株を使用した。

hiPSC として判別し、各生細胞数を計測した。

（2）ヒト間葉系幹細胞の培養（3）細胞の未分化マーカー陽性率測定

hiPSC から分化誘導した体細胞のモデルとして、

添加細胞と流出細胞のそれぞれを蛍光標識 BC2LCN

ヒ ト 骨 髄 由 来 間 葉 系 幹 細 胞（hbMSC：human bone（rBC2LCN − 635、富士フイルム和光純薬製）と蛍光標

marrow mesenchymal stem cell, 細胞番号：JCRB1133、

識 TRA − 1 − 60 抗 体（R&D Systems 製、Anti − Human

JCRB 細胞バンクより分譲）を 10 cm ディッシュに播TRA − 1 − 60（R）Alexa Fluor 488 Antibody） で 染 色 し、種し、37℃、CO2 濃度 5％の条件下で培養した。培地

各細胞の BC2LCN および TRA − 1 − 60 の陽性率をセルとしては 10 vol％のウシ胎児血清（BioWest 製）を含ソーターで解析した。

むダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地（10 vol％ FBS ／ DMEM 培地）を用いた。培養終了
後、細胞を PBS（−）で洗浄し、Accutase（PromoCell［6］ddPCR 法 に よ る BC2LCN レ ク チ ン カ ラ ム の
hiPSC 除去能評価製）を加えて 37℃で 5 分間静置した後、新たに培地

BC2LCN レクチンカラムを Y − 27632 含有 MACS 緩を加えてピペッティングを行い剥離した細胞を回収し衝液で平衡化したのち、カラムに、hiPSC 5.0 × 105

た。回収した細胞を含む液を遠心分離し上清を除去しcells と hbMSC 5.0 × 105 cells を含む細胞混合液を添た後、細胞を Y − 27632 含有 MACS 緩衝液に懸濁させ加した。同カラムに Y − 27632 含有 MACS 緩衝液をさて以下の実験に使用した。

らに添加し、カラムから流出した細胞を回収したのち、（3）Cell Tracker Orange で染色した hbMSC の調製

RNeasy Mini kit（QIAGEN 製）を用いて、流出した細［4］の（2）で培養した hbMSC がディッシュ中で 80

胞から RNA を抽出した。droplet digital RT − PCR（以〜 90％まで増殖した段階でディッシュ内の培養液を下、ddPCR）法により流出した細胞中の NANOG 遺

吸引廃棄し、RPMI − 1640 培地（富士フイルム和光純

伝子コピー数を計測し、hiPSC 数および hiPSC 流出率薬製）で細胞を洗浄した。その後、あらかじめ調製しを算出した。ddPCR 法には、試薬として one step RTていた Cell Tracker Orange（Thermo Fisher Scientific− ddPCR kit for Probe（Bio − Rad 製）を使用し、装置

製 ） 含 有 RPMI − 1640 培 地 で 20 分 間 イ ン キ ュ ベ ーとして QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System（Bioトした。インキュベート後の細胞を 10 vol％ FBS ／− Rad 製）を使用した。

DMEM 培 地 で 一 晩 培 養 し、 上 記［4］の（2）と 同 様 に30東ソー研究・技術報告［7］BC2LCN レクチンカラムから流出した細胞の再培養
BC2LCN レクチンカラムを Y − 27632 含有 MACS 緩5

