簡便かつ高効率なES/iPS 細胞の培養法
京都大学ウィルス・再生医科学研究所

末盛博文 先生

ES 細胞の培養は、マウスの繊維芽細胞をシート状に培養したフィーダー細胞の上で増殖させるといった方法が一般的であり、歴史的には非常に手間のかかる培養法と考えられていた。その方法では臨床応用に適さないだろうということで、フィーダーを必要とせず、培養液に関しても成分が明確にわかるものを使用するべきという流れで現在は考えられている。そのような流れの中で、去年我々が発表した、簡便で効率の良い培養法を本日は紹介する

1)

precoat 法と mix 法との違いを検証するため、iMatrix 濃度を通常使用

図3

濃度よりもかなり希釈し（0.1 µg/cm2, 0.05 µg/cm2, 0.02 µg/cm2）、細Mix法でのiPS細胞の接着効率胞の生育を比較した。ROCK inhibitor を培地に添加しているので、播種後 1 日目でも、0.02 µg/cm2 とかなり低い濃度域でも接着しているように見えるが、培地交換し 1 時間経過すると iMatrix 0.02 µg/cm2 の precoat法では細胞が剥がれ始め、iMatrix 0.05 µg/cm2 では、かなりの細胞が死んでいることが確認された。ただしその程度は、precoat 法に比べて mix法の方がよりマイルドに見える。さらに 1 日経過すると、precoat 法ではiMatrix 0.02 µg/cm2, 0.05 µg/cm2 では、細胞がかなり剥がれてしまう。
mix 法では、iMatrix 0.02 µg/cm2 の場合、さすがに細胞は剥がれてしまうが、iMatrix 0.05 µg/cm2 では precoat 法よりも接着が良いように見える。iMatrix 0.1 µg/cm2 の場合が最も差が明確で、mix 法では全てのコロニーがしっかり接着しているが、precoat 法の場合はコロニーが十分に接着できていないことが確認された。

その培養法は、ラミニン E8 フラグメントを使用した培養法で、従来のその問題を解決するために我々は、iMatrix を培地や細胞と一緒に培養

コ ー テ ィ ン グ に ど の く ら い の 時 間 が 必 要 か と い う こ と に つ い て、方法に比べ簡単に培養することが可能となった。ES 細胞の培養表面には皿に播いたらどうなるだろうと考え、実際に培養してみたところ、細胞

iMatrix 0.1 µg/cm2 の 濃 度 で 使 用 し た 場 合、1 時 間、30 分、15 分、7インテグリンが発現しており、接着する培養表面には適当な接着分子・は培養皿に接着し、すくすくと増殖することが確認された（図１）。どの分、3 分とコーティング時間を変えて precoat 法と mix 法を比較したと基質分子を予めコーティングしておき、ES 細胞・iPS 細胞はそのコーティようなことが起こっているのかということで、iMatrix と他の接着基質ころ、播種後 1 日目において ROCK inhibitor を添加した培地では 3 分間ングに接着し、増殖するというのが従来の培養法である。ES 細胞・iPS（ラミニン 521, ビトロネクチン）とを、従来法（precoat 法）と改良法（mixのコーティングでも、それなりに接着していることがわかる。ただ、播細 胞 の 効 果 的 な 接 着 分 子 に は、ラ ミ ニ ン 511 E8 フ ラ グ メ ン ト や full法）とで比較したところ、いずれの接着基質も適切な濃度で使用した場合

種後 2 日目において ROCK inhibitor が除去されると、コーティング時length のラミニン 521、ビトロネクチンなどが使われる。接着がうまくは、しっかりと接着するが、使用濃度を下げると precoat 法の場合は接間 3 分、7 分、15 分の場合はほとんどの細胞が剥がれてしまい、コーいかないと、細胞は死んでしまったり分化してしまったりするため、維着効率が下がるが、mix 法の場合は、より低い使用濃度でも最大の接着ティング時間は少なくとも 30 分間は必要であり、理想的には 1 時間以上持培養において接着表面をコントロールすることは重要だと考えられて効率を維持する不思議な現象が起こった（図２）。ただし、他の接着基質置いた方が良いが、mix 法に比べると precoat 法の接着が低いようであいる。

