Japan Bioanalysis Forum

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DG2018-35

10th JBF Symposium

1Japan Bioanalysis Forum

DG2018-35 メンバー
石井 琢帆（サンプラネット）
Takuho Ishii

保坂 信哉（科研製薬）

植田 あゆみ（新日本科学）
Ayumi Ueda

加藤 尚志（バイオタージ）

真弓 剛（全星薬品）
Tsuyoshi Mayumi

安田 穣（TRC）

Hisashi Kato

Yutaka Yasuda

中井 直子（第一三共）

山川 達也（富士フィルム）

Naoko Nakai

Tatsuya Yamakawa

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Shinya Hosaka

丹羽 誠（日本化薬）
Makoto Niwa

10th JBF Symposium, 20192

Japan Bioanalysis Forum

DG2018-35の取り組みについて
生体試料中薬物濃度分析法の あとでセク
ションAの真度及び精度の基準の設定方法において内容に整測定対象の標品がない場合においても合させる
より合理的な判断を実施するため、統計学的観点より「不確かさ」を指標に、既存の概念（真度および精度)にとどまらないアプローチを含めて代謝物定量の戦略を構築し、提案する。

http://bioanalysisforum.jp/【DG2018-35 目的】【不確かさ】
正確に知ることのできない「真の値」を基準とした「誤差」を用いずに統計処理や実際の測定値を利用し「真の値が存在する可能性の高い範囲」を推測した値の事。
10th JBF Symposium, 20193

Japan Bioanalysis Forum

DG2018-35の取り組みについて• 生体試料中薬物濃度分析法のバリデーション[a-c]において一般に精度15%以内（LLOQにおいて20%以内）、真度85%から115%（LLOQにおいて80%から120%）という基準（クロマトグラフィー法の場合）が設けられているが、その設定根拠まではガイドライン・ガイダンス等に明示されていない。
• 本邦のガイドライン[a]では，特別な分析方法を用いる場合や得られた濃度情報の使用目的によっては，科学的な判断に基づき，あらかじめ妥当な判断基準を設定する等，柔軟な対応を考慮することが必要であるとされているが、判断基準の設定
方法についてはコンセンサスには至っていない。
• JBF-DGとして、真度及び精度の基準の設定方法について
2017年度（9 th JBF）は、標品がある場合の濃度測定を想定して考察し2018年度は、標品が無い場合を想定し、引き続きDGのテーマとして設定した。

http://bioanalysisforum.jp/【背景】[a] 厚生労働省医薬食品局審査管理課長通知：「医薬品開発における生体試料中薬物濃度分析法のバリデーションに関するガイドライン」について、平成25年7月11日 薬食審査発0711第1号[b] Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research(CDER),Center for Veterinary Medicine (CVM), May 2001.
[c] Guideline on bioanalytical method validation. 21 July 2011, EMEA / CHMP / EWP /192217 /2009 Rev. 1 Corr. 2 Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP).

10th JBF Symposium, 20194

Japan Bioanalysis Forum

DG活動内容目的に応じた適切な分析方法[1] P. Timmerman et al., Tiered approach into practice:scientific validation for chromatography-based assays inearly development – a recommendation from the European
Bioanalysis Forum. Bioanalysis (2015) 7(18): 2387-2398.

EBF white paper [1] in vitro試験 [2]7 th JBF
詳細な読み込みを実施[2] B. Buscher et al., Bioanalysis for plasma protein
binding studies in drug discovery and drug development:
views and recommendations of the European Bioanalysis
Forum. Bioanalysis (2014) 6(5):673-82.

（DG2015-16）

日本の実態に照らした適否も含めアンケート調査を実施・評価
結果をもとにDGメンバーで考察

8 th JBF（DG2016-20）

代謝物の定量精度がどの程度であれば10%ルールの判断可能か？

（ MIST/ICH-M3対象となるか否か)
生体試料中薬物濃度分析法の真度及び精度の基準の設定方法について
９th JBF（DG2017-28）･（標準物質がある前提）「Full Validation していない代謝物の分析法の取り扱い」を考察

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確認 ＆ 議論 するにあたり・・・･（標準物質がない前提）
10 th JBF
既存の概念（真度および精度)にとどまらないアプローチ （DG2018-35）を含めて代謝物の定量戦略を構築し，提案する10th JBF Symposium, 20195

Japan Bioanalysis Forum

一般的な代謝物定量化までの流れ
非臨床試験

ヒト代謝物
生成量-予測

ヒト代謝物 予測
（種類）

臨床試験

代謝物 特定極微小ピークまで
全て定量化は難しい。

見積もりの不確かさについての判断は？

ヒト代謝物
生成量-概算不確かさを知れば
代謝物定量化判断を合理的に出来るのでは？

定量化判断

ヒト代謝物 検索

段階的に

構造解析

定量化判断

代謝物
標品合成

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情報

代謝物検量線作成・定量化

曝露量検討

代謝物定量法
Full Validation
10th JBF Symposium, 20196

１．臨床試験における代謝物チェックのストラテジー
標品が無い場合にも10 th JBF
（DG2018-35）

より速い段階で「Full Validation＆MIST対応が必要か否かの判断」
を「高い確度」で行うことは出来ないか？

10th JBF Symposium, 2019http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

