愛知学院大学薬学会誌

第8巻

＝総説＝
薬物動態および毒性試験への応用を目指した
ヒト iPS 細胞由来肝細胞の作製とその培養技術
Generation and culture techniques of human iPS cell-derived
hepatocytes for application to pharmacokinetic/toxicokinetic studies
堺 陽子 1,2，岩尾岳洋 2，國正淳一 1，松永民秀 2*
Yoko Sakai 1,2, Takahiro Iwao2 , Junichi Kunimasa1 , Tamihide Matsunaga2*
1

1

愛知学院大学 薬学部 臨床薬物動態学講座
Laboratory of Clinical Pharmacokinetics, Aichi Gakuin University School of Pharmacy2

名古屋市立大学大学院 薬学研究科 臨床薬学分野
Department of Clinical Pharmacy, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Nagoya City University

2

Summary
The liver plays important roles in metabolism, detoxiﬁcation, and bile formation and secretion in humans. Now, various models, such asanimals, human hepatocytes, hepatic microsomes, and hepatocarcinoma cell lines, are used in drug pharmacokinetic studies. But there aresome problems such as species differences, a difﬁculty in obtaining fresh human hepatocytes, lot-to-lot variations, and decrease of hepaticfunctions during in vitro culture. Recently, induced pluripotent stem cells (iPS cells) were generated and expected for not only regenerative
medicine but also drug development studies. Thus, human iPS cell-derived hepatocytes would provide a valuable model for various
applications involving hepatic pharmacokinetic and toxicokinetic studies. However, the cells are functionally immature. We have investigateda hepatic differentiation of human iPS cells with a focus on extracellular matrix (ECM) and culture techniques. Here, we review effects of
ECM and the techniques on functions of hepatocytes cultured in vitro.
Keywords: iPS cells, hepatic differentiation, pharmacokinetic study, toxicokinetic study, extracellular matrix, culture techniques

1. 緒言

vivo 試験系としては実験動物が用いられることが多いが，ヒトとの間には種差があるため，結果をヒトへ外

肝臓は，代謝や解毒，胆汁の生成・分泌など生体内挿することが困難である．In vitro 試験系としては，ヒにおいて重要な役割を担っている．特に薬物代謝は，

ト肝ミクロソームやヒト初代肝細胞，ヒト肝ガン由来

腎臓や小腸，肺でも行われるが，肝臓の主たる機能での HepG2 細胞などがよく用いられている 2,3）．しかし

ある 1）．医薬品開発において，薬物動態試験は必須項

肝ミクロソームは，小胞体局在の酵素による代謝のみ目であることから，肝臓において医薬品候補化合物がしか評価できないといった問題点がある．また，ヒト

どの程度代謝を受けるかということをより正確に予測

初代肝細胞は，高価であるのに加え，薬物代謝酵素活することが必要である．また，医薬品による肝毒性は性は個人差が大きいことが知られていることから，調開発中止となる原因のひとつとなることから，これを製された肝細胞の機能は，ドナーが違うと大きく異な

予 測 す る こ と も 非 常 に 重 要 で あ る． 現 在， さ ま ざ まる こ と も 問 題 で あ る．HepG2 細 胞 は 薬 物 代 謝 活 性 やなモデル系を用いてこれらの評価が行われている．In

輸送活性が極めて低いなどさまざまな問題がある 3,4）．

*Corresponding author
Prof. Tamihide Matsunaga
名古屋市立大学大学院 薬学研究科 臨床薬学分野（〒 467-8603 愛知県名古屋市瑞穂区田辺通 3-1）
Department of Clinical Pharmacy, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Nagoya City University, Nagoya, Japan (3-1 Tanabe-dori, Mizuho-ku, Nagoya Aichi 467-8603, JAPAN)
TEL / FAX: 052-836-3751*E-mail address: tmatsu@phar.nagoya-cu.ac.jp