（ラミニン 521, ビトロネクチン）の場合は、そのような現象は見られず、る。

本発表の中心となるラミニン E8 フラグメントは、もともと大阪大学のmix 法では高い接着効率が認められないということが明らかとなった。

どのようなメカニズムで、mix 法において細胞が接着するのかという関口清俊先生と我々が協力し、ラミニン 511 がヒト ES 細胞・iPS 細胞のこのような現象が見られるのは、現状 iMatrix のみで、他の接着分子でことについて検討した。インテグリン分子と iMatrix があるときに、細接着培養に有用だということを明らかにした。ところが、ラミニン 511は確認されていない。さらに、細胞株（ヒト ES 細胞 H9, ヒト iPS 細胞胞表面にあるインテグリン分子が iMatrix に接着し、その後細胞が伸展は非常に巨大な分子であり、製造・精製が困難ということで、関口先生

253G1）や培地の種類（タンパク含量の少ない TeSR-E8, タンパク含量のするというのが通常のパターンになる。では mix 法のときに考えられるがその機能ドメインであるラミニン 511 E8 フラグメントを作製した。こ多い StemFit® AK03N）
に関しても検討したところ、細胞株を問わず、ことは、細胞が浮遊状態にあるときに iMatrix がインテグリンに接着し、れは、iMatrix 511 やカイコに作らせた iMatrix 511-silk という製品で㈱ま た 培 地 の 種 類 や 培 地 中 の タ ン パ ク 含 量 を 問 わ ず、mix 法 を 使 え ば

その後この状態で何もない培養皿表面に接着するのか、あるいは表面にマトリクソームから販売されている。

precoat 法よりも、より低い接着基質の濃度で precoat 法と同程度の高一 定 量 の iMatrix の 接 着 が 必 要 な の か、と い う こ と 検 証 し て み た。

従来の方法は、iMatrix-511（以下 iMatrix）を適切な濃度に希釈して培い接着効率を示すことが明らかとなった（図３）。mix 法では、precoat

iMatrix と細胞をインキュベートした後、細胞だけを集めて播種する群養皿に入れ、iMatrix の断片は培養皿表面に吸着するが、この工程は一時法のパフォーマンスを示すのに、接着基質の使用濃度は大体 4 分の 1 からと、mix 法 で 播 種 し た 群（mix 法 で 播 種 し た 15 分 後 に 培 地 交 換 し、間から一晩かかると考えられている。その後、コーティング液を除いた5 分の 1 程度ですむため、コスト削減が可能となる。細胞接着効率が最大

iMatrix を除いた群）に関して、播種後 2 日目までの細胞接着を比較した。後に、ES 細胞 /iPS 細胞と培地を添加し、培養することができる。ここでとなる適切な濃度の iMatrix を使用した場合、mix 法も precoat 法も同程

前者の群は、iMatrix が培養液中に無く細胞表面に吸着しただけであるた

問題なのは、コーティングする手間や時間がかかり作業効率を悪くする度の細胞増殖効率を示すことが確認された。

め、さすがに接着せず、すぐに剥がれてしまい、播種後 2 日後にはほとことである。もう一点は、準備した培養皿数に対して播種する細胞が十では、mix 法の場合、どのように細胞が接着しているのか、precoatんど培養皿から細胞がいなくなった。mix 法で播種した 15 分後に培地交分に得られなかった場合には培養皿の何枚かは廃棄することになり、法と比較し時間を追ってみたところ（播種 5 分後 , 15 分後 , 120 分後）、換し、iMatrix を除いた群は、播種後ある程度接着しているが十分な接着コーティング剤は高価であるのでコストが高くなる。逆に予想より多く

precoat 法と同様に mix 法でも、5 分で細胞はほぼ動かない初期接着状態の細胞が得られた場合にも用意していた培養皿の枚数が限られてしまうとなり、15 分もすると伸展をはじめ、120 分後には完全に伸展しているなど､培養スケールの柔軟な変更ができない。

