DG2020-49
中和抗体分析
－アッセイフォーマット選択とアッセイパフォーマンス向上のための議論－
Neutralizing Antibody Assay:
Discussion to Select Assay Format andImprove Assay Performance(DG2020-49)

12th JBF Symposium, DG2020-49

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Japan Bioanalysis Forum1

Japan Bioanalysis Forum

Name

Company

清水 浩之
Hiroyuki Shimizu

田辺三菱製薬株式会社
Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation

小島 知子
Tomoko Kojima

株式会社サンプラネット
Sunplanet Co., Ltd.

中井 直子
Naoko Nakai

第一三共株式会社
DAIICHI SANKYO CO., LTD.

小田 祐輝
Yuki Oda

小野薬品工業株式会社
Ono Pharmaceutical Co., Ltd.

清水 啓友
Hirotomo Shimizu

旭化成ファーマ株式会社
Asahi Kasei Pharma Corporation

若松 明
Akira Wakamatsu

グラクソ・スミスクライン株式会社
GlaxoSmithKline K.K.

横田 喜信
Yoshinobu Yokota

パレクセル・インターナショナル株式会社
Parexel International Inc.

12th JBF Symposium, DG2020-49

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DG Members

2

Japan Bioanalysis Forum

活動の内容（Contents of Our Activity）
9

10

11

2021
1

12

TC

TC

TC

TC

TC

8/24

9/23

10/28

11/26

12/22

2
TC

TC

3
TC

1/21 2/10 2/25
ポスター作成

8/19
推進委員会

10/21
推進委員会

12/16
推進委員会

2/17
推進委員会

・合計8回のTeamsを用いた電話会議
・合計4回のDG推進委員との定期進捗報告会
・活動期間中はeメールでのコミュニケーションをベースとした

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JBFシンポ3/9-11

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2020
8

3

Japan Bioanalysis Forum

免責事項

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本発表における資料等に対する翻訳、集計等はDGメンバーが行ったものである。正しくは元の資料等を参照されたい。

12th JBF Symposium, DG2020-49

4

Japan Bioanalysis Forum

背景及び目的
特に臨床試験での抗薬物抗体分析において、ADA陽性と判定された試料については中和抗体分析を実施することがある。
その際に、どのようにアッセイフォーマットを選択し、いつ分析法を構築すべきか明確な指針はない。
DG2019-43で実施されたJBFサポーターへのアンケート結果においても、cell-based
assayとligand binging assayの両方が用いられていた。

中和抗体分析のアッセイパフォーマンス
一般的には、cell-based assayのアッセイパフォーマンスはligand binging assayよりも低いと考えられる。

DG2020-49の目的
中和抗体分析に関するいくつかの文献等を参照し、バイオ医薬品の薬効機序に着目してどのようなアッセイフォーマットが用いられているか調査した。調査の過程でレビューした薬物耐性の改善とカットポ
イント設定に関する文献も紹介する。
過去の申請資料から、それぞれのバイオ医薬品の中和抗体分析で選択されたアッセイフォーマットを調査した。
Cell-based assayのアッセイパフォーマンス向上のための対策を議論した。
本発表では、DGの議論内容の概要を紹介し、DGからの提案を共有する。

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中和抗体分析のアッセイフォーマット

5

Japan Bioanalysis Forum

Background and Purpose
Neutralizing antibody (NAb) assay is potentially conducted on samples that are
determined as ADA positive, particularly in clinical studies.
There are no clear guidelines on how to select the assay format and when todevelop the assay.
According to the results of the questionnaire to JBF supporters by DG2019-43,
both cell-based assay and ligand binging assay were used.

Assay Performance of Neutralizing Antibody Assay
The assay performance of cell-based assay is generally considered to be lower
than that of ligand binding assay.

Purpose of DG2020-49
We investigated what assay format was used by focusing on the mechanism of action (MoA) of
biotherapeutics with reference to several literatures on NAb assay. The literatures on drug
tolerance improvement and cut point setting reviewed during our discussion are also introduced.
The assay format selected for NAb assay of each biotherapeutic was reviewed based on each CTD.
We discussed measures to improve the assay performance of cell-based assay.
An overview of our DG’s discussion and proposal on assay format is presented.

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Assay Format of Neutralizing Antibody Assay

6

Japan Bioanalysis Forum

Strategy for Selecting NAb Assay Format from EBF
Symposium
Feedback from EBF Focus Workshope. ケーススタディ：薬物ターゲットの干渉と薬物耐性の改善法
g. 補足：スクリーニングアッセイにおけるカットポイント設定

申請資料調査Cell-based assayにおけるアッセイパフォーマンス
まとめ

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本発表の流れ7Strategy for Selecting
NAb Assay Format fromEBF Symposium

12th JBF Symposium, DG2020-49

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Japan Bioanalysis Forum

8

Japan Bioanalysis Forum• AAPS Working Group on NAbsから、中和抗体分析のアッセイフォーマット
選択のストラテジーが提言された。
（White Paper）• EBFシンポジウムで発表された。
https://e-b-f.eu/wp-content/uploads/2018/06/fw20160912-Jim-McNally.pdf

DGメンバーで本発表
資料をレビュー、議論した。発表内容をまとめて、重要な点をピックアップした。

12th JBF Symposium, DG2020-49

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Strategy for Selecting NAb Assay Format

9

Japan Bioanalysis ForumHistorical performance for cell-based NAb format

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Genesis of the cell-based NAb performance• NAbはバイオ医薬品の全体的なリスク/ベネフィット評価に影響を及ぼす可能性がある。
• Cell-based formatの選択は、中和する相互作用のサブセットではなく、生物学的作用の全体を評価することに基づく。
• Theoretical example：受容体への結合は、生物学的機能に必要であるが、十分ではない。他のNAbエピ
トープが影響する可能性のある下流のバイオロジーに必要な構造変化があるかもしれない。

MoAの定義が重要。例えば、単に薬物の受容体への結合だけでなく、受容体が構造変化しサブユニットが結合して薬効を発揮する場合などは、これら全体の作用を含んでMoAと考えるべき。
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10Japan Bioanalysis Forum

Revisiting the rationale and providing a MoA based
approach to select a format• 免疫反応の発現とその影響• ADA産生率の高さ• 豊富でない内因性因子への影響• in vivoで影響のあるNAb濃度• バイオロジーの反映• 標的への薬理作用の組み込み• 薬物-標的相互作用の機序• 目的の効果のためのバイオ医
薬品のデザイン上の特性

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Scientific basis for NAb assay formats selection

薬物のMoA、アッセイパフォーマンス、免疫原性のリスクの3つのファクターを考慮して、アッセイフォーマットを選択 。これらのうち、MoAが第一のファクターと提言。

• 感度、マトリックス干渉（特異性、選択性）• 薬物耐性（Ctroughでの感度）• 可溶性標的を含む他血清成分に対する細胞の反応性• 経時的な再現性• 受容体発現細胞株の妥当性

12th JBF Symposium, DG2020-49

11

Japan Bioanalysis Forum

Revisiting the rationale and providing a MoA based
approach to select a format
申請資料調査におけるMoAによるNAb測定法の分類

アゴニスト
アンタゴニスト（液性因子）
アンタゴニスト（細胞受容体）

アンタゴニスト（リガンド）

細胞傷害活性（ADC）

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Primary Determinant - MoA

細胞傷害活性補充療法（酵素）

薬物のMoA、モダリティ、標的、標的との相互作用からアッセイフォーマットを推奨。
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12Japan Bioanalysis Forum

Potential assay formats

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Case Study A

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13

Japan Bioanalysis Forum

Potential assay formats

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Case Study B

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14

Japan Bioanalysis Forum

Potential assay formats

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Case Study C

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15

Japan Bioanalysis Forum

Secondary considerations of risk assessment and assay
performance• 高いADA産生率のリスクがあるが、影響のリスクが低い場
合、スループットと頑健性のために競合的LBAが有利になる可能性がある。
• 内因性分子への影響が高い場合、MoAから考えて間違った
オプションを選択する余地は少ない。
• 影響のリスクが高い場合、薬物存在下での感度がより重要となり、競合的LBAが有利になる可能性がある。

免疫原性のリスクとアッセイパフォーマンスが、
アッセイフォーマット選択の第二のファクター。

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Secondary Determinants – Risk Assessment and Assay Performance• 2つの異なるフォーマットを同時に実行可能な場合、強く影響を受ける（初期の分析法開発で両方をテストする）。
• 薬物耐性を改善するための操作（競合的LBAのためのより多くのオプション）• 薬物及び可溶性標的両方の血清中濃度• 総合的なアッセイパフォーマンス
• 最適なパフォーマンス及びMoAとの関連性を検討するための細胞株や他試薬の選択（あるCBAは他の全てと異なる）

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16

Feedback from EBF
Focus Workshop

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Japan Bioanalysis Forum

17

Japan Bioanalysis ForumEBF Focus Workshop
について記された資料を元にDGメンバーでレビュー議論し重要な点をまとめた。

12th JBF Symposium, DG2020-49

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Feedback from EBF Focus Workshop

18

Japan Bioanalysis Forum

a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.

Summary (European Bioanalysis Forum Workshop….. 2016)
Introduction (In early 2016 the European Bioanalysis Forum (EBF)…)
The current regulatory landscape & future challenges
A rapidly changing regulatory environment
Challenges of drug tolerance & interferences in immunogenicity assays
Alternatives for NAb assessment
Cut-point setting in ADA & NAb assays
Closing panel discussion & meeting outputs
Conclusion & future perspective

a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.

