−報3

文−

誘電泳動を利用した血中希少がん細胞の検出・解析システムの開発
最
森
飯
秋
片
二

上
本
嶋
山
山
見

聡
篤
和
泰
晃

文＊ 1
史＊ 1
樹＊ 1
之＊ 1
治＊ 2
達＊ 1

Development of a System Utilizing Dielectrophoresis for Detection andAnalysis of Rare Tumor Cells in Peripheral Blood
Toshifumi MOGAMI
Atsushi MORIMOTO
Kazuki IIJIMA
Yasuyuki AKIYAMA
Koji KATAYAMA
Toru FUTAMI

Circulating tumor cells (CTCs) are tumor cells shedding from the primary tumor and are circulating in the bloodstream of patients with metastatic cancer. The number of CTCs in peripheral blood predicts survival of patients.
In addition, CTCs are expected to be a source for the molecular characterization of primary tumors. To date, avariety of systems for detection and analysis of CTCs have been developed, after appearance of the CellSearch ®
System firstly approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) as a CTCs enumeration system. In thisstudy, we aimed to develop a capture system for molecular characterization of single CTCs based on a high-density
dielectrophoretic microwell array technology. In order to verify our method, we performed preclinical tests utilizing
model specimen where cancer cell lines were spiked in whole blood obtained from healthy donors. The developmentof the system was performed in the following four processes; (1) process to enrich the cancer cells by the negativeenrichment manner from a model specimen; (2) process to entrap the enriched cells in microwell array; (3) processof immunofluorescent staining of the entrapped cells followed by fluorescent microscopic detection, and (4) process
to isolate the detected cancer cells in order to perform genetic analysis. As a result, our system showed a highdetection rate and an excellent linearity for the number of cancer cells spiked into the specimen, demonstrating aprominent performance compared with the CellSearch® system. Furthermore, we performed a genetic analyses ofsingle isolated lung cancer cells from microwell array, and successfully detected alterations in the EGFR gene. As
mentioned above, we have established a reliable CTCs detection and analysis system utilizing dielectrophoretic
microwell array technology. Results of a proof-of-principle preclinical study indicated that this system has potential
for the molecular characterization of captured CTCs from patients.

＊1＊2

ライフサイエンス研究所／細胞診断グループ
ライフサイエンス研究所／装置開発グループ

TOSOH Research & Technology Review Vol.58（2014）

4があることである。種々の 1 細胞レベルでの解析は技

1．緒言

術的にいまだ容易ではないが、がんの進行に伴う血行近年、がん診断の精度を高めるため、また治療方針

性遊離のメカニズムを解明するために、現在までにい決定に寄与する情報を得るために、分子的な細胞特性

くつかの研究手法が開発され評価されている 22 − 26。こ評価手法が用いられている。例えば、ある種のがんでれらの手法では通常、複数のシステムを組合せるこ

しばしば見られるゲノム DNA の異常は、そのがんをとによって CTCs の検出と単離といった複雑な操作治療するための分子標的薬の効果を予測する指標とを行っている（例えば、CellSearch® システムによるなっている 1。これらのがんの特性評価はこれまで主CTCs の濃縮と検出、それに続くマイクロマニピュレーに、がん組織の一部を採取（生検、バイオプシー）しションによる細胞単離、またはセルソーターによる細たものを試料として行われてきたが、生検にはがん患者

胞単離が実施されている 24, 26）。誘電泳動技術もまた、への侵襲性、及び採取の非簡便性という課題がある 2。

CTCs を含むがんの 1 細胞レベルでの単離と特性評価

血中循環がん細胞（Circulating Tumor Cells ; CTCs）に利用されている 27 − 29。しかしながら、誘電泳動技術

はがんの遺伝子異常を検出するための新たな試料とを利用した初期の研究では、細胞濃縮工程と細胞単離なっており、検体が血液の採取だけで済み、その低侵工程との間での操作中に希少ながん細胞をロスしてし襲性や採取の簡便性から従来の生検を代替するものとまうことが大きな問題となっていた 24,26,27。

してリキッドバイオプシー（Liquid Biopsy）という概

今回我々は、新たに開発した誘電泳動デバイスを用念が生まれている 3 − 7。CTCs はがん原発巣から遊離しいた CTC 検出・解析システムを完成した。本システ

血流に乗って全身を循環しているがん細胞であり、転ムでは、細胞濃縮工程から細胞単離工程まで一貫して®

実施するため、操作中の希少細胞のロスが低減されてシステム（Janssen Diagnostics 製）は、米国食品医薬おり、希少ながん細胞の 1 細胞レベルでの検出と単離

