qPCRを用いた定量におけるバリデーションの考え方
第9回JBFシンポジウム
株式会社新日本科学内山朝子

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Japan Bioanalysis Forum

小原栄1、成冨洋一2、橋本義孝3、花田雄志4、増本真理2、渡辺恭子51株式会社新日本科学，2アステラス製薬株式会社，3小野薬品工業株式会社，

4アスビオファーマ株式会社，5第一三共株式会社

9th JBF Symposium, DG2017-33

1

Japan Bioanalysis Forum

LBA

Bioanalysisのツールとしての使用が増えたが、バリデーションに関するガ
イドライン等が存在しないLuminex
FCS

LC-MS

qPCR

目標
現実

バリデーションの中身を検討するには，
実験方法，数値の取り扱い等に関する「共通認識」が不足している

バリデーションに関するDiscussion Paperの作成

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DG2017-33 「qPCR for Bioanalysis」

欧米と親和性の高いものをまずは、ツールとしてのqPCRの特徴、Bioanalysisに用いる際の留意点をまとめる
9th JBF Symposium, DG2017-33

2

Japan Bioanalysis Forum

DG2017-33 「qPCR for Bioanalysis」

氏名

所属

内山 朝子

株式会社新日本科学小原栄

株式会社新日本科学

成富

洋一

アステラス製薬株式会社

橋本義孝

小野薬品工業株式会社

花田雄志

アスビオファーマ株式会社

増本

真理

アステラス製薬株式会社

渡辺恭子

第一三共株式会社

中村 隆広（アドバイザー）

株式会社新日本科学

9th JBF Symposium, DG2017-33

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構成メンバー（50音順）

3

Japan Bioanalysis Forum

はじめに

qPCR： quantitative polymerase chain reaction= 定量PCR=real-time PCR = リアルタイムPCR

Real-time PCR をrtPCR と記載しない
RT-PCR (Reverse Transcription)-PCRと混同する場合がある。

DNAを検出するアッセイ→qPCR
RNAを検出するアッセイ→RT-qPCR

9th JBF Symposium, DG2017-33

統一する

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用語の使用について4

Japan Bioanalysis Forum

PCRの基本メカニズム

Denature
95 ℃

95 ℃前後の高い温度でDNAの二本鎖を解離
1サイクル

Annealing/
Extension
60 ℃

Primer

温度を下げることでプライマーが結合し，60 ℃前後で酵素反応により相補鎖が伸長

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増幅前の標的DNA

標的DNAが2倍となる

qPCRでは，これらのDNAが蛍光として検出される

Nサイクル繰り返すことで，標的DNAを2n倍で増幅することができる

9th JBF Symposium, DG2017-33

5

Japan Bioanalysis Forum

RT-qPCRの基本メカニズム
発現定量、RNAウイルス定量を行う場合は，標的がRNAとなる

逆転写のStepが必要
AAAAAAAmRNA

TTTTTTTmRNA

逆転写酵素により，cDNAが合成される
mRNA
cDNA
RNase HによりRNAが分解され，一本鎖cDNAが残る

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オリゴdTプライマー，
ランダムプライマーなど

cDNA

cDNAを鋳型とし，qPCRを行う．

9th JBF Symposium, DG2017-33

6

Japan Bioanalysis Forum

蛍光検出ー加水分解Probe①通常は，FRETによってレポーターの蛍光は吸収されている．
レポーター励起光Rhttp://bioanalysisforum.jp/

蛍光共鳴エネルギー転移現象（FRET）

Q
3’
クエンチャー5’レポーター②伸長反応によりプローブが加水分解されることで蛍光を発する．
ForwardPrimer

R

Probe

Q

ForwardPrimer

R

Probe

Q

5’

3’

5’

3’

3’

5’

3’

5’

ReversePrimer

プローブには特異的塩基配列を用いるので、標的に対する特異性が高い
9th JBF Symposium, DG2017-33

7

Japan Bioanalysis Forum

蛍光検出ーSYBR GreenSYBR GreenがDNAにインターカレートして蛍光を発する

S
S

S

3’

