大規模ゲノム改変と微生物育種

生合成遺伝子クラスターの高度強制発現による合成生物学が拓く有用天然物の創製
中沢威人・恒松雄太・石川格靖・渡辺賢二 *これまでさまざまな生物種から膨大な数の天然物が単させることができるのではないかと考えた．転写活性を離・構造決定され，その中から多数の医薬品や農薬が生増大させることができれば，新規化合物の単離へと繋がみ出され有効利用されてきた．今後も次々と新規有用天る．さらに，目的生合成遺伝子の cDNA を獲得するこ然物が発見されることに期待が寄せられている．しかしとができるようになり，続いて遺伝子工学的な異種発現ながら，現状では新規天然物の獲得がますます難しくシステムの確立された出芽酵母を用い，精製酵素によるなってきている．その理由としては ,（1）長い歴史の中in vitro 合成系で新規化合物の生合成に関する精密機能解で数多くの天然物が探索され，すでに発見されてしまっ析も達成されるであろう．このように機能未知遺伝子ク

たこと ,（2）採集できる生物，培養できる微生物は限らラスターによって生合成される化合物の化学構造を決定れた一部の種であることから，これらが化合物多様性のすることができれば，さらに多くの天然物の生合成機構限界となっていることなどが挙げられる．最近の研究開を解明することに繋がると考えられる．

発によって難培養微生物の培養技術も着々と向上しつつ現代においても新たな新規天然物を取得することの学ある一方で，新規天然物を獲得するためのこういったア術的，産業的な重要性は不変である．このような状況のプローチは決して真新しいものではなく，どちらかと言下，天然物の生合成遺伝子を用い新規天然物の獲得を目えば伝統的な天然物化学の研究手法であると言える．

指す，新しい融合研究分野である「シンセティックバイ

近年のゲノム解析の目覚ましい進展によって，多くのオロジー（合成生物学）」による取り組みが行われはじ生物の遺伝子情報を容易に手に入れられるようになっめた．本稿では，休眠型生合成遺伝子クラスターの活性た．これらの情報およびこれまでの糸状菌に関する分子化および天然物生合成遺伝子の出芽酵母を用いた異種発生物学的研究結果から，実験室における一般的な糸状菌

現系による新規天然物生産と生合成機能解析への挑戦にの培養法では糸状菌の二次代謝産物生合成遺伝子の転写ついて解説する．

活 性 は 低 い こ と が 明 ら か と な っ た． 実 際 に 糸 状 菌Aspergillus Àavus では，55 種類の二次代謝産物生合成遺伝子クタスターが染色体上にコードされていることが示

不活性（休眠）型生合成遺伝子の活性化
二次代謝産物生合成遺伝子クラスターの構造二次されているが，生成物である天然物が単離され生合成経代謝産物の生合成には，多数の酵素による触媒反応が関路が明らかとなっているは 3 種類のみである．また，特わっている場合がほとんどである．糸状菌では原則とし定の培養条件に限られるが本菌種のトランスクリプトーて，ある一つの二次代謝産物の生合成に関わるすべてのム解析の結果からも，二次代謝産物の生合成を司る遺伝酵素の遺伝子は，ゲノム上に群（クラスター）を形成し子群の転写活性が低いことも示唆されている．つまり，て配置されている．近年の糸状菌ゲノム解読の結果，特糸状菌のゲノム上に生合成遺伝子はコードされているに子のう菌類のゲノム上には，現在までに単離されてきが，天然物として生産を確認できない化合物が多数存在た化合物の種類よりも遥かに多くの生合成遺伝子クラスすると考えられる．そこで筆者らは，糸状菌が持つ潜在ターが存在することが明らかとなってきた．文献 1) およ的な二次代謝産物生合成能力を活用することで，新規天び筆者らが行った最近の研究結果（未発表）からは，大然物の創製および得られる化合物の生合成機構の精密解部分（6 割以上）のクラスターの転写発現は，通常の研析が可能となれば天然物化学に新しい方法論を付け加え究室における培養条件では不活性化されていることが明られると考えた．しかしながら，遺伝子クラスターの転らかとなった．

写活性が極めて低い場合，その生合成遺伝子の mRNA遺伝子操作による活性化

そのような不活性型クラを単離し cDNA を合成することは困難である．そこで，スターを人為的に活性化させて生合成産物を得る個々の転写されていないと推定される目的生合成遺伝子の転手法に関しての解説は，本稿引用文献 2) を参考にして写因子を糸状菌菌体内で発現できれば，転写活性を増大頂きたい．活性化の手法は，大きく 2 つに分類できる．

* 著者紹介 静岡県立大学大学院薬学研究科薬学専攻（准教授） E-mail: kenji55@u-shizuoka-ken.ac.jp

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する多数の二次代謝産物の生産を可能とした．
糸状菌由来微量天然物の酵母宿主系による生産
スピロトリプロスタチン類の生物合成

