DG2023-61
Immunogenicityの予測―バイオアナリストの観点からー
Prediction of Immunogenicity-from the perspective of bioanalysts-

15 th JBF Symposium DG2023-61

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum1

Japan Bioanalysis Forum

Name

Company

岡本 裕美
Hiromi Okamoto

第一三共株式会社
Daiichi Sankyo Co., Ltd.

駒場 淳二
Junji Komaba

小野薬品工業株式会社
ONO PHARMACEUTICAL CO., LTD.

齊藤 哲
Tetsu Saito

Axcelead Drug Discovery Partners 株式会社
Axcelead Drug Discovery Partners, Inc.

安原 秀典
Hidenori Yasuhara

住友ファーマ株式会社
Sumitomo Pharma Co., Ltd.

http://bioanalysisforum.jp/

DG members

15 th JBF Symposium DG2023-61

2

Japan Bioanalysis Forum

活動内容◆ Jun 2023
✓ メンバー募集◆ Jul 2023～Dec 2023
✓ 現状の整理と議論内容の選抜✓ In vitroの各評価系についてレビュー論文を元に役割分担決定✓ ELISpotについてDG内で講演会開催✓ 本ポスター要旨の作成✓ Immunogenicityの予測の国内実施状況についてアンケート作成/実施◆ Dec 2023～ Jan 2024
✓ アンケート結果の集計✓ ポスター作成

http://bioanalysisforum.jp/◆ 12 Jul 2023
✓ キックオフミーティング◆ 5 Feb 2024
✓ ポスター発表
15 th JBF Symposium DG2023-61

3

Japan Bioanalysis Forum

免責事項

http://bioanalysisforum.jp/◆本発表における資料等に対する調査、集計等はDG
メンバーが行ったものである。
正しくは元の資料等を参照されたい。

15 th JBF Symposium DG2023-61

4

背景

15 th JBF Symposium DG2023-61

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

5

Japan Bioanalysis Forum

バイオ医薬品は、抗原として作用し意図しない免疫反応を引き起こすことで、医薬品の有効性や安全性に影響を与えることがある。
近年in silico、 in vitroを中心としたImmunogenicityの予測手法が欧米を中心に発展しており、本邦においても予測への関心は年々高まっている。

Immunogenicityの中でも抗薬物抗体産生の予測を中心に、文献から情報収集を行った。特に、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を用いたin vitroアッセイ手法及び測定に用いる分析機器を中心に、バイオアナリストの観点から情報を整理した。更にJBF参加
企業へアンケートを行い、各社のImmunogenicityの予測に対する取り組みを調査した。
15 th JBF Symposium DG2023-61

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本DGの背景6Japan Bioanalysis Forum

免疫原性とバイオ医薬品
抗原

出典：プレシデント(2020年7月3日号）オンラインより

出典：国立医薬品食品衛生研究所

生物薬品部

http://bioanalysisforum.jp/➢ 一般的に、抗原が抗体産生や細胞性免疫を誘導する性質を免疫原性と呼ぶ。
➢ バイオ医薬品は抗原として作用し、投薬された患者で抗体産生が誘導される場合がある。
➢ 抗体誘導により、有効性・安全性に影響を及ぼす可能性がある。
➢ バイオ医薬品の有効性・安全性を確保するためは、免疫原性について十分に理解し、評価することが重要である。
HPより一部改変

細胞性免疫
15 th JBF Symposium DG2023-61 液性免疫（抗体の産生）

7

Japan Bioanalysis Forum

タンパク製剤における免疫原性リスク要因

http://bioanalysisforum.jp/

タンパク製剤の配列/機能の観点から

患者/臨床プロトコールの観点から
Amy Rosenberg (FDA) ,Non-clinical Immunogenicity
Assessment of Generic Peptide
Products: Development,
Validation, and Sampling(2021)より一部抜粋

その他、製剤中に含まれる宿主由来
タンパク質などの不純物も免疫原性に影響することが知られている。

15 th JBF Symposium DG2023-61

8

Japan Bioanalysis Forum

タンパク製剤における抗薬物抗体の産生機序③ 抗原受容体※2によって、ペプチドとMHCクラスIIの複合体が認識→T細胞
活性化・増殖、サイトカイン産生② ペプチドとMHC
クラスIIの複合体がAPC表面に提示※1 樹状細胞＝抗原提示細胞（APC）※2 T細胞抗原受容体（T-cell receptor: TCR）

http://bioanalysisforum.jp/① 薬物が樹状細胞※1に取り込まれ、ペプチドに分解④ サイトカインによりB細胞が活性化→抗薬物抗体を産生
Tourdot S, et al. Bioanalysis. (2019)より一部抜粋

15 th JBF Symposium DG2023-61

9

Japan Bioanalysis Forum➢ タンパク製剤やその他バイオ医薬品の非臨床研究開発段階において、候補化合物のヒトにおける免疫反応を各種手法を用いて評価すること
で、候補化合物の免疫原性のポテンシャルを予測することである。
➢ 予測結果を元に候補化合物の選抜等を行い、免疫原性リスクの低い化合物を選択することで、ヒトに投与する際の安全性と有効性の確保に寄与する。
➢ 評価方法として、in silico、in vitro（ex vivo）、in vivoおよびそれらを組み合わせた手法が用いられている。

→ Immunogenicityの予測として、免疫原性リスクの低い化合物
を非臨床の段階で選抜するために、上記の種々の取り組みが行われているが、その手法と技術は発展途上である。

http://bioanalysisforum.jp/

Immunogenicityの予測とは

本DGでは、主にタンパク製剤におけるImmunogenicityの予測方法について議論を行った。
15 th JBF Symposium DG2023-61

10各評価法の紹介

15 th JBF Symposium DG2023-61

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Japan Bioanalysis Forum

11

Japan Bioanalysis Forum

評価法Overview

http://bioanalysisforum.jp/⑥In vitro PBMC assay⑦In vitro DC+Tcell Assay②In vitro HLA assay④DC internalization assay①In silico③MAPPs⑤Peptide-based assays

DC; dendritic cells（樹状細胞）,
HLA; Human Leukocyte Antigen（ヒト白血球抗原）,
MAPPs; MHC-II-associated peptide proteomics ,PBMC; Peripheral Blood Mononuclear Cells（末梢血単核細胞）,⑧B cell assays
Ducret A, et al. MAbs. (2022)より一部抜粋

15 th JBF Symposium DG2023-61

12

Japan Bioanalysis Forum

評価法Overview
Assay

Utility

Pros.

Cons.

③
MAPPs

●ヒト化/非免疫化のための「ホットス ●頑健なアッセイ系
ポット」を特定する●DCによる自然抗原プロセシ●配列に関連しない変化が抗原提示(バイ ングに依存
オシミラーなど)に及ぼす影響を評価●豊富なデータ④●抗原提示及び潜在的に免疫原性に及ぼDCす外的要因(例えば、凝集、汚染物質)のinternalization
影響を評価
assay
●ドナー間の一貫した反応●対象介在性の潜在的干渉を評価する（DC
前臨床免疫原性試験(例えば抗TNF)によmaturation
る生物学的評価
assay）⑤●ヒト化/非免疫化のための「ホットス
Peptide-based ポット」を早期に特定（Peptideassays
based）

http://bioanalysisforum.jp/●大規模な塩基配列パネルから高リスク●一次配列のみに基づく①
変異体を抽出可能。
●ハイスループット●主にMHC結合の予測に依存
In silico●相同性の高いクローンをランキング●低コスト●主要な抗原プロセシング、プレゼン●ヒト化/非免疫化の配列設計をサポート
テーション、T細胞認識プロセスは考慮外●抗体が特定のHLA型と結合す●HLA抗原と抗体の相互作用だけを評価す②
るかどうかを評価できるため、●HLA分子とターゲット抗原との結合をるため、他の重要な免疫応答要素（如何In vitro HLA
個別アレルへの応答の予測可能。
測定し、抗体の特異的な反応性を検出に抗体が免疫系を活性化するか）を考慮
assay●アッセイの条件やパラメー
することができない
ターを制御でき、高い再現性●すべてのMHCクラスⅡ結合因子がT細胞によって認識されたり、免疫応答を引き起こしたりするわけではない●現在、HLA-DRにのみ適応可能●抗原性や免疫原性の評価ではない●化学的に生成されるペプチド(すべての●評価対象となるタンパク（抗 ペプチドが細胞装置によって生成される体）の作製不要
わけではない)●T細胞応答の評価●業界で使用されるさまざまな読み取り
およびアッセイの設定
Ducret A, et al. MAbs. (2022)より一部引用

15 th JBF Symposium DG2023-61

13

Japan Bioanalysis Forum

評価法Overview
Assay

Utility

Pros.

Cons.

