「地球冷却微⽣物を探せ」
分析結果レポートの⾒⽅
ver. 2.1

気体分析レポート
レポートファイル
レポートファイルは 「Gas_ExpXXXX_YYMMDD」という名前で、htmlとpdfの2種類があります（YYMMDDはレポートが作成された⽇付）。
pdfファイルは、ダウンロードしても、そのままブラウザ上でも閲覧できます。htmlファイルは、PCにダウンロードした後、普段お使いのウェブブラウザーアプリ（Google Chrome, Safariなど）で開いてください。

インタラクティブな図の⾒⽅（図2, htmlのみ）
グラフをダウンロードしたい
グラフの右側にあるツールバーの「download plot as a png」をクリックしてください。
注⽬した領域を詳しく⾒たいツールバーの「Zoom」をクリックして、グラフ上の注⽬したい領域をドラッグで選択してください。表⽰領域を左右上下に移動したい場合は、ツールバーの「Pan」をクリックしてください。表⽰領域を初期に戻したい場合は、ダブルクリックまたはツールバーの「Reset Axes」をクリックしてください。
ズームイン・ズームアウトしたい
ツールバーの「+ (Zoom in)」「- (Zoom out)」を押してください。表⽰領域を初期に戻したい場合は、ダブルクリックまたはツールバーの「Reset Axes」をクリックしてください。
データの値を⾒たい、⽐較したいツールバーの「Show closest data on hover」をクリックしてください。グラフ上でマウスオーバーする（データにカーソルを乗せる）とサンプル名や値が表⽰されます。また「Compare dataon hover」をクリックすると、縦に並んだ全てのデータの値を⾒ることができます。
注⽬したサンプルだけのグラフにしたい
右側の凡例からサンプルをクリックすることで、グラフに表⽰するサンプルを選択できます。ツールボックスから「Autoscale」をクリックすると、表⽰されたサンプルに対して適切な領域が表⽰されます。表⽰領域を初期に戻したい場合は、ダブルクリックまたはツールバーの「Reset Axes」をクリックしてください。

インタラクティブな表の⾒⽅（表1, 2, htmlのみ）
表が⾒切れている場合は、左右にスライドすることで表⽰領域を変えることができます。注⽬した要素で表を並べ替えたいときは、表の1⾏⽬にある▼をクリックしてください。

気体分析レポート

実験参加者（代表者）のお名前
武羅泥 雷蔵 様

YYYY-MM-DD

サンプルが東北⼤学に到着してから、7〜14⽇でデータをお返しします。

データシートに記載された緯度・経度をもとに、地図上にプロットしています気体分析レポート

htmlファイルでは、グラフを動かすことができます。詳細はインタラクティブな図の⾒⽅をご覧ください。

1〜3回⽬に採取した気体のN2O濃度を点でプロットし、近似直線を点線で⽰しています。

気体分析レポート

データシートに記載された情報を元に⼟壌サンプルの情報を⽰しています。

N2O放出速度

pHと⽔分は東北⼤学で測定。
n.d.は未測定です。

気温と湿度はデータシートに記載された情報を⽰しています。未記載の場合はn. d.

htmlファイルでは、表を動かすことができます。詳細はインタラクティブな表の⾒⽅ をご覧ください。

気体分析レポート

データシートに記載された緯度・経度をもとに、地図上にプロットしています気体分析レポート

N2O濃度

htmlファイルでは、表を動かすことができます。詳細はインタラクティブな表の⾒⽅ をご覧ください。

微⽣物分析レポート
レポートファイル
レポートファイルは 「Microbiome_ExpXXXX_YYMMDD」という名前のフォルダの中にあります（2つのpdfファイルと4つのhtmlファイル）。
pdfファイルは、ダウンロードしても、そのままブラウザ上でも閲覧できます。htmlファイルは、PCにダウンロードした後、普段お使いのウェブブラウザーアプリ（Google Chrome, Safariなど）で開いてください。

微⽣物分析の概要
微⽣物叢（Microbiota）とは、ヒトや動物、植物などの⽣物回りや⼟壌、⽔、⼤気などの環境中に存在する多様な微⽣物の集合体です。微⽣物には、真正細菌と古細菌、真菌や微細藻類 、原⽣動物などの真核⽣物、それに⾮細胞性⽣物群のウイルスやウイロイド、ファージなどが含まれています。⾝近な例では、私たちヒトの場合、消化器、⽪膚、⼝腔、⿐腔、呼吸器、⽣殖器など外部環境と接するあらゆる場所に微⽣物が⽣息しそれぞれ特有の微⽣物叢を形成ており、全体でおよそ1000種、数⼗兆個の微⽣物が⽣息しているといわれています。
⼟壌は、⾃然界の中でも最も多様な微⽣物が存在し複雑な微⽣物叢が形成されていると考えられており、採取いただいた⼟壌を解析することで、新たな⼟壌微⽣物の発⾒や農業・環境改善に寄与しうる微⽣物叢に関する知⾒の蓄積が期待できます。このレポートでは、採取いただいた⼟壌サンプルの微⽣物叢をアンプリコンシークエンス（Amplicon Sequencing）という⼿法で分析した結果をご報告いたします。
アンプリコンシークエンスでは次世代シークエンサー（Next-Generation Sequencer, NGS）を利⽤し、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction, PCR）で増幅した「特定のゲノム領域」のDNA塩基配列を解析します。本プロジェクトでは「特定のゲノム領域」として、(i) 進化系統分類のための指標である16S rRNA遺伝⼦、(ii) N2Oを削減する（≒地球を冷却する）機能の指標であるnosZ 遺伝⼦ (次項コラム参照) の2種類を対象としています。
塩基配列を取得した後は、これまでの⽣物学の知識の集⼤成である⼤規模な塩基配列データベースを参照して、サンプル中にどんな微⽣物が含まれていたのかを推定します [右図]。

