ミトコンドリアのDNAを標的にした根本的な治療薬の開発を目指して
永瀬 浩喜

くすり で異常なミトコンドリアを除去し正常なミトコンドリアを増やす

第６回ミトコンドリア病研究公開フォーラム 令和４年２月５日

ミトコンドリア置換による治療の試み (2016年4月男児出産)
根本的な治療、発症予防効果が考えられる しかし 異常なミトコンドリアが残る可能性
異常なミトコンドリアの増加を防ぐ、完全に除去する治療・薬剤が必要

Nature (2016-05-26) | doi: 10.1038/nature.2016.19948

Nature (2017-04-06) | doi: 10.1038/nature.2017.21761

DNAに配列特異的に結合する薬の研究を行っていますDNA副溝結合化合物（Minor Groove Binder）
放線菌などの細菌が創る
Streptomyces
secrete antibiotics
as a homing drug
targeting parasite
genome to protectfrom parasite
invasion

抗生物質
Staphylococcus Aureus

Minor groove binders recognize DNA sequence

Favored (+), disfavored (－)

ミトコンドリアのDNAを標的にした根本的な治療薬の開発を目指して
大腸菌
46,000,000 bp 4千6百万対（E. Coli genome）

約 3000 倍＞＞＞

抗生物質（他の菌を駆逐し自身を増加）
細菌ゲノムを標的にしたDNA副溝結合化合物
マイナーグルーブバインダー

ミトコンドリア
16,569 bp 1万７千対弱

変異ミトコンドリアを駆逐する
抗ミトコンドリア物質も創れるはず第６回ミトコンドリア病研究公開フォーラム 令和４年２月５日

変異ミトコンドリアDNA配列を識別する
MELAS3242G変異特異的標的化合物を合成した

TPP: triphenylphosphonium

CCC024-TPP
ミトコンドリアに運ぶ化合物

結合出来ない認識し結合

ATGGCAGGGCCCGG

ATGGCAGAGCCCGG

MELAS ３２４３G 変異配列

正常 ミトコンドリア 配列

変異ミトコンドリアDNA配列を特異的に識別する化合物

SPRアッセイという方法で６０倍結合力が強い

薬が核のDNAではなくミトコンドリアDNAに届いている
CCC024-TPPはミトコンドリアに局在する薬の細胞内局在(TPP)

ミトコンドリアの局在(Cyt C） 薬がミトコンドリアに局在

HeLa(3243G High)(3 d)

HeLa(3243G Low)
(14 d)
3243G High cybrid： 3 days after CCC024-TPP treatment (100nM)

3243G Low cybrid： 14 days after CCC024-TPP treatment (500nM)

「変異ミトコンドリアDNAに結合することで変異ミトコンドリアが増え難くなる」と考えた
このことを確認するため
MELAS 3243G変異を持つヒト子宮頸がん細胞モデルを利用した
3243 A>G mtDNAを持つ
ヘテロプラスミーのMELAS
患者さんの血小板

HeLamt3243
HeLa (3243G High) MELAS 3243G変異を82％ mutated DNA 82％持つ
fusionHeLa (3243G Low)
55％C持つ55％ mutated DNAHeLa

r0HeLa
ミトコンドリアを持たない細胞

fusionHeLamtHeLa

Enucleated HeLa cells
Cybrids were provided by Profs. J. Hayashi and K. Nakada group (Tsukuba Univ.)

CCC024-TPPの投与実験

CCC024-TPP の投与で変異ミトコンドリアの割合が減少
総ミトコンドリアDNA数は増加した
変異ミトコンドリアの割合が多い（82％）細胞では細胞が増えなくなったが、割合が少ない細胞（55％）やない細胞には影響しなかった
60 days CCC024-TPPtreatment in 3243G low cells

総ｍｔDNA数増加

130125120115110105
100

5 uM 10 uM 20 uM% of wild-type mtDNA

CCC024-TPP / DMSO
55

正常ｍｔDNA増加

5045403530DMSO

CCC024-TPP

20 uM treatmentRelative Intensity

Relative # of mtDNA

1353243G High cells

130120110
1009080706050403020100変異ｍｔDNA８２％
細胞増殖抑制
0.1

1110110HeLamtHeLa (HeEB1)

