ABML2011

O2-1

2011年11月3日-5日 東京（芝浦工業大学）

細胞の空間配置を自在に制御した脳神経ネットワークの３D 再構成技術の開発
3D reconstruction of the neuronal network controlling the spatial arrangement of cells○小田原あおい 1,2
1.東京工科大学

鈴木郁郎 1後藤正男 1

2.バイオ情報メディア科 バイオニクス専攻

Aoi ODAWARA, Ikuro SUZUKI, Masao GOTOH
Tokyo University of Technology
Abstract: We have developed the 3D reconstruction techniques of neuronal network using the collagen gel photo-thermal
etching method and the orientation method of collagen fibers. The advantage of these methods are that it allows control of
the cell numbers and the position of synaptic connections during cultivation thro ugh photo-thermal etching where a portionof the collagen gel layer is melted with a 1064nm infrared laser beam, and that it allows control of cell position anddirection of neurite in 3D through the PDMS micro chamber and the orientation of collagen fiber. Using these methods, wehave constructed the 3D neuronal network model with multiple layers, and confirmed the function of it by Ca 2+ imaging.
These techniques can potentially be used for regenerative medicine and development of dr ug screening model, as well as
research in basic neural biology.
Key Words: 3D reconstitution, Collagen gel, 1064nm laser, fiber orientation, Ca2+ imaging
1. Introduction
生体組織を人工的に３次元再構成する技術は、医薬品開発の評価モデルや再生医療分野で未来の移植技術として期待されている[1,2]。これまでに、細胞から組織を人工的に創る研究は、心臓などの組織を対象に研究が進み細胞シートを使った移植治療が行われてきた。
本研究は、生体組織の中でも最も再構成することが難しいとされている脳組織に着目し、神経ネットワークの細胞数制御技術および脳神経回路機能で重要となる情報の伝達方向（神経突起の伸長方向）を３次元で制御した培養技術の開発を行った。

2-3 Orientation control of collagen gel fiber
細胞の空間配置と情報の伝達方向を制御した３次元培養技術として、コラーゲン繊維配向技術を開発した。PDMS マ
イクロ加工技術による、細胞体の位置制御と組み合わせて多層構造の 3 次元脳回路モデルを構築した(Fig.2)。
Collagen gel fiber

orientation
コラーゲン繊維の配向

2. Materials and methods
2-1 cell culture
ラット胎児（E18）から海馬神経細胞を採取し、neurobasalMedium（Invitrogen）、B27 Supplement（Invitrogen）、CO25%37℃下で培養をおこなった。

Fig.2 Orientation control of collagen gel fiber
3. Results
3-1-1 Photo Thermal Collagen Gel Etching method
細胞播種後に任意の細胞を選択し、レーザ加工を施した結果、細胞数を制御した培養に成功した。免疫化学染色法
により、レーザ加工した部分のみ Collagen gel が排除されていることが観察された (Fig.3.a)。単一孤立培養だけでなく、Fig.3 は 1 細胞レベルで細胞数を制御した培養結果を示している(Fig.3.e～h)。

2-2 Photo Thermal Collagen Gel Etching method
細胞数や異種細胞の細胞間相互作用を培養中に自在に制御できる技術として、コラーゲンゲルレーザ加工技術を開発した。ITO ガラス上にコラーゲンゲルをコートし、その上から調整した細胞を播種し、その後、1064nm レーザで任意の細胞を選んで細胞の周りをレーザ加工した(Fig.1)。

1064nm laser3cell
networkaCollagen gel
etching area

Collagen gel
etching areabefdgh

Collagen gel
c1cellnetwork
glial cell

Fig.3 control of cell numbers(a)Collagen typeⅠ (b)MAP2(c)Hoechst33258(d)Phase contrast(e)1cell(f)2cell(g)3cell(h)5cell
Scale bars=20μm

ITO glassFig.1 Photo Thermal Collagen Gel Etching method
O2-1-1

A3-1-2 Control of neural elongation
脳神経回路機能で最も重要となる情報を担う神経突起の方向を任意の方向に誘導し結合させることができた。培養
2 日目にレーザ加工により伸長可能なエリアを制御した。
培養 3 日目(加工 2 日後) (Fig.4.a)に伸長可能なエリアに沿って伸長している様子が観察され、培養 4 日目(加工後 3日目)(Fig.4.b)に。細胞間での結合を確認することができた。

B
3D soma area Ⅰ

3D direction
control of neuriteb1

3D soma area Ⅰ

23D direction
control of neurite

3

3D soma area Ⅱb
3D soma area Ⅱaa a1c
2
3D direction
control of neurite

33D soma area Ⅲ3secΔF/F0=0.1

3SFig.4 control of neural elongation(a)加工 2 日後(DIV3) (b)加工 3 日後(DIV4)(c)免疫化学染色画像(Red: Collagen typeⅠ Blue: Hoechst
33258、Green:MAP2) Scale bars=20μm

Fig6. 3D neuronal network with multiple layers(A)免疫化学染色画像 (B)Ca2+ imaging（Red: Tau1、Green:MAP2、Blue: Hoechst 33258）
Scale bars=100μm

3-2-1 Orientation control of collagen gel fiber
PDMS マイクロ加工技術とコラーゲン繊維の配向技術を用いた結果、細胞体の位置と突起の伸長方向を制御することができた(Fig.5)。細胞体の位置を制御し、そこからコラーゲン繊維に沿って伸長突起が一方向に伸びている様子が観察された。さらに、顕微鏡観察下で Z 軸の方向に焦点をずらしていくと、伸長突起が 3 次元的に伸長している様子が確認された。

4. Summary
4-1 Photo Thermal Collagen Gel Etching method
コラーゲンゲルレーザ加工技術を用いて、培養中に細胞数を制御した脳神経ネットワークの構築、および突起伸長方向を任意の方向に誘導することに成功した。
この技術の特徴は、①細胞播種後に細胞数・種類を制御できる②培養中に任意形状にコントロールできること（シナプス位置の制御ができる）ことである。
4-2 Orientation control of collagen gel fiber
PDMS マイクロ加工技術とコラーゲン繊維配向技術を用いて、3 次元的に多層構造の脳回路を再構築することに成功した。また、Ca2+イメージングにて再構築したモデルの機能を確認することができた。
この技術の特徴は、①細胞体位置と伸長方向の制御②多層構造の再構築を 3 次元脳回路の再構成できることである。
これらの開発した技術は、神経細胞の厳密な細胞間相互作用解析、再生医療や薬剤評価モデルへの応用が期待される。

3D soma area

3D direction
control of neurite

5. References[1]Tao Xu, Peter Molnar, Cassie Gregory, Mainak Das,
Thomas Boland, James J. Hickman.
Electrophysiological characterization of embryonichippocampal neurons cult ured in a 3D collagenhydrogel. Biomaterials 30 (2009) 4377– 4383.
[2]Anja Kunze, Michele Giugliano, Ana Valero a,PhilippeRenaud. Micropatterning neural cell cultures in 3Dwith a multi-layered scaffold. Biomaterials 32(2011)2088-2 098.

Fig5. 3D reconstructed neuronal circuits
免疫化学染色画像（Blue: Hoechst 33258、Green:MAP2）
Scale bars=100μm
3-2-2 3D neuronal circuits with multiple layers
PDMS マイクロチャンバにより細胞体の位置を制御した
結果神経突起の伸長方向を制御した多層での 3 次元脳回路を再構築することができた(Fig.6.A)。
構築した多層脳回路モデルの機能評価として Ca2+イメージングを行った。その結果、層間で活動が伝播している様子が観察された(Fig.6.B-b)。
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