第 16 回日本再生医療学会総会
味の素株式会社 ランチョンセミナー
日時：2017 年 3 月 8 日（水）会場：仙台国際センター 会議棟 2 階 萩

再生医療の新たな培養法の展開
再生医療の早期実現のためには培養技術の進歩が必要不可欠である。

本 セ ミ ナ ー で は 、i P S 細 胞 の 培 養 技 術 の最新事例を紹介する。

演題①

演題②

応用に向けたiPS細胞の培養法の開発

多能性幹細胞の分化制御における培地組成の重要性〜メチオニン除去培地を利用した分化制御〜

京都大学 iPS細胞研究所
未来生命科学開拓部門

中川誠人 先生

東京工業大学 生命理工学院
生命理工学系

粂昭苑 先生座長

大阪大学大学院工学研究科
生命先端工学専攻

紀ノ岡正博 先生

応用に向けた iPS 細胞の培養法の開発
京都大学 iPS 細胞研究所 未来生命科学開拓部門

中川誠人 先生

iPS 細胞は血液細胞や線維芽細胞などの体細胞に初期化因子を導入することで容易に樹立することができるようになった。それらの iPS 細胞は試験管の中でいろいろな体細胞に分化することができるため、そのような技術を活用した臨床応用が進みつつある（図１）。
iPS 細胞から目的の細胞・組織を作り出し、患者に移植することで治療が可能になると考えられる。
本発表では iPS 細胞の応用に向けて、我々が取り組んできた培養法の開発のアップデートに関して報告する。

臨床応用可能なフィーダーフリー培養の開発

量は小さく、精製後の収量も非常に高く、臨床応用するのに適していた。実際にこの E8 フラグメントを iPS 細胞の培養に使用すると非常にフィーダー細胞を使用した conventional な iPS 細胞の培養法につい有 効 で あ る こ と が 確 認 さ れ た。そ し て 現 在、こ の フ ラ グ メ ン ト はて説明する。フィーダー細胞と iPS 細胞を共培養することで、iPS 細胞

iMatrix-511 という製品として販売されている（医療応用可能な臨床グは元気に育つことができる。iPS 細胞を継代する際は、フィーダー細胞

レードの iMatrix-511MG も販売されている）。

を取り除き、iPS 細胞のコロニーを細かく砕き、それらをまた新しい続いて培地の開発について説明する。当初、E8 フラグメントと市販

フィーダー細胞と共培養し、この操作を繰り返すことで細胞を増やしの培地で培養を試みたが、細胞の状態があまり良くなかったため、培地ていくことができる。ただ、このフィーダー法を臨床応用するには、も一から開発する必要があると考え、味の素と共同研究を進めてきた。

多くのハードルを越えなければならない。そこで我々は、解決しなけ

その結果完成したのが、StemFit® 培地であり、我々は主に StemFit®

ればならない課題として、まずはフィーダー細胞を使用せず、コー

AK03N を使用している。AK03N は、生物由来原料を含まない安全性ティング材で代替する方法が良いと考えた。さらに培地の中に動物由来の高い培地である。一から組成検討をし、299 番目の候補培地が現在の成分（FBS など）を含まないものが必要であると考えた。これら 2 点に関StemFit® 培 地 の 組 成 の ベ ー ス と な っ て い る。iMatrix-511 として開発を進めてきたので紹介する。

StemFit® 培地の組み合わせは、iPS 細胞や ES 細胞などのヒト多能性幹細胞の培養に非常に適した培養系である 2)。

まずはコーティング材の開発について説明する。開発当初、すでにヒト ES/iPS 細胞の接着培養に関して、ヒト ES/ iPS 細胞は接着分子でフィーダーフリー培養法の有用性あるα6β1 インテグリンを発現し、細胞外基質であるラミニン 511 に結合することは、海外のグループより報告されていた 1）。そこで我々はこのラミニン 511 に着目し、フィーダーフリー培養に取り込もうと考

このフィーダーフリー培養法の大きな特徴はシングルセル培養が可能えた。ラミニンはα, β, γの 3 つのペプチド鎖が絡まり合って一つのなことである。iPS 細胞を iMatrix-511 でコートしたプレートにシング構造体を形成している。ラミニン全長だと分子量が 800 kDa と非常にルセルで播種したものを、Time-lapse 顕微鏡（BioStation CT、ニコ大きなタンパクであるため、精製度が低くなり臨床応用の課題となる。