●標的HLA分布を示す異なるドナー間で、●免疫調節治療薬が読み出しを妨害する●DCによる自然抗原プロセシン
バイオ医薬品の提示ペプチドを認識する
可能性
グに依存する
T細胞レパートリーにおける特異的TCRの●様々な手法と測定法があり、標準化さ●T細胞応答の評価
頻度を評価
れていない

⑦ In vitro
DC+TcellAssay(wholeprotein)●バイオ医薬品の取り込み、プロセシン●免疫調節治療薬が読み出しを妨害する
グ、提示を評価し、その後、標的HLA分 ●DCによる自然抗原プロセシン
可能性
布を表す異なるドナー間で、バイオ治療 グに依存する●様々な手法と手順があり、標準化され薬の提示ペプチドを認識するT細胞レパー ●T細胞応答の評価ていない
トリーにおける特異的TCRの頻度を評価

http://bioanalysisforum.jp/⑥ In vitro
PBMC assay(wholeprotein)●現在のところメモリーB細胞応答に限定●バイオ医薬品に対する既存／交差反応●免疫調節治療薬は読み出しを妨害する⑧
性抗体の評価●個々の抗体分泌B細胞を検出可能性がある。
B cell assays ●ADA産生が認められた患者におけるB する唯一のアッセイ法●コントロールはドナーパネル全体の反クローンの同定
応を想起する必要がある●モデル動物の作製は一般にコストと手間がかかる。
●トランスジェニックモデルでは一般に、●現段階では、ADA形成に至る⑨●バイオ医薬品の翻訳後修飾、製剤、作単一のHLAを含む特定のタンパク質に限までに必要な免疫反応の全段階
In vivo models 用機序を含む製品関連因子の評価
定されるため、様々なポピュレーションを含む唯一のアッセイ法を模倣できない。
●免疫原性のヒトT（およびB）細胞エピ
トープに関する情報は得られない。
Ducret A, et al. MAbs. (2022)より一部抜粋

太字で示したAssayを中心にDG内で議論を行った。
15 th JBF Symposium DG2023-61
14

Japan Bioanalysis Forum

Assay

薬物の取り込み

薬物の分解

HLAとの結合

T cell活性化

エピトープ情報

評価期間

コスト① In silico

×

×

〇

×

△

〇

〇

② In vitro HLA
assay

×

×

〇

×

〇

〇

△

③ MAPPS

〇

〇

〇

×

〇

×

×

④ DC internalization

〇

×

×

×

×

〇

△

⑥ In vitro PBMC
assay
⑦ In vitro DC-T cell
assay

〇

〇

〇

〇

×

×

×

〇

〇

〇

〇

×

×

×

http://bioanalysisforum.jp/

In vitro試験のpros consと選択基準⑥In vitro PBMC assay⑦In vitro DC+Tcell Assay②In vitro HLA assay④DC internalization assay①In silico③MAPPs⑤Peptide-based assays⑧B cell assays

1つの手法で全ての項目を満たす
ものは無いため、各手法の特徴を把握し、状況に応じて手法を使い分ける必要がある。

Ducret A, et al. MAbs. (2022)より一部抜粋

15th JBFシンポジウム DG2023-61

15

Japan Bioanalysis ForumIn silico手法～概要～◆ in silico手法は抗体の配列、構造、および相互作用パターンなどの情報を活用し、抗体と抗原の相互作用におけるエピトープの特性やカバリッジなどの要素からImmunogenicityを予測する。また、機械学習や統計的手法がモデルの改善に継続的に貢献している。
➢ ドッキングシミュレーション：抗体の相互作用予測➢ 分子動力学シミュレーション：抗体の立体構造とダイナミクスの結合形成モデル➢ ホモロジーモデリング：既知の構造と類似性のあるタンパク質構造を利用し、未知の構造を推定➢ ファーマコフォアモデル：抗体とターゲット間の分子相互パターンについて、特徴量を組み入れた予測 etc...
◆ 一度に大量の情報を処理できるため、費用対効果に優れているとされている。
◆ 非臨床試験データや臨床試験データを組み合わせたアプローチも開発されており、より精度の高い予測が試みられている。一方で、予測モデルの標準化やガイドラインの策定が指摘されている。

http://bioanalysisforum.jp/①◆ 本項では、in silico活用の評価フローの一例とReview論文に記載されたデータベースを提示
し、企業における活用を議論したい。
Khetan R, et al. MAbs. (2022)より一部抜粋

15 th JBF Symposium DG2023-61

16

Japan Bioanalysis ForumIn silico手法～概要～
Jawa V, et al. Clinical Immunology. (2013)
Khetan R, et al. MAbs. (2022)より一部抜粋

http://bioanalysisforum.jp/

Example roadmap for immunogenicity prediction

15 th JBF Symposium DG2023-61

17

Japan Bioanalysis ForumIn silico解析 ~データベース／ソフトウェア~
Khetan R, et al. MAbs. (2022)より一部抜粋

Datebase Name
Immune Epitope
Database (IEDB)MHCBN 4.0
BcipepLeadscope Toxicity
Database

Application

Link

Experimental data on antibody and T cell epitopes.

https://www.iedb.org/

A database of MHC/TAP binding peptides and T-cell epitopes.
Database of B-cell epitopes.
The Leadscope Toxicity Database contains over 180,000
chemical structures with over 400,000 toxicity study results.

https://webs.iiitd.edu.in/raghava/mhcbn/

Application
Protein Antigenicity predictor
Continuous B-cell epitope predictor.
Discontinuous B-cell epitope predictor.
Prediction of discontinuous B cell epitopes from protein threedimensional structures
Antibody epitope prediction
A tool to predict linear antigenic epitopes
Antibody-specific epitope prediction
Immunogenicity risk assessment
Immunogenicity risk assessment
Rosetta-based biotherapeutic deimmunization platform
Antibody humanization toolin silico toxicology assessments

Link

https://webs.iiitd.edu.in/raghava/bcipep/info.html
https://www.leadscope.com/product_info.php?pro ducts_id=78

Software (free)
Software Name
ANTIGENpro
COBEproBEpro (PEPITO)
DiscoTope
ElliProSVMTriP
AbAdapt
RANKPEPNetMHCIIpan
MHCEpitopeEnergy
Hu-mAb
TOPKAT

Software (paid)

https://scratch.proteomics.ics.uci.edu/
https://pepito.proteomics.ics.uci.edu/info.html
http://www.cbs.dtu.dk/services/DiscoTope/
http://tools.iedb.org/ellipro/
http://sysbio.unl.edu/SVMTriP/
https://sysimm.org/abadapt/
http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html
https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetMHCIIpan-4.0/

https://www.rosettacommons.org/docs/latest/rosetta_basics/scoring/MHCEpitopeEn
ergy
https://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/sabdab-sabpred/sabpred/humab
https://www.toxit.it/en/services/software/topkat

http://bioanalysisforum.jp/

Database (free)

Name
Company Application
EpiMatrix EpiVax
An integrated toolkit for the selection and optimization of antigens and the design of epitope
LabZient™ Abzena
Predictive in-silico evaluation with laboratory methods to de-risk the application
EpibaseLonza
In silico immunoprofiling services and in vitro cellular assays predict and compare the immunogenicity risk potential

フリーのソフトウェアは多数報告されている。一方、メーカーは社内情報を開示できない
ので、ライセンス料を支払い、非公開の予測ソフトウェア等を使用しているのでは？
15 th JBF Symposium DG2023-61

18

Japan Bioanalysis ForumIn silico解析～活用事例～

http://bioanalysisforum.jp/

Khetan R, et al. MAbs. (2022)より一部抜粋

さまざまなHLA-II型と相互作用する
HLA-II結合ペプチドを提示し、分子の構造と相互作用に基づいて免疫原性ポテンシャルを予測する。

機械学習（サポートベクターマシーン）を利用して、タンパク質のトリペプチドの類似性と傾向スコアから、B細胞に認識されるタンパク質表面領域（抗原エピトープ）B細胞エピトープを予測する。
機械学習をベースとした構造活性相関による毒性予測ツール。特定のエピトープとMHC（主要組織適合遺伝子複合体）分子の相互作用領域から潜在的なT細胞エピトープを予測する。

15 th JBF Symposium DG2023-61

19

Japan Bioanalysis Forum

DGコメント➢ 聴講者の皆様
気になるところがあれば、ポストイットにご記入ください。

主には創薬段階での活用になると考えている。免疫原性リスクの高いペプチドを探索することができるので、MAPPsなどと組み合わせて、多数の候補品からの絞り込みに使用可
能ではないか。一方で、全長でのin silico予測は現段階では精度が低いのではないか？ということをDG内で議論した（あまり知られていないのでは？）。

JBFでin silicoについて議論できるか？

http://bioanalysisforum.jp/

免疫原性評価におけるin silicoの予測の使い方は？

本DGメンバーも含め、JBF参加者の多くは生体試料分析をバックグラウンドとしており、専門的に話すことができないため、今回はoff the tableとしたい。学会当日にコメントがもらえると嬉しい。

15 th JBF Symposium DG2023-61

20

Japan Bioanalysis Forum②

In vitro HLA assay～概要～

in vitro HLA assayは、抗原となるタンパク製剤のペプチド断片と、リコンビナントのHLA（MHC-classⅡ）との結合を評価する手法である（細胞不使用）。