衝液で平衡化したのち、各カラムに hiPSC 5.0 × 10

第 66 巻（2022）

3．結果と考察［1］生産性が向上した低分子量化 BC2LCN レクチンの作製

cells と Cell Tracker Orange で染色済みの hbMSC 5.0

100 mL の培地を添加した 500 mL のフラスコを用× 105 cells を含む細胞混合液を添加した。同カラム

いて低分子量化 BC2LCN レクチン発現用遺伝子組換に Y − 27632 含 有 MACS 緩 衝 液 を さ ら に 添 加 し、 カ

え大腸菌を培養し、抽出処理後、ニッケルキレート

ラムより流出した細胞を回収した。培地として 10

クロマトグラフィーで精製した結果、精製収量は 475

vol％ FBS ／ DMEM 培地を用い、回収した細胞を 10

mg ／ L −培養液であった。一方、同一条件での天然型

cm ディッシュに播種して 37℃、CO2 濃度 5％の条件

BC2LCN レクチンの精製収量は 162mg ／ L −培養液で下で培養した。同時にカラム処理をしていない Cell

あり、低分子量化することにより、大腸菌での生産性

5Tracker Orange で染色した hbMSC 5 × 10 cells を 10

が約 3 倍向上することが明らかとなった。また、低分

cm ディッシュ 1 枚に播種して培養し、培養 3 日目に

子量化 BC2LCN レクチンの H タイプ 3 型糖鎖に対す両細胞の画像観察を行い、細胞を回収後、セルソーター

る結合親和性（解離定数：KD）は 11 nM であり、天を用いて BC2LCN および TRA − 1 − 60 陽性率を測定し然型 BC2LCN レクチンの解離定数（11 nM）と同等でた。

あることを確認した。

［8］BC2LCN レ ク チ ン カ ラ ム を 用 い た 高 未 分 化 度［2］安定化 BC2LCN レクチンの作製と機能評価
低分子量化 BC2LCN レクチンをコードする遺伝子

hiPSC の精製を鋳型としてランダム遺伝子変異導入を行い、得られ（1）未分化状態を逸脱したモデル細胞の調製
加熱処理した培地を用いて hiPSC を培養することた BC2LCN レクチンの加熱処理後の PC − 9 細胞への14）

結合性を指標としたスクリーニングにより安定性がを参考にして、未分化状態を逸脱したモデル細胞（未向上した BC2LCN レクチン発現株を取得した。取得

分化逸脱モデル細胞）を調製した。hiPSC の 201B7 株

したレクチン発現株のアミノ酸配列解析により安定

により未分化状態を逸脱した細胞を調製した文献

を Easy iMatrix − 511･silk をコートした 10 cm ディッ

性向上に寄与する 2 ヶ所のアミノ酸置換（低分子量

シュに播種し、37℃、CO2 濃度 5％の条件下で培養し化 BC2LCN レクチンのアミノ酸配列 39 番目のグルタた。培養 2 日目までの培地には StemFit AK02N を用い、ミン残基のロイシン残基への置換、同 72 番目のシス培養 3 日目からは、加熱処理培地（StemFit AK02N のテイン残基のグリシン残基への置換）を同定し、これ

B 液および C 液を 56℃で 30 分間加熱処理し、加熱処ら 2 ヶ所のアミノ酸置換を組み合わせることで、さ理していない A 液と混合して調製）で培養した。加熱

らに安定性が向上した安定化 BC2LCN レクチンを作処理培地を用いた培養では、3 日に一度培地交換を行製した。前記［1］と同様の方法により精製した安定化

い、
7 日目に
［4］
の
（1）
と同様の方法により細胞を回収し、BC2LCN レクチンの精製収量は 480 mg ／ L −培養液

未分化逸脱モデル細胞を調製した。

であり、低分子量化 BC2LCN レクチンとほぼ同等で（2）高未分化度 hiPSC の精製あることを確認した。また、安定化 BC2LCN レクチ

BC2LCN レクチンカラムを Y − 27632 含有 MACS 緩

ンの H タイプ 3 型糖鎖に対する解離定数は 3.9 nM で衝液で平衡化したのち、未分化逸脱モデル細胞またはあり、低分子量化 BC2LCN レクチンよりも結合性が［4］の（1）の方法により通常培養した hiPSC を 1.0 ×

強いことを確認した。さらに、安定化 BC2LCN レク

6

10 cells 添加した。同カラムに Y − 27632 含有 MACS

チンの変性中点温度（Tm）は 94.4℃であり、天然型

緩衝液をさらに添加し、カラムより流出した細胞を回BC2LCN レクチンおよび低分子量化 BC2LCN レクチ

収したのち、
終濃度が 0.2 M となるよう L−フコース（東ンよりも変性中点温度が 10℃以上向上していること

京化成工業製）を添加した MACS 緩衝液を添加して、を確認した（Table １）。

カラムに吸着した細胞を脱着させて回収し、それぞれ

なお、天然型 BC2LCN レクチンの X 線結晶構造解の生細胞数と未分化マーカー陽性率をセルソーターで析の結果 8） から、BC2LCN レクチンは 3 量体を形成解析した。