7

Japan Bioanalysis Forum

臨床試験における代謝物チェックのストラテジー
7－9 th JBF
1. First In Human study における代謝物の探索的測定のデータで最初のチェックを行う
2. 段階的にQualified method等で代謝物を定量
3. ヒト HOT ADMEのデータで10％ルールの評価
4.（3の結果を受け）【ICH-M3】(10%ルール)
Full Validated Methodによる代謝物測定実施要不要の最終判断を実施 ヒトでみられた代謝物を非臨
床試験で特徴づける必要が
5.（4の結果を受け）あるのは、その代謝物の臨床での曝露量が、投与薬物に
HOT ADMEのデータで10％超となれば関連する総ての物質の曝露
Full Validated Methodを作成し量の10％ を超え、かつ、ヒトにおける曝露量が毒性試験
代謝物を測定してでの 最大曝露量よりも明ら
ヒトと動物の代謝物濃度を比較する
かに高い場合のみである。
10th JBF Symposium, 2019http://bioanalysisforum.jp/

本Discussion Groupが妥当であると考える「代謝物チェックの流れ」

8Japan Bioanalysis Forum

臨床試験における代謝物チェックのストラテジー
3.の「HOT ADMEでの比較」を実施すれば間違いのない最終判断が出来るが、その前に判断を実施したい。
毒性試験実施時期等を考えると、HOT ADMEの結果を待っていられない場合もあるのでは？

HOT ADMEの結果を待たずに、Full Validation測定実施の要･不要を早期に繰り上げ判断する事は可能か？

客観的かつ合理的に判断する方法、ストラテジーをDGで検討（標準物質がある場合）
昨年度DGで討議＞結果および方向性 DGが提示

９th JBF（DG2017-28）（標準物質がない場合）

本年度DGで討議＞どのように判断するか？
（ポスター）2. 代謝物の曝露量見積もり
3. 標品が無い代謝物定量時の不確かさ評価

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HOT ADMEは開発の初期に実施することは難しい。

10 th JBF
（DG2018-35）

9Japan Bioanalysis Forum

臨床試験における代謝物チェックのストラテジー
10 th JBF
7－9 th JBF（標準物質がある場合）（標準物質がない場合） （DG2018-35）
標品がある場合（動物血漿で検出されている等）標品がない場合（未知代謝物検索を含む）
動物血漿で検出されている 等
未知代謝物を含む
代謝物検索

100
未変化体
代謝物１
10

Intensity

Concentration

未変化体
代謝物1

7th JBF Symposium, 2016

代謝物2９th JBF1

0.1
0（標品がある場合）
昨年DGの討議結果でなんとなく方向性は
4
8
12
16
20
24
Time
確認可能。＞去年のDGを紹介
標品合成／定量（DG2017-28）

検体
Blank

Time

代謝物検索と探索的な測定方法（標品が無い場合）で定量サイクルを回す。
代謝物検索と探索的なメソッドでの定量サイクルを回す
どうやって大きそうだと判断するか？
代謝物曝露が未変化体の10%を標準物質がない場合にも代謝物曝露が未変化体の10%を超える恐れがある場合は段階的に測定メソッドをQualified＞今年の議題 パートBCへ
超えるおそれがある場合には、段階しながら定量を継続
3を待たずに、的に測定MethodをQualifiedし １＆２の結果だけでながら定量を継続
10th JBF Symposium, 2019http://bioanalysisforum.jp/

1000

10

2．代謝物の曝露量見積もり
標品が無い場合にも10 th JBF
（DG2018-35）

より速い段階で「Full Validation＆MIST対応が必要か否かの判断」
を「高い確度」で行うことは出来ないか？

10th JBF Symposium, 2019http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

11

Japan Bioanalysis Forum

代謝物の曝露量見積もり【一般的に用いられている主なアプローチ】
1．UV
先行型
1. UV 先行型
 UVにて投与前後の試料を比較（投与前にはないピーク：代謝物候補） UVとマスクロ取得 → 該当ピークのMSスペクトル作成→ 分子量 → MS/MS（構造を知る）

２．精密質量MS 先行型
 精密質量MSのフルスキャンからXIC → Data-dependent MS/MS
 化合物がUV吸収をほとんど持たない場合や、血中濃度が低くUVでは検出困難な場合にも適用可能

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標品のない代謝物の定量戦略

3．Predicted
2. Predicted SRM型
SRM型
 Predicted SRM→そのまま同プラットフォームでQualified method
10th JBF Symposium, 201912

Japan Bioanalysis Forum

代謝物の曝露量見積もり【一般的に用いられている主なアプローチ】
UV：被験者の投与前後の血漿との比較
↓MS：該当ピークのMSスペクトル取得↓
MS/MS：構造を知る
場合によってMSn

精密質量MS 先行型

Predicted SRM 先行型

精密質量MS：

代謝物予測ソフトで予測した代謝物↓

フルスキャンからXIC↓

MS/MS：
Data - dependent
MS/MS 実施

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UV 先行型

Predicted SRM：
条件生成
↓
測定

（特徴的SRMで、投与前には無いピーク）

得られた情報を基に代謝物を合成
一致するかを確認

状況により UVピーク・MSレスポンス
から量の見当をつける場合あり

合成品による定量化へ
10th JBF Symposium, 2019

10th JBF

標品無しでの見当づけがどの程度信頼できるか（DG2018-35）

13Japan Bioanalysis Forum

代謝物の曝露量見積もり
バリデーション未実施の代謝物の定量化（DG2017-28）

バリデーション未実施でも検量線作成、定量して検討をつける。
標品のない場合

10 th JBF
（DG2018-35）

研究現場としては、標品がない場合でも定量的に代謝物を評価したい。
→Qualified methodとしたい。
（可能であれば標品合成も）評価の妥当性に悩むよりも標品合成した方が良いのではないかとの意見あり。
（⇒標品合成についてDG検討）

UV(MS)について
UV(MS)ピークから量の見当をつけ、量が多ければ標品合成を推奨。
UVでモル吸光係数（MSでイオン化効率）が維持されている、という仮定
はどのくらい正しいか。
仮定については経験や化学的視点から考えると良いかも。

