ミトコンドリア病に対する①生化学診断・遺伝子診断システム②患者レジストリ
埼玉医科大学 小児科
大竹 明
埼玉医科大学ゲノム医学研究センター
岡崎康司
千葉県こども病院 代謝科
村山 圭

ミトコンドリア病研究・患者公開フォーラム 2016.1.23 TKP品川カンファレンスセンターミトコンドリア= 生体内の発電所

原料- 脂肪-糖- タンパク質I

III IVV

エネルギー(ATP)II“ミトコンドリア病” = 呼吸鎖異常症
OXPHOS (酸化的リン酸化)病
少なくとも5000人に1人（Skaldal D et al. : Brain 2003）

いかなる症状, いかなる臓器・組織, 何歳でも, いかなる遺伝形式でも - Munnich & Rustin (Am.J.Med.Genet. 2001, 106:4-17)他を改編

難聴（抗生物質難聴）

視神経萎縮, 白内障
網膜色素変性症

貧血, 血小板減少
白血球減少
骨髄異形成症

尿細管障害, 腎症
糸球体硬化症

肝不全, 絨毛萎縮
難治性下痢

ガングリオン, 顔貌異常
副甲状腺機能低下症
多毛症

心筋症, 伝導障害心内膜線維弾性症

糖尿病, 内分泌障害

ミトコンドリア異常で引き起こされる病気・症状の一覧

Mitochondrial DNA and disease. N Engl J Med 333, 638–644 (1995)

Can manifest as any symptom, in any organs or tissues, at any age
and4with any mode of inheritance.

ミトコンドリア病を引き起こすミトコンドリアと核遺伝子

Monogenic mitochondrial disorders. New Eng J Med 366, 1132–1141 (2012).

It is estimated that 1000 to 1500 genes are encoded in the nucleus.

発症年齢別の原因遺伝子の割合
ミトコンドリアDNAが病因の割合

≧6Y

1250%

121Y-6Y

122433%

1M-1Y

225230%<1M10LIMD

2mean 2.7 days

0%

13%

667%

2620%

40%

mtDNA mutaion (+)

60%

80%

mtDNA mutation (-)

100%

発症年齢別の原因遺伝子の割合
ミトコンドリアDNAが病因の割合

≧6Y

1250%

121Y-6Y

122433%

1M-1Y

225230%<1M10LIMD

2mean 2.7 days

0%

13%

667%

2620%

40%

mtDNA mutaion (+)

60%

80%

mtDNA mutation (-)

100%ミトコンドリア病(MRCD)を疑う患者
臨床診断、化学診断、画像診断
mtDNA 変異スクリーニング（血液、尿沈査）

陰性・皮膚線維芽細胞の酸素消費速度
・臓器・皮膚線維芽細胞の呼吸鎖複合体酵素活性・量・サイズ

陽性・染色体微細異常解析（高密度オリゴヌクレオチドアレイ）
・既知原因遺伝子に対するターゲットエキソームおよびミトコンドリアDNA解析（次世代シークエンサー）
陰性
全エキソーム解析（次世代シークエンサー）
・ 病因候補遺伝子の同定
・ レスキュー実験による病因の確定
・ iPS 細胞を用いた機能解析
新薬、新治療法の開発

陽性

家族検索

呼吸鎖異常症のスクリーニング
１．血中乳酸 ＞2.5mM, 22.5 mg/dL (永続性)２．L/P ＞ 20
３．3-OHB/AcAc ＞ 2
４．食後の血中乳酸＆ケトン体の上昇（x 1.2 以上）
５．2g/kg の経口ブドウ糖負荷→乳酸とL/P上昇（15分ごとに90分まで測定）(Sokol RJ Mitochondrial Hepatopathies.
In Liver Disease in Children 3rd Ed. Cambridge Univ Press, 2007)