し、39 番目のグルタミン残基は 3 量体の中心方向に突き出ており、グルタミン残基の窒素原子と酸素原31

4,00080
A280
Conductivity

3,000

60

2,000

40

1,000

20

0

0

1,000

2,000

3,000

4,000

5,000

6,000

7,000

Conductivity［mS ／ cm］

Absorbance at 280 nm［mAu］

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）

0

Elution volume（mL）

Fig.２

Table１Chromatogram of stable BC2LCN lectin purification using TOYOPEARL Giga－Cap® CM－650M（Arrow：Collected area of BC2LCN lectin）

Properties of each BC2LCN lectin

Productivity
KD※1
Tm［mg ／ L－medium］［nM］ ［℃］
Native162
11
82.3
Low M.W.
475
11
81.9
Stable
480
3.9
94.4
※1
Dissociation constant for H－type 3 glycan

BC2LCN lectin

トグラフィーを行った。陽イオン交換クロマトグラ
フィーにはクエン酸緩衝液（pH5.0）を用い、異なる NaCl 濃度で洗浄および溶出することにより、1 段
階のカラムクロマトグラフィーで高純度な安定化
BC2LCN レクチンを精製した（Fig. ２）。精製した安定化 BC2LCN レクチンの収量は 2.5g ／ L −培養液であり、フラスコ培養時よりも 5 倍以上の生産性を達成し子は中心にある水分子との水素結合を介して、3 量体た。精製した安定化 BC2LCN レクチンの純度を分析

BC2LCN レクチンを安定化しているものと推測されした結果、SDS − PAGE で単一バンドであることを確る。39 番目のグルタミン残基がロイシン残基に置換認し（Fig. ３）、SEC 分析でも単一ピークであることされた安定化 BC2LCN レクチンでは、この水分子をを確認した。さらに、精製した安定化 BC2LCN レク

排除し、同じく中心を向いている 41 番目のイソロイ

チン溶液中のエンドトキシン濃度を測定した結果、規シン残基との疎水的相互作用が増強された結果、高い

格値（≦ 10 EU ／ mg − protein、EU：エンドトキシン

熱安定性がもたらされていると推測された。

単位）を満たす（0.4 EU ／ mg − protein）ことを確認

以上の結果から、天然型 BC2LCN レクチンの低分した。

子量化および低分子量化 BC2LCN レクチンへのランダム遺伝子変異導入により、生産性と安定性および H
タイプ 3 型糖鎖への結合性が飛躍的に向上した安定化

er

BC2LCN レクチンを作製することができた。
［3］安定化 BC2LCN レクチンの生産

kDa

動物由来原料を含まない当社独自組成の培地 3.2 L

rk
ma
ht
g
i
n
e
ti
rw
lec
ula CN
L
lec
2
o
M
BC

95

を添加した 10 L 培養槽に、生産用遺伝子組換え大腸菌の前培養液 0.3 L を添加し、溶存酸素濃度のモニタ

72
55
43

リングにより追加培地量を制御する方法で大腸菌を34

高密度培養したのち、回収した培養液から遠心分離

26により培養上清を除去して菌体を回収した。同様に動物由来原料を含まない当社独自組成の抽出液を用

17

いて大腸菌内に発現した安定化 BC2LCN レクチンを抽出し、遠心分離による上清の回収とフィルター濾

11

過による清澄化を順次行い、得られた BC2LCN レク
チン溶液の pH と電気伝導度を調整後、TOYOPEARL
GigaCap®CM − 650M を 用 い た 陽 イ オ ン 交 換 ク ロ マ
32

Fig.３

SDS－PAGE of purified stable BC2LCN lectin東ソー研究・技術報告［4］iPS 細胞分離剤および BC2LCN レクチンカラム

第 66 巻（2022）

カラムから流出した細胞への分離剤の混入を抑制する
ため、カラムの下部に目開き 40 μm のフィルターをの作製

装着し、iPS 細胞分離剤を充填して BC2LCN レクチン

（1）カラムを利用した細胞分離
簡便な方法により短時間に大量の hiPSC を処理するため、BC2LCN レクチン固定化担体を充填したカラ

カラムを作製した（Fig. １）。
（2）BC2LCN レクチンカラムの基本特性評価

ムを用いた細胞分離法を考案した。具体的には、粒子2.0 × 106 cells の hiPSC（201B7 株、253G1 株、状担体の間隙に細胞を通過させることにより、担体表