品局（FDA）に医療機器として認可されている唯一が可能となる。

移性のがん患者の末梢血中に検出される。CellSearch®

の臨床的 CTC 計数装置である。CellSearch システム

本報告では、白血球除去による CTCs の濃縮工程、によれば、転移性乳がん、転移性前立腺がん、及び転蛍光顕微鏡を用いた画像解析による免疫表現型分析工

移性大腸がんの患者における治療開始前・開始後の程、そして CTC の単離工程とそれに続く 1 細胞レベ

CTC 数は、がんの再発までの期間、及び全生存期間

ルでの遺伝子変異解析とからなる一連の操作による、と相関があり、治療開始前・開始後のいずれの場合も前臨床・原理検証実験結果を説明する。誘電泳動を利CTC 数が一定数より多い場合はそうでない場合と比用した我々の CTC 検出・解析システムは高性能かつ較して、再発までの期間、及び全生存期間とも短かっ

簡便なものであり、今後の臨床試験における性能評価

8

た 。現在、CTCs の臨床的意義は上記のがん種の他が待たれている。

にも非小細胞肺がん、小細胞肺がん、及び胃がんでの検証試験が報告されている 9 − 12。
現在まで、血液から CTCs を濃縮し検出するための種々のシステムが開発されている 5。それらのシステ®

2．実験方法と結果［1］倫理委員会

ムは、CellSearch に代表されるようにがん細胞表面

本研究は東ソー株式会社旧東京研究所倫理委員会にに発現している上皮性接着分子（EpCAM）に結合すて倫理面・安全面に関する審査を受け、承認されている抗 EpCAM 抗体を利用した CTCs 濃縮機能を持つもる（管理番号 TR14 － 01）。

の 13 − 15、抗 EpCAM 抗体に依存しない CTCs 濃縮機能を持つもの 16 − 18、または CTCs と白血球細胞との細胞［2］誘電泳動の原理と実用

径の違いにより CTCs を濃縮する膜状フィルターによ

誘電泳動は不均一電界に置かれた細胞等の誘電体粒→子が、力を受ける現象である。不均一電界 E に置かれるもの

19 − 21、以上の 3 種類に大きく分類される。しかしながら、CTCs の EpCAM 発現量や細胞径はがん種により異なるため、抗 EpCAM 抗体を利用した CTCs
濃縮方法やフィルターによる濃縮方法では CTCs を取5

りこぼすことが指摘されている 。さらに CTCs の特た液媒体中の球状粒子（例えば細胞）が受ける誘電泳→
動力 F は、下記の式で表される；→＝ 2πεmα3 εcell −εm → →2F
ε ＋ 2ε ∇ E
cellm

性評価の結果わかったことは、CTCs は多様性をもつ

ここでε m 及び ε cell はそれぞれ媒体と粒子の誘電率、細胞群であり、そのため 1 細胞レベルでの解析の必要

αは粒子径を表す 30。このように、誘電泳動力は粒子東ソー研究・技術報告第 58 巻（2014）

5

ElectrodeAC
Voltage

SpacerPhotoresist

Cell
DEP Force
MediumElectrodegap

Non-uniform
Electric field
30 µm

Electrode
50 µm

Fig.１

Microwell

30 µm

Light shielding film

Schematic drawings of the cell entrapment chamber utilizing
dielectrophoresis (DEP)の体積、媒体と粒子の誘電率の差、及び不均一電界のことが好ましく、また交流電圧は細胞が素早く引き寄

大きさの二乗にそれぞれ比例する。そして ε cell −ε m

せられるために矩形波であることが好ましい。

が 0 より大きい場合、粒子は不均一電界の強い方向に

また、等張液とするため、200 ～ 500 mM の糖（マンニトールやスクロース等）水溶液が溶媒として一般

引き寄せられる。
Fig. １に誘電泳動力による微細孔アレイへの細胞捕に用いられる。

捉の模式図を示した。上部平板電極に対向する下部電Fig. ２に微細孔アレイ基板の作成方法を示す。酸極に形成した絶縁膜上の微細孔に、一様でない不均一

化 イ ン ジ ウ ム ス ズ（ITO） 透 明 電 極 の 薄 膜（ 膜 厚な電界（電気力線）が与えられると、細胞は電界の集150nm、抵抗率 10 Ω／ sq）を片面に成膜したガラス板

