Japan Bioanalysis Forum

DG2018-36

Quantitative analysis of oligonucleotide
therapeutics by LC-MS

http://bioanalysisforum.jp/

LC-MSによる
核酸医薬品の定量

10th JBF Symposium, DG2018-36

1

Japan Bioanalysis Forum新井 浩司
Koji Arai

⽯川 千裕
Chihiro Ishikawa

⼤崎 史雄
Fumio Osaki(ＬＳＩメディエンス)(⼤⽇本住友製薬)（アステラス製薬）

鎌倉 健雄
Takeo kamakura⼾嶋 ⿇美
Asami Toshima

林 善治
Yoshiharu Hayashi（塩野義製薬）（協和発酵キリン）（ｼﾐｯｸﾌｧｰﾏｻｲｴﾝｽ）

安原 秀典
Hidenori Yasuhara

横井 宏之
Hiroyuki Yokoi

若松 明
Akira Wakamatsu（⽥辺三菱製薬）（⼤塚製薬）（ｸﾞﾗｸｿ･ｽﾐｽｸﾗｲﾝ）

10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

Members2

Japan Bioanalysis Forum

活動の経緯 Activities
May 2018

26 Jun 2018

 キックオフ会議 Kick off Face to Face meeting

Jul 2018〜Dec 2018 TC と メールを⽤いた議論 TC and discussion used by E-mail アンケート (Oct 2018) Survey

Jan 2017〜Feb 2017

http://bioanalysisforum.jp/

 メンバー募集 Members application

 ポスター準備 Posters preparation

10th JBF Symposium, DG2018-363

Japan Bioanalysis Forum

定義 Definition
核酸あるいは修飾型核酸が直鎖状に結合したオリ
ゴ核酸を薬効本体とし，タンパク質発現を介さず直接⽣体に作⽤するもので，化学合成により製造される医薬品
出典︓
井上 貴雄︓核酸医薬品の開発動向, 先端治療技術の実⽤化と開発戦略（核酸医薬,免疫療法,遺伝⼦治療,細胞医薬品）, 第1章, 第1節, 3-18
（2017）
10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

本DGにおける核酸医薬品の定義

4

Japan Bioanalysis Forum

核酸医薬品の種類（左︓細胞内で作⽤するもの，右︓受容体等に作⽤するもの）
出典︓南海 浩⼀，核酸医薬品⽤オリゴヌクレオチドの製造，⽣産と技術

http://bioanalysisforum.jp/

核酸医薬品の分類 Classification

第67巻 第2号（2015）

10th JBF Symposium, DG2018-36

5

Japan Bioanalysis Forum

分類

Pros

Cons

LC-MS(/MS)

LCガイドラインに準拠可
代謝物との分離が可能

前処理が煩雑感度不⾜HPLC-UVLCガイドラインに準拠可
代謝物との分離が可能

感度不⾜

Hybridization-LCfluorescence

⾼感度
代謝物との分離が可能
前処理が簡便報告例少ないやや⾼コストLBA

LBAガイドラインに準拠可
スループットが⾼い
⾼感度

前処理が煩雑定量法確⽴に時間必要
代謝物との分離が困難

qPCR

⾼感度
前処理が簡便⽇間差があり再現性が悪い
代謝物との分離が困難

電気泳動

条件検討が不要で，簡便

⼯程数が多く，スループットが悪い
感度不⾜
代謝物との分離が困難

ラベル化（蛍光 or RI）

前処理等がなく，最も簡便

RIは合成に時間・コストがかかる
蛍光⾊素修飾は化合物の物性が変わる可能性がある10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

核酸医薬品 各種分析法 Overview

6

Japan Bioanalysis Forum

化学合成医薬品

核酸医薬品

バイオ医薬品

分⼦量

通常 < 1kDa

通常 ≦ 10kDa

通常 ≧ ３0kDa

⽣産⽅法

化学合成

化学合成

バイオテクノロジー技術

種特異性

⾮特異的

時に種特異的

種特異的

主な定量分析法

 主にクロマトグラフィー
法（LC-MS, HPLC, GC）

 クロマトグラフィー法（LC-MS/MS,HPLC,GC)
 リガンド（LBA）結合法（ハイブリダイゼーション＋ELISA, SPR, ECL）

 主にリガンド（LBA）結合法（ELISA, SPR, ECL）

出典︓ICH S6 対応研究班，核酸医薬品の⾮臨床安全性を考える，医薬品医療機器レギュラトリーサエンス，
PMDRS，46(5)，286〜289（2015）
本間 尚⼦︓核酸医薬品の承認審査における薬物動態評価，第40回薬物動態談話会講演資料（2018）