−7−

＝総説＝

薬物動態および毒性試験への応用を目指したヒト iPS 細胞由来肝細胞の作製とその培養技術

viral oncogene homolog（c-MYC））を導入することによって樹立された（Fig. 1）8）．このヒト iPS 細胞はほぼ全ての組織細胞に分化し得る能力を有し，また，この作製方法は比較的容易であるにも関わらず，高い再現性が得られる画期的な手法である．また，ヒト iPS 細胞は，ほぼ無限に増殖可能であるため，確立されたプロトコールに沿って分化させることで、組織細胞を安定して供給することができる．さらに，様々なヒトの細胞から樹立する
ことは，様々な遺伝的背景を有するヒト iPS 細胞を得る

Table1. Characteristics of human ES iPS cells7,8）ことが可能となることから，幹細胞研究が大きく進展することとなった．

近年，従来の株化細胞に比べて高い薬物動態学的機能を現在，我々は薬物動態および毒性試験への応用に向け有する HepaRG 細胞が注目されるようになってきているて，ヒト iPS 細胞から肝細胞への分化誘導研究を行ってが，単一のクローンであるということが問題である 5）．

いる．そこで本総説では，ヒト iPS 細胞から肝細胞へのそこで，これらの問題を解決することが可能となりうる分化に関する現状と，肝細胞の機能に対する細胞外マト

ヒト胚性幹細胞（embryonic stem cells：ES 細胞）やヒト

リ ッ ク ス（extracellular matrix：ECM） の 影 響 お よ び in

人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells：iPS 細胞）

vitro 培養技術について，我々の研究成果も含めて概説すから肝細胞への分化誘導に関して多くの研究が行われてる．

おり 6），ヒト多能性幹細胞由来肝細胞は，創薬研究にお2. ヒト iPS 細胞から肝細胞への分化誘導

ける有用なモデル系として期待されている．
1998 年に Thomson らによって樹立された ES 細胞は，様々な種類の細胞に分化する多能性と高い増殖能を有す

ヒト iPS 細胞から肝細胞への分化法は，2009 年に初る（Table 1）7,8）．したがって，再生医療や細胞治療，創めて報告されて以来いくつか報告されているが，その主薬研究などへの利用が期待され，特に海外では臨床応用な方法として分化誘導の際にはサイトカイン等の液性因を目指した研究が盛んに行われている．しかし，ヒト子が用いられている 9）．具体的には，activin A などを用

ES 細胞は生命の萌芽である受精卵を滅失して樹立する

いて内胚葉に分化誘導後，ﬁbroblast growth factor（FGF）

ため，生命倫理上大きな問題がある．一方，この倫理的や bone morphogenic protein（BMP）などを用いて肝芽細問題が大幅に解消され，ES 細胞と同様の性質をもった胞に分化誘導する．その後，hepatocyte growth factor（HGF）

細胞がヒト iPS 細胞である．ヒト iPS 細胞は 2007 年にや oncostatin M（OSM），dexamethasone（DEX） な ど を

Takahashi らによって，レトロウイルスベクターを用いて用いて肝細胞に成熟させる方法である．我々は，サイ体細胞に 4 種類の遺伝子（octamer transcription factor-3/4

トカインと低分子化合物を組み合わせた肝細胞への分化（OCT3/4），sex determining region Y-box 2（SOX2），誘導法を報告しており，内胚葉から肝芽細胞への分化誘

Kruppel-like factor 4（KLF4），v-myc myelocytomatosis

導には，dimethyl sulfoxide（DMSO）を，肝芽細胞からFig. 1. Generation of human pluripotent stem cells and their potential−8−Sakai et al.

Fig. 2. Schematic of the protocol for the differentiation into hepatocytes from human iPS cells10）
Activin A, 100 ng/mL; dimethyl sulfoxide, (DMSO), 1%; valproic acid, (VPA), 2mM; hepatocyte growth factor, (HGF),
10 ng/mL; oncostatin M, (OSM), 20 ng/mL; dexamethasone, (DEX), 100 nM
肝細胞への分化誘導には，低分子化合物である valproicが重要となる．インテグリンはさまざまな ECM をリガ

acid（VPA）を用いることで，効率よくヒト iPS 細胞をンドとし，これらと結合することで細胞の増殖や移動，

10）

肝細胞に分化誘導する方法を確立している（Fig. 2） ．

分化などを制御するシグナルを伝達する．以下では，そVPA は臨床の現場では抗てんかん薬として用いられていのリガンドとなる代表的な ECM について，それらの肝るが，ヒストン脱アセチル化酵素（histone deacetylase：細胞の機能に対する効果とともに紹介する．

