計画研究：2000〜2004年度

細胞性粘菌のゲノム解析による細胞分化を制御する遺伝子システムの解明●漆原秀子1)◆田仲可昌1)◆森尾貴広1)

1)筑波大学大学院生命環境科学研究科◆前田ミネ子2)2) 大阪大学大学院理学研究科〈研究の目的と進め方〉
我々ヒトを始めとする高度に複雑化した生物は様々な器官や組織の集合として体が成り立っている。そのような多細胞体制の基本は、生殖細胞と体細胞とに構成細胞が「分化」することである。体細胞は自身のもつ遺伝情報を子孫に伝えることはできないが、その能力を持つ生殖細胞が機能を十分有効に発揮して同じ内容であるはずの遺伝情報をもつ子孫をつくることができるよう、サポート体制を構築している。この体細胞の分化によって個体の機能として高度化が達成されているのであり、細胞分化のしくみを理解することは生命現象の理解にとって非常に重要である。しかしながら、そのために高度に複雑化した生物を対象として研究するのは困難であり、同時にまた細胞分化の本質が捉えにくいと考えられる。
そこで本計画では、最もシンプルな細胞分化を示す系の一つとして、生活環に単細胞と多細胞の時期をもつ独特な生物である細胞性粘菌を使用し、細胞分化を制御する遺伝子ネットワークの解明に向けた研究を行うことを目的とした。細胞性粘菌は土壌中に生息する真核微生物である。通常は単細胞アメーバとしてバクテリアなどを捕食して分裂増殖しているが、餌を食べつくして飢餓状態になると約10万個の細胞が集合してナメクジ形の移動体と呼ばれる多細胞体を形成する。移動体は主として走行性によって移動するが、その中では将来胞子になる細胞（生殖細胞）と柄を形成する細胞（体細胞）が分化する。やがて地表に達すると、胞子塊とそれを持ち上げる柄からなる子実体を形成する（図１）。胞子は小動物の足などに付着して拡散し、餌が豊富な場所に移ることができた場合に発芽して増殖を再開する。飢餓の始まりから子実体が形成までは、生育に適した22℃で約24時間である。

細胞性粘菌は特徴的な生活環に加えて、実験室での培養と同調的発生の誘導が容易であること、形質転換をはじめとするほとんどの分子生物学的手法の適用が可能であること、ハプロイドで34Mbとコンパクトなゲノムを持っていることなどから、生化学的、遺伝学的解析に好都

合な材料として研究に用いられている。また、細胞運動のモデルとして、さらに最近では肺炎の原因となる
Legionella pneumophila菌の感染宿主となることなどから医学的研究にも利用されている。我々は、この生物の細胞分化がゲノムにどのようにプログラムされているかを知るために、まず細胞性粘菌のもつ遺伝子レパートリーを把握し、次いでそれらの遺伝子間の制御関係を解析する研究を行った。
〈研究開始時の研究計画〉
研究対象としては、細胞性粘菌の中でも国際的に最も多用されているキイロタマホコリカビ（Dictyostelium
discoideum）を中心材料とした。D. discoideumにおいては1999年度までのゲノム特定研究によって増殖期と移動体期のEST解析が展開されていた。本特定領域研究では、その成果を発展させながら、以下の項目について研究を進める計画とした。図２には各項目間の関係と研究の全体像を示している。

【１】cDNAリソースの整備：
上述したように、これまでに増殖期と発生期でcDNA
ライブラリーを作製し、ランダムに選んだクローンのEST解析によって約5,300の独立遺伝子を得ていた。しかしそれらは遺伝子の部分配列であり、配列情報の質としては低かった。また、当初遺伝子数は8,000〜10,000と予測されていたが、それを考慮すると未決定の遺伝子が多く残されていた。そこで、以下の方法によってD.
discoideumにおける遺伝子レパートリーに関する情報の質と量を高めることとした。
①オリゴキャップ法による完全長cDNAライブラリーを作製し、さらに多くの配列決定を行う②両端からの配列がマージしていない遺伝子については
内部配列の決定を行う。
③有性生殖期のcDNAライブラリーを作製し、配列決定
してより多くの新規遺伝子情報を得る。

