第 15 回日本再生医療学会総会
味の素株式会社 ランチョンセミナー
日時：2016 年 3 月 18 日（金）会場：大阪国際会議場5F 大ホール

再生医療の新たな培養法の展開
再生医療の早期実現のためには培養技術の進歩が必要不可欠である。

本 セ ミ ナ ー で は 、i P S 細 胞 の 培 養 技 術 の最新事例を紹介する。

演題①

演題②

ヒトiPS細胞を臨床応用可能にするための培養法の開発

幹細胞の挙動制御に基づく未分化維持・分化誘導手法の開発
大阪大学大学院工学研究科

京都大学 iPS細胞研究所

生命先端工学専攻

未来生命科学開拓部門

生物プロセスシステム工学領域

中川誠人 先生

金美海 先生座長

大阪大学大学院工学研究科
生命先端工学専攻

紀ノ岡正博 先生

ヒト iPS 細胞を臨床応用可能にするための培養法の開発
京都大学 iPS 細胞研究所 未来生命科学開拓部門

中川誠人 先生

ヒト多能性幹細胞の一つである iPS 細胞は我々の体を構成する様々な体細胞へと分化する能力を持ったまま、ほぼ無限に増殖する。この特徴から再生医療への応用が期待されているが、細胞を医療応用に使用する場合には、安全な培養環境を構築し、細胞品質を確保することが重要である。我々の開発したヒト iPS 細胞を臨床応用可能にするための培養法、ならびにその培養系がヒト多能性幹細胞に与える影響について紹介したい。

しては、㈱ニッピから iMatrix-511 という製品名で発売され図3ている。
培地の課題としては、従来の iPS 細胞の培養に用いていた培地には様々な動物由来成分が含まれていた点である。このような動物由来成分を全く含まず、これらの成分を化合物が人工的なタンパク質かで代替し培地を開発できないかと、味の素㈱と共同開発を行った。その成果として完成したのが、StemFit® 培地である 3)。StemFit®AK03N に関しては、生物由来原料を全く含まない培地である。培地開発には数年を要し、組成決定までには 299 種類もの組成を検討し、299 番

iPS 細胞技術の応用

フィーダーフリー培養系の開発

目の組成が AK03N のベースとなっている。この培地に関し

iPS 細胞は体細胞を出発点として初期化することで多能性コンベンショナルな iPS 細胞の培養法である、オンフィーをもち、試験管内で分化誘導が可能である。iPS 細胞の応用

ダー培養法は細胞の生育が安定的で研究用途には適している

iPS 細胞のみならず ES 細胞の培養にも使用可能である。ことしては、病態モデルの作製、創薬の薬効評価ならびに毒性が、臨床応用するには幾つか課題がある。オンフィーダー培試験、これまでできなかったスクリーニング系の構築、細胞養系では、培地にウシやブタなどの動物由来の成分が含まれ移植のソース等が挙げられる（図 1）。iPS 細胞を臨床応用するため安全性の確保に課題があり、またフィーダー細胞がマるために、iPS 細胞研究所（CiRA）を中心として iPS 細胞のスウス由来の細胞を使用する点で臨床応用のハードルが高い。

トックプロジェクトが進行中である。ストックプロジェクト

更には、iPS 細胞とは別にフィーダー細胞のハンドリングがでは、HLA ホモ型の健常人の方を探し、その方の血液から加わるため非常に労力がかかる。これらの課題を解決するた

移植後の免疫拒絶を回避できるような iPS 細胞を作製していめに、我々の研究チームは培養基材と培地の開発に的を絞っる。臨床グレードの iPS 細胞を作製するには今の技術では１て探索を進めてきた。

年程度要するが、凍結保存すればすぐに使用できるというメ

基材に関しては、iPS 細胞を培養する際、ディッシュ上にリットがある。日本は島国であるため、HLA 型の保存に偏人工的なタンパク質をコートし、その上で培養できないか、りがあり、日本の中から一番頻度が高い HLA ホモドナーのという発想で進めてきた。さまざまな施設の研究成果 1) によ方を探し、その血液から iPS 細胞作製し移植可能となる割合

り、iPS 細胞の培養に必要な細胞外基質としてラミニン 511は、計算上日本人の 20％をカバーできることになる。という分子が非常に有効であること、またそれらに iPS 細胞が接着する際にα6β4 インテグリンが非常に重要な役割を図1果たしていることが明らかとなっている。これらのことか

iPS細胞技術の応用ら、ラミニン 511 をコーティング基材として使用することを決定した。ラミニン 511 の全長は、αβγの構造体が鎖状無いという確認が取れているため、臨床応用可能な iPS 細胞の培養法が構築されたと考える。この培養法は、CiRA のては、ヒト多能性幹細胞の培養用に最適化されているので、iPS 細胞のストックプロジェクトにも活用されている。昨年
度、臨床用の iPS 細胞が出荷されたが、その細胞もこの培養の StemFit® 培地をラミニン 511-E8 と組み合わせて使用す法で培養されたものである。現在では、臨床応用のみならずることで、シングルセルで培養が可能となっている。このメ基礎研究においても幅広く使用されている。たとえば、シンリットとしては、シングルセルにすることで細胞をカウントグルセル培養が可能なので、ゲノム編集後のクローニングにして、目的の細胞数を播種でき、従来の細胞塊で発生していも応用可能である。また、iPS 細胞をサンプルとして回収すた継代時の個人間での手技の差が改善された。また、これまる際にフィーダー細胞の混入を気にされる先生はこの培養法

