59●抗体定量用アフィニティークロマトグラフィー
カラム TSKgel® Protein A − 5PW の開発
バイオサイエンス事業部

開発部

セパレーション G藤井荒木

智康祐− 650F と同様であり、基材である TSKgel G5000PW

1．はじめにも TOYOPEARL と 同 じ 化 学 的 性 質 を 持 つ た め、

近年、バイオ医薬品市場の成長は著しく、特に免疫グロブリン G（IgG）を中心とした抗体医薬品につTOYOPEARL AF − rProtein A HC − 650F と類似した分離選択性を有すると考えられる。

いては、2012 年に 460 億ドルであった市場規模が、また、本カラムは、高流速下で使用できるよう基材

2018 年には 772 億ドルまで拡大すると予測されていの粒子径や機械的強度が最適化されているため、IgG

1）

る 。抗体医薬品の研究開発や製造プロセス構築では、のハイスループット分析に使用可能である。

細胞培養液中の IgG の迅速かつ高精度な定量が必要と本カラムの仕様を表 1 に示す。

される。さらに、その商業製造プロセスにおいても、重要な品質管理項目として IgG 濃度の評価が行われ品フィニティークロマトグラフィー（AFC）が、IgG 定番基量法の一つとして用いられている。

充塡剤

当事業部では、分取用 Protein A 充塡剤として、高い吸着容量とアルカリ耐久性を有する TOYOPEARL

TSKgel Protein A−5PW カラムの仕様

表１る。これらの場面で、Protein A をリガンドとしたア®

0023483
材 多孔性の親水性ポリマー

平均粒子径 20μm
平均細孔径 100 nm
リ ガ ン ド 遺伝子組換え Protein A

AF − rProtein A − 650F と TOYOPEARL AF − rProtein A

サHC − 650F を商品化している。最近、我々はこれらのカラム 材

イズ 4.6 mm I.D.×3.5 cm＊質 PEEK

出 荷 溶 媒 20 ％エタノール水溶液製造技術をベースとして、抗体医薬品の研究開発及び＊Polyetheretherketone

品質管理分野での IgG 定量をターゲットとした AFCカラム「TSKgel® Protein A-5PW」を開発・上市した。
本稿では、当該カラムの基本的な性質や特徴について報告する。

2.2

標準的分離条件

多くの IgG は中性付近（pH 7.0 〜 7.5）で Protein Aと結合し、酸性条件下（pH 2.5 〜 3.5）でそれが解離

2．TSKgel Protein A − 5PW の基本特性
2.1充塡剤の性質するため、本カラムを用いた IgG の分離では、通常、pH の異なる 2 液のステップグラジェント溶出法を用いる。具体的には、中性付近の吸着用溶離液であらか

TSKgel Protein A − 5PW は、多孔性の親水性ポリマー

じめカラムを平衡化後、試料を注入し、IgG のみを吸基材 TSKgel G5000PW に、遺伝子組換え Protein A を着させる。その後、酸性の溶出用溶離液に切り替えて導入した充塡剤を、PEEK カラムに充塡した AFC カ

IgG を溶出させる。溶離液としては吸着、溶出用ともラムである。Protein A は IgG の Fc 領域と特異的に結りん酸塩緩衝液が一般的であるが、溶出には低 pH の合するため、IgG と夾雑物を含む細胞培養液上清などクエン酸塩緩衝液も使用できる。の試料から IgG を特異的に吸着、分離することが可能

0.15 mol/L NaCl などの高濃度の塩を溶離液に添加である。また、濃度既知の IgG 試料を用いて試料負荷することも可能であるが、疎水性の高い IgG はカラム量とピーク面積との関係を基に検量線を作成することへの非特異的吸着が起こる場合がある。疎水性の高いにより、濃度未知の試料中の IgG を定量することがでIgG の分離の際には、エタノールなどの水溶性有機溶きる。

媒を吸着及び溶出用溶離液へ添加すると、非特異的吸本カラムのリガンド及びリガンド固定化方法着の抑制に効果的である。但し、これらの場合には溶は、 分 取 用 充 塡 剤 TOYOPEARL AF − rProtein A HC

離液の切替えによるベースラインの変動が生じる場合

TOSOH Research & Technology Review Vol.60（2016）60があるので、試料を注入する前に溶離液の切替えのみ

ノクローナル IgG の場合、0.15 mol/L NaCl を含む溶を実施して確認する必要がある。

離液（クロマトグラム（3））ではピークの溶出が最も例として、種々の溶離液にてヒト化モノクローナル遅く、テーリングを示した。しかし、このヒト化モノ

IgG を含むチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞

クローナル IgG の場合には吸着画分の相対ピーク面積

培養液上清を分離したときのクロマトグラムを図 1 にに顕著な差は認められず、吸着能や回収率に対する溶示す。いずれの溶離液でも IgG を溶出できたが、溶出離液組成の影響が小さいことが示唆された。

