Photon Factory Activity Report 2014 #32(2015) BBL-6A/ 2013G076

膜タンパク質結晶化への利用を目指した脂質立方相の光誘起相転移の研究
Light-induced phase transition of lipid cubic phase for the use of membrane protein
crystallization
栗田晋吾 １, 伊平 寛１, 奧津哲夫１, 高橋 浩 2*
1
群馬大学大学院理工学府 分子科学部門, 〒376-8515 桐生市天神町 1-5-1
2
群馬大学大学院理工学府 理工学基盤部門, 〒371-8510 前橋市荒牧町 4-2
Shingo Kurita1, Hiroshi Ihira1, Tetsuo Okutsu1, Hiroshi Takahashi２*
1
Division of Molecular Science, Graduate School of Science and Technology,Gunma University, 1-5-1 Tenjin, Kiryu, 376-8515, Japan2
Division of Pure and Applied Science, Graduate School of Science and Technology,
Gunma University, 4-2 Aramaki, Maebashi, 371-8510, Japan

1 はじめに放射光源の高輝度化、高性能検出器の開発により微小なタンパク質結晶でも構造解析が可能となり、構造生物学は著しく発展した。しかしながら、主要な生体機能の多くを担う膜タンパク質に関する構造生物学は、それほど活発ではない。発展を妨げている最大のものは、膜タンパク質の結晶化の難しさである。
膜タンパク質の結晶化の方法として、脂質立方相を利用するものが注目されている[1]。これは、まず、立方相の構造を取っている脂質二重層に膜タンパク質を再構成し、その後、立方相がラメラ相（L相）に相転移させ、膜タンパク質の結晶化を促す方法である[1]。一般に、この相転移の誘起には、塩の脱水効果が利用されている。

図１：AZTMA の光異性化反応。
我々は、この脂質立方相を使う膜タンパク質の結晶化の効率化を目指し、分子形状が光化学反応で変化する界面活性剤を、脂質立方相に加えて、光照射を使って脂質の相を制御できないか検討してきている。利用した界面活性剤は、図１および図２に、化学 構 造 を 示 し た
4-Butylazobenzen-4'(oxyethyl)trimethyl-ammonium bromide)（AZTMA）で、この分子は、紫外(UV)線を照射すると二重結合部位が、trans から cis に変化し、可視光照射で元に戻る[2]。さらに、AZTMA のアルキル鎖の長さの異なる、他の３つの界面活性剤も用意した。これらのAZTMA 系界面活性剤を脂質モノオレインの立方相に加えた系の構造を調べるともに、光照射が立方相構造からラメラ構造への転移を引き起こすかを明らかにするのが、本研究の目的である。

