第５回ミトコンドリア病研究公開フォーラム
2021年1月23日（土）ミトコンドリア病を起こす遺伝子
順天堂大学 医学研究科
難病の診断と治療研究センター
センター長
岡﨑康司

ミトコンドリア病とはミトコンドリアの働きが低下することが原因で起こる病気の総称

Johns DR, N Engl J Med. 1995

■ いかなる症状、いかなる臓器・組織、何歳でも、いかなる遺伝形式でも発病し得る■ エネルギー代謝系（ミトコンドリア呼吸鎖）の先天代謝異常症である■ 出生 5,000人に 1人の割合で発症する■ 特に幼少時期発症例は症状が多彩で重篤致死の症例が多い■ 根治的治療法がなく、対症的治療法にとどまるミトコンドリア病の遺伝（20,000 遺伝子）
ミトコンドリアゲノム

13 proteins

核ゲノム

ミトコンドリア病の原因遺伝子～ 1,500 proteins

22 tRNA
2 rRNA

ミトコンドリアゲノムおよび核ゲノムの異常で疾患が発症するが、小児領域では20-30%がミトコンドリアゲノムの異常によると考えられている。

現在までに350以上の原因遺伝子が同定され、ほとんどが劣性（潜性）遺伝形式をとる。

当研究グループのミトコンドリア病研究体制
ミトコンドリア病疑い >3,000症例（千葉県こども病院、埼玉医科大学）
生化学診断>1,100症例
今年度 174症例 解析済
さらに 200症例 解析予定

パネルシーケンス>700症例

全エクソーム解析>700症例

全ゲノム解析
>160症例

検証実験
サンガーシーケンスによるバリデーション、家族の解析
レスキュー実験、CRISPRを用いた遺伝子ノックアウト
解析レポート返却
治験、治療、出生前診断

ミトコンドリア病研究拠点として世界から認識
Toward an Alliance for Genomics and Health in the Asia-Pacific
ドイツ

アメリカ

日本

東北メディカルメガバンク

Helmholtz Zentrum München
Technische Universität München

The Children's Hospital ofPhiladelphia
Broad Institute of MIT andHarvard
Columbia University MedicalCenter

京都大学

東京大学
首都大学東京
大阪大学
九州大学

オーストリアParacelsus Medical University Salzburg
Medical University of Innsbruck

イギリス
Newcastle University
MRC Mitochondrial Biology UnitUniversity of Cambridge

オランダAMED・難治性疾患実用化事業 村山班

オセアニア
Royal Children's Hospital andDepartment of Paediatrics
University of Melbourne

Antwerp University

Kohda, Kishita, Okazaki et al.
PLOS Genet 2016

スウェーデン
Karolinska Institutet

イタリア

東北メガバンクのデータが疾患の解析に使われた第1号として共同プレスリリース

University of Bari

MRPS23, QRSL1
2014

2015

GTPBP3COQ4SLC25A26

2016

2017

IARS

ATAD3
delC1QBP

2018

2019

2020

TOP3A

PTCD3

NDUFA8

ATAD3dup当研究グループのミトコンドリア病研究体制
ミトコンドリア病疑い >3,000症例（千葉県こども病院、埼玉医科大学）
生化学診断>1,100症例
今年度 174症例 解析済
さらに 200症例 解析予定

パネルシーケンス>700症例

全エクソーム解析>700症例

全ゲノム解析
>160症例

検証実験
サンガーシーケンスによるバリデーション、家族の解析
レスキュー実験、CRISPRを用いた遺伝子ノックアウト
解析レポート返却
治験、治療、出生前診断

次世代シーケンサーを用いた遺伝子診断
遺伝子パネル–およそ30%の診断率–既知遺伝子の異常を調べる–臨床の現場に素早く結果を返却する

全エキソームシーケンス（WES）/ 全ゲノムシーケンス(WGS)–診断率を上げるためには、新規の遺伝子の同定が必要–機能解析実験が必要（レスキュー、モデル生物）–患者データの集積（同じ遺伝子に異常をもち、同じ症状を呈する患者）
RNAシーケンス（RNA-seq）–WESや遺伝子パネルで遺伝子異常が見つからなかった症例に対して、RNAから異常を明らかにする–発現異常、スプライシング異常、モノアレリック発現を同定することができるミトコンドリア病パネルの対象遺伝子

核コードの原因遺伝子（合計367）- Rahman et al. Review, Lancet. 2018 Jun 23;391(10139):2560-2574.
- Stenson et al. Review, Essays Biochem. 2018 Jul 20;62(3):399-408. など

