● NMR による糖鎖構造解析
株式会社東ソー分析センター

南陽事業部 解析グループ
大阪大学 理学研究科

株式会社東ソー分析センター

南陽事業部

田中真木
梶原谷本

解析グループ孝勇太
康宏
典之

抗体糖鎖を構成する主要な単糖は、中性糖のガラク

1．はじめにトース（Gal）、マンノース（Man）、フコース（Fuc）、糖鎖は単糖がエーテル結合により連なった構造をしアミノ糖の N −アセチルグルコサミン（GlcNAc）、酸ており、生体内において糖脂質や糖タンパク質といっ性糖の N −アセチルノイラミン酸（NeuNAc）の 5 種た複合糖質、及び遊離糖鎖として普遍的に存在する。

類である（Fig.1c）。これらの構成単糖はいずれも 6

これらの糖鎖は細胞の分化、タンパク質の構造安定性員環であり、その炭素及び水素には 1 〜 6 位（NeuNAcの制御、タンパク質寿命の決定など、その構造によりは 1 〜 9 位）の番号付けがされている。このうち、2、様々な生物活性に関与する。ヒトにおいては、糖鎖を3、4、6 位には、他の糖とグリコシド結合できる水酸構成する単糖には修飾体も含めると 10 種類以上存在基が存在する（Fig.1d）。また、1 位の水酸基が、環とし、発現する場所により特徴的な単糖種が選択され、同一平面上に位置する equatorial 配置のβアノマーと多様な糖鎖構造を形成、多様な機能を発現する。

水酸基が環に垂直な axial 配置のαアノマーの 2 種類

抗体（本稿では特に Immunoglobulin G; IgG を指す）が存在する（Fig.1e）。

は糖タンパク質であり、これを有効成分とする抗体医抗体糖鎖は（i）多種の単糖から構成される「複合薬品は、近年急速に研究開発が進められているバイオ型」、（ii）マンノース残基が大半を占める「高マンノー医薬品の 1 種である。抗体機能と糖鎖構造は密接に関ス型」、（iii）（i）と（ii）が複合した「混成型」の 3 種

わりがあり、糖組成および糖鎖構造はアミノ酸組成や類に大別される。また、例えば単に「複合型」といっ配列等と並び、医薬品規制調和国際会議（ICH）のガても、生合成メカニズムの不完全性により、構成単糖1）の種類や数、分岐や結合様式により多様な構造が見らイドライン（Q6B）に解析の必要性が示されている 。
そこで本報告では、抗体機能と糖鎖構造の関連、及び主に NMR を用いた糖鎖構造解析技術についてまとめた。なお、本技術は SDGs で掲げる国際目標「すべてabNeuNAcの人の健康と福祉」という社会課題に対し、分析技術の深化と発展により高機能かつ安全な医薬品の開発に貢献することを目指す。

Galc

抗体は 2 本の重鎖と 2 本の軽鎖から構成される150kDa の糖タンパク質であり、重鎖 CH2 ドメイン中Gal(G)載する。またセリン（Ser）及びスレオニン（Thr）残基の酸素（O）に結合する、O −結合型と総称される糖鎖の存在の報告もあるが本稿では取り上げない。

GlcNAcGlcNAc(GN)NeuNAc(NA)6’5’ 2’3’窒素（N）に結合していることから、一般に N −結合に付加する N −結合型糖鎖のことを「抗体糖鎖」と記

Fuc(F)GalManMan GlcNAc
GlcNAce4’鎖が結合している（Fig.1a,b）。この糖鎖は Asn 側鎖の型糖鎖と総称される。本稿では以降、抗体の Asn297

Man(M)

dの 297 番目のアスパラギン（Asn297）残基に 1 対の糖FucManN-Linked
glycans
NeuNAc2．糖鎖構造と抗体機能

GlcNAcFig.１

1’α-anomer

β-anomera) 3D structure of IgG (PDB ID: 1IGY). N-Linked
glycans are represented by red sticks. b) An exampleof the N-linked glycan of anti-bodies. c) Mainconstituent monosaccharides of antibodies. d) The
hydroxy groups which can form the glycosidic bonds.
The numbing of carbon and hydrogen atoms isannotated by blue letters. e) The anomers of Gal.