1101009080706050403020100

変異ｍｔDNA０％
細胞影響なし0.1

変異ｍｔDNA５５％細胞増殖抑制なし
0.1

10HeLa110
10090807060504030201003243G Low cells

1101009080706050403020100

変異ｍｔDNA０％
細胞影響なし0.1

148h treatment of CCC024-TPP (μM)

10

CCC024-TPP の投与で変異ミトコンドリアがなぜ減少するのか？
不良ミトコンドリアを除去する仕組み（マイトファジー）が活性化
MELAS変異をもつミトコンドリアが不良として認識されるようになった

ミトコンドリアの場所と一致してオートファジー

不良ミトコンドリアを自食している

ミトコンドリアを品質管理する機構がある
健常人では頻繁に不良ミトコンドリアは発生するが、品質管理機構で除去される
ミトコンドリア病患者では変異ミトコンドリアが品質管理機構から逃れ、除去できない もしくは除去しきれない不良ミトコンドリア除去 Mitochondria Quality Control （MQC）
Organelle Level
オートファジー
Autophagy

マイトファジー
Mitophagy

ミトコンドリア異常

細胞外排泄
Exocytosis

変異ミトコンドリアを品質管理機構によって不良品として認識できるようにすれば変異ミトコンドリアを除去できる
排出された不良ミトコンドリアは周囲の細胞へ

ミトコンドリア
品質管理

活性酸素産出細胞が増えなくなる

細胞老化Cellular Senescence
細胞外排泄

Pyroptosis

Senolytics

Apoptosis
Efferocytosis

Ferroptosis

Necrosis 細胞老化や細胞死が誘導され不良ミトコンドリアを除去
病勢の拡大

不良細胞除去（不良ミトコンドリアを多く持つ細胞を除去）
Cellular Level

CCC024-TPPはMELAS3243G変異を多く持つ細胞の細胞死を誘導した
不良ミトコンドリアを細胞ごと除去 ＝ 病的細胞の除去% of cells with fragmented nucleus

3243G High

CCC024-TPP

細胞死の誘導HeEB1

caspase3…posi.
cleaved caspase3%cleaved%

p<0.0001
908070

細胞死の誘導60DMSO

50403020
100DMSO CCC024-TPPDMSO PIP2-TPP

Non treat

CCC024-TPP

fragmented nucleus

cleaved caspase 3

ミトコンドリアは細胞間を移動する
不良ミトコンドリアを排泄する細胞がミトコンドリア病のそれぞれの臓器症状の原因？
ミトコンドリア病の臓器症状の誘発にも細胞間移動が関与？
P29 細胞 (正常な mtDNA)
MitoTracker Deep Red

比較的小さな細胞外小胞を介したミトコンドリアの移動+24時間両細胞を共培養
A11 細胞 (ND6 G13997A)
CellLight mitochondria-GFP

マクロファージ
好中球

20 mm

細胞外小胞分泌によるミトコンドリア移動
Tunneling nanotubes mediated mitochondria transfer

トンネルナノチューブ（周囲細胞と同調 ミトコンドリアも移動）

ミトコンドリアは細胞間を移動できる
BMC Molecular and Cell Biology 2021

局所臓器でミトコンドリア病の症状が発症する仕組みに関する仮説

血管排出
炎症や老化により変異ミトコンドリアをばらまく細胞が生じ、局所で異常ミトコンドリアを多く含む細胞が増加、局所症状の原因となる

マクロファージ血管などの細胞外に出たミトコンドリアはマクロファージや好中球に貪食される
近接する細胞には移動できるが、遠隔への移動は困難• 変異ミトコンドリアの供給原細胞から周囲細胞に変異mtDNAが移動• 感染症・炎症によって変異ミトコンドリアの排出が増加する• 組織の多くの細胞で変異ミトコンドリアが増加し、症状が増悪