ミトコンドリアゲノム全周（16,569 bp）

低コスト化 と 搭載遺伝子追加 を達成
昨年まで

Amplicon-seq, IonS5 (Thermo)
A Nuclear Gene

80,000 yen / sample @32-plex
B Whole mtDNA

241 genes

16.6kb

Total 3,900 amplicons

Total 162 amplicons

現在

Target-capture (IDT), MiSeq (Illumina)

15,000 yen / sample @24-plex

Indexed DNA Library

Indexed DNA Library

Pool of 12-libraries

2X Pooled libraries(24-plex)

新規原因遺伝子の発見

MedにATAD重複例を報告

ATAD3A, ATAD3B, ATAD3Cの間には相同配列が多く存在するため、組換えにより欠失(Desaiet al, Brain, 2016; Harel et al, Am J Hum Genet,2016)や重複(Fraizier et al, Med, 2020;
Gunning et al, Am J Hum Genet, 2020)が生じうる。ゲノム配列が非常に複雑なため、正確な構造異常を明らかにするには、ロングリードシーケンスが非常に有効となる。
Harel et al, Am J Hum Genet, 2016

2017年に欠失例を報告した

ATAD3領域のdeletionを追加で3例同定すると共に、新たにduplicationの症例を４例発見した

ATAD3の機能・病態• コレステロール代謝の変化• コレステロールは粗面小胞体と接するミトコンドリア内膜へ運ばれる。
ATAD3はmtDNAとコレステロールの豊富なmt内膜のドメインに関与。
• ミトコンドリアはATAD3とともに細胞内コレステロールの恒常性に重要な役割を果たす。

4症例でATAD3C-ATAD3B-ATAD3A領域のATAD3 duplicationを同定

Control

duplication

duplication

duplication

duplication

WES data (Exome Depth)
Patient
Pt0262 HCM, died at 2 months, cloudy cornea
Pt0713 HCM, died at 1 month
Pt1342

Heart failure, died at 1 month, cloudy
corneaPt0353 HCM, died at 10 days

早期発症かつ、心筋症(＋角膜混濁)

AMEDプレスリリース（2020.7.10）

NDUFA8(世界で未報告症例)
症例（Pt1753）• 臨床診断: ミトコンドリア細胞症• 主症状: 発達遅滞、低身長、小頭症、てんかん、高乳酸血症

Yatsuka Y. Clinical Genet 2020

ミトコンドリア呼吸鎖診断：
線維芽細胞における呼吸鎖Ｉ

NDUFA8 homozygous mutation causes protein loss

Yatsuka Y. Clinical Genet 2020

診断率向上を目指した新たな展開

研究目的

VUSの蓄積とその解決の必要性
遺伝子解析の内訳（N=690）

N.D.

Firm

34%

36%

VUS30%
 これまでは、家族解析やウエスタンブロット、レスキュー実験、個別の検証実験等を経て、VUSをPathogenicと判定していた。

 現在は症例数が増え、検証は数ヶ月から数年かかることもあり、VUSの解決は診断の大きな律速過程となってきた。

日本人小児ミトコンドリア病の固有VUSに対する網羅的な機能的アノテーション

実施体制

AMED
契約
契約
順天堂大学・岡﨑康司
北海道大学・山田勇磨

情報提供

研究統括
VUS検証アッセイ系の構築
およびVUSの細胞レベルと個体レベルでの解析

試料・
情報提供

研究協力者
新田 和広
杉浦 歩
木下 善仁（近畿大学）
八塚 由紀子情報提供

情報提供

日本ミトコンドリア学会

IRUD

J-MO bank

千葉県こども病院・村山圭
埼玉医科大学・大竹明
検体サンプリング
生化学診断

情報提供

情報提供

AMED難治性疾患実用化事業（村山班）

難病プラットフォーム

治療法開発, 診断システム, レジストリシステム

研究計画・方法
公共データ
核遺伝子VUS

核遺伝子VUS

研究ストラテジー細胞での核遺伝子
VUS評価

ゼブラフィッシュでの核遺伝子VUS評価

細胞：KO細胞（HEK293）
ベクター導入：遺伝子（VUS）アッセイ：ATP, pH, OCR,GFP強度(GFP融合遺伝子)

遺伝子導入：CRISPRによる遺伝
子欠損およびmRNA(VUS)

細胞でのVUS検証
ミトコンドリア遺伝子(mt-tRNA)

