Photon Factory Activity Report 2018 #36 (2019)

BL-6A/2016G058

低い pH が誘起する生体脂質膜の２分子膜液晶相から双連続単純キュービック相への相転移
Low-pH-Induced Lamellar to Bicontinuous Primitive Cubic Phase Transition inBiomembranes
岡俊彦 1,2, Moynul Hasan3, Md. Zahidul Islam3, Md. Moniruzzaman3, 山崎昌一 1,2,3,*
1
静岡大学 電子工学研究所, 2 静岡大学 理学研究科, 3 静岡大学創造科学技術大学院〒422-8529 静岡市駿河区大谷 836
1,2
Toshihiko Oka , Moynul Hasan3, Md. Zahidul Islam3, Md. Moniruzzaman3, Masahito Yamazaki1-3, *1
Research Institute of Electronics, 2Dept. Phys., Grad. Sci., 3Integrated Bioscience, Grad. Sci. andTech., Shizuoka University, 836 Oya, Suruga-ku, Shizuoka, 422-8529, Japan
1 はじめに生体膜や脂質膜の双連続キュービック相（QII 相）は 3 次元的に規則的につながった１枚の膜であり、その膜面は極小曲面を形成する。QII 相の構造を持つ膜は生体中でも見出されており、条件が変われば 2分子膜の液晶相 (Lα 相) に転換する例も知られている。
我々は、膜の表面電荷（負電荷を持つ脂質の膜内濃度、または膜界面に結合する荷電ペプチド濃度で制御）による静電相互作用 (EI) の変化により異なる QII相間の相転移や QII 相と Lα 相の多重層リポソーム(MLV)の間の相転移が誘起されることを発見し、系統的な研究を行ってきた [1]。たとえば、100 mM
NaCl を含む緩衝液中で pH を下げることにより、ジオレオイルホスファチジルセリン (DOPS)とモノオレイン (MO) の混合膜の Lα 相が QIID 相に相転移するが、これは EI による相転移の一例である [2]。DOPSや MO は細胞中の生体膜でも重要な脂質であり、pH変化は細胞中で生理的な役割を果たしているので、この膜系での研究は生理的に重要である。
この低い pH が誘起する Lα 相から QIID 相の相転移のキネティックスの研究のために、ストップトフローと放射光を組み合わせた時分割 X 線小角散乱法(TR-SAXS) を用いてこの相転移の研究を行った [3,4]。
100 mM NaCl 存在下では、低い pH にしてから 1 分以内に DOPS/MO (2/8) 膜は Lα 相からヘキサゴナル II(HII) 相に転移し、その後ゆっくり HII 相が QIID 相に転移した。それぞれの転移の速度定数を求め、初期過程（Lα 相から HII 相への転移）の速度定数は pH が高くなるにつれて小さくなることを見出した 。これはEI の変化による L相と QII 相の間の相転移のキネテ
ィックスの最初の実験結果である。さらに、この相転移の温度依存性を解析することによりそれぞれの素過程の活性化エネルギーを求めることに成功した[5]。
水溶液中の静電相互作用は水溶液中のイオン強度に大きく依存する。本研究では、低イオン強度における DOPS/MO (2/8) 膜の低い pH による相転移やそのキネティックスを研究し、高イオン強度下の相転移の結果と比較考察した [6]。
2 結果および考察
まず 50 mM NaCl を含む緩衝液中の DOPS/MO (2/8)
膜の構造の pH 依存性を SAXS を用いて調べた。中性では膜は Lα 相であったが（図 1a）、その中性の膜の懸濁液に低い pH の緩衝液を加えると、最終 pH が2.75 以下では膜は双連続単純キュービック相（QIIP相）（図 1b）に相転移した（図 1c）。低い pH でも塩濃度が高いときは別のキュービック相（QIID 相）が安定であった。たとえば、pH 2.6 の時は 75 mM
NaCl 以上(100 mM 以下)で QIID 相が安定であった。