ン）でイメージング観察すると、シングルセルから分裂を繰り返し、一一方、大阪大学の関口先生は、ラミニン 511 のインテグリン結合ドメ週間後には大きなコロニーが形成されることが観察できた。従来のオンイン（ラミニン 511-E8 フラグメント）のみを組み換えタンパク質としてフィーダー培養法（SNL 法）とフィーダーフリー培養法（Ff 法）の比較を発現し精製する技術を既に確立されていたため、我々は関口先生に共同

行 う と、Ff 法 の 場 合 は 支 持 細 胞 の 代 わ り に iMatrix-511 を、培 地 は研究を申し込み、このフラグメントを使用し iPS 細胞の維持培養ができStemFit® 培地を使用し、播種に関しては、SNL 法ではコロニーを小さないかと検討を始めた。この E8 フラグメントは 150 kDa と比較的分子めの塊に砕いて播種するのに対し、Ff 法ではシングルセルにし、細胞数をカウントすることで一定数の細胞を播種することができる。継代率

図1に関しては、SNL 法では 1：3 〜 1：5 程度であったが、Ff 法では 1：1

iPS細胞技術の応用00 まで培養効率を上げることに成功した。培地交換に関しては、SNL

例えば RNA-seq 等の場合にも、Ff 法でサンプル調製することで綺麗な応じて 6 日間で継代する等調整し、問題なく安定した培養を行うことがデータが得られることが期待できる（図２）。

できている。
上記事項は、非常に細かい改良ではあるが、このような検討を積み重フィーダーフリー培養法の改良ねることでより安定した iPS 細胞の培養が実現できていると考えている。

基本的な培養法のプロトコールは、CiRA や我々の研究室のホームページにおいても公開しているが、現在はより均質で良質な iPS 細胞の続いて、iMatrix-511 のコーティングに関する検討を報告する。現在、培養法の開発を目指し、培養法の改良検討を実施している。

iPS 細胞の継代において、iMatrix-511 は継代を始める前に、プレート我々が実施している Ff 法では、iPS 細胞を継代する際に、まずコロニーに 1 時間以上コーティングする方法（pre-coating method、プレコーを TrypLETM Select で処理し、細胞間接着をメインに剥がす。この時ト法）で実施しているが、最近、京都大学 ウイルス・再生医科学研究所

点で iPS 細胞は iMatrix-511 と接着したままであるため、さらにスク胚性幹細胞分野の宮崎先生より、プレコートをせずに、iPS 細胞を播種レーパーで剥がし取り、ピペッティングすることでシングルセルにすする際に培地中に iMatrix-511 と Y を添加し播種すると（mix method,ることができる。このシングルセルになった細胞を、新しく iMatrix-mix 法）、培養が上手くいくという内容の報告があった 3)。我々もこの511 をコートしたプレートに播種することで、またコロニーを得ることmix 法の検討を実施したので報告する。上記論文では、この mix 法を実ができ、細胞の拡大培養が可能となっている。現在公開している培養施すると、使用する iMatrix-511 を減量できるという内容であったた

法では、TrypLETM Select の処理時間は 4 分間実施することになっていめ、我々も、iMatrix-511 を通常量（×1）から、1/2, 1/4, 1/8, 1/16 とるが、検討を進めた結果、もう少し延長して処理した方が、細胞生存減量し培養を試みた。通常のプレコート法の培養時とコロニー形態を率が高く、最終的に得られる細胞数も多いことが明らかとなり、現在比較すると、mix 法の iMatrix-511 を通常量（×1）
では、コロニーの輪

我々のラボでは 10 分間（クローンによる多少の差あり）処理することで、郭がはっきりし、コロコロとしたコンパクトなコロニーが形成される安定した培養が可能となっている。

