第回

68

2 0 16（平成 28 年度）

日本生物工学会大会講演要旨集

第 68 回

日本生物工学会大会
講演要旨集

二〇一六（平成会期2016 年 9 月 28 日（水）～ 30 日（金）会

場 富山国際会議場（富山市大手町 1 番 2 号）

ANA クラウンプラザホテル富山（富山市大手町 2 番 3 号）

第 68 回日本生物工学会大会講演要旨集
2016 年 8 月 25 日発行
発行所◦ 表紙写真について（左より）◦

おわら風の盆 , 黒部峡谷鉄道 , 雨晴海岸 , 雷鳥 , みくりが池 , 黒部ダム

日本生物工学会

公益社団法人 日本生物工学会〒 565-0871 大阪府吹田市山田丘 2-1
大阪大学工学部内
TEL. 06-6876-2731 FAX. 06-6879-2034
E-mail: info@sbj.or.jp
http://www.sbj.or.jp

年度）

28

公益社団法人日本生物工学会

第 68 回
日本生物工学会大会プログラム（2016）
一般講演・シンポジウム
会 期会 場

2016 年 9 月 28 日（水）〜 30 日（金）富山国際会議場（富山市大手町 1 番 2 号 )ANA クラウンプラザホテル富山（富山市大手町 2 番 3 号）

授賞式典・受賞講演
日会

時場

2016 年 9 月 28 日（水）9：00 〜 11：15
富山国際会議場 3 階 メインホール（A 会場）（生物工学奨励賞・アジア若手賞の講演日程については大会日程表をご覧下さい）

懇 親 会
日
会

時
場

2016 年 9 月 28 日（水）18：30 〜 20：30
ANA クラウンプラザホテル富山 3 階 鳳

ランチョンセミナー期 間会 場

2016 年 9 月 28 日（水）〜 30 日（金）富山国際会議場 3 階 A 会場
ANA クラウンプラザホテル富山 3 階 C, D, E 会場

展 示 会
期 間
会 場

2016 年 9 月 28 日（水）〜 30 日（金）富山国際会議場 3 階 展示会会場（ホワイエ）

英語論文の書き方セミナー
日
会

時
場

2016 年 9 月 28 日（水）16：00 〜 17：30
富山国際会議場 2 階 B 会場

生物工学若手研究者の集い（若手会）総会・交流会 2016
日
会

時
場

2016 年 9 月 29 日（木）18：30 〜 20：30
ANA クラウンプラザホテル富山 3 階 鳳

公益社団法人日 本 生 物 工 学 会

TEL. 06-6876-2731 FAX. 06-6879-2034
E-mail: info@sbj.or.jp
http://www.sbj.or.jp

目

次

大会日程表 ………………………………………………………………………………………… （3）会場案内図 ………………………………………………………………………………………… （5）実行委員会担当者表 ……………………………………………………………………………… （8）受賞者一覧 ………………………………………………………………………………………… （9）ポスター発表日程・演題番号表・講演番号の見方 ……………………………………………（10）プログラム
第 1 日目

授賞式・受賞講演，シンポジウム，一般講演 ………………………………（11）第 2 日目

受賞講演，シンポジウム・招待講演，若手会口頭発表，一般講演 ………（27）

第 3 日目一般講演（午前），シンポジウム，一般講演（午後）………………………（46）要旨
第 1 日目

受賞講演 …………………………………………………………………………（77）シンポジウム ……………………………………………………………………（79）一般講演 …………………………………………………………………………（91）

第 2 日目

受賞講演 ……………………………………………………………………… （141）
シンポジウム・招待講演 …………………………………………………… （143）
一般講演 ……………………………………………………………………… （169）

第 3 日目一般講演（午前） …………………………………………………………… （219）シンポジウム ………………………………………………………………… （265）
一般講演（午後） …………………………………………………………… （279）

人名索引 ………………………………………………………………………………………… （323）キーワード索引 ………………………………………………………………………………… （340）
ランチョンセミナープログラム ……………………………………………………………… （355）
ランチョンセミナー要旨 ……………………………………………………………………… （357）2016 年 9 月 1 日（木）～ 11 月 24 日（木）まで
大会 HP（http://www.sbj.or.jp/2016/abstract/）
で 講 演 要 旨 集 E-PUB 版 の ダ ウ ン ロ ー ド が 可 能 に
なります。

3

大会日程表
9 月 28 日（水）会場

A 会場
（国際会議場 3 階）

午 前
9:00-11:15

昼
11:45-12:45

授賞式・受賞講演（功労賞，生物工学賞，功績賞）[L] タカラバイオ株
式会社

午

後

13:30-15:30

16:00-18:00[S] 培養計測技術の最近のトピックス【本部企画】[S] 生物工学研究者の生命情報との向き合い方〜バ

Ｂ会場（国際会議場 2 階）

イオインフォマティクス入門から応用へ〜[L] 株式会社島津製作所

Ｃ会場（ANAクラウンプラザ3階）

英語論文の書き方セ
ミナー（〜 17:30）[IS]Toward Sustainable Palm Oil Industry
Coexisting with Environmental and Biodiversity
Conservation[IS]Biotechnology of Enzymes in Aldoxime-Nitrile
Pathway from Microorganisms, Plants and Animals《ERATO Asano Active Enzyme Molecule Project》

Ｄ会場（ANAクラウンプラザ3階）[L] 株式会社エー
ビー・サイエックス

Ｅ会場（ANAクラウンプラザ3階）

18:3020:30

懇親会[S] 遺伝子改変技術によるセルエンジニアリングの革新：産業応用に向けて

ポスター会場 I（国際会議場 2 階）
ポスター会場 II（ANA クラウンプラザ 3 階
ASUKA）

ポスター発表

9 月 29 日（木）会場

A 会場
（国際会議場 3 階）
Ｂ会場
（国際会議場 2 階）

午 前
9:00-11:00（～ 11:30）

昼
11:45-12:45[S] 学会活動が先導する実用化研

代議員会（11:40-12:45）

究・技術〜学会は産官学の出会いの場となれるか〜

午
13:0013:20

分析科学の新たな展開[L] 株式会社シクロ
ケムバイオ[IS]Japan-Korea Joint Symposium

若手会口頭発表

若手会総
会・交流会

[IS]10th Japan-Korea Biomass
Symposium[L] ヒューマン・メ受賞講演 [S] 微生物の潜在能力に注目した有用
タボローム・テクノ（斎藤賞） 二次代謝産物の「ものづくり」戦略
ロジーズ株式会社

ポスター会場 I（国際会議場 2 階）
ポスター会場 II（ANA クラウンプラザ 3 階
ASUKA）

ポスター発表

9 月 30 日（金）会場

午 前
9:00-11:00

A 会場（国際会議場 3 階）

後

13:00-15:00

15:30-17:30[S] 酒類製造における革新技術【本部企画】[S] 生命ビッグデータの利活用による生物工学のイ

Ｂ会場（国際会議場 2 階）

ノベーション[L] サーモフィッ

シャーサイエンティフィック株式会社

Ｃ会場（ANAクラウンプラザ3階）[IS]Gap Filling of Metabolic Pathway andApplication to Producing Valuable Compounds[S] 和食の機能性のメカニズム〜生活習慣病予防，Ｄ会場（ANAクラウンプラザ3階）

腸内細菌へのインパクト〜[L] 日本ウォーター

Ｅ会場（ANAクラウンプラザ3階）
ポスター会場 I（国際会議場 2 階）
ポスター会場 II（ANA クラウンプラザ 3 階
ASUKA）

午

昼
11:30-12:30[L] 東ソー株式会社

ズ株式会社

ポスター発表

S：シンポジウム IS：国際シンポジウム L：ランチョンセミナー

18:3020:30

受賞講演 [S]2D/3D プリンタを用いる細胞操作（照井賞） の可能性

受賞講演
Ｄ会場
Advancements in Medical[L] アジレント・テ（アジア（ANAクラウンプラザ3階） Engineering Using Nano- andクノロジー株式会社若手賞）
Micro-biotechnology （〜 11:30）
Ｅ会場[S] 新規な核酸関連酵素の開発と（ANAクラウンプラザ3階） その産業応用

16:00-18:00[S] バイオエンジニアリングにおける産業創出に向けて〜[IS]Artiﬁcial Molecular Design toCreate Neobiological Molecules

13:30-15:30

受賞講演 [S] 有用微生物の農作物への新しい展（江田賞） 開とその将来像[S] 植物代謝工学研究最前線〜新Ｃ会場（〜 11:30）（ANAクラウンプラザ3階）
協賛：AMED「革新的バイオ医
薬品創出基盤技術開発事業」

後[S] セルフリー（無細胞）タンパク質合成技術の新展開

ポスター発表5

会場への交通案内【JR 富山駅より】
市内電車（セントラム）…約 7 分

駅構内の「路面電車富山駅」→「国際会議場前」下車

バス…約 5 分「城址公園前」下車 徒歩 3 分
タクシー…約 5 分
徒歩…城址大通りを南へ約 15 分
【富山空港より】タクシー…約 20 分
バス（空港連絡バス）…約 25 分 「総曲輪（そうがわ）」下車 徒歩 2 分【高速道路（北陸自動車道）より】
富山 IC より約 10 〜 15 分

国道 41 号線を富山駅方面に北上

a

6

会場案内
【富山国際会議場】

7【ANA クラウンプラザホテル富山】

8

第 68 回日本生物工学会大会（2016）
実行委員会・業務分担（○：責任者）
実行委員長

伊藤 伸哉

総務

○木元 久・西島 謙一・戸田 弘

会計○内田 博之・牧野 祥嗣・小谷 真也

広報○清水 一憲・戸田 弘

プログラム○本多 裕之・中野 秀雄・伊藤 伸哉・金原 和秀・堀 克敏・中川 智行・
西島 謙一・田丸 浩・岩崎 雄吾・加藤 竜也・清水 一憲・加藤 竜司・
金岡 英徳・兒島 孝明

会場○三宅 克英・末 信一郎・濱野 吉十・野崎 功一・仁宮 一章・
松崎 千秋・馬場 保徳

シンポジウム○中野 秀雄・朴 龍朱・本多 裕之・伊藤 伸哉・中川 智行・堀 克敏・
中村 剛

受付

○冨田 昌弘・河原崎 泰昌・牧野 祥嗣

授賞式○金原 和秀・近藤 徹弥・加藤 竜也

展示・ポスター○鈴木 徹・加藤 康夫・吉田 豊和・星野 一宏・里村 武範

懇親会○高木 昌宏・櫻井 明彦・米田 英伸

クローク○田口 悟朗・高橋 裕里香・高野 真希

若手交流会○小栁 喬・清水 一憲・加藤 竜司・戸田 弘

ランチョンセミナー○田丸 浩・嶋村 隆・大久保 勉・山口 庄太郎・伊藤 伸哉

会議室

○戸田 弘

顧問

浅野 泰久・飯島 信司・宇多川 隆

9日本生物工学会 2016 年度受賞者

去る 5 月 19 日，理事会が開催され，本年度の受賞者が決定しましたのでお知らせ申し上げます．
■第 35 回 生物工学賞 園元 謙二（九州大学大学院農学研究院・教授）「アプローチをデザインするスマート発酵工学の基盤研究」■第 10 回 生物工学功績賞 本多 裕之（名古屋大学大学院工学研究科・教授）「短鎖ペプチドの新機能発現に関する研究」■第 10 回 生物工学功労賞 坂口 正明（サントリースピリッツ（株）商品開発研究部・スペシャリスト）「産学連携活動の新規提案と推進による学会の活性化」■第 10 回 生物工学功労賞 松井 和彦（味の素（株）研究開発企画部 兼 コーポレート戦略部・上席理事）「産学連携活動の活性化策の検討と企画・運営」■第 49 回 生物工学奨励賞（江田賞） 伊藤考太郎（キッコーマン（株）研究開発本部・チームリーダー）「しょうゆ醸造に寄与する麹菌由来グルタミナーゼに関する研究」■第 52 回 生物工学奨励賞（斎藤賞） 松浦 友亮（大阪大学大学院工学研究科・准教授）「セルフリータンパク質合成系を用いた進化分子工学技術の開発」■第 39 回 生物工学奨励賞（照井賞） 河原 正浩（東京大学大学院工学系研究科・准教授）「キメラ受容体による細胞運命制御系の構築とライブラリー選択への応用」■第 25 回 生物工学技術賞
該当者なし■第 13 回 生物工学アジア若手賞（Young Asian Biotechnologist Prize） Dr. Choowong Auesukaree（Mahidol University, Thailand）

Molecular mechanisms underlying yeast adaptive responses to environmental stresses and pollutants■第 5 回 生物工学アジア若手研究奨励賞（The DaSilva Award） Dr. Uschara Thumarat（Prince of Songkla University, Thailand）

Biochemical characterization and molecular engineering of recombinant cutinases and carboxylesterase from athermophilic actinomycete, Thermobifida alba AHK119■第 24 回 生物工学論文賞
1）古屋 俊樹 *・下島 洋・木野

邦器（早稲田大学，* 現，東京理科大学）
Alteration of the substrate speciﬁcity of cytochrome P450 CYP199A2 by site-directed mutagenesis

2）高木 博史 1・橋田 恵介 1・渡辺 大輔 1・那須野 亮 1・大橋 正孝 2・伊波 朋哉 3・鼠尾まい子 3・塚原 正俊 3
（1 奈良先端科学技術大学院大学，2 奈良県産業振興総合センター，3 株式会社バイオジェット）

Isolation and characterization of awamori yeast mutants with l-leucine accumulation that overproduce isoamyl
alcohol3）Mohamed Ali Abdel-Rahman1,2・Yaotian Xiao1・田代 幸寛 1・Ying Wang1・善藤 威史 1・酒井 謙二 1・園元 謙二 1
（1 九州大学，2Al-Azhar University, Egypt）
Fed-batch fermentation for enhanced lactic acid production from glucose/xylose mixture without carbon catabolite
repression4）稲生 崇規 *・河邉 佳典・山城 拓郎 **・亀山雄二郎 ***・汪雪・井藤彰・上平 正道（九州大学，* 現，テバ製薬，** 現，日医工，*** 現，医薬品医療機器総合機構）
Improved transgene integration into the Chinese hamster ovary cell genome using the Cre-loxP system5）佐藤 俊輔・丸山 裕之・藤木 哲也・松本 圭司 *（（株）カネカ，* 現，大阪大学大学院工学研究科 カネカ基盤技術協働研究所）
Regulation of 3-hydroxyhexanoate composition in PHBH synthesized by recombinant Cupriavidus necator H16
from plant oil by using butyrate as a co-substrate6）南畑 孝介 *・前田 泰一 **・山口 哲志・石原 亘 ***・石渡 晟 ****・高森 智史 *****・山平 真也・長棟 輝行（株）キッコーマン，*** 現，（株）長瀬産業，**** 現，（株）グリコ，***** 現，（東京大学，* 現，九州大学，** 現，（株）ユニリーバー）

Photosensitizer and polycationic peptide-labeled streptavidin as a nano-carrier for light-controlled proteintransduction■第 5 回 生物工学学生優秀賞（飛翔賞）
1）Ellen（東北大学）「大腸菌の K 取込み輸送体の解析」
2）西川 洋平（早稲田大学）「マイクロドロップレットによる単一微生物からの効率的な全ゲノム増幅法の開発」
3）劉 秋実（名古屋大学）「ウイルス表層機能ペプチドを提示する細胞質内送達用ナノキャリアの開発」
4）石井 友理（関西学院大学）「酢酸菌を宿主とした効率的タンパク質発現系の構築」
5）白米 優一（愛媛大学）「ポリ -γ- グルタミン酸バイオシステムの新たな生理機能と応用に関する研究」
6）安達 桂香（九州大学）「Clostridiales 目細菌群のクオラムセンシングとクオラムクエンチングに関する研究」

10

ポスター発表日程・演題番号表
ポスター発表日 ： 9 月 28 日（水）〜 30 日（金）（各演題掲示時間は 9 月 28 日（水）・29 日（木）は 10：00 〜 18：00，
30 日（金）の午前のセッションは 29 日（前日）の 18：15 〜翌 30 日 11：00，同日午後のセッション
は 11：15 〜 17：30 まで）
会場： ポスター会場Ｉ（国際会議場 2 階），ポスター会場 II（ANA クラウンプラザホテル 3 階 ASUKA)
発表・討論時間 ：（1 〜 2 日目） 奇数番号 16:00 〜 17:00
偶数番号 17:00 〜 18:00（3 日目午前） 奇数番号 9:00 〜 10:00
偶数番号 10:00 〜 11:00（3 日目午後） 奇数番号 15:30 〜 16:30
偶数番号 16:30 〜 17:30

11

第 1 日（9 月 28 日）
太字の一般講演は今年度の生物工学学生優秀賞（飛翔賞）受賞者の発表です．
開始時間

講演番号

演

発表者氏名（所属）題○印は講演者を示す

授賞式・受賞講演（生物工学功労賞，生物工学賞，生物工学功績賞）
富山国際会議場

3 階 A 会場（メインホール）（9:00～11:15）

授賞式（9:00～9:50）
9:00

会長挨拶

9:05

KSBB 会長挨拶

9:10

名誉会員，功労会員推戴
各賞授賞

9:20
10:00

1A-Aa01〈生物工学功労賞〉
産学連携活動の新規提案と推進による学会の活性化...................................................................................................... ○坂口 正明（サントリースピリッツ）

10:05

1A-Aa02〈生物工学功労賞〉
第 10 回生物工学功労賞受賞にあたって.................................................................................................................................. ○松井 和彦（味の素）

10:15

1A-Aa03

座長：五味 勝也

〈生物工学賞〉

アプローチをデザインするスマート発酵工学の基盤研究............................................................................. ○園元 謙二 1,2（1 九大院・農, 2 九大・バイオアーク）
10:50

1A-Aa04

座長：木野 邦器

〈生物工学功績賞〉

短鎖ペプチドの新機能発現に関する研究.......................................................................................................................... ○本多 裕之（名大院・工）シンポジウム（午後の部）
培養計測技術の最近のトピックス【本部企画】
富山国際会議場

3 階 A 会場（メインホール）（13:30～15:30）

はじめに........................................................................................................................................................ 児島 宏之

13:30

座長：児島 宏之
13:35

1S-Ap01

人工光型植物工場の課題と将来性........................................................................ ○古在 豊樹（植物工場研究会（特定非営利活動法人））

14:05

1S-Ap02

再生医療のための細胞操作および培養技術...................................................................................................................... ○福田 淳二（横国大院・工）

座長：富田 悟志

14:35

休憩

12

座長：安原 貴臣
14:55

1S-Ap03

キャピラリー電気泳動－質量分析計（CE/MS）を用いた抗体産生の評価.............................................................. ○東條 繁郎（ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ）
おわりに.................................................................................................................................................... 佐久間 英雄

15:25

生物工学研究者の生命情報との向き合い方～バイオインフォマティクス入門から応用へ～
富山国際会議場

2 階 B 会場（特別会議室）（13:30～15:30）

はじめに............................................................................................................................................................ 蟹江 慧

13:30

座長：牧野 智宏
13:32

1S-Bp01

遺伝疫学データに基づく DNA メチル化と生活習慣病の関係........................................... ○中杤 昌弘 1, 市原 佐保子 2, 山本 健 3, 大中 佳三 4, 松原 達昭 5, 横田 充弘 6
（1 名大病院・先端医療, 2 三重大院・地域イノベーション学, 3 久留米大・医・医化学,
4

九大院・医・老年医学, 5 愛知学院大・歯・内科学, 6 愛知学院大・歯・ゲノム情報応用診断学）
座長：牧野 智宏

13:55

1S-Bp02

高速 DNA シークエンシングとバイオインフォマティクスを駆使した転写制御ネットワーク解析........................................................................................... ○兒島 孝明, 中野 秀雄（名大院・生命農学）

14:18

1S-Bp03

アミノ酸物性指標を用いたペプチドインフォマティクスの可能性........................................................................................ ○蟹江 慧 1, 伊藤 圭祐 2, 本多 裕之 3, 加藤 竜司 1

座長：牧野 智宏

（1 名大院・創薬科学, 2 静県大院・薬食生命, 3 名大院・工）
座長：牧野 智宏
14:41

1S-Bp04

バイオ産業におけるメタボロームデータの利活用.............................................................................................................. ○緒方 法親（日本バイオデータ）
座長：牧野 智宏

15:04

1S-Bp05

ヒト常在性ビフィズス菌種と宿主との親和性について........................................... ○小田巻 俊孝 1, 堀米 綾子 1, 菅原 宏祐 1, 南 淳一 2, 阿部 文明 2, 清水 金忠 1
（1 森永乳業 基礎研, 2 森永乳業 素材研）
おわりに........................................................................................................................................................ 兒島 孝明

15:27

Toward Sustainable Palm Oil Industry Coexisting with Environmental and Biodiversity Conservation〈国際シンポジウム〉
ANA クラウンプラザホテル富山
13:30

3 階 C 会場（13:30～15:30）

Keynote....................................................................................................................................................... Kenji Sakai
座長：Kenji Sakai

13:35

1S-Cp01

Promotion of green economy with palm oil industry for biodiversity conservation in Malaysia............................................................................................................................................○Yoshihito Shirai（Grad. Sch. Life Sci. Syst. Eng., Kyushu Inst. Technol.）13

座長：Kenji Sakai
13:55

1S-Cp02

Process integration and zero emission system in the palm oil mill.......................................................................................................... ○Mohd Ali Hassan 1, Yoshihito Shirai 2（1 Dept. Bioprocess Tech., Faculty of Biotech., Univ. Putra Malaysia,2

Dept. Biol. Functions Eng, Grad. Sch. Life Sci. Sys. Eng., Kyushu Inst. Tech.,）
座長：Kenji Sakai

14:15

1S-Cp03

Utilization of oil palm biomass for acetoin production using engineered Escherichia coli............ ○Mohd Zulkhairi Mohd Yusoff 1,2, Hironaga Akita 1, Nobutaka Nakashima 3,4, Tamotsu Hoshino 1,3（1 Res. Inst. Sustainable Chem. AIST, 2 Dept. Bioprocess Technol, UPM, 3 Bioproduction Res. Inst. AIST,
4

Dept. of Biological Information, Tokyo Inst. Technol.）
座長：Yoshihito Shirai

14:30

1S-Cp04

Waste biotransformation and accelerating recycle in oil palm industry....................................... ○Yukihiro Tashiro 1, Clament Chin Fui Seung 1, Mohd Ali Hassan 2, Kenji Sakai 1（1 Fac. Agr., Kyushu Univ., Japan, 2 Universiti Putra Malaysia, Malaysia）
座長：Yoshihito Shirai

14:50

1S-Cp05

Bacterial community analysis as a tool in assessing the pollution due to palm oil mill effluent............................. ○Norhayati Ramli 1, Siti Suhailah Sharuddin 1, Diana Mohd-Nor 1,2, Mohd Ali Hassan 1,
Yoshihito Shirai 2, Toshinari Maeda 2, Kenji Sakai 3（1 Dept. of Bioprocess Technol., Fac. Biotechnol Biomol. Sci., UPM,
2

Grad. Sch. Life Sci. Syst. Eng., Kyushu Inst. Technol., 3 Fac. Agric., Kyushu Univ.）
座長：Yoshihito Shirai

15:10

1S-Cp06

Effects of land-use gradient changes on biodiversity in tropical rainforest of Borneo................................................................................... ○Charles Vairappan 1, Tin- Hoe Seng 1, Jaya Seelan 1,
Kishneth Palaniveloo 1, Yukihiro Tashiro 2, Kenji Sakai 2（1 ITBC, Univ. Malaysia Sava, 2 Fac. Agric., Kyushu Univ.）

Biotechnology of Enzymes in Aldoxime-Nitrile Pathway from Microorganisms, Plants and Animals〈ERATO Asano Active Enzyme Molecule Project 国際シンポジウム〉
ANA クラウンプラザホテル富山

3 階 D 会場（13:30～15:30）
座長：Yasuhisa Asano

13:30

1S-Dp01

Access and use of fern hydroxynitrile lyase for biocatalysis...................... ○Anton Glieder 1, Elisa Lanfranchi 2, Margit Winkler 2, Karl Gruber 3, Thea Pavkov-Keller 3（1 NAWI, Inst. Mol. Biot., Graz. Univ. Tech., 2 ACIB GmbH, Graz, 3 Inst. Mol. Biosc., Univ. Graz）
座長：Yasuhisa Asano

14:10

1S-Dp02

Hydroxynitrile lyases and enzymes related to mandelonitirle metabolism in plants and animals........ ○Yuko Ishida 1,2, Yasuhisa Asano 1,2（1 Biotechnol. Res. Center, Toyama Pref. Univ., 2 ERATO, JST）

14:35

1S-Dp03

Engineering nitrile hydratase by salt-bridges and disulfide-bridges................................ ○Huimin Yu 1,2,3, Song Jiao 1,2, Ji Yang 1,2, Jing Zhang 1,2, Jie Chen 1,2, Zhongyao Shen 1

座長：Yasuhisa Asano（1 Dept. Chem. Eng., Tsinghua Univ., China, 2 Key Lab Indust. Biocatal., ME., China,
3Cent. Synt. Syst. Biol., Tsinghua Univ., China）
座長：Yasuhisa Asano

15:05

1S-Dp04

Aldoxime dehydration in the (bio)synthesis of nitriles........................................................................................................ ○Richard Metzner 1,2, Yasuhisa Asano 1,2（1 Biotechnol. Res. Center, Toyama Pref. Univ., 2 ERATO, JST）

14

遺伝子改変技術によるセルエンジニアリングの革新：産業応用に向けて
ANA クラウンプラザホテル富山

3 階 E 会場（13:30～15:30）

はじめに........................................................................................................................................................ 河原 正浩

13:30

座長：河原 正浩
13:33

1S-Ep01

ゲノム編集の最新方法論.................................................................................................................. ○佐久間 哲史（広島大院・理）

13:52

1S-Ep02

iPS 細胞での効率的なゲノム編集を目指した CRISPR ツールボックス......................................................................................... ○堀田 秋津 1,2（1 京大・CiRA, 2 京大・iCeMS）

座長：河原 正浩

座長：河原 正浩
14:11

1S-Ep03

ゲノム操作工学によるバイオ医薬品高生産細胞株構築技術の開発....................................................................................................... ○河邉 佳典, 上平 正道（九大院・工）14:30

1S-Ep04

細胞の遺伝子改変による創薬プラットフォームの開発.......................................................................................................................... ○河原 正浩（東大院・工）

座長：河邉 佳典

座長：河邉 佳典
14:49

1S-Ep05

遺伝子改変技術を支援するベクターの開発と疾患治療の実用化........................................................................... ○峰野 純一（タカラバイオ株式会社 CDM センター）

15:08

1S-Ep06

遺伝子治療の安全性評価―ゲノム編集技術の応用における留意点―.................................................................................................................. ○佐藤 陽治（国立医薬食衛研）

座長：河邉 佳典

おわりに........................................................................................................................................................ 河邉 佳典

15:27

一般講演
富山国際会議場

2 階ポスター会場 I（16:00～18:00）【酵素学，酵素工学】
16:00

1P-1p001

進化工学的手法を用いた立体選択的カルボニルレダクターゼの熱安定性・有機溶媒耐性の向上........................................... ○小野 智博 1, 井上 瑞葉 1, 岡野 憲司 1, 出来島 康方 2, 川端 潤 2, 本田 孝祐 1
（1 阪大院・工, 2 三菱化学科学技術研究セ）

17:00

1P-1p002

Methylobacterium extorquens AM1 のメタノール脱水素酵素のアイソザイムに関する研究........................................... ○一小路 貴士 1, 矢野 裕之 1, 中川 智行 2, 谷 明生 3, 田中 三男 1, 三井 亮司 1
（1 岡山理大・理, 2 岐阜大・応生科, 3 岡山大・資源植物科研）

16:00

1P-1p003

Methylobacterium extorquens AM1 による植物生理活性物質の分泌と植物共生......................................................... ○田中 美知留, 矢野 裕之, 田中 三男, 三井 亮司（岡山理大・理）

17:00

1P-1p004

Aspergillus aculeatus 由来 FAD 型グルコースデヒドロゲナーゼホモログの機能解析............................................................. ○岡 修司, 谷 修治, 炭谷 順一, 川口 剛司（阪府大院・生環科）

16:00

1P-1p005

Cordyceps militaris 由来リボヌクレオチドレダクターゼの発現及び機能解析.................................. 小島 康弘 1, ○加藤 竜也 1,2, 朴 龍洙 1,2（1 静大・農, 2 静大グリーン科学技術研）

17:00

1P-1p006

Aspergillus oryzae 由来 D-乳酸脱水素酵素（D-LDH）のアロステリック特性.................................................................................... ○渡部 昭, 佐藤 陽子, 五味 勝也（東北大院・農）

16:00

1P-1p007

超好熱性アーキアにおける NAD+熱分解産物の代謝機構..............................................○蜂須賀 真一 1, 佐藤 喬章 1,2, 跡見 晴幸 1,2（1 京大院・工, 2 JST, CREST）

15

17:00

1P-1p008

病原菌由来 S46 ペプチダーゼの酵素学的諸性質の解明........................................... ○伊藤 康広 1, 鈴木 義之 1, 志田 洋介 1, 阪本 泰光 2, 田中 信忠 3, 小笠原 渉 1（1 長岡技科大, 2 岩手医科大・薬, 3 昭和大・薬）

16:00

1P-1p009

Burkholderia 属細菌由来アセチルコリンエステラーゼ組換え体の諸性質解析と農薬検出系への応用.............................. ○北村 智彬 1, 藤本 拓哉 1, 泊 直宏 2, 山本 佳宏 2, 鶴岡 直樹 3, 茂里 康 4, 渡部 邦彦 1（1 京府大院・生命環境, 2 京産技研, 3 産総研・生物プロセス, 4 産総研・健康工学）

17:00

1P-1p010

麹菌由来イソプリメベロース生成酵素を用いた新奇オリゴ糖の生産................................................................................... ○松沢 智彦, 矢追 克郎（産総研・生物プロセス）

16:00

1P-1p011

GH5_8 マンナナーゼの熱安定化メカニズムの解明........................................... ○熊谷 祐也 1,2, 裏地 美杉 1, Wan Kun 1, 奥山 正幸 2, 木村 淳夫 2, 畑中 唯史 1
（1 岡山生物研, 2 北大院・農）

17:00

1P-1p012

乳酸菌 Leuconostoc mesenteroides 由来不溶性グルカンの細菌型 α-1,3-グルカナーゼによる加水分解.......................... ○矢野 成和 1, 難波 孝行 2, 玉木 友理 2, 残間 寿美香 1, 今野 博行 1, 立木 隆 3, 若山 守 3（1 山形大院・理工, 2 山形大・工, 3 立命館大・生命科学）

16:00

1P-1p013

A structurally novel chitinase from the hyperthermophilic archaeon, Thermococcus chitonophagus.............................................. ○Tamotsu Kanai 1,2, Ayumi Horiuchi 1, Mehwish Aslam 1, Haruyuki Atomi 1,2（1 Grad. Sch. Eng., Kyoto Univ., 2 CREST, JST）

17:00

1P-1p014

Streptomyces thermodiastaticus 由来耐熱、好酸性キチナーゼの諸性質の検討.......................................................... ○武 慶太郎 1, 藤木 英寿 1, Suyotha Wasana 2, 高木 一好 1, 若山 守 1（1 立命館大院・生命科学, 2 Dept. of Ind. Biotechnol., Grad. Agro-ind, Prince of Songkla Univ.,）

16:00

1P-1p015

Streptomyces 属放線菌由来の 2 つの β-D-ガラクトフラノシダーゼの比較........................................... ○松永 恵美子 1, 八色 奈央 1, 豊田 早紀 1, 岡 拓二 2, 樋口 裕次郎 1, 竹川 薫 1（1 九大院・農, 2 崇城大・生物生命）

17:00

1P-1p016

Bacillus 属細菌由来ピルビン酸化ガラクトース含有糖鎖分解酵素の諸性質の解析............................................................................ ○松藤 仁美, 樋口 裕次郎, 竹川 薫（九大院・生資環）

16:00

1P-1p017

Kitasatospora sp. MK-1785 株由来マルトトリオース生成アミラーゼ L191R 変異酵素の X 線結晶構
造解析...................... ○殘華 智子, 西村 重徳, 谷 修治, 炭谷 順一, 川口 剛司（阪府大院・生環科・応生科）

17:00

1P-1p018

ハイマンノース型糖鎖を有する Aspergillus glaucus MA0196 由来アスパルティックプロテアーゼの特性解析............................................... ○竹中 慎治 1, 林 理希 1, 仙波 弘雅 1, 田中 耕生 1, 吉田 健一 1, 土居 幹治 2
（1 神戸大院・農・応生, 2 マルトモ）

16:00

1P-1p019

Ruminiclostridium josui 由来のフェルラ酸エステラーゼ Fae1A および Fae1B の酵素特性......................................................... ○間宮 愛, 粟冠 真紀子, 木村 哲哉, 粟冠 和郎（三重大院・生資）

17:00

1P-1p020

酵素法によるアルギニンからの 3-ヒドロキシオルニチンおよび trans-3-ヒドロキシプロリンの合成...................................................................................... ○原 良太郎 1, 北辻 早希 2, 山縣 海 2, 木野 邦器 1,2（1 早大・理工研, 2 早大・先進理工）

16:00

1P-1p021

ヒスチジン水酸化酵素の特性解析と組換え大腸菌による 3-ヒドロキシヒスチジン生産........................................ ○中島 悠太 1, 原 良太郎 2, 木野 邦器 1,2（1 早大・先進理工, 2 早大・理工研）

17:00

1P-1p022

リジン水酸化酵素発現大腸菌を利用したヒドロキシリジン生産プロセスの開発............................................. ○木内 愛海 1, 原 良太郎 2, 山縣 海 1, 三宅 良磨 3,4, 川端 潤 3,4, 木野 邦器 1,2（1 早大・先進理工, 2 早大・理工研, 3 三菱化学科学技術研究センター,
4

16:00

1P-1p023

エーピーアイコーポレーション）

シトクロム P450 BM3 と補酵素再生系の近接配置による酵素反応................................................................................ ○畠山 真由美 1, 野北 昂志 1, 北岡 卓也 2, 一瀬 博文 2（1 九大院・生資環, 2 九大院・農）

17:00

1P-1p024

固定化酵素を利用したバニリン合成........................................ ○古屋 俊樹 1,2, 黒岩 麻里 1, 木野 邦器 1（1 早大・先進理工, 2 東理大・理工）16【タンパク質工学】
16:00

1P-1p025

タンパク質工学と代謝系改変によるコリン応答転写スイッチの超高感度化...................... ○鈴木 紳一郎, 星野 孝幸, 河合（野間） 繁子, 斎藤 恭一, 梅野 太輔（千葉大院・工）17:00

1P-1p026

タンパク質工学による Talaromyces cellulolyticus 由来セロビオハイドロラーゼの耐熱化.......................................................... ○蒲池 沙織, 井上 宏之, 松鹿 昭則, 星野 保, 石川 一彦（産総研）

16:00

1P-1p027

糸状菌 Aspergillus nidulans における新規ポリ-ADP リボース加水分解酵素の生理的役割......................................................... ○渡邊 美紀, 宮地 雄大, 平野 澪, 山本 竜也, 志水 元亨, 加藤 雅士

17:00

1P-1p028

Endocytic Transport of Amyloid beta-42 in the presence of Oxidized Derivatives of Cholesterol...................................................................... ○Neha Sharma 1, KeangOK Beak 1, Huong Thi Thanh Phan 2,（名城大・農）Naofumi Shimokawa 1, Masahiro Takagi 1（ Sch. Mater. Sci., JAIST, 2 Hanoi Natl Univ. of Educ.）
1

16:00

1P-1p029

嗅覚受容体の匂い分子応答に対するシトクロム P450 の効果....................................... ○浅川 賢史 1, 福谷 洋介 1, Savangsuksa Aulaphan 1, 松波 宏明 2, 養王田 正文 1
（1 農工大院・工, 2 Dept. of Molecular Genetics and Microbiology, Duke Univ. Medical center）

17:00

1P-1p030

カイコ‐ＢｍＮＰＶ バクミド発現系で発現させたブタ由来リラキシン関連因子の効率的精製と構造解析.....................................○石崎 真章 1, 加藤 竜也 1,2, Park Sungjo 3, Terzic Andre 3, 高坂 哲也 1, 朴 龍洙 1,2（1 静大院・農・応生化, 2 静大グリーン科技研, 3 メイヨー医科大）

16:00

1P-1p031

ケラチン分解酵素の機能不明 C 末端ドメインの機能解析................................................................................ ○杉田 愼之助, 大政 健史, 古賀 雄一（阪大院・工）17:00

1P-1p032

ブレビバチルスによる細胞内タンパク質の可溶性発現........................................................................................ ○植野 陽平, 花方 寛, 宮内 明（ヒゲタ醤油研）

16:00

1P-1p033

Cupriavidus 属細菌由来ベンゼンジオキシゲナーゼの発現及び機能解析............................................................... ○島袋 美波 1, 浜口 慎也 1, 渡邊 仁 1, 野口 恵一 2, 養王田 正文 1
（1 農工大院・工, 2 農工大・機器分析セ）

17:00

1P-1p034

アミノ酸モノオキシゲナーゼ変異体の合理的設計........................................................................ ○森 裕太郎, 白井 智量, 近藤 昭彦（理研・バイオマス）

16:00

1P-1p035

Geobacter 属細菌由来還元的脱ハロゲン化酵素の異種発現系構築と補因子の再構成............................................................................ ○中村 龍貴, 野島 良太, 養王田 正文（農工大院・工）17:00

1P-1p036

新規抗マラリア薬標的タンパク質、PfERC の結晶化用試料の調製...................................................................................... ○平岡 修 1, 坂本 沙祐里 2, 洲崎 悦子 1,2, 杉山 成 3（1 就実大・薬, 2 就実大院・医療薬, 3 阪大院・理）

16:00

1P-1p037

麹菌由来の両親媒性タンパク質 ハイドロフォービンの機能評価........................................... ○安藤 祐人 1, 中野 宏軌 1, 石倉 幹大 1, 陶山 友彰 2, 藤田 夏美 2, 中島 春紫 2
（1 明治大院・農, 2 明治大・農）17:00

1P-1p038

小胞体内在分子シャペロン Calnexin と PDI ファミリータンパク質間相互作用の解析............................................................................................... ○中尾 仁美, 迫野 昌文（富山大院・理工）【発酵生理学，発酵工学】
16:00

1P-1p039

Lactococcus lactis における高温下での Cit 生産メカニズムの解明................................................. ○山本 恵理, 渡部 玲子, 古市 圭介, 浅見 幸夫（明治・食機能科学研）

17:00

1P-1p040

新たな芳香族アミン化合物の発酵生産系の構築.................................................................................... ○生井 智仁 1, 桝尾 俊介 2, 茂本 亮輔 1, 高谷 直樹 2
（1 筑波大院・生命環境, 2 筑波大・生命環境系）

17

16:00

1P-1p041

コリスミ酸ピルビン酸リアーゼ発現コリネ型細菌を用いたプロトカテク酸の生産................................................................................... ○岡井 直子 1, 三好 孝則 2, 竹嶋 康誠 1, 田中 耕生 3,
吉田 健一 1, 桑原 広明 2, 荻野 千秋 4, 近藤 昭彦 1
（ 神戸大・科技, 帝人, 3 神戸大・自科・研究環, 4 神戸大院・工）
1

17:00

1P-1p0422

酢酸発酵における酢酸菌の膜結合型アルデヒド脱水素酵素 AldFGH の役割................................................................................... ○福成 聖也 1, 新納 俊 1, 児玉 知大 1, 松谷 峰之介 2,
片岡 尚也 1,2,3, 藥師 寿治 1,2,3, Theeragool Gunjana 4, 松下 一信 1,2,3（ 山口大・農, 山口大院・創成科学, 3 山口大・中高温微セ, 4 カセサート大・理）
1

16:00

1P-1p043

2

Corynebacterium glutamicum の耐熱性における浸透圧の影響......... ○村田 龍太郎 1, Nawarat Nantapong 2, 松谷 峰之介 1, 片岡 尚也 1,3,4, 藥師 寿治 1,3,4, 松下 一信 1,3,4（1 山口大院・創成科学, 2 スラナリー工科大, 3 山口大・農, 4 山口大・中高温微セ）

17:00

1P-1p044

アミノ酸と C4-ジカルボン酸が酢酸菌 Acetobacter pasteurianus の耐熱性に与える影響................................................. ○中西 里菜 1, 松谷 峰之介 1, 片岡 尚也 1,2,3, 藥師 寿治 1,2,3, 松下 一信 1,2,3（1 山口大院・創成科学, 2 山口大・農, 3 山口大・中高温微セ）

16:00

1P-1p045

酸素抑制条件下におけるコリネ型細菌の糖消費速度と細胞内酸化還元レベルの相関................................................................ ○柘植 陽太 1,2, 植松 君夫 1, 山本 省吾 1, 須田 雅子 1, 乾 将行 1,3（1 RITE, 2 金沢大・新学術, 3 奈良先端大・バイオ）

17:00

1P-1p046

PHB 蓄積時の Halomonas sp. KM-1 の代謝物解析....................................................................... ○松下 功 1, 盤若 明日香 1, 西村 拓 1, 坪田 潤 1, 河田 悦和 2
（1 大阪ガス, 2 産総研）

16:00

1P-1p047

Thermophilic ethanol fermentation by genetically engineered Moorella thermoacetica............................ Rahayu Farida, Auto Kawai, Yuki Iwasaki, Akihisa Kita, Takahisa Tajima, Junichi Kato,○Yutaka Nakashimada（Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.）

17:00

1P-1p048

根粒菌 Bradyrhizobium diazoefficiens における D-ピペコリン酸代謝経路の解析......................................................................... ○堀木 雅文, 日比 慎, 高橋 里美, 小川 順（京大院・農）

16:00

1P-1p049

Acetobacter 属酢酸菌における酢酸過酸化能発現メカニズム...................................................... ○佐々木 大樹 1, 石川 森夫 1, 鈴木 敏弘 1, 今井 健太郎 1, 吉田 将也 1,
山本 有紀 1, 松原 拓哉 1, 兼崎 友 2, 吉川 博文 2,3, 貝沼（岡本） 章子 1
（ 東京農大・応生科・醸造, 2 東京農大・ゲノムセ, 3 東京農大・応生科・バイオ）
1

17:00

1P-1p050

静置発酵で醸造した米酢に含まれるポリアミン類........................................................... ○加藤 彩織 1, 赤坂 直紀 2, 石井 友理 1, 佐古田 久雄 2, 藤原 伸介 1
（1 関西学院大院・理工, 2 マルカン酢）

16:00

1P-1p051

ブタノール生産菌におけるリファンピシン耐性変異株の特性解析..................................................... ○信木 公介, 清 啓自, 川嶋 草平, 門倉 利守, 鈴木 健一朗, 中山 俊一（東農大院・農）17:00

1P-1p052

Citrobacter braakiiTB-96 株による廃グリセロールからの 1,3-プロパンジオール生産における最適培
養系の構築........................................................................................ ○野中 大輔 1, 森田 峻秀 2, 清 啓自 2, 中島 敏明 2
（1 筑波大, 2 筑波大院・生命環境）

16:00

1P-1p053

Citrobacter braakii TB-96 株におけるバイオディーゼル廃グリセロールからの 1,3-PD 収率の向上......................................................... ○森田 峻秀, 清 啓自, 野中 大輔, 瀬田 幸平, 鈴木 敏弘, 中島 敏明

17:00

1P-1p054

ギ酸による高 1,3-プロパンジオール生産菌 Citrobacter braakii TB-96 株の増殖抑制................................................................... ○清 啓自 1, 森田 峻秀 1, 野中 大輔 2, 瀬田 幸平 1, 中島 敏明 1

（筑波大院・生命環境）（1 筑波大院・生命環境, 2 筑波大）

18

【代謝工学】
16:00

1P-1p055

低 Ca 環境でもメタノールに生育できる Methylobacterium zatmanii の メタノール脱水素酵素の性質について.................................................................... ○Wang Lun 1, 菅沼 宗矢 1, 谷 明生 2, 早川 享志 1, 中川 智行 1
（1 岐阜大・応生科, 2 岡山大・資源植物科研）

17:00

1P-1p056

Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110 由来 REE 依存型メタノール脱水素酵素の酵素化学的諸性質....................................................................................... ○菅沼 宗矢 1, 王 倫 1, 日比野 歩美 1, 三井 亮司 2,
谷 明生 3, 海老原 章郎 1, 早川 享志 1, 中川 智行 1
（1 岐阜大・応生科, 2 岡山理大・理, 3 岡山大・資源植物科研）

16:00

1P-1p057

ナイロンオリゴマー分解菌 Arthrobacter sp. KI72 における 6-アミノヘキサン酸代謝系の同定........................................... ○竹原 一起 1, 谷本 悠樹 1, 藤井 翼 1, 加藤 太一郎 2, 武尾 正弘 1, 根来 誠司 1
（1 兵庫県大院・工, 2 鹿児島大院・理工）

17:00

1P-1p058

代謝改変した大腸菌による好気培養条件での酪酸生産................................................................ ○片岡 尚也 1,2,3, Vangnai Alisa S. 4, 藥師 寿治 1,2,3, 松下 一信 1,2,3（1 山口大・農, 2 山口大院・創成科学, 3 山口大・中高温微セ, 4 チュラロンコン大）

16:00

1P-1p059

好熱性水素細菌 Hydrogenobacter thermophilus TK-6 のヒドロゲナーゼ機能の解析............................................................... ○井上 達也 1, 平野 伸一 2, 松本 伯夫 2, 石井 正治 1, 新井 博之 1
（1 東大院・農生科, 2 電中研）

17:00

1P-1p060

硫黄代謝関連遺伝子の改変による大腸菌のシステイン発酵生産性の向上................................................. ○河野 祐介 1, 仲谷 豪 2, 西口 みゆ 2, 鶴岡 愛 2, 高木 博史 2, 大津 厳生 1,2（1 筑波大・国際産学連携本部, 2 奈良先端大・バイオ）

16:00

1P-1p061

大腸菌 nudH 遺伝子の機能解析とシステイン発酵生産への応用.................................................................. ○石井 寛子 1, 鶴岡 愛 2, 河野 祐介 1, 高木 博史 2, 大津 厳生 1,2（1 筑波大・国際産学連携本部, 2 奈良先端大・バイオ）

17:00

1P-1p062

大腸菌における硫黄源のカタボライト抑制機構の解明.......................................................... ○西口 みゆ 1, 城山 真恵加 1, 河野 祐介 2, 高木 博史 1, 大津 厳生 1,2（1 奈良先端大・バイオ, 2 筑波大・国際産学連携本部）

16:00

1P-1p063

好熱性水素細菌 Hydrogenobacter thermophilus TK-6 におけるチオ硫酸酸化代謝の解析................................................... ○小倉 一将 1, Dahl Christiane 2, 三本木 至宏 3, 新井 博之 1, 石井 正治 1
（1 東大院・農生科, 2 Inst. Microbiol. Biotechnol., Univ. Bonn, 3 広島大院・生物圏）

17:00

1P-1p064

代謝経路解析に基づく定常期にコハク酸を生産する大腸菌の開発.................................................................................... ○戸谷 吉博, 白木 孝典, 清水 浩（阪大院・情報）

16:00

1P-1p065

Shewanella 属細菌において新たに発見された CRP/cAMP 制御系の生理機能とその制御機構の解明............................................................................ ○笠井 拓哉, 高妻 篤史, 渡邉 一哉（東薬大院・生科）

17:00

1P-1p066

メバロン酸生産大腸菌の細胞内代謝状態の定量的な評価..................................................................... ○永井 暉, 戸谷 吉博, 松田 史生, 清水 浩（阪大院・情報）

16:00

1P-1p067

バイオプロセス効率化に向けた合成クオラムセンシングと代謝トグルスイッチによる大腸菌表現型の可塑的制御...................................................................... ○相馬 悠希 1, 花井 泰三 2（1 九大・生医研, 2 九大院・農）

17:00

1P-1p068

メタボリックトグルスイッチを用いた γ-アミノ酪酸生産............................................................... ○藤原 由梨 1, 中川 拓弥 2, 鶴野 圭悟 3, 相馬 悠希 4, 花井 泰三 3
（1 九大・農, 2 九大院・生資環, 3 九大院・農, 4 九大・生医研）【醸造学，醸造工学】
16:00

1P-1p069

ストレス環境におけるアルコール発酵力の改善を目指した酵母 RIM15 遺伝子のプロモーター改変....................................... ○渡辺 大輔 1, 金子 亜紀江 2, 杉本 幸子 1, 大貫 慎輔 2, 高木 博史 1, 大矢 禎一 2
（1 奈良先端大・バイオ, 2 東大院・新領域）

19

17:00

1P-1p070

清酒酵母の機能性アミノ酸蓄積変異株の分離と醸造特性の解析......................................................................................................... ○大橋 正孝 1, 渡辺 大輔 2, 高木 博史 2
（1 奈良産振セ・バイオ・食品グループ, 2 奈良先端大・バイオ）

16:00

1P-1p071

VID24 遺伝子変異の接合型を指標としたリンゴ酸高生産酵母の育種................................................................. ○根来 宏明, 小高 敦史, 松村 憲吾, 秦 洋二（月桂冠・総研）

17:00

1P-1p072

光トラッピング細胞融合法を用いた融合酵母によるホエー由来醸造飲料の開発......................... ○山畑 直樹 1, 田口 耕造 2, 若山 守 1（1 立命館大院・生命科学, 2 立命館大院・理工）

16:00

1P-1p073

酢酸イソアミル高生産酵母における ATF1 発現制御機構.................................................. ○大原 佑介, 猿渡 通代, 高橋 俊成, 山田 翼, 末野 和男（菊正宗酒造）

17:00

1P-1p074

国酒酵母の特異性....................................................................... ○森谷 千星, 門倉 利守, 金井 里紗, 義盛 光代, 安藤 周輝,
数岡 孝幸, 中山 俊一, 竹田 正久, 田中 尚人, 鈴木 健一朗（東農大応生科・醸造）

16:00

1P-1p075

ピルビン酸低減清酒酵母 TCR7 の異数性染色体と醸造特性..................................................................................... ○田口 誠我 1, 澤田 和敬 3,4, 浜島 弘史 2, 赤尾 健 5,
野口 秀樹 6, 豊田 敦 6, 藤山 秋佐夫 6,7, 北垣 浩志 2,3（1 佐賀大院・農, 2 佐賀大・農, 3 鹿児島大院・連農科,
4

佐賀県工技セ, 5 酒総研, 6 遺伝学研, 7 総研大・遺伝）

17:00

1P-1p076

超音波照射下における酵母 Saccharomyces cerevisiae の増殖促進機構の解明......................................... ○江口 夏帆, 胡 宏海, 野口 明徳, 小栁 喬（石川県立大院・生資環・食品）

16:00

1P-1p077

有機酸生成低減変異株 DNPR89 の網羅的遺伝子発現解析....................................................................................... ○山元 翔太 1, 清 啓自 1, 久保田 恵理 2, 兼崎 友 2,
矢嶋 俊介 2, 門倉 利守 1, 鈴木 健一朗 1, 中山 俊一 1
（1 東農大・応生科・醸造, 2 東農大・ゲノムセ）

17:00

1P-1p078

香気成分改変焼酎開発のための酵母の探索及び育種................................................. ○蕪 卓弥, 山本 佳奈子, 西森 大貴, 門倉 利守, 鈴木 健一朗, 中山 俊一

16:00

1P-1p079

酵母における TTC 還元に関与する因子の特定......................................................... ○田中 純平, 門倉 利守, 鈴木 健一朗, 中山 俊一（東農大院・農）

17:00

1P-1p080

清酒麹菌 A. oryzae 由来 ΔocpO の酒質特性と ACP アイソザイム遺伝子の発現..................................................................... ○山下 伸雄, 玉田 佳大, 浅井 拓也, 明石 貴裕（白鶴酒造）

16:00

1P-1p081

白麹菌グリコシルセラミドがヒト表皮角化初代培養細胞の皮膚バリア機能の遺伝子発現に及ぼす影（東農大・応生科・醸造）

響の解析.......................................................... ○藤川 彩美 1, 阪本 真由子 1, 松永 陽香 1, 酒谷 真以 1, 尾上 貴俊 2,
北村 整一 2, 鍔田 仁人 2, 浜島 弘史 1, 戸田 修二 3, 北垣 浩志 1
（1 佐賀大・農, 2 東洋新薬, 3 佐賀大・医）17:00

1P-1p082

沖縄県の自然界から採取した黒アスペルギルス菌の分子系統解析....................................... 伊勢 孝太郎 1, 鼠尾 まい子 1, 東 春奈 1, 渡邉 泰祐 2, 外山 博英 3, ○塚原 正俊 1
（1 バイオジェット, 2 日大・生資科, 3 琉球大・農）

16:00

1P-1p083

清酒オリゴペプチドに関与する米グルテリンタンパク質の米粒内局在解析................................................................................................ ○高橋 圭, 河野 弘美, 奥田 将生（酒総研）【食品科学，食品工学】
17:00

1P-1p084

植物エキス発酵飲料に含まれるアミノ酸................................................................................ ○川添 直樹, 山森 昭, 岡田 秀紀（大高酵素・総研）

16:00

1P-1p085

大豆可溶化のための大豆ボディ構造体に関する研究........................................................................................... ○橋本 恭兵, 笠井 尚哉（阪府大院・生環科）

20

17:00

1P-1p086

未熟練 QDA パネリストによる官能評価値のフードメタボロミクスへの運用の提案................. ○冨尾 紋子 1, 早川 文代 2, 福﨑 英一郎 1（1 阪大院・工・生命先端, 2 農研機構・食品研）

16:00

1P-1p087

メタボローム解析による GABA 含有発酵乳に含まれるユニークな代謝産物の探索............................................................................ ○萩 達朗, 小林 美穂, 野村 将（農研機構・畜産部門）

17:00

1P-1p088

パン生地発酵過程における代謝産物変化............................................................................ ○中村 敏英, 冨田 理, 齋藤 勝一（農研機構・食品研）

16:00

1P-1p089

麹甘酒とその乳酸発酵物のメタボローム解析........................................................................................ ○倉橋 敦 1, 小黒 芳史 1, 西脇 俊和 2, 小林 和也 2
（1 八海醸造・研究開発, 2 新潟農総研・食研セ）

17:00

1P-1p090

乳酸発酵甘酒の水溶性成分および揮発性成分のプロファイル解析............................................................................ ○冨田 理, 齋藤 勝一, 中村 敏英（農研機構・食品研）

16:00

1P-1p091

酒類を対象とした LC/MS による多成分解析.......................................................................... ○中西 豪 1, 行平 大地 2（1 島津製作所, 2 ライフィクス）

17:00

1P-1p092

固相誘導体化法を用いた黒コショウの GC/MS メタボローム解析............................... ○恩田 浩幸 1, 杉立 久仁代 2, 佐々野 僚一 3, 松尾 俊介 3, 佐川 岳人 1, 福﨑 英一郎 4（1 エスビー食品, 2 アジレント・テクノロジー, 3 アイスティサイエンス, 4 阪大院・工・生命先端）

16:00

1P-1p093

短期熟成試験味噌中のアンジオテンシン I 変換酵素阻害物質の精製および解析................................................... ○北川 学 1, 多田 孝清 2, 山田 南実 1, 春野 玲弥 2, 東 隆行 2, 小池 祥悟 1
（1 マルコメ, 2 KRI）

17:00

1P-1p094

ポリアミン高含有納豆製造に向けた大豆品種の比較.................................................................... ○小林 和也, 堀井 悠一郎, 渡辺 聡（新潟農総研・食研セ）

16:00

1P-1p095

S-アデノシルメチオニン高生産清酒酵母における肝細胞保護作用................................................. ○信田 亮太 1, 金井 宗良 2, 藤井 力 2（1 八海醸造・研究開発, 2 酒総研）

17:00

1P-1p096

乳酸菌と酵母で発酵させた風味の良い液性ぬか床の開発...................................................... ○小野 浩, 西尾 翔子, 岩谷 和輝, 小澤 幸央, 河本 哲宏（東海漬物）

16:00

1P-1p097

小麦ふすまの各種長時間・複セルラーゼ処理............................................................................................... ○柴田 晃, 笠井 尚哉（阪府大院・生環科）

17:00

1P-1p098

酸味受容体(ASICs)タンパクをセンサーとした電気生理学的アッセイ法による酸味抑制物質のスクリーニング.................................................................................... ○玉村 朋大 2, 柴田 泰宏 1, 塚本 義則 2, 鵜川 眞也 1（1 名市大院・医, 2 中部大院・応生）

16:00

1P-1p099

Leuconostoc mesenteroides NTM048 株が産生する免疫賦活能を有する菌体外多糖........................................... ○松﨑 千秋 1, 早川 あすか 1, 松本 健司 2, 加藤 紀彦 3, 山本 憲ニ 1, 久 景子 4
（1 石川県大・生物資源研, 2 石川県大・生資環, 3 京大院・生命, 4 日東薬品工業）

17:00

1P-1p100

原料および発酵方法の異なるビール中の代謝物および香気成分の分析.................................................................................... ○杉立 久仁代 1, 関口 桂 1, 行平 大地 2, 中村 貞夫 1
（1 アジレント・テクノロジー, 2 ライフィクス）

16:00

1P-1p101

腸管 IgA 産生を増強する Lactobacillus antri の細胞壁成分の解析............................................................................................ ○寅本 拓 1, 山崎 思乃 2, 國澤 純 3, 片倉 啓雄 2
（1 関西大院・理工, 2 関西大・化生工, 3 医薬健栄研）【環境浄化，修復，保全技術】
17:00

1P-1p102

セシウム蓄積細菌の探索およびセシウム蓄積変異株の作成......................................................................... 吉岡 潤一, 渡辺 剛, 松本 貴良, ○林 秀謙（前工大・工）

16:00

1P-1p103

線虫を用いた土壌中の Cs 吸収菌の回収プロセスの構築................................................................... ○合田 亮 1, 伊藤 みさご 1, 星 英之 2, 倉橋 健介 3, 徳本 勇人 1
（1 阪府大院・工・化工, 2 阪府大院・現シス, 3 阪府大高専）

21

17:00

1P-1p104

嫌気発酵菌を利用した 137Cs 含有バイオマスの除染............................................... 野本 健太 1, 伊藤 みさご 1, 合田 亮 1, 星 英之 2, 倉橋 健介 3, ○徳本 勇人 1
（1 阪府大院・工・化工, 2 阪府大院・現シス・環境共生科学, 3 阪府大高専）

16:00

1P-1p105

カリウム輸送タンパクの人工進化によるセシウム蓄積微生物の創出............ ○加藤 創一郎 1,2, 金田 祥宜 1, 福田 あかね 1, 北川 航 1,2, 曾根 輝雄 1, 浅野 行蔵 1, 鎌形 洋一 1,2（1 北大院・農, 2 産総研・生物プロセス）

17:00

1P-1p106

放射性セシウム汚染作物からのセシウム溶出特性とウシルーメン微生物処理・ナノ磁性粒子による除染................................................................................. ○馬場 保徳 1,2, 日尾 彰宏 2, 並木 禎尚 3, 多田 千佳 2,
福田 康弘 2, 三宅 克英 1, 齋藤 雅典 2, 中井 裕 2（1 石川県大・資源研, 2 東北大院・農, 3 了徳寺大・健康）

16:00

1P-1p107

トンネル掘削残土埋立地滲出水のヒ素高蓄積植物によるヒ素除去技術の開発................................................ ○黄 毅 1,2, 宮内 啓介 1, 菅野 弘樹 1, 髙橋 太雅 1, 菅原 一輝 2, 水戸 光昭 3,
成瀬 美樹 4, 中村 真理子 4, 門間 聖子 4, 井上 千弘 2, 遠藤 銀朗 1
（1 東北学院大・工, 2 東北大院・環境, 3 仙台市交通局, 4 応用地質(株)）17:00

1P-1p108

大腸菌により異種発現した海綿由来シリカ重合酵素の自己集合体形成と機能評価........................................................................................ ○中島 一紀, 小栗 秀俊, 川﨑 了（北大院・工）16:00

1P-1p109

大気浄化型壁面緑化における土壌環境の解析..................................................... ○久保田 謙三, 天保 美咲, 河目 裕介, 西部 洋晴（大和ハウス工業）

17:00

1P-1p110

環境汚染物質 1,4－ジオキサン分解微生物の探索.................................................................................. ○佐藤 駿 1, 高田 真由 2, 山田 綾華 2, 倉根 隆一郎 1,2（1 中部大院・応生, 2 中部大・応生）

16:00

1P-1p111

1,4-ジオキサン分解細菌の炭素資化能評価....................................................................................... ○小池 至人 1, 久田 一輝 1, 黒田 真史 1, 池 道彦 1,
角田 翼 2, 井上 大介 2, 清 和成 2, 山本 哲史 3
（1 阪大院・工, 2 北里大・医, 3 大成建設）

17:00

1P-1p112

金属腐食に及ぼす硫酸還元菌およびメタン菌の影響................................................................................................ ○平野 伸一, 長岡 亨, 松本 伯夫（電中研）

16:00

1P-1p113

環境単離株 FT01 の新規金属腐食メカニズムの解析................................................................... ○渡辺 宏紀 1, 稲葉 知大 3, 宮野 泰征 1, 尾花 望 2, 野村 暢彦 1
（1 筑波大院・生命環境, 2 秋田大・理工, 3 産総研・環境管理）【バイオマス，資源，エネルギー工学】
17:00

1P-1p114

人工プロモーターを用いたセルロース系バイオエタノール生産に資する遺伝子組換え酵母の開発.......................................................... ○藤森 一浩, 小林 洋介, 佐原 健彦, 扇谷 悟, 鎌形 洋一（産総研）

16:00

1P-1p115

ペントースリン酸経路遺伝子発現の最適化による C5C6 糖同時発酵酵母の ethanol 生産性の向上.............................................................. ○小林 洋介 1, 藤森 一浩 1, 佐原 健彦 1, 鈴木 俊宏 2, 蒲池 沙織 2,
松鹿 昭則 2, 星野 保 1,2, 扇谷 悟 1, 鎌形 洋一 1
（ 産総研・生物プロセス, 2 産総研・機能化学）
1

17:00

1P-1p116

酵母 Saccharomyces cerevisiae へのセルラーゼ生産能の付与......................................................... ○松崎 浩明, 上田 賢一, 山﨑 新平, 秦野 琢之（福山大・生命工）

16:00

1P-1p117

サイクリック加水分解法：新たなバイオエタノール生産工程の確立に向けて................................................................... ○オリベイラ サヌエ, 大島 淳（長浜バイオ大院・バイオ）

17:00

1P-1p118

低コストバイオ燃料開発に向けた、セルロース系資源作物からの非破壊糖取出しを目指して....................................................... ○米倉 円佳 1, 青木 直大 2, 廣瀬 竜郎 3, 大杉 立 2, 近藤 聡 1, 大音 徳 4（1 トヨタ自動車・バイオ・緑化研, 2 東大院・農生科,
3

農研機構・中央農研, 4 トヨタ自動車・未来研）

22

16:00

1P-1p119

草本系バイオマス由来ヘミセルロース強力分解菌の探索.............................................................................. ○湯下 佳和 1, 田中 沙季 2, 松本 帆南 2, 倉根 隆一郎 1,2（1 中部大院・応生, 2 中部大・応生）

17:00

1P-1p120

特異的にナノセルロース分解を行う微生物の単離............................................................................... ○高橋 仁志, 大槻 隆司（山梨大院・医工農・生環）

16:00

1P-1p121

草本バイオマスを利用したグルコース生産............................................................................................... ○荒木 希和子, 久保 幹（立命館大・生命）

17:00

1P-1p122

発酵熱を利用した熱溶菌性糸状菌からのグルコース生産................................................. ○中井 貴久, 森 慶太, 荒木 希和子, 久保 幹（立命館大院・生命科学）

16:00

1P-1p123

バイオマス細胞壁分解への放線菌フェルラ酸エステラーゼの添加効果................................................................................ ○裏地 美杉, 万 クン, 畑中 唯史（岡山県生科総研）

17:00

1P-1p124

バイオマスと熱溶菌糸状菌を用いたエネルギー生産ルートの確立................................................................ ○西澤 尚樹, 久保 幹, 荒木 希和子（立命館大院・生命科学）

16:00

1P-1p125

固定化酵母 Candida magnoliae を用いたキシリトールの微生物生産.................................................................... ○姜 林涛, 堀内 淳一, 熊田 陽一（京工繊大院・工芸科学）

17:00

1P-1p126

Kluyveromyces marxianus におけるキシリトール脱水素酵素の補酵素特異性改変による効果..................................................................................... ○鈴木 俊宏 1, 橋本 智代 1, 星野 保 1,2, 松鹿 昭則 1,2（1 産総研・機能化学, 2 広島大院・先端物質）

16:00

1P-1p127

キシリトール資化性を導く変異型 Saccharomyces cerevisiae 菌株を用いた発酵解析........................................................................................ ○谷 龍典, 田口 久貴, 赤松 隆（崇城大院・工）17:00

1P-1p128

Gas sparging affects acetic acid fermentation by Clostridium thermocellum and Moorella thermoacetica....................................................................... ○Harifara Rabemanolontsoa, Piradee Jusakulvjit, Shiro Saka

16:00

1P-1p129

嫌気性細菌 Clostridium paraputrificum を基盤とした植物バイオマスからの水素ガス生産方法の検討........................................... 関 兵馬 1, 吉田 稜 2, 三縄 由希子 1, 粟冠 真紀子 1, ○木村 哲哉 1, 粟冠 和郎 1

（Dept. Socio-Environ. Energy Sci., Grad. Sch. Energy Sci., Kyoto Univ.）（1 三重大院・生資, 2 三重大・生資）
17:00

1P-1p130灌漑用水条件の異なるエジプト産ホホバ種子中の代謝物の変動解析............................................................................ ○藤波 友樹 1, 松川 哲也 1, Hegazy Adel 2, 梶山 慎一郎 1（1 近畿大院・生物理工・生工, 2 Univ. Sadat City, Egypt）

16:00

1P-1p131

Effect of alkalinity on dry anaerobic digestion of Swine manure in a prototype cylindrical digester..................................................................................... ○Hesborn Andole Ondiba, Weiwei Huang, Wei Cai,
Ziwen Zhao, Tian Yuan, Zhongfang Lei, Zhenya Zhang（Univ. Tsukuba）

ANA クラウンプラザホテル富山

3 階ポスター会場 II（ASUKA）（16:00～18:00）【生体医用工学】
17:00

1P-2p132

B 型肝炎ウイルス及びバイオナノカプセルの初期感染機構の解析........................................................................................ ○劉 秋実, 曽宮 正晴, 黒田 俊一（阪大・産研）

16:00

1P-2p133

様々な抗体を提示可能なバイオナノカプセルによる能動的標的化 DDS ナノキャリアの開発......................................................................... ○立松 健司, 李 昊, 飯嶋 益巳, 黒田 俊一（阪大・産研）

17:00

1P-2p134

炎症性疾患治療を指向したマクロファージ機能制御剤の基礎評価............................. ○戸井田 力 1, 藤田 聡史 1, 姜 貞勲 2（1 産総研・バイオメディカル, 2 国立循研セ）

16:00

1P-2p135

細胞内薬剤デリバリーのための光溶解性トランスフェリン凝集体の開発............................................... ○山口 哲志 1, 石渡 晟 2, 南畑 孝介 2, 山平 真也 1, 岡本 晃充 2, 長棟 輝行 2
（1 東大・先端研, 2 東大院・工）

23

17:00

1P-2p136

担癌マウスを用いたポリアクリル酸修飾過酸化チタンナノ粒子の生体内分布の解明............................................................... ○鈴木 貴弘 1, 森田 健太 1, 西村 勇哉 2, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 2
（1 神戸大院・工, 2 神戸大・自科・研究環）

16:00

1P-2p137

イミノ二酢酸修飾ヒアルロン酸鉄イオン架橋ハイドロゲルによる腹膜癒着防止効果の検討...................................................................... ○戚 蟠 1, 天野 由貴 2, 切田 勝久 2, 太田 誠一 1, 伊藤 大知 1,2（1 東大院・医, 2 東大院・工）17:00

1P-2p138

酸化還元応答性ハイドロゲルを基材とする細胞組織体の形成と機能評価.................. ○神谷 典穂 1,2, 内藤 翔乃 1, 香川 元気 1, 森山 幸祐 3, 若林 里衣 1, 南畑 孝介 1, 後藤 雅宏 1,2（1 九大院・工, 2 九大・未来化セ, 3 九大・先導研）

16:00

1P-2p139

治療効果を有する肝臓構築を目指して............................................................. ○白木川 奈菜, 坂本 裕希, 木村 遥奈, 井嶋 博之（九大院・工）17:00

1P-2p140

Polymer2 を用いた HEK293 細胞の新しい 3D 培養法構築........................................................................................ ○金木 達朗 1, 林 寿人 1, 川原 浩治 2, 西野 泰斗 1
（1 日産化学工業, 2 北九州高専）

16:00

1P-2p141

磁力を利用した in vitro 三次元がんモデル：がん細胞浸潤挙動の半自動解析法の開発........................ ○清水 一憲 1, 山本 修平 1, 本多 裕之 1,2（1 名大院・工, 2 名大・予防早期医療創成セ）

17:00

1P-2p142

3 次元培養によるヒト脂肪由来幹細胞の脂肪への分化とマイクロティッシュの作製................................................. ○宮本 義孝 1,2, 池内 真志 1, 野口 洋文 3, 八木 透 4, 生田 幸士 1, 林 衆治 2
（1 東大・先端研, 2 名大院・医, 3 琉球大・医, 4 東工大院・情報理工）

16:00

1P-2p143

正常血圧条件下におけるかん流培養を可能とする多層血管モデルの作製と評価........................................................................................ ○木下 敬太, 山田 真澄, 関 実（千葉大院・工）【セル＆ティッシュエンジニアリング】
17:00

1P-2p144

CHO 細胞を用いた抗体生産プロセスにおける糖鎖構造解析........................................................................................ ○森下 明彦 1, 鬼塚 正義 2, 大政 健史 3, 秦 信子 1
（1 株式会社 Ig-M, 2 徳島大院・ソシオ, 3 阪大院・工）16:00

1P-2p145

細胞集塊挙動によるヒト間葉系幹細胞の心筋方向への分化指向性誘導.................................................................................... ○小川 祐樹, 金 美海, 紀ノ岡 正博（阪大院・工）17:00

1P-2p146

維持培養および胚様体形成期間中の培地がヒト iPS 細胞の心筋分化誘導に与える影響............................................................................ ○澤登 美空, 大貫 喜嗣, 黒澤 尋（山梨大院・総研部）

16:00

1P-2p147

ノコダゾール処理によるヒト iPS 細胞の心筋分化誘導............................................................................ ○山口 千尋, 大貫 喜嗣, 黒澤 尋（山梨大院・総研部）

17:00

1P-2p148

タンパク質マイクロファイバーの高効率作製とその細胞培養系への応用...................................................... ○平松 久卓, 堀 綾香, 矢嶋 祐也, 山田 真澄, 関 実（千葉大院・工）16:00

1P-2p149

細胞の自己集合化誘導コーティング剤（CAT）を用いたスキャホールドフリー軟骨リングの簡易作製............................................................................................................. ○岩井 良輔 1, 根本 泰 2, 中山 泰秀 3
（1 岡山理大・技科研, 2 株式会社ブリヂストン, 3 国循セン研・生体医工）

17:00

1P-2p150

細胞膜内面の in vitro 解析を指向した細胞膜シートの開発.................................................................. ○泉田 森 1, 山口 哲志 2, 三澤 龍志 1, 山平 真也 1, 河原 正浩 1,
鈴木 智子 3, 高木 智子 3, 佐藤 香枝 3, 長棟 輝行 1, 岡本 晃充 1,2（1 東大院・工, 2 東大・先端研, 3 日本女子大・理）

16:00

1P-2p151

酸素透過性マイクロウェルアレイチップを用いた毛包原基の大量調製........................................................................................ ○景山 達斗 1, 吉村 知紗 2, 片岡 健 3, 福田 淳二 1
（1 横国大院・工, 2 横国大, 3 岡山理大・理）

24

17:00

1P-2p152

マイクロ光造形法と生体適合性金めっき法を用いた立体細胞シートの作製.................○小林 優香 1, Cordonier Christopher E.J. 2, 永瀬 史憲 1, 本間 英夫 2, 丸尾 昭二 1, 福田 淳二 1
（1 横国大院・工, 2 関東学院大・工）16:00

1P-2p153

スフェロイド積層型バイオ 3D プリンターにより作製した３次元組織についての培地成分・分泌代
謝物の一斉分析..................................... ○森 翔太郎 1, 仁宮 一章 2, 高橋 憲司 1（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術）

17:00

1P-2p154

スフェロイド積層型バイオ 3D プリンターを用いた毛細血管様構造を有する 3 次元組織の作製..................................... ○和田 亜樹 1, 仁宮 一章 2, 高橋 憲司 1（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術）

16:00

1P-2p155

新規 CHO 細胞株の樹立......... ○岩間 千草 1,5, 増田 兼治 2,5, 窪田 みち 1,5, 堀内 貴之 1,5, 野中 浩一 2,5, 上平 正道 3,5, 大政 健史 4,5（1 株式会社ちとせ研究所, 2 第一三共株式会社, 3 九大院・工, 4 阪大院・工,
5

17:00

1P-2p156

次世代バイオ医薬品製造技術研究組合）

CHO 安定遺伝子座への抗体遺伝子逐次導入による安定高生産株の構築............... ○山名 良正 1,2, 成田 純也 2, 近藤 雅子 1,2, 大竹 敦子 1,2, 鈴木 惠介 1,2, 河邉 佳典 3, 上平 正道 3
（1 TOTO・総研, 2 MAB 組合, 3 九大院・工・化工）

16:00

1P-2p157

CRIS-PITCh 法を用いたノックイン CHO 細胞の作製....................................................................................... ○小松 眞也 1, 河邉 佳典 2, 小松 将大 2, 井藤 彰 2,
佐久間 哲史 3, 中村 崇裕 4, 山本 卓 3, 上平 正道 1,2（1 九大院・シス生科, 2 九大院・工, 3 広島大院・理, 4 九大院・農）

17:00

1P-2p158

Cre-loxP による逐次遺伝子組込み法における生産 CHO 細胞株構築の迅速化...................................... ○羽田 毅 1, 河邉 佳典 1, 汪 雪 1, 井藤 彰 1, 山名 良正 2, 近藤 雅子 2, 上平 正道 1
（1 九大院・工・化工, 2 TOTO・総研）

16:00

1P-2p159

CHO 細胞における安定染色体の遺伝子地図作成と CRISPR/Cas9 システムを用いた遺伝子ターゲッ
ティングによる抗体生産株の構築........................................................ ○吉冨 耕太 1, 山野 範子 2,3, 鬼塚 正義 2,3, 古賀 雄一 1, 大政 健史 1,2,3（1 阪大院・工, 2 徳大院・生物資源産業, 3 MAB 組合）

17:00

1P-2p160

染色体異数性を持つ抗体生産 CHO 細胞の網羅的遺伝子発現解析...................................... ○田中 翔 1, 山野 範子 2,3, 緒方 法親 3,4, 鬼塚 正義 2,3, 古賀 雄一 1, 大政 健史 1,2,3（1 阪大院・工, 2 徳大院・生物資源産業, 3 MAB 組合, 4 日本バイオデータ）

16:00

1P-2p161

バイオ医薬品生産を目指したチャイニーズハムスター肺組織からの無血清馴化不死化細胞株樹立............................. ○山野 範子 1,2, 大政 健史 2,3（1 徳大院・生物資源産業, 2 MAB 組合, 3 阪大院・工）17:00

1P-2p162

CHO 細胞を用いたサメ由来重鎖抗体の分泌発現コンストラクトの検討................................... ○野村 嘉紀 1, 鬼塚 正義 2,3, 香川 悠馬 4, 山野 範子 2,3, 古賀 雄一 1, 大政 健史 1,2,3（1 阪大院・工, 2 徳島大院・生物資源, 3 MAB 組合, 4 徳島大院・先端技科）

16:00

1P-2p163

Tret1 遺伝子導入による CHO 細胞の抗体凝集抑制と細胞増殖能の改善..... ○原田 涼之介 1, 鬼塚 正義 2,3, 黄川田 隆洋 4,5, 小出 静代 3, 古賀 雄一 1, 山野 範子 2,3, 大政 健史 1,2,3（1 阪大院・工, 2 徳大院・生物資源産業, 3 MAB 組合, 4 農研機構, 5 東大院・新領域）

17:00

1P-2p164

免疫系 T 細胞の成熟化シグナルと温感.................. ○薮内 里実 1, 大久保 由布 1, 白 京玉 1, 星野 邦秀 1,2, 辻野 義雄 1,2, 下川 直史 1, 高木 昌宏 1
（1 北陸先端大・マテリアル, 2 高砂香料工業株式会社）

16:00

1P-2p165

卵白タンパク質特異的糖鎖改変システムの開発.............................. 森脇 脩一郎, 奥嵜 雄也, 淺井 聖也, 土田 将大, ○金岡 英徳, 西島 謙一, 飯島 信司

17:00

1P-2p166

ニワトリ IFITM の抗ウイルス機能の解析.............................................. 奥嵜 雄也, 木溪 俊介, 金岡 英徳, ○西島 謙一, 飯島 信司（名大院・工）（名大院・工）25【バイオセンシング，分析化学】
16:00

1P-2p167

LC-MS ならびに HPLC-ELSD を用いたアルギン酸不飽和オリゴ糖と DEH の検出............................................. ○藤井 玲央奈 1,5, 三宅 英雄 1,5, モリ テツシ 2,5, 田中 礼士 1,5, 高木 俊幸 3,5,
吉川 裕之 4,5, 黒田 浩一 3,5, 植田 充美 3,5, 柴田 敏行 1,5（1 三重大院・生資, 2 早大・理工, 3 京大院・農, 4 阪大院・工, 5 JST・CREST）

17:00

1P-2p168

自動プレカラム誘導体化法を利用した HPLC によるアミノ酸のキラル分離.............................................................................................. ○熊谷 浩樹（アジレント・テクノロジー）

16:00

1P-2p169

LC-TOFMS を用いた非誘導体化アミノ酸鏡像体の高速一斉分析法の開発.................................................................................... ○紺屋 豊, 谷口 百優, 福﨑 英一郎（阪大院・工）17:00

1P-2p170

LC-TOFMS を用いた D, L-アミノ酸を含む生理活性アミン類の一斉分析法の開発.................................................................................... ○谷口 百優, 紺屋 豊, 福﨑 英一郎（阪大院・工）16:00

1P-2p171

ヘモグロビン A1C とレクチン AAL の結合に対する温度の影響............................................................... ○加畑 眞人 1, 長谷 英理菜 1, 小林 夕香 2, 上野 泰 2, 吉宗 一晃 1
（1 日大・生産工, 2 J-オイルミルズ・商品開発研究所）

17:00

1P-2p172

新規プロテインＡカラムによる免疫グロブリンの迅速定量.............................................................. ○大森 俊昂, 藤井 智, 奥村 晴美, 荒木 康祐, 中谷 茂（東ソー）

16:00

1P-2p173インスリン存在下における膵 β 細胞インスリン分泌応答の連続測定...................................................................................... ○重藤 元 1,2, 小野 拓人 3, 黒田 章夫 3, 舟橋 久景 1
（1 広島大学・サステナセ, 2 広島大・グローバルキャリアセ, 3 広島大院・先端物質）

17:00

1P-2p174

ITO 電極による深海底堆積物由来ストレプトマイセス属微生物の電気回収........................................... ○小山 純弘 1, 西 真郎 1, 長野 由梨子 1, 能木 裕一 1, 秦田 勇二 2, 坪内 泰志 1
（1 海洋研究開発機構, 2 埼玉工大・工・生命環境化学）

16:00

1P-2p175

Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics targeting bacterial protein synthesis........... Duyen Tran, ○Hideyuki Matsuura, Kazuki Ujiie, Misa Muraoka, Kazuo Harada, Kazumasa Hirata（Grad. Sch. Pharm. Sci., Osaka Univ.）

17:00

1P-2p176

デジタル PCR によるサンゴ共在微生物由来 16S rRNA 遺伝子数の精密定量................................................................................... ○竹田 裕貴 1, 細川 正人 2, 西川 洋平 1, 小川 雅人 1,
伊藤 通浩 1, 須田 彰一郎 3, 中野 義勝 4, 竹山 春子 1
（1 早大・先進理工, 2 JST・さきがけ, 3 琉球大・理, 4 琉球大・熱帯生物圏研究セ）

16:00

1P-2p177

ピコリットル容量の微小液滴を用いた単一微生物からの網羅的な全ゲノム増幅................................................................................. ○西川 洋平 1, 細川 正人 2,3, 小川 雅人 1, 竹山 春子 1,3（1 早大院・先進理工・生医, 2 JST・さきがけ, 3 早大・ナノライフ創研）

17:00

1P-2p178

ヒト皮膚表面における発汗代謝物と微生物分布の可視化........................................................................................................ ○筒井 聡志 1, 伊達 康博 1,2, 菊地 淳 1,2,3（1 横市大院・生命医, 2 理研, 3 名大院・生命農学）

16:00

1P-2p179

センシング分子を最密充填状態で精密に整列固定化する二次元膜の開発....................................................................................................... ○飯嶋 益巳, 黒田 俊一（阪大・産研）

17:00

1P-2p180

信号累積型イオン感応性電界効果トランジスタによるセイヨウワサビペルオキシダーゼ測定法................................................... ○西矢 芳昭 1, 坂井 華美 1, 井原 弘絵 1, 泊 直宏 2, 山本 佳宏 2, 谷 敏夫 3（1 摂南大・生命科学, 2 京都市産技研, 3 バイオエックス）

16:00

1P-2p181

自然環境中における気象変動と化学プロファイルの統合的データマイニング........................................................................................................ ○伊達 康博 1,2, 篠 阿弥宇 1, 菊地 淳 1,2,3（1 理研・CSRS, 2 横市院・生医, 3 名大院・生命農）

17:00

1P-2p182

噴流圧力による培養細胞の力学特性評価................................................... ○田中 信行 1, 髙原 順子 1, 粟津 茜 1, 春園 嘉英 2, 那須 博光 2, 田中 陽 1（1 理研・生命システム, 2 北川鉄工所）

26【センサー、計測工学】
16:00

1P-2p183

ナノ粒子表面の局所表面プラズモン共鳴効果を用いたノロウイルスの迅速検出..................................................................... ○竹村 謙信 1, Adegoke Oluwasesan 2, 朴 龍洙 1,2, 鈴木 哲朗 3
（1 静岡大院・総合科技研・農学専攻・応生化, 2 静岡大グリーン科技研, 3 浜医大・医・医学科）

17:00

1P-2p184

Alloyed L-cysteine-capped alloyed quaternary CdZnTeS quantum dots of two internal structures.................................................... Oluwasesan Adegoke, ○Enoch Y. Park（Res. Inst. Green Sci. Technol.）

16:00

1P-2p185

抗体相補性決定領域に基づいた揮発性爆発化合物の特異的ペプチドプローブの開発.............................................................................. ○武藤 正記 1,2, 矢内 健太郎 1,2, 田中 祐圭 1,2, 上田 宏 3,
Wang Jin 2,4, 小野寺 武 2,4, 都甲 潔 2,5, 大河内 美奈 1,2（ 東工大・物質理工, 2 JST・ImPACT, 3 東工大・化学生命科学研,
1

4

九大・味覚・嗅覚センサ研究開発セ, 5 九大院・シス情）

17:00

1P-2p186

DNA staining nanoparticles for nucleus imaging........................................................................... ○Chi-Hsien Liu, Min-Han Tsao, Soubhagya Laxmi Sahoo

16:00

1P-2p187

イメージング質量顕微鏡の食品科学への応用.......................................................................................................................... ○新間 秀一（阪大院・工）（Grad. Inst. Biochem. Biomed. Eng., Chang Gung Uni）

英語論文の書き方セミナー
アクセプトされる英語論文の書き方セミナー： 英語論文投稿における査読対策
富山国際会議場

2 階 B 会場（特別会議室）（16:00～17:30）

講師：西川 マリ（Mary Nishikawa）（カクタス・コミュニケーションズ株式会社）
主催：生物工学教育委員会・英文誌編集委員会
協力：英文校正エディテージ（カクタス・コミュニケーションズ株式会社）

ランチョンセミナー
1LA1
富山国際会議場

タカラバイオ株式会社

3 階 A 会場（メインホール）（11:45～12:45）

1LC2

株式会社島津製作所

ANA クラウンプラザホテル富山

1LE3

3 階 C 会場（11:45～12:45）

株式会社エービー・サイエックス

ANA クラウンプラザホテル富山

3 階 E 会場（11:45～12:45）

27

第 2 日（9 月 29 日）
太字の一般講演は今年度の生物工学学生優秀賞（飛翔賞）受賞者の発表です．
開始時間

講演番号

演

発表者氏名（所属）題○印は講演者を示す

受賞講演（生物工学奨励賞（江田賞・斎藤賞・照井賞），
生物工学アジア若手賞）
富山国際会議場
13:00

2A-Ap01

3 階 A 会場（メインホール）（13:00～13:20）
座長：吉田 聡〈生物工学奨励賞（江田賞）〉

しょうゆ醸造に寄与する麹菌由来のグルタミナーゼに関する研究.................................................................................................................. ○伊藤 考太郎（キッコーマン）
ANA クラウンプラザホテル富山
13:00

2A-Ep01

3 階 E 会場（13:00～13:20）
座長：福﨑 英一郎

〈生物工学奨励賞（斎藤賞）〉

セルフリータンパク質合成系を用いた進化分子工学技術の開発.......................................................................................................................... ○松浦 友亮（阪大院・工）ANA クラウンプラザホテル富山
13:00

2A-Cp01

3 階 C 会場（13:00～13:20）
座長：大政 健史

〈生物工学奨励賞（照井賞）〉

キメラ受容体による細胞運命制御系の構築とライブラリー選択への応用.......................................................................................................................... ○河原 正浩（東大院・工）ANA クラウンプラザホテル富山
13:00

2A-Dp01

3 階 D 会場（13:00～13:20）
座長：跡見 晴幸

〈生物工学アジア若手賞〉

Molecular mechanisms underlying yeast adaptive responses to environmental stresses and pollutants..................................................... ○Choowong Auesukaree 1, Chuenchit Boonchird 2, Satoshi Harashima 3,
Prayad Pokethitiyook 1, Maleeya Kruatrachue 1（ Dept. Biol., Fac. Sci., Mahidol Univ., 2 Dept. Biotechnol., Fac. Sci., Mahidol Univ.,
13Fac. Biotechnol. Life Sci., Sojo Univ.）

28

シンポジウム（午前の部）
学会活動が先導する実用化研究・技術～学会は産官学の出会いの場となれるか～
富山国際会議場

3 階 A 会場（メインホール）（9:00～11:00）
座長：中澤 昌美

9:00

2S-Aa01

ものづくり系工学会での産官学連携................................................................................................................. ○辻川 正人（阪府大・URA セ）

9:30

2S-Aa02

バイオテクノロジーは地域産業に変革をもたらすか!!
......................................................................................................... ○山本 佳宏（京都市産技研 バイオ）座長：大橋 正孝

座長：岩木 宏明
10:00

2S-Aa03

機能性食品素材としての酒粕発酵物とショウガ麹の開発.............................................................................................. ○渡辺 敏郎（園田学園女子大・食物栄養）

10:30

2S-Aa04

酵母「101H」の開発と泡盛の商品化 ～シンポジウムから発信した奈良の研究シーズと沖縄の産業

座長：小高 敦史
ニーズ～.......................................................................................................... ○高木 博史（奈良先端大・バイオ）

植物代謝工学研究最前線～新産業創出に向けて～
富山国際会議場

2 階 B 会場（特別会議室）（9:00～11:00）

はじめに........................................................................................................................................................ 村中 俊哉

9:00

座長：田口 悟朗
9:05

2S-Ba01

テルペノイドの代謝多様性と遺伝子ディスカバリー........................................................................... ○關 光, 福島 エリ オデット, 村中 俊哉（阪大院・工）9:25

2S-Ba02

植物代謝研究に役立つ相関ネットワーク解析（金平糖解析）......................................................................................................... 萬年 一斗 1, 尾形 善之 2, ○鈴木 秀幸 1

座長：田口 悟朗

（1 （公財）かずさ DNA 研・バイオ研究開発, 2 大阪府大・生命環境）
座長：岡澤 敦司
9:45

2S-Ba03高増殖するタケ培養細胞の物質生産への応用可能性：合理的代謝フロースイッチングによるタケ懸濁細胞のヒドロキシ桂皮酸アミド生合成経路の改変................ 野村 泰治 1, 荻田 信二郎 1,2, ○加藤 康夫 1（1 富山県大・生工研セ, 2 県大広島・生命科学）
座長：岡澤 敦司

10:05

2S-Ba04

高度機能分化した植物組織培養の物質生産への活用 -可能性と課題................................................................................ ○大西 昇, 大川 博志, 間宮 幹士（キリン・基盤研）
座長：村中 俊哉

10:30
10:55

2S-Ba05

植物と微生物：イソキノリンアルカロイド生産の展望...................................................................................................................... ○佐藤 文彦（京大院・生命）
おわりに........................................................................................................................................................ 村中 俊哉

29

Artificial Molecular Design to Create “Neobiological Molecules”＜国際シンポジウム＞
協賛：AMED 「革新的バイオ医薬品創出基盤技術開発事業」
ANA クラウンプラザホテル富山
9:00

3 階 C 会場（9:00～11:30）

Opening remarks............................................................................................................................................................. Yuji Ito
座長：Yuji Ito

9:02

2S-Ca01

Engineering by proxy: Monobody-mediated control of enzyme specificity and activity............................................................................................................................................ ○Shohei Koide 1,2（1 Perlmutter Cancer Center, New York Univ Langone Medical Center,2

Dept Biochem & Mol Biol, Univ of Chicago）
座長：Yuji Ito

9:27

2S-Ca02

Application of next-generation sequencing to antibody engineering........................... Aerin Yoon, Sanghoon Lee, Soohyun Kim, Duck-kyun Yoo, Hyroi Kim, ○Junho Chung（Seoul National University College of Medicine）
座長：Yuji Ito

9:52

2S-Ca03

Self-assembling supramolecular nano-architectures created from de novo protein nano-building blocks................. Naoya Kobayashi, Naoya Kimura, ○Ryoichi Arai（Fac. Textile Sci. Technol., Shinshu Univ.）

10:07

2S-Ca04〈招待講演（韓国生物工学会）〉

座長：Ryoichi Arai

Marine-derived biosilicification: Silica-forming proteins and their applications..... Mi Ran Ki, Ki Baek Yeo, Sung Ho Kim, Jong Ki Kim, Kho My Nguyen, Van Pham, ○Seung Pil Pack
（Dept. Biotechnol. and Bioinfo. Sch. Sci. Tech., Korea Univ.）
座長：Ryoichi Arai
10:27

2S-Ca05

cDNA display method and its applications for in vitro selection of functional peptides.............................................................................................................................................. ○Naoto Nemoto（Grad. Sch. Sci. & Eng., Saitama Univ.）
座長：Ryoichi Arai

10:47

2S-Ca06

RNA as a promising biopolymer to generate neobiological structures and functions.................................................................... ○Yoshiya Ikawa（Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama）

11:07

2S-Ca07〈招待講演（韓国生物工学会）〉

座長：Ryoichi Arai

Biomolecule building blocks for memory device development................................................................................................................................................ ○Hyun Ho Lee（Myongji University）
11:27

Closing remarks..................................................................................................................................................... Ryoichi AraiJapan-Korea Joint Symposium “Advancements in Medical Engineering Using Nano- and Micro-biotechnology”〈国際シンポジウム〉
ANA クラウンプラザホテル富山 3 階 D 会場（9:00～11:30）
9:00

Opening remarks..................................................................................................................................................Enoch Y. Park
座長：Enoch Y. Park

9:05

2S-Da01

NanoBiosensors for biomedical applications.......................................................................................... ○Eiichi Tamiya（Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.）

30

座長：Enoch Y. Park
9:20

2S-Da02

Nanobiolelectronic device toward biocomputing system....................................................................................................................................... ○Jeong-Woo Choi 1,2（1 Dept. Chem. Biomol. Eng., Sogang Univ., Korea,
2

Reserach Center for Sogang-Harvard Disease Biophysics, Sogang Univ., Korea）
座長：Enoch Y. Park

9:40

2S-Da03

10:00

Biomedical application of microfluidic device with low cost flow control............................................................................................. ○Yuzuru Takamura（Sch. Mater. Sci., JAIST）
Break
座長：Eiichi Tamiya

10:10

2S-Da04

Formation of cellular sticker on extracellular matrix network and its potential medical application................................. ○Kwanwoo Shin 1,2, Youhwan Kim 1,2, Serin Lee 1,2, Keelyong Lee 1,2, Sojung Nam 1,2（1 Dept. Chemistry and Inst. of Biol. Interf., Sogang Univ., Korea,
2

Research Center for Sogang-Harvard Disease Biophysics, Sogang Univ., Korea）
座長：Eiichi Tamiya

10:30

2S-Da05

Rapid generation of monoclonal antibodies using lymphocyte-microarray chip............................................................................... ○Tatsuhiko Ozawa, Hiroyuki Kishi, Atsushi Muraguchi（Dept. Immunol., Grad. Sch. Med. Pharm. Sci., Univ. Toyama）
座長：Eiichi Tamiya

10:50

2S-Da06

A soft microfluidic device as an in vitro model for studying mechanobiology of tubular organs.............................Hyeonji Yu 1,2, Dongwon Kang 1,2, Kwangin Shin 1, Minji Hwang 1,2, ○Jungwook Kim 1,2（1 Dept. Chem. Biomol. Eng., Sogang Univ., Korea,
2

11:10

2S-Da07

Res. Center for Sogang-Harvard Disease Biophysics, Korea）
座長：Eiichi Tamiya〈招待講演（韓国生物工学会）〉

Aptamer-based strategies for biosensing and switching of DNA polymerase............................................................................................................................................ ○Hyun Gyu Park
（Dept. Chem. Biomol. Eng., Korea Adv. Inst. Sci. Technol.）
11:25

Closing remarks................................................................................................................................................... Eiichi Tamiya

新規な核酸関連酵素の開発とその産業応用
ANA クラウンプラザホテル富山

3 階 E 会場（9:00～11:00）
座長：保川 清はじめに........................................................................................................................................................ 藤原 伸介

9:00

座長：藤原 伸介
9:10

2S-Ea01

新規３酵素の組み合わせによる cDNA 合成技術の開発.............................................................................................................................. ○保川 清（京大院・農）

9:30

2S-Ea02デジタル PCR の高感度化と臨床診断への応用........................................................ ○柳原 格, 名倉 由起子, 吉村 芳修（大阪母子保健総合医療セ研）

座長：藤原 伸介

座長：藤原 伸介
9:45

2S-Ea03

CRISPR/Cas9 を利用したゲノム編集技術開発から学ぶこと.......................................................................................................................... ○石野 良純（九大院・農）

10:05

2S-Ea04

核酸分解酵素の組み合わせによる迅速なゲノム合成手法の開発.............................................................................................................. ○板谷 光泰（慶應大先端生命研）

座長：保川 清31

座長：保川 清10:25

2S-Ea05

Point of care testing を志向した多項目遺伝子検査........................................................................................ ○佐野 創太郎, 兼﨑 祐介, 宮本 重彦（カネカ）
座長：保川 清10:40

2S-Ea06

簡便な遺伝子検出法「NASBA - 核酸クロマト法」の原理とその応用............................................................................................................... ○宇治家 武史, 林 司（カイノス）
座長：藤原 伸介
おわりに（総括）............................................................................................................................................................ 保川 清

10:55

シンポジウム（午後の部）
有用微生物の農作物への新しい展開とその将来像
富山国際会議場

3 階 A 会場（メインホール）（13:30～15:30）

はじめに............................................................................................................................................................ 高木 忍

13:30

座長：高木 忍
13:35

2S-Ap01

植物病害に対する微生物農薬の研究開発の現状および今後の展望.......................................................................................................... ○吉田 重信（農研機構・中央農研）
座長：安枝 寿14:05

2S-Ap02

植物の免疫システムと共棲微生物を介した環境適応........................................................................................... ○西條 雄介, 晝間 敬（奈良先端大・バイオ）

14:30

2S-Ap03

水生植物由来 PGPB の作用機構と農作物への利用可能性................................................................................................... ○森川 正章, 三輪 京子（北大院・環境）

座長：松山 彰収

座長：石井 正治
14:55

2S-Ap04

Trichoderma asperelloides SKT-1 株のイネ種子消毒剤としての開発と企業化.................................................................................................. ○渡辺 哲（クミアイ化学工業株式会社）
おわりに........................................................................................................................................................ 石井 正治

15:25

バイオエンジニアリングにおける分析科学の新たな展開
富山国際会議場

2 階 B 会場（特別会議室）（13:30～15:30）

はじめに............................................................................................................................................................ 座古 保

13:30

座長：座古 保13:34

2S-Bp01

新たな分析試薬としての二重鎖 DNA 担持ナノ粒子...................................................................................................... ○前田 瑞夫（理研・前田バイオ工学）

14:04

2S-Bp02〈招待講演（韓国生物工学会）〉

座長：座古 保Separation efficiency of DNA-protein conjugates via free-solution capillary electrophoresis.............................................. ○Jong-In Won, Dong Hyun Kim（Dept. Chem. Eng., Hongik Univ., Korea）

32

座長：座古 保14:24

2S-Bp03

人工アロステリック酵素の創出による各種高感度ホモジニアス免疫測定法の開発.............................................................................................. ○上田 宏 1, 蘇 九龍 1, 董 金華 1, 岩井 宏徒 1,2（1 東工大・化生研, 2 東大院・工）座長：上田 宏14:42

2S-Bp04

臨床検査におけるバイオ分析技術の実用化.............................................................................................................................. ○村上 淳（アークレイ）
座長：上田 宏15:12

2S-Bp05

非天然糖を用いた糖タンパク質品質管理系の機能解析.................................................................................................................. ○迫野 昌文（富山大院・理工）
おわりに........................................................................................................................................................ 迫野 昌文

15:28

2D/3D プリンタを用いる細胞操作の可能性
ANA クラウンプラザホテル富山

3 階 C 会場（13:30～15:30）
座長：境 慎司

13:30

2S-Cp01

Tissue Engineering のためのバイオプリンティングの戦略と今後の課題.................................................................................. ○中村 真人 1, 杉本 和之 1, 塚本 佳也 1,2, 吉田 真人 1
（1 富山大院・理工, 2 阪大院・生命機能）
座長：境 慎司

13:55

2S-Cp02

細胞運動を評価する遺伝子導入細胞マイクロアレイ.............................................................................................. ○藤田 聡史（産総研・バイオメディカル）

14:01

2S-Cp03

インクジェットプリンティングの細胞凍結保存への応用...................................................................................................................... ○秋山 佳丈（信州大・繊維）

座長：藤田 聡史

座長：藤田 聡史
14:08

2S-Cp04

西洋わさび由来ペルオキシダーゼによる架橋反応を利用した 3D バイオプリンティング......................................... ○境 慎司 1, 田谷 正仁 1, 中村 真人 2（1 阪大院・基礎工, 2 富山大院・理工）

14:15

2S-Cp05

バイオ分野へのインクジェット技術の応用.............................................................................................. ○山口 修一（株式会社マイクロジェット）座長：秋山 佳丈

座長：秋山 佳丈
14:40

2S-Cp06

細胞の微小環境制御に基づいた組織工学............................................................................................... ○松崎 典弥, 明石 満（阪大院・工・応化）
座長：中村 真人（司会）パネルディスカッション............................................................................................................................. パネリスト（全発表者）

15:05

10th Japan-Korea Biomass Symposium〈国際シンポジウム〉
ANA クラウンプラザホテル富山

3 階 D 会場（13:30～15:30）
座長：Yutaka Tamaru

13:30

2S-Dp01

Bioenergy and chemicals from sustainable biomass resources................................... Hah Young Yoo, Dong Sup Kim, Ju Hun Lee, Soo Kweon Lee, ○Seung Wook Kim（Dept. Chem. Biological Eng., Korea Univ）

33

座長：Yutaka Tamaru
14:00

2S-Dp02

Isolation of biorefinery enzymes for brown macroalgae degradation from bacterial metagenome............... ○Tetsushi Mori 1, Mami Takahashi 1, Yumiko Yamada 1, Toshiyuki Shibata 2, Toshiyuki Takagi 3,
Reiji Tanaka 2, Hideo Miyake 2, Kouichi Kuroda 3, Mitsuyoshi Ueda 3, Haruko Takeyama 1（1 Fac. Sci. and Eng., Waseda Univ., 2 Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ., 3 Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.）
座長：Yutaka Tamaru

14:30

2S-Dp03

Biological saccharification by anaerobic thermophilic bacteria........................................................................................................................................ ○Akihiko Kosugi 1,2（1 JIRCAS, 2 Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba）
座長：Yutaka Tamaru

15:00

2S-Dp04

Designer microbes equipped with nano-scale protein complexes................................................................................................................. Jeong Eun Hyeon, ○Sung Ok Han（Dept. Biotechnol., Korea Univ.）

微生物の潜在能力に注目した有用二次代謝産物の「ものづくり」戦略
ANA クラウンプラザホテル富山

3 階 E 会場（13:30～15:30）

はじめに........................................................................................................................................................ 荒川 賢治

13:30

座長：荒川 賢治
13:35

2S-Ep01

抗生物質の濃度依存的現象「抗生物質ホルミシス」の理解と応用.............................................................................................. ○保坂 毅（信州大・バイオメディカル研）
座長：荒川 賢治

13:57

2S-Ep02

Application of advanced NMR techniques for analysis of actinobacterial metabolism..................................................................................................................... ○Dana Ulanova, Masashi Tsuda（Dept. Mar. Resour. Sci., Fac. Agric. Mar. Sci., Kochi Univ.）
座長：荒川 賢治

14:19

2S-Ep03

多価不飽和脂肪酸合成酵素の機能解析............................................................................................ 林 祥平 1, ○佐藤 康治 2, 氏原 哲朗 3, 大利 徹 2（1 北大院・総合化学, 2 北大院・工, 3 協和発酵バイオ）
座長：大利 徹

14:41

2S-Ep04

物質生産を志向した未利用遺伝子の発掘と宿主の改変.......................................................................................................................... ○鮒 信学（静県大・食栄）

15:03

2S-Ep05

放線菌二次代謝生合成・制御系の合理的改変による休眠二次代謝の発掘.......................................................................................................... ○荒川 賢治（広島大院・先端物質）

座長：大利 徹

15:25

おわりに
............................................................................................................................................................ 大利 徹

若手会口頭発表
富山国際会議場

2 階 B 会場（特別会議室）（16:00～18:00）

若手会が選定した博士後期課程学生による口頭発表です．
（ポスター 3P-2a176～184 参照）

34

一般講演
富山国際会議場

2 階ポスター会場 I（16:00～18:00）【酵素学，酵素工学】
16:00

2P-1p001

高基質親和性を有する好熱性光合成細菌由来サルコシンオキシダーゼ.................................. ○竹本 淳一, 山本 眞知, 加納 周作, 中野 祥平, 西矢 芳昭（摂南大・生命科学）

17:00

2P-1p002

ピルビン酸オキシダーゼ／酢酸菌キナーゼ法による実用的 ATP 再生法............................................................................................................... ○北岡 本光, 西本 完（農研機構）

16:00

2P-1p003

高比活性 L-グルタミン酸オキシダーゼの異種発現と酵素学的性質............................................................... ○林 優花 1, 野本 健斗 1, 長南 圭介 1, 酒瀬川 信一 2, 杉森 大助 1
（1 福島大・共生システム理工, 2 旭化成ファーマ）

17:00

2P-1p004

FMO 法と QM/MM 法による D-アミノ酸オキシダーゼの反応機構の理論的検討......................................................................................................... ○阿部 幸浩 1, 庄司 光男 2, 浅野 泰久 3
（1 東洋紡, 2 筑波大学・計算科学研究セ, 3 富山県大・生工研セ）

16:00

2P-1p005

アミノアシルプロリン合成におけるピロフォスファターゼの効果と菌体反応系での生産............................................ ○鈴木 伸 1, 原 良太郎 2, 木野 邦器 1,2（1 早大・先進理工, 2 早大・理工研）

17:00

2P-1p006

Fatty acyl-AMP リガーゼを利用した脂肪酸アミド合成法の開発........................................ ○平井 健吾 1, 原 良太郎 2, 木野 邦器 1,2（1 早大・先進理工, 2 早大・理工研）

16:00

2P-1p007

ブナシメジ（Hypsizygus marmoreus）由来メタロプロテアーゼの遺伝子クローニング................................................................. ○福田 泰久, 大庭 将矢, 藤井 謙吾, 白坂 憲章（近畿大・農）

17:00

2P-1p008

エリンギ由来セリンアミノペプチダーゼの非触媒領域の酸化が及ぼす基質特異性への影響.................................................................. ○東海 彰太 1, 有馬 二朗 2（1 鳥取大院・連農, 2 鳥取大・農）

16:00

2P-1p009

Brevundimonas diminuta 由来のコバルト依存性 L-アミノ酸アミダーゼの X 線結晶構造解析................................................... ○米田 英伸 1, 泉 厚志 2, 浅野 泰久 1,2（1 富山県大・工, 2 JST, ERATO）

17:00

2P-1p010

黄麹菌 D-アミノ酸特異的アミノペプチダーゼ(DamA)の機能解析とアミノリシス反応に対する溶媒の影響............................ 森田（松下） 真由美, 服部 領太, 鈴木 聡, ○楠本 憲一（農研機構 食品研究部門）

16:00

2P-1p011

Candida antarctica lipase A の組換え大腸菌での菌体外生産........................................................................ ○服部 菜月, 中野 秀雄, 岩崎 雄吾（名大院・生命農学）

17:00

2P-1p012

鉄硫黄酸化細菌 Acidithiobacillus ferrooxidans 由来テトラチオン酸ハイドロラーゼの結晶構造解析............................................... ○長谷 成記 1, 中山 久之 1, 小坂 恵 2, 玉田 太郎 3, 上村 一雄 1, 金尾 忠芳 1
（1 岡山大院・環境生命, 2 岡山大院・自科, 3 国立量子科技研）

16:00

2P-1p013

Pseudomonas cichorii 由来組換え D-タガトース 3-エピメラーゼを用いたデオキシケトヘキソースのエピ化反応............................................○熊谷 拓也 1, 吉原 明秀 2, 秋光 和也 2, フリート ジョージ W.J. 3, 何森 健 2（1 香川大学院 農学研究科, 2 香川大国際希少糖研究教育機構, 3 オックスフォード大学）

17:00

2P-1p014

ナイロン加水分解酵素のサブユニット会合と熱安定化機構の解析....................................................................................... ○伊東 雅人 1, 衣笠 凌 1, 羽田 圭吾 1, 大塚 裕斗 1,
竹原 一起 1, 重田 育照 2, 武尾 正弘 1, 根来 誠司 1
（1 兵庫県立大学・工・応化, 2 筑波大・計算科学研究センター）

16:00

2P-1p015

有機溶媒中でのナイロンの酵素分解..................................................... ○岡崎 秀明, 伊東 雅人, 生越 大輔, 竹原 一起, 武尾 正弘, 根来 誠司（兵庫県大院・工）35【タンパク質工学】
17:00

2P-1p016

インフルエンザウイルス A（H5N1)由来のヘマグルチニンと受容体結合解析......................................... ○鹿島 諒人 1, 吉田 佐和子 1, 尾形 慎 2, 宮崎 剛亜 1,3, 加藤 竜也 1,3, 朴 龍洙 1,3（1 静大院・農・応生化, 2 福島高専, 3 静大グリーン科学技術研）

16:00

2P-1p017

Functional analysis of Kup transport system in Escherichia coli..............................○ Ellen, Naomi Hoshi, Yi-Hsin Su, Kei Nanatani, Shin Hamamoto, Nobuyuki Uozumi（Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ.）

17:00

2P-1p018

Serratia marcescens type 1 secretion system による HasA 分泌機構の解明...... ○山下 純平 1, 小出（吉田） 静代 2, 中西 智美 1, 市原 拓巳 1, 辻 明彦 2,3, 大森 謙司 4, 湯浅 恵造 2,3（1 徳島大院・先端技科, 2 徳島大院・ソシオ, 3 徳島大・生物資源, 4 名大院・創薬科学）

16:00

2P-1p019

接着性ナノファイバータンパク質 AtaA の分泌を促進するタンパク質 TpgA の発見.................................................. ○吉本 将悟, 石川 聖人, 廣重 竜太, 鈴木 淳巨, 堀 克敏（名大院・工）17:00

2P-1p020

オオミジンコにおける組換えタンパク質の卵への輸送系の確立............................................................................................ ○辻 勇祐, 加藤 泰彦, 渡邉 肇（阪大院・工）16:00

2P-1p021

小胞体内在分子シャペロン存在下におけるアミロイドベータの凝集挙動解析............................................................................................... ○北内 健太, 迫野 昌文（富山大院・理工）

17:00

2P-1p022

ドラッグデリバリーを目指したシャペロニン GroEL/ES 複合体の応用............................................ ○依田 ひろみ, 高村 岳樹, 小池 あゆみ（神奈川工大院, 工, 応用バイオ）

16:00

2P-1p023

静電相互作用による小分子-タンパク質共結晶の作製........................................... ○塚本 啓介 1, 南畑 孝介 2, 安達 基泰 3, 清水 瑠美 3, 黒木 良太 4, 長棟 輝行 1
（1 東大院・工, 2 九大院・工, 3 量研機構, 4 原子力機構）

17:00

2P-1p024

16:00

2P-1p025

N 末端ペプチドタグによる難発現タンパク質発現増大効果の応用と機構解析........................................................................................... ○加藤 晃代, 中野 秀雄（名大院・生命農学）
超安定化二量体新規人工蛋白質 Super WA20 (SUWA)の創製と自己組織化蛋白質ナノブロック複合体構築................................................................................ ○木村 尚弥, 小林 直也, 新井 亮一（信州大・繊維）

17:00

2P-1p026

金属結合人工タンパク質の構造解析..... ○鎌田 健一 1, Voet Arnout 2, Tama Jeremy 1（1 横市大院・生命医科学, 2 Dept. Chem., KU Leuven.）

16:00

2P-1p027

イネ由来 α-アミラーゼの内毒素中和メカニズムの解明.......................................... ○落合 秋人, 渡邉 和史, 菅井 寛, 田中 孝明, 谷口 正之（新潟大・自然研）【抗体工学】
17:00

2P-1p028

スプライシング因子過剰発現による B 細胞株における抗体遺伝子変異の増強................................................................... ○太田 愛美, 西山 由美子, 清木 俊雄, 植月 英智, 川口 祐加,
仲尾 祐輝, 曲 正樹, 徳光 浩, 金山 直樹（岡山大院・自科）

16:00

2P-1p029

Serratia marcescens type 1 secretion system を用いた大腸菌による 1 本鎖抗体分泌系の構築............................................... ○浜垣 秀平 1, 高木 大地 2, 市原 拓巳 2, 辻 明彦 3, 大森 謙司 4, 湯浅 恵造 3
（1 徳島大院・先端技科, 2 徳島大・工, 3 徳島大・生物資源, 4 名大院・創薬科学）

17:00

2P-1p030

CHO 細胞における PDIa4 の抗体産生に及ぼす影響........................................... ○小松 圭 1, 公文 健人 1, 福谷 洋介 1, 鬼塚 正義 2, 大政 健史 3, 養王田 正文 1
（1 農工大院・工, 2 徳島大院・ソシオ, 3 阪大院・工）16:00

2P-1p031

新規抗体-酵素融合タンパク質(Zipbodyzyme)の開発......................................................... ○中野 秀雄, 森 昭博, 加藤 晃代, 兒島 孝明（名大院・生命農学）

17:00

2P-1p032

細胞表層 FIA 法とイムノチャンバーを用いる抗体高分泌細胞の１細胞育種....................................................................................................... ○良元 伸男, 黒田 俊一（阪大・産研）

36

16:00

2P-1p033

ファージ提示法を利用した CDR 模倣ペプチドライブラリーの構築......................................................... ○柳沢 美貴, 二井手 哲平, 服部 峰充, 中澤 光, 熊谷 泉, 梅津 光央

17:00

2P-1p034

シガトキシン２に対するウサギモノクローナル抗体の取得................................................. ○森下 しおみ, 加藤 晃代, 兒島 孝明, 中野 秀雄（名大院・生命農学）

16:00

2P-1p035

蛍光免疫センサー Quenchbody によるがん抗原タンパク質 HER2 の検出.................................................................................................... ○岡 裕也 1, 鄭 熙陳 2, 董 金華 2, 上田 宏 2（東北大院・工）（1 東工大院・総理工, 2 東工大・化生研）
17:00

2P-1p036

抗体の足場構造への変異導入が特異性に与える影響.............................. ○中山 純一 1, 服部 峰充 1, 中澤 光 1, 金子 美華 2, 加藤 幸成 2, 熊谷 泉 1, 梅津 光央 1
（1 東北大院・工, 2 東北大院・医）16:00

2P-1p037

抗体ダイレクトクローニング法による組換え抗体の樹立.......................................................................... ○加藤 三恵子 1, 羽生 義郎 2（1 バイオピーク, 2 産総研）

【発酵生理学，発酵工学】
17:00

2P-1p038

好熱菌発酵産物を給与したブタにおける腸内乳酸菌叢の変化.................................................................................. ○吉川 翔太 1, 宮本 浩邦 1,2,3, 須田 亙 2,4, 新名 俊行 5,
井藤 俊行 5, 大野 博司 6, 服部 正平 4,7, 児玉 浩明 1
（ 千葉大院・融合, 2 慶応大・医, 3 サーマス, 4 東京大院・新領域,
1

5

16:00

2P-1p039

京葉プラントエンジニアリング, 6 理研・IMS, 7 早稲田大院・先進理工）

Bioluminescence and electrochemical activities of Vibrio fischeri in batch and continuous cultures.................................................... ○Hyung Joo Kim 1, Minju Chang 1, Yong-Keun Choi 1, Kwang Jin Kim 2,
Hak Jin Song 1, Sok-young Shim 1, Wu-Young Jeong 1（1 Dept. Biological eng., Konkuk Univ., 2 Natl. Horticultural Res. Inst., Rural Development Administration）

17:00

2P-1p040

麹菌におけるタンパク質高発現システムの構築..................................................... ○佐藤 伊純, 山崎 将太朗, 出村 拓, 加藤 晃（奈良先端大・バイオ）

16:00

2P-1p041

土壌から分離した油脂高生産菌 Rhodosporidium paludigenum 1164 株の評価............................................................................ ○真野 潤一, 橘田 和美, 北岡 本光（農研機構・食研）

17:00

2P-1p042

Pseudozyma antarctica 由来リパーゼを利用したマンノシルエリスリトールリピッド高生産技術の開発....................................... ○雜賀 あずさ 1, 小池 英明 2, 福岡 徳馬 1, 山本 周平 3, 岸本 高英 3, 森田 友岳 1
（1 産総研・機能化学, 2 産総研・生物プロセス, 3 東洋紡（株）・敦賀バイオ）

16:00

2P-1p043

酸素供給が Sophorolipid 生産に与える影響............................................................................ ○生越 克典, 三輪 秀和, 平田 善彦（サラヤ株式会社）

17:00

2P-1p044

油糧酵母 Pseudozyma hubeiensis を用いたグルコース・キシロース・アラビノース同時発酵................................................................................... ○谷村 あゆみ 1, 高島 昌子 2, 杉田 隆 3, 遠藤 力也 2,
大熊 盛也 2, 岸野 重信 1, 島 純 4, 小川 順 1（1 京大院・農, 2 理研・BRC-JCM, 3 明薬大・薬, 4 龍大・農）

16:00

2P-1p045

Moniliella megachiliensis の浸透圧ストレス適応における ROS 産生とポリオール生成................................................................................... ○岩田 悠志 1, 渡邉 泰祐 1,2, 荻原 淳 1,2, 春見 隆文 1,2（1 日大・生資科, 2 日大院・生資科・生資利用）

17:00

2P-1p046

PUT4 遺伝子導入酵母株の脂肪酸組成の変化............................................................................................... ○三木 健夫, 村松 昇（山梨大院・医工総）

16:00

2P-1p047

醸造酵母ヒストン脱アセチル化酵素遺伝子破壊株の清酒醸造特性.................................................................................................... ○冨本 和也, 赤尾 健, 福田 央（酒総研）

17:00

2P-1p048

高濃度エタノールストレスによる翻訳抑制下でも優先的に翻訳される酵母 BTN2 の解析とその応用................................................................ 加藤 沙枝, 山内 雪菜, ○井沢 真吾（京工繊大院・工芸科学）

37

16:00

2P-1p049

高濃度バニリンストレスによる翻訳抑制下でも優先的に翻訳される酵母 VIE1 の解析.................................................... ○Nguyen Trinh TM, 石田 陽子, 井沢 真吾（京工繊大院・工芸科学）

17:00

2P-1p050

花酵母による廃牛乳を基質とした高機能微生物タンパク (SCP) 生産........................................................................................ ○大塚 光雄 1, 清 啓自 1, 茂野 俊也 2, 中島 敏明 1
（1 筑波大院・生命環境, 2 つくば環微研）

16:00

2P-1p051

N-アセチルグルコサミン資化性酵母 Scheffersomyces stipitis の特性解析............................................................................ ○猪熊 健太郎, 蓮沼 誠久, 近藤 昭彦（神戸大院・科）

17:00

2P-1p052

酵母表層への酵素立体的配置技術の開発......................................................... ○黒野 浩幹, 猪熊 健太郎, 蓮沼 誠久, 近藤 昭彦（神戸大院・科）

16:00

2P-1p053

定量プロテオミクスを用いた出芽酵母中心代謝安定化機構の解析.................................................................................... ○松田 史生, 富田 淳美, 清水 浩（阪大院・情報）

17:00

2P-1p054

抗生物質生産株の新規な固／液界面スクリーニング法............................................................. ○小田 忍, 林 優佑, 大澤 果穂, 大箸 信一（金工大・ゲノム研）【代謝工学】
16:00

2P-1p055

大腸菌を用いたコリスミ酸派生化合物合成プラットホームの開発............................................................................ ○野田 修平, 白井 智量, 近藤 昭彦（理研・環境資源）

17:00

2P-1p056

低温菌シンプル触媒におけるアスパラギン酸生産................................................. ○羅 宮臨風, 田島 誉久, 中島田 豊, 加藤 純一（広島大院・先端物質）

16:00

2P-1p057

シンプル酵素触媒構築を目指した低温菌における鉄誘導型プロモーターの探索................................................. ○土井 和博, 田島 誉久, 中島田 豊, 加藤 純一（広島大院・先端物質）

17:00

2P-1p058

2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の発酵生産収率向上のための大腸菌の代謝工学的改変.............................................................. ○濵野 雄大 1, 仁宮 一章 2, 柘植 陽太 2, 梶田 真也 3, 政井 英司 4,
片山 義博 5, 敷中 一洋 6, 大塚 祐一郎 7, 中村 雅哉 7, 高橋 憲司 1
（ 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術, 3 農工大・生物システム応科,1

4

長岡技科大, 5 日大・生資科, 6 農工大院・工, 7 森林総合研）

16:00

2P-1p059

BGL 提示大腸菌に適した代謝改変戦略を用いたセロビオースからのプトレシン生産.................................................................................... ○田中 勉, 西川 弘樹, 近藤 昭彦（神戸大院・工）17:00

2P-1p060

メバロン酸生産大腸菌株の定常期における代謝状態の解明......................................................... ○増田 亜美, 戸谷 吉博, 徳山 健斗, 坂野 聡美, 吉川 勝徳, 清水 浩

16:00

2P-1p061

in silico 代謝シミュレーションと実験室進化実験の統合によるコハク酸高生産大腸菌の構築.................................................................................... ○徳山 健斗, 戸谷 吉博, 清水 浩（阪大院・情報）

17:00

2P-1p062

イソプロパノール生産向上のための代謝システムの数理解析.................................................................................... ○藤田 純孝 1, 濱田 浩幸 2, 岡本 正宏 2, 花井 泰三 2

（阪大院・情報）（1 九大院・生資環, 2 九大院・農）
16:00

2P-1p063

糖代謝系遺伝子の破壊による Citrobacter freundii IFO13545 のバイオ凝集剤生産の改善............................................... ○柏 雅美 1, 宮本 弘毅 1, 池本 啓史 1, 木村 和幸 2, 根来 誠司 1, 武尾 正弘 1
（1 兵庫県大院・工, 2 （株）兵庫分析センター）

17:00

2P-1p064

Synechocystis sp.PCC 6803 の暗・嫌気条件でのカリウムイオン添加による有機酸生産への影響................................................................................ ○川村 優樹, 上田 紗季子, 小山内 崇（明治大・農）

16:00

2P-1p065

出芽酵母の PHO13 欠損はアセトアルデヒド耐性能を強化する............................................................................ ○高木 哲史, 早川 享志, 中川 智行（岐阜大・応生科）

17:00

2P-1p066

Thiamine: an important factor for acetaldehyde tolerance in the budding yeast.................................. ○ Annisyia Zarina Putri, Nodoka Kubota, Takashi Hayakawa, Tomoyuki Nakagawa（Fac. Appl. Biol. Sci., Gifu Univ.）

38

16:00

2P-1p067

Pichia methanolica グルコース抑制解除株を用いた AOD アイソザイムの発現制御機構の解析......................................................... ○土井 遼平, 蓮實 凉子, 早川 享志, 中川 智行（岐阜大・応生科）

17:00

2P-1p068

イソブタノール生産酵母の構築：オルガネラ局在の検討................................................... ○森田 啓介 1, 松田 史生 1, 伊田 賢吾 3, 石井 純 2, 近藤 昭彦 3, 清水 浩 1（1 阪大院・情報, 2 神戸大・自科・研究環, 3 神戸大院・工）【醸造学，醸造工学】
16:00

2P-1p069

純米酒中の α-EG 生産の研究............................................. ○橋本 弓加 1, 徳田 耕二 2, 尾関 健二 1（1 金工大・ゲノム研, 2 車多酒造）

17:00

2P-1p070

ビール醸造における各種糖質添加の影響................................................. ○木本 裕, 山根 健司, 藤本 佳則, 小川 浩一（日本食品化工・研究所）

16:00

2P-1p071

LC/MS による非ラベル化遊離アミノ酸分析法の確立と清酒酵母の系統によるアミノ酸取込の違い................................................................................................... ○清野 珠美, 廣岡 青央（京都市産技研）

17:00

2P-1p072

難消化性澱粉分解活性を有する酵素の高温登熟障害米消化能について................................................. ○伊藤 俊彦, 野口 巧実, 大友 敬太郎, 大阪 朝美, 藤田 直子, 橋爪 克己（秋田県立大・生資科）

16:00

2P-1p073

GC×GC-TOFMS で取得した揮発性成分プロファイルと清酒の「押し味」の相関解析.......................... ○玉田 佳大 1, 西村 泰央 2, 大東 功承 1, 西本 遼 1, 浅井 拓也 1, 山下 伸雄 1, 明石 貴裕 1
（1 白鶴酒造, 2 LECO ジャパン）

17:00

2P-1p074

清酒メタボロームへの原料米品種、精米歩合、酵母菌株の影響................................................. 小里 孟 1,2, 梅尾 美幸 1, 平田 章悟 1,2, 矢澤 彌 1, 織田 健 1, ○岩下 和裕 1,2（1 酒総研, 2 広島大院・先端物質）

16:00

2P-1p075

日本酒の醸造における酵母のメタボロームデータを利用した発酵呼吸状態の推定.......................○藤丸 裕貴, 門脇 真史, 佐藤 友哉, 田口 誠我, Jannatul Ferdouse, 澤田 和敬, 北垣 浩志

17:00

2P-1p076

醤油の特徴香成分である 4-hydroxy-2(or 5)-ethyl-5(or 2)-methyl-3(2H)-furanone の生合成に関わる酵素（佐賀大・農）遺伝子の同定................................................................. 上原 健二, ○渡部 潤, 茂木 喜信, 月岡 祐一郎（ヤマサ醤油）
16:00

2P-1p077

様々な醸造食品に含まれるグリコシルセラミド量の測定..................................................... ○阪本 真由子, 宮川 幸, 松永 陽香, 酒谷 真以, 藤川 彩美, 北垣 浩志

17:00

2P-1p078

Zymomonas mobilis を用いたホエーを原料とするエタノール発酵および食酢醸造の検討....................................................................................... ○荻山 大輝, 若山 守（立命館大院・生命科学）

16:00

2P-1p079

紫芋焼酎粕を原料としたデザートソースの開発と機能性.......................................................... ○多賀 直彦 1, 岩下 小太郎 2, 越智 大起 2, 椛田 聖孝 1, 村田 達郎 1,（佐賀大・農）芝田 猛 1, 荒木 朋洋 1, 安田 伸 1, 松田 靖 1, 本田 憲昭 1
（1 東海大・農, 2 東海大院・農）
17:00

2P-1p080

黒糖焼酎の香気に及ぼす蒸留法の影響.............. ○島田 麻里奈 1, 落合 佑香 2, 吉﨑 由美子 2, 奥津 果優 2, 二神 泰基 2, 玉置 尚徳 2, 髙峯 和則 2
（1 鹿児島大院・農, 2 鹿児島大・農）

16:00

2P-1p081

芋焼酎醪中に生息している乳酸菌に関する研究................................................. ○宮川 博士, 小境 敏揮, 鈴木 恵利香, 河野 邦晃, 岩井 謙一, 高瀬 良和

17:00

2P-1p082

酸素・水素安定同位体比に基づく清酒の産地識別..................................................... ○栗林 喬 1, 城 斗志夫 2, 金桶 光起 1（1 新潟県醸造試, 2 新潟大・農）（霧島酒造）

39【食品科学，食品工学】
16:00

2P-1p083

Pediococcus pentosaceus の持つ免疫賦活作用.................................................................... 山田 康伸, 今井 伸二郎, ○西野 智彦（東京工科大・応生）

17:00

2P-1p084

伝統的発酵食品の製造工程における細菌混入経路の次世代シーケンスによる解析....................... ○鈴木 市郎 1,2, 白 至桓 1, 杉田 龍兵 3, Nakamura Gouvea Natalia 1, 武田 穣 1, 小泉 淳一 1
（1 横国大院・工, 2 横国大・リスク共生, 3 横国大・理工）

16:00

2P-1p085

pH 非調整型の培養系ヒト腸管モデルの確立................................................................................ ○佐々木 建吾 1, 佐々木 大介 1, 近藤 昭彦 1, 大澤 朗 2（1 神戸大院・科学技術イノベーション, 2 神戸大・自科・研究環）

17:00

2P-1p086

農産品から単離した乳製品用乳酸菌の多機能性評価.............................................. ○高屋 朋彰 1, 根来 雄哉 2（1 小山高専・物質, 2 小山高専専攻科・物質）

16:00

2P-1p087

和歌山県日高地方の紀州なれずしの細菌叢の解析............................................................................ ○川瀬 貴斗, 早川 享志, 中川 智行（岐阜大・応生科）

17:00

2P-1p088

液体表面培養したカバノアナタケが生産する生理活性物質の評価.................................................................................... ○高柴 則子 1, 藏本 彩加 1, 米田 任伸 2, 櫻井 明彦 1
（1 福井大院・工, 2 福井大・工）

16:00

2P-1p089

胞子形成過程を回避した酵母の人為的有性生殖法........................................................................................ ○福田 展雄 1, 石井 純 2, 近藤 昭彦 2, 本田 真也 1
（1 産総研・バイオメディカル, 2 神戸大院・イノベ）

17:00

2P-1p090

麹菌によるアクリル酸分解の研究...................... ○尾関 健二 1, 河上 春樹 1, 久保 廣海 1, 上杉 大智 1, 坪井 宏和 2, 坊垣 隆之 2, 岩井 和也 3
（1 金工大・ゲノム研, 2 大関・総研, 3 UCC 上島珈琲・イノベーションセンター）

16:00

2P-1p091

パルミチン酸誘導性炎症に対する白麹抽出物の抗炎症効果....................................... ○大城 沙織 1, 神戸 悠輝 2, 奥津 果優 1, 吉﨑 由美子 1, 宮田 篤郎 2, 髙峯 和則 1
（1 鹿大院・農, 2 鹿大院・医歯）17:00

2P-1p092

アメフラシ消化液より単離したフロロタンニン結合蛋白質、EHEP の特性解析................................................ ○辻 明彦, 桑村 修司, 湯浅 恵造（徳島大院・生物資源産業学研究部）

16:00

2P-1p093

統計的実験計画法を用いた乳酸菌生産のためのアレルゲンフリー培地の最適化........................ ○ターナー ピーター 1, 小川 博 1, 阿部 吉邦 1, Cabrera-Ostertag Ignacio 2, Menton John 2（1 セントラル科学貿易, 2 Kerry, WI, USA）

17:00

2P-1p094

R-α リポ酸処理したラット肝がん細胞の経時的メタボローム解析.............○生田 直子 1, 近本 啓太 2, 浅野 雄哉 2, 横川 遥香 2, 寺尾 啓二 3, Rimbach Gerald 4, 松郷 誠一 2
（1 神戸大院・医, 2 金沢大院・自科, 3 (株)シクロケム, 4 Inst. Hum. Nutri. Food Sci. Kiel Univ.）

16:00

2P-1p095

新規食品機能性成分コリンエステル類の抗高血圧作用.................................................................. ○中村 浩蔵 1,2, 山口 翔平 2, 渡辺 旭 1, 小山 正浩 2, 猪狩 直樹 3
（1 信州大院・農, 2 信州大・農, 3 大和薬品（株））

17:00

2P-1p096

Optimization of polysaccharides extraction from Inonotus obliquus using subcritical water technology............................ ○Xi Yuan, Hongyi Sun, Zhenya Zhang（Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba）

16:00

2P-1p097

メリンジョ由来グネチン C の抗動脈硬化作用..................... ○関根 由璃子 1, 宮崎 均 2, 吉田 滋樹 2（1 筑波大院・生命環境, 2 筑波大・生命環境系）

17:00

2P-1p098

Lactococcus lactis のナイシン高生産株スクリーニング系の開発........................................... ○三田 麻友華 1, 山本 理奈 1, 大島 悟 2, 依田 伸生 2, 山崎 思乃 1, 片倉 啓雄 1
（1 関西大・化生工, 2 明治）

16:00

2P-1p099

白米ペプチド由来睡眠ホルモン合成酵素活性化因子の同定.......................................................... ○畑中 唯史 1, 守谷 智恵 2, 川上 賀代子 2, 藤田 明子 3, 川上 晃司 3,
下田 博司 4, 裏地 美杉 1, 万 クン 1, 坪井 誠二 2
（1 岡山生物研, 2 就実大薬, 3 (株)サタケ, 4 オリザ油化(株)）40【環境浄化，修復，保全技術】
17:00

2P-1p100

青枯病菌 Ralstonia solanacearum のホウ酸走化性に関わる新規センサータンパク質の解析............................................. ○緋田 安希子, 田島 誉久, 中島田 豊, 加藤 純一（広島大院・先端物質）

16:00

2P-1p101

Ralstonia solanacearum の twitching motility 阻害剤の探索.......................................................................................................... ○伊達 修平（広島大院・先端物質）

17:00

2P-1p102

Rhodococcus 属細菌を用いたヒ素検出システムの構築....................................................................................... ○富田 尚樹 1, 荒井 佑哉 2, 佐藤 舜 2, 庄司 有理 2,
平間 知之 1, 福田 雅夫 3, 遠藤 銀朗 2, 宮内 啓介 2
（1 東北学院大院・工・環境建設工, 2 東北学院大・工, 3 長岡技科大）16:00

2P-1p103

海洋生物試料からの好気的セレン酸還元性微生物の分離と培養............................................. ○阪口 利文 1,2, 内田 菜月 1, 馬越 智也 2, 岡村 好子 3, 石川 輝 4, 田口 和典 4（1 県大広島・生命科学, 2 県大広島・環境科学, 3 広島大院・先端物質, 4 三重大院・生資）

17:00

2P-1p104

ジノテフランが微生物生態系に及ぼす影響評価...................................... ○伊藤 秋実, 脇屋 香, 狩山 美沙紀, 小橋 興次, 坂上 吉一, 早坂 大亮, 森 美穂
（近畿大・農）

16:00

2P-1p105

ネオニコチノイド系農薬のイミダクロプリドが微生物生態系に及ぼす影響評価...................................... ○脇屋 香, 伊藤 秋実, 狩山 美沙紀, 小橋 興次, 坂上 吉一, 早坂 大亮, 森 美穂

17:00

2P-1p106

Sphingomonas bisphenolicum AO1 株の環境汚染物質分解能の向上と安定化....................................................................................................... ○高 未麗 1, 村澤 友紀恵 2, 松村 吉信 2,3（近畿大・農）（1 関西大院・理工, 2 関西大・化生工, 3 関西大・ORDIST）
16:00

2P-1p107

炭化水素分解菌 Rhodococcus erythropolis NDKK6 を活性化させる共生微生物の探索................................................................ ○野濱 元輝, 荒木 希和子, 久保 幹（立命館大院・生命科学）

17:00

2P-1p108

ノニルフェノールモノオキシゲナーゼ遺伝子を用いたビスフェノール S の分解....................................... ○近成 直斗 1, 栗岡 純平 1, 田村 亮太 1, 加藤 太一郎 2, 根来 誠司 1, 武尾 正弘 1
（1 兵庫県大院・工, 2 鹿児島大学大学院理工学研究科）

16:00

2P-1p109

Penicillium sp. CHY-2 株による模擬汚染土壌中の 4-tert-ブチルフェノール分解特性..................................... ○小野寺 瑠依, 梅本 穂乃香, 矢島 由佳, 張 傛喆（室工大院・工・環境創生）

17:00

2P-1p110

抗がん剤フルオロウラシルの分解挙動と細胞毒性残存性の検討........................................................................................... ○岡山 真哉, 前田 憲成（九工大院・生体工）

16:00

2P-1p111

Dehalococcoides 共生微生物の獲得とトリクロロエテン嫌気的脱塩素化への利用............................................................................ ○會田 悠人 1, 池上 健太郎 1, 矢木 修身 2, 養王田 正文 1
（1 農工大院・工, 2 東京大学）

17:00

2P-1p112

シアン分解能を有する Pedobacter 属細菌の単離と解析.................................................................................... ○寺田 彩音 1, 小松 大祐 2, 西村 実 2, 養王田 正文 1
（1 農工大院・工, 2 株式会社アイ・エス・ソリューション）

16:00

2P-1p113

富栄養汽水性佐鳴湖からのアンモニア酸化細菌の単離および特性解析................................................................................. ○杉山 和哉 1, 工藤 勇人 1, 田代 陽介 1, 二又 裕之 1,2,3（1 静大院・工, 2 静大グリーン研, 3 静大・創科技院）【バイオマス，資源，エネルギー工学】
17:00

2P-1p114

土壌環境中のリン供給に対する微生物と金属元素の影響解析.................................................................... ○蒋 天翼, 荒木 希和子, 久保 幹（立命館大院・生命科学）

16:00

2P-1p115

土壌中の金属成分と微生物活性の関係解析.................................................... ○Niamatullah Sidiq, 荒木 希和子, 久保 幹（立命館大院・生命科学）

41

17:00

2P-1p116

アカテガニが示すバイオマス分解活性の解析............................................................... 裏 佳織 1, 知田 真之介 1, 馬場 保徳 1, 柳井 清治 2, ○三宅 克英 1
（1 石川県大・生物資源研, 2 石川県大・生資環）

16:00

2P-1p117

茹で麺排水への酵素剤添加による固形成分への凝集・沈降性付与機構の解明........................................................................................ ○渡辺 昌規 1, 西山 航生 1, 塩野 忠彦 2, 楠 信行 3
（1 山形大院・農, 2 広島県立総合技術研究所・食品, 3 くすのき厨房（株））

17:00

2P-1p118

ジスプロシウム高吸収能を示す酵母の探索........................................................................................... 晃佑 垣田, ○岸田 正夫（阪府大院・生環科）

16:00

2P-1p119

酵母における酸耐性・塩耐性付与遺伝子の解析と分子育種による耐性強化....................................... ○松鹿 昭則 1,2, 鈴木 俊宏 1, 根冝 香奈子 1, 橋本 智代 1, 五島 徹也 3, 星野 保 1,2（1 産総研・機能化学, 2 広島大院・先端物質, 3 酒総研）

17:00

2P-1p120

Process simulation for efficient acetic acid production from nipa sap................................................... ○Dung Van Nguyen 1, Pinthep Sethapokin 2, Harifara Rabemanolontsoa 1,
Eiji Minami 1, Haruo Kawamoto 1, Shiro Saka 1（1 Grad. Sch. Energy Sci., Kyoto Univ.,
2

16:00

2P-1p121

On leave from King Mongkut's Instit. Technol. Ladkrabang to Kyoto Univ.）

超低栄養性細菌 Rhodococcus erythropolis N9T-4 株の効率的培養法の確立.................................................................................... ○松岡 友洋 1, 新谷 政己 2, 金原 和秀 2, 吉田 信行 2
（1 静大・工, 2 静大院）

17:00

2P-1p122

Serratia marcescens において 2,3-ブタンジオール生産性を増大させる変異の解析.................................. ○張 琳 1, 大槻 隆司 1（1 山梨大学・医工農・生環, 2 山梨大学・医工農・生環）

16:00

2P-1p123

大腸菌グルコース燃料電池の出力向上を目指した糖代謝と呼吸鎖の改変....................................................................... ○福井 早紀 1, 駒 大輔 2, 大本 貴士 2, 尾島 由紘 1, 東 雅之 1
（1 阪市大院・工, 2 大阪市工研）

17:00

2P-1p124

好熱菌発酵産物ならびに電子供与体としての有機物添加時における硝酸態窒素減少と菌叢解析................................................................................. ○荒岡 亮祐 1, 井藤 俊行 2, 宮本 浩邦 3,4, 児玉 浩明 1,3（1 千葉大・園芸, 2 京葉プラントエンジニアリング, 3 千葉大院・融合, 4 サーマス）

16:00

2P-1p125

窒素除去を目的とした微生物燃料電池の単離菌を用いた評価............................................................................ ○荒井 雄貴, 井上 千弘, 須藤 孝一（東北大院・環境）

17:00

2P-1p126

蓄電性 Mackinawite の充放電前後における結晶構造解析........................................... ○由井 嵐士 1, 鈴木 渓 2, 安藤 翔太 3, 田代 陽介 1, 小暮 敏博 4, 二又 裕之 1,2,5（1 静大・創科技院, 2 静大院・自然科学系教育学部,
3

16:00

2P-1p127

静大・工, 4 東大院・理学系研究所, 5 静大・グリーン研）

微生物燃料電池アノード電極上の微生物群集細胞内代謝解析............................................................................ ○佐々木 大介 1, 佐々木 建吾 1, 柘植 陽太 2, 近藤 昭彦 1（1 神戸大院・科学技術イノベーション, 2 金沢大・新学術創成研究機構）

17:00

2P-1p128

メタノール原料からの共重合ポリヒドロキシアルカン酸生合成に向けた Methylobacterium extorquens
AM1 の代謝改変..................................................... ○海野 源人, 折田 和泉, 中村 聡, 福居 俊昭（東工大院・生命理工）

16:00

2P-1p129

脂質系バイオマスからの中鎖ホモポリヒドロキシアルカン酸の生合成とその物性解析................................... ○廣江 綾香 1,2, 石井 大輔 2,3, 加部 泰三 4, 岩田 忠久 2,3, 田口 精一 5, 柘植 丈治 1,2（1 東工大院・総理工, 2 JST・CREST, 3 東大院・農生科, 4 JASRI, 5 北大院・工）17:00

2P-1p130

3HHx を高含有率で含む共重合ポリエステルの遺伝子組換え水素細菌による CO2 からの生合成................................................................... ○森 舜也 1, 丸尾 浩希 1, 折田 和泉 2, 福居 俊昭 2, 田中 賢二 1
（1 近大院・産理工・生環化, 2 東工大院・生命理工）

16:00

2P-1p131

Ralstonia eutropha 代謝改変株による糖質およびグリセロールからのポリヒドロキシアルカン酸共重合体の生合成....................................... Zhang Mengxiao, 折田 和泉, 中村 聡, ○福居 俊昭（東工大・生命理工学院）

42

ANA クラウンプラザホテル富山

3 階ポスター会場 II（ASUKA）（16:00～18:00）【生物化学工学】
17:00

2P-2p132

CRISPR/Cas を用いた高耐久性酵母の創製............................................................................ ○三ツ井 良輔, 山田 亮祐, 荻野 博康（阪府大院・工）16:00

2P-2p133

糸状菌の細胞内共生を利用した新規高機能株構築法確立への試み............................................................................ ○角田 貴一, 高野 真希, 星野 一宏（富山大院・理工）

17:00

2P-2p134

麹菌 Aspergillus oryzae 金属プロテアーゼ AdmA, AdmB の炭素源飢餓条件での役割.......................................... ○小林 拓嗣, 大岩 達郎, 前田 浩, 竹内 道雄, 山形 洋平（農工大院・連農）

16:00

2P-2p135

微細藻類加水分解液の 2-ピロン-4,6-ジカルボン酸発酵培地への適用.......................................... ○野口 愛 1, Htet April N 1, 仁宮 一章 2, 柘植 陽太 2, 梶田 真也 3, 政井 英司 4,
片山 義博 5, 敷中 一洋 6, 大塚 祐一郎 7, 中村 雅哉 7, 本多 了 1, 高橋 憲司 1
（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術, 3 農工大・生物システム応科,
4

17:00

2P-2p136

長岡技科大, 5 日大・生資科, 6 農工大院・工, 7 森林総合研）

酸性条件下における寒天平板培養法の問題点の把握と SCF 法の利用...................................................................................... ○高野 力 1, 安田 竜馬 2, 村山 晃一 3, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大・生物資源, 2 筑波大院・生命環境, 3 フタムラ化学）

16:00

2P-2p137

試料の有効な前処理と SCF 法の組み合わせによる新規微生物の培養化............................. ○長谷川 智弘 1, 村山 晃一 2, 青柳 秀紀 1（1 筑波大院・生命環境, 2 フタムラ化学）

17:00

2P-2p138

SCF 法を用いた植物試料からの新規微生物の培養と評価（第 2 報）................................. ○小林 和輝 1, 村山 晃一 2, 青柳 秀紀 1（1 筑波大院・生命環境, 2 フタムラ化学）

16:00

2P-2p139

最少量の低毒性イオン液体で前処理したバイオマスからの糖化・発酵生産プロセスの開発.......................................................... ○志津田 有成 1, 仁宮 一章 2, 柘植 陽太 2, 梶田 真也 3, 政井 英司 4,
片山 義博 5, 敷中 一洋 6, 大塚 祐一郎 7, 中村 雅哉 7, 高橋 憲司 1
（ 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術, 3 農工大・生物システム応科,
1

4

17:00

2P-2p140

長岡技科大, 5 日大・生資科, 6 農工大院・工, 7 森林総合研）

遺伝子組換え大腸菌を用いたフェニル乳酸生産に影響を与える遺伝子の発現解析........................................... ○宮川 寛規 1, 川口 秀夫 2, 荻野 千秋 1, 老沼 研一 3, 高谷 直樹 3, 近藤 昭彦 2
（1 神戸大院・工, 2 神戸大院・科学技術イノベーション, 3 筑波大院・生命環境）【バイオプロセス】
16:00

2P-2p141

組換えタンパク質発現時における共発現 LEA ペプチドの発現条件の至適化........................................................................................... ○池野 慎也, 岩水 岳教（九工大院・生体工）

17:00

2P-2p142

転写因子改変放線菌を用いた異種タンパク質生産........................................... ○柏木 紀賢 1, 西岡 雅都 1, 廣瀬 修一 2, 曽田 匡洋 2, 荻野 千秋 3, 近藤 昭彦 1（1 神戸大院・科学技術イノベーション, 2 長瀬産業・ナガセ R&D センター, 3 神戸大院・工）16:00

2P-2p143

グラム陰性菌由来のファイバータンパク質による微生物の固定化と表層提示技術の統合............................................................................................ ○中谷 肇, 小原 優季, 堀 克敏（名大院・工）17:00

2P-2p144

ボロン酸ゲルによる希少ヘキソースの新規分離法の確立............................................................... ○後藤 成暁 1, 十川 直也 1, 野崎 智帆 1, 吉原 明秀 2, 森本 兼司 2
（1 香川大学院 農学研究科, 2 香川大学国際希少糖研究教育機構）

16:00

2P-2p145

PEG 鎖長の異なる光分解回収型 PEGylation 試薬の合成と評価.................................................................................. ○金兵 知毅 2, 山口 哲志 1, 塩田 英史 2, 岡本 晃充 1,2（1 東大・先端研, 2 東大院・工）

43

17:00

2P-2p146

抗体精製用プロテイン A クロマトグラフィー担体の高機能化........................ ○西八條 正克 1,2, 鴻池 史憲 1,2, 荻原 侑莉恵 1,2, 中野 喜之 1,2, 船木 正大 1,2, 水口 和信 1,2（1 カネカ, 2 MAB 組合）

16:00

2P-2p147

低分子化抗体精製用アフィニティクロマト担体の開発............................ ○村田 大 1,2, 吉田 慎一 1,2, 荻原 侑莉恵 1,2, 西八條 正克 1,2, 船木 正大 1,2, 水口 和信 1,2（1 カネカ, 2 MAB 組合）

17:00

2P-2p148

Fc レセプターを用いた抗体分析用アフィニティ分離剤による糖鎖改変抗体の解析.............................................................................................. ○山中 直紀, 寺尾 陽介, 田中 亨, 朝岡 義晴,
青木 大, 西山 しずか, 大江 正剛, 井出 輝彦
（東ソー）

16:00

2P-2p149

抗体及び低分子化抗体精製向け新規プロテインＬアフィニティー充てん剤の機能評価................................................................................. ○田中 亨, 小林 秀峰, 荒木 康祐, 中谷 茂（東ソー）

17:00

2P-2p150

光応答性マイクロウェル法を用いた細胞の選別.................... ○高木 理沙 1, 山口 哲志 2, 榊原 昇一 3, 田端 和仁 1, 野地 博行 1, 飯野 亮太 4, 岡本 晃充 1,2（1 東大院・工, 2 東大・先端研, 3 阪大産研, 4 分子研）

【セル＆ティッシュエンジニアリング】
16:00

2P-2p151

Analysis of cell migratory dispersion through spatial measurement of nucleus density..................................... ○Ziyu Chen, Mee-Hae Kim, Masahiro Kino-oka（Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.）

17:00

2P-2p152

糖尿病性腎症おける細胞外マトリクスの早期変遷解析................................. ○赤塚 愛里 1, 村澤 裕介 2, 王 碧昭 1（1 筑波大院・生命環境, 2 国立長寿医療セ）

16:00

2P-2p153

ラット骨髄培養細胞における時計遺伝子 Per2 発現の振動開始位相の解析.......................... 切明 研人 1, 深浦 恵梨 1, ○藤原 政司 1, 西出 真也 2, 本間 さと 2, 本間 研一 2, 髙木 睦 1（1 北大院・工, 2 北大院・医）17:00

2P-2p154

軟骨再生用間葉系幹細胞のマイクロキャリアによる増殖.......................................................................... ○天笠 翼 1, 髙橋 伊織 1, 目良 恒 2,3, 脇谷 滋之 3, 髙木 睦 1（1 北大院・工, 2 新潟大・魚沼基幹病院, 3 武庫女大・健スポ）

16:00

2P-2p155

デジタルホログラフィック顕微鏡を用いた位相差解析によるガン細胞識別....................................................................................................... ○髙木 睦, 倉島 つぐみ（北大院・工）17:00

2P-2p156

動物細胞の機能変化を利用したクロム検出.................................................................................... ○小川 亜希子, 保坂 浩章, 田中 雄士（鈴鹿高専）

16:00

2P-2p157

マウス神経幹細胞/前駆細胞における亜鉛制御関連遺伝子の発現解析........................................................................................ ○西川 麻裕, 森 英樹, 原 正之（阪府大院・理）

17:00

2P-2p158

凍結保護剤を用いない瞬間凍結保存法における保存期間の細胞生存率への影響........................................................................................ ○篠瀬 真人 1, 上野 明 2, 山口 修一 2, 秋山 佳丈 1
（1 信州大院・理工学, 2 株式会社マイクロジェット）

16:00

2P-2p159

iPS 細胞技術を利用した機能的ヒト NKT 細胞の大量培養とがん免疫療法モデル......................... ○山田 大輔, 伊豫田 智典, 谷口 克, 藤井 眞一郎, 古関 明彦（理研 統合生命医科学）

17:00

2P-2p160

ボツリヌス菌由来 Hemagglutinin を用いたヒト iPS 細胞の高密度懸濁培養法の確立................................................ ○山本 陸 1, 都倉 知浩 1,2, Nath Suman Chandra 1, 金 美海 1, 紀ノ岡 正博 1
（1 阪大院・工, 2 藤森工業）

16:00

2P-2p161

単一集塊でのヒト iPS 細胞培養における高密度化の限界についての検討................................................................................................... ○植野 真伍, 紀ノ岡 正博（阪大院・工）17:00

2P-2p162

クローン培養系を用いたヒト iPS 細胞培養中に生じる不均質性の解明.................................................................................... ○近藤 伸彦, 金 美海, 紀ノ岡 正博（阪大院・工）

44

16:00

2P-2p163

紫外線照射コラーゲンゲル上で培養した脳毛細血管内皮細胞におけるインテグリン遺伝子の発現解析..................................................................... ○土岐 麻菜, 佐藤 綾香, 森 英樹, 原 正之（阪府大院・理）

17:00

2P-2p164

ポリアミド繊維上における神経幹細胞／前駆細胞の接着と三次元的な伸展........................................................................................ ○森 英樹, 藤田 雅徳, 原 正之（阪府大院・理）

16:00

2P-2p165

光増感反応で生じた活性酸素種がラット間葉系幹細胞の分化へ及ぼす影響........................................................................................ 城田 裕介, 森 英樹, ○原 正之（阪府大院・理）

17:00

2P-2p166

膵 β スフェロイドの遠心充填による立体組織作製................................................................................ ○大西 希咲, 榎本 詢子, 福田 淳二（横国大院・工）16:00

2P-2p167

ヒト iPS 細胞由来脂肪細胞を用いた没食子酸エピガロカテキンの機能性評価.......................... ○清水 康子 1, 大貫 喜嗣 1, 河野 高徳 2, 卯川 裕一 2, 提坂 裕子 2, 望月 和樹 1, 黒澤 尋 1（1 山梨大院・総研部, 2 株式会社・伊藤園・中央研究所）

17:00

2P-2p168

筋収縮力測定マイクロデバイスの開発と筋萎縮モデルへの応用.................................................................................. ○弦間 里歩 1, 清水 一憲 1, 後藤 友規 1, 本多 裕之 1,2（1 名大院・工, 2 名大・予防早期医療創成セ）

16:00

2P-2p169

アプタマー修飾オリゴペプチド層を用いた選択的な細胞のキャッチ＆リリース....................................○榎本 詢子 1, Gautieri Alfonso 2, 福田 淳二 1（1 横国大院・工, 2 ミラノ工科大）

17:00

2P-2p170

3 次元ゲル培養からの形態情報による細胞塊選抜システムの開発.......................................... ○渋田 真結 1, 佐々木 寛人 2, 田村 磨聖 3, 蟹江 慧 1, 松井 裕史 4, 杉浦 慎治 3,
金森 敏幸 3, 柳沢 真澄 5, 佐藤 琢 3, 高木 俊之 3, 加藤 竜司 1
（1 名大院・創薬, 2 名大院・工, 3 産総研, 4 筑波大, 5 エンジニアリングシステム）

16:00

2P-2p171

GFP 陰性造影法による生細胞の構造計測技術の開発............................................................................... ○田中 正太郎, 高桑 雄一（東女医大・医・生化学）

17:00

2P-2p172

培養上清成分のインプロセス・モニタリングによる細胞非侵襲的なヒト iPS 細胞の未分化性の評価............................................... ○豊田 健一 1, 鈴木 崇 1, 畑林 邦忠 2, 平丸 大介 1, 高橋 雅俊 1, 加川 健一 2
（1 島津製作所, 2 東京エレクトロン 革新技術企画室）

16:00

2P-2p173

畳み込みニューラルネットワークによる C2C12 細胞分化の識別................................................................... ○新岡 宏彦 1, 浅谷 学嗣 2, 大東 寛典 2, 田川 聖一 1, 三宅 淳 1（1 阪大院・基礎工, 2 阪大 基礎工）

17:00

2P-2p174

細胞画像情報を用いた凍結ストレスに対する幹細胞品質変化の評価....................................................................... 松本 恵 1, 蟹江 慧 2, 清水 一憲 1, 本多 裕之 1, ○加藤 竜司 2
（1 名大院・工, 2 名大院・創薬科学）

16:00

2P-2p175

ヒト iPS 細胞の継代培養中発生する逸脱細胞の簡便な除去法の構築.................................................................................... ○金 美海, 松原 佳史, 紀ノ岡 正博（阪大院・工）17:00

2P-2p176

プラズマ照射活性化培地を用いた残存未分化ヒト iPS 細胞の選択的除去....................................................................................... ○長島 拓則 1, 清水 一憲 1, 松本 凌 1, 田中 宏昌 2,
水野 正明 3, 吉川 史隆 4, 堀 勝 2, 本多 裕之 1,5（ 名大院・工, 名大・未来社会創造機, 名大病院, 名大院・医, 5 名大・予防早期医療創成セ）
1

2

3

4

16:00

2P-2p177

密着結合タンパクの機能特性に基づいた網膜毒性の新規 in vitro 毒性評価系の構築................................................................................. Xie Yucheng, 金 美海, ○紀ノ岡 正博（阪大院・工）17:00

2P-2p178

ナノニードルアレイを用いたビメンチン陽性癌細胞分離技術の開発.................................................................. ○松本 雄太 1, 清水 桂太 1, 飯嶋 益巳 3, 黒田 俊一 3, 中村 史 1,2（1 農工大院・工, 2 産総研・バイオメディカル, 3 阪大・産研・生体分子反応科学）

16:00

2P-2p179

人工骨格筋組織の収縮力測定による薬剤評価系の構築.................................................................. ○池田 一史 1, 井藤 彰 2, 今田 隆介 2, 河邉 佳典 2, 上平 正道 1,2（1 九大院・シス生科, 2 九大院・工）17:00

2P-2p180

アルギン酸カルシウム犠牲層を用いたゼラチンハイドロゲルの 3 次元構築...................................................................................... ○伊野 浩介 1, 横川 裕紀 1, 珠玖 仁 2, 末永 智一 1,3（1 東北大院・環境, 2 東北大院・工, 3 東北大・WPI-AIMR）

45【核酸工学】
16:00

2P-2p181

人工 mRNA スイッチによるヒト内在性タンパク質の検知.................................................. ○川﨑 俊輔 1,2, 藤田 祥彦 2, 齊藤 博英 2（1 京大院・医, 2 京大・CiRA）

17:00

2P-2p182

代謝物と RNA の 2 入力に応答する AND ゲートリボザイムの開発............................................................................ ○内藤 卓人, 井川 善也, 松村 茂祥（富山大院・理工）

16:00

2P-2p183

グループ I リボザイムの集積制御による RNA ナノ構造の選択的形成と活性評価.................... ○大井 宏紀 1, 藤田 大介 1, 鈴木 勇輝 2,3, 杉山 弘 2,3, 遠藤 政幸 2,3, 松村 茂祥 1, 井川 善也 1
（1 富山大院・理工, 2 京大 iCeMS, 3 京大院・理）【糖鎖工学】
17:00

2P-2p184

フコース結合型糖鎖合成に関わる酵素群をノックアウトした CHO-K1 細胞の構築......................................................... ○岩崎 将士, 三崎 亮, 大橋 貴生, 藤山 和仁（阪大・生工国際セ）

16:00

2P-2p185

成熟糖鎖合成を促進する糖鎖修飾改変植物体の作出........................ ○佐藤 圭悟 1, 弓岡 仁美 1,2, 磯山 純子 1, 土肥 浩二 1, 大橋 貴生 1, 三崎 亮 1, 藤山 和仁 1
（1 阪大・生工国際セ, 2 大阪成蹊短大・栄養）

17:00

2P-2p186

糖転移酵素 GnTI 遺伝子発現抑制による植物型糖鎖構造の改変.............................................................. 土肥 浩二 1, ○弓岡 仁美 1,2, 磯山 純子 1, 菊池 輝美 1, 藤山 和仁 1
（1 阪大・生工国際セ, 2 大阪成蹊短大・栄養）

16:00

2P-2p187

均一な糖鎖構造を有する抗体 Fc 領域の生産と解析........................................... ○千葉 靖典 1, 高橋 佳江 1, 岩城 隼 2,3, 石田 秀樹 2,3, 松崎 祐二 2,3, 平林 淳 1,3（1 産総研・創薬基盤, 2 東京化成工業, 3 次世代バイオ医薬品製造技術研究組合）

ランチョンセミナー
2LC1

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アジレント・テクノロジー株式会社

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46

第 3 日（9 月 30 日）
太字の一般講演は今年度の生物工学学生優秀賞（飛翔賞）受賞者の発表です．
開始時間

講演番号

演

発表者氏名（所属）題○印は講演者を示す

一般講演（午前の部）
富山国際会議場

2 階ポスター会場 I（9:00～11:00）【分類，系統，遺伝学】
9:00

3P-1a001

モンゴル国から分離した酵母の多様性及び Metschnikowia 属 2 新種の生育特性と脂質生産能............................. ○Jambaldorj Ulziichimeg 1, 山崎 敦史 1, Balijinova Tsetseg 2, 安藤 勝彦 1, 鶴海 泰久 1
（1 NITE・NBRC, 2 モンゴル科学院・生物研究所）

10:00

3P-1a002

鹿児島県及び山口県で分離した油脂酵母 Lipomyces 属及び油脂生産能について................................................................................................... ○山崎 敦史, 川﨑 浩子（NITE・NBRC）

9:00

3P-1a003

歯周病原性細菌 Eikenella coorodens の新規溶血因子の同定................................................................................................. ○島谷 雅文 1, 高原 沙里 1, 阿座上 弘行 1,2,3（1 山口大・農, 2 山口大院・創成科学・農学系, 3 山口大・中高温微セ）

10:00

3P-1a004

MALDI-TOF MS を用いたバイオマーカーによる Acinetobacter 属細菌の高精度識別.......................................... ○下平 潤, 則武 ちあき, 野口 正宏, 上條 知昭, 川﨑 浩子（NITE・NBRC）

9:00

3P-1a005

MALDI-TOF MS を用いた Aspergillus flavus とその類縁菌の迅速同定法のための前処理最適化.................................................................................... ○上條 知昭, 下平 潤, 川﨑 浩子（NITE・NBRC）

10:00

3P-1a006

生分解性プラスチック分解糸状菌 B47-9 株のゲノム解析と同定............................................................... ○山下（鮫島） 結香 1, 小板橋 基夫 1, 小池 英明 2, 佐藤 豊三 1,
森脇 丈治 1, 雜賀 あずさ 2, 森田 友岳 2, 北本 宏子 1
（1 農研機構, 2 産総研）

9:00

3P-1a007

青枯病菌に感染する Viunalikevirus、RP15 の単離と解析........................................................................... ○川崎 健 1, 三原 知子 2, 緒方 博之 2, 藤江 誠 1, 山田 隆 1（1 広島大院・先端物質, 2 京大・化研）

10:00

3P-1a008

畑土壌微生物叢の解析................................................................... ○小西 智之 1, 坂井 沙織 2, 海野 智史 2, 橋本 賢一 2, 川崎 寿 2（1 電機大院・先科技, 2 東電大・工・環境化）【遺伝子工学】
9:00

3P-1a009

コリネ型細菌における乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 ldhA の発現制御機構の解析........................................................○豊田 晃一 1, 乾 将行 1,2（1 RITE・バイオ, 2 奈良先端大・バイオ）

10:00

3P-1a010

Corynebacterium glutamicum によるグルタミン酸生産に対するストレスの影響....................................................... ○尾形 駿介 1, 齊藤 正輝 2, 吉川 勝徳 2, 古澤 力 3, 清水 浩 2, 平沢 敬 1（1 東工大・生命理工学院, 2 阪大院・情報, 3 理研・生命システム）

9:00

3P-1a011

ピぺリジン分解菌の分離と分解系遺伝子の解析................................................................... ○山本 泰誠, 岩木 宏明, 長谷川 喜衛（関西大 化学生命工）

47

10:00

3P-1a012

大腸菌 tolC 欠損株が酸感受性を示す機構の解析................................................. ○神田 健, 安彦 弦太, 岩井 伯隆, 和地 正明（東工大・生命理工学院）

9:00

3P-1a013

Bacillus 属由来酵素の PHA モノマー供給能解析.................................................................................... ○木原 崇博 1, 廣江 綾香 1, 水野 康平 2, 柘植 丈治 1
（1 東工大院・総理工, 2 北九州高専）

10:00

3P-1a014

枯草菌の iolH がイノシトール代謝において果たす生理的意義...................................... ○松本 明日香 1, Reuss Daniel 2, 田中 耕生 3, 石川 周 1, 竹中 慎治 4, 吉田 健一 1
（1 神戸大院・科学技術イノベーション, 2 Dept. General Microbiology, Gottingen Univ.,
3

9:00

3P-1a015

神戸大・自科・研究環, 4 神戸大院・農・生命機能）

Bacillus 属細菌のシリカ蓄積メカニズムの解析................................................... ○池田 丈 1, 田中 達也 1, 中川 美樹 2, 本村 圭 1, 廣田 隆一 1, 黒田 章夫 1（1 広島大院・先端物質, 2 広島大・工）

10:00

3P-1a016

Negative chemotactic response toward maleate in Ralstonia solanacearum............................... ○Mattana Tunchai, Akiko Hida, Takahisa Tajima, Yutaka Nakashimada, Junichi Kato

9:00

3P-1a017

メタン酸化細菌の細胞内レドックス状態の可視化.................. ○石川 聖人 1,5, 田中 裕也 2, 田中 謙也 3, 木村 恒太 3, 加藤 創一郎 4,5, 中西 周次 5, 堀 克敏 1

（Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.）（1 名大院・工, 2 阪大・基礎工, 3 阪大院・基礎工, 4 産総研・生物プロセス, 5 阪大・太陽エネ研）
10:00

3P-1a018

植物生長促進細菌によるシロイヌナズナの生長促進作用メカニズムの解析....................................... ○中岡 知規 1, 澤田 祥子 2, 大浦 麻里 1, 田中 雄也 2, 阿野 貴司 1,2, 岡南 政宏 1,2（1 近畿大院・生物理工, 2 近畿大・生物理工）

9:00

3P-1a019

R-IVET 法によるマウス消化管特異的に発現するビフィズス菌遺伝子の同定................................................... ○石神 夏実 1, 河口 礼佳 1, 平等 清夏 1, 阪中 幹祥 2, 横田 篤 1, 吹谷 智 1（1 北大院・農・微生物生理学, 2 石川県立大院・生資環）

10:00

3P-1a020

ビフィズス菌プロモーターの機能解析..................... ○小酒井 智也 1, 野村 泉 2, 鈴木 徹 2（1 岐阜大院・応生・応生, 2 岐阜大・応生・応生）

9:00

3P-1a021

転写因子の競合デザインによる Half-adder 回路のコンパクト設計.......................... ○湯本 達弥, 佐伯 和哉, 河合（野間） 繁子, 斎藤 恭一, 梅野 太輔（千葉大院・工）10:00

3P-1a022

異なる環境試料からの新規自己伝達性プラスミドの取得............................................................................ ○仲田 裕貴, 金原 和秀, 新谷 政己（静大・創科技院）

9:00

3P-1a023

納豆菌由来 pLS20cat を用いた新規プラスミドベクターシステムの開発....................................................................... ○宮野 恵 1, 田中 耕生 2, 石川 周 1, 竹中 慎治 3, 吉田 健一 1
（1 神戸大院・科学技術イノベーション, 2 神戸大・自科・研究環, 3 神戸大院・農・生命機能）

10:00

3P-1a024

新規抗生物質の開発に向けた微生物群集の単離培養を伴わないスクリーニング手法の確立....................................................................................... ○山元 奈緒, 中島 信孝（東工大院・生命理工）

9:00

3P-1a025

Tricholoma matsutake NBRC30605 株の De novo 解析および糖質分解酵素遺伝子の特定................................................. ○大沼 広宜 1, 福田 泰久 2, 白坂 憲章 2（1 近畿大院・農, 2 近畿大・農）

10:00

3P-1a026

繊毛虫テトラヒメナを用いたセルラーゼ生産ベクターの確立......................................... ○海老原 哲男 1,2, 増田 光平 2, 遠藤 浩 2, 仁宮 一章 3, 小田切 正人 4, 守屋 繁 4（1 名大・遺伝子, 2 金沢大院・自科, 3 金沢大・環日本海域環境研究セ, 4 理化学研究所 基幹研究所）

9:00

3P-1a027

CRISPR-PCS 法を基盤とした酵母染色体の多様な操作技術の開発................................................................................... ○笹野 佑 1, 長澤 宏器 1, 木村 駿太 1, Kaboli Saeed 1,
中井 大志 1, 村山 亮太 1, 杉山 峰崇 1, 原島 俊 2（1 阪大院・工, 2 崇城大・生物生命）

10:00

3P-1a028

DSB により誘発されるゲノム再編を駆動力とする出芽酵母の新規育種技術........................................... ○池内 暁紀 1, 中村 里沙 1, 田中 秀典 1, 村本 伸彦 1, 中村 隆宏 2, 太田 邦史 2
（1 豊田中研, 2 東大院・総合文化）

9:00

3P-1a029

メタノール資化酵母 Hansenula polymorpha の改良 CRISPR/Cas9 によるゲノム編集........................................................................................ ○沼本 穂, 前川 裕美, 金子 嘉信（阪大院・工）

48

10:00

3P-1a030

CRISPR Cas9 system による遺伝子組み換え Schizosaccharomyces pombe を用いた有機酸生産.............................................. ○高山 征也, 尾崎 愛子, 山口 理絵, 田中 勉, 近藤 昭彦（神戸大院・工）9:00

3P-1a031

マンノシルエリスリトールリピッド生合成に関わるアシル転移酵素破壊株の作製........................................................................................................... ○吉田 優太, 小西 正朗（北見工大）

10:00

3P-1a032

ミトコンドリア局在配列のモデル化から考察するタンパク質局在シグナル配列の膜認識仮説...................................................................................... ○鈴木 絢子 1,2, 徳田 茜 1, 星田 尚司 1, 赤田 倫治 1
（1 山口大院・創成科学・化学系, 2 現)大分大・工）9:00

3P-1a033

酵母においてメタノール誘導性遺伝子発現を制御する転写因子 Hap 複合体の機能解析................................................. ○小田 沙織 1, 由里本 博也 2, 阪井 康能 2（1 鳥取大・工, 2 京大院・農）【酵素学，酵素工学】
10:00

3P-1a034

Geobacillus stearothermophilus 由来マレートデヒドロゲナーゼの反応性考察と機能改変........................................................................................... ○下澤 勇弥, 西矢 芳昭（摂南大・生命科学）

9:00

3P-1a035

Aspergillus oryzae RIB40 ギ酸オキシダーゼの Phe510 は FAD 修飾と酵素活性に寄与する.............................................. ○岩越 亮汰, 田邊 直人, 道林 泰樹, 沖 昌也, 内田 博之（福井大院・工）10:00

3P-1a036

エステラーゼを生産する環境細菌の単離........................................... ○奥野 圭祐 1, 橋本 明里 2, 鳥居 誉 2, 前田 真美 2, 阿野 貴司 1,2, 岡南 政宏 1,2（1 近畿大院・生物理工, 2 近畿大・生物理工）

9:00

3P-1a037

Ruminiclostridium josui の制限酵素 RjoI の性質と R. josui の形質転換...................................................................................................................... ○汪 亜運（三重大院・生資）

10:00

3P-1a038

細菌 Chitiniphilus shinanonensis が保有するキチン代謝に関与する遺伝子群の解析.............................................. ○佐藤 弘晃, 松山 友香, 田口 悟朗, 野川 優洋, 下坂 誠（信州大・繊維）

9:00

3P-1a039

Biosynthesis of 2-epi-5-epi-valiolone by in vitro synthetic biology approach.................................................................... ○JianJiang Zhong 1, Song-Yan Huang 2, Y.-H. Percival Zhang 3（1 State Key Lab. Microb. Metab., Sch. Life Sci. Biotechnol., Shanghai Jiao Tong Univ., 2 State Key Lab.
Bioreactor Eng., Sch. Bioeng., East China Univ. Sci. Technol., 3 Dep. Biol. Syst. Eng., Virginia Tech）

10:00

3P-1a040

Falsirhodobacter sp. alg1 由来のアルギン酸リアーゼを用いたアルギン酸単糖の調製....................................... ○村瀬 祥光 1, 柴田 敏行 1, モリ テツシ 2, 田中 礼士 1, 植田 充美 3, 三宅 英雄 1
（1 三重大院・生資, 2 早大・理工学術院, 3 京大院・農）

9:00

3P-1a041

シトクロム P450 の活性化において外来電子伝達タンパク質を利用するための戦略.................................................................................... 鈴木 里沙, ○平川 秀彦, 長棟 輝行（東大院・工）10:00

3P-1a042

ナノ空間反応場を利用した１分子 DNA 増幅システムの構築.......................................................... 松浦 俊一 1, 馬場 知哉 2, 千葉 真奈美 1, ○角田 達朗 1, 山口 有朋 1,3（1 産総研・化学プロセス, 2 遺伝研・系統生物, 3 JST・さきがけ）

9:00

3P-1a043

持続的酵素反応プロセスを実現する酵素-メソポーラスシリカ複合体の開発......................................... ○松浦 俊一 1, 池田 丈 2, 千葉 真奈美 1, 角田 達朗 1, 黒田 章夫 2, 山口 有朋 1,3（1 産総研・化学プロセス, 2 広島大院・先端物質, 3 JST・さきがけ）【タンパク質工学】
10:00

3P-1a044

静電相互作用を駆動力とした迅速なストレプトアビジンの結晶化.............................................................. ○南畑 孝介 1, 安達 基泰 2, 清水 瑠美 2, 黒木 良太 3, 長棟 輝行 4,5（1 九大院・工, 2 量研機構, 3 原子力機構, 4 東大院・工・化生,
5

9:00

3P-1a045

東大院・工・バイオエンジニアリング）

ホモ二量体化モジュールの導入による細胞内タンパク質間相互作用検出の高感度化................................................................. ○鹿島 大揮, 河出 来時, 長棟 輝行, 河原 正浩（東大院・工）

49

10:00

3P-1a046

カニ殻堆肥由来“Cellulosimicrobium sp.NTK2”の結晶性キチン分解能と分解酵素の生産................................................................. ○仁木 大輔, 西川 康太, 藤村 夏紀, 有馬 二朗（鳥取大・農）

9:00

3P-1a047

細胞増殖を効率的に誘導するチロシンモチーフのスクリーニング................................................................................ ○梅根 輝来人, 長棟 輝行, 河原 正浩（東大院・工）10:00

3P-1a048

動物細胞内で強制発現させたがん抗原タンパク質の細胞内凝集機構の解析............................................. ○正元 晃平, 新土居 奈緒美, 本荘 知子, 二見 淳一郎（岡山大院・自科）

9:00

3P-1a049

Hek293 細胞を用いた全長がん抗原タンパク質の網羅的調製条件の最適化............................................. ○大川 祐也, 新土居 奈緒美, 本荘 知子, 二見 淳一郎（岡山大院・自科）

10:00

3P-1a050

カイコ発現系を利用した抗体および膜タンパク質調製の試み.............................. ○柴田 真実 1, 中澤 光 1, 加藤 昌彦 2, 長屋 英和 2, 眞田 英明 2, 熊谷 泉 1, 梅津 光央 1
（1 東北大院・工・バイオ工, 2 シスメックス株式会社）

9:00

3P-1a051

原核生物における J タンパク質による Hsp90 と Hsp70 の協同的シャペロン作用の仲介と機能調節.......................................................................................................... ○仲本 準（埼玉大院・理工・分子）

10:00

3P-1a052

カチオン化法による Hepatocyte Nuclear Factor-4α (HNF-4α) タンパク質の細胞導入と核内転写活性の評価............................................... ○中野 智貴 1, 曳野 隆之 1, 曾 芳琴 1, 西尾 知樹 1, 二見 淳一郎 2, 二見 翠 1（1 岡山理大・工, 2 岡山大院・自科）

9:00

3P-1a053

昆虫嗅覚受容体発現酵母を利用した迅速な匂い分子検出システムの基盤構築.......... ○福谷 洋介 1,2, 田中 良拓 2, 養王田 正文 1,2（1 農工大・院工・生命工, 2 農工大・工・生命工）【抗体工学】
10:00

3P-1a054

抗原結合に伴う抗体の構造変化の解析...................................................................................... ○岡本 優太 1, 野田 勝紀 1, 福井 希一 1, 内山 進 1,2（1 阪大院・工, 2 岡崎統合バイオサイエンスセ）

9:00

3P-1a055

高感度免疫検査への利用を目指した材料親和性ペプチド融合単鎖抗体の高密度配向固定........................................... ○谷端 怜奈 1, 高橋 浩一 2, 平山 良朗 2, 権平 文夫 3, 堀内 淳一 1, 熊田 陽一 1（1 京工繊大院・工芸科学, 2 デンカ, 3 デンカ生研）

10:00

3P-1a056

テンプレートスイッチ反応と懸垂液滴アレイ式磁気ビーズ反応法を用いた抗体 cDNA 迅速合成システムの開発..... ○松原 悠紀 1, 黒澤 信幸 2, 磯部 正治 2（1 富山大院・理工学教育部, 2 富山大院・理工学研究部）

9:00

3P-1a057

免疫検査の高感度化を目指した Whole 抗体の配向固定化条件の検討........................................... ○神𠮷 菜摘 1, 高橋 浩一 2, 平山 良朗 2, 権平 文夫 3, 堀内 淳一 1, 熊田 陽一 1（1 京工繊大院・工芸科学, 2 デンカ, 3 デンカ生研）

10:00

3P-1a058

Expression and refolding of antigen-binding fragments (Fab) with the leucine zipper in E. coli.
........................... ○Panwad Ritthisan, Teruyo Ojima-Kato, Satomi Nagai, Takaaki Kojima, Hideo Nakano（Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.）

9:00

3P-1a059

DNA ハイブリダイゼーションを用いる抗体固定化技術の開発とイムノクロマトの高性能化................................................................................... ○岡林 雪乃 1, 高橋 浩一 2, 平山 良朗 2, 権平 文夫 3,
犬飼 忠彦 4, 川瀬 三雄 4,5, 堀内 淳一 1, 熊田 陽一 1（1 京工繊大院・工芸科学, 2 デンカ, 3 デンカ生研, 4 TBA, 5 東北大学医工学研究科）

10:00

3P-1a060

形質細胞内発現抗体を利用した抗原特異的モノクローナル抗体新規単離法(FIXAA)の開発......... ○塚本 薫 1, 黒澤 信幸 2, 磯部 正治 2（1 富山大院・理工学教育部, 2 富山大院・理工学研究部）

9:00

3P-1a061

取得困難な修飾部位特異的モノクローナル抗体の新規効率的作製法の開発......... ○藤 聡志 1, 黒澤 信幸 2, 磯部 正治 2（1 富山大院・理工学教育部, 2 富山大院・理工学研究部）

50

10:00

3P-1a062

低分子抗体―薬物複合体開発：リジン残基側鎖の化学反応へ界面活性剤が及ぼす影響................................................................................... ○服部 修平 1, 服部 峰充 1, 中澤 光 1, 二井手 哲平 1,
松永 淳 2, 李 宣和 2, 大江 知行 2, 梅津 光央 1
（1 東北大院・工, 2 東北大院・薬）9:00

3P-1a063

次世代抗体医薬を目指した立体構造特異的モノクローナル抗体の作製およびその評価............................................................. ○磯﨑 勇志, 三浦 広己, 湊元 幹太, 冨田 昌弘（三重大院・工）【発酵生理学，発酵工学】
10:00

3P-1a064

菌体外 β グルカンを産生する Aureobasidium pullulans の網羅的遺伝子発現解析.................................................................. ○内山 博文 1,4, 岡部 満康 3, 道羅 英夫 2, 加藤 竜也 2, 朴 龍洙 2
（1 静大・創科技院, 2 静大グリーン研, 3 アウレオ, 4 アウレオサイエンス）

9:00

3P-1a065

イオンビーム変異法による耐熱性乳酸生産糸状菌の Xylose 発酵変異株の構築.................................................................................... ○山下 聖樹 1, 高野 真希 1, 畑下 昌範 2, 星野 一宏 1
（1 富山大院・理工, 2 若狭湾エネ研）

10:00

3P-1a066

亜臨界前処理したオカラの霊芝菌糸体発酵及び抽出した多糖類の評価................................................................................................... ○官 羽, 張 振亜（筑波大院・生命環境）

9:00

3P-1a067

Polysaccharides Production from Solid-state Co-fermentation of Okara and Pretreated Corn Straw...............................................○Yue Guan, Zhenya Zhang（Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba）

10:00

3P-1a068

Effects of heating treatment and fermentation on antioxidative compound of tempe............................................................................................................... ○Dewi Kusumah 1, Isamu Maeda 1,2（1 Fac. Appl. Biosci., Tokyo Univ. Agric., 2 Fac. Agric., Utsunomiya Univ.）

9:00

3P-1a069

糸状菌 Aspsergillus terreus によるデンプン系バイオマスからのイタコン酸の直接生産.................................................................................... ○清 菜都実 1, 高野 真希 2, 畑下 昌範 3, 星野 一宏 2
（1 富山大・工, 2 富山大院・理工, 3 若狭湾エネ研）

10:00

3P-1a070

二形性調節因子による酵母化 Mucor circinelloides の構築および好気的 Ethanol 生産................................................................................ ○岩倉 遼, 高野 真希, 星野 一宏（富山大院・理工）

9:00

3P-1a071

海洋性 A.thiooxidans SH 株の末端酸化酵素の解析................................................................ ○上村 一雄, 吉野 永里子, 金尾 忠芳（岡山大院・環境生命）

10:00

3P-1a072

自然界からのアラキドン酸含有脂質蓄積緑藻株のスクリーニング.......................................................... ○加藤 康夫 1, 木野 貴仁 1, 米田 有紗 1, 野村 泰治 1, 荻田 信二郎 1,2（1 富山県大・生工研セ, 2 県大広島・生命科学）

9:00

3P-1a073

好熱性新菌種 Bacillus hisashii N11T 株の経口給与がマウスに及ぼす抗肥満効果................... ○岩田 菖子 1, 須田 亙 2,3, 福田 真嗣 4, 大野 博司 4, 服部 正平 2,5, 児玉 浩明 1, 宮本 浩邦 1,3,6（1 千葉大院・融合, 2 東京大院・新領域, 3 慶應大・医, 4 理研・IMS, 5 早大・先進理工, 6 サーマス）

10:00

3P-1a074

発酵食品からのデンプン資化性乳酸菌の分離と諸性質の検討...................................................................................................... ○山本 脩幾（立命館大院・生命科学）【代謝工学】
9:00

3P-1a075

糸状菌 Asperigillus niger 有機酸輸送体遺伝子破壊株によるシュウ酸生産......................................... ○吉岡 育哲, 上田 由佳, 小林 慶一, 桐村 光太郎（早大・先進理工・応化）

10:00

3P-1a076

デンプンからの直接乳酸生産に資する麹菌でのピルビン酸代謝関連酵素の欠損................................................... ○笹倉 直也 1, 若井 暁 2, 浅井 菜々実 2, 堤 浩子 3, 秦 洋二 3, 近藤 昭彦 2
（1 神戸大院・工, 2 神戸大院・イノベ, 3 月桂冠・総研）

9:00

3P-1a077

三種セルラーゼ共・強発現麹菌によるセルロースからのコウジ酸生産................................................... ○若井 暁 1, 浅井 菜々実 1, 荻野 千秋 2, 堤 浩子 3, 秦 洋二 3, 近藤 昭彦 1（1 神戸大院・イノベ, 2 神戸大院・工, 3 月桂冠・総研）

51

10:00

3P-1a078

アーキアを利用した炭化水素生産............................................ ○佐藤 喬章 1,3, 福家 翼 1, Jha Savyasachee 1, Tansengco Myra 2, 跡見 晴幸 1,3（1 京大院・工, 2 Dept. Sci. & Technol., ITDI, 3 JST・CREST）

9:00

3P-1a079

二相培養法によるラン藻 Synechococcus elongatus PCC7942 の脂肪酸生産性の向上.......................................................... ○加藤 明宏 1, 高谷 信之 1,2, 鵜瀬 和秀 1, 前田 真一 1,2, 小俣 達男 1,2（1 名大院・生命農学, 2 JST CREST）

10:00

3P-1a080

藍藻 Synechococcus elongatus PCC 7942 代謝改変株の増殖特性と光合成特性................................................................................ ○林原 加代子 1, 広川 安孝 2, 花井 泰三 2, 村上 明男 1
（1 神戸大・自科・研究環, 2 九大院・農）

9:00

3P-1a081

Euglena gracilis における一次代謝産物の変化................................................................................ ○冨田 結芙子, 吉岡 和政, 小山内 崇（明治大・農）10:00

3P-1a082

プロモーター変更による合成代謝経路導入シアノバクテリアの 1,3-propanediol 生産性向上................................................. ○広川 安孝 1,2, 牧 佑紀 1,2, 花井 泰三 1,2（1 九大院・農, 2 JST・CREST）

9:00

3P-1a083

合成代謝経路を導入した Synechocystis sp. PCC 6803 による isopropanol 生産.................................................................................... ○山下 泰一, 広川 安孝, 花井 泰三（九大院・農）

10:00

3P-1a084

桔梗抽出液により白色脂肪細胞から誘導したベージュ脂肪細胞の特性........................................................ ○塩見 尚史, 伊藤 茉莉絵, 渡邊 桂子（神戸女学院大・人間科学）

9:00

3P-1a085

Poly(3-Hydroxybutyrate-co-3-Hydroxy-2-Methylbutyrate)の生合成............................................................. ○中崎 瞳, 古舘 祥, 廣江 綾香, 柘植 丈治（東工大院・総理工）

10:00

3P-1a086

Clostridium perfringens の毒素発現を制御する内在性クオラムクエンチングの実態解明..................................................... ○安達 桂香 1, Ravindra Pal Singh 1, 大谷 郁 2, 園元 謙二 1, 中山 二郎 1
（1 九大院・農, 2 ミヤリサン製薬）

9:00

3P-1a087

腸内共生微生物代謝に注目した魚類飼料応答解析法の構築............................................................ ○坂田 研二 1, 坪井 裕理 1, 朝倉 大河 1,2, 伊達 康博 1,2, 菊地 淳 1,2,3（1 理研 CSRC, 2 横市院・生医, 3 名大院・生命農）【オミクス解析】
10:00

3P-1a088

メタボロミクスによる大腸菌による 1-ブタノール生産における重要因子の解明.............................................................. ○中島 広裕 1, Sastia Prama Putri 1, Liao James C. 2, 福﨑 英一郎 1（1 阪大院・工, 2 Dept. Chem. Biomol. Eng., UCLA）

9:00

3P-1a089

Rational and efficient selection of gene targets for strain improvement using metabolomics approach..................................................... ○ Sastia Putri 1, Toshiyuki Ohtake 1, James C. Liao 2, Eiichiro Fukusaki 1（1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Dept. Chem. Biomol. Eng., UCLA）

10:00

3P-1a090

メタボローム解析を用いた大腸菌のバイオ燃料耐性関連物質の探索.............. ○阿知和 弘樹, Theo Shao Thing, Sastia Prama Putri, 福﨑 英一郎（阪大院・工・生命先端）

9:00

3P-1a091

南極産担子菌酵母 Mrakia blollopis の低温ストレス反応...................................................................................................................... ○辻 雅晴（国立極地研究所）

10:00

3P-1a092

代謝物解析を用いた微生物におけるメチルクエン酸回路の分布の検討....................................................................................................... ○田部井 仁美, 宮越 俊一（群馬高専）

9:00

3P-1a093

ラビリンチュラ類 Aurantiochytrium 属のメタボローム解析による育種標的の探索.................................................................................. ○渡邉 研志 1,3, Arafiles Kim Hazel V. 1, 岡村 好子 1,3,
田島 誉久 1,3, 松村 幸彦 2,3, 中島田 豊 1,3, 秋 庸裕 1,3（ 広島大院・先端物質, 2 広島大院・工, 3 JST・CREST）
1

10:00

3P-1a094

Metabolic profiling of Drosophila melanogaster metamorphosis...................................................... ○Thuy An Phan Nguyen 1, Masamitsu Yamaguchi 2, Eiichiro Fukusaki 1（1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.）

52

9:00

3P-1a095

13

C 代謝フラックス解析法を用いた動物培養細胞の NADPH ターンオーバー速度の計測....................................................................... ○岡橋 伸幸 1, 松田 史生 1, 河野 晋 2, 高橋 智聡 2, 清水 浩 1（1 阪大院・情報, 2 金沢大・がん進展制御研）

10:00

3P-1a096

D-アミノ酸の微量定量のための LC-MS/MS 分析法の開発................................................................. ○中野 洋介, 紺屋 豊, 谷口 百優, 福﨑 英一郎（阪大院・工）9:00

3P-1a097

イオンクロマトグラフィー高分解能質量分析による陰イオン性代謝物分析手法の開発....................................................................................... 和泉 自泰 1, 高橋 政友 1, 鈴木 隆弘 2, 押川 清孝 1,
木村 元一 2, 坂本 茂 2, 松本 雅記 1, ○馬場 健史 1
（1 九大・生医研, 2 サーモフィッシャー）【環境工学，廃水処理技術】
10:00

3P-1a098

アルボサイクリン生産放線菌を用いた微生物農薬の開発........................... ○大池 達矢 1, 前田 みのり 2, 松川 哲也 1,2, 岡南 政宏 1,2, 梶山 慎一郎 1,2, 阿野 貴司 1,2（1 近畿大院・生物理工・生物工, 2 近畿大・生物理工・生物工）

9:00

3P-1a099

Streptomyces sp. KT 株の微生物農薬としての可能性........................... ○前田 みのり 1, 大池 達矢 2, 岡南 政宏 1,2, 松川 哲也 1,2, 梶山 慎一郎 1,2, 阿野 貴司 1,2（1 近畿大・生物理工・生物工, 2 近畿大院・生物理工・生物工）

10:00

3P-1a100

燻炭が Bacillus 属細菌 IA 株の生育を促進するメカニズムの解明................................. ○江邉 正平, 大池 達矢, 岡南 政宏, 阿野 貴司（近畿大院・生物理工・生物工）

9:00

3P-1a101

ウレアーゼ生産菌の分離とそれを利用した土の強度改良効果............................................................................................ ○米光 裕 1, 高山 陽加 1, 林 和幸 2, 西本 真琴 1
（1 和歌山高専・物質, 2 和歌山高専・環境都市）

10:00

3P-1a102

リングレース担体を用いた固定床一槽式アナモックスプロセス.................................................................................... ○上野 嘉之 1, 多田羅 昌浩 1, 柴田 晴佳 1, 石川 秀 2（1 鹿島・技術研, 2 鹿島・エンジ本部）

9:00

3P-1a103

有機酸資化性細菌を用いたメタン発酵廃液中の有機酸除去............. ○中井 昇太 1,2, 高橋 宏和 1,2, 三浦 豊和 1,2, 秋 庸裕 1,2, 中島田 豊 1,2, 松村 幸彦 2,3, 岡村 好子 1,2（1 広島大院・先端物質, 2 科学技術振興機構, 3 広島大院・工）10:00

3P-1a104

自家発酵熱型高温好気処理における主要細菌の体系的フィードバック分離と諸特性解析..................................................................... ○福井 諒, 朝倉 侑弥, 田代 幸寛, 酒井 謙二（九大院・農）

9:00

3P-1a105

ラボスケールでの自家発酵熱型高温好気処理によるし尿の液肥化における諸要因の影響.................................................. ○朝倉 侑弥, 河野 祥尚, 程 慧君, 田代 幸寛, 酒井 謙二（九大院・農）

10:00

3P-1a106

複合微生物系であるコンポスト化で接種した微生物を生かして使う温度制御................................................................................... 平井 秀平, ○中崎 清彦（東工大・環境社会理工）

9:00

3P-1a107

生物ろ過槽由来 Mn 酸化細菌群集の培養と硝酸濃度の影響........................................... ○飯田 早紀 1, 鈴木 市郎 1, 三好 萌栄子 1, 杉田 龍兵 2, 武田 穣 1, 小泉 淳一 1
（1 横国大院・工, 2 横国大・理工）

10:00

3P-1a108

新規シデロフォアのスクリーニングと廃水からのニッケル回収への利用...................................................................... 保里 明日香 1,2, 坪田 洸一郎 1, 袋布 昌幹 1, ○篠崎 由紀子 1（1 富山高専, 2 長岡技科大）9:00

3P-1a109

トランスクリプトーム解析による Pseudomonas stutzeri NT-I のセレン代謝関連遺伝子群の推定........................................................................................ ○櫻井 紫乃, 黒田 真史, 池 道彦（阪大院・工）10:00

3P-1a110

酵母の細胞表層多糖の改変と金属吸着................................................. ○高橋 大地, 松川 真弓, 尾島 由紘, 東 雅之（阪市大院・工・化生系）

9:00

3P-1a111

Rhodococcus sp. Br-6 による複数の酸化還元メディエーターを介した臭素酸還元............................................................................ ○藤屋 寛子, 玉井 奈生子, 天知 誠吾（千葉大・園芸）

53

10:00

3P-1a112

硫黄酸化細菌を利用したタングステン含有コンクリート中のタングステンの迅速分析........................................................................................ ○杉尾 剛 1, 杉尾 理恵 1, 根岸 敦規 2, 井川 秀樹 3
（1 杉尾化学合成独立栄養細菌研, 2 安藤ハザマ・技研, 3 日本ヒューム・技研）

9:00

3P-1a113

化学物質の微生物に対する毒性を評価するフロー式蛍光計測システムの開発......................................................... ○櫻井 琢磨, 新谷 政己, 木村 元彦, 金原 和秀（静大・創科技院）【バイオマス，資源，エネルギー工学】
10:00

3P-1a114

海洋底泥中における共生系アルギン酸分解メカニズムの解明と揮発性脂肪酸生産への応用......................................................... ○喜多 晃久 1,3, 三浦 豊和 1,3, 岡村 好子 1,3, 秋 庸裕 1,3, 松村 幸彦 2,3,
田島 誉久 1,3, 加藤 純一 1, 西尾 尚道 1, 中島田 豊 1,3（ 広島大院・先端物質, 2 広島大院・工・エネ環, 3 JST・CREST）
1

9:00

3P-1a115

Alginate degradation product of anaerobic bacterium supports growth of oleaginous thraustochytrid,
Aurantiochytrium sp.
........... ○Kim Hazel V. Arafiles 1, Yuri Eramoto 1, Kenshi Watanabe 1, Akihisa Kita 1, Yoshiko Okamura 1,3,
Takahisa Tajima 1, Yukihiko Matsumura 2,3, Yutaka Nakashimada 1,3, Tsunehiro Aki 1,3（1 Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2 Grad. Sch. Eng., Hiroshima Univ., 3 CREST, JST）

10:00

3P-1a116

コーンコブ糖化液中の発酵阻害物質に耐性を示す酵母のスクリーニング......................................................................... ○石田 奨, 荒川 知子, 加藤 勇太, 小西 正朗（北見工大）

9:00

3P-1a117

高セルロース含有コーンコブ残渣を原料とした同時糖化発酵による D-乳酸の効率的生産............................................................ ○谷口 麻菜美, 堀内 淳一, 熊田 陽一（京工繊大院・工芸科学）

10:00

3P-1a118

ビフェニル/PCB 分解細菌のリグニン由来芳香族化合物代謝酵素の探索と同定....................................................................................... ○渡邊 崇人 1, 藤原 秀彦 2, 末永 光 3, 木村 信忠 3,
廣瀬 遵 4, 二神 泰基 5, 後藤 正利 6, 古川 謙介 2
（1 京大・生存研, 2 別府大・食物栄養, 3 産総研・生物プロセス,
4

9:00

3P-1a119

宮崎大・工, 5 鹿大・農, 6 佐賀大・農）リグニン由来フェノール類を原料としたムコン酸生産....................... ○菊地 晟弘 1, 杉田 晴佳 1, 顔 昊 1, 高橋 健司 2,3, 上村 直史 2,3, 政井 英司 2,3, 園木 和典 1,3（1 弘前大院・農生, 2 長岡技科大院・工, 3 ALCA, JST）

10:00

3P-1a120

酵素糖化残渣リグニンを原料としたリグノモノマーの生産とその生物変換への応用................................................................................ ○落合 芋葉子 1, 仁宮 一章 2, 柘植 陽太 2, 高橋 憲司 1
（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術）

9:00

3P-1a121

酵素糖化残渣リグニンを硬化剤として用いたエポキシ樹脂の合成.................................................................................... ○井上 優里 1, 仁宮 一章 2, 柘植 陽太 2, 高橋 憲司 1
（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術）

10:00

3P-1a122

リグノセルロース系バイオマスのみからなるノボラックフェノール樹脂の合成................................................................................ ○山岡 幸太郎 1, 仁宮 一章 2, 柘植 陽太 2, 高橋 憲司 1
（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術）

9:00

3P-1a123

林地残材糖化液を原料とした乳酸発酵生産............................................. ○荒井 隆益 1, 池 正和 2, 小杉 昭彦 1（1 国際農研セ, 2 農研機構・食総研）

10:00

3P-1a124

乳酸デヒドロゲナーゼを異種発現する白色腐朽菌による木質バイオマスからの乳酸産生................................................................................... ○加古 博子 1, 森 智夫 1, 河岸 洋和 1,2,3, 平井 浩文 1,2（1 静大・農, 2 静大グリーン研, 3 静大・創科技院）

9:00

3P-1a125

白色腐朽菌 Trametes versicolor K-41 株による木質バイオマスからの水素産生..................................... ○曽我 亜由美 1, 髙橋 沙綾 1, 有本 美沙 1, 森 智夫 1, 河岸 洋和 1,2,3, 平井 浩文 1,2（1 静大・農, 2 静大・グリーン研, 3 静大・創科技院）

54

10:00

3P-1a126

Clostridium cellulovorans および Clostridium beijerinckii の共培養系によるシュガービートパルプからの有用物質生産..................................... 川出 雄二郎 1, ○富田 寿男 1, 岡﨑 文美 1, López-Contreras Ana M. 2, 田丸 浩 1,3,4（1 三重大院・生資, 2 Wageningen UR・Food Biobased Res., 3 三重大・新産業, 4 三重大・生命支セ）

9:00

3P-1a127

Effect of Cassava Pulp Supplement on 1,3-propanediol Production by Clostridium butyricum................................................. Waraporn Apiwatanapiwat 1,2, Pilanee Vaithanomsat 2, ○Akihiko Kosugi 1,3（1 Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2 Kasetsart Univ, 3 JIRCAS）

10:00

3P-1a128

乾式法を用いた下水汚泥と稲わらの混合消化における稲わらの効果と微生物叢の解析............................................................................ ○野澤 太朔, 張 振亜, 雷 中方（筑波大院・生命環境）

9:00

3P-1a129

雑草を原料とした高 C/N 比メタン発酵における微生物群構成種の単離........................................................................................... ○松田 修平, 大槻 隆司（山梨大院・医工総）

10:00

3P-1a130

褐藻の耐塩半連続メタン生産における固形分添加量増加による過負荷の影響................................................................................ ○三浦 豊和 1,3, 喜多 晃久 1,3, 岡村 好子 1,3, 秋 庸裕 1,3,
松村 幸彦 2,3, 田島 誉久 1,3, 加藤 純一 1, 中島田 豊 1,3（1 広島大院・先端物質, 2 広島大院・工・エネ環, 3 JST・CREST）

9:00

3P-1a131

海洋性メタン発酵モデルの構築....................................................... ○矢野 友寛 1,3, 三浦 豊和 1,3, 喜多 晃久 1,3, 田島 誉久 1,3, 加藤 純一 1,
秋 庸裕 1,3, 岡村 好子 1,3, 松村 幸彦 2,3, 中島田 豊 1,3（1 広島大院・先端物質, 2 広島大院・工・エネ環, 3 JST・CREST）

ANA クラウンプラザホテル富山

3 階ポスター会場 II（ASUKA）（9:00～11:00）【生合成，天然物化学】
10:00

3P-2a132

Citrobacter 属細菌におけるキトサン様バイオ凝集剤の多糖化・分泌関連遺伝子の探索...................... ○武尾 正弘 1, 池本 啓史 1, 宮本 弘毅 1, 木村 和幸 2, 柏 雅美 1, 加藤 太一郎 3, 根来 誠司 1
（1 兵庫県大院・工, 2 （株）兵庫分析センター, 3 鹿児島大院・理工）

9:00

3P-2a133

γ-ポリグルタミン酸の分子構造に関する一考察................................................................................... 栗田 あかね 1, 中野 太一 1, 高橋 良輔 2, 北村 進一 2,
山口 良弘 1,3, 荻田 亮 1,4, 田中 俊雄 1, ○藤田 憲一 1（1 阪市大院・理, 2 阪府大院・生環科, 3 阪市大・複合先端, 4 阪市大・健康・研セ）

10:00

3P-2a134

polygodial の殺真菌活性における液胞膜障害の意義................................................................ ○荻田 亮 1,3, 近藤 拓也 1, 山口 良弘 1,2, 藤田 憲一 1, 田中 俊雄 1
（1 阪市大院・理, 2 阪市大・複合先端, 3 阪市大・健康研セ）

9:00

3P-2a135

ストレプトスリシン類縁生合成遺伝子群に見出した Ala-tRNAAla 依存型ペプチド合成酵素の機能解析........................................................... ○松田 貫暉 1, 丸山 千登勢 1, 橋本 絢子 2, 新家 一男 3, 濱野 吉十 1
（1 福井県大・生物資源, 2 JBIC, 3 産総研）

10:00

3P-2a136

抗生物質 BD-12 生合成に関与する N-メチル基転移酵素の機能解析................................................................................ ○新倉 春香 1, 丸山 千登勢 1, 新家 一男 2, 濱野 吉十 1
（1 福井県大・生物資源, 2 産総研）

9:00

3P-2a137

Photobacterium profundum 由来エイコサペンタエン酸合成酵素の異種宿主発現........................................................................... ○中 真以 1, 林 祥平 1, 佐藤 康治 2, 氏原 哲朗 3, 大利 徹 2（1 北大院・総合化学, 2 北大院・工, 3 協和発酵バイオ）

10:00

3P-2a138

多価不飽和脂肪酸合成酵素におけるタンデムアシルキャリアプロテインの機能解明............................................................................................ ○林 祥平 1, 佐藤 康治 2, 氏原 哲朗 3, 大利 徹 2（1 北大院・総合化学, 2 北大院・工, 3 協和発酵バイオ）

55

9:00

3P-2a139

Cyclopenin 類を viridicatin 類へと変換する糸状菌由来酵素シクロペナーゼの発見と精密機能解析...................................... ○岸本 真治, 石川 格靖, 山田 陽香, 平山 裕一郎, 渡辺 賢二（静岡県大・薬）10:00

3P-2a140

Penicillium purpurogenum における PP-V 生産と細胞内アンモニウム濃度の関連性.................................................................. ○小嶋 涼 1, 新居 鉄平 1, 春見 隆文 1,2, 荻原 淳 1,2, 渡邉 泰祐 1,2（1 日大院生資研究科・生資利用, 2 日大・生資科）

9:00

3P-2a141

Penicillium purpurogenum における citrinin 生産能の評価............................................. ○荻原 淳 1,2, 茂木 美樹 2, 小嶋 涼 2, 新居 鉄平 1, 渡邉 泰祐 1,2, 春見 隆文 1,2（1 日大・生資科, 2 日大院・生資科・生資利用）

10:00

3P-2a142

休眠型天然物生合成遺伝子を利用した機能性新規物質の探索とその生合成解明.......................................................... ○恒松 雄太, 山本 剛, 横山 葵, 岸本 真治, 渡辺 賢二（静県大薬）9:00

3P-2a143

Cordyceps sphecocephala による蛍光物質の生産およびその特性評価............................................. ○藤澤 祐哉 1, 高野 真希 2, 星野 一宏 2（1 富山大・工, 2 富山大院・理工）

10:00

3P-2a144

卵菌による長鎖多価不飽和脂肪酸生産........................................................................................ ○吉田 磨仁 1, 松下 貴子 1, 東條 元昭 2, 永峰 賢 3（1 北大院・地環科, 2 阪府大院・生環科, 3 ロム）

9:00

3P-2a145

メラニン生成キー酵素チロシナーゼの抑制物質の微生物からのスクリーニングとその細胞毒性................................................................................ ○倉地 亜子, 塚本 義則, 車 炳允（中部大院・応生）

10:00

3P-2a146

Pseudomonas sp. C8 株が生産する増殖抑制物質の特定とその生産機構................... ○鈴木 研志 1, アズワニ ファティマ 2, 犬塚 友麻 3, 本荘 雅宏 4, 田代 陽介 3, 二又 裕之 1,3,5（1 静大・創科技院, 2 プトラ マレーシア大, 3 静大院・工, 4 静大・工, 5 静大・グリーン研）

9:00

3P-2a147

フェニルプロパノイド類の抗酸化能力と構造との相関関係............................................................................................... ○横川 遥香, 松郷 誠一（金沢大院・自科）

10:00

3P-2a148

Cordyceps sphecocephala を用いた新規神経突起伸長物質の生産およびその特性評価................................................................................ ○西川 絢, 高野 真希, 星野 一宏（富山大院・理工）

9:00

3P-2a149

放線菌 Streptomyces rochei 生合成制御系変異株の二次代謝プロファイル解析.............................. 岩國 美由季, 高橋 譲, 鈴木 敏弘, 木梨 陽康, ○荒川 賢治（広島大院・先端物質）

10:00

3P-2a150

粘液細菌 Sorangium cellulosum の分離と有用物質の探索.......................................................................................................................... ○木村 義雄（香川大・農）

9:00

3P-2a151

新規抗菌物質 demethyl-L-681,217 の単離とその生合成........................................................................................ ○小谷 真也 1, 菅井 翔吾 1, 小牧 久幸 2, 逸見 光 3（1 静大院・農, 2 NBRC, 3 農研機構）

10:00

3P-2a152

ジスプロシウムで惹起される巨大菌のポリ-γ-グルタミン酸増産現象と関連遺伝子分析............................................ ○白米 優一 1, 松村 歩梨 2, 芦内 誠 1,2（1 愛媛大院・連合農, 2 高知大・農）

9:00

3P-2a153

新規分離培養手法を用いた海綿由来の有用化合物産出菌の探索............................................................................... ○町田 光史 1, Dawoon Jung 2, 青井 議輝 2, 中尾 洋一 1
（1 早大院・先進理工・化・生化, 2 広島大・ISSD）

10:00

3P-2a154

Visualization of toluene-degrading Pseudomonas putida using fluorescent in situ hybridization (FISH)......................... ○Hak Jin Song 1, Kwang Jin Kim 2, Yong-Keun Choi 1, Minju Chang 1, Sok-young Shim 1,
Wu-Young Jeong 1, Sang Hyun Lee 1, Yung-Hun Yang 1, Hyung Joo Kim 1（ Dept. Biological eng., Konkuk Univ., 2 Natl. Horticultural Res. Inst., Rural Development Administration）
1【有機化学，高分子化学】
9:00

3P-2a155

細胞親和性電子伝達ポリマーを介した生細胞への電子注入........................................................... ○金子 真大 1, 石川 聖人 2, 加藤 創一郎 3, 橋本 和仁 4, 中西 周次 5
（1 東大院・工, 2 名大院・工, 3 産総研, 4 物質材料機構, 5 阪大・太陽エネセ）

56【ペプチド工学】
10:00

3P-2a156

切断リンカーを利用した細胞内機能性ペプチド探索系の確立.................................................................. ○小﨑 一功 1, 清水 一憲 1, 松本 凌 1, 田邊 智哉 1, 本多 裕之 1,2（1 名大院・工・生物機能, 2 名大・予防早期医療創成セ）

9:00

3P-2a157

短鎖ペプチドの物理化学特徴に基づく長鎖機能性ペプチドの探索とデザイン............................................. ○岩田 晋明 1, 久米 暁子 1, 河合 駿 2, 加藤 竜司 2, 清水 一憲 1, 本多 裕之 1,3（1 名大院・工, 2 名大院・創薬科学, 3 名大・予防早期医療創成セ）

10:00

3P-2a158

AuNP-tag を用いた生体分子修飾による金ナノ粒子の高機能化....................................... ○的場 晴香 2, 前原 康秀 1, 重森 陽士郎 2, 石田 尚之 2, 今村 維克 2, 今中 洋行 2
（1 岡山大・工, 2 岡山大院・自科）

9:00

3P-2a159

病原性微生物を対象としたプログラム細胞死誘導物質の探索.......................................................... ○大田 悠里 1,2, 宮本 龍樹 1,2, 横田 亜紀子 2, 常田 聡 1, 野田 尚宏 1,2（1 早大・先進理工, 2 産総研・バイオメディカル）

10:00

3P-2a160

気生微細藻類 Vischeria helvetica 由来プロテアーゼによって生成した カゼインオリゴペプチドのACE 阻害活性............................................................ ○井上 悠希, 油井 信弘, 阿部 克也（工学院大・先進工・生化）

9:00

3P-2a161

環状バクテリオシン enterocin NKR-5-3B の生合成における環状化部位アミノ酸残基の影響..................... ○善藤 威史 1, 杉野 春貴 1, Perez Rodney Honrada 1, 石橋 直樹 1, 中山 二郎 1, 園元 謙二 1,2（1 九大院・農, 2 九大・バイオアーク）