Roche PA, et al. Nat Rev
Immunol. (2015)より一部抜粋

結合を評価

リコンビナント化

15 th JBF Symposium DG2023-61

http://bioanalysisforum.jp/

ペプチド断片化21

Japan Bioanalysis Forum

手法の概略図ユウロピウム標識
ストレプトアビジン

Pre-mix
ビオチン標識
ペプチド④

ペプチド①

リコンビナント
HLA②

抗HLA抗体③①~評価フロー例~◆ タンパク製剤の重複したペプチドライブラリー①を作製。
◆ 用いるHLAアレルのタンパク②とそれに対する抗抗体③を準備。
◆ ②に結合するビオチン標識トレーサーペプチドを準備（④）。
◆ 96wellプレートに③を固相。
◆ ①と④を②とインキュベーションしたものを、プレートに添加し③と反応させ、ユーロピウム
標識ストレプトアビジンで検出。

互いに一部重複した15merのペプチドライブラリー

重複配列

ペプチド1
ペプチド2
ペプチド3
ペプチド4
・
・
・

・
・
・

http://bioanalysisforum.jp/

In vitro HLA assay

15merのアミノ酸

HLAとタンパク製剤のペプチド断片の反応性を確認
HLAとの結合活性で免疫原性を評価
15 th JBF Symposium DG2023-61

Jawa V, et al. Front Immunol. (2020)参照

22

Japan Bioanalysis Forum

DGコメント➢ 聴講者の皆様
気になるところがあれば、ポストイットにご記入ください。

利点：比較的少数のHLAアレルでもリコンビナントさえ作ればアッセイを行うことが可能であり、PBMCより入手しやすいと考えられる。
欠点：ペプチドライブラリー自体の作製コストがかかる、ペプチド設計や純度、コンタミなどにより偽陽性、偽陰性が生じる可能性がある。

実施する上での留意点など、DGで出たコメントは？

http://bioanalysisforum.jp/

In vitro HLA assayの利点と欠点は？

リコンビナントタンパク自体の信頼性（反応性や安定性など）の担保が課題では、というコメントがあった。また、ELISAの競合法での実施だが、条件検討などは手間がかかる可能性が高いと言えそう。欠点にもある通り、ペプチド断片化して実施することで偽陽性、偽陰性の確率は上昇すると思われるため、MAPPsの方が有用ではないかという議論になった。
15 th JBF Symposium DG2023-61

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Japan Bioanalysis Forum③MHC-II-associated peptide proteomics(MAPPs)～概要～
MAPPsは、タンパク製剤そのものを細胞に添加し、樹状細胞内でHLA分子に結合した抗原由来のペプチド断片をモニターし、抗原提示されやすい配列を同定する手法である。

http://bioanalysisforum.jp/

Roche PA, et al. Nat Rev
Immunol. (2015)より一部抜粋

15 th JBF Symposium DG2023-61

24

Japan Bioanalysis Forum

MAPPs~原理と目的~MHC-II-Associated Peptide Proteomics (MAPPs) は 、 DC 内 で の抗原プロセシングを経てHLA分子に結合した抗原由来のペプチド断片について、ペプチドの配列をLC-MS/MSを用いて同定する技術である。
In silicoによるT細胞エピトープ予測がペプチドとHLAの結合のみを予測するのに対し、MAPPsは実際の抗原提示機構に近い状態でペプチド断片を検出できる。

MAPPsの利用目的① 類似の蛋白製剤間の免疫原性の相対比較② 抗原提示されやすい「ホットスポット」配列の同定③ in silico免疫原性予測の検証④抗原提示の機序解明
15 th JBF Symposium DG2023-61

http://bioanalysisforum.jp/

MAPPsとは？

25

Japan Bioanalysis Forum

MAPPs～具体的なフロー～バイオ医薬品単球
単離分化

http://bioanalysisforum.jp/

PBMC
単離

MHC Class II上へのペプチド提示

Maturation

新鮮血
ドナー

PBMC
（新鮮／凍結）単球

未熟樹状細胞

成熟樹状細胞

溶解

データ
解析

データベースを用いたペプチド配列同定LC-MS/MS

LC-MS/MS
分析

ペプチド
抽出

ペプチド混合物

抗MHC ClassII 抗体での免疫沈降

抗体／ペプチド複合体

Cell lysate

Steiner G, et al. J. Proteome Res. (2020)より一部抜粋

15 th JBF Symposium DG2023-61

26

Japan Bioanalysis Forum

MAPPs～アウトプットのイメージ～

Cluster：共通配列を有する、長さの異なるペプチド群

MAPPsにより同定されたMHC Class
II提示ペプチド。
1人のドナーからでも異なる長さのペプチドが提示される。

http://bioanalysisforum.jp/

アミノ酸
配列番号

抗原提示のされやすさをHeatmapで表示
複数ドナーで抗原提示→免疫原性リスクが高い
Rombach-Riegraf V , et al. J. PLOS ONE. (2014)より一部抜粋

15 th JBF Symposium DG2023-61

27

Japan Bioanalysis Forum

MAPPsと臨床ADA陽性率の関係
重鎖

軽鎖

低

低

中

低

高

ADA陽性率高

http://bioanalysisforum.jp/

臨床試験でのADA陽性率高
抗原提示されたペプチドを含むCluster

臨床試験でADA陽性率が高い薬剤ほど、MAPPsで多くのClusterが認められた。
Karle A, et al. J. MAbs. (2016)より一部抜粋

15 th JBF Symposium DG2023-61

28

Japan Bioanalysis Forum

MAPPs
論文

Sekiguchi N, etal. MABS(2018)/Chugai

Steiner G, et al. J.
Proteome Res.
(2020)/Roche

Di Ianni A, et al.
Life Sci Alliance(2023)/Merck
SeronoHartman K, et al.
Biology(2023)/
Roche

評価抗体
（陽性対照）

Infliximab
Adalimumab
Etanercept
In-houe Abs

Infliximab
In-house Abs（KLH）Infliximab
Trastuzumab
In-house Abs（KLH）

Adalimumab
ATR-107（KLH）

PBMCのソース

凍結

新鮮血

新鮮血

凍結

ドナー数

20

3

10

3

# of monocyte

1.4 - 5.4 × 106

3× 106 cells

6× 106 cells

2.5× 106 cells

免疫沈降に用いた
抗MHC ClassII抗体

G46-6 (Becton Dickinson)

L243(BD Biosciences)G46-6 (Becton
BioLegend)

L243(RayBiotech),
SPV-L3(Biotium),
1a3, B7/21(Leinco),CR3/43, WR18(BioTechne),Tu39(BioL
egend)

免疫沈降に用いた
ビーズまたは固相
カラム•CNBr-activatedSepharose 4B beads (GEHealthcare UK)•FG NHS magnetic beads(Tamagawa Seiki)•CNBractivatedSepharose 4B• NHS-activatedmagnetic Sepharose
Beads(GE Healthcare
Europe)•Streptavidinsepharose magnetic
beads (GE Healthcare•FG-NHS magnetic
beads•(Tamagawa Seiki)

Streptavidin
cartridge(Agilent)

LC-MS/MS

http://bioanalysisforum.jp/～論文条件一覧～

逆相ナノLC-MS/MSシステム（いずれも高分解能質量分析装置を使用）

15 th JBF Symposium DG2023-61

29

Japan Bioanalysis Forum

MAPPs～推奨条件（例）～ドナー

ドナー数は創薬初期の配列評価で10例程度、中～後期はHLAの多様性を考慮したリスク評価として15～30例
HLAのGenotypingは必須

PBMC

新鮮血由来と凍結PBMCの両方の報告がある。
HLAのGenotypingは必須

細胞数

Monocyteとして1～6x106 cells

コントロールまたは
ベンチマーク蛋白

陰性対照：Medium
陽性対照：確実に抗原提示されるタンパク（KLHなど）
ベンチマーク：臨床でのADA陽性率が明らかになっている抗体医薬（adalimumab、infliximab、rituximabなど）

QC

LC-MS/MSの性能評価のためのQCと、サンプル調製のQCは分けて考えるべき。
・LC-MS/MS：約5000の異なるMHC-classIIペプチドから約1000のタンパクを同定・サンプル調製：各ドナーにおいて、選択されたタンパク（KLH、アルブミン、ベンチマーク抗体など）について、検出されるべきペプチドが検出されることを評価

http://bioanalysisforum.jp/

推奨条件

Ducret A, et al. MAbs. (2022)より一部抜粋

15 th JBF Symposium DG2023-61

30

Japan Bioanalysis Forum

MAPPsはどういった目的で使うべき？

➢ 聴講者の皆様
気になるところがあれば、ポストイットにご記入ください。

MAPPsは比較的時間も手間も掛かるので、免疫原性予測としてルーティンに用いられる
方法ではないと考えている。あるタンパクでin vitroのPBMCやDC/T cellアッセイで免
疫原性が高いという結果が得られた際に、T細胞エピトープを予測する目的に使われることが多いのではないか？T細胞エピトープが予測できれば、アミノ酸配列を改変するなどして、より低リスクの候補分子を選択することに役立つと考えている。

MAPPsの結果はHeatmapとして得られるが、その結果からアミノ酸配列の改変などを行うための判断基準はどうすればよいか？

http://bioanalysisforum.jp/

DGコメント

個人的な意見だが、改変を行うかどうかの明確な判断基準を設定することは困難と考えている。上述のように、MAPPsを行う時点で既にその分子は免疫原性が高いと考えられており、且つ、改変を行う意向が強いことが想定される。そのため、Heatmap上に他の分子では認められていない領域にClusterが明確に現れたなら、その領域を中心に改変を行うべきではないか？
15 th JBF Symposium DG2023-61