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標品のある場合

９th JBF（⇒ 定量性および、Radio-HPLC（以下ラジオ）との紐付けについてDG検討）
14

Japan Bioanalysis Forum

代謝物の曝露量見積もり「UVで代謝物のモル吸光係数が維持されている」という仮定はどの程度正しいか
未変化体の検量線傾きa、 代謝物の検量線傾きa’※ISが共通であれば傾きはそのまま使用
未変化体回収率b、代謝物回収率b’
推定レスポンス比 (a’*b/a*b’)を求めてみる
回収率を考慮して補正した代謝物のレスポンス(a’/b’)が未変化体レスポンス(a/b)の何倍か

検討内容：論文選択基準

a’は分子量補正し，(a’ b)/ (ab’)がモル吸光係数の比となるようにした

データベース：PubMed データ抽出ルール（概要把握のため）：複数マトリックスある場合は一番初めに登場する（一番関心が高い）データ，
回収率は濃度依存性がないことを確認後，高濃度の数値を代表として使用．
2013年～2018年
検索式 (‘metabolite’ ‘liquid chromatography’ ‘reversed
phase’) NOT ‘mass spectrometry’
蛍光検出をマニュアル除去、UV検出を選択
検量線パラメータ、回収率の記載がある文献を選択

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検討内容：公知論文からの解析

15

Japan Bioanalysis Forum

代謝物の曝露量見積もり
出
典

波長
nm

未変化体

未変化
体MW

代謝物
MW

a

b

代謝物

a’

b’

(a’ b)/
(ab’)

1

238

Risperidone

410.49426.490.0193

0.93

9-OH体

0.0154

0.92

0.805

2

325

Columbianadin

328.36246.260.28040.8535エステル脱離体*

0.13610.85370.485*

3273

Caffeine

194.19180.160.508

0.9328

脱メチル体

0.484

0.9493

0.937

4

243

Toltrazuril

423.41455.41

674

0.944

スルホン体

460

0.900

0.716

423.41439.41

スルホキシド体

688

0.914

1.06

5

335

Lumefantrine

528.94472.830.00130.8780脱ブチル体

0.00130.9220

0.921

6

280

Tamoxifen

371.52357.500.006470.755

N-脱メチル体

0.0201

0.860

2.73

371.52387.524-水酸化体0.05457

0.958

0.664

371.52373.50Endoxifen

0.0122

0.805

1.76

http://bioanalysisforum.jp/「UVで代謝物の吸光度が維持されている」という仮定はどの程度正しいか

a: 未変化体の検量線傾き a’: 代謝物の検量線傾き b: 未変化体回収率 b’ 代謝物回収率* 代謝で脱離した側に共役二重結合有り
a’は分子量補正し，(a’ b)/ (ab’)がモル吸光係数の比となるようにした

赤字は大きく変化した値

概ね、酸化、脱アルキルなどの代謝によって大きくは変化しない（代謝物は未変化体の1.0±0.4倍程度）が場合により大きく動くことがある．

16

Japan Bioanalysis ForumUVレスポンスの引用文献[2] Zhang YB, Yang XW, “Tissue distribution study of columbianadin and its active
metabolite columbianetin in rats “ , Biomedical Chromatography 2016 30:2, 256-262.
[3] Begas E, Kouvaras E, Tsakalof AK, Bounitsi M et al., “Development and validation of areversed-phase HPLC method for CYP1A2 phenotyping by use of a caffeine metabolite
ratio in saliva”, Biomedical Chromatography 2015 29:11 1657-1663.
[4] Zheng W, Jiang Z, Zhang L et al., “Simultaneous determination of toltrazuril and its
metabolites in chicken and pig skin+fat by UPLC-UV method”, Journal of Chromatography
B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 2014 972, 89-94.
[5] Khuda F, Iqbal Z, Shah Y et al., “Method development and validation for simultaneous
determination of lumefantrine and its major metabolite, desbutyl lumefantrine in humanplasma using RP-HPLC/UV detection”, Journal of Chromatography B: Analytical
Technologies in the Biomedical and Life Sciences 2014 944, 114-122.

http://bioanalysisforum.jp/[1] Mandrioli R, Mercolini L, Lateana D et al., “Analysis of risperidone and 9hydroxyrisperidone in human plasma, urine and saliva by MEPS-LC-UV “, Journal of
Chromatography B, 2011 879, 167–173.

[6] Antunes MV., Rosa DD., Viana TDS et al., “Sensitive HPLC-PDA determination oftamoxifen and its metabolites N-desmethyltamoxifen, 4-hydroxytamoxifen and endoxifen
in human plasma”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2013 76, 13-20.

10th JBF Symposium, 201917

Japan Bioanalysis Forum

代謝物の曝露量見積り
MS：未変化体で代替した検量線での評価はどの程度信頼できるか？



未変化体検量線（代替検量線）で代謝物を定量するとした仮定でのケーススタディ（文献1）⇒ MSの代謝物レスポンスは未変化体レスポンスの0.014～8.6倍で大きな変化幅があり、そのまま代替検量線とはできない。
放射性標識体データを利用して代謝物定量のための補正を行っている事例（文献2, 3）
⇒ MSについては、未変化体検量線（代替検量線）で代謝物を定量することはできず、代謝物定量のための補正が避けられない。

http://bioanalysisforum.jp/

検討内容：公知論文にみられる検討[1] Hatsis P, Waters NJ, Argikar UA, Implications for metabolite quantification by mass spectrometry in the absence ofauthentic standards. Drug Metab. Dispos. 2017; 45(5): 492-496.
[2] Tozuka Z, Aoyama S, Nozawa K, et al., Comprehensive quantitative and qualitative liquid chromatography-radioisotopemass spectrometry analysis for safety testing of tolbutamide metabolites without standard samples. J. Pharm. Sci. 2011;
100(9): 4024-36.
[3] Gong Y, Chen J, Shi Y et al., Standard-free bioanalytical approach for absolute quantitation of drug metabolites utilizing
biosynthesis of reciprocal radio and stable isotopologues and its application. Anal Chem. 2017; 89(16): 8399-8404.