S

5’

5’

S

S

3’
5’

S

S

S

S

S

S
S

S

S

ReversePrimer

dsDNAを非特異的に検出するため、標的であることを確認するために融解曲線解析も必要
融解曲線
特異反応
非特異反応

Fluorescence

Fluorescence

増幅曲線

非特異反応

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5’ForwardPrimer特異反応

Temperature (℃)

9th JBF Symposium, DG2017-33

8

Japan Bioanalysis Forum

データ解析方法
増幅曲線（Amplification Plot）
サイクルごとの蛍光シグナルをプロットしたもの

dNTPやPCR Primerの枯渇等により引き起こされる

検出量
Threshold
指数関数的増幅領域
に設定する

1

Cq値

20

増幅曲線がThreshold Lineと交差する時のサイクル数

40

サイクル数

理論的には元のサンプル量に2倍の差がある場合，1サイクル違いで増幅曲線が得られる．

指数関数的
増幅領域

用語

http://bioanalysisforum.jp/（Log表示・片対数）

プラトー状態Cq: quantification cycle
Ct: threshold cycle
機器メーカーによって異なる呼称
ここではCqに統一

9th JBF Symposium, DG2017-33

9Japan Bioanalysis Forum

データ解析方法

理論的には元のサンプル量に2倍の差がある
場合，1サイクル違いで増幅曲線が得られる．

検量線の傾きから，PCR効率を算出できる．

Cq値

PCR効率（PCR Efficiency）
E （PCR Efficiency）=

コピー数（Log表示），相対値

10 （-1/slop） –1※理論通りに増幅している場合，
PCR効率=100 %
検量線の傾き（Slop）≒ -3.32

9th JBF Symposium, DG2017-33

http://bioanalysisforum.jp/

検量線（Standard Curve）
検量線試料のコピー数や相対値に対するCq値をプロットして作成

10

Japan Bioanalysis Forum

Application of qPCR
試験の種類

検出するものPCR or RT-PCR

特性試験（濃度測定）

なし

体内分布
遺伝子治療製剤(ウイルスベクター、
プラズミド等)

核酸製剤

細胞製剤

ワクチン評価マトリックス

ホスト組織

vDNA or vRNA or DNA
ベクターそのもの

PCR or RT-PCR
ベクター次第排出試験（感染性確認）vmRNA（ウイルス由来RNA)

RT-PCR

細胞

遺伝子
発現測定

mRNA
（ホスト由来）RT-PCR

ホスト組織

遺伝子
発現測定

mRNA
（ホスト由来）RT-PCR

ホスト組織

特性試験（未分化iPS検出）

mRNA（未分化iPS由来）

RT-PCR

細胞製剤

体内分布

DNA（細胞製剤由来）

PCR

ホスト組織

感染実験
（感染防御試験のウイルス力価測定）

vDNA or vRNA
（ウイルスそのもの）

PCR or RT-PCR（ウイルス次第）

ホスト組織

排出試験
（排出確認）

9th JBF Symposium, DG2017-33

尿、糞、血液等

http://bioanalysisforum.jp/

製剤の種類

DGで取り扱うもの

11Japan Bioanalysis Forum

本日の内容

2. RT-qPCRの留意点
3. 試験実施方法

4. 細胞の定量について
5. 実験施設

6. その他注意事項消耗品

http://bioanalysisforum.jp/

1. qPCR, RT-qPCR共通の留意点

7. バリデーションに関するディスカッション
9th JBF Symposium, DG2017-33

12

Japan Bioanalysis Forum

一般的な実験の流れ
②組織採取

qPCR
DNA測定

1反応中に同等量の核酸を添加

RT-qPCR
RNA測定⑤qPCR測定copies/rxnを算出③細かく破砕後，
溶解、核酸抽出④濃度測定

http://bioanalysisforum.jp/①対象動物に被験物質投与

qPCR step
cDNA合成（RT step）

9th JBF Symposium, DG2017-33

13

1. qPCR，RT-qPCR共通の留意点

9th JBF Symposium, DG2017-33

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

14

Japan Bioanalysis Forum

組織採取（Step ②）
留意点

例：水やDNA awayによる器具の洗浄等*DNA away の使用過多、サンプルへの混入は逆効果

9th JBF Symposium, DG2017-33

http://bioanalysisforum.jp/

組織中に存在するターゲット遺伝子によるクロスコンタミネーションを防ぐため、組織採取の順番、解剖器具の洗浄に最新の注意を払う。

15

Japan Bioanalysis Forum

核酸抽出（Step③）
組織
切り出し
A.