HDAC）阻害作用を有することも知られている．我々の研究では，この HDAC 阻害作用が肝細胞への分化促進

3-1. コラーゲンに重要な役割を果たしていることが示唆された．その他

哺乳類においてコラーゲンは組織を構築する主要なにも，Takayama らは発生の過程で肝細胞への分化・成タンパク質であり，全タンパク質の約 30% を占めてい熟に関与する転写因子類をアデノウイルスベクターにる 16）．コラーゲン構造をとっている分子種には少なくよって導入し，ヒト iPS 細胞由来肝細胞を作製する方法

とも 6 種類（I − V 型と I 型トリマー）ある．このうちを報告している 11）．Takebe らは，正常ヒト臍帯静脈内

最も多いのは I 型コラーゲンであり，全コラーゲン量の皮細胞（human umbilical vein endothelial cells：HUVECs）

80–90% を占める．I 型コラーゲンは特有の物理的・生物とヒト間葉系幹細胞（mesenchymal stem cells：MSCs）を学的性質を有するため，様々な細胞培養の ECM として共培養させることにより肝芽（liver bud）を作製し，免汎用されている．

疫不全マウスに移植することで，機能を有した肝組織を1953 年に Grobstein によって，コラーゲンが細胞増殖

12）．以前はヒト iPS 細胞由来と形態形成に関して重要な役割を果たしていることが報

肝細胞は胎児様の性質を有しており，機能的にも未熟で告された 17）．1956 年には Ehrmann らによって，コラー

あったが，近年さまざまな分化誘導法が報告されており，

ゲンコーティング上とガラス上での各種細胞の成長の比

成熟化という課題は徐々に克服されつつある．今後さら較を検討し，コラーゲンコーティング上において細胞のに研究が進むことで，ヒト初代肝細胞に匹敵する機能を成長が促進したと報告された 18）．また，ラット肝実質細有したヒト iPS 細胞由来肝細胞の作製が可能となること

胞をコラーゲンコーティングした培養皿上で培養するこが期待される．

とで，プラスチックやガラス製培養皿よりも長期間の生作製したと報告している

存が確認されている 19）．さらに，肝細胞をコラーゲンゲ
3. 細胞外マトリックス

ル上で培養することによって，分化や機能が 20 日間維
持することを可能にしたとの報告もある 20）．このよう

近年，ECM の量的変化や質的変化によって細胞の分に，コラーゲンによって細胞分化や細胞増殖が促進され化・増殖の制御が行われている可能性が指摘されている理由として 2 つのことが考えられている．まず一つは

13）．また，細胞が S 期に入るためには ECM との接着細胞が基底膜を作製する能力を促進させること，もう一が必須であり，たとえ成長因子が存在していても細胞はつは細胞を tissue culture treated polystyrene（TCPS）プレー

ECM との接着が無い限り DNA 合成期への移行はできなトに移した時に起こる細胞の扁平化および伸展による体いことが知られている 14）．さらに，細胞が ECM と接着積の増大を阻止し，細胞の形状や体積を維持することですることで発生したシグナルによりアポトーシスを回避ある．つまり，コラーゲンの生体での役割は動物の体のするという接着依存性の細胞内シグナル伝達機構も明ら構造を支えるのみと考えられていたが，細胞の再生，分るかになっている15）．したがって，細胞− ECM 間相互作用は肝細胞の増殖や分化，機能発現においても極めて重化，形態形成などにも影響を及ぼしていることが明らかとなっている．

要だと考えられる．この相互作用において，細胞側では細胞膜表面に存在する細胞接着分子であるインテグリン

−9−

＝総説＝

薬物動態および毒性試験への応用を目指したヒト iPS 細胞由来肝細胞の作製とその培養技術

3-2. マトリゲルの A13（RQVFQVAYIIIKA）部分が強い活性を有するこ

マ ト リ ゲ ル は マ ウ ス Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）とを示した 29）．そこで，A13 をコーティングしたプラス肉腫由来のゲルで，ECM の主要な成分であるラミニ

