DG2014-07
分析法の構築野田 巧1，大住 孝彦2，神波 亜矢子3，
副島 呉竹4，戸田 亜希子5，服部 芳明6，牟田口 国則7

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

小野薬品工業株式会社1，大塚製薬株式会社2，田辺三菱製薬株式会社3，富山化学工業株式会社4，
株式会社新日本科学5，コアメッド株式会社6，株式会社住化分析センター7

6th JBF Symposium, DG2014-07

1

前処理法

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum2

背景

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

3

Japan Bioanalysis Forum

回答者背景
Q1. 回答者の所属は？

Q2. 担当されているステージはどこですか？

Domestic CRO
27.8%
Domestic
pharmaceuticalcompany 58.8%

Domestic genericpharmaceuticalcompany 3.1%

Foreignpharmaceuticalcompany 9.3%

その他・医薬品受託分析機関

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Other 1.0%

回答数：97件

4Japan Bioanalysis ForumQ3. レギュレーション下（信頼性基準あるいはGLP）での生体試料分析経験はありますか？

Q4. レギュレーション下での生体試料分析のための分
析法構築を行ったことがありますか？
回答数：95件

回答数：95件

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

レギュレーション下での生体試料分析経験5

Japan Bioanalysis ForumQ5. 内標準物質には何をよく用いますか？

回答数：94件

その他
・上記いずれも使用する
・安定同位体と類縁体が半々・非臨床は類縁体，臨床は安定同位体 など

Q6. 内標準物質の種類（安定同位体あるいはそれ以外）によって分析法を変更しますか？（複数回答可）

http://bioanalysisforum.jp/

内標準物質関連その他
・類縁体に変更する場合
回収率，クロマトの保持時間
定量範囲の確認 など
6
6th JBF Symposium, DG2014-07

Japan Bioanalysis Forum

分析法構築前に入手する物性情報

http://bioanalysisforum.jp/

Q7. 分析法構築前にどのような物性情報を入手しますか？

その他
・吸着性
・吸湿性
・logD

・保存安定性（光，熱）・非臨床PKの分析条件
・MSの場合，精密質量と同位体存在比率 など
6th JBF Symposium, DG2014-07

7前処理法の選択

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

8

Japan Bioanalysis Forum

前処理法の選択Q8. 最もよく利用する前処理法はどれですか？
＜Q9. 選択理由＞
http://bioanalysisforum.jp/

回答数：89件

その他
・創薬ステージによる・2つの方法を組み合わせる・測定感度による など
6th JBF Symposium, DG2014-07

その他
・化合物の物理化
学的性状に合わせて前処理を設定する
9

Japan Bioanalysis Forum

前処理法の選択
Q10. 次に利用する前処理法はどれですか？
回答数：85件

その他
・創薬ステージによる・基本的に固相以外選択しない

http://bioanalysisforum.jp/＜Q11. 選択理由＞

その他
・夾雑成分の除去
・前処理効率・マトリクス効果の低減 など
th10
6 JBF Symposium, DG2014-07

Japan Bioanalysis Forum

前処理法の選択
Q12. 第3選択の前処理法はどれですか？
＜Q13. 選択理由＞

http://bioanalysisforum.jp/

回答数：83件

その他
・珪藻土のカートリッジタイプ
・カラムスイッチング
・マトリクス効果の低減 など

その他
・珪藻土を用いた液液抽出は簡便にクリーンアップできる
・固相も液液も適さない場合
・頑健性 など

6th JBF Symposium, DG2014-07

11

除タンパク法6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

12

Japan Bioanalysis Forum

除タンパク法Q１４．抽出溶媒として何を第一選択としますか？
Other
2.5%

回答数：79件

Methanol
26.6%

Acetonitrile
69.6%

Q１５．その理由は？ （複数回答）
Number of responses
0Extracting efficiency
Degree of protein denaturation
Solubility
Routine use
Cost
Environmentally friendly
No experience
Other

20

40

60

33
50

http://bioanalysisforum.jp/

Noexperience
1.3%

32
30
8

2
1
13

6th JBF Symposium, DG2014-07

13

Japan Bioanalysis Forum

除タンパク法
Q１６．次に良く利用する抽出溶媒は何ですか？

Acetonitrile
25.3%

Ethanol
3.8%

回答数：79件

その他
・アセトニトリル/メタノール混液

Other
6.3%

Methanol
59.5%

Q１７．その理由は？
（複数回答）
Number of responses
0Extracting efficiency
Degree of protein denaturation
Solubility
Routine use
Cost
Environmentally friendly
No experience
Other

10

20

30

40

36

http://bioanalysisforum.jp/

Noexperience
5.1%

30
28
18
4
3
4
8

6th JBF Symposium, DG2014-07

14Japan Bioanalysis Forum

除タンパク法Q１８．第三選択の抽出溶媒は何ですか？
Tetrahydrofuran
5.6%
Methanol
9.7%

その他
・ブチルメチルエーテル
・トリクロロ酢酸

Ethanol
18.1%
Other
18.1%

No experience
43.1%

Q１９．その理由は？
（複数回答）
Number of responses
0Extracting efficiency
Degree of protein denaturation
Solubility
Routine use
Cost
Environmentally friendly
No experience
Other

