DG2019-42
LBAによるマルチプレック
スアッセイの現状と課題
Current State and Issues
Facing Multiplex LBAs
11th JBF Symposium, DG2019-42

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Japan Bioanalysis Forum1

Japan Bioanalysis Forum

Name

Company

前田 健一
Kenichi Maeda

積水メディカル株式会社
SEKISUI MEDICAL CO., LTD.

平澤 由貴
Yoshitaka Hirasawa

株式会社イナリサーチ
Ina Research Inc.

木下 誠司
Seiji Kinoshita

株式会社LSIメディエンス
LSI Medience Corporation

摺木 志保
Shiho Suruki

協和キリン株式会社
Kyowa Kirin Co., Ltd.

谷口 康徳
Yasunori Taniguchi

株式会社新日本科学
Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd.

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DG Members※アドバイザー： 清水 浩之（田辺三菱製薬株式会社）
11th JBF Symposium, DG2019-422

Japan Bioanalysis Forum

活動の内容（Contents of our activity）
Jun 2019

DGサポーターからDGメンバー募集
Member recruitment

2019年7月30日 Jul 30, 2019
キックオフ会議

Kick off meeting2019年8月〜12月 Aug to Dec 2019

Web会議（平均月1回）及びメールによる議論
Monthly teleconferences and e-mail conversations

2020年1月〜2月

Jan to Feb 2020

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2019年6月

議論のまとめ及びシンポジウム発表準備
Summary of discussion and poster preparation
11th JBF Symposium, DG2019-42

3

Japan Bioanalysis Forum

Ligand binding assay (LBA) においてElectrochemiluminescence (ECL) やLuminex 等によるマルチプレックスアッセイが利⽤されている．
一回の測定で多項目の濃度測定が可能となる一⽅で，シングルプレックスアッセイ時とは異なる課題があると推測される．例えば，マルチプレックスアッセイの評価⽅法や評価基準に関しては，C-Path のPoints toConsider Document* では対象外となっており，各社それぞれのポリシーで実施⽅法や基準が設定されていると推測する．

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背景及び目的*: Points to Consider Document: Scientific and Regulatory
Considerations for the Analytical Validation of Assays Used in the
Qualification of Biomarkers in Biological Matrices issued by C-Path
11th JBF Symposium, DG2019-42

4

Japan Bioanalysis Forum

本DG では，LBA によるマルチプレックスアッセイの使⽤目的や使⽤プラットフォーム，バリデーションの実施状況とその評価基準や評価⽅法の設定を議論した．また，バイオアナリシス分野におけるLBA によるマルチプレックスアッセイの実情を調査し，今後のバイオアナリシスに生かすとことを目的とした．

11th JBF Symposium, DG2019-42

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背景及び目的5

Japan Bioanalysis Forum

Multiplex ligand binding assays (LBAs), such as
Electrochemiluminescence (ECL) or Luminex, are commonly
used.
Multiplex LBAs are able to measure multiple analytes
simultaneously in a single assay; however, there seems tobe some issues centric to multiplex LBAs which differ fromthat of singleplex LBAs. For example, the evaluation andacceptance criteria of multiplex LBAs are excluded from thescope of the Points to Consider Document: Scientific andRegulatory Considerations for the Analytical Validation of
Assays Used in the Qualification of Biomarkers in Biological
Matrices issued by C-Path. It appears to the members of thisDG that the evaluation of multiplex LBAs is performed
according to various policies established separately by eachcompany.
11th JBF Symposium, DG2019-42

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Background and Objective

6

Japan Bioanalysis Forum

This DG mainly focused on the intended purpose, platform
selection, decisions on whether to validate multiplex LBAs,
and the validation method itself. Additionally, weinvestigated the current state of multiplex LBAs inbioanalysis as well as discussed in detail issues multiplex
LBAs are facing along with mitigation efforts.

11th JBF Symposium, DG2019-42

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Background and Objective

7

Japan Bioanalysis Forum

議論の内容1（Contents of discussion）

使⽤目的
プラットフォーム
申請資料やGLP試験への利⽤状況

バリデーションの評価⽅法及び基準（Evaluation
and Criteria of Method Validation）
バリデーション実施状況及び目的
評価項目及び基準

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マルチプレックス測定の現状（Current State ofMultiplex LBAs）

バリデーション成⽴事例（Examples ofValidation of Multiplex LBAs)
11th JBF Symposium, DG2019-42

8

Japan Bioanalysis Forum

議論の内容2（Contents of discussion）

QC試料
バッチ採⽤基準
実試料の再測定基準及び実施⽅法
測定キットのロット間差担保トラブルと対処（Troubleshooting）

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マルチプレックス測定の運⽤状況（Operation ofMultiplex LBAs）

アンケート結果（Results of a Questionnaire
Survey）
11th JBF Symposium, DG2019-42

9Japan Bioanalysis Forum

Current State of Multiplex
LBAs
11th JBF Symposium, DG2019-42

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マルチプレックス測定の現状

10Japan Bioanalysis Forum

利⽤目的
どのような時に利⽤するか︖
限られた実試料量で複数分析対象がある場合
多数の分析対象を類似プラットフォームで測定したい場合
網羅的に解析したい場合
作業の効率化を図る場合

測定対象は︖
DG内の意⾒

動物の⾎清，⾎漿，尿ヒトの⾎清，⾎漿細胞培養上清11th JBF Symposium, DG2019-42

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DG内の意⾒11

Japan Bioanalysis Forum

プラットフォームの選択基準
プラットフォーム選択時に考慮するのは︖
分析対象の市販キットの有無
スクリーニングや急ぎの場合は同時分析対象数やキットの⼊⼿速度
キットの費用測定時の実試料使用量
分析対象数が30以上の場合は費⽤⾯や実試料使⽤量を考慮して
Luminexを選択
感度や定量範囲（ただし，Luminexの場合，定量下限が変わってしまう可能性あり）再現性の⾯でECLを優先
バリデーションのガイドラインの適用しやすさの⾯でECLを優先
11th JBF Symposium, DG2019-42

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DG内の意⾒12

Japan Bioanalysis Forum

測定キットの利⽤状況

基本的に市販キットを⽤いた測定市販キットがない分析対象だったため，⾃家調製で2plexや12plexの測定系を組んだ例がある

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市販キットを使⽤するか︖
⾃家調製の測定系を使⽤するか︖