チックプレート上に肝細胞を播種し，その肝特異的マー

ン -111 や IV 型コラーゲン，エンタクチンなどに加え，カー遺伝子の発現を調べると，マトリゲル上に播種しtransforming growth factor（TGF）-βや FGF など様々な増た場合と同様に tyrosine aminotransferase，tryptophan-2,3-

殖因子も含んでいる．近年，マトリゲル上で培養したラッdioxygenase および CYPs の発現が維持されていた．また，

ト初代肝細胞の hepatocyte nuclear factor（HNF）4α及びラミニン -111 上で培養することによって，ヒト iPS 細胞

HNF6 の遺伝子発現や DNA 結合活性はコラーゲン上でから分化させた肝幹前駆細胞の大量培養が可能であると培養した時と比較して高いことが報告された 21）．また，の報告もある 30）．この方法では 3 ヶ月以上にわたって培

肝特異的マーカーである albumin（ALB）や cytochrome

養が可能であり，このヒト iPS 細胞由来肝幹前駆細胞はP450（CYP）1A2，CYP2E1，CYP3A1，CYP3A2 の 発 現

肝細胞様細胞および胆管細胞様細胞の両方への分化能力の増加もタンパク質レベルで確認された．さらに，肝前を有していることも認められている．

駆細胞である小型肝細胞は，マトリゲルの処理によって
4. 肝細胞の機能向上を目指した培養技術

成熟化や基底膜様構造の形成，肝特異的転写因子の発現誘導をもたらす可能性があるとの報告もある 22）．これら
は，マトリゲル上で培養を行なうことで肝細胞が球形を4-1. スフェロイド培養法

示し，立体的な形態をもたらすこと，またマトリゲルの生体内で肝臓は三次元的に肝細胞同士，さらには非実主要成分であるラミニンが肝特異的タンパク質の発現を質細胞や血管内皮細胞などが密に凝集して肝組織を構成促進するなど，肝機能向上には，マトリゲルの性質が大することでその機能を発揮している．一般的な細胞培養きく関与していることを示唆している

23,24）．

は二次元的にプラスチック培養皿上に接着するように培

我々は，ヒト iPS 細胞から肝細胞への分化の過程にお養を行うため，実際の生体内とは環境が大きく異なる．

いて ECM としてマトリゲルを用いることで，肝特異的一方，スフェロイド培養は細胞をプラスチック培養皿上マーカーや薬物代謝酵素遺伝子の発現がコラーゲンを用に接着させることなく，細胞が多数集合した球状の細胞

25）．この理由に凝集塊（スフェロイド）を形成させ三次元的に培養する

ついても上述したマトリゲルの作用によるものであると方法である．したがって，二次元培養法に比べて，より考えられる．

生体内の環境に近い状態で培養が可能となる．

いた場合よりも高いことを報告している

スフェロイドを形成するための三次元培養法に関して
3-3. ラミニン

は多くの方法が知られている．最近では，微細加工技術

基底膜を構成する主要成分のひとつであるラミニンはを応用したマイクロウェルを利用して均一な大きさのス

基底膜への細胞接着において中心的役割を果たしておフェロイドを大量に作製できる培養基材が開発されていり，主に上皮組織の構築に関わっていると考えられてる．代表的なものとしては，感光材ポリマーを用いている．ラミニンはα鎖，β鎖，γ鎖の 3 つのポリペプチ

加工した直径 100 μm の細胞接着領域を 100 μm 間隔

ド鎖からなるヘテロ三量体である．α鎖の細胞接着ドメで配置した Cell-able® プレート（東洋合成工業社製）がインには Arg-Gly-Asp（RGD）というアミノ酸配列があある．接着基質としては，I 型コラーゲンを使用していり，この配列が細胞との接着に深く関与していることがる．このプレート上で凍結ヒト肝細胞と 3T3-swiss albino

26）．また，β鎖には Tyr-lle-Gly-Ser-Arg（フィーダー細胞）を共培養することで肝細胞をスフェ（YlGSR）や Pro-Asp-Ser-Gly-Arg（PDSGR）などのアミロイド状で培養することが可能となり，54 日間もの長報告されているノ酸配列も見いだされており，これらは上皮性細胞との期間にわたり CYP 活性や ALB 分泌などの肝特異的な機接着に関与すると考えられている 27）．しかし，これらの能を維持することができる．Elien らによると，スフェ