− 97 −

④ゲノム配列決定を促進する。
【２】データベースの整備：
以上の配列データはこれまでに構築・維持している公開データベースであるDictyostelium cDNA Database (略称：Dicty̲cDB)に登録してすべて公開するとともに、以下のとおり付加価値を高める。これは我々自身の以後の配列解析に役立つものである。
①PHRAPプログラムによる再アセンブルを行い、独立遺伝子（cDNAコンティグ）セットをバージョンアップ
する②クローン及びcDNAコンティグにアノテーションを付してカタログ化する③ゲノム配列とのアラインメントを行い、エクソン・イ
ントロン構造とともに転写開始点を明確にする【３】遺伝子発現プロフィールの取得：
独立遺伝子セットから適当なクローンを選抜してスポットした5.3Kのマイクアレイを作製し、ホールマウント
イン・シチュハイブリダイゼーション（WISH）による空間的発現パターンの解析と組み合わせ、以下の項目に関する遺伝子発現プロフィールを取得・解析する。
①正常発生のタイムコースに伴うトランスクリプトーム
変化②脱分化過程のタイムコースに伴うトランスクリプトー
ム変化③細胞周期の位相特異的トランスクリプトームの把握④細胞種（予定胞子または予定柄細胞）特異的遺伝子の抽出と解析【４】転写因子の抽出とネットワーク解析：
遺伝子発現制御に中心的役割を果たすと期待される転写因子遺伝子に照準を当て、転写因子遺伝子（候補）を計
算機的に抽出し、遺伝子間相互作用を解析する。そのために以下の研究を行う。
①遺伝子破壊株を高効率で作製する方法の開発とその適用②遺伝子破壊株の表現型解析とマイクロアレイを用いた下流遺伝子の同定③定量PCRによる遺伝子発現タイムコースの取得とSsystemによるネットワークの推定④有性生殖期遺伝子の発現制御に関する研究【５】シス制御因子の抽出：
遺伝子の空間的・時間的発現を制御するのは遺伝子上流のプロモーター配列である。ゲノムとcDNA配列の情報が利用できるようになった段階で、上流配列内で中心的に作用するシス制御因子を以下のステップによって計算機的に抽出する。
①ゲノムとcDNA配列のアラインメントデータを利用し、遺伝子上流配列を取得してデータベース化する②遺伝子を空間的・時間的発現パターンによってグループ化する③発現グループに特徴的な上流配列中のエレメントを統計処理によって抽出する定を行った。
②cDNAコンティグの中で両端からの配列がマージしておらず、内部配列が不明なものについて、それぞれに適当なクローンを選抜し、プライマーウォーキングに
よって内部配列の決定を行った。
③P C R に よ る 増 幅 を 基 本 と し た S S H （ S u p p r e s s i v e
Subtractive Hybridizaation）法により、配偶子期の差
分化ライブラリーを作製し、各クローンの両端から配列決定を行った。この配列決定も国立遺伝学研究所小原雄治博士らとの共同研究である16。
以上の配列決定によって得られた配列データを表１にまとめて示す。

④cDNA解析がさきがけとなって1998年に欧米のコンソーシアムでD. discoideumのゲノム解析が開始されたが、この種特有の高(A+T)含率のためにアセンブルが難航していた。我々はcDNAのクローンならびにコン
ティグ情報をHAPPYマッピン
グのマーカーとして提供し、アセンブルに大いに貢献した。ゲノム解読は2005年に完了し、Nature誌に発表され、日本のcDNA解析チームも共
著者として加わった29）。ゲ
ノム解析により、以前から示唆されていた細胞性粘菌は真核生物の系統で植物が分岐した後、菌類が分岐する前に分岐したという系統関係がさらに支持された（図３）。しかし系統的には隔たっている
ものの、細胞性粘菌は酵母よりはヒトと構造的に類似の遺伝子をはるかに多くもつことも同時に明らかとなった。