概要
序論
規制の現状と今後の課題
急速に変化する規制環境
免疫原性試験における薬物耐性と干渉の課題
NAb評価の代替法
ADA & NAbアッセイにおけるカットポイント設定
クロージングパネルディスカッション＆会議のアウトプット
結論と今後の展望
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Contents

19

Japan Bioanalysis Forumb. 序論

European Bioanalysis Forum Workshop, Lisbon, Portugal, September 2016
At the recent European Bioanalysis Forum FocusWorkshop, ‘current analysisof immunogenicity: best practices and regulatory hurdles’, several important
challenges facing the bioanalytical community in relation to immunogenicity
assays were discussed through amixture of presentations and panel sessions.
The main areas of focus were the evolving regulatory landscape, challenges
of assay interferences from either drug or target, cut-point setting andwhether alternative assays can be used to replace neutralizing antibody
assays. This workshop report captures discussions and potential solutions
and/or recommendations made by the speakers and delegates.

EBF Focus Workshop
で主な焦点となった領域
規制状況の進展薬物または薬物ターゲットのアッセイ干渉
カットポイント設定
中和抗体アッセイに代わる
代替アッセイの使用可否

In early 2016 the European Bioanalysis Forum (EBF) [1] created an
immunogenicity strategy workstream to address challenges within the
bioanalytical community when developing, validating andimplementing assays for antidrug antibody (ADA) assessment during
biotherapeutic drug development.
Just prior to the strategy workstream formation, the European
Medicines Agency (EMA) had published a revised draft to the 2006
immunogenicity guideline EMEA/CHMP/BMWP/14327/2006 [2],shortly followed in 2016 by a new draft guidance from the US FDA
focused on immunogenicity assay development and validation [3].
The EBF community reviewed and commented on both documents
during public consultation and it became evident there were several
key challenges that warranted further discussion in the format of a
focus workshop [4]. This meeting took place in Lisbon in September
2016 with around 80 delegates and 13 speakers.

【EMA】
2006：免疫原性ガイドライン 発出
2016：改定案 発表【FDA】
2009：ガイダンス 発出
2016：改定案 発表（免疫原性アッセイの開発とバリデーションに焦点）

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a. 概要

この両方の文書をレビューし、ワークショップで討議(2016年9月： 今回の発表内容 ）【FDA】
Guidance for Industry : Clinical Immunogenicity Considerations for Biosimilar and Interchangeable Insulin Products, Draft (2019)
Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products-Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection (2019)【EMA】
Guideline on Immunogenicity assessment12of ththerapeuticproteins (2017) DG2020-49
DG追記（2021年2月現在）
JBF Symposium,

20Japan Bioanalysis Forumc. 規制の現状と今後の課題
免疫原性アッセイの開発およびバリデーションを具体的に記載したガイダンス文書
2016年9月（ワークショップ当時）：EMAおよびFDAによって発出されたもののみ。
日本やブラジルなどの国際調和会議（ICH）参加国で、この話題に関して発表された規制やガイドラインはない

臨床開発プログラムにおいて、いつどのような免疫原性試験を実施すべきか

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The starting point of the discussions was an overview of thecurrent regulatory landscape given by Michaela Golob (onbehalf of the EBF). Globally, there are various regulatory
documents concerning immunogenicity, however, guidance
documents specifically describing immunogenicity assay
development and validation have only been published by the
EMA and FDA. Within the International Council for
Harmonization (ICH) regions such as Japan and Brazil, there
are currently no regulations or guidelines released on this
topic. Outside the ICH regions there are several documents
delineating immunogenicity but no dedicated regulations
describing immunogenicity assay development and validation.
The EBF invited EMA and FDA representatives to present theircurrent draft guidelines and to inform the audience on current
discussions and thinking within their agencies. Joao A. PedrasVasconcelos represented the FDA and gave an update on the
US perspective on therapeutic protein immunogenicity. He
explained regulatory expectations on providing an
immunogenicity risk assessment and a suitable sampling planfor clinical studies.
As well as the development of validated ADA assays,
containing a multi-tiered approach of a binding antibody(screening) assay, a confirmatory assay, a titer assay andpotentially a neutralizing antibody (NAb) depending on thestage of development. Joao referred to preclinicalimmunogenicity with the primary utility being theinterpretation of toxicology and pharmacology data.
Nevertheless such preclinical assessment may also reveal
potential antibody-related toxicity that could be monitored inclinical trials and therefore appropriate storage of preclinicalimmunogenicity samples is strongly recommended.
The level of immunogenicity testing within the clinicaldevelopment program is highly correlated to the potential risk
and should be described by a formal risk assessment starting
early in development. Jo˜ao then discussed the FDA view on
assay design and validation parameters, especially
recommending cell-based NAb assays due to their tendency to
be more reflective of the in vivo situation. However,competitive ligand-binding assays (CLBAs)might be a suitable
alternative in some situations. Additionally, he presented the
FDA recommendation on clinical sampling and storage
strategy, the latter being of importance should an agency
request reanalysis following submission of the Biological
License Application.

潜在的なリスクと高い相関を示すので、開発の初期から正式なリスク評価によって実施されるべき

FDAの見解in vivoの状況をより反映する傾向があるため

Cell-based NAbアッセイを推奨。
しかし、状況によっては競合的リガンド結合アッセイ（CLBAs）が適切な代替法となる可能性がある。

DGコメントLBAsのほうがin vivoの状況をより反映する状態とは？
Cell-based assayを構築するにあたり
生体内の状態から著しく乖離している条件を設定する必要がある場合
生体内の状態よりもかなり多くのリガンドを添加しないと定量できない場合 など

12th JBF Symposium, DG2020-49

21

Japan Bioanalysis Forumd. 急速に変化する規制環境
EMAガイドライン と FDAガイダンス の比較（適用範囲、分子フォーマット、バイオシミラー、陽性対照、感度、薬物耐性、特異性／特性評価、アッセイのカットポイント、等）

課題：異なる地域における複数の申請に対応するために両文書を遵守する必要がある
免疫原性に特化したICHの取組みが開始されることが理想。
しかし、ICH規則を満たすための指針文書を作成するためには、少なくとも
さらにもう1つのICH参加国によるガイダンスの発出が必要となる。

両ガイダンスの記載内容は概ね整合性が取れている。
両ガイダンス文書の記載に差があるポイント
生物学的製剤の定義 および そこから派生する免疫原性評価の必要性
上記のように両ガイダンスで異なった分類分けとなった場合でも・・・
いかなる分子フォーマットのリスク評価も重要。
評価を行う際には多元的なアプローチをとるべき。

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Following on from Michaela’s introduction to theimmunogenicity landscape plus the presentations from the
FDA and EMA reviewers, the regulatory theme was continued
with further focus on the EMA and FDA draft guidance
documents released for public consultation in 2015 and 2016
respectively. The aims of the session were to update delegateson the main comments and suggested revisions submitted by
the EBF to both agencies and highlight the key areas ofcomment. This was followed by a regulatory panel session
where questions were posed to the two regulators plus
Michaela Golob and Joanne Goodman.
The summary of the EBF comments on the two new draft
guidance documents was presented by Joanne (on behalf ofthe EBF). While a significant number of comments werereceived, the main focus of the presentation concerned thescope of the documents, molecule formats, biosimilars,
positive controls, sensitivity, drug tolerance,
specificity/characterization, assay cut-points, NAbs andgeneral comments. While parts of the guidance documents
are aligned between the two agencies, one of the challenges
for the community as a whole is to adhere to both documents
to cover multiple filings in different regions. Ideally an ICH
harmonization effort dedicated to immunogenicity could beinitiated, yet unfortunately this would require at least one
more ICH region to produce a guidance document to fulfil the
ICH rules.
The definition of a biologic and therefore the need for
immunogenicity assessment varied especially in the area of
peptides dependent on their size. A risk assessment for any
molecule format is vital and multifactorial approaches should
be taken when producing the assessment. Additionally, it isrecommended that this assessment is formed early indevelopment. However, clinical consequence of theimmunogenic response should be the driving factor rather
than ADA incidence. Everyone was in agreement that wherean endogenous nonredundant counterpart is present, thenthis should automatically be classed as high risk.

評価：開発初期の実施を推奨。
ADA発現率よりも、むしろ免疫原性応答の臨床的な結果が（リスク評価を）促進する因子となる。
内因性物質がそれにあたる場合は、自動的に高リスクに分類されるべき。

12th JBF Symposium, DG2020-49

22

Japan Bioanalysis Forumd. 急速に変化する規制環境
免疫原性試験 結果の評価
規制当局の審査により、その妥当性が確認および判断されるまで未確定→ 開発中にデータを再評価したり、測定法を再更新したりしなければならないことは珍しくない。

【FDAの推奨】

抗体が血清および血漿マトリックス中で安定であることがよく知られているため正式にADA自身の安定性評価を実施することは不可能なので、それに代わる方法として陽性対照を保存した場合の分析結果を用いる
FDAガイダンス(p.16) ：Because it is generally not feasible to establish the stability of subject samples, FDA
recommends storing subject samples in a manner that preserves antibody reactivity at the time of testing.

測定法（Full Validationの必要性）
フルバリデートされた測定系：バイオ医薬品の認可申請時、および一般的に第Ⅲ相として合意された
ピボタル試験を支持する場合にのみ必要。（高リスク分子については、第Ⅰ相試験までの早い段階での準備が求められるが、それ以外の場合は、試験の 適格性が確認 されていれば良い）
臨床試験実施中にリアルタイムで免疫原性の解析が必要となることは通常まれであり、関連する安全性情報がある場合にのみ要求されるであろう（リアルタイム報告：FDA提出の10％未満）。

アッセイフォーマットの選択について
NAbアッセイについてはガイダンス文書の中でさらに検討が必要であり、
アッセイ形式の選択は十分に記述されているが、このようなアッセイにおける相対的な感度および薬物耐性に対する期待に関して詳細はない。

「バリデーション＞＞適格性確認」という意味合いバリデーション＝Full Validation
適格性確認＝Fit for Propose

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It should be remembered that an immunogenicity assay is only
validated when deemed so by regulatory review. This can raise
the requirement for further testing and therefore sample
storage becomes critical; it is not uncommon for applicants to
the FDA, as well as to the EMA, to have to reassess their dataor revalidate assays during development. Since it is wellknown and documented that antibodies are stable in serumand plasma matrices [5], the recommendation was to use
trending analysis of positive controls as a viable alternative toformal stability assessments. Validated assays are only
required at Biological License Application submission andwhen supporting a pivotal trial that was generally agreed as
Phase III.
Although for high-risk molecules this could be as early as
Phase I. Otherwise it is acceptable for an assay to only bequalified in the earlier stages of drug development.
Furthermore it is usually rare that real-time immunogenicity
analysis is required and will only be requested when there is arelated safety signal; such cases equate to less than 10% of
FDA submissions.
Finally, NAb assays still need further consideration within theguidance documents, the choice of the assay format is welldescribed but there are no details with respect to the
expectation for relative sensitivity and drug tolerance in suchassays.

