PRESS RELEASE

2023 年 12 ⽉ 25 ⽇

報 道 解 禁 日 時 ： なし（即時報道可）
配信

先：文部科学記者会、科学記者会、岡崎市政記者会、名古屋教育記者会

報道関係者各位
⼤学共同利⽤機関法⼈ ⾃然科学研究機構 ⽣命創成探究センター
⼤学共同利⽤機関法⼈ ⾃然科学研究機構 基礎⽣物学研究所
国⽴⼤学法⼈ 名古屋⼯業⼤学

分裂酵⺟の細胞機能を制御する有機⼩分⼦を開発―細胞内タンパク質の空間配置を誘導するシステムを確⽴―
発表の概要
今回、⾃然科学研究機構 ⽣命創成探究センター（ExCELLS：エクセルズ）／基礎⽣物学研究所 定量⽣物学研究グループの中村彰伸 研究員、杉⼭博紀 研究員、後藤祐平 助教、⻘⽊⼀洋 教授らは、名古屋⼯業⼤学⼤学院⼯学研究科の築地真也 教授との共同研究により、分裂酵⺟の細胞内で核や細胞膜に⾃発的に集積（局在化）する有機⼩分⼦「⾃⼰局在性リガンド」を開発し、分裂酵⺟の細胞内タンパク質の局在を強制的に移⾏誘導することで細胞機能を制御する化学遺伝学ツール（SLIPT システム）を確⽴することに成功しました。
本成果は、⽶国の学術誌「ACS Chemical Biology」に 2023 年 11 ⽉ 22 ⽇付けで発表されました。