〈研究期間の成果〉【１】cDNAリソースの整備13, 21 ：①増殖期、集合期、移動体期、形態形成期の４種類の発生段階についてオリゴキャップ法による完全長cDNA
ライブラリーを作製し、各クローンの両端から配列決− 98 −

その他、繰り返し構造からなる独特のテロメア構造の存在や非常に多くの遺伝子ファミリーを持つことなどの多くの興味深い性質が示された。また、予測遺伝子は上方修正され、12,500とされた。これはショウジョウバエの遺伝子数に近い大きな数である。多細胞化に必要な遺伝子を備えることによって遺伝子の総数が格段に増加していると考えられる。
【２】データベースの整備32：得られたcDNAの配列データはすべてほぼリアルタイ
ムでDicty̲cDBに登録し、公開した。また、研究計画に基づいて以下の整備を行った。
①新たな配列の登録を受けてPHRAPプログラムによるア
センブルをやりなおし、cDNAコンティグをバージョンアップした。最終版はVer 7.2で、シングルトンを含むPHRAP コンティグとして11,129本、リードペアによる調整後は8,402であり、Orphan contigを除外すると、最終的に独立遺伝子に対応するコンティグとしては
6,790という数値が得られた。これはゲノム配列からの予測遺伝子数12,500の約54.3%に相当する。残り45.7%は、ストレス条件下等、未解析の環境条件でのみ発現する
もの、発現レベルが極めて低いか発現しないものであると考えられる（図４）。

③cDNA配列とゲノム配列とのアラインメントには、エクソン抽出プログラムであるGeneSeqerを使用した。多重遺伝子の存在や繰り返し配列のために正確なアライン
メントが得られなかった遺伝子の例や、配列そのものがシングルパスで精度が低いためにイントロンが過剰に予測された例もあるが、約80%のコンティグについてアラ
インメントが得られた。これらの結果はDicty̲cDB中の、コンティグインデックスページからJavaアプレットとして表示される（図６）(http://dictycdb.biol.tsukuba.ac.jp/CSM̲Contig/）。

【３】遺伝子発現プロフィールの取得：①ゲノムに記された発生プログラムの全容を知るために、発生過程における遺伝子発現開始直後から２時間おきの細胞からmRNAを調製してマイクロアレイ解析を行い、個々の遺伝子発現パターン及び発生に伴うトランスクリプトームの変化を調べた。図７（上）に例示されているように、個々の遺伝子の発現パターンはいく
つかのグループに分けられる。図７（下）はそのような発現パターンで遺伝子をクラスタリングし、変化の大きい2,000遺伝子について示したものである。
②各クローンとコンティグについてカタログを作成し、公開した（http://dictycdb.biol.tsukuba.ac.jp/catalogue/Catalogue.html）。クローンの機能分類結果から、増殖期では基本代謝や翻訳関係の遺伝子が多く発現しているのに対し、発生期に入ると細胞間相互作用やシグナル伝達に関わる遺伝子が多く発現するようになることが明瞭に示された（図５）。