31

Japan Bioanalysis Forum④

DC internalization～概要～

MAPPs及び次項で示すT cell assay等の評価は、いずれも免疫応答の後期過程をモニターする手法であるのに対し、DC internalizationは最初の過程である薬物のAPCへの取り込みをモニターする手法である。
T cell assay
MAPPs

15 th JBF Symposium DG2023-61

Activation

http://bioanalysisforum.jp/

Roche PA, et al. Nat Rev
Immunol. (2015)より一部抜粋

32Japan Bioanalysis Forum

DC internalization～評価フロー例～
Melendez R, et al. Bioanalysis. (2022)より一部抜粋

MFI(全染色）MFI(外部染色）with Fixation and Permeabilization

w/o Fixation and Permeabilization

PBMC
Isolation

Internalization

CD14+
monocytes
IL4
GM-CSF

Endo-lysosomal pathway
Dendritic cell

Dendritic cell(DC)

AlexaFluor-647-goat F(ab)’2

human IgG

http://bioanalysisforum.jp/

MFI : medianfluorescence intensity◆ PBMCからCD14陽性単球を分離し、IL4＆GM-CSF培養によるDC分化◆ IgG（Mab）にFRETアッセイ用のアクチベーターを反応させ、結合◆ DC分化後の細胞に100ug/mLのMabを24h、37℃処理し、内在化◆ Washout後に、4%ホルマリンで固定。膜透過処理群と未処理群でFlow Cytometryで分離◆ Mabに対する結合性と、透過処理後の結合性の差分から内在化指数 (=MFI(全染色)-MFI(外部染色))を算出

15 th JBF Symposium DG2023-61

33

Japan Bioanalysis Forum～論文条件一覧～

論文

Xue L, et al. Clin Exp
Immunol. (2016) /Pfizer

Wen Y, et al. AAPS J.
(2020) /Eli Lilly

Melendez R, et al. Bioanalysis.
(2022) /Genentech

Assay種別

DC-T

DC-T

DC-T

実験ソース

健康なボランティア

正常ドナー

-

単球の分離

-

CD14 beads (Miltenyi )CD14 beads (Miltenyi )MoDCへの分化

PBMCから単球とT細胞を単離。
IL-4＋GM-CSF＋基礎培地から誘導

PBMCから単離。
IL-4＋GM-CSF＋基礎培地から誘導

PBMCから単離。
IL-4＋GM-CSF＋基礎培地から誘導

細胞数

Unknown

1.0 x106 cells/mL

0.3x106 cells/mL

個体数

N=9~11

N>40

N=10（8~25の範囲で増減）

検出手法

Fixation and Permeabilization
フルオロフォアに直接的に結合され F(ab)’2に結合したFRET対を利用し、 Solution前後に蛍光標識二次抗体を添加た抗体の内在化をモニターする手法 抗体の内在化を検出する（抗体結合体が することで、差分解析から内在指数を（フルオロフォアの取り込みの差は エンドリソソーム経路で内在化され、 算出する方法論。水溶性の高いフルオ
内部移行の読み取りまで反映） FRET対が分離し、蛍光シグナルが検出） ロフォアの影響やアーティファクトを検出せず、特異性が高い

被験物質の濃度50 µg/mL

4 µg/mL

100 µg/ml

ポジコン

KLH

mAb1

Bococizumab

ネガコン

PF-1

Isotype IgG

Bevacizumab
Evolocumabなど

15 th JBF Symposium DG2023-61

http://bioanalysisforum.jp/

DC internalization

34

Japan Bioanalysis Forum

DGコメント➢ 聴講者の皆様
気になるところがあれば、ポストイットにご記入ください。

DCへの特異的な取り込みを検出できるポテンシャルを秘めており、PBMC/T cell assayとは異なるリードアウトとなることから、複合的な考察につなげられるのではない？
一方で、PBMC/T cell assayとは違って、歴史が浅く、まだ科学的な特徴づけもなされていないため、今後の評価に注視したい。

DC internalizationのメリットは？

http://bioanalysisforum.jp/

DC internalizationは免疫原性の途中過程なので、抗原性や免疫原性の評価と直接関係せず、実際のリスク評価には活用しづらいのではないか？

細胞の取り込み過程であることから、PBMCを用いたほかのアッセイ（T cell assay等）と比べて、ロット差が生じがたく、一貫性のある反応と言われている。また、取り込み過程をモニターするため、スループットがよい（反応時間がPBMC/DC+T cell assayと比べて短い）点も利点と言えるのではないか？
15 th JBF Symposium DG2023-61

35

Japan Bioanalysis Forum

In vitro ⑥PBMC/⑦DC+T cell

～概要～

PBMC assayまたはDC-T cell assayは、いずれも Tcellの活性化をモニターすることで、薬物のAPCへの取り込み→peptideの提示→T cellの活性化の一連の動きを評価する手法
Roche PA, et al. Nat Rev
Immunol. (2015)より一部抜粋

http://bioanalysisforum.jp/

Activation

15 th JBF Symposium DG2023-61

36

Japan Bioanalysis Forum

In vitro PBMC/DC+T cell ～手法の概略～
T cellの増殖・活性化を指標とした Human PBMC/DC+T cell assay
それぞれの特徴

Pros：比較的簡便なassayで、ステップ数が少なく、評価期間が短くて済む
Cons：PBMCに含まれるDC細胞は少ないため、感度が高くない。T cellに直接作用するような薬剤では正しい評価にならないことが想定される。

➢ DC-T assay：PBMCから単離したmonocyteをDCに分化させ、一定の比率でT cellと共培養したものでT cellの増殖・活性化を観察。
Pros：DCとT cellの比率を最適化することで、感度を高くすることが可能
Cons：細胞の単離・分化などが必要なため、assayステップが多く、評価期間も長くなる。

http://bioanalysisforum.jp/➢ PBMC assay：PBMCに含まれるDC・T cellを利用し、目的薬物を添加することによるT cellの増殖・活性化を観察。

薬物全体、部分的なpeptideいずれでも評価可能であり、生体内で生じるであろう抗薬物抗体産生につながるT cellの増殖・活性化を観察することが可能であるところが利点と考えている。
15 th JBF Symposium DG2023-61

37

Japan Bioanalysis Forum

In vitro PBMC/DC+T cell ～具体的なフロー～
PBMC

CD4＋T

CD4＋T CD4＋T

B CD4＋T CD8 T CD8 T
CD4＋T NK
NK
DC
(実際は1/5～10)
mono
CD4＋Tmono
CD8＋T
NK CD8＋T
CD4＋T
CD4＋T
B
＋

DC-T

＋

Challenge

単+離 CD14mono

単CD4+(-CD8+)
離➢ T cellの増殖➢ サイトカイン分泌

mono

分
化

CD4＋T

CD4＋T CD4＋T

CD4＋T

CD4＋T
CD4＋T

ｍDC

ｍDC

NK
CD4＋T CD4＋T
CD4＋T
＋
＋
B CD4＋T CD8 T CD8 T
CD4＋T
NK
NK
DC
(実際は1/5～10)
＋
mono
CD4 T
mono
＋
CD8 T
NK CD8＋T
CD4＋T
CD4＋T
B

Challenge→Wash out

CD4＋T

CD4＋T

Activation

http://bioanalysisforum.jp/

ActivationNK

PBMC assayはシンプルな手順、DC-T assayは感度の面でメリットがあり、いずれの手法を選択するかは個別の判断と思われる。

15 th JBF Symposium DG2023-61

38

Japan Bioanalysis Forum

In vitro PBMC/DC+T cell ～assayの留意点～➢ PBMCについて–使用するPBMCのcondition• 新鮮PBMC• 凍結PBMC(-80℃ or 液体窒素)
PBMC使用条件について• 健常人 or 患者由来
• HLAカバレッジ(例数)• 細胞数

PBMCのコンディションが結果に影響する可能性あり
必要に応じてPBMCソースを判断。
HLAカバレッジや細胞数が試験コストに直結する。

➢ DC/T cellについて––––

Monocyteの分離方法
DCやT cellの分離法はいくつか知T cellの分離方法
られているが、どの手法を選べばmonocyteの分化方法
よいかが悩みどころ・・・
各細胞の細胞数（DCとT cellの比率）➢ 培養・刺激条件について–––

刺激タイミング・測定までの期間
抗原の種類・濃度刺激のポジティブ・ネガティブ
コントロール

http://bioanalysisforum.jp/–

培養期間と刺激タイミング・抗原
刺激濃度は報告間でかなり幅がある印象。何をコントロールとすればよいかも議論がありそう。

15 th JBF Symposium DG2023-61

39

Japan Bioanalysis Forum

In vitro DC-T cell assay～論文条件例～

Karle A, et al. MAbs.
(2016) /Novartis

Xue L et al. Clin Exp
Immunol. (2016) /Pfizer

Assay種別

DC-T

DC-T

DC-T

実験ソース

Healthy (and HX575
treatment patient)