中する方向（電気力線が密な方向）、すなわち微細孔（70mm × 40mm ×厚さ 1mm）上に、スパッタリングの方向へ引き寄せられる。ここで実際に細胞が受けるによりクロム（Cr）の薄膜（膜厚 100nm）を形成した。

誘電泳動力は、不均一電界の交流周波数と、細胞が置その上にネガ型フォトレジスト（SU − 8）をスピンコー

かれる液媒体の電気伝導度にも影響を受ける。その理

トにより塗布することで厚さ 30µm の層を形成し、微由はε m 及び ε cell が周波数及び液媒体の電気伝導度の細孔（直径 30µm、孔間隔 50µm）に対応するパター影響を受けるからである。媒体の電気伝導度は、媒体ンを形成したフォトマスクを介してフォトレジストをに過剰に電流が流れないよう 200 µS ／ cm 未満である

紫外線露光し、続いて現像、ベークを行い、所定の微Photoresist
Light shielding film
ITO
Glass substrate

Developing solution

Ceric ammonium nitrate solution

Fig.２

Schematic diagram of the photolithographic method, with corresponding
etching, to fabricate the microwell array substrate

TOSOH Research & Technology Review Vol.58（2014）6細孔に相当する凹部をレジストに形成した。ここで露［3］がん細胞の濃縮

光条件として、微細孔の底部に Cr が露出するように健常者の血液は従業員からボランティアで提供さ露光時間、現像時間を調整した。最後に硝酸二アンモ

れ、EDTA − 2K 真空採血管（テルモ製、VP − DK050K）

ニウムセリウム液により露出した Cr 膜を剥離し、微に採血した。スパイク試験では、細胞数を調整した生細孔の底部に電極部材である ITO を露出させた。ネ

きたがん細胞株を 3mL の血液に添加（スパイク）し、ガ型フォトレジストとして用いた SU − 8 は、紫外線露

さらに RosetteSepTM Human CD − 45 Depletion Cocktail

光された部分が硬化しエポキシ系樹脂となり、微細孔（STEMCELL technologies 製）を添加した。そこに等を有する絶縁膜となる。微細孔の深さはレジスト厚と量の生理食塩水を加え 6mL の希釈血液とし、全量を等しく、30µm とした。Fig. ３に完成した微細孔アレ

LymphoprepTM 比重差分離液（密度：1.077 ± 0.001 g ／イ基板を示す。なお、ITO 電極と絶縁膜との間に、微ml, 浸透圧：280 ± 15 mOsm／kg−H2O, Axis−Shield 製）

細孔底面を除く ITO 電極表面を覆うように形成したに重層し、遠心した（2000 × g、5 分、25℃）。なお

Cr 膜は遮光膜の役割を果たし、レジストの自家蛍光

RosetteSepTM は白血球と複数の赤血球との凝集体を形を遮光する。

成する試薬であり、その後の密度勾配遠心分離と組み

Fig. ４に細胞捕捉チャンバーを示す。細胞捕捉チャ

合わせることで不要な白血球を効率的に除去すること

ンバーは、前述の微細孔アレイ基板と、シリコンゴムができる。遠心後、濃縮された単核細胞層を回収し、製スペーサーを介して空間を設けるように反対側に0.35％クエン酸を含む PBS で洗浄し、遠心した（300

位置するもう一枚の ITO 電極形成ガラス板とからな

× g、10 分、25℃）。僅かに混入する赤血球を破砕する。従って電極間距離は、スペーサーの厚みと等しい

るため、遠心後のペレットを 9.0 g ／ L NH4Cl, 1.0 g ／ L

1mm となる。なお、電極間に設けられた空間にはおKHCO3, 0.037 g ／ L EDTA − 4Na からなる溶血液によりよそ 800 µL の溶液を保持することができ、また約 30

懸濁し、室温で 5 分静置した後、300 mM マンニトー

万個の微細孔が開口する。細胞捕捉チャンバーに細胞ル水溶液で希釈し遠心した（300 × g、5 分、25℃）。

懸濁液を導入し、周波数 100 kHz ～ 10 MHz 、強度 20

上清を注意深く除去し、再度 300 mM マンニトール水～ 50 Vp − p の交流電圧を一対の電極間に印化すると、溶液にて希釈し遠心（300 × g、5 分、25℃）した後、電界強度 40 ～ 100 kV ／ m の不均一な交流電界が発生