10:00

3P-2a162

金ナノ粒子合成に寄与する二機能性ペプチドのキャラクタリゼーション.......................................... ○田中 祐圭 1,2, 大河内 美奈 1,2（1 東工大・物質理工学院, 2 JST・ImPACT）

9:00

3P-2a163

ペプチド修飾ポアセンサによる微生物検出............................................. ○大河内 美奈 1,2, イルファ ハヌン ハルリサ 1, 武藤 正記 1,2, 田中 祐圭 1,2,
横田 一道 2,3, 筒井 真楠 2,3, 谷口 正輝 2,3, 川合 知二 2,3（1 東工大・物質理工学院, 2 ImPACT, 3 阪大・産研）

10:00

3P-2a164

大豆タンパク質由来カチオン性ペプチドの抗菌・抗炎症・創傷治癒活性の解析...................................... ○齊藤 健吾, 野本 貴史, 落合 秋人, 田中 孝明, 谷口 正之（新潟大・自然研）

9:00

3P-2a165

アミノ酸置換によるコメ抗菌ペプチドの抗炎症活性の増強とその機構の解明.......................................... ○豊田 竜, 金子 陽徳, 落合 秋人, 田中 孝明, 谷口 正之（新潟大・自然研）

10:00

3P-2a166

アミノ酸置換によるコメ抗菌ペプチドの創傷治癒活性の増強とその機構の解明.......................................... ○生江 俊樹, 豊田 竜, 落合 秋人, 田中 孝明, 谷口 正之（新潟大・自然研）

9:00

3P-2a167

ローヤルゼリー酵素加水分解物からの生理活性ペプチドの精製と同定およびその機能解析...................................... ○平塚 祐也, 川部 純弥, 落合 秋人, 田中 孝明, 谷口 正之（新潟大・自然研）

10:00

3P-2a168

大豆タンパク質酵素加水分解物からの生理活性ペプチドの精製と同定およびその機能解析...................................... ○野田 悠輔, 川部 純弥, 落合 秋人, 田中 孝明, 谷口 正之（新潟大・自然研）

9:00

3P-2a169

コメ糠タンパク質酵素加水分解物からのカチオン性ペプチドの精製と同定およびその生理活性の解明......................................................... ○谷口 正之, 亀田 光裕, 落合 秋人, 田中 孝明（新潟大・自然研）

10:00

3P-2a170

納豆水抽出物中のカチオン性ペプチドの精製と同定およびその生理活性の解析...................................... ○野本 貴史, 幡本 晃太, 落合 秋人, 田中 孝明, 谷口 正之（新潟大・自然研）【脂質工学】
9:00

3P-2a171

マイクロ流路による water-in-oil エマルジョンの調製............................................................. ○池田 奈央, 岩上 千華, 伊藤 伸哉, 牧野 祥嗣（富山県大・工）

57

10:00

3P-2a172

蜂の子に含まれるグリコシルセラミドの免疫細胞に対する活性の解析.................................................................. ○酒谷 真以 1, 濱 侑紀 2, 松永 陽香 1, 藤川 彩美 1, 門脇 真史 1,
鶴田 裕美 3, 吉賀 豊司 1, 浜島 弘史 1, 柘植 圭介 3, 北垣 浩志 1
（1 佐賀大院・農, 2 株式会社正栄, 3 佐賀工技セ）

9:00

3P-2a173

局所麻酔薬による膜ラフト模倣構造熱安定性の低下................................................................ ○菅原 恒, 下川 直史, 高木 昌宏（北陸先端大・マテリアル）

10:00

3P-2a174

浸透圧印加による荷電脂質膜の張力誘起相分離............................................................ ○山本 遼太, 下川 直史, 高木 昌宏（北陸先端大・マテリアル）

9:00

3P-2a175

リン脂質組成非対称リポソームにおける膜内外層間相互作用と相分離挙動............................................................ ○大井 克仁, 下川 直史, 高木 昌宏（北陸先端大・マテリアル）【生物工学若手研究者の集い（若手会）】
以下の 9 演題は若手会が選定した博士後期課程学生によるポスター発表です．
第 2 日（29 日）16:00～18:00 に B 会場で口頭発表も行われます．

10:00

3P-2a176

振盪フラスコ培養中の気相および液相の CO2 と O2 の挙動解析....................................................................................... ○高橋 将人, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）

9:00

3P-2a177

組換え大腸菌を用いたラムノースを出発基質とする 1-プロパノール発酵生産.......................................... ○松原 充, 浦野 信行, 鳴滝 藍, 山田 尚平, 片岡 道彦（阪府大院・生環科）

10:00

3P-2a178

精製プロセスを伴わない低分子抗体の定量的薬効・蛋白質間相互作用スクリーニング.................. ○杉山 在生人 1, 梅津 光央 1, 中澤 光 1, 浅野 竜太郎 2, 二井手 哲平 1, 服部 峰充 1, 熊谷 泉 1（1 東北大院・工, 2 農工大院・工）9:00

3P-2a179

油脂生産と菌体内油脂回収に適した Lipomyces 酵母のスクリーニング........................................................................... ○柳場 まな 1, 正木 和夫 2, 南アルプス市 3＊, 長沼 孝文 1
（1 山梨大院・医工総・生命, 2 (独)酒類総研, 3 南アルプス市）＊著者からの希望により自治体名を記載しています。

10:00

3P-2a180

ミジンコにおける 2A ペプチドを用いたバイシストロニック発現システムの構築..................................................................... ○熊谷 仁志, 加藤 泰彦, 松浦 友亮, 渡邉 肇（阪大院・工）9:00

3P-2a181

核酸医薬原料となるヌクレオシドアナログ生産に有用な微生物触媒の探索と機能解析......................................................... ○光川 侑輝, 日比 慎, 松谷 成裕, 堀之内 伸行, 高橋 里美, 小川 順
（京大院・農）10:00

3P-2a182

スイホウガンによる抗原特異的な抗体生産系の開発................................................ ○額田 夏生 1, アヴシャル 恵利子 1, 中井 沙織 1, 都築 祥子 1, 田丸 浩 1,2,3（1 三重大院・生資, 2 三重大・生命支セ, 3 三重大・新産業）

9:00

3P-2a183

生体制御分子硫酸体の生理機能評価技術開発........................................................○下平 武彦 1, 黒木 勝久 1, Liu Ming-Cheh 2, 榊原 陽一 1, 水光 正仁 1
（1 宮崎大院・農工総合, 2 トレド大・薬）

10:00

3P-2a184mRNA から構成される多入力 microRNA 応答性人工遺伝子回路の構築......................................... ○松浦 理史 1,2, 藤田 祥彦 2, 齊藤 博英 2（1 京大院・医, 2 京大・iPS 細胞研）

58

シンポジウム（午後の部）
酒類製造における革新技術【本部企画】
富山国際会議場 3 階 A 会場（メインホール）（13:00～15:00）
はじめに............................................................................................................................................................ 堤 浩子

13:00

座長：堤 浩子
13:03

3S-Ap01

未利用資源のエネルギーを利用した焼酎製造.............................................................................................................................. ○奥村 隆享（霧島酒造）
座長：堤 浩子

13:26

3S-Ap02

清酒醸造を支える酵母開発技術................................................................................................... ○中原 克己, 稲橋 正明（日本醸造協会）

13:49

3S-Ap03

泡盛の商品展開における基盤研究の活用.................................................................................................................. ○塚原 正俊（バイオジェット）座長：堤 浩子

座長：山田 修14:12

3S-Ap04

酒類製造における革新技術；まるごと果実瞬間凍結粉砕浸漬製法 Freeze-Crush-Infusion (FCI)...................................................................................................... ○藤原 裕之（サントリースピリッツ）

14:35

3S-Ap05

研究開発の知見を生産技術に活用する事例紹介......................................................................................... ○伊藤 義訓（アサヒビール・ 研究開発本部）

座長：山田 修おわりに........................................................................................................................................................ 安原 貴臣

14:58

生命ビッグデータ の利活用による生物工学のイノベーション
富山国際会議場

2 階 B 会場（特別会議室）（13:00～15:00）

はじめに........................................................................................................................................................ 富田 因則

13:00

座長：石井 一夫
13:05

3S-Bp01

グローバル化時代と地球温暖化に適した晩生コシヒカリの NGS 解析に基づく開発..................... ○富田 因則 1, 岩瀬 雄大 1, 石井 一夫 2（1 静岡大・グリーン科学技術研究所, 2 農工大）座長：石井 一夫

13:21

3S-Bp02

網羅的遺伝子発現情報から重要遺伝子群を選択する方法の確立.................................................................. ○小林 拓嗣 1, 古崎 利紀 2, 石井 一夫 2, 有江 力 3, 山形 洋平 1,3（1 農工大院・連農, 2 農工大院・農学系ゲノム人材育成プログラム, 3 農工大院・農）
座長：石井 一夫

13:36

3S-Bp03

Understanding the gene control mechanism of physiological disorders in mangosteen using RNA-seq................................................. ○Deden Derajat Matra 1,2,4, Toshinori Kozaki 3, Kazuo Ishii 3, Eiichi Inoue 4（1 Plant Prod. Div., Dept. Agro. Hort., Fac. Agric., Bogor Agricultural Univ., 2 United Grad. Sch. Agric. Sci.,
Tokyo Univ. Agric. Technol., 3 Grad. Sch. Agric., Tokyo Univ. Agric. Technol., 4 Coll. Agric., Ibaraki Univ.）59

座長：富田 因則
13:52

3S-Bp04

担子菌ウシグソヒトヨタケ子実体形成過程の Strand-specific RNA-seq 解析..................................... ○村口 元 1, 梅澤 究 2, 新倉 舞 2, 吉田 誠 2, 古崎 利紀 2, 石井 一夫 2, 酒井 杏匠 3,
志水 元亨 3, 中堀 清 4, Choi Cindy 5, Ngan Chew Yee 5, Lindquist Erika 5, Lipzen Anna 5,
Tritt Andrew 5, Haridas Sajeet 5, Barry Kerrie 5, Grigoriev Igor V. 5, Pukkila Patricia J. 6
（1 秋田県大院・生資, 2 農工大院・農, 3 名城大院・農,4

岡山大院・自科, 5 JGI, 6 Dept. Biol., Univ. North Carolina）
座長：富田 因則

14:08

3S-Bp05

昆虫のバキュロウイルスに対する抵抗性メカニズムの解明.................................................................. ○岩田 賢人 1, 石井 一夫 2, 古崎 利紀 2, 水谷 哲也 3, 大松 勉 3,
長井 誠 3, 齋藤 康将 1, 井上 真紀 1, 仲井 まどか 1（ 農工大院・農, 2 農工大・農学系ゲノム人材育成プログラム,
1

3

農工大・国際家畜感染症防疫研究教育センター）
座長：富田 因則

14:23

3S-Bp06

材料の異なる堆肥の生物脱臭効果および微生物叢に関する研究....................................................................................... ○北村 里香 1, 石井 一夫 2, 古崎 利紀 2, 前田 勇 3,
飯郷 雅之 3, 黒倉 健 3, 岩渕 和則 4, 齋藤 高弘 3（ 宇都宮大・バイオセ, 2 農工大, 3 宇都宮大・農, 4 北大院・農）1

座長：富田 因則
14:39

3S-Bp07

機械学習システムによる人工知能の生物工学への応用.................................................................................... ○石井 一夫 1, 古崎 利紀 1, 中村 和敬 2, 當仲 寛哲 2
（1 農工大院・農, 2 USP 研究所）
おわりに........................................................................................................................................................ 石井 一夫

14:55

Gap Filling of Metabolic Pathway and Application to Producing Valuable Compounds〈国際シンポジウム〉
ANA クラウンプラザホテル富山

3 階 C 会場（13:00～15:00）
座長：Tomohiro Tamura

13:00

3S-Cp01

Discovery of valuable genes by massive sequencing and time lapse analysis of environmental RNAs............................................................ ○Nobutaka Nakashima, Yuya Nakamura（Sch. Life Sci. Technol.）
座長：Nobutaka Nakashima

13:12

3S-Cp02

Transcriptome and translatome of the model antibiotic producer Streptomyces coelicolor A3(2)........................................................................................................................................ ○Byung-Kwan Cho（Dept.Biol.Sci., KAIST, South Korea）
座長：Nobutaka Nakashima

13:36

3S-Cp03

Genome-mining based natural product discovery.............................................................................................................................................. ○Pei-Yuan Qian
（Division of Life Science and Environmental Science Programs, Hong Kong University of Science andTechnology）
座長：Nobutaka Nakashima

14:00

3S-Cp04

Current Status of CBD and Nagoya Protocol on ABS, including the Synthetic Biology..................................................................................... ○Mutsuaki Suzuki（National Institute of Genetics）
座長：Tomohiro Tamura

14:12

3S-Cp05

Prediction and identification of sequences coding for orphan enzymes.................................................................. ○Takuji Yamada（Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Tech）

60

座長：Takuji Yamada
14:36

3S-Cp06

Elucidation of gene regulatory network by structural equation modelling........................................................................................................................................○Sachiyo Aburatani（AIST）

和食の機能性のメカニズム～生活習慣病予防、腸内細菌へのインパクト～
ANA クラウンプラザホテル富山

3 階 D 会場（13:00～15:00）

はじめに........................................................................................................................................................ 北垣 浩志

13:00

座長：北垣 浩志
13:05

3S-Dp01

日本食の健康機能性.......................................................................................................................... ○都築 毅（東北大院・農）

13:30

3S-Dp02

アジア人の食と腸内細菌叢の関連性................ ○中山 二郎 1, 本田 倫子 2, Kisuse Juma 2, 百田 理恵 2, 田中 優 2, 園元 謙二 1, Lee Yuan-Kun 3

座長：北垣 浩志

（1 九大院・農, 2 九大院・生資環, 3 Dept. Microbiol., Natl. Univ. Singapore）
休憩

13:55

座長：中山 二郎
14:00

3S-Dp03

麹菌プロテアーゼの腸内細菌叢への影響.............................................................................................................. ○加藤 範久（広島大院・生物圏）

14:25

3S-Dp04

麹グルコシルセラミドの腸内細菌叢への影響....................................................................................... 藤川 彩美 1, 佐藤 友哉 1, 浜島 弘史 1, 柳田 晃良 2,

座長：中山 二郎

光武 進 1, 永尾 晃治 1, 中山 二郎 3, ○北垣 浩志 1
（1 佐賀大・農, 2 西九州大学, 3 九大院・農）
座長：中山 二郎
14:45

3S-Dp05

麹グリコシルセラミド分解物の PPAR への影響........................................................................................ ○浜島 弘史, 光武 進, 北垣 浩志（佐賀大・農）
おわりに........................................................................................................................................................ 中山 二郎

14:55

セルフリー（無細胞）タンパク質合成技術の新展開
ANA クラウンプラザホテル富山

3 階 E 会場（13:00～15:00）

はじめに........................................................................................................................................................ 松浦 友亮

13:00

座長：松浦 友亮
13:02

3S-Ep01

ヒト因子由来無細胞タンパク質合成系の開発と応用.................. ○町田 幸大 1,2, 重田 友明 1, 今高 寛晃 1,2（1 兵庫県大院・工, 2 理研・ライフサイエンス）

13:25

3S-Ep02

昆虫嗅覚受容体の機能的再構成系の構築と匂いセンサへの応用................................................................................ ○櫻井 健志, 光野 秀文, 神崎 亮平（東大・先端研）

座長：松浦 友亮

座長：松浦 友亮
13:48

3S-Ep03

再構成型無細胞タンパク質合成システムを利用した新規タンパク質定量法「MS-QBiC」による体内時刻の測定.................................................................... ○清水 義宏, 鳴海 良平, 上田 泰己（理研・生命システム）61

座長：清水 義宏
14:11

3S-Ep04

セルフリータンパク質合成系を用いた特殊ペプチド創薬.................................................................................................. ○窪田 規一（ペプチドリーム株式会社）
座長：清水 義宏

14:34

3S-Ep05

無細胞合成抗原を用いた抗膜タンパク質抗体作製技術................................................................................................. ○竹田 浩之, 澤崎 達也（愛媛大・PROS）
おわりに........................................................................................................................................................ 清水 義宏

14:57

一般講演（午後の部）
富山国際会議場

2 階ポスター会場 I（15:30～17:30）【遺伝子工学】
15:30

3P-1p001

慢性皮膚疾患である乾癬関連遺伝子群の酵母を利用した解析............................................................................ ○辻 竜海（山口大学院 創成科学研究科 化学系専攻）

16:30

3P-1p002

高温耐性酵母 Ogataea polymorpha による乳酸生産.................................. ○杉山 峰崇 1, 加藤 謙斗 1, 深谷 健 1, 橋本 晋弥 1, 笹野 佑 1, 金子 嘉信 1, 原島 俊 2（1 阪大院・工, 2 崇城大・生物生命）

15:30

3P-1p003

Expression of an AT-biased Rhizopus glucoamylase gene in Aspergillus oryzae................................................................ ○Dalia Zaouil, Mizuki Tanaka, Takahiro Shintani, Katsuya Gomi

16:30

3P-1p004

Cas9 タンパク質を用いた麹菌のゲノム編集技術の開発......................................... ○嶋本 孝平 1,2, 齊藤 亮太 1, 和田 悠作 3, 織田 健 1, 奥田 将生 1,2, 岩下 和裕 1,4（Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.）（1 酒総研, 2 広島大院・生物圏, 3 ファスマック, 4 広島大院・先端物質）
15:30

3P-1p005

非相同末端結合に関与する遺伝子破壊株における麹菌の TALENs を用いたゲノム編集...................................................................... ○水谷 治 1, 荒添 貴之 2, 利田 賢次 1, 林 梨咲 1, 大里 修一 2,
佐久間 哲史 3, 山本 卓 3, 桑田 茂 2, 山田 修 1（1 酒総研, 2 明治大院・農, 3 広島大院・理）

16:30

3P-1p006

HMG-CoA reductase inhibitor FR901512 生産菌における生産性向上 UV 変異株の変異点解析................................................................ ○伊東 広哉 1,3, 松井 真 1, 熊谷 俊高 2,3, 町田 雅之 3,4, 柴田 孝 1,3（1 アステラス製薬, 2 ファームラボ, 3 TRAHED, 4 産総研）

15:30

3P-1p007

麹菌マルトーストランスポーター MalP 分解に関わる CreD-HulA 間の相互作用解析...................................... ○多田 日菜子, 田中 瑞己, 平本 哲也, 新谷 尚弘, 五味 勝也（東北大院・農）

16:30

3P-1p008

麹菌におけるカーボンカタボライト抑制関連因子 CreB の細胞内局在解析............................................................. ○一瀬 桜子, 田中 瑞己, 新谷 尚弘, 五味 勝也（東北大院・農）

15:30

3P-1p009

麹菌カーボンカタボライト抑制制御因子 CreA の分解におけるカルボキシ末端領域の関与................................................................................ ○田中 瑞己, 新谷 尚弘, 五味 勝也（東北大院・農）

16:30

3P-1p010

糸状菌の鉄恒常性維持を担う転写因子 HapX のシステインリッチ領域の機能解析................................................................. ○村田 俊輔, 小森 誠也, 志水 元亨, 加藤 雅士（名城大・農）

15:30

3P-1p011

Aspergillus aculeatus セルラーゼ誘導発現における sepM 遺伝子破壊の影響......................................................... ○津村 亮輔, 谷 修治, 炭谷 順一, 川口 剛司（阪府大院・生環科）

16:30

3P-1p012

Aspergillus aculeatus におけるセルロース系バイオマス分解酵素生産調節因子の探索......................................................... ○白柳 英俊, 谷 修治, 炭谷 順一, 川口 剛司（阪府大院・生環科）

15:30

3P-1p013

Aspergillus 属糸状菌の細胞壁 alpha-1,3-グルカンの二次代謝物生産に及ぼす影響................................................................. ○張 斯来, 田中 瑞己, 新谷 尚弘, 五味 勝也（東北大院・農）

62

16:30

3P-1p014

麹菌のアミラーゼ生産に関与する転写因子 MalR の核局在シグナル変異体の機能解析.......................................... ○今野 友維, 鈴木 空太, 田中 瑞己, 新谷 尚弘, 五味 勝也（東北大院・農）

15:30

3P-1p015

麹菌のプロテアーゼ低生産および細胞壁構成因子破壊による異種タンパク質生産量への影響.......................................... ○新庄 梨沙, 渡邊 崇健, 田中 瑞己, 新谷 尚弘, 五味 勝也（東北大院・農）

16:30

3P-1p016

有用糸状菌 Trichoderma reesei 日本型変異株の網羅的表現型解析................................................................... ○平沢 大樹 1, 志田 洋介 1, 田代 康介 2, 久原 哲 2, 小笠原 渉 1（1 長岡技科大, 2 九大院・農）

15:30

3P-1p017

白色腐朽菌 Phanerochaete chrysosporium が有するセスキテルペン合成酵素の同定および機能解析............................................. ○筌場 将太 1, 北岡 卓也 2, 一瀬 博文 2（1 九大院・生資環, 2 九大院・農）

16:30

3P-1p018

超好熱性アーキア由来ヘリカーゼの PCR 反応への影響........................................................................................ ○川戸 克展 1, 秀瀬 涼太 1, 保川 清 2, 藤原 伸介 1
（1 関西学院大院・理工, 2 京大院・農）

15:30

3P-1p019

ランダム変異による超好熱菌糖代謝変異株の単離と解析................................................... ○東 健弘 1, 二石 涼平 1, 折田 和泉 1, 中村 聡 1, 今中 忠行 2, 福居 俊昭 1
（1 東工大・生命理工学院, 2 立命館大・生命科学）

16:30

3P-1p020

光化学系 II 耐熱性 D1/D2 タンパク質と D1 プロセシングプロテアーゼの中温性シアノバクテリアでの発現......................................................... 鶴田 開生, 田中 誠, 原口 典久, 中山 泰宗, 長濱 一弘, ○松岡 正佳（崇城大・生物生命）

15:30

3P-1p021

水面浮遊性微細藻類 FFG039 株における遺伝子組換え技術の確立.............................. ○櫻井 美季 1, 野島 大佑 1, 若田 裕一 2, 細川 隆史 2, 邑上 健 2, 吉野 知子 1, 田中 剛 1（1 農工大院・工, 2 富士フイルム株式会社）

16:30

3P-1p022

シマミミズ Eisenia fetida を用いた異種遺伝子発現系の構築............................................................. ○町田 悠, 伊佐 猛, 圡田 喜野, 赤澤 真一（長岡高専・物質工）15:30

3P-1p023

Heterologous Gene Expression as A tool to Obtain Some Chemical Compound from Bifidobacteria........................................................................................... ○Hend Altaib 1, Izumi Nomura 2, Tohru Suzuki 2（1 Grad. Sch. Fac. Appl. Biol. Gifu Univ., 2 Fac. Appl. Biol. Sci., Gifu Univ.）

16:30

3P-1p024

SUMO2 変異体ライブラリからの HER2 親和性選択............................................................. ○河上 佳奈, 伊藤 春佳, 伊藤 伸哉, 牧野 祥嗣（富山県大・工）15:30

3P-1p025

大腸菌による抗結核薬 D-サイクロセリンの高レベル異種生産...................... ○熊谷 孝則 1, 小澤 智紀 2, 青田 達明 1, 谷本 桃子 2, 的場 康幸 1, 野田 正文 1, 杉山 政則 1
（1 広大院・医歯薬保健学, 2 広大・薬）

16:30

3P-1p026

認知症を引き起こす神経変性疾患原因タンパク質の酵母を用いた凝集性解析.................................................................................. ○浦野 大樹 1, 鈴木 絢子 1,2, 星田 尚司 1, 赤田 倫治 1
（1 山口大院・創成科学・化学系, 2 現大分大・工・応化）

15:30

3P-1p027

シャペロン共発現がポリヒドロキシアルカン酸分子量へ与える影響................................................................................ ○南部 友香 1, 百武 真奈美 2, 廣江 綾香 1, 柘植 丈治 1
（1 東工大院・総理工, 2 理研・バイオマス）

16:30

3P-1p028

Stenotrophomonas maltophilia エステラーゼの遺伝子クローニングと大量発現....................................... ○鳥居 誉 1, 奥野 圭祐 2, 朝倉 紗也栞 1, 大浦 麻里 2, 阿野 貴司 1,2, 岡南 政宏 1,2（1 近畿大・生物理工, 2 近畿大院・生物理工）

15:30

3P-1p029

蛍光タンパク質を利用した白色腐朽菌 Phanerochaete sordida YK-624 株の交配技術開発.......................................................... ○近藤 旺次郎 1, 隅谷 友紀 1, 森 智夫 1, 河岸 洋和 1,2,3, 平井 浩文 1,2（1 静大・農, 2 静大グリーン研, 3 静大・創科技院）

63【植物細胞工学，組織培養，育種工学】
16:30

3P-1p030

Identification of beta-amyrin 28-oxidase in Glycyrrhiza uralensis.................... ○Keita Tamura 1, Hikaru Seki 1, Hideyuki Suzuki 2, Mareshige Kojoma 3, Toshiya Muranaka 1（1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Kazusa DNA Res. Inst., 3 Fac. Pharm. Sci., Health Sci. Univ. Hokkaido）

15:30

3P-1p031

キク科 Flaveria 属形質転換系と遺伝子発現誘導系の確立........................................................................ ○岡 美慧, 谷口 幸美, 宗景 ゆり（関西学院大院・理工）

16:30

3P-1p032（講演中止）

15:30

3P-1p033

シロイヌナズナのディフェンシンに関する組換えタンパク質の調製と解析............................................................ ○角谷 茜, 柳川 大樹, 今井 博之（甲南大院・自然科学・生物）

16:30

3P-1p034

土壌肥沃度指標に基づく薬用植物の有機栽培........................................................................................ ○山﨑 透 1, 荒木 希和子 1, 上野 省一 2, 久保 幹 1（1 立命館大院・生命科学, 2 ノエビア・研究開発部）【酵素学，酵素工学】
15:30

3P-1p035

Aspergillus oryzae RIB40 由来ギ酸オキシダーゼにおける Tyr99, Phe405 の役割................................................................. ○田邊 直人, 道林 泰樹, 沖 昌也, 内田 博之（福井大院・工）16:30

3P-1p036

ラン藻 Synechocystis の乳酸脱水素酵素の生化学解析.................................................................................... ○伊東 昇紀, 竹屋 壮浩, 小山内 崇（明治大・農）15:30

3P-1p037

海洋細菌由来マルチ銅オキシダーゼを用いた塩基性色素の脱色.................................................................................... ○海老原 京太 1, 吉川 潤 2, 堀口 博文 2, 天知 誠吾 1
（1 千葉大院・園芸, 2 合同酒精(株)）16:30

3P-1p038

サルコシンオキシダーゼの L-チオプロリンに対する反応性評価............................................................................ ○岡島 奨, 吉田 知左, 西矢 芳昭（摂南大・生命科学）

15:30

3P-1p039

超好熱古細菌由来 glycerol 代謝酵素の酵素活性調整の分子機構.................................................. ○古賀 雄一, 高野 築, 小西 佳菜子, 小林 淳, 大政 健史（阪大院・工）16:30

3P-1p040

D-サイクロセリン生合成に関わる新規ヘムタンパク質 DcsA の構造と性質...................... ○的場 康幸 1, 古川 裕貴 1, 柳澤 幸子 2, 宇田 成利 1, 熊谷 孝則 1, 小倉 尚志 2, 杉山 政則 1（1 広島大院・医歯薬保健, 2 兵庫県大院・生命理）

15:30

3P-1p041

イオン液体による酵素の耐熱化 ： 安定化剤、反応溶媒への展開................................................................................................... ○金子 恒太郎, 河合 功治（ミヨシ油脂）

16:30

3P-1p042

クマモリシンのカルシウムイオン結合部位特異的変異体の作製と熱安定性の解析......................................................... ○洲鎌 勇太 1, 尾山 廣 2, 伊東 昌章 1（1 沖縄高専, 2 摂南大・理工）

15:30

3P-1p043

Toxin-antitoxin 分子認識機構：病原菌由来 RNA インターフェレンスの特異的認識配列の同定.......................................................... 横田 亜紀子 1, 宮本 龍樹 1,2, 大田 悠里 1,2, 常田 聡 2, ○野田 尚宏 1,2（1 産総研・バイオメディカル, 2 早大・先進理工）

16:30

3P-1p044

合成生物学的手法により構築したシアノバクテリアによる CO2 からバイオエチレンへの変換効率に関する研究........................................................................................ ○神藤 定生 1, 林 茉依 2, 細田 晃文 2, 田村 廣人 2
（1 名城大・理工, 2 名城大・農）

15:30

3P-1p045

ジアホラーゼ内包硫化カドミウムナノ粒子の作製と水系/非水系における特性評価............................................................ ○安田 信幸, 油井 信弘, 阿部 克也（工学院大・先進工・生化）

16:30

3P-1p046

D-erythro-3-ヒドロキシアスパラギン酸デヒドラターゼの機能解析および光学分割への応用............................................. ○柴野 可菜, 長野 弘幸, 横田 篤, 和田 大（北大院・農・微生物生理学）

15:30

3P-1p047

Pseudomonas nitroreducens 由来 γ-グルタミルトランスペプチダーゼの構造と機能に関する研究................................................. ○佐野 千晴, 岡住 脩平, 今岡 大士, 若山 守（立命館大院・生命科学）

64

16:30

3P-1p048

Exiguobacterium acetylicum 由来ポリ乳酸分解活性を有するプロテアーゼの精製と諸特性解析............................................................................................... ○田所 花菜, 杉森 大助（福島大院・理工）

15:30

3P-1p049

Synechocystis sp. PCC 6803 由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの精製と特徴....................................................................................................... ○竹屋 壮浩, 小山内 崇（明治大・農）16:30

3P-1p050

Flavobacterium aquatile 由来 β-1,3-oligoglucan phosphorylase 遺伝子の発現..................................... ○中越 麻里菜, 谷 修治, 炭谷 順一, 川口 剛司（阪府大院・生環科・応生科）

15:30

3P-1p051

ジペプチド Val-Gly 合成能を有する L-アミノ酸エステラーゼのクローニングと精製および諸性質の検討.................................................. ○田中 貴大 1, 高木 一好 2, 若山 守 1（1 立命館大院・生命科学・生工,
2

16:30

3P-1p052

立命館大院・生命科学・応化）

ジペプチド Trp-His 合成能を有する L-アミノ酸エステラーゼの精製と諸性質の検討............................................................................................ ○牧 慶子 1, 田中 貴大 1, 高木 一好 2, 若山 守 1（1 立命館大院・生命科学・生工, 2 立命館大院・生命科学・応化）

15:30

3P-1p053

L-アミノ酸エステラーゼによるイミダゾールペプチドの酵素合成に関する研究......................................................................................................... ○小塩 茂々子 1, 高木 一好 2, 若山 守 1（1 立命館大院・生命科学・生工, 2 立命館大院・生命科学・応化）

16:30

3P-1p054

糸状菌 Aspergillus nidulans が有する GH134 ファミリーに属する糖質加水分解酵素の生理学的役割の解明................................................................................... ○新沢 祐大 1, 酒井 杏匠 1, 木本 紗蘭 1, 嶺澤 美帆 1,
望月 麻衣 1, 神藤 定生 2, 志水 元亨 1, 加藤 雅士 1
（1 名城大・農, 2 名城大・理工）

15:30

3P-1p055

糸状菌および放線菌由来 GH134 に属する β-1,4-マンナナーゼの機能解析と活性部位残基の探索.......................................................... ○木本 紗蘭 1, 酒井 杏匠 1, 新沢 祐大 1, 嶺澤 美帆 1, 山田 みゆき 1,
望月 麻衣 1, 神藤 定生 2, 志水 元亨 1, 加藤 雅士 1
（1 名城大・農, 2 名城大・理工）

16:30

3P-1p056

好アルカリ性細菌 Cellvibrio sp. WU-0601 由来ネオアガロビオース加水分解酵素の酵素的特徴............................................................ ○渡辺 輝彦, 樫村 佳奈, 桐村 光太郎（早大・先進理工・応化）

15:30

3P-1p057

Aspergillus niger NRRL 328 由来 III 型ポリケタイド合成酵素の機能解析................................. ○丸海老 純也, 渡邉 昭太郎, 小林 慶一, 桐村 光太郎（早大・先進理工・応化）【タンパク質工学】
16:30

3P-1p058

嗅覚受容体膜輸送機構の解明に向けた RTP の機能構造解析....................................................... ○玉木 良平 1, 福谷 洋介 1, 池上 健太郎 1, 松波 宏明 2, 養王田 正文 1
（1 農工大院・工, 2 デューク大・メディカルセンター）

15:30

3P-1p059

Selfassembling supramolecular nanostructures created by de novo extender protein nanobuilding blocks.................................................... Naoya Kobayashi 1, Kouichi Inano 1, Takaaki Sato 1, Keisuke Miyazawa 2,
Takeshi Fukuma 2, Michael H. Hecht 3, ○Ryoichi Arai 1（1 Fac. Textile Sci. Technol., Shinshu Univ., 2 Coll. Sci. Eng., Kanazawa Univ.,
3

16:30

3P-1p060

Dept. of Chem., Princeton Univ.）

カイコ由来糖転移酵素 GnTII 及び GalT オルソログの機能解析............................................................................... ○宮下 龍之介 1, 宮崎 剛亜 1,2, 加藤 竜也 1,2, 朴 龍洙 1,2（1 静大・創科技院, 2 静大・グリーン科技研）

15:30

3P-1p061

乳酸オキシダーゼのタンパク質工学による基質特異性の改変...................................................................................... ○比留田 美咲, 西矢 芳昭（摂南大院 生命科学）

16:30

3P-1p062

N 末端蛍光標識抗体プローブを用いた抗原の蛍光検出.................................. ○福永 圭佑 1, 渡邉 貴嘉 1, Novitasari Dian 1, 阿部 亮二 2, 大橋 広行 2, 芳坂 貴弘 1
（1 北陸先端大・マテリアル, 2 ウシオ電機）

65

15:30

3P-1p063

脂肪酸アシル-ACP 還元酵素の in vivo 迅速活性評価法の開発............................................................................................... ○林 勇樹, 新井 宗仁（東大院・総合文化）

16:30

3P-1p064

シグナル伝達分子の特異的活性化を目的とした新規受容体の開発.............................................................. ○Kongkrongtong Tatphon, 長棟 輝行, 河原 正浩（東大院・工）15:30

3P-1p065

細胞死シグナルを利用したタンパク質間相互作用阻害分子選択法の開発.................................................................................... ○江口 晃弘, 長棟 輝行, 河原 正浩（東大院・工）16:30

3P-1p066

シリカ粒子形成促進タンパク質“グラシン”の機能を利用した GFP のシリカへの固定化.................................................................................... ○小林 大起 1, 天野 太郎 2, 有馬 二朗 1, 清水 克彦 3
（1 鳥取大・農, 2 鳥取大院・農, 3 鳥取大産学）

15:30

3P-1p067

CutA1 及び VHH 抗体を利用した高感度バイオセンシングシステムのデザイン......................................................... ○伊達 弘輝, 石田 尚之, 今村 維克, 今中 洋行（岡山大院・自科）

16:30

3P-1p068

アクセサリータンパク質を標的とした抗センダイウイルス薬の開発................................................. ○小田 康祐, 的場 康幸, 入江 崇, 坂口 剛正（広大院・医歯薬保健学）【発酵生理学，発酵工学】
15:30

3P-1p069

4-aminocinnamic acid の発酵生産システムの構築............................................................. ○皆川 一, 桝尾 俊介, 周 勝敏, 高谷 直樹（筑波大・生命環境）

16:30

3P-1p070

光学活性ジカルボン酸モノアミド生産に有用な新規微生物イミダーゼ............................................................. ○間中 千尋, 光川 侑輝, 志澤 宏明, 日比 慎, 高橋 里美, 小川 順
（京大院・農）15:30

3P-1p071

タンデム酵素反応を利用した S-アルキルシステインスルフォキシド生産のためのバイオプロセス
開発............................................................. 日比 慎, ○松岡 智里, 飯星 貴幸, 小園 祥子, 高橋 里美, 小川 順
（京大院・農）16:30

3P-1p072

出芽酵母における褐藻類由来糖質（アルギン酸とマンニトール）の代謝機序........................................................................................... 松岡 史也 1, 柏原 貴幸 1, 平山 誠 1, 田中 秀樹 1,
佐薙 潤季 1, 橋本 渉 1, 村田 幸作 2, ○河井 重幸 1
（1 京大院・農, 2 摂南大・理工）

15:30

3P-1p073

Effect of fixed-bed bioreactor on higher bio-hydrogen production........................................................ ○Chenyu Zhao, Nan Zhang, Mishma Silvia Stanislaus, Yingnan Yang

16:30

3P-1p074

Semi-continuous anaerobic digestion under illumination condition for mitigating ammonia inhibition................................ ○Nan Zhang, Mishma Silvia Stanislaus, Chenyu Zhao, Haoyuan Gao, Yingnan Yang

（Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba）（Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba）
15:30

3P-1p075

バイオマスを原料としたフェニルプロパノイドの発酵生産......................................... ○佐々倉 有麻 1, 桝尾 俊介 2, 高谷 直樹 2（1 筑波大院・生命環境, 2 筑波大）

16:30

3P-1p076

Study on the intermittent illumination to mitigate ammonia inhibition under mesophilic condition................................ ○Haoyuan Gao, Nan Zhang, Mishma Silvia Stanislaus, Chenyu Zhao, Yingnan Yang

15:30

3P-1p077

Development of bioprocess with designed biomass: Design of rice straw hydrolysate for efficient butanol（Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba）
production without carbon catabolite repression............. ○Tao Zhao 1, Yukihiro Tashiro 1, Takuya Noguchi 1, Jin Zheng 2, Kenji Sakai 1, Kenji Sonomoto 1,3（1 Fac. Agric., Kyushu Univ., 2 Univ. Sci. Technol. Beijing, 3 Bio-Arch., Kyushu Univ.）

66【オミクス解析】
16:30

3P-1p078

実験室進化とオミックス解析によるイソプロパノール耐性大腸菌の育種.................................................................................. ○堀之内 貴明 1, 酒井 亜希 1, 田辺 久美 1, 古澤 力 1,2（1 理研・生命システム, 2 東大院・理）

15:30

3P-1p079

Widely targeted metabolic profiling for improvement of 1-butanol-producing Synechococcus elongatus............. ○Artnice Mega Fathima 1, Walter Lavina 1, Sastia Prama Putri 1, James Liao 2, Eiichiro Fukusaki 1（1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Dept. Chem. Biomol. Eng., UCLA）

16:30

3P-1p080

酢酸菌 Komagataeibacter europaeus 由来転写因子 Lrp の標的遺伝子の網羅的探索.......................................................... ○石井 友理 1, 赤坂 直紀 2, 佐古田 久雄 2, 秀瀬 涼太 1, 阿部 達明 3,
兼崎 友 4, 石川 森夫 3, 貝沼（岡本） 章子 3, 藤原 伸介 1
（1 関西学院大院・理工, 2 マルカン酢, 3 東京農大・応生科醸造, 4 東京農大・ゲノムセンター）

15:30

3P-1p081

担子菌 Coprinopsis cinerea の子実体形成初期に発現するタンパク質の探索およびその機能解析について................................................... ○酒井 杏匠 1, 相島 奈央 1, 村口 元 2, 吉田 誠 3, 志水 元亨 1, 加藤 雅士 1
（1 名城大院・農, 2 秋田県立大・生物資源, 3 東京農工大・農）

16:30

3P-1p082

メタボロミクスに基づく Saccharomyces cerevisiae の連続培養におけるエタノール生産の低減...................................................................................... ○井村 誠 1, 岩切 亮 1, 馬場 健史 2,3, 福﨑 英一郎 3（1 興人ライフサイエンス, 2 九大・生医研, 3 阪大院・工）15:30

3P-1p083

ゲノミクスとトランスクリプトミクスを用いた麹菌変異株の変異点の同定と解析................................................................................ ○吉村 太郎 1,2, 和田 洋樹 1,2, 松田 俊文 2, 佐藤 敦史 1,
小川 真弘 1,3, 松島 健一朗 1, 小山 泰二 1,3, 伊藤 考太郎 1（1 キッコーマン, 2 キッコーマン食品, 3 野田産研）

16:30

3P-1p084

バイオ医薬生産に向けた CHO 細胞培養情報データ解析システムの構築...... ○許 漢修, 荒木 通啓, 蓮沼 誠久, 河野 愛子, 近藤 昭彦（神戸大院・科学技術イノベーション）

15:30

3P-1p085

ハッサク葉のストレス応答反応における二次代謝物質の変動解析..... ○伊佐木 芳 1, 松川 哲也 1,2, 梶山 慎一郎 1（1 近畿大院・生物理工・生物工, 2 近畿大・附属農場）

16:30

3P-1p086

和食固有素材摂食による生体応答プロファイリング
..................................................................................... 益田 静香 1, ○嶋 秀明 1, 伊達 康博 2,3, 篠 阿弥宇 2,
梶川 瑞穂 1, 井上 能博 1, 石戸 聡 1, 菊地 淳 2,3,4（ 昭和薬大・薬, 理研・環境資源科学研究セ, 3 横市大院・生医, 4 名大院・生命農学）
12【生体情報工学，バイオインフォマティクス】
15:30

3P-1p087

Staphylococcus aureus に注目したアトピー性皮膚炎の重症化メカニズムの理解.......................................................... ○沖野 凪沙 1, 稲垣 瑞穂 1, 佐藤 綾子 1, 澤野 博之 1, 坪内 芙美香 1,
林 将大 2, 田中 香お里 2, 兼崎 友 3, 吉川 博文 3, 鈴木 徹 1（ 岐阜大・応生科, 岐阜大・生命科学総合研究支援センター, 3 東農大・応生科）
1

16:30

3P-1p088

2

Aspergillus section Flavi の比較ゲノム解析...................................................... ○佐藤 敦史 1, 松島 健一朗 1, 伊藤 考太郎 1, 服部 正平 2,3, 光山 統泰 4
（1 キッコーマン, 2 東大院・新領域, 3 早大・先進理工, 4 産総研）

15:30

3P-1p089

糖質系高分子に対する分子動力学計算のためのパラメーター設定支援プログラム................................................... ○園部 智彩 1, 矢部 誠 2, 上田 一義 1, 近藤 敬子 3, 片平 正人 3, 武田 穣 1（1 横国大院・工, 2 横浜市大院・生命医科, 3 京大・エネルギー理工研）

16:30

3P-1p090

Effect of d-and l-menthol on stability of membrane heterogeneity......... ○Pooja Gusain 1, Kunihide Hoshino 1,2, Yoshio Tsujino 1,2, Naofumi Shimokawa 1, Masahiro Takagi 1（1 Sch. Mater. Sci., JAIST, 2 Takasago International Corporation）

67

15:30

3P-1p091

ディープラーニングを用いた生体分子解析......................................................... ○三宅 淳, 金下 裕平, 浅谷 学嗣, 東 侑之介, 田川 聖一, 新岡 宏彦

16:30

3P-1p092

シェルスクリプトを用いたパラレルモンテカルロ法の構築と生物工学への応用............................................................. ○石井 一夫 1, 中村 和敬 2, 當仲 寛哲 2（1 農工大・農, 2 USP 研）

15:30

3P-1p093

糖残基を指標とする抗菌性化合物探索のためのゲノム情報解析ツールの開発............................................................. ○木村 明音, 笹川 真稚, 市川 夏子, 藤田 信之（NITE・NBRC）

16:30

3P-1p094

アンチセンス核酸による配列特異的な殺菌....................................................................................... ○木野 裕太, 中島 信孝（東工大院・生命理工）

15:30

3P-1p095

環境試料 RNA の大量シーケンシングと経時解析による有用遺伝子の大規模検索............................................................................................ ○中村 祐哉 1, 森 宙史 1, 黒川 顕 2, 中島 信孝 1

（阪大院・基礎工）（1 東工大院・生命理工, 2 東工大・地球生命研）
16:30

3P-1p096

細胞画像情報解析による抗がん剤プロファイリング技術の開発.................................................................. ○河合 駿 1, 岡田 法大 1, 湯澤 勝浩 2, 佐々木 寛人 2, 蟹江 慧 1,
清田 泰次郎 3, 清水 一憲 2, 本多 裕之 2, 加藤 竜司 1
（1 名大院・創薬科学, 2 名大院・工, 3 ニコン）

15:30

3P-1p097

乳化を指標とした細胞壁形成阻害剤の新規スクリーニング法の検討................................................................ ○根路銘 伸介, 尾島 由紘, 東 雅之（阪市大院・工・化生系）【システムバイオロジー】
16:30

3P-1p098

海洋微生物群集による有機化合物の変換過程：NMR を用いた網羅型解析............................................................................... ○内宮 万里央 1, 伊達 康博 1,2, 坪井 裕理 1, 菊地 淳 1,2,3（1 理研 CSRS, 2 横市大院・生命医, 3 名大院・生命農）【環境工学，廃水処理技術】
15:30

3P-1p099

フローサイトメーターを用いた、長期冷蔵保存した海水中における微生物細胞の膜損傷状態の評価.................................................................................... ○高橋 裕里香 1, 古澤 之裕 2, 畠 俊郎 1, 西田 洋巳 1
（1 富山県大・工, 2 富山県大・教養）

16:30

3P-1p100

家庭内使用タオルに生息する細菌によるバイオフィルム形成の解析................................................................................ ○諸星 知広, 池谷 謙太, 池田 宰（宇都宮大院・工）15:30

3P-1p101

テレフタル酸分解菌の取得とその性質................................................... ○中島 鈴佳 1, 野中 大輔 1, 森田 穂 1, 内堀 孝博 3, 清 啓自 2, 中島 敏明 2
（1 筑波大, 2 筑波大院・生命環境, 3 パナック工業）

16:30

3P-1p102

P. pseudoflava および P. palleronii による芳香族化合物の生物分解に関する研究..... ○中屋 江梨花, モタカトラ ベンカテスワーレディ, 矢島 由佳, 張 傛喆（室工院・工・環境創生）

15:30

3P-1p103

高濃度脂肪酸を効率的に分解する酵母の単離と挙動解析法の検討............................................................................................. ○仲山 真美, 綾部 里美（SG ラボラトリー）

16:30

3P-1p104

産業用リパーゼによる新規コポリエステルの生分解.......................................... ○廣田 泰志 1, 川西 琢也 1,2, 滝口 昇 1,2（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・理工）

15:30

3P-1p105

都市排水を利用した微細藻類のバイオ燃料生産に向けた新規候補株の探索.................................................................................... ○星川 優美子 1, 野島 大佑 1, 高野 博幸 2, 田中 剛 1（1 農工大院・工, 2 太平洋セメント）

16:30

3P-1p106

Pelomonas saccharophila MRB3 によるコウキクサ成長促進効果の検討.................................................................................... ○加地 由季子 1, 黒田 真史 1, 玉木 秀幸 2, 池 道彦 1
（1 阪大院・工, 2 産総研・生物プロセス）

68

15:30

3P-1p107

環境中の微生物群集がコウキクサの成長に及ぼす影響の評価................................................................... ○黒田 真史 1, 石澤 秀紘 1, 玉木 秀幸 2, 森川 正章 3, 池 道彦 1
（1 阪大院・工, 2 産総研・生物プロセス, 3 北大院・環境）

16:30

3P-1p108

FISH 法と定量 PCR 法による国内下水処理施設におけるバルキング関連糸状性細菌の探索............................................................................................... ○新田見 匡 1, 庄司 仁 2, 野口 愛 3, 押木 守 4,
黒田 真史 5, 金田一 智規 6, 福田 淳二 1, 栗栖 太 7（1 横国大院・工, 2 成蹊大・理工, 3 金沢大・理工, 4 長岡高専・環境都市,
5

阪大院・工, 6 広島大院・工, 7 東大院・工）15:30

3P-1p109

Development of P/Ag/Ag2O/Ag3PO4/TiO2thin film modified by polyethylene glycol for water treatment................................................................. ○Qiansu Ma, Zetao Dong, Qi Zhu, Xiaohong Hu, Yingnan Yang

16:30

3P-1p110

Improvement of silver modified TiO2 solar-light-driven photocatalyst by hydrothermal method............................................................... ○Zhu Qi, Xiaohong Hu, Mishma Silvia Stanislaus, Yingnan Yang

（Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba）（Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba）
15:30

3P-1p111

Inactivation of Escherichia coli using P/Ag/Ag2O/Ag3PO4/TiO2 photocatalyst under LED irradiation................................................................................................ ○Na Liu, Qi Zhu, Ruida Xiao, Yingnan Yang
（Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba）【バイオマス，資源，エネルギー工学】
16:30

3P-1p112

気生微細藻類 Vischeria helvetica の脂質生合成を制御するストレス応答 シグナル伝達............................................................................... ○油井 信弘, 阿部 克也（工学院大・先進工・生化）

15:30

3P-1p113

低温・弱光において生育可能な気生微細藻類の探索と特徴づけ............................................................ ○西田 章弘, 油井 信弘, 阿部 克也（工学院大・先進工・生化）

16:30

3P-1p114

塩ストレス下におけるウキクサデンプン合成代謝の特徴とそのデンプン増産への応用..................................................................... ○高木 航平, 李 彦, 遠山 忠, 森 一博（山梨大院・医工総）

15:30

3P-1p115

Effects of photocatalytic pretreatment on Chlorella vulgaris to enhance biohydrogen production......................... ○Mishma Silvia Stanislaus 1, Qi Zhu 1, Chenyu Zhao 1, Nobuaki Negishi 2, Yingnan Yang 1（1 Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2 AIST）

16:30

3P-1p116

オイル高蓄積海洋珪藻 Fistulifera solaris におけるオイルボディタンパク質の解析.................................................................................... ○野島 大佑, 吉野 知子, 田中 剛（農工大院・工）15:30

3P-1p117

明暗周期下で効率的に油脂を生産するための海洋性緑藻培養技術の開発................................................................... ○藤原 悠右 1, 加藤 悠一 1, 賀 詩欣 2, 蓮沼 誠久 1, 近藤 昭彦 1（1 神戸大院・科学技術イノベーション, 2 Harbin Institute of Technology, China）

16:30

3P-1p118

海藻由来好熱菌を用いた海藻分解プロセスの検討........................................... 藤井 健太 1, 奥中 淳平 2, 冨永 有里絵 1, 八木 寿梓 3, ○大城 隆 1, 鈴木 宏和 1
（1 鳥取大院・工・化生応工, 2 鳥取大・工・生応工, 3 鳥取大・工・GSC）

15:30

3P-1p119

ミトコンドリア電子伝達系制御によるユーグレナ低酸素下ワックスエステル生産の調節................................................................................ ○中澤 昌美 1,2, 太田 剛志 1, 石川 孝博 2,3, 上田 光宏 1,
阪本 龍司 1, 乾 博 2,4, 中野 長久 1, 宮武 和孝 1,5（1 阪府大院・生環科, 2 JST・CREST, 3 島根大院・生資科,
4

16:30

3P-1p120

阪府大院・総リハ, 5 帝塚山学院大・人間科）

ラン藻スピルリナからの高生産エタノール変換プロセスの開発..................................... ○藍川 晋平 1, 猪熊 健太郎 1, 若井 暁 1, 佐々木 建吾 1, 蓮沼 誠久 1, 近藤 昭彦 1,2（1 神戸大院・イノベ, 2 神戸大院・工）

69

15:30

3P-1p121

藍藻 Synechocystis sp. PCC 6803 hox 遺伝子変異株のコントロールされた培養条件における有機酸
生産................................................................................... ○中島 満晴 1, 飯嶋 寛子 1, 白井 智量 2, 岡本 真美 2,
蓮沼 誠久 3, 近藤 昭彦 2,3, 平井 優美 2, 小山内 崇 1,2（1 明治大・農, 2 理研・CSRS, 3 神戸大院・工）16:30

3P-1p122

Analysis of light response mechanisms in carotenoid synthesis of the yeast Rhodosporidium toruloides................ ○Dung Pham Khanh 1, Atsushi Miyata 1, Yosuke Shida 1, Harutake Yamazaki 2, Kazuo Masaki 3,
Kazuki Mori 4, Kosuke Tashiro 4, Satoru Kuhara 4, Hiroaki Takaku 2, Wataru Ogasawara 1（1 Nagaoka Univ. Technol., 2 Fac. Appl. Life Sci., Niigata Univ. Pharm. Appl. Life Sci.,
3

NRIB, 4 Fac. Agric., Kyushu Univ.）

15:30

3P-1p123

II-VI 族化合物半導体結晶を合成する光合成細菌のスクリーニング.................................................................... ○清水 稜, 富永 依里子, 岡村 好子（広島大院・先端物質）

16:30

3P-1p124

ヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した大腸菌を用いた無機-バイオハイブリッド光触媒による水からの水素製造...................................................... ○本田 裕樹 1, 渡邊 源規 1, 萩原 英久 1,2, 伊田 進太郎 1,2, 石原 達己 1,2（1 九大カーボンニュートラル・エネルギー国際研, 2 九大院・工）15:30

3P-1p125

光合成細菌と枯草菌の共培養による酸素ガス共存下の窒素固定................................................................................................... ○前田 勇, 久下沼 匠（宇都宮大院・農）

16:30

3P-1p126

Is Archaerhodopsin a powerful photosensitizer of the TiO2 based solar energy conversion system ?
...................................................................... ○Luomeng Chao 1, Gang Dai 2, Xiong Geng 3, Tatsuo Iwasa 1,3（1 Grad. Sch. Eng., Muroran Ins. Technol., Japan,,2

Coll. Chem. Environ. Sci., Inner Mongolia Normal Univ., China,
3

15:30

3P-1p127

Div. Eng., Muroran Ins. Technol., Japan）

銀ナノ粒子・ボロン樹脂・クレイからなる新規光触媒の暗所と可視光照射下におけるカビ胞子に対する殺菌効果........................................................... ○深野木 伸太 1, 宮﨑 愛 1, 山本 幸次郎 1, 伊東 謙吾 2, 田中 賢二 1
（1 近大院・産理工・生還化, 2 伊都研）

16:30

3P-1p128

銀ナノ粒子・ボロン樹脂・クレイからなる新規光触媒の暗所と可視光照射下における病原細菌殺菌効果........................................................... ○宮﨑 愛 1, 深野木 伸太 1, 山本 幸次郎 1, 伊東 謙吾 2, 田中 賢二 1（1 近畿大院・産理工・生環化, 2 伊都研）

15:30

3P-1p129

銀ナノ粒子・ボロン樹脂・クレイからなる新規光触媒の近赤外光照射下における殺菌効果........................................................... ○山本 幸次郎 1, 深野木 伸太 1, 宮﨑 愛 1, 伊東 謙吾 2, 田中 賢二 1（1 近畿大院・産業理工・生環化, 2 伊都研）

ANA クラウンプラザホテル富山

3 階ポスター会場 II（ASUKA）（15:30～17:30）【生物化学工学】
16:30

3P-2p132

LAL 固定化ビーズを用いたエンドトキシンの高感度・迅速検出法の開発と利用（第３報）............................ ○猪瀬 陽加 1, 飯島 綾 2, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大・生物資源, 2 筑波大院・生命環境）

15:30

3P-2p133

LAL 固定化ビーズ法を用いたグラム陰性菌の培養に伴うエンドトキシンの遊離特性の定量的解析............................ ○大瀧 賀也 1, 飯島 綾 2, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大・生物資源, 2 筑波大院・生命環境）

16:30

3P-2p134

Development of a novel co-culture-cell bioreactor system for bioethanol production from rice straw...........................................................................................................................○Yu-Kuo Liu, Yi-Chieh Lee（Grad. Inst. Biochem. Biomed. Eng., ChangGung Univ., Taiwan, ROC）

70

15:30

3P-2p135

有機溶媒非耐性菌による疎水性物質生産を目的とした隔壁二相培養系の提案............................................. ○滝口 昇 1, 穴田 侑也 2, 川西 琢也 1（1 金沢大・理工, 2 ダイト株式会社）

16:30

3P-2p136

負電荷脂質を含む生体模倣膜での多価カチオン添加による相分離構造形成............................................................ ○古田 一夢, 下川 直史, 高木 昌宏（北陸先端大・マテリアル）

15:30

3P-2p137

タンパク質のアミロイド化を利用した機能性材料の開発.................................................................. ○大島 立樹 1, 迫野 昌文 2（1 富山大・工, 2 富山大院・理工）

16:30

3P-2p138

バイオナノカプセルとリポソームの複合粒子による in vivo での抗腫瘍効果............................................................... ○西村 勇哉 1, 鈴木 貴弘 2, 森田 健太 2, 荻野 千秋 2, 近藤 昭彦 1（1 神戸大・科学技術イノベーション, 2 神戸大院・工）15:30

3P-2p139

ショウジョウバエ株化神経細胞 BG2-c6 を用いたアミロイド β 神経細胞毒性評価............................................................... ○山下 涼太 1, 板田 鉄平 1, 中川 裕之 2, 上井 幸司 1, 徳楽 清孝 1
（1 室工大院・工・環境創生, 2 福岡大・理・地球圏科学）

16:30

3P-2p140

Fish-killing activities and possible toxic factors of Chattonella marina and Chattonella antiqua............................................................................................. Daekyung Kim 2, Kichul Cho 2, ○Tatsuya Oda 1（1 Grad. Sch. Fish. Sci. Environ. Stud., Nagasaki Univ., 2 Jeju Center, KBSI, Korea）

15:30

3P-2p141

Corynebacterium glutamicum を用いたヘミセルロース系バイオマスからのカダベリン生産................................................................. ○今尾 健太, 山口 理絵, 田中 勉, 近藤 昭彦（神戸大院・工）16:30

3P-2p142

カバノアナタケの液体表面培養による抗酸化物質の生産................................................................................ ○藏本 彩加, 高柴 則子, 櫻井 明彦（福井大院・工）15:30

3P-2p143

σ 因子欠損放線菌の 3,4-AHBA 生産への影響........................................................................................ ○釜我 圭 1, 柏木 紀賢 2, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 2
（1 神戸大院・工, 2 神戸大院・科学技術イノベーション）

16:30

3P-2p144

固定化フォトバイオリアクターを用いた合成代謝経路導入シアノバクテリアによる 1,3 プロパンジ
オール生産.................................... ○端 瞭太 1,2, 堀内 淳一 1,2, 熊田 陽一 1,2, 広川 安孝 2,3, 花井 泰三 2,3, 村上 明男 2,4（1 京工繊大院・工芸科学, 2 JST・CREST, 3 九大院・農, 4 神戸大院・工）15:30

3P-2p145

Sortase A を用いた大腸菌体内での代謝酵素の連結とその影響......................................... ○松本 拓也 1, 田中 勉 2, 近藤 昭彦 1（1 神戸大院・科イノ, 2 神戸大院・工）16:30

3P-2p146

黄麹菌 hydrophobin-cutinase 間相互作用における hydrophobin N 末端側の寄与...................... ○田中 拓未 1, 深谷 愛衣 2, 佐藤 大貴 1, 對馬 裕誠 1, 上原 健二 1, 高橋 徹 3, 阿部 敬悦 1,2,3（1 東北大院・農, 2 東北大・農・応生化, 3 東北大・未来研）

15:30

3P-2p147

腸内有用細菌のストロンチウム除去特性の解析（第 2 報）........................................................................................... ○遠藤 輪, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）

16:30

3P-2p148

模擬微小重力培養が腸内細菌の生理活性に及ぼす影響の解析と利用（第 2 報）................................................................................... ○長谷川 文香, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）

15:30

3P-2p149

大腸菌フロック上での組換えタンパク質固相発現系の構築........................................................................................ ○尾島 由紘 1, 布上 翔太 2, 東 雅之 1, 田谷 正仁 2
（1 阪市大院・工・化生系, 2 阪大院・基礎工）16:30

3P-2p150

15:30

3P-2p151

菌体表面疎水性とバイオフィルム形成量との関係解明......................................... ○谷川 絢美 1, 小田 忍 2, 大箸 信一 2（1 金工大院・工, 2 金工大・ゲノム研）
変異原性ヌクレオシド dP による細胞死誘発に関与する遺伝子の特定と, その集積によって構築された高効率ネガティブ選択系.......................... ○河合（野間） 繁子, 佐伯 和哉, 湯本 達弥, 斎藤 恭一, 梅野 太輔（千葉大院・工）16:30

3P-2p152

LEA peptide - confer tolerance to salinity and temperature in E.coli.
............................ ○Nishit Pathak, Shinya Ikeno（Grad. Sch. Life Sci. Syst. Eng., Kyushu Inst. Technol.）

15:30

3P-2p153

凝集性酵母における新規な阻害剤耐性機構の解明......................................................... ○糸見 明穂 1, 紀平 和枝 1, Kahar Prihardi 1, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 2
（1 神戸大院・工, 2 神戸大院・科学技術イノベーション）

71

16:30

3P-2p154

ストロンチウムがツバキ花粉の生理活性に及ぼす影響の解析.................................................................................. 山下 綾子 1, ○中村 真由 2, 望月 玲於 1, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大院・生命環境, 2 筑波大・生物資源）【培養工学】
15:30

3P-2p155

強化平板法と発育遅延解析法を併用した「固液培地生存性差分(DiVSaL)法」による微生物の新規損
傷菌数評価...................................................................................... ○岩田 吏世 1, 坂元 仁 2, 土戸 哲明 2, 古田 雅一 1,2（1 阪府大院・工, 2 阪府大・21 科研機構・微制研セ）

16:30

3P-2p156

大腸菌細胞質内における ssrA タグ認識プロテアーゼ活性評価のためのレシオメトリックセンサーの開発........................................................................................................ ○坂元 仁 1,2, 古田 雅一 1,2,3, 土戸 哲明 1
（1 阪府大・21 科研, 2 阪府大・放研セ, 3 阪府大院・工・量子）

15:30

3P-2p157

細胞間相互作用を利用した新規微生物制御法の開発................................................. ○勝亦 雄太, 豊福 雅典, 小川 和義, 野村 暢彦（筑波大院・生命環境）

16:30

3P-2p158

白色腐朽菌によるマンガンペルオキシダーゼの高効率生産に向けた pH シフト条件の検討.................................................................................... ○嶋田 亮, 森本 康介, 櫻井 明彦（福井大院・工）15:30

3P-2p159

イオンビーム照射によるリグニンペルオキシダーゼ高生産株の育種.................................................................................... ○三木 紀彦 1, 杉浦 康友 1, 畑下 昌範 2, 櫻井 明彦 1
（1 福井大院・工, 2 若狭エネ研）

16:30

3P-2p160

新規酢酸耐性酵母 KS47-1 株における耐性機構に関する基礎検討......................................................................... ○加藤 勇太, 荒川 知子, 石田 奨, 小西 正朗（北見工大）

15:30

3P-2p161

酵母 Kluyveromyces marxianus によるキシロース条件下でのタンパク質分泌生産................................... ○星田 尚司 1,3,4, 木寺 研太 1, 瀧下 竜太 2, 藤岡 経久 1, 深川 泰紀 2, 赤田 倫治 1,3,4（1 山口大院・創成科学, 2 山口大・工, 3 山口大・中高温微生物セ, 4 山口大・生命医工セ）

16:30

3P-2p162

CHO 細胞培養における予測制御技術を応用したグルコース濃度制御法................................... 生田目 哲志 1, 中村 幸弘 1, 伊﨑 文晃 1, 平野 明成 1, ○下田 聡一郎 1, 大政 健史 2
（1 横河電機・イノベーションセンター, 2 阪大院・工）15:30

3P-2p163

軟培養面によるヒト iPS 細胞増殖への影響............... ○堀江 正信 1, 藤田 英明 2,3（1 京大・RIRC・生化工, 2 理研・生命システム, 3 阪大・免疫）

16:30

3P-2p164

コロニー形態情報解析を用いた iPS 細胞における培養工程の評価................................................................................... ○吉田 啓 1, 長坂 理紗子 1, 蟹江 慧 1, 清田 泰次郎 2,
古江-楠田 美保 3, 清水 一憲 4, 本多 裕之 4, 加藤 竜司 1
（1 名大院・創薬科学, 2 ニコン, 3 医薬基盤研究所, 4 名大院・工）15:30

3P-2p165

神経分化工程の非破壊評価に向けた細胞画像情報解析法の開発................................................................... ○藤谷 将也 1, Binti Huddin Noor Safika 2, 河合 駿 1, 蟹江 慧 1,
清田 泰次郎 3, 清水 一憲 2, 本多 裕之 2, 加藤 竜司 1
（1 名大院・創薬科学, 2 名大院・工, 3 ニコン）

16:30

3P-2p166

Muse 細胞の非侵襲的・迅速な濃縮法の開発...................................................................................... ○江橋 具 1,3, 冨田 悠一 2, 𠮷田 健祐 3, 山地 秀樹 3
（1 神戸大・自科・研究環, 2 神戸大・工, 3 神戸大院・工）15:30

3P-2p167

遺伝子導入による皮膚細胞から肺細胞への分化転換.............................. ○二宮 直登 1,2,3, 野口 隆明 1, 関根 麻莉 1, 道上 達男 2, 浅島 誠 3, 王 碧昭 1, 栗崎 晃 3（1 筑波大院・生命環境, 2 東大院・総合文化, 3 産総研）

72

【バイオプロセス】
16:30

3P-2p168

コリネ型細菌によるパラアミノ安息香酸の高生産................................................. ○久保田 健 1, 渡邉 彰 1, 須田 雅子 1, 小暮 高久 1, 平賀 和三 1, 乾 将行 1,2（1 RITE・バイオ, 2 奈良先端大・バイオ）

15:30

3P-2p169

ピルビン酸高生産大腸菌を利用したピルビン酸の生産......................................................................................................... ○秋田 紘長 1, 中島 信孝 2,3, 星野 保 1,3（1 産総研・機能化学, 2 東工大院・生命理工, 3 産総研・生物プロセス）

16:30

3P-2p170

Pyruvate decarboxylase 遺伝子を発現した微生物によるシンナムアルデヒドからの光学活性ジオールの生産.............................................. ○大竹 遥, 關谷 悠介, 井野口 諒太, 根岸 佑香里, 宮越 俊一（群馬高専）

15:30

3P-2p171

有機溶媒耐性菌を宿主とした SMO-LSADH 共発現システムによる光学活性エポキシド生産............................................................................................ ○戸田 弘 1, 小栁 喬 2, 榎本 俊樹 2, 伊藤 伸哉 1
（1 富山県大・生工研セ, 2 石川県大・生資環）

16:30

3P-2p172

単細胞生物用液／液界面バイオリアクターによるシトロネロールの変換............................................................................................................. ○石川 麻子 1, 小田 忍 2, 大箸 信一 3
（1 金工大院・工, 2 金工大・ゲノム研, 3 金工大・ゲノム研）

15:30

3P-2p173

Biotransformation of 3’-hydroxydaidzein by Escherichia coli expressing O-methyltransferase............................................................○Te-sheng Chang, Xin-Yi Huang, Ya-Ting Tsai, Dong-Sheng Wang
（Dept. Biotechnol., NUTN, Taiwan）

16:30

3P-2p174

インドアイ（マメ科）からの固体藍染料の微生物............................................................................................................. ○常盤 豊 1, 角 寿子 2, 世嘉良 宏斗 3
（1 グリーン・プロダクツ・ラボ, 2 北の藍染織工房, 3 沖縄県工技セ）

15:30

3P-2p175

好気発酵による (R)-3-ヒドロキシ酪酸生産............................................... ○世嘉良 宏斗 1, 花城 隆二 1, 合田 雅浩 1, 照屋 盛実 1, 楽 隆生 2, 常盤 豊 3（1 沖縄県工技セ, 2 甲南化工, 3 グリーン・プロダクツ・ラボ）

16:30

3P-2p176

デザインドバイオマス研究：好熱性乳酸菌による混合糖代謝系の解析とエナジーケーンからの高効率乳酸生産..................................................................... ○沼口 真緒 1, Tan Jiaming 1, Abdel-Rahman Mohamed Ali 1,2,
田代 幸寛 1, 善藤 威史 1, 酒井 謙二 1, 園元 謙二 1,3（ 九大院・農, 2 Al-Azhar University, 3 九大・バイオアーク）
1

15:30

3P-2p177

Settatia 属細菌による BDF 廃液代謝に対する pH の影響.......................................... ○内山 佳祐 1, 川西 琢也 1,2, 滝口 昇 1,2（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・理工）

73

ランチョンセミナー
3LA1
富山国際会議場

3LC2

東ソー株式会社

3 階 A 会場（メインホール）（11:30～12:30）

サーモフィッシャーサイエンティフィック 株式会社

ANA クラウンプラザホテル富山

3LE3

3 階 C 会場（11:30～12:30）

日本ウォーターズ株式会社

ANA クラウンプラザホテル富山

3 階 E 会場（11:30～12:30）

9 月 28 日 （水）授賞式・受賞講演（9:00 〜 11:15）

富山国際会議場 3 階 A 会場（メインホール）

授賞式（会長挨拶，KSBB 会長挨拶，名誉会員 ･ 功労会員推戴，各賞授賞）〈生物工学功労賞
受賞者

受賞挨拶〉

坂口 正明（サントリースピリッツ）

産学連携活動の新規提案と推進による学会の活性化

1A-Aa01

p. 77

1A-Aa02

p. 77

1A-Aa03

p. 78

1A-Aa04

p. 78〈生物工学功労賞 受賞挨拶〉
受賞者

松井 和彦（味の素）

第 10 回生物工学功労賞受賞にあたって〈生物工学賞 受賞講演〉
受賞者

園元 謙二（九大院・農）アプローチをデザインするスマート発酵工学の基盤研究〈生物工学功績賞 受賞講演〉
受賞者

本多 裕之（名大院・工）

短鎖ペプチドの新機能発現に関する研究シンポジウム（13:30 〜 15:30）

富山国際会議場 3 階 A 会場 , 2 階 B 会場 / ANA クラウンプラザホテル富山 3 階 C, D, E 会場

培養計測技術の最近のトピックス【本部企画】

1S-Ap01 〜 1S-Ap03

p. 79

生物工学研究者の生命情報との向き合い方〜バイオインフォマティクス入門から応用へ〜

1S-Bp01 〜 1S-Bp05

p. 80

Toward Sustainable Palm Oil Industry Coexistingwith Environmental and Biodiversity Conservation

1S-Cp01 〜 1S-Cp06

p. 83

Biotechnology of Enzymes in Aldoxime-Nitrile Pathway from Microorganisms,
Plants and Animals 〈ERATO Asano Active Enzyme Molecule Project〉
1S-Dp01 〜 1S-Dp04

p. 86

遺伝子改変技術によるセルエンジニアリングの革新：
産業応用に向けて

p. 88

一般講演

1S-Ep01 〜 1S-Ep06

ポスター掲示時間（10:00 〜 18:00）

ポスター会場 Ⅰ：富山国際会議場 2 階
ポスター会場 Ⅱ：ANA クラウンプラザホテル富山 3 階 ASUKA

酵素学，酵素工学

1P-1p001 〜 024

p. 91

タンパク質工学

1P-1p025 〜 038

p. 97

発酵生理学，発酵工学

1P-1p039 〜 054

p. 100代謝工学

1P-1p055 〜 068

p. 104

醸造学，醸造工学

1P-1p069 〜 083

p. 108

食品科学，食品工学

1P-1p084 〜 101

p. 111

環境浄化，修復，保全技術

1P-1p102 〜 113

p. 116

バイオマス，資源，エネルギー工学

1P-1p114 〜 131

p. 119

生体医用工学1P-2p132 〜 143

p. 123

セル＆ティッシュエンジニアリング

1P-2p144 〜 166

p. 126

バイオセンシング，分析化学

1P-2p167 〜 182

p. 132

センサー，計測工学

1P-2p183 〜 187

p. 136

生物工学功労賞

1A-Aa01

産学連携活動の新規提案と推進による学会の活性化○坂口 正明（サントリースピリッツ）
Masaaki_Sakaguchi@suntory.co.jp

1A-Aa0277

第 10 回生物工学功労賞受賞にあたって○松井 和彦（味の素）
kazuhiko_matsui@ajinomoto.com

この度は第１０回生物工学功労賞を受賞させて頂き、身に余る光栄に存じております．功労賞にご推薦、ご支援いただきました五味会長をはじめ関係各位に深く感謝しております．２００１年～２００９年 関西支部委員として企画担当
や副支部長、２００９年～２０１３年 理事、２０１３年～現在 監事を拝命し、日本生物工学会の活動を務めてまいりました．関係した主な学会活動について振り返ってみたいと思います．
１．産学連携活動の推進
飯島会長の時代（２００９～２０１１年）から日本生物工学会の重点方針の中に「学から産へ」という目標が示され、「産」を意識した活動を本格的に実施するようになりました．２００９年の名古屋大会では、「酒造業者との交流会」を行い、２０１０年の宮崎大会では、本部企画として「醸造」、「培養・計測」、「産学連携」の３テーマでシンポジウムを実施し、また展示業者との交流会を行いました．企業にも役立つ学会活動を基本方針として意識し、活動をすることを打ち出し、「産」活性化の機運が高まっておりました．
２０１１年～２０１３年 産学連携委員会の委員長に柳副会長、幹事長に坂口が就任し、原島会長、理事各位との自由討論を重ね、産学連携活動の課題について議論を行いました．（１）学会での産学連携活動とは （２）産・学のニーズをどのように反映するか （３）産・学の出会いの場を育成するには （４）教育での産学連携が可能か （５）産官の若手の学会活動への参加をするには などの問題意識を具現化するために、産学連携活動の基本骨格とその達成のための新規提案と推進を行いました．その具体的な内容は、・本部企画シンポジウム（醸造、培養・計測、産学連携）の継続
・【新規】産学技術研究会 ２回／年の定例化
・【新規】教育活動 生物工学基礎教育セミナー（１回／年）、産業界からの非常勤講師派遣の斡旋などの活動推進、新規提案・実践により産学連携活動、日本生物工学会活動の活性化を考案いたしました．
２０１２年７月に実施いたしました第１回産学技術研究会（サントリー研修所）に参加した学生より原稿用紙２枚の手紙を頂きました．
「産業界からの発表を聴いて、今まで学業や就活で落ち込んでいたが、自分なりの軸を固めることができ、背中を押して下さった」などについて書かれており、その後希望する食品分野への就職もできたとのことでした．
産学連携活動の真の目標は、知識を授けることはほんの一部に過ぎず、人づくり（人間形成）であることを強く感じました．また参加者からの温かいご支援、協賛を頂きました．
２．生物工学懇話会、特別講演の活性化
生物工学懇話会や日本生物工学会大会の特別講演において、幅広い内容での産業界からの演者・テーマを推薦したことにより、参加者の学会への意識向上、活性化につながったのではないかと思います．
「ホンダの DNA：挑戦・創造・革新」（元ホンダ技研・小林三郎）、「脳とイノベーション」（脳科学・茂木健一郎）、「気づく力がヒット商品を生む」（商品コンセプト研究・小山良朗）、「「はやぶさ」が挑んだ人類初の往復宇宙旅行、その7 年の歩み」（JAXA・川口淳一郎）など大会ではなかなか聴けない興味深いテー
マと演者であったとの声を頂きました．
産業界の実践的な講演は、たいへん面白くわかりやすい、学会の雰囲気が変わってきている、産からの提案が多くなっているなどの声を多くの先生、学生や産業界会員から頂きました．プロフェッショナルな実践者からの講演は、迫力がありました．
３．学会行事へのサポート
９０周年記念行事、生物工学会年次大会などの運営、学会行事などへ積極的なサポートをいたしました．企業の学会への貢献については、各社の文化の違いによってさまざまであると考えております．日本生物工学会は、賛助会員１０
６社の協力もあり、日本生物工学会財政の大きなウエイトを占めており、産業界からの協力がなかったら長期的な活動が成り立ちません．このような状況の中、産学連携活動の会場などの提供において可能な支援をさせていただき、産学の一層の交流に繋がったのでないかと思います．
４．JABEE 活動の推進
生物工学会派遣の JABEE 委員として、徳島大学、崇城大学の審査を実施し、JABEE 活動を実施しいたました．大学教育の中に産感覚が少しでも伝わればとの思いで、審査員を担当させていただき、大学の抱えている「あるべき姿」について提案をさせて頂きました．
以上、主な学会活動を振り返りましたが、これら活動の推進において、学会会
員各位、学会役員・事務局、産業界・大学各位の皆様から絶大なるご支援を賜り、感謝しております．会員の著名な先生から「これからも日本生物工学会への今以上の貢献をお願いいたします」と激励のメッセージを頂き、まだまだ現役の身でもあり微力ながら今後の学会発展のために協力を継続していきたいと思っております．また、学会活動を通じて広範囲な産学の専門家や学生と関係できること楽しみにしております．
最後になりますが、過分な賞を頂き心より感謝申し上げます．

この度は第 10 回生物工学功労賞をいただくことになり、身に余る光栄と存じております。大阪大学工学部醗酵工学科在学中に日本生命中之島研修所で開催された日本醗酵工学会の年次大会のスライド映写係りとしてアルバイトをさせていただいたことが、本学会との繋がりの端緒となりました。研究室の先輩が発表される姿を見て、いつかは自分もと思ったことが記憶に残っています。1981
年に大学院工学研究科醗酵工学専攻前期課程を修了し、味の素（株）に入社後、本学会の正会員となり、情報収集の目的で何度か年次大会に参加させていただ
き、一度だけですが口頭発表もさせていただきました。また、共著者として学会英文誌に投稿させていただいたこともありますが、学会本部や支部の活動には直接的にも間接的にも関わることもなく、年会費だけは支払う、ごく普通の正会員として過ごしておりましたところ、2009 年の春に、突然、本学会事務局
から、学会理事を引き受けていただきたいとの連絡がありました。どうしたものかと上司に相談したところ、お引き受けして少しは学会に貢献するようなこともしなさいとの指導があり、また、任期は 2 年ということでしたので、お引き受けすることにしました。飯島会長、原島会長、園元会長の下で、産学連携担当の理事を務めさせていただき、様々な方々との出会いがあり、これまでにない経験をさせていただき、気がつけば 6 年が経過しておりました。今振り返ると、不思議な縁があって、ある日突然、新たに進む道への門戸が開き、その道を縁に従って歩いてきた 6 年であったように思います。山村雄一元大阪大学総長の「天命を待って人事を尽くす」という言葉が頭を過ったことがありました。
理事会では、学会の将来構想や活性化策について盛んに議論が交わされる 6 年間でありましたが、産学連携の活性化も課題の一つでした。産学連携担当の理事の方々と共に年次大会における本部企画シンポジウムの企画・運営に取り組
み、また、2011 年度、2012 年度は柳産学連携委員会委員長、坂口幹事のリーダーシップの下、産学連携活動の新たな活性化策（生物工学産学技術研究会と生物工学基礎教育セミナーの開催、大学等への非常勤講師の斡旋等）の検討に関わり、柳委員長の「継続は力なり」という方針を引き継ぎ、2013 年度、2014
年度は倉橋産学連携委員会委員長の下、幹事として上記本部企画シンポジウム
や年 2 回の生物工学産学技術研究会、年 1 回の生物工学基礎教育セミナーを継続開催いたしました。学会本部の産学連携活動のホームページの改訂や大学等への非常勤講師の斡旋等にも取組みました。また、国際交流担当としての役割もいただき、横田国際担当理事のリーダーシップの下、学会本部主催の国際シンポジウム（SBJ シンポジウム）のコンセプト立案に関与し、第 1 回、第 2 回の SBJ シンポジウム実行委員会委員として企画・運営にも関わらせていただきました。上記のような取組みが継続実施できたことは、各取組みの内容の検討や実行に、実に多くの産業界やアカデミアの方々に積極的に関わっていただいたからだと思っております。改めて関わっていただいた方々に厚く感謝申し上げます。
日本生物工学会は生物を研究対象として、実学、知・技の実用化を志す者が集う、切磋琢磨の場であると思います。産学連携担当の理事を務める中で思っていたことは、交流がなければ連携も生まれないということです。会員の方々にとって、年次大会や本学会主催の様々な交流の場は、情報収集や研究ネットワー
クの拡大の場として、或いは新たな連携を生む場として機能しているのだろうと思います。生物工学産学技術研究会では実に多くの学生の方々に参加いただきました。懇親会では、学生の方々と企業の方々が熱心に話されている姿を何度も見かけました。本学会主催の交流の場は、自らのキャリアの振り返りや新
たな道に進むきっかけの場にもなっているのかもれないと思った次第です。今後とも、本学会が益々発展し、社会に貢献することを祈念するとともに、本学会を介して様々なステークホルダー間の交流が活発になることを期待しております。
最後になりますが、この度の功労賞受賞に際しまして、これまでご指導、ご支援いただいた多くの方々に心から御礼申し上げます。

Activation of the SBJ by the new action and promotion of universityindustry collaboration

Acceptance speech - Meritorious Service Award○Masaaki Sakaguchi(Suntory Spirits Ltd.)Key words

university-industry collaboration, activation, new action and promotion○Kazuhiko Matsui(Ajinomoto Co., Inc.)

Key words

industry-academia collaboration

78

生物工学賞／生物工学功績賞

1A-Aa03

アプローチをデザインするスマート発酵工学の基盤研究○園元 謙二 1,2（1九大院・農, 2九大・バイオアーク）sonomoto@agr.kyushu-u.ac.jp

この度の生物工学賞の受賞は、ご指導頂きました多くの先生方、共同研究者、研究室のスタッフと学生諸氏など、すべての皆様のご協力の賜物であり、篤く御礼申し上げます。
私の最初の研究歴は、酵素工学の分野で、バイオリアクターの反応素子としての生体触媒の開発に関する生物工学的研究である。次は、生命体としての発酵
微生物を扱う発酵工学の研究である。これらの職歴【工学部（工業化学）と農学部（応用微生物学）】と研究歴【酵素工学と微生物工学】において、生物工学をカバーする多くの研究分野（メタボローム、代謝工学、酵素工学、バイオイ
ンフォマティクス、システム生物学など）における研究“アプローチ”の修得を意識してきた。そして、単位操作である、微生物のスクリーニング・育種から培養・発酵法（プロセス）の確立・制御、ダウンストリームにおいて、異なる研究分野の視点を取り入れてきた。最近の研究に、これら研究“アプローチ”を“デザイン”する発酵工学の新たなコンソーシアム“スマート発酵工学”がある。
(1) 乳酸発酵を活用した植物バイオマスのカスケード利用
乳酸発酵によって種々のバイオマスから生産される乳酸ラセミ体や酢酸は、安
定性、貯蔵性、輸送性に優れており、腐敗微生物によるバイオマス分解に伴う炭素損失を防ぐことができる上、フィードストックとしての利用が可能である。
これら有機酸を利用し、Clostridium 属細菌の代謝転換に伴うブタノール生産を効率よく行うことができるサルベージ合成に初めて成功した（第 16 回＆第 21
回生物工学論文賞など）。また、乳酸からピルビン酸への反応に NAD+非依存的な乳酸脱水素酵素の存在（第 21 回論文賞）やメタボローム解析によって乳酸や酢酸からブタノールへのカーボン流束を初めて証明した（第 21 回論文賞など）。
(2) 動的代謝モデル化と律速代謝経路の理論的推定
代謝モデルは代謝解析や発酵プロセスの最適化などに有効なツールである。化
学量論式より構成される静的代謝モデルは代謝フラックス解析に広く用いられているが、代謝ダイナミクスを予測することはできない。そこで、代謝解析ツー
ルを用いて、発酵の動的代謝モデル化および感度解析による律速代謝経路の特定を行った。キシロースの乳酸発酵では、ホモおよびヘテロ発酵の２つの代謝
経 路 が キ シ ロ ー ス 濃 度 に 依 存 し た が 、 ピ ル ビ ン 酸 代 謝 の Pyruvate
dehydrogenase、Pyruvate-formate lyase、Lactate dehydrogenase がキー代謝経路と予測でき、実験的にも証明した。また、ブタノール発酵では、酪酸の再利用経路がブタノール生産に重要な影響を与えることがわかった。これらの成果は、
実験非依存的にターゲット遺伝子を予測でき、代謝工学分野に与える影響は大きい。
(3) デザインドバイオマス研究、そしてスマート発酵工学への展開
デザインドバイオマスを「発酵微生物の能力が最大限利用できるようにデザインされた適合物質」と定義した。従来研究では、最初に発酵原料に用いるバイ
オマスを決定した後、優秀微生物の分離・育種や優秀微生物による効率的発酵プロセスの構築を行う。デザインドバイオマス研究では、これまで得られてきた様々な知的財産物・技術（優秀微生物や効率的発酵プロセス）に適するように基質の探索や改変を行い、それらデザインドバイオマスによる『適応型発酵プロセス』の構築を目指すものである。具体的な成果として、炭素源ヘキソー
スとしてグルコースを使用せず、バイオマスの糖化プロセスでのグルコースによる生産物酵素阻害、および発酵プロセスでのカーボンカタボライト抑制（CCR）
を同時に解決した（第 22 回論文賞など）。
構築した『適応型発酵プロセス』の例として、ブタノール発酵だけでも、CCRを回避した回分・流加発酵（第 22 回論文賞）、Cell-recycling による高密度連続
発酵、逐次添加流加発酵（第 21 回論文賞）、pH-stat 流加発酵、“Living cell”を導入した回分・連続ブタノール生産プロセス（第 16 回論文賞など）を開発した。
また、L-乳酸発酵では、同様に CCR を回避した流加発酵（第 24 回論文賞）並びに究極の無殺菌開放発酵を実現した。さらに、乳酸菌を利用した焼酎蒸留粕
の高付加価値素材への転換プロセスの構築にも成功した（第 17 回論文賞、第18 回生物工学技術賞）。
一方、微生物利用の出発点とも言える微生物のスクリーニングでは、律速代謝の予測および無殺菌発酵のアプローチを導入した。すなわち、CCR の回避予測となるセロビオース・キシロース資化能と好熱性に着目した結果、優れた適合乳酸菌の分離に成功した。また、これまでのいくつかの研究分野（代謝工学、
メタボローム、システム生物学、酵素工学など）に加えて、このように獲得した適合微生物の特性に適う適合植物の創出（糖化効率の向上やセルロース含量の調整など）と検証を植物育種学研究者との積極的なコラボも伴うデザインド
バイオマス研究を含め、“基盤とする発酵工学と他分野の研究アプローチをデザインする”【スマート発酵工学】の構築に邁進している。

1A-Aa04

短鎖ペプチドの新機能発現に関する研究○本多 裕之（名大院・工）honda@nubio.nagoya-u.ac.jp

10 数年前よりペプチドの多様性に魅了され、細胞やタンパク質・酵素に作用することで機能性食品素材あるいは医薬品原薬として利用価値のある機能性短鎖ペプチドの探索を進めると共にターゲット分子との相互作用に関する学理の探索を目指している。さらにその相互作用を積極的に活用して従来にない新機能を発現させる研究を行っている。以下に概要を簡潔に述べる。
【細胞／タンパク質相互作用による機能性ペプチドの探索】
Fmoc 固相合成法で、配列の異なるペプチドを活性化セルロース膜上にスポット合成し、機能性ペプチド探索を行った。アンジオテンシンに結合する血圧降下ペプチド VVIVIY、乳酸菌接着・凝集ペプチド（QRCVNLQA）、がん免疫ペプチド(GYPVTNAVI)、Aβ 神経毒軽減ペプチド（KIILI）、抗体 Fc 領域認識ペプ
チド（NKFRGKYK）など、短鎖ながら高い親和性を示すペプチドの探索に成功した。また紫外線照射で解裂・遊離できるフォトリンカーを合成し、アミラー
ゼ阻害ペプチド RHWYYRYW の探索にも成功した。さらに細胞アッセイができるシステムを構築し、細胞死誘導ペプチド CNSCWSKD、間葉系幹細胞選択性ペプチド（NLLPG, ALNGR, VRYYR）（同他学協会 2）なども探索した。
【配列情報解析による相互作用に関する学理の探索】
なぜその配列が高結合活性を示すのかを明らかにすることが分子認識の学理の深化につながる。ランダムペプチドライブラリーを合成し、ターゲット分子との相互作用の強弱を捉え情報解析することで、高結合活性が得られる配列の特徴を、ルール（相互作用に関する学理）として抽出した。例えば胆汁酸に結合することを作動原理とするコレステロール吸収阻害ペプチドでは、「N 末端 4 残基目のアミノ酸のサイズが大きく、4 残基目のタンパク質安定化指標が大きいと胆汁酸結合活性が高い」という学理が得られた。いろいろなターゲット分子に対して特徴の異なる分子認識が生まれていると考えられる。ライブラリーサ
イズをどこまで広げれば様々な分子認識に対してロバストな探索法になるのかを明らかにする必要がある。そこで 20 種類のアミノ酸を疎水度と電荷で４グループに分けて合成する方法を考案した。この方法では 4 残基では原理的に 256
種類のペプチドライブラリーで良い。得られたデータを主成分分析で解析することで認識に重要な主成分も得られた（未発表データ）。
【ペプチド間相互作用に基づく分析プローブ用ペプチド（Peptide Beacon）の開発】
アンジオテンシン結合ペプチドに銀微粒子結合機能があることを発見し、アンジオテンシンの有無により色調変化する分子プローブになることを明らかにした。抗体 Fc 領域認識ペプチドでも同様の分子プローブなることを明らかにした。さらにターゲット分子とペプチドの相互作用を積極的に活用した新機能の発現を目指して、分子プローブのデザインをおこなった。モデルとなるターゲッ
ト分子として IgG 認識ペプチド（NKFRGKYK）を蛍光標識し、これと強く相互作用するペプチドを探索した。この親和性ペプチドにクエンチャー分子を連結し、両者をタンデムに配置したところ、抗体の有無に応答して蛍光強度が変化するという新機能を発現した分子プローブが開発できた。抗体検出感度は250nM であり簡易計測に使用可能である（同他学協会 12）。
【細胞内導入特性の発現と可溶化ペプチドライブラリーを用いた細胞内機能性ペプチドの探索】
上記のペプチドはいずれも細胞外で機能するペプチドである。ペプチドの細胞内導入に関しては Cell Penetrating Peptide(CPP)が知られている。しかし、CPP を使って細胞内に導入できるペプチドはいまだ特定されていない。そこで活性化
セルロース膜にまず上記のフォトリンカーを結合し、CPP としてオクタアルギ
ニン（R8）を合成した後、トリペプチドを合成、蛍光色素ラベルも施して、細胞内導入可能な可溶性ペプチドライブラリーを構築した。全 8000 種類のトリペ
プチドのうち 31 種類を合成し細胞アッセイシステムを使って HeLa 細胞に導入可能なペプチドを調べたところ、約 1/4 の 8 ペプチドは導入困難であった。それらのペプチドを疎水度と等電点で整理したところ明らかな特性の偏りが示され、細胞内導入のルール（学理）が特定できた。上記の細胞内導入可能なペプ
チドライブラリーを使って、実際にミトコンドリアのチャネルタンパクに結合して細胞死を誘導するペプチドの探索をおこなった。8 残基ペプチド LNLISKLF
は 20 分以内にミトコンドリアのカルシウム放出が確認できその後アポトーシス
することがわかった（未発表データ）。
【おわりに】
機能性ペプチドは、食品素材、医薬品原薬として、また新しい分析プローブとしての可能性があり、その探索法の確立が望まれる。我々は固相合成法での結合強度情報に配列情報処理を組み合わせて、その一つの方法を提言している。
ディスプレイ法に代わる、あるいはその欠点を相補する方法として認知され、今後ますます多くの機能性ペプチドの探索につながることを期待したい。

Basic study on smart fermentation technology by designed approaches

Provision of new function for short-chain peptide

Key words
smart fermentation technology, designed biomass, butanol, opticallypure lactic acidKey words○Kenji Sonomoto1,2(1Fac. Agric., Kyushu Univ., 2Bio-Arch., Kyushu Univ.)○Hiroyuki Honda(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)functional peptide, screening, informational analysis

培養計測技術の最近のトピックス【本部企画】

1S-Ap01

人工光型植物工場の課題と将来性○古在 豊樹（植物工場研究会（特定非営利活動法人））
kozai@faculty.chiba-u.jp

1S-Ap0279

再生医療のための細胞操作および培養技術○福田 淳二（横国大院・工）fukuda@ynu.ac.jp

人工光型植物工場（以下、植物工場）における野菜などの生産技術に関する現状と今後の技術革新の方向性について述べる。2016 年 2 月現在、商業的に生産販売している植物工場の数は 200 弱であり、2009 年以降増加傾向にある。生産コストの内訳は、原価償却費 30％、電気料金 25％、人件費 25％、その他 20％程度と言われている。環境制御、その見える化、労働作業性、生産物の品質、生産化管理全般などに関する技術レベルは高いとは言えず、今後改善すべき点が多い。最近、LED ランプの性能向上により 30％以上の節電が可能になり、また、光質制御による野菜・薬用植物の機能成分向上の研究開発が進んでいる。
筆者らは、植物工場栽培室への資源投入速度と植物生産速度などを連続計測して、投入資源利用効率の見える化システムを開発している。以上の動きから、
今後 5 年前後で生産コストの半減と生産速度の 50％向上の実現が見えてきている。最後に、世界の植物工場事情に関して紹介する。

生体内の細胞は、血球系の細胞以外は壁付着性細胞であり、材料への接着状態
がその細胞の機能や増殖、アポトーシスなどの運命決定に重大な影響を及ぼすことが知られている。本講演では、材料表面の微細加工や表面修飾技術を利用した細胞操作技術について紹介する。特に、フォトリソグラフィーなどの微細加工技術を用いて作製したウェルアレイ基板と、これを利用した肝細胞、iPS細胞、毛髪原基などへの応用について具体的に紹介する。また、我々は電気化
学反応を利用した細胞の接着・脱着の動的な制御技術を確立し、これを再生医療のための細胞操作へと応用してきた。この技術には、金電極表面に結合して自己組織化し、密な単分子層を形成するオリゴペプチドの設計も含まれる。この技術の最大の特長は、比較的素早く細胞を脱離できることであり、立体臓器の構築においてこの特徴を利用したいくつかの方法を考案してきた。例えば、肝細胞や心筋細胞シートの脱離・積層化、細胞の位置あるいは種類特異的な選別技術、血管構造の形成技術である。特に血管構造の形成技術では、肝細胞へ分化させた iPS 細胞をスフェロイド化し、血管構造の周囲に包埋することで、血管構造を含む立体的な肝臓組織の構築に取り組んでいる。これらの細胞操作と計測技術を組み合わせることで、生体システムを解析できる基盤技術へと展開できる可能性がある。

Issues and perspectives of plant factory with artificial lighting

Manipulation and 3D culture of cells for regenerative medicine○Toyoki Kozai(Japan Plant Factory Association (NPO))

Key words
control

plant factory, Resource use efficiency, cost reduction, Rate variable○Junji Fukuda(Grad. Sch. Eng., Yokohama Natl. Univ.)

Key words

tissue engineering, liver regeneration

80

培養計測技術の最近のトピックス【本部企画】／生物工学研究者の生命情報との向き合い方～バイオインフォマティクス入門から応用へ～

1S-Ap03

キャピラリー電気泳動－質量分析計（CE/MS）を用いた抗体産生の評価○東條 繁郎（ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ）
tojo@humanmetabolome.com

メタボローム解析は、唯一細胞内と培地両者を評価できるオーム解析であるため、生物を用いた生産系を評価する手段として大変有効な解析手法です。
生命現象の理解の深度化に対する要求性の高まりに応える手段として、測定機器の発達によって一斉網羅解析（オーム解析）が可能になりました。主要なオーム解析方法として DNA を解析対象としたゲノム、RNA を解析対象としたトタ
ンスクリプトーム、タンパク質を解析対象としたプロテオーム、代謝産物を解析対象としたメタボロームがあります。
オーム解析登場以前では、DNA・RNA・タンパク質・代謝産物を各々部分的に注目して解析が行われて来ましたが、オーム解析により細胞・組織全体を対象として解析が行われるようになり、これまでの研究では注目されてこなかった部分が、重要な要素を担っている事が明らかになってきています。
代謝物を解析することで得られた結果は、各段階の反応の結果である事。また、代謝物は生命現象に対して直接的な原因である可能性が高いと考えられています。さらに、解析対象物質数が少ないこと、各代謝物に対する過去からの知見の蓄積がある事から解釈が容易です。
弊社が主に使用している CE-MS は、キャピラリー電気泳動装置（CE）と質量分析計（MS）を組み合わせた物で水溶性代謝産物を測定することを得意としています。生体中の代謝物の多くが水溶性代謝物であるため、CE-MS による解析
は生体内の代謝物を観察する上で最も適した解析方法だと考えられます。
CHO 細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）を用いて医薬用抗体が生産されます。これは、単純なタンパク質（例えば、インシュリン）などであれば、大腸菌や酵母を用いて現在は生産されていますが、抗体のように糖鎖がその認識に必要な場合には、高等動物の細胞を用いる必要があります。
商業ベースで既に売上上位に位置する抗体医薬品ですが、その製造過程の発展の余地は十分にある事と考えられています。
メタボローム解析は、培地・細胞内両者を評価することが出来る唯一のオーム解析です。その為、各段階の細胞と培地を測定することで、細胞内の細胞の状態と培地での代謝物の過不足を確認する事により容易に細胞内で何が起こっているのか・生産系の中でどの反応が律速の段階になっているのかを確認する事が出来るため基礎培地及びフィードの改良の為のヒントを得ることが出来ます。
本シンポジウムでは、CHO 細胞と培地のメタボローム解析の一例として、徳島大学の大政教授・鬼塚先生と弊社との共同研究の成果を一例として発表します。
細胞を用いた物質生産の際に生産効率を低下させる要因の一つに細胞の凝集があります。大政研究室では、この細胞凝集を防ぐ手段として培地にトレハロー
スまたは NaCl を添加することを見出しました。さらに、凝集を防いだ結果、CHO 細胞の生存日数の増加とそれに伴う抗体産生能の増加が確認されました(1)。そこで、CE-MS を用いて細胞内と培地を測定することで生存日数と抗体産生能の増加のメカニズムについて代謝の方面から解析を行いました。
その結果、通常培地では急速にグルコースの消費とそれに伴う乳酸の生産が起こった結果、培養後期にエネルギー不足による細胞死が起こっているのに対して、トレハロースや NaCl を添加し細胞凝集を防いだ結果、グルコースの取り込み速度の低下が起こり、グルコースの消費速度が低下した結果、培養後期までエネルギー状態が維持されたために、通常培地で観察されるような早い時間での細胞死が引き起こされずに生存期間の増加に繋がったと考えられます(2)。
これらの結果は、細胞と培養上清の両者を測定することで代謝物の出入りを観察する事が出来ること。他のオーム解析は、全て相対面積値での結果報告になりますが、メタボローム解析では一部の代謝物に関しましては、濃度定量を行うことが可能であるためより正確に結果を評価することが出来ます。
さらにこの濃度定量が可能であると言う事は、測定結果がそのまま培地改良に用いる事が出来ますので、使い勝手の良い培地改良ツールとして使うことが出来ます。
以上のように、CE-MS を用いた CHO 細胞の抗体産生能に対する評価は、他のオーム解析では出来ない細胞内と培地と両者を比較検討する事でより詳細に生産状態を確認すること出来るため、生産中の細胞の状態の確認及び培地の確認が出来るため、培地の最適化を行う上での強力なツールになり得ると考えます。
(1) Onitsuka M J Biosci Bioeng. 2014 May;117(5):632-8.
(2) Badsha MB J Biosci Bioeng. 2016 Jul;122(1):117-24

Evaluation of antibody production using a capillary electrophoresis-mass
spectrometry (CE / MS)○Shigeo Tojo
(Human Metabolome Technologies)

Key words

metabolic analysis, CHO cell, medium, antibody

1S-Bp01

遺伝疫学データに基づく DNA メチル化と生活習慣病の関係○中杤 昌弘 1, 市原 佐保子 2, 山本 健 3, 大中 佳三 4, 松原 達昭 5,横田 充弘 6
（1名大病院・先端医療, 2三重大院・地域イノベーション学, 3久
留米大・医・医化学, 4九大院・医・老年医学, 5愛知学院大・
歯・内科学, 6愛知学院大・歯・ゲノム情報応用診断学）
mnakatochi@med.nagoya-u.ac.jp

2 型糖尿病や心筋梗塞、肥満、メタボリックシンドロームといった生活習慣病の患者数は年々増加の一途を辿っており、これらの疾患発症リスクを低減するための方策が求められてきている。そのためには、これらの疾患の発症メカニ
ズムの解明及び、発症を予知するリスクマーカーの同定が急務である。生活習
慣病の発症は、食生活や運動習慣、喫煙、飲酒等の環境因子と遺伝因子の交互作用によって生じると考えられ、これらの因子を同定するために、これまでに多数の遺伝疫学研究が行われてきた。近年、マイクロアレイや次世代シークエ
ンサーにより一度に数十万種以上の一塩基多型(Single nucleotide polymorphism,
SNP)を測定可能になってからは、これらを活用したゲノムワイド関連研究(Genome-wide association study, GWAS)が実施されるようになり、生活習慣病と関連する遺伝子や SNP が多数同定されてきた。しかしながら多くの生活習慣病
において、現在までに報告された SNP で説明できる遺伝因子は 10％未満と非常に少ない。そのような中、遺伝子の発現や働きは、DNA のメチル化を初めとする後天的ゲノム修飾を受けて決定されることが明らかになってきた。この様な DNA メチル化サイトの変動が生活習慣病の発症に影響を及ぼすならば、今後の予防医学に重要な情報になると考えられる。本講演では、遺伝疫学的デー
タ、特に DNA メチル化情報を用いた疾患発症メカニズム解明のアプローチについて紹介する。
我々はこれまでに地域住民を対象としたコホート集団北名古屋ゲノム疫学研究(Kita-Nagoya genomic epidemiology study, KING study)を構築し、一般の健診情報
以外にもレジスチン、アディポネクチン等のバイオマーカー、SNP アレイ、DNA メチル化アレイ(Illumina HumanMethylation450)を測定してきた。本 DNA
メチル化アレイは、ヒトの DNA 配列中に存在する 45 万カ所以上のシトシン塩
基における DNA メチル化状態を一度に測定できるマイクロアレイである。我々は福岡コホート研究(Fukuoka cohort study)との共同研究により、複数のエピゲノ
ムワイド関連研究(Epigenome-wide association study, EWAS)を実施し、生活習慣病と DNA メチル化の関係について興味深い知見を得てきた。EWAS は非常に有用な研究方法であるものの、非常に多くの DNA メチル化サイトから探索を行うため、偽陽性も多い。本講演では、複数の例を紹介しながら、EWAS における解析方法、解釈の仕方を概説したい。
DNA メチル化状態は年齢や喫煙の環境因子により大きく変動させられる事が報告されている。我々のデータにおいても最初にこれらの因子との関連を調査を行い、有意な DNA メチル化サイトが確認できた。特に喫煙については、あるDNA メチル化サイトにおいて禁煙者の DNA メチル化状態は非喫煙者と喫煙者の中間の状態を示していた。これは、禁煙の効果が DNA メチル化を介して観察できていると期待でき、生活習慣改善評価のモデルケースになり得ることを示唆している。
次に、生活習慣病のリスクマーカーとして考えられているタンパク質 レジスチンに着目し、後天的ゲノム修飾である DNA メチル化が血漿中のレジスチン濃度調節に如何なる影響を及ぼすか検討した。男性 192 例を対象とした血漿レジ
スチン濃度の EWAS の結果、DNA メチル化サイト cg02346997 がゲノムワイド
有意水準に到達し、負の関連を示した(β = -0.270±0.041, p = 6.02×10-10)。このサイトはレジスチンタンパク質をコードする RETN 遺伝子のプロモーター上に位置している。レジスチンは主に単球で発現していることから、1202 名分の単球
由来の公開データを基に評価した所、cg02346997 は、単球における RETN 遺伝
子発現量とも負の関連を示した(-0.298±0.016, 4.23×10-70)。更に、KING study に
おいて SNP アレイとの統合解析を実施した結果、cg02346997 は、RETN のプロ
モーターに位置する SNP rs3219175 のマイナーアレル数と負の関連を示した(β= -0.396±0.043, p = 4.43×10-17)。これまで SNP rs3219175 のマイナーアレルは、血中のレジスチン濃度と強い正の関連を示すことが報告されてきた。しかしながら、これらの SNP が如何にしてレジスチン濃度を調節しているかは明らかでなかった。SNP 情報、エピゲノム情報を統合的に解析した今回の結果から、
SNP rs3219175 は近隣のメチル化サイトにおける DNA メチル化状態を介して発現量を調節し、その結果、血中レジスチン濃度を調節している可能性を示した。
最後に現在進行中の研究として、健常者と心筋梗塞を対象に、心筋梗塞の発症に関係する DNA メチル化サイトの探索についても紹介したい。我々は、ゲノ
ムワイド有意水準(P < 1.0×10-7)に到達した DNA メチル化サイトの特定に成功した。この DNA メチル化サイトの近隣には冠動脈疾患と強い関連のある遺伝子が存在していることから、心筋梗塞発症の新たなメカニズム解明に寄与する事が期待できる。現在、この DNA メチル化サイトを含めより詳細な解析を進めている。
これらの結果から、DNA メチル化サイトは、生活習慣や生活習慣病の発症、更にはそのリスクマーカーの全てと関わりが確認できた。DNA メチル化サイトに注目したより詳細な研究は、最終的に生活習慣病の予知・予防に繋げられると期待できる。

Relation between lifestyle disease and DNA methylation based on genetic
and epidemiological data

○Masahiro Nakatochi1, Sahoko Ichihara2, Ken Yamamoto3, Keizo Ohanaka4,
Tatsuaki Matsubara5, Mitsuhiro Yokota6(1Nagoya Univ. Hosp., 2Grad. Sch. Regional Innov. Stud., Mie Univ., 3Sch. Med.,
Kurume Univ., 4Grad. Sch. Med., Kyushu Univ., 5Sch. Dent., Aichi Gakuin Univ.,
6Sch. Dent., Aichi Gakuin Univ.)
Key words
epigenetic, DNA methylation, genetic epidemiology, lifestyle disease生物工学研究者の生命情報との向き合い方～バイオインフォマティクス入門から応用へ～

1S-Bp02

高速 DNA シークエンシングとバイオインフォマティク
スを駆使した転写制御ネットワーク解析

1S-Bp03○兒島 孝明, 中野 秀雄（名大院・生命農学）
kojimat@nuagr1.agr.nagoya-u.ac.jp

81

アミノ酸物性指標を用いたペプチドインフォマティクスの可能性○蟹江 慧 1, 伊藤 圭祐 2, 本多 裕之 3, 加藤 竜司 1
（1名大院・創薬科学, 2静県大院・薬食生命, 3名大院・工）kanie-k@ps.nagoya-u.ac.jp

高速 DNA シークエンシングは、サンガー法などの従来の DNA 配列解析法に比べて圧倒的なスループットでのデータ取得を可能とし、現在様々な分野で広く利用されている。一方で、これによって得られる配列データが膨大であるが故、その扱いに苦慮されている方が生物工学研究者の中でも存外多いのではないだ
ろうか。バイオインフォマティクス初心者の我々もその例に漏れず、試行錯誤を重ねながら膨大な配列データと向き合い、その可視化や有用情報の抽出を試みてきた。本講演では、高速 DNA シークエンス技術を用いた糸状菌由来転写因子による転写制御ネットワーク解析をケーススタディとしてビッグデータとの向き合い方を紹介したい。
転写因子は、標的 DNA 配列に特異的に結合し、遺伝子の発現を制御するタン
パク質群の総称であり、生体内の様々な機能に関与している。この転写制御機
構の全貌解明を目的として、現在様々な形のアプローチがなされている。とりわけクロマチン免疫沈降法 (ChIP) と高速 DNA シークエンシングを組み合わせ
た ChIP-Seq は、ゲノム上の転写因子結合部位を直接的かつ網羅的に解析する手法として広く用いられている。しかしながらこの手法は、培養ステップを必要とする点に加え、過剰発現された転写因子の結合のみを指標とする為、細胞内では本来結合しない擬陽性の配列を選択するリスクを孕む。一方、標的転写因
子発現株及びその欠損株より調製した mRNA を高速 DNA シークエンシングによって解析を行う RNA-Seq は、転写因子によって発現制御される遺伝子(Differentially Expressed Gene, DEG) を網羅的に同定することができる。しかし、
この RNA-Seq によって検出される発現変動は、標的転写因子の間接的な影響による一種の解析ノイズも含む為、検出 DEG が実際に標的転写因子に直接制御されているか判別することは極めて困難とされる。
我々は、高速 DNA シークエンシングを利用した２種類の転写因子制御部位の網羅的解析技術、Genomic SELEX-Seq (gSELEX-Seq) と RNA-Seq を融合させた転写因子による転写制御機構の新規網羅的解析システムの確立に成功した。
gSELEX-Seq は in vitro で濃縮選択したゲノム上の標的転写因子結合領域の情報を、RNA-Seq は培養細胞より回収した mRNA ライブラリーから各遺伝子の発現量の情報をそれぞれ出力する。これにより、本手法は標的転写因子によってin vitro、in vivo 両解析系に内包する解析ノイズを除去でき、直接的に発現制御される遺伝子の検出を可能とする。
この解析システムを用いて Aspergillus nidulans における糖代謝遺伝子群の転写活性化因子 AmyR の結合部位のゲノムワイド解析を試みた。A. nidulans ゲノム
ライブラリーを調製し、AmyR を用いた gSELEX を 3 ラウンド実施した。これによって得られた選択 DNA プールの配列を高速 DNA シークエンサーによって解析し、総計約 10 Gb の配列データを取得した。このデータを基にバイオイン
フォマティクス解析を実施し、AmyR の結合モチーフの抽出及び AmyR 結合活性を示す候補プロモーター配列リストの作成を行った。
また、A. nidulans 野生株及び AmyR 欠損株を培養し、これらの細胞由来の mRNA
をそれぞれ調製した。この mRNA ライブラリーを高速 DNA シークエンサーによって解析し、取得した総計約 2.5 Gb の配列データをバイオインフォマティク
ス解析に供した。その結果、AmyR による発現制御を受ける既知の 8 遺伝子のうちの 7 遺伝子を含む 41 種類の遺伝子において、AmyR 依存的な発現変動が検出された。
次に、gSELEX-Seq より得られた候補プロモーター下流に位置する遺伝子とRNA-Seq より得られた発現変動遺伝子の積集合をとったところ、上記の 7 遺伝子を含む 23 種類の遺伝子が検出された。これらは、AmyR 結合領域を上流に保持し、かつ AmyR 依存的にその発現レベルが変動することから、AmyR によって直接的に発現制御を受ける遺伝子であることが強く示唆された。これらの結果から、gSELEX-Seq と RNA-Seq 及びバイオインフォマティクスを駆使した本解析パイプラインは、標的転写因子によって直接的に発現制御される遺伝子を高精度に検出するトランスクリプトーム解析法であると考えられる。

ペプチドはアミノ酸 20 種類が組み合わさることによって構成されており、数個から数十個がペプチド結合でつながった分子である。ペプチドはタンパク質に比べ分子量が小さいにも関わらず、生体内の多くの生理作用を司るシグナル分子として機能している。高血圧症やアルツハイマー病などの疾患に関わるもの
から、大豆ペプチドやゴマペプチドなどの食品分野に応用されているもの、細胞接着や分化維持など組織工学分野で研究されているものなど、様々な分野で注目されている。このような多くの機能や分野で注目されているペプチドであるが、その配列の多様性は非常に多岐にわたる。ペプチドは 20 種類のアミノ酸で構成されるため、2 残基では 400 種類、3 残基では 8,000 種類であるが、10 残基ともなると 10 兆種類を超え、組み合わせの数が分子の長さとともに爆発的に増大する。このため、未だ発見されていない新たな機能を持ったペプチドが存在する可能性が高い分子であるとも言える。
我々は、機能性ペプチドの網羅的探索を行うため、ペプチドアレイを用いた探索を行ってきた。ペプチドアレイは、Ronald Frank が 1992 年に開発した手法であり[1]、セルロースメンブレン上に任意のペプチド配列を任意の位置に Fmoc
固相合成で合成することができる。ペプチドアレイは、抗体認識部位を特定するエピトープマッピングをするために従来使用されていた。我々は更にその適用範囲を広げ、タンパク質結合ペプチド[2]、金属結合ペプチド[3]、細胞死誘導
ペプチド[4]、細胞接着ペプチド[5]など、多数の機能性ペプチドをペプチドアレ
イにより探索してきた。しかし、ペプチドアレイの最大の問題点は、その網羅数の少なさである。機能性ペプチド探索には、ファージディスプレイ法、ビー
ズディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などが存在し、それらのバリエー
ションが 107 オーダーほどであるのに対し、ペプチドアレイは 1 実験で得られるバリエーションが 103 オーダーほどと、非常に少ない。
そこで我々は、ペプチドアレイと情報処理解析を用いた効率的かつルール化可
能な、新規手法を考案し研究を進めてきている。他のペプチド探索手法と比較した、ペプチドアレイ法の利点に、①任意のペプチドを合成することが可能な点、②ネガティブテータを取得することが可能な点が挙げられ、これらの利点をうまく活用することで、ペプチドアレイの網羅性を上げようとした。この 2つの利点は、ペプチド探索と情報処理解析を組み合わせる上で非常に重要で、①は情報処理解析で得られたルールやモデルに対し、任意のペプチドを合成できることは、ルール・モデルの実証を容易化できる。また②は、情報処理解析にはデータのバリエーションが必要となり、ポジティブデータだけの解析だけ
では、ルール・モデルつくりが困難になる。以上より、ペプチドアレイデータ
は、情報処理解析手法との組み合わせとの相性が良いと考えられる。
ペプチドを情報処理するためには、配列データであるペプチドを情報化(数値化)しなくてはいけない。我々は、ペプチドの最小単位であるアミノ酸に着目
し、アミノ酸の性質を数値化することを目標とした。アミノ酸の性質としては、
疎水度、電荷、サイズなどが存在し、これらは全て数値化データとして存在している。京都大学化学研究所バイオインフォマティクスセンターが提供している ゲ ノ ム ネ ッ ト に 、 ア ミ ノ 酸 イ ン デ ッ ク ス (AAindex: http://www.genome.jp/
aaindex/)はデータベース化されており、我々はその情報を用い、ペプチドの数値化に用いた。具体的には、報告されている 544 種類の AAindex から、独立した 13 指標を用い解析に使用している。本講演では、ペプチドアレイデータを中
心にアミノ酸指標を用いたペプチドインフォマティクスの事例(小分子、細胞、
トランスポーター)を紹介する。

Transcriptional regulation analysis by using high-throughput DNA
sequencing and bioinformatics

Possibility of peptide informatics by using amino acid index

Key words
transcriptome, Aspergillus nidulans, high-throughput screening,bioinformatics

Key words○Takaaki Kojima, Hideo Nakano(Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)[1] Tetrahedron. 1992;48(42):9217-9232.
[2] Biochem Biophys Res Commun. 2004;315(1):22-9.
[3] Acta Biomater. 2010;6(6):2301-6.
[4] Biochem Biophys Res Commun. 2007;362(4):1063-8.
[5] J Biosci Bioeng. 2006;101(6):485-95.

○Kei Kanie1, Keisuke Ito2, Hiroyuki Honda3, Ryuji Kato1(1Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2Grad. Sch. Integr. Pharm. Nutr. Sci., Univ.
Shizuoka, 3Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

peptide array, peptide informatics, amino acid index

82

生物工学研究者の生命情報との向き合い方～バイオインフォマティクス入門から応用へ～

1S-Bp04

バイオ産業におけるメタボロームデータの利活用○緒方 法親（日本バイオデータ）
norichik@nbiodata.com

1S-Bp05

ヒト常在性ビフィズス菌種と宿主との親和性について○小田巻 俊孝 1, 堀米 綾子 1, 菅原 宏祐 1, 南 淳一 2, 阿部 文明 2,
清水 金忠 1
（1森永乳業 基礎研, 2森永乳業 素材研）
t-odamak@morinagamilk.co.jp

メタボロームデータの取得・解析は、高速 DNA シークエンス技術の登場以前
より実施されてきた。近年高速 DNA シークエンス技術の普及により、ゲノム比較解析や遺伝子発現変動解析の実施が容易になったため、それらのデータと組み合わせたメタボロームデータの利活用が進められてきている。本発表では、バイオ産業での利用を目的とした研究例を取り上げながら、各種網羅的データを組み合わせる手法について議論する。
ここで扱うメタボロームデータとは、ヒューマン・メタボローム・テクノロジー
ズ株式会社（http://humanmetabolome.com/）が提供しているような、キャピラ
リー電気泳動-質量分析法によって得たデータを指す。キャピラリー電気泳動質量分析法によって得られたデータは、既知の化合物データベースとの照合によって帰属され、分析した試料中に、どの化合物がどれだけ含まれていたのかを示すデータに変換される。従ってメタボロームデータは、試料中に含まれる未知の成分を解明したい場合よりも、試料中に含まれる既知の成分の量について分析したい場合に利点が多い。演者の経験では、バイオ産業、特に微生物を用いた製造に関連して試料の科学的な分析を行なう場合、未知の成分について扱いたい場面はほとんどなく、解糖系をはじめとする良く研究された化合物の量を扱う場面が多かった。
メタボローム解析を行なって試料中に含まれる既知の化合物の量を分析する時の興味の対象は、生体内でどのような反応が起きている、もしくは起きていな
いのかということである。例えばバイオエタノールの製造において、微生物が消費した原料のうち、最終的にエタノールとして得られるものの割合を増大させることがニーズとして想定できる。このとき微生物の内部で起こっている現象は、既知の化合物の反応の連鎖によって説明可能であり、それぞれの反応の速度や規模に興味がある。
メタボローム解析では多数の化合物について量の情報が得られるが、微生物内部の反応の速度や規模に興味がある場合において、複数の試料メタボロームデー
タに基づく個々の化合物の量の変動にはどのような意味があるだろうか。ここで問題になるのは、個々の化合物の量が互いに独立でないことである。微生物
内部の任意の化合物の量が少ないということは、代謝パスウェイ上で任意の化合物より上流にある化合物の量が不足することによって引き起こされうると同時に、任意の化合物を基質とする代謝パスウェイ上で下流にあたる化合物への変換速度・規模の増大によって引き起こされうる。従って、試料間の比較において化合物量の単純な大小関係は、解明したい生命現象について限られた情報しか提供しない。また、技術的な問題として、分析機器の精度向上に伴って多数の検体について多数のデータが得られることで、どのような比較においても統計上の有意差が得られてしまうことも挙げられる。
バイオ産業においてメタボロームデータを利活用するためには、微生物内部で起こる酵素反応の速度・規模に関連したデータに変換することが望ましい。具
体的な方法としては、測定によって得られたメタボロームデータを、代謝パス
ウェイ上の基質-生成物の関係性に帰属することが挙げられる。基質-生成物の関係性に帰属させることにより、それぞれの反応について基質と生成物の量の比を求めることができる。現在のメタボロームデータではそれぞれの化合物について絶対濃度を示すことは困難であるが、複数の試料間で任意の反応について基質と生成物の量の比を比較する場合には、絶対濃度が必要でない。それぞれの基質-生成物の関係性を繋ぐ酵素について、変異の有無や遺伝子発現量のデータを取得することは、高速 DNA シークエンス技術を用いて実施可能であり、そのようにして網羅的データを組み合わせることで、分析対象試料の特徴を迅速に抽出することができる。
シンポジウムでは、メタボロームデータとゲノムデータを組み合わせた解析例、
メタボロームデータとトランスクリプトームデータを組み合わせた解析事例を紹介する。特に、公共のデータベースや公共の解析ツール等を活用した、今すぐ誰にでも利用可能な方法を紹介したい。

人間の腸内には数百種類、数百兆個もの細菌が棲息しており、宿主の健康維持に大きく関与している。なかでも我々は健康な乳幼児の腸内に Bifidobacterium
属細菌、所謂ビフィズス菌が非常に多く生息していることから、このビフィズ
ス菌が乳幼児、ひいては宿主の健康を維持するために重要な役割を担っているのではないかとの仮説を立証すべく、１９６０年代から研究を開始した。その結果、数多くの研究からビフィズス菌の有用性が示され、今や善玉菌の代表格として多くの機能性食品に用いられるようになった。
Bifidobacterium 属の細菌は現在 50 種程度に分類されているが、主にヒト腸管から検出されるビフィズス菌は 10 菌種程度であり、乳児と成人で棲息する菌種も異なっている。各菌種はそれぞれの生息環境に適応することで独自の進化を遂げてきた結果、ヒトにはヒト特有の、動物には動物特有の菌種が生息するようになったのではないかと推測されるが、その理由は十分明らかにされていない。
我々はヒトの腸内環境に適応進化してきたと考えられるヒトに生息するビフィ
ズス菌種 Human-Residential Bifidobacteria (HRB)がヒトとの相性もよく健康素材として優れているのではないかとの考えに基づき１９７０年代より製品に活用してきたが、科学的な根拠を持ってヒトとの親和性の高さを長年証明できずにいた。
今回我々は、バイオインフォマティクスを活用することでこれら菌種間の本質的な差を見出せるのではないかと考え、始めにプロバイオティクスとしても幅広く利用されている HRB である B. longum と B. breve、および nHRB である B.
animalis の 3 菌種の計 49 株について比較ゲノム解析を実施した。その結果、HRB と nHRB との間には炭水化物代謝や葉酸等のビタミン産生能力に大きな違いがあることが示唆され、特に乳児腸管に棲息する HRB（乳児型 HRB）には、母乳に含まれるヒトミルクオリゴ糖（Human Milk Oligosaccharide、 HMO）の代
謝関連遺伝子が多く分布していることが示された。そこで数菌株を用いて HMO
特有の基本骨格であるラクト－N－テトラオース(LNT)およびラクト－N－ビ
オース(LNB)に対する資化能を in vitro 試験で確認後、HRB 及び nHRB の計 37
株を用いて、実際に母乳中での増殖性を確認した。母乳には６～７％の乳糖が含まれていることから、作業仮説としては、すべてのビフィズス菌種が増殖するものの、HRB の増殖が nHRB よりも速い、というものであった。実際、乳児型 HRB は母乳中に良く増殖を示した一方で、成人型 HRB や nHRB では予想に反しほとんどの株が増殖を示さないどころか、検出限界値以下まで菌数が低下した。そこで母乳に含まれている抗菌活性物質に対する耐性を確認したところ、他の哺乳類よりもヒトの母乳で特に濃度が高いと言われているリゾチームに対し、乳児型 HRB は高い耐性を示した一方で、nHRB が低い濃度のリゾチーム存在下で生育が抑制されたことから、母乳での増殖性とリゾチーム耐性が良く相関していたことが判明した。以上より、HMO の代謝能に加えてリゾチームへの耐性機構を獲得した乳児型 HRB は、母乳との親和性を高めることで乳児腸管という特殊な環境に高度に適応してきたと考えられた。
本講演ではこれら結果に付随して、バイオインフォマティクスによる腸内菌叢
解析や整腸作用に関する研究成果についても紹介できればと考えている。

Application of Metabolome Analyses in Bio-industry

High compatibility of Human-Residential Bifidobacteria (HRB) with host

○Norichika Ogata(Nihon BioData Corp.)

Key words

metabolome, total metabolite pool analysis, genome, transcriptome○Toshitaka Odamaki1, Ayako Horigome1, Hirosuke Sugahara1, Junichi Minami2,
Fumiaki Abe2, Jin-zhong Xiao1(1Next Generation Sci. Inst., Morinaga Milk Ind., 2Food Ingredients & Techno. Inst.,
Morinaga Milk Ind.)Key words
lysozymebifidobacterium, microbial flora, human milk oligosaccharide,Toward Sustainable Palm Oil Industry Coexisting with Environmental and Biodiversity Conservation〈国際シンポジウム〉

1S-Cp01

Promotion of green economy with palm oil industry forbiodiversity conservation in Malaysia

1S-Cp02○Yoshihito Shirai(Grad. Sch. Life Sci. Syst. Eng., Kyushu Inst. Technol.)shirai@life.kyutech.ac.jp

83

Process integration and zero emission system in the palm
oil mill○Mohd Ali Hassan1, Yoshihito Shirai2(1Dept. Bioprocess Tech., Faculty of Biotech., Univ. Putra Malaysia,2
Dept. Biol. Functions Eng, Grad. Sch. Life Sci. Sys. Eng., Kyushu
Inst. Tech.,)alihas@upm.edu.my

Science and Technology Research Partnership for Sustainable Development(SATREPS) is an international collaborative research program supported by JST and
JICA targeting global issues and involving partnership between researchers in Japanand developing countries.
The purpose of our SATREPS project, “PROMOTION OF GREEN ECONOMYWITH PALM OIL INDUSTRY FOR BIODIVERSITY CONSERVATION IN
MALAYSIA” is to encourage any green economy by using excess energy and biomass
rationally wasting from palm oil mills, resulting in achieving zero-discharge of palm
oil mill effluent (POME). And the environment around the mill can be maintained
under good conditions, resulting in not disturbing biodiversity thereabouts. Our zerodischarge means that no waste but only valued products can come out from the mills.
We have already set up our pilot-plants which compose of three elements, a POME
treatment system, Yamasen-bio-charcoal oven and bio-compost production systems in
Keningau Palm Oil Mill SDN. BHD. (KPOM) in Sabah. In the POME treatment
system, we are investigating the effect of the denatured oil in the condensed water froma sterilization process of FFB to reduce drastically the COD source in the POME in
advance and much facilitating the POME treatment.
Here we are challenging to examine how much the POME treatment would affect thebiodiversity of the environment nearby by checking the microbial biodiversity in thewater and the soil. Finally we will consider the effect of the zero-discharge on the
microbial biodiversity from the mill by using treated water both from our pilot plants
and ponds for POME treatment of the mill.
At the same time, we consider any value chains from the excess biomass and energy toencourage the modernization of palm oil industry to promote more economy andemployment. For example, the separated denatured oil should be any raw materials
chemicals and liquid fuels. The sludge after the POME treatment is so far just waste.
However, we have confirmed that compost with higher and the same quality ofcompost can be produced from the sludge and empty fruit bunch (EFB) and moreincome can be obtained1. On the other hands we have developed several newtechnologies to provide new materials including nano-composites, which would beconsidered as one of the highest value-added products. Then we can considered any
feasible and optimum business models based on our results including microcomposites, bio-charcoal and bio-compost. We shall be pleased to discuss withanybody from the business sectors in this occasion.
Reference
1. A. Mohd Ali et al. Journal of Cleaner Production 91, 96-99 (2015).

This paper describes the international collaborative research and development
initiatives to develop a modern palm oil mill incorporating innovative and clean
technologies, with the production of value-added products from the oil palm biomass.
The biogas captured from the anaerobic treatment ponds is converted to green
electricity for grid connection, with a high fit-in tariff. The anaerobic sludge is cocomposted with the empty fruit bunch to produce an organic fertilizer with highnutrient content, which can partially substitute the chemical fertilisers in the oil palm
plantation. The final effluent to be discharged to the river is treated with activatedcarbon produced from the oil palm biomass, which makes it clean enough to berecycled back to the palm oil mill. With these strategies and process integration inplace, the palm oil mills can be modernised and improved, towards achieving a zero
emission system.

Promotion of green economy with palm oil industry for biodiversity
conservation in Malaysia

Process integration and zero emission system in the palm oil mill

○Yoshihito Shirai(Grad. Sch. Life Sci. Syst. Eng., Kyushu Inst. Technol.)Key words

palm oil, biomass, microbial community○Mohd Ali Hassan1, Yoshihito Shirai2(1Dept. Bioprocess Tech., Faculty of Biotech., Univ. Putra Malaysia, 2Dept. Biol.
Functions Eng, Grad. Sch. Life Sci. Sys. Eng., Kyushu Inst. Tech.,)Key words

palm oill mill, oil palm biomass, zero emission

84

Toward Sustainable Palm Oil Industry Coexisting with Environmental and Biodiversity Conservation〈国際シンポジウム〉

1S-Cp03

Utilization of oil palm biomass for acetoin production
using engineered Escherichia coli
○Mohd Zulkhairi Mohd Yusoff1,2, Hironaga Akita1,
Nobutaka Nakashima3,4, Tamotsu Hoshino1,3(1Res. Inst. Sustainable Chem. AIST, 2Dept. Bioprocess Technol,
UPM, 3Bioproduction Res. Inst. AIST, 4Dept. of Biological
Information, Tokyo Inst. Technol.)mohdzulkhairi-yusoff@aist.go.jp

A zero emission concept for promotion of green economy with palm oil industry has
been proposed for an international collaboration between universities, government
agencies and industries in Malaysia and Japan under umbrella of SATREPS. The
project framework is to develop a technology on biomass utilization for other valueadded products. Malaysia is second-largest palm oil producer in the world. As aleading industry in world’s oil production, palm oil industry has left behind a hugeamount of biomass from its plantation and milling activities as compared to other typesof agricultural biomass. This industry becomes establish from time to time due to theworld requirement on palm oil product. The plantation area for palm oil has gradually
increased from 0.5 million hectares in early 1970s up to 4.5 million hectares in 2006.
Moreover, the dry biomass was generated more than 80 million tonnes in 2010, andthis value is expected to be increased up to 110 million tonnes in 2020. The hugeamount of these biomass causes environmental problem, and subsequently increases
the cost of waste management.
The palm oil industry generates abundant of solid biomass such as oil palm fronds(OPF), empty fruit bunch (EFB) and mesocarp fiber (MF). In plantation area, OPF are
regularly produced during the harvesting of fresh fruit bunches and pruning of palm
tree. OPF are left in the plantation for nutrient recycling and soil preservation.
Meanwhile, huge amount of the EFB, which is dumped at the mill or mulching at theplantation area. For MF, it is burnt in a boiler for power generation in the mill.
However, MF is inefficiently utilized due to power generated is more than enough forthe energy required. Thus, we proposed the utilization of MF for the efficientconversion to acetoin, which is used as flavor enhancer and fragrance agent incosmetic industry.
In this study, we performed pretreatment method for sugar extraction from MF throughchemical-free approach by using hydrothermal pretreatment method. The hydrothermal
treatment condition was determined based on effect of temperature and retention time.
The 75 g of pretreated mesocarp fibre was used as substrate for enzymatic hydrolysis.
The glucose and xylose concentrations in the hydrolysate were reached 32-35 g・L-1
and 3-6 g・L-1, respectively. Subsequently, we produced acetoin using hydrolysate
from MF as the carbon source with engineered Escherichia coli. This engineered E.
coli is not requiring antibiotics to maintain plasmid and artificial inducers for gene
expression. To enhance the acetoin productivity of the engineered E. coli, the effects oftemperature, initial pH culture, stirrer speed and airflow rate were investigated withreagent-grade glucose and xylose. As a result, the productivity was 1.5-fold higher
than under the standard condition, which suggested that acetoin production could be
improved through optimization. Under optimal culture condition, about 2 g・ L-1
acetoin was produced using hydrolysate from mesocarp fibre as the carbon source
without supplemented glucose, xylose or yeast extract.

1S-Cp04

Waste biotransformation and accelerating recycle in oilpalm industry○Yukihiro Tashiro1, Clament Chin Fui Seung1, Mohd Ali Hassan2,
Kenji Sakai1(1Fac. Agr., Kyushu Univ., Japan, 2Universiti Putra Malaysia,
Malaysia)
tashiro@agr.kyushu-u.ac.jp

Oil palm (Elaeis guineensis Jacq), or informally called the golden crop is currently themost potent plantation crop in Malaysia. Its glossy goldish fruits yield two valuable
vegetable oils after processing, contributing to the generation of high income for boththe industry and country. Accompany by the drastically increment of oil palm planting
areas and yield improvement of planting material benefit from the plant breeding
programme, waste biomass generated from oil palm industry had simultaneously
increased. In field, two main waste biomasses are identified as oil palm frond (OPF)
generated from daily pruning activity and oil palm trunk (OPT) during the replanting
cycles. In the palm oil mill, both solid and liquid wastes are generated from theprocessing and oil extraction activities of fresh fruit bunch (FFB). These include empty
fruit bunch (EFB), mesocarp fiber, palm kernel shell and cake, decanter cake and palm
oil mill effluent (POME).
Composting is one of the techniques use by the industry for handling wastes that are
originally produced from the processing of FFB. This technique uses a biothermal
process generated by indigenous microorganisms undergoing fermentation anddegradation of organic matters contained in the waste biomass. However, theconventional composting method is rather slow and less functional due to its naturehigh carbon to nitrogen ratio. In addition, POME remains the major waste temporarily
stored in mills that potentially increase the treatment cost and environmental risk. The
new composting plant introduced under the SATREPS project by Japanese government
has likely provided useful techniques in handling the above mentioned problems. Cocomposting of EFB-POME not only drastically reduced both the biomass and effluent
wastes; it also shortened the composting period and lowered the carbon to nitrogenratio, making it suitable to be used as organic amendment for application in field.
We further aim to transform the co-composted product into functional compost that is
capable of promoting plant growth via the potential indigenous bacteria which
proliferating in the co-composted product. Several highly multifunctional plant growthpromoting (PGP) bacterial isolates with combination of PGP activities such as:solubilization of phosphorus (P), potassium (K) and silicon (Si); and production ofsiderophore (Fe), ammonia (NH3), and auxin (IAA) were isolated and identified in the
EFB-POME co-compost. In addition, several bacterial isolates with moderate to strong
antifungal activity against Ganoderma boninense (ACCT ® 204074TM), the causal
pathogen of basal stem rot disease in oil palm were also isolated and demonstrated.
Interestingly, many of the bacterial isolates exhibiting strong xylan and carboxymethyl
cellulose degradation ability also showed moderate to strong in vitro antifungal activity
against G. boninense. The presence of these bacteria in the co-compost suggests theirmajor contribution in accelerating the composting period to as short as 40 days, withcombination of POME that was rich in nitrogen content that finally bring down the
carbon to nitrogen ratio (C/N) somewhere around 12 as previously reported.
Agrochemical contributes the highest variable production cost in oil palm industry andexcessive use of these chemicals could cause substantial environmental and ecologicaldamage. This urges the industry to find alternative sources for maintaining yield andcontrolling plant disease. The introducing of the EFB-POME co-compost has
retransformed the oil palm industry in handling wastes simultaneously producing akind of value-added compost that could substitute for the agrochemical function after
undergo biotransformation by PGP and composting bacteria. We believe the results
showed by this study could catalyst the implementation of co-composting plant by
more oil palm companies, hence accelerating recycle of waste produced in oil palm
industry. Thus, sustainable biomass production and utilization and the triple bottom
line goal or the concept of 3Ps (people, planet and profits) for sustainable agriculture
could be achieved.

Utilization of oil palm biomass for acetoin production using engineered

Escherichia coli

○Mohd Zulkhairi Mohd Yusoff1,2, Hironaga Akita1, Nobutaka Nakashima3,4,
Tamotsu Hoshino1,3(1Res. Inst. Sustainable Chem. AIST, 2Dept. Bioprocess Technol, UPM,
3Bioproduction Res. Inst. AIST, 4Dept. of Biological Information, Tokyo Inst.
Technol.)
Key words
Oil palm biomass, Mesocarp fiber, Escherichia coli, Acetoin

Waste biotransformation and accelerating recycle in oil palm industry○Yukihiro Tashiro1, Clament Chin Fui Seung1, Mohd Ali Hassan2, Kenji Sakai1(1Fac. Agr., Kyushu Univ., Japan, 2Universiti Putra Malaysia, Malaysia)

Key words
multi-functional bacteria, Plant growth promoting bacteria, cocompost, palm oilToward Sustainable Palm Oil Industry Coexisting with Environmental and Biodiversity Conservation〈国際シンポジウム〉

1S-Cp05

Bacterial community analysis as a tool in assessing thepollution due to palm oil mill effluent

1S-Cp06○Norhayati Ramli1, Siti Suhailah Sharuddin1, Diana Mohd-Nor1,2,
Mohd Ali Hassan1, Yoshihito Shirai2, Toshinari Maeda2, Kenji Sakai3(1Dept. of Bioprocess Technol., Fac. Biotechnol Biomol. Sci., UPM,
2
Grad. Sch. Life Sci. Syst. Eng., Kyushu Inst. Technol., 3Fac.
Agric., Kyushu Univ.)
yatiramli@upm.edu.my85

Effects of land-use gradient changes on biodiversity intropical rainforest of Borneo○Charles Vairappan1, Tin- Hoe Seng1, Jaya Seelan1,
Kishneth Palaniveloo1, Yukihiro Tashiro2, Kenji Sakai2(1ITBC, Univ. Malaysia Sava, 2Fac. Agric., Kyushu Univ.)
csv@ums.edu.my

Malaysia is ranked as the second largest producer of palm oil in the world. The major
problem in this industry is the production of a highly polluting wastewater known aspalm oil mill effluent (POME). POME is considered as the most harmful waste
generated from palm oil processing industry if the waste was not properly treated. In
Malaysia, 85% of palm oil mill used the ponding system as their preferable treatment
method for POME, which later will be discharged into the nearby river. Numerous
studies have shown that bacterial population are highly dynamic and can differ
strongly in their response to resource availability such as organic carbon, nitrogen andphosphorus. Hence, the loss or changes of microbial diversity is considered a major
threat because of its important for ecosystem functions. To date, little is known about
microbial communities involved in the polluted river due to POME, either theirstructural and functional diversity or their response to environmental constraints.
Therefore, this study aims to identify and compare the bacterial community structureand function present in the effluent-receiving river located near palm oil mill. The
PCR-DGGE and Illumina Miseq have been used in analysing the microbial community
structures, whereas the nucleic acid double staining (NADS) assay based on flow
cytometry has been used in assessing the microbial community function. The findings
demonstrated a significant difference of microbial community present in the upstream
and downstream part of the effluent-receiving river water, in relation with the changesof the physicochemical properties. Hence, it is believed that the microbial communitythat play a key role in biogeochemical processes caused by POME final discharge has
the potential to be used as indicator microorganism capable of indicating
contamination caused by POME.

Tropical forests regulate regional and global climate, provide a wide range of
ecosystem services to over a billion people, and support close to 50% of flora andfauna. The island harbours an estimated 14,423 plants and 1640 vertebrate species, ofwhich 28% are endemic and 534 species are considered to be threatened withextinction. The extent of forest in Borneo declined by 16.8x106 ha from 1973 to 2010
because of logging and ENSO-induced wildfires. Previously, timber extraction resulted
in gradient degradation of habitat from primary forest to secondary forest, whichfurther degraded, fragmented and cleared for agricultural purposes, primarily for the
monocultures of oil palm. Hence, it has caused dramatic changes on the population andspecies diversity in tropical forest in Borneo. In the effort of accessing the impact ofalteration in land use gradient, we have carried out the study on community anddiversity of species, focusing on microorganism, vertebrates, and invertebrates. To
date, we found that land use conversion has significantly altered the diversity andcommunity structure of various organisms.

Bacterial community analysis as a tool in assessing the pollution due to palm
oil mill effluent

Effects of land-use gradient changes on biodiversity in tropical rainforest of
Borneo○Norhayati Ramli1, Siti Suhailah Sharuddin1, Diana Mohd-Nor1,2,
Mohd Ali Hassan1, Yoshihito Shirai2, Toshinari Maeda2, Kenji Sakai3(1Dept. of Bioprocess Technol., Fac. Biotechnol Biomol. Sci., UPM, 2Grad. Sch.
Life Sci. Syst. Eng., Kyushu Inst. Technol., 3Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words
Miseq

microbial community, palm oil mill effluent, PCR-DGGE, Illumina○Charles Vairappan1, Tin- Hoe Seng1, Jaya Seelan1, Kishneth Palaniveloo1,
Yukihiro Tashiro2, Kenji Sakai2(1ITBC, Univ. Malaysia Sava, 2Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words

biodiversity, bacterial consortium, palm oil, forest soil

86

Biotechnology of Enzymes in Aldoxime-Nitrile Pathway from Microorganisms, Plants and Animals〈ERATO Asano Active Enzyme
Molecule Project 国際シンポジウム〉

1S-Dp01

Access and use of fern hydroxynitrile lyase forbiocatalysis○Anton Glieder1, Elisa Lanfranchi2, Margit Winkler2, Karl Gruber3,
Thea Pavkov-Keller3(1NAWI, Inst. Mol. Biot., Graz. Univ. Tech., 2ACIB GmbH, Graz,
3
Inst. Mol. Biosc., Univ. Graz)a.glieder@tugraz.at

Hydroxynitrile lyase enzymes (HNLs) catalyze the synthesis of chiral cyanohydrins,
key building blocks for pharmaceuticals and agrochemicals. HNLs are a heterogeneousclass of enzymes because a number of different protein folds with distinct catalytic
sites are known today [1]. We determined the amino acid sequence of a new HNL with
yet another protein fold and an unprecedented active site from a fern species (Davallia
teyermanii). First, transcriptome data from a normalized cDNA library was acquired
Next, peptide fragments were identified via a Blue Native PAGE coupled HNL activity
assay combined with LC-MS/MS sequencing [2]. The new enzyme (DtHNL) is not
related to any known HNL and is the first described HNL with a Bet v1 fold based on
its high-resolution x-ray structure. Interestingly, it is also a unique protein within theBet v1 superfamily because its catalytic triad is distinct to other described catalytic
triads of HNL enzymes.
DtHNL revealed to be a versatile enzyme for biocatalysis as it shows high specificactivity, tolerance for low pH, high expression levels in E. coli and P. pastoris andexcellent selectivity for the production of R-cyanohydrins. Its utility for the synthesisof several cyanohydrins was demonstrated in typical biphasic conditions, giving almost
full substrate conversion to cyanohydrins with good to excellent enantioselectivities[3].
Acknowledgements: This project is financed by the European Union’s Seventh
Framework Programme FP7/2007-2013 under grant agreement no. 289646 (Kyrobio)
and has been supported by the Austrian BMWFW, BMVIT, SFG, Standortagentur
Tirol, Government of Lower Austria and ZIT through the Austrian FFG-COMETFunding Program.
___[1] Winkler M, et al. Comprehensive Chirality, Synthetic methods VI, vol. 7.
Amsterdam: Elesevier; 2012. P. 350-71.
[2] Lanfranchi E, et al. Curr. Biotechnol. 2015;4:111-117.
[3] Lanfranchi E, et al., manuscript in preparation

1S-Dp02

Hydroxynitrile lyases and enzymes related tomandelonitirle metabolism in plants and animals○Yuko Ishida1,2, Yasuhisa Asano1,2(1Biotechnol. Res. Center, Toyama Pref. Univ., 2ERATO, JST)y-ishida@pu-toyama.ac.jp

Cyanohydrins are valuable building blocks for synthesis of fine chemicals andpharmaceuticals. In industrial biotechnology, hydroxynitrile lyase (HNL) is considered
as one of the important biocatalysts, which is able to enantioselectively produce thecyanohydrins in mild conditions. Since the biotechnology has required more efficientand stable enzymes, we have to develop the better enzyme(s) using rational protein
engineering. However, speed of the consecutive improvement may be insufficient tosatisfy our demands. Therefore, discovery of the enzyme(s) with new structure isindispensable, coming up with the new ideas and strategies to apply them in theindustry.
In plants and animals HNL plays a role in decomposition of stored cyanohydrins,
causing release of hydrogen cyanide in their defense system. Number of the species on
the earth and in the ocean is estimated as 11 million. The prediction gave us the ideathat unexplored plants and animals possess our interest enzymes. In this presentation, I
will introduce our exploration of following HNLs and mandelonitrile oxidase (MOX)
from plants and animals.
1. Intensive screening of 163 plant species identified 7 new HNLs (Asano et al, 2005).
Although specific activity of them were not superior to that of the industrial HNL fromthe almond (PaHNL), the HNL derived from the passion fruit, Passiflora edulis(PeHNL), showed an enantiomeric excess (ee) of 99% in biphasic system of
diisopropyl ether. It had a molecular mass of 14.4 kDa, which is the smallest HNL
among reported HNLs (Ueatrongchit et al, 2010). We expect that the HNL will be asuitable model molecule for protein engineering.
2. Cyanogenic millipedes use hydrogen cyanide as a defense chemical, which isdecomposed from mandelonitrile through HNL. We isolated HNL from the invasive
millipede, Chamberlinius hualinensis (ChuaHNL). Its pH and temperature stabilities
were comparable to those of PaHNL. The specific activity was 5 times higher than thatof PaHNL, indicating that the ChuaHNL has the highest specific activity among
reported HNLs. Furthermore, it was able to synthesize (R)-mandelonitrile frombenzaldehyde and potassium cyanide with an ee of 99% in aqueous condition(Dadashipour et al, 2015). This HNL will be a biocatalyst to spur the industrial
synthesis of fine chemicals and pharmaceuticals in the next generation.
3. Mandelonitrile oxidase (ChuaMOX) was identified during study of mandelonitrile
metabolism in the millipede. It stoichiometrically consumes the oxygen and catalyzes
the synthesis of benzoyl cyanide and hydrogen peroxide from (R)-mandelonitrile, andwas newly classified into mandelonitrile:oxygen oxidoreductase (EC 1.1.3.-). To apply
this enzyme to industrial biotechnology, it is necessary to expand its substratespecificity using protein engineering. On the basis of its localization, ChuaMOX is aunique component of the suicide defense system in the millipede species (Ishida et al,2016).
Acknowledgements
All studies in this presentation were collaborated with Drs. A. H.-Kittikun, Y.
Kuwahara, K. Tamura K, N. Doi, T. Ueatrongchit, M. Dadashipour, T. Yamaguchi, K.
Yamamoto, A. Ina, Y. Ichiki,T. Ohmiya, and M. Morita.
References
Asano Y, Tamura K, Doi N, Ueatrongchit T, H-Kittikun A, Ohmiya T (2005) Screening
for new hydroxynitrilases from plants. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry69: 2349-2357
Dadashipour M, Ishida Y, Yamamoto K, Asano Y (2015) Discovery and molecular andbiocatalytic properties of hydroxynitrile lyase from an invasive millipede,
Chamberlinius hualienensis. Proceedings of the National Academy Sciences of theUnited States of America 112: 10605-10610
Ishida Y, Kuwahara Y, Dadashipour M, Ina A, Yamaguchi T, Morita M, Ichiki Y,
Asano Y (2016) A sacrificial millipede altruistically protects its swarm using a drone
blood enzyme, mandelonitrile oxidase. Scientific Reports In press
Ueatrongchit T, Tamura K, Ohmiya T, H-Kittikun A, Asano Y (2010) Hydroxynitrile
lyase from Passiflora edulis: Purification, characteristics and application inasymmetric synthesis of (R)-mandelonitrile. Enzyme and Microbial Technology 46:
456-465

Access and use of fern hydroxynitrile lyase for biocatalysis○Anton Glieder1, Elisa Lanfranchi2, Margit Winkler2, Karl Gruber3,
Thea Pavkov-Keller3(1NAWI, Inst. Mol. Biot., Graz. Univ. Tech., 2ACIB GmbH, Graz, 3Inst. Mol. Biosc.,
Univ. Graz)

Key words

bioconversion, lyase, enzyme production, crystallographic study

Hydroxynitrile lyases and enzymes related to mandelonitirle metabolism inplants and animals○Yuko Ishida1,2, Yasuhisa Asano1,2(1Biotechnol. Res. Center, Toyama Pref. Univ., 2ERATO, JST)Key words
hydroxynirile lyase, mandelonitrile oxidase, Passiflora edulis,
Chamberlinius hualienensis

Biotechnology of Enzymes in Aldoxime-Nitrile Pathway from Microorganisms, Plants and Animals〈ERATO Asano Active Enzyme
Molecule Project 国際シンポジウム〉

1S-Dp03

Engineering nitrile hydratase by salt-bridges anddisulfide-bridges

1S-Dp04○Huimin Yu1,2,3, Song Jiao1,2, Ji Yang1,2, Jing Zhang1,2, Jie Chen1,2,Zhongyao Shen1(1Dept. Chem. Eng., Tsinghua Univ., China, 2Key Lab Indust.
Biocatal., ME., China, 3Cent. Synt. Syst. Biol., Tsinghua Univ.,
China)
yuhm@tsinghua.edu.cn
Stability intensification of multimeric enzymes is of great importance for industrial
biocatalysis. Various strategies have been utilized to improve the enzyme stability,
among which salt-bridges and disulfide bond bridges are effective and focused in thiswork. Nitrile hydratase (NHase) is a double-subunit enzyme widely used for industrial
production of acrylamide from acrylonitrile. Using NHase as a model enzyme, saltbridges and disulfide-bridges were introduced to rationally improve its stability. The
deformation-prone thermal-sensitive regions of NHase were first identified by MD
simulation and RMSF calculation, and each terminus was found the most instable“short-board” region. Therefore, the stabilized salt-bridge interactions in thethermophilic NHase were transferred into the corresponding thermal sensitive regionsof mesophilic NHase-TH. Results showed that a C-terminal salt-bridge was powerfulfor stability intensification with unreduced activity, through triggering global changesof the salt bridge networks in the engineered NHase. Further, some salt-bridge based
circular oligo-peptides were designed and introduced into N-/C-terminal regions ofNHase as a universal “stability-enhanced tag”. Significantly enhanced stability/activity
was observed in the diverse engineered NHases as expected. Interface of different
subunits is another “short-board” region causing thermal instability of enzymes.
Introducing rigid disulfide-bridges into the interface give a probable way toremarkably improve the enzyme stability. But the difficulty is the balance between
flexibility and rigidity of the structure of NHase. Assisted by molecular simulation,interface disulfide bonds of NHase were designed and engineered NHases wereconstructed. A mutant NHase with significantly enhanced stability and unreduced
activity was obtained and overexpressed in R. ruber cells. Catalyzed by resting cells of
the engineered R. ruber containing the engineered NHase, high titer of acrylamide
were obtained in both lab-scale and industrial-scale. This work is supported by the
National Key Basic Research Project 973 (No. 2013CB733600) and National Natural
Science Foundation of P. R. China (No. 21476126).

87

Aldoxime dehydration in the (bio)synthesis of nitriles○Richard Metzner1,2, Yasuhisa Asano1,2(1Biotechnol. Res. Center, Toyama Pref. Univ., 2ERATO, JST)
metzner@pu-toyama.ac.jp

In recent years, the production of fine chemicals and pharmaceuticals relying on theuse of toxic reagents, e.g. cyanide salts, have become the focus of process development
not only from an ecological but also economic point of view. Apart frommethodologies to remove toxic materials from downstream processing, substitution of
the corresponding reagents by less toxic or easier-to-handle compounds is a common
approach. Some examples include the use of primary carboxylic amides and theirdehydration by trifluoroacetic anhydride, or the dehydration of aldoximes with oxalyl
dichloride in the presence of catalytic amounts of triphenylphosphine oxide.
But also in nature, this concept of generating organic nitriles from other C-N functionalgroups is present. The discovery of an aldoxime-nitrile pathway in Bacillus sp. OxB-1
by Asano and Kato represented the first biocatalytic analog to the previously
mentioned aldoxime dehydration. [1] The catalyst in this case is a redox-active iron(II)heme protein, which enables a formal elimination of water, giving a reaction with aperfect atom economy. It was later determined that these aldoximes are biosynthesizedfrom aromatic amino acids by several oxidation steps, thus offering an access routefrom amino acids towards nitriles. In contrast to this bacterial transformation, a recent
study from Yamaguchi et al. also showed that plant metabolism can use P450 enzymes
and NADPH to dehydrate aldoximes.[2,3] Although only four aromatic amino acids areabundant in nature, the substrate specificity of these aldoxime dehydratases (Oxd) issurprisingly broad. Numerous synthetic aryl-, arylalkyl-, and heteroaryl-aldoximes
were successfully converted to their respective nitriles in both aqueous and binary
solvents. In addition, it was recently discovered that these enzymes also exhibit
enantioselectivity for 2-arylpropionaldoximes.[4] Although it is common forbiocatalysts to have an enantiopreference, the complexity of diastereomeric chiral E/Zaldoximes, a low thermodynamic barrier for E/Z-isomerization and low
enantioselectivity for Z-aldoximes concealed this valuable property in previous studies.
By decreasing the free enthalpy of the biotransformation, the inherent E/Zisomerization was suppressed and an excellent enantioselectivity for E-aldoximes
identified, with up to 98% ee for the synthesis of (S)-2-phenylpropionitrile.
Apart from the selectivity of these enzymes, a major bottleneck is the rather low
substrate concentration of currently 5-20 mM, corresponding to about 1-3 g/L, which isstill far from an industrial application. Although there have been industrial processes
using aldoxime dehydratases for the production of achiral or racemic fragrance nitriles,[5]
the current aim is a general application of these useful biocatalysts in asymmetricsynthesis. This presentation will therefore include ongoing research with several
methodologies to surpass these limitations by the use of binary solvent systems andheterologous catalysis with immobilized aldoxime dehydratases.
We gratefully acknowledge the extensive work on the plant cytochrome P450 aldoxime
dehydration by Dr. Takuya Yamaguchi and the preparation of His-tagged OxdB by Dr.
Yufeng Miao. We also would like to thank SpinChem AB (Umea, Sweden) andEnginzyme AB (Stockholm, Sweden) for technical support regarding a rotating-bed
reactor system (RBR) and immobilization resins for our enzymes. This study was
supported by the Exploratory Research for Advanced Technology Program of theJapan Science and Technology Agency.
[1] Y. Asano, Y. Kato, FEMS Microbiol. Lett.1998, 158, 185-190.
[2] Y. Miki, Y. Asano, Appl. Environ. Microbiol.2014, 80, 6828-6836.
[3] T. Yamaguchi, K. Noge, Y. Asano, Plant. Mol. Biol.2016, 91, 229-239.
[4] R. Metzner, S. Okazaki, Y. Asano, H. Gröger, ChemCatChem2014, 6, 3105-3109.
[5] A. Piatesi, W. Siegel, K.-U. Baldenius, Int. Pat. Appl. WO/2013135601, 2012.

Engineering nitrile hydratase by salt-bridges and disulfide-bridges○Huimin Yu1,2,3, Song Jiao1,2, Ji Yang1,2, Jing Zhang1,2, Jie Chen1,2, Zhongyao Shen1(1Dept. Chem. Eng., Tsinghua Univ., China, 2Key Lab Indust. Biocatal., ME., China,
3Cent. Synt. Syst. Biol., Tsinghua Univ., China)

Key words

nitrile hydratase, stability, salt bridge, disulfide bondAldoxime dehydration in the (bio)synthesis of nitriles○Richard Metzner1,2, Yasuhisa Asano1,2(1Biotechnol. Res. Center, Toyama Pref. Univ., 2ERATO, JST)Key words
synthesis

aldoxime dehydratase, cytochrome P450, immobilization, asymmetric

88

遺伝子改変技術によるセルエンジニアリングの革新：産業応用に向けて

1S-Ep01

ゲノム編集の最新方法論○佐久間 哲史（広島大院・理）tetsushi-sakuma@hiroshima-u.ac.jp

1S-Ep02

iPS 細胞での効率的なゲノム編集を目指した CRISPR
ツールボックス○堀田 秋津 1,2（1京大・CiRA, 2京大・iCeMS）
akitsu.hotta@cira.kyoto-u.ac.jp

次世代の遺伝子改変技術であるゲノム編集は、近年急速な発展を遂げ、基礎生
物学分野はもちろん、医歯薬学、農水畜産学、細胞工学、微生物工学、環境工学など、あらゆる生命科学関連研究において必須の研究手法となりつつある。
ゲノム編集では、任意のゲノム領域に DNA 二本鎖切断を導入し、内在の修復機構を利用することで、遺伝子のノックアウトやノックイン、染色体操作（広域欠失や逆位、重複、転座など）が可能となる。更に、DNA 配列そのものには傷を入れず、DNA やヒストンの化学修飾のみを改変することで、遺伝子座特異的に転写を調節するエピゲノム編集技術の開発も盛んに進められている。現在
では、最も簡便かつ汎用性の高いゲノム・エピゲノム編集ツールとして CRISPRCas9 が広く利用されているが、より特異性を高めたバリアントや標的配列の制限を緩和させたバリアント、別種のバクテリアに由来するサイズの小さい Cas9など、Cas9 の改良が続々と進められている他、Cas9 とは異なるタンパク質（Cpf1や Argonaute など）を利用するシステムも報告されており、ゲノム編集ツールの進化速度は増すばかりである。また、低分子化合物を用いて DNA 二本鎖切断の修復機構をコントロールし、遺伝子ノックインの効率を高める試みや、従来利用されてきた相同組換えとは異なる修復経路を利用した遺伝子ノックイン法、従来法では合成が著しく困難であった長鎖一本鎖 DNA を容易に調整して遺伝子ノックインに利用する手法、またそれぞれ別々に利用されてきた二本鎖DNA と一本鎖 DNA を組み合わせて遺伝子ノックインのドナーとして供する手法など、様々なゲノム編集操作の高度化も著しい。このように、ゲノム編集の技術開発は、生命科学研究史上、類を見ないほど日進月歩で進んでおり、またその重要性は日増しに高まっている。一方で、あまりの進展速度の速さゆえ、現状を把握しきれない研究者が多いのもまた事実である。本講演では、ゲノム編集の原理と応用について、演者による研究開発の経緯を交えながら、基礎情報から最新の研究動向に至るまでを俯瞰的に概説する。本講演がゲノム編集の最新方法論を理解する一助となれば幸いである。

iPS 細胞は多種多用な疾患患者から樹立することができ、旺盛な増殖能力と分化多能性を持つために、細胞レベルでのヒト病態学へと幅広く応用されている。
これと並行して、近年の TALEN や CRISPR-Cas9 に代表されるゲノム編集技術の革新的な技術発展により、ヒト iPS 細胞での精密な遺伝子改変が可能となってきた[Hotta and Yamanaka, Annu Rev Genet, 2015 | Li et al., Methods, 2016]。
TALEN および CRISPR はどちらも非常に効率的なゲノム編集ツールであるが、約半分を反復配列が占めるヒトゲノムにおいて、どこをターゲットにするかに応じて DNA 切断パターンや遺伝子変異の修復戦略が大きく変わってくる。我々はまず、ターゲット部位の特異性を担保するために、ヒトゲノム中での特異性の高い領域を可視化したデータベースや、切断部位前後の微小相同領域(MMEJ,
Microhomology Mediated End Joining)を介した切断パターンの予測プログラム insilico Genome Editing Tools (iGEATs: https://apps.cira.kyoto-u.ac.jp/igeats/)を開発
し、ゲノム編集を効率的かつ正確に作用させられるよう検討を重ねてきた。
次に、ゲノム編集技術を遺伝子変異修復へと応用するため、先天性単一遺伝子疾患の中でも重症を呈する Duchenne 型筋ジストロフィーの原因遺伝子変異修復を試みた[Hotta A, J Neuromuscul Dis, 2015]。患者の皮膚線維芽細胞からエピ
ソーマル法を用いて iPS 細胞を樹立し、ジストロフィン遺伝子の変異を修復すべく、適切な長さのエクソンを一つ飛ばしてタンパク質の読み枠を元に戻すエ
クソンスキッピング法や、数塩基の挿入欠損により読み枠を元に戻すフレーム
シフト法、そして欠損エクソンをノックインで修復する手法などの検討を行った。これらの修復 iPS 細胞を骨格筋細胞へと分化させると、期待通り修復ジス
トロフィンタンパク質の発現が回復していることを確認した。
ゲノム編集はターゲット以外の部位を切断して変異を導入してしまうオフター
ゲットが最大の懸念事項である[Ishida K et al., Int J Mol Sci, 2015]。我々はオフ
ターゲット切断に伴う副作用変異の有無を検証するために、それぞれの修復 iPS
細胞において核型解析、CNV コピー数解析、およびエクソーム配列解析を行い、何れも致命的な変異は検出されなかった[Li et al, Stem Cell Reports, 2015]。
今後、ゲノム編集技術を用いた遺伝子治療を実現するためには、遺伝子修復 iPS細胞を分化させて移植する生体外 (ex vivo)遺伝子治療や、患者の体内で直接ゲノム編集を行う生体内(in vivo)遺伝子治療といったアプローチを検討していく必要がある。
このように CRISPR-Cas9 システムは非常に簡便かつ効率的なゲノム編集ツールであるが、ターゲット配列に PAM 配列とマッチする DNA 配列が必要であり、ターゲット部位選択の最大の障壁の一つである。一般的には"NGG"配列を PAMとして認識する化膿性レンサ球菌 (Streptococcus pyogenes, Sp)由来の CRISPRCas9 が最も広く使われているが、それ以外にもこれまでに様々な細菌種から
CRISPR 配列が同定されており、それぞれ違う PAM 配列を認識することが知られている。我々は Sp 由来 Cas9 の他、種々の CRISPR システムの DNA 切断活性を検討し、黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus, Sa)由来 Cas9 やアシダミノ
コッカス (Acidaminococcus sp., As)由来 Cpf1 はヒト細胞で高い切断活性を示すものの、髄膜炎菌 Neisseria meningitidis (Nm)由来とサーモフィラス菌 Streptococcus
thermophilus (St)由来 Cas9 はほとんど切断活性が無いことを見いだした。様々な CRISPR ツールを使い分けることで、ターゲット可能な領域を増やすことができ、DNA 変異タイプに応じた使い分けが今後、益々重要となる。我々の取り組むヒト細胞でのゲノム編集の効率化方法も紹介したい。

Current methodologies of genome editing

CRISPR toolbox towards efficient genome editing in patient iPS cells○Tetsushi Sakuma(Grad. Sch. Sci., Hiroshima Univ.)

Key words

genome engineering, TALEN, CRISPR-Cas9○Akitsu Hotta1,2(1CiRA, Kyoto Univ., 2iCeMS, Kyoto Univ.)

Key words

genome engineering, CRISPR, iPS cells, gene therapy

遺伝子改変技術によるセルエンジニアリングの革新：産業応用に向けて

1S-Ep03

ゲノム操作工学によるバイオ医薬品高生産細胞株構築技
術の開発

1S-Ep04○河邉 佳典, 上平 正道（九大院・工）kawabe@chem-eng.kyushu-u.ac.jp

バイオ医薬品の中でも特に注目されている抗体医薬は、糖鎖付加などの翻訳後修飾や適切なフォールディングができる動物細胞により生産されており、中でもチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞が生産ホストとしてよく用いられている。CHO 細胞による抗体医薬品生産では、プラットフォーム化が進められており、細胞株構築から細胞培養、分離精製、さらには製剤化までの流れが確立されている。しかし、生産における最上流プロセスとなる細胞株構築では、
通常、DHFR-MTX 法や GS-MSX 法をはじめとする遺伝子増幅処理が、高生産細胞株構築のために行われている。しかし、その方法は確立されてはいるものの、未知メカニズムによるところもあるため、数多くの細胞の中から、労力と時間をかけて製造に適した導入遺伝子の高生産細胞株の選抜が行われている。
そのため、高品質の生産物を安定的に高生産する細胞を迅速かつ確実に構築す
る技術の開発が望まれている。
我々はこれまで、部位特異的遺伝子導入法として組換え酵素 Cre と変異 loxP を用いて、CHO 細胞染色体にあらかじめ組み込んだ loxP 部位に酵素依存的に目的遺伝子を繰り返し導入できる部位特異的遺伝子多重化法、逐次遺伝子組込みシステム（AGIS）を開発してきた。システムの有効性をレポーター遺伝子で実証し、目的遺伝子を組換え抗体遺伝子発現ユニットとした場合、導入した発現
ユニット数に応じた抗体生産量の増加が見られた。Cre-RMCE による AGIS に
おいては、3 種類の独立して組換え反応が可能な変異 loxP を使用していたた
め、各組込み段階での効率が異なっていた。AGIS に関わる変異 loxP の数を 2種類に減らすことで、逐次組込みに用いる変異 loxP を限定でき、組込み反応をよりシンプルにした AGIS を開発し、AGIS での組込み効率を安定化させることができた。また、AGIS における目的遺伝子の組込み効率を高めるために、AGISに適した変異 loxP を探索したところ、組込み効率および反応特異性の高く、AGIS に適用可能な変異 loxP を、これまでに報告がない配列を含めて決定する
ことができた。
本演題では、これらの研究成果や、発現ユニットの最適化や逐次遺伝子組込みによる生産細胞株構築の迅速化法、人工ハイブリッドレトロウイルスを用いた
Cre/loxP による特定部位への遺伝子導入法など我々の最近の取り組みを紹介するとともに、今後の展望について議論したい。

細胞の遺伝子改変による創薬プラットフォームの開発○河原 正浩（東大院・工）kawahara@bio.t.u-tokyo.ac.jp

細胞で様々な機能を発揮するタンパク質の構造や機能の理解は、ゲノミクス、
プロテオミクスの時代を経て急速に進展し、人工タンパク質のデザインも行えるようになってきた。一方、近年の遺伝子工学的技術のめざましい進展により、遺伝子改変によって機能性細胞を意のままに創製できる時代となってきた。これらの知見や技術を利用し、細胞の遺伝子改変技術を創薬プラットフォームの確立に結び付けられれば、既存の創薬開発の幅を広げることができ産業応用上有用であろう。
演者らは、創薬開発の普遍的なターゲットともいえるタンパク質間相互作用を、生きた哺乳動物細胞で簡便に検出できる手法の開発を目指した。そこで注目したのが、増殖シグナルを伝達するサイトカイン受容体である。サイトカイン受容体はリガンドを受容したのち、複数の受容体鎖が近接することでキナーゼを活性化させ、シグナルを伝達する。この動作原理を応用すれば、標的タンパク
質間の相互作用に応じて増殖シグナルを伝達する人工受容体が創製でき、その結果、細胞増殖の有無をリードアウトとした簡便な検出系が実現できると考えた。
この概念を利用して、創薬の重要なターゲットである膜タンパク質に対する抗体を取得する系を構築した 1)。この系では、サイトカイン受容体 gp130 の細胞外ドメインを標的膜タンパク質抗原で置換した人工受容体遺伝子を構築し、細胞に導入して発現させる。この細胞に小分子リガンド依存的に二量体化する改変抗体遺伝子をさらに導入し、分泌発現させると、抗原特異的抗体であれば人工受容体に結合し、小分子リガンド依存的に細胞増殖を誘導するであろうという発想である。実際に、標的膜タンパク質抗原として癌抗原 ErbB2 を用いて実験したところ、ErbB2 特異的抗体クローンを用いた場合に小分子リガンド依存的な細胞増殖を誘導でき、また高親和性抗体発現細胞を大部分の低親和性抗体
発現細胞との混合物から濃縮することができた。
また、前出の概念を利用して、細胞内のタンパク質間相互作用を検出する系も構築した 2)。この系では、相互作用を検出したい二種類の標的タンパク質をそれぞれ増殖因子受容体 c-kit の細胞内ドメインに連結した人工受容体を細胞質で共発現させる。標的タンパク質間相互作用が生じたときには c-kit 細胞内ドメインが二量体形成により活性化され、増殖シグナルを伝達するであろうと考えた。
実際に、相互作用することが知られている FKBP12 と FRB 変異体、あるいはMDM2 の N 末端ドメインと pDI ペプチドのペアを標的タンパク質として用いて実験したところ、いずれの相互作用も細胞増殖をリードアウトとして検出できた。また、高親和性ペプチド発現細胞を大部分の低親和性ペプチド発現細胞との混合物から濃縮することができた。
本講演ではこれらの研究成果を報告するとともに、今後の展望についても議論したい。
1) Miura, T. et al., Biotechnol. Bioeng. 113, 1113-1123 (2016).
2) Mabe, S. et al., Sci. Rep. 4, 6127 (2014).

Generation of high-producer CHO cells using accumulative gene integration
system○Yoshinori Kawabe, Masamichi Kamihira(Fac. Eng., Kyushu Univ.)

Key words
integration

CHO cells, Cre-loxP, accumulative gene integration, targeted

89

Development of drug discovery platforms based on genetic engineering ofcells○Masahiro Kawahara(Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)

Key words

protein-protein interaction, signal transduction, screening

90

遺伝子改変技術によるセルエンジニアリングの革新：産業応用に向けて

1S-Ep05

遺伝子改変技術を支援するベクターの開発と疾患治療の実用化

1S-Ep06○峰野 純一（タカラバイオ株式会社 CDMセンター）
minenoj@takara-bio.co.jp

遺伝子治療の安全性評価―ゲノム編集技術の応用における留意点―○佐藤 陽治（国立医薬食衛研）
yoji@nihs.go.jp

1990 年 11 月、米国 NIH に於いてアデノシンデアミナーゼ欠損重症複合免疫不全症（ADA-SCID）に対する世界で初めての遺伝子治療が実施され、1995 年北海道大学で同じく ADA-SCID に対する日本で初めての遺伝子治療が実施された。当社は 1995 年に、レトロウイルスベクターを用いた造血幹細胞や T 細胞への遺伝子導入効率を飛躍的に高める補助剤「レトロネクチン」を開発し、遺伝子治療への取り組みが始まった。1999 年、フランス INSERM にて、X 連鎖重症複合免疫不全症に対する正常 IL-2 受容体 γ 鎖遺伝子を CD34 陽性細胞に導入
して自家移植する遺伝子治療を施され、際立った成功を収めたが、その後自家移植した患者に T 細胞白血病が発症、レトロウイルスベクターを用いた幹細胞
遺伝子治療の危険性が指摘され、SIN 型レトロウイルスベクターなどレトロウ
イルスベクターの改良やレンチウイルスベクターなど安全性の高いベクターの開発が進められた。iPS 細胞を樹立するため山中らが最初に使用した遺伝子導入ベクターはレトロウイルスベクターであった。その後、レンチウイルスベク
ター、アデノウイルスベクター、プラスミドベクター、センダイウイルスベク
ターなど遺伝子導入ベクターが順次使用した iPS 細胞の樹立が試みられていった。さらに cre-lox 系による挿入遺伝子の抜き取り、エピソーマルベクターな
ど、既存の遺伝子導入方法、制御方法を用いてより効率が高く安全性の高い iPS
細胞樹立方法が開発されていった。2012 年に重症または多発性の膵炎を伴うリポ蛋白リパーゼ欠損症（LPL 欠損症）に対する遺伝子治療薬が、2015 年にメラノーマに対する遺伝子治療薬が、それぞれ EMEA（欧州医薬品審査庁）と FDA（アメリカ食品医薬品局）により承認され、グローバル製薬企業も開発に名乗りを上げ、実用化にしのぎを削っている。遺伝子改変 T 細胞を用いたがん免疫細胞療法は T 細胞に遺伝子を導入してその細胞傷害性を利用して治療する療法
で、近年、HLA class I 分子上に提示されたがん抗原を特異的に認識する T 細胞
受容体（TCR）遺伝子をキラー T 細胞に導入して患者に輸注する ex vivo 遺伝
子治療（TCR 遺伝子治療）で多くの有効性が報告されている。また、細胞表面に存在する抗原を認識する一本鎖抗体（ScFv）から成るキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor；CAR）遺伝子をキラー T 細胞に導入する ex vivo 遺伝
子治療（CAR-T）も積極的に行われ、ALL や CLL で効果を上げている。2013
年、SCIENCE 誌の「ブレークスルー・オブ・ザ・イアー 2013」にがん免疫療法が選ばれ、免疫チェックポイント阻害抗体に加えて CAR を用いた遺伝子治療が取り上げられた。この様に、遺伝子治療の歴史は安全で高効率のベクター
開発の歴史でもあり、その経験と知識は再生医療やゲノム編集など、遺伝子改
変を伴う技術に浸透している。近年注目を集めているアデノ随伴ウイルスベク
ター（AAV）は、低い免疫原性・非病原性であるため安全性が高いベクターとして遺伝子治療への有用性が報告され、LPL 欠損症の遺伝子治療製剤や、最近国内で実施された AADC 欠損症の遺伝子治療に使用されている。我々は T 細胞を用いたがん免疫細胞療法の実用化のため、治療用遺伝子を効率的に発現するベクターの開発に着手、TCR に於いては T 細胞の内在性の TCRα 鎖・β 鎖を減じて目的とするがん抗原特異的 TCR 遺伝子を効果的に発現するベクター、CARに於いては新規細胞内ドメインを持つベクターの開発を行ってきた。がん抗原
NY-ESO-1 特異的 TCR を用いた固形がんに対する遺伝子治療臨床試験、抗 CD19
CAR を用いた非ホジキンリンパ腫に対する CAR 遺伝子治療臨床研究の支援を実施しているが、これら T 細胞を用いたがん免疫細胞療法の実用化をめざし、
1）治療用遺伝子を効率的に発現するベクターの開発、2）患者への負担を低減するため成分採血ではなく少量採血（全血 50～100 mL）から遺伝子改変 T 細胞
を 10^9 超の大量調製する技術の開発。3）高タイターガンマレトロウイルスベ
クターの開発、ベクター及びその産生マスターセルバンクの GMP 製造。4）閉鎖系システムを用いた遺伝子改変 T 細胞の作製方法の開発と GMP 製造。5）
LAM-PCR や挿入遺伝子コピー数測定など、遺伝子改変細胞投与後の患者モニタリングのための品質試験方法の開発とバリデーション。6）ウイルスベクターの GMP 製造施設及び、遺伝子導入細胞の GMP 調製施設（セルプロセッシング
センター：CPC）のデザイン、建設、品質管理システムの構築、等を進めてきた。本講演では、がん免疫細胞療法を中心に、ベクター開発と遺伝子治療実用化への取り組みと成果に関して紹介したい。

遺伝子治療は、致死的・重篤で治療法に乏しい先天性疾病等の根治的治療法となる可能性があり、大きな期待が寄せられている。特に、近年進展が著しいゲ
ノム編集技術の遺伝子治療への応用は、今後急激に開発が進むことが予想される。この際、当然ながら、ゲノム編集を利用した遺伝子治療の安全性の評価方
法を確立するとともに、安全性判断基準に関するガイダンス・コンセンサスを並行して構築することが必須となる。

Vector development to assist gene engineering technology and trial for
disease treatment

Points to Consider for the Safety of Gene Therapy Products and Genome
Editing Technologies○Junichi Mineno(Takara Bio Inc., CDM center)

Key words

gene therapy, TCR, chimeric antigen receptor, vector

ゲノム編集は次世代遺伝子治療として臨床応用の期待も大きいが、まだ開発初期段階の先端的技術であり、安全性が確立されたものとはいえない。特に、問題とされるのがオフターゲット効果である。オフターゲット効果とは、染色体の標的外の部位で遺伝子挿入やゲノム編集が起こることにより生理的に重要な
目的外遺伝子の機能が破壊されたり、発がん遺伝子等の望ましくない遺伝子が活性化される効果のことであり、ハザード（危険因子）の一つと考えられ、その評価法の開発が望まれている。オフターゲット効果の解析アプローチとしては、塩基配列検索技術が有効と考えられ、その開発および解析結果に基づいた
ゲノム編集技術応用遺伝子治療の安全性評価のガイダンスの作成等、安全性確保のための基盤の形成が課題である。
オフターゲット効果の他に、一般的に遺伝子治療においては、生殖細胞への遺伝子導入の可能性や非増殖性ウイルスベクターが増殖性を獲得する可能性など
が安全性上の懸念事項として挙げられる。また、ウイルスベクターを直接患者に投与する遺伝子治療（in vivo 遺伝子治療）の場合には、ウイルスベクターの体外への排出とモニタリングが大きな課題となる。体外で遺伝子導入を行った細胞を患者に投与する場合（ex vivo 遺伝子治療）には、再生医療等安全性確保法が定義する「細胞加工物」としての品質・安全性の確保も求められる。なお、いずれの場合であっても、先端的医療（＝経験の乏しい医療）であるという観点から、遺伝子治療を受けた患者の長期フォローアップの実施とリスクマネジ
メントプランの策定が重要とされている。

○Yoji Sato
(Natl. Inst. Health. Sci.)

Key words

gene therapy, genome editing, safety酵素学，酵素工学

1P-1p001 進化工学的手法を用いた立体選択的カルボニルレダク
ターゼの熱安定性・有機溶媒耐性の向上

91

1P-1p003 Methylobacterium extorquens AM1 による植物生理活性物質の分泌と植物共生○田中 美知留, 矢野 裕之, 田中 三男, 三井 亮司（岡山理大・理）rmitsui@dbc.ous.ac.jp○小野 智博 1, 井上 瑞葉 1, 岡野 憲司 1, 出来島 康方 2, 川端 潤 2,
本田 孝祐 1
（1阪大院・工, 2三菱化学科学技術研究セ）
tomohiro_ono@bio.eng.osaka-u.ac.jp「背景と目的」
Ogataea minuta 由来カルボニルレダクターゼ(OCR1)は位置・立体選択的なケト基の還元反応を触媒し、医薬品合成前駆体として有用なキラルアルコール生産酵素として産業利用されている。通常、酵素反応は水中で行われるが OCR1 の基質の中には水に溶けにくいものがあるため、これらの難水溶性基質を水系反応相に溶かし込むために、dimethyl sulfoxide (DMSO)やエタノールのような親水性の有機溶媒が用いられる場合がある。本研究では進化工学的手法により OCR1の有機溶媒耐性ならびに熱安定性の向上を試みたので報告する。
「方法」
有機溶媒として DMSO、OCR1 の基質として 2,2,2-trifluoroacetophenone (TFAP)を用いた。野生型 OCR1 を鋳型としてエラープローン PCR を行い大腸菌の形質転換を行うことで変異型 OCR1 のライブラリを構築した。変異型 OCR1 を発現させた組換え大腸菌のコロニーをメンブランフィルターに写し取り、60% (v/v)
DMSO に浸して 50℃で 2 時間インキュベートした。その後 OCR1 によるシクロ
ヘキサノール酸化反応と MTT の還元による呈色反応をカップリングさせることにより、OCR1 活性のハイスループットなスクリーニングを行った。この方法により約 40000 株のライブラリから 15 株が選別された。これらの株から
OCR1 粗酵素液を調製し、50% (v/v) DMSO 存在下で 50℃でンキュベートした後の TFAP に対する残存活性を評価した。活性測定の結果 V166A の変異を持った
OCR1 が最も高い活性を示した。野生型 OCR1 と V166A 変異体を用いて酵素の熱および有機溶媒への耐性を比較した。この結果、主に熱ストレスへの耐性の変化が V166A 変異体の安定性向上に寄与していることが明らかになった。現
在、V166A 変異体を用いた難水溶性ケト化合物の変換試験を実施中である。

【目的】 Methylobacterium 属は環境中に普遍的に見いだされる細菌であるが、近年植物との共生関係を有していることに注目が集まっている。Methylobacterium
属は植物より放出されるメタノールを得て生育する一方で、オーキシンやサイ
トカイニンといった植物ホルモンを生産することにより植物の生長促進を促し、葉上優勢種として共生関係を構築している。私たちはこれまでにMethylobacterium 属の植物生長に寄与する化合物として酸化還元酵素の補酵素でもある PQQ に着目して研究を進めてきた。今回新たに Methylobacterium 属が生産する植物生理活性物質の候補としてポリアミンに着目したので報告する。
【方法・結果】 Methylobacterium 属は土壌中に存在する La3+や Ce3+等のランタノ
イドを生育環境シグナルとして利用していると考えている。PQQ は M. extorquens
AM1 を用いてメタノールを炭素源とした場合、葉上環境を意図して La3+非存在下で培養すると培養液中に分泌されるが、土壌環境を意図する La3+濃度が高い条件で培養を行った場合はほとんど菌体外に分泌されないことを明らかにしてきた。今回 PQQ 同様にプトレシンなどのポリアミンが植物との共生に関与していることを推定し、M. extorquens AM1 のポリアミン分泌にかかわることが推定されるポリアミンパーミアーゼ(PPase)に着目した。メタノールを炭素源として培養した菌体の PPase 遺伝子発現量を RT-qPCR を用いて測定し、コハク酸を用いて培養した菌体と比較した。この結果、PPase 遺伝子はメタノールにより誘導されていることが明らかになった。現在 PQQ 生合成系遺伝子と同様に La3+濃度が PPase 遺伝子の発現に影響を与えるのか、また PPase の発現が見られる培
養条件で菌体外にポリアミン分泌を行っているのか検討中である。

Improvement of the thermal and organic-solvent tolerance of anenantioselective carbonyl reductase by directed evolution

Production of physiologically active plant substances by M. extorquens AM1for plant symbiosis.

Key words
carbonyl reductase, thermal stability, organic-solvent tolerance,
directed evolution

Key words
Methylobacterium extorquens AM1, methylotroph, polyamine, plant
symbiotic bacteria

1P-1p002 Methylobacterium extorquens AM1 のメタノール脱水素

1P-1p004 Aspergillus aculeatus 由来 FAD 型グルコースデヒドロゲ○Tomohiro Ono1, Mizuha Inoue1, Kenji Okano1, Yasumasa Dekishima2,
Hiroshi Kawabata2, Kohsuke Honda1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2MCRC)

酵素のアイソザイムに関する研究○Michiru Tanaka, Hiroyuki Yano, Mitsuo Tanaka, Ryoji Mitsui(Fac. Sci., Okayama Univ. Sci.)

ナーゼホモログの機能解析○一小路 貴士 1, 矢野 裕之 1, 中川 智行 2, 谷 明生 3, 田中 三男 1,
三井 亮司 1
（1岡山理大・理, 2岐阜大・応生科, 3岡山大・資源植物科研）
rmitsui@dbc.ous.ac.jp○岡 修司, 谷 修治, 炭谷 順一, 川口 剛司（阪府大院・生環科）
oka24@baseball.zaq.jp【目的】Methylobacterium 属は植物に生育促進物質を供給することにより植物か
らのメタノールの放出を促し、葉上の優勢種として共生している。植物の発芽から生長に伴い Methylobacterium 属は複数のメタノールデヒドロゲナーゼ(MDH)
使い分けて土壌から葉上へと移行していることが考えられる。本研究で用いている M. extorquens AM1 の MDH はゲノム中に Ca2+を補欠因子とする mxaFI と
La3+, Ce3+等のランタノイドを補欠因子とする xoxF1 と機能未知の xoxF2 が存在している。La3+や Ce3+は一般的な土壌中にも広く存在していることが報告されている。私たちは M. extorquens AM1 が培地中の La3+濃度に応じて xoxF1 の発現量をコントロールしており、La3+濃度が極めて低い場合にのみ MxaFI を発現することを報告してきた。葉上には La3+や Ce3+は土壌と比較すると極めて少なく、
ランタノイドが土壌と葉上を検知するシグナルとなっていると推測される。そこで今回は Methylobacterium 属の植物との共生に各 MDH が果たす役割を明らかにすることを目的として XoxF2 に着目して解析を行ったので報告する。
【方法・結果】XoxF2 の役割を明らかにするため XoxF1 と同様に His-tag が付与されるように設計した株を作製し、発現を RT-qPCR、発現産物をウェスタンブ
ロットにより確認した。その結果、メタノールを炭素源とした場合、xoxF1 も
xoxF2 も La3+の添加により誘導を受けることが明らかになった。しかし、炭素源としてコハク酸を用いた場合、XoxF1 は La3+を添加することで発現が確認できるのに対し、XoxF2 は La3+を添加しても発現しなかった。このことから XoxF2
は La3+とメタノールの共存在下で発現することが明らかになった。

【目的】自己血糖値測定に使用される酵素センサに応用可能な酵素として FAD
型グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が注目されている。FAD-GDH は
数種の Aspergillus 属において菌体外酵素として生産されることが報告されている。我々は Aspergillus aculeatus においてゲノム情報から FAD-GDH 遺伝子と相同性の高い二つのホモログ遺伝子（gdha, gdhb）が存在していることを見いだした。特に GDHA は一次配列のホモロジー解析から FAD-GDH と FAD 型グルコー
スオキシダーゼの中間に位置しており、他の Aspergillus 属が有する FAD-GDHと異なった性質を有している可能性が考えられた。そこでこれら二つの遺伝子を発現させ、発現産物の酵素学的性質を検討することを目的とした。
【方法及び結果】A. aculeatus のゲノムから gdha, gdhb を取得し、推定されるシ
グナル配列、イントロンを除去した領域を PCR により増幅した。得られた遺伝
子を大腸菌発現ベクター pET20b に発現産物の C 末端側に His-tag が付加される
よう挿入したプラスミドを用いて大腸菌を形質転換した。形質転換体を 15℃にて培養し、SDS-PAGE により発現産物を確認したところ、ほとんどの発現産物
が不溶性画分に分画されたが、可溶性画分に GDH 活性が確認された。GDHA
は Aspergillus 属の他の FAD-GDH と同様に糖鎖が付加されることが予想されるが、今回糖鎖が付加されない大腸菌において活性を検出することができた。現
在 gdhb について大腸菌での発現を検討中であり、両遺伝子の A. oryzae を宿主とした発現についても報告予定である。

Expression analyses of lanthanides-dependent methanol dehydorogenases in
M. extorquens AM1.

Functional analysis of FAD-dependent glucose dehydrogenase homologues
from Aspergillus aculeatus

Key words
Methylobacterium extorquens AM1, methylotroph, methanol
dehydrogenase, plant symbiotic bacteria

Key words○Takashi Ichikoji1, Hiroyuki Yano1, Tomoyuki Nakagawa2, Akio Tani3,
Mitsuo Tanaka1, Ryoji Mitsui1(1Fac. Sci., Okayama Univ. Sci., 2Fac. Appl. Biol. Sci., Gifu Univ., 3IPSR., Okayama
Univ.)○Shuji Oka, Shuji Tani, Junichi Sumitani, Takashi Kawaguchi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Aspergillus aculeatus, FAD-dependent glucose dehydrogenase

92

酵素学，酵素工学

1P-1p005 Cordyceps militaris 由来リボヌクレオチドレダクターゼの発現及び機能解析

1P-1p007 超好熱性アーキアにおける NAD+熱分解産物の代謝機構○蜂須賀 真一 1, 佐藤 喬章 1,2, 跡見 晴幸 1,2（1京大院・工, 2JST, CREST）
atomi@sbchem.kyoto-u.ac.jp

小島 康弘 1, ○加藤 竜也 1,2, 朴 龍洙 1,2（1静大・農, 2静大グリーン科学技術研）
park.enoch@shizuoka.ac.jp【背景・目的】冬虫夏草属に属する Cordyceps militaris（サナギタケ）は抗腫瘍作用・免疫調節作用などの生理活性を示すコルジセピンを産生する。コルジセ
ピンは冬虫夏草菌のみ産生することが認められており、アデノシンのリボース
部分の 3’位の水酸基が水素に置換された構造である。しかし、コルジセピンの生合成経路は未だ判明していないが、リボヌクレオチドレダクターゼ（RNR）
によってアデノシン二リン酸（ADP）のリボースの 3’位の水酸基が水素に置換され、3’-dADP を生成し、それに続く脱リン酸化酵素との反応によりコルジセ
ピンが合成されると推測されている。本研究では、C. militaris NBRC9787 由来の RNR の ADP から 3’-dADP への触媒反応について解析を行った。
【方法・結果】C.militaris 由来 RNR は二つのサブユニット（CmR1, CmR2）から成る酵素であるため、pCold I ベクター（TaKaRa）を用いて RNR 発現用ベク
ター、pCold I-RNR CmR1 及び pCold I-RNR CmR2 を構築し、大腸菌 BL21 による発現を行った。特に CmR1 については、大腸菌由来シャペロン GroES-GroELとの共発現によりその可溶性を向上させた。発現された CmR1 および CmR2 を精製して、ADP と反応させて HPLC により生成物の解析を行った。この結果、
ADP から 2’-dADP への生成は確認されたが、3’-dADP の生成は確認できなかった。このことから C. militaris NBRC9787 由来の CmR1 および CmR2 から成る
RNR は RNR 活性を有していることは認められたものの、コルジセピン生合成には直接関与しないと考えられた。

【背景・目的】超好熱菌を含めた全ての生物にとって、nicotinamide adenine
dinucleotide（NAD+）は酸化（還元）酵素の反応において重要な補因子の 1 つである。しかし、NAD+は高温で不安定であり、分解されやすいことが知られている。そのため超好熱菌のような高温環境で生育する生物は、生体内の NAD+
濃度を維持するような機構や、NAD+の熱分解産物を代謝するような機構を有すると考えられる。そこで本研究では、至適生育温度が 85℃である、超好熱性アーキア Thermococcus kodakarensis を対象として、NAD+の熱分解に対応する機構を解明することを目的とした。
【実験・結果】まず、85℃において NAD+を熱処理し、その分解産物を解析した。その結果、NAD+の熱分解産物が nicotinamide および ADP-ribose であることを同定した。そこで、この ADP-ribose を代謝する可能性のある酵素を T.
kodakarensis の ゲ ノ ム 上 か ら 探 索 し た と こ ろ 、 そ の 候 補 と し て ADP-ribose
pyrophosphatase (ADPR-PPase）と推定される TK2284 遺伝子を見出した。ADPRPPase は一般に、ADP-ribose を ribose 5-phosphate (R5P)および AMP に分解する酵素である。そこで TK2284 組換え型タンパク質を調製し、ADP-ribose を含めた様々なヌクレオシド二リン酸誘導体に対して基質特異性を検討したところ、
ADP-ribose および ADP-glucose に対して有意な活性を示した。この 2 つの基質に対して、速度論的解析を行ったところ、ADP-ribose に対する kcat/Km 値は
ADP-glucose に対する値よりも約 53 倍高いことが示された。よって、TK2284
タンパク質の生理的基質は ADP-ribose である可能性が高いと考えられた。以上の結果から、高温環境に生育する本菌において、NAD+の熱分解から ADP-riboseが生じてしまい、それを TK2284 タンパク質が再利用可能な R5P や AMP に分解していることが予測される。

Expression and functional analysis of ribonucleotide reductase of Cordyceps

Metabolism dealing with thermal degradation of NAD+ in
hyperthermophilic archaea

militaris

Yasuhiro Kojima1, ○Tatsuya Kato1,2, Enoch Y. Park1,2(1Fac. Agric., Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)

Key words

Cordyceps militaris, Ribonucleotide reductase, Cordycepin

1P-1p006 Aspergillus oryzae 由来 D-乳酸脱水素酵素（D-LDH）のアロステリック特性○Shin-ichi Hachisuka1, Takaaki Sato1,2, Haruyuki Atomi1,2(1Grad. Sch. Eng., Kyoto Univ., 2JST, CREST)

Key words

1P-1p008 病原菌由来 S46 ペプチダーゼの酵素学的諸性質の解明○伊藤 康広 1, 鈴木 義之 1, 志田 洋介 1, 阪本 泰光 2, 田中 信忠 3,
小笠原 渉 1
（1長岡技科大, 2岩手医科大・薬, 3昭和大・薬）owataru@vos.nagaokaut.ac.jp○渡部 昭, 佐藤 陽子, 五味 勝也（東北大院・農）gomi@biochem.tohoku.ac.jp【目的】 乳酸脱水素酵素(LDH)では、バクテリア由来の一部の L-LDH がホモ 4量体構造をとりフルクトース 1,6-ビスリン酸(FBP)によるアロステリック制御を受けることが非常によく解析されているが、D-LDH に関しては一部のバクテリ
アの酵素を除いてそのアロステリック特性の解析はほとんど行われていない。
先に我々は、乳酸の効率的な生産を目指し、麹菌ゲノム解析情報を利用してAspergillus oryzae から D-LDH 遺伝子を探索し大腸菌で高発現させ、その酵素学的諸性質を報告した(1)。今回は、本酵素のアロステリック特性について調べたので報告する。
【結果と考察】先に報告した A. oryzae 由来の D-LDH は、SDS-PAGE、Blue Native
PAGE 及びゲルろ過法を用いた解析からホモ 6 量体であると推定された(1)ため、本酵素についてアロステリック特性の有無について解析した。基質(ピルビン酸)、補酵素(NADH)のみを反応系に含む場合の活性を 100％とした際の相対活性は、1mM FBP の存在下では 133％まで賦活化された。また、FBP によるアロ
ステリック制御を受ける Thermus aquaticus や Lactobacillus casei の L-LDH がク
エン酸や Mn2 ＋ のような金属イオンによって活性化されることから、本酵素についても解析したところ 1mM クエン酸の存在下で本酵素は 165％まで活性が上昇し、1mM の Mg2 ＋、Ca2 ＋の存在下で各々 149％、150％の相対活性を示した。
この結果から、A. oryzae 由来の D-LDH は FBP、クエン酸、Mg2 ＋及び Ca2 ＋に
よってヘテロトロピックな活性化を受けることが明らかとなった。このように、真菌類由来の D-LDH がバクテリアのアロステリック制御型 L-LDH のエフェク
ター因子である FBP やクエン酸によって活性化される例は初めてであり、本酵素の FBP、クエン酸の有無によるピルビン酸を基質とした基質飽和曲線も解析し報告する。

hyperthermophile, NAD+, ADP-ribose, thermal degradation(1) 渡部ほか、2016 年度日本農芸化学会大会講演要旨集、p53[背景と目的] 当研究室は、これまでに Pseudoxanthomonas mexicana WO24 由来の peptidase family S46 に属する dipeptidyl aminopeptidase BII (PmDAP BII) の立体構造と切断メカニズムの構造機能相関を初めて明らかにした。S46 ペプチダー
ゼの基質 P1 認識残基として、アミノ酸 675 番目(PmDAP BII)が見出されており、G / R / S の 3 種のアミノ酸が普遍的に保存されている。G が保存されているグループ(G タイプ)の PmDAP BII は脂肪族、芳香族および塩基性アミノ酸に特異的である。一方、同じく G タイプの歯周病原因菌 Porphyromonas gingivalis
由来 dipeptidyl peptidase7(PgDPP7)は PmDAP BII の基質特異性に加え、酸性アミノ酸に対して特異性を示す事から、アミノ酸 675 番目の他に基質特異性へ関与する残基の存在が示唆された。そこで本研究では、G タイプの基質特異性を決定するメカニズムの完全解明を目指し、PmDAP BII と PgDPP7 に加え、G タイ
プの多剤耐性日和見菌 Stenotrophomonas maltophilia 由来 SmDPP7 の酵素学的諸性質の解析を行うことで、新たな基質特異性決定残基の解明を目指した。
[結果] 発現用ベクターは、大腸菌に対してコドン使用頻度最適化した全合成遺伝子 pgdpp7 および smdpp7 を pET22b(+)に導入し、PgDPP7 と SmDPP7 の発現および精製に成功した。そして、新たに SmDPP7 の基質特異性が DAP BII の基質特異性に加え、プロリン特異性の保持を明らかにした。さらに、PmDAP BIIの立体構造と PmDAP BII、PgDPP7 および SmDPP7 のマルチプルアライメント
解析の併用により、S1 ポケットにおいて PgDPP7 だけが 4 残基(A670 / G673 /D674 /T684)を保存していた。推定した 4 残基は、PgDPP7 のみが保持する酸性特異性の要因と推測し、変異酵素解析を行う予定である。また、DAP BII で報告されているプロリンのイミド結合切断能について、PgDPP7 および SmDPP7で解析中である。

Allosteric function of homohexameric D-lactate dehydrogenase from

Enzymatic characterization of S46 peptidase from pathogenic bacteria

Aspergillus oryzae○Akira Watanabe, Yoko Sato, Katsuya Gomi
(Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)

Key words

Aspergillus oryzae, D-lactate dehydrogenase, D-lactic acid, allosteric○Yasuhiro Ito1, Yosiyuki Suzuki1, Yosuke Sida1, Yasumitsu Sakamoto2,
Nobutada Tanaka3, Wataru Ogasawara1(1Nagaoka Univ. Technol., 2Sch. of Pharm., Iwate Med. Univ., 3Sch. of Pharm.,
Showa Univ.)

Key words

Dipeptidyl peptidase, substrate specificity, family S46

酵素学，酵素工学

1P-1p009 Burkholderia 属細菌由来アセチルコリンエステラーゼ組換え体の諸性質解析と農薬検出系への応用

93

1P-1p011 GH5_8 マンナナーゼの熱安定化メカニズムの解明○熊谷 祐也 1,2, 裏地 美杉 1, Wan Kun 1, 奥山 正幸 2, 木村 淳夫 2,
畑中 唯史 1
（1岡山生物研, 2北大院・農）hatanaka@bio-ribs.com○北村 智彬 1, 藤本 拓哉 1, 泊 直宏 2, 山本 佳宏 2, 鶴岡 直樹 3,
茂里 康 4, 渡部 邦彦 1（1京府大院・生命環境, 2京産技研, 3産総研・生物プロセス, 4産総研・健康工学）
kwatanab@kpu.ac.jp【背景・目的】既存の農薬検出器は高コストかつ操作が煩雑であるため、より安価で簡便な検出系開発が急がれている。本研究では、動物由来以上に安価で機能改変容易な微生物由来アセチルコリンエステラーゼ (AChE)を用いて、農薬による阻害性を指標とした定量的検出系の開発を試みている。これまでに AChE
産生菌の Burkholderia 属細菌 Para-1 株を単離し、AChE とその遺伝子の研究を行っているが、元菌株は AChE 産生量が少ないため、大腸菌発現系を用いた組換え体 AChE (rAChE)の大量発現を行い、諸性質の解析と農薬検出器への応用を試みた。
【方法・結果】Para-1 株由来 AChE は 57.5 kDa で動物由来 AChE とは約 30％の一次配列相同性があり、Ser-Glu-His の活性残基とオキシアニオンホールの形成が共通するなど、酵素機能と構造が類似すると予想された。一方動物由来 AChEとは異なり、一次配列内に 10 個もの Cys 残基を保持していた。また大腸菌発
現では、培養温度 25℃以下で可溶化し、Para-1 株と比べ約 200 倍の活性を示した。この大腸菌無細胞抽出液を 2 種のクロマトグラフィー（DEAE-cellulose、Superdex 200）に供し、rAChE を電気泳動的に均一に精製した。rAChE 0.02 μg/
mL を 37℃、5 min 処理すると活性が約 90％減少したが、50 倍濃度 BSA 添加で
約 90％の活性が維持されたため、rAChE の安定性には温度とタンパク質濃度が重要であると判った。また rAChE の Km は 0.36 mM と元菌株由来 AChE と同等で、有機リン農薬(methamidophos)、カルバメート農薬（propoxur）に対する Ki
もそれぞれ 0.079 mM、0.74 mM と動物由来 AChE と同値だったため、農薬検出系への応用に rAChE が動物由来 AChE の代替酵素になると示唆された。現在、
農薬検出系デバイス、ion-sensitive field-effect transistor (ISFET)を用いた農薬濃度分析への応用を進めると共に、rAChE 安定化に向けた変異体作製も試みている。

【背景と目的】一次構造からマンナナーゼは主に Glucoside Hydrolase Family (GH)
5 および 26 に分類される。GH5 はサブファミリー(GH5_X)が提唱されており、マンナナーゼは GH5_7, 8, 10 および 17 に分類される。GH5_8 は actinobacteria,
firmicutes および proteobacteria 由来のタンパク質から構成される。これまでに4 種類の放線菌マンナナーゼの性状解析を行ってきた。これらは actinobacteria
内の異なる分枝に属し、すべてカルシウムイオン(Ca)により熱安定性が上昇する。本研究は一部の配列に共通した Ca による熱安定化の分子機構の解明に加え、GH5_8 タンパク質における熱安定化メカニズムについて考察した。
【方法】放線菌 Streptomyces thermolilacinus 由来マンナナーゼ(StMan)は大腸菌を宿主とし組換えタンパク質として作製した。点変異体は PCR によって作製した。Ca との結合定数は ITC により求めた。タンパク質配列は CAZy database より取得し、neighbor-joining 法により系統樹を作製した。マンナンに対する酵素
活性は 3,5-ジニトロサリチル酸法により求めた。
【結果と考察】StMan のループ 7 にある 4 つのアミノ酸（Gly276, Asp283, Pro284
および Glu286）が Ca の結合に関与し、熱安定性の上昇に関わることが分かった。ループ 6 の Ser247 およびループ 7 の Asp279 は水素結合を形成する。これ
らの Ala 変異体は Ca 結合能を有し、親酵素よりも弱いが Ca による熱安定性の上昇も保持していた。親酵素と変異酵素の Ca が無い場合の熱安定性は変わらないことから、ループ間の水素結合が熱安定化に必須であった。水素結合の形
成は StMan と同じ分枝のタンパク質だけに保存されており、他の 3 種類のマンナナーゼには見られなかった。また一次構造からループ 7 への Ca 結合メカニ
ズムは GH5_8 に広く存在する可能性が示された。

Studies of acetylcholinesterase from Burkholderia sp. Para-1 for simple
pesticides analyzer

Mechanism of thermal stability in GH5_8 mannanases○Chiaki Kitamura1, Takuya Hujimoto1, Naohiro Tomari2, Yoshihiro Yamamoto2,
Naoki Tsuruoka3, Yashushi Shigeri4, Kunihiko Watanabe1(1Grad. Sch., Life Environ. Sci., Kyoto Pref. Univ., 2KITC, 3BRI. AIST, 4Health Res.
Inst., AIST)

Key words

Burkholderia sp., acetylcholinesterase, residual pesticides, ISFET

1P-1p010 麹菌由来イソプリメベロース生成酵素を用いた新奇オリ
ゴ糖の生産○Yuya Kumagai1,2, Misugi Uraji1, Kun Wan1, Masayuki Okuyama2, Atsuo Kimura2,
Tadashi Hatanaka1(1Res. Ins. Biol. Sci., (RIBS) Okayama, 2Grad. Sch. Agric., Hokkaido Univ.)

Key words
analysis

actinomycetes, glycoside hydrolase, thermostability, phylogenetic

1P-1p012 乳酸菌 Leuconostoc mesenteroides 由来不溶性グルカンの細菌型 α-1,3-グルカナーゼによる加水分解○矢野 成和 1, 難波 孝行 2, 玉木 友理 2, 残間 寿美香 1, 今野 博行 1,
立木 隆 3, 若山 守 3（1山形大院・理工, 2山形大・工, 3立命館大・生命科学）
shige-y@yz.yamagata-u.ac.jp○松沢 智彦, 矢追 克郎（産総研・生物プロセス）
matsuzawa-tomohiko@aist.go.jp

麹菌の生産するイソプリメベロース生成酵素はキシログルカンオリゴ糖の非還元末端からイソプリメベロース（α-D-Xylp-(1,6)-D-Glcp）を遊離するユニークな酵素であり、我々は本酵素をコードする遺伝子（ipeA: isoprimeverose producing
enzyme A）を真核微生物において初めて同定することに成功した。IpeA の基質
特異性を調べたところ、本酵素はキシログルカンオリゴ糖の非還元末端のイソ
プリメベロースユニットを厳密に認識し、グルカン主鎖を加水分解してイソプ
リメベロースを遊離することが明らかになった。そのため、非還元末端にキシロース側鎖のないキシログルカンオリゴ糖や、キシロース側鎖にさらにガラク
トースなどの糖が付加したキシログルカンオリゴ糖には作用できない。また、
IpeA は加水分解活性だけでなく、高い糖転移活性も有していることが明らかになり、本酵素を用いることでキシログルカンオリゴ糖にイソプリメベロースユ
ニットを転移し、非天然型の新奇オリゴ糖を生産できることが明らかになった。

【背景と目的】 乳酸菌 Leuconostoc mesenteroides は、スクロースを炭素源とした時、菌体外に不溶性グルカンを生産する。この不溶性グルカンは、α-1,6-グルコシド結合と α-1,3-グルコシド結合から構成されており、グルカンスクラーゼの糖転移反応によって生成される。不溶性グルカンは、真菌、あるいは細菌由来
デキストラナーゼによって加水分解されることは知られているが、α-1,3-グルカ
ナーゼを用いた検討は十分に行われてこなかった。本研究では、Bacillus circulans
KA-304 の α-1,3-グルカナーゼを用いて、不溶性グルカンの加水分解を行い、加水分解産物を分析することを目的とした。
【 方 法 】 不 溶 性 グ ル カ ン は 、 L. mesenteroides の 培 養 液 か ら 調 製 し た 。 L.
mesenteroides はスクロースを炭素源に改変した MRS 培地で 2 日間培養し、遠心分離することで不溶性グルカンを回収した。得られた不溶性グルカンは、蒸留水で 2 回洗浄し、凍結乾燥した。B. circulans KA-304 の α-1,3-グルカナーゼ
は、大腸菌発現系を用いて生産した。
【結果と考察】不溶性グルカン（1％）含む反応液に、α-1,3-グルカナーゼ（0.3mg/ml）を添加して加水分解反応を行った結果、約 1.5 mM の還元糖が遊離することを確認した。同基質をデキストラナーゼで加水分解した場合は、約 16 mM の還元糖が遊離した。α-1,3-グルカナーゼによる加水分解産物を分析したところ、グルコース、ニゲロース、ニゲロトリオースとニゲロテトラオースが含まれていた。以上の結果から、不溶性グルカンの主鎖は α-1,6-グルコシド結合から構成されているが、長鎖の α-1,3-グルコシド結合のみからなる分枝も存在することが確認できた。さらに本研究では、デキストラナーゼ処理とアルカリ抽出処理したグルカンを調製し、α-1,3-グルカナーゼによる加水分解反応を行った。

Production of novel oligosaccharides using Aspergillus oryzae
isoprimeverose producing enzyme

Hydrolysis of insoluble glucan from Leuconostoc mesenteroides by bacterial
α-1,3-glucanase○Tomohiko Matsuzawa, Katsuro Yaoi
(BRI. AIST)

Key words

Aspergillus oryzae, oligosaccharide, xyloglucan, transglycosylation○Shigekazu Yano1, Takayuki Nanba2, Yuri Tamaki2, Sumika Zanma1,
Hiroyuki Konno1, Takashi Tachiki3, Mamoru Wakayama3(1Grad. Sch. Sci. Eng., Yamagata Univ., 2Fac. Eng., Yamagata Univ., 3Coll. Life Sci.,
Ritsumeikan Univ.)