B.

キットを用いた抽出

DNA/RNA
溶出液

10~25mg 組織の一部を採取し抽出分布に差がないことの確認が必要

 全組織を溶解し、その一部から抽出
Pro: 組織内分布に偏りが有っても可Con: 標的の濃度が薄くなる。経費高。

組織全量
溶解

C.
一部

溶解

http://bioanalysisforum.jp/

例：

粉砕
ホモジェナイズ 全組織を粉砕し、その一部から抽出
Pro: 組織内分布に偏りが有っても可
経費低。
Con: 標的の濃度が薄くなる。
コンタミリスク高。

組織を丸ごと粉砕

9th JBF Symposium, DG2017-33

16Japan Bioanalysis Forum

核酸抽出（Step③）
組織
切り出し

粉砕
ホモジェナイズ

キットを用いた抽出

DNA/RNA
溶出液

組織からの核酸抽出の効率は５～１００％（サンプルによって異なり、一定しない）

http://bioanalysisforum.jp/

キット：シリカを用いたカラム法、マグネットビーズ法、フェノール/クロロホルム法等、多数存在。

⇒通常の方法では組織内のターゲット核酸濃度を正確に算出することはできない。
通常、PCRが定量として保証できるのは抽出後の核酸溶液に含まれる核酸の量のみ
DNA溶出液
キット抽出
核酸抽出効率不均一

この中の濃度の定量性には欠ける

9th JBF Symposium, DG2017-33

この中の濃度には高い定量性有17Japan Bioanalysis Forum

問題解決可能か？
例：Internal Standard（IS）の使用

DNA検出の時のみ

既知量のIS

キット
DNA抽出

ISの抽出率から組織内の標的濃度を算出

IS: ホスト、analyteの遺伝子配列をクロスしない核酸（ヒト、使用動物以外の遺伝子核酸）

http://bioanalysisforum.jp/

DNA溶出液抽出効率算出の可能化により、組織内の標的濃度が算出可

注意点: 実績報告例が限られている。バックグランドデータが少ない

9th JBF Symposium, DG2017-33

18

Japan Bioanalysis Forum

核酸濃度測定（Step④）- 方法
注：通常は1反応に添加する核酸量を一定とすることで抽出効率のバラつきを補正するため、正確な濃度測定が必要。
吸光度法
 OD260の吸光度値から算出

Pro: 簡便
Con: DNA vs. RNAの識別不可
タンパク質のコンタミが影響
例： Nanodrop
Nanovue
その他吸光度計 DNAもしくはRNA特異的に蛍光で検出
Pro: サンプル中に存在する
analyte以外の物質に影響を受けない
Con: 使用がまだ一般化されていない

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蛍光法

例： PicoGreen
RiboGreen
Qubit

9th JBF Symposium, DG2017-33

19

Japan Bioanalysis Forum

核酸濃度測定（Step④）- 核酸の質の保証
Q: どこまで求めるべき？
注：質が悪いと、反応の阻害、核酸の断片化による反応可能な鋳型DNA配列の減少等の可能性が考えられる。

吸光度

電気泳動像から核酸の分解度を自動的に一つの数値として表示（10点満点）

OD260/280：1.8~2.0
OD230/260：2.0~2.2

Intact RNA:
RIN10

230,280nmで吸光する不純物の混入割合を示す

吸光度クロマトグラム

アガロースゲル電気泳動（RNA）

RIN

28S

Partially degraded
RNA:RIN5
Strongly degraded
RNA:RIN3

http://bioanalysisforum.jp/

濃度以外に考えられる方法

RIN (RNA Integrity Number)
DIN (DNA Integrity Number)

