ミトコンドリア病研究公開フォーラム
2021年1月23日

ミトコンドリア病の研究最前線
順天堂大学大学院 神経学講座
IMS三芳総合病院 臨床検査科

田中雅嗣

ミトコンドリア病の診断・治療
1. 制限酵素による治療（MLS-CoxIV-SmaI）
2. ピルビン酸ナトリウムの臨床治験
3. ミトコンドリア病の診断薬開発（GDF15）
4. 非侵襲的呼気分析（[13C]-Pyr）5. 細胞内過還元改善療法（LOXCAT）
6. ゲノム編集（CRISPR-Cas9）
7. 新しい遺伝子治療法（TALE-DddA-UGI）
8. GDF15受容体（GFRAL）と抗体医薬

ミトコンドリアDNA (mtDNA)
Mitochondrial DNA

Mitochondria

Cell

16569 bp
37 Genes
mRNA：13
rRNA：2
tRNA：22

Heteroplasmy
Presence of mutant and wildtype mtDNA in a cell

Respiratory Chain: Oxidative Phosphorylation System
Complex INARP mutation
m.8993T>G
ATP6 p.L156R
Nature Reviews Genetics 2012 13 878

Complex II

Complex III

Complex IV

Complex Vm.8993T>G変異に基づくNARP病に対する制限酵素を用いた遺伝子治療法

ミトコンドリアに制限酵素を送り込む
完全なる治癒変異mtDNAの排除と野生型mtDNAの復権
BeforeDay 2

Day 23

全mtDNA →変異mtDNA →
変異mtDNA →

← 野生型
mtDNA

AflII AflII AflII AflII AflII AflII+++SmaI
SmaI
SmaI
NARP3-1サイブリッドに遺伝子導入し3週間培養したサザンブロット解析

遺伝子導入後にミトコンドリア膜電位とATPレベルが正常化した％ 膜電位

細胞内ATP含量

細胞の蛍光測定

ルシフェラーゼ法ミトコンドリア遺伝子治療の過程
制限酵素Sma Iの発現↓
変異mtDNAの破壊↓
呼吸鎖酵素の生合成の低下↓
エネルギー危機 (ATP欠乏)↓野生型mtDNA複製の促進↓
ATP合成と呼吸活性の上昇→ 完全治癒結論と今後への展望
我々は制限酵素Sma Iをミトコンドリアに輸入し変異型mtDNAを選択的に除去した

解決すべき問題
1. どのようにm.3243A>G 変異を特異的に攻撃する酵素を設計できるか？
2. どのように遺伝子を骨格筋・心筋・脳に送り届けることができるか？
3. どのように遺伝子治療の間のエネルギー危機を克服できるか？

2020年 ノーベル化学賞「ゲノム編集」
生命の設計図を操る最先端技術
品種改良や病気の治療

リライティング・ザ・コード・オブ・ライフ
エマニュエル・シャルパンティエ
ジェニファー・ダウドナ

CRISPR/Cas9によるゲノム編集

ガイドRNAmitoRGEN/SpCas9

ヌクレアーゼにミトコンドリアの標的シグナルを付加する。
ガイドRNAにRNAインポート決定因子に付加する（現時点では ヒトミトコンドリアへのRNAインポートの4つの決定要因：MRP、RP、HDおよびHF）。
ヘアピン構造をガイドRNAの足場構造（テトラループ・ステムループ）の中に導入する。

問題点◎ ミトコンドリアにCas9を送り込む✕ ミトコンドリアにsgRNAを送り込む
sgRNA (single guide RNA)

塩基エディター DdCBE を使ってmtDNA C•G→T•A に修正

A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing.
Mok et al. Nature 2020-07-08.
(Mitochondrial genome editing gets precise. Aushev, Herbert. Nature 2020-07-08

シトシン（C）の脱アミノ反応によってウラシル（U）が生じる

ミトコンドリア病の新規遺伝子治療法
部位特異的にCをUに変える酵素DdCBEをミトコンドリアに送り込む
変異型の塩基配列
5’-GGGCCC-3’
3’-CCCGGG-5’
酵素DdCBEによる塩基変換（C→U）
5’-GGGCCC-3’
3’-CUCGGG-5’
DNA複製でUの反対側にAが取り込まれる
5’-GAGCCC-3’
3’-CUCGGG-5’
DNA複製でAの反対側にTが取り込まれる
5’-GAGCCC-3’
3’-CTCGGG-5’
これは野生型の塩基配列である