1231A3 株）をカラムに添加した場合の hiPSC の流出面に固定化した BC2LCN レクチンと結合する細胞を率は、いずれも 2％以下であり、98％以上の hiPSC が担体に吸着させ、BC2LCN レクチンと結合しない細胞

カラムに吸着することを確認した。さらに、異なる細を素通りさせる方法である（Fig. ４）
。後述するように、胞数の hiPSC をカラムに添加し、カラムへの hiPSC

本手法により短時間で大量の細胞分離が可能であるこの最大吸着量を調べた結果、1.0 × 107 cells ／ mL −分とから、BC2LCN レクチン以外の細胞結合性リガンド離剤であることを確認した。これは、hiPSC 表面に存を用いることにより、様々な細胞の大量分離が可能で在する H タイプ 3 型糖鎖に結合する安定化 BC2LCNある。

レクチンが、前記担体に固定化された後も H タイプ 3（2）iPS 細胞分離剤の作製

型糖鎖に対して結合能を有することを意味している。

安定化 BC2LCN レクチンの分子量は約 14,000 であhiPSC 由来の細胞治療製品の製造では、患者一人当たることから、安定化 BC2LCN レクチンを担体表面にり 10 ～ 20 億個（1.0 ～ 2.0 × 109 cells）の細胞が必要

固定化するため、粒子状担体として排除限界分子量がと試算されているが 15）、我々が開発した iPS 細胞分離

10,000 で あ る TOYOPEARL®HW − 40EC を 選 択 し た。

剤を用いれば、10 億個（1.0 × 109 cells）の hiPSC を

担体の間隙への細胞の目詰まり抑制と、均一な細胞分

100 mL の分離剤充填カラムで処理することができる。

離を実現するため、HW − 40EC を粒径 150 ～ 250 μm

また、iPS 細胞以外の細胞として K562 細胞（ヒト慢に分級したのち、固定化用官能基としてマレイミド基性骨髄性白血病由来細胞）、RD 細胞（ヒト胎児横紋筋を導入し、中性条件で安定化 BC2LCN レクチンと反肉腫由来細胞）、hbMSC をカラムに添加して回収率を応させることで、iPS 細胞分離剤を作製した。

調べた結果、これらの細胞はカラムにほとんど吸着せず、作製したカラムは iPS 細胞選択性が高いことを確［5］BC2LCN レクチンカラムの作製と基本特性評価認した。さらに、カラムの滅菌安定性を調べるため、（1）BC2LCN レクチンカラムの作製

カラムを 80％エタノール水溶液に一晩浸漬後、流出

小スケールでの細胞分離を想定し、上部に細胞懸濁

液中の生菌数とカラムの hiPSC 吸着能を調べた結果、液および洗浄用緩衝液を添加するリザーバーを有し、流出液中に生菌は確認されず、iPS 細胞の吸着能も変出口に三方コックを備えたカラムを設計した。また、化しないことを確認した。

hiPSC

Differentiated cell

Washing buffer
Separation resin
BC2LCN lectin

Separation resin

Differentiated cell

Fig.４

Image of hiPSC separation using BC2LCN lectin column

33

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）

認した（Fig. ６, Fig. ７）。なおカラムから流出した［6］分化細胞中の未分化 hiPSC 除去
hiPSC 由来の細胞治療製品に残存する未分化 hiPSC

iPSC のマーカー陽性率がカラム添加前の値から著し除去のモデル実験として、hiPSC 由来の細胞治療製品

く減少していることから、カラムから流出する hiPSCの代わりに分化細胞である hbMSC を用い、hbMSC

は未分化度が低いものであることが示唆される。一と hiPSC とを含む細胞混合液を用いて実験を行った。

方、同じ細胞混合液を陰性対照カラムに添加した場合

BC2LCN レクチンカラムと陰性対照カラムに hiPSCの hiPSC の流出率は 96.4％であり、BC2LCN レクチと hbMSC の細胞混合液を添加し、カラムから流出しンカラムが高選択的に hiPSC を吸着することを確認た生細胞数をセルソーターで計測することにより算出した。カラムへの細胞混合液の添加から、流出細胞のした hiPSC および hbMSC の回収率を Fig. ５に示す。