11th JBF Symposium, DG2019-42

13

DG内の意⾒Japan Bioanalysis Forum

申請⽤資料及びGLP試験での利⽤状況
DG内の意⾒ECLを利⽤した非臨床試験で経験がある．
信頼性基準でECL及びLuminexを利⽤した臨床試験の経験がある．
信頼性基準でLuminexを利⽤した非臨床試験の経験がある．
GLP試験におけるサイトカイン測定の要望がある．

GLP試験での利⽤について

バリデーションを取得して，GLP試験の一項目で使⽤経験がある．
バリデーションは⾏なっていないが，試験内で再現性等を確認し，GLP試験の一項目で使⽤経験がある．
GLP試験の要望があり，バリデーションも取得予定．
GLP試験で利⽤した経験はない．
11th JBF Symposium, DG2019-42

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申請⽤資料への利⽤について

14バリーデーションの評価方法及び基準
Evaluation and Criteria of
Method Validation
11th JBF Symposium, DG2019-42

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Japan Bioanalysis Forum

15

Japan Bioanalysis Forum

バリデーションの実施状況(ECL)
DGメンバーの実施状況
信頼性基準下での治験時のヒト臨床実試料のバイオマー
カー測定
非GLP試験下での非臨床毒性試験のバイオマーカー測定

バリデーションを取得しない測定試験として探索目的のヒト臨床実試料のバイオマーカー測定（実試料が集まってからの一括測定等）
非臨床試験のバイオマーカー測定

11th JBF Symposium, DG2019-42

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バリデーション取得の測定試験として

16

Japan Bioanalysis Forum

DGメンバーの実施状況
バリデーション取得の測定試験として信頼性基準下での治験時におけるヒト臨床実試料のバイオマーカー及びADA測定
非GLP試験下での非臨床毒性試験のバイオマーカー測定
GLP試験の一項目での測定
バリデーションを取得しない測定試験として探索目的のヒト臨床実試料のバイオマーカー測定（実試料が集まってからの一括測定等）
In vitroのサイトカイン測定
非臨床試験のバイオマーカー測定
以下にDGのメンバー内でのバリデーション実施時の評価⽅法について取り纏めた
11th
JBF Symposium, DG2019-42

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バリデーションの実施状況(Luminex)

17

Japan Bioanalysis Forum

バリデーション時の評価項目

LBAのガイドラインに準じて以下の内容で実施
検量線，定量限界，再現性，希釈直線性及び希釈平⾏性，選択性，安定性
各施設マルチプレックスに特化したSOPはない
マルチプレックス測定においては, 分析試料を一律希釈した際に各分析対象ごとに測定値の評価を⾏うが, 一部の分析対象が基準を満たさない場合が想定され, 対応が求められる
11th JBF Symposium, DG2019-42

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DGのメンバー内でのバリデーション実施時の評価項目

18Japan Bioanalysis Forum

適合基準
LBAガイドラインに従い，真度±20%以内（定量
上限及び下限は±25%以内）
バリデーション前の予備検討結果から真度±30%以内に緩めた例もあった
Luminexの測定においては「定量下限の蛍光強度の平均値-３SD＞Blankの蛍光強度の平均値+3SD（6日間）」とする意⾒もあった
定量下限の蛍光強度がBlankの蛍光強度と近い値になる場合もあるため
11th JBF Symposium, DG2019-42

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検量線，定量限界の評価基準-119Japan Bioanalysis Forum

ECL及びLuminexのキットにおいては検量線範囲がロットごとに異なることがあり，可能ならば実試料を全て測定できるようにキットを準備

測定キットのロットが変わり，バリデーション時と実試料測定時に検量線範囲が変わる際には, 定
量範囲の設定が通常の単一分析対象測定とは異なり，運⽤での対応となる（各ロットの検量線範囲を使⽤する等）

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検量線，定量限界の評価基準-2「トラブル事例 トラブル③︓標準物質のロット変更」
57〜61ページ参照
11th JBF Symposium, DG2019-42

20

Japan Bioanalysis Forum

再現性の評価基準-1

再現性試料は3または5濃度で設定, 3または6日間の
再現性
適合基準例

真度±20〜30%以内
精度20〜30%以下

Buffer及び標準物質を⽤いて, 定量限界を含む5濃度の試料調製が可能11th JBF Symposium, DG2019-42

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Buffer試料を⽤いた再現性評価

21

Japan Bioanalysis Forum

再現性の評価基準-2
再現性試料は3濃度で設定, 3または6日間の再現性
マトリックス使⽤時には事前に測定値を確認し, 妥当な再現性
試料を選択する（標準物質を添加することもあり）
適合基準例
1. 真度の評価は実施せず, 精度30%以下
2. 初回値に対する真度±30%以内, 精度30%以下

マトリクス試料を⽤いた定量限界試料の調製は困難であり，3濃度での再現性試料を調製（定量限界試料はBuffer系試料で確認）との意⾒もあった．
但し，各分析対象の測定値に⼤⼩があり，厳密に濃度設定すると各分析対象に対して異なる希釈倍率となり，マルチプレックス
測定での対応が不可となる．
11th JBF Symposium, DG2019-42

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マトリックス試料を⽤いた再現性評価

22

Japan Bioanalysis Forum

評価試料
標準物質添加マトリックス試料（希釈直線性）
標準物質未添加マトリックス試料（希釈平⾏性）
適合基準例
1. 希釈前測定値に対して真度±20%以内
2. 希釈試料の測定値（4濃度）と希釈倍率の決定係
数（R2）≧0.98
3. 希釈倍率間の測定値の精度20〜30%以下（希釈平⾏性の場合）
11th JBF Symposium, DG2019-42

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希釈直線性及び希釈平⾏性の評価基準-123Japan Bioanalysis Forum

マルチプレックス測定特有の問題として，各分析対象の希釈直線性（平⾏性）が成⽴する範囲が異なる場合がある
1. 実試料を各希釈倍率で別々に実施
2. マルチ測定の目的が薄れるため同一の希釈倍率で実施（評価項目の重要度により対応）

実試料の測定値が定量上限を超えないようなパネルでは，希釈直線性や平⾏性の実施が不要の意⾒もあった

11th JBF Symposium, DG2019-42

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希釈直線性及び希釈平⾏性の評価基準-224Japan Bioanalysis Forum