DGコメント

目的に準じて分析法をある程度確認（実施者が判断しながら評価項目を決定）と考えられる。

12th JBF Symposium, DG2020-49

23

Japan Bioanalysis Forume.免疫原性試験における薬物耐性と干渉の課題

ケーススタディ

薬物耐性と干渉が、データ解釈にどのように影響しうるか
上記が問題である場合のアッセイ感度を改善するために適用できる戦略
FDAガイダンスには、以下の一文として簡単に記載してあるのみ。
FDA ガイダンス(p.22)
V. ASSAY DEVELOPMENT
D-Development of Neutralization Assay
5. Additional Considerations for Neutralization Assayd. The presence of onboard drug should also be considered when designing neutralization assays,
particularly when drugs with a long half-life are used.
中和アッセイを設計する際、特に半減期の長い薬剤を使用する場合は、共存している薬剤の存在も考慮する必要がある。

詳細別途後述記載（p.25 – p.33）

1) 薬物ターゲットの干渉と薬物耐性は、ADAおよびNAbアッセイに影響を及ぼす。
その克服方法について。（2つのケーススタディ）

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The session on ‘challenges of drug tolerance andinterferences’ included case studies andpresentations by James Munday (Covance),
Robert Nelson (Novimmune) and Thomas Emrich(Roche Pharma Research and Early Development).
This session reviewed the challenges associatedwith drug tolerance and target interference for
immunogenicity assessment assays. James gave
an introduction to why ADA assay tolerance andtarget interference are important to understandand how they can affect data interpretation. He
then reviewed strategies that can be applied to
improve assay sensitivity when drug tolerance andtarget interference are an issue.

上記文献：ケース1 ADAの薬物耐性の改善について（今回のDGの対象外）
ケース2 NAbの薬物耐性の改善について （DG discussionの対象）

2) ADA解析のピットフォール(落とし穴）とその課題を克服するために使用できる戦略について。
12th JBF Symposium, DG2020-49

24

Japan Bioanalysis Forume. ケーススタディ：薬物ターゲットの干渉と薬物耐性の改善法
薬物耐性の改善に応用できる方法
・アッセイデザインの最適化（共インキュベーション VS 段階的手法）
・標準酸解離（MSDB）
・酸解離を伴う固相抽出（SPEAD）
・アフィニティーキャプチャー溶出（ACE）
・沈殿と酸解離（PandA）等

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The first presentation given by James
Munday described how the existence of
biological therapeutics with long acting
exposure is resulting in an increased
requirement for designing ADA assays
with an increased tolerance of free drug.
The presentation reviewed methods thatcan be applied to improve drug tolerance,
including optimization of assay design(co-incubation vs stepwise approach),standard acid dissociation as described by
Patton et al. [6], solid phase extraction
with acid dissociation (Smith et al.) [7],affinity capture elution (Bourdage et al.)[8] and precipitation and acid dissociation(PandA) (Zogbhi et al.) [9]. The review
showed how the equipment platformchoice, assay design and assay format can
all influence the drug tolerance achievedin an ADA assay.

https://www.e-b-f.eu/wp-content/uploads/2018/06/fw201609-08-Robert-Nelson.pdf

12th JBF Symposium, DG2020-49

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Japan Bioanalysis Forume. ケーススタディ：薬物ターゲットの干渉と薬物耐性の改善法
薬物耐性の改善に応用できる方法:一例として酸解離を伴う固相抽出法（SPEAD）を挙げる。

ADA

ビオチン標識薬物

薬物

酸解離

ビオチン化薬物添加中和

ストレプトアビジン
プレートに採取

洗浄

酸

ルテニウム標識薬物

ECLにて検出

ルテニウム標識薬物添加
中和

ビオチン化薬物コーティング
したECLプレートに採取

12th JBF Symposium, DG2020-49

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酸

酸解離

出典：第11回JBFシンポジウム DG2019-43資料

26

Japan Bioanalysis Forume. ケーススタディ：薬物ターゲットの干渉と薬物耐性の改善法
ケース1：ADAの薬物耐性の改善について（今回のDGの対象外）
薬物ターゲットの存在がアッセイ干渉を引き起こす可能性があるADAブリッジングアッセイ
薬物ターゲットが薬物とその標的エピトープの間の界面でADA結合を阻害し、偽陰性となる可能性がある。
また、ターゲットが多量体である場合、アッセイで使用される重要な試薬とブリッジを形成し、偽陽性となる可能性もある。
【ブリッジングアッセイ】

偽陽性
偽陰性

上記を克服するための戦略

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The performance of ADA bridging assays,
where the presence of the drug target cancause ADA assay interference, was also
reviewed and discussed. A drug target may
inhibit ADA binding at the interface between
drug and its target epitope resulting in a false
negative ADA result. Alternatively, if the target
is multimeric it may form a bridge with thecritical reagents used in the assay resulting ina false-positive ADA result. Strategies forovercoming such target interference werediscussed. These involved either removal of
the target by affinity capture/acid dissociation
techniques or by inhibition of the drug–target
interaction with the target receptor or with
antibodies to a different complementaritydetermining region (CDR) to that used by the
drug.
Robert Nelson then presented two casestudies on ‘overcoming drug and target
interference in ADA and Nab assays’. The firstcase study examined challenges in bridging
ADA assays when the therapeutic target issoluble and multimeric. Robert showed how
anti-target antibodies that are noncompetitive
with the monoclonal antibody (mAb)therapeutic had been used in a methodology
to deplete the target and so minimize the riskof false-positive results in the screening assay.
The method included a mild acidic treatment
to dissociate drug: ADA complexes andincrease drug tolerance and minimize the riskof false-negative screening results.

アフィニティーキャプチャー/酸解離技術による
薬物ターゲットの除去
ターゲット受容体と薬物-ターゲット相互作用の阻害
薬物の結合部位とは異なる
相補性決定領域（CDR）に対する抗体による除去→ 偽陰性＆偽陽性の発生を回避

12th JBF Symposium, DG2020-49

27

Japan Bioanalysis Forume. ケーススタディ：薬物ターゲットの干渉と薬物耐性の改善法
ケース1：ADAの薬物耐性の改善について（今回のDGの対象外）

分析条件（インキュベーション時間および 処理なし/酸性下での前処理）、ADA陽性対照の性質、および少しずつ異なるブリッジングイムノアッセイプラットフォーム（ELISAおよびECLIA）が、特に残留薬物（薬物干渉）の存在下で分析感度に及ぼす影響を提示

各アッセイプラットフォームが、特に残留薬物の存在下で分析感度に及ぼす影響

12th JBF Symposium, DG2020-49

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Using case studies, Thomas presented theimpact of assay conditions (incubation timeand native/acid pretreatment), the nature of
ADA positive controls and to a minor extent
different bridging-immunoassay platforms(ELISA and ECLIA) on the analytical sensitivity,
especially in the presence of residual drug
(drug interference).

28

Japan Bioanalysis Forume. ケーススタディ：薬物ターゲットの干渉と薬物耐性の改善法
ケース2：NAbの薬物耐性の改善について（今回のDGの対象）
ケース１ で偽陰性＆偽陽性を回避したのと同じ薬物作用機序に基づく最も適切なフォーマット
マトリックス干渉

Nabと複合体を形成することがある(偽陰性)細胞ベースのアッセイパラメーターのシフトを引き起こす可能性がある

IC80濃度の目標値およびEC80濃度を用いて実験ウインドウを定義した方法
薬物－ADA複合体を解離させ、可溶性ターゲットを変性させるために穏やかな酸性処理を採用する。
抗イディオタイプ抗体を用いて、Drugを除去し、偽陰性結果のリスクを最小限に抑える。

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In the second case study, Robertdescribed how EC80 levels of target andIC80 levels of drug were used to define
the experimental window in a cell-based
assay to assess the neutralizing activity of
ADA, and how the presence of even low
levels of target and drug present insamples could confound the NAb
assessment. Robert illustrated how a mild
acidic treatment was employed todissociate drug–ADA complexes anddenature the soluble target; anti-idiotypic
antibodies were then used to remove themAb therapeutic and minimize the risk offalse negative results. The method
included a size exclusion buffer exchange
step to remove sample and buffer
components, which were incompatible
with the cell-based assay.
In his talk, Thomas Emrich emphasized
the need for a deep understanding not
only of the characteristics of ADAs
analytes themselves, but also of theirinteraction partners, the drug and its
target.