①生化学診断・遺伝子診断システム

呼吸鎖酵素活性の測定
検体: 1) 臓器：肝臓, 骨格筋, 心筋2) 細胞; 皮膚線維芽細胞測定する酵素: 呼吸鎖I ～ IV、クエン酸合成酵素
吸光度計による測定: 鍵となる物質を青字で示す
呼吸鎖 I: NADH + H+ + CoQ1 → NAD + CoQ1・H2
呼吸鎖 II: Succinate + CoQ1 → Fumarate + CoQ1・H2
呼吸鎖 III: DB.H2 + Cyto c (ox) → DB + Cyto.c(reduced)
呼吸鎖 IV: Cyto.c (reduced) + O2 → Cyto.c (ox) + H2O

クエン酸合成酵素: Oxaloacetate + Acetyl CoA → Citrate + CoA.SH（マーカー酵素）

CoA.SH + DTNB → CoA.S-S-nitrobenzoate +Thionitrobenzoate anion

新たな手法：酸素消費量

正常細胞

酵素活性及び遺伝子変異によりMRCDと確定診断された細胞F13 正常細胞
F391 NDUFAF6
F612 Surf1
F881 Unknown

酵素活性測定では低下が認められなかったLeigh脳症

BN-PAGE, 従来のNative-PAGE, SDS-PAGEの比較

Blue Native 電気泳動+ 可溶化剤（石けん）
電気泳動(クマシーブルーを加えた条件で)ウエスタンブロット
によるタンパク質量の検討
or ゲルを直接に 活性染色

呼吸鎖酵素測定用に改良を重ねる質的異常型呼吸鎖 I 欠損症例のBN-PAGEによる解析
N Pt. 1N Pt. 1Supercomplex

kDa

Complex I

669 -Complex V
Complex III

440 -232 -Complex IV

134 -Complex II

活性染色

ウェスタンブロット

呼吸鎖複合体 [I+III+IV] 活性低下症例の肝臓粗抽出液を用いたBN-PAGE 解析
酵素タンパク量 Cont 1 Pt. 50 Cont 2 Pt. 63 CoI def Cont mito.
Complex I
Complex III
Complex IV
Complex II

酵素活性Complex I
Complex II
Pt. 50 もPt. 63 もI, III, IV が低下

Mt DNA枯渇症候群（MTDPS）?

相補性解析を行った10症例のBlue Native電気泳動による検討
BN-PAGE & Western blot: anti-39 kDa subunit of Complex I
FS6ND3kDa

669 -NABC D EFGHI

JN
Supercomplex

750k

Assembled
Complex I（～９００ｋDa）

440 -232 134 -Assembled
Complex II

同一相補性グループとされた症例BとC（後にNDUFS6異常症と判明）でアセンブリー中間体と考えられる約７５０ｋDaのサブコンプレックスを検出．

2次元 BN-PAGE

1. BN-PAGE
gel strip
2. Overlay onto
SDS-PAGE gel plate

3. Sandwich strip
between plates
12Low
High
MW BN-PAGE MWHigh
MWSDSPAGE

Low
MW

4. Pour acrylamide& run gel

5. Transferand probe同じ相補性グループの患者さんの2次元 BN-PAGE

BN

900k

Supercomplex（用いた抗体）39kSDS30k20k17k15k14k
39k

SDS

30k
20k17k15k14k

NormalPt C39k

SDS30kPt B200k(?)
600k 750k Patient’s
Supercomplex

17k BとCに共通したいくつかの中間体を検出
NDUFS6異常埼玉医科大学小児科

ミトコンドリア病はまずその存在を疑って診断する
1.高乳酸血症（高乳酸尿症・高アラニン血症・髄液中乳酸高値）
2.単一病因では説明のできない多臓器にまたがる症状

呼吸鎖酵素活性と量酸素消費量

岡崎先生の遺伝子のお話しをここでお読み下さい②患者レジストリ

登録制度はなぜ必要なのか（1） ミトコンドリア病は、患者数の極端に少ない遺伝性希少難病である。近年、病態解明の進歩に伴い、治療法の開発と臨床応用が急速に進展している。
 新薬開発、臨床試験を始めるためには、患者さんがどこに何人いるのか、どのような治療を受けて生活しているのか、受けている治療がどのような効果をもたらしているのかを知ることが重要である。