ゲノム解析

ミトコンドリア遺伝子VUS

細胞：患者線維芽細胞
ベクター導入：MITO-Porter +mt-tRNA(VUS)
アッセイ：ATP, pH, OCR

細胞でのVUS検証
ミトコンドリア遺伝子(タンパクコード)細胞：患者線維芽細胞
ベクター導入：MTS+遺伝子(VUS)
アッセイ：ATP, pH, OCR

アッセイ：初期発生における形態変化、ミトコンドリア機能

遺伝子診断の迅速化
治療方針への展開
公共データベースへの還元

研究計画・方法

先行したVUS検証による迅速診断の実現

通常のフロー

本研究のストラテジー

VUS同定から遺伝子診断に至るまで検証対象VUSの選出（日本人の正常人コホート）
2ヶ月以上の検証実験が並列に進行するため多くの時間と労力が掛かっていた。

作業の時間と量のイメージ

検証実験
病原性確定
VUS → Pathogenic

作業の時間と量のイメージ

VUS同定（ミトコンドリア病コホート）

病原変異同定（ミトコンドリア病コホート）

検証実験

遺伝子診断確定

病原性確定
VUS → Pathogenic
遺伝子診断確定

時間短縮

ハイスループットアッセイにより同時に100以上のVUSを先回りで解決してしまう。

使用する細胞の作製と蓄積

研究計画・方法
核遺伝子
症例数

ミトコンドリア遺伝子遺伝子

17

PDHA111NDUFAF610

ECHS18SURF17BOLA3

5

DNM1L, RARS2, TAZ

4

ACAD9, AIFM1, DGUOK, POLG

3

GTPBP3, FBXL4, IARS, NDUFB11,NDUFV2, QRSL1, SLC25A4, SUCLA2

約600のVUS（20遺伝子）

約100のVUS（タンパクコードx70, mt-tRNAx30）

KO細胞（HEK293）作製

患者皮膚線維芽細胞バイオバンク

NDUFAF6, ECHS1, SURF1, BOLA3, DNM1L, TAZ,ACAD9, SLC25A4などの作製済みあるいは作製中。
SURF1, BOLA3, DNM1Lについてはノックアウト取得済

これまでに約2000のストックを蓄積、み。

上記の遺伝子異常をもつ細胞を網羅。

ゲノム解析により同定されたRARS2 のVUS
Pt No.
Pt0222
Pt0222
Pt1874
Pt1874Pt2206
Pt2286
Pt2286AA change
RARS2:NM_001350505:exon16:c.1321C>T:p.L441F
RARS2:NM_001350505:exon16:c.1306G>T:p.D436Y
RARS2:NM_001350505:exon18:c.1558C>T:p.H520YRARS2:NM_001350505:exon1:c.9C>A:p.C3X
RARS2:NM_001350505:exon11:c.944G>C:p.R315PRARS2:NM_001350505:exon7:c.463G>A:p.A155T
RARS2:NM_001350505:exon1:c.16C>T:p.R6C

3.5KJPNv2.20180625.MAF
論文報告済みNA(Kohda et al, 2016)
NANANANA
NA
0.0003

Tommo(jmorp)に登録のあったp.R6Cは病的変異と考えられる

研究計画・方法

96ウェルアッセイの概要

96 ウェルマルチプレートを用いたミトコンドリアの機能アッセイ

ATPアッセイ：ATP 変化(ルシフェラーゼを利用したアッセイ)
pH アッセイ ：乳酸増加に伴うpH 変化(pH 応答プローブによるアッセイ)
OCRアッセイ：酸素消費量(Oxygen consumption rate: OCR)
ATP アッセイ・pHアッセイ

OCRアッセイ発光および蛍光をマルチプレートリーダー(PerkinElmer Nivo)で測定し、96 穴マルチプレートのそれぞれのウェルで定量値を算出する。

細胞外フラックスアナライザー（Agilent Technologies
XFe24/XFe96）を用いて96 穴マルチプレートで各ウェルの値を算出する。

CellTiter-Glo® 2.0

Mito-ID®
細胞外pHセンサープローブ

研究計画・方法
核遺伝子（日本人症例に多い20の原因遺伝子; ～600VUS）
細胞（HEK293）
KO細胞
正常細胞
正常細胞

ベクター

遺伝子導入

検証項目
VUSの有害性

VUSを導入した遺伝子/正常遺伝子

リポフェクション

VUSを導入した遺伝子+GFP/正常遺伝子+GFP

VUSのドミナントネガティブ効果
VUSのタンパク質発現への影響

VUS

96ウェルプレートへ

ガラクトース培地*
およびグルコース培地*ミトコンドリア呼吸はグルコースを主なリソースとするため、これをガラクトースに置き換えることで、細胞にミトコンドリア機能の負荷を与え、ミトコンドリア異常を顕在化できる

