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容量 :保存条件 :

pET Expression vector pETUA
DV200
15 μg (TE バッファーの塩を含むプラスミドの凍結乾燥物)
-20ºC

製品概要:
pETUA は高コピー数、アンピシリン耐性の T7 発現ベクターです。T7 発現系は最も強力は発現系の一つで、大腸菌 BL21 (DE3)株と組み合わせて広く利用されています。BL21(DE3)のゲノムには T7 RNA ポリメラーゼ遺伝子が挿入されており、これは lacUV5 プロモーターの制御下にあります。 isopropyl-1-thio-β-Dgalactopyranoside (IPTG)の存在下で T7 RNA ポリメラーゼは発現し、pETUA の T7 プロモーターからの高レベルの転写を誘導します。弊社の取り扱う 6 種類の T7 発現ベクター中で、pETUA は毒性の無いタンパク質の高レベルでの発現に適しています。また、pETUA は大腸菌内で高いコピー数となるため、プラスミド精製に利点があります。

| プラスミドマップ:
Xba I 112
Nde I 151

1T7P

BamH I 237
Sma I 242
Kpn I 246
Sac I 252
EcoR I 258
Sal I 270
Hind III 276
Not I 283

6XHis

pUC Ori

T7Ter

pETUA
2741 bp

Amp

T7 promoter :T7 transcription start :His Tag :T7 terminator :pUC ori :Amp (bla) :

74-90
91
166-183359-406
1955-2574
940-1800| 再溶解 :pETUA 凍結乾燥品を 15 μｌの滅菌水で溶解してください。1 μg/µl プラスミド（1×TE バッファー）となります。

| T7 発現ベクターの特徴
弊社では 6 種類の T7 発現ベクターを取り扱っています。これのベクターは同じマルチクローニングサイトを持ち、それぞれ以下のような特徴を有しています:
コピー数レプリコン

耐性

用途

pETUA

高pUC

アンピシリン

毒性の無いタンパク質

pETBA

中

pMB1

アンピシリン

一般的な発現

pETIA

中

pMB1

アンピシリンlac リプレッサーによる厳密な制御

pETUK

高pUC

カナマイシン

毒性の無いタンパク質

pETBK

中

pMB1

カナマイシン

一般的な発現

pETIK

中

pMB1

カナマイシンlac リプレッサーによる厳密な制御

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使用方法| pETUA への遺伝子クローニング:
組み換えタンパク質を正しく発現させるために、目的の遺伝子を pETUA の N 末端ペプチドと同じフレームで繋ぐことが必要です。pETUA の開始コドンは下記マルチクローニングサイトで ATG で示されています。
pETUA を適切な制限酵素で完全に切断し、挿入遺伝子とのライゲーションに用いてください。使用する制限酵素が 1 つの場合、ベクターの脱リン酸化を推奨します。ライゲーションの方法については市販のライゲース等のプロトコルに従ってください。ライゲーション後の形質転換には発現用ではない大腸菌株(DH5α やJM109 等)を用いてください。得られたクローンはコロニーPCR、精製プラスミドの制限酵素処理等で遺伝子の挿入を確認してください。また、得られたプラスミドのシークエンス確認が推奨されます。
T7 promoter
XbaI
GATCCCGCGA AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACCAC AACGGTTTCC CTCTAGAAAT
AspProAlaL ysLeuIleAr gLeuThrIle GlyArgProG lnArgPhePr oSerArgAsn
NdeI
6×His
AATTTTGTTT AACTTTAAGA AGGAGATATA CATATGCGGG GTTCTCATCA TCATCATCAT
AsnPheVal* **Leu***Gl uGlyAspIle HisMetArgG lySerHisHi sHisHisHisEKBamHI
CATGGTATGG CTAGCATGAC TGGTGGACAG CAAATGGGTC GGGACGATGA CGATAAGGAT240
HisGlyMetA laSerMetTh rGlyGlyGln GlnMetGlyA rgAspAspAs pAspLysAspKpnIEcoRI
SalI
NotI
CCCCGGGTAC CGAGCTCGAA TTCGATTTCG TCGACAAGCT TAGCGGCCGC CGTTTAATCC
SmaI
SacI
HindIII
ProArgValP roSerSerAs nSerIleSer SerThrSerL euAlaAlaAl aVal***Ser120180300