しかし、まだMELASの病因となる
m.3243A>G変異は修正できないミトコンドリア病に対する治療薬・診断薬の同時開発
ピルビン酸

GDF15

CH3-CO-COOー

Growth Differentiation Factor 15

平成30年度 日本医療開発研究機構
難知性疾患等実用化研究事業
ミトコンドリア病に合併する高乳酸血症に対する点滴用ピルビン酸ナトリウム150 mM ピルビン酸Na
16.5 g/L
8.25 g/500 mL

ピルビン酸ナトリウムの臨床治験―試薬からの希少疾病治療薬開発の試み―
GMPに準拠した治験薬製造
安全性・安定性・急性毒性
第Ⅱ相臨床試験を完了

点滴: 150 mM × 0.5 L→ 15 mM × 5 L blood

メイロンに代わる新しいアシドーシス補正薬

治療薬開発のスケジュール
平成24年度456789 10 11 12 1平成25年度
2345678

9 10 11 12 1

平成26年度2345678

9 10 11 12 1

平成27年度2345678平成28年度

9 10 11 12 1

2345678

9 10 11 12 1

23非臨床試験
実施・終了

戦略相談11月
治験届7月

第1相試験
3月

10月

第 2/3 相試験

治験届11月
3月

難治疾患等克服研究事業重点研究ステップ１

3月

7月

申請前相談9月
申請12月

難治疾患等克服研究事業重点研究ステップ２

ミトコンドリア病（リー脳症）

ヒトがATPを得る方法は２つ
解糖系 vs. 酸化的リン酸化系
ミトコンドリアに期待できないなら解糖系に頼るしかない
乳酸自体に毒性はない
NADHの過剰が悪者である
解糖系を動かす方法 ＝ ピルビン酸投与

0細胞の培養にピルビン酸添加が必須(mtDNAを失った細胞 or 呼吸機能を失った細胞)ブドウ糖
細胞はブドウ糖の他に↓ → 2 NADH + 2 H+ アミノ酸などを代謝する
ピルビン酸↓ ← 2 NADH + 2 H+ アミノ酸の酸化により水素が過剰になる
乳酸
NADHが蓄積し+が不足する
NAD
解糖系における水素 (NADH) の収支はゼロ

乳酸／ピルビン酸 比↑
解糖系が機能停止

過剰なNADHが解糖系を停止
1. GAPDH (グリセロアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素)

GAP + NAD+ → DPG + NADH + H+
GAP = glyceraldehyde 3-phosphate
DPG = 1,3-diphosphoglycerate

2. PGK (diphosphglycerate kinase)
DPG + ADP → 3-PG + ATP
これら２つの反応は強固に連結されているので過剰なNADHは解糖系によるATP産生を阻害する

NAD+不足で解糖系が停止
1. GAPDH (グリセロアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素)

GAP + NAD+ → DPG + NADH + H+
この反応が右向きに進むためには自由エネルギー変化が負である必要がある
このためには[NAD+]の濃度は[NADH]の 1000倍以上でなくてはならない

L/P比が25.6以上になると解糖系によるATP産生が停止する(Voet and Voet: Biochemistry)ピルビン酸はATP合成を回復させる
ピルビン酸 + NADH + H+ → 乳酸 + NAD+
[乳酸]/[ピルビン酸] < 25.6
[乳酸] = 2.56 mM = 23.04 mg/dL[ピルビン酸] = 0.1 mM = 0.88 mg/dL[乳酸] = 25.6 mM = 230.4 mg/dL[ピルビン酸] = 1 mM = 8.8 mg/dL[ピルビン酸]の濃度を上昇させれば[乳酸] の濃度が高くてもATPを作り出せる
ブドウ糖 + 2 ADP + 2 Pi → 2 乳酸+ 2 ATP + H2Oピルビン酸は最小のケト酸
Pyruvate
CH3CIIO

CH3-CO-COOー

COOーピルビン酸はお酒の元
ブドウ糖 → ピルビン酸
ピルビン酸 → エタノール + CO2↑
（中間代謝物 = アセトアルデヒド）
CH3-CO-COOH → CH3-CHO + CO2↑
CH3-CHO + NADH + H+ → CH3-CH2-OH

日本酒・ビール・ワインの醸造過程において二酸化炭素の泡が出ている時そこにはピルビン酸が大量に存在

自分を実験台にする
09:00 サントリー角 50 mL + H2O 50 mL
10:00 ピルビン酸ナトリウム 5 g
呼気中のアルコール濃度を測定

LDH

LactatePyruvateピルビン酸はアルコール分解促進
アルコール → アセトアルデヒド → 酢酸
CH3-CH2-OH + NAD+ → CH3-CHO + NADH + H+
CH3-CHO + NAD+ → CH3-COOH + NADH + H+ピルビン酸 + NADH + H+ → 乳酸 + NAD+呼気
中のエタノール濃度