ATPアッセイpHアッセイ
OCRアッセイ

各VUSでKO細胞のミトコンドリア機能が回復するか評価

各評価系で回復がみられないVUSはPathogenicである可能性が高い

研究計画・方法
ミトコンドリア遺伝子（mt-tRNA, ～30/100VUS）
細胞（線維芽細胞)

ベクター

遺伝子導入

患者細胞

MITO-PorterでパックしたVUSを導入した
tRNA遺伝子/正常遺伝子

MITO-Porter

正常細胞

検証項目
VUSの有害性
VUSのドミナントネガティブ効果

MITO-Porter

96ウェルプレートへミトコンドリア移行

ガラクトース培地
およびグルコース培地

ATPアッセイpHアッセイ
OCRアッセイ

各VUSで患者細胞のミトコンドリア機能が回復するか評価

各評価系で回復がみられないVUSはPathogenicである可能性が高い

研究計画・方法 MITO-Porterによるミトコンドリアへの分子送達
Confidential

mt-tRNAのVUS評価に対するMITO-Porterを用いた遺伝子導入
北海道大学 山田勇磨 准教授
3. ミトコンドリア送達 [膜融合]
外膜 膜間腔 内膜

送達分子候補
3. 送達
遺伝子

核酸化合物

ペプチド

タンパク質
マトリクス

パッケージング
R8:ミトコンドリア結合素子

MITO-Porter
1. 細胞導入

2. ミトコンドリア結合[マクロピノサイトーシス][静電的相互作用]

R8:膜透過性ペプチド
細胞質

核

MITO-Porterは膜融合を介してミトコンドリア内へ送達分子を導入するため、送達分子の物性やサイズを制限しないDDSになりえる
Yamada Y. et al., Biochimica et Biophysica Acta 1778: 423-432 (2008).
特許取得 第5067733号

研究計画・方法

有力バリアントの個体レベルでの検証
ゼブラフィッシュの利点

・ハイスループットアッセイ系に対応
・組織学的なアッセイが簡便
・胚発生が早く、発生初期に異常を検出しやすい
申請者らの研究を含め、多くのミトコンドリア病モデルゼブラフィッシュでは発生初期の異常を呈する

SURF1欠損モデル 発生異常
Baden et al, JBC, 2007

IARS欠損モデル 発生異常と脳の奇形
Murayama, Okazaki et al, AJHG, 2017

GTPBP3欠損モデル 心臓の形成異常
Chen et al, NAR, 2019

本研究から期待される効果・医学への貢献• VUSを先回りして解決することでミトコンドリア病の診断を迅速化できる• 本研究で得られたバリアントの評価を公開することにより、他機関で同定されたVUSを解決へと導く• 原因遺伝子解決から治療への展開を加速する• 本アッセイ系が、他の疾患研究へ波及することが期待される

Acknowledgements
研究にご協力頂いた患者様ならびに、連携各病院の主治医に感謝いたします。

Juntendo Univ.
Atsuko Okazaki
Kazuhiro Nitta
Ayumu Sugiura
Yoshihito Kishita
Yukiko Yatsuka
Nurun Nahar Borna

Saitama Med. Univ.
Akira Ohtake
Hiroko Harashima
Rie Takeuchi
Megumi Saito

Chiba Children’s
Hospital
Kei Murayama
Ayako Matsunaga
Masaru Shimura
Takuya Fushimi
Makiko Tajika
Keiko Ichimoto
Minako Tominaga
Nana Akiyama

[質問]ミトコンドリア病には、いくつかの遺伝子異常が知られており、また、それぞれに病態が異なり、進行度合いも異なります。このような病態の実態を把握するためにも、患者家族会のメンバーが増えることで、病態の実態を知るアンケート調査などが行えると思います。このようなアンケート調査は医学的に有効であるかどうかをお聞きしたい。これからのJ-MO Bank/RADDARJ
J-MO Bank

データ提供
患者さん
主治医

他の研究班1
他の研究班2

他の研究班3

情報提供

埼玉医科大学
千葉県こども病院

電子
証
明

データ
入出力

京都大学
RADDARJ

進行する肥大型心筋症により死亡した5ヵ月女児

8528番目の塩基に点変異
orbid =ATPase6と8の重複領域
Map of the Human mtDNA Genome

患者心筋でATP合成酵素が消失

Imai A et al. Int J Cardiol. 2016;207:203-205.

本論文により変異が確定し患者さんへも発信

確定
報告

本論文によりm.8528T>Cは心筋症の“確定“変異として登録

論文を読んだ患者の母親から治療法に関する問い合わせ