図２：本研究で使用した物質の化学式。
2 実験
アルキル鎖の長さの異なる 4 種の光異性化界面活性 剤 ( 図 ２ ) 、 ４ -(Trimethylamioethoxy)
azobenzenebromide (C0), ４ -ethylazobenzene-4’(oxyethyl) trimethylammonium bromide (C2), 4butylazobenzen-4'-(oxyethyl)trimethylammoniumbromide) (C4, AZTMA), ４ -hexylzobenzene-4’(oxyethyl)trimethylammonium bromide (C6) は 、 文 献[3.4]の方法を参考に合成した。
AZTMA 系界面活性剤含有水溶液をモノオレインの粉末に加えて、自作のシリンジミキサーにより機Photon Factory Activity Report 2014 #32 (2015) B械的な攪拌により混合する方法でサンプルを作製した。加えた AZTMA 系界面活性剤の濃度はモノオレインに対して 7mol%の割合とした。
サンプルの光異性化反応を起こさせる光照射は、300W キ セ ノ ン シ ョ ー ト ア ー ク ラ ン プ（USHIO,UXL-300D）に、バンドパスフィルターを組み合わせてものを光源として行った。
偏光観察は、実体顕微鏡（Olympus，SZX9）に偏光フィルター（Olympus, SZX-AN）を組み合わせてクロスニコル条件で行った。
X 線 回 折 測 定 は 放 射 光 科 学 研 究 施 設 （ PhotonFactory； PF）の BL-6A で行われた。X 線検出器には、Ｘ線光子計数型 2 次元検出器 PILATUS 100K、ならびに、１M（Dectris、スイス）を使用した。カ
メラ長(約 1000 mm)は、ベヘン酸銀の回折データから決定した。露光時間は 60 秒であった。
3 結果および考察
AZTMA(C4)・モノオレイン系では、UV 光照射前、クロスニコル条件で観察すると光を通さない暗い偏光顕微鏡画像が、UV 光照射によって AZTMA をtrans 体から cis 体に光異性化させると、偏光が解消し、光が透過する明るい画像となった。このサンプルに可視光を照査し、AZTMA を再び trans 体に戻すと、元の暗い像に戻った。偏光を示さない状態は、系が等方的であり、立方相構造を取っていることを示唆し、偏光を示す明るい像は、ZTMA 系界面活性剤・モノオレイン混合系が、ラメラ構造を取ったことを示唆すると考えられる。
アルキル鎖長を変えた系の実験において、C0 系
では、UV 光照射は偏光に何らの影響も与えなかった。C2 系では UV 光照射は、C4 の AZTMA と比較すると少ない光透過量の増加しか観察されなかった。
これは C2 系では、相転移が起きにくいためと考えられる。C6 系では、UV 光照射有無にかかわらず最初から光透過が認められ、C6 の構造が trans 体、cis体にかかわらず常にラメラ構造を取っているものと推測された。
偏光観察の結果をまとめると、次のようになる。
アルキル鎖が短いと UV 光照射によって光異性化が起こっても系全体の相構造を変化させるには至らない。一方、アルキル鎖が長すぎるのも好ましくなく、C6 系では相構造の変化は起こっていないと推定される結果となった。光異性化反応をきっかけとして
相 構 造 を 起 こ す に は 、 AZTMA 系 界 面 活 性 剤 が7mol％の濃度では、C4 程度アルキル鎖長が最適であるといえる。
偏光観察によるものは推定であり、正確な構造は
X 線回折によって決定する必要がある。その結果は、
C0,C2,C4 系においては、偏光観察から推定された通りの構造変化が認められた。すなわち、C0,C2 の両系においては、UV 光照射の有無にかかわらず、Ia3d の空間群を持つ立方相の構造であった。ただ、C0 系では格子定数を含め全くの変化が、光照射の前後で認められなかったが、C2 系では、UV 光照射後の系で格子定数の減少が認められた。C4 である
AZTMA でも、偏光観察の予測通りで、UV 光照射
前は Ia3d の立方相の構造であったものが、照射後、繰り返し周期が 4.7nm のラメラ構造へ転移したことが X 線回折から確認できた。
しかしながら、C6 系においては、現時点で偏光観察と X 線回折の結果が一致しない状況となっている。偏光観察からはラメラ構造と UV 光照射前の状態で、C6 系のサンプルは Ia3d の立方相構造を示した（図３）。UV 光照射後では、図３に示したように、Ia3d の立方相構造の回折ピークに加えて、強度としては弱いが、約 5.2nm の繰り返し周期を持つラメラ構造に由来するピークが出現した（図３の矢印で示したピーク）。UV 光照射後、立方相の方の格子定数が減少することは、C2 系と同様であった。
偏光観察と X 線回折の結果の不一致の理由は不明
であるが、両実験において、光照射を全く同一な条件で実験することが実現できていないため、その点に関しては改善の必要がある。
いずれにせよ、AZTMA 系界面活性剤・モノオレイン混合系の光異性化反応による構造変化は、AZTMA 系界面活性剤のアルキル鎖の長さに依存することが明らかとなった。

図３：モノオレイン/C6 系の回折像。黒線：UV 光照
射前。青線：UV 光照射後。照射前の構造は、そのピーク位置（図の上の赤い線）の比から Ia3d の空間群を持つ立方相であることが分かる。照射後、弱いながら矢印で示したラメラ構造に由来すると思われるピークが出現した。
参考文献[1] G. Rummel et al., J. Struct. Biol. 121 82 (1998).
[2] A. Matsumura et al., Langmuir 27 1610 (2010).
[3] J. Ruchmann et al., Macromolecules 44 604 (2011).
[4] T. Hayashita et al., Colloid Polym. Sci. 272 1611
(1994).
* hirotakahashi@gunma-u.ac.jp