微⽣物分析レポート
⼟壌サンプル中の微⽣物組成（微⽣物叢）
まずはじめに、ご提供いただいた⼟壌にどのような微⽣物が含まれていたのか、微⽣物の組成（Microbial Profile）を確認してみましょう。⽣物の進化系統分類のための指標として広く活⽤されている16S rRNA遺伝⼦とN2Oを削減する機能の指標であるnosZ 遺伝⼦を対象としてアンプリコンシークエンスを実施し、得られたデータから微⽣物の組成を推定しました。
現在、⼀般的に採⽤されている⽣物の分類体系では、全ての⽣物は界（かい、Kingdom）・⾨（もん、Phylum）・綱（こう、Class）・⽬（もく、Order）・科（か、Family）・ 属（ぞく、Genus）・種（しゅ、Species）の７つの階級に沿って命名・分類されています [下図] 。

界動物界門

脊索動物門

綱目
科
属種

哺乳綱

大まか

食肉目
イヌ科
イヌ属
イヌ
（飼犬）

細やか

16S rRNA遺伝⼦を対象とた解析結果について、「ExpXXXX_16Sv3v4_Class.html」では⽐較的⼤まかな分類階級として 綱（こう、Class）に着⽬、「ExpXXXX_16Sv3v4_Genus.html」では⽐較的細やかな分類階級として属（ぞく、Genus）に着⽬した微⽣物の組成をそれぞれ⽰しています。
また、「ExpXXXX_nosZC1_Genus.html」と「ExpXXXX_nosZC2_Genus.html」ではそれぞれnosZ 遺伝⼦のクレード1とクレード2を対象に、属（ぞく、Genus）に着⽬した微⽣物の組成を⽰しています。
関⼼を持ったバクテリアの特徴などについてインターネットなどで調べてみましょう。

微⽣物分析レポート

各⼟壌サンプル中の微⽣物の組成。どんな種類の微⽣物がどんな割合 (%) で存在するかを棒グラフで⽰しています。

グラフ内の各微⽣物の分類名。

No Taxonomic Information
既知のどの⽣物にも似ていない塩基配列をもつバクテリア
Others
上位20の分類群以外のものをすべてまとめてOthersとしたサンプルの説明。気体分析レポートの表1とほぼ同じです。

グラフ内の各微⽣物の分類名。

種々のデータベースへのリンク。

NCBI Taxonomy
アメリカ国⽴⽣物⼯学情報センターのデータベース
Encyclopedia of Life
⽣物に関するオンライン百科事典
MicrobeDB
国⽴遺伝学研究所の微⽣物データベース
PubMed
学術⽂献の検索サイト

コラム
窒素は循環する 窒素原⼦は最も還元された状態（-3）のアンモニア、最も酸化された状態（+5）の硝酸など、様々な状態で環境中に存在している。微⽣物は酸化反応や還元反応を通して、⽣態系における窒素の循環に関与している。⾮常に多様な反応が知られており、代表的な3種類の反応を紹介する。
窒素固定：⼀部の微⽣物は、エネルギーを消費して⼤気中の窒素ガスをアンモニアに変換すること（窒素固定）ができる。このアンモニアを養分としてアミノ酸、タンパク質などの有機態窒素を合成する。また植物と共⽣する微⽣物には、植物から光合成エネルギーをもらいながら窒素固定を⾏い、アンモニアを植物へ供給できるものもいる（例、ダイズ根粒に共⽣するBradyrhizobium 属細菌など）。⼈類は⼯業的に窒素固定（ハーバー・ボッシュ法）できるようになったが、多量の化⽯エネルギーを消費し、⾃然の循環を超える窒素を供給していることが⼤きな問題となっている。
硝化：⼀部の微⽣物は、アンモニアを亜硝酸・硝酸に酸化（硝化）した時の酸化エネルギーで⽣育することができる。硝酸は⼟壌に保持されにくく、降⾬によって地下⽔に流出してしまう。また硝化の過程で⽣産された⼀酸化窒素や亜硝酸が、N2O発⽣に繋がる場合もある（硝化由来のN2O発⽣）。
脱窒：⼀部の微⽣物は、酸素の代わりに硝酸を使って呼吸し、硝酸を窒素ガスまで還元して⼤気へと放出する（脱窒）。脱窒は4つのステップ（脱窒1から脱窒4）があるが、全てのステップの遺伝⼦を持つ“完全型”の脱窒菌もいれば、⼀部の遺伝⼦を持っていない脱窒菌もいる。脱窒の最終ステップ（脱窒4：N2Oから窒素）の遺伝⼦を持っていない脱窒菌は、窒素まで変換できずにN2Oを⼤気に放出してしまう。