次に糸状菌

Aspergillus fumigatus が産生する超微量成分スピロトリプロスタチンの生物全合成を目指した筆者らの研究を紹
図 1．特定の狙った休眠型生合成遺伝子クラスターの活性化実
験概略図

介する．
スピロトリプロスタチン類は静岡県大井沖海底土壌より分離された糸状菌 A. fumigatus BM939 株より発見
さ れ た 化 合 物 で あ る 9)． 同 糸 状 菌 を は じ め と し たAspergillus 属や近種である Penicillium 属糸状菌からはスピロトリプロスタチンと同様にトリプトファンとプロリンからなるジケトピペラジン骨格を有した数多くの類縁化合物が発見されており，これらの化合物は 5 員環もしくは 6 員環が 4 ないし 5 つ連続した共通骨格を有している．その生物活性としては，動物細胞に対する細胞周期阻害活性などが知られており，特に近年では，フミトレモルジン C が乳がん細胞に特異的に過剰発現している
薬剤耐性膜タンパク質 BCRP を阻害することが明らか
図 2．不特定多数の休眠型生合成遺伝子クラスターの網羅的活性化実験の概略図となり，新たな抗がん化学療法剤の候補として注目されている 10)．
スピロトリプロスタチン A および B は A. fumigatus の約 400 l も の 培 養 液 中 か ら そ れ ぞ れ，1.2 mg お よ び一つは，ある特定のクラスターを狙って活性化させる方11 mg 程度しか得られない超微量成分である．有望な薬法 で あ る． た と え ば 筆 者 ら が 行 っ た こ と と し て，剤リード化合物の候補であるにも関わらず，さらなる詳

Aspergillus oryzae，A. Àavus，Chaetomium globosum

細な生物活性の評価を行うには化合物量が絶対的に不足などの糸状菌の不活性型クラスター内に存在する転写因している．その興味深い生物活性と特徴的なスピロ環構子を強制発現させることにより，そのクラスターを活性造から，多くの合成化学者の興味を引き，それぞれの研化させ，生合成産物の獲得を行った（図 1）．

究グループにおいて各種独創的な方法論に基づく全合成

二つ目は，不特定多数のクラスターを一挙に活性化さが達成されてきた 11)．しかしながら，効率的な化合物供せる手法である（図 2）．光受容シグナルの下流で働く給に関して言えば，合成にかかる労力と時間，費用の観3)

LaeA および，それと協調して機能する velvet 複合体
4)

点から十分といえる合成ルートが開発されたとは言い難の構成因子 をコードする遺伝子の破壊および強制的高い．そこで筆者らは，スピロトリプロスタチン生合成に発現によって，幅広い糸状菌において二次代謝産物生合関与する遺伝子を取得し，出芽酵母を用いた異種宿主に成量の変動および未知代謝物の生産が報告されている 5)．

よる発現系にてスピロトリプロスタチン生合成経路を再また，ヒストン修飾およびクロマチン構造変換に関与する構築することで生物による de novo 全合成をおこない，本6)

遺伝子を操作することでも同様の結果が得られている ．

化合物の効率的な供給を目指すとともに，その特徴的な一方で遺伝子操作をスピロ環構造の形成機構を解明することを目的とした．

行わずに不活性型クラスターを活性化させ，生合成産物超微量成分の生合成機構の解明は非常に挑戦的な課題と遺伝子操作によらない活性化

7,8)．これらは，なる．これまでの生合成研究では，化合物生産を司るとが主な要因であ推定された生合成遺伝子を欠損させ，得られた変異体のることに着目し，そういった制御を抑制させることで達培養液から単離された生合成中間体の化学構造に基づい成された．すなわち，ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤てその生合成経路を解析する手法がほとんどであった．

および DNA メチル化酵素阻害剤という低分子化合物をところが，超微量成分を研究対象とした場合，目的化合糸状菌に投与することで，不活性型クラスターが生合成物が微量成分であるため，遺伝子変異体から生合成中間の獲得に成功した例も報告されている
不活性化は エピジェネティック制御

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生物工学

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大規模ゲノム改変と微生物育種体を単離することが格段に困難となる．したがって，そピペラジン骨格は非リボソーム依存性ペプチド合成酵素の生合成経路を証明するためには生合成遺伝子の発現に（nonribosomal peptide synthetase, NRPS）である FtmAよる物質生産確認が最適であると考えられる．また，異により構築されブレビアナミド F を生合成し，さらにプ種発現による天然物生合成経路の特定は，欠損株の作製

レニル基転移酵素（FtmB）によりトリプロスタチン B が，により得られた実験結果と比較して明確であり，学術的続いてシトクロム P450 酵素（FtmC）およびメチル基転に意義深い成果となる可能性が高い．つまり，二次代謝移酵素（FtmD）が働くことでトリプロスタチン A が生産物に関して言えば異種発現では，宿主となる菌株には成する（図 3）．続いて，シトクロム P450 酵素（FtmE）