Key words

Leuconostoc mesenteroides, insoluble glucan, alpha-1, 3-glucanase

94

酵素学，酵素工学

1P-1p013 A structurally novel chitinase from thehyperthermophilic archaeon, Thermococcus

1P-1p015 Streptomyces 属放線菌由来の 2 つの β-D-ガラクトフラ
ノシダーゼの比較○松永 恵美子 1, 八色 奈央 1, 豊田 早紀 1, 岡 拓二 2, 樋口 裕次郎 1,
竹川 薫 1（1九大院・農, 2崇城大・生物生命）
takegawa@agr.kyushu-u.ac.jp

chitonophagus○Tamotsu Kanai1,2, Ayumi Horiuchi1, Mehwish Aslam1,
Haruyuki Atomi1,2(1Grad. Sch. Eng., Kyoto Univ., 2CREST, JST)atomi@sbchem.kyoto-u.ac.jp
A structurally novel chitinase, Tc-ChiD, was identified from Thermococcus
chitonophagus, a hyperthermophilic archaeon that can grow on chitin as the soleorganic carbon source. The gene encoding Tc-ChiD contains regions corresponding toa signal sequence, two chitin-binding domains and a putative catalytic domain. This
catalytic domain shows no similarity with previously characterized chitinases, but
resembles an uncharacterized protein found in the mesophilic anaerobic bacterium
Clostridium botulinum. Recombinant Tc-ChiD protein was produced in Escherichia
coli. Enzyme assays using N-acetylglucosamine (GlcNAc) oligomers indicated that TcChiD can hydrolyze GlcNAc oligomers longer than (GlcNAc)4. Chitinase assays using
colloidal chitin suggested that Tc-ChiD is an exo-type chitinase that releases(GlcNAc)2 or (GlcNAc)3. Analysis using GlcNAc oligomers modified with pnitrophenol suggested that Tc-ChiD recognizes the reducing end of chitin chains. In T.
chitonophagus, another chitinase ortholog that is similar to Thermococcus
kodakarensis chitinase, ChiA, is present that can degrade chitin from the non-reducing
ends. Therefore, the presence of multiple chitinases in T. chitonophagus with different
modes of cleavage may contribute to its unique ability to efficiently degrade chitin.

Aspergillus 属など一部の糸状菌の糖鎖の末端やガラクトマンナン(GM)の側鎖には 1 個ならびに複数個のガラクトフラノース(Galf)が結合している。β-D-ガラク
トフラノシダーゼ(Galf-ase)はこの Galf のグリコシド結合を加水分解して、遊離させることができる酵素であり、糖鎖中の Galf の機能及び構造解析を行うために重要な酵素である。我々は Galf-ase を生産する放線菌（JHA19）を単離し、そのゲノム配列を決定して本酵素の同定に成功した。さらに、本酵素が Galf 特
異的な新奇酵素であることを明らかにした(Matsunaga et al. PLOS ONE e0137230
2015)。我々は JHA19 株以外にも別の放線菌 JHA26 株の培養液中にも、高い
Galf-ase 活性を見出した。そこで JHA26 株の全ゲノム塩基配列を決定し、JHA19
Galf-ase と相同性の高い遺伝子を検索した。その結果、JHA26 株も Streptomyces
属放線菌に属していること、またゲノム中の１遺伝子が Galf 特異的な Galf-ase
であることがわかった。そこで JHA19 と JHA26 由来の Galf-ase の比較を行った。両酵素の諸性質に関しては大きな違いはなかったが、JHA19 Galf-ase がJHA26 酵素よりも比較的熱に安定であることがわかった。また、JHA19 Galf-ase
は C 末端側に AbfB ドメインを持つのに対し、JHA26 Galf-ase は N 末端側に P14
ドメインを持つことがわかった。JHA26 Galf-ase の P14 ドメインを除去しても、
pNP-Galf 及び Aspergillus fumigatus から調製した GM に対する酵素活性は変化しなかったことから、P14 ドメインは本酵素活性に重要ではないことがわかった。

A structurally novel chitinase from the hyperthermophilic archaeon,

Comparison of two β-D-galactofuranosidases from Streptomyces species

Thermococcus chitonophagus○Tamotsu Kanai1,2, Ayumi Horiuchi1, Mehwish Aslam1, Haruyuki Atomi1,2(1Grad. Sch. Eng., Kyoto Univ., 2CREST, JST)Key words

chitinase, archaea, hyperthermophile, chitin

1P-1p014 Streptomyces thermodiastaticus 由来耐熱、好酸性キチ
ナーゼの諸性質の検討○Emiko Matsunaga1, Nao Yairo1, Saki Toyota1, Takuji Oka2, Yujiro Higuchi1,
Kaoru Takegawa1(1Fac. Agric., Kyushu Univ., 2Fac. Biotechnol. Life Sci., Sojo Univ.)

Key words
beta-galactofuranose, beta-galactofuranosidase, Streptomyces sp.,
Aspergillus sp.

1P-1p016 Bacillus 属細菌由来ピルビン酸化ガラクトース含有糖鎖分解酵素の諸性質の解析○武 慶太郎 1, 藤木 英寿 1, Suyotha Wasana 2, 高木 一好 1, 若山 守 1（1立命館大院・生命科学, 2Dept. of Ind. Biotechnol., Grad. Agroind, Prince of Songkla Univ.,）
wakayama@sk.ritsumei.ac.jp【目的】キチンは N-アセチルグルコサミンが β-1,4 結合した、セルロースに次いで豊富な生物資源である。キチナーゼ (EC.3.2.1.14)は、キチンの加水分解を触媒する酵素であり、キチン含有資源の分解に利用されている。通常キチン処理は高温かつ極端な pH 条件下で行われることから、キチンの分解に使用する酵
素には、厳しい環境に耐性を持つものを使用した方が有利である。本研究では、
中度好熱性細菌である Streptomyces thermodiastaticus がキチンを唯一の炭素源として培養した場合に生産する数種類のキチン分解酵素のうちキチナーゼ 1 (Chi1)を精製し、精製酵素の諸性質を検討した。
【方法・結果】キチンを唯一の炭素源とした培地で S. thermodiastaticus を培養し、培養上清をろ過して粗酵素液を得た。この粗酵素液を弱陰イオン交換カラムおよび強イオン交換カラムを用いて精製し、Chi1 の精製酵素を得た。Chi1 はpH 5.5 で活性が最大になり、pH 1.5 から 6.0 までの範囲で最大活性の 80%以上の活性を示した。また、各 pH で処理した酵素を最適 pH で反応させた結果、
pH 1.5 から 9.0 までの広い範囲で 80%以上の残存活性を示した。Chi1 は 65℃で最大の活性を示し、同温度で 3 時間処理した後でも、100%の残存活性を示した。Chi1 は食塩に対する安定性も高く、10%（w/v）食塩存在下まで 90%以上、15%（w/v）食塩存在下でも 87%の残存活性を示した。

Thermostable and acidic chitinase from Streptomyces thermodiastaticus○Keitaro Take1, Hidehisa Fujiki1, Wasana Suyotha2, Kazuyoshi Takagi1,
Mamoru Wakayama1(1Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Dept. of Ind. Biotechnol., Grad. Agroind, Prince of Songkla Univ.,)

Key words

chitinase, thermostable enzyme, acid tolerance, Streptomyces○松藤 仁美, 樋口 裕次郎, 竹川 薫
（九大院・生資環）
takegawa@agr.kyushu-u.ac.jp

分裂酵母 Schizosaccharomyces pombe が生産する糖タンパク質の N-結合型糖鎖には、酸性糖鎖として非還元末端のガラクトースにピルビン酸が付加されたピルビン酸化ガラクトース(PvGal)が存在する。分裂酵母において PvGal の生合成に関与する新奇ピルビン酸転移酵素について明らかにしたが、分裂酵母の PvGal
代謝機構や、他の生物の PvGal 含有糖鎖を分解する酵素に関する報告はこれまで全くない。そこで本研究では、土壌微生物の中から PvGal 含有糖鎖を分解する酵素の探索を行い、PvGal 含有糖鎖分解酵素の諸性質について明らかにすることを目的とした。
酵素検索用の基質として 4-nitrophenyl(pNP)-β-PvGal を使用した。pNP-β-PvGal
は pNP-β-Gal と分裂酵母のピルビン酸転移酵素 Pvg1p を PEP 存在下で反応させ、HPLC により反応液から精製した。約 200 種の土壌サンプルの培養液を粗酵素液として pNP-β-PvGal と反応させたところ、最終的に Bacillus cereus と近縁なグラム陽性 1 細菌の菌体内に pNP-β-PvGal から pNP を遊離する酵素活性を確認した。次に、酵素反応液を薄層クロマトグラフィーで解析したところ、本菌の酵素は pNP-β-PvGal を pNP と PvGal とに分解する新奇な酵素であることが示唆された。本菌の全ゲノム配列の解読を行ったところ、全推定 ORF の中から、候補遺伝子を大腸菌内で生産し酵素活性を測定した結果、GH1 に属する
arylphospho-β-glucosidase に相同性が高い１遺伝子が pNP-β-PvGal 分解酵素活性を有していることが分かった。本酵素の諸性質を調べたところ、本酵素は pNPβ-PvGal 分解活性を示すが、pNP-β-Gal、pNP-β-Glc、pNP-β-Xyl 分解活性も有していた。さらに、分裂酵母野生株菌体に本酵素を作用させることで、酸性糖鎖に吸着する試薬であるアルシアンブルーの吸着量の減少が確認され、分裂酵母
菌体表層の N-結合型糖鎖にも作用する可能性が示唆された。

Identification and characterization of enzymes required for the degradationof pyruvylated galactose-containing oligosaccharides from Bacillus sp.
○Hitomi Matsufuji, Yujiro Higuchi, Kaoru Takegawa(Grad. Sch. Bioresour. Bioenviron. Sci., Kyushu Univ.)

Key words

glycosidase, Bacillus sp., pyruvylated galactose酵素学，酵素工学

1P-1p017 Kitasatospora sp. MK-1785 株由来マルトトリオース生成
アミラーゼ L191R 変異酵素の X 線結晶構造解析

95

1P-1p019 Ruminiclostridium josui 由来のフェルラ酸エステラーゼ
Fae1A および Fae1B の酵素特性○殘華 智子, 西村 重徳, 谷 修治, 炭谷 順一, 川口 剛司（阪府大院・生環科・応生科）
monger@biochem.osakafu-u.ac.jp○間宮 愛, 粟冠 真紀子, 木村 哲哉, 粟冠 和郎（三重大院・生資）
sakka@bio.mie-u.ac.jp【背景と目的】Kitasatospora sp. MK-1785 株が生産するマルトトリオース生成ア
ミラーゼ（G3Amy）は澱粉から特異的にマルトトリオース（G3）を生成する
alpha-アミラーゼである。本酵素は加水分解活性のみならず高い糖転移活性を有している。糖転移反応における糖受容体として水酸基を有する化合物を認識できるため、G3 配糖体合成酵素としても応用が期待される。本研究では糖転移反応効率の向上を目指し作製された多数の変異体の中から、加水分解に対する糖転移活性が最も上昇した変異体 L191R のアポ型と生成物 G3 複合体の立体構造
を X 線結晶構造解析から明らかにした。
【方法】分泌シグナル（M1～A33）および触媒ドメイン（A34～Y489）をコードする G3Amy 遺伝子を発現ベクター pTrc99A に挿入し、大腸菌を形質転換することで G3Amy (L191R) 遺伝子を分泌発現させた。発現産物をペリプラズム画分より精製後、ポリエチレングリコールを含む沈殿剤を用いた Sitting drop 法
よって結晶化を行った。この結晶を用いて SPring-8 にて回析強度データを収集
し、X 線結晶解析を行った。
【結果】変異体 L191R のアポ型と、G3 複合体の立体構造をそれぞれ分解能 1.7Å、1.8 Å で得た。G3 複合体ではサブサイト-3 から -1 に G3 が観察され R191の側鎖ははっきりと見ることができなかったが、アポ型では R191 は Subsite -2，-3付近に存在するにも関わらず、側鎖は Subsite +1 方向を向いていた。変異を導入した R191 以外に、アポ型、G3 複合体ともに WT との構造の違いはみられなかった。L191R となることで糖転移活性が増大する理由として、R191 側鎖が活性部位近傍で糖受容体と相互作用している可能性が考えられた。

【背景と目的】細菌や真菌類が持つフェルラ酸エステラーゼは、ヘミセルロース
内に存在するフェルラ酸のエステル結合を加水分解し、他の細胞壁分解酵素の多糖類へのアクセスを増強すると言われている。一方、フェルラ酸には抗酸化作用があり、血圧降下、血糖値低下などの作用を有するため、生活習慣病の予防・改善への利用が期待される。本研究では、Ruminiclostridium josui 由来のフェルラ酸エステラーゼ Fae1A および Fae1B を発現・精製し、その酵素特性を明らかにした。
【方法、結果および考察】R.josui の fae1A と fae1B 遺伝子にコードされる酵素はいずれもシグナルペプチド配列を有し、糖質エステラーゼファミリー 1 の触媒モジュール(CE1)、ファミリー 6 の糖質結合モジュール(CBM6)、ドックリンモ
ジュールから成るモジュラー酵素であり、両者のアミノ酸配列の相同性は 61％である。Fae1A および Fae1B の発現用プラスミド構築にはベクターとして
pET-28a(＋)ΔN-His を用い、シグナルペプチドを除いた fae1A と fae1B 遺伝子領域をそれぞれ導入した。構築したプラスミドを大腸菌 BL21-CodonPlus (DE3)RIPL 株に導入し Fae1A と Fae1B を発現し、HisTrap カラムを用いて精製した。
至適温度や至適 pH および熱安定性や pH 安定性はフェルラ酸エチルを基質として測定した。その結果、Fae1A と Fae1B の至適温度 50℃、至適 pH 6.5、熱安定性は 30℃～45℃の範囲で安定であった。pH 安定性について、Fae1A は pH 6.5～pH 9.0 の範囲で、Fae1B は pH 6.5～pH 8.0 の範囲で安定であった。Fae1A は
pNP-フェルラ酸を分解したが（比活性 2.6U/mg-protein）、Fae1B は活性を示さなかった。また、両酵素は天然基質である小麦ふすまに対して分解活性を示し、フェルラ酸や p クマル酸などのヒドロキシケイ皮酸を遊離した。遊離するフェルラ酸量は、キシラナーゼの共存により増加した。

Crystal structure analysis of maltotriose-forming amylase L191R mutant
from Kitasatospora sp. MK-1785

Characterization of ferulic acid esterases Fae1A and Fae1B derived from
Ruminiclostridium josui.

○Tomoko Zanka, Sigenori Nishimura, Shuji Tani, Jun-ichi Sumitani,
Takashi Kawaguchi(Dep. Appl. Life Sci., Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Key words
analysis

maltotriose, maltooligosaccharide-forming amylase, crystal structure

1P-1p018 ハイマンノース型糖鎖を有する Aspergillus glaucus

MA0196 由来アスパルティックプロテアーゼの特性解析○竹中 慎治 1, 林 理希 1, 仙波 弘雅 1, 田中 耕生 1, 吉田 健一 1,
土居 幹治 2
（1神戸大院・農・応生, 2マルトモ）
stakenaka@people.kobe-u.ac.jp○Ai Mamiya, Makiko Sakka, Tetsuya Kimura, Kazuo Sakka(Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ.)

Key words

feruloyl esterase, Ruminiclostridium josui, xylanase

1P-1p020 酵素法によるアルギニンからの 3-ヒドロキシオルニチン
および trans-3-ヒドロキシプロリンの合成○原 良太郎 1, 北辻 早希 2, 山縣 海 2, 木野 邦器 1,2（1早大・理工研, 2早大・先進理工）
ryo_h@aoni.waseda.jp【目的】
我々は、かつお節のかび付けに伴う色相変化の機構を明らかにすることを目的とし、かび付けに用いられる Aspergillus 属の生成する脱色因子（アスパルティッ
クプロテアーゼ）の特性解析を行ってきた１, ２）。その中で、A. glaucus MA0196
は多量の糖鎖を有するアスパルティックプロテアーゼを分泌することを見出し、その諸性質を報告した３）。同酵素には多量の糖鎖が付加していることが明らかとなったが、その詳細な構造や意義は解明されていない。そこで、糖鎖の構造解析、同酵素遺伝子のクローニングと発現を行った結果、既報の酵素にない性質を見出したので、それを報告する。
【方法および結果】
MY20 培地１）にて MA0196 株を培養し、培養上清から各種クロマトグラフィー
によりプロテアーゼを単一に精製した。PNGase F や Endo H 処理によって本酵素の分子量は 240 kDa 前後（ゲル濾過法）から 42 kDa（SDS-PAGE）に減少した。BlotGlyco のマニュアルに従って糖鎖の切断・精製・ラベル化を行い、LCMSIT-TOF 分 析 と GlycoMod に よ る 検 索 結 果 か ら N 型 糖 鎖 と し て (GlcNAc)2(Man)3+(Man)n (n=1-6) を見出すことができた。続いて、プロテアーゼ遺伝子のクローニングを行い、糖鎖をもたない組換えプロテアーゼを Pichia pastoris にて高発現させた。MA0196 株由来プロテアーゼと組換えプロテアーゼの特性比
較したところ、脱色活性、至適温度・pH などについては相違が見られなかったが、糖鎖を有する親株酵素は水分活性がより低い条件下でも高い活性を示した。
１）J. Sci. Food Agric. 93:1349-1355, 2013. ２）J. Sci. Food Agric. (2016, DOI:
10.1002/jsfa.7688)
３）第 66 回生物工学会大会（北海道、2P-053、2014）．

【目的】2-オキソグルタル酸依存型アミノ酸水酸化酵素は，アミノ酸側鎖の炭素に対して位置・立体選択的にヒドロキシ基を導入可能とする。化学的な観点か
ら，当該酵素反応は炭素-水素結合を官能基の介在なしに新たな結合へ直接変換でき，効率の良い反応として関心が寄せられている。近年，我々を含めて当該酵素群の精力的なスクリーニングにより，多様なヒドロキシアミノ酸の工業的生産プロセスが報告されている。しかし，この酵素群では得られない化合物も多い。そこで本研究では，水酸化に続く酵素反応を導入することにより，これら化合物に対するユニークな合成プロセスの開発を試みた。
【方法・結果】Streptomyces sp.由来アルギニン水酸化酵素，Mesorhizobium loti 由来アルギナーゼおよびオルニチンシクロデアミナーゼの各遺伝子を大腸菌で発現させ，当該酵素を用いた反応系において trans-3-ヒドロキシプロリン (Hyp) を合成する 3 段階の反応プロセスを検討した。はじめに，水酸化酵素によりアルギニンから 3-ヒドロキシアルギニンを得た。次に，アルギナーゼを作用させて3-ヒドロキシアルギニン (3-hArg) を 3-ヒドロキシオルニチン (3-hOrn) に変換した。さらに，オルニチンシクロデアミナーゼによって 3-hOrn を環化することでtrans-3-Hyp の合成を確認した。続いて，各反応系を最適化し，酵素の速度論的解析を実施した。その結果，アルギナーゼの 3-hArg に対する kcat はアルギニンと比較して 1/20 であったのに対し，オルニチンシクロデアミナーゼの 3-hOrn
に対する kcat はオルニチンと比べて 1/28000 と大幅に低かった。この結果から，
本反応プロセスのボトルネックは環化反応であることが示され，これは trans-3Hyp 合成における律速性と一致した 1)。
1) Hara, R., et al., Appl Microbiol Biotechnol, 100, 243-253 (2016).

Characterization of high-mannose type aspartic protease from Aspergillus
glaucus MA0196

Multi-enzymatic synthesis of 3-hydroxyornithine and trans-3hydroxyproline from arginine

Key words
Aspergillus glaucus, aspertic protease, high mannose enzyme, N-linked
oligosaccharides

Key words
3-hydroxyornithine, trans-3-hydroxyproline, hydroxylase, 2oxoglutarate-dependent dioxygenase○Shinji Takenaka1, Lihui Lin1, Hironori Senba1, Kosei Tanaka1, Ken-Ichi Yoshida1,
Mikiharu Doi2
(1Dep. Agrobio., Grad. Sch. Agri. Sci., Kobe Univ., 2Marutomo Co., Ltd.)○Ryotaro Hara1, Saki Kitatsuji2, Kai Yamagata2, Kuniki Kino1,2(1Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ., 2Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)

96

酵素学，酵素工学

1P-1p021 ヒスチジン水酸化酵素の特性解析と組換え大腸菌による
3-ヒドロキシヒスチジン生産

1P-1p023 シトクロム P450 BM3 と補酵素再生系の近接配置による
酵素反応○中島 悠太 1, 原 良太郎 2, 木野 邦器 1,2（1早大・先進理工, 2早大・理工研）
kkino@waseda.jp○畠山 真由美 1, 野北 昂志 1, 北岡 卓也 2, 一瀬 博文 2（1九大院・生資環, 2九大院・農）ichinose@agr.kyushu-u.ac.jp【目的】ヒドロキシヒスチジン (HyHis) は抗がん剤ブレオマイシンなどの構造中に見られ、医薬品原料として期待される化合物である。我々は、遊離 L-ヒスチ
ジンを位置・立体選択的に水酸化し、HyHis に変換可能な 2-オキソグルタル酸
依存型ジオキシゲナーゼを見出している 1)。当該酵素を用いる合成法は、安価に供給可能な L-ヒスチジンを原料として利用でき、効率的であるため、工業的に有意な手法と成り得る。本研究では、当該酵素の特性解析および生成物の同定を行い、菌体反応系による HyHis の効率的生産プロセスの開発を目指した。
【方法・結果】Sulfobacillus thermotolerans 由来ヒスチジン水酸化酵素遺伝子をHis-tag 融合タンパク質として大腸菌内で高発現させ、Ni2+アフィニティーおよびゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。精製酵素反応において、L-ヒスチジンから HyHis を生成する最適反応条件を検討した。本酵素は 35℃、pH
7.5 において最大活性を示し、5-35℃、pH 6.0-8.5 の範囲で安定的に活性を維持した。NMR により生成物の構造解析を行い、HyHis が 3-HyHis であることを確認した。さらに、当該ヒスチジン水酸化酵素を高発現させた大腸菌を用いて菌体反応を実施したところ、L-ヒスチジンから高い収率で 3-HyHis 合成を達成することができた。
1) 原ら，2015 年度日本生物工学会大会講演要旨集 p.103 (演題番号 1P-058)【緒言】Bacillus megaterium 由来の cytochrome P450 BM3（CYP102A1）は、ヘム
ドメインと還元酵素ドメインからなる一原子酸素添加酵素である。P450 BM3は長鎖脂肪酸の水酸化を行うことが知られているが、変異導入により短鎖脂肪酸やアルカンへの位置・立体特異的な水酸化能を持つため、有用物質生産の触媒ツールとしての利用が期待される。しかし、P450 BM3 を利用した触媒反応
を生体外で行うには補酵素である NAD(P)H の供給が必要となり、実用化への障壁となっている。本研究では、NADH 再生系である Glycerol dehydrogenase(GLD) を NADH 駆動型の P450 BM3 (W1046A) と近接場に配置することによりP450 BM3 反応系への効率的な NADH の供給を試みた。2 種の酵素を近接場へ配置する手法として Staphylococcus aureus 由来の Sortase A (SrtA) により 2 種の酵素を連結する手法と、Clostridium thermocellum 由来のコヘシン－ドックリン
相互作用を利用した手法を用いて比較を行った。
【方法と結果】S. aureus の SrtA 遺伝子、C 末端に SrtA の認識配列を付加した
Escherichia coli DH5α 由来 GLD、N 末端にペンタグリシンを付加した P450 BM3(W1046A) をそれぞれ pET22 ベクターへ導入し、E. coli BL21 (DE3) star を宿主として発現、精製を行った。また、C. thermocellum のコヘシン領域を連結した
GLD、ドックリン領域を連結した P450 BM3 (W1046A) も pET22 ベクターへ導入し、発現、精製を行った。精製したそれぞれの酵素を近接場へ配置し、酵素活性を測定した。

Characterization of histidine hydroxylase and production of 3hydroxyhistidine by Escherichia coli

Sequential enzymatic reaction catalyzed by self-assembled cytochrome P450
BM3 and glycerol dehydrogenase○Yuta Nakajima1, Ryotaro Hara2, Kuniki Kino1,2(1Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words
dioxygenase

3-hydroxyhistidine, hydroxylase, 2-oxoglutarate-dependent

1P-1p022 リジン水酸化酵素発現大腸菌を利用したヒドロキシリジ
ン生産プロセスの開発○Mayumi Hatakeyama1, Takashi Nogita1, Takuya Kitaoka2, Hirofumi Ichinose2(1Grad. Sch. Bioresour. Bioenviron. Sci., Kyushu Univ., 2Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words

cytochrome P450, sortase A, cohesin, cofactor regeneration

1P-1p024 固定化酵素を利用したバニリン合成○古屋 俊樹 1,2, 黒岩 麻里 1, 木野 邦器 1
（1早大・先進理工, 2東理大・理工）
tfuruya@fuji.waseda.jp○木内 愛海 1, 原 良太郎 2, 山縣 海 1, 三宅 良磨 3,4, 川端 潤 3,4,
木野 邦器 1,2
（1早大・先進理工, 2早大・理工研, 3三菱化学科学技術研究センター, 4エーピーアイコーポレーション）
kkino@waseda.jp【目的】ヒドロキシリジン (HYL) は医薬品原料として工業的に有用な化合物である。我々はこれまでに塩基性アミノ酸水酸化酵素であるクラバミン合成酵素(CAS) 1)とアルギニン 3-水酸化酵素 (VioC) 2)における基質の構造類似性に着目して、ゲノム情報を利用したアミノ酸水酸化酵素の探索を行い、リジン 3S-水酸化酵素 2 種類、リジン 4R-水酸化酵素 4 種類の計 6 種類のリジン水酸化酵素を取得している 3)。本研究では、これらリジン水酸化酵素の特性解析、およびリジンからの 3S-HYL および 4R-HYL 生産を検討した。
【方法・結果】リジン 3S-水酸化酵素およびリジン 4R-水酸化酵素の計 6 種類の酵素遺伝子をそれぞれ His-tag 融合タンパク質として大腸菌内で高発現させ、当該酵素の活性に対する温度と pH の影響をみた。各酵素の至適反応条件は15-40°C、pH6.0-9.0 の範囲にあった。また、リジン以外に対する基質特異性を検討したところ、リジン 3S-水酸化酵素は 5R-HYL、リジン 4R-水酸化酵素は 5RHYL および 3S-HYL に対しても活性を有することを明らかにした。これらを踏
まえ、リジン水酸化酵素遺伝子をそれぞれ高発現させた大腸菌を用いた菌体反応により HYL の生産性を比較した。その結果、3S-HYL 生産では Kineococcus
radiotolerans NBRC 101839T 由 来 リ ジ ン 3S- 水 酸 化 酵 素 、 4R-HYL 生 産 で は
Niastella koreensis NBRC 106392T 由来リジン 4R-水酸化酵素を用いた際に最も収率が高く、リジンをほぼ完全に変換した。
1) Biochemistry, 29, 6499-6508 (1990).
2) ChemBioChem, 5, 1274-1277 (2004).
3) 原ら、2014 年度日本生物工学会大会講演要旨集 p.43 (演題番号 1P-104)【目的】フレーバーやフレグランスとして有用なバニリンはバニラビーンズからの抽出により得られるがその量は限られており、代替製法として微生物や酵素を利用したバイオプロセスに関心が寄せられている。これまでに、バイオマス
資源のフェルラ酸を原料としたバニリン合成が試みられているが、既報の経路
は補酵素を必要とするためその供給が高生産を阻む一因となっている。我々はこれまでに、補酵素非依存性の脱炭酸酵素と酸化酵素からなる新規バニリン合成経路を設計し、これらの酵素を発現させた組換え大腸菌を利用してバニリンを合成可能なことを実証している 1,2)。本研究では、補酵素非依存性の特徴を生かし、固定化酵素によるバニリンの効率的合成について検討した。
【方法・結果】脱炭酸酵素および酸化酵素の陰イオン交換樹脂への吸着について検討したところ、両酵素とも Sepabeads EC-EA に活性を保持した状態で固定化できた。二段階目の酸化酵素はイソオイゲノールをバニリンに変換する活性も有するため、まずイソオイゲノールからのバニリン合成について検討した。その結果、固定化により酵素の安定性が向上し、10 回の繰り返し利用で 6.8 mg（1 ml スケール）のバニリンが生成した。フェルラ酸を原料とした場合、固定化した脱炭酸酵素と酸化酵素からなるカスケード反応で、4-ビニルグアヤコー
ルを中間体としてバニリンを合成可能なことも明らかにした。
本研究の一部は、Novozymes Japan Research Fund 2016 の事業として実施した。
1) T. Furuya, M. Miura, K. Kino, ChemBioChem, 15, 2248 (2014).
2) T. Furuya, M. Miura, M. Kuroiwa, K. Kino, N. Biotechnol., 32, 335 (2015).

Production of hydroxylysine by whole cell reaction of Escherichia coli
expressing lysine hydroxylase

Biotechnological production of vanillin using immobilized enzymes○Aimi Kiuchi1, Ryotaro Hara2, Kai Yamagata1, Ryoma Miyake3,4,
Hiroshi Kawabata3,4, Kuniki Kino1,2(1Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ., 3Mitsubishi
Chemical Group Science and Technology Research Center, 4API Corporation)

Key words

hydroxylysine, lysine hydroxylase, dioxygenase○Toshiki Furuya1,2, Mari Kuroiwa1, Kuniki Kino1(1Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2Fac. Sci. Technol., Tokyo Univ. Sci.)

Key words

oxygenase, decarboxylase, immobilized enzyme, vanillin

タンパク質工学

1P-1p025 タンパク質工学と代謝系改変によるコリン応答転写ス
イッチの超高感度化

97

1P-1p027 糸状菌 Aspergillus nidulans における新規ポリ-ADP リ
ボース加水分解酵素の生理的役割○渡邊 美紀, 宮地 雄大, 平野 澪, 山本 竜也, 志水 元亨, 加藤 雅士（名城大・農）mkato@meijo-u.ac.jp○鈴木 紳一郎, 星野 孝幸, 河合（野間） 繁子, 斎藤 恭一,
梅野 太輔（千葉大院・工）umeno@faculty.chiba-u.jp

現在使われている遺伝子転写誘導系は、糖の誘導体や抗生物質など、高価な合成化合物を誘導物質として用いるものが多く、これが有価物質の発酵生産などへの利用をコスト面で阻んできた。また，食品生産プロセスなどへの展開を鑑みて，低価格なだけではなく，安全で消費者イメージの良い化合物を誘導剤とした新しい遺伝子発現系の開発が望まれている。
本研究室では、卵黄成分として知られる栄養素コリンに応答する誘導系の進化
デザインをおこなってきた（Saeki, et al., ACS Synth. Biol., 2016：doi: 10.1021/
acssynbio.5b00230）。大腸菌の浸透圧応答系の一部である BetI/betO 系を実験室
内「進化」させ，コリンにより任意の遺伝子を高い on/off 比で制御できる発現誘導系を作製した。ただし，この発現系には，誘導に比較的高い濃度（～10mmol/L）のコリンを要するという難点があった。そこで，大腸菌のコリン代謝の操作による高感度化を目指した。
まず， Bet プロモータの下流にコリントランスポータ BetT を追加配置した。このポジティブループ形成による細胞毒性はみられず，誘導系のコリン感度だけが 200 倍向上した。更に，コリンをグリシンベタインへと代謝する内在経路をゲノム上の betA 遺伝子欠損によって遮断したところ，コリンへの応答感度が更に 20 倍向上した。こうして都合 4,000 倍の高感度化を施すことによって，任意のタンパク質遺伝子や代謝経路の発現を，わずか数 μmol/L のコリンの投入によって S/N 比高くオンオフできるようになった。本講演では，こうして創った完成系の Bet 誘導系のアセチルコリンや β メチルコリンなどに対する応答挙動などについても報告する。

【目的】
ポリ (ADP-リボース) (PAR) 化は、タンパク質の翻訳後修飾の一種で、エピジェ
ネティクス制御などに関わることが明らかになっている。PAR の分解に関与する酵素として、ポリ (ADP-リボース) グリコヒドロラーゼ (PARG) が知られている。 PARG は、高等真核生物では高度に保存されているが、糸状菌のゲノム中には既知の PARG と相同性を示す遺伝子は確認されなかった。そこで本研究では、候補遺伝子からリコンビナントタンパク質を調製・機能解析することにより、糸状菌の parg 遺伝子を特定し、さらに、その生理的役割を明らかにすることを目的とした。
【方法・結果】
A. nidulans のゲノム中からヌクレオチドを基質にすると考えられる parg 候補遺
伝子を 7 種選抜し、リコンビナントタンパク質を調製後、 PARG 活性を測定した。そのうち 1 種に Mg2 ＋ 依存的な PAR の分解活性が検出された。さらに、精製タンパク質と PAR の反応生成物を LC-MS/MS にて解析したところ、ADP-リ
ボースが検出された。これらの結果から、このタンパク質が PARG 活性を有することが明らかになり、これを fungal PARG (fPARG) と命名した。次に、 fPARGの in vivo での機能を解析するため、parg 候補遺伝子の遺伝子破壊株 Δfparg を作製し、 PAR の分解活性、細胞内局在性、DNA 損傷剤等に対する影響を検討した。Δfparg 株では PAR の分解活性が顕著に低下していた。また、 fPARG は
主に核に局在していた。DNA 損傷剤に対する影響を検討したところ、野生株に比べて Δfparg 株は DNA 損傷剤に対して感受性を示した。以上の結果から、糸状菌では fPARG が PARG として機能しており、DNA 修復に関与をしていることが明らかになった。

Hypersensitive choline-induced transcriptional switch constructed byprotein engineering and metabolic modification

Functional roles of novel poly (ADP-ribose) hydrolase in Aspergillus○Shinichiro Suzuki, Takayuki Hoshino, Shigeko Kawai-Noma, Kyoichi Saito,
Daisuke Umeno(Grad. Sch. Eng., Chiba Univ.)

Key words
factorinduction system, directed evolution, synthetic biology, transcriptional

1P-1p026 タンパク質工学による Talaromyces cellulolyticus 由来セロビオハイドロラーゼの耐熱化

nidulans○Miki Watanabe, Yuta Miyachi, Mio Hirano, Tatsuya Yamamoto,
Motoyuki Shimizu, Masashi Kato
(Meijo Univ. Agric.)

Key words
Aspergillus nidulans, poly (ADP-ribose), poly (ADP-ribose)
glycohydrolase

1P-1p028 Endocytic Transport of Amyloid beta-42 in the presenceof Oxidized Derivatives of Cholesterol○蒲池 沙織, 井上 宏之, 松鹿 昭則, 星野 保, 石川 一彦（産総研）
kazu-ishikawa@aist.go.jp○Neha Sharma1, KeangOK Beak1, Huong Thi Thanh Phan2,
Naofumi Shimokawa1, Masahiro Takagi1(1Sch. Mater. Sci., JAIST, 2Hanoi Natl Univ. of Educ.)
takagi@jaist.ac.jp【目的】再生可能資源である木質系バイオマスの利用に関し、酸糖化などと比べて、(1)室温付近での糖化によりエネルギー使用量の削減が可能、(2)過分解が起
こらないことによる糖収率の向上、といった利点から、酵素糖化法の開発が主流となっている。これまでに、様々な構成成分を持つ木質系バイオマスの完全糖化に必要とされるコア酵素群が明らかとなっている。そのため我々は、雑菌
汚染の回避や、反応効率の向上、および、酵素の再利用を通したシステムの効率化を目指して、コア酵素群の耐熱化を行っている。中でも、結晶性セルロー
スを分解することのできるセロビオハイドロラーゼ (CBH I) は、糖化反応において重要な酵素である。今回は、セルラーゼ生産糸状菌 Talaromyces cellulolyticus
由来 TcCBH I の耐熱化について報告する。
【方法・結果】既知構造情報から、TcCBH I のホモロジーモデリングを行った。
得られた立体構造情報を用いて、耐熱性糸状菌 Rasamsonia emersonii 由来の耐熱性 CBH I と構造比較することにより、立体構造的に、タンパク質耐熱化に寄与すると考えられる変異導入部位および残基を導き出した。各種変異プラスミドを作製し、T. cellulolyticus を形質転換した後、デンプン誘導により、菌体外に各種変異型 TcCBH I を分泌させた。培養液上清を回収し、硫安沈殿および各種クロマトグラフィーによる精製を経たのち、耐熱性評価を行った。pNP-Lactose
を基質に用いた活性測定および蛍光色素を用いた熱変性温度測定の結果から、有意な変異を 4 か所同定した。これらの各変異をまとめて導入した改良型
TcCBHI を作製し、評価した結果、野生型と比べて変性温度が約 8℃上昇し、比活性を維持したまま、至適温度および残存活性についても向上させることに成功した。

Introduction: Aggregation of amyloid beta in misfolded form results into formation ofamyloid plaques in the brain that eventually leads to Alzheimer’s disease. When newlytranslated proteins reach to Endoplasmic reticulum (ER) in misfolded form, they cause
fatal stress to the organelle known as ER stress. It was previously reported that evenexternally added Aβ-42 could cause ER stress. Herein, we proposed that this ER stresscould be due to endocytic vesicular transport. In the past research, we found that 7ketocholesterol (7-keto) enhanced the association of Aβ-42 with the cell membrane
though its presence could not result in the endocytic transport. We had focused on the
involvement of 25-hydroxycholesterol (25-OH), raft, ER and cytoskeleton in thepresent study.
Results and discussion: We studied the interaction and endocytic transport of Aβ-42 in
the Jurkat cells in the presence of oxysterols. Endocytic transport could be observed
exclusively in case of 25-OH though interaction of Aβ-42 was strong at surface of
membrane in 7-keto containing cells. After the intracellular transport, Aβ-42 wasobserved to reach ER which could possibly be microtubule-dependent.
Conclusion: 25-OH Cholesterol is important factor in the endocytic transport ofexternally added Aβ-42 in T cells. Thus, this study will further the understanding about
the pathogenesis of neurodegenerative diseases which happens to affect human brain inaged people.

Protein engineering of cellobiohydrolase from Talaromyces cellulolyticus forthermostability

Endocytic Transport of Amyloid beta-42 in the presence of Oxidized
Derivatives of Cholesterol

Key words
protein engineering, thermostability, cellobiohydrolase, Talaromyces
cellulolyticus

Key words○Saori Kamachi, Hiroyuki Inoue, Akinori Matsushika, Tamotsu Hoshino,
Kazuhiko Ishikawa(AIST)○Neha Sharma1, KeangOK Beak1, Huong Thi Thanh Phan2, Naofumi Shimokawa1,
Masahiro Takagi1(1Sch. Mater. Sci., JAIST, 2Hanoi Natl Univ. of Educ.)
amyloid beta, ER stress, Endocytosis, oxysterol

98

タンパク質工学

1P-1p029 嗅覚受容体の匂い分子応答に対するシトクロム P450 の効果

1P-1p031 ケラチン分解酵素の機能不明 C 末端ドメインの機能解析○浅川 賢史 1, 福谷 洋介 1, Savangsuksa Aulaphan 1, 松波 宏明 2,
養王田 正文 1（1農工大院・工, 2Dept. of Molecular Genetics and Microbiology,
Duke Univ. Medical center）
yohda@cc.tuat.ac.jp○杉田 愼之助, 大政 健史, 古賀 雄一（阪大院・工）kogay@mls.eng.osaka-u.ac.jp

生物の嗅覚機構の解明には匂い分子をリガンドとする嗅覚受容体(OR)の機能解明が重要であるが、OR を実験細胞に発現させてもその匂い分子応答を完全には再現できていない。近年嗅粘液中のシトクロム P450(CYP)が OR の匂い分子応答を変化させることが示唆された。本研究では CYP を介した OR の匂い分子応答の機能解明を目的とした。HEK293T 細胞にシグナル伝達因子が導入された
Hana3A 細胞に、MOR161-2 とマウス嗅上皮由来 CYP を共発現させ、MOR161-2のアセトフェノン応答の変化を調べた。アセトフェノン添加培地で培養した
CYP 発現細胞の培養上清を GC-MS により分析し、培地成分の変化を調べた。
その結果 CYP1a2 発現細胞はアセトフェノンをサリチル酸メチルに代謝することによって MOR161-2 のアセトフェノン応答を増大させることを明らかにした。in vivo でも CYP が OR の匂い分子応答に関与することを示すため、マウスがアセトフェノンを嗅いで活性化する OR の数が CYP 阻害剤の導入により変化するか調べた結果、CYP の阻害が MOR161-2 のアセトフェノン応答を低減させることを示した。以上より、in vitro と in vivo の双方向のアプローチによって、CYP が MOR161-2 のアセトフェノンへの応答に関与していることを明らかにした。さらに他の OR および CYP についても解析を進めており、本発表ではこれらの結果についても合わせて報告する。

【背景・目的】好熱性細菌 Fervidobacterium islandicum 由来のプロテアーゼ
Islandisin はケラチン分解能を持つ酵素である。本酵素はサチライシン型のプロテアーゼであるが、活性ドメインの C 末側に 2 つの機能未知ドメイン(SD1、SD2)を有する。これらは他のケラチン分解酵素にも保存されており、ケラチン分解に関与していると推測される。また SD1 は抗体 IgG の抗原認識部位である
Fv 領域と類似の β サンドイッチ構造をしており、基質との相互作用に関係するドメインの可能性がある。SD1、SD2 の機能を解明することを目的とし、本研究では SD1、SD2 の組換え発現系を構築し、そのケラチンに対する吸着性の有無を調べた。
【方法】Islandisin 遺伝子から SD1、SD2 単独または SD1 と SD2 両方をコードする部分を PCR により増幅し、各々を pET25b ベクターにクローニングした。
E.coli BL21 CodonPlus(DE3)を形質転換し、得られた形質転換体から目的タンパ
ク質の調製を行った。難溶解性の粉末ケラチンに調製したドメイン溶液を加え、30 分静置した後、ケラチン画分と非結合画分に分け SDS-PAGE に用い、ケラチンとの結合アッセイの前後でドメインタンパク質の量の変化を観察した。
【結果・考察】ケラチンとの結合アッセイを行う前のサンプルでは、各々のドメ
インタンパク質がメジャーバンドとして観察されたが、結合アッセイ後ではSD1 が殆ど観察されなかった。また、SD1+SD2 においてもタンパク質量の減少が確認されたが、SD2 のみでは変化は見られなかった。結合アッセイ前後でのバンドの減少は、ケラチンとの相互作用により非結合画分から取り除かれたことを意味する。このことから、SD1 のケラチンとの吸着性の存在が示唆された。本発表では結合の詳細と酵素学的意義を明らかにする。

Effect of cytochrome P450 on the response of olfactory receptors by
conversion of odorants

Functional analysis of C-terminal domain of the keratin-degrading enzyme

Key words
odorant response, cytochrome P450, HEK293T cell, in situ
hybridization

Key words

1P-1p030 カイコ‐ＢｍＮＰＶ バクミド発現系で発現させたブタ

1P-1p032 ブレビバチルスによる細胞内タンパク質の可溶性発現○Mavashi Asakawa1, Yosuke Fukutani1, Aulaphan Savangsuksa1,
Hiroaki Matsunami2, Masafumi Yohda1(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Dept. of Molecular Genetics andMicrobiology, Duke Univ. Medical center)

由来リラキシン関連因子の効率的精製と構造解析○石崎 真章 1, 加藤 竜也 1,2, Park Sungjo 3, Terzic Andre 3,
高坂 哲也 1, 朴 龍洙 1,2（1静大院・農・応生化, 2静大グリーン科技研, 3メイヨー医科大）park.enoch@shizuoka.ac.jp【背景・目的】ブタ精巣で発見されたリラキシン関連因子（Insulin-like peptide 3:
INSL3）は造精機能維持や精子生理に関与し精子の運動能の向上等、家畜の受胎率向上への活用が期待されている。しかし、生体から単離出来る INSL3 はご
く微量であるため、生体からの調製は困難である。そこで、INSL3 の量産を目指してカイコ‐バクミド発現系を用いた INSL3 の発現を行ったところ、活性体を精製することに成功した １。しかし、従来法では精製効率が低かったため、本研究ではカイコ体液から新たな INSL3 精製法について検討した。また精製した組換え INSL3 について、結合様式を調べ、カイコの翻訳後修飾が哺乳動物と類似であることを明らかにした。
【方法・結果】ブタ精巣由来 INSL3 遺伝子をカイコで発現可能な Bombyx morinucleopolyhedrovirus (BmNPV) バクミドに挿入することで組換え BmNPV バクミ
ドを構築し、カイコ幼虫に注射して発現させた。発現させたタンパク質は体液から回収した。得られた体液に対し、3 倍量の 1 M 塩酸を加えて酸処理を行い、遠心分離により沈殿を取り除いた。得られた塩酸処理上清を 5 M 水酸化ナトリ
ウムで中和すると再度沈殿が生じたため、遠心分離により再度沈殿を取り除いた。この中和上清から Anti-DDDDK-tag アフィニティ精製した。１ステップカ
ラムのクロマトグラフィーで純度 90％の組換え INSL3 が得られ、従来法に比べ、収量が約 5 倍改善された。nanoLC-ESI-MS/MS によるジスルフィド結合解析を行ったところ、88％の組換え INSL3 が正常なジスルフィド結合を有しており、大部分が活性体であることが示唆された。

○Shinnosuke Sugita, Takeshi Omasa, Yuichi Koga
(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

serine protease, thermophile, binding, keratin○植野 陽平, 花方 寛, 宮内 明
（ヒゲタ醤油研）
y-ueno@higeta.co.jp【背景】組換えタンパク質の発現には様々な発現系が用いられている。その選択にあたっては、細胞内タンパク質の発現には細胞内発現系、分泌タンパク質の発現には分泌発現系を用いることで発現成功率を高めることができると考えられている。細胞内発現系としては大腸菌発現系（以下、大腸菌）が多く用いられているが、目的とするタンパク質によっては不溶化したり発現量が低かったりするなどの問題が起こりうる。一方でブレビバチルス発現系（以下、ブレビ
バチルス）は主に分泌発現系として用いられているが、これまでのところ細胞内発現系としては注目されておらず有用性は明らかでなかった。そこで今回は、ブレビバチルスを細胞内発現宿主として利用し、大腸菌では不溶化するタンパ
ク質の可溶性発現が可能であるかどうかを試験することにした。
【実験と結果】好熱性古細菌 Sulfolobus tokodaii 由来の細胞内タンパク質のうちいくつかは大腸菌で発現させると不溶化することが知られていた。これらのタ
ンパク質をコードする遺伝子をブレビバチルス用ベクター pBIC の開始コドン直下に導入し、菌体内に発現させたところ、可溶性画分に目的タンパク質が確認された。この結果から、ブレビバチルスが細胞内発現系として利用できるだ
けでなく、大腸菌では発現困難だったタンパク質の可溶性発現も可能であることが示された。発表ではこれらの結果を示すとともに、ブレビバチルスで可溶性発現が可能である理由についても考察したい。

第 67 回日本生物工学会大会講演要旨集 p. 248

１

Efficient purification and structural analysis of boar insulin-like peptide 3
expressed in silkworms○Masaaki Ishizaki1, Tatsuya Kato1,2, Sungjo Park3, Andre Terzic3,
Tetsuya Kohsaka1, Enoch Y. Park1,2(1Dept. Appl. Biol. Chem., Fac. Agric., Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci.
Technol., Shizuoka Univ., 3Mayo Clinic coll. Med.)Key words

Silkworm, BmNPV, Insulin-like peptide, Mass spectrometry

Successful Expression of Intracellular Proteins as Soluble Form by
Brevibacillus Expression System○Yohei Ueno, Hiroshi Hanagata, Akira Miyauchi(R & D Dept., Higeta Shoyu)

Key words
Brevibacillus choshinensis, Escherichia coli, recombinant protein,inclusion bodyタンパク質工学

1P-1p033 Cupriavidus 属細菌由来ベンゼンジオキシゲナーゼの発現及び機能解析99

1P-1p035 Geobacter 属細菌由来還元的脱ハロゲン化酵素の異種発現系構築と補因子の再構成○島袋 美波 1, 浜口 慎也 1, 渡邊 仁 1, 野口 恵一 2, 養王田 正文 1
（1農工大院・工, 2農工大・機器分析セ）
yohda@cc.tuat.ac.jp○中村 龍貴, 野島 良太, 養王田 正文（農工大院・工）masafumi.yohda@yohda.net

ベンゼンによる土壌地下水汚染浄化方法として、微生物によるベンゼン生分解を利用したバイオレメディエーションが期待されている。微生物中で、ベンゼンはまず水酸化され、複数の中間代謝物を経て TCA 回路に取り込まれる。この生分解経路の中で、ベンゼンの水酸化反応を行う触媒酵素がベンゼンジオキシ
ゲナーゼ (BeDO) である。BeDO は、水酸化酵素のオキシゲナーゼと電子伝達酵素のレダクターゼやフェレドキシンから構成され機能していることが分かっているが、詳細な構造や反応機構は不明である。本研究では、ベンゼン分解機
構の解明を目指し、当研究室で単離に成功したベンゼン分解活性を持つ
Cupriavidus 属細菌由来の BeDO 構成因子の機能構造解析を行うことを目的とした。BeDO の構成因子であるオキシゲナーゼ α 及び β サブユニット、レダクター
ゼ、フェレドキシンを大腸菌で可溶性画分へ発現させ、精製した。各構成因子の活性や機能について、レダクターゼの紫外可視吸光スペクトル測定を行った
結果、補因子 FAD の導入と[2Fe-2S]クラスター形成が確認された。また、NADHにレダクターゼを添加し、NADH の極大吸収 340 nm とレダクターゼの極大吸
収 450 nm における吸光度変化を測定した結果、NADH とレダクターゼ間での電子伝達が観察された。さらに BeDO の水酸化活性測定を行ったところ、経時的に増加するピークが検出され、酵素反応によりベンゼンがピロガロールまで水酸化された可能性が考えられた。

ハロゲン呼吸細菌は、有機ハロゲン化合物の分解によってのみエネルギーを獲得する。このハロゲン化合物の分解を行うのが、還元的脱ハロゲン化酵素（RDase）である。RDase は、Fe-S クラスターとコリノイドを有する表在性膜タンパク質であることが明らかとなっている。しかしながら、ハロゲン呼吸細菌
が嫌気性細菌であり大量培養が困難なことや、RDase の酸素感受性が高く、活性型の RDase の獲得が困難なことから、詳細な研究は進んでない。そこで本研
究では、テトラクロロエテン（PCE）還元的脱ハロゲン化酵素（PceA）の異種発現系の構築、活性型 PceA 獲得のための補因子再構成法の確立及び PceA の機
能解析を試みた。
PCE 分解能を有する微生物混合培養系のメタゲノムから Geobacter lovleyi KB1
株由来 pceA と高い相同性を有する遺伝子をクローニングし、N 末側にトリガー
ファクター融合タグを付加した TF-PceA として大腸菌で発現させた。発現したTF-PceA を尿素変性し、好気条件にて Ni Chelating カラムで精製した。精製産物を嫌気条件下に移し、補因子の添加と尿素の除去を行い、リフォールディン
グと補因子の再構成を行った。
酵素活性の有無を調べるため、再構成した TF-PceA に PCE(基質/電子受容体)とTi(III)-citrate(電子供与体)を添加し、ガスクロマトグラフィーで解析した。PCEの減少に伴って、TCE および cis-DCE のピークの増加が確認された。また、吸収スペクトルを測定したところ、Fe-S クラスターおよびコリノイドに由来するピークが検出された。このことから、TF-PceA に補因子が結合し、活性が得られた可能性が示唆された。
これは、RDase 及び補因子を有する嫌気性タンパク質の獲得方法のプラットフォームになることが期待される。発表では、RDase の獲得法や機能解析についての最新の結果についても報告する。

Expression and functional characterization of benzene dioxygenase from
Cupriavidus sp.

Heterologous expression and cofactor reconstitution of reductive
dehalogenase from Geobacter sp.

○Minami Shimabukuro1, Shinya Hamaguchi1, Hisashi Watanabe1,
Keiichi Noguchi2, Masafumi Yohda1(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Instr. Anal. Center, Tokyo Univ.
Agric. Technol.)Key words

oxygenase, flavoprotein, reductase

1P-1p034 アミノ酸モノオキシゲナーゼ変異体の合理的設計○森 裕太郎, 白井 智量, 近藤 昭彦（理研・バイオマス）
akihiko.kondo@riken.jp○Ryuki Nakamura, Ryota Nojima, Masafumi Yohda(Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words
reductive dehalogenase, protein expression, protein refolding,bioremediation

1P-1p036 新規抗マラリア薬標的タンパク質、PfERC の結晶化用試料の調製○平岡 修 1, 坂本 沙祐里 2, 洲崎 悦子 1,2, 杉山 成 3（1就実大・薬, 2就実大院・医療薬, 3阪大院・理）hiraoka@shujitsu.ac.jp

植物の光合成によって固定化された CO2 を炭素源として生産されるバイオマス
からの物質生産を可能にするバイオリファイナリーは、資源枯渇問題に大きく寄与することから、精力的に研究が進められている技術分野である。これまで、物質生産菌に異種由来の酵素を導入することで、目的化合物の生合成を達成した報告が多くなされている。こうした中で、酵素に改変を加えることにより、新規の人工代謝経路 (野生型酵素では本来基質として認識しない化合物を標的とする触媒反応経路) を構築し、目的化合物を生産する技術の確立が強く望まれている。ここで鍵となるのは、目的とする反応を触媒するような酵素変異体
を、如何にして合理的に設計するかとなる。
本研究では、目的化合物として acetonitrile (AcN) に注目し、大腸菌を用いた AcN生産のための酵素変異体の合理的設計について検討する。標的酵素として。
amino acid N-monooxygenase (AaNMo) を選択した。AaNMo は特定のアミノ酸に対して水酸化ののち脱炭酸反応を触媒し、オキシム化合物を生成する酵素である。シアノアミノ酸代謝経路においては、次に脱水酵素によりニトリル化合物へと変換される。この時、alanine を出発基質とすることで、AcN を最終生成物とする人工代謝反応を構築することができる。そこで今回、AcN 生成のための酵素変異体設計として、天然の AaNMo の基質特異性について検討し、活性中
心 の ア ミ ノ 酸 残 基 と 比 較 を 行 っ た 。 ま ず AaNMo を コ ー ド す る 遺 伝 子 をpET22b(+) vector に挿入し、大腸菌 C41 (DE3) 株へと形質転換を行った。 IPTG
での誘導後、発現検討を行った。この時、N 末端の膜貫通ドメインを欠損させることで，可溶体として AaNMo を獲得することに成功した。次に得られた
AaNMo について、各アミノ酸を基質とした活性測定を行い、ホモロジーモデ
リングにより作成した立体構造との比較を行った。

マラリアは、ハマダラカの吸血により媒介される Plasmodium 属の原虫感染により引き起こされる感染症である。現在、感染地域では薬剤耐性マラリア原虫が発生し、新しい作用機序を有する新規抗マラリア薬の開発が急務となっている。
我々は、これまでに環状過酸化構造を有するユニークな新規抗マラリア薬候補
化合物 N89 が 薬剤耐性原虫にも有効であり、in vitro、in vivo で優れた抗マラリ
ア活性を示すことを見出し、N89 固定化カラムクロマトグラフィーによりマラ
リア原虫のライセートから N89 標的タンパク質、PfERC（小胞体局在性カルシ
ウム結合タンパク質）を同定したことをすでに報告した。さらに、X 線結晶構
造解析を行う目的で、E.coli BL21 株を用いて PfERC をマルトース結合タンパク質（MBP）との融合タンパク質として細胞内に発現させたのち、アミロースカ
ラムクロマトグラフィーおよび陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより、ほぼ単一になるまで精製し、N89 および Ca イオンとの特異的相互作用を観察し報告した。しかしながら、C 末の分解物の混入が精製過程を複雑にし、収率が低下する問題が生じたため、発現条件を精査してきた。今回、C 末分解物の混入を防ぐために N 末端側の MBP タグに加えて C 末端側にも His タグを導入
して発現精製を試みたところ、これまで発現産物が単一の単量体（分子量 40kDa）として存在していると思われてきたが、実際は 2 種類の単量体の混合物であることが確認された。さらにゲルろ過解析により単量体のみならず分子量500 kDa 以上の会合体の存在が確認され、全部で 3 種類の発現産物が存在していることがわかった。そこで、それぞれについて精製および特性解析を行い、結晶化用試料としての良否を考察したのでここに報告する。

Rational design of engeneered amino acid N-monooxigenase

Expression of malarial endoplasmic reticulum-resident calcium-binding
protein for crystallization○Yutaro Mori, Tomokazu Shirai, Akihiko Kondo(BMEP, RIKEN)

Key words

P450, acetonitrile, mutants○Osamu Hiraoka1, Sayuri Sakamoto2, Etsuko Suzaki1,2, Shigeru Sugiyama3(1Sch. Pharm., Shujitsu Univ., 2Grad. Sch. Clinic. Pharm., Shujitsu Univ., 3Grad.
Sch. Sci., Osaka Univ.)

Key words

protein expression, Plasmodium falciparum, crystallization

100

タンパク質工学／発酵生理学，発酵工学

1P-1p037 麹菌由来の両親媒性タンパク質 ハイドロフォービンの機能評価

1P-1p039 Lactococcus lactis における高温下での Cit 生産メカニズ
ムの解明○安藤 祐人 1, 中野 宏軌 1, 石倉 幹大 1, 陶山 友彰 2, 藤田 夏美 2,
中島 春紫 2
（1明治大院・農, 2明治大・農）harushi@isc.meiji.ac.jp○山本 恵理, 渡部 玲子, 古市 圭介, 浅見 幸夫（明治・食機能科学研）
eri.yamamoto@meiji.com

ハイドロフォービンは、糸状菌・担子菌が生産する両親媒性の分泌タンパク質
であり、気液界面において自己集合し、強固な重合体を形成する。分子量は8~15 kDa と低分子量であり、特徴的なパターンで保存された 8 つの Cys 残基を有するが、アミノ酸配列のパターンは多様であり、さまざまな機能が見い出されている。ハイドロフォービンは物質表面のぬれ性の変換、各種物質を乳化・相間移動させるバイオサーファクタントとしての利用、免疫回避能を活用した薬剤輸送など、さまざまな応用利用が期待されている。
これまでに筆者らは、麹菌 Aspergillus oryzae のハイドロフォービン hypA~D について解析を行っており、気中菌糸または分生子に部位特異的に発現することを明らかにしている。一般にハイドロフォービンは強い吸着性のため大量生産・精製が困難である。そこで筆者らが独自に構築したタンパク質高生産の麹菌宿主を用い、各種のハイドロフォービン遺伝子を発現させることにより生産・精製を試みた。得られた精製タンパク質ついて、ハイドロフォービンとしての機能性の評価・比較を行ったので報告する。

【背景】Lactococcus lactis（Lc. lactis）は、アルギニン（Arg）を細胞内に取り込
み、シトルリン（Cit）を経てオルニチン（Orn）を生産するアルギニンデイミ
ナーゼ経路を有し、生育至適温度では、ほとんどの株が培地中の Arg を Orn に変換する。一方、Lc. lactis を生育に適さない高温下で培養すると、多くの株はArg の代謝能自体が低下するものの、一部の株は Cit を高濃度に生産することを確認している。しかし、この一部の Lc. lactis 株で見られる高温下での Cit 生
産メカニズムは明らかになっていない。
【目的】Lc. lactis における高温下での Cit 生産メカニズムを解明する。
【方法】(1)高温下での Cit 生産能が高い株と低い株について、アルギニンデイミ
ナーゼ経路に関わる酵素の遺伝子を解読し、推定されるアミノ酸配列を比較した。(2)高温下における細胞膜の状態を、蛍光色素である SYTOX green を用いて検証した。(3)高温下での Cit 生産能が低い株にナイシンを添加し、Cit 生産能の変化を検証した。(4)高温下での Cit 生産能が高い株について、ナイシン遺伝子の欠損株を作出した。
【結果】(1)高温下での Cit 生産能と、アルギニンデイミナーゼ経路に関わる酵素のアミノ酸配列に、関連性は確認出来なかった。(2)高温下での Cit 生産能が高い株の細胞膜に、高温下でのみ孔が形成されることを確認した。(3)ナイシンの添加により、Cit 生産能が向上した。(4)ナイシン遺伝子の欠損により、高温下での高 Cit 生産能が失われた。
【結論】一部の Lc. lactis における高温下での高い Cit 生産能は、自身の生産するナイシンによって細胞膜に孔が形成され、その孔を介して Cit が細胞外に拡散することで生じることが示された。

Functional analysis of Hydrophobins: amphiphilic protein produced byAspergillus oryzae.

Elucidation of the mechanism of L-Citrulline production by lactococcus
lactis under high temperature○Yuto Ando1, Hiroki Nakano1, Kandai Ishikura1, Tomoaki Suyama2,
Natsumi Fujita2, Harushi Nakajima2(1Grad. Sch. Agric., Meiji Univ., 2Sch. Agric., Meiji Univ.)

Key words

hydrophobin, biosurfactant, Aspergillus oryzae

1P-1p038 小胞体内在分子シャペロン Calnexin と PDI ファミリー
タンパク質間相互作用の解析○Eri Yamamoto, Reiko Watanabe, Keisuke Furuichi, Yukio Asami(Food Sci. Res. Lab. R&D Div. Meiji Co.,Ltd)

Key words

Lactococcus lactis, nisin, gene knockout, amino acid

1P-1p040 新たな芳香族アミン化合物の発酵生産系の構築○生井 智仁 1, 桝尾 俊介 2, 茂本 亮輔 1, 高谷 直樹 2
（1筑波大院・生命環境, 2筑波大・生命環境系）
takaya.naoki.ge@u.tsukuba.ac.jp○中尾 仁美, 迫野 昌文（富山大院・理工）msakono@eng.u-toyama.ac.jp【背景と目的】 分子シャペロン calnexin (CNX), calreticulin (CRT)は小胞体内でのタンパク質品質管理機構における中心的なタンパク質として知られている。
CNX, CRT は PDI (Protein disulfide isomerase)ファミリータンパク質である ERp57と複合体を形成し、協同的に糖タンパク質フォールディングの補助を行うと考えられているが、近年、ERp57 以外のタンパク質と分子シャペロンが相互作用することが複数報告された。本研究では、CNX と相互作用を行う PDI ファミ
リータンパク質の探索を目的とし、相互作用解析に向けた網羅的スクリーニン
グ法の開発を行った。
【方法】PCR 及び制限酵素を用いて HaloTag 融合 CNX (Halo-CNX)プラスミドベ
クターを作製した。大腸菌による Halo-CNX 融合タンパク質の発現、及び、ヒ
スタグ精製を行い、HaloTag タンパク質の固定場となる Halo リガンドを有する
セファロースビーズ (粒子) を用いて Halo-CNX 固定粒子を作製した。同様に
CNX を融合していない HaloTag タンパク質を固定した粒子を調製し、コントロールとして用いた。Halo-CNX 粒子を用いたプルダウン実験を、ERp57 及び
PDI タンパク質を用いて行った。プルダウン後、溶液から単離した粒子に結合した ERp57, PDI を SDS-PAGE で評価した。
【結果と考察】 プルダウン実験の結果、ERp57 では CNX 固定粒子においてのみ
ERp57 の推定分子量位置にバンドが認められた一方、PDI においてはバンドが示されなかった。このことから、ERp57 は CNX と相互作用し、PDI は相互作用しないことが示唆された。いずれの結果も既報と一致しており、スクリーニン
グ手段としての融合タンパク質によるプルダウンは有効であると考えられる。
今後、他の PDI ファミリータンパク質に適応し、網羅的相互作用解析を行っていく。

【背景】芳香環にアミノ基が直接結合した芳香族アミン化合物は、ポリイミドな
どの高性能なポリマーの原料となることから、産業上有用な化合物である。これらを植物バイオマスを原料として発酵生産することができれば、脱石油型、循環型社会の構築に貢献すると期待される。しかし、芳香族アミン化合物は一般に微生物に対する毒性が強いことが知られており、微生物により生産できるものはまだ少ない。本研究室では、これらの化合物の発酵生産系の構築を目指しており、これまでに種々の芳香族アミン化合物を、微生物を用いて生産することに成功してきた。本研究では、発酵生産が可能な芳香族アミン化合物の種類を増やすことにより、バイオポリマーの産業上での利用可能性をさらに高めることを目的とする。
【方法・結果】Pseudomonas fluorescens が持つ papABC は、芳香族アミン化合物の一種である 4-アミノフェニルアラニン(4-APhe)の生産に関わる遺伝子であることを示した。この遺伝子を発現させた大腸菌に、さらに、各種の aromatic
amine decarboxylase、phenylpyruvate decarboxylase 遺伝子を導入したところ、グルコースを原料として 4-aminophenylethylamine や 4-aminophenylacetate といった芳香族アミンを生産することができた。また、4-APhe の代謝に関与すると推定される機能未知の遺伝子を papABC を発現させた大腸菌に導入し、得られた組換え大腸菌を、4-APhe 生産条件下で培養した。この培養液を HPLC を用いて分析したところ、papABC のみを発現させ大腸菌では見られない化合物が含まれていた。この化合物は新規の 4-APhe 誘導体であると期待される。

Analysis of protein-protein interaction between ER chaperone calnexin and
PDI family protein.

Construction of the bacterial fermentation system for new aromatic aminecompoundKey words
interaction

Key words○Hitomi Nakao, Masahumi Sakono(Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama)Calnexin, Protein disulfide isomerase, ERp57, Protein-protein○Tomohito Namai1, Shunsuke Masuo2, Ryosuke Shigemoto1, Naoki Takaya2(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Faculty of Life & Environ. Sci.,
Univ. Tsukuba)
aromatic amine, fermentation, biopolymer

発酵生理学，発酵工学

101

1P-1p041 コリスミ酸ピルビン酸リアーゼ発現コリネ型細菌を用い1P-1p043 Corynebacterium glutamicum の耐熱性における浸透圧○岡井 直子 1, 三好 孝則 2, 竹嶋 康誠 1, 田中 耕生 3, 吉田 健一 1,
桑原 広明 2, 荻野 千秋 4, 近藤 昭彦 1
（1神戸大・科技, 2帝人, 3神戸大・自科・研究環, 4神戸大院・工）okai@port.kobe-u.ac.jp○村田 龍太郎 1, Nawarat Nantapong 2, 松谷 峰之介 1,
片岡 尚也 1,3,4, 藥師 寿治 1,3,4, 松下 一信 1,3,4（1山口大院・創成科学, 2スラナリー工科大, 3山口大・農, 4山口
大・中高温微セ）
kazunobu@yamaguchi-u.ac.jp

たプロトカテク酸の生産の影響[目的] 化石資源は有限であり、化成品原料・プラスチック原料のバイオマスからの生産が望まれる。本研究ではポリマー原料となる芳香族化合物を、糖を原料として微生物発酵生産することを目的とし、プロトカテク酸（3,4-ジヒドロ
キシ安息香酸、PCA）の生産を行った。PCA は化成品やポリマーの原料、抗酸化剤として有用な化合物である。PCA はコリネ型細菌において４-ヒドロキシ安息香酸から変換され有機酸へと代謝されるが本来菌体外生産はされない。そこでコリスミ酸から 4-ヒドロキシ安息香酸への反応を触媒するコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ（CPL）をコリネ型細菌芳香族アミノ酸生産株に導入し、糖からコリスミ酸を経るプロトカテク酸の生産系を構築した(1)。今回グルコースの逐次添加による PCA 発酵生産について報告する(2)。
[方法と結果] 大腸菌由来コリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子（ubiC）を C.
glutamicumPhe 生産株（ATCC21420）に導入した F(UbiC)株を用いた。本株をグ
ルコースを用い 30℃で好気的に培養し、24 時間毎にグルコースを添加して菌体外の芳香族化合物を定量した。また宿主株についてゲノム部分配列を決定し
PCA 代謝経路について解析を行った。C. glutamicumF(UbiC)株は pH7.5 において50g/l グルコースから 615mg/l の PCA を生産した。フェドバッチ反応では 50g/l
グルコースの初期添加により 24 時間で 550mg/l、その後 24 時間毎の糖添加により 117g/l グルコースから 1140mg/l の PCA を 96 時間で生産した。また宿主株は単独で PCA を生産することができ、ゲノム上には PCA 代謝クラスターが保存されていたが取り込み系の変異が示唆された。
[謝辞] 本研究は文部科学省先端融合プログラム「バイオプロダクション次世代
農工連携拠点」の一環として行われたものである。
1) 第 65 回本大会要旨集(1P-117).
2）Appl.Microbial.Biotechnol.,100(1).135-145(2016).

【背景と目的】Corynebacterium glutamicum はグルタミン酸やリジンなどのアミノ酸生産菌として知られており、産業的なアミノ酸発酵に広く利用されている。
このアミノ酸発酵を行う際、発酵熱や機械熱、外気温の上昇等に伴い発酵槽内の温度上昇が引き起こされるが、この温度上昇は菌の生育や生産効率の低下を招く。そこで耐熱性を有する菌株を用いることで、生産の安定や冷却コストの削減などが期待できる。我々は耐熱性を有する菌株の育種と耐熱性機構の解明を目指しており、これまでにタイで分離された耐熱性株の有効利用 1)、活性酸
素種の抑制因子(酵素)の重要性 2)について報告している。今回、C. glutamicumの耐熱化、さらに高温生育と浸透圧との関係を解析した。
【方法と結果】C. glutamicum の標準株である KY9002 株 を高温適応育種することにより、その生育限界温度が 2℃上昇した耐熱化株 c-2D 株を獲得した。この野生株と耐熱化株において、培地中へのカリウムやソルビトールなどの浸透圧物質の添加による影響を検証したところ、共に高温での生育の向上が確認された。また、タイで単離された耐熱性をもつ N24 株及び温度感受性の KY9714 株
においても同様の結果が得られた。さらに高温生育時の細胞内カリウム濃度を測定すると、低浸透圧(通常培養)下で KY9002 株は温度上昇に伴い細胞内カリ
ウム濃度の低下が確認されたが、c-2D 株では維持されていた。一方、高浸透圧条件下では KY9002 株においても細胞内カリウム濃度が高く維持されていることが示された。以上の結果から、高温での生育低下の一因が少なくとも細胞内
カリウムイオンの流出に起因しており、その流出を防ぐことで耐熱性を獲得していることが示唆された。現在、高温生育時におけるカリウムイオン流出の要因について解析を進めている。
1) 農芸化学会(2015), 2A21p14、2) 生物工学会(2014), 1p-114

Production of Protocatechuic acid by Corynebacterium glutamicum
expressing Chorismate:pyruvate lyase

Effect of osmotic pressure on thermo-tolerance in Corynebacterium

Key words
Corynebacterium glutamicum, protocatechuic acid, chorismate
pyruvate lyase

Key words
potassium

1P-1p042 酢酸発酵における酢酸菌の膜結合型アルデヒド脱水素酵

1P-1p044 アミノ酸と C4-ジカルボン酸が酢酸菌 Acetobacter○Naoko Okai1, Takanori Miyoshi2, Yasunobu Takeshima1, Kosei Tanaka3,
Ken-ichi Yoshida1, Hiroaki Kuwahara2, Chiaki Ogino4, Akihiko Kondo1(1Grad.Sch.Sci.Tech.Innov.,Kobe Univ., 2Teijin Ltd., 3Org. Adv. Sci. Technol. Kobe
Univ., 4Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)

素 AldFGH の役割○福成 聖也 1, 新納 俊 1, 児玉 知大 1, 松谷 峰之介 2, 片岡 尚也 1,2,3,
藥師 寿治 1,2,3, Theeragool Gunjana 4, 松下 一信 1,2,3（1山口大・農, 2山口大院・創成科学, 3山口大・中高温微セ, 4カ
セサート大・理）seiya.41.21@gmail.com

glutamicum○Ryutaro Murata1, Nantapong Nawarat2, Minenosuke Matsutani1,
Naoya Kataoka1,3,4, Toshiharu Yakushi1,3,4, Kazunobu Matsushita1,3,4(1Grad. Sch. Sci. Tech., Yamaguchi Univ., 2Suranaree Univ Tech., 3Fac. Agric.,
Yamaguchi Univ., 4RCTMR, Yamaguchi Univ.)
Corynebacterium glutamicum, thermo-torerance, osmotic pressure,pasteurianus の耐熱性に与える影響○中西 里菜 1, 松谷 峰之介 1, 片岡 尚也 1,2,3, 藥師 寿治 1,2,3,
松下 一信 1,2,3（1山口大院・創成科学, 2山口大・農, 3山口大・中高温微セ）
nkataoka@yamaguchi-u.ac.jp【目的】酢酸発酵は酢酸菌によるエタノールの酸化によっておこなわれる。生化
学的な解析から, この過程は, 酢酸菌の細胞質膜に存在する 2 つの膜結合型酵素,
アルコール脱水素酵素(ADH)と aldFGH 遺伝子にコードされるアルデヒド脱水
素酵素(ALDH)によって触媒される連続的な酸化反応によると考えられている。
すなわち ADH によってエタノールがアセトアルデヒドに酸化され, ALDH に
よってアセトアルデヒドが酢酸に酸化されると考えられるが, 遺伝学的な証拠は乏しい。私たちはその膜結合型 ALDH に着目し, 遺伝学的また生理学的な解析を行った。
【方法・結果】Acetobacter pasteurianus SKU1108 株の ALDH の触媒サブユニット
をコードする aldH 遺伝子破壊株を構築した。この株はエタノールを含まない培地において対照株と同様の生育を示したが, エタノールを含む酢酸発酵条件下での生育が悪く, 酢酸の生成が著しく低下した。aldH 遺伝子をプラスミドで相補することで, 生育や酢酸発酵能は回復した。ΔaldH 株の細胞懸濁液のオキシダー
ゼ活性は対照株と差がなく, 細胞膜懸濁液のオキシダーゼ活性は, ΔaldH 株は対照株に比べわずかに低下した。第 2 の ALDH 遺伝子の存在が示唆され, 本菌のゲノム情報を精査したところ, aldFGH とは別の ALDH として aldSLC 遺伝子を見い出した。ΔaldH 株と対照株の細胞膜懸濁液を用いアセトアルデヒドに対する親和性を調べたが差は見られなかった。しかし, 酢酸発酵条件下と非酢酸発酵
条件下で生育させた対照株では, アセトアルデヒドに対する親和性に差が見られた。酢酸発酵条件下では AldFGH が, 非酢酸発酵条件下では AldSLC が主要な
ALDH となることが示唆され, 両条件下での aldFGH と aldSLC の転写量を RT－
PCR により調べた。aldFGH に変化は見られず, aldSLC の転写産物が酢酸発酵条
件下で低下したため, 上記の仮説を支持する結果を得た。

【背景と目的】 耐熱性の微生物は発酵生産時の温度制御の管理の簡便化や冷却コストの削減等が見込まれ、発酵産業への貢献が期待される。食酢生産に利用可能な酢酸菌 Acetobacter pasteurianus SKU1108 は 37℃でも酢酸を生産し、蓄積された酢酸に対して耐性を持つ。我々は以前、SKU1108 株の高温適応育種を酢
酸発酵条件下で行い、3 つの耐熱化株を取得した。特に 38.5℃から段階的に温度を上げて適応育種し、40℃で単離された TH-3 株は、高温での酢酸発酵能が優れていた。次世代シーケンサーにより、取得された耐熱化株 TH-3 の変異を解析し、少なくともアミノ酸輸送体、C4-ジカルボン酸輸送体とウリジリル転移酵素 PII の遺伝子に起こった変異が耐熱性に関与することが判明した (1)。本研
究では、TH-3 に生じていた変異と耐熱性獲得機構との関連を理解するために、アミノ酸や C4-ジカルボン酸の培地への添加が本菌に与える影響を調べた。
【方法と結果】終濃度 0.2%の 19 種アミノ酸、0.1%チロシン、そして 10 mM C4ジカルボン酸をそれぞれ添加した培地を用いて、酢酸発酵条件下、37℃、40℃
において、SKU1108 の振とう培養を行った。コハク酸、フマル酸、リンゴ酸,
Gln, Arg, Ala, Asp, Asn, Thr, Lys, His の添加が高温で SKU1108 の生育と酢酸生成能を向上させた。そのなかでも、コハク酸, フマル酸, リンゴ酸, Gln, Arg, Ala,
Asp は、高温での生育を TH-3 並みに上昇させた。現在、高温での生育を向上させたアミノ酸、C4-ジカルボン酸を対象に、本研究で耐熱性への関与が明らかとなっている輸送体との関係を調査している。また、対象としているアミノ酸、C4-ジカルボン酸がどのような機構で耐熱性に寄与するかを明らかにすべく、発酵時における代謝産物の変化を解析している。

Role of a membrane-bound aldehyde dehydrogenase in the acetic acidfermentation with Acetobacter sp

Effect of amino acids and C4-dicarboxylates on thermotolerance of○Seiya Fukunari1, Shun Nina1, Tomohiro Kodak1, Minenosuke Matsutani2,
Nagoya Kataoka1,2,3, Toshiharu Yakushi1,2,3, Gunjana Theeragool4,
Kazunobu Matsushita1,2,3(1Fac. Agric., Yamaguchi Univ., 2Grad. Sch. Sci. Tech., Yamaguchi Univ., 3RCTMR,
Yamaguchi Univ., 4Fac. Sci., Kasetsart Univ.)
Key words
Acetobacter pasteurianus, aldehyde dehydrogenase, vinegar
fermentation

引用文献(1) Matsutani et al. (2013), J. Biotech., 165, 109-119.

Acetobacter pasteurianus○Rina Nakanishi1, Minenosuke Matsutani1, Naoya Kataoka1,2,3,
Toshiharu Yakushi1,2,3, Kazunobu Matsushita1,2,3(1Grad. Sch. Sci. Tech., Yamaguchi Univ., 2Fac. Agric., Yamaguchi Univ., 3RCTMR,
Yamaguchi Univ.)

Key words
Acetobacter pasteurianus, thermal adaptation, fermentation,
thermotolerance

102

発酵生理学，発酵工学

1P-1p045 酸素抑制条件下におけるコリネ型細菌の糖消費速度と細胞内酸化還元レベルの相関

1P-1p047 Thermophilic ethanol fermentation by geneticallyengineered Moorella thermoacetica○柘植 陽太 1,2, 植松 君夫 1, 山本 省吾 1, 須田 雅子 1, 乾 将行 1,3（1RITE, 2金沢大・新学術, 3奈良先端大・バイオ）inui@rite.or.jp

Rahayu Farida, Auto Kawai, Yuki Iwasaki, Akihisa Kita,
Takahisa Tajima, Junichi Kato, ○Yutaka Nakashimada(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)
nyutaka@hiroshima-u.ac.jp

コリネ型細菌はアミノ酸生産菌として工業的に広く利用されているグラム陽性細菌である。本菌は酸素抑制条件下で反応することで著量の有機酸を生産し、代謝工学的改変を施すことにより、各種アミノ酸も高生産する。物質生産においては目的産物の収率に加えて、原料の消費速度も重要なファクターである。
本研究では酸素抑制条件下におけるグルコース消費速度の向上を目的に、グルコース消費速度と細胞内の酸化還元レベルとの関係を調べた。
初めに添加することでグルコース消費速度が向上するピルビン酸や炭酸水素ナ
トリウムを加えると、細胞内の NADH/NAD+ 比は著しく低下した。次に様々な
グ ル コ ー ス 消 費 速 度 を 示 す 、 野 生 株 や 各 種 遺 伝 子 （ Phosphoenolpyruvatecarboxylase (PEPC)、Lactate dehydrogenase (LDH)、Malate dehydrogenase (MDH)）の欠損株の NADH/NAD+ 比を測定したところ、グルコース消費速度と逆相関の関係を示した。そこで NADH/NAD+ 比を強制的に低下させるため、NADH
dehydrogenase 遺伝子（ndh-II）をそれぞれの株で高発現したところ、野生株、
PEPC 遺伝子欠損株と MDH 遺伝子欠損株で NADH/NAD+ 比の低下とともに、グルコース消費速度がそれぞれ 26%、28%、230%増加した。LDH 遺伝子欠損
株では NADH/NAD+ 比は低下したが、顕著なグルコース消費速度の向上は見られなかった。最後に大規模な代謝改変をして作製した乳酸高生産株でも同様に
ndh-II の高発現を行った結果、グルコース消費速度は 8%増加し、それに伴い乳酸生産量も 7%増加した。本手法は酸素抑制条件下におけるコリネ型細菌の物
質生産において、グルコース消費速度を向上させるための汎用的な利用が期待できる。

The use of thermophilic bacteria for ethanol fermentation will facilitate the recovery of
ethanol, since aqueous ethanol readily vaporizes at temperatures above 50 ℃, making
possible continuous distillation of ethanol. Furthermore, thermophilic bacteria havehigher growth and metabolic rates than mesophilic bacteria, and the risk of microbial
contamination is lower. In this context, since thermophilic acetogen Moorella spp cangrow at 55 ~ 60 ℃ and ferments 1 mol of glucose to 3 mol of acetate, Moorella spp.
are promising candidates for thermophilic ethanol fermentation. Thus we attempted toconstruct ethanol transformants of Moorella thermoacetica. Ethanol was produced
from acetyl-CoA in a two-step reaction by aldehyde dehydrogenase (ALDH) andalcohol dehydrogenase. However, the activity of ALDH was extremely low in M.
thermoacetica. Furthermore, most of acetyl-CoA is converted to acetate byphosphotransacetylase and acetate kinase. Therefore, to delete the acetate pathway andenhance the ALDH, 2 phosphotransacetylase genes (pdul1, 2) were disrupted andpromoter enhanced aldh (aldehyde dehydrogenase gene) was inserted on the genome
by homologous recombination. Consequently, we successfully constructed ethanoltransformants of M. thermoacetica. The transformants (Δpdul12::aldh) ferments 120
mM glucose to 210 mM ethanol (ethanol yield was 87.5 %) in 72 h at 55 ℃ in batch
culture. Furthermore, we succeeded thermophilic ethanol fermentations with
distillation in fed-batch culture.

Glucose consumption rate critically depends on redox state in
Corynebacterium glutamicum under oxygen deprivation

Thermophilic ethanol fermentation by genetically engineered Moorella
thermoacetica○Yota Tsuge1,2, Kimio Uematsu1, Shogo Yamamoto1, Masako Suda1,
Masayuki Inui1,3(1RITE, 2InFiniti, Kanazawa Univ., 3Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)

Rahayu Farida, Auto Kawai, Yuki Iwasaki, Akihisa Kita, Takahisa Tajima,
Junichi Kato, ○Yutaka Nakashimada(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words
Corynebacterium glutamicum, Redox state, Glucose consumption rate,
NADH dehydrogenase

Key words

1P-1p046 PHB 蓄積時の Halomonas sp. KM-1 の代謝物解析

1P-1p048 根粒菌 Bradyrhizobium diazoefficiens における D-ピペコ○松下 功 1, 盤若 明日香 1, 西村 拓 1, 坪田 潤 1, 河田 悦和 2
（1大阪ガス, 2産総研）
imatsu@osakagas.co.jp

ethanol fermentation, thermophilic, biomass, acetate

リン酸代謝経路の解析○堀木 雅文, 日比 慎, 高橋 里美, 小川 順
（京大院・農）ogawa@kais.kyoto-u.ac.jp（目的）Halomonas sp. KM-1 は、好気条件で PHB を蓄積し、酸素供給を制限することで PHB を 3-ヒドロキシ酪酸に分解し、菌体外に放出する。私達は、Halomonas sp. KM-1 が PHB を蓄積する際の菌体内の代謝の挙動を明らかにする目的で、代謝物を網羅的に調べた。
（方法）培養は 3L ファーメンターを用いて、炭素源としてグルコース、窒素源
として硝酸、もしくは尿素を用いて、流加培養により約 30 時間培養を行った。
培養開始から継時的にサンプリングを行い、菌体を破砕後、菌体内物質を抽出して、GC-MS により分析を行った。
（結果）好気条件で PHB が徐々に蓄積するにつれて、4-アミノ酪酸（GABA）、グルタミン酸の蓄積が顕著に見られ、Halomonas sp. KM-１は、TCA 回路の α ケ
トグルタール酸から分岐する GABA 回路を保有することがわかった。Halomonas
sp. KM-１は、窒素源の欠乏条件下で PHB を生産することが知られているが、窒素源の NH3 が 4-アミノ酪酸、グルタミン酸として蓄積して NH3 の生体利用が抑制されることで、PHB の蓄積が引き起こされることが示唆された。

環状イミノ酸であるピペコリン酸はタンパク質非構成性であるが、自然界に広く分布していることが知られている。また、その誘導体として抗生物質など様々
な生理活性物質が知られており、これらの物質の生合成におけるピペコリン酸の変換経路に関する研究が行われている。さらにエナンチオマーである L-ピペ
コリン酸と D-ピペコリン酸に関して生理的な役割の違いも示唆されている。この様に自然界におけるピペコリン酸代謝を解明することは生理学的に重要な意義がある。L-ピペコリン酸の代謝に関しては、L-2-アミノアジピン酸を経由してグルタミン酸に至る経路が詳細に解析されている。これに対して、D-ピペコ
リン酸は根粒菌 Sinorhizobium meliloti によって分解されることが報告されているが、その代謝経路や関連酵素は未だに解明されていない。
本研究において根粒菌 Bradyrhizibium diazoefficiens USDA110 株が D-ピペコリン
酸を単一炭素源として生育することを見出した。また、PLP 阻害剤としてアミノオキシ酢酸を添加した休止菌体反応においては、D-ピペコリン酸より変換された 2-アミノアジピン酸が蓄積することが観察された。ゲノム配列解析結果か
ら USDA110 株は既知の L-ピペコリン酸代謝関連酵素を保持しておらず、今回発見された D-ピペコリン酸代謝は新規酵素群により行われている可能性が高いと考えられる。現在、USDA110 株における D-ピペコリン酸代謝関連酵素を特定することを目的として研究を進めている。

Metabolite analysis of Halomonas sp. KM-1 accumulating PHB

D-Pipecolic acid metabolism in a leguminous bacteria Bradyrhizobium
diazoefficiens○Isao Matsushita1, Asuka Hannya1, Taku Nishimura1, Jun Tubota1,
Yoshikazu Kawata2(1Osaka Gas Co., Ltd., 2AIST)

Key words

Halomonas, poly(3-hydroxybutyrate), GABA, L-glutamate○Masafumi Horiki, Makoto Hibi, Satomi Takahashi, Jun Ogawa(Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)

Key words
D-pipecolic acid, leguminous bacteria, Bradyrhizobium diazoefficiens,
D-amino acid

発酵生理学，発酵工学

1P-1p049 Acetobacter 属酢酸菌における酢酸過酸化能発現メカニズム

103

1P-1p051 ブタノール生産菌におけるリファンピシン耐性変異株の特性解析○佐々木 大樹 1, 石川 森夫 1, 鈴木 敏弘 1, 今井 健太郎 1,
吉田 将也 1, 山本 有紀 1, 松原 拓哉 1, 兼崎 友 2, 吉川 博文 2,3,
貝沼（岡本） 章子 1
（1東京農大・応生科・醸造, 2東京農大・ゲノムセ, 3東京農大・応生科・バイオ）
okamoto@nodai.ac.jp○信木 公介, 清 啓自, 川嶋 草平, 門倉 利守, 鈴木 健一朗,
中山 俊一
（東農大院・農）s3nakaya@nodai.ac.jp【目的】食酢醸造用酢酸菌 Acetobacter aceti および Acetobacter pasteurianus は、
いずれも生じた酢酸を菌体内で完全酸化する酢酸過酸化能を示す。その一方で、両種の基幹代謝経路は大きく異なっており、過酸化時の代謝経路も両者で異なっている可能性が示唆された。演者らはこれまでに、TCA サイクルにおいてスク
シニル-CoA からコハク酸への変換をバイパスするアセチル-CoA ヒドロラーゼ（AarC）が、両種に共通して酢酸過酸化に重要な役割を有することを明らかにしている。1) 今回、その他の TCA サイクル周辺経路の関与について検討を行
い、Acetobacter 属酢酸菌における酢酸過酸化のメカニズムに関する知見を得たので報告する。
【方法および結果】A. aceti および A. pasteurianus について、エタノール培養時における基幹代謝経路構成因子の転写挙動解析を RNA-seq 法で行った。その結果、AarC と同様に、酢酸のアセチル CoA への変換に関与するアセチル-CoA シンテターゼ（Acs）が、両種ともに酢酸過酸化時に高発現することを確認した。
しかし、本因子の破壊株について、エタノール存在下での生育挙動を比較した
ところ、両種ともに aarC の破壊で見られたような酢酸過酸化能の欠失 1)は示さなかった。以上より、Acetobacter 属酢酸菌については、Acs は共通して酢酸過
酸化時に高発現するものの、過酸化能発現においては AarC が第一義的な役割を担っていることが強く示唆された。
1）今井ら（2015）第 67 回 日本生物工学会 講演要旨集，pp. 121．

【目的】ブタノール生産菌 Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 の至適発
酵温度は 30℃でありそれ以上の培養温度ではブタノール生成量が著しく低下す
るが、RNA ポリメラーゼ阻害剤であるリファンピシン耐性を指標としより高温域でも発酵可能な変異株 RIFR91 株（以下 RIFR91）を取得している。稲わらを基質としてセルロース分解菌と RIFR91 を混合培養したところ、高温域での発酵能を獲得するとともに、RIFR91 は親株である N1-4 と比較して 1.5 倍高いブ
タノール生成量(9.6 g/L)を示した。本研究では、この向上したブタノール生産量の原因を解明することを目的とした。
【方法・結果】グルコースを炭素源とした TYA 培地において 30℃で 24 時間培養した培養上清を限外濾過により粗酵素を取得した。RIFR91 のタンパク濃度は親株よりも 1.6 倍高くタンパクの分泌量が多いことが示唆された。得られた粗酵素に対して、稲わら分解に関与する xylanase、xylo-glucanase、exo-glucanase
活性を測定したところ、RIFR91 の活性はそれぞれ 1.5、1.3、10.2 倍高かった。
粗酵素を LC-MS/MS によるショットガン解析に供した結果、β-xylanase, βglucanase, glycosyl hydrolases family 39 と推定されるタンパク等が RIFR91 においてのみ検出された。以上の結果より、RIFR91 の混合培養におけるブタノール生成量の向上は、ヘミセルラーゼやセルラーゼ分泌量の向上に起因していることが示唆された。

Study on acetate overoxidation mechanism in the genus Acetobacter

Characterization of rifampicin resistant mutant of Clostridium
saccharoperbutylacetonicum N1-4

○Daiki Sasaki1, Morio Ishikawa1, Toshihiro Suzuki1, Kentaro Imai1,
Masaya Yoshida1, Yuki Yamamoto1, Takuya Matsubara1, Yu Kanesaki2,
Hirofumi Yoshikawa2,3, Akiko Okamoto-Kainuma1(1Dept. Ferment. Sci., Tokyo Univ. Agric., 2Genome Res. Center, Tokyo Univ.
Agric., 3Dept. Biosci., Tokyo Univ. Agric.)○Kosuke Nobuki, Keiji Kiyoshi, Souhei Kawasima, Toshimori Kadokura,
Kenitiro Suzuki, syuniti Nakayama(Grad. Sch. Agric., Tokyo Univ. Agric.)

Key words
Acetobacter, acetic acid fermentation, acetate overoxidation, acetyiCoA synthetase

Key words

1P-1p050 静置発酵で醸造した米酢に含まれるポリアミン類

1P-1p052 Citrobacter braakiiTB-96 株による廃グリセロールから○加藤 彩織 1, 赤坂 直紀 2, 石井 友理 1, 佐古田 久雄 2, 藤原 伸介 1
（1関西学院大院・理工, 2マルカン酢）
fujiwara-s@kwansei.ac.jp

cellulase, mutant, butanol, Clostridiumの 1,3-プロパンジオール生産における最適培養系の構築○野中 大輔 1, 森田 峻秀 2, 清 啓自 2, 中島 敏明 2
（1筑波大, 2筑波大院・生命環境）
nakajima.toshiaki.ga@u.tsukuba.ac.jp

ポリアミン(PA)は、老化抑制、抗炎症作用、記憶・学習改善等の生理活性作用を有している。特に、哺乳類において大・小腸では正常な腸管機能を維持する
上で極めて重要な役割を果たしている(1)。しかし大腸腸管内 PA 濃度は加齢に伴い減少し、その結果炎症性疾患のリスクが著しく高まるため、腸管内の PA 濃度の適正化は老年期における QOL の向上において必須である。PA は日本の伝統的な発酵食品に高濃度で含まれる事が知られており(2)、日本人が長寿たる所以と考えられる。PA の高蓄積には、原料となるタンパク質源や種々の発酵食品
生産微生物の代謝と相関があると考えられる。我々は日本の伝統調味料である食酢に注目し、様々な食酢の PA 成分を調べた。特に食酢製造に関与する原料と微生物が PA 成分に与える影響を精査した。発酵方法では通気発酵法と静置発酵法の違いに注目した。さまざまな食酢の PA 成分を、高速液体クロマトグ
ラフ及びガスクロマトグラフを用いて行いて検証したところ、特に静置発酵法
による米酢に PA が著量含まれていた。分析に供した米酢の中にはアグマチンを高含有する事例も認められた。米酢製造では、黄麹菌による原料米の液化・糖化、出芽酵母によるアルコール発酵及び酢酸菌による酢酸発酵の工程が必要である。伝統的な静置発酵で醸造された米酢には独特な風味があり、PA 特有のアミン臭は顕在化しない。今回の結果は静置発酵法で作られた米酢の機能性食品としての可能性を示す。
(1) Kibe et al. 2014. Sci.Rep 4:4548.
(2) Okamoto et al. 1997. Biosci. Biotech. Biochem. 61:1582-1584.

【目的】現在、化石燃料の代替燃料として、バイオディーゼル燃料（以下 BDF）
が注目されている。しかし、BDF 生産の副産物である廃グリセロールは、廃棄物としてコストをかけて処分されている。そこで、BDF の利用性向上のために、微生物による廃グリセロールを基質とした 1,3 プロパンジオール（以下 1,3PD）発酵生産を検討した。1,3-PD は、近年ポリエステルや化粧品の原料などとして需要が高まっており、今後大きな市場になると予測されている。これまでに、当研究室はグリセロール資化性 1,3-PD 高生産菌 Citrobacter braakii TB-96 株を取得している。本研究では、この TB-96 株の 1,3-PD 生産性の向上を目的とし、培養系の構築、及び最適培養条件の検討を行った。
【結果】先行研究において、TB-96 株は温度 30℃、pH8、純グリセロール逐次添加が 1,3-PD 生産の最適条件であるとわかっている。上記の条件で培養を行い、48 時間で 51.1 g/l の 1,3-PD 生産を達成した。また、このとき 15 時間で最大 2.67
g/l/h と高い 1,3-PD 生産性を示した。更なる 1,3-PD 生産性の向上を目的として、
これまで検討をしていなかった前培養条件の検討を行った。これまで前培養は、pH 調整なしで、batch 培養を行っており、菌体が定常期であった 24 時間で植菌していた。これを、pH8 で一定にした Fed-batch 培養を行い、菌体が対数増殖期である 9 時間で植菌を行った。その結果、Fed-batch 培養では 9 時間で最大 3.4
g/l/h の 1,3-PD 生産性を示した。今後は更なる TB-96 株の 1,3-PD 高生産性を目的とした、細胞の固定化や連続培養系の構築を行っていきたい。本研究は、JST,ALCA の一環として行われた。

Highly-concentrated agmatine and other polyamines contained in the rice
vinegarConstruction of optimal culture system of 1,3-propanediol production fromwaste glycerol by Citrobacter braakii TB-96○Saori Kato1, Naoki Akasaka2, Yuri Ishii1, Hisao Sakoda2, Shinsuke Fujiwara1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ., 2Marukan Vinegar Co., Ltd.)Key words

polyamine, agmatine, rice vinegar, Acetobacter pasteurianus○Daisuke Nonaka1, Takahide Morita2, Keiji Kiyoshi2, Toshiaki Nakajima-Kambe2(1Univ. Tsukuba, 2Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

1,3-propanediol, Citrobacter, glycerol, biodiesel fuel104

発酵生理学，発酵工学／代謝工学

1P-1p053 Citrobacter braakii TB-96 株におけるバイオディーゼル
廃グリセロールからの 1,3-PD 収率の向上

1P-1p055 低 Ca 環境でもメタノールに生育できる

Methylobacterium zatmanii の メタノール脱水素酵素の性質について○森田 峻秀, 清 啓自, 野中 大輔, 瀬田 幸平, 鈴木 敏弘, 中島 敏明（筑波大院・生命環境）
nakajima.toshiaki.ga@u.tsukuba.ac.jp○Wang Lun 1, 菅沼 宗矢 1, 谷 明生 2, 早川 享志 1, 中川 智行 1
（1岐阜大・応生科, 2岡山大・資源植物科研）
t_nakaga@gifu-u.ac.jp【背景・目的】現在、化石燃料の代替エネルギーとしてバイオディーゼル燃料(BDF)が注目されている。BDF は植物油などを原料とする脂肪酸メチルエステ
ルであり、その利用は地球温暖化抑制に効果的であるとされる。しかし、BDF生産において副生する廃グリセロールは高アルカリ性かつ不純物を含むため、再利用が困難であり、コストをかけて処分されている。今後、BDF の増産に伴い廃液処理コストは増大すると見込まれる。従って、廃グリセロールの有効利
用及び BDF 生産のコスト削減のため、これを基質とした有用物質の発酵生産が注目されている。そこで本研究では、ポリマー原料やアクリル酸の前駆体として利用される、1,3-プロパンジオール(1,3-PD)の廃グリセロールからの生産を検討することとした。我々はこれまでにグリセロール資化性の 1,3-PD 高生産菌
Citrobacter braakii TB-96 株を環境中から単離した。本研究では TB-96 株による廃グリセロールからの 1,3-PD 生産及び収率の向上を目的とした。
【方法・結果】 先行研究において、TB-96 株の最適 1,3-PD 生産条件(pH8,温度30℃)で純グリセロールの逐次添加培養を行った結果、培養開始 48 時間で 1,3PD 生産 50.1 g/L を得た。同様の条件及び培養法で、基質として未精製の廃グリ
セロールを使用した場合においても 48 時間で 30.0 g/L の 1.3-PD 生産量を達成した。一方、この時主副産物である乳酸の消費グリセロールあたりの収率は0.33 mol/mol であり、純グリセロールを基質とした際の乳酸収率(0.13 mol/mol)を大きく上回った。グリセロールを基質とした際の、乳酸の生産は、補酵素のNADH を 1,3-PD 生産と競合することが知られている。そのため、1,3-PD の収率向上には乳酸生産系の制御が効果的であると考えられた。本研究は JST, ALCAの一環として行われた。

【目的】Methylobacterium 属細菌はメタノールを唯一の炭素源として生育できる
メチロトローフ細菌である。近年、Methylobacterium 属細菌が Ca の代わりに軽希土類に依存したメタノール生育能力を持つことが見いだされ、その鍵酵素が軽希土類を補因子とする新規なメタノール脱水素酵素（MDH）であることが明らかとなった。また、Ca と軽希土類である La が共存すると La-MDH が支配的に誘導され、Ca と重希土類の場合は、Ca-MDH が優先的に誘導されることがすでに報告されている 1)。しかし、低 Ca 環境下ではどのような MDH が機能す
るかこれまで報告がない。私たちは、低 Ca 環境下でも生育可能なメチロトロー
フ細菌 M. zatmanii GM41 株をスクリーニングし、そのメタノール生育の特徴を観察してきた 2)。今回、低 Ca 環境下で生育した GM41 株から MDH を精製し、その酵素化学的諸性質を明らかにすることを目的とした。
【方法・結果】M. zatmanii GM41 株は、M. extorquens が生育できないような低Ca 環境でも十分なメタノール生育を示す。低 Ca 環境で生育した GM41 株から無細胞抽出液を調製し、硫安沈殿（70%）、Butyl TOYOPEARL 6050S および
Hitrap SP カラムクロマトグラフィーを行い、MDH を精製した。SDS-PAGE お
よび PMF 解析から、精製酵素は約 60 kDa の α サブユニットと 10 kDa の β サブ
ユニットからなる MxaFI 型 MDH であることが明らかとなった。MDH の比活性は 0.112 U/mg であり、最適温度は 50℃であった。Km 値は 0.160 mM、Vmax は0.125 U/mg であった。
1) Vu HN et al. (2016) J Bacteriol. 198:1250-1259.
2) 王 倫ら (2015) 第 67 回日本生物工学会大会要旨集. 2P-107.

Improvement of 1,3-PD yield from glycerol-containing biodiesel waste by
Citrobacter braakii TB-96

Methanol dehydrogenase from Methylobacterium zatmanii grown on
methanol with low Ca environment○Takahide Morita, Keiji Kiyoshi, Daisuke Nonaka, Kohei Seta, Toshihiro Suzuki,
Toshiaki Nakajima-Kambe(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

1,3-propanediol, glycerol, Citrobacter, biodiesel waste

1P-1p054 ギ酸による高 1,3-プロパンジオール生産菌 Citrobacterbraakii TB-96 株の増殖抑制○Lun Wang1, Soya Suganuma1, Akio Tani2, Takashi Hayakawa1,
Tomoyuki Nakagawa1(1Fac. Appl. Biol. Sci., Gifu Univ., 2IPSR., Okayama Univ.)

Key words

Methylobacterium zatmanii, methanol dehydrogenase, MxaFI

1P-1p056 Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110 由来 REE 依存
型メタノール脱水素酵素の酵素化学的諸性質○清 啓自 1, 森田 峻秀 1, 野中 大輔 2, 瀬田 幸平 1, 中島 敏明 1
（1筑波大院・生命環境, 2筑波大）
nakajima.toshiaki.ga@u.tsukuba.ac.jp○菅沼 宗矢 1, 王 倫 1, 日比野 歩美 1, 三井 亮司 2, 谷 明生 3,
海老原 章郎 1, 早川 享志 1, 中川 智行 1
（1岐阜大・応生科, 2岡山理大・理, 3岡山大・資源植物科研）
t_nakaga@gifu-u.ac.jp【背景】
グリセロールはバイオディーゼル生産における主な副産物で、その処分がバイオディーゼル生産の課題の 1 つとなっている。Citrobacter braakii TB-96 株はグリセロールから 1,3-プロパンジオール（以下 1,3-PD）を対数増殖期に盛んに生産し、24 時間で 48 g/L の 1,3-PD を生産する高 1,3-PD 生産菌である。しかし、その増殖は培養 15 時間で停止し、菌数（OD580nm）は低下し始める。同時に 1,3PD 生産も低下するためこの増殖停止が TB-96 株の最大 1,3-PD 生産量の頭打ちの一因と考えられた。そこで、本研究では TB-96 株の 1,3-PD 生産量増大のた
め、増殖停止要因の特定を目指した。
【方法・結果】
TB-96 株が培養 15 時間以降に死滅しているかを確認するため、菌数と生菌数としてコロニー形成数（以下 CFU）を測定した。その結果、菌数と CFU は同時に低下を始め、菌数の減少は死滅に起因することが示唆された。次に、最適培地（酵母エキス、リン酸カリウム、pH 8.0）で発酵産物による影響を検討した。
その結果、TB-96 株の副産物で 24 時間で 25 g/L 生産するギ酸存在下で細胞増殖速度は低下し、23 g/L 以上では増殖できなかった。しかし、この時 CFU は減少
せず、増殖抑制のみで死滅には至らなかった。これまでに培地の酵母エキス量を増大すると菌数低下の開始が遅延することが判明しており、酵母エキスによりギ酸の毒性を抑制している可能性が考えられた。そこで、最適培地と PBS(-)
でギ酸の添加有無で CFU の変化を測定した。最適培地ではギ酸添加の有無に関わらず、初発以上の CFU を維持し続けた。一方、PBS(-)では 1.5 時間でギ酸添
加なしでは初発と同等の CFU であったが、ギ酸添加ありで CFU はは急落した。
以上より、TB-96 株の増殖抑制と死滅は副産物のギ酸に起因すると考えられ、その毒性は酵母エキスの成分により抑制されることが示唆された。本研究はJST, ALCA の一環として行われた。

【目的】レアアース（REE）とは周期表第 3 族スカンジウム（Sc）、イットリウ
ム（Y）およびランタン（La）からルテチウム（Lu）までの 17 種類の金属の総称である。これらの金属種は土壌に一般的に存在しているが、その生物への影
響はあまり解明されていない。近年、REE を補因子とするメタノール脱水素酵
素（MDH）が Methylobacterium 属細菌や根粒菌 Bradyrhizobium 属細菌などの植物共生細菌から見いだされた。Methylobacterium 属細菌は REE 依存型 MDH の他にも Ca 依存型 MDH を持っているが、REE 存在下では優先的に REE 依存型
MDH が発現することが報告されている。さらに、通常メタノール生育を行わない Bradyrhizobium 属細菌も REE の存在下ではメタノール生育が可能となることから REE と植物共生細菌のメタノール資化には密接な関わりがあることが示
唆されている。しかし Bradyrhizobium 属細菌由来の REE 依存型 MDH の酵素化
学的諸性質はこれまで詳細に解析されていない。本研究では B. diazoefficiens の持つ REE 依存型 MDH の酵素化学的性質を解明し、根粒菌のメタノール生育における REE の役割を解明することを目的とする。
【方法・結果】メタノール／Ce 培地に生育した USDA110 株から無細胞抽出液を調製し、硫安沈殿（70%）、Butyl TOYOPEARL 6050S および Hitrap SP カラム
クロマトグラフィーを行い、Ce 依存型 MDH を SDS-PAGE にて単一バンドになるまで精製した。精製酵素は 64 kDa のサブユニットからなる単量体で、補因子として Ce を保持していた。Ce-MDH の比活性は 13.2 U/mg、最適温度は 35℃であった。Km 値は 67.2 μM、Vmax は 12.9 U/mg であった。この結果は M. extorquens
AM1 由来の Nd-MDH とほとんど変わらず、B. diazoefficiens においても Ce-MDH
によって十分なメタノール生育を示すものと考えられる。よって、根粒菌においては REE がメタノール生育に必須因子であることが示唆された。

Growth inhibition of high 1,3-propanediol producing bacteria Citrobacterbraakii strain TB-96 by formic acidCharacterization of REE-dependent methanol dehydrogenase from
Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110○Keiji Kiyoshi1, Takahide Morita1, Daisuke Nonaka2, Kohei Seta1,
Toshiaki Nakajima-Kambe1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Univ. Tsukuba)

Key words

Citrobacter braakii, growth inhibitor, 1,3-propanediol, formic acid

○Soya Suganuma1, Lun Wang1, Ayumi Hibino1, Ryoji Mitsui2, Akio Tani3,
Akio Ebihara1, Takashi Hayakawa1, Tomoyuki Nakagawa1(1Fac. Appl. Biol. Sci., Gifu Univ., 2Fac. Sci., Okayama Univ. Sci., 3IPSR., Okayama
Univ.)

Key words
elements

Bradyrhizobium diazoefficiens, methanol dehydrogenase, rare earth

代謝工学

1P-1p057 ナイロンオリゴマー分解菌 Arthrobacter sp. KI72 における 6-アミノヘキサン酸代謝系の同定

105

1P-1p059 好熱性水素細菌 Hydrogenobacter thermophilus TK-6 のヒドロゲナーゼ機能の解析○竹原 一起 1, 谷本 悠樹 1, 藤井 翼 1, 加藤 太一郎 2, 武尾 正弘 1,
根来 誠司 1
（1兵庫県大院・工, 2鹿児島大院・理工）
negoro@eng.u-hyogo.ac.jp○井上 達也 1, 平野 伸一 2, 松本 伯夫 2, 石井 正治 1, 新井 博之 1
（1東大院・農生科, 2電中研）
amishii@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp<方法および結果>
4-アミノ酪酸代謝経路との類似性から、6-アミノヘキサン酸はアミノトランス
フェラーゼによりアジピン酸セミアルデヒドに変換され、その後デヒドロゲナー
ゼによりアジピン酸へと変換されると予測した。アミノトランスフェラーゼについては 4-アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼの配列を、デヒドロゲナーゼについては NADP+依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼの配列をクエリとして、
Arthrobacter sp. KI72 ドラフトゲノム配列において相同性のある遺伝子(各々、nylD、nylE と命名)を探索した。各候補遺伝子を PCR で増幅し、コールドショッ
ク発現ベクター(pCold I)に組み込み、大腸菌より高発現したタンパク質を Histag 融合タンパク質として精製した。6-アミノヘキサン酸をアミノ基供与体とし、ピルビン酸またはグリオキシル酸をアミノ基受容体として酵素反応を行い、生成物を TLC で検出した。その結果、アラニン、グリシンが検出され、NylD
は 6-アミノヘキサン酸アミノトランスフェラーゼであると同定した。また、
NADP+を補酵素として、アジピン酸セミアルデヒドからアジピン酸への変換活性を有する酵素(NylE)を同定した。以上より、6-アミノヘキサン酸は、まず NylD
によりアジピン酸セミアルデヒドへ、次いで NylE によりアジピン酸へ変換されると結論した。

【背景及び目的】ヒドロゲナーゼは一般的に酸素感受性である。そのため、水素細菌には微好気性（至適酸素濃度数%）のものが多いが、Hydrogenobacter
thermophilus TK-6 株は高酸素濃度条件下(酸素濃度 30%以上)においても生育可
能な好熱性水素細菌である。H. thermophilus TK-6 の近縁種 Aquifex aeolicus が 3つのヒドロゲナーゼ HydrogenaseI, II, III を有しているのに対して、本菌はそれぞれのホモログ（Hup1、Hup2、Hyn）に加えて、4 つ目のヒドロゲナーゼ Hox
を有している。これまでにトランスクリプトーム解析の結果から、hox, hup1 が酸素濃度に依らず恒常発現しており、高酸素濃度条件では特に hox の転写量が上昇することが明らかとなっている。よって Hox が本菌に特徴的な高酸素濃度での増殖に関与することが推定されるが、その役割は不明確である。そこで、本研究では hox 遺伝子破壊株の解析を通じて Hox が本菌の増殖に果たす役割を推定することを目的とした。
【方法及び結果】これまでに、我々のグループにおいて作成された遺伝子破壊株
Δhox 株と Δhup1 株、および野性株を一定の酸素濃度条件下（10, 20, 30, 40%）で培養を行い、それぞれの増殖を評価した。その結果、Δhox 株は酸素濃度 30%で増殖遅延が生じ、40%において完全に増殖が抑制された。その一方で、野性株および Δhup1 株は今回試験した酸素濃度範囲においては同様の増殖挙動を示し、高酸素濃度 40 %においても増殖は維持された。よって、本菌の高酸素濃度
条件下での特徴的な増殖には Hox が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。現在、本菌が有する主要なヒドロゲナーゼについて高酸素濃度条件下での活性評価を進めている。本発表では前述の結果と合わせ、本菌の増殖過程
における各ヒドロゲナーゼの役割について考察を行う。

Metabolic pathway of 6-aminohexanoate in nylon oligomer-degrading
bacterium.

Studies on the functions of hydrogenases in Hydrogenobacter thermophilus
TK-6

<目的>
Arthrobacter sp. KI72 はナイロンオリゴマー(6-アミノヘキサン環状/直鎖状オリ
ゴマーの総称)を単一炭素源/窒素源として生育する。本微生物が保持する 3 種類の酵素(NylA/NylB/NylC)により、同オリゴマーは 6-アミノヘキサン酸まで分解されるが、これより下流の代謝経路は解明されていない。モノマー以降の代
謝系は、不要ナイロンからの有用物質への変換や、バイオマスからのナイロン原料の生産への応用が期待できる。本研究では 6-アミノヘキサン酸代謝経路の同定を目的として検討を行った。

○Ikki Takehara1, Yuuki Tanimoto1, Tsubasa Fujii1, Dai-ichiro Kato2,
Masahiro Takeo1, Seiji Negoro1(1Grad. Sch. Eng., Univ. Hyogo, 2Grad. Sch. Sci. Eng., Kagoshima Univ.)

Key words

6-aminohexanoate, Arthrobacter, metabolism

1P-1p058 代謝改変した大腸菌による好気培養条件での酪酸生産○片岡 尚也 1,2,3, Vangnai Alisa S. 4, 藥師 寿治 1,2,3, 松下 一信 1,2,3（1山口大・農, 2山口大院・創成科学, 3山口大・中高温微セ, 4チュ
ラロンコン大）nkataoka@yamguchi-u.ac.jp【背景・目的】酪酸は, 食品香料やプラスチックの原料といった用途を持つ, 産業
的に広く利用されている炭素数 4 の直鎖脂肪酸である。生物学的な酪酸生成は,Clostridium 属細菌や代謝改変された大腸菌により報告されているが, その多くが酸素を絞った微好気および嫌気培養条件でのもので, 好気培養条件での報告例はほとんど存在しない。そこで本研究では, 好気培養条件における酪酸生成およびその生産性の評価を目的に設定し, 研究に着手した。
【方法・結果】我々は以前, 好気培養条件で機能するブタノール合成代謝経路を報告した (1, 2)。その際, 少量ではあるが酪酸の生成が確認され, これは, 報告したブタノール合成代謝経路が, 酪酸生成に利用可能であることを示唆していた。
そこで, ブタノール合成代謝経路を改変することで新規な酪酸合成代謝経路を設計し, 大腸菌内で構築した。構築株を用いて 167 mM のグルコースを含む発酵培
地で 24 時間好気的に培養したところ, 24.2 mM の酪酸生成が確認され, 設計した酪酸合成代謝経路が, 好気培養条件で機能することが明らかになった。現在, 造成した組換え大腸菌による酪酸の生産性を評価するべく, 培養条件の検討による生産の効率化に取り組んでいる。
1. Kataoka et al., J. Biotechnol., 204: 25-32 (2015).
2. Kataoka et al., 第 65 回 日本生物工学会大会, 2P-117 (2013).

Butyrate production under aerobic growth conditions by metabolicallyengineered Escherichia coli

○Naoya Kataoka1,2,3, Alisa S. Vangnai4, Toshiharu Yakushi1,2,3,
Kazunobu Matsushita1,2,3(1Fac. Agric., Yamaguchi Univ., 2Grad. Sch. Sci. Tech., Yamaguchi Univ., 3RCTMR,
Yamaguchi Univ., 4Chulalongkorn Univ.)

Key words

butyrate, Escherichia coli, synthetic metabolic pathway○Tatsuya Inoue1, Shin-ichi Hirano2, Norio Matsumoto2, Masaharu Ishii1,
Hiroyuki Arai1(1Grad. Sch. Agric. Life Sci., Univ. Tokyo, 2CRIEPI)

Key words

hydrogen-oxidizing bacteria, hydrogenase

1P-1p060 硫黄代謝関連遺伝子の改変による大腸菌のシステイン発
酵生産性の向上○河野 祐介 1, 仲谷 豪 2, 西口 みゆ 2, 鶴岡 愛 2, 高木 博史 2,
大津 厳生 1,2
（1筑波大・国際産学連携本部, 2奈良先端大・バイオ）ohtsu.iwao.fm@u.tsukuba.ac.jp【背景・目的】
大腸菌は、硫酸イオン（SO42-）またはチオ硫酸イオン（S2O32-）から、生育に必須の L-システインを合成する二つの硫黄同化経路を有している。従って、チオ硫酸経路上の cysM 遺伝子の欠損株は、S2O32-を単一硫黄源として生育できない
が、SO42-では生育できる。これに対し、SO42-があっても、S2O32-が同時に存在
すると cysM 欠損株が生育できない現象（チオ硫酸リプレッション、TSR）を
我々は見いだしている。そのメカニズムは不明であるが、遺伝子スクリーニン
グ実験の結果、この現象には nudH 遺伝子（mRNA 分解に関与する酵素）が必要であることも見いだしている。そこで、本研究では、この遺伝子のシステイ
ン発酵生産に対する効果を明らかにすることを目的とした。
【方法・結果】
まず、システイン生産の硫黄源として、高価だが生産性の高い「チオ硫酸塩」と安価だが生産性の低い「硫酸塩」、その両方が存在する条件でシステイン発酵生産を行った。その結果、nudH 遺伝子を破壊したシステイン生産大腸菌株（システイン生合成系強化株）では、硫酸塩からのシステイン生産量が約 2 倍に増加した。この結果は、nudH 遺伝子が SO42-同化の抑制に寄与する上記の事実とも整合している。これを踏まえ、システイン生産を向上させることが分かっている yciW 遺伝子と gshA 遺伝子の破壊もさらに加えた変異株を用いて、炭素源
および硫黄源を流加するジャーファーメンター培養に供したところ、16 g/L のシステイン生産に成功した。本発表では、これらのプロセスやその効果について紹介・議論したい。なお、本研究は、農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業の支援を受けて行った。

Enhancement of cysteine production using Escherichia coli by sulfur
metabolic gene engineering○Yusuke Kawano1, Takeshi Nakatani2, Ai Tsuruoka2, Miyu Nishiguchi2,
Hiroshi Takagi2, Iwao Ohtsu1,2(1International Innov. Interface Organization, Univ. Tsukuba, 2Grad. Sch. Biol. Sci.,
NAIST)

Key words
metabolism

Escherichia coli, cysteine biosynthesis, fermentation, sulfur

106

代謝工学

1P-1p061 大腸菌 nudH 遺伝子の機能解析とシステイン発酵生産への応用○石井 寛子 1, 鶴岡 愛 2, 河野 祐介 1, 高木 博史 2, 大津 厳生 1,2（1筑波大・国際産学連携本部, 2奈良先端大・バイオ）ohtsu.iwao.fm@u.tsukuba.ac.jp

1P-1p063 好熱性水素細菌 Hydrogenobacter thermophilus TK-6 におけるチオ硫酸酸化代謝の解析○小倉 一将 1, Dahl Christiane 2, 三本木 至宏 3, 新井 博之 1,
石井 正治 1
（1東大院・農生科, 2Inst. Microbiol. Biotechnol., Univ. Bonn, 3広島
大院・生物圏）
amishii@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp【背景と目的】大腸菌は生育に必須のシステイン（Cys）を生合成する、硫酸イオン（SO42-）を利用する硫酸経路とチオ硫酸イオン（S2O32-）を利用するチオ硫酸経路という二種類の硫黄同化経路を有する。当研究グループはこれまでに、チオ硫酸経路上の cysM 遺伝子（S-スルホシステイン合成酵素）を欠損させた株が硫酸塩を単一硫黄源とした場合は生育するが硫酸塩とチオ硫酸塩が同時に存在する条件では生育できない現象（チオ硫酸リプレッション）を見いだしている。さらに ΔcysMΔX 二重欠損株ライブラリーを用いたスクリーニング実験の結果、硫酸塩＋チオ硫酸塩条件で生育可能な ΔcysMΔnudH 二重欠損株を取得した。nudH 遺伝子は RNA 5’ピロホスホヒドラーゼをコードしており mRNA の分解に関与する事が報告されているが、硫黄代謝との関連は不明である。そこで本研究では nudH 遺伝子の機能解析と Cys 発酵生産への効果を明らかにする事を目的とした。
【方法・結果】nudH 遺伝子の硫黄代謝との関連や機能を明らかにする為、nudH
遺伝子の転写調節因子の探索や nudH 下流遺伝子の硫黄代謝への影響の検証、野生株と nudH 欠損株の硫酸イオン輸送活性の比較やマイクロアレイによる発現比較解析などを実施した。これらの実験結果から、nudH 欠損株は硫酸塩単一
硫黄源条件下で、既知の S-スルホシステインを経由するチオ硫酸経路とは異なる経路を用いる事によりチオ硫酸イオンからの Cys 合成が促進されている可能性が示唆された。さらに nudH 欠損株を用いた Cys 発酵試験の結果、nudH 欠損
株は野生株と比較して 1.4 倍の Cys 生産量を示した。さらに当研究グループがこれまでに Cys 生産性が向上することを見いだしている yciW 遺伝子欠損も組み合わせた ΔnudHΔyciW 株は野生株と比較して 2 倍の Cys 生産量を示した。
なお、本研究は農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業の支援を受けて行った。

Hydrogenobacter thermophilus TK-6 は伊豆の峰温泉付近の土壌から単離された好熱性絶対独立栄養性の水素細菌である。本菌は水素またはチオ硫酸をエネルギー源とし、二酸化炭素を唯一の炭素源として生育する。当研究室では今までに、本菌が元素硫黄を中間生成物としたチオ硫酸の酸化代謝を持つことを明らかにしている。本菌の硫黄代謝関連遺伝子破壊株は作成されているが、その表現型
解析は十分に為されていない。そこで本研究では、遺伝子破壊株の表現型解析
を中心として、H. thermophilus における硫黄代謝関連遺伝子の生理学的機能解明を目的とした。
本研究では野生株、遺伝子破壊株の生育をとりながら、培養液中の各種硫黄化
合物濃度を測定し、チオ硫酸培養条件下における硫黄化合物の挙動を明らかにした。チオ硫酸を酸化する遺伝子の破壊株では生育の遅延、培養液中の元素硫黄の蓄積が確認されたことから、これらの酵素がチオ硫酸からのエネルギー獲得に関わることが示唆された。
硫黄代謝においては、硫黄化合物のキャリアタンパク質が重要な役割を果たす。
ロダネーゼはその一種であり、H. thermophilus でも 2 つの遺伝子が存在する。
本研究では 3 種類の破壊株 (Δrhd1, Δrhd2, Δrhd1Δrhd2)の生育および硫黄化合物
量の変化を測定した。Δrhd1 株では野生株と比較して、チオ硫酸の消費が促進されたことから、rhd1 の破壊は本菌の代謝に影響を与えることが示唆された。
Δrhd2 株の表現型の変化は見られず、また Δrhd1Δrhd2 株の表現型は Δrhd1 株と同様の結果となった。
以上の結果から、既往の研究で硫黄代謝に関わるとされた遺伝子が in vivo においても重要な働きをすることが示唆された。今後、各酵素の詳細な解析を進めることで H. thermophilus における硫黄代謝の全容を詳らかにしていく予定である。

Functional analysis of the nudH gene in Escherichia coli and its application
to cysteine production

Analyses of thiosulfate-oxidizing metabolism in Hydrogenobacter
thermophilus TK-6

Escherichia coli, cysteine, sulfur, catabolite repression

Key words
hydrogen-oxidizing bacteria, metabolism, sulfur metabolism,
Hydrogenobacter thermophilus○Hiroko Ishii1, Ai Tsuruoka2, Yusuke Kawano1, Hiroshi Takagi2, Iwao Ohtsu1,2(1International Innov. Interface Organization, Univ. Tsukuba, 2Grad. Sch. Biol. Sci.,
NAIST)

Key words

1P-1p062 大腸菌における硫黄源のカタボライト抑制機構の解明○西口 みゆ 1, 城山 真恵加 1, 河野 祐介 2, 高木 博史 1, 大津 厳生 1,2（1奈良先端大・バイオ, 2筑波大・国際産学連携本部）
ohtsu.iwao.fm@u.tsukuba.ac.jp○Kazumasa Ogura1, Christiane Dahl2, Yoshihiro Sambongi3, Hiroyuki Arai1,
Masaharu Ishii1(1Grad. Sch. Agric. Life Sci., Univ. Tokyo, 2Inst. Microbiol. Biotechnol., Univ.
Bonn, 3Grad. Sch. Biosphere Sci., Hiroshima Univ.)

1P-1p064 代謝経路解析に基づく定常期にコハク酸を生産する大腸菌の開発○戸谷 吉博, 白木 孝典, 清水 浩
（阪大院・情報）shimizu@ist.osaka-u.ac.jp【背景】大腸菌は硫酸イオン（SO42- ）を取り込みシステインシンセターゼ A（CysK）によってシステイン（Cys）を合成する硫酸経路と、チオ硫酸イオン（S2O32-）を取り込みシステインシンテターゼ B（CysM）によって Cys を合成す
るチオ硫酸経路の二つの Cys 生合成経路が存在する。Cys は細胞内毒性が高い
ため厳密に制御されており、(1)Cys によるフィードバック阻害と(2)Cys 合成に関与する遺伝子群を活性化する転写因子 CysB による制御が知られている。こ
うした背景の中、私たちは環境中に SO42-と S2O32-が同時に存在すると、大腸菌
は S2O32-から Cys を合成する「チオ硫酸リプレッション（TSR）」を備えていることを発見した。しかし、そのメカニズムは不明である。
【方法・結果】そこで、炭素源や窒素源のカタボライトリプレッションと同様に硫黄源のカタボライトリプレッション TSR もトランスポーターによる制御ではないかと考えた。大腸菌は唯一の SO42-のトランスポーターであり S2O32-も輸送する CysPTWA と、S2O32-を特異的に輸送する YeeED の２つの輸送経路を有している。私達は、yeeE 欠損株が野生株や cysM 欠損株と同様に TSR を受けるのに対し、cysA 欠株は TSR を受けないことを見出した。CysPTWA 経路の場合細胞内に S2O32-として取り込まれるが、YeeED 経路の場合 S2O32-は硫黄転移酵素 YeeD
により亜硫酸イオンへとして細胞内に取り込まれる点で異なる。次に、S2O32-がTSR 解除の原因であるかどうかを検証した。MBP タグを付加した MBP-CysBと DIG 標識した cysP フラグメントを用いて、硫酸ナトリウムまたはチオ硫酸ナトリウム条件下でゲルシフトアッセイを行った。ゲルシフトアッセイの結果、
硫酸ナトリウム条件下と比較するとチオ硫酸ナトリウム条件下のバンドが減少した。これより、S2O32-が存在すると、CysB が CysPTWA オペロンのプロモーターに結合できなくなることが判明した。

【背景と目的】
微生物を用いた増殖非連動型の物質生産では、原料を菌体合成に使用しないですむため、高い目的物質の収率が期待できる。代謝経路の化学量論モデルを用いたシミュレーションに基づく改変は効果的なアプローチであるが、増殖非連型の物質生産ための方法は存在しなかった。我々は、代謝フラックスの取りうる範囲に着目することで、定常状態を維持するには目的物質の生産が不可欠になるように代謝経路を設計する手法(Solution space design [SSDesign])を開発した。本発表では、大腸菌によるコハク酸生産について、定常期での生産に有効な遺伝子破壊を予測し、その効果を検証した。
【結果】
大腸菌の中枢代謝経路の化学量論モデルを用いて SSDesign を実行した結果、
pykA, pykF, sfcA, pntAB, sthA の遺伝子破壊、もしくは pykA, pykF, sfcA, maeB, zwfの遺伝子破壊により、定常期に 1 mol/mol 以上の収率でコハク酸を生産することが予測された。そこで、大腸菌 BW25113 株を親株として、これらの多重遺伝子破壊株 (SSD-01 と SSD-02)を構築し、定常期におけるコハク酸の収率を評価した。まず、細胞を増やすため、各菌株をグルコースを炭素源とする合成培
地で好気培養した。増殖停止後の細胞を回収し、10 g/L のグルコースと炭酸水
素ナトリウムを加えた合成培地に再懸濁し、微好気条件で培養を継続した。定常期におけるコハク酸収率は、親株の 0.15 mol/mol に対して、SSD-01 株では0.34 mol/mol、SSD-02 株では 0.40 mol/mol に増加した。遺伝子破壊によりコハク酸収率は向上したものの、設計通りの収率は実現できておらず、これは予測に用いたモデルに含まれていない代謝経路が働いたことを示唆している。モデルに含まれる代謝経路を検討することで、より高精度な予測と設計を実現する。

Functional Analysis of Sulfur catabolite repression in Escherichia coli

Metabolic pathway engineering of Escherichia coli for succinate production
during stationary phase○Miyu Nishiguchi1, Maeka Shiroyama1, Yusuke Kawano2, Hiroshi Takagi1,
Iwao Ohtsu1,2(1Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST, 2International Innov. Interface Organization, Univ.
Tsukuba)

Key words

Escherichia coli, cysteine, fermentation, sulfur metabolism○Yoshihiro Toya, Takanori Shiraki, Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words
metabolic engineering, metabolic pathway modification, Escherichia
coli, succinate代謝工学

1P-1p065 Shewanella 属細菌において新たに発見された CRP/
cAMP 制御系の生理機能とその制御機構の解明

107

1P-1p067 バイオプロセス効率化に向けた合成クオラムセンシングと代謝トグルスイッチによる大腸菌表現型の可塑的制御○笠井 拓哉, 高妻 篤史, 渡邉 一哉（東薬大院・生科）
kazuyaw@toyaku.ac.jp○相馬 悠希 1, 花井 泰三 2
（1九大・生医研, 2九大院・農）taizo@brs.kyushu-u.ac.jp【背景】cAMP receptor protein (CRP) は多くの細菌に保存されている転写因子であり、cAMP と複合体を形成して標的遺伝子の転写を活性化する。CRP/cAMP
制御系の生理機能は大腸菌において調べられており、糖代謝のカタボライト抑制に関与することが知られている。しかし CRP は糖を代謝できない多くの環境
細菌にも保存されており、これらの細菌における CRP/cAMP 制御系の役割には
不 明 な 点 が 多 い 。 そ こ で 本 研 究 は 糖 を 代 謝 で き な い 環 境 細 菌 Shewanella
oneidensis MR-1 株の CRP/cAMP 制御系の生理機能とシグナル伝達経路の解明を目的とした。MR-1 株では CRP は嫌気呼吸等の異化代謝の制御に関与することが知られている。本発表では本株において新たに発見された cAMP 濃度調節因
子と CRP/cAMP 制御系の生理機能について報告する。
【結果】cAMP 分解酵素をコードすると予想された遺伝子の破壊株 (ΔcpdA) を作
製し、cAMP 濃度を測定した結果、ΔcpdA 株は野生株 (WT) の約 3 倍の cAMPを蓄積していた。この結果から、CpdA が MR-1 株における重要な cAMP 濃度調節因子であることが示された。ΔcpdA 株の生育特性を調べた結果、乳酸最少培地 (LMM) において、本株の増殖は WT よりも著しく低下することが明らかとなった。この原因を探索するため ΔcpdA 株のトランスクリプトーム解析を行った結果、本株ではメチオニン、S-アデノシルメチオニン (SAM) およびヒスチジン合成遺伝子の発現量が著しく減少していることが判明した。これら 3 つの化合物を LMM へ添加すると、ΔcpdA 株の増殖は大幅に改善された。以上の結果からこれらの化合物の合成は cAMP 濃度の上昇によって抑制されることが明らかとなり、CRP/cAMP 制御系は異化代謝に加え、同化代謝の制御にも関与することが示唆された。今後は CRP/cAMP 制御系が同化代謝を制御する分子機構を明らかにしていく予定である。

【背景・目的】 微生物による高効率の物質生産プロセスを実現するには，宿主表現型の適切な改変が必要であるが，プロセス全体を通じて最適な表現型は必ずしも均一ではない．例えば，菌体増殖に重要な TCA 回路は，様々な物質生産の前駆体となる Acetyl-CoA を消費するため，菌体増殖と物質生産に最適な表現
型は互いに相反する．宿主が自らの菌体密度を感知して対立する表現型を可塑的に制御できれば，菌体増殖と物質生産の双方を最大化できる．我々はこれまでに，大腸菌による Isopropanol (IPA) 生産をモデルケースとして，誘導剤添加に伴って TCA 回路を遮断し，余剰の代謝流束を IPA 生産経路に利用する事で「菌体増殖型表現型」から「IPA 生産型表現型」へと制御する代謝トグルスイッ
チ (MTS) を構築している．本研究では，MTS による表現型制御を大腸菌による自律的な菌体密度感知と遺伝子発現制御によって誘導するために，Vibrio
fischeri 由来のクオラムセンシング機構である lux システムの大腸菌での再構成に取り組んだ．
【方法・結果】 lux システムでは LuxI により合成される Acyl homoserine lactone(AHL) が菌体増殖と連動して環境中に拡散し，これを LuxR が感知して複合体を形成し，Plux プロモータ下流の遺伝子発現を誘導する．MTS による表現型制
御を最適な菌体密度で自律的に誘導するには，lux システムによって遺伝子発現が誘導される菌体密度を適宜調整する必要がある．そこで，Plux の両端に lacO
配列を導入することで AHL-LuxR 複合体との結合を LacI リプレッサーの立体障害で制限できる PluxlacO プロモータを構築し，IPTG 濃度に依存して遺伝子発現誘導が開始される菌体密度を調整可能な合成 lux システムを構築した．これをMTS と統合することで，培養開始時に添加する IPTG 濃度に依存して様々な菌
体密度で自律的に表現型を制御する IPA 生産大腸菌の構築に成功した．

Novel physiological function of CRP/cAMP-dependent regulatory system in
Shewanella oneidensis MR-1.

Phenotypic control by synthetic quorum sensing and metabolic toggle switch
for efficient bioprocess○Takuya Kasai, Atsushi Kouzuma, Kazuya Watanabe(Grad. Sch. Life Sci., Tokyo Univ. Pharm. Life Sci.)

Key words

Shewanella oneidensis MR-1, cAMP, metabolism, signal transduction

1P-1p066 メバロン酸生産大腸菌の細胞内代謝状態の定量的な評価○Yuki Soma1, Taizo Hanai2(1Med. Inst. Bioreg., Kyushu Univ., 2Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words

1P-1p068 メタボリックトグルスイッチを用いた γ-アミノ酪酸生産○藤原 由梨 1, 中川 拓弥 2, 鶴野 圭悟 3, 相馬 悠希 4, 花井 泰三 3
（1九大・農, 2九大院・生資環, 3九大院・農, 4九大・生医研）
taizo@brs.kyushu-u.ac.jp○永井 暉, 戸谷 吉博, 松田 史生, 清水 浩
（阪大院・情報）shimizu@bio.eng.osaka-u.ac.jp[研究背景] メバロン酸は化成品の原料となる炭素数 6 の有機酸である。これまでに Entorococcus faecalis 由来の生合成経路遺伝子を導入した大腸菌が構築され、グラムスケールの発酵生産が報告されている。本研究ではさらなる代謝改変に向けた知見を得るために、大腸菌メバロン酸生産株の細胞内代謝物濃度を絶対定量し、代謝状態を熱力学的に評価することを試みた。
[方法と結果] 大腸菌 MG1655 株の染色体に λDE3 遺伝子を組み込んだ Moc 株と、E. faecalis 由来の mvaES 遺伝子を強発現した ES 株を、非標識または[U-13C]
グルコース含む M9 培地で回分培養した。フィルター法および冷メタノール法
でクエンチ、回収した菌体からクロロホルム-メタノール-水法で代謝物を抽出した。[U-13C]グルコース培地で培養した菌体由来の抽出液と、非標識培地由来の菌体の抽出液に混合したサンプルを液体クロマトグラフ‐質量分析計 (LCMS/MS) とガスクロマトグラフ (GC‐MS) を用いて測定した。各代謝物の非標
識体と[U-13C]標識体のピーク面積比から、代謝物質濃度を正確に定量した。
[結果と考察] E. faecalis 由来の mvaES 遺伝子を導入した大腸菌 ES 株を M9 培地
で回分培養したところ、メバロン酸比生産速度、対糖収率はそれぞれ 2.75 ± 0.07
mmol/gDW/h、26.01 ± 0.02％だった。ES 株およびコントロール株 (Moc 株) から
細胞内代謝物を抽出し、絶対濃度を定量した。両株で FBP が最も高含量だった(26.90 ± 0.00 および 22.00 ± 0.00 mmol/gDW/h)。また、ES 株では解糖系とクエン酸回路の代謝物濃度が Moc 株に比べて有意に減少していた。絶対濃度からギブス自由エネルギー変化 (ΔG) を算出した結果、解糖系、ペントースリン酸経路、クエン酸回路の反応の ΔG が 0 に近く、Moc 株と ES 株間で大きな差異は認められなかった。

The quantitative rating of intracellular metabolism in mevalonateproducing Escherichia coli
○Hikaru Nagai, Yoshihiro Toya, Fumio Matsuda, Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words
mevalonate

intracellular metabolites, Escherichia coli, absolute quantification,

Escherichia coli, quorum sensing, toggle switch, TCA cycle【背景・目的】 γ-アミノ酪酸 (GABA) は，ストレス低減作用などを有するため
食品添加物や医薬品に利用されるほか，高強度バイオプラスチックの原料として注目されている．従来，GABA はグルタミン酸脱炭酸酵素 (GAD) を強発現させた大腸菌などの高密度菌体に前駆体であるグルタミン酸を外部添加するバイ
オコンバージョンで生産されてきた．近年，コスト軽減を目指して，より安価な基質であるグルコースからの発酵生産手法が開発されている．GABA 発酵では菌体増殖に重要な TCA 回路の中間代謝物である α-ケトグルタル酸 (α-KG) からグルタミン酸合成を経由して GABA を生産するため，菌体増殖と GABA 生
産が互いに競合して生産性低下を招く．GABA 発酵の効率化には，この競合関係を解消し，菌体増殖と比産性の双方を担保する必要がある．本研究では，大腸菌による GABA 発酵において，TCA 回路の他，GABA 生産と競合する様々な代謝流束を発酵過程の任意のタイミングで遮断し，代謝流束を GABA 生産経路に転換するためのメタボリックトグルスイッチ (MTS) の開発に取り組んだ．
【方法・結果】 GABA 生産との競合反応として，α-KG からのスクシニル CoA
合成を触媒する sucA，イソクエン酸からのグリオキシル酸合成を触媒する aceAに着目し，これらの発現を制御する人工遺伝子回路を構築した．回路は IPTG
添加によって PLlacO1 下流の tetR が発現すると，PLtetO1 下流の sucA, aceA の発現が抑制され，同時に GABA 生産系遺伝子群 (pyc, gdhA, gadB) が発現する設計とした．同回路を ΔsucA ΔaceA 株に導入して MTS 株とし，GABA 生産系遺伝子群のみを導入したコントロール株と GABA 生産性を比較した．培養開始後 3
h に 0.1 mM IPTG を添加した MTS 株は，コントロール株と比較して最終体密度が約 0.7 g-DCW/L 低下したものの，比生産速度が 7.6 倍に向上し，GABA 生産
量は 4.4 倍 (3.2 g/L) に向上した．

Production of gamma-aminobutyric acid by metabolic toggle switch○Yuri Fujiwara1, Takuya Nakagawa2, Keigo Tsuruno3, Yuki Soma4, Taizo Hanai3(1Fac. Agric., Kyushu Univ., 2Grad. Sch. Bioresour. Bioenviron. Sci., Kyushu Univ.,
3Fac. Agric., Kyushu Univ., 4Med. Inst. Bioreg., Kyushu Univ.)

Key words

Escherichia coli, GABA, synthetic biology, toggle switch

108

醸造学，醸造工学

1P-1p069 ストレス環境におけるアルコール発酵力の改善を目指した酵母 RIM15 遺伝子のプロモーター改変

1P-1p071 VID24 遺伝子変異の接合型を指標としたリンゴ酸高生
産酵母の育種○渡辺 大輔 1, 金子 亜紀江 2, 杉本 幸子 1, 大貫 慎輔 2, 高木 博史 1,
大矢 禎一 2
（1奈良先端大・バイオ, 2東大院・新領域）
ohya@k.u-tokyo.ac.jp【背景】 我々は以前に、清酒酵母きょうかい 7 号および近縁株が示す高いアルコール発酵力の主要な原因として、Greatwall ファミリープロテインキナーゼをコードする RIM15 遺伝子上の機能欠失変異を同定した 1,2) 。しかしながら、
Rim15p は、アルコール発酵の調節だけでなくストレス応答においても重要な役割を果たしているので、その機能欠損は、清酒もろみよりも厳しい発酵環境では不利に働く可能性がある。そこで本研究では、アルコール発酵力とストレス耐性を兼ね備えた株を創出するために、RIM15 遺伝子の 5'-UTR 領域に、糖新生遺伝子 PCK1 のプロモーター配列を挿入した。

○根来 宏明, 小高 敦史, 松村 憲吾, 秦 洋二
（月桂冠・総研）
negoro@gekkeikan.co.jp

1) Appl. Environ. Microbiol., 78: 4008-4016 (2012)
2) Appl. Environ. Microbiol., 82: 340-351 (2016)【目的】 清酒中のリンゴ酸は呈味に寄与する重要な成分であり、これまでに様々なリンゴ酸高生産酵母が育種されている。最近我々は、コハク酸ジメチル（DMS）
感受性を指標に取得したリンゴ酸高生産酵母 K-901H において、VID24 の変異（p.G131R）が高生産となる要因であることを報告した 1)。K-901H は二倍体であり VID24 変異をヘテロ接合型に有することから、この変異は優性もしくは半優性であると推測した。今回、VID24 変異の接合型が表現型に与える影響を検証し、得られた知見を利用してリンゴ酸生成能を更に増強させる育種法の開発を行った。
【方法と結果】 遺伝子組換えにより VID24 変異をヘテロ接合型あるいはホモ接合型として二倍体酵母に導入し、得られた株を DMS 感受性試験と清酒醸造試
験に供した。その結果、変異型 VID24 のコピー数に応じて DMS 感受性とリンゴ酸生成能が増加したことから、VID24 変異は半優性の形質であると考えられた。次に、遺伝子組換えを用いずに、K-901H を親株として VID24 変異がホモ接合型となった株の取得を試みた。ヘテロ接合性の消失を促進させる紫外線照射、DMS 含有培地におけるナイスタチン濃縮、および YM10 培地でのリンゴ酸生成能の評価を組み合わせることで、ホモ接合型株（K-901H×2）を得た。清酒醸造試験において、K-901H と K-901H×2 のリンゴ酸濃度はそれぞれ 0.53 g/l
および 1.19 g/l であったが、一方でエタノール生成は同程度であった。以上より、VID24 変異の接合型を指標にリンゴ酸生産能が異なる実用清酒酵母を育種することができた。
1) H. Negoro et al., J. Biosci. Bioeng., 121(6), 665-671 (2016)

Promoter engineering of the Saccharomyces cerevisiae RIM15 gene for
improvement of alcoholic fermentation rates under stress conditions

Breeding of high malate-producing diploid sake yeast with a homozygous
mutation in the VID24 gene

【結果】 プロモーター改変株は、グルコースの豊富な発酵前半では RIM15 遺伝
子の発現を抑制し、ストレスが強くなる発酵後半に RIM15 遺伝子の発現を誘導した。その結果、単独の回分発酵試験（グルコース 20％）では、RIM15 遺伝子破壊株よりも高い生存率を維持しながらも、同程度の発酵速度を示すことができた。さらに、繰り返し回分発酵試験（グルコース 20％、10 回繰り返し）や高グルコース条件における回分発酵試験（グルコース 40％）では、RIM15 遺伝子
破壊株を上回る高い発酵速度を示した。以上の結果から、アルコール発酵調節とストレス応答の両方を司る RIM15 遺伝子のプロモーター改変の有効性を新たに示すことができた。

○Daisuke Watanabe1, Akie Kaneko2, Yukiko Sugimoto1, Shinsuke Ohnuki2,
Hiroshi Takagi1, Yoshikazu Ohya2(1Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST, 2Grad. Sci. Frontier Sci., Univ. Tokyo)

Key words

alcoholic fermentation, stress response, RIM15, promoter engineering

1P-1p070 清酒酵母の機能性アミノ酸蓄積変異株の分離と醸造特性の解析○Hiroaki Negoro, Atsushi Kotaka, Kengo Matsumura, Yoji Hata
(Res. Inst., Gekkeikan Sake Co., Ltd.)Key words

malic acid, VID24, Homozygous mutation, Diploid sake yeast

1P-1p072 光トラッピング細胞融合法を用いた融合酵母によるホエー由来醸造飲料の開発○大橋 正孝 1, 渡辺 大輔 2, 高木 博史 2
（1奈良産振セ・バイオ・食品グループ, 2奈良先端大・バイオ）ohashi-masataka@office.pref.nara.lg.jp○山畑 直樹 1, 田口 耕造 2, 若山 守 1（1立命館大院・生命科学, 2立命館大院・理工）
wakayama@sk.ritsumei.ac.jp【背景と目的】我々は清酒の消費低迷を打破するために、ユニークな清酒酵母の開発を目指している。これまでの研究で、遺伝子組換え体を用いずにエタノー
ル生産性の高い清酒酵母を分離する過程で、アルコール性疲労の抑制や肝臓の働きを助けるなどの機能性を有するオルニチンを細胞内に高蓄積する変異株を分離することに成功した。オルニチンを高生産する清酒酵母を用いた醸造によって、新たなコストをかけることなく、機能性を有するオルニチンを多く含む清酒や酒粕を製造することが期待できる。
そこで、本研究では、得られた変異株を用いて清酒の小仕込み試験を行い、醸造特性を解析するとともに、清酒や酒粕中のオルニチン量を測定した。
【方法及び結果】協会酵母 901 号を EMS 変異処理後、プロリンアナログのアゼ
チジン-2-カルボン酸（AZC）を含有する SD 寒天培地で生育できる株を分離した。次に、各株を SD 液体培地で 2 日間培養後、細胞内のプロリン含量をアミノ酸アナライザーで測定し、親株よりも 5 倍以上蓄積した株を選抜した。さらに、寒天培地でのスポット試験によって、親株よりもエタノール耐性の高い 4株を選抜した。興味深いことに、これら変異株のうち 3 株では親株の 7.3～13.3
倍ものオルニチンを細胞内に蓄積していた。これら変異株を用いて、総米 200gの小仕込み試験を 15℃、一段仕込みで行った。その結果、これら 3 株の発酵能は、親株と有意な差はなく、エタノール含量も親株より上回った。また、細胞内にオルニチンを最も多く蓄積する変異株で醸造した清酒中には親株の 2.4 倍、また酒粕中には親株の 3 倍のオルニチンをそれぞれ含むことが判明した。

【背景・目的】ホエーの成分は主にラクトース（乳糖）であり他にタンパク質、
ミネラル、脂肪などが含まれる。チーズ生産時の主な副産物として大量に生産されるため、ホエーの工業的利用法が求められている。乾燥したホエーは 75%
が炭水化物であるにもかかわらず、バイオエタノールの原料として利用し始めたのは最近である。原因として、ラクトースを資化できる微生物の種類が少ないことと、資化できたとしても発酵効率が悪く少量のエタノールしか生産できないことが挙げられる。例えば、チーズから単離された酵母の一種である
Kluyveromyces lactis はラクトースを資化できるが、エタノール生産量は 4 v/v%程度であり、醸造時間も 1 週間と時間がかかる。また、エタノール生産能が高く醸造用酵母としても広く利用されている酵母 Saccharomyces cerevisiae はラク
トースを資化することができない。そこで本研究では、ラクトース資化性の酵
母とエタノール生産能の高い酵母を細胞融合させることで、両方の形質をもったハイブリッド酵母を作製することを目的とした。
【方法・結果】
1. 発酵試験（目的：親株の発酵特性を調べる。）
培地は 20 w/v%グルコースを含む YPD 培地を用いた。K. lactis は 3.3 v/v%のエ
タノールを生産し、S. cerevisiae は 12.2 v/v%のエタノールを生産した。
2. プロトプラスト化（目的：細胞同士を融合させるための条件検討を行う。）
プロトプラスト化前後の細胞数を血球計算盤により測定し、最適なプロトプラ
スト化条件を定めた。
3. スクリーニング（目的：親株と融合株を選別する方法を確立する。）
二種の親株の糖資化性、糖発酵性、エタノール耐性、安定生育温度を調べることで、親株と融合株とを分ける方法を考案した。単一炭素源としてラクトース
を用いて 37℃で培養すれば親株は生育せず、融合株だけが生育する。

Isolation of Japanese sake mutants that accumulate a functional amino acidand analysis of their fermentation profiles

Production of fermented beverages made from whey by fused yeast using
optical trapping method○Masataka Ohashi1, Daisuke Watanabe2, Hiroshi Takagi2(1Nara Pref. Inst. Ind. Dev., 2Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)

Key words

Japanese sake yeast, a functional amino acid accumulation○Naoki Yamahata1, Kozo Taguchi2, Mamoru Wakayama1(1Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Grad. Sch. Sci. and Eng., Ritsumeikan
Univ.)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, cell fusion, Whey

醸造学，醸造工学

1P-1p073 酢酸イソアミル高生産酵母における ATF1 発現制御機構○大原 佑介, 猿渡 通代, 高橋 俊成, 山田 翼, 末野 和男（菊正宗酒造）y-ohara@kikumasamune.co.jp

1091P-1p075 ピルビン酸低減清酒酵母 TCR7 の異数性染色体と醸造
特性○田口 誠我 1, 澤田 和敬 3,4, 浜島 弘史 2, 赤尾 健 5, 野口 秀樹 6,
豊田 敦 6, 藤山 秋佐夫 6,7, 北垣 浩志 2,3（1佐賀大院・農, 2佐賀大・農, 3鹿児島大院・連農科, 4佐賀県工
技セ, 5酒総研, 6遺伝学研, 7総研大・遺伝）ktgkhrs@cc.saga-u.ac.jp

酢酸イソアミルは主要な吟醸香の一成分であり、酵母のアルコールアセチルト
ランスフェラーゼ (AATase) により生合成される。AATase をコードする ATF1 の発現は不飽和脂肪酸により抑制されるので、酢酸イソアミルを高生産させるには原料米の精白度を高める必要がある。我々は低コストでフルーティーな清酒醸造を目指し、オーレオバシジン A 耐性を示す酵母変異株の中から、低精白米仕込みにおいて酢酸イソアミルを親株の 2 倍以上生成する酵母変異株 (hia 株)
を 4 株選抜した。清酒小仕込み試験の結果、製成酒の官能評価が最も高かった
hia1 株では親株に比べ AATase 活性および ATF1 発現量が増加しており、培養時にリノール酸を添加してもそれらの低下は認められなかった。さらに hia1 株の全ゲノム解析を行った結果、ATF1 の転写活性化因子である MGA2 にホモ接合型ナンセンス変異 (Ser706*) が生じていることが明らかとなった。今回は、この変異型 MGA2 が ATF1 の発現制御に及ぼす影響について報告する。
hia 株 4 株は独立した選抜により得られたため、同一クローンではない。4 株のゲノム DNA を等量ずつ混合後、全ゲノム解析を行った結果、出現頻度が 100%の SNP は MGA2 (Ser706*) のみであった。これは、得られた 4 株全ての MGA2に同様のホモ接合型ナンセンス変異が生じていることを示している。そこで、正常な MGA2 または変異型 MGA2 を BY4743Δmga2 株に導入し、ATF1 の発現を調べたところ、変異型 MGA2 の導入により ATF1 の発現量が増加した。培養時にリノール酸を添加すると、正常な MGA2 導入株では ATF1 の発現量が低下
したが、変異型 MGA2 導入株では ATF1 の発現量は低下するものの、リノール酸を添加しない場合の正常な MGA2 導入株と同レベルであった。以上の結果より、MGA2 のナンセンス変異 (Ser706*) が不飽和脂肪酸による ATF1 発現抑制を解除する一因であると考えられる。

【背景と目的】近年、消費者のアルコール離れが進む中で低アルコール清酒市場は数少ない成長市場である。当研究室では低アルコール清酒の製造に適した清酒酵母として、オフフレーバーの原因となるピルビン酸の残存を防ぐ清酒酵母 TCR7 の育種を行った。TCR7 は、協会 7 号酵母の突然変異株で、ピルビン酸のミトコンドリ
アへの輸送阻害剤である α トランスシアノ桂皮酸の耐性を指標として選抜したものだったが、そのメカニズムは明らかになっていない。そこで、そのゲノムを次世代ゲノムシークエンサー HiSeq2500 で解析したところ、11，14 番染色体が参照株の染色体の 1.5 倍のシグナル量を示し、異数性を持つことが示唆された。このことから TCR7 の real time PCR を用いたゲノム解析と清酒小仕込み後の醪中の有機酸解析を行い、異数性染色体とピルビン酸低減性との関係性を調べた。
【方法・結果】
異数性染色体が醪中のピルビン酸の低減に影響を与えているかを調べるにあたって遺伝的バックグラウンドを揃えるために TCR7 の一倍体を取得する必要があった。まず一倍体取得実験を行ったところ 46 株取得することに成功した。次にそれらのゲノムを real time PCR で解析を行った結果、ある TCR7 一倍体株では 11番染色体上にある遺伝子 ZRT3 が、参照株よりも 2.17±0.07 倍増加していたことから、この株の 11 番染色体が 1 本から 2 本になっていると考えられた。さらに、TCR7 一倍体株を用いて小仕込みを行ったところ、2 本の異数性染色体を持
つ一倍体株では、1 本のみ異数性染色体を持つ一倍体株よりも醪中のピルビン酸濃度が低い傾向にあった。これらの結果から、異数性染色体の本数と醪中のピルビン酸濃度に関係性があることが示唆された。

Regulation of ATF1 expression in yeast mutants with enhanced isoamyl
acetate productivity

Anueploidy of pyruvate-underproducing sake yeast TCR7

○Yusuke Ohara, Michiyo Sawatari, Toshinari Takahashi, Tasuku Yamada,Kazuo Sueno(Kiku-Masamune Sake Brewing Co., Ltd.)Key words

Saccharomyces cerevisiae, MGA2, ATF1, isoamyl acetate

1P-1p074 国酒酵母の特異性○森谷 千星, 門倉 利守, 金井 里紗, 義盛 光代, 安藤 周輝,
数岡 孝幸, 中山 俊一, 竹田 正久, 田中 尚人, 鈴木 健一朗（東農大応生科・醸造）
kadokura@nodai.ac.jp○Seiga Taguchi1, Kazutaka Sawada3,4, Hiroshi Hamajima2, Takeshi Akao5,
Hideki Noguchi6, Atushi Toyoda6, Asao Fujiyama6,7, Hiroshi Kitagaki2,3(1Grad. Sch. Agri. Saga Univ., 2Fac. Agric., Saga Univ., 3Grad. Sch. Agri. Sci.
Kagoshima Univ., 4Ind. Technol. Center Saga, 5NRIB, 6NIG, 7Grad. Univ. Adv.
Stud.)

Key words

sake yeast, genome, pyruvate, NGS

1P-1p076 超音波照射下における酵母 Saccharomyces cerevisiae の増殖促進機構の解明○江口 夏帆, 胡 宏海, 野口 明徳, 小栁 喬
（石川県立大院・生資環・食品）
koyataka@ishikawa-pu.ac.jp【目的】国酒である清酒、焼酎、泡盛の醸造に使用される清酒酵母、焼酎酵母、泡盛酵母を、当研究室では国酒酵母と呼んでいる。これら国酒酵母は The
YEASTS, 5th Edit.において、Saccharomyces cerevisiae の synonym とされている。
しかし、The YEASTS, 5th Edit.の key to species では、必ずしも S. cerevisiae には同定されず、分類学的に矛盾が生じている。また、これまでに提唱してきた当研究室での独自の指標では、清酒酵母は他の Saccharomyces 属との区別が可能であり、国酒酵母においてもそれぞれ特徴的な性質があることが考えられる。
そこで本報告では、当研究室の独自の指標により国酒酵母について比較検討した。
【方法および結果】平成 27 年度本大会同様に、清酒酵母 S. sake25 株、焼酎酵母
31 株（1964 年分離株 28 株）、泡盛酵母 16 株（1964 年分離株 13 株）を用いて、独自の指標の一部であるビタミン欠培地での増殖、33℃におけるメレジトースの資化性、カリウム欠培地での増殖、SDS-PAGE による GAPDH アイソザイム
パターンの比較、AWA1 遺伝子断片の有無、rDNA による分子系統学的解析を行った。国酒酵母は、世界的な酵母の分類学においては S. cerevisiae であるが、S. cerevisiae および Saccharomyces sensu strict とは区別することが可能であり、国酒酵母である清酒酵母、焼酎酵母、泡盛酵母はそれぞれで特異性を有するものと考えられた。

味噌、醤油、アルコール飲料などの製造において最も多くの時間が割かれるのは、酵母による発酵工程であり、生産性向上のための時間短縮化が求められている。近年、超音波による微生物の増殖・代謝促進が報告されているが、本技
術による発酵促進技術のさらなる発展のためにはメカニズム解明が不可欠である。本研究ではこれまで、超音波照射に伴う酵母 Saccharomyces cerevisiae S288C
株及び K-7 株の生理状態の変化について精緻に調べており、DNA マイクロアレ
イにより 37 遺伝子について両酵母株に共通した発現量変動を確認している。
Real-time PCR 解析により両株の変動遺伝子の詳細を調べた結果、細胞膜合成遺伝子(INO1, OPI3 )や、細胞壁マンノプロテイン遺伝子(CWP/DAN/TIR )が特徴的に発現変動していること、これらの発現変動の特徴が高圧・低温条件下で培養した酵母と共通していることから、同条件下と類似したストレスが細胞壁・膜に与えられたと考えられた。
高圧・低温条件下での酵母増殖阻害の一因として細胞膜の流動性低下によるア
ミノ酸、特にトリプトファンの取り込み阻害が報告されているが、超音波照射
した酵母には同現象は認められず逆に増殖促進が起こっていることから、類似したストレスを受けながらも細胞応答に相違があることが確かめられた。また、細胞周期をフローサイトメトリーにより経時的に測定したところ、超音波照射した酵母細胞は定常期到達までの時間が短縮していることが示唆された。現在、細胞の環境適応の要である細胞膜の状態を調べるため、細胞膜の脂肪酸組成を解析中である。

Species specificity of Japanese kokushu yeast

Elucidation of the growth stimulation mechanism of ultrasound-irradiatedSaccharomyces cerevisiae.

○Chise Moriya, Toshimori Kadokura, Risa Kanai, Mitsuyo Yoshimori, Shuki Ando,
Takayuki Kazuoka, Syunichi Nakayama, Masahisa Takeda, Naoto Tanaka,
Kenichiro Suzuki(Dept.Ferment.Sci.,Tokyo Univ. Agric.)

Key words

sake yeast, shochu yeast, awamori yeast, taxonomy○Kaho Eguchi, Honghai Hu, Akinori Noguchi, Takashi Koyanagi(Dept. Food Sci., Ishikawa Prefectural Univ.)

Key words
stimulation

ultrasound irrdatiation, yeast, Saccharomyces cerevisiae, growth

110

醸造学，醸造工学

1P-1p077 有機酸生成低減変異株 DNPR89 の網羅的遺伝子発現解析

1P-1p079 酵母における TTC 還元に関与する因子の特定○田中 純平, 門倉 利守, 鈴木 健一朗, 中山 俊一（東農大院・農）s3nakaya@nodai.ac.jp○山元 翔太 1, 清 啓自 1, 久保田 恵理 2, 兼崎 友 2, 矢嶋 俊介 2,
門倉 利守 1, 鈴木 健一朗 1, 中山 俊一 1（1東農大・応生科・醸造, 2東農大・ゲノムセ）
s3nakaya@nodai.ac.jp【目的】酒質の多様化を目的とし、清酒酵母 K901 を親株に呼吸阻害剤である
2,4-dinitrophenol(DNP)に耐性を示し有機酸生成量に顕著な差がみられる変異株を取得している。中でも DNPR89 の YM10 培地における有機酸生成量は親株であるＫ 901 と比較してリンゴ酸は 29.4％、コハク酸は 61.4％、酢酸は 41.3％に低下した。本研究では RNA-seq 法により網羅的に転写量を比較解析することで
DNPR89 の低有機酸生成機構の解明を試みた。
【方法・結果】最も有機酸生成量が多い培養 36 時間の転写量を比較した。酢酸
生合成に関して、細胞質においてアセトアルデヒドを酢酸に変換する
ALD6(Aldehyde dehydrogenase)の DNPR89 における転写量は親株と比較して46.8％に低下しており、その酵素活性も 61.7％に低下していた。また、ミトコ
ンドリアにおいてアセトアルデヒドを酢酸に変換する ALD4 の発現量も 44.6％に低下しており生合成に関与する遺伝子群の転写量の減少が確認された。一方、酢酸代謝に関連し酢酸 を Acetyl CoA に 変換する ACS1 と ACS2(Acetyl-coA
synthetase)の転写量もそれぞれ 67.7％、59.5％に低下していた。酢酸を唯一の炭素源とした時の DNPR89 の生育能を調べたところ、親株と比較して顕著に生育能が低下していた。以上のことから、酢酸生成能の低下は活発な酢酸代謝の結果ではなく、酢酸の生合成能の低下によることが推察された。同様にリンゴ酸とコハク酸の低生成機構についても合わせて報告する。

【目的】 還元されることで赤色を呈する TTC(2,3,5-Triphenyltetrazoliumchloride)染色試験とは、生体の代謝活性を測定する試験方法の一つであり、醸造分野においては酵母の識別等で利用されている。TTC 染色性はミトコンドリア活性の指標でもあるが、酵母において TTC 還元に直接的に関与する酵素は明らかにされていない。そこで本研究では、特に電子伝達系の遺伝子群を標的とし遺伝子破壊株を取得することで TTC 還元を担う酵素の解明を目的とした。
【結果】 TTC 染色性を示さない実験室酵母 BY4741 に URA3 を導入した株
BY4741U は赤色を呈することから、URA3 の相補により TTC 染色性が向上することを明らかとした。この BY4741U を親株とし、電子伝達系に関与する遺伝子群を破壊したところ Complex III のサブユニットである COR1、Complex IV のサブユニットである COX4 の破壊株において TTC 染色性を失ったことから、これら電子伝達系の酵素が TTC 染色性に関与することが明らかとなった。また、
BY4741U を親株とした COR1 破壊株と COX4 破壊株における Complex III、
Complex IV の酵素活性を比較したところ、COR1 破壊株における Complex IV の酵素活性は低下していなかったのに対して、COX4 破壊株における Complex IIIの酵素活性は低下していた。以上のことから、TTC は Complex IV で還元され電子伝達系の活性が低下することでも染色性が低下することが示唆された。

Global expression analysis of low organic acid producing mutant derived
from Kyokai 901

Identification of enzymes related to TTC reduction in yeast○Shota Yamamoto1, Keiji Kiyoshi1, Eri Kubota2, Yu Knesaki2, Shunsuke Yazima2,
Tosimori Kadokura1, Kenichiro Suzuki1, Shunichi Nakayama1(1Dept.Ferment,Sci., Tokyo Univ. Agric., 2Genome Res.Center,Tokyo Univ.Agric)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, organic acid, RNA-seq

1P-1p078 香気成分改変焼酎開発のための酵母の探索及び育種○蕪 卓弥, 山本 佳奈子, 西森 大貴, 門倉 利守, 鈴木 健一朗,
中山 俊一
（東農大・応生科・醸造）
s3nakaya@nodai.ac.jp○Jumpei Tanaka, Toshimori Kadokura, Kenichiro Suzuki, Shunichi Nakayama(Grad. Sch. Agric., Tokyo Univ. Agric.)

Key words
Saccharomyces cerevisiae, TTC staining, gene disruption,
mitochondria

1P-1p080 清酒麹菌 A. oryzae 由来 ΔocpO の酒質特性と ACP アイ
ソザイム遺伝子の発現○山下 伸雄, 玉田 佳大, 浅井 拓也, 明石 貴裕（白鶴酒造）
yamashita@hakutsuru.co.jp【目的】焼酎の香気成分は原料由来の成分と酵母が生成する成分が主であるため、多様な酵母を用いて醸造することで焼酎の酒質の多様化が期待される。清酒酵母、焼酎酵母、泡盛酵母、ワイン酵母はアルコール・有機酸生成能等で異なる性質を示すため、生成する香気成分にも差異がある可能性が高い。そのためこれらの醸造酵母を使用することで異なる香気を示す焼酎の醸造が可能になることが期待される。さらに、これらの醸造酵母の育種 によりその特徴を伸ばすことが可能であることも予想される。そこで本研究では新規で多様な香気を示す醸造酵母の取得を目的としその選別と育種を行った。
【結果】焼酎・泡盛・清酒・ワイン醸造に用いられる酵母の中からクエン酸耐性能が特に高い 12 株を選抜し芋焼酎の小仕込試験後、香気成分の測定及び官能評
価により酒質を比較した。香気成分量について主成分分析したところ醸造酵母
群によって香気成分の生成パターンが異なっており、異なる醸造酵母を用いることによって多様な香気の芋焼酎が醸造可能であることが明らかになった。また用いた株の中で最も香気成分量が少なかった SH4 株を用いた場合、香気成分
量の多かった他の醸造酵母と比較して官能評価において芋らしい香りがするという評価を多く得た。このことは香気成分量が少ないことで原料由来の香りを
引 き出 すことができることを示唆している。そこで SH4 を親株とし 2,4Dinitrophenol 耐性を指標とし香気成分低減変異株を取得した。その結果、ethyl
acetate、isobutyl alcohol、phenylethyl acetate、β-phenylethylalcohol が減少した株
は官能評価において SH4 よりも芋の香りが強かった。以上の様に、様々な醸造
酵母や育種株を用いることで多様な酒質を示す焼酎醸造が可能であることが示された。

【背景・目的】実用清酒麹菌 A. oryzae より酸性カルボキシペプチダーゼ（ACP）の 1 つであるカルボキシペプチダーゼ O をコードする遺伝子 ocpO を欠失させた株を取得した結果、米麹の ACP 力価は親株の約 1/3 に大きく減少した。その酒質について一部報告したが 1）、製成酒のアミノ酸は減少したものの、ACP 力
価のように大きな変化ではなかった。この現象を解明するための実験を行うとともに、ΔocpO 株由来の製成酒の官能特性を含めた酒質を詳細に評価することにした。
【方法・結果】液体培養および固体培養（製麹）において、対数増殖期の菌体より RNA を抽出し、発現解析を行ったところ、ACP アイソザイムをコードする
ocpA が固体培養特異的に突出して発現していた。また ocpB も野生型の ocpOよりも発現量は高い傾向にあった。このことが ocpO を破壊しても、醪中のカ
ルボキシペプチダーゼ活性がそれほど低下せず、アミノ酸が生成する要因ではないかと推察した。この点について検討を行うとともに、ΔocpO で醸成した清酒のジペプチド分析の他、味覚センサー等を用いた官能評価を行った。

Isolation and breeding of yeast showing different aroma component inshochu brewing

Brewing characteristics of ocpO disruptants from A. oryzae and expressionsof carboxypeptidase genes○Takuya Kabura, Kanako Yamamoto, Hirotaka Nisimori, Tosimori Kadokura,
Kennitirou Suzuki, Syunniti Nakayama(Dept.Ferment,Sci ,Tokyo,Univ.Agric)

Key words

shochu, Saccharomyces cerevisiae

1)山下ら：日本生物工学会 2015 年度大会

○Nobuo Yamashita, Yoshihiro Tamada, Takuya Asai, Takahiro Akashi(Hakutsuru Sake Brewing Co., Ltd.)Key words

acid carboxypeptidase, sake, Aspergillus oryzae醸造学，醸造工学／食品科学，食品工学

1P-1p081 白麹菌グリコシルセラミドがヒト表皮角化初代培養細胞の皮膚バリア機能の遺伝子発現に及ぼす影響の解析

111

1P-1p083 清酒オリゴペプチドに関与する米グルテリンタンパク質の米粒内局在解析○藤川 彩美 1, 阪本 真由子 1, 松永 陽香 1, 酒谷 真以 1, 尾上 貴俊 2,
北村 整一 2, 鍔田 仁人 2, 浜島 弘史 1, 戸田 修二 3, 北垣 浩志 1
（1佐賀大・農, 2東洋新薬, 3佐賀大・医）ktgkhrs@cc.saga-u.ac.jp○高橋 圭, 河野 弘美, 奥田 将生（酒総研）
k.takahashi@nrib.go.jp【背景と目的】麹を含んだ発酵食品などの素材は日本で長年保湿剤、化粧品として安全に使われてきた経験があるが、どの成分が保湿に寄与しているかはわかっていなかった。一方、我々は麹を形成する白麹菌 Aspergillus kawachii に独自のグリコシルセラミド(GC)が多量に含まれていることを見出してきた 1)。これまでに白麹菌由来の GC を含む弱アルカリ耐性脂質画分が、ヒト表皮角化初代培
養細胞のバリア機能を改善することを確認している。本研究では、GC 単体に由来する効果を明らかにすることを目的とした。
【方法】白麹菌を液体培養した後クロロホルム・メタノール溶液で脂質を抽出した。抽出物からシリカゲルクロマトグラフィー及び HPLC を用いて GC を精製
し 、 ヒ ト 表 皮 角 化 初 代 培 養 細 胞 （ PromoCell, Normal Human Epidermal
Keratinocytes (NHEK) adult, single donor）に添加した。細胞を 48 時間培養した後、RNA を抽出精製し、定量 real time PCR により遺伝子発現を測定した。
【結果と考察】白麹菌 GC20μg/mL の添加群では、無添加群と比較して表皮のタ
イトジャンクション形成に関与する遺伝子 OCLN と脂質の輸送に関与する遺伝
子 ABCA12 がそれぞれ平均して 1.4 倍、1.5 倍の亢進した発現量を示した（n=6，p<0.05）。この結果は、白麹菌 GC が皮膚のバリア機能を改善する可能性を示唆している。今後は GC 以外の夾雑成分が皮膚バリア機能に及ぼす影響についても着目し、研究を進めていきたい。
1) J. Agric. Food Chem., 60 (46), 11473-82 (2012)【背景と目的】清酒を含む醸造酒はジペプチド・トリペプチドを中心に様々な低分子オリゴペ
プチドを含んでおり、呈味や生理機能に影響を与える可能性が期待されている。
特に清酒には、ビールやワインと比べて豊富で多様なジペプチドが含まれることが分かっている(文献 1)。我々の最近の研究から、吟醸酒の特定の低分子オリ
ゴペプチドは、吟醸香の認知と相関し(文献 2)、吟醸酒の品質の高さと相関することが分かってきた(文献 3)。
一方、清酒の低分子オリゴペプチドは、原料米のグルテリンタンパク質のアミノ酸配列を大きく反映することも示唆されている(文献 1)。グルテリンは複数種類の遺伝子から成り、米タンパク質の約 50～60%をも占め、しかも消化酵素による分解を受けやすい性質から、醸造微生物の栄養状態及び清酒のオリゴペプ
チド組成に大きく影響すると考えられるため、米グルテリンの米品種やイネ栽
培環境、或いは精米歩合による変動・影響を調べることは、醸造学の観点から重要である。そこで本研究では、米グルテリンタンパク質の米粒内局在・分布について明らかにすることを目的とした。
【方法と結果】
2009~2012 年度に収穫した米７品種を用い、米の外側から内側まで４つに分画した米粉末に対し、５種類の抗グルテリン抗体を用いたイムノブロットにより発現強度を解析した他、イネ(山田錦・日本晴)開花後 17 日目の未成熟米について、免疫蛍光染色により米粒内の局在を解析した。その結果、概ね米の内側に比べて米の外側に多い順から GluA, GluB-4/5, GluB-1, GluD, GluC-1 であり、グルテリンサブタイプによって蓄積場所が異なることが明らかとなった。
文献 1 J Chromatogr. A 1242, 17-25 (2012); 文献 2 JBB 121, 274-280 (2016); 文献 3
PLoS ONE 11(3): e0150524 (2016)

The effect of glycosylceramide from Aspergillus kawachii on the barrier
function of human skin cells

Localization of seed storage proteins in rice grain; Evidence for glutelinsubtype-dependent localization○Ayami Fujikawa1, Mayuko Sakamoto1, Haruka Matsunaga1, Mai Sakatani1,
Takatoshi Ogami2, Seiichi Kitamura2, Masahito Tsubata2, Hiroshi Hamajima1,
Shuji Toda3, Hiroshi Kitagaki1(1Fac. Agric., Saga Univ., 2Toyoshinyaku Co., Ltd., 3Fac. Med., Saga Univ.)

Key words

skin barrier, glycosylceramide, Aspergillus kawachii

1P-1p082 沖縄県の自然界から採取した黒アスペルギルス菌の分子系統解析○Kei Takahashi, Hiromi Kohno, Masaki Okuda(National Research Institute of Brewing)

Key words

Japanese sake, oligopeptide, rice protein, distribution

1P-1p084 植物エキス発酵飲料に含まれるアミノ酸○川添 直樹, 山森 昭, 岡田 秀紀（大高酵素・総研）
date-lab@ohtakakohso.co.jp

伊勢 孝太郎 1, 鼠尾 まい子 1, 東 春奈 1, 渡邉 泰祐 2, 外山 博英 3,○塚原 正俊 1（1バイオジェット, 2日大・生資科, 3琉球大・農）tsuka@biojet.jp【背景と目的】黒麹菌は、沖縄県の特産品である泡盛の醸造を支える重要な微生物である。我々は、黒麹菌株の違いによる泡盛品質への影響の解析や新たな泡
盛黒麹菌の開発と共に、黒麹菌の由来や地域特性の解明による泡盛振興を目指した取り組みを進めている。近年、黒麹菌は Aspergillus luchuensis として再分類され A. niger とは別種であることが明確に示された（Yamada et al., J. Biosci.
Bioeng., 112, 233-237, 2011）。今回、黒アスペルギルス菌の詳細な分子系統解析が可能な手法について検討し、沖縄県の自然界から採取した複数の黒アスペル
ギルス菌株を対象とした解析を行った。
【方法・結果】泡盛黒麹菌株、および沖縄県各地より単離した黒アスペルギルス
菌株から DNA を抽出し、断片化、ライブラリー作成を行い、次世代シーケン
サー Miseq(イルミナ)による全ゲノム情報を得た。得られたリードについて A.
luchuensis NBRC4314 株をリファレンスとしてマッピングを行い、それぞれの菌株の情報を抽出した。まず、ITS や β-tubulin など複数遺伝子を対象として解析したところ、A. luchuensis および A. niger の分別ができたものの、A. luchuensis
内での違いはほとんど検出できなかった。次に、ミトコンドリア DNA の全長
約 30K 塩基を対象とした解析を行ったところ、A. luchuensis をいくつかのグルー
プに分けることができた。さらに、ゲノムの全 SNP を対象とした解析を行った
ところ、A. luchuensis 間の詳細な差異を検出することができた。これらの手法を用いて、沖縄県の自然界から採取した黒麹菌群を解析した結果、複数のグルー
プに分けられることが明らかとなった。

【目的】植物エキス発酵飲料（FPE）は数十種の植物原料等からショ糖の浸透圧を利用してエキスを抽出し、酵母や乳酸菌等により 37℃で 180 日以上発酵・熟成させて製造した飲料である。この FPE 製造に関わる発酵微生物は製造環境中に定着しており、特に植物エキスの抽出工程時に自然に取り込まれるよう調整されている。FPE の機能性について調査したところ、FPE 投与によるラットの生涯飼育試験において寿命延命効果を示し、さらに白血病の自然発症率も減少
した 1)。また幾つかの抗酸化物質が存在し、ラットのアルコール性胃粘膜障害の抑制効果を有することを明らかにした 2)。近年では十数種のオリゴ糖の存在も確認され、そのうち数種は新規オリゴ糖であった 3）。この様に FPE には未解
明な機能性物質が存在する可能性が示唆され、様々な視点から研究を行っている。本研究では FPE に存在するアミノ酸に着目し調査を行った。
【方法と結果】FPE は SP-Toyopearl 650M を用いたイオン交換により単糖類を除去した後、吸着画分を濃縮しアミノ酸含有試料を得た。この試料を OPA および
Dabsyl-Cl を用いて誘導体化し、HPLC によりアミノ酸分析を行った。OPA による HPLC 分析の結果、数種のアミノ酸のピークが検出され、D-alanine の溶出時
間と一致するピークも確認された。また、両誘導体化法により GABA と溶出時間が一致するピークも確認できた。GABA はすでに機能性が知られており、また D 体のアミノ酸もその機能性が近年注目されている。これらの FPE 中に含まれているアミノ酸類が、FPE における味質や機能性の一端を担っている可能性が示唆されたので、その生成量や生成過程、さらには未同定のピーク等も現在調査中である。
1）阿部ら、第 38 回日本実験動物学会（1991）札幌
2）岡田ら、日本栄養・食糧学会誌 58. 209‐215 （2005）3）Okada et al ., Carbhydr Res., 345, 414-418 (2010)

Molecular phylogenetic analysis of the black Aspergillistrains isolated fromthe field in Okinawa

Amino acid in fermented beverage of plant extracts

Kotaro Ise1, Maiko Nezuo1, Haruna Azuma1, Taisuke Watanabe2, Hirohide Toyama3,○Masatoshi Tsukahara1(1Biojet, 2Coll. Bioresour. Sci., Nihon Univ., 3Fac. Agric., Univ. Ryukyus)
Key words

Aspergillus luchuensis, Awamori, fungus, phylogenetic analysis○Naoki Kawazoe, Akira Yamamori, Hideki Okada(Gen. Inst. Ohtakakohso Co., LTD.)

Key words

amino acid, D-alanine, GABA, fermented beverage of plant extracts

112

食品科学，食品工学

1P-1p085 大豆可溶化のための大豆ボディ構造体に関する研究○橋本 恭兵, 笠井 尚哉（阪府大院・生環科）
kasai@biochem.osakafu-u.ac.jp

1P-1p087 メタボローム解析による GABA 含有発酵乳に含まれる
ユニークな代謝産物の探索○萩 達朗, 小林 美穂, 野村 将
（農研機構・畜産部門）
thagi@affrc.go.jp

大豆は良質な脂質やタンパク質を豊富に含み、世界生産量は 3 億トン以上にもなる非常に重要な食品・発酵・飼料素材である。しかしながら、大豆自体の構
成組織やその特徴は十分に解明されておらず、未だ十分な食品・発酵・飼料素材としての利用がなされていない。大豆細胞を構成する組織の中でも大豆ボディ
構造体（DBCSS）はオイルボディやプロテインボディを貯蔵する最も主要な構成組織であり、主に膠着性のタンパク質からなり、強アルカリ条件下でないと可溶化されないことからその利用が困難であった。そこで DBCSS の組織の解
明と中性から酸性域での可溶化酵素やその生産菌の探索を試みた。
DBCSS は生大豆を単細胞化処理（オートクレーブ 121℃、20 分間）後、選抜されたセルラーゼ（合同酒精製 GODO-TCF）、ペクチナーゼ（Novozymes 製 Pectinex
Ultra SP-L）を用いた 1 次細胞壁、2 次細胞壁の可溶化除去、脱脂を行い、分離
調製し、これを用いた探索によって DBCSS に対し中性域で組織の約 50%~70%程度の可溶化活性を持つ市販プロテアーゼ（GENENCOR 製 Protex 7L）を見出した。また、分解抵抗性組織解明のために、生大豆、脱脂大豆及び豆乳より調製した DBCSS およびその分解残渣を用いてアミノ酸分析、熱分解マススペク
トル分析、酵素反応の位相差顕微鏡観察などを行い組織の解明を試みた。DBCSSの主要成分はタンパク質であったが、中性プロテアーゼ処理、アルカリプロテ
アーゼ処理、アルカリ抽出処理の段階ごとに残存アミノ酸量が減少することが判明し、熱分解マススペクトル分析では特にアルカリ抽出処理残渣に脂肪族系のフラグメントが確認された。
また、完全可溶化達成のため、脱脂大豆由来 DBCSS 中性プロテアーゼ残渣を用いて可溶化に伴うハロ観察による抵抗性 DBCSS 可溶化酵素生産菌の探索など、更に検討を行っている。

【背景と目的】発酵乳の製造過程で、乳酸菌によるカゼイン分解や乳酸発酵など
によって多種多様な代謝産物が生み出されるが、発酵に用いる乳酸菌の種類によって発酵乳中の代謝産物の量や種類が異なる。そのため、発酵乳の品質評価
や機能性物質の探索を目的として、様々な発酵乳をターゲットとしてその中に含まれる物質の同定が進められている。本研究では、γ-アミノ酪酸(GABA)を生産する Lactococcus lactis を用いて GABA を多く含むユニークな発酵乳を作製し、GABA 発酵乳中に含まれる代謝産物をメタボローム解析で明らかにすることとした。
【方法】GABA を生産しない乳酸菌 L. lactis 01-1 株と GABA 生産菌 01-7 株をス
キムミルク培地に接種し、30℃・48 時間培養して発酵乳を製造した。なお、
01-1 株のみで製造した発酵乳をコントロールとした。GABA 含有発酵乳とコントロールに含まれる代謝産物を CE-TOFMS で解析し、代謝パスウェイとの照合を行ったほか、アンギオテンシン変換酵素(ACE)阻害活性ペプチドを探索するとともに、各発酵乳の ACE 阻害活性を調べた。
【結果と考察】コントロール発酵乳と比較し、GABA 含有発酵乳には GABA 以
外にオルニチンが 23 倍多く含まれていた。これは、アルギニンからシトルリン
を経てオルニチンが生産されるアルギニンデイミナーゼ経路によるものと考えられる。また、GABA 含有発酵乳ではクエン酸が完全に代謝され、その代謝産物と考えられるオキソグルタル酸の量が数倍増加していた。ペプチドについて
は、ラクトトリペプチドとして知られる Val-Pro-Pro をはじめ、ACE 阻害活性を有していると推定されるペプチドが GABA 含有発酵乳に多く含まれており、それを反映するように、GABA 発酵乳中の ACE 阻害活性はコントロールよりも高い傾向であった。なお本研究は、「SIP(次世代農林水産業創造技術)委託研
究」(農研機構)によって実施された。

Studies on body complex for solubilization of soybean seed

Metabolomics approach to screening for unique metabolites in GABA-richfermented milk

○Kyohei Hashimoto, Naoya Kasai(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Key words

soybean, protein

1P-1p086 未熟練 QDA パネリストによる官能評価値のフードメタ
ボロミクスへの運用の提案○Tatsuro Hagi, Miho Kobayashi, Masaru Nomura(NILGS)

Key words

Lactococcus lactis, GABA, fermented milk, metabolome

1P-1p088 パン生地発酵過程における代謝産物変化○中村 敏英, 冨田 理, 齋藤 勝一（農研機構・食品研）
nakamrto@affrc.go.jp○冨尾 紋子 1, 早川 文代 2, 福﨑 英一郎 1（1阪大院・工・生命先端, 2農研機構・食品研）
fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景と目的】QDA 法（Quantitative Descriptive Analysis；定量的記述分析法）
は，食品の二次機能を定量的に表現するための優れた方法の一つである．近年，
QDA とメタボローム情報との相関の解析から，食品のおいしさに関わる品質特性成分を探る試みがなされている．しかし，QDA の確立にはパネリストの習熟やパネリスト間のバラツキを抑えるためのキャリブレーションなどを行う必要があり，多大な時間と労力を要する．本研究は習熟訓練途上の QDA パネリス
トによるバラツキのある官能評価値の有効運用法を検討した．
【材料と方法】
植物工場で栽培したミニトマト 8 品種を用いた．9 名のパネリストにより 24 項
目の官能評価項目について 150 点満点の評価値をつけた．GCMS による低分子
水溶性成分の網羅的分析によりメタボローム情報を得た．多変量解析には
PCA，ピアソン相関等を試行した．
【結果と考察】本研究で用いた官能評価値は QDA 法の訓練途中の試し評価の値である．また，評価には各パネリストが別個体のミニトマトを食している．そのため，ミニトマト品種間よりもパネリスト間（またはミニトマト個体間）でのバラツキが大きく平均値を代表値として用いる妥当性に疑問が生じたため，数値の選抜法，外れ値の規定の基準について考察した．さらに，官能評価値を順位に換算して品種間の差を表現することを試みた．順位換算によって情報量は減少するが，品種間の差の表現においては解析品質の向上が示唆された．当
該解析法により熟練途上の QDA パネリストのデータであっても一定のレベルでフードメタボロミクスに運用できる可能性が示された．

【背景・目的】パン作りにおいて、パン酵母による生地の発酵は非常に重要な工程であり、製品の品質（香りや膨らみ等）に大きな影響を与える。これまでにパン生地の代謝産物を網羅的に且つ経時的に解析した報告はない。そこで発酵過程のパン生地中の揮発性成分および水溶性成分の変動について明らかにするために、経時的にメタボローム解析を行った。また、生地の発酵は短すぎても長すぎても膨らみが悪くなり、発酵完了のタイミングを判断することは難しい。
パン生地発酵過程における代謝産物の変化と焼成パンの比容積との相関が明らかになれば、発酵完了のタイミングを客観的に判断できる可能性もあると考えられる。
【方法・結果】パン生地は通常の発酵工程およびガス抜きをしない工程で作成し、それぞれの生地を経時的にサンプリングして解析を行った。水溶性成分については、パン生地を凍結乾燥、メタノール水溶液抽出の後、減圧乾固したものを重水に溶解し NMR スペクトルの測定を行った。その結果、水溶性成分については経時的な変化はみられたが、ガス抜きの影響は経時変化に比べて小さいことが示された。また、パン生地の揮発性成分については、パン生地を専用
バイアルに入れ、短時間の加熱処理後にヘッドスペース部分の成分を SPME
ファイバーで捕集して GC/MS で測定した。揮発性成分については経時的な変化以外にも焼成パンの比容積と相関がみられる代謝産物を確認することができた。

Suggestion for operation of sensory value generated by unskilled QDA
panelists to food metabolomics

Changes of metabolites in the dough during fermentation○Ayako Tomio1, Fumiyo Hayakawa2, Eiichiro Fukusaki1(1Dept. Biotech., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Food Research Institute, NARO)

Key words

metabolomics, sensory evaluation, mini-tomato○Toshihide Nakamura, Satoru Tomita, Katsuichi Saito(NFRI)

Key words

dough fermaton, SPME-GC/MS, 1NMR, metabolomics

食品科学，食品工学

113

1P-1p089 麹甘酒とその乳酸発酵物のメタボローム解析

1P-1p091 酒類を対象とした LC/MS による多成分解析【目的】我が国の伝統的米発酵飲料である麹甘酒は、その栄養価の高さから「飲む点滴」と言われている。しかしながら、その含有成分に関する研究は意外に少なく、網羅的な解析の例はない。そこで、麹甘酒の含有成分の把握を目的としてメタボローム解析を行った。さらに、甘酒の風味及び成分改質を目的に乳酸菌魚沼株 (Lactobacillus sakei UONUMA) を用いて乳酸発酵した試料についても解析を行ったので併せて報告する。本株は、新潟県魚沼地域の雪室で保存した発酵食品から分離され、低温でも速やかに増殖でき酸の生成が少ないという特徴を有する 1)。
【方法】麹甘酒は、精米歩合 60％米から製麹した麹と水のみを用いて作製した。
この麹甘酒に、乳酸菌魚沼株を接種して適当な pH となった時点で殺菌し、これを麹甘酒の乳酸発酵物とした。これらについて、イオン性代謝産物を CETOFMS によって、脂溶性代謝産物を LC-TOFMS によって網羅的に検出した。
【結果】CE-TOFMS 及び LC-TOFMS による分析の結果、甘酒で 353 物質、乳酸発酵甘酒で 324 物質が検出され、そのうち甘酒だけで検出された物質が 11、乳酸発酵甘酒だけで検出された物質が 13 あった。一般に言われるように糖はグルコースが主成分であり、アミノ酸やビタミン B 群が豊富であることを再確認した。その他にも有機酸、脂肪酸、核酸、アミン、ジペプチド等の組成を明らかにした。また、乳酸発酵によりシトルリンやオルニチン、細胞膜構成成分と考えられるオレイン酸やリノレン酸が増加した。さらに、セロトニンを含めていくつかの物質が新生しており興味深い結果を得た。本解析によって、麹甘酒とその乳酸発酵物の基盤的情報が得られ、麹甘酒の栄養機能性解析を進める上で重要な知見となった。
1) 新規乳酸菌およびこの乳酸菌を利用した発酵食品の製造方法、新潟県、特許第 5577559 号（2014）【背景と目的】 食品分野におけるメタボローム解析の手法は、食品の品質を定量的に評価する、また食品の風味や旨味と相関している食品中成分を探し出すという目的においても有効である。本研究ではビールやワインといった酒類を対象として、トリプル四重極型 LC/MS による９７成分の一斉分析を行い、得られた分析データに対して、主成分分析（PCA）および階層的クラスター解析（HCA）による評価を試みた。分析対象としたのは、食品中に含まれるアミノ酸・有機酸・ヌクレオシドであり、5 種類のビール系飲料における特徴的な成分の特定、また産地・ブドウ品種の異なるワインでの多成分解析を検討した。
【方法】 5 種類のビール系飲料は脱気してから、またワインはそのまま試料として内部標準物質を添加して、さらに限外濾過フィルター（MWCO 3 kDa）による除タンパク質を行った。回収した濾液を 200 倍に希釈して、超高速液体クロマトグラフ Nexera および LCMS-8060 による 97 成分の一斉分析を実施した。また得られた MRM データに対しては、Traverse MS ソフトウェアを用いたピーク
同定作業を行い、内部標準物質に対する面積比を基にして PCA および HCA を実施した。
【結果】 一斉分析の結果、5 種類のビールからはアミノ酸、有機酸、核酸関連物
質など 58 成分が確認されており、これらの面積比を基にして PCA・HCA を実施した。PCA の結果からは、5 種類のビールが score plot 上でうまく分類されることを確認した。またビールを特徴づける成分として、proline や BCAA、ヌク
レオシドなどの化合物が loading plot 上にて確認された。さらに 5 種類のビールを対象に HCA を実施したところ、大きく 3 つのグループに分類されることを確認した。またワインに対しても得られた分析結果を基に、産地・ブドウ品種の違いを PCA・HCA によって確認することができた。

Metabolomics of amazake using rice koji and its lactic acid fermentation
products

Multicomponent analysis by LC/MS for the components in alcoholic
beverages○倉橋 敦 1, 小黒 芳史 1, 西脇 俊和 2, 小林 和也 2
（1八海醸造・研究開発, 2新潟農総研・食研セ）a.kurahashi@hakkaisan.jp○Atsushi Kurahashi1, Yoshifumi Oguro1, Toshikazu Nishiwaki2,
Kazuya Kobayashi2(1R&D center, Hakkaisan Brewery Co., Ltd., 2Food Res. center, Niigata Agricultural
Res. Inst.)

Key words

amazake, koji, lactic acid fermentation, Lactobacillus sakei

1P-1p090 乳酸発酵甘酒の水溶性成分および揮発性成分のプロファ
イル解析○中西 豪 1, 行平 大地 2
（1島津製作所, 2ライフィクス）
naka@shimadzu.co.jp○Tsuyoshi Nakanishi1, Daichi Yukihira2(1Shimadzu Corp., 2Reifycs Inc.)

Key words

mass spectrometry, food, metabolomics, statistical analysis

1P-1p092 固相誘導体化法を用いた黒コショウの GC/MS メタボ
ローム解析○冨田 理, 齋藤 勝一, 中村 敏英（農研機構・食品研）
s.tomita@affrc.go.jp○恩田 浩幸 1, 杉立 久仁代 2, 佐々野 僚一 3, 松尾 俊介 3,
佐川 岳人 1, 福﨑 英一郎 4（1エスビー食品, 2アジレント・テクノロジー, 3アイスティサイ
エンス, 4阪大院・工・生命先端）
hiroyuki_onda@sbfoods.co.jp【背景・目的】甘酒は日本固有の伝統的発酵飲料である．甘酒は栄養価に優れ，夏季の健康維持を助ける食品として古くから親しまれてきた．現在も各地の醸造企業において甘酒が製造されているが，近年では甘酒をさらに乳酸発酵させた新規飲料が開発されている．乳酸の爽やかな風味を付与するだけでなく，保存性の向上や，乳酸菌とその発酵産物による健康増進効果も期待できる．本研
究では乳酸発酵甘酒の成分プロファイルを明らかにし，既存の製品間での特徴解析を行うことを目的とした．
【方法・結果】試料として乳酸発酵甘酒 10 点と，比較対象として甘酒 7 点を用いた．これらの pH はそれぞれ 3.1-3.9 および 5.0-5.7 であり，甘味・酸味や香気に違いが認められた．これらの試料について NMR 解析により低分子水溶性成
分，SPME-GC/MS 解析により揮発性成分のメタボローム解析を行った．水溶性
成分については，大部分の糖類は残存していることや，甘酒と同様に多数のアミノ酸が含まれることが確認された．また製品間には，乳酸，酢酸，エタノー
ル，GABA，オルニチンなどのシグナル強度の差が認められ，使用された乳酸菌の種や株による違いが表れていると考えられた．揮発性成分のプロファイル
については，製品間の原料や製造環境に相関すると考えられる特徴が第一に表れた．酒粕が使用されている製品からは脂肪酸エチルエステルが強く検出され，一部の製品からは樽香を構成する成分が検出された．また，乳酸発酵甘酒には遊離脂肪酸類が甘酒に比べて多い傾向がみられ，乳酸発酵により生じた可能性が考えられた．その他に検出された成分についても製品間でピーク強度は異なり，原料となる甘酒と乳酸菌株との組み合わせなど，製造工程の違いの影響を受けていることが予想された．

【目的】近年、メタボローム解析手法を用いた食品の品質評価が盛んに行われるようになっている。特に、アミノ酸などの不揮発性成分を誘導体化した GC/MS
分析は広く普及している。メタボローム解析を行う際に用いられる前処理手法
として Bligh & Dyer 法が用いられるが、多検体の試料を同時に処理する上では、抽出および誘導体化の工程には長時間を有することが問題点であった。しかし最近では、固相カラム上で短時間かつ容易に誘導体化を行う固相誘導体化法も提唱されている。そこで本研究では、固相誘導体化法を黒コショウのメタボロー
ム解析に適用すべく検討を行った。黒コショウは広く普及している香辛料の一つである。しかしながら、これまで黒コショウの代謝物に着目したメタボロー
ム研究は行われていなかった。

NMR- and GC/MS-based metabolic profiling of amazake fermented bylactic acid bacteria

Analysis of the components in Black pepper using in-SPE derivatization
method for GC-MS metabolome analysis○Satoru Tomita, Katsuichi Saito, Toshihide Nakamura(Food Res. Inst., NARO)

Key words

lactic acid fermentation, metabolomics, NMR, SPME-GC/MS【実験方法・結果】試料には、インド産黒コショウを使用した。そして Bligh &Dyer 法と固相誘導体化法の両手法で前処理を行い、アミノ酸および有機酸に焦点を絞り GC/MS 分析を実施した。固相誘導体化法については、Bligh and Dyer
法で採用されている抽出法に併せて、アセトニトリル水溶液（アセトニトリル：
水＝８：２）による抽出も行い比較分析を行った。その結果、アセトニトリル
水溶液抽出を行った後に固相誘導体化を行った場合、安定的にアミノ酸および有機酸を検出することができ、Bligh and Dyer 法と同等の結果となった。また、
アセトニトリル水溶液による抽出の影響で、Bligh and Dyer 法では検出できない
ピペリンなどの疎水性物質も検出が可能であった。よって、アセトニトリル水溶液抽出と固相誘導体化法を組み合わせることで、黒コショウのメタボローム
解析が、迅速かつ容易にできる可能性が示唆された。

○Hiroyuki Onda1, Kuniyo Sugitate2, Ryoichi Sasano3, Syunsuke Matsuo3,
Takehito Sagawa1, Eiichiro Fukusaki4(1S&B foods Inc., 2Agilent Technologies Japan, Ltd., 3AiSTI SCIECE co., 4Dept.
Mat. Life Sci., Osaka Univ.)

Key words

Black pepper, metabolome analysis, in-SPE derivatization method

114

食品科学，食品工学

1P-1p093 短期熟成試験味噌中のアンジオテンシン I 変換酵素阻害
物質の精製および解析

1P-1p095 S-アデノシルメチオニン高生産清酒酵母における肝細胞保護作用○信田 亮太 1, 金井 宗良 2, 藤井 力 2（1八海醸造・研究開発, 2酒総研）
shinada@hakkaisan.jp○北川 学 1, 多田 孝清 2, 山田 南実 1, 春野 玲弥 2, 東 隆行 2,
小池 祥悟 1
（1マルコメ, 2KRI）
manabu_kitagawa@marukome.co.jp【背景と目的】 2015 年の国民健康・栄養調査によると日本人男性の約 7 割、女性の約 5 割（年齢 40～74 才）が高血圧（140/90 mmHg 以上）であると報告されている。高血圧治療のターゲットとして血圧上昇に関与するアンジオテンシ
ン I 変換酵素(ACE)の阻害が挙げられ、味噌にも ACE 阻害物質が存在することが報告されている。これまでに我々は、味噌の製法を好適化することにより、
ACE 阻害活性を強化した短期熟成試験味噌を作製した。しかし、短期熟成試験
味噌中の ACE 阻害物質については不明であった。そこで本研究では、短期熟成
試験味噌から ACE 阻害成分の精製を行い、その解析を実施した。
【方法】 短期熟成試験味噌および一般熟成味噌（信州味噌）を水抽出し、得られた抽出液を限外濾過により 30kDa 以上、10-30kDa、3-10kDa、3kDa 以下に分画し、ACE 阻害活性を測定した。更に逆相クロマトグラフィーを用いて精製し、得られた活性画分について、LC-Q-MS/MS 分析、LC-TOF-MS 分析、NMR
分析を実施した。
【結果】 短期熟成試験味噌、一般熟成味噌それぞれの限外濾過により得られた
3kDa 以下の画分は、共に他の画分と比較して高い ACE 阻害活性を示した。さらに、3kDa 以下の画分を逆相クロマトグラフィーで分画した結果、活性画分について ACE 阻害活性が報告されているジペプチド AY、GY、SY、FY、IY、
GW、AW の存在が確認された。また、短期熟成試験味噌中の ACE 阻害活性が最も高い画分について NMR 分析を実施した結果、ゲンチオビオース配糖体などの新規活性成分が含有されていることが示唆された。現在、その作用機序や詳細な構造について解析を行っている。

【目的】S-アデノシルメチオニン（SAM）は、肝機能障害における治癒効果が確認されている化合物であり、微生物の中でも酵母が、その中でも清酒酵母が高生産することが知られている。我々は、温度感受性清酒酵母のスクリーニングの過程で SAM 高生産株を単離したので、その酵母の肝細胞保護作用について検討を行った。
【方法】スクリーニングで得た温度感受性株を SAM 高生産培地である O-培地お
よび D-培地で培養し、増殖性および菌体内 SAM 量を測定した。ヒト肝腫瘍由来細胞 HepG2 細胞を用いて、エタノール障害における清酒酵母抽出物の保護作用を検討した。保護作用に関しては、TNF-α 産生抑制と感受性抑制について検討した。取得した同一菌株を使用して、SAM を高生産させた菌体（SAM 菌体）と、ほとんど生産していない菌体（Control）の酵母抽出液を調製した。これらの抽出液を HepG2 細胞に添加して、TNF-α 産生抑制ならびに感受性試験を行った。TNF-α 感受性試験は、ルシフェラーゼアッセイを用いて TNF-α 感受性抑制能（NF-κB 活性抑制効果）を検証した。
【結果】変異処理を施した約 5,000 株の内、37℃で生育できなかった温度感受性株 4 株を選抜した。さらに、この中から SAM を高生産し、かつ親株と同程度の生育を示した菌株 1 株を選抜した。この菌株を SAM 高生産株として肝機能保護作用試験に供試した。TNF-α 産生抑制については、SAM 菌体および Control
ともに菌体の濃度依存的に TNF-α の産生が抑制された。TNF-α 感受性抑制については、SAM 菌体、Control ともに低濃度域では同等の抑制効果であったが、高濃度域では SAM 菌体の方が抑制効果が高く、エタノール障害における保護作用が認められた。また、清酒酵母が生産する SAM 以外の何らかの物質にも保護作用があると考えられた。

Purification and characterization of Angiotensin I Converting Enzyme
inhibitor from short-term fermented Miso

Hepatocyte protective effect in S-adenosylmethionine high productive sakeyeast srtain○Manabu Kitagawa1, Takakiyo Tada2, Minami Yamada1, Remi Haruno2,
Takayuki Azuma2, Shogo Koike1(1Marukome Co., Ltd., 2KRI Inc.)

Key words

Miso, Angiotensin I Converting Enzyme inhibitor, LC-MS, NMR○Ryota Shinada1, Muneyoshi Kanai2, Tsutomu Fujii2(1R&D Center,Hakkaisan Brewery Co., Ltd., 2NRIB)

Key words

S-adenosylmethionine, sake, yeast, Saccharomyces cerevisiae

1P-1p094 ポリアミン高含有納豆製造に向けた大豆品種の比較

1P-1p096 乳酸菌と酵母で発酵させた風味の良い液性ぬか床の開発【背景と目的】ポリアミン(PA)は生命活動に必須のポリカチオンであり，多くの生物にはスペルミジン(Spd)及びスペルミン(Spm)並びにジアミンのプトレッシン(Put)が遍在している。また，これまでの先行研究から PA の健康機能性面にも関心が高まっており，PA 高含有食品の開発が求められている。PA は大豆に豊富に含まれており，大豆加工品の中でも納豆は PA 量が特に高いことが明らかになっている。しかしながら，大豆品種と納豆中 PA 量との関係は，十分に検討されていない。そこで本研究では，PA 高含有納豆製造のために大豆品種と納豆中 PA 量に関する調査を行った。
【方法】PA 高含有大豆品種の選抜と原料大豆と納豆中 PA 量の関係を確認するために，16 品種（国産 14 品種・外国産２品種）とこれらの大豆を用いて製造した納豆の PA 量を測定した。さらに，PA 高含有大豆品種を決定するために，９品種の国産大豆(n≧3)を対象に PA を定量した。PA はサンプルから５%トリ
クロロ酢酸水溶液を用いて抽出し，分離カラムに TSKgel polyaminepak（東ソー製），誘導体化試薬に o-フタルアルデヒドを用いたポストカラム HPLC 法により定量した。
【結果及び考察】16 品種の大豆を分析した結果，各大豆品種が固有の PA 組成を有しており，PA を顕著に含有する品種も確認された。また，大豆と納豆中 PA
量との間で高い相関（R 値，Put：0.96，Spd：0.95 及び Spm：0.94）を示し，納豆中 PA 量は原料の大豆に大きく依存することが明らかになった。さらに，国産大豆９品種を分析し，「ナカセンナリ」が PA 高含有品種であることを明らかにした。
なお，本研究は，「農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業」の一部として行った。

ぬか漬の漬床であるぬか床は野菜を漬け込むことで乳酸菌、酵母による発酵が進む。ぬか床製法は経験的な手法によるところが多く、安定して量産化することが難しいため、現在もほとんど工業化されていない。我々は発酵ぬか床を量
産化・工業化することを目的に研究を進めた。
我々は発酵ぬか床を量産化するために脱脂米ぬかを水に懸濁、酵素処理した液性米ぬかを作成し、ここにスターターとして乳酸菌と酵母を添加、発酵させ、液性ぬか床を作製する方法を考案した。
液性ぬか床製造に使用する乳酸菌と酵母を選抜するために、発酵したぬか床から分離した乳酸菌、酵母を液性米ぬかにて 24℃、48 時間発酵後、理化学分析、官能評価を行った。その結果、乳酸菌 Lactobacillus plantarum、酵母 Pichia
kudriavzevii を選抜した。この 2 菌種により風味の良い液性ぬか床が作製出来る
ことが分かった。
乳酸菌 L. plantarum と酵母 P. kudriavzevii で発酵させた液性ぬか床の香気成分をGC-MS により分析した結果、乳酸菌と酵母を共培養することにより、2Methlpropanoic acid、3-Methylbutanoic acid が検出された。これらの成分は液性
ぬか床の独特の香りに関与していると考えられ、乳酸菌、酵母の単独培養では検出されなかったことから、乳酸菌と酵母の相互作用によって生成されると考えられた。

Comparison of soybean cultivars for enhancement of the polyamine contents
of natto, the fermented soybean using Bacillus subtilis (natto)

Development of tasty liquid-nukadoko fermented with lactic acid bacteria
and yeast○小林 和也, 堀井 悠一郎, 渡辺 聡
（新潟農総研・食研セ）
kobayashi.kazuya@pref.niigata.lg.jp○Kazuya Kobayashi, Yuichiro Horii, Satoshi Watanabe(Food Res. center, Niigata Agricultural Res. Inst.)