10th JBF Symposium, 201918

Japan Bioanalysis Forum

代謝物の曝露量見積り
代替検量線の妥当性についての小括【一般的に用いられている主なアプローチ】
精密質量MS 先行

Predicted SRM

 代謝物レスポンスは未変化体レスポンスと大きく異なる場合が多い 未変化体検量線での代謝物定量は適切でない
 代謝物グループ分け（物性の近いもので代替検量線を作る）は避けられない

UV 代替検量線

UV 先行

 代謝物レスポンスは概ね未変化体の 1.0±0.4 倍程度
 だが場合により大きく動く⇒ どの程度推奨できるか？

上記2つとラジオを組み合わせる事によって、レスポンスと絶対量（濃度）の関係を知ることが出来る
ラジオによるUV、MSレスポンスの補正

http://bioanalysisforum.jp/

MS代替検量線

 真度は格段に良くなるが精度はどうか，「見当付け」にそこまで必要か ⇒値付けは推奨できるか？

課題を包括的に扱うため，
不確かさの概念を取り入れて検討することにした19

Japan Bioanalysis Forum【不確かさ】とは• 「誤差」は、「真の値」からのズレ値と定義されてきたが「真の値」は誰にもわからないため、
厳密には「誤差」を求めることは不可能。 （「真の値」はJIS Z8103に定義)• 「不確かさ」は、測定全体の各手順において測定値のばらつきを引き起こす様々な要因について評価し統計的な処理を行うことでhttp://bioanalysisforum.jp/• 「不確かさ」は、正確に知ることのできない「真の値」を基準とした「誤差」を用いずに統計処理や実際の測定値を利用し「真の値が存在する可能性の高い範囲」を推測した値の事。

「真の値」が存在しうる範囲として求められる。
10th JBF Symposium, 201920

3．標品が無い代謝物
定量時の不確かさ評価
標品が無い場合にも10 th JBF
（DG2018-35）

より速い段階で「Full Validation＆MIST対応が必要か否かの判断」
を「高い確度」で行うことは出来ないか？

10th JBF Symposium, 2019http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

21

Japan Bioanalysis Forum

標品が無い代謝物 定量時の不確かさ評価
不確かさ試算を如何に行うか 真度・精度を議論するには、生データレベルでのリアルデータが必要。
しかし，各社のデータを発表することは難しい。
 不確かさを導入することで、実際の個別代謝物定量値が得られていない状況でも、公知論文等も参照しつつ、一般的な経験値を基に議論を重ねる事が出来る。
 標準偏差で検討していけるメリットはDGにとって大きい。

代謝物定量の不確かさを評価し本当に代替検量線では目的を達しないのか
目的を達成するためには何が重要なのかを検討することにした。

http://bioanalysisforum.jp/

不確かさ導入の意義

10 th JBF

今回のDGでは、UVとラジオを用いた定量における不確かさを比較し、評価する。

（DG2018-35）

22

Japan Bioanalysis Forum

標品が無い代謝物 定量時の不確かさ評価
シナリオ1 UVで代謝物を定量化する場合

標準溶液／内標準溶液の調製

不確かさ要因未変化体標準物質 10 mg（又は内標準物質）
溶媒*添加

５桁天秤

（セミミクロ天秤；最小表示 0.01 mg）*溶媒：超純水又はアセトニトリル

メスアップ 10 mL（原液：1 mg/mL）

メスフラスコ

原液 1 mL＋溶媒* → 50 mL（溶液：20000 ng/mL）
溶液（20000 ng/mL) 1 mL＋溶媒* → 50 mL（溶液：400 ng/mL）

ホールピペット
メスフラスコ

標準液濃度
(Cst)
試料中
内標準液濃度(Cism)
標準液中
内標準液濃度(Cis)

http://bioanalysisforum.jp/

代謝物標品無し 未変化体標品あり 未変化体の一点代替検量線使用
内標準物質有り（未変化体用の内標準物質のイメージ）

溶液（400 ng/mL) 2.5 mL＋溶媒* → 100 mL（溶液：10 ng/mL）

10th JBF Symposium, 201923

Japan Bioanalysis Forum

標品が無い代謝物 定量時の不確かさ評価
シナリオ1 UVで代謝物を定量化する場合

不確かさ要因代替検量線試料の調製
標準溶液 100 µL＋内標準溶液 10 µL → 代替検量線用試料

ピストン式
ピペット

血漿試料の調製
血漿 100 µL＋内標準溶液 10 µL ＋メタノール 500 µL

血漿試料
10th JBF Symposium, 2019

試料中
内標準液濃度(Cism)

ピストン式
ピペット

標準液中
内標準液濃度
(Cis)

前処理中
回収率

前処理
回収率
(SP)