Healthy

Healthy

CD4+CD25

CD4+

CD4+

10 Days

5 Days-Antigen pulse(T細胞数)

5×104 cells

1×105 cells

3×105 cells

Antigen pulse(mDC細胞数)

1×104 cells

1×104 cells

3×104 cells

48 h

7 Days

7 Days

個体数

24 (responder:8, nonresponsers:16

50

11

被験物質

組み換えエリスロポエチン

上市抗体

ATR-107(anti-IL-21R)

ポジコン

-

KLH・humanized A33

KLH

ネガコン

-

Medium alone

PF-1

T細胞
細胞培養期間Antigen pulse

15 th JBF Symposium DG2023-61

http://bioanalysisforum.jp/

Schneider T, et al. Blood
Adv. (2017) /Novartis

論文40Japan Bioanalysis Forum

論文～論文条件一覧～

Hamze M, et al. Sec.
Mazor R, et al. Proc Natl
Vaccines and MolecularAcad Sci U S A. (2014) /Therapeutics (2017) /NIH
Université Paris

Lamberth K, et al. Sci
Transl Med. (2017) /Novo Nordisk

Assay種別

PBMC

PBMC

PBMC

実験ソース

Healthy (and Cancer)

Crohn’s/RA

Healthy

細胞数2 × 106 PBMCs

Not Stated

4-6 × 106 CD8+ Depleted
PBMCs

個体数

50 (16)750

細胞培養期間

14–17 Days

10 Days

8 Days

被験物質

Recombinant immunotoxin mAb: Rituximab, Infliximab rFVIIa, Vatreptacog alfa

ポジコン

-

KLH

-

ネガコン

-

Buffer

-15 th JBF Symposium DG2023-61

http://bioanalysisforum.jp/

In vitro PBMC assay

41

Japan Bioanalysis Forum

In vitro PBMC assay
条件

ドナー

目的に応じてドナー数は異なると考えられる。
10～50例

PBMC

新鮮血由来と凍結PBMCの両方の報告がある。
HLAのGenotypingは必須

細胞数

PBMCとして2～5 x 106 cells

Negative Control

MediumPositive control

KLH

BenchmarkAdalimumab、Infliximab、Rituximabなど

抗原刺激濃度Incubation時間
Detection ①

抗原に依存
7–20 日間T cellの増殖

Detection ②

T cellからのサイトカイン分泌15th JBFシンポジウム DG2023-61

http://bioanalysisforum.jp/

項目～推奨条件（例）～42

Japan Bioanalysis Forum

In vitro DC-T assay～推奨条件（例）～

項目
ドナー

条件
目的に応じてドナー数は異なると考えられる。10～50例

PBMC

新鮮血由来と凍結PBMCの両方の報告がある。HLAのGenotypingは必須

T cellの精製
Monocyteの細胞数

CD4+ビーズ、またはCD8+ビーズ除去処理後のCD4+ビーズ
T cellの1/5～1/10

T cellの細胞数

1×105 ～1×106 cells/well

DCへの分化方法

GM-CSF + IL-4 (iDC)、Cytokine cocktail、 TNFα (mDC)

抗原刺激濃度

5–450 µg/ml (抗原に依存)

刺激後の培養時間

24 h～7 days

Positive controls

KLH

Negative controls
BenchmarkDetection ①

BufferAdalimumab、Infliximab、Rituximabなど

Detection ②

http://bioanalysisforum.jp/

Monocyteの精製方法 接着法、CD14+ビーズ

T cellの増殖
T cellからのサイトカイン分泌

15 th JBF Symposium DG2023-61

43

Japan Bioanalysis Forum~分析手法~➢ T cellの増殖• 3H-Thymidine取り込み• Flow Cytometry• ELISpot 等➢ サイトカイン分泌• ELISpot• Multiplex 等
詳細は各分析手法の項目の中に記載がある。各手法とも感度や実施の容易さなど、ケースに応じて分析手法を選択していると思われる。

http://bioanalysisforum.jp/

In vitro PBMC/DC+T cell→in vitro PBMC/DC+T cellなどでメインで使用されているFlow Cytometry
及びELISpotについてはP48以降に測定法の詳細を示す。
15 th JBF Symposium DG2023-61

44

Japan Bioanalysis Forumhttps://www.miltenyibiotec.com/JP-en/applications/Drugdiscovery-and-development/assays-for-immunogenicityprediction.html

T細胞活性化の評価を用いたケースで、実際の臨床ADA発生とImmunogenicity予測の関連性はいくつか報告があり、どのように比較するか難しいが、それなりに関連するという結果が出ている。

http://bioanalysisforum.jp/

In vitro assayと臨床ADA陽性率の関係

Cohen S, et Al. MAbs. (2021)より一部抜粋

15 th JBF Symposium DG2023-61

45

Japan Bioanalysis Forum

DGコメント➢ 聴講者の皆様
気になるところがあれば、ポストイットにご記入ください。

細胞を用いた比較的長い期間のassayなので、評価の堅牢性は高くないと考えている。
N数を増やしたり、細胞のconditionをなるべく合わせたりすることが良いように思われるが、実施例のヒアリングはまだまだできていない状況である。多くの実施例を集めた
うえで留意点をまとめられると良いのだが・・・

報告によって試験条件が異なっているので、なにかしら指標になるようなものがあると良いのだが・・・

http://bioanalysisforum.jp/

PBMC/DC-T cellの評価の堅牢性はどの程度ある？

AAPSなどのreviewを見ても、試験条件が揃っている部分と揃っていない部分があり、難しい課題である。

15 th JBF Symposium DG2023-61

46

Japan Bioanalysis Forum

HLAの多様性と評価に用いるPBMC
各種in vitro評価で使用するPBMCの人口カバー率（カバーレッジ）は、
その評価結果の有用性を左右する重要な指標の一つである。

➢ HLAの頻度例（DR-DQ：日本人）
DQ1

HP(%)
17.0

Coverage
17

DR4

DQ4

12.1

29.1

DR9

DQ3

10.3

39.4

DR8

DQ1

8.3

47.7

DR13

DQ1

7.4

55.1

DR12

DQ7

5.9

61

DR4

DQ3

5.8

66.8

DR1

DQ1

5.4

72.2

DR14

DQ1

4.6

76.8

DR4

DQBL

3.0

79.8

DR11

DQ7

2.4

82.2

DR8

DQ4

2.4

84.6

DR4

DQ7

1.9

86.5

DR8

DQ3

1.9

88.4

DR9

DQBL

1.9

90.3

DRJ25

DQ7

1.6

91.9

DRBL

DQ1

0.9

92.8

DR14

DQ7

0.9

93.7

DR9

DQ7

0.8

94.5

DR16

DQ1

0.8

95.3

DR12

DQ3

0.7

96

DR10

DQ1

0.6

96.6

DR8

DQ7

0.5

97.1

DR7

DQ2

0.4

97.5

DR12

DQ1

0.3

97.8

DR15

DQ7

0.3

98.1

DRBL

DQ7

0.3

98.4

DR8

DQBL

0.2

98.6

HLA Haplotype frequencies
120

100

80

60

40

20

0
0

5

10

15

20

25

30

http://bioanalysisforum.jp/

DQ

DR15

Coverage（％）

DR

Donor

https://jshi.smoosy.atlas.jp/ja/hla_data 日本組織適合性学会のデータより求めるHLAの頻度(90％以上等)にあわせて異なるHLAハプロタイプを持つ
PBMCドナーの試料数を判断する必要があるが、各種ドナーのPBMCの安定的な入手とそのコストについては、DG内でも課題とする声が多く上がった。
15 th JBF Symposium DG2023-61

47

In vitroのImmunogenicity予測に一般的に用いられる測定法

15 th JBF Symposium DG2023-61

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum48

Japan Bioanalysis Forum

Tool/Tech

Flow
Cytometry(Surface)

Flow
Cytometry(Intracellular)

ELISpot

ELISA

Molecule detected

Surfaceintracellularand surface

Secreted(in situ)

Secreted

Multiparameter

Yes

Yes

No

No

Single cell/cell
subset information

Yes

Yes

Frequencies, no
subset info.