18S

DIN
視覚的に不純物の混入を示す
引用：アジレントテクノロジー株式会社データth
9 JBF Symposium, DG2017-33

20

Japan Bioanalysis Forum

核酸安定性（After Step④）
Q: 核酸の安定性はどこまで必要？どうやって実施？

→経時的にqPCR測定することで、安定性保証が可能
２．組織内核酸安定性？
組織切片に核酸、もしくはウイルス/細胞を添加して凍結保存？
難点①
この状態で保存することは考えうることだが、組織内にターゲットが存在する状態を作るのは難しい？

http://bioanalysisforum.jp/

１．抽出されたDNAの安定性評価は可能

難点②
抽出効率でもばらつくことを考慮しても難しい？

9th JBF Symposium, DG2017-33

21

Japan Bioanalysis ForumqPCR測定（Step⑤）- 標準物質
qPCRの標準物質は、絶対定量の場合コピー数が既知でなくてはならないという概念がある。

Pros

Cons

プラズミド

・安定性が高い。
・大量製造が容易（初期クローニングは必要）。

・Analyteとの同等性

合成核酸・配列決定が自由（変異配列に対応可）
・クローニングの必要無し。

・Analyteとの同等性

・Analyteとの同等性

・安定性が低い・必要量が準備できない可能性大・製造に時間がかかる
・ロット間差大・コピー数計算の信頼性に問題

ゲノム核酸

http://bioanalysisforum.jp/

標準物質の種類

一般的にはプラズミドが使用されることが多い。
9th JBF Symposium, DG2017-33

22

Japan Bioanalysis ForumqPCR測定（Step⑤）- 標準物質
プラズミドを用いた際の留意点

環状

処理

直鎖状

制限酵素処理で直鎖状にして使用

その場合の留意点：
酵素処理後、DNA精製をし直すか⇒サンプルロスの可能性
精製無し⇒Buffer, 酵素がOD値やPCR効率に与える影響
標準物質の質の保証

http://bioanalysisforum.jp/

サイズの大きな環状プラズミドは検量線の直線性が上手く出ないと言われることもある。

制限酵素

濃度、OD260/280、DIN、HPLC：どこまで必要か。
安定性：試験の前後で標準物質のCq値に変動が無いことを担保できれば良い？

9th JBF Symposium, DG2017-33

23

Japan Bioanalysis ForumqPCR測定（Step⑤）- マトリックス 1
qPCRにおけるマトリックス効果

2. 高濃度核酸がマトリックスに存在することによるprimer/probe,
dNTP等の散乱等
1. によるデータへの影響が最も大きい

http://bioanalysisforum.jp/

1. 抽出されたDNAに含まれるPCR反応阻害物質の影響

マトリックス効果はマトリックス濃度由来ではなく、DNA抽出の質とマトリックスの希釈倍率次第

Q：どうやってマトリックス効果のバリデーションをする？
・必要？
・もしくは試験時に各サンプルを確認することでバリデーションは必要なし？

9th JBF Symposium, DG2017-33

24

Japan Bioanalysis ForumqPCR測定（Step⑤）- マトリックス 2

マトリックスDNAの有無により検量線データに影響が無いことを示すことができれば、マトリックスDNAの添加の必要は無い？
マトリックスにすべき核酸抽出された核酸は、由来組織次第で質が違うことが考えられる
Ex. 皮膚－PCR阻害物質であるメラニンの混入が多い
糞便―PCR阻害物質が多い

http://bioanalysisforum.jp/

検量線へのマトリックスの添加の必要性

Q：検量線のマトリックスにはどのDNAを使う？
多臓器を測定する場合、検量線のマトリックスにはどの組織由来DNAが最適か。
Mix vs. 代表組織、動物の系統は揃える？
9th JBF Symposium, DG2017-33