こと、また mix 法の 1/2 使用量の場合、プレコート法と同じようなコ２点目のポイントとしては、シングルセルで播種する際には、ROCKロニー形態を示すことが明らかとなった。以前の検討より、プレコー

inhibitor である Y-27632（以下、Y）を培養液中に添加する必要がある

ト法において iMatrix-511 の使用量を多くした場合、コロニーがコンパが、その処理時間の検討を実施した。公開しているプロトコールでは、クトに形成され、細胞もあまり増えないということが分かっていたた

over night での処理というアバウトな記載がされているが、最適な処

め、今回の mix 法の検討結果においては、iMatrix-511 の通常量（×1）

理時間を検討した結果、播種後 24 時間は必ず Y の処理を行うというこの使用は過剰であり、通常の半分の使用量に減らすことで、プレコーと、また播種後 48 時間以内には Y を除去し、新しい Y の入っていないト法と同様の培養ができるのではないかと考えている。さらに減量しStemFit® 培地に置換するのが最も良い条件ということが明らかとなった 1/4, 1/8, 1/16 使用量に関しては、丸いコロニーが形成されず、明ている。それ以上 Y の処理時間を延長すると、細胞生存率が低下し、未らかにラミニンの量が不足していることが分かった。

分化マーカーの発現が低下することが確認されている。
3 点目のポイントとしては、シングルセルで播種してからコロニーを形培養法の改良のアップデートとしては、以下 3 点が挙げられる。

成し継代するまでの培養期間に関して、プロトコールでは 8±1 日とい

1) TrypLETM Select の処理時間は 4 分間より延長し 10 分間程度処理すう間隔で継代するよう記載があるが、最適な培養期間に関して検討をる（クローンによっては剥がれ易いものもあり、観察しながら処理時間を調整する必要がある）。

実施したので報告する。具体的には、ヒト iPS 細胞である 201B7 と Ff

2) シングルセルで播種する場合の Y の処理時間に関しては、播種後 24法で培養した iPS 細胞 2 種を使用し、培養期間を 5 日間から 9 日間まで時間は必ず処理し、48 時間までに除去する。

ふり、各日数における未分化マーカー TRA-1-60 陽性細胞の割合を測定 し た。そ の 結 果、TRA-1-60 陽 性 細 胞 の 割 合 は 播 種 後 6, 7 日 目 を3) 継代期間は 7 日間がベストと考えられる。加えて、iMatrix-511 のピークに、培養日数の延長とともに低下することが明らかとなった。

コーティングに関しては、現在はまだプレコート法で実施している

この結果を受け、我々は基本的には 7 日間の培養期間で実施し、必要にが、mix 法においても安定した培養が可能と考えられるため、更なる条件検討を実施し問題が無いようであれば、新たな Ff 法として報図2

告できればと考えている。

新たに開発した臨床グレードのiPS細胞の培養方法

法 は ほ ぼ 毎 日 実 施 す る の に 対 し、Ff 法 で は 2 日 お き に 実 施 し、【参考文献】

Weekend-free 培養が可能となった。Ff 法の凍結法に関しては、市販

1）Rodin S, et al. Nat Biotechnol. 2010; 28(6): 611-5

品の STEM-CELLBANKER® を使用し、緩慢法（-80℃）で凍結するこ

2) Nakagawa M, et al. Sci. Rep. 2014; Jan 8(4): 3594とで、質の高いストックを作製可能であることが確認できている。ま3) Miyazaki T, et al. Sci Rep. 2017; Jan 30(7): 41165

た、こ の iMatrix-511 と StemFit®AK03N は、PMDA（独 立 行 政 法 人
医薬品医療機器総合機構）から臨床応用可能なものとして同意を得られていることも重要なポイントである。実際に、この Ff 法は CiRA で実施している iPS 細胞のストックプロジェクトにおいて採用されている。
また、本培養法は、臨床応用だけではなく基礎研究においても有用であると考えている。例えば、この培養法でゲノム編集を行う場合、シングルセルクローニングを容易に実施することが可能となっているため、より効率的に目的の細胞を取得することができると考えられる。その他、SNL 法で使用するマウスのフィーダー細胞の混入を避けたい実験系、

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多能性幹細胞の分化制御における培地組成の重要性〜メチオニン除去培地を利用した分化制御〜
東京工業大学 生命理工学院 生命理工学系

粂昭苑 先生多能性幹細胞の分化における培地の重要性に関して発表する。当研究室では
iPS 細胞から主に消化器官への分化誘導を行っており、細胞移植治療あるいは創薬への応用を目指している。これまで分化誘導における、足場や増殖因子などの培養環境に関する検討を重ねてきた。
本日は、培養環境の中でも培地における分化制御という点に関して発表する。
皆さんもご経験があるかもしれないが、iPS 細胞を分化誘導する