選択性の評価基準-1

適合基準例
真度±20%以内
真度(%)＝真度(%)＝

選択性試料中分析対象測定値
内因性分析対象測定値+ 標準物質添加濃度✕100

選択性試料中分析対象測定値 – 内因性分析対象測定値✕100
標準物質添加濃度

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評価試料
個体別試料に標準物質を添加（注釈）選択性試料の真度は評価は，上記どちらかの計算式にて評価
11th JBF Symposium, DG2019-42

25

Japan Bioanalysis Forum

内因性濃度が高い場
合は，標準物質添加
濃度を高めに設定する必要がある

標準物質添加濃度
内因性濃度
11th JBF Symposium, DG2019-42

△
〇

低
低

〇
標
準
物
質

内
因
性
低
高

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マルチプレックス測定特有の問題として，各分析対象
により内因性濃度が異なる→適切な標準物質添加濃度が異なる→予備検討で個体別試料の選択及び標準物質添加量を設定する必要あり

理論濃度

選択性の評価基準-2高高26

Japan Bioanalysis Forum

評価試料
マトリックス試料（標準物質未添加⼜は添加）を2または3濃度
適合基準例
初期値に対する真度±20〜30%以内
内因性濃度が低く検出できない場合，評価しないという意⾒もあった（測定値が得られた実測定試料で評価
対応）

11th JBF Symposium, DG2019-42

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安定性の評価基準27

Japan Bioanalysis Forum

バリデーションの評価方法及び基準
まとめ

LBAガイドラインよりも判定基準を緩める事例あり
予想される変化に応じて，適合基準を緩めることを許容しても良いと考える（判定基準についてはアンケートを実施）
キット添付品の標準物質を使⽤する場合，複数分析対象の標準物質が混合されており，測定キットのロット変更時の検量線・QC試料調製には運用⾯での規定が必要

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バリデーションの実施基準は基本的にLBAのガイドラインに準じて設定

選択性評価時の個体別試料及び標準物質添加濃度は各分析対象の内因性濃度を考慮して設定する必要がある
11th JBF Symposium, DG2019-42

28

バリデーション成⽴事例
Examples of Validation ofMultiplex LBAs
11th JBF Symposium, DG2019-42

