平成 29 年度 血液医学分野 一般研究助成 研究成果報告書

核内受容体を介した免疫記憶形成機構の解明とワクチン療法への応⽤

高田健介
北海道大学大学院獣医学研究院【研究の背景】
過去に感染したことのある病原体が再び体内に侵入すると、免疫系はより迅速で強力に応答し、病原体は速やかに排除される。この現象は免疫記憶と呼ばれ、ワクチンの基本原理として予防医学に多大な貢献を果たしてきた。免疫記憶の本体
は、抗原特異的に活性化した後、長期にわたり体内で維持される記憶リンパ球である。最近の研究から、記憶 T 細胞の分化は脂質分解による緩やかで持続的なエネルギー代謝に依存することが分かってきたが、詳細な分子メカニズムは解明されていない 1)。

【⽬的】

T 細胞は活性化に伴って増殖しエフェクター細胞となるが、95％以上は死滅し、一部の細胞だけが記憶 T 細胞へと分化する。本研究は、全身の様々な組織で脂質代謝を競合的に制御することが知られている核内受容体 RORと REV-ERB に着目し 2-4)、T 細胞の記憶形成における細胞運命決定機構の一端を解明する。さらに、これらの核内受容体に対する特異的合成リガンドを用いて、ワクチン・免疫療法への応用を目指す。

【⽅法】

1) T 細胞免疫応答における核内受容体の発現変動
生体内での T 細胞応答に伴う ROR（遺伝子名 Rora）および REV-ERB（遺伝子名 Nr1d1 および Nr1d2）の発現の変化を検討した。卵白アルブミンを特異的に認識する OT-I 抗原受容体発現 T 細胞を OT-I トランスジェニックマウスの二次リンパ組織から単離し、レシピエントマウスに養子移入した。さらに、卵白アルブミン由来ペプチド（SIINFEKL）でパスルした樹状細胞を追加移入することで、ドナーT 細胞に対し抗原刺激を加えた。その後、経時的にレシピエントマウスの二次リンパ組織からドナーT 細胞を単離し、各種転写因子の mRNA 発現を定量的 PCR で解析した。
2) 核内受容体リガンドが T 細胞の生存に及ぼす影響
OT-I トランスジェニックマウスの脾細胞を卵白アルブミン由来ペプチドおよび IL-2 の存在下で 3 日間培養し、in vitro で活性化させた。その後、核内受容体リガンドとサイトカイン（IL-2 あるいは IL-15）の存在下で培養した。トリパンブルー染色および PI 染色により生存 CD8T 細胞の数と頻度を計測し、核内受容体を介したシグナルが活性化後の T 細胞の生存に与える影響を検討した。また、活性化後に細胞を CFSE 染色し培養に供することで、核内受容体リガンド存在化におけるサイトカイン依存的細胞分裂を評価した。
3) 核内受容体リガンドを用いた腫瘍免疫療法の検討
卵白アルブミン由来ペプチドの刺激により in vitro で活性化させた OT-I T 細胞を IL-2 と REV-ERB リガンドの存在下で 2日間培養し、エフェクターT 細胞を得た。あらかじめ卵白アルブミン発現組換え胸腺腫細胞（EG7）を皮下投与して腫瘤を形成させたレシピエントマウスに対し、作成したエフェクターT 細胞を静脈内投与した。経時的に腫瘍サイズを測定した。腫瘍106

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2018 年度

研究成果報告集平成 29 年度 血液医学分野 一般研究助成 研究成果報告書の直径が 20 mm を超えた段階でマウスを安楽死させた。

404080802020202010101010000000で一定の発現が見られ、活性化直後に急激に低下するが、その後回復して記憶期に特に高い発現を示した（図 1）。
2) 核内受容体リガンドが T 細胞の生存に及ぼす影響

1.5
1.50.80.81.01.00.40.40.50.50.000.00

Bcl6

1.001.00

Id30.75
0.75
0.50
0.50

1212Rora0.000

Nr1d1OT-I T 細胞に in vitro で抗原刺激を加え活性化させた後、核内受88容体リガンドとサイトカインの存在下で培養することにより、核内受容体0.250.25

Nr1d2333322221111その結果、REV-ERB リガンドにより細胞の生存が大きく向上したのに000000

Naive
Naive
D5D5D10
D10D15D15D60
D6044NaiveNaive
D5D5D10D10D15D15D60D60を介したシグナルが活性後の T 細胞の生存に与える影響を検討した。
対し、ROR リガンドでは逆に生存が低下した（図 2A, B）。一方で、細胞

Naive
Naive
D5
D5D10
D10
D15
D15
D60
D60

胞の分化に重要とされる Eomes や Bcl6、Id3 と同様、ナイーブ T 細胞

Eomes

Id2

Naive
Naive
D5
D5
D10
D10
D15
D15
D60
D60減少する傾向を示した（図 1）。一方、Nr1d1 および Nr1d2 は、記憶細1.21.2

