Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18、1.9 μm カラムによる超高速分離アプリケーションノート
農業・食品検査・低分子医薬品

著者
Anne Mack
Agilent Technologies, Inc.

概要

2.1 × 50 mm、1.9 μm の Agilent InfinityLab Poroshell 120 カラムにより、10 種類の化合物を 0.3 分、最小分離度 2.2 でベースライン分離 できました。InfinityLab Poroshell カラムでは、同じ分析 を Agilent

ZORBAX Eclipse Plus C18、4.6 × 250 mm、5 µm カラムで実施した場合と比べ、分析スピードが 120 倍向上し、移動相を 98 % 節約することができました。また、両カラムの選択性はほぼ同じであるため、メソッド変換が容易です。

はじめに実験方法

れています。表面多孔質粒子のカラムでは、それに相当する全多孔質粒ムボリュームと分散を抑えるため、標準構成のシステムに変更を加えましに、物質移動距離がより短く、カラムに充填されている粒子の粒子サイズカラムを示します。

液体クロマトグラフィーには、表面多孔質粒子の LC カラムが広く使用さ今回の調査には、Agilent 1290 Infinity LC システムを使用しました。システ子のカラムに比べ、より低圧で高い分析効率が得られます [1]。これは主た。表 1 に、システム構成の詳細と、調査に使用した 2 種類の Agilent LC分布がきわめて狭いためです [2]。現在、表面多孔質粒子は、効率をさら

表 2 に、すべての分析に用いた LC メソッドパラメータを示します。カラムに高 めるため小粒子化が進んでいます。カラムの効率が高いほど、分析間のクロマトグラフィー分離条件を一定にするために、1.9 µm カラムによを高速化できるだけでなく、分解能と感度が向上し、より信頼性の高いる高速分析を除き、すべてのメソッドをカラムボリュームに応じて幾何学結果が得られます。

的にスケーリングしました。

アジレントの LC カラムファミリには、メソッド変換を容易にし、スケーラ

今回の調査では、10 種類の化合物を分析しました。9 種類のアルキルフェビリティを確保するために 数々の 改善 が 重 ねられてきました。全多孔ノン類は、アジレントから標準溶液として購入しました。また、チオ尿素を質粒子 の Agilent ZORBAX カラムと表面多孔質粒子 の Agilent InfinityLab

Sigma-Aldrich 社から購入し、標準溶液に加えてボイドボリュームマーカー

Poroshell カラムは、固定相自体にほとんど違いがないため、メソッドをとして使用しました。アセトニトリルは Honeywell 社 (Burdick and Jackson) か容易に更新できます。新たにメソッドを開発しなおす必要はありません

ら購入しました。水は、Milli-Q システム (Millipore 社) で生成された、0.2 µm[3]。

フィルタでろ過した 18 MW のものを使用しました。

今回の調査では、粒子径の小さい Poroshell カラムを使用することで、従来型の 5 µm カラムと比較して、アルキルフェノン類の分離効率をどの程度高めることができるかを調べました。その結果、InfinityLab Poroshell カラ

ムでは、時間、溶媒、サンプル、およびコストを大幅に節約できることが実証されました。

表1. UHPLC システムの構成

Agilent 1290 Infinity LC システムの構成

Agilent 1290 Infinity バイナリポンプ (G4220A)

Agilent 1290 Infinity 高性能オートサンプラ (G4226A)

35 µL 溶媒ミキサー : Jet Weaver、35 µL/100 µL (G4220-60006)

シートアセンブリ、超低分散、Agilent 1290 Infinity オートサンプラ用 (G4226-87030)

オートサンプラからヒーター : キャピラリ、ステンレス製、0.075 × 220 mm、SV/SLV (5067-4784)

茶色のスクリュートップバイアル、ラベル付き、認定済み、2 mL、100 個 (5182-0716)
青のスクリューキャップ、PTFE/赤色シリコンセプタム、100 個 (5182-0717)

Agilent 1290 Infinity カラムコンパートメント (G1316C)
Agilent 1290 Infinity ダイオードアレイ検出器 (G4212A)

