PI ポリアミド化合物の開発
永瀬 浩喜

千葉県がんセンター 研究所

第３回ミトコンドリア病研究・患者公開フォーラム 2018 年 2 月 24 日（土） 12：50-17：30

千葉県がんセンターは、千葉市の中心部から東南約5.5㎞に位置し、緑豊かな自然に囲まれています「ロボットを操縦して手術」

ミトコンドリアとがんそしてミトコンドリア標的治療へライソソーム リボソーム
ゴルジ体

細胞膜
細胞質
小胞体
ペルオキシソーム

中心体

核
ミトコンドリア
Biology Wise より

千葉県がんセンターでのミトコンドリア研究がんの転移をひきおこすミトコンドリア遺伝子異常の発見
Angiogenesis

Lung metastasis

転移しない肺がん転移をする肺がん Lung metastasis

Angiogenesis

G13997A

ROS production

ROS production

Reduction of complex I
activity (G13997A)

G13997A (ND6)

ROS production

Metastaticability (%)

G13997A

G13997A

0/6 (0)8/8 (100)

0/6 (0)12/12 (100)
Science 320(5876) 661‐664 2008

Specific mitochondrial DNA mutation in mice regulates diabetes and lymphoma development

活性酸素を産生するミトコンドリア異常マウスは老化は認めなかったが糖尿病やがんを起こしやすく、抗酸化剤の飲用で発症が抑えられた
Mice with normal
mitochondria
正常なミトコンドリアを持つマウス

Mice with type B mutation
mitochondria
病原性突然変異B
ミトコンドリアを持つマウス

Mice with type A mutation
mitochondria
病原性突然変異A
ミトコンドリアを持つマウス
ROSROS

ROS

reactive oxygen species (ROS)+
ROS産生

ミトコンドリアの突然変異は二十日ネズミに血液のがんをおこし、また、このがんは、抗酸化剤で予防できた。
（つくば大学との共同研究）

lactic acidosis
高乳酸血症のみ

lactic acidosis, DM, Lymphoma
高尿酸血症・糖尿病・リンパ腫

Treat with N-acetylcysteine(NAC) an antioxidant

ROS

Mice with type A mutation mitochondria
ROS
病原性突然変異A
ミトコンドリアを持つマウス
ROS

Reduced lactic acidosis, DM, Lymphoma
高尿酸血症・糖尿病改善・リンパ腫発症予防
Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jun 26;109(26):10528-33. Epub 2012 Jun 11.

No. of lung nodules/mouse

ミトコンドリア呼吸鎖に関係する遺伝子にがんでも変異が集積していた
100806040200肝臓や肺、骨などに転移したがんではミトコンドリア遺伝子の異常が多い
Category

Somaticmutations(missense andnonsense)

Selected SNPs
and SNVs

Mutations in the ND1
Adjacent mucosa

Tumor lesion**Wild type*
Wild type**
T3394C

Wild type

T3398C*
G3709A

CancerNo. of cases with the indicatedmutation / Total No. of cases
Group 2Group 1(Primary w/(Primary w/odiatant meta &distant meta)
Metastases)

Significance

NSCLC

5/44

9/38

ns

Colon cancer

6/15

4/16

nsTotal

11/59

13/54

ns

NSCLC

4/44

12/38

p = 0.0104*
p < 0.05**

Colon cancer

3/15

5/16

nsTotal

7/59

17/54

p = 0.0109*
p < 0.05**

Lung
adenocarcinoma

1/22

12/29

p = 0.0036*
p < 0.01**

Colonadenocarcinoma

2/15

3/9

nsTotal

3/37

15/38

p = 0.0018*
p < 0.01**

ミトコンドリアの呼吸鎖遺伝子から翻訳されるたんぱく質の形が変わってしまっている
A****

*

Wild type

C3497T

Wild type

C3689G

Wild type(LgAdBrM-2)

ND1 - Wild type (318 aa)

ND1 – A64V

G3709A*

Wild type

G3955A(LgCa-169)(ColonLivM-4)

GCATCAAACTACGCCCTGATCGGCGCA
N S N Y A L I G A

GGCGCACTGCGAGCAGTAGCCCAAACA
G A L R A V A Q T

ATCGAATACGCCGCAGGGCCCCTTCGCI E Y A A G P F A

ND1 - Wild type

ND1 - A128G

CCCCTAAAACCCGTCACATCTACCATC
P L K P V T S T I*(LuAdBrM-5)

ND1 - Wild type

CCCCTAAAACCCGCCACATCTACCATC
P L K P A T S T I*

ND1 - Wild type

ND1 – A135T

GCATCAAACTACGGCCTGATCGGCGCA
N S N Y G L I G A

ND1 – A217T

GGCGCACTGCGAACAGTAGCCCAAACA
G A L R T V A Q T

ATCGAATACGCCACAGGGCCCCTTCGCI E Y A T G P F A

B
ND1 - Wild type

IMSMatrix

ND1 – A64VIMS

ND1 - A128GMatrix

IMS

ND1 - A217T

ND1 – A135T

MatrixIMSMatrix

IMS

IMS: intermembrane space Matrix：mitochondrial matrix sideMatrix

臨床医から創薬研究の経験
そしてミトコンドリア標的治療へ

Against Cancer

米国ONYX社で開発に携わった腎臓がんや肝臓がんに対する治療薬

ソラフェニブ

1996年最初の発見
2005年米国承認
2007年日本承認

New England Journalof Medicine 2007

大村智博士
ノーベル医学・生理学賞

数百万個3万個の候補100個の候補8個が薬になるミトコンドリア病は、ミトコンドリアだけでなく細胞の核の中の遺伝子異常でも起きる核に記憶されたタンパク質

核内遺伝子

ミトコンドリア遺伝子(37)