ピルビン酸飲用↓Time (min)Lac Pyr Glucose

MCTGLUT Lac Pyr
LDH(d) Alcohol oxidation
Ethanol
ADH
Acetaldehyde

NAD+NADH + H+NAD+ALDH

AcetateNADH + H+

Cytoplasm
Glucose
NADH + H+
G-6-P

+NAD
F-6-P

FBP
+GAPDHAPNADGAPDH +BPG
H + NADH
PGK
3PG
ADP
2PGATPPEP
ADPPKPyrATPアルコール↓アセトアルデヒド↓酢酸

お酒を飲むと赤くなる人
ALHD2*2 heterozygote
ピルビン酸投与によってアセトアルデヒドが上昇ピルビン酸療法の理論的背景

14年前

ピルビン酸ナトリウムの作用機序

解糖系によるATP産生ブドウ糖

PEP Kinase
PEP + ADP →Pyruvate + ATP

↓
2 PEP

↓
2 ピルビン酸

↓
2 乳酸

NAD+
NADH + H+
NADH + H+
NAD+

PEP (ホスホエノールピルビン酸)

ブドウ糖から２分子のピルビン酸が生じ２分子のATPが得られる

+
解糖系はNAD 不足で停止する↓

乳酸の過剰蓄積
ピルビン酸の絶対的不足
NAD+が再生不能

GAP

ATPが得られない

ブドウ糖↓ピルビン酸

↓

乳酸

NAD+

NADH + H++
NADH + H
NAD+

ミトコンドリアでも解糖系でもATPが作れないミトコンドリア病の赤ちゃん
胎児は臍帯と胎盤によって母親とつながっている
出生時体重は 3000 g
母体と切り離されると高乳酸血症を発症する
胎児は乳酸を排出し母親は乳酸からブドウ糖を糖新生系によって再生する

透析によって子宮内環境を維持する
乳酸↓

母体胎盤臍帯↓ピルビン酸

点滴用ピルビン酸ナトリウム
ピルビン酸Na
150 mM
16.5 g/L
8.25 g/500 mL
点滴150mM×0.5L
メイロンに代わる新しい→
15mM×5L
アシドーシス補正薬
blood（製薬企業 募集中）

ドイツでの臨床試験の報告
特発性心筋症患者8人の冠状動脈にピルビン酸ナトリウム 150 mMを直接注入↓
心拍出量の上昇・心拍数の低下
陽性変力作用Haemodynamic effects of intracoronary pyruvate inpatients with congestive heart failure: an open study
Hermann et al. Lancet 353: 1321-1323, 1999

Cardiac index (L/min/m2)

Cardiac output (mL/m2)

心拍出量および心係数へのピルビン酸の効果

Pre Pyruvate Pyruvate NaCl(370 mL/h) (740 mL/h)

Pre Pyruvate Pyruvate NaCl(370 mL/h) (740 mL/h)ミトコンドリア病の非侵襲的検査
安定同位元素を用いた呼気試験
ピロリー菌 → 除菌 → 胃癌予防

[13C]尿素
呼気テスト

赤外分光法による13CO2/12CO2比の測定
赤外吸光
酸素や窒素は吸収しない
二酸化炭素
O=13C=O O=12C=O
13CO の波数 = 2280 cm-1
212CO の波数 = 2380 cm-1
213CO
212CO
24気圧に圧縮して感度を上げる

POC One （大塚電子）

13C 標識ピルビン酸[1-13C]Pyruvate → [1-12C]Acetyl-CoA

CH3-CO-COOH → CH3-CO-CoA[2-13C]Pyruvate → [1-13C]Acetyl-CoA[3-13C]Pyruvate → [2-13C]Acetyl-CoA[1-13C]Pyruvate[2-13C]Pyruvate

8070206010500030609012015012015040[3-13C]Pyruvate

3020201010000306090120150Time (min)[1-13C]ピルビン酸からの13CO2の急速な排出は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDHC）の活性を示す。

0306090Time (min)[2-13C]ピルビン酸または[3-13C]ピルビン酸を基質として使用した場合、急速な排出は検出されない。

PDHC
ピルビン酸脱水素酵素

Pyruvate
CH3-CO-COOH
CO2Acetyl-CoA
CH3-CO-S-CoA[1-13C]Pyruvate + CoA-SH + NAD+
↓13CO + Acetyl-CoA + NADH + H+
2