Key words

polyamine, natto, fermented soybean, soybean○小野 浩, 西尾 翔子, 岩谷 和輝, 小澤 幸央, 河本 哲宏（東海漬物）
ono-hir@kyuchan.co.jp○Hiroshi Ono, Shoko Nishio, Kazuki Iwaya, Yukio Ozawa, Tetsuhiro Kawamoto(Tokai Pickling)

Key words

nukadoko, lactic acid fermentation, lactic acid bacteria, yeast

食品科学，食品工学

1P-1p097 小麦ふすまの各種長時間・複セルラーゼ処理○柴田 晃, 笠井 尚哉（阪府大院・生環科）
kasai@biochem.osakafu-u.ac.jp

115

1P-1p099 Leuconostoc mesenteroides NTM048 株が産生する免疫賦活能を有する菌体外多糖○松﨑 千秋 1, 早川 あすか 1, 松本 健司 2, 加藤 紀彦 3, 山本 憲ニ 1,
久 景子 4（1石川県大・生物資源研, 2石川県大・生資環, 3京大院・生命, 4日
東薬品工業）
chiaki@ishikawa-pu.ac.jp＜背景＞小麦ふすまは、小麦粒の表皮部分であり、少なくとも 6 層からなり、小麦粉製粉時に生成されるほか、醤油製造時のように、小麦粒そのままが発酵原料として使用される場合には発酵物中に残っている。この場合には、小麦ふ
すまを除いて小麦粒の澱粉やタンパク質が利用されるが、どの程度まで糖化利用されたかは十分に解明されていない。また、小麦ふすまは、植物繊維として各種加工食品にも利用されているほか、バイオマス利用でも関心が持たれ、従来セルラーゼによる糖化も報告されているが、そのほとんどが、1 日以内の検討であり、澱粉も残存していることから、十分な検討はされていないと考えられる。そこで、本研究では、各種のセルラーゼを用いて、長時間の糖化を行なうと共に、セルラーゼ再糖化も行い、糖化できる量を検討した。また本結果を利用して、醤油製造時の小麦ふすまに残る糖化物量も評価した。
＜方法と結果＞小麦ふすまは、供与された小麦粉製造時に生成されるものを洗浄し使用した。検討に用いたセルラーゼは、食品加工用セルラーゼ 23 種類を用い、3 日間 45℃ 0.05M 酢酸緩衝液 pH 5.0 中で酵素反応を行った。セルラーゼ再反応は、1 回目のセルラーゼ処理において、これまでにダイズをよく分解し、コーヒー豆崩壊活性も有するトリコデルマ起源セルラーゼで処理を行なった小麦ふすまに、更に 23 種のセルラーゼを再度酵素反応させた。その結果、セルラーゼ糖化は、1 日目では完全に作用せず、3 日目まで徐々に作用した。また、再糖化でもさらに反応し、糖化量は同様に徐々に 3 日目まで増加した。多くのセルラーゼでこの現象は認められたが、1 種のセルラーゼでは、1 回目 3 日間でほぼ糖化が終了し、2 回目以降ほとんど糖化しないものがあった。このことは、
本酵素処理を用いた醤油製造小麦の残存糖化量の評価に利用可能であり、その評価も行った。

目的
プロバイオティクスの有用性の一つに、粘膜免疫に重要なイムノグロブリン A（IgA）の産生誘導が挙げられる。本研究室では乳酸菌 173 株のスクリーニング
により、IgA 産生を強く誘導する Leuconostoc mesenteroides NTM048 株を見出している（J Appl Microbiol 116, 980-989, 2014）。本研究では、この NTM048 株の菌体外多糖（EPS）の、免疫賦活剤としての可能性を明らかにするため、マウス生体試験によって粘膜免疫系および全身免疫系への影響を検証するとともに、
インフルエンザウイルス感染防御における有効性を検討した。
方法
NTM048 株の産生する EPS を 0、0.05、0.1、0.5、1%添加した飲水を BALB/cA
マウスに 42 日間摂取させ、EPS 投与の免疫系に対する効果を検証した。すなわ
ち腸管粘膜における IgA 産生誘導能を明らかとするために糞中 IgA 量を測定し、全身免疫系への影響を明らかにするために脾臓 T 細胞のポピュレーション解析を行った。また、インフルエンザウイルス抗原（H1N1）特異的 IgA の産生誘導能を、in vitro で抗原にて免疫感作したパイエル板細胞を用いて測定した。
結果
EPS 投与後 35 日以降の糞中 IgA 量において、0.1、0.5、1%投与マウスに有意な上昇（P< 0.05）が認められた。また投与後 42 日のマウス脾臓リンパ球を FACS
解析したところ、0.5、1%投与マウスにおけるヘルパー T 細胞の割合の有意な上昇（P< 0.05）と、1%投与マウスにおける CD4 陽性ヘルパー T 細胞の割合の有意な上昇（P< 0.01）が認められた。H1N1 抗原に対する有効性試験においては、EPS 添加培地で培養したパイエル板細胞において、EPS 無添加より有意に高い（P < 0.01）H1N1 抗原特異的 IgA の産生が認められた。これらの結果より、本 EPS は腸管粘膜免疫系および全身免疫系の賦活効果が期待できると共に、インフルエンザウイルスなどの病原体からの感染防御に有効であることが示唆された。

Long and multiple cellulases digestion of wheat bran

Immunomodulating activity of exopolysaccharides produced by
Leuconostoc mesenteroides strain NTM048○Akira Shibata, Naoya Kasai(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Key words

wheat bran, cellulase○Chiaki Matsuzaki1, Asuka Hayakawa1, Kenji Matsumoto2, Toshihiko Katoh3,
Kenji Yamamoto1, Keiko Hisa4(1Res. Inst. Bioresour. Biotechnol., Ishikawa Pref. Univ., 2Fac. Bioresour. Environ.
Sci., Ishikawa Pref. Univ., 3Grad. Sch. Biostud., Kyoto Univ., 4Nitto Pharm. Ind.)Key words

probiotics, exopolysaccharide, lactic acid bacteria

1P-1p098 酸味受容体(ASICs)タンパクをセンサーとした電気生理

1P-1p100 原料および発酵方法の異なるビール中の代謝物および香○玉村 朋大 2, 柴田 泰宏 1, 塚本 義則 2, 鵜川 眞也 1（1名市大院・医, 2中部大院・応生）
mittsukamoto@isc.chubu.ac.jp○杉立 久仁代 1, 関口 桂 1, 行平 大地 2, 中村 貞夫 1
（1アジレント・テクノロジー, 2ライフィクス）
kuniyo_sugitate@agilent.com

近年、日本では食の欧米化等に伴って生活習慣病に対する懸念が益々深まりつつある。このような中、近年食酢の長期的摂取(15ml/day×10weeks)により、血清中のトリグリセリドや内臓脂肪の低下、血圧の低下効果等がヒト介入試験で検証されてきており、食事を通しての食酢の日常的な接種が生活習慣予防において有効な手段に取り上げられている。しかしながら、食酢特有の刺激的な酸味が要因となって食酢の日常的な摂取が広く実践されているとは言いがたい状
況にある。そこで、我々はこの生活習慣病に大きな効果のある食酢の食事を通しての日常的摂取をより可能にする手段としての酸味を抑制する安心・安全な物質の開発を目的として、酸味受容体(ASICs：Acid Sensing Ion Channels)タンパ
クをセンサーとする電気生理学的アッセイ法を用いて酸味抑制物質の自然界からのスクリーニングを試みた。方法としては、アフリカツメガエル卵母細胞に
human ASICs の cRNA をインジェクションし、卵母細胞に ASICs を発現させたものを電気生理学的にタンパク質の活性を確認した。その結果、カテキン類の一部に ASICs の活性を抑制する物質 2 種類(サンフェノン BG-3 及びカメリアエ
キス 30S-OP)を確認することができたので報告する。

【目的】ビールは世界で広く飲まれている嗜好性飲料であり、多くの醸造元が存在するが、地域や原料、発酵方法などによって全く異なる風味を醸し出している。今回は、ビールの原料および発酵方法が製品に与える影響を調べるため、
香気成分および代謝物の測定を試みた。これらの成分はいずれも GC/MS を用いて分析することが可能であり、ビールを構成する成分を網羅的に把握することで、商品開発や品質管理に役立てることが可能だと考えられる。
【方法】原料や発酵方法の異なる数種類のビールをサンプルとした。アミノ酸、
有機酸、核酸などの代謝物は、Captiva ND Lipids を用いタンパク質と脂質を除去し、乾固した後に、メトキシム化およびトリメチルシリル化を行い GC/MS
および GC/MS/MS 分析に供した。香気成分分析は固相マイクロ抽出法(SPME法)を用いた。カラムに導入された成分は 1 本のカラムで分離した後、スプリッターを用いて 1:1 に分岐し、GC/MS および臭気閾値の低い硫黄化合物を選択的に測定できる化学発光硫黄検出器(SCD)での同時検出を行なった。
【結果】香気成分、代謝物とも、検出したピークを主成分分析したところ、第一主成分で原料の違い、第二主成分で発酵方法の違いをグループ分けすることができた。また、興味深いことにビールメーカーによっては発酵方法が異なっても検出される代謝成分は似た傾向にあるビールが存在し、共通の原料を使用していることが示唆された。しかしながら、上面発酵と下面発酵では明らかにビールの風味が異なり、上面発酵のビールの方が爽やかでフルーティな香りを持つものが多い。SCD 分析では揮発性硫黄化合物であるジメチルスルフィド、硫化水素、メタンチオール、メチルチオアセテートなどが検出されたが、これらの成分は上面発酵ビールでは濃度が低かったため、硫黄化合物の香りに与える影響は大きいと考えられた。

Screening of Substances Repressing Sour taste using Electrophysiological
Assay with ASICs

Analysis of flavor compounds and metabolites in beer of different
ingredients and fermentation

学的アッセイ法による酸味抑制物質のスクリーニング○Tomohiro Tamamura2, Yasuhiro Shibata1, Yoshinori Tsukamoto2, Shinya Ugawa1(1Grad. Sch. Med., Nagoya City Univ., 2Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Chubu
Univ.)

Key words

acid sensing ion channels

気成分の分析

○Kuniyo Sugitate1, Katsura Sekiguchi1, Daichi Yukihira2, Sadao Nakamura1(1Agilent Technologies Japan, 2Reifycs)

Key words

beer, flavor compounds, metabolites, GC/MS

116

食品科学，食品工学／環境浄化，修復，保全技術

1P-1p101 腸管 IgA 産生を増強する Lactobacillus antri の細胞壁成分の解析

1P-1p103 線虫を用いた土壌中の Cs 吸収菌の回収プロセスの構築○合田 亮 1, 伊藤 みさご 1, 星 英之 2, 倉橋 健介 3, 徳本 勇人 1
（1阪府大院・工・化工, 2阪府大院・現シス, 3阪府大高専）
tokumoto@chemeng.osakafu-u.ac.jp○寅本 拓 1, 山崎 思乃 2, 國澤 純 3, 片倉 啓雄 2
（1関西大院・理工, 2関西大・化生工, 3医薬健栄研）
katakura@kansai-u.ac.jp【 背景・目的 】IgA は、腸管において病原体の粘膜上皮細胞への定着を阻止す
るため、その産生の増強は感染症の予防に効果的である。我々は、腸管リンパ組織であるパイエル板の細胞を用いた評価系から、Lactobacillus antri の高い IgA
産生増強作用を示し、さらにその作用が樹状細胞上の Toll-like receptor（TLR）
2 を介していることを明らかにしている。本研究では、TLR2 のリガンドとなる菌体成分の特定を目的に、IgA 産生増強作用を担う L. antri の細胞壁成分の解析を行った。
【 方法 】乳酸菌は MRS 培地で 37℃, 24 時間培養して、生理食塩水で洗浄し、70％エタノールで殺菌した後、減圧乾燥して実験に供与した。IgA 産生増強作用の評価には、マウス腸管から調製したパイエル板細胞を用いた。パイエル板
細胞に菌体あるいは菌体成分を添加して 4 日間培養し、培養上清中の IgA 濃度
を ELISA 法にて測定した。
【 結果 】菌体を超音波破砕すると、処理時間が長くなるに伴い、IgA 産生増強
作用が低下したことから、本菌株による IgA 産生増強には菌体の構造が重要であることが示唆された。そこで、菌体の構造を保持したまま、SDS 溶液による煮沸処理後、アクチナーゼによる除タンパク、メタノールおよびクロロホルムによる脱脂、核酸分解酵素による除核酸を順次行い、各細胞壁成分を除去した
フラクションの IgA 産生の増強能を測定した。その結果、クロロホルムによる脱脂処理により IgA 産生増強作用が低下し、逆にクロロホルム抽出物には IgA
産生増強作用が認められた。一方で除タンパクや除核酸の影響は認められなかった。さらにリポテイコ酸などの細胞壁脂質を菌体表層に露出させる効果があると考えられる溶菌酵素で菌体を処理すると、IgA 産生増強作用が強まった。これらのことから、L. antri の細胞壁の脂質成分が TLR2 に結合して IgA 産生を増強していると考えられた。

福島第一原発事故により広範囲に放射性物質が拡散した。その中で 137Cs は土壌中に長く滞留すると言われている。一方、土壌中の一部の微生物には 137Cs 吸収
能があることが知られている。さらに、土壌中の Caenorhabditis elegans（C.
elegans）は、様々な微生物を捕食できる。そこで本研究では、光忌避等の習性
により安易に回収できる C. elegans を用いた土壌中の 137Cs 吸収菌回収プロセスの構築を研究目的とした。
Cs 吸収菌には、Rhodococcus erythropolis CS98 株（R. erythropolis）を用いた。
CsCl を添加した線虫培養専用の NGM 寒天培地上に、前培養した R. erythropolis
培養液を塗布し、ここへ C. elegans を置いた。一方、R. erythropolis のみを培地に塗布したもの、または C. elegans のみを培地上に置いて培養したものを比較検討に用いた。培養実験は、好気条件下、25 ℃で、培養時間を 9 日間とした。
検討の結果、R. erythropolis だけを培養した場合に、良好なコロニー形成が見られた。両者を培地上で共培養させると、C. elegans だけを培養した条件における増殖挙動に比べて、C. elegans が大量に増殖しており、この結果は、C. elegans
が R. erythropolis を捕食していることを示唆すると考えられる。次に、C. elegansが培養後に体内に吸収した Cs 量を測定した。ろ紙上で回収した C. elegans を硝酸溶液中に投入し、90 ℃に加熱して Cs を溶出させ、希釈液の Cs 濃度を ICPMASS で測定した。その結果、R. erythropolis が培地中から吸収した Cs を、C.
elegans が体内に蓄積できることが明らかとなった。

Analysis of cell wall components of Lactobacillus antri that enhance
intestinal IgA production

Development of a process for the recovery of Cs accumulating bacteria insoil using C.elegans○Taku Toramoto1, Shino Yamasaki-Yashiki2, Jun Kunisawa3, Yoshio Katakura2(1Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ., 2Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ.,
3
NIBIOHN)

Key words

lactic acid bacteria, IgA, cell wall components, TLR2

1P-1p102 セシウム蓄積細菌の探索およびセシウム蓄積変異株の作成○Ryo Goda1, Misago Ito1, Hidenobu Hoshi2, Kensuke Kurahashi3,
Hayato Tokumoto1(1Dept. Chem. Eng., Grad. Sch. Eng., Osaka Pref. Univ., 2Dept. Environ. Syst. Sci.,
Grad. Sustainable Syst. Sci., Osaka Pref. Univ., 3Osaka Pref. Univ. Colle. Technol.)Key words

Caenorhabditis elegans, Radioactive substances, bioremediation

1P-1p104 嫌気発酵菌を利用した 137Cs 含有バイオマスの除染

野本 健太 1, 伊藤 みさご 1, 合田 亮 1, 星 英之 2, 倉橋 健介 3,○徳本 勇人 1（1阪府大院・工・化工, 2阪府大院・現シス・環境共生科学, 3阪
府大高専）
tokumoto@chemeng.osakafu-u.ac.jp

吉岡 潤一, 渡辺 剛, 松本 貴良, ○林 秀謙（前工大・工）h-hayashi@maebashi-it.ac.jp【背景と目的】2011 年 3 月の福島第一原発事故により環境中に多量の放射性セシウムが放出され、環境中からのセシウム除去が必要である。一部の細菌が菌体内にセシウムを取り込むことが知られており、取り込まれたセシウムは負電荷を持つポリリン酸と結合し、セシウムの毒性が弱まることで菌体内に蓄積すると考えられている。本研究はセシウム蓄積能が高い放線菌の選抜を行い、それらの菌株から菌体内のポリリン酸量の増加した変異株の作成を行い、セシウ
ム蓄積能を強化した放線菌の取得を目指す。
【方法】NBRC より提供を受けた放線菌のスクリーニング株(RD 株)を 1 mM CsCl
を含む液体培地で培養を行った。菌体を回収し、乾燥重量を測定後、菌体を濃硝酸より加熱溶菌させ、原子吸光測定によりセシウム量を測定し、蓄積量を算出した。さらに高蓄積能株についてはチオストレプトン耐性変異株の取得を行った。チオストレプトン耐性変異株は菌体内のポリリン酸量を増加する可能性がある。チオストレプトンを添加した平板培地に菌株を塗布し、生育した菌株をチオストレプトン耐性変異株とした。これらの耐性変異株についても菌体内のセシウム蓄積量の測定を行った。
【結果及び考察】RD 株のセシウム蓄積能の測定を行ったところ、最高で 74
μmol/g(dry weight)であった。以前に報告した RD 株で最も高い蓄積能を示した
菌株は Dietzia timorensis で約 200 ~ 300 μmol/g であったので、今回の RD 株の蓄積能は低い傾向にある。また、セシウム蓄積能が高い D. timorensis を使用してチオストレプトン耐性変異株の取得を行ったところ、セシウム蓄積量が増加した変異株を取得した。今後、これらの変異株の菌体内ポリリン酸量の測定を行う予定である。

福島第一原発事故で周囲に拡散した 137Cs は、降雨により森林や山地中で循環すると言われており、137Cs 含有バイオマスが大量に発生している。そこで、バイ
オマスの嫌気発酵分解に関わる菌が、137Cs を吸収することができれば、137Cs 含有バイオマスの減容化、除染が同時に達成できるプロセスが構築できるのではないかと考えた。本研究では、嫌気発酵菌叢に CsCl を投与し培養した菌叢を解析し、菌叢内で優勢化する微生物種を探索した。
消化発酵汚泥を 2 mL、可溶化でんぷんを 2 g/L、CsCl を 0, 10, 50, 100 mg/L とな
るように加えて総量 5 mL で封入した。その後、嫌気条件下、37 ℃で 6 日間静置培養を行い、培養期間中は、メタン生成量を測定した。実験の結果、対照以外の条件では、嫌気発酵の最終生成物であるメタンの生成量が増加することがわかった。このことから、CsCl 存在下において、嫌気発酵は阻害されないことが示唆された。さらに、培養 1, 2, 4, 6 日目に採取した培養液を遠心分離し得られた固相を硝酸で溶解し、Cs 濃度を測定した。その結果、対照では検出されなかった Cs が、CsCl を投与した培養条件における固相から検出されたため、Csは液相から固相に移行することが分かった。また、PCR-DGGE 法で菌叢構造の解析を行った。その結果、CsCl を投与した条件と対照を比較すると、バンドパ
ターンが変化した。よって、消化発酵汚泥は CsCl 存在下で菌叢構造が変化することが分かった。さらに、構成菌種の解析を行うと、対照と比較して、
Tepidibacter 属が菌叢内で特に優勢化したことが明らかになった。以上より、消化発酵汚泥は、CsCl 存在下で培養すると、Tepidibacter 属が菌叢内で優勢化し、Cs を吸収する主要な菌である可能性が高いことがわかった。

The search of cesium accumulation bacteria and the construction of cesium
accumulation mutant.

Decontamination of 137Cs Containing-Biomass Using Anaerobic Bacteria

Junichi Yoshioka, Go Watanabe, Takara Matsumoto, ○Hidenori Hayashi(Fac. Eng., Maebashi Inst. Technol.)Key words

actinomycetes, cesium, accumulation

Kenta Nomoto1, Misago Ito1, Ryo Goda1, Hidenobu Hoshi2, Kensuke Kurahashi3,○Hayato Tokumoto1(1Dept. Chem. Eng., Grad. Sch. Eng., Osaka Pref. Univ., 2Dept. Environ. Syst. Sci.,
Grad. Sustainable Syst. Sci., Osaka Pref. Univ., 3Osaka Pref. Univ. Colle. Technol.)Key words

Anaerobic fermentation, Decontamination, 137Cs

環境浄化，修復，保全技術

1P-1p105 カリウム輸送タンパクの人工進化によるセシウム蓄積微
生物の創出

117

1P-1p107 トンネル掘削残土埋立地滲出水のヒ素高蓄積植物によるヒ素除去技術の開発○加藤 創一郎 1,2, 金田 祥宜 1, 福田 あかね 1, 北川 航 1,2,
曾根 輝雄 1, 浅野 行蔵 1, 鎌形 洋一 1,2（1北大院・農, 2産総研・生物プロセス）s.katou@aist.go.jp○黄 毅 1,2, 宮内 啓介 1, 菅野 弘樹 1, 髙橋 太雅 1, 菅原 一輝 2,
水戸 光昭 3, 成瀬 美樹 4, 中村 真理子 4, 門間 聖子 4, 井上 千弘 2,
遠藤 銀朗 1
（1東北学院大・工, 2東北大院・環境, 3仙台市交通局, 4応用地質(株)）
nklocalking@gmail.com

セシウム（Cs）の放射性同位体は核廃棄物等に由来する放射能汚染の主要な原因物質である。生物を使った Cs 回収は低コスト・低環境負荷という観点から注目されている。実際にある種の植物や微生物に Cs 蓄積能が確認されているが、これらの生物は Cs と性質が類似するカリウム（K）の輸送系を介して非特
異的に Cs を取り込んでいるに過ぎない。そのため K が Cs よりも多い環境では
Cs の取り込みは格段に低下してしまう。大腸菌は 3 種の K 輸送系（Kup, Kdp,
Trk）を持ち、そのうち Kup にのみ非特異的 Cs 輸送活性が確認されている。しかし Kup の Cs 輸送活性・親和性は K に対するものの 1/10 以下にすぎない。本
研究では大腸菌の Kup タンパクを人為的に進化させ、高い Cs 輸送活性・親和性を持つ変異型 Kup を作製・選抜し、大腸菌に高い Cs 取り込み能を付与させることを試みた。エラープローン PCR 法によりランダムに変異が導入された大腸菌 kup 遺伝子断片を増幅し、ベクターに組み込んだのち大腸菌 kup 欠損株に形質転換した。異なる変異型 Kup を発現する大腸菌株を約 3 万株回収しライブ
ラリーを作製した。細胞内への Cs の取り込みが K 欠乏条件において大腸菌の生育を促進する、という知見に基づき、変異株ライブラリーを K 欠乏・Cs 存在下で集積培養した。その結果、K 欠乏・Cs 存在下で有意に増殖が改善する
C1 株、C2 株を得ることができた。この 2 株は K+ 10 μM、Cs+ 10-100 μM の条
件で、大腸菌野生株と比較して最大で 46 倍の Cs+取り込み能を示した。C1 には E80G、C2 には D283N，T374A および T512A のアミノ酸置換が確認された。
2 菌株共に酸性アミノ酸に変異が入っていることから、陽イオンの認識に関与することが知られている酸性アミノ酸が Cs+に対する親和性・特異性にも寄与していることが示唆された。現在、得られた変異型 Kup の Cs+および K+輸送活性の詳細な速度論的解析を進めている。

交通路線整備等のためのトンネル掘削残土等には土壌環境基準を上回るヒ素や重金属が含まれていることがある。したがって建設掘削残土の再利用および埋立処分には細心の注意が必要である。また、基準値以上のヒ素等を含む残土埋立地等から発生する滲出水は適切に処理を行った後に放流される必要がある。
トンネル等の掘削残土埋立地の滲出水に含まれるヒ素の既存の除去方法として
吸着・イオン交換法や凝集沈殿法があるが、一般に浄化コストが高くまた大量の二次廃棄物が発生することが問題である。本研究では、これらに代わる低コストのヒ素除去方法としてヒ素高蓄積植物を用いたファイトエキストラクショ
ンによる浄化技術を開発することを目的として、仙台市のトンネル掘削残土埋立地にヒ素高蓄積植物モエジマシダの水耕栽培処理のパイロットプラントを設置し、pH 9 前後のアルカリ性でかつ環境基準値を超えるヒ素（20~25 ppb）を含む実残土埋立地滲出水からヒ素を除去する現地実験を行った。このシダ水耕栽培処理プラントに水理学的滞留時間 1.13 日で約 3 ヶ月間埋立地滲出水を連続的に通水し、滲出水原水および水耕栽培処理水を 0.45 μm メンブレンフィルターで濾過後に ICP-MS でヒ素濃度を測定したところ、処理水のヒ素濃度は環境基準値である 10 ppb 以下に浄化できた。また、pH も環境基準値範囲である 8.3 程度まで低下させることができた。その間にモエジマシダの羽片および根の旺盛な伸長も確認され、このシダの羽片には高濃度(最大で約 1500 mg/kg)のヒ素を蓄積されたことが確認できた。

Construction of cesium-accumulating bacteria by molecular evolution of apotassium transporter

Technology development for arsenic removal from soil dumping site
drainage by hyperaccumulator plant○Souichiro Kato1,2, Yoshiki Kanata1, Akane Fukuda1, Wataru Kitagawa1,2,
Teruo Sone1, Kozo Asano1, Yoichi Kamagata1,2(1Grad. Sch. Agric., Hokkaido Univ., 2BRI. AIST)

Key words

cesium, potassium, transporter, molecular evolution

1P-1p106 放射性セシウム汚染作物からのセシウム溶出特性とウシ
ルーメン微生物処理・ナノ磁性粒子による除染○Yi Huang1,2, Keisuke Miyauchi1, Hiroki Kanno1, Taiga Takahashi1,
Kazuki Sugawara2, Mitsuaki Mito3, Haruki Naruse4, Mariko Nakamura4,
Mariko Monma4, Chihiro Inoue2, Ginro Endo1(1Fac. Eng., Tohoku Gakuin Univ., 2Grad. Sch. Environ. Stud. Tohoku Univ.,
3
Transp. Bureau. Sendai. City, 4OYO Co., Ltd.)Key words
Drainage from soil dumping site, biological arsenic removal fromcontaminated water, arsenic hyperaccumulator plant Pteris vittata, hydroponics
treatment

1P-1p108 大腸菌により異種発現した海綿由来シリカ重合酵素の自己集合体形成と機能評価○中島 一紀, 小栗 秀俊, 川﨑 了
（北大院・工）nakashima@geo-er.eng.hokudai.ac.jp○馬場 保徳 1,2, 日尾 彰宏 2, 並木 禎尚 3, 多田 千佳 2, 福田 康弘 2,
三宅 克英 1, 齋藤 雅典 2, 中井 裕 2（1石川県大・資源研, 2東北大院・農, 3了徳寺大・健康）
ybaba@ishikawa-u.ac.jp【背景・目的】
放射性セシウム（以下、rCs）に汚染された作物は、フィルムやシートで覆われて屋外に保管されている。焼却処理を進めることのできない地域では、経年劣化や野生動物の活動により外装フィルムが破損しはじめ、環境への rCs の再拡散が懸念される。本研究では、生産年度の異なる汚染作物の rCs 溶出特性を調査し、その除染方法を検討した。
【材料・方法】
生産年度（2010、2012、2014 年）の異なる牧草もしくは稲わら（1300～30000
Bq/kg）を供試した。作物体における放射性物質の分布は、イメージングプレー
ト（IP）に感光させたのち Typhoon FLA 7000 による画像解析で確認した。除染処理は、汚染作物を細断もしくは粉砕し、酸、アルカリあるいはウシルーメン
微生物処理を行ったのち、溶出した rCs をナノ磁性除染剤により回収した。rCsの測定には、2480WIZARD ガンマカウンターあるいは Ge 半導体検出器を使用した。
【結果・考察】汚染作物の rCs の水による抽出率（一晩浸漬）は、2011 年 3 月のフォールアウ
トを受けた作物で低く（5%程度）、原発事故後の 2012・2014 年に生産された作物では高い（60%程度）傾向がみられた。これらに、酸、アルカリもしくはルーメン微生物処理を行った結果、溶出率の最大値はフォールアウトを受けた作物で 20%、それ以外で 95%程度にまで向上し、溶出した rCs はナノ磁性除染剤でほぼ 100%回収された。フォールアウトを受けた作物の溶出率の低い要因は、水素爆発由来の難溶性 rCs 粒子（Adachi et al. (2013)）を直接浴びたものと考察された。IP による画像解析の結果はこれを支持した。一方、2012 年以降に生産された作物は、本処理により放射線量を大幅に低減できることが示唆された。

【背景・目的】 シリカテインは海綿動物のガラス骨格中に含まれる酵素であり，温和な条件下でシリカの重合を触媒する。しかし，シリカテインは，疎水性ド
メインを有し，水溶液中で多量体を形成するため不溶化・沈殿しやすい性質をもつ。シリカテインを工学的分野に応用するためには，シリカテインの自己集合体形成と機能について解明する必要がある。本研究では，大腸菌を用いた異種発現によりシリカテインを作製し，リフォールディング操作により可溶化後，
シリカテインの自己集合体形成と酵素機能について調査を行った。
【方法】 大腸菌発現用にコドンを最適化した Suberites domuncula 由来シリカテ
イン遺伝子を挿入した pCold 発現ベクターを用いて大腸菌 BL21(DE3)株を形質転換した。形質転換体を前培養後，IPTG 添加によりシリカテインの発現誘導を行い，15℃で 24 h 培養した。菌体破砕後，沈殿画分のインクルージョンボディーを回収した。変性剤（6 M 尿素）を用いてタンパク質を可溶化し，グルタチオンを含むリフォールディング溶液を外液とした透析を行うことでシリカテインのリフォールディングを行った。作製したシリカテインとシリカ源であるテト
ラエトシキシラン（TEOS）を混合し，振とうすることでシリカの重合を行った。
【結果】 pCold 発現ベクターを用いた低温発現誘導により，シリカテインが過剰発現されることを確認した。また，発現したシリカテインは大部分が不溶性画分に存在することを確認した。リフォールディングを行うことでシリカテインの可溶化に成功したが，リフォールディング後のタンパク質溶液をしばらく静置すると，徐々に自己集合体を形成して凝集体となることが明らかとなった。
また，可溶化した状態のシリカテインがシリカ重合活性を有することを確認した。

Cesium elution properties of a radiation-polluted biomass andcesium recovery by using cattle rumen microbes and nano magnetic particle.

Self-assembly and functional analysis of silica-polymerizing enzyme fromsponge expressed in E. coli

Key words
rumen bacteria, nano magnetic particle, radiation-polluted biomass,cesium recovery

Key words○Yasunori Baba1,2, Akihiro Hio2, Yoshihisa Namiki3, Chika Tada2,
Yasuhiro Fukuda2, Katsuhide Miyake1, Masanori Saito2, Yutaka Nakai2(1Res. Inst. Biores. Biotech., Ishikawa Pref. Univ., 2Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku
Univ., 3Fac. Hlth. Sci., Ryotokuji Univ.)○Kazunori Nakashima, Hidetoshi Oguri, Satoru Kawasaki(Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.)

biomineral, silica, self-assembly, refolding

118

環境浄化，修復，保全技術

1P-1p109 大気浄化型壁面緑化における土壌環境の解析

1P-1p111 1,4-ジオキサン分解細菌の炭素資化能評価【背景・目的】近年、建築物の意匠性や緑視率の向上などを目的に、建築物の壁面に植栽を設ける「壁面緑化」の導入事例が増えている。著者らは鋼製フレームに土壌を充填し、この土壌に植栽する方式の壁面緑化技術を開発してきた。この方式では
単に植栽のための土壌基盤を大きくとれるだけでなく、土壌に強制的に通気する機構を付与できる特徴がある。通気によって植栽の根圏環境を改善すると共に、土壌をバイオフィルターのように取り扱うことで、大気汚染物質を浄化することが可能である。これまでに本方式の壁面緑化が自動車から排出される窒素酸化物（NOx）を低減できることを確認している。そこで、約 2 年間にわたって連続的に一般道の大気を通気した場合に、植栽や土壌環境がどのように変化するかについて解析することとした。
【方法】
壁面緑化の試験体は断面積：10 m2×土壌厚：150 mm とし、このうち 4 m2 分には通風機構を設けた（＝浄化部）。浄化部には、敷地に隣接する一般道（通行台数：約 1,400 台/日）から大気を導入した。通風量は約 90 m3/h、通気線速度は40 mm/sec とした。1 ヶ月おきに植栽の生育を確認すると共に、浄化部および非浄化部から土壌を採取し、炭素、窒素、リン、カリウムなどの成分濃度、総細菌数、および物質循環に関わる微生物活性を評価した。測定期間は 2014 年 5 月～2016 年 3 月までの約 2 年間とした。
【結果】
浄化部と非浄化部で植栽を比較すると、通気を行った浄化部の方が若干生育が良かった。一方、土壌中の各種成分濃度や総細菌数、微生物活性には浄化部と非浄化部で顕著な差がなく、年間を通して同じような変動を示した。これらの結果から、大気を土壌に連続的に通気することで、植栽の生育が若干促進されるが、土壌中の各種成分濃度や微生物には大きな影響がないと考えられた。

【背景と目的】1,4-ジオキサンは工業的に広く使用されている反面、毒性を有し、発がん性の可能性が指摘されている有害物質であり、1,4-ジオキサン含有
産業廃棄物の不法投棄による地下水汚染の対策技術の確立が求められている。
本研究では、1,4-ジオキサン汚染地下水のバイオレメディエーション技術の確立を目指し、1,4-ジオキサン分解細菌を特異的に増殖させる炭素源の探索を行った。
【実験方法・結果】7 菌株の 1,4-ジオキサン分解細菌、及び活性汚泥について、13 種類の炭素源の資化性の評価を行った。グリオキシル酸、グリコール酸、エ
チレングリコール、フェノール、1,4-ブタンジオール、1-ブタノール、グルコー
ス、及び酢酸は活性汚泥により資化されたため、非特異的に環境細微生物によって資化されるものと考えられた。一方、ジエチレングリコールは、Pseudonocardia
dioxanivorans CB1190、Rhodococcus aetherivorans JCM14343 による資化は認められなかったものの、他の 1,4-ジオキサン分解細菌は全て資化能を示し、特にMycobacterium sp. D6、Pseudonocardia sp. D17 は良好な増殖を示した。グリオキ
サールは、JCM14343 株でのみ資化が認められ、活性汚泥を含めて他の菌株では資化が認められなかった。以上より、1,4-ジオキサン分解細菌を特異的に増殖させ得る基質として、ジエチレングリコール及びグリオキサールが見出された。これらの基質を、浄化現場に導入する分解細菌や土着性の分解細菌の特性を考慮して適切に利用することで、効率的なバイオレメディーションを達成できるものと期待される。

Analysis of soil environment in the green wall system which can purify air
pollution

Studies on growth substrates specific for 1,4-dioxane-degrading bacteria○久保田 謙三, 天保 美咲, 河目 裕介, 西部 洋晴（大和ハウス工業）
kenzo-k@daiwahouse.jp○Kenzo Kubota, Misaki Tempo, Yusuke Kawame, Yosei Nishibe(Daiwa House Industry Co., Ltd.)Key words

green wall, air pollution, soil environment○小池 至人 1, 久田 一輝 1, 黒田 真史 1, 池 道彦 1, 角田 翼 2,
井上 大介 2, 清 和成 2, 山本 哲史 3
（1阪大院・工, 2北里大・医, 3大成建設）
ike@see.eng.osaka-u.ac.jp○Keito Koike1, Kazuki Hisada1, Masashi Kuroda1, Michihiko Ike1,
Tsubasa Tsunoda2, Daisuke Inoue2, Kazunari Sei2, Norifumi Yamamoto3(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Sch. Med., Kitasato Univ., 3Taisei Corp.)

Key words

1,4-dioxane, Specific substrate, bioremediation, groundwater

1P-1p110 環境汚染物質 1,4－ジオキサン分解微生物の探索

1P-1p112 金属腐食に及ぼす硫酸還元菌およびメタン菌の影響

背景：1,4-ジオキサンは平成 21 年 11 月に水質汚濁防止法が改定され、公共水
域、地下水での基準値（0.05mg/l）と新たに制定された。さらに、国際がん研究機構によりクラス 2B（人に対する発がん性が疑われる）カテゴリに分類されている。現在は、ほとんどが反応・抽出用溶剤として利用され、処理にはオゾ
ン+UV による分解除去が行われているが、処理コストが高いなど問題点を抱えている。

【背景及び目的】近年、微生物反応が急速な腐食、設備劣化を引き起こす「微生物腐食」が報告されている。鋼材設備保全のため適切な腐食対策が必要であるが、その基盤となる腐食を誘引する微生物種やその腐食メカニズムなどの情報が不足している。我々のグループではこれまでに、嫌気環境試料より獲得した
腐食性微生物群集が炭素鋼表面で形成するバイオフィルムの微生物叢解析を実施し、硫酸還元菌 Desulfovibrio vulgaris やメタン菌 Methanofollis liminatans に近縁の微生物種が腐食に関与することを明らかにしている。そこで、本研究では硫酸還元菌及びメタン菌の腐食における役割を明らかにするために、複数種の硫酸還元菌およびメタン菌を対象とし、単独もしくは 2 種（硫酸還元菌＋メタン菌）共存条件での腐食活性を評価することを目的とした。
【方法及び結果】硫酸還元菌 3 種 D. vulgaris, D. alaskensis, Desulfovibrio. sp (単離株 ) 、 メ タ ン 菌 3 種 M. liminatans, Methanosarcina acetivorans, Methanococcus
maripaludis を対象とし、それぞれ単独及び複合条件下での腐食試験を実施した。腐食試験は炭素鋼片（SS400, 8 mm 角）１枚を浸漬した VM-I 培地に硫酸還元菌及びメタン菌を摂取し、嫌気条件下 30℃で 1 カ月培養を行った（無菌区、単独培養試験区、混合培養試験区それぞれ n=12）。腐食活性と微生物作用の相関を明らかにするため、0, 3, 7, 21, 28 日目に各条件 3 本の試料を開封後、炭素鋼片を取り出し、炭素鋼片の重量測定を行った。その結果、１組の硫酸還元菌/
メタン菌の組み合わせにおいて、単独培養条件に対して約 5 倍の腐食による炭素鋼片の重量減少が観察された。複合条件下では単独条件下では観察されない
バイオフィルムの形成が見られており、本発表ではバイオフィルム内での 2 種の量比などから推定される腐食促進メカニズムについて考察する。

○佐藤 駿 1, 高田 真由 2, 山田 綾華 2, 倉根 隆一郎 1,2（1中部大院・応生, 2中部大・応生）
silverspoongoldfork@gmail.com

目的：1,4-ジオキサンをより安価なコスト及び低環境負荷を目指して、特に現行法の活性汚泥法に組み込める分解微生物の探索を行うことを目的とした。
方法及び結果：1,4-ジオキサン含有平板培地を用いてスクリーニングを行い、単離を行った。単離した 1,4-ジオキサン減少率を TOC 計にて測定した。
その結果を報告する。

Screening of environmental pollutants, 1,4-dioxane, degrading
microorganism(s)○Takashi Sato1, Mayu Takada2, Ayaka Yamada2, Ryuitiro Kurane1,2(1Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Chubu Univ., 2Coll. Biosci. Biotechnol., Chubu
Univ.)

Key words

1,4-dioxane○平野 伸一, 長岡 亨, 松本 伯夫（電中研）
s-hirano@criepi.denken.or.jp

Influence of sulfate reducing bacteria and methanogens on metal corrosion○Hirano Shin-ichi, Nagaoka Toru, Matsumoto Norio(CRIEPI)

Key words

corrosion, carbon steel, sulfate reducing bacteria, methanogen環境浄化，修復，保全技術／バイオマス，資源，エネルギー工学

1P-1p113 環境単離株 FT01 の新規金属腐食メカニズムの解析○渡辺 宏紀 1, 稲葉 知大 3, 宮野 泰征 1, 尾花 望 2, 野村 暢彦 1
（1筑波大院・生命環境, 2秋田大・理工, 3産総研・環境管理）
nomura.nobuhiko.ge@u.tsukuba.ac.jp

1191P-1p115 ペントースリン酸経路遺伝子発現の最適化による C5C6
糖同時発酵酵母の ethanol 生産性の向上○小林 洋介 1, 藤森 一浩 1, 佐原 健彦 1, 鈴木 俊宏 2, 蒲池 沙織 2,
松鹿 昭則 2, 星野 保 1,2, 扇谷 悟 1, 鎌形 洋一 1（1産総研・生物プロセス, 2産総研・機能化学）
k-fujimori@aist.go.jp

微生物金属腐食は微生物の活動が主要因子とされる金属腐食で、常温・中性環
境においても金属材料が大きな腐食損傷を受ける場合がある。よって、その理解と防止が求められている。先行研究において千葉県富津湾から単離された微生物 FT01 はステンレス片(SUS303)に対して有効な付着性を示す。さらに、共焦点顕微鏡を用いた観察ではステンレス表面に立体的なバイオフィルムを形成し、その下では金属腐食が生じていることが明らかとなった。また、ゲノム情報より FT01 は既知の金属腐食性細菌の特徴を持たないことが明らかとなった。
そこで、本研究では FT01 の金属腐食メカニズムの解明を目的とした。鉄イオンを抜いた海水模倣培地での培養では、通常の海水模倣培地での培養に比べてステンレス表面上のバイオフィルム量が増加することが CV 染色を用いたバイオフィルム定量により明らかとなった。興味深いことにバイオフィルムの増加に伴って、バイオフィルム下の腐食がより大きく促進されることが顕微鏡観察
により明らかとなった。この結果から、バイオフィルムの形成量の増加が腐食の進行に大きな影響を与えていることが予想される。現在は FT01 のバイオフィ
ルム形成因子に関して詳細な解析を行っている。

【目的】 Saccharomyces cerevisiae は、xylose を効率良く資化することができない
が、xylose 代謝遺伝子を導入することにより、ペントースリン酸経路（PPP）
および解糖系を介して ethanol を生産することが可能になる。しかし、ethanol
生産性向上ためには PPP の代謝フローの改善が必要である。また、同時糖化発酵(SSF)プロセスにより ethanol 生産を行う場合、より高い温度条件下で ethanol生産を行う必要がある。これまでの研究で、我々は、XR/XDH 導入株において、xylose を唯一の炭素源とする培地を用いた高温条件の発酵試験で、S.
cerevisiae の代わりに耐熱性酵母 Kluyveromyces marxianus 由来の PPP 遺伝子に着目し、4 種類すべての PPP 遺伝子を挿入した株が最も高い xylose 消費速度・
ethanol 生産性を示すことを明らかにした。そこで、本研究では、SSF プロセスに適した遺伝子組換え酵母の開発のために、xylose 代謝遺伝子として XI を導入した株における PPP 遺伝子の発現強化・代謝改善について検討を行った。
【方法・結果】 XR/XDH または XI を導入した S. cerevisiae IR-2 haploid 株のPHO13 領域に PPP 遺伝子を相同組み換えによって挿入した株を 85 g/L glucose,
35 g/L xylose を含む培地を用いて 36℃条件下で発酵試験を行った。その結果、
XI 導入株は、XR/XDH 導入株よりも 1.2 倍高い ethanol yield を示した。また、PHO13 を欠損させると、xylose 代謝はむしろ低下した。そこで、XI 導入株のGPD2 領域に各種 PPP 遺伝子を挿入した株を作成し、発酵試験を行った。その結果、KmRKI1 と ScTKL1 のみを高発現する株が最も高い ethanol productivity を示すことを明らかにした。また、コントロール株（gpd2Δ）に比べ、xylose 消費速度は約 2 倍に向上した。

Analysis of microbiologically influenced corrosion by FT01

Optimization of the pentose phosphate pathway genes in simultaneous
hexose and pentose fermentation○Hiroki Watanabe1, Tomohiro Inaba3, Yasuyuki Miyano1, Nozomu Obana2,
Nobuhiko Nomura1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Grad. Sch. Eng. Akita University,
3
Res. Inst. Environ. Manage. Technol., AIST)○Yosuke Kobayashi1, Kazuhiro Fujimori1, Takehiko Sahara1, Toshihiro Suzuki2,
Saori Kamachi2, Akinori Matsushika2, Tamotsu Hoshino1,2, Satoru Ohgiya1,
Yoichi Kamagata1(1BRI. AIST, 2ISC. AIST)

biofilm, Microscopy, Microbially Influenced Corroson

Key words
Saccharomyces cerevisiae, ethanol fermentation, pentose phosphatepathway, xylose isomerase

1P-1p114 人工プロモーターを用いたセルロース系バイオエタノー

1P-1p116 酵母 Saccharomyces cerevisiae へのセルラーゼ生産能のKey words

ル生産に資する遺伝子組換え酵母の開発

付与○松崎 浩明, 上田 賢一, 山﨑 新平, 秦野 琢之（福山大・生命工）matsuzak@bt.fubt.fukuyama-u.ac.jp○藤森 一浩, 小林 洋介, 佐原 健彦, 扇谷 悟, 鎌形 洋一（産総研）
k-fujimori@aist.go.jp【背景・目的】従来、出芽酵母において、外来遺伝子発現には PGK1 や TDH ３などの解糖系遺伝子のプロモーターが用いられてきたが、同時糖化発酵（SSF）
プロセスにおいては、これらのプロモーターは xylose 代謝遺伝子の発現には決して最適なものではない。なぜならば、ＳＳＦプロセスは、酸素制限下、糖化酵素の至適温度が通常 50℃以上のため酵母にとっては比較的高温、雑菌汚染対策のため低 pH など、酵母にとっては非常にストレスフルな環境であると考えられる。そこで、glucose/xylose を糖源とするエタノール発酵プロセス適した人
工プロモーターをデザインし、各種発酵試験によりその性能を検証した。
【方法・結果・考察】Zid & O’Shea (Nature, 2014)らが明らかにした、glucose 飢餓状態で高い発現量を示し、細胞質移行およびリボソーム占有率の高い遺伝子群の中から、上記のよう背景を踏まえて HSP ファミリー遺伝子に着目した。中でも有望な遺伝子として HSP26 をベースに、その他の HSP ファミリー遺伝子のストレス応答に関与すると思われる cis-elements を最適化したものを一定間隔で配置した。転写開始点を含む 5’-UTR に相当する部分は HSP26 を用いたが、Kozak 配列は出芽酵母に最適化した。さらに、glucose 存在下で XI 遺伝子発現を向上させるために glucose-repression（負の制御）に関与する転写因子の結合配列を除去した。領域置換 37、挿入 9、削除 33、移動１の合計 80 ステップの改変によりデザインされた 480 bp の人工塩基配列を pSynSR480 と名づけ、合成した。pSynSR480 により XI を発現制御する遺伝子発現カセットを AUR 部位に染色体導入した組換え酵母を作成し、YPDX 擬似糖化液、SSF によりエタノー
ル発酵性能を検証したところ、コントロール pPGK1 に比べ xylose 消費速度、
ethanol 生産性が著しい向上した。

近年、エネルギー消費量の増大により化石燃料の枯渇が危惧されている。そこで、バイオマス資源を利用したエネルギー生産が注目されている。しかし、食糧となる糖・デンプン系バイオマスの利用は、食糧不足や食糧の価格高騰を招く。本研究では、アルコール発酵酵母 Saccharomyces cerevisiae への遺伝子導入によるセルラーゼ生産能の付与により、セルロース系バイオマスからのバイオエタノールの生産を目指している。当研究室の過去の研究で Cryptococcus flavus
由来のカルボキシメチル（CM）-セルラーゼ（CMC1）や Saccharomycopsis
fibuligera 由来の β-グルコシダーゼ（BGL1）の生産能を付与したが、セルロー
スからのエタノール生産量は十分ではなかった。エンド型とエキソ型など種々のセルラーゼの生産によりセルロース分解効率を高めることが重要であると考えた。そこで、BGL1 及び細菌 Cellulomonas fimi 由来のエンド型セルラーゼ（cenA）とエキソ型セルラーゼ（cex）の３種のセルラーゼ生産能の付与を検討した。まず、cenA 遺伝子と cex 遺伝子を GAP プロモーター、MEL1 分泌シグナ
ル配列と GAP ターミネーターとの間に連結した S. cerevisie 分泌発現型 cenA とcex を持つ YEp 型プラスミド pHM1061 を構築した。また、BGL1 遺伝子を GAP
プロモーター下流に連結した分泌発現型プラスミド pHM1062 を構築した。
pHM1061 と pHM1062 を導入した二重形質転換体は、コンゴレッド染色と pNPG 活性によりセルラーゼと β-グルコシダーゼを分泌生産していることが確認できた。しかし、セルラーゼ活性は低いと考えられた。さらに、CMC1 遺伝子
を GAP プロモーター下流に連結した分泌発現型プラスミド pSC7 を導入した三重形質転換体は CM セルロースを基質としてグルコース（または CM グルコース）を生じた。

Design of the artificial promoter SynSR480 for production of bio-ethanolfrom cellulosic biomass

Breeding of cellulase-producing Saccharomyces cerevisiae○Kazuhiro Fujimori, Yosuke Kobayashi, Takaehiko Sahara, Satoru Ohgiya,
Yoichi Kamagata(AIST)

Key words

ethanol, promoter, expression, Saccharomyces cerevisiae○Hiroaki Matsuzaki, Ken-ichi Ueda, Shinpei Yamasaki, Takushi Hatano(Fac. Life Sci. Biotechnol., Fukuyama Univ.)

Key words

cellulase, Saccharomyces cerevisiae, ethanol fermentation

120

バイオマス，資源，エネルギー工学

1P-1p117 サイクリック加水分解法：新たなバイオエタノール生産工程の確立に向けて

1P-1p119 草本系バイオマス由来ヘミセルロース強力分解菌の探索○湯下 佳和 1, 田中 沙季 2, 松本 帆南 2, 倉根 隆一郎 1,2（1中部大院・応生, 2中部大・応生）
rkurane@isc.chubu.ac.jp○オリベイラ サヌエ, 大島 淳
（長浜バイオ大院・バイオ）a_ohshima@nagahama-i-bio.ac.jp【背景と目的】従来のバイオエタノール製造は、糖やデンプンを多く含む食糧となるバイオマスから製造されており、食糧不足や価格競争を引き起こすと危惧されている。一方で、バイオエタノールは重油等の液体燃料と混合することが可能であるなどといった理由から、需要は年々高まっており、増産は必要不可
欠であると考えられている。しかし現在、バイオエタノール製造に関する大きな問題点はその生産コストである。
本研究ではバイオエタノール生産におけるコスト削減のための研究を行った。
研究材料として未利用植物資源の中でも、ブラジルで生産量が多いサトウキビの搾りかすであるバガスに注目した。比較的安価で行うことのできる酸加水分
解法を利用し、安価で自力稼働可能な新たなバイオエタノール生産工程の確立を目指した。
【方法】前処理としてバガスを粉砕し、半導体工場から廃棄される H2SO4 を用いて、特注圧力釜（200℃, 15.3 気圧）において酸加水分解を行った。この条件下におけるバガスの最適反応条件を決定し、回収するグルコースが過分解を起こさないために段階的に加水分解を行う方法、サイクリック加水分解法を用いてグルコースを回収した。最後に出芽酵母を用いてアルコール発酵を行い、さらに濃縮・蒸留を経てバイオエタノールを回収した。
【結果と考察】回収したグルコースが希硫酸によって過分解がおこりにくい新たな高温高圧での製造方法「サイクリック加水分解法」を確立できた。反応条件
20 mim, [H2SO4] 50 mM におけるバガスの乾燥重量当たりの糖化率は 5 cycle で
約 23％となった。ブラジルで発生されるバガスの 1/4 をこの方法を利用し、バ
イオエタノールを製造すると、得られるバイオエタノール量の理論値は約 407万トンであり、18.5％もの増産が期待できる。

【目的】現在、バイオエタノールの原材料として利用されているものとしては、
とうもろこしやサトウキビなどの糖化が簡単なもので、これらは第１世代バイ
オエタノールと呼ばれている。これらは食物のとの競合がおこり、作物の価格上昇が問題となっている。一方、セルロース系バイオマスとして容易で安定して収集可能な草本系・木質系バイオマスが注目を集めている。これらは第２世
代バイオエタノールと呼ばれている。これらの資源の糖化法としては現在化学的手法によりに行われているが、強酸・高温条件下で行われるため、収率の低下や高コスト化などの問題となっている。これに変わる糖化技術として酵素糖化法が注目されている。この手法を用いることにより、科学的手法よりも低コ
ストかつ高効率に草本系・木質系バイオマスを分解することができる。本実験では草本系ヘミセルロースに着目し、ヘミセルロース高分解菌の探索を行った。
【方法】菌株は自然界よりスクリーニングを行い、各菌株から酵素液を作成した。それらを水洗した粗粉砕稲わらおよび、キシランに加え糖度を測定した。
糖度測定は DNS 法及び、ソモギーネルソン法を用いた。分解活性をもとに高分解菌を単離した。
【結果】スクリーニングの結果ヘミセルロースを強力に分解すると思われる菌株を取得できた。その菌株の特徴や生産する酵素についての報告を行う。

Cyclic Hydrolysis: Advanced System for Next Generation of Bio-Ethanol
Producing

Newly isolated microorganism that secretes hemicellulose rapidly
sccharifying enzymes on milled herbal biomass.

○Sanuê Oliveira, Atsushi Ohshima(Grad. Sch. Biosci., Nagahama Inst. Bio-Sci. Technol.)Key words

bio-ethanol, acid hydrolysis, ethanol fermentation, bagasse

1P-1p118 低コストバイオ燃料開発に向けた、セルロース系資源作
物からの非破壊糖取出しを目指して○Yoshikazu Yushita1, Saki Tanaka2, Honami Matsumoto2, Ryuichiro Kurane1,2(1Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Chubu Univ., 2Coll. Biosci. Biotechnol., Chubu
Univ.)

Key words

hemicellulose, saccharification, xylose

1P-1p120 特異的にナノセルロース分解を行う微生物の単離○高橋 仁志, 大槻 隆司（山梨大院・医工農・生環）
tohtsuki@yamanashi.ac.jp○米倉 円佳 1, 青木 直大 2, 廣瀬 竜郎 3, 大杉 立 2, 近藤 聡 1,
大音 徳 4（1トヨタ自動車・バイオ・緑化研, 2東大院・農生科, 3農研機構・
中央農研, 4トヨタ自動車・未来研）
madoka_yonekura@mail.toyota.co.jp【背景と目的】バイオ燃料として、食糧と競合しないバイオマス由来のエタノールが注目されているが、セルロースを原料としたエタノール発酵では、糖化のコストが課題となっている。一方、植物から光合成産物である糖（ショ糖および単糖）を、非破壊で連続的に取り出せれば、直接エタノール発酵が出来、コスト削減につながると考えられる。そこで植物から人工的に、非破壊で糖を取出す技術の開発を行った。
【方法】
植物からの糖取出し方法として、排水液（溢液）を用いることを試みた。排水は、根における水分吸収が活発で且つ葉の気孔が閉じている場合に、葉内の主に細胞間隙の水が排水組織を通して滲出する現象である。一方 SWEET として知られる糖トランスポーターは、糖を細胞外に排出する活性を持ち、モデル植物シロイヌナズナでは Clade I から IV に分類される全 17 種類の AtSWEET 遺伝子が知られる。
そこでモデル植物シロイヌナズナやイネを用い、SWEET 遺伝子を過剰発現することで、排水液中に糖を排出させ、排水液として糖を取り出すことを試みた。
【結果】
シロイヌナズナやイネで、SWEET 遺伝子を過剰発現した結果、CladeIII のSWEET 遺伝子過剰発現時にのみ、高糖濃度の排水液が得られた。シロイヌナ
ズナにシロイヌナズナ由来 AtSWEET12 遺伝子を過剰発現した場合は単糖当量で平均 6 mM、イネにイネ由来 OsSWEET13 遺伝子を過剰発現した場合は単糖当量
で平均 185 mM の糖濃度の排水液が得られた。Clade III SWEET 遺伝子の共通アミノ酸配列を元に設計した、人工 SWEET 遺伝子の導入によっても、単糖当量
で平均 21 mM の糖濃度の排水液が得られた。

【背景・目的】ナノセルロ―ス(NC)は、セルロースを物理的あるいは化学的に処理することでナノサイズになったセルロースの総称である。NC はセルロースが原料であるため、自然界では微生物によって通常のセルロース(WC)繊維と同様に分解されるであろうと考えられていた。我々は各種土壌を微生物源として NC に接種し、継代したところ、WC を分解しないが、NC を特異的に分解する微生物群を見出した。本研究では NC 分解微生物群から NC 分解菌を単離することを目的とした。
【方法・結果】本研究ではセルロースナノウィスカーを NC として用いた。各微生物群の継代培養に従い、Sφrensen 培地あるいは YEC 培地を用いて、1％WC
又は NC を含む寒天培地を調製し、NC 分解微生物群を塗布して、好気条件下
あるいは嫌気条件下で培養した。その結果、好気条件下の YEC 培地においてNC の分解によるクリアゾーン形成が認められたコロニーを画線分離し、単離株を得た。
1％NC または WC を含む YEC 液体培地に単離株を植菌し、30℃で 60 日間振盪培養した。15 日ごとに培養液を採取し、酸性デタージェント処理を経て、フェノール硫酸法により NC 及び WC の残存量を定量した。その結果、単離株は NCを分解するが、WC を分解しないことが示された。
単離株を同定するために 16S rRNA 領域の遺伝子配列決定を行った。BLAST 検索の結果からは Cellulosimicrobium 属細菌由来配列と 100％の一致がみられた。
しかし既知の種とは生理学的特徴がかなり異なっており、単離株は新種の細菌である可能性が高いと考えられた。
単離株による NC 分解の様式に興味がもたれることから、現在、単離株の分泌酵素の精製、および NC 分解産物の調査を進めている。

Aiming to extract sugars nondestructively from cellulosic crops for low costbiofuelIsolation and characterization of the bacterium specifically degrading
cellulose nanowhisker○Madoka Yonekura1, Naohiro Aoki2, Tatsuro Hirose3, Ryu Ohsugi2,
Satoshi Kondo1, Chikara Ohto4(1Biotech. & Afforestation Lab., Toyota Motor Corp., 2Grad. Sch. Agric. Life Sci.,
Univ. Tokyo, 3CARC, NARO, 4Future Proj. Div., Toyota Motor Corp.)

Key words

cellulosic biomass, saccharification, biofuel, sugar extraction○Hitoshi Takahashi, Takashi Ohtsuki(Dept. Life Environ. Sci., Grad. Sch. Med. Eng. Agr. Sci., Univ. Yamanashi)

Key words

cellulose nanowhisker, isolation, degradation, Cellulosimicrobiumバイオマス，資源，エネルギー工学

1P-1p121 草本バイオマスを利用したグルコース生産○荒木 希和子, 久保 幹
（立命館大・生命）
kiwakosa@fc.ritsumei.ac.jp

121

1P-1p123 バイオマス細胞壁分解への放線菌フェルラ酸エステラー
ゼの添加効果○裏地 美杉, 万 クン, 畑中 唯史（岡山県生科総研）
hatanaka@bio-ribs.com【背景と目的】 雑草は人間の活動範囲に旺盛に繁茂する草本植物の総称であり、資源として未利用な草本バイオマスである。一方、バイオエタノールは再生可能エネルギーとして利用されつつあるが、主な原料が作物であるため、食糧と競合しないバイオマスの探索が課題となっている。バイオエタノールの原料として雑草を利用することができれば、除草管理としても効果的である。
また、Fusarium sp.72-1（以下 72-1 株）は木質由来のバイオマスに旺盛に生育し、55℃の熱を加えると自己溶解し、グルコースを生産する糸状菌である。草本バイオマスを 72-1 株の培地としたグルコース生産方法を確立できれば、効率的かつ低コストにエネルギー生産を行うことができると考えられる。本研究では、糸状菌バイオマスを介したグルコース生産に適した雑草を探索することを目的とし、草本種の特性と糸状菌を介したグルコース生産効率の関係を調べた。
【方法】 四季ごとに大学敷地内で旺盛に生育する草本を採取し、植物体に含まれる成分を分析した。また、72-1 株によるグルコース生産能を調べるため、粉末化した草本に 72-1 株を植菌し、30℃で 9 日間培養を行った。
【結果と考察】 成分分析の結果、草本種によって成分量が異なり、特に窒素の含有量が大きく異なっていることがわかった。中でもマメ科植物では窒素量が高く、秋に採取したアレチノヌスビトハギ (Desmodium paniculatum) の窒素量は68,340 mg/kg だった。また、同種であっても成分量は季節により変化した。全
ての草本種で 72-1 株が生育し、アレチノヌスビトハギにおいて最大濃度 4.05 g/
L のグルコースが生産された。このことから、72-1 株は窒素含有量が高いマメ科の植物に旺盛に生育する傾向にあり、特に成長時期の植物がグルコース生産に適していることが示唆された。

【目的】放線菌由来フェルラ酸エステラーゼ（FAE、R18 および R43）は、植物細胞壁からフェルラ酸（FA）を加水分解することができる酵素であり、米糠な
どの未利用バイオマスからの FA 抽出に効果を示す。また、植物バイオマス利用の重要なプロセス、細胞壁分解にも有用である可能性がある。今回、放線菌
FAE の植物細胞壁分解への有用性を評価するため、脱脂米糠、トウモロコシ穂軸、サトウキビバガス等のイネ科植物バイオマスを材料とし、FAE と放線菌由
来糖加水分解酵素処理による糖類の生産を分析した。
【方法と結果】粉砕した各バイオマスに、0.1M トリスマレイン酸バッファー(pH7.0) を添加後、99℃で 5 分間加熱した。冷却後、R18 および R43、また糖加
水分解酵素として放線菌キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼを混合し、40℃で 24 時間振とうした。さらに、遠心分離によって上清を回収し、HPLC にて分析した。
脱脂米糠およびサトウキビバガスを材料とした場合、六炭糖から構成される 3－6 糖のオリゴ糖の生成量が FAE の添加によって増加した。一方、トウモロコ
シ穂軸からは、五炭糖で構成される 2 糖の生成が、FAE の添加によって著しく増加した。サトウキビバガスからの FA 抽出には、FAE と糖加水分解酵素の共処理が最も効果が見られ、この結果は脱脂米糠のものと一致した。また、今回用いた放線菌キシラナーゼは、人工基質 ρ-ニトロフェニルセロビオシドに分解活性を示した。材料としたバイオマスによって、六炭糖もしくは五炭糖のオリゴ糖が生成したのは、放線菌キシラナーゼの基質となる細胞壁構造中のセルロー
スおよびキシロース含量比が異なるためと考えられる。また、サトウキビバガ
スや脱脂米糠の細胞壁においては、FAE が糖加水分解酵素類と協調的に働くことで、細胞壁分解が促進され、FA のみならず、セルロース由来糖類の生産が向上すると考えられた。

Glucose production using biomass of wild herbaceous plants

Degradation of biomass cell walls by using Strptomyces feruloyl esterase○Kiwako S. Araki, Motoki Kubo
(Fac. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words
biomass

energy production, glucose, heat lytic filamentous fungi, herbaceous

1P-1p122 発酵熱を利用した熱溶菌性糸状菌からのグルコース生産○中井 貴久, 森 慶太, 荒木 希和子, 久保 幹
（立命館大院・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp○Misugi Uraji, Kun Wan, Tadashi Hatanaka(Res. Inst. Biol. Sci., Okayama Pref.)Key words

Streptomyces, biomass, feruloyl esterase

1P-1p124 バイオマスと熱溶菌糸状菌を用いたエネルギー生産ルートの確立○西澤 尚樹, 久保 幹, 荒木 希和子（立命館大院・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp【背景・目的】 植物由来のバイオマスは食料と競合しないバイオエタノールの原料である。しかし、植物由来のバイオマスの糖化には多くのエネルギーが必要であることが課題である。Fusarium sp. 72-1 (以降、72-1 株) は植物由来のバ
イオマスを基質として生育し、55℃の熱をかけることで自己溶解して細胞壁由
来のグルコースを放出する熱溶菌性糸状菌である。72-1 株を用いることで植物由来のバイオマスを穏やかな条件下でグルコースに変換する手法が確立されている。本研究では、72-1 株を自己溶解させるための熱源として微生物の活動によって発生する発酵熱に着目し、72-1 株の自己溶解に必要な熱エネルギーを削減することで、さらにエネルギー効率よくグルコースを生産する手法を検討した。
【方法・結果】 小麦フスマ 100 g に対して水を 60 g 加えた固体培地で 72-1 株を10 日間培養した。培養後、72-1 株の菌体を培地ごと真空断熱式の保温容器に移し替え、綿栓をして室温で 24 時間静置した。処理中の発酵熱の発生による温度変化と、72-1 株の自己溶解に伴ったグルコース生産の経時変化を調べるため、
2 時間おきに保温容器内の温度、培地中のグルコース量および 72-1 株の菌体量の測定を行った。この結果、保温容器内の温度が、72-1 株からの発酵熱によって実験開始から 4 時間の時点で 55℃に達し、その前後の時間帯に 72-1 株の菌体量の減少とグルコース量の増加が著しいことがわかった。グルコースの最大生産量は実験開始から 8 時間の時点の 58.3 mg/g medium であることが明らかになった。一方、同じサンプルを外部から 55℃の熱を加える従来の手法で処理した場合に得られたグルコース量は 52.5 mg/g であった。外部からの加温を必要とせずに発酵熱を利用して 72-1 株からグルコースを生産する手法で、加温を必要とする従来の手法と同程度のグルコースを生産できた。

【背景・目的】食料と競合しないバイオマスとして、農作物として利用されない
植物由来のバイオマスが注目されているが、多くは難分解性物質を多く含むため、現在ではエネルギー資源として再利用されていない。当研究室が単離・同定した Fusariumsp. 72-1 (以下、72-1 株) は植物由来のバイオマスを基質とし旺盛に生育する。この菌株は熱を加えることで自己溶解し、細胞壁由来のグルコースを放出するため、この性質を利用して従来の糖化法よりも温和な条件で糖化することが可能である。したがって、得られた糖をエタノールに変換すること
で、バイオマスと糸状菌由来のエネルギー生産ルートを確立することができる。
本研究では、バイオマスと熱溶菌糸状菌から得られたグルコースを原料とし、エタノールを生産することを目的とした。
【方法・結果】清酒酵母のエタノール生産能を確かめるため、グルコース濃度を調整した酵母用完全液体培地に清酒酵母培養液を植菌し、酵母培養装置でアルコール発酵させた。培養後のエタノール量を測定したところ、グルコース濃度
400 g/l のときに最大であった。また、グルコース濃度 10 g/l の系でもエタノー
ルが得られ、低濃度のグルコースでもアルコール発酵が可能であった。
次に、熱溶菌糸状菌から得られたグルコースを用いて、清酒酵母でアルコール発酵を行った。小麦ふすま培地で静置培養した 72-1 株を熱処理し、熱溶菌溶液
を酵母培養装置にいれ清酒酵母培養液を植菌してアルコール発酵させた。培養後、得られた上清を減圧蒸留し、蒸留液を HPLC を用いて定性・定量を行った
結果、エタノールの生成が確認できた。100 g のバイオマスから得られたグルコースは 7.14 g であり、そこから生産されたエタノールは 15.3 mL であった。
以上より、バイオマスと熱溶菌糸状菌由来のグルコースからのエタノール生成
方法が確立された。

Glucose production from heat lytic fungi by heat of decomposition

Established ethanol production roots from biomass and heat lytic fungi○Takahisa Nakai, Keita Mori, Kiwako S. Araki, Motoki Kubo
(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words

glucose, heat of decomposition, heat lytic fungi○Naoki Nishizawa, Motoki Kubo, Kiwako S. Araki(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words
cerevisiae

ethanol fermentation, filamentous fungi, Fusarium, Saccharomyces

122

バイオマス，資源，エネルギー工学

1P-1p125 固定化酵母 Candida magnoliae を用いたキシリトールの微生物生産

1P-1p127 キシリトール資化性を導く変異型 Saccharomyces
cerevisiae 菌株を用いた発酵解析○姜 林涛, 堀内 淳一, 熊田 陽一（京工繊大院・工芸科学）
horiuchi@kit.ac.jp[目的]本研究室では未利用バイオマスを原料としたバイオプロセスによるキシリトール生産を検討している。これまで、キシロース資化性酵母 Candida
magnoliae を用い、コーンコブを原料としたキシリトールの効率的生産について報告してきた 1)が、実用化のためには更なる効率化が必要である。そこで生産コストの低減を目的にプロセスの連続化を進めることとし、固定化 Candida
magnoliae による高効率的なキシリトール生産プロセスの検討を行った。
[実験方法及び結果] バイオマスとしてコーンコブを用いた。粉砕したコーンコ
ブを 1.5% H2SO4 により、121℃、60min の条件で加水分解・ろ過後中和し、キ
シロース濃度 22 ｇ/L～25 ｇ/L の加水分解液を得た。C. magnoliae をアルギン酸
ナトリウムで包括固定化したところ、良好な増殖が認められたため、この固定化菌体をエアリフト型バイオリアクターに有効容量の 10%充填し、温度 30℃、
PH7.0 の条件で回分培養及び繰り返し回分培養を行うと共に、酸素移動速度(OTR) 条 件 が キ シ リ ト ー ル 生 産 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 し た 。 そ の 結 果 、OTR=2.56mmol-O2/L・h の OTR 条件において収率 0.65g-xylitol/g-xylose、生産性
0.27g/L・h で繰り返し回分培養を行うことが可能で、菌体固定化の有用性が示唆された。現在、固定化菌体を用いた連続培養を実施中である。
［参考文献］１) 堀内淳一；化学工学,77,12,845-848(2013)

Microbial production of xylitol using immobilized yeast Candida magnoliae○Lintao Jiang, Jun-ichi Horiuchi, Yoichi Kumada(Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)Key words

immobilization, xylitol, repeated batch culture, airlift bioreactor

1P-1p126 Kluyveromyces marxianus におけるキシリトール脱水素酵素の補酵素特異性改変による効果○谷 龍典, 田口 久貴, 赤松 隆
（崇城大院・工）akamatsu@bio.sojo-u.ac.jp【目的】キシロース資化性組換え S. cerevisiae 株からキシロース資化能が向上した Hex+株 SCB38 を構築し，次世代シーケンサと遺伝解析でその原因遺伝子を特定している。また，キシリトール資化性 Xyt+変異体を分離し，gal80 が原因
遺伝子であること，GAL2 発現が資化に必要であること，Gal2 はキシリトール輸送を行うこと等を明らかにしている。そこで，キシリトール資化性株のキシロースやキシリトール培地での発酵を行い，補酵素やその回転とエタノール生
産との関係を調べる。
【方法と結果】20 g/L キシロースまたはキシリトール培地
pH 5.0 を用い，嫌気的もしくは好気的に，初発細胞濃度(A660)が 20，温度 30℃
で発酵を行った。グルコース，キシロース，キシリトール，グリセロール，エタノール濃度は HPLC で測定した。gal80Δ 株の嫌気的発酵で，キシリトール培
地のキシリトールは，培養 100 時間後でも 15.6 g/L 残存したが，キシロース培
地のキシロースは 12 時間で消費し，エタノールは培養とともに増加して 100 時
間後に 5.6 g/L となり，キシリトールは 25 時間までは増加して 7.3 g/L に，その後，徐々に減少して 6.5 g/L になった。一方，好気的培養で，キシリトール培地のキシリトールは 50 時間で 90％弱が消費し，100 時間後には全て消費した。エタノールは 50 時間までは徐々に増加して 4.2 g/L となり，その後，減少した。
キシロース培地のキシロースは 12 時間でほぼ消費し，12 時間まではエタノー
ル(5.4 g/L)もキシリトール(3.4 g/L)も増加するが，その後に減少した。親株やTDH3p － GAL2 株などの発酵を解析した結果も併せ，Xyl1 の補酵素要求性（NADPH もしくは NADH），Xyl2 の補酵素要求性 NAD+，Xyl2 反応後に生じるNADH の NAD+への酸化とキシリトール消費との関係や Xyl1 反応後に生じるキシリトールがなぜ蓄積するのかなどを考察する。

Xylose and xylitol fermenation of Saccharomyces cerevisiae strains leading
to xylitol assimilation○Tatsunori Tani, Hisataka Taguchi, Takashi Akamatsu(Grad. Sch. Eng., Sojo Univ.)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, xylitol, D-xylose, fermentation

1P-1p128 Gas sparging affects acetic acid fermentation by

Clostridium thermocellum and Moorella thermoacetica○鈴木 俊宏 1, 橋本 智代 1, 星野 保 1,2, 松鹿 昭則 1,2（1産総研・機能化学, 2広島大院・先端物質）
a-matsushika@aist.go.jp○Harifara Rabemanolontsoa, Piradee Jusakulvjit, Shiro Saka
(Dept. Socio-Environ. Energy Sci., Grad. Sch. Energy Sci., Kyoto
Univ.)
rabemanolontsoa.harifara.5c@kyoto-u.ac.jp

バイオマスからのエタノール生産には、糖化反応と発酵反応を同時に行うことが生産コスト削減の観点から望まれる。この同時糖化発酵には糖化酵素の反応
温度領域(40℃以上)で発酵が可能な高温耐性酵母が必要となる。高温耐性酵母
Kluyveromyces marxianus は同時糖化発酵に用いる有望な酵母として期待されているが、キシロース発酵能は十分ではない。前回大会では、K. marxianus のキ
シロース還元酵素(XR), キシリトール脱水素酵素(XDH), キシルロースリン酸化酵素(XK)を K. marxianus で過剰発現させることで野生型株よりもキシロース発酵能が向上することを報告したが、キシロース消費速度は依然として低い。そこで、本研究では K. marxianus のキシロース消費速度の向上を目的とした。
Saccharomyces cerevisiae において、補酵素特異性を NAD+要求性から NADP+要求性に改変した Scheffersomyces stipitis XDH(変異型 XDH)を過剰発現させることでエタノール収率が向上することが報告されている。補酵素として NAD+を使用する K. marxianus XDH の補酵素認識領域と S. stipitis XDH における領域との保存性が高かったため、S. stipitis 変異型 XDH における変異と同様の変異を K.
marxianus XDH に導入することによって、K. marxianus XDH の補酵素特異性をNAD+要求性から NADP+要求性に変更した。そして、この K. marxianus 変異型
XDH を K. marxianus で過剰発現させた結果、30℃でのキシロース消費速度(0.47g/L)は、変異導入前と比較して 4.7 倍増加した。さらに、40℃でのキシロース消費速度(0.89 g/L)は、30℃と比べて 1.8 倍増加した。これらの結果から、K.
marxianus XDH の補酵素特異性を改変することで、キシロース消費速度を顕著に向上させることに成功した。

A novel process to produce ethanol via acetic acid fermentation by Clostridium
thermocellum and Moorella thermoacetica (C. thermoaceticum) has been developed
for the valorization of lignocellulosic biomass with improved carbon conversion
efficiency. To optimize the process, the effects of gas conditions on acetic acidfermentation of glucose and cellobiose by the co-culture of anaerobic C. thermocellumand M. thermoacetica were investigated in 500 mL fermenters. Sparging with external
CO2 showed the highest acetic acid yield which was above the theoretical maximum,
indicating that the external CO2 was also fermented to acetic acid. This creates anoverestimation of the products from the actual substrate and an erring material balance.
When N2 was sparged with the same flow-rate as CO2, almost no acetic acid could be
produced and the microorganisms showed minor growth which could mean that thepurged N2 might have inhibited the cells. On the other hand, when fermentation was
accomplished without gas sparging but with N2 in the headspace, reasonable acetic
acid near the theoretical maximum was obtained and the microorganisms could growproperly. From these results, it became clear that to obtain accurate mass balance andrealistic acetic acid yield using C. thermocellum and M. thermoacetica, the ideal gas
condition is N2, without sparging. This fermentation system would support the progress
towards efficient acetic acid-based ethanol production from lignocellulosics.

Alteration of coenzyme specificity in a xylitol dehydrogenase from
Kluyveromyces marxianus

Gas sparging affects acetic acid fermentation by Clostridium thermocellumand Moorella thermoacetica○Toshihiro Suzuki1, Tomoyo Hashimoto1, Tamotsu Hoshino1,2,
Akinori Matsushika1,2(1ISC, AIST, 2Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words
bioethanol

Kluyveromyces marxianus, xyloe fermentation, coenzyme specificity,○Harifara Rabemanolontsoa, Piradee Jusakulvjit, Shiro Saka
(Dept. Socio-Environ. Energy Sci., Grad. Sch. Energy Sci., Kyoto Univ.)

Key words

acetic acid, Clostridium thermocellum, M. thermoacetica, CO2 fixation

バイオマス，資源，エネルギー工学／生体医用工学

1P-1p129 嫌気性細菌 Clostridium paraputrificum を基盤とした植物バイオマスからの水素ガス生産方法の検討

1P-1p131 Effect of alkalinity on dry anaerobic digestion of Swine
manure in a prototype cylindrical digester

関 兵馬 1, 吉田 稜 2, 三縄 由希子 1, 粟冠 真紀子 1, ○木村 哲哉 1,
粟冠 和郎 1
（1三重大院・生資, 2三重大・生資）
t-kimura@bio.mie-u.ac.jp

次世代クリーンエネルギーの水素ガスをバイオマスから微生物によって直接生産 す る こ と を 究 極 の 目 的 と し て 、 当 研 究 室 保 有 の 中 温 菌 Clostridium
paraputrificum M21 を 中 心 と し た シ ス テ ム の 構 築 を め ざ し て い る 。 C.
paraputrificum M21 はデンプンやキチンなどを炭素源として短時間で増殖し水素ガスを高生産するが、豊富な植物細胞壁を分解出来ない。そこで、植物細胞壁
分解性の嫌気性細菌と組み合わせて植物バイオマスから直接水素ガスを効率的に生産する検討を行った。まず、植物細胞分解性の嫌気性菌 Ruminiclostridium
josui, Ruminiclostridium thermocellum, Clostridium stercorarium の単独培養によるガス生産性を調べたが、これらは C. paraputificum と比較して水素ガス生産性が低かった。そこで、C. paraputridicum の生育温度 45℃において生育の早かった
R. josui と の 組 み 合 わ せ を 考 え た 。 ハ ン ゲ ー ト チ ュ ー ブ で 前 培 養 し た C.
paraputrificum M21 と R. josui を、ボールミルセルロース 1 g を炭素源とする GS
改変培地 90 mL に 10mL 添加し、45℃で培養して水上置換法でガスを回収した。C. paraputrificum 単独では生育せず、R. josui は 10 日でボールミルセルロー
スを完全分解し 14 mL の水素ガスを生産した。一方、C. paraputrificum と R. josuiを共存培養したところ、10 日間の培養でほとんどセルロースを分解して 81 mLの水素ガスを生産した。R. josui 単独では乳酸の生産が多かったのに対して、共存培養では酪酸が増えていた。共存培養液中の DNA 解析から両株の増殖が示された。

Bio-hydrogen gas production from plant biomass by anaerobic bacterium

Clostridium paraputrificum

Hyoma Seki1, Ryo Yoshida2, Yukiko Minawa1, Makiko Sakka1, ○Tetsuya Kimura1,
Kazuo Sakka1(1Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ., 2Fac. Bioresour., Mie Univ.)

123○Hesborn Andole Ondiba, Weiwei Huang, Wei Cai, Ziwen Zhao,
Tian Yuan, Zhongfang Lei, Zhenya Zhang(Univ. Tsukuba)zhang.zhenya.fu@u.tsukuba.ac.jp

Anaerobic digestion (AD) is one of the best sustainable technologies for energy
production and recovery from organic solid wastes. Little information is available on
how to use alkalinity index to control and manage dry AD. This study aims to test thefeasibility of using alkalinity to manage dry AD system for swine manure treatment
and clarify its effect on the stability and efficiency of the newly-developed prototype
cylindrical digester system.
Swine manure was collected from a pig farm in Ibaraki. A prototype cylindricaldigester with a diameter of 40 mm and length of 1000 mm (1.3 liters) was designed,
fabricated and operated under mesophilic conditions (38℃). Total solids (TS) was
adjusted to 15% before feeding into the digester. The alkalinity of manure wasincreased by 3000 g/L using sodium bicarbonate (NaHCO3, E1) with the raw swine
manure as the control (E0).Biogas components were quantified by gas chromatographymachine.
Only one peak appeared on day 5 in the biogas production for the E0 experiment whichalmost ceased on day 18. The E1 experiment exhibited two biogas peaks, i.e. on day 10(38.64 ml/g-VSreduced/d) and day 26 (33.34 ml/g-VSreduced/d), and its biogas production
lasted for 35 days. This difference is most probably attributable to the high alkalinity inE1 that stabilized the digestion process and minimized the influence of pH variations
on methanogenesis. In comparison to 235 liters of biogas produced from E0, 60%
increase in biogas production was detected in E1 (377 liters).

Effect of alkalinity on dry anaerobic digestion of Swine manure in a
prototype cylindrical digester○Hesborn Andole Ondiba, Weiwei Huang, Wei Cai, Ziwen Zhao, Tian Yuan,
Zhongfang Lei, Zhenya Zhang(Univ. Tsukuba)

Key words
Clostridium paraputrificum, hydrogen production, biomass,
Ruminiclostridium josui

Key words

1P-1p130 灌漑用水条件の異なるエジプト産ホホバ種子中の代謝物

1P-2p132 B 型肝炎ウイルス及びバイオナノカプセルの初期感染機の変動解析○藤波 友樹 1, 松川 哲也 1, Hegazy Adel 2, 梶山 慎一郎 1（1近畿大院・生物理工・生工, 2Univ. Sadat City, Egypt）
kajiyama@waka.kindai.ac.jp

alkalinity, dry anaerobic digestion, swine manure, cylindrical digestor

構の解析○劉 秋実, 曽宮 正晴, 黒田 俊一（阪大・産研）askinomi101044@sanken.osaka-u.ac.jp【目的及び背景】ホホバ (Simmondsia chinensis) は乾燥や塩ストレスに強く、不毛な土地でも生育可能なアメリカ南西部原産の植物である。その種子中には、有用な代謝産物であるホホバオイルやシモンドシン類を含んでおり、その商業的価値の高さから現在では世界各地で栽培されている。一方で、国土の 96%が砂漠地帯であるエジプトでは、新規農産業として、既存の水資源と競合しない
下水処理水などの未利用水を用いたホホバの大規模栽培が検討されている。しかしながら、灌漑用水条件がホホバの代謝物にどのような影響を与えるのか等を調査した研究は未だに報告されていない。本研究では、灌漑用水条件の異なるエジプトの 5 つの地域で栽培されたホホバの種子中のホホバオイルとシモン
ドシン類を分析し、多変量解析を行うことにより、灌漑用水条件と代謝物の関係について調査することを目的とした。
【方法及び結果】灌漑用水条件 (塩濃度、重金属濃度等) の異なるエジプトの 5つの地域 (Luxor, Ismailia, Sinai, 6th October, Cairo) で栽培されたホホバの種子をそれぞれ破砕後、ヘキサンおよび 80%アセトニトリル水溶液にて順次抽出し、それぞれ GC/MS 及び LC/MS に供して、ホホバオイルおよびシモンドシン類の分子種の同定と定量を行った。得られた分析結果を主成分分析に供することにより、各灌漑条件で特徴的な代謝パターンについて考察した。その結果、塩濃度や重金属濃度はホホバオイルの総量よりも組成に影響する一方で、シモンド
シン類においてはこれらは総量と組成の両方に影響することが明らかとなった。

【背景】バイオナノカプセル（BNC）は、B 型肝炎ウイルス（HBV）のヒト肝臓特異的感染機構を担う外皮 L タンパク質を出芽酵母で発現することにより得た直径約 50 nm の中空ナノ粒子であり、DDS ナノキャリアとして開発されている（山田、Nat Biotech 2003; 曽宮と黒田、ADDR 2015）。現在、HBV 受容体として低親和性の HSPG（heparan sulfate proteoglycan）と高親和性の NTCP（Nataurocholate co-transporting protein）が同定されているが、HBV や BNC の細胞内侵入及びエンドソーム脱出における役割は不明である。
【目的】HBV/BNC の細胞内侵入過程における HBV 受容体 HSPG 及び NTCP の役割を解明する。
【方法と結果】ヒト肝癌由来細胞 HepG2（NTCP 陰性、HSPG 陽性、HBV 感染不可）と NTCP 発現 HepG2（HBV 感染可）を用いて、蛍光標識した BNC、MyrBNC（NTCP に結合するミリストイル化 BNC；HBV モデル）及び HBV 表面抗原粒子（HBsAg；ミリストイル化 L タンパク質を含む）の細胞内取り込みをフ
ローサイトメトリー及び共焦点レーザー顕微鏡により解析した。その結果、上記粒子は NTCP 非依存的に細胞内に取り込まれ、ヘパリン添加により完全に阻害された。また、NTCP アンタゴニストである Myr-47 ペプチド（L タンパク質
N 末端部分）は、NTCP 発現の有無と関わらず、上記粒子の細胞内取り込みを阻害した。なお、上記粒子の細胞内局在に大きな差は認められなかった。以上の結果は、HBV、BNC 及び Myr-BNC は、細胞表層 NTCP とは無関係に HSPG
依存的に細胞内侵入することを示している。従来、NTCP と相互作用すると考えられてきた Myr-47 ペプチドが、HSPG または未知の HBV 受容体とも相互作用する可能性が示唆された。さらに、HBV 感染成立に NTCP が必須なことから、エンドソーム内 NTCP が少なくとも HBV のエンドソーム脱出に関係していると考えられた。

Variability analysis of metabolites in Egyptian jojoba seeds cultivated on
various irrigation conditions

Elucidation of early infection machinery of hepatitis B virus and bionanocapsule○Tomoki Fujinami1, Tetsuya Matsukawa1, Adel Hegazy2, Shin'ichiro Kajiyama1(1Div. Biol. Sci., Grad. Sch. Biol. Oriented. Sci. Technol., Kindai Univ., 2Univ. Sadat
City, Egypt)

Key words

jojoba, GC/MS, LC/MS, PCA○Qiushi Liu, Masaharu Somiya, Shun'ichi Kuroda(ISIR, Osaka Univ)

Key words
bio-nanocapsule, hepatitis B virus, heparan sulfate proteoglycan, Nataurocholate cotransporting polypeptide

124

生体医用工学1P-2p133 様々な抗体を提示可能なバイオナノカプセルによる能動的標的化 DDS ナノキャリアの開発

1P-2p135 細胞内薬剤デリバリーのための光溶解性トランスフェリ
ン凝集体の開発○立松 健司, 李 昊, 飯嶋 益巳, 黒田 俊一（阪大・産研）kenji44@sanken.osaka-u.ac.jp○山口 哲志 1, 石渡 晟 2, 南畑 孝介 2, 山平 真也 1, 岡本 晃充 2,
長棟 輝行 2
（1東大・先端研, 2東大院・工）yamaguchi@bioorg.rcast.u-tokyo.ac.jp

バイオナノカプセル（BNC）は、B 型肝炎ウイルスの高度なヒト肝臓特異的感染機構を担う同ウイルス外皮 L タンパク質を出芽酵母細胞内で発現して得た中空ナノ粒子で、内封薬物を肝臓特異的に送達できる薬物送達（DDS）ナノキャ
リアである（山田ら、Nat. Biotech. 2003）。また、BNC はリポソーム等の従来型
DDS ナノキャリアと複合体形成して、BNC 由来の能動的標的化能、免疫機構から逃れるステルス化能、そして細胞質内送達能を付与できることが明らかになっている（曽宮ら、Adv. Drug Deliv. Rev. 2015）。これまでに、L タンパク質のヒト肝臓認識部位を Protein A 由来の IgG Fc 領域結合 Z ドメインのタンデム分子に置換した ZZ 提示型 BNC（ZZ-BNC）を作製し、抗体特異性により生体内の任意部位への DDS にも成功してきた。しかしながら、Z ドメインに結合できる抗体種は限られており ZZ-BNC の応用範囲が限定されていた。本研究では、Protein A より幅広い抗体種と結合可能な Protein L や Protein G の抗体結合ドメ
インのタンデム分子を提示する BNC ３種類を ZZ-BNC と同様に作製した（Protein G 由来タンデム分子提示 BNC, GG-BNC; Protein L 由来タンデム分子提示 BNC, LL-BNC；Protein L/Protein G 分子提示 BNC, LG-BNC）。LL-BNC、LGBNC は直径 30 - 40 nm の粒子構造を呈していたが、GG-BNC は粒子形成しなかった。これまでに抗上皮成長因子（EGF）レセプター抗体を提示する ZZ-BNC
は、EGF レセプターを高発現するヒト扁平上皮癌由来 A431 細胞にエンドサイ
トーシスで取り込まれたので、LL-BNC、LG-BNC についても同様の検討を行った（立松ら、Acta Biomaterialia 2016）。本発表では、抗体特異性による能動的標的化 DDS ナノキャリアにおける LL-BNC、LG-BNC の可能性を論じる。特に、LL-BNC、LG-BNC により初めて達成された画期的な能力について紹介したい。

体内や体表の疾患部位でのみ光照射によって薬剤を活性化する光線力学的療法（photo dynamic therapy: PDT）が、肺癌や加齢黄班変性など幅広い疾患の治療に実用化されている。現在、PDT に利用されるのは、光照射によってラジカルを発生する薬剤であり、主に細胞死を誘導して治療効果を得る。一方、疾患の中には、原因となる細胞を殺すのではなく、薬剤を用いて生体本来のシステムを活性化または補助することで治療できるものも多い。そこで、光照射によって、望みの部位のみに任意の薬剤を送達する技術が求められている。
我々はこれまでに、ビオチン化した光分解性保護基でタンパク質を修飾し、ス
トレプトアビジン（SA）を用いて架橋することによって光溶解性のタンパク質
凝集体を創る方法を開発し、報告してきた。このタンパク質凝集体は、望みのタイミングに望みの場所で光照射によって溶かし、タンパク質を大量に放出できる。本研究では、細胞表層の受容体を介して自発的に細胞内に取り込まれる
鉄イオン輸送タンパク質、ヒトトランスフェリン（Tf）を薬剤担体として用い、薬剤修飾 Tf の光依存的な溶解を介して薬剤の細胞内デリバリーを光制御する方法を開発した。モデル薬剤として、評価のしやすいドキソルビシン（Dox）を用い、Dox 修飾 Tf の放出による細胞へのアポトーシス誘導を指標に本技術を評価した。その結果、毒性のない微弱な光を用いて、光選択的なアポトーシス誘導が確認できた。今後、他の薬剤のデリバリーも評価する必要があるが、原理的に PDT へ応用可能な新しい薬剤デリバリー技術が開発できた。

An active-targeting DDS nanocarrier using bio-nanocapsule displaying
various type of immunoglobulins

Photolytic transferrin aggregates for controlled intracellular release ofdrugs○Kenji Tatematsu, Hao Li, Masumi Iijima, Shun'ichi Kuroda(Inst. Sci. Ind. Res., Osaka Univ.)

Key words

drug delivery system, antibody, virus, transfection

1P-2p134 炎症性疾患治療を指向したマクロファージ機能制御剤の基礎評価○Satoshi Yamaguchi1, Akira Ishiwatari2, Kosuke Minamihata2, Shinya Yamahira1,
Akimitsu Okamoto2, Teruyuki Nagamune2(1RCAST, Univ. Tokyo, 2Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)

Key words

protein

1P-2p136 担癌マウスを用いたポリアクリル酸修飾過酸化チタンナ
ノ粒子の生体内分布の解明○鈴木 貴弘 1, 森田 健太 1, 西村 勇哉 2, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 2
（1神戸大院・工, 2神戸大・自科・研究環）
akondo@port.kobe-u.ac.jp○戸井田 力 1, 藤田 聡史 1, 姜 貞勲 2（1産総研・バイオメディカル, 2国立循研セ）
toita-r@aist.go.jp

我々の生体防御に炎症反応が不可欠であるが、炎症性細胞やこれらが産生する
生理活性分子群の異常亢進は心筋炎、大腸炎など炎症性疾患を引き起こす。炎症性疾患の組織には、多くのマクロファージ(M1 型)が浸潤しており、炎症性メ
ディエータの産生を通じて直接的・間接的に疾患の悪性化に関与している。マクロファージは周辺環境の変化に応答し、容易にその性質が変換される。すな
わち、炎症性マクロファージ(M1 型)と抗炎症性マクロファージ(M2 型)に大別され、互いに相反した性質を示す。健常者では、M1 型と M2 型のバランスが制御されているが、炎症性疾患患者では M1 型が亢進しており炎症系が破綻した状態である。
生体内において、アポトーシス細胞が細胞表面にホスファチジルセリン(PS)を露出すると、マクロファージは PS を認識し貪食する。貪食の際、PS がマクロファージの受容体に結合することで、マクロファージを M1 型から M2 型に変換する。我々はこの現象に着目し、アポトーシス細胞を模倣したリポソームを作製した。本研究では、ホスファチジルコリン、PS から構成されるリポソーム(PSL)を薄膜水和法により調製し実験に使用した。
調製した PSL は約 300 nm であり、アニオン性の PS に起因する負の表面電荷を示した。PSL を種々の培養細胞(HepG2, HeLa, NIH-3T3)およびマクロファージ(RAW264.7)に添加し、PSL の取込みを評価したところ、RAW264.7 細胞に選択的に取り込まれることが明らかとなった。リポ多糖(LPS)により RAW264.7 細胞を刺激すると、炎症性サイトカインの産生量の増大が認められたが、PSL 添加により減少した。PSL は種々の炎症性疾患の治療に有望である。

【目的および方法】
日本人の死因の第一位であるがんの治療の確立は人類にとって長年の課題である。近年、放射線によるがん治療のひとつとして、すい臓がんなどの低酸素腫瘍に対して放射線感受性を増大させつつ、周囲の正常組織へのダメージを最小限に抑える、放射線増感治療の研究が行われている。本研究グループでは、
TiO2 ナノ粒子をポリアクリル酸(PAA)修飾、および過酸化水素処理したポリア
クリル酸修飾過酸化チタンナノ粒子(PAA-TiO X)を用いた放射線増感治療に着目している。これまで、PAA-TiOX と放射線の併用による治療効果が担癌マウスを用いた in vivo 系において確認されている。本研究では PAA-TiOX の更なる有効性の向上のために、粒子のマウス生体内分布の解明及び、腫瘍への受動的粒子蓄積について検討した。
【結果】
ICP-AES 分析の結果から、肝臓では経時的に Ti 含有量が増加、腫瘍では経時的に Ti 含有量が減少したことが確認された。また、過酸化水素処理をしていない
PAA-TiO2 においても同様の結果が得られたことから、この結果は Ti ナノ粒子の特性に依るものだと考えられる。従って、ナノ粒子を腫瘍内に留まらせて、治療効果を向上させるには、腫瘍を特異的に認識する機能を粒子に付与させる必要があると考えられる。この結果を踏まえ、腫瘍に過剰発現している上皮成長因子受容体(EGFR)に特異的結合する抗 EGFR 抗体を結合させることで更なる粒子の特異性向上を目指していく。今後の予定として、上記の腫瘍標的能を付与した粒子を作製した後に、PAA-TiOX-抗 EGFR 抗体における生体内分布の解明を行い、有効性の向上を検証する。

Development of macrophage-targeted nanomedicine for inflammatory
disease treatment

Biodistribution of poly-acrylic acid conjugated peroxide titanium
nanoparticles in xenograft mouse models○Riki Toita1, Satoshi Fujita1, Jeong-Hun Kang2(1Biomed. Res. Inst., AIST, 2NCVC)

Key words

drug delivery system, drug carrier, inflammation, macrophage○Takahiro Suzuki1, Kenta Morita1, Yuya Nishimura2, Chiaki Ogino1,
Akihiko Kondou2(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Org. Adv. Sci. Technol. Kobe Univ.)

Key words

mouse, biodistribution, titanium dioxide, nanoparticle

生体医用工学

1P-2p137 イミノ二酢酸修飾ヒアルロン酸鉄イオン架橋ハイドロゲ
ルによる腹膜癒着防止効果の検討

125

1P-2p139 治療効果を有する肝臓構築を目指して○白木川 奈菜, 坂本 裕希, 木村 遥奈, 井嶋 博之（九大院・工）shirakigawa@chem-eng.kyushu-u.ac.jp○戚 蟠 1, 天野 由貴 2, 切田 勝久 2, 太田 誠一 1, 伊藤 大知 1,2（1東大院・医, 2東大院・工）taichi@m.u-tokyo.ac.jp【背景と目的】腹膜癒着は外科手術において深刻な問題であり、癒着によって不妊症や腸閉塞などが問題として挙げられる。既存のゲル状癒着防止材として、Intergel は一度市場に出回ったが、腹腔内の鉄イオン濃度の上昇とハイドロゲルの長期残存によって重篤な炎症を引き起こし、現在はすべて生産中止され、現在臨床で用いられているヒアルロン酸ゲル状癒着防止材は存在しない。本研究では、低濃度の鉄イオンによって架橋されたイミノ二酢酸修飾ヒアルロン酸(HA-IDA)ハイドロゲルの開発と癒着防止効果の評価を目的とした。
【方法】イミノ二酢酸(IDA)を HA のグルクロン酸部位のカルボキシル基にアミド結合を介してコンジュゲイションした HA-IDA を合成した。その後、NMR
により IDA の修飾を確認した。また、架橋に必要な Fe3+濃度の検討を行った
後、HA-IDA の毒性を評価するため、MTT アッセイを行った。さらに、in vivoではラット盲腸擦過・腹壁切除癒着モデルにおける腹膜癒着防止効果の検討を行った。
【結果】NMR によって、HA-IDA の合成を確認できた。IDA は鉄イオン（III）と高い錯体形成能を持つ、イオン交換基である。FeCl3 水溶液で架橋した所、
HA-IDA/Fe3+ハイドロゲルの弾性率は HA を鉄イオンで架橋した HA/Fe3+の弾性率より高く、また HA-IDA は HA に比べ低い濃度の鉄イオンによってハイド
ロゲルを形成できることが確認された。また、HA-IDA/Fe3+ハイドロゲルは invitro で低毒性を示した。ラット盲腸擦過モデルにおいて、HA-IDA/Fe3+ハイド
ロゲルは、1 週間後の開腹時に腹腔内残留をすることなく、さらに、無処置のコントロールや、同じく鉄イオンで架橋したコハク酸修飾キトサンハイドロゲ
ルなどと比較したところ、腹膜癒着形成を低減する効果を示した。

肝臓は代謝の中心臓器であり、重篤な肝不全患者に対する根本的な治療法は移植しかなく、慢性的なドナー不足が問題となっている。これに対して我々は、移植用のドナー肝臓を人工的に構築すべく、臓器工学的肝臓の構築に取り組んでいる。
血管構造を有する足場材料（脱細胞化肝臓）を用いて臓器規模の血管網の構築を行い、血管網周囲に対して細胞周囲環境を整えた肝細胞を配置し、細胞増殖・血管新生により、肝臓構築を目指している。治療効果のある肝臓構築の達成には、細胞を立体的に配置した後、肝機能を発現させることが重要である。その為、肝機能発現に向けた組織構築の最適化が重要となる。
本研究では、構築した肝組織体の肝機能評価を目指し、肝不全モデルラットの構築とそれに対する血液体外循環を構築し、肝組織体を適用することでその機能評価に取り組んだ。
吸入麻酔下のラットに対して、右葉に温虚血を施した後、中葉、左葉、尾状葉を切除した。温虚血の時間依存的にラットの生存率が低下し、右葉を組織学的に評価したところ、内部において肝細胞の壊死と再生に向けた細胞分裂が観察された。また、血中成分を評価したところ、アンモニア、ALT、AST の上昇が見られ、肝不全状態を再現されていることが示唆された。
ラットの頸動脈から血液を引き出し、頸静脈に戻すという血液体外循環系を構築した。これを前述の肝不全モデルラットに対して施し、構築した肝組織体を適用することで、肝組織体の機能評価を試みた。その結果、構築した肝組織体が治療に対して有効なことが期待された。
以上の結果から、肝組織体の構築のための評価系の構築が期待された。今後は本評価系を用いて、肝組織構築法の最適化を行い、移植可能な肝臓構築を目指す。

The prevention of peritoneal adhesions by ferric ion-crosslinked hydrogelsof hyaluronic acid modified with iminodiacetic acids.

Construction of organ engineered-liver which will be effective for clinicaltreatment○Pan Qi1, Yuki Amano2, Katsuhisa Kirita2, Seiichi Ohta1, Taichi Ito1,2(1Grad. Sch. Med., Univ. Tokyo, 2Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)

Key words

peritoneal adhesion, hyaluronic acid, iminodiacetic acid, hydrogel

1P-2p138 酸化還元応答性ハイドロゲルを基材とする細胞組織体の形成と機能評価○Nana Shirakigawa, Hiroki Sakamoto, Haruna Kimura, Hiroyuki Ijima(Fac. Eng., Kyushu Univ.)

Key words
failure rat

liver regeneration, decellularization, whole organ engineering, liver

1P-2p140 Polymer2 を用いた HEK293 細胞の新しい 3D 培養法
構築○神谷 典穂 1,2, 内藤 翔乃 1, 香川 元気 1, 森山 幸祐 3, 若林 里衣 1,
南畑 孝介 1, 後藤 雅宏 1,2（1九大院・工, 2九大・未来化セ, 3九大・先導研）
nori_kamiya@mail.cstm.kyushu-u.ac.jp○金木 達朗 1, 林 寿人 1, 川原 浩治 2, 西野 泰斗 1
（1日産化学工業, 2北九州高専）
kanaki@nissanchem.co.jp

高分子ハイドロゲルは、物質透過性や高含水率といった生体組織との類似性より、細胞培養基材やドラッグデリバリーシステム用のキャリアーとして広く利用されている。合成高分子を主成分としたハイドロゲルは、その高分子ネット
ワーク中に生理活性物質等の有用物質を組み込むための分子設計、即ち、目的に応じた機能化が可能である。 当研究グループは、最近、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ (HRP) の酵素触媒反応を介した新たなハイドロゲル作製法を確立した。本手法では、チオール基 (SH 基) が修飾された分岐型高分子、HRP、そして HRP の基質となる小分子フェノール誘導体を混合することで、常温、中性
pH、反応時間３０分程度で、ジスルフィド結合を架橋点としたハイドロゲルが得られる。本手法の鍵は、系中の SH 基の自己酸化により生じる僅かな過酸化水素を使って HRP 触媒反応が進行する点にあり、過酸化水素による細胞のダメージを最小化できる点にある。従って、上記の成分を含むゾル溶液と、細胞懸濁溶液を混合し、しばらく放置することで、生細胞をハイドロゲル中に簡便に包括することができる。さらに、得られたゲル骨格は還元剤の添加により崩壊するため、細胞の回収が可能である。
本研究では、細胞接着性を示さない PEG-SH のみからなるハイドロゲル中で細胞包括培養を行い、細胞組織体（スフェロイド）の形成を試みた。HepG2 細胞を用いた包括培養の基礎検討の結果、基材となる PEG 濃度に依存して異なるサ
イズ（直径 30 ～ 70 μm 程度）のスフェロイドの形成が確認された。さらに、還元剤の添加によりハイドロゲルを崩壊し、回収されたスフェロイドの機能を評価したところ、肝細胞特異的な機能を有することを確認した。

【背景と目的】昨年の本会において、細胞を接着させる機能を有しかつ不溶性のナノファイバー様基材である Polymer2 を見出し、Polymer 2 に MDCK 細胞を接着させた新しい 3D 培養法について報告した。今回、ヒト糖鎖型タンパクの生産に用いられている HEK293 細胞の 3D 培養法について検討したので報告する。
【方法】Polymer 2（0.003%～0.03%）を市販の各 HEK293 培養用培地に添加し、50ml ミニリアクターと組み合わせて HEK293 細胞の静置培養あるいは撹拌培養を試みた。培養後の生細胞数は Cell Titer -Glo 法による ATP 値として、また培養上清中の IFNβ 値は ELISA 法にて測定した。
【結果と考察】HEK293 細胞を培地のみ（未添加条件）で培養すると巨大な細胞凝集塊を形成し、凝集塊の形成
は HEK293 細胞に対する懸濁培養用培地を用いても同様に観察された。一方、Polymer2 を添加した培地では、HEK293 細胞が培養液中に分散するだけでなくPolymer2 ファイバーへ吸着している形態が観察された。また未添加条件に比べて良好な細胞増殖性を示し、その増殖効果はミニリアクターを撹拌することでさらに増強した。さらにヒト IFNβ を強制発現する HEK293 細胞を用いた試験でも Polymer 2 添加による増殖促進効果を認め、培養上清に分泌するヒト IFNβ量は未添加条件と比較して約 3 倍の値を示した。以上の結果から、Polymer2 による 3D 培養法は、HEK293 細胞におけるヒト糖鎖型タンパク生産に有用である可能性が示唆された。

Redox-responsive hydrogels as potent matrices for cell spheroid formation

New 3D culture system of HEK293 cells using Polymer2○Noriho Kamiya1,2, Shono Naito1, Genki Kagawa1, Kosuke Moriyama3,
Rie Wakabayashi1, Kosuke Minamihata1, Masahiro Goto1,2(1Fac. Eng., Kyushu Univ., 2CFC, Kyushu Univ., 3Inst. Material. Chem. Eng.)

Key words

cell immobilization, hydrogel, biomaterial, peroxidase○Ttasuro Kanaki1, Hisato Hayashi1, Hiroharu Kawahara2, Taito Nishino1(1Nissan Chemical Industries, 2Dept. Mat. Sci. Chem. Eng., KCT)

Key words

HEK293, 3D culture, protein vaccine

126

生体医用工学／セル＆ティッシュエンジニアリング

1P-2p141 磁力を利用した in vitro 三次元がんモデル：がん細胞浸潤挙動の半自動解析法の開発

1P-2p143 正常血圧条件下におけるかん流培養を可能とする多層血管モデルの作製と評価○清水 一憲 1, 山本 修平 1, 本多 裕之 1,2（1名大院・工, 2名大・予防早期医療創成セ）
honda@nubio.nagoya-u.ac.jp○木下 敬太, 山田 真澄, 関 実（千葉大院・工）m-yamada@faculty.chiba-u.jp【緒言】
生体外において作製された血管組織は，血管に関連した病態モデル，あるいは薬効評価モデルとしての応用が期待されている。これまでに血管組織作製のための様々な手法が提案されており，当研究グループでも，ハイドロゲル製の流路構造を用いることで，多層・分岐・肉厚構造を有した血管組織の作製手法を提案してきた。しかしながら，これまでに報告された多くの血管組織モデルでは，正常血圧を再現することは困難であった。そこで本研究では，シリコーン
樹脂製の流路内面において血管平滑筋細胞を内包した Ba-アルギン酸ハイドロ
ゲル層を形成させ，その内面に更に血管内皮細胞を接着させる新規手法を提案する。実際にヒトの正常血圧を印加した状態においてかん流培養を行い，血管組織の機能評価を試みた。

【背景と目的】 がんの浸潤・転移機構解明のため、微小環境におけるがん細胞と周辺細胞、特に血管内皮細胞との相互作用解析が進められている。我々はこれまでに、磁性ナノ粒子と剣山状磁性デバイスを用いた磁気細胞マイクロパター
ニング法を開発し、血管内皮細胞ネットワークへのがん細胞の浸潤挙動を評価できる in vitro 三次元がんモデルの構築に成功している[1]。しかし、解析が非常に煩雑であったため、多条件アッセイへの応用が困難であった。そこで本研
究では、がん細胞浸潤挙動を半自動的に定量解析するプログラムを作成し、複数種のがん細胞や抗がん剤を用いた多条件アッセイに応用した。
【方法】 赤色蛍光標識した正常ヒト血管内皮細胞（HUVEC）を培養し、血管様ネットワークを形成させ、緑色蛍光標識したがん細胞塊を、アレイ状に配置し、蛍光顕微鏡画像を取得した。がん細胞塊と最も近い HUVEC との間の重心間距離を半自動計測し、同時にがん細胞塊の伸展度（周囲長）を計測して、がん細胞の HUVEC ネットワークへの浸潤を評価した。重心間距離に対してがん細胞塊の伸展度をプロットし、単独培養時のがん細胞塊伸展度と比べ、有意（3SD以上）に挙動変化した重心間距離を求めた。
【結果と考察】 4 種のがん細胞株を用いて実験を行った。がん細胞株に共通して
HUVEC に接近するほど伸展度が大きくなったことから、がん細胞塊と HUVECの距離ががん細胞の浸潤挙動に大きく影響することがわかった。また in vivo での浸潤能が高いがん細胞株ほど、HUVEC から遠い距離でも伸展することがわかった。作用機序の異なる複数の抗がん剤（Cimetidine, Erlotinib, Paclitaxel）の作用についても実験を行った。HUVEC との距離に応じたがん細胞塊の伸展度の変化が抗がん剤ごとに大きく異なることが明らかになった。
[1] Yamamoto et al., PLoS ONE (2014)【実験および結果】
レプリカモールディングによって BaCl2 粒子を内包した PDMS 製の流路を作製した。血管平滑筋細胞を懸濁した，細胞接着性を有する RGD 修飾アルギン酸
Na 水溶液を流路内へ導入したところ，流路内壁面において Ba-アルギン酸ハイ
ドロゲル層が形成された。その後，血管内皮細胞を懸濁させた培養液を導入したところ，ハイドロゲル表面に細胞が接着し，培養 7 日後には細胞が単層に組織化することで，多層状の血管組織が形成された。次に，血管平滑筋細胞のみで作製した血管組織を，ヒトの正常血圧である 120 mmHg の圧力を印加した状態でかん流培養したところ，流路構造や組織は破断することなく，安定して培養が可能であった。また，機能評価としてエラスチンの免疫染色を行ったとこ
ろ，圧力を印加した血管組織においてエラスチン発現量が向上している様子が観察された。今後は，多層状の血管組織において，正常血圧を印加した状態でかん流培養を行い，漏えい性などの機能評価を行う。

In vitro 3-D cancer model: a semi-automated method for quantifying cancer
cell invasion

Fabrication of multilayered vascular tissue models enabling perfusion
culture under normal blood pressures and their characterization

Key words
magnetite nanoparticle, in vitro cancer model, cell-based assay, highthroughput screening

Key words

1P-2p142 3 次元培養によるヒト脂肪由来幹細胞の脂肪への分化と

1P-2p144 CHO 細胞を用いた抗体生産プロセスにおける糖鎖構造○Kazunori Shimizu1, Shuhei Yamamoto1, Hiroyuki Honda1,2(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2PME, Nagoya Univ.)

マイクロティッシュの 作製○Keita Kinoshita, Masumi Yamada, Minoru Seki
(Grad. Sch. Eng., Chiba Univ.)hydrogel, vascular tissue, perfusion culture, organ on a chip解析○森下 明彦 1, 鬼塚 正義 2, 大政 健史 3, 秦 信子 1
（1株式会社Ig-M, 2徳島大院・ソシオ, 3阪大院・工）shata@ig-m.biz○宮本 義孝 1,2, 池内 真志 1, 野口 洋文 3, 八木 透 4, 生田 幸士 1,
林 衆治 2（1東大・先端研, 2名大院・医, 3琉球大・医, 4東工大院・情報理工）
myoshi1230@gmail.com【目的】脂肪組織由来幹細胞（adipose-derived stem cells, ASCs）は、多分化能を有し、脂肪組織採取時における侵襲も少なく大量に確保できることから、再生医療分野で幹細胞の供給源として注目されている。安全な細胞治療を行うためには、生体外環境下、ASCs から脂肪へ分化させ、適切な大きさ、品質のマイ
クロティッシュを作製する必要がある。そこで、本研究では、ASCs から脂肪への分化方法として、三次元培養デバイス TASCL によるクラスター形成から
マイクロティッシュを作製したので報告する。
【方法】本実験では、微細加工技術を用いて、ポリジメチルシロキサン（PDMS）から成る TASCL を作製した。本デバイスは、10mm 四方の基板上に、貫通孔の上部・下部形状を自在に設計可能であり、1 枚のデバイス内に多数配置することができる。親水化処理後の TASCL を超低接着性培養皿上に設置し、所定量の ASCs 懸濁液を播種・培養した後、脂肪への分化とその機能について評価した。
【結果】TASCL 上でのクラスター形成から、脂肪への分化とマイクロティッシュを作製することができた。また、Oil Red O 染色より脂肪滴が観察され、細胞内のトリグリセライドも蓄積されていることから、脂肪細胞への分化が確認できた。さらに、2 次元培養と比べて、TASCL による 3 次元培養は脂肪細胞への分化を短期間で誘導することができた。
【結論】3 次元培養による脂肪細胞への分化、短期間でのマイクロティッシュの作製に成功した。3 次元培養による微小内環境をデザインすることにより、より分化誘導の高効率化が期待できる。

【背景及び目的】
抗体医薬品生産において, 抗体の品質を管理することは非常に重要である. 特に,抗体に付加される糖鎖構造は, 抗体の高次構造の安定化, 生理活性の調節, 抗原性, 体内動態に影響を及ぼすため, その詳細な解析が必要である. 生産された抗体の糖鎖構造は不均一であり, その分布は宿主細胞や培養条件に影響を受けることが知られている. 本研究では, 抗体生産 CHO 細胞を異なる培養条件下で培養し,得られた抗体の糖鎖構造解析を行うことで, 培養条件の変化が糖鎖構造に及ぼす影響を調査した.

Adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells in 3D
culture (TASCL device)

Characterization of oligosaccharides in antibody production process using
CHO cells

Key words
3D culture, Adipose-derived stem cell, Adipose-like Microtissues,
Tapered stencil for cluster culture (TASCL)Key words○Yoshitaka Miyamoto1,2, Masashi Ikeuchi1, Hirofumi Noguchi3, Tohru Yagi4,
Koji Ikuta1, Shuji Hayashi2(1RCAST, Univ. Tokyo, 2Grad. Sch. Med., Nagoya Univ., 3Fac. Med., Univ.
Ryukyus, 4Grad. Sch. info. Sci. Eng., Tokyo Tech)【方法】
IgG1 生産 CHO 細胞を異なる培養条件下で培養し, 培養上清より IgG1 を精製した. 酵素消化等の方法によって, 精製 IgG1 より N-結合型糖鎖, または, O-結合型
糖鎖を遊離させ, その構造, 及び, 分布を高速液体クロマトグラフィー(HPLC), または, キャピラリー電気泳動(CE)を用いて解析する. 糖鎖を構成する単糖の組成,
及び, 含量の解析も同様に行う.
また, 培養過程の細胞より細胞内代謝産物を抽出し, 異なる培養条件下における細胞の代謝産物量を比較する.

○Akihiko Morishita1, Masayoshi Onitsuka2, Takeshi Omasa3, Shinko Hata1(1Ig-M Co., Ltd.,, 2Inst. Technol. Sci., Tokushima Univ., 3Grad. Sch. Eng., Osaka
Univ.)
Chinese hamster ovary cells, Antibody, sugar chain

セル＆ティッシュエンジニアリング

1P-2p145 細胞集塊挙動によるヒト間葉系幹細胞の心筋方向への分化指向性誘導127

1P-2p147 ノコダゾール処理によるヒト iPS 細胞の心筋分化誘導○山口 千尋, 大貫 喜嗣, 黒澤 尋
（山梨大院・総研部）
kurohiro@yamanashi.ac.jp○小川 祐樹, 金 美海, 紀ノ岡 正博（阪大院・工）kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景と目的】ヒト iPS 細胞の品質管理においては、原材料となる細胞集団の均一化は重要である。微小管形成阻害剤であるノコダゾールによるヒト iPS 細胞の細胞周期同調が可能であることが明らかになったが、ヒト ES 細胞においてはノコダゾー
ルを添加すると未分化関連遺伝子の発現量が減少することが報告されている。
我々はノコダゾールの特性である細胞同調によってヒト iPS 細胞を均一性を高め、さらに未分化性を減少にさせることにより効率的な分化誘導が行えると考えた。本研究では、ノコダゾールの添加条件の違いがヒト iPS 細胞からの心筋細胞分化に及ぼす影響について明らかにした。

幹細胞の分化誘導過程において，未分化細胞の混入や不均質な特性に由来した
目的外の細胞発生による分化誘導効率の低さが問題となっている．これまで我々は，一時的な細胞集塊の伸縮を伴う遊走挙動を通して集塊内で細胞が交ざることによってヒト間葉系幹細胞の分化指向性が心筋方向へ誘導されることを報告してきた．本研究では，細胞集塊挙動を利用した分化指向性制御による分化誘導について検討した．一時的な伸縮を伴う細胞集塊挙動はデンドリマー提示培
養面上で分化誘導因子を添加しない 10%FBS/DMEM を用いた培養で確認され，遊走促進剤である HMG-1 を培地中に添加することで継続的な細胞集塊の伸縮を伴う遊走挙動が観察され，心筋方向への分化指向性の指標となる cTnT 陽性
細胞比率が HMG-1 を添加しない条件と比較して高くなっていることが確認された．また，細胞集塊を新たなデンドリマー面に継代することによって，細胞集塊の分散および再形成が確認され，cTnT 陽性細胞比率が増加することを確認した．そこで，デンドリマー面で培養された細胞群と，HMG-1 を添加した培養の後に継代培養することで，cTnT 陽性細胞比率が高くなった細胞群に対し，分化誘導促進剤である TGFbeta1 を添加した培地で培養したところ，TGF の添加の有無によって，どちらの細胞群でも cTnT 陽性細胞比率には違いがほとんど見られなかった．しかしながら，cTnT の mRNA 発現量は，デンドリマー面で培養された細胞群では TGF によって，2.2 倍上昇していたのに対し，継代によって cTnT 陽性細胞比率が高くなった細胞群では，TGF によって，4.0 倍上昇しており，分化指向性の誘導によって，分化の程度がより増強されやすいことが示唆された．これらの結果から，細胞集塊挙動を利用した初期の分化指向性を制御することが幹細胞の分化誘導を促進する為の新たな概念として提案することが出来る．

【結果と考察】
ノコダゾール処理条件の違いが心筋分化に影響を及ぼすことが明らかになった。
EB 形成期間中処理では、EB の生育が抑制された。一方、分化前処理では、拍動性心筋細胞の発生時期が早くなった。以上より、ノコダゾール処理によってヒト iPS 細胞の心筋細胞分化を促進できることが示唆された。

Directing of differentiation propensity in hMSCs toward a cardiomyogenic
lineage

Effect of nocodazole treatment on differentiation of human iPS cells into
cardiomyocytes

Key words
differentiaton propensity, human mesenchymal stem cells, aggregation,
cell behaviors

Key words

1P-2p146 維持培養および胚様体形成期間中の培地がヒト iPS 細胞

1P-2p148 タンパク質マイクロファイバーの高効率作製とその細胞○Yuuki Ogawa, Mee-Hae Kim, Masahiro Kino-oka(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)の心筋分化誘導に与える影響【方法】
フィーダー細胞（SNL76/7）非存在下でヒト iPS 細胞（201B7、理研 BRC）を培養した。Accutase によりシングルセルに分散し、3000 cells/well となるように
Lipidure(96U-A)に播種した(day 0)。4 日間の浮遊培養により胚様体(EB)を形成した(day 0-4)。形成後、PSC cardiomyocytes differentiation kit medium A および
medium B にて合計 4 日間の浮遊培養を行った(day 4-8)。その後、8 日間の接着培養を行った。ノコダゾール処理は終濃度 200 ng/mL にて、前処理(day -1-0)、
EB 形成期間中処理(day 0-4)、および分化前処理(day 3-4)の 3 条件を行った。毎日顕鏡下にて細胞様相および拍動率を計測した。

○Chihiro Yamaguchi, Yoshitsugu Ohnuki, Hiroshi Kurosawa(Grad. Fac. Interdisc. Res., Univ. Yamanashi)

iPS cells, cardiomyocyte differentiation, nocodazole

培養系への応用○澤登 美空, 大貫 喜嗣, 黒澤 尋
（山梨大院・総研部）
kurohiro@yamanashi.ac.jp○平松 久卓, 堀 綾香, 矢嶋 祐也, 山田 真澄, 関 実（千葉大院・工）m-yamada@faculty.chiba-u.jp【背景と目的】ヒト iPS 細胞由来心筋細胞は再生医療をはじめ広い分野への応用が期待されている。ヒト iPS 細胞は一般的にマウスフィーダー細胞上で培養が行われるが、異種細胞の混入や細胞集団の不均一性の原因となるため、フィーダー細胞非存在下でヒト iPS 細胞を維持培養(feeder-free 培養)することが求められる。現在、様々な feeder-free 培養に適した培地が市販されているが、使用する培地により
ヒト iPS 細胞の性質が異なるという問題がある。維持培養及び EB 形成時の培地の違いは、その後の分化誘導効率にも影響を与えると考えられる。よって本研究では feeder-free 用培地の違いがヒト iPS 細胞における心筋細胞の分化誘導に及ぼす影響を明らかにした。
【方法】
ヒト iPS 細胞(201B7、理研 BRC)を異なる feeder-free 用培地で培養した。Accutase
によりシングルセルまで分散し Lipidure(96U-A)に 3000 cells/well で播種後各培
地にて 4 日間浮遊培養し胚様体(EB) 形成した。その後 PSC Cardiomyocyte
Differentiation Kit(Thermo)の MediumA、MediumB にて合計 4 日間浮遊培養し、
Maintenance Medium にて 8 日間接着培養を行った。形成した EB の形態観察、
発生した拍動性心筋細胞の割合、および心筋細胞関連遺伝子の発現解析により評価を行った。
【結果と考察】維持培養および EB 形成期間中に使用する feeder-free 用培地の違いは、ヒト iPS
細胞からの拍動性心筋細胞の発生形態および心筋細胞関連遺伝子の発現量に影響を及ぼし、ヒト iPS 細胞を心筋細胞に分化誘導する際の維持培養や EB 形成
期間中の培地がその後の心筋細胞の発生に影響を与えることが示唆された。したがって効率的な目的細胞への分化誘導には維持培養及び EB 形成時の培地を適切に選択することが重要である。

【緒言】
細胞外基質（ECM）タンパク質を加工して作製した微小なファイバーは，線形組織の作製や細胞の伸展方向制御を可能とする細胞培養基材として期待されている。これまでにマイクロ流路を用いてタンパク質ファイバーを作製する手法は報告されているが，直径数 um の微小なファイバーの作製は困難であり，また作製速度が不十分である，といった問題があった。本研究では，微小な ECM
ファイバーを効率的に作製するための新規手法として，パターン化ハイドロゲ
ルファイバーを利用する手法を提案する。具体的には，ECM タンパク質を含む領域を並列的に形成したアルギン酸ハイドロゲルファイバーを作製し，タンパ
ク質を架橋した後にアルギン酸を選択的に除去することで，直径数 um の ECM
ファイバーが並列的に得られる。また ECM ファイバーの応用として，3 次元環
境において細胞増殖を促進する足場材料としての利用を試み，細胞の増殖挙動を評価した。
【実験及び結果】
微細なノズルアレイ構造を組み込んだマイクロ流路構造を作製し，ECM タンパ
ク質を含むアルギン酸 Na 水溶液および含まないアルギン酸 Na 水溶液を連続的に導入し，ゲル化させることで，外縁部あるいは内部に 8 つの ECM 含有領域を有するハイドロゲルファイバーを作製した。続いて，ファイバーに含まれるタンパク質を架橋した後，クエン酸三ナトリウム水溶液を用いてアルギン酸を除去したところ，直径 5~6 um のファイバーが効率的に得られることが確認された。また，ECM ファイバーを足場材料として，細胞（HepG2 細胞）とともにハイドロゲルに導入し，3 次元的環境において培養を行ったところ，ファイバーを用いた場合には，細胞がファイバーに接着し効率的に増殖する様子が確認された。本研究で得られたファイバーは，3 次元組織構築などの様々な細胞培養系において有用であると考えられる。

Effect of feeder-free medium type during maintenance and EB formation
cultures on cardiomyocytes differentiation from human iPS cells.

Efficient production of ECM protein microfibers and their application tocell culture systems○Miku Sawanobori, Yoshitsugu Ohnuki, Hiroshi Kurosawa(Grad. Fac. Interdisc. Res., Univ. Yamanashi)

Key words

iPS cells, maintenance culture, EB formation, cardiomyocytes○Hisataka Hiramatsu, Ayaka Hori, Yuya Yajima, Masumi Yamada, Minoru Seki
(Grad. Sch. Eng., Chiba Univ.)

Key words

extracellular matrix, microfluidic device, protein, microfiber

128

セル＆ティッシュエンジニアリング

1P-2p149 細胞の自己集合化誘導コーティング剤（CAT）を用いた
スキャホールドフリー軟骨リングの簡易作製

1P-2p151 酸素透過性マイクロウェルアレイチップを用いた毛包原
基の大量調製○岩井 良輔 1, 根本 泰 2, 中山 泰秀 3
（1岡山理大・技科研, 2株式会社ブリヂストン, 3国循セン研・生
体医工）
iwai@rit.ous.ac.jp○景山 達斗 1, 吉村 知紗 2, 片岡 健 3, 福田 淳二 1
（1横国大院・工, 2横国大, 3岡山理大・理）
fukuda@ynu.ac.jp【目的】感染、炎症や免疫反応などの問題点から、再生医療においては人工の足場材料を用いずに細胞のみから組織を組み上げる方法の開発が望まれている。
気管軟骨のようなリング形状が必要とされるのような組織の作製においては、
細胞印刷装置を用いた組織構築が期待されているが、装置が高価、特殊でスケー
ルアップが困難な培養系であることなどから、製品化に際してはその生産性が課題となる。我々は、細胞の自己集合化誘導コーティング剤（CAT）を開発した。CAT の印刷表面に細胞を播種するだけで、印刷面に接着した細胞は 1 日程
度の培養で自己集合して細胞組織体が形成する。本研究では、この CAT を用いた組織作製技術を用いて軟骨リングを従来の細胞を播種するだけの培養法にて作製することを目的とした。
【方法と結果】培養皿表面にシリコーン板（T: 1 mm）を貼付することで作製したリング形の溝（D: 6-20 mm, d: 2-12 mm）に CAT 溶液を流し込み乾燥させた後、ラットの肋軟骨細胞を 5.0×104 cells/cm2 以上の密度で播種した。細胞は播種
1 時間以内に溝底表面に接着してコンフルエント単層を形成した後、約 8-10 時
間の間に一体集合・凝集化して約 200 μm 厚のリング形の凝集体を溝内側のシリコーン板周囲に形成した。凝集体は 3 週間培養することで、ラットの気管軟骨と同等以上の力学的強度を有する軟骨リングへと成熟化した。また、シリコー
ン板のサイズを調節することによって、2 mm からヒトの気管軟骨輪と同等の15 mm まで、任意のサイズの軟骨リングを得ることが出来た。
【結論と展望】従来の培養皿を用いて単に軟骨細胞を播種するだけの簡易操作にて、任意のサイズのスキャホールドフリーの軟骨リングを作製することに成功した。安全性と生産性に優れた軟骨組織の作製法になり得ると考え、軟骨リングの移植評価実験と大量作製モデルの開発を進めている。

毛髪疾患の新しい治療法として、毛髪を生み出す毛包の種（毛包原基）を生体外で構築し、これを移植する毛髪再生医療に期待が寄せられている。毛包は胎児期において、上皮系細胞と間葉系細胞の相互作用により、毛包原基が形成されることで発生する。これを模倣し、毛包原基を生体外で構築してヌードマウ
ス皮下に移植すると、正常な毛が再生されることが示されている。しかし、この手法では、上皮系細胞と間葉系細胞のペレットをそれぞれ作製し、微小ゲル内に顕微鏡下で手作業で隣接配置するという手順が含まれている。ヒトの毛髪再生を考えると数万の毛包が必要であり、この手法をそのまま適用すると、多大な労力が必要となる。本研究では、独自に作製した PDMS マイクロウェルア
レイチップを用いて、毛包原基を大量に作製する技術を開発した。この技術は、酸素供給の改善された環境下では、1：1 で混合した上皮系細胞と間葉系細胞が自発的に 1 つの凝集体を形成し、なおかつその内部ではそれぞれの細胞種が分離されるという現象の発見に基づいている。このため、細胞混合液を単にチッ
プ上に播種するのみで、すべてのウェル内で毛包原基が形成され、作製した毛包原基は、ヌードマウスの皮膚に移植すると、正常な毛周期を繰り返す毛包を形成した。作製したチップは、培地表面からの酸素供給に加えて、酸素透過性の高い PDMS 膜を介した底面からも酸素供給可能である。このため、大量細胞培養で課題となる細胞の低酸素障害が抑えられ、毛包原基の大量培養を実現することができた。さらに、チップ内で均一かつ規則的に作製した毛包原基をシートとしてコラーゲンゲルに転写した後、ヌードマウスにこのシートを移植することにより、ヌードマウス皮下に規則的な間隔で毛を再生できる可能性が示された。

Preparation of scaffold-free cartilage rings using cell self-aggregationinducible surface

Large-scale preparation of spatially-aligned hair follicle germs on oxygen
permeable microarray chip

○Ryosuke Iwai1, Yasushi Nemoto2, Yasuhide Nakayama3(1RIT, Okayama Univ. Sci., 2Dept. Chem. Products, Bridgestone Corp., 3Div.
Biomed. eng., NCVC)

Key words

regenerative medicine, tissue engineering

1P-2p150 細胞膜内面の in vitro 解析を指向した細胞膜シートの開発○Tatsuto Kageyama1, Chisa Yoshimura2, Ken Kataoka3, Junji Fukuda1(1Grad. Sch. Eng., Yokohama Natl. Univ., 2Yokohama Natl. Univ., 3Fac. Sci.,
Okayama Univ. Sci.)

Key words

hair follicle germ, microarray, mass culture, hair regenerative medicine

1P-2p152 マイクロ光造形法と生体適合性金めっき法を用いた立体細胞シートの作製○泉田 森 1, 山口 哲志 2, 三澤 龍志 1, 山平 真也 1, 河原 正浩 1,
鈴木 智子 3, 高木 智子 3, 佐藤 香枝 3, 長棟 輝行 1, 岡本 晃充 1,2（1東大院・工, 2東大・先端研, 3日本女子大・理）okamoto@chembio.t.u-tokyo.ac.jp○小林 優香 1, Cordonier Christopher E.J. 2, 永瀬 史憲 1,
本間 英夫 2, 丸尾 昭二 1, 福田 淳二 1
（1横国大院・工, 2関東学院大・工）fukuda@ynu.ac.jp

細胞膜近傍には細胞の運命を司る因子が数多く存在するが、露出している細胞
膜外面に比べ、細胞膜内面近傍の因子を解析する技術は限られている。遺伝子操作を使用した解析やイメージングは確立した方法だが、前者は細胞という複雑系の中で因果関係が不明確なことが多く、後者は融合発現させる蛍光タンパ
ク質による影響を排除できない。一方、近年、人工膜上に膜タンパク質を再構成する技術が、膜近傍の生体システムを定量的に把握してその機能のための必要十分条件を確定する方法として期待されているが、複雑な膜近傍の分子システムの再構成にはいまだ程遠い。
これらを踏まえ、我々は in vitro 解析に使用できる「生きたままの」分子状態の細胞膜シートを開発した。具体的には、PEG 脂質を介して基板上に細胞を固定
後、マイクロ流体のせん断応力によって細胞上部を瞬間的に破砕し、細胞内面を上部に向けた細胞膜シートを構築した。蛍光顕微鏡および走査型電子顕微鏡
観察によって細胞膜シートの形成を確認し、後者では細胞膜裏打ち繊維を保存した均質な膜シートであることも確認した。また、光退色後蛍光回復法（FRAP）
により、膜の流動性が損なわれていないことも確認した。
次に、この膜シート上で膜タンパク質の細胞内ドメインの解析を試みた。まず、酵素認識タグ配列を細胞内ドメインに付与した GPCR に対して、酵素を用いた選択的標識が可能であることが示された。また、破砕前にリガンドを感作させた受容体について、細胞内ドメインのチロシン残基のリン酸化を抗体染色によって検出することにも成功した。
本研究で開発した細胞膜シートは、細胞膜内面関連因子の解析や阻害剤スクリー
ニングを可能にするとともに、細胞内分子システム再構成の基盤として応用することによって様々な生命システムの理解に役立つことが期待される。

【背景と目的】再生医療の分野では、角膜や心臓、食道の損傷部に細胞シートを移植することで癒着や臓器そのものの機能を回復させる治療が行われている。
しかしながら、内耳や歯のように移植する組織の構造が複雑である場合、その形状に合わせた細胞シートを移植することが望ましい。そこで本研究では、マイクロ光造形法により、taylor-made な鋳型を作製し、めっき法によって金薄膜を形成させる。そして電気化学細胞脱離法を用いることで、鋳型形状に基づいた立体的な細胞シートを作製することを目的とした。
【方法】電気化学細胞脱離法に利用できる金めっき法を見出すため、光造形用樹
脂でフラットな基板を作り、2 種類の金めっき法（医療用金めっき・生体適合性金めっき）で金薄膜を形成し、細胞毒性や脱離効率などを評価した。次に、マイクロ光造形法を用いて複雑な立体構造を作製し、金めっきを行った。次に独自に開発した自己組織化オリゴペプチドを金表面に修飾した。そしてペプチド層を介して細胞を接着させた後、シート状になるまで細胞を培養した。その後、鋳型の周囲をハイドロゲルで覆い、電位を印加することで、細胞を金表面からハイドロゲル側に転写した。
【結果と考察】2 種のめっき法を比較した結果、医療用金めっき法で作製した基板には細胞は接着しなかったが、生体適合性金めっき法では良好な細胞接着が観察された。また、この基板上にオリゴペプチドを介して接着したヒト繊維芽細胞は、- 1.0 V(vs. Ag/AgCl)の電位を 5 分間印加することで、約 90％が脱離・回収可能であり、ほぼすべての細胞が良好に生存していることを確認した。さらに、マイクロ光造形法で作製したモデル鋳型に形成した立体細胞シートは、電位を印加し細胞を脱離させることで、内表面が細胞層に覆われた立体的な細胞シートをハイドロゲル内に構築することができた。

Development of cell membrane sheet for in vitro analysis of membrane
inner surface

3D cell sheet engineering by using electrochemical trigger○Shin Izuta1, Satoshi Yamaguchi2, Ryuji Misawa1, Shinya Yamahira1,
Masahiro Kawahara1, Tomoko Suzuki3, Tomoko Takagi3, Kae Sato3,
Teruyuki Nagamune1, Akimitsu Okamoto1,2(1Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo, 2RCAST, Univ. Tokyo, 3Fac. Sci., Japan Women's
Univ.)
Key words
cell membrane, in vitro analysis, cell immobilization, signaltransduction○Yuka Kobayashi1, Christopher E.J. Cordonier2, Fuminori Nagase1, Hideo Honma2,
Shoji Maruo1, Junji Fukuda1(1Grad. Sch. Eng., Yokohama Natl. Univ., 2Coll. Eng., Kanto Gakuin Univ.)

Key words
detachment

cell sheet, stereolithography, gold plating, electrochemical cell

セル＆ティッシュエンジニアリング

1P-2p153 スフェロイド積層型バイオ 3D プリンターにより作製した３次元組織についての培地成分・分泌代謝物の一斉
分析○森 翔太郎 1, 仁宮 一章 2, 高橋 憲司 1
（1金沢大院・自科, 2金沢大・新学術）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp

1291P-2p155 新規 CHO 細胞株の樹立○岩間 千草 1,5, 増田 兼治 2,5, 窪田 みち 1,5, 堀内 貴之 1,5,
野中 浩一 2,5, 上平 正道 3,5, 大政 健史 4,5（1株式会社ちとせ研究所, 2第一三共株式会社, 3九大院・工, 4阪
大院・工, 5次世代バイオ医薬品製造技術研究組合）
takayuki.horiuchi@chitose-bio.com【目的】従来、がん研究は培養皿上の 2 次元状態に展開したがん細胞を用いて行われてきた。しかし、2 次元培養したがん細胞と立体構造を持つ生体内の腫瘍とは多くの点で異なる性質が見られるという問題がある。そこで、本研究では、がん細胞を含むスフェロイド（培養細胞の凝集塊）を材料としてバイオ 3D プ
リンターによりさらに生体内の腫瘍の性質に近い 3 次元がん組織の作製の検討を行った。また、現在バイオ 3D プリンターで作製した 3 次元組織の内部構造
は組織を切断し、観察する方法が用いられている。しかし、3 次元組織の作製には長い時間を要するため、切断する方法は効率が悪い。従って、本研究では質量分析機を用いて培地成分の一斉分析を行い、内部構造との関連性を検討し、非破壊的分析方法の確立も目指した。
【方法および結果】がん細胞（ヒト乳腺癌 MDA-MB-231、MCF-7）のみでは安定したスフェロイドを作製することができない。そこで、がん細胞とヒト皮膚
繊維芽細胞（NHDF）を混合し、バイオ 3D プリンターで用いるのに適切なス
フェロイド（直径 400~600μm の球形）となる条件を検討した。その結果、最適な混合比および細胞の最適播種数を算出し、がん細胞を含むスフェロイドを安定して作製することができた。さらに、そのスフェロイドを用いたバイオ 3D
プリンターでの積層にも成功した。また、作製した 3 次元組織の内部構造の評
価と培地成分・細胞外代謝物の一斉分析についても報告を行う。

【背景と目的】CHO (Chinese Hamster Ovary) 細胞株は、抗体医薬品などの医療用タンパク質の生産に広く用いられている。この細胞株は、1957 年に Puck らに
よってチャイニーズハムスター卵巣組織の初代培養から樹立された上皮細胞を起源とし(1, 2)、その派生細胞株が抗体医薬品の製造に使用される。本研究ではバイオ医薬品製造用宿主への適用を目指し、新規に CHO 細胞株を樹立することを目的とした。
【方法と結果】チャイニーズハムスターから摘出し、細断した卵巣組織片を出発材料として初代培養を行った。まず、培地・培養条件の検討によって、初代培
養細胞を安定かつ大量に取得できる条件を確立した。しかし、卵巣組織からの増殖細胞には上皮細胞と線維芽細胞が混在していた。これらの初代培養細胞に関する形態と増殖能の解析過程で、それぞれの細胞は接着性に差異が認められたため、その性質を利用した線維芽細胞の選択的除去方法を確立した。上皮細胞の選択的回収と、培養・継代を繰り返すことにより、6 ケ月以上の長期継代培養を経て、独立した 8 ラインの細胞株の樹立に成功した。これらの新規 CHO
細胞株は安定に維持、継代することが可能であった。
【参考文献】1. Jayapal KP, et al. (2007) Chem. Eng. Prog. 103:40-47.
2.大政 健史ほか(2015)「抗体医薬における細胞構築・培養・ダウンストリームのすべて」CMC 出版.

Production of tissue by bio-3D printer and its non-invasive diagnosis byextracellular metabolomics

Establishment of novel CHO cell lines○Shotaro Mori1, Kazuaki Ninomiya2, Kenji Takahashi1(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Inst. Frontier Sci. Initiative,
Kanazawa Univ.)

Key words

bio-3D printer, tumor spheroid, extracellular metabolomics

1P-2p154 スフェロイド積層型バイオ 3D プリンターを用いた毛細血管様構造を有する 3 次元組織の作製○和田 亜樹 1, 仁宮 一章 2, 高橋 憲司 1
（1金沢大院・自科, 2金沢大・新学術）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp○Chigusa Iwama1,5, Kenji Masuda2,5, Michi Kubota1,5, Takayuki Horiuchi1,5,
Koichi Nonaka2,5, Masamichi Kamihira3,5, Takeshi Omasa4,5(1Chitose Lab. Corp., 2Daiichi Sankyo Co., Ltd., 3Fac. Eng., Kyushu Univ., 4Grad.
Sch. Eng., Osaka Univ., 5Mfg. Tech. Assoc. Biologics)

Key words
Chinese hamster ovary, cell line establishment, production oftherapeutic proteins

1P-2p156 CHO 安定遺伝子座への抗体遺伝子逐次導入による安定高生産株の構築○山名 良正 1,2, 成田 純也 2, 近藤 雅子 1,2, 大竹 敦子 1,2,
鈴木 惠介 1,2, 河邉 佳典 3, 上平 正道 3
（1TOTO・総研, 2MAB組合, 3九大院・工・化工）
yoshimasa.yamana@jp.toto.com【目的】近年、細胞から臓器を人工的に作製し、再生医療や創薬、臨床など様々な分野に応用する研究が注目を集めている。３次元人工組織の課題として、スキャフォールド（細胞接着用の足場材料）による副作用の排除が挙げられる。
本研究では、ヒト皮膚繊維芽細胞（NHDF）と血管内皮細胞（HUVEC）の共培養により作製した、毛細血管様構造を有する直径 500 μm の細胞凝集塊（スフェロイド）と、バイオ 3D プリンターを用いて微小血管様構造を有するスキャ
フォールドフリーな 3 次元組織を作製することを試みる。
【方法および結果】NHDF と HUVEC を共培養した混合スフェロイドと、混合フェロイドの上から更に HUVEC で被覆した２層スフェロイドを作製したとこ
ろ、どちらのスフェロイドにおいても毛細血管様構造が確認された。また、ス
フェロイドの大きさや真円度、HUVEC の分布について評価を行ったところ、
HUVEC の播種数に依存することがわかった。バイオ３ D プリンターと混合ス
フェロイドを用いて作製したモデル３次元組織においても、スフェロイドと同様に毛細血管様構造の形成が確認できた。

【背景と目的】
抗体医薬品生産用 CHO 細胞株には、発現安定性と高生産性が要求される。一般的に、細胞株構築はランダム挿入体の遺伝子増幅プールからのスクリーニン
グでなされており、安定高生産株の取得には手間と期間を要する。
TOTO（株）は、CHO の hprt 遺伝子座に発現ベクターを組み込むことで、安定発現株を確実に作製する技術を開発している。一方、九州大学は Cre/変異 LoxP
による逐次遺伝子導入システムを開発しており、ベクターを特定の遺伝子座に複数コピー導入することが可能となっている。本研究では、両技術の融合により、hprt 遺伝子座へ複数コピーのベクターを逐次導入し、安定かつ高生産な
CHO を作製する技術の開発を目的とした。
【方法】
CHO の hprt 遺伝子座に、逐次導入の起点となる変異 LoxP 配列を相同組換えによって組込み、逐次導入の起点となる CHO AGIS クローンを作製した。ヒト化
抗体重鎖、軽鎖発現カセットを搭載した逐次導入ベクターを作製し、上記クローンに Cre 発現プラスミドと共導入することで逐次導入クローンを取得した。
【結果と考察】hprt 遺伝子座への抗体遺伝子逐次導入によって、導入コピー数に比例した抗体
遺伝子 mRNA の増加を確認した。また、抗体生産量もコピー数に比例して増加した。また、100PDL 以上の発現安定性を確認した。

Tissue engineering of 3D tissue with micro vascular like structure using
bio-3D printer with multicellular spheroid

Generation of stable and high producer CHO cell lines of recombinant
antibodies by transgene integration into hprt locus using an accumulative
gene integration system○Aki Wada1, Kazuaki Ninomiya2, Kenji Takahashi1(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Ints. Frontier Sci. Initiative,
Kanazawa Univ.)

Key words

Bio-3D printer, Micro vascular structure, Image analysis○Yoshimasa Yamana1,2, Junya Narita2, Masako Kondo1,2, Atsuko Otake1,2,
Keisuke Suzuki1,2, Yoshinori Kawabe3, Masamichi Kamihira3(1Res. Inst., TOTO Ltd., 2Manufacturing Technology Association of Biologics, 3Fac.
Eng., Kyushu Univ.)
Key words
homorogous recombination, accumulative gene integration, antibody,
CHO

130

セル＆ティッシュエンジニアリング

1P-2p157 CRIS-PITCh 法を用いたノックイン CHO 細胞の作製○小松 眞也 1, 河邉 佳典 2, 小松 将大 2, 井藤 彰 2, 佐久間 哲史 3,
中村 崇裕 4, 山本 卓 3, 上平 正道 1,2（1九大院・シス生科, 2九大院・工, 3広島大院・理, 4九大院・農）kamihira@chem-eng.kyushu-u.ac.jp

1P-2p159 CHO 細胞における安定染色体の遺伝子地図作成と

CRISPR/Cas9 システムを用いた遺伝子ターゲッティン
グによる抗体生産株の構築○吉冨 耕太 1, 山野 範子 2,3, 鬼塚 正義 2,3, 古賀 雄一 1,
大政 健史 1,2,3（1阪大院・工, 2徳大院・生物資源産業, 3MAB組合）
omasa@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景と目的】CHO 細胞ゲノムの部位特異的な改変技術は、組換えタンパク質の高生産・高安定・高性能化に重要である。これまで比較的低い組換え効率である相同組換え法がしばしば用いられてきた。我々はこれまでに、TALEN を用いて CHO 細胞の特定ゲノム領域に組換え抗体遺伝子を高効率に導入できることを報告している。本研究では、CRISPR-Cas9 システムを応用した CRIS-PITCh法を用いて、CHO 細胞の特定ゲノムに外来遺伝子をノックインした遺伝子組換
え CHO 細胞を作製した。
【方法と結果】CHO 細胞ゲノムで、比較的安定発現を示すことがわかっている、
Hprt 遺伝子座を標的とした。レポーター遺伝子（Puro 耐性ならびに DsRed 遺伝子）を、標的部位周辺と相同性をもつマイクロホモロジーアーム（20 bp）で挟
み、ノックイン用のドナーベクターを作製した。Hprt エキソン 2 領域ならびにマイクロホモロジーアーム部分に対するガイド RNA（gRNA）を設計し、ゲノム編集ベクター pX330 に組込んだ。ドナーベクターと pX330 を CHO-K1 細胞へリポフェクション試薬により遺伝子導入後、薬剤（6-TG とピューロマイシン）ならびに蛍光スクリーニングで、クローンを選抜した。樹立した細胞におけるゲノム DNA を PCR 法で評価したところ、ジョイント部分の増幅が見られた。また、シークエンス解析結果から、プラスミドのバックボーンを持ち込まず、期待どおりノックインされていることがわかった。赤色蛍光強度をフロー
サイトメトリーで解析したところ、すべてのクローンで均一な発現を示した。
本研究の一部は、経済産業省の「平成 26 年度次世代医療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業（国際基準に適合した次世代医薬等製造技術）の再委託事業」の支援によって行われた。

【背景及び目的】バイオ医薬品に多用されている Chinese hamster ovary（CHO）
細胞は、他の生産宿主と比べて高生産株取得が困難な場合がある。CHO 細胞を用いた抗体生産株構築においては通常、外来遺伝子は染色体上の不特定な位置に導入されている（ランダムインテグレーション法）。一方近年、高生産株を効率よく構築する手段として、染色体上の標的した配列に抗体発現遺伝子を導入する遺伝子ターゲッティング法が注目を集めている。しかし、染色体上の有用な領域は未だ十分には解明されていない。そこで本研究では、これまでの研究から安定な染色体と考えられる 1 番染色体に着目し、CHO 細胞ゲノムライブラ
リーを用いた 1 番染色体の遺伝子地図の作成、並びに、CRISPR / Cas9 システムを用いた 1 番染色体への抗体遺伝子のターゲッティングを行い、抗体生産株の構築を試みた。
【実験材料及び方法】遺伝子地図は、CHO ゲノム BAC ライブラリーから 1 番染色体に対応するクローンの配列情報に基づいて作成した。CHO-K1 細胞を用いて、1 番染色体の異なる 3 領域に CRISPR/Cas9 システムを用いたリポフェクションを行い、3 種類の IgG 抗体生産細胞株を樹立した。構築した細胞株について培養を行い、比増殖速度ならびに比生産速度を評価した。
【結果及び考察】CHO 細胞の 1 番染色体の遺伝子地図を構築し、対応する計 91
個の遺伝子をマッピングした。これに基づいて 3 領域を選択し、ターゲッティ
ングベクターを構築し、トランスフェクションを行い、細胞株を構築した。1番染色体へのターゲッティングにより構築した細胞株の抗体比生産速度は、3
種類ともランダムインテグレーションにより構築した細胞株よりも約 2~9 倍高い結果が得られた。この結果より、1 番染色体において選択した領域が効率的な抗体遺伝子発現に有用な領域である可能性が示唆された。現在、再現性について検討中である。

Generation of knock-in CHO cells using CRIS-PITCh system

Construction of antibody-producing cell lines using CRISPR/Cas9 systemand development of the gene map by focusing on the stable chromosome in
CHO cells○Shinya Komatsu1, Yoshinori Kawabe2, Shodai Komatsu2, Akira Ito2,
Tetsushi Sakuma3, Takahiro Nakamura4, Takashi Yamamoto3,
Masamichi Kamihira1,2(1Grad. Sch. Syst. Life Sci., Kyushu Univ., 2Fac. Eng., Kyushu Univ., 3Grad. Sch.
Sci., Hiroshima Univ., 4Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words

CHO cells, Targeted integration, genome editing tools, CRIS-PITCh

1P-2p158 Cre-loxP による逐次遺伝子組込み法における生産 CHO
細胞株構築の迅速化○Kota Yoshitomi1, Noriko Yamano2,3, Masayoshi Onitsuka2,3, Yuichi Koga1,
Takeshi Omasa1,2,3(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Grad. Sch. Biosci. Bioind. Tokushima Univ.,
3
MAB)
Key words
CHO cells, chromosome stability, CRISPR/Cas9, antibody productivity

1P-2p160 染色体異数性を持つ抗体生産 CHO 細胞の網羅的遺伝
子発現解析○羽田 毅 1, 河邉 佳典 1, 汪 雪 1, 井藤 彰 1, 山名 良正 2,
近藤 雅子 2, 上平 正道 1
（1九大院・工・化工, 2TOTO・総研）
kamihira@chem-eng.kyushu-u.ac.jp○田中 翔 1, 山野 範子 2,3, 緒方 法親 3,4, 鬼塚 正義 2,3, 古賀 雄一 1,
大政 健史 1,2,3（1阪大院・工, 2徳大院・生物資源産業, 3MAB組合, 4日本バイオデータ）
omasa@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景と目的】我々はこれまでに目的遺伝子をゲノム上の特定部位に逐次的に複数導入可能な、逐次遺伝子組込みシステム（AGIS）を開発してきた。本研究では、AGIS での 2 つのドナープラスミドを一度に遺伝子導入することと、FACS
で蛍光細胞をスクリーニングすることで、scFv-Fc 遺伝子が多重化された生産
CHO 細胞株構築の迅速化を試みた。
【方法】ドナープラスミドの R2 と P3R は scFv-Fc 遺伝子を有し、P3R は mCherry
遺伝子も有す。ドナープラスミドの一方（R2）を、MC 作製用プラスミドに乗せ、MC 作製用大腸菌へ形質転換後、アラビノース誘導した（MC-R2）。EGFP
遺伝子と 2 つの scFv-Fc 遺伝子を有する細胞（CHO/scFv-Fc×2）へ、ドナープラ
スミド（R2 or MC-R2、P3R）と Cre 発現ベクターを共導入し、FACS で解析・単離した。単離した細胞のゲノム DNA を PCR、定量 PCR、シークエンス解析
で、scFv-Fc 発現量を ELISA 法で評価した。
【結果と考察】CHO/scFv-Fc×2 へ遺伝子導入後、FACS にて解析したところ、緑色から赤色蛍光へシフトした細胞が見られ、MC-R2 を用いた場合、R2 と比較して 10 から 20 倍高くなった。赤色陽性細胞を単離後、取得した細胞株のゲノ
ム PCR 解析したところ、正しく反応したことを示す特異的なバンドが検出できた。また、定量 PCR 法で評価したところ、4 つの scFv-Fc 遺伝子発現ユニットが組込まれていることを確認した。反応に関与した変異 loxP は期待したシーク
エンスとなっていた。培地上清中の scFv-Fc 生産量と細胞数から比生産速度を測定したところ、発現ユニット数の増加に伴って向上していることがわかった。
（本研究は、次世代バイオ医薬品製造技術研究組合により助成を受けて実施した。）【背景・目的】バイオ医薬品の代表的生産宿主細胞の Chinese hamster ovary (CHO)
細胞の染色体数は、生体外での長期培養等により、不均一な分布が生じる (染色体異数性) 。これまでの研究で、主な染色体数が 20 本 (通常) と 39 本の CHODG44 細胞を単離し、それらを宿主として IgG3 生産株を構築した結果、後者において比生産速度が約 5 倍増加することが明らかとなった 1)。本研究では、主な染色体数が 20 本、39 本の DG44 由来細胞株（SC20, SC39）とそれらを宿主とした IgG3 生産株（IgG3-SC20, SC39）の計 4 細胞株について、網羅的遺伝子
発現解析手法である(1)High Coverage Expression Profiling (HiCEP) 法、(2)mRNAseq 法を用いて遺伝子発現パターンを解析し、CHO 細胞における染色体異数性や抗体生産に影響を及ぼす遺伝子を解明することを目的とした。
【方法】HiCEP 及び mRNA-seq は(株)メイズの受託により行った。SC20, SC39細胞株について、細胞数当たりの β-actin の発現比を定量し、mRNA-seq のデー
タに対して細胞数補正を行った上で、染色体数の異なる細胞株間における発現量比のヒストグラムを作成した。
【結果・考察】HiCEP 及び mRNA-seq 解析の結果、比生産速度の高い IgG3-SC39
は、IgG3-SC20 と比較して発現量が増加する遺伝子数よりも発現量が低下する
遺伝子数が多く、宿主である SC39 と比較しても発現量が増加する遺伝子数よりも発現量が低下する遺伝子数が多い結果となった。また、ヒストグラム解析
より、細胞体積当たりの SC39 及び IgG3-SC39 の遺伝子発現量は、mRNA-seqの総発現遺伝子 10063 個に対し、90%の遺伝子において SC20 のものを下回った。染色体数の多い SC39 株では細胞体積当たりの遺伝子発現量の低下が引き起こされ、これが染色体数の多い細胞における形質に影響を及ぼしている可能性が示唆された。
1) Yamano et al., J. Biosci. Bioeng., (in press) 2016

Generation of recombinant CHO cells using AGIS

Transcriptome analysis of antibody-producing CHO cells with chromosome
aneuploidy○Takeshi Hada1, Yoshinori Kawabe1, Xue Wang1, Akira Ito1, Yoshimasa Yamana2,
Masako Kondo2, Masamichi Kamihira1(1Dep. Chem. Eng., Fac. Eng., Kyushu U., 2Res. Inst., TOTO Ltd.)Key words

accumulative gene integration, Cre/LoxP system, scFv-Fc○Sho Tanaka1, Noriko Yamano2,3, Norichika Ogata3,4, Masayoshi Onitsuka2,3,
Yuichi Koga1, Takeshi Omasa1,2,3(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Grad. Sch. Biosci. Bioind. Tokushima Univ.,
3
MAB, 4Nihon BioData Corp.)

Key words
mRNA-seq

Chinese hamster ovary cells, Chromosomal aneuploidy, HiCEP,

セル＆ティッシュエンジニアリング

1P-2p161 バイオ医薬品生産を目指したチャイニーズハムスター肺組織からの無血清馴化不死化細胞株樹立

131

1P-2p163 Tret1 遺伝子導入による CHO 細胞の抗体凝集抑制と細胞増殖能の改善○山野 範子 1,2, 大政 健史 2,3（1徳大院・生物資源産業, 2MAB組合, 3阪大院・工）omasa@bio.eng.osaka-u.ac.jp○原田 涼之介 1, 鬼塚 正義 2,3, 黄川田 隆洋 4,5, 小出 静代 3,
古賀 雄一 1, 山野 範子 2,3, 大政 健史 1,2,3（1阪大院・工, 2徳大院・生物資源産業, 3MAB組合, 4農研機構, 5東大院・新領域）
omasa@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景及び目的】チャイニーズハムスターの卵巣由来細胞 (CHO)細胞は、組換
えタンパク質の高度な翻訳後修飾が可能、無血清馴化培養が可能等の理由より、
タンパク質医薬品生産宿主細胞として多用されている上皮細胞様の細胞株である。CHO 細胞を宿主細胞としたバイオ医薬品は、現在の売上世界上位 10 医薬品の中の 6 品目抗体医薬品など多数の品目が上市され、CHO 細胞に基づく培養方法、無血清培地、工業生産、安全性確認のプラットフォームが確立している。
そこで本研究は、従来の CHO 細胞よりさらに高増殖、かつ高生産性のチャイ
ニーズハムスター由来の新規高生産宿主細胞の開発を目的とし、肺由来の細胞株を樹立した。
【方法】初代培養は、1 mm 角に刻んだチャイニーズハムスター肺組織を IMDM
培地 (20%血清)中に静置し行った。増殖してきた細胞を継代により維持し、血清濃度を順次低下させることにより、市販の CHO 無血清培地に馴化させ、純度試験を行った。樹立した無血清浮遊培養細胞への GFP 発現ベクターの導入効率は、フローサイトメーターにより評価した。また、抗体 (IgG1)発現ベクターを導入し、安定発現株を構築した。
【結果及び考察】チャイニーズハムスター肺組織より取得した初代培養細胞は、
主に線維芽細胞様の形態を示した。細胞は 400 日以上の継続培養、また、凍結融解が可能であることを確認した。動物由来成分を含まない合成培地による無血清浮遊馴化培養に成功し、CHO-K1 細胞よりも増殖の速い、0.066 h -1 の比増殖速度を得た。樹立した細胞株は、無菌試験、マイコプラズマ否定試験、in vitro
ウイルス試験を通過し、その安全性を確認した。遺伝子導入法の検討により、50%以上の効率で GFP 発現ベクターの導入が可能となった。現在、構築した抗体生産株について細胞の安定性と生産性の評価を行っており、新たな生産宿主細胞としての展開が期待される。

[背景]抗体医薬品の製造過程において、品質や安全性の低下につながる抗体凝集の形成を抑制することが必要である。細胞培養中に発生する抗体凝集を抑制するために、我々はケミカルシャペロンの一種であるトレハロースを培地に加える培養法を開発してきたが、添加により生じる細胞増殖能の低下を改善することが課題であった。細胞増殖能低下の原因を培地浸透圧による細胞へのスト
レスではないかと推測し、本研究では、ネムリユスリカ由来トレハローストラ
ンスポーター(TRET1)を抗体生産 CHO 細胞に導入しトレハロースに由来する浸透圧ストレス低減を試みることで、トレハロース培地を用いた凝集抑制と細胞増殖能改善の両立を目的とした。
[方法]CHO-HcD6 及び TRET1 を導入した CHO-HcD6-TRET1 細胞を、それぞれコントロール培地、100mM トレハロース含有培地の二種類の培地で半回分培養を行い、培養中の生細胞濃度及び抗体濃度を測定した。また培養上清から Protein
G スピンカラムを使用して抗体を精製し、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて凝集体含有量を分析した。
[結果・考察]トレハロース培地では CHO-HcD6-TRET1 の最大細胞濃度は CHOHcD6 の 2 倍以上に増加し、浸透圧ストレスの軽減により増殖能が向上したことが示唆された。トレハロース培地における抗体の比生産速度はコントロール
培養と比較して、CHO-HcD6、CHO-HcD6-TRET1 共に 1.3～1.4 倍同程度上昇した。ゲル濾過分析の結果、トレハロース培地では凝集体・二量体のピークが減
少し、培養中の凝集形成が抑制されていた。
以上の結果より抗体生産 CHO 細胞に TRET1 を導入することで、トレハロース
培地の凝集抑制能を維持しつつ細胞増殖性を改善できることが示された。今後、比生産速度の上昇や凝集抑制機構の詳細を解析するため、細胞内の凝集体量やトレハロース濃度の関連性の検討を行う。

Establishment of the serum-free adapted immortalized cell line from
Chinese hamster lung

Suppressed antibody aggregation and improved cell growth by exogenous
expression of Tret1 in recombinant CHO cells.

○Noriko Yamano1,2, Takeshi Omasa2,3(1Grad. Sch. Biosci. Bioind., Tokushima Univ., 2MAB, 3Grad. Sch. Eng., Osaka
Univ.)

Key words

Chinese hamster, cell line development, fibroblast, serum-free culture

1P-2p162 CHO 細胞を用いたサメ由来重鎖抗体の分泌発現コンストラクトの検討○Ryonosuke Harata1, Masayoshi Onitsuka2,3, Takahiro Kikawada4,5,
Shizuyo Koide3, Yuichi Koga1, Noriko Yamano2,3, Takeshi Omasa1,2,3(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Grad. Sch. Biosci. Bioind. Tokushima Univ.,
3
MAB, 4NARO, 5Grad. Sch. Frontier Sci. Tokyo Univ.)

Key words
trehalose

Chinese hamster ovary (CHO) cells, antibody aggregation, Tret1,

1P-2p164 免疫系 T 細胞の成熟化シグナルと温感○薮内 里実 1, 大久保 由布 1, 白 京玉 1, 星野 邦秀 1,2, 辻野 義雄 1,2,
下川 直史 1, 高木 昌宏 1
（1北陸先端大・マテリアル, 2高砂香料工業株式会社）
takagi@jaist.ac.jp○野村 嘉紀 1, 鬼塚 正義 2,3, 香川 悠馬 4, 山野 範子 2,3, 古賀 雄一 1,
大政 健史 1,2,3（1阪大院・工, 2徳島大院・生物資源, 3MAB組合, 4徳島大院・先端技科）
omasa@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景】サメ由来重鎖抗体 Immunoglobulin New Antigen Receptor(IgNAR)はタン
パク質変性剤を多く含む環境下でも非常に高い構造安定性を示すことからバイオテクノロジーへの応用が期待されている。現在、抗体医薬生産において Chinese
Hamster Ovary(CHO)細胞を宿主とした生産プラットフォームが確立しているた
め、応用を見据えた IgNAR 生産においても CHO 細胞を宿主細胞とした生産系が望ましい。IgNAR は 6 つの Ig ドメイン（V ドメイン、C1-C5 ドメイン）で構成されており、構造安定性と分泌生産能が高い領域のみを同定できれば、有用領域のみを利用した IgNAR 型新規低分子抗体の開発が可能になると考えられる。そこで本研究では CHO 細胞を発現宿主とし、IgNAR 各発現コンストラク
トの分泌能を検討した。
【方法】Nurse Shark 由来 IgNAR を３領域に分割し、C 末端にヒト IgG1-Fc 領域を融合した VC1-Fc、C2C3-Fc 及び C4C5-Fc 発現ベクターを CHO 細胞へ遺伝子導入した。培養上清から Protein A スピンカラムを用いた精製、SDS-PAGE 及びELISA により、各発現コンストラクトの分泌能を検討した。
【結果・考察】構築した全ての IgNAR 発現コンストラクトにおいて培地への分泌が確認されたが、VC1-Fc 及び C4C5-Fc の分泌生産量は約 0.15 mg/mL に対し、C2C3-Fc は 0.05 mg/mL 程度と低い分泌量であった。SDS-PAGE では同程度の分子量をもつ 3 つのコンストラクトのうち、C2C3-Fc では配列中に 2 ヶ所のN 型糖鎖修飾部位が存在するが、糖タンパク質に特有のスメアバンドが検出され、糖鎖の結合が推定された。以上より、C2C3-Fc の分泌量が低い原因として、
糖鎖修飾過程もしくは糖鎖修飾に関連する細胞内での立体構造形成過程に問題があると考えらえた。現在の結果より、CHO 細胞を利用した新規 IgNAR 低分子抗体の開発を行う場合、VC1 および C4C5 領域を利用することが分泌生産に有効であることが示唆された。

【目的】細胞膜には、飽和脂質やコレステロールを豊富に含むラフト領域が存在
し、信号伝達に重要であると考えられている。T 細胞を活性化するレクチン(ConA)存在下では、ラフトが膜上で集積後、細胞骨格を介して内部へ集積することから、我々は T 細胞活性化には、ラフトと細胞骨格が重要と考えた。また細胞膜には、温度変化を感知する TRP チャネルが存在し、そのうちの１つである TRPV1 はカプサイシンによって活性化し、温感を感知する。そこで、T 細胞を例にラフト集積機構の温度依存性とカプサイシンによる影響について調べた。
【方法】T 細胞のラフト領域は CT-B 488、F-actin は Rhodamine phalloidin、微小管は Oregon Green による染色を行った。T 細胞に温感剤として Capsaicin、情報分子として ConA を作用させ、温度調節下で共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。
【結果】ConA 非存在下では、ラフトは温度が低いほど安定で、アクチン重合状
態は温度が高いほど安定であった。このとき、微小管は細胞膜下に局在しているのが観察された。ConA 存在下では、ラフトの細胞内部への集積が観察でき、27℃以下ではラフトのみが集積し、27℃以上ではアクチンとラフトが細胞内部の同じ場所に集積した。このとき微小管は、すべての温度でラフトの集積時に中心体から放射線状に伸びている様子が観察された。以上の結果からラフト集
積には、低温(＜ 27℃)でのラフトのみの安定性に依存した集積と、高温(≧27℃)
でのアクチンも関与した集積の 2 種類があると考えられ、微小管はラフト集積時に必要であると考えられた。またカプサイシン存在下では、全ての温度(23℃~37℃)でもラフト集積を起こすことからアクチンがラフトの安定性により低温でも関与しており、この事がラフトに存在すると考えられる TRPV1 の温感にも関わっていると考えられた。

Secretory expression of immunoglobulin new antigen receptor fragments inchinese hamster ovary cells

Maturation of T cell and heat sensitizeation

Key words
Immunoglobulin New Antigen Receptor, Chinese Hamster Ovary(CHO) cells, shark antibody, Molecular design

Key words○Yoshiki Nomura1, Masayoshi Onitsuka2,3, Yuma Kagawa4, Noriko Yamano2,3,
Yuichi Koga1, Takeshi Omasa1,2,3(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Grad. Sch. Biosci. Bioind. Tokushima Univ.,
3
MAB, 4Grad. Sch. of Adv. Tech. & Sci., Tokushima Univ.)○Satomi Yabuuchi1, Yufu Okubo1, Keangok Baek1, Kunihide Hoshino1,2,
Yoshio Tsujino1,2, Naofumi Shimokawa1, Masahiro Takagi1(1Sch.Mat.Sci., JAIST, 2TAKASAGO International Corporation)

capsaicin, raft domain, temperature, cytoskeleton

132

セル＆ティッシュエンジニアリング／バイオセンシング，分析化学

1P-2p165 卵白タンパク質特異的糖鎖改変システムの開発

森脇 脩一郎, 奥嵜 雄也, 淺井 聖也, 土田 将大, ○金岡 英徳,
西島 謙一, 飯島 信司（名大院・工）kaneoka@nubio.nagoya-u.ac.jp

1P-2p167 LC-MS ならびに HPLC-ELSD を用いたアルギン酸不飽
和オリゴ糖と DEH の検出○藤井 玲央奈 1,5, 三宅 英雄 1,5, モリ テツシ 2,5, 田中 礼士 1,5,
高木 俊幸 3,5, 吉川 裕之 4,5, 黒田 浩一 3,5, 植田 充美 3,5, 柴田 敏行 1,5（1三重大院・生資, 2早大・理工, 3京大院・農, 4阪大院・工, 5JST・
CREST）
shibata@bio.mie-u.ac.jp【背景と目的】
鶏卵は人類にとって重要なタンパク源であり、その高い経済性と生産性からトランスジェニックニワトリをタンパク質性医薬品生産のため生きたバイオリア
クターとして利用する技術の開発が進められつつある。本研究では、次の段階
として糖鎖制御による生産タンパク質の高品質化・高機能化技術の開発を目指す。糖鎖構造末端のシアル酸は生理活性に大きな影響を与えることから、シアル酸転移酵素(STs)の活性は糖鎖制御を考える上で、非常に重要である。我々はニワトリ STs の基礎的な解析を行うと同時に、トランスジェニックニワトリを作製する際にホストへの影響を最小限に抑えるため、導入遺伝子の卵白タンパ
ク質特異的発現システムの開発を行った。
【方法・結果】
糖鎖構造には N-結合型と O-結合型の 2 種類があり、今回は O-結合型糖鎖形成に関わるニワトリ ST6GalNAc ファミリーの解析を行った。ニワトリ ST 遺伝子
を培養細胞（293FT cells）に強制発現し、その cell lysate を用いて 14C 標識 CMPシアル酸の転移反応を行った。その結果、ニワトリ ST6GalNAc1/2/3 は合成糖とタンパク質(Fetuin)を基質とした場合、活性を検出できたが、ST6GalNAc4/5/6の活性は検出できなかった。
また、卵白タンパク質特異的発現システム開発のためにニワトリリゾチームプ
ロモーター(Plyso)の解析を行った。Plyso が持つ DNA エレメントを組み込んだヒトエリスロポエチン (hEPO)を発現するレトロウイルスベクター (pMSCV/GFP/
Plyso-hEPO-WPRE)を数種類構築し、キメラニワトリを作製した。キメラニワト
リの卵白タンパク質の解析を行った結果、リゾチームの輸卵管エンハンサーにより卵白タンパク質特異的な発現が誘導された。

【目的】アルギン酸は，褐藻類に最も多く含まれている多糖類である 1)。本研究では，エンド型アルギン酸リアーゼ（EndoAly）と Falsirhodobacter sp.のエキソ
型アルギン酸リアーゼ（AlyFRB）2)を用いて不飽和オリゴ糖（AUOs）と 4-deoxyL-erythro-5-hexoseulose uronic acid（DEH）をそれぞれ調製し，LC-MS と HPLCELSD によりそれらの検出を試みた。
【方法】アルギン酸 Na 水溶液に EndoAly を加えて反応を行い，AUOs を調製した。さらに AUOs に AlyFRB のリコンビナントタンパク質を加えて反応を行い，DEH を調製した。分光光度分析と TLC を用いて分解産物の確認を行った後，
LC-MS と HPLC-ELSD を用いて AUOs と DEH の検出を試みた。
【結果】イオンクロマトグラフィー用カラムとギ酸アンモニウム緩衝液のアイソ
クラティク送液を用いて LC-MS 測定を行った。AUOs の場合，TIC 上で三つのピークが検出された。MS のネガティブモードで SIM 測定を行った結果，これらは，不飽和二糖（保持時間 4.5 分），不飽和三糖（保持時間 6.8 分），不飽和四糖（保持時間 12.1 分）であることが分かった。AlyFRB の反応液では，TIC 上
で保持時間 3.2 分に顕著なピークが検出された。SIM 測定の結果，このピークの質量数は，DEH の脱プロトン化分子の質量数と一致した。HPLC-ELSD も同様，DEH と不飽和オリゴ糖の分離と検出を示すクロマトグラムが得られた。
本研究は，科学技術振興機構・戦略的創造研究推進事業 CREST の支援を受けて行われた。
1) 柴田ら，第 66 回日本生物工学会大会、2P-135，(2014).
2) Mori, T. et al., PLoS ONE, 11, e0155537 (2016).

Glyco-engineering in chicken egg-white to produce biotherapeutic proteins

Separation and detection of alginate unsaturated oligosaccharides and DEH
using LC-MS and HPLC-ELSD

Shuichiro Moriwaki, Yuya Okuzaki, Seiya Asai, Masahiro Tsuchida,○Hidenori Kaneoka, Ken-ichi Nishijima, Shinji Iijima(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

Key words

transgenic chicken, glycosyltransferase, transcription

1P-2p166 ニワトリ IFITM の抗ウイルス機能の解析

奥嵜 雄也, 木溪 俊介, 金岡 英徳, ○西島 謙一, 飯島 信司（名大院・工）nishijma@nubio.nagoya-u.ac.jp○Reona Fujii1,5, Hideo Miyake1,5, Tetsushi Mori2,5, Reiji Tanaka1,5,
Toshiyuki Takagi3,5, Hiroyuki Yoshikawa4,5, Kouichi Kuroda3,5, Mitsuyoshi Ueda3,5,
Toshiyuki Shibata1,5(1Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ., 2Fac. Sci. Eng., Waseda Univ, 3Grad. Sch.
Agric., Kyoto Univ., 4Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 5CREST, JST)Key words
LC-MS, HPLC-ELSD, Alginate unsaturated oligosaccharides, 4Deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid

1P-2p168 自動プレカラム誘導体化法を利用した HPLC によるア
ミノ酸のキラル分離○熊谷 浩樹（アジレント・テクノロジー）
hiroki_kumagai@agilent.com【背景・目的】 生物はウイルスに対する自己防衛機構としてウイルス感染直後から働く自然免疫系を持っている。この際、インターフェロン（IFN）が抗ウ
イルス活性タンパク質の発現を誘導することで、感染細胞およびその周囲の細胞 に 抗 ウ イ ル ス 活 性 を 付 与 す る 。 IFITM (interferon-inducible transmembraneprotein)ファミリーは、IFN により誘導される抗ウイルスタンパク質の一種であり、感染の初期ステップを妨害する活性が知られている。哺乳類ではインフル
エンザウイルスをはじめ種々のウイルスに対する阻害活性が知られるが、ニワ
トリ IFITM の機能解析は進んでいない。そこで、ニワトリ IFITM の機能解析をめざした。
【方法・結果】 ニワトリに存在する数種の IFITM ホモログの発現についてリア
ルタイム RT-PCR で解析した結果、ニワトリ IFITM3 は成鶏で発現量が高いのに対し、ニワトリ IFITM10 はニワトリ胚の特に生殖腺で発現が高いことがわかった。次に、これらの遺伝子をクローニングし、細胞に強制発現させて局在を観察したところ、細胞膜及び細胞質への局在が観察された。一般に、IFITM
はウイルス-細胞間の膜融合を阻害することが知られている。ニワトリ IFITMの膜融合阻害活性を明らかにするため、ニワトリ IFITM を一過的に発現させた細胞に対して VSV-G タンパク質を発現させて細胞の融合を観察した。VSV-G
発現細胞は短時間の酸性処理により細胞融合を起こすが、ニワトリ IFITM10 によりこの融合が抑制されることを見いだした。また、VSV-G エンベロープでシュードタイプ化したレトロウイルスをニワトリ胚線維芽細胞 (DF-1)に感染させ、感染効率を測定したところ、IFITM3 で抑制活性が確認された。

【目的】HPLC によるアミノ酸のキラル分離は主に、キラル固定相を用いる方法と、アミノ酸のジアステレオマーを逆相分離する方法により行われている。多種類のアミノ酸を同時にキラル分離する場合は、ジアステレオマーを逆相分離する方法が有利であり、UHPLC やコアシェル型充塡剤の利用により精度の高い高速分析が可能となっている。本研究では、コアシェル型充塡剤による分離能と分析速度の向上、およびオートサンプラによるプレカラム誘導体化の自動化について検討し、食品中の L-および D-アミノ酸の分離への適用を試みた。
【方法】HPLC システムは Agilent 1290 Infinity II LC System に蛍光検出器を接続して 使用した。L-および D-アミノ酸の誘導体化は、OPA と N-isobutyryl-L-cysteine
により蛍光誘導体化とジアステレオマー形成を同時に行った。反応はオートサ
ンプラのインジェクタプログラム機能を利用して自動で行った。分離カラムには、高速・高分離が期待できるコアシェル型充塡剤 Agilent Poroshell HPH-C18を使用した。
【結果と考察】高機能オートサンプラを利用することで、1 級アミノ酸のプレカ
ラム蛍光誘導体化とジアステレオマー形成を同時に自動で行えることが確認できた。その結果、ジアステレオマーを利用するキラル分離を簡便かつ精度よく行うことができた。また、コアシェルカラムにより、迅速で効率の良い分離が可能であることがわかった。さらに、食酢などの食品中のアミノ酸のキラル分析に適用し、良好な結果を得ることができた。

Analysis for anti-viral function of chicken IFITMs

Pre-column derivatization-HPLC method for enantioseparation of aminoacids

Yuya Okuzaki, Shunsuke Kidani, Hidenori Kaneoka, ○Ken-ichi Nishijima,
Shinji Iijima(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

Key words

chicken, anti-virus○Hiroki Kumagai(Agilent Technologies)

Key words

amino acid, enantiomer, HPLC

バイオセンシング，分析化学

1P-2p169 LC-TOFMS を用いた非誘導体化アミノ酸鏡像体の高速一斉分析法の開発

1P-2p171 ヘモグロビン A1C とレクチン AAL の結合に対する温度の影響○加畑 眞人 1, 長谷 英理菜 1, 小林 夕香 2, 上野 泰 2, 吉宗 一晃 1
（1日大・生産工, 2J-オイルミルズ・商品開発研究所）
yoshimune.kazuaki@nihon-u.ac.jp○紺屋 豊, 谷口 百優, 福﨑 英一郎（阪大院・工）fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景と目的】
Glycine を除くタンパク質構成アミノ酸はいずれも不斉炭素を持ち，鏡像体（L体と D-体）が存在するが，自然界での存在比は L-体に大きく偏っている。両者は旋光性以外の物理化学的性質が全く同一なため，L-アミノ酸の大量存在下，微量の D-アミノ酸を分離・検出することは技術的に難しい．そのため，高等生
物の生体内からは D-アミノ酸は検出されず，L-アミノ酸のみが存在すると長い間考えられてきた．
しかし近年の分析技術の進歩に伴い，ヒトを含む様々な高等生物においても Dアミノ酸の存在が明らかとなり，食品や医療をはじめ様々な分野で D-アミノ酸が注目・研究されるようになった．だが，従来の分析法では誘導体化処理が必要であったり，鏡像体分離能やスループットが不十分といった問題があり，簡便で高速・高分離能を有する分析法の開発が期待されている．
20 種類のタンパク質構成アミノ酸の側鎖は，性質が多岐（親水/疎水性，酸/塩
基性，脂肪族，環状等）にわたるため，鏡像体分離を考慮しなくとも，一斉分
析するには高いレベルのクロマト分離技術が要求される．よって，さらに鏡像体分離も同時に達成することは，非常に高難度の課題といえる．我々は，誘導体化処理を必要としないアミノ酸鏡像体の一斉分析法の開発を試みた．

133

血中ヘモグロビン A1C （HbA1C ）は，グルコース 1 分子がヘモグロビン（Hb）と非酵素的に結合した糖化ヘモグロビンの一つで，Hb に対する HbA1C の割合
は糖尿病診断の重要なバイオマーカーである．現在 HbA1C はこれに特異的な抗体や酵素を用いて測定されている．我々はこれまでに糖結合性タンパク質であるレクチンの中で特にヒイロチャワンタケ由来レクチン（AAL）がヘモグロビ
ンよりも HbA1C に高い親和性を持つことを示唆した．レクチンは比較的安価で安定性も高いため，この結合を用いた HbA1C 測定法の開発を試みている．レク
チン AAL を用いた HbA1C 測定では，HbA1C を ELISA プレートに固相化し，ペルオキシダーゼで標識したレクチン AAL と結合させ，TMB Peroxidase substrate
system により基質を発色させて測定した．この時の洗浄液の温度を室温から4℃にしたところ，室温の場合よりも 0.1μg の HbA1C を測定したときの吸光度が3.3 倍程度上昇した．レクチン AAL と HbA1C との結合に対する温度の影響を調べたので報告する．

【方法と結果】
キラルカラム（CROWNPAK CR-I：ダイセル）と LC-TOFMS（Nexera：島津，TripleTOF 5600：AB SCIEX）を用い，良好なクロマトが得られる LC 条件を検討した．その過程において，通常用いられる逆相モードではなく，HILIC モー
ドで分析することにより，鏡像体が良好に分離することを発見した．その結果，
Glycine および第二級アミンの Proline を除く 18 種類の鏡像体は，10 分間のア
イソクラティック分析でありながら全てベースライン分離するという，従来法をはるかに凌ぐ高速一斉分析法の開発に成功した．

Development of simultaneous analytical method for underivatized chiralamino acids using LC-TOFMS○Yutaka Konya, Moyu Taniguchi, Eiichiro Fukusaki(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

D-amino acid, enantioseparation, LC-TOFMS

1P-2p170 LC-TOFMS を用いた D, L-アミノ酸を含む生理活性アミン類の一斉分析法の開発

Effect of temperature on the binding between hemoglobin A1C and lectin
AAL○Masato Kabata1, Erina Hase1, Yuka Kobayashi2, Yasushi Ueno2,
Kazuaki Yoshimune1(1Coll. Ind. Technol., Nihon Univ., 2R&D Div., J-OIL MILLS, Inc.)

Key words

Hemoglobin A1C, Lectin AAL

1P-2p172 新規プロテインＡカラムによる免疫グロブリンの迅速定量○谷口 百優, 紺屋 豊, 福﨑 英一郎（阪大院・工）fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp○大森 俊昂, 藤井 智, 奥村 晴美, 荒木 康祐, 中谷 茂（東ソー）
toshitaka-ohmori-sw@tosoh.co.jp

Glycine を除く全てのタンパク質構成アミノ酸は不斉炭素を持ち，光学異性体である L-体と D-体に分類されるにも関わらず，自然界に存在するアミノ酸のほとんどは L-アミノ酸である．そのため，多くの生物は特異的に L-アミノ酸を利用していると考えられ，D-アミノ酸は重要視されてこなかった．
しかし，アミノ酸の光学異性体を分離分析する技術の向上によって D-アミノ酸が高等生物や植物，食品など自然界に広く存在し，その機能や呈味は L-体とは大きく異なることが明らかとなった．そのため，アミノ酸分析において光学異性体を考慮する必要性が認識され始めたが，光学異性体である D-アミノ酸とL-アミノ酸は旋光性以外の物理化学的性質が等しく，また，試料中の D-アミノ
酸は L-アミノ酸に対して一般に極微量であるため，D-アミノ酸類の分離及び検出は難しく，高分離能かつハイスループットな分析法は存在しなかった．
そこで，本研究では，当研究室で開発した Glycine および二級アミン Proline を除くタンパク質構成アミノ酸 18 種の光学異性体を分離分析することが可能な
LC-TOFMS 法をさらに発展させ，食品中微量 D-アミノ酸の定量分析を可能とするために，分析条件の最適化を行った．その結果，タンパク質構成アミノ酸 18
種の光学異性体について，完全分離および一斉分析を 10 分で達成した．次に，構築した分析系の定量性を回収率や検量線の直線性によって評価した結果，信頼性の高い定量分析を行うことが可能であることが示された．さらに，当該分
析法の特徴から，タンパク質構成アミノ酸だけでなく様々なアミン類を対象とした一斉分析が可能であると考えられた．そこで，標準溶液を用いて主要代謝に関わるアミン類の分析を行い，それらの分離度を評価した．その結果，非タンパク質構成アミノ酸やアミン類 100 種以上を含めた一斉分析が可能であることが示された．

[緒言]
モノクローナル抗体(mAb)及びその改変体はバイオ医薬品として広く用いられ、多くのバイオ医薬品企業が今後もその開発に注力すると予想されている。抗体
医薬品の開発には高速かつ高精度の mAb 定量法が要求される。一方、プロテイ
ン A は多くの抗体の Fc 領域に高い親和性を有することが知られており、プロ
テイン A を固定相とする充塡剤・カラムは mAb の定量や精製に頻用されている。今回、我々は遺伝子組換えプロテイン A をリガンドとした HPLC 用アフィ
ニティーカラム「TSKgel® Protein A-5PW」を開発した。本カラムは機械的強度の高い親水性架橋ポリマー粒子に、抗体に対する吸着量が高いプロテイン A を固定化した充填剤を用いているため、高流速下での mAb の迅速定量が可能なこと、mAb の定量範囲が広いことが特長である。本発表では、当該カラムの特性とチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞培養液上清中の mAb の定量への適用例を紹介する。
[結果]
検量線 ：ポリクローナルヒト IgG(pIgG)を用い検量線を作成し、市販プロテイ
ン A カラムと比較した。本カラムは 2 ～ 200 μg(0.1 ～ 10 g/L)の範囲で良好な直線性(R2= 0.9996)を示した。一方、市販カラムの直線性範囲は 20 μg(1 g/L)以下であった。
測定流速の影響：ヒト化モノクローナル IgG1 を含む CHO 細胞培養液上清を試料とし、異なる流速(1.0 ～ 4.0 mL/min)における検量線を比較した。流速に依らず同等の直線性(R2≧ 0.999)が得られた。
カラム耐久性：pIgG を含む CHO 細胞培養液上清を繰り返し注入し、クロマト
グラム及び検量線の変化を観察した。2,000 回注入後もクロマトグラム及び検量線に顕著な変化は見られなかった。
mAb を用いた添加回収試験：異なる濃度のヒト化モノクローナル IgG1 を含む
CHO 細胞培養液上清を測定し、回収率を求めた。0.5 ～ 5.0 g/L の範囲で 100 ～105%の回収率が得られた。

Development of simultaneous analytical method for amines including D, Lamino acids using LC-TOFMS

Fast quantification of Immunoglobulin G by a novel Protein A analytical
HPLC column○Moyu Taniguchi, Yutaka Konya, Eiichiro Fukusaki(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

D-amino acids, enantioseparation○Toshitaka Ohmori, Satoshi Fujii, Harumi Okumura, Kosuke Araki,
Shigeru Nakatani(Tosoh Corp.)

Key words

HPLC, IgG, Protein A, affinity chromatography

134

バイオセンシング，分析化学

1P-2p173 インスリン存在下における膵 β 細胞インスリン分泌応答の連続測定

1P-2p175 Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics
targeting bacterial protein synthesis○重藤 元 1,2, 小野 拓人 3, 黒田 章夫 3, 舟橋 久景 1
（1広島大学・サステナセ, 2広島大・グローバルキャリアセ, 3広島大院・先端物質）
hisafuna@hiroshima-u.ac.jp

Duyen Tran, ○Hideyuki Matsuura, Kazuki Ujiie, Misa Muraoka,
Kazuo Harada, Kazumasa Hirata(Grad. Sch. Pharm. Sci., Osaka Univ.)
hmhide@phs.osaka-u.ac.jp【背景と目的】従来、生細胞インスリン分泌応答測定は、薬物などによる刺激により分泌されたインスリンの最終的な総量を測定する、もしくは、培地を総入れ替えしながら単位時間当たりに分泌されたインスリンの量を測定することにより行われてきた。しかしインスリン分泌細胞である膵 β 細胞はインスリン感
受性細胞でもある。これまでに自身が分泌したインスリンを受容することによりインスリン分泌を調整している可能性が示唆されているが、インスリン存在下におけるインスリン分泌挙動は未解明な部分が多い。
当研究室ではこれまでに、洗浄操作なしにインスリンを測定するためのタンパ
ク質プローブを開発してきている。そこで本研究ではこのプローブを利用して、インスリン存在下における膵 β 細胞株のインスリン分泌応答の連続測定を行った。
【方法・結果】発光タンパク質である Nluc、インスリン受容体標的認識部位である αCT および L1、蛍光タンパク質である YPet を融合したインスリン検出用
タンパク質プローブ（NαLY）を作製した。NαLY はインスリンを認識すると構造変化を起こし、Nluc と YPet が近接すること起因する生物発光共鳴エネルギー
転移シグナルを発する。膵 β 細胞株を培養し、本プローブを用いて培地中のイ
ンスリン濃度変化を連続測定した。インスリンを外部添加した後、グルコースで細胞を刺激した場合、インスリン分泌応答は観察されず、逆にインスリンの吸収が観察された。一方、インスリン分泌誘導薬で刺激した場合、インスリン
外部添加後であってもインスリン分泌応答とそれに続くインスリンの吸収が観察された。以上の様に、インスリン存在下における生細胞インスリン分泌応答の連続測定によって、従来法では注目されてこなかった細胞応答の違いが評価可能であることが示された。

Residual antibiotics present in environmental water, due to antibiotic overuse andmisuse, are a serious global health concern, contributing to the emergence and spreadof resistant bacteria. Thus, development of a detection method suitable for thescreening of environmental water for antibiotics is an urgent need. In this study, we
have focused on the development of a simple, paper-based, colorimetric biosensor forthe detection of antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis. This biosensor isbased on the detection of a color change induced by β-galactosidase, which issynthesized on freeze-dried paper discs containing an in vitro transcription/translation
system. When a water sample without antibiotics is applied to the paper discs, βgalactosidase can be synthesized, and it hydrolyzes a colorimetric substrate, resulting
in a color change from yellow to purple. By contrast, in the presence of antibiotics, thecolor change can be hampered due to an inhibition of β-galactosidase synthesis. We
believe that this easy-to-use and inexpensive biosensor has the potential to be used forthe screening of environmental water samples for antibiotics, particularly indeveloping countries where resources are limited.

Continuous monitoring of insulin secretion response in the presence of
insulin

Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics targeting bacterial
protein synthesis○Hajime Shigeto1,2, Takuto Ono3, Akio Kuroda3, Hisakage Funabashi1(1ISSD., Hiroshima Univ., 2Glob. Car. Des. Cent., Hiroshima Univ., 3Grad. Sch. Adv.
Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words

BRET, insulin secretion, live cell response, living cell

1P-2p174 ITO 電極による深海底堆積物由来ストレプトマイセス属
微生物の電気回収

Duyen Tran, ○Hideyuki Matsuura, Kazuki Ujiie, Misa Muraoka, Kazuo Harada,
Kazumasa Hirata(Grad. Sch. Pharm. Sci., Osaka Univ.)

Key words

biosensor

1P-2p176 デジタル PCR によるサンゴ共在微生物由来 16S rRNA
遺伝子数の精密定量○小山 純弘 1, 西 真郎 1, 長野 由梨子 1, 能木 裕一 1, 秦田 勇二 2,
坪内 泰志 1
（1海洋研究開発機構, 2埼玉工大・工・生命環境化学）
skoyama@jamstec.go.jp○竹田 裕貴 1, 細川 正人 2, 西川 洋平 1, 小川 雅人 1, 伊藤 通浩 1,
須田 彰一郎 3, 中野 義勝 4, 竹山 春子 1
（1早大・先進理工, 2JST・さきがけ, 3琉球大・理, 4琉球大・熱帯生物圏研究セ）haruko-takeyama@waseda.jp【結果】Streptomyces sp. ST.28 株を 1/20 濃度の人工海水(1/20ASW)中に分散させ、ITO パターン電極の ITO 電極領域に胞子が選択的に付着するか調査した。ST.28株胞子は-0.2V vs. Ag/AgCl の電位印加条件で、ITO 電極領域にもっとも多く選択的に付着した。1/20ASW から Mg イオンを除去すると、ITO 電極基板に ST.
28 株胞子はほとんど付着しなくなる事が明らかとなった。ST.2013-005、ST.
2014-008、ST.2014-023、ST.2014-027、そして Streptomyces albus の 5 株について
も、ST.28 株胞子と同様に ITO パターン電極の ITO 電極領域へ選択的に付着するか検討した。その結果、1/20ASW に分散させたすべての試験菌株は、-0.2V
vs. Ag/AgCl の電位印加条件で ITO 電極領域へ選択的に付着することを明らかとした。上記条件を本技術に適用することでで、駿河湾の深海底堆積物から
Streptomyces sp.様のコロニーを多数得ることにも成功した。

サンゴには多種の微生物が相互関係を保持しながら共在し、その組成や絶対数
は、海域環境や季節に伴って変化すると考えられ、サンゴ礁域の環境評価の指標の１つになる可能性がある。しかし、サンゴの抽出 DNA 試料中には PCR 阻
害物質や多量の夾雑 DNA が存在するため、従来の qPCR では 16S rRNA 遺伝子数の正確な定量が困難であった。一方で、ドロップレットデジタル PCR (dPCR)
では、標的遺伝子の絶対数をエンドポイントでデジタル計測する。反応効率に依存せずに定量を行うため、サンゴ抽出 DNA においても高精度な定量が期待できる。そこで本研究では dPCR を用いてサンゴ共在微生物由来 16S rRNA 遺伝子数を定量することを検討し、その季節変動や地点間差を評価することを目的とした。
液滴形成用マイクロ流体デバイスは Polydimethylsiloxane (PDMS)を用いて作製した。シリンジポンプを用いて PCR 反応液の液滴を連続形成し、流路から回収して PCR を行った。その後顕微鏡を用いて蛍光を示す液滴数をカウントし、標的遺伝子数に換算した。サンプルとして沖縄県瀬底島周辺の 3 地点においてサンゴ(ウスエダミドリイシ: Acropora tenuis)を定期採取し、その抽出 DNA を用いた。
結果、dPCR では、qPCR において正確な定量が不可能な阻害物質存在濃度域においても安定的な計測が可能であった。dPCR によりサンゴ共在微生物に由来する 16S rRNA 遺伝子数の季節変動、地点間差異が確認され、地点間差は最大
約 25 倍となった。
dPCR は PCR 阻害物質に対する高い耐性があり、qPCR では計測不能なサンプ
ルにおいても高精度に 16S rRNA 遺伝子数を定量することが出来た。本手法により、サンゴ共在微生物数に相当する情報をサンゴコロニー単位で追跡することが可能となった。共在微生物数の情報を環境要因や菌叢情報と合わせて評価することで、両者の関連性の詳細な理解につながると期待される。

Electrical retrieval of deep-sea sediments derived Streptomyces sp. using an
ITO electrode

Accurate quantification of coral associated bacteria 16S rRNA gene bydigital PCR【背景と目的】演者らは、環境中の微生物を生きたままマイナスの微弱電位を印加した電極基板上に誘引付着させ、高周波微弱変動電位印加で剥離回収する手法を開発している。電気回収された環境微生物の菌叢解析から放線菌門微生物のバイオマスは相応量存在し、その多くが新奇微生物であることを見いだしている。本研究では、放線菌の中でも生物活性物質の大部分を生産するストレプ
トマイセス属に着目し、深海由来放線菌門ストレプトマイセス属微生物の選択的な電気回収の可能性と、電極基板上への付着メカニズムについて検討した。
【方法】青森県下北半島東方沖水深 1180m の深海底堆積物(CK06-06)から新規に分離された 5 株の Streptomyces sp.、そして S. albus の合計 6 株を試験菌株とし、電位印加した電極基板上に胞子が付着するか調査した。また深海底堆積物から、Streptomyces sp.を選択的に電気回収し、寒天培地培養が可能か検討した。

○Sumihiro Koyama1, Shinro Nishi1, Yuriko Nagano1, Yuichi Nogi1, Yuji Hatada2,
Taishi Tsubouchi1(1JAMSTEC, 2Dept. Life Sci. Green Chem., Saitama Inst. Technol.)Key words
electrode

Streptomyces sp., Deep-sea sediment, Electrical retrieval, ITO○Hiroki Takeda1, Masahito Hosokawa2, Yohei Nishikawa1, Masato Kogawa1,
Michihiro Ito1, Shoichiro Suda3, Yoshikatsu Nakano4, Haruko Takeyama1(1Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2PRESTO, JST, 3Fac. Sci., Univ. Ryukyus,
4
Tropical Biosphere Res. Center, Univ. Ryukyus)

Key words
rRNA

droplet digital PCR, microfluidic device, coral associated bacteria, 16S

バイオセンシング，分析化学

1P-2p177 ピコリットル容量の微小液滴を用いた単一微生物からの網羅的な全ゲノム増幅

135

1P-2p179 センシング分子を最密充填状態で精密に整列固定化する
二次元膜の開発○西川 洋平 1, 細川 正人 2,3, 小川 雅人 1, 竹山 春子 1,3（1早大院・先進理工・生医, 2JST・さきがけ, 3早大・ナノライフ創研）
haruko-takeyama@waseda.jp○飯嶋 益巳, 黒田 俊一（阪大・産研）skuroda@sanken.osaka-u.ac.jp

Multiple Displacement Amplification (MDA)に代表される全ゲノム増幅法により、単一微生物を対象としたゲノム解析が可能となりつつある。しかしながら、従来までの単一細胞を対象とした全ゲノム増幅では、反応液中に混入した目的外
DNA の増幅により反応が阻害され、ゲノム再構成時のカバー率が低下することが問題であった。そこで本研究では、マイクロ流体デバイスを用いた微小液滴作製技術を応用し、単一細胞を包埋した液滴内にて全ゲノム増幅を行う手法の開発を行った。
PDMS (Poly(dimethylsiloxane))を用いて、内部に十字構造を配したマイクロ流体
デバイスを作製した。液滴成分および分散媒であるオイルをデバイス内に導入し、ピコリットル容量の液滴を毎秒約 700 個の割合で連続生成可能とした。また、2 種の液滴を毎秒 200 個の割合で融合させるシステムを開発し、単一細胞を包埋した液滴と全ゲノム増幅試薬を含む液滴との融合を可能とした。モデル
微生物に大腸菌を用いて液滴内での増幅を行った結果、増幅反応後の液滴内でDNA 結合色素由来の蛍光が確認された。蛍光を示した液滴を分取して 2 次増幅を行った後、次世代シーケンサーによる解析を行った結果、80%以上のカバー率が達成された。また、本技術により得られた増幅産物では、コンタミネーショ
ン DNA に由来する増幅産物の割合が、従来法に比べて抑制されることが判明した。さらに、複数種の細胞が混在する場合においても、個々の細胞を液滴内に個別に包埋することにより、ゲノム情報がクロスコンタミネーションすることなく増幅可能であることが明らかとなった。本技術を用いることにより、理論上 10000 個以上の細胞に対して一度に網羅的な全ゲノム増幅を行うことが可能となった。以上の結果から、本技術は環境中の微生物を対象とした網羅的な全ゲノム解析に応用が可能であると考えられる。

【背景】 我々は、イムノセンサー表面に IgG を最密充填状態で整列固定化する
ために、Fc 領域を固定して Fv 領域を放射状に提示するバイオナノカプセル（ZZ-BNC）を足場分子として開発した。ZZ-BNC は、各種バイオセンシング（QCM、SPR、ELISA、FIA 等）の検出感度や抗原結合量を著しく改善すると共に、検出用 IgG の使用量を著しく減らすことができた（飯嶋ら、生物工学会
誌、93（2015） 248-258）。最近では、ヒト IgG1 Fc 融合受容体によるリガンド
分子の高感度検出にも ZZ-BNC は有効であることが判明した。
【目的】 ZZ-BNC の粒子構造は物理的ストレスに対して堅牢性が高く、センサー
基板にドーム状に結合して IgG を整列化する。しかし、基板側の ZZ-BNC を構成する ZZ-L タンパク質が無駄になり、基板表面から高さ数 nm 以内の相互作用を検出する SPR やエリプソメトリー等では、ドーム状構造の嵩高さ（約 18nm）は不利であった。そこで本研究では、ZZ-L タンパク質を基板上二次元膜に展開することを目指した。
【方法】 ZZ-BNC を界面活性剤処理して ZZ-L ミセル化し ZZ-L 提示二次元膜の作製条件を検討した。
【結果と考察】 ZZ-BNC を 5% Tween 80 で処理すると、ドーム構造から ZZ-L ミ
セル（高さ約 0.4 nm, 直径約 10.0 nm）に変化した。また、ZZ-L ミセルを基板上の脂質一重膜に接触させると、同ミセルはクラスターを形成しながら二次元膜に展開した。さらに、QCM や SPR イムノセンサーに使用すると、IgG 結合量及び抗原結合量は ZZ-BNC に比べて約 4 倍上昇した。しかし、１抗体分子あたりの抗原結合能は大きく変化しないことから、ZZ-L 提示二次元膜は、ZZ-BNC
同様に IgG の精密整列化を達成しつつ、ZZ-BNC 以上にクラスター化を促進すると考えられた。

Massively parallel whole genome amplification of single bacteria using
picoliter-sized droplets

Reconstituted planar ZZ-L membrane for the closest packed and oriented
immobilization of sensing molecules○Yohei Nishikawa1, Masahito Hosokawa2,3, Masato Kogawa1, Haruko Takeyama1,3(1Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2PRESTO, JST, 3Res. Org. Nano Life Innov.,
Waseda Univ.)

Key words

microfluidic device, whole genome amplification, single cell

1P-2p178 ヒト皮膚表面における発汗代謝物と微生物分布の可視化○筒井 聡志 1, 伊達 康博 1,2, 菊地 淳 1,2,3（1横市大院・生命医, 2理研, 3名大院・生命農学）
Jun.kikuchi@riken.jp○Masumi Iijima, Shun'ichi Kuroda(ISIR, Osaka Univ.)

Key words
Bio-nanocapsule, planar membrane, closest packed, oriented
immobilization

1P-2p180 信号累積型イオン感応性電界効果トランジスタによるセイヨウワサビペルオキシダーゼ測定法○西矢 芳昭 1, 坂井 華美 1, 井原 弘絵 1, 泊 直宏 2, 山本 佳宏 2,
谷 敏夫 3（1摂南大・生命科学, 2京都市産技研, 3バイオエックス）nishiya@lif.setsunan.ac.jp【背景・目的】
ヒトを対象としたメタボノミクス研究では、侵襲性の低い尿や糞便といった試料が好んで用いられる。一方で血液から即時に産生・排出される汗はより短時間の代謝変動を捉えることが期待出来るが当該研究はほとんど行われていない。
そこで本研究では汗に含まれる代謝物及び汗と密接な関係があることが知られている表在微生物叢の解析を行い、汗中代謝物と表在微生物の関係性からヒトの代謝動態を可視化することを試みた。
【実験】
複数人のボランティアから日時・採取部位の情報とともに提供された汗試料は、独自に最適化した分析プロトコルを用いて NMR メタボノミクスならびに微生物叢解析を行った。多変量解析および相関解析では、得られたデータを数値化
し、フリーの統計解析ソフトウェアである R を用いた。
【結果】
NMR メタボノミクスによる代謝物の一斉解析の結果、汗に含まれている代謝物として、有機酸やアミノ酸を中心とする 25 種類以上の物質を同時に検出することが可能であった。また、微生物叢については Proteobacteria や Actinobacteriaを始めとした多くの菌種が存在し、足と腕、顔と首では似たような微生物プロ
ファイルを示した。さらに、代謝物データ及び表在微生物叢のデータについて
多変量解析および相関解析等を行うことで個体内変動や採取部位による違いなどを可視化し、両者の関係性を明らかにした。

【背景および目的】イオン感応型電界効果トランジスタ（ISFET）は化学反応で生じるプロトンの増減を直接電気信号として取り出すことができるため、幅広い種類の酵素反応の計測に応用できるバイオセンサとなり得る。ISFET の応用について数多くの研究がなされたが、際立った応用例は見当たらない。バイオ
センサとするには感度が十分でなく、微小な変化に対応できないとされてきたからである。この点を改良するために、われわれは信号累積型 ISFET（SAISFET）を開発した。これは、電荷がセンサ内に蓄積できるように改良されており、測定を瞬時に複数回繰り返しデバイス内に信号を累積させ、増幅した後に信号を取り出す。これにより高感度バイオセンサとしての応用が可能になった。
SA-ISFET は光路長を必要とする光学測定系を使用しないので装置の小型化に向いており、低コストで測定に高い技術力を必要としないといった数多くの特長を有している。今回、基礎分析や臨床検査にて多用されるセイヨウワサビペ
ルオキシダーゼ活性測定を検討したので報告する。
【方法および結果】ペルオキシダーゼ反応で微少プロトン量の変化を伴う系として、2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid)（ABTS）を用いるシンプ
ルな測定法を考案した。本測定法の ABTS をはじめとする試薬組成および測定条件を設定し、SA-ISFET にて信号累積回数 10 回での測定を実施した。結果として、ペルオキシダーゼ反応による過酸化水素の定量が可能なことを確認できた。25℃にて 1～2 分間でのアッセイが可能であり、直線性も良好であった。通常の ISFET との比較では、10 回の累積測定により大幅な感度向上が見られた。
また、再現性についてもバイオセンサとして問題無いレベルであった。さらに、免疫検査における標識酵素検出系としての応用を確認することができた。

Visualization for sweat metabolites and microorganism distribution onhuman skin surface

An assay method for horseradish peroxidase using signal accumulation typeof ISFET○Satoshi Tsutsui1, Yasuhiro Date1,2, Jun Kikuchi1,2,3(1Grad. Sch. Med., Lifesci., Yokohama City Univ., 2CSRS, RIKEN, 3Grad. Sch.
Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)

Key words

metabonomics, data mining, microbiome, NMR○Yoshiaki Nishiya1, Hanami Sakai1, Hiroe Ihara1, Naohiro Tomari2,
Yoshihiro Yamamoto2, Toshio Tani3(1Life Sci., Setsunan Univ., 2Kyoto Inst. Technol., 3Bio-X)

Key words

Peroxidase, Assay, Transistor, Signal accumulation

136

バイオセンシング，分析化学／センサー、計測工学

1P-2p181 自然環境中における気象変動と化学プロファイルの統合
的データマイニング

1P-2p183 ナノ粒子表面の局所表面プラズモン共鳴効果を用いたノロウイルスの迅速検出○伊達 康博 1,2, 篠 阿弥宇 1, 菊地 淳 1,2,3（1理研・CSRS, 2横市院・生医, 3名大院・生命農）
jun.kikuchi@riken.jp

人類は自然環境から多種多様な生態系サービスの恩恵を享受しており、持続的に利用・開発していくためにはその環境“恒常性”を維持することが重要である。
そこで我々は環境恒常性評価技術の確立を目指し、多様な自然環境中における有機・無機物質群や微生物叢などのプロファイリング技術を報告してきた[1-5]。
本研究では、気温や降水量等の気象変動を考慮し、上記プロファイリング技術と組み合わせることにより、自然環境を総合的に評価可能なデータマイニング法について検討した。環境中より得られたサンプル中に含まれる有機物質は、
水およびメタノール等の溶媒を用いて抽出し、NMR 装置を用いて計測した。
得られた NMR シグナルは、当研究室において開発された SpinAssign[6]やSpinCouple[7]等のウェブプログラムを活用してアノテーションを行った。また、
無機物質群については硝酸溶液を用いて抽出し、ICP 装置で計測した。得られたデータを数値化・マトリクス化し、多変量解析等を用いて有機物・無機物のプロファイリングを行うことにより、時空間的特徴抽出が可能であった。本会
では、時系列分析や機械学習等の手法を取り入れることにより、気象データの変動と関連付けられた表現型のデータや有機・無機プロファイリングデータを統合的に評価可能なデータマイニング法を中心に議論したい。
[References] (1) Ogura, et al. (2015) ACS Chem. Biol., 10, 1908－1915, (2) Yoshida,
et al. (2014) Sci. Rep., 4, 7005, (3) Wei, et al. (2015) Anal. Chem., 87, 2819－2826,(4) Ito, et al. (2014) Anal. Chem., 86, 1098－1105, (5) Asakura, et al. (2014) Anal.
Chem., 86, 5425－5432, (6) Chikayama, et al. (2010) Anal. Chem., 82, 1653－1658,(7) Kikuchi, et al. (2016) Anal. Chem. 88, 659－665.

