グルコシル化リン脂質の新規合成法
群馬大学

大学院理工学府 分子科学部門
教授 松尾 一郎
2023年11月16日

1

糖リン脂質の簡便合成
リン脂質

一段階

DMC

H2O / CH3CH2CN

糖類

水溶液中
糖とリン酸が反応する

糖リン脂質
Org. Biomol. Chem., 21, 2138-2142 (2023)
doi.org/10.1039/D2OB02173K.

水溶液中、無保護の糖を2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド（DMC)で活性化、リン脂質と反応させることで糖リン脂質が簡便に合成できるようになった。
本反応は様々な糖類に適応が可能で、例えばアジド基修飾糖を用いることで糖部分が修飾された糖リン脂質が合成できる。得られた糖リン脂質をリポソーム化後、クリック反応により、リポソーム表面に対して任意の置換基の導入が可能となった。
2

糖リン脂質は生理活性を有する
OHOOH OPOOO

ホスファチジルグルコシド

OPA (18:0, 20:0)糖転移酵素：UGGTOHOHOHOOOH O• 哺乳類で初めて見出された1)グルコース含有リン脂質O• 脂質マイクロドメインを構成する2)O• ホスファチジン酸のリン酸がUGGT（ UDPグルコース:糖タンパク質グルコース転移酵素）によってグルコシル化されることが示唆されている3)。

H OPOOO

PtdGlc (18:0, 20:0)

リパーゼ：PLA2
OH
HO
HOO

OOH O

1)
2)
3)

H OH
P

O
O

O
O

LysoPtdGlc (18:0)

Nagatsuka et al., FEBS Lett. 2010 497, 141,
Murase,, et al., Biochemistry 2010 49, 4732
Hung et al., PNAS 2022, 119, 51, e2214957119
3これまでの糖リン脂質の合成は多工程が必要であった
Greimel らの報告1),2)

1) Tetrahedron Lett. 2008 49, 3562, 2) Science 2015, 349, 974.

4水中で糖の一位を活性化する試薬

DMC：2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド
2-chloro-1,3-dimethylimidazolinium chloride

1972年

H.B. Koenigらがペニシラン酸のアミド化のために初めて利用1)

1999年

Isobe, Ishikawaらが脱水縮合剤として汎用的な利用例を報告2)

2009年

Shodaらが糖の1位を活性化できることを発見、糖鎖合成に幅広く応用3, 4)

2021年

FairbanksがDMCをShoda's試薬と提唱 3)

正田らは、DMCが水溶液中、糖の1位を活性化することを見出した4,5,6)

51) H.B. Koenig et al., Chem. Abstr. 1972, 77, 140048, 2) T. Isobe, T. Ishikawa, J. Org. Chem. 1999, 64, 6984-6988, 3) A. J. Fairbanks, CR 2021, 499,108197, 4) T. Tanaka et al, Tetrahedron Lett. 2009, 50, 2154, 5) K. Serizawa et al., Chem. Lett. 2017, 46, 1024, 6) G. Li et al., CHIMIA 2018, 72, 874.

5

DMCを用いた糖リン酸結合の構築

DMC (3 eq.), TEA (12 eq.)
4 oC, 1 h,
水 / アセトニトリル＝1/2600 MHz 1H NMR spectrum in D2O

5.0

4.0

3.0

収率 56%

質量分析装置による解析

2.0

1.0ppm分析条件: 溶媒A: 5 mM ammonium formate in water pH4,
溶媒 B: 5 mM ammonium formate in water/acetonitrile =5/95 v/v pH4, solvent B = 80% isocratic, column: TOSOH
Amide 80, 2.0 mmI.D. x 15 cm 3 μm, flow rate: 200 uL/min,Oven temperature: 40 oC, Ionization mode: ESI negative,
The MS detector was run in SIM mode, m/z = 373.10,
sample: The reaction mixture was diluted with 2,500 times
by mixed solvent (solvent A/B=30/70) and injected 3 μL.

6糖ーリン酸結合反応における溶媒効果
Entry a123456789101112131415Sugar
D -glucose(α/β = 45/55)
D -glucose
D -glucose
D -glucose
D -glucose
D -glucose
D -glucose
D -glucose
D -glucose
D -glucose
D -glucose
D -glucose
D -glucose
D -glucose
D -glucose

Solvent (v/v) b

Yield (%) (α/β) c, d

H2 O

5 (1/77)

H2O/CHCl3 (1/1)
H2O/CH2Cl2 (1/1)
H2O/dioxane (1/1)
H2 O/THF (1/1)
H2 O/DMF (1/1)
H2O/DMSO (1/1)
H2 O/acetone (1/1)
H2O/CH 3CN (1/1)
H2O/CH3CH2CN (1/1)
H2O/CH 3CN (1/2)
H2O/CH 3CN (2/1)
H2O/CH3CH2CN (1/2)
H2O/CH3CH2CN (2/1)
H2O/CH3CH2CN (4/1)

7 (1/3)15 (1/5)
39 (1/6)
36 (1/7)
29 (1/4)
22 (1/3)
44 (1/8)
39(1/11)28(1/19)41(1/10)23(1/20)41(1/11)18(1/27)
14(1/40)a All reactions were performed under the following conditions: sample concentration: 0.05 M glucose (3.2 μmol), 0.05 M glycerophosphate(3.2μmol), TEA (28.8 μmol), DMC (9.6 μmol); solvent (v/v); total volume: 69 μL; reaction temperature: 4 oC; reaction time: 1 h. b Indicated solvent ratio isvolume/volume. c The reaction yield was calculated from LC-MS chromatograms of the reaction mixture based on a standard curve of product. d The
α/β ratio was determined via LC-MS.