ことが確認された。このように初期の kinetics も precoat 法と mix 法は図1

図3

効率を示さなかった。結論から言えば、mix 法でなぜ細胞がきちんと接着して、なぜ伸展するのか、なぜ低い使用濃度で precoat 法と同等以上のパフォーマンスが得られるのかというのは、今のところ解明できていない。
この mix 法を行う際によくあるトラブルを挙げると、播種密度が高い場合、培地中の iMatrix が細胞に全部吸着してしまうのか上手くいかな
いことがある（2-5×104/cm2 以上では播種しない方が良い）。ストック解
凍時等、大量のデブリ（細胞片、死細胞）が存在する場合でも、同じ理由で precoat 法を薦める。ROCK inhibitor を除去すると細胞が剥がれてしまう場合は、おそらく iMatrix の添加量が少ないため、使用濃度を上げ最適化する必要がある。また最適な濃度は細胞株や使用する培地によっても変わってくる。
mix 法の想定される利用法としては、以下の通り。
・iMatrix の使用量が少ないため費用削減が可能
・precoat しないため時間短縮になる
・培養のスケールアップ・ダウンにも柔軟に対応可能
・CPF 内での作業工程の簡略化になる・自動培養装置への展開がしやすくなる
mix 法による培養法の改善・簡便化は、臨床用の ES 細胞株の樹立と分配への展開を目的としている。臨床用の ES 細胞株の樹立と分配の流れを説明すると、提供医療機関からいただいた凍結胚を、解凍後に内部細胞塊を取り出し、iMatrix と StemFit® の培地中で培養することで、未分化細胞が増殖し維持培養が可能となる。ES 細胞を樹立し、凍結保存した後に、臨床用ストックを作製するが、並行して非臨床の培養施設で評価用Mix法でのiPS細胞の接着効率のストックを作製し分化能などの特性解析をする。適当な時期に細胞株樹立を大臣報告すると、細胞に正式な名前が付き、使用する場合は使用どちらも同様の傾向が見られた（図４）。

方法の概略

図2

研究への細胞株の追加を申請し使用を開始できる。評価の結果、細胞が使用できることが確認でき、臨床研究に進もうとする場合は、臨床用のMix法でのhES細胞の接着効率ストックを分配していくといったスキームを考えている。興味のある方は、私の方まで連絡いただきたい。

【参考文献】

1）Miyazaki T, et al. Sci Rep. 2017; Jan 30(7): 41165.

12効率的なヒト iPS 細胞の樹立・維持培養法
京都大学 iPS 細胞研究所

中川誠人 先生

現在では、体細胞の初期化から凍結ストック作製に到るまで臨床応用可能な方法が確立されている。樹立に関しては、京都大学 iPS 細胞研究所で実施している
HLA ホモドナー由来ヒト iPS 細胞ストックの製造にエピソーマルベクターが使用されているが、最近ではより高率な方法としてセンダイウイルス（SeV）や RNA を使った技術も関心を集めている。
今回は、それらを使った樹立方法、ならびに維持培養法の改良を検討したので紹介したい（図１）。

効率的な iPS 細胞の樹立に向けて〜 RNA, SeV を用いた樹立方法の検討〜

ことがわかっていたため、Day7 以降は bFGF を含む AK03N で樹立を図2続け、Day11 において TRA-1-60 の陽性率をフローサイトメーターで臨床グレードのiPS細胞の培養方法測定した。その結果、Day11 における TRA-1-60 陽性率は 80-90% であることが確認された。本検討により、センダイウイルスを使用した場合でも、非常に高い樹立効率を示すことが明らかとなった。センダイウイルスを樹立に使う利点としては、線維芽細胞だけでなく、血球細胞にも適用可能という点である。