多くの場合存在しない生合成遺伝子の導入を試みることによりインドール環とジケトピペラジン環が縮環しフミになる．したがって，そこで得られる化合物は，導入さト レ モ ル ジ ン C を 生 成 し， も う 一 つ 別 の シ ト ク ロ ム

れた遺伝子による合成産物であることが直接的に証明さP450 酵素（FtmG）が働くことで 12D,13D-ジヒドロキれる．さらに，異種発現ではいったん目的の生合成遺伝

シフミトレモルジン C が，さらにプレニル基転移酵素

子をクローニングし発現系を構築するための分子生物学（FtmH）が働くことでフミトレモルジン B が生成する．

的操作が必要不可欠となる．そこで得られた発現系を活最 後 に D- ケ ト グ ル タ ル 酸 依 存 型 ジ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ

用し，化合物の合理的な設計に基づき生合成遺伝子を改（FtmF）が働くことでベルクローゲンが生成する．この変した後，望む誘導体を合成するための実験を効率的かように，主骨格を形成する一つの NRPS 酵素と多くの種つ迅速に行うことができる．

類の修飾酵素が働くことで，数多くの関連化合物が生産

スピロトリプロスタチンの類縁化合物であるトリプロされているトリプロスタチン類であるが，ほぼすべてのスタチン類，フミトレモルジン類，ベルクローゲンの生生合成遺伝子の機能解析が行われているにも関わらず，合成については，いくつかのグループにより多くの遺伝スピロトリプロスタチン類に至る生合成経路やスピロ環子の機能が明らかにされている

12)．それによると，これ形成に関与する生合成遺伝子については同定されていならの化合物のトリプトファンとプロリンからなるジケトかった．そこで，まずは出芽酵母によりスピロトリプロ

図 3．スピロトリプロスタチン類の推定生合成経路

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スタチン類の推定前駆体を生産させるシステムを構築すまとめることとし，その候補化合物としてデメトキシフミトレ
モルジン C の生産を検討した．デメトキシフミトレモル

上記の研究は生物を利用したモノづくりであり，依然ジン C を生合成する遺伝子は，A. fumigatus IFO4057 株

として有機合成による精密なモノづくりには至らない部のゲノム DNA からクローニングし，自律複製可能な出分も多いが，場合によっては有機合成で必須な煩雑な反芽酵母用シャトルベクターへ導入し目的の発現ベクター

応操作や極度の強酸・塩基性，酸化・還元条件，高価なを構築した．導入した生合成遺伝子群は，ftmA，ftmB，基質や金属触媒などのレアメタルを必要とすることなftmC（遺伝子名は長田らによる A．fumigatus BM939 株

く，単純な糖類を加えた培養液を振とう培養するだけでの命名13)に準拠した）であり，それぞれ酵素の機能は目的の化合物を得ることが可能である．加えて，基質認NRPS，プレニル基転移酵素およびシトクロム P450 で識能の高い生体酵素でさえ，その基質特異性を拡大する

あ る．また， 生 合 成 遺 伝 子 群 に 含 ま れ る シ ト クロム

ような変異を導入するなどして，より柔軟に変換反応がP450 酵素活性の効率的な再生のため，出芽酵母由来
NADPH-シトクロム P450 還元酵素遺伝子（NCP1）を達成されるように進化させれば，新たな化合物を創製す合わせて導入した．上記プラスミドを用い目的化合物を出芽酵母発現系で高収量にて合成するために，宿主染色体中に基質供給系遺伝子群を導入することとした．まずは，NRPS が適切にホロ化されるよう，A. nidulans 由来ホスホパンテテニル基転移酵素遺伝子（npgA）を導入し，一方でプレニル基を大量に供給するため，メバロン酸経路の初期段階であるマロン酸を基質としてマロニル-CoA を生合成する酵素遺伝子（MatB）を酵母染色体へ挿入した出芽酵母株 SCKW5 を作成した．上記で示したベクターおよび染色体に導入された遺伝子は，ウエスタンブロッティングによってそれぞれ酵母細胞内で発現することが確認された．続いて，酵母宿主 SCKW5 を上記で構築した適切な発現ベクターで形質転換した後，液体培養によって 2% ガラクトースを加え 30qC で発現誘導し，得られた培養液から各種クロマトグラフィーによって目的化合物を分離精製した．その結果，ブレビアナミることも期待できる．
文献1) Georgianna, D. R. et al.: Mol. Plant Pathol., 11, 213(2010).
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6） Bok, J. W. et al.: Nat. Chem. Biol., 5, 462 (2009).
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12) Li, S.-M.: J. Antibiot., 64, 45 (2011).
13) 鈴木宏和ら：第 50 回天然有機化合物討論会講演要旨集,
p. 137 (2008).

ド F を 22 mg/l，トリプロスタチン B を 4.0 mg/l，デメ
トキシフミトレモルジン C を 2.6 mg/l の収量にて得ることに成功した．スピロトリプロスタチン類を高収量で得るためには，今後さらなる遺伝子導入や培養条件の検討が必要である．

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