日本学術会議 公開シンポジウム「子どもの毒性学：子供の高次脳機能への化学物質曝露影響の把握に関わる、臨床、応用および基礎科学の現状と展望」

アセフェート経口投与によるマウスの情動認知行動影響種村健太郎
東北大学大学院農学研究科
動物生殖科学分野
1

背景
効果の高い化学物質によって健康被害が生じる、という問題がある。
被害を未然に防ぐ為に、化学物質の安全性を評価することが、国家レベル、国際レベルで随時行われている。
その為に、実験動物を用いた「毒性試験」が行われている。

220219 日本学術会議
公開シンポジウム 「子どもの毒性学」

2

脳と神経に対する毒性を調べる試験★現在、国際的に推奨されている試験〇急性の末梢神経系への影響（麻痺、痙攣）を検出しやすい。
✖遅発性の中枢神経系（情動行動・認知行動）への影響を検出しにくい。
胎児期～小児期に化学物質に曝露された後に、遅発性に情動行動・認知行動の異常が誘発される、という毒性を検出する研究している。

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3

発生-発達期

化学物質曝露→神経シグナル異常→脳の微細構造の異常
微細構造の異常が固定される（不可逆的になる）
成熟期
行動異常等の脳の機能障害が顕在化する

この様な「遅発性中枢神経毒性」は、国際的に推奨されている試験ではカバーできない
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4

動物モデル：マウス（C57/BL6）（遺伝子改変マウスの情報を利用できる。）

遅発性中枢神経毒性の検出システム
1）神経作動性の化学物質を胎生期～幼若期に曝露するプロトコール
2）高精度かつスループット性の高い成熟期の行動解析プロトコール
3）神経科学的物証（病理形態学、分子生物学）の収集プロトコール

分子メカニズムの解明
4）網羅的遺伝子発現変動解析

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5

アセフェート経口投与によるマウスの情動認知行動影響

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6

＝｜O／＼ N ／P＼ OS
H／｜

ACEPHATE＝アセフェートO

C4H10NO3PS
O,S-ジメチル-N-アセチルホスホロアミドチオエート（CAS No. 30560-19-1）

用途：農薬・殺虫剤（ADI：0.0024mg/kg/day）
作用機序：コリンエステラーゼ阻害
急性毒性：縮瞳、筋痙直、発汗、嘔吐、目眩・・・

LD50 ： 700mg/kg（ラット、経口投与）
LD50 ： 233mg/kg（マウス、経口投与）
LD50 ： 681mg/kg（イヌ、経口投与）
LD50 ： 800mg/kg（ニワトリ、経口投与）

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7

幼若期及び成熟期におけるアセフェート（7、20、70 mg/kg）
単回強制経口投与による中枢影響解析

溶媒投与対照群

2週齢
投与

11週齢
投与

溶媒

溶媒

幼若期及び成熟期投与群とも、急性末梢神経毒性発現を呈するが、それらは24時間後には消失し、幼若期投与群

アセフェート溶媒以後の飼育環境下での一般状態に異常は認められなかった成熟期投与群溶媒

アセフェート220219 日本学術会議
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8幼若期及び成熟期におけるアセフェート（7、20、70 mg/kg）
単回強制経口投与による中枢影響解析

溶媒投与対照群

2週齢
投与

11週齢
投与

溶媒

溶媒

12-13週齢

神経行動毒性解析
行動解析

幼若期投与群

成熟期投与群

アセフェート溶媒

溶媒

アセフェート220219 日本学術会議
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形態解析
遺伝子発現解析

9

行動解析
遺伝子改変マウスの行動解析で実績があり、比較的に短時間で、判りやすい結果が得られる試験を選択した。
→化学物質による行動影響があるか？
→毒性発現と呼べる行動異常か？

オープンフィールド試験

明暗往来試験

高架式十字迷路試験

条件付け プレパルス驚愕反応
学習記憶試験
抑制試験

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10単回強制経口投与による遅発性情動-認知行動解析を元に行動様式の逸脱（t-検定）レベルを示す為のレーダー図