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Japan Bioanalysis Forum

29

Japan Bioanalysis Forum

項目

内容

対象

バイオマーカー測定（⾎漿)プラットフォーム

FCM（Cytometric Bead Array）

評価の位置付け

信頼性基準

分析対象数

3

バリデーション
項目

評価基準設定検量線

Buffer系で調製

真度・精度

マトリックスに標準物質を添加して調製
3濃度で3日間直線性

3試料×4濃度（Bufferで希釈）

安定性

マトリックスに標準物質を添加して調製

検量線

検量線のR^2を評価（99%以上）

真度・精度

精度100±20％

直線性

相対値が100±20％以内，決定係数（R^2）が0.98以上

安定性

初期値の±20％

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バリデーションの成⽴事例1

30

Japan Bioanalysis Forum

項目

内容

対象

バイオマーカー測定（細胞培養上清）

プラットフォーム

ECL

評価の位置付け

信頼性基準

分析対象数

2

バリデーション
項目

評価基準設定検量線

Buffer系で調製

真度・精度

ECL測定︓Buffer系で調製，6濃度，1回細胞培養〜測定︓3ドナーの培養上清，3回

直線性なし（希釈倍率は一定として測定）

安定性細胞，培養上清

検量線

真度100±30％以内（下限は100±50%）

真度・精度

精度100±30％以内・30%以下（下限は100±50％・50%）

安定性

初期値の±30％以内

11th JBF Symposium, DG2019-42

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バリデーションの成⽴事例2

31

Japan Bioanalysis Forum

項目

内容

対象

バイオマーカー測定（⾎漿)プラットフォーム

Luminex

評価の位置付け

信頼性基準

分析対象数

6

バリデーション
項目

評価基準設定検量線

Buffer系で調製

真度・精度

Buffer（キット添付QC）及びマトリックス系で5濃度で3日間

直線性

3濃度

安定性

マトリックス試料（標準物質未添加試料）

検量線

真度100±30％

真度・精度

真度100±30％，(Buffer系はキット基準値内)
精度30%以下

直線性

基準なし

安定性

真度100±30％

11th JBF Symposium, DG2019-42

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バリデーションの成⽴事例3

32

Japan Bioanalysis Forum

項目

内容

対象

抗体測定（⾎漿)プラットフォーム

Luminex

評価の位置付け

信頼性基準

分析対象数

12

バリデーション
項目

評価基準設定検量線

Buffer系で調製

真度・精度

Buffer系で5濃度（n=3）で6日間

MRD

マトリックスに標準物質を添加後，Bufferで希釈（5濃度，各n=4，4個体）

安定性

マトリックス試料（標準物質添加試料）

検量線

真度100±20％（上限と下限は100±25%）
定量下限蛍光強度(FI)­3SD > ブランクのFI+3SD

真度・精度

真度100±20％（上限と下限は100±25%)
精度20%以下（上限と下限は25%以下）

MRD

真度100±20％，精度20%以下

安定性

真度100±25％

11th JBF Symposium, DG2019-42

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バリデーションの成⽴事例433

Japan Bioanalysis Forum

項目

内容

対象

バイオマーカー測定（尿）プラットフォーム

Luminex

評価の位置付け

GLP

分析対象数

7

バリデーション
項目

評価基準設定検量線

Buffer系で調製

真度・精度

Buffer系（キット添付QC）で調製
3濃度，n=6，1回．2濃度，n=1，3日．

直線性

3濃度

添加回収

2濃度

安定性

マトリックス試料（標準物質未添加試料）

検量線

真度100±25％以内（上限・下限は100±30%）

真度・精度

真度100±30％以内，精度30%以下

直線性

真度100±25%以内

添加回収

回収率100±25%以内

安定性

初期値±25％以内

11th JBF Symposium, DG2019-42

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バリデーションの成⽴事例534

Japan Bioanalysis Forum

項目

内容

対象

バイオマーカー測定（⾎漿）プラットフォーム

ECL

評価の位置付け

GLP

分析対象数

4

バリデーション
項目

評価基準設定検量線

Buffer系で調製

真度・精度

Buffer系で調製
4濃度，n=6，1回．4濃度，n=2，3日．

直線性

7濃度

添加回収

2濃度

安定性

マトリックス試料（標準物質添加試料）

検量線

真度100±20％以内（上限・下限100±25%）

真度・精度

真度100±25%以内，精度25%以下

直線性

真度100±25%以内

添加回収

回収率100±25%以内

安定性

初期値±25％以内

11th JBF Symposium, DG2019-42

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バリデーションの成⽴事例635測定時の運用

Operation of Multiplex LBAs

11th JBF Symposium, DG2019-42

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Japan Bioanalysis Forum

36

Japan Bioanalysis Forum

QC試料の設定⽅法
DGメンバーの経験︓キット添付QC試料が添付⽂書記載の適合基準を満たさないことがある．

2. QC試料を調製

標準物質からBufferを使⽤して調製する．
マトリックス使⽤の場合，標準物質未添加で分析対象に適切な濃度のマトリックス試料があれば使⽤する．測定値が得られない分析対象については，マトリックスにキット添付標準物質を添加する．プレート上のQC試料が増加してしまうデメリットがある．

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1. キット添付QC試料を使用

3. 設定なし

非GLP試験の場合，キットにQC試料がない場合など
11th JBF Symposium, DG2019-42

37

Japan Bioanalysis Forum

分析対象ごとに検量線及びQC試料の測定結果を判定
し，適合基準を満たさなかった分析対象のみ再測定を実施する．
検量線及びQC試料の適合基準を満たさなかった分析
対象が少数であれば手技に問題はないとして全分析対
象の測定結果を採⽤するという事例もあった．
「トラブル事例 トラブル①︓一部の分析対象で適合基準を満たさない」47ページ参照

11th JBF Symposium, DG2019-42

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バッチの採⽤基準38

Japan Bioanalysis Forum

実試料の再測定基準
1. 定量上限を超えた場合

2. 二重測定のCV＞20%
DGメンバーはCVを20%以上に設定した経験がある
複数の分析対象を測定し，ある1実試料の1つの分析
対象のみのCVが適合基準を満たさない場合は，再測定を実施

3. Luminexにおいて，Beadsカウント＜50

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希釈再測定を実施

上記のいずれか⼜は複数を設定する例があった
11th JBF Symposium, DG2019-42

39

Japan Bioanalysis Forum

初回測定と同様に試薬を調製し，測定を実施する．再測定の対象となる分析対象のみのデータ取得及び解析を実施する．
Luminexにおいて，Beadsの凝集がみられ，Beads
カウントが50未満となった場合，プレートを洗浄して再度測定するとBeadsの凝集が改善され，Beadsカ
ウントが上昇する場合がある．
「トラブル事例 トラブル① 〜分類②の対処法（DGメ
ンバーの⾒解）〜」50〜51ページ参照

11th JBF Symposium, DG2019-42

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再測定の実施⽅法

40

Japan Bioanalysis Forum

同一試験では同一ロットを使⽤する．
同一被験者は同一ロット，同一プレートでの測定が好ましい．
ロットが変更となる場合は，標準物質のロットを統一
したり，ロット変更時に新旧ロットでQualification
Runを実施する．標準物質のロットが変更となる場合
は，実試料を新旧ロットで測定して定量値を確認する
ことを考慮する．

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測定キットのロット間差の担保

ロット間差を確認しないこともある．

「トラブル事例 トラブル③︓標準物質のロット変更」及び「トラブル④︓キットのロット変更」57〜62ページ参照
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41

トラブルと対処

Troubleshooting

11th JBF Symposium, DG2019-42

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Japan Bioanalysis Forum

42

Japan Bioanalysis Forum

トラブル事例
1. 一部の分析対象で適合基準を満たさない
2. 希釈倍率の設定が難しい
3. 標準物質のロットにより定量範囲が変わってしまう⇒対応についてDGメンバーの⾒解を協議

その他の事例

4. キットのロット変更による事例
5. クロストークが疑われる事例⇒事例と対応について紹介
11th JBF Symposium, DG2019-42

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DGメンバーの意⾒，アンケートで多かった事例

43

Japan Bioanalysis Forum

DGメンバー

一部の実試料において複数分析対象のうちの1分析対象のみreplicateのCVのバラつきが大きく，データの採否を悩んだ．
（複数意⾒，アンケートでも同様の意⾒）

DGメンバー

キットを使⽤した測定で常にQC試料が適合基準外れる分
析対象がある．
（複数意⾒）

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トラブル①︓⼀部の分析対象で適合基準を満たさない〜DGメンバー，アンケートで挙げられた事例〜

⼀部の分析対象で適合基準を満たさない事例があったという声が多数
11th JBF Symposium, DG2019-42

44

Japan Bioanalysis Forum

トラブル①︓⼀部の分析対象で適合基準を満たさない〜事例分類〜

⼀部の分析対象で適合基準を満たさない適合基準を満たさないのは特定の分析対象である適合基準を満たさないのは特定の分析対象ではない

分類①

分類②

バッチの採⽤基準を満たさない（QC試料が基準外）

測定試料の採⽤基準を満たさない（replicateのCVが基準外）

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分類③

意⾒が多かったのは分類①②の事例
DGメンバーで分類①②③の事例の対処法について⾒解をまとめた11th JBF Symposium, DG2019-42

45

Japan Bioanalysis Forum

トラブル①︓⼀部の分析対象で適合基準を満たさない〜分類①の対処法（DGメンバーの議論）〜

特定の分析対象がバッチの採⽤基準を満たさない（QC試料が基準外）
対処法1：キット付属以外のQC試料を準備する
キット付属のQC試料が採⽤基準を満たさないことが多いです．
（複数意⾒）
キット付属以外のQC試料を準備すると改善することもあるので，
まずは「標準物質からQC試料を調製する」ことを試します．
（複数意⾒）

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分類①

標準物質から調製したQC試料でもダメだった経験があります．
そのときは⾎清などの⽣体試料を⼩分け保存してQC試料として使⽤しました．ただ，安定性の担保が難しいです．
11th JBF Symposium, DG2019-42