（検体および緩衝液成分を除去するためのサイズ排除緩衝液交換ステップが含まれ、除去した緩衝液成分は細胞ベースのアッセイに影響がない）

ADAs分析対象物質自身の特性だけでなく、それらの相互作用パートナー、薬物およびそのターゲットの深い理解が必要である。
（次ページに実験内容詳細記載）

12th JBF Symposium, DG2020-49

29

Japan Bioanalysis Forume. ケーススタディ：薬物ターゲットの干渉と薬物耐性の改善法

http://bioanalysisforum.jp/

IC80濃度の目標値およびEC80濃度を用いて実験ウインドウを定義した方法＜図の状況＞
Target：サイトカイン
Drug：サイトカインに対する抗体

細胞はサイトカインの受容体を発現していて、リン酸化STAT結合配列をプロモーター領域に組み込んだルシフェラーゼ遺伝子が導入されている。
まず、細胞にサイトカインを曝露するとシグナル経路が活性化され発光量が上がっていく。

12th JBF Symposium, DG2020-49

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Japan Bioanalysis Forume. ケーススタディ：薬物ターゲットの干渉と薬物耐性の改善法
IC80濃度の目標値およびEC80濃度を用いて実験ウインドウを定義した方法

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Cell-based assayのアッセイパラメーターのシフト

サイトカインとそれに対する抗体の濃度をそれぞれEC80とIC80にTarget EC80の濃度を採用すると、サンプルからのサイトカインの固定しADAの濃度を上げていくと、シグナル経路が活性化され、混入による影響を最小限にできる。次に、サイトカインの濃度を発光量が上がっていく。
EC80に固定しサイトカインに対する抗体の濃度を上げていくと、シグナル経路が抑制され、発光量が下がっていく。
結論：サンプルに含まれるTargetやDrugの濃度によって、NAb評価を混乱させる場合があるため、最適化する必要がある。ADAの相互パートナーであるDrugやそのTargetについても深く理解する必要がある。

12th JBF Symposium, DG2020-49

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Japan Bioanalysis Forum

Cell ベースのアッセイでDrug Toleranceの例
3.3 nM (500ng/mL）のDrugで影響を受けている。

Drug and Target Depletionをしたら・・・
影響を受けにくくなった。

12th JBF Symposium, DG2020-49

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e. ケーススタディ：薬物ターゲットの干渉と薬物耐性の改善法

32Japan Bioanalysis ForumIn another example, it was
shown how even low abundantoligomeric soluble targets can
mimic ADA responses in aclassical bridging ADA assay(target interference) that may
lead to false-positive
interpretation of ADA testing
results. Workarounds by using
competitive anti-target
antibodies or balanced
reduction of sensitivity bysample dilution and benefit
from increased drug
tolerance/sensitivity due tocomplex dissociation were
presented.

試料中に存在するターゲットおよび薬物の濃度が低くてもNAb評価を複雑にする場合がある
ADA解析のピットフォール(落とし穴）
少量のオリゴマー可溶性ターゲットであっても、ADA検査結果の偽陽性
解釈につながる可能性のある古典的なブリッジングADAアッセイ（ターゲット干渉）において、ADA応答を模倣できる方法がある。
競合的抗ターゲット抗体を用いることによる作業、または検体希釈による感度のバランスのとれた減少、および複雑な解離による薬物耐性／感受性の増加から得られるベネフィットが示された。

12th JBF Symposium, DG2020-49

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e. ケーススタディ：薬物ターゲットの干渉と薬物耐性の改善法

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Japan Bioanalysis Forume.免疫原性試験における薬物耐性と干渉の課題
測定法の検討において必須なこと
NAbとADA、両方のアッセイを構築する上で使用される、相互作用タンパク質への深い理解
高感度、特異性の高い検出を実現するため臨床的に意味のある免疫原性の検討• 薬理活性をもつ薬物• 臨床的安全性および有効性マーカー• 曝露に対するADAの影響を常に統合的に解析すべき

必要条件をすべて満たすことも必要だが、前に進めるために適切な方法を構築することも大切。

酸解離技術：適用するには、注意が必要

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In summary, careful characterization of ADA
assays and understanding of the interacting
proteins of ADAs under assay conditions is aprerequisite for sensitive and specific detection of
ADAs. However, clinically meaningful investigationof immunogenicity is always an integrated analysis
of ADA impact on exposure by measurement ofpharmacological active drug, clinical safety andefficacy markers.
The session showed that there are a broad arrayof techniques and assays in the analytical toolbox
to build sensitive ADA assays that address thechallenges of drug tolerance and target
interference. However, to do this the analyticalscientist needs a deep understanding of theinteracting proteins that are used to build both
NAb and ADA assays.
It is only then that we can be certain of generating
clinically meaningful immunogenicity assessment
results. The panel discussion highlighted thechallenges faced across the community withbuilding assays that can meet all the requirements
but identified ways forward. There was somecaution noted on applying acid dissociation
techniques to all assays, whether this was needed
or not; acid dissociation can change immunogenic
epitopes and should therefore only be applied insituations where there is a demonstrated need toincrease drug tolerance. Changing the method
equilibrium can sometimes be a more effective
way of improving assay performance.

酸解離は免疫原性エピトープを変化させる可能性がある。
したがって、薬物耐性を高める必要性が実証されている状況でのみ適用すべきである。

12th JBF Symposium, DG2020-49

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Japan Bioanalysis Forum

f. NAb評価の代替法
様々な作用機序(MoA)および生物学的製剤の複雑性に基づくリスク評
価より臨床的に重要なNAbを検出するための代替法について議論する。
「細胞ベースのアッセイと非細胞ベースのアッセイの使用を評価」に加えて
NAbアッセイをADAおよびPK／PDアッセイに置き換えることの議論が進行中
専用のNAbアッセイを、ADAとPK／PDの統合的評価に置き換える強い傾向があるが規制当局にはかなりためらいがあり、依然として標準的な3段階アプローチ（in vitro NAbアッセイを含む）を要求している。

実際にNAbの結果からは（患者のリスク管理に十分な）データが得られるが、ADAおよびPK／PDのみでは患者のリスク管理に十分ではないという例がある。
特に、NAbsの存在が患者に対する高い安全性リスク(内因性の重複していな
いカウンターパートと部分的または完全に同一のタンパク製剤）と関連している
場合に当てはまる。

しかし、多くの場合、免疫原性データを適切に解釈するための専用のin vitro NAbアッセイは本当に必要ではない。

【前例】 抗TNFα mAb
ADA力価、PKおよび臨床的エンドポイントの組合せで現象を説明できた。

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The aim of the session was to discuss alternatives for detecting
clinically relevant NAbs using risk based assessment regarding
varying modes of action (MoA) and complexity ofbiotherapeutics. In addition to evaluating the use of cell-based
versus non-cell-based assays, there are ongoing discussions
within the biopharmaceutical industry to replace NAb assays
with ADA and PK/PD assays, which was highlighted by the first
speaker Daniel Kramer (Sanofi). Jim McNally’s (Merck Serono)presentation focused on the recent White Paper from the
AAPS Working Group on NAbs, which described when to selectcell-based versus competitive ligand binding (CLBA) NAb assay
formats.
Although there is a strong tendency within thebiopharmaceutical industry to replace dedicated NAb assays
with an integrated assessment of ADAs and PK/PD, regulatory
agencies are rather hesitant and still request the standard
three-tiered approach (including in vitro NAb assays). Daniel
Kramer acknowledged that there are indeed instances in which
NAb results do provide data that, but ADA and PK/PD alone,
are not sufficient for risk management of patients. This isespecially the case if the presence of NAbs is associated with ahigh safety risk for patients (therapeutic proteins partially or
fully identical to a nonredundant endogenous counterpart).
However, in most other cases, dedicated in vitro NAb assays
are not really needed to interpret immunogenicity data
adequately. Retrospectively this can be seen for example with
anti-TNFα mAbs for which the combination of ADA titers, PK
and clinical end points were used successfully. Daniel Krameremphasized that further discussion with authorities is urgently
needed in order to gain a common understanding on this topic.

→ 規制当局とのさらなる議論が緊急に必要であると強調

12th JBF Symposium, DG2020-49

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Japan Bioanalysis Forum

f. NAb評価の代替法

In conclusion, only a minority of safety issues have been
detected due to traditional NAb assay findings. Indeed, ADA
and PK/PD assays could predict better NAb status in somecases. However, regulatory agencies may not (yet) consider
ADA and PK/PD assays as replacements to dedicated NAb
assays. In addition, the validation of PD assays can bechallenging. Thus, retrospective and prospective analyses areneeded to obtain a better understanding of the utility of theseassays. In theory, a single PK assay for the determination ofactive drug may be enough for the determination of NAb
status.

（AAPS Working Group on Neutralizing Antibodies；2016年 ）NAb Assayフォーマットの検討
タンパク製剤の開発の初期から開始されるべき

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To address the selection of NAb assay format, an AAPS
Working Group published a White Paper in 2016 [10] that
focused on using anMoA rationale for assay design. Jim
McNally presented how the choice between cell-based andnon-cell-based formats should be driven by a strong scientificrationale that assesses the neutralization of thebiotherapeutic’s function. Of secondary concern should be thetypical parameters associated with development andvalidation of a bioanalytical assay: sensitivity, tolerance of
matrix, drug tolerance and reproducibility.
In practical terms, the assessment of potential assay formats
should begin early in the development of a biotherapeutic.
The need to generate reagents and identify viable cell lines
can require long lead times and, therefore, should be initiatedbased on a robust immunogenicity risk assessment for the
program. In addition, early and frequent consultation with theregulatory agencies can mitigate potential clinical holds andquestions around the immunogenicity of the biotherapeutic.

NAbアッセイフォーマット選択における薬物の作用機序を理論的根拠としたアッセイの構築に焦点を当てたホワイトペーパーを公表

必要な試薬の作製と試験に使用できる細胞株の確認には長いリードタイムを要する可能性がある。
開発計画プログラムに対する頑健な免疫原性リスク評価に基づいて開始すべきである。

タンパク製剤の開発計画プログラム：
開発初期～第3相試験、申請までの臨床試験、どの試験でどのように安全性や有効性を確認するかという、開発計画プログラム

さらに、規制当局との早期かつ頻繁な相談により、生物学的製剤の免疫原性に関する潜在的な臨床上の懸念や疑問を緩和することができる。

NAb Assayフォーマットの選択
従来のNAbアッセイの知見：安全性の問題はごく少数しか検出されていない。
理論的には、NAb産生の状態を把握するには、活性本体の薬物を捉えられる1種類のPK測定法で十分であるが、当局とのさらなる議論が必要である。

12th JBF Symposium, DG2020-49

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Japan Bioanalysis Forum

f. NAb評価の代替法
NAb Assayフォーマットの選択（続き）

High risk of ADA impact may place greater emphasis on assay
sensitivity in the presence of circulating drug, which may alsofavor CLBAs. Finally, implementation of the most suitable NAb
assay format should always be based on scientific justification.
It may be beneficial to develop both CLBA and cell-based Nab
assays early during the drug-development process to collectdata and gain understanding for the assay format selection.