有機態窒素

アンモニア窒素

⼀酸化⼆窒素

⼀酸化窒素

NH4+N2N2ONO

窒素固定

脱窒4

脱窒3

還元 -3NH2OH-1NO3NO2-

硝化3

硝化20

地下⽔へ流出脱窒1

脱窒2ヒドロキシルアミン

硝化1

硝酸

亜硝酸+1+2+3+5 酸化

N2O消去遺伝⼦を調べる 温室効果ガスであるN2Oを消去するためには、N2O発⽣ステップに対してN2O消去ステップ（脱窒4）が充分に働く必要がある。このステップは「N2O 還元酵素（遺伝⼦名はnosZ ）」が⾏なっている。nosZ 遺伝⼦には⼤きく分けてクレード1（clade I）とクレード2（clade II）の2種類が知られている。クレード1の微⽣物は 脱窒ステップ1-4を全て持っている“完全型”の脱窒菌が多い。⼀⽅で、クレード2の微⽣物は脱窒ステップ2や3の遺伝⼦を持っていないものも多く、彼らは「脱窒の最終ステップの専⾨家」なのかもしれない。
⽇本のどこかにある「N2Oを消去する⼟壌」には、どんなnosZ 遺伝⼦を持った微⽣物がいるのだろう？
まだまだ謎が多いnosZ 遺伝⼦を調べるには、それぞれの⼟壌についてnosZ 遺伝⼦リストを作る必要がある。この市⺠科学プロジェクトでは、皆さんに送っていただいた⼟壌について、クレード1とクレード2のそれぞれのnosZ 遺伝⼦をPCR増幅して、そのDNA配列を読む「アンプリコン解析」を実施する。

微⽣物分析レポート
⼟壌サンプル中の微⽣物種多様性（α多様性）
微⽣物の組成を包括的に分析してわかることの⼀つに種多様性（Species DiversityあるいはAlpha Diversity）という概念があります。これは、特定の環境（今回は瓶に⼊れた⼟壌サンプル）の中に、どのくらいの数の微⽣物種が存在するか、また、それぞれの微⽣物種の量的なバランスはどうなっているかを定量的に評価する試みです。
“どのくらいの数” は、豊富さ（Richness）として評価され、・Observed ASV [系統関係を考慮しない]・Faith の Phylogenetic Diversity [系統関係を考慮する]などの指標が提案されています。
“量的なバランス” は、均等度（Evenness）として評価され、・Shannon の Evenness Index [情報エントロピーの概念を活⽤]・Pielou の Evenness Index [Shannonの指標を改良]などの指標が提案されています。
「ExpXXXX_16Sv3v4 _AlphaDiversity.pdf 」では、提供いただいた⼟壌サンプルの種多様性をまとめています。ページごとに各⼟壌サンプルで計算した上記4つの指標を⽰します [下図]。どの指標も値が⼤きいほど「種多様性（豊富さや均等度）が ⾼い」と⾒なせます。⼀般的に「多様な性質をもつ個体が存在すれば、様々な環境変化に対応できる」という観点で、種多様性は⾼い⽅が望ましいと考えられています。

⽔⾊の領域は、データ全体の分布を⽰すバイオリン図
Observed ASV

Faithʼs Phylogeneticdiversity

⽩丸は他のサンプルの値、⾚丸は当該サンプルの値を⽰す
Shannonʼs
Evenness index

Pielouʼs
Evenness index微⽣物分析レポート
⼟壌サンプル間の微⽣物叢の類似性（β多様性）
異なる場所や環境同⼠で微⽣物の組成がどれくらい似ているか、違っているか、すなわち微⽣物叢の類似度（専⾨的には Beta Diversity）を評価しました。微⽣物叢の類似性を定量的に評価する指標は複数提案されていますが、今回は代表的な指標である UniFrac 距離（UniFrac Distance）を⽤いて解析を実施しました。
「ExpXXXX_16Sv3v4 _BetaDiversity.pdf 」では、今までに届いた全てのサンプル間で網羅的にUniFrac 距離を定量し、全サンプルの関係性を主座標分析（Principal Coordinate Analysis）という⼿法で可視化しました。

各点が個々のサンプルを⽰します。
⼟壌を採った場所の⼟地利⽤種別ごとに⾊分けしています。

当該サンプルの点だけ、丸で囲んでハイライトしています。

点同⼠の距離が近いほど微⽣物叢がよく似ていると⾔えます。