ミトコンドリア機能
非侵襲的評価13C標識ピルビン酸
代謝分析
Wu et al.
Metabolic analysis of 13Clabeled pyruvate fornoninvasive assessment ofmitochondrial function.
Ann NY Acad Sci
1201: 111–120, 2010

PDHC欠損症に対する非侵襲的検査
健常成人と10ヶ月児 [p.Ala169Val]の比較
20 mg of [2-13C] or [1-13C]Pyruvate

808070706060

D13CO2/12CO2

Δ13CO2/12CO2100 mg of [2-13C] or [1-13C]Pyruvate

50403050403020201010000306090

Time (min)1201500306090

Time (min)120150CE-TOFMSによる細胞内代謝産物の解析[13C]-Labeled Lactate vs[13C]-Labeled Pyruvate

紙健次郎 博士
曽我朋義 教授
慶應義塾大学
鶴岡キャンパス

Capillary Electrophoresis Timeof Flight Mass-Spectrometry

細胞内外の[13C]ピルビン酸と[13C]乳酸の交換
細胞内に取り込まれたピルビン酸はアラニン・乳酸・リンゴ酸に転換

COO|
C=O
|
CH3Pyruvate

COO|+H3 NCH|
CH3COO|
C=O|
CH3COO|
HCOH|
CH3Lactate

AlaninePyruvate
COO|
HCOH
|
CH3Lactate

COO|
CHOH
|
H2C−COOMalate乳酸の影響 ATP↓, ADP↑, AMP↑, IMP↑

アデニル酸キナーゼ
2 ADP → ATP + AMP
AMPデアミナーゼ
AMP → IMP + NH3

乳酸によるエネルギー危機

2SD 細胞の生体エネルギー的な変化
暴露実験 10 mM 乳酸 vs 10 mMピルビン酸
Lactate/Pyruvate Ratio

NADH/NAD+2SA cell (10 mM Lactate)
2SA cell (10 mM Pyruvate)
2SD cell (10 mM Lactate)2SD細胞 (10 mM Pyruvate)

ATPADPAMP

ミトコンドリア病の体外診断薬の開発
Mitochondrion 20: 34-42, 2015

ミトコンドリア病の病因変異を有する細胞モデルで乳酸負荷で上昇し、ピルビン酸投与で発現が低下する遺伝子産物を同定 → ELISA: 培養上清・患者血清で測定

human 143B
osteosarcoma cells

mtDNA-deficientρ0206 cells

enucleated myoblasts

myoblasts(MELAS patient)

Fusion2SD cells

2SA cells

m.3243A>G mutant mtDNA: 94% m.3243A>G mutant mtDNA: 0%46

乳酸暴露後の遺伝子発現パターンのクラスター解析

0h4h8h
10 mM Lactate

0h4h8h
10 mM Pyruvate

2SA cells

0h4h8h
10 mM Lactate

0h4h8h10 mM Pyruvate

2SD cells

GDF15は細胞培養液に分泌される
1 mMPyruvate

10 mMLactate

10 mMPyruvateControl

2SA cybrid
Disease model2SD cybrid

ELISA
GDF15 concentrationin culture media

Cultured for 24 hours
60

GDF15 (pg/ml)

50
40
30
20
10

1P ：1 mM Pyruvate0

1P 10L 10P 1P 10L 10P
2SA cybrid

2SD cybrid

10L：10 mM Lactate
10P：10 mM Pyruvateミトコンドリア病患者血清 GDF15とFGF21
GDF15
10000

FGF2112000

P < 0.001

10000

FGF21 (pg/mL)

GDF15 (pg/mL)

8000
6000

4000

8000
6000
4000

2000

2000

00MeanP < 0.01

Control

Mitochondrial
disease285.2

2632.9(pg/ml)(pg/ml)Mean

Control

Mitochondrial
disease294.6

1138.1(pg/ml)(pg/ml)ミトコンドリア病の新規体外診断薬
医学生物学研究所に抗体作成依頼
抗GDF15ポリクローナル抗体
抗GDF15モノクローナル抗体
ELISAによる測定系完成

ラテックス凝集法による測定系開発
薬事承認申請・保険収載を目指す
汎用機（TBA-16000c）での検査

ピルビン酸ナトリウム
酸塩基平衡を保つ
乳酸アシドーシス治療剤

乳酸アシドーシスの病態
血液が酸性に傾く
細胞内も酸性になる細胞内から「有機酸」を排出できない細胞内の中間代謝物のバランスが崩れる
細胞がエネルギーを得ることができない神経細胞が壊死してしまう

細胞内を中性に保つために血液を弱アルカリ性に保つ
肺と腎臓の働きC6H12O6 + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H2O細胞内で生じた二酸化炭素を肺から排出する細胞内で生じた有機酸を血液に排出する
腎臓は「酸」を尿に排泄する