フィルターろ過後に窒素乾固
水／アセトニトリル(90/10) 100 µLを加えて再溶解

標準液濃度
(Cst)

http://bioanalysisforum.jp/

代謝物標品無し 未変化体標品あり 未変化体の一点代替検量線使用
内標準物質有り（未変化体用の内標準物質のイメージ）24

Japan Bioanalysis Forum

標品が無い代謝物 定量時の不確かさ評価
代謝物標品無し 未変化体標品あり 未変化体の一点代替検量線使用
内標準物質有り（未変化体用の内標準物質のイメージ）

HPLC-UV 測定

不確かさ要因代替検量線用試料／血漿試料 をHPLCに注入
HPLC移動相：水／アセトニトリル
90/10⇒10/90グラジエント

UVピークレスポンス比を算出
代替検量線用試料（未変化体標準物質／内標準物質）
血漿試料（代謝物／内標準物質）

ピーク強度
測定ばらつき感度ばらつき††未変化体と代謝物の間でモル吸光係数の違いは50％以内であると仮定

代謝物測定値(Rmet)

試料中
内標準測定値(Rism)
未変化体
標準液測定値(Rst)
標準液中内標準測定値(Riss)

レスポンス比
(RR)

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シナリオ1 UVで代謝物を定量化する場合

血漿試料のUVピークレスポンス比：代謝物/内標準物質
標準試料のUVピークレスポンス比：未変化体標準物質/内標準物質

ヒト代謝物濃度＝

血漿試料のUVピークレスポンス比
標準試料のUVピークレスポンス比
10th JBF Symposium, 2019

×標準溶液濃度 10 (ng/mL)25

Japan Bioanalysis Forum

標品が無い代謝物 定量時の不確かさ評価
シナリオ1 UVで代謝物を定量化する場合

代謝物濃度(Cmet)

値

標準
不確かさ

単位

感度係数

標準
不確かさ
(ng/mL)

1.00 ng/mL

1

0.539

Cism*Cst*SP*RF*Riss/(Cis*Rism*Rst)

0.010-Cism*Cst*SP*Rmet*RF*Riss/(Cis*Rism^2*Rst)

0.010-Cism*Cst*SP*Rmet*RF*Riss/(Cis*Rism*Rst^2)

0.010

Cism*Cst*SP*Rmet*RF/(Cis*Rism*Rst)

0.010

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不確かさ要因単位

代謝物測定値(Rmet)

100000

count

1000

試料中内標準測定値(Rism)

100000

count

1000

未変化体標準液測定値(Rst)909000

count

9090

標準液中内標準測定値(Riss)

90900

count

909

標準液濃度(Cst)

9.09

ng/mL

0.076

ng/mL

Cism*SP*Rmet*RF*Riss/(Cis*Rism*Rst)

0.008

試料中内標準液濃度(Cism)

1.00

ng/mL

0.012

ng/mL

Cst*SP*Rmet*RF*Riss/(Cis*Rism*Rst)

0.012

標準液中内標準液濃度(Cis)

0.91

ng/mL

0.010

-Cism*Cst*SP*Rmet*RF*Riss/(Cis^2*Rism*Rst)

0.011

レスポンス比(RR)1

0.5

Cism*Cst*SP*Rmet*Riss/(Cis*Rism*Rst)

0.500

前処理回収率(SP)1

0.2

Cism*Cst*Rmet*RR*Riss/(Cis*Rism*Rst)

0.200

count
count
count

count

ng/mL

26

Japan Bioanalysis Forum

標品が無い代謝物 定量時の不確かさ評価
代謝物測定値(Rmet) ≒ 0%
試料中内標準測定値(Rism)

前処理回収率（SP)14%

レスポンス比（RR)
86%

レスポンス比の見積もりを正確にする
and/or 前処理の再現性向上により代謝物濃度測定の精度向上が可能≒ 0%

未変化体標準液測定値(Rst) ≒ 0%
標準液中内標準測定値(Riss) ≒ 0%
標準液濃度(Cst) ≒ 0%
試料中内標準液濃度(Cism)≒ 0%

標準液中内標準液濃度(Cis)≒ 0%

今回使用を仮定した天秤は、本来の使い方より粗い。
（10 mgを秤量する場合には、６桁天秤が必要。
5桁天秤の精度としては、100 mg単位の桁数しか保障されないので、10 mgの秤量には不十分）

各プロセスの不確かさを評価すると、レスポンス比および前処理回収率以外の要因が結果測定の不確かさに与える影響はごく小さい。

http://bioanalysisforum.jp/

シナリオ1 UVで代謝物を定量化する場合レスポンス比(RR)＝(代謝物レスポンス/内標準物質レスポンス)/(未変化体標準物質レスポンス/内標準物質レスポンス)
実質は代謝物のモル吸光係数／未変化体のモル吸光係数27Japan Bioanalysis Forum

標品が無い代謝物 定量時の不確かさ評価
実際の検討例 （DG2018-35）
10 th JBF

シナリオ1 UVで代謝物を定量化する場合

UVのみで測定した場合

合成標準不確かさ：
各要因の標準不確かさの２乗和の平方根（測定プロセス全体の不確かさそのもの）

1.00 ± 1.08 ng/mLの範囲に存在する。

http://bioanalysisforum.jp/

代謝物濃度(1 ng/mL）に対して
合成標準不確かさ:0.54 ng/mL
拡張合成標準不確かさ：
拡張合成標準不確かさ(k=2):1.08 ng/mL 得られた合成標準不確かさに包含係数（k）を乗じて得られた値
包含係数k=2の場合，全測定値の95 %がこの範囲に含まれることを意味する⇒この時、代謝物の濃度は

 代謝物は最大2.08 ng/mL と見積もられるので、未変化体が20.8 ng/mL以上あればその採血時点における代謝物は95%の確率で10%ルールにかからない。
*ハミルトンプール法（p.39参照）
 これより、プール*後の血漿を測定することでAUCを濃度として評価することができる
 今回試算のUV条件（代替検量線）で、血漿プールのAUC測定値が5%であれば真値10%ではないといえる ⇒ Recommendationの一つ
10th JBF Symposium, 201928