合成ペプチドは，細胞接着活性が弱いという難点が存在

ロイドの直径が 95 ± 13 μm の場合に最も機能が高いする．また，ポリペプチド鎖の組み合わせ（α鎖 5 種，と報告されており 31），Cell-able® プレートを用いること

β鎖 3 種，γ鎖 3 種）によって少なくとも 19 種類の異なで，適切なサイズのスフェロイドを形成することが可能

るアイソフォームが存在する 28）．肝細胞の機能維持に積となる．フィーダー細胞として使用する 3T3-swiss albino

極的に関与しているアイソフォームであるラミニン -111

は他の 3T3 細胞と比較してこのプレートに対しての接着は，分子量 80 万の巨大なタンパク質である．Kikkawa

性が強く，また肝細胞増殖促進因子であるプレイオトロ

らは肝細胞接着活性ペプチドを検出するためにラットフィンを放出することが知られている 32）．このことも肝初代肝細胞を用いて検討したところ，ラミニン -111 中細胞の機能を維持してスフェロイドを形成させるための− 10 −

Sakai et al.

を積み重ねて多層構造を形成する方法である（Fig. 3A）．

重要な要因であると考えられる．
Takayama らはスフェロイド培養が可能なナノピラー

これは細胞と細胞間もしくは細胞と ECM を接着させ，プレート ®（日立ハイテクノロジーズ社製）を使用し，細胞シートを作製する．しかし，この方法は作製した細ヒト iPS 細胞から肝細胞への分化誘導を行い，その有用胞シートを剥離する際に用いる剥離液によって細胞間接性を報告している 33）．このプレートを用いて三次元的

着や細胞と ECM 間の接着も破壊させてしまうため，こに分化誘導を行うと，二次元的に分化誘導した場合と比の点に注意が必要である．そこで，この問題を解決する

較して，薬物代謝酵素や薬物トランスポーター，核内転ために，Haraguchi らによって温度応答性培養皿が開発

写因子の発現上昇が認められた．また，CYP2C9 およびされた 35）．これはゲル状態にした温度応答性のハイドロ

CYP3A4 活性の上昇や，rifampicin によるこれら薬物代

ゲル上に細胞を播種し，37℃で単層培養により細胞シー

謝酵素活性の誘導も認められた．さらに，HepG2 細胞とトを作製した後，温度を 20℃まで下げることでハイドロ比較して，薬剤性の肝毒性の評価にも優れていることをゲルをゾル化してシートを剥離する方法である．これに報告している．

より，不可能であった細胞シートの作製と回収が可能とフラスコ内の培地を撹拌し，細胞を浮遊させることでなった．そしてこの細胞シートを複数積み重ねることで，スフェロイドを形成させる方法によってヒト ES/iPS 細立体的な組織を形成できる積層培養法を確立した．実際胞から肝細胞の分化誘導を行ったとの報告もある 34）．こにこの方法を用いて肝細胞シートと内皮細胞シートを重の方法で作製した肝細胞は，肝細胞マーカー遺伝子の発層化させることにより，ALB 合成能を維持した肝細胞の現だけでなく，肝細胞の特徴的な機能（ALB 分泌や尿素長期培養が可能であると報告している 36）．また，Sakai

産生，LDL の取り込み，グリコーゲンの蓄積，CYP のらはヒト初代肝細胞とヒト皮膚由来線維芽細胞（TIG-118

誘導など）が認められている．また，このスフェロイド細胞）の共培養シートを作製し，これを TK-NOG マウ

を肝障害モデルマウスに移植することで，生存期間の延ス（肝臓のアルブミン遺伝子エンハンサー / プロモーター

長も認められた．

支配下に herpes simplex virus-1 thymidine kinase（HSV-TK）

このようにスフェロイド培養法は肝細胞培養の研究にを導入し，ガンシクロビル投与によって肝障害をきたす

おいて多くの検討がされており，機能向上に有用である

ようにデザインされたマウス）の皮下に移植した後，移ことが示されている．しかし，多くの報告は肝細胞のみ

植組織の構造や血清中のヒト ALB（hALB），ヒト alphaでスフェロイドを作製しており，実際の肝小葉内部の構

1-antitrypsin（hα1-AT）濃度およびマウスの生存率を検造を十分には反映していないということや，類洞構造が討した 37）．その結果，血管が新生されたヒト肝組織が構存在していないため，薬物がスフェロイドの内部に十分築され，その構造は肝細胞と血管が交互に配列する肝小に浸透しないなどの問題点も指摘されていることから，葉に類似していた．また，共培養シートを移植したマウ