CLBAsが選択される場合
リスクベースのアプローチを利用することにより、CLBsは細胞ベースのNAbアッセイの代わりに使用することができる。
例1）ADA発現率の高リスクおよびADAによる影響の低リスク
細胞ベースのアッセイと比較して、処理能力および頑健性の増加によりCLBAに有利に働く可能性がある。
例2）循環血中に薬物が存在する場合
ADAによる影響のリスクが高いことから、アッセイ感度に重点が置かれる可能性があり、CLBAsに有利に働く可能性もある。

最も適切なNAbアッセイフォーマットの実施：常に科学的正当性に基づくべき

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Further discussions with authorities are needed in order togain common understanding in this topic. Additionally CLBAs
can be used to replace cell-based NAb assays by utilizing a risk
based approach evaluating the MoA and complexity ofbiotherapeutic treatment. For example, high risk of ADA
incidence and low risk of ADA impact may favor CLBAs due toincreased throughput and robustness compared with cellbased assays.

データを収集し、アッセイ形式の選択のための理解を得るために、薬剤開発過程の初期に
CLBAsと細胞に基づくNAbアッセイの両方を開発することは有益であろう。

12th JBF Symposium, DG2020-49

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Japan Bioanalysis Forumg. ADA & NAbアッセイにおけるカットポイント設定

A particular discussion point was the recent draft FDA guidanceon setting the cut-point, which seeks to control the FPR at thecost of a potentially biased estimate of the relevant percentile[11]. This is a departure from previous guidance. The
simulations presented [12] showed that the FPR of the cutpoint proposed in the draft of the FDA guidance may yield 10%
FPR on average for the screening assay, which is not congruent
with the original intent of the earlier AAPS White Papers[11,13,14], which advocated an average 5% FPR.
However the simulation presented in [12] were based on asample size of approximately, n = 50. When considering thebalanced design proposed in [11] that would yield a total ofover n = 300 sample results (50 subjects times three
independent runs by each of two analysts), the FPR of the cutpoint presented in [12] should be much lower than 10% on
average. Further evaluation using data from several ADA
assays has shown the FPR to be approximately 6–7%.

ADAおよびNAbアッセイにおけるカットポイント設定の統計学的側面
1）基本的考え方に焦点を当て、文献に記載された異なるアプローチを描写
カットポイントの設定法の更新（EBF Focus Workshopでの特別な議論点）

FDAガイダンス案（2016）と AAPS発信のWhite paper（2008）との比較

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Statistical aspects of cut-point setting in ADA and NAb assays
were covered by two speakers. The first presentation given by
Simon Cowen (LGC) focused on the basic concepts, delineating
different approaches described in the literature. These varyfrom classical unbiased estimators of the percentile inquestion to the use of robust methods and prediction or
tolerance limits. Particular emphasis was placed on theunderlying statistical question each of these addresses, andthe performance of several methods was compared.

FDAガイダンス案（関連するパーセンタイルの潜在的に 平均5% FPRを提唱（発信当初の意図）
偏った推定値に代えてFPR（偽陽性率）を制御する方法）でシミュレーションすると提案されたカットポイントのFPRは、スクリーニングアッセイ
一致しなくなったに対して平均して10% FPRをもたらす可能性がある
詳細別途後述記載（p.49）.

提示されたシミュレーションは、約n=50の被験者数に基づいていた。n=300個を超える標本結果（2 人の分析者のそれぞれが3 回の独立したランの50
被験者） を生成するバランスの取れたデザインを検討する場合、表示される
カットポイントのFPR は平均10％ よりもはるかに低くなる。
いくつかのADAアッセイのデータを用いたさらなる評価により、FPRは約6～7％
th JBF Symposium, DG2020-49
12であることが示されている。

38

Japan Bioanalysis Forumg. ADA & NAbアッセイにおけるカットポイント設定
2）先に述べた要件を遵守したカットポイントを設定するためのAdditional questions, such as the evaluation of the suitabilityof negative quality control as a normalization factor for
floating cut-point calculations, when and how to use titration
cut-points, objective statistical criteria for comparing titer
results between samples and criteria for determining
treatment-boosted ADA were also discussed.

包括的な実践的ガイドを提供
外れ値の評価プロセス
統計モデリングあるいは、簡略化されたアプローチによって取り組むことが可能。実践上特に重要なのは、試験実施中に使用するためにバリデーション中に決定された試験前のカットポイントの適合性であり、それは関連する不確実性を伴うサ
ンプルに基づく推定値である。
シミュレーションにより検討

95％の症例でFPRが2～11％の間で変動していた。
試験中のベースライン・検体でこれらの限界値から外れたFPRが得られた場合には、その差をさらに理解するために、試験前のバリデーションデータと試験中の投与前のベースラインデータとの平均値および分散の統計学的比較を行い、新たな試験中のカットポイントを設定することが推奨される。

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The second speaker, Viswanath Devanarayan (Abbvie),
provided a comprehensive practical guide to setting the cutpoint that adheres to the requirements laid out previously,
which is also straightforward to implement despite thepotential complexity of the task. The outlier evaluation
process can be tackled using statistical modelling where
statistician support is available, or by the simplified approachdescribed here.
Of particular practical importance is the suitability of aprestudy cut-point determined during validation for use
during in-study implementation, as the former is an estimatebased on a sample with an associated uncertainty. This wasinvestigated by simulation using the Shankar et al. design [11],and it was found that in 95% of the cases the FPR varied
between 2 and 11%. It was recommended that if the in-study
baseline samples yielded an FPR outside these limits, astatistical comparison of the means and variances between
the prestudy validation data and the in-study predose baseline
data should be made to further understand the differences,
and a new in-study cut-point should be established.

詳細別途後述記載（p.47）

12th JBF Symposium, DG2020-49

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Japan Bioanalysis Forumg. ADA & NAbアッセイにおけるカットポイント設定
カットポイント設定に関連する日常的課題

Therefore, robust alternatives for cut-point calculation may beneeded. Additionally, sensitivity and selection of the low
positive control (LPC) level is often set at an inappropriately
low level. For the run control acceptance, the determination oflower limits for positive controls should be adequate, higher
limits are not necessary. Furthermore, drug tolerance testing is
not meaningful for the LPC sample. This should be performed
using a threefold higher level than LPC. For confirmatory
assays it may not be possible to inhibit the LPC below theconfirmation assay cut-point as the signal has already reached
the instrument background level. Thus, the percent inhibition
limit should not be applied for the LPC.

Validationに関する具体的な指示を提供する唯一のWhite Paper （2008当時）
業界内の標準的なアプローチ：
EMAおよびFDAのガイドラインも同じ原則に従う。
しかし、推奨されている事項は、ある種のAssay
法にのみ特化しており、特に、バックグラウンドが低く非常に感度の高い測定法には適していない。

カットポイント算出のための強固な代替案が必要となる可能性がある。

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The session then moved onto two speakers who presented
some of the everyday challenges related to cut-point setting.
Timo Piironen (Syrinx Bioanalytics) emphasized that to date
Shankar et al. [11] has been the only White Paper to provide
specific instructions for the validation of immunogenicity
assays. This has become a standard approach within theindustry and the recent EMA and FDA guidelines follow thesame principles. However, the recommendations may besuitable for some assay formats and problematic for others.
Very sensitive assays (at or below ng/ml range) with abiological background signal close to the instrument
background/noise and low variability often do not pass thestatistical tests and recommendations of the article.

感度および低陽性対照（LPC）レベルの選択
試験の合否判定にあたっては、陽性対照の下限値の設定が適切である必要がある。
Drug tolerance limit (DTL)検査はLPC検体にとって意味がない。
LPCの3倍のレベルを用いて行うべき。
確認アッセイでは、信号が機器バックグラウンドレベルにすでに到達しているため、確認アッセイのカットポイント以下でLPCを阻害することができない場合がある。
したがって、LPCについては％阻害限界を適用すべきではない。

12th JBF Symposium, DG2020-49

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Japan Bioanalysis Forumg. ADA & NAbアッセイにおけるカットポイント設定
カットポイント解析（ヒト治療用抗体）

Therefore, an appropriate assay strategy needs to beestablished which: distinguishes pre-existing antibodies fromfalse-positive results due to other interfering factors (e.g.,multimeric drug target); avoids generation of an
inappropriately high cut-point; and reduces the risk of falsenegative results.
In Denise’s presentation three case studies were discussed:
usage of immunoglobulin depleted naive sera for cut-point
evaluation; immunogenicity sample measurement directly in aconfirmatory assay; and selection of pre-existing antibody
negative samples assuming a mixed distribution model for cutpoint evaluation. Finally it was concluded that the incidence ofpre-existing antibodies should be reported along withtreatment-induced and treatment-boosted ADA responses.
Additionally the impact of pre-existing antibodies on
immunogenicity (such as higher immunogenicity incidence insubjects with pre-existing antibodies vs those without)combined with PK, PD, safety and efficiency should be
evaluated.