46

Japan Bioanalysis Forum

トラブル①︓⼀部の分析対象で適合基準を満たさない〜分類①の対処法（DGメンバーの議論）〜

特定の分析対象がバッチの採⽤基準を満たさない（QC試料が基準外）
対処法2：救済措置を設ける
分析の分析の目的に応じて採用基準を変えるという選択肢もあります
ね．例えば，「QC試料のシグナルの濃度依存性を確認できたら⼤⼩関係については信頼できる」といった対応も可能ではないでしょうか．
「基準外となった分析対象が少数であれば手技に問題はないとして全分析対象の測定結果を採⽤する」とした経験もあります．

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分類①

これらの場合， データの解釈には注意が必要ですね．スクリー
ニングや探索目的にのみ使⽤した⽅が良いかもしれません．

11th JBF Symposium, DG2019-42

47

Japan Bioanalysis Forum

トラブル①︓⼀部の分析対象で適合基準を満たさない〜分類①の対処法（DGメンバーの議論）〜

特定の分析対象がバッチの採⽤基準を満たさない（QC試料が基準外）
対処法3：シングルプレックス測定を試す
シングルプレックス測定で改善することもあるので， 重要な因子であればシングルプレックス測定するのも⼀案です．
マルチプレックス測定が選択されている理由が「少量の試料で複数分析対象を評価したい」という場合，分けて測定するのはできれば避けたいですね ．

11th JBF Symposium, DG2019-42

http://bioanalysisforum.jp/

分類①

48

Japan Bioanalysis Forum

トラブル①︓⼀部の分析対象で適合基準を満たさない〜分類①の対処法（DGメンバーの⾒解）〜

特定の分析対象がバッチの採⽤基準を満たさない（QC試料が基準外）

第1選択︓キット付属以外のQC試料を使用する• キット付属の標準物質からQC試料を調製する• 生体試料（例︓⾎清）をQC試料とする

第2選択︓バッチ採用基準に救済措置を設ける• 分析の目的に応じてQC試料の適合基準を変える• 基準外となった分析対象が少数であれば手技に問題はないとして全分析対
象の測定結果を採⽤する

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分類①

第3選択︓基準を満たさない分析対象はシングルプレック
ス測定する
11th JBF Symposium, DG2019-42

49

Japan Bioanalysis Forum

トラブル①︓⼀部の分析対象で適合基準を満たさない〜分類②の対処法（DGメンバーの議論）〜

測定試料の採⽤基準を満たさない（replicateのCVが基準外）
まずは再測定することが多いですね．再測定する試料がない場合
は初回分析値を参考値として報告するか欠測値としています．
（複数意⾒）
基本的には全ての処理をやり直しますが， LuminexでBeads
count<50のためにCVの基準値を外れた場合，同時にプレー
トに調製した検量線，QC試料，該当測定試料の残余を再測定に供することも許容されるのではないでしょうか．

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分類②

再測定でも同じ試料が基準外となることがあり，マトリックス
成分が影響している可能性を考えています．この場合は初回分
析値を参考値として報告するか欠測値とすることが多いです．
11th JBF Symposium, DG2019-42

50

Japan Bioanalysis Forum

トラブル①︓⼀部の分析対象で適合基準を満たさない〜分類②の対処法（DGメンバーの⾒解）〜

測定試料の採⽤基準を満たさない（replicateのCVが基準外）

第1選択︓再測定する• 最初の処理から全てやり直す• 同じプレートから再測定する（Luminexの場合）

第2選択︓参考値扱いとする/欠測値とする• 再測定に必要な量の試料がない場合は初回分析値を参考値とする• 再測定でも同じ試料の同じ分析対象のCVが基準外となった場合は初回分
析値を参考値とする

11th JBF Symposium, DG2019-42

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分類②

51

Japan Bioanalysis Forum

トラブル①︓⼀部の分析対象で適合基準を満たさない〜分類③の対処法（DGメンバーの議論）〜

適合基準を満たさないのは特定の分析対象ではない
この場合も再測定することが多いですね．再測定する試料がない
場合は初回分析値を参考値として報告するか欠測値としています．
（複数意⾒）
マルチプレックス測定の全ての分析対象で適合基準を満たす確率はシングルプレックス測定よりも低いので，確率論的に妥当であればより緩和した基準を設定しても良いのでは︖（アンケートでも同様の意⾒）
その場合，「適合基準を満たさないのは特定の分析対象ではないことを示す」「緩和基準は妥当であることを示す」必要があるた
め，バリデーション試験が重くなりますね．⻑期・⼤規模・再測定が難しい試験で考慮すれば良いのではないでしょうか．緩和基
準設定⽅法の詳細は要議論と思います．
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分類③

52

Japan Bioanalysis Forum

トラブル①︓⼀部の分析対象で適合基準を満たさない〜分類③の対処法（DGメンバーの⾒解）〜

適合基準を満たさないのは特定の分析対象ではない

第1選択︓再測定する• マルチプレックス測定で再測定し，初回測定で基準外となった分析対象のみ再測定結果を採⽤する

第2選択︓参考値扱いとする/欠測値とする• 再測定に必要な量の試料がない場合

第3選択︓救済措置を設定する

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分類③• 多数の分析対象が同時にバッチ採⽤基準を満たす確率はシングルプレック
ス測定より低い⇒確率を考慮してバッチ採⽤基準を緩和する

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53

Japan Bioanalysis Forum

DGメンバー

分析対象によって適した希釈倍率が異なる（複数意⾒）

DGメンバー

実試料分析における適切な希釈倍率を事前に設定することが難しい（アンケートでも同様の意⾒）http://bioanalysisforum.jp/

トラブル②︓希釈倍率の設定が難しい〜DGメンバー，アンケートで挙げられた事例〜

最適な希釈倍率は測定対象ごとに異なる⇒希釈倍率をどのように設定しているか︖
11th JBF Symposium, DG2019-42

54

Japan Bioanalysis Forum

トラブル②︓希釈倍率の設定が難しい〜対処法（DGメンバーの議論）〜

キット指定のMRDで⼀律希釈することが多いです．最適の希釈倍率が分析対象ごとに若⼲異なる場合は中間の希釈倍率とします（例︓2, 4, 8倍の場合は4倍とする）．大きく異なる場合は複数の希釈倍率に分ける他ないですが，マルチプレックス測定の利点が生かしきれないのが残念ですね．
①希釈直線性・希釈平⾏性が成⽴する，マトリックスの影響が⼩さくなる希釈倍率②測定試料が定量範囲内に⼊る希釈倍率の両⽅を考慮する必要があるのでは︖