Agilent OpenLAB CDS ChemStation Edition、リビジョン C.01.05 [35]Agilent LC カラム

バイアルインサート、250 µL、ガラス製、樹脂製の脚付き、100 個 (5181-1270)

熱交換器、低分散、1.6 µL、ダブル (G1316-60005)

ヒーターからカラム: InfinityLab クイックコネクトアセンブリ、105 mm、0.075 mm (5067-5961)
カラムからフローセル: キャピラリ、ステンレス製、0.075 x 220 mm、SV/SLV (5067-4784)

超低分散 Max-Light カートリッジフローセル、10 mm (G4212-60038)

G4220A: B.06.53 [0013]
G4226A: A.06.50 [003]
G1316C: A.06.53 [002]G4212A: B.06.53 [0013]

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、4.6 × 250 mm、5 µm (959990-902)
Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18、2.1 × 50 mm、1.9 µm (699675-902)2表2. UHPLC メソッドパラメータ

流量

移動相

カラム

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、4.6 × 250 mm、5 µm

Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18、2.1 × 50 mm、1.9 µmA) 水B) アセトニトリル

Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18、2.1 × 50 mm、1.9 µm (高速)(mL/min) グラジエント
1.00.5
2.3

36 分で35 ～ 95 %B

3 分で35 ～ 95 %B

20
10.3 分で50 ～ 100 %B

結果と考察

注入量(μL)

サンプルp/n 5188-6529(約 1 mL) + 0.1 mL の1 mg/mL チオ尿素

1コンパートメント (° C)

25ダイオード

アレイ検出器254 nm、80 Hz
254 nm、80 Hz

60254 nm、160 Hz

体的 な選択性に高い相関性 があるため、メソッドの変更 は 不要でした。

ただし、カラム寸法が異なることから、より小さいカラムボリュームに合基準として、10 種類 の 化合物 を全多孔質粒子 の Agilent ZORBAX Eclipse

わせてグラジエント、流量、および注入量を幾何学的にスケーリングしま

Plus C18、4.6 × 250 mm、5 µm カラムにより分離しました。この分離 にした。また、InfinityLab Poroshell 1.9 µm カラムでは、この粒子径に最適なかかった 時間 は 36 分、最小分離度 は 6.1 でした。結果 のクロマトグラ

流量で分析するために、流量を上 げました。その結果、分析スピードがムを図 1 に示します。図 1 には、同じ LC メソッドを表面多孔質粒子の12 倍向上し、移動相消費量は 96 %、サンプル量は 95 % 減少しましたが、Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18、2.1 × 50 mm、1.9 µm カラム用に変最小分離度 5.5 という良好な性能が維持されました。

換して分析した結果も示されています。ZORBAX Eclipse Plus C18 カラムとInfinityLab Poroshell 120 EC-C18 カラムの結合相は非常によく似ており、全mAU
2,000
1,750
1,500
1,250
1,000
7505002500mAU
1,000カラム

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、4.6 × 250 mm、5 µm カラム
1.0 mL/min、36 分で 35～95 %B、25 °C、254 nm
最小分離度 = 6.15101520253035 分

Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18、2.1 × 50 mm、1.9 µm カラム
0.5 mL/min、3 分で 35～95 %B、25 °C、254 nm

800

最小分離度 = 5.5250 mm、5 µm カラムによる分析との比較:

600• 12 倍高速• 移動相使用量が 96 % 減少

400

• サンプル注入量が 95 % 減少

200
051015202530

図 1. アルキルフェノン類の分析メソッドを Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、4.6 × 250 mm、5 μm カラムから高性能のAgilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18、2.1 × 50 mm、1.9 μm カラムへ変換することにより、時間、サンプル、溶媒、およびコストを大幅に節約することができます。

335 分

粒子径の小さい表面多孔質粒子の利点は、非常に高い分析効率と分解ことができました。Eclipse Plus 250 mm、5 µm カラムを用いたメソッドでのた性能を利用して超高速分析を行うことができます。図 2 に、InfinityLab98 % 減少しましたが、良好な最小分解能が維持されました。