上清を注意深く除去し、がん細胞が濃縮された単核細し、数分のうちに直径 5 ～ 30 µm のヒトの細胞をそれ

胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液の電気伝導度はぞれの微細孔に捕捉することができる。

200 µS ／ cm 未満であり、また含まれる白血球数は検体個人差により 1 × 105 ～ 5 × 105 個の範囲であった。
［4］微細孔アレイでの細胞の捕捉
市販の交流電源（エヌエフ回路設計ブロック製、WF1974）を細胞捕捉チャンバーの一対の電極間に接続し、がん細胞が濃縮された単核細胞懸濁液をチャンバーに導入し、即座に交流電圧（3 MHz、20 Vp − p、

100 µm

Fig.３

The microwell array fabricatedon the plane ITO electrode矩形波）を 3 分間印加し、誘電泳動力により細胞を微細孔アレイに捕捉した。続いて、ポリ− L −リジンを含む 300mM マンニトール水溶液を細胞捕捉チャンバーに導入し 3 分間静置した。なお、ポリ− L −リジンはカチオン性ポリマーであり、負電荷を帯びた細胞膜と相互作用し、細胞を微細孔底面へ接着する働きがある。
チャンバー内の溶液を吸引除去した後、ホルムアルデ

30mm

ヒドを含むエタノールをチャンバー内に満たし、室温
inlet / outlet
70mm

で 10 分間静置した。なおエタノールは細胞膜を透過性にすることで細胞内外の物質の移動を可能とし、またホルムアルデヒドはタンパク質同士を架橋すること

Fig.４

The cell entrapment chamber, which is consistsof the microwell array substrate and another glass
substrate coated with ITO thin film

で核や細胞骨格など細胞内構造の形態を安定化する。
チャンバーからエタノールを吸引除去した後、1％ 牛東ソー研究・技術報告

血清アルブミン（BSA）を含む PBS からなるチャンバー

第 58 巻（2014）7［6］スパイク試験

洗浄液によりチャンバー内を洗浄し、さらに FcR ブ

スパイク試験により我々の開発した CTC 検出・解ロッキング試薬（Miltenyi Biotec 製）を含むチャンバー

析システムの性能を評価した。蛍光画像解析により、洗浄液を導入し室温で 10 分間静置することで、非特CK 陽性／ DAPI 陽性／ CD45 陰性の細胞をがん細胞

異標識ブロッキングを行った。

と判定し、一方で CK 陰性／ DAPI 陽性／ CD45 陽性［5］がん細胞の免疫蛍光染色と画像取得用いたスパイク試験で得られた画像の一例を示しておの細胞を白血球と判定した。Fig. ５は SK − BR − 3 を上皮性マーカーの一つであるサイトケラチン（CK）

り、矢印で示す細胞はがん細胞と判定される。

の発現が高い細胞株（乳がん SK − BR − 3、非小細胞

Fig. ６にスパイク細胞数に対する検出された細胞数

肺がん PC − 9）を用いたスパイク試験では、細胞捕捉のプロットを示す。CK 高発現細胞株である SK − BR −チャンバー内の溶液を吸引除去後、PBS に 1％ BSA、

3 及び PC − 9 の結果は高い直線性を示し決定係数（R2）0.05 ％ Tween20、FITC 標 識 － 抗 CK 抗 体（ ク ロ ー ン

はそれぞれ 0.9735、0.9999、平均検出率（及び変動係数）®

CK3 − 6H5）、Alexa Fluor 488 標 識 － 抗 Pan − CK 抗はそれぞれ 81.1％（10.7％）、81.5％（5.0％）であった。

体（クローン AE1 ／ AE3）
、PE 標識－抗 CD45 抗体（クその一方で、CK 低発現細胞株である PC − 14 の結果

ローン J33）、DAPI、及び FcR ブロッキング試薬を加は、平均検出率が 13.1％（Fig.6 黒塗）と低く、FITC

えた免疫蛍光染色試薬溶液をチャンバー内に満たし、標識－抗 CK 抗体（クローン CK3 − 6H5）及び Alexa

室温で 30 分間静置した。未反応の抗体を吸引除去後、Fluor® 488 標 識 － 抗 Pan − CK 抗 体（ ク ロ ー ン AE1 ／チャンバー内をチャンバー洗浄液で洗浄し、次いでAE3）の組合せ使用では CK 低発現細胞の検出には免300mM マンニトール水溶液を満たした。