さらに肝臓への分化誘導を行うと、アルブミン陽性細胞ならびにア際、細胞株によって分化が進みやすい株や、未分化細胞が残存しやルブミン分泌量が増加することが認められる。一方、膵臓方向に分すい株があり、分化効率が変わってくる。そういう問題点を解決し化誘導をかけると、PDX-1 の発現が増加し、膵臓への分化効率の向たい、というところから研究が始まった。残存した未分化細胞を除上が認められた。

去できないかということで、いろいろな検討をしたところ、以下のここまでは、分化誘導途中での Met 要求性を検討した結果である

論文に出会った 1）。マウス ES 細胞におけるアミノ酸の依存性を検討が、以降は、未分化細胞のおける Met 要求性を未分化細胞に焦点をした論文である。それぞれアミノ酸を一つずつ除いた培地で、細胞当て、検討したので報告する。具体的には、ES 細胞・iPS 細胞に対を培養した際、スレオニンを除いたときにマウスの ES 細胞は生存でして、9 種類の必須アミノ酸を一つずつ除去した培地を用いて検討きないということを示している。その考察としては、スレオニンデを実施した。その結果、Met 除去培地で培養した条件下において、ヒドロゲナーゼ（TDH）という酵素を ES 細胞は高発現しており、スどの ES 細胞もしくは iPS 細胞においても、未分化細胞がきれいに死レオニン代謝への依存度が高いと考えられている。一方ヒトの細胞滅することが明らかとなった。これらの実験は除去培地を 2 日間処

では、TDH は pseudogene（偽遺伝子）である点から、マウスとは異理した実験であり、さらに処理時間の検討を細かく行った結果、処なる挙動を示すだろうと考え、ヒトにおける検討を実施した。

理時間 5 時間と非常に速い段階において、既に未分化細胞の増殖は我々も 20 種類のアミノ酸を一つずつ除いた培地を調製し、それら低下し、処理時間 1 日となるとアポトーシスを起こした細胞が有意の培地を、分化誘導の途中で使用し、アミノ酸の要求性を検討した。に増加することが明らかとなった（図１）。さらに処理 5 時間の時点

その結果、非常に興味深いことに、メチオニン（Met）を除去した際における代謝物の解析を実施した。先述の通り、SAM はメチル基ドに、他のアミノ酸除去培地と異なる挙動を示すことが明らかとなっナーとして、体内で起こる全てのメチル化に関与している重要な代た。Met は、含硫アミノ酸でメチル基を有し、S- アデノシルメチオ謝物であるが、処理 5 時間の時点で、すでに SAM の濃度が低下してニン（SAM）を介したメチル基のドナーとして非常に有名である。検いることが明らかとなった。しかしながら、細胞自身がそれを素早討の結果、他のアミノ酸除去培地の群に比べ、Met 除去培地におい

図1て、OCT3/4 陽性細胞が選択的に死滅すること、内胚葉マーカーである SOX17 の発現が変化しないこと、Met 濃度依存的にこの現象

メチオニン除去：5時間で細胞増殖抑制
24時間で細胞死が始まる

く感知し、合成酵素を up-regulation することで、SAM の量が回復

図2

す る。サ ル ベ ー ジ 回 路（MTA 回 路）が 発 動 さ れ る こ と で、Met やSAM の量が回復するという co-response が起こり、2 日間継続して代謝物において細胞死をレスキューできるのか検証した結果、Metや SAM の添加により、細胞死がレスキューされること、また MTA（5'-methylthioadenosine、サルベージ回路中の代謝物）やホモシステインの添加によっても、部分的ではあるがレスキューされることが明らかとなった。
続いて、Met と SAM のどちらが重要なのかという検討を実施した。MAT2A/2B のノックダウンを行うことで細胞死を再現できる
こ と、そ し て シ ク ロ ロ イ シ ン と い う MAT 阻 害 剤 の 添 加 に よ り、Met 量を変えずに SAM だけを低下した場合においても、細胞死を再現できるということから、SAM が非常に重要であると考えてい分化誘導法 3）に sphere 培養にて分化誘導を行う方法 4）を組み合わせる。て、Met 除去培地の効果を検討した。その結果、初期の分化誘導に次に細胞内ではどのような現象が起こっているのかを検討した。