7

糖ーリン酸結合反応の反応機構の理解に向けてOHHOHOOO

Entry a1

Sugar
D-glucose

Solvent (v/v) b

Yield (%) (α/β) c, d

H2O/CH3CN (1/1)

39(1/11)

H2O/CH3CN (1/1)

32(1/11)2(α/β = 45/55)
α-D-glucose

3β-D-glucose

H2O/CH3CN (1/1)

35(1/11)4

2-deoxyD-glucose

H2O/CH3CN (1/1)--- ea All reactions were performed under the following conditions: sample concentration: 0.05 M glucose (3.2 μmol), 0.05 M glycerophosphate(3.2μmol), TEA (28.8 μmol), DMC (9.6 μmol); solvent (v/v); total volume: 69 μL; reaction temperature: 4 oC; reaction time: 1 h. b Indicated solvent ratio isvolume/volume. c The reaction yield was calculated from LC-MS chromatograms of the reaction mixture based on a standard curve of product. d The
α/β ratio was determined via LC-MS. e Less than 1% of the product was detected during LC-MS analysis.

8水溶液中でのPtdGlcの一段階合成

LCMS analysis(3 eq)TEA (12 eq.), 4 oC, 1 h,
水 / プロピオニトリル（５/１）

SFC/QqQMS analysis
1400000
1200000

Intensity

1000000
800000600000400000200000005101520Retention time (min)分 析 条 件 : (A) solvent system A: 5 mM ammonium formate inwater/methanol/acetonitrile = 1/3/96 v/v pH7, solvent system B: 20 mM
ammonium formate in water/methanol = 10/90 v/v pH7, solvent B = 0-40%
gradient, 30min, column: Waters BEH Amide 2.1 mm I.D. x 15 cm, 1.7µm, flow rate: 600 µL/min, Oven temperature: 40 oC, Ionization mode: ESInegative, The MS detector was run in SIM mode, m/z = 893.61, sample:
100 µM, 3 µL

分析条件: Analytical conditions: mobile phase A: CO2, mobile phase B: 0.1%
w/v ammonium acetate in MeOH/H2O = 95/5 v/v, mobile phase B = 1% (0-1min), 1-65% (1-12 min), 65% (12-18 min), 65-1% (18-18.1min), 1% (18.120min), column: Waters Torus DEA, 1.7 µm, 3.0 mm I.D. x 10 cm, flow rate:
1 mL/min, Oven temperature: 50 °C, back pressure: 10 MPa, ionization
mode: ESI negative, The MS/MS detector was run in MRM mode, m/z =893.5 > 283.2, sample: The reaction mixture was diluted with 50,000 times
by MeOH and injected 1 µL.

9PtdGlcの収率向上の取り組み(3 eq)TEA (12 eq.), 4 oC, 1 h,
水 / プロピオニトリル

EntryaSolvent(v/v)b

Yield(%)cα/βratiod

DMCとグルコースを段階的に加えることで収率が向上
10090

1H2O/CH3CH2CN (1/5)

3780

1/2

234

H2O/CH3CH2CN (1/2)

56

H2O/CH3CH2CN (1/1)

55

H2O/CH3CH2CN (2/1)

46

1/7
1/19

Yield (%)

7060
504030

1/32

20
105

H2O/CH3CH2CN (5/1)

35e

1/68

All reactions were performed under the following conditions: sample concentration:
0.15 M glucose (3.6 μmol), 0.05 M phosphatidic acid: 3 (1.2 μmol), TEA (14.4 μmol),DMC (3.6 μmol); solvent (v/v); total volume: 24 μL; reaction temperature: 4 °C; reaction
time: 1 h. b Indicated solvent ratio is volume/volume. c The reaction yield was calculated
based on a standard curve of PtdGlc 4 via LC-MS analysis. d The α/β ratio wasdetermined by SFC/QqQMS. e Isolated yield.

011st22nd3
3rd44th

55th

Reaction conditions: phosphatidic acid (6 µmol), D-glucose (3 equiv.),DMC (9 equiv.), and TEA (36 equiv.) in H2O/CH3CH2CN (5:1, total volume:90 µL) were allowed to react at 4 °C. At each step, additional glucose (3equiv.), DMC (9 equiv.), and TEA (18 equiv.) in H2O/CH3CH2CN (5:1, total
volume: 45 µL) solution were added.