No

Antigen-specificity

Yes

Yes

Yes

Yes

Post-assay viability

Yes

No

No

Yes

Quantitation ofproteinPossible

PossibleNo

Yes

Instrumentation

Flow cytometer

Flow cytometer

ELISpot reader

Spectrophotometer

http://bioanalysisforum.jp/

各測定法の比較in vitro PBMC/DC+T cellなどでメインで使用されているFlow Cytometry及びELISpotについて以降に測定法の詳細を示す。
15 th JBF Symposium DG2023-61

49

Japan Bioanalysis Forum～原理～

高分子学会HP、およびDG2016-27より一部抜粋

http://bioanalysisforum.jp/

Flow Cytometry

散乱光や蛍光に基づき流路内の細胞1つずつの情報を測定する方法
・細胞に傷害を与えないで流すための緩衝液（シース液）中で細胞1つずつを一列に並べ、レーザー光を当てて散乱光や蛍光を測定することにより細胞1つずつの情報を取得
・用途：細胞計数 / 細胞の大きさ / (DNA量に基づく)細胞周期 / (蛍光標識抗体を用いた)細胞表面
マーカー解析 / 細胞分取 / (蛍光標識高分子などの)細胞内導入解析
15 th JBF Symposium DG2023-61

50

Japan Bioanalysis Forum～必要なモノ～

必要な試薬・器材•
フローサイトメーター: 細胞の表面の特定のタンパク質を検出するための光学機器•
フローサイトメトリーカウンティングビーズ: 一定のサイズと量のビーズが含まれており、解析時の結果の定量化とサンプル間の比較に使用される。
•
抗体プローブ: 標的タンパク質を特定するための表面抗原を認識する抗体•
細胞培養試薬: セルベースの実験で使用する培地、成長因子、抗生物質などの試薬•
細胞固定化剤: 適切な試料処理と安定性のために細胞を固定化するために使用される試薬•
細胞ラベル試薬: ターゲットタンパク質を検出またはマーキングするための蛍光標識抗体や色素試薬•
バッファーソリューション: サンプルの処理や細胞の処理中に使用される試薬ソリューション
MarkerFunction

Monocytes

Immature DC

Mature DC

CD14

LPS-induced Macrophage activation

+++

-/+

-

CD80

Co-stimulation for T cell activation

-

++

++

CD83

Lymphocyte activation

-

-/+

++

CD86

Co-stimulation for T cell activation

-

+

+++

HLA-DR

Antigen Presentation

+

++

+++

CD209

DC-T cell interactions, DC migration

-/+

++

+

CD40

Co-stimulation for T and B cell activation

+

+

+++

http://bioanalysisforum.jp/

Flow Cytometry

DC: dendritic cells

15 th JBF Symposium DG2023-61

51

Japan Bioanalysis Forum

Flow Cytometry～バリデーション～

http://bioanalysisforum.jp/

DG2016-27より抜粋
bioanalysisforum.jp/images/2017_8thJBFS/P8_DG2016-27_HP.pdf

本DGではバリデーション項目については議論していない。
評価指標については適宜最新の知見を調査する必要がある。
15 th JBF Symposium DG2023-61

52

Japan Bioanalysis Forum

ELISpot～原理～
13 th JBF Symposium DG2021-50より抜粋
https://bioanalysisforum.jp/event/discussion.html

IL-2やIFN-γなどが主

http://bioanalysisforum.jp/

PBMCもしくは単離したT cellなどを添加

サイトカインの検出をスポットとして認識し、スポットの数の増殖（＝T cellの増殖）を確認する。
今回はフォーカスしなかったが、薬物で補足・検出し、スポットの増殖（＝B cellの活性化）を確認することで抗体産生まで確認できるという報告もある（⑧B cell assays）。
15 th JBF Symposium DG2023-61

53

Japan Bioanalysis Forum～必要なモノ～

必要な試薬・器材• ELISpotリーダー：• ELISpot Plate：ELISpot用のプレート。補足抗体がプレコートされたものもある。
• 補足抗体：特定のサイトカインを補足するための抗体• 検出抗体：特定のサイトカインを検出するための標識抗体。ELISAと同様
でALPやHRPの他にビオチン化されたものとストレプトアビジン-ALP/HRP
を反応させて用いることも可能• 基質：ALPもしくはHRPの基質

http://bioanalysisforum.jp/

ELISpot

Immunogenicityの予測では主に一般的なサイトカインを検出している。
キット化されているものが多く、測定法開発のハードルは低いと思われる。
ただし、ELISpotリーダーが必要な点はデメリットとして挙げられる。

15 th JBF Symposium DG2023-61

54

Japan Bioanalysis Forum

ELISpot～他の測定法との違い～

DGコメント：ELISAなどのLBA法は細胞培養上清中のサイトカインを検出するため、サイトカイン量の増減を示す。ELISpotはサイトカインを産生した細胞をスポットとして検出するため、細胞の増減を示す。一般的には、各細胞が産生したサイトカイン量（スポットの濃淡）はカウントせず、スポットの数をカウントし指標とする。

ELISpotは高感度だと聞くけれど、本当？高感度だからELISpotを使った方が良いの？
DGコメント：一般的な資料には、ELISpotは従来のELISAと比べて非常に高感度だと言われている。一方で、昨今はECLやデジタルELISA等高感度な機器が開発されており、それぞれサイトカインのキットも売られていることから、一概には比較が難しい。
上述の通り、得られるアウトプットが異なることから、何を検出したいかによって使い分ける必要があると考えている。
13 th JBF Symposium, 2022

http://bioanalysisforum.jp/

結局サイトカインを検出するなら、ELISAやECLと何が違うの？

55

Japan Bioanalysis Forum

ELISpot～バリデーション①～（参考）GCC（Global CRO Council）の指針は、主に規制ガイドライン下での実サンプル測定を見越したバリデーションであることから、各社が非臨床研究段階で行うImmunogenicityの予測において、厳密に沿う必要はない。しかしながら、社内で堅牢な系を構築するにあたり参考になると考えられるため、下に示す。
Recommendation

Islam R, et al. Bioanalysis. (2022)より一部抜粋

SOP

Should include PBMC isolation, counting method, cell handling, plate reading
method, training requirements and equipment specific procedures
It is suggested that the type of collection tube (heparin), sample collection andhandling times, shipping times determined during method development andvalidation also be included
Normalization • Intra- and inter-subject, as neededof results• Multiple baselines possible• Normalization against negative control
Criticalreagents• PBMC (refer to Corsaro et al. [30] for recommendation for using high-quality
PBMC; alternative criteria may be utilized when evaluated during method
development and confirmed to support the context of use); also, it is possible toconsider the option of CPT tubes for collection as an alternative to removal of
granulocytes at point of analysis• Detection antibodies• Positive controls• Lot-to-lot bridging should be performed• In the absence of vendor-provided stability data, stability experiments must be
performed to demonstrate critical reagent stability as per usage in the assay
SOP: Standard operating procedure.
15 th JBF Symposium DG2023-61

http://bioanalysisforum.jp/

Parameter

56

Japan Bioanalysis Forum

ELISpot～バリデーション②～（参考）Islam R, et al. Bioanalysis. (2022)より一部抜粋
Recommendation• Patient samples reflecting study population should be used during method
development and validation, if available• All runs should include positive controls and negative controls• Run all controls and samples in triplicate (three wells per result) during
validation and sample analysis
Quality controls • At least two levels of positive control and one negative control (media only)• Acceptable range should be established during validation• Reference sample/trending control for each day ELISpot is run
Validation• Precisionparameters• Sensitivity (LLOQ and LOD)
based on COU • ULOQ/reportable range• Specificity• Ruggedness and robustness• Linearity• Critical reagent stability• Whole blood or PBMC stability
Precision• Minimum ten donors• Inter-assay: should include a minimum of six runs with three replicates each by
two analysts over multiple days
• Intra-assay: minimum one run and six replicates• CV ≤30%• Total error 40% (LLOQ 50%)
COU: Context of use; LLOD: Lower limit of detection.
15 th JBF Symposium DG2023-61
57

http://bioanalysisforum.jp/

Parameter
Sample type

Japan Bioanalysis Forum

ELISpot～バリデーション③～（参考）http://bioanalysisforum.jp/

Islam R, et al. Bioanalysis. (2022)より一部抜粋
Parameter
Recommendation
Sensitivity• Determined based on precision data; the intermediate precision as LLOQ
(LLOQ and LOD) should be based on the acceptable intermediate precision of 40%• LOD is determined based on two SDs above the mean of replicate negative
control samples• Due to the mathematical considerations of a high % CV at low spot numbers
per well, statistical testing [32] is recommended for samples that are below 30
spots per well and above the LOD• LLOQ ≥ LLOD
ULOQDefined as the maximum number of individual spots per well the ELISpot plate
reader software can discriminate; this can be achieved by counting spots using
a series of cell dilutions treated with mitogen, or peptide for a donor with a verystrong peptide response
Specificity
Positive control greater than negative control; should also be tested with nonspecific peptides such as beta-actin; in thecase of non-specific peptides, the response must be less than LLOQ; in addition,
specificity should examine the full extent to which an assay responds to all
subsets of an analyte [30]; often this may also include an assessment ofspecificity for the target cell type, especially for assays aiming to measure thiscomponent
Ruggedness and • Maximum fold difference between assay ruggedness factor levels is expectedrobustness
to be less than twofold for tenfold dilutionof cells; in the case of analysts and instruments – should meet the % CV criteria• Inter-laboratory comparison studies may be performed to demonstrate assay
ruggedness
15 thStandard
JBF Symposium
58
LLOD: Lower limit of detection; SD:
deviation.DG2023-61