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希釈倍率をどのように設定すべきか︖①はキット指定のMRDで概ね満たすのではないでしょうか（必要に応じてバリデーション試験で確認）．②は可能であれば事前検討で評価したいですが，⼊手が難しい場合は①のみ考慮して設定することになりますね．
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55

Japan Bioanalysis Forum

トラブル②︓希釈倍率の設定が難しい〜対処法（DGメンバーの⾒解）〜

第1選択︓キット指定のMRDで⼀律希釈する• 最適な希釈倍率が分析対象ごとに若⼲異なる場合は中間の希釈倍率とする

第2選択︓複数の希釈倍率に分けて測定する• 最適な希釈倍率が分析対象ごとに⼤きく異なる場合（細胞培養上清等に多い）

11th JBF Symposium, DG2019-42

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希釈倍率をどのように設定すべきか︖

56

Japan Bioanalysis Forum

DGメンバー

標準物質（Calibrator Blend）濃度がロット依存のため，のため，キットのロットが変わると定量範囲が変わってしまう（複数意⾒，アンケートでも同様の意⾒）

標準物質は複数の分析対象の混合物として提供されており，ロットごとに含有⽐が異なる⇒ロット変更時の対応について苦慮する声が多数

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トラブル③︓標準物質のロット変更〜DGメンバー，アンケートで挙げられた事例〜

57

Japan Bioanalysis Forum

トラブル③︓標準物質のロット変更〜対処法（DGメンバーの議論）〜

標準物質のロットが変わると定量範囲も変わってしまう

標準物質のロットが試験内で変わらないように準備します．
（複数意⾒）
できればロット変更は避けたいのですが，⻑期の試験や想定以上に再測定が発生した場合に，ロット変更せざるを得なかった経験があります．
（複数意⾒）

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対処法1：同一試験内では標準物質のロットを統一する

58

Japan Bioanalysis Forum

トラブル③︓標準物質のロット変更〜対処法（DGメンバーの議論）〜

標準物質のロットが変わると定量範囲も変わってしまう
バリデーション試験(ロット変更前)の検量線範囲が10-1000pg/mL，
ロット変更後の検量線範囲が12-1200pg/mLの場合，ロット変更後の定量範囲はどうしますか︖
ロット変更時にQualification runを実施し，ロット変更後の検量線範囲を定量範囲とします．上記の例の場合，定量範囲は121200pg/mLとし，定量下限未満の試料は「BLQ（<12pg/mL）」
等LLOQ濃度がわかるように注釈をつけて報告します．

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対処法2：ロットごとに定量範囲を変える（複数意⾒）
定量範囲はバリデーション試験の検量線範囲と変更後ロットでの検量線範囲の重複部分としたこともあります．上記の例の場合，定量範囲は12-1000pg/mLとしました．
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59

Japan Bioanalysis Forum

トラブル③︓標準物質のロット変更〜対処法（DGメンバーの議論）〜

標準物質のロットが変わると定量範囲も変わってしまう

標準物質が複数の分析対象の混合物として提供されていることが原因なので，分析対象ごとに市販されれば良いのですが・・・（アンケートでも同様の意⾒）
キットのメーカーに依頼したことがあるのですが，その時は分
析対象ごとの提供は不可との回答でした．
別メーカーのリコンビナント品を購⼊して標準物質として使⽤することも考えられますが，予備検討も必要なので手間や試験規模を考慮して判断すべきですね．また，キットの標準物質と異なる結果が出た場合，判断に迷うかもしれません．
11th JBF Symposium, DG2019-42

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対処法3：分析対象ごとに標準物質を入手する

60

Japan Bioanalysis Forum

トラブル③︓標準物質のロット変更〜対処法（DGメンバーの⾒解）〜

第1選択︓試験内でロットを統⼀する• ⻑期試験や想定以上に再測定が発生した場合は不可

第2選択︓ロットごとに定量範囲を変更する• 定量範囲はロット変更後の検量線範囲とする• 定量範囲はバリデーション試験とロット変更後の検量線範囲の重複範囲とする• いずれもLLOQ濃度がわかるように注釈に記載して結果を報告する

第3選択︓分析対象ごとに標準物質を⼊⼿する

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標準物質のロットが変わると定量範囲も変わってしまう• メーカーに依頼したが不可だったという事例あり• キットと別メーカーの標準物質を購⼊する（予備検討の手間や試験規模を考慮して判断）11th JBF Symposium, DG2019-42

61

Japan Bioanalysis Forum

トラブル④︓キットのロット変更〜事例と対応〜

他の分析対象は基準を満たしていたため，該当ロットのキットに問題はないと判断しました．試験計画書でQC試料を精度管理としていたが，該当ロットの分析対
象にはバッチ採用基準を設定せず，基準を満たさない
分析対象も測定値を採用しました．
以降の試験では同⼀被験者の全ての時点の実試料が揃ってから同⼀測定バッチで測定を実施するようにしていますが，⻑期の試験の場合は安定性も考慮する必要がありますね．また，「QC試料のシグナルの濃度依存性を確認できたら⼤⼩関係については信頼できる」のように分析の目的に応じて基準を緩和することもあります．
11th JBF Symposium, DG2019-42

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DGメンバー

キットのロット変更後に特定の分析対象のキット添付の
QC試料がキット記載の採用基準を満たさなくなりました．

62

Japan Bioanalysis Forum

DGメンバー

ある分析対象の未知試料のシグナルが他の分析対象よりも⼤幅に高く，他の分析対象の測定結果が不安定になったことがあります（QC試料の真度が基準外となる，CVが⼤きくなる）．
高シグナルの分析対象のみシングルプレックスで測定したところ，結果が安定したことから，クロストークを疑っています．
バリデーション試験でクロストークを評価するには「特定の分析対象の標準物質だけ含量を多くしたときの影響を確認する」必要がありますが，標準物質を個別に⼊手できないことが多いので難しいですね．実試料でクロストークが疑われる場合に評価すれば良いと思います．

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トラブル⑤︓クロストーク〜事例と対応〜63アンケート結果
Results of a Questionnaire
Survey11th JBF Symposium, DG2019-42