バリデーション試験 既存の抗体：生物学的外れ値として除去される。
しかし、新しいコンストラクト（例：ナノボディまたは単鎖フラグメントの開発など）に伴い、既存の抗体の発生率が増加するエビデンスが増えている。

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During immunogenicity assay validation, especially for humantherapeutic antibodies, samples with pre-existing antibodies
are usually removed as biological outliers from cut-point
analysis. However, with the development of new antibody
constructs, for example, nanobodies or single chain fragments
there is growing evidence for increased incidence of preexisting antibodies. Denise Sickert (Novartis) emphasized that
immunogenicity cutpoint determination is challenging when ahigh incidence of pre-existing antibodies is observed, forexample, from 20 to up to 100% of treatment naive subjects.
Currently, no standard cut-point evaluation procedure exists
for such cases.

既存の抗体の発現率が高い場合
既存の抗体（投与前検体中の抗体）がある場合のカットポイント評価手順はない
治療歴のない被験者の20～100％に達するまで、免疫原性のカットポイント決定は困難。

適切なアッセイ戦略を確立する必要がある
既存の抗体を他の妨害因子（多量体薬物標的等）による偽陽性結果から区別する
不適切に高いカットポイントの生成を回避する
偽陰性結果のリスクを低下させる。
など

投与前検体中の抗体の発現率（当局への報告必須）
既存の抗体の発現率について「投与により誘導されるADA反応」や「投与により増強されるADA反応」
とともに報告すべき。
PK、PD、安全性及び有効性と相まって、既存の抗体が免疫原性に及ぼす影響（既存の抗体を有する被験者の方が有さない被験者よりも免疫原性の発現割合が高いなど）も評価すべき。

12th JBF Symposium, DG2020-49

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Japan Bioanalysis Forumg. ADA & NAbアッセイにおけるカットポイント設定
Of the three types of cut-point that can be calculated
following the Shankar et al. design [11]: fixed, floating anddynamic, there was general consensus that a floating cutpoint was most desirable for screening assays, and that thismethod could even be applied in cases where a fixed cutpoint was indicated, providing additional reassurance incase of small changes in assay performance during the instudy phase. The use of a dynamic cut-point was strongly
discouraged, and was seen as a red flag prompting
questions about the robustness of the assay itself.
Discussing the FPR of the screening assay, it was notforeseen that a statistical method yielding a 10% FPR [12] atthe validation stage would provide any practical benefit.
Calculation of an FPR at the 5% level in validation would be
expected to yield an in-study FPR of 2–11%. If the in-study
baseline samples yielded an FPR outside these limits, thiswould be a trigger to evaluate an in-study cut-point.
In populations with a relatively high incidence of preexisting ADA, likely no standard approach is possible.
Strategies may include immunoglobulin-depleted drug naive
sera for cut-point setting, analysis of all samples in theconfirmatory assay using subject specific cut-points, as well
as application of titers in determining subject status,
although the latter may be difficult in cases of high titers ofpre-existing antibodies. Regulators acknowledge these
difficulties and advise to interact with them early on a caseby-case basis.
On the practicalities of performing assays it was noted thatthree duplicate negative control samples are most often
used, spread across the immunoassay plate. Inclusion of a
mid-positive control was considered beneficial by someregulators in evaluating the robustness of assay
performance when reviewing the validation package, but
was not considered a requirement in sample analysis.

【パネルディスカッション】「fixed」「floating」「dynamic」の3種類のカットオフポイント
Floatingカットポイント： スクリーニングアッセイで推奨（fixedカットポイントが適応とされた症例でも適用可能。試験段階中にアッセイ性能に変化量が生じた場合でも対応可能）

Dynamicカットポイント：推奨しない（アッセイ自体の頑健性が不安視）
スクリーニングアッセイのFPR
バリデーション期で10% FPR をもたらす統計的手法がベネフィットをもたらすことは予期されない。バリデーションで5％レベルのFPRを算出すると試験中のFPRは2～11％になると予想される。試験中のベースライン・検体からこれらの限界値を外れたFPRが得られた場合、これは試験中のカットポイントを評価するためのトリガーとなるであろう。
詳細別途後述記載（p.47 ）既存のADAの発現割合が高い集団→ 標準的なアプローチは不可能である可能性が高い。

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The session wrapped up with a panel discussion thatcovered a number of topics related to setting of cut-points
and practicalities of performing assays.

【戦略】 • カットオフポイント設定のための免疫グロブリン除去薬物ナイーブ血清• 被験者特異的カットオフポイントを用いた確認アッセイにおける全サンプルの分析• 被験者の状態を決定する際の力価の適用（既存の抗体の高力価の場合には困難）
規制当局はこれらの困難を認め、ケースバイケースで早期に協業するよう助言する。

12th JBF Symposium, DG2020-49

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Japan Bioanalysis Forumh. クロージングパネルディスカッション＆会議のアウトプット
A need for retrospective and prospective analysis to address
whether alternative assay formats such as functional PK assays
can be used to replace NAb assays. Such examples should beshared at conferences and via publications with an emphasison whether immunogenicity safety signals would have been
missed if alternative approaches were employed in the placeof an NAb assay.
It is apparent that the industry has not standardized themethods for reporting drug tolerance and that the practicalmethods differ between laboratories. Additionally antibody
titer can be calculated with or without the inclusion of theminimal required dilution; even when minimal required
dilution is included in the titer calculation it may range fromonly the initial sample dilution or may include other sources ofdilution such as acid dissociation and/or dilution when added
to labelled reagents. Further discussion on this topic iswarranted with the aim to standardize these parameters.
A consortium should be formed to share data and one
suggestion was an interaction of the EBF with the European
Immunogenicity Platform.
A focus workshop to discuss case studies where
immunogenicity has adversely impacted PK.
The EBF to consider providing training on immunogenicity,
maybe as a preworkshop activity.

5つの明白なアウトプット
1）機能的PKアッセイのような別のアッセイ形式がNAbアッセイの代わりに使用できるかどうかを検討するためのレトロスペクティブおよびプロスペクティ
ブ解析の必要性（NAb試験の代わりに別の方法を採用した場合には、免疫原性の安全性シグナルが見逃されたかどうかに重点を置いて、学会や出版物で共有すべき）

2）業界が薬物耐性の報告方法を標準化すべき（実際的な方法が臨床試験間で異なる）

3）抗体力価：MRDを含む場合と含まない場合とで計算することができる。

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The workshop closed with a final discussion where thesummaries from each session were presented. There were fivetangible outputs from the meeting:（MRDが力価計算に含まれる場合であっても、最初の試料希釈のみからの範囲であっても よい
し、又は標識試薬に添加された場合に酸の解離及び／又は希釈のような他の希釈源を含むことがある。これらのパラメータを標準化するための議論が必要。）

4）データを共有するためにコンソーシアムを形成すべき（EBFとヨーロッパ免疫原性プラットフォームとの相互作用。免疫原性がPKに悪影響を及ぼした
ケーススタディを議論するフォーカスワークショップ）.

5）トレーニングの提供を検討：EBFは、おそらくワークショップ前の活動として、免疫原性に関するトレーニングの提供を検討する。

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Japan Bioanalysis Forum

Immunogenicity and appropriate strategies to confidently andaccurately assess immune responses in both preclinical andclinical studies is a constantly evolving landscape. New draft
guidance documents from both the EMA and FDA have been
published and as a result have improved alignment acrossregulatory regions in some areas of immunogenicity assay
development and validation but differences still exist.
Harmonization through ICH would be of benefit but not a
short-term reality. As further clinical examples are discovered
and our understanding deepens, more emphasis on assay
performance and characterization of the immune response isrequested from regulators..
While patient safety is always of upmost concern, the context
and relevance of these requests must come from the impact ofa resultant clinical response, if indeed one is seen. This should
be considered through the generation of a molecule specificrisk assessment, preferably at an early stage of drug
development. However, there should be a balance of fulfilling
regulatory requirements as they appear in the guidance
documents and applying sound scientific logic; simply
following guidance to the letter will not guarantee a successful
drug registration and conversely omitting certain parameters
does not automatically mean rejection of the submission.
Continued presentation of case studies and discussion within
the industry is required and the EBF aim to be an integral partof those activities. For more details please visit the conference
website [15].

前臨床研究と臨床研究の両方において、免疫応答を確信を持って正確に評価するための免疫原性と適切な戦略は、絶えず発展している。EMAとFDAの両方からの新しいガイダンス文書案が発表され、その結果、免疫原性アッセイの開発とバリデーションの一部の分野で規制地域間が無くなるように改善されてきているが、相違点は依然として存在する。
ICHを通じた調和は有益であるが、短期的な実現はないであろう。
さらなる臨床例が発見され、われわれの理解が深まるにつれて、アッセイの性能および免疫応答の特徴付けにさらに重点を置くことが規制当局から要請される。
患者の安全性は常に最も懸念されるものであるが、もし実際に反応が見られた
場合、規制当局からの要請の背景と妥当性は、結果として生じる臨床反応の影響からもたらせられる。
このことは、分子特異的なリスク評価を作成することを通して、できれば医薬品開発の初期段階で考慮すべきである。
しかし、ガイダンス文書に記載されている規制要件を満たすことと、科学的に信頼できる論理を適用することとの間にはバランスが必要である。単に文書としてのガイダンスに従うだけでは、医薬品登録の成功を保証することはできず、また、逆にある種のパラメータを省略しても、自動的に申請を拒絶することにはならない。

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i. 結論と今後の展望

ケーススタディの継続的な発表と業界内での議論が必要であり、EBFはそれらの活動の不可欠な部分であることを目指している。詳細はカンファレンスホームページを確認。
European Bioanalysis Forum. Focus slides. http://focus201609.europeanbioanalysisforum.eu/slides-2/

12th JBF Symposium, DG2020-49

44

「g. ADA & NAbアッセイにおけるカットポイント設定」 の補足

スクリーニングアッセイにおける
カットポイント設定
12th JBF Symposium, DG2020-49

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Japan Bioanalysis Forum45

Japan Bioanalysis Forumg. 補足 ：スクリーニングアッセイにおけるカットポイント設定

FDAは、ブランクサンプル（negative control patients）
測定値の95パーセンタイルをスクリーニングアッセイのカットポイ
ントに推奨している（下図）。