○竹村 謙信 1, Adegoke Oluwasesan 2, 朴 龍洙 1,2, 鈴木 哲朗 3
（1静岡大院・総合科技研・農学専攻・応生化, 2静岡大グリーン
科技研, 3浜医大・医・医学科）
park.enoch@shizuoka.ac.jp【背景・目的】ノロウイルスは毎年多くの感染者が確認されるウイルスである。
主な感染経路はヒトからヒトへの接触感染であり、感染すると発熱、嘔吐、下痢及び腹痛が症状として現れ、極めてまれにではあるがけいれんを伴う小児例や脳症などのケースも報告され、高齢者や幼児に感染した場合、重症化の可能性がある。現在治療や予防薬として直接効果のある薬剤はなく、発症した場合も対症療法で対応せざるを得ない状況である。高齢化社会が進んでいる現代社
会ではノロウイルスが与える社会的影響がより高くなりつつあり、感染の拡大を防ぐために、高感度かつ迅速な検出法が求められている。本研究では蛍光性
半導体ナノ粒子(quantum dot, QD)と銀－金ナノ粒子(Ag-AuNP)を用いた局所表面
プラズモン共鳴蛍光増強効果によるノロウイルスの迅速検出を試みた。
【方法・結果】QD(CdTeSeS)をホットインジェクション法により作製した。アス
コルビン酸を用いて AgNO3 中に加えた HAuCl4 を還元し、銀ナノ粒子表面上へロッド状の金ナノ粒子を配置した Ag-AuNP を作製した。L-システインを修飾した 2 種 の ナ ノ 粒 子 表 面 に 抗 Genotype II Norovirus 抗 体 を 1-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)
carbodiimidehydrochloride(EDC)-NHydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHS)を用いた EDC/NHS カップリングによってコンジュゲートし、NV14-QD、NV14-Ag-AuNP とした。この検出液に被験体ノロウイルス様粒子（NV VLP）を含む溶液を加え、それぞれ 5 分間反応
させた後に蛍光強度を測定した(励起光 450 nm、蛍光 636 nm)。結果として、0.54 ng/ml を検出限界として、ウイルス濃度依存的な蛍光増強が確認できた。

Data mining based on integration of climatic and chemical variations innatural environments

Rapid detection of Norovirus using localized surface plasmon resonance(LSPR)

Key words
NMR metabolomics, multivariate analysis, machine learning, timeseries analysis

Key words

1P-2p182 噴流圧力による培養細胞の力学特性評価

1P-2p184 Alloyed L-cysteine-capped alloyed quaternary CdZnTeS○Yasuhiro Date1,2, Amiu Shino1, Jun Kikuchi1,2,3(1RIKEN CSRS, 2Grad. Sch. Med. Life Sci., Yokohama City Univ., 3Grad. Sch.
BioAgriSci., Nagoya Univ.)○田中 信行 1, 髙原 順子 1, 粟津 茜 1, 春園 嘉英 2, 那須 博光 2,
田中 陽 1（1理研・生命システム, 2北川鉄工所）
nobuyuki.tanaka@riken.jp○Kenshin Takemura1, Oluwasesan Adegoke2, Enoch Y Park1,2, Tetsuro Suzuki3(1Dept. Appl. Biol. Chem., Fac. Agric., Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci.
Technol., 3Hamamatsu Univ. Sch. Med.)
Quantum dots, Ag-AuNPs, Norovirus, detection

quantum dots of two internal structures

Oluwasesan Adegoke, ○Enoch Y. Park
(Res. Inst. Green Sci. Technol.)park.enoch@shizuoka.ac.jp【目的】これまでに著者らは、対象物表面を覆う液体を気体噴流により一時的に除去した際の液体の振る舞いにより、表面の濡れ性を評価する非接触濡れ性評価法を開発し、培養細胞表面の濡れ性評価に成功している。本研究では、噴流圧力に対する培養細胞の力学的耐性を明らかにすることを目的としている。
【方法】細胞培養液として、Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）に仔牛血
清を 10 v/v%およびペニシリン－ストレプトマイシン溶液を 1v/v%添加したものを調製した。マウス骨格筋芽細胞株 C2C12 を培養液でコンフルエントになるまで培養した。細胞がコンフルエントになった細胞培養ディッシュに一定量の10v/v% DMEM を注ぎ入れ、空気噴流を用いた液体除去を行った。
【結果】液体除去を行った際の空気噴流の圧力が 90 kPa を超えた際に、培養細胞がディッシュ表面から剥離したことを確認した。【考察】非接触濡れ性評価法においては、空気噴流の圧力は最大でも 20 kPa 程度であり、培養細胞は十分な噴流圧力耐性を有すると考えられる。今後、噴流に対する細胞障害性について解析を行う予定である。

The development of alloyed quantum dot (QD) nanocrystals with attractive opticalproperties for a wide array of chemical and biological applications is a growing
research field. In this work, size-tunable engineered band gap composition-dependent
alloying and fixed-composition alloying were employed to fabricate new L-cysteinecapped alloyed quaternary CdZnTeS QDs exhibiting different internal structures.
Lattice parameters simulated based on powder X-ray diffraction (PXRD) revealed theinternal structure of the composition-dependent alloyed CdxZnyTeS QDs to have a
gradient nature, whereas the fixed-composition alloyed QDs exhibited a homogenousinternal structure. Transmission electron microscopy (TEM) and dynamic lightscattering (DLS) analysis confirmed the size-confined nature and monodispersity of
the alloyed nanocrystals. The zeta potential values were within the accepted range of
colloidal stability. Circular dichroism (CD) analysis showed that the surface-capped Lcysteine ligand induced electronic and conformational chiroptical changes in thealloyed nanocrystals. The photoluminescence (PL) quantum yield (QY) values of thegradient alloyed QDs were 27-61%, whereas for the homogenous alloyed QDs, the PL
QY values were spectacularly high (72-93%). Our work demonstrates that engineered
fixed alloying produces homogenous QD nanocrystals with higher PL QY thancomposition-dependent alloying.

Mechanical property assessment for cultivated cells by flow pressure

Alloyed L-cysteine-capped alloyed quaternary CdZnTeS quantum dots of
two internal structures○Nobuyuki Tanaka1, Junko Takahara1, Akane Awazu1, Yoshihide Haruzono2,
Hiromitsu Nasu2, Tanaka Yo1(1QBiC, RIKEN, 2KITAGAWA IRON WORKS)

Key words

tissue engineering, sensor, mechanical property, wettability

Oluwasesan Adegoke, ○Enoch Y. Park
(Res. Inst. Green Sci. Technol.)Key words

Quantum dots, nanocrystal, quantum yield

センサー、計測工学

1P-2p185 抗体相補性決定領域に基づいた揮発性爆発化合物の特異的ペプチドプローブの開発

137

1P-2p187 イメージング質量顕微鏡の食品科学への応用○新間 秀一（阪大院・工）sshimma@bio.eng.osaka-u.ac.jp○武藤 正記 1,2, 矢内 健太郎 1,2, 田中 祐圭 1,2, 上田 宏 3,
Wang Jin 2,4, 小野寺 武 2,4, 都甲 潔 2,5, 大河内 美奈 1,2（1東工大・物質理工, 2JST・ImPACT, 3東工大・化学生命科学研,
4
九大・味覚・嗅覚センサ研究開発セ, 5九大院・シス情）okochi@chemeng.titech.ac.jp【背景と目的】 揮発性を示す 2,4,6-trinitrotoluene (TNT)は代表的な爆発性化合物
であり、爆発物のマーカー分子として簡便な計測が求められており、対象化合物を特異的に認識する分子プローブを検出部に修飾したセンサの開発が進められている。合成ペプチドは低分子で安定性が高く、デザイン性の高い分子プロー
ブとして着目されているが、特異性の高いペプチドの報告は少なく課題が残されている。本研究では、抗体のアミノ酸配列を解析し、得られた抗体の相補性
決定領域 (CDR)の配列に基づいた特異性の高い爆発性化合物認識プローブの開発を目指した。
【方法】 抗 TNT 抗体産生ハイブリドーマ細胞から Total RNA を抽出し、RACE法により増幅した目的遺伝子断片のシークエンス解析を行った。得られた CDRのアミノ酸配列をセルロースメンブレン上にスポット合成したペプチドアレイを用いて 2,4,6-trinitrophenyl-keyhole limpet hemocyanine conjugate (TNP-KLH)との結合アッセイを行った。結合量が高いことが示された CDR 配列に基づいてペプチドライブラリーを作製し、結合量が高いペプチド配列を検討した。競合
結合法により取得したペプチドプローブの特異性について評価を行った。
【結果】 化合物選択性の高い TNT 認識プローブの開発を目的とし、CDR のアミノ酸配列をリード配列とした TNT 認識ペプチドの設計を行った。シークエンス
解析により得られた CDR 配列から最も結合力の高い配列として 14 残基の重鎖CDR3 を取得した。選抜した重鎖 CDR3 の断片化解析を行った結果、C 末端の2 残基を消去した配列において、結合量が 1.85 倍に増加した。さらに、競合結合法により類似物質である硝酸アミル及びトルエンに対して特異性を示すことが示された。以上の結果から、本手法により揮発性化合物に対して特異性を示すペプチドプローブの設計が可能であることが示された。

イメージング質量顕微鏡は、質量分析による試料表面の成分分析から様々な分子が可視化できるツールとして注目されている。その応用範囲は動物組織を用いた医学・生物学分野以外に広がり、食品においても「ある成分が・どこに・
どれだけ分布しているか」を知ることが可能である。このように、新たな技術
を新たな分野へ適用することで、今後新たな視点が提供される期待がある。現在、その可能性を十分に有しているイメージング質量顕微鏡であると思うが、食品分野における応用例は報告も含め非常に少なく、どのような分子が見えてくるのかということについて議論されることも少ない。本ポスターでは、イメー
ジング質量顕微鏡を食品分野に応用するにあたり、試料前処理法の工夫からデータ解釈までの一連の流れについて紹介し議論したい。

Development of volatile explosive specific peptide probe based oncomplementarity determining region

Feasibility study of imaging mass microscope for food analysis○Masaki Muto1,2, Kentaro Yanai1,2, Masayoshi Tanaka1,2, Hiroshi Ueda3,
Jin Wang2,4, Takeshi Onodera2,4, Kiyoshi Toko2,5, Mina Okochi1,2(1Sch. Mater. Chem. Tech., Tokyo Tech, 2ImPACT, JST, 3Lab. Chem. Life Sci.,
Tokyo Tech, 4R&D TAOS, Kyushu Univ., 5Grad. Sch. Sci. Electrical Eng., Kyushu
Univ.)
Key words
peptide probe, volatile explosive, anti-TNT antibody, complementarity
determining region

1P-2p186 DNA staining nanoparticles for nucleus imaging○Chi-Hsien Liu, Min-Han Tsao, Soubhagya Laxmi Sahoo(Grad. Inst. Biochem. Biomed. Eng., Chang Gung Uni)
chl@mail.cgu.edu.tw

Monitoring DNA events in the nucleus continues to draw wide interest among
researchers since the need of understanding biological mechanisms. However, theproblems like limited diffusion rate and fluorescence quenching in the cytosols have to
be overcome.Herein, magnetic nanoparticles (MNPs) were modified with fluorescentdye via covalent conjugation. The prepared MNPs were characterized by fluorescence
spectrometry, transmission electron microscopy, Fourier transform infrared and photon
correlation spectrometry to verify their optical and chemical properties. The effects ofvarious parameters such as pH effect, salt effect and contact time on the adsorption
isotherms of single strand DNA and plasmid DNA were investigated to understand themechanism. The nucleus of human embryonic kidney cells and rabbit corneal epithelial
cells could be labeled within 1 minute. The modified MNPs exhibited brightfluorescence and retained good magnetic properties. Biocompatibility assay revealed
that the MNPs were low toxic and suitable for biomedical application. The
chromosome adsorption phenomenon could be explained by using the Langmuir
isotherm. Both the adsorption of ssDNA and pDNA on the MNPs obeyed the pseudosecond order kinetic model. Cellular imaging assay of the nanoparticles in two
mammalian cells showed their excellent DNA targeting and chromosome imaging. The
advantages such as the fluorescence and specific DNA adsorption made the MNPs
promising for fluorescent labeling.

DNA staining nanoparticles for nucleus imaging○Chi-Hsien Liu, Min-Han Tsao, Soubhagya Laxmi Sahoo(Grad. Inst. Biochem. Biomed. Eng., Chang Gung Uni)

Key words

nanoparticles, nucleus labeling, DNA separation, imaging○Shuichi Shimma(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

mass microscope, imaging mass spectrometry

9 月 29 日 （木）受賞講演（13:00 〜 13:20）

富山国際会議場 3 階 A 会場（メインホール）/ ANA クラウンプラザホテル富山 3 階 C, D, E 会場

〈生物工学奨励賞（江田賞）受賞講演〉
受賞者

伊藤 考太郎（キッコーマン）

しょうゆ醸造に寄与する麹菌由来のグルタミナーゼに関する研究
2A-Ap01

p. 141〈生物工学奨励賞（斎藤賞）受賞講演〉
受賞者

松浦 友亮（阪大院・工）セルフリータンパク質合成系を用いた進化分子工学技術の開発
2A-Ep01

p. 141〈生物工学奨励賞（照井賞）受賞講演〉
受賞者

河原 正浩（東大院・工）キメラ受容体による細胞運命制御系の構築とライブラリー選択への応用
2A-Cp01

p. 142〈生物工学アジア若手賞受賞講演〉
受賞者

Choowong Auesukaree（Mahidol University, Thailand）“Molecular mechanisms underlying yeast adaptive responses
to environmental stresses and pollutants”

2A-Dp01

p. 142

シンポジウム・招待講演（午前 9:00 〜 11:00/11:30, 午後 13:30 〜 15:30）

富山国際会議場 3 階 A 会場 , 2 階 B 会場 / ANA クラウンプラザホテル富山 3 階 C, D, E 会場
午前

学会活動が先導する実用化研究・技術〜学会は産官学の出会いの場となれるか〜
2S-Aa01 〜 2S-Aa04

植物代謝工学研究最前線〜新産業創出に向けて〜

Artificial Molecular Design to Create “Neobiological Molecules”
協賛：AMED「革新的バイオ医薬品創出基盤技術開発事業」

2S-Ba01 〜 2S-Ba05

p. 145

2S-Ca01 〜 2S-Ca07 ( 〜 11:30)

p. 147(2S-Ca04, 2S-Ca07)〈招待講演（韓国生物工学会）〉

Japan-Korea Joint Symposium“Advancements in Medical Engineering Using Nano- and Micro-biotechnology”
2S-Da01 〜 2S-Da07 ( 〜 11:30)(2S-Da07)〈招待講演（韓国生物工学会）〉

新規な核酸関連酵素の開発とその産業応用
午

p. 149, 150

p. 151

p. 1542S-Ea01 〜 2S-Ea06

p. 154

2S-Ap01 〜 2S-Ap04

p. 157

後

有用微生物の農作物への新しい展開とその将来像
バイオエンジニアリングにおける分析科学の新たな展開〈招待講演（韓国生物工学会）〉

2D/3D プリンタを用いる細胞操作の可能性

10th Japan-Korea Biomass Symposium

2S-Bp01 〜 2S-Bp05

p. 1592S-Cp01 〜 2S-Cp06

p. 162(2S-Bp02)

2S-Dp01 〜 2S-Dp04

微生物の潜在能力に注目した有用二次代謝産物の「ものづくり」戦略
2S-Ep01 〜 2S-Ep05

一般講演

p. 143

p. 160p. 165

p. 167

ポスター掲示時間（10:00 〜 18:00）

ポスター会場 Ⅰ：富山国際会議場 2 階

ポスター会場 Ⅱ：ANA クラウンプラザホテル富山 3 階 ASUKA
酵素学，酵素工学
タンパク質工学
抗体工学
発酵生理学，発酵工学
代謝工学
醸造学，醸造工学
食品科学，食品工学
環境浄化，修復，保全技術
バイオマス，資源，エネルギー工学
生物化学工学
バイオプロセス
セル＆ティッシュエンジニアリング
核酸工学
糖鎖工学

2P-1p001 〜 015

p. 1692P-1p028 〜 037

p. 176

2P-1p016 〜 027

2P-1p038 〜 054

2P-1p055 〜 068
2P-1p069 〜 082

2P-1p083 〜 099
2P-1p100 〜 113
2P-1p114 〜 131

2P-2p132 〜 140
2P-2p141 〜 150

2P-2p151 〜 180

2P-2p181 〜 183
2P-2p184 〜 187

p. 173
p. 178p. 183
p. 186
p. 190p. 194
p. 197
p. 202
p. 204
p. 207
p. 214
p. 215

生物工学奨励賞（江田賞）／生物工学奨励賞（斎藤賞）

2A-Ap01

しょうゆ醸造に寄与する麹菌由来のグルタミナーゼに関する研究○伊藤 考太郎（キッコーマン）koito@mail.kikkoman.co.jp

グルタミナーゼは、グルタミンをグルタミン酸とアンモニアに加水分解する酵素である。グルタミン酸はしょうゆにおいて中心的な役割を果たす旨味成分である。しょうゆ中のグルタミン酸は、以下 2 つの経路から作られると考えられている。すなわち、(1) 原料タンパク質が麹菌のタンパク分解酵素によってアミノ酸にまで分解され、原料タンパク質中に含まれるグルタミン酸が直接遊離する経路、(2)原料タンパク質の分解によって生じたグルタミンがグルタミナーゼによってグルタミン酸へと変換される経路である。麹菌由来のグルタミナーゼ
活性としょうゆ諸味中のグルタミン酸量との間に正の相関が見られることから、
しょうゆ醸造では、麹菌由来のグルタミナーゼが重要であると古くから考えられていた。しかし、麹菌由来のグルタミナーゼは、生産量が低く、菌体に結合しており、かつ、麹菌がプロテアーゼを大量に生産するため酵素精製がとても困難であり、タンパク質側からしょうゆ醸造に寄与するグルタミナーゼを探す
アプローチは難しい状況にあった。そこで、ゲノム情報を活用し、真にしょう
ゆ醸造に寄与するグルタミナーゼを遺伝子側から明らかにするアプローチで研究を行った。

2A-Ep01

セルフリータンパク質合成系を用いた進化分子工学技術の開発○松浦 友亮（阪大院・工）matsuura_tomoaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp

セルフリータンパク質合成系は、生細胞を用いないため界面活性剤や脂質存在下などの環境で、様々な人工鋳型（終止コドンレス RNA、ピューロマイシン修
飾された RNA など）を用いてタンパク質合成が行える柔軟性を有する。これ
らの特性を利用し、種々の in vitro タンパク質進化工学的法が開発されてきた。
一方、従来法は可溶性タンパク質のみを対象とし、一般に不溶性でありかつ、会合体を形成する膜タンパク質を対象とすることは難しかった。我々は、これまでに構築した高効率無細胞翻訳系、細胞サイズリポソーム内タンパク質合成技術を用い膜タンパク質をディスプレイする技術を再構成型セルフリータンパ
ク質合成系と細胞サイズのリポソームを用いて構築し、これをリポソームディ
スプレイ法（Liposome display）法と名付けた。加えて、本手法が複数の異なる
膜タンパク質の進化分子工学に適用可能であることを示した。本発表では、リポソームディスプレイ法とこれを用いた構成的アプローチ研究について紹介する。

○酵母由来の耐塩性グルタミナーゼ遺伝子の単離
しょうゆ醸造では麹菌由来のグルタミナーゼが重要視される一方で、麹菌由来のグルタミナーゼは、耐塩性に乏しいことが知られており、しょうゆ醸造に適した耐塩性グルタミナーゼの開発も求められていた。我々は様々な微生物から耐塩性グルタミナーゼをスクリーニングした結果、、Cryptococcus 属酵母にその活性を見出した。そのグルタミナーゼを精製し、部分アミノ酸配列を基に遺伝子を単離した。その結果、Cryptococcus 属酵母由来のグルタミナーゼは、既知のグルタミナーゼと相同性が低く、新しいタイプのグルタミナーゼ（Gah）であることが明らかになった。
○麹菌グルタミナーゼ遺伝子の探索、破壊株の作製およびそれを用いたしょう
ゆの試醸
2005 年 に 麹 菌 Aspergillus oryzae RIB40 株 の 、 2011 年 に は 麹 菌 A. sojae
NBRC4239 株のゲノム情報が明らかとなった。そこで、それらのゲノム配列情報を用いて、他生物種由来の既知グルタミナーゼと相同性のある遺伝子を探索した結果、麹菌 A. sojae のゲノム配列中には、上述の新しいタイプのグルタミナーゼ(Gah)を含め、10 個のグルタミナーゼ遺伝子が存在することが判明した。
これらの遺伝子の中からしょうゆ醸造でのグルタミン酸生成に寄与している真のグルタミナーゼを明らかにすることを目的に A. sojae を宿主として単独または多重遺伝子破壊株を作製し、それら破壊株を用いたしょうゆの試験醸造、さらに精製酵素による酵素化学的検討を行い、下記の結果を得た。
(1) しょうゆ醸造でグルタミン酸生成に寄与するグルタミナーゼは、基質特異性の異なる 4 つのグルタミナーゼ（GahA、GahB、GgtA、Gls）であり、そのうち
GahA、GahB、Gls は、ゲノム情報が開示されて初めて見出されたグルタミナー
ゼであった。
(2) 麹菌のグルタミナーゼとして初めて報告された GtaA はしょうゆ醸造では効果が無く、グルタミナーゼ活性を持つタンパク質が必ずしもしょうゆ醸造で機能するとは限らなかった。
(3) Gls は菌体内酵素であった。最も効果は小さかったが、しょうゆ醸造において菌体内酵素が作用することを初めて実証した。
(4) 高グルタミン酸含有のしょうゆを得るには、我々が見出した Cryptococcus 属
酵母由来の新規なグルタミナーゼ(Gah)と相同性の高い GahA または GahB が必須であった。
(5) 精製酵素による機能解析の結果、GahA または GahB は、諸味中で作用するのに適した性質(耐塩性や低い至適 pH など)は無かったが、遊離のグルタミンだ
けでなく、ペプチドの C 末端に位置するグルタミンにも作用するペプチドグル
タミナーゼ活性を有する特徴的なグルタミナーゼであった。Cryptococcus 属酵
母由来の Gah もペプチドグルタミナーゼ活性を持つことを同時に明らかにし、ペプチドグルタミナーゼ・アスパラギナーゼ遺伝子として初めて同定した。
(6) しょうゆのグルタミン酸の生成が従来考えられていた 2 つの経路からだけではなく、ペプチドの状態でグルタミン酸に変換され、その後、ペプチダーゼにより遊離される第 3 の経路が存在すること、しょうゆ醸造でグルタミン酸量を高めるにはこの第 3 の経路が重要であることを明らかにした。
しょうゆ醸造においてより旨味を増強するために、ペプチドグルタミナーゼ活性の高い麹菌を育種することが有効であると考えられる。

Studies on glutaminase of koji mold, which are involved in glutamate
production during soy sauce fermentation.
○Kotaro Ito(Kikkoman Corp.)

Key words

Aspergillus sojae, soy sauce, glutaminase, L-glutamate

141

In vitro evolution of proteins using cell-free protein synthesis system○Tomoaki Matsuura(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
in vitro coupled transcription/translation, in vitro molecular
evolutionary engineering

142

生物工学奨励賞（照井賞）／生物工学アジア若手賞

2A-Cp01

キメラ受容体による細胞運命制御系の構築とライブラ
リー選択への応用

2A-Dp01○河原 正浩（東大院・工）kawahara@bio.t.u-tokyo.ac.jp

Molecular mechanisms underlying yeast adaptive
responses to environmental stresses and pollutants○Choowong Auesukaree1, Chuenchit Boonchird2,
Satoshi Harashima3, Prayad Pokethitiyook1, Maleeya Kruatrachue1(1Dept. Biol., Fac. Sci., Mahidol Univ., 2Dept. Biotechnol., Fac. Sci.,
Mahidol Univ., 3Fac. Biotechnol. Life Sci., Sojo Univ.)
choowong.aue@mahidol.ac.th

近年、細胞の医療応用分野においては、iPS 細胞の開発が契機となり、各種多能性幹細胞を利用した再生医療や遺伝子治療が大きくクローズアップされている。今後、バイオ産業や医療応用として展開するための課題として、治療用の細胞を医療経済的な観点も含めて効率的に調製する技術、および安全な遺伝子治療や再生医療を実現するために、移植する細胞の運命を生体外および生体内において自在に制御する技術が必要とされており、まさに生物化学工学的な視点が求められている。一方、抗体医薬や蛋白質間相互作用を標的とした創薬が近年注目されており、医療応用に有用な分子を簡便にスクリーニングできる手法の開発が求められている。
そこで本研究では、動物細胞表面に発現しており、細胞の運命を制御することが知られているサイトカイン受容体に着目し、サイトカイン受容体を工学的に改変することで特定の細胞の運命だけを選択的に制御することを考えた。まず、
サイトカイン受容体のリガンド結合部位である細胞外領域を一本鎖抗体で置換し、元の受容体が認識するリガンドとは全く異なる人工的なリガンド(抗原)を認識させて情報伝達を行うという、いわば「細胞運命のスイッチ素子」を考案した。本研究における最大の特徴は、多様性を持つ抗原-抗体反応をベースとしている点であり、種々の抗原に応答するキメラ受容体を合理的にデザインでき
れば、増殖・分化・遊走・死などの多様な運命シグナル伝達系を複数の抗原を用いて自由に制御できる可能性がある。また、抗原として安価な物質を選べば、高価なサイトカインを用いずに目的細胞を医療経済的にも達成可能なレベルで調製する技術にもなりうる。
本技術の医療応用への大きな課題として、1)治療用細胞に近い初代培養細胞での適用、2)他の受容体ファミリー分子への適用、3)増殖以外の細胞運命の制御、が挙げられた。1）の課題に関しては、IL-2 受容体(IL-2R)キメラを用いてマウス脾臓由来 T 細胞の増殖を、トロンボポエチン受容体(c-Mpl)キメラを用いてマ
ウス骨髄由来造血幹細胞の増殖をそれぞれ促進することに成功し、株化細胞のみならず生体から取得した初代培養細胞にも適用できることを示した。また、
2）の課題に関しては、受容体型チロシンキナーゼファミリーに属する上皮成長
因子受容体(EGFR）、マクロファージコロニー刺激因子受容体(c-Fms）、幹細胞
因子受容体(c-Kit)、インシュリン受容体(IR)を用いたキメラ受容体を構築し、いずれも抗原依存的な増殖シグナルを伝達することを示した。この後に詳しく述べる Fas, Rank も含めると、3 つの受容体ファミリーの計 10 種類の受容体のシグナル伝達を模倣可能であることを示した。さらに、3）の課題に関しては、cFms, c-Mpl キメラ受容体を用いて、抗原依存的な細胞遊走、および細胞運動制御に成功し、細胞死誘導受容体である Fas を用いたキメラ受容体によって、抗原添加によりがん細胞を細胞死誘導することにも成功した。また、増殖・死誘導型キメラを組み合わせて、増殖から死へ細胞運命を変換するユニークな系も実証した。さらに、破骨細胞分化に関わる受容体 Rank を用いたキメラ受容体をマクロファージ細胞株で発現させ、抗原依存的に破骨細胞への分化を促進することができた。従って、本研究の手法を用いて適切な受容体をエンジニアリ
ングすることによって、増殖のみならず、遊走・死・分化の運命制御が可能であることを示した。
これらの成果を基に、細胞運命を指標としたスクリーニング系への応用を指向した研究も進めた。具体的には、増殖誘導型キメラ受容体の抗体部分をライブラリー化したキメラ受容体を発現させ、目的抗原存在下で増殖した細胞を得る
ことで抗原結合性抗体を選択する系の実証にも成功した。この成果は、動物細胞の増殖を指標としたユニークな抗体選択系であり、キメラ受容体を細胞質で発現させることにより細胞内抗体(intrabody)も簡便に取得できることも示した。
また、受容体を抗体以外の蛋白質と融合したキメラを構築することで、細胞内での様々な蛋白質間相互作用の検出法やスクリーニング系への応用へと系を発展させつつある。今後、疾患関連蛋白質を標的とした蛋白質間相互作用阻害剤
あるいは阻害ペプチド探索と、疾患医療への応用が考えられる。
以上より、本研究の手法は、今後の再生医療や創薬開発に大きく貢献する生物
化学工学的な基盤技術になると考えられる。

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has long been used in industrial ethanol
production. During ethanol fermentation, yeast cells are simultaneously exposed tomultiple stresses, such as high ethanol concentration, high osmotic pressure, andtemperature fluctuations, which affect cell growth and viability. The understanding ofmolecular mechanisms required for tolerances to these stresses present during
fermentation is important for successful engineering of multiple-stress resistant yeast
strains, which is desirable for efficient bioethanol production. Our genome-wide study
revealed that vacuolar H+-ATPase, which is currently known to function inmaintenance of intracellular pH, is important for tolerance to several alcohols
including ethanol. However, we showed that a role for vacuolar H+-ATPase in theregulation of the cell wall stress response and the prevention of endogenous oxidative
stress, rather than in the intracellular pH homeostasis, is important for protecting yeast
cells against ethanol stress. In addition, we found that Cu/Zn-superoxide dismutase andtrehalose metabolic enzyme were required for tolerance to various stresses tested,suggesting their roles in conferring multiple-stress tolerance. Furthermore, the studies
in thermotolerant S. cerevisiae strains suggest the roles of protein quality control
system and energy metabolism in thermotolerance. In another aspect, S. cerevisiae is
widely used as an ideal eukaryotic model organism for biological research. We used S.
cerevisiae to investigate the toxicity of environmental pollutants such as pesticides andheavy metals. The effects of alachlor, a commonly used herbicide, on protein
denaturation, induction of oxidative stress, and disturbance of cell wall and membrane
integrities were explored. Moreover, we also showed the protective action of watersoluble extract from leaves of Moringa oleifera Lam., one of the most widely used
medicinal plants, against cadmium toxicity through the reduction of intracellular
reactive oxygen species and the inhibition of cadmium uptake. In conclusion, we
believe that the better understanding of mechanisms underlying adaptive stressresponses provides important information required for improving stress-tolerance trait
of not only yeast but also the other organisms, which is desirable for increasing
production yeild of a number of beneficial biological products.

A cell fate controlling system using chimeric receptors and its application tolibrary screening

Molecular mechanisms underlying yeast adaptive responses toenvironmental stresses and pollutants○Masahiro Kawahara(Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)

Key words

chimeric receptor, cell fate control, library selection○Choowong Auesukaree1, Chuenchit Boonchird2, Satoshi Harashima3,
Prayad Pokethitiyook1, Maleeya Kruatrachue1(1Dept. Biol., Fac. Sci., Mahidol Univ., 2Dept. Biotechnol., Fac. Sci., Mahidol Univ.,
3Fac. Biotechnol. Life Sci., Sojo Univ.)

Key words
cerevisiae

stress response, ethanol fermentation, pollutant, Saccharomyces

学会活動が先導する実用化研究・技術～学会は産官学の出会いの場となれるか～

2S-Aa01

ものづくり系工学会での産官学連携○辻川 正人
（阪府大・URAセ）
masatot@mtr.osakafu-u.ac.jp

１．イノベーションの創出
イノベーションがなければ日本は立ち行かない。GDP の 20%近くを輸入している国として、そのための資金を得るために輸出が必要であり、多種多様なものを輸出して貿易収支はほぼ差引ゼロ。輸出額の最も多いのが自動車で全体の20％程度であるというのが基本的な現在の我が国の経済である。
我が国は、原料を輸入して製品として輸出する加工貿易が宿命で、それは明治の開国当時から変わりようがない。厳しい国際競争に負けるわけにはいかない
ので加工技術、すなわち工業の高度化を進め続けなくてはならない。
これからも自動車産業には期待するし、我が国最大手では今期の開発予算に 2兆円を超す開発予算を準備しており、これまで以上の成果も期待できる。しかし、いつまでも自動車が日本を代表する商品であり続けるとはいえない。第 5期科学技術計画のいう大変革時代には間断のないイノベーションの創出が求められる。
２．産学連携の現実
イノベーションの創出には産学連携が必須と考えられ、それはオープンイノベー
ションの一環として活発に議論されるようになる。平成 14 年、内閣府が産学官連携促進会議を発足させ、平成 24 年までに 11 回の会議を行った。平成 16 年からはイノベーションジャパン（大学見本市）と同時開催で大学シーズの売込みなど活発な産学連携促進活動が進められている。
助成金や補助金などの産学連携促進のための多額の投資について、その評価が文部科学省と経産省の合同で進められた。平成 25 年度には産学連携評価モデル
が多くの大学から提案され検証された。これらによって国主導の産学連携がどれほど実績の少ないものであったかが明らかとなった。
３．オープンイノベーション
地球規模で最先端の技術や知識を組合せることにより、新たな価値を生み出そうとするオープンイノベーションの高まりは、従来の学の技術シーズ提案型の産学連携に加えて、課題解決型の産学連携モデルの重要性が高まることを示唆してはいる。資源に乏しい我が国が培ってきた様々な先端技術を活かした課題
解決型の産学連携を進めることにより、科学技術の成果を世界に向けて発信す
ることは、我が国に期待される大きな役割であり、同時にそれが我が国の成長の糧であるとする産学官連携促進会議の示すところに間違いはない。
しかし、実際にオープンイノベーションと呼ばれているものは、元請けが下請けに作って欲しいものを作らせることができなくなっているという現実での大企業の悲痛な叫びでもある。長いデフレの後、これまでのように元請けには下請けと一緒に技術を開発していけるものづくりの技術者がいなくなり、世界一の部品を作る技術を持つ下請けも元請けの要求をものづくりに翻訳することができなくなっている。
４．産学連携に果たす学会の役割
現在、内閣府がまとめ役となり省庁の垣根を取り払った形での SIP（戦略的イ
ノベーション創成プロジェクト）が進められている。そこでは次世代の日本の経済活動を支えるべき産業が 10 の課題としてあげられている。1. 革新的燃焼技
術、2. 次世代パワーエレクトロニクス、3. 革新的構造材料、4. エネルギーキャ
リア、5. 次世代海洋資源調査技術、6. 自動走行システム、7. インフラ維持管理・
更新・マネジメント技術、8. レジリエントな防災・減災機能の強化、9. 次世代
農林水産業創造技術、10. 革新的設計生産技術である。
日本は技術で生きていかねばならないということがあらためて示されている。
これらのうちの幾つかが、30 年後にも現在の日本車が担っている基幹産業としての責任を分担できるようになっていなければならない。
課題が示されていて産学連携による共同開発が求められている。多様な高度技術を持つ多くの企業がある。しかし、これらをイノベーションとして展開していけなくては意味がない。まとめ役は大企業であろうか。少なとも経済産業省が描いているイノベーションのイメージは大企業から出てくるものではない。
グローバルニッチトップ企業が創出すべきものである。大企業が扱えないニッ
チ市場であるが我が国でトップであるならグローバル展開できるというイメー
ジである。産学が顔をあわせる場として、学会に求められている役割はここにある。
ものづくり系工学会として、材料を対象とする鉄鋼協会や金属学会、さらにより技術に特化した鋳造工学会や熱処理技術協会などは、多くの会員の所属は企業である。例えば日本鋳造工学会の正会員のうち 85%の所属が企業である。春
夏の大会だけでなく、いくつもの技術開発指向の研究会が産学連携で組織され運営されている。これらから国の大型公募に向けての共同開発グループが形成されていく。
太平洋戦争後 70 年、敗戦の焼け野原から立ち上がった日本の工業力は 1979 年にはジャパン・アズ・ナンバーワンと評されるまでになった。しかし、1990 年のバブル崩壊、その後の失われた 20 年や 30 年と言われるデフレ時代を生き延びた企業はそのこと自体が高い技術と生産性を持っている証拠である。日本は図らずも贅肉がそぎ落とされた強靭な産業構造を持つに至ったともいえる。オール日本でイノベーション創出への準備は整っている。学会のやるべきことは多い。

Promotion of Industry-Government-Academia Cooperations at someEngineering Societies○Masato Tsujikawa(Res. Admin. Cen., Osaka Pref. Univ.)

Key words

Joint development, cooperation with industry

2S-Aa02143

バイオテクノロジーは地域産業に変革をもたらすか!!
○山本 佳宏（京都市産技研 バイオ）qyamay@tc-kyoto.or.jp

我が国では微生物を利用した様々な食品が生産されている。日本酒、醸造酢、漬物、味噌、醤油のような大規模工場スケールで生産されるメジャーな製品から地域の農林水産物を巧みに利用して地場企業で生産される地域特異性の高い
食材、食品まで多くのバリエーションが存在する。食品産業は地域の農林水産業と密接に連携し、地方における独創的なものづくり産業として、地域経済でも大きな部分を占めている。
醸造製品・食品を製造する中小企業の多くは、技術者の経験を基盤として製造担当者の伝承により製造がおこなわれてきた。一次産業従事者の減少やバブルとその崩壊による経済の混乱中、多くの企業の淘汰と再編が行われているが、地域の消費に支えられた企業の中には、コンビニエンスストア、ネット販売等の流通の変革の波に乗り、独自の販路を獲得した企業も多数存在する。また。
最近では海外からのインバウンドの波に乗り、その需要を急激に拡大している例もあり、今後の海外需要が定着することで大きなビジネスチャンスをつかむ可能性も見えている。
地域産業の中核となる中小食品メーカーでは、「安全で」、「おいしく」、「特徴的で」、「低コスト」な製品を求めており、加えて、流通システムへの対応として、「賞味期限の長期化」にも取り組んでいる。
「安全」においては多くの製造現場では微生物、小動物の対策を高度化し、製品の微生物検査などの対策を行うことで対応を行っている。しかしながら、現在の検査は寒天平板培地を用いた分析手法であり、ジャストオンタイムの流通シ
ステムと、２４時間以上を要するこの分析手法では対応できなくなっている。
「おいしさに」おいては、市場の嗜好に合った製品を逸早く開発し、販路を確保することであるが、日常生活の変化、特に食生活の洋風化に伴い、食品の嗜好も大きく変化している。バブル以後の 4 半世紀で、伝統的な食品も減塩化、弱酸味、無臭化など嗜好も大きく変化し、醸造製品の代表である清酒においても燗酒中心から冷酒へ変化が進み、特に特定名称酒と呼ばれるプレミア商品の需要が伸びている。このカテゴリーは冷酒中心の商品展開であり、製品に求められる特性も燗酒を中心にしていたころとは全く異なるものになっている。
一方、バイオテクノロジーの進捗は著しく、微生物資源の収集においては 10 万
株を超える微生物ライブラリーが構築され、醗酵産業の基盤が整備され、また、多種の微生物のゲノムシークエンスが明らかにされ、遺伝子と対応するタンパ
ク質の機能、その代謝ネットワークについても徐々に明らかになりつつある。
食品のおいしさは味覚、臭覚に作用する代謝成分に大きく依存しており、特に醗酵製品においては原料び含まれる成分を微生物によってより好ましい代謝産物として回収することに他ならない。バイオテクノロジーの進捗とそれを支える分析技術は従来の分析方法では解析できなかった微量成分、例えばオフフレー
バーやジペプチド、トリペプチドのような類似性の高い有機化合物の分離定量も可能になり、食品としての品質向上、というより、より市場の要求に沿った「特徴的な」製品を醗酵工程の制御により作り出すことも夢ではなくなってきている。
今回は、地域の取り組みのケーススタディとして、平成 14 年度より進めてきた
京都市バイオシティ構想での取り組みと平成 26 年度より進める京都ライフイノ
ベーション推進戦略の中で取り組む微生物を利用した地域産業の支援について紹介する。
京都市では経済産業省から支援を受け、平成 16 年に京都バイオ計測プロジェク
トを立ち上げ、産学公連携による産業支援を実施してきた。地域に集積する分析機器、試薬関連企業と連携したバイオ計測技術の開発と成果品である分析技
術を利用した地場企業による製品開発の例を紹介する。
事例 1 は清酒製造用酵母開発のため開発したプロテオーム解析技術を地域研究用試薬メーカーと連携しキット化している。現在では開発した試薬キットを活用し、多数寄せられている食品異物(クレーム)分析への活用する事例を紹介する。
事例 2 では大学の先端研究の中で培われた分析技術を活用し、研究用試薬メー
カーでキット化することで簡便な分析技術として普及することになった脂肪酸
分析キットを紹介するとともに、この研究開発を発展させ、食品のおいしさを左右する基幹成分である有機酸を迅速分析する技術開発を紹介する。そしてこの技術を応用し、高付加価値清酒の生産性拡大を目指す取り組みを紹介する。
事例 3 では大学の先端技術で開発された ISFET 半導体センサーを実用化するために、センサーに適した計測手法を開発した例を示すとともに、この手法を発展させ、半導体センサーによる食品流通の安全を担保するための技術開発の取り組みを紹介する。
併せて、産学官連携を促進するために JST の支援により整備された拠点、京都
バイオ計測センターのコンセプトと設備、活動状況について紹介する。この事
業では産学連携、実機を使った産産、産学、学学の意見交換、連携構築のためのメンバー募集等、学界活動での利用の拡大を熱望しているところである。

The biotechnology leads to a change in the local industry○Yoshihiro Yamamoto(Applied Fermentasion. Biotechnol.,Kyoto Municipal Inst. Ind. Technol. Culture)

Key words

proteome, enzyme activity, yeast, sensor

144

学会活動が先導する実用化研究・技術～学会は産官学の出会いの場となれるか～

2S-Aa03

機能性食品素材としての酒粕発酵物とショウガ麹の開発○渡辺 敏郎（園田学園女子大・食物栄養）
watnb-ts@sonoda-u.ac.jp

食の欧米化が進んだことで、日本人の栄養バランスは大きく偏ってきている。
食事における脂肪の割合が増え、それとともに、わが国の肥満人口は急激に増加している。なかでもメタボリックシンドロームは、動脈硬化性疾患の進展リ
スクを高めることから特に問題視されている。しかし、日本人は、食の欧米化
以前ではメタボリックシンドロームに該当する人の割合は少なく、その要因として日本人は昔から発酵食品を好んで摂取してきたことが考えられた。つまり発酵食品にはこのメタボリックシンドロームの症状を改善できる成分が存在することが示唆された。日本の気候風土は発酵に適しており、特に麹菌を利用した発酵食品は清酒、味噌、醤油などバラエティーに富んでいる。なかでも麹と酵母の並行複発酵によって醸し出される清酒は適度に摂取すれば「百薬の長」と言われるほど体に良いとされている。また清酒の絞り粕である酒粕は栄養価に優れ、食物繊維も豊富な発酵食品で、近年様々な機能性が報告されている。
そこで、異なる研究機関が連携して得られた革新的イノベーション事例として、
再発酵処理により機能性を向上させた酒粕発酵物の商品化と麹の新しい活用法
としてショウガ麹の開発について紹介する。
酒粕発酵物
酒粕発酵物は、酒粕を酵母で再発酵させ、米由来のレジスタントプロテインの含有量を凝縮させたものである。レジスタントプロテインとはタンパク質でありながら食物繊維様の生理機能を示す食品成分で、特に酒粕由来のレジスタン
トプロテインは油の吸着能が高く、一般的に油の吸着効果で定評のあるキトサンと比べても、高い効果であることが確認された。肥満を誘発させたラットによる動物実験では、酒粕発酵物を与えると腸間膜脂肪、腎周囲脂肪、精巣周囲脂肪の重量はいずれも対照群に比べて有意に減少した。一方で、筋肉の重量は減少せず、酒粕発酵物は脂肪組織のみを低下させることが確認された。そこで、肝臓の脂肪酸合成系酵素活性を測定すると、酒粕発酵物を与えるとその活性は抑制された。また摘出した脂肪組織を電子顕微鏡で観察したところ、酒粕発酵物を与えたラットの脂肪細胞は対照群に比べて細胞の肥大化抑制が確認された。
酒粕発酵物の摂取により、糞重量が有意に増加し、糞中の総脂肪排泄量も有意に増加した。これは摂取した過剰の脂質を酒粕発酵物が対外に排泄させ、その結果、肥満を改善したことが考えられた。以上のことから、酒粕発酵物には肥満抑制効果があることが認められ、同時に脂質代謝改善効果もあることからメタボリックシンドロームに対応した新素材となりうることが示された。
ショウガ麹
ショウガ麹は、原料のショウガチップを麹菌で製麹し、乾燥・粉砕後、粉末化したものである。通常、麹は穀類を原料に製麹し、発酵用途としてはデンプンを分解させるために使用することが多いので α－アミラーゼの活性が高い。しかし、ショウガ麹は、α－アミラーゼの活性よりもプロテアーゼの活性が高く、タンパク質を分解する効果の高い素材であることが考えられた。またショウガ
麹は、製麹過程においてショウガの辛味成分であるジンゲロールが体を温める効果を有するショウガオールに効率よく変換されていることも確認された。そこで、冷え性の女性被験者にタンパク質とショウガ麹を同時に摂取させること
で，冷え性の改善効果を調べた。その結果、ショウガオールによる体を温める
効果とショウガ麹のプロテアーゼがタンパク質を加水分解し、それが利用される際に誘導される体熱産生のダブル効果によって冷え性が改善できることが明らかとなった。
発酵食品には、まだ知られていない多くの可能性が眠っており、新しい発想や技術を活用させるとさらに優れた発酵素材の誕生が考えられる。このような革新的イノベーション開発の成功には学会等を中心とした各機関の有機的連携が必須であろう。

Development of re-fermented sake lees and ginger koji as functional food○Toshiro Watanabe(Dept. Food and Nutrition, Sonoda Women's Univ.)

Key words

fermentation, sake lees, ginger, Koji making

2S-Aa04

酵母「101H」の開発と泡盛の商品化 ～シンポジウムから発信した奈良の研究シーズと沖縄の産業ニーズ～○高木 博史（奈良先端大・バイオ）hiro@bs.naist.jp

科学者にとって、地道な研究の成果が実用化されることは大きな喜びである。
最近、演者の個人的な思いである沖縄への貢献が「泡盛酵母の開発と商品化」という形で実現した。本講演では、学の立場から泡盛酵母の研究開発に関する経緯を紹介するとともに、産官学の有機的連携を生み出すための学会活動についても議論したい。
＜奈良の研究シーズ＞ 当研究室では、ゲノム情報や遺伝解析などの基盤的知見が蓄積された実験室酵母を用いて、アミノ酸の代謝制御や生理機能に着目した
新規なストレス耐性機構を解析し、得られた基礎的知見を産業酵母（パン酵母、
酒類酵母、バイオエタノール酵母など）の育種に応用することを目指している。
これまでに、主にセルフクローニング法によって、プロリンやアルギニンを高生産する産業酵母を作製し、ストレス耐性や発酵生産性の向上に成功している。
＜沖縄の産業ニーズ＞ 沖縄の伝統的蒸留酒「泡盛」の製造では、エタノール生産性の向上がコスト低減に直結するが、エタノールは酵母の生育と発酵を阻害
し、濃厚な仕込みは酵母にとって高浸透圧の環境である。また、冷却コストの点から高温での発酵が望ましいことから、泡盛製造の効率化には、エタノール・
高浸透圧・高温などのストレスに耐性を示す酵母が必要である。一方、泡盛の主要な芳香成分は酵母の発酵過程で主にアミノ酸から生成される。泡盛製造にはエタノール生産性・芳香性の高い酵母（泡盛 101 号）が使用されており、育種に関する研究は行われていない。従って、泡盛の酒質の向上や差別化には、アミノ酸の組成や生成量に特徴を有する酵母の育種が重要である。
＜本学会大会シンポジウムの開催＞ 演者は平成 24 年度より沖縄県「琉球泡盛調査研究支援事業」に参画し、産業振興を目指した基盤研究を進めてきた。また、平成 25 年度本大会でシンポジウム（温故知新：沖縄の伝統蒸留酒「泡盛」の研究開発）を企画し、地方伝統産業の先端研究例として、「微生物機能を活用
した新しい泡盛の開発」「熟成の科学」などの研究成果を発信するとともに、沖縄発の次世代シーケンサーによる比較ゲノム・育種への有用性と波及効果についても議論した。このシンポジウムを機に産官学の有機的連携に一層弾みがついた。
＜ 101H 酵母の開発＞ 清酒やパンの主要な香気成分として知られる酢酸イソア
ミル（i-AmOAc）とその前駆体のイソアミルアルコール（i-AmOH）は、主にロイシン（Leu）の生合成に依存して生成され、これらの含量を増加させると泡盛の酒質に影響を及ぼすことが予想される。酵母の Leu 生合成経路は、LEU4遺伝子がコードする α-イソプロピルリンゴ酸合成酵素（IPMS）の活性が Leu によるフィードバック阻害を受けることで調節されている。そこで、Leu のアナログである 5,5,5-トリフルオロロイシン（TFL）に耐性を示す泡盛酵母の変異株を単離し、その特性を解析した。TFL 耐性変異株の中から、親株（101 株）に比べて細胞内の Leu 濃度が高く、泡盛中の i-AmOH、i-AmOAc 含量が増加し、泡盛の香味性を向上させる菌株（18-T55 株）を取得した。18-T55 株は LEU4 遺伝子上に 2 つのヘテロ対立変異（LEU4Ser542Phe, LEU4Ala551Val）を有しており、いずれのアミノ酸置換も TFL 耐性、IPMS のフィードバック阻害解除、Leu 蓄積を引き起こすことが判明した。また両残基は、IPMS 内の Leu 結合部位の近傍にあると予想され、置換に伴う立体障害がフィードバック阻害解除の原因であると結論づけた。本研究は泡盛酵母の育種としては初めての報告であり（Takagi
et al., J. Biosci. Bioeng., 119, 140-147, 2015; 生物工学論文賞）、アミノ酸アナログ
耐性変異株の取得が泡盛酵母の育種において有効であることが実証できた。
＜実用化への道＞ 実機醸造を行った結果、18-T55 株はアルコール生成などに問題はなく、親株の良好な特性を引き継いでいた。香気成分については、i-AmOH
および i-AmOAc が実機規模においても増加していたが、他の成分も顕著に増加しており、LEU4 遺伝子以外の変異によるものと考えられた。また官能評価では、フルーティーかつやや濃厚な評価が得られた。以上の結果から、18-T55 株
は泡盛の商業生産に活用できるとともに、親株と異なる特徴的な風味を有する
泡盛醸造が可能であることから、「101H 酵母」と命名した。101H 酵母を用いた
新たな泡盛「101H」を昨年 10 月に新里酒造より商品化した。ブランデーのよ
うな甘さと果実のような華やかさが好評を博し、本年 5 月からは新商品「HYPER
YEAST101」として販売を開始した。
今回のようなシーズとニーズのマッチング（実用化）には、(1)研究者自身の意
欲・熱意、(2)共感者・理解者との信頼関係、(3)努力・幸運・感謝、(4)学会・論文発表などが必須であると感じている。学会活動はそのための効果的なツールであり、特に本学会は産官学連携の芽を育む場として存在価値を発揮している。
最後に、夢の実現に導いていただいた研究室メンバー、バイオジェット、新里酒造、琉球大学の皆様に深く感謝します。

101H Yeast and Awamori: Nara research seeds and Okinawa industrial
needs○Hiroshi Takagi(Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)

Key words

yeast, awamori, industry-government-university

植物代謝工学研究最前線～新産業創出に向けて～

2S-Ba01

テルペノイドの代謝多様性と遺伝子ディスカバリー○關 光, 福島 エリ オデット, 村中 俊哉（阪大院・工）hseki@bio.eng.osaka-u.ac.jp

2S-Ba02145

植物代謝研究に役立つ相関ネットワーク解析（金平糖解析）
萬年 一斗 1, 尾形 善之 2, ○鈴木 秀幸 1
（1（公財）かずさDNA研・バイオ研究開発, 2大阪府大・生命環境）hsuzuki@kazusa.or.jp

構造多様性に富む植物テルペノイドは、医薬、機能性食品、香料、工業原料として重要な化合物群である。しかしながら、後述する抗マラリア薬原料のアル
テミシニンのように特定の植物種の特定の部位にのみ蓄積するため生産性が低い化合物や、あるいは抗炎症剤として多用されるグリチルレチン酸のように原料植物の生産国による輸出規制のため今後の安定調達が懸念されているものもある。このような化合物の代替生産技術として、アルテミシニン前駆物質の生産ですでに実用化されているような組換え微生物での生産が挙げられるが、そのためには生合成に関わる酵素遺伝子の同定が不可欠である。本発表では、トリテルペノイド、セスキテルペノイドの生合成に関わる酵素遺伝子の探索と組換え出芽酵母における有用テルペノイド生産に向けた私たちの研究について紹介したい。
テルペノイドの中で、炭素数 30 の鎖状化合物である 2,3-オキシドスクアレンを共通前駆体とするトリテルペノイドは、様々な生薬の主活性成分を含む化合物
グループである。トリテルペノイドの生合成においては、2,3-オキシドスクア
レンを様々な様式で閉環するオキシドスクアレン環化酵素、環状トリテルペンの部位特異的な酸化反応を触媒するシトクロム P450 モノオキシゲナーゼ（P450）が重要な役割を果たしている。植物では、P450 は大きな遺伝子ファミリーを形成するため特定の特化代謝産物（あるいは二次代謝産物）の生合成に関与する分子種の特定は容易ではない。私たちは、データベース上に公開されている配列情報および次世代シークエンサーを用いた de novo トランスクリプ
トーム解析を行うことで取得した新規配列情報からの候補 P450 遺伝子マイニ
ングと酵素機能解析を進め、異なる反応性を示す種々のトリテルペノイド生合成関連 P450 のカタログ化を進めてきた。さらに、これらの遺伝子を用いて、最重要生薬の基原植物であるマメ科のカンゾウ（甘草）が生産し、抗炎症剤として医薬、化粧品などに配合されるグリチルレチン酸や天然にはレアなトリテ
ルペノイドの組換え酵母を用いた生産系の構築に取り組んでいる。
また、私たちは炭素数 15 のファルネシル二リン酸を共通前駆体として生成するセスキテルペノイドの生合成についても研究を進めている。アルテミシニンは、
古くから漢方原料として用いられているヨモギ属植物の一種であるクソニンジン（Artemisia annua）が生産するセスキテルペノイドである。アルテミシニン
は現在、抗マラリア薬原料として不可欠となっている。ノーベル財団のプレス
リリースによると、アルテミシニンによりアフリカだけでも毎年 10 万人もの命が救われており、アルテミシニンを発見した中国のトゥ・ヨウヨウ氏は 2015 年のノーベル生理学・医学賞を受賞している。興味深いことに、200 から 400 種が存在するヨモギ属の中でアルテミシニンを産生するのはクソニンジンのみとされている。私たちは、クソニンジンが有する「例外的な」アルテミシニン産生能を決定づけている遺伝的要因を明らかにすべく、クソニンジンとその他のアルテミシニン非産生ヨモギ属植物の化学的、分子生物学的な比較解析を進めた。中でも、アルテミシニン生合成経路における鍵酵素であるセスキテルペン合成酵素の ADS（アモルファジエン合成酵素）に着目し、アルテミシニン非産
生種における ADS 相同遺伝子の有無、発現および酵素機能解析を行った。その結果、ミブヨモギ（A. maritima）およびクラムヨモギ（A. kurramensis）において、ADS に対して 83%のアミノ酸配列同一性を示す相同タンパクをコードする遺伝子が発現していることを見出した。これら二つの ADS 相同タンパク質について酵素機能解析を行ったところ、ファルネシル二リン酸を基質として(＋)alpha-ビザボロールを生成する新規セスキテルペン合成酵素であることが判明した。また、ニガヨモギ（Artemisia abisinthium）からは ADS に対して 90%のアミノ酸配列同一性を示す相同タンパクをコードしうる遺伝子を見出した。ニガヨ
モギ由来 ADS 相同タンパクの酵素機能を調べたところコイズミオールと呼ばれるレアなセスキテルペンを生成する新規酵素であることが判明した。このような、高い相同性を示しながら異なる反応性を示すホモログタンパクの発見は、ADS の酵素活性制御において特に重要なアミノ酸残基を推定するうえで有用な情報をもたらすだけでなく、微生物ホストを利用した、天然にはレアな、あるいは非天然型セスキテルペノイドのコンビナトリアル生合成にも利用しうるものと考えられる。

演者らは、植物代謝研究におけるオミックス研究支援を目的として、相関ネッ
トワーク解析ソフトウェア ConfeitoGUIplus の開発を行ってきた。相関係数をもとにネットワーク描画を行う点は一般的な相関ネットワーク解析と同様である
が、本ソフトウェアはネットワークの内側と外側を自動判別し、偽陰性・偽陽性を低減するように要素の再分配を行う独自のアルゴリズムを搭載している。
このアルゴリズムにより、膨大な定量値テーブルから高精度なモジュール抽出が可能となっている。
ConfeitoGUIplus の最大の特徴は、あらゆるオミックス解析データが利用可能という点であり、DNA アレイ解析や次世代シークエンス解析（RNA-Seq 解析）
によるトランスクリプトーム解析データ、質量分析機器から得られるメタボロー
ム解析データなど、幅広いデータに適用可能である。そのため、遺伝子や代謝物のリソースが整備されていない非モデル植物の代謝研究において、最も効果を発揮するデータマイニングツールと言える。本発表では、植物代謝研究で目にする機会の多いオミックス解析データに焦点を当て、これらに対して
ConfeitoGUIplus を適用した 3 件の実用例の紹介を行う。
（1） シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の遺伝子共発現解析
従来法との比較によって ConfeitoGUIplus の有用性を示すため、シロイヌナズナの公開 DNA アレイ解析データ（22,746 probes x 9,442 experiments）を用いて遺伝子共発現解析を行った。一般的に、同一生合成経路で機能する酵素遺伝子の共発現関係の抽出に比べ、生合成経路を構成する遺伝子群とそれを制御する転写制御因子との共発現関係の抽出の方が困難とされる。本発表では、脂肪族グ
ルコシノレート生合成経路を対象とし、当該経路の制御を司る転写制御因子の抽出を試みた例について述べる。ConfeitoGUIplus による網羅解析の結果、先述の 22,746 個の probe は発現パターンの類似性により 583 個のモジュールに分割された。脂肪族グルコシノレートの骨格形成において重要な酵素のひとつ
CYP83A1 が含まれるモジュールに着目したところ、同じく骨格形成を担う
CYP79F1・CYP79F2・SOT18 などの酵素遺伝子を Myb28・Myb29 が制御する様子が示されていた。この結果は、2007 年の理研・平井らの報告内容とも合致しており、従来行われてきた遺伝子共発現解析においても ConfeitoGUIplus が遜色
なく機能することが示されたと言える。
（2） ニガウリ（Momordica charantia）のサポニン生合成酵素遺伝子の探索
ウリ科植物の苦味配糖体サポニンは、特有な変形ラノスタン系骨格トリテルペ
ン Cucurbitadienol の酸化を起点として構造多様性を示すことが知られている。
そこで、Cucurbitadienol を酸化する P450 遺伝子の単離を効率的に行うため、遺伝子共発現解析を行った。ニガウリ由来の 10 種類の器官（葉、茎、果実、根など）の RNA-Seq 解析を行い、既知の P450 との相同性をもとに 29,920 個の contig
から 997 個まで P450 候補遺伝子を絞り込んだ。既に活性が明らかとなっている Cucurbitadienol 合成酵素（CBS）遺伝子と選抜した P450 候補遺伝子の定量値
テーブルを入力データとして、ConfeitoGUIplus を用いた遺伝子共発現解析を行った。その結果、McCBS 遺伝子は 4 個の P450 遺伝子とともにモジュールを形成した。酵母異種発現系を利用して、モジュールに含まれていた P450 遺伝
子の活性測定を行ったところ、少なくとも 3 遺伝子については Cucurbitadienolを基質として認識することが判明した。小コストで非モデル植物の遺伝子共発
現解析を実現し、その上、極めて効率的に目的遺伝子の探索が可能であることを示した好例である。
（3） 大根おろしの呈味成分に着目した代謝物アノテーション
大根おろし独特の辛味には Glucoraphenin が関与するとされているが、食品の呈味性は非常に複雑な現象であり、ひとつの代謝物だけで到底規定できるものではない。そこで、Glucoraphenin と協調的に働く代謝物の中から新規辛味成分の探索を試みた。大根おろしの辛味は経時的に減少するという特徴を加味し、すりおろしてからの時間が異なる試料からそれぞれメタノール抽出を行い、LCMS 分析に供した。得られたメタボローム解析データを ConfeitoGUIplus で解析した結果、LC-MS 分析で検出された 2,305 ピークの中から Glucoraphenin と協働するピーク候補として 53 ピークが抽出された。Glucoraphenin をはじめとする辛味成分には、炭素・窒素・硫黄原子から成るイソチオシアネート構造が共通して見られ、この構造に起因して辛味を示すとされている。精密質量をもとに
理論組成式演算を行った結果、25 ピークがイソチオシアネート構造を取り得る
組成式を示し、このうち 10 ピークは代謝物データベースにも登録されていない
ことがわかった。これらのピークに対応する化合物が辛味を呈する可能性は極めて高く、Glucoraphenin や他の既知辛味成分と協働して、大根おろしの呈味を形成するものと推測される。

Genetic diversity of P450s and terpene synthases as drivers of plantterpenoid diversity

Application of correlation network analysis software (ConfeitoGUIplus) inplant metabolism research○Hikaru Seki, Ery Odette Fukushima, Toshiya Muranaka(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

Plant, terpenoid, biosynthesis, enzyme

Kazuto Mannen1, Yoshiyuki Ogata2, ○Hideyuki Suzuki1(1Dept. R&D, Kazusa DNA Res. Inst., 2Grad. Sch. Life Env. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Key words
transcriptome analysis, metabolome analysis, data mining technique,software development

146

植物代謝工学研究最前線～新産業創出に向けて～

2S-Ba03高増殖するタケ培養細胞の物質生産への応用可能性：合理的代謝フロースイッチングによるタケ懸濁細胞のヒド
ロキシ桂皮酸アミド生合成経路の改変

2S-Ba04

高度機能分化した植物組織培養の物質生産への活用 -可能性と課題○大西 昇, 大川 博志, 間宮 幹士（キリン・基盤研）
n-onishi@kirin.co.jp

野村 泰治 1, 荻田 信二郎 1,2, ○加藤 康夫 1（1富山県大・生工研セ, 2県大広島・生命科学）
ykato@pu-toyama.ac.jp

化学合成法や抽出法に代わる有用植物二次代謝産物の生産方法として、大腸菌や酵母等の微生物宿主へ生合成遺伝子を導入し目的化合物を高生産する試みが近年盛んに行われている。遺伝子組換え操作が容易で細胞の増殖が速いことがその理由であると考えられるが、基質の添加またはその生合成系の導入の必要性や発現酵素の不溶化など、高い生産性の実現には多くの障壁を伴う。一方で、植物細胞は本来的には微生物宿主を使用する際の問題点の多くを克服でき、植物二次代謝生産には適していると考えられるが、微生物に比べて増殖が遅く遺伝子組換え操作が煩雑で時間を要することから、物質生産宿主としての利用は進んでいない。我々は植物細胞を宿主とした遺伝子組換えによる物質高生産を可能とする汎用性の高い基盤技術があれば、上記のようなデメリットを超えて宿主としての利用が進むと考え、「合理的代謝フロースイッチング」と命名した
ストラテジーの確立と一般化を目指している。これは宿主植物細胞における主
要二次代謝系を明らかにした上で、当該生合成中間体から分岐する新たな二次代謝生合成系を遺伝子組換えにより導入することで、効率的に代謝経路を改変
し目的物質の高生産に導くものである。本講演では、増殖性が高く、高効率な遺伝子組換え法や増殖／木化促進等の培養フェーズ調節法が確立されている、
当研究室で樹立されたタケ（ハチク）Pn 懸濁細胞を用いて、本ストラテジーの実証実験を行った結果について発表する。
増殖促進条件および木化促進条件で培養した Pn 細胞のメタノール抽出物を逆相系 HPLC にて分析した結果、特に木化促進条件で蓄積量が増加し、クロマト
グラム中でほぼ排他的に検出されるメジャー化合物 1 種とそれに付随して増加するマイナー化合物 1 種が見出された。精製物の構造解析および化学合成標品との一致から、メジャー化合物は feruloylputrescine (FP)、マイナー化合物は pcoumaroylputrescine (pCP)であることが分かった。これらヒドロキシ桂皮酸アミ
ドはヒドロキシ桂皮酸 CoA チオエステルと putrescine の縮合によって生合成されることから、Pn 細胞ではフェニルプロパノイド代謝系とポリアミン代謝系が極めて活発であると考えられた。そこで、これらの生合成中間体を基質とする
外来の二次代謝生合成酵素の導入による「代謝フロースイッチング」の可否を検討するため、p-coumaroyl-CoA/feruloyl-CoA と、putrescine の生合成中間体であ る agmatine の 縮 合 反 応 を 触 媒 す る オ オ ム ギ 由 来 の agmatine
coumaroyltransferase (ACT) 遺伝子を CaMV35S プロモーター制御下で高発現する組換え株を作製し、組換え細胞における代謝物の分析を行った。その結果、
ACT 組換え株の細胞内には予想通り ACT 反応産物である p-coumaroylagmatine(pCA)と feruloylagmatine (FA)が高蓄積する一方で、Pn 細胞にもともと高蓄積していた pCP/FP の蓄積量は顕著に減少していたことから、pCP/FP 生合成系が
pCA/FA 生合成系へと効率的にスイッチングされていることが示唆された。ACT
組換え懸濁細胞における主要代謝産物である pCA の生産量は、木化促進条件での培養後期に最大となり、150～350 mg/L にも達した。以上の結果から、植物培養細胞を用いた高効率物質生産系の確立における「合理的代謝フロースイッ
チング」の有用性が強く示唆された。

植物組織培養法の本質的な特徴の１つは、自然界には通常出現しない植物形態を実現し得ることである。脱分化した細胞の長期培養などはその典型例であろう。同特徴は、種苗の増殖及び有用物質の生産の両分野において、長年多岐に渡る知見を生み出している。有用物質の生産については、80 年～90 年代に実用化されたムラサキ培養細胞によるシコニンの生産やチューベローズ培養細胞での多糖の生産例があり、それら技術は現在まで脈々と受け継がれ更に発展を遂げている。またミシマサイコやオタネニンジンでは、培養根と言う別の形で機能分化した組織も同様に実用利用に活用されて来た。現在改めて有用物質の生産に組織培養を用いる機運が高まっているが、それは上記の優れた実用技術をベースに代謝解析や遺伝子工学等の最新技術を組合せることによって、次世代の物質生産技術の創出に繋がり得る環境が整いつつあるからである。
我々は長年、種苗の増殖に組織培養法の利用を図っている。これまでに、種々の機能分化した組織がドミナントに誘導される基本現象を把握し、得られる形態を高度化することにより複数の基幹増殖技術として確立して来た。其々の技術のベースとなった現象は以下の通りである。 (1)「もやし状」の茎の高密度増殖、(2)地下茎（ストロン）形態での継続的増殖、(3)塊茎の植物体全体での形
成、(4)破砕組織からの不定芽の同調的誘導、(5)不定胚の高効率での誘導。また組織の脱水等の工程により、定芽/不定芽/不定胚の生育能力が顕著に改善されることも見出した。これら一連の基本技術の保有により多様な植物種の増殖が可能となっている。一方、増殖技術の事業活用に向けては、基本技術とは別に実用的なスケールアップ法が不可欠となる。種々の方向性（培養槽の形状/サイズ/材質/他）を検討した結果、最終的にリユース可能な袋型の培養槽（内容積8L）と周辺技術を開発し、種苗生産に求められる簡便且つ柔軟な大量培養系を実現した。
これら「機能分化した組織」を「大量/安価」に増殖し得るシステムは、有用物質への生産にも応用し得ると思われる。現在その実証に向けた各種の技術開発を進めている（農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業「高度機能分化した植物組織培養による有用サポニン生産技術開発」他）。本発表では、各組織の典型的な増殖形態と袋型培養槽による大量増殖実用例を紹介し、有用物質への展開の可能性と課題について言及する。

Production of useful compounds using bamboo cultured cells by "Rational
metabolic-flow switching".

Application of new tissue culture methods to produce useful compounds potential and challenge -Key words
plant secondary metabolite, bamboo cultured cells, hydroxycinnamic
acid amide, biosynthesis

Key words

Taiji NOMURA1, Shinjiro OGITA1,2, ○Yasuo KATO1(1Biotechnol. Res. Center, Toyama Pref. Univ., 2Dept. Life Sci., Pref. Univ.
Hiroshima)○Noboru Onishi, Hiroshi Okawa, Kanji Mamiya(Cent. Lab. for Key Tech., Kirin Co., Ltd.)tissue culture, bioreactor, useful compounds

植物代謝工学研究最前線～新産業創出に向けて～／Artificial Molecular Design to Create “Neobiological Molecules”＜国際シンポジウ
ム＞

2S-Ba05

植物と微生物：イソキノリンアルカロイド生産の展望○佐藤 文彦（京大院・生命）fsato@lif.kyoto-u.ac.jp

植物が産生する様々な二次代謝産物は、植物自身の防御物質等として有用であるとともに、我々にとっても医薬品等の有用化合物として有益である。一方、これらの成分の生合成は特定の植物種や組織に限定されることが多く、環境要因による変動とともに、生産性の不安定性をもたらしている。従って、植物細胞の全能性の立証以来、過去 40 年以上に渡り、細胞培養や代謝工学、さらには、合成生物学的手法等、様々な方法により生産性の改善が試みられている。
ここでは、モルヒネ等重要な医薬品を含むイソキノリンアルカロイドの植物細胞、ならびに、微生物における代謝工学／合成生物学研究の現状と課題を総括する。
イソキノリンアルカロイドは鎮痛薬モルヒネや抗菌整腸薬ベルベリン、あるいは抗菌剤サンギナリンなど、極めて多様な生理活性ならびに構造をもつ一群のアルカロイドである。構造的に多様ではあるが、前述のいずれの化合物も、チロシン由来のドーパミンと 4-hydroxyphenylacetaldehyde から合成されるノルコ
クラウリンを出発材料として合成される。これまでに、ベルベリンを高産生す
るオウレン培養細胞やサンギナリンを産生するハナビシソウ培養細胞等を用いて、ノルコクラウリン生合成から重要中間体レチクリン生合成に至る生合成酵素の単離や生合成酵素遺伝子の単離、さらには、レチクリンから前述のモルヒ
ネ等多様な化合物へと分岐する生合成系が遺伝子レベルで明らかになってきている。さらに、単離された遺伝子を用いて、植物細胞での代謝工学や、合成生物学による微生物生産系が構築されてきた（文献１）。
特に、注目される進展は、モルヒネ生合成系で唯一不明であった S-レチクリン
から R-レチクリンへの変換酵素遺伝子が昨年同定されるとともに、酵母、あるいは、大腸菌系を用いて、単純な基質（グルコース）からのテバイン（モルヒ
ネ前駆物質）の合成が報告されたことである（文献２、３）。現在報告されている微生物でのモルフィナンアルカロイド生産性は、ug/L から mg/L 程度であり、実用化には大幅な生産性の向上が必要であるが、植物細胞の生育の遅さと比較すると、今後の生産性の改善による微生物生産には期待がもたれる。特に、テバインを出発材料とした実用的なオピエート（人工的鎮痛剤）の合成は、現在の植物由来の製法よりより効率的な生産と考えられる。一方、植物細胞は生育が遅いとはいえ、微生物による発酵生産では困難な多様な化合物を産生する能力と高い蓄積能を有している。
以上のように、植物細胞、微生物とも、それぞれ、利点と欠点を有しており、目的化合物の実生産には、それぞれの特性を活かした生産体系の構築が不可欠である。なお、実生産においては、既存の生産物を凌駕する機能性をもつ化合物の生産が不可欠と思われる。また、モルフィナンアルカロイド生合成系を有する微生物の場合、不正利用に対する管理が必要であり、合成生物学における生命倫理の課題についても述べたい。

2S-Ca01147

Engineering by proxy: Monobody-mediated control of
enzyme specificity and activity○Shohei Koide1,2(1Perlmutter Cancer Center, New York Univ Langone Medical
Center, 2Dept Biochem & Mol Biol, Univ of Chicago)
Shohei.Koide@nyumc.org

Over the last two decade, our group has invented and refined the monobody
technology. Monobodies are synthetic binding proteins built on the scaffold of the
fibronectin type III domain. From highly designed combinatorial libraries, we havegenerated monobodies with high potency and specificity to diverse target molecules. I
will present applications of the monobody technology to controlling enzyme
properties. Standard approaches for engineering enzymes modify enzymes themselves.
However these approaches are often impeded by unavailability of a detailed
understanding of the structure-function relationship or an appropriate high-throughput
assay. We have recently developed a strategy that overcomes these limitations. In our
approach, catalytic properties of enzymes are precisely modulated with monobodies
directed to an unmodified enzyme. We generate monobodies that bind in the close
vicinity to the active site of an enzyme but do not inhibit the catalytic activity. This
strategy enriches the type of monobodies that are likely to alter the substrate specificityof the targeted enzyme, enabling us to identify "modulator" monobodies by screening asmall number of candidates. Using this strategy, we successfully altered substratespecificity of two enzymes with distinct active-site architecture. Similarly, by targeting
monobodies to a regulatory site, we have generated both allosteric activators andinhibitors of oncogenic kinases. Our work provides a new paradigm for engineering
enzymes and expands enzyme-engineering technologies.

参考文献
1) Sato F. Biosci. Biotechnol. Biochem. 77, 1-9 (2013), 2) Galanie S. et al., Science
349, 1095-1100 (2015), 3) Nakagawa A. et al. Nat. Comm. 7, 10390 (2016)

Perspectives of Isoquinoline Alkaloid Production via Metabolic Engineering○Fumihiko Sato
(Grad. Sch. Biostud., Kyoto Univ.)

Key words
bioethics

metabolic engineering, synthetic biology, isoquinoline alkaloids,

Engineering by proxy: Monobody-mediated control of enzyme specificity
and activity○Shohei Koide1,2(1Perlmutter Cancer Center, New York Univ Langone Medical Center, 2Dept
Biochem & Mol Biol, Univ of Chicago)

Key words
protein engineering, directed evolution, combinatorial protein library,
enzyme engineering

148

Artificial Molecular Design to Create “Neobiological Molecules”＜国際シンポジウム＞

2S-Ca02

Application of next-generation sequencing to antibody
engineering
Aerin Yoon, Sanghoon Lee, Soohyun Kim, Duck-kyun Yoo,
Hyroi Kim, ○Junho Chung(Seoul National University College of Medicine)junhochung@me.com

2S-Ca03

Self-assembling supramolecular nano-architectures
created from de novo protein nano-building blocks
Naoya Kobayashi, Naoya Kimura, ○Ryoichi Arai
(Fac. Textile Sci. Technol., Shinshu Univ.)
rarai@shinshu-u.ac.jp

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool to analyze individual genes
inside complex library. And it was a big question whether we can apply it to antibody
engineering and get diverse antibody clones using the NGS data.
After bio-panning of three scFv phage libraries on antigen, we prepared plasmid DNApool of the last round. Then we performed NGS and obtained HCDR3 sequences.
Using these HCDR3 sequences we synthesized PCR primers and performed PCR to
get the physical DNA of scFv clones from the plasmid DNA pool. The scFv DNA wascloned into phagemid vector and the binding activity of scFv clones was determined tocompare with that of clones obtained from conventional colony selection.
Most of the antibody clones obtained using NGS showed reasonable binding activity,
which was quite comparable to that of antibody clones from conventional colony
selection.
In conclusion, our study demonstrated that NGS provides an effective tool for
obtaining antibody clones from antibody library in a high through-put manner.

Living organisms are maintained by various self-assembling biomolecules including
proteins, nucleic acids, sugars, and lipids. The chemical reconstitution of living matteris one of the ultimate goals of chemistry, biology, and bioengineering. Molecular
design to create artificial proteins that self-assemble into supramolecular complexes as“neobiological molecules” is an important step toward achieving the goal and further
applications.
Recently, we described the three-dimensional structure of WA20, a de novo protein that
forms an intermolecularly folded dimeric 4-helix bundle (so-called dimeric“nunchaku”-like structure) (Arai, R. et al., J. Phys. Chem. B, 2012, 116, 6789). To
harness the unusual intertwined structure of WA20 for the self-assembly of
supramolecular nanostructures, we created a protein nano-building block (PN-Block),called WA20-foldon as a simple and versatile nano-building block, by fusing thedimeric structure of WA20 to the trimeric foldon domain of fibritin from bacteriophage
T4 (Kobayashi, N. et al., J. Am. Chem. Soc., 2015, 137, 11285). The WA20-foldon
fusion protein was expressed in the soluble fraction in Escherichia coli, purified, andshown to form several homooligomeric forms. The stable oligomeric forms were
further purified and characterized by a range of biophysical techniques. Size exclusion
chromatography, multi-angle light scattering, analytical ultracentrifugation, and smallangle X-ray scattering (SAXS) analyses indicate that the small form (S form), middle
form (M form), and large form (L form) of the WA20-foldon oligomers exist as
hexamer (6-mer), dodecamer (12-mer), octadecamer (18-mer), and tetracosamer (24mer), respectively. These findings suggest that the oligomers in multiples of 6-mer are
stably formed by fusing the interdigitated dimer of WA20 with the trimer of foldon
domain. Pair-distance distribution functions obtained from the Fourier inversion of the
SAXS data suggest that the S and M forms have barrel- and tetrahedron-like shapes,
respectively. These results demonstrate that the de novo WA20-foldon is an effective
building block for the creation of self-assembling artificial nano-architectures.
Moreover, we designed and constructed an ultra-stabilized variant of the de novo
dimeric protein WA20, Super WA20 (SUWA). Surprisingly, the thermal denaturation
temperature of SUWA is 122 °C above the boiling point of water. Stabilized PNBlocks using the ultra-stabilized de novo dimeric protein SUWA are useful fordeveloping ultrastable nano-architectures and nano-biomaterials.
Furthermore, we designed and created de novo extender protein nanobuilding blocks(ePN-Blocks), constructed by fusing tandemly two de novo WA20 proteins withvarious linkers, as a new series of PN-Blocks to construct self-assembling extended
and cyclized chain-like nanostructures. Also, we successfully reconstructed
heteromeric complexes as quaternary structures from extender and stopper PN-Blocks
by denaturation and refolding. In addition, we demonstrate that the complexes canfurther self-assemble into supramolecular nanostructures on mica surface as “superquaternary structures,” suggesting further possibilities of the PN-block approach.
All these results demonstrate that the PN-Block approach using the de novo dimeric
proteins is a powerful strategy for artificial molecular design to create self-assemblingnano-architectures and supramolecular nanostructures as “neobiological molecules.”Application of next-generation sequencing to antibody engineering

Self-assembling supramolecular nano-architectures created from de novo
protein nano-building blocks

Aerin Yoon, Sanghoon Lee, Soohyun Kim, Duck-kyun Yoo, Hyroi Kim,
○Junho Chung(Seoul National University College of Medicine)

Key words

antibody, phage display

Naoya Kobayashi, Naoya Kimura, ○Ryoichi Arai
(Fac. Textile Sci. Technol., Shinshu Univ.)

Key words
protein engineering, protein nanobuilding block, de novo protein,supramolecular nanostructureArtificial Molecular Design to Create “Neobiological Molecules”＜国際シンポジウム＞

2S-Ca04 〈招待講演（韓国生物工学会）〉
Marine-derived biosilicification: Silica-forming proteins
and their applications
Mi Ran Ki, Ki Baek Yeo, Sung Ho Kim, Jong Ki Kim,
Kho My Nguyen, Van Pham, ○Seung Pil Pack
(Dept. Biotechnol. and Bioinfo. Sch. Sci. Tech., Korea Univ.)
spack@korea.ac.kr
Silica with nontoxic and highly biocompatible characteristics can be applied for tissue
scaffolds, drug-delivery system, biosensors and imaging. For silica synthesis,
conventional methods typically require a combination of high temperatures andextreme pH and also it is difficult to prepare controlled structures. However, thediscovery of the critical molecules involved in biosilicifica found both in diatoms(silaffins and polyamines) and sponges (silicateins) brings out understandings about
silica forming process in vivo and has presented a new paradigm for silica synthesis
under ambient or mild conditions. The use of biosilicification machinery is based on
the availability of enzymatically active recombinant proteins involved in silica
formation. Recombinant silicatein (SIL), however, was expressed both inheterogeneous host systems, yielding limited quantities of the protein or inclusion
body. To overcome these limitations, design of SIL or SIL-like protein should be
required. In this study, two alternative silica-forming proteins are focused: CAT,hypothetical cathepsin-like protein from Nematostella vectensis; and SIL-likecathepsin (SLC), a mutant CAT obtained by mutating residues.

2S-Ca05149

cDNA display method and its applications for in vitro
selection of functional peptides○Naoto Nemoto(Grad. Sch. Sci. & Eng., Saitama Univ.)
nemoto@fms.saitama-u.ac.jp

Evolutionary molecular engineering has successfully been applied for development
and optimization of wide range of peptides/proteins, including antibody drugs andindustrial enzymes. Currently, phage display is used as the most popular evolutionary
molecular engineering technique to select a peptide with affinity against a target
molecule, but diversity of library obtained by this technique is not so high. Hence, toexpand the library size and also to introduce non-natural amino acids, in vitro display
techniques are developed that utilize cell-free translation system.
cDNA display1, which was developed by our group based on mRNA display, is one of
the most promising in vitro display techniques, and can create a library of 1012 peptide
molecules. In mRNA display, a peptide is covalently conjugated with its encodingmRNA in a ribosome via a puromycin molecule. In cDNA display, however, a peptide
is linked with its corresponding cDNA by the specially designed puromycin-linker.
Because DNA is much more stable than RNA, cDNA display is more favorable forselections in biological conditions. Another benefit of cDNA display is the ease ofmodification of displayed proteins and peptides after translation, because the displayed
molecules can be immobilized on a magnetic bead using the above-mentioned linker,
which allows for rapid and efficient buffer exchange.
In this symposium, I will present applications of cDNA display method to develop
peptide aptamers against three different kinds of target species, 1) a G protein-coupled
receptor on living cells: growth hormone secretagogue receptor (GHS-R), 2) achemical functional group: amino-group, and 3) liposome: artificial lipid bilayer.
Traditionally, in vitro display techniques (e.g., ribosome display, mRNA display) havenot been applied for selections using living cells because mRNA-protein complexes
are not ribonuclease-resistant. With cDNA display, in contrast, we succeeded inscreening a peptide library and identifying an antagonistic peptide of GHS-R2. Next,
we obtained some peptide aptamers that recognize a specific functional group on asolid phase (i.e., amino group on beads or glass) from a disulfide-rich peptide library3.
In addition, we recently performed in vitro selection to obtain peptides that bound toliposome from random peptide library (30 residues in length). After six rounds of
selection, the random sequences were converged to a unique consensus amino acidsequence. The selected peptide was chemically synthesized and modified withfluorescein at C-terminus. We then examined how the peptide interacted with liposome
membrane using a confocal laser scanning microscopy. Interestingly, the peptide
seemed to anchor into liposome membrane with its N-terminal half. So, we fused red
fluorescent protein (RFP) to the C-terminus of the liposome-binding peptide andconfirmed that the peptide-RFP conjugate could also interact with liposome
membrane4. These examples illustrate the practical utility of cDNA display technique
as a platform to identify novel peptides with interesting features.
A part of the study was supported by JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific
Research on Innovative Areas “Molecular Robotics”, Grant-in-Aid for Scientific
Research (C) and the Core Research for Evolutional Science and Technology (CREST)
Program, through the Japan Science and Technology Agency.
References:
1. Mochizuki, Y., et al., ACS Comb. Sci., 13, 478-485 (2011)
2. Ueno, S., et al., PNAS, 109, 11121-11126 (2012)
3. Mochizuki, Y., et al., Chem Commun, 50, 5608-5610 (2014)
4. Kobayashi, S., et al, submitted

Marine-derived biosilicification: Silica-forming proteins and theirapplications
Mi Ran Ki, Ki Baek Yeo, Sung Ho Kim, Jong Ki Kim, Kho My Nguyen, Van Pham,○Seung Pil Pack
(Dept. Biotechnol. and Bioinfo. Sch. Sci. Tech., Korea Univ.)
Key words

Biosilica, Silicatein, Cathepsin

cDNA display method and its applications for in vitro selection of functional
peptides○Naoto Nemoto(Grad. Sch. Sci. & Eng., Saitama Univ.)

Key words
evolutionary molecular engineering, in vitro selection, cDNA display,
peptide aptamer

150

Artificial Molecular Design to Create “Neobiological Molecules”＜国際シンポジウム＞

2S-Ca06

RNA as a promising biopolymer to generate neobiologicalstructures and functions

2S-Ca07 〈招待講演（韓国生物工学会）〉
Biomolecule building blocks for memory device
development○Yoshiya Ikawa(Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama)
yikawa@sci.u-toyama.ac.jp

RNAs are versatile biopolymers that act not only as DNA-like genetic materials but
also have diverse functions in regulation of cellular biosystems. RNA is capable ofregulating gene expression by sequence-specific hybridization. This feature allows thedesign of RNA-based artificial gene regulators (riboregulators). RNA can also build
complex 2D and 3D nanostructures, which afford protein-like functions (riboswitches
and ribozymes) and make RNA an attractive material for nano-biotechnology.
Interactions between GNRA tetraloops and their receptors motifs are found frequently
as modular units in different classes of RNA structures. Because of their functional
importance, GNRA/receptor interactions have been investigated with regard to theirbiochemical properties and 3D structures. Artificial RNA motifs that can functionallyreplace the naturally occurring GNRA/receptor interactions have been isolated fromRNA libraries [1,2].
By using these natural and artificial GNRA/receptor motifs, we have designed dimeric,trimeric, and tetrameric RNA nanostructures based on the Tetrahymena group I
ribozymes, which can exhibit catalytic ability depending on controlled
oligomerization. Because most of RNA-based nanostructures reported previously are
unrelated to naturally occurring RNAs with modular structures, modular redesign ofcomplex RNA structures allows us large ribozymes to be used as modular parts in
RNA nanotechnology and RNA synthetic biology [3].
References[1] Ishikawa, J., Fujita, Y., Maeda, Y.,Furuta, H., Ikawa, Y. GNRA/receptor interacting
modules: versatile modular units for natural and artificial RNA architectures. Methods,
54, 226-238 (2011)[2] Ishikawa, J., Furuta, H., Ikawa, Y. An in vitro-selected RNA receptor for the
GAAC loop: modular receptor for non-GNRA-type tetraloop. Nucleic Acids Res., 41,3748-3759 (2013)[3] Tanaka, T., Matsumura, S., Furuta, H., Ikawa, Y. Tecto-GIRz: engineered group I
ribozymes the catalytic ability of which can be controlled by self-dimerization.
ChemBioChem., accepted (2016)

RNA as a promising biopolymer to generate neobiological structures andfunctions○Yoshiya Ikawa(Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama)

Key words

RNA, ribozyme, RNA nanotechnology, group I intron○Hyun Ho Lee(Myongji University)
hyunho@mju.ac.kr

Conjugation of various biomolcules on nanoparticles (NPs) has recently initiated novel
works in the nanoelectronic and bioelectronic device. In this presentation, bioelecronic
structures using protein, short-peptide, aptamer, antibiotic, oligo-DNA conjugatedsemiconductor or metal NPs as charge storaging elements on metal-pentaceneinsulator-silicon (MPIS) floating gate device and metal-insulator-metal (MIM)
resistive switching device are introduced and discussed. Particularly, highly specificmolecular recognition between streptavidin-biotin, aptamer-cell membrane peptide,chromatin protein-histone protein, and complementary oligo-DNA hybridization
mimicked from biological systems have been employed as formation mechanism of
self-assembly monolayers (SAMs) of the NPs.
The potential outlook of this research will be a tangible progress of biomolecularelectronics implemented by the interface between biomolecules and electronics. In
addition, bioelectronic structures using biomolecules of neuro-molecules or neurotransmitters conjugated NPs as nanotrap elements on MIM resistive switching device
are demonstrated and discussed. Neurotransmitter molecules were chemicallyconjugated to the NPs respectively and current/voltage (I-V) characteristics of theresistive switching were detected to show bistable and multistate electrical resistive
conditions, which accomplish analog switching characteristics. Thus, the device canopen up a bioelectronic device acting as memory and calculation elements
simultaneously, aiming at neuromorphic device.

Biomolecule building blocks for memory device development○Hyun Ho Lee(Myongji University)

Key words

Nanoparticle, Memory device, Bioelectronics

Japan-Korea Joint Symposium “Advancements in Medical Engineering Using Nano- and Micro-biotechnology”〈国際シンポジウム〉

2S-Da01

NanoBiosensors for biomedical applications○Eiichi Tamiya(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)tamiya@ap.eng.osaka-u.ac.jp

2S-Da02

151

Nanobiolelectronic device toward biocomputing system○Jeong-Woo Choi1,2(1Dept. Chem. Biomol. Eng., Sogang Univ., Korea, 2Reserach
Center for Sogang-Harvard Disease Biophysics, Sogang Univ.,
Korea)
jwchoi@sogang.ac.kr

Nanotechnology has come to collaborate with biotechnology. Interdisciplinary
Nanobiotechnogy researches have been based on nanomaterials, bionano studies andnanodivices. Nanostructured metals have been studied for the localized surface
plasmon resonance (LSPR) and electrochemical biosensors. Photonic plasmon spectra
are caused by the refractive index variations that result from the binding of molecules
to the metal nanostructures. There are optically detectable parameters in biophotonics
and biosensor devices. We have studied several types of nanostructures (Anal.Chem.
77, 6976, 2005, Anal.Chem.79, 1855, 2007, ACS Nano, 3, 446, 2009, Anal. Chem. 82,
1221, 2010), (1) gold-capped nanostructure connecting with the core of silica
nanoparticle capped by deposited gold film, (2) gold-deposited porous anodic alumina
layer chip, (3) gold nanoparticles onto silicon oxide /silicon interferrometric multilayerand (4) nano-pillar structures by nanoimprinted polymer materials and sputtering a thingold layer on them. The bio-sensing of these nanostructures have been examined bymonitoring the biomolecular interactions in various flexible formats. Antibody-antigen
and DNA hybridization reactions were performed to detect various biomarkers, withthe detection limit of picogram levels. The multi array format was constructed by acore-shell structured nanoparticle layer, which provided 300 － 1000 spots on thesensing surface (Anal.Chem.78, 6465, 2006). A microfluidic biochip based on PDMS
was useful for real-time analysis, rapid detection. DNA amplification process (PCR)(Anal.Chim.Acta, 66,111,2010).and monoclonal antibody production from hybridoma
cell library can be monitored. Electrochemistry measurements connecting to LSPR
chips were successfully exploited in a simultaneous detectable scheme. The binding of
melittin to lipid membrane was measured using localized surface plasmon resonance,
and the permeability of the lipid membrane was then assessed electrochemically as afunction of melittin with the purpose of seeking a novel, sensitive detection system for
peptide toxins (Anal.Chem.80,1859,2008). These nanoporous structures weretransferred to the cyclo-olefin polymer film surface from the porous mold by a thermal
nanoimprinting process. A plasmonic substrate was fabricated by sputtering a thinlayer of gold onto this nanopillar polymer structure and the refractive index response ina variety of media was evaluated. Finally, the biosensing capacity of this novel
plasmonic substrate was verified by analysis of human immunoglobulin (Anal.Chem.
84,5494, 2012).Gold nanoparticle-antibody can be linked with new electrochemical
immunoassay as GLEIA (gold linked electrochemical immunoassay). High sensitive
detection of human chorionic gonadotropin (0.36 pg/mL) and insulin (0.1ng/mL) werereported (Electroanalysis, 20,14,2008). Antioxidative activity in food and amount ofresidual pesticides are also monitored by redox indicators and printable electrodes.
Microbial respiration activity can be monitored by printable electrodes and mobile
detector and applied to rapid measurement of microbial viable cells (Electrochim.Acta,
82,132,2012). Eletrochemical luminescence was also studied for monitoring enzyme
activity and immuno-reactions with luminol-gold nano particles (Electrochim.Acta
180,409,2015). Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) was also discussed withgold and silver nanoparticles interacting with bio-molecules. Gold nanoparticles weresuccessfully delivered into single cells. Spatiotemporal measurements of SERS
fingerprints suggested the dynamic molecular interactions and transformations taking
place at different locations with time in cardiomyocytes (PLoS ONE, 6(8)e22801,2011) . Raman imaging was also useful for ex vivo analysis for osteoblast
differentiation. (Scientific Reports, 5:12529, 2015)

Nanobioelecronic devices based on hybrid biomaterial have emerged as a breakthroughwith huge potentiality to generate new concepts and technologies for the developmentof new age electronic devices. The main concept of bioelectronics was generated fromthe fact that biomaterial, especially metalloproteins, can be used as a functional unit inan electronic device. Major challenges in bioelectronic field include theminiaturization, and the demonstration of various functions implemented inbiomaterial to alter silicon-based electronic devices. It has been difficult todemonstrate a single molecular-based computing device in current computing system,
since such silicon-based system requires complex functionality to be developed at thesingle molecular level. In this point of view, metalloprotein-based conceptual
biomemory device was developed which demonstrateed memory characteristics
including ‘read’, ‘write’ and ‘erase’ function. Further, multi-bit memory function andnanoscale memory function are also demonstrated. Afterwards new hybrid material
including metalloprotein/DNA/nanoparticle has been developed to constructbioprocessing device to achieve various functions at the single molecular level. A
metalloprotein that exhibits redox property is used as a biomemory signal source, andvarious nanoparticles with complementary DNA and metal ions are used as input
signals to acquire processed output signals. Various functions including ‘information
reinforcement’, ‘information regulation’ and ‘information amplification’ areaccomplished in this device due to various input signals. The proposed hybridmaterial-based bioprocessing device by the integration with neural cell should be a
new type of platform for development of biomolecular-based biocomputing system.

NanoBiosensors for biomedical applications

Nanobiolelectronic device toward biocomputing system○Eiichi Tamiya(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

biosensor, nano biotechnology, immuno-assay, bioimaging

Acknowledgements
This research was supported by Leading Foreign Research Institute Recruitment
Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the
Ministry of Science, ICT & Future Planning (MSIP) (2013K1A4A3055268) and by the
National Research Foundation of Korea (NRF) grant funded by the Korea government(MSIP) (No. 2014R1A2A1A10051725).
References
1. Lee, T.; Kim, S.-U.; Min, J.; Choi, J. W.; Adv. Mater., 2010, 22: 510.
2. Lee, T.; Yagati, A.K.; Min, J.; Choi, J. W.; Adv. Func. Mater., 2014, 24: 1781.
3. El-Said, W. A.; Cho, H. -Y.; Yea, C. -H.; Choi, J. W.; Adv. Mater., 2014, 26: 910.
4. Kim, T. -H.; Yea, C. -H.; Chueng, D. -S., Yin, P. T.; Conley, B.; Dardir, K.; Pak, Y.;
Jung, G. Y.; Choi, J. W.; Lee, K. -B.; Adv. Mater., 2015, 27: 6356.

○Jeong-Woo Choi1,2(1Dept. Chem. Biomol. Eng., Sogang Univ., Korea, 2Reserach Center for SogangHarvard Disease Biophysics, Sogang Univ., Korea)

Key words

metalloprotein, hybrid material, bioelectronics, bioprocessing device

152

Japan-Korea Joint Symposium “Advancements in Medical Engineering Using Nano- and Micro-biotechnology”〈国際シンポジウム〉

2S-Da03

Biomedical application of microfluidic device with low
cost flow control

2S-Da04○Yuzuru Takamura(Sch. Mater. Sci., JAIST)
takamura@jaist.ac.jp

Formation of cellular sticker on extracellular matrix
network and its potential medical application○Kwanwoo Shin1,2, Youhwan Kim1,2, Serin Lee1,2, Keelyong Lee1,2,
Sojung Nam1,2(1Dept. Chemistry and Inst. of Biol. Interf., Sogang Univ., Korea,
2
Research Center for Sogang-Harvard Disease Biophysics, Sogang
Univ., Korea)
kwshin@sogang.ac.kr

Many microfluidic devices have been developed for biomedical application, and someof them were functionalized by fluid control on chip. Fluid controls on chip are
required especially for the implementation of multi-step procedure of reaction, precise
or small sample handling, self-standing chip with automated operation, etc., and thesefunctions constitute a large part of the most attractive features of the microfluidic
devices. The micro pumps and valves for those fluid control on-chip, however, request
expensive technique and procedures for fabrications sometimes, which are disturbing
the easy realization of these chips for practical use. Our groups are studying costeffective fluid control on-chip. Here, we would like to introduce 3 examples ofdifferent types of them; (1) cost-effective and precise pneumatic micro pump forautomated immunoassay with washing step, (2) ultra-low fluid control enabling
sequential reagent deliver on-paper for full-automated ELISA, (3) low-cost highly
integrated pumps and valves with electrical control PZT actuator by solution process
for single-cell analysis on tissues.
For the first topic, we developed an automated compact immunoassay chip with lowcost disposable, mass-producible, postage-stamp-size microchip, for measurement of
insulin and glucose from whole blood [1]. The microchip consists of five layers of airlayers, diaphragm membrane, flow layers, screen-printed electrodes and substrates.
The chip can be produces in-print process and screen printing, and enables whole
protocols for immunoassay including sample loading, washing, and loading of reagent
for electrochemical measurement. It can measure glucose and sub-nanogram orderinsulin from 2 μl whole blood, within 15-20 min without handling help.
For the ultra-low cost applications, we report a new methodological concept toautomated paper-based devices for multistep sequencing of sandwich ELISA [2]. The
device is fabricated on the NC membrane, and consists of several flow pathways(channel) separated by barrier-lines patterned by inkjet printer. The required reagents,
such as antibodies (Abs) and substrates, were pre-spotted on the membrane at proper
locations in the pathways. To use it, people put the end of the device into a sample
solution, which migrates along with the channel by capillary action, then dissolves andconveys the pre-spotted reagents. The solution flows into separated channel and/or mix
again in a proper timing and sequence by design of the flow-path. Finally, the multisteps of the sequence of ELISA can be performed automatically. We confirmed that ahigh-sensitive ELISA was successfully performed with the measurement of the humanchorionic gonadotropin (hCG). The sensitivity was improved with pre-concentration
setup and pH changing system integrated also by paper technique. It enables powerless measurement, with high-sensitivity by enzyme amplification, just by dipping thedevices into samples, and waiting few tens minutes.
For more complex supplications, we are developing on-chip lead zirconium titanate(PZT) actuators array, using solution process. This process is using functional inks
which can be materials for semiconductor, insulator, conductor, structural material, andpiezo-electric material, just by painting and annealing. By using these ink, we canfabricate transistor, wires, fluidic channel, sensor-s and actuators with low-cost just by
printing and annealing. We already made PZT actuator by solution process withtemperature less than 450 degree C, which is advantageous for integration withtransistor to drive and control the actuators. By this technique, we can integrate andcontrol thousands of valves and pumps actively on a chip. We are now planning to use
this technic to develop a chip for single cells analysis on 2D plane, such as cell array,tissue surfaces, sections, and cultured cell networks.
[1] S. Shiohara, et al., Microsystem Technologies, 20, 273-279, 2013.
[2] A. Amara et al., Lab on Chip, 13, (2913), 126-135.

Spontaneous, highly ordered large-scale fibronectin networks driven by electrostatic
polymer patterns are fabricated, and these precisely controlled protein connections aredemonstrated. It is examined whether this scheme, universal to various fibrillar
extracellular matrix proteins beyond fibronectin, collagen, and laminin, can be selforganized. These data reveal a novel bottom-up method to form anisotropic, freestanding protein networks to be used as flexible, transferrable substrates for cardiac
and neuronal tissue engineering1. We demonstrated applications of these networks totemplate the formation of ECM composite fibers and cell patches, so-called “ECMnetwork based cell sheet”. Collectively, our results suggest that proteins that areendowed with β-sheet molecular domains and do not require external crosslinking toform insoluble fibers are capable of self-assembling into networks and that theseprecisely controlled connections provide a flexible, transferable substrate customized
for tissue engineered cardiac and neuronal scaffolds. In this method, one of the mostadvantageous points is that one can use patient’s own cells to produce the patientspecific patches, while minimizing severe inflammation. Therefore, we will present
our recent application, applying self-healing patches for dermatological, and organspecific application.2 Recently, we further developed to initiate the ECM
fibrollogenesis on lipid vesicles. We controlled the surface charge density of
unilamellar lipid vesicles, and monitored the surface adsorption and network-formationof ECM proteins (collagen and fibronectin). Improved mechanical strength against
osmotic pressures was carefully measured. Once the ECM network formed on thevesicle surface, the mechanical properties of liposomes were changed. We could finally
mimic the living cellular properties with these minimal cell structures, artificiallyfabricated with ECM and lipid molecules.3

Biomedical application of microfluidic device with low cost flow control

Formation of cellular sticker on extracellular matrix network and its
potential medical application○Yuzuru Takamura(Sch. Mater. Sci., JAIST)

Key words

biosensor, microfluidic device, lab on paper, ELISA

1. Seungkuk Ahn, et al., Adv. Mater. 27 (18), 2838-2845 (2015)
2. Youhwan Kim, et al., Int. Neurourol J, 20 Suppl 1, S23-S29 (2016)
3. Kwanwoo Shin, submitted (2016)○Kwanwoo Shin1,2, Youhwan Kim1,2, Serin Lee1,2, Keelyong Lee1,2, Sojung Nam1,2(1Dept. Chemistry and Inst. of Biol. Interf., Sogang Univ., Korea, 2Research Center
for Sogang-Harvard Disease Biophysics, Sogang Univ., Korea)

Key words

extracellular matrix, fiber, fibronectin, Liposome

Japan-Korea Joint Symposium “Advancements in Medical Engineering Using Nano- and Micro-biotechnology”〈国際シンポジウム〉

2S-Da05

Rapid generation of monoclonal antibodies using
lymphocyte-microarray chip

2S-Da06○Tatsuhiko Ozawa, Hiroyuki Kishi, Atsushi Muraguchi(Dept. Immunol., Grad. Sch. Med. Pharm. Sci., Univ. Toyama)
toz@med.u-toyama.ac.jp

153

A soft microfluidic device as an in vitro model forstudying mechanobiology of tubular organs
Hyeonji Yu1,2, Dongwon Kang1,2, Kwangin Shin1, Minji Hwang1,2,○Jungwook Kim1,2(1Dept. Chem. Biomol. Eng., Sogang Univ., Korea, 2Res. Center for
Sogang-Harvard Disease Biophysics, Korea)
jungwkim@sogang.ac.kr

Monoclonal antibodies produced by single B-cell clones are widely used in laboratory
researches as well as clinical applications due to their high specificity and high affinity.
Because each B-cell clone expresses an antibody with a unique antigen-binding
structure and because more than 109 B-cell clones producing distinct antibodies exist ineach individual, it is difficult to detect and identify antigen-specific antibodyproducing B-cells whose frequencies are very rare. Hybridoma cells are conventionallyproduced for producing mouse monoclonal antibodies. However, production of humanor rabbit hybridoma cells is difficult.
To overcome this problem, we have developed a lymphocyte-microarray chip with alarge number of microwells whose size and shape just fit for capturing a single cell.
The chip allows rapid and comprehensive analysis of single cells. We have utilized
lymphocyte-microarray chip and developed novel system for screening antibodysecreting cells at single cell levels (immunospot array assay on a chip, ISAAC). It can
detect antigen specific antibody-secreting cells from primary human or rabbit
peripheral blood mononuclear cells and can produce their antigen-specific monoclonal
antibodies within a week. Using ISAAC technology, we obtained many human or
rabbit monoclonal antibodies that were specific to viruses, autoantigens,phosphorylated peptides, and G-protein coupled receptors. In this talk, I would like tointroduce lymphocyte-microarray chip, the generation of monoclonal antibodies using
the chip and the applications of the produced antibodies.

Mechanobiology is a field of science at the interface of biology and engineering andfocuses on the way that physical forces and changes in cell or tissues mechanics
contribute to development, physiology, and pathological condition. For example,
mechanobiological study on the formation of atherosclerotic plaque in arteries revealed
that disturbed blood flow near geometrically complex arteries - curved, branched, orbifurcating - contributes to increases in the permeability of endothelium and therecruitment of leukocytes, which in turn make such arterial regions to be more prone tothe formation of atherosclerotic plaque. A number of tubular organs exist in our body,e.g. blood and lymphatic vessels, airways of lungs, and urethra, inside which fluids
flow and exert mechanical forces, e.g. hydrostatic pressure, circumferential stress, andshear stress on luminal walls. Characteristics of the mechanical force vary upongeometrical and mechanical properties of luminal walls, which may also be varied
temporally during development or pathogenesis. In light of this, a development of invitro models of tubular organs whose geometrical and mechanical properties, andhence, the forces exerted by fluids on cells comprising luminal walls can be variedsystematically would be helpful in studying mechanobiology of tubular organs. Here
we present the unique method to develop the soft tubular microfluidic device that
recapitulates geometrical and mechanical properties, and thus the forces exerted by
fluids, of vasculatures and their pathological condition. For future studies, we aim tosystematically explore the effects of the forces exerted by the blood on ECs attachedon the hydrogel channel.

Rapid generation of monoclonal antibodies using lymphocyte-microarraychip

A soft microfluidic device as an in vitro model for studying mechanobiologyof tubular organs○Tatsuhiko Ozawa, Hiroyuki Kishi, Atsushi Muraguchi(Dept. Immunol., Grad. Sch. Med. Pharm. Sci., Univ. Toyama)

Key words

monoclonal antibody, lymphocyte-microarray chip, ISAAC

Hyeonji Yu1,2, Dongwon Kang1,2, Kwangin Shin1, Minji Hwang1,2,○Jungwook Kim1,2(1Dept. Chem. Biomol. Eng., Sogang Univ., Korea, 2Res. Center for Sogang-Harvard
Disease Biophysics, Korea)
Key words

hydrogel, microfluidic device, mechanobiology

154Japan-Korea Joint Symposium “Advancements in Medical Engineering Using Nano- and Micro-biotechnology”〈国際シンポジウム〉／
新規な核酸関連酵素の開発とその産業応用

2S-Da07 〈招待講演（韓国生物工学会）〉

2S-Ea01

Aptamer-based strategies for biosensing and switching of
DNA polymerase○Hyun Gyu Park
(Dept. Chem. Biomol. Eng., Korea Adv. Inst. Sci. Technol.)hgpark@kaist.ac.kr

新規３酵素の組み合わせによる cDNA 合成技術の開発○保川 清（京大院・農）yasukawa@kais.kyoto-u.ac.jp

In this presentation, I will introduce several aptamer-based innovative technologies
developed in my group. First, a novel DNAzyme molecular beacon strategy wasdeveloped for target-induced signal-amplifying colorimetric detection of target nucleic
acids and target protein. By rationally designing enzymes for signal amplification,
ultrasensitive aptasensors were developed and successfully tested in systems to detecttarget nucleic acids and target lysozyme with a detection limit down to 1 pM and 0.1
fM, respectively. We also probed a novel concept that target DNA can induce
switching of DNA polymerase activity, which was successfully employed to identify
the presence of target DNA with high levels of sensitivity and selectivity. We further
developed a new strategy to modulate DNA polymerase activity in a reversible andswitchable manner by utilizing specific metal ion-mediated base pairings (T-Hg2+-T
and C-Ag+-C) within DNA aptamer having the inhibitory capability against DNA
polymerase. These works will greatly advance aptamer-based strategies for biosensing
and artificial modulation of DNA-related biological reactions.

RNA 解析の情報量は DNA 解析よりも多い。例えば、トランスクリプトーム解
析では同一個体でも細胞種や外部刺激が異なれば、結果が異なる。一方、RNA解析の中核をなす cDNA 合成技術は 1980 年代から進歩しておらず、モロニー
マウス白血病ウイルス（MMLV）あるいはトリ骨髄芽球症ウイルス（AMV）由来の逆転写酵素（RT）が使われ続けている。cDNA 合成は、鋳型 RNA がつく
る二次構造および RT の不安定性により、感度あるいは正確性（正しいヌクレ
オチドを取込む性能）が DNA 合成に及ばない。
近年、MMLV RT において、鋳型プライマーとの結合領域に存在し側鎖が負電荷を有する残基（E286、E302）が正電荷を有する残基に、分子表面に存在する疎水性残基（L435）が電荷を有する残基に、RNase H 活性の触媒残基（D524）
が Ala にそれぞれ置換されることにより耐熱性が向上した変異体 E286R/E302K/
L435R/D524A（MM4）が開発された 1)。また、高い耐熱性と校正活性を有する
好熱性細菌 Thermotoga petrophila K4 株由来ファミリー A DNA ポリメラーゼ（K4pol）において、RNA との結合でリボース 2’位水酸基と立体障害を起こすと予測された L329 が Ala に置換されることにより逆転写活性を獲得した変異体
K4polL329A が開発された 2)。さらに、超好熱性アーキア Thermococcus kodakarensis
由来スーパーファミリー 2 の DNA/RNA ヘリカーゼである Tk-EshA が、PCR で見られる非特異的増幅を軽減させることが見出された 3)。我々は、MM4、
K4polL329A、Tk-EshA の組み合わせることにより、RNA の二次構造やプライマーのミスアニールをなくすことによる高感度な cDNA 合成技術の開発を試みた。
これまで知られている MM4、K4polL329A 、Tk-EshA の最適反応条件は異なる。
我々はタグチメソッドとよばれている品質工学の技法を用いて、嘔吐型セレウス菌の毒素であるセレウリド合成遺伝子 cesD の mRNA4)をモデル RNA として、16 のパラメーター（MM4、K4polL329A、Tk-EshA、dNTP、KCl、Tris-HCl、Bicine-NaOH、 MgCl2、Mn(OCOCH3)2、CH3COOK、トレハロース、ATP、大腸菌 RNA、プライマー、グリセロールの各濃度および反応温度）を最適化した。
その結果、MM4 だけを用いた cDNA 合成と比較して、感度が 100～1000 倍向
上した。このことから、これら新規３酵素の組み合わせが cDNA 合成反応に有用であることが示唆された。この開発は独立行政法人科学技術振興機構の研究成果展開事業（先端計測分析技術・機器開発プログラム）による成果である。
1. K. Yasukawa et al. J. Biotechnol. 150, 299-306 (2010)
2. S. Sano et al. J. Biosci. Bioeng. 113, 315-321 (2012)
3. A. Fujiwara et al. Appl. Environ. Microbiol. in press (2016)
4. K. Yasukawa et al. Enzyme Microb. Technol. 46, 391-396 (2009)

Aptamer-based strategies for biosensing and switching of DNA polymerase

Development of cDNA synthesis method with a combination of novel three
enzymes○Hyun Gyu Park
(Dept. Chem. Biomol. Eng., Korea Adv. Inst. Sci. Technol.)Key words

biosensor, DNA aptamer, DNA polymerase, DNA switch○Kiyoshi Yasukawa(Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)

Key words

cDNA, reverse transcriptase, DNA polymerase, helicase

新規な核酸関連酵素の開発とその産業応用

2S-Ea02デジタル PCR の高感度化と臨床診断への応用○柳原 格, 名倉 由起子, 吉村 芳修（大阪母子保健総合医療セ研）
itaruy@mch.pref.osaka.jp

デジタル PCR は、最近開発された技術で特にコピー数（あるいは発現量）の少ない遺伝子の検出に適している。一方、通常のリアルタイム PCR 機器で定量解析が十分にできるサンプルをデジタル PCR を用いて解析する意味は無い。デジタル PCR がその威力を発揮するのは、反応溶液中に存在する数コピーから数十コピー、せいぜい数百コピーの遺伝子を同定するような場合に限られる。また
デジタル PCR の利点の一つは、通常のリアルタイム PCR と異なり絶対定量を行う際にスタンダード遺伝子の検量線を作成する必要がない。
市販されているデジタル PCR 機器には大きく 2 つの方式が採用されている。一つはドロップレットと呼ばれる微細な液滴中に１分子の遺伝子が入るように調整し PCR を行う方式である。Bio-Rad Laboratories 社などが採用している。他方
Thermo Fisher Scientific 社は、20,000 個のウエルに十分に希釈したサンプルを入れて PCR 反応を行い、陰性ウエル数を求め絶対定量を行う。これらいずれの方
法も 1 ドロップ或いは 1 ウエル中に１分子の遺伝子が入ることが理想であるが、必ずしもそうはならないため、ポワソン分布などの計算により各社ソフトを用
いて補正を行っている。
さて、デジタル PCR 技術の臨床応用について概説する。演者の専門の感染症の立場からすると、例えば数は少なくとも極めて病原性が高い細菌やウイルスの微量同定が可能な場合、隔離を含めた対策が取りやすい。より高感度に絶対定量できる本技術は非常に有用である。また、ウイルス疾患などで治療効果や、病状把握のため、従来は検出が困難なレベルでのウイルス量の定量は、病勢や病態を知る上でも重要である。また、次世代シーケンサーを用いた膨大なメタ
ゲノム情報から臨床上重要な菌を抽出し、同定してゆくのは実際には経験と知識が必要でなかなか困難な作業である。次世代シーケンサーで得られたデータを補完する意味においても極微量の細菌核酸を定量できるデジタル PCR はパワフルなツールとなる。他方、デジタル PCR は、レアな変異の検出にも威力を発揮する。例えば 1 万個に 1 個の癌関連遺伝子の変異を見つけることも理論上可能である。次世代シーケンサーによる癌関連遺伝子の解析と併せて用いること
により、残存腫瘍の検索や、超早期再発の検出など、臨床上重要な情報が得られる。これらの技術応用は、今はまだ実験的な側面が多いが症例を重ねることにより、本技術のより広い臨床応用が加速するものと考えられる。
デジタル PCR の技術的な問題点について言及する。ドロップレットであれ、ウエルであれエンドポイント PCR の結果が反映される。微量 PCR 反応を如何に効率的に行い、バックグラウンドと正確に区別するかは重要である。我々は、ヘリカーゼを利用し、臨床応用を視野に入れた効率的な核酸増幅技術の開発を行ってきた。デジタル PCR は 98℃に変性行程があるため、特に耐熱性ヘリカー
ゼに着目した (1)。非特異的な増幅を避けるため TaqMan プローブを用い 20,000
ウエルチップを用いてデジタル PCR を行った。その結果、これまでのところ耐熱性ヘリカーゼの添加によりデジタル PCR の効率が改善される場合があることが分かってきた。遺伝子の配列によりその効果は変動したため、標的に応じた最適化は必要である。デジタル PCR 技術を臨床現場での汎用性の高い医療技術として進化させるには、多くの臨床検体を用いた検討と、さらなる高感度化（革新的な１分子 PCR 増幅技術の開発など）が望まれる。

2S-Ea03

155

CRISPR/Cas9 を利用したゲノム編集技術開発から学ぶ
こと○石野 良純（九大院・農）ishino@agr.kyushu-u.ac.jp

生物は自らの遺伝情報の安定な維持と子孫への伝達のために、種々の DNA 代
謝酵素を有する。DNA 複製、修復、組換えなどの生命の基本メカニズムを理解しようとする研究が、DNA に作用する酵素の発見に繋がり、試験管内で DNAを切り貼りする遺伝子操作技術をもたらした。生物学における技術革新である。
その後、耐熱性 DNA ポリメラーゼの研究が PCR 技術の実用化に繋がり、遺伝子操作が顕著に簡便になった時に二度目の技術革新が起きた。最近脚光を浴びている RNA 誘導型ヌクレアーゼ CRISPR/Cas9 システムを利用したゲノム編集
技術は、その簡便性の高さにより急速に普及し、３度目の技術革新をもたらした。演者が 1986 年に発見した奇妙な繰り返し配列は、大腸菌のリン酸代謝制御
機構の分子生物学的研究で、アルカリホスファターゼアイソザイム形成に関わる酵素の遺伝子解析の中で見つかった。Iap 酵素をコードする遺伝子の下流に、
29 ヌクレオチドからなる規則正しい繰り返し配列が、32 ヌクレオチド長のス
ペースを挟んで 5 回繰り返していた。この独特の繰り返し配列が何を意味するのか不明であったが、これが後に、CRISPR (clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats) と呼ばれることになる。生命科学がゲノム解析時代に入り、多くの遺伝子配列データが蓄積されたことによって、CRISPR がアーキアの大部分と真正細菌の半分に見ること、繰り返し配列に挟まれたスペーサー領域がウイルスやプラスミドなどの外来遺伝子と類似性があることがわかった、またCRISPR の近傍には保存された遺伝子クラスターが見つかり、CRISPR と関連する機能を有していると予想されて、cas (clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)と名付けられた。こうして、CRISPR が原核生物の獲得免疫機能を担うことが予想され、それが実験的に証明された。cas は外来 DNA に対する免疫獲得と、次に同じ DNA が侵入した時にそれを切断するために必要な種々の酵素、蛋白質因子（Cas）をコードしている。遺伝子操作のはさみの役目をする制限酵素が外来 DNA を切断して、感染から自分自身を守る機能を担う
ように、CRISPR-Cas の免疫系もある特定の DNA を切断することで免疫を発揮するので、その機構をゲノム上の狙った位置での切断技術に応用できることに気付いた研究者は、CRISPR-Cas を用いたゲノム編集操作を試み、見事実用的な技術開発に成功した。演者が 1986 年（論文は 1987 年）に発見した繰り返し
配列は、ゲノム編集技術に応用されたことで、30 年の時を超えて思いがけなく
CRISPR として有名になった。本講演では、CRISPR 発見からその応用に至るまでの軌跡を辿りながら、CRISPR/Cas9 システムを利用したゲノム編集技術を概説するとともに、画期的な技術開発にとって核酸関連酵素研究が如何に重要であるかを議論したい。

(1) Fujiwara A. et al., Appl. Environ. Microbiol., 82, 3022-31 (2016)

Digital PCR, its clinical application○Itaru Yanagihara, Yukiko Nakura, Michinobu Yoshimura(Dept. Dev. Med., Res. Inst., MCH Osaka)

Key words

digital PCR, helicase

CRISPR/Cas9 ～from discovery of CRISPR to application for the practicalgenome editing～○Yoshizumi Ishino(Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words

genome, enzyme reaction, DNA binding, DNA-binding protein

156

新規な核酸関連酵素の開発とその産業応用

2S-Ea04

核酸分解酵素の組み合わせによる迅速なゲノム合成手法の開発

2S-Ea05○板谷 光泰（慶應大先端生命研）
mita2001@sfc.keio.ac.jp

生物（細胞）は全てゲノムを保有している。ゲノムは数百から数千の遺伝子を含む DNA 高分子であり、この巨大 DNA、特に 500 ｋｂを超える DNA を無傷で丸ごとクローニングできる宿主は枯草菌(1)と酵母(2)に限られる。現存のゲノ
ムを丸ごと取り扱うだけでなく、新たに有用なゲノムを設計してそれを完全合成できる時代になっている。即ち生物（細胞）の生き様そのものを計画的に予測し設定することが可能になったことから、特定の遺伝子が在る（または無い）
ことを前提にしたゲノムデザイン手法が今後の大きな課題である。
丸ごとクローニング、ゲノム合成、そしてゲノム編集の手段は通常の遺伝子ク
ローニング技術とは異なることが多い。我々は、枯草菌を宿主として巨大 DNAを合成するシステムを構築する道程(3)で核酸分解酵素を多用しており、「核酸合成」のために「核酸分解酵素」を使用するという一見パラドックスに見える例を紹介したい。
「ゲノム設計→ゲノム合成→細胞への導入→有用細胞→ゲノム
再設計→」の循環を繰り返す合成生物学的なアプローチでは時として自然に学
ぶ方法論は有効である。新規な機能を持つ核酸分解酵素の必要性も含めて巨大DNA 合成のためのツールとして核酸分解酵素の選択と応用を考えてみたい。
【参考文献】(1) Itaya, et al., PNAS, 102, pp15971-15976 (2005).
(2) Hutchison, et al., Science, 351,(2016).
(3) 板谷、柘植.日本生物工学会誌 91, pp319-321 (2013).

Point of care testing を志向した多項目遺伝子検査○佐野 創太郎, 兼﨑 祐介, 宮本 重彦（カネカ）
Sotaro.Sano@kaneka.co.jp

PCR などの核酸増幅法の開発により、核酸の分析技術は飛躍的に向上した。これらの技術を応用した遺伝子検査は、免疫的検査などに比べ相対的に高い検出性能を有しており、今では感染症検査や食品の品質検査などに不可欠な検査方法となっている。また近年、患者にとってより身近な場所（小規模医療施設やベッドサイドなど）における早期診断を志向した POCT（Point of care testing）という検査コンセプトが注目されており、遺伝子検査に関しても早期診断に資する POCT としての活用が期待されている。しかし、一般的な遺伝子検査は、煩雑な工程、長い時間、高価で大型の専用機器が必要であり、十分な設備や専門性の高い人員の確保が困難な小規模医療施設や発展途上国における普及が立
ち遅れている。
当社では、遺伝子検査の簡便・迅速化技術の開発を通してこの課題解決に取り組んでおり、その中で “カネカ核酸クロマト型チップ” を開発した。核酸クロマ
ト型チップは、ペーパークロマトグラフィーと DNA-DNA ハイブリダイゼー
ションの原理を応用した検出チップであり、PCR 産物を約 5 分で目視検出することができる。核酸クロマト型チップを用いた遺伝子検査においては、3’側の標的 DNA に相補的なプライマー領域と 5’側の DNA タグ領域を、非天然修飾部
位で繋いだ特殊なプライマーを利用する。このプライマーを利用して PCR を行うと、DNA ポリメラーゼによる伸長反応は非天然修飾部位においてブロックされ、5’側に一本鎖の DNA タグを有する PCR 産物が得られる。これらの両末端に存在する 2 種類の DNA タグは、それぞれ検出チップや着色粒子に固定化された DNA プローブ（DNA タグと相補的な一本鎖 DNA）と、熱制御などの特別な処理を必要とせず、室温下で選択的に結合する。つまり、このシステムによれば、一般的な PCR 産物の検出において必要な電気泳動槽や蛍光検出機を用いずに、PCR 産物をチップに展開するだけの簡便な操作で、その有無を迅速に判定することが可能である。また、DNA タグと DNA プローブの組み合わせは理論上無数に存在するため、検出チップ上に固定化する DNA プローブの種類や位置、着色粒子の色を変えることにより、多項目同時検査にも容易に対応可能である。
本講演においては、①DNA ポリメラーゼの鋳型認識特性を利用した核酸クロマ
ト型チップの開発経緯、②高感度化および多項目化に関する取り組み、③核酸
クロマト型チップを用いたウイルス性感染症および食中毒原因菌の検査システ
ムに関する内容を紹介する。

Use of certain DNases to synthesize large-sized genome DNA

Multiplex nucleic acid detection chip towards point of care testing

Key words
Bacillus subtilis, genome engineering, genome synthesis,
deoxyribonucleses

Key words○Mitsuhiro Itaya(Inst. Adv. Biosci. Keio Univ.)○Sotaro Sano, Yusuke Kanezaki, Shigehiko Miyamoto(Kaneka corp.)

multiplex PCR, DNA polymerase, DNA chip, POCT

新規な核酸関連酵素の開発とその産業応用／有用微生物の農作物への新しい展開とその将来像

2S-Ea06

簡便な遺伝子検出法「NASBA - 核酸クロマト法」の原理とその応用2S-Ap01○宇治家 武史, 林 司（カイノス）
ujiie-t@kainos.co.jp

これまで微量な標的遺伝子を高感度に検出するために、PCR 法を始めとしてNASBA 法や LAMP 法など様々な核酸増幅法が開発されてきた。核酸の検出法にも様々な技術があるが、標的核酸の配列情報を利用するか否かで２つに大別される。前者はハイブリダイゼーションに基づく TaqMan プローブ法や核酸ク
ロマト法などであり、後者にはゲル電気泳動法やピロリン酸マグネシウムを利用した濁度検出法が含まれる。このセッションでは、NASBA 核酸増幅法と核酸クロマト法を組み合わせた遺伝子検出法技術について焦点をあて、その原理や応用例について報告する。
NASBA 法は、３種類の酵素（逆転写酵素、RNase H、T7 RNA polymerase）と２種類のプライマーを用いた定温核酸増幅法である。具体的には１本鎖核酸（主に RNA）から逆転写酵素と RNase H の作用で標的遺伝子に対するプロモーター付きの ds－cDNA を形成させ、T7 RNA polymerase による転写反応で多量の一本鎖 RNA を合成する方法である。この一連の増幅反応は定温下で進行するため、ヒートブロックがあれば実施可能であり（特殊な専用機器は必要ない）、その増幅性能は 10 コピーの合成 RNA を 30－90 分間で 1012 倍に増幅する。また、NASBA 法の増幅産物が一本鎖 RNA であるため、以降の検出反応にハイブリダ
イゼーション法を利用する場合、変性工程を省略できるメリットがある。
核酸クロマト法は、標的核酸をクロマトストリップ上でラテラルフローにより検出する技術である。その検出操作は展開液を加えた増幅産物をクロマトスト
リップ上で展開するだけであり、非常に簡単である。標的核酸固有の塩基配列とサンドイッチハイブリする捕捉及び標識の 2 種オリゴプローブを設計することで特異性の高い検出が可能である。標識オリゴプローブに着色粒子を結合することで、標的核酸の目視検出ができる。更にクロマトストリップ上の捕捉用
オリゴプローブの種類を増やせば、複数の標的を１つのストリップで識別検出することも可能となる。
NASBA-核酸クロマト法の応用例として、ゲノム変異の多い RNA ウイルスの１つであるノロウイルスの検出や、市中肺炎の主要な原因菌である 5 菌種
（ Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumonia,
Chlamydophila pneumonia, Legionella pneumophila ）の Multiplex NASBA、増幅反
応阻害確認用の Internal Control との共増幅系、短時間での検出例、二本鎖核酸への応用などを紹介する。

NASBA－nucleic acid chromatography, a rapid and easy-to-use method forgene detection○Takeshi Ujiiye, Tukasa Hayashi(KAINOS LABORATORIES, INC.)

Key words

NASBA, nucleic acid chromatography

157

植物病害に対する微生物農薬の研究開発の現状および今後の展望○吉田 重信（農研機構・中央農研）
yoshige@affrc.go.jp

微生物農薬（ここでは微生物殺菌剤を指す）を活用した植物病害の生物的防除は、近年問題となっている薬剤耐性病原菌の出現や農薬残留の問題等を解決するための有力な病害防除手段として注目され、そのさらなる研究および製剤開発への期待が世界的規模で高まっている。しかしながら、我が国における近年の微生物農薬の販売量は、横ばいあるいは漸減の傾向となっている。我が国で微生物農薬の利用拡大が伸び悩む要因には様々なことが想定されるが、その中の一つに難防除病害である土壌伝染性病害（土壌病害）に対する開発が遅れていることが挙げられる。生産現場では土壌病害の防除に対するニーズは高い一方で現有する防除手段は限られていることから、土壌病害対策用の微生物農薬を新たに開発し防除手段の選択肢を拡げることは、生産現場での問題解決を図る上で喫緊に取り組むべき課題となっている。さらに、近年の我が国の農業においては、農業従事者の高齢化等に対応するための省力化・低コスト化技術の開発がより一層求められており、病害虫防除技術分野においては、より幅広い
スペクトラムを持つ農薬の開発に対する期待も高まっている。例えば、野菜・畑作に対する殺菌剤と殺虫剤のそれぞれ単独の出荷金額は、近年減少傾向であるにも関わらず、病害と虫害を一剤で防除する「殺虫殺菌剤」に該当する化学
農薬の出荷額は増加傾向にある。このことは、生産者が農薬散布の省力化および低コスト化に対する高い指向性を持っていることを示唆している。すなわち、病害と虫害の一剤防除を可能とする等の幅広いスペクトラムを持つ微生物農薬を開発することは、化学農薬の低減を目指す生産者や産地に対し防除手段の選択肢の幅を拡げることにつながるだけでなく、農薬使用の省力化および低コスト化にも貢献でき、総合的病害虫雑草管理（Integrated Pest Management: IPM）の一層の推進に役立つことが期待できる。
こうした背景のもと、演者らの研究グループは、一般に防除が困難とされ、多くの現場で被害が深刻となっているナス科野菜の土壌病害であるトマトおよびナスの青枯病、トマト萎凋病および根腐萎凋病を対象に、将来的に微生物農薬として開発できる微生物を選抜し、その効果的な処理法の開発を目指す研究を、
農林水産省のプロジェクト研究「低投入型農業のための生物農薬等新資材及びその利用技術の開発」（平成 23～25 年度）の中で行った。この中で、元来害虫に対し殺虫活性を示すことが知られている幾つかの微生物を用いて検討を行ったところ、細菌では Bacillus thuringiensis、糸状菌では Paecilomyces tenuipes が、トマト青枯病等の土壌病害に対しても実用性の高い抑制活性を持つことを見出し、これらを虫害と病害の両方への効果（デュアルコントロール効果）を示す
微生物として活用出来る可能性を明らかにした。
本講演では、微生物農薬開発の現状および本プロジェクト研究の背景に加え、上述のプロジェクト研究で得られた成果として B. thuringiensis および P. tenuipes
による実際の病害発生抑制試験の成績や推定される抑制機構等について概説するとともに、これら微生物の効果的な活用への提言および実用化に向けた展望等についても触れてみたい。

Current progress and perspectives on development of biopesticides against
plant diseases○Shigenobu Yoshida(NARO/ARC)

Key words
tenuipes

biopesticide, soilborne disease, Bacillus thuringiensis, Paecilomyces

158

有用微生物の農作物への新しい展開とその将来像

2S-Ap02

植物の免疫システムと共棲微生物を介した環境適応○西條 雄介, 晝間 敬
（奈良先端大・バイオ）saijo@bs.naist.jp

2S-Ap03

水生植物由来 PGPB の作用機構と農作物への利用可
能性○森川 正章, 三輪 京子（北大院・環境）
morikawa@ees.hokudai.ac.jp

植物の細胞表面には微生物の構成成分 Microbe-Associated Molecular Patterns(MAMP)や、自己の細胞ダメージシグナル Damage-Associated Molecular Patterns(DAMP)を認識して防御応答を誘導するパターン受容体が備わっている。それにもかかわらず、植物の体表や組織内には無数の共棲微生物が病兆や防御応答を引き起こすことなく棲息しており、植物の栄養吸収や生体防御を助ける有用菌は持続的農業を推進するシーズとして高い注目を集めている。しかしながら有用菌を安定して活用するためには、宿主植物と共棲菌の相互作用を制御する仕組みに関する理解を深めることが極めて重要な位置付けにある。私たちは、
野外圃場や温室で土栽培のアブラナ科植物から組織内に棲息している糸状菌を単離して、モデル植物シロイヌナズナにおいて植物の成長促進効果を指標に機能評価を進めている。炭疽病菌と極めて近縁な Colletotrichum 属糸状菌でありながら、顕著な植物成長促進効果を有する菌株を単離して、菌の感染生理や菌に対する宿主植物の免疫応答を調べている。その結果、宿主植物は共棲菌との間で環境条件や両者の遺伝子背景次第で運命が激変するようなダイナミックな相互作用を展開していること、並びに MAMP/DAMP 受容体を始めとする植物の免疫システムによる菌の制御が成長促進効果には必要であることを示唆する知見を得た。その他の最新の研究成果と合わせて報告する。

地球上のあらゆる動物や植物は微生物と共生していると言っても過言ではない．
近年，ヒューマンマイクロバイオームやプラントマイクロバイオームなど網羅的に微生物菌叢を解析する研究も盛んに行われている．微生物にとって，植物と共生することには光合成作用でつくりだされる栄養分を享受できる利点がある．一方，植物にとって病原菌は困り者であるが, 病原菌を排除したり成長を助けてくれる作用をもった有益な細菌も根粒菌をはじめ多く知られている．しかしこれまでの植物にまつわる微生物共生の研究は作物野菜や穀物あるいは樹木など土壌植物を対象とするものがほとんどであった．私たちは，いまから５年ほど前に北海道大学植物園に自生しているアオウキクサの表層から植物の成長速度をおよそ 2 倍に加速する付着細菌（Plant Growth-Promoting Bacteria: PGPB，
学名 Acinetobacter calcoaceticus P23）を発見した．すなわち，一旦無菌化したコ
ウキクサなどのウキクサ植物に PGPB-P23 を共生させると無菌コウキクサに比べて葉（葉状体という）の数がどんどん増えて行く．当初この細菌は水質浄化作用を目的に高性能なフェノール分解菌として選抜してきたものであり，コウ
キクサと共生することで外部から栄養を与えなくても光照射条件下において持続的に分解活性を発揮できることも報告している 1)．そしてあらかじめ PGPBP23 を表層に付着優占化させたコウキクサが下水二次処理水や河川水など環境
水中においても良好に生育し，野生コウキクサに比べてやはり 2 倍程度のコウ
キクサバイオマス生産速度や水質浄化速度を示すことを JST-ALCA プロジェク
ト研究「根圏微生物共生系を活用した高次植生バイオプロセスの開発（近藤昭彦 PL）」において実証している．また，最近になって PGPB-P23 が生産する水生植物の成長を促進する微生物因子：PGFAC23 および，その合成に関わる遺伝
子群を特定することにも成功した 2)．興味深いことに，PGFAC23 はさまざまな土壌微生物が生産するインドール酢酸やシデロフォアなどの低分子の植物成長促進因子とは異なっていた．多くの外生共生細菌は植物表面などに付着する為の接着剤として細胞外多糖を分泌するが，PGPB-P23 が分泌する細胞外多糖こ
そが PGFAC23 であり，これがコウキクサの成長を促進しているらしい．この
細胞外多糖 PGFAC23 は分子量 5,000 ダルトンを超える高分子化合物であるために植物に取り込まれることはなく，植物の表面にとどまって成長を促す刺激物
質となっているのかも知れない．すなわち，細菌 PGPB-P23 を投与する方法以外に PGFAC23 を製剤化してこれを一度水槽に投入しておけばウキクサ植物の成長を長期間にわたって促進し続けてくれる可能がある．長い生命の歴史においてコウキクサと付着細菌 PGPB23 相互にどのようなやりとりがあって，
PGFAC23 の構造にゆきついたのか共進化の点でも大変興味深い．
一方，PGPB-P23 を含む JST-ALCA プロジェクト研究で発見した多くの水生植物由来 PGPB は，植物に対する成長促進と同時にクロロフィル量を増大させる効果を有している．そこで作物植物についても同様の効果が見られるかについて水耕栽培レタスとイネについて試験したところ，わずかではあるが大腸菌な
ど非成長促進細菌に比べて有意なクロロフィル量の増加が観察された 3)．今後，
水生植物由来 PGPB が新たな有用微生物資源として植物工場での省エネ作物生産技術などに貢献できれば幸いである．
1) Yamaga F, Washio K, Morikawa M. (2010)
Sustainable biodegradation of phenol by Acinetobacter calcoaceticus P23 isolated
from the rhizosphere of duckweed Lemna aoukikusa.Environ. Sci. Technol. 44(16),6470-6474
2) 特願 2015-130895 「植物の生長を促進する方法、植物生長促進物質を製造する方法及びこれらに利用されるタンパク質」
3) Suzuki W, Sugawara M, Miwa K, Morikawa M. (2014)
Plant growth-promoting bacterium Acinetobacter calcoaceticus P23 increases thechlorophyll content of the monocot Lemna minor (duckweed) and the dicot Lactuca
saliva (lettuce).
J. Biosci. Bioeng. 118(1), 41-44

Immune control of endophytic microbes in plants for stress adaptation

Functional mechanism of aquatic PGPB and its potential use for crop
production○Yusuke Saijo, Kei Hiruma(Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)

Key words

plant immunity, endophytic microbes, plant-microbe interactions○Masaaki Morikawa, Kyoko Miwa
(Grad. Sch. Environ. Sci., Hokkaido Univ.)

Key words
plant growth-promoting bacteria, PGPB, Lemna minor, Acinetobacter
calcoaceticus P23

有用微生物の農作物への新しい展開とその将来像／バイオエンジニアリングにおける分析科学の新たな展開

2S-Ap04 Trichoderma asperelloides SKT-1 株のイネ種子消毒剤としての開発と企業化

2S-Bp01○渡辺 哲（クミアイ化学工業株式会社）s-watanabe@kumiai-chem.co.jp

159

新たな分析試薬としての二重鎖 DNA 担持ナノ粒子○前田 瑞夫（理研・前田バイオ工学）
mizuo@riken.jp

従来から、農作物の効率的な生産のため化学合成農薬が使用されてきた。近年、
化学農薬をはじめとする化学合成品の環境汚染や環境負荷が社会問題として取り上げられているが、効率的な作物生産は、限られた耕地面積から作物を得て、人々の生活を支えるために重要な課題である。このような社会情勢の中、環境
汚染や環境負荷を低減し、かつ効率的な作物生産を行うための一手段として、自然界に存在する微生物を利用した病害虫防除法、すなわち微生物農薬による防除が注目されてきた。しかしながら、一般に微生物農薬は１）効果が緩慢である。２）対象病害虫が限られる。３）生きた生物を利用する点から、保存安
定性に欠けるため流通性に乏しい。４）化学農薬に比べ値段が高い。５）生物－生物間の現象であるため、作用メカニズムが不明瞭である。などの問題点があるため、企業による商品化には不向きであるとされてきた。
本講演ではバイオコントロール微生物 Trichoderma 属糸状菌 SKT-1 株が、イネ
種子伝染性病害に対して化学農薬に匹敵する防除活性を示し、且つ、その適用病害が広いことに着目し、上記の問題点を克服することで SKT-1 株の商品化に成功したことを作用メカニズム研究の結果と併せて報告する。
Trichoderma 属糸状菌 SKT-1 株（以下 SKT-1 株）は、すでに報告があるように
イネ種子伝染性病害に対して化学農薬に匹敵する防除活性を有する。Biocontrol
agent（以下、BCA）を“種”レベルまで同定することによって、環境生物に対する 安 全 性 の 予 測 が 可 能 に な る 。 そ こ で SKT-1 株 の SEM(scanning electron
microscopy)による形態観察及び rDNA ITS のシーケンスによる菌学的同定を行ったところ、本株は Trichoderma asperelloides と同定された。現在までに報告されている T. asperelloides は、ヒト、動物及び植物に対する病原性に関する報告は一切ない。T. harzianum はマッシュルーム栽培における有害菌であり、さらに T. viride はイネに対する立枯病菌として知られているが、T. asperelloides は
過去に植物病原菌としての報告はない。他方、BCA の生育至適温度などの生理的諸性質を明らかにすることは、高い防除活性を BCA に発揮させるための必要条件となる。そこで SKT-1 株の生育至適温度を調べたところ、一般に行われているイネの催芽温度や育苗温度（30℃）と一致することを確認した。
さらに、SKT-1 株の効率的で安価な菌体生産のため、培地成分及び培養条件を検討することによる大量生産方法の研究を行った。また、生きた微生物である
SKT-1 株の流通性向上のため、製剤組成に関する研究を行った。液体培養で得られた胞子は固体培養で得られる分生胞子とは異なり、耐久性に乏しかった。
従って、保存形態は冷蔵を要するものとなったが、分生胞子に比べ低いコストで生産することができ、この液体培養によって得られた胞子を製剤化したエコホープ®（登録番号 21009 号）を商品化した。一方、固体培養でのみ得ることができる分生胞子を日本古来の麹培養法によって効率的に取得し、かつ保存安定性を向上させる製剤組成検討を行った結果、合成ゼオライトやシリカゲルなど
吸水性を有する物質との組成物を完成させた。この組成物中の分生胞子はイネ
ばか苗病に対して防除効果を示したことから、乾燥状態に置かれても発芽能力は奪われることなく安定な保存が可能となった。分生胞子の製剤組成物は先のエコホープに続き、エコホープ®DJ（登録番号 21902 号）として商品化した。
作用機構解析では、SKT-1 株の野生株及び REMI(restriction enzyme mediatedintegration)法により、レポータータンパク質である GFP(green fluorescent protein)を発現させた遺伝子組み換え体を用いることによって、SKT-1 株の主要対象病
害であるイネばか苗病菌(Gibberella fujikuroi)の作用メカニズムに関する研究を行った。SKT-1 株とイネばか苗病菌との人工培地上での対峙培養では、イネばか苗病菌の細胞壁の溶解や、GFP タンパク質の消失が観察された。この結果
は、SKT-1 株がイネばか苗病菌に対して細胞壁溶解酵素を作用させることによって、イネばか苗病菌の生長・生命活動を停止させていることを示唆した。更に、
イネ種籾を用いた in situ 解析では、催芽時にイネ胚部位に SKT-1 株及びイネばか苗病菌の菌糸の旺盛な伸長が認められた。また、イネ胚部位上において、SKT-1 株の菌糸伸張が認められた際に、イネばか苗病菌の伸長した菌糸の切断が観察された。これは先の対峙培養における観察結果とよく一致していた。従って、SKT-1 株はイネ胚部位にてイネばか苗病菌の生長を阻害し、病害を防除していることが明らかになった。
以上、化学農薬に匹敵する防除効果を示す SKT-1 株の種の同定によって、ヒトや環境に対する安全性を予測し、また、経済的な培養方法の確立と、流通性を向上させた製剤組成物を確立することで Trichoderma 属糸状菌 SKT-1 株の商品化に成功した。一方、作用メカニズム解析を行うことで、本株が効率的かつ安全な BCA であることを明らかにした。以上より、Trichoderma 属糸状菌 SKT-1
株は微生物農薬として高い実用性を有していると考えられる。

直径数ナノメートルから数十ナノメートルの金ナノ粒子が水に分散した溶液は赤色を呈する。これは金ナノ粒子の表面に局在化しているプラズモン(自由電子の集団振動)が可視領域の光と共鳴して、光を吸収するからである。この特性を利用して金ナノ粒子をラベル化剤として用いたバイオセンシング手法が様々に開発されている。一方、何らかの外的条件によって金ナノ粒子が集合体を形成
すると、共鳴する光の波長が長波長側にシフトして、溶液は赤色から紫色ない
し青色へと変化する。この金ナノ粒子の凝集に伴う色調の変化を利用して様々な分子センシングへの展開が試みられている。たとえば免疫反応や生化学反応などとカップルして金ナノ粒子の凝集が誘起されるようなシステムの設計が国内外で活発に進められてきた。最も広く使われている仕組みは粒子間を分析対
象物質が橋渡しするような形、すなわち架橋反応である。我々はこれと全く異なる仕組みとして、DNA 二重らせんを担持した金ナノ粒子の非架橋メカニズム
による凝集反応を見出し、分子ないしバイオセンシングに応用することを提案してきた。すなわち、DNA 二重らせんで表面修飾した金ナノ粒子は、あるイオ
ン強度以上で自発的かつ迅速に凝集する。この非架橋凝集現象は粒子の大きさと DNA の長さによらないが、DNA の二重らせん形成よりもはるかに鋭敏な温度依存性と塩濃度依存性を示す。また、粒子からみて最も外側に位置する DNA
末端にミスマッチがあると凝集は全く起こらない。このことは DNA 二重らせん末端構造の揺らぎが金ナノ粒子の分散挙動などのメゾスコピックな現象へ変換・増幅されていることを意味しており、分析化学におけるナノ粒子ないしコ
ロイド分散系の利用について新たな観点を与えるものではないかと考えている。
参考文献) 宝田徹, 前田瑞夫: 分析化学, 64(1), 15-23 (2015).

Development and commercialization of Trichoderma SKT-1, a highly
effective biocontrol agent

Double-stranded DNA-functionalized nanoparticles for a novel analyticalreagent○Satoshi Watanabe(Kumiai Chemical industry Co., Ltd)Key words

Trichoderma sp., rice seedborne diseases, Bakanae disease○Mizuo Maeda(Bioengineering Lab., RIKEN)

Key words

DNA nanomaterial, nanoparticle, SNP typing, chemical sensor

160

バイオエンジニアリングにおける分析科学の新たな展開

2S-Bp02 〈招待講演（韓国生物工学会）〉

2S-Bp03

Separation efficiency of DNA-protein conjugates via freesolution capillary electrophoresis○上田 宏 1, 蘇 九龍 1, 董 金華 1, 岩井 宏徒 1,2（1東工大・化生研, 2東大院・工）ueda@res.titech.ac.jp○Jong-In Won, Dong Hyun Kim(Dept. Chem. Eng., Hongik Univ., Korea)
jiwon@hongik.ac.kr

As the Human Genome Project was completed, genetic information could be obtained
from individuals, and this information can be widely applied to the biological fields.
However, DNA sequencing or separation by conventional capillary electrophoresis
with a polymer matrix has some inherent limitations, such as expense of polymer
matrix and the limitation of sequencing read length. As DNA fragments have a linear
charge-to-friction in free-solution, DNA fragments aren’t separated by size. However,size-based separation of DNA is possible in free-solution conjugate electrophoresis if a“drag-tag” is attached to DNA fragments because it breaks linear charge-to-friction
scaling. Although several research results demonstrated the feasibility of DNA
separation by free-solution capillary electrophoresis (FSCE), generation of acompletely monodisperse drag-tag and finding a strong as well as site-specificconjugation method between a DNA fragment and a drag-tag are still challenges. In
this study, we propose an efficient FSCE method by conjugating a biologicallysynthesized elastin-like polypeptide (ELP) and green fluorescent protein (GFP) to
DNA fragments. In this case, GFP acts as a substituted fluorescent dye as well as a
drag-tag, and ELP acts as an additional drag moiety endowing high resolving power. In
order to produce strong and site-specific conjugation, a methionine residue in drag-tags
is replaced with an azidohomoalanine (AHA) or homopropargylglycine (Hpg), which
can be conjugated specifically to a DNA fragment. Finally, the separation efficiency
according to the size of drag-tags was investigated.

人工アロステリック酵素の創出による各種高感度ホモジ
ニアス免疫測定法の開発

任意分子を検出可能なバイオセンサー酵素の実現法として、 抗体ドメインの利用による人工アロステリック酵素の創出が考えられる。しかし通常，抗原の結合による抗体の構造変化(induced fit)はかなり微小であって，これまでこの変化を利用して酵素活性を制御する一般的な方法は提唱されていない。今回我々は，
抗体重鎖・軽鎖可変領域 VH, VL が抗原依存的に会合する現象を利用し，多量体型ないし単量体型の抗原依存的アロステリック酵素の創出に成功したので報告する。
我々は以前，VH, VL を会合により酵素活性が回復する β ガラクトシダーゼ変異体 Δα，Δω の N 末側にそれぞれ融合し，両者の会合を抗原 NP (4-hydroxy-3nitrophenacetyl)あるいはニワトリリゾチームにより誘導することで酵素活性の向上を発光活性により高感度に検出した(OS-ECIA 法, Anal. Chem., 74, 2500,
2002)。但し本系は変異体酵素の安定性が低く，再構成により得られる酵素活性およびその変化量も低い問題があった。そこで今回，天然では４量体で存在する β グルクロニダーゼ(GUS)の界面に変異を導入した 2 量体型変異体酵素 GUSm
(Geddie and Matsumura, J. Mol. Biol., 369, 1052, 2007)を利用し，これをレポーターとした同様のバイオセンサー酵素 VH-GUSm, VL-GUSm を構築した。これらの混合物に抗原 NP を加えた所，4 量体形成によりその酵素活性は抗原不在時に比べ最大 5 倍まで増加し，さらにその信号は発色あるいは蛍光強度で容易に検出できた。興味深いことに，この活性化率は以前報告した ELISA における変化率を上回っていた。酵素の安定性も高く，本系は今後広く各種低分子の検出系に応用できる可能性がある。
これらの多量体型センサーは，二種類の検出試薬を準備する必要があり，また検出感度的に不利な可能性もある。我々は以前、抗体 VH, VL を大腸菌 TEM-1β-lactamase の円順列変異体(cpBLA)の N/C 末端にそれぞれ連結することで、抗原結合により酵素活性を制御可能な融合タンパク質 Fv-cpBLA を構築した(Bioconj. Chem.22, 633, 2011)。しかし，その比活性 kcat 変化は 2 倍以下に留まり，実用的な抗原検出系とは言い難かった。そこで今回、VH / VL の界面近傍に新規
N, C 末端を移動させた円順列変異体 cpVH / cpV L (Clampbody; Cbody)を設計し、これらを構造既知の cpBLA (Guntas et al., Chem. Biol., 11, 1483, 2004)の N/C 末端にそれぞれ連結させたタンパク質 Cbody-cpBLA を構築することで、より効果的な活性制御ができないか試みた。ヒト Bone gla protein (BGP)C 末端認識抗体をもとに不溶性画分より調製した Cbody-cpBLA は抗原結合能と酵素活性を保持しており、酵素活性評価の結果、抗原を加えると有意に kcat が増加した。そこで反応溶液中に適量の変性剤あるいは界面活性剤を添加したところ、kcat の抗原依
存性は約 4.7 倍に向上し、健常人の血液中濃度以下の 0.24 nM の抗原ペプチドを特異的に検出できた(Bioconj. Chem.. 27, 868, 2016)。以上より、Cbody-cpBLAが抗原添加により酵素活性を制御可能な単量体型アロステリック（センサー）酵素であること、タンパク質の末端間距離を利用した活性制御に Clampbody が適していることが明らかとなった。今後，これらの人工アロステリック酵素の臨床診断，食品検査，環境計測等への応用が期待される。

Separation efficiency of DNA-protein conjugates via free-solution capillaryelectrophoresis

Development of sensitive homogeneous immunoassays by creating artificial
allosteric enzymes

Key words
capillary electrophoresis, drag-tag, elastin-like polypeptide, green
florescent protein

Key words○Jong-In Won, Dong Hyun Kim(Dept. Chem. Eng., Hongik Univ., Korea)○Hiroshi Ueda1, Jiulong Su1, Jinhua Dong1, Hiroto Iwai1,2(1CLS-IIR, Tokyo Tech, 2Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)

antibody, enzyme sensor, biosensor, protein engineering

バイオエンジニアリングにおける分析科学の新たな展開

2S-Bp04

臨床検査におけるバイオ分析技術の実用化○村上 淳（アークレイ）murakamia@arkray.co.jp

当社は、自動分析システムのパイオニアとして、長きに渡り、診断・治療・検診のための臨床検査用の機器・試薬並びに診断支援ツールの研究開発・生産・販売・アフターサポートを行ってきた。検査領域としては、糖尿病検査、尿検
査、遺伝子検査、ポイントオブケア（POC）検査といった領域を中心に事業を展開している。また、大病院・研究機関向けから、中小病院やクリニック向け、さらには患者様が自ら使用する機器まで、幅広い医療現場のニーズに応える製品を生み出してきた。これらの臨床検査システムには、例えば血糖測定においては酵素反応と電気化学反応を利用した酵素電極法など、生物工学分野の研究者には馴染みがある様々なバイオ分析技術が用いられている。しかし、これらの技術を実用化、とりわけ臨床検査分野において実際に製品化していくためには、アカデミアで行われている研究とは異なる視点での技術開発や課題解決が求められる。本講演では、当社の製品・技術や、それらに用いられているバイ
オ分析技術をご紹介するともに、その技術を実用化するにあたり、どのような課題が存在したのか、またそれらの課題を解決するためにどのような研究開発を行ったのかなどをご紹介したい。さらに、現在研究開発を進めている技術や研究課題についても可能な範囲でご紹介したい。

2S-Bp05161

非天然糖を用いた糖タンパク質品質管理系の機能解析○迫野 昌文（富山大院・理工）msakono@eng.u-toyama.ac.jp

小胞体における Calnexin (CNX)/Calreticulin (CRT) サイクルは、糖タンパク質産
生の品質管理に重要な役割を果たす(Helenius et al., Annu Rev Biochem 73 (2004)
1019)。高マンノース型糖鎖を有するフォールディングが未成熟な糖タンパク質
は、分子シャペロン、糖転移酵素、糖加水分解酵素などの様々なタンパク質の仲介により、成熟した状態となる。Glucosidase I, Glucosidase II (G II)によりグライコフォームを Glc3Man9GlcNAc2(G3M9)から Glc1Man9GlcNAc2(G1M9)にトリミングされた糖タンパク質は、レクチンシャペロン CNX/CRT の基質となる。
CNX/CRT から解離した糖タンパク質は、G II によるグルコースのトリミングを受ける。正常にフォールディングした糖タンパク質はゴルジ体へ輸送されるが、フォールディングが不完全な糖タンパク質は、糖転移酵素 UGGT によりグルコースの転移を受け再び CNX/CRT の基質となる。
蛍光化合物などの疎水性化合物を結合した高マンノース型糖鎖は非タンパク質化合物であるにもかかわらず、GII、UGGT、CRT などの品質管理関連タンパク質の基質として認識されることが、これまでにわかっている(Totani et al., Angew
Chem Int Ed Engl 44 (2005) 7950; Sakono et al., Biochim Biophys Acta 1840 (2014)2904)。また、UGGT による糖鎖化合物への糖転移反応における速度定数は、変性糖タンパク質を用いた時と比べても同等であることから(Sakono et al., Biochem
Biophys Res Commun 426 (2012) 504)、合成糖鎖化合物は変性状態の糖タンパク
質をミミックしていることが推察され、この糖鎖化合物は糖タンパク質品質管
理機構を検討するための優れたツールであると期待される。
糖関連酵素の活性メカニズムや基質特異性を調べるために、アザ糖やデオキシ糖、チオ糖などの糖の類縁体を基質として用いる方法は、有効な手段である。
特にチオ糖は、様々な糖加水分解酵素の阻害剤として効果的に機能することが報告されている(Kajimoto et al., J Am Chem Soc 113 (1991) 3187)。そこで、本研究では、合成糖鎖を用いて、環内酸素が硫黄に置換されたチオ糖が、小胞体関連
タンパク質の働きに及ぼす影響を検討した(Sakono et al., in submitted)。UGGT の糖供与体である UDP-グルコースの類縁体である UDP-チオグルコースを化学合成し、UGGT による合成糖鎖への糖転移反応を試みた。その結果、反応効率は若干低下するものの、チオグルコースが合成糖鎖に転移することを見出した。
また、産生したチオグルコース転移 G1M9 糖鎖は、ノーマルの G1M9 糖鎖と同程度に分子シャペロン CRT と相互作用することが明らかになった。一方で、CNX は、ノーマルの糖鎖に比べて大きく相互作用が低下した。この傾向は、
CNX のホモログであるカルメギンにも見られた。これまで、CNX と CRT の機能的差は明らかにされておらず、このチオグルコースの結果は、両者の機能に違いがあることを示した最初の例といえる。また、チオグルコース転移 G1M9
糖鎖は、G II の基質とならず、チオグルコースの加水分解は行われなかった。
したがって、チオグルコースを品質管理系に導入することで、一部の酵素機能を調整することができると考えられる。今後、チオグルコースが CNX/CRT サ
イクルの詳細を明らかにする有効なプローブとなると期待する。

Practical application of bioanalytical methods for clinical laboratory test
○Atsushi Murakami(ARKRAY, Inc.)

Key words

diagnostic technology, in vitro diagnostic

Analysis of glycoprotein quality control system using thio-sugar○Masafumi Sakono(Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama)

Key words

glycosidase, glycosyltransferase, molecular chaperone

162

2D/3D プリンタを用いる細胞操作の可能性

2S-Cp01

Tissue Engineering のためのバイオプリンティングの戦略と今後の課題

2S-Cp02○中村 真人 1, 杉本 和之 1, 塚本 佳也 1,2, 吉田 真人 1
（1富山大院・理工, 2阪大院・生命機能）
maknaka@eng.u-toyama.ac.jp

細胞運動を評価する遺伝子導入細胞マイクロアレイ○藤田 聡史（産総研・バイオメディカル）
s-fujita@aist.go.jp

3D プリンタは今、世界的大ブームとなり、生体組織や臓器の作製を目指したバイオプリンティングは重要キーワードのひとつとなっている。
バイオプリンティングとは、あらかじめデザインした設計に基づいて生きた細胞や生体材料を適材適所配置しながら、２次元、３次元積層して生きた組織や臓器をボトムアップ的に作製する技術、およびその研究のことをいう。積層造
形以外の作り方も含めてバイオファブリケーションというが、生体組織や臓器を作るための重要な医工学技術である。間違いなく再生医工学のこれからを拓く研究領域である。
従来の再生医工学の技術の壁を破るための戦略として、バイオプリンティングの研究は、(1)機械化、 (2)デジタル化、(3)実装化、(4)3 次元化を意識して進められてきた。細胞培養に伴う様々な手作業を機械の手に変え、デジタル化するのは、従来よりもはるかに高度な細胞培養・組織構築を実現するためである。
また、3 次元の生体組織を作る場合、内部まで細胞を含めて有意な構造を作りこむ必要がある。そこでバイオプリンティングでは生きた細胞、生体を構成する材料を、直接、適材適所あるべき場所に実装しながら 3 次元積層造形を行うことを目指してきた。生きた細胞は生体組織の必須材料であるが、細胞浮遊液
では造形は不可能である。そこで、細胞が生きられるよう液体でありながら個体でもあるハイドロゲルが 3 次元化の鍵となる。装置の開発とともにゲル材料の開発が必要である。
今、バイオプリンティングは、世界で注目され、世界で３ D プリンタを使っての研究が進み始めた。しかし、バイオプリンティングの目指すところは、生きて機能する生体組織の作製である。その目的達成には、3 次元適材適所配置することに加え、作った構造物を如何に培養するか、如何に組織形成を進めるかの技術開発が必要である。それらの対策を含めた設計と製作が次の課題である。

細胞運動（遊走）は、発生や細胞組織の恒常性維持などの様々な生理的現象において重要な役割を担っている。また、癌転移の一因子と考えられており、癌転移抑制を目指した抗がん剤開発において、そのメカニズムを詳細な理解が望まれている。本発表では、インクジェットプリンターを用いて構築する細胞運
動評価用の遺伝子導入細胞マイクロアレイ（トランスフェクションマイクロア
レイ：TCM）技術、及び本技術を応用した細胞運動能を指標にした関連遺伝子のスクリーニングについて紹介する。
TCM の作製において、まず DNA や siRNA などの核酸とカチオン性脂質の複合体であるリポプレックスをスライドガラスや細胞培養用ディッシュなどの固相面にマイクロアレイとしてプリントする。その上面に細胞を播種すると、細胞に固相面から遺伝子が取り込まれ、細胞内で遺伝子が発現した結果、細胞の表現型が変化するため、その細胞状態を解析する事で遺伝子機能の評価が可能となる。細胞運動評価用 TCM では、基板上を細胞が運動し、固相基板面のスポッ
トから siRNA を取り込む。siRNA が細胞運動を阻害する場合、細胞はスポット
上面で運動を停止するため、画像解析による細胞の位置情報に基づいて、運動関連遺伝子のスクリーニングや評価を行う事が可能であると考え、開発を進めた。
まず、TCM を用いた細胞運動評価が可能である事を確認するため、細胞運動に重要とされる複数の既知の遺伝子の siRNA をアレイ化した TCM で実験を行った。その結果、細胞運動がアレイ化されたスポット上で停止し、画像解析により運動能を簡便に評価ができる事を確認した。続いて、細胞運動に大きく関わるとされる 738 種類のキナーゼをターゲットとした大規模スクリーニングを、
本 TCM を用いて行った。スクリーニングの結果 30 種類の siRNA が細胞運動を阻害し、2 種類の siRNA が細胞運動を促進する事を見出した。
TCM は、細胞運動のみならず、様々な細胞表現型に基づいた遺伝子スクリーン
グや薬剤スクリーニングに威力を発揮できる技術であり、今後さらなる創薬開発、診断、毒性評価への応用を目指して開発をすすめたい。

Strategy of bioprinting for tissue engineering and next issues

Transfected cell microarray for detecting cell migration○Makoto Nakamura1, Kazuyuki Sugimoto1, Yoshinari Tsukamoto1,2,
Naoto Yoshida1(1Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama, 2Grad. Sch. Frontier Biosci., Osaka
Univ.)

Key words

bioprinting, biofabrication, bio-artificial organ, biomaterial○Satoshi Fujita(Biomed. Res. Inst., AIST)

Key words

microarray transfection, cell migration, inkjet printing

2D/3D プリンタを用いる細胞操作の可能性

2S-Cp03

インクジェットプリンティングの 細胞凍結保存への応用○秋山 佳丈（信州大・繊維）
aki@shinshu-u.ac.jp

2S-Cp04

163

西洋わさび由来ペルオキシダーゼによる架橋反応を利用した 3D バイオプリンティング○境 慎司 1, 田谷 正仁 1, 中村 真人 2
（1阪大院・基礎工, 2富山大院・理工）sakai@cheng.es.osaka-u.ac.jp

細胞の凍結保存法は細胞株の長期間維持および輸送において必須の技術であり，
iPS 細胞や ES 細胞の樹立によりその重要性はさらに増している．細胞凍結保存において，高い生存率を得るためには，どのように細胞を凍結させるかが重要となる．通常の培養液中で細胞を一般的な冷却速度で凍結すると，細胞内外の水分子が結晶化し，氷晶が生成される．その氷晶によって，細胞膜や細胞内小器官などの細胞構造が破壊されてしまい，融解後細胞は生存できなくなる．そのため，細胞の凍結保存において，水の結晶化を抑制しガラス化させることが重要である．このガラス化を促進するために，従来の凍結保存技術では，凍結保護剤を添加する．最も一般的な緩慢凍結法では，凍結が進むにつれて添加した凍結保護剤により細胞が脱水され，最終的に細胞内の水はガラス化される．
その結果，氷晶の生成は防ぐことは出来るが，凍結保護剤自身の毒性および凍結過程における脱水により一部の細胞は壊死する．特に，霊長類 iPS 細胞など
は凍結耐性が低いため，高濃度の凍結保護剤を添加し急速に凍結するガラス化法が用いられる．しかし，この場合，高濃度に添加した凍結保護剤自身の細胞毒性が問題となってくる．
そこで，著者は新たな細胞凍結保存技術として，インクジェット技術を用いた瞬間凍結による細胞凍結保存法を提案し，研究を進めている．本手法では，純水であっても，10 6 度/秒以上で冷却すれば，ガラス化することに着目した．すわなち，細胞懸濁液をインクジェット技術により 1 nL 以下の微小液滴として，液体窒素で急速した基板の上に吐出することで，瞬間的に凍結する．これにより，細胞を含む液滴をガラス化し，凍結保護剤を用いずに細胞の凍結保存実現を目指す．当初，液滴サイズを 200 pL として実験を行ったが，細胞の生存率は約 15 %と低かった．しかし，液滴サイズを 20 pL とすることで，細胞生存率を約 60 %まで高めることに成功している．また，微小液滴の瞬間凍結メカニズムを解明に向けて，高速度カメラによる液滴凍結過程の観察や有限要素法による伝熱シミュレーションを行ったので，それらの結果についても紹介したい．

西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（HRP）は、過酸化水素存在下でフェノール性水酸基同士の架橋形成反応を触媒する。我々は、これまでにこの酵素反応を経て水溶液から得られるヒドロゲルの、各種用途における生体材料としての有用性を報告してきた。本発表では、この HRP 酵素反応によりゲル化する高分子
水溶液をバイオインクとして用いる 3D バイオプリンティングに関して紹介する。
細胞を生存したまま構造物中に包括することのできるバイオインク材料として最も広く用いられてきたのは、アルギン酸水溶液である。バイオインク材料としてアルギン酸水溶液の有用な点は、カルシウムのような多価金属イオンを含む水溶液と接触すると瞬時にゲルが形成し、さらにそのゲル化は細胞に穏和であることである。一方で、組織体を作製するという観点からは、細胞接着性や生分解性などにおいて十分な性能を有しておらず、新たなバイオインクの開発が続けられている。HRP 酵素反応によるゲル化は、溶液中のフェノール性水酸
基濃度や、HRP 濃度、過酸化水素濃度の制御によりゲル化に要する時間を制御可能である。さらに、細胞接着性や生分解性に優れるゼラチンからもフェノー
ル性水酸基を導入することによってゲルを得ることが可能である。我々は、フェノール性水酸基を導入した高分子と HRP を溶解させた水溶液に細胞を分散させたものを 1 つのノズルから吐出し、もう 1 つのノズルからフェノール性水酸基を導入した高分子と過酸化水素を同じ場所に吐出することにより、細胞を含む
三次元ヒドロゲル構造物を作製することに成功している。本技術は、これまでに開発してきたさまざまな材料をインクライブラリとして利用可能であるため、機能的な組織体を作ることを目的とする 3D バイオプリンティング分野において有用なものになると期待される。

Application of Inkjet printing for cryopreservation of animal cells

3D bioprinting through horseradish peroxidase-mediated cross-linking○Yoshitake Akiyama(Fac. Textile Sci. Technol., Shinshu Univ.)

Key words

cryopreservation, inkjet printing○Shinji Sakai1, Masahito Taya1, Makoto Nakamura2(1Grad. Sch. Eng. Sci., Osaka Univ., 2Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama)

Key words

tissue engineering, enzyme, gelation

164

2D/3D プリンタを用いる細胞操作の可能性

2S-Cp05

バイオ分野へのインクジェット技術の応用○山口 修一（株式会社マイクロジェット）
yamaguchi2@microjet.co.jp

文字や画像の印刷に使われているインクジェット技術が、プリンテッドエレク
トロニクス分野では、液晶ディスプレイの部品製造や薄膜塗布等に応用され、実用化されている。また、３ D プリンティング分野では、7 つある造形技術の内２つがインクジェット技術を応用したものであり、インクジェット技術は、
次世代のデジタルものづくり革命の本命技術として益々注目を集めている。
一方、このインクジェット技術をバイオ分野でバイオマテリアルのデジタルハ
ンドリング技術として応用する場合、従来のプリンターに使われているインクジェット技術では、多くの課題を抱えていた。中でも液体をハンドリングする
インクジェットヘッドに課題があり、プリンター用のインクジェットヘッドに代わり、バイオ専用のインクジェットヘッドが必要とされていた。
本発表では、プリンター用インクジェットヘッドが持つ課題点を明らかにすると共に、それらを解決したバイオ用の各種インクジェットヘッドを紹介する。
さらにこれらのヘッドを用いて実用化されたスポッター、マイクロアレイヤー、
１細胞プリンター（Single Cell Printer）等のバイオ機器についても紹介する。これらの機器の例を見るまでもなく、バイオ分野の液体ハンドリング分野にも、今後大きなデジタル化の波が押し寄せるであろう。

2S-Cp06

細胞の微小環境制御に基づいた組織工学○松崎 典弥, 明石 満
（阪大院・工・応化）
m-matsus@chem.eng.osaka-u.ac.jp【緒言】生体内において、細胞の機能（例えば、接着、増殖、分化、生存、組織化、タンパク産生など）は、細胞外マトリックス（ECM）と呼ばれる糖タンパ
ク質が細胞表面の微小環境を調節することで制御されている（図 1 上）。昨今のヒト人工多能性幹細胞（iPS 細胞）に代表される幹細胞研究の進歩により、正常および疾患特異的なヒト細胞を研究現場で用いることが可能となってきた。
しかし、“細胞も材料の一つ”ととらえ、再生医療や創薬分野の基礎研究から産業まで幅広く応用するためには、生体の ECM のように細胞の微小環境を調節し、その性質を自在に制御可能な革新技術の開発が重要である。
我々は、細胞表面の微小環境を調節し、細胞の性質を制御可能な人工 ECM として機能する高分子ナノ薄膜を設計し、細胞の様々な機能を制御した斬新かつ独創的な研究を展開してきた。以下に概要をまとめる。
【細胞表面への ECM ナノ薄膜形成と三次元組織体の構築】細胞表面の微小環境を制御するためには、生体の ECM のように細胞毒性を発現しない高分子ナノ
薄膜の分子設計が重要となる。これまで、細胞表面への薄膜形成に関する様々な研究が報告されている。特に、簡便かつ汎用性の高い交互積層法（LbL 法）
を用いた細胞表面へのナノ薄膜形成が注目されてきた。しかし、静電相互作用
を駆動力とした LbL 法では、カチオン性高分子の細胞膜への強い非特異吸着に
より細胞毒性が発現することが課題であった。そこで我々は、静電相互作用ではなく生体高分子の分子認識を利用した新しい LbL 法を考案した。ECM の成分であるフィブロネクチン（FN）は、コラーゲンやゼラチン（G）と 0.6-5.0 x
10-6 M という解離定数（Kd）で相互作用することが報告されている。従って、FN と G は、中性水溶液環境下で分子全体として弱い酸性（アニオン性）を有しているが、その分子認識機構により、静電反発を引き起こすことなく相互作用し、高い生体適合性の LbL 薄膜を細胞表面に形成できることを見出した。膜
厚は LbL 浸漬回数に依存して増加し、数 nm から 100 nm まで制御可能であった。また、細胞の生存率は、膜厚に依存せずほぼ 100%であり、細胞の増殖や接着形態、分化誘導にも影響しないことが明らかとなった。さらに興味深いことに、膜厚の増加に依存して抗炎症作用があることや、物理ストレスに対する保護機能があることも見出した。
我々は、細胞表面に形成した FN-G ナノ薄膜（人工 ECM）が、生体の ECM と同様に細胞膜インテグリン分子と相互作用することで細胞－細胞間を接着させる機能があると考え、ナノ薄膜を細胞間接着層として用いた「細胞積層法」と「細胞集積法」を考案した。細胞表面に形成した少なくとも 6 nm 以上の FN-G
ナノ薄膜が接着足場として機能することを見出し、望みの細胞を望みの場所に配置して積層できることを明らかにした。さらに、毛細血管構造を導入するため、細胞集積法により臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC）を皮膚由来線維芽細胞（NHDF）にてサンドイッチ培養した結果、緻密かつ均一なネットワーク構造の形成が確認された。本手法を用いて皮膚微小リンパ管内皮細胞（NHDMEC）とHUVEC を共サンドイッチ培養することで、それぞれ独立した毛細血管・リンパ管網が形成された。
【インクジェットプリントによる三次元組織チップの作製と薬剤毒性試験への応
用】細胞積層法で構築した積層構造体を生体組織モデルとして薬剤応答評価に応用するためには，細胞種や層数が異なる組織モデルを大量に作製する必要がある。マイクロメートルサイズの様々な組織モデルを集約した「組織チップ」が構築できれば，医薬品評価において大変有効である。そこで、インクジェッ
トプリント装置による細胞プリントの技術開発に取り組んだ。
チップ化するためには細胞を空間に留める必要がある。本研究では、直径 500μm、高さ 200 μm のウェルを 440 個有するウェル基板を用いた。組織チップとして薬剤評価への応用を目的として、ヒト肝癌細胞（HepG2）と HUVEC のヘ
テロ積層組織チップの作製に取り組んだ。肝組織は肝細胞が血管に挟まれた三次元構造であるため、HepG2 を HUVEC で挟んだ積層構造を構築することでHepG2 の代謝活性の向上が期待される。そこで、HepG2 と HUVEC の 1-3 層構
造を一枚のチップの中に作製して種々の活性を評価した。肝細胞機能の指標となるアルブミン産生量を評価した結果、7 日間培養後において 3 層構造が 1 層構造と比較して 4 倍以上のアルブミンを産生することが明らかとなった。また、
薬物代謝酵素の一種であるシトクロム P450 3A4（CYP3A4）の産生量と活性を評価した結果、やはり 3 層構造が最も高い産生量と代謝活性を有していることが確認された。そこで、実際に毒性が報告されているトログリタゾン（TGZ）
を用いて評価を行った。3 層構造においてより低濃度でも死細胞が顕著に観察され、特に TGZ が 50 μM の場合、1 層構造では 16%の死細胞割合であったのに対して 3 層構造では 60%（約 4 倍）まで増加し、HUVEC で挟んだ 3 層構造にすることで HepG2 の薬物代謝活性が向上することが明らかとなった。
本三次元肝組織チップは、肝組織のハイスループットな薬効・毒性評価を可能とする革新的なツールとして応用が期待される。

Inkjet technology for bio applications○Shuichi Yamaguchi(MICROJET Corporation)

Key words

inkjet, inkjet head, single cell printer, biomaterials

Tissue engineering based on control of cell microenvironments○Michiya Matsusaki, Mitsuru Akashi(Dept. Appl. Chem., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
engineeringcell microenvironments, extracellular matrix, nanofilms, tissue

10th Japan-Korea Biomass Symposium〈国際シンポジウム〉

2S-Dp01

Bioenergy and chemicals from sustainable biomass
resources
Hah Young Yoo, Dong Sup Kim, Ju Hun Lee, Soo Kweon Lee,
○Seung Wook Kim(Dept. Chem. Biological Eng., Korea Univ)
kimsw@korea.ac.kr

2S-Dp02

165

Isolation of biorefinery enzymes for brown macroalgae
degradation from bacterial metagenome○Tetsushi Mori1, Mami Takahashi1, Yumiko Yamada1,
Toshiyuki Shibata2, Toshiyuki Takagi3, Reiji Tanaka2, Hideo Miyake2,
Kouichi Kuroda3, Mitsuyoshi Ueda3, Haruko Takeyama1(1Fac. Sci. and Eng., Waseda Univ., 2Grad. Sch. Bioresour., Mie
Univ., 3Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)
moritets@aoni.waseda.jp

As the world population has grown and more countries have become industrialized,
demand of energy and chemical products have increased steadily. Thus, there is a great
concern in exploring an alternative resource, and biomass have received attention assustainable feedstocks for the production of alternative energy and chemicals. In past
years, we have collected inedible biomass resources such as instant noodle wastes,
whey, algal biomass, woods, grasses and agricultural residues etc. These biomass
resources were utilized as the feedstock in the production process such as bioethanol,
2,3-butanediol, cephalosporin C, lactulose and enzymes. In this study, we would like tointroduce some researches that include strain improvement, process design anddevelopment of environmental friendly production. Production of various bioproducts
such as bioethanol, 2,3-butanediol, and cephalosporin C, was performed by the
improved specific strain and the sugars from biomass were used as carbon sources. To
improve sugar recovery from biomass, various pretreatments such as acid, alkali,
proton and electron beam irradiation were applied and the effective conditions were
statistically optimized. Moreover, biomass to final production was evaluated based on
overall mass balance and the processes were simulated by using Super Pro Designer
program. Furthermore, the hydrolysates form biomass (glucose) was also used as a fuelsource of enzymatic fuel cell (EFC) system.
References:
1. X. Yang et al., Renew. Sust. Energ. Rev., 49, 335-349 (2015)
2. S.J. Yang et al., Chem. Eng. J., 275, 227-234 (2015)
3. H.Y. Yoo et al., Biotechnol. J., 10, 1894-1902 (2015)

With the recent demand in new biomass resources for the production of biofuels,
brown macroalgae recently serves as a potential candidate due to its rapid growth, highcrop yield and mass-producibility. However, brown macroalgae comprises of large
polysaccharides, including alginate, cellulose, hemicellulose and laminaran,
comprising more than 40％ of its composition that requires to be degraded before it
can be used for bioethanol production. To degrade large polysaccharides for
subsequent downstream process, conventional methods such as hydrolysis are utilized
but in most cases these methods are complex, require high-energy consumption and areless environmental friendly. Recently, as an alternative method for polysaccharide
depolymerization, the demand for the more economical and environmental friendly
method using biorefinery enzymes has been highlighted. As a result, numerous
discoveries of such enzymes including alginate lyases, laminarinase, amylase, cellulase
etc. has been reported. In addition, recent efforts via the introduction of gene clusters
encoding for enzymes involved in polysaccharide degradation into ethanologenic
bacteria and yeast to establish highly talented and robust microorganisms, have further
revolutionized brown macroalgae utilization. Due to the success of such systems,
attempts to further isolate and search for highly potential ethanologenic hosts or more
efficient biorefinery genes are underway. However, many of these attempts have been
limited to microorganisms isolated using culture dependent methods. As we know,
99％ of microorganisms obtained from the environment are considered as uncultivable,
thus current culture dependent methods exclude the possibility of finding potential
biorefinery enzymes from these microorganisms. Therefore, to further promote thediscovery of novel and highly efficient enzymes for polysaccharide depolymerization,
metagenomics serves as an important alternative. Thus far, our group has conducted
intensive screening of various important enzymes from numerous environmental
samples using metagenomic libraries established from environmental microbes. Here,
we present the potential of metagenomics in the screening for highly active andefficient enzymes for macroalgae degradation and our results on the large scale
screening for such enzymes against metagenomic libraries constructed from microbes
isolated from 3 fermented brown algae, Ecklonia kurome, Eisenia bicyclisand Ecklonia
cava targeting the alginate degrading enzyme, alginate lyase. Using plate screening andsugar screening assays such as the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) assay and thin-layer
chromatography (TLC), we successfully isolated approximately 70 - 100 putative
genes encoding for endolytic and exolytic alginate lyases, broadly distributed among
the Polysaccharide Lyase (PL) families of alginate lyases. In addition, in silico analysis
has also allowed us to identify unique gene clusters harboring genes encoding for
enzymes involved in alginate degradation. Based on this putative gene collection,
protein expression and enzyme activity analysis are currently being conducted. From
this work, we hope to be able to identify novel and highly efficient enzymes to further
facilitate bioethanol production from macroalgae.

Bioenergy and chemicals from sustainable biomass resources

Isolation of biorefinery enzymes for brown macroalgae degradation frombacterial metagenome

Hah Young Yoo, Dong Sup Kim, Ju Hun Lee, Soo Kweon Lee, ○Seung Wook Kim(Dept. Chem. Biological Eng., Korea Univ)

Key words

biomass, biochemicals, biorefinery, bioprocess○Tetsushi Mori1, Mami Takahashi1, Yumiko Yamada1, Toshiyuki Shibata2,
Toshiyuki Takagi3, Reiji Tanaka2, Hideo Miyake2, Kouichi Kuroda3,
Mitsuyoshi Ueda3, Haruko Takeyama1(1Fac. Sci. and Eng., Waseda Univ., 2Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ., 3Grad. Sch.
Agric., Kyoto Univ.)
Key words
metagenomics, biorefinery enzymes, macroalgae

166

10th Japan-Korea Biomass Symposium〈国際シンポジウム〉

2S-Dp03

Biological saccharification by anaerobic thermophilic
bacteria

2S-Dp04○Akihiko Kosugi1,2(1JIRCAS, 2Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)
akosugi@affrc.go.jp

Many microorganisms capable of producing cellulose and hemicellulose-degrading
enzymes have been reported and characterized [1]. Clostridium thermocellum, ananaerobic, thermophilic, spore-forming bacterium, is the most potent cellulosedegrading bacterium known to produce cellulosomes [2]. The cellulosomes of C.
thermocellum contain a surprisingly large variety of enzymes and show attractive
enzymatic properties for the degradation of complex plant biomass. In promisingattempts to enhance the hydrolytic ability of C. thermocellum cellulosomes, designer
cellulosomes and reconstruction of recombinant cellulosomes have been studied using
model and natural substrates. C. thermocellum produces low levels of cellulosomescompared to the high level of cellulase secretion of Trichoderma reesei, which can
produce several functionally distinct cellulase components. Although C. thermocellum
exhibits one of the highest observed microbial growth rates on cellulose, it produces
less cellulase on a mass basis than aerobic microorganisms. As one promising costeffective process to resolve these problems, consolidated bioprocessing relies on C.
thermocellum to ferment substrate to desired products in one step without adding
externally produced enzymes.
Here, we report on biological saccharification by C. thermocellum cultures
supplemented with thermostable β-glucosidases, which we named biologicalsimultaneous enzyme production and saccharification (BSES) [3]. BSES required no
addition of cellulolytic enzymes. It can directly produce glucose from cellulosic
materials due to supplementation of cellulose degrading cultures with β-glucosidase.
Exclusive glucose accumulation of glucose occurred when C. thermocellum wascultured with a thermostable β-glucosidase under a high cellulose load. Our process isthe first instance of biological saccharification with exclusive production andaccumulation of glucose from lignocellulosic biomass.
To apply BSES to practical process, we screened an anaerobic thermophilic
cellulolytic-xylanolytic bacteria adaptable to various lignocellulosic biomass (e.g.,corn stover, rice straw, bagasse, and potato pulp). Novel an anaerobic
alkalithermophilic cellulolytic-xylanolytic bacteria Cellulosibacter alkalithermophilus
which has strong solubilization ability for untreated lignocellulosic biomass [4]. C.
alkalithermophilus exhibited polysaccharide degradation ability broader than C.
thermocellum. We would like to talk about BSES process using C. alkalithermophilus
for lignocellulosic biomass. This approach may resolve a significant barrier toeconomical production of bio-based chemicals and fuels from lignocellulosic biomass.

Designer microbes equipped with nano-scale protein
complexes
Jeong Eun Hyeon, ○Sung Ok Han(Dept. Biotechnol., Korea Univ.)samhan@korea.ac.kr

C1, 3, 5 and 6 based carbon sources are the most abundant utilizable the natural
resource. The design of enzyme and microbe is a key biological technology that can beused for C1, 3, 5 and 6 biorefinery. The design of enzyme and microbe is a usefulstrategy as tools in whole-cell biocatalyst systems for C1, 3, 5 and 6 biorefinery andhas drawn considerable attention as an attractive strategy for bioprocess applications.
Prior to fermentative production of valuable biochemical product from the C1, 3, 5 and6 based carbon sources by microbes, the lignocellulosic materials and hydrocarbons
should be absorbed and fixed by available state for use. In this study, we wereassembled the functional enzyme complexes containing a recombinant scaffolding
protein from Clostridium cellulovorans and various chimeric enzymes such as
endoglucanase CelE, laccase CueO, xylanase XynB in several industrial strains such as
Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris and Corynebacterium glutamicum forutilizing of lignocellulosic biomass into valuable products including ethanol and aminoacids. Moreover, functional enzyme complexes were displayed on the cell surface of C.
glutamicum to directly convert natural biomass to derived reducing sugars bysynergistic hydrolysis effect. Carbon monoxide (CO) gas was successfully efficiently
converted from CO to CO2 by functional enzyme complexes on the cell surface ofRalstonia eutropha containing carbon monoxide dehydrogenase (CODH) and carbon
monoxide sensing heme protein (CooA) with enhanced CO binding affinity. Also, S.
cerevisiae was metabolically engineered to utilize glycerol as a C3 carbon source andto produce high value product such as ethanol and fatty acid ethyl ester (FAEE) fromby-product such as glycerol. Also, we demonstrated the feasibility of employing C.
glutamicum as host for ALA production and for potential biosynthesis of additional
tetrapyrrole compounds, such as porphyrins and hemoproteins. These results suggestthat the complexed system may be a promising strategy for C1, 3, 5 and 6 biorefinery
as biological tools for production of high value biochemicals such as biofuel,bioplastics. To facilitate the widespread use of biological degradation and hydrocarbon
recycling, it is necessary to develop new enzymes and novel microbes that are both
effective and economical.

[1] Lynd L, Weimer P, van Zyl W, Pretorius I.: Microbiol Mol Biol Rev 2002,
66:506-577.
[2] Bayer E, Belaich J, Shoham Y, Lamed R.: Annu Rev Microbiol 2004, 58:521-554.
[3] Prawitwong P, Waeonukul R, Tachaapaikoon C, Pason P, Ratanakhanokchai K,
Deng L, Sermsathanaswadi J, Septiningrum K, Mori Y, Kosugi A.: Biotechnol
Biofuels. 2013 6:184. doi: 10.1186/1754-6834-6-184.
[4] Watthanalamloet A, Tachaapaikoon C, Lee YS, Kosugi A, Mori Y, Tanasupawat S,
Kyu KL, Ratanakhanokchai K.: Int J Syst Evol Microbiol. 2012 62:2330-2335.

Biological saccharification by anaerobic thermophilic bacteria

Designer microbes equipped with nano-scale protein complexes

Key words
Clostridium thermocellum, cellulosome, cellulosic biomass, biologicalsaccharification

Key words○Akihiko Kosugi1,2(1JIRCAS, 2Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Jeong Eun Hyeon, ○Sung Ok Han(Dept. Biotechnol., Korea Univ.)

protein engineering, metabolic engineering, bioresources, biorefinery

微生物の潜在能力に注目した有用二次代謝産物の「ものづくり」戦略

2S-Ep01

抗生物質の濃度依存的現象「抗生物質ホルミシス」の理
解と応用

2S-Ep02○保坂 毅（信州大・バイオメディカル研）
thosaka@shinshu-u.ac.jp

抗生物質という言葉が誕生して 70 年あまりになる。その間、様々な微生物の二次代謝産物から数多くの抗生物質が見つけ出され、我々人類はそれらから多大な恩恵を受けてきた。現在では、抗がん作用等の生理活性を示す物質も抗生物質と呼ぶことがあるが、抗生物質の元来の定義は、微生物が生産し、他の微生物の生育を抑制する効果をもち、動物に対して毒性が低い化学物質とされている。いずれにしても、抗生物質と聞けば、抑制や阻害というイメージが湧いてくる。ただ、いつも疑問に思うのは、なぜ微生物は抗生物質をつくるのか、抗生物質本来の働きは何なのか、といった点である。本講演では、これらの疑問に触れながら、演者らの最近の研究成果を紹介する。
多剤耐性菌が次々と発生する中で、新たな抗生物質の発見が求められている。
しかし、細菌の二次代謝産物から得られることの多い新奇抗生物質の発見数は減少の一途を辿っている。この窮地の打破に向けた重要課題の一つとして、「細菌に散在する潜在的な二次代謝能を活用するための手法の開発」、があげられている。この課題は、過去十数年のゲノムプロジェクトの成果から導かれた事実、「細菌、とりわけ代表的な抗生物質生産菌である放線菌には、通常の培養では検出に到らない極低発現の二次代謝産物生合成遺伝子が予想以上に多く存在す
る」、に基づいている。これを受けて、放線菌に散在する潜在遺伝子を機能させ、新たな抗生物質の生産に結び付ける手法の開発が、遺伝子工学や代謝工学など、様々な面から世界的に進められるようになった。これまでに、リボゾー
ム工学と呼ばれる斬新な手法など、我が国の研究からも抗生物質の探索に有効な手法が数多く生み出されてきた 1)。
演者らは、前述した課題に取り組む中で大変興味深い知見を得た 1, 2)。リンコマ
イシン（LIN）は、リボソームに作用してタンパク質合成を阻害する抗生物質である。放線菌基準株 Streptomyces coelicolor A3(2) は、最小生育阻止濃度（MIC）
以上の LIN 存在下で、当然ながら生育できない。一方、この放線菌は、1/80~1/2
MIC の LIN 存在下では、非存在下に比べて色素抗生物質を高生産する。つまり、低濃度の LIN 存在下において、S. coelicolor A3(2) は、潜在能力を発揮して、二次代謝が活性化した状態になる。演者らはこれまでに、MIC より低い濃度のリボソーム攻撃性抗生物質に二次代謝活性化作用があることを様々な放線菌で確認してきた。抗生物質のそのような濃度依存的現象はホルミシスといえる。ホルミシスとは、ある物質が持つ作用の二相性のことで、高濃度では有害に働くが、低濃度であれば逆に有益な作用をもたらし、生物活性を刺激する現象を指す。抗生物質ホルミシスに関する研究は、Davies（ブリティッシュコロ
ンビア大学）により先駆的に進められてきており、MIC より低濃度の抗生物質存在下で細菌の遺伝子発現が大きく変化することが実証されている 3)。放線菌を対象とした分野において、抗生物質ホルミシスと表立って表現して活用した
事例はさほど多くないが、演者らの成果に加えて、低濃度の抗生物質存在下で二次代謝産物の類縁体の生産パターンが変化する現象がいくつか報告されている。これらの成果は、抗生物質のホジティブな面を活用すれば、放線菌の潜在的二次代謝能を引き出せることを強く示唆している。
演者らはこれまでの解析から、放線菌 S. coelicolor A3(2) が LIN 存在下で色素抗生物質を高生産する条件において、同菌の培養最終菌体量が LIN 非存在下に比べて多くなることも見出した。抗生物質である LIN が、放線菌の生育に対してプラスに働くことは全く予想外であった。加えて、この現象が起こる条件では、FoF1ATP 合成酵素の発現や機能が変化して、結果的に細胞内の ATP 量が高くなることも判ってきた。このことが菌体量増加の原因となっている可能性は十分に考えられる。その他には、LIN 存在下で、ABC トランスポーターや LIN の標的である 23S rRNA のメチル化酵素の発現が劇的に高くなることも明らかになった。この結果は、細胞内に LIN が蓄積しないように、かつ LIN が標的部位に作用しないようにと、細胞が LIN から逃れ生き延びようと活動している様子を如実に示している。詳細な仕組みは解析中であるが、以上のように、LIN という一つの抗生物質の作用で、放線菌の性質が大きく変化することがはっきり見えてきた。

Application of advanced NMR techniques for analysis ofactinobacterial metabolism○Dana Ulanova, Masashi Tsuda(Dept. Mar. Resour. Sci., Fac. Agric. Mar. Sci., Kochi Univ.)
ulanova@kochi-u.ac.jp

Actinomycetes are potent producers of useful bioactive compounds. However, many
natural products have no or low production under standard laboratory conditions. Thus,
development of methods to activate or enhance such metabolite's production isimportant for novel compound discovery.
Many cultivation-based activation approaches have been reported. The addition ofprimary metabolism inhibitors at subinhibitory concentrations affects primary and/or
secondary biosynthetic pathways, which can result in increased production of
secondary metabolites (Craney et al., Chem Biol, 2012, p.1020, Imai et al. Appl
Environ Microbiol, 2015, p.3869). In this study, we analyzed the effect of inhibitor
triclosan on secondary metabolism of actinomycetes. Triclosan was added at different
stages of bacterial growth and secondary metabolite production was analyzed by LCMS and NMR profiling.
In addition, we use dynamic nuclear polarization-NMR technique for a real-timevisualization of bacterial metabolism. Dynamic nuclear polarization (DNP) is a
hyperpolarization technique, which enables to increase the NMR signal intensities by
several orders of magnitude by transfer of spin polarization from electrons to nuclei. In
this talk, we will introduce the application of this technique for analysis ofactinobacterial metabolism in vivo. Actinobacterial cultures at mid-exponential phaseof growth were fed with hyperpolarized 2-13C pyruvate and 13C-NMR spectra wererecorded every 2 s starting from 0.5 s after feeding. As a result, we observed the realtime conversion of pyruvate to intermediates of primary metabolic pathways, such as
citric acid cycle, etc. Moreover, time-dependent differences in individual signal
maxima and decay, as well as minor signal differences were detected between
individual species. In conclusion, DNP-NMR technology is a useful tool for assaying
intracellular reactions in short-time scale and could be used for comparing metabolic
kinetics of different actinobacteria.

前述した演者らの研究成果は、「抗生物質とはそもそも何か」の理解を更に難し
くさせている。放線菌の二次代謝は、生合成遺伝子、基質、シグナル分子や制御因子、さらにはエネルーギー源となる物質などが複雑に作用し合い、巧妙なバランスで成り立っている。そのバランスを整えるのに抗生物質が一役買っているのかもしれない。放線菌の二次代謝産物から新しい抗生物質を見つけ出す
研究を更に発展させるためには、生産者である放線菌の性質のみならず、抗生物質の本質も見抜き深く理解することが、とても重要であると演者らは考えている。
Imai, Y. et al.: Appl. Environ. Microbiol., 81, 3869 (2015).
保坂 毅：生物工学会誌, 94(7), in press (2016).
3)
Davies, J. et al.: Curr. Opin. Microbiol., 9, 445 (2006).
1)

2)

Understanding the mechanism of the hormetic effects of antibiotics and its
application○Takeshi Hosaka(ICCER, Shinshu Univ.)

Key words

actinomycetes, secondary metabolism, antibiotics, hormesis

167

Application of advanced NMR techniques for analysis of actinobacterial
metabolism○Dana Ulanova, Masashi Tsuda(Dept. Mar. Resour. Sci., Fac. Agric. Mar. Sci., Kochi Univ.)

Key words
NMR

actinomycetes, secondary metabolism, primary metabolism, DNP-

168

微生物の潜在能力に注目した有用二次代謝産物の「ものづくり」戦略

2S-Ep03

多価不飽和脂肪酸合成酵素の機能解析
林 祥平 1, ○佐藤 康治 2, 氏原 哲朗 3, 大利 徹 2（1北大院・総合化学, 2北大院・工, 3協和発酵バイオ）
syasu@eng.hokudai.ac.jp

2S-Ep04

物質生産を志向した未利用遺伝子の発掘と宿主の改変○鮒 信学（静県大・食栄）
funa@u-shizuoka-ken.ac.jp

ドコサヘキサエン酸 (DHA) やエイコサペンタエン酸 (EPA) に代表される多価不飽和脂肪酸 (PUFA) は機能性脂質と呼ばれ、様々な健康増進効果が報告されており、その需要は年々増加している。現在の主な PUFA 供給源は魚油等の海洋資源であるが、海洋資源の枯渇や安定供給が問題となっており、新たな供給源として微生物発酵が注目さている。しかしその生産性は十分ではなく、その向上が望まれている。
PUFA はある種の海洋性微細藻類や細菌により生産され、一部の菌株ではポリケチド合成酵素 (PKS) に似た構造を有するマルチドメインからなる巨大な酵素複合体である PUFA 合成酵素により行われる。また本酵素には複数の連続したアシルキャリアプロテイン (ACP) ドメインを持つという PKS には見られない特徴がある。このタンデム ACP の機能解析例として、6 つの ACP を持つ原核微生物 Shewanella japonica 由来の PUFA 合成酵素の ACP に順次変異を導入して不活性型にした結果、不活性型ドメイン数の増加に伴い PUFA 生産性が低下する
ことが報告されている（Jiang ら, JACS 2008, p. 6336）。
真核微細藻類である Schizochytrium sp. 由来 PUFA 合成酵素は OrfABC の 3 サブ
ユニットより構成され、その OrfA 中に 9 個の連続した ACP ドメインが存在する。そこで上述の現象が真核微細藻類でも再現するか検討した。ACP ドメイン数を 4 から 11 個とした orfA 遺伝子を再構築し、大腸菌で異種宿主発現させPUFA 生産能を評価した。その結果、真核微細藻類由来の酵素においても ACP
ドメイン数の減少に伴い生産能は低下した。興味深いことに、ACP ドメイン数
を 4 個としても生産能を保持していたことから、本 PUFA 合成酵素は幅広い
ACP ドメイン数を許容できると考えられた。そこで、10 および 11 個へと増加させ生産能に対する影響を検証した。その結果、ACP ドメイン数の増加により、PUFA 生産能の向上が確認された。以上より、PUFA 合成酵素の ACP ドメ
インの数は、生産性を制御していると考えられた。
次に、本現象の普遍性を原核微生物由来 PUFA 合成酵素を用いて検証した。ACP
ドメインを 4 個もつ Shewanella oneidensis 由来 PUFA 合成酵素 (PfaABCD) のACP ドメイン数を 5、6、7、8、および 9 個に増加させ、大腸菌における異種宿主発現により PUFA 生産能を評価した。その結果、本酵素においても ACP ドメ
イン数の増加に伴った PUFA 生産能の向上が認められた。
以上より、PUFA 合成酵素は複数の ACP ドメインを許容可能であり、その数により PUFA 生産能が制御されていることが明らかとなり、ACP ドメイン数の増加による PUFA 生産能向上に成功した。

1907 年に John Norman Collie は、芳香族ポリケタイドの生合成に根本的な規則性が存在する可能性を示唆した。1955 年、Arthur Birch は acetate hypothesis を提唱し、芳香族ポリケタイドの生合成の規則性が解明された。現在、芳香族ポリケタイドの生合成は、ほぼ理解されていると言っても過言ではない。しかしながら、半世紀以上前の単純な生合成反応であっても、生合成「酵素」とその反
応メカニズムの多くは解明されていない。そのため、有用にも関わらず、微生物生産など、安価大量調整が達成されていない。
環構造は二次代謝産物に化学的な多様性をもたらし、多彩な生理活性の要因となっている。芳香族ポリケタイドの生合成は、ポリケタイド鎖生成と環形成に分けられる。ポリケタイド鎖は、ポリケタイド合成酵素（PKS）により合成される。PKS は I～III 型に分類され、カビの I 型、放線菌の II 型、細菌、カビお
よび植物の III 型が芳香族ポリケタイドの合成を担う。ポリケタイド鎖の環化は、PKS の型によって異なる。I 型 PKS では、同一ポリペプチド上の producttemplate (PT) domain や thioesterase domain などが、II 型 PKS では subunit の環化酵素が、それぞれ環形成を担う。一方、III 型 PKS には環形成のための domain
や subunit がないと考えられていた。我々は、III 型 PKS の反応に関与する環化酵素が存在すると考え、研究を開始した。
我々は、互いに相同性が高い二種の III 型 PKS が、それぞれナフタレンとイソ
クマリン骨格の合成を触媒することを見出した。放線菌由来の IG64_RS22470
は、既知 III 型 PKS、RppA（ナフタレン骨格を合成する）と相同であるのにも関わらず、閉環反応を触媒しない。閉環反応は、IG64_RS22470 とオペロンを形成する環化酵素（IG64_RS22475）により RppA とは異なる様式で行われ、最終的にイソクマリン骨格を与える。最近、III 型 PKS の環形成反応を変化させる酵素、OAC（II 型 PKS の環化酵素 TcmI の相同蛋白）が見出された。環化酵素の発見は、OAC についで二例目の成果である。驚くべくことに、環化酵素（IG64_RS22475）は、I 型 PKS の PT domain と相同であった。PT domain は一部の I 型 PKS に特有であると考えられているが、本発見により細菌にも分布していることが明らかになった。また、イソクマリン類はカビ、地衣類、植物から見出されており、様々な生理活性を有する。本発見はイソクマリンの微生物生産に繋がる成果である。
我々は、放線菌の II 型 PKS の環化酵素 SnoaL に相同な酵素・Soce2135 を粘菌から見出した。Soce2135 は、SoceCHS1（ナフタレン骨格合成する RppA のホモログ）、Soce2134（aldo-keto reductase）とオペロンを形成していた。詳細な検討の結果、本オペロンは 1,8-DHN の合成を担うことが判明した。Soce2135 は脱水酵素であり、上述の環化酵素（IG64_RS22475）とは異なり、閉環反応には関与しなかった。予期していなかった結果ではあるが、本発見は細菌から 1,8-DHNの生合成酵素が見出された初めての例である。なお、カビにおいて、1,8-DHNを前駆体とする DHN メラニンは植物への感染に必須である。本成果は全く新規なメカニズムによる、植物病原性の細菌の防除手法の開発に繋がる可能性がある。
生産生物からの収量が少ない場合、複雑な構造のため有機合成が煩雑な場合など、芳香族ポリケタイドは大量調整が困難なことが多い。一方、大腸菌や放線菌の組換え体を用いた芳香族ポリケタイドの異種生産が注目されている。しかしながら、大腸菌は本来、二次代謝産物を生産しないため、組換え大腸菌によるポリケタイド生産では収量が少ない。また、放線菌には芳香族化合物の異化経路が存在し、組換え放線菌では芳香族ポリケタイドの分解が懸念される。我々は大腸菌の一次代謝流量の増強を行い、芳香族ポリケタイドの収量の劇的な改善に成功した。芳香族ポリケタイドの前駆体は malonyl-CoA である。一方、
malonyl-CoA は脂肪酸合成の基質でもあり、その生合成は厳格に制御されている。そこで、大腸菌 E. coli BL21 株の脂肪酸合成酵素（FAS）遺伝子 fabH、
fabF、fabB の破壊株および fabB/fabH、fabF/fabH の二重破壊株を作製した。生体内 acetyl-CoA および malonyl-CoA 濃度を測定した結果、各 FAS 破壊株では親株よりもそれらの濃度が高かった。特に ΔfabFH 株では、それぞれ 6 倍、45 倍
濃度が親株よりも高かった。また、転写量解析の結果、各 FAS 破壊株において脂肪酸生合成の正の制御因子 fadR、acetyl-CoA carboxylase・accABCD、FAS 遺伝子の転写量が親株よりも上昇していた。以上より、脂肪酸生合成に関する酵
素の転写量の上昇が malonyl-CoA 量の増大の一因であることが判明した。さらに、各 FAS 破壊株ではグリオキシル酸回路における負の転写抑制因子 iclR の転写量が上昇し、同回路の生合成酵素 aceA、aceB の転写が抑制されていた。グリオキシル酸回路で消費される acetyl-CoA の量が減少したことが acetyl-CoA 量の増大の原因であると推測された。
以上のように我々は、芳香族ポリケタイドの生合成酵素の探索研究とその異種生産のための宿主の改良を行っている。本シンポジウムでは、上記の成果を概説し、その意義を中心に議論する。

Functional analysis of tandem acyl carrier protein in polyunsaturated fatty
acid synthases

Biosynthesis and production of aromatic polyketides in bacteria

Shohei Hayashi1, ○Yasuharu Satoh2, Tetsuro Ujihara3, Tohru Dairi2(1Grad. Sch. Chem. Sci. Eng., Hokkaido Univ., 2Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.,
3
Kyowa Hakko Bio)

Key words
acid, ACP

polyunsaturated fatty acid, docosahexaenoic acid, eicosapentaenoic○Nobutaka Funa
(Sch. Food Nutr. Sci., Univ. Shizuoka.)

Key words

biosynthesis, Escherichia coli, aromatic ring compound, malonyl-CoA

微生物の潜在能力に注目した有用二次代謝産物の「ものづくり」戦略／酵素学，酵素工学

2S-Ep05

放線菌二次代謝生合成・制御系の合理的改変による休眠
二次代謝の発掘

2P-1p001 高基質親和性を有する好熱性光合成細菌由来サルコシン
オキシダーゼ○荒川 賢治（広島大院・先端物質）
karakawa@hiroshima-u.ac.jp

放線菌は微生物由来二次代謝産物の７割近くを生産する有用土壌微生物である。放線菌二次代謝産物に関して、近年では生合成遺伝子の改変による非天然型抗生物質の創製も盛んに行われており、創薬の研究シーズとして期待される。
我々が研究対象としている放線菌 Streptomyces rochei 7434AN4 株は２つのポリケチド抗生物質ランカサイジン(LC)・ランカマイシン(LM)を生産し、３つの線状プラスミド pSLA2-L,-M,-S を保持している。その中でも pSLA2-L は、LC,LM
生合成遺伝子の他にもこれらの制御遺伝子や構造未知の type-II 型ポリケチド(roc)・カロテノイド(crt)生合成遺伝子群も有しており、二次代謝生産と制御の相関性が興味深い。
我々は制御カスケード解析を行うに当たり、数多くの制御遺伝子変異株を取得している。とくにリプレッサー srrB を破壊すると LC,LM 大量生産株が取得できた。この知見は本菌の潜在的二次代謝産物のゲノムマイニングに応用可能であることを示唆している。そこで我々は、srrB に加えて「主要二次代謝生合成」である LC, LM 生合成遺伝子に対して変異を施した三重変異株 KA57 株を構築した。本株は分子式 C10H20N2O3 のアゾキシアルケン化合物 KA57-A を蓄積した。KA57-A は親株の通常培養では検出できず、遺伝子工学による休眠二次
代謝の覚醒に成功した。さらに上述の代謝物に関しては生合成遺伝子が同定されておらず、それらの生合成マシナリー、とりわけアゾキシ結合の形成機構は大変興味深い。標識化合物の取り込み実験により、cis-1-ヘキセニル基 (C1’-C6’)は脂肪酸由来であり、C-1 位は酢酸の 2 位炭素由来であることが示唆された。
一方、C2-C4 位に関しては、[2,3,3-2H3]DL-serine を添加したところ、KA57-A の
H-4 位にのみ重水素の取り込みが認められた。また[1,1-2H2]1-hexylamine を添加し、常法に従って精製したところ、KA57-A の他に分離困難な夾雑物が認められた。2H-NMR および ESI-MS 解析を行ったところ、まず 2H-NMR において δD= 6.78, 4.14 が検出できた。前者は [1’-2H]-KA57-A の 1’位シグナルに対応する化
学シフト値であり、ESI-MS においても同様に[M+Na]+=240 が検出できた。一方、 [M+Na]+=243 のピークも検出できており、分子式は C10H202H2N2O3 と示唆された。これは[1’,1’-2H2]1’,2’-dihydro-KA57-A に相当しており、2H-NMR における後者の高磁場シグナルは本化合物に対応すると考えられる。重水素標識ヘキシルアミン添加時の夾雑物の蓄積は、KA57-A 生合成における 1’,2’-不飽和化がアゾキシ結合形成後に生じることを意味している。本発表では生合成の詳細
および生物活性についても言及する。

169○竹本 淳一, 山本 眞知, 加納 周作, 中野 祥平, 西矢 芳昭（摂南大・生命科学）
nishiya@lif.setsunan.ac.jp【背景および目的】 腎疾患のマーカーであるクレアチニンは、酵素法により高い精度で測定されている。クレアチニン測定酵素法は、細菌が産生する３つのクレアチニン代謝酵素、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、サルコシンオキ
シダーゼ（Sox）によりクレアチニンを過酸化水素に導き、発色定量する。ク
レアチニン測定酵素法の精度を高めるためには、追随酵素である Sox の触媒効率を高め、測定反応を速やかに終点に持っていく必要がある。優れた臨床検査用酵素を開発し予防医学に貢献するという大きな目標の一環として、今回、好熱性光合成細菌由来 Sox ホモログの特性評価を行った。
【実験方法および結果】 好熱性光合成細菌には、既知の Sox と 30%台の相同性を有するタンパク質遺伝子が存在する。本遺伝子のアミノ酸配列を構造比較したところ、既知 Sox の活性中心近傍アミノ酸残基とは一部に異なる特徴が認められた。われわれは、本タンパク質が Sox であり、既知の酵素とは触媒効率に差異が見られることを期待した。本タンパク質の特性を評価したところ、サル
コシンに対する Km 値が既知酵素（Bacillus 属由来）の約 1/30 と極めて高い基質親和性を有することが分かった。また、ソフトウェア MOE により構築した Soxの構造モデルを基に、変異効果を解釈した。
【結論】 本 Sox はクレアチニン測定酵素法の精度向上に資するレベルの高い基
質親和性を有していた。本 Sox をクレアチニン測定に応用することにより、酵素法測定の精度を更に高めることが可能となり、測定の信頼性向上に貢献することが期待される。

sarcosine oxidase from a thermophilic photosynthetic bacterium with highsubstrate specificity○Jyunichi Takemoto, Machi Yamamoto, Syusaku Kano, Shohei Nakano,
Yoshiaki Nishi(Life Sci,Setsunan Univ.)