最も大規模な遺伝子発現変化は細胞の集合後に起きること、また細胞運命が決定される移動体期に次の大きな− 99 −

変化のあることが明らかとなった。増殖期から発生期に入ることによって発現する遺伝子群の大幅な入れ替えのあることがはっきりと示された10。発生開始に伴ってダウンレギュレートされる遺伝子は翻訳関連の遺伝子が、アップレギュレートされる遺伝子としてはタンパク質プ
分解、シグナル伝達、多細胞体形成関連遺伝子が多く含まれることがわかった。これらの結果は、図４に示した
機能カテゴリーごとのクローン出現頻度が増殖期と集合期で大きく変化するという結果によく一致している。
②次に、「脱分化」過程でのトランスクリプトーム変化を解析した。細胞性粘菌の移動体では前部の役20%を将来柄を形成する細胞が（予定柄細胞領域）、後部80%は将来胞子となる細胞が占める（予定胞子領域）という、明瞭なパターンが形成されている（図８．上）。しかし、発生の途中で人為的に移動体を切断すると、どの部分からも小さいながら正常な形の子実体が形成することが知られている（図８．右）。つまり、細胞が脱分化・再分化して分化した細胞の比率を調整するのである。これは、臓器再生のモデルと捉えることもできる興味深い現象である。

分制御系のヒスチジンキナーゼ遺伝子dhkA破壊株では脱分化が正常に進行しないことから、この遺伝子が脱分化の制御に関わっていることが示唆された。
③増殖期から発生期への移行が細胞周期のどの時点でおきるのかについて解析し細胞周期と遺伝子発現についての基本的知見を得るために、細胞周期の間での遺伝子変化を調べた。2種の異なった同調法(温度シフト法及び高細胞密度状態からの希釈法)によって細胞周期を同調させた細胞から、1時間毎にRNAサンプルを抽出した。細
胞性粘菌の増殖／分化の仮想的なチェックポイントであるPS点(G2後期)前後の細胞由来のRNAサンプルを用いたマイクロアレイ解析により、PS点付近で発現レベルが変動する遺伝子44種を同定した。また、PS点直前に飢餓処理を行い、分化過程を誘導した細胞を用いたアレイ解析
からPS点を超えて分化過程に進む際に発現レベルの変動する遺伝子92種を同定した。
④空間的遺伝子発現解析の強力なツールとなる移動体
期でのホールマウントイン・シチュハイブリダイゼーシ
ョン（WISH）の手法を確立し、マイクロアレイ結果と組み合わせて細胞タイプ特異的遺伝子の抽出を行い、特に予定柄細胞領域の詳細な部域化について解析した。これにより、予定柄細胞に特異的な遺伝子を新規に36種同定するとともに予定柄細胞領域にはこれまで考えられた以上の複雑なパターン形成のあることを明らかにした14（図10）。

この現象を遺伝子発現の点から解析するために、発生のいくつかの時期で細胞を機械的にばらばらにし、栄養条件において増殖期への「脱分化」を行わせ、その過程での遺伝子発現変化をマイクロアレイで解析した20（図９）。

また、54種類の予定胞子細胞特異的な新規遺伝子を同定し、それらを4種類の発現パターンに分類した（図11）。

その結果、どの時期から脱分化する場合でも、
i) もとの分状態を維持している時期、ii) 発現遺伝子が大きく変化する時期、iii) 増殖期の遺伝子発現プロフィールを示す時期、の3つの段階を経ることがわかった。発生がどの程度進行していたかによって変化するのは、ii)期の長さであった。
脱分化は単なる無秩序な崩壊の過程ではなく、ゲノムにプログラムされた過程であると考えられる。実際、二成− 100 −

WISHのイメージは、空間的発現データベース
として公開している33（図12）
。

ATLAS

また、36種の転写因子遺伝子について、定量PCRで解析し、6つの 発現パターンに分類した。遺伝子破壊株における発現パターンも追加して、S-システムによる遺伝
子ネットワークの推測を行った（図15）。