細胞内を中性に保つために血液を弱アルカリ性に保つ
血液pHの正常値は7.47.0以下 or 7.6以上では長く生存できない
血液pHが弱アルカリ性である理由
1) 細胞内で絶えず産生される酸を中和する
2) ほぼ中性に保たれている細胞内pHの下では、細胞の中間代謝産物が解離する
3) 血液が酸性では有機酸を細胞から排出できない
4) 血液が弱アルカリ性なら有機酸を細胞から血液へ排出できる代謝性アシドーシスの改善に対するピルビン酸ナトリウムの効果
Yang et al. Artificial Cells, Nanomedicine,and Biotechnology, 2016; 44: 48–55
目的：代謝性アシドーシスに対するピルビン酸ナトリウム（SP）の効果を調べる。方法：生体内実験では、塩化アンモニウム（NH4Cl）誘発高塩素アシドーシス
ラットモデルに対するSPの効果を評価しました。 SPは、SP1、SP2、およびSP3グループに対して、それぞれ2、4、および6 mmol / kg-1の全用量で注入されました。重炭酸ナトリウム（SB）による治療を陽性対照（2mmol/kg）として使用し、生理食塩水（NS）による治療を容量対照（2 mL/kg）として使用しました。注射後のpH、血液ガス、電解質、グルコース、クレアチニン（Cr）、および尿素分析のために、眼静脈叢から血液をサンプリングしました。 in vitro実験では、プロピオン酸を適用して、ヒト内皮細胞の細胞内アシドーシスを誘発しました。細胞内pH（pHi）は、SPの添加後に蛍光測定されました。結果：生体内研究では、SP1群のpHはNS群のpHと比較して有意な差を示さなかった。 SP2およびSP3グループは、NSグループよりも高いpHでした（P <0.01）。 SP3グループは、SBグループ（P <0.05）およびSP1グループ（P <0.05）よりも高いpHを示しました。さらに、SP治療はカルシウムの異常を改善し、血中カリウム濃度を低下させました。 SP3グループは、SP1グループよりも高い血糖値を示しました（P<0.05）。血漿Crおよび尿素レベルのすべてのグループ間で有意差は観察されませんでした。 in vitro試験
では、SPの添加直後にpHiが上昇しました。結論：データは、SPによる血管内治療が代謝性アシドーシスを改善するための新しい治療戦略であることを示唆しています。

最近の基礎研究 (Harvard大学)
細胞内の過還元状態を解消する

人工的に酵素を連結する
LOXCAT
乳酸酸化酵素とカタラーゼ
乳酸をピルビン酸に酸化する
乳酸 + O2 → ピルビン酸 + H2O2
その時に生じた過酸化水素を水と酸素にする
H2O2 → H2O + ½ O2

ブドウ糖
ピルビン酸

人工酵素
乳酸

細胞外液

乳酸ピルビン酸

LOX = Lactate Oxidase
乳酸酸化酵素
乳酸を酸化し、ピルビン酸に変換する
この時、過酸化水素を発生する

CAT = Catalase
カタラーゼ
過酸化水素を水分子に変換する
この時、酸素を発生する

LOXCAT
融合酵素
乳酸をピルビン酸に変換
酸素と水分子を生じる

ピルビン酸ナトリウムの効能効果
ミトコンドリア研究から新規医薬品を開発

代謝性アシドーシス改善薬の妥当性
代謝性アシドーシスの原因

心筋梗塞・溺水・窒息・敗血症
一酸化炭素中毒・シアン中毒
末梢組織への酸素供給の途絶
ミトコンドリア酸化的リン酸化系の障害

GFRAL
GDF15の受容体

Nature 550: 195, 2017

GFRAL = GDF15の受容体が、延髄のArea postrema（最後野）とNucleus
tractus solitarius（孤束核）にある。 ここは嘔吐中枢である。
血液脳関門が完全ではないので、体の状態をGDF15を介してモニターできる。
GDF15-GFRAL-RET単なるバイオマーカーからストレス対応ホルモンへ②細胞へのストレスによってGDF15が放出され、血流によって標的である受容体に運ばれる①有害物質への曝露
感染性物質や有毒な食物の摂取【妊娠初期の悪阻】
胎盤から分泌された
GDF15は発達途中の胎児が有害物質に曝されないよう妊婦の食欲を制御③脳幹の最後核にあるGFRAL受容体への作用によって、嫌悪・忌避の応答が惹起される（食欲低下・嘔気・寡動）④行動変化により有害因子への曝露が回避される