アプリケーションノート

食品検査・農業

高分解能 GC/Q-TOF によりヘンプオイル中で同定された化合物に基づく天然物の精密質量ライブラリ

著者

Sofia Nieto andMatthew Curtis
Agilent Technologies, Inc.

概要

このアプリケー ションノートで は、 ヘンプ CBD オイル の 包 括 的 な GC × GC デ ータに 基 づく、GC/Q-TOF MS の精密質量天然物ライブラリの作成について説明します。包括的 な GC × GC 手法を用いて複雑 なマトリックスをクロマトグラフィーにより分離することで、一次元（1D） GC 分離を用いた場合よりも優 れた結果 を得ることができました。ライブラリがヘンプ CBD オイルサンプルから直接構築されたため、化合物 を正確 に同定して明瞭 なスペクトルを抽出するには、GC × GC 手法 が必要でした。この 研究 では、GC/Q-TOF 電子イオン化（EI）天然物スペクトルライブラリを用 いた、ターゲット/ノンターゲットスクリーニングワークフローの例を示します。

はじめにAgilent MassHunter Quantitative Analysis ソ フト ウ ェ ア 10.2 のに取り入 れたりすることは、世界中の多くの分野で人気 が高まっていま

GC × GC ソフトウェア 2.9 を用いて GC/Q-TOF データを処理しました。

ヘンプオイルや CBD オイルを直接製品として使用したり、その他の製品す。ヘンプ植物（大麻）は、特に織物繊維や建築資材などのさまざまな用途に使用されてきた、非常に豊富な天然資源です。1,2 ヘンプから生成される潜在的な生物活性化学物質のグループとしては、カンナビノイド、Agilent Unknowns Analysis ソフト ウェア ツ ー ル、 お よ び Agilent

MassHunter Qualitative Analysis ソ フト ウ ェ ア 10 と GC Image

化合物の初期同定には、NIST 17 ライブラリと NIST 20 ライブラリを使用しました。

テルペン、フラボノイドなどがあります。3 ヘンプおよびヘンプ製品の化学分析における重要な方向性の 1 つは、さまざまなヘンプ株の化学組成を調査し、特定の化学的特性を持つ化合物を特定することです。

ヘンプ 由来 の 濃縮 CBD オイルは 複雑 なサンプルであり、通常 はシンプルな 1D 構成 で 350 ～ 560 個 の 分離 ピークが 生成 されます。このため、個々の化合物をクロマトグラフィーにより分離するには、包括的な GC × GC 手法 が適しています。高分解能精密質量 GC/MS は、より正確 な化合物同定 に適しています。このアプリケーションノートでは、Agilent 7250 GC/Q-TOF を用いて、これらのサンプルタイプのリテンションインデックス（RI）ベースの EI 精密質量ライブラリを作成する方法を説明します。目的は、全体的なデータ分析時間を短縮し、このサンプルタイプ固有の化合物をより正確に同定できるようにすることです。

実験方法

サンプルと抽出この研究で使用したサンプルには、犬用のおやつに使用される 5 種類のヘンプ CBD オイルが含まれていました。

データ取り込みとデータ処理

高分解能 7250 GC/Q-TOF MS を用いて、CBD オイルサンプルと大麻サンプルは、抽出物を分析しました。
1D GC と、Zoex ZX2 サーマルモジュ

レータ（図 1）と Agilent 7890B GC を用いた包括的な GC × GC 構成で分離しました。Agilent J&W DB-5ms ウルトライナート 30 m カラムを使用して、1D GC データを取り込みました。GC × GC 構成では、1 次カラムとして Agilent DB-5ms ウルトライナート 30 m カラム、2 次カラム

図 1. Zoex ZX2 サーマルモジュレータの構成図
表 1. データ取り込みパラメータ
GC および MS 条件

タの詳細は、表 1 を参照してください。化合物の同定とライブラリ収集のため、RI をアルカンラダーに基づいて計算しました。

1D
Agilent 7250 GC/Q-TOF

GC
注入口
注入口温度
注入量

カラム

として 2.8 m Agilent J&W DB-HeavyWAX を組み合わせて使用しました。
データは EI モード、70 eV で取り込みました。データ取り込みパラメー