回収までの一連の操作を 15 分以内で完了したことか分化細胞である hbMSC の回収率が 93.8％であったのら、BC2LCN レクチンカラムを用いることにより、分に対して、hiPSC の流出率は 1.5％であり、hiPSC の化細胞中に混入した未分化細胞を短時間で高効率に除ほとんどはカラムに吸着し、カラムから流出しない

去できることが明らかとなった。

ことが判明した（Fig. ５）。カラムに添加した細胞と、カラムから流出した細胞の未分化マーカー陽性率を 2［7］ddPCR 法 に よ る BC2LCN レ ク チ ン カ ラ ム の種類の未分化マーカー（BC2LCN, TRA − 1 − 60）を用

hiPSC 除去能評価

いて測定した結果も、流出した細胞の陽性率は 1％未

BC2LCN レクチンカラムに hiPSC と hbMSC の細胞満であり hiPSC がほとんど含まれていないことを確

混合液を添加し、セルソーターよりも検出感度の高い

Recovery rate［％］ddPCR 法により、カラムから流出した細胞中の hiPSC
100

93.8

の細胞数を計測したのち、hiPSC の流出率を算出した

96.4

結果、hiPSC の細胞数は 2487 ± 206 個、流出率は 0.50
73.3

75

± 0.041％であり、セルソーターにより計測した場合と同等の結果であることを確認した（Table ２）。

50
25
0

［8］カラム処理後の再培養

1.5
hbMSC

hiPSC

hbMSC

BC2LCN lectincolumnFig.５

BC2LCN レ ク チ ン カ ラ ム に hiPSC と hbMSC の 細

hiPSC

Negative control
columnTable２

Recovery rate of unbound hiPSC and hbMSC to
BC2LCN lectin column（Unbound cells：cells passed through fromcolumn by MACS buffer washing）

NANOG copy number
per hiPSC
13.8±0.27

Before column treatment

99.0

Positive rate［％］99.2 97.3

57.9

50
24.5

25
1.1

34

Negative control
column

97.5

75

0

Fig.６

Number of hiPSCs Unbound hiPSC［％］
in unbound cells
0.50±0.041
2487±206

After column treatment
BC2LCN lectincolumn100

Detection of hiPSC in unbound cells to BC2LCN
lectin column by ddPCR

1.9

hbMSC

0.0
hiPSC

1.5 1.9

0.6

hbMSC

hiPSC

BC2LCN

TRA－1－60

hbMSC

hiPSC

Positive rate of undifferntiated markers of cells before and after column treatment

東ソー研究・技術報告第 66 巻（2022）

Cell Tracker Orange
hiPSC

BC2LCN

TRA－1－60

hMSC

Beforecolumn treatment

BC2LCN lectincolumn treatment

Negative control
column treatment

Fig.７

Flow cytometry of cells before and after column treatment

未分化マーカー陽性率（BC2LCN, TRA − 1 − 60）はカ

hbMSC

Unbound cells（control）

ラム処理する前の hbMSC と同等であり、hiPSC がほ
とんど混入していないことを確認した（Fig. ９）。従って、細胞混合液中に混在する hiPSC が除去されることで、BC2LCN レクチンカラムから流出した分化細胞が再培養可能であることが明らかとなった。

Fig.８ Morphologies of hbMSC and unbound cells after 3 daysin culture（Scale bar：100 µm）［9］BC2LCN レ ク チ ン カ ラ ム を 用 い た 高 未 分 化 度
hiPSC の精製
（1）未分化逸脱モデル細胞の調製
加 熱 処 理 し た 培 地（mTeSR1、STEMCELL

胞混合液を添加し、カラムから流出した細胞を再培養

Technologies 製）を用いて hiPSC を培養することでした結果、通常培養した hbMSC と細胞の形態は変わ

未分化状態を逸脱した細胞を調製した文献 14） を参考

らず、通常通り培養可能であることを確認した（Fig.