10アシル鎖長が異なるPtdGlcの合成
Entry

Phosphatidic acid

1Productyield (%)α/β ratio(18:0, 18:0-PA) TEA salt

321 / 542(18:1, 18:1-PA) TEA salt

29

1 / 403(18:0, 16:0-PA) TEA salt

28

1 / 484(16:0, 18:0-PA) TEA salt

27

1 / 73

5(16:0, 16:0-PA) TEA salt

31

1 / 5020

1 / 50

OOH6(16:0, 16:0-PA) Na salt

（市販のPA）

HOHOOOOOH OPOOO-+NHEt3O

All reactions were performed under the following conditions: sample concentration: 0.15 M sugar (3.6 μmol), 0.05 M phosphatidic acid(1.2 μmol), TEA (14.4 μmol), DMC (3.6 μmol); solvent: H2O/CH3CH2CN (1/5); total volume: 24 μL; reaction temperature: 4 °C;
reaction time: 1 h. b Isolated yield. c The content of α anomer was determined via 1H-NMR analysis. Relative quantification errors wereestimated as outlined in the supporting information. n.d., below limit of detection. d The sodium salt of the PA acceptor was used.
11固相上でリン脂質に対する糖の導入が可能
O
HO P OOOPAOH +Cl ClN

グルコースの活性化
O

O

OOO

HO P OOOOOHO P OOOPOOHOHHO P OOOOOOOOHOHOOHO P OOOPOOOOOOOPOHOH

O

有機溶媒水N

O

O P O
O
O

O

O
O

O

POH

O

OH

O

O P O
O

O
HOO
HOO

HO P O
OO

O

OPO
O

O

O
OP

OH

固相担体への保持

グルコシル化反応

グルコース

POH

OH

OH

OOO

O
O P O
OO

O
O

O

POH
OH

O

O

O
O

O

OHO O
HO

マイクロフロー反応装置によるPtdGlcの合成
DMC

O
O

O

固相担体上で反応

O
O

O

C-18固相担体にホスファチジン酸を吸着させる

O

O

PO

O
O
O

溶出

メタノールで溶出

水O

O
O P O
O

糖リン脂質
12

化学修飾したグルコースを用いても同様の反応が進行（糖修飾リポソームへの展開）

PA(18:0, 20:0)

PtdN3Glc

CH3CH2CN/H2O(5/1)
１）DOPC/PtdN3Glcを用いたリポソームを調製
２）クリック反応の条件で蛍光標識

PtdGlcN3HOHOOOH

OO

N3 N3OHOHO P ODMCOHOHOHO P O HO P O

OH

OO

HOO

O

HO P OHO P OHO P OHO P OHO P O

５μm

13従来技術とその問題点
既に報告されている糖リン脂質の合成は合成工程が⾧く、精製に有機溶媒が必要など効率的ではなかった。
多段階反応に起因する煩雑さ
精製工程が必要で有機溶媒が必要等の問題があり、広く利用されるまでには至っていない。
14

新技術の特徴・従来技術との比較• 従来技術の問題点であった、工程数を大幅に短縮することに成功した。
• 従来は各段階で精製が必要であったが固相反応を利用することで効率よく合成することが可能となった。
• 本技術の適用により、一段階の反応で糖リン脂質が合成できるため、コストも使用する有機溶媒も大幅に削減されることが期待される。
15

想定される用途• 本技術の特徴を生かすためには、リン脂質の高機能化・高付加価値化• 糖リン脂質を利用した高機能化リポソーム調製とDDSなど医療応用。
• 上記以外に、安定同位体標識糖リン脂質を合成することで、生体内の生理活性糖リン脂質の分布など生物化学研究試薬としての利用も期待される。
16

実用化に向けた課題• 現在、１００mgスケールの反応でグルコースの導入が可能なことは確認済み。
• オリゴ糖の導入も確認しているが応用例が少ないので今後検討が必要である。
• 立体選択性を制御すると収率が低下する傾向にあるので、糖のグリコシドの立体異性体の混合物としも利用可能な材料に展開できるか検討が必要。
17

企業への期待• リン脂質のリン酸基の化学修飾法とし、材料分野での利用を期待• リン脂質の技術を持つ、企業との共同研究を希望。
• 糖リン脂質の単離精製条件は確立しているが分取レベル（グラムスケール）で検討したことがないため量産化を期待。
• 糖リン脂質を医療応用や生体分析用の試薬としての開発の企業には、本技術の導入が有効と思われる。

18

本技術に関する知的財産権• 発明の名称• 出願番号• 出願人• 発明者:糖リン脂質の製造方法、及び糖リン脂質:特願2022-195299:群馬大学:松尾一郎、石井希実、狩野航輝• 発明の名称• 出願番号• 出願人• 発明者:糖リン脂質の製造方法:特願2023-122231:群馬大学:松尾一郎、石井希実、狩野航輝
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お問い合わせ先
群馬大学
産学連携・知的財産活用センター
ＴＥＬ:
ＦＡＸ:
e-mail:0277-30-1171～1175
0277-30-1178
tlo＠ml.gunma-u.ac.jp20