効率的な iPS 細胞の維持培養に向けて〜フィーダーフリー培養法の改良〜

を TRA-1-60 で染色すると、しっかりときれいに染まった。さらに

我々は iPS 細胞を臨床応用可能なものにするために、基材は iMatrix、Day14 まで樹立を進め、フローサイトメーターで TRA-1-60 の陽性率

培地は StemFit® を使った新しいフィーダーフリーの培養法を開発してを解析したところ、AK03N bFGF(-) で樹立を行った場合にはこの時点きた（図２）。フィーダー法に比べてフィーダーフリーの方法は、非常iPS 細胞の樹立で重要なことは初期化因子の導入方法だと考えられでおよそ 90% の細胞が TRA-1-60 陽性であったなお、低酸素条件によに簡便で、培養経験が少ない人でも習得しやすい培養法であると考える。エピソーマルベクターを使った方法のメリットは、臨床用の iPS 細る優位性は認められなかった。本検討により、線維芽細胞に RNA を導ている。基材の iMatrix と培地の StemFit® は臨床使用可能な試薬とし添加し、セルスクレーパーで物理的にかき取って細胞を回収している。胞の製造方法として使用されている実績があること、さらに自分たち入した結果、非常に高い樹立効率が得られることが確認できた。現在のて PMDA の確認が得られているということが大きなメリットである。

しかし、この物理的な刺激が細胞にとっては良くないだろうと感じてでベクターを容易に変換・作製できるため、（基礎）研究者にとって使いと こ ろ 血 球 細 胞 の RNA 初 期 化 に は 成 功 し て い な い。血 球 細 胞 へ のこの培養法は、京都大学末盛博文先生らのグループが進められていいたが、なかなか解決する方法が見つからなかった。その一つの方法やすいベクターだということである。しかしながら、樹立効率が低く、RNA の導入のところが難しく、改良を進めている。RNA をラボで合成る臨床用ヒト ES 細胞の製造にも使用されており、ES 細胞を用いた臨床と し て、温 度 感 受 性 マ ト リ ッ ク ス（DIC ㈱ と の 共 同 研 究・開 発、樹立後の iPS 細胞におけるベクターの残存確認が必要なことがデメリッ

し、先のキットと同様のプロトコールで初期化を行ったがうまくいかな研究をする上でも、この培養方法が適用可能であると考えている。培DIC̲S05 コート）を評価した。TrypLETM select の処理に続く培地再添トである。エピソーマルベクター以外の方法としては、センダイウイ

かった。しかし、つい最近ほかのグループから市販のキットで RNA を養方法に関しては、2014 年に論文発表したと同時に、プロトコールも加後からセルスクレーパーで回収するまでの時間が長くなるほど回収

ルスと RNA を使った方法がある。センダイウイルスは導入効率が高合成し、線維芽細胞を高効率に初期化できることが報告された 1) 。

公開した 2)。フィーダーフリーの培養法においても、iPS 細胞はコロ

後 の 細 胞 の viability が 低 下 す る こ と が わ か っ た。同 様 の 作 業 をく、ゲノムに取り込まれないことがわかっている。しかし、バイオハ

我々もこの論文の追試を進める予定である。

ニーを形成するため、そのコロニーをばらばらにし、シングルセルとDIC̲S05 コートしたプレートで培養した iPS 細胞を用いて行った場合して播種し培養する、といった繰り返しで継代を行う。2014 年に公開には、セルスクレーパーを使わずピペッティングだけで細胞の回収がザードレベル P2 で扱う必要があり、自分たちでベクターを自在に作製センダイウイルスを使った樹立に関しても、条件検討を進めている。

できない点がデメリットである。RNA による樹立を行う場合のメリッ

センダイウイルスの感染条件としては、線維芽細胞（1×10 cells/poi

したプロトコールでは、『細胞をばらばらにする際、TrypLE

select可能であり、しかも回収後の細胞の viability 低下が抑制された。以上

トはゲノムに取り込まれないことであるが、導入効率・樹立効率や、自nt）と SeV（CytoTune®-iPS 2.0、㈱ ID ファーマ）を混合し、1 時間ほを 4 分間処理し、その後セルスクレーパーで細胞をかき取って回収すの結果から、温度感受性マトリックス（DIC̲S05 コート品：Cepallet

