ABML2011

OS2-4

2011年11月3日-5日 東京（芝浦工業大学）

脱細胞小口径人工血管の表面修飾と高開存性
Luminal surface modification and the patency of small-diameter acellular vascular grafts○山岡哲二（国循研セ）、三橋直人（国循研セ・鈴鹿医科大）、佐久間貴大（国循研セ・鈴鹿医科大）、森反俊幸（鈴鹿医科大）、藤里俊哉（大工大）、馬原淳（国循研セ）

Tetsuji YAMAOKA, National Cerebral and Cardiovascular Center (NCVC)
Naoto MIHARA and Takahiro SAKUMA, NCVC and Suzuka University of Medical Science
Toshiyuki MORITAN, Suzuka University of Medical Science
Toshiya FUJISATO, Osaka Institute of Technology
Atsushi MAHARA, NCVC
Abstract: We have been studying decellularization technology which involves the ultrahigh-hydrostatic pressure (UHP) at
1000MPa and the following washing process. Although, the decellularized aorta implanted to porcine resulted in excellent
result of the patency, neointima formation, and SMCs infiltration, slight calcification was found in rare case after the longperiod implantation. Especially, in the case of small-diameter aorta, the transplantation result was not satisfactory may be
due to the retarded endothelialization of the luminal surface. Actually, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)
did not adhere onto the acellularized tissue well. In this study, lunminal surface of the acellular small vascular bloodvessels was modified with an EC-affinity peptide sequence, (Pro-Hyp-Gly)7-REDV. The amount of HUVECs adhering
onto the surface was increased by the peptide modification. In addition, the patency in rat abdominal descending aorta
replacement system was also greatly improved.
Key Words: Acellular tissue, High pressure, Patency, vascular graft

1. 緒言

近年、同処理手法の小口径血管への適応を目指して、ラ

我が国においては、年間 60000 本以上の人工血管（PETット腹部下行大動脈を脱細胞処理して、同種同所性移植の製、PTFE 製、PU 製）が国内で使用され、16000 個の人工弁評価を続けてきたが、小口径の血管の移植後の開存性は必（機会弁と生体弁が約同数）が用いられている。いずれも、ずしも満足できるものではなかった。そこで、本研究では、優れた成績をおさめているが、合成材料やグルタールアル脱細胞血管内空面の血管内皮細胞親和性を向上させることデヒドにより架橋処理した動物由来材料から作成されていで、開存性に優れた小口径人工血管について検討した。

るこれらの非分解性心血管系医療部材では、抗凝固剤の必要性や、感染性、あるいは長期埋入時における石灰化が大きな問題となる。近年、多くの再生型組織の研究が進んで

2. 実験
2-1 血管表面のペプチド修飾いるが、自己組織へと置き換わることで、これらの多くの(Pro-Hyp-Gly)の７回繰り返し配列と REDV 配列を有する問題点が解決できると期待されている。一つの有望な戦略

オリゴペプチドと、コントロール配列を含む５種類のオリは、実際の組織から細胞成分を除去した「脱細胞組織」のゴペプチドを設計した。ブタの下行大動脈を 8mmx8mm に細利用であり、当センターでは平成 12 年より厚労科研費補助切し、1000MPa で 10 分間の UHP 処理により脱細胞処理を施金（北村惣一郎主任）のサポートを得て研究を開始した。

した。その後、脱細胞化組織は 10μM のオリゴペプチド溶

その後、等方静水圧印加処理を利用した心血管系組織の脱液に 60℃で 60 分間浸漬し徐冷した。

細胞化システムを構築し、その in vivo における性能を評
2-2 In vitro HUVEC 接着試験価してきた（Fujisato T et al. in “CardiovascularQ-Dot 625 により標識された正常ヒト臍帯静脈内皮細胞