1. 研究の背景
分裂酵⺟（Schizosaccharomyces pombe）は、真核単細胞⽣物であり、哺乳類細胞に類似する細胞分裂の様式を⽰すことから、さまざまな細胞機能の制御メカニズムを解明するための有⽤なモデル⽣物として広く⽤いられています。これまでに、分裂酵⺟では特定の遺伝⼦を⽋失させる遺伝⼦ノックアウトにより、その遺伝⼦がコードするタンパク質と細胞機能の関係が研究されてきました。しかし、遺伝⼦ノックアウトによるアプローチでは、致死性遺伝⼦の研究が困難であることや、時間分解能が低いという問題がありました。
そこで、まず本研究グループは、細胞内のタンパク質が特定の細胞内⼩器官（オルガネラ：例えば核、微⼩管、ゴルジ体、スピンドル極体など）に局在化することで、細胞機能を精密に制御していることに着⽬しました。この細胞内タンパク質の局在を、有機⼩分⼦を⽤いて、任意のタイミングで強制的に変えること（局在移⾏誘導）が可能になれば、⾼い時間分解能で細胞機能を制御するための強⼒なアプローチになるものと考えました。
これまでに、有機⼩分⼦を⽤いた細胞内タンパク質の局在制御の従来法として、２種類のタンパク質の⼆量体化を誘導する CID 法（Chemically-Induced Dimerization：⼆量体誘導化合物）が報告されています。しかし、この CID 法を分裂酵⺟で⽤いるためには、特定の遺伝⼦をノックアウトする必要があることや、分裂酵⺟の細胞機能が阻害されるという問題があります。また、１種類の標的タンパク質の局在移⾏を誘導するために、２つのタンパク質タグの発現を必要とします。
これらの問題を解決するために、本研究グループは、分裂酵⺟の細胞機能を阻害することなく、１つのタンパク質タグで標的タンパク質の局在を迅速に移⾏誘導することが可能な有機⼩分⼦ツールの新規開発に取組みました。
2. 研究の成果
本研究グループは、以前の研究注 1 で、ミリスチン酸に D 体システインを連結した化合物（mDc モチーフ）が、細胞膜に⾃発的に局在化することを⾒出しました。この mDc モチーフに、⼤腸菌由来ジヒドロ葉酸還元酵素（eDHFR）に特異的に結合するリガンドのトリメトプリム（TMP）を連結することで、細胞膜局在性 TMP（mDcTMP）を開発しました。この mDcTMP を、哺乳類細胞の培養液に添加すると、細胞膜を透過して細胞質に⼊り、ゴルジ体で D 体システイン側鎖にパルミトイル基が修飾（パルミトイル化）され、⼩胞輸送により細胞膜に局在化します。この細胞膜に局在化した mDcTMP に eDHFR が結合することで、eDHFR の細胞質から細胞膜への局在移⾏を誘導することが可能です。さらに、eDHFR のリガンド結合ポケットの近傍にリジン残基を６つ挿⼊することで開発した iK6DHFR タグによって細胞膜に局在する性質をさらに⾼めています。
本研究グループは、mDcTMP のように化合物単独で特定のオルガネラに局在化する有機⼩分⼦を「⾃⼰局在性リガンド」（self-localizing ligand; SL）と名付け、この⾃⼰局在性リガンドを⽤いた細胞内タンパク質の移⾏誘導系を SLIPT（SL-Induced Protein Translocation）システムと名付けました。
本研究では、哺乳類細胞⽤に開発したこの SLIPT システムが、分裂酵⺟にも適⽤できるかを評価するところから始めました（図１A）。まず、システイン残基のパルミトイル化機構が分裂酵⺟で保存されていること、および分裂酵⺟が TMP ⾮感受性であることに着⽬し、mDcTMP により、細胞機能を阻害することなく分裂酵⺟で iK6DHFR の細胞膜局在化を誘導できるものと考えました。そこで、実際に iK6DHFR に緑⾊蛍光タンパ
ク質 mNeonGreen（mNG）を連結した⼈⼯タンパク質（iK6DHFR-mNG）を安定発現する分裂酵⺟株を樹⽴し、共焦点レーザー顕微鏡を⽤いた同⼀視野のタイムラプスイメージングにより、mDcTMP 添加前後のiK6DHFR-mNG の細胞内局在の変化を観察しました。mDcTMP 添加前は、iK6DHFR-mNG は核内を含め細胞全体に拡散していますが、mDcTMP を添加すると、iK6DHFR-mNG は細胞膜へと局在化しました。
しかし、⻑時間のイメージングの結果、この mDcTMP による iK6DHFR-mNG の細胞膜局在化は 1〜2 時間後には解消し、細胞質へと戻ってしまうことが判明しました。本研究グループは、mDcTMP のアミド結合が、分裂酵⺟のプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）により切断されたことで、iK6DHFR の細胞膜局在化が解消したものと推測し、mDcTMP のプロテアーゼ耐性を⾼めた mDcTMP4Me を新たに設計・合成しました（図１B）。この mDcTMP4Me を⽤いることで、分裂酵⺟で iK6DHFR-mNG の細胞膜局在化を 12 時間以上持続させる
ヘ キ ス トことが可能となりました（図１C）。また、核局在化モチーフとして機能する蛍光⾊素Hoechstを TMP に連結することで開発した、核局在性 TMP（hoeTMP）を⽤いることで、iK6DHFR-mNG を細胞質から核内に移⾏誘導することにも成功しました（図１D,E）。

図１.分裂酵⺟⽤に最適化した SLIPT システム(A)細胞膜局在性の⾃⼰局在性リガンドを⽤いた iK6DHFR 融合タンパク質の細胞質から細胞膜への局在移⾏誘導の概略図。(B)リンカー部位の 4 箇所のアミド結合を N-メチル化することによりプロテアーゼ耐性を⾼めた細胞膜局在性 TMP（mDcTMP4Me）の分⼦構造。(C)プロテアーゼ耐性を⾼めた mDcTMP4Meを⽤いることで iK6DHFR-mNG の細胞膜局在化を 12 時間以上持続させることが可能。(D)核局在性 TMP（hoeTMP）の分⼦構造。(E) hoeTMP を⽤いることで iK6DHFR-mNG を細胞質から核内に移⾏誘導することが可能。

次に、分裂酵⺟の内在性タンパク質の細胞膜局在化による細胞機能制御に取組みました。細胞周期の進⾏を制御する重要なキナーゼタンパク質である Cdc2 を最初の標的タンパク質として選択し、cdc2 遺伝⼦の 3ʼ
末端に iK6DHFR-mNG 遺伝⼦を導⼊（ノックイン）した分裂酵⺟株を樹⽴しました。iK6DHFR-mNG を連結した内在性 Cdc2（Cdc2-iK6DHFR-mNG）の局在および細胞株の細胞周期は、野⽣型株とほぼ同⼀に保たれていました（図 2A,B）。この細胞株に mDcTMP4Me を添加すると、Cdc2-iK6DHFR-mNG が、核内から細胞膜に徐々に局在化し、分裂酵⺟の細胞⻑が⾮常に⻑くなる様⼦が観察されました（図 2C,D）。本結果は、核内で細胞周期の進⾏を制御していた核内 Cdc2 を強制的に細胞膜に局在化させたことで、Cdc2 の機能が阻害され、細胞周期の進⾏も阻害されたと考えられます。