【４】転写因子の抽出とネットワーク解析：
Dicty̲cDB及びゲノム配列データベースから転写因子遺伝子（候補）約280種を抽出した。網羅的遺伝子破壊株作
製に不可欠の方法の効率化を検討し、酵母の系で考案されていた Fusion-PCR をもとにして、遺伝子破壊用コンストラクトをクローニングを経ることなしに迅速に構築する方法を開発した9, 11。
転写因子（候補）遺伝子の破壊を試み、18種について成功した。これらの破壊株のうち、形態形成運動に顕著な異常を示すGATA型Znフィンガー転写因子遺伝子amvA（図13・14）破壊株のマイクロアレイ解析により、発現パ
ターンが変化した137種の遺伝子を同定した。Homeoboxと7つのAnkyrin repeatsを持つ転写因子Wariai遺伝子の破壊株についても、発現が減少する13遺伝子、増加する8遺伝子を同定した。

配偶子で発現が誘導される遺伝子については多くの破壊株やRNAi株の単離に成功した。その中には、交配型特異的な発現を示し、細胞間相互作用に影響する遺伝子
gmsA、細胞接着性の制御に関わることが示されたracF2などがある。また、細胞性粘菌の発生で中心的役割を果
たすcAMPシグナル伝達経路の新たな、かつ有性生殖期
特異的制御因子をコードするtmcBなどが含まれ、発生様式に共通したシステムを利用しながら、制御様式で微調整をする興味深い実態などが明らかにされた。

− 101 −

【５】シス因子制御の抽出27：
遺伝子発現制御の実際が明らかになるにつれ、細胞分化に関わるゲノム上の制御領域を知る必要が高まってくる。そこで、ゲノムワイドに転写のシス制御因子を抽出する計算機プログラムを開発し、実行した。
まずゲノムとcDNAコンティグのアラインメントによって転写開始点の上流200塩基から下流100延期までの配列を取得し、上流配列としてデータベース化した（図16）。
このデータベースはGUIを備えたWebページを提供し、SOAPに基づいた解析プログラムとのインターフェイス
を備えている。

次にランダムに生成した4から20までの塩基配列を候補配列としてそのそれぞれと上流配列とをダイナミックプ
ログラミングでアラインメントし、高いスコアを得たものについて発現パターンによるグループに特徴的であるかどうかを統計処理で評価した。この過程は非常に多くの計算が必要なため、計算機ネットワークを構築して分散を行った（図17）。

まず、最初にゲノム情報が公開された２番染色体についてこのプログラムを実行したところ、表２に示すシス
制御因子候補の結果が得られた。このうち、S期に特徴的として抽出された配列は既知のシス因子であった。このことは、他の抽出された配列が実際にシス因子として機能している可能性が高いと期待される。