核酸医薬品は中分⼦としての位置づけ

低分⼦医薬品とバイオ医薬品の特徴を併せ持つ

http://bioanalysisforum.jp/

既存の医薬品との⽐較

核酸医薬品のBioanalysis

クロマトグラフィー法とLBA法のどちらも適⽤可能
10th JBF Symposium, DG2018-36

7

Japan Bioanalysis Forum

LC-MSを⽤いた核酸医薬品の定量

代謝物との分離な経験

核酸医薬品BioanalysisへのLC-MSの活⽤

http://bioanalysisforum.jp/

低分⼦医薬品での豊富

時間・コスト・汎⽤性

現状の課題と対策について議論
10th JBF Symposium, DG2018-36

8

Japan Bioanalysis Forum

議論のテーマ Topic Themes
前処理

内標準物質

バリデーション

装置

LBAとの⽐較

http://bioanalysisforum.jp/

条件設定

今回の議論のテーマ（LC-MSを⽤いた核酸医薬品定量の全体像を把握する）
10th JBF Symposium, DG2018-36

9

前処理（Sample preparation）

10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

10

Japan Bioanalysis Forum• LC-MS 分析に際して，⾎漿，組織ホモジネート，尿等のマトリックスから測定対象の核酸医薬品を抽出する必要がある．
• 核酸医薬品は化学修飾, リガンド付加等により天然の核酸と物性が⼤きく異なるため，化合物毎の最適化が必要である．
アンケート Q20より

14

12

12
10
8

7

6

5

5
4

4

3

3
2

2

2
1

1

1

1

⑦

⑧

⑨

1

0
①

②

③

④

⑤

⑥

⑩

⑪

⑫

⑬

測定法構築時の課題（上位3つ）は︖
①
②
③
④
⑥
⑧
⑨
⑩
⑪
⑬
⑭

容器への吸着
キャリーオーバー（インジェクター回り）
キャリーオーバー（配管，カラム）
内標準物質の選択、⑤安定性
前処理法の検討、⑦検量線レンジ
検量線が直線になりにくい（2次曲線）
カラムの選択定量に使⽤するイオン（m/z）の設定
定量下限、⑫機器のメンテナンス
⾦属アダクトイオンの影響
その他

http://bioanalysisforum.jp/

⽣体試料の前処理 Sample Preparation⑭

前処理⽅法の最適化が測定法構築の成功の鍵
10th JBF Symposium, DG2018-36

11

Japan Bioanalysis Forum 液液抽出︓フェノール・クロロホルム抽出
 固相抽出︓Oasis HLB, Oasis WAX, Clarity OTX 等
 液液抽出＋固相抽出 その他︓市販 RNA 抽出キット, 相補鎖プローブ等
最初に検討する前処理⽅法は︖① 液液抽出② 固相抽出
③ 市販のDNA/RNA抽出キット

http://bioanalysisforum.jp/

代表的な前処理⽅法 Typical Methods④ その他

アンケート Q14より

固相抽出法が主流

10th JBF Symposium, DG2018-36

12

Japan Bioanalysis Forum

液液抽出法 Liquid-Liquid Extraction (LLE)

代表的なプロトコル

事前にProteinase K 処理することで回収率や前処理中の安定性が改善．
変性剤や界⾯活性剤添加するケースも．

☜ Tips

⽣体試料↓
化合物により最適なpHが異なる
フェノール・クロロホルム添加↓撹拌条件（時間，強さ，温度）※撹拌，遠⼼分離後に上層（⽔相）を採取
がクリティカルに影響↓（クロロホルム添加、※を繰り返す）↓ （共沈剤添加、エタノール沈殿）
フェノール除去、脱塩を⽬的に↓実施するケースあり
LC-MS
10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

 核酸抽出の最も古典的な⼿法．
 フェノールでタンパクを不溶化．遠⼼分離後，中間層にタンパク質が凝集することを利⽤し，上層の核酸を回収する．

13

Japan Bioanalysis Forum

固相抽出法 Solid-Phase Extraction (SPE)
代表的なプロトコル☜ Tips
Oasis HLB(イオンペア試薬)，
固相カートリッジ/プレート
Oasis WAX, Clarity OTX 等
洗浄 & 平衡化↓
事前にProteinase K 処理することでサンプルロード
回収率や前処理中の安定性が改善．
↓（マトリックスに⼤きく依存）
洗浄
変性剤や界⾯活性剤添加するケースも．
↓
溶出濃縮が必要な場合に実施．
↓
完全乾固しない⽅がよい場合も．
分解や再溶解液の組成に注意．
(乾固, 再溶解)
フィルターろ過するケースも．
↓
LC-MS

10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

 複数の分離モードから化合物に最適なものを選択．
 96wellタイプを⽤いたハイスループット化や⾃動化が可能．

14

Japan Bioanalysis Forum

液液抽出＋固相抽出 LLE + SPE
 どちらか⼀⽅のみでは精製が不⼗分な場合︓
 分析カラムが劣化し，安定的に連続分析できない
 再現性が悪い
 固相抽出時に詰まる（繊維質の組織等）→ ２ステップの丁寧な前処理で解決する可能性
 スループット性に⼤きな課題．
 SPE(Clarity OTX)では1ステップ抽出が可能なケースも．

10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

 液液抽出と固相抽出を組み合わせる⼿法．

15

Japan Bioanalysis Forumその他 前処理⽅法 Other Preparations
 市販核酸抽出キット

 有機溶媒や酸による除タンパク回収率が低く，⼀般的には⽤いられない

 相補鎖プローブを⽤いた Hybridization 法
1本鎖核酸で報告例あり

Bioanalysis (2017) 9(23), 1859–1872

 強陰イオン交換磁気ビーズ

揮発性の塩で溶出することで脱塩不要

http://bioanalysisforum.jp/

化学修飾核酸には適⽤できないケースが多い

Rapid Commun Mass Spectrom.
2011 Nov 15;25(21):3207-15.

