博士学位論文要旨

ヒト酸性ほ乳類キチナーゼの活性喪失と復活に関する研究

工学研究科

化学応用学専攻

博士後期課程生命工学研究室
学籍番号bd14001

氏名

大川 一明

指導教員

小山 文隆
1教授

目次
第 Ⅰ章

研究の背景

第 Ⅱ章

ヒト AMCase の活性の喪失

第 Ⅲ章

Nonsynonymous SNPs を利用した AMCase の活性の復活

第 Ⅳ章

AMCase の進化的解析

第 Ⅴ章

総合考察

第 Ⅵ章

結論

2

I章

序論

キチンは，N-アセチル-D-グルコサミン (GlcNAc) が β-1,4 結合した多糖で，甲殻類や昆虫の外骨格，寄生虫や真菌類の細胞壁に主要成分である。キチンの構造は，セルロースと類似の構造であるが，2 位炭素の水酸基がアセトアミド基になっている。
キチナーゼは，キチンの β-1,4 グリコシド結合を加水分解する。細菌類，真菌類，植物，線虫と節足動物など様々な生物は，キチナーゼを合成している。
これらのキチナーゼは，キチンを分解することで，自身の防御あるいは炭素，窒素，エネルギー源として利用することに重要であると考えられている。
ほ乳類はキチンを合成しないにもかかわらず，キチナーゼを合成している。
マウスとヒトでは活性を持つキチナーゼとしてキトトリオシダーゼ(chitotriosidase, Chit1) と酸性ほ乳類キチナーゼ (acidic mammalian chitinase,AMCase) の二種類を合成している。両酵素は糖質加水分解酵素のファミリー 18に属しており，触媒ドメインのアミノ酸配列に類似性が有り，(β/α)8-TIM バレルの基本構造を持つ一群のグループで，細菌類キチナーゼに高い配列相同性を示す。このファミリーには，キチナーゼに構造が似ているがキチナーゼ活性を欠損しているキチナーゼ様タンパク質 (chitinase-like proteins) が含まれている。
Chit1 の活性は，常染色体劣性遺伝のリソソーム蓄積症である Gaucher 病で顕著に上昇すると報告されている。Chit1 は最初のほ乳類のキチナーゼで，最初に精製，クローン化された分子である。Chit1 の生理的役割は不明だが，キチンを含む病原体からの防御が考えられている。劣性遺伝性の Chit1 活性の欠損は，コーカサス人 (白人) で一般的に観察される。
もう一つのほ乳類キチナーゼである AMCase は，酸性の等電点から，酸性ほ乳類キチナーゼ (acidic mammalian chitinase, AMCase) と命名された。AMCase は3

50 kDa の酵素で，マウスの胃と肺で発現している。AMCase は，特定の病態下で過剰発現することから注目されている。例えば，AMCase mRNA とタンパク質レベルの上昇は喘息モデルマウス，抗原誘導性のアレルギー性喘息モデルマウスで見られる。ヒトにおいて，AMCase はアレルゲンを暴露した喘息患者の肺，および喘息患者の肺胞マクロファージで増加する。さらに，ヒト AMCase では，一塩基多型 (single nucleotide polymorphisms, SNPs) に基づく AMCasevariants が同定されている。ヒト AMCase では特定の多型と気管支喘息のハプロタイプとの連関が報告されている。しかし，ヒトにおける AMCase のキチナーゼ活性の遺伝的制御に関する知識はとても限られており，生体内での生物・医学的役割もほとんど分かっていない。
ヒト AMCase は，マウス AMCase とアミノ酸配列の相同性が 90％ で，よく似ている。しかし，ヒトとマウス AMCase では，その性質がかなり異なる。
加えてヒト AMCase には，アミノ酸置換を伴う一塩基多型 [non-synonymous
SNPs (nsSNPs)] が存在する。ヒト AMCase variants のアミノ酸配列をマウスAMCase と比較すると，ヒト AMCase でのアミノ酸置換は，マウス AMCase のアミノ酸と一致している場合と，一致していない場合があった。
この研究において，大腸菌の系を用いヒトとマウス AMCase の酵素機能の比較と nsSNPs にコードされた AMCase variants によるキチナーゼ活性の変化について詳細に検討した。