2DMS

Agilent 7890B GC
マルチモード注入口、4 mm Agilent ウルトライナートライナ、シングルテーパライナ（ウール入り）

280 ℃
1 µL

1 次：Agilent J&W DB-5ms

ウルトライナート、

30 m × 0.25 mm、0.25 µm
2 次：Agilent J&W DB-プログラム

60 ℃で 5 分間、3 ℃ /min で290 ℃まで昇温、25 分間保持

キャリアガスカラム流量

モジュレーションサイクル：–
60 ℃で 5 分間、4 ℃ /min

で 300 ℃まで昇温、25 分間保持

ヘリウム

6秒

1 mL/min 定流量モード–

低温噴流

13 L/min––高温噴流時間300 ℃
320 ms–

高温噴流温度トランスファライン温度

280 ℃

イオン源温度

200 ℃

四重極温度150 ℃

イオン化エネルギー

70 eV

イオン化電流スペクトル採取レート

質量範囲20.25 mm、0.25 µm

HeavyWAX、2.8 m × 100 μm、0.1 μm
オーブン温度Agilent J&W DB-5ms

ウルトライナート、30 m ×5 µA
50 Hz

5 Hzm/z 40 ～ 650

結果と考察2D リテンションタイム（RT）により化合物の化学的分類を確認すること

で、化合物の同定の信頼性が大幅に向上しました。

天然物の精密質量ライブラリの作成

さらに、フラグメントイオンの精密質量と正確 な同位体比 を使用して可包括的 なパーソナル化合物データベースライブラリ（PCDL）を作成し、の 信頼性 を向上させました。化合物スペクトルの Fragment Formulaです。これらの複雑 なサンプルをクロマトグラフィーで適切に分離するたて実行しました（図 3A）。個々のイオンの元素組成に基づいて m/z 測定を使用して同じサンプルセットを分析し、精密質量ライブラリとスクリーニにエクスポートしました（図 3）。異性体 の明確 な同定 が不可能 な場合この研究の目的は、 ヘンプ CBD オイルサンプルに基づいて精密質量の標準的な 1D GC 構成で確実に高速スクリーニングできるようにすること
め、包括的な GC × GC 構成を使用してデータを収集しました。1D 構成ング手法を検証しました。

GC Image GC × GC ソフトウェアを用いて GC × GC データを視覚化し、NIST 17 ライブラリと NIST 20 ライブラリを用いて化合物を暫定的に同定しました。アルカンラダー C8 ～ C30 を用いて一次元目の Kovats

能性 のある元素組成 を減らすことで、CBD オイルサンプルの成分同定

Annotation は、MassHunter Qualitative Analysis ソフトウェアを用い値を理論値に自動変換してから、アノテーション付きスペクトルを PCDLは、化合物名の代わりにインデックス付き分子式を化合物に割り当てました。最新の PCDL には約 350 個の化合物スペクトルが含まれており、そのうち 260 個以上のエントリに名前と構造が割り当てられています。

RI を計算し、さらなる化合物同定に使用しました。2D プロットでは、各化合物種の明確な分離が見られます（図 2）。

図 2. CBD オイルサンプルの GC × GC/Q-TOF クロマトグラム上の化合物種のマッピング

3A×105

2.095.0854[C7 H11]+

1.81.6Counts

1.4
1.2
1.00.80.6
0.40.2041.0385[C3 H5]+404567.0542[C5 H7]+55.0542[C4 H7]+5055606570110.1088[C8 H14]+79.0541[C6 H7]+7580859095121.1010[C9 H13]+136.1245[C10 H16]+

154.1350[C10 H18 O]+

100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160

Mass-to-charge (m/z)

B

図 3.（A）スペクトルの Fragment Formula Annotation は、高品質な精密質量ライブラリの作成における重要なステップです。
（B）ヘンプと天然物の PCDL には、リテンションタイムとリテンションインデックスの両方が含まれます。すべてのスペクトルに、フラグメントイオンの m/z 理論値が割り当てられています。

4

PCDL 内のさまざまな化合物種の内訳は、図 4 のとおりです。可能な場合は式を同定しています。PCDL に含まれるスペクトル全体の約半数は、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、および各種アルコールです。

精密質量ライブラリを用いたターゲットおよびノンターゲットワークフロー

ターゲットとノンターゲットのいずれのワークフローも、天然物 PCDL と、ヘンプ CBD オイルサンプルから取り込んだ 1D GC/Q-TOF データを用いて評価しました。ノンターゲット分析は、Unknowns Analysis ソフトウェアを用いて実行しました（図 5）。精密質量用のデコンボリューションア

ルゴリズム（SureMass）を使用してマトリックスから個々の成分を分離し、新しい天然物 PCDL を使用して化合物を同定しました。特筆すべきは、1D と 2D の GC メソッド間でオーブンプログラムが異なるにもかかわらず、成分およびヒット間の RI の差異が小さかった点です（図 5B）。

ターゲットスクリーニングは、MassHunter Quantitative Analysis ソフトウェアで、GC スクリーナアルゴリズムを使用して実行しました（図 6）。
このワークフローでは、標準物質も使用すれば、サスペクト化合物スクリーニングとターゲット定量が同時に容易に行えます。この方法のもう 1つの利点 は、化合物ごとに非常に柔軟にパラメータを設定できることです。各ワークフローのスクリーニング条件を個別に最適化し、偽陽性と偽陰性を最小限に減らしました。