 イオン交換クロマトグラフィーでの分取
代謝物解析等の定性分析で報告例あり

10th JBF Symposium, DG2018-36

16

Japan Bioanalysis Forum

前処理の注意点 Problems in sample Preparation
 低回収率 再現性不良 前処理中に分解 分析カラムの劣化

 MS汚染による感度低下
 SPE基材のロット差

回収率に影響する因⼦ タンパク結合 化学修飾やリガンド付加による物性変化
 吸着
 前処理中の安定性
10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

前処理に起因したトラブルの事例

17Japan Bioanalysis Forum

前処理の課題 Problems in sample Preparation

12

①
②
③
④
⑤
⑥

11

10

9

8

7
6

6

回収率
前処理中の安定性
マトリックス効果
スループット
再現性
その他

4

2

2

2

その他

・吸着
・クリーンナップ

0
①

②

③

④

⑤

⑥

http://bioanalysisforum.jp/

Q15 ⽣体試料中の核酸医薬品をLC-MSで定量する際の前処理法の課題を教えてください

回収率が⼤きな課題 → 改善できれば⾼感度化に繋がる
10th JBF Symposium, DG2018-36

18Japan Bioanalysis Forum

回収率

Recovery

DG 内の意⾒

感度不⾜の際に, 原因特定の⼀環として前処理の各ステップで回収率を算出するケースがある.

後々のトラブルを考慮し、回収率5割を⽬標に検討.

Cさん

Bさん

http://bioanalysisforum.jp/

Aさん

再現性や感度に問題なければ回収率は検討しない．

各社で対応は様々.
回収率の算出⾃体が難しいとの意⾒も.
10th JBF Symposium, DG2018-36

19

Japan Bioanalysis Forum

各前処理の回収率例(1)

希釈のみ

LLE

タンパク沈殿LLE＋SPE

酵素消化

SPE

酵素消化＋LLE

Methods

Type of OGN

Matrices

Recovery

Simple dilution

PS ODNs

Mouse plasma

94%

Simple dilution

PS ODNs

Mouse urine

87-97%

PP with SDS solution and ammonium acetate- OGN precipitation with ethanol

PS ODNs

Enzyme digestion with multicomponent digestion
reagent

siRNAs duplexes

Cell culture and formulated media>95%

Enzyme digestion – LLE with phenol/chloroform(1:1)

PS ODNs

Mouse brain, heart, kidney, muscle

50-85%

Enzyme digestion – LLE with phenol/chloroform(1:1)

PS ODNs

Mouse liver, lung, spleen and tumor

12-75%

Enzyme digestion – LLE with phenol/cresol
reagent

PS ODNs

Mouse plasma and tissues (liver, kidney, spleen,
heart, lung, brain and bone marrow)

98 ±3%

Enzyme digestion – LLE with phenol/chloroform/water reagent

PS ODNs

Plasma and urine~80%

LLE with phenol/chloroform (1:1)

PS ODNs

In vitro incubation of oligonucleotides with humanliver microsomes95%

LLE with phenol/chloroform (2:1, v/v) withammonium hydroxide, DTT and DNP

PS and LNA ODNs

Mouse plasma

89 ± 2%

LLE with phenol/chloroform (2:1, v/v) withammonium hydroxide, DTT and DNP

PS and LNA ODNs

Mouse liver and kidney homogenate

92 ± 5%

LLE with phenol/chloroform/isoamyl alcohol(25:24:1)