第 Ⅱ章

ヒト AMCase の活性の喪失

ヒト AMCase は，マウス AMCase とアミノ酸配列の一次構造の相同性が90％ で，よく似ている。しかし，ヒト AMCase は，至適が pH 4 付近である4のに対して，マウス AMCase の至適が pH2 と性質が異なる。本 研 究 に お い て ，ヒ ト と マ ウ ス AMCase を N 末 端 に Protein A，C 末 端 に V5 エ ピ ト
ー プ と (His)6 を 付 加 し た 融 合 タ ン パ ク 質 (ProteinA-AMCase-V5-His)として発現し，そのキチナーゼ活性の比較を行った。また，ヒトAMCase の キ チ ン 分 解 活 性 の 減 少 の 原 因 と な る 領 域 の 決 定 す る た め ，
ヒ ト と マ ウ ス AMCase 間 で キ メ ラ タ ン パ ク 質 を 発 現 し た 。 作製したヒト AMCase のキチナーゼ活性は，pH 2.0-4.0 において，マウス AMCase のそれぞれ約 1/75-1/11 だった。さらに発現したキメラタンパク質の結果からヒトAMCase の活性中心を含む N 末端領域が活性を著しく低下させていることが分かった。

第 Ⅲ章

Nonsynonymous SNPs を利用した AMCase の活性の復活
ヒト AMCase では複数の AMCase アミノ酸置換体 (variant) が一塩基多型を基に同定されており，ヒト AMCase では特定の多型と気管支喘息のハプロタイプとの連関が報告されている。この研究においてヒト AMCase のキチナーゼ活性が自然発生的な nsSNPs のアミノ酸置換によって酵素機能が変化するかどうかを検討した。ヒト AMCase のキチナーゼ活性に関わる触媒ドメインとヒンジ領域に存在する nsSNPs の影響を調べるため，3 種類の天然型の variants (A~C)と 1 種類の人工的な variant (C/B) を作製し，マウス AMCase のキチナーゼ活性と比較した。ここで使用したヒト AMCase variants には nsSNPs によるアミノ酸置換が 6 種類存在している。さらに，キメラタンパク質の結果からヒト

5AMCase の N 末領領域の 3 アミノ酸置換 （N45D, D47N, R61M） が重要であると考え，この N 末領領域の 3 アミノ酸置換がマウス AMCase の酵素活性に影響を与えるか調べるためにマウス AMCase 変異体を作製し発現した。ヒト
AMCase のキチナーゼ活性は 1 塩基置換にコードされたアミノ酸置換で変動した。特に，キメラタンパク質の結果から，ヒト AMCase の N 末領領域の 3 アミノ酸置換（N45D, D47N, R61M）が，キチナーゼ活性に重要であることが明らかになった。加えて，マウス AMCase の M61R を変異させると著しくキチナーゼ活性が低下したことから，ヒトにおける M61R はキチナーゼ活性に高い影響を持っていることが強く示唆された。

第 Ⅳ章

AMCase の進化的解析

マウス AMCase において M61R の置換によってキチナーゼ活性を喪失したことから，R61 がヒト AMCase のキチナーゼ活性の喪失の原因であることが分かった。そこでヒトとマウス以外のほ乳類 AMCase で 61 番目のアミノ酸はM であるかどうかを検証した。その際に AMCase のキチナーゼ活性にどのような影響が与えられるかを検討した。さらに 10 種のほ乳類の nonsynonymous
SNPs と synonymous SNPs の比 (dN/dS) を比較した。61 番目の M はヒトとオランウータンではそれぞれ R と I に置換されており，どちらもマウス AMCaseのキチナーゼ活性に大きな影響を与えた。このことから AMCase の 61 番目に存在する M が R に変異するのはヒトに特異的なことであり，61M は高いキチナーゼ活性を保持するのに必須のアミノ酸残基であることが分かった。さらに，AMCase の dN/dS はヒトのみ dN/dS > 1 となり，正の自然選択の状態であることが分かった。このことはヒト AMCase が進化の過程において機能的制約6が緩和されていることを示唆する。