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Japan Bioanalysis Forum64

Japan Bioanalysis Forum

実施期間︓ 2019年12月9日〜12月20日
設問数︓
19問
収集回答数︓27件

11th JBF Symposium, DG2019-42

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アンケート概要65

選択式Japan Bioanalysis Forum

①製薬企業
②CRO
②
54%
(14件)

①
46%
(12件)

11th JBF Symposium, DG2019-42

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Q1 所属について

66

選択式

Japan Bioanalysis Forum

①経験あり
②経験なし
②
37%
(10件)

①
63%
(17件)

11th JBF Symposium, DG2019-42

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Q2 マルチプレックス測定の経験について

67

選択式

Japan Bioanalysis Forum①ECL②Luminex
②
42%
(8件)
回答者背景
1試験
①
ECL
2～4試験
5試験以上
1試験
② Luminex 2～4試験
5試験以上

2
7
2
0
3
5

11th JBF Symposium, DG2019-42

①
58%
(11件)

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Q3 プラットフォームについて

68

記述式

Japan Bioanalysis Forum①少量の試料で複数項目を評価したい場合②多項目を探索的・網羅的に測定したいとき③コストや作業時間の低減のため④特殊な試料の場合
③
12%
(2件)

④
6%
(1件)

②
41%
(7件)

11th JBF Symposium, DG2019-42

①
41%
(7件)

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Q4 選択の理由について

69

選択式

Japan Bioanalysis Forum①バイオマーカー測定②ADA測定③イムノグロブリンのサブクラスやアイソタイピング
回答者背景①

バイオマーカー測定

②

ADA測定

③

イムノグロブリンのサブクラスやアイソタイピング

1試験
2～4試験
5試験以上
1試験
2～4試験
5試験以上
1試験
2～4試験
5試験以上

2
8
7
0
2
0
2
0
0

②
9%
(2件)

③
9%
(2件)

11th JBF Symposium, DG2019-42

①
82%
(19件)

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Q5 使⽤目的について

70

選択式

Japan Bioanalysis Forum①動物の細胞株，細胞培養上清など②動物の⾎漿，⾎清，尿など③ヒトの細胞株，細胞培養上清など④ヒトの⾎漿，⾎清，尿など
回答者背景
1試験
細胞株，細胞培養上清
2～4試験
など
5試験以上
動物
1試験
血漿，血清，尿など 2～4試験
②
5試験以上
1試験
細胞株，細胞培養上清
③
2～4試験
など
5試験以上
ヒト
1試験
④
血漿，血清，尿など 2～4試験
5試験以上
①

2
0
0
1
7
2
1
1
2
5
7
1

④
45%
(13件)

11th JBF Symposium, DG2019-42

①
7%
(2件)

③
14%
(4件)

②
34%
(10件)

http://bioanalysisforum.jp/

Q6 分析対象について

71

選択式

Japan Bioanalysis Forum①使⽤する試料量②再現性の良さ③スループットの良さ④過去の実績
③
22%
(4件)

④
6%
(1件)

①
11%
(2件)

②
61%
(11件)

11th JBF Symposium, DG2019-42

http://bioanalysisforum.jp/

Q7 プラットフォームの選択において優先する事項について

72

選択式

Japan Bioanalysis Forum①探索・検討レベル②社内意思決定または非GLP試験レベル③信頼性基準試験レベル④GLP試験レベル
回答者背景
1試験① 探索・検討レベル 2～4試験
5試験以上
1試験
社内意思決定または②
2～4試験
非GLP試験レベル
5試験以上
1試験
信頼性基準試験
③
2～4試験
レベル
5試験以上
1試験
④
GLP試験レベル
2～4試験
5試験以上

3
5
3
2
3
1
4
4
1
1
1
1

③
31%
(9件)

④
10%
(3件)

11th JBF Symposium, DG2019-42

②
21%
(6件)

①
38%
(11件)

http://bioanalysisforum.jp/

Q8 データの位置づけについて

73

選択式

Japan Bioanalysis Forum①ECLの経験あり②Luminexの経験あり
③経験なし
回答者背景
1試験
①
ECL
2～4試験
5試験以上
1試験
② Luminex 2～4試験
5試験以上
経験なし
③

5
3
1
4
0
2
4

③
21%
(4件)
②
32%
(6件)

11th JBF Symposium, DG2019-42

①
47%
(9件)

http://bioanalysisforum.jp/

Q9 バリデーションの経験について

74

選択式

Japan Bioanalysis Forum

検量線

21%(11件)

再現性

21%(11件)

安定性20%(10件)
12%(6件)

添加回収試験

14%(7件)

希釈直線性
8%(4件)

希釈平⾏性
その他(特異性など)http://bioanalysisforum.jp/

Q10 バリデーションの評価項目について(ECL)

4%(2件)

11th JBF Symposium, DG2019-42

75

選択式

Japan Bioanalysis ForumQ11 再現性の適合基準について(ECL)

真度±20%以内
精度20%以下

7%(1件)
14%(2件)真度±25%以内
精度25%以下

36%(5件)真度±30%以内
精度30%以下

36%(5件)真度±30%超
精度30%超http://bioanalysisforum.jp/

真度±15%以内
精度15%以下

7%(1件)

11th JBF Symposium, DG2019-42

76

選択式

Japan Bioanalysis Forum

検量線

24%(10件)

再現性

24%(10件)

安定性

15%(6件)

添加回収試験

15%(6件)

希釈直線性

15%(6件)

希釈平⾏性
その他(特異性など)5%(2件)

http://bioanalysisforum.jp/

Q12 バリデーションの評価項目について(Luminex)

2%(1件)

11th JBF Symposium, DG2019-42

77

選択式

Japan Bioanalysis ForumQ13 再現性の適合基準について(Luminex)
0%(0件)

真度±20%以内
精度20%以下

18%(2件)真度±25%以内
精度25%以下

18%(2件)真度±30%以内
精度30%以下
真度±30%超
精度30%超46%(5件)

http://bioanalysisforum.jp/

真度±15%以内
精度15%以下

18%(2件)11th JBF Symposium, DG2019-42

78

選択式

Japan Bioanalysis Forum①基準から外れた分析対象の結果は使⽤不可としている②測定系の特性を理解した上で結果を考察に使⽤している③その他
・状況によって①か②にしている．
・”そのレベルの分析法” として，データの採⽤及び評価に使⽤する．
・結果を参考値として使⽤する．
・基準を満たさなかったことがない
③
①
20%
25%
(4件)
(5件)
②
55%
(11件)