疫蛍光染色能力が不十分であることが推測された。そ一方、CK の発現が低い細胞株（非小細胞肺がんの証拠に、Alexa Fluor® 488 標識二次抗体を使用する

PC − 14）を用いたスパイク試験では、細胞捕捉チャン

免疫蛍光染色プロトコルにより、PC − 14 の検出率（及

バー内の溶液を吸引除去後、PBS に 1％ BSA、0.05％

び変動係数）は 77.7％（15.7％）（Fig.6 白塗）に改善

Tween20、 抗 CK 抗 体（ ク ロ ー ン CK3 − 6H5、AE1、した。これは弱い CK シグナルが二次抗体により増幅

AE3）、及び FcR ブロッキング試薬を加えた一次抗体されたこと、及び二次抗体が FITC よりも明るい色素

試薬溶液をチャンバー内に満たし、室温で 30 分間静である Alexa Fluor® 488 で標識されていることが起因置した。未反応の抗体をチャンバー洗浄液により洗していると考えられる。以上の結果から、我々の開発浄 し た 後、PBS に 1 ％ BSA、0.05 ％ Tween20、Alexa

した CTC 検出・解析システムはがん細胞を精度良く®

Fluor 488 標 識 － 抗 マ ウ ス IgG1 抗 体、PE 標 識 － 抗

検出し、また少数の細胞から多数の細胞まで同様に検CD45 抗体（クローン 5B1）
、DAPI、及び FcR ブロッ

出可能であることが示された。

キング試薬を加えた蛍光標識二次抗体溶液をチャン

続いて、CellSearch® との比較試験をブラインド試

バー内に満たし、室温で 20 分間静置した。なお使用

験により行った。ブラインド試験とは、血液にスパイした抗 CK 抗体のサブタイプは全てマウス IgG1 であり、一方抗 CD45 抗体（5B1）のサブタイプはマウス
IgG2 であるため、二次抗体である抗マウス IgG1 によ

DAPI

CD45−PE

CK−FITC

Bright Field Image

る交差反応は起こらなかった。未反応の抗体を吸引除去後、チャンバー内をチャンバー洗浄液で洗浄し、次いで 300mM マンニトール水溶液を満たした。
がん細胞の免疫蛍光染色工程の後、細胞捕捉チャン
バーを蛍光顕微鏡（IX 71、オリンパス製）の自動ス
テージ上に載せ、EM − CCD カメラ（ADT − 100、フロー
ベル製）により微細孔アレイ全体の画像を取得した。
蛍 光 画 像 は 各 蛍 光 波 長（DAPI、FITC（Alexa Fluor®
488）、PE）について取得し、明視野画像も併せて取得した。画像取得及び解析は特注のソフトウェアを用いて行った。

Fig.５

A typical example of captured images of tumor cells
and white blood cells in the spike-in experiments

TOSOH Research & Technology Review Vol.58（2014）

8

SK−BR−3

Detected cell number

Detected cell number

500
100

250

0

0

PC−14
1000

R2 ＝ 0.9999

1000

750

0

Detected cell number

PC−9
R2 ＝ 0.9735

1000

250 500 750 1000
Spiked cell number

0

100

0

100

750
500
100

250
0

0

0

250 500 750 1000
Spiked cell number

0100

R2 ＝ 0.9709

750
500
100

250
0

Fig.６

0

250 500 750 1000
Spiked cell number

0

Immunofluorescent protocol which utilizes;●：only primary anti−CK antibody◇：primary anti−CK antibody and also secondary antibody

Plots of the number of detected cells against the number of spiked cells in the spike−in experiment

クしたがん細胞株の種類、及び個数を測定者に知ら細胞の検出では CellSearch® に対し優位であり、またせずに行う試験のことである。任意のがん細胞（SK

EpCAM ／ CK 高発現細胞の検出では CellSearch® と− BR − 3、PC − 9、PC − 14 のどれか）を添加した血液同等の性能を示した。

3mL を我々の CTC 検出・解析システムで測定した。
一方、並行して CellSave 血液保存管に採取した血液［7］1 細胞単離・1 細胞遺伝子変異解析

量 10 mL に比例したがん細胞数を添加したサンプル®

画像解析により CTC と判定された細胞を微細孔ア

を、比較用に CellSearch システムで測定した。併せ

レイから単離し遺伝子変異解析を行うため、シリンジてがん細胞を添加していない血液検体も両システムでポンプと L 字型ガラスキャピラリー（内径 30µm）を測定した。結果を Table 1 に示す。平均検出率（我々装着したマイクロマニピュレーターによる細胞単離機®