図 1： DOPS/MO (2/8) 膜の構造の pH 依存性。(a) pH 6.7(b) pH2.55 の SAXS パターン。(c) QIIP 相の格子定数の pH依存性。50 mM NaCl 存在下。

Photon Factory Activity Report 2018 #36 (2019)

種々の pH の緩衝液にある DOPS/MO (2/8) 膜の温度を 25 C から 50 C まで 1 K/min の速度で上昇させ、その間の構造変化を PILATUS3 検出器を用いて測定した (Photon Factory BL6A)。図 2 は pH 2.55 の結果を示す。32 C で QIIP 相から HII 相に相転移が起こったが、50 C においても QIIP は少し共存した。QIIP 相の格子定数は 29 C まではほぼ一定で、それ以上の温度から減少したが、HII 相の格子定数は温度とともに減少した。pH 2.65 においても、ほぼ同様の温度依存性の結果を得た。

図 2：DOPS/MO (2/8) 膜の 25 ~50 C の温度変化に伴う相と構造の変化。pH 2.55。50 mM NaCl 存在下。

モニターした。図 3a は最終 pH が 2.65 で 25 C のときの結果を表す。混合後の初期は Lα 相の SAXS ピークのみが観測されたが、混合後 20 s 後から HII 相のピークが現れ始め、その強度は 100 s までは時間とともに増大し、その後減少した。200 s から QIIP 相のピークが現れ始め、時間とともに増大した。この結果は、50 mM NaCl を含む緩衝液中の DOPS/MO (2/8)
膜の低い pH が誘起する相転移では、まず最初の過程で Lα 相から HII 相への転移が急速に起こり、その後の過程で HII 相から QIIP 相へのゆるやかな転移が起こることを示している（図 3b）。
素過程の速度定数を定量的に比較するために、初期過程（Lα 相から HII 相への転移）と 2 番目の過程（HII 相から QIIP 相への転移）の速度定数を、SAXSのそれぞれの相のピーク強度の時間変化を NMF 法（非負値行列因子分解法）により解析することにより求めた。初期過程の速度定数は温度とともに大きく増大し、その温度変化の解析から見かけの活性化エネルギーを導出した（図 4a）。一方、２番目の過程の速度定数は温度とともに減少した（図 4b）。以上の結果を、活性化状態の自由エネルギーが温度依存的に変化する場合の相転移理論により解析し、定性的には実験結果を説明できることを明らかにした。

次に、図１の低い pH が誘起する Lα 相から QIIP 相の相転移のキネティックスパスウエイを解明するた
め に 、 TR-SAXS を 用 い て 研 究 し た (SPring-8,BL40B2)。50 mM NaCl を 含 む 緩 衝 液 中 で 中 性 のDOPS/MO (2/8)-MLV と低い pH の緩衝液をストップ
トフローにより急速混合し、低い pH にジャンプさせたときの相と構造の時間変化を TR-SAXS により(a)

図 4：相転移の速度定数の温度依存性。(A)は初期過程、(B)は 2 番目の過程。pH 2.55 (黒)、pH 2.65 (赤)。
(b)

図 3：低イオン強度下の低い pH による DOPS/MO (2/8)
膜の Lα 相から QIIP 相への相転移のキネティックスパス
ウエイ。(A) pH 6.7 から 2.65 に ジャンプさせたときのSAXS パターンの時間変化。50 mM NaCl 存在下。(B)この相転移のキネティックスパスウエイの模式図。

謝辞
図 14 は文献 [6] よりアメリカ化学会の許可を得て転載した。
参考文献[1] M. Yamazaki, Adv. Planar Lipid Bilayers Liposomes,9, 163, (2009)[2] Y. Okamoto et al., Langmuir, 24, 3400, (2008)[3] M. M. Alam et al. J. Chem. Phys. 134, 145102 (2011)[4] T. Oka et al., Langmuir, 30, 8131 (2014)[5] T. Oka et al., Langmuir, 32, 1327 (2016)[6] T. Oka et al., Langmuir, 33, 12487 (2017)* yamazaki.masahito@shizuoka.ac.jp