分たちで合成した RNA が使えるのかどうかなどに関しては未知である

どインキュベーションした。その際、ボリュームをかなり小さくするこる。シングルセルにして播種する場合は Y-27632（ROCK 阻害剤）を培（セパレット））を用いることで、より簡単な作業で、より良い状態の細ため、我々自身の手で検討を行った。

胞を培養できる可能性が示唆された。

5TMとで高密度な感染条件にし、その後 iMatrix をコーティングしたプレー地に添加することで細胞死を回避できる。その処理時間はオーバーナ

RNA を用いた樹立方法に関して、取扱い易い細胞であるヒト線維芽トに細胞を播種した（Day0）。このときの培地は AK03N bFGF(-) を使イトで行う。培養期間は 8±1 日とする。』としていた。当時は、細かな細胞を元細胞として用いることとした。iMatrix-511（㈱マトリクソー

用し、感染後の培地交換も、AK03N bFGF(-) を使用したが、Day7 か検証ができていなかった部分があったため、その後、私たちは細々とム、以下 iMatrix）をプレコートしたプレートに線維芽細胞を播種しらは bFGF を添加した通常の AK03N に切り替えたほうが、成績が良いした検証を行ってきた。

（Day0）、その後 4 日間連続で RNA のトランスフェクションを行った

TrypLE（導入試薬は RNAiMAX を、キットは㈱リプロセルから販売されている

図1

StemRNA-3rd Gen Reprogramming Kit を 使 用）。そ の 際 に、StemFit® AK03N か ら bFGF（C 液）を 抜 い た も の（StemFit® AK03N bF

iPS細胞技術の応用

TM

select の処理時間を検討したところ、TrypLE

京都大学

事前にコーティングする必要がないため、より簡単に効率良く iPS 細胞
TMを培養でき、かつラミニンの使用量は半分で実施できることから、コselect のストの面でも有用な方法と考えている 3）。

処理を長くした方が、Viability が上がり、それに伴い回収できる細胞数も増えることが分かった。現在、TrypLETM select の処理は 10 分程【参考文献】度まで延ばしている。

GF(-)）、つまり StemFit® AK03N の A 液と B 液のみを混合したものを培養期間を検討した結果、7 日より培養期間を延ばすと viability が低用いた。トランスフェクション後も AK03N bFGF(-) で培地交換を行下するため、7 日間で培養サイクルを回す方が、1 週間のスケジュール

い、Day11 と 14 で評価した。キット添付のプロトコールでは低酸素状を立てやすく、その点でも良いだろうと考えている。

態で培養することを推奨しているため、通常の酸素濃度の群と並行しY-27632 の処理時間に関しては、24 時間より処理時間が短くなるとて低酸素濃度における検討も実施した。また同様に、キット推奨の培

細胞の viability が低下してくることが確認されているため、現在は 24地である NutriStem（Biological Industries）や、bFGF（＝C 液）も混合時間〜48 時間と時間を決めて処理している（処理期間が長すぎても細胞した AK03N も同様に評価した。

の viability が低下する）。

Day11 の段階で NutriStem または AK03N bFGF(-) を使った場合で1）Kogut I, et al. Nat. Commun. 2018, Feb 21(9):745
2）Nakagawa M, et al. Sci. Rep. 2014; Jan 8(4): 3594.
3）Miyazaki T, et al. Sci Rep. 2017; Jan 30(7): 41165.

凍結ストックを作製するタイミングとしては、継代後 6 〜 7 日目で作iPS 細胞様のコロニー形成が確認された。しかしながら、bFGF の入っ製すると、その後の再培養の成績が良いことがわかってきた。

た AK03N の場合は、線維芽細胞の増殖が強いせいか、コロニー形成は認められなかった。AK03N bFGF(-) で確認できた Day11 のコロニー細胞を回収する際は、TrypLETM select の処理をした後に、培地を再3

末盛博文先生が開発された mix 法で培養すると iMatrix を4