Japan Bioanalysis Forum～バリデーション④～（参考）Islam R, et al. Bioanalysis. (2022)より一部抜粋
Parameter
Recommendation
Ruggedness • Maximum fold difference between assay ruggedness factor levels is expected toandbe less than twofold for tenfold dilution
robustness of cells; in the case of analysts and instruments – should meet the % CV criteria• Inter-laboratory comparison studies may be performed to demonstrate assay
ruggedness
Linearity• Serial dilute PBMC from a high responder into PBMC from a non-responder• Use at least six donors (high responders) and at least three dilutions• Sample reactivity expected to decrease as cell input decreases• R2 values 0.97
Selectivity• Ten different lots/donors of PBMC (refer to Corsaro et al. [30] forrecommendation for using high-quality PBMC)• Decide on and establish level of response needed for LLOQ from the PBMCs in MD,
to determine the level of reactivity
needed for selectivity determination of the assay in validation• Controls for selectivity are based on media and PBMC positivity criteria for aselectivity sample established based onmeaningful level of reactivity of that which is below the background reactivity [30];the difference between selectivity
samples is the media controls with PBMC responses ≤ LLOQ; +/- 40%• ≥70% of the lots should pass this criterium
MD: Method development.
GCCのアンケートでも、PBMCや検出抗体は重要試薬とするコメントが多数あった。堅牢な系の構築には、バリデーションの内容と共に、それらの入手方法、取り扱いに気を付けるべきである。

15 th JBF Symposium DG2023-61

http://bioanalysisforum.jp/

ELISpot

59

ー応用ー

QSPモデルの活用

15 th JBF Symposium DG2023-61

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

60

Japan Bioanalysis Forum

Quantitative Systems Pharmacology (QSP)は、生物学的な複雑さと薬理学的な挙動を数学的にモデリングする手法である。
In silicoやin vitroの免疫原性評価プラットフォームが、生体内での複雑なADA産生プロセスの中の一部のリスク因子にフォーカスしているのに対し、QSPモデルでは一連のADA産生プロセスのモデルに組み込み、ADA産生を予測する。
免疫反応モデルの一例。
モデルにはADAの産生に関わる膨大なパラメータや仮説が含まれている。
QSPモデルの構築と検証には大量のデータが必要
であり、まだ免疫原性予測として一般的な手法ではない。
https://www.pmda.go.jp/files/000231334.pdf

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QSPモデルによる免疫原性予測 ～概要～

61

Japan Bioanalysis Forum

仮想被験者のADA

仮想被験者のPK

In silicoやin vitroなど
薬剤固有のデータ、母集
団データ及び治験デザイ
ンを免疫反応モデルとPBPKモデルを統合した
IG Simulator に 入 力 することで、患者集団におけるADAと薬剤の経時的な推移を予測する。

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QSPモデルによる免疫原性予測～活用事例～

社内の意思決定に活用

Kierzek AM, et al. CPT Pharmacometrics Syst Pharmacol. (2019)より一部抜粋

15 th JBF Symposium DG2023-61

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Japan Bioanalysis Forum長所:• 複雑な生物学的プロセスを数学的にモデリングすることで、Immunogenicityの発生メカニズムを理解しやすくなる。
• 個々の患者の遺伝子や病態に基づいた予測が可能である。
• 創薬早期段階でImmunogenicityを評価できるため、開発リスクとコストを削減することが可能である。
短所:• QSPモデリングは非常に複雑であり、多くの生物学的パラメータと仮定が必要である。仮定の確からしさの検証は困難である。
• モデルの予測精度は、モデルがどれだけ現実の生物学的プロセスを正確に再現できるかに大きく依存する。抗体産生プロセスにはまだ解明されていない部分が多いため、予測難易度は高い。

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QSPモデルによる免疫原性予測～ Pros＆Cons～

したがって、QSPはバイオ医薬品のImmunogenicity予測における強力なツールであると考えられるものの、現時点での利用は限定的と考えられる。
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63

Immunogenicity予測の潮流と運用

15 th JBF Symposium DG2023-61

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Japan Bioanalysis Forum64

Japan Bioanalysis Forum

Immunogenicityの予測の世界的な流れ
3極のガイダンス：
・FDA：Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products — Developing and Validating Assays for AntiDrug Antibody Detection（2019年1月）
・EMA：Guideline on Immunogenicity assessment of therapeutic proteins （2017年5月）
・MHLW：整備中？
公開シンポジウム：
・Non-clinical Immunogenicity Assessment of Generic Peptide Products: Development, Validation, andSampling - 01/26/2021 - 01/26/2021 | FDA（2021年）
・Workshop on immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins | European
Medicines Agency (europa.eu)（2016年）
学会発表／最新Review：
・13th Open Scientific EIP Symposium on Immunogenicity of Biopharmaceuticals（2022年）
・14th Open Scientific EIP Symposium on Immunogenicity of Biopharmaceuticals（2023年）
・Preclinical risk assessment strategy to mitigate the T-cell dependent immunogenicity of protein
biotherapeutics: State of the art, challenges and future perspectives (2023年、PMID: 37311374)
・Fit-for-Purpose Validation and Establishment of Assay Acceptance and Reporting Criteria of Dendritic Cell
Activation Assay Contributing to the Assessment of Immunogenicity Risk (2020年、PMID: 32839919）
・Survey Outcome on Immunogenicity Risk Assessment Tools for Biotherapeutics: an Insight into Consensus
on Methods, Application, and Utility in Drug Development (2023年、PMID: 37266912)

http://bioanalysisforum.jp/◆ 近年開催されたワークショップや、論文のレビューなどを以下に示す。

近年発表やWSが増えており、各社・各極が興味を示している。
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Japan Bioanalysis Forum

Survey Outcome on Immunogenicity Risk Assessment Tools for
Biotherapeutics: an Insight into Consensus on Methods, Application, andUtility in Drug Development。
第１段階の調査は 2016 年に実施。製薬業界における予測ツールへの関心を評価
第２段階の調査は 2018 年から 2021 年に実施。アッセイ法とアプリケーションにフォーカス

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Immunogenicityの予測：米国でのアンケート結果

欧米では10年近く前からImmunogenicityの予測への関心が徐々に高まっている。各社で運用されている評価条件は似た部分と大きく異なる部分があり、今後のハーモナイズは課題であると感じた。
Gokemeijer J, et al. AAPS J. (2023)より一部抜粋

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Japan Bioanalysis Forum

Immunogenicity予測運用例 (Eli Lilly)

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Walsh RE, et al. MAbs. (2022)より一部抜粋

15 th JBF Symposium DG2023-61

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Japan Bioanalysis Forum

初期Lead selection

後期Lead selection

Lead optimization

Lead候補分子が多数あり効果的
な絞り込みが必要な段階

Lead候補分子が複数(2-4個程度？)あり絞り込みが必要な段階

Lead候補分子は絞り込まれ、Leadを最適化して最終薬物にする段階

親和性

活性

特異性

In Silico

抗体A

〇

〇

〇

×

抗体B

〇

△

△

〇

抗体C

△

〇

×

〇

抗体D

〇

〇

〇

△

抗体E

△

×

△

〇

抗体F

△

△

〇

〇

抗体G

〇

〇

△

×

抗体H

〇

△

×

〇

抗体I

〇

×

〇

△

・・・

・・・

・・・

・・・

・・・

スキップも
Low
risk

High
risk

Middlerisk※選び方は各社判断〇工数や評価期間にメリットがあるため、初期の絞り込みはin silicoが有用。
〇in silicoにも様々な手法があるため、適切な手法を判断する必要あり。
全長でのin silico予測をどの程度重視するかは要議論

全長をMAPPsで評価し、リスク部分の抽出

全長をPBMC/DCT cell assayなどで評価しスコア化

他のパラメーターも併せて
総合的判断➢ 親和性・特異性➢ in vitro・in vivo活性➢ 安定性・溶解度➢ Immunogenicity newなど
in vitro評価のコストと期間を許容できるか

HLAで提示されることが想定されるpeptide
Low risk

リスクpeptideのPBMC/DC-T cellassayによる評価
High risk

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Immunogenicity予測の運用案

In silico評価等を用いた変異導入
Risk mitigation
どこまで
mitigationすればよい？

15 th JBF Symposium DG2023-61

特性評価

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アンケート結果

15 th JBF Symposium DG2023-61

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Japan Bioanalysis Forum69

Japan Bioanalysis Forum◆ DG2023-61では、国内製薬企業及びCROにおけるImmunogenicityの予測の実施状況の調査を行った。
◆ アンケート期間：2023年12月14日～12月29日◆ 対象者：JBFパートナー及びその関係者（回答者は各社代表1名に限定）◆ 有効回答数：19
CRO（3）

16%
外資製薬メーカー
5%（1）

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アンケート概要

内資製薬メーカー
79%（15）

15 th JBF Symposium DG2023-61

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Japan Bioanalysis Forum

回答いただいた製薬メーカー各社の状況
Q.創薬ステージでのタンパク製剤が占める割合（プロジェクト数）は？
（回答数16）

いいえ

無回答

50%以上

12%

19%

6%
25%未

25～50%

はい

満

19%

94%

50%

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Q.創薬ステージでタンパク製剤（ペプチド含む）はありますか？
（回答数16）

多くの企業がタンパク製剤を扱っている。
15 th JBF Symposium DG2023-61

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Japan Bioanalysis Forum

アンケート：ADA産生のプロジェクトへの影響
Q. ADAの産生が原因で開発中止または開発計画に影響が生じたことはあるか？
Q.非臨床試験（研究ステージ）（回答数16）
Q.臨床試験（開発ステージ）