25

Japan Bioanalysis Forum

マトリックス効果（阻害効果）の例１
例2)gDNAを希釈することで阻害効果が改善される場合

例1)各組織由来gDNAに105 copies/reactionの陽性コントロールを加えた場合
105 copies/rxn
陽性コントロール

105 copies/rxn 陽性コ
ントロール

組織B由来
gDNA

検
出
量

添加gDNA量10 ng/rxn
組織C由来
gDNA

添加gDNA量
100 ng/rxn

検出量ThresholdThreshold

添加gDNA量
1 μg/rxn
Cq undetermined

組織D由来
gDNA
Cq undetermined1

http://bioanalysisforum.jp/

組織A由来
gDNA

1

サイクル数

通常は陽性コントロールと同じところでCq値が観測されるが，gDNA中に阻害物質がある場合は，Cq値が高くなる，もしくは観測されない．

サイクル数

20

40

添加gDNA量が1 µg/rxnの場合、Cq値がND。
100 ng/rxn，10 ng/rxnになるように希釈すると用量依存的にCq値が回復。
10ng/rxnで理想値が得られる。

9th JBF Symposium, DG2017-33

26

Japan Bioanalysis Forum

マトリックス効果（阻害効果）の例２
マトックス効果無判定

STD7STD STD STD STD3
6
5
4
Threshold

STD5

STD4 STD
3

ThresholdQC7 QC6 QC QC
54QC5 QC4QC3

QC3

Cycle

Cycle

Cq値3（約10倍）近い「ずれ」が生じている

http://bioanalysisforum.jp/

Fluorescence

マトリックス効果有判定

蛍光量に違いは見られるが、Cq値に差が無い
STD: マトリックス無QC：マトリックス有9th JBF Symposium, DG2017-33

27

Japan Bioanalysis ForumqPCR測定（Step⑤）- Threshold
Q: Thresholdを設定するべきか？

 Thresholdを設定すべきかどうかは、
どのガイドラインや手引書にも記載が無い（指数関数的に増幅し、直線でプ
ロットされていればどこでもよい）。

①②③

 Auto解析を用い、設定しない場合が多いよう。
 Thresholdをマニュアルで動かせば、Cq値を変動させることができ、基準への適合不可を変えることができる。

http://bioanalysisforum.jp/①～③のどれも可 同一プレート内サンプル間でのCq値の比較や、同一プレート内にある検量線を用いてコピー数換算をする場合には、Auto機能でも問題ない。

9th JBF Symposium, DG2017-33

28

Japan Bioanalysis ForumqPCR測定(Step⑤)-Cq値 vs. コピー数換算値

 qPCRでは、ピペット操作等で発生する許容可能なCq値変動が1.5であることから、適合基準ではCq値を用いて，Cq値変動が1.5以内であれば重要な違いではないとされることが多い。

 Cq値でもコピー数換算値でも良いが、Thresholdを固定しない場
合は別プレート間でCq値の比較ができない。
Thresholdを固定すれば、別プレート間でもCq値の比較はできる