Unmodified and PS
siRNA duplexes

Vitreous humor

14-40%

LLE with phenol/chloroform (2:1, v/v) withammonium hydroxide – OGN precipitaion

PS ODNs

Plasma samples

75.39-80.43%

PS:phosphorothioate, ODN:oligodeoxynucleotide, LNA:locked nucleic acid

Journal of Chromatography B 1090 (2018) 90-100

10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

16%

20

Japan Bioanalysis Forum
LLE

タンパク沈殿LLE＋SPE

酵素消化

SPE

酵素消化＋LLE

Methods

Type of OGN

Matrices

Recovery

LLE with phenol/dichloromethane (1:1, v/w) –SPE with Oasis HLB

PS ODNs

Rat plasma

70.2-79.4%

LLE with phenol/chloroform (2:1, v/w) – SPEwith Oasis HLB

PS ODNs

Rat plasma

72.4-85.6%

LLE with phenol/chloroform/isoamyl alcohol(25:24:1, v/v/v) – SPE with Oasis HLB

PS ODNs

Human plasma

68-78%

SPE with Oasis HLB

PS ODNs

SPE with Oasis HLB

PS ODNs

Monkey plasma

22.8 ± 6.5%

SPE with Oasis HLB

PS ODNs

Rat and human plasma

30-64%

SPE with Oasis HLB

PS ODNs

Human plasma

65.2-73.8%

SPE with Oasis HLB

PS ODNs

Rat plasma48%

SPE with Oasis HLB

PS ODNs

Mice plasma

60.8%

SPE with Clarity OTXPS ODNs

Plasma97%

SPE with Clarity OTX

MOE RNA gapmer

Plasma76%

SPE with Clarity OTXPS OGNs

Rat plasma>70%

SPE with Clarity OTX

2ʼ-O-methyl, 2ʼfluoro siRNA OGNs

Rat plasma

90.1%

SPE with Oasis WAX

Unmodified ODNs

Human plasma

57.9-67.6%

21-25%

http://bioanalysisforum.jp/

各前処理の回収率例(2)希釈のみ

PS:phosphorothioate, ODN:oligodeoxynucleotide, LNA:locked nucleic acid

Journal of Chromatography B 1090 (2018) 90-100

10th JBF Symposium, DG2018-36

21

Japan Bioanalysis Forum
LLE

タンパク沈殿LLE＋SPE

酵素消化

SPE

酵素消化＋LLE

Methods

Type of OGN

Matrices

RecoverySPE with phenyl-bonded column

PS OGNs with MOE
modifications

Monkeys plasma, urine and tissues~80%

SPE with phenyl-bonded column

OGNs with MOE
modifications

Monkeys plasma, urine and tissues<10%

SPE with Varian C18OH

PS OGNs

Mouse plasma~80%

SPE with C2-emore disk extraction plate2ʼ-O-methyl RNA
OGNs

Rat plasma79%

SPE with DEAE anion-exchange extraction plate2ʼ-O-methyl RNA
OGNs

Rat plasma

55%

SPE with strong anion exchange column – SPEwith reversed phase column – SPE with desalting
membranes

PS ODNs

Human plasma~40%

PS:phosphorothioate, ODN:oligodeoxynucleotide, LNA:locked nucleic acid

Journal of Chromatography B 1090 (2018) 90-100

核酸フォーマットやマトリックスによって回収率は様々であり、
現状, 汎⽤的な⼿法は存在しない.

http://bioanalysisforum.jp/

各前処理の回収率例(3)

希釈のみ対象とする核酸によって，最適な前処理法を模索する必要がある.
10th JBF Symposium, DG2018-36

22

装置（Instrument）

10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

23

Japan Bioanalysis Forum

吸着・キャリーオーバー対策

機器使用上の注意点

LC‐MSの感度

内標準物質の選択

10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

装置24Japan Bioanalysis Forum 同じ向きに⾮共有電⼦対を持つ原⼦が2個以上存在すると⾦属表⾯に吸着する可能性が⾼くなる
 リン酸基は⾦属配位性吸着を⽰す典型的官能基
核酸医薬品は⾦属に吸着しやすい傾向
Mhttp://bioanalysisforum.jp/

吸着・キャリーオーバー対策

O
O

P
O

M: MetalO

10th JBF Symposium, DG2018-36

25

Japan Bioanalysis Forum

吸着が抑制された素材の使⽤
コーティング（キレーション）
競合的に吸着を抑制

http://bioanalysisforum.jp/

吸着・キャリーオーバー対策

注⼊時の対応10th JBF Symposium, DG2018-36

26

Japan Bioanalysis Forum

吸着・キャリーオーバー対策
LC（分析カラム含む）の接液部材質のメタルフリー化
PEEKインサートカラム，ガラスインサートカラム
PEEKインサートの配管やフューズドシリカチューブ

ガードカラム（PP製）の使⽤ガードカラム（PP製）の使⽤（頑健性には注意）

http://bioanalysisforum.jp/

吸着抑制効果のある素材の使⽤

低吸着仕様のプレート，バイアル，チップの使⽤
10th JBF Symposium, DG2018-36

27

Japan Bioanalysis Forum

吸着・キャリーオーバー対策
測定前にリン酸を通液移動相にキレート剤を添加
キレート剤が感度低下などを引き起こす可能性あり

ニードル洗浄液にキレート剤を添加

http://bioanalysisforum.jp/

コーティング（キレーション）

ニードル洗浄液にブランクマトリックスを添加
10th JBF Symposium, DG2018-36

28

Japan Bioanalysis Forum

吸着・キャリーオーバー対策
注⼊試料への添加剤の⼯夫
・リン酸塩

・キレート剤・⾼濃度IS
・他の核酸医薬品，オリゴヌクレオチド

注⼊時の対応
注⼊順序の⼯夫

http://bioanalysisforum.jp/

競合的に吸着を抑制

洗浄⽤にブランクサンプルを注⼊
10th JBF Symposium, DG2018-36

29

Japan Bioanalysis Forum

機器使⽤上の注意点
Q13より① アミン系イオンペア試薬+
フッ素系アルコールを⽤いた逆相系② アミン系イオンペア試薬を⽤いた逆相系③ HILIC系④ イオンペア試薬を⽤いない逆相系⑤ その他

 イオンペア試薬を⽤いた例が多い

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート

 次測定（他化合物）へ影響が懸念される
10th JBF Symposium, DG2018-36

30

Japan Bioanalysis Forum

機器の専有化a

LCの専有化
消耗品の交換洗浄

http://bioanalysisforum.jp/a

LC及びイオン源の専有化

トラブルのリスク

コスト

LC及びMSの専有化

イオンペア試薬フリーの核酸医薬品測定⽅法が構築できれば，コストダウンとトラブルリスクの低減を同時に達成可能
10th JBF Symposium, DG2018-36

31

Japan Bioanalysis Forum

機器の専有化
Q19より

 専有化している割合は少ない
 専有化する場合はLC及びMSを専有化しているケースが多い

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート① LC及びMSを専有化している② LCのみ専有化している③ MSのみ専有化している④ 専有化はしていない
10th JBF Symposium, DG2018-36