今後さらなる研究の発展が期待される．

スにおいて，hALB や hα1-AT の血中濃度は肝細胞のみで作製したシートを移植したマウスよりも有意に高値で4-2. 積層培養法

あり，生存率も高かった．

積層培養法とは，細胞層を 1 層ずつ重ねて多層構造を2 つ目の方法としては，細胞層の上に新たな細胞層を培構築する方法であり，この方法は 2 つに大別することが養していく方法である（Fig. 3B）．Matsusaki らは単層培養出来る．まず 1 つ目として，平面で培養した細胞シートした細胞の表面をおよそ 6 nm の厚さとなるようにフィブ
ロネクチン（FN）とゼラチン（G）のナノ薄膜で覆うこと
で，その薄膜上に細胞を積層化できることを報告した 38）．
2009 年には，これを応用して開発された CellFeuille（ セルフィーユ）が製品化されている．また，単一細胞表面に FN-G ナノ薄膜を形成することで，短期間で三次元組織体を構築できる細胞積層法も考案した 39）．
このような培養法は複数種類の細胞を積層化できることや，一度に多層構造が構築できるため，より生体の環
境に近い状態で培養可能であることが期待できる．しかし，スフェロイドと同様に積層数を多くすればするほどFig. 3. Generation of 3-demensional cell sheets by using atemperature-responsive hydrogel (A) and ﬁbronectin-gelatin
nanoﬁlms (B)

酸素や栄養を細胞層内部へ供給することが困難になることが課題であると考えられる．

− 11 −

＝総説＝

薬物動態および毒性試験への応用を目指したヒト iPS 細胞由来肝細胞の作製とその培養技術

Fig. 4. Oxygen supply to the static cultured hepatocytes in the plate bottom48）を検討した 45）．この培養法により，細胞間に微小胆管の4-3. サンドイッチ培養法
サンドイッチ培養法とは，細胞をコラーゲンゲルやマ形成促進が認められた．これは，ヒト iPS 細胞由来肝細トリゲルなどの ECM で挟んで培養する方法である．初胞の機能向上や胆管系輸送評価には有用である可能性が

代肝細胞をコラーゲンゲルにてサンドイッチ培養する考えられる．

と，単層培養を行ったときと比較して ALB 分泌能や薬物の取り込み活性，代謝活性などの肝特異的な機能が向40）4-4. 酸素濃度を考慮した培養法．また，この培養法では三肝実質は肝小葉という組織学的単位の集合として知ら次元構造が形成され，肝機能の比較的長期間の維持が可れているが，機能的な面からは細葉という単位の集合体

能になり，細胞の極性も認められる．さらに，胆管腔がとして捉えられている．細葉は門脈周辺域（zone 1），小形成するとともに胆管側膜上に排泄トランスポーターが葉中間体（zone 2），小葉中心域（zone 3）に区別される．

上することが知られている41）．したがって，サンKurt らはラット初代肝細胞を用いて，それぞれの zone のドイッチ培養法は，薬物の胆汁排泄を評価するための方肝細胞が要求する栄養素や酸素濃度に違いがあること，法として用いられる．

それに伴い機能的役割にも違いが生じていることを報告

局在化することも報告されている

サンドイッチ培養法はコラーゲンゲルだけでなく，している 46）．このことから，初代肝細胞やヒト iPS 細胞

マ ト リ ゲ ル を 上 部 か ら 覆 う 方 法 も 報 告 さ れ て い る．

由来肝細胞を培養する際に，異なる酸素濃度を考慮してGermano らが行った研究では，上部から覆うマトリゲル

培養することによって，それぞれの zone に特徴的な機能層を 2 層，3 層，4 層と多くしていくに従って，マウスを有する肝細胞を培養できる可能性が考えられる．