9th JBF Symposium, DG2017-33

http://bioanalysisforum.jp/

Q: バリデーションの適合基準はCq値か、コピー数換算値か？

29

2. RT-qPCRの留意点

9th JBF Symposium, DG2017-33

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum30

Japan Bioanalysis Forum

分類

名称

絶対定量

Pfaffl法

検量線の
必要性

特徴

Application○

コピー数既知の標準物質で作成した検量線を用いて定量

微生物、遺伝子組換え食物の定量○

希釈率などの相対値で検量線を作成。そこから得られるPCR増幅効率を用いて比較定量遺伝子の発現解析☓

基準とするサンプルとのサイクル数の比較で相対的な濃度差を算出

遺伝子の発現
解析

相対定量
ΔΔCq法

9th JBF Symposium, DG2017-33

http://bioanalysisforum.jp/

定量方法

31

Japan Bioanalysis Forum

絶対定量
既知のコピー数が含まれるサンプルを使用して検量線を作成する．
検量線に測定サンプルのCq値を当てはめてサンプル中のコピー数を算出する．

http://bioanalysisforum.jp/

主に、DNA定量に使われる。
RTを含まないqPCRの部分を絶対定量する
検量線（Standard Curve）

増幅曲線（Amplification Plot）
濃度未知のサンプル

検出量

108 107 106 105 104

Cq値

ThresholdCopies/reaction

1

20

40
サイクル数

9th JBF Symposium, DG2017-33

4

5

6

7

8

コピー数
（Log表示）32

Japan Bioanalysis Forum

相対定量（ΔΔCq法）
調べたい遺伝子（ターゲット遺伝子）の量をコントロール遺伝子の量で補正し，サンプルごとに比較することで相対的に定量する．

理論的に1サイクルで2倍の差（nサイクルで2nの差）ということを利用し，相対的に定量する．

2-ΔΔCq

検量線は用いない例）サンプルNo.1を基準に相対定量
サンプル

標的遺伝子
のCq値
（A）

内在性コント
ロールのCq値
（B）

No.1

20

16

20-16

No.2

23

17

ΔCq値
（A-B）

ΔΔCq値
（各サンプルのΔCq値）（No.1のΔCq値）

2-ΔΔCq
乗数項に代入

No.1を基準とした標的遺伝子の発現
比較（内在性コント
ロールで補正）

=4

4-4

=0

2 -（0）
=1

1

23-17

4-6

2 -（-2）
=4

4

=6

=-2

http://bioanalysisforum.jp/

ΔΔCq法

実際，PCR効率が100 %ということはないため，ΔΔCq法を用いると結果にずれが生じることが多い
相対定量の場合も，検量線を作成し増幅効率を加味して評価したほうがよい．

9th JBF Symposium, DG2017-33

ΔΔCq法は旧式になりつつある

33

Japan Bioanalysis Forum

相対定量（Pfaffl法）

Nサイクル ⇒ 標的DNA 2 n 倍に
（1 + 100 %）＝２

増幅効率は系に依存しており，標的によって効率は変わってくる

増幅効率が90 %の時（1 + 増幅効率）＝（1 + 90 %）= 1.9 ⇒ 標的DNA 1.9 n 倍に10サイクル実施した場合
増幅効率100 %の時 ⇒ 標的DNAは 1024 倍に増幅効率90 %の時

増幅効率の差が評価に与える影響が大きい⇒ 標的DNAは 613 倍にPfaffl法
標的遺伝子と内在性コントロールそれぞれのPCR効率を加味して相対比を算出する．

http://bioanalysisforum.jp/

増幅効率の考え方
増幅効率が100 %の時＝増幅効率が1の時（1+PCR効率）「Cq（基準サンプル）- Cq（各サンプル）］ 標的遺伝子（1+PCR効率）［Cq（基準サンプル）- Cq（各サンプル）］

Q：解析方法は統一すべき？

内在性コントロール

Pfaffl M.W., Nucleic Acids Res. 2001 ; 29（9）: e45

9th JBF Symposium, DG2017-33

34

Japan Bioanalysis Forum

標準物質
RT
cDNA

PCR

RTの効率は一定でない。
標準物質はRNAでなく、DNA
利点

欠点

プラズミド

・安定性が高い。
・大量製造が容易（初期クローニングは必要）。
・コピー数既知・Analyteとの同等性

合成核酸・配列決定が自由（変異配列に対応可）
・クローニングの必要無し。
・コピー数既知・Analyteとの同等性

・Analyteとの同等性

・コピー数未知cDNA

9th JBF Symposium, DG2017-33

http://bioanalysisforum.jp/

mRNA

35

Japan Bioanalysis Forum

内在性コントロール遺伝子
目的：ターゲット遺伝子の発現量を補正する

 従来はGAPDHやβ-アクチンが用いられてきたが、これらの発現量は変動しているとの報告が多数。
内在性コントロール遺伝子の設定を誤れば、ターゲット遺伝子の発現量を過大/過小評価する可能性が考えられる。
注意点： １．標的となる細胞や組織での発現量は適切か
２．刺激に対する発現の安定性を検討

論文レベルで検索/検討

http://bioanalysisforum.jp/

 内在性コントロール遺伝子の発現量は、採取したRNAの品質や逆転写反応の効率を反映する。

内在性コントロール遺伝子は2~3種類おき、その平均を用いて補正する。
参考資料： Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometricaveraging of multiple internal control genes:

Vandesompele et al., 2002. 3(7) Genome Biology 2002.