Japan Bioanalysis Forum

標品が無い代謝物 定量時の不確かさ評価
シナリオ2 ラジオ（非臨床）併用、 UV（臨床）で代謝物を定量化する場合

Cold標準溶液／内標準溶液の調製
未変化体標準物質 10 mg（又は内標準物質）
溶媒*添加

不確かさ要因５桁天秤（セミミクロ天秤；最小表示 0.01 mg）*溶媒：超純水又はアセトニトリル

メスアップ 10 mL（原液：1 mg/mL）

メスフラスコ

原液 1 mL＋溶媒* → 50 mL（溶液：20000 ng/mL）
溶液（20000 ng/mL) 1 mL＋溶媒* → 50 mL（溶液：400 ng/mL）

ホールピペット
メスフラスコ

標準液濃度(Cst)
試料中代謝物
ピーク強度(UV)
Rmet,uv
標準液中
内標準
ピーク強度
(UV)
Ris,uv

http://bioanalysisforum.jp/

代謝物標品無し，未変化体標品あり，未変化体の一点検量線使用．代謝物と未変化体のピーク
レスポンス比*の関係をラジオの測定を介して紐づける． *ピークレスポンス比： 代謝物のモル吸光係数／未変化体のモル吸光係数溶液（400 ng/mL) 2.5 mL＋溶媒* → 100 mL（溶液：10 ng/mL）

10th JBF Symposium, 201929

Japan Bioanalysis Forum

標品が無い代謝物 定量時の不確かさ評価
シナリオ2 ラジオ（非臨床）併用、 UV（臨床）で代謝物を定量化する場合

未変化体値付け検量線線用試料の調製
標準溶液 100 µL＋内標準溶液 10 µL → 代替検量線用試料

不確かさ要因ピストン式
ピペット

Hot動物試料の調製
動物血漿 100 µL＋内標準溶液 10 µL ＋メタノール 500 µL
フィルターろ過後に窒素乾固

ピストン式
ピペット

標準液濃度
(Cst)
試料中代謝物
ピーク強度(UV)
Rmet,uv
標準液中
内標準
ピーク強度
(UV)
Ris,uv

http://bioanalysisforum.jp/

代謝物標品無し，未変化体標品あり，未変化体の一点検量線使用．代謝物と未変化体のピーク
レスポンス比*の関係をラジオの測定を介して紐づける． *ピークレスポンス比： 代謝物のモル吸光係数／未変化体のモル吸光係数

水／アセトニトリル(90/10) 100 µLを加えて再溶解

Hot動物試料
10th JBF Symposium, 201930

Japan Bioanalysis Forum

標品が無い代謝物 定量時の不確かさ評価
シナリオ2 ラジオ（非臨床）併用、 UV（臨床）で代謝物を定量化する場合

Cold臨床試料の調製
ヒト血漿 100 µL＋内標準溶液 10 µL ＋メタノール 500 µL

不確かさ要因

標準液濃度
(Cst)

ピストン式
ピペット

試料中代謝物
ピーク強度(UV)
Rmet,uvフィルターろ過後に窒素乾固
水／アセトニトリル(90/10) 100 µLを加えて再溶解

前処理中
回収率

Cold臨床試料

標準液中
内標準
ピーク強度
(UV)
Ris,uv

http://bioanalysisforum.jp/

代謝物標品無し，未変化体標品あり，未変化体の一点検量線使用．代謝物と未変化体のピーク
レスポンス比*の関係をラジオの測定を介して紐づける． *ピークレスポンス比： 代謝物のモル吸光係数／未変化体のモル吸光係数

前処理
回収率
(SP)
10th JBF Symposium, 201931

Japan Bioanalysis Forum

標品が無い代謝物 定量時の不確かさ評価
シナリオ2 ラジオ（非臨床）併用、 UV（臨床）で代謝物を定量化する場合

HPLC-UV 測定

不確かさ要因未変化体値付け検量線用試料を HPLCに注入
HPLC移動相：水／アセトニトリル
90/10⇒10/90グラジエント

UVピークレスポンス比（未変化体標準物質／内標準物質）を算出 ①

ピーク強度
測定ばらつき

標準未変化体ピーク強度(RID)Rst,rid
標準未変化体ピーク強度(UV)Rst,uv
試料中代謝物
ピーク強度(UV)Rmet,uv

標準液中内標準
ピーク強度(UV)Ris,uv

Cold臨床試料を HPLCに注入
HPLC移動相：水／アセトニトリル
90/10⇒10/90グラジエント

ピーク強度
測定ばらつきUVピークレスポンス比（目的代謝物／内標準物質）を算出 ②

10th JBF Symposium, 2019http://bioanalysisforum.jp/

代謝物標品無し，未変化体標品あり，未変化体の一点検量線使用．代謝物と未変化体のピーク
レスポンス比*の関係をラジオの測定を介して紐づける． *ピークレスポンス比： 代謝物のモル吸光係数／未変化体のモル吸光係数

試料中内標準ピーク強度(UV)Rsim,uv

32

Japan Bioanalysis Forum

標品が無い代謝物 定量時の不確かさ評価
シナリオ2 ラジオ（非臨床）併用、 UV（臨床）で代謝物を定量化する場合

UV 測定 ⇒ RID（ラジオ測定）

不確かさ要因動物中未変化体
ピーク強度(RID)
Rsta,rid

ピーク強度
測定ばらつき動物中未変化体
ピーク強度(UV)
Rsta,uv

Hot動物試料 HPLCに注入
HPLC移動相：水／アセトニトリル
90/10⇒10/90グラジエント

UV ピークレスポンスを算出
動物未変化体UVレスポンス③
動物代謝物UVレスポンス④
RID ピークレスポンスを算出
動物未変化体RIDレスポンス⑤
動物代謝物RIDレスポンス⑥※下記比率の割り出しは試料毎に行うと仮定し，内標準物質のレスポンスは使用しない仮定．

等モルでの代謝物／未変化体UVレスポンスの比（⑦）＝（④／⑥）÷（③／⑤）＝（④×⑤）／（⑥×③）

動物中代謝物
ピーク強度(RID)
Rmeta,rid

http://bioanalysisforum.jp/

代謝物標品無し，未変化体標品あり，未変化体の一点検量線使用．代謝物と未変化体のピーク
レスポンス比*の関係をラジオの測定を介して紐づける． *ピークレスポンス比： 代謝物のモル吸光係数／未変化体のモル吸光係数

動物中代謝物
ピーク強度(UV)
Rmeta,uv

ヒト代謝物濃度＝(②／①)×標準溶液濃度10 (ng/mL)÷⑦
10th JBF Symposium, 201933

Japan Bioanalysis Forum

標品が無い代謝物 定量時の不確かさ評価
シナリオ2 ラジオ（非臨床）併用、 UV（臨床）で代謝物を定量化する場合

代謝物濃度(Cmet)

感度係数

標準
不確かさ
(ng/mL)

1

0.206

150

count

2

count

-(SP*Rmet,uv/Rism,uv)*(Ris,uv/Rst,uv^2)*
Cst*(Rsta,uv*Rmeta,rid)/(Rmeta,uv*Rsta,rid)0.010

動物中未変化体ピーク強度(RID)Rsta,rid 50000

count

1500

count

-(SP*Rmet,uv/Rism,uv)*(Ris,uv/Rst,uv)*
Cst*(Rsta,uv*Rmeta,rid)/(Rmeta,uv*Rsta,rid^2)

0.030

動物中未変化体ピーク強度(UV)Rsta,uv 1500

count

15

count

(SP*Rmet,uv/Rism,uv)*(Ris,uv/Rst,uv)*
Cst*(Rmeta,rid)/(Rmeta,uv*Rsta,rid)0.010

動物中代謝物ピーク強度(RID)Rmeta,rid 5000

count

150

count

(SP*Rmet,uv/Rism,uv)*(Ris,uv/Rst,uv)*
Cst*(Rsta,uv)/(Rmeta,uv*Rsta,rid)0.030

動物中代謝物ピーク強度(UV)Rmeta,uv

150

count

1.5

count

-(SP*Rmet,uv/Rism,uv)*(Ris,uv/Rst,uv)*
Cst*(Rsta,uv*Rmeta,rid)/(Rmeta,uv^2*Rsta,rid)0.010

試料中代謝物ピーク強度(UV)Rmet,uv

150

count

1.5

count

(SP/Rism,uv)*(Ris,uv/Rst,uv)*
Cst*(Rsta,uv*Rmeta,rid)/(Rmeta,uv*Rsta,rid)0.010

標準液中内標準ピーク強度(UV)Ris,uv

150

count

1.5

count

(SP*Rmet,uv/Rism,uv)*(1/Rst,uv)*
Cst*(Rsta,uv*Rmeta,rid)/(Rmeta,uv*Rsta,rid)0.010

試料中内標準ピーク強度(UV)Rism,uv

150

count

1.5

count

-(SP*Rmet,uv/Rism,uv^2)*(Ris,uv/Rst,uv)*
Cst*(Rsta,uv*Rmeta,rid)/(Rmeta,uv*Rsta,rid)0.010

標準液濃度(Cst)

1

ng/mL

0.009 ng/mL

0.009

前処理回収率(SP)1(SP*Rmet,uv/Rism,uv)*(Ris,uv/Rst,uv)*(Rsta,uv*Rmeta,rid)/(Rmeta,uv*Rsta,rid)(Rmet,uv/Rism,uv)*(Ris,uv/Rst,uv)*
Cst*(Rsta,uv*Rmeta,rid)/(Rmeta,uv*Rsta,rid)

標準未変化体ピーク強度(UV)Rst,uv

0.2

http://bioanalysisforum.jp/

不確かさ要因標準
単位 不確か 単位
値
さ1.00 ng/mL

0.200

34

Japan Bioanalysis Forum

標品が無い代謝物 定量時の不確かさ評価
動物中代謝物ピーク強度(RID)Rmeta,rid
標準未変化体ピーク強度(UV)Rst,uv ≒ 0%
２%
動物中未変化体ピーク強度
動物中未変化体ピーク強度(UV)Rsta,uv ≒ 0%
(RID)Rsta,rid２%

動物中代謝物ピーク強度(UV)Rmeta,uv ≒ 0%
試料中代謝物ピーク強度(UV)Rmet,uv ≒ 0%
標準液中内標準ピーク強度(UV)Ris,uv ≒ 0%
試料中内標準ピーク強度(UV)Rism,uv ≒ 0%
標準液濃度(Cst) ≒ 0%
前処理回収率(SP) ≒ 0%

各プロセスの不確かさを評価すると、前処理回収率以外の要因が測定結果の不確かさ全体に与える影響はごく小さい。

前処理回収率（SP)94%

http://bioanalysisforum.jp/

シナリオ2 ラジオ（非臨床）併用、 UV（臨床）で代謝物を定量化する場合

前処理の再現性向上により、代謝物濃度測定の精度向上が可能
10th JBF Symposium, 201935

Japan Bioanalysis Forum

標品が無い代謝物 定量時の不確かさ評価
シナリオ2 ラジオ（非臨床）併用、 UV（臨床）で代謝物を定量化する場合

10 th JBF
（DG2018-35）

代謝物濃度(1 ng/mL）に対して
合成標準不確かさは0.21 ng/mL
拡張合成標準不確かさ(k=2)は0.41 ng/mL⇒この時、代謝物の濃度は合成標準不確かさ：
各要因の標準不確かさの２乗和の平方根（測定プロセス全体の不確かさそのもの）

http://bioanalysisforum.jp/

実際の検討例

UVとラジオで測定した場合

拡張合成標準不確かさ：得られた合成標準不確かさに包含係数（k）を乗じて得られた値包含係数k=2の場合，全測定値の95 %がこの範囲に含まれることを意味する

1.00 ± 0.41 ng/mLの範囲に存在する。

 代謝物は最大1.41 ng/mL と見積もられるので、未変化体が14.1 ng/mL以上あればその採血時点における代謝物は 95%の確率で10%ルールにかからない。
*ハミルトンプール法（p.39参照）
 これより、プール*後の血漿を測定することでAUCを濃度として評価することができる
 今回試算のラジオ条件（代替検量線）で、血漿プールのAUC測定値が7%であれば真値10%ではないといえる ⇒ Recommendationの一つ
10th JBF Symposium, 201936

Japan Bioanalysis Forum

標品が無い代謝物 定量時の不確かさ評価
代謝物推定における不確かさ

シナリオ1 UVで代謝物を定量化

シナリオ2 ラジオ（非臨床）併用で定量化

UVのみで測定した場合、UVとラジオのレスポンス比を測定することにより代謝物濃度(1 ng/mL）の場合
合成標準不確かさは0.54 ng/mL
拡張合成標準不確かさ(k=2)は1.08 ng/mL

代謝物濃度(1 ng/mL）の場合
合成標準不確かさは0.21 ng/mL
拡張合成標準不確かさ(k=2)は0.41 ng/mL

ラジオを併用する事により、拡張不確かさを1/2以下にする事が出来る
UV条件（代替検量線）では、血漿プールのAUC測定値が5%であれば真値10%ではないといえる。

http://bioanalysisforum.jp/【結果】
求めたい値：未変化体と代謝物のレスポンス比（モル吸光係数比）

ラジオ併用条件（代替検量線）では、血漿プールのAUC測定値が7%であれば真値10%ではないといえる。

10th JBF Symposium, 201937

Japan Bioanalysis Forum

標品が無い代謝物 定量時の不確かさ評価
代謝物推定における不確かさ
不確かさの主成分は未変化体と代謝物のレスポンス比の差異。
その次に前処理操作におけるばらつきとUV測定の不確かさが大きく寄与する。
標準液等の調製不確かさの寄与は小さく、天秤やピペットの種類の違いによる精度の差も（適切に使用していれば）ほとんど寄与しない。
代謝物と未変化体の間のUV検出におけるレスポンス比の差を正確に見積もれれば不確かさは小さくできる。
また前処理のばらつきを抑えることでも、不確かさを小さくすることはできる。

http://bioanalysisforum.jp/【考察】

ラジオを併用した場合、前処理のばらつきが不確かさの殆どを占めるため、前処理操作の再現性を高めることでより精度の高い代謝物濃度の推測が可能となる。
10th JBF Symposium, 201938

Japan Bioanalysis Forum






代謝物比率の評価に必要なものは時点毎の濃度ではなくAUC「ハミルトンプール」により平均血漿中濃度が得られる
平均血漿中濃度に試料採取時間（ex. 24h）をかけるとAUCになる
試料採取時間は定数のため、ハミルトンプール後の未変化体と代謝物の濃度比は両者のAUC比に等しい

4hHamilton RA, Garnett WR, Kline BJ.
Determination of mean valproic acid serum
level by assay of a single pooled sample.
Clin Pharmacol Ther. 1981; 29: 408-413.

8h
12h

2h
0h

12 3
プール比率

http://bioanalysisforum.jp/

参考：ハミルトンプール法

24h

4

8
10th JBF Symposium, 2019639

4．まとめ
標品が無い場合にも10 th JBF
（DG2018-35）

より速い段階で「Full Validation＆MIST対応が必要か否かの判断」
を「高い確度」で行うことは出来ないか？

10th JBF Symposium, 2019http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum40

Japan Bioanalysis Forum

代替検量線のあり方

DG35’s Recommendation

10 th JBF
（DG2018-35）

1. MSでの代謝物レスポンスは未変化体レスポンスと大きく異なる場合が多く、未変化体検量線で代謝物をそのまま定量することは適切でない。
代謝物をグループ分けし、物性の近いもので代替検量線を作る等の対応は必要。
2. UVの代謝物レスポンスは、概ね未変化体の1.0±0.4 倍程度だが場合により大きく動くことがある。

http://bioanalysisforum.jp/

まとめ ー⇒ 科学的妥当性を考えた対応、レスポンスが動く可能性を考慮した対応が必要
10th JBF Symposium, 201941

Japan Bioanalysis Forum【不確かさ】の検討から

DG35’s Message

10 th JBF
（DG2018-35）

1. 今まで知られている代謝物UVレスポンスの情報から、レスポンスが桁違いに小さい代謝物が、大きいピークとComparableな曝露を示すことは考えにくい。
DG35’s Recommendation

放射性標識未変化体から生成した代謝物を含む試料をHPLC又はLC/MSで測定して、代謝物レスポンスの値付けをすることにより、大きく不確かさを改善、実用的な不確かさを得ることができる。
10th JBF Symposium, 2019http://bioanalysisforum.jp/

まとめ ー42