で 1:3 〜 1:5 程度の継代率が、フィーダーフリー（以下、Ff）を用いている。

培養法では、1:100 まで伸ばすことが可能となった。さらに、培地交換に関しては、オンフィーダー培養法（SNL 法）

今後の展望に関しては、ほぼ毎日交換を行っていたが、Ff 培養法では、今回、iMatrix-511 と StemFit® 培地を用いた Ff 培養法を1 日ないしは 2 日おきに培地交換をすれば十分であるという構築できたが、まだスタート地点に立ったにすぎないと考えことがわかってきた。これまでの SNL 法に比べ、非常に簡ている。よって今後は詳細な検討を進めながら、よりロバス便に iPS 細胞を増やすことが可能となった（図 2, 3）。

トネスな培養法の開発を進めていきたいと考えている。さらに は、Ff 培 養 法 が 細 胞 に 与 え る 影 響 を 解 析 し、そ れ を

iMatrix-511 と StemFit®AK03N を使用した培養系に関フィードバックし次世代の培養システムの構築に繋げていきしては、PMDA の事前相談において、臨床使用しても問題
図2たい。それには培地や基材のみならず、機器や人も含まれる
ため、様々な業種の人と協力しながら開発を進め、臨床応用新たに開発した臨床グレードのiPS細胞の培養方法に貢献していきたいと考えている。に繋がったタンパク質で、インテグリン結合ドメインを有す【参考文献】る。ただ、ラミニン 511 は、非常に分子量が大きく精製度

1) Rodin S, et al. Nat. Biotechnol. 2010；28(6)：611-5が低い。そのため、大阪大学の関口先生の研究室では、ラミ

2) Miyazaki T, et al. Nat. Commun. 2012；

ンンのインテグリン結合ドメインのみをリコンビナントタン

3：1236

パク質（ラミニン 511-E8 2））として精製する技術をすでに開3) Nakagawa M, et al. Sci. Rep.

発されており、非常に精製度も高く収量も良いので、共同研2014；8(4)：3594

究を依頼した。そして、実際に iPS 細胞のコーティング基材として使用したところ、非常に効率良く培養することができた。よって、ラミニン 511-E8 をコーティング剤として使用することが有効であると結論付けた。ラミニン 511-E8 に関

1Feeder-free culture system for hPSCs

2

幹細胞の挙動制御に基づく未分化維持・分化誘導手法の開発
大阪大学大学院工学研究科 生命先端工学専攻

金美海 先生

iPS 細胞を未分化維持から分化誘導、組織化する培養プロセスの過程において、iPS 細胞イーブ型もしくはプライム型で維持させるためのスコップ造（世代数）を変えることで、細胞挙動（遊走）を変化させ、分や、山頂から下降へと分化誘導するスコップ、谷の淵から逸化の方向性を制御することが可能であった。この現象は、ヒ脱した細胞を消すための消しゴムのような道具が必要と考え

ト iPS 細胞のみならず、ヒト間葉系細胞やマウス ES 細胞、ている。山の下の方に行くと、分岐点が多く複雑になり制御

ウサギの軟骨細胞においても、同様に制御できることが明ら困難となるため、山の頂上の未分化維持の状態でしっかりとかとなっている 2) 〜 8)。

制御することが重要と考えている（図）。の産業応用のためには、未分化維持したまま細胞増殖させる過程が非常に重要と考える。我々

ヒト多能性幹細胞培養手法の開発におけの方向性を揃えることができると考えている。
現状の 2 次元培養と 3 次元培養では細胞到達密度に限界がる現状と課題ある。また、細胞播種密度が極めて低い場合は細胞死が起こ

培養容器内の細胞を取り巻く環境について考えると、細胞り易く、一方で播種密度が高い 3 次元培養等の条件では、立の挙動（遊走）に影響を与える細胞間接着および細胞 - 基質間体的な細胞集塊形成により細胞の不均一性の問題が発生す接着の相互作用で、細胞挙動のバランスや内在性のシグナルる。それらの課題を解決し、どのような培養条件でも均一なが変化し、細胞の運命が変化していると考えている。これら細胞集団を得る細胞培養条件を設計する必要がある。そのたの関係性を制御することで、細胞の運命づけをコントロールめに、①細胞培養の境界領域の拡大を目指した培養手法の開し、培養プロセスの設計に応用できないかと考えている。ま発、②培養方法を評価する方法論の構築、③細胞を培養プロセた培養プロセスの設計には、培養操作ならびに装置の設計とスの各ステージでみる（見る、診る、観る）ためのツールの開