第 Ⅵ章

総合考察

本研究では，nsSNPs にコードされることによって生じたヒト AMCase variantのキチナーゼ活性を調べた。ヒト AMCase の活性は，マウスに存在しない特異的なアミノ酸によって顕著に減少した。Variant A と B はアミノ酸置換によって活性を失っている酵素と考えることが出来る。従って，ヒト AMCase は進化の過程で機能を失い偽遺伝子になったと推定される。この仮説は霊長類だけでなく遠縁のほ乳類との比較の結果からも裏付けられている。偽遺伝子化は遺伝子の機能喪失により表現型の適応のための機会を提供すると考えられてきたゲノムの進化現象である。
他の霊長類の AMCase 遺伝子が dN/dS の値が進化的現象において中立の値に近いのに対してヒト AMCase のみ dN/dS が高い。このことから，ヒトAMCase は進化の過程で機能的喪失を起こし，未知の表現形の適応が起きている可能性が高い。また，マウス AMCase と比較したとき，ヒト AMCase のキチナーゼ活性が減少しているのに加えて，胃の組織においても mRNA の発現量が相対的に減少している。これは現代人がキチン含有食物を大量に消費しないことからも考えられることである。そして多くの胃の疾患は，外因性の生物による感染に関連している。ピロリ菌の感染に関連した胃炎の重症度は内在性のキチナーゼの活性に関係している可能性がある。このことから，ヒトの胃でのAMCase のキチナーゼ活性が低いことに関連した胃の疾患への応答に関してはまだ不明な点が多い。
Max Seibold の先行研究において，酵素活性部位のコード領域付近にある新規7の variant (A290G, G296A, G339T) を含む 8 つの nsSNPs が同定されている。
加えて，集団遺伝学的解析から AMCase variant G339T (R61M) は喘息に対して保護的に働くと報告されている。本研究において，AMCase の61番目に存在する M はヒトとオランウータンを除く多くほ乳類で完全に保存されていた。加えて，M61R と M61I は野生型マウス AMCase のキチナーゼ活性の著しい減少を引き起こした。つまり，本研究や Max Seibold の先行研究における喘息に対して保護的に働くヒト AMCase G339T (R61M) はキチナーゼ活性を保持したAMCase であることを示した。
また最近の研究でネアンデルタール人とデニソワ人のゲノムが配列決定されている。それらが AMCase 遺伝子において M61 あるいは R61 を有するかどうかを決定することは興味深いことである。
この研究において不活性化していたアイソフォームを組み合わせることでヒト AMCase の再活性化を実現できた。マウス AMCase のアミノ酸配列ととてもよく保存された variant C/B は高い活性を有し，マウス AMCase と似た pH依存性であった。これらの結果は酵素に導入された特異的アミノ酸置換はその活性を低下させる（特に，M61R および M61I 置換はキチン分解活性に重要である）が，一方で活性を保持している酵素において保存されたアミノ酸の存在は
ヒト AMCase をマウス AMCase 並みに再活性化する。それに加え，この研究ではヒト AMCase のキチン分解活性を低下させる原因となる nsSNPs によって特定のアミノ酸を決定した。ここでのコンセプトの概略は将来，最小の遺伝子操作による酵素活性の増強に利用することができる。

第 Ⅶ章

結論
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AMCase は，喘息とアレルギー性炎症，食物消化に関わっている。しかし，
AMCase のキチナーゼ活性の遺伝的制御に関する知見は，とても限られていた。
ヒト AMCase のキチナーゼ活性は，マウス AMCase に比べ，著しく低下していた。さらに，ヒトとマウスで AMCase のキメラタンパク質を作製することで，ヒト AMCase のキチナーゼ活性が活性中心を含む N 末領域が存在することで低下していることを明らかにした。
ヒト AMCase に存在する nsSNPs にコードされたアミノ酸置換はキチナーゼ活性に影響を与えていることを明らかにした。ヒト AMCase は，N45，D47，R61 をマウス AMCase のアミノ酸配列において保存されている D45，N47，M61 に置換することによってキチナーゼ活性を著しく上昇させることができた。
他方，マウス AMCase のキチナーゼ活性は M61R 変異を導入することで顕著に減少させることができた。
さらに，AMCase の M61 は，ヒトやオランウータンを除いた他の霊長類やほ乳類で保存されていた。オランウータンの AMCase は 61I であり，これもマウス AMCase に置換してもキチナーゼ活性を低下させたことから，M61 は，AMCase のキチナーゼ活性にとって重要なアミノ酸残基であることが示された。
以上，本博士学位論文の結論として，ヒト AMCase キチナーゼ活性が nsSNPsによって制御され，高い活性を有したヒト AMCase variant のアミノ酸置換は，マウス AMCase のアミノ酸配列と一致することを明らかにした。

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