Key words

Creatinine assay, Sarcosine oxidase, Substrate specificity, Mutagenesis

2P-1p002 ピルビン酸オキシダーゼ／酢酸菌キナーゼ法による実用的 ATP 再生法

○北岡 本光, 西本 完
（農研機構）
mkitaoka@affrc.go.jp

キナーゼは通常その基質である ATP 高濃度下で強い基質阻害を受ける。ATP が効果であることも合わせるとキナーゼ反応による物質生産を実用的に行うためには ADP から ATP を再生する系を組み合わせて用いることが必要である。ATP
を再生するためには ADP-ATP と同程度以上の結合エネルギーを持つリン酸エステルからのリン酸転移を行う必要がある。実用的な ATP 再生系として例えばピルビン酸キナーゼ、クレアチン酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、ポリリン酸キナー
ゼを用いる系などが報告されている。ピルビン酸オキシダーゼと酢酸キナーゼ
を組み合わせて用いることにより、ピルビン酸をエネルギー源として正リン酸を ATP に導入する方法について検討を行った。モデル系として、ガラクトキ
ナーゼによるガラクトース 1-リン酸の合成を試みた。
ピルビン酸、リン酸、ガラクトースを基質とし、触媒量の ATP の存在下にピルビン酸オキシダーゼ、酢酸キナーゼ、ガラクトキナーゼを作用させることによるガラクトース 1-リン酸の生成を確認した。ピルビン酸オキシダーゼは酸素分子を基質とするため、反応速度は反応液の比気液接触面積および気相の酸素分圧の影響を受けた。ピルビン酸オキシダーゼはピルビン酸 1 分子をリン酸 1 分子の存在下に酸素酸化し、アセチルリン酸 1 分子を生成する酵素とされている。
しかしながら、ピルビン酸 1 分子から生成可能なガラクトース 1-リン酸は 0.5分子以下であった。本反応を最適化したところ 1 M のピルビン酸をエネルギー源として 400 mM のガラクトース 1-リン酸を合成することに成功した。さらに、
本反応とホスホリラーゼの反応を同時に行うことにより高収率でのオリゴ糖のワンポット酵素合成が可能であることを実証した。

Mining of silent secondary metabolites by altering the main biosynthetic
pathways and their regulatory system in Streptomyces species○Kenji Arakawa(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words

biosynthesis, Streptomyces, repressor, secondary metabolite

Practical regeneration of ATP employing pyruvate oxidase and acetatekinase○Motomitsu Kitaoka, Mamoru Nishimoto(NARO)

Key words

ATP regeneration, kinase, pyruvate oxidase, acetate kinase

170

酵素学，酵素工学

2P-1p003 高比活性 L-グルタミン酸オキシダーゼの異種発現と酵
素学的性質

2P-1p005 アミノアシルプロリン合成におけるピロフォスファター
ゼの効果と菌体反応系での生産○林 優花 1, 野本 健斗 1, 長南 圭介 1, 酒瀬川 信一 2, 杉森 大助 1
（1福島大・共生システム理工, 2旭化成ファーマ）
sugimori@sss.fukushima-u.ac.jp【背景・目的】既報 L-グルタミン酸オキシダーゼ（LGOX）は、比活性、耐熱性、ならびに大腸菌による異種発現に関して技術的課題が残されている。そこ
で、これら課題を克服する LGOX の開発を目指し、スクリーニングを行った。
その結果、比活性が高く、大腸菌により容易に発現できる LGOX を放線菌から見出した。本発表では、本 LGOX の精製と大腸菌による異種発現、ならびに発現酵素の酵素学的諸性質について報告する。
【方法・結果】放線菌 NT1 株菌体内から有機溶媒沈殿とカラムクロマトグラ
フィーにより LGOX を部分精製した。部分精製酵素は pH 6、50℃付近で最大活性を示し、その比活性は 11 U/mg-protein であった。本酵素は、L-グルタミン酸
以外のアミノ酸には活性を示さない非常に高い基質特異性を有していた。SDSPAGE で得られたバンドを LC-MS 解析することでペプチド配列を取得し、次世
代シーケンサーにより取得した NT1 株のドラフトゲノムシーケンス中から本酵素遺伝子を推定した。推定 orf をクローニング、大腸菌発現させ、LGOX 活性を確認することで目的 LGOX 遺伝子（2073 bp）を特定した。さらに、690 アミノ酸残基からなる本酵素の推定アミノ酸配列を決定した。本酵素のアミノ酸配列は、放線菌 monoamine oxidase や推定 LGOX のアミノ酸配列と約 80%以上の高い相同性を示した。pET24a と E. coli BL21 (DE3)を用いて NT1 株 LGOX を異種発現させた結果、可溶性画分として菌体内に発現（比活性 4.7 U/mg-protein）
させることに成功した。さらに、発現 LGOX は pH 5.1、55℃で 45 min 活性低下が認められず、既知 LGOX のなかでも比較的高い耐熱性を持つことがわかった。

○鈴木 伸 1, 原 良太郎 2, 木野 邦器 1,2（1早大・先進理工, 2早大・理工研）
kkino@waseda.jp【目的】アミノアシルプロリン(Xaa-Pro)は血圧上昇抑制作用や血糖降下作用を示す有用化合物である。我々は、非リボソーム型ペプチド合成酵素のアデニル化(A)ドメインを利用することで Xaa-Pro の酵素的合成に成功している。さらに、
Deinococcus proteolyticus MRP 由来の class III PPK2(Deipr_1912)を用いた単一酵素による AMP からの ATP 再生系を構築し、ATP を必要とし AMP を生成する
本反応への有効性を報告 1)している。しかし、反応速度が低く Xaa-Pro 合成量が少ないことが課題であった。A ドメインによるアデニル化は基質特異性評価に用いられる ATP-PPi 交換反応に見られるように可逆的であり、過剰のピロリン酸(PPi)存在下で逆反応が進行する。本研究では、反応で生じる PPi をピロフォ
スファターゼ(PPase)により分解することでアデニル化を促進し、Xaa-Pro 合成
速度を向上できると考えた。
【方法・結果】Brevibacillus parabrevis IAM1032 由来 tyrocidine synthetase A の A
ドメイン(TycA-A)を用いた Trp-Pro 合成に Deipr_1912 による ATP 再生系を共役させた反応に大腸菌由来の PPase を添加した。その結果、12 時間までの反応速度が 14 倍に上昇した。さらに、反応条件の最適化により 72 時間で最大 6.2 mMの Trp-Pro 合成を達成した。予想通り PPase 添加の効果を得ることができた。
本結果より、大腸菌を利用する反応では宿主由来の PPase が作用し同様の効果が得られると考えた。Xaa-Pro およびプロリンそれぞれの分解酵素遺伝子 pepQおよび putA を欠損させた大腸菌にて TycA-A と Deipr_1912 を発現させ、Trp-Pro
生産を検討した。菌体反応においても ATP 再生系の共役により AMP を初発基質とした Trp-Pro の生成が確認でき、精製酵素反応と比較して高濃度の AMP が必要ではあるが、24 時間で 6.7 mM の Trp-Pro 生産を達成した。
1) 鈴木ら, 2015 年度日本生物工学会大会講演要旨集 p.103 (演題番号 1P-059)

Heterologous expression and characterization of L-glutamate oxidase withhigh specific activity

Effect of pyrophosphatase on aminoacyl proline synthesis and the
production by whole cell reaction

Key words
L-glutamate oxidase, heterologous production, high specific activity,
thermostability

Key words

2P-1p004 FMO 法と QM/MM 法による D-アミノ酸オキシダーゼ

2P-1p006 Fatty acyl-AMP リガーゼを利用した脂肪酸アミド合成法○Yuka Hayashi1, Kento Nomoto1, Keisuke Chonan1, Shin-ichi Sakasegawa2,
Daisuke Sugimori1(1Fac. Symbio. Syst. Sci., Fukushima Univ., 2Asahi Kasei Pharma Corp.)の反応機構の理論的検討○Shin Suzuki1, Ryotaro Hara2, Kuniki Kino1,2(1Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ.)

pyrophosphatase, aminoacyl proline, NRPS, polyphosphate kinaseの開発○平井 健吾 1, 原 良太郎 2, 木野 邦器 1,2（1早大・先進理工, 2早大・理工研）
kkino@waseda.jp○阿部 幸浩 1, 庄司 光男 2, 浅野 泰久 3
（1東洋紡, 2筑波大学・計算科学研究セ, 3富山県大・生工研セ）
yukihiro_abe@toyobo.jp【背景と目的】浅野らは、D-アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)の R-フェニルアラニンに作用する porcine kidney D-amino acid oxidase(pkDAO)について、Y228L とR283G の 2 か所をミューテーションすることにより R-a-メチルベンジルアミン
に対して基質特異性を示す酵素を合成した。DAAO の反応機構として(1)ヒドリ
ド移動、(2)1 電子移動、(3)ポーラー機構が提案されているが、詳細は解明されていない。本研究では、これら 2 種類の基質が受ける周囲の残基からの相互作
用をフラグメント分子軌道(FMO)法で求め、次に反応経路を量子古典混合計算(QM/MM)法で検討した。
【計算方法】DAAO および pkDAO の結晶構造（PDB ID: 1VE9, 3WGT）中に基質を置き、周囲に水を配置して系を作り、20 ns 間の MD シミュレーションを行った。反応中心から半径 50Å の球状に系を切り出して QM/MM 計算モデルとした。フラビン環と基質、およびその間に存在する水、さらに重要と思われる残基を QM 領域にとり、QM/MM (B3LYP-D3(6-31G*)/Amber99)法で構造最適化した。酵素表面から 6Å 内の水を残して、FMO 法により基質と周辺残基との相互作用を計算した。また、nudged elastic band (NEB)法により反応経路および遷移状態を推定した。
【結果と考察】1VE9-RPHE および 3WGT-RMBA の 2 つの系において、反応は基質の a 炭素から電子を 1 つ有した H 原子(すなわち H・として)がフラビン N5へ移動すると同時に、基質の N 原子とフラビン C4a の間で電子の移動があることが示唆された。

【目的】我々は、非リボソーム型ペプチド合成酵素 (NRPS) 由来のアデニル化ド
メインにおけるアミノ酸のカルボキシ基活性化機構に着目し、その反応機構においてプロリンなど求核性の高い化合物を作用させると多様なアミド化合物合成が可能であることを報告している 1)。本研究では、NRPS と同じアデニレー
ト合成酵素スーパーファミリーに属するアシル CoA 合成酵素 (ACS) に着目し、脂肪酸のアデニル化に続き、求核性の高いアミン類を作用させることで、アミド結合の形成が可能と推察し、脂肪酸アミド合成を検討した。
【方法・結果】ACS のひとつである Fatty acyl-AMP ligase (FAAL) は、細胞表面における複合脂質の生合成の開始反応を触媒し、長鎖の脂肪酸をアデニル化す
る fadD 遺伝子にコードされる 2)。そこで、Mycobacterium smegmatis mc2155 由
来の FAAL を利用した脂肪酸アミドの合成を検討した。当該酵素の基質をデカン酸 (C10) とし、求核剤にプロリンを含む種々のアミンを用い、ATP および
MgSO4 存在下で反応したところ、予想通り decanoyl-L-Pro をはじめ多くの組み合わせで脂肪酸アミド化合物の合成を確認した。また、脂肪酸の基質特異性を検討しところ、C6-C9 の脂肪酸においても同様にアミド化合物が合成可能であった。以上の結果は、NRPS のアデニル化ドメインを利用した場合と同じく、ACS
による脂肪酸のアデニル化とそれに続く求核置換反応によりアミド結合形成が可能であり、簡便かつ汎用性のあるアミド化合物の新たな合成法を提案するものである。
1) 鈴木ら, 日本農芸化学会 2013 年度大会講演要旨集, 4C15a08
2) Trivedi, O.A., et al., Nature, 428, 441-445 (2004)

Reaction mechanism of D-amino acid oxidases revealed by FMO andQM/MM methods

Development of fatty acid amide synthesis using fatty acyl-AMP ligase○Yukihiro Abe1, Mitsuo Shoji2, Yasuhisa Asano3(1TOYOBO Co., Ltd., 2CCS, Univ. Tsukuba, 3Biotechnol. Res. Center, Toyama Pref.
Univ.)

Key words

D-amino acid oxidase, reaction mechanism, FMO, QM/MM○Kengo Hirai1, Ryotaro Hara2, Kuniki Kino1,2(1Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words
bondfatty acyl-AMP ligase, acyl-CoA synthetase, fatty acid amide, amide酵素学，酵素工学

2P-1p007 ブナシメジ（Hypsizygus marmoreus）由来メタロプロテ
アーゼの遺伝子クローニング

171

2P-1p009 Brevundimonas diminuta 由来のコバルト依存性 L-アミノ酸アミダーゼの X 線結晶構造解析○福田 泰久, 大庭 将矢, 藤井 謙吾, 白坂 憲章（近畿大・農）yfukuta@nara.kindai.ac.jp○米田 英伸 1, 泉 厚志 2, 浅野 泰久 1,2（1富山県大・工, 2JST, ERATO）
hkomeda@pu-toyama.ac.jp【背景と目的】きのこ類微生物の最大の特徴は、肉眼で観察可能なきのこ（子実体）形成という劇的な形態変化である。近畿大学農学部、寺下らは、酸性プロ
テアーゼ（Pepsin）の特異的阻害剤である S-PI（Streptomyces-Pepsin Inhibitor）
を培養基に添加すると子実体の形成を促進し、メタロプロテアーゼの阻害剤である Talopeptin や Phosphoramidon を培養基に添加した場合では著しい形成阻害を示す現象を、いくつかの食用きのこにおいて発見した。本発表では H.
marmoreus の子実体形成に関わると考えられる Phosphoramidon 感受性プロテアーゼの遺伝子クローニングについて報告する。
【方法と結果】ブナシメジ供試菌株には、H. marmoreus NN12 株を用い、菌床栽培を行った。芽だし処理後の培養菌糸をメタロプロテアーゼ源として酵素精製を行った。N 末端アミノ酸配列決定のためのプロテインシーケンス分析は、
PPSQ-31B（島津製作所）を用いて解析を行い、内部配列の決定には、autoflex
speed TOF/TOF-KN2（Bruker）を用いた。また、供試菌株である H. marmoreus
NN12 株のドラフトゲノム配列の決定を、次世代シーケンサー NextSeq500（illumina）を用いて行い、得られたドラフトシーケンス内で BLAST 検索を行い、遺伝子配列の決定を行った。本メタロプロテアーゼ遺伝子は、Fungalysin（Peptidase M36 family）および Zn-dependent metalloprotease（亜鉛プロテアーゼ）の配列モチーフをもつプロテアーゼであることが解明された。
本研究は、JSPS 科研費 26870730 及び、私立大学戦略的研究基盤形成支援事業
S1512004 の助成を受けたものである。

[目的]Brevundimonas diminuta 由来のコバルト依存性 L-アミノ酸アミダーゼ(LAA)は L-フェニルアラニンアミド(L-Phe-NH2)などのアミノ酸アミドを L-立体
選択的に加水分解する６量体酵素で、反応液中にコバルトイオンが存在するときに顕著に酵素活性が上昇する(1)。本酵素はアミノ酸アミドラセマーゼと共存させることで、ラセミ体アミノ酸アミドの動的光学分割による効率的な L-アミノ酸の合成に利用可能である。本研究では、LAA の高機能化のための構造情報を得ることを目的として X 線結晶構造解析を行った。
[方法と結果]組換え大腸菌の無細胞抽出液より硫安分画と各種クロマトグラ
フィーにより精製した LAA を用いて結晶化を行った。2mM CoCl2 と 2mM L-Pheを含む条件でハンギングドロップ法での結晶化条件の探索を行い、良好な X 線
回折を与える結晶を得た。Photon Factory の放射光を用いて回折データを収集し、Pseudomonas putida のロイシンアミノペプチダーゼの構造を用いた分子置換法により LAA の 2.5Å 分解能の構造を決定した。本酵素の結晶は P1 の非対称単位に４個の６量体分子、すなわち 24 個のサブユニットを含む。サブユニッ
ト当たり２個のコバルト原子がアスパラギン酸、グルタミン酸、およびリジン残基の側鎖と結合した領域が本酵素の活性中心と考えられ、コバルトイオンによって活性化された水分子により基質のアミド結合の加水分解が進行すると予想された。
(1)Komeda H, Hariyama N, Asano Y, Appl Microbiol Biotechnol (2006) 70:412-421.

cDNA cloning of metalloprotease gene from Hypsizygus marmoreus

X-ray crystallographic analysis of cobalt-dependent L-amino acid amidasefrom Brevundimonas diminuta○Yasuhisa Fukuta, Masaya Oba, Kengo Fuji, Norifumi Shirasaka(Fac. Agric., Kinki Univ.)

Key words

metallo protease2P-1p008 エリンギ由来セリンアミノペプチダーゼの非触媒領域の酸化が及ぼす基質特異性への影響○Hidenobu Komeda1, Atsushi Izumi2, Yasuhisa Asano1,2(1Fac. Eng., Toyama Pref. Univ., 2JST, ERATO)

Key words

amino acid, amidase, X-ray crystallography

2P-1p010 黄麹菌 D-アミノ酸特異的アミノペプチダーゼ(DamA)の機能解析とアミノリシス反応に対する溶媒の影響○東海 彰太 1, 有馬 二朗 2
（1鳥取大院・連農, 2鳥取大・農）arima@muses.tottori-u.ac.jp

森田（松下） 真由美, 服部 領太, 鈴木 聡, ○楠本 憲一（農研機構 食品研究部門）
kusumoto@affrc.go.jp【目的】我々はエリンギから、ファミリー S9 に属する新奇セリンアミノペプチ
ダーゼを取得した。本酵素は加水分解と拮抗してアミノリシス反応を触媒し、水系溶媒中で容易にジペプチド類を合成する。従って、本酵素の基質特異性の拡大は、様々な有用ペプチド類の合成の一手段となり得る。一方で、本酵素は過酸化水素処理により基質特異性変化が確認された。そこで本研究では、本酵素の基質認識機構の解明を目指し、この性質変化を足掛かりとして、酸化が予測されたアミノ酸残基の機能解析を行った。
【方法及び結果】本酵素を 1％の過酸化水素で 1 時間酸化すると、L-Phe-pNA に対する活性は保持されたが、L-Leu-pNA に対する活性は極端に低下した。酸化
処理した本酵素の MALDI-TOF MS 解析の結果、本酵素を構成するアミノ酸配列中の Leu193-Arg211 が酸化部位の一つとして特定された。この領域は、触媒部位から遠く離れており、基質認識に果たす役割が未解明である β-プロペラド
メインの一部に位置していた。そこで、特定された領域中の最も酸化されやすいと思われる Met203、及び本酵素中に存在する Cys を Ala に置換し、活性に与える影響を比較検討した。その結果、Cys の Ala 置換では、両基質に対する活性が低下したのに対して、Met203 の Ala 置換では、L-Leu-pNA に対する活性のみが低下し、酸化処理と似た効果が観察された。さらに、本残基を酸化されに
くい Ala に置換した上で、1％の過酸化水素処理による基質特異性の継時変化を検討した結果、1 時間処理まで L-Leu-pNA に対する活性が保持された。これらの結果から、酸化の初期段階において、Met203 が優先的に酸化されることで本酵素の基質特異性変化が引き起こされると考えられた。

【背景】我々はこれまでに、黄麹菌 Aspergillus oryzae ゲノムデータベースより
D-アミノ酸特異的アミノペプチダーゼ活性を有しかつアミノリシス活性を有する 遺 伝 子 (AOR_1_124064, old locus tag AO090138000075) を 見 出 し 、 Dstereoselective aminopeptidase (DamA) と名づけ、その酵素学的機能解析を行った（M. Matsushita-Morita et al. Appl. Biochem. Biotechnol. 171:145-164, 2013)。本発表
では、さらに本酵素の破壊株や過剰発現株を作製し、麹菌での機能の推定を試みた。また DamA のアミノリシス活性に着目し、ペプチド合成の最適な溶媒の検討を行った。
【方法と結果】A. oryzae RIB40 (ΔligD, ΔpyrG)株を宿主株として，上記遺伝子の破壊株と過剰発現株を作製し、各株の寒天培地で胞子形成と形態成長を比較した。その結果、対照株と比較して、破壊株と過剰発現株は大きな形態の差は見られなかった。また、DamA は D-Leu-NH2 基質に対して、加水分解活性だけでなく D-Leu-D-Leu-NH2 などのペプチド合成を行うアミノリシス活性を示すが、これまでにこの活性は 3.0M NaCl が添加された水溶液中で促進される事を明らかにしている。今回、酵素反応液中の溶媒を 8 種類の有機溶媒（各終濃度 50％）に変えて、DamA のアミノリシス活性によるペプチド合成への影響を調べた。
その結果、反応終了後の各液を TLC プレートで展開したところ、反応液中にエタノールやメタノール、ブタノール、イソプロパノールが存在すると、水溶液のみの反応液と比較して、新たなペプチドと思われる幾つかのスポットが確認できた。また、50％エタノール含有反応液は、メタノール含有反応液とはほぼ同等だが、他の 6 種の有機溶媒よりも多いスポットが確認でき、3.0M NaCl 添加の反応液と比較しても、ペプチド合成が進むことが明らかとなった。

Effect of oxidation of non-catalytic domain of serine aminopeptidase from
Pleurotus eryngii on its substrate preference

Investigation of aminolytic activity for D-stereoselective aminopeptidase of○Shota Tokai1, Jiro Arima2(1United. Grad. Sch. Agric. Sci., Tottori Univ., 2Agric., Tottori Univ.)

Key words

aminopeptidase, Pleurotus eryngii, substrate specificity, oxidation

Aspergillus oryzae

Mayumi Matsushita-Morita, Ryota Hattori, Satoshi Suzuki, ○Ken-Ichi Kusumoto(NFRI)

Key words

D-amino peptidase, aminolysis, Aspergillus oryzae, peptide synthesis

172

酵素学，酵素工学

2P-1p011 Candida antarctica lipase A の組換え大腸菌での菌体外生産

2P-1p013 Pseudomonas cichorii 由来組換え D-タガトース 3-エピメ
ラーゼを用いたデオキシケトヘキソースのエピ化反応○服部 菜月, 中野 秀雄, 岩崎 雄吾（名大院・生命農学）
iwasaki@agr.nagoya-u.ac.jp○熊谷 拓也 1, 吉原 明秀 2, 秋光 和也 2, フリート ジョージ W.J. 3,
何森 健 2（1香川大学院 農学研究科, 2香川大国際希少糖研究教育機構,
3
オックスフォード大学）
yoshihara@ag.kagawa-u.ac.jp【背景と目的】リパーゼの位置選択性を利用した油脂の加工・分析は応用上重要な技術である。現在知られているリパーゼによる油脂の位置選択的反応のほとんどは、リパーゼの sn-1,3-位特異性を利用したものに限定されている。その理由は、極めて厳密な sn-1,3-位特異性を有する酵素が知られているのに対し、厳密な sn-2 位特異性を有するリパーゼがないからである。
担子菌類酵母 Candida antarctica は二種のリパーゼ A 及び B を産生するが、そのうちリパーゼ A (Candida antarctica lipase A, CALA）は油脂の sn-2 位に弱い位置選択性を示す。
本研究の最終目標は CALA を蛋白質工学的に改変し、厳密な sn-2 位特異性を付与することである。この目的のため、野生型 CALA 及びその変異体を簡便に調製できる発現系が必要である。そこで本研究では CALA の組換え大腸菌での細胞外発現系の構築を目指した。
【方法と結果】 大腸菌用にコドン最適化した人工 CALA 遺伝子の上流に pelBsignal 配列を付加した CALA 発現プラスミドを構築した。このプラスミドを保持した E. coli BL21(DE3)を用いて発現実験を行ったところ、CALA は培養上清中に検出された。培養条件を最適化した後、培養上清から CALA の精製を行ったところ、200 mL の培養上清から 2.8mg の精製 CALA を得る事ができた。精製 CALA の N 末端配列を決定し、pelB シグナルペプチドが正しく除去されていることを確認した。また、精製 CALA を用いてトリアシルグリセロール分解反応を行い、生成するジアシルグリセロールの異性体組成を分析したところ、組換え CALA は 2 位選択性を有することを再検証した。

【目的】Pseudomonas cichorii ST24 由来 D-タガトース 3-エピメラーゼ（D-TE）
は基質特異性の広い酵素であり、D-タガトースと D-ソルボース間の可逆的なエピ化反応を触媒するだけでなく、ケトヘキソースやケトペントースの炭素第三位のエピ化反応も触媒する希少糖生産にとって重要な酵素である。本研究では炭素第一位もしくは炭素第六位がデオキシ化されたデオキシケトヘキソースに着目し、D-TE のデオキシケトヘキソースに対する反応性を評価した。
【方法・結果】P. cichorii ST24 由来組換え D-TE は HiTrap Q HP、HiTrap Phenyl
HP、Resource Q カラムを用いたクロマトグラフィーによって単一に精製され、単量体の分子量は 32 kDa であった。精製 D-TE を用いてデオキシ-ケトヘキソー
スに対する反応性を HPLC で分析した。6-デオキシ-ケトヘキソースに対して Dタガトースに対する比活性を 100% とした時の相対活性は、6-デオキシ-L-ソル
ボース 67.1%、6-デオキシ-L-タガトース 64.4%、6-デオキシ-D-タガトース
36.4%、6-デオキシ-D-プシコース 14.1%、6-デオキシ-L-プシコース 13.5%、6-デオキシ-D-フルクトース 6.61%、6-デオキシ-L-フルクトース 3.92%、6-デオキシD-ソルボース 2.87%であった。また、すべての 1-デオキシケトヘキソースに対しては僅かに活性が確認された。本酵素の D-タガトースおよび D-プシコースに対する比活性は、それぞれ 67.0 U/mg、42.3 U/mg であり 6-デオキシ-デオキシ
ケトヘキソースに対する活性は決して低いものではないことを示している。また、6-デオキシ-ケトヘキソースに対する Km を D-タガトースと比較したとき、
D-タガトースに対する Km が 51mM と報告されているのに対してすべての 6-デオキシ-ケトヘキソースではこの値を下回る結果が得られ、D-タガトースより基質親和性が高いことが示された。

Extracellular production of Candida antarctica lipase A by a recombinant
Escherichia coli.

Epimerization of deoxy-ketohexoses by D-tagatose 3-epimerase from
Pseudomonas cichorii ST24

Key words
Candida antarctica lipase A, Escherichia coli, positional specificity,
triacylglycerol

Key words
D-tagatose 3-epimerase, deoxy-ketohexose, enzymatic epimrization,
Pseudomonas cichorii

2P-1p012 鉄硫黄酸化細菌 Acidithiobacillus ferrooxidans 由来テト

2P-1p014 ナイロン加水分解酵素のサブユニット会合と熱安定化機○Nazuki Hattori, Hideo Nakano, Yugo Iwasaki(Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)

ラチオン酸ハイドロラーゼの結晶構造解析○Takuya Kumagai1, Akihide Yoshihara2, Kazuya Akimitsu2, George W.J. Fleet3,
Ken Izumori2(1Kagawa Univ. Agric, 2International Inst. Rare Sugar Res. Educ., Kagawa Univ.,3
Oxford Univ.)

構の解析○長谷 成記 1, 中山 久之 1, 小坂 恵 2, 玉田 太郎 3, 上村 一雄 1,
金尾 忠芳 1
（1岡山大院・環境生命, 2岡山大院・自科, 3国立量子科技研）
tkanao@cc.okayama-u.ac.jp○伊東 雅人 1, 衣笠 凌 1, 羽田 圭吾 1, 大塚 裕斗 1, 竹原 一起 1,
重田 育照 2, 武尾 正弘 1, 根来 誠司 1（1兵庫県立大学・工・応化, 2筑波大・計算科学研究センター）
negoro@eng.u-hyogo.ac.jp【背景と目的】鉄硫黄酸化細菌 Acidithiobacillus ferrooxidans は、二酸化炭素を唯一の炭素源とし、生育のためのエネルギーを二価鉄または還元型無機硫黄化合物を酸化することにより獲得する好酸性の化学合成独立栄養細菌である。我々は、本菌の異化的硫黄代謝における鍵酵素の一つ、テトラチオン酸ハイドロラー
ゼ（4THase）を分離精製し、これをコードする遺伝子（Af-tth）を同定した。
4THase は、テトラチオン酸（S4O62-）を単体硫黄（S0）とチオ硫酸（S2O32-）、硫酸（SO42-）に加水分解する反応を触媒する。本酵素は、Acidithiobacillus 属と一部の好酸性微生物からのみ活性が報告されている非常にユニークな酵素であり、その詳細な解析は酵素反応機構の解明や、本菌の硫黄代謝を理解するために必要不可欠である。本研究では組換え Af-Tth の結晶を用いた X-線結晶構造解析を行い、立体構造の決定と反応機構の解明など詳細な研究を行うことを目的とした。
【方法と結果】組換え大腸菌より得た Af-Tth の封入体を refolding することで活性型酵素を獲得し、高度に精製した後これを結晶化することに成功した。さらに Se-Met 置換した Af-Tth の結晶を同様に作成し、MAD 法により解析し位相を決定した。これらより得られたデータを解析した結果、Af-Tth 結晶は空間群 P32であり、本酵素は Class において All beta proteins、Fold において 8-bladed betapropeller に構造分類されることが分かった。次に反応機構を解明するために酵
素-基質複合体を形成させ、X-線照射による回折像データを得た。その結果、基質のテトラチオン酸と推定される電子雲を確認することができた。本酵素では、
他の多くの硫黄代謝酵素で活性中心として働く Cys 残基が基質付近で確認されなかったことから、Cys 残基が関与しない新規な反応機構を有することが期待できた。

【目的】ナイロン加水分解酵素 NylC は 6-アミノヘキサン酸オリゴマー、ポリア
ミド PA6、PA66、PA4 をエンド型で加水分解する酵素であり、前駆体として発現後、Asn266/Thr267 間で自己分断されて活性化酵素となる。本酵素は同一モ
ノマー４分子が会合したテトラマー構造（D2 対称）を有する。これまで、サブユニット界面の置換により、熱変性 Tm 値が 41～88℃まで変化することを見いだしている。本研究では、生化学的、計算科学の両面からサブユニット会合と熱安定化機構の解析を行った。
【方法および結果】耐熱性が最も高い NylC-G122Y130A36Q263(Tm =88℃)を親型酵素とし、新たな変異を導入すると、殆どの変異体で熱安定性が低下するか、或いは、細胞内での発現が見られなくなるという現象が観察された。RT-PCR による遺伝子発現量算出から、mRNA の合成は正常に行われていると判断した。
NylC に対するポリクローナル抗体を用いて、免疫分析を行ったところ、変異体
種により、1) 可溶画分に活性型として存在 2) 可溶画分に前駆体型として存在、
3) 沈殿画分に前駆体型として存在、4) 可溶画分にフラグメントのみが存在の 4
種類の挙動を取ることが分かった。3) の状態は、モノマー間の不適切な会合による不溶性凝集体の形成、4) の状態は、細胞内のプロテアーゼによる分解を受け、フラグメント化したものと推測した。NylC 変異体の挙動を MD シミュレー
ションにて解析を行うと、122 位変異体のサブユニット間距離が、Tm 値の上昇に伴い近接する現象が見られた。また、フラグメントのみが存在していた GYAQQ299D 変異体では、残基間距離の経時変化において、不規則なパルスが多数存在していた。各種変異体の溶液状態での挙動を、免疫分析結果と、計算科学分析結果を合わせて考察する。

Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of tetrathionatehydrolase from iron- and sulfur-oxidizing bacterium Acidithiobacillus

Analysis of thermostability and subunit assembly of NylC

ferrooxidans○Naruki Hase1, Hisayuki Nakayama1, Megumi Kosaka2, Taro Tamada3,
Kazuo Kamimura1, Tadayoshi Kanao1(1Grad. Sch. Environ. Life Sci., Okayama Univ., 2Grad. Sch. Nat. Sci. Technol.,Okayama Univ., 3QST)Key words
tetrathionate hydrolase, sulfur metabolism, Acidithiobacillus
ferrooxidans○Masato Itoh1, Ryo Kinugasa1, Keigo Hada1, Hiroto Ohtsuka1, Ikki Takehara1,
Yasuteru Shigeta2, Masahiro Takeo1, Seiji Negoro1(1Grad. Sch. Eng., Univ. of Hyogo, 2Center of Comp. Sci., Univ. of Tsukuba)

Key words

nylon, biodegradation, enzyme

酵素学，酵素工学／タンパク質工学

2P-1p015 有機溶媒中でのナイロンの酵素分解○岡崎 秀明, 伊東 雅人, 生越 大輔, 竹原 一起, 武尾 正弘,
根来 誠司（兵庫県大院・工）negoro@eng.u-hyogo.ac.jp

1732P-1p017 Functional analysis of Kup transport system in
Escherichia coli

○ Ellen, Naomi Hoshi, Yi-Hsin Su, Kei Nanatani, Shin Hamamoto,Nobuyuki Uozumi(Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ.)
uozumi@biophy.che.tohoku.ac.jp【目的】不要ポリマーの再資源化は循環型社会構築の観点から重要な検討課題である。合成ポリマー分解を効率化するためには、i）分解酵素の高機能化、ii）
モノマー化が容易なポリマーの探索、iii）ポリマーを溶解する有機溶媒・イオ
ン液体中での反応などのアプローチが考えられる。特に、有機溶媒中での酵素
反応は、化学処理と酵素処理の連携を容易にする。これまで、ナイロンでは、ポリマーを溶解させ、且つ、酵素反応が可能な溶媒条件は見いだされていない。
本研究では、ナイロンのリサイクル処理で、エチレングリコール（EG）が用いられていることに着目し、６ナイロンおよびその関連基質について、EG および、水混合系でのナイロン分解酵素の活性と安定性について検討した。
【方法及び結果】ナイロン分解酵素として、親型 NylC に４アミノ酸置換を有し、耐熱性が最も高い G122Y130A36Q263 変異体（Tm=88℃）を用いた。基質として、６ナイロン粉末 0.8g を EG20ml に分散させ、オイルバスを用いて 160℃で
攪拌しながら溶解させた後、冷却したものを用いた。EG を種々の割合で水と混ぜ、これに上記の基質溶解液を終濃度 5mg/ml、ナイロン分解酵素を 1mg/mlになるように加え、60℃で酵素反応を行った。経時的に反応溶液の上清 60μl をサンプリングし、遊離アミノ基の定量から分解性を評価した。EG／水混合系では、ナイロンは微粒子懸濁状態となるが、ナイロン凍結粉砕標品を直接、水に懸濁させた系に較べて、より均一に分散可能であること、 EG 濃度の上昇に伴い、酵素活性は阻害されるが、10% EG 中では、水懸濁試料と比較して、分解性が約 2 倍に上昇することが分かった。

Potassium (K+) is one of the major intracellular cations in living cells. for maintaining
turgor pressure and membrane potential of cells. In Escherichia coli, there are four
major K+ uptake transport systems; TrkH, TrkG, Kdp, and Kup, which are responsible
to maintain cell internal K+ concentration. EcKup is considered as a prototype of
Kup/HAK transporters in bacteria and plant cells. Last year, we showed that EcKup
was selective for K+, Rb+ and Cs+ over Li+, Na+, Ca2+, Sr2+ and Mn2+. In addition, Na+
and Cs+ presence in the environment affected K+ uptake. Here, we further characterized
the EcKup transport system using K+ uptake system deficient E. coli. We found that K+
uptake by EcKup was optimum at around neutral pH condition but not acidic pH asreported by Trchounian & Kobayashi (1999). According to the membrane topology of
EcKup (Sato et al., 2014), EcKup showed a long cytoplasmic side C-terminal domain.
We found that cell expressing C-terminal domain truncated EcKup grew better than thecells expressing the full length EcKup in the minimal medium. In addition, truncated
EcKup has slightly higher cation uptake activity, compare to full-length transporter.

Enzymatic hydrolysis of nylons in organic solvent

Functional analysis of Kup transport system in Escherichia coli

○Hideaki Okazaki, Masato Itou, Daisuke Ogoshi, Ikki Takehara, Masahiro Takeo,
Seiji Negoro(Grad. Sch. Eng., Univ. Hyogo)

Key words

Nylon○ Ellen, Naomi Hoshi, Yi-Hsin Su, Kei Nanatani, Shin Hamamoto,Nobuyuki Uozumi(Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ.)

Key words

transporter, K+ homeostatis, cell membrane, Escherichia coli

2P-1p016 インフルエンザウイルス A（H5N1)由来のヘマグルチニ

2P-1p018 Serratia marcescens type 1 secretion system による HasA

○鹿島 諒人 1, 吉田 佐和子 1, 尾形 慎 2, 宮崎 剛亜 1,3, 加藤 竜也 1,3,
朴 龍洙 1,3（1静大院・農・応生化, 2福島高専, 3静大グリーン科学技術研）
park.enoch@shizuoka.ac.jp○山下 純平 1, 小出（吉田） 静代 2, 中西 智美 1, 市原 拓巳 1,
辻 明彦 2,3, 大森 謙司 4, 湯浅 恵造 2,3（1徳島大院・先端技科, 2徳島大院・ソシオ, 3徳島大・生物資源,
4
名大院・創薬科学）
kyuasa@tokushima-u.ac.jp【背景・目的】インフルエンザウイルス A（H5N1)はトリ型インフルエンザウイ
ルスであるが、変異によって受容体との結合能が変化することによるパンデミッ
クが最も危惧されている。2 種類のインフルエンザウイルス A（H5N1)（A/Vietnam/1194/2004、 A/duck/Hunan/795/2002）由来のヘマグルチニン（HA-VT、
HA-HU）は、アミノ酸配列が 97％一致しているが、HA-HU の受容体への結合能は HA-VT に比べて低い。そこで、これら HA の受容体結合能の違いを詳細に解析するために、HA-HU 変異体を作製して受容体との結合能を解析した。
【方法・結果】HA-HU の 98 番目のアスパラギン、128 番目のアスパラギン酸、
133 番目のセリン及び 160 番目トレオニンをそれぞれアスパラギン酸、セリン、
ロイシン及びトレオニン残基に置換した N98D、D128S、S133L 及び A160T 変
異体を作製して、カイコ-バクミド発現系を用いて発現した。Fetuin agarose ゲルを用いて精製をして、受容体モデル糖鎖（Neu5Acα2,3 Linker3-γPGA および
Neu5Acα2,6-γPGA）を用いた ELISA によって結合能を解析した。4 つの変異体のうち、S133L 変異体と A160T 変異体において HA-HU よりも高い結合能が確認され、解離定数は HA-VT、S133L および A160T 変異体でそれぞれ 3.2×10-8、4.7×10-8、1.4×10-7 M であった。この結果から、HA-HU の 133 番目と 160 番目のアミノ酸残基が受容体との結合に深く関与していることが示唆された。現在、
S133L と A160T の 2 つの変異を入れた変異体の受容体結合能解析を行っている。

[目的] 大腸菌や Serratia marcescens などのグラム陰性菌には数種のタンパク質分泌機構が備わっており、その 1 つである type 1 secretion system (T1SS)は ABC
protein、MFP、OMP の 3 つのタンパク質で構成され、タンパク質をシグナルペ
プチド非依存的に 1 ステップで菌体外に分泌する。S. marcescens では、2 つのT1SS (Lip system; LipB-LipC-LipD、Has system; HasD-HasE-HasF)がそれぞれLipA、HasA の選択的な分泌を行っている。ABC protein である LipB や HasD が分泌タンパク質の基質選択に関与することが報告されているが、その詳細な分子機構は不明である。これまでに我々は、LipB を 5 つの領域に分け、それぞれの領域を相当する HasD に置換したモザイク ABC protein を作製し、その 1 つである ABCLHLLL が LipC-LipD との組み合わせにより、本来の Lip system では分泌できない HasA を分泌することを明らかにした。本研究では、HasA 認識に関わる HasD 領域(約 150 アミノ酸)を細分化して更なる認識部位の特定を行った。
[結果及び考察] ABCLHLLL の HasD 領域を LipB アミノ酸配列に部分置換し、HasAの分泌を調べた結果、HasD の a.a. 223-260 が HasA 分泌に関わることが示された。約 40 アミノ酸の中でも相同性が低い 4 アミノ酸(LipB: 258LGGW、HasD:
248
CGAL)に着目し、4 アミノ酸を HasD 配列に置換した LipBCGAL 及び LipB 配列に置換した HasDLGGW をそれぞれ作製し、HasA の分泌を調べた。その結果、LipBCGAL-LipC-LipD により HasA が分泌されたのに対して、HasDLGGW-HasE-TolCによる分泌は認められなかった。この結果より、HasD の 4 アミノ酸(248CGAL)
が HasA の分泌に重要であることが明らかとなった。T1SS により分泌されるタ
ンパク質は C 末端に分泌に関わる領域を持つことが報告されているため、現在、HasA の C 末端欠失変異体を作製し、分泌に関わる領域について検討しており、併せて報告したい。

Analysis of the binding capability of hemagglutinins from influenza virus A(H5N1) with its receptor

The mechanism of secretion of HasA by the Serratia marcescens type 1
secretion system

ンと受容体結合解析○Ryoto Kashima1, Sawako Yoshida1, Makoto Ogata2, Takatsugu Miyazaki1,3,
Tatsuya Kato1,3, Enoch Y. Park1,3(1Dept. Appl. Biol. Chem., Fac. Agric., Shizuoka Univ., 2Fukushima Natl. Coll. Of
Technol., 3Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)

Key words

hemagglutinin, influenza virus, silkworm

分泌機構の解明○Junpei Yamashita1, Shizuyo Koide-Yoshida2, Tomomi Nakanishi1,
Takumi Ichihara1, Akihiko Tsuji2,3, Omori Kenji4, Keizo Yuasa2,3(1Grad. Sch. Adv. Technol. Sci., Tokushima Univ., 2Inst. Technol. Sci., Tokushima
Univ., 3Fac. Biosci. Bioind., Tokushima Univ., 4Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya
Univ.)
Key words
secretory production, type 1 secretion system, Serratia marcescens

174

タンパク質工学

2P-1p019 接着性ナノファイバータンパク質 AtaA の分泌を促進す
るタンパク質 TpgA の発見

2P-1p021 小胞体内在分子シャペロン存在下におけるアミロイド
ベータの凝集挙動解析○吉本 将悟, 石川 聖人, 廣重 竜太, 鈴木 淳巨, 堀 克敏
（名大院・工）khori@nubio.nagoya-u.ac.jp○北内 健太, 迫野 昌文（富山大院・理工）msakono@eng.u-toyama.ac.jp【背景と目的】アシネトバクター属細菌 Tol 5 はバイオフィルム形成に依存せず、様々な材料表面に対し高い接着性を示す。この高い接着性は三量体型オー
トトランスポーターアドヘシン（TAA）のひとつである AtaA によるものである。AtaA を有用な微生物に生やして接着性を付与することにより担体に対して微生物を直接固定化できるため、新規の微生物固定化法として期待されている。
しかしながら AtaA を含む TAA の分泌機構はあまりわかっておらず、異種発現において発現がうまくいかないことがあるなどの問題があった。そこで本研究
では、ゲノム上で ataA 遺伝子のすぐ下流に位置し ataA 遺伝子とオペロンを形成している tpgA 遺伝子に注目し、その機能を調べることを目的とした。
【方法】
Tol 5 株を LB 培地で培養し、浸透圧ショックで破砕後、超遠心法により膜画
分、ペプチドグリカン画分をそれぞれ分離した。AtaA と TpgA の相互作用は、TpgA を固定した Ni ビーズによるプルダウンアッセイで確認した。Tol 5 の tpgA
欠損株における AtaA の細胞表層提示量は免疫蛍光染色により、菌体の接着性はポリスチレンプレートに対する付着試験により定量した。
【結果と考察】細胞分画とプルダウンアッセイにより TpgA は AtaA と相互作用して外膜にアンカリングされていることが示された。また TpgA は PGN にも結合していた。Tol
5 の tpgA 欠損株は AtaA の表層提示量が減少し、菌体の接着性が低下した。これらの結果は TpgA が AtaA、PGN 両者と複合体を形成し、AtaA の分泌を促進していることを示唆している。

【背景と目的】 アミロイドベータ (Aβ)は 40 前後のアミノ酸から成るポリペプチドであり、モノマーペプチドからオリゴマーを経て線維状凝集体へと変化する。
アルツハイマー病は、Aβ 線維状凝集体が脳内に蓄積することが原因で引き起こされる神経変性疾患である。これまでに、Aβ ストレスにより小胞体内在分子シャペロンが発現誘導すること、また小胞体内在分子シャペロンが酸化ストレス条件下で細胞表面または細胞外へと誘導されることが報告されている。このことから、Aβ 酸化ストレス条件下で小胞体シャペロンが小胞体外へと誘導されることが推測される。本研究では、小胞体内在分子シャペロンによる Aβ の凝集挙動への影響に関する検討を行う。
【方法】小胞体シャペロンタンパク質の DNA (カルレティキュリン(CRT)、タン
パク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)、PDI ファミリータンパク質(ERp57))を組み込んだプラスミドを大腸菌 BL21 に形質転換し、タンパク質を発現、精製した。Aβ1-42 およびタンパク質溶液を混合し、37℃の空気恒温槽で 24 時間イン
キュベートした後、チオフラビン T (ThT)分析、Western-blot、Dot blot、透過型
電子顕微鏡(TEM)による評価を行った【結果と考察】ThT 分析の結果より、小胞体シャペロン(CRT、PDI、ERp57)は、濃度依存的に Aβ の線維形成を抑制することが明らかになった。また、SDSPAGE/Western-blot および Dot blot の結果において、小胞体シャペロン存在下では、Aβ はモノマーの状態で存在していることが強く示唆された。さらに、TEMを用いた形態観察においても、小胞体シャペロン存在下では、Aβ 線維凝集体が減少していることが明らかになった。このことから、小胞体シャペロンが効果
的に Aβ の線維形成を抑制することが示唆された。

Discovery of a novel periplasmic protein assisting the secretion of thenanofiber protein AtaA

Influences of ER chaperones on amyloid beta fibrillation○Shogo Yoshimoto, Masahito Ishikawa, Ryuta Hiroshige, Atsuo Suzuki,
Katsutoshi Hori
(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

Key words

autotransporter, adhesion, adhesin, protein secretion

2P-1p020 オオミジンコにおける組換えタンパク質の卵への輸送系の確立○Kenta Kitauchi, Masafumi Sakono(Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama)

Key words
chaperone

Alzheimer's desease, Amyloid beta, Endoplasmic reticulum, molecular

2P-1p022 ドラッグデリバリーを目指したシャペロニン GroEL/ES複合体の応用○辻 勇祐, 加藤 泰彦, 渡邉 肇
（阪大院・工）watanabe@bio.eng.osaka-u.ac.jp○依田 ひろみ, 高村 岳樹, 小池 あゆみ（神奈川工大院, 工, 応用バイオ）koike@bio.kanagawa-it.ac.jp

効率的なバイオ医薬品の生産技術の確立は、現代医療において必要不可欠である。しかしながら、これまで組換えタンパク質の生産に広く利用されてきた大腸菌等ではタンパク質構造が安定せず不活性になる、培養細胞では培地が高価でありランニングコストがかかる、などの課題がある。そこで新たにオオミジ
ンコで組換えタンパク質を生産し卵に蓄積させ、その卵から回収する方法を提案する。ミジンコの卵は親個体から容易に分離可能で、卵の回収により親個体
由来の夾雑タンパク質を排除した効率的な回収が期待できる。遺伝子改変によりヒト型のタンパク質修飾を持たせること、さらには飼育が簡単かつ迅速に繁殖するので安価な生産も可能である。
本研究では卵黄タンパク質前駆体ビテロジェニン（vitellogenin:Vtg）の輸送機構を利用することとした。Vtg は脂肪細胞で合成された後、血リンパに分泌され、受容型エンドサイトーシスにより卵へ取り込まれる。オオミジンコの Vtg
はその N 末端に種を超えて保存された分泌シグナル配列（Signal peptide:VtgSP）に類似した配列を持つ。一方で、同じ甲殻類の淡水エビの Vtg で特定された Vtg受容体との相互作用領域と類似のアミノ酸配列も有する。そこでこれら 2 つの配列が in vivo で Vtg の輸送に関わるか否かを GFP と連結し解析した。
GFP あるいは VtgSP-GFP を発現するプラスミドを産卵直後の卵に注入した。24
時間後、GFP 発現プラスミドではプラスミドが取り込まれた特定の細胞内で局所的な蛍光が観察された。一方で VtgSP-GFP では全身で蛍光が観察され、その蛍光パターンから細胞間隙を流れる血リンパへの分泌が示唆された。受容体との相互作用領域の解析についても併せて報告する予定である。

【目的】 シャペロニン GroEL は、直径約 5 nm の空洞を 2 つ持つ 14 量体分子であり、ATP 依存的にコシャペロン GroES を結合することで、空洞入口に結合した細胞内変性タンパク質を空洞内に落とし込み、折れ畳みを補助する。ATP 加
水分解活性低下型変異体 GroEL(D52/398A)は、GroEL/ES 複合体を最長 12 日間維持でき、水溶性ナノカプセルとして利用できる可能性がある。本研究では、
DDS 展開を目指し、GroEL/ES 複合体の細胞導入試験を行った。
【方法】 精製した GroEL(D52/398A)、核移行シグナル融合 GroES 変異体 (GroESNAS) または野生型 GroES (GroES-WT) を用い、被内包物と共に 1 mM ATP 存在
下で GroEL/ES 複合体を形成した。播種後 24 時間以上経過した CHL 細胞に、終濃度 0.05～1 μM の GroEL/ES 複合体を添加し、所定時間細胞培養した。被内包物に変性 GFP を用いた場合は、生細胞中の GroEL/ES 複合体の局在を蛍光顕微鏡下で観察し、フラーレンまたはその誘導体を用いた場合は、細胞固定と蛍光染色を経て小核発生率を算出した。
【結果・考察】 GFP を用いた実験では、GroEL/ES-WT 複合体は細胞質に留まったが、GroEL/ES-NAS 複合体は内包物を維持したまま 24 時間前後で細胞核へ到達した。フラーレンを用いた実験では、UVA 照射による小核発生率が、フラーレン誘導体を内包した GroEL/ES-NAS 複合体を添加したときに 3%まで上昇した。これらの結果から、GroEL/ES 複合体は、細胞に適用する水溶性ナノカプセ
ルとしての利用が期待できる。

Establishment of the system of recombinant protein transport into the eggs
in Daphnia magna

Application of GroEL/ES Complexes for Drug Delivery System○Yusuke Tsuji, Yasuhiko Kato, Hajime Watanabe(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
peptideDaphnia magna, recombinant protein production, vitellogenin, signal○Hiromi Yoda, Takeji Takamura-Enya, Ayumi Koike-Takeshita(Dept. Appl. Chem. Biosci., Grad. Sch. Eng., Kanagawa Inst. Tech.)

Key words

GroEL, GroES, nanocapsule, DDS

タンパク質工学

2P-1p023 静電相互作用による小分子-タンパク質共結晶の作製○塚本 啓介 1, 南畑 孝介 2, 安達 基泰 3, 清水 瑠美 3, 黒木 良太 4,
長棟 輝行 1
（1東大院・工, 2九大院・工, 3量研機構, 4原子力機構）
kosukeminami@mail.cstm.kyushu-u.ac.jp

1752P-1p025 超安定化二量体新規人工蛋白質 Super WA20 (SUWA)の創製と自己組織化蛋白質ナノブロック複合体構築○木村 尚弥, 小林 直也, 新井 亮一（信州大・繊維）rarai@shinshu-u.ac.jp【背景と目的】 タンパク質結晶は、タンパク質分子が規則的に配列した多孔質構造を有しており、X 線構造解析の用途のみならず、近年では細孔内の反応場としての利用や、細孔内に様々な分子を配列することによる機能性材料としての利用が期待されている。本研究室では、ストレプトアビジン(SA)の末端に正電荷あるいは負電荷を持つペプチドタグを遺伝子工学的に付与した SA 組換体
を互いに混合することで、静電相互作用により SA 結晶が迅速に得られることを明らかとした。本研究では、電荷を有する小分子を反対の電荷を持たせた SA
組換体と混合することにより、小分子と SA の共結晶の作製を検討した。
【実験方法】パラフィンオイル重層下で SA 組換体と電荷を有する小分子（DNA,ペプチド, デンドリマー）を混合することにより結晶化を検討した。混合後、25℃で静置し、光学顕微鏡を用いて観察した。
【結果】 正電荷を付与した SA(SA(+))と負電荷を持つペプチド（YD8Y）あるい
はオリゴ DNA（A9,C9,T9）を混合した溶液および、負電荷を付与した SA(SA(-))と正電荷を持つペプチド（YR8Y）を混合した溶液において、12 時間静置後に結晶が観察された。また、SA(+)とデンドリマー（PAMAM, エチレンジアミン
コア, -COONa, Generation=1.5）を混合した溶液および、SA(-)とデンドリマー（PAMAM, シスタミンコア, -NH2, Generation=2）を混合した溶液において、混合後、36 時間において結晶が観察された。以上の結果より、静電相互作用を利用して、電荷を有する小分子と SA の共結晶が作製できることが示された。

これまでに、分子間フォールディング 4 本ヘリックス二量体を形成する“ヌンチャク型”構造の新規人工蛋白質(de novo protein) WA20 を用いて、蛋白質ナノブ
ロック(Protein Nano-building Block: PN-Block)を開発し、多様な自己組織化ナノ構造複合体の創出に成功してきた(N. Kobayashi et al., JACS, 2015)。将来のナノ材料等への応用に向けて、本研究では、PN-Block を構成する WA20 のさらなる構造安定化を目的として、立体構造を基にした合理的設計により、疎水性コア増強等のアミノ酸変異を導入した改変新規人工蛋白質 Super WA20 (SUWA)を設計構築した。CD スペクトル測定による熱変性実験より、WA20 の変性中点温度
Tm は 75℃であるのに対し、SUWA の Tm は 122℃と極めて高く、47℃もの熱安定化に成功した。また、SUWA に導入したアミノ酸変異の内の 1~2 残基ずつをWA20 に導入した各変異体を作製し、熱変性実験より Tm を算出した。その結果、各変異体の Tm の増加分の和が SUWA の Tm の増加分とほぼ近く、導入したアミノ酸変異が相加的に寄与して非常に高い熱安定性を獲得したことが示唆された。さらに、変性剤(GdnHCl)に対する構造安定性の比較を行ったところ、WA20 の変性中点濃度は 3.5 M であるのに対し、SUWA は 6 M と非常に高く、大幅な変性剤濃度耐性の向上が明らかとなった。さらに、この SUWA を利用した PN-Block として SUWA-foldon を作製し、Native PAGE, SEC-MALS, SAXS 解析等を行ったところ、複数の自己組織化ナノ構造複合体の構築が示唆された。
また、熱変性実験を行ったところ、これらのナノ構造複合体も構造安定性の向上が示された。以上の結果より、非常に高い熱安定性を獲得し、蛋白質ナノブ
ロック(PN-Block)として利用可能な超安定化二量体人工蛋白質 SUWA の設計開発に成功し(特許出願中)、今後、PN-Block を用いたナノバイオ材料開発等への応用が期待される。

Co-crystallization of electrostatically charged various small molecules andstreptavidin

Ultra-stabilized dimeric de novo protein SUWA for self-assembling protein
nano-building blocks○Keisuke Tsukamoto1, Kosuke Minamihata2, Motoyasu Adachi3, Rumi Shimizu3,
Ryota Kuroki4, Teruyuki Nagamune1(1Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo, 2Fac. Eng., Kyushu Univ., 3QST, 4JAEA)

Key words

protein, co-crystallization, electrostatic interaction, streptavidin

2P-1p024 N 末端ペプチドタグによる難発現タンパク質発現増大効
果の応用と機構解析○Naoya Kimura, Naoya Kobayashi, Ryoichi Arai
(Fac. Textile Sci. Technol., Shinshu Univ.)

Key words
protein nano-building block (PN-Block), de novo protein design,
thermal stability, hydrophobic core

2P-1p026 金属結合人工タンパク質の構造解析○鎌田 健一 1, Voet Arnout 2, Tama Jeremy 1（1横市大院・生命医科学, 2Dept. Chem., KU Leuven.）jtame@tsurumi.yokohama-cu.ac.jp○加藤 晃代, 中野 秀雄（名大院・生命農学）
teruyo.ojima@gmail.com【背景と目的】大腸菌や酵母は組換えタンパク質発現のために最も良く用いられているが、発現させたいタンパク質によっては、難発現である場合がある。我々のグループでは、そのような難発現タンパク質の N 末端に 4 アミノ酸から成る
SKIK ペプチドタグ配列を付加することにより、タンパク質発現量を増大可能であることを見出した。そこで、本講演では、1) 検出タグとしての利用法開発
および 2) タグ配列付加により大腸菌発現系でタンパク質発現量が増大するメカ
ニズム解明の 2 点を目的として、これまでに得られた結果を発表する。
【方法・結果・考察】まず、SKIK ペプチドに対するウサギポリクローナル抗体を調製し、これにより SKIK タグの含まれる発現物を検出可能か検討した。本
抗体を一次、HRP 標識抗ウサギ IgG 抗体を二次抗体として発現物を dot blot 法で検出した。その結果、SKIK 付加発現物はネガティブコントロールに対して優位なシグナルが得られた。以上より、SKIK タグは発現向上効果に加え、検出用タグとしても使用可能であると考えられる。
次に、モデルとして大腸菌において難発現であったマウス抗体遺伝子を用い、
タグ有・無で発現させたときの細胞増殖、mRNA 量およびタンパク質量を測定した。発現誘導 3 時間～48 時間の経時測定の結果、タグの有無にかかわらず大腸菌増殖速度に変化はなかった。一方、mRNA およびタンパク質量には大きな変化が見られ、タグ有ではタグ無に対してそれぞれ 1/6 倍および 30 倍の量を示した。以上より、N 末端タグ付加により、mRNA コピー数当たりの翻訳効率が著しく増大している可能性が考えられた。

Application and analysis of an N-terminal peptide tag for improvement in
the expression level of difficult-to-express proteins in E. coli
○Teruyo Kato, Hideo Nakano(Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)

Key words

difficult-to-express protein, peptide tag, translation【背景と目的】近年、数多くのタンパク質の立体構造が決定され、それらの機能が解明されてきた。タンパク質の立体構造は、水素結合をはじめとする様々な相互作用が複雑に関与することで保たれている。そしてその複雑さからコン
ピューターの発達した昨今でも、意図した構造の人工タンパク質をデザインすることは簡単ではないとされている。人工的にタンパク質をデザインしようとする試みは盛んに行われており、当研究室では Pizza と呼ばれる人工タンパク質を開発した。Pizza はコンピューターによってデザインされた、完全回転対称型の人工タンパク質であり、特定の機能はないが容易に作成でき、安定性も高い。構造解析のための結晶化も容易である。本研究では Pizza を用いて、その機能化と構造解析を行っていく。
【方法】Pizza の中心開口部にあるセリン残基をヒスチジン残基に変更した変異型 Pizza を設計、大腸菌 BL21(DE3)株を使用して発現・精製を行った。その後得られたタンパク質に金属イオン(Cd、Ni、Zn)を添加し、結晶化実験を行った。
そこで得られた結晶を用いて X 線結晶構造解析を行い、結晶構造を決定した。
併せて ITC(等温滴定カロリメトリー)、AUC(超遠心分析)による測定も行った。
【結果と考察】ITC、AUC の結果から、Pizza と金属イオンは大きな構造の変化(例えば金属イオンを介した二量化など)はせずに結合していることがわかった。
結晶構造解析から、Zn であればヒスチジン 3 残基に対して Zn イオン 1 つをシェアした、設計通りの構造をとっていることがわかった。

Structural analysis of artificial metal binding proteins○Kenichi Kamata1, Arnout Voet2, Jeremy Tama1(1Grad. Sch. Med. Life Sci., Yokohama City Univ., 2Dept. Chem., KU Leuven.)

Key words

artificial protein, self-assembling, computational design

176

タンパク質工学／抗体工学

2P-1p027 イネ由来 α-アミラーゼの内毒素中和メカニズムの解明○落合 秋人, 渡邉 和史, 菅井 寛, 田中 孝明, 谷口 正之（新潟大・自然研）
ottie@eng.niigata-u.ac.jp

2P-1p029 Serratia marcescens type 1 secretion system を用いた大腸菌による 1 本鎖抗体分泌系の構築○浜垣 秀平 1, 高木 大地 2, 市原 拓巳 2, 辻 明彦 3, 大森 謙司 4,
湯浅 恵造 3
（1徳島大院・先端技科, 2徳島大・工, 3徳島大・生物資源, 4名大院・創薬科学）kyuasa@tokushima-u.ac.jp【目的】内毒素は、細菌の細胞壁を構成する主要な成分であり、グラム陰性菌のリポ多糖（Lipopolysaccharide, LPS）とグラム陽性菌のリポテイコ酸（Lipoteichoic
acid, LTA）が知られている。内毒素は、細胞が破壊されると大量に放出され、ヒト体内に入ると、発熱、炎症、細胞や組織の損傷などの症状を誘発する。当研究室では、長い食経験を持つ米成分の新機能に着目し、これまでにイネ由来
α-アミラーゼ AmyI-1 が内毒素と結合して中和することを見出した。また、X 線
結晶構造解析などにより、それらの結合に関わると推定される構造（糖鎖結合部位（SBS1, SBS2）および活性中心に存在）を見出している。本研究では、部位特異的変異導入解析により結合部位の同定を行った。また、 RAW264 細胞を用いた in vitro における抗炎症試験を行うことにより、タンパク質医薬品としての可能性を検討した。
【方法と結果】 AmyI-1 の各変異体は、過去に当研究室で構築した組換え AmyI-1の大腸菌発現システムを利用して調製し、表面プラズモン共鳴 （SPR）を用いた生体分子間相互作用解析により AmyI-1 と内毒素との結合を評価した。その結果、 AmyI-1 は糖鎖結合部位においてのみ LPS を認識し、活性中心および糖鎖結合部位の両方において LTA を認識することが明らかになった。また、LPSに対する結合には糖鎖結合部位 SBS2 の寄与が大きく、LTA に対する結合には
SBS1 の寄与が大きいことが考えられた。
AmyI-1 の抗炎症作用は、LPS により誘導された NO 産生の抑制試験により評価した。その結果、LPS により誘導された NO 産生量が AmyI-1 の濃度依存的に減少したことから、AmyI-1 は抗炎症作用を有することがわかった。

[目的] 抗体医薬品は、副作用が少なく、高い治療効果を示すことから、非常に注目されている。抗体生産の宿主として CHO 細胞が用いられているが、膨大なコストがかかり、抗体医薬品が高価になるといった問題が生じている。宿主の代替候補の 1 つとして大腸菌が挙げられるが、分泌生産が困難であり、菌体破砕等の工程が必要になる。これまでに我々は、Serratia marcescens の 2 つのtype 1 secretion system (T1SS) (Lip system; LipB-LipC-LipD、Has system; HasDHasE-HasF)の ABC protein である LipB と HasD の 5 つの領域をそれぞれ置換した mosaic ABC protein の研究において、その 1 つである ABCLHLLL が本来の Lip
system では分泌されない異種タンパク質 HasA を分泌することを見出した。本
研究では、このシステムを用いて一本鎖抗体(scFv)の分泌生産について検討した。[結果及び考察] 大腸菌 DH5 株に FLAG タグを scFv の C 末端に付加させた
scFv-FLAG を ABCLHLLL-LipC-LipD と と も に 導 入 し 、 scFv の 分 泌 を 調 べ た 。
ABCLHLLL-LipC-LipD によって scFv が分泌されるだけでなく、LipB-LipC-LipD、さらには LipC-LipD によっても分泌された。また、LipC、LipD の単独による分泌を調べた結果、LipC のみによって scFv が分泌されることが明らかとなり、
LipC が大腸菌由来代替タンパク質と協調して scFv を分泌する可能性が考えられた。T1SS によるタンパク質分泌機構では、分泌タンパク質の C 末端が分泌に関わり、特に Lip system による HasA の分泌には VAL を含む C 末端約 20 ア
ミノ酸が重要であることが示されている。scFv-FLAG の C 末端には VAL に類似した VTV が存在するため、これを ATA に置換した scFvATA-FLAG を作製し、分泌されるか検討した。scFvATA の分泌は認められず、scFv-FLAG の分泌に C 末端 VTV が重要であることが示された。現在、分泌生産の向上に向けて、条件検討を行っており、併せて報告したい。

Elucidation of the mechanism of endotoxin neutralizing effect of α-amylasefrom Oryza sativa

Secretion of a single-chain Fv antibody by the S. marcescens type 1 secretion
system in E. coli

○Akihito Ochiai, Kazuhito Watanabe, Hiroshi Sugai, Takaaki Tanaka,
Masayuki Taniguchi(Grad. Sch. Sci. Technol., Niigata Univ.)

Key words

Oryza sativa, amylase, anti-inflammatory drug, endotoxin neutralizing

2P-1p028 スプライシング因子過剰発現による B 細胞株における抗体遺伝子変異の増強○Shuhei Hamagaki1, Daichi Takagi2, Takumi Ichihara2, Akihiko Tsuji3,
Kenji Omori4, Keizo Yuasa3(1Grad. Sch. Adv. Technol. Sci., Tokushima Univ., 2Fac. Eng., Tokushima Univ.,
3Fac. Biosci. Bioind., Tokushima Univ., 4Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ.)

Key words

scFv, type 1 secretion system, secretory production, Escherichia coli

2P-1p030 CHO 細胞における PDIa4 の抗体産生に及ぼす影響○小松 圭 1, 公文 健人 1, 福谷 洋介 1, 鬼塚 正義 2, 大政 健史 3,
養王田 正文 1（1農工大院・工, 2徳島大院・ソシオ, 3阪大院・工）masafumi.yohda@yohda.net○太田 愛美, 西山 由美子, 清木 俊雄, 植月 英智, 川口 祐加,
仲尾 祐輝, 曲 正樹, 徳光 浩, 金山 直樹（岡山大院・自科）
nkanayam@okayama-u.ac.jp

厳密な抗原特異性を持つ抗体は、近年医薬品としての応用が進んでいる。我々は抗体遺伝子への変異導入を任意に ON/OFF 可能なニワトリ B 細胞株 DT40SW を用いて、in vitro 抗体作製システムを構築してきた。DT40 細胞の変異能力の改良は、この抗体作製技術において重要な課題である。最近、スプライシン
グ因子 SRSF1 のアイソフォーム SRSF1-3 が DT40 細胞における抗体遺伝子への変異導入に重要な役割を果たしていることを見いだした。本研究では、SRSF1-3の操作により DT40 細胞の変異能力を改良し、抗体取得を効率化することを検討した。SRSF1-3 を DT40-SW 細胞に過剰発現させると、野生型に比べて変異能力が上昇した。そこで、mCherry 遺伝子を抗体重鎖可変部遺伝子と置換し、
mCherry-Fc タンパク質を細胞表面に提示し、かつ分泌発現できるように改変した DT40 細胞株にも同様に SRSF1-3 を過剰発現させた。mCherry 遺伝子への変異導入効率は、野生型 DT40-SW 細胞では抗体遺伝子への効率と比べて低いことが分かっていたが、SRSF1-3 を過剰発現させることによって変異導入効率を
元の 3 倍程度、抗体遺伝子への導入効率と同等レベルに向上させることに成功した。現在、この方法によって多様化させた変異 mCherry ライブラリーから機能が変化した変異体の取得を試みるほか、特定の特異性を有したモノクローナ
ル抗体遺伝子を導入した DT40 細胞においても SRSF1-3 過剰発現の効果を検証している。DT40 細胞における SRSF1-3 の過剰発現は、変異が導入されにくい
標的遺伝子への変異導入の向上による抗体作製の効率化に利用できる可能性がある。

抗体医薬品は分子標的医薬の 1 つとして利用されている。抗体は糖鎖及び多数のジスルフィド結合を有する複雑な構造であり、6 割が CHO(Chinese Hamster
Ovary)細胞により産生されている。抗体高産生株の樹立は 1 細胞のスクリーニ
ング等から行われてきたが、さらなる生産量の向上には、小胞体(ER)における抗体の構造形成の効率化が重要であると考えられる。本研究では、CHO 細胞のER における抗体構造形成において重要な役割を担っている ER シャペロンを特定し、その機能解析と抗体分泌の効率化への応用を目的としている。モデル細胞として Trastuzumab 産生細胞 CHO Hc6 を用いた。Tunicamycin による ER スト
レス誘導下で種々の ER シャペロンの mRNA 発現量を qRT-PCR で解析したところ、ジスルフィド形成を触媒する PDIa4(protein disulfide isomerase)の発現量が増大することが分かった。そこで、合成 siRNA を用いて pdia4 のノックダウン
を行い、標的抗体の検出を行うことで培養上清、破砕後上清における抗体産生能への影響を検討した。pdia4 mRNA 発現量を約 70%抑制した際に細胞内において未成熟抗体の比存在量増加が確認され、抗体の構造形成に PDIa4 が関わっていることが示唆された。また、in vitro における解析から PDIa4 はモノマーで存在しており、インスリンに対する還元能を有していることが確認された。現在、更なる解析を進めており、発表では最新の結果についても交えて報告する。

Enhancement of Ig somatic hypermutation in a B cell line by overexpressing a splicing factor.

Effect of Protein disulfide isomerase PDIa4 on antibody production○Manami Otha, Yumiko Nishiyama, Toshio Seiki, Hidetomo Uetsuki,
Yuka Kawaguchi, Yuki Nakao, Masaki Magari, Hiroshi Tokumitsu,
Naomi Kanayama(Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Okayama Univ.)

Key words

antibody, somatic hypermutation, splicing factor○Kei Komatsu1, Kento Kumon1, Yosuke Fukutani1, Masayoshi Onitsuka2,
Takeshi Omasa3, Masafumi Yohda1(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Inst. Technol. Sci., Tokushima
Univ., 3Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
isomerase

Antibody production, Chinese hamster ovary, protein disulfide

抗体工学

2P-1p031 新規抗体-酵素融合タンパク質(Zipbodyzyme)の開発○中野 秀雄, 森 昭博, 加藤 晃代, 兒島 孝明（名大院・生命農学）
hnakano@agr.nagoya-u.ac.jp

1772P-1p033 ファージ提示法を利用した CDR 模倣ペプチドライブラ
リーの構築○柳沢 美貴, 二井手 哲平, 服部 峰充, 中澤 光, 熊谷 泉, 梅津 光央（東北大院・工）mitsuo@prn.che.tohoku.ac.jp

酵素修飾された抗体は、ELISA などの免疫検出に汎用されている。これまで抗体への酵素の付加は主に化学修飾により行われており、煩雑な実験操作が必要
で、抗体一分子に対する修飾酵素分子数を制御できないという欠点がある。遺伝子的に抗体と酵素を融合すればこれらの問題を解決できるが、これまでの報
告は、ほとんどが一本鎖抗体と酵素の融合に関するものであり、Fab と酵素を遺伝子的に融合させた例は非常に少ない。当研究グループでは、Fab 抗体の重鎖・軽鎖それぞれのＣ末端に互いに接着するペプチドロイシンジッパー(LZ)を付加することにより、大腸菌内で容易に活性体として合成できる Fab 抗体「Zipbody」を開発した。本研究では、Zipbody―酵素融合融合体を大腸菌により細胞質内で発現させ、その機能を評価した。
マウス由来抗大腸菌 O157 Zipbody にルシフェラーゼ(Luc)を融合させた ZipbodyLuc 融合体を作製し、検出抗体として ELISA を実施したところ、Luc の発光により抗原を検出することができた。一方、LZ が付加されていない同 Fab 抗体にLuc を融合したものでは、発現量は Zipbody-Luc と同等であったにも関わらず、
その検出シグナルは著しく低下した。このことから、酵素活性および抗原結合活性の両方を保持する酵素標識 Fab を作製するには、LZ が必要であることが分かった。また、ウサギ由来の Zipbody に Luc を融合した Zipbody-Luc 融合体や、GFP とマウス由来 Zipbody を融合した Zipbody-GFP 融合体においても、同様の結果を得た。このことから、LZ を用いることで、様々な検出用タンパク質を遺伝的に Fab 抗体(Zipbodyzyme と名付けた)に融合することで、容易に bifunctional
な抗体－酵素融合タンパク質を作製できることが示唆された。

近年、標的特異性の低さから複数の作用点を持つ低分子医薬に代わり、高い標的特異性を持つバイオ医薬が注目されている。その中で、ペプチド医薬は有機合成が可能で、かつ、進化工学操作を用いて標的特異性を比較的容易に設計可能であるが、体内で分解されやすく、抗体ほどの標的特異性は設計しにくい。
一方、抗体医薬は非常に高い標的特異性を持つが、その開発工程は複雑で、かつ、生物剤であるため調製にコストが掛かってしまうことが課題となっている。
そこで私達は、抗体の分子認識領域(CDR)に移植可能な環状構造を持つペプチド医薬を開発することで、構造的安定性や標的特異性が十分でない場合には、抗体の CDR の 1 つへ配列を移植し、抗体医薬の開発へも繋げていくことができるプロセスの構築を目指している。
本研究では、ペプチドを移植する抗体としてラクダ抗体の可変領域断片 VHHを用いた。VHH には 3 つの CDR(1～3)が存在し、CDR1 と CDR3 は VHH の立体構造形成に関与していないことから、ペプチド移植が可能であることが報告されている。そこで、VHH の結晶構造情報から CDR1 と CDR3 を模倣可能なペプチド構造を検討した結果、ペプチド両末端にチオール基を側鎖に持つシステイン残基を持たせ、CDR1 の模倣には有機リンカー分子を介した反応を行い、
CDR3 の模倣にはチオール基同士の反応を行うことで、CDR を模倣した環状ペプチドを設計できることがわかった。今回は、この環状ペプチドを提示した
ファージライブラリーを構築し、標的分子に対して親和性を持つペプチドの取得を試みたので報告する。

Development of a new format of antibody-enzyme complex(zip body)

CDR-mimic peptide library on phage for step-by-step antibody construction○Hideo Nakano, Mori Akihiro, Teruyo Kato-Ojima, Takaaki Kojima(Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)

Key words

antibody, enzyme, Escherichia coli

2P-1p032 細胞表層 FIA 法とイムノチャンバーを用いる抗体高分泌細胞の１細胞育種○Miki Yanagisawa, Teppei Niide, Takamitsu Hattori, Hikaru Nakazawa,
Izumi Kumagai, Mitsuo Umetsu(Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ.)

Key words

2P-1p034 シガトキシン２に対するウサギモノクローナル抗体の取得○良元 伸男, 黒田 俊一（阪大・産研）skuroda@sanken.osaka-u.ac.jp

抗体医薬生産において、優良な Chinese hamster ovary（CHO）細胞株の選抜は重要である。従来の選抜法では、限界希釈による１細胞からのコロニー形成後に抗体産生能を評価するが、増殖初期から能力の低い細胞が推計学的に出現する為に大部分の細胞株候補が平均化してしまい、不確実で無駄が多い。従って、優良な細胞株を効率よく樹立するには、１細胞単位で選抜し、その能力を維持
しつつ安定的に増殖させる必要がある。本研究では、ヒト抗体産生 CHO 細胞を対象とし、大規模な細胞集団の個々の１細胞の抗体分泌量を非侵襲的かつリアルタイムに定量できる細胞表層 FIA 法（CS-FIA）を行った。分泌抗体を捕捉する分子として脂質標識抗ヒト IgG 抗体を細胞表層に提示し、直径 30 μm のウェルが 84,640 個成形されたマクロチャンバーに細胞を導入して個々の１細胞から分泌された抗体を直ちに自身の近傍に捕捉し、蛍光標識抗原を用いて可視化した。また蛍光を指標として自動で目的細胞を１細胞単離可能な全自動１細胞解析単離装置を併用し、抗体高産生 CHO 細胞の１細胞からの安定的な培養を行った。一方、抗ヒト IgG 抗体をチップ上に固相化し、分泌抗体を目的細胞を導入したチャンバー周辺に捕捉し、検出分子を用いて目的細胞を同定するイ
ムノチャンバー法を新たに開発し、目的細胞検出の評価を行った。結果、CSFIA の検出限界は 0.66 fg/cell と判明し、１細胞単離した 46 細胞の抗体高分泌候
補株について、増殖後に ELISA に供したところ、培養１週間では大部分の娘細胞が親株より高い抗体分泌能を有し、1 ヶ月後では半数程度の娘細胞が２倍程度の抗体分泌能を維持した。またイムノチャンバーアレイチップは CS-FIA より目的細胞の検出のダイナミックレンジが 150 倍以上であると判明し、今後、目的細胞の取りこぼしのより少ないスクリーニングができると期待された。

Single cell-based breeding of antibody-secreting cells by using CS-FIA andimmunochamber array chip
○Nobuo Yoshimoto, Shun'ichi Kuroda(ISIR, Osaka Univ.)

Key words

single-cell analysis, antibody, cell surface display, mammalian cell

peptide medicines, antibody, evolution technology, phage display○森下 しおみ, 加藤 晃代, 兒島 孝明, 中野 秀雄（名大院・生命農学）
nakano@molbiotech-nagoya.org【背景・目的】我々のグループでは、動物の末梢血から B 細胞を単離し、1 細胞
逆転写反応と PCR により得られた L 鎖と H 鎖の DNA フラグメントを無細胞タ
ンパク質合成系にて Fab(fragment of antigen binding)として発現させ評価する迅
速なモノクローナル抗体取得法（SICREX[single-cell RT-PCR linked in vitro
expression]法）を開発し、様々な抗体の取得に取り組んでいる。本研究では、抗体の抗原決定部位のバリエーションが豊富であり、かつ免疫化や採血がマウスに比べ容易なウサギを用いた SICREX を実施し Shigatoxin2 に対する抗体取得を目的とした。
【方法と結果】まずはじめに、Shigatoxin2 の無毒変異体(E167Q)を大腸菌により組換え生産・精製した。これを抗原としてウサギ（New Zealand White rabbit）に免疫後、ウサギ末梢血より血清を得た。免疫経過 1～7 日間において抗原結合能を有する末梢血中リンパ球の存在率をフローサイトメーターを用いて継時的に測定したところ、1 日後の割合が最も高く、目的細胞が血中に多く存在していることが示唆された。さらに、抗原特異的な抗体産生細胞を効率良く回収するために、1 細胞に単離する段階で、蛍光標識した抗原と小胞体染色試薬により二重染色し、フローサイトメーターによる単離を試みた。これらの細胞から
SICREX を行ったところ、PCR により遺伝子の増幅が見られたため、現在得られた抗体遺伝子の性能解析を行っている。

Generation of rabbit anti-Shiga toxin 2 monoclonal antibody by SICREX○Shiomi Morishita, Teruyo Kato, Takaaki Kojima, Hideo Nakano(Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)

Key words

rabbit, monoclonal antibody, B cell

178

抗体工学／発酵生理学，発酵工学

2P-1p035 蛍光免疫センサー Quenchbody によるがん抗原タンパク
質 HER2 の検出

2P-1p037 抗体ダイレクトクローニング法による組換え抗体の樹立○加藤 三恵子 1, 羽生 義郎 2
（1バイオピーク, 2産総研）
mieko.kato@bio-peak.com○岡 裕也 1, 鄭 熙陳 2, 董 金華 2, 上田 宏 2（1東工大院・総理工, 2東工大・化生研）
ueda@res.titech.ac.jp【緒言】蛍光色素修飾抗体 Quenchbody (Q-body) は、蛍光色素を抗体に部位特異的に修飾した免疫センサーである。修飾された色素は抗原非存在下には抗体内の抗原結合部位近傍にある Trp 残基との間に生じる光誘起電子移動によって消光 (quench) されているが、抗原結合により消光が解除され発光する。Q-body の蛍光は抗原濃度依存的に増大するため、標的抗原と混合させるだけで検出・測定が行える簡便かつ迅速なアッセイツールとなりうる。本研究では乳がんなどのがん細胞の膜上で過剰発現している腫瘍マーカーであるヒト上皮成長因子受容体 HER2 を Q-body を用いて検出することを目的とした。免疫組織化学法など、現在の臨床現場における HER2 検出法と比較し煩雑な手順が不要な迅速検出系となると期待される。
【方法】抗 HER2 抗体にヒト抗体合成ライブラリ由来の Fab 断片である Fab37 を用いた。Fab37 は抗原結合部位に多くの Trp 残基を持ち、Q-body として高い性能があると期待された。大腸菌にて目的タンパクを発現させ、蛍光色素を修飾
し Q-body を作製した。その後、精製 HER2 タンパク質ならびに HER2 発現細胞を用いてその性能を評価した。
【結果】蛍光色素 TAMRA, ATTO520 で１箇所ラベルした Q-body を用いて、溶液中での蛍光測定において、HER2 に特異的かつ高い（それぞれ最大 2.3, 4 倍）蛍光応答が得られた。さらにその感度(EC50)は 1 nM 以下と、報告されている
Kd 値に近い値であった。また、ATTO520 修飾 Q-body を細胞培養上清に加え20 分間おくだけで、HER2 発現細胞のみを特異的に蛍光検出することに成功した。
【結論と展望】Q-body を用いて HER2 発現細胞を簡便迅速に蛍光検出することに成功した。現在、Q-body の細胞内局在を評価するとともに、血清中での細胞イメージング、及び生体イメージングを目指し近赤外領域に蛍光波長を持つ色素を用いた Q-body を作製している。

モノクローナル抗体は研究・診断に必須のツールであり、抗原親和性・特異性の高い抗体を、確実に短期間で作製する技術が求められている。組換え技術を用いるインビトロ抗体作製法は、従来のハイブリドーマ法に比べて、多くのクローンを短期間でスクリーニングできる等の大きな利点を持っている。しかし、膨大な抗体多様性を反映したライブラリーの構築が難しいことや、スクリーニ
ングで得られるクローンに疑陽性が多いこと等の技術的な問題があり、実用的な抗体の樹立には未だ困難がある。我々は、これらの問題を克服するために、コロニーを用いて組換えモノクローナル抗体（scFv）産生クローンを短期間でスクリーニングする、抗体ダイレクトクローニング法を確立した。本方法は、抗原を免疫した動物の B 細胞から抗体遺伝子（VH, VL）抽出し、分泌発現ベク
ターに組込み、抗体遺伝子ライブラリーを作製する。このライブラリーで大腸菌を形質転換後、コロニー形成・抗体の発現誘導・抗原抗体反応の３つを同時に行う。コロニーを形成させると同時に、培地中に含まれる発現誘導剤によって、陽性クローンから分泌発現された抗体が抗原コートメンブレンに捕捉される。抗体に付加した His タグを利用して、抗原に結合した抗体を検出し、陽性クローンをクローニングする。本研究では、ウサギにマウス IgG を免疫し、抗マウス IgG モノクローナル抗体を樹立し、その特異性・親和性を評価した。その結果、ハイブリドーマ法に比べて、スクリーニング規模が拡大されたことで、陽性クローンを 10 倍以上多く得られた。さらに、ウサギ等のマウス以外の動物
種のモノクローナル抗体が樹立可能なことや、樹立する抗体が組換え抗体であるため、簡便に短時間で抗体の生産が可能になる等、多くの利点がある。

Detection of cancer cell antigen HER2 by a fuluorescent immunosensor
Quenchbody

Recombinant monoclonal antibodies by direct cloning method○Yuya Oka1, Hee-Jin Jeong2, jinhua Dong2, Hiroshi Ueda2(1Interdiscip. Grad. Sch. Sci. Eng., Tokyo Tech, 2CLS-IIR, Tokyo Tech)

Key words

antibody, protein engineering, biosensor, Cancer cells

2P-1p036 抗体の足場構造への変異導入が特異性に与える影響○中山 純一 1, 服部 峰充 1, 中澤 光 1, 金子 美華 2, 加藤 幸成 2,
熊谷 泉 1, 梅津 光央 1
（1東北大院・工, 2東北大院・医）mitsuo@prn.che.tohoku.ac.jp○Mieko Kato1, Yoshiro Hanyu2(1Bio-Peak Co., Ltd., 2AIST)

Key words

scFv, monoclonal antibody, screening, colony assay

2P-1p038 好熱菌発酵産物を給与したブタにおける腸内乳酸菌叢の変化○吉川 翔太 1, 宮本 浩邦 1,2,3, 須田 亙 2,4, 新名 俊行 5, 井藤 俊行 5,
大野 博司 6, 服部 正平 4,7, 児玉 浩明 1
（1千葉大院・融合, 2慶応大・医, 3サーマス, 4東京大院・新領域,
5
京葉プラントエンジニアリング, 6理研・IMS, 7早稲田大院・
先進理工）kodama@faculty.chiba-u.jp

抗体分子は、相補性決定領域(CDR)で標的分子を認識し結合している。そのため、標的に対する抗体の特異性や親和性を変化させる時には、CDR へ変異を導入するのが一般的である。その中で私達は、CDR 以外の領域(足場構造)に変異が入ることで抗体の標的親和性が 20 倍向上した経験から、足場構造への変異導入は緩やかな分子認識変化を促せるのではと考えてきた。現在、私が標的としているイソクエン酸デヒドロゲナーゼ 1/2(IDH1/2)は、脳腫瘍患者の予後診断に有用なマーカーであり、特定箇所において 12 種の変異体が存在する。その中で私たちの共同研究者は、結合性が弱いながら 6 種類の変異型 IDH1/2 を認識する抗体(MsMab-1)の取得に成功した。私達は、この抗体の取得によって、緩やかな特異性変化を促せる変異導入法を構築できれば、分子認識が曖昧な抗体か
ら特定の変異型 IDH1/2 に特異的な抗体の作製や 12 種類全てに親和性を持つ抗体の作製が可能でないかと考えた。そこで本研究では、「足場構造中において他の抗体配列では出現頻度が低い残基」に注目し、その残基への変異が与える
MsMab-1 抗体の特異性・親和性の変化を解析した。
まず、私は抗体の変異体を迅速・簡便に調製する必要があると考え、大腸菌で発現が可能な組換えタンパク質である一本鎖 Fv(scFv)を設計した。次に、膨大な抗体配列情報を有する abYsis における抗体群と MsMab-1 の Fv 部分の配列を比較して出現頻度が 1%以下である残基に対して各々 19 種の一残基変異体を作製し、IDH1/2 ペプチドに対する結合活性評価を行った。
その結果、抗原認識に直接関わらない足場構造にありながら分子認識能に重要なアミノ酸残基と特異性向上に関与する因子が示唆されたので報告する。

【背景と目的】海産資源を 70～80℃の高温下で発酵させた飼料（好熱菌発酵産物）は、家畜の成長促進、内臓脂肪の減少など様々な生理作用を有する[1,2]。
糞便中の有機酸含量を調べたところ、動物種（ブタ、ニワトリ）に関わらず、好熱菌発酵産物の給与によって排泄糞中の乳酸含量が低下していた[3]。この結果は、好熱菌発酵産物によって腸内の乳酸代謝に関わるバクテリアの種類が大きく変化していることを示唆している。そこで好熱菌発酵産物を給与したブタ（試験区）と通常のブタ（対照区）との糞便サンプル（各 n=4）を用いて、糞便中の生菌数、MRS 選択培地上で生育する乳酸菌の種類を検証した。
【実験方法】ブタ糞便サンプルを希釈し、一般嫌気性細菌用培地である GAM 培
地と乳酸菌選択培地である MRS 培地に塗抹し、培養可能なバクテリアを選抜した。その後、選抜されたバクテリアを rep-PCR 解析により分類し、各グルー
プの代表菌株について 16S rRNA 遺伝子配列による簡易同定を行った。
【結果】GAM 培地を用いた糞便中の生菌数測定では試験区/対照区の間に有意な差は認められなかった。一方で、MRS 選択培地で生育するバクテリアの種類には大きな違いがあり、試験区では Lactobacillus amylovorus が顕著に増加し、対照区で大部分を占めていた Streptococcus alactolyticus はほとんど検出されなかった。この結果は、16S rRNA 遺伝子配列の次世代シークエンスによる解析結果と一致していた。今後、単離された L. amylovorus と S. alactolyticus の乳酸産生能などの生化学的な特徴を解析し、好熱菌発酵産物を給与された動物腸内の乳酸濃度制御の分子機序を解明していく予定である。

How does introducing mutations for scaffold of antibody influencespecificity?

Administration of thermophile-fermented compost modulates gut lactic acidbacterial flora in pigs

○Junichi Nakayama1, Takamitsu Hattori1, Hikaru Nakazawa1, Mika Kaneko2,
Yukinari Katou2, Izumi Kumagai1, Mitsuo Umetsu1(1Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 2Grad. Sch. Med., Tohoku Univ.)

Key words

scaffold, MsMab-1, IDH1/2[1] Miyamoto et al. (2012) Res. Vet. Sci., 93:137-142[2]宮本浩邦、児玉浩明(2015) Medical Science Digest 4 月号 49-51[3] Ito et al. (2016) J. Biosci. Bioeng. 121: 659-664○Shota Yoshikawa1, Hirokuni Miyamoto1,2,3, Wataru Suda2,4, Toshiyuki Shinmyo5,
Toshiyuki Ito5, Hiroshi Ohno6, Masahira Hattori4,7, Hiroaki Kodama1(1Grad. Sch. Adv. Integr. Sci., Chiba Univ., 2Med., Keio Univ., 3Sermas, 4Fro. Sci.,
Tokyo Univ., 5Keiyo Plant Eng., 6RIKEN IMS, 7Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words

probiotics, lactic acid bacteria, gut microbiota, compost

発酵生理学，発酵工学

2P-1p039 Bioluminescence and electrochemical activities of Vibrio
fischeri in batch and continuous cultures

179

2P-1p041 土壌から分離した油脂高生産菌 Rhodosporidium
paludigenum 1164 株の評価

○Hyung Joo Kim1, Minju Chang1, Yong-Keun Choi1,
Kwang Jin Kim2, Hak Jin Song1, Sok-young Shim1, Wu-Young Jeong1(1Dept. Biological eng., Konkuk Univ., 2Natl. Horticultural Res.
Inst., Rural Development Administration)
hyungkim@konkuk.ac.kr○真野 潤一, 橘田 和美, 北岡 本光（農研機構・食研）
jmano@affrc.go.jp

The bioluminescence and electrochemical activities of Vibrio fischeri were studied atboth unsteady and steady states of growth. The cultivations were carried out using a 5liter jar fermentor, and electrochemical signal and bioluminescence intensity weremonitored. For the electrochemical measurement, a three-electrode electrochemicalsystem was used in the presence of electrochemical mediator (2-Hydroxy-1,4naphtoquinone). In the early exponential stage of batch culture, both electrochemicalsignal and luminescence intensity were synchronized with the increase in bacterial
number. However, from the late exponential stage of the culture, rapid decreases insignals both electrochemical signal and luminescence intensity were observed. Whenthe electrochemical signal and luminescence intensity from V. fischeri were monitored
in chemostat, the intensities of both signals from the bacteria were closely related withthe dilution rate. These results suggest that use of chemostat for the application of V.
fischeri based on its bioluminescence activity is reliable and therefore avoids high error
generation during the bioactivity and bioluminescence measurements.

油脂の生産に適した微生物宿主の開発を目的として、有望な菌株を天然から探索した。土壌から収集した菌株の中で最もトリアシルグリセロールの生産性が高い株について炭素源の資化性など、生理学的特性を評価するとともに、26S
rRNA 遺伝子の塩基配列を解析した。この結果から、当該菌株を担子菌系酵母の Rhodosporidium paludigenum と同定した。次に、本菌株の生育特性について評価を行い、生育に最適な pH が 5、温度が 30℃であることを確認した。続いて、バッフル付きフラスコを用いて本菌株のフェドバッチ培養を行い、高密度
培養条件下での油脂生産性を評価した。24 時間ごとに炭素源としてグルコースを逐次添加し、10 日間で 132 mg/mL の乾燥菌体を得た。得られた菌体からブライダイヤー法を用いて油脂を抽出し、96 mg/mL に相当する油脂を回収した。この結果から、菌体内の油脂含量は 73％と推定した。重量比での対糖収率は 15%であり、熱量換算で原料グルコースのもつエネルギーの 34%が生産物として回収されたと評価した。得られた油脂の脂質クラスは主にトリアシルグリセロー
ルで、脂肪酸組成はパルミチン酸とオレイン酸が中心であった。本菌株は、菌体内にトリアシルグリセロールを蓄積するだけでなく、菌体外にトリアシルグ
リセロールとは異なる脂質を著量分泌生産することも確認された。この脂質の化学構造については、現在解析中である。

Bioluminescence and electrochemical activities of Vibrio fischeri in batchand continuous cultures

Evaluation of a high lipid-producing strain, Rhodosporidium paludigenum
No. 1164

Key words
Vibrio fischeri, bioluminescence, electrochemical activities, threeelectrode system

Key words

2P-1p040 麹菌におけるタンパク質高発現システムの構築

2P-1p042 Pseudozyma antarctica 由来リパーゼを利用したマンノ○Hyung Joo Kim1, Minju Chang1, Yong-Keun Choi1, Kwang Jin Kim2,
Hak Jin Song1, Sok-young Shim1, Wu-Young Jeong1(1Dept. Biological eng., Konkuk Univ., 2Natl. Horticultural Res. Inst., Rural
Development Administration)○佐藤 伊純, 山崎 将太朗, 出村 拓, 加藤 晃
（奈良先端大・バイオ）kou@bs.naist.jp○Junichi Mano, Kazumi Kitta, Motomitsu Kitaoka(Food Res. Inst., NARO)

Rhodosporidium paludignum, lipid

シルエリスリトールリピッド高生産技術の開発○雜賀 あずさ 1, 小池 英明 2, 福岡 徳馬 1, 山本 周平 3, 岸本 高英 3,
森田 友岳 1
（1産総研・機能化学, 2産総研・生物プロセス, 3東洋紡（株）
・敦賀バイオ）
morita-tomotake@aist.go.jp

麹菌は、タンパク質への糖鎖修飾が可能であり、高純度なタンパク質の精製が容易であるため、高付加価値タンパク質の生産に利用されている。導入した遺伝子の発現には、転写や翻訳といった様々なステップ全てが重要であるが、これら複数のステップが最適化された発現系は麹菌では未だ開発されておらず、各ステップを効率化することにより生産性が大きく向上する可能性がある。転写の段階において遺伝子ごとに転写される mRNA 量が大きく異なっているように、翻訳段階においても mRNA 種により翻訳されるタンパク質の量は大きく異なっている。mRNA から翻訳されるタンパク質の量は、結合するリボソームの量に大きく依存し、その結合効率は mRNA の 5’側に存在する 5’UTR( untranslated
region)の配列が規定することが報告されている。本研究では、麹菌内の mRNAについて、高い翻訳効率を示す mRNA を同定し、その 5’UTR を導入遺伝子発現系に活用することを目的とした。
まず、リボソームの結合数により mRNA を分画する手法であるポリソーム解析と次世代シーケンサーを用いて 5’UTR を決定する CAGE 解析を組み合わせた大規模解析を行い、リボソームが多く結合している mRNA とその 5’UTR を複数同定した。次に、同定した候補 5’UTR をレポーター遺伝子と連結した発現ベクターの構築を行い、一過的に麹菌に導入し、レポーター活性を指標として、
候補 5’UTR の翻訳能力の評価を行ったので報告する。

【背景と目的】
ジアステレオマー型マンノシルエリスリトールリピッド（MEL-B）は、担子菌
系酵母 Pseudozyma tsukubaensis が植物油から量産する糖脂質であり、優れた保湿効果を示すことから化粧品素材として実用化されている。一方、生産効率の更なる向上が、用途拡大のための課題になっている。本研究では、P. tsukubaensisにリパーゼ遺伝子を導入し、植物油からの MEL-B 生産量の向上を試みた。
【方法】
P. antarctica T-34 株由来リパーゼ（CALA、CALB）の発現ベクターを作成し、P. tsukubaensis 1E5 株に導入した。得られた遺伝子組換え株を、オリーブ油を炭素源として培養し、高速液体クロマトグラフィ（HPLC）で、MEL-B の生産量を定量した。
【結果と考察】グルコースを炭素源とした際の CALA 導入株の培養上清のリパーゼ活性は8.2±2.7 U/mL であり、一方、CALB 導入株および空ベクター導入株（コントロール）ではほとんど活性が見られなかった。オリーブ油を炭素源としてリパーゼ
導入株を培養した結果、CALA 導入株では菌体増殖速度がコントロールよりも早く、培養 3 日目の MEL-B 生産量も約 1.5 倍に増加した。CALB 導入株の MELB 生産量はコントロールと同程度であった。また、ジャーファーメンター培養においても、CALA 導入株の MEL-B 生産量はコントロールよりも高く、培地中のリパーゼ活性を高めることで、植物油からの MEL-B 生産効率を向上できることを明らかにした。今後、リパーゼ遺伝子の発現量や培養条件の最適化によって、MEL-B 生産量の更なる向上が期待される。本研究は JST の研究成果展
開事業 A-STEP により実施した。

Development of efficient transgene expression system in Aspergillus oryzae

Enhanced the productivity of diastereomeric mannosylerythritol-B using
lipase from Pseudozyma antarctica T-34

○Izumi Sato, Shotaro Yamasaki, Taku Demura, Kou Kato
(Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)

Key words

Aspergillus oryzae, transgene expression, translation, 5'-UTR○Azusa Saika1, Hideaki Koike2, Tokuma Fukuoka1, Shuhei Yamamoto3,
Takahide Kishimoto3, Tomotake Morita1(1ISC, AIST, 2BRI. AIST, 3Tsuruga Inst. Technol., TOYOBO CO., LTD.)

Key words

mannosylerythritol lipid, Pseudozyma tsukubaensis, lipase

180

発酵生理学，発酵工学

2P-1p043 酸素供給が Sophorolipid 生産に与える影響○生越 克典, 三輪 秀和, 平田 善彦（サラヤ株式会社）
hirata@saraya.com

2P-1p045 Moniliella megachiliensis の浸透圧ストレス適応におけるROS 産生とポリオール生成○岩田 悠志 1, 渡邉 泰祐 1,2, 荻原 淳 1,2, 春見 隆文 1,2（1日大・生資科, 2日大院・生資科・生資利用）
iwata.hisashi@nihon-u.ac.jp【背景と目的】Sophorolipid （SL） は糖と油から酵母の発酵によって生産される
天然の界面活性剤である。現在 SL は高洗浄性と良好な生分解性を併せ持つ低起泡性界面活性剤としての性質を活かし、洗濯用洗剤や台所洗剤などに配合されている。SL の高生産時には酸素を多量に供給する必要があることがフラスコを用いた検討によって明らかとなっており、通気撹拌培養においても撹拌数や通気量などの条件が重要となることが予想される。そこで、SL の発酵生産における撹拌数や通気量の条件、従来のタービン翼から酸素供給性能に優れた新規
攪拌翼（スーパーミックス：佐竹化学機械工業株式会社）への変更を行い、SLの生産性の評価を行なった。
【方法】グルコースと植物油、脂肪酸を炭素源とし、100 L 発酵槽を用いて好気培養を行った。植物油、脂肪酸が検出限界以下になった時点を培養終点とした。
タービン翼、撹拌数 500 rpm、通気量 36 L/min の条件を対照とし、攪拌翼や撹拌数、通気量を変更し、SL 生産性を評価した。また、CFD 解析によるボイド率分布の可視化や撹拌動力の算出を行った。
【結果】攪拌翼を変更した結果、SL の生産速度が 1.4 倍に向上し、培養日数が2 日短縮された。撹拌数を 500 rpm から 600 rpm へ増加させた結果、SL の生産速度が僅かに向上し、培養日数が 1 日短縮された。通気量を 36 L/min から 9 L/
min に減少させた結果、SL の生産速度が 0.6 倍に低下し、培養日数が 2 日増加した。CFD 解析によるボイド率分布の可視化の結果、攪拌翼の変更は撹拌数を増加させることよりもボイド率分布をより均一にさせることが示唆された。また、撹拌動力の算出を行なった結果、撹拌数を 600 rpm にした条件が最も動力が大きく、撹拌翼を変更した場合が最も少なかった。以上の結果から、攪拌翼を新規攪拌翼に変更することで、低動力でより高い SL 生産が可能であることが示唆された。

[背景・目的]我々は Moniliella megachiliensis のエリスリトール生産性向上を目的として、本菌のエリスリトール生成機構について研究を行っている。これまでに、短時間のストレス負荷において、種々のストレス負荷剤による ROS 産生が適合溶質であるグリセロール及びエリスリトールの生成比に影響を与えるという結果を得た。そこで今回は、本菌にとってさらにストレス負荷が大きいと考えられる長時間培養時における ROS 産生とエリスリトール生成について解析
し、エリスリトール生成の生理的意義を考察した。
[方法]栄養増殖培地(YPD)にて 0.5 M NaCl, 1.0M グルコースの浸透圧負荷を行って 72 時間まで培養し、12 時間毎に培養菌体を回収した。それら細胞のポリオー
ル生成量を HPLC、遺伝子発現を RT-PCR により解析した。ROS の蓄積は、細胞を蛍光試薬 DCF-DA により処理した後、マルチプレートリーダーで 528 nmの蛍光強度を測定した。
[結果]ROS は、NaCl やグルコースの浸透圧負荷条件下で培養 12 時間後に、ス
トレス負荷前と比較して約 3 倍に増加し、その後、NaCl 条件下では、細胞増殖とともに減少した。グルコース下では、細胞外グルコースの消費に伴い、72 時
間後に約 4 倍増加した。一方、細胞内エリスリトール蓄積量は、ER3 遺伝子(Erythrose reductase 3)の発現と相関性を示し、培養 36 時間で最大となった(NaCl;
120μg/mg dry cell、グルコース;35μg/mg dry cell)。また、抗酸化酵素遺伝子のSOD1, SOD2 は、細胞増殖や ROS 産生に応答するように発現レベルが変化した。以上のことから、本菌は浸透圧の種類により、ROS の発生動態が異なるとともに、その程度により関連遺伝子の発現を制御することでポリオール生成や細胞増殖を調節し、環境適応を図っているものと推測された。
本研究の一部は、戦略的創造研究推進事業 ALCA の助成を受けて行った。

The Influence of oxygen supply condition on Sophorolipid production

Relationship between ROS generation and erythritol biosynthesis in osmotic
stress adaptation of Moniliella megachiliensis○Katsunori Namakoshi, Hidekazu Miwa, Yoshihiko Hirata(Saraya co. LTD)

Key words

biosurfactant, fermentation

2P-1p044 油糧酵母 Pseudozyma hubeiensis を用いたグルコース・
キシロース・アラビノース同時発酵○Hisashi Iwata1, Taisuke Watanabe1,2, Jun Ogihara1,2, Takafumi Kasumi1,2(1Coll. Bioresour. Sci., Nihon Univ., 2Dept. Biores. Util. Sci., Grad. Sch. Biores.
Sci.)

Key words
soluteMoniliella megachiliensis, osmotic stress, ROS genration, compatible

2P-1p046 PUT4 遺伝子導入酵母株の脂肪酸組成の変化○三木 健夫, 村松 昇
（山梨大院・医工総）takemiki@yamanashi.ac.jp○谷村 あゆみ 1, 高島 昌子 2, 杉田 隆 3, 遠藤 力也 2, 大熊 盛也 2,
岸野 重信 1, 島 純 4, 小川 順 1（1京大院・農, 2理研・BRC-JCM, 3明薬大・薬, 4龍大・農）ogawa@kais.kyoto-u.ac.jp

酵母の中には、炭素源を油脂に変換し、菌体内に蓄積するものが存在する。非可食系バイオマスから発酵生産される油脂、いわゆる第二世代バイオ燃料は、エネルギー問題等の観点から、軽油代替燃料として期待を集めている。リグノ
セルロース系バイオマスの糖化液には、グルコースだけでなくキシロースやア
ラビノースも含まれている。従って、油糧酵母を用いてリグノセルロース系バ
イオマスから効率よく油脂を生産するためには、キシロースおよびアラビノー
スをも発酵に利用することが欠かせない。さらに、培養時間短縮のため、グルコースリプレッションが起こらないことも望まれる。本研究では、リグノセル
ロース系バイオマスからの油脂の発酵生産を目指し、グルコース、キシロース、
アラビノースを同時利用して油脂を蓄積する酵母の探索を行った。
西表島、利尻島などから分離した酵母 1189 株を対象とし、混合糖としてグル
コース、キシロース、アラビノースを糖源としたモデル糖化液を用いた際の油脂蓄積能、およびそれら糖の消費能を評価した。12 株を選抜し、残存糖濃度および油脂濃度を分析した結果、混合糖を同時利用し、かつ高油脂蓄積能を示す
Pseudozyma hubeiensis IPM 1-10 株を選抜することができた。さらに、P. hubeiensis
IPM 1-10 株は、単一糖源よりも、混合糖源のときのほうが、糖利用率も油脂蓄積量も高かった。このことから、P. hubeiensis IPM 1-10 株は、混合糖を含むリ
グノセルロース系バイオマスからの油脂生産に有用であることが示唆された。

【背景と目的】酵母にとってプロリンは他のアミノ酸に比べて、資化され難いア
ミノ酸のひとつとされている。我々は、実用酵母が示すプロリン難資化性について研究を進めている。これまでに、プロリン膜輸送タンパク質をコードする
PUT4 遺伝子を導入した酵母株では、プロリンの取り込み量力が増大することを明らかにしている。本研究では、PUT4 株の脂肪酸組成の変化について調査を行った。
【方法】S. cerevisiae OCM-2 株(MAT a/a, delta ura3/ura3)および本株に PUT1, PUT2,
PUT3 および PUT4 遺伝子を導入した株を、プロリン（0.5 ｇ/L）を含む SD 合成培地(150ml)に、波長 610nm における濁度が 0.1 になるよう接種し、28℃で静置培養した。培養後、菌体を集菌・洗浄し凍結乾燥させ、脂肪酸抽出メチル化
キットおよびメチル化脂肪酸精製キット(Cat. No.06482-04, 06482-94；ナカライテスク)用いて脂肪酸を抽出・精製した。メチル化脂肪酸試料をガスクロマトグ
ラフィーに供し、脂肪酸構成比を測定した。
【結果と考察】S. cerevisiae OCM-2 株(MAT a/a, delta ura3/ura3)および本株に PUT1,
PUT2, PUT3 および PUT4 遺伝子を導入した株の脂肪酸組成を比較した結果、プ
ロリンを含まない SD 培地で培養した場合ではいずれの株の脂肪酸組成（C10,
C14, C14:1, C16, C16:1, C18, C18:1, C20, C20:1）は同様であったのに対して、プ
ロリンを含む培地で培養した場合、PUT4 遺伝子導入株で C16:1 および C18:1の割合が低下した。この現象は、PUT4 株をプロリン含有培地で培養した場合にのみ見られることから、細胞内にプロリンを多く取込んだ酵母は、何らかのストレスを受けている可能性が示唆された。

Lipid production through simultaneous utilization of glucose, xylose, andarabinose by Pseudozyma hubeiensis

Effect of PUT4 gene transfection on fatty acid component in yeast S.
cerevisiae OCM-2○Ayumi Tanimra1, Masako Takashima2, Takashi Sugita3, Rikiya Endoh2,
Moriya Ohkuma2, Shigenobu Kishino1, Jun Shima4, Jun Ogawa1(1Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 2BRC-JCM, RIKEN, 3Dept. Microbiol., Meiji
Pharma. Univ., 4Faculty of Agric., Ryukoku Univ.)

Key words

oleaginous yeast, fermentation, lipid, pentose○Takeo Miki, Noboru Muramatsu(Grad. Sch. Med. Eng., Univ. Yamanashi)

Key words

proline, yeast, stress発酵生理学，発酵工学

2P-1p047 醸造酵母ヒストン脱アセチル化酵素遺伝子破壊株の清酒
醸造特性

181

2P-1p049 高濃度バニリンストレスによる翻訳抑制下でも優先的に翻訳される酵母 VIE1 の解析○Nguyen Trinh TM, 石田 陽子, 井沢 真吾（京工繊大院・工芸科学）
thioredoxin@kit.ac.jp○冨本 和也, 赤尾 健, 福田 央
（酒総研）
k.tomimoto@nrib.go.jp

ヒストン脱アセチル化酵素（histone deacetylase, HDAC）は、DNA-ヒストン間の結合を強めることでヌクレオソームを安定化させ、多くの遺伝子の転写を抑制的に制御することが知られている。醸造酵母においても、HDAC を介した転写制御は重要と予想されるが、この観点からの報告は従来ほとんどなかった。
そこで、清酒酵母 K701 を親株とし、RPD3・HDA1・SIR2・HST1 の各 HDAC
遺伝子単独破壊株を作製し、それらの清酒醸造特性を確認した。その結果、
HDA1・SIR2・HST1 破壊株では、HDA1 破壊株で酢酸イソアミルの増加（1.8倍）、酢酸の減少（0.5 倍）が見られたが、それ以外に目立った変化は見られなかった。一方、RPD3 破壊株では発酵力がやや低下したものの、酢酸イソアミ
ルの大幅な増加（2.2 倍）が見られ、フーゼルアルコール・有機酸の組成も変化していた。Rpd3p は~1.2 MDa の Rpd3L 複合体を形成することから、同複合体構成に必須の遺伝子 DEP1・SDS3 各単独破壊株を作製し、それらの清酒醸造特性も確認した。その結果、発酵力低下、フーゼルアルコール・リンゴ酸以外の有機酸組成の変化はいずれも Rpd3L 複合体の欠損が理由であることが分かった。また、フーゼルアルコール組成の変化については、それらの合成に関わる
分岐鎖アミノ酸合成関連遺伝子の転写量が変化していることが確認された。さらに、ワイン酵母 EC1118 の RPD3 破壊株を作製し、清酒醸造特性を調べたところ、発酵力低下・フーゼルアルコール組成の変化は清酒酵母と同様であった
ものの、有機酸組成の変化は異なっており、酢酸イソアミルも微増に留まる等、清酒酵母の同破壊株とはやや異なる傾向を示した。以上の結果より、一部のHDAC は清酒醸造において発酵力・二次代謝産物生産に関与することが明らかとなった。

木質系バイオマスの糖化前処理によって生じるバニリンは酵母の生育や発酵能を阻害するため、第二世代バイオエタノールの効率的な製造を目指す上で大きな障壁となっている。また、グルコース枯渇や高濃度エタノールなどと同様に、高濃度のバニリンは翻訳抑制を酵母細胞内で引き起こす。翻訳抑制下ではストレス耐性獲得に必要とされる一部の遺伝子のみが優先的に翻訳され、大半の遺伝子は転写量が増加しても翻訳産物レベルに反映されない。そのため、通常の発現系でバニリン耐性を改善することは困難である。そこで本研究では、高濃度バニリン存在下でも優先的に翻訳される酵母遺伝子の同定とその応用に取り組んだ。機能未知の遺伝子 VIE1 の mRNA レベルはバニリン濃度依存的に増加した。また、そのタンパク質は非ストレス条件下でほとんど検出されなかったが、高濃度バニリン存在下では顕著に増加した。加えて、VIE1 プロモーターを用いることで、翻訳抑制を引き起こす高濃度バニリン存在下でも任意の遺伝子を効率的に翻訳・発現させることに成功した。また、バニリン同様にバイオマ
スの糖化前処理によって生じる発酵阻害物質のフルフラールや HMF によっても VIE1 の発現誘導が認められた。以上の結果から、VIE1 は翻訳抑制ストレスである高濃度バニリンやフルフラール、HMF 存在下でも優先的に翻訳されることが明らかとなった。これらの発酵阻害物質存在下でも機能する VIE1 プロモー
ターを用いた発現系を利用することで、酵母の発酵阻害物質に対する耐性や第二世代バイオエタノールの製造効率を改善できる可能性が強く示唆された。

Sake-brewing characteristic of histone deacetylase gene-disrupted yeast

Yeast VIE1 overcomes pronounced translation repression caused by severe
vanillin stress○Kazuya Tomimoto, Takeshi Akao, Hisashi Fukuda(NRIB)

Key words

sake yeast, histone deacetylase, RPD3, isoamyl acetate

2P-1p048 高濃度エタノールストレスによる翻訳抑制下でも優先的に翻訳される酵母 BTN2 の解析とその応用○TM Nguyen Trinh, Yoko Ishida, Shingo Izawa(Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)Key words

vanillin, lignocellulosic materials, translation repression, furfural

2P-1p050 花酵母による廃牛乳を基質とした高機能微生物タンパク(SCP) 生産加藤 沙枝, 山内 雪菜, ○井沢 真吾（京工繊大院・工芸科学）
thioredoxin@kit.ac.jp○大塚 光雄 1, 清 啓自 1, 茂野 俊也 2, 中島 敏明 1
（1筑波大院・生命環境, 2つくば環微研）
nakajima-toshiaki.ga@u.tsukuba.ac.jp

翻訳抑制を引き起こすストレス条件下では大部分の遺伝子の発現は抑制され、耐性獲得に必要とされる一部の遺伝子のみが翻訳される「優先的翻訳」が行われる。高濃度エタノールストレス (>9% v/v) は酵母の翻訳を強く抑制するが、これまでどのような遺伝子が高濃度エタノール存在下で優先的に翻訳されているかは不明であった。今回、v-SNARE binding protein をコードする BTN2 が高濃度エタノール存在下で優先的に翻訳されることを明らかにした。非ストレス
条件下や低濃度エタノールストレス下では BTN2 の発現はほとんど検出されなかったが、高濃度エタノール処理によって転写レベル、タンパク質レベルともに顕著に上昇した。一方、エタノールを除去すると Btn2 タンパク質は比較的速やかに消失した。また、BTN2 のプロモーターを用いることで、高濃度エタノー
ルストレス下における BTN2 以外の遺伝子(CUR1, GIC2, YUR1)の発現誘導に成功した。そのため、翻訳抑制によってこれまで困難であった高濃度エタノール存在下での遺伝子発現誘導が BTN2 プロモーターによって可能となり、高濃度
アルコール発酵の実現や発酵効率の改良などに同プロモーターが活用できると考えられた。また、BTN2 のプロモーター領域内の heat shock elements (HSEs)
が、エタノールによる転写活性化だけでなく優先的翻訳にも重要な役割を担う
可能性が強く示唆されたため、現在その検証を行っている。さらに、BTN2 の発現誘導における実験室酵母とワイン酵母・清酒酵母の違いについても解析中
で あ る (Yamauchi and Izawa. Prioritized expression of BTN2 of Saccharomyces
cerevisiae under pronounced translation repression induced by severe ethanol stress.
submitted)。

乳牛から搾乳して得られる生乳は、気温や天候などの気象条件により生産量が変動する。また毎日の搾乳を怠ると乳房炎になるため、牛乳生産のコントロー
ルは難しいとされている。そのため、酪農家は急な出荷量の変化に対応が出来ないという問題がある。生産量が需要を上回った場合、牛乳は産業廃棄物として処理される。このような問題を背景に、過剰に生産した牛乳の環境に配慮した有効利用法が必要とされている。現在、有効利用法の一つに液体飼料化が挙げられるが、高い含水量の為に腐敗による影響を受けやすく、また可搬性にも問題がある。そこで本研究では牛乳を原料に酵母を用いて Single Cell Protein（SCP）生産を行うことにより廃棄量、および廃棄処理費用の低減を目的とした。産業利用を見越しイメージの良い花から単離した酵母を牛乳で増殖させ、菌体を回収し SCP を配合飼料添加物としての商品化を最終目標としている。
研究室保有の花酵母は、油脂分解酵母としてスクリーニングしたものであり、牛乳中での生育に適した株とは限らない。そのため、新規に花酵母の採取を行った。つくば市内に自生する花をサンプリング・希釈し、牛乳寒天培地、YM 培
地、MRS 培地にプレーティングして培養を行った。結果、6 株の乳酸菌と 4 株の酵母を得た。現在、これらの菌株の有用性を検証している。研究室保有の花
酵母については、26S rRNA D1/D2 領域塩基配列を決定し、その配列を用いて帰属分類群を推定した。結果、所有している株の約半数が Pichia anomala と同定された。Pichia anomala は、油脂分解酵母と知られ、油脂系廃棄物からの SCP生産株としての特許を取得されている。現在、SCP 生産株の絞り込みを行い、高生産かつ廃水処理能を持った花酵母の探索・組み合わせの検討を行っている。
また、使用菌株の絞り込みを行う段階で菌体の栄養分析も行ってゆく。

Yeast BTN2 overcomes pronounced translation repression caused by severe
ethanol stress

Production of Single Cell Protein (SCP) from waste milk by using yeasts
isolated from flowers

Sae Kato, Yukina Yamauchi, ○Shingo Izawa(Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)Key words

ethanol stress, mRNA flux, translation repression, BTN2

○Mitsuo Otsuka1, Keiji Kiyoshi1, Toshiya Shigeno2, Toshiaki Nakajima1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Tsukuba Inst. of Environ.
Microbiol)

Key words

yeast, Single-Cell-Protein, milk, scp

182

発酵生理学，発酵工学

2P-1p051 N-アセチルグルコサミン資化性酵母 Scheffersomyces
stipitis の特性解析

2P-1p053 定量プロテオミクスを用いた出芽酵母中心代謝安定化機
構の解析○猪熊 健太郎, 蓮沼 誠久, 近藤 昭彦（神戸大院・科）akondo@kobe-u.ac.jp○松田 史生, 富田 淳美, 清水 浩
（阪大院・情報）
fmatsuda@ist.osaka-u.ac.jp【目的】N-アセチルグルコサミン（以下、GlcNAc）は、甲殻類の殻や昆虫の外骨格、および多くの糸状菌、酵母、藻類の細胞壁の主要成分の１つであるキチンの主要な構成単糖である。キチンの自然界における年間生産量は 1010～1011
トンと試算されており、セルロースに次いで豊富に存在するバイオマス資源であると考えられている。しかしながら、セルロースに比べ、キチンの利用に関する研究は進んでおらず、キチン系廃棄物のほとんどは未利用の状態にある。
そのため、キチンおよびその構成単糖である GlcNAc からの微生物を利用した有用物質生産法の開発が求められている。本研究では、GlcNAc を炭素源としてバイオ燃料の一種であるエタノールを生産できる酵母 Scheffersomyces (Pichia)
stipitis の発酵特性および GlcNAc 代謝経路の解析を試みた。
【結果および考察】酵母 S. stipitis を用いて、異なる通気条件で GlcNAc を炭素源とした発酵試験を行い、通気条件がエタノール生産の及ぼす影響を検討した。
その結果、この酵母が嫌気条件では理論収率の 82%という高い収率でエタノー
ルを生産できるのに対し、好気条件ではエタノールを全く生産しないことが明らかとなった。この特性を利用すれば、この酵母に GlcNAc からエタノール以外の有用物質を生産させることも可能になると期待される。また、この酵母のGlcNAc 代謝経路をより詳細に解析するために、CE-TOFMS を用いた代謝物解析も進めており、その結果についても報告する。

【背景】出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae は高いエタノール発酵能力を持つが、酵素発現量が解糖系の代謝フラックスを維持するためにどのように協調して増加、減少しているのかは明らかではない。そこで、中心代謝に関わる酵素タン
パク質をコードする遺伝子の 1 遺伝子破壊株の中心代謝酵素量を定量プロテオーム解析法で網羅的に測定することを試みた。
【方法】S. cerevisiae BY4742 株およびその１遺伝子破壊株を用いた。非標識または[U-13C]グルコース含む SD 培地(100 mL)で回分培養し、菌体を回収後、タンパク質を抽出し、定法に従ってトリプシン消化を行った。トリプシン消化物は
nanoLC-UFMS (Prominence nano+LCMS-8040)を用いて分析した（カラム: Lcolumn C18, 0.1*150mm, 移動相:アセトニトリル／水／ギ酸、流量: 400 nl/min、
ESI ポジティブイオンモード、検出：MRM）。各ペプチドの非標識体と[U-13C]
標識体のピーク面積比から相対タンパク量を求めた。データ解析には Skyline
ver 2.5 を用いた。
【結果】対数増殖期にある野生株およびその１遺伝子破壊株の総計 31 株から、タンパク質を抽出し、定量プロテオーム解析法を用いて 110 種の中心代謝酵素の発現量を定量した。得られた酵素発現プロファイルデータを用い、全酵素間で発現量の相関係数を算出し、1 遺伝子破壊株間で協調して発現量が増加、減少する酵素の共発現ネットワークを作製した。ストレス応答に関わるグローバ
ルレギュレーターの Msn2p/Msn4p が発現調節するトレハロース代謝酵素群がクラスターを形成していた。これらの結果から、出芽酵母中心代謝の安定化機構
としてトレハロース代謝が関与している可能性が示唆された。

Characterization of N-acetylglucosamine-assimilating yeast Scheffersomyces
stipitisTargeted proteome analysis of the central metabolism related enzymes in○Kentaro Inokuma, tomohisa Hasunuma, Akihiko Kondo(Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

N-acetylglucosamine, yeast, Scheffersomyces stipitis, ethanol

Saccharomyces cerevisiae○Fumio Matsuda, Atsumi Tomita, Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words
Saccharomyces cerevisiae, targeted proteome analysis, central
metabolism, trehalose

2P-1p052 酵母表層への酵素立体的配置技術の開発

2P-1p054 抗生物質生産株の新規な固／液界面スクリーニング法【背景・目的】近年、環境負荷の軽減などの理由から、酵母を用いたバイオマスを原料とするエタノール生産が注目されている。そのコストおよびエネルギー
消費の大幅な削減のためには、セルラーゼの生産、糖化、発酵を一度に行う統合型バイオプロセス(Consolidated Bioprocessing: CBP)の実現が必要である。我々は、セルロースの同時糖化発酵を可能とするセルラーゼ表層提示酵母の細胞表層における酵素活性の向上に取り組んでいる。本研究では、細胞表層に提示されるセルラーゼの配置に着目し、表層提示に使用するアンカータンパクが、提示されるタンパクの配置に及ぼす影響の解析を行った。

【目的】 抽出液面固定化システムを基幹とする液／液界面スクリーニングシス
テム 1)では、株によって中空マイクロスフェアー層が崩壊する場合があるうえに、増殖の遅い放線菌へ適用することが困難である。そこで、難寒天平板／疎水性有機層界面でカビもしくは放線菌を増殖させて脂溶性二次代謝物を有機層中に蓄積させる固／液界面スクリーニング法を考案し、液面固定化システムとの二次代謝物プロファイルの比較検討と抗生物質生産株のスクリーニングへの適用を図った。
【方法】 修正サブロー寒天平板／ジメチルシリコンオイル(KF-96L-1CS）界面に増殖するカビが生産する代謝物プロファイルの比較を、液体培養、抽出液面固定化との間で HPLC-PDA で行った。同培養系を６穴マルチウエルプレートに適用し、624 株の分離カビについて、Pichia anomala NBRC10213 と Candida utilis
NBRC 0619 に対する抗真菌活性物質の生産能を調べた。
【結果】 Aspergillus niger NBRC 32074、Penicillium multicolor IAM 7153、Rhizomes
oryzae NBRC 31005、Nemonic aenea SF10099-1 の４株を寒天平板／シリコンオ
イルの固／液界面培養系で培養した結果、液体培養系で水層中に生産・蓄積される代謝物とは大きく異なるプロファイルが得られたが、抽出液面固定化シス
テムの有機層中に蓄積される代謝物のプロファイルと概ね類似していた。上記の固／液界面培養法を抗真菌物質生産カビのスクリーニング（ペーパーディス
ク法）に適用したところ、P. anomala NBRC 10213 と C. utulis NBRC 0619 に対するヒット率は、それぞれ 7.9%と 3.1%であった。なお、上記固／液界面培養
系を放線菌のスクリーニングに適用した結果についても報告する。
1)
Oda, S., et al., J. Antibiot., 68, 691-697 (2015).

○黒野 浩幹, 猪熊 健太郎, 蓮沼 誠久, 近藤 昭彦（神戸大院・科）akondo@kobe-u.ac.jp【結果】酵母 Saccharomyces cerevisiae 由来の SAG1 アンカーおよび SED1 アン
カーを高感度緑色蛍光タンパク(EGFP)に付与することで EGFP を細胞表層に提示させ、共焦点レーザー顕微鏡観察と免疫電子顕微鏡解析を行い、GPI アンカー
による表層提示の局在を調べた。その結果、GPI アンカーを付与している株にのみ EGFP の表層提示が確認できた。さらに SAG1 アンカーを付与した EGFP
よりも SED1 アンカーを付与した EGFP の方が、EGFP を細胞表層の外側に提示できることが確認された。この結果を応用し、EGFP の代わりにセルラーゼを導入したセルラーゼ表層提示酵母を構築することで、セルロース分解効率の向上が期待される。

Development of steric positioning technology of enzymes on yeast○Hiroki Kurono, Kentaro Inokuma, Tomohisa Hasunuma, Akihiko Kondo(Grad. Sch. Sci, Technol, Innov, Kobe Univ.)

Key words
cell surface display, EGFP, immunoelectron microscopy,
Saccharomyces cerevisiae○小田 忍, 林 優佑, 大澤 果穂, 大箸 信一（金工大・ゲノム研）
odas@neptune.kanazawa-it.ac.jp

Novel solid-liquid interface screening system for antibiotic-producing
microorganisms○Shinobu Oda, Yusuke Hayashi, Kaho Oshawa, Shinichi Ohashi(Genome Biotechnol. Lab., Kanazawa Inst. Technol.)Key words

interface screening system, screening, antibiotics, interface bioreactor

代謝工学

2P-1p055 大腸菌を用いたコリスミ酸派生化合物合成プラットホー
ムの開発

183

2P-1p057 シンプル酵素触媒構築を目指した低温菌における鉄誘導型プロモーターの探索○野田 修平, 白井 智量, 近藤 昭彦（理研・環境資源）
shuhei.noda@riken.jp○土井 和博, 田島 誉久, 中島田 豊, 加藤 純一（広島大院・先端物質）
jun@hiroshima-u.ac.jp

持続可能な社会形成のため、石油依存社会から、エネルギーや化成品を再生可
能なバイオマス資源に依存したバイオリファイナリー社会への変革が求められている。本研究においては特に、「菌体触媒を用いた芳香族化合物合成」に注目した。その中でも特に、芳香族アミノ酸合成経路の中間代謝物であるコリスミ酸を起点とした芳香族化合物合成プラットホームの開発を目指した。サリチル酸を含む合計 7 種類の芳香族化合物、そこから派生する有機酸をターゲット化
合物として定めた。本研究では、コリスミ酸周りの芳香族化合物合成の最終反応で目的化合物と同時にピルビン酸が生じることに注目し、これら芳香族化合物の合成に最適な代謝デザインを行った。
まず、L-フェニルアラニン生産大腸菌（ATCC31882）に対し、芳香族化合物合成のために重要な化合物であるホスホエノールピルビン酸を蓄積するような代謝改変を行った。続いて、細胞内での主なピルビン酸獲得反応を目的化合物合成時に制限した菌体へと改変した。創製した菌体は、試験管培養、ジャーファー
メンターを用いた培養により、各化合物の生産性を評価した。
2-L ジャーファーメンターを用いたサリチル酸生産において、培養 48 時間で11.5 g/L の生産性を達成し、グルコースからの収率は 40% (mol/mol)であった。
他の化合物に関しても、試験管培養 1-3 g/L の生産性を達成した。

【目的】我々は中温菌由来の酵素を発現させた低温菌を利用したシンプル酵素触
媒による効率的な変換技術の開発を行っている。本触媒では熱処理により低温菌由来の代謝酵素が失活し、目的産物を生成する中温菌由来の酵素のみが機能するため、基質を目的産物に完全に変換させることが期待できる。この特性を活かすことで中温菌由来の豊富な酵素を利用して自由な反応経路の構築が可能である。本触媒を構築するうえで現在プロモーターとして tac を用いている。
しかし複数酵素の発現には不十分であるため、より強力なプロモーターの探索が必要である。Shewanella frigidimarina は鉄還元細菌でることから、本株には鉄誘導型タンパク質の発現に関わる配列があり、鉄による制御が可能ではないかと考えられる。そこで本研究では S. frigidimarina からクエン酸鉄（III)による制
御可能なプロモーターの探索を行った。

Metabolic engineering of Escherichia coli to produce various chorismate
derivatives

Exploration of the iron-inducible promoter for the psychrophilic cell based
simple biocatalysis○Shuhei Noda, Tomokazu Shirai, Kondo Akihiko(CSRS., RIKEN)

Key words

aromatic ring compound, Escherichia coli, metabolic engineering

2P-1p056 低温菌シンプル触媒におけるアスパラギン酸生産○羅 宮臨風, 田島 誉久, 中島田 豊, 加藤 純一（広島大院・先端物質）
jun@hiroshima-u.ac.jp【方法および結果】S. frigidimarina にクエン酸鉄（III)を加え、3 日間培養後、生菌数を測定したところ数倍まで増加していた。このことから鉄が増殖に何らかの影響を与えたと考えられる。そこで、クエン酸鉄（III)を加えることでよりタ
ンパク質の発現が高くなる遺伝子の上流配列がプロモーターとして機能するのではないかと考え、鉄誘導型高発現タンパク質の同定を行った。二次元電気泳動ならびに Nano-LC/MS を用いて同定を行ったところ、ATP synthase subunit α、GTP cyclohydrolase, Malate dehydroganase が見いだされた。これらの遺伝子上流
配列を pKZ27 に挿入しプロモーター活性評価用プラスミドを構築した。現在、それらの低温菌導入株において β-ガラクトシダーゼによる活性評価を行っている。

○Kazuhiro Doi, Takahisa Tajima, Yutaka Nakashimada, Junichi Kato
(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words

psychrophile, promoter, iron respiration, simple biocatalysis

2P-1p058 2-ピロン-4,6-ジカルボン酸の発酵生産収率向上のための大腸菌の代謝工学的改変○濵野 雄大 1, 仁宮 一章 2, 柘植 陽太 2, 梶田 真也 3, 政井 英司 4,
片山 義博 5, 敷中 一洋 6, 大塚 祐一郎 7, 中村 雅哉 7, 高橋 憲司 1
（1金沢大院・自科, 2金沢大・新学術, 3農工大・生物システム応科, 4長岡技科大, 5日大・生資科, 6農工大院・工, 7森林総合研）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp【背景、目的】本研究室では低温菌を利用したシンプル酵素変換触媒の構築を進めている。低温菌は 30℃以上で生育不可能な菌であるため、その代謝酵素は中温での加熱により簡単に除去することができる。そのため、中温菌由来の酵素を発現させた低温菌を中温で熱処理することで物質変換に必要な酵素だけが活性を保持したまま細胞内に残される。したがって、酵素を精製することなく低コストで物質変換を行うことが可能である。これまでに低温菌にアスパルター
ゼを発現させたシンプル酵素触媒により、フマル酸がアスパラギン酸に効率的に変換されることを実現している。本研究では、乳酸を原料としてアスパラギ
ン酸を生産するための低温菌シンプル触媒を目的としている。
【方法、結果】乳酸からアスパラギン酸を作り出すために四つの酵素反応を経由する経路を設計した、放線菌 Streptomyces avermitilis 由来のマリックエンザイム（malic enzyme）を低温菌 Shewanella livingstonesis に導入したところ、低温菌での発現が確認できなかったため、大腸菌を利用して酵素を発現・精製し、特性化してた。マリックエンザイムはリンゴ酸を基質にしてピルビン酸を生成する酵素で、本研究ではその逆反応を利用したいが、精製された酵素を調べた結果、
この逆反応の触媒活性が見られなかった。現在、逆反応を触媒できる酵素として、植物及び動物由来のものを候補として低温菌での発現を進めている。

【目的】近年、木質系バイオマスを原料とした有用物質の生産が活発になっている。我々は、その中でも特に、新規ポリマーの原料としての利用が期待されている 2-ピロン-4,6-ジカルボン酸(PDC)の生産に関する研究に注目した。既往の研究により、バイオマスから取り出すことのできる単糖であるグルコースからの組み換え大腸菌による PDC 発酵生産システムの構築には成功している。しかし、現状の大腸菌株では、PDC の収率が低いという問題点がある。そこで本研
究では、さらなる遺伝子組み換えによる大腸菌の代謝工学的改変を行い、PDCの前駆体であるエリスロース-4-リン酸(E4P)とホスホエノールピルビン酸(PEP)
への代謝反応の促進を行うことで PDC の効率的な生産を目指した。
【方法および結果】E4P、PEP への代謝反応を促進させる手段としては、それぞれ tktA、ppsA 遺伝子をターゲットとしてプラスミドベクターによる過剰発現を行った。加えて、PEP に関してはホスホトランスフェラーゼ系(PTS)により大量に消費されることが知られているため、PTS に関する遺伝子の 1 つである、ptsG遺伝子をゲノム DNA から破壊することで、PTS による PEP の消費を抑制した。
グルコースを単一炭素源とした最小培地において、tktA、ppsA 過剰発現株、ptsG
破壊株を用いた発酵試験を行ったところ、いずれにおいても PDC 収率は向上
し、その中でも特に、ppsA を過剰発現し、ptsG を破壊した株において最も高い
PDC 収率を示した。

Aspartic acid production by a psychrophile-based simple biocatalyst

Metabolic engineering of Escherichia coli for enhanced production of 2pyrone-4,6-dicarboxylic acid

○Gonglinfeng Luo, Takahisa Tajima, Yutaka Nakashimada, Junichi Katou(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words

psychrophile, enzymatic conversion, malic enzyme, aspartic acid

○Takehiro Hamano1, Kazuaki Ninomiya2, Yota Tsuge2, Shinya Kajita3, Eiji Masai4,
Yoshihiro Katayama5, Kazuhiro Shikinaka6, Yuichiro Otsuka7, Masaya Nakamura7,
Kenji Takahashi1(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Ints. Frontier Sci. Initiative,
Kanazawa Univ., 3Grad. Sch. Bio-Appl. Syst. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.,4
Nagaoka Univ. Technol., 5Coll. Bioresour. Sci., Nihon Univ., 6Grad. Sch. Eng.,Tokyo Univ. Agric. Technol., 7Forestry Forest Products Res. Inst.)
Key words
metabolic engineering, Escherichia coli, 2-pyrone-4, 6-dicarboxylic
acid

184

代謝工学

2P-1p059 BGL 提示大腸菌に適した代謝改変戦略を用いたセロビ
オースからのプトレシン生産

2P-1p061 in silico 代謝シミュレーションと 実験室進化実験の統合によるコハク酸高生産大腸菌の構築○徳山 健斗, 戸谷 吉博, 清水 浩
（阪大院・情報）shimizu@bio.eng.osaka-u.ac.jp○田中 勉, 西川 弘樹, 近藤 昭彦（神戸大院・工）tanaka@kitty.kobe-u.ac.jp

細胞表層工学及び代謝工学は、微生物を用いた物質生産において重要な技術である。微生物の表層にバイオマス分解酵素を提示することで、その微生物に対してバイオマス分解能の付与が可能となる。また、微生物の代謝を改変することで副生成物の生産を抑制し、目的生産物の収量・収率を向上させることができる。
本研究では、プトレシンを目的生産物とし、代謝改変を施すことによりグルコー
スからの生産量を 15mM にまで向上させた。この代謝改変株に対して BGL を提示させ、セロビオースを炭素源としてプトレシン生産を行った。その結果生産量は 4.6mM であり、グルコースに比べて低くなった。増殖速度はグルコースよりやや遅い程度であり、糖の供給が律速ではないと考えられる。一方で、この BGL 提示株を用いてグルコースからプトレシン生産を行ったところ、BGLを提示していない株と同様の増殖を示したにもかかわらず、その生産量は 4mM程度と非常に低くなった。これより、細胞表層提示微生物に適した代謝改変が必要であることが示唆された。現在、BGL 提示株において生産量を向上させる
代謝改変について検討を進めている。

【背景と目的】微生物による物質生産の高度化に向け、代謝経路全体における物
質収支を考慮し、増殖時の代謝状態を予測するシミュレーション技術が開発された。このシミュレーション技術を用いることで、目的物質生産に有効な遺伝
子破壊戦略を in silico で設計できる。しかし、設計通りに遺伝子破壊を行っても、細胞の代謝状態がすぐに予測した状態に移行せず期待通りの生産性が得られない場合もある。本研究では、増殖連動型のコハク酸生産が期待される遺伝子破壊株をシミュレーション結果に基づいて構築し、更に実験室進化実験を行うことで、遺伝子破壊株の増殖速度向上に伴ってコハク酸生産性を向上させることを目的とした。
【方法と結果】大腸菌のゲノムスケール代謝モデル iAF1260 (1260 遺伝子・2077
反応・1039 代謝物質) を用いて、グリセロールを基質とした増殖連動型コハク酸生産が期待できる多重遺伝子破壊候補を探索したところ、adhE-pykAF-gldApflB の 5 重遺伝子破壊株は収率 0.26 mol/mol でコハク酸を生産することが予測された。大腸菌 BW25113 株を宿主として予測された 5 遺伝子破壊株を構築し、グリセロールを単一炭素源とした合成培地で培養したところ、コハク酸生産収率は 2.8 倍向上したが、代謝シミュレーションの予測に比べて生産収率と増殖速度は低い値となった。本設計は増殖連動型の生産を戦略としているため、継代培養により増殖速度の向上した菌株を獲得し、適応的に代謝状態を予測状態に近づけることで、コハク酸収率を向上させることを試みた。構築した遺伝子破壊株を用いて、試験管での継代培養実験を独立に 5 系列行ったところ、全ての系列において 100 世代目の進化株は進化前の遺伝子破壊株に比べて増殖速度が 2.5 倍以上に向上した。最も生産性の高い進化株では、進化前に比べてコハ
ク酸収率は 4.3 倍向上し、0.25 mol/mol に達した。

Putrescine production from cellobiose using metabolically- and cell surface
engineered E. coli

Adaptive laboratory evolution for in silico designed succinate producing○Tsutomu Tanaka, Hiroki Nishikawa, Akihiko Kondo(Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)

Key words
biomass

metabolic engineering, cell surface engineering, Escherichia coli,

2P-1p060 メバロン酸生産大腸菌株の定常期における代謝状態の解明○増田 亜美, 戸谷 吉博, 徳山 健斗, 坂野 聡美, 吉川 勝徳, 清水 浩
（阪大院・情報）shimizu@bio.eng.osaka-u.ac.jp

Escherichia coli

○Kento Tokuyama, Yoshihiro Toya, Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words
succinate

Escherichia coli, metabolic simulation, evolutionary engeneering,

2P-1p062 イソプロパノール生産向上のための代謝システムの数理解析○藤田 純孝 1, 濱田 浩幸 2, 岡本 正宏 2, 花井 泰三 2
（1九大院・生資環, 2九大院・農）taizo@brs.kyushu-u.ac.jp【背景と目的】定常期の菌体を用いた物質生産は基質を細胞合成に使用しないため、増殖期に比べ高い生産収率が期待できる。本研究ではメバロン酸生産を定常期で行うことで生産性の向上を試みた。また、定常期を実現する際に制限する基質の違いが、メバロン酸の生産性や代謝状態に及ぼす影響について調べた。
【結果】
大腸菌 K-12 MG1655(DE3)株に Enterococcus faecalis 由来のメバロン酸合成経路
遺伝子を導入した株を使用した。細胞の増殖に必須な栄養源である硫黄、窒素またはマグネシウム源を欠損した合成培地を用いて、定常期でメバロン酸生産
株を評価したところ、増殖期に比べメバロン酸の生産性が向上した。中でも硫
黄欠損条件で最も生産性が高く、増殖期では 27%(C-mol/C-mol)であったメバロン酸の炭素収率が 61%(C-mol/C-mol)に向上した。硫黄欠損条件では鉄-硫黄クラスターを作ることができず、これを必要とする TCA 回路中の複数の酵素が働かないことが知られている。そのため、TCA 回路から放出される CO2 が減少し、より多くのアセチル CoA がメバロン酸に変換されたと考えられる。また、メバ
ロン酸の合成には補酵素 NADPH が必要であり、この NADPH は中枢代謝で生産される。定常期でメバロン酸収率が向上した要因を明らかにするため、メバ
ロン酸合成に必要な NADPH が中枢代謝経路のどの反応で生産されたか調査した。同位体標識基質を用いて、大腸菌における主な NADPH の生産源であるペントースリン酸経路の流束を計測した結果、ペントースリン酸経路だけでは必要な NADPH が賄えていないことが明らかになり、トランスヒドロゲナーゼ反応により NADPH が賄われていることが予想された。そこで、トランスヒドロ
ゲナーゼをコードする遺伝子を欠損したところ、メバロン酸生産性が低下した
ことから、トランスヒドロゲナーゼが NADPH の供給に寄与していることが示唆された。

【背景と目的】当研究室は、遺伝子組み換え大腸菌の発酵機能を応用し、グルコースを出発原料としてイソプロパノール（IPA）を生産することに成功した。
次に、発酵法による IPA 生産能を高めるため、IPA 生産経路内の律速段階の活性化や競合経路を抑制する方策を探っている。IPA 生産は還元力を必要とし、物質生産と細胞増殖の間で同化代謝と炭素源に関わる競合を呈する特徴がある。
このような特徴を有するシステムの代謝改変候補の探索では、システム同定、
システム解析、システム制御などの数理解析の適用が有効となる。そこで、本研究では、解糖系、TCA 回路、ペントースリン酸経路からなる系（異化代謝）に酸化還元バランスと同化代謝を統合した新規数理モデル(提案モデル)を構築
し、IPA 生産速度を増強する代謝改変候補の探索を実践した。
【方法】IPA 生産大腸菌を最小培地で培養し、経時的に代謝物濃度を測定した。
この実験データをもとに、代謝シミュレーション用のソフトウェアである
WinBEST-KIT を用いて速度式を立式し、パラメータを調整後、シミュレーショ
ンおよび感度解析に供した。
【結果と考察】感度解析の結果、提案モデルを用いた数理解析は従来のモデルでは推定されなかった代謝改変候補を提案した。酸化還元バランスと同化代謝の考慮は物質生産の制御系の検証にも有用であると考えられた。

Elucidation of metabolic state of mevalonate producing Escherichia coli at
stationary phase

Mathematical analysis of metabolic systems for enhancing isopropanol
production○Ami Masuda, Yoshihiro Toya, Kento Tokuyama, Satomi Banno,
Katsunori Yoshikawa, Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words

stationary phase, Escherichia coli, mevalonic acid, flux analysis○Sumitaka Fujita1, Hiroyuki Hamada2, Masahiro Okamoto2, Taizo Hanai2(1Grad. Sch. Bioresour. Bioenviron. Sci., Kyushu Univ., 2Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words
kinetic modeling, valuable chemicals production, Escherichia coli,
redox balance

代謝工学

2P-1p063 糖代謝系遺伝子の破壊による Citrobacter freundii
IFO13545 のバイオ凝集剤生産の改善

185

2P-1p065 出芽酵母の PHO13 欠損はアセトアルデヒド耐性能を強化する○柏 雅美 1, 宮本 弘毅 1, 池本 啓史 1, 木村 和幸 2, 根来 誠司 1,
武尾 正弘 1
（1兵庫県大院・工, 2（株）兵庫分析センター）
takeo@eng.u-hyogo.ac.jp○高木 哲史, 早川 享志, 中川 智行（岐阜大・応生科）
t_nakaga@gifu-u.ac.jp

バイオ凝集剤は、現在普及している化学系凝集剤に比べ、環境低負荷であるが生産コストが高いために普及していない。Citrobacter freundii IFO13545 株は、酢酸からキトサン様バイオ凝集剤を生産するが、その生産コスト低減を目的とし、遺伝子破壊による高生産株の育種や安価な有機基質利用株の育種を行っている。本凝集剤はアミノ多糖であるため、酢酸を炭素源とした場合、糖新生か
らアミノ糖合成経路を経由する。そこで、本研究では、それらの経路への炭素フローの増加や逆流防止のため、解糖系（EMP 経路、PP 経路）の遮断やアミノ糖から EMP 経路への流入遮断など、主に遺伝子破壊による凝集剤の高生産化の可能性を検討した。
既に Citrobacter 属細菌で確立した相同組換えによる遺伝子破壊法を用いて、IFO13545 株の３つ遺伝子（フォスフォフルクトキナーゼ遺伝子、グルコサミン
6-リン酸デアミナーゼ遺伝子、グルコース 6-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）を破壊し、PCR 並びにサザンハイブリダイゼーションにより破壊を確認した。
これらの遺伝子を単独、二重あるいは三重に破壊した遺伝子破壊株を構築し、酢酸を単一炭素源とする無機塩培地でそれらを培養し（30℃、150 rpm）、その培養上清の凝集力価をカオリン懸濁法により評価した。その結果、単独の遺伝子破壊では顕著な凝集力価の上昇はなかったが、二重破壊株で野生株の数倍、さらに三重破壊株でその約 1.4 倍の凝集力価の上昇が確認でき、これらの遺伝子破壊が凝集剤の高生産に有効であることが示唆された。

【目的】
アセトアルデヒド（AA）は出芽酵母のアルコール発酵時における重要な代謝中間体であるが、他の生体因子と結合してその機能を阻害する毒性化学物質として知られている。このため、代謝抑制因子である AA への耐性を強化すること
は、酵母の分子育種としての課題である。我々はこれまでに、NADPH を消費/供給する代謝系と、それを制御する因子が AA 耐性に重要であることを報告してきた。特に転写因子 Stb5p は、AA ストレス下で NADPH の供給源であるペン
トースリン酸経路（PPP）を活性化させ、NADPH の生産を促すため AA 耐性における鍵因子である 1)。しかし、Stb5p のみでは AA 耐性の制御機構を十分に説明することはできず、多様な因子によって複雑に制御されていることが推察される。本研究では、酵母の AA 耐性機構の制御に関与する他の因子の同定と、その機能解明を目的とした。
【方法・結果】
出芽酵母の一遺伝子欠損株ライブラリより STB5 の欠損株を、また遺伝子綱引き法を用いた STB5 の過剰発現株を、細胞外部からの AA ストレス試験に供した。STB5 の欠損は AA に強い感受性を示した一方で、過剰発現によって野生株よりも生育が改善することはなかった。一方、PHO13 はその欠損により酵母のキシロース代謝系を活性化し、Stb5p の発現量を増大させる因子として、近年報告されている 2)。そこで同遺伝子の一遺伝子欠損株を用いて、AA ストレス下における生育を観察したところ、野生株と比較して顕著な AA 耐性を示した。
これらのことから、AA 耐性に STB5 は必須の因子であるものの、量的依存ではないことが推察された。さらに、PHO13 は AA 耐性機構を抑制している因子であり、AA 耐性に重要とされる NADPH 生産系への関与が示唆された。
1) Matsufuji et al. (2010) J Basic Microbiol, 50: 494-498
2) Kim et al. (2015) Appl Environ Microbiol, 81:1601-1609

Improved production of bioflocculant by disruption of genes related tosugar metabolism in Citrobacter freundii IFO13545

Deletion of PHO13 in the budding yeast enhances acetaldehyde tolerance○Masami Kashiwa1, Koki Miyamoto1, Keisi Ikemoto1, Kazuyuki Kimura2,
Seiji Negoro1, Masahiro Takeo1(1Grad. Sch. Eng., Univ. Hyogo, 2Hyogo Anaysis Center Co. Ltd.)Key words
freundiibiofloccurant, chitosan-like biopolymer, gene disruption, Citrobacter2P-1p064 Synechocystis sp.PCC 6803 の暗・嫌気条件でのカリウム
イオン添加による有機酸生産への影響○Tetsushi Takagi, Takashi Hayakawa, Tomoyuki Nakagawa(Fac. Appl. Biol. Sci., Gifu Univ.)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, acetaldehyde, Stb5p, Pho13p

2P-1p066 Thiamine: an important factor for acetaldehyde
tolerance in the budding yeast○川村 優樹, 上田 紗季子, 小山内 崇（明治大・農）tosanai@meiji.ac.jp○ Annisyia Zarina Putri, Nodoka Kubota, Takashi Hayakawa,
Tomoyuki Nakagawa(Fac. Appl. Biol. Sci., Gifu Univ.)
t_nakaga@gifu-u.ac.jp

カリウムはシアノバクテリアを含む全ての生物に必須な栄養素とされている。
また、シアノバクテリアは酸素発生型光合成を行うバクテリアで基礎から応用までの広い範囲での研究が行われている微生物である。中でも Synechocystis
sp.PCC 6803 の主な代謝は外部環境の状態によって変化し、暗・嫌気条件で有機酸・水素を生成する。今回はカリウムイオンがこの Synechocystis sp.PCC 6803の主要な代謝を大きく変化させることを発表する。

【Introduction】 The budding yeast is one of the most popular microorganisms, which
are widely used in several industries, such as alcohol fermentation and breadmaking.
During these fermentation processes, the budding yeast synthesizes a large amount ofacetaldehyde as an important intermediate in the cell. Since acetaldehyde is highly
toxic compounds, the yeast needs to take care for its toxicity during fermentation step.
In a previous study, Aranda and del Olmo reported that some genes, which participate
in the vitamin B1 (thiamine) biosynthesis, were up-regulated under acetaldehydestress1). Therefore, we think that thiamine may be one of the most important factors forthe acetaldehyde tolerance system in the yeast. In this study, we investigated somephysiological roles of thiamine for acetaldehyde tolerance in the budding yeast.
【Results & discussion】Based on increasing of thiamine concentrations in the medium,
acetaldehyde sensitivity of the yeast was recovered up to 12 μM thiamine
supplementation. On the other hand, it is known that the yeast cell uptake thiaminefrom outside of the cell, using thiamine transporter Thi7 and Thi72. Strain thi7Δ
showed acetaldehyde sensitivity compared with the wild type strain, although strain
thi72Δ showed same phenotype. These facts brought us to a conclusion that thebudding yeast requires thiamine under acetaldehyde stress, and thiamine has somephysiological roles for acetaldehyde tolerance system in the budding yeast.
1) Aranda & del Olmo (2004) AEM, 70: 1913.

Countercation effect of potassium metabolite biosynthesis ,in Synechocystis
sp.PCC 6803

Thiamine: an important factor for acetaldehyde tolerance in the budding
yeast○Yuhki Kawamura, Sakiko Ueda, Takashi Osanai(Sch. Agric., Meiji Univ.)

Key words

Synechocystis○ Annisyia Zarina Putri, Nodoka Kubota, Takashi Hayakawa, Tomoyuki Nakagawa(Fac. Appl. Biol. Sci., Gifu Univ.)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, acetaldehyde, thiamine, Thi7

186

代謝工学／醸造学，醸造工学

2P-1p067 Pichia methanolica グルコース抑制解除株を用いた AOD
アイソザイムの発現制御機構の解析

2P-1p069 純米酒中の α-EG 生産の研究○橋本 弓加 1, 徳田 耕二 2, 尾関 健二 1
（1金工大・ゲノム研, 2車多酒造）
ozeki@neptune.kanazawa-it.ac.jp○土井 遼平, 蓮實 凉子, 早川 享志, 中川 智行（岐阜大・応生科）
t_nakaga@gifu-u.ac.jp【目的】
メチロトローフ酵母 P. methanolica はメタノール酸化酵素（AOD）をコードする遺伝子を 2 コピー（MOD1 と MOD2）持ち、MOD1 と MOD2 がメタノールにより強力に誘導されることから、P. pastoris などとともに異種遺伝子発現系に広く利用されている産業用酵母である。一方、我々は AOD の発現制御の重要な要素は「メタノール誘導」と「グルコース抑制」の 2 要因であると考えてきた。
AOD はグルコースが存在する場合、グルコース抑制が働き、その発現は観察されない。また、キシロースやグリセロールといった炭素源で生育した場合、AOD は一部誘導される。我々は、AOD がキシロース等の炭素源で誘導されるのは「これら炭素源で抑制がかからない」だけであり、「誘導されている」のではないと考えてきた。今回は AOD 発現制御の詳細を探るため、P. methanolicaのグルコース抑制解除株を獲得し、そのメタノール応答について観察した。
【結果・考察】P. methanolica の 2-DG 非感受性変異株を選抜し、グルコース抑制解除株（RH3株）とした。野生株はグルコース+メタノール培地に生育した場合、AOD 活性を示さなかったが、RH3 株はメタノール生育細胞と同等の AOD 活性を示し、9 種の AOD アイソザイムの誘導が観察された。一方、RH3 株は炭素源がグルコースのみの培地において Mod1p のみ誘導したものの、ほとんど AOD 活性を示さなかった。これまでメチロトローフ酵母の AOD の発現制御はグルコース抑制によって調整されると考えられていたため、グルコース抑制が解除された
株ではメタノールが存在しなくても AOD 発現が観察されると予想していたが、グルコースのみでは AOD を誘導しなかった。つまり、キシロース等による AODの発現はグルコース抑制がかからないのではなく、炭素源によって AOD の発現が誘導されている可能性を示している。

【目的】これまでに清酒仕込では 3％、焼酎仕込および酒粕再発酵仕込では 2％を超える α-EG を発酵時に製造可能であった。また α-EG には、従来報告されている UV 照射による角質細胞の角化のバランスを取る荒れ肌改善効果以外に、皮膚表面の水分蒸発を抑制する速効性の保湿効果や真皮層にある線維芽細胞の細胞賦活化作用に伴う、コラーゲン生産量を増やす新規の保湿効果を報告した。
また石川県産の清酒中の α-EG 含量が、灘・伏見の大手ブランドの清酒より含量が多い報告をしており、今回サンプル数を増やし、純米酒製造時の α-EG 量を比較し、その含量の違いは何に起因しているかを仕込み方法から解明することを目的とする。
【方法】石川県産の純米酒 14 点（精米歩合 60-65％）と灘・伏見の大手ブランド 18 点（精米歩合 70％）の α-EG 含量の分析を HPLC により行った。また山廃酒母、速醸酒母と各酒母を用いた醪中での α-EG の製造効率を比較した。その分析結果を受け速醸酒母の有無による総米 45g の小仕込を実施し、α-EG の生産
効率、純米酒中に残存するアミラーゼ系酵素活性を比較した。
【結果および考察】石川県産の純米酒の方が灘・伏見の大手ブランドのそれより
1.4 倍 α-EG を含有していることが分かった。山廃酒母と速醸酒母を比較すると、発酵日数は山廃酒母が長くなるが α-EG 含量は少なくなる傾向であった。
これらの酒母を用いた純米酒醪中の α-EG 含量はほぼ同量で 0.9-1.0％と高くなることが分かった。酒母の有無による純米酒の小仕込では酒母がある醪で α-EG
量は 1.2％であり、酒母がない醪で 0.9％となり、酒母を立てる仕込が α-EG を高める仕込方であることが分かった。それ以外の原因として純米酒中に残存するアミラーゼ系酵素バランスの違いについても報告する。

Induction analysis of AOD isozymes using glucose de-repressed mutants ofStudy of alfa-EG production in Junmai-shu

Pichia methanolica○Ryohei Doi, Ryoko Hasumi, Takashi Hayakawa, Tomoyuki Nakagawa(Fac. Appl. Biol. Sci., Gifu Univ.)

Key words
repression

Pichia methanolica, alcohol oxidase, AOD isozymes, glucose○Yumika Hashimoto1, Koji Tokuda2, Kenji Ozeki1(1Genome Biotechnol. Lab., Kanazawa Inst. Technol., 2Shata Syuzo)

Key words

Junmai-shu, alfa-EG

2P-1p068 イソブタノール生産酵母の構築：オルガネラ局在の検討

2P-1p070 ビール醸造における各種糖質添加の影響【背景】出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae の物質生産能向上に向けた代謝改変が試みられているが、細胞小器官による反応の区画化、副産物の生成等の種々の課題が存在する。本研究ではイソブタノール生産株の構築を目指し、遺伝子操
作と代謝シミュレーションを組み合わせて前述の課題解決を試みた。
【方法】酵母のゲノムスケール代謝モデル (iMM904) を用いて、フラックスバラ
ンス解析に基づく代謝シミュレーションを実施した。S. cerevisiae YPH499 株およびピルビン酸脱炭酸酵素 (PDC) 欠損変異株に酢酸リチウム法でベクターを導入し形質転換体を得た。株のイソブタノール発酵能評価は 5 mL の 20 g/L グル
コース SD 培地を用い、培養開始から 2 日目の培溶液をガスクロマトグラフィーで測定した。
【結果】イソブタノールはピルビン酸から 5 反応で生成し、酵母では前半 3 反応がミトコンドリアに存在している。PDC を欠損させたモデル iMM904 での代謝シミュレーションでは、後半 2 反応を細胞質に追加した場合イソブタノールの理論最大収率は 28%となったが、5 反応全てを細胞質かミトコンドリアに局在化すると収率を 54%と 86%まで増加できることを見出した。後半 2 反応を触媒する代謝酵素を細胞質で発現させた S. cerevisiae YPH499 株のイソブタノール生産収率は 0.9%と低く経路の活性化の必要性が示唆されたが、この株の細胞質に
さらに前半 3 反応の代謝酵素を発現した株では収率が 1.3%に向上した。さらにPDC 欠損株に同経路を導入した株では収率が 2.9%となった。一方で後半 2 反応の代謝酵素をミトコンドリアで発現した株では収率が 2.2%となった。ミトコ
ンドリアでのイソブタノール生産にはピルビン酸の供給が重要であると考え、ピルビン酸輸送タンパクをコードする MPC1 欠損株を培養した。その結果イソブタノール生産収率は 1/5 に減少し、輸送タンパクの重要性が示唆された。

【目的】ビール中の各種糖質の含有量・組成は、その香味や物理化学的性質を左右することが知られている。一方で、いわゆる発泡酒や新ジャンルと言われる
ビール系飲料では、副原料として様々な糖質が使用されている。これら糖質の使用が発酵経過、あるいはビール品質にどのような影響を及ぼすのか確認することを目的として、以下の検討を行った。
【方法及び結果】下面発酵酵母（W-34/70）を用いて、各種糖質標品の発酵性について検討した。また麦芽に加えて、これら糖質あるいは水飴を原料として発酵前液を調製し、試譲評価を行った。一般的な発酵性糖（フラクトース、グル
コース、スクロース、マルトース）をそれぞれ原料の 3 分の 1 弱用いた結果、発酵経過や発酵後の糖組成に明確な違いは認められなかったものの、香味特徴
は異なり、フラクトースではフルーティーさ、グルコースでは強い硫黄臭、マ
ルトースでは麦芽感やコクが指摘され、スクロースはフラクトースとグルコースの中間的な特徴を示した。また、マルトースを主成分とする水飴を原料の 3
分の 2 程度使用し、その一部を非発酵性糖であるイソマルトース、パノース、
ニゲロース、ゲンチオビオースを含む水飴にそれぞれ置換したところ、発酵後のエキス分は使用した水飴の組成に応じて増加し、各々に特徴的な香味を示した。発酵前液に含まれる発酵性糖および非発酵性糖について、その組成を調整することで、発酵後のビールあるいはビール系飲料の香味特徴を一定程度制御可能であることが示された。

Engineering of Saccharomyces cerevisiae for isobutanol production:
pathway localization in organelle

The effects of various sugars added in beer brewing

Key words
Saccharomyces cerevisiae, isobutanol, metabolic engineering,mitochondria

Key words○森田 啓介 1, 松田 史生 1, 伊田 賢吾 3, 石井 純 2, 近藤 昭彦 3,
清水 浩 1（1阪大院・情報, 2神戸大・自科・研究環, 3神戸大院・工）shimizu@bio.eng.osaka-u.ac.jp○Keisuke Morita1, Fumio Matsuda1, Kengo Ida3, Jun Ishii2, Akihiko Kondo3,
Hiroshi Shimizu1(1Grad. Sch. IST, Osaka Univ., 2Org. Adv. Sci. Technol. Kobe Univ., 3Grad. Sch.
Eng, Kobe Univ.)○木本 裕, 山根 健司, 藤本 佳則, 小川 浩一（日本食品化工・研究所）
yutaka.kimoto@nisshoku.co.jp○Yutaka Kimoto, Kenji Yamane, Yoshinori Fujimoto, Koichi Ogawa(Nihon Shokuhin Kako Co., Ltd.)beer, fermentable sugar, non-fermentable sugar, sulphury flavour醸造学，醸造工学

2P-1p071 LC/MS による非ラベル化遊離アミノ酸分析法の確立と清酒酵母の系統によるアミノ酸取込の違い

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2P-1p073 GC×GC-TOFMS で取得した揮発性成分プロファイルと清酒の「押し味」の相関解析○清野 珠美, 廣岡 青央（京都市産技研）
kiyono@tc-kyoto.or.jp○玉田 佳大 1, 西村 泰央 2, 大東 功承 1, 西本 遼 1, 浅井 拓也 1,
山下 伸雄 1, 明石 貴裕 1
（1白鶴酒造, 2LECOジャパン）
akashi@hakutsuru.co.jp【背景・目的】弊所ではこれまで GC によるクロロギ酸エステル化法を用いたア
ミノ酸分析を行っていたが，この方法にはアルギニンが検出できないという欠点があった。近年，単純な溶媒条件で，アミノ酸を誘導体化 (ラベル化) せずに分離できる LC/MS 専用カラムが登場した。そこで，(1) この非ラベル化アミノ酸分離カラムと弊所所有の LC/MS を用いて，遊離アミノ酸の迅速分析法を確立するため，条件検討を行った。(2) 次に，この分析方法を利用して，異なる系
統の清酒酵母によるアミノ酸取込能の違いを調べた。
【方法】(1) LC/MS は ACQUITY TQD (Waters)を，カラムは Intrada amino acid
(Imtakt) を使用し，0.1％ギ酸－80％アセトニトリルと 100 mM ギ酸アンモニウ
ム－20％アセトニトリルの 2 液によるグラジエント溶出により，各アミノ酸を分離させた。検出は，多重反応モニタリング (MRM) モードで行った。分析試
料は 0.1％ギ酸で適宜希釈し，0.45 μm フィルターろ過後，分析に供した。内部
標準には，市販の安定同位体アミノ酸混合溶液を使用した。(2) 協会酵母 701 号と 901 号を麹汁培地にて一定期間培養し，培養前後の培地中のアミノ酸分析を行い，比較した。
【結果】(1) 確立した分析条件により，1 試料 20 分でアルギニンを含む天然アミノ酸 20 種類を分析することが可能となった。内部標準による補正を行うこと
で，1-100 μM の濃度幅で良好な検量線を作成することができた。(2) 一部のアミノ酸において，701 号よりも 901 号の方が培養前後の濃度が大きく減少しており，この 2 種類の清酒酵母のアミノ酸取込能が異なる可能性が示唆された。

【背景と目的】「押し味」とは後味にごく味があってしっかりした感じの味わい
1)のことであり、灘酒の特長とされる味わいの一つである。我々は、基本的な醸
造方法や一般分析値がほぼ同一の製成酒であっても、「押し味」の強度に違いが見られることを経験的に把握している。こうした酒質の違いに関連する成分が把握できれば、おいしさの追求や品質管理に有用であると期待される。これまでに我々は、不揮発性成分のプロファイルと「押し味」の相関解析を行ってきたが、明瞭な相関を見出すことはできなかった。そこで本研究では、GC×GCTOFMS を用いた揮発性成分のノンターゲット分析により、揮発性成分プロファ
イルと「押し味」の相関解析を試みたので報告する。
【方法と結果】基本的な醸造方法や一般分析値がほぼ同一であるが「押し味」の強度に違いがある清酒サンプル 9 点を用いた。各サンプルに含まれる揮発性成分を濃縮後、固相抽出し、GC×GC-TOFMS に供した(n=3)。その結果、1686 ピー
クが検出され、FR 値（検体間分散値/検体内分散比）を指標としてサンプル間の違いを評価するのに有用と考えられる 121 ピークを抽出した。これら 121 ピー
クの分析値を説明変数、「押し味」の強度を目的変数とした PLS 回帰分析を行った。その結果、モデルの予測性能の指標である Q2 値が 0.947 となり、不揮発性成分の分析値を用いた場合（Q2 値：0.640）と比較して高い精度のモデルが構築できた。さらに、「押し味」の強度と相関の高い成分が複数抽出可能であった。
1) 灘酒研究会編「改定 灘の酒用語集」（1997）

LC/MS analysis of amino acids without labeling and differences of aminoacid intake of sake yeast

Correlational analysis of volatile components profiles obtained by GC×GCTOFMS and sake taste “oshiaji”○Tamami Kiyono, Kiyoo Hirooka(Kyoto Municipal Inst.)

Key words

LC/MS, amino acid, sake yeast

2P-1p072 難消化性澱粉分解活性を有する酵素の高温登熟障害米
消化能について○Yoshihiro Tamada1, Yasuhisa Nishimura2, Koushou Oohigashi1,
Haruka Nishimoto1, Takuya Asai1, Nobuo Yamashita1, Takahiro Akashi1(1Hakutsuru Sake Brewing Co., Ltd., 2LECO Japan Corporation)

Key words

sake, two-dimensional gas chromatography, PLS

2P-1p074 清酒メタボロームへの原料米品種、精米歩合、酵母菌株の影響○伊藤 俊彦, 野口 巧実, 大友 敬太郎, 大阪 朝美, 藤田 直子,
橋爪 克己（秋田県立大・生資科）
toito@akita-pu.ac.jp

小里 孟 1,2, 梅尾 美幸 1, 平田 章悟 1,2, 矢澤 彌 1, 織田 健 1,
○岩下 和裕 1,2（1酒総研, 2広島大院・先端物質）
iwashitact@nrib.go.jp[目的] 澱粉合成酵素及び澱粉分枝酵素のアイソザイム SSIIIa、BEIIb の二重欠損
変異体米（ΔSSIIIa/BEIIb）（以下#4019 と表記）は、アミロース含量 46%の超高アミロース米であり、難消化性を示す。演者らはこれまでに＃4019 を基質に用いた難消化性澱粉分解酵素活性測定法を構築し、焼酎用白麹菌 (Aspergillus
kawachii)が生産する耐酸性グルコアミラーゼに高い活性を認めた。一方、イネの登熟期気温が高くなるとアミロペクチン側鎖の中鎖と長鎖が増加するとの報告が有る。本研究で用いている#4019 のアミロペクチン鎖長分布も中鎖及び長鎖比率が高いことから、白麹菌が生成する難消化性澱粉分解酵素は高温登熟障
害米の消化を促進する働きが有ると考えられる。そこで、2010 年産秋田酒こまちを高温登熟障害米試料とした醸造環境下における消化試験を行った。
[方法・結果] 秋田酒こまち（50％精米）と、焼酎用白麹菌を用いて製麴した麹に 10 mM 酢酸緩衝液を 5 倍量加えて酵素を抽出した。その後#4019 分解活性を有する酵素を陰イオンクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーにてSDS-PAGE 上で単一となるまで精製した。次に、精製酵素を用いて、同一の水田から収穫した年度の異なる 70％精米秋田酒こまち（2010, 2011, 2013 年産）を基質とした消化試験をした。対照には酒造用グルコアミラーゼ「アマノ」SD（天野エンザイム）を陰イオン交換クロマトグラフィーで精製したものを用いた。その結果、酒造用グルコアミラーゼと比較して、#4019 分解活性を有する
酵素は高温登熟障害米の澱粉を効率よく分解出来ることが示された。

【目的】 清酒中には 300 種類を超える成分が報告され、メタボロームそのものである事から当グループでも醸造酒メタボライト分析法を開発し解析を進めている。これまでに市販清酒の解析から、精米歩合と清酒メタボライトの大きな相関が見られたが、一般の清酒製造では、精米歩合が異なると製麹方法や使用
酵母、発酵温度など精米歩合と連動して変化する醸造条件が多数存在する。そこで小仕込みを行って掛米精米歩合、酵母菌株などについて検討を行ってきた。
今回、精米歩合の異なる米麹を作製し小仕込みを行い、これまでの条件と合わせて解析を行ったので報告する。
【方法・結果】 原料米は山田錦と日本晴の 2 種類で 40，50，60，70％精米とし、麹菌 RIBOIS01 株を用いて定法に従い恒温恒湿器により同条件で製麹を行った。
出麹歩合は 120％とほぼ均一で、各種酵素活性を測定した後、K ７、K1801 株の 2 種類の酵母菌株を使用し小仕込みを行ない、15℃で 20 日間発酵を行った。
その後、一般成分分析、メタボローム解析を行い、以前に取得していた市販清酒および掛米の精米歩合を変えた小仕込み清酒と比較を行った。その結果、市販清酒で精米歩合との相関が見られた成分ピーク 267 個の内、掛米だけの精米歩合と相関が見られたピークが 126 個、麹米を含めた場合 146 個のピークと相関が見られ、100 個のピークが両条件で相関を示した。また、酵母菌株に相関が見られたピークは、掛米・総米それぞれ 338 個、291 個であった。しかし、原料米との相関が見られたピークについては、掛米・総米がそれぞれ 49 個と182 個で麹米の影響が大きくなった。以上の結果から、麹米は精米歩合の違い
よりも原料米品種の違いに大きな影響を与える事が明らかになった。

Ability of glucoamylase from Aspergillus kawachii in digestion of the hightemperature matured rice that contain resistant starch.

Effect of rice cultivar, polishing ratio and yeast strain on sake metabolites○Toshihiko Ito, Takumi Noguchi, Keitaro Otomo, Tomomi Osaka, Naoko Fujita,
Katsumi Hashizume(Dept. Bioresour. Sci., Akita Pref. Univ.)

Key words

Aspergillus kawachii, high amylose content rice

Hajime Kozato1,2, Miyuki Umeo1, Shogo Hirata1,2, Hisashi Yazawa1, Ken Oda1,○Kazuhiro Iwashita1,2(1NRIB, 2Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words

metabolome, sake, fermentation process

188

醸造学，醸造工学

2P-1p075 日本酒の醸造における酵母のメタボロームデータを利用した発酵呼吸状態の推定

2P-1p077 様々な醸造食品に含まれるグリコシルセラミド量の測定○阪本 真由子, 宮川 幸, 松永 陽香, 酒谷 真以, 藤川 彩美,
北垣 浩志（佐賀大・農）ktgkhrs@cc.saga-u.ac.jp○藤丸 裕貴, 門脇 真史, 佐藤 友哉, 田口 誠我, Jannatul Ferdouse,
澤田 和敬, 北垣 浩志（佐賀大・農）ktgkhrs@cc.saga-u.ac.jp<背景・目的>
酸素濃度は微生物の生理状態に多大な影響を及ぼすことから、発酵産業における微生物による物質の発酵生産には酸素濃度が極めて重要な意義を持つ。しかし酸素濃度の測定には煩雑な操作、測定物の量が必要なことから、特に微小環
境や局所的な酸素濃度を測定することは現在の科学技術ではできないと言ってよい。実際の発酵物は不均一であり、局所的な酸素濃度が重要である場合が多いにもかかわらず，そうした情報にアクセスできていない。
以前の実験によりメタボローム解析を利用して酸素濃度を局所的に、かつ高い精度で推定できる可能性が示唆され、今回は実用的な手法の開発を試みた。
<実験方法>
清酒酵母 RAK1536(K7Δhis3 株)を用い、YPD10%glucose で流動パラフィンを添加して静置培養、YPG3%glycerol で振盪培養を行い、完全発酵型、完全呼吸型の酵母を用意し、それらを嫌気的条件で培養して次第に発酵的に移行させた。
これらの細胞から親水性代謝物を抽出、誘導体化後 GC-FID で分析した。得られた代謝物データで PCA と PLS 回帰分析を行った。
<結果・考察>GC-FID で検出された 35 個の代謝物データを用いて PCA を行ったところ、第二主成分（寄与率 20.2%）で完全発酵型と完全呼吸型が分離された。35 成分の内、PC2 において因子負荷量の大きかった 1 つを目的変数、残りを説明変数として PLS 回帰分析を行った。一つの潜在変数 t が仮定され、完全発酵型(t=0)と完全呼吸型(t=-2)を分離し、R2 値 85.3%、Q2 値 75.6%という安定した回帰式が得られた。そこで、実際に小仕込試験を行い、もろみから回収した酵母の代謝物
データを作成した PLS 回帰式に当てはめたところ、発酵型に近い(t=-0.2~-0.4)と判別された。今回得られた PLS 回帰式を用いることで発酵型、呼吸型酵母の判別をできることが期待される結果となった。

The trial to estimate the redox state of yeasts using metabolome data
○Yuki Fujimaru, Masafumi Kadowaki, Tomoya Satou, Seiga Taguchi,
Ferdouse Jannatul, Kazuataka Sawada, Hiroshi Kitagaki(Fac. Agric., Saga Univ.)

Key words

Metabolome, PLS, PCA, GC-FID

2P-1p076 醤油の特徴香成分である 4-hydroxy-2(or 5)-ethyl-5(or 2)methyl-3(2H)-furanone の生合成に関わる酵素遺伝子の同定【目的・背景】麹は日本で千年以上の食経験がある日本独自の食材であり、日本酒や味噌など多くの発酵食品の基盤である。我々は麹にはグリコシルセラミド(GC)が一般の食品と比べて多量に（0.2-3.0 mg/g 乾燥重量）含まれていることを明らかにしてきた 1,2)。GC には肌への塗布や経口摂取によって保湿効果をもたらすとの報告がある。また経口摂取による大腸がんの予防効果が報告されるな
ど、近年様々な機能性があることがわかってきている。しかし日本の醸造食品に含まれる GC の報告はなかった。そこで日本の醸造食品の機能性解明につなげることを目的とし、麹を原料とする醸造食品中の GC 量を測定した。そして醸造食品から日本人が摂取する GC が、食事全体の内どれ程の割合を占めているかを推定することとした。
【実験方法】醸造食品から抽出した脂質を薄層クロマトグラフィーにて分離し、染色した。染色した脂質を画像解析ソフトにて解析し GC の定量を行った。
【結果・考察】味噌からは 18μg/g、塩麹からは 197μg/g、甘酒からは 20μg/mL のGC が確認された。一方、肉には平均 5.4μg/g、野菜には平均 0.64μg/g の GC が含まれていることが報告されている 3,4)。これらのことから日本伝統の醸造食品には動物・植物由来食品と比較して多くの GC が含まれていると考えられた。
日本人の食事に含まれる GC 量は 8.1~38.9mg/meal4) という報告があることから、日本人の GC 摂取に伝統的醸造食品が大きく貢献していると考えられた。これらを踏まえて日本の醸造食品の機能性について考察したい。
1)Takahashi et al., J. Oleo Sci., 63, 1, 15-23 (2014)2)Sawada et al., Appl. Environ. Microbiol., 81(11):3688-98 (2015)3)菅原達也 日本栄養・食糧学会誌 第 66 巻第 4 号 177-183 (2013)
4) Yunoki et al. Biosci.Biochem.,72(1),222-225,2008

Quantitation of glycosylceramide in Japanese fermented foods○Mayuko Sakamoto, Miyuki Miyagawa, Haruka Matsunaga, Mai Sakatani,
Ayami Fujikawa, Hiroshi Kitagaki(Fac. Agric., Saga Univ.)

Key words

glycosylceramide, Koji

2P-1p078 Zymomonas mobilis を用いたホエーを原料とするエタ
ノール発酵および食酢醸造の検討○荻山 大輝, 若山 守
（立命館大院・生命科学）
wakayama@sk.ritsumei.ac.jp

上原 健二, ○渡部 潤, 茂木 喜信, 月岡 祐一郎（ヤマサ醤油）j_watanabe@yamasa.com【背景と目的】甘いカラメル様の香気を有する 4-hydroxy-2(or 5)-ethyl-5-(or 2)methyl-3(2H)-furanone (HEMF)は醤油の特徴香成分の 1 つであり、その強い抗酸化活性や抗腫瘍活性から機能性成分としても注目されている。我々は醤油中における同成分の強化を最終目的とし、これまでに出芽酵母非必須遺伝子破壊株
コレクションから HEMF 高生産株のスクリーニングに成功している。しかし、HEMF 生合成に関与する酵素遺伝子や、HEMF の前駆体等についての全容は明らかになっておらず、HEMF 高生産を検討する上で障害となっていた。
【方法】イチゴ由来の 4-hydroxy-2, 5-dimethyl-3(2H)-furanone (HDMF)/HEMF 生合
成酵素のホモログを出芽酵母ゲノムデータベースから検索した。また、出芽酵
母の無細胞抽出液から、HEMF 合成活性を指標として HEMF 生合成酵素を半精製し、ペプチドマスフィンガープリンティングにより酵素遺伝子を同定した。
同定した酵素遺伝子を大腸菌で発現させ、翻訳産物である酵素を精製した。
【結果と考察】データベース検索及び HEMF 合成活性を指標とした精製から、出芽酵母の YNL134C が候補遺伝子として同定された。大腸菌で発現させた
YNL134C 翻訳産物は、リボースとグリシンの加熱混合物とアセトアルデヒドから NADPH 依存的に HEMF を生成した。YNL134C 破壊株及び高発現株の HEMF
生産性は、それぞれ低下及び上昇したことから、YNL134C 翻訳産物が HEMF 生
産に関わる酵素であると結論付けた。さらに、様々な検討から、(2E)-ethylidene-4hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanone (EDHMF)が HEMF の前駆体であることを確認した。以上の結果を総合すると、リボースとグリシンの加熱混合物とアセトア
ルデヒドから EDHMF が化学的に生成され、さらに EDHMF を YNL134C 翻訳産
物が NADPH 依存的に還元することで HEMF が生成されると考えられた。

【目的】ホエーはチーズ生産における副産物であり、世界中で大量に生産されている。ホエーにはラクトース、タンパク質、ミネラルといった成分が含まれるため栄養的に優れた素材である。しかし、ホエーは味が悪く、保存性も悪いことからその大部分が廃棄されている。ホエーの活用法としては家畜の餌としての利用、バイオエタノール生産への応用があげられるが、さらなるホエーに高付加価値を付与する活用法が求められている。そこで、本研究ではホエーの栄
養分を生かした新規食酢(ラクトー酢)を提案することで、保存性の良い高栄養な食品を作ることでホエーの高付加価値化を試みた。特に、本研究では食酢醸
造のエタノール生産段階で、酵母菌よりもエタノール生産速度が速いとされる
Zymomonas mobilis を使用した。
【方法・結果】脱塩ホエーと軟水を混合し加熱処理後、濾過し、ホエー液を準備した。ホエー液中に Aspergillus oryzae を生育させた小麦ふすまを添加し、ホエー中のラクトースおよびタンパク質を加水分解した。続いて、Z. mobilis を添加し、エタノール生産を行った。その後、Acetobacter pasteurianus を添加し、酢酸発酵を行った。酢酸発酵終了後、80℃で 30 分火入れ殺菌し、遠心した上清をラクトー酢とした。ラクトー酢中の 17 アミノ酸、Ca2+、Mg2+、酸度を測定した。
ホエーから最大エタノール量 4.0 w/v%および最大酢酸量 3.6 w/v%の生産に成功した。ラクトー酢中の 17 アミノ酸は市販されている食酢よりも数十倍高く、酸度 4.7%、Ca2+4.7mM、Mg2+23mM を含む栄養価が高い食酢が得られた。また、本研究は Z.mobilis とホエーを利用した初めての食酢醸造である。

Identification of an enzyme involved in the biosynthesis of HEMF in yeast

Ethanol fermentation from whey using Zymomonas mobilis and lactovinegar production

Kenji Uehara, ○Jun Watanabe, Yoshinobu Mogi, Yuichiro Tsukioka(Yamasa Corp.)

Key words

HEMF, soy sauce, yeast, YNL134C○Daiki Ogiyama, Mamoru Wakayama(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words

whey, Zymomonas mobilis, Lacto-vinegar, Fermented food

醸造学，醸造工学

189

2P-1p079 紫芋焼酎粕を原料としたデザートソースの開発と機能性

2P-1p081 芋焼酎醪中に生息している乳酸菌に関する研究【背景】焼酎粕は、焼酎製造時に製品となる焼酎の約 2 倍量発生するため、その処理あるいは利用が求められている。紫芋焼酎粕は、鮮やかな色調、加熱により衛生的、そのまま食用可能、およびアントシアニン色素など機能性成分を豊富に含むなど、機能性食品原料として多くの利点を有している。
【目的】本格焼酎“阿蘇之魂”の紫芋焼酎粕を原料とする機能性食品として、色調や粘性などを活かし簡便な方法で加工するデザートソースを開発した。本研究は、デザート
ソースの成分分析、およびデザートソースと原料である紫芋焼酎粕の機能性について比較検討した。
【方法・結果】紫芋焼酎粕を原料としたデザートソースの製造は、焼酎粕をメッシュにかけて大きな固形分を取り除いた後、甘味料や酸味料などを加えて調味を施した。デザートソースの成分として、一般的な食品
成分および精確なアルコール濃度を分析した。デザートソースおよび紫芋焼酎
粕の機能特性を明らかにするために、ポリフェノールおよびアントシアニン含量を測定した。デザートソースには、紫芋焼酎粕由来の機能性成分が含まれていることが示唆された。以上から、従来は廃棄されてきた焼酎粕を食品原料として利用出来ることが示された。

【目的】芋焼酎醪中には麹と酵母以外にもさまざまな微生物が生息しており、その中でも特に乳酸菌は酒質に影響を及ぼす可能性が高い。そこで我々は醪中から単離した乳酸菌の生理学的性質と、酒質にどのような影響を及ぼすか評価した。また、その乳酸菌の由来と菌数を調査し、一次および二次仕込みに持ち込まれる乳酸菌数とその時の酒質への影響を確認した。
【方法】まず発酵中の一次および二次醪中の乳酸菌数を経時的に調査した。菌を単離・同定後、生理学的性質を評価した。乳酸菌の由来調査は Y-Pit を用いた
拭き取り検査にて行なった。最後に、特徴ある性質を有する乳酸菌の初発添加量とその時の酒質への影響を評価した。
【結果】乳酸菌数は二次 2 日目に最大となり、発酵が進むに従い減少した。単離
株はほとんどが桿菌である Lactobacillus 属であり、特に L. casei グループはク
エン酸資化能が高かった。乳酸菌は一次・二次工程それぞれから持ち込まれており、原料である米麹と芋が起因していた。単離株を同定したところ、Leuconostoc
属などの球菌がメジャーであり、醪中の菌叢とは異なった。単離株のストレス耐性を調査した結果、桿菌は球菌と比較して格段に耐性が強く、これにより醪
中へ持ち込まれた球菌は死滅し、桿菌のみが生き残ると推察された。初発菌数を 101～107 cells/ml として酒質への影響を調査したところ、107 cells/ml を超えると醪中で直ちに増殖し、揮発酸度やエタノール濃度に大きな影響が表れた。105
cells/ml においても若干の影響が確認されたことから、現場で焼酎造りを安定して行なうためには、乳酸菌の持ち込みを 104 cells/ml 以下に抑える必要があり、醪中に乳酸菌が同程度検出されても酒質への影響はなく正常な発酵が行われる
ことが分かった。

Development and function of dessert sauce using distillery wastewater frompurple sweet potato

Studies on Lactic acid bacteria in sweet potato shochu mash

○多賀 直彦 1, 岩下 小太郎 2, 越智 大起 2, 椛田 聖孝 1, 村田 達郎 1,
芝田 猛 1, 荒木 朋洋 1, 安田 伸 1, 松田 靖 1, 本田 憲昭 1
（1東海大・農, 2東海大院・農）ntaga@agri.u-tokai.ac.jp○Naohiko Taga1, Kotarou Iwashita2, Taiki Oti2, Kiyotaka Kabata1,
Tatsurou Murata1, Takeshi Shibata1, Tomohiro Araki1, Shin Yasuda1,
Yasushi Matsuda1, Kenshou Honda1(1Sch. Agric., Tokai Univ., 2Grad. Sch. Agric., Tokai Univ.)

Key words

shochu distillery wastewater, anthocyanin, antioxidation○宮川 博士, 小境 敏揮, 鈴木 恵利香, 河野 邦晃, 岩井 謙一,
高瀬 良和（霧島酒造）
hiroshi-miyagawa@kirishima.co.jp○Hiroshi Miyagawa, Toshiki Kosakai, Erika Suzuki, Kuniaki Kawano,
Kenichi Iwai, Yoshikazu Takase(Kirishima Shuzo Co., Ltd)Key words

shochu, lactic acid bacteria, stress resistance, initial viable cells

2P-1p080 黒糖焼酎の香気に及ぼす蒸留法の影響

2P-1p082 酸素・水素安定同位体比に基づく清酒の産地識別【目的】焼酎は常圧蒸留法または減圧蒸留法で製造され，常圧蒸留で得られた焼酎は濃醇で重厚な香味となり，減圧蒸留では癖のない軽快な香味となる．これまでに黒糖焼酎の香気に及ぼす蒸留法の影響について調べられたことはない．
そこで演者らは，2 種類の蒸留法で得られた焼酎を GC-MS で分析し、揮発成分濃度に差が認められる成分の同定と，それらの成分の中で酒質に影響を与える
揮発成分の探索を目的とした．
【方法および結果】麹米 400 g，麹歩合 55％，汲水歩合 257％の規模で黒糖焼酎の一般的な二次仕込み法に従い，仕込みを行った．黒糖焼酎もろみを 2 つに分けて，それぞれ常圧蒸留，または減圧蒸留を行い，焼酎サンプル（常圧黒糖焼酎および減圧黒糖焼酎）を作製した．また各焼酎サンプルに対して官能評価および GC-MS 分析を行った．官能評価の結果，常圧蒸留焼酎は穀物様の香りと濃厚な味わいが、減圧蒸留焼酎は華やかな香りと酸味が高くなった．この結果から，これまでの報告と同様に，常圧蒸留および減圧蒸留によって黒糖焼酎の風味に差異が生じることが認められた．また両焼酎を GC-MS 分析した結果，
34 成分がピーク面積に差が認められ，この 34 成分のうち 28 成分の濃度を求めた．得られた濃度と文献に示されている匂い閾値を用いて OAV (odor active value)を算出することで，酒質に影響を有する揮発成分の同定を試みた．

【目的】近年、清酒の海外への輸出量が増加し、高品質な日本国産清酒を証明す
る科学的な識別法のニーズは急速に高まっている。原料・産地判別手法として注目されている安定同位体比分析は、環境要因による生体構成元素の安定同位体比の変化によって、産地情報を特定する方法であり、さまざまな飲食品への応用が期待されている。しかし、清酒では、酸素安定同位体比による清酒製造に使用された地下水の起源判別への応用が報告されている以外に、ほとんど研究がなされていない。そこで本研究では、清酒と清酒製造に使用した醸造用水
中の酸素・水素安定同位体比を分析し、清酒の産地判別への可能性を検証した。
【試料および分析方法】2014～2015 年の間に、新潟県内の酒造場で製造された清酒（純米酒）と同酒造場の醸造用水を、それぞれ 19 点採取した。清酒は、安定同位体質量分計 TC/EA Delta V-Conflo III (Thermo Fisher Scientific 社) を用いて、醸造用水はキャビティリングダウン分光分析装置 PICARRO L2120-i (Picarro
社) を用いて、それぞれの試料中の酸素・水素同位体比を測定した。
【結果】清酒の酸素・水素安定同位体比は、醸造用水のそれらと、高い相関性を持つことが明らかとなった。醸造用水によく用いられる地下水などの水の安定同位体比には、地域性があることが知られていることから、清酒中の酸素・水素安定同位体比による清酒の産地判別の可能性が示唆された。現在、この判別法が、国産清酒と海外産清酒の識別に応用可能かどうかを検討している。

Effect of distillation method on the flavor of brown sugar shochu

Hydrogen and oxygen stable isotope analysis for tracing the geographicalorigin of sake○島田 麻里奈 1, 落合 佑香 2, 吉﨑 由美子 2, 奥津 果優 2,
二神 泰基 2, 玉置 尚徳 2, 髙峯 和則 2
（1鹿児島大院・農, 2鹿児島大・農）k6943994@kadai.jp○Marina Shimada1, Yuka Ochiai2, Yumiko Yoshizaki2, Kayu Okutsu2,
Taiki Futagami2, Hisanori Tamaki2, Kazunori Takamine2(1Grad. Sch. Agric., Kagoshima Univ., 2Fac. Agric., Kagoshima Univ.)

Key words

brown sugar shochu, distillation method○栗林 喬 1, 城 斗志夫 2, 金桶 光起 1（1新潟県醸造試, 2新潟大・農）kuribayashi.takashi@pref.niigata.lg.jp○Takashi Kuribayashi1, Toshio Joh2, Mitsuoki Kaneoke1(1Niigata Pref. Inst. Brewing, 2Fac. Agric., Niigata Univ.)

Key words

sake, authentication, stable isotope, geographical origin

190

食品科学，食品工学

2P-1p083 Pediococcus pentosaceus の持つ免疫賦活作用

2P-1p085 pH 非調整型の培養系ヒト腸管モデルの確立

1．はじめに乳酸菌は自然界に広く分布している微生物であり、プロバイオティクスとしても有用とされるが、最近では、免疫賦活作用にも注目が集まっている。
食経験が豊富な漬物から乳酸菌の分離を行い、アレルギー抑制効果が高い乳酸菌を選抜することを目的とする。

【背景・目的】100 兆に及ぶ細菌で構成されるヒト腸内細菌叢は宿主の健康・疾病に密接に関係していることが明らかにされ、腸内フローラのバランスを改善するために機能性食品が注目されている。食品成分の機能性評価は動物給餌実
験やヒト介入試験による in vivo 系で行われてきたが、前者は腸内細菌叢や消化物の腸内滞留時間がヒトと異なる事、後者は倫理的制限が指摘されている。そこで我々は、反復実験や時系列での評価が可能となる in vitro 培養系ヒト腸管モデルを構築してきた。培養系ヒト腸管モデル中では細菌叢構成の種レベルでの多様性や酢酸・プロピオン酸・酪酸の組成が糞便のものと近似しており、既知のプレバイオティクスを添加することで Bifidobacterium 属の生育促進効果を評価できることを報告している 1)。一方、盲腸から下行結腸に至るヒト腸管下部において pH が徐々に増加することが知られている。本報告において、pH の変動を再現する培養系ヒト腸管モデルを構築することを目的とした。
【方法・結果】培養器に GAM 培地を基礎培地として投入して、嫌気状態を保つために窒素・炭酸混合ガスを曝気した。初期 pH を 6.5 に調整して、健常人 8 人ずつの糞便を投入して 37℃で 30 時間培養した。培養期間中、pH は一端 5.5-6.0付近に減少した後に徐々に 6.5 近傍に増加していく傾向を示した。短鎖脂肪酸(SCFA)濃度を高速液体クロマトグラフィーにより測定すると、培養後期には酢酸・プロピオン酸・酪酸が優先しており糞便中と同じく酢酸濃度が最も高かった。また、アミノ酸の一種であるタウリン添加の効果についても報告するつもりである。
1)2016 年度日本農芸化学会

山田 康伸, 今井 伸二郎, ○西野 智彦（東京工科大・応生）
nishino@stf.teu.ac.jp

2．実験方法キムチなどの発酵食品から乳酸菌を分離し、菌の形状・性状の観察を行うこと
でスクリーニングを行った。その後、16S rRNA 遺伝子配列を解析することで菌種同定を行った。分離された乳酸菌に対し、ELISA 法にて、炎症性サイトカイ
ンの TNF-α の産生誘導量を測定することでアレルギー抑制効果を評価した。
3．結果と考察
キムチ、市販乳酸菌飲料から、Leuconostoc 属、Weissella 属、Pediococcus 属の乳酸菌を分離することができた。これらスクリーニングによって選抜された菌株のうち、最も高い TNF-α 産生誘導量を示した株は、16S rRNA 遺伝子配列を解析した結果、Pediococcus pentosaceus と高い相同性を示した。

Immunostimulation activity of Pediococcus pentosaceus
Yasunobu Yamada, Shinjiro Imai, ○Tomohiko Nishino(Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Univ. Technol.)Key words

lactic acid bacteria, screening, allergy

2P-1p084 伝統的発酵食品の製造工程における細菌混入経路の次世代シーケンスによる解析○佐々木 建吾 1, 佐々木 大介 1, 近藤 昭彦 1, 大澤 朗 2（1神戸大院・科学技術イノベーション, 2神戸大・自科・研究環）
sikengo@people.kobe-u.ac.jp

Construction of a fermentation system to simulate human intestinal
microbiota without pH regulation○Kengo Sasaki1, Daisuke Sasaki1, Akihiko Kondo1, Ro Osawa2(1Grad. Sch. Sci. Tech. Kobe Univ., 2Org. Adv. Sci. Technol. Kobe Univ.)

Key words

microbiota, human intestine, fermentation

2P-1p086 農産品から単離した乳製品用乳酸菌の多機能性評価○高屋 朋彰 1, 根来 雄哉 2
（1小山高専・物質, 2小山高専専攻科・物質）
tkouya@oyama-ct.ac.jp○鈴木 市郎 1,2, 白 至桓 1, 杉田 龍兵 3, Nakamura Gouvea Natalia 1,
武田 穣 1, 小泉 淳一 1
（1横国大院・工, 2横国大・リスク共生, 3横国大・理工）
suz-1@ynu.ac.jp【目的】伝統的発酵食品には様々な微生物が含まれているが、その中には人為的に添加される麹や酵母など以外に、意識せずに加わったものも存在する。それらが製造のどの過程で加わったかが解明できれば、品質や製造工程の管理などに有益である。韓国の伝統的発酵食品であるコチュジャン（辛子味噌）では、ガスが発生し製品を損なう‘膨れ‘事故が発生する。我々はこの原因として、製品に含まれる Bacillus 属細菌がガス発生に関与すること、および pH の上昇がガス発生を引き起こすことを特定した。加熱後包装した製品には、他にも様々な細菌が存在していた。そこで、コチュジャン製造の各工程や原料に含まれる細菌群の組成を次世代シーケンスで解析し、製品に含まれる各細菌が加わる経路を調査した。
【方法】製品の原料である小麦、麹、唐辛子など、および一次・二次発酵、包装
工程からサンプルを採取し、DNA を抽出した。16S rRNA 遺伝子の V4 領域をPCR で増幅し、Illumina MiSeq で塩基配列を決定した。得られた配列は Qiimeを用いて操作的分類単位(OTU)に分け、簡易同定を行った。優占度の高い OTUについて各原料・工程サンプルでの優占度のパターンを Horn 指数で比較し、
非計量 MDS でマッピングして k-mean 法でクラスタリングして、サンプルでの動態が類似するものを選別した。クラスターごとに細菌の動態をグラフで可視化した。
【結果と考察】Bacillus 属はいくつかのクラスターに分かれた。ガス発生の原因
菌は麹と唐辛子の両方から混入していたが、別のクラスターの Bacillus は唐辛子からのみ混入した。他の細菌の内、Staphylococcus 属細菌や Lactobacillus 属細菌は麹から、Enterobacter 属細菌は唐辛子から混入していた。このように、次世
代シーケンスでの菌叢解析を用いて、発酵食品の製造工程における各細菌の混入経路を特定することができた。

【背景・目的】栃木県は生乳生産量全国第 2 位の畜産県である．しかし，コスト高・採算性の問題や後継者不足，生産業者の減少などから，全国の酪農家戸数
や国内の生乳生産量は減少し続けている．本研究では，栃木県の地域特産品からチーズ製造に利用できる微生物を分離し，その機能性（人工消化液耐性，
GABA 生産能など）を評価した．
【方法】分離源として栃木県の農産品を用いた．乳酸菌の選別・同定は，HPLCを用いた乳酸生産量の測定，X-gal を用いた乳糖分解酵素（β-galactosidase）生産能の判別，リトマスミルクを用いた乳タンパク質の酸凝固性評価，血液寒天培地を用いた安全性評価，および 16S rDNA 解析による微生物の同定を行った．
選別した乳酸菌について，人工消化液耐性，胆汁酸耐性に及ぼす菌体外多糖（EPS）の影響，GABA 生産性，および小腸モデル細胞（Caco-2）を用いた腸管吸着性を評価した．
【結果・考察】14 菌株の乳酸菌を単離・同定し，乳製品製造に適した 4 菌株
（ONCT 6002 株，ONCT 6009 株，ONCT 6011 株，ONCT 6013 株）を選別した．
これらの菌株は Lactococcus lactis や Lactocabillus plantarum と高い相同性を示した．次に，人工胃液（pH 2.8, 3 h），人工腸液（pH 7.0, 7 h）曝露後における生残性を評価した．その結果，選別した 4 菌株の生残性は 49~67%であり，既存の乳酸菌（Lactobacillus gasseri JCM 11046）などの生残性（8~32%）と比較して高い値であった．また，ONCT 6009 株や ONCT 6011 株は人工胃液に対する耐性が高いこと，および ONCT 6011 株の耐性には EPS が影響していることが示唆された．薄層クロマトグラフィー（TLC）を用いた GABA 生産能評価により，
ONCT 6002 株や ONCT 6013 株は GABA 生産能を有していることが明らかとなった．現在，小腸モデル細胞（Caco-2）を用いてこれらの菌株の腸管吸着性の評価を行っている．

Determination of contamination sources in production process of traditional
fermented food by NGS.

Evaluation of multifunctional dairy lactic acid bacteria isolated fromagricultural products○Ichiro Suzuki1,2, Ji-Hwan Back1, Ryuhei Sugita3, Natalia Nakamura Gouvea1,
Minoru Takeda1, Jun-ichi Koizumi1(1Grad. Sch. Eng., Yokohama Natl. Univ., 2RSC, Yokohama Natl. Univ., 3Coll. Eng.
Sci., Yokohama Natl. Univ.)

Key words
Bacillus sp.

traditional fermented food, contamination, next generation sequencing,○Tomoaki Kouya1, Yuya Negoro2(1Dept. Mater. Chem. Bioeng., Natl. Inst. Technol. Oyama Coll., 2Mater. Chem.
Bioeng. Adv. Crs., Natl. Inst. Technol. Oyama Coll.)

Key words

lactic acid bacteria, dairy products, acid and bile tolerance, GABA

食品科学，食品工学

191

2P-1p087 和歌山県日高地方の紀州なれずしの細菌叢の解析

2P-1p089 胞子形成過程を回避した酵母の人為的有性生殖法【目的】
なれずしは、塩漬けした魚を米飯とともに乳酸発酵させた伝統食品であり、日本各地で今なお親しまれている郷土料理である。和歌山県日高地方では、塩漬けしたサバを米飯の上にのせ、アセの葉で包んで桶に漬け込み、重石をのせて数週間から数ヶ月発酵させたなれずしを、今なお毎年、秋祭にあわせて各家庭で作られている。これまで日本各地の様々ななれずしの発酵過程における菌叢や成分組成の解析が行われてきたが、和歌山県日高地方の紀州なれずしについて詳細な解析をした報告例はあまりない。そこで、本研究では和歌山県日高地方の家庭で作られた紀州なれずしについて解析をおこなうことにした。
【結果・考察】和歌山県日高地方の家庭で 2015 年 11 月に仕込んだなれずし（仕込み期間 15日）を入手し、サンプルとした。紀州なれずしは、pH3.93±0.08 で、有機酸量
は乳酸が 985 mg/100 g、酢酸が 51 mg/100 g であった。魚肉部の脂肪酸組成は生サバのものとほぼ同様であり、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸が多く、米飯部はリノール酸の割合が高かった。一方、紀州なれずしの米飯部の乳酸菌の生菌数を観察したところ、3.3×109 cfu/g であった。さらに魚肉部の微生物群集を 16S rRNA を指標に解析をしたところ、目レベルでは 98.0%がLactobacillales、科レベルでは Lactobacillaceae が 85.4%、Leuconostocaceae が3.7%、Streptococcaceae が 3.6%であった。また、紀州なれずしから直接 12 株の乳酸菌を単離し、種レベルでの同定をおこなったところ、すべて Lactobacillus
plantarum subsp. plantarum と同定された。これらの結果から、紀州なれずしの主要発酵乳酸菌は Lb. plantarum subsp. plantarum であり、アセの葉由来であることが推測された。

出芽酵母利用の歴史は古代文明にまで遡るものであるが、現代の産業利用においても、なお優秀な菌株を育種することが重要である。交雑育種法では、接合型が異なる 2 種類の酵母（a 型および α 型）を掛け合わせることで、新たな特性を有する優良菌株を創製する。一般に、産業用酵母は接合能を有さない a/α型の接合型であるため、まずこれらの酵母から胞子を取得して、接合能を有す
る a 型および α 型酵母を製造する必要がある。ところが産業用酵母の多くは、胞子形成能および胞子発芽率が低いため、a 型および α 型酵母を得るために多大な労力を要する。
一方で、a/α 型の酵母を培養していると、極低頻度ではあるが染色体の複製異常が発生し、a 型および α 型酵母が出現することが知られている。本研究では、培養液中に存在する希少な a 型および α 型酵母を簡便に単離する技術を確立した。本技術は、酵母の接合型依存的に G418 耐性遺伝子を発現するものであり、耐性遺伝子を有するプラスミドを標的酵母に導入し、G418 含有培地中でスクリーニングを行うことで a 型および α 型酵母を得ることができる。
実証例の１つとして、清酒酵母に対して本技術を適用したところ、異なる親株からそれぞれ a 型および α 型酵母を獲得し、さらに単離した酵母を交雑させる
ことに成功した。最後に薬剤の選択圧を除去することで、不要となったプラス
ミドを酵母細胞から排除した。外来遺伝子が除去されていることは PCR 法により確認した。本手法においては胞子形成の必要がないため、従来は交雑育種に利用することが困難であった産業用酵母にも有効である。

Analysis of microbial flora in “Kisyu Narezushi” Hidaka region, Wakayama

Artificial sexual reproduction for yeasts without sporulation○川瀬 貴斗, 早川 享志, 中川 智行（岐阜大・応生科）
t_nakaga@gifu-u.ac.jp○Takati Kawase, Takashi Hayakawa, Tomoyuki Nakagawa(Fac. Appl. Biol. Sci., Gifu Univ.)

Key words
foodlactic acid bacteria, Lactobacillus plantarum, Narezushii, fermented

2P-1p088 液体表面培養したカバノアナタケが生産する生理活性物
質の評価○福田 展雄 1, 石井 純 2, 近藤 昭彦 2, 本田 真也 1
（1産総研・バイオメディカル, 2神戸大院・イノベ）
nob-fukuda@aist.go.jp○Nobuo Fukuda1, Jun Ishii2, Akihiko Kondo2, Shinya Honda1(1Biomed. Res. Inst., AIST, 2Grad. Sch. Sci, Technol. Innov. Kobe Univ.)

Key words

crossbreeding, gene expression, screening, yeast

2P-1p090 麹菌によるアクリル酸分解の研究○尾関 健二 1, 河上 春樹 1, 久保 廣海 1, 上杉 大智 1, 坪井 宏和 2,
坊垣 隆之 2, 岩井 和也 3
（1金工大・ゲノム研, 2大関・総研, 3UCC上島珈琲・イノベーショ
ンセンター）
ozeki@neptune.kanazawa-it.ac.jp○高柴 則子 1, 藏本 彩加 1, 米田 任伸 2, 櫻井 明彦 1
（1福井大院・工, 2福井大・工）a_sakura@u-fukui.ac.jp【諸言】 カバノアナタケは古くからロシアなどで民間療法に利用されてきた。
その生理活性として免疫賦活や抗腫瘍などが報告されているが、天然物の存在
数が少なく研究開発が進んでいない。そこで当研究室では、カバノアナタケ菌
糸体の液体表面培養による生理活性物質の生産について検討してきた。
本発表では、培養菌糸体のエタノール抽出物と多糖の生理活性について、in vitro
及び in vivo で評価した結果を報告する。
【方法】 カバノアナタケ（Inonotus obliquus NY-1）を液体表面培養法（培地 150
ml、28 ℃）で 30 日間培養し、菌糸体を凍結乾燥・粉砕後にエタノールで抽出した。抽出後の菌糸体を熱水でさらに抽出し、抽出液からエタノール沈殿によって多糖を回収した。エタノール抽出物と多糖画分の抗酸化活性を ORAC、
SOD、ABTS、FRAP、DPPH の 5 つの方法で測定した。また、免疫賦活活性をマクロファージ様細胞（RAW 264）の NO 生産能で測定した。さらに、これらの抽出物の延命効果を線虫（C. elegans N2）で評価した。線虫は各試料と餌となる大腸菌を添加した寒天培地で飼育し、線虫の生死は接触刺激に対する反射
運動で判定した。
【結果・考察】 エタノール抽出物は ORAC 法、ABTS 法、DPPH 法、FRAP 法において約 40 %の 抗酸化活性を示し、多糖画分よりも高い値であった。このことから、エタノールに溶解するポリフェノール類、脂質などの抗酸化物質がカ
バノアナタケ培養菌糸体のエタノール抽出物中にも存在すると考えられる。一方、多糖画分はリポ多糖（LPS）の 30 %程度の免役賦活活性値を示した。
次に、エタノール抽出物と多糖画分を添加した培地で線虫を飼育したところ、
未添加よりも線虫の寿命が長くなる傾向にあった。現在エタノール抽出物をさらに分画し、各画分の抗酸化活性および線虫延命効果を評価しているところである。

【目的】これまでに液体抽出工程で加熱焙煎時に生成するアクリルアミド（AA）の低減化方法を検討した。アミダーゼ高生産セルフ麹菌のセルロース固定化菌体で処理することにより、コーヒー中の AA の低減化を行うことが可能であった。但し AA をより効率よく分解するためには、AA よりも麹菌での毒性が強いアクリル酸（AS）も同時に低減化が望まれ、固定化担体の繰り返し利用により、担体へのより強固な固定化麹菌の処理技術の改良も必要であった。
【方法】AS 分解候補遺伝子を絞り込むために、単一炭素源として AS 濃度と時間を変化させて培養条件からの麹菌 DNA マイクロ解析を行った。AS 分解に関与する可能性が高い遺伝子をアミダーゼ高生産セルフ麹菌に遺伝子導入した麹菌（ASC5-4）を育種した。この育種株、アミダーゼ高生産セルフ麹菌（4 copy）、
親株の RIB40 で AS および AA を添加した水およびコーヒーでの低減化試験を行った。セルロース担体（東レ CA タイプ）は、乾燥状態では板状で麹菌胞子懸濁液を分散時に、立方体を形成し、この際胞子が担体内部に入り込む培地濃
度、時間、温度を変化させ、胞子が発芽し菌糸がより強固な足場をしっかり形
成する条件を検討した。その後栄養培地で担体の外側まで菌糸を生育させ、菌体重量が多くなる条件および低減化試験後の再利用できる培養条件を検討した。
【結果および考察】ASC5-4 の麹菌は水およびコーヒーでの AS の低減化効率が高くなることが分かった。また AA の低減化には特に効率が上がる現象は認められなかった。これにより育種した麹菌は AS 分解に関連する遺伝子の 1 つであることが分かった。しかしながらアミダーゼと連動せずに別々で働き、細胞内での各酵素の局在性に問題があると考えられる。アミダーゼ高生産麹菌の繰り返し再利用の条件を確立し、セルロースの担体の廃棄処理を抑える技術開発の目途が付いた。

Characterization of bioactive substances from Inonotus obliquus cultivatedby liquid surface culture

Study of acrylic acid degradation by Aspergillus oryzae○Noriko Takashiba1, Ayaka Kuramoto1, Hidenobu Yoneda2, Akihiko Sakurai1(1Grad. Sch. Eng. Fukui Univ., 2Sch. Eng. Fukui Univ.)