初代肝細胞間にできる細管や細胞数が増加していく傾向
42）

Matsui らは，上層からマトリゲル含有培地を常に添．また，Swift らはマウス初代

加し，下層には酸素透過性の良い poly-dimethylsiloxane

肝細胞を用いて ECM の組み合わせと播種する細胞密度（PDMS）膜とコラーゲンが共有結合を形成したプレートを変え，比較検討している 43）．この報告では，排出トラ（PDMS プレート）を用い，ラット初代肝細胞のサンド

ンスポーターである Mrp4 のタンパク質発現量以外で大イッチ培養を行った．対照として，コラーゲンコーティ

きな差は認められなかった．そこで，Mrp4 の発現量とングした TCPS プレートと比較すると，微小胆管形成がタウロコール酸の胆汁排泄能の解析を行ったところ，1.0

促進したと報告している 47）．このことから，胆管形成やもしくは 1.25 × 106 cells/well の細胞密度で播種し，コラー

胆汁排泄能は酸素濃度によって制御されている可能性がゲン / マトリゲルの組み合わせでサンドイッチ培養を行考えられる．

があると報告している

い，培養 3 日目に評価するという条件が胆汁排泄能の評
価に適していることが示された．

ラット肝細胞を TCPS プレート上でコンフルエントにして培養した場合，気液界面からの培養液相中への酸

ヒト iPS 細胞からの分化誘導法にも，サンドイッチ培

素供給速度は，酸素消費速度を満たすことができない

養を用いた報告はいくつかある．例えば，ヒト iPS 細胞が，一方で，PDMS プレートにおける単位面積当たりのから心筋細胞に分化誘導する際に，マトリゲル / マトリ

酸素供給速度は，酸素消費速度を十分に上回ることが報

ゲルのサンドイッチ培養を行うことで，機能が向上した

告されている 48）．したがって，インキュベーター内の酸ことが報告されている 44）．

素濃度を肝細胞が必要とする濃度に適切に調整すること

Bi らは，I 型コラーゲンがコートされている BioCoat
6で，肝細胞の酸素消費量を完全に充足することが可能に

プレート上に 0.35 × 10 cells/well の凍結ヒト肝細胞を播なる（Fig. 4）．そこで，Xiao らはインキュベーター内の種し，上層からマトリゲルで覆ったサンドイッチ培養法

酸素濃度を 5%，10% もしくは 20% としてサンドイッチ− 12 −

Sakai et al.

培養を行い，ラット初代肝細胞が要求する酸素濃度の検49）したものである．しかし，in vitro で分化・培養された肝．その結果，10% 酸素下で培養した肝細胞細胞は，生体内の肝細胞と同等の性質を示すに至っていで，細胞の形態や機能の維持，生存率の改善が認められ，ないのが現状である．我々は，優れた肝細胞の分化・培

毛細胆管ネットワークも観察された．しかし，5% 酸素養法の開発には，生体内の肝臓の構造上の特徴や肝細胞濃度下で培養した細胞は，細胞に供給できる酸素量が生の周りの環境をより詳細な解明と理解が必要であると考体内と比較し低いことから，ミトコンドリアで好気的代えている．これからも，生体内の肝細胞に近い in vitro

謝を行うための十分な酸素を得ることができず，嫌気的での分化・培養法を確立し，薬物動態および毒性試験を代謝を行っていることが考えられた．さらに，TCPS とはじめとしたさまざまな試験系に応用して，医薬品候補

PDMS 膜では酸素透過速度（フラックス）に違いがある

化合物の動態 / 毒性スクリーニングや薬剤性肝障害のメ

ため，TCPS プレートでの培養では嫌気的代謝となってカニズムの解明に貢献していくことを目指してさらに研いることも示された．生体内の肝臓における酸素濃度は，究を進めていきたい .