研究計画に対応させて記述した成果以外にも、個別遺伝子の解析等を中心として、末尾に記載した多くの研究成果をあげることができた。なお、全体のまとめを
Humana Pressか ら 近 々 出 版 さ れ る Methods in
Enzymologyに掲載できたことは意義深い34。
〈国内外での成果の位置づけ〉
どの生物種においても同様であるが、研究者コミュニティにとってゲノムの解析結果はまたとない有用な情報である。配列情報のみでなく、遺伝子のクローンが手に入るのであればその価値は計り知れない。一方それを生み出すための労力・経費・時間は到底個々の研究者が立ち向かえるものではない。細胞性粘菌研究者コミュニテ
ィにおいてもその認識は深刻であった。1995年の細胞性粘菌国際会議の場で日本がそれに取組んで欲しいと要請された時点でどれだけの勝算があったかは顧みるのも恐ろしいほどであるが、とにかく日本の研究者が総力を挙げて何らかの努力をすることになった。それがDictyostelium cDNAプロジェクトの開始であるが、２期にわたるゲノム特定その他の支援、とりわけ今期の「ゲノム生物学」特定領域の支援によって多大な成果をあげることができことは内外の大きな賞賛を得ているところである。
最も高く評価されたのはcDNAリソースの整備であろう。当該リソースのデータベース"Dicty̲cDB"では、ほとんどリアルタイムで配列データを公開し、各国からのクローン請求に応じてきた。
（http://dictycdb.biol.tsukuba.ac.jp/cDNA/req̲clones.html）
データベースには年間約６０万件のアクセスがあり、送付したクローンは2000件を超えている。細胞性粘菌研
究者以外からも利用が高い。未発表データのウエブ公開に対しては議論のあるところではあるが、細胞性粘菌研
究者のコミュニティではこの姿勢はきわめて高く評価されている。投稿論文のレフェリーコメント冒頭に「この著者たちはcDNAデータを早くから公開し国際的な、研究の進展に大きく貢献してきた。」と、まず謝辞が述べられるほどである。これにならって、３年送れてスタート
したゲノム解析コンソーシアムもデータを定期的にリリースし、研究者の利用に供する形となった。
次に大きく評価されているのが、ゲノム解析のさきがけとなった点である。上述のようにD. discoideumのゲノ
ムはA,Tの含量が80%と高く、ゲノム解読を躊躇させるのに十分であった。そのような状況で、まずcDNAの大規模解析が立ち上がり、成功裡に進んでいることがコンソーシアム立ち上げの後押しとなったのである。このような経緯から、cDNA解析による日本の貢献はゲノム解析のグループはもとより、全くゲノム解析にかかわりのな
い研究者からも広く認められるところとなっている。
cDNAリソースは単に個別クローンの提供にとどまらず、DNAマイクロアレイの作製、発現プロフィールの解
析結果の発表で、さらに大きな成果となった。DNAマイ
クロアレイに使用するPCR増幅のクローンセットは共同研究という形で配布したが、これは９件を数えており、
現在までに４報の論文となっている。最近になってサン
ガーセンターがゲノムから予測した遺伝子配列のオリゴ
DNAをスポットしたアレイを作製して共同研究を受け入れるようになったことから、アレイに関しては日本の役
割はひとまず終了した感があるが、従来リソースに関して本質的に欧米依存的であった日本の細胞性粘菌研究者
が国際的にこれだけ大きく貢献できるようになったのが− 102 −

cDNA解析によるものであるということは、これまでが問題であったとはいえ、国内的には最も大きく評価されても良いのではなかろうか。
解析結果としての評価が高いのは発生期のマイクロア
レイ解析、WISHによる詳細なパターン解析などである。
これらは大規模なcDNA解析がなければなし得なかったことである。上流配列の解析はcDNAとゲノムの両方が揃って始めて可能になるものであり、ゲノム解析グルー
プから期待が寄せられている。細胞性粘菌ではdictybaseという統合データベースがあり、そこにはゲノム配列もcDNA配列も投入されてアラインメントが行われている。
キュレーターによる作業は10%程度しか完了していないが、我々はGeneSeqer結果をもとにして独自の検討を進めており、その結果も期待されている。
このように、本特定領域の支援を受けた細胞性粘菌
cDNA、ゲノムの解析は国際的に極めて有意義なものであり、わが国の科学的、政治的立場を著しく高めるものとなったことは誰の目にも明らかである。