Quantification of mRNA using real-time reverse transcription of PCR (RT-PCR):
trends and problems: Bustin, 2002.29, 23-39. J Mol Endo

9th JBF Symposium, DG2017-33

36

3. 試験実施方法（FDA Gene Therapy Guidanceより）9th JBF Symposium, DG2017-33

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

37

Japan Bioanalysis Forum

前臨床におけるqPCRを用いた体内分布試験の実施方法について、FDAより発行された”Guidance for industry: Gene therapy clinical trials-Observing subjects for delayed adverse effect”には、以下3つの記載がある。

この限界が95%の信頼性で検出できること。
Q: 1反応に実際に1μg gDNAを添加するのか•

通常はPCR1反応中のtotal DNA量は～200ng•

多量のDNAで反応が上手くいかない可能性•

小さな臓器からは十分量のDNAが抽出できない可能性•

多量のgDNA添加でPCR阻害物質の量も増える

しかし…
50 vector -------1μg gDNA
5 vector ---------100ng gDNA
0.5 vector -------10ng gDNA
Q: 本当に換算値でOK?

1μg入れる
必要は無い•

95%の確立で検出するのは
ほぼ不可能

•

95%で検出できる理論的限界値は3Copy*（ポワソン分布の原理）

http://bioanalysisforum.jp/

１．定量下限定量下限は50 vector/μg gDNAであり、できるだけ多くのgDNAを加え、導き出された検出限界を報告書に記載*Ref: The MIQE Guidelines. Bustin et al., 2009. Clinical Chemistry 55:4, 611-622

9th JBF Symposium, DG2017-33

38

Japan Bioanalysis Forum

２．スパイクサンプル（Internal Control, IC)の使用
1組織に対し，少なくとも3重で試料を用意し，1試料に既知量の標準物質をスパイクする

105copy
標準物質

Q: なぜここまで必要？

http://bioanalysisforum.jp/例： 結果が陰性、もしくは期待値よりも低かった際に、PCR阻害物質の影響ではないことを確認しなくてはならない。
 サンプルによってPCR阻害物質の混入量が違うことが予想されるため、サンプル毎に保証しなくてはならない。

PCR

OK

2.3x102
copy

2.3x102
copy

1.0x105copy

NG

2.3x102
copy

2.3x102
copy

1.0x103copy

NGの場合、サンプルを希釈して再測定*ICの使用は他のPCRバリデーションに関する文献にも記載されている
Ref: Checklist for optimization and validation of realtime PCR assays. Raymaekers et al., 2009. J. Clin Lab anal.
23:145-151.

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3．各サンプルのn数
組織全体の大きさと実際に使用するサンプルの大きさを考慮して，各組織でのn数が適切な理由を述べる

Q: 「無い」というために必要な n数は？
組織の一部を採材する場合
1反応中に標的核酸が含まれる確率をケースバイケースで考える？
全組織を使用する場合

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安全性試験の一環である体内分布試験の場合，組織における被験物質の「無いことの証明」が必要である．

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4. 細胞の定量について

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細胞加工製品を検出する場合の標的遺伝子細胞製剤で標的となる遺伝子

感度が高い

シングルコピー遺伝子
1細胞中に2コピー存在する遺伝子

マルチコピー遺伝子
1細胞中に複数コピー存在する遺伝子

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1細胞中には…

細胞製剤の体内分布をみる場合

マルチコピー遺伝子を用いる

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最も研究されている標的配列
Alu配列

 霊長類に特異的な反復配列
 長さ：約300塩基 ヒト遺伝子に存在するSINE（short interspersed element) の中で、最もコピー数が多いといわれている（約106コピー）
 遺伝子へのAlu配列挿入は、個人によって異なる

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細胞製剤をPCRで検出する場合の標的遺伝子として最も研究されている感度は高いが…