99

TOSOH Research & Technology Review Vol.63（2019）れる 2）。の共同研究により実施した。

抗体糖鎖の構造は抗体の活性や動態、安全性等と密接に関わりがある。抗体糖鎖の還元末端の Fuc を除去、またはバイセクティング GlcNAc の付加量が増加する

4．NMR による糖鎖構造解析技術の導入と抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性が増強される。
また、非還元末端 Gal が増加すると、補体依存性細胞
3）傷害活性が増強されるとされている 。抗体の薬理活

NMR による糖鎖構造の解析技術導入のため、測定及び構造解析手法の導入を検討した。

性を制御するためには、抗体糖鎖の構造を把握することが重要である。

［1］検討試料
N −結合型糖鎖は、梶原教授らが単離した Gal(β1-4)3．抗体糖鎖の構造解析

GlcNAc( β 1-2)Man( α 1-6)[Gal( β 1-4) GlcNAc( β 1-2)
Man( α 1-3)]Man(β1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc(β1)-Asn

抗体糖鎖を測定、同定する技術としては、HPLC ／及 び NeuNAc(α2-6)Gal(β1-4) GlcNAc(β1-2)Man(α蛍光検出法、キャピラリー電気泳動法、高速陰イオ1-6)[NeuNAc( α 2-6)Gal( β 1-4)GlcNAc( β 1-2)Man( αン交換クロマトグラィー／電気化学検出器法、質量分1-3)]Man(β1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc(β1)-Asn と、( 株 )析法が現在広く用いられている。特に、質量分析法ア ク ロ ス ケ ー ル よ り 購 入 し た Gal(β1-4)GlcNAc(β（MALDI − TOF ／ MS、LC − ESI − MS） は ng オ ー ダ ー1-2)Man( α 1-6) [NeuNAc( α 2-6)Gal( β 1-4)GlcNAc( β試料から分子量やフラグメント等の構造情報を得るこ1-2)Man(α1-3)]Man(β1-4)GlcNAc(β1-4)[Fuc(α1-6)]とが可能であり、弊社でも質量分析法を用いた糖鎖同GlcNAc(β1)-Asn 及び Man(α1-2)Man(α1-6)[Man(α定手法を確立、分析事業を展開している。中でも LC1-2) Man( α 1-3)]Man( α 1-6)[Man( α 1-2)Man( α 1-2)

− ESI − MS ／ MS 法は高精度に糖鎖構造を同定可能でMan(α1-3)]Man(β1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc(β1)-Asnあるが、解析には標品の LC 分離パターン、MS 及びの計 4 試料（凍結乾燥品）を用いた。以下、本稿ではMS ／ MS スペクトルとの照合が必須である。

各々 G2、S2G2、SG2Fb、M9 と表記する。

また、溶液 NMR による糖鎖構造解析技術も発展してきた。これまでに 2 次元構造および 3 次元構造解析、動態解析、相互作用解析等の様々な測定、解析手法が4）確立されている 。

［2］前処理S2G2 1.0mg を PP 製サンプルチューブに量り取り、99.96％の重水（2H2O、以下 D2O）約 100µL に溶解し溶液 NMR の利点は主に以下の 2 点である。

た後、N2 パージにて乾固した。この操作を追加で 2①試料を D2O 等の溶媒に溶解することで簡易的に回繰り返した後、1.7mm NMR 試料管に封入した。

測定でき、非侵襲的で測定後の試料の回収が可能で（NMR 測定では主に 1H 原子を観測する。そのため、ある。

試料の解離性 1H やサンプルチューブ壁面に付着した②溶液内における糖鎖の構造や動態に関する情報を軽水（1H2O）は解析の妨げとなる。特に微量での測定、原子レベルで得ることができる。

解析の場合、その影響は自ずと大きくなる。上記の操

特に構造解析については、原子を繋げていくことで単作は、これらの影響を最小限にする。）

糖種やグリコシド結合を解析するため標品が必要無
く、構造未知な抗体糖鎖を解析可能である。一方で、上記で述べた他の測定法に対して低感度であり、比較的大量の試料が必要であるという問題点がある。

［3］NMR 測定及びデータ処理
1.7mm CryoProbe を 装 着 し た 700MHz NMR を 用い、1 次元 1H NMR 及び各種 2 次元 NMR スペクトル

弊 社 で は 2018 年 に、 検 出 系 を 極 低 温 に し て 熱を測定した（Table. 1）。2 次元 NMR スペクトルでは、ノ イ ズ を 軽 減 し た 微 量 溶 液 用 プ ロ ー ブ（1.7mm

