Lipid NanoParticle (LNP) のご紹介

1

LNP （Lipid NanoParticle）
LNPとは生体内で核酸を細胞内へ導入・作用させるための脂質ナノ粒子。
LNPを構成する脂質には、粒子中に核酸を保持させるため、及び細胞内への導入・エンドソームからの核酸の放出のためにイオン性カチオン脂質 （Ionizable cationic lipid） が使用されている。

代表的なLNP製剤〇 コミナティ (Pfizer-BioNTech社)
mRNA内包COVID-19ワクチン〇 スパイクバックス (旧COVID-19ワクチンモデルナ）（Moderna社)
mRNA内包COVID-19ワクチン〇 オンパットロ (Alnylam社)

siRNA内包アミロイドーシス治療薬
2

LNPの作製方法「エタノール希釈法」
脂質/エタノールを核酸/水系緩衝液へ添加・分散させることにより粒子を形成する。

■ バッチタンク内での撹拌による方法
脂質/エタノール

核酸/水系緩衝液LNP撹拌

■ マイクロ流路を用いた方法 （製法特許）脂質/エタノール

核酸/水系緩衝液

LNP

3実施例：作成方法による違い
核酸：ssDNA

脂質組成

脂質モル比 (%)

DOTAP

40.0

DMG-PEG2000

2.0

DSPC

10.0

Chol48.0

LNP物性データ
ゼータ電位(mV)

脂質濃度(mg/ml)

0.142

454.0

核酸保持率※（％）
12198

950.212

413.0

113

91

1550.141

432.8

69

56

平均粒子径(nm)

No.

作製方法

1

スターラーによる撹拌

104

2

A社マイクロ流路

3

B社マイクロ流路

PDI

核酸濃度(µg/mL)※ 核酸保持率 (%) =核酸濃度×100
仕込核酸濃度1234

LNPの脂質組成
コミナティ組成

脂質モル比 (%)

スパイクバックス組成

オンパットロ組成

脂質

脂質モル比 (%)

モル比 (%)

カチオン脂質ALC-031546.3

SM-102

50.0

D-Lin-MC3-DMA50.0

PEG脂質

ALC-0159

1.6

DMG-PEG2000

1.5

DMG-C-PEG2000

1.5

DSPC

DSPC

9.4

DSPC10.0

DSPC10.0

コレステロール

Chol42.7

Chol38.5

Chol38.5

DSPC: ジステアロイルホスファチジルコリン。リポソーム製剤でも使われている脂質。
参考文献：International Journal of Pharmaceutics, 601(2021), 120586※ LNPの脂質組成比について特許がとられており、各社脂質を変えて独自の製剤としている。

LNP模式図5

実施例：コミナティ組成
核酸：Fluc-mRNA

脂質組成

脂質

モル比 (%)

ALC-0315

46.3

ALC-0159

1.6

DSPC

9.4

Chol42.7

LNP物性データ
平均粒子径(nm)122.6

PDI0.087

ゼータ電位(mV)

脂質濃度(mg/ml)

-19.7

2.49

※１ 核酸保持率 (%) =核酸濃度(µg/mL)96

仕込核酸濃度 核酸保持率※1(µg/mL)
（％）
10096

※2内包率（％）

83

核酸濃度
Triton X100(+)核酸濃度−Triton X100(−)核酸濃度×100 ※2 内包率 (%) =×100
仕込核酸濃度
Triton X100(+)核酸濃度

6実施例：スパイクバックス組成
核酸：Fluc-mRNA

脂質組成

脂質

モル比 (%)

SM-10250.0

DMG-PEG2000

1.5

DSPC

10.0

Chol38.5

LNP物性データ
平均粒子径(nm)
166.4

PDI
0.187

ゼータ電位(mV)

脂質濃度(mg/ml)