Naive
Naive
D5
D5
D10D10D15D15
D60
D60に、活性化後に急激な発現上昇を示し、その後、記憶形成に伴ってRelative mRNA expression

細胞の分化成熟に重要な転写因子である Tbx21 や Prdm1、Id2 と同様

Naive
Naive
D5D5D10D10D15D15D60D60

各種転写因子の発現動態を検討した。その結果、Rora はエフェクター

Naive
Naive
D5
D5D10D10D15D15D60D60303020204040

本研究ではまず、生体内での T 細胞応答に伴う核内受容体および4040303060601) T 細胞免疫応答における核内受容体の発現変動

Prdm1

Naive
Naive
D5
D5
D10
D10
D15
D15D60
D60

Tbx21果】

Naive
Naive
D5D5D10D10D15D15D60D60【結Days (post stimulation)の増殖（図 2C）や表現型（図 2D）には大きな影響は見られなかった。

図 1. T 細胞免疫応答における核内受容体遺伝子の発現

IL-2

Cell viability (%)

6040402020034IL-1560560DMSO
ROR ligand
REV-ERB ligand

B

4Cell # (x105)

ADMSO
ROR ligand
REV-ERB ligand

32134506IL-2

IL-15

Days (post stimulation)CDMSO
ROR ligand
REV-ERB ligand
IL-2

IL-15

D

IL-2
IL-15

DMSO

図 2. 活性化 T 細胞に及ぼす核内受容体リガンドの影響（A）生存細胞頻度の経時的変化。（B）培養終了時の細胞数。（C）
CFSE 染色による細胞分裂の評価。（D）培
養終了時の細胞の表現型解析。

RORligand

REV-ERBligand

CFSE

CFSE

CD43(1B11)

CD253) 核内受容体リガンドを用いた腫瘍免疫療法の検討
溶媒である DMSO 処理後の T 細胞を投与された対照群にくらべ、REV-ERB リガンド処理後の T 細胞を投与された実験群では、腫瘍の成長が顕著に阻害されるとともに（図 3B）、マウスの生存期間が延長した（図 3C）。

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A

EG7 thymoma cells (s.c.)

Recipient

D9D0Spleen cells

OT-I TCR Tg

D40

OT-I (i.v.)

3 days2 days

OVA+ IL-2

IL-2±REV-ERB ligand

B

No T celltransfer

DMSO
OT-I

REV-ERB ligand
OT-I

Tumor volume (mm3 )4000

No transfer
DMSO
REV-ERB ligand

OT-I

3000

2000

1000
001020Days after tumor inoculation

CNo transfer
DMSO
REV-ERB ligand

100Survival %755025001020

図 3.核内受容体リガンドによる T 細胞の抗腫瘍効果の増強（A）実験の流れ。（B）写真中の矢頭は投与から 12 日目の腫瘍塊。腫瘍サイズの経時的変化をグラフで示す。（C）レシピエントマウスの生存率。

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Days after OT-I transfer【考察】

RORと REV-ERB は転写因子として、標的遺伝子プロモーター上の同じ配列に結合し、転写を競合的に制御することが知られている 3, 4)。活性化 T 細胞の in vitro での生存が核内受容体リガンドに大きく影響されるという本研究の知見は、記憶形成過程における T 細胞の死滅と生存を当該核内受容体が決定する可能性を示唆する一方、生体内での役割を直接的に示すものではない。現在、ROR欠損マウス、REV-ERB欠損マウスと OT-I 抗原受容体トランスジェニックマウスの交配を進めており、今後、生体内における記憶 T 細胞分化に当該核内受容体の欠損が与える影響を検討する予定である。また、これまでに、リガンド処理後の T 細胞を対象としてマイクロアレイ解析を実施し、予備的知見ながら、当該核内受容体によって発現制御を受ける標的候補遺伝子を見出した。今後、詳細な分子機構を検討し、免疫記憶機構の解明につなげたい。

【臨床的意義・臨床への貢献度】
記憶 T 細胞あるいはエフェクターT 細胞の分化に関与するいくつかの転写因子がこれまでに報告されているが、これらを人為的に制御する術はない。一方、本研究が着目する核内受容体は、特異的リガンドによって直接的に制御可能であり、免疫療法に応用できる可能性は高い。本研究では、REV-ERB リガンドが in vitro で活性化 T 細胞の生存を大きく改善させるという独自の知見に基づき、当該試薬が腫瘍免疫療法の効果を大幅に増強することを見出した。今後、この知見を進展させ、実用化に向けた検討を進めていきたい。

【参考・引⽤⽂献】
1.

Man K et al., 2015 Nat Rev Immunol 15: 574-584.

2.

Zhang Y et al., 2015 Science 348: 1488-1492.

3.

Everett LJ et al., 2014 Trend Endocrinol Metab 25: 586-592.

4.

Kojetin DJ et al., 2014 Nat Rev Drug Discov 13: 197-216.

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