のシステム vs. CellSearch ）は以下の通りであった；

構を構築し、微細孔に捕捉された細胞を吸引し単離

EpCAM ／ CK 高発現細胞 SK − BR − 3（n ＝ 3）, 80.1％

した。Fig. ７は L 字型ガラスキャピラリーによる微vs. 58.0％；EpCAM ／ CK 高発現細胞 PC − 9（n ＝ 2）,

細孔からの細胞を吸引の模式図である。なお Fig. ８

75.8 ％ vs. 85.6 ％；EpCAM 無 発 現 ／ CK 低 発 現 細 胞に示すように、細胞単離機構によって標的のがん細胞

PC − 14（n ＝ 3）, 61.9％ vs. 0.0％。また両システムとも、のみが吸引され、近隣の微細孔に捕捉された白血球はがん細胞を添加していない血液検体からはがん細胞と微細孔から吸引されることはなかった。単離した単一判定される細胞は検出されなかった。以上の結果のよ細胞は市販の PCR チューブに吐出した。PCR チュー

うに、我々のシステムは EpCAM 無発現／ CK 低発現

ブに回収した単一細胞のゲノム DNA の配列解析を

Table１Comparative detection data from the spike−in experiment using
tumor cell lines（our system vs. the CellSearch® system）
CellSearch® system

Our system
Cell Line

Mean percentage
Mean percentage（％） of detected cells CV（％）
n of detected cells CV（％）（％）

SK−BR−3

3

80.1％（76−84％）

4.7

58.0％（49−69％）

17.6

PC−9

2

75.8％（72−79％）6.

85.6％（77−94％）

13.8

PC−14

3

61.9％（46−85％）

33.3

N.D.

−

N.D.

−

N.D.

−

Healthy donor 4

Foot note；CV：coefficient of variation. N.D.：not detect東ソー研究・技術報告第 58 巻（2014）

9

実験には非小細胞肺がん細胞株 H1975 と PC − 9 とを用いた。なお H1975 のゲノム DNA にはエクソン 20
上に T790M 変異、エクソン 21 上に L858R 変異が存在する。一方 PC − 9 のゲノム DNA には上記のどちらの変異も存在しないため、遺伝子変異陰性の対照細胞として用いた。両細胞株を別々に血液にスパイクし、前述と同様がん細胞濃縮、微細孔アレイへの捕捉、細Tip of glass
capillary

胞膜透過、及び免疫蛍光染色の各工程を実施した。細
胞捕捉チャンバーの上部平板電極を取外し、細胞単離30 µm機構によりがん細胞を単離し回収した。回収した細胞は 1 細胞ごとに全ゲノム増幅し、サンガーシーケンシ
Fig.７

Schematic drawings of isolation of single tumor cell.

ング法により EGFR 遺伝子を解析した。その結果、単離された H1975 細胞の 1 細胞ごとの全ゲノム増幅の行うために、Ampli 1™ 全ゲノム増幅キット（Silicon

成功率は高く、80％（12 ／ 15）であった。全ゲノム増

Biosystems 製）を用いて全ゲノム DNA の増幅を行っ幅が失敗したケースでは、DAPI による核染色やホルた。アガロースゲル電気泳動により全ゲノム増幅の成ムアルデヒドによる化学固定が影響していると推定さ功を確認した後、〜 100 ng の全ゲノム増幅産物を鋳れ、実際の臨床検体に含まれる希少細胞の解析のため型としてサンガーシーケンシング法により遺伝子配列には、さらなるプロトコルの最適化が必要であると思解析を行った。

われる。H1975 全ゲノム増幅産物のサンガーシーケン

非 小 細 胞 肺 が ん に お い て、 上 皮 成 長 因 子 受 容 体

シングの結果、Fig. ９に示したように EGFR 遺伝子（epidermal growth factor receptor, EGFR ）遺伝子におのエクソン 20 とエクソン 21 にそれぞれ T790M 変異