各 1H 原子の置かれた周辺環境に応じて 2 次元方向にCryoProbe）を装着した 700MHz NMR を導入し、特分離することで 1H ピークの重なりを緩和し、解析のに 1H 原子について単位質量当たり国内最高感度を誇曖昧さを除くことができる。2 次元方向のデータは離る。本報告では、この装置を用いた測定、解析技術の散的に取得し、高速フーリエ変換（FFT）により処理検討結果と展望について報告する。なお、本研究は大することでスペクトルを得た（通常手法）。解析には

阪大学 理学研究科 梶原康宏教授及び真木勇太助教とTopSpin4.0.6 及び sparky ver.3.1145）を用いた。

100

東ソー研究・技術報告

2D NMR spectra measured for 1.0 mg of S2G2.
NS2)Duration3)(min)2,048 ( H)
2,048 (1H)
4,096 (13C)
2,048 (13C)
2,048 (13C)
1,024 (13C)

242288133
271
220
113458497

－－

1,692

1

DQF-COSY
TOCSY
edited-HSQC
edited-HSQC4)
HSQC-TOCSY
HMBC
Total5)aAnomeric protons

NeuNAc-3’’

NeuNAc-3’b
GN1,2-2’
GN1,2-6’
G1,2-6’’G1,2-4’G1,2-5’8Hz(β)

1) Total points for indirectly observed dimensions.
2) Number of Scans per FID.
3) Measurement time.
4) The splitted cross peaks via 1JCH.
5) Total measurement time.

G1,2-1’1H (ppm)以外）が低磁場側に、GlcNAc と NeuNAc のアセタミいに似た構造であることから激しい重なりが観測された。解析結果の例を Fig.2a に示した。
また、各種 2 次元 NMR により解析した結果を併せて示した。HSQC スペクトル上の相関ピークに帰属し（Fig.2b）、HMBC スペクトルにより各構成単糖の 1 位
C と他の構成単糖の相関を解析することで、グリコ160Hz
βNA1e170Hz
α170Hzαクのみ観測する（3 −［2］参照）。単糖の 1 位（NeuNAcppm 付近では、構成単糖はいずれも 6 員環であり、互GN1,2-5’GN1,2-4’c糖鎖の 1H − NMR では、炭化水素に由来する 1H ピーppm と 2.6 ppm に比較的単離して観測された。3 〜 4G1,2-2’
G1,2-3’G1,2-1’［4］解析結果

ド基メチルが 2.2 ppm 付近に、NeuNAc の 3 位が 1.9

GN1,2-3’

G1,2-6’

GN1,2-1’

d13

Acetamide
methyl protons

Other protons

13C (ppm)

Samplingpoints1)

Experiments

G1
13C (ppm)

Table. 1

第 63 巻（2019）

M1
NA2

1H (ppm)

Fig.２

GN1
GN3 GN4

M3
M2
G2GN2a) 1D 1H-NMR spectrum of S2G2 in D2O. b) 2D 1HC edited-HSQC spectrum of S2G2 in D2O. The
assignments of Gal and GlcNAc are annotated in redand blue letters, respectively. The anomeric 1H peaksof Gal are also shown in a box with J-couplingconstants. c) A slice extracted from 2D 1H-13C HMBC
spectrum. The sequential connectivity between Galand GlcNAc is represented by the dashed red lines.
d) The analysis of anomer type of Man residues.
e) The structure of S2G2 analysed by NMR
spectroscopy. The assignments of monosaccharide
residues are annotated with letters and numbers.
13シド結合位置を解析した（Fig.2c）。
Gal、GlcNAc の 1 位の水酸基の位置は、隣接 1H と
3

1［1］不均一サンプリングと圧縮センシングのカップリング（ J HH）による 1 位の H ピークの分裂

NMR の感度は試料量に比例し、基本的には試料量幅（約 8Hz）からβ−アノマーであると決定した（Fig.2b,を 1 ／ 10 にすると感度も 1 ／ 10 となる。そこで、積算

31in box）。Man については、 J HH による H ピークの分で感度を 10 倍にしようとすると、NMR の感度は積算

裂幅がαとβ−アノマーでほぼ同一であるが、直接結回数の平方根に比例して上昇するため、100 倍の積算、1311合する C とのカップリング（ J CH）による H ピークつまり 100 倍の時間が必要である。4 −［3］において、1.0の分裂幅がα−アノマーでは約 170Hz、β−アノマーでmg 糖鎖の各種測定に要した時間は約 1 日であるので、は約 160Hz の分裂を与える。そのため、1J CH で 1H 方