0.417

1.29※１ 核酸保持率 (%) =核酸濃度(µg/mL)77

仕込核酸濃度 核酸保持率※1(µg/mL)
（％）
10077

※2内包率（％）

93

核酸濃度
Triton X100(+)核酸濃度−Triton X100(−)核酸濃度×100 ※2 内包率 (%) =×100
仕込核酸濃度
Triton X100(+)核酸濃度

7実施例：オンパットロ組成
核酸：Fluc-mRNA

脂質組成

脂質

モル比 (%)

D-Lin-MC3-DMA

50.0

DMG-C-PEG2000

1.5DSPC

10.0

Chol38.5

LNP物性データ
平均粒子径(nm)
162.5

PDI
0.143

ゼータ電位(mV)

脂質濃度(mg/ml)

9.38

1.38

※１ 核酸保持率 (%) =核酸濃度(µg/mL)
64

仕込核酸濃度 核酸保持率※1(µg/mL)
（％）
100

64

※２内包率（％）

87

核酸濃度
Triton X100(+)核酸濃度−Triton X100(−)核酸濃度
×100 ※2 内包率 (%) =×100
仕込核酸濃度
Triton X100(+)核酸濃度

8実施例：各組成LNPでのmRNA導入効率比較２
1.4×104個のマウス腹水由来マクロファージ様細胞（RAW264.7）を96 well plateで培養。
0.025 µg ｍRNA相当量のmRNA-LNPを細胞に添加。
↓48時間後PBS洗浄後、細胞を溶解して溶液中のルシフェラーゼ活性を測定。
細胞毒性試験では、 4時間前に10 µLのWST-8を添加し450 nmの吸光度を測定。

Day 0Day 1Day 3細胞毒性試験

35001203000

1002500

2000
15001000

細胞生存率 (%)

発光量 (x103 CPS)

ルシフェラーゼアッセイ

806040500

20009実施例：各組成LNPでのmRNA導入効率比較
1.4×104個のマウス腹水由来マクロファージ様細胞（RAW264.7）を96 well plateで培養。
0.2 µg ｍRNA相当量のmRNA-LNPを細胞に添加。
↓48時間後PBS洗浄後、細胞を溶解して溶液中のルシフェラーゼ活性を測定。
細胞毒性試験では、 4時間前に10 µLのWST-8を添加し450 nmの吸光度を測定。

Day 0Day 1Day 3細胞毒性試験

60001205000

100400030002000

細胞生存率 %

発光量 (x103 CPS)

ルシフェラーゼアッセイ

8060401000200010実施例： 時間によるmRNA導入効率比較
1.4×104個のマウス腹水由来マクロファージ様細胞（RAW264.7）を96 well plateで培養。
0.1 µg ｍRNA相当量のmRNA-LNPを細胞に添加。
↓24または48時間後
Day 2, 3 10 µLのWST-8を添加し4時間前に450 nmの吸光度を測定。
Day 0Day 1細胞毒性試験@48hr

1201201001008060
40

細胞生存率 (%)

細胞生存率 (%)

細胞毒性試験@24hr

80
60
4020200011実施例： mRNA量による導入効率比較
1.4×104個のマウス腹水由来マクロファージ様細胞（RAW264.7）を96 well plateで培養。
0.1または0.01 µg ｍRNA相当量のmRNA-LNPを細胞に添加。
↓24時間後
10 µLのWST-8を添加し4時間前に450 nmの吸光度を測定。

Day 0Day 1Day 2

ルシフェラーゼアッセイ

細胞毒性試験
120

スパイクバックス組成
4000800
600
400200

3500
3000
2500
2000
1500
1000

00.10.01mRNA (µg)

1086400.10.01mRNA (µg)

8060

40
202

500010012

発光量 (x103 CPS)1000

発光量 (x103 CPS)

発光量 (x103 CPS)

1200

オンパットロ組成

細胞生存率 (%)

コミナティ組成0.10.01mRNA (µg)

0mRNA量0.10.01

0.10.010.10.01 (µg)

培地の コミナティ組成 スパイクバック オンパットロ組
みス組成
成12