ミトコンドリアに記憶されたタンパク質

核に記憶されている
遺伝子 (約270)

牧場全体が細胞核

ミトコンドリア核
ミトコンドリア

遺伝子を直接標的にした治療法の開発

ゲノム編集・抗生物質は、細菌がウィルスなどの外的から自らを守る免疫機構
放線菌

Innate immune system
In lower organisms, even conserved in higher organisms

黄色ブドウ球菌

抗生物質
DNA結合化合物

Nuclease
Restriction enzyme
DNA methylation
Chromatin structure
TALE Nuclease
CRISPR CASInterfering RNA

抗生物質(遺伝子に結合する)

Genome editing
Anti‐viral strategy

子安房内に引き込んでウィルスを撃退
細胞外に毒をだして他の細菌を退治

Acquired immune system
Higher organisms, such as vertebrates

遺伝子の配列を認識して結合する薬の開発

Antibiotics

Streptomyces

Minor groove binders
Streptomyces
secrete antibiotics
as a homing drug
targeting parasite
genome to protectfrom parasite
invasion

Staphylococcus Aureus

Minor groove binders recognize DNA sequence

Favored (+), disfavored (－)

DNAとくっ付いて離れなくなる薬を病気の遺伝子に運んで遺伝子を止める

Creation of adduct formation between Oligo (ODN1) and KR12
5 min1 hour

16 hours

Chemistry. 2014 20(5):1310‐7.
Chemistry. 2015 21:1‐9.

遺伝子の転写を止める（遺伝子が読めなくなる）
Alkylation of template strand of coding region causes effective gene silencing
Alkylating of coding region

Coding strand

Polymerase
Template strand

Coding region

下村 脩博士ノーベル化学賞
緑色蛍光タンパク質(GFP) の発見と開発

Nucleic Acids Res. 2006; 34(4): 1189–1195.

抗がん剤の開発： KRAS変異配列標的アルキル化剤の開発
標的ゲノム配列への介入 化合物の自動合成系の確立 がん細胞への特異的取り組み、蓄積、貯留
2 weeks

PIポリアミド薬物複合体(PDC)

標的配列に対する薬剤候補の自動合成を創薬プラットフォームとして企業（S社）と連携して開発

単回投与で大腸がん縮小 連続投与での膵臓がん縮小

ヒト大腸がん移植モデルでの腫瘍縮小効果（単回投与）
薬剤候補として企業導出をA社と協議中

膵臓がん自然発症モデルでの腫瘍縮小効果（連続投与）
薬剤候補として企業導出を視野

がん幹細胞持続集積・ 正常臓器での副作用低減
・ がん幹細胞への送達
・ 薬物耐性機構からの回避
・ DDSの付加を必要としない候補薬剤がコンパニオン診断薬に細胞内ゲノム結合配列をNGS解析を用いて同定可能
血中KRAS変異DNAを濃縮、デジタルPCRで診断
T社との共同出願

23

ミトコンドリDNAを直接標的にした治療薬ができるか？

ミトコンドリアの中に薬を運んでミトコンドリア遺伝子の発現を調節できた

Mitochondria penetrating
peptide (MPP)

ND6呼吸鎖遺伝子の発現を抑制

PIP1‐TPP structure+1)
2)TPP ー ββDp ββ

PyBOP, DIEA, NMP, 1 hNMP, 4 hミトコンドリアのDNAのあるところに薬の候補が届いている

PIP‐TPP localization in HeLamt 3243 55% cybrids

ミトコンドリア病患者さんのミトコンドリアDNAを55％持った細胞

Green:anti‐TPP
Antibody provided by Dr. Murphy (Cambridge Univ.)

CytC: redMerge

ミトコンドリアのDNAのあるところに薬の候補が届いている

PIP‐TPP localization in HeLamt 3243 82% cybrids
ミトコンドリア病患者さんのミトコンドリアDNAを82％持った細胞

green: anti‐TPP

Red: anti cytC

Merge

55

(正常バンド濃度/異常バンド濃度 x100)