登録制度はなぜ必要なのか（2） 日本では患者数や重症度、生活の質（QOL）など、患者の実態が明確にされていなかったため、新薬の国際共同治験に参加できず、欧米での承認後、国内臨床開発に着手するため、深刻なドラッグラグ問題があった。

 このような問題を解決するために、日本先天代謝異常学会は患者家族会の全面的な協力を得て『先天代謝異常症患者登録制度（JaSMIn & MC-Bank）』を設立した。

 ミトコンドリア病は小児慢性疾病分類では先天代謝異常症の1つであり、この精度に乗り患者登録を進めることにした。

データベースを考えるときに
１．概観：コーディネーターは大竹、奥山
２．登録内容と機能：
医学的情報＋患者の実際の生活状況
最新の診断法、治療法開発の原資
３．どこに作る（組織、人材、資金、運営・維持）：千葉県ガンセンター 成育医療研究センター
４．海外のDBとの連携：三牧、古賀
25

ＪａＳＭＩｎについて• 日本先天代謝異常学会が運営する患者登録制度• 患者自身が「実名」で登録する“Ｓｅｌｆ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ”による登録。
• 個々の疾患の専門医が定期的にデータクリーニングを行う。

• 患者リストを用いた新たな研究が進行中である。（発展性のある患者登録）

登録状況（JaSMIn）

疾患郡疾患名ミトコンドリア病

Leigh脳症、MELAS、PDHC異常症の他

登録数

8227

JaSMInまとめ
疾患名
Leigh脳症
MELAS
PDHC欠損症
CPEO(1名はKSSを併発)
MERRF
Pearson病
レーベル病
分類不明
計人数（名）
2812651113084

JaSMInまとめ-2
性別

年齢女40

≦5

男445<, ≦15 2515<

総計 84

1940

総計 84
29

JaSMInの5つの課題
1. 登録制度を継続するためには

2. 登録情報の正確性を保つためには
3. 登録情報を他の研究へ活用するためには

4. 登録患者へのフィードバックは
5. 登録数を増やすためには日本先天代謝異常学会
委員長：大竹

患者登録委員会

明（埼玉医科大学）副委員長：奥山虎之（国立成育医療研究センター）*グループリーダー疾患群

ライソゾーム病&ペルオキシソーム病

担当者名*酒井 規夫（大阪大学）
小林 博司（東京慈恵会医科大学）
大橋 十也（東京慈恵会医科大学）
櫻井 謙（東京慈恵会医科大学）
濱崎 考史（大阪市立大学）
難波
成田

アミノ酸代謝異常症
尿素サイクル異常症

有機酸代謝異常症
脂肪酸代謝異常症
金属代謝異常症
糖代謝異常症その他の神経性疾患
ミトコンドリア病

栄二（鳥取大学）
綾（鳥取大学）

下澤 伸行（岐阜大学）＊
高柳 正樹（帝京平成大学）
伊藤 哲哉（名古屋市立大学病院）
坂本 修（東北大学）
中村 公俊（熊本大学）
松本 志郎（熊本大学）
長谷川 有紀（島根大学小児科）
深尾 敏幸（岐阜大学）
但馬 剛（広島大学）
窪田 満（国立成育医療研究センター）
清水 教一（東邦大学医療センター大橋病院）
伊藤 康（東京女子医科大学）
福田 冬季子（浜松医科大学）
新宅 治夫（大阪市立大学）＊
村山 圭（千葉県こども病院）
濱田 悠介（大阪大学）
野口 篤子（秋田大学）