〈達成できなかったこと、予想外の困難、その理由〉（１）単離できなかった遺伝子：
先に述べたように、cDNA配列のアセンブルによって得た独立遺伝子は6,790で、予測遺伝子の54.3%である。
これをどのように評価すべきであろうか。完全長cDNA以前の段階で、26,954のESTから5,381の独立遺伝子が得られていた。その５倍近くにもなる13万以上の配列を追加して、新たに得られた遺伝子は1,400であった。考えられる理由はいくつかあるが、第１はcDNAのすさまじい重複である。たとえば、伸長因子遺伝子は、実に5,000近くのクローンが得られている。この高発現遺伝子に関しては当初かなり危惧しており、実際にコロニーハイブリ
ダイゼーションを行って高頻度出現遺伝子のクローンを配列決定から除外したライブラリーもある。しかしその煩わしさと労力を考えると、高々数パーセントのクローンであればランダムに配列決定するほうが効率的という結論になった。完全長cDNAの場合には逆転写がmRNAの5'端まで到達したものに限られることとなり、必然的に短いcDNAへのバイアスがかかることになるのであろう。この点、差分化ライブラリーでの新規遺伝子発見効率は高かった。これは次に述べる生育条件の差にも関わることではあるが、同じ時期の細胞から作製した通常のライブラリーに比較すると重複率はきわめて低かった。
第二の理由は我々が対照としなかった環境条件下で発現する遺伝子の存在である。単細胞生物はダイナミックに変化する野外の環境条件に対応できる必要があり、温度、浸透圧、pH、他生物の存在等、さまざまなストレスに対応する遺伝子発現を行っていると考えられる。さらに、ほとんど発現「しない」遺伝子も予測の中には含まれているはずである。また、予測ミスに対して、cDNAのアセンブルミスも存在すると考えられる。多くのメンバーを持つ遺伝子ファミリーがどの程度正しく仕分けられているかは今後の解析に待たねばならない。
（２）不十分だった転写因子遺伝子の解析：
この特定領域研究５年間の後半では転写因子に照準を合わせて遺伝子ネットワークを解析することにした。そのために転写因子破壊株を網羅的に作製し、発現が変化する下流遺伝子をマイクロアレイ解析でリストアップすることにより転写制御ネットワークを明らかにする、というのが筋書きであった。しかしながら、残念なことに転写因子破壊株の作製は成功率が悪く、得られた破壊株でも目立った表現型の変化がないためにアレイ解析に踏み切れないものが多い、という状況となった。破壊コン
ストラクトの作製そのものは効率よくできるのであるが、やはり細胞性粘菌の形質転換効率の低さが律速となった。
それでも他の遺伝子破壊株作製に比べて一段と効率が悪かったので、転写因子候補の抽出には、たとえば「DNA結合領域をもつ」というような性質を考慮に入れるが、そのような選抜によって生存に関わっているものが多く含まれたためという可能性も考えられる。
一方で、ゲノム解析結果はD. discoideumには転写因子が比較的少ないということを示唆した。遺伝子ネットワークを把握するために「転写因子を中心に解析を進める」という戦略が目的達成のために結果的には適当でなかったとかもしれない。
（３）もちこされた計算機予測の正否判定：
上流配列からのシス因子抽出は「正解」が得られているという事実から、十分使用に耐えると期待される。しかし、我々の目的は「使えるプログラムの作成」までではなく、それを実行して実際に遺伝子ネットワークを明らかにすることである。その点で、得られた結果の検証と、全データを投入しての予測まで及ばなかったことは残念である。この作業が５年間の４年目に開始されたこと、インフォマティクスに携わる人員の少なかったことが敗因である。さらに付け加えるなら、ゲノムとcDNAのアラインメントがGeneSeqerで成功しなかったものについて別プログラム（Sim4など）の利用を始めたことなども直線的に作業が進行することの妨げとなった。
いまひとつの計算機による解析である、発現パターンからのネットワーク予測についても同様である。こちらは予測の正否を知るために遺伝子破壊株を作製して正確な遺伝
子発現パターンを取得するという作業が必要であるが、やはりそこまで手が回らなかったという結論である。
おしなべた自己評価および反省としては、遺伝子リソースの整備はかなり成果をあげることができたといえる。
しかし、それを用いた解析については手を広げすぎた傾向があり、結局はっきりとした結論が得られないまま今後の課題として残すものが多くなってしまったというところであろうか。
〈今後の課題〉
前の項目で述べた不本意な部分に関してはすべて今後の課題となるわけであるが、そのなかでも、「これは何としても達成されるべきである」、あるいは「これに取り組
むと今後の展望が開ける」というものに絞って整理してみたい。
（１）遺伝子レパートリーの精密検討からユニ・ジーンセ
ットへ：
cDNAクローンをこれ以上ふやすのではなく、ゲノムからの予測遺伝子とcDNAとを精密に対応させることによって遺伝子レパートリーを完全に把握する必要がある。
ゲノム解析の終わった今、遺伝子予測のエラー、cDNA
アセンブルのエラーを修正する作業そのものは一見生産的でないようにも思えるが、その過程に含まれるcDNA
クローンの精密な検討によって、アンチセンスとしては
たらくRNAや非コードRNAが炙り出されてくることを期待している。また、cDNAの独立遺伝子セットを確定して各々のベストローンを選抜し、ユニ・ジーンセットの− 103 −