PCRの標的がヒト細胞に大量に存在する遺伝子であるため，
コンタミネーションの除去が難しい
試薬や消耗品由来のヒトDNAのコンタミネーションを完全に除去することはできない

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マルチコピー遺伝子を標的とした場合の考慮点
PCRの結果から得られるのは…
評価したいのは合成核酸が標準物質の場合… コピー数/reaction
細胞由来のgDNAが標準物質の場合… DNA量/reaction

細胞数への
換算が必要

細胞数への換算方法①シングルコピー遺伝子の測定結果より
細胞あたりのコピー数を算出

細胞由来のgDNA細胞由来のgDNA

シングルコピー
遺伝子標的qPCR
コピー数を算出
シングルコピー遺伝子
は1細胞中2コピー
細胞数を算出②細胞あたりの理論ゲノムDNA量から換算

マルチコピー
遺伝子標的qPCR
コピー数を算出

pg濃度での検量線を作成し，濃度を算出

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細胞数

核酸の平均分子量から，理論的な1細胞あたりのゲノム量は6.6pg
濃度を6.6 pgで割ることにより細胞数へ換算

細胞あたりのマルチコピー遺伝子のコピー数を算出
実際の測定で得られたコピー数から細胞数を換算

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5. 実験施設

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PCR施設
操作ごとにエリアを区分し，移動を一方向にする
PCRキャビネットの利用もコンタミネーション防止には効果的
Clean

pre-PCR area

PCR amplification

核酸以外の試薬（プライマー，バッファー等）を取り扱う．

サンプルやコントロールなどを取り扱う．

PCR装置を設置し，PCR増幅を行う．
PCRキャビネット

Post-PCR area
Dirty

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master-mix area

増幅したPCR産物を取り扱う電気泳動等を実施する．
European Pharmacopoeia 2.6.21より引用

厚生労働省の「血液製剤のウイルスに対する安全性確保を目的とした核酸増幅検査（NAT）の実施に関するガイドライン」にも同等の記載： http://www.mhlw.go.jp/newinfo/kobetu/iyaku/kenketsugo/dl/140814_01a.pdf
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6. その他留意点

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消耗品 チップは必ずフィルター付き。

 「Human DNA-free」グレードの消耗品も存在するが、これも100%-freeという意味ではない。

 チューブや核酸は核酸低吸着性のものを選ぶ。
 ボルテックスのかけすぎによる、核酸のプラスチックへの吸着に注意する。
 DNAaway の使用はDNA除去に有用だが、多用によるサンプルへの
コンタミに注意

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 PCR grade = DNase-, RNase-free, 微生物DNA-free （特に大腸菌）の意味。その他のDNAは保証していない。

機器
 コンタミ防止のためにPCRチャンバーを使用する。
 qPCR機器には、ROX補正が必要なものと、ROXが反応阻害を起こすものがあるため、機器とマスターミックスの相性に留意
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7. バリデーションに関する
ディスカッション

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バリデーション項目と適合基準（DG内の意見、要議論）
項目

現状を考慮すると50%程度

検量線

r2≧0.98, 増幅効率が85～110%

特異性

試薬コントロールと動物gDNAの両方で増幅が認められない、あるいは動物gDNAで増幅が認められてもCq値の差<1.5、または定量下限との乖離の差で妥当と判断することもありうる

マトリックス効果

動物gDNA原液 vs. H2O or bufferにQCサンプルをスパイクし、その間でCq値差が<1.5、検量線slopeが-3.6～3.1 。阻害が認められる場合、・DNA抽出法の再検
討、・希釈の適用・定性的な判断に用いる

定量下限

真度及び精度のクライテリアを満たす最低濃度

検出限界

95%信頼性で検出できる濃度

安定性

Cq値変動が＜1.5

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真度及び精度

適合基準

選択性、キャリーオーバー、希釈直線性は必要なし。
Q:実際に即しているのか？
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来年度のDGでも引き続きバリデーションのDiscussion Paper作成のためのディスカッションをしていく予定です。

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