32

Japan Bioanalysis Forum

LC-MSの感度 (LBAとの⽐較)①〜 0.1 ng/mL②

0.1 〜 1 ng/mL

40③

1 〜 10 ng/mL

35④

10 〜 100 ng/mL30⑤

100 ng/mL〜

50

総回答に対する割合

45

25
20
15
10
5
0
①

②

③
LC-MS




④

⑤

LBA etc

http://bioanalysisforum.jp/

アンケートQ7とQ25より作成

LC-MSと⽐較すると，感度不⾜は否めない．
LBAでは確認できない代謝物（配列違いの核酸やリガンド修飾核酸のリガンドが外れたものなど）を確認できるのがMSの強みである．
10th JBF Symposium, DG2018-36

33

Japan Bioanalysis Forum

LC-MSの改善点
核酸医薬品定量にLC-MSを使うときに改善されると良い点② MSの感度がもっと向上すれば③ 吸着が起こらない素材が⼊⼿できるようになれば④ 未変化体と代謝物の分離定量のニーズがもっと⾼まれば⑤ 核酸医薬品にフォーカスしたガイドラインが作成さ
れれば
⑥ その他
アンケート

Q31より

http://bioanalysisforum.jp/① 前処理が簡便化されればMSの感度が⼀番の課題
10th JBF Symposium, DG2018-36

34

Japan Bioanalysis Forum

LC-MSの⾼感度化対策

イオン化効率向上関連
前処理関連

http://bioanalysisforum.jp/

LC関連

MS関連
10th JBF Symposium, DG2018-36

35

Japan Bioanalysis Forum

LC-MSの⾼感度化対策

カラム温度を上昇させてピークをシャープにする

核酸に適したポアサイズの充填剤を⽤いる

http://bioanalysisforum.jp/

LC関連

吸着が起きない配管にする• ステンレス配管は吸着しやすい• PEEK，PEEKSIL，セラミックのシステムを推奨
10th JBF Symposium, DG2018-36

36

Japan Bioanalysis Forum

LC-MSの⾼感度化対策

ナノフロー，マイクロフローでイオン化効率向上

http://bioanalysisforum.jp/

イオン化効率向上関連

ポストカラムで有機溶媒を添加してイオン化効率向上

10th JBF Symposium, DG2018-36

37

Japan Bioanalysis Forum

LC-MSの⾼感度化対策

前処理での濃縮

リン酸基のマスクにより吸着回避

ビオチン化相補鎖によるアフィニティー濃縮

http://bioanalysisforum.jp/

前処理関連

回収率はそれほど⾼くない

10th JBF Symposium, DG2018-36

38

Japan Bioanalysis Forum

LC-MSの⾼感度化対策

複数トランジションのピーク合算• 四重極型では難しい• 選択性が下がる可能性あり

http://bioanalysisforum.jp/

MS関連

⾼分解能MSでのS/N⽐の向上

10th JBF Symposium, DG2018-3639内標準物質（Internal standard）

10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum40

Japan Bioanalysis Forum

内標準物質の必要性・選択肢
内標準物質の選択肢（アンケート結果）① 必須② ケースバイケース①

安定同位体標識体②

スクランブル配列体③

PolyTのような核酸塩基のポリマー④

開発候補品を伸⻑したもの⑤

開発候補品の⼀部の配列を変更したもの（塩基数は同じ）⑥

保持時間が類似する低分⼦化合物⑦

その他③ 必須ではない
アンケート

Q21より

アンケート

Q22より

http://bioanalysisforum.jp/

内標準物質の必要性（アンケート結果）

内標準物質は必要であるとの共通認識だが，選択肢については各社意⾒が分かれる．
10th JBF Symposium, DG2018-36

41

Japan Bioanalysis Forum

内標準物質を⽤いるメリット
 前処理・イオン化のばらつきを補正できる．
 吸着防⽌剤としての役割を果たすこともある．
内標準物質を⽤いるデメリット
 内標準物質の選択次第では，回収率や保持時間の違い
によって，逆に再現性が悪くなることもある．
 コスト⾯がネックになることがある．

10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

内標準物質のメリット・デメリット

42

Japan Bioanalysis Forum

選択肢

特徴安定同位体
標識体

類縁体（塩基の延⻑，配列の⼊れ替え）

構造類似性は問わない(⻑鎖PolyTなど)

保持時間

ほぼ⼀致

ずれやすい

ずれやすい

合成難度

コスト⾯がネック
SIを複数箇所に⼊れる必要あり

合成しやすい最も合成しやすい

回収率

測定物質とほぼ同じ

ある程度同じ挙動異なる

クロストーク

発⽣する可能性あり

発⽣しにくい発⽣しにくい10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

内標準物質の選択肢

43

バリデーション（Validation）

10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

44

Japan Bioanalysis Forum

バリデーション Validation

 バリデーション試験は必須
 （申請までの適⽤を考えた場合）
 BMVガイドラインのバリデーション評価項
⽬を満たすためDiscussion
 核酸医薬品の特徴
 注意点
10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

LC-MSによる核酸測定

45

Japan Bioanalysis Forum

分類

意⾒まとめ

バリデーション項⽬

基本はLCガイドラインに従う．

標準物質

標準物質の純度が低分⼦よりも低い．

対象マトリックス

基本は⾎漿．

 ⾎漿⾎清が多い 組織の経験もそれなり(アンケートQ6より)

20

15

15

10

8

5

1
0

①
⾎漿⾎清

②
組織

③
尿

0
④
その他

メンバーの意⾒として

 PK/PDや毒性発現に関わる場合、組織中濃度測定のバリデーションも必要︖
 標的臓器 (肝臓，腎臓，脳，神経組織及び筋⾁) の定量も視野．
 ⾎漿と核酸分解酵素の存在割合の異なる組織ホモ
ジネート等での検討．
 髄腔内投与の場合CSF中も測定︖
 ⾎漿とCSF両⽅測定．
 CSFとのKp評価の実績あり．

10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

予備検討時に確認した⽅が良い項⽬など①46

Japan Bioanalysis Forum

分類

意⾒まとめ

選択性
代謝物の扱い予測される主要代謝物からの流れ込みの確認．
〇容易に予測される末端塩基⽋損体等は予め合成する．

低分⼦と同様のアプローチで，in vivo等でmajor
な代謝物を検索する．
〇必要に応じて同時定量を検討する

安定性

 安定性に影響を与えそうなものは確認しておく．
 全⾎から⾎漿への調製過程．
 抗凝固剤 組織溶解バッファーなど

http://bioanalysisforum.jp/

予備検討時に確認した⽅が良い項⽬など②(参考) 3ʻ-エキソヌクレアーゼに関しては，げっ⻭類・
ヒトの⾎漿中において安定性に種差がないことが報告されている1)th JBFANTISENSE
RESEARCH
AND DEVELOPMENT 1:141-151 (1991)
101)
Symposium,
DG2018-36

47

Japan Bioanalysis Forum

分類

意⾒まとめ

テクニカル⾯インタクト及び活性体に関連して，測定対象と投与されたものが異なる場合の考え⽅は︖(2本鎖siRNAの場合など（測定対象は1本鎖となる))
 抗体医薬品と同様（タンパクをペプチドで測定）
 標準物質を合成，検量線を作成し測定（活性代謝物と同じアプローチ）
インタクトな⼆本鎖状態での濃度確認⽅法は︖
 ⼆本鎖状態でのMS検出は現状困難．
 ⼆本鎖の標品を⼊⼿しアンチセンス鎖とセンス鎖を分別定量することは可能．
 濃度が⼀致したとしても，2本鎖状態の確認ができたかの判断には注意が必要．

10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

予備検討時に確認した⽅が良い項⽬など③48

Japan Bioanalysis Forum

予備検討時に確認した⽅が良い項⽬など④
分類

意⾒まとめ

その他

核酸医薬品のLC-MS測定の評価基準は︖
 EBFの⾒解2)
 ⾼分⼦︓LBA-GL推奨 [20%基準]（特にimmunoaffinityによる前処理の場合）

 ペプチドやオリゴヌクレオチド
︓ LC-GL推奨 [15%基準]

2) Bioanalysis. 2013;5(18):2211–4

スペクトルパターンの確認

http://bioanalysisforum.jp/(抗体医薬品のLC-MS測定には，LBA-GLを適応) ⽣体マトリックスの種類や，前処理前後によってス
ペクトルパータンが変化しないかを確認．
◎特に四重極の装置で測定時は注意する．
10th JBF Symposium, DG2018-36

49

Japan Bioanalysis Forum

測定法構築時の課題
Q20より

 簡便なジェネリックメソッドがないこと
 吸着／キャリーオーバーの回避⽅法
①
②
③
④
⑥
⑧
⑨
⑩
⑪
⑬
⑭

14

12

12
10
8

7

6

5

5
4

4

3

3
2

2

2
1

1

1

⑦

⑧

⑨

1

1

⼤きな課題
容器への吸着
キャリーオーバー（インジェクター回り）
キャリーオーバー（配管，カラム）
内標準物質の選択、⑤安定性
前処理法の検討、⑦検量線レンジ
検量線が直線になりにくい（2次曲線）
カラムの選択定量に使⽤するイオン（m/z）の設定
定量下限、⑫機器のメンテナンス
⾦属アダクトイオンの影響
その他

その他の意⾒

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート

・LC条件

0
①

②

③

④

⑤

⑥

⑩

⑪

⑫

⑬

⑭

10th JBF Symposium, DG2018-36

50

Japan Bioanalysis Forum

検量線︔メンバー議論
 基本はできる限り直線が望ましい．
 直線にならないならその理由を追求すべき?
 バリデーション項⽬が適合すれば，曲線でも可︖

Q2; ⼆次曲線（Quadratic）で実施する上での懸念点は?
 ⼆次曲線のバッチ間での傾きが揃わない︖
 吸着が原因の場合、施設間での差が懸念点.
 分析⾯での不備を指摘される︖
 曲線にするための科学的な説明が可能︖

Q3;アンカリングポイントの設定は︖

http://bioanalysisforum.jp/

Q1; 検量線は直線︖曲線︖

 バリデーションの基本項⽬（検量線、⽇内再現性）が取得できれば問題ないのでは.

10th JBF Symposium, DG2018-36

51

Japan Bioanalysis Forum

検量線︔メンバー議論及びまとめ 直線で引ける範囲に限定.
 低濃度はLBA法．
 バリデーション項⽬を満たせば曲線も可．
 検量線を2本作成（低濃度，⾼濃度）．

DGからの推奨は・・・
 第⼀選択は直線．
 バリデーション項⽬を満たせば，曲線でも科学的根拠は不要．
 やむを得ない場合，直線の範囲内で作成したり，直線を2本作成する．

10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

Q4;直線で引けない場合の対応

52

Japan Bioanalysis Forum

測定対象についてメンバー議論①
理想はインタクトと活性体両⽅測定．

安全性評価の中のTK濃度測定では，
インタクトの濃度測定で最低限クリアできる．

AUCベースでMIST対象
なら両⽅必須．

活性体が正確に評価
可能なら測定対象．

活性代謝物は、in vivoである程度⽣成する場合は測定対象にする．

http://bioanalysisforum.jp/

Q;測定対象はインタクトのみか︖
活性体も測定するのか︖

代謝活性体がどのような活性（意味）を持つか次第で測定対象．

10th JBF Symposium, DG2018-36

53

Japan Bioanalysis Forum

測定対象についてメンバー議論②
 ⾎漿中に添加した時点で，1-2塩基脱離体が分解物として⽣成された経験あり．
 代謝で⽣成する可能性があるなら代謝物．
 末端塩基脱離体はオンターゲットでも，オフターゲットの懸念が増⼤．
 核酸特有の課題として，暴露量が⾼い場合評価が必須(暴露の基準を低分⼦と同じとしていいかは不明）．

A;結局のところ測定対象は︖

http://bioanalysisforum.jp/

Q; 1〜2塩基脱離体の扱いは︖

 測定対象は薬効や毒性説明に必要と考えるものを選択．
10th JBF Symposium, DG2018-36

54

Japan Bioanalysis Forum

核酸医薬品の代謝物定量
Q28より

 明確なガイドラインのない現状ではケースバイケース①

低分⼦医薬品と同じレベル（ICH M3）での定量評価が必要②

新しい基準（ガイドライン）を作成し，その基準に従った定量評価が必要③

代謝物の定量評価は必要だと考えるが，対象は開発品ごとに変える④

キャリアを結合させた核酸医薬品ではキャリア脱離体の定量は必要と考えるが，それ以外の代謝物については不要⑤

⽣成される可能性のある代謝物とその毒性はin silicoやin vitroでカバーできるため定量評価は不要⑥

その他
その他の意⾒

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート

・わからない10th JBF Symposium, DG2018-36

55

Japan Bioanalysis Forum

現状

2018

将来

LBA法が主流（Hyb-ELISA, ECL etc.）

Patisiranの測定⽅法（2018年US承認）
⾮臨床試験︓LC-MS/MS
臨床試験︓ATTO-Probe-HPLC

http://bioanalysisforum.jp/

既承認核酸医薬品の測定⽅法について

LC-MS/MS, HPLC測定が増加する可能性︖

10th JBF Symposium, DG2018-36

56

Japan Bioanalysis Forum

⼀般名

商品名

分類

マトリックス

測定法

Nusinersen
SodiumSPINRAZA®

アンチセンス

CSF
⾎漿など

LBA法
(Hyb-ELISA
Hyb-ECL)

Mipomersen
SodiumKYNAMRO®

アンチセンス

⾎漿
尿LBA法(Hyb-ELISA)
キャピラリー電気泳動

Pegaptanib
SodiumMACUGEN®

アプタマー

⾎漿

LBA法
(Dual HybELISA)Patisiran

ONPATTROTM

siRNA

⾎漿

（⾮臨床）
LC-MS/MS（臨床）
ATTO-ProbeHPLC

10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

既承認の核酸医薬品情報57

LBAとの⽐較（Comparison with LBA ）10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

58

Japan Bioanalysis Forum

LBA概要

測定に⽤いる第⼀選択(アンケートQ23より)

http://bioanalysisforum.jp/

LBAにて核酸医薬品を測定する場合の⼀般的なスキーム①LC-MS法，②LBA法，③qPCR，④その他
Emfier, SM et al., (2005) Oligonucleotides,.15(2) 119-131

10th JBF Symposium, DG2018-36

59

Japan Bioanalysis Forum

LBAとの⽐較

特異性・代謝物の評価

スループット・頑健性

感度・ダイナミックレ
ンジ

測定対象の特性10th JBF Symposium, DG2018-36

メソッド開発測定値の意味http://bioanalysisforum.jp/

⽐較項⽬

60

Japan Bioanalysis Forum• LC-MSはLBAに⽐べて，特異性が⾼い．
• 未変化体と代謝物の分別定量を含む，代謝物評価に有⽤．
• 核酸医薬品の代謝物として，以下のものが想定される．
①エキソヌクレアーゼによる②エンドヌクレアーゼによる③DDSリガンドの⽋失・代謝

末端塩基からの分解物

分解物（未知代謝物解析）• 未変化体との分別検出可能• 予測できない構造の分解物• LC-MSが唯⼀の検出⼿法

は検出困難• ただし，感度・分⼦量次第①• 定量には標品必要③②

http://bioanalysisforum.jp/

特異性・代謝物の評価

Ligand10th JBF Symposium, DG2018-36

61

Japan Bioanalysis Forum

特異性・代謝物の評価

主要代謝物• 標品を合成し，定量評価

マイナーな代DDSリガンド

謝物/分解物の代謝• 可能な範囲で評価•可能な範囲で評価•例

PS→PO体不純物• 安全性評価はホワ
イトペーパー参照の上，各社判断（ガイドラインは未整備）

10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/• 代謝物は低分⼦と同様，MISTガイダンスに沿って評価．

62

Japan Bioanalysis Forum

感度・ダイナミックレンジ
Q7,8,24,25より• 感度︓LC-MS < LBA/qPCR• ダイナミックレンジ︓ LC-MS ≒ LBA/qPCR
LLOQ

LC-MS

LBA/qPCR〜 0.1 ng/mL

04

0.1 〜 1 ng/mL

2

1 〜 10 ng/mL

ダイナミックレンジ

LC-MS

LBA/qPCR

〜100倍

2

2

4

100〜300倍

8

3

7

3

300〜1000倍

73

10 〜 100 ng/mL

511000倍〜

1

4

100 ng/mL 〜

10

10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート（単位︓件）

63

Japan Bioanalysis Forum

メソッド開発• LC-MSは⼀度メソッドを確⽴すれば，その後の修正が容易．
•即座に対応可能•複数配列の網羅的評価に重宝

塩基配列の変更

LBAの場合•対応に時間を要する•プローブ再作成が必要

マトリックスの変更（⾎清→組織）•影響⼩さい•バックグランドが上がる場合もあり•影響⼤きい•バックグランドが上がる（組織中DNAの影響）DDSリガンド等の修飾の変更•⼤きな変更には条件検討必要•種々の条件検討が可能•適切なプローブ選択により，影響回避可能な場合もあり•変更できる条件はプローブのみ

http://bioanalysisforum.jp/

LC-MSの場合

ステージ•配列や修飾の最適化まで•スクリーニング評価向き•候補品が絞られた後•開発段階

10th JBF Symposium, DG2018-36

64

Japan Bioanalysis Forum

スループット・頑健性
LC-MSの場合

ルーチン分析のスループット

LBAの場合•1サンプル当たりの数秒•前処理はルーチン化可能•Gyrolabの使⽤により⾃動化も可能•1サンプル当たりの最低6分程度•前処理も含めて低スループット

頑健性•キャリーオーバー等，制御しきれない部分が残る•特殊な固相・カラム使⽤時には，ロット間差が影響•内標準補正によりばらつきを低減•キットのロット間差や重要試薬が問題になる可能性もある•Well間でのばらつきが⼤きく，特に⽇間再現性が難しい場合もある（天然型の場合）

http://bioanalysisforum.jp/• LC-MSはLBAに⽐べて，スループット・頑健性の⾯で劣る．
• ⼀⽅，メソッド⽴ち上げまでのコスト・時間の⾯では有利．

コスト・時間•安価（移動相や前処理に使⽤する⼀般的な試薬のみ）•調達にも時間を要しない•⾼価（特殊プレートや複数の酵素を
使⽤）•プローブ作成も時間と費⽤がかかる

10th JBF Symposium, DG2018-36

65

Japan Bioanalysis Forum

測定対象の特性（向き/不向き）
LC-MSの場合

LBAの場合塩基⻑•20mer程度以下•短いものほど有利•20-25mer以上で有⽤•短いと選択的かつ⾼親和性のプローブが作りにくいDDSリガンド結合体•結合体をそのまま検出可能•プローブの設計により，DDSリガン
ドの影響を回避（リガンド有無の判別は不可）

http://bioanalysisforum.jp/• LC-MSはLBAに⽐べて，特異性・汎⽤性が⾼く，複数成分の同時測定が可能．

2本鎖（siRNAなど）•2本鎖のままの測定は困難であり，乖離して測定•センス鎖も同時測定可能•乖離して測定•センス鎖の測定には別途系⽴ち上げが必要•ただし，2本鎖に対する抗体が取れれば測定可能10th JBF Symposium, DG2018-36

66

Japan Bioanalysis Forum• LC-MSとLBAでは測定されるものは同じか︖⇒検出原理が異なるため，測定値⾃体の持つ意味をよく考察する必要がある（未変化体/代謝物込み，総量/フリー体）．
LC-MSの場合

LBAの場合検出しているもの•核酸医薬品そのものを直接的に検出•核酸医薬品の物量を，結合したラベルの強度に変換し間接的に検出

タンパク結合の影響•前処理の過程で変性剤が⽤いられる
ため，タンパク質は不活性化される．
総濃度（結合形濃度＋⾮結合形濃度）として測定•タンパク変性を伴わない前処理の場合，⾮特異的吸着したものは測定されないため，⾮結合形濃度として測定•Proteinase K処理や界⾯活性剤，熱処理などを加える前処理の場合，タンパク質は不活性化される．総濃度として測定

10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

測定値の意味67

Japan Bioanalysis Forum• LC-MS・LBAどちらの⼿法を使うべきか︖⇒ガイドラインの項⽬を満たせば，創薬〜開発段階で利⽤可能であり，⽬的に応じて使い分けが可能．
⇒ LC-MSは感度・頑健性の点で劣るものの，開発段階では特異性を活かして代謝物分析等に，創薬段階では塩基配列に依存しないことから，
メソッドの汎⽤性を活かしたスクリーニング評価に適⽤可能．
LC-MS

LBA

特異性

○

×

感度

×

○

ダイナミックレンジ

同程度

同程度

メソッドの汎⽤性

○

△

ステージ

創薬

開発

スループット

×

○

頑健性

×

○

塩基⻑

25mer以下

20mer以上

10th JBF Symposium, DG2018-36

http://bioanalysisforum.jp/

⼩括68