0.1 mg 糖鎖では 100 日必要と試算される（あくまで単113向にピークを分裂した H − C edited − HSQC スペクト

純に 100 倍した時の試算値である）。これは少なくとルを用いて解析した（Fig.2d）。

も企業レベルで受託できるタイムスケール（約 3 日）

以上より、各構成単糖の帰属、立体異性、グリコシド結合位置の解析手法を導入し、抗体糖鎖の構造解析技術を構築した（Fig.2e）。と比較すると非現実的である。
この問題について本研究では、不均一サンプリング（NUS）による高速測定と圧縮センシング（CS）によるデータ処理を検討した。NUS と CS は近年の NMR

5．微量糖鎖構造解析へ向けた技術基盤の構築
ここでは 0.1mg 糖鎖の構造解析技術の構築と、更なる微量糖鎖構造解析の展望について述べる。

装置に組み込まれており、比較的簡便に使用可能であるというメリットがある。
NUS は通常の離散的なサンプリングは行わず、同一のサンプリング空間において測定ポイントをランダ
101

TOSOH Research & Technology Review Vol.63（2019）

ムに“間引く”ことで、分解能を損なわず測定時間をTable.２

2D NMR spectra measured for 0.1mg of S2G2

短縮可能な測定法である。例えば、測定ポイント数を1 ／ 8 にすると、測定時間を 1 ／ 8 まで短縮でき、節約

Experiments

Samplingpoints2)(％)

NS3)

した時間を積算や分解能の増加に充てることができる

Sampling
space1)

Duration4)（min）

DQF-COSY
TOCSY
edited-HSQC
edited-HSQC5）
HSQC-TOCSY
HMBC

2,048 (1H)
2,048 (1H)
4,096 (13C)
2,048 (13C)
2,048 (13C)
1,024 (13C)

512(25％)512(25％)512(12.5％)256(12.5％)512(25％)256(25％)

8832
3264
128

126
127
434
210
909
1,848－－－

3,654（Fig.3a,b）。

abGN3-3’

GN3-3’
GN1-3’
GN2-3’
NA-6’

G1G2-3’NA-6’

GN4-3’cGN1-3’

GN2-3’

G1,2-3’

G1-3’

GN4-3’

GN1FM1Total6）

1) Conventional regularly sampling space for indirectly
observed dimensions.
2) Total points selected in a poisson-gap non-linear sampling
scheduling.
3) Number of Scans per FID.
4) Measurement time.
5) The splitted cross peaks via 1JCH.
6) Total mesurement time.

M3

NAG2

M2

GN3GN4

GN22D 1H-13C HSQC spectra of 1mg of SG2Fb. 512 points
were linearly acquired and processed by FFT (a), and512 points selected from 2,048 sampling space were
non-linearly acquired and processed by CS (IRLS)(b). The assignments are also annotated. c) The
structure of SG2Fb.

NA1,2-5’

aGN4-2’
GN1,2-2’
GN4-6’

GN3-6’ GN3-2’
GN1,2-6’

M1,2-6’G1,2-6’NA1,2-9’
M3-4’ NA1,2-7’
M1,2-4’NA1,2-4’
M3-6’
G1,2-4’
M3-2’
GN1,2,3-3’ NA1,2-6’ G1,2-2’
M1,2-3’G1,2-3’NA1,2-8’
M2-5’
GN1,2,3-5’
G1,2-5’
M1-2’ M2-2’
M3-5’
M1-5’-5’
GN4-3’
GN4-4’ GN4-5’
GN3-4’
G1,2-6’’

NUS により間引いて測定したデータは FFT で処理

GN1,2-4’

M3-3’

できない。そのため CS により、測定したポイントの13C (ppm)

Fig.３

1H (ppm)b［2］0.1 mg 糖鎖の構造解析

M2-1’

装置及び測定法は基本的に 4 −［3］と同一である。測GN3Asn

d NA1,2 GN4
GN1,2

NA1,2-3’’

NA1,2-3’

M3-1’実施した。また測定、解析手法としての有用を確認す［3］NMR 測定及びデータ処理

M1-1’ GN1,2-1’
GN3-1’
G1,2-1’

試料調製には 0.1 mg S2G2 を用い、4 −［2］と同様にるため、G2、SG2Fb、M9 を用いて構造解析を検討した。

cGN4-1’
13C (ppm)

構成することで 2 次元 NMR スペクトルを得た。

13C (ppm)

データを参照し、間引いた測定ポイントのデータを再

1H (ppm)

Fig.４

1H (ppm)

2D 1H-13C HSQC spectra of 0.1mg of S2G2. The
extracted regions; CH (except for anomeric groups)(a). anomeric CH (b), CH2 (c) and acetamide CH3
groups (d), are displayed. The assignments are alsoannotated in each spectrum.