図２.SLIPT による細胞周期の進⾏の阻害（A,B）mDcTMP4Me なしのときのタイムラプスイメージングと細胞⻑の経時変化。
（C,D）mDcTMP4Me 添加時のタイムラプスイメージングと細胞⻑の経時変化。

さらに、他の細胞周期の進⾏に関与する内在性タンパク質に iK6DHFR-mNG をノックインした 16 細胞株を新たに樹⽴しました。これら細胞株に mDcTMP4Me を添加すると、そのうち 12 個の細胞株で iK6DHFR-mNG連結タンパク質の細胞膜局在化を誘導することができました。さらに、培養を継続することで様々な表現型（細胞形態の変化、細胞死など）を誘導することに成功しました。また、mDcTMP4Me 添加前後の分裂酵⺟をタイムラプスイメージングで観察することで、表現型が現れるまでの過程を⾼い時間解像度で捉えることに成功しました。以上の結果より、mDcTMP4Me を⽤いた分裂酵⺟の内在性タンパク質の局在制御法が、さまざ
まな内在性タンパク質に起因する細胞機能を制御・解析するための汎⽤性の⾼いツールになるものと期待できます。

図 3. 致死性遺伝⼦ spg1 の働きを SLIPT により⾼い時間解像度で観察する。
（Ａ）Spg1 の細胞膜への局在変化（左）と、Spg1 の機能が阻害され 12 時間後に形態以上を⽰した細胞（右）。
（Ｂ）Spg1 の細胞質／スピンドル極体の局在が、細胞膜に強制的に移⾏誘導されることで、分裂酵⺟の細胞分裂が阻害され、多核化が起こり、細胞⻑が伸⻑し続けた後に細胞死に⾄る⼀連のプロセスをタイムラプスイメージングで観察することに成功した。