Regeneration Therapies Using Tissue Engineering
Approaches (Mori H. and Matsuda H. Eds)”; 83-94 (2005)）。
具体的には、ブタ胸部下行大動脈血管やブタ肺動脈弁に対して、水系溶媒を媒体として 1 万気圧という高圧を印加することで細胞を処理し、その後の洗浄工程を経て、細胞破片を取り除駆手法である。この手法により、生体組織特有の力学的特性も保存されたまま、組織中のドナー由来細胞を除去できることが確認でき、同種移植手術で良好な結果（HUVEC）はオリゴペプチド溶液に浸漬した脱細胞化組織へと播種（2x105cells/tissue）し、37℃で 60 分間インキュベートした。PBS で洗浄後、接着している細胞を共焦点レーザー顕微鏡により観察し、その数を定量化するために、接着した細胞成分を Lysis buffer に溶解させて Q-dot 625の蛍光強度を定量した。
2-3 In vivo 移植実験が得られている。

In vivo でのオリゴペプチド修飾効果を検討するため、
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脱細胞化したラットの下行大動脈をオリゴペプチド溶液にインベージョンに基づくものと考えられ、その結果、安定浸漬し、その後 SD ラット（7-8 week old）に移植した。血な REDV ペプチドの固定化が行えたものと考えられる。

管の開存性は、MRI およびレーザードップラー解析により以上の結果よりオリゴペプチドによる修飾により血管評価した。移植後の組織再生の様子は、組織染色により評の開存率や組織再生能を向上させたことから、コラーゲン価した。

結合性オリゴペプチドにより脱細胞化組織を迅速に修飾できる可能性が強く示唆された。

3. 結果と考察(Pro-Hyp-Gly)の７回繰り返し配列と REDV 配列を含むオリゴペプチド溶液に浸漬した脱細胞化組織に対して細胞を播種した結果、表面に多くの接着細胞が観察された。また、溶解液の蛍光スペクトル測定から、約 80%程度の細胞が接着していることを確認した。一方でコントロール配列のオリゴペプチドを用いた場合や、オリゴペプチド溶液に浸漬しない場合では、接着細胞はほとんど観察されなかった（Figure 1）。また、繊維芽細胞を播種した場合には、配列特異的細胞接着は認められなかった。以上の結果より、オリゴペプチド溶液に脱細胞化組織を浸漬することで、表面に REDV 配列を修飾することが可能であり、配列特異的に内皮細胞が脱細胞化組織へ接着することが示された。

Figure 2 MRI images of abdominal aorta andvein after 1 month transplantation of thedecellularized blood vessels modified withPOG7G3REDV.

参考文献
(1)

Fujisato T, Minatoya K, Yamazaki S, Meng Y, Niwaya K,
Kishida A, et al. In: Mori H, Matsuda H, editors.

Figure 1. CLSM
images of Q-dot 625
labeled HUVEC
cells harvested onoligopeptide treateddecellularizedtissue. Scale bar is150μm.

Cardiovascular regeneration therapies using tissue
engineering approaches. Tokyo: Springer; 2005. P.83-94.
(2)

Mo X, An Y, Yun C-S, and Yu S.M, Nanoparticle-Assisted
visualization of binding interactions between collagenmimetic peptide and collagen fibers, Angew. Chem. Int. Ed
2006, 45, 2267-2270..

次いで、オリゴペプチドによる表面修飾効果について検討するため、オリゴペプチド溶液に浸漬した脱細胞化血管をラットの下行大動脈へ移植し、開存性ならびに組織再生について検討した。(Pro-Hyp-Gly)の７回繰り返し配列とREDV 配列を含むオリゴペプチド溶液で修飾された脱細胞化血管を移植した結果、移植後１か月において約 80%の割合で血管が開存していることが MRI 画像から示唆された（Figure 2）。さらに、組織染色の結果、移植血管の表面に再生した血管組織（平滑筋細胞と内皮細胞）が示された。
しかし、コントロール配列を用いた場合や非修飾の脱細胞化組織では 20～40%程度の開存率に留まり、有意な内皮化形成は認められなかった。コラーゲン模倣ペプチドである(Pro-Hyp-Gly)7 の優れた脱細胞組織親和性は、ストランド
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