PPI-100/120
PPI-95/120
PPI-90/120

OF-DIS+3+2+10-1-2-3OF-C%
OF-N
LD-L-TIME

FZ3

LD-N

FZ2

LD for L
FZ1
EP-ENT

EP-DIS
EP-OPEN-TIME+/-3: p<0.01+/-2: p<0.05+/-1: p<0.1
0: p>0.1

OF: オープンフィールド試験-10min
OF-DIS : 総移動量
OF-C% : 中央滞在率
OF-N : 移動回数
LD: 明暗往来試験-5min
LD-L-TIME : 明所滞在時間
LD-N : 明暗往来数
LD for L : 初移動までの時間
EP: 高架式十字迷路試験-10min
EP-DIS :高所総移動量
EP-OPEN-TIME : 柵無しアーム部滞在時間
EP-ENT : number of entry in arms
FZ: 条件付け学習記憶試験-6min
FZ1 : 学習度（短期記憶形成度）
FZ2 : 空間-連想記憶
FZ3 : 音-連想記憶
PPI: プレパルス驚愕反応抑制試験-30min
PPI-90/120 : プレパルス 90db/120db
PPI-95/120 :プレパルス95db/120db
PPI-100/120:プレパルス100db/120db

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11アセフェート（7、20、70 mg/kg）
単回強制経口投与による成熟期の行動逸脱レベル

7 mg/kg
PPI-100/120
PPI-95/120
PPI-90/120

幼若期投与群FZ3

OF-DIS420-2-4-6

FZ2

OF-C-TIME
OF-N
LD-L-TIME
LD-N
LD for L

FZ1
EP-ENT
PPI-100/120
PPI-95/120

成熟期投与群

20 mg/kg

PPI-90/120
FZ3
FZ2

PPI-95/120
PPI-90/120
FZ3

OF-DIS420-2-4-6

OF-C-TIME
OF-N
LD-L-TIME
LD-N

EP-DIS
EP-OPEN-TIME

OF-DIS420-2-4-6OF-C-TIME
OF-N
LD-L-TIMELD-N

FZ2EP-DIS
EP-OPEN-TIME

LD to LFZ1EP-ENT

PPI-100/120

70 mg/kg

LD to LFZ1EP-ENT

PPI-100/120
PPI-95/120
PPI-90/120
FZ3

PPI-95/120
PPI-90/120
FZ3

OF-DIS420-2-4-6

OF-C-TIME
OF-N
LD-L-TIME
LD-N
LD for L
EP-DIS
EP-OPEN-TIME

OF-DIS420-2-4-6

FZ2EP-DIS
EP-OPEN-TIME

FZ2
FZ1
EP-ENT

PPI-100/120

OF-C-TIME
OF-N
LD-L-TIME
LD-N
LD for L

FZ1EP-ENT
PPI-100/120
PPI-95/120
PPI-90/120
FZ3FZ2EP-DIS
EP-OPEN-TIME
OF-DIS420-2-4-6

OF-C-TIME
OF-N
LD-L-TIME
LD-N
LD for L

FZ1EP-ENT

EP-DIS
EP-OPEN-TIME+/-3: p<0.01+/-2: p<0.05+/-1: p<0.1
0: p>0.1

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12アセフェート（70 mg/kg）
単回強制経口投与による成熟期の行動逸脱レベル

幼若期投与群

成熟期投与群

OF-DIS420-2-4-6

OF-DIS420-2-4-6

PPI-100/120
PPI-95/120
PPI-90/120
FZ3

OF-C-TIME
OF-N
LD-L-TIMELD-N

FZ2LD for L
FZ1EP-ENT

EP-DIS
EP-OPEN-TIME↗
不安関連行動逸脱に起因する行動異常か？

PPI-100/120
PPI-95/120
PPI-90/120
FZ3

OF-C-TIME
OF-N
LD-L-TIME
LD-N

FZ2

LD for L

FZ1
EP-ENT

EP-DIS
EP-OPEN-TIME↗
認知機能不全に起因する行動異常か？

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公開シンポジウム 「子どもの毒性学」+/-3: p<0.01+/-2: p<0.05+/-1: p<0.1
0: p>0.113形態解析
HE染色を施した脳組織標本を用いた病理観察↓
神経細胞死、神経細胞変性（例えば神経原線維変化）、神経細胞脱落、大脳皮質層構造の破綻…等の異常は認められない。
所謂、神経病理学的所見が得られない。
↓行動異常はあるが毒性学的に問題とされるものではない？

国際的に推奨されている試験では、「問題なし」とされる恐れがある？

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14遺伝子発現解析

Percellome 法：サンプルのDNA濃度を精密に計測し、添加した外部標準mRNA（スパイクRNA）の測定値を基準として、サンプルの測定値を細胞１個当たりのmRNA発現コピー数に換算することでmRNA発現絶対量を得ることができる。
↓
化学物質による遅発中枢影響について分子レベルで見落としなく解析することができる。