おいては、分化誘導効率に大きな影響を与えなかったが、後期におMet 除去 5 時間の処理における遺伝子発現プロファイルを解析した

いては Met 除去群において、INSULIN 陽性細胞が増え、さらには結 果、Met 除 去 し た 場 合、他 の ア ミ ノ 酸 除 去 群 に 比 べ、発 現 が糖応答性の Insulin 分泌が亢進されることが示された。これらの結果UP/DOWN する遺伝子が非常に多いことが明らかとなった（図２）。

より、Met 除去培地の処理により、膵β細胞への分化誘導効率が向そ の 中 で、と く に 細 胞 周 期・細 胞 死・p53 関 連 の 遺 伝 子 が 多 く上することが示唆された。

up-regulate されているということ、しかしながら p53 は転写レベ

また、分化誘導の各 step における、遺伝子発現解析の結果、対照

ルではそれほど大きな変化が無かったということから、p53 につい（完全培地）群に比べ Met 除去培地群において、分化誘導後期において詳しく調べたところ、p53 が安定化されていることが明らかとなて大きく発現変動する遺伝子が多く、そのメカニズムに関しては、った。p53 は Met 濃度依存的に発現量が安定化され、これらの結果おそらく先述の H3K4me3 の発現減少が関与していると考えていは細胞死と関連性があるということから、p53 のノックダウン実験

る。

を行ったところ、細胞死の部分的なレスキューが認められた。これ

以上の結果をまとめると、Met 除去することによって、分化促らの結果より、p53 の up-regulation は細胞死を惹起しているとい

進やエピゲノム、代謝物の変化を起こし、このような変化が多能性うことが説明できると考えている。

維持や分化制御に影響を与えていると考えている。

他の変化としては、未分化マーカーである NANOG も 5 時間の処

最後に、Met 除去培地に関しては、既に多くの先生方からご関心理で down-regulation されること、未分化維持 / 分化に関与する頂けているが、もしご興味があれば当研究室にご連絡いただければ、H3K4me3 に関しても発現が激減していることが示された。これら

当研究室より配布することが可能である。の結果から、未分化細胞の多能性維持が crisis を起こし、分化刺激【参考文献】に対して感受性が高まっているのではないかと考えられる。これを

1）Wang J, et al. Science, 2009; 325(5939): 435-9

証明するために、短時間の Met 除去の条件下（10 時間処理）で、複数

2）Shiraki N, et al. Cell Metab. 2014; 19(5): 780-94
3）Shahyalal HM, et al. J. Mol. Cell Biol. 2014; 6(5): 394-406

も、分化促進の傾向が認められた。具体的なデータとしては、内胚Met が必要としない訳ではなく 4 日間以上 Met 除去培地で培養する

4）Schultz TC, et al. Plos One. 2012; 7(5): e37004

葉（SOX17 発現上昇）・中胚葉（T 発現上昇）・外胚葉（PAX6・MAPと SOX17 陽性の内胚葉細胞も死滅してくることも明らかとなった。

2 発現上昇）ということから、Met 除去が代謝に影響し、未分化維持

このように、ヒト ES/iPS 細胞において、未分化細胞が非常に高いの crisis を起こすとともに、分化の感受性を高めていることが示唆

Met 要求性を示すこと、またその要求性は未分化細胞と内胚葉へのされた。このように長時間の Met 除去培地処理により未分化細胞を分化細胞とでは異なることを利用し、未分化細胞を除去できている除去することができ、短時間の処理により分化促進が可能になること考えられる。その証拠として、マイクロアレイ解析の結果、Metとで、とくに長時間処理においては、将来的に造腫瘍性細胞に対す代謝酵素群ならびにシステイン代謝酵素群の発現が、未分化細胞にる対処方法の一つとして応用できると考えている 2）。さらに分化促

おいて高発現を示すことが明らかとなっており、Met 代謝が激しく進に関しては、我々が既に確立している 5 step の膵β細胞に対する動いていることがわかる。さらに、未分化細胞が除去された状況で、

3

高発現処理することで細胞死が起こるのではないかと考えている。さらに、の方法による分化誘導を行ったところ、いずれの分化条件においてが認められることが明らかとなった。さらに、分化細胞が完全に未分化細胞：メチオニン -システイン代謝酵素群が4