その他

ある

その他

ある

6%

12%

6%

12%

無回答

無回答
19%

13%
ない

ない

63%

69%

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コメント：薬効評価が難しいケースがある

コメント：タンパク製剤の開発経験が少ないため（複数回答あり）

影響があったと回答した企業は一部ではあるが、開発経験が少ない
企業が多いことも一因であると考えられる。
15 th JBF Symposium DG2023-61

72

Japan Bioanalysis Forum

アンケート：Immunogenicityの予測の実施状況
Q. タンパク製剤開発におけるImmunogenicityの予測を実施しているか？
（回答数16）
わからない

6%

37%
「実施している」もしくは「実施を検討している」企業は、創薬ステージでのタンパク製剤が占める割合が、「 25% 未 満 」 ～ 「 50% 以 上 」 ま で様々な企業が含まれた。

実施していない38%

実施を検討している「実施していない」企業は、創薬ステージでのタンパク製剤が占める割合（プロジェクト数）が、「25%未満」
もしくは「無回答」の企業のみであった。

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実施している

19%

過半数の企業が実施、もしくは実施を検討している。
15 th JBF Symposium DG2023-61

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Japan Bioanalysis Forum

アンケート：実施している部署
CMC

その他

0%

合成（抗体作製部署）

11%

薬物動態
22%

11%

薬理
17%

安全性

39%

「その他」の内訳：• 非臨床全体• 研究（配列設計）段階では凝集傾向や安定性に関連する配列のリスク低減の観点から、またCMC開発段階では凝集やHCPなどの不純物レベル、安定性などの潜在的リスクに基づいて、CMCと創薬・前臨
床が協働するケースは考えられる。
部署に切り分けが各社異なるため一概には言えないが、関連論文の著者の所属も多種
多様（薬物動態、トランスレーショナルサ
イエンス、抗体工学など）であり、特定の部署が実施しているわけではなかった。

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Q. 「実施している」「実施を検討している」企業において、Immunogenicityの予測を実施している部署は？
（回答数10）

実施部署は安全性が最多ではあるが、各社様々である。
ADAは毒性評価の観点では安全性に関わるが、PKやPDにも影響を与えること、配列設計の最適化は合成部署と、関係部署が多岐にわたこと、
また実施ステージによって関係部署が異なるためと考えられる。
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Japan Bioanalysis Forum

アンケート：国内CROにおける受託状況
Q. Immunogenicityの予測に関わる試験の委託を受けたことがあるか？
（回答数3）

実施したことがある

0

実施したことはないが問い合わせを受けたことがある

1

実施したことがない

2

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回答数

国内CROへの委託問い合わせは少ない。
一方で、CROに委託している企業は多いことから、BAを中心としたCROではなく、それぞれ専門の海外CROへ委託しているのではないか。
15 th JBF Symposium DG2023-61

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Japan Bioanalysis Forum

アンケート：実施施設
Q. 「実施している」「実施を検討している」企業において、タンパク製剤開発におけるImmunogenicityの予測を実施している施設は？ （回答数10）

0%

10%

CROと社内の両方で実施

主に社内

わからない

20%

0%

主にCRO

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無回答

その他

70%

主にCROを用いて実施している企業が多い。
15 th JBF Symposium DG2023-61

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Japan Bioanalysis Forum

アンケート：実施内容

in vivo※

その他

実施経験はない

0%

7%

7%

in silico
40%

MAPPs
6%
in vitro（T細胞、B細胞の活性化）
40%※設問が悪く、通常の非臨床試験のADA測定も含んで回答された可能性もある。

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Q. 「実施している」「実施を検討している」企業において、タンパク製剤
開発におけるImmunogenicityの予測として何を実施しているか？（回答数9）

In silico及びin vitroのアッセイを実施している企業が多数。
一部企業でMAPPsやin vivoの試験が実施されている。
15 th JBF Symposium DG2023-61

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Japan Bioanalysis Forum

アンケート：実施時期
Q. 「実施している」「実施を検討している」企業において、何をいつ実施しているか？
（回答数9）
非臨床中期（～5個程度）

非臨床後期（1個）

in silicoin vitro
MAPPs
in vivoin silicoin vitro
MAPPs
in vivoin silicoin vitro
MAPPs
in vivo

その他
実施経験はない
無回答

その他
実施経験はない
無回答

その他
実施経験はない
無回答

0

1

2

3
回答数

4

5

6

0

1

2

3

4

5

6

回答数

0

1

2

3

4

5

回答数

※臨床試験開始後に実施しているという回答はなかった

6

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非臨床初期（化合物が多数）

In silicoは比較的初期～中期、in vitroやMAPPsは中期～後期のある程度化合物が絞られた段階で実施している企業が多い。
In vitroやMAPPsを実施するにはマンパワーとコストがかかることから、多検体で実施するのが難しいためと思われる。
15 th JBF Symposium DG2023-61

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Japan Bioanalysis Forum

アンケート：実施する化合物
Q. 「実施している」「実施を検討している」企業において、実施する化合物を決める判断基準はあるか？
（回答数8）
判断基準はある4

判断基準はない4

判断基準：• 免疫原性の低減が重要なプロジェクトかどうか。
• 薬効、物性、PK等のクライテリアを満たすこと。
• 適応疾患による。
• 対照群は設定するが、明確なクライテリアはない。

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回答数

判断基準がないということは、所定のステージに上がった際は全ての候補化合物において実施すると推察される。
一方で、対象疾患やモダリティなどから、免疫原性が評価が必要と判断されたプロジェクトのみで実施するという声もあった。
15 th JBF Symposium DG2023-61

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Japan Bioanalysis Forum

アンケート：実施上の課題 ～in silico及びin vitro～
Q. In silicoもしくはin vitroを実施して、課題に感じることは？
回答内容

現状では予測精度の判定が困難なのでどの方法がよいか判断できない。
In silico False positiveの可能性が拭えない。
MHC-class IIへの結合活性を予測するツールが多いと思うが、その下流も予測できるようになって欲しい。
様々なツール（有償・無償）があり、どれを使うべきかわからない。
臨床外挿性は？
ある程度のMHC Class IIのタイプをカバーできるのドナーの確保が困難

In vitro

判定基準の標準化と明確化がされていない。

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臨床外挿性は？

T細胞活性化薬などMoAによっては適切に評価するのが困難。
（PBMCの）ロットによって反応性が異なり、比較検討しづらい。
スループットが悪い。
15 th JBF Symposium DG2023-61

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Japan Bioanalysis Forum

アンケート：実施上の課題 ～MAPPs及びin vivo～
Q. MAPPsもしくはin vivoを実施して、課題に感じることは？
回答内容
臨床外挿性は？データの再現性は？
MAPPs 論文通りに手法をトレースしてみたが、感度が不十分であった。
ドナーを何例集めればいいのかわからない。
あくまでPotentialの判定であり、必ずしも免疫原性が高いペプチドが見つかるとは限らないため、使いづらい。
非臨床から臨床への外挿性が低い。（※設問が悪く、通常の非臨床試験のADA

In vivo 測定も含んで回答された方もいた可能性もある。）

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コストパフォーマンスが悪い。

課題に関しては、DG内でも同様の声が多数出ました。当日ぜひ議論できますと幸いです。また、特に気になる点はスライドP84の「今後の課題」の中にポストイットでコメントしていただけると参考になります。
15 th JBF Symposium DG2023-61

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Japan Bioanalysis Forum

アンケート：実施理由
Q. 実施しようと思ったきっかけは？

実施部署の所属でないのではっきりは分からないが，免疫原性のリスクを下げるために実施していると思われる。
臨床試験での成功確率向上を目的としてヒト細胞での反応性を確認するため。
海外の学会で、欧米の製薬会社が積極的に免疫原性を評価していることを知り、社内でも取り組むベきと考えた。
一方、どこの部署がイニシアチブを取るかに関してはすんなりと決まらず、最初に提案した部署（薬物動態研究部）が担当することになった。

候補物質間での優劣をつけるため。

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フォーマットが多様化する中で免疫原性が問題となるケースが今後増えると想定されたため。

FDAのimmunogenicityガイダンスやEIAなどの情報から、特に最近は必要性が増していると感じたため。

アンケート結果は以上です。ご協力いただいた方、
本当にありがとうございました！！
15 th JBF Symposium DG2023-61

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総括

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Japan Bioanalysis Forum83

Japan Bioanalysis Forum

Immunogenicityの予測について、技術の進展により様々な手法が開発され、製薬メーカー各社において創薬段階で実用化されていることがわかった。国内においても、多数の企業がin vitro評価まで実施（もしくは実施を検討）している
ことが窺われた。
一方で、規制下の薬物濃度測定のような厳密な規格化やクライテリア設定は行われておらず、各社がそれぞれ独自の基準を持っていることもわかったことから、DG内では判断基
準のハーモナイズを要望する声もあがった。

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総括

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Japan Bioanalysis Forum

DG内で話題になったものの議論できなかったこと：• 判定のスコア化とクライテリアについて• PBMCの入手性• ニューモダリティーのImmunogenicityリスクと予測

その他にも興味がある、議論したい、して欲しい項目がありましたらぜひポストイットにてお知らせください！

15 th JBF Symposium DG2023-61

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今後の課題85