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STATISTICAL EVALUATION OF SEVERAL METHODS FOR
CUT-POINT DETERMINATION OF IMMUNOGENICITYSCREENING ASSAY

カットポイント

Meiyu Shen, Xiaoyu Dong, and Yi Tsong

Office of Biostatistics/Office of Translational Sciences, Center for Drug Evaluation
and Research, U.S. Food and Drug Administration, Silver Spring, Maryland, USA
The cut point of the immunogenicity screening assay is the level of response of theimmunogenicity screening assay at or above which a sample is defined to be positive andbelow which it is defined to be negative. The Food and Drug Administration Guidance forIndustry on Assay Development for Immunogenicity Testing of Therapeutic recommends
the cut point to be an upper 95 percentile of the negative control patients. In this article,
we assume that the assay data are a random sample from a normal distribution. The sample
normal percentile is a point estimate with a variability that decreases with the increaseof sample size. Therefore, the sample percentile does not assure at least 5% false-positive
rate (FPR) with a high confidence level (e.g., 90%) when the sample size is not
p.47
sufficiently enough. With this concern, we propose to use a lower confidence
参照
limit for a percentile as the cut point instead. We have conducted an extensive
literature review on the estimation of the statistical cut point and compare several
selected methods for the immunogenicity screening assay cut-point determination in termsof bias, the coverage probability, and FPR. The selected methods evaluated for the
immunogenicity screening assay cut-point determination are sample normal percentile, theexact lower confidence limit of a normal percentile (Chakraborti and Li, 2007) and theapproximate lower confidence limit of a normal percentile.
It is shown that the actual coverage probability for the lower confidence limit of anormal percentile using approximate normal method is much larger than the required
confidencelevel with a small number of assays conducted in practice.
We recommend using the exact lower confidence limit of a normal percentile
for cut-point determination.

5%
95％

ブランクサンプルにおいて、5%以下の確率でしか観察されない、カットポ
イント以上の測定値を、陽性と判断する。
一方で、陰性であるにもかかわらず、
5%の確率で陽性と間違って判断してしまう可能性を含む［5%偽陽性率 (FPR)］。

正規分布からランダムにサンプリングした測定値を仮定した場
合、上記のカットポイントは、ばらつきを持った点推定値であり、サンプル数の増加に伴いそのばらつきは小さくなる。サンプル数
が十分でない場合、点推定値の信頼度は低くなり、5%偽陽性率 (FPR) を保証できなくなる。
この点を考慮して、点推定値ではなく、パーセンタイルの下側
信頼限界をカットポイントに用いることを提案する。
本論文では、いくつかのスクリーニングアッセイのカット
ポイント設定方法を比較検討し、推奨方法を提示する。

12th JBF Symposium, DG2020-49

p.48
参照

46

Japan Bioanalysis Forum

Question
カットポイントは、ばらつきを持った点推定値であり、サンプル数の増加に伴いそのばらつきは小さくなる、とは？（スライド p.46の疑問）
バリデーションで算出した5％偽陽性率を示すカットポイントは、試験中（検体測定）において、2～11％偽陽性率になる可能性がある、とは？（スライド p.39、42の疑問）① 母平均=0、母標準偏差=1の正規分布からランダムに値をサンプリングした。
② n=50でサンプリングした値の平均値および標準偏差 (SD) を、母集団の母平均値および母標準偏差として、95
パーセンタイル (=平均値＋1.645 x SD) を算出し、これを推定カットポイントとした。
赤線：母平均=0、母標準偏③ ②の操作を10000回繰り返し、算出した10000個の推定カットポイントのヒストグラムを作成した。
差=1の正規分布における、95④ n=100、n=300でサンプリングした場合のヒストグラムと比較し、ばらつきの違いをみた。
パーセンタイル = 1.645
n=50

n=50の場合、推定カットポイントの95%信頼区間（正規分布を仮定）は、1.211~2.056であった。これは、偽陽性率2.0% ~11.3%を示した。

n=100

n=300

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g. 補足 ：スクリーニングアッセイにおけるカットポイント設定

サンプル数 (n) の増加に伴い推定カットポイントのばらつきは小さくなる

12th JBF Symposium, DG2020-49

この計算はShen (J Biopharm Stat; 2015)の、Method 1の方法に基づいています
標本サンプルから推定する95パーセンタイルの90%下側信頼限界の正確な値は、論文をご参照ください。

47

Japan Bioanalysis Forumg. 補足 ：スクリーニングアッセイにおけるカットポイント設定

前スライドの、n=50でサンプリングを繰り返した時のカット
ポイントのヒストグラムを、母平均=0、母標準偏差=1の正規分布を重ねたもの。
AAPS発信のWhite paper（2008）の方法

青線：母平均=0、母標準偏差=1の正規分布における、95パーセンタイル= 1.6455%偽陽性率を保証するとは、実際の臨床検体測定
時、5％以下の偽陽性率で、陽性サンプルを見落としてしまう確率を低く抑えること。
FDAガイダンス案（2016）の方法

このヒストグラムにおいて、青線より左側の面積の割合は、約90％、右側の面積の割合は、約10％

このヒストグラムにおいて、青線より左側の面積の割合は、約50％、右側の面積の割合は、約50％

1回のサンプリングでは、カットポイントが上図のヒストグラムのどの位置に来るかわからない。カットポイントが青線よりも右側に位置すると、偽陽性率が5%以下になり、5％偽陽性率を保証できなくなる。その確率は約50％である。

赤線：90%下側信頼限界（今回のシミュレーショ
ンでは、1.357）

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Question
点推定値ではなく、パーセンタイルの下側信頼限界をカットポイントに用いることを提案する、とは？
（スライド p.46の疑問）

そこで、ヒストグラムの面積の90%が、青線の左側に来るように、
カットポイントを左側にずらして設定（赤線）し、 1回のサンプリン
グで、カットポイントが青線よりも右側に位置する確率を10%にする。これは、95パーセンタイルの片側90％信頼区間の下限値をカットポイントにする、ということ。偽陽性率が5%以下になる確率
は、10%となり、5％偽陽性率を保証できる。

12th JBF Symposium, DG2020-49

48

Japan Bioanalysis Forumg. 補足 ：スクリーニングアッセイにおけるカットポイント設定

AAPS発信のWhite paper（2008）のカッ
トポイント：青線

FDAガイダンス案（2016）のカッ
トポイント(n=50)：赤線

このヒストグラムにおいて、青線より左側の面積の割合は、約90％、右側の面積の割合は、約10％⇒ 赤線は、青線に対する、片側90％信頼区
間の下限値

FDAガイダンス案（2016）のカッ
トポイント(n=300)：赤線

5%n=50でサンプリングを繰り返した時のカットポイントの平均値（青線）は、5%偽陽性率に近づく

約10%

ヒストグラムの面積の90%が、青線の左側に来るように、カットポイントを左側にずらして設定（赤線）した場合、n=50でサンプリングを繰り返した時のカットポイントの平均値（赤線）は、約10%偽陽性率に近づく

6~7%

n数を増やせば、カットポイントの平均値（赤線）は5%に近づく。n=300でサンプリングを繰り返した時のカットポイントの平均値（赤線）は、6~7%偽陽性率に近づく

12th JBF Symposium, DG2020-49

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Question
FDAが提唱するスクリーニングアッセイにおけるカットポイントは、10%偽陽性率か、5%偽陽性率 か？
（スライドp.38の疑問）

49

Japan Bioanalysis Forum

Shankar (J. Pharm. Biomed. Anal; 2008 )Shen (J Biopharm Stat; 2015)

Cut-point 設定方法

点推定値［AAPS発信のWhite paper（2008）の方法］

信頼区間の下限値［FDAガイダンス案（2016）の方
法］

課題点 (Shankar) と解決方法 (Shen)

95パーセンタイルの点推定値をカットポイントにすると、約50%の確率で、5%以下の偽陽性率を示すカットポイントに設定される

左記の課題に対し、95パーセンタイルの下側信頼限界を
カットポイントに設定すれば、5%以下の偽陽性率を示す
カットポイントに設定される確率をより低く抑えることができ
る

データ分布

正規性あり

正規性あり

n数

n=50

n=50

計算式

カットポイント＝平均値＋1.645 x 標準偏差 (SD)（下図青線）

95パーセンタイルの点推定値の片側90％信頼区間の下限値をカットポイントとする（下図赤線）
計算式の詳細は論文をご参照ください

具体例

赤線：カットポイント［95パーセンタイル（青線）の片側90%信頼区間の下限値］

カットポイントCut-point
のイメージ

5%
95％

12th JBF Symposium, DG2020-49∞

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g. 補足 ：スクリーニングアッセイにおけるカットポイント設定

片側90％信頼区間50

Japan Bioanalysis Forumg. 補足 ：スクリーニングアッセイにおけるカットポイント設定

VI. ASSAY
VALIDATION
One
approachthat allows for high assurance of a 5% false-positive rate
B.
Validation
Screening
Assay
is to apply aof90%
one-sided
lower confidence interval for the 95th
2. Cut-Point of Screening Assay
percentile of the negative control population (Shen et al. 2015). ThisOne approach that allows for high assurance of a 5% false-positive rate is to
willassureleast a 5%
rate forwith
90%
confidence
apply
a 90%atone-sided
lowerfalse-positive
confidence interval
thea95th
percentileof thelevel.
Thisapproachprobabilityof Thisthe will
assay
identifying
negative
controlimproves
population the(Shen
et al. 2015).
assureat least a all
5%
subjects
whoratemaydevelopantibodies.
false-positive
witha 90% confidence
level. This approach improves theprobability of the assay identifying all subjects who may develop antibodies.