Key words
elegans

Inonotus obliquus, bioactive substances, life span, Caenorhabditis○Kenji Ozeki1, Haruki Kawakami1, Hiroumi Kubo1, Daichi Uesugi1,
Hirokazu Tsuboi2, Takayuki Bogaki2, Kazuya Iwai3(1Genome Biotechnol. Lab., Kanazawa Inst. Technol., 2Ozeki, 3UCC)

Key words

Aspergillus oryzae, acryl acid, acrylamide, immobilization

192

食品科学，食品工学

2P-1p091 パルミチン酸誘導性炎症に対する白麹抽出物の抗炎症効果

2P-1p093 統計的実験計画法を用いた乳酸菌生産のためのアレルゲ
ンフリー培地の最適化○大城 沙織 1, 神戸 悠輝 2, 奥津 果優 1, 吉﨑 由美子 1, 宮田 篤郎 2,髙峯 和則 1
（1鹿大院・農, 2鹿大院・医歯）k8673711@kadai.jp○ターナー ピーター 1, 小川 博 1, 阿部 吉邦 1,
Cabrera-Ostertag Ignacio 2, Menton John 2（1セントラル科学貿易, 2Kerry, WI, USA）
turner@cscjp.co.jp【背景と目的】我々はこれまでに、食餌性肥満モデルマウスに白麹を与えると、体重や血糖値の正常化といった、抗肥満作用があることを明らかにした。しかしながら、白麹がどのようなメカニズムで抗肥満作用を発揮するのかは明らかではない。一方、肥満において血中で増加するパルミチン酸は炎症を惹起し, 肥
満病態において全身の慢性炎症がインスリン抵抗性を引き起こすことが報告されている。そこで本研究では、白麹抽出物がパルミチン酸による炎症の抑制を介して抗肥満効果を示す可能性を検討した。
【方法】白麹は Bligh-Dyer 法に従って抽出後、DMSO に溶解した。Raw264 マウ
スマクロファージ細胞に対して、白麹抽出物添加および非添加条件下においてパルミチン酸を曝露し、炎症性メディエーター(IL-1β、TNF-α、IL-6、COX2、
iNOS)の遺伝子発現量を real-time PCR で測定した。また、抗炎症効果の作用機序を調べるために、p38、JNK、NF-κB それぞれのリン酸化体の発現量に及ぼす
白麹抽出物の効果をウェスタンブロッティング法で測定した。
【結果と考察】パルミチン酸の曝露によって IL-1β と iNOS の遺伝子発現量は増加しなかったが、TNF-α と COX2 と IL-6 の遺伝子発現量が有意に増加し、この遺伝子発現の増加は 5~50 μg/mL の濃度範囲の白麹抽出物の添加によって濃度依存的に抑制された。さらに、パルミチン酸によってリン酸化 NF-κB とリン酸化 JNK の発現量は増加しなかったが、リン酸化 p38 の発現量は増加し、この増加は白麹抽
出物の添加によって有意に抑制された。以上の結果から、白麹は肥満などに付随すると考えられるパルミチン酸誘導性炎症に対して p38 によるシグナル経路を阻害することで抗炎症効果を持つ可能性が示唆された。

目的: 加工程度の異なる複数の酵母エキスと、エンドウ豆、綿花、米などの原料を由来とするアレルゲンフリーのペプトンを配合して、L. acidophilus, L. lactis,
L. bulgaricus を培養するための混合培地を開発する。
方法: 開発において、バイオスクリーン C を用いたマイクロタイタースケール
での高スループット初期スクリーニング法と単体重心統計的設計の手法を用いた。最終 OD 値が最も高い値を示した個々の成分を選択し、それらの成分を配合した混合培地の結果もまた最大値を示した。フラスコを用いた振とう培養における最適化の第二ラウンドでは、培地成分の比率を RSM（応答局面法）計画に従って体系的に変化させて最適化を行った。最適化した混合培地は最後に pH調整機能のついたベンチトップ型バイオリアクターでバリデーションを行い、その発酵過程の最終段階で CFU/ml 数を測定した。
結果：バイオリアクターを用いての比較において、最適化した培地によるバイ
オマスの収量は、コントロールの培地による収量よりも増加もしくは同等のレベルであった。よって、酵母エキスとペプトンの配合を最適化することによってアレルゲンフリーの培地を使用することが可能になった。

The inhibitory activity of white koji against the palmitic acid-induced
inflammation on Raw264 cells

Allergen-free culture media optimization for lactic acid bacteria production
using statistical DoE○Saori Ohki1, Yuki Kambe2, Kayu Okutsu1, Yumiko Yoshizaki1, Atsuro Miyata2,
Kazunori Takamine1(1Grad. Sch. Agric., Kagoshima Univ., 2Grad. Sch. Med. Dent., Kagoshima Univ.)

Key words

koji, anti-inflammatory effect, palmitic acid

2P-1p092 アメフラシ消化液より単離したフロロタンニン結合蛋白
質、EHEP の特性解析○Peter Turner1, Hiroshi Ogawa1, Yoshikuni Abe1, Ignacio Cabrera-Ostertag2,
John Menton2(1Central Scientific Commerce, Inc., 2Kerry, WI, USA)

Key words
lactic acid bacteria, Allergen-free culture media, media optimization,
Protein hydrolysates

2P-1p094 R-α リポ酸処理したラット肝がん細胞の経時的メタボ
ローム解析○生田 直子 1, 近本 啓太 2, 浅野 雄哉 2, 横川 遥香 2, 寺尾 啓二 3,
Rimbach Gerald 4, 松郷 誠一 2
（1神戸大院・医, 2金沢大院・自科, 3(株)シクロケム, 4Inst. Hum.
Nutri. Food Sci. Kiel Univ.）s-matsugoh@se.kanazawa-u.ac.jp○辻 明彦, 桑村 修司, 湯浅 恵造（徳島大院・生物資源産業学研究部）
tsuji.akihiko@tokushima-u.ac.jp［目的］陸上植物は没食子酸エステル誘導体からなるポリフェノールを含むのに対し、褐藻類はフロログルシノールが縮合したフロロタンニンをポリフェノー
ルとして含有する。これまでアラメ、クロメなどから Eckol, Bieckol, Dieckol などが同定されている。フロロタンニンはアミラーゼなど消化酵素に阻害作用があるため、血糖値上昇を防ぐための機能性成分として注目されている。また、
近年, フロロタンニンの脂肪細胞分化抑制作用やがん細胞増殖抑制作用なども報告されている。昨年度の本大会において、アラメフロロタンニンはアメフラシ
beta-グルコシダーゼに対して強い阻害作用を持つが、アメフラシ消化液にはフロロタンニンと特異的に結合し、その酵素阻害作用を抑制する蛋白質（EHEP,
Eisenia Hydrolysis Enhancing Protein）が存在することを報告した。フロロタンニ
ンの大量調整法はまだ確立されていないが、EHEP は機能性成分であるフロロ
タンニンを効率良く回収するためのツールとして使える可能性がある。今回、その特性についてさらに解析を進めた。
［結果、考察］EHEP は、25kDa のモノマーであり、ウエスタンブロットや RTPCR により、肝膵臓が主たる合成場所であることが判明した。クローニングの結果 229 アミノ酸を含む３つの特徴的なシステイン残基配列からなるキチン結合ドメインを有することが判明した。しかし、キチンとの結合活性はなく、フロロタンニンと特異的に反応し、不溶性の沈殿を形成した。また、フロログル
シノールとも結合する。現在、等温滴定型カロリメトリーによって結合作用を解析しているので、合わせて報告したい。

【目的】α リポ酸（LA）はエネルギー産生に関わる補酵素の一つとして作用する物質であり、R 型と S 型の光学異性体が存在するが、生体内では R-α リポ酸(R-LA)のみが生合成されている。R-LA は熱等に対する安定性がラセミ体（DLLA）に比べて低いため、サプリメントなどの食品には DL-LA が配合されている場合が多い。また、LA は強い抗酸化作用を有し、種々のがん細胞に対してアポトーシスを誘導することが報告されているが、そのメカニズムについて細胞の代謝系に着目した研究例はほとんどない。そこで本研究では、LA ががん細胞の代謝系に及ぼす影響を調べることを目的とし、ラット肝がん細胞を用いて、R-LA および DL-LA 処理後の細胞内に存在する代謝物を経時的に評価した。
【方法】ラット肝がん由来の H4IIEC3 細胞を 16 時間血清飢餓状態にしたのち、100μM に調整した R-LA および DL-LA を添加し、0、0.5、1、 3、 6、 12、 24
時間後に細胞を回収した。回収した細胞内に存在する水溶性代謝物を抽出し、GC/MS によりメタボローム解析を行った。得られたデータはタンパク量で補正した。なお、実験に用いた LA 濃度では細胞毒性がないことを事前に確認した。
【結果】解析の結果、LA 処理したラット肝がん細胞では解糖系および TCA 回路の代謝物レベルが低いことが分かった。また、DL-LA に比べて R-LA 処理した細胞では、トレオニン、グリシン、セリンなどの主に糖原性アミノ酸レベルが低かった。これらの結果から、LA は解糖及び糖新生を抑制することが示唆された。また、R-LA と DL-LA とで細胞内レベルに有意な差がある代謝物が多く存在することが分かった。

Characterization of phlorotannin-binding protein, EHEP from sea hare

Metabolomic study of time-course effect of R-Alpha-Lipoic Acid in
H4IIEC3 Hepatocytes○Akihiko Tsuji, Shyuji Kuwamura, Keizou Yuasa(Fac. Biosci. Bioindust. Tokushima Univ.)

Key words

phlorotannin, Eisenia bicyclis, enzyme inhibitors○Naoko Ikuta1, Keita Chikamoto2, Yuya Asano2, Haruka Yokokawa2, Keiji Terao3,
Gerald Rimbach4, Seiichi Matsugo2(1Grad. Sch. Med., Kobe Univ., 2Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ.,
3
Cyclochem. Co. Ltd., 4Inst. Hum. Nutri. Food Sci. Kiel Univ.)

Key words

lipoic acid, metabolomics, glyconeogenesis, H4IIEC3

食品科学，食品工学

193

2P-1p095 新規食品機能性成分コリンエステル類の抗高血圧作用

2P-1p097 メリンジョ由来グネチン C の抗動脈硬化作用【目的】哺乳類の神経伝達物質であるアセチルコリン(AcCh)は、自然界に普遍的に存在する。その他、プロピオニルコリン(PrCh)、ブチリルコリン(BuCh) が生体に存在することが報告されている。昨年、我々は、ソバスプラウト乳酸発酵
物に、これらのコリンエステル類に加えて、新規な天然コリンエステル・ラク
トイルコリン(LaCh)が存在することを発見した。本研究では、これらのコリンエステル類の高血圧自然発症ラット(SHR)における抗高血圧作用を検討した。
【方法】雄性 11 週齢 SHR へ、10-9mol/kg の用量でコリンエステル類を単回経口投与しテイルカフ法で血圧測定し降圧作用を調べた。同 SHR 由来胸部大動脈を用いた血管等尺性張力試験でコリンエステル類の血管拡張作用を評価した。また、雄性 10-13 週齢 SHR の腹部大動脈に血圧センサを挿入、腎交感神経に神経
電位センサを取り付け、AcCh を 10-8mol/kg の用量で反復経口投与し、テレメトリー法で血圧および腎交感神経活動を測定し、血圧上昇抑制作用を調べた。本
研究は、信州大学動物実験委員会で承認された計画に基づいて実施された。
【結果】単回経口投与試験では、AcCh、PrCh、D-および L-LaCh で有意な降圧作用が確認され、コリンエステル類が極低用量の経口投与で生理活性を引き起こすことが明らかとなった。また、AcCh、PrCh、D-LaCh には血管拡張作用が確認され、M3 ムスカリン性アセチルコリンレセプター（M3mAChR）に作用することが示された。AcCh 反復経口投与試験では、有意な血圧上昇抑制作用と、
腎交感神経活動低下が見られた。腎交感神経活動によって放出されたノルアド
レナリンは、副腎でアドレナリンに変換されて血中に放出され血圧上昇を引き起こす。本研究の結果は、経口投与されたコリンエステルが M3mAChR に作用し、神経活動を介して抗高血圧作用を引き起こしている可能性を示唆している。

【背景と目的】動脈硬化は、体内の過剰な活性酸素種によって血管内皮細胞（EC）
が傷害を受けることに起因すると考えられており、これが日本人の死因の約 3割を占める心疾患、脳血管疾患の根底病変となる。このような背景から近年、活性酸素種への抵抗性や EC の創傷治癒力を向上させる植物由来の抗酸化物質が注目されている。代表的なスチルベノイドであるレスベラトロール及びその二量体の一種である ε-ビニフェリンは抗動脈硬化作用を有するが、単量体と二量体という構造の違いにより活性が異なることが報告されている。一方、健康効果が報告されているメリンジョ（Gnetum gnemon L.）に含まれるグネチン Cはレスベラトロール二量体の一種であるが、抗動脈硬化作用については明らかとなっていない。そこで本研究では、グネチン C をメリンジョ粉末から精製し、レスベラトロール及び ε-ビニフェリンとその抗動脈硬化作用を比較することを目的とした。
【方法と結果】グネチン C はメリンジョ粉末から 50% EtOH で抽出し、固相抽出による分離、分取 HPLC による精製を行った。抗動脈硬化作用は、創傷治癒効果及び一酸化窒素（NO）産生量によって評価した。生物検定の結果、グネチ
ン C は三種の化合物中で最も低濃度で高い創傷治癒効果、NO 産生効果を示した。また、NO 合成酵素阻害剤の添加により創傷治癒効果が抑制されたことから、スチルベノイドによる創傷治癒の促進は NO 産生を介して行われることが明らかとなった。以上の結果から、生物検定に用いた三種の化合物が NO 産生を介して創傷治癒を促進するという作用メカニズムは同様であったが、その活性は二量体間でも差があったことから、スチルベノイドの抗動脈硬化作用は重合度のみではなく、構造の違いにも起因していることが明らかとなった。

Antihypertensive effect of choline esters, novel functional ingredients in
foods

Anti-atherosclerotic effect of gnetin C isolated from Melinjo (Gnetum
gnemon L.)○中村 浩蔵 1,2, 山口 翔平 2, 渡辺 旭 1, 小山 正浩 2, 猪狩 直樹 3
（1信州大院・農, 2信州大・農, 3大和薬品（株））
knakamu@shinshu-u.ac.jp○Kozo Nakamura1,2, Shohei Yamaguchi2, Akira Watanabe1, Masahiro Koyama2,
Naoki Igari3(1Grad. Sch. Agric., Shinshu Univ., 2Fac. Agric., Shinshu Univ., 3R & D Dept.,
Daiwa Pharm. Co., Ltd.)Key words

choline ester, antihypertension, telemetry

2P-1p096 Optimization of polysaccharides extraction from

Inonotus obliquus using subcritical water technology○関根 由璃子 1, 宮崎 均 2, 吉田 滋樹 2
（1筑波大院・生命環境, 2筑波大・生命環境系）
yoshida.shigeki.gf@u.tsukuba.ac.jp○Yuriko Sekine1, Hitoshi Miyazaki2, Shigeki Yoshida2(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Faculty Life Environ. Sch., Adv.
Sci. Mat. Univ. Tsukuba)

Key words

gnetin C, resveratrol, epsilon-viniferin, endotherial cell

2P-1p098 Lactococcus lactis のナイシン高生産株スクリーニング系の開発○Xi Yuan, Hongyi Sun, Zhenya Zhang(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)zhang.zhenya.fu@u.tsukuba.ac.jp○三田 麻友華 1, 山本 理奈 1, 大島 悟 2, 依田 伸生 2, 山崎 思乃 1,
片倉 啓雄 1
（1関西大・化生工, 2明治）
katakura@kansai-u.ac.jp[Introduction] In our previous studies, aqueous extracts of Inonotus obliquus (alsocalled chaga mushroom) possessed antioxidant activity and exhibited potent anticancer
ability. Recently, extracting screening anticancer active ingredients from naturalvegetation using various methods has become a research hotspot all over the world.
Subcritical water technology (SWT) is a burgeoning environmental technique used tobe very effective to selectively extract a variety of polar or non-polar organic
compounds.
[Methods and results]
In this study, the extraction of polysaccharides from Inonotus obliquus using
subcritical water technology (SWT) was discussed. A Box-Behnken design (BBD)
combined with response surface methodology has been employed to optimize
extraction parameters (temperature, residence time and liquid-solid ratio) of SWT.
Fourier transform infrared spectra confirmed its polysaccharide characterization via
typical peaks. In addition, the significant in vitro antioxidant profiles of BSP were
demonstrated that polysaccharides exhibited significant scavenging activity effects on
ABTS and hydroxyl radicals.

背景・目的
ナイシンは乳酸菌が生産するバクテリオシンの 1 つで、日本でも食品添加物として認可されている。ナイシン発酵液を保存料として添加する場合、食品の風
味を損なわないようにナイシンを高濃度に生産させなければならない。しかしナイシンは、あるレベルまで生産されるとそれ以上の生産が抑制され、また、
乳酸菌自身が生産する乳酸によってナイシンの生産性が低下する。本研究では乳酸菌のナイシン生産性を向上させる為、高濃度のナイシン存在下でも生産抑制が起きない菌株の取得を目的とする。
方法
ナイシン生産株として Lactococcus lactis ME-550 株、ナイシンの生産性をバイオ
アッセイで求める為の指示菌として Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
JCM1002T を用い、培養には MRS 寒天培地を用いた。
結果
ME-550 株に対するナイシンの最小生育阻止濃度は 8 IU/μL であったので、まず、自然突然変異によって、この濃度のナイシンに耐性のある株を、更に、12
IU/μL のナイシンに耐性を持つ株を得た。次に、培地の pH の低下を抑えた状態
で指示菌の阻止円の大きさを観察するために、以下の方法を開発した。まず、
生存率 1%となるように紫外線で変異処理した耐性株 102 CFU と MRS 培地で培養した指示菌 0.25 mL を含む MRS 寒天培地 10 mL をシャーレに注いで固化させた。その上に、0.4 g の炭酸カルシウムを含む MRS 寒天培地 10 mL を注いで固化させ、30℃で 24 h 培養した。その後、炭酸カルシウムを含む上層の培地を取り除き、下層に形成された阻止円の大きさを指標にスクリーニングを行った。
現在、得られた高生産株の評価を行っている。

Optimization of polysaccharides extraction from Inonotus obliquus using
subcritical water technology

Deveiopment of Screening System for Nisin Production by Lactococcus○Xi Yuan, Hongyi Sun, Zhenya Zhang(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words
antioxidant

polysaccharides, Inonotus obliquus, response surface methodology,

lactis○Madoka Mita1, Rina Yamamoto1, Satoru Oshima2, Nobuo Yoda2,
Shino Yamasaki-Yashiki1, Yosio Katakura1(1Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ., 2Meiji Co.,Ltd.)Key words

nisin, Lactococcus lactis, screening, bioassay

194

食品科学，食品工学／環境浄化，修復，保全技術

2P-1p099 白米ペプチド由来睡眠ホルモン合成酵素活性化因子の同定

2P-1p101 Ralstonia solanacearum の twitching motility 阻害剤の探索

○伊達 修平
（広島大院・先端物質）
jun@hiroshima-u.ac.jp○畑中 唯史 1, 守谷 智恵 2, 川上 賀代子 2, 藤田 明子 3, 川上 晃司 3,
下田 博司 4, 裏地 美杉 1, 万 クン 1, 坪井 誠二 2
（1岡山生物研, 2就実大薬, 3(株)サタケ, 4オリザ油化(株)）hatanaka@bio-ribs.com[背景と目的] 寝不足の要因のひとつとして、脳内で作られる睡眠ホルモンであるメラトニン分泌リズムの異常が考えられる。メラトニンは、血中より供給される L-トリプトファンを前駆物質として、セロトニンに変換された後, セロト
ニン N-アセチルトランスフェラーゼ (NAT) とヒドロキシインドール-O-メチル
トランスフェラーゼにより合成される、脳内の松果体で合成される睡眠ホルモンである。これらの酵素のうち NAT が最もよく時間情報に応答し、 その活性は強いリズム性を示す。つまり、 NAT 活性の変動とメラトニンの合成量はほぼ対応しており、NAT はメラトニン合成の律速酵素である。本発表では、白米ペプチドに含まれる NAT 活性化因子の同定を試みたので報告する。
[結果と考察] 市販白米ペプチドを、逆相固相担体に吸着させ、40％メタノールで溶出することによって、NAT を活性化させる因子が濃縮される画分を得た。
さらに、HPLC-C18 カラムによる分画を行った。評価法は、以下の通り。動物
細胞用発現ベクターに、NAT 遺伝子を組み込み、COS-7 細胞に形質転換し、NAT 発現細胞（COS/NAT 細胞）を得た。COS/NAT 細胞を 48 時間培養し、被験物質を添加し、24 時間共培養した。回収した COS/NAT 細胞を、ホモジナイ
ズし、遠心上清を回収した。上清に含まれる NAT 活性を HPLC にて測定した。
その結果、NAT 活性化因子が濃縮される画分を、イオントラップ型 LC-MS 分
析にかけ、配列を同定したところ、3 種のペプチド配列を見出した。見出した配列を持つペプチドを人工合成したところ、3 種のうち 2 種のペプチドが有意に NAT 活性を上昇させることを確認した。

【目的】青枯病菌は土壌伝染性の植物病原菌であり、有効な感染防除法が必要とされている。土壌中の青枯病菌は swimming による水相中の移動および twitchingによる固体表面の移動を駆使して植物へ接近、感染すると報告されている。これらの運動を阻害することで、農薬に偏重しない感染防除が可能になるかもしれない。そこで本研究では、特に twitching に着目し青枯病菌の twitching 阻害剤の探索を行った。
【結果】供試株として MAFF106611 株を用いて、6 種類の化合物における twitching
阻害効果を解析した。その結果、 D-リンゴ酸、 D-酒石酸に阻害効果がみられた。 D-リンゴ酸については増殖の抑制がみられたため、この twitching 阻害効
果は増殖の抑制に起因していると考えられた。一方、 D-酒石酸については増殖の抑制が見られなかったため、別の twitching 阻害機構が存在すると考えられる。現在、 twitching 阻害の詳細な作用機序の解析を行っている。

Activated factors of serotonin-N-acetyltransferase in rice pepides

Study on inhibitor of twitching motility in Ralstonia solanacearum○Tadashi Hatanaka1, Chie Moritani2, Kayoko Kawakami2, Akiko Fujita3,
Koji Kawakami3, Hiroshi Shimoda4, Misugi Uraji1, Kun Wan1, Seiji Tsuboi2(1RIBS, Okayama, 2Shujitsu Univ., 3Satake Co. Ltd., 4ORIZA OIL & FAT CHEM.
Co. Ltd.)

Key words

rice, peptide

2P-1p100 青枯病菌 Ralstonia solanacearum のホウ酸走化性に関わる新規センサータンパク質の解析○Shuhei Date
(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words

twitching motility, Ralstonia solanacearum, malic acid, tartaric acid

2P-1p102 Rhodococcus 属細菌を用いたヒ素検出システムの構築○富田 尚樹 1, 荒井 佑哉 2, 佐藤 舜 2, 庄司 有理 2, 平間 知之 1,
福田 雅夫 3, 遠藤 銀朗 2, 宮内 啓介 2（1東北学院大院・工・環境建設工, 2東北学院大・工, 3長岡技科大）kmiya@mail.tohoku-gakuin.ac.jp○緋田 安希子, 田島 誉久, 中島田 豊, 加藤 純一（広島大院・先端物質）
jun@hiroshima-u.ac.jp【目的】青枯病菌 Ralstonia solanacearum は土壌伝染性の植物病原菌である。現
在 有 効 な 感 染 防 除 法 は な く 、 深 刻 な 農 作 物 被 害 を 引 き 起 こ し て い る 。 R.
solanacearum は走化性を駆使して植物に感染することから、走化性の知見を応用することで新たな感染防除法が提案できるのではないかと考えた。そのためにはまず、R. solanacearum の走化性について詳しく知る必要がある。これまでの解析の中で、R. solanacearum はホウ酸に対して非常に強い走化性を示すことが偶然にも発見された。ホウ酸走化性はこれまでに報告のない走化性であり、非常に興味深い。そこで本研究では、ホウ酸走化性に関わるセンサータンパク
質の特定および当該タンパク質に関する詳細な解析を行った。
【方法・結果】ゲノム情報より R. solanacearum は 22 種類の走化性センサータン
パク質（Mcp）を保有すると予測される。そこで、22 mcp 遺伝子単独破壊株ラ
イブラリを構築し、本ライブラリによるホウ酸走化性センサーの特定を試みた。
その結果、22 種類の Mcp のうち Mcp11 がホウ酸走化性に関与することが明らかとなった。ホウ酸 Mcp に関する知見はなく、Mcp11 は新規のタンパク質であるといえる。そこで、Mcp11 に関してより詳細な解析を試みた。Mcp11 のリガ
ンド結合領域（LBD）のみを発現・精製し、In vitro にて Mcp11 とホウ酸の結合を測定した。円二色性（CD）測定および等温滴定熱量測定（ITC）による解析の結果、ホウ酸は Mcp11 の LBD に直接的に結合することが明らかとなった。
このようにホウ酸を直接感知するタンパク質は植物病原菌に特徴的であることが Protein-BLAST の結果より示唆された。ホウ酸に対して走化性を示すことにどのような意義があるのかについては現在解析中である。

【背景と目的】ヒ素による土壌汚染、地下水汚染は、地球規模で大きな環境問題となっており、日本においてもヒ素は検出頻度の高い汚染物質の一つである。
ヒ素は 5～50 mg を摂取すると中毒症状を起こすだけでなく、数十 ppb の低濃度であっても長時間の摂取によって慢性中毒を引き起こし、発癌等の原因となる為、ヒ素による環境汚染実態の早急な解明が必要である。本研究では、生物学的なヒ素検出方法の確立を目的として、細菌を用いた高感度のヒ素検出シス
テムの構築と検証を行った。
【実験方法】ヒ素耐性を示す細菌 Rhodococcus jostii RHA1 のヒ素耐性遺伝子群
arsRBC のうち、arsR とその上流の ArsR 結合領域を PCR で増幅し、発光タン
パク質をコードする luxAB の上流に挿入してレポータープラスミドを構築した。
このプラスミドを R.jostii RHA1、R.erythropolis IAM1399 及びそれらのヒ素耐性
遺伝子群破壊株に導入した後、さまざまなヒ酸および亜ヒ酸濃度下で培養し、濁度（OD600）と発光量を測定した。発光量の平均値を OD600 で割ったものを単
位菌数あたりの発光量とした。
【結果と考察】レポータープラスミドを保持する RHA1 株、IAM1339 株、およびそれらのヒ素耐性遺伝子群破壊株はヒ酸または亜ヒ酸存在下で発光した。また、野生株に比べてヒ素耐性遺伝子群破壊株の方が感度が高いことも明らかになった。IAM1399 株のヒ素耐性遺伝子群破壊株を用いた時、環境基準である
0.01mg/L 以下のヒ素の検出が可能であった。また、培地にリン酸を加えることで亜ヒ酸とヒ酸を区別して検出できる可能性が示された。

Analysis of novel sensory protein for chemotaxis to boric acid in Ralstonia

Arsenic detection system using Rhodococcus strains

solanacearum○Akiko Hida, Takahisa Tajima, Yutaka Nakashimada, Junichi Kato
(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words
chemotaxis, boric acid, Ralstonia solanacearum, methyl-accepting
chemotaxis protein○Naoki Tomita1, Yuya Arai2, Shun Sato2, Yuri Shoji2, Tomoyuki Hirama1,
Masao Fukuda3, Ginro Endo2, Keisuke Miyauchi2(1Grad. Sch. Eng., Tohoku Gakuin Univ., 2Fac. Eng., Tohoku Gakuin Univ.,
3
Nagaoka Univ. Technol.)Key words

arsenic, biosensor, Rhodococcus

環境浄化，修復，保全技術

2P-1p103 海洋生物試料からの好気的セレン酸還元性微生物の分
離と培養

195

2P-1p105 ネオニコチノイド系農薬のイミダクロプリドが微生物生態系に及ぼす影響評価○阪口 利文 1,2, 内田 菜月 1, 馬越 智也 2, 岡村 好子 3, 石川 輝 4,田口 和典 4（1県大広島・生命科学, 2県大広島・環境科学, 3広島大院・先端
物質, 4三重大院・生資）
sakaguchi@pu-hiroshima.ac.jp○脇屋 香, 伊藤 秋実, 狩山 美沙紀, 小橋 興次, 坂上 吉一,
早坂 大亮, 森 美穂
（近畿大・農）mori_m@nara.kindai.ac.jp【背景・目的】セレンは地殻や生体構成元素として地球上の地圏・生物圏に幅広く分布する元素である。動物では生命活動の必須元素であると考えられており、特異的な代謝プロセスの存在が示唆されている。微生物においても嫌気呼吸における最終電子受容体として利用できることが判明しており、異化代謝によるセレン酸の還元から元素体セレンナノ微粒子の形成が可能である。更に、異化
代謝とは異なる硫黄同化や共代謝的なプロセスによってセレン・テルルオキサ
ニオンを還元できる微生物の存在が明らかになってきている。そこで、本研究では陸上に比して多様な生物相、環境を有する海洋に着目し、海洋底質、海洋
生物試料などから好気的な条件でのセレン酸還元が可能な微生物の分離と分離
株の諸性質ついて調査した。
【方法・結果】本研究では三重大学練習船勢水丸による海洋調査航海で採取された様々な試料を用いて目的微生物の分離を行った。あらかじめ作製したセレン酸を含む分離培地のプレートやバイアルに採取試料を船上で素早く植菌した。
その後、ラボに持ち帰り 25℃でインキュベートし、元素体セレン特有の赤色コ
ロニーの形成を指標として目的微生物を分離した。分離後、各分離株に対して
光学・電子顕微鏡による観察、生化学特性、16SrDNA に基づく分子系統解析などを調査した。また、セレン酸添加時の好気的条件での還元とセレンナノ微粒子の形成、各種セレン・テルルオキサニオン対する生育について調査した。その結果、遠州灘で採取されたサルパから Acidovorax 属に分類される（SSe6-1
株）や東シナ海のトロールで漁獲されたカナド内蔵から（KND-1 株）好気条件
でセレン酸の還元が認められた分離株が得られた。さらに、分離株によるセレンナノ微粒子の形成が確認され、嫌気プロセスを必要としないセレン酸の除去・回収への活用が期待された。

【背景と目的】 農薬は作物の品質を保証し、収量を確保するうえで必要不可欠なものとなっている。しかしながら、その生態リスク評価は、魚類ではメダカやコイ、甲殻類ではオオミジンコ、藻類ではアオミドロといったように、限られた生物種に対してのみ行われている。現在、世界で広く普及しているネオニ
コチノイド系農薬の中にはミツバチが大量死・大量失踪する蜂群崩壊症候群の原因と疑われているものがあり、イミダクロプリドは欧州で 2013 年から 2 年間という期限付きで使用と販売が禁止されたネオニコチノイド系農薬の一つである。本研究では、屋外に人工水田を用意し、農薬未散布のコントロール区とイ
ミダクロプリド散布区において、微生物の数や種類にどのような影響を与えるのかを経時的に調査した。
【方法と結果】 イミダクロプリド粒剤を 5 L の土が入った、横 30 ｃｍ、縦 60
ｃｍ、深さ 3 ｃｍの育苗箱一箱に終濃度が 20 μg/L になるように 50g ずつ散布し、イネ株に 24 時間暗所で浸透移行させた後、人工水田のイミダクロプリド散
布区に移植した。試験期間は当該地域の農事暦に合わせ、2014 年と 2015 年の5 月下旬から 10 月下旬とし、その期間にそれぞれ経時的にサンプリングを行なった。ランダムに 20 箇所から計 2 L の水と 5 箇所から計 200 g の土壌をそれぞれ採取し、混合したものを試料として用いた。水試料と土壌試料の細菌数と真菌数を寒天平板塗抹法により算出した。イミダクロプリドの濃度は、各試料から抽出・濃縮後に LC-MS/MS で測定した。農薬未散布区とイミダクロプリド
散布区を比較した結果、水試料と土壌試料の細菌数と真菌数に著しい差は認められなかった。2 年目の土壌試料中のイミダクロプリド濃度は、1 年目に比べて減少する速度が遅くなり、119 日後も約 2 μg/L の残存がみられた。

Isolation of marine microbes capable of reducing selenate under aerobic
condition

Impact assessment of neonicotinoid pesticide imidacloprid on the microbial
ecosystem○Toshifumi Sakaguchi1,2, Natsuki Uchida1, Tomoya Umakoshi2,
Yoshiko Okamura3, Akira Ishikawa4, Kazunori Taguchi4(1Dept. Life Sci., Pref. Univ. Hiroshima, 2Dept. Environ. Sci., Pref. Univ. Hiroshima,
3
Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 4Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ.)

Key words

Acidovorax sp., marine microbe, selenate reduction, biomineralization

2P-1p104 ジノテフランが微生物生態系に及ぼす影響評価○伊藤 秋実, 脇屋 香, 狩山 美沙紀, 小橋 興次, 坂上 吉一,
早坂 大亮, 森 美穂
（近畿大・農）mori_m@nara.kindai.ac.jp○Kaori Wakiya, Akimi Ito, Misaki Kariyama, Kouji Kobashi, Yoshikazu Sakagami,
Daisuke Hayasaka, Miho Mori
(Fac. Agric., Kinki Univ.)

Key words

imidacloprid, neonicotinoid peticide, impact assessment

2P-1p106 Sphingomonas bisphenolicum AO1 株の環境汚染物質分解能の向上と安定化○高 未麗 1, 村澤 友紀恵 2, 松村 吉信 2,3（1関西大院・理工, 2関西大・化生工, 3関西大・ORDIST）
ymatsu@kansai-u.ac.jp【背景と目的】現在、ジノテフランを有効成分とした農薬スタークルは、植物への浸透移行性に優れ、病害虫に高い殺虫効果を発揮する殺虫剤として世界的に普及している。しかし、農薬の使用は対象とする病害虫や作物以外にも周辺の生態系に影響を及ぼすことが危惧されている。そこで本研究では屋外に人工水田を用意し、農薬未散布のコントロール区とジノテフラン散布区に分け、水田生態系において、ジノテフランが微生物にどのような影響を与えるのかを経時的に調査した。
【方法】幅 1.2 ｍ、長さ 2.8 ｍの人工水田を設置し、2014 年と 2015 年の 5 月から 9 月までの期間にそれぞれ計 10 回（0 と 2 時間後、1、3、7、14、28、56、
91 と 119 日後）のサンプリングを行った。ランダムに 20 箇所から計 2 L の水と 5 箇所から計 200 g の土壌を採取し、試料として用いた。各試料の細菌数と真菌数は寒天平板塗抹法により、ジノテフラン濃度は LC-MS/MS により算出した。水試料については、COD、全リン、全窒素を測定した。
【結果】コントロール区とジノテフラン散布区の水と土壌試料において、細菌数
および真菌数の経時的変化に顕著な差は認められなかった。水質測定の結果、測定した 3 項目について 2 つの区画で有意差は認められなかった。水試料のジノテフラン濃度については、散布後 2 時間後が最大となり 1 日後、3 日後に大きく減少した。土壌試料のジノテフラン濃度は、1 年目と比較して 2 年目の全
サンプリング日程で上回った。現在、各区画からの分解菌の単離を試みている。

<目的> ポリカーボネート樹脂などの原料であるビスフェノール A(BPA)は、内分泌撹乱物質として生態系に悪影響を及ぼすことが危惧され、近年では水環境での合成樹脂汚染も深刻化し、これらを併せ持った対策が求められている。当研究室では BPA を完全分解する Sphingomonas bisphenolicum AO1 株を単離し、BPA 分解に関わる bisdAB がプラスミド pBAR1 にコードされていることを明らかにした。AO1 株は多様な芳香族化合物も分解できる、幅広い環境汚染物質分解菌として期待される。一方、AO1 株から BPA 分解能を失った AO1L 株が単離され、分解能の不安定性がその活用の障害となっており、その一因に pBAR1の遺伝子構造の不安定性が予想された。本研究では次世代シーケンサーを用いて AO1 株のゲノム構造を明らかにし、分解能の向上、ならびにその安定化を試みた。
<方法と結果> AO1 株のゲノム DNA を次世代シーケンサー(Illumina)で解析し、断片配列を CLC Genomics Workbench (QIAGEN)で解析した結果、76 contigs、総塩基数約 5.1 Mb が解明された。RAST server で遺伝子機能を予測した結果、70遺伝子が芳香族化合物分解に関与し、新たな BPA 分解関連酵素遺伝子の存在も予想された。総塩基数 80,317 bp の pBAR1 では 67 遺伝子が推定され、BPA 分
解関連遺伝子として bisdAB と adh、lsd、bisdF、有機塩素化合物分解に関わる
had が確認された。また、14 個のトランスポサーゼ遺伝子と 21 個の接合伝達に関わる遺伝子も推定され、pBAR1 の約半数が DNA 可動に関わるものであった。
次に、BPA 分解関連遺伝子を保持する組換えプラスミドを AO1 株に導入し、AO1 株の BPA 分解能の向上を試みたが、顕著な BPA 分解能の増強は確認できなかった。一方、AO1L 株にこの組換えプラスミドを導入した結果、BPA 分解能は回復した。今後は高発現プロモーターを用いてプラスミドを改良し、BPA
分解能の向上を試みる予定である。

Impact assessment dinotefuran on the microbial ecosystem

Improvement on the pollutant-degradation activity of Sphingomonas
bisphenolicum AO1.

○Akimi Ito, Kaori Wakiya, Misaki Kariyama, Kouji Kobashi, Yoshikazu Sakagami,
Daisuke Hayasaka, Miho Mori
(Fac. Agric., Kinki Univ.)

Key words

dinotefuran, impact assessment, neonicotinoide pesticide○Miryo Koh1, Yukie Murasawa2, Yoshinobu Matsumura2,3(1Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ., 2Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ.,
3
ORDIST, Kansai Univ.)

Key words

bisphenol A, biodegradation, genome, Sphingomonas

196

環境浄化，修復，保全技術

2P-1p107 炭化水素分解菌 Rhodococcus erythropolis NDKK6 を活性化させる共生微生物の探索

2P-1p109 Penicillium sp. CHY-2 株による模擬汚染土壌中の 4-tertブチルフェノール分解特性○野濱 元輝, 荒木 希和子, 久保 幹
（立命館大院・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp○小野寺 瑠依, 梅本 穂乃香, 矢島 由佳, 張 傛喆
（室工大院・工・環境創生）
ychang@mmm.muroran-it.ac.jp【背景と目的】炭化水素分解菌である Rhodococcus erythropolis NDKK6 は難分解
性長鎖シクロアルカンを唯一の炭素源として生育できる。しかし、R. erythropoolisを用いた炭化水素汚染土壌の浄化実験では、3 週間程度で菌数が減少して炭化水素分解の効率が低下し、菌数と分解能を長期間維持できないという課題がある。
これを解決する方法として生物の共生に着目した。生物には、異なる種が共存することにより、生存率や適応度が工場する共生関係が存在することが知られている。したがって微生物同士の共生によりバイオレメディエーションの効率を高められるのではないかと考えた。本研究では細菌との共生が炭化水素分解菌 R. erythropolis を活性化させるかを検証することを目的とした。
【方法】R. erythropolis の活性を調べるため、Bacillus subtilis (natto) TAKAHASHIとそれぞれ共培養実験を行った。三角フラスコに 1/10 LB 液体培地 100 mL 入
れ、R. erythropolis と B. subtilis (natto)をそれぞれ 1.0×106 cells/ml ずつ植菌した。
また、コントロールとして R. erythropolis のみの 1.0×106 cells/ ml 植菌した系を作製した。この菌液を振とう培養 (120 rpm, 30℃, 48 h)後、さらに 1/10 LB 固体
培地に 100μl ずつ植菌し、静置培養(30℃, 48 h)した後に菌数を測定した。同様の実験を炭化水素分解菌である Gordonia terrae NDKY76A と B. subtilis (natto)を用いて行った。
【結果・考察】B. subtilis (natto)と共培養を行ったとき、R. erythropolis の菌数は8.2×108 cfu/ml となり、コントロールの菌数 2.5×108 cfu/ml と比較すると共培養の方が菌数が増加したことが分かった。G. terrae と共培養をさせたときの菌数が 7.0×107 となり共生することが分かった。これより B. subtilis (natto)との共生により炭化水素分解菌を活性化させることが明らかとなった。

[背景および目的] アルキルフェノール類の一つである 4-tert-ブチルフェノール
は、水生生物への毒性などが確認されている。4-tert-ブチルフェノールは石油の精製工程などで用いられており、石油精製工場の周辺地域では汚染水の漏れなどにより土壌汚染が発生する可能性がある。発生した汚染土壌の除去方法として、分解微生物を添加し汚染物質の除去を行うバイオオーグメンテーションがある。本研究では、Penicillium sp. CHY-2 株（GeneBamk accession number
AB980801）を用いて模擬汚染土壌中の 4-tert-ブチルフェノール分解実験を行い、その分解能を調査した。
[方法] 室蘭工業大学構内の土壌を用いて調製した 4-tert-ブチルフェノール模擬
汚染土壌に、Penicillium sp. CHY-2 株を接種した。HPLC（高速液体クロマトグラフ）により 4-tert-ブチルフェノール濃度の経時変化を測定し、CHY-2 株の 4tert-ブチルフェノール分解能を調査した。また希釈平板法により、土壌中の細菌類および真菌類の生菌数を計測した。
[結果] 模擬汚染土壌中の 4-tert-ブチルフェノール濃度の経時変化を測定したところ、CHY-2 株を添加した系において、実験開始から 10 日目以降 4-tert-ブチル
フェノール濃度の減少が見られ、21 日目では完全に分解された。また生菌数計
測の結果より、CHY-2 株の添加は土壌中の細菌類の生菌数に影響を与えないということが確認された。本研究の結果から、CHY-2 株は模擬汚染土壌中で効果
的に 4-tert-ブチルフェノールを分解するということが明らかになった。

Searching co-bacteria to activate the capacity of Rhodococcus erythropolis
NDKK6

Degradation characteristics with Penicilium sp. CHY-2 in a 4-tertbutylphenol-contaminated soil

Key words

Key words○Genki Nohama, Kiwako S. Araki, Motoki Kubo
(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Rhodococcus, Bacillus subtilis

2P-1p108 ノニルフェノールモノオキシゲナーゼ遺伝子を用いたビ
スフェノール S の分解○Rui Onodera, Honoka Umemoto, Yuka Yajima, Young-Cheol Chang(Grad. Sch. Eng., Muroran Inst. Technol.)biodegradation, fungus, 4-tert-butylphenol

2P-1p110 抗がん剤フルオロウラシルの分解挙動と細胞毒性残存性の検討○近成 直斗 1, 栗岡 純平 1, 田村 亮太 1, 加藤 太一郎 2, 根来 誠司 1,
武尾 正弘 1
（1兵庫県大院・工, 2鹿児島大学大学院理工学研究科）
dcefr7m7@gmail.com○岡山 真哉, 前田 憲成（九工大院・生体工）
toshi.maeda@life.kyutech.ac.jp

ビスフェノール S(BPS)は、極めて耐熱性の高いスーパーエンジニアリングプラ
スティックの合成原材料としてその生産量・使用量が増加しつつある。しかしながら、これまでの研究により、本物質は極めて難分解であることが知られている。我々は、内分泌撹乱物質・ノニルフェノール(NP)の分解の研究で、Sphingomonas 属細菌から NP モノオキシゲナーゼの遺伝子(nmoA)のクローニン
グに成功し、この酵素が NP ばかりでなく、BPS をも分解することを明らかにした。本研究では、芳香族化合物の分解特性の異なる３つの Pseudomonas 属細菌にこの遺伝子を導入し、BPS からの代謝物の分析による分解経路の決定と宿主の代謝経路を活用した分解の改善を検討した。
まず、広宿主域ベクター pBBR1MCS-2 に nmoA を組み込んだ組換えプラスミド
pBNMOA-F をエレクトロポレーション法により P. putida の３株（KT2440 株,
MT4 株, TSN1 株）に導入した。0.2mM の BPS を含む無機塩培地ベースの菌体懸濁液を振盪培養（30 度、150rpm）して分解試験を実施し、その上清を HPLC
分析あるいは代謝物の分取後に 1H-NMR 分析して、BPS 分解の評価と代謝物の構造を決定した。
代謝物の分析により、BPS は NP モノオキシゲナーゼにより４位（あるいは 4'位）の炭素が酸化され、炭素ー硫黄結合が開裂してハイドロキノンとフェノールス
ルホン酸に分解されるか、あるいは NIH シフト化合物である 2,5,4'-トリヒドロ
キシジフェニルスルホンに変換されることがわかった。この物質も同じ酵素、同じ機構でハイドロキノンとハイドロキノンスルホン酸へと分解された。一方、主要な代謝物であるハイドロキノンを分解できる TSN1 株に nmoA 遺伝子を導入した株は、0.2mM の BPS をハイドロキノンの蓄積なく 2 時間程度で速やかに分解できた。

【背景と目的】近年、細胞増殖阻害を有している抗がん剤由来の化学物質が環境中で検出されており、正常な生態系に悪影響を与えることが危惧されている。
世界のがん患者は増加傾向にあり、これに伴い治療に用いられる抗がん剤の使用量も増加し、抗がん剤による重篤な環境汚染が危惧される。このような環境汚染を防ぐためには、環境中における抗がん剤の生分解挙動の把握は必須であるが、これに関する研究はほとんど行われていない。本研究では、使用頻度が高く、環境中で検出されている抗がん剤フルオロウラシルを標的化合物とし、複合系微生物群の代表である下水汚泥を用いて、細胞毒性評価、生分解性評価、
フッ素イオン測定と代謝物の同定を行った。
【方法】1%（w/v）下水汚泥と 10 mg/L のフルオロウラシルを混合し、30℃、120
rpm で反応させ、HPLC で生分解性評価と生成した代謝物の追跡、ならびにフッ素イオン測定を行った。また、LC-TOF-MS を用いて代謝物の構造同定を試みた。細胞毒性評価として、100 mg/L のフルオロウラシルを添加した LB 寒天培
地に、希釈した下水汚泥を散布して、30℃、24 時間静置培養を行った。その後、生菌数測定を行った。
【結果と考察】フルオロウラシルは、下水汚泥中の微生物群で代謝物に変換され、この代謝物が生成し蓄積されると、フルオロウラシルの分解速度が著しく遅くなった。このことから、この代謝物は下水汚泥中の微生物群に対して強い毒性を示していることが示唆された。また、細胞毒性評価では、フルオロウラ
シル含有プレート上での生菌数が、対照物と比べ約 100 倍少なかったことから、環境中の微生物群に対しても、高い細胞毒性を示すことがわかった。フッ素イオンの量は、最終的には添加したフルオロウラシル相当モル分が検出されており、無害化されていることが示唆された。

Biodegradation of Bisphenol S using a Nonylphenol Monooxygenase Gene

Relationship between biodegrdability and residual cytotoxicity of 5fluorouracil, an anticancer drug

○Naoto Chikanari1, Junpei Kurioka1, Tamura Ryota1, Daiichiro Kato2,
Seiji Negoro1, Masahiro Takeo1(1Grad. Sch. Eng., Univ. Hyogo, 2Grad. Sch. Sci. Eng., Kagoshima Univ.)

Key words

biodegradation, bisphenol S, hydroquinone, NIH shift○Shinya Okayama, Toshinari Maeda(Grad. Sch. Life Sci. Syst. Eng., Kyushu Inst. Technol.)Key words

anticancer drug, biodegradation, fluorine ion, cytotoxicity

環境浄化，修復，保全技術／バイオマス，資源，エネルギー工学

2P-1p111 Dehalococcoides 共生微生物の獲得とトリクロロエテン
嫌気的脱塩素化への利用

197

2P-1p113 富栄養汽水性佐鳴湖からのアンモニア酸化細菌の単離および特性解析

○杉山 和哉 1, 工藤 勇人 1, 田代 陽介 1, 二又 裕之 1,2,3（1静大院・工, 2静大グリーン研, 3静大・創科技院）
thfutam@ipc.shizuoka.ac.jp○會田 悠人 1, 池上 健太郎 1, 矢木 修身 2, 養王田 正文 1
（1農工大院・工, 2東京大学）
yohda@cc.tuat.ac.jp【目的】Dehalococcoides 属細菌は、土壌汚染の主要な原因物質であるクロロエ
テン類をエテンまで完全に嫌気的脱塩素化できる唯一の微生物である。しかし、単独での培養が非常に困難であり分解能も低く、培養や実用化には共生菌の存在が必須である。本研究では、Dehalococcoides 属細菌の生育に必要な共生菌を獲得し、効率的な Dehalococcoides 属細菌培養系を構築し、バイオオーグメン
テーションへの利用を目的としている。
【方法】Dehalococcoides mccartyi IBARAKI 株を含む混合培養系(1)から、シェイクアガー法により、共生菌を獲得した。これらの共生菌と D. mccartyi UCH-ATV1
株を混合培養した。クロロエテン類の分解はガスクロマトグラフィーによる測定で確認した。
また、菌叢及びゲノム解析を、次世代シーケンサーを用いて行った。
【 結 果 ・ 考 察 】 UCH-ATV1 株 は 製 品 評 価 技 術 基 盤 機 構 と 共 同 で 単 離 し た
Dehalococcoides 属細菌であり、トリクロロエテンをエテンまで完全に脱塩素化可能である。本菌、単独ではクロロエテン類の分解は非常に遅いが、獲得した共生菌と混合培養を行うことで脱塩素化を促進することに成功した。この培養
系の菌叢解析の結果、Petrimonas、Desulfovibrio、Dehalococcoides、Clostridiumの４種類存在することが明らかとなった。また、PacBio RSII による解析データ
から UCH-ATV1 株の全ゲノム配列を決定できた。
(1) Yohda M. et al. Genome sequence determination and metagenomic characterizationof a Dehalococcoides mixed culture grown on cis-1,2-dichloroethene. J Biosci Bioeng.

【背景と目的】富栄養化汽水湖の水質浄化を図る一環として、潜在的浄化能力の発現は重要である。静岡県浜松市に位置する佐鳴湖は全国有数の富栄養化汽水湖であり、これまで窒素循環に関わる微生物生態系の解析を実施した。その結果、底泥表層において脱窒および硝化微生物が最も高密度で生息していることが示された。底泥表層を用いアンモニアを基質とした動力学的解析からは KS
および KI 値がそれぞれ 0.14 mM および 2.2 mM であることが示された。佐鳴湖
底泥表層において硝化微生物群は低濃度アンモニア酸化の重要な役割を担っていることが示唆された。硝化微生物生態系の理解に向け、硝化微生物の単離および特性解析を目的とした。
【方法】支持体（ポリウレタンスポンジ）を佐鳴湖底泥表層土懸濁液に浸漬し硝化微生物を付着させた。その後支持体を鉛直方向に 10 個連結し Down-flow
Hanging Sponge リアクターを構築した。アンモニア濃度 0.4 mM 含む培地を上方から 1.0 L day-1 で供給し、通気条件下で連続培養した。2.5cm 角に切り取ったスポンジから DNA を抽出し、real-time PCR によるアンモニア酸化酵素遺伝
子（amoA）を定量した。DHS リアクターから抽出した液を用いて、混釈平板法による硝化微生物の単離を実施した。
【結果】アーキア由来 amoA はおおよそ 7 × 107 copies mm-3 sponge で維持された
一方で、バクテリア由来 amoA は培養開始直後でおよそ 3 × 103 copies mm-3
sponge であり、培養 202 日目でおよそ 3 × 106 copies mm-3 sponge まで増加した。
16S rRNA 遺伝子を用いた相同性解析より、単離株は Brevibacterium および
Xanthobacteraceae に 99%の相同性を示した。また、amoA の保有およびアンモ
ニアの消費が確認された一方で、亜硝酸および硝酸の検出は確認されなかった。
現在、単離株の動力学的解析を進めている。

Isolation of symbiotic microorganisms for Dehalococcoides and application
for anaerobic dechlorination of trichloroethene

Isolation and characterization of ammonia-oxidizing bacteria fromeutrophied brackish Lake Sanaru

Key words
bioremediation, Dehalococcoides, anaerobic bioremediation,
trichloroethylene

Key words
eutrophication, nitrifying bacteria, brackish lake, Down-flow Hanging
Sponge reactor

2P-1p112 シアン分解能を有する Pedobacter 属細菌の単離と解析

2P-1p114 土壌環境中のリン供給に対する微生物と金属元素の影響○Yuto Aita1, Kentaro Ikegami1, Osami Yagi2, Masafumi Yohda1(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Univ. Tokyo)○寺田 彩音 1, 小松 大祐 2, 西村 実 2, 養王田 正文 1
（1農工大院・工, 2株式会社アイ・エス・ソリューション）
ayane.terada@yohda.net【諸言】工場等から環境中に排出されるシアン化合物（以下シアン）は、細胞内呼吸阻害を引き起こす毒性の高い物質であり、土壌・地下水汚染の原因となっている。シアンで汚染された土壌の浄化法の 1 つとして、微生物の生分解能を利用したバイオレメディエーションが挙げられる。特に、分解能を有する微生物を外部で培養し、汚染サイトに投入するバイオオーグメンテーション法は、確実な浄化が期待されている。そこで、本研究ではバイオオーグメンテーショ
ン法に有用なシアン分解菌を獲得することを目的とした。微生物によるシアン
分解が確認されたシアン汚染地下水を対象とし、16S rRNA 及びシアン分解酵素
遺伝子の解析によりシアン分解菌を同定した。更に、シアン分解菌の単離培養を試みた。
【実験方法及び結果】微生物によるシアン分解が確認されたシアン汚染地下水からゲノム DNA を精製し、16S rRNA 遺伝子を PCR で増幅してシーケンス解析を行った。その結果、地下水中にはシアン加水分解酵素であるニトリラーゼを所有する Pedobacter heparinus strain DSM 2366 と 97%の相同性を有する微生物の存在が確認された。さらに、汚染地下水から精製したゲノム DNA より
Pedobacter 属細菌由来のニトリラーゼ遺伝子が PCR で増幅された。そこで、
Pedobacter 属細菌が地下水中のシアン分解を担っていると考え、16S rRNA 遺伝
子及びニトリラーゼ遺伝子を指標に、ニトリラーゼを有する Pedobacter 属細菌を単離した。この菌の培養液にシアン化カリウムを加えると、シアン分解が確認された。今後は、本菌の分解能を調べることにより、バイオオーグメションへの利用の可能性を評価する。

Isolation and characterization of Pedobacter sp. which is capable ofdegrading cyanide○Ayane Terada1, Daisuke Komatsu2, Minoru Nishimura2, Masafumi Yohda1(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2In Situ Solution)

Key words

bioremediation, cyanide, Pedobacter, nitrilase○Kazuya Sugiyama1, Yuto Kudo1, Yosuke Tashiro1, Hiroyuki Futamata1,2,3(1Grad. Sch. Eng., Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.,
3
Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ.)

解析○蒋 天翼, 荒木 希和子, 久保 幹
（立命館大院・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp【背景と目的】リン（P）は、全ての生物の生存に必須の栄養素である。しかし、リンは環境中から供給される量に限りがあり、リン供給が植物の成長にとってしばしば制限要因になっている。地球環境中におけるリンの循環を介したリン供給率は、有機物を無機物に分解する土壌微生物の働きによって増加する。
しかしながら、土壌中に金属元素（Fe, Al, Mg など）が存在するとリンを吸着するため、リン供給率は低下することが知られている。われわれのこれまでの研究では、特定の土壌においては総細菌数とリン循環活性は正の相関を示すのに対し、全国の土壌を用いた解析ではその傾向が見られなかった。そのことか
ら、植物に対するリンの供給率を正確に把握するには、土壌中の金属元素量を測定することが重要であると考えられる。本研究では、土壌中のリン循環活性とリン供給率に対する微生物と金属の影響を調べることを目的とした。
【方法と結果】日本各地の 120 地点から土壌サンプルを採取し、土壌中のリン循
環活性、リン供給率と pH, 金属量、微生物量を測定し、これらの関係性について解析した。その結果、微生物の多い土壌にも、リン循環活性が高いものから低いものまで存在し、リン循環の高いところでは、Fe, Al, Ca などの含有量が少なくリンの供給率が高いことがわかった。また、リン供給率は土壌の pH にも影響を受けることが示唆された。このことから、土壌環境中において、植物が利用できるリン供給率には、リン循環に関わる微生物量に加え、土壌に含まれる金属元素量が大きく影響していることが明らかとなった。

Influences of bacteria and metals on the availability of phosphate in soil
environment○Tianyi Jiang, Kiwako S. Araki, Motoki Kubo
(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words

bacteria, phosphate

198

バイオマス，資源，エネルギー工学

2P-1p115 土壌中の金属成分と微生物活性の関係解析○Niamatullah Sidiq, 荒木 希和子, 久保 幹
（立命館大院・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp

2P-1p117 茹で麺排水への酵素剤添加による固形成分への凝集・沈降性付与機構の解明○渡辺 昌規 1, 西山 航生 1, 塩野 忠彦 2, 楠 信行 3
（1山形大院・農, 2広島県立総合技術研究所・食品, 3くすのき厨房（株））
mwata@tds1.tr.yamagata-u.ac.jp【背景と目的】 農地の肥沃度を向上させるため、土壌中の細菌数、窒素循環活性（アンモニア酸化活性と亜硝酸酸化活性）、リン循環活性、全窒素（TC）、全炭素（TN）等の解析（SOFIX：Soil fertile index）を行い、データベースの構築を行ってきた。本 SOFIX データベースから、土壌中の TC、TN、および C/N 比の違いにより、細菌数が大きく変動することが明かとなった。また、土壌中のTC、TN、C/N 比を調整することにより、土壌細菌数を増加させることが可能となった。しかしながら、細菌数の増加と窒素循環活性やリン循環活性は必ずしも一致していなかった。本研究では、細菌の生育や活性と関係が深い、土壌中の金属成分に着目し、土壌中の金属成分が窒素循環活性やリン循環活性に及ぼす影響を解析することを目的とした。
【方法】 土壌サンプルは、農地を中心に日本各地から採取した。土壌中の TC、TN、金属成分は、それぞれ全有機体炭素計、ケルダール法、および原子吸光法
により行った。細菌数測定、窒素循環活性（アンモニア酸化活性と亜硝酸酸化活性）、リン循環活性は、それぞれ eDNA 法、SOFIX 窒素循環活性法、およびSOFIX リン循環活性法により解析した。使用した金属は、植物成長に用いられている範囲に基づいて調整した。
【結果と考察】 細菌数は、Mg、Ca、Mn、および Zn を添加することにおいて増加が認められた。一方、Fe 添加においては変化がなかった。窒素循環活性においては、Ca と Fe が抑制傾向に働く傾向が認められたが、Mg、Mn、および Zn
においては活性化した。これらの金属はアンモニア酸化活性や亜硝酸酸化活性に影響を与えていることが考えられた。一方、リン循環活性においては、Zn を添加することにより顕著に活性が向上した。この結果から、Zn 添加はリン循環に関与する微生物活性に正の影響を与えることが示唆された。

【目的】現在，茹で麺排水は，洗米排水と同様に難分解性であるデンプンを含有しているため，一般排水と比べコスト高となってしまう問題を有している。これまでに演者らは，安価な茹で麺排水処理装置の開発の一環として，食品工業
用プロテアーゼ添加による茹で麺排水中固形成分への凝集・沈降性付与について検討を行い，これまでに固形成分表層小麦由来タンパク質特異的な分解、固形成分表層の負のゼータ電位（表面電位）の増大と濁度（NTU)の低下を認めた。しかしながら、本現象に対する工業用プロテアーゼに含有する糖化酵素等、他の酵素の関与については明らかとなっていない。そこで本研究では，詳細な本凝集沈降性付与機構を解明するにあたり，各種工業用酵素処理による排水中固形成分への凝集沈降性付与と添加酵素剤由来のプロテアーゼ、糖化酵素活性との関連性ついて検討を行った。
【方法・結果】茹で麺排水に対し，各種酵素（工業用計 13 種）を任意量添加・反応後，5 種の酵素剤において，濁度の低下と固形成分の急速沈降が認められた。さらに酵素剤添加後の茹で麺排水中の各種酵素活性の測定を行った結果，
プロテアーゼ，α-グルコシダーゼの双方の活性を示した。また，プロテアーゼ
活性のみを有する Protease N，グルコシダーゼ（α, β-）活性のみを有する
OPTIMASE CX15L においては，濁度の低下と固形成分の急速沈降は認められなかった。これらの結果より、茹で麺排水中固形成分の凝集・沈降性付与現象は，
プロテアーゼの作用による固形成分表層の特定タンパク質分解・除去以外に，デンプンの非還元末端に結合しているタンパク質の分離，デンプン表層の水酸基露出による負のゼータ電位形成も α-グルコシダーゼの作用として本現象に寄与している可能性を示唆した。現在，重回帰分析による各種酵素活性と本現象との関連について解析を進めている。

Relationship between microbial activity and minerals in soil environment

Mechanism of sedimentation and flocculating ability of solid particle inwaste water○Sidiq Niamatullah, Kiwako S. Araki, Motoki Kubo
(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words

bacteria, microbial community○Masanori Watanabe1, Koki Nishiyama1, Tadahiko Shiono2, Nobuyuki Kusunoki3(1Grad. Sch. Agric., Yamagata Univ., 2Hiroshima tech. res. inst., 3Kusunoki Kitchen
Instrument Co. Ltd.)Key words
protease for food processing, sedimentation, flocculation, wheat noodle
manufacturing

2P-1p116 アカテガニが示すバイオマス分解活性の解析

2P-1p118 ジスプロシウム高吸収能を示す酵母の探索

日本の海岸に面した森林、いわゆる水辺林では、アカテガニやヨコエビなどの生息がよく観察される。これらの甲殻類は落ち葉や木片などのバイオマスを食料として利用する。アカテガニやヨコエビは森林物質循環と河口域の生態系（特に魚類生産）の中で重要な役割を果たしているが、そのバイオマス分解メカニ
ズムはほとんどわかっていない。本研究ではアカテガニとヨコエビの新規バイ
オマス分解システムを明らかにし、バイオマス有効利用技術への応用をはかることを目的としている。本発表ではアカテガニ消化管由来懸濁液のバイオマス
分解活性（特にリグニン分解活性）についての解析とその活性に対する消化管
細菌群の貢献度について報告する。
加賀地方や能登地方の水辺林に生息するアカテガニから消化管抽出液を作製し、そのバイオマス分解能力を解析した。セルラーゼ活性やリグニン分解活性を検討したところ、非常に強いグアヤコール酸化活性を検出することができた。我々はこれまでにバイオマス分解能力のあるアカテガニ消化管由来細菌群を単離しており、消化管の強いバイオマス分解活性が細菌群に由来するのではと考え、アカテガニを抗生物質添加環境で飼育した。その結果、通常環境で飼育したカニと比べて顕著に低下したグアヤコール酸化活性しか示さなくなった。また因果関係は不明だが、多くの抗生物質処理アカテガニは死んでしまうことが判明した。消化管細菌群はアカテガニの食性と生存に大きな役割を果たしているものと考えている。従前の単離細菌群についての解析も引き続き行っており、こちらについても新規の知見を報告する予定である。

現代社会において様々なハイテク製品に利用されている希少金属元素の安定供給に関わる金属マネジメントシステム開発は、年々重要さを増している。近年、それらを都市鉱山といわれる廃棄製品や都市排水などから効率良く回収、再利用する技術開発研究が行われており、その一つとして微生物の生物機能を利用する生物回収法が注目されている。我々の研究グループは、以前より、毒性金属であるカドミウム（Cd）やマンガン（Mn） を吸収する酵母の単離・解析を行っている。今回、レアアースの一種であるジスプロシウム（Dy）を高効率で吸収できる酵母の探索を試みた。ジスプロシムはネオジウムと共にハードディ
スクなどの磁気メモリー、MRI(磁気共鳴画像診断装置)、燃料電池自動車のモーターなどの高磁気製品や赤色領域スペクトル線を放出する高輝度放電ランプなどに使用されている極めて重要な金属元素である。
研究室で保存している酵母菌株についてジスプロシウムを添加した完全培地で培養後、培養菌体を回収し、菌体画分に含まれるジスプロシウム量を測定した。
また、あまりジスプロシウムを吸収しない Saccharomyces cerevisiae を指標菌として用い、S. cerevisiae よりも１菌体あたりで高いジスプロシウム含量を示す酵母菌株をスクリーニングした。その結果、野菜農場の土壌を採集されて、保存されていた２菌株（FC-ALT02 株および FC-ALT05 株）が単離された。両菌株について完全培地で培養後に集菌し、得られた菌体をジスプロシウム溶液と混合攪拌しながら反応させたところ、菌体画分にジスプロシウムの吸収が認められた。また両菌株の菌体と様々な金属溶液とを懸濁し、その金属の菌体画分への吸収量を検定したところ、特にジスプロシウムに対して高吸収性を示すことが判明した。現在、両菌株の同定とジスプロシウム吸収条件を検討している。

Study on biomass-degrading activities from gut of herbivorous crustacea,
Chiromantes haematocheir

Screening of yeast strains showing high dysprosium-absorbance

裏 佳織 1, 知田 真之介 1, 馬場 保徳 1, 柳井 清治 2, ○三宅 克英 1（1石川県大・生物資源研, 2石川県大・生資環）
miyake@ishikawa-pu.ac.jp

Kaori Ura1, Shinnosuke Chida1, Yasunori Baba1, Seiji Yanai2, ○Katsuhide Miyake1(1Res. Inst. Bioresour. Biotechnol., Ishikawa Pref. Univ., 2Fac. Bioresour. Environ.
Sci., Ishikawa Pref. Univ.)

Key words

biomass, lignin, lignin degradation, Chiromantes haematocheir

晃佑 垣田, ○岸田 正夫（阪府大院・生環科）
masyksd@biochem.osakafu-u.ac.jp

Kousuke Kakita, ○Masao Kishida(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Key words

yeast, biosroption, dysprocium, rare metal

バイオマス，資源，エネルギー工学

2P-1p119 酵母における酸耐性・塩耐性付与遺伝子の解析と分子育種による耐性強化

199

2P-1p121 超低栄養性細菌 Rhodococcus erythropolis N9T-4 株の効率的培養法の確立○松岡 友洋 1, 新谷 政己 2, 金原 和秀 2, 吉田 信行 2
（1静大・工, 2静大院）
tnyoshi@ipc.shizuoka.ac.jp○松鹿 昭則 1,2, 鈴木 俊宏 1, 根冝 香奈子 1, 橋本 智代 1,
五島 徹也 3, 星野 保 1,2（1産総研・機能化学, 2広島大院・先端物質, 3酒総研）
a-matsushika@aist.go.jp【目的】バイオマスからのエタノールや乳酸の生産コスト低減化のために、前処
理・糖化工程で使用される酸や中和で生成する塩に対して耐性が向上した酵母を育種することが重要である。我々は最近、酸や塩などのストレスに強い耐性を示す酵母 Issatchenkia orientalis から酸耐性・塩耐性に関わる遺伝子（IoGAS1）を単離し、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）において発現させることにより、低 pH 又は高濃度硫酸塩のストレス条件下でエタノール生産性を顕著に向上させることに成功している。本研究では、IoGAS1 と高い相同性をもつ S.
cerevisiae 由来 GPI アンカー型タンパク質をコードする GAS1 の酸耐性・塩耐性
効果を、IoGAS1 と比較することで検討した。
【方法及び結果】転写発現解析により、I. orientalis 由来 IoGAS1 は pH2.0 の条
件、S. cerevisiae 由来 GAS1 は pH3.0 の条件で発現量が最大になることが分かった。また、硫酸塩存在下では、pH 値に関わらず、いずれの遺伝子も発現量が上昇することが示された。pH2.3 又は 5.0％の硫酸塩を含む pH2.5 の培地において、GAS1 過剰発現株は野生型株よりも増殖能が向上した。さらに、低 pH（pH2.1）又は高濃度硫酸塩（5.0％, pH2.4）の条件下で、GAS1 過剰発現株は野生型
株に比べてエタノール生産性が 32％以上増加した。このように、GAS1 は IoGAS1と同様に酵母の酸耐性・塩耐性に寄与することが明らかとなったが、GAS1 の耐性効果は IoGAS1 と比較して低かった。

【緒言】備蓄原油中から単離された Rhodococcus erythropolis N9T-4 株は，炭素源
および窒素源無添加の無機固体培地(BM 培地)上において良好な生育を示す超低栄養性細菌である．本菌は生育に二酸化炭素を要求するが，その際特別のエネ
ルギーの添加を必要としないというユニークな特性を示す．また窒素源については，大気中の微量アンモニアを利用できることが明らかとなっている．最近，低栄養生育時にトレハロースやグリコーゲンなどの糖質を細胞内に蓄積することが判明し，微生物バイオマスとしての利用可能性について検討している．一方で，本菌は BM 固体培地には良好に生育するものの，液体培地での生育が極めて悪く，多くの菌体を得るためには効率的な液体培養法の確立が必要となる．
本研究では，スポンジを支持体とした液体培養を試み，同時に培地成分ついても検討したので報告する．
【方法および結果】 本菌は寒天またはシリカゲルを支持体とした固体培地上で良好な生育を示す。これらの支持体に代わるものとして、市販のポリウレタン
スポンジを 6 cm×6 cm×1 cm の大きさに加工し，500 ml 容ビーカー中で 12 ml の
BM 液体培地をスポンジに十分に含ませた．初発菌濃度を OD660 ＝ 0.002 となるように接種し，30℃で静置培養を行った．その結果，スポンジを支持体として用いた系では，スポンジを用いない系と比較して培養液 1 ml 当たりの菌体量が約 2.5 倍に増加した．また，スポンジの厚さが薄いほど培養液 1 ml 当たりの菌体量が増加する傾向が見られた．さらに，従来の BM 培地では窒素源として硝酸ナトリウムを添加していたが，塩化アンモニウムに置き換えることにより菌体の生育が向上した．スポンジの材質，その他の培地成分など培養条件の最適化も行い，アルデヒド脱水素酵素など低栄養条件で特異的に発現する酵素活性についても検討したので併せて報告する．

Characterization of a gene required for tolerance to low pH and salt stressin yeasts

Establishment of effective oligotrophic cultivation system for Rhodococcus
erythropolis N9T-4○Akinori Matsushika1,2, Toshihiro Suzuki1, Kanako Negi1, Tomoyo Hashimoto1,
Tetsuya Goshima3, Tamotsu Hoshino1,2(1ISC, AIST, 2Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 3NRIB)

Key words
fermentation

Issatchenkia orientalis, acid tolerance, salt tolerance, ethanol

2P-1p120 Process simulation for efficient acetic acid production
from nipa sap○Tomohiro Matsuoka1, Masaki Shintani2, Kazuhide Kinbara2, Nobuyuki Yoshida2(1Fac. Eng. Shizuoka Univ., 2Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ.)

Key words

oligotroph, Rhodococcus erythropolis, liquid culture

2P-1p122 Serratia marcescens において 2,3-ブタンジオール生産性を増大させる変異の解析○張 琳 1, 大槻 隆司 1
（1山梨大学・医工農・生環, 2山梨大学・医工農・生環）
tohtsuki@yamanashi.ac.jp○Dung Van Nguyen1, Pinthep Sethapokin2,
Harifara Rabemanolontsoa1, Eiji Minami1, Haruo Kawamoto1,
Shiro Saka1(1Grad. Sch. Energy Sci., Kyoto Univ., 2On leave from King
Mongkut's Instit. Technol. Ladkrabang to Kyoto Univ.)
saka@energy.kyoto-u.ac.jp
Efficient acetic acid production from nipa sap was proposed as a new environmentallybenign manufacturing process. The results showed that reducing sugars from the sap
composed mainly of sucrose, glucose and fructose as hydrolyzed by oxalic acid orinvertase can be converted into acetic acid by Moorella thermoacetica (formerly
Clostridium thermoaceticum) with high conversion efficiency of 98% as comparedwith only around 25-30% for the traditional vinegar production. To upgrade theprocess to pilot scale and analyze its energy consumption, process simulation was
accomplished using Pro/IITM software with a nipa sap fed rate of 750 kg/h. The processincludes hydrolysis step (by acid or enzyme) and fermentation step. Heat exchangers
were used and could recover 1,053 and 1,058 MJ/h in the case of acid and enzymatic
pretreatments, respectively. As a result, total energy consumption for the entire process
was reduced to 378.7 MJ/h when acid hydrolysis was used and 383.7 MJ/h in the caseof enzymatic hydrolysis. Although there were no major differences in the energy
consumptions of these hydrolysis methods, oxalic acid shows higher advantage interms of price. It was also found that regardless of the type of hydrolysis, fermentation
step consumed higher energy compared with hydrolysis step. The preliminary resultsfrom this process simulation can be useful for further pilot-plant process design ofefficient acetic acid production from nipa sap.

【背景・目的】2,3-ブタンジオール（2,3-BD）はそれ自体もインクなどの原料として使われる有用な化合物であるが、化学産業の重要な基幹化合物である 1,3ブタジエンに容易に変換できるという特徴がある。1,3-ブタジエンの発酵生産は困難であるが、2,3-BD を生産する微生物は多く報告されている。筆者らは
2,3-BD 生産株として Serratia marcescens NBRC3735 株を用いている。NBRC3735
野生株を親株として、UV 変異処理を行い、30%グルコース寛容 2,3-BD 高生産
変異株（30GT）を取得した。本研究では野生株及び変異株のドラフトゲノムを決定し、変異株ゲノム上の変異点の特定を試みた。
【方法】野生株と変異株から精製したゲノム DNA を、HiSeq2500 を用いてペアリード解析し、クリーニングした配列を S.marcescens SM39 株の既知ゲノムにマッピングし、サブトラクション解析により変異株ゲノム上の変異箇所を特定した。
【結果・考察】変異株ゲノムにはサブトラクション解析の結果、3 ヶ所の 1 塩基置換変異が見出された。いずれも ORF 内に見出されたが、アミノ酸置換を伴う
変異は 1 ヶ所だけであった。推定アミノ酸配列の相同検索結果から、変異遺伝
子はイソコリスマターゼスーパーファミリーに属する酵素をコードすると考えられた。変異は遺伝子産物の活性には影響しにくいと考えられたが、変異株は高糖濃度寛容となり 2,3-BD 生産性が向上していることから、同変異が遺伝子産物の機能に与える影響に興味がもたれた。現在、この遺伝子産物の機能を調査するために、大腸菌での発現精製を行っている。

Process simulation for efficient acetic acid production from nipa sap

Search of mutations associated with increase of the 2,3-butanediol
productivity in Serratia marcescens○Dung Van Nguyen1, Pinthep Sethapokin2, Harifara Rabemanolontsoa1,
Eiji Minami1, Haruo Kawamoto1, Shiro Saka1(1Grad. Sch. Energy Sci., Kyoto Univ., 2On leave from King Mongkut's Instit.
Technol. Ladkrabang to Kyoto Univ.)

Key words

nipa sap, acetic acid, Moorella thermoacetica, process simulation○Lin Zhang1, Takashi Ohtsuki1(1Dept. LifeEnviron. Sci., Grad. Sch. Med. Eng. Agr. Sci., Univ. Yamanashi, 2Dept.
LifeEnviron. Sci., Grad. Sch. Med. Eng. Agr. Sci., Univ. Yamanashi)

Key words

Serratia marcescens, genome mapping, Isochorismatase superfamily

200

バイオマス，資源，エネルギー工学

2P-1p123 大腸菌グルコース燃料電池の出力向上を目指した糖代謝と呼吸鎖の改変

2P-1p125 窒素除去を目的とした微生物燃料電池の単離菌を用いた評価○福井 早紀 1, 駒 大輔 2, 大本 貴士 2, 尾島 由紘 1, 東 雅之 1
（1阪市大院・工, 2大阪市工研）
azuma@bioa.eng.osaka-cu.ac.jp○荒井 雄貴, 井上 千弘, 須藤 孝一（東北大院・環境）
inoue@er.kankyo.tohoku.ac.jp

バイオマスから得られるクリーンエネルギーの一つとして、バイオ燃料電池に注目が集まっている。しかしその出力はまだ低く、改善が求められている。我々は、バイオ燃料電池の微生物触媒として大腸菌を用い、糖代謝遺伝子の欠損が出力に与える影響について 2015 年度に報告した。本発表ではそれらの結果を踏
まえ、大腸菌のグルコース代謝および呼吸鎖関連遺伝子の染色体上での改変を行い、出力を評価した結果について報告する。
出力の評価には各電極溶液量が 7.5 mL の 2 槽型セルを用いた。電極には炭素棒
もしくは炭素繊維を用い、18 時間電流と電圧を測定し出力評価を行った。また、負極槽のグルコース量を HPLC により測定しクーロン効率を計算した。染
色体上の遺伝子の改変 1)により、触媒として有利な複数の機能を大腸菌に集約することで、燃料電池に最適な菌株の構築を目指している。例えば、電子伝達系の初期段階で働く Ndhll 遺伝子(ndh)をフマル酸還元酵素の遺伝子(frdA)上に導入した組換え株を触媒に用いて出力を評価した結果、18 時間の総出力は野生型と比べ約 20％増加し、クーロン効率は 1.5 倍となった。これは、frdA の破壊に
より TCA サイクルの逆回転が抑制され、より多くの NADH が生成したこと、
さらに ndh の過剰発現により電子伝達系に流入する電子が増えたことが改善に繋がったと考えられる。現在、この株をベースにしてさらなる遺伝子改変を進めている。
1) Koma D, et. al. Appl Microbiol Biotechnol, 93, 815-829 (2012).

[背景]排水処理と発電を同時に行うシステムとして微生物燃料電池が注目されている。現在、アノード反応に微生物を用い、カソード反応には白金触媒を用いた系が研究の主流となっているが、カソード反応にも微生物を用いることが可能なことが知られている。カソード反応に微生物を用いることで、白金と比較した場合よりも低コストで、またカソード槽の反応次第では、新たな機能を持つ微生物燃料電池の提案が行える。本研究では、細胞外電子伝達系により細胞外から電子を取り込み、硝酸の還元反応を行うことが報告されている
Thiobacillus denitrificans をカソード反応に用い、硝酸イオンの除去機能を持った微生物燃料電池の評価を行う。
[方法]ポリプロピレン製セル、プロトン交換膜(Nafion117)、グラファイト製電極を用いて、二槽型の微生物燃料電池を作成した。アノード槽では、電子供与体として 20mM の酢酸ナトリウムを与え、Geobacter sulfurreducens を電子生成微生物として用いた。カソード槽では、電子受容体として 30mM の硝酸カリウ
ムを与え Thiobacillus denitrificans を電子消費生物として用いた。燃料電池は嫌気条件、30℃に保ち運転を行った。運転に伴う、電子受容体、供与体の濃度変化を確認するために、定期的にサンプリングを行い、イオンクロマトグラフによる分析を行った。また、電池の性能評価を行うために、外部抵抗を接続し、電圧の変化をデジタルマルチメータを用いて記録した。
[結果]アノード槽、カソード槽ともに微生物を用いた場合にのみ、電流が生成することが確認され、最大電力密度は 16mW/m2 であった。同時に、アノード
槽では酢酸イオンの減少が確認され、カソード槽でも硝酸イオンの減少が確認された。これにより、両極の反応に微生物を用いた場合でも電池が機能することが示され、含窒素廃水処理への応用が期待される。

Modification of glucose metabolism and respiration chain for the power
improvement of glucose fuel cell using Escherichia coli

Evaluation of Microbial fuel cell for denitrification with isolate○Saki Fukui1, Daisuke Koma2, Takashi Ohmoto2, Yoshihiro Ojima1,
Masayuki Azuma1(1Grad. Sch. Eng., Osaka City Univ., 2Osaka Mun. Tech. Res. Inst.)

Key words

Escherichia coli, microbial fuel cell, metabolism, TCA cycle

2P-1p124 好熱菌発酵産物ならびに電子供与体としての有機物添加時における硝酸態窒素減少と菌叢解析○Yuki Arai, Chihiro Inoue, Koichi Suto
(Grad. Sch. Environ. Stud. Tohoku Univ.)

Key words

Microbial Fuel Cells, denitrification, wastewater treatment

2P-1p126 蓄電性 Mackinawite の充放電前後における結晶構造解析○荒岡 亮祐 1, 井藤 俊行 2, 宮本 浩邦 3,4, 児玉 浩明 1,3（1千葉大・園芸, 2京葉プラントエンジニアリング, 3千葉大院・融合, 4サーマス）
kodama@faculty.chiba-u.jp○由井 嵐士 1, 鈴木 渓 2, 安藤 翔太 3, 田代 陽介 1, 小暮 敏博 4,
二又 裕之 1,2,5（1静大・創科技院, 2静大院・自然科学系教育学部, 3静大・工, 4東大院・理学系研究所, 5静大・グリーン研）
thfutam@ipc.shizuoka.ac.jp

窒素は植物の成長に必須の栄養素であり、作物の収量増加に直結する。そのため、現代の農業では化学肥料として硝酸態窒素(NO3-N)を土壌に投与し、作物の生産性向上を図っている。その一方で、過剰に投与された硝酸態窒素の土壌中への残留が、水質汚染や連作障害などの原因となっており、過剰な硝酸態窒素の除去は、環境保全型農業の重要課題の一つとなっている。硝酸態窒素の減少
は土壌中の微生物により還元的に行われ、亜硝酸、一酸化窒素、亜酸化窒素を経て窒素として大気中に放出される経路(脱窒)と亜硝酸からアンモニアに変化する経路(DNRA ; dissimilatory nitrate reduction to ammonium)の二つがある(1)。これらの経路では異なる微生物が様々な還元反応を触媒している。したがって、脱窒と DNRA のいずれの経路が選択されるかは、土壌微生物叢ならびに電子供
与体としての有機酸濃度に左右されると考えられるが、その詳しい作用機構は不明である。そこで我々は、モデル菌叢として好熱性発酵産物を、また電子供与体としてコハク酸ならびにエタノールを用いることで、土壌中の硝酸態窒素がどのような経路を選択して減少していくのか、その作用機構の解析を土壌微
生物叢の変化に着目して行った。好熱性発酵産物は、これまで土壌改良材として広く使用されており、脱窒作用を持つことが明らかとなっている(2)。菌叢の変化は 16S ならびに 18SrRNA 領域に関して次世代シーケンサーで解析し、バ
クテリアおよび糸状菌の変化を調べた。その結果、好熱菌発酵産物添加群では脱窒作用を持つバクテリアが増加する傾向が観察され、コハク酸およびエタノー
ル添加群では DNRA 作用を持つ糸状菌が増加する傾向が確認された。
(1)Giles et al. (2012) Front Microbiol. 2012; 3: article 407.
(2)Ishikawa et al. (2013) Appl. Microbiol. Biotechnol. 97: 1349-1359

バイオミネラルとは生物が生成した無機化合物を指し、骨や貝殻など多様な形
態や機能を有することが知られている。これまで本研究室では、微生物燃料電池 負 極 上 か ら 単 離 し た Desulfovibrio sp. HK-II 株 が Mackinawite (FeX+1S,
X=0~0.11)を主成分とする蓄電性の黒色物質(Rchargeable Bio-Material: RBM)を生成することを見出している。バイオミネラルが蓄電能を有するという報告はこれまで無く、本物質は新規蓄電材料として期待されている。そこで本研究では、RBM の充放電機構解明を最終目標とした。そのため、まず本物質および化学合
成 Mackinawite の電気化学的および物質科学的特性の比較を行った後、化学合成 Mackinawite の充放電機構解明を試みた。
充放電容量測定結果から、化学合成 Mackinawite の充放電容量は RBM と比較して約 2 倍高いことが確認された。また、走査電子顕微鏡観察から、共に襞構造を有することが確認されたが、RBM は化学合成 Mackinawite と比較して 10~100
倍大きい物質であった。したがって、化学合成 Mackinawite の充放電容量が高い要因として、襞状の微粒子であることから表面積が広く、充放電に伴う酸化還元反応が潤滑に行われる可能性が示唆された。さらに、各物質の形状が異なるのは、化学合成 Mackinawite および RBM の形成速度が異なることが要因であると示唆された。また、化学合成 Mackinaiwte の充放電実験前後の X 線回折法
から、充電時には Mackinawite であった物質が放電時に Lepidocrocite (betaFeOOH)に変化する様子が確認された。
以上の結果から、我々が見出したバイオミネラルの新たな機能である充放電能の機構解明につながる新規知見を得た。しかし、物質変化に伴う硫黄等の詳細な挙動は不明であり、それらは現在解析中である。

Microbial diversity and nitrate reduction in soil amended with compost ororganic carbon sources

Effect of charge/discharge on crystal structure of Rechargeable
Mackinawite○Ryosuke Araoka1, Toshiyuki Ito2, Hirokuni Miyamoto3,4, Hiroaki Kodama1,3(1Fac. Horticul., Chiba Univ., 2Keiyo plant engineering co.,Itd, 3Grad. Sch. Adv.
Integr. Sci., Chiba Univ., 4Sermas co.,Itd)

Key words

compost, denitrification, DNRA, microbial diversity○Arashi Yui1, Kei Suzuki2, Shota Ando3, Yosuke Tashiro1, Tshihiro Kogure4,
Hiroyuki Futamata1,2,5(1Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ.,
3Fac. Eng. Shizuoka Univ., 4Grad. Sch. Sci. Univ. Tokyo, 5Grad. Sch. Eng. Shizuoka
Univ.)
Key words
Biomineralization, Rechargeable material, Desulfovibrio, Mackinawite

バイオマス，資源，エネルギー工学

2P-1p127 微生物燃料電池アノード電極上の微生物群集細胞内代
謝解析

201

2P-1p129 脂質系バイオマスからの中鎖ホモポリヒドロキシアルカン酸の生合成とその物性解析○佐々木 大介 1, 佐々木 建吾 1, 柘植 陽太 2, 近藤 昭彦 1
（1神戸大院・科学技術イノベーション, 2金沢大・新学術創成研
究機構）
daisuke@port.kobe-u.ac.jp○廣江 綾香 1,2, 石井 大輔 2,3, 加部 泰三 4, 岩田 忠久 2,3,
田口 精一 5, 柘植 丈治 1,2（1東工大院・総理工, 2JST・CREST, 3東大院・農生科, 4JASRI, 5北大院・工）tsuge.t.aa@m.titech.ac.jp【目的】我々はこれまでに、微生物群集を対象とした網羅的な細胞内代謝解析を実施し、各代謝物の濃度から、群集の代謝状態と機能とを結びつけて評価する
ことに成功している。今回、その技術を微生物燃料電池（MFC）内の微生物群集に適用して、電流生成に寄与する代謝状態を群集の構造とともに解明し、発電性能の向上に貢献する知見を得ることを目的とした。
【方法】250 mL 容量のエアカソード型 MFC を、水理学的滞留時間 24h で運転した。代謝状態を比較するため、安定した電流生成が起こる状態とほとんど起こらない状態を創出する目的で、模擬排水の pH を 7.0 と 4.0 に調整した。電流値を指標に、定常状態までそれぞれ運転して、アノード電極上から回収した微生物群集の細胞内代謝物を抽出し、トリプル四重極 LC/MS・GC/MS を用いて解析した。また、16S rRNA 遺伝子を標的とした群集の定量・構造解析を行い、比較した。
【結果】物理化学的パラメータは pH 7.0 と pH 4.0 とで比較的に近い値を示した
が、電気化学的パラメータは全く異なる値をとったことから、代謝状態の違いが予想された。代表的な電流生成菌グループである Geobacteraceae のアノード
電極での全菌に対する割合は、電流生成が旺盛な pH 7.0 で 26.7%、ほとんど電流生成が起こらない pH 4.0 で 0.1%であった。群集構造解析からは、pH 7.0 のみで電流生成菌が優位に検出された（15.4%）。MFC の群集代謝解析では、我々が以前実施した電流生成菌；Geobacter sulfurreducens の網羅的代謝解析の結果と同様に、電流生成の大小に応じた代謝状態の違いが観察された。つまり、電流生成菌の電流生成に呼応した TCA 回路の活性化、NADH/NAD+ 比の減少、ATP/ADP 比の増加が検出された。このように、人為的に発電性能をコントロー
ルしたラボスケールの MFC において、電流生成量を微生物群集の代謝解析から特徴付けることに成功した。

【背景・目的】中鎖ホモポリヒドロキシアルカン酸(中鎖ホモ PHA)は，炭素数6~14 の中鎖 3 ヒドロキシアルカン酸(3HA)の単一重合体であり，近年新しく報告されているバイオプラスチックの一つである．従来の PHA やポリ乳酸と異なり，透明・軟質なフィルムを合成できるため，新しい用途への利用が期待されている．一方で，生産性の低さと炭素源（植物由来の精製脂肪酸）の調達が課題となっており，本研究ではこれらの課題解決に取り組んだ．また，3HA モノ
マーの側鎖長と材料物性の関連を明らかにすることを目的とした．
【実験】中鎖ホモ PHA の合成には，脂肪酸分解経路を欠損させた大腸菌を用いた．PHA 合成経路を構築するため，大腸菌に 3 遺伝子(acsPp, phaC1Pp, phaJ4Pa)を導入し，ミネラル培地で 3 日間培養した．このとき，ポリマー炭素源として，
単一脂肪酸ナトリウム精製品及び混合脂肪酸粗製製品を加え，培養条件や酵素改変によりポリマー生産量の増加を目指した．ポリマーの生産量及び組成は，ガスクロマトグラフィーにて，力学物性，熱物性は引張試験及び示差走査熱量測定で決定した．
【結果・考察】脂肪酸精製品からの生産量が 0.14 g/L, 0.008 g/L だったポリヒド
ロキシデカン酸 P(3HD)，ポリヒドロキシドデカン酸 P(3HDD)は，検討後はそれぞれ 2.51 g/L，1.44 g/L と飛躍的に向上した．また，混合脂肪酸粗製製品（ドデカン酸を 50%含む）からは，3HDD リッチな(70-80 %)中鎖ヘテロ PHA が合成可能であった．中鎖ホモ PHA の物性は，石油系生分解性ポリマーであるポリ
カプロラクトンに近く，側鎖が長いポリマーほど，機械強度・融点が上昇した．
また，3HDD リッチ PHA は，P(3HD)の物性に近く，中鎖ホモ PHA と同等に利用可能であることが示唆された．

Metabolomic profiles from microflora associated with anode electrodes in
microbial fuel cells

Biosynthesis of medium-chain-length homo polyhydroxyalkanoate andanalysis of its material property

Key words
metabolic analysis, microbial community, microbial fuel cell,
Geobacter spp.

Key words
polyhydroxyalkanoate, medium-chain-length homopolymer,
Escherichia coli, fatty acid

2P-1p128 メタノール原料からの共重合ポリヒドロキシアルカン酸

2P-1p130 3HHx を高含有率で含む共重合ポリエステルの遺伝子組○Daisuke Sasaki1, Kengo Sasaki1, Yota Tsuge2, Akihiko Kondo1(1Grad. Sch. Sci. Tech. Inno., Kobe Univ., 2Inst. Front. Sci. Init., Kanazawa Univ.)

生合成に向けた Methylobacterium extorquens AM1 の代
謝改変○Ayaka Hiroe1,2, Daisuke Ishii2,3, Taizo Kabe4, Tadahisa Iwata2,3, Seiichi Taguchi5,
Takeharu Tsuge1,2(1Interdiscip. Grad. Sch. Sci. Eng., Tokyo Tech, 2CREST, JST, 3Grad. Sch. Agric.
Life Sci., Univ. Tokyo, 4JASRI, 5Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.)

換え水素細菌による CO2 からの生合成○森 舜也 1, 丸尾 浩希 1, 折田 和泉 2, 福居 俊昭 2, 田中 賢二 1
（1近大院・産理工・生環化, 2東工大院・生命理工）
tanaka@fuk.kindai.ac.jp○海野 源人, 折田 和泉, 中村 聡, 福居 俊昭（東工大院・生命理工）tfukui@bio.titech.ac.jp【目的】Methylobacterium extorquens AM1 株は通性メチロトローフであり、そのC1 化合物代謝に関して多くの知見があることから、次世代資源であるメタノー
ルからの有用物質生産に有用である。また本菌は環境低負荷型の高分子材料であるポリヒドロキシアルカン酸（PHA）生合成能を有している。先行研究において、AM1 株の PHA シンターゼを Aeromonas caviae 由来広基質特異性 PHA シ
ンターゼ PhaCAc とした AM1CAc 株はコバルト制限条件（C1 代謝が抑制）でのメ
タノール培養において少量の 3HV (C5), 3HHx (C6)ユニットが 3HB (C4)ユニットと共重合した P(3HB-co-3HV-co-3HHx)を生合成することが示されたが、PHA 蓄
積率、3HHx 分率がともに低かった。本研究では 3HHx ユニットの供給と取り込みの強化を目指した改変を目的とした。
【方法および結果】 染色体上の PHA シンターゼ遺伝子を 3HHx ユニット重合能が高い PhaCAc 変異体 (PhaCNSDG)遺伝子に置換する相同性組換えを行った。作製した AM1CNSDG 株はコバルト非制限条件でも少量の 3HHx ユニットを含む PHA
をメタノールから生合成した。さらに AM1CNSDG 株を宿主として、C1 代謝中間体である ethylmalonyl-CoA を 3HHx-CoA の前駆体となる butyryl-CoA へ変換する ethylmalonyl-CoA 脱炭酸酵素 (Emd）の遺伝子を染色体に導入した結果、宿主株と比較して PHA 中の 3HHx 分率が増加した。emd および 3HHx-CoA 供給系
酵素遺伝子をベクター上で共発現することで、さらなる 3HHx ユニットの増加が期待される。また、得られた組換え株の半回分培養による高密度培養と PHA生産を検討する。

【目的】3-ヒドロキシ酪酸(3HB)と中鎖(C6－C12)の 3-ヒドロキシアルカン酸(3HA)が共重合したポリエステル(PHA)は柔軟性に優れた生分解性プラスチックとして期待されている。しかし、共重合 PHA を糖など安価な炭素源から合成できる菌はほとんどなく、また中鎖 3HA 含有率が低いことが課題となっている。福居らがクロトニル-CoA カルボキシラーゼ/レダクターゼ遺伝子 ccr の導入を始めとする様々な代謝改変を加えた Ralstonia eutropha は、フルクトースから 3-ヒド
ロキシヘキサン酸(3HHx)を 22.2mol%で含む P(3HB-co-3HHx)を 48wt%蓄積した
1）。今回、独立栄養条件での CO2 からの合成について検討した。
【実験】 A.caviae 由来 PHA シンターゼ変異酵素遺伝子 phaCNSDG の染色体挿入を行った R.eutropha 株を宿主とし、ccr、R.eutropha 由来(R)-エノイル-CoA ヒドラ
ターゼ遺伝子 phaJ4a、およびマウス由来エチルマロニル-CoA デカルボキシラー
ゼ の 合 成 遺 伝 子 emd を 高 発 現 さ せ た 組 換 え 株 MF01/pBPP-ccrJ4a-emd( 以 下MF01 株と称す)を作製した。これを完全無機塩合成培地に接種し、混合ガス(H2/O2/CO2=8:1:1)を基質としてフラスコ培養した。また、アセトアセチル-CoA
レダクターゼ(PhaB1)の遺伝子欠損株を宿主に用いた組換え株 MF01ΔB1 も試験した。
【結果】 菌体増殖量は MF01 株よりも MF01ΔB1 株のほうが大きく、野生株と遜色無かった。P(3HB-co-3HHx)蓄積率は MF01 株のほうが高く、培地窒素源である硫安の濃度を 0.5g/l とした際に 95.1wt%にも達した。3HHx 含有率は MF01ΔB1
株のほうが MF01 株よりもずっと多く、硫安 1.0g/l の時に 3HHx を 51.7mol%も含有していた。
1) C.Insomphun,H.Xie,J.Mifune,Y.Kawashima,I.Orita,S.Nakamura,T.Fukui, MetabolicEngineering,27,38-45,2015

Metabolic engineering of Methylobacterium extorquens AM1 for productionof polyhydroxyalkanoate copolymer from methanol.

Biosynthesis of copolymer with high 3-HHx unit from CO2 by engineered

Key words
metabolic engineering, Methylobacterium extorquens,
Polyhydroxyalkanoate, methanol

Key words
CO2fixation○Gento Unno, Izumi Orita, Satoshi Nakamura, Toshiaki Fukui(Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Tech)

Ralstonia eutropha○Shunya Mori1, Kouki Maruo1, Izumi Orita2, Toshiaki Fukui2, Kenji Tanaka1(1Grad.Sch.Humanity-Oriented Sci.&Eng.,Kindai Univ, 2Grad. Sch. Biosci.
Biotechnol., Tokyo Tech)
Ralstonia eutropha, P(3HB-co-3HHx), hydrogen-oxidizing bacteria,

202

バイオマス，資源，エネルギー工学／生物化学工学

2P-1p131 Ralstonia eutropha 代謝改変株による糖質およびグリセ
ロールからのポリヒドロキシアルカン酸共重合体の生合成

2P-2p133 糸状菌の細胞内共生を利用した新規高機能株構築法確立への試み○角田 貴一, 高野 真希, 星野 一宏（富山大院・理工）khoshino@eng.u-toyama.ac.jp

Zhang Mengxiao, 折田 和泉, 中村 聡, ○福居 俊昭（東工大・生命理工学院）
tfukui@bio.titech.ac.jp【目的】C4 および C6 ユニットからなる共重合体ポリエステルである P(3HBco-3HHx)は柔軟性に優れた環境低負荷型バイオプラスチックであり、通常は植物油・脂肪酸の β-酸化を経由した経路により生合成される。本研究ではポリヒ
ドロキシアルカン酸（PHA）生産菌 Ralstonia eutropha の複合代謝改変株により糖質やグリセロールを原料とした P(3HB-co-3HHx)生合成を目的とした。
【方法および結果】、広基質特異性 PHA シンターゼ変異酵素遺伝子 phaCNSDG の染色体挿入とアセトアセチル-CoA レダクターゼ遺伝子 phaB1 の破壊、グルコー
ス資化性付与，グリセロール資化性強化を施した R. eutropha 組換え株を宿主として、クロトニル-CoA カルボキシラーゼ/レダクターゼ遺伝子 ccrMe、短鎖特異的(R)-エノイル-CoA ヒドラターゼ遺伝子 phaJAc、マウス由来エチルマロニルCoA デカルボキシラーゼ emdMm1)を広宿主域ベクターで導入した組換え株はフル
クトースおよびグルコースから乾燥菌体重量あたり約 75 wt%で P(3HB-co-11 mol% 3HHx)を生合成した。一方でグリセロールからは P(3HB-co-4 mol% 3HHx)を
41 wt%で蓄積したが生合成速度が極度に低下し、蓄積に長時間を要したことから、グリセロール炭素源での PHA 生合成には PhaB1 の機能が重要と考えられた。グリセロール原料での共重合ポリエステルの生産性と 3HHx 分率を改善す
る改変についてさらに検討した。
1) C. Chayatip et al. Metab. Eng. 27: 38-45, 2015

【背景】自然界には他種微生物の細胞内で生育する微生物が存在している。その一例として糸状菌 Rhizopus microsoprus を宿主とし、その内部に生育する原核生物 Burkholderia sp.の共生に関する研究がされている。この現象により宿主がエンドサイトーシスなどにより細胞外微生物を内包化し、新機能の獲得が期待できる。そこでこの現象を利用し、共生による高機能株構築法を確立させるため、本研究では微生物内生化を行うための条件について検討した。
【方法】モデル微生物として糸状菌 R.microsporus を宿主、内生菌にはグラム陰性細菌 Zymomonas mobilis を使用した。各菌体の懸濁液を新鮮な培地へ植菌し、共培養することにより自然誘発的に内生化させた。導入確認は内生菌に特異的なプライマーを用いた FISH 法と PCR 法により行った。宿主および内生菌の膜電荷は中和滴定により測定した。菌体間の親和性は混合懸濁液の上部の濁度変化を測定することで間接的に求めた。
【結果・考察】自然誘発的な内生化を確認するために、共培養を行い FISH 法とPCR 法により宿主細胞内に Z.mobilis の存在が確認できた。しかし、自然誘発的な内生化は安定に実現できないことがわかった。そこで、宿主表面への内生菌吸着能が向上できれば宿主細胞内への取り込み率が向上すると考えられるので各菌体間の親和性について検討した。R.microsporus および Z.mobilis の膜電荷を測定した結果、pH7 および 6 が中和点であることがわかった。そこで、各菌体間に膜電荷が対極になると考えられる pH6.5 の溶液中で親和力を間接的に測定した結果、混合懸濁液上部の濁度は pH7 のとき最小となったため、Z.mobilis が最も多く宿主に吸着したと考えられる。現在、本研究で得られた条件下での接触導入法または、リポソームやプロトプラストを介した導入法についても試みている。

Metabolic Engineering of Ralstonia eutropha for biosynthesis ofpolyhydroxyalkanoate copolymer from sugars and glycerol

Novel Construction of Hybrid Strain by Endosymbionts in Filamentous
FungusMengxiao Zhang, Izumi Orita, Satoshi Nakamura, ○Toshiaki Fukui(Sch. Life Sci. & Technol., Tokyo Tech.)

Key words
biomass

metabolic engineering, Ralstonia eutropha, polyhydroxyalkanoate,

2P-2p132 CRISPR/Cas を用いた高耐久性酵母の創製○三ツ井 良輔, 山田 亮祐, 荻野 博康（阪府大院・工）yamada@chemeng.osakafu-u.ac.jp○Kiichi Tsunoda, Maki Takano, Kazuhiro Hoshino(Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama)

Key words

Rhizopus microsporus, endosymbiont, endobacteria

2P-2p134 麹菌 Aspergillus oryzae 金属プロテアーゼ AdmA, AdmBの炭素源飢餓条件での役割○小林 拓嗣, 大岩 達郎, 前田 浩, 竹内 道雄, 山形 洋平（農工大院・連農）y-yama@cc.tuat.ac.jp【目的】酵母 Saccharomyces cerevisiae の代謝反応を利用し、様々な有用物質を生産する研究が行われている。しかし、酵母は生育過程で生産する様々な代謝産物や発酵熱により生育阻害を受けることで、有用物質生産の効率が低下する。
したがって、様々な代謝産物や発酵熱への高い耐性を有する高耐久性酵母を創製することができれば、酵母による有用物質生産効率の向上が期待できる。そこで本研究では、ゲノム編集技術である CRISPR/Cas を用いて酵母の熱耐性および pH 耐性の向上を試みた。
【方法及び結果】ガラクトース存在下で機能する GAL1 プロモーター下流にStreptococcus thermophilus 由来 Cas9 遺伝子を、RPR1 プロモーター下流に酵母ゲ
ノム DNA 上に多数存在する δ 配列を標的化する guide RNA 遺伝子を配置した
プラスミド pUStCas_δ を構築した。プラスミド pUStCas_δ で形質転換した酵母を高温または低 pH 条件下でガラクトースを炭素源とした培地で継代培養することで、熱耐性と pH 耐性が向上したゲノム改変体をそれぞれ取得することに成功した。取得した高耐久性酵母は様々な有用物質の生産に応用可能であると考えられる。

【背景・目的】 麹菌 Aspergillus oryzae は、膜タンパク質である a disintegrin andmetalloproteinase (ADAM) をコードする遺伝子 admA, admB を持つ。哺乳類
ADAM は、細胞膜上に存在し、特定の膜タンパク質を切断、遊離することでシグナル伝達に関与することが知られている。これまでに我々は、admA, admB 遺伝子欠損により細胞壁の構成が変化し、シグナル伝達に関わる遺伝子の転写レベルが変化することを示した。これらの結果より、麹菌 ADAM も哺乳類同様に細胞膜上のタンパク質を切断することでシグナル伝達に関わる可能性が考えられたが、これらの変化に直接関与するかは不明である。我々は、麹菌 ADAMと相互作用するタンパク質を同定することでこの問題を解決することにした。
【方法・結果】 麹菌 ADAM である AdmA, AdmB の局在を解析するために、GFPとの融合タンパク質を発現する株を作製した。作製した株を蛍光顕微鏡による観察や抽出したタンパク質を抗 GFP 抗体によるウェスタンブロッティングにより解析した。その結果、AdmB-GFP は大部分が液胞で分解を受け、一部が細胞膜上に局在することが示唆された。この解析の過程で、AdmB-GFP は培養時間依存的に発現量が増加することが示され、栄養源により AdmB の発現が誘導されるのではないかと考えた。最小培地で培養後に菌体を回収し、炭素源を含まないもしくは含む培地に移し、発現解析を行った。その結果、AdmB は炭素源を含む培地よりも含まない条件で発現量が増加することが明らかになった。次に、この炭素源飢餓条件で admA, admB 欠損株とコントロール株を培養し、細胞内外のタンパク質を調製し、SDS-PAGE に供した。その結果、欠損株とコントロール株の間でバンドパターンに変化が見られた。現在、発現が変化したタ
ンパク質の同定と相互作用タンパク質候補の探索を行っている。

Improvement of stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae by
CRISPR/Cas

Roles of metalloproteases, AdmA and AdmB, under carbon starvation in
Aspergillus oryzae○Ryosuke Mitsui, Ryosuke Yamada, Hiroyasu Ogino(Dept. Chem. Eng., Osaka Pref. Univ.)

Key words
engineering

Saccharomyces cerevisiae, tolerance, CRISPR/Cas, genome○Takuji Kobayashi, Tatsurou Oiwa, Hiroshi Maeda, Michio Takeuchi,
Youhei Yamagata(United Grad. Sch. Agric. Sci., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words

Aspergillus oryzae, protease, ADAM, carbon starvation

生物化学工学

2P-2p135 微細藻類加水分解液の 2-ピロン-4,6-ジカルボン酸発酵培
地への適用

203

2P-2p137 試料の有効な前処理と SCF 法の組み合わせによる新規微生物の培養化○野口 愛 1, Htet April N 1, 仁宮 一章 2, 柘植 陽太 2, 梶田 真也 3,
政井 英司 4, 片山 義博 5, 敷中 一洋 6, 大塚 祐一郎 7, 中村 雅哉 7,
本多 了 1, 高橋 憲司 1
（1金沢大院・自科, 2金沢大・新学術, 3農工大・生物システム応科, 4長岡技科大, 5日大・生資科, 6農工大院・工, 7森林総合研）
noguchi@se.kanazawa-u.ac.jp○長谷川 智弘 1, 村山 晃一 2, 青柳 秀紀 1
（1筑波大院・生命環境, 2フタムラ化学）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp【目的】2-ピロン-4,6-ジカルボン酸 (PDC) は樹脂モノマーの前駆物質であるが，その化学的な生産方法は確立されておらず，これまで組換え微生物を用いた生物変換・発酵生産を報告してきた．しかしながら，グルコース 1 分子あたりのPDC 発酵収率は十数％にとどまっており，より変換効率の高い条件の検討（培養条件，遺伝子組み換え等）が必要である．微細藻類は細胞内に多糖（デンプン等）を蓄積することが知られており，糖原料としての利用が検討されている．
また，多糖以外にもタンパク質，脂質，灰分等が含まれていることから，本研
究では多糖以外の成分がグルコースからの PDC 変換に与える影響を検討した．
【方法および結果】微細藻類には Chlorella emersonii (NIES-2151)を，グルコース
を PDC に変換する株として既報と同一の組換え大腸菌を用いた．微細藻類の加水分解は National Renewable Energy Laboratory の手法に従った．糖源は実験系と対照系にそれぞれ藻類加水分解物と試薬グルコースをグルコース濃度で 2 g/Lになるよう添加した．また，培地の栄養分としてトリプトンと酵母エキスをそれぞれ 10 g，5 g の 1 倍，1/2 倍，1/4 倍，1/8 倍で添加した 4 条件を用意し，培養は 37℃で行った．すべての条件においてグルコースは 12 時間以内にすべて消費された．同一の糖源においては，栄養分が低くなればなるほど 48 時間後の菌体濃度・PDC 濃度は低くなったが，同一の栄養条件では実験系の方が対照系
よりもそれらが高くなった．グルコース 1 分子あたりの PDC 変換収率は実験系において最高で 20％となり，既存の知見よりも高い値となった．以上より，微細藻類の加水分解物は PDC 生産においてグルコース源だけではなく栄養源としても利用可能であることが示された．

【緒言】 寒天平板培養法（AP 法）は微生物の単離培養に広く用いられてきたが、これまでに単離培養された微生物は自然界に存在する微生物の 1％前後であり、限界が指摘されている。現在、残された 99％の未培養微生物（microbial
dark matter）の培養化、利用が求められている。この現状を踏まえ、我々は特殊セルロースフィルムを用いる SCF 法 1)を開発し、土壌等の環境試料を培養した結果、SCF 法は AP 法と異なる多様な微生物が培養化できることを明らかにした 2) 。今回は、環境試料中の微生物群集を意図的に変化させる前処理を施した系における SCF 法の有効性について検討した。
【方法と結果】 筑波大構内で採取した土壌試料を滅菌生理食塩水に懸濁した後、前処理として孔径 0.8 μm のフィルターで濾過し、試料中からサイズの大きな微生物を排除した。前処理した試料を R2A 培地を用いて AP 法と SCF 法で培養し、各プレートで得られた培養微生物群集を PCR-DGGE 法により比較解析した。その結果、前処理を施した試料でも SCF 法は AP 法と異なる微生物が培養化できた。また、前処理と SCF 法を組み合わせることでのみ培養化する新規微生物の存在が示唆された。次世代シークエンサーを用いてフィルター濾過前後の土壌試料中の微生物群集を解析した結果、フィルター濾過により未培養門に属する微生物の割合が著しく増大することが示された。種々検討した結果、フィ
ルター濾過等の試料の有効な前処理と、SCF 法を組み合わせて使用することは新規微生物の培養化に有効であることが示唆された。現在、増殖の速い微生物
を選択的に排除する前処理を用いた系での SCF 法の有効性について検討中である。1） H25 生物工学会要旨 p. 144. 2） H27 生物工学会要旨 p.139.

Application of microalgae hydrolysate to the 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acidfermentation media

Cultivation of new micro-organisms using the combination of effective pretreatments and SCF method○Mana Noguchi , April N Htet , Kazuaki Ninomiya , Yota Tsuge , Shinya Kajita ,Eiji Masai4, Yoshihiro Katayama5, Kazuhiro Shikinaka6, Yuichiro Otsuka7,
Masaya Nakamura7, Ryo Honda1, Kenji Takahashi1(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Ints. Frontier Sci. Initiative,
Kanazawa Univ., 3Grad. Sch. Bio-Appl. Syst. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.,4
Nagaoka Univ. Technol., 5Coll. Bioresour. Sci., Nihon Univ., 6Grad. Sch. Eng.,Tokyo Univ. Agric. Technol., 7Forestry Forest Products Res. Inst.)
Key words
2-pyrone-4, 6-dicarboxylic acid, microalgae, hydrolysates
1

1

2

2

3

2P-2p136 酸性条件下における寒天平板培養法の問題点の把握とSCF 法の利用○Tomohiro Hasegawa1, Koichi Murayama2, Hideki Aoyagi1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Futamura Chemical Co., Ltd.)Key words
filmagar plate, microbial dark matter, pretreatment, specialized cellulose

2P-2p138 SCF 法を用いた植物試料からの新規微生物の培養と評価（第 2 報）○小林 和輝 1, 村山 晃一 2, 青柳 秀紀 1
（1筑波大院・生命環境, 2フタムラ化学）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp○高野 力 1, 安田 竜馬 2, 村山 晃一 3, 青柳 秀紀 1,2（1筑波大・生物資源, 2筑波大院・生命環境, 3フタムラ化学）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp【緒言】 微生物の単離培養には寒天やゲランガムをゲル化剤として用いる平板培地が一般的に使用されている。しかし、酸性条件下ではゲル化剤が加水分解し、使用困難になる場合がある。これまで、経時的な培地の弾性変化の定量的把握や、その解決策の提案は十分になされていない。本研究では、好酸性菌の培養における従来の平板培地の問題点や使用可能な範囲を明らかにするとともに、その解決策として本研究室で開発した SCF 法 1)の利用を試みた。
【方法と結果】 好酸性菌の単離培養に用いられる GYE 培地と 9-K 培地を用いて種々のゲル濃度、培地濃度、培養温度、pH 1~6 の条件で寒天とゲランガムの平板培地を調製した。レオメーターを用いて経時的に平板培地の弾性を測定した
結果、すべての条件で弾性低下が認められたが、特に pH 1 や 2 で弾性が顕著に低下した。種々検討した結果、従来の平板培地では低 pH 条件下で弾性低下や不均一性が生じるため、長期間の培養には使用できない事が示唆された。また、
弾性が 8 kPa 以下になるとコロニー形成が崩れ、単離培養に支障が生じる事が示唆された（弾性に基づき単離培養に使用できる期間の推算が可能）。寒天平板培地と SCF 培地で、酸性環境から採取した試料を 30℃で培養した。PCR-DGGE
法を用いて培養微生物群集を比較解析した結果、SCF 法に特異的な細菌の存在が示唆された。現在、SCF 法を用い、低 pH 条件での長期間培養による環境試
料からの好酸性菌の培養化について検討中である。1) H25 生物工学会要旨 p.144【緒言】 寒天平板培養法（AP 法）で単離培養できる微生物は、環境中の 1%前後であることが指摘されており、残された 99%の未培養微生物（microbial dark
matter）の培養化による新たな生物資源の開拓が求められている。この現状を踏まえ我々は、本研究室で開発した特殊セルロースフィルムを用いた培養法（SCF 法）を、新規微生物の分離源としてワサビなどの種々の植物試料に適用した 1）。その結果、SCF 法と AP 法で異なる培養微生物群集が形成され、特にヒノキで大きな違いが現れた 1）。今回は、SCF 法を複数の樹木試料に適用し、培養微生物群集の解析と新規微生物の培養化を試みた。
【方法と結果】 SCF 法と AP 法を用いて、調製した種々の樹木試料（ヒノキ樹
皮、クロマツ樹皮と葉、カエデ樹皮と葉など）を塗布し、培養を行った。試料は（公財）新技術開発財団植物研究園（静岡県熱海市）で採取した。得られたコロニーの DNA を抽出し、DGGE 法で培養微生物叢を解析した結果、特にヒノキやカエデの樹皮において、SCF 法と AP 法で異なるバンドが複数検出された。また、これら樹木試料中の微生物群集と、その培養微生物群集を次世代シーケンサーにより比較解析した結果、SCF 法でのみ生育する（もしくは生育しやすい）微生物の存在が示唆された。また、樹木試料中には、新門候補を含む未培養微生物が多く存在していることが明らかとなった。種々検討した結果、樹木試料は新規微生物の分離源として優れており、SCF 法と適切に組み合わせることで新規微生物の培養化が期待できることが示唆された。現在、液体窒素を用いた試料の前処理についても検討中である。
1）H27 生物工学会要旨 p.138

Problems in agar plate culture method under acidic condition andapplication of SCF method

Cultivation of novel microorganisms from plant samples using SCF culture
method and it's evaluation (part 2)○Chikara Takano1, Ryoma Yasuda2, Koichi Murayama3, Hideki Aoyagi1,2(1Coll. Agro-bio. Resour. Sci., Univ. Tsukuba, 2Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ.
Tsukuba, 3Futamura Chemical Co., Ltd.)Key words

acid hydrolysis, acidophilic bacteria, agar, specialized cellulose film

○Kazuki Kobayashi1, Koichi Murayama2, Hideki Aoyagi1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Futamura Chemical Co., Ltd.)Key words
bark

microbial dark matter, PCR-DGGE, specialized cellulose film, tree

204

生物化学工学／バイオプロセス

2P-2p139 最少量の低毒性イオン液体で前処理したバイオマスからの糖化・発酵生産プロセスの開発

2P-2p141 組換えタンパク質発現時における共発現 LEA ペプチドの発現条件の至適化○志津田 有成 1, 仁宮 一章 2, 柘植 陽太 2, 梶田 真也 3, 政井 英司 4,
片山 義博 5, 敷中 一洋 6, 大塚 祐一郎 7, 中村 雅哉 7, 高橋 憲司 1
（1金沢大院・自科, 2金沢大・新学術, 3農工大・生物システム応科, 4長岡技科大, 5日大・生資科, 6農工大院・工, 7森林総合研）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp○池野 慎也, 岩水 岳教（九工大院・生体工）
ikeno@life.kyutech.ac.jp【目的】現在、石油資源の代替資源として木質系バイオマス資源の利用が期待されている。木質系バイオマスから単糖を製造し燃料や有用物質へ変換する際、効率的な酵素糖化のためにはリグノセルロースの複雑な構造を緩和する糖化前処理を行う必要がある。近年、イオン液体を用いた前処理が提案されている。
しかし、イオン液体は高価であり、生体触媒を阻害してしまうという問題があるため、イオン液体量を削減し、かつ低毒性なイオン液体を用いる必要がある。
そこで本研究では、イオン液体量を削減するため、共溶媒としてジメチルスル
ホキシド(DMSO)を添加し、低毒性なイオン液体としてコリン酢酸(ChOAc)を用
いて糖化前処理を行った。そして、イオン液体前処理の問題点を改善し、糖化・発酵まで一貫した有用物質生産プロセスの開発を目的とした。
【方法および結果】まず、イオン液体量を削減するため、前処理の際のBiomass:ChOAc:DMSO 比を検討した。結果、Biomass:ChOAc:DMSO=1:1:1 が最適な前処理条件であることが示唆された。次に、in situ 糖化（イオン液体の存在下でバイオマスを酵素糖化すること）の際のイオン液体の最適な希釈倍率を検討した。結果、最適な希釈倍率は ChOAc の 20 倍量であると示唆された。最後に、上記で得られた条件を用いて、前処理、in situ 糖化を行い、得られた糖化液からの ethanol もしくは 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid の発酵生産まで一貫して実験を行った。その際、ChOAc は発酵微生物に対して毒性を示すことが考えられたため、発酵の前に電気透析にて ChOAc を取り除いた。結果、電気透析後の糖化液を炭素源として、発酵が可能であることが分かった。

【背景と目的】 LEA(Late Embryogenesis Abundant)タンパク質は植物の種子や一部の動物から発見された天然変性タンパク質であり、細胞内のタンパク質等を保護する機能を担っている。当研究室ではこの LEA タンパク質内の繰り返し配列をモチーフとして LEA ペプチドを設計し、大腸菌内で目的タンパク質と共発現させると目的タンパク質の発現量が増大することを報告してきた。しかし、LEA ペプチドの発現量とその発現誘導のタイミングを変化させた際の目的タン
パク質の発現量を評価できていなかった。本研究では、目的タンパク質と LEAペプチドを異なる発現系を用いて共発現させることで、目的タンパク質発現に対しての LEA ペプチドの発現量および発現誘導のタイミング等、発現条件の至適化を行った。
【実験方法と結果】 pBAD 系ベクターと pET 系ベクターに目的タンパク質である GFP 遺伝子と LEA ペプチド遺伝子をそれぞれ導入し、発現系の構築を行った。GFP を L-Arabinose、LEA ペプチドを IPTG で発現誘導し、各発現誘導剤の添加量を調整することで GFP の発現量を評価した。L-Arabinose 添加量およびIPTG 添加量に対して、GFP 発現量を評価したところ、LEA ペプチドを 0.1mM
IPTG で発現誘導を行うと、GFP の発現量が極大となった。この条件で、0.8％の L-Arabinose で GFP の発現誘導を行うと、LEA ペプチドを共発現させなかった場合と比較して GFP 発現量は約 10 倍となった。一方、LEA ペプチドを GFP
発現誘導前に発現させると、GFP の発現が著しく増大することを明らかにした。

Saccharification and fermentation from biomass pretreated with minimum
amount of biocompatible ionic liquid

Optimizing condition of co-expression LEA peptide for the recombinant
protein expression in E.coli○Yusei Shizuta , Kazuaki Ninomiya , Yota Tsuge , Shinya Kajita , Eiji Masai ,Yoshihiro Katayama5, Kazuhiro Shikinaka6, Yuichiro Otsuka7, Masaya Nakamura7,
Kenji Takahashi1(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Ints. Frontier Sci. Initiative,
Kanazawa Univ., 3Grad. Sch. Bio-Appl. Syst. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.,4
Nagaoka Univ. Technol., 5Coll. Bioresour. Sci., Nihon Univ., 6Grad. Sch. Eng.,Tokyo Univ. Agric. Technol., 7Forestry Forest Products Res. Inst.)
Key words
Lignocellulosic biomass, Ionic liquid pretreatment, 2-pyrone-4, 6dicarboxylic acid
1

2

2

3

4

2P-2p140 遺伝子組換え大腸菌を用いたフェニル乳酸生産に影響を与える遺伝子の発現解析○宮川 寛規 1, 川口 秀夫 2, 荻野 千秋 1, 老沼 研一 3, 高谷 直樹 3,
近藤 昭彦 2
（1神戸大院・工, 2神戸大院・科学技術イノベーション, 3筑波大院・生命環境）ochiaki@port.kobe-u.ac.jp○Shinya Ikeno, Takanori Iwamizu(Grad. Sch. Life Sci. Syst. Eng., Kyushu Inst. Technol.)Key words

Escherichia coli, protein expression, LEA peptide, L-arabinose

2P-2p142 転写因子改変放線菌を用いた異種タンパク質生産○柏木 紀賢 1, 西岡 雅都 1, 廣瀬 修一 2, 曽田 匡洋 2, 荻野 千秋 3,
近藤 昭彦 1
（1神戸大院・科学技術イノベーション, 2長瀬産業・ナガセR&Dセンター, 3神戸大院・工）akondo@kobe-u.ac.jp

フェニル乳酸（PhLA）は、バイオプラスチックなど化成品の工業原料や医薬品
原料としての活用が期待されている。これまでに、遺伝子組換え大腸菌を用いた発酵法により、グルコースから 29 g/L の生産性が報告されているが、産業利用に向けたさらなる生産性の向上が求められる。発酵生産による PhLA の収率
は、基質となるグルコースの濃度と負の相関関係を示すことが報告されている。
しかし、このメカニズムはまだ解明されていない。そこで本研究では、遺伝子組換え大腸菌による PhLA 発酵の生産性の向上を目的に、グルコース供給制限
による PhLA 収率増加のメカニズムを解析した。
【方法・結果】グルコース濃度が PhLA 発酵細胞における遺伝子発現に与える影響を調べるために、初期グルコース濃度が高い条件（40 g/L）と低い条件（5 g/
L）のフラスコ培養細胞から total RNA を抽出して、各種遺伝子の発現量を定量
PCR により比較解析した。その結果、低グルコース濃度条件では芳香族アミノ酸トランスアミナーゼをコードする tyrB の発現量が、高グルコース濃度条件より約 1/2 倍に減少していた。この結果から、低グルコース濃度条件では、PhLA
生合成と拮抗する下流のシキミ酸経路のフェニルアラニン生合成が抑制されることで、PhLA 収率が増加していた可能性が示唆された。
現在、上記の遺伝子発現の違いをグルコース消費の定常状態で調べるために、
ジャーファメンターを用いた流加培養によりグルコース供給の十分条件と制限
条件を確立し、2 条件から回収した細胞におけるキーエンザイムをコードする
遺伝子発現量の比較を行っている。

放線菌は形態学的に着目されている土壌細菌であり、二次代謝生産能や様々な分泌酵素を生産する点から着目されている。様々な遺伝子改変ツールも近年開発されており、抗生物質、宿主由来のタンパク質、異種タンパク質等の物質生産を行う宿主としても放線菌は着目される。我々は以前、Streptoverticillium
cinnamoneum 由来の Phospholipase D プロモーターを用いて、放線菌宿主から異種タンパク質を大量生産する技術を開発した。更なるタンパク質生産向上を目指すため、内在遺伝子の改変を試み、異種タンパク質生産の生産量を評価した。
遺伝子改変のターゲットとして、複数の菌体内遺伝子発現に影響を与えると考えられる転写因子に着目した。
Streptomyces lividans 1326 を元株にして、複数の転写因子をターゲットに各 1 遺伝子破壊株、1 遺伝子過剰発現株を作成した。作成した株に Stv. cinnamoneum
由来の Phospholipase D タンパク質発現ベクターを導入し、分泌タンパク質の生産量や酵素活性により評価を行った。その結果、複数の転写因子改変株でタンパク質の生産量や酵素活性の値に変化が確認された。また、転写因子改変株の中にはこれまでに報告例がない表現型変化を行っている株も見られた。本発表ではこれらの結果をまとめて紹介したいと考えている。

Effects of glucose concentration on gene expression patterns during
phenyllactic acid production by recombinant Escherichia coli

Effect of transcription factor mutation in Streptomyces lividans on
recombinant protein production○Hiroki Miyagawa1, Hideo Kawaguchi2, Chiaki Ogino1, Ken-Ichi Oinuma3,
Naoki Takaya3, Akihiko Kondo2(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Technol. Innov., Kobe Univ., 3Grad. Sch.
Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

Escherichia coli, Phenyllactic acid, Shikimate pathway○Norimasa Kashiwagi1, Masato Nishioka1, Shuichi Hirose2, Masahiro Sota2,
Chiaki Ogino3, Akihiko Kondo1(1Grad. Sch. Sci. Tech. Inov., Kobe Univ., 2Nagase Co., Ltd., 3Grad. Sch. Eng, Kobe
Univ.)

Key words
Streptomyces lividans, strain engineering, transcription factor,
recombinant protein

バイオプロセス

2P-2p143 グラム陰性菌由来のファイバータンパク質による微生物の固定化と表層提示技術の統合

205

2P-2p145 PEG 鎖長の異なる光分解回収型 PEGylation 試薬の合成と評価○金兵 知毅 2, 山口 哲志 1, 塩田 英史 2, 岡本 晃充 1,2（1東大・先端研, 2東大院・工）okamoto@chembio.t.u-tokyo.ac.jp○中谷 肇, 小原 優季, 堀 克敏
（名大院・工）nakatanih@nubio.nagoya-u.ac.jp

本研究では Acinetobactor 属細菌由来の三量体型表層タンパク質である AtaA
ファイバーの高い着性と、AtaA ファイバーを利用した表層提示技術とを同時に利用可能な方法論の確立を目的とした。
2 種類のファイバーを区別するために提示用ファイバーには AtaA の部分欠損変異体（deltaNHisAtaA）を利用し、N 末端に His-tag を融合した。また、2 種類のファイバーを提示する際にヘテロ三量体が生じ、機能が損なわれることがない
ように、三量体化に必要な膜貫通ドメイン（TM）に着目し、提示用ファイバーの TM を他の TAA の TM に置換したタンパク質を設計した。これらの提示用
ファイバーを Tol 5 細胞で発現させ、表層発現していることをフローサイトメ
トリーで確認後、付着試験を行った。その結果、膜貫通ドメインを置換した変異体を発現させた場合は相加的な付着量の増加が観察され、膜貫通ドメインを置換していない変異体を発現させた Tol 5 細胞は付着量が減少していた。透過型電子顕微鏡によって細胞表層に生えている AtaA ファイバーを観察したとこ
ろ、膜貫通ドメインを置換していないファイバーを発現させた Tol 5 細胞では野生型の AtaA ファイバーの本数が少なく、膜貫通ドメインを置換したファイバーを発現させた Tol 5 細胞では、細胞表層に球状の頭部を持つ野生型のファイバーが多く見られた。このことから、膜貫通ドメインを置換していない表層
提示用 AtaA ファイバーを Tol 5 細胞で発現させると野生型の AtaA ファイバーと干渉し、ヘテロマーを形成し、AtaA の付着能に影響が及ぶことが推定された。したがって、AtaA を利用し、異なる機能を持つファイバーを複数表層提示させるためには、AtaA の膜貫通ドメインの入れ替えが有効に働くことが示唆された。

タンパク質性医薬品は、バイオ医薬品市場におけるシェアを年々拡大している。
しかし、タンパク質は外部環境の変化や界面での吸着などによって変性し、高濃度条件下では容易に凝集する。そのため、医療現場に届くまでの製造、運搬、保管の過程で変性・凝集が生じ、それに伴う薬効の損失や血栓や重度の免疫応
答による人体への悪影響が懸念される。そこで、タンパク質性医薬品の高濃度水溶液を製造現場からベッドサイドに届くまで高度に安定化する技術が求められている。
タンパク質性医薬品の安定化法として、ポリエチレングリコール(PEG)をタン
パク質に修飾する PEGylation 法が広く用いられ、タンパク質の凝集抑制の効果が報告されている。一方、嵩高い PEG 鎖が基質のアクセスを阻害することによる活性損失や、PEG 化タンパク質を複数回投与した際に産生される抗 PEG 抗体による血中滞留性の低下、といった問題も指摘されている。そこで、我々は光分解回収型 PEGylation 法を開発してきた。本手法では、光分解性リンカーを介して PEG 鎖を修飾することによってタンパク質を安定化し、使用直前に光照
射によって簡便・迅速に PEG 鎖を分解脱離できる。また、脱離した PEG 鎖は固相に吸着除去されるため、未修飾のタンパク質のみの溶液に戻すことができる。
モデルタンパク質としてニワトリ卵白リゾチーム(HEWL)を用いて、本手法の有用性を検証した。熱安定性解析により、PEG 鎖修飾による安定化効果が確認され、また、光照射による PEG の脱離および固相吸着による脱離 PEG の除去も確認された。さらに、PEG 化 HEWL はほとんど活性を示さなかったのに対し、光照射によって活性が回復し、未修飾の HEWL に近い比活性を示すことが確認された。本発表では PEG 鎖長を変えることで見られる安定化効果ならびに活性回復率への影響についても報告する。

Integration of bacterial immobilization and surface display by a bacterial
surface fiber protein.

Synthesis and evaluation of photocleavable and recoverable PEGylation
reagents with various lengths○Hajime Nakatani, Yuki Ohara, Katsutoshi Hori
(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

Key words

Acinetobacter , TAA, immobilization, surface display

2P-2p144 ボロン酸ゲルによる希少ヘキソースの新規分離法の確立○後藤 成暁 1, 十川 直也 1, 野崎 智帆 1, 吉原 明秀 2, 森本 兼司 2
（1香川大学院 農学研究科, 2香川大学国際希少糖研究教育機構）
morimoto@ag.kagawa-u.ac.jp＜目的＞ 希少糖とは、「自然界にその存在量が少ない単糖とその誘導体」であり、一部の希少糖は生理機能を有することから健康食品や医薬品への応用が期待されている。当研究室では微生物由来の異性化酵素を用いて希少糖の生産を行っているが、反応後の分離が問題となっている。本研究では生産コストや生産効率を改善するためにボロン酸と希少糖との親和性に着目し、酵素反応液か
ら希少糖の分離について検討した。

○Tomoki Kinpyo2, Satoshi Yamaguchi1, Hidefumi Shiota2, Akimitsu Okamoto1,2(1RCAST, Univ. Tokyo, 2Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)

Key words

PEGylation, Stabilization of protein, Photo irradiation, Protein drug

2P-2p146 抗体精製用プロテイン A クロマトグラフィー担体の高機能化○西八條 正克 1,2, 鴻池 史憲 1,2, 荻原 侑莉恵 1,2, 中野 喜之 1,2,
船木 正大 1,2, 水口 和信 1,2（1カネカ, 2MAB組合）
Masakatsu.Nishihachijo@kaneka.co.jp＜結果および考察＞ 本研究で試験した 10 反応液のうち明確に分離できたのは
6 反応液であった。例えばフルクトースとプシコース混合液およびプシコースとアロース混合液は、グリシン-NaOH 緩衝液（pH8.5）を溶出液に用い流速 0.5
mL/min の条件で分離され、タガトースとガラクトース混合液は、リン酸ナトリ
ウム緩衝液（pH8.0）を溶出液に用い流速 0.5 mL/min の条件で分離された。残りの 4 種はピークが重なり分離できなかったことや、反応産物への平衡比が低く分離の確認までには至らなかった。しかしながら、条件を検討すれば将来的にボロン酸は各種希少糖の分離が可能であることが示唆された。現在、緩衝液の種類や温度などの条件について検討中である。

【背景と目的】 抗体医薬品の製造において、培養工程の抗体発現量は近年の技術革新により飛躍的に向上している。高発現培養液は高濃度の抗体だけでなく、従来の培養液よりも多くの不純物を含み、精製工程への負担を大きくしている。
精製工程の中では抗体を選択的に吸着し、高純度に精製可能なプロテイン A ク
ロマトグラフィー担体（以下、PA 担体）によるキャプチャー工程が特に重要である。これまでの PA 担体開発は繰り返し使用のためのアルカリ洗浄に対応した改良を中心に進められてきたが、最近では高発現培養液に対応した高機能化が求められている。例えば、単位時間当たりの生産性向上のための高流速化・
高結合容量化、不純物除去能の向上及び高濃度抗体の凝集体形成を避けるための抗体酸溶出特性の改善等が挙げられる。
【方法と結果】
我々は、計算化学と遺伝子工学的手法を用いたプロテイン A リガンドの改変と基材への固定化技術の深耕により、リガンドの単点（配向性制御）固定化による抗体結合容量の向上に加えて、抗体溶出特性や不純物除去能も改善した新規
PA 担体を開発した。新規 PA 担体は 60 g/L 以上の高い動的結合容量を示し、かつ、市販 PA 担体に比べ温和な酸性 pH 条件で抗体を溶出可能であった。この優れた抗体溶出特性によって溶出液体積の低減、溶出液中の不純物（宿主由来タンパク質や DNA、抗体の凝集体）含量の低減、さらには溶出液の pH 中和工程
での抗体の高回収率などが可能になった。本発表では、新規開発した PA 担体の基本性能に加え、細胞培養液を用いた場合の性能評価結果についても紹介する。

Development of a novel separation method of rare hexoses using boronic
acid gelHigh performance Protein A chromatography resin for antibody
purification＜方法＞ さまざまな微生物由来の酵素を用いて 4 種のケトヘキソースを基質として 10 種の反応液を調製した。これらの希少糖混合液をボロン酸ゲルが充填されたカラムに供した。ボロン酸は、アルカリ側の pH で糖との親和性が増加することが報告されていることから、本研究では溶出液に pH8.0 以上のリン酸ナ
トリウム緩衝液もしくはグリシン-NaOH 緩衝液を用いた。分離させる温度はコ
スト削減の観点から室温に設定した。分離後の各画分を HPLC で分析した。

○Shigeaki Goto1, Naoya Sogawa1, Chiho Nozaki1, Akihide Yoshihara2,
Kenji Morimoto2(1Kagawa Univ. Agric, 2Internationsal Inst. Rare Sugar Res. Educ., Kagawa Univ.)

Key words

rare sugar○Masakatsu Nishihachijo1,2, Fuminori Konoike1,2, Yurie Ogihara1,2,
Yoshiyuki Nakano1,2, Masahiro Funaki1,2, Kazunobu Minakuchi1,2(1Kaneka Corp., 2MAB)

Key words

Protein A, affinity chromatography, antibody

206

バイオプロセス

2P-2p147 低分子化抗体精製用アフィニティクロマト担体の開発○村田 大 1,2, 吉田 慎一 1,2, 荻原 侑莉恵 1,2, 西八條 正克 1,2,
船木 正大 1,2, 水口 和信 1,2（1カネカ, 2MAB組合）
Kazunobu.Minakuchi@kaneka.co.jp

2P-2p149 抗体及び低分子化抗体精製向け新規プロテインＬアフィ
ニティー充てん剤の機能評価○田中 亨, 小林 秀峰, 荒木 康祐, 中谷 茂
（東ソー）
tooru-tanaka-pb@tosoh.co.jp【背景と目的】 低分子化抗体は、Fab や scFv に代表されるような多様なフォー
マットがあり、次世代型抗体医薬品や診断薬として開発が進められている。これらの低分子化抗体は、Protein G（PG）担体や Protein L（PL）担体を使用した
精製プロセスの検討が試みられている。しかし市販の PG 担体および PL 担体
は、分子種によって結合容量や回収率が低くなるという課題があり、プラット
フォームへの適用が困難である。一般的には低分子化抗体の精製にはイオン交換担体等を組合わせたプロセスが用いられ、品目毎に複雑な条件設定が必要となる。しかし、汎用性の高いアフィニティ担体を開発できれば、低分子化抗体
精製プロセスのプラットフォーム化が可能になると期待できる。
【方法と結果】
PG 担体に関しては、in vitro screening 法を用いた PG の改変により、Fab への結合能が野生型 PG と比較して数十倍向上した改変 PG を開発した。改変 PG を固定化した担体は、Fab に対する高い結合容量と 90%以上の高い精製回収率を達成した。PL 担体に関しては、各種 Fab との結合能評価をベースとした PL の改変により、抗体結合スペクトルの広い改変 PL を開発した。改変 PL を固定化した担体は、既存の PL 担体には結合しない Fab に対しても高い結合容量を示し、汎用性の高さを確認した。
本発表では、次世代の低分子化抗体精製用アフィニティ担体である上記新規 PG
担体および新規 PL 担体の機能評価を中心に発表する予定である。

【背景と目的】ガンや自己免疫疾患の治療薬として抗体医薬品が開発され、近年、市場が大きく拡大している。しかし、現在利用されている抗体医薬品は動物細胞培養により生産される完全分子型が主であり、高い製造コストや標的組織への低浸透性が課題となっている。そのため、低分子量化（Fab、scFv、
Diabody など）による低コストな微生物生産系の適用や組織浸透性改善についての研究開発が活発に行われている。一方、完全分子型抗体は精製プロセスにおいて Fc 領域に親和性を持つ Protein A をリガンドとしたアフィニティークロ
マトグラフィー（AFC）が標準的に利用されているのに対し、Fc 領域を含まな
い低分子化抗体は Protein A をリガンドとして利用することができない。そこで、このような低分子化抗体の精製でも利用可能な AFC 用充てん剤として、抗体の κ 軽鎖に親和性を持つ組換え Protein L を親水性多孔質ポリマーに導入した、TOYOPEARL® AF-rProtein L-650F を開発した。今回の発表ではその基本特性について報告する。
【方法】本充てん剤をカラムに充てんし、ヒト Fab 動的吸着容量、抗体溶出挙動、及びカラム圧力損失を評価した。また、アルカリ耐久性の評価として、充てん剤を NaOH 水溶液に浸漬し、吸着容量の経時変化を調べた。
【結果】Fab 動的吸着容量を他社 Protein L 充てん剤と比較した結果、50%以上高い値を示した。つづいて、完全分子型抗体及び Fab の溶出挙動を評価したとこ
ろ、いずれも pH3～4 の酸性緩衝液で溶出・回収が可能であった。また、パイロットスケールの充てんカラムにおいて、高流速かつ低圧力で操作可能であることを確認した。充てん剤の洗浄に汎用される NaOH 水溶液に対する耐久性に関しては、他社品と比べて約 2 倍高いことが分かった。以上の結果から、本充てん剤は低分子化抗体の高効率精製に有用と考えられた。

Affinity chromatography resin for antibody fragments purification

Functional evaluation of a novel protein L affinity resin for purification of
antibodies and their fragments○Dai Murata1,2, Shinich Yoshida1,2, Yurie Ogihara1,2, Masakatsu Nishihachijo1,2,Masahiro Funaki1,2, Kazunobu Minakuchi1,2(1Kaneka Corp., 2MAB)

Key words

Protein G, Protein L, affinity chromatography, antibody fragments

2P-2p148 Fc レセプターを用いた抗体分析用アフィニティ分離剤による糖鎖改変抗体の解析○Toru Tanaka, Hidetaka Kobayashi, Kosuke Araki, Shigeru Nakatani(Tosoh Corp.)

Key words

purification, antibody fragments, Fab, protein L

2P-2p150 光応答性マイクロウェル法を用いた細胞の選別○高木 理沙 1, 山口 哲志 2, 榊原 昇一 3, 田端 和仁 1, 野地 博行 1,
飯野 亮太 4, 岡本 晃充 1,2（1東大院・工, 2東大・先端研, 3阪大産研, 4分子研）
yamaguchi@bioorg.rcast.u-tokyo.ac.jp○山中 直紀, 寺尾 陽介, 田中 亨, 朝岡 義晴, 青木 大, 西山 しずか,大江 正剛, 井出 輝彦（東ソー）
naoki-yamanaka-cc@tosoh.co.jp【背景と目的】抗体医薬はがんや炎症、免疫疾患などの難治療領域を対象とする
ことからその市場が拡大している。特にがん領域における免疫細胞を介した細胞傷害活性を作用メカニズムとする抗体医薬の開発が活発に行われ、抗体の Fc領域に結合する N 型糖鎖の構造、存在割合がその活性を左右することが知られている。このことから翻訳後修飾などにより分子多様性を有する抗体医薬は適切な方法でその品質を維持し、同一性を担保することが求められている。
著者らはこれまでに抗体糖鎖構造を認識しその違いに基づき抗体を分離する Fc
レセプター(FcR)をリガンドとした分離剤を開発してきた。本発表ではその FcR
分離剤を用いて異なる糖鎖構造を有する抗体を分析し、結合特性・分離特性を評価したので報告する。
【方法】CHO 細胞株に目的抗体発現ベクターを導入し、異なる糖鎖構造を有す
る抗体産生細胞株の作製を行った。独自に開発した FcR リガンドを固定化した分離剤を用いて糖鎖改変抗体を分析した。各々の抗体の細胞傷害活性、及び N型糖鎖構造と FcR 分離剤を用いて得られた分離結果を照合し解析した。
【結果】作製した 2 種類の糖鎖改変抗体を試料として FcR 分離剤を用いてクロマト操作を行った結果、保持時間が異なるピークが得られた。また、これらの抗体を用いて特性解析を行ったところ細胞傷害活性及び糖鎖構造分布に明らかな違いがあることを確認した。

細胞生物学の基礎研究から再生医療までの幅広い分野において、一細胞レベル
で細胞を選別することによって細胞の更なる解析や利用を可能にする技術が求められている。近年、マイクロウェル中に細胞を一つずつ入れて並べ、画像解析によって細胞を識別し、マニピュレーターで目的の細胞を一つずつ回収する
一細胞アレイ技術が報告されている。この手法では、一細胞ずつの形態や表現
型を多角的かつ継時的に解析できるため、既存法である FACS や MACS では選別が困難な細胞種をより正確に識別することができる。一方、マニピュレーター
を用いた回収は時間がかかり、特別な装置を要する。そこで、我々は、よりハ
イスループットに細胞を回収できるマイクロウェル法の開発を志向し、光応答性マイクロウェル法の開発を行ってきた。光応答性マイクロウェル法では、流路内にてマイクロサイズのウェルに光分解性のゲル材料で細胞を一つずつ固定化する。画像解析により細胞を識別後、目的の細胞を含むウェルのみに光を照射してゲルを溶解させ、選択的に細胞を取り出すことができる。そこで、本研
究では、この光応答性マイクロウェル法を用いて、細胞の選別を試みた。モデルとして蛍光タンパク質を発現させた BaF3 細胞と発現させていない BaF3 細胞を用意し、それらを混ぜたモデル細胞検体を一細胞ずつウェル内に並べ、固定化した。蛍光顕微鏡観察によって蛍光を有する細胞を識別し選択的に光照射を行った後、流路に培地を流すことによるせん断応力を利用して、光溶解したウェ
ルから細胞を取り出した。その後、流路の出口から細胞を回収し、培養後に蛍光を有する細胞の比率を調べることによって、細胞選別の精度を確認した。本
発表では、動物細胞以外に、藻類の選別を行った結果についても報告したい。

Analysis of sugar chain modified antibodies with the affinity resin couplingengineered Fc receptor

Cell sorting using photo-responsive microwell method○Naoki Yamanaka, Yosuke Terao, Toru Tanaka, Yoshiharu Asaoka, Masaru Aoki,
Shizuka Nishiyama, Seigo Ooe, Teruhiko Ide(Tosoh Corp.)

Key words

affinity resin, Fc receptor, antibody, sugar chain○Risa Takagi1, Satoshi Yamaguchi2, Shouichi Sakakihara3, Kazuhito Tabata1,
Hiroyuki Noji1, Ryota Iino4, Akimitsu Okamoto1,2(1Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo, 2RCAST, Univ. Tokyo, 3ISIR, Osaka Univ., 4IMS)

Key words

single cell, photo-responsive hydrogel, micro-wellセル＆ティッシュエンジニアリング

2P-2p151 Analysis of cell migratory dispersion through spatial
measurement of nucleus density

207

2P-2p153 ラット骨髄培養細胞における時計遺伝子 Per2 発現の振動開始位相の解析

切明 研人 1, 深浦 恵梨 1, ○藤原 政司 1, 西出 真也 2, 本間 さと 2,
本間 研一 2, 髙木 睦 1（1北大院・工, 2北大院・医）takagi-m@eng.hokudai.ac.jp○Ziyu Chen, Mee-Hae Kim, Masahiro Kino-oka(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp

The major aim of the proposed work is to develop a quantitative understanding of cell
migratory dispersion, a process that is closely linked to stages of development, tissue
repair, and tumor metastasis. To better understand the quantitative contributions of cell
dispersion, we have developed a novel culture system for measuring cell dispersion
with quantitative fluorescent imaging approaches. Retinal pigment epithelial (RPE)
cells at the confluent state were obtained after 7-day culture in the limited area insideof removable ring, and after ring removal. In further culturing, tight junction, ZO-1 andnuclei of cells were stained, which determined the cell density, and ZO-1- positive celldensity, along with radius direction from center of the culture to the outer. In theculture with the ring removal, the random migration of the cells in the peripheral
region was observed and nucleus density toward the outside of ring increased, and theirZO-1 expression was negative. This suggested that the removal of region limitation
released physical restriction in the periphery region of cultured cells and induced cell
migration. Thus, our culture system can evaluate cell dispersion potential throughspatial measurement of nucleus density, and the ring culture system also induce thepreferential cell migratory dispersion in a number of different cell types, suggestingthat it is a useful tool for evaluation in incipient functional impairment of cell-celladhesion in stages of development, tissue repair, and tumor metastasis.

【目的】培養細胞中の時計遺伝子 Per2 発現の概日振動が、振動減衰後の培地交
換、血清刺激、グルコース添加などの操作により再び誘起されることは確認されているが、各操作による振動開始位相を比較して解析した報告はほとんどない。そこで、本研究では Per2 プロモーターにルシフェラーゼを連結したレポーター遺伝子を導入した Per2::Luc ラットの骨髄由来間葉系幹細胞（MSC）様細胞を用いて、各操作による振動開始位相を比較して解析することを目的とした。
【方法】MSC 様細胞を 35Φ ディッシュに高密度で接着させた後、ルシフェリン（100 μM）および 5%または 10%FBS 含有 DMEM-LG 培地に交換して、10 分毎にルシフェラーゼ発光強度を測定した。測定開始 5 日後に発光強度が減衰した
時点で、培地交換（グルコース濃度 0.9 g/L）、血清刺激（5%血清培地から 50%
血清培地への交換）、グルコース添加（0.9 g/L）の各操作を行い、さらに 3 日間測定した。発光強度の振動曲線から、振動ピークの位相を 0 rad、ピーク前をマ
イナス rad、ピーク後をプラス rad、すなわち振動の谷を π rad と定義して、各操作直前および直後の位相を算出した。
【結果・考察】振動減衰後の位相（操作直前の位相）がピーク付近、または谷付
近の時点で、上記の各操作を各々行った。その結果、いずれの操作でも操作直後の位相は操作直前の位相と相関がなく、操作の種類毎にほぼ等しくなった。
その操作直後の位相の平均は、培地交換では－0.05π rad、血清刺激では－0.44π
rad、グルコース添加では 0.21π rad と、操作の違いにより大きく異なることがわかった。これらの操作直後の位相の値を各操作による振動開始のメカニズムと合せて考察した。

Analysis of cell migratory dispersion through spatial measurement of
nucleus density

Initial phase of circadian oscillation of clock gene Per2 expression in
cultured rat bone marrow cells○Ziyu Chen, Mee-Hae Kim, Masahiro Kino-oka(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
cell adhesion

cell migratory dispersion, spatial measurement of nuclei density, cell-

Kento Kiriaki1, Eri Fukaura1, ○Masashi Fujiwara1, Shin-ya Nishide2, Sato Honma2,
Ken-ichi Honma2, Mutsumi Takagi1(1Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ., 2Grad. Sch. Med., Hokkaido Univ.)

Key words

circadian oscillation, clock gene, luciferase, Per2

2P-2p152 糖尿病性腎症おける細胞外マトリクスの早期変遷解析

2P-2p154 軟骨再生用間葉系幹細胞のマイクロキャリアによる増殖【背景と目的】糖尿病性腎症(DN)は近年、我が国における透析治療の導入原因
第一位の難疾患である。透析治療はリスクを抱え、多大な時間と費用を費やす
為、DN 治療法の開発は患者の QOL 向上に必須である。DN 腎では、細胞外マ
トリクス（ECM）タンパクが過剰に蓄積し、線維症を誘発、長期的には腎機能不全を引き起こすとされている。よって本研究では、糸球体（血液濾過を司る組織）の ECM に着目し、DN 発症早期における ECM 変遷を解析することで、DN 腎で生じる ECM タンパク変性と腎機能障害の関係の解明を目指す。
【材料・方法】糖尿病誘発剤 STZ（ストレプトゾトシン）を腹腔内投与することにより、早期 DN モデルマウスを作製した。一方、クエン酸緩衝液を投与したマウスをコントロールとした。投与 2，4 週間後の腎組織に（１）組織切片染色、（２）タンパク質を抽出、ゲル濾過の各フラクションに含まれる ECM を
Dot blot 法で検出することによる、ECM 変遷解析を行った。
【結果】DN 早期で既に ECM 蓄積が始まっていることが組織切片染色により明らかになった。また、DN 糸球体内において、炎症誘発性 ECM の蓄積、マクロ
ファージの浸潤を始めとする炎症関連因子の存在が、免疫染色により認められた。さらに、Dot blot 法による ECM 変遷解析により、DN 腎において、基底膜を構成する主要な ECM である IV 型コラーゲンとラミニンの低分子化と、間質系 ECM である I 型コラーゲン、フィブロネクチンの高分子化が観察された。これらの結果から、DN 発症早期では、血液濾過機能を司る基底膜 ECM の消化される一方、間質組織由来の ECM の会合や線維形成、炎症誘発性 ECM の蓄積が起こっていることが示唆された。
【考察】DN 腎でみられる過剰な ECM の蓄積は、複数種類の ECM の破壊と再構成を繰り返した過程から生じる結果であると推測される。また、ECM 蓄積には炎症が関係している可能性が示唆された。

【目的】自家と異なり他家軟骨再生で必要となる大量のヒト間葉系幹細胞(MSC)の培養方法として、マイクロキャリア培養の可能性を検討した。
【方法】ヒト骨髄由来 MSC を 10% FCS 含有 DMEM 培地を用いて表面型マイクロキャリア(Cytodex 1, GE Healthcare 社)に接着させ、スピナーフラスコ中(液量10 ml)で 37℃、5% CO2 雰囲気下で撹拌培養した。さらに、マイクロキャリアからマイクロキャリアへのトリプシンを用いない継代方法（Beads-to-beads 継代法）を検討するとともに、表面抗原(CD90、CD166)の陽性率をフローサイトメー
ターにより測定した。
【結果・考察】マイクロキャリアの浮遊に必要な最低撹拌速度である 30 rpm 以
上の種々の撹拌速度(30, 60, 90 rpm)で培養したところ、マイクロキャリア凝集体の割合は各々 64, 32, 20 %となったが、最終細胞濃度は 60 rpm で最も高かった。Beads-to-beads 継代後も継代前と同等の増殖速度で増殖した。さらに 60 rpm
での増殖では MSC 表面抗原の陽性率は約 90%に維持されていた。以上から、
マイクロキャリア(Cytodex 1)を用いた MSC の大量培養の可能性を確認することができた。

Analysis of transitional changes of extracellular matrix at early stage ofdiabetic nephropathy

Growth of mesenchymal stem cells using microcarrier for regenerative
medicine of cartilage○赤塚 愛里 1, 村澤 裕介 2, 王 碧昭 1
（1筑波大院・生命環境, 2国立長寿医療セ）
wang.pichao.ft@u.tsukuba.ac.jp○Airi Akatsuka1, Yuksuke Murasawa2, Picao Wang1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Natl. Center Geriatrics
Gerontology)

Key words

glomeruli, extracellular matrix, inflammation, diabetes○天笠 翼 1, 髙橋 伊織 1, 目良 恒 2,3, 脇谷 滋之 3, 髙木 睦 1（1北大院・工, 2新潟大・魚沼基幹病院, 3武庫女大・健スポ）
takagi-m@eng.hokudai.ac.jp○Tsubasa Amagasa1, Iori Takahashi1, Hisashi Mera2,3, Shigeyuki Wakitani3,
Mutsumi Takagi1(1Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ., 2Uonuma Kikan Hosp., Niigata Univ., 3Sch.
Health Sports Sci., Mukogawa W. Univ.)

Key words

mesenchymal stem cell, microcarrier, agitation, CD90

208

セル＆ティッシュエンジニアリング

2P-2p155 デジタルホログラフィック顕微鏡を用いた位相差解析によるガン細胞識別

2P-2p157 マウス神経幹細胞/前駆細胞における亜鉛制御関連遺伝
子の発現解析

○西川 麻裕, 森 英樹, 原 正之
（阪府大院・理）hara@b.s.osakafu-u.ac.jp○髙木 睦, 倉島 つぐみ（北大院・工）takagi-m@eng.hokudai.ac.jp【目的】再生医療用の細胞培養では、非侵襲的にガン細胞の混入有無を診断することが望ましい。これに対して当研究室で、細胞透過光に生ずる位相差を位相
シフトレーザー顕微鏡 (PLM) を用いて調べた結果、正常細胞、ガン細胞の各々の細胞内の位相差プロファイルの形を利用して、両者を識別できることがわかった。そこで、PLM より安価で小型なデジタルホログラフィック顕微鏡(DHM)を用いた細胞内の位相差プロファイルの解析によるがん細胞識別の検討を目的とした。
【方法】上皮様のヒト正常前立腺上皮細胞 (PREC) およびヒト前立腺ガン細胞株(PC-3)、さらに線維芽様のヒト正常骨髄間葉系幹細胞 (MSC)およびヒト骨肉腫
細胞 (HuO-3N1) を 35Φ ディッシュに接着後、下からレーザー光を透過して DHM
により細胞内全個所の位相差を定量した。培養中の未知細胞の細胞内位相差プ
ロファイル形状が正常細胞とガン細胞のいずれの典型的プロファイルに近いかを示すパラメーター Cancer index (CI) を計算した。測定後細胞を固定し、DAPI
で核を染色後、蛍光顕微鏡で観察した。
【結果・考察】上皮様細胞、線維芽様細胞ともに、ガン細胞、正常細胞 (各 n =10) の CI は各々 100%の確率で正および負の値となり、識別できることがわかった。また、細胞内位相差プロファイルの最高値付近に核が存在すること、正常細胞の方が核が伸長して大きくなっていることが分かった。従って、正常細胞とガン細胞の位相差プロファイル形状の差は、屈折率の高い核の伸長の違いによる可能性があると考えられた。

【背景と目的】神経発生において神経幹細胞の分化や移動といった現象に多くの亜鉛結合タンパク質が関与することが報告されているにもかかわらず、中枢神経系を構築する細胞を生み出す神経幹細胞における亜鉛制御機構については知られていない。神経幹細胞に対する亜鉛の影響評価は神経発生毒性に関わる亜鉛制御機構を明らかにするとともに、神経幹細胞の亜鉛含有培地の改良にも役立つ。本研究ではマウス神経幹細胞/前駆細胞（NSPC）の分化過程における亜鉛トランスポーターを中心とした亜鉛制御タンパク質の発現を解析することを目的とした。
【方法と結果】胎齢 14 日目の ICR マウス脳から採取し、細胞増殖因子（20ng/mL EGF, 20 ng/mL b-FGF）を含む培地で培養した NSPC と、1%ウシ胎仔血清を含む培地でさらに 7 日間培養し neuron と astrocyte に分化誘導した細胞を実験に用いた。細胞に塩化亜鉛（ZnCl2）を添加し一定時間培養後、金属結合タンパ
ク質 metallothionein ファミリー遺伝子（Mt1, Mt2, Mt3, Mt4）及び金属トランスポーター遺伝子の発現を定量的 RT-PCR 法で調べた。Mt は NSPC よりも分化誘
導後の細胞で高発現していた。Mt1, Mt2 は亜鉛濃度に依存して発現量が上昇したのに対し、Mt3, Mt4 の発現量は亜鉛濃度に依存しなかった。亜鉛を細胞外から細胞内に輸送する亜鉛トランスポーターのうち、Zip8 は NSPC、Zip4 は分化誘導細胞で顕著に発現量が高かった。NSPC が分化する過程において亜鉛ホメ
オスタシスの維持機構が変化している可能性が示唆された。また、分化誘導に伴い ZnCl2 に対する細胞の感受性が変化したことから、培養条件下で亜鉛濃度を調節することが神経幹細胞の増殖性を高めたり、細胞種を制限して選択的に培養する技術として利用できる可能性がある。

Noninvasive discrimination of cancer cell by phase-shift analysis using
digital holographic microscope

Expression analysis of genes associated with zinc regulation in mouse neural
stem/progenitor cells○Mutsumi Takagi, Tsugumi Kurashima(Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.)

Key words

noninvasive discrimination, cancer cell, laser phase shift, DHM

2P-2p156 動物細胞の機能変化を利用したクロム検出○小川 亜希子, 保坂 浩章, 田中 雄士（鈴鹿高専）
ogawa@chem.suzuka-ct.ac.jp○Mayu Nishikawa, Hideki Mori, Masayuki Hara
(Grad. Sch. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Key words

zinc, neural stem cell, differentiation

2P-2p158 凍結保護剤を用いない瞬間凍結保存法における保存期間の細胞生存率への影響○篠瀬 真人 1, 上野 明 2, 山口 修一 2, 秋山 佳丈 1
（1信州大院・理工学, 2株式会社マイクロジェット）aki@shinshu-u.ac.jp

動物細胞は、クロム化合物により糖質代謝や増殖といった生理機能が変化し、その変化量（感受性）は、細胞の種類によって異なることが知られている。本
研究では、動物細胞のクロム感受性を利用し、六価クロムと三価クロムとを別々に検出し、各クロムについて定量可能な分析法の構築を目指している。
初めに我々は、動物体内でのクロム分布情報、細胞機能との関連性について調査した。その結果、三価クロムは生体内で血液、肝臓、腎臓などに分布し、糖の取り込みや代謝促進に関与していることが分かった。また、六価クロムはヒトや動物に対しアレルギー性皮膚炎を生じることや発癌性をもつこと、神経毒
性、遺伝的毒性、免疫毒性といった生体障害性を有することが分かった。これらの情報を基に、クロムに対して感受性が高いと期待された３種類の細胞株を選択した。選択した細胞株は、Hep G2(ヒト由来肝実質細胞株)、PANC-1(ヒト膵癌由来細胞株)および V79（肺由来線維芽細胞株）である。
続いて各細胞株を対象とし、MTT アッセイと LDH 細胞毒性試験を用いて、細胞の活動度（活性）測定を行った。結果、六価クロムについては、MTT アッセ
イで PANC-1 が他の２種の細胞に比べて低濃度な六価クロムを検出できた。一方、LDH 細胞毒性試験では検出できなかった。三価クロムについては、まずEDTA を用いて三価クロム錯体を形成させた後、無血清培地を用いて試験した。
MTT アッセイでは、Hep G2 が他の細胞に比べて低濃度な三価クロムが検出された。一方、LDH 細胞毒性試験については、PANC-1 のみで三価クロムが検出された。

【背景・目的】細胞凍結保存において，凍結時の水分子の結晶化を抑え，細胞への損傷を防ぐことが重要である．従来の細胞凍結保存法では，氷晶の生成や成長を抑制するために，凍結保護剤を添加しているが，凍結保護剤による細胞毒性の問題がある．そこで我々は，凍結時の冷却速度が高いほど，結晶サイズは小さくなることに着目した．微小液滴を吐出可能なインクジェット技術を用いて微小液滴中に細胞を内包し，液体窒素で冷却した基板に吐出することで，瞬間的に細胞を凍結する．それにより，氷晶の生成や成長を抑制し，細胞の損傷を抑えることで，凍結保護剤を用いない細胞凍結保存法の開発を目指す．本研
究では，瞬間凍結による保存期間を設けたときの細胞生存率への影響を評価す
る．
【方法】細胞を瞬間的に凍結するために，インクジェット装置と液体窒素を用いた凍結装置を開発した．本装置は，細胞を内包した約 20 pL の液滴を液体窒素で冷却したガラス基板に吐出することで，細胞を瞬間的に凍結する．そして，
このガラス基板を予め液体窒素で冷却しておいたクライオチューブに入れ，液体窒素凍結保存容器の気相中で 1 週間保存した．その後，37℃に温めた培養液にガラス基板ごと浸すことで，急速に細胞を解凍した．解凍後 3 時間培養し，Calcein AM および PI を用いて細胞の生死判定を行った．
【結果・考察】凍結保存期間を設けずに凍結後すぐに解凍したときの生存率は58.2 ％であったのに対し，凍結保存期間を 1 週間とした場合の生存率は 46.9 ％と低下した．この原因として，ガラス基板をクライオチューブへ移動させるわ
ずかな時間に凍結した液滴が昇温し氷晶の生成や再結晶化による成長が起きた可能性や，凍結された微小液滴中の水分が昇華し，保存中に細胞が凍結乾燥状態になった可能性が考えられる．

Detection of chromium by changing the functions of animal cells

Influence of cryopreservation period to cell viability in flash freezing
method without cryoprotectant○Akiko Ogawa, Hiroaki Hosaka, Yushi Tanaka(Nat. Inst. Tech., Suzuka)

Key words

chromium, MTT assay, LDH activity assay○Masato Shinose1, Akira Ueno2, Shuichi Yamaguchi2, Yoshitake Akiyama1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Shinshu Univ., 2MICROJET Co.)

Key words
free

flash freezing, inkjet cell printing, cryopreservation, cryoprotectant-

セル＆ティッシュエンジニアリング

2P-2p159 iPS 細胞技術を利用した機能的ヒト NKT 細胞の大量培
養とがん免疫療法モデル

209

2P-2p161 単一集塊でのヒト iPS 細胞培養における高密度化の限界についての検討○山田 大輔, 伊豫田 智典, 谷口 克, 藤井 眞一郎, 古関 明彦（理研 統合生命医科学）
daisuke.yamada@riken.jp○植野 真伍, 紀ノ岡 正博（阪大院・工）kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp

NKT（Natural killer T）細胞は NK マーカーを発現しながら遺伝子再構成されたT 細胞受容体（TCR）を有する T 細胞の亜群で，キラー T 細胞とヘルパー T 細胞の機能を併せ持つ特異的な T 細胞である．拘束される抗原提示分子や，抗原
特異性，T 細胞受容体の可変性などによっていくつかのグループに分けられるが，その多くは TCR の α 鎖に可変性のないインバリアントな TCR（Vα24-Jα18）を発現する細胞である．この TCR は MHC/HLA ではなく CD1d という糖脂質抗原を乗せる分子を認識する．したがって NKT 細胞は HLA に拘束されることなく活性化され様々なサイトカイン，ケモカインを産生することができる．特に多量に産生されるインターフェロンガンマにより，自然免疫系 NK 細胞および獲得免疫系キラー T 細胞を共に増殖促進・活性化させること（アジュバント効果）と NKT 細胞自身の NK 活性により抗腫瘍効果を発揮する．実際に NKT 細胞標的がん治療の臨床試験が行われ長期平均生存期間延長効果が認められた．
しかし担がん状態に伴って NKT 細胞の減少，機能不全などのために，この治療法を希望する全ての患者に適用できていない．そこで本研究では iPS 細胞技術を利用して機能的な NKT 細胞を大量に調製することを目的とした．
まず末梢血またはさい帯血由来のヒト NKT 細胞を糖脂質抗原を乗せた樹状細胞（Dendritic cell: DC/Gal）により活性化後，センダイウイルスベクターにより初期化因子を導入し iPS（NKT-iPS）細胞の樹立をおこなった．次に NKT-iPS
細胞から NKT 細胞への分化誘導については既に報告されていたヒト ES 細胞から T 細胞への分化誘導方法を改良することで成功した（iPS-NKT 細胞）．さらにこの iPS-NKT 細胞を純化培養する方法を確立し，最終的に 5x107 個の iPSNKT 細胞を調製することができた．本発表では iPS-NKT 細胞の機能に関しても議論したい．

【背景および目的】ヒト人工多能性幹細胞 (iPS 細胞) は，再生医療あるいは創薬ツールへの応用が期待されている．iPS 細胞を用いて組織や臓器を構築するためには，未分化状態の細胞を効率的に増幅させる培養プロセスの確立が求められる．しかし，産業スケールでの有効な培養手法は未だ確立されていない．例
えば，バイオリアクターを用いた懸濁培養法は，液流によるシェアストレスが生じるため，集塊同士の合一や崩壊が引き起こされる．本研究では，培養底面に高密度にディンプルが配列された 6 well micro-patterned plate を用いて，単一集塊を同プレート内で静置させたまま複数同時に培養し，均質な集塊を高密度で培養する培養手法を提案する．
【方法および結果】6 well micro-patterned plate を用い，hiPS 細胞 (Tic，成育医療センター ) を Stem fit AK02N 培地 (Ajinomoto) 下で 168 h 培養，播種から 96 h 後以降は細胞数の計測を 24 h ごとに行った．培地交換は，培養期間を通じて培地
成分の枯渇や老廃物の蓄積が起こらない培地交換頻度を算出して行った．コン
トロールとして 24 h ごとに培地交換を行った条件でも細胞数の計測を行った．
その結果，培地交換頻度を増やした条件における最終到達細胞密度はコントロー
ルの約 1.5 倍であった．このことから培地交換頻度を増加させることによって，最終到達細胞密度の向上を達成できることが示された．またこの最終到達細胞
密度は，バイオリアクターを用いた懸濁培養法での最終到達細胞密度よりも高い値であった．以上の結果より 6 well micro-pattered plate を用いた単一集塊培養
法は，既存の培養法と比較して，均質な集塊を高密度で培養できる新たな培養手法であることが示された．

Application of iPS technology for NKT cell-mediated tumor immunotherapy

Investigation of maximum cell density in 3D static aggregate culture of
hiPSCs○Daisuke Yamada, Tomonori Iyoda, Masaru Taniguchi, Shin-ichiro Fujii,
Haruhiko Koseki(RIKEN IMS)

Key words
killer T cell

NKT, induced pluripotent stem cell, tumor immunotherapy, natural

2P-2p160 ボツリヌス菌由来 Hemagglutinin を用いたヒト iPS 細胞の高密度懸濁培養法の確立○Shingo Ueno, Masahiro Kino-oka(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
densityhuman induced pluripotent stem cell, single aggregate culture, high cell

2P-2p162 クローン培養系を用いたヒト iPS 細胞培養中に生じる不均質性の解明○山本 陸 1, 都倉 知浩 1,2, Nath Suman Chandra 1, 金 美海 1,
紀ノ岡 正博 1（1阪大院・工, 2藤森工業）
kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp○近藤 伸彦, 金 美海, 紀ノ岡 正博（阪大院・工）kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp【緒言】
ヒト人工多能性幹細胞 (hiPS 細胞) を用いた再生医療分野において細胞の大量培養技術が必要とされている．培地量当たりの獲得細胞数が大きい三次元懸濁培
養は細胞の大量培養手法として優位であるが未だ課題も多い．懸濁培養中ではhiPS 細胞は球状細胞集塊を形成するが，培養液中での合一や増殖による集塊径の増大は増殖阻害を引き起こす．増殖阻害を回避するため集塊分割が行われる
が，既存の酵素処理による集塊分割手法では単一細胞への分離により細胞自死が誘導され細胞密度が減少する．また酵素処理による分割は煩雑な操作が要求されスケールアップの際に，より簡便な操作が要求される．本研究では hiPS の培養において，細胞間接着を特異的に阻害し集塊分割を行う新たな継代操作を開発し，高密度培養を達成した．
【方法及び結果・考察】
二次元平面上で培養した hiPS 細胞 (Tic，成育医療センター) を回収，単一細胞処理を行い 30 mL 攪拌培養槽 (Able Co.) に播種，懸濁培養を行った．継代操作として，従来の継代操作（酵素処理を用いた継代操作；細胞集塊の洗浄，酵素処理，集塊分割，洗浄，細胞播種）と新規の継代操作（ボツリヌス菌由来ヘマ
グルチニン (HA) を用いた継代操作；HA 添加，暴露，物理的集塊分割，洗浄，再播種）を比較したところ，従来の酵素処理法では，再播種後，操作時のストレス由来の細胞死による細胞数の低下及びその後の再増殖に対するラグタイムが観察されていたが，HA を用いる新方法では，両者が見られず，継代後，良好な再増殖が確認された．
また HA の細胞分割効果は一定の時間経過とともに減衰することが確認され，
HA を用いた継代操作には，分割後の洗浄が不要であることが分かった．そこで，HA による細胞分割操作を高密度培養へ適用した結果，未分割の条件と比較し高密度な培養を達成することが可能となった．

【背景および目的】ヒト人工多能性幹細胞（iPS 細胞）は再生医療や創薬への応用に向けて研究が広く行われている．これらの応用に向けて，iPS 細胞の質を維持したまま増幅させるための培養手法の開発が活発になってきている．培養手法の開発と平行して，「iPS 細胞の特性，安全性の検証」および「質の良いiPS 細胞の判定」は，iPS 細胞の品質管理を行うために取り組まなくてはならな
い重要な課題である．そこで本研究では，単一の細胞から増殖したことが保証されるクローン培養系を用いたヒト iPS 細胞培養中に生じる不均質性の解明を行った．

High density culture of hiPSCs through disruption of aggregate with HA in
suspension culture

Evaluation of heterogeneity in maintenance culture of human iPS cells using
clonal culture system

Key words
human induced pluripotent stem cell, cell-cell adhesion, disruption ofcell aggregate, high density culture

Key words○Riku Yamamoto1, Tomohiro Tokura1,2, Suman Chandra Nath1, Mee-Hae Kim1,
Masahiro Kino-oka1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Fujimori Kogyo Co.,LTD)【方法および結果】継代培養中のヒト iPS 細胞を StemFit 培地とラミニン 511-E8
フラグメント（iMatrix-511）でコートした培養面に 6.5 cells/cm2 の密度で播種した．播種直後に画像取得を行い単一細胞であることを確認し，11 日目までクローン培養を行った．培養終了後，未分化マーカーの１つである Oct3/4 に対する免疫染色を行い，細胞が未分化状態であるか確認した．細胞が形成したコロ
ニーの面積を測定した結果，面積には 0.19 から 1.5 mm2 まで大小のばらつきがあることが確認された．さらに，大きさが 0.83 mm2 以上のコロニーでは未分化状態から逸脱した細胞が発生することが確認された．これらの結果から，通常の継代培養を行っている細胞には，分裂速度が異なる細胞集団が混在しており，分裂速度が高い細胞集団ほど，未分化状態からの逸脱（変異細胞の発生）が起こる可能性が高いことが示唆された．以上より，細胞形態の異型に分けて評価することが困難であるフィーダーレス培養中の iPS 細胞において，クローン培養系を用いることで不均質性を評価することが可能であると考えられる．

○Nobuhiko Kondo, Mee-Hae Kim, Masahiro Kino-oka(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

iPS cells, Heterogeneity, Clonal culture, Cell quality

210

セル＆ティッシュエンジニアリング

2P-2p163 紫外線照射コラーゲンゲル上で培養した脳毛細血管内皮細胞におけるインテグリン遺伝子の発現解析

2P-2p165 光増感反応で生じた活性酸素種がラット間葉系幹細胞の分化へ及ぼす影響○土岐 麻菜, 佐藤 綾香, 森 英樹, 原 正之
（阪府大院・理）
morihide@b.s.osakafu-u.ac.jp

城田 裕介, 森 英樹, ○原 正之（阪府大院・理）hara@b.s.osakafu-u.ac.jp【目的】コラーゲンは紫外線（UV）照射により分子間架橋される。3 重らせん構造を持つ I 型コラーゲンで形成された線維化コラーゲンゲルに UV 照射すると蛋白質分子間が架橋され、ゲル表面の構造や粘弾性に変化が生じる。我々は以前に、ゲルの UV を照射がマウス由来脳毛細血管内皮細胞株である bEnd.3 細胞の線維化コラーゲンゲル表面に対する接着性や伸展性を高めることを発見した。本研究では、bEnd.3 細胞の線維化コラーゲンゲル表面への接着機構を探る
ため、UV 照射コラーゲンゲル上で培養した同細胞で接着分子インテグリンの遺伝子発現変化を解析した。
【方法と結果】0.5%I 型コラーゲン溶液と 10 倍濃度リン酸緩衝生理食塩水を混合し、ディッシュ上にて 37℃で一晩静置して線維化コラーゲンゲルを作製した。このゲルに UV 照射したものを UV 照射コラーゲンゲルとした。UV 照射／未照射コラーゲンゲル上で細胞を培養すると、各々のゲル上の細胞で異なる
接着性及び伸展性を示した。各ゲル上で培養した細胞におけるインテグリン遺伝子の発現量を定量的 RT-PCR 法を用いて測定し ΔΔCt 法にて比較した。その結果、UV 未照射コラーゲンゲル上の細胞で高かった Itgα2 の発現が UV 照射コ
ラーゲンゲル上の細胞では低下した。更に、UV 照射コラーゲンゲル上で生じた細胞の形態変化が未変性のコラーゲン分子を添加することによって元に戻るかどうかを検討するため、0.02%コラーゲンを培地に添加し、UV 照射コラーゲ
ンゲル上で培養した細胞を観察した。その結果、コラーゲンを添加したことによる細胞の増殖や形態の大きな変化は殆どみられなかった。このことから、UV
照射コラーゲンゲル上における細胞の接着性や形態変化はゲル表面の粘弾性や微細構造などの物理的要因によるものではないかと考えられる。

【背景と目的】活性酸素種が従来から知られる細胞傷害性とは別に、幹細胞の増殖や分化の調節に影響を及ぼすことが最近報告されている。しかし、その機構については未解明の点が多い。光増感色素に対する光照射によって活性酸素種が発生する光増感反応を利用すれば、細胞培養容器内での活性酸素発生を制御しやすくなる。本研究では、骨、軟骨、脂肪細胞に分化できる体性幹細胞である間葉系幹細胞（MSC：mesenchymal stem cell）を用いて、可視光照射下の光増感色素から生じた活性酸素種が培養した MSC の生存と骨細胞への分化傾向に与える影響を調べた。
【方法と結果】7 週齢 F344 雄ラットの大腿骨から MSC を採取し、15％(v/v)ウシ
胎仔血清(FBS)含有 MEM 培地（増殖培地）中で培養し、増殖させた。光増感反応を起こさせるために、光増感色素である 1 μM hematoporphyrin（HP）または
10 μM rhodamin B（RhB）を培地に添加し、白色 LED 光源による白色光を室温にて照射した。細胞が生存できる光照射条件を決めるために、細胞生存率試験
によって光照射時間を検討し、光照射時間を 10 分間に設定した。光照射処理以降の培地には増殖培地または Dexamethasone 等を含んだ骨分化誘導培地を用い、
14 日間培養した。培養１日目の MSC の分化関連遺伝子 Runx2, Alpl, Sox9, Acan,
Pparg, Cebpa、アポトーシス関連遺伝子 Bcl2, Bax2 の遺伝子発現レベルの変化を調べた。光照射処理後、増殖培地で培養した MSC では分化関連遺伝子とアポ
トーシス関連遺伝子はやや発現が増加する傾向が見られた。

Expression analysis of integrin genes in bEnd.3 cells cultured on UVirradiated collagen gels

Effects of ROS induced by photodynamic reaction on the differentiation of
rat mesenchymal stem cells○Mana Doki, Ayaka Sato, Hideki Mori, Masayuki Hara
(Grad. Sch. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Key words

collagen, ultraviolet, integrin, endothelial cell

2P-2p164 ポリアミド繊維上における神経幹細胞／前駆細胞の接着と三次元的な伸展

Yusuke Shirota, Hideki Mori, ○Masayuki Hara
(Grad. Sch. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Key words
reactive oxygen species, mesenchymal stem cell, photodynamic
reaction, differentiation

2P-2p166 膵 β スフェロイドの遠心充填による立体組織作製○大西 希咲, 榎本 詢子, 福田 淳二（横国大院・工）fukuda@ynu.ac.jp○森 英樹, 藤田 雅徳, 原 正之
（阪府大院・理）
morihide@b.s.osakafu-u.ac.jp【目的】神経幹細胞／前駆細胞（NSPC）はニューロンやグリア細胞への多分化
能と自己複製能を有する中枢神経系の体性幹細胞である。NSPC の増殖には無血清培養によってニューロスフェアと呼ばれる細胞集塊を形成しながら増殖させる培養法が用いられる。ニューロスフェア培養では細胞の密度が高まると培
養容器中でニューロスフェア同士の接着が生じ、より大きな細胞集塊を形成する頻度が高まり、培養容器底に溜まりやすくなる。本研究ではニューロスフェ
ア同士の接着を減らすために細胞が接着できる網目状ポリアミド線維を用いてNSPC を培養し、細胞集塊の形成や増殖にどのように変化するかを検討した。
【方法及び結果】Polyamide-6,6（PA66）メッシュに γ 線（0-60 kGy）を照射した
後、アクリル酸水溶液に 25℃、24 時間浸漬することにより PA66 繊維上にポリアクリル酸（PAA）をグラフト重合した。最もグラフト率が高かった 60％(v/v)
アクリル酸水溶液への浸漬条件を用い、更に PAA 上にゼラチンや細胞外マトリクス成分を含むマトリゲルの修飾処理を行った。これらの PA66 繊維上でマウス胎仔（E14）脳由来 NSPC を培養し、繊維上への接着、増殖、細胞集塊形成を観察した。繊維上に接着した NSPC は 2 日目から顕著に増殖した。未処理のPA66 繊維やゼラチン修飾 PA66 繊維にも NSPC は接着し、細胞集塊を形成が見られたが、マトリゲル修飾 PA66 繊維では NSPC は繊維上に細胞が三次元的に伸展する様子が見られた。PA66 繊維上の細胞集塊を Nestin、GFAP、TubulinβIII
抗体を用いて蛍光免疫染色をおこなった。多くの Nestin や GFAP 陽性の細胞が繊維上を伸展していた。

【目的】糖尿病に対する現在の治療法として、インスリン注射や膵島移植が用いられているが、合併症やドナー不足といった課題がある。そこで近年、新たな方法として、生体外で作製した細胞組織体を移植する再生医療が注目されている。その実現には、必要な細胞を大量に調製し、さらに、立体的な組織作製する手法の確立が求められる。そこで、本研究では、膵 β 細胞を大量調製するための培養器作製と、円柱状の組織体（シリンドロイド）の作製および移植手法の確立を目的とした。
【方法・結果】細胞の大量調製を実現するため、球状凝集体（スフェロイド）の作製が可能な培養器を考案した。スフェロイド培養を行うことで、大量の細胞の培養に必要な面積を低減できるだけでなく、インスリン分泌などの機能の向上も期待できる。そこで、微細加工機を用いて、直径 500 μm のウェル構造を有する鋳型を作製した後、酸素透過性が高いシリコーンゴム（PDMS）を鋳型に流して転写することで、スフェロイド培養器を作製した。作製した培養器を用いて膵 β 細胞（MIN6、神戸大清野先生より提供）を 3 日間培養することで、
直径約 150 μm のスフェロイドを大量に作製することができた。培養器の底面からも酸素を供給することで、膵 β 細胞の増殖活性とインスリン遺伝子の発現が促進されることを確認した。続いて、作製したスフェロイドは、4 分間の遠心操作のみで中空糸膜（内径 570 μm、孔径 0.2 μm、東洋紡より提供）内に充填され、シリンドロイドを作製できることを示した。さらに、中空糸とシリンジを接続し、培地の水圧によってシリンドロイドを回収し、生死染色と PCR 遺伝
子解析により組織体の評価を行った。その結果、回収したシリンドロイドは膵
β 細胞としての機能を有しており、注射の要領で組織を生体内に移植できる可能性が示された。

Adhesion and three-dimensional extension of neural stem/progenitor cells onpolyamide fibers

Fabrication of Cylindroid by centrifugation of Pancreatic Spheroids○Hideki Mori, Masanori Fujita, Masayuki Hara
(Grad. Sch. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Key words

fiber, neural stem cell, polyamide, three dimension○Kisaki Onishi, Junko Enomoto, Junji Fukuda(Grad. Sch. Eng., Yokohama Natl. Univ.)

Key words

pancreas, spheroid, cylindroid, PDMS

セル＆ティッシュエンジニアリング

2P-2p167 ヒト iPS 細胞由来脂肪細胞を用いた没食子酸エピガロカ
テキンの機能性評価○清水 康子 1, 大貫 喜嗣 1, 河野 高徳 2, 卯川 裕一 2, 提坂 裕子 2,
望月 和樹 1, 黒澤 尋 1（1山梨大院・総研部, 2株式会社・伊藤園・中央研究所）
kurohiro@yamanashi.ac.jp【背景・目的】
肥満を予防するために、健康機能性食品が注目されている。その中でも茶カテ
キンは飲料として簡単に摂取することができる。しかし、茶カテキンが脂肪細胞の増加や脂肪の蓄積を抑制する作用は明らかになっていない。この原因として、脂肪細胞研究に使用されるヒト脂肪細胞のロット間差や、脂肪細胞分化の源となる間葉系幹細胞がすぐに脂肪細胞への発生能力を失ってしまうことが挙げられる。そこで、我々は無限増殖能を有し、遺伝的背景が既知であるヒト iPS
細胞から分化誘導した脂肪細胞を用いて食品機能性成分の評価を目指している。
本研究では、ヒト iPS 細胞から脂肪細胞へ分化誘導後、茶カテキンの主成分である没食子酸エピガロカテキン(Epigallocatechin gallate; EGCG)の抗炎症効果および脂肪蓄積抑制効果について検討した。
【方法】
本研究では、Hemopoietin Cocktail(HC)を用いた方法(以下、HC 法)を使用し、白色脂肪細胞および褐色脂肪細胞を選択的に分化誘導した。分化誘導後の脂肪細胞の種類および EGCG による脂肪蓄積能(代謝能)への影響を定量 RT-PCR による遺伝学的解析によって調べた。
【結果・考察】定量 RT-PCR の結果から、EGCG 非添加群と比較して EGCG 添加群では、褐色脂肪細胞へ分化誘導した細胞において、PPARγ1 および HOXC9 の遺伝子発現量が減少し、PRDM16 が増加した。PRDM16 は褐色脂肪細胞化シグナルを促進させるため、脂肪細胞の褐色化が促進されている可能性がある。これにより白色脂肪細胞が減少し、その特異的マーカーである HOXC9 の発現量の減少が引き起こされたものと考えられる。白色脂肪細胞へ分化誘導した細胞においても、
PRDM16 および HOXC9 に同様の傾向がみられた。以上により、EGCG はヒト
iPS 細胞由来脂肪細胞の褐色化を促進することが示唆された。

Evaluation of functional activity of epigallocatechin gallate using adipocytes
derived from human iPS cells.
○Yasuko Shimizu1, Yoshitsugu Ohnuki1, Takanori Kawano2, Yuuichi Ukawa2,
Yuko M. Sagesaka2, Kazuki Mochizuki1, Hiroshi Kurosawa1(1Grad. Fac. Interdisc. Res., Univ. Yamanashi, 2ITO EN LTD., Central Res. Inst.)

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2P-2p169 アプタマー修飾オリゴペプチド層を用いた選択的な細胞のキャッチ＆リリース○榎本 詢子 1, Gautieri Alfonso 2, 福田 淳二 1
（1横国大院・工, 2ミラノ工科大）
fukuda@ynu.ac.jp【目的】様々な細胞の懸濁液の中から特定の細胞を分離、濃縮、回収できる技術
は、再生医療やがん研究、創薬などいくつかの分野において有用である。本研
究では、アプタマーの選択性を利用して、特定の細胞のみを基板上に接着させる。さらに、電気化学的な反応を利用し、接着した細胞を非侵襲的に回収・分離する技術の確立に取り組んだ。
【方法】独自に設計したオリゴペプチドの自己組織化単分子膜を金表面上に形成させ、この末端に肝癌細胞と特異的に結合するアプタマーを結合させた。選択的な細胞接着のためには、アプタマーの立体構造が重要となる。そこで、まずはペプチドとアプタマーの相互作用による立体構造を分子力学計算により検討した。次にペプチドとアプタマーを修飾した基板上に肝癌細胞と正常肝細胞を播種し、細胞選択性を評価した。そして、接着した細胞を、金基板に-1.0 V (vs.
Ag/AgCl)を 5 分間印加し、自己組織化単分子膜と金表面との結合を切断することで、細胞を脱離させた。
【結果・考察】ペプチドの自己組織化単分子膜のみを修飾した表面には、細胞が全く接着しないことを確認した。次に、分子動力学計算の結果、ペプチド層に結合させるアプタマー密度を増加させると、アプタマー同士の静電反発によりアプタマーが立体的な構造を示すことを見出した。アプタマーをペプチド表面に修飾し、細胞懸濁液を播種した結果、肝癌細胞が 98％の選択性で接着した。
接着した全ての細胞は、5 分間の電圧印加のみで回収可能であった。また、回収した肝癌細胞は良好な生存率を示し、増殖能やタンパク分泌量もコントロールと同様であることを確認した。さらに、この操作を繰り返すことで、肝癌細胞の濃縮が可能であることが示された。よって、アプタマーを利用した細胞分
離濃縮システムの開発に向けた基盤技術を確立した。

Catch-and-release of target cells using aptamer-modified oligopeptide○Junko Enomoto1, Alfonso Gautieri2, Junji Fukuda1(1Grad. Sch. Eng., Yokohama Natl. Univ., 2Dept. Elec. Info. Bioeng. Politec.
Milano)human iPS cells, adipocytes, epigallocatechin gallate

Key words
self-assembled peptide, selective cell attachment, electrochemical celldetachment, aptamaer

2P-2p168 筋収縮力測定マイクロデバイスの開発と筋萎縮モデルへ

2P-2p170 3 次元ゲル培養からの形態情報による細胞塊選抜システ

Key wordsの応用○弦間 里歩 1, 清水 一憲 1, 後藤 友規 1, 本多 裕之 1,2（1名大院・工, 2名大・予防早期医療創成セ）
honda@nubio.nagoya-u.ac.jp

ムの開発○渋田 真結 1, 佐々木 寛人 2, 田村 磨聖 3, 蟹江 慧 1, 松井 裕史 4,
杉浦 慎治 3, 金森 敏幸 3, 柳沢 真澄 5, 佐藤 琢 3, 高木 俊之 3,
加藤 竜司 1
（1名大院・創薬, 2名大院・工, 3産総研, 4筑波大, 5エンジニアリン
グシステム）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp【背景と目的】超高齢化社会を目前に、筋萎縮の予防薬や治療薬の開発に注目が集まっている。抗筋萎縮薬開発のための細胞アッセイでは、平面培養した筋管細胞の太さや筋タンパク質量の変化などを指標として筋萎縮度が評価されている。しかし、より直接的に筋萎縮度を評価するためには、筋管細胞が発揮する収縮力を測定することが重要であると考えられる。本研究では、収縮力測定機
構を組み込んだマイクロデバイス上で培養三次元骨格筋組織を構築するプロセスを開発し、その筋組織デバイスを筋萎縮モデルとして利用することを検討した。
【方法と結果】ポリジメチルシロキサン(PDMS)を用いて柱状の力測定機構をもつマイクロデバイスを作製した。収縮力測定機構部分で、マウス筋芽細胞(C2C12)とフィブリンを用いて三次元筋組織を構築した。筋組織が電気刺激に応答して収縮することで柱が動き、その変位量から収縮力を定量した。デバイス形状と培養条件を検討し、収縮能を有する三次元筋組織を数週間保つことが可能になった。次に、デキサメタゾン（Dex）を用いてデバイス上の筋組織に萎縮を誘導した。平面培養した筋管細胞を有意に細くする Dex 濃度を見出し、同濃度のDex をデバイス上の筋組織に加えた。Dex 添加前と 24 時間後に電気刺激(20 V、
30 Hz、2 ms)を加え、柱の変位量変化から収縮力変化を算出した。その結果、Dex 添加により収縮力が有意に低下することが明らかになった。また Dex 添加
後の筋組織では、萎縮関連遺伝子の発現が増加することを見出した。現在は、開発した筋萎縮モデルの特性解析を進めている。

創薬探索の分野において、がん組織の浸潤・転移を防ぎ、再発のリスクを低下させるための新規薬剤の開発が求められている。多くの先行研究から、株化された細胞とは大きく異なり、腫瘍組織内の細胞は生体特有のヘテロ性（不均質性）を持ち、これが薬剤耐性やがんの特性と大きく関わっていることが明らかとされつつある。しかし、従来の分子生物学的手法において、未知のヘテロ性を限定されたマーカーなどの染色技術だけで評価・分類することは極めて難し
く、がんの特性の評価は病理組織などにおける組織学的な特徴の形態的評価が主流であった。また、in vitro においてがん細胞を生体内に近いような機能性を維持したまま培養することも技術的には難しく、3 次元での培養の有効性が知られてはいたが高いスループット性を維持しながら培養中の情報を解析することは難しかった。
我々は、高度に設計された光分解性ゲルを用いた 3 次元培養という培養環境と、
細胞画像解析技術による表現型による未知の集団の分類技術、およびこれを自動的に光照射・回収する装置の機能性を組み合わせ、3 次元培養した細胞を表現型（形態）で分類した場合の細胞集団のヘテロ性についての評価および特種なクローンの選抜についての検証を行ったのでこれを報告する。本研究では、
この検証のためいくつかのモデル細胞株を用いて細胞種特有の細胞形態や増殖
パターンというリアルタイムな 3 次元培養情報を取得し、表現型解析の精度および有効性について検証した。

Development of in vitro skeletal muscle atrophy models.

Development of cell selection system using cell morphology underphotoresponsive gel culture○Riho Genma1, Kazunori Shimizu1, Yuki Goto1, Hiroyuki Honda1,2(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2PME, Nagoya Univ.)

Key words
atrophy

microdevice, tissue engineering, electrical stimulation, skeletal muscle○Mayu Shibuta1, Hiroto Sasaki2, Masato Tamura3, Kei Kanie1, Hirofumi Matsui4,
Shinji Sugiura3, Toshiyuki Kanamori3, Masumi Yanagisawa5, Taku Satou3,
Toshiyuki Takagi3, Ryuji Kato1(1Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 3AIST,
4
Univ. Tsukuba, 5ESCO)
Key words
Cancer, Cell image analysis, Photoresponsive polymer, Single cell
analysis

212

セル＆ティッシュエンジニアリング

2P-2p171 GFP 陰性造影法による生細胞の構造計測技術の開発○田中 正太郎, 高桑 雄一（東女医大・医・生化学）
shtanaka@research.twmu.ac.jp

2P-2p173 畳み込みニューラルネットワークによる C2C12 細胞分化の識別○新岡 宏彦 1, 浅谷 学嗣 2, 大東 寛典 2, 田川 聖一 1, 三宅 淳 1（1阪大院・基礎工, 2阪大 基礎工）
niioka@bpe.es.osaka-u.ac.jp【目的】細胞の構造計測技術は、基礎研究分野のみならず、細胞や組織の病理診
断、再生医療における品質管理、一細胞解析における細胞分類など、臨床や応用分野においても重要な基盤技術である。本課題では、未だ十分とは言えない「生細胞の」構造計測技術の発展を目指し、新規技術を開発したので報告する。
【方法】今回報告する陰性造影法（Negative contrast imaging）は、細胞質に緑色
蛍光タンパク質（GFP）を過剰発現させた生細胞を、共焦点顕微鏡を用いて撮影するというシンプルな技術である。細胞本体のみならず、GFP が内腔に侵入しない核膜やオルガネラも観察可能である（Tanaka S et al., Sci. Rep., 2016）。この細胞の連続断層画像より構築した 3 次元像を元に、細胞本体および核、オル
ガネラの構造情報（形状・体積・個数・配置など）を取得する。本技術は、ライブイメージングで一般的に行われるマーカータンパク質の過剰発現を必要としない為、細胞機能への影響が少なく、「あるがまま」の状態にある細胞をリア
ルタイムで観察できる。今回の報告では、研究モデルとして（１）マスト細胞
ヒスタミン顆粒の構造情報（２）がん細胞塊（スフェロイド）の細胞構造情報について紹介する。【結果】間期のラットマスト細胞（RBL-2H3、体積：1,300～3,500μm3 ）に含まれる検出可能なオルガネラは最大で 1,000 個程度であり、体積の中央値は 0.17μm3 であった。また、ヒト結腸腺癌細胞株（HCT116）で構築したスフェロイド（直径 280μm）を観察したところ、接着面より 100μm までの細胞構造を計測する事が可能であった。
【考察】一連の実験により、本技術の原理が実証された。現在、技術の最適化を進めている。

再生医療において、ヒト臓器の構築には大量の細胞が必要であり、個々の細胞を人の手で扱っていては多大なコストが必要になる。近年、細胞の自動培養装置については様々なものが登場しているが、今後、細胞の質や状態を非侵襲、自動的かつ高速に判断する装置が必要になると考えられる。我々は、Deep
Learning の一手法である CNN (Convolutional Neural Network)[1,2]を構築し、位相差顕微鏡像から細胞の分化識別を行なった。実験では、試料としてマウス骨格
筋芽細胞 (C2C12)を用い、高速演算処理のために自作の PC (GPU: NVIDIA
GTX980Ti、CPU: Intel Corei7-4790K , メモリ: 8GB)と、独自に開発した Deep
Learning ライブラリ Sigma 用いた。C2C12 は分化誘導を行なうと、徐々に細長い形状に変化し，最終的に細胞核が融合し多核の筋管細胞へと分化する。分化誘導を開始した日を Day 0 とし、Day 0 および分化後である Day 6 それぞれの細胞位相差像(各 1000 枚、1 枚の画像サイズは 200x200 pixels)を取得した。各画像
を CNN によって学習し、テストデータ(各 100 枚)の分類を行なったところ 93%の精度で識別が可能であった。また、Day 0, Day 3, Day 6 の比較的大きい細胞
画像(4080x3072pixel)を用いて、画像内の各領域(200x200 pixel)の細胞を CNN により識別し、Day 0 と認識すれば青色、Dya 3 あるいは Day 6 と認識すればそれ
ぞれ緑色、赤色というように色分けした。分化度の違いを色で視覚的に表現できたと言える。

A novel method for detailed analysis of living cell structure by GFP-negative
contrast imaging

Recognition of C2C12 cellular differentiation by using convolutional neuralnetwork○Shotaro Tanaka, Yuichi Takakuwa(Dept. Biochem.,Sch. Med., Tokyo Women's Med. Univ.)

Key words

living cell, structural analysis, confocal microscopy, GFP

2P-2p172 培養上清成分のインプロセス・モニタリングによる細胞
非侵襲的なヒト iPS 細胞の未分化性の評価

参考文献[1] Y. LeCun et al., Neural Computation, 1, 541 (1989)[2] D. Cireşan et al., Proc. Int. Joint Conf. Neural Netw. (IJCNN), Jul./Aug. pp.1918(2011)○Hirohiko Niioka1, Satoshi Asatani2, Hironori Ohigashi2, Seiichi Tarawa1,
Miyake Jun1
(1Grad. Sch. Eng. Sci., Osaka Univ., 2Sch. Eng. Sci., Osaka Univ.)

Key words
Learning

differentiation, Image analysis, Convolutional Neural Network, Deep

2P-2p174 細胞画像情報を用いた凍結ストレスに対する幹細胞品質変化の評価○豊田 健一 1, 鈴木 崇 1, 畑林 邦忠 2, 平丸 大介 1, 高橋 雅俊 1,
加川 健一 2（1島津製作所, 2東京エレクトロン 革新技術企画室）
tkenichi@shimadzu.co.jp

松本 恵 1, 蟹江 慧 2, 清水 一憲 1, 本多 裕之 1, ○加藤 竜司 2
（1名大院・工, 2名大院・創薬科学）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp

再生医療や創薬支援への応用を目的として、高品質且つ大量に多能性幹細胞を調製し供給する技術開発が求められている。多能性幹細胞の重要な特性の一つである未分化性の評価には遺伝子発現解析、FACS、免疫染色など種々の方法が確立されている。一方、これらの手法は細胞侵襲的であるため、インプロセス
で細胞の状態を評価することは困難である。我々は、培養上清の多成分分析による細胞非侵襲的な新規インプロセス細胞評価手法の確立を目指し、液体クロマトグラフ質量分析計を用いた培養上清の一斉分析手法を開発した。開発した分析手法は、基礎培地成分および主要分泌代謝物の計 95 成分を 17 分で一斉分
析することが可能であるという特長を有する。
未分化 iPS 細胞の培養上清および播種翌日より各胚葉系に分化誘導刺激を施した培養上清をサンプルとして、培養に伴う成分変化を上記の一斉分析手法を用いてデータ取得した。その結果、未分化維持された iPS 細胞と各胚葉系それぞれにおいて特徴的な継時変化を示す複数の化合物を見出すことができた。より特徴的なマーカーを絞り込むために、上記の成分分析データを多変量解析に供した。その結果、分化誘導の初期段階から細胞の分化状態を区別できる可能性が示された。以上のように、培養上清の多成分一斉分析が、細胞非侵襲的な新規インプロセス細胞評価手法となる可能性を確認することができた。

間葉系幹細胞（MSC）は、様々な種類の細胞への分化能を有する多能性細胞であり、近年臨床的に様々なメリットを有する再生医療等製品の細胞源として大きな注目を集めている。体性幹細胞である MSC は、取得が容易であり、培養技術もかなり確立されている面があるが、人為的な継代操作によるストレスなどによって増殖能や分化能の低下が生じることや、細胞活性に大きな個人差があることが知られており、製品生産における品質管理の問題はいまだに解決されていない。現状、再生医療の現場では、患者細胞の品質評価やクオリティコ
ントロールは医師や培養技術者の感覚的・経験的な顕微鏡観察だけで補われており、定量性・作業量において限界が問題視されつつある。今後、再生医療や細胞治療が安全かつ安定な医薬品製造に近い産業構造を有するには、細胞の品質を製造工程の途中から常に評価・計測することと、その細胞活性（細胞品質）についての予測を行うような手法の確立が強く望まれている。我々はこれまで細胞形態の情報解析を行うことによって、細胞そのものの品質の変化を非破壊的、定量的、かつ早期に評価できる可能性を示してきている。我々は今回、今後 MSC の製品としての発展を考える際、避けては通れない「バンキング」における凍結ストレスの影響を評価するため、19 ロットの MSC について網羅的な遺伝子発現評価と分化能評価を行い、これを画像解析結果と紐づけることによって、どこまでの細胞の品質の程度を画像解析が評価することができるのかについて、工学的に感度および精度の観点から検証したのでこれを報告する。

Non-invasive evaluation of human Pluripotent Stem cells

Evaluation of cellular quality change by cryopreservation stress usingmorphology-based analysis○Kenichi Toyoda1, Takashi Suzuki1, Kunitada Hatabayashi2, Daisuke Hiramaru1,
Masatoshi Takahashi1, Kenichi Kagawa2(1Shimadzu Corp., 2Innovative Technology Planning Dept)

Key words

iPS cells, Liquid chromatography-mass spectrometry, Bioprocess

Megumi Matsumoto1, Kei Kanie2, Kazunori Shimizu1, Hiroyuki Honda1,○Ryuji Kato2(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Inst. Technol., 2Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ.)
Key words
expression

morphological change, mesenchymal stem cell, bioinformatics,

セル＆ティッシュエンジニアリング

2P-2p175 ヒト iPS 細胞の継代培養中発生する逸脱細胞の簡便な除
去法の構築

213

2P-2p177 密着結合タンパクの機能特性に基づいた網膜毒性の新規
in vitro 毒性評価系の構築○金 美海, 松原 佳史, 紀ノ岡 正博（阪大院・工）kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp

Xie Yucheng, 金 美海, ○紀ノ岡 正博（阪大院・工）kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp

iPS 細胞の再生医療や創薬スクリーニング用製品作成の実用化を進めるためには、高品質の iPS 細胞を安定的に大量培養することが必要となる。近年では、
培地・基質の開発により、逸脱発生が低減しているが，偶発的に発生した逸脱細胞を含むコロニーの除去は未だ必須である．しかし、逸脱細胞の除去は，コストや操作時間等の関係で産業発展には未だ問題が多く，未分化細胞と逸脱細胞の生物的特徴の差異を利用した単純な逸脱細胞除去に対する操作手法が望まれている．
これまで我々は、iPS 細胞の未分化状態からの逸脱する過程で E-カドヘリンによる細胞間接着の差異が生じることを確認し、細胞－細胞間接着を阻害するボ
ツリヌス菌由来のヘマグルチニン(HA)を培地に添加すると逸脱細胞の選択的剥離が可能であることを実証した。本研究では、これらの除去現象を利用し、継代培養中発生する逸脱細胞の簡便な除去法の構築を目指した。iPS 細胞の未分化維持培養における HA の添加効果を添加方法および HA 添加濃度の条件を
種々変化させ、逸脱細胞の除去を最適条件について検討し、連続継代による分化状態の維持を確認した。種々の継代培養条件での逸脱細胞の除去検証試験を行い、（「どの細胞株でも」「フィーダーの有無にかかわらず」「どの培地・基質
でも」）HA 添加による逸脱細胞の除去が可能であることを確認した。さらに、
より確度の高い HA 変異体を探索するため、サブユニットを置換したキメラ HAや、糖結合能を増強するような変異を導入した変異体 HA の作製を行い、逸脱細胞除去に対し、効率よい HA を確定することができた。HA 添加による逸脱細胞の除去の簡易化は，継代時の従来の逸脱細胞を含むコロニーの丁寧な除去
操作を不要とし，継代培養の自動化への展開が容易となるため幹細胞産業における細胞源確保の際に欠かせない，大量培養操作に多大な貢献が見込まれる．

【目的】哺乳類の網膜は、再生能力が低い組織であり、非臨床安全性試験において化学物質の暴露により網膜毒性が惹起された場合、その変化の多くは非可逆性であり、医薬品開発において開発が制限される因子となり得る。そのため、網膜毒性スクリーニングや網膜毒性機序解明のための高質な in vitro 試験系の確立が求められている。網膜色素上皮（RPE）細胞は網膜機能の恒常性維持に係わるとともに、その機能異常は化学物質による密着結合（タイトジャンクショ
ン）障害に一次的あるいは二次的に影響を与えている。そこで本研究では RPE細胞を用いて核密度やタイトジャンクションを指標とした網膜毒性の新規 invitro 毒性評価系の構築を試みた。

A simple and robust method for culturing undifferentiated iPS cells using
botulinum haemagglutinin

Novel in vitro assay tools for retinal toxicity using retinal epithelial pigment
cells

Key words
Human induced pluripotent stem cells, Botulinum Haemagglutinin,
Selective removal of deviation, Maintenance culture

Key words
Human retinal pigment epithelial cells, Retinal toxicity assay, Nucleus
density, Tight junction

2P-2p176 プラズマ照射活性化培地を用いた残存未分化ヒト iPS 細2P-2p178 ナノニードルアレイを用いたビメンチン陽性癌細胞分離○長島 拓則 1, 清水 一憲 1, 松本 凌 1, 田中 宏昌 2, 水野 正明 3,
吉川 史隆 4, 堀 勝 2, 本多 裕之 1,5（1名大院・工, 2名大・未来社会創造機, 3名大病院, 4名大院・医,5
名大・予防早期医療創成セ）
honda@nubio.nagoya-u.ac.jp○松本 雄太 1, 清水 桂太 1, 飯嶋 益巳 3, 黒田 俊一 3, 中村 史 1,2（1農工大院・工, 2産総研・バイオメディカル, 3阪大・産研・生体分子反応科学）
Chikashi-nakamura@aist.go.jp【背景と目的】 ヒト iPS 細胞から分化させた細胞群の再生医療への利用が期待されている。しかし、細胞移植後に未分化のまま残存したヒト iPS 細胞が奇形腫を形成する可能性が指摘されている。このため、ヒト iPS 細胞由来の分化細胞群から残存未分化細胞を除去する技術の開発が求められている。本研究では、
近年がん治療などに応用されているプラズマ照射活性化培地（PAM）に注目し、PAM による未分化ヒト iPS 細胞の選択的除去を試みた。
【方法】アルゴンガスによる非平衡大気圧プラズマをヒト iPS 細胞用培地に照射することで PAM を作製した。未分化ヒト iPS 細胞 201B7 株と分化細胞である
正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）を希釈した PAM に曝露し、それぞれの細胞の生死を顕微鏡観察や WST-8 法で評価した。
【結果と考察】個別に培養した未分化ヒト iPS 細胞と NHDF を段階希釈した PAMに曝露したところ、NHDF は死滅せずに未分化ヒト iPS 細胞のみが選択的に死滅する濃度域が存在した。このことから、未分化ヒト iPS 細胞は NHDF に比べて PAM に対して強い感受性を有していることが示唆された。未分化ヒト iPS 細胞と蛍光染色した NHDF を共培養し、PAM で処理した後にフローサイトメー
ターでそれぞれの細胞数を計測したところ、初期細胞比が iPS 細胞：NHDF =1：8 の条件において、PAM 処理なしでは約 16.8%含まれていた未分化ヒト iPS
細胞が、PAM 処理ありでは約 1.4%以下に低下した。リアルタイム RT-PCR により、未分化ヒト iPS 細胞ではカタラーゼやグルタチオンペルオキシダーゼ 1遺伝子の発現量が NHDF に比べて有意に低いことが確認され、本現象への関与が示唆された。これらの結果から、PAM は残存未分化ヒト iPS 細胞を選択的に除去するための有用な手段になると期待される。

中間径フィラメント、ビメンチンは間葉系細胞のマーカーであり、癌細胞における上皮間葉転換の指標である。腫瘍組織を形成する細胞群からビメンチンをマーカーとして生きた細胞の分離および培養が可能となれば、癌幹細胞分離あるいは癌細胞株の樹立に繋がる技術に発展すると我々は期待している。
我々は AFM 探針を加工し作製したナノニードルを用い、これを抗体修飾する
ことにより、細胞内の中間径フィラメントなどの骨格タンパク質を、力学的に検出する技術の開発を行ってきた。本手法では、ナノニードルを細胞に挿入し、引き上げる際のフォースカーブ上に現れる抗原抗体結合破断力の最大値をFishing force とし評価する。ヒト子宮頸癌細胞 HeLa とヒト乳腺癌細胞 MCF-7
はそれぞれビメンチン陽性、陰性細胞であるが、これらに対してナノニードルの膜貫通効率が最も高い 4℃条件下で Fishing force の測定を行った結果、HeLa
で 56.9±63.8 nN、MCF-7 で 6.3±5.4 nN であり、S/N 比 9.0 を達成した。
この結果を踏まえ、現在ナノニードルを１万本配列したナノニードルアレイを用いて、混合癌細胞集団からビメンチン陽性癌細胞を分離する手法の開発を検討しており、その結果に関しても併せて報告する。

Selective Elimination of Residual Undifferentiated Human iPSCs by
Plasma-Activated Medium.

Development of separation technology for vimentin positive cancer cellusing nanoneedle array○Mee-Hae Kim, Yoshifumi Matsubara, Masahiro Kino-oka(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)胞の選択的除去○Takunori Nagashima1, Kazunori Shimizu1, Ryo Matsumoto1, Hiromasa Tanaka2,
Masaaki Mizuno3, Fumitaka Kikkawa4, Masaru Hori2, Hiroyuki Honda1,5(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2Inst. Innovat. Future Soc., Nagoya Univ., 3Nagoya
Univ. Hosp., 4Grad. Sch. Med., Nagoya Univ., 5PME, Nagoya Univ.)