アデニンの限定的な変異のみ標的可能
この方法は リー脳症に応用できるかもしれない
アルキル化剤による副作用

Hidaka et al., 2022, Cell Chemical Biology 29, 1–6 2022
https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2021.08.003

根治的治療・予防法の開発が必要
原因変異ミトコンドリアを排除できれば可能に•根本的な原因である異常ミトコンドリアおよび異常ミトコンドリアを持つ細胞を除去することが必要•

ミトコンドリアDNAの変異が多くの場合 異常ミトコンドリアの原因となっている•

各細胞内にミトコンドリアは多数存在し、多くの重要な機能を担うが除去しても細胞は維持可能•

特定の臓器で症状を示す病態では局所投与、特定臓器移行性等も将来的に付与できる•

異常ミトコンドリアを細胞から除去することはゲノム編集等でも可能であるが再発、安全性や製剤が問題「二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ標的薬」特願2019-053528による
全く新しい治療薬の提案
薬によってミトコンドリアの品質管理機構の活性化し、異常ミトコンドリア除去を促進
そして 異常ミトコンドリアを多数持つ細胞に対する細胞死を誘導
AMED令和3年度「難治性疾患実用化事業」
希少難治性疾患に対する画期的な医薬品の実用化に関する研究分野 採択

配列特異的認識によって変異ミトコンドりアDNA（ｍｔDNA）を除去する
症状緩和

予防

治療

変異ミトコンドリアの増加

PIP-TPPPIP-TPPPIP-TPP正常

変異 ミトコンドリア

マイトファジー

正常な細胞ホメオスタシス
変異ミトコンドリアDNAは抹消分割後マイトファジーにより除去
PIP-TPP予防

症状緩和

ミトコンドリアのQC
マイトファジーにより除去
細胞外放出

ROS ↑マイトファジー

ミトコンドリアのQC
病的変異mtDNA増加
オートファジー
ATP産生低下 もしくはATP産生低下とROS産生増 マイトファジーによる除去
治療
PIP-TPP

SASP
老化細胞細胞死誘導ミトコンドリアのQC
ミトコンドリアのQC
変異ｍｔDNAが増えすぎた細胞は 細胞死耐性細胞は老化細胞に細胞死により除去（慢性炎症、細胞死遅延）ミトコンドリア置換による治療を補完
根本的な治療、発症予防効果が考えられる しかし 異常なミトコンドリアが残る可能性
異常なミトコンドリアの増加を防ぐ、完全に除去する治療・薬剤としてのPIP-TPP

PIP-TPPNature (2016-05-26) | doi: 10.1038/nature.2016.19948

Nature (2017-04-06) | doi: 10.1038/nature.2017.21761

ミトコンドリアと疾患
ミトコンドリア病
MELAS
Leigh脳症
生活習慣病
糖尿病
脳神経系疾患循環器系疾患
腎機能不全

難聴
がん
老化

不良ミトコンドリアは様々な病気の原因
加齢とともに 不良ミトコンドリア増加、活性酸素産生、老化細胞増加、組織老化促進、低酸素環境の構築、がん発症、悪性化にも関与不良ミトコンドリアが除去できなくなることが原因？

ミトコンドリア関連疾患の根治・予防法の開発
不良ミトコンドリア除去機構（細胞の自浄作用）を再活性化する薬剤開発不良ミトコンドリアの除去
正常ミトコンドリアの増加
薬剤によるミトコンドリア
正常クオリティー
コントロールQCの再活性化