時間やピーク形状が異なった。ここで用いたヒト化モ

このように、溶離液組成により IgG の溶出挙動が異なるが、IgG の特性によっても溶出挙動が変わることが予想される。つまり、最適な分離条件は IgG の種類

150
夾雑物によって異なる可能性があるため、条件検討を適宜実モノクローナル
IgG施することが望ましいだろう。

⑴20 mmol/L
りん酸緩衝液（吸着画分の相対面積：41 ％）120

また、前記ヒト化モノクローナル IgG を含む CHO細胞培養液上清を、種々の pH の溶出用溶離液を使用して分離した場合、pH が高くなるに伴いモノクローナル IgG の溶出が遅くなったが、そのピーク形状や吸90

着画分の相対ピーク面積に対する影響はほとんど認めmAU⑵50 mmol/L
りん酸緩衝液（41 ％）られなかった 2）。
2.360⑶20 mmol/L
りん酸緩衝液+ 0.15 mol/L NaCl
（39 ％）

分析温度の影響

ヒト化モノクローナル IgG を含む CHO 細胞培養液
上清を、種々のカラム温度で分離したときのクロマトグラムを図 2 に示す。15 〜 35 ℃の条件で、ピーク形30状や吸着画分の相対ピーク面積に対する影響は見られ⑷20 mmol/L
りん酸緩衝液+ 10 ％エタノール（40 ％）なかった。一方、吸着画分のピークトップ時間は、温度が低くなるにしたがってわずかに遅くなる傾向を示した。

000.5

11.5

2

溶出時間［min］

図１

モノクローナル IgG の分離に対する溶離液塩濃度
及び添加剤の影響

120

9035 ℃（吸着画分の相対面積：42 ％）mAu〈測定条件〉
カラム：TSKgel Protein A−5PW（4.6 mm I.D.×3.5 cm）
溶離液：⑴ A：20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 7.4
B：20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 2.5⑵ A：50 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 7.4
B：50 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 2.5⑶ A：20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液+ 0.15 mol/L NaCl，pH 7.4
B：20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液+ 0.15 mol/L NaCl，pH 2.5⑷ A：20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 7.4/ エタノール＝90/10（v/v）
B : 20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 2.5/ エタノール＝90/10（v/v）
試料：0.5 g/L ヒト化モノクローナル IgG を含む CHO 細胞培養液上清溶離液切替：0 → 0.5 分 溶離液 A
0.5 → 1.1 分 溶離液 B1.1 → 2.0 分 溶離液 A（再平衡化）（ポンプとインジェクタとの間にスタティックミキサ（容量 10 μL）を装着）
流速：2.0 mL/min
検出：UV 280 nm（フローセル 1 mm、検出感度 Range 0.5）
温度：25 ℃
注 入 量：20μL

6025 ℃（43 ％）3015 ℃（42 ％）
000.5

11.5

溶出時間［min］〈測定条件〉
溶離液と温度を除き図 1 と同じ
溶 離 液 A：20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 7.4
B：20 mmol/L りん酸ナトリウム緩衝液，pH 2.5
温度：15，25，35 ℃

図２

分析温度の影響2

東ソー研究・技術報告

2.4

第 60 巻（2016）

試料塩濃度の影響

611200IgG 定量に供される細胞培養液中の塩濃度は、培養
1000

塩濃度の異なる IgG 試料を測定した結果を図 3 に示す。NaCl 濃度 0.57 〜 300 mmol/L の範囲では、IgG ピー
クの形状や面積にほとんど変化は認められなかった。
塩濃度の異なる試料であっても、IgG がカラム内の充塡剤に特異的に吸着し、溶出時には塩濃度の影響が排ピーク面積（mV・s）

環境等により一定でないことが考えられる。そこで、

y ＝ 9.9441x + 11.921
R2 ＝ 0.9999

800600400200除されたためと考えられる。

0210
NaCl：300 mmol/L

20406080
IgG 負荷量（μg）

100120〈測定条件〉
試料、注入量、温度を除き図 2 と同じ
試 料：0.001〜1 g/L ヒトポリクローナル IgG（溶離液 A に溶解）
注入量：100μL
温 度：25 ℃

140mAu0NaCl：150 mmol/L

図４IgG の低濃度域検量線

70
NaCl：0.57 mmol/L450000.511.5

溶出時間［min］〈測定条件〉
試料、温度を除き、図 2 と同じ
試 料：1 g/L ヒトポリクローナル IgG（NaCl 濃度の異なる溶離液 A に溶解）
温 度：25 ℃