Key words

human iPSCs, Regenerative Medicine, Plasma, Oxidative Stress【実験および結果】ヒト ES 由来 RPE 細胞をラミニンコートされた磁石型培養
容器を作製し 5×104 cells /cm2 の密度で播種し 7 日間成熟培養を行った。成熟した PRE 細胞は、磁石型培養容器を培養面から外し、2 つのモデル毒性薬剤阻害剤 (Chloroquine, Chlorpromazin)を用い、種々の濃度で細胞に加えた。細胞核とタイトジャンクションの蛍光染色を行い、画像解析で成熟度の評価を行った。それぞれの阻害剤における細胞死とタイトジャンクション喪失の 50%細胞毒性抑制濃度 (IC50)を算出した結果、Chloroquine において阻害剤の活性が 84.5 と8.6μM で検出された。しかし、Chlorpromazin においては、二つの IC50 で有意的な差が見られなかった。これらの結果より、細胞死と細胞間接着喪失のどちらかに対する選択的阻害薬、または非選択的阻害薬のいずれかに分類することを可能になった。以上の結果から、細胞遊走を誘導による細胞毒性試験において細胞死とタイトジャンクション喪失の作用時間および判定法が細胞毒性評価に大きな影響を及ぼすことが明らかとなり、今後の RPE 細胞毒性試験実施に当たって有益な示唆を与えるものと思われる。

Yucheng Xie, Mee-Hae Kim, ○Masahiro Kino-oka(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

技術の開発○Yuta Matsumoto1, Keita Shimizu1, Masumi Iijima3, Shun'ichi Kuroda3,
Chikashi Nakamura1,2(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Biomed. Res. Inst., AIST, 3Dept.
Biomol. Sci. React., Inst. Sci. Ind. Res., Osaka Univ.)

Key words

vimentin, antibody, nanoneedle, cell separation

214

セル＆ティッシュエンジニアリング／核酸工学

2P-2p179 人工骨格筋組織の収縮力測定による薬剤評価系の構築○池田 一史 1, 井藤 彰 2, 今田 隆介 2, 河邉 佳典 2, 上平 正道 1,2（1九大院・シス生科, 2九大院・工）kamihra@chem-eng.kyushu-u.ac.jp

2P-2p181 人工 mRNA スイッチによるヒト内在性タンパク質の検知○川﨑 俊輔 1,2, 藤田 祥彦 2, 齊藤 博英 2
（1京大院・医, 2京大・CiRA）
s.kawasaki@cira.kyoto-u.ac.jp[目的] 生体筋肉を模倣した人工筋組織は、筋機能を向上させる薬剤を in vitro で探索するためのツールとなりうる。これまでに本研究室では、生体における運動機能の根幹である骨格筋に焦点を当て、磁力を用いたティッシュエンジニア
リングによって筋芽細胞の三次元構築を行い、電気刺激に応じて収縮力を発生する人工筋組織の作製に成功している。本研究では、5 種類の低分子薬剤をモデル薬剤として、筋分化誘導培養中に添加し、人工筋組織の収縮力測定を行う
ことで筋肉機能発揮への有効性を評価した。
[実験方法及び結果] マウス筋芽細胞株 C2C12 細胞を培養皿で平面培養し、分化誘導 7 日後における筋管の免疫染色と細胞核数から分化率を算出したところ、
5 種類すべての薬剤において分化率の向上がみられた。さらに、磁力を用いた
磁気工学的手法により C2C12 細胞を三次元構築し、7 日間分化誘導培養を行った。この際、モデル薬剤としてトリコスタチン A（TSA）、バルプロ酸ナトリウ
ム（VPA）、酪酸ナトリウム（SB）、アピシジン（API）および 5-アザシチジン（5AC）を分化誘導培養 4 日目に添加した。分化誘導後、作製した人工筋組織が電気刺激に応じて生じる収縮力を測定したところ、TSA（0.01μM および 0.1μM）
添加で収縮力が増強した。一方で、TSA が Follistatin 遺伝子の発現量を増加させることが報告されており、本研究においても Follistatin 遺伝子発現と人工筋組織の収縮力の関係を調べるために、C2C12 細胞に Follistatin 遺伝子を強制発現させ、収縮力測定を行った。その結果、Follistatin 遺伝子を強制発現した人工筋組織は、コントロールと比較して有意に収縮力が向上したことから、骨格筋の収縮力向上には Follistatin シグナル系が重要な役割を有していると考えられた。本手法による人工筋組織および収縮力測定は薬剤評価のための有用なツールであると考えられる。

細胞の種類や状態は、主にタンパク質によって決定されている。従って、標的細胞で特異的に発現するタンパク質の存在を検知し、その細胞運命を制御できれば、生命工学、医療応用において有用なツールとなりうる。
mRNA スイッチは mRNA の 5’UTR に特定のタンパク質と結合する RNA（アプタマー）領域を持つ遺伝子スイッチである。このスイッチは mRNA 上のアプタ
マーにタンパク質が結合することで、自身の翻訳を抑制する。原理的には、任意のタンパク質と結合するアプタマーを組み込むことで、望んだタンパク質を検知して翻訳を抑制する mRNA スイッチが作製できる。しかし、これまでに作製された mRNA スイッチでは、ヒト内在性タンパク質を検知できていない。そこで、人工 mRNA スイッチの開発には、新たな設計原理が必要である。
我々は、mRNA に組み込むアプタマー配列を改変することで、ヒト内在性タンパク質を検出できる人工 mRNA スイッチの開発に成功した。我々の作製したmRNA スイッチは、スプライシング関連タンパク質と幹細胞マーカータンパク質に応答し、目的遺伝子の発現を抑制できる。これらのスイッチは、内在のタンパク質発現レベルで機能した。さらに我々は、幹細胞マーカータンパク質に応答するスイッチを細胞に導入し、iPS 細胞を識別することにも成功した。
これらの結果は、人工 mRNA スイッチの新たな設計方法を提供する。我々の設計方法を用いることで、任意のタンパク質に応答する mRNA スイッチが作製でき、細胞種特異的な運命制御や、生きた細胞内における目的タンパク質の発現量測定が期待できる。

A drug testing based on contractile force generation of tissue-engineered
skeletal muscle constructs

Detection of human endogenous proteins via synthetic mRNA switches○Kazushi Ikeda1, Akira Ito2, Ryusuke Imada2, Yoshinori Kawabe2,
Masamichi Kamihira1,2(1Grad. Sch. Syst. Life Sci., Kyushu Univ., 2Fac. Eng., Kyushu Univ.)

Key words
drugtissue engineering, skeletal muscle, drug testing, low molecular weight

2P-2p180 アルギン酸カルシウム犠牲層を用いたゼラチンハイドロ
ゲルの 3 次元構築

○Shunsuke Kawasaki1,2, Yoshihiko Fujita2, Hirohide Saito2(1Grad. Sch. Med., Kyoto Univ., 2CiRA., Kyoto Univ.)

Key words

RNA switch, Translational Regulation, aptamer, Synthetic Biology

2P-2p182 代謝物と RNA の 2 入力に応答する AND ゲートリボザ
イムの開発○伊野 浩介 1, 横川 裕紀 1, 珠玖 仁 2, 末永 智一 1,3（1東北大院・環境, 2東北大院・工, 3東北大・WPI-AIMR）
ino.kosuke@bioinfo.che.tohoku.ac.jp○内藤 卓人, 井川 善也, 松村 茂祥（富山大院・理工）
smatsumu@sci.u-toyama.ac.jp

細胞培養において、ハイドロゲルは有用な細胞足場材料である。特に、ファイバー型のハイドロゲルは取り扱いが簡単なため、移植医療において有用である。
また、ハイドロゲルファイバーは、3 次元構築のための部品として有用である。
さらに、ノズル型の 3D バイオプリンタではハイドロゲルファイバーを吐出しており、3D バイオプリントにおいてもハイドロゲルファイバーの開発は重要である。ハイドロゲル内で細胞培養するためには、コラーゲンやゼラチンなどの細胞培養に適した材料を使用する必要がある。このようなハイドロゲル材料を希望の形に成型する手法が、様々に提案されている。
成型しやすいハイドロゲルとして、アルギン酸カルシウムハイドロゲルが挙げられる。アルギン酸カルシウムハイドロゲルは、アルギン酸ナトリウム溶液と塩化カルシウム溶液を混ぜるだけで迅速に形成される。一方、アルギン酸カル
シウムハイドロゲルは細胞接着部位を持たないため、3 次元細胞培養においては不向きである。
そこで本研究では、アルギン酸カルシウムハイドロゲルを犠牲層に用いること
で、ゼラチンハイドロゲルを簡単に成型する手法を開発した。この手法では光硬化性ゼラチンを使用しており、犠牲層を取り除いた後でも、光硬化したゼラ
チンハイドロゲルが成型された構造を保っている。また、光硬化性材料である利点を用いて、ハイドロゲル材料（ファイバー）同士の接着を可能し、3 次元
ハイドロゲル構築を可能にした。この手法は、3D バイオプリンティングへの応用が可能であり、複雑な 3D ハイドロゲルへの展開が期待できる。

【背景と目的】
グラム陽性菌の mRNA から発見された glmS リボザイムは、代謝物であるグル
コサミン 6 リン酸（GlcN6P）を補酵素として自身の RNA を切断する分子スイッチである。我々は、これを二種類の分子に応答する AND ゲートスイッチへと改変することを目指した。glmS リボザイムは、触媒中心をもつ「コア領域」と、リボザイム構造の安定化に寄与する「周辺領域」の 2 つのモジュールから構成されている。そこで、これらモジュールを物理的に分割し、コア領域をス
イッチ本体、周辺領域をアクチベーター（入力 RNA 分子）と見なし、アクチ
ベーター RNA によるスイッチ ON 機能の実現を目指した。これにより、代謝物と RNA の 2 入力に応答する、より精密な制御が可能な AND ゲート RNA ス
イッチを構築できると考えた。
【方法】
上記のように glmS リボザイムを分割し、スイッチ本体（コア）とアクチベー
ター RNA を別々に作製した。次に、コア RNA の 3’末端を蛍光標識した。その後、コアとアクチベーターを混合し、GlcN6P を添加することで反応を開始、反応終了後の未切断物と切断物を変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。最後に蛍光イメージャーで定量し、切断活性を評価した。
【結果と考察】glmS リボザイムを物理的に分割し混合することで、その活性が再構成された。
しかし、入力がない状態でのシグナルの漏れが確認されたため、新たな変異体を設計・作製したところ、シグナルの漏れは抑制された。また、入力のアクチ
ベーター RNA をよりシンプルなオリゴ RNA に置き換えることにも成功し、さらに、すでに活性化しているコアに別のオリゴ RNA を加えることで不活性化
することも可能となった。今後、スイッチ ON 時の活性の向上や入力を多様化することで、合成生物学における制御素子としての応用が期待できる。

3D gelatin-based hydrogels using alginate calcium templates

Development of an AND-gate ribozyme responding to metabolite and RNA
inputs○Kosuke Ino1, Yuki Yokokawa1, Hitoshi Shiku2, Tomokazu Matsue1,3(1Grad. Sch. Environ. Stud. Tohoku Univ., 2Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 3WPIAIMR, Tohoku Univ.)

Key words

gelation, 3D culture, 3D structure○Takuto Naito, Yoshiya Ikawa, Shigeyoshi Matsumura(Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama)

Key words

Ribozyme, Synthetic biology, glmS ribozyme, AND-gate核酸工学／糖鎖工学

2P-2p183 グループ I リボザイムの集積制御による RNA ナノ構造の選択的形成と活性評価

215

2P-2p185 成熟糖鎖合成を促進する糖鎖修飾改変植物体の作出○佐藤 圭悟 1, 弓岡 仁美 1,2, 磯山 純子 1, 土肥 浩二 1, 大橋 貴生 1,
三崎 亮 1, 藤山 和仁 1
（1阪大・生工国際セ, 2大阪成蹊短大・栄養）
fujiyama@icb.osaka-u.ac.jp○大井 宏紀 1, 藤田 大介 1, 鈴木 勇輝 2,3, 杉山 弘 2,3, 遠藤 政幸 2,3,
松村 茂祥 1, 井川 善也 1
（1富山大院・理工, 2京大iCeMS, 3京大院・理）yikawa@sci.u-toyama.ac.jp【背景と目的】RNA ナノ構造体の構築には、これまで主に 100 塩基未満の RNA 鎖が用いられてきた。また、細胞内の機能性 RNA で多く見られる 300～1000 塩基の鎖を用いた例はまだ少ない。我々は，約 400 塩基長の酵素活性を有する RNA 分子（リボザイム）を用いて，機能を有する RNA 構造体の形成を試みた。
【方法】
本研究では，自らの活性で自身をイントロンとして切りだすスプライシング反応を行う繊毛虫テトラヒメナ由来のグループ I（GI）リボザイムを用いた。GI
リボザイムをコア・リボザイム (ΔP5) とアクチベーター(P5abc)の 2 つの構造モジュールに分割し，P5abc を ΔP5 の適切な位置にリンカーを挿み組み込んだ。
モジュールを再編成したリボザイムの ΔP5 と P5abc は分子間でのみ相互作用する。P5abc は ΔP5 の酵素活性を活性化する機能を有するため，集積構造の形成に応じて酵素活性が発現する。
複数の特異的相互作用部位の導入，リンカー長の変更による相互作用界面の角度制御により，リボザイムを系統的に設計した。その組み合わせによりリボザ
イムを選択的に集積させ，非変性ゲル電気泳動によって会合体の同定を行った。
また，その集積に依存した触媒活性も測定した。
【結果と考察】複数の特異的相互作用部位の導入，相互作用界面の配向の制御によって選択的に多量体(三角形,四角形)への集積に成功した。配向の組み合わせを変えることによって特定の構造が有利になることを非変性ゲル電気泳動によって確認した。
また集積依存的なリボザイムの基質切断活性は，二量体と閉環三量体に集積する場合で比較すると，RNA 濃度が低条件下では閉環三量体の活性低下はより抑制されていた。この結果は閉環構造がナノ構造の安定化に寄与していることを示唆する。

【背景と目的】
現代のバイオテクノロジーを用いた医療用タンパク質の生産はチャイニーズハ
ムスター卵巣 (CHO) 由来細胞で盛んに行われている。しかし、CHO 細胞による生産は、培養槽の建設や管理が非常に高コストであることや、ヒトに感染性があるウイルスにより汚染される可能性などの課題があげられる。このような課題を解決できる宿主生物として植物が注目されている。生産コストが安価で、動物病原体汚染のない植物体は、CHO 細胞の課題を克服するために適した宿主である。また、多くの医療用タンパク質には N 結合型糖鎖が付加しているが、その糖鎖は付加したタンパク質の生理活性や分泌、フォールディングなどその性質に深く関わっており、医療用タンパク質生産において合成途中などの多様な構造の糖鎖は、その生理活性などの面からその品質が低下する恐れがある。
品質を保つためには糖鎖修飾を促進させ、成熟糖鎖への集約が不可欠となってくる。そこで本研究では植物体 Nicotiana tabacum SR1 において成熟糖鎖への集約化の方法を模索した。
【方法および結果】
本研究では、糖鎖修飾経路の初期段階に関わる酵素 Mannosidase I(Man I)に着目した。N. tabacum 由来 Man I を導入することでその活性を増強し、糖鎖修飾経路初期段階の未成熟なハイマンノース型糖鎖をより成熟糖鎖へ集約させるよう試みた。ハイマンノース型糖鎖は植物体内において全可溶性タンパク質に付加した糖鎖のうち 10%～15%程度存在していることがわかっている。qRT－PCR
および Man I 酵素活性測定の結果、Man I 発現量および活性の増強された個体が得られた。また糖鎖構造解析の結果、未成熟な糖鎖であるハイマンノース型
糖鎖の減少に成功した。このため、Man I 増強は糖鎖の成熟を促進させ、糖鎖構造の集約化に有効に活用されることが期待される。

Selective formation of GI ribozyme-based catalytic polyhedrons

Production of the glyco-engineerd Nicotiana tabacum facilitates N-glycans
maturation○Hiroki Oi1, Daisuke Fujita1, Yuki Suzuki2,3, Hiroshi Sugiyama2,3,
Masayuki Endo2,3, Shigeyoshi Matsumura1, Yoshiya Ikawa1(1Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama, 2Inst. for Integr. Cell-Material Sciences(WPI-iCeMS), 3Grad. Sch. Sci., Kyoto Univ.)○Keigo Sato1, Hitomi Yumioka1,2, Junko Isoyama1, Koji Dohi1, Takao Ohashi1,
Ryo Misaki1, Kazuhito Fujiyama1(1ICBiotech, Osaka Univ., 2Dept. Nutritl. Sci., Osaka-Seikei Coll.)

Key words
Group I ribozyme, RNA-RNA interaction, RNA nanostructure, RNAnanotechnology

Key words

2P-2p184 フコース結合型糖鎖合成に関わる酵素群をノックアウト

2P-2p186 糖転移酵素 GnTI 遺伝子発現抑制による植物型糖鎖構した CHO-K1 細胞の構築

N-glycans, plant biopharmaceutical, transgenic tobacco

造の改変○岩崎 将士, 三崎 亮, 大橋 貴生, 藤山 和仁（阪大・生工国際セ）
fujiyama@icb.osaka-u.ac.jp

土肥 浩二 1, ○弓岡 仁美 1,2, 磯山 純子 1, 菊池 輝美 1, 藤山 和仁 1
（1阪大・生工国際セ, 2大阪成蹊短大・栄養）
fujiyama@icb.osaka-u.ac.jp【背景と目的】近年注目されている抗体は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）
細胞を宿主とした遺伝子組換えによって生産される。抗体は糖タンパク質である。糖タンパク質の糖鎖はタンパク質の安定性や生理活性に大きな影響を及ぼ
すこと、糖鎖構造の違いが免疫原性をもたらすことが知られており、糖鎖構造を改変することでタンパク質の機能向上が期待できる。特に、抗体では Fc 領域
が持つ N-結合型糖鎖から α1,6-フコース残基（コアフコース）を除去すること
で、抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性が大幅に向上することが知られている。
すなわち、コアフコースを合成しないバイオリアクターを構築できれば、付加価値の高い抗体医薬品生産の有用宿主となりうると考える。そこで本研究では、
コアフコース合成に関わる遺伝子をノックアウトした CHO 細胞の構築を目指す。
【方法および結果】ノックアウト細胞の構築には CRISPR-Cas9 ゲノム編集技術を用いた。まず、一つの標的遺伝子をノックアウトするためのベクターを構築
し、CHO-K1 細胞に導入した。標的遺伝子を破壊した細胞群からノックアウト
細胞をスクリーニング、単一クローン化した。最終的に遺伝子配列を解析する
ことによって標的遺伝子の変異を確認した。遺伝子破壊が認められた細胞の抽出物を用いてレクチンブロッティングを行った結果、変異体糖鎖は野生型と比較して半分程度にフコース結合が減少した。さらに、遺伝子破壊が認められた細胞株をベースとして、別のコアフコース合成に関わる遺伝子をノックアウト
することで、二重変異株を構築している。

【背景と目的】 植物を利用した組換え医療用タンパク質の生産は、今日主流である動物細胞での生産系と比較して、低コスト化が期待でき、動物病原体汚染に対して安全であるといった利点がある。一方で、現在注目されている医療用タンパク質の多くは糖鎖を持つ糖タンパク質であり、糖鎖はタンパク質の生物学的活性の発揮に極めて重要である。しかし、植物で生産したタンパク質には、動物にはない植物特有の N 結合型糖鎖が存在し、アレルゲン性を示すことが懸念されている。本研究では、タバコ植物 (Nicotiana tabacum SR1) を用い、糖転移酵素 (GnTI: N-Acetylglucosaminyltransferase I) の活性を抑制することで、植物型糖鎖の付加を阻害し、かつ単一な糖鎖構造 (M5) を合成できる有用宿主植物の作出を目的とした。
【方法】RNA interference 法を用いて GnTI 発現を抑制することで、N 結合型糖鎖修飾経路を遮断した。すなわち、アンチセンス型、アンチセンス－センス型、
センス－アンチセンス型の RNA を植物細胞内で転写するベクターを構築し、形質転換植物を作出した。リアルタイム PCR (RT-PCR) 法を用いて GnTI のmRNA の相対的発現量を定量し、ミクロソーム画分の GnTI 活性を測定することで形質転換植物をスクリーニングした。さらに、抗西洋ワサビペルオキシダー
ゼ抗体を用いたウエスタンブロットおよび、選抜した個体ついて詳細な糖鎖構
造解析を行った。
【結果】形質転換植物の GnTI 発現を RT-PCR 法で調べ、野生型に比べて GnTI
mRNA の発現量が低下した株を得た。また、発現量とミクロソーム画分における GnTI 活性には相関が認められた。さらに T1 世代では、センス－アンチセン
ス型で GnTI の発現が顕著に抑制されていた。この T2 植物ラインの糖鎖構造解
析により、野生型に比べて植物型糖鎖の含量が減少し、M5 型糖鎖の蓄積量の増加が認められた。

Construction of CHO cells for production of fucose-free antibodies

Modification of plant-specific N-glycan structure by suppression of Nacetylglucosaminyltransferase I expression○Masashi Iwasaki, Ryo Misaki, Takao Ohashi, Kazuhito Fujiyama(ICBiotech, Osaka Univ.)

Key words

fucosylation, Chinese hamster ovary, glycoengineering

Koji Dohi1, ○Hitomi Yumioka1,2, Junko Isoyama1, Terumi Kikuchi1,
Kazuhito Fujiyama1(1ICBiotech, Osaka Univ., 2Dept. Nutritl. Sci., Osaka-Seikei Coll.)

Key words

glycosylation, glycosyltransferase, Nicotiana tabacum

216

糖鎖工学

2P-2p187 均一な糖鎖構造を有する抗体 Fc 領域の生産と解析○千葉 靖典 1, 高橋 佳江 1, 岩城 隼 2,3, 石田 秀樹 2,3, 松崎 祐二 2,3,
平林 淳 1,3（1産総研・創薬基盤, 2東京化成工業, 3次世代バイオ医薬品製造
技術研究組合）y-chiba@aist.go.jp

抗体等のバイオ医薬品の製造プロセスの段階において、細胞株の選抜やスケー
ルアップ時の糖鎖構造の相違を確認するために、糖鎖をより迅速かつ再現性よく解析する技術が求められている。我々は抗体の糖鎖分析の際に用いる手法の適合性を担保するための校正物質の開発を検討してきた。昨年度の大会では、酵母で生産した抗体 Fc 領域の糖鎖を酵素的に処理し、化学合成した糖鎖と付け替えることにより均一な糖鎖構造を有する Fc 領域の調製条件の検討を報告した。今回は、昨年度検討した方法によるアガラクト二分岐複合型（G0）糖鎖、モノガラクトシル二分岐複合型（G1, G1'）糖鎖、アシアロ二分岐複合型(G2)糖鎖を付加した Fc の生産と糖鎖構造解析、ならびにコアフコース付アガラクト二分岐複合型（G0F）糖鎖を有する Fc の合成について報告する。
メタノール資化性酵母 Ogataea minuta 株によりヒト抗体の Fc 領域を発現、糖鎖の切断と精製を行なった。一方、化学合成した G0、G1、G1'、G2 型糖鎖を切断しながら、直接糖鎖を転移する方法で Fc への糖鎖転移を行なった。未反応物が確認されたため、プロテイン G カラムを用いることによりそれぞれ目的の Fcを精製した。得られた G0-Fc、G1'-Fc、G2-Fc を等量混合し、これらから糖鎖を切り出して蛍光標識し、HPLC にて分析を行なった。その結果、G0 糖鎖のピー
ク面積が他に比べて若干少ないことから、これが調製した Fc のサンプルに依存するのか、精製法や分析に依存し減少するのかを検討している。一方、フコース転移酵素 FUT8 を用いた G0-Fc へのフコース転移を検討した。レクチンブロッ
トおよび HPLC による解析により、24 時間以内にフコース修飾が完了することが示唆された。今後ガラクトース転移酵素を利用し、G2F-Fc の作製を検討したい。

Production and evaluation of IgG Fc region with homogeneous glycan○Yasunori Chiba1, Yoshie Takahashi1, Jun Iwaki2,3, Hideki Ishida2,3,
Yuji Matsuzaki2,3, Jun Hirabayashi1,3(1BRD, AIST, 2Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 3MAB)

Key words

antibody, glycosynthase, homogeneous glycan, Ogataea minuta

9 月 30 日 （金）シンポジウム（13:00 〜 15:00）

富山国際会議場 3 階 A 会場 , 2 階 B 会場 / ANA クラウンプラザホテル富山 3 階 C, D, E 会場

3S-Ap01 〜 3S-Ap05

p. 265

生命ビッグデータ の利活用による生物工学のイノベーション
3S-Bp01 〜 3S-Bp07

p. 267

Gap Filling of Metabolic Pathway and Application
to Producing Valuable Compounds

3S-Cp01 〜 3S-Cp06

p. 271

和食の機能性のメカニズム〜生活習慣病予防，腸内細菌へのインパクト〜
3S-Dp01 〜 3S-Dp05

p. 2743S-Ep01 〜 3S-Ep05

p. 276

酒類製造における革新技術【本部企画】

セルフリー（無細胞）タンパク質合成技術の新展開

一般講演（午前の部） ポスター掲示時間（9 月 29 日 18:15 〜 30 日 11:00）
ポスター会場 Ⅰ：富山国際会議場 2 階

ポスター会場 Ⅱ：ANA クラウンプラザホテル富山 3 階 ASUKA
分類，系統，遺伝学

3P-1a001 〜 008

p. 2193P-1a034 〜 043

p. 227

3P-1a009 〜 033

遺伝子工学
酵素学，酵素工学

3P-1a044 〜 053

タンパク質工学
抗体工学
発酵生理学，発酵工学

3P-1a054 〜 063
3P-1a064 〜 074

3P-1a075 〜 087

代謝工学
オミクス解析
環境工学，廃水処理技術
バイオマス，資源，エネルギー工学
生合成，天然物化学
有機化学，高分子化学
ペプチド工学
脂質工学
生物工学若手研究者の集い（若手会）

3P-1a088 〜 097
3P-1a098 〜 113
3P-1a114 〜 131

3P-2a132 〜 154
3P-2a155

p. 221
p. 229p. 232
p. 234
p. 237
p. 240p. 243
p. 247
p. 251

p. 257

3P-2a156 〜 170

p. 257

3P-2a176 〜 184

p. 262

3P-2a171 〜 175

p. 261

一般講演（午後の部） ポスター掲示時間（9 月 30 日 11:15 〜 17:30）
ポスター会場 Ⅰ：富山国際会議場 2 階

ポスター会場 Ⅱ：ANA クラウンプラザホテル富山 3 階 ASUKA
遺伝子工学
植物細胞工学，組織培養，育種工学
酵素学，酵素工学
タンパク質工学
発酵生理学，発酵工学
オミクス解析
生体情報工学，バイオインフォマティクス
システムバイオロジー
環境工学，廃水処理技術
バイオマス，資源，エネルギー工学
生物化学工学
培養工学
バイオプロセス

3P-1p001 〜 029

p. 2793P-1p035 〜 057

p. 287

3P-1p030 〜 034

3P-1p058 〜 068

3P-1p069 〜 077

3P-1p078 〜 086

3P-1p087 〜 097
3P-1p098

p. 286
p. 293
p. 296
p. 298p. 300p. 303

3P-1p099 〜 111

p. 3033P-2p132 〜 154

p. 311

3P-1p112 〜 129

3P-2p155 〜 167
3P-2p168 〜 177

p. 306
p. 317
p. 320分類，系統，遺伝学

3P-1a001 モンゴル国から分離した酵母の多様性及びMetschnikowia 属 2 新種の生育特性と脂質生産能219

3P-1a003 歯周病原性細菌 Eikenella coorodens の新規溶血因子の同定○島谷 雅文 1, 高原 沙里 1, 阿座上 弘行 1,2,3（1山口大・農, 2山口大院・創成科学・農学系, 3山口大・中高温
微セ）
azakami@yamaguchi-u.ac.jp○Jambaldorj Ulziichimeg 1, 山崎 敦史 1, Balijinova Tsetseg 2,
安藤 勝彦 1, 鶴海 泰久 1
（1NITE・NBRC, 2モンゴル科学院・生物研究所）
tsurumi-yasuhisa@nite.go.jp

目的 NITE バイオテクノロジーセンター（NBRC）では、生物多様性条約に基づ
き、生物遺伝資源の二国間移転に関する枠組みを構築し、アジア諸国において微生物の探索支援事業を行っている。本研究では、モンゴル国の発酵食品及び植物から分離した酵母の多様性と、新種候補株の生育特性、脂質生産量及びその脂肪酸組成の分析結果を報告する。
方法 モンゴル国の伝統的な発酵食品及び植物から YM20 培地（20% Glucose,
0.3% Malt extract, 0.3% Yeast extract, 0.5% Peptone）を用いて集積培養した後、希釈平板培養法により酵母を分離した。分離株は 26S rRNA 遺伝子 D1/D2 領域塩基配列（以下、26S rRNA）の解析による簡易同定を行った。さらに、新規性が認められた 2 株について、生育特性、脂質生産量及びその脂肪酸組成の分析を行った。
結果と考察 2013 年に 102 株、2014 年に 66 株の合計 168 株の酵母を分離し、
26S rRNA 解析から 18 属 27 種を推定した。
高 頻 度 で 分 離 さ れ た の は 、 発 酵 食 品 か ら は Saccharomyces cerevisiae 、
Kluyveromyces marxianus 及び Dekkera anomala であり、植物からは S. cerevisiae、Metschnikowia reukaufii 及び Candida parapsilosis であった。
Metschnikowia 属の新種として推定される 2 株（MN13-F0057 及び MN13-F0074）
が生産する脂質の脂肪酸組成を調べたところ、各々中鎖脂肪酸のラウリン酸を総脂質の 50%及び 70%程度生産し、さらにオレイン酸及びパルミチン酸を生産することが明らかとなった。生育特性の調査からは、両株とも 10%濃度以上のD-Xylose を含む培地で生育することから、植物バイオマスを原料としたラウリン酸の生産に応用できる可能性が示唆された。
なお、本研究で分離したモンゴル国由来の酵母はすべて NBRC より提供可能である。

歯周病原性細菌 Eikenella corrodens 1073 株は重度歯周病患者からの臨床分離株
であり、羊血液寒天培地上でコロニーの周りの血液が透明になる β 溶血が観察される。
まず、溶血因子の精製を試みた。1073 株を培養後、培養上清および細胞外被画分を得た。これらの画分の溶血アッセイを行ったところ、細胞外被画分から濃度依存的に溶血活性が見られた。そこで、この画分を界面活性剤で可溶化し、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを行った。
その結果、約 65kDa の単一なタンパク質として精製され、濃度依存的に溶血活性が認められた。Ｎ末端アミノ酸シークエンスの解析の結果、得られた配列は既にゲノムが解読されている E. corrodens 23834 株の X-Proryl aminopeptidase(HlyA)の 2 から 11 番目のアミノ酸配列とほぼ一致していた。したがって、この65kDa のタンパク質が溶血因子であることが示唆された。
次に、このタンパク質の大腸菌での発現を試みた。HlyA をコードする遺伝子(hlyA)を発現ベクター pET22b(+)に繋ぎ、E. coli BL21(DE3)に導入した。これを培養し、IPTG の添加により発現誘導を行ったところ、約 65kDa のタンパク質の発現が確認できた。Ni カラムでこのタンパク質を精製したところ、精製タンパク質から溶血活性が見られた。
さらに、HlyA の遺伝子欠損株の作成を試みた。hlyA 遺伝子の中にカナマイシ
ン耐性遺伝子を挿入し、これをプラスミド pBR322 に繋いだ。これをエレクト
ロポレーションにより E. corrodens 1073 株に導入し、得られたカナマイシン耐性株の中から、フザリン酸耐性によるカウンターセレクションでテトラサイク
リン感受性株をスクリーニングし、hlyA 欠損株を得た。欠損株からは溶血活性が見られなかった。これらの結果から、HlyA が本菌の溶血因子であることが確認された。

Diversity of yeasts in Mongolia, and lipid producing two new species ofMetschnikowia

Identification of novel hemolytic factor in periodontopathogenic bacterium,○Ulziichimeg Jambaldorj1, Atsushi Yamazaki1, Tsetseg Balijinova2,
Katsuhiko Ando1, Yasuhisa Tsurumi1(1NBRC, NITE, 2Inst.General & Experimental Biol., Mongolia)

Key words

yeast, lipid, D-xylose, Metchnikowia

3P-1a002 鹿児島県及び山口県で分離した油脂酵母 Lipomyces 属
及び油脂生産能について

Eikenella corrodens○Masafumi Shimatani1, Sari Takahara1, Hiroyuki Azakami1,2,3(1Fac. Agric., Yamaguchi Univ., 2Grad. Sch. Sci. and Tech for Innov., Yamaguchi
Univ., 3Res. Cent. for Thermotol. Microb. Resour., Yamaguchi Univ.)

Key words
periodontopathogenic bacteria, Eikenella corrodens, hemolytic factor,
aminopeptidase

3P-1a004 MALDI-TOF MS を用いたバイオマーカーによるAcinetobacter 属細菌の高精度識別○山崎 敦史, 川﨑 浩子（NITE・NBRC）
yamazaki-atsushi@nite.go.jp○下平 潤, 則武 ちあき, 野口 正宏, 上條 知昭, 川﨑 浩子（NITE・NBRC）
jshimo74@gmail.com【背景と目的】Lipomyces 属酵母は、Saccharomycetales 目に属する子のう菌酵母であり、本酵母が大量に生産する油脂はバイオ燃料に活用できると期待されている。土壌が主な生息域とされているが、その生態や種分布については不明な点が多い。本研究では、鹿児島県及び山口県で収集した土壌から Lipomyces 属
酵母の分離を行い、生息地や環境との相関性を調べるための分布情報の蓄積と、高油脂生産能を有する新規酵母株を取得することを目的とした。
【方法と結果】無窒素培地(NDM)を用いた希釈平板法により土壌試料から取得したムコイド状の酵母コロニーに対し、26S rRNA D1/D2 領域及び Elongation Factor
1α 遺伝子(EF-1α)の塩基配列を用いた分子系統解析による同定を行った。
鹿児島県の森林土壌から取得した Lipomyces 属酵母は合計 59 株であり、88.1%
が L. starkeyi となり大部分を占め、残り 11.9%が L. doorenjongii であった。山口
県からは合計 48 株が得られ、そのうち 56.3%が L. starkeyi で最も多くを占め、続いて L. doorenjongii が 41.7%、L. chichibuensis が 2.1%だった。
L. doorenjongii は、我々がこれまでに北海道、埼玉県、千葉県、静岡県及び沖縄
県の土壌から分離した酵母の中で、唯一沖縄県から分離されていた。鹿児島県
及び山口県は、静岡県と沖縄県の中間にあたる場所に位置していることから、
L. doorenjongii は本州の南西から分布し、沖縄県では L. starkeyi と置き換わるよ
うに優占種になると考えられた。また、L. kononenkoae、L. spencermartinsiae、
L. yamadae 及び L. yarrowii の 4 種が、沖縄県では分離されたが鹿児島県及び山口県から分離されなかったことも Lipomyces 属各種の分布と気候との間に何らかの関係性があるためと考えられる。
また、分離酵母株の中から遺伝的に異なる 20 株を選び、脂質生産量及びその脂肪酸組成を測定したため併せて報告する。

【背景・目的】Acinetobacter 属細菌には、環境汚染物質分解菌や原油分解菌など、産業上有用な株が存在する。一方で、Acinetobacter 属には日和見感染菌種も存在することから、有用株を利用するためには、正確な種名を同定し、日和見感染菌種ではないことを確認する必要がある。しかし、Acinetobacter 属は 16S
rRNA 遺伝子配列の多型度が低く、正確な同定が困難である。また、表現性状が非常に類似しており、MALDI-TOF MS による指紋判定法では種レベルでの正確な識別・同定を行うことができない。そこで、本研究では、MALDI-TOF MSを用いて、Acinetobacter 属を種レベルで高精度に識別・同定するためのバイオ
マーカーの作成を目的とした。
【方法】バイオマーカーとしてリボソームタンパク質を想定し、Acinetobacter 属
基準株 28 株のゲノム情報からリボソームタンパク質の理論分子量を算出するとともに、微生物同定で使用されている Shimadzu 社製及び Bruker Daltonics 社製の両 MALDI-TOF MS を用いて測定を行った。リボソームタンパク質の理論分
子量と実測値とを比較して、2 社の MALDI-TOF MS で検出可能なリボソームタ
ンパク質のなかからバイオマーカーを選抜した。
【結果】最終的に、11 個のリボソームタンパク質をバイオマーカーとして選抜した。選抜したバイオマーカーの妥当性を検証するために、既に種レベルで同定されている Acinetobacter 属株 32 株を MALDI-TOF MS で測定し、バイオマー
カーによる同定を行った結果、全て種レベルで正確に同定することができた。
この結果より、選抜したバイオマーカーが Acinetobacter 属株の種ベルでの識別・同定に有効であることが示された。

Isolation and analysis for lipid production ability of genus Lipomyces in
Kagoshima and Yamaguchi

Development of biomarkers for high quality identification of Acinetobacter
species using MALDI-TOF MS○Atsushi Yamazaki, Hiroko Kawasaki(NBRC, NITE)

Key words

Lipomyces, taxonomy, ecology, biofuel○Jun Shimodaira, Chiaki Noritake, Masahiro Noguchi, Tomoaki Kamijo,
Hiroko Kawasaki(NITE・NBRC)

Key words

Acinetobacter , MALDI-TOF MS, biomarker, ribosomal protein

220

分類，系統，遺伝学

3P-1a005 MALDI-TOF MS を用いた Aspergillus flavus とその類
縁菌の迅速同定法のための前処理最適化

3P-1a007 青枯病菌に感染する Viunalikevirus、RP15 の単離と解析

○上條 知昭, 下平 潤, 川﨑 浩子（NITE・NBRC）
kamijo-tomoaki@nite.go.jp○川崎 健 1, 三原 知子 2, 緒方 博之 2, 藤江 誠 1, 山田 隆 1（1広島大院・先端物質, 2京大・化研）
takeru@hiroshima-u.ac.jp【背景と目的】 MALDI-TOF MS を用いた微生物の迅速同定が臨床分野だけではなく，食品の品質管理分野に広がりつつあるが，未だ糸状菌への対応が進んでいない状況である．その大きな原因はデータの安定化が確保できていないことにある．そこで，産業的に有用な糸状菌と有害菌が混在することが知られている Aspergillus flavus 類縁菌について，安定したデータを得るための前処理を検討したので報告する．
【方法】 A. flavus 類縁菌である Aspergillus flavus，Aspergillus oryzae，Aspergillus
tamarii，Aspergillus parasiticus，Aspergillus sojae，Aspergillus nomius を用い，培地による影響（平板培養と液体培養，培地の種類の違い，培養日数の違い）を検討した．さらに，菌体を回収してからの，溶菌方法の違いによるデータの安定性について比較を行った．溶菌後は，同様の方法で 80%エタノール処理と70％ギ酸：アセトニトリル処理後，その上清 1μL をマトリックス剤 CHCA および Sinapinic acid（SA）を用いて解析を行い，検出されるマススペクトルのデータの安定性を比較した．得られたデータを用いてデータベースを構築し，クラスタリング解析を実施し，前処理方法による同定結果に影響を与えるかどうかについて併せて検討を行った．
【結果と考察】 平板培養においては培地を変えても液体培養を行った時に比べ，安定した結果が得られなかった．また，液体培養では培養日数を統一することで安定したマススペクトルのデータを得ることができた．さらに SA を用いても良好なピークを得ることができた．加えて，培養条件が異なるとクラスタリ
ングの結果にも影響を与えることが明らかとなり，培養条件を統一することにより，MALDI-TOF MS を用いた指紋判定による迅速同定が可能となることが示
唆された．

【目的】青枯病菌 Ralstonia solanacearum は温暖な気候を中心に世界中に分布す
る土壌伝染性の植物病原細菌である。本菌はトマトやナスなど経済的に重要な作物を多数含む 50 科 200 種以上もの植物に感染し被害を及ぼしている。この菌は地中深くで何年も生存するため、一度汚染された土壌から完全に除去することが困難である。そこで当研究室では、この菌に特異的に感染するファージに着目し、予防や防除技術への利用、青枯病菌検出ツールや研究ツールとしての応用を目指した研究を行っている。これらの目的のためにはファージストックの拡充が必須で有り、自然界からの単離を続けている。今回、Viunalikevirus（以下 VLV）に類似した RP15 ファージを単離、解析したのでこれを報告する。
【方法・結果】VLV は Gammaproteobacteria に感染する T4-related なファージであり特徴的な尾部構造を持つ。尾部プレートの先端にはフォーク様突起が、プレートの横には星形の突出構造が存在し、高い吸着効率を示す。今回発見した
RP15 は Betaproteobacteria である R. solanacearum に感染するファージであり、TEM 観察から星形の突出構造の存在は確認できたが、プレート先端の突起は観察できなかった。全ゲノム配列を決定したところ、167,619 bp であり、17 個もの tRNA をコードしていた。GC 含量は 44.7％と宿主の 67%よりも極端に低かった。他の VLV との比較を行うと、tail spike 遺伝子が存在せず、TEM 観察の結果を支持するものとなった。また、吸着実験を行ったところ T4 と同程度の吸着係数を示し、VLV の Limestone1 等と比べると 1/10 程度であった。一方で、吸着後の可逆性について解析したところ同程度の吸着係数を持つ RSL1 と比べはるかに安定した結合を示した。このことから星状構造が安定的な吸着に関与することが予想された。系統解析の結果 VLV の sister branch を形成すると考えた。

Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS
identification of Aspergillus flavus and its related fungiCharacterization of Viunalikevirus infectiong phytopathogen Ralstonia
solanacearum.

○Tomoaki Kamijo, Jun Shimodaira, Hiroko Kawasaki(NBRC, NITE)

Key words

MALDI-TOF MS, Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, identification

3P-1a006 生分解性プラスチック分解糸状菌 B47-9 株のゲノム解析と同定○Takeru Kawasaki1, Tomoko Mihara2, Hiroyuki Ogata2, Makoto Fujie1,
Takashi Yamada1(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2Inst. Chem. Res., Kyoto Univ.)

Key words

phage, Ralstonia solanacearum

3P-1a008 畑土壌微生物叢の解析○小西 智之 1, 坂井 沙織 2, 海野 智史 2, 橋本 賢一 2, 川崎 寿 2（1電機大院・先科技, 2東電大・工・環境化）
kawasaki@cck.dendai.ac.jp○山下（鮫島） 結香 1, 小板橋 基夫 1, 小池 英明 2, 佐藤 豊三 1,
森脇 丈治 1, 雜賀 あずさ 2, 森田 友岳 2, 北本 宏子 1（1農研機構, 2産総研）
kitamoto@affrc.go.jp【背景と目的】 生分解性プラスチック（生プラ）を効率よく分解する糸状菌
B47-9 株は、乳化した生プラを単一炭素源として液体培養すると、培養上清中にクチナーゼ様の生プラ分解酵素を高純度に分泌する。我々は、様々な生プラ
分解性を示す酵素を、使用済み生プラ製農業用資材の効率的分解促進に用いるための検討を進めている。本研究では、酵素生産性の向上を目指して、B47-9株のゲノム配列を解読するとともに、本菌株の同定を試みた。
【方法と結果】ゲノム解読はペアエンド、メイトペアライブラリーを作成し、Illumina 社の Miseq システムを用いて実施した。その結果、B47-9 株のゲノムサ
イズは 39.3 Mbp、GC 含量は 52.4 %であった。さらに、Aspergillus nidulans FGSC
A4 株のゲノム情報を参考にして、14,202 個の遺伝子の存在が推定された。B47-9株は菌株の同定に必要な胞子を作らず、同定が完了できない。そこで、遺伝子レベルでの解析を進めた。リボソーム遺伝子（LSU, SSU）、および ITS 全領域の配列比較から、B47-9 株は Paraphoma 属に属すると断定した。B47-9 株に最も近縁の Paraphoma 属の 6 株（農業生物資源ジーンバンク保存株）は、いずれも 2 種類の生プラフィルム（ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンサクシ
ネート-co-アジペート）分解能を示し、このうち B47-9 株が最も強力であった。
本成果により、これまでほとんど解明されていない Paraphoma 属のゲノム科学
情報の拡充や、酵素生産株としての利用が期待される。
本研究は農林水産産業・食品産業科学研究推進事業 25017AB および JSPS 科研
費 No.25・40169 の助成を受けて行った。

70 億人を超えて急増する世界人口と途上国の経済発展によって食糧需要の拡大は続いている。これらを賄うには農業技術の進歩が欠かせない。現在の地球は、砂漠化などで新たな農地の拡張は難しく、水耕栽培などで農地を持たない機械的に栽培するといった新しい農業技術の開発や現在の農地の面積当たりの収穫量を飛躍的に伸ばす必要が出てきている。
現在の農地の面積当たりの収穫量を伸ばすには植物の品種改良といった方法で収穫量を伸ばせるがそれにもいずれ限界が来ると考えられる。
そこで我々は農地の回転率を上げることで面積当たりの収穫量を伸ばすことを考えている。回転率を上げるには植物を育てる過程で必要な栄養素 17 元素が不可欠である。このうち 9 元素は、炭素、酸素、水素、窒素、リン、カリウム、
カルシウム、マグネシウムで多量必須元素であり、8 元素は、鉄、マンガン、
銅、亜鉛、ホウ素、塩素、モリブデン、ニッケルで微量必須元素、これらが必須栄養素と呼ばれている。これら 17 元素のうち窒素、リン、硫黄などといったものが土壌中の微生物を介して植物に吸収されている。また、他にも立枯病や連作障害といった植物が病気や生育不良にならないことも収穫量を伸ばすのには不可欠である。
このように土壌中には植物の生育に役に立つ微生物、菌根菌などといったものから、立枯病などといった植物を病気にする病原菌が存在する。次世代シーケ
ンサを用いた 16S や 18S のアンプリコン解析によって農地の土壌の微生物叢の分析を行った。その結果、小松菜の作付け前、栽培途中、収穫直後といった周囲の環境変化に応じて微生物叢に違いがみられた。

Draft genome sequence and identification of biodegradable plastic
degrading fungi B47-9

Analysis of field soil microbiota○Yuka Sameshima-Yamashita1, Motoo Koitabashi1, Hideaki Koike2, Toyozo Sato1,
Jyoji Moriwaki1, Azusa Saika2, Tomotake Morita2, Hiroko Kitamoto1(1NARO, 2AIST)

Key words

biodegradable plastic, phylogenetic analysis, cutinase, Paraphoma○Tomoyuki Konishi1, Saori Sakai2, Satoshi Umino2, Ken-ichi Hashimoto2,
Hisashi Kawasaki2(1Grad. Sch. Adv. Sci. Technol. Tokyo Denki Univ., 2Dept.Green Sust. Chem.,Eng.
Dept.,Tokyo Denki Univ.)

Key words

Next Generation Sequencer, NGS, soil

遺伝子工学3P-1a009 コリネ型細菌における乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
ldhA の発現制御機構の解析

221

3P-1a011 ピぺリジン分解菌の分離と分解系遺伝子の解析○山本 泰誠, 岩木 宏明, 長谷川 喜衛（関西大 化学生命工）
iwaki@kansai-u.ac.jp○豊田 晃一 1, 乾 将行 1,2（1RITE・バイオ, 2奈良先端大・バイオ）mmg-lab@rite.or.jp【背景と目的】乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)はピルビン酸を NADH 依存的に乳酸へ還元する酵素であり、生体内の酸化還元バランスの維持において重要である。我々は有用工業微生物である Corynebacterium glutamicum における酸化還元
バランスの調節機構の解明を目的として、LDH をコードする遺伝子 ldhA の発現制御機構の解析を進めている。これまでに糖応答因子 SugR および乳酸応答
因子 LldR が転写抑制因子として働くことを明らかにしている。しかし ldhA の定常期における誘導は sugR-lldR 破壊株においても見られることから、別の転写因子の関与が示唆されていた。本研究では、cAMP receptor protein ファミリーに属するグローバルレギュレーター、GlxR の関与について解析を行った。
【方法】プロモーター活性を lacZ 遺伝子を用いたレポーターアッセイにより、遺伝子の mRNA レベルを定量 PCR によりそれぞれ測定した。GlxR タンパク質を組換え大腸菌より精製し Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)により
DNA 結合活性を検出した。
【結果と考察】in silico 解析により、ldhA 遺伝子上流に GlxR 結合サイトが予測されている 1。この結合サイトを削除することにより定常期におけるプロモー
ター活性の誘導が大きく減少した。EMSA により、この結合サイトに GlxR が弱いながらも結合することを示した。コンセンサス結合配列と比較して保存された塩基の置換によりこの結合は消失した。反対に、コンセンサス結合配列に近づけることにより GlxR の結合は強まった。さらに、結合を阻害する変異により、プロモーター活性は減少し、結合を促進する変異により活性は増加した。
染色体上へ同じ変異を導入することで ldhA の発現が GlxR の結合強度に応じて変化することを示した。以上より、GlxR が ldhA の転写活性化因子として働く
ことを明らかにした。
1. J. Biotechnol. 143(4), 239-46, (2009)【目的】脂環式アミンであるピぺリジンは、医薬中間体など工業的に広く使用されている。環境中に放出されると発がん性のあるニトロソ化合物に変換される
ため、その微生物分解についての知見は重要である。本研究では、土壌からピペリジン分解菌を分離するとともに、トランスポゾン挿入変異によりピペリジン分解に関与する遺伝子の同定を試みた。
【方法と結果】10mM ピペリジンを唯一の炭素源・窒素源として含む無機塩培地
を用い、集積培養を行い、土壌からピペリジン分解菌 4-3 株を分離した。4-3 株
は、16SrRNA 遺伝子配列に基づく系統解析の結果、Pseudomonas 属に帰属された。本菌株のピペリジン代謝経路およびピペリジン代謝に関与する遺伝子を解析するために、トランスポゾン(Tn5-31Tp)を利用し、ピペリジン資化能が欠損した 2 菌株(M1 と M7)を取得した。これらの変異株のトランスポゾン挿入部位を特定するために、トランスポゾン周辺領域をインバース PCR 法で増幅し、塩基配列の解析を行った。その結果、M1 株では、ポリアミン ABC トランスポー
ターの基質結合タンパク質様遺伝子に、M7 株では、FMN 結合タンパク質様遺伝子にトランスポゾンが挿入されていることが明らかになった。現在、トラン
スポゾン挿入遺伝子周辺領域の塩基配列を解析し、分解機構の解明を試みている。

The transcriptional regulatory mechanism of the ldhA gene encoding lactate
dehydrogenase, in Corynebacterium glutamicum

Isolation and genetic characterization of piperidine degrading bacterium

Key words
Corynebacterium glutamicum, transcriptional regulation, lactate
dehydrogenase

Key words

3P-1a010 Corynebacterium glutamicum によるグルタミン酸生産

3P-1a012 大腸菌 tolC 欠損株が酸感受性を示す機構の解析○Koichi Toyoda1, Masayuki Inui1,2(1RITE, 2Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)に対するストレスの影響○Taisei Yamamoto, Hiroaki Iwaki, Yoshie Hasegawa(Dept. Life Sci. & Biotechnol. Kansai Univ.)

piperidine, degradation, Pseudomonas○神田 健, 安彦 弦太, 岩井 伯隆, 和地 正明（東工大・生命理工学院）
mwachi@bio.titech.ac.jp○尾形 駿介 1, 齊藤 正輝 2, 吉川 勝徳 2, 古澤 力 3, 清水 浩 2,
平沢 敬 1（1東工大・生命理工学院, 2阪大院・情報, 3理研・生命システム）
thirasawa@bio.titech.ac.jp【背景と目的】コリネ型細菌の一種である Corynebacterium glutamicum は、グルタミン酸生産菌として日本で単離された通性嫌気性のグラム陽性細菌であり、発見から 50 年以上経つ現在でも、グルタミン酸の生産メカニズムには不明な点が多い。我々は、そのメカニズムを解明することを目指して、ペニシリン添加によるグルタミン酸生産誘導時の遺伝子発現変化について、DNA マイクロアレ
イを用いて解析した。その結果、ストレス応答に関わる転写因子の制御下にある遺伝子が、多く発現変動を起こすことを見出し、グルタミン酸生産がストレス応答の一部として機能していることが推測された。本研究では、C. glutamicumの野生株およびグルタミン酸排出にかかわるメカノセンシティブチャネル
NCgl1221 の変異株によるグルタミン酸生産に対するストレスの影響、特に金属イオンの影響を調べた。
【実験方法および結果】グルコースを基質とした合成培地で培養し、C. glutamicumの野生株 ATCC 13032 に対して銅 (II)・鉄 (II)・コバルト (II)・過酸化水素を対数増殖初期に添加してグルタミン酸生産を測定したところ、銅 (II)や鉄 (II)の添加によりわずかながらグルタミン酸の生産が確認された。そこで、グルタミン
酸が恒常的に排出される NCgl1221 の変異株 (A111V)について銅 (II)・亜鉛 (II)・
鉄 (II)・マンガン (II)・マグネシウム (II)の添加を行い、添加後のグルタミン酸生産を測定したところ、銅 (II)・亜鉛 (II)・鉄 (II)・マンガン (II)の添加による顕著なグルタミン酸生産の誘発が確認された。特に、銅 (II)の添加では著しく生産量が増大しており、その生産性は野生株にペニシリンを添加した際と同程度であったことから、銅代謝がグルタミン酸生産に関与する可能性が示唆された。

【背景と目的】大腸菌 Escherichia coli の外膜を貫通するチャネルタンパク質である TolC は、内膜上のポンプタンパク質と共役し、抗生物質等の外来物質や、
インドール等の代謝物を能動的に排出することが知られている。当研究室では、大腸菌の tolC 遺伝子欠損株が酸感受性を示すことを見出し、主要な酸耐性機構の一つである GAD システムの発現誘導が阻害されていることを明らかにした。
大腸菌 tolC 欠損株では、TolC 排出システムの基質が細胞内に蓄積することで、GAD システムの発現誘導が阻害されている可能性が考えられた。そこで tolC
欠損株において、TolC 排出システムの基質の一つであるインドールの合成酵素をコードする遺伝子 tnaA を欠損させたところ、GAD システムの発現の回復が見られ、酸耐性能も回復した。従って、tolC 欠損株では、蓄積したインドール
により GAD システムが抑制されていると考えられた。本研究では、インドールによる GAD システムの発現抑制が起こるメカニズムの解明を目的とした。
【方法】インドールによる抑制シグナルを伝達する経路の特定のため、GAD シ
ステムの転写制御因子と tnaA 遺伝子との二重欠損株を構築し、GAD assay により GAD システムの発現の程度を調べた。(1)転写制御因子欠損株では GAD シス
テムの発現が抑制されること、(2)それがインドールによる抑制に関与する因子であれば、tnaA との二重欠損にしても GAD システムの発現が回復しないことが予想された。
【結果】(1)、(2)の条件を満たす転写制御因子として、GadE と RpoS の 2 つの因子を特定した。GadE は GAD システムのマスターレギュレーターであり、GAD
システムの発現に必須であると考えられている。RpoS は gadE 遺伝子上流のプ
ロモーター領域を認識し、転写を促進すると考えられているシグマ因子である。
現在、TolC と RpoS の関連性について解析中である。

Effect of stress on glutamate production by Corynebacterium glutamicum

Analysis of Escherichia coli tolC mutant showing increased acid sensitivity○Shunsuke Ogata1, Masaki Saito2, Katsunori Yoshikawa2, Chikara Furusawa3,
Hiroshi Shimizu2, Takashi Hirasawa1(1Dept. Life Sci. Technol., Tokyo Tech, 2Grad. Sch. IST, Osaka Univ., 3QBiC,
RIKEN)

Key words

Corynebacterium glutamicum, glutamate fermentation, stress, Cu2+

○Takeshi Kanda, Genta Abiko, Noritaka Iwai, Masaaki Wachi(Dept. Life Sci. Technol.)Key words

Escherichia coli, acid tolerance, transporter, TolC

222

遺伝子工学

3P-1a013 Bacillus 属由来酵素の PHA モノマー供給能解析

3P-1a015 Bacillus 属細菌のシリカ蓄積メカニズムの解析【背景と目的】微生物が炭素源として貯蔵するポリヒドロキシアルカン酸(PHA)
は生分解性、熱可塑性、生体適合性を有するバイオポリエステルである。現在、PHA 生産宿主として用いられている Escherichia coli や Ralstonia eutropha はグラム陰性菌で、内毒素リポポリサッカライド(LPS)を合成する。LPS は PHA 精製の際に同時に抽出されるため、PHA を医療用担体として利用するためには LPSを取り除く工程が余分に必要となる。そこで LPS 非生産宿主として Bacillus 属に着目した。しかし、Bacillus 属の PHA 合成遺伝子クラスターの解析は、グラ
ム陰性菌ほど進んでいない。本研究では、Bacillus 属の PHA 合成遺伝子クラス
ターに含まれる 2 つのモノマー供給酵素候補である enoyl-CoA hydratase (PhaJ)と oxidoreductase について解析を行った。
【方法】脂肪酸からモノマーを供給する PhaJ の解析は炭素数 4 のクロトニル
CoA を基質として in vitro 系で活性測定を行った。また、in vivo 系では幅広い基
質特異性を有する PHA 重合酵素遺伝子(phaC)と共に phaJ を導入した大腸菌に
炭素数 12 の脂肪酸から PHA を生産させ、ガスクロマトグラフィーにより合成した PHA の含有量と組成を測定した。Oxidoreductase は pET-15b に導入してタンパク質の過剰発現系を構築した。
【結果と考察】 In vitro 系で Bacillus 属の PhaJ が炭素数 4 の基質に対して活性を有していることを示した。また、in vivo 系においても炭素数 4 と 6 のモノマー組成が増加したことから、Bacillus 属の PhaJ は PHA 重合酵素と類似した短鎖
PHA に基質特異性があると考えられる。また、oxidoreductase については pETシステムを用いた過剰発現系を構築した。この oxidoreductase のアミノ酸配列
は D-amino acid oxidase と高い相同性を有することから、現在、アミノ酸代謝の観点から PHA 生産との相関性を探索している。

【背景・目的】ケイ素（シリコン，Si）は酸素に次いで地殻上に二番目に多く存在する元素であり、産業的にも広く利用されている。珪藻や放散虫，一部の海綿や一部の高等植物などは可溶性のケイ酸（Si[OH]4）の形でケイ素を積極的に取り込み、その重合体であるシリカ（SiO2）を骨格や殻などとして利用する。
これまでシリカを蓄積するとして知られていた生物は真核生物ばかりであったが、当研究室では、グラム陽性細菌 Bacillus cereus とその近縁種が胞子形成期にケイ酸を取り込み、胞子表面にシリカとして蓄積することを発見した。これまでに、真核生物由来のシリカ形成ペプチドとの相同性解析を足掛かりとして、
胞子殻タンパク質のひとつである CotB1 がシリカ蓄積に関与することを明らかにした[1]。現在は、これとは異なるアプローチとして、形成されたシリカ中に含まれる有機物を調べることで、シリカ形成メカニズムの解析を進めている。
【方法・結果】ケイ酸を添加した培地中で B. cereus を培養し、シリカが蓄積された胞子を調製した。得られた胞子を濃硝酸・濃硫酸混合液中で強熱し、シリカ外部の有機物を分解した後、超遠心によりシリカを回収した。フッ酸（HF）
処理によりシリカを溶解し、溶出した画分を SDS-PAGE に供した。泳動後のゲ
ルを CBB 染色に供したところ、低分子量の領域にバンドが観察された。現在、得られた物質の同定を進めている。

Evaluation of PHA monomer-supplying capability of enzymes from Bacillus
spp.

Mechanism of silica accumulation in Bacillus cereus spores○木原 崇博 1, 廣江 綾香 1, 水野 康平 2, 柘植 丈治 1
（1東工大院・総理工, 2北九州高専）
tsuge.t.aa@m.titech.ac.jp○Takahiro Kihara1, Ayaka Hiroe1, Kouhei Mizuno2, Takeharu Tsuge1(1Interdiscip. Grad. Sch. Sci. Eng., Tokyo Tech, 2Kitakyushu Natl. Coll. Technol.)Key words

PHA, Bacillus sp., monomer supply, activity assay

3P-1a014 枯草菌の iolH がイノシトール代謝において果たす生理的意義○池田 丈 1, 田中 達也 1, 中川 美樹 2, 本村 圭 1, 廣田 隆一 1,
黒田 章夫 1
（1広島大院・先端物質, 2広島大・工）ikedatakeshi@hiroshima-u.ac.jp[1] Motomura et al. J. Bacteriol. 198, 276 (2016)○Takeshi Ikeda1, Tatsuya Tanaka1, Miki Nakagawa2, Kei Motomura1,
Ryuichi Hirota1, Akio Kuroda1(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2Fac. Eng., Hiroshima Univ.)

Key words

Bacillus cereus, biomineralization, silica, spore

3P-1a016 Negative chemotactic response toward maleate in
Ralstonia solanacearum○松本 明日香 1, Reuss Daniel 2, 田中 耕生 3, 石川 周 1, 竹中 慎治 4,
吉田 健一 1
（1神戸大院・科学技術イノベーション, 2Dept. General
Microbiology, Gottingen Univ., 3神戸大・自科・研究環, 4神戸大院・農・生命機能）
kenyoshi@kobe-u.ac.jp○Mattana Tunchai, Akiko Hida, Takahisa Tajima,
Yutaka Nakashimada, Junichi Kato
(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)
jun@hiroshima-u.ac.jp[目的]
枯草菌における myo-inositol(MI)代謝には、iolABCDEFGHIJ と iolRS、iolT という多数の遺伝子が関与している。リプレッサーをコードする iolR は iol 遺伝子群の発現制御を担っており、MI 存在下では iol 遺伝子群が転写誘導される。iol
遺伝子群の中で未だ酵素学的機能が特定されていないのは iolH のみであった。
本研究では iolH が果たす生理的意義を解明することを目的とした。
[方法と結果]我々は IolH の構造より推論して、そのトリオースリン酸異性化酵素活性を見出した。枯草菌には解糖系で働くトリオースリン酸異性化酵素の遺伝子 tpiA が存在するが、その転写発現がグルコース非存在下で低下することが示されている。
MI を代謝して生育する際に不足するトリオースリン酸異性化酵素活性を iolHが補う可能性を想起して、枯草菌の標準株(168 株)において、iolR と iolH それ
ぞれの単独破壊あるいは二重破壊を施し、MI を唯一の炭素源とする最少培地で生育させて増殖を比較した。iolH の単独破壊による影響は殆ど見られなかったが、iolR を破壊すると生育の停滞遅延が生じた。さらに、iolR の単独破壊株とiolR と iolH の二重破壊株を比較すると、後者において最終的に到達する細胞濃度が明らかに低減した。この原因として、iolR の破壊によって iol 遺伝子群が強制的に誘導されるため MI がすみやかに代謝されるが、tpiA の低発現に起因するトリオースリン酸異性化酵素活性の不足が iolH の欠損のために補われなくな
るので MI の最終代謝産物であるジヒドロキシアセトンリン酸が蓄積して生育への悪影響が現れた可能性が考えられた。そこで、iolR, iolH 破壊株においてtpiA を過剰に発現すると上記の生育遅延等が解消された。すなわち、グルコー
ス非存在下の MI 代謝において、iolH は第 2 のトリオースリン酸異性化酵素遺伝子として TpiA 発現の不足を補う役割を果たしていることが強く示唆された。

Ralstonia solonacearum, the causal agent of bacterial wilt disease, is regarded as oneof the world’s most destructive plant pathogenic bacteria. Previous studies found thatchemotaxis is an essential trait for the early stage of host invasion and pathogenic
fitness in R. solanacearum, so we have attempted to functionally characterizechemoreceptors, so called methyl-accepting chemotaxis proteins (MCPs), in thispathogen. R. solanacearum strain Ps29 exhibited strong negative chemotactic response
to a nonmetabolizable maleate, while two well-studied Pseudomonas spp., P.
aeruginosa PAO1 and P. putida F1 showed no response to it. P. fluorescens Pf0-1, on
the other hand, weakly attracted to maleate. The result of quantitative chemotaxis assay
of R. solanacearum Ps29 with various concentration of maleate showed that repellant
strength increased as the concentration increasing. To identify MCP potentially sensing
maleate, single mcp gene-deletion mutants library of strain Ps29 was screened. Among
22 mutants, only Δmcp16 mutant strain failed to chemotactic response to maleate,
whereas the other mutants showed no significant difference of the response comparing
with that of wild-type strain. Δmcp16 complemented with mcp16 gene successfully
restored chemotaxis response toward maleate, further confirming that mcp16 encodes
chemotactic transducers mediating negative response to maleate.

Physiological significance of Bacillus subtilis iolH on inositol metabolism

Negative chemotactic response toward maleate in Ralstonia solanacearum○Asuka Matsumoto1, Daniel Reuss2, Kosei Tanaka3, Shu Ishikawa1,
Shinji Takenaka4, Ken-ichi Yoshida1(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2Dept. General Microbiology,
Gottingen Univ., 3Org. Adv. Sci. Technol. Kobe Univ., 4Grad. Sch. Agric., Kobe
Univ.)

Key words

Bacillus subtilis, inositol○Mattana Tunchai, Akiko Hida, Takahisa Tajima, Yutaka Nakashimada,Junichi Kato
(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words

chemotaxis, Ralstonia solanacearum, maleate

遺伝子工学3P-1a017 メタン酸化細菌の細胞内レドックス状態の可視化○石川 聖人 1,5, 田中 裕也 2, 田中 謙也 3, 木村 恒太 3,
加藤 創一郎 4,5, 中西 周次 5, 堀 克敏 1
（1名大院・工, 2阪大・基礎工, 3阪大院・基礎工, 4産総研・生物プロセス, 5阪大・太陽エネ研）
ishikawa.masahito@nubio.nagoya-u.ac.jp

223

3P-1a019 R-IVET 法によるマウス消化管特異的に発現するビフィ
ズス菌遺伝子の同定○石神 夏実 1, 河口 礼佳 1, 平等 清夏 1, 阪中 幹祥 2, 横田 篤 1,
吹谷 智 1（1北大院・農・微生物生理学, 2石川県立大院・生資環）
s-fukiya@chem.agr.hokudai.ac.jp【背景・目的】
微生物によるメタンの有用物質変換は近年注目されているが、反応の第一段階であるメタンの好気的酸化は還元力を必要とする反応であることに留意しなくてはならない。極めて安定なメタンを水酸化できるメタン酸化細菌は、一般的に C1 化合物しか基質として利用することができない。それゆえ、メタンの変換物質を生産物として回収してしまうと、細胞は増殖維持に必要な炭素源、メタン酸化に必要な電子源を失うことになる。従って、メタン由来の有用物質生
産を持続させるには、細胞増殖と還元力を安定に維持することが重要である。
このような背景のもと、本研究では安定なメタン由来の有用物質生産に適した条件を見出すために、メタン酸化細菌の細胞内レドックス状態の可視化を試みた。手法としては、蛍光タンパク質プローブを利用する方法と電気化学計測法を検討した。
【実験・結果】
広宿主域プラスミド pJN105 に NADH センサー蛍光タンパクである PeredoxmCherry をクローニングし、代表的なメタン酸化細菌である Methylococcus
capsulatus Bath 株へ導入した。得られた形質転換体の菌懸濁液に、メタン、ギ酸を添加したところ、蛍光強度の上昇が確認された。また、細胞膜透過性と生体適合性を兼ね備えた電子伝達メディエーターを含む菌懸濁液の開回路電位を、Ag/AgCl 電極を参照電極、グラッシーカーボンを作用電極とした２電極系で測定した。電位が一定になった後、メタン、ギ酸を添加したところ、電位が大きく低下した。どちらの手法による結果も、目論見通りの変化を示したことから、代謝に伴う細胞内レドックス状態の変動を正しくモニターできたと考えられる。

【背景・目的】ビフィズス菌は宿主に対して整腸作用などの有用な効果を発揮す
る腸内細菌として知られているが，消化管における生存や宿主との相互作用の機構は未だ明らかになっていない．そこで本研究では，これらの機構解明の端緒として，R-IVET (recombinase-based in vivo expression technology) 法を用いて，消化管特異的に発現するビフィズス菌の遺伝子を網羅的に同定することを目的とした．
【方法】これまでの研究で確立した Bifidobacterium longum 105-A 株（105-A 株）の R-IVET 系を使用した．本系では，loxP に挟まれたスペクチノマイシン (Sp)耐性遺伝子 (SpR) を 105-A 株の染色体上に挿入した宿主株に，105-A 株のランダ
ムな DNA 断片を Cre ORF 上流に連結したベクターを導入することにより，ゲノムライブラリーが構築されている．この DNA 断片中のプロモーター領域が機能すると，Cre が発現して SpR が除去される．これを利用して，まず本ライ
ブラリーを Sp 含有液体培地で培養し，培地中で機能するプロモーター領域を有する株を排除した（1 次選抜）．1 次選抜後のライブラリーを BALB/c 雌マウ
スへ経口投与し，糞便中からライブラリーを回収した．Sp 含有寒天培地へのレプリカ試験により Sp 感受性株，すなわちマウス消化管特異的に機能するプロ
モーター領域を有する株を選抜した（2 次選抜）．プロモーター領域のゲノム上の位置を決定し，その下流の遺伝子をマウス消化管特異的に発現する遺伝子として同定した．
【結果】1 回目の投与試験により，マウス消化管特異的に発現すると推測される
遺伝子 23 個が同定され，それらの中には消化管での発現誘導が報告されている遺伝子も含まれていた．さらなる遺伝子の同定および R-IVET 法の有効性を検証するため，2 回目の投与試験を行い，Sp 感受性株を 60 株取得した．現在，
消化管特異的に発現する遺伝子の同定を進めている．

Visualization of an intracellular redox state of methane oxidizing bacteria

Identification of Bifidobacterium genes specifically expressed in the mouseintestine by R-IVET○Masahito Ishikawa1,5, Yuya Tanaka2, Kenya Tanaka3, Kota Kimura3,
Souichiro Kato4,5, Shuji Nakanishi5, Katsutoshi Hori1(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2Sch. Eng. Sci., Osaka Univ., 3Grad. Sch. Eng.
Sci., Osaka Univ., 4BRI. AIST, 5RCSEC. Osaka Univ.)○Natsumi Ishigami1, Hiroka Koguchi1, Sayaka Hiratou1, Mikiyasu Sakanaka2,
Atsushi Yokota1, Satoru Fukiya1(1Lab. Microbial Physiol., Grad. Sch. Agric., Hokkaido Univ., 2Grad. Sch. Biores.
Environ. Sci., Ishikawa Pref. Univ.)

Key words
methane oxidation, intracellular redox state, mediator, electrochemicalmeasurement

Key words

3P-1a018 植物生長促進細菌によるシロイヌナズナの生長促進作用

3P-1a020 ビフィズス菌プロモーターの機能解析

メカニズムの解析

Bifidobacterium longum, R-IVET, gene expression○小酒井 智也 1, 野村 泉 2, 鈴木 徹 2（1岐阜大院・応生・応生, 2岐阜大・応生・応生）
jiji556important@yahoo.co.jp○中岡 知規 1, 澤田 祥子 2, 大浦 麻里 1, 田中 雄也 2, 阿野 貴司 1,2,
岡南 政宏 1,2
（1近畿大院・生物理工, 2近畿大・生物理工）
okanami@waka.kindai.ac.jp【背景と目的】細菌と植物は多様な相互関係を築いており、植物の生長を促進す
る細菌も存在している。このような細菌は植物生長促進細菌(PGPB)と呼ばれており、植物の生長を直接的または間接的に促進する。PGPB は植物ホルモン様物質の産生、リンや鉄の可溶化などを行っていると考えられる。また、一部の
PGPB では植物生長促進作用に加え、植物病原菌の増殖を抑制する作用も併せ持つことが知られている。これまでに我々は、シロイヌナズナの芽生えの側根伸長を促進する Pseudomonas fluorescens A-2 株を単離している。これは揮発性物質を分泌することによってシロイヌナズナの生長を促進しているようであった。さらに Fusarium oxysporum や Rhizoctonia solani などの植物病原菌の増殖を抑制する働きを持つことがわかった。本研究では P. fluorescens A-2 株が持つ、
植物生長促進(PGP)作用に関わる遺伝子の同定を目的とした。
【方法】PGP 作用に関わる遺伝子を同定するために、P. fluorescens A-2 株に亜硝酸処理を行い、A-2 株の変異体プールを作製した。変異体をシロイヌナズナの芽生えと共生させ、シロイヌナズナの側根伸長を促進できない A-2 変異株の単離を試みた。得られた変異株の 1 つである A-2(C37)株に野生型 A-2 株のゲノム
DNA 断片を導入し、再び PGP 作用を示すことができるようになった A-2(C37)
復帰株の選抜を試みた。PCR を用いて、A-2(C37)復帰株に導入された DNA 断片の増幅を試みた。
【結果】PGP 作用を示さなくなった A-2 人工変異株を多数単離した。A-2(C37)
変異株にゲノム DNA 断片を導入することによって、PGP 作用が復帰した
A-2(C37)復帰株を単離することができた。A-2(C37)復帰株に導入された DNA 断
片は、4kbp の断片であった。導入された DNA 断片の解析結果も報告する予定である。

【目的】近年，様々なビフィズス菌の全ゲノム配列がわかっている。しかし，ゲノム上の配列がもつ機能についてはわからないことが多い。ゲノムの中でも，遺伝子上流に存在するプロモーターは，mRNA への転写の中心的な役割を担っている。プロモーター配列の中でも特に重要な-10 領域と-35 領域については，
ビフィズス菌において解明されていない。そこで，Bifidobacterium longum 内での二つの領域の最適な配列の特定を試みた。
【方法】B. longum NCC2705 から mRNA を抽出して RNA-seq を行った。遺伝子
発現量の変化から，130 種類の遺伝子上流に存在する転写開始点（TSS）を推定した。さらに，推定 TSS の上流 55 bp の配列に対して隠れマルコフモデルを適応し，-10 領域と-35 領域の 6 塩基モチーフをそれぞれ推定した。
推定した二つの 6 塩基モチーフのプロモーター活性を測定するために，クロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）を用いたレポーターアッ
セイを行った。プラスミドの構築においては，ベクターとして pKO403 を用い，プロモーター領域，CAT 遺伝子，hup ターミネーターを Golden-Gate 法により組み込むことで，目的のプラスミドを得た。また，各 6 塩基モチーフに 1 塩基ずつ変異を加えることで，各塩基の最適なプロモーター配列を特定しようとした。プラスミドはエレクトロポレーションにより B. longum 105-A に形質転換し，CAT アッセイを行った。
【結果及び考察】RNA-seq の結果の解析から，ビフィズス菌プロモーターの-10
領域と-35 領域の 6 塩基モチーフのコンセンサス配列は，それぞれ 5’-TTGTGC-3’と 5’-TACAAT-3’と推定された。また，この配列に基づいてレポーターアッセイを行った結果，-10 領域と-35 領域の最適な配列は，それぞれ 5’-TTGNNN-3’と5’-TATAAT-3’であることがわかった。これらの配列は，大腸菌と比較して類似したものであった。

Study on mechanisms for a plant growth promotion effect of bacteria on
Arabidopsis thaliana

the analysis of the promoter in Bfidobacterium○Nakaoka Tomonori1, Sawada Shoko2, Ooura Mari1, Tanaka Yuuya2,
Ano Takashi1,2, Okanami Masahiro1,2(1Grad. Sch. Biol. Ortd. Sci. Technol., Kindai Univ., 2Fac. Biol. Ortd. Sci. Technol.,
Kindai Univ.)

Key words

Pseudomonas, Arabidopsis thaliana, plant growth promotion○Tomoya Kozakai1, Izumi Nomura2, Tohru Suzuki2(1Grad. sch. Fac. Appl. Bio. Sci., Gifu Univ., 2Fac. Appl. Bio. Sci., Gifu Univ.)

Key words

bifidobacterium, promoter

224

遺伝子工学

3P-1a021 転写因子の競合デザインによる Half-adder 回路のコンパクト設計

3P-1a023 納豆菌由来 pLS20cat を用いた新規プラスミドベクター
システムの開発○湯本 達弥, 佐伯 和哉, 河合（野間） 繁子, 斎藤 恭一,
梅野 太輔（千葉大院・工）umeno@faculty.chiba-u.jp○宮野 恵 1, 田中 耕生 2, 石川 周 1, 竹中 慎治 3, 吉田 健一 1
（1神戸大院・科学技術イノベーション, 2神戸大・自科・研究環, 3神戸大院・農・生命機能）
kenyoshi@kobe-u.ac.jp【背景と目的】 人工的な転写制御ネットワークの製作技術は進歩し続けている
が，転写制御のカスケードデザインに依る現行の遺伝子回路設計学で創り得る
ネットワークの集積度には大きな限界がある．これは，制御ステップ数とともにノイズや分布が急拡大するからに他ならない．本研究では，RNA ポリメラー
ゼと転写制御タンパク質どうしが繰り広げる結合競合現象を進化デザインする
ことによって，たったひとつのプロモータの上に，Boolean 型 2 入力論理回路のすべてを実現できるフォーマットを提案する．また，この手法を用いた，世界最小の Half-adder 回路の迅速な構築例を報告する．
【結果および考察】
1. 結合競合を利用した単層論理ゲートの開発
choline 応答型転写因子 BetI，無水テトラサイクリン（aTc）応答型転写因子 TetR
を選び，これらが T7 プロモータに対して機能を発揮できる オペレータ-PT7 間の距離を上下流それぞれに対して割り出した．こうして独立に作用できる上下
流２つのオペレータ配列に，それぞれ部分重複させるかたちで外側からもう１つずつのオペレータを配置した．こうして作製した計４つのオペレータと PT7の複合プロモータを部分ランダム化すると，EQUAL ゲートを含む６種類の異なる論理ゲートが得られた．
2. XOR/AND ゲートの構築
BetI の進化工学により，逆転型（choline が co-repressor として働く）の変異体を得た．これを野生型 TetR と共に EQUAL ゲートに作用させると，XOR ゲー
トとして振る舞った．tetO/lacO/BetO の部分重複ライブラリの中から選抜した
aTc/choline の AND ゲートと一細胞に共存させることにより，歩留まり良く Halfadder 回路が構築できた．

[目的]
納豆菌由来の接合伝達プラスミド pLS20cat は 15 分の液体培養でも伝達する程に 高 効 率 で 、 Bacillus anthracis, B. cereus, B. licheniformis, B. megaterium, B.
pumilus, B. thuringiensis の他バチラス属にも伝達出来ることが確認されている。
また pLS20cat は自身だけでなく oriT を持つ可動プラスミドも伝達することが出来る。我々は pLS20cat と可動プラスミド pGR16B を用いて二親接合と三親接合を行い、両プラスミドの伝達について調べることを目的とした。
[結果]
pLS20cat を持つヘルパーと pGR16B を持つドナー、レシピエントの三親接合を行った。15 分の液体培地では pLS20cat のみ伝達したが、pGR16B は伝達しなかった。しかし 20 時間の寒天培地では、pLS20cat のみならず pGR16B の伝達も確認された。一方 pLS20cat と pGR16B の両者を持つドナーを用いて二親接合を行うと、15 分でも pLS20cat と pGR16B の伝達が確認された。このことから、三親接合では pLS20cat がドナーへ伝達され、続いて pGR16B が伝達されるという 2 段階を経ると想定され、そのため効率が低いと考えられた。そこで、pLS20catの oriT を欠損させ自身が伝達不能となった pLS20catΔoriT を作製し接合を行うと、20 時間の三親接合においても pGR16B が伝達されなくなった。しかし二親接合では、pLS20cat を用いた時と同様の効率で pGR16B が伝達された。このことから三親接合における可動プラスミドの伝達は想定通り 2 段階を経ており、接合伝達プラスミドがヘルパーからドナーへ伝達することが不可欠であると確認された。
pLS20catΔoriT を用いた二親接合では、可動プラスミドのみを選択的にレシピエントへ伝達可能で、一度伝達された可動プラスミドがさらに第 3 者へ伝達されることもない。従って、この二親接合は自然形質転換能力を持たない菌株に遺伝子を導入するための新規遺伝子操作ツールとして応用可能である。

The minimal Half-adder circuits constructed by competition design among
operators and promoters

A novel plasmid-vector system based on pLS20cat of Bacillus subtilis (natto)○Tatsuya Yumoto, Kazuya Saeki, Shigeko Kawai-Noma, Kyoichi Saito,
Daisuke Umeno(Grad. Sch. Eng., Chiba Univ.)

Key words
adder

Boolean logic gate, protein displacement, binding competition, Half-

3P-1a022 異なる環境試料からの新規自己伝達性プラスミドの取得○仲田 裕貴, 金原 和秀, 新谷 政己（静大・創科技院）
shintani.masaki@shizuoka.ac.jp

プラスミドは染色体外の自己複製遺伝子で，その伝播は微生物の急速な進化・適応能に寄与し，微生物の遺伝子組換えの必須ツールである．対象となる微生物の機能解析やその利用には，その微生物に適したプラスミドベクター（宿主ベクター系）の開発が非常に重要であるが，現在ベクターとして利用可能なプ
ラスミドの種類は，環境中に生息する種々の微生物を網羅するほど十分とはいえない．そこで，新規宿主ベクター系の開発を目指し，新たなプラスミドを取得することを目的とした．プラスミドの取得は，自己伝達性プラスミドが可動性プラスミドを伝達させる能力を指標とする三親接合を利用して行った．既知の可動性プラスミドを用い，受容菌には染色体上に GFP 遺伝子を挿入した
Pseudomonas resinovorans CA10dm4GFP 株を用いた．環境試料由来のプラスミドと，可動性プラスミドを受け取った接合完了体は，可動性プラスミドが宿主に付与する抗生物質耐性能と，受容菌の GFP 遺伝子の発現を指標に選抜した．また，環境試料としては 2 種類のサンプルを用いた．環境試料由来のプラスミドを保持していると推定される菌株，169 株の単離を行い，プラスミドの有無については改変アルカリ SDS 法で抽出後，電気泳動によって調べた．プラスミドに相当するバンドを確認できた菌株は，不和合性群 IncP-1 または PromA に属するプラスミドの，特定の領域を増幅するプライマーを準備して PCR を行った
後，増幅産物の有無を調べた．これまでに 115 株が環境由来のプラスミドを保持すると推定され，うち 66 株について PCR を行ったところ，19 株が IncP-1 ま
たは PromA のプラスミドを保持すると推定され，残りは別グループのプラスミ
ドであることが示唆された．本研究により，環境試料由来のプラスミドを取得する系を確立でき，現在は同様の手法を用いて嫌気条件下でのプラスミドの取得も試みている．

Plasmid capturing from different environmental samples○Hiroki Nakata, Kazuhide Kimbara, Masaki Shintani(Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ.)

Key words

plasmid, capturing, environmental bacteria○Megumi Miyano1, Kosei Tanaka2, Shu Ishikawa1, Shinji Takenaka3,
Ken-ichi Yoshida1(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2Org. Adv. Sci. Technol. Kobe Univ.,
3
Grad. Sch. Agric.,Kobe Univ.)

Key words

conjugation, Bacillus subtilis, gene transfer

3P-1a024 新規抗生物質の開発に向けた微生物群集の単離培養を伴わないスクリーニング手法の確立○山元 奈緒, 中島 信孝（東工大院・生命理工）nnakashima@bio.titech.ac.jp＜背景・目的＞
多種類の抗生物質に耐性を示す、多剤耐性細菌の出現と蔓延が世界的な問題となっている。その耐性の獲得速度は年々早まっており、この先さらに増していくと考えられる耐性菌に対応できる抗生物質の新規開発が求められている。しかし、既存の抗生物質の約 70％を産生している土壌細菌は、そのほとんどが単離培養することが困難であり、このことが抗生物質の開発の枷となっている。
そこで本研究では、単離培養という過程を経ずに土壌細菌をスクリーニングする方法を確立し、土壌細菌から新規抗生物質を探索することを目的とする。
＜方法・結果＞
実験は大腸菌を宿主として行った。しかし、野生型大腸菌の細胞外膜は疎水性の物質が透過しづらいため、土壌細菌が産生する化合物が疎水性だった場合その作用を観察することが難しい。そこで、外膜に欠損があり疎水性抗生物質感
受性の大腸菌変異体を作製し、この変異大腸菌を用いた。まず、河川・海・森
林など様々な環境から土壌試料を採取し、3 種類の液体培地で 2 週間培養した。
培養後、培養液の上澄みを濃縮・フィルター滅菌し、土壌細菌が産生する化合物を含む液体を得た。この液体を、前培養した大腸菌に加え 4 時間培養し、濁度を測定することで成長阻害の有無を確認した。このスクリーニング手法により、土壌細菌の産生する抗生物質の濃度が非常に低いという問題を克服することができた。41 種類の土壌試料をそれぞれ 3 種類の培地で培養して得られた
123 試料についてスクリーニングを行ったところ、29 サンプルで大腸菌の成長阻害が確認された。現在はこれらの試料中に含まれる成長阻害をもたらす化合物の同定方法、その化合物を産生する微生物種の特定方法を検討している。また今後は、創薬においてまだ標的になっていない遺伝子産物を標的にした「標的志向型のスクリーニン」を行う予定である。

Establishment of the method of screening microbial community without
isolation for developing novel antibiotics○Nao Yamamoto, Nobutaka Nakashima(Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Tech)

Key words

soil bacteria, antibiotics

遺伝子工学3P-1a025 Tricholoma matsutake NBRC30605 株の De novo 解析お
よび糖質分解酵素遺伝子の特定○大沼 広宜 1, 福田 泰久 2, 白坂 憲章 2
（1近畿大院・農, 2近畿大・農）sirasaka@nara.kindai.ac.jp

225

3P-1a027 CRISPR-PCS 法を基盤とした酵母染色体の多様な操作技術の開発○笹野 佑 1, 長澤 宏器 1, 木村 駿太 1, Kaboli Saeed 1, 中井 大志 1,
村山 亮太 1, 杉山 峰崇 1, 原島 俊 2（1阪大院・工, 2崇城大・生物生命）
sasano@bio.eng.osaka-u.ac.jp

1) Kusuda, M. et al., Mycoscience, 47, 184-189, (2006)

近年、ストレス耐性等の有用形質は多くの場合、複数の遺伝子によって制御されていることが明らかになってきた。これにより染色体や長大な遺伝子領域を自在に操作する染色体工学技術の重要性が高まっている。染色体の任意箇所での分断技術や、染色体上の任意領域を欠失や重複させる技術、あるいは染色体間で相互転座や融合を行う技術を開発することは、有用菌株を育種する上で非常に重要である。我々は出芽酵母において、染色体を任意の位置で分断し 2 つの機能的な染色体に分割する技術である PCS 法を開発し、これを基盤とした
様々な染色体工学技術を開発してきた。これにより染色体の任意領域の欠失や重複が可能となった。さらに近年、PCS 法の効率を大幅に向上させた CRISPRPCS 法を開発した。CRISPR-PCS 法は、任意の箇所で DNA 二重鎖切断（DSB）
を引き起こすことが出来る CRISPR/Cas9 システムを PCS 法と組み合わせた技術であり、染色体分断の効率を数百倍以上向上させることにより、従来の PCS
法では一度の操作で一か所の分断が限界であったのに対し、CRISPR-PCS 法では最大 4 か所の染色体部位を同時に分断することができるようになった。
本研究では、CRISPR-PCS 法を染色体分断以外の染色体操作に応用することを試みた。その結果、9 番染色体と 15 番染色体の約 25 kb の遺伝子領域の同時欠失、及び 3 番染色体と 15 番染色体の約 200 kb の領域の同時重複に成功した。
さらに、これまで不可能であった 400 kb の染色体重複も可能となった。加えて、9 番染色体と 15 番染色体間の相互転座にも成功し、染色体間操作も可能となった。以上より、CRISPR-PCS 法は酵母において多様な染色体操作を可能にする染色体工学の基盤技術となり得ることが示された。今後は本技術を利用したゲノム機能の解明や有用菌株育種への応用が期待される。

De novo sequence analysis of Tricholoma matsutake NBRC30605 andspecify of glycoside hydrolase genes

Development of a versatile chromosome manipulation technology in yeast
based on CRISPR-PCS[目的] 外生菌根菌であるマツタケ(Tricholoma matsutake)の人工培地上での糖質分解酵素活性は弱く,生育に長期間要することからマツタケの人工栽培が困難とされている.他にも要因の一つとして,マツタケのゲノム,またはタンパクのデータ
ベースの情報が少ないことが挙げられる．本研究では,マツタケの人工栽培を目指すための基礎データを得るため,ゲノムデータベースを構築し,これまでに明らかにされている糖質分解酵素系をコードする遺伝子配列を特定することを目的とした.演者らはマツタケ NBRC 30605 の全ゲノム配列を解析し,楠田ら 1)により報告された β-グルコシダーゼの内部アミノ酸配列およびコードするゲノム配列を決定した.
[結果] NextSeq500( illumina )を用いてマツタケ NBRC 30605 株の全ゲノム情報を取得・解析し,DDBJ に公開した( DDBJ/EMBL/GenBank : accession number ;BDDP00000001-BDDP00088884 )．続いて本菌株の培養ろ液より β-グルコシダー
ゼ( 160kDa )を単一に精製した．精製した β-グルコシダーゼを Endo-H 処理
し,SDS-PAGE 後,トリプシンによるゲル内消化で得られたペプチド断片を autoflex
speed TOF/TOF-KN2 (Bruker) を用いて MS/MS 解析を行い, 内部アミノ酸配列を決定した.それぞれのアミノ酸配列を JGI T.matsutake 945 (V3.0) BLAST system ゲ
ノム配列をリファレンスとしてマツタケ NBRC 30605 株の配列情報に検索をしたところ, β-グルコシダーゼに相当するゲノム配列が見られ, ほぼ同一であった.
本研究は私立大学戦略的研究基盤形成支援事業( S1512004 )の助成を受け行われたものである.

○Hiroki Onuma1, Yasuhisa Fukuta2, Norifumi Shirasaka2(1Grad. Sch. Agric. Kinki Univ., 2Fac. Agric., Kinki Univ.)

Key words

tricholoma matsutake, whole genome sequence, beta-glucosidase○Yu Sasano1, Koki Nagasawa1, Shunta Kimura1, Saeed Kaboli1, Taishi Nakai1,
Ryota Murayama1, Minetaka Sugiyama1, Satoshi Harashima2(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Fac. Biotechnol. Life Sci., Sojo Univ.)

Key words
CRISPR-PCS, Chromosome engineering, Saccharomyces cerevisiae,
CRISPR/Cas9

3P-1a026 繊毛虫テトラヒメナを用いたセルラーゼ生産ベクターの3P-1a028 DSB により誘発されるゲノム再編を駆動力とする出芽○海老原 哲男 1,2, 増田 光平 2, 遠藤 浩 2, 仁宮 一章 3,
小田切 正人 4, 守屋 繁 4（1名大・遺伝子, 2金沢大院・自科, 3金沢大・環日本海域環境研
究セ, 4理化学研究所 基幹研究所）
hendoh@staff.kanazawa-u.ac.jp○池内 暁紀 1, 中村 里沙 1, 田中 秀典 1, 村本 伸彦 1, 中村 隆宏 2,
太田 邦史 2
（1豊田中研, 2東大院・総合文化）
e1412@mosk.tytlabs.co.jp

確立

酵母の新規育種技術

現在、主要なバイオエタノールの発酵は、酵母 Saccharomyces. cerevisiae が最も有効な生産手段として成果を挙げてきている。バイオ燃料は、トウモロコシ Zea
mays やサトウキビ Saccharum officinarum といった糖質系原料が主であるが、これらは食物としても十分に利用価値のある資源である。近年では、セルロースなどの木質系原料を分解することでグルコースを獲得し、発酵に利用する研究も行われている。しかし、その製法は希硫酸や濃硫酸等を用いた加水分解によるものであり、分解処理におけるエネルギーは生産するバイオ燃料から得られるエネルギーよりも高く、従来の方法でははるかに非効率であった。
そこで低コストで効率的にセルロースを分解し、獲得したグルコースを自身の栄養として利用しているオオシロアリ Hodotermopsis. sjostedti に注目した。シロ
アリは自身が分泌するセルラーゼと彼らの腸内で共生している鞭毛虫や細菌が放出するセルラーゼを利用し、両者のセルラーゼの相乗作用により効率的なセルロース分解を可能としている。宿主シロアリよりも高い活性を有している腸内共生生物由来のセルラーゼを利用することで、木質系バイオマスから容易にグルコースを獲得できるものと期待した。
シロアリ腸内共生生物が持つセルラーゼの一種 Glycoside Hydrolase family5 に分類 さ れ る Endoglucanase(EG5) を 、 モ デ ル 生 物 で あ る 繊 毛 虫 テ ト ラ ヒ メ ナ
Tetrahymena thermophila で発現できるベクターを構築した。相同組み換えによりテトラヒメナへ EG5 分泌ベクターを導入し、ジニトロサリチル酸法によってセルラーゼ活性測定を行った。その結果、酵母より 1 細胞当たりの活性が高い
ことが示された。
最終的には複数のセルラーゼ遺伝子を 1 細胞に導入し、好気環境下での効率的なセルロース分解システムをテトラヒメナにより実現することを目指す。

再生可能な資源である植物バイオマスを微生物プロセスによって、低コストで燃料や化成品に変換するためには、微生物の物質生産性を飛躍的に向上させる育種技術が必要である。特に、実用プロセスで重要となる耐熱性や阻害物耐性などの量的形質は、複数の遺伝子が複雑に関与するため、従来の少数遺伝子を標的とした育種技術では限界がある。
近年、比較ゲノム解析により、ゲノムの倍加と DNA の二本鎖切断（DSB）により誘発されるゲノム再編が生物進化の駆動力となった可能性が示唆されている。ゲノムの重複、欠失、転座、逆位などのゲノム再編は遺伝子発現の変動をもたらし、生物の遺伝的多様性獲得の重要な要因となってきたと考えられる。
我々は、生物進化に着目した新たな育種技術として、好熱菌由来制限酵素 TaqIを酵母等の細胞内で発現させ、加温により TaqI の DSB 活性を制御する事で大規模なゲノム再編を誘発できる「TAQing システム」を開発した。
本手法を用いて、キシロース資化遺伝子を導入した出芽酵母（Saccharomyces
cerevisiae）のキシロース資化速度と耐熱性の進化育種を行った結果、40℃でキ
シロース発酵可能な株を取得した。取得した株の全ゲノムタイリングアレイ解析を行った結果、複数のコピー数多型とゲノム再編が検出され、TAQing シス
テムにより様々な遺伝的多様性が誘発されることが分かった。

Establishment of vector to secret cellulase by Tetrahymena thermophile

A novel breeding method; genome rearrangement induced by multiple DNA
double strand breaks in yeast.

○Tetsuo Ebihara1,2, Kouhei Masuda2, Hiroshi Endo2, Kazuaki Ninomiya3,
Masato Odagiri4, Shigeru Moriya4(1Center for research , Nagoya University, 2Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa
Univ., 3Inst. Nat. Environ. Technol., Kanazawa Univ., 4Adv. Sci. Inst., RIKEN)

Key words

heterologous production, protist, cellulase, termite○Akinori Ikeuchi1, Risa Nakamura1, Hidenori Tanaka1, Nobuhiko Muramoto1,
Takahiro Nakamura2, Kunihiro Ohta2(1Toyota Cent. R&D Labs. Inc., 2Grad. Sch. Arts Sci., Univ. Tokyo)

Key words
genome engineering, evolutionary engeneering, Saccharomyces
cerevisiae, bioethanol

226

遺伝子工学

3P-1a029 メタノール資化酵母 Hansenula polymorpha の改良
CRISPR/Cas9 によるゲノム編集

3P-1a031 マンノシルエリスリトールリピッド生合成に関わるアシル転移酵素破壊株の作製○沼本 穂, 前川 裕美, 金子 嘉信（阪大院・工）kaneko@bio.eng.osaka-u.ac.jp○吉田 優太, 小西 正朗（北見工大）
konishim@mail.kitami-it.ac.jp

メタノール資化酵母 Hansenula polymorpha は、50℃近い高温でも生育可能であり、メタノール誘導による異種タンパク質生産宿主としても利用される産業酵
母の 1 つである。これまで、本酵母で開発した YCp 型ベクターを使用して、高等動植物でゲノム編集技術として注目されている CRISPR/Cas9 システムの活用を検討し、10-3 の頻度で変異株が得られることを確認した。しかしながら、実用的にはさらに高い変異効率が望まれる。そこで、Yarrowia lipolytica での例 1)を参考に、sgRNA を tRNA 遺伝子の直後に連結して発現させるように再設計した。tRNA 配列は、転写後 tRNA プロセシングによって除去される。また、Cas9の発現を高めるために、H. polymorpha の中で最も転写レベルの高い HpTDH3のプロモーターを使用した。HpADE12、HpPHO84、HpPHO1 遺伝子を標的として作製したそれぞれの CRISPR/Cas9 プラスミドを野生型株に導入したところ、30~70%の頻度で標的配列中に塩基の欠失や挿入をもつ変異体を得られた。この変異効率は以前の CRISPR/Cas9 システムより 100 倍向上した。この改良した
CRISPR/Cas9 システムにより、本酵母でも効率的なゲノム編集が可能になった。
本研究は、公益財団法人発酵研究所平成 23 年度寄付講座助成で実施された。
1) Schwartz et al., ACS Synth. Biol., 5, 356-359 (2016)【背景・目的】
マンノシルエリスリトールリピッド（MEL）は Ustilago 属の真菌が生産する糖
脂質型界面活性物質であり、化粧品などへの応用研究が進んでいる。Pseudozyma
hubeiensis SY62 株は脂肪酸側鎖を 2 本持つジアシル MEL を選択的に生産することができ、かつ、その生産性は既知の MEL 生産菌の中で最も優れている。
既知の MEL 生産菌は 2 種類のアシルトランスフェラーゼが関与しジアシル MEL
を選択的に合成するため、モノアシル MEL は容易に生産できない。そこで、
MEL 代謝関連遺伝子を特定し、遺伝子破壊により MEL 合成代謝中間体を選択的に生産できる組み換え株の構築を試みた。
【方法・結果】
Ilumina HiSeq で取得したドラフトゲノムデータからアシルトランスフェラーゼ
遺伝子（mac1）の配列を推定し、部分配列（上流・下流）を PCR 増幅した。
大腸菌-Ustilago シャトルベクター pUXV1 のハイグロマイシン耐性マーカー配列を PCR 増幅した。In fusion cloning kit を使用し、耐性マーカーを mac1 部分配列ではさみ込むように連結させ、pUC19 の BamHI サイトにクローニングし、
mac1 遺伝子破壊カセットを作製した。破壊カセットを制限酵素で切り出し、エレクトロポーレーション法により SY62 に遺伝子導入した。得られた組換え株のゲノム DNA を抽出し、PCR 法にて目的遺伝子の破壊が達成されている株を選択したところ、1 株で mac1 遺伝子の破壊が確認できた。TLC 分析により、得られた mac1 破壊株はジアシル MEL 生産していないことが確認できた。同時にモノアシル MEL は検出されなかった。現在、得られた mac1 破壊株が生産している代謝産物の特定を試みている。

Genome editing of Hansenula polymorpha using an improved CRISPR/Cas9
systemDisrupting an acyltransferase in mannosylerythritol lipid biosynthesis for
Pseudozyma hubaiensis SY62

○Minori Numamoto, Hiromi Maekawa, Yoshinobu Kaneko(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
polymorpha

Genome editing, CRISPR/Cas9, methylotrophic yeast, Hansenula

3P-1a030 CRISPR Cas9 system による遺伝子組み換え

Schizosaccharomyces pombe を用いた有機酸生産○Yuta Yoshida, Masaaki Konishi(Kitami Inst. Technol.)Key words
acyltransferase, gene disruption, Pseudozyma hubeiensis SY62,
Mannosylerythritol lipids

3P-1a032 ミトコンドリア局在配列のモデル化から考察するタンパ
ク質局在シグナル配列の膜認識仮説○高山 征也, 尾崎 愛子, 山口 理絵, 田中 勉, 近藤 昭彦（神戸大院・工）tanaka@kitty.kobe-u.ac.jp○鈴木 絢子 1,2, 徳田 茜 1, 星田 尚司 1, 赤田 倫治 1
（1山口大院・創成科学・化学系, 2現)大分大・工）suzuki-ayako@oita-u.ac.jp＜研究背景・戦略＞
近年石油資源の枯渇や地球温暖化の問題から、オイルリファイナリー型社会から再生可能資源であるバイオマスを用いて有用物質を生産するバイオリファイ
ナリー型の社会への転換が求められている。本研究では耐酸性に優れた分裂酵
母を用いての有機酸生産を試みた。CRISPR Cas9 system を用いて分裂酵母内の代謝経路を改変することで、有機酸生産能に優れた分裂酵母を作製することを目指した。
＜結果・今後の展望＞
有機酸生産において副産物となる代謝経路の破壊、及び代謝経路に関する遺伝子を挿入することによる経路の強化を行った。CRISPR Cas9 system により主要な副生成物であるエタノール生産の遺伝子 adh の破壊に成功した。それにより、
エタノールの生産は抑えられた。しかし、アセトアルデヒドの蓄積や、補酵素の不均衡さによって生育が遅くなる。そこでアセトアルデヒドを酢酸に転換する遺伝子 atd1 や NAD+を再生する遺伝子 nox を挿入することによって生育の改善を検討した。また、有機酸生産に関する遺伝子の挿入を行うことで、エタノー
ル生産量を抑制し且つ有機酸生産能の優れた株の作製を行っている。

細胞内におけるタンパク質の局在は，局在シグナル配列と呼ばれる短いペプチ
ド配列で決定されるが、明確なコンセンサス配列がないものが多い。本研究では，ミトコンドリア局在配列を基に，大量の削除及び置換変異シリーズを作製し，どの配列が最少のミトコンドリア局在配列となるかを解析した。さらに，類推される特定のアミノ酸で構成したリピート配列を人工的に作製し，ミトコ
ンドリア局在シグナル配列のモデル化を行った。このような大量変異配列を構築するために，まず，酵母 Kluyveromyces marxianus を利用した効率良い変異遺伝子構築を行い，最終的に“塩基性-疎水性-疎水性”の 3 アミノ酸残基の 3 回以上のリピート配列がミトコンドリアに局在させることを明らかにした。この配列は酵母 Saccharomyces cerevisiae でもミトコンドリア局在を示すと考えたが，局在は見られなかった。このことは，ミトコンドリア局在配列には種の特異性が存在することを示す。次に，S. cerevisiae においても局在配列のモデル化を行った結果，非常に似た配列の 4 回リピート配列がミトコンドリアに局在した。
興味深いことに，この配列は K. marxianus およびヒト培養細胞においてもミトコンドリア局在を示したので，この配列こそが，生物種共通のミトコンドリア
局在モデル配列となると考えている。この過程で，ミトコンドリア局在モデル
配列のリピート数を単に増加させるだけで，細胞膜に選択的に局在することを発見した。現在，ミトコンドリア局在シグナル配列はミトコンドリア膜上の受容体タンパク質によって認識されると考えられているが，我々は本研究の結果から，ミトコンドリアや細胞膜タンパク質へのターゲッティングは，細胞膜とミトコンドリア膜自身の違いを認識しているのではないかと考えている。

Organic acid production using Schizosaccharomyces pombemodified
metabolism by CRISPR Cas9 system

Membrane recognition hypothesis for protein localization signal sequences
based on modeling analyses of mitochondrial targeting sequences

Key words
Schizosaccharomyces pombe, organic acid, CRISPR Cas9 system,
metabolic engineering

Key words
biology○Takayama Seiya, Ozaki Aiko, Yamaguchi Rie, Tanaka Tsutomu, Kondo Akihiko(Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)○Ayako Suzuki1,2, Akane Tokuda1, Hisashi Hoshida1, Rinji Akada1(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov. Chem., Yamaguchi Univ., 2Fac. Eng., Oita Univ)

Mitochondrial targeting sequence, Protein localization, yeast, Synthetic

遺伝子工学／酵素学，酵素工学

3P-1a033 酵母においてメタノール誘導性遺伝子発現を制御する転写因子 Hap 複合体の機能解析

227

3P-1a035 Aspergillus oryzae RIB40 ギ酸オキシダーゼの Phe510 はFAD 修飾と酵素活性に寄与する○岩越 亮汰, 田邊 直人, 道林 泰樹, 沖 昌也, 内田 博之（福井大院・工）uchida@u-fukui.ac.jp○小田 沙織 1, 由里本 博也 2, 阪井 康能 2
（1鳥取大・工, 2京大院・農）s.oda@bio.tottori-u.ac.jp

メチロトローフ酵母は強力なメタノール誘導性プロモーターを持つため、異種遺伝子発現系の宿主として広く利用されている。しかしながら、メタノールによる遺伝子発現誘導の分子メカニズムの全貌は未だ明らかになっていない。メ
チロトローフ酵母を十分に活用し異種タンパク質の生産性・多様性を向上させるために、この分子メカニズムを解明することは重要な課題である。
申請者は、メチロトローフ酵母 Candida boidinii を用いて、メタノール誘導性遺伝子発現を制御する転写因子の取得、機能解析を行ってきた。申請者が見出した転写因子 Hap 複合体は、Saccharomyces cerevisiae において呼吸代謝関連遺伝
子を制御し、エタノール等の非発酵性炭素源での生育に必要であることが知られているが、C. boidinii においてはメタノール誘導性遺伝子の転写を正に制御することがわかった。解析を進め、CbHap 複合体の核移行・DNA 結合様式を解明し、さらに複合体構成因子 CbHap3 の C 末端領域が遺伝子の転写活性化に必要であることを見出した。興味深いことに、この C 末端領域はメチロトローフ
酵母でのみ高度に保存されており、メタノール誘導機構において重要な役割を持つと考えられる。
今回は C. boidinii に加え、産業で一般的に用いられているメチロトローフ酵母
Pichia pastoris における Hap 複合体の役割についても報告する。

[背景と目的]
ギ酸オキシダーゼ（FOD）は、酸素存在下でギ酸を二酸化炭素に酸化し、同時に過酸化水素を産出する酵素で、GMC oxidoreductase family に属する。属する
他の酵素は非共有結合または共有結合した FAD をコファクターとするのに対して、FOD は 8-formylFAD をコファクターとする。また、他の酵素では、FAD の
イソアロキサジン環近傍に活性発現に重要な His-Asn 対又は His-His 対が存在するのに対して、FOD では 8-formyl FAD のイソアロキサジン環近傍に His-Arg 対（Aspergillus oryzae RIB40 由来 FOD では His511-Arg554 対）が存在する。
X 線結晶解析によって構築した A. oryzae RIB40 由来 FOD の活性部位で、Phe510
は 8-formylFAD のイソアロキサジン環のベンゼン環部位の近傍に存在している。
本研究では、Phe510 の役割の解明するため、変異体を作成し、変異体におけるFAD の 8-formyl FAD への修飾、および酵素活性を調べた。

Functional analysis of Hap complex that regulates methanol-induced gene
expressionin the methylotrophic yeast

Phe510 contributes to FAD modification and catalysis in formate oxidase ofAspergillus oryzae RIB40○Saori Oda1, Hiroya Yurimoto2, Yasuyoshi Sakai2(1Fac. Eng., Tottori Univ., 2Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)

Key words

methylotrophic yeast, transcriptional regulation, gene expression

3P-1a034 Geobacillus stearothermophilus 由来マレートデヒドロゲ
ナーゼの反応性考察と機能改変[方法と結果]F510Y、F510W、F510A 変異体酵素を部位特異的変異導入法により作成し、Nisepharose カラムと Hi-trap Q カラムを用いて酵素を精製した。精製酵素の可視吸収スペクトル分析、熱抽出物の可視吸収スペクトル分析と HPLC 分析を経時的に行うことにより、コファクターの構造の変化を追った。
F510Y と F510W では、精製終了時点で、酵素内に 8-formylFAD だけが存在した。F510A では、精製終了時点では、FAD と 8-formylFAD が存在し、保存中にFAD が 8-formylFAD に修飾された。ワイルドタイプの比活性に比べて、F510Yの比活性は約 3 分の 1 であったが、F510W と F510A の比活性はそれぞれ 1 桁、2 桁小さかった。また、F510W の酸素による酸化半反応は、ワイルドタイプの酸化半反応に比べて遅かった。
これらの結果は、Phe510 が FAD の 8-formyFAD への修飾と酵素反応に関与すること、及び酸化半反応に重要であることを示唆している。

○Ryota Iwagoshi, Naoto Tanabe, Daijyu Doubayashi, Masaya Oki,HIroyuki Uchida(Grad. Sch. Eng. Fukui Univ.)

Key words
modification

formate oxidaze, 8-formylFAD, aromatic amino acid, FAD

3P-1a036 エステラーゼを生産する環境細菌の単離○奥野 圭祐 1, 橋本 明里 2, 鳥居 誉 2, 前田 真美 2, 阿野 貴司 1,2,
岡南 政宏 1,2
（1近畿大院・生物理工, 2近畿大・生物理工）
okanami@waka.kindai.ac.jp○下澤 勇弥, 西矢 芳昭（摂南大・生命科学）
nisiya@lif.setsunan.ac.jp

マレートデヒドロゲナーゼ(MDH)は、肝臓の逸脱酵素であるグルタミン酸オキ
サロ酢酸トランスアミナーゼ(GOT)の反応を追随可能なため、肝機能の測定用検査薬に応用されている。
現在、GOT 測定用酵素としてブタのミトコンドリア由来 MDH(pm-MDH)と好熱菌 で あ る Geobacillus stearothermophilus お よ び Thermus flavus 由 来 MDH(gsMDH,tf-MDH)が市販されている。われわれは、Excel を用いた検査反応シミュ
レーションにより３種の MDH の有用性を比較し、gs-MDH がもっとも少量でGOT 測定が可能なことを検証した。さらに、ホモロジーモデリングによりオー
プンおよびクローズドの立体構造を予測した。その結果、オープン構造とクローズド構造では２つのループ領域が大きく動き、gs-MDH の活性部位は pm-MDH,tfMDH と比較して狭まった。したがって、これらのループが MDH の反応性に重要な役割を持つと推定した。また、MDH と相同性の高いラクテートデヒドロ
ゲナーゼ(LDH)のアミノ酸置換による機能改変も参考に、モデル構造から gsMDH の活性部位に存在する Arg86 の変異体やループ周辺のアミノ酸を置換した変異体を作成した。これら変異体の反応性の変化を調べたので報告する。

【背景と目的】生分解性プラスチック製品の農業利用は、農業の環境負荷および従事者負担を軽減するための重要な課題の一つである。生分解性プラスチック
は、従来のプラスチックと同等の機能や物性を兼ね備えながら、ある一定の条
件下で自然界に存在する細菌の働きによって分解される。分解機構の一つは、細菌が産生するエステラーゼによる加水分解であるが、自然条件下では、細菌の活性やエステラーゼの特性によって分解は極めて緩慢であると考えられる。
生分解性プラスチックの効率的な分解には、反応条件や熱安定性などにおいて優れるエステラーゼを入手し利用することが必要である。そこで、優れたエス
テラーゼを産生する細菌の単離を目的とした。
【方法と結果】土壌、自然水、植物葉表面から細菌を抽出し、トリオレインを含む寒天培地に塗布した。コロニーの周辺にクリアーゾーンを形成する細菌をエステラーゼ産生菌として単離した。単離された細菌について、培養液に分泌されるエステラーゼ活性を測定したところ、研究室保有の Stenotrophomonas
maltophilia 4A 株の活性と同等かそれ以上の活性を示す細菌を複数、単離することができた。これらのエステラーゼ産生菌の酵素について、産生至適温度、産生至適培地、反応至適温度、反応至適 pH、基質特異性、熱安定性について確認したので、報告する。

Improvement of malate dehydrogenase from Geobacillus
stearothermophilus

Isolation of esterase-producing bacteria and characterization of theiresterase

Key words
Malate dehydrogenase, Simulation, Homology modeling, Geobacillus
stearothermophilus

Key words○Yuya Shimozawa, Yoshiaki Nishiya(Life Sci,Setsunan Univ.)○Keisuke Okuno1, Akari Hashiomoto2, Takashi Torii2, Mami Maeda2,
Takashi Ano1,2, Masahiro Okanami1,2(1Grad.Sch. Biol. Ortd.Sci. Technol., Kindai Univ., 2Fac. Biol. Ortd.Sci. Technol.,
Kindai Univ.)
Stenotrophomonas maltophilia, esterase, biodegradable plastic

228

酵素学，酵素工学

3P-1a037 Ruminiclostridium josui の制限酵素 RjoI の性質と R.
josui の形質転換

3P-1a039 Biosynthesis of 2-epi-5-epi-valiolone by in vitro synthetic
biology approach○汪 亜運（三重大院・生資）515d3s1@m.mie-u.ac.jp○JianJiang Zhong1, Song-Yan Huang2, Y.-H. Percival Zhang3(1State Key Lab. Microb. Metab., Sch. Life Sci. Biotechnol.,Shanghai Jiao Tong Univ., 2State Key Lab. Bioreactor Eng., Sch.
Bioeng., East China Univ. Sci. Technol., 3Dep. Biol. Syst. Eng.,
Virginia Tech)jjzhong@sjtu.edu.cn【背景と目的】Ruminiclostridium josui (Clostridium josui)は、中温性のセルロース
分解性嫌気性細菌であり、セルラーゼ複合体（セルロソーム）を形成する。本菌のセルロース分解系の解析と分子育種を目的として、R. josui への効率的な遺伝子導入系の確立を目指している。本研究では、形質転換系を確立する上で阻害要因となる R. josui の制限酵素 RjoI の性質を明らかにすることを目的とした。
【方法】R. josui 無細胞抽出液からの RjoI の精製は、HiTrap Heparin HP 及び HiTrap
Q HP カラムクロマトグラフィーにより行った。基質として、大腸菌の dam-株
または dam+株から調製したプラスミド pQE-30T DNA などを用いた。制限酵素
反応には主に M バッファー（NIPPON GENE）を用いた。
【結果と考察】HiTrap Heparin HP 及び HiTrap Q HP カラムにより部分精製した
RjoI の酵素活性を Dam メチラーゼでメチル化されたプラスミド pQE-30T と非メチル化 pQE-30T を基質として測定したところ、RjoI はメチル化された DNA
のみを切断し、アガロースゲル電気泳動による泳動パターンが Sau3AI や DpnIと同じであったことから、その認識配列は A がメチル化された G met ATC であることが分かった。また、RjoI 処理後の DNA 断片を鋳型にして塩基配列を決定したところ、その切断部位は A と T の間(G met A↓TC)であること、すなわち平滑末端を生じることが分かった。ゲノム上に dpnC 遺伝子と相同性のある遺伝子が見出され、本遺伝子の大腸菌への導入を試みたところ、dam-株のみで形質転換が得られたことから、本遺伝子が RjoI をコードすることが予想された。
さらに、pJIR751 を基本とする発現ベクターの構築と R. josui への導入の結果についても報告する。

The platform technology of in vitro synthetic biology possesses advantages such as
high product yield and simplified process with its great potential for biomanufacturing.
2-epi-5-epi-Valiolone, the cyclic product of sedoheptulose 7-phosphate, is an important
precursor of many bioactive C7N-aminocyclitols, and here an artificial in vitro
biosynthetic pathway of 2-epi-5-epi-valiolone from fructose 6-phosphate was designed
by including the by-product xylulose 5-phosphate into the enzymatic transformation.
The contribution of this by-product transformation branch to the biosynthesis ofsedoheptulose 7-phosphate and 2-epi-5-epi-valiolone was verified by experiments.
Through the newly designed pathway, the production of sedoheptulose 7-phosphateand 2-epi-5-epi-valiolone from fructose 6-phosphate could reach a molar yield of
62.8% and 77.3% for each, which was much higher than that without the addition of
the by-product transformation branch. Production of C7N-aminocyclitols via thisdesigned pathway could be extended to starting raw materials of low-cost renewablebiomass, which will be discussed in this presentation.

Characterization of a Ruminiclostridium josui restriction enzyme RjoI andtransformation of R. josui

Biosynthesis of 2-epi-5-epi-valiolone by in vitro synthetic biology approach

Key words
Ruminiclostridium josui, restriction endonuclease, transformation,
electroporation

Key words
valiolone

3P-1a038 細菌 Chitiniphilus shinanonensis が保有するキチン代謝

3P-1a040 Falsirhodobacter sp. alg1 由来のアルギン酸リアーゼを用○Yayun Wang
(Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ.)に関与する遺伝子群の解析○JianJiang Zhong1, Song-Yan Huang2, Y.-H. Percival Zhang3(1State Key Lab. Microb. Metab., Sch. Life Sci. Biotechnol., Shanghai Jiao Tong
Univ., 2State Key Lab. Bioreactor Eng., Sch. Bioeng., East China Univ. Sci.
Technol., 3Dep. Biol. Syst. Eng., Virginia Tech)in vitro synthetic biology, enzyme reaction, bioconversion, 2-epi-5-epi-

いたアルギン酸単糖の調製○村瀬 祥光 1, 柴田 敏行 1, モリ テツシ 2, 田中 礼士 1, 植田 充美 3,
三宅 英雄 1
（1三重大院・生資, 2早大・理工学術院, 3京大院・農）miyake@bio.mie-u.ac.jp○佐藤 弘晃, 松山 友香, 田口 悟朗, 野川 優洋, 下坂 誠
（信州大・繊維）mashimo@shinshu-u.ac.jp【背景と目的】Chitiniphilus shinanonensis SAY3 株は、フレーク状のキチンを効
率よく分解資化する強力なキチン分解細菌である。既に、SAY3 株の全ゲノム
ドラフト配列を取得し、49 個のキチン分解関連酵素遺伝子を検出した。この中には、糖質加水分解酵素 GH ファミリー 18, 19, 20 に属する触媒ドメインを有す
るタンパク質をコードする遺伝子が、それぞれ 22, 3, 1 個確認できた。本研究では、キチンを炭素源とした合成培地を用いて SAY3 株を培養し、実際に発現している遺伝子を調査することにより、本株のキチン分解代謝系を解明することを目的とした。
【方法】グルコースおよび粉末キチンを炭素源とした M9 合成培地で SAY3 株を培養した。対数増殖期の細胞より全 RNA を調製し、次世代シークエンサを用いて RNA シークエンスを行った。得られた配列データを SAY3 株ゲノムにマッピングし、グルコースおよびキチン培養での発現量の相対比を調査し、キチン培養で発現が確認された遺伝子からキチン代謝系に関与する酵素群を推定した。
また、各遺伝子を大腸菌で異種宿主発現し、得られた組換えタンパク質のキチン分解活性を調査した。
【結果】既に推定済みの 49 個のキチン分解関連酵素遺伝子について、キチン培
地における発現量および大腸菌発現タンパク質のキチン分解活性の有無を確認した。また、N-acetylglucosamine (GlcNAc)の細胞内への取り込みに関与が予想される輸送系タンパク質、および GlcNAc 代謝に関する酵素をコードする遺伝子が検出された。これらの結果をもとに SAY3 株のキチン分解代謝系の全容を推定した。

Falsirhodobacter sp. alg1 は、PL7 に属するエンド型アルギン酸リアーゼ遺伝子（alyFRA）と PL15 に属するエキソ型アルギン酸リアーゼ遺伝子（alyFRB）が存在することがゲノム解析から明らかとなった。基質であるアルギン酸は、エンド型およびエキソ型アルギン酸リアーゼによって不飽和単糖を生成し、その後、不飽和単糖は開環し、4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid（DEH）に変換する。そこで本研究では、alyFRA と alyFRB の組換え体を作製し、これら 2 種のアルギン酸リアーゼを用いた DEH の調製を試みた。
alyFRA と alyFRB の発現プラスミドを作製し、大腸菌 BL21(DE3)に形質転換した。培養を行い、菌体から目的タンパク質を可溶化させ、単一バンドになるまで精製を行った。収量は培地 1 L あたり、AlyFRA は 4.7 mg、AlyFRB は 10.0 mgであった。
作製した組換え体酵素と、アルギン酸ナトリウムを反応させて得られた生成物を TLC に供した結果、AlyFRA の生成物では 3 糖以上のアルギン酸オリゴ糖を検出した。AlyFRB の生成物ではグルコースの位置に近いところにスポットを検出し、AlyFRA と AlyFRB を用いた時の生成物も同等の位置にスポットを検出し、AlyFRB の生成物の時よりも濃いスポットを検出した。さらに、これら
2 つの反応液を LC/MS で分析した結果、トータルイオンクロマトグラムで 1
ピークのみを検出し、m/z=175 での選択イオン検出法から生成物は DEH であると評価した。本発表では、DEH の効率的な調製法について説明する。

Analysis of genes involved in chitin catabolism in the bacterium

Preparation of alginate monosaccharide using two alginate lyases from
Falsirhodobacter sp. alg1

Chitiniphilus shinanonensis○Hiroaki Sato, Yuka Matsuyama, Goro Taguchi, Masahiro Nogawa,
Makoto Shimosaka(Fac. Textile Sci. Technol., Shinshu Univ.)

Key words

chitin, chitinase, gene expression analysis○Yoshihiro Murase1, Toshiyuki Shibata1, Tetsushi Mori2, Reiji Tanaka1,
Mitsuyoshi Ueda3, Hideo Miyake1(1Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ., 2Fac. Sci. and Eng., Waseda Univ., 3Grad. Sch.
Agric., Kyoto Univ.)

Key words

Falsirhodobacter , alginate lyase, alginate, DEH

酵素学，酵素工学／タンパク質工学

3P-1a041 シトクロム P450 の活性化において外来電子伝達タンパ
ク質を利用するための戦略

229

3P-1a043 持続的酵素反応プロセスを実現する酵素-メソポーラス
シリカ複合体の開発○松浦 俊一 1, 池田 丈 2, 千葉 真奈美 1, 角田 達朗 1, 黒田 章夫 2,
山口 有朋 1,3
（1産総研・化学プロセス, 2広島大院・先端物質, 3JST・さきがけ）
matsuura-shunichi@aist.go.jp

鈴木 里沙, ○平川 秀彦, 長棟 輝行（東大院・工）hirakawa@bio.t.u-tokyo.ac.jp【緒言】水溶性シトクロム P450（P450）の多くは、電子伝達タンパク質を介して補酵素 NAD(P)H に由来する電子を受けることにより触媒サイクルを回す。
P450 は電子伝達タンパク質とオペロンを形成しているとは限らないため、P450にパートナーとなる電子伝達タンパク質は実験的に探索する必要がある。そこ
で、本来の電子伝達タンパク質パートナーの代替として由来の異なる電子伝達タンパク質を利用することが多い。しかし、由来の異なる電子伝達タンパク質を利用した場合、電子伝達効率が低いため、P450 は低い触媒活性しか発揮できない。本研究では、i)熱安定性の高い電子伝達タンパク質を人為的に P450 に近接させることにより、電子伝達タンパク質－P450 間の弱い相互作用を補った上で、安定的に長時間反応を行うことで、反応率を向上させ、さらに、ii)補酵素
再生系を導入し、見かけの補酵素濃度を下げることにより、過剰な電子伝達タ
ンパク質の還元を避けることで、無駄な還元力の消費を抑えることを目指した。
【結果・考察】ヘテロ三量体タンパク質を利用して Sulfolobus acidocaldarius 由来
P450（CYP119）、好熱性細菌 Thermus thermophilus 由来フェレドキシン（FdX）、フェレドキシン還元酵素（FNR）を近接させると、FNR と FdX を介した NADPH
から CYP119 への電子伝達効率は向上した。FdX と FNR は 55 度において２４
時間以上活性を低下させなかったのに対して、CYP119 は 3 時間程度しか活性を発揮しなかった。これは NADPH の枯渇によるものであり、亜リン酸脱水素酵素による NADPH 再生系を導入したところ、反応時間を伸ばすことに成功し、反応率は 10 倍以上向上した。したがって、補酵素再生系を利用した電子供給速度の制御は低い電子伝達効率に起因する P450 の低反応率の問題を解決するのに有用であることが明らかとなった。

【背景・目的】固定化酵素を利用した低環境負荷型の物質変換プロセスでは、２種類以上の酵素の組み合わせによる新たな反応経路の構築が期待されている。
例えば、医農薬中間体として付加価値の高い光学活性アルコールの高効率合成に向け、補酵素再生系を組み込んだ異種酵素反応場の利用法が提案されている。
しかし、酵素の安定性や再利用性に課題が残されており実用化に至っていない。
我々は、無機多孔質材料（メソポーラスシリカ）の規則性ナノ細孔に酵素を高密度かつ安定に配列化する手法を提案し、これまでに酵素の凝集失活の抑制や熱安定性の向上効果を見出している。本研究では、メソポーラスシリカの細孔を異種酵素の集積組立場とした高効率の酵素反応場の構築を目指し、モデル反応として補酵素再生による難分解性化学染料（アゾ染料）の分解検証を試みた。
また、反応中のシリカ細孔からの酵素の脱離を抑制するために、シリカ結合タンパク質（Si-tag）を融合したハイブリッド酵素を適用し、固定化酵素の再利用性の向上を図った。
【方法・結果】異種酵素（グルコース脱水素酵素およびアゾ還元酵素）によるア
ゾ染料（メチルレッド）の還元分解を検証した結果、遊離の酵素や非多孔質シリカを用いた固定化酵素ではグルコース脱水素酵素の補酵素再生能の低下が認められた。一方、シリカ細孔に固定化した酵素では補酵素再生およびアゾ染料
分解における本来の活性が保持され、異種酵素の安定性向上場としてのメソポー
ラスシリカの優位性を明らかにした。また、シリカ表面への Si-tag 融合酵素の配向固定によって補酵素再生系が効率的に機能するようになり、その結果、異種酵素が連動した高効率かつ持続的な酵素反応を実現した。さらに、Si-tag を介した強固な結合により、固定化酵素の繰り返し耐久性（再利用性）が著しく向上した。

Steady electron donation to a soluble cytochrome P450 through a foreign
electron transfer protein

Development of enzyme-mesoporous silica composites for achieving durable
enzyme reaction process

Risa Suzuki, ○Hidehiko Hirakawa, Teruyuki Nagamune(Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)

Key words
enzymecytochrome P450, NAD(P)H, cofactor regeneration, thermostable○Shun-ichi Matsuura1, Takeshi Ikeda2, Manami Chiba1, Tatsuo Tsunoda1,
Akio Kuroda2, Aritomo Yamaguchi1,3(1Res. Inst. Chem. Proc. Technol., AIST, 2Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima
Univ., 3PRESTO, JST)Key words
immobilized enzyme, silica-binding protein, glucose dehydrogenase,coenzyme regeneration

3P-1a042 ナノ空間反応場を利用した１分子 DNA 増幅システムの3P-1a044 静電相互作用を駆動力とした迅速なストレプトアビジン

松浦 俊一 1, 馬場 知哉 2, 千葉 真奈美 1, ○角田 達朗 1,
山口 有朋 1,3
（1産総研・化学プロセス, 2遺伝研・系統生物, 3JST・さきがけ）
matsuura-shunichi@aist.go.jp○南畑 孝介 1, 安達 基泰 2, 清水 瑠美 2, 黒木 良太 3, 長棟 輝行 4,5（1九大院・工, 2量研機構, 3原子力機構, 4東大院・工・化生, 5東大院・工・バイオエンジニアリング）
kosukeminami@mail.cstm.kyushu-u.ac.jp【背景・目的】犯罪捜査や化石試料等における遺伝子の精密診断では、極微量のDNA しか得られないことが多く、数分子レベルの DNA からの高感度かつ高精度の増幅技術の開発が求められている。しかし、従来のポリメラーゼ連鎖反応
法（PCR）等の DNA 増幅技術では、標的の DNA 分子が極度に減少すると、標的以外の DNA に起因する非特異的な DNA 増幅（バックグラウンド）が増大し、標的 DNA の選択的増幅が阻害される点に課題があった。この課題の克服には、微量の標的 DNA であっても、DNA 増幅酵素／標的 DNA／プライマーの間での特異性を高度に維持できる反応場の確立が不可欠である。本研究では、
細孔径をナノレベルで調節可能なメソポーラスシリカに酵素を精確に配向・集積させ、酵素周辺の反応環境を至適化することによって標的 DNA のみの選択的増幅を図るという、新規の反応制御技術を提案する。ナノ空間への DNA 増
幅酵素の精密配置と反応制御の実現により、究極的には１分子レベルの極微量
DNA からの増幅を可能にする技術開発を目的としている。
【方法・結果】細孔径の異なる７種類のメソポーラスシリカ（細孔径：2~25nm）に DNA 増幅酵素（耐熱性 DNA ポリメラーゼ）を固定化し、環状のプラ
スミド DNA 上の標的配列（約 1.2 kb）の PCR 増幅を試みた。基質 DNA を 108
分子から段階的に減少させたところ、従来法の DNA 増幅酵素が遊離状態での反応系では 105 分子以下で非特異的な DNA 増幅が進行し、標的 DNA の選択的増幅が阻害された。一方、固定化酵素では、同条件において非特異的な DNA
増幅の抑制が示唆され、メソポーラスシリカの細孔径の最適化によって、数分
子レベルの基質 DNA からの選択的増幅が可能となった。以上より、メソポー
ラスシリカのナノ空間が DNA 増幅における副反応抑制場として活用でき、DNA
増幅反応の特異性及び感度を飛躍的に向上できることを明らかにした。

【背景】 タンパク質結晶は、内部にタンパク質分子が規則的に並んだ多孔質構造を有しており、X 線結晶構造解析の用途以外にも、反応場や、任意の分子を配列させるテンプレートとして用いるなどの利用が期待できるナノ材料である。
しかし、一般的にタンパク質結晶の調製は困難であり、得られる量も極僅かであり、タンパク質結晶の材料としての利用を検討する上で、タンパク質結晶を迅速かつ簡便に調製する手法を確立することが求められている。そこで本研究では「静電的相互作用」を駆動力としたタンパク質結晶技術について検討を行った。ストレプトアビジン(SA)をモデルタンパク質として、SA の末端に正電荷あるいは負電荷を有するペプチドタグを導入した組換体を調製し、それらを互いに混合することによる迅速な結晶化を検討した。
【実験方法および結果】 SA の C 末端に R4Y あるいは D4Y を導入した SA 組換体(SA-R4Y, SA-D 4Y)を調製し、各 SA 組換体をテラサキプレート上で、5 μL の体積で等モル比で混合し、結晶化の検討を行った。溶液の白濁が生じた。12 時
間、インキュベート後の溶液は白濁が消失し、容器の底面ならびに気液界面において正方平板状あるいは棒状の結晶が観察された。SA 組換体を混合後、約30 分で結晶核の形成の生成が確認され、その後約 3 時間にかけて結晶成長が観察された。2 μM の極めて低濃度の SA 溶液からも結晶を得ることが出来た。以上の結果より、極めて短時間でかつ低濃度の SA 溶液から結晶を得ることに成功した。

Construction of a single-molecule DNA amplification system using
nanoporous reaction field

Genetically fused charged pepetides induce rapid crystallization of
streptavidin

Key words
immobilized enzyme, DNA polymerase, mesoporous silica, singlemolecule PCR

Key words

構築

Shun-ichi Matsuura1, Tomoya Baba2, Manami Chiba1, ○Tatsuo Tsunoda1,
Aritomo Yamaguchi1,3(1Res. Inst. Chem. Proc. Technol., AIST, 2Genet. Strains Res. Ctr., NIG, 3PRESTO,
JST)

の結晶化

○Kosuke Minamihata1, Motoyasu Adachi2, Rumi Shimizu2, Ryota Kuroki3,
Teruyuki Nagamune4,5(1Fac. Eng., Kyushu Univ., 2QST, 3JAEA, 4Dept. Chem., Biotechnol., Grad. Sch.
Eng., Univ. Tokyo, 5Dept. Bioeng., Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)
crystallization, streptavidin, electrostatic interaction, charged-peptide

230

タンパク質工学

3P-1a045 ホモ二量体化モジュールの導入による細胞内タンパク質
間相互作用検出の高感度化

3P-1a047 細胞増殖を効率的に誘導するチロシンモチーフのスク
リーニング○鹿島 大揮, 河出 来時, 長棟 輝行, 河原 正浩（東大院・工）kawahara@bio.t.u-tokyo.ac.jp○梅根 輝来人, 長棟 輝行, 河原 正浩（東大院・工）kawahara@bio.t.u-tokyo.ac.jp

タンパク質は酵素活性・分子認識機能といった非常に高度な機能を有し、細胞内においては相互作用を介して協奏的に働くことにより細胞増殖などを制御している。近年、タンパク質間相互作用 (protein-protein interaction: PPI) の網羅的研究が盛んであり、細胞内 PPI を検出する系として、哺乳類細胞にキメラタン
パク質を導入した MaMTH, KISS, MAPPIT といった系が開発されている。しかし、これらの系においては十分なリードアウトを得るためにキメラタンパク質を過剰発現させているため発現が不安定であり、バックグラウンドの低減が課題とされてきた。
そこで、本研究室では、受容体型チロシンキナーゼの 1 つである c-kit の細胞内ドメイン (c-kit ICD) に着目し、これを標的タンパク質 (POI) の C 末端側に融合したキメラタンパク質を開発した。c-kit ICD は POI の相互作用依存的に二量体を形成して下流シグナルを活性化し細胞増殖を誘導する。これを IL-3 依存的に増殖するマウス由来 Ba/F3 細胞に導入し、IL-3 非存在下で培養した際の PPI 依
存的な細胞増殖を指標とした新規スクリーニング系を構築した。しかし、従来系においては検出可能な対象が比較的強い相互作用を持つタンパク質に限られ、検出感度が課題となっていた。そこで本研究では POI の複合体形成の helper
module として小分子依存的にホモ二量体化するタンパク質を POI の N 末端側に導入して、感度増強及び制御を図った。その結果、小分子濃度依存的に細胞増殖が誘導され、helper module 無しの従来系では検出できなかった細胞内 PPIの検出に成功した。今後、本系は PPI スクリーニング系として医薬品開発の場での応用が期待される。

【背景と目的】細胞はリガンドの刺激を受けることにより細胞膜上の受容体が活性化され、細胞内にシグナル伝達を起こすことで様々な細胞運命を辿るということが知られている。シグナル伝達経路の一つである JAK/STAT 経路の活性化
機構は、受容体上のチロシンモチーフという数残基のペプチド配列中のチロシン残基がリン酸化されることで始まり、細胞内のシグナル伝達分子がこの部位に結合し活性化され、最終的に細胞運命を制御する。シグナル伝達分子はモチー
フのチロシン周辺の数残基まで認識し結合するため、モチーフ配列によってシグナル伝達分子の活性化プロファイルが変化し、配列そのものが間接的に細胞運命を制御していると言える。そこで本研究は、チロシンモチーフ配列のライ
ブラリを作製し、細胞内で増殖というフェノタイプを効率的に誘導することのできるモチーフのスクリーニングを行った。
【方法・結果】まず、ミリストイル化シグナル配列、有機小分子 AP20187 依存的に二量体化する FKBPF36V、JAK 結合ドメイン、STAT1 結合モチーフを融合した人工受容体を作製した。次に、モチーフ中のチロシン下流の三残基をランダ
ム化したライブラリ遺伝子を作製し、この遺伝子を IL-3 依存的に増殖する
Ba/F3 細胞に導入し受容体を発現させた。この細胞を AP20187 存在下で数日間
マルチウェルプレートで培養し、著しい増殖を示した細胞を選択した。この結果、18 のクローンをスクリーニングすることに成功した。次にスクリーニング
した細胞をそれぞれ複数濃度の AP20187 存在下で培養し増殖アッセイを行った
結果、全ての細胞でリガンド濃度依存的な増殖を示した。これらの細胞を
AP20187 で刺激し各シグナル伝達分子の活性化を検出した結果、増殖に寄与するとされる STAT3, 5, PI3K, MEK1/2 の活性化プロファイルがクローン間で大きく異なっていることを見出した。

Highly sensitive detection of intracellular protein-protein interactions byintroducing a homo-dimeric module

Screening of tyrosine motifs which can induce efficient cell proliferation○Daiki Kashima, Raiji Kawade, Teruyuki Nagamune, Masahiro Kawahara(Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)

Key words
selection

protein interaction, chimeric protein, mammalian cytoplasm, positive

3P-1a046 カニ殻堆肥由来“Cellulosimicrobium sp.NTK2”の結晶性
キチン分解能と分解酵素の生産○Kirarto Umene, Teruyuki Nagamune, Masahiro Kawahara(Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)

Key words

signal transduction, tyrosine phosphorylation, screening, proliferation

3P-1a048 動物細胞内で強制発現させたがん抗原タンパク質の細胞内凝集機構の解析○仁木 大輔, 西川 康太, 藤村 夏紀, 有馬 二朗（鳥取大・農）arima@muses.tottori-u.ac.jp○正元 晃平, 新土居 奈緒美, 本荘 知子, 二見 淳一郎（岡山大院・自科）
futamij@okayama-u.ac.jp【目的】キチンの分解物は様々な生理機能を持つため、医療・食品分野への利用が期待される。しかし、キチンは水に溶けず、分解には酸処理等の様々な工程が必要であり、繁雑さや環境負荷に関する問題が残されている。我々は、結晶性キチンのダイレクトな分解と利用を目指し、カニ殻廃棄物の迅速な堆肥化を可能とする完熟コンポストから、結晶性キチンを直接分解できる微生物の単離とキチン分解酵素の探索を行った。
【方法及び結果】本コンポストをもとに、炭素源として結晶性キチンのみを添加した培地で集積培養を行った結果、結晶性キチンを分解する微生物が 1 株単離された。16SrRNA 系統解析の結果、本菌は放線菌の一種である Cellulosimicrobium
属細菌であると同定された。2%（w/v）の結晶性キチンを含む培地中 25℃で本菌を培養すると、徐々に結晶性キチンが分解され、2 日目付近から、培養上清から GlcNac-p-nitrophenol (-pNP)及び(GlcNac)2-pNP の分解活性が確認された。また、SDS-PAGE 及びキチンザイモグラフィー解析を行った結果、キチンを含有する培地で本菌を培養すると、キチン分解系のタンパク質が 10 種程度分泌していることが明らかとなり、N 末端配列解析を行った結果、Glycoside Hydrolase
family 18 に属する酵素が 3 種（30、40、及び 60 kDa）と約 20 kDa の Chitinbinding Protein が同定された。上記のうち 40 及び 60 kDa のバンドの N 末端配列は同じであったため、40 kDa の酵素は 60 kDa の酵素からモジュールが外れたものであると推定された。なお、ザイモグラフィー解析の結果、20 kDa のバ
ンドからもキチン分解活性が確認された。

がんと精巣に限局した発現を示し、がんの悪性化と相関する Cancer-Testis(CT)抗原は、現在 156 種類、バリアントを含めると 243 種類の存在が報告されている。これらの CT 抗原はがん免疫治療のワクチン抗原、ならびに腫瘍免疫応答の活性化レベルを測定するための診断薬の作製に必須である。これらの CT 抗原の詳細な機能は不明なものが多いが、構造上の特徴は天然変性領域が多く細胞内では様々なタンパク質と複合体を形成するハブタンパク質として機能し、細胞増殖を亢進しているものと推定されている。これらの CT 抗原をヒト由来の Hek293 細胞や HeLa 細胞内で強制発現をさせると、8 割以上の CT 抗原が細胞内で凝集することが確認された。本研究では細胞内で凝集した各種の CT 抗
原が、どの様な機構で凝集しているのかを解析した。各種のがん抗原を HeLa
細胞内で強制発現させて免疫染色を行うと、各がん抗原は細胞内で様々な形状の凝集体を形成することが観察された。一方で我々は以前、ヒト細胞内の総タ
ンパク質は核酸成分を完全に除去すると変性状態でありながら水中で高い溶解性を示すことを見出してきた。実際に、強制発現で不溶化した CT 抗原も、核酸成分を除去すると大部分が可溶化された。In vivo での凝集体形成と核酸との相互作用について、各種の染色法で解析したが、現時点では細胞内凝集体は変性タンパク質のみから構成され、核酸成分の混入は検出されていない。これまでの解析結果を小括すると、動物細胞内で形成される強制発現がん抗原タンパ
ク質の凝集体は、大腸菌内でしばしば観察される組換えタンパク質のインクルー
ジョンボディとよく似た性質の凝集体であるものと判断された。

Crystalline chitin degrading potential of “Cellulosimicrobium sp.NTK2”
and its production of chitinases

Analysis of aggregation mechanism of cancer antigen by forced expression
in mammalian cells.

○Daisuke Niki, Kota Nishikawa, Natsuki Fujimura, Jiro Arima(Fac. Agric., Tottori Univ.)

Key words

Cellulosimicrobium, chitinase, zymography, chitin binding protein○Kohei Shogen, Naomi Niidoi, Tomoko Honjo, Junichiro Futami(Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Okayama Univ.)

Key words

protein, protein engineering, protein aggregation

タンパク質工学

3P-1a049 Hek293 細胞を用いた全長がん抗原タンパク質の網羅的調製条件の最適化

231

3P-1a051 原核生物における J タンパク質による Hsp90 と Hsp70の協同的シャペロン作用の仲介と機能調節○大川 祐也, 新土居 奈緒美, 本荘 知子, 二見 淳一郎（岡山大院・自科）
futamij@okayama-u.ac.jp○仲本 準（埼玉大院・理工・分子）
nakamoto@mail.saitama-u.ac.jp

腫瘍局所での免疫抑制状態を解除する免疫チェックポイント阻害剤の登場で、がん免疫療法が現実的なオプションとして注目されている。腫瘍免疫応答の活性化は QOL の高い延命効果に相関するが、患者個々人の免疫細胞の活性化レ
ベルやがん抗原種の個人差が大きい。従って、個々人の腫瘍免疫応答の活性化
レベルを簡便に測定できる診断薬の開発で、がんの個別化医療が大きく発展する可能性が高い。我々は、がん細胞内で異常に発現している各種のがん抗原タ
ンパク質に対する抗体の出現（Antigen-Spreading）が腫瘍免疫応答の活性化レ
ベルを評価できるバイオマーカーと考え、抗体価の変動を適切にモニタリング
する抗体検査技術を開発中である。この技術開発には多種多様の全長がん抗原のリソースの網羅的整備が必要である。大半のがん抗原は細胞内タンパク質であり、大腸菌を宿主とした生産系が利用できるが、一部のがん抗原は大量調製が困難な膜タンパク質であり、Hek293 細胞を用いた一過的なタンパク質生産系の活用が適していた。本研究では独自開発の超高発現ベクターを活用し、乳がんマーカーでもある膜タンパク質の Her2 抗原やがんと精巣に限局した発現を示す Cancer-Testis(CT)抗原をモデルとして発現・精製条件の最適化を行った。また、一部のがん抗原は大腸菌の細胞内で速やかに分解される問題点があったが、Hek293 細胞を用いることで全長がん抗原の取得が可能になった。これらの全長がん抗原を用いた抗体検査技術の可能性について発表したい。

【背景と目的】微生物は、食品・医薬品・バイオエタノールなどの生産に利用されている。このような有用物質生産の場においては、微生物は浸透圧、酸あるいは熱などのストレスに曝されて生育阻害が生じるために、生産性が低下することがある。自然界に生育し、様々な環境ストレスに曝されるシアノバクテリ
アなどの微生物は、高度な自己防御機構をもつと考えられるが、微生物のストレス耐性機構に関する知見は、有用物質生産の改善に役立つものと期待される。
分子シャペロンは、ストレス下で高発現し、変性タンパク質の凝集抑制や機能的構造への折り畳み、タンパク質凝集塊の可溶化・再活性化などの機能を通して、宿主のストレス耐性に深く関わる一群のタンパク質である。我々は、シア
ノバクテリアの分子シャペロン Hsp90 と Hsp70 が協調的に作用することを明らかにしたが、J タンパク質（DnaJ/Hsp40）がこれらシャペロンの仲介者として働くことを支持する結果を得たので発表する。
【方法】シアノバクテリア（Synechococcus elongatus）の Hsp90、Hsp70、種々のJ タンパク質を高度に精製して実験に用いた。変性タンパク質の凝集反応は、
光散乱強度（濁度）測定により解析した。
【結果】プルダウン法により、II 型 J タンパク質である DnaJ2 は、J ドメインを含まない C 末側領域で Hsp90 と物理的に相互作用することを明らかにした。これは、Hsp70-DnaJ2-Hsp90 の３者複合体形成を示唆するものである。DnaJ2 は、
Hsp90 の変性タンパク質凝集阻止活性を阻害したが、Hsp70 のそれには影響を与えなかった。DnaJ2 は Hsp90-基質複合体の安定性を調節して、基質の解離あるいは（Hsp90 から）Hsp70 への基質移動を容易にするのではないかと考えられる。

Optimization of preparation methodology for multiple full-length cancer
antigens using Hek293 cells

Prokaryotic J protein mediates co-operation of Hsp90 with Hsp70 andcontrols the chaperone function○Yuya Okawa, Naomi Niidoi, Tomoko Honjo, Junichiro Futami(Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Okayama Univ.)

Key words

protein, protein engineering, protein expression

3P-1a050 カイコ発現系を利用した抗体および膜タンパク質調製の試み○Hitoshi Nakamoto(Dept. of Biochem. Mol. Biol., Grad. Sch. Sci. Eng. Saitama Univ.)

Key words

folding mechanism, HSP70, Hsp90, Molecular chaperone

3P-1a052 カチオン化法による Hepatocyte Nuclear Factor-4α(HNF-4α) タンパク質の細胞導入と核内転写活性の評価○中野 智貴 1, 曳野 隆之 1, 曾 芳琴 1, 西尾 知樹 1, 二見 淳一郎 2,
二見 翠 1（1岡山理大・工, 2岡山大院・自科）
mfutami@bme.ous.ac.jp○柴田 真実 1, 中澤 光 1, 加藤 昌彦 2, 長屋 英和 2, 眞田 英明 2,
熊谷 泉 1, 梅津 光央 1
（1東北大院・工・バイオ工, 2シスメックス株式会社）mitsuo@prn.che.tohoku.ac.jp

細胞間の物質の認識・授受を担う膜タンパク質は重要な創薬ターゲットであり、これに特異的に作用する抗体が分子標的薬として開発されている。このような抗体を取得する手段の一つにファージ提示法があり、この手法ではファージに標的結合の機能をもつ抗体の断片を提示させて調製した 105~10 種からなる抗体群を、標的膜タンパク質と相互作用させることで、目的の特異性を持つ抗体断片を取得し、その配列情報を元にして様々な有用抗体作製に反映させる。しかし膜タンパク質は活性を有した状態で発現させ、構造を安定に保ったまま調製することが困難であるという課題がある。また候補抗体の中から構造的安定性を持った抗体を確実に選抜するためには、ファージに提示された膨大な量の候
補抗体群から、なるべく数多くの有望抗体断片を選択して実際に組換えタンパ
ク質として調製し、定量的に機能と安定性を検証する必要があるが、このスク
リーニングを可能にするには多種類の抗体断片を同時に調製可能な発現系が必要となる。
そこで我々はこれらの課題を解決する発現系として、膜タンパク質を調製可能
かつ、組換え抗体の多品種調製に適した高細胞密度な小型リアクターであるカイコを宿主とした発現系に注目し、膜タンパク質に特異的に相互作用する抗体
取得のプロセスの開発を試みている。今回はカイコ発現系を利用して、膜タン
パク質の一種である B 型インフルエンザヘマグルチニンの活性を示す形での調製、および 11 種類の低分子抗体 scFv の迅速な調製に成功したので報告する。
この結果は膜タンパク質特異的抗体取得プロセスの開発に、カイコ発現系が利用可能であることを示している。

HNF-4α は、肝臓の機能の代謝経路に関わる多数の遺伝子の転写を司る。HNF-4αの働きを人工的に制御することができれば、肝細胞の機能の制御法に繋がる。
本研究はカチオン化タンパク質導入法により HNF-4α タンパク質を細胞に導入し、細胞内で機能させることを目的に行った。カチオン化法とはタンパク質を化学修飾により正の電荷を付加させることで、表面が負電荷に富む生きた細胞にタンパク質を導入させる方法である。インクルージョンボディとして大腸菌に発現させた HNF-4α 組み換えタンパク質を変性剤で溶かし、システイン側鎖にジスルフィド結合を介して 4 級アミン、または平均分子量 600,1200,1800 のポ
リエチレンイミン(PEI)を繋げ変性カチオン化 HNF-4α を得た。これらの変性カ
チオン化 HNF-4α を導入し、細胞質に到達した場合、細胞質内の還元環境により、４級アミンや PEI は HNF-４ α より解離し、HNF-４ α は活性構造を取ると予想される。細胞導入した HNF-4α タンパク質の核内転写活性を調べるために、
HNF-4α の結合 DNA モチーフの下流にルシフェラーゼ遺伝子を繋げてレポー
ターアッセイ系を構築した。このレポーター遺伝子と各種カチオン化 HNF-4αを細胞導入し、細胞内に入った HNF-４ α の活性を評価した。その結果、分子量 1200、1800 の PEI を付加させた HNF-4α タンパク質の導入により、転写活性の上昇がみられた。この結果から、HNF-4α タンパク質をカチオン化法により細胞の外から導入することで、細胞内で機能することが分かった。

Silkworm expression system suitable for high-throughput preparation of
antibody fragment and membrane protein.

Chemically cationized protein transduction of Hepatocyte Nuclear
Factor-4α ( HNF-4α) and evaluation of the nuclear transcription activity.

○Mami Shibata1, Hikaru Nakazawa1, Masahiko Kato2, Hidekazu Nagaya2,
Hideaki Sanada2, Izumi Kumagai1, Mitsuo Umetsu1(1Dept. Biomol. Eng., Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 2Sysmex Corp.)

Key words

silkworm express system, scFv, baculovirus○Tomoki Nakano1, Takayuki Hikino1, Houkin Sou1, Tomoki Nishio1,
junichiro Futami2, Midori Futami1(1Fac. Eng., Okayama Univ. Sci., 2Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Okayama Univ.)

Key words

hepatocyte, protein

232

タンパク質工学／抗体工学

3P-1a053 昆虫嗅覚受容体発現酵母を利用した迅速な匂い分子検出システムの基盤構築

3P-1a055 高感度免疫検査への利用を目指した材料親和性ペプチド
融合単鎖抗体の高密度配向固定○福谷 洋介 1,2, 田中 良拓 2, 養王田 正文 1,2（1農工大・院工・生命工, 2農工大・工・生命工）
fukutani@cc.tuat.ac.jp○谷端 怜奈 1, 高橋 浩一 2, 平山 良朗 2, 権平 文夫 3, 堀内 淳一 1,
熊田 陽一 1
（1京工繊大院・工芸科学, 2デンカ, 3デンカ生研）
horiuchi@kit.ac.jp

嗅覚は生物の持つ高感度な匂いセンサーであるため、生物の嗅覚機能を模倣したセンサーの研究開発が広く行われている。嗅覚システムの中の匂い検出部である嗅覚受容体は、嗅覚神経細胞の膜上に発現している７回膜貫通タンパク質である。我々はかねてから出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae を宿主に、嗅覚受容体を発現させる手法を構築することで、嗅覚受容体の機能解析と酵母を使った匂いセンサー開発を目指し研究を進めている。
昆虫の嗅覚受容体は、哺乳類の嗅覚受容体とは異なる膜貫通構造とり、共受容体(Orco)とのヘテロ２量体を形成し機能する。その複合体自身が匂い応答性のイオンチャネル活性をもつという昆虫独自の機構を持つことが明らかになっている。本研究では、ショウジョウバエ由来の嗅覚受容体と Orco を共発現させた出芽酵母を構築し、特定の匂い分子に応答する、これまでよりも迅速な検出が可能なバイオセンシングシステムへの応用を目指した。
OR47a、Orco それぞれの酵母発現発現ベクターを構築し、出芽酵母に共発現させた、目的遺伝子の発現を確認したのちに、受容体の細胞膜への局在の有無を確認した。リガンド検出にはカルシウムイオンインジケーターである G-GECOを導入し、匂い分子応答性のイオンチャネル活性の有無を試験した。本発表においては、この昆虫嗅覚受容体の出芽酵母での機能的発現の有無や、匂いセン
サー応用への展望などについて報告する。

【諸言】免疫検査に利用されてきた Whole 抗体は、動物細胞や実験動物を利用して生産されるため高コストであり、高分子量のため、プレート表面に高密度かつ均一な配向で固定化できず、検査の高感度化が難しい。一方、単鎖抗体（scFv）は大腸菌を宿主として安価に生産可能であり、C 末端に材料親和性ペプ
チドタグを導入することで、プレート上に高密度かつ高配向に固定化できる。
先行研究において、モデル抗体におけるペプチドタグ融合 scFv の生産方法、固定化方法などは十分に検討されたため、本研究ではこれらの技術の汎用性を広げることを目的とし、scFv とペプチドタグの組合せによるプレートへの吸着性、固定化後の抗原結合活性を評価した。特に、同じ scFv と同じアミノ酸配列を有する Whole 抗体との比較を行った。
【実験】CRP をモデル抗原とし、組換え大腸菌を用いてポリスチレン親和性ペプチド融合 scFv(scFv-PS)および PMMA 親和性ペプチド融合 scFv(scFv-PM)を、大腸菌を用いて生産した。scFv-PS、scFv-PM および Whole 抗体を PBS で 25μg/
ml となるよう希釈し、scFv-PS は親水性 PS プレート、scFv-PM は PMMA プレー
ト、Whole 抗体は両方のプレートに固定化した。これらのプレートを用い、Sandwich ELISA によって CRP の検出を行い、固相化された抗体の活性を評価した。
【結果と考察】PBS 中の抗体を親水性 PS プレートに固定化した場合、scFv-PSの方が Whole 抗体よりも高いシグナルが得られ、約 5 倍低濃度の CRP を検出できた。また、PMMA プレートに固定化した場合は、Whole 抗体のシグナルはほとんど得られなかったのに対し、scFv-PM は高いシグナルが得られた。以上の結果より、材料親和性ペプチド融合 scFv は材料表面に対し、ペプチドタグの親和力によって強く結合し、高密度かつ高活性な状態で固定化できることが示された。

Construction of the rapid odor detection system using insect odorant
receptor expression yeast

Immobilization of scFv antibodies through materials-binding peptides forapplication to sensitive immunoassay○Yosuke Fukutani1,2, Tanaka Yoshihiro2, Masafumi Yohda1,2(1Dept. of Biotechnol. Tokyo Univ. of Agric. and Technol., 2Dept. of Biotechnol.
Tokyo Univ. of Agric. and Technol.)Key words

odorant response, yeast

3P-1a054 抗原結合に伴う抗体の構造変化の解析○岡本 優太 1, 野田 勝紀 1, 福井 希一 1, 内山 進 1,2（1阪大院・工, 2岡崎統合バイオサイエンスセ）
suchi@bio.eng.osaka-u.ac.jp○Reina Tanibata1, Koichi Takahashi2, Yoshiaki Hirayama2, Fumio Gondaira3,
Jun-ichi Horiuchi1, Youichi Kumada1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2Denka, 3Denka-Seiken)

Key words

antibody, immobilization

3P-1a056 テンプレートスイッチ反応と懸垂液滴アレイ式磁気ビー
ズ反応法を用いた抗体 cDNA 迅速合成システムの開発○松原 悠紀 1, 黒澤 信幸 2, 磯部 正治 2
（1富山大院・理工学教育部, 2富山大院・理工学研究部）
isobe@eng.u-toyama.ac.jp

抗体医薬品はがんや自己免疫疾患などに対する新しい治療薬として需要の拡大が見込まれている。一方で、抗原に抗体が結合した後の免疫細胞の活性化機構
については未だ不明な点が多い。以前より、抗原の結合に伴って抗体に構造変化が生じる可能性が指摘されてきたが、この構造変化が起こっているかは依然として不明で、さらに、構造変化が生じているとしても、それが免疫細胞の活性化に関係するか否かは不明である。こうした抗原と抗体の相互作用に伴う構造変化と活性化機構との関係を明らかにできれば、新しいタイプの抗体創薬の可能性が広がると考えられる。
本研究では抗原の結合に伴う抗体の構造変化の解明を目的とし、抗原の結合に伴う Fab の構造変化を水素重水素交換質量分析法(HDX-MS)を用いて解析した。
HDX-MS はタンパク質を軽水から重水に移した際に、主鎖のアミド水素が重水素に置換される現象を利用する手法で、結晶化や安定同位体ラベルなどの必要が無く、溶液中でのタンパク質の構造変化や相互作用部位を迅速に解析可能である。
まず抗体をパパインで切断し、必要となる Fab を各種液体クロマトグラフィー
を用いて、分離精製を行った。次に HDX-MS の測定濃度の条件設定に必要となる、Fab と抗原の解離定数 KD を等温滴定カロリメトリー(ITC)を用いて測定した。その後、HDX-MS により、抗原と結合していない際の Fab と抗原と複合体を形成した Fab の水素重水素交換反応の速度を比較した。
その結果、ITC により決定した KD の値は約 4 nM であった。一方、HDX-MSの結果では、抗原との結合に伴い、交換速度が変化する部位が複数存在していた。本研究により、HDX-MS により抗原との結合部位や構造変化部位を決定できることが分かった。

【背景と目的】我々は迅速かつ大規模なモノクローナル抗体の単離を可能とするため、多数の抗体産生単一細胞から確実に抗体 cDNA を合成するための懸垂液
滴アレイ式磁気ビーズ反応法(MAGrahd 法)を開発した。本法は、薄層平板下にアレイ状に懸垂配置された液滴中に存在する核酸が結合した磁気ビーズを、薄層平板上部から近づけた磁石によって液滴から液滴へ移動させることにより、溶液交換や撹拌などの煩雑な操作を一切行うことなく、1 個の細胞から効率よ
く cDNA を合成する方法である。本法を用いた 5’RACE 用 cDNA 合成は、mRNA
抽出、逆転写反応、デオキシターミナルトランスフェラーゼ(TdT)によるホモポ
リマーテーリングからなる全 8 工程(HT 法)が必要で、反応に 135 分の時間を要してきた。我々は本工程をさらに効率化するため、逆転写酵素のターミナルト
ランスフェラーゼ活性を利用するテンプレートスイッチ反応と液滴反応法を組み合わせた手法(SW 法)を新たに開発することで、5’RACE 用 cDNA 合成にかかる時間とコストを大幅に減少させることに成功したので報告する。
【方法と結果】SW 法を用いた 5’RACE 用 cDNA 合成は、磁気ビーズ含有細胞溶
解液滴、洗浄液滴 1、2、スイッチプライマー含有逆転写反応液滴、洗浄液滴 3、4 の計 6 工程からなり、全反応に要する時間が約 90 分と、HT 法に比べ 45 分間短縮された。ラット抗体産生単一細胞を用い、HT 法並びに SW 法で作製された cDNA から抗体可変領域増幅を行い電気泳動により増幅効率を比較した結果、両者に差は認められなかった。更に、増幅された可変領域断片から作製した抗体遺伝子を細胞に導入し、抗体分泌量を調べた結果、SW 法の方が高い分泌量を示す傾向が観察された。以上の結果より SW 法を用いることで、より多数の単一細胞から抗体を作製することが可能となったことから、ヒト自己免疫疾患等の解析への応用が期待される。

The analysis of conformational change in antibodies associated with
antigens-binding

The quick cDNA synthesis system of antibody gene by using templateswitching and MAGrahd method○Yuta Okamoto1, Masanori Noda1, Kiichi Hukui1, Susumu Uchiyama1,2(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Okazaki bioscience inst.)

Key words

antibody, structural analysis○Yuuki Matsubara1, Nobuyuki Kurosawa2, Masaharu Isobe2(1Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama, 2Grad. Sch. Sci. Eng. Res., Univ.
Toyama)Key words

antibody, single cell

抗体工学

3P-1a057 免疫検査の高感度化を目指した Whole 抗体の配向固定化条件の検討3P-1a059 DNA ハイブリダイゼーションを用いる抗体固定化技術の開発とイムノクロマトの高性能化○岡林 雪乃 1, 高橋 浩一 2, 平山 良朗 2, 権平 文夫 3, 犬飼 忠彦 4,
川瀬 三雄 4,5, 堀内 淳一 1, 熊田 陽一 1
（1京工繊大院・工芸科学, 2デンカ, 3デンカ生研, 4TBA, 5東北大学
医工学研究科）horiuchi@kit.ac.jp○神𠮷 菜摘 1, 高橋 浩一 2, 平山 良朗 2, 権平 文夫 3, 堀内 淳一 1,
熊田 陽一 1
（1京工繊大院・工芸科学, 2デンカ, 3デンカ生研）
horiuchi@kit.ac.jp[緒言]一般的に ELISA 法では、完全長抗体(Whole 抗体)が抗原認識部位を溶液側に配向させた状態でプレート表面に固定化されることが望ましいが、プレートの表面状態や抗体のアミノ酸配列の違いによって固定化状態は大きく異なる。
したがって、Whole 抗体の高密度化・配向制御に適した表面状態・固定化条件の探索が求められている。本研究では、Whole 抗体の動物種や Fv ドメインのアミノ酸配列によらず、再現性良く高密度かつ均一な配向で固定化できる表面状
態・固定化条件の探索を行った。
[実験]pH 2～8.5 の各バッファーを用いて Whole 抗体(マウスモノクローナル抗体・ウサギポリクローナル抗体) を 10 μg/ml に希釈し、親水度の異なる 2 種類のポリスチレンプレートに固定化し、Sandwich ELISA により抗原（NP および
CRP）に対する結合活性を評価した。
[結果と考察]Sandwich ELISA の結果より、マウスモノクローナル抗体およびウ
サギポリクロ―ナル抗体は親水度のより高い PS プレートに対して固定化可能であり、固定化後の抗原結合活性は、pH5.5 以下のバッファーで固定化した場
合において向上することが明らかになった。親水化 PS plate では、非イオン性
界面活性剤である Tween20 を共存させて固定化した際にも抗原結合活性が低下
しないことから Whole 抗体の親水性プレートに対する吸着は主に静電的相互作用であると考えられる。親水度が中程度の PS plate においても pH3 で抗体を固定化した際にシグナルが向上したため同様の効果によるものと考えられる。したがって、Whole 抗体の Fc 領域の荷電性アミノ酸の分布がプレートへの吸着性に大きく関与していることが明らかとなった。

Characterization of antibodies immobilized on the surfaces of PS plates withdifferent surface properties○Natsumi Kamiyoshi1, Koichi Takahashi2, Yoshiaki Hirayama2, Fumio Gondaira3,
Jun-ichi Horiuchi1, Youichi Kumada1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2Denka, 3Denka-Seiken)

Key words

antibody, immobilization, IgG

3P-1a058 Expression and refolding of antigen-binding fragments(Fab) with the leucine zipper in E. coli.

233[諸言]イムノクロマトグラフィは、インフルエンザや感染症の迅速かつ簡便な検査方法として医療診断に利用されている。しかし、リガンド抗体の失活や検体の非特異吸着によって、検出感度・特異性が変化し、その結果、偽陽性・偽陰性等の誤診をまねく可能性がある。ニトロセルロース（NC）膜は、タンパク質の吸着容量が大きいものの、吸着後に抗原認識部位の構造が変化しやすく、残存活性は大きく損なわれることが多い。そこで本研究では、抗体にオリゴ
DNA を標識し、DNA Hybridization を用いて NC 膜上に固定化にすることで、残存活性の向上と抗原検出シグナルの向上を目的とした。
[操作] 25μM に調製した Ligand DNA を NC 膜上に２ μL スポットした後、UV照射によって固定化した。NC 膜を洗浄後、相補 DNA を修飾した抗 FluB 抗体
を同じ位置にスポットし、DNA Hybridization により抗体を固定化した。さらに、NC 膜をブロッキング後、濃度 0ng/mL～1000ng/mL の NP 抗原を加えて 1
時間インキュベートした。NC 膜上に捕捉された NP 抗原にビオチン化抗 FluB
抗体ならびに AP-streptavidine を反応させ、BCIP/NBT で発色させた。抗原検出の様子を観察した。また、物理吸着で NC 膜上に固定化した抗 FluB 抗体による抗原検出の様子と比較した。
[結果]NP 抗原を上述の方法で検出した。DNA Hybridization 法では、10ng/mL のNP 抗原を検出できたのに対し、物理吸着法では 1000 倍の抗体濃度（1mg/ml）
で固定化した場合でも 100ng/mL の抗原しか検出できなかった。以上のことから、DNA Hybridization を用いることで安定かつ高密度に抗体を NC 膜上に固定化できることが明らかとなった。

Immobilization of antibody utilizing DNA hybridization○Yukino Okabayashi1, Koichi Takahashi2, Yoshiaki Hirayama2, Fumio Gondaira3,
Tadahiko Inukai4, Mitsuo Kawase4,5, Jun-ichi Horiuchi1, Yoichi Kumada1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2DENKA, 3DENKA-SEIKEN,
4
TBA, 5Tohoku)

Key words

antibody immobilization, nitrocellulose, DNA hybridization

3P-1a060 形質細胞内発現抗体を利用した抗原特異的モノクローナ
ル抗体新規単離法(FIXAA)の開発○Panwad Ritthisan, Teruyo Ojima-Kato, Satomi Nagai,
Takaaki Kojima, Hideo Nakano(Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)
nakano@molbiotech-nagoya.org○塚本 薫 1, 黒澤 信幸 2, 磯部 正治 2
（1富山大院・理工学教育部, 2富山大院・理工学研究部）
isobe@eng.u-toyama.ac.jp

Antibodies have become important for several applications in clinical research, therapy
and medical diagnostics. Fragment antigen-binding (Fab) can be applied to such
purposes. However, overexpression of Fab in E. coli cells often leads to theaccumulation of inclusion bodies, which limits the application for Fab production
using E. coli expression system. Inclusion bodies refolding requires extensive
processing, including isolation of inclusion bodies from cell, solubilization, refoldingof solubilized protein and purification of refolded protein to recovery functions of
biological activity.
Leucine zipper LZA and LZB form a heterodimeric coiled-coil structure, the fusion ofwhich peptides to Fab enhanced correct pairing of heavy chain (Hc) and light chain(Lc), leading to more efficient formation of active Fab in E.coli expression systems.
The new Fab format is named as ‘Zipbody’.
In this study, we examined various conditions to obtain a high amount of a zipbody,
m6FabLZ, a leucine zipper-fused mouse Fab which binds to E. coli O157, from theinclusion bodies expressed in E.coli BL21 (DE3). The isolated inclusion body was
mildely soblubized in 3 M Urea using freeze-thawing method followed by step-wise
dialysis and the incubation with GSSG. The yield of purified m6FabLZ was 0.25 gfrom 1 L culture. The refolded showed a high affinity and specificity toward E. coli
O157 in ELISA. These results demonstrate that the refolding method can be utilized
for high-yield production of Fab in E. coli.

[背景と目的]
抗体は研究用試薬・診断薬としての用途のみならず医薬品開発の有力な素材として注目されている。我々は小胞体親和性蛍光色素を用いた抗原特異的形質細胞同定法（ERIAA）を開発し、これに単一細胞由来抗体遺伝子単離発現法を組み合わせることで、様々な動物からモノクローナル抗体を効率よく作製するためのシステムを完成させている。しかし ERIAA による抗原特異的形質細胞の同定は、細胞膜上で発現する僅かな抗体に対する蛍光標識抗原の結合性に依存しているため、抗体産生細胞がごく稀にしか存在しない場合には、高精度な分離が困難であった。一方形質細胞の細胞質には、膜上に発現する抗体に比べ２桁以上多い抗体が蓄えられている。そこで我々は、形質細胞の細胞質に蓄えられる抗体に蛍光標識抗原を作用させることで、例え極低頻度にしか抗原特異的な形質細胞が存在していなくても、確実に目的の抗体を産生する細胞を同定し、抗体遺伝子の増幅を行い、抗体を取得するための手法を開発したので報告する。
[方法と結果]我々は、細胞固定・細胞膜処理の条件を種々検討することで、抗原特異的な形
質細胞を高精度に単離し、抗体遺伝子を増幅するための新技術（FIXAA）を開発した。FIXAA 法の精度を検証するためのモデル実験として、抗体を産生しな
い Jurkat 細胞に抗体産生細胞であるハイブリドーマを一定の割合で加えた細胞集団より、ハイブリドーマの単離並びに抗体可変領域遺伝子断片の増幅を試みた。その結果、ハイブリドーマの存在率が 0.01％であっても、約 50％の成功率
で V 領域の増幅を行うことができた。本技術は、従来法で取得が極めて困難であった標的タンパク質に対する抗体取得に道を開くものと期待される。

Expression and refolding of antigen-binding fragments (Fab) with theleucine zipper in E. coli.

Novel method for the isolation of antigen specific plasma cells byintracellular antibody staining○Panwad Ritthisan, Teruyo Ojima-Kato, Satomi Nagai, Takaaki Kojima,
Hideo Nakano(Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)

Key words

inclusion body, refolding, solubilization○Kaoru Tsukamoto1, Nobuyuki Kurosawa2, Masaharu Isobe2(1Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama, 2Grad. Sch. Sci. Eng. Res., Univ.
Toyama)Key words

antibody, single cell, flow cytometry

234

抗体工学／発酵生理学，発酵工学

3P-1a061 取得困難な修飾部位特異的モノクローナル抗体の新規効率的作製法の開発

3P-1a063 次世代抗体医薬を目指した立体構造特異的モノクローナ
ル抗体の作製およびその評価○藤 聡志 1, 黒澤 信幸 2, 磯部 正治 2
（1富山大院・理工学教育部, 2富山大院・理工学研究部）
isobe@eng.u-toyama.ac.jp○磯﨑 勇志, 三浦 広己, 湊元 幹太, 冨田 昌弘（三重大院・工）tomita@chem.mie-u.ac.jp

生体内に存在する多くのタンパク質は、特定のアミノ酸残基に対するリン酸化
やメチル化などの様々な修飾によってその機能が制御されている。このような修飾タンパク質を特異的に検出するモノクローナル抗体(MAb)は、様々な生物
機能の制御過程をモニターするための有用なツールとなる。我々は、形質細胞内に保持される多量の抗体に対する抗原の結合性を利用して、免役された個体から抗原特異的形質細胞を同定し、そこから抗体遺伝子を単離・発現させることで、抗原特異的 MAb を確実に取得する新規手法(FIXAA 法)を開発した。本
手法の有効性を示すため、種々の細胞ストレスに応じて様々な修飾を受ける p53
タンパク質に着目し、これまで単離できなかったリン酸化された Thr18 を含む
p53 を特異的に認識する MAb の単離を試みた。p53 由来の Thr18 がリン酸化されたペプチド(pT18)を抗原としてモルモットに免疫を行った後、得られたリン
パ球を固定・膜透過処理後、蛍光標識 pT18、蛍光標識非リン酸化 Thr18 ペプチ
ド(蛍光標識 T18)、並びに抗 IgG 抗体を用いて染色を行い、pT18 強陽性細胞群から T18 陽性細胞をサブトラクションすることで、pT18 特異的抗体を発現する形質細胞のシングルセルソーティング・抗体遺伝子単離・発現を行った。得られた抗体の交差反応性を ELISA 法により解析した結果、重鎖・軽鎖の両免疫グロブリン遺伝子の増幅に成功した MAb の 96％以上が非修飾ペプチドには反応
せず修飾ペプチドに選択的に結合した。その中から pT18 を特異的に検出する
ウエスタン法と免役染色に使用可能な KD 値 0.2nM のモノクローナル抗体の取得に成功した。本法により、種々の翻訳後修飾タンパク質に対する特異的抗体の効率的な作製が可能になると考えられる。

近年、分子標的治療薬として抗体医薬が注目されている。抗体医薬は、その高い特異性・親和性のため、より効果的な治療が期待できる。本研究では、標的分子として GPCR (G タンパク質共役受容体) に着目した。GPCR は様々な疾患に関与しており、GPCR に対する特異的モノクローナル抗体は、抗体医薬としての利用価値が非常に高いと考えられる。さらに、生体内で機能している全てのタンパク質は立体構造を有しており、標的分子の高次構造を認識するモノク
ローナル抗体の作製は、今までにはない特徴を持つと推測される。そこで、本研究において GPCR の 1 つである CRHR1 (コルチコトロピン放出ホルモン受容体 1) に対する立体構造特異的モノクローナル抗体の効率的作製およびその評価を目的とした。
新規ハイブリドーマテクノロジーである「立体構造特異的モノクローナル抗体作製法」に基づき、CRHR1 に対する立体構造認識モノクローナル抗体を作製した。
その結果、多くのハイブリドーマの作製に成功した。ハイブリドーマ上清中の
立体構造認識抗体を抗原発現 CHO 細胞を用いた Cell-ELISA 法に基づき評価したところ、陽性ハイブリドーマが確認された。そこで、限界希釈法に基づきクローン化を行ったところ、IgG タイプのモノクローナル抗体の作出に成功した。
さらに、抗原発現 CHO 細胞を用いた免疫蛍光染色を行ったところ、細胞表面への特異的結合が確認された。これらの結果から、得られたモノクローナル抗体は目的抗原の立体構造を認識している可能性が極めて高いことが示された。
今後、組換えバキュロウイルスを用いた抗体評価を行うと共に、CRHR1 のリガンドである CRF との競合アッセイも行う予定でいる。立体構造特異的モノク
ローナル抗体の次世代抗体医薬への応用を目指す。

Novel method for the high-throughput isolation of modification-specificmonoclonal antibodies

Stereospecific monoclonal antibodies for next generation of therapeutic
medicine○Satoshi Fuji1, Nobuyuki Kurosawa2, Masaharu Isobe2(1Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama, 2Grad. Sch. Sci. Eng. Res., Univ.
Toyama)Key words

antibody, single cell, flow cytometry

3P-1a062 低分子抗体―薬物複合体開発：リジン残基側鎖の化学反応へ界面活性剤が及ぼす影響○Yushi Isozaki, Hiroki Miura, Kanta Tsumoto, Masahiro Tomita(Grad. Sch. Eng., Mie Univ.)

Key words
antibody

GPCR, hybridoma technology, stereospecific antibody, therapeutic

3P-1a064 菌体外 β グルカンを産生する Aureobasidium pullulansの網羅的遺伝子発現解析○服部 修平 1, 服部 峰充 1, 中澤 光 1, 二井手 哲平 1, 松永 淳 2,
李 宣和 2, 大江 知行 2, 梅津 光央 1
（1東北大院・工, 2東北大院・薬）mitsuo@prn.che.tohoku.ac.jp○内山 博文 1,4, 岡部 満康 3, 道羅 英夫 2, 加藤 竜也 2, 朴 龍洙 2
（1静大・創科技院, 2静大グリーン研, 3アウレオ, 4アウレオサイ
エンス）
park.enoch@shizuoka.ac.jp

抗体依存性細胞傷害作用や補体依存性細胞傷害作用を有する抗体医薬品はリンパ腫などのがん種に高い治療効果を発揮するが、さらなる高機能化に向けて、抗体に低分子医薬品を化学接合させた抗体－薬物複合体(ADC)や、抗体の可変領域(Fv)のみを用いて分子量を減少させた腫瘍浸透性の高い低分子抗体が開発されている。本研究では、IgG 型抗体ではなく腫瘍浸透性の高い低分子抗体のADC 化を目指し、低分子抗体の表面にあるリジン残基のアミノ基について化学
反応特性を評価した。
抗体の Fv の重鎖と軽鎖をグリシンリッチなリンカーで繋いだ一本鎖 Fv(scFv)を設計し、大腸菌を用いて scFv が会合した二価の低分子抗体を調製した。まず、
この低分子抗体と様々な混合比で N-ヒドロキシスクシンイミドビオチン(NHSビオチン)を反応させ、ビオチンの修飾率を HABA アッセイにより測定した。
その結果、混合比を高くすると反応効率が向上するが、低分子抗体の安定性が減少した。そこで、安定性を向上するために界面活性剤を用いた。反応溶液を様々な界面活性剤濃度にして化学接合を行い、ビオチンの修飾率を測定したところ、界面活性剤を入れることにより反応効率が減少するが、低分子抗体の凝集が緩和された。さらに、界面活性剤が化学接合に及ぼす影響を評価するために、化学接合時の界面活性剤濃度が異なるビオチン修飾低分子抗体の優先修飾
リジン残基を質量分析法により測定することで、リジン残基の同定を試みている。

【背景と目的】 Aureobasidium pullulans を液体培養すると酵母様の細胞形態をとり、ある培養条件下では菌体外に水溶性の β-1,3-1,6-グルカン（β グルカン）を産生する。真菌類が普遍的に有する細胞壁 β グルカンとは異なり、この水溶性
β グルカンの β-1,6 側鎖はグルコース 1 分子から形成されているが、その生合成
経路・分泌機構などは明らかにされていない。本研究では、網羅的遺伝子発現解析により水溶性 β グルカンの生合成・分泌に関わる候補分子を探索することを目的とした。
【方法】 β グルカン高生産培地（米糠含有培地）、β グルカン低生産培地（ポテトデキストロース培地）にて 72 h 振盪培養した菌体から total RNA を抽出し、シーケンスライブラリを調製した。MiSeq システム（illumina）を用いて得られた RNA-seq データから、各種解析を行った。
【結果と考察】 両群間の遺伝子発現量の比較において、β グルカン高生産培地で培養した菌体ではタンパク質分解酵素・トランスポーターなどの遺伝子発現
レベルが亢進し、翻訳・代謝関連の遺伝子発現レベルが低下するという傾向が見られた。また、有意に発現量が亢進した遺伝子リストには細胞壁の β-1,6-グルカン合成に関わる Kre6 遺伝子が含まれていた。しかしながら、この Kre6 遺伝子を破壊した株を作製して野生株と比較したところ β グルカン産生量に変化はなく、明らかな表現型の違いは観察されなかったことから Kre6 は水溶性 βグルカンの産生には関与しないことが示唆された。現在は Kre6 ホモログである
Skn1 の遺伝子及びその他候補遺伝子の破壊株の作製を行い、得られた株の表現
型を元に目的分子の同定を試みている。

Small antibody drug conjugate: influence of chemical reaction around lysine
residues by surfactant

Transcriptome analysis of extracellular β-glucan producing Aureobasidium
pullulans○Shuhei Hattori1, Takamitsu Hattori1, Hikaru Nakazawa1, Teppei Niide1,
Atsushi Matsunaga2, Seon Hwa Lee2, Tomoyuki Oe2, Mitsuo Umetsu1(1Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 2Grad. Sch. Pharm., Tohoku Univ.)

Key words

surfactant, antibody-drug conjugate, amine coupling○Hirofumi Uchiyama1,4, Mitsuyasu Okabe3, Hideo Dohra2, Tatsuya Kato2,
Enoch Y. Park2(1Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci. Technol. Shizuoka
Univ., 3Aureo Co., Ltd., 4Aureo-science Co., Ltd.)Key words

Aureobasidium pullulans, beta-1, 3-glucan, transcriptome

発酵生理学，発酵工学

3P-1a065 イオンビーム変異法による耐熱性乳酸生産糸状菌のXylose 発酵変異株の構築

235

3P-1a067 Polysaccharides Production from Solid-state Co-

fermentation of Okara and Pretreated Corn Straw○山下 聖樹 1, 高野 真希 1, 畑下 昌範 2, 星野 一宏 1
（1富山大院・理工, 2若狭湾エネ研）
khoshino@eng.u-toyama.ac.jp○Yue Guan, Zhenya Zhang(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)zhang.zhenya.fu@u.tsukuba.ac.jp

近年リグノセルロースからのバイオリファイナリーによる乳酸生産が注目されている。効率の高い生産技術の一つとして同時糖化発酵 (SSF)があるが、通常の SSF はセルラーゼ剤の至適温度と比較して菌体の増殖温度が低いため、SSF
を増殖温度で行う必要がある。そのため耐熱性乳酸生産微生物が求められる。
そこで、耐熱性 Rhizopus oryzae を乳酸生産に用いたが、40℃における Xylose 発
酵能が低く、ヘミセルロース由来の Xylose を乳酸に変換しづらい。そこで本研
究は、SSF によるリグノセルロースからの乳酸生産効率の向上のため、イオン
ビーム変異法を用いて耐熱性乳酸生産糸状菌の Xylose 発酵変異株の構築を試みた。
本研究では耐熱性 R.oryzae NBRC5384 を用いた。変異誘導として菌株の分生子
懸濁液にイオンビーム(WERC2 、Carbon 2,500 Gy)を照射した。この分生子をXylose を含む液体培地にて 40℃で静置培養し、112 株の変異株を取得した。各
変異株をそれぞれ 40℃で振盪培養し、最も安定に乳酸生産した XM-40 株を獲得した。XM-40 を 120 g/L の Glucose で 40℃、好気振盪培養した時、120 h で
64 g/L の乳酸を生産できた (Wild：56 g/L)。一方 50 g/L の Xylose で培養した場
合、28℃で Wild および XM-40 は乳酸を 8-13 g/L 生産できた。しかし 40℃で行った場合、XM-40 は 120 h で 14.7 g/L 生産できた (Wild：0.04 g/L)。この結果
から、XM-40 はイオンビーム変異によって温度上昇による Xylose 代謝酵素の活性低下を抑制したと考えられる。そこで 40℃で培養した各菌株を回収し、細胞内の Xylose reductase、Xylose dehydrogenase、Lactate dehydrogenase 活性を測定した。培養 24 h における XM-40 の酵素活性はそれぞれ Wild の 14、101、109倍高い活性を示した。これらの結果からイオンビームにより構築した XM-40
は、Xylose から乳酸への代謝にかかわる酵素群が Wild よりも高発現していることが示唆された。

The fermentation of straw feedstock is difficult due to its lignocellulose structure, thus
appropriate pretreatment of straw before fermentation is necessary. As a foodprocessing residue，okara contains profuse nutrients like high proteins which arealways neglected. In this study, these two materials were used as substrate for solidstate co-fermentation with Ganodorma lucidum, aiming to make full use of nutrients inthe straw and okara to develop functional food materials.
[Methodology and Results]Subcritical water pretreatment was performed under
different temperatures, holding time and solid-to-liquid ratio. Dried okara andpretreated corn straw were mixed in different proportions as the substrate forfermentation along with Ganoderma lucidum. Fermentation was carried out at 23℃ for
21 days. Polysaccharide content was quantified with phenol-sulfuric acid method.
Single factor and orthogonal tests were employed in this study to optimize thepretreatment and co-fermentation conditions. The mixed substrate is more beneficial to
the growth of Ganoderma lucidum mycelium during the fermentation process thansingle substrate under the same condition. Furthermore, when the pretreated corn straw
was used for co-fermentation，the yield of polysaccharides was higher than the control
tests without pretreatment. The highest yield of polysaccharide was obtained at
pretreatment temperature of 190℃. Little growth of Ganoderma lucidum was observed
during co-fermentation when the pretreatment temperature was above 200℃.

Construction of a Xylose-fermentable Mutant from Thermotolerant Lactic
acid-producing Fungi by Ion-beam Irradiation

Polysaccharides Production from Solid-state Co-fermentation of Okara andPretreated Corn Straw○Satoki Yamashita1, Maki Takano1, Masanori Hatashita2, Kazuhiro Hoshino1(1Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama, 2WERC)

Key words

Rhizopus oryzae, xylose fermentation, lactic acid, ion-beam

3P-1a066 亜臨界前処理したオカラの霊芝菌糸体発酵及び抽出した多糖類の評価○Yue Guan, Zhenya Zhang(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words
subcritical water pretreatment, co-fermentation, Ganoderma lucidum,
polysaccharide

3P-1a068 Effects of heating treatment and fermentation on
antioxidative compound of tempe○官 羽, 張 振亜
（筑波大院・生命環境）
zhang.zhenya.fu@u.tsukuba.ac.jp○Dewi Kusumah1, Isamu Maeda1,2(1Fac. Appl. Biosci., Tokyo Univ. Agric., 2Fac. Agric., Utsunomiya
Univ.)
kusumahdewi0402@yahoo.com

背景と目的
オカラとは豆腐、豆乳などの生産過程により、排出される残渣である。先行研
究によると、オカラを基質とした食用キノコ及び薬用キノコの発酵技術が開発され、発酵産物に顕著な抗酸化活性も確認された。これらの研究成果から、微生物発酵法を用いることで、オカラの再資源化が可能になり、発酵産物を一般
食品及び機能性食品の素材として利用する可能性もあると考えられる。そこで、オカラを亜臨界前処理することで、発酵効率の向上が可能だと考えた。本研究では、霊芝菌糸体発酵物の有効成分の一つである多糖類に着目し、抗酸化活性を評価し、亜臨界前処理をすることで、オカラの再資源化効率の向上や機能性
食品素材の開発を目的とした。
方法
オカラを異なる条件（温度、維持時間、固液比）で亜臨界前処理をし、植菌した。20 日、23℃の発酵を行い、発酵物から多糖類を抽出し、量を測定し、前処理をしない系との比較をした。また、抽出した多糖類の抗酸化活性も検討した。
結果
170℃以下で前処理をした系の多糖類の量が前処理をしない系のより多いのがわかった。また、抽出した多糖類には抗酸化活性が持っていることが確認された。

Food processing changes quality and quantity of many nutritional compounds in foods
that determine food bioavailability and functionality. One of the functionality that
beneficial for human health is anti oxidative effect. Tempe is a traditional fermented
soybean that uses Rhizopus spp. as starter strains. The aim of this study is to observe
the effects of heating treatment and fermentation on nutrition compound. The
experiment use regular boiling process and autoclave method as treatments. Sampling
was carried out at different fermentation periods after inoculating Rhizopus
microspores var. oligosporus. DPPH scavenging assay, ABTS assay and Reducing
power assay were used to observe antioxidant activity. The fungal biomass wasmeasured with quantification of fungal DNA by qPCR. The results show that before
fermentation, autoclaved grains possess higher antioxidant activity compared to boiled
one. This antioxidant activity was kept increasing during fermentation process. During
autoclaving, nutrition compounds like carbohydrate were maintained within the grains
compared to boiling process. Autoclaving made the fungi grow to higher density.
Simultaneously, this good fungal growth on the grains may participate on higher
antioxidant activity in autoclaving grains

Effect of sub-critical water pre-treatment of the Okara and evaluation of theextracted polysaccharides from Ganoderma mycelia fermentation product

Effects of heating treatment and fermentation on antioxidative compound oftempe○Yu Guan, Zhenya Zhang(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words
modification

sub-critical water pretreatment, fermentation, polysaccharide,○Dewi Kusumah1, Isamu Maeda1,2(1Fac. Appl. Biosci., Tokyo Univ. Agric., 2Fac. Agric., Utsunomiya Univ.)

Key words

fermentation, antioxidant, soybean, heating process

236

発酵生理学，発酵工学

3P-1a069 糸状菌 Aspsergillus terreus によるデンプン系バイオマス
からのイタコン酸の直接生産

3P-1a071 海洋性 A.thiooxidans SH 株の末端酸化酵素の解析○上村 一雄, 吉野 永里子, 金尾 忠芳（岡山大院・環境生命）
kamimura@okayama-u.ac.jp○清 菜都実 1, 高野 真希 2, 畑下 昌範 3, 星野 一宏 2
（1富山大・工, 2富山大院・理工, 3若狭湾エネ研）
khoshino@eng.u-toyama.ac.jp[目的] イタコン酸は米エネルギー省(DOE)が定めたバイオマスからの生産が求められる低分子化学物質の一つである。この化合物は分子中に 2 つのカルボキシル基を有し、化学修飾により様々な乳化重合に適用できることから、接着剤や抗菌剤の原料など化学工業から医療分野まで幅広く利用できる。Ustilago
maydis, Pseudozyma antarctica および Aspergillu terreus がイタコン酸を生産する
ことが知られており、中でも A.terreus は低 pH で増殖し、イタコン酸を生産できるという特徴を有する。そのため、バイオマス由来の雑菌に汚染されることが少なく、殺菌処理の手間が省けるという利点がある。本研究では A.terreus を用いてデンプン系バイオマスからの直接イタコン酸生産の可能性を検討した。
[方法・結果] 本研究で使用したイタコン酸生産菌として A. terreus NBRC 6123
を使用した。培養は液体培地で好気振盪培養を 28℃で 5-8 日間行った。Glucose
50 g/L を基質とした時、培養 8 日でイタコン酸を 24.7 g/L 生産できた(収率:68.5％)。また基質をそれぞれ 50 g/L の Maltose, Soluble starch, Corn starch として
5 日間振盪培養した結果、それぞれ 7.15, 0.67, 0.54 g/L のイタコン酸が生産できた。この結果、デンプン系バイオマスからの直接イタコン酸生産は現状では難しいことがわかった。そこで、デンプン系加水分解酵素の分泌特性を検討した。
Corn starch を 基 質 と し て 5 日 間 培 養 し た 時 の 培 養 液 中 の Glucoamylase, αAmylase, α-Glucosidase 活性はそれぞれ 1.99, 0, 0.10 U/L であった。これらの結果
から本菌株は、α-Amylase および α-Glucosidase の分泌が低いことから、デンプンから直接イタコン酸を生産しにくいことがわかった。そこで、デンプンからのイタコン酸の直接生産を目指し、イオンビーム変異法による加水分解酵素高発現変異株の構築を検討している。

【背景と目的】A.thiooxidans SH 株は、当研究室が単離した最適増殖 pH が 4.0、2.0%の NaCl 存在下で最適な増殖を示す好酸性好塩性の硫黄酸化細菌である。
本菌は、塩含有環境下でのバクテリアリーチングに利用できるが、その効率を向上させるために、硫黄代謝機構の解明は欠かすことが出来ない。また、好酸性 NaCl 要求性の硫黄酸化細菌の硫黄の酸化経路はほとんど解明されておらず、その機構の解明は、応用面に反映できるのみならず、地球レベルでの硫黄のサイクルに関して重要な知見をもたらすことが期待される。本菌は、チオ硫酸の酸化にチオ硫酸デヒドロゲナーゼを用いる。酸素はキノンを電子受容体に用いることを明らかにされている。還元されたキノンの酸化機構を明らかにするため、本研究では、チオ硫酸増殖細胞の末端酸化酵素の性質を明らかにすることにした。
【方法】チオ硫酸生育細胞から膜画分を調製し、界面活性剤（n-ドデシル-β-Dマルトピラノシド）を用いて膜タンパク質を可溶化した。TMPD 酸化活性測定
によって、末端酸化酵素である、cytochrome c oxidase もしくは、ubiquinol oxidaseの活性を検出し、陰イオン交換カラム、疎水カラム、ハイドロキシアパタイト
カラムに供し末端酵素の精製を試みた。最終標品を用いて、酵素の性質検討を行った。
【結果考察】最終標品の TMPD の酸化活性の反応最適 pH は 7.5 で、反応最適温
度は 40℃であった。酵素は、膜画分から 13.2 倍に精製され、最終標品の SDSPAGE 解析の結果、51.8、41.1、30.1kDa のタンパク質が主要な成分として含まれていた。スペクトル解析により、527、560、607 nm のピークが確認され、最終標品はユビキノン（Q2）を電子受容体とすることが明らかになったため、ba3タイプの ubiquinol oxidase である可能性が示唆された。

Direct Itaconic Acid Production from Starches with Aspergillus terreus

Analysis of a terminal oxidase in the marine sulfur-oxidizing bacterium A.
thiooxidans SH○Natsumi Sei1, Maki Takano2, Masanori Hatashita3, Kazuhiro Hoshino2(1Fac. Eng., Univ. Toyama, 2Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama, 3WERC)

Key words

Aspergillus terreus, itaconic acid, starch, ion-beam

3P-1a070 二形性調節因子による酵母化 Mucor circinelloides の構
築および好気的 Ethanol 生産○Kazuo Kamimura, Eriko Yoshino, Tadayoshi Kanao(Grad. Sch. Environ. Life Sci., Okayama Univ.)

Key words
marine, Acidithiobacillus thiooxidans, thiosulfate dehydrogenase,ubiquinol oxidase

3P-1a072 自然界からのアラキドン酸含有脂質蓄積緑藻株のスクリーニング○加藤 康夫 1, 木野 貴仁 1, 米田 有紗 1, 野村 泰治 1,
荻田 信二郎 1,2（1富山県大・生工研セ, 2県大広島・生命科学）
ykato@pu-toyama.ac.jp○岩倉 遼, 高野 真希, 星野 一宏（富山大院・理工）khoshino@eng.u-toyama.ac.jp【目的】二形性真菌は、温度や pH、血清、CO2 の有無などの様々な環境の変化に応じて酵母体と糸状体に形態変化する。Candida albicans などは酵母体から糸状体に形態変化させ、病原性を示す。一方、本研究室で開発した接合菌 Mucor
circinelloides 4572J は好気条件で糸状体、完全嫌気条件で酵母体へと形態変化する真菌であり、好気嫌気条件下で Ethanol 発酵が可能な菌株である。酵母化
4572J を用いた Ethanol 生産では菌糸が発酵槽内に絡みつく問題がなく、物質移動の改善により発酵効率の向上が期待できる。さらに、連続培養を行いながら培養液から直接 Ethanol の分離回収を行うためには好気条件下での酵母化が望ましい。そこで本研究では 4572J の二形性メカニズムを応用して好気条件での酵母化および連続 Ethanol 生産について検討した。
【方法・結果】4572J を 70％ N2 ＋ 30％ CO2 の嫌気条件下で培養し酵母体とし、4572J の酵母体を本培養に用いた。4572J は Glucose 基本培地において培養 24
時間で 50 g/L の Glucose から酵母体は 22 g/L、糸状体は 17 g/L の Ethanol を生産した。4572J における二形性変化は細胞内 cAMP 濃度や細胞膜構成成分が関係しているとされている。そこで本培養では、細胞内 cAMP の蓄積および細胞膜形成に影響を与える化合物を添加し好気条件下で培養を行い、形態の観察および Ethanol 生産の検討を行った。cAMP 分解酵素 Phosphodiesterase を阻害する
Caffeic acid、細胞膜成分 Ergosterol に影響を与える Nerol を培地に添加し好気培養を行った。その結果、0.5 mM の Caffeic acid を添加したとき酵母体が多く確認でき、20 g/L の Ethanol を生産できた。Nerol は 5 μM で酵母体が多く確認で
き 25 g/L の Ethanol を生産できた。cAMP や細胞膜形成に関与する試薬を添加することによって、好気条件で酵母化できた。現在、好気条件下における連続
Ethanol 生産を検討中である。

【目的】
高度不飽和脂肪酸（PUFA）の一種であるアラキドン酸（ARA）は、様々な生理機能を有するプロスタグランジン等の生合成前駆体となるだけでなく、乳児や高齢者の脳や体の発達に不可欠である等、その機能性が注目されている。本
研究では、自然界から広く緑藻を単離し、各種栄養条件下にて培養後、ARA 含
有脂質を蓄積する株を選抜した。
【方法及び結果】
富山県内外の湖沼水、地面、植物体表面等よりサンプリングを行い（延べ150 ヶ所）、抗細菌物質を添加した無機塩のみからなる固体 C 培地上で緑藻株を単離した。得られた緑藻約 500 株を各々、Glucose、Glycerol 添加及び無添加の固体 C 培地上、明・暗の計 6 条件下にて培養し、生育特性を観察することで栄養要求性の検討を行った。このようにして培養した緑藻株中への ARA 含有脂質の蓄積を確認するため、加メタノール分解により構成脂肪酸をメチルエステ
ル（FAME）化し、以後の分析に供した。まず 1 次スクリーニングとして、
FAME を二重結合数 0-2 及び 3 以上で分離する簡易 TLC 分析を行い、後者を主に与える緑藻を 263 株選抜した。次に 2 次スクリーニングとして、Ag イオンをコートしたシリカゲル TLC により FAME を二重結合数で詳細に分離分析し、ARA メチルエステルと移動度が一致するものを与える 71 株を選抜した。3 次
スクリーニングとして、FAME をキャピラリーガスクロマトグラフィー分析に供し、ARA 含有脂質を蓄積する目的株 20 株を選抜した。このうち最も高含量に ARA を蓄積する数株について、単位培養液及び藻体当たりに ARA 含有脂質を最も良く蓄積する培養条件の検討を行った。

Construction of Yeast-like Mucor circinelloides by Using Dimorphism
Regulators and Its Aerobic Ethanol Production

Screening of green algal strains accumulating arachidonic acid-containing
lipids.

○Ryo Iwakura, Maki Takano, Kazuhiro Hoshino(Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama)

Key words

Mucor circinelloides, dimorphism, ethanol production○Yasuo Kato1, Takahito Kino1, Arisa Yoneda1, Taiji Nomura1, Shinjiro Ogita1,2(1Biotechnol. Res. Center, Toyama Pref. Univ., 2Dept. Life Sci., Pref. Univ.
Hiroshima)

Key words

arachidonic acid, green algae, fermentation, lipid

発酵生理学，発酵工学／代謝工学

3P-1a073 好熱性新菌種 Bacillus hisashii N11T 株の経口給与がマウスに及ぼす抗肥満効果

237

3P-1a075 糸状菌 Asperigillus niger 有機酸輸送体遺伝子破壊株によるシュウ酸生産○岩田 菖子 1, 須田 亙 2,3, 福田 真嗣 4, 大野 博司 4, 服部 正平 2,5,
児玉 浩明 1, 宮本 浩邦 1,3,6（1千葉大院・融合, 2東京大院・新領域, 3慶應大・医, 4理研・IMS, 5早大・先進理工, 6サーマス）
h-miyamoto@faculty.chiba-u.jp○吉岡 育哲, 上田 由佳, 小林 慶一, 桐村 光太郎（早大・先進理工・応化）
kkohtaro@waseda.jp【背景・目的】当研究室は、家畜生産性の向上作用を持つ高温発酵産物中から機能性候補微生物として好熱性の新菌種 Bacillus hisashii N11T 株（国際寄託番号
NITE BP-863）を見出すことに成功し、低濃度の B. hisashii をマウスや豚に経口投与した場合には、成長促進効果を確認している。そこで本研究では、B. hisashiiの動物に対する作用機序の解明を目的に、本菌のマウスに与える影響を詳細に解析した。【方法】2 系統のマウス（C57BL/6、BALB/c）に対して馴化処理後、高濃度 B. hisashii 飲水給与群（107 cfu/ml）、並びに非給与群を設定し、高脂肪食条件下にて 35 日間飼育した。血液成分、肝臓における代謝物、糞中の細菌叢を解析した。
【結果】低濃度 B. hisashii 給与試験の結果とは異なり、高濃度給与
群では非給与群よりも体重増加率が低く推移する傾向にあった。CT による腹部断面の画像解析を行った結果、給与群では非給与群よりも脂肪積算値が有意に減少するとともに、血清グルコースやトリグリセリド濃度が減少し、逆にアディポネクチン濃度は増加していた。CE-TOFMS により肝臓中の代謝産物のメ
タボローム解析を行った結果、給与群では解糖系の抑制傾向が確認された。さらに、盲腸内容物と排泄糞中の細菌叢を NGS により解析した結果、給与群では
非給与群よりも Firmicutes 門の割合が低く、逆に Bacteroidetes 門の割合が高い
ことが確認された。これらの傾向は、C57BL/6 よりも BALB/c において顕著であった。以上の結果から、高濃度の B. hisashii 経口給与は、肥満制御に関与す
る腸内細菌叢と血液成分の変化を伴って肥満抑制傾向を強めるが、その傾向はマウスの系統依存的に異なることが示唆された。

【目的】クエン酸生産糸状菌 Aspergillus niger は pH 5.5 以上、とくにアルカリ性
や高濃度のリン酸存在下などの培養条件下でシュウ酸を生産する。シュウ酸はサイトゾルで oxaloacetate hydrolase (EC 3.7.1.1) がオキサロ酢酸に作用することで生成し、当該酵素遺伝子高発現株ではシュウ酸生産量が増大した [1]。 一方、
当研究室では A. niger におけるミトコンドリア局在型有機酸輸送体をコードする 2 種の遺伝子 (ctpA と cocA) に関する破壊株を作製し [2,3]、とくに cocA 破壊
株ではクエン酸生産量が減少することを見出している [3]。本研究では、2 種の遺伝子破壊株を用いたシュウ酸生産試験を行い、有機酸輸送体遺伝子破壊の影
響について検討した。
【方法および結果】A. niger WU-2223L は、当該培養条件下では 12 日間の培養で30 g/L のグルコースを炭素源とする OA 培地で 24 g/L のシュウ酸を生産した。
一方、ctpA 破壊株 DCTPA-1 は 22 g/L、cocA 破壊はクエン酸生産条件で COCA-1
は 25 g/L のシュウ酸を生産し、最終的な生産量はほぼ同じであった。DCTPA-1
はクエン酸生産条件下と同様にシュウ酸生産条件下に培養初期の生育およびシュウ酸生産の遅延が生じたが、最終的な生産量は親株とほぼ同等であった。
また、DCOCA-1 では親株に比べクエン酸生産量が減少する一方で、シュウ酸
生産量は親株と同等であった。以上より、シュウ酸生産ではミトコンドリア局
在型有機酸輸送体 CTPA や COCA の関与は少なく、とくにクエン酸生産とシュウ酸生産ではミトコンドリア局在型有機酸輸送体 COCA の役割が異なることが示唆された。
[1] K. Kobayashi, et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 41, 749-756 (2014).
[2] K. Kirimura, et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 80, in press (2016).
[3] 小林慶一, 他, 日本農芸化学会 2016 年度大会, 講演番号 4F120 (2016).

Anti-obesity effects of oral administration of Bacillus hisashii N11T on themouse

Production of oxalic acid by organic acid transporter gene disruptants in○Shoko Iwata1, Wataru Suda2,3, Shinji Fukuda4, Hiroshi Ohno4, Masahira Hattori2,5,Hiroaki Kodama1, Hirokuni Miyamoto1,3,6(1Grad. Sch. Adv. Integr. Sci., Chiba Univ., 2Grad. Sch. Fro. Sci., Tokyo Univ., 3Fac.
Med., Keio Univ., 4RIKEN IMS, 5Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 6Sermas ltd.)

Key words

Bacillus sp., thermophile, mouse, gut microbiota

3P-1a074 発酵食品からのデンプン資化性乳酸菌の分離と諸性質の検討

Aspergillus niger○Isato Yoshioka, Yuka Ueda, Keiichi Kobayashi, Kohtaro Kirimura(Dept. Appl. Chem., Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words

Aspergillus niger, citric acid, organic acid transporter, oxalic acid3P-1a076 デンプンからの直接乳酸生産に資する麹菌でのピルビン酸代謝関連酵素の欠損○山本 脩幾（立命館大院・生命科学）
wakayama@sk.ritsumei.ac.jp○笹倉 直也 1, 若井 暁 2, 浅井 菜々実 2, 堤 浩子 3, 秦 洋二 3,
近藤 昭彦 2
（1神戸大院・工, 2神戸大院・イノベ, 3月桂冠・総研）
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp

古来より日本の各地において、醤油、味噌、酒などの醸造食品や、すぐき、しば漬けなどの漬物をはじめとした多くの発酵食品が作られてきた。このような発酵食品には多様な種類の乳酸菌が存在し、風味の形成や保存性の向上に寄与してきた。乳酸菌のなかには多糖類であるデンプンを分解・利用できるデンプ
ン資化性乳酸菌が存在しており、そのような乳酸菌は食品に利用がされているものもあり、多くの有用な機能が報告されている。そこで、本研究では米やジャガイモなどのデンプンを原料とした、発酵食品や、乳酸飲料などの開発を目的として発酵食品から分離したデンプン資化性乳酸菌の諸性質を検討した。
発酵食品や生野菜より、改変 MRS 培地に単離した菌のうち液体培地に培養し、α-アミラーゼの活性測定、乳酸定量をおこない、その中から活性、乳酸生産量が高い 3 菌株について 16S rRNA シーケンス解析により同定した。その結果、最も活性の高い 2 菌株は Lactococcus 属の一種であることが明らかとなった。そこで、以上の 2 菌株をそれぞれ Lactococcus lactis subsp. S.Y.I、Lactococcus lactis
subsp. S.Y.II と命名した。前者の α-アミラーゼは 55℃、pH 7.0 付近で、最も高い活性を示した。

本研究の目的は、麹菌 Aspergillus oryzae を用いたデンプンからの L-乳酸の高効率生産を目的とした代謝改変の影響を調べることである。乳酸は、従来の石油系プラスチックの代替品として注目されるバイオプラスチックの原料となる物
質で、植物バイオマスから微生物変換による生産が可能である。これまでに、
栄養要求性麹菌 A. oryzae NSPlD1 株に牛由来の lactate dehydrogenase (LDH) 遺伝子を導入し、デンプンから約 30 g/L の L-乳酸を生産することに成功している。しかしながら、その変換効率は 30%と悪く、乳酸生産の基質であるピルビン酸がエタノール生産や TCA 回路に使われていると考えられた。本研究ではL-乳酸生産の競合経路の遺伝子破壊による代謝改変を試み、乳酸の生産量等を検討した。
LDH 導入株では、L-乳酸の生産だけでなく、副産物として約 10 g/L のエタノー
ル生産が確認された。そこで、エタノール生産を無くす目的で、エタノール生
合成経路上のピルビン酸デカルボキシラーゼ(PDC)をコードする遺伝子を破壊した株(PDC 破壊株)を構築した。PDC 破壊株は、エタノール生産が抑制され、乳酸生産量も 40 g/L に改善された。これと並行して、ピルビン酸をオキサロ酢
酸に変換して、TCA 回路を効率的に回すために必要なピルビン酸カルボキシラーゼ(PYC)をコードする遺伝子を破壊した株(PYC 破壊株)も構築した。PYC
破壊株においても、約 40 g/L の乳酸生産が確認された。また、PYC 破壊株ではエタノール生産能が残存しており、実際にエタノール生産が確認された。そこ
で、PDC および PYC 二重破壊株を構築し、乳酸生産量の変化を評価したが、二重破壊株では生育に悪影響が出て、乳酸生産能も向上しなかった。PYC 破壊
株においても TCA 回路上の有機酸の蓄積が観察されたことから、現在、TCA
回路に対する流出の改善を進めている。

Characterization of starch-hydrolyzing lactic acid bacteria isolated fromfermented foods

L-lactate production from starch by pyruvate metabolism-engineered
Aspergillus oryzae.

○Shuuki Yamamto(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words

fermentation, amylolytic lactic acid bacteria○Naoya Sasakura1, Satoshi Wakai2, Nanami Asai2, Hiroko Tsutsumi3, Youji Hata3,
Akihiko Kondo2(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci. Tech. Innov., Kobe Univ., 3Res. Inst.,
Gekkeikan Sