Japan Bioanalysis Forum

Hybridization assayによる核酸医薬品の定量
Quantitative analysis of oligonucleotide
therapeutics by Hybridization assay

12th JBF Symposium

http://bioanalysisforum.jp/

DG2020-48

1Japan Bioanalysis Forum

DG members
NameCompany

葛西 康之

塩野義製薬株式会社

才原 良子

株式会社LSIメディエンス

辻野 好美

株式会社東レリサーチセンター

羽成 優

シミックファーマサイエンス株式会社

早田 洋平

株式会社新日本科学

山本 卓

積水メディカル株式会社

村越 かおり田辺三菱製薬株式会社

渡辺 恭子

第一三共株式会社

Ryoko Saihara
Yoshimi Tsujino
Suguru Hanari
Yohei Hayata
Takashi Yamamoto
Kaori Murakoshi
Kyoko Watanabe

SHIONOGI & CO., LTD.

LSI Medience Corporation

Toray Research Center, Inc.

CMIC Pharma Science CO., Ltd.

Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd.

http://bioanalysisforum.jp/

Yasuyuki Kasai

SEKISUI MEDICAL CO., LTD.
Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation
Daiichi Sankyo Co., Ltd.
12th JBF Symposium, 2021

2

Japan Bioanalysis Forum

活動の内容 Activities

Jul 2020～Aug 2020
1 Sep 2020
キックオフミーティング Kick of meetingSep 2020～Dec 2020
TCとメールを用いた議論 TC and discussion used by E-mailアンケート（Oct 2020） Survey

http://bioanalysisforum.jp/

メンバー募集 Members application

Dec 2020～Feb 2021
ポスター作成 Posters preparation
12th JBF Symposium, 2021

3

1. イントロダクション

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

4

Japan Bioanalysis Forum

本DGの目的DG2018-36
LC-MS

DG2020-48
Hybridization assay（LBA）

昨今、Hybridization assayを用いる
核酸医薬品定量が増えてきている。

Hybridization assayは、測定手法、プローブ作製法、サンプル調製法が様々。
各社で試行錯誤が繰り返されている。

http://bioanalysisforum.jp/

DG2017-33
qPCR

核酸医薬品の測定法には様々な分析手法があるが、DGではLBAに関する議論はまだ実施されていなかった。

Hybridization assayの全体像の把握、現状の課題を抽出するとともに、LC-MSとの違いについてDG内で議論し、問題解決への一助としたい。
12th JBF Symposium, 2021

5

Japan Bioanalysis Forum

定義 Definition（修飾）核酸が十数～数十塩基連結したオリゴ核酸で構成され、遺伝子発現を介さず直接生体に作用するもので、化学合成により製造される医薬品

http://bioanalysisforum.jp/

本DGにおける「核酸医薬品」の定義

引用：
井上貴雄：核酸医薬品の開発動向と規制整備の現状（Pharm Tech Japan）, Vol. 35, No. 13, P8（2019）12th JBF Symposium, 2021

6

Japan Bioanalysis Forum

核酸医薬品の分類 Classification

アンチセンス
(1本鎖DNA/RNA)

アンチセンス
(1本鎖DNA/RNA)

アプタマー(1本鎖DNA/RNA)mi RNA mimic(2本鎖RNA)
CpGオリゴCpGモチーフを含む
1本鎖DNASi RNA(2本鎖RNA)細胞の内側で機能する核酸医薬品

http://bioanalysisforum.jp/

デコイ(2本鎖DNA)細胞の外側で機能する核酸医薬品

引用：井上貴雄,核酸医薬品開発の現状, Drug Delivery System, 31-1, 2016

12th JBF Symposium, 2021

7

Japan Bioanalysis Forum

化学合成医薬品

核酸医薬品

バイオ医薬品

分子量< 1kDa≤ 10kDa

30 kDa

生産方法

化学合成

化学合成

バイオテクノロジー技術

標的

細胞内、細胞外

細胞内、細胞外

細胞外

特異性

非特異的

時に特異的

特異的

主な
定量法

主に
クロマトグラフィー法（LC-MS, HPLC等）

クロマトグラフィー法（LC-MS, HPLC等）
Hybridization assay（ELISA, ECL等）

LBA法（ELISA, ECL等）

引用（一部改変）：
ICH S6 対応研究班，核酸医薬品の⾮臨床安全性を考える，医薬品医療機器レギュラトリーサエンス，
PMDRS，46(5)，286〜289（2015）
本間尚⼦：核酸医薬品の承認審査における薬物動態評価，第40回薬物動態談話会講演資料（2018）

http://bioanalysisforum.jp/

既存の医薬品との⽐較

核酸医薬品は中分⼦としての位置づけ
低分⼦医薬品とバイオ医薬品の特徴を併せ持つ
核酸医薬品のBioanalysis
クロマトグラフィー法とHybridization assay（LBA法）のどちらも適⽤可能
12th JBF Symposium, 2021

8

Japan Bioanalysis Forum

分類

Pros

Cons

LC-MS(/MS)

LCガイドラインに準拠可
代謝物との分離が可能

前処理が煩雑感度不⾜HPLC-UVLCガイドラインに準拠可
代謝物との分離が可能

感度不⾜

Hybridization-LCfluorescence

⾼感度
代謝物との分離が可能
前処理が簡便報告例少ないやや⾼コストHybridization assay(LBA)

LBAガイドラインに準拠可
スループットが高い
⾼感度

前処理が煩雑定量法確⽴に時間必要
代謝物との分離が困難

qPCR

⾼感度
前処理が簡便⽇間差があり再現性が悪い
代謝物との分離が困難

電気泳動

条件検討が不要で、簡便

⼯程数が多く，スループットが悪い
感度不⾜
代謝物との分離が困難

ラベル化（蛍光 or RI）

前処理等が無く、最も簡便

RIは合成に時間・コストがかかる
蛍光⾊素修飾は化合物の物性が変わる
可能性があるhttp://bioanalysisforum.jp/

核酸医薬品 各種分析法

引用：10th JBF Symposium, DG2018-36（2018）
12th JBF Symposium, 2021

9

Japan Bioanalysis Forum

Hybridization assayによる核酸医薬品定量

Nucleaseで切断

Hybridization、
酵素添加

添加

核酸医薬品

測定

http://bioanalysisforum.jp/【Cutting assay】

Capture probe

12th JBF Symposium, 2021

10

Japan Bioanalysis Forum

Hybridization assayによる核酸医薬品定量【Ligation assay】
Detection
probe

Hybridization、
酵素添加

添加

Capture
probe

核酸医薬品

洗浄時に
Washout

洗浄ステップ

http://bioanalysisforum.jp/

Ligaseで結合測定

12th JBF Symposium, 2021

11

Japan Bioanalysis Forum

Hybridization assayによる核酸医薬品定量

Detection
probe

添加

Hybridization

Captureprobe

測定

http://bioanalysisforum.jp/【Dual Hybridization assay】

核酸医薬品

12th JBF Symposium, 2021

12

2. アンケート結果
アンケート期間：2020/10/19～10/30
回答者数：28名① 属性および核酸医薬品の経験② 分析手法
③ 核酸医薬品のハンドリング④ 分析法バリデーション
12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum13

2. アンケート結果①属性および核酸医薬品の経験

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

14

Japan Bioanalysis Forum

属性および核酸医薬品の経験
Q1：所属について教えてください
Q3：核酸医薬品の分析経験化合物
Q2：核酸医薬品の分析経験年数は何年
数はどれくらいになりますか？？
くらいになりますか？
回答者数：28名
回答者数：28名
18
16

（3)

14
12

（5)

10
8

（2)
（3)

6
4

5年以上

（6)

2～4年

＜Hybri（1)＞

1年
0年

（6)

2

（2)

0

（1)

6～10
化合物
（2)

21化合物以上（1)＜Hybri（1)＞1化合物（5)＜Hybri（5)＞http://bioanalysisforum.jp/＜＞内はHybridization assayの経験化合物数2～5化合物（13)＜Hybri（6)＞

ここ数年で経験者が増加
しているが、経験化合物数は多くない
12th JBF Symposium, 2021

15

Japan Bioanalysis Forum

属性および核酸医薬品の経験

18
16

5年以上
（3)

（3)

14
12

（5)

10
8

（2)
（3)

6
4

5年以上

（6)

2～4年
1年

2～4年
（5)

0年

経験なし
（10)

1年（5)

http://bioanalysisforum.jp/

Q1：所属について教えてください
Q8：Hybridization assayの経験
Q2：核酸医薬品の分析経験年数は何年
年数は何年くらいになりますか？
くらいになりますか？
回答者数：28名
回答者数：23名

（6)

2

（2)

0

（1)

核酸医薬品の分析経験者でもHybridization assayの経験者は半分ほど
12th JBF Symposium, 2021

16

Japan Bioanalysis Forum

属性および核酸医薬品の経験
Q4：核酸医薬品の分析経験のある核酸医薬品分析法を教えてください（複数回答）

Q5-7：経験のある核酸医薬品の全長を教えてください（複数回答）
回答者数：13名
20

15

(0)
(1)

(2)
(3)

50mer以上

10
(13)

5
0

25mer-50mer(13)

25mer以下
(2)
(1)
(2)

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

回答者数：21名

全長毎で測定法の違いは見られず、ステージで測定法を使い分けていると
考えられる

17

Japan Bioanalysis Forum

属性および核酸医薬品の経験(8)8

アンチセンス
(6)

siRNA
miRNA
アプタマー

4

(3)

CpGオリゴ

(3)

デコイ

(2)

0

(0)

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Q11：Hybridization assayで経験のある核酸医薬品の種類を教えてください （複数回答）
回答者数：13名

アンチセンス、siRNAが多い
デコイは実施されていなかった18

Japan Bioanalysis Forum

属性および核酸医薬品の経験

(9)

9
8
7
6

マウス

(6)

ラット

5
4

(4)

サル
(4)

3

ヒト

http://bioanalysisforum.jp/

Q13：Hybridization assayで経験のある動物種を教えてください（複数回答）
回答者数：12名

2
1
0

12th JBF Symposium, 2021

19

Japan Bioanalysis Forum

属性および核酸医薬品の経験

12

(11)

10

血漿

8

CSF
(7)

組織

6

その他 (具体的に)

4

(3)

2
0

• 血清
• 骨髄
• 脳、筋肉、目

http://bioanalysisforum.jp/

Q14：Hybridization assayで経験のあるマトリックス種を教えてください（複数回答）
回答者数：12名(0)

12th JBF Symposium, 2021

20

Japan Bioanalysis Forum

属性および核酸医薬品の経験

(9)
9

(9)

探索
段階

製薬企業

8
7

(6)

6

探索
段階

(4)

(3)
開発
段階

5

CRO
(5)
開発
段階

4
3
2
1
0

探索段階
開発段階

http://bioanalysisforum.jp/

Q15：Hybridization assayを使う時期を教えてください（複数回答）
回答者数：12名

探索段階は製薬メーカーが自社で実施→開発段階からCROへ委託の傾向があると推測される12th JBF Symposium, 2021

21

2. アンケート結果② 分析手法12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

22

Japan Bioanalysis Forum

分析手法

12

Cutting assay (1 probe法)
Ligation assay（2 probe法）(9)

Dual-Hybridization assay

8

その他 (具体的に)

4

(3)

(3)

(4)

• 蛍光物質を結合させたProbeと標的核酸を
Hybridization後、蛍光検出器付き高速液
体クロマトグラフィーにより検出• Ligation法以外の2probe法

0

http://bioanalysisforum.jp/

Q10：Hybridization assayで経験のある分析手法について教えてください（複数回答）
回答者数：13名

Ligation assay (2 probe法)の経験数は大半を占める
12th JBF Symposium, 2021

23

Japan Bioanalysis Forum

分析手法

(9)

9
8

ELISA

(7)

7

ECL

6

Gyrolabその他 (具体的に)

5
4
3

(3)

• 高速液体クロマトグラフィー• Luminex

http://bioanalysisforum.jp/

Q12：Hybridization assayで経験のある分析機器を教えてください（複数回答）
回答者数：13名

2
1

(1)

0

ELISA、ECLでの実施が大半

12th JBF Symposium, 2021

24

Japan Bioanalysis Forum

Probe作製法

12(11)

Digoxigenin (DIG)

108

AlexaやSulfo-Tag等の直標識

6

その他 (具体的に)

4• FITCを使用した経験もあります．

(4)

http://bioanalysisforum.jp/

Q22：検出側の標識はどのようにしますか？（複数回答）
回答者数：12名

2
0(1)

DIGを使用している人が多い
分析機器の変更が容易というメリットも。

12th JBF Symposium, 2021

25

Japan Bioanalysis Forum

Probe作製法
Q23：Cutting assayで修飾は入れますか？
回答者数：4名

入れる

(2)

2

http://bioanalysisforum.jp/

3

入れない
(1)

1

両方に該当
(1)

Nucleaseで切断

0

Hybridization
、酵素添加

添加

測定

入れる

入れない

両方に該当

核酸医薬品
Capture probe

12th JBF Symposium, 2021

26

Japan Bioanalysis Forum

Probe作製法

片方のプローブのみに修飾を入れる
ケースはなかった5(4)

4

Capture probeのみ入れる(4)

Detection probeのみ入れる
両方のProbeに入れる

3

両方のProbeに入れない

2

Detection
probe

Ligaseで結合

Hybridization
、酵素添加

添加

1
0

Capture
probe

(0)

(0)

洗浄ステップ

http://bioanalysisforum.jp/

Q24：Ligation assayで修飾は入れますか？
回答者数：8名

核酸医薬品

洗浄時に
Washout

Capture probeのみ入れる

Detection probeのみ入れる

測定
両方のProbeに入れる

両方のProbeに入れない

12th JBF Symposium, 2021

27

Japan Bioanalysis Forum

Probe作製法

Capture probeを測定対象より長10くし、測定対象とDetection probe(8)

8をLigationする

6

Capture probeを測定対象より短
くし、Capture probeと4

Detection probeをLigationする

20

http://bioanalysisforum.jp/

Q25：Detection probeのLigation方法を教えてください
回答者数：9名(1)

Capture probeを測定対象より長くし、測定対象とDetection probeをLigationする

Capture probeを測定対象より短くし、Capture probeとDetection probeをLigationする

12th JBF Symposium, 2021

測定対象とDetection probeを
Ligationするケースが多い28

2. アンケート結果③ 核酸医薬品のハンドリング

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

29

Japan Bioanalysis Forum

核酸医薬品のハンドリング

(10)

10
9
8
7

(6)

(7)

DEPC水

6

DNase/RNase free水5

Milli-Q水4

その他 (具体的に)

3
2
1
0

http://bioanalysisforum.jp/

Q17：核酸医薬品及びプローブ調製に関する部分で使用する水を教えてください（複数回答）
回答者数：18名• TE Buffer(1)12th JBF Symposium, 2021

30

Japan Bioanalysis Forum

核酸医薬品のハンドリング

20

DNA低吸着チューブ(17)

PCRグレートのチューブ

16

低吸着等でない一般的なチューブ

12その他 (具体的に)

8

(7)

4
0

(3)

(3)

DNA低吸着チューブ

PCRグレートのチューブ

低吸着等でない一般的なチューブ

その他 (具体的に)12th JBF Symposium, 2021

• TPX製品• タンパク低吸着チューブ• 吸着等がなければ一般的なRNase，
DNaseフリーのチューブを使用しています

http://bioanalysisforum.jp/

Q19：サンプル調製や保存に使用するチューブの種類を教えてください（複数回答）
回答者数：20名

低吸着チューブなど
なんらかのケアをしている傾向にある

31

Japan Bioanalysis Forum

核酸医薬品のハンドリング

12DNA低吸着チップ(10)

PCRグレートのチップ
8

LoRetentionチップ

(7)
(6)

DNA低吸着等でない一般的なチップ(6)

その他 (具体的に)

40• 吸着等がなければ一般的なRNase，
DNaseフリーのチップを使用しています(1)
DNA低吸着チップ

PCRグレートのチップ

LoRetentionチップ

DNA低吸着等でない一般的なチップ

その他 (具体的に)12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Q20：サンプル調製に使用するピペットチップの種類を教えてください（複数回答）
回答者数：20名使用するチューブ同様
チューブ低吸着チップなど
なんらかのケアをしている傾向にある

32

Japan Bioanalysis Forum

サンプル調製法

6

(6)

PBS

4

4

ビーズ

3

3

凍結粉砕
(2)

2

ホモジナイザー

アルカリ溶液（NaOH等）(3)

DNA抽出キット等に含まれる
核酸抽出用Buffer
その他 (具体的に)• RNAisoPlus

2
(1)

1

1
0

(5)

5
(5)

5

Q27：組織ホモジナイズを調製する際に使用するBufferを教えてください（複数回答）回答者数：7名

0

ビーズ

凍結粉砕

http://bioanalysisforum.jp/

Q26：経験のある組織ホモジナイズ
方法を教えてください（複数回答）回答者数：9名

(0)
PBS

アルカリ溶液（NaOH等）

ホモジナイザー

DNA抽出キット等に含まれる核酸抽出用Buffer

その他 (具体的に)12th JBF Symposium, 2021

核酸抽出用Buffer
でホモジナイズする
ケースが多いようだ33

Japan Bioanalysis Forum

サンプル調製法

血漿 回答者数：16名
12

組織 回答者数：12名
12

(11)

10

10

8

8

6
4

6

(4)

4

2
0

(1)

する
(4)

2

(4)

(4)

しない
両方に該当

http://bioanalysisforum.jp/

Q28&Q29：サンプル調製法（血漿・組織）でProteinase K処理はしますか？

0

する

しない

両方に該当

血漿はProteinase K処理をしないケースが多い
12th JBF Symposium, 2021

34

Japan Bioanalysis Forum

サンプル調製法

(15)

16
14
12
10

(9)

8

室温

6

on icehttp://bioanalysisforum.jp/

Q18：サンプル調製時の温度を教えてください（複数回答）
回答者数：20名

420

室温でのハンドリングが多い傾向にあるが、核酸の性質によってはon iceで実施する必要もある
12th JBF Symposium, 2021

35

Japan Bioanalysis Forum

サンプル調製法
Q21：検量線試料の調製方法を教えてください（複数回答）
回答者数：20名
用時調製

(13)

12

低分子同様、標準溶液を使用して(11)

マトリックスへ添加
その他 (具体的に)

8

4
(2)

0

http://bioanalysisforum.jp/

LBA同様、マトリックスを使用して16

LBA同様、マトリックスを使用して用時調製

低分子同様、標準溶液を使用してマトリックスへ添加その他 (具体的に)12th JBF Symposium, 2021

• LC-MS/MSですが，マトリックスで希釈しています．
またはマトリックス（血漿）を使用して標準溶液を調製しています．
• うまく行く方法であればどちらでもよい．

回答者の半数が低分子と同じ手法を採用している

36

Japan Bioanalysis Forum

前処理法
Q31：ハイブリダイズ時の反応時間を教えてください
回答者数：13名
(8)

8

15
(12)

6

10

する
しない
両方に該当

5
(2)

0

(0)

ハイブリダイズの工程では熱処理をするケースがほとんどであった

4

30分
1時間

(3)

2
0

2時間
(1)

(1)

その他

http://bioanalysisforum.jp/

Q30：ハイブリダイズ時に熱処理をしますか？
回答者数：14名• 3時間、
16～18時間

1時間程度で実施する場合がほとんどであったが、オーバーナイトで実施するケースも見られた
12th JBF Symposium, 2021

37

Japan Bioanalysis Forum

前処理法

8

6

(8)

Q33：ハイブリダイズ中の振盪の有無を教えてください
回答者数：13名
10

(6)

液相
固相

4

(1)

0

8

する

6

しない

（プレートベース）

4（プレートベース）

2

固相

2

(9)

両方に該当
(3)

http://bioanalysisforum.jp/

Q32：ハイブリダイズ時の条件を教えてください（複数回答）
回答者数：13名(1)0

液相、プレート内（固相）半々であった

ハイブリダイズ中に振盪しない場合が多い
12th JBF Symposium, 2021

38

Japan Bioanalysis Forum

分析法の構築http://bioanalysisforum.jp/

Q34：分析法の構築Hybridization assayで直面する頻度が高い問題を教えてください（複数回答）
回答者数：13名
12
10

(9)

(10)

感度

8

堅牢性（再現性）

6

希釈直線性

4

安定性

(4)

特になし

2
0

(0)

(1)

12th JBF Symposium, 2021

感度、堅牢性で悩むケースが多い→組織中濃度測定の場合、高感度が求められるためと考えられる

39

2. アンケート結果④分析法バリデーション

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum40

Japan Bioanalysis Forum

測定単位

(8)
8

(7)

7
6

g

5

mol
その他 (具体的に)

4
3• g/L, mol/L2
1

http://bioanalysisforum.jp/

Q16：Hybridization assayで使用する測定単位を教えてください（複数回答）
回答者数：13名(1)

0

12th JBF Symposium, 2021

41

Japan Bioanalysis Forum

分析法のバリデーション

10

0

8

1
2～5

(7)

6～10

6

(5)

11～20
21以上

4
2
0

http://bioanalysisforum.jp/

Q35：Hybridization assayを使用した分析法バリデーションの経験数を教えてください
回答者数：14名

(1)
(0)

(0)

(1)

12th JBF Symposium, 2021

42

Japan Bioanalysis Forum

分析法のバリデーション

(10)

10

LBAガイドラインを参照

8

クロマトグラフィーガイドラインを参照

6

LBAガイドラインから数項目抽出
クロマトグラフィーガイドラインから数

4
2
0

項目抽出
(1)

http://bioanalysisforum.jp/

Q36：Hybridization assayの分析法バリデーションにおいて、実施項目はどのように決定しますか？（複数回答）
回答者数：10名(2)(0)

12th JBF Symposium, 2021

LBAガイドラインを参考にしている人が多い43

Japan Bioanalysis Forum

分析法のバリデーション

(6)

6
5

配列が短い核酸を用意して確認

4
3

確認しない

(2)

2

http://bioanalysisforum.jp/

Q37：Hybridization assayの分析法バリデーションにおいて、特異性は確認しますか？
回答者数：8名

1
0

12th JBF Symposium, 2021

44

Japan Bioanalysis Forum

分析法のバリデーション(3)3

http://bioanalysisforum.jp/

Q38：Hybridization assayにおいて、プローブのロットが切り替わった場合、パーシャルバリデーションは実施しますか？
回答者数：8名
する
実施しない
(2)

2

(2)

両方に該当
その他 (具体的に)

1• 経験がないが，おそらくしない• ロットが切り替わったことがない(1)

LBAのガイドラインに従うなら重要試薬の位置付けのため確認は必要？
しかし、あくまで化学合成品のためロット間で差が出るかは不明。
DG内でも意見が分かれた。

0

12th JBF Symposium, 2021

45

Japan Bioanalysis Forum

分析法のバリデーション

(6)

6
5
4

ある
ない

(3)

両方に該当

3
2
1
0

(0)

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Q39：Hybridization assayの分析法バリデーションにおいて、クライテリアを広げたことはありますか？
回答者数：9名

基本的にはクライテリアは広げずに実施することが多い。
しかし組織中濃度測定などで、やむを得ず広げることも。

46

Japan Bioanalysis Forum

分析法のバリデーション

(0)

5

(0)

4
3
2

(5)

(0)
(5)

10%
(2)

1
0

15%以上
5%

http://bioanalysisforum.jp/

Q40-42：クライテリアを広げたことがある場合、どの程度広げましたか？回答者数：5名(1)

12th JBF Symposium, 2021

47

3. トラブル事例紹介

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum48

Japan Bioanalysis Forum

トラブル事例-1

バックグラウンドが高い原因として、下記があげられると思います。
① プローブの非特異的反応② Cutting assayの場合、Cutting処理がうまく行われていない③ Ligation assayの場合、Detection probeがうまく洗浄できていない④ 検出抗体の非特異的反応①の場合、ブロッキング剤を検証する、プローブ濃度を下げる必要があるかもしれません。
②の場合、S1ヌクレアーゼ等の酵素量をあげることで改善する場合もあります。①同様プローブ濃度を下げることも検討ください。
③の場合、Washの回数を増やすことで改善する場合もあります。改善が見られない場合、
Detection probeを更に短いものにする、もしくは修飾をなくし親和性を下げるなど、プローブ設計
を検討ください。Capture probeとDetection probeをLigationさせる検出法に変えることも検討ください。S1ヌクレアーゼ処理を追加することでバックグランドが下がる場合もあります。
④の場合、①同様ブロッキング剤の検証、検出抗体濃度を下げる必要があるかもしれません。
12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

バックグランドが高くなりました。

49

Japan Bioanalysis Forum

トラブル事例-2

目的の感度、ダイナミックレンジが得られない原因として、下記があげられると思います。
① Hybridizationの効率が悪い② 複合体がプレートに補足できていない①の場合、Probeに修飾を加えたり、Hybridization時に使用するBufferの塩濃度にも注意する必要があるかもしれません。一般的には塩濃度が高いほうがHybridizationの効率は良くなる傾向にあるようです。
②の場合、フリーのCapture probeが多くプレートに反応し、複合体が補足できていない場合も考えられます。プレート添加時は、複合体とフリーのCapture probeの競合となるため、プローブ濃度を下げることを検討ください。

http://bioanalysisforum.jp/

目的の感度が得られません。
ダイナミックレンジが狭くなります。

その他にも、測定プレートへの持ち込み量を増やす、検出系や分析機器の変更も有用と思います。
ELISAの場合、吸光度検出から蛍光や発光検出への検討、もしくはECLやGyrolabへの変更も検討ください。
12th JBF Symposium, 2021

50

Japan Bioanalysis Forum

トラブル事例-3

測定対象とDetection probeの反応がうまく進んでいない可能性が考えられます。
測定対象の修飾が多い場合、うまく反応が進まない場合もあるようです。
まずは、Hybridization反応のインキュベーション条件（温度、Buffer条件、反応時間）を変更するなど、条件の最適化を実施してみてください。
それでも改善されない場合、 Templateの設計変更（Capture probeを測定対象より短くしCapture probeとDetection probeをLigationする）ことや、場合によってはCutting assayに切り替えることも検討ください。

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Ligation反応が進行しませんでした。
（Capture probeを測定対象より長くし、測定対象とDetection probeをLigationする場合）

51

Japan Bioanalysis Forum

トラブル事例-4

ばらつきが大きい原因は、Hybridization反応やプレートへの反応など、反応の際の影響が大きいと思われます。
反応時の温度均一性を高めるために、適切な機器を使用ください。
室温での反応の場合でも、インキュベーターに入れることで温度均一性が保てると思います。
Hybridization反応時もサーマルサイクラーで実施することもよいと思います。
その他にも、Buffer条件、反応時間の変更も考慮ください。

テストプレート（Hybridization反応用）の外側のウェルでシグナル値が高くなりました。

http://bioanalysisforum.jp/

測定系のばらつきが大きいです。

酵素を用いる場合、酵素を新調し実施してみてください。
また、再現性を得るために、温度は一定で行うよう心がけましょう。
12th JBF Symposium, 2021

52

Japan Bioanalysis Forum

トラブル事例-5酵素を用いる場合、酵素を新調し実施してみてください。
また、再現性を得るために、温度は一定で行うよう心がけましょう。
詳細は「トラブル事例-4」をご参照ください。

プレートウォッシャーでの洗浄時，複合体が壊れてシグナル値が減衰してしまいました。

http://bioanalysisforum.jp/

測定法構築後に反応が進まなくなりました。再現性も悪いです。

プレートウォッシャーでは洗浄が強すぎたのかもしれません。
手動での洗浄（マルチチャンネルピペットで洗浄液を添加）に変更してみてください。
測定対象とプローブの親和性を高く保つため、Bufferの塩濃度にもご注意ください。

12th JBF Symposium, 2021

53

Japan Bioanalysis Forum

トラブル事例-61塩基短い核酸も測定されると思いますが，その薬理作用も加味した測定系の妥当性について
LBAのクライテリアをそのまま適応するのが難しい時がある、1塩基違い
等の核酸を区別するのが難しい（特異性）
DG回答：
Hybridization assay（LBA）では1塩基違いを完全に区別することは難しいと思われます。代謝物を分けて分析する必要がある場合にはLC-MS等での分析をご検討ください。どのような代謝物が産生されるかの検証はとても重要となります。代謝物が産生されないことがあらかじめ検証されていれば、代謝物は考慮せずに測定できる可能性もあるかもしれません。
各社のポリシーに沿って対応が必要と思われます。

http://bioanalysisforum.jp/

Q43：Hybridization assayで何か困った経験があれば差支えのない範囲で教えてください 回答者数：4名

フック効果を実際に経験したことがあるか？
DG回答：
DG内でフック効果の経験者はいませんでした。

12th JBF Symposium, 2021

54

2. Hybridization assay vs LC-MS① 論文調査結果② メリット＆デメリット比較

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum55

2. Hybridization assay vs LC-MS① 論文調査結果

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

56

Japan Bioanalysis Forum

論文調査

調査論文数：22報（Hybridization 9 + MS 13）
調査化合物数：39種

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Hybridization assay及びLC-MSを用いた生体試料
中薬物濃度分析について，文献調査を実施した．

57

Japan Bioanalysis Forum

論文調査

核酸種

塩基長

測定ステージ

Hybridization assay(12種類)

アンチセンス：7種（18～25 mer）
miRNA：3種（20～22 mer）
siRNA：1種（21 mer）
リボザイム：1種（33 mer）

LC-MS
(27種類)
アンチセンス：23種（13～20 mer）
脂質結合オリゴ：1種（13 mer）
PS-ODN：1種（24 mer）
siRNA：1種（センス21-mer、アンチセンス23-mer）Unmodified DNA oligonucleotides ：1種（15mer）

MSは短い核酸に強みがある？

～20 mer：7種
21～25 mer：4種
26～50 mer：1種～20 mer：25種
21～25 mer：2種

前臨床：8種臨床：3種
メソッド開発or不明：1種

前臨床：4種臨床：2種
メソッド開発or不明：21種

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

項目58

Japan Bioanalysis Forum

論文調査
動物種

LC-MS
(27種類)

マウス、ラット、サル、ヒト

マウス、ラット、ウサギ、サル、ヒト

動物

血漿、血清、CSF、細胞、尿、胆汁、糞、組織（肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓、）

血漿、CSF、尿、組織（肝臓、腎臓、脳、肺、脾臓、心臓）

ヒト

血清、血漿、尿、赤血球、K562細胞

血漿、尿～50倍： 3種
～100倍： 2種～1000倍：4種
1000倍～：3種～50倍： 0種
～100倍： 1種～1000倍：25種
1000倍～：0種（不明1種）

マトリックス

ダイナミックレンジ

Hybridization assayのダイナミックレンジは様々

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Hybridization assay(12種類)

項目

59

Japan Bioanalysis Forum

論文調査

その他

Hybridization assay(12種類)

LC-MS(27種類)

Hybridization手法
Cutting assay（1 probe法 ）：2種
Ligation assay（2 probe法 ）：8種
Dual-Hybri（2 probe法 ）：1種

検量線サンプル調製
マトリックスにスパイク：24種
マトリックスで希釈：2種

検出系
ELISA（Alkaline Phosphatase）：11種
ECL：2種

ホモジナイズ条件
Lysis Buffer：3種
Lysis Buffer + ProK処理：1種
水：1種

プローブ
DIG：12種
ルテニウム直標識：1種

サンプル調製
PCI抽出：1種
SPE：6種
PCI抽出→SPE：4種
Hybridization：3種

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

項目60Japan Bioanalysis Forum

論文調査
論文調査 纏め

Hybridization assay

 塩基長に関してもアンケート同様の結果となった。調査した論文にはアプタマーは含まれておらず、論文上で50mer以上の実施は確認できなかった。
 Hybridizationの手法に関してもアンケート同様の結果となり、Ligation assay（2 probe法）での実施が最も多かった。
 検出系は論文上、ELISAが多く、ECLの実施は2報にとどまった。一方アンケートについても論文同様の傾向とはなったが、ECLの実施はELISAと同程度であり、徐々にECLでの実施にシフトして来ているものと思われる。

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

 アンケート同様、アンチセンスの分析が多く、今回調査した論文にはデコイの実施はなかった。

61

Japan Bioanalysis Forum

調査文献リスト（Hybridization assay）
No.DOIタイトル

10.1038/s41598- Application of Locked Nucleic Acid Oligonucleotides for siRNA Preclinical019-40187-4
Bioanalytics
Development and validation of a sensitive, specific, and rapid
10.1016/j.japna.22
hybridization-ELISA assay for determination of concentrations of a003.07.002
ribozyme in biological matrices
Development and Application of an Ultrasensitive Hybridization-Based10.1089/nat.2014.
3
ELISA Method for the Determination of Peptide-Conjugated0528
Phosphorodiamidate
10.1089/nat.2011. Enzyme-Linked Bridging Assay Method for the Quantification of
40319
Oligonucleotide-Based Drugs in Biological Matrices"
A Specific Picomolar Hybridization-Based ELISA Assay for the
10.1007/s110955
Determination of Phosphorothioate Oligonucleotides in Plasma and006-0082-3
Cellular Matrices
A Novel Ultrasensitive Hybridization-Based ELISA Method for 210.1208/s122486
Methoxyphosphorothiolate MicroRNAs and Its In vitro and In vivo
010-9214-0
Application"
Development of an Ultrasensitive Noncompetitive Hybridization–Ligation
10.1006/abio.200
7Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Determination of
2.5576
Phosphorothioate Oligodeoxynucleotide in Plasma"
8 -ヌシネルセン申請資料

9 -Inotersen non-clinical review
12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

162Japan Bioanalysis Forum

調査文献リスト（LC-MS）
No.DOIタイトル

10.1016/j.omtn.20 Dose-Finding Study and Pharmacokinetics Profile of the Novel 13-Mer
20.01.036.
Antisense miR-221 Inhibitor in Sprague-Dawley Rats
Pharmacokinetic evaluation of liposomal nanoparticle-encapsulated
10.1016/j.jconrel.
2
nucleic acid drug: A combined study of dynamic PET imaging and2018.12.006
LC/MS/MS analysis
Hybridization Liquid Chromatography−Tandem Mass Spectrometry: An
10.1021/acs.analc
3
Alternative Bioanalytical Method for Antisense Oligonucleotide
hem.0c01382
Quantitation in Plasma and Tissue Samples
10.1016/j.jpba.20 Development and validation of a bioanalytical method for quantification of4
LNA-i-miR-221, a 13-mer oligonucleotide, in rat plasma using LC-MS/MS
17.12.027
10.1016/j.jpba.20 Development and validation of bioanalytical methods for LNA-i-miR-221
5
20.113451
quantification in human plasma and urine by LC-MS/MS
10.4155/bioQuantitative analysis of imetelstat in plasma with LC-MS/MS using solid6
2017-0145
phase or hybridization extraction
Development and validation of LC-MS/MS method for the detection and10.1016/j.jpba.20
7
quantification of CpG oligonucleotides 107 (CpG ODN107) and its
12.06.022
metabolites in mice plasma
A One-Step Solid Phase Extraction Method for Bioanalysis of a
10.1208/s122488
Phosphorothioate Oligonucleotide and Its 3′ n-1 Metabolite from Rat
012-9394-x
Plasma by uHPLC-MS/MS

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

163Japan Bioanalysis Forum

調査文献リスト（LC-MS）
No.DOIタイトル

10.4155/bio.13.31 Quantification of oligonucleotides by LC–MS/MS: the challenges of
9quantifying a phosphorothioate oligonucleotide
10.4155/bio.11.10 Quantitation of locked nucleic acid antisense oligonucleotides in mouse
100
tissue using a liquid–liquid extraction LC–MS/MS analytical approach
10.4155/bioLC-TOF-MS methods to quantify siRNAs and major metabolite in plasma,11
2019-0134
urine and tissues
10.1208/ps06010 Development of a bioanalytical method for quantification of a 15-mer
12
3oligonucleotide at sub-ng/ml concentrations using LC–MS/MS
LC–MS quantification of oligonucleotides in biological matrices with SPE or
10.4155/bio13
hybridization extraction
2019-0117

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

964

2. Hybridization assay vs LC-MS②メリット＆デメリット比較

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

65

Japan Bioanalysis Forum

メリット＆デメリット比較① 前処理、分析機器に関する点（DG内で最も多かった意見に👑👑）
測定系の性能• 高感度👑👑
• マトリックス効果を受けにくい
前処理• 血漿の場合，前処理不要• サンプル使用量が少ない• LBAと大差ないハンドリング
メソッド開発• メソッド開発に時間を要しない• プローブがあれば比較的簡単に測定系の構築が可能• 検出が容易• LBAで使用する一般的なプレートリーダを使用できる• 操作の自動化が容易

LC-MS
測定系の性能• 多成分の同時測定が可能👑👑
• 選択性が高い👑👑
• 代謝物を分離できる👑👑• ダイナミックレンジが広く，再測定頻度が低い。👑👑
• 構造解析・推定・代謝物検索が可能• ばらつきが小さい• ダイレクトに化合物を分析できる安心感
メソッド開発• 複数の前処理法から最適な方法を選択することができる

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

メリット

Hybridization assay

66

Japan Bioanalysis Forum

メリット＆デメリット比較① 前処理、分析機器に関する点（DG内で最も多かった意見に👑👑）
測定系の性能• 機器によっては吸着の懸念• マトリックス効果を受ける• Dynamic rangeが狭く，再測定頻発が高い、多段階希釈必要となる👑👑• ばらつきが大きい• 代謝物との分離が難しい（選択性低）👑👑
• 代謝物を含む測定値となる場合がある
メソッド開発• 前処理条件（ハイブリ条件）が測定対象
により多様• プローブの設計が必要• 重要試薬の手配に時間がかかる• 系や測定枚数によっては温度管理が面倒（恒温攪拌機が複数必要）• 化合物ごとにプローブが必要

LC-MS
測定系の性能• 感度が低い👑👑• キャリーオーバーが多い• マトリックス効果を受ける• ISとの分離
前処理• 前処理が煩雑、多岐にわたる• LLE (PCI) and/or SPEが必要• ISが必要👑👑
メソッド開発• 検討に時間がかかる• 機器が専有化になる• 化合物毎に条件をセットアップ• 適切なISの選択が難しい

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

デメリット

Hybridization assay

67

Japan Bioanalysis Forum

メリット＆デメリット比較② スループット、頑健性、コストに関する点（DG内で最も多かった意見に👑👑）
スループット• DDS、修飾違いなど、配列が同じであれば同一メソッドで測定可能• 測定のスループットが高い👑👑
• 機器トラブルはほぼない
頑健性• 分析装置による影響はほぼない• 全自動化することで高スループット化が可能コスト• ランニングコストが安い• 測定機器が安価

LC-MS
スループット• 分析のスループットは良い👑👑• n=1測定で問題ない• 分析条件の汎用性が高い
頑健性• バラツキが少ない• ヒト間差が少ない👑👑
コスト• 特殊なカラム以外は安価👑👑
• 一般的な試薬のため安価

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

メリット

Hybridization assay

68Japan Bioanalysis Forum

メリット＆デメリット比較② スループット、頑健性、コストに関する点（DG内で最も多かった意見に👑👑）
スループット• 二重測定が必要👑👑• インキュベートなど測定外で手順が煩雑
頑健性• LBAの基準に準拠するのが難しいこともある• 再現性が低い（施設間差大）• CVが乱れやすい印象（特にcutting）👑👑
• プレート間差、ロット間差が出る可能性
コスト• 化合物毎にProbeの設計が必要となり、作成時間およびコストがかかる（初動コ
ストが高い）• 化合物毎に分析法を検討• 分析系構築の際の検討項目が多い• プローブ、試薬等が高価👑👑

LC-MS
スループット• 測定のスループットが低い👑👑
頑健性• カラムの劣化など、大量サンプル測定に注意が必要• 装置コンディション（吸着など）が影響しやすい👑👑
• 経時的なイオン強度の低下が生じやすい（IS必須）👑👑
• 機器トラブルが多い
コスト• ランニングコストが高い• 核酸分析に適した分析カラムが必要• 測定機器が高価• 機器の管理👑👑（低分子と中分子で使用をわける）

12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

デメリット

Hybridization assay

69

Japan Bioanalysis Forum

メリット＆デメリット比較
メリット・デメリット 纏め☺ 高感度で検討時間が比較的短く、通常のLBA同様の操作であることから作業面は容易。
☹ 一方で、Duplicate（あるいはTriplicate）分析が必要となるため、1日の処理本数はLC-MSに劣る可能性がある。LBA特有の施設間差、ヒト間差がみられる場合も。代謝物との分離も困難である場合が多い。

LC-MS☺ 代謝物との分離が可能で多成分同時分析が可能であることが最大のメリット。

http://bioanalysisforum.jp/

Hybridization assay☹ Hybridization assayと比較し前処理が煩雑になる傾向が見受けられ、イオンペアを用いた分析の場合、機器は専用機となる可能性も。感度低下や機器トラブルも考えられるため、Hybridization assayより装置コンディションに気を配る必要がある。

12th JBF Symposium, 2021

70

Japan Bioanalysis Forum

小活
分析手法をどのように使い分けるか？？
• 組織など汚い試料に強いため開発初期• 感度が良いため開発後期

 LC-MSを選択するステージとして• メソッド開発がすぐできるため開発初期• 多検体処理が可能なため開発後期

DG内で注目する視点によって、意見が分かれた
各分析手法の原理、特徴、測定目的を良く考える必要がある。

http://bioanalysisforum.jp/

 Hybridization assayを選択するステージとして目的、用途に応じて分析手法を選択する！
12th JBF Symposium, 2021

71

Japan Bioanalysis Forum

質問事項

核酸の場合、qPCRなどで増幅させて測定する方式があると思うのですが、qPCR
等ではなく、ハイブリダイゼーションアッセイを使用しなければならない理由というのはありますでしょうか？
DG回答：
必ずHybridization assayを選択しなければならないということはなく、それぞれの分析手法の特徴をご理解いただき、選択する必要があると存じます。
q-PCRで増幅させて分析することも可能で、増幅を行いますので高感度に測定できることが利点と思います。
一方で、q-PCRと比較した場合のHybridization assayの利点としては、サンプルを精製する必要がなく、サンプルに直接プローブを添加し処理が可能であるため、抽出効率を考慮する必要がありません。またLBAガイドラインに準拠することも可能です。
さらに、核酸医薬品がターゲットの場合、20mer程度と短い、修飾核酸や末端にDDSがついているなど、増幅自体が難しいこともあるようです。
また、LBAやqPCRでは代謝物を分けて分析することは困難ですので、代謝物を考慮する必要があ
る場合、LC-MSを用いることが必要となります。
従って、分析の目的やステージなどに応じ、分析手法を選択することが重要になると考えております。
12th JBF Symposium, 2021

http://bioanalysisforum.jp/

シンポジウム中にいただいた質問及び回答を記載します。
ご質問ありがとうございました！

72Thank you!
ポスターの内容についてご質問がある場合は下記メールアドレスまでご連絡ください。
suguru-hanari@cmicgroup.com

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

受付期間は2022年3月31日までとなります
12th JBF Symposium, 2021

73