Relative intensity

正常mtDNA量がPIP2‐TPP投与で増加傾向 変異mtDNA量は減少傾向
HeLamt3243A>G 55%5045<正常DNAバンド40変異DNAバンド

35
DMSO530
DMSO10→20DMSO10

PIP 5uM

PIP 10uM

PIP10→20uM

135130125120

DMSO10→20115110105100
PIP 5uM

PIP 10uM

PIP 10→20uM<正常DNAバンド<Relative intensity (PIP treated/DMSO)DMSO: negative control

変異DNAバンド

PIP 10uM→20uM

PIP1‐TPP という薬剤候補は ミトコンドリア病の細胞でミトコ
ンドリアのオートファジー（ミトコンドリアを壊す）を誘導
MWM

PIP1‐TPP treatment (d)26d48d63d

DMSO 1μM ５μM

DMSO 1μM ５μM

DMSO 1μM ５μM← PINK1

大隅良典教授 ノーベル医学・生理学賞

遺伝子異常は、DNAの異常だけでない遺伝子配列は正常でも遺伝子がで亡くなったり出すぎると病気が起きるDNAの巻き方が変わると遺伝子の出方が変わる
遺伝子 DNA は長い ひも

ひもがもつれないように糸巻の芯のようなたん白質（ヒストン）があります
一つの細胞に約２ｍのDNAが格納されていてヒトは６０兆個の細胞を持っていますので、一人当たり１２００億キロメートルのDNA、太陽系の半径の約１６倍の長さのDNAを持っています。
Science published online 18 August 2010

双子は遺伝配列は同じでも年を取ってくると遺伝子の修飾のパターンが変わる
遺伝子の巻き方が変わる
Identical Twins

PNAS 102:10604, 2005

34

DNAの糸をほぐして遺伝子の発現を導き出す薬を山中因子に運ぶ
HAT activator
CTB

SAHA

HDAC inhibitor

iPS 細胞みたいな細胞ができた

PIP‐I PIP‐ICTB SAHA

Day 4Day 8

Day 18200 µm

200 µm200 µmSignificant morphological change only with SAHA‐PIPs

Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 1 – 5

同じ遺伝子の場所に似た作用を持つ
別々の薬を運ぶと同じような遺伝子を発現させることができた。

HDAC inhibitor, SAHA and HAT activator, CTB induced a similar
gene expression profile when delivered by the same PIP

体から取り出した細胞からiPS細胞を作り、薬で変異ミトコンドリアを減らし、様々な臓器になることができる細胞として体にもどす

PIP－TPPPIP PIP-SAHA
TALEN

Cell therapy: Infusion of genetically modified stem cells,
immune activation, modification of cell environment,
replacement of tissue defects after surgery or chemo
Journal of Cellular Biochemistry 113:381–387 (2012) modified

小児希少疾患フリードライヒ運動失調症の遺伝子を薬で出させる
Aseem Z. Ansari Science 30 Nov 2017:eaan6414DOI: 10.1126/science.aan6414

Friedreich’s ataxia (FRDA) caused by loss of FXN expression due to expanded GAA repeats.
Loss of FXN induce mitochondrial dysfunction.

薬を肝臓に集めるか腎臓に集めるかをコントロールして副作用軽減
3 daysDAPI

1LiverKidney

5
Liver

Kidney

DMSO

Liver

KidneyFITC

9 daysMergedDAPI

FITC

Mergedまとめ• PIポリアミド化合物のようなDNA副溝結合化合物（MGB）は、生体遺伝子のコントロールに使用できる• 核内ゲノムDNAのみでなく、ミトコンドリアゲノムDNAにも送達できる• ゲノムDNA結合蛋白や修飾酵素を制御できる低分子化合物のゲノム上の特定の部位に送達ができる• 腫瘍集積性などの薬物動態のコントロールができ、生体内で安定• 動物で副作用が許容されたChiba Cancer Center Research InstituteNobuko Koshikawa
Takayoshi Watanabe
Jason Lin
Takahiro Inoue
Nina Matsuo
Asuka Hattori
Nanami Yasui
Mayu Shinohara
Sun Ki
Yume Tabata
Rie Igarashi
Tomoko Koga

Atsushi Takatori
Osamu Shimozato
Hiroyuki Yoda
Kiriko Hiraoka
Yuto Hirano
Yu Ishihara
Yoshiaki Maru
Yasuko Imai
Hirokazu Sugimoto
Toshinori Ozaki
Yuki Kaiho
Kei Murayama

Kyoto University

Nihon University

Hiroshi Sugiyama
Toshikazu Bando
Ganesh N. Pandian
Akimichi Ohtsuki

Noboru Fukuda
Yoshiaki Matsumoto
Isao Saito
Xiaofei Wang
Min Chen
Kyoko Fujiwara
Makoto KimuraRajeev Mishra
Asako Oguni
Kaoru Tagata
Tsukasa Suzuki

Chiba University
Atsushi Kaneda
Ken‐ichi Shinohara

Tokyo University
Satoru Miyano
Seiya Imoto

UCSF

Allan Balmain

Gentire Biosystems

Advanced Industrial
Science and Technology
Paul Horton

RIKEN
Shigeharu Wakana
Atsushi Yoshiki

Funded by AMED
Practical Research for Innovative Cancer Control
P‐DIRECTMEXT
Academic Frontier Project 2006‐2010
KIBAN (B)
Innovative Areas “Conquering Cancer throughNeo‐dimensional Systems Understanding“ミトコンドリア研究で高名な先生も来日します 。
Mitochondorion誌のChief editor