ける数種類の変異が、EGFR を標的とした分子標的薬（C2369 ＞ T）、L858R 変異（T2573 ＞ G）が存在する®

ゲフィチニブ（製品名イレッサ 、アストラゼネカ社）
31

シーケンスクロマトグラムが得られた。一方、同様のの奏功性と関連していることが知られている 。そこ

操作を PC − 9 細胞について行った結果、エクソン 20、で非小細胞肺がん患者の CTCs のゲノム DNA 情報をエクソン 21 のいずれにも変異は見られなかった。以得ることを狙いに、微細孔アレイから単離した単一が上の結果から、我々の開発した CTC 検出・解析シス

ん細胞に対しサンガーシーケンシングを行い、EGFR

テムにより得られたがん単一細胞はゲノム DNA 配列

遺伝子における数種類の遺伝子変異の検出を試みた。

解析に十分耐えうる品質であることが示された。

DAPI

CD45-PE

CK-FITC

Bright Field Image

Tumor cell 1
BeforeAfter

Tumor cell 2
Before

After

Fig.８

Demonstration of isolation of targeted single tumor cells by aspiration

TOSOH Research & Technology Review Vol.58（2014）

10

exon 21
Wild-type

PC-9

T2573

L858R mutation

H1975

T2573＞G

exon 20
Wild-type

PC-9

C2369

T790M mutation

H1975

Fig.９

C2369＞T

Sequencing chromatograms with T790M EGFR
exon 20 mutation and L858R EGFR exon 21 mutation
obtained from WGA product from a single H1975
cell isolated by our CTC detection system.

3．まとめ
以上のように、高密度誘電泳動微細孔アレイを利用

診断・治療機器の総合研究開発プロジェクト、血中循
環がん細胞検出技術【CTC 検出自動化】（2010 年～2015 年）の助成を受け実施された。

した有力な CTCs 検出・解析システムを確立した。本
システムはヒト血液に含まれる希少細胞の特性評価及び単一細胞レベルでの単離を可能とする。これまで報告したように、本システムの利点として以下が挙げられる。
（１）
表面マーカー等に依存しない細胞捕捉、
（２）

引用文献
（１）NB. La Thangue, DJ. Kerr, Nat. Rev. Clin. Oncol .,8,587（2011）

CTCs の濃縮から単一細胞単離まで一貫し実施可能、（２）MJ. Overman, J. Modak, S. Kopetz, R. Murthy, JC.

（３）細胞ロスの無い微細孔アレイでの免疫蛍光染色、

Yao, ME. Hicks, JL. Abbruzzese, AL. Tam, J. Clin.

（４）整列した微細孔からの安定した単一細胞分取、Oncol .,31,17（2013）（５）ゲノム DNA の変異検出などの追加解析が可能。

（３）M. Yu, S. Stott, M. Toner, S. Maheswaran, DA.

現在、CTC 検出技術の更なる高精度化を達成すべHaber, J. Cell Biol .,192,373（2011）

く、血液からの細胞濃縮工程の改良や誘電泳動による（４）ES. Lianidou, Clin. Chem.,58,805（2012）

細胞捕捉性能の向上といった対策を実施している。ま（５）C. Alix-Panabieres, K. Pantel, Clin. Chem ., 59, 110た臨床現場での性能評価試験を実施するために各工程の自動化を進めており、今後の医療機関での評価が待たれている。
最後に、本研究開発の実施にあたり、洪泰浩先生、
渡辺勝先生（両名とも所属は和歌山県立医科大）、小
泉史明先生、澤田武志先生（両名とも所属は都立駒込病院）には技術的なご指導・ご助言をいただいた。ま（2013）（６）T M . G o r g e s , K . P a n t e l , Cancer Immunol.

Immunother ., 62, 931（2013）（７）E. Heitzer, M. Auer, P. Ulz, JB. Geigl, M. Speicher,

Genome Med ., 5, 73（2013）（８）K. Pantel, RH. Brakenhoff, B. Brandt, Nat. Rev.

Cancer , 8, 329（2008）

た野口昭子氏、柏木菜穂子氏には技術支援をいただい（９）MG. Krebs, R. Sloane, L. Priest, L. Lancashire, JM.

た。以上のご協力いただいた方々に対し、ここに感謝

Hou, A. Greystoke, TH. Ward, R.Ferraldeschi,

申し上げる。本研究開発は、独立行政法人新エネル

A. Hughes, G. Clack, M. Ranson, C. Dive, FH.

ギー・産業技術開発機構（NEDO）によるがん超早期Blackhall, J. Clin. Oncol ., 29, 1556（2011）

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