討を行った

動脈 zone では 13%，静脈 zone では 5% 程度であることが知られている 46）．したがって，酸素濃度の工夫を凝ら

6. 謝辞

した培養法は，in vivo に近い環境下での肝細胞培養法を可能にしているものと思われる．

本研究を遂行するにあたって御協力頂いております名

Cho らは，ラット初代肝細胞に酸素を供給しながら，
異 種 細 胞 で あ る 3T3-J2 細 胞 と 共 培 養 を 行 い，60 mm

古屋市立大学大学院薬学研究科臨床薬学分野（薬学部臨
床薬学教育研究センター）各位に感謝致します．

ディッシュ内でのそれぞれの細胞播種密度（肝細胞数と7. 引用文献

3T3-J2 細胞数の割合を 1：9（低），1：3（中），9：1（高））と共培養日数（2，7，10，14 日目）がもたらす肝機能の変化に関して検討している 50）．その結果，肝細胞密度1）Jochheim A., Hillemann T., Kania G., Scharf J., Attaran M.,

が高密度より低密度において，肝細胞数の増殖が優れて

Manns M.P., Wobus A.M., Ott M., Int. J. Dev. Biol., 48,

いた．また，ALB 分泌量は，共培養日数に関係なく，低・23–29 (2004).

中密度において単位肝細胞あたりの分泌量が高値を示し

2）Puviani A.C., Ottolenghi C., Tassinari B., Pazzi P.,

た．尿素合成能は，10 日目を過ぎると，それぞれの播

Morsiani E., Comp. Biochem. Physiol., 121, 99–109 (1998).

種密度での違いは認められなかった．肝細胞は多くの酸

3）Olsen A.K., Hansen K.T., Friis C., Chem. Biol. Interact.,
107, 93–108 (1997).

素を消費し，高い代謝能を有する特徴を持つ．肝細胞数がフィーダー細胞数よりも少ないことは，単位肝細胞が4）Brandon E.F.A., Raap C.D., Meijerman I., Beijnen J.H.,

取り込める酸素量が増加し，これに伴って，肝機能の向Schellens J.H.M., Toxicol. Appl. Pharmacol., 189, 233–
246 (2003).

上に繋がると考えられる．
我々も，ヒト iPS 細胞から肝細胞への分化の過程にお5）Andersson T.B., Kanebratt K.P., Kenna J.G., Expert Opin.
Drug Metab. Toxicol., 8, 909–920 (2012).

いて酸素を分化の初期から供給することで，肝特異的マーカーの mRNA 発現量が上昇するという結果を得て

6）Katsuda T., Sakai Y., Ochiya T., J. Stem Cells, 7, 1–17 (2012).

いる（未発表データ）．このように培養容器や酸素濃度

7）Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitzを考慮することで，肝細胞の機能向上もしくは目的とす

M.A., Swiergiel J.J., Marshall V.S., Jones J.M., Science,
282, 1145–1147 (1998).

る機能発現を制御できる可能性がある．

8）Takahashi K., Okita K., Nakagawa M., Yamanaka S., Nat.
Protoc., 2, 3081–3089 (2007).

5. まとめ9）Touboul T., Hannan N.R., Corbineau S., Martinez A.,
本総説では，ヒト iPS 細胞から肝細胞への分化の現状

Martinet C., Branchereau S., Mainot S., Strick-Marchandと，肝細胞の機能を制御するような培養技術や ECM に

H., Pedersen R., Di Santo J., Weber A., Vallier L.,
Hepatology, 51, 1754–1765 (2010).

ついて述べてきた．組織工学によると，ECM はシグナ
ル分子や足場として細胞を支持する役割があり，現在で10）Kondo Y., Iwao T., Yoshihashi S., Mimori K., Ogihara

は組織再生の礎を担っている．ECM の量や質が細胞のR., Nagata K., Kurose K., Saito M., Niwa T., Suzuki T.,

形態や機能の相違を生じさせることを念頭に置き，肝細Miyata N., Ohmori S., Nakamura K., Matsunaga T., PLoS
One, 9, e104010 (2014).

胞の培養に応用していく必要がある．また，今回紹介した肝細胞培養法は，既知から最新の報告を大まかに分類

11）Takayama K., Inamura M., Kawabata K., Sugawara− 13 −

＝総説＝

薬物動態および毒性試験への応用を目指したヒト iPS 細胞由来肝細胞の作製とその培養技術

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