所属
Krabbe病
異染性白質ジストロフィー
Pompe病
Fabry病
ムコ多糖症
Niemann-Pick病C型
Gaucher病
GM1、GM2-ガングリオシドーシス
副腎白質ジストロフィー
グループ全疾患及び総括
フェニルケトン尿症
シトリン欠損症
尿素サイクル異常症

有機酸代謝異常症
有機酸/脂肪酸代謝異常症
脂肪酸代謝異常症
Wilson病
glut-1欠損症
糖原病
小児神経伝達物質病
ミトコンドリア病及び総括
ミトコンドリア病

患者本人（代諾者）による登録申請書記入②登録申請書収集①登録申請書配布

⑤
フ
ィ
ード
バ
ック

先天代謝異常症患者登録システム（JaSMIn）
事務局

最新情報

⑤
フ
ィ
ード
バ
ック

国立成育医療研究センター③情報入力＆データ化④研究企画立案
先天代謝異常症患者の実態調査
新しい治療法・早期診断法など

患者登録委員会
日本先天代謝異常学会

研究結果

JaSMInからMO Bank<http://mo-bank.com/index.html>(Mitochondrial disease research
Organization data Bank / 新生児・小児ミトコンドリア病臨床情報バンク)へ患者と主治医の協力による疾患登録シート記入①登録シート
配布

フィー
ドバック

疾患登録シートは患者会と研究者で共同作成

日本
先天代謝異常学会

ミトコンドリア病患者会ネットワーク（主治医・患者の共同体：仮）バックアップ②登録シート
収集

村山班臨床情報バンク（MO Bank）
千葉県こども病院・がんセンター
④ 研究
申請
審査

最新情報
学会・セミナー
患者会フォーラムなどで報告

ドバック(JaSMIn,&MC-Bank)

成育医療研究センター ③ 情報入力＆データ化⑤情報開示

連結可能匿名化専門医
研究者

日本 フミトコンド ィ
リア学会 ー

研究結果
製薬会社

新しい治療法
早期診断法などに関する研究

34

患者レジストリーの意義①登録：希少疾患を対象とする登録制度の実用性と現状について広く世間に周知し、主に患者さん自身による登録を促す。
②情報提供：詳細な患者情報を医療従事者や薬剤会社等コメディカル、時には一般社会へも提供し、最新の診断法、治療法開発の原資とする。
③還元：登録データを通じて得られた、治療を含む病気等についての最新情報を患者さん自身に還元する。

まずはDB始めましょう！！！

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JaSMIn
成長
登録数増加

新規治療薬
関連研究
活性化

Acknowledgements
Department of Pediatrics, Saitama Medical University
Harashima H, Takeuchi R, Yamazaki T, Sasaki N
Department of Metabolism, Chiba Children’s Hospital
Ajima M, Baba K, Tajika M, Fushimi T, Muta K, Kawachi E, Ichimoto K,
Tsuruoka-Murakami T, Fujinami A, Murayama K, Takayanagi M
Department of pediatrics, Jichi Medical UniversityMori M
Saitama Medical University Research Center for Genomic Medicine
Kishita Y, Matoba N, Hirata T, Yatsuka Y, Hiraki K, Moriyama Y, Tokuzawa
Y, Nakachi Y, Kohda M, Tochigi H, Tamaru S, Uehara N, Mizuno Y, KatoH, Okazaki Y
Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology
Tanaka M
Department of Legal Medicine, Osaka University Graduate School ofMedicine
Emoto Y, Yamamoto T
Graduate School of Medicine, The University of Tokyo
Kita K
SBI Pharmaceuticals CO., LTD
Takahashi K, Koda T, Imamura K, Kurumiya S, Tanaka T, Nakajima M et al.
Murdoch Childrens Research InstituteDavid R Thorburn
Department of Biochemistry, La Trobe University
Mike T Ryan

All Patients and their doctors in charge40