11th JBF Symposium, DG2019-42

http://bioanalysisforum.jp/

Q14 バリデーションの適合基準について

79

選択式

Japan Bioanalysis Forum①キット付属のQCを使⽤している②⾃社で作成した試料を設定している③設定していない
③
12%
(3件)
②
33%
(8件)

①
54%
(13件)

11th JBF Symposium, DG2019-42

http://bioanalysisforum.jp/

Q15 QC試料の設定について

80

選択式

Japan Bioanalysis Forum①QCが外れた分析対象を再測定している②10項目中8項目が基準を満たしていればOKなどの救済処置を設定している③QC試料の値は参考値として，基準では管理していない④その他
・状況によって①②③のどれかにしている．
③
・目的次第で再測定するか，参考値とするか
4%
判断する．
(1件)
・再測定が困難という場合がありえる． ②

④
14%
(3件)

14%
(3件)

11th JBF Symposium, DG2019-42

①
68%
(15件)

http://bioanalysisforum.jp/

Q16 QC試料が適合基準を外れた場合について

81

記述式

Japan Bioanalysis ForumQ17 キットのロット間差について

②
44%
(8件)

①
56%
(10件)

11th JBF Symposium, DG2019-42

http://bioanalysisforum.jp/①担保している(その場⾯に合ったらする)②担保していない

82

記述式Japan Bioanalysis Forum[担保している場合の⽅法]
別ロットのキット間で同一試料を測定し，データを⽐較して担保している．更に，それぞれのロットで検量線を作成してQCと共に管理図を作成して品質を保証している．
新ロットのキットと標準品から作製した検量線を使⽤し，旧ロットの標準品で作製したQCを測定して基準値以内に⼊れば担保できたと考える．
同一試料を測定し，乖離度30%以内であることを確認する．
検量線及び真度精度を確認する．
一⽅で検量線を作成，両ロットのQC試料の真度で評価する．
11th JBF Symposium, DG2019-42

http://bioanalysisforum.jp/

Q17 キットのロット間差について

83

記述式

Japan Bioanalysis ForumQ17 キットのロット間差について
試験内でロットが変わらないようにしている．
それぞれのロットで検量線を作成して測定しているため問題無いと考えている．
実施したほうが良いと思うが，費⽤などの⾯からそこまではしていない．
経験している試験がレギュレーション範囲外である
ことと，検量線と精度管理QCでバッチごとに確認しているため．
使⽤ロットでデータ採⽤基準を満たすことを確認のうえ使⽤する．

11th JBF Symposium, DG2019-42

http://bioanalysisforum.jp/[担保していない場合の理由]

84

記述式

Japan Bioanalysis Forum①特定の分析対象が基準外となる②希釈倍率設定③標準品のロット変更④キットのロット間差
③
18%
(2件)

④
9%
(1件)

②
36%
(4件)

11th JBF Symposium, DG2019-42

①
36%
(4件)

http://bioanalysisforum.jp/

Q18 トラブルについて

85

記述式

Japan Bioanalysis Forum[特定の分析対象が基準外となる]
QCの真度，精度が基準内に⼊らないことが多い．
一部基準を満たさない物質があった．
[希釈倍率設定]
広い希釈範囲でパラレリズムが成⽴するマーカーと成⽴しないマーカーがあった．成⽴しないマーカー
は狭い希釈範囲とした．
各項目での検出濃度範囲がバラバラで，複数希釈率を設定し，複数回測定が必要となった．
11th JBF Symposium, DG2019-42

http://bioanalysisforum.jp/

Q18 トラブルについて

86

記述式

Japan Bioanalysis Forum[標準品のロット変更]
ロットによってStock solutionの濃度が変わるので，ロットごとに検量線を設定した．
kit付属のキャリブレーターのロット変更（測定対象の混合物の含有⽐率が違う）で検量線範囲を変更せざるをえなかった（ECL）．
[キットのロット間差]
ロット間差が⼤きい．

11th JBF Symposium, DG2019-42

http://bioanalysisforum.jp/

Q18 トラブルについて

87

記述式

Japan Bioanalysis Forum

申請資料に使うなどの実⽤可能と考える線をどこに引くか提案してほしい．また，探索目的として使⽤するようなレベルの再現性や選択性については，明らかにしたうえで議論してほしい．
マルチプレックスにガイドラインの基準は適さない．探索的な測定が多いので，Fit for purposeでの測定で良いと思う．
標準品を分けて市販してほしい．
臨床試験検体測定でQualificationレベルで実施されているケースがどれぐらいあるか．
複数物質のうち，1つだけが判断基準を満たさない場合，対策が取れない．
シングル測定と複数測定で真度精度など影響されるかどうかについて，バイオマーカー測定の場合に，バリデーションでどこまで追及するべきか．
11th JBF Symposium, DG2019-42

http://bioanalysisforum.jp/

Q19 その他議論したいことなど

88

記述式

Japan Bioanalysis Forum

ECLのキットではキャリブレーターが混合された状態で送られてくるため，それぞれの濃度をこちらで設定することができない．
マルチプレックスならではのバリデーション項目はないか．
項目間のクロスリアクションの検証など．
ロットごとに検量線範囲が違っているので継続試験の場合に困る．また，データ処理した際に，⾃動でフィットの悪い点が除外されて定量上限や下限も除外されるため，それを許容していいものか迷う．
レギュレーション下でキットを⽤いて実施した場合，恒久的確保の担保と，製造中止になった場合の対応（フルバリなのか，パーシャルで対応かなど）について．

11th JBF Symposium, DG2019-42

http://bioanalysisforum.jp/

Q19 その他議論したいことなど

89

記述式

Japan Bioanalysis Forum

採⽤基準の指標．バイオマーカー（内因性物質）が多いと思われるので，代替マトリックスの選定⽅法もしくは標準的な代替マトリックスの設定．
確率論的に，測定対象すべてのQC試料が基準を満たす確率はシングルプレックスに⽐べてかなり低くなるが，統計学的な基準を設定することはできないか．
バリデーションにおける真度，精度についてどこまで許容できると考えるか．

など

http://bioanalysisforum.jp/

Q19 その他議論したいことなど

多数のご意⾒有難うございました
11th JBF Symposium, DG2019-42

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