EK: Enterokinase recognition sequence (AspAspAspAspLys↓)
ATG: start codon
TAA : stop codon| pETUA の配列
DNA 配列は弊社ウェブサイトで取得いただけます。

https://www.biodynamics.co.jp/products/ex-pack/2
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| 発現:
1. 形質転換で得られたコロニーを抗菌薬添加済みの LB 液体培地 3 ml に植菌し、37℃で一晩振とう。
2. 翌朝、0.5 ml の培養菌液を抗菌薬添加済みの 10 ml の LB 液体培地に加える。OD600 が 0.5 になるまで 37℃で振とう培養を行う*1, *2。
*1

約 2 時間での OD600 =0.5 となることが多いものの、培養時間は発現プラスミドに依存します。

*2

BL21(DE3)pLys 株を使用する場合、短時間の培養であればクロラムフェニコール添加の必要はありません。

3. OD600 が 0.5 に達したら、一部(例: 1 ml)を分取して遠心を行い、集菌し、解析を行うまで-80℃で保存する。
残りの菌体に IPTG を終濃度 1 mM になるように加え、37℃で 3 時間振とう培養する*。
*

IPTG 濃度と誘導時間は一般的な目安であり、目的タンパクによっては条件を最適化することをお勧めします。

4. 3 時間後、菌体回収前に発現を確認する。菌体の一部(例: 1 ml) を分取し、遠心して集菌する。

| 解析:
1. 菌体 (1 ml 培養液から集菌)を 200 µl の 1× PBS に懸濁する。
2. 一部 (例: 100 µl) を等量の 2 × SDS サンプルバッファーと混合する。
3. 85℃で 5 分間加熱した後、10,000 g で 10 分間遠心する。
4. 上清 (例: 5-25 µl)を SDS-PAGE で解析する*。
*

ウェスタンブロッティングも目的タンパク質の発現を解析する上で有用です。

• 2 × SDS sample buffer : 2% sodium dodecyl sulfate, 5% 2-mercaptoethanol, 20 % glycerol,0.02% BPB, 62.5 mM Tris-HCl, pH6.8• 1× PBS buffer.: 20 mM sodium phosphate, 150 mM sodium chloride, pH7.4

12345678pETUA によるタンパク質発現
44 KDa のタンパク質の遺伝子を pETUA にクローニングした。このプラスミドを用いて BL21(DE3)の形質転換を行い、コロニーを得た。6 つのコロニーから発現培養を行い、10 % ポリアクリルアミドゲル SDS 電気泳動に供した。

97 K
66 K
45 K

39 K
レーン 1: DynaMarker® Protein Eco ( #DM610)
レーン 2: 遺伝子を挿入していない pETＵA
レーン 3-8 : 遺伝子を挿入して得られたクローン 1-620 K

矢印: 発現した 44 kDa のタンパク質● 発現における注意点
1. T7 発現系は、強力な発現系であるため、IPTG 非誘導時でも低レベルの目的タンパク質の発現が起きます。この低レベルでの発現は、目的タンパク質が大腸菌に対して毒性を有する場合、問題となることがあります。その場合、非誘導時の発現を減らすために以下の方法が必要となることがあります。
a) pETUA, pETUK ではなく、コピー数の少ない pETBA, pETBK を使用する。
b) 厳密な発現の制御ができる pETIA, pETIK を使用する。
c) グルコース(0.5 – 1%)を含む液体培地や寒天培地を使用する*。
*
グルコースは lacUV5 プロモーターからの転写を低下させることが知られています 2)。

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d) BL21(DE3)株の代わりに、BL21(DE3)pLysS 株を使用する*。
*

pLysS プラスミドにコードされる T7 リゾチームは T7 RNA ポリメラーゼに結合し、不活性化します 3)。 これにより、目的タンパク質の非誘導時の発現が低下します。

2. 一晩培養した BL21(DE3)菌液(0.5 ml)を LB 液体培地(10 ml)に加えて培養した際、OD600 が 0.5 に達する迄に長時間(5 時間以上)を要する場合、目的のタンパク質が大腸菌に対して毒性を有する可能性があります。
3. BL21(DE3)菌体が IPTG による誘導後に溶ける場合、目的のタンパク質が大腸菌に対して毒性を有する可能性があります。

参考文献:
1) Studier, F.W. and Moffatt, B.A., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113–130.
2) Moffatt, B.A. and Studier, F.W., Cell 49 (1987) 221-227
3) Pan, S. and Malcom, B.A., BioTechniques 29 (2000), 1234–1238
一般的な参考文献
Sambrook, J. and Russell, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

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