220219 日本学術会議
公開シンポジウム 「子どもの毒性学」

15アセフェート(70mg/kg)投与により、行動解析後の脳における遺伝子プロファイルは、幼若投与群と成熟期投与群で異なる。
発現が増加/減少（copy数>1t-test: p<0.01, ratio>1.2）
した遺伝子(プローブセット: PS)数
大脳皮質

海馬

228/47

6/951/29

35/33

4/2

122/8

137/12

26/0

86/10

1/51

0/30/26

脳幹

小脳220219 日本学術会議
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16アセフェート(70mg/kg)投与により、行動解析後の脳における遺伝子プロファイルは、幼若投与群と成熟期投与群で異なる。
発現が増加/減少（copy数>1t-test: p<0.01, ratio>1.2）
した遺伝子(プローブセット: PS)数
大脳皮質

海馬

228/47

6/951/29

35/33

4/2

122/8

137/12

26/0

86/10

1/51

0/30/26

Auts2

脳幹

小脳
220219 日本学術会議
公開シンポジウム 「子どもの毒性学」

17

幼若投与群と成熟期投与群の大脳、海馬、脳幹、小脳、Percellome法により抽出された（ copy数>1t-test: p<0.01, ratio>1.2 ）遺伝子の既知パスウェイへの関与についてIngenuity Pathway Analysisにて解析した。

グルコーストランスポーター１欠損症

220219 日本学術会議
公開シンポジウム 「子どもの毒性学」

18

幼若投与群と成熟期投与群の大脳、海馬、脳幹、小脳、Percellome法により抽出された（ copy数>1t-test: p<0.01, ratio>1.2 ）遺伝子の既知パスウェイへの関与についてIngenuity Pathway Analysisにて解析した。

難治性てんかん220219 日本学術会議
公開シンポジウム 「子どもの毒性学」

19

幼若投与群と成熟期投与群の大脳、海馬、脳幹、小脳、Percellome法により抽出された（ copy数>1t-test: p<0.01, ratio>1.2 ）遺伝子の既知パスウェイへの関与についてIngenuity Pathway Analysisにて解析した。

軽度アルツハイマー病

220219 日本学術会議
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20

幼若投与群と成熟期投与群の大脳、海馬、脳幹、小脳について、Percellome法により抽出された（ copy数>1t-test: p<0.01, ratio>1.2 ）遺伝子の既知パスウェイへの関与についてIngenuity Pathway Analysisにて解析した。

髄鞘形成不全？
220219 日本学術会議
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21

幼若投与群と成熟期投与群の大脳、海馬、脳幹、小脳について、Percellome法により抽出された（ copy数>1t-test: p<0.01, ratio>1.2 ）遺伝子の既知パスウェイへの関与についてIngenuity Pathway Analysisにて解析した。

220219 日本学術会議
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軸索機能異常？

22

幼若投与群と成熟期投与群の大脳、海馬、脳幹、小脳について、Percellome法により抽出された（ copy数>1t-test: p<0.01, ratio>1.2 ）遺伝子の既知パスウェイへの関与についてIngenuity Pathway Analysisにて解析した。

220219 日本学術会議
公開シンポジウム 「子どもの毒性学」

軸索機能異常？

23

幼若投与群と成熟期投与群の大脳、海馬、脳幹、小脳について、Percellome法により抽出された（ copy数>1t-test: p<0.01, ratio>1.2 ）遺伝子の既知パスウェイへの関与についてIngenuity Pathway Analysisにて解析した。

長期記憶の形成不全？
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【結果1】
アセフェートの単回強制経口投与によって、末梢神経影響が消失した後に行動異常が認められた。
幼若期投与群の行動異常は、成熟期投与群の行動異常とは質的に異なる「情動異常を伴う記憶異常」である。

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【結果2】
アセフェートの単回強制経口投与時期によって、遅発影響を分子レベルで捉えることに成功した。
「幼若期投与群では大脳影響が大きく」、「成熟期投与群では海馬影響が大きい」、ことから脳の部位ごとで異なる状態にある。

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【結果3】
特に、幼若期投与群に、自閉スペクトラム症に起きやすいことが知られている「てんかん」関連遺伝子の発現かく乱が認められたことから、妊娠中の女性を含めて乳幼児のいる場所での、神経作動性化学物質の使用はより慎重であることが望ましい。

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国立医薬品食品衛生研究所毒性部
菅野 純 先生
北嶋 聡 先生
相﨑 健一 先生
齊藤 洋克 先生
星薬科大学
五十風 勝秀 先生
大塚 まき 先生

徳島文理大学
冨永 貴志 先生
冨永 洋子 先生
九州大学
中島 欽一

先生

広島大学
今村 拓也 先生

日本バイオアッセイセンター
古川 祐介 先生

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