When using the approach published by Shen et al., the reportable value foreach sample should be the average of the six measurements. The statisticalmethod used to determine the cut-point should be based on the statistical
distribution of the data. For example, the 95th percentile of the normal
distribution is estimated by the mean plus 1.645 standard deviation. Other
approaches may be used for estimating 95th percentile, including the use of
median and median absolute deviation value instead of mean and standard
deviation.

C. Validation of Confirmatory Assay
One approach for the estimation of the confirmatory assay cut-point is to usean 80% to 90% one-sided lower confidence interval for the 99th percentile.
Because the purpose of this assay is to eliminate false-positive samples
arising as a result of non-specific binding, it is adequate to use a 1% falsepositive rate for the calculation of the confirmatory cut-point.

FDAガイダンスでの記載内容
スクリーニングアッセイのカットポイントは、
95パーセンタイルの点推定値の片側90％信頼区間の下限値とする。これは、少なくとも、90％の信頼度で、5%偽陽性率を保証している。
正規分布における95パーセンタイルは、平均値＋1.645 x 標準偏差 (SD) で推定される。

確認試験のカットポイントは、
99パーセンタイルの点推定値の片側80~90％
信頼区間の下限値とする。

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FDAガイダンスは、スクリーニングアッセイの場合、カット
ポイントを左図の青線（95パーセンタイル）ではなく、
赤線［95パーセントタイル（青線）の片側90%信頼区間の下限値］にしましょうと言っている。

他、タイトレーションアッセイ、中和抗体アッセイの
カットポイントに関する記載では、特に信頼区間について、言及していない。

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51

申請資料調査

12th JBF Symposium, DG2020-49

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Japan Bioanalysis Forum

52

Japan Bioanalysis Forum

調査対象：PMDA申請資料概要
薬物 ：バイオ医薬品
期間 ：2015－2020年 に承認
承認年
モダリティ
作用機序
中和抗体の測定法（Cell-based assay、Ligand binding assay 等）
カットポイント
感度
Drug Tolerance Limit

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申請資料調査各項目について調査。

12th JBF Symposium, DG2020-49

53

Japan Bioanalysis Forum

作用機序によるNAb測定法の分類
活性測定 : 酵素活性測定、血液凝固因子の活性測定等
LBA : Ligand Binding assay

53品目

CBA : Cell-based assay

NAbの測定法
モダリティ

作用（MOA)

合計

活性測定

LBA

酵素

補充療法(酵素）

6

3.5

0

1.5

1

血液凝固関連系因子補充療法(酵素以外）

10

6

0

0

4

ホルモン

アゴニスト

3

0

0

2

1

ワクチン

ワクチン

1

0

0.5

0.5

0

抗体

融合タンパク質CBA 記載無し

アンタゴニスト（細胞受容体）

8

0

6.5

1.5

0

アンタゴニスト（液性因子）

16

0

11

2

3

5

0

1

3

1

細胞障害活性（ADC)

2

0

0

1

1

補充療法(酵素以外）

1

0

0

0

1

1

0

1

0

0

53

9.5

20

11.5

12

細胞障害活性

アンタゴニスト（リガンド）

32

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調査対象：PMDA申請資料概要
薬物 ：バイオ医薬品
期間 ：2015－2020年 に承認

開発途中で測定法が変更になった薬物は、それぞれ0.5でカウントした

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54

Japan Bioanalysis Forum

作用機序によるNAb測定法の分類
酵素
血液凝固関連系因子
ホルモン【融合タンパク質】
1

ワクチン
抗体
融合タンパク質

【酵素】
4

0.5

0

記載無し
CBA
LBA
活性測定

2

融合タンパク質

酵素
血液凝固関連系因子

【抗体】

抗体

活性測定

CBA

LBA

記載なし

ホルモン
ワクチン

1
0

記載無し
CBA
LBA
活性測定

【血液凝固関連因子】
6
4

10

2

8
0

記載無し
CBA

LBA
活性測定

6
4
2
0

【ワクチン】【ホルモン】
2

0.5

0.25

0

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3

記載無し
CBA
LBA
活性測定

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1

0

記載無し
CBA
LBA
活性測定

55

Japan Bioanalysis Forum

年代別によるNAb測定法の分類
記載無し

16

承認年度

酵素活性

2015

3

2.5

1.5

1

2016

0.5

3.5

2

6

2017

1

4.5

1.5

0

2018

2

4.5

4.5

4

4

2019

2

4

2

0

2

2020

1

1

0

1

合計

9.5

20

11.5

12

作用機序による分類

14
12
10
8
6

0
1
2015

2
2016

酵素活性

3
2017

LBA

4
2018

CBA

5
2019

6
2020

記載無し

年代別による分類

測定法の傾向測定法の傾向補充療法（酵素、血液凝固関連因子）→酵素活性測定が主流

大きな傾向は確認されなかった。
DGコメント

http://bioanalysisforum.jp/

NAbの測定法
LBA
CBA

抗体 → LBAが主流
12th JBF Symposium, DG2020-49

56

Cell-based assayにおけるアッセイパフォーマンス

12th JBF Symposium, DG2020-49

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum57

Japan Bioanalysis Forum

Cell-based assayにおけるアッセイパフォーマンス

・Cell-based assayのパフォーマンスがなぜ低いか？については、
明確に明らかにはされていないため、まずはメンバー間でブレイン
ストーミングし、潜在的な課題がどこにあるのかを見極めた上で解決策を議論した（以降、スライドに記述）。

12th JBF Symposium, DG2020-49

http://bioanalysisforum.jp/

・一般的にはLigand binging assayよりも低いと考えられる。

58

Japan Bioanalysis Forum

Cell-based assayにおいて抽出された課題②細胞の品質の担保（例：細胞の抗原発現量が安定しない、継代に伴う生細胞数の減少や活性の低下、コンタミ防止など）③活性の指標（サイトカイン産生量など）が薬物添加により急峻に増加又は低下する④感度が低いhttp://bioanalysisforum.jp/①細胞増殖因子などのマトリックスの影響の排除（細胞死を見る場合）⑤ばらつきが大きい
12th JBF Symposium, DG2020-49

59

Japan Bioanalysis Forum

Cell-based assayにおけるアッセイパフォーマンス向上策-1
Q.細胞増殖因子などのマトリックスの影響をどう排除するか？

DGとしての回答

Q.細胞の抗原発現量が安定しないとき、どうするか？
A.一過性発現細胞ではなく、安定発現細胞を用いる。
Q.継代に伴い活性を持つ細胞の数が減るとき、どうすべきか？
A. Cell lineの場合、活性の指標が大きく変化してくる継代数を目安とすることが考えられる。また、Cell viabilityを目安とすることができる。
Q.細胞のコンタミ防止の観点から、どのように保管すべきか？

http://bioanalysisforum.jp/

A.マトリックス由来であれば、 SPEAD法やBEAD法などで除去可能である。

A. 保管方法はもとより、メディウム調製時にコンタミチェックすべき（ディッシュに取って数日間インキュベータで静置）。また、元になる細胞については、液体
窒素下で保管することでコンタミを抑止できる。
12th JBF Symposium, DG2020-49

60

Japan Bioanalysis Forum

Cell-based assayにおけるアッセイパフォーマンス向上策-2
DGとしての回答

A. 細胞のロットや種類を変更することで対応可能な場合がある。また、共培養系の場合は相互の細胞数の割合を最適化することで対応可能な場合がある。
（細胞AとBの比較を以下に例示）✖

細胞B
サイトカイン産生量

サイトカイン産生量

細胞A

薬物濃度

12th JBF Symposium, DG2020-49

薬物濃度

✔

http://bioanalysisforum.jp/

Q.活性の指標（サイトカイン産生量など）が薬物添加により急峻に増加することへの対応としては？

61

Japan Bioanalysis Forum

Cell-based assayにおけるアッセイパフォーマンス向上策-3
DGとしての回答

A.細胞の種類や検出法、細胞Lot選択、培養条件の最適化（培地組成、細胞密度、培養時間など）を検討すべきである。また、本質はともかくポジコンを変更することも問題解決手法の一案である。
Q.ばらつきを抑制するためにできることは？
A.可能な限り培養条件を揃えて均質な実験系にする。また、原因がマトリックス
由来のものであれば、 SPEAD法やBEAD法などで除去可能であるので、酸処理法を検討すべきである。

12th JBF Symposium, DG2020-49

http://bioanalysisforum.jp/

Q.感度を向上させるためにできることは？

62

Japan Bioanalysis Forum

中和抗体分析に関するいくつかの文献等を参照し、バイオ医薬品の薬効機序に着目してどのようなアッセイフォーマットが用いられているか調査した。薬効機序、アッセイパフォーマンス、免疫原性のリスクを考慮し、アッセイフォーマットを選択すべきであった。選択における重要な点をまとめた。
薬物耐性の改善、カットポイント設定に関する文献等を紹介した。
近年のバイオ医薬品53品目の申請資料から、中和抗体分析で選択されたアッセイフォーマットをまとめた。補充療法（酵素、血液凝固関連因子）では酵素活性測定が、抗体ではLBAが主に用いられていた。

http://bioanalysisforum.jp/

まとめ

Cell-based assayのアッセイパフォーマンス向上のための対策を議論し、DGの回答を紹介した。
12th JBF Symposium, DG2020-49

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Japan Bioanalysis Forum

Summary

The literatures on drug tolerance improvement and cut point setting
were introduced.
The assay format selected for NAb assay based on the recent
application of 53 biotherapeutics was summarized. Enzyme
bioactivity assay was mainly used for replacement therapy(Enzymes and blood coagulation-related factors). LBA was mainly
used for antibodies.

http://bioanalysisforum.jp/

We investigated what assay format was used by focusing on themechanism of action (MoA) of biotherapeutics with reference toseveral literatures on NAb assay. An assay format should be selectedby considering MoA, assay performance and risk based assessment.
Critical points on the selection of assay format were summarized.

We discussed measures to improve the assay performance of cellbased assay and introduced our proposals.
12th JBF Symposium, DG2020-49

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