に、 加 熱 処 理 し た 培 地（StemFit AK02N） を 用 い て８）。さらに、再培養した細胞の未分化マーカー陽性

hiPSC を培養し、未分化逸脱モデル細胞を調製した。

率を、セルソーターを用いて測定した結果、2 種類の

なお、参考文献では、加熱処理した培地で hiPSC を

Cell

Unbound cells

hiPSC（control）

hbMSC（control）

Fig.９

Cell Tracker Orange

BC2LCN

TRA－1－60

99.9％
0.5％

0.0％

100.0％

1.5％

97.5％

99.9％
0.3％

1.1％

Flow cytometry of unbound cells after 3 days in culture

35

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）

培養することにより、BC2LCN や SSEA − 4 などの未変化はほとんど認められなかったが、未分化マーカー

分化マーカーの発現量が低下し、初期分化マーカーで陽性率の低い細胞、すなわち、未分化状態を逸脱したある SSEA − 1 を発現することが報告されている。

細胞が増加することが確認され、hiPSC を培養する際（2）未分化逸脱モデル細胞の形態に、未分化状態を逸脱した細胞が発生する状況を再現することができた。

hiPSC を加熱処理した培地で培養した未分化逸脱モデル細胞の形態は、通常培養した hiPSC とそれほど（4）高未分化度 hiPSC の精製

変わらなかったことから、細胞の形態だけでは、培養

BC2LCN レクチンは H タイプ 3 型糖鎖などのフコーした細胞中に未分化状態を逸脱した細胞がどの程度存

ス含有糖鎖に結合性を有し（Fig. 12）、過剰量の L −フ

在しているかは判別できないと考えられた（Fig. 10）。

コースの添加により BC2LCN レクチンと糖鎖の結合（3）未分化逸脱モデル細胞の未分化マーカー発現解析

を解離できる、つまり、BC2LCN レクチンカラムに

BC2LCN レクチンカラムで処理する前の未分化逸吸着した hiPSC は、L −フコースを含む緩衝液で洗浄

脱モデル細胞と通常培養した hiPSC の未分化マーカーすることでカラムから脱着させることができると考え陽性率を測定したところ、未分化逸脱モデル細胞の陽られる。そこで、未分化逸脱モデル細胞と通常培養し性率は 90％以下であり、通常培養した hiPSC と比べた hiPSC をそれぞれ BC2LCN レクチンカラムに添加て大幅に低下したことが判明した（Fig. 11）。加熱処

し、MACS 緩衝液を通液してカラムに吸着しない細胞

理した培地を用いて hiPSC を培養しても、細胞形態のを回収したのち、0.2 M L −フコース含有 MACS 緩衝

Culture days

Medium

0day

2day

5day

Heat－treated
StemFit AK02

StemFit AK02
（untreated）

Fig.10Morphologies of hiPSC cultured in heat－treated medium and non－treated medium（Scale bar：100 µm）

Model deviated cells

Positive rate［％］

100

84.6

89.8

98.6

98.4

hiPSC
99.8

99.2

99.9

99.8

75
50
25
0
BeforeAfter

Column Treatment
BC2LCN

Fig.11

36

BeforeAfter

Column Treatment
TRA－1－60

Positive rate of undifferntiated markers in model deviatedcells and hiPSC before and after column treatment

東ソー研究・技術報告

HO

OH
HO

O

HO
O

OH
OH

Fig.12Oた（Fig. 11）。以上の結果から、BC2LCN レクチンカ

O
NHAc

O

Me

ら未分化度の高い hiPSC を精製できることを確認しOH

O

第 66 巻（2022）

ラムを用いることにより、hiPSC の製造で発生した未分化状態を逸脱した細胞を除去し、高未分化度を維持OHした高品質な hiPSC を精製できる可能性を示すことができた。

Structure of H－type 3 glycan（Dotted line：L－fucose）

4．まとめ
液で洗浄することにより、カラムに吸着した細胞を脱以上のように、天然型 BC2LCN レクチンの分子改着させた。L −フコースを含まない MACS 緩衝液によ良により、生産性と安定性が飛躍的に向上した安定る洗浄で流出した細胞（Unbound cells）と、L −フコー