ミトコンドリア病治療
生活習慣病・老化予防
抗がん剤
抗老化剤

DISEASED

ミトコンドリアQC機構
不良ミトコンドリア除去
Mitophagy

ミトコンドリアQC機構

細胞ダメージ不良

過剰の不良ミトコンドリアによるダメージで細胞周期が停止

CCC018-TPP

Exocytosis

薬剤による不良ミトコンドリア除去

薬剤によるマイトファジー誘導
マイトファジー：不良ミトコンドリアの自食

不良ミトコンドリアの自食と排泄

慢性炎症

生活習慣病 がん
老化促進

Proinflammatory
factors
SASP 老化物質・炎症物質不良ミトコンドリアを分泌薬剤による老化細胞除去促進

Senolytics抗老化薬
老化細胞を特異的に死滅 Cellular senescence

ミトコンドリアDNAを配 Apoptosis
列特異的に認識し不良 細胞死誘導
BCL2阻害剤等併用
ミトコンドリアを除去す
る薬剤候補
一定期間で老化細胞は細胞死老化細胞誘導特許 特願2019-053528
PCT/JP2020/012498
WO/2020/189779
Cancer Science Dec. 2021
BMC Molecular & Cell Biol 2021
Scientific Reports 2017
Cancer Science Jun. 2021
Biochem Biophys Res Com 2021

低分子化した化合物でも効果があり、実用化が可能
経口、経皮投与でも効果があるくすりの開発へ

皮膚透過性

ミトコンドリアにきちんと薬が届く

ミトコンドリア病の変異を持つ細胞に強い効果

ミトコンドリア病の変異ホモプラスミー細胞に細胞死病気の原因細胞を除去できる

CC3

DNAに影響し、細胞死を誘導
BBRC 2021

mtDNA変異をもつ肺がん細胞で老化を誘導
細胞死を抑制する遺伝子の阻害によって細胞死誘導（Senolytics）

CCC-021-TPP
薬剤候補

ミトコンドリアマーカー

共局在
移植腫瘍増殖抑制

変異を有する細胞

変異の無い細胞

摂餌体重変化なし

腫瘍は中心壊死、免疫細胞浸潤を認める

細胞老化の誘導
Cancer Science 2022

Kyoto University
Hiroshi Sugiyama
Toshikazu Bando
Ganesh N. Pandian
Akimichi Ohtsuki

Chiba University
Atsushi Kaneda
Ken-ichi Shinohara

Kumamoto University
Takumi Era

Juntendo University
Nobuko Koshikawa
Seigi Yamamoto
Jason Lin
Keizo Takenaga
Rie Igarashi
Yuki Kaiho
Sei Sakuma
Kohei Tsuji
Yuki Kida
Jihang Yao
Ex-lab members

Atsushi Takatori
Takayoshi Watanabe
Osamu Shimozato
Kei Murayama
Yasutoshi Tatsumi
Yoshiaki Maru
Rino Nankinzan
Yoko Ota
Akiko Tsujimoto
Takanori Inagaki

Nina Matsuo
Asuka Hattori
Hiroyuki Yoda
Yuto Hirano
Mayu Shinohara
Yu Ishihara
Nanami Yasui
Jun ItoSun Ki
Yasuko Imai
Yayoi Ebata
Yoshinao Shinozaki Yume Tabata

Isamu Hoshino
Yousuke Iwadate
Fumitaka Ishige
Xudong Zhang
Nanako Toyofuku
Eriko Isogai
Hruo Mikami
Yoko Nakamura
Miho Kusakabe
Tadamichi Denda

Kiriko Hiraoka
Takahiro Inoue
Hirokazu Sugimoto
Toshinori Ozaki
S. Krishnamurthy
Tomoko Koga
Yoshiyasu Kitagawa

Yasushi Okazaki

UCSF

Nihon University
Noboru Fukuda
Yoshiaki Matsumoto
Kyoko Fujiwara
Isao Saito
Xiaofei Wang
Min Chen
Makoto Kimura
Rajeev Mishra
Asako Oguni
Kaoru Tagata
Tsukasa Suzuki

AISTPaul Horton
Daisuke Tominaga

Allan Balmain

Gentire Biosystems
Saitama Medical University
Akira Otake

Chiba Children’s Hospital
Kei Murayama

Funded by AMED
Practical Research for Innovative Cancer Control P-DIRECT
Development of advanced manufacturing technologies for biologics

Funded by MEXTKIBAN (B) KIBAN (C) Academic Frontier Project 2006-2010
Innovative Areas “Conquering Cancer through Neo-dimensionalSystems Understanding“