図 4. PCDL 内の化合物種5

図 5. Agilent MassHunter Unknowns Analysis ソフトウェアでのノンターゲットスクリーニング。
（A）SureMass は、単一成分スペクトルを効率的に抽出できる精密質量デコンボリューションアルゴリズムです。
（B）ExactMass 機能では、スペクトル中の精密質量イオンがヒットの分子式のサブセットと一致するかどうかを検証できるため、偽陽性をなくすことができます。

6図 6. Agilent MassHunter Quantitative Analysis ソフトウェアのターゲットスクリーニング概要ウィンドウ

いずれの場合も、（マニュアル操作で検証して確認）真のヒットのほとん
どが、80 以上という高いライブラリ一致スコア（LMS）で検出されました（表 2 および 3）。ノンターゲット手法を使用した場合、LMS が 80 未満の真のヒットの数が、ターゲットスクリーニングと比べてかなり多くなっています。ターゲットスクリーニングを使用した場合には、真のヒットのほとんどの LMS が 90 を超えています。LMS 閾値は、スクリーニングメソッ

ドにおける主要パラメータの 1 つです。このため、これら 2 つの手法の違いに注意し、アプリケーションごとに個別に最適化することが重要です。
全体的に、精密質量天然物 PCDL を用いたスクリーニングワークフロー

では、ターゲットとノンターゲットのいずれの手法を用いても、同定され表 2. CBD オイルおよび大麻サンプル全体の、LMS によるノンターゲットスクリーニングで確認された化合物の割合
一致スコア

CBD1

CBD2

CBD3

CBD4

CBD5

CBD6

大麻抽出物

> 90

45.4

48.5

42.5

39.2

41.5

49.3

45.2

80 ～ 90

20.1

20.4

24.8

24.2

24.6

23.3

18.3

< 80

34.5

31.1

32.7

36.6

33.8

27.4

36.5

表 3. CBD オイルおよび大麻サンプル全体の、LMS によるターゲットスクリーニングで確認された化合物の割合る化合物の数にそれほど違いはありません（表 4）。そして、ターゲットス

一致スコア

CBD1

CBD2

CBD3

CBD4

CBD5

> 90

69.0

63.8

71.4

76.3なります。

80 ～ 90

20.5

19.1

16.9

12.1

< 80

10.5

17.0

11.7

11.6

クリーニングのほうが、全サンプルで同定される真のヒット数が少し多く

CBD6大麻抽出物

64.4

63.1

50.4

16.7

20.9

23.9

19.0

16.025.6

表 4. ターゲット/ノンターゲットスクリーニング手法で同定された真のヒット数の比較

ワークフロー /サンプル名

大麻

CBD1

CBD2

CBD3

CBD4

CBD5

CBD6

ターゲットス

抽出物

クリーニング

187

201

230

233

169

172112

ノンターゲット

スクリーニング

174

196

214

227

142

146

1047

結論

このアプリケーションノートでは、GC × GC/Q-TOF MS で分析したヘンプ CBD オイルサンプルを用いた、大麻素材およびその他の天然物の新しい精密質量ライブラリの作成について説明しています。このライブラリは

1D GC/Q-TOF データで使用できるように設計されており、申請すれば無料で使用できます。ターゲット/ノンターゲットのいずれのワークフローも

参考文献
1.

Andre, C. M.; Hausman, J.; Guerriero, G. Cannabis Sativa: The
Plant of the Thousand and One Molecules. Front. Plant Sci.
2016, 7, 19.DOI: 10.3389/fpls.2016.00019

2.

Gallily, R.; Yekhtin, Z.; Hanus, L.O. The Anti-Inflammatory
Properties of Terpenoids from Cannabis. Cannabis Cannabinoid
Res. 2018, 3(1), 282–290.DOI: 10.1089/can.2018.0014

3.

Flores-Sanchez, I. J.; Verpoorte, R. Secondary Metabolism inCannabis. Phytochem. Rev. 2008, 7, 615–639.

この天然物 PCDL に対応しています。そして、ターゲットスクリーニング手法のほうがやや高感度です。

免責事項

アジレントの製品および溶液は、大麻の品質管理および安全性試験を目的とした、州/国の法律で許可されているラボでの使用を想定しています。

ホームページ

www.agilent.com/chem/jp

カストマコンタクトセンタ

0120-477-111

email_japan@agilent.com
本製品は一般的な実験用途での使用を想定しており、医薬品医療機器等法に基づく登録を行っておりません。
本文書に記載の情報、説明、製品仕様等は予告なしに変更されることがあります。
DE00519179

アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 2022
Printed in Japan, November 2, 2022
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