図３2.540002

試料塩濃度の影響

ピーク面積［mV・s］0すことが分かっている 2）。そこで、ここではさらにIgG 濃度範囲を広げた場合の定量性を確認した。

2500
2000
1500

500
0

ヒトポリクローナル IgG を試料とした検量線の評価
荷量として 2 〜 200 μ g）の範囲で良好な定量性を示

3000

1000

検量線

では、20 μ L 注入の場合、IgG 濃度 0.1 〜 10 g/L（負y ＝ 1.3137x + 6.5868
R2 ＝ 1.0000

3500

0500

1000

1500 2000 2500
IgG 負荷量（μg）

3000

3500

〈測定条件〉
試料、温度、UV 計検出感度を除き図 2 と同じ
試 料：0.1〜150 g/L ヒトポリクローナル IgG（溶離液 A に溶解）
注入量：20μL
温 度：25 ℃
UV 計検出感度：Range 4

まず、低濃度域として、注入量 100 μL、IgG 濃度 0.001

図５〜 1 g/L（0.1 〜 100 μ g）の条件で定量性を評価した。

IgG の高濃度域検量線

結果を図 4 に示す。IgG 負荷量とピーク面積との間に良好な直線関係が得られ、S ／ N 比＝ 10 を指標としてた結果、ピーク形状に顕著な変化は認められなかった。

求めた定量下限は 0.5 mg/L（0.05 μ g）となった。一方、また、連続注入の前後で、検量線の直線性に差は見ら

高濃度域の定量性確認として、注入量 20 μ L、IgG 濃れなかった 2）。

度 0.1 〜 150 g/L（2 〜 3,000 μ g）の条件で検量線を作成した結果を図 5 に示す。前述の低濃度域と同様に良好な直線関係が得られたことから、高濃度域でのIgG 定量も可能であることが分かった。

2.7

アルカリ洗浄一般的に、カラムに強く吸着した成分の除去にはNaOH 水溶液による洗浄（アルカリ洗浄）が有効であるが、カラムにダメージを与える可能性がある。そこ

2.6

耐久性で、アルカリ洗浄に対する本カラムの安定性を評価しヒトポリクローナル IgG を含む CHO 細胞培養液上た。図 6 に、0.1 mol/L NaOH 水溶液 500 μ L を繰り

清を試料として、2,000 回以上の連続注入試験を行っ返し注入する方法でアルカリ洗浄を行い、洗浄前後でTOSOH Research & Technology Review Vol.60（2016）

62120

相対ピーク面積［％］

100806040200

洗浄前

500μL×5 回後

500μL×10 回後〈測定条件〉
試料、温度を除き図 2 と同じ
試 料：10 g/L ヒトポリクローナル IgG（溶離液 A に溶解）
温 度：25 ℃（試料注入バルブを用いて 0.1 mol/L NaOH 水溶液 500μL を注入。
5 回注入ごとにヒトポリクローナル IgG を測定。）

図６

アルカリ洗浄前後の相対ピーク面積の IgG ピーク面積を比較した結果を示す。洗浄 5、10性が得られることが確認された。なお、流速 4.0 mL/

回後のピーク面積は洗浄前とほぼ同じであったことかmin では、1 分以内でのハイスループット分析が可能

ら、カラムの吸着能は変化していないものと考えられであった 2）。

た。
2.92.8

各種 IgG の分析

Protein A に対してヒト IgG と同様のアフィニティー

高速分析

流速 1.0 ～ 4.0 mL/min の範囲で、ヒト化モノクローを持つとされる、マウス及びウサギ IgG の分析を検討

ナル IgG を含む CHO 細胞培養液上清を分離した結した。マウスモノクローナル IgG を含むマウス腹水と、果、流速を変化させても吸着画分の相対面積にほとん

ウサギ IgG（リコンビナント）を含む CHO 細胞培養

ど差は生じなかった。また、流速 1.0 mL/min 及び 4.0

液上清のクロマトグラムを図 7 に示す。結果、両方のmL/min の条件で作成したヒトポリクローナル IgG の試料において IgG を吸着、溶出できることが確認され検量線の比較において、いずれの場合も良好な直線た。

320

240

mAu

ウサギ IgG160
マウス IgG−1800
マウス IgG−2000.5

11.5

溶出時間［min］〈測定条件〉
試料、温度を除き図 2 と同じ
試 料：ウサギ IgG（リコンビナント）を含む CHO 細胞培養液上清
マウスモノクローナル IgG を含むマウス腹水
温 度：25 ℃

図７

ウサギ IgG 及びマウス IgG の吸着、溶出クロマトグラム2東ソー研究・技術報告

3．まとめ
本 稿 で は IgG の 高 速 分 析 用 AFC カ ラ ム TSKgel
Protein A − 5PW について紹介した。本カラムは耐久性に優れており、アルカリ洗浄も可能なことから、夾雑物を多く含む細胞培養液中の IgG の迅速かつ高精度な定量に適している。また、IgG の定量範囲が広いため、培養初期の低濃度試料から高濃度試料まで分析可能である。本カラムが抗体医薬品分野における IgG の定量分析で、広く使用されることを期待したい。

引用文献
１）特許庁、平成 26 年度

特許出願技術動向調査報

告書（概要）抗体医薬
２）東ソー株式会社、セパレーションレポート、No.
117

第 60 巻（2016）63