ライブラリーを構築することは今後細胞性粘菌を材料とする研究にさらなる有効なリソースとして貢献するはずである。言わずもがなではあるが、ゲノム解析はゲノム解読の出発点である。今後は以下に信頼できる情報を抽出し、リソースを有効に利用するかということがゲノム解析に関わった研究者に課せられていると考えている。
（２）全遺伝子アレイの作製：
cDNAをスポットしたマイクロアレイは、発生過程や脱分化過程での遺伝子発現プロフィールの解析に実際に大きな成果をあげた。しかしながら、我々の使用したアレイは二つの問題があった。cDNAクローンのインサー
ト全長をPCR増幅したものがスポットされているため、どうしてもバックグラウンドが高くなること、全遺伝子がスポットされていないこと、の２点である。サンガーセンターが全予測遺伝子のオリゴDNAをスポットしたアレイを作製し、共同研究体制を可能にしている。実際に我々は現在cDNA解析が少ない有性生殖期遺伝子を同定するために共同研究を行なっている。しか、共同研究に
は実験範囲やスピードの問題で限界があるため、やはり日本で同等かあるいはそれ以上のアレイを作製することが強く望まれる。
（３）有効な遺伝子機能解析系の開発：
転写因子（候補）遺伝子解析の箇所で言及したが、「ハイスループットで」 「ゲノムワイドな」 「ポストゲノム解析」を行うために不可欠の遺伝子破壊株作製が、現状では十分な効率で実現しない。細胞性粘菌を形質転換し、形質転換体を選抜する過程が問題である。画期的な方法でその効率を高めるか、あるいは細胞性粘菌細胞を経ないで、たとえばin vitroで機能を解析できる実験系の開発が火急の課題である。
（４）インフォマティクスとの有機的結合：
ゲノム解析のように大量の情報が相手となる領域では情報学の手法がどうしても必要となる。ゲノム特定領域でも多くのシンフォマティクス系の研究者が参加し、我々の学系拡販でも研究者として採用した。また、海外との共同研究も行っている。その経験と反省から、何度も言われていることであるが、彼らとのさらに有機的な結合が必要であると実感している。これは人材育成を含めた双方向からの歩み寄り以外に解決策はないのであろうが。
最後に、我々の計画研究はゲノム特定領域の中での共同研究、総括班による支援によって初めて可能になったので、ここに特筆しておきたい。
塩基配列決定：国立遺伝学研究所小原雄治博士のグループ
完全長ライブラリーの作製：
東京大学医科学研究所菅野純夫博士のグループ
DNAマイクロアレイの作製：
九州大学久原哲博士のグループ〈研究期間の全成果公表リスト〉
１）論文
1. 0602072148
Saito, T., Morio, T., and Ochiai, H.,, A second functionaldelta-5 fatty acid desaturase in the cellular slime mold
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2. 0202111636
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3. 0202111643
Maeda, M., Kuwayama, H., Yokoyama, M., Nishino, K.,
Morio, T., Urushihara, H., Katoh, M., Tanaka, Y., Saito,
T., Ochiai, H., Takemoto, K., Yasukawa, H., andTakeuchi, I. Developmental changes in the spatial
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4. 0302221450
Bogdanovic, A., Bruckert, F., Morio, T., and Satre, M. A
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5. 0030222151
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