いった量的拡大を目指した観点と、細胞挙動制御の質的改善発が重要と考えている。の観点、双方からのアプローチが必要であると考える。

Hemagglutin（HA）に注目して研究している。HA を iPS 細細胞挙動を操作する設計ツール

は細胞培養のスケールを、マイクロレベル（単細胞）から、メソレベル（擬似胚葉体）、マクロレベル（組織）、メガレベル（臓器・個体）と分けて考え、培養手法を汎用化できるような培養プロセスを研究している。

先述の消しゴムのような機能をもつ素材として、我々は胞培養系に添加することで、未分化逸脱細胞が剥がれ、選択的に除去できることが明らかとなった。HA は細胞間接着を未分化維持制御の具体的な検討として、我々の研究室では切断する機能があるが、未分化維持と未分化逸脱細胞の細胞デンドリマーという素材を用いて研究を行ってきた。デンド

間接着の強度の違いを利用して未分化逸脱細胞のみを選択的リマーは、グルコーストランスポーターもしくはインテグリに除去していると考えている（特許出願中）。

ンとの結合を介して細胞接着する。デンドリマーは枝鎖の構当研究室では、幹細胞の挙動制御に基づく未分化維持なら造を変化させたり、枝鎖の先端にリガンドを付けたりするこびに分化誘導の各手法を研究しており、今回それらの一部をとができ、それらの密度を変えることで、接着する細胞密度紹介したが、最終的にはそれらを繋ぎ、より広い範囲で展開や細胞挙動をコントロールできる。実際にデンドリマーの構図していきたいと考えている。

生命の発生現象を表す「ワディントン地形」の制御に基づいた培養手法の開発【参考文献】
1) Sekine R, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
2011；1:108(44)：17969-73

細胞挙動の操作による細胞運命の制御細胞を継代する際の課題として、継代を重ねるたびに増殖が良い細胞と悪い細胞が混在することが挙げられる。細胞の成育は培地や基質、細胞株の影響も受けるが、同じ材料を使細胞の挙動は、細胞遊走と細胞間接着、細胞 - 基質間接着ったとしても、育て方（操作者のスキルやセンス）によってバの 3 つのバランスで成り立っていると考えている。これら 3ラつきが発生する。そこで我々は、以下 3 点を軸に、細胞を点の三角形の内側の範囲では、細胞は未分化維持し、その範中心としたモノづくりを進めている。

囲から外す（外れる）ことで分化誘導が進むと考えている。細2) Kim MH, et al. Biomaterials. 2014；35(22)：5670-83) Kim MH, et al. Biochem. Eng. J. 2014；84,53-584) Mashayekhan S. et al. Polymers 2011；3,2078-87

5) Kim MH, et al. Biotechnol. Adv. 2010；
28(1), 7-16

胞遊走を促進させたり、細胞間接着を阻害したりすること

6) Kim MH, et al. Biomaterials 2010；31(30),で、積極的に分化誘導を起こすことが可能と考え、現在それ① 培養の材料によらず、どのような条件でも問題なく培養

7666-77

らの手法の開発を行っている。

できる細胞培養の境界領域の拡大を行う。

7) Mashayekhan S. et al. Biomaterials 2008；
29(31), 4236-43

細胞挙動を操作するための細胞外環境（場）の設計ツールと② 細胞の育て方のルール作りをし、細胞培養の条件や操作

8) Kino-oka M et al. Biomaterials 2007；

して、細胞遊走・細胞間接着・細胞 - 基質間接着を促進もしの許容範囲を確定する。

28(9), 1680-8

くは阻害する、ハサミや消しゴム、のりのような機能をする③ 熟練者であろうが素人であろうが、大量培養装置であろ道具が必要と考えている。

うが、あらゆる培養に対応できるようにしていく必要がワディントン地形の概念 1) に基づいて、細胞分化過程を考ある（スキルとセンスのいい操作者のヒトづくり）。

えると、未分化維持細胞が山の頂点の谷に、中腹の谷に三胚未分化維持増殖の段階でバラつきの大きい細胞集団を分化葉、山の底辺に各細胞組織といったように示される。それぞ誘導した場合、分化の方向性が拡散し、さらに大きなバラつれの谷を越える変化があることによって、各分化ステージ進きが発生すると考えている。故に、未分化維持増殖の段階でむ。この概念を、我々が開発している手法の探索に応用して細胞挙動を制御することで、それらの細胞を分化誘導した際考えると、未分化維持細胞が位置する、山の頂点の谷底にナ34