定項目及びパラメータを Table. 2 にまとめた。NUSには sine 関数で重み付けした poisson gap sampling を採用した6,7）

また同様に、G2、SG2Fb 及び M9 においても一意。また、CS には反復再重み付け最小二乗的な構造解析に成功した（Fig.5b,c,d）。このことから、

8）100 µg の糖鎖試料で構造解析に必要なレベルの各種 2法（IRLS） を用いた。

次元 NMR スペクトルを 3 日以内で取得でき、かつ様々な抗体糖鎖の構造解析に有用な測定手法であることを［4］解析結果
1S2G2 について、 H-NMR スペクトルの他、良好な証明した。

各種 2 次元 NMR スペクトルを 3 日以内に取得する

本技術の内、特に 1H − 13C HMBC スペクトルは一意ことに成功し、100％の帰属と構造解析に成功した。

的なグリコシド結合情報を与える一方で低感度であ1113

S2G2 の H − NMR ス ペ ク ト ル、2D H − C edited −り、これまでに 0.1 mg の抗体糖鎖（10 糖残基程度）HSQC スペクトル及び帰属を Fig.4 に示した。

で測定に成功した例は報告されておらず、我々の知る102東ソー研究・技術報告aGal２）A. Varki et al., Essentials of Glycobiology, 3rdb

NeuNAcGal

GlcNAcManNeuNAc

GlcNAcGalGlcNAc

GalFucdMan
NeuNAcManMan GlcNAc
GlcNAcGlcNAcGal

Fig.５

edition .（2017）
GlcNAcMan
Man GlcNAc

GlcNAcc

GlcNAcMan

Man
Man GlcNAc
Gal

第 63 巻（2019）

GlcNAc

Man

Man
Man

83 − 88（2013）４）K. Kato, et al., NMR in Glycoscience andGlycotechnology（2017）

ManMan３）Y. Yagi & S. Suzuki, CHROMATOGRAPHY , 34（2）,５）T.D. Goddard & D.G. Kneller, SPARKY 3 , Univ. ofGlcNAc

ManMan GlcNAc
ManManN-Linked glycans (0.1mg) analysed by NMR
spectroscopy. The structure of S2G2 (a), G2 (b),SG2Fb (c) and M9 (d) are uniquely determined.

California, San Francisco.
６）S.G. Hyberts, K. Takeuchi and G. Wagner, J. Am.

Chem. Soc ., 132（7）,2145 − 2147（2010）７）P.C. Aoto et al., J. Magn. Reson ., 246, 31 − 35（2014）８）K. Kazimierczuk. & V.Y. Orekhov, Angew. Chem.

Int. Ed. Engl ., 50（24）,5556 − 5559（2011）

限り初めての成功例である。本技術は、抗体医薬品等から分取した糖鎖の高精度な構造解析に有用であると考えられる。
［5］更なる微量糖鎖構造解析への展望
1H − 13C 相関 NMR 測定では、天然存在比 1％程度の13C 核を用いるために大きく感度を失ってしまう。そのため、1H − 1H 相関 NMR 測定のみを用いた測定技術検討を進めている。今後、1 〜 10 µg 程度でも一意的な構造解析が可能となれば、今まで解析が困難であった抗体糖鎖の構造解析への糸口となると考えられる。

6．まとめ
抗体糖鎖の構造を解明する手段として、NMR による糖鎖構造の解析技術を導入した。また、NUS 及びCS を用いることで 0.1 mg 糖鎖の構造解析を可能し、様々な糖鎖に有用かつ堅牢な構造解析技術であることを証明した。
本手法は、LC − MS 法等と異なり標品が無くても一意的な構造解析が可能なため、抗体医薬品より分取した N −結合型糖鎖の解析手法として有用であると考えられる。

参考文献
１）ICH Steering Committee, ICH harmonizedtripartite guideline , International conferenceon harmonization of technical requirements forregistration of pharmaceuticals for human use.
（1999）

103