化 BC2LCN レ ク チ ン を 開 発 す る と と も に、 安 定 化

ス含有緩衝液による再洗浄によりカラムから脱着した

BC2LCN レクチン固定化担体を充填した BC2LCN レ細胞（Desorbed cells）中の生細胞数をセルソーター

クチンカラムを開発した。我々が開発した BC2LCNにより計測し、算出した各細胞の回収率を Fig. 13 にレ ク チ ン カ ラ ム は、 治 療 用 細 胞 に 残 存 す る 未 分 化示した。流出細胞（Unbound cells）の回収率は未分

hiPSC を簡便な操作により短時間で除去可能であるだ

化逸脱モデル細胞では 1.9％、通常培養した hiPSC でけでなく、未分化度が低下した hiPSC から未分化度

は 0.2％となり、また、脱着細胞（Desorbed cells）のが高い hiPSC を精製できることから、hiPSC 由来の細回収率は未分化逸脱モデル細胞では 84.2％、通常培養

胞治療製品および高品質な hiPSC の製造において有した hiPSC では 75.4％となった。通常培養した hiPSC

用な技術となると期待される。

は未分化マーカー陽性率が高く、BC2LCN レクチン

さらに、我々が開発したカラムを利用した細胞分離

カラムへの結合が強いため、脱着細胞の回収率が低く

技術は、BC2LCN レクチン以外の細胞結合性リガンドなったと考えられるが、MACS 緩衝液中の L −フコーを用いることで、他の様々な細胞の分離も可能になる

ス濃度をさらに上げることで、脱着細胞の回収率を上ことから、治療用細胞製造における分離精製技術の発げることができると推測された。

展に貢献するものと期待される。

さらに、BC2LCN レクチンカラムで処理後の脱着
細胞の未分化マーカー陽性率を測定したところ、通常

5．謝辞培養した hiPSC から得られた細胞の陽性率は 99％以上であり、カラムに添加する前とほとんど変化しな

本開発を進めるにあたり、hiPSC を用いた BC2LCN

かったが、未分化逸脱モデル細胞から得られた細胞のレクチンカラムの性能評価に関して多くのご助言をい陽性率は 98％以上となり、未分化逸脱モデル細胞かただいた大阪大学大学院工学研究科生物工学専攻・紀Model deviated cells

hiPSC

100

Recovery rate［％］

84.2

75.4

80
60
40
20
0

1.9
Unboundcells

Fig.13

0.2
Desorbed
cells

Unboundcells

Desorbed
cells

Recovery rate of unbound cells and desorbed cells from BC2LCN lectin column（Unbound cells：cells passed through from column by MACS buffer washing）（Desorbed cells：cells desorbed from column by 0.2 M L－fucose containing MACS buffer washing）

37

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）

ノ岡正博教授ならびに堀口一樹助教（現、大阪大学大学院基礎工学研究科物質創成専攻）に厚く御礼申し上げます。

6．引用文献１）K. Takahashi and S. Yamanaka, Cell , 126（4）, 663（2006）
２）K. Takahashi, et al., Cell , 131（5）, 861（2007）
３）日本医療研究開発機構（AMED）、2019 年度再生医療・遺伝子治療の市場調査（2020）
４）Hentze, H. et al., Stem Cell Res ., 2（3）, 198（2009）５）堀口一樹、生物工学、97（11）, 663（2019）６）金美海、紀ノ岡正博、生物工学、96（6）, 333（2018）７）H. Tateno, et al., J. Biol. Chem ., 286（23）, 20345（2011）
８）O. Sulak, et al., Structure , 18
（1）
, 59（2010）
９）GenPept URL：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
protein/（BC2L − C レクチン登録番号：WP_006490828）
10）特開 2020 − 025535
11）平谷一人、日本胸部疾患学会雑誌、29
（9）
，1096
（1991）
12）特開 2022 − 122816
13）佐藤陽治、『再生医療等製品原料基準』のあり方に関する検討 WG 報告書（2014）14）T. Watanabe, et al., Biochem. Biophys. Res.

Commun ., 529, 575（2020）15）R. Zweigerdt, Adv. Biochem. Eng. Biotchnol ., 114,
201（2008）

38