3. 本研究の課題と今後の展望
本研究では、分裂酵⺟の細胞内タンパク質の局在を、⾃⼰局在性リガンド（mDcTMP4Me, hoeTMP）を⽤いて化学遺伝学的に細胞膜や核内に移⾏誘導する SLIPT システムを確⽴することに成功しました。この SLIPTシステムを⽤いることで、分裂酵⺟内のさまざまな内在性タンパク質の局在を、1 リガンド・1 タンパク質の様式で移⾏誘導することが可能となり、また内在性タンパク質の強制的な局在移⾏を起点とする細胞機能制御に成功しました。
しかし、より迅速にタンパク質局在や細胞機能の制御を⾏うためには、さらなる改良が必要です。
mDcTMP4Me による iK6DHFR-mNG の細胞膜局在化は、哺乳類細胞では 5 分で完了しますが、分裂酵⺟では 30分掛かってしまいます。これは、分裂酵⺟が細胞壁を持つ⽣物であり、細胞外から細胞質への分⼦透過に時間が掛かっている可能性、あるいは分裂酵⺟に発現する薬剤トランスポーターによる有機⼩分⼦の排出の可能性が考えられます。この問題を解決するためには、mDcTMP4Me の細胞壁／細胞膜透過性をさらに⾼める必要があると考えられます。これにより、より早い時間スケールで進⾏する細胞機能の制御が可能になり、分裂酵⺟の細胞機能をより詳細に解析することが可能になると期待できます。また、本研究では、細胞膜と核を標的オルガネラとしましたが、原理的に局在化モチーフの交換により他のオルガネラを標的化することも可能になるものと考えられます。本研究グループは、先⾏研究で哺乳類細胞の微⼩管、ゴルジ体、⼩胞体といったオルガネラを標的化するための局在化モチーフを開発しています。今後は、分裂酵⺟⽤に局在化モチーフを最適化し、さまざまなオルガネラへのタンパク質局在化を制御することで細胞機能のオン／オフを緻密に制御するための基盤技術として展開したいと考えています。
注 1）https://doi.org/10.1021/acschembio.0c00014
4. ⽤語解説
CID 法：Chemically-Induced Dimerization 法、有機⼩分⼦化合物を⽤いたタンパク質⼆量体化技術。⼩分⼦化合物を添加する任意のタイミングでタンパク質の⼆量体化を誘導することができ、タンパク質の局在変化や活性を制御することができる。
モチーフ：有機⼩分⼦化合物内で特定の機能を持つ構造。mDc モチーフは細胞膜への局在化能をもつ。
リガンド：⽣体分⼦と結合して機能する⼩分⼦化合物。
5. 発表雑誌
雑誌名 ACS Chemical Biology
掲載⽇ 2023 年 11 ⽉ 22 ⽇
論 ⽂ タ イ ト ル ： Chemogenetic Manipulation of Endogenous Proteins in Fission Yeast Using a SelfLocalizing Ligand-Induced Protein Translocation
著者：Akinobu Nakamura, Yuhei Goto*, Hironori Sugiyama, Shinya Tsukiji, Kazuhiro Aoki*(*co-corresponding authors)
DOI： https://doi.org/10.1021/acschembio.3c00478
6. 研究グループ
本研究は、⽣命創成探究センター／基礎⽣物学研究所の⻘⽊ ⼀洋教授のグループ、名古屋⼯業⼤学の築地 真也教授との共同研究で⾏われました。
7. 研究サポート
本研究は、下記の補助⾦による⽀援を受けて実施されました。
l ⽇本学術振興会科研費・特別研究奨励費（19J01341：中村彰伸）
l ⽇本学術振興会科研費・若⼿研究（19K16050：後藤祐平）
l ⽇本学術振興会科研費・若⼿研究（22K15110：後藤祐平）
l 科学技術振興機構・ACT-X（JPMJAX22B8：後藤祐平）
l 住友財団・基礎科学研究助成（後藤祐平）
l ⽇本学術振興会科研費・特別研究奨励費（21J01354：杉⼭博紀）
l ⽇本学術振興会科研費・若⼿研究（22K15115：杉⼭博紀）
l 特定⾮営利活動法⼈酵⺟細胞研究会・地神芳⽂記念研究助成⾦（杉⼭博紀）
l ⽇本学術振興会科研費・新学術領域研究「分⼦夾雑の⽣命化学」（18H04546, 20H04706：築地真也）

l ⽇本学術振興会科研費・学術変⾰領域研究(A)「⽣物を陵駕する無細胞分⼦システムのボトムアップ構築学」（21H05226：築地真也）
l ⽣命創成探究センター共同利⽤研究（ExCELLS プロジェクト研究）（23EXC601-1：築地真也、⻘⽊
⼀洋）
l ⽇本学術振興会科研費・基盤研究(B)（22H02625：⻘⽊⼀洋）l ⽇本学術振興会科研費・新学術領域研究「情報物理学でひもとく⽣命の秩序と設計原理」（19H05798：⻘⽊⼀洋）l 科学技術振興機構・CREST（JPMJCR1654：⻘⽊⼀洋）
本研究に関するお問い合わせ先⽣命創成探究センター 定量⽣物学研究グループ
基礎⽣物学研究所 定量⽣物学研究部⾨教授 ⻘⽊ ⼀洋 （あおき かずひろ）
TEL: 0564-59-5235
E-mail: k-aoki@nibb.ac.jp
名古屋⼯業⼤学⼤学院⼯学研究科 ⼯学専攻（⽣命・応⽤化学領域）
教授 築地 真也（つきじ しんや）
TEL：052-735-5428
Email：stsukiji@nitech.ac.jp<報道担当>
⾃然科学研究機構 ⽣命創成探究センター 研究戦略室
TEL: 0564-59-5203
FAX: 0564-59-5202
E-mail: press@excells.orion.ac.jp
基礎⽣物学研究所 広報室
TEL: 0564-55-7628
FAX: 0564-55-7597
E-mail: press@nibb.ac.jp
名古屋⼯業⼤学 企画広報課
TEL：052-735-5647
Email：pr@adm.nitech.ac.jp