10

20

30

14
13

http://bioanalysisforum.jp/

Acetone5.6%

回答数：72件

17
3

1
3
25
8

6th JBF Symposium, DG2014-07

15Japan Bioanalysis Forum

除タンパク法Q２０．抽出溶媒は試料の何倍添加しますか？
Equal amount
3.8%

http://bioanalysisforum.jp/

More than 5-fold
6.4%

Other
7.7%

回答数：78件

1～2-fold
9.0%

4～5-fold
12.8%
2～4-fold
60.3%

その他
・メタノールなら5倍以上、アセトニトリルなら3倍以上
・可能な限り倍率を上げる

6th JBF Symposium, DG2014-07

16

Japan Bioanalysis Forum

除タンパク法

Other
1.3%

Normally
added
1.3%

No
experience
Not added 9.0%
11.5%

http://bioanalysisforum.jp/

Q２１．酸を添加した抽出溶媒を用いた経験はありますか？
（例：0.1 vol%ギ酸メタノール） 回答数：78件

If needed
78.2%

6th JBF Symposium, DG2014-07

17Japan Bioanalysis Forum

除タンパク法
Q２２．酸を添加する場合、何を第一選択としますか？
Other
3.8%

回答数：78件

No experience
17.9%
Formic acid
69.2%

Q２３．酸を添加する理由（複数回答）
Number of responses
0

20

40

Change to unbound form

33

Compound stabilization

38

Change to undissociated molecule30

No experience
Other

http://bioanalysisforum.jp/

Trichloroacetic
acid
6.4%
Perchloric acid
2.6%

14
3

6th JBF Symposium, DG2014-07

その他
・夾雑物除去18

Japan Bioanalysis Forum

除タンパク法Q２４．沈渣の除去方法として、何を第一選択としますか？
No experience
1.3%

Other
1.3%

Filter6.4%

回答数：78件

http://bioanalysisforum.jp/

Plate forproteinextraction
7.7%

Centrifugation
83.3%

6th JBF Symposium, DG2014-07

19

Japan Bioanalysis Forum

除タンパク法Q２５．バイアルに詰める前に乾固操作は行いますか？

Notevaporated
58.8%

回答数：85件

その他
・ケースバイケース
・基本は乾固したくない
・感度や物性（再溶解されるか）によっては乾固することもある

http://bioanalysisforum.jp/

Other
28.2%

Evaporated
12.9%

Q２６．バイアルに詰める前に
以下のような対応をしますか？
Number of responses
0

20

40

To match ratio of organic solvent with mobile phase60

59

To match buffer concentration and/or pH with mobile
phase

29

Do nothing
Other（複数回答）

24
13

6th JBF Symposium, DG2014-07

20

Japan Bioanalysis Forum

除タンパク法Q２７．リン脂質除去フィルターを使用したことはありますか？

Uninterested
12.2%

Often
2.0%

回答数：49件

http://bioanalysisforum.jp/

Unknowing
6.1%

Tried but not
used
28.6%

Want to but
haven't tried
51.0%

感想
・回収率が悪くなり、あまり効果がなかった。
・機会があれば試してみたい・フィルターのメーカーや化合物によって回収率が悪いことがあった。

6th JBF Symposium, DG2014-07

21

液-液抽出法

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

22

Japan Bioanalysis Forum

液-液抽出法Q28. 抽出溶媒として何を第一選択としますか？
回答数：78件

n-Hexane
6.4%

http://bioanalysisforum.jp/

Other
9.0%

No experience
12.8%
Ethyl acetate
34.6%

Diethyl ether
10.3%
Methyl tert-butyl
ether
26.9%
その他コメント･ 化合物の物性に合わせる･ クロロフォルム

6th JBF Symposium, DG2014-07

23

Japan Bioanalysis Forum

液-液抽出法Q30. 次に良く利用する抽出溶媒は何ですか？
回答数：71件

No experience
26.8%

http://bioanalysisforum.jp/

Diethyl ether
18.3%

Methyl tert-butyl
ether
19.7%

Other
5.6%
n-Hexane
5.6%

Dichloromethane
8.5%

Ethyl acetate
15.5%

その他コメント･ クロロホルム/メタノール(2/1)
･ ジエチルエーテルと酢エチやイソ
プロパノールの混液･ イソプロパノール

6th JBF Symposium, DG2014-07

24

Japan Bioanalysis Forum

液-液抽出法Q32. 第三選択の抽出溶媒は何ですか？
回答数：68件

No experience
42.6%

Ethyl acetate
14.7%

Diethyl ether
8.8%
Other
2.9%
Dichloromethane
2.9%

その他コメント

http://bioanalysisforum.jp/

n-Hexane
19.1%

Methyl tert-butyl･ カートリッジ型なら酢酸エチルもある．
ether（エマルジョン生成のため，通常は使用しない）
8.8%･ 冷アセトニトリル
25
6th JBF Symposium, DG2014-07

Japan Bioanalysis Forum

液-液抽出法Q29, 31, 33
その抽出溶媒を選択した理由は何ですか？ （複数回答可）
20

39

Extracting efficiency

27

Volatility
Routine use

19

Removes impurities

17
12

Solubility
Environmentally friendly

9
5

4 2

8

19
9

4 2

100

26

10

7

1st choice76

その他コメント

Cost 1 3
Other

36

80

2nd choice

http://bioanalysisforum.jp/

0

Number of responses
40
60

3rd choice･ 文献を参考にした･ 委託者指定･上層にきて、比較的きれいといえばジエチルエーテル．もちろんt-ブ
チルメチルエーテルがもっといいですが、抽出がやや落ちる．
･プレートを利用できる

6th JBF Symposium, DG2014-07

26

Japan Bioanalysis Forum

液-液抽出法Q34. 抽出溶媒は第一選択として試料の何倍添加しますか?
回答数：67件

More than 10-fold
11.9%

8～10-fold
10.4%

Less than 3-fold
17.9%

http://bioanalysisforum.jp/

Other
4.5%
3～5-fold
35.8%

5～8-fold
19.4%
その他コメント
委託者の指定に従う
物性に依存するが5倍以上
ケースバイケース
6th JBF Symposium, DG2014-07

27

Japan Bioanalysis Forum

液-液抽出法

010

Number of response
20
30

40

44

If needed

12

Normally added

Not added

6

Other

2

50

http://bioanalysisforum.jp/

Q35. 抽出するときに，生体試料に緩衝液等を添加してpHを調整したことはありますか？（複数回答可）

その他コメント
物性に合わせる

6th JBF Symposium, DG2014-07

28

Japan Bioanalysis Forum

液-液抽出法Q36. 酸を添加する場合、何を第一選択としますか？
回答数：69件

http://bioanalysisforum.jp/

No experience
20.3%
Other
5.8%
Hydrochloric
acid
8.7%

Formic acid
62.3%

Trichloroacetic
acid, 2.9%

その他コメント
委託者指定
リン酸緩衝液リン酸
過塩素酸
6th JBF Symposium, DG2014-07

29

Japan Bioanalysis Forum

液-液抽出法Q37. 塩基を添加する場合，何を第一選択としますか？

No experience
25.6%

Ammoniumhydroxide
32.6%

Other
4.7%
Phosphate buffer
11.6%

Sodiumhydroxide
25.6%

http://bioanalysisforum.jp/

回答数：41件

その他コメント
委託者指定HPLCであればリン酸緩衝液，MSであればアンモニア水又は炭酸水素アンモニウム
6th JBF Symposium, DG2014-0730

Japan Bioanalysis Forum

液-液抽出法Q38. 緩衝液を添加する理由は何ですか？（複数回答可）
0
Change to undissociatedmolecule

45

Compound stabilization

21

Change to unbound form

Other

13

4

50
http://bioanalysisforum.jp/

Number of responses
25

その他コメント
委託者指定
抽出率を一定にするため再現性向上
分子型，イオン型に変更しながら精製抽出するため
6th JBF Symposium, DG2014-07

31

Japan Bioanalysis Forum

液-液抽出法Q39.バイアルに詰める前に乾固操作は行いますか？
Not evaporated
5.6%

Other
8.5%

Evaporated
85.9%

その他コメント
委託者指定要求される感度と化合物の物性による可能であれば乾固しない
HPLCに影響があるため6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

回答数：71件

32Japan Bioanalysis Forum

液-液抽出法Q40. 最後に実試料をバイアルに詰める前に、以下のような対応をしますか？ （複数回答可）
20

To match ratio of organic solvent withmobile phase

Number of responses

58

To match buffer concentration and/or
pH with mobile phase40

Do nothing

5

Other

7

40

60

http://bioanalysisforum.jp/

0

その他コメント
移動相で再溶解する
分離に影響がなければ，移動相の組成と合わせないこともある
可能であれば，移動相より有機溶媒比率を下げる
移動相で溶解する フィルターを通す
33
6th JBF Symposium, DG2014-07

Japan Bioanalysis Forum

液-液抽出法Q41. 珪藻土を用いた液液抽出カラムを使用したことはありま
すか？
Uninterested
11.4%
Tried but not
used
18.2%

Often
9.1%

Want to but
haven't tried
36.4%

Unknowing
25.0%

http://bioanalysisforum.jp/

回答数：44件

その他コメント
ロット差が見られたことがあった
6th JBF Symposium, DG2014-0734固相抽出法

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

35

Japan Bioanalysis Forum

固相抽出法
Q42．第一選択として用いる固相カラムのメーカーはどこですか？
http://bioanalysisforum.jp/

回答数：44件

その他
・委託者指定による
・特に決めておらず手元にあるもの

6th JBF Symposium, DG2014-07

36

Japan Bioanalysis Forum

固相抽出法
Q43．ケミストリは何を第一選択としますか？
回答数：45件

http://bioanalysisforum.jp/

Mixed-phase
8.9%

Reversedphase
91.1%

その他
・委託者指定による6th JBF Symposium, DG2014-0737

Japan Bioanalysis Forum

固相抽出法

Yes
28.3%
Depends on thecompounds’
properties
60.9%

No
10.9%

http://bioanalysisforum.jp/

Q44．第一選択として固相に添加する前に試料のpHを調整しますか？
回答数：46件

その他
・委託者指定による6th JBF Symposium, DG2014-07

38

Japan Bioanalysis Forum

固相抽出法
Q45．第一選択としてどのように洗浄しますか？ （複数回答可）

Mixture ofwater andorganic solvent
42.9%

Water
49.2%

Organic solvent
7.9%

http://bioanalysisforum.jp/

回答数：46件

その他
・委託者指定による・有機溶媒で溶出が認められない場合に限り，有機溶媒を使用する
・ステップワイズに溶出力を上げる

6th JBF Symposium, DG2014-07

39

Japan Bioanalysis Forum

固相抽出法
Q46．第一選択としてどの有機溶媒で溶出しますか？（複数回答可）

Mixed solvent of theeluting composition
optimized forcompounds
25.4%

http://bioanalysisforum.jp/

回答数：46件

Organic solvent
added with acid or
base
14.9%

Methanol
34.3%

Acetonitrile
25.4%

その他
・ 委託者指定による

6th JBF Symposium, DG2014-0740

Japan Bioanalysis Forum

固相抽出法
Q47．第一選択としてどのように通液しますか？

Centrifugation
26.1%

Pressurization
13.0%

Aspiration
60.9%

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

回答数：46件

41Japan Bioanalysis Forum

固相抽出法
Q48．第一選択としてどのタイプを用いますか？

µElution-type(concentratable)
28.9%

http://bioanalysisforum.jp/

回答数：45件

Cartridge-type
40.0%

Well-type
31.1%

その他
・委託者指定による
・手元にあるものを使う

6th JBF Symposium, DG2014-0742

Japan Bioanalysis Forum

固相抽出法
Q49．バイアルに詰める前に乾固操作は行いますか？

No
52.5%

http://bioanalysisforum.jp/

回答数：40件

Yes
47.5%

その他
・ ケースバイケース （×３）
・ 検出感度による・ 要求感度によって決める
・ 要求される感度と化合物の物性による・ 可能な限り乾固させないように

6th JBF Symposium, DG2014-0743

Japan Bioanalysis Forum

固相抽出法
Q50．最後に実試料をバイアルに詰める前に、以下のような対応をしますか？ （複数回答可）
回答数：44件

To match bufferconcentration
and/or pH withmobile phase
32.8%

To match ratioof organic
solvent withmobile phase
53.1%

その他

http://bioanalysisforum.jp/

Do nothing
14.1%

・ 移動相で溶解する（×２）
・ 分離に影響がなければ，有機溶媒比率を上げる
・ 可能であれば，移動相よりも有機溶媒比率を下げる・ 移動相より溶出力の弱い溶媒に溶解する・ pH，塩濃度は必要であれば合わせている

6th JBF Symposium, DG2014-0744前処理法（その他）

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum45

Japan Bioanalysis Forum

前処理法（その他）
Q５１．1回の前処理で使用する血漿量（µL）は？
0～10
2.4%

100～200
9.8%

回答数：49件

http://bioanalysisforum.jp/

More than
200
2.4%

10～20
14.6%
20～30
22.0%

50～100
39.0%
40～50
9.8%

30～40
0.0% μL（以上）～μL（未満）意見
・げっ歯類（特にマウス）は極力少ない量で実施。大動物はケースバイケース。
・100～1000 µLでなるべく少ない量

6th JBF Symposium, DG2014-07

46

Japan Bioanalysis Forum

前処理法（その他）
Q５２．前処理で高感度化を検討するとき、以下の選択肢のどれから順に実施しますか？ 回答数：45件
0.0%

2nd
4th
Increase plasma volume

20.0%

22.2%

40.0%

60.0%

33.3%

80.0%

17.8%

100.0%

26.7%

2.2%
Increase clean-up process

22.2%

40.0%

Evaporate

31.1%

28.9%

Analyze using more sensitive LC-MS

44.4%

15.6%

35.6%

22.2%

17.8%

20.0%

20.0%

http://bioanalysisforum.jp/

1st
3rd

＜トータルスコアによる対処順位＞①高感度のLC-MSで対応する⇒②濃縮乾固を行う⇒③血漿使用量を増やす⇒④クリーンアップ過程を追加する
6th JBF Symposium, DG2014-07

47

Japan Bioanalysis Forum

前処理法（その他）

Always done
4.1%

Not done
44.6%

Depend oncompound
51.4%

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Q５３．安定性を考慮して、抽出溶媒など前処理に用いる
回答数：74件
試薬・試液を冷却していますか？

48

Japan Bioanalysis Forum

前処理法（その他）

回答数：49件

意見・前処理中に他の化合物に変換しないように注意する（例：代謝物→未変化体）
・抱合体を含む場合は加水分解されないように注意する
・物性が大きく異なる場合、いずれの化合物も高い回収率を得られるよう注意する
・内標準物質は、可能な限り未変化体の安定同位体を用いる
・特になし

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Q５４．複数化合物（例えば、未変化体及び代謝物）を前処理する場合、1化合物を前処理する場合と違って何か注意している点は？

49

Japan Bioanalysis Forum

前処理法（その他）
Q５５．非臨床と臨床で前処理法は変えていますか？
Alwayschanged4.3%

Notchanged23.2%

Depend oncompound71.0%

回答数：69件

意見
・動物は大きくなるほど夾雑物質が汚くなるから

Q５６．変えている場合、その理由は？
Number of responses

0Work efficiency
Cost
Environmentally friendly
Routine use
Improve sensitivity
Designation by outsourcer
Improve robustness
Compound's property
Have automated preparation system
Not changed
Other

20

40

18

5
1
2

http://bioanalysisforum.jp/

Tried butnotchanged
1.4%

36

4
32

5
1

15
2

6th JBF Symposium, DG2014-0750

Japan Bioanalysis Forum

前処理法（その他）
Q５７．回収率は評価しますか？
Number of responses
10

20

Evaluate by precision30

29

Evaluate by accuracy

19

Evaluate by both precision and accuracy

20

Not evaluate

14

Other

13

意見
・回収率は算出するが、判断基準は設けない。
・精度で評価し、真度の基準は設けないが80%程度を目標とする。
・確認する程度。バリデーションでは基本評価しない。
・基準値は、開発ステージによって変更する。
・基準値は設けないが、真度より精度の値を重要視する。

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

051Japan Bioanalysis Forum

前処理法（その他）
Q５８．回収率を評価する場合、具体的にどのような基準を
回答数：69件
設けていますか？

No
criteria
50.0%

Less than10%
3.3%

真度（Accuracy）
Less than 50%
3.8%

50～60% 60～70%
11.5%
3.8%
70～80%
3.8%

10～15%
46.7%

No criteria
69.2%
More than80%
7.7%

http://bioanalysisforum.jp/

精度（Precision）

意見
・安定した測定を実現するために回収率80%以上は欲しいと感じる。
・最低でも精度20%以内。ステージが上がれば、ガイドライン等の値に準じる。
・低、中、高濃度試料の回収率が同程度の値を示していれば良い。

6th JBF Symposium, DG2014-0752

Japan Bioanalysis Forum

前処理法（その他）
Q５９．前処理のどの時点で内標準物質を添加しますか？
回答数：70件

Add to sample
directly
91.4%

意見・前処理の全過程のばらつきを補正するため
・内標準物質が安定同位体でない場合、試料に直接添加すると誤差が大きくなるので、再溶解時に添加する・ケースバイケース
6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Include I.S. in
extraction
solvent
7.1%

When re-fuse
1.4%

53

Japan Bioanalysis Forum

前処理法（その他）
Q６０．ISRが導入されて、前処理に関して以前から変更
した点はありますか？
Response of numbers

Tighten criteria in validation

10

20

1

Develop a robust preprocessing method
Develop a simple preprocessing method

27
1

Tighten criteria on recovery

Set criteria, e.g. voltex time or aspiration rate
Evaluate effects of metabolite on bioanalysis using
in vivo sample
Utilize two or more I.S. when analyzeing two or
more
Utilize I.S. as stable isotope

30

3
1

http://bioanalysisforum.jp/

0

5

5
14

6th JBF Symposium, DG2014-07

54

Japan Bioanalysis Forum

アンケートまとめ（前処理法の選択）
Selection of preparation method

Efficiency, Cost 51.7%

36.0% Sensitivity,
Robustness

6.7%
Protein precipitaion

2nd Choice
11.4%
Liquid-liquid
extraction

Liquid-liquid
extraction

Solid phase extraction

88.6%

80.0%

Solid phaseextraction

Proteinprecipitation

2nd Choice
20.0%
Liquid-liquid
extraction

http://bioanalysisforum.jp/

1st Choice 作業効率・コストを理由に除タンパク法を選択する
 感度・頑健性を理由に固相抽出法を選択する
 液液抽出法は、第一選択としてほとんど用いられていない
6th JBF Symposium, DG2014-07

55

Japan Bioanalysis Forum

前処理法の選択のDecision Tree
Selection of preparation method

Operation efficiency
Cost

Proteinprecipitaion
Trash is too much !
Improve recovery rate

Improve sensitivity
or robustness

Sensitivity
Clean-up efficiency

Solid-phaseextraction

Improve operation efficiency
or bring down costGet very complex
Improve recovery rate

Liquid-liquid
extraction

http://bioanalysisforum.jp/

What do you put much value on ?

その他の注意点・固相抽出のイオン交換モードやMIXモードは特にクリーンアップ効率が高い。
一方、逆相モードのHLBでは脂溶性の高い化合物の選択性や回収率が低い場合がある。
・液液抽出は単純な極性分配のため物性の異なるものを同時に抽出することは難しい

6th JBF Symposium, DG2014-07

56

Japan Bioanalysis Forum

除タンパク法の抽出溶媒選択のDecision Tree
Selection of extraction solvent
With your proprietrary Know-how

Extracting efficiency
Degree of protein denaturation

Acetonitrile/Methanol
mix solution

When a compound can’t
be solved in acetonitrile

MethanolIn some cases,
adding acid tosolvent may beeffective !?

If ester exchange reaction or
methylation reaction may be
happened.
Ethanol, isopropanol, acetone, tetra-hydrofuran, methyl tert-butyl ether
Trichloroacetic acid

http://bioanalysisforum.jp/

Acetnitrile

補足・アセトニトリルは沈査が固化しているので、デカントしやすい。
・アルコール系は固化がマイルドなので、フィルターで沈査除去が可能。
・抽出力を考慮すると、溶媒の添加量の目安は、アセトニトリルで試料の3倍、メタノールで試料の5倍程度が望ましい。

6th JBF Symposium, DG2014-07

57

Japan Bioanalysis Forum

抽出溶媒に酸を添加するときの注意点

補足
・一般的にギ酸が汎用されており、トリクロロ酢酸も用いられている。
注意点
・ギ酸メタノールは長期保存するとエステル化が進行し、変性効率の低下が懸念される。したがって、用時調製を推奨する。
・不安定さは血漿中安定性に起因する場合もあるので注意が必要。

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

抽出溶媒に酸を添加するケース
・前処理中の化合物が不安定な場合・化合物がタンパクと結合して回収率が低い場合

58

Japan Bioanalysis Forum

固相抽出で回収率が悪い場合の対処法（逆相系で保持が予想される場合の対処法）

アプライ時にトラップされない
問題解決：
 希釈溶媒に若干の有機溶媒
Ex. 10～20%エタノール
 除タンパク後，水で希釈
Ex. デカント試料に水を添加
 酸または塩基を添加
Ex. 数%のギ酸，アンモニアなど固相からの溶出が不十分
問題解決：
 溶出溶媒を変更
Ex. メタノール⇔アセトニトリル
 溶出量・回数を増やす
Ex. 2～3回に分けて溶出
Ex. 2～3倍量添加 ゆっくりと通液
Ex. 吸引スピード，遠心速度

http://bioanalysisforum.jp/

逆相モード

回収率が悪い場合の原因究明にはマスバランス試験の実施も効果的
6th JBF Symposium, DG2014-07

59

Japan Bioanalysis Forum

マスバランス試験実施例（前処理過程のどこで化合物をロスしているかを確認） WS：Working Solution
Solvent ：Diluent solvent of WS

PlasmaWS 5 μL
Water

Reversed Phase←Conditioning←Conditioning
PlasmaApply Sample*
Apply Sample*
Solvent 5 μL
Water
←wash
←wash
←Elute←Elute←Solvent 5 μL
←WS 5 μL
←I.S. 5 μL
←I.S. 5 μL
←Solvent 5μL←WS 5μL←I.S. 5μL
←I.S. 5μL
B Sample
D Sample
A Sample
C Sample

http://bioanalysisforum.jp/

Reversed Phase*：Collected through the sample

Area ratio of A Sample/Area ratio of C Sample×100=Recovery Rate（1）Area ratio of B Sample/Area ratio of D Sample×100=Rate of Filtrate（2）100‐（1）‐（2）＝Rate of remained at solid phase
6th JBF Symposium, DG2014-07

60

Japan Bioanalysis Forum

固相デバイスの一般的な違いµElution type

Well type

Cartridge type

Well typeµElution type

Sorbent mass

Large

MediumSmall

Sample volume

Large

MediumSmall

Elution volume

Large

Mediumsmall

Evapolatednecessary

Case by case

Case by caseThroughput

slow

middlefast

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Cartridge type61

測定法（分析条件）

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum62カラムの選択

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum63

Japan Bioanalysis Forum

推奨法：カラムの選択
First choice 3 µm

Particle
Technology

ChemistryID

LengthFully Porous

C18

2 mm

50 mm
http://bioanalysisforum.jp/

Particle
Size

Choice for the requirement
Selectivity

Retention

Sub-2 μm

Fully Porousoror

2.2～2.7 μm

Core shellSensitivity

Strong interaction to aromatic compounds
The mobile phase same as ODS can be used
Methanol is recommended to use

Reversed phase column
with unique ligand

Throughput

75~150 mm

Phenyl，PFP



Specialty C18:Mixed-mode, Active silanol sites,
Polymer coating ..
100% aqueous mobile phase can be used

< 50 mm

Injection volume
Large: > 2 mm
Small: < 2 mm

6th JBF Symposium, DG2014-07

64

Japan Bioanalysis Forum

推奨法：カラムの選択①
第一選択• カラムサイズ：– カラム長さ：50mm» カラム容積が小さく移動相の置換，追い出し時間の短縮化に有利– カラム内径：2mm» カラム断面積に応じた最適流速領域がMSのイオン化に最適» 試料の負荷量が多い時は，移動相より極性の高い溶媒にする，又はグラジエント条件を用いる事で良好なピーク形状が得られる– 粒子径：3µm» 5µmより高い分離度を有し最適流量範囲が広い» 高分離分析・分析時間短縮のためにセミミクロLCで最も汎用的である

http://bioanalysisforum.jp/

 全多孔性C18カラム• 化合物の溶出挙動（時間，ピーク形状）を目安にして移動相やカラム条件の最適化を行う．
6th JBF Symposium, DG2014-07

65

Japan Bioanalysis Forum

推奨法：カラムの選択②
第二選択
選択性を変えたい場合• ODSで分離が不十分なときや保持が弱い場合に有用• 芳香族化合物に対して特に強い相互作用を発揮し，ODSと同じ移動相を用いる事ができるため汎用且つ効率的に検討を行える

ODSで保持が弱い場合
 ユニークな官能基を有した逆相系カラム• 逆相モードにおける移動相，注入溶媒の種類を変える事なくカラムの評価が可能である．
• 最大100％の水系移動相を用いることができるカラム．
• 極性基を有したものや二次相互作用の強いカラムを用いる．
6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

 フェニル基を有するカラム

66

Japan Bioanalysis Forum

カラムの選択Q62. 第一選択のカラムはありますか？
No
40.3%

Yes
59.7%

選択理由

number of responses
150Singlecompound6

Multicompound7

Selectivity

2

13

7
Run time30

3

http://bioanalysisforum.jp/

回答数：72件

1
Routine use

6th JBF Symposium, DG2014-07

Others67

Japan Bioanalysis Forum

カラムの選択Q63.どのような種類のカラムを第一選択として利用します
か？

充填基材

10

Single compound

36

Multi compound

0

11

21

11

Fully Porous

Core shell

10

50

number of responses
20
30
40

Single compound

46

50

http://bioanalysisforum.jp/

0number of responses
20
30
40

1

官能基

Multi compound

35
C18

2

Others6th JBF Symposium, DG2014-07

68

Japan Bioanalysis Forum

カラムの選択Q63.どのような種類のカラムを第一選択として利用しますか？
number of responses
25

Single compound

50

34

2

6

2

長さ

Multi compound 1
30mm

0

22
50mm

2
75mm

7

3

100mm

150mm

number of responses
25

Single compound

4150

http://bioanalysisforum.jp/

0

31

内径

Multi compound

31

31

2mm
3mm
4.6mm
6th JBF Symposium, DG2014-07

69

Japan Bioanalysis Forum

カラムの選択Q63.どのような種類のカラムを第一選択として利用します
number of responses
か？
10Single compound

9

Multi compound

8

20

30

8

40

23

50

4 1

粒子径

Sub2μm

6

17

4

3μm

2.6～2.7μm

5μm

Othersnumber of responses
100Single compound

5

6

1

4

1 2

20

http://bioanalysisforum.jp/

0

4

メーカー

Multi compound
GL science

2

3

1

Waters3

2

4

Phenomenex

6th JBF Symposium, DG2014-07

Shiseido70

Japan Bioanalysis Forum

カラムの選択Q64.選択性を変えたい場合の2ndチョイスカラムがあれば教えて下さいOthers21.7%
Ion-exchange
column13.0%

Phenylcolumn65.2%

その他・フェニル系カラム
C18と選択性が変わるので比較的骨格別に分析できるので・イオン交換系カラム
保持力及び夾雑物との分離性を考慮すると，HILICより使いやすい
6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

回答数：23件

71Japan Bioanalysis Forum

カラムの選択Q65.通常のODSで保持が弱い化合物を測定する際のカラ
ム選択は？
Ion-exchange
column15.0%
Reversedphase column
with a uniqueligand42.5%

General C18
column 22.5%

HILIC column
20.0%

http://bioanalysisforum.jp/

回答数：40件

その他
・いずれも使用する・化合物物性による6th JBF Symposium, DG2014-07

72

Japan Bioanalysis Forum

カラムの選択Q66.安定化にかける時間の設定方法は？（複数回答可）
number of responses
20

Constant time

40

10

Until column pressure is constant38

Set the time from LC line volume andcolumn volume
Others29
6

http://bioanalysisforum.jp/0

その他
・移動相に用いる溶媒の種類と混合比率によって大まかに分けている．
・化合物物性による．
・フルスキャンのスペクトルが安定するまで
6th JBF Symposium, DG2014-0773

溶出法，移動相

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum74

Japan Bioanalysis Forum

溶出法
Q６７．どのタイプの溶出法を第一選択としますか？
Stepwiseelution
2.9%
Isocratic
elution36.2%

http://bioanalysisforum.jp/

Gradient
elution60.9%

回答数：69件＜選択理由＞
回答数：41件
number of responses
0
5
10
15

Run time
Concnetrating analyte
Shorten columun equilibrium time
Reducing carry-overReducing matrix effect to the next sample
Selected elution pattern
Others
その他

13
1

7
10
7
1

2

・委託者の指定による・押し出しを目的としたグラジエントであり，分離時はイソクラティック・カラムトップでの濃縮とピークをシャープにする事で感度を稼ぐ

6th JBF Symposium, DG2014-0775

Japan Bioanalysis Forum

溶出法
Q６８．第一選択の溶出方法の有機溶媒比率を教えてください（記述回答）• 50%（2件）， 60%（3件）， 70%（1件）， 80%（2件）

 グラジエント
Start ratio

Gradient method ratio

5%

5→80%（1→6 min)，

5→90%（5 min），

5→5→95→95→5% （0→2→5→5.1→9 min）

10%

10→90%（2件），

10→90%（0→3 min)10→10→90→90%（0→0.5→2.0→2.5 min)http://bioanalysisforum.jp/

 アイソクラティック

10→70%(0→5 min)20%

20→95%，

20→95%(1→3min)

 決まっていない• グラジエント条件は10%刻みで条件変更しながら決定
6th JBF Symposium, DG2014-07

76

Japan Bioanalysis Forum

移動相
Q６９．第一選択の有機溶媒についてお聞かせ下さい
回答数：70件
Methanol
10.0%

Acetonitrile
87.1%

Q７０．Q６９の選択理由を教えて下さい（複数回答可）
number of responses
0

Universal use

回答数：44件

10

20

19

3

Column pressure

28

Elution efficiency

Ｑ６９，Ｑ７０のその他
・委託者の指定による

http://bioanalysisforum.jp/

Others2.9%

19

Ionization efficiency

52

Low background noise

6

1

30

1

Others 1 1

Acetonitrile

6th JBF Symposium, DG2014-07

Methanol

Others77

Japan Bioanalysis Forum

移動相
Q７１．第一選択の添加剤とその濃度について教えてください＜濃度＞

Acetic acid
3.2%

TFA
1.6%

回答数：62件

Ammonium
formate
1.6%

Formic acid90.3%

Added regents
Formic acidconcentration
0.05%

Counts
1

0.1%

39

5mM

1

10mM

1

Others

14*

TFA

0.1%

1

Ammonium formate
Acetic acid

10mM
0.1%

1
1

Others1

10mM

1

Others1

Ammoniumacetate
3.2%

Ammonium acetate

http://bioanalysisforum.jp/＜添加剤＞

回答数：62件*1回目アンケートは濃度選択肢がなかったため多数となった6th JBF Symposium, DG2014-07

78

Japan Bioanalysis Forum

移動相
Q７２．第一選択の添加剤の理由を教えてください（複数回答可）
number of responses
015

Routine condition

OthersFormic acid

1 1

http://bioanalysisforum.jp/

13

1 1

1

pH control
Low background noises

30

24

Ionization efficiency
Bufferr action

回答数：51件

11

1

2

3

2

Acetic acid

その他
・委託者の指定による・調製が簡便、汎用性：5件

Ammonium formate

TFA

Others・化合物の物性や文献情報による：3件・シンプルな方から開始

6th JBF Symposium, DG2014-07

79

Japan Bioanalysis Forum

移動相
Q７３．（LC-MSにおける）イオンペア試薬の使用の経験は
？
No
55.1%

Yes
44.9%

使用理由
・保持向上：９件
・ピーク形状、分離改善：４件
・委託者の指定
その他
・イオンペア的にTFA等の使用はあるが，界面活性剤的なものはMSだとない・あまり良い思い出がない ・現状，ルーチンでは使っていない
6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

回答数：69件

80Japan Bioanalysis Forum

移動相（流速）Q７４．第一選択の流速は？

回答数：34～37件

number of responses
20

40

Isocratic

15

12

4

2 1 3

Gradient

15

12

4

4

Stepwise7

0.2mL/min

8

1 2 1

0.3mL/min

130.4mL/min112

http://bioanalysisforum.jp/

00.5mL/min

その他
・委託者の指定による・使用カラムによる・ステップワイズの時は流速もステップワイズ選択するカラムに依存
・0.2～0.4 mLで適切なカラム圧や目的に合っている条件を選択
6th JBF Symposium, DG2014-07

81

Japan Bioanalysis Forum

移動相（流速）Q７５．第一選択の流速の理由を教えてください（複数回答可）

Avoiding high pressure

7

Recommended flow rate of columun

6

4

Ionization efficiency

4

4

Routine condition

4

1 2 11Others
0.2mL/min

90.3mL/min

20

25

3 1 3

http://bioanalysisforum.jp/

0High resolution

回答数：41件

number of responses
5
10
15

1 2

1

2 2 111111 3

0.4mL/min

0.5mL/min

0.6mL/minothers*LC溶出法により流速が違う場合の回答は、Othersに含みました

その他
・委託者の指定による・作業効率を上げるため・カラムの耐圧と分析時間の高速化
・ミキシングデッドボリュームを考慮
・自分の中で基本の条件なので、その後でモディファイしやすい

6th JBF Symposium, DG2014-0782

キャリーオーバー6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum83

Japan Bioanalysis Forum

Carryover原因追究フロー※ To confirm how many
injections are necessary
in order to eliminate
Multiple Injection ofCarry Overa Blank Sample

No Change

Increase the injection
volume ofthe above blank sample
Enhancementof the intensity

Needle(outside)

Investigate by changing to …
・ Run gradient without injection(Disconnect AS or Optional inj. mode) or・ Multiple gradient cycles per 1 run

Peak notdetected

No Change

Injector(Needle(inside),
Valve,Loop,
Joints, …)
6th JBF Symposium, DG2014-07

Peakdetected

http://bioanalysisforum.jp/

Decrease

Column(Frit, Guard,
Material…)
84

Japan Bioanalysis Forum

推奨法：キャリーオーバー対策
Needle
洗浄条件の最適化

脂溶性が高いもの水/メタノール/アセトニトリル/2-プロパノールをベースとし，
2-propanolの比率，アセトニトリルの比率を上げていく。
必要があれば酸を加える。
水溶性が高いものpHの検討を行う。
保持のためにpHを調整している場合，塩抜きも効果がある。

http://bioanalysisforum.jp/

・ 洗浄液量，回数を増やす。
・ 洗浄液検討（化合物の溶解性を考慮する）

・ 内部洗浄の使用
これだけで解決することは稀だが，効果がある場合もある。
6th JBF Symposium, DG2014-0785

Japan Bioanalysis Forum

推奨法：キャリーオーバー対策
Column (Frit, Guard, Material…)
・ 初期溶媒比率を上げる。
・ 洗浄用グラジエントを測定用グラジエントの後に追加する。

カラムの交換・変更
・ 担体への吸着が疑われる際は，カラムケミストリの変更，新品への交換の他，ある程度使用済みのカラムへの交換が有効な場合もある。

移動相の変更

http://bioanalysisforum.jp/

グラジエント変更

・ 化合物の溶解度を考慮して変更する。

6th JBF Symposium, DG2014-07

86Japan Bioanalysis Forum

推奨法：キャリーオーバー対策
Injector (Valve, Needle，Loop, Joints…)
・洗浄又は交換後，挙動を確認する。
新品への交換の他，ある程度使用済みのパーツへの交換が有効な場合もある。
測定ごとに交換することを意図するものではない。
・コーティングや材質の異なるパーツが入手できる場合は検討してみる。

移動相の変更

http://bioanalysisforum.jp/

各パーツの洗浄・交換

・ 化合物の溶解度を考慮して変更する。

6th JBF Symposium, DG2014-07

87

Japan Bioanalysis Forumキャリーオーバー
AnswerCounts

Yes

71

No

1

＜引き起こさない理由＞
・オートサンプラーのWashパラメータ設定で（ほぼすべて）解決可能
・十分な洗浄で回避可能

Q７７．LLOQの何％から対応しますか？
5～10％
19.4%

Others6.9%

10～15％
29.2%

回答数：72件20％≤
27.8%
15～20％
16.7%

http://bioanalysisforum.jp/

Q７６．経験はありますか？

＜その他コメント＞
・実試料を多数分析する際，増加する可能性も考慮し5%未満でも対応
・検量線の基準値から頻繁に逸脱した場合

6th JBF Symposium, DG2014-07

88

Japan Bioanalysis Forumキャリーオーバー
Q７８．キャリーオーバーに対応する基準値の理由は？
回答数：43件

http://bioanalysisforum.jp/（複数回答可）6th JBF Symposium, DG2014-07

89

Japan Bioanalysis Forumキャリーオーバー
Q７９．原因の追究の手順をお持ちでしょうか？

手順をお持ちな場合，可能な範囲で教えてください
No.

Comment

1
2
3
4
5
6

空打ち（ Injバルブのみ作動）→ブランク注入→ブランク注入（複数回）
流路、カラム、インジェクター、測定機器
どこに吸着するかを特定してパーツを変えるか、溶解成分を移動相に添加する洗浄液の検討、グラジエントをアイソクラティックへ変更、カウンターイオンを検討
注入部、カラム、配管などを順に検討
手あたり次第に試行錯誤する。

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

回答数：70件

90Japan Bioanalysis Forumキャリーオーバー
回答数：88件

http://bioanalysisforum.jp/

Q８０．原因箇所はどこが多いとお考えですか？
また，除去法は？（複数回答可）＜除去法＞
・原因パーツの洗浄，交換・初期溶媒比率変更
・洗浄液・移動相・カラムの変更
・グラジエントプログラムに洗浄工程を組み込む

6th JBF Symposium, DG2014-07

91

Japan Bioanalysis Forumキャリーオーバー

より溶解度の強い有機溶媒， +酸 or塩基
50％メタノール水溶液
メタノール＋酸
メタノール，アセトニトリルに酸（ぎ酸， TFA，酢酸）の添加
IPA
アセトニトリル，2-プロパノール，水，ギ酸の混液
2-プロパノール／アセトニトリル／水混液（ 5： 1： 1）
有機溶媒の混液（アセトニトリル /メタノール）組成は、化合物によって調整
2-プロパノール、 pHを調整する。
アセトニトリル/メタノール/2-プロパノール/0.1%ギ酸水溶液の等量混合液を使用。
メタノール /イソプロパノール
酸添加溶液と 50%イソプロパノール
移動相の塩抜きサンプル溶解液から、酸あるいは塩基除いた組成
水 /MeOH/iPrOH/MeCN 1/1/1/1
水／アセトニトリル／イソプロパノール混液
70%アセトニトリル
アセトニトリル

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Q８１．オートサンプラーニードルの第一選択の洗浄液があれば教えてください(自由コメント)

92

Japan Bioanalysis Forumキャリーオーバー
Q８２．除去できなかった場合の対処方法について（複数回答可）http://bioanalysisforum.jp/

回答数：78件＜その他コメント＞
・カラムスイッチ
・ブランク試料の注入
・Wash溶液として溶媒のみでなく，ブランク試料の除タン上清もおくと影響を小さくできる事が多い
・検体の間に溶媒バイアルをセットし毎回検体をサンドイッチして注入・移動相条件とカラムの変更（物性に合わせて移動相の初期条件を変更）
・一定エリアのピークが消えない際，サンプル濃縮で対応（スプリッター使用で頭打ちを防ぐ）

6th JBF Symposium, DG2014-07

93

Japan Bioanalysis Forumキャリーオーバー
Q８２．除去できなかった場合の対処方法について例）検量線範囲1～1000 ng/mLの分析法において1000 ng/mL注入後，0.25 ng/mL相当のキャリーオーバーが起こる場合
Validation報告書にLLOQの25%のキャリーオーバーが起こることを記載し，実測定の計画書またはSOPに，分析法としてキャリーオーバーの懸念があること，
X番目のピークエリアからX+1番目のピークエリアへの影響を評価し，影響がある場合は当該サンプルを再測定することを記載しておく．

http://bioanalysisforum.jp/＜その他コメント＞
・ 事前に測定値に基準を設け再測定を行う

なお，Validation時にキャリーオーバーが無い場合においても，計画書またはSOPに同様の記載をしておくことで万が一の事態にも対処可能

6th JBF Symposium, DG2014-07

94

Japan Bioanalysis Forumキャリーオーバー
回答数：41件

http://bioanalysisforum.jp/

Q８３．対処法の順番を教えてください．

Ranking of approach＜トータルスコアによる対処順位＞①定量範囲変更⇒②オートサンプラー変更，高濃度試料注入後Wash溶液注入⇒④影響の出ない注入順へ変更
6th JBF Symposium, DG2014-07

95

Japan Bioanalysis Forumキャリーオーバー

理由

メーカー，機種名
HTC-PAL，Agilent

洗浄方法，吸着しにくい材質のパーツに変更することが可能．

島津SIL-10A

シンプルで一番よかった

Nexera

3液洗浄

資生堂、Nanospace SI2

超音波洗浄機能があり、一定の効果が認められた。

おそらくWaters製品

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Q８４．キャリーオーバー対策に有効なオートサンプラーがありましたらお聞かせください96測定法（その他）

6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum97

Japan Bioanalysis Forum

マトリクスの影響
Q８５．検討段階におけるマトリクス効果の評価法について
number of responses
お聞かせ下さい（複数回答可）
回答数：70件
050
12post column infusion
Not evaluated the matrix effect2

Q８６．マトリクスの影響がある場合（マトリクスファクターが1にならなかった場合），除去は試みますか？
Others
6%

No
3%
No**
15%

回答数：71件

Yes
38%
No*
38%

その他
・大量かつ連続測定では，検討では読めない変化がある可能性が高いため，エフェクトが無い
条件を一度は詰めて見る・ケースバイケース；2件

http://bioanalysisforum.jp/

64

Quantitatively evaluation using the sample containing plasma or not

No*:When it have no influence on determined value
No**：When it is normalized by internal standard

6th JBF Symposium, DG2014-07

98

Japan Bioanalysis Forum

マトリックスの影響
Q８７．マトリックスの影響がある場合，その除去方法についてお聞かせ下さい（複数回答可）
5

10

15

20

25

Cange of gradient method

26

Change of mobile phase21

Change of pretreatment method

29

Change of analytical column
OthersNo Experience30

21

http://bioanalysisforum.jp/

number of responses
01
4
回答数：40件

6th JBF Symposium, DG2014-0799

Japan Bioanalysis Forum

マトリックスの影響
Q８８．マトリックス効果に対する対処順番を教えてください（順位づけ）

number of responses
5

Change of gradient method

10

5

1st

2nd

4

3
9

Others 1 1 1

17

4th

40

5

4
4

6

10

13

3

3

13
3rd

35

17

8

2 1

30

14

18
1

25

11

Change of pretreatment method

No Experience20

13Change of mobile phase

Change of analytical column

15

http://bioanalysisforum.jp/

0

2
11
5

16
23

5th

6th

NA
回答数：39～40件＜トータルスコアによる対処順位＞①グラジエント変更⇒②前処理変更⇒③移動相変更⇒④分析カラム変更
6th JBF Symposium, DG2014-07100Japan Bioanalysis Forum

測定法（その他）
Q８９．保持時間，測定時間（run time）の目安はありますか？
Number of responses
40

Retention time

40

Run time

44

Set a target

4

Set a criteron

22
4

13

80
回答数：66件
回答数：61件

Not determined＜コメントより＞保持時間
・ k = 2，3-4，または5と各社まちまち。(k; capacity factor)
・ kを使わない場合，測定時間の半分を目安とされているようであった。

http://bioanalysisforum.jp/

0

測定時間・ 5分以内または10分以内を目安にというものが主であった。
・ 複数成分分析時は15分との意見もあった。
6th JBF Symposium, DG2014-07

101

Japan Bioanalysis Forum

測定法（その他）
Q９０．LLOQピークの高さの目安はありますか？
回答数：75件

S/N ratio
72.0%＜その他コメント＞
・ Area 3000 count・ SNより、ISからのコンタミ等その他の要因で決まることも多い
・ intensity 300以上
・ 見た目とLLOQのQC試料の定量性で判断しています．
・ 結果的にだいたいS/N＝50位で感度を留めることが多い
・ S/N比5以上だと安心できるが、こだわりません
・ バックグラウンドとの比較で判断・ API5000(AB SCIEX)であれば高さとして1000程度
6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

notdetermined
16.0%

others12.0%102Japan Bioanalysis Forum

測定法（その他）

・マトリックス中の夾雑物質の違い
・定量濃度範囲を変更することがある・臨床では非臨床より高感度で測定する場合がある
・ヒトサンプルの測定経験なし

Q９２．変更している場合，その理由は？
number of responses
05Work efficiency
6
Environmentally friendly
6
Routine use
6
Improve sensitivity
Designation by outsourcer
1
Improve robustness
Compound's property
3
Effect of metabolites
Differ in development section of analytical method
7
Differ in test facility
2
Improve throughput
3
Others1
6th JBF Symposium, DG2014-07

1015

http://bioanalysisforum.jp/

Q91.非臨床（動物）と臨床（ヒト）で測定法（分析条件）は変更していますか？ 回答数：40件 ＜その他コメント＞
・委託者の指定による

20

17
18
9

103

Japan Bioanalysis Forum

測定法（その他）
Q９３．ISRが導入されて，測定法（分析条件）に関して以前と変更したことはありますか？
Use of longer
columun2.5%

No change
67.5%

Considerationof matrix effect30.0%

http://bioanalysisforum.jp/

回答数：40件

Use of longer
analysis time
for separating
obstructive
impurities
5.0%

Use of near
neutral mobile
phase
2.5%

6th JBF Symposium, DG2014-07

104

Japan Bioanalysis Forum

測定法（その他）
Q９４．測定法（分析条件）における高感度化の検討を行う
際の第一選択を教えてください（順位づけ） 回答数：41～42件
number of responses
20

40

Change to high-sensitivity MS

18

Change to high pressure resistance LC 1 4

6

3

6

4 1

17

Change of column length 1 3

7

4

6

3 1

17

Change of flow rate

3

Change of mobile phase

2

15
5

Increase of injection volume
Column switching method
1st

2nd

11

9

7

Others 11 2 4
3rd
4th
5th

4

13

19
2 3

2 3

6

14
7th

8
3

8th

5

3 12 2
14

15
6th

3

15

8

5 12

http://bioanalysisforum.jp/

0

18
NA

＜トータルスコアによる対処順位＞①注入量変更⇒②高感度機へ変更⇒③流速変更⇒④移動相変更⇒⑤カラム長変更⇒⑥高圧LCへ変更⇒⑦カラムスイッチング
105
6th JBF Symposium, DG2014-07

Japan Bioanalysis Forum

測定法（その他）









N-oxideやacyl glucuronideは不安定であり、溶出位置がaglyconeに近く、妨害になりやすい。標品や投与試料がない場合にどうしようもないが、もし分離しやす
い条件が経験的に知られているなら採用したい。
前処理の労力が大きいメソッドが多く，1日当たりの処理検体数が向上しないことが，1つの悩みです。
少しくらい悩むのが楽しい。
複数の物質を同時測定するときに、イオン化効率に差異があって定量範囲が合わないこと
検量線が頭打ちになった際の対処手順 ・核酸，ペプチド等の構築手順
物性の異なるものの同時測定，ペプチドの分析，高極性化合物（HILICが使えな
かった場合の測定法構築）

http://bioanalysisforum.jp/

Q９５．測定法の構築に関する疑問・悩みがありましたら教えてください（１）

最近は新しいカラムがどんどん出ているので、試すだけでも大変。実は、測定に関しては、前処理ほどセオリーが通用しないような気がする

6th JBF Symposium, DG2014-07

106

Japan Bioanalysis Forum

測定法（その他）LC-MSの場合、前処理・移動相条件はイオン化との兼ね合いだと思いますが、今回のアンケートではイオン化に関する条件設定がありませんでした。
現在、ガイドラインでは要求されない、いわば「nice to do」のバリデーション項目が提案されては、結局「測定法開発段階で確認しましょう」という落としどころで結論されています。実際にこれらは対応されているのかどうか知りたいです。
P-Iにおけるヒト血漿中薬物濃度の定量において代謝物による定量妨害や、backconversionの影響を事前に予測したり（in vitro試験をどれだけ信頼するか、代謝予測ソフトを使うか、動物in vivo試料を使うか）、サンプル入手後に検討したりしたい（ほとんど可能性のないようなキラル変換も確認するか、HPLC保持時間を
ゆっくりとって妨害の有無を検討するか、など）と思うのですが、他社の様子を知りたいです。

http://bioanalysisforum.jp/

Q９５．測定法の構築に関する疑問・悩みがありましたら教えてください（２）複数化合物同時分析において、（通常は等量を混ぜて評価）、濃度差が大きい倍に生じる現象（相互変換やキャリーオーバー、分離）をどう評価するかがいつも悩みます

6th JBF Symposium, DG2014-07

107

MSの選択6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

108

Japan Bioanalysis Forum

MSの選択
Q96.第一選択のMSはありますか？
メーカー
Waters8.3%
AB SCIEX
91.7%

AB SCIEX機種
回答数：22件

Others31.8%
TQ5500or 6500
13.6%

その他
・再現性が高い・高感度であるため・頑健性が高く，信頼しているから．
・世界中メソッドの移管が楽だから（同型機をみつけやすい）

6th JBF Symposium, DG2014-07

API4000
40.9%

http://bioanalysisforum.jp/

回答数：24件

API5000
13.6%

109

Japan Bioanalysis Forum

MSの選択
メーカー
回答数：14件

OthersThermo 7.1%
21.4%
Waters14.3%

AB SCIEX
57.1%

その他
・Thermo
分解能を細かく設定できるので，妨害ピークを回避できることがある
API5000と比べて頭打ちしづらく高濃度領域が取りやすい・Waters
UPLC接続のため分析時間が短い
6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Q97.第二選択のMSはありますか？

110Japan Bioanalysis Forum

MSの選択

 OrbiTrap velos→代謝物構造推定のため．
 代謝物の構造決定に高分解能MSを用いていた．代謝物量を見積もるた
めにピーク面積を算出したことはあったが，きちっとした定量に定性用MSを用いたことはない．

Q99 ．定量にイオンモビリティーまたはイオントラップ機能を用いたことはありますか？
 MSは目的に応じて使い分けるべき．
 医薬品の申請には使わないが、結構高感度で簡単に測定できた．
 バックグラウンド低減のために使用し，十分な効果が得られた．
 MRM3の定量性について他社から情報を得たい．
6th JBF Symposium, DG2014-07

http://bioanalysisforum.jp/

Q98 ．定量に高分解能MS（HRMS）を用いたことはありますか？

111