能が得られることです。LC システムの圧力上限以下であれば、この優 れ分析結果と比較すると、分析スピードが 120 倍向上し、移動相消費量はPoroshell 1.9 μm カラムの圧力上限で分析した結果 を示します。その際、表 3 に、すべてのクロマトグラフィー結果の比較をまとめます。

移動相の粘度を低減するために高温にしました。これにより、流量を 2.3mL/min まで上げ、圧力を 1,150 bar に抑えることができました。また、10種類の化合物を含むサンプルの分離時間を最大限に短縮するために、カラムの比較時に用いたメソッドのグラジエントをわずかに調整しました。
その結果、10 種類すべての化合物を 0.3 分、最小分離度 2.2 で分離する

mAU
Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18、2.1 × 50 mm、1.9 µm カラム

1,000

2.3 mL/min、0.3 分で 50～100 %B、60 °C、254 nm
最小分離度 = 2.2

250 mm、5 µm カラムによる分析との比較:• 120 倍高速

800

• 移動相使用量が 98 % 減少

600

400

200

00.05

0.10

0.15

0.20分0.25

図 2. 高性能の Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18、2.1 × 50 mm、1.9 μm カラムを用い、カラムの上限圧力に近い圧力で分析することにより、メソッドの分析性能を損なうことなく時間、溶媒、およびコストをさらに節約することができます。
表3. 2 種類の LC カラムによるアルキルフェノン類の分析結果の比較カラム

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、4.6 × 250 mm、5.0 µm

Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18、2.1 × 50 mm、1.9 µm
Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18、2.1 × 50 mm、1.9 µm (超高速)圧力 (bar)

条件付き

最小分離度 ピークキャパシティ (nC)

分析時間 (分)移動相消費量 (mL)36

基準となる 5 μm での36基準となる 5 μm での分析

91

3.0基準となる 5 μm での1.5基準となる 5 μm での分析より430.3

基準となる 5 μm での0.69基準となる 5 μm での分析より

181

6.1134420

5.51150

2.24分析

分析より 12 倍高速分析より 120 倍高速

移動相消費量が 96 % 減少
移動相消費量が 98 % 減少結論

分離効率に優れた Agilent InfinityLab Poroshell 120、1.9 μm カラムを使用することで、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、5 μm カラムなど従来型カラムを用いた既存のメソッドを改善することができます。InfinityLab Poroshell カ

ラムと ZORBAX カラムは 同様の結合相を持つため、メソッド変換 が容易で、新たにメソッドを開発しなおす必要はほとんどありません。また、LCシステムの圧力上限以下であれば、InfinityLab Poroshell 1.9 μm カラムにより超高速分離を実現できます。
このメソッドでは、従来の LC カラムと比べ、時間、溶媒、サンプル、およびコストを大幅に節約することが可能です。

5参考文献1. A. Gratzfield-Hugsen, E. Naegele.「Agilent InfinityLab Poroshell 120 カラムによる効率の最大化」、アジレントテクノロジーアプリケーションノート、

資料番号 5990-5602JAJP, 2016.

2. V. R. Meyer.Practical High Performance Liquid Chromatography.Fourth
Edition, p. 34. Wiley (2004).
3. 「Poroshell 120 EC-C18 カラムと ZORBAX Eclipse Plus C18 カラム間でのメソッド変換」、アジレント・テクノロジーアプリケーションノート、

資料番号 5990-6588JAJP, 2011.

詳細情報

本文書のデータは代表的な結果を記載したものです。

アジレント製品とサービスの詳細については、アジレントのウェブサイト

www.agilent.com/chem/jp をご覧ください。

ホームページ

www.agilent.com/chem/jp

カストマコンタクトセンタ

0120-477-111
email_japan@agilent.com
本製品は一般的な実験用途での使用を想定しており、医薬品医療機器等法に基づく登録を行っておりません。本文書に記載の情報、説明、製品仕様等は予告なしに変更されることがあります。アジレントは、本文書に誤りが発見された場合、また、本文書の使用により付随的または間接的に生じる損害について一切免責とさせていただきます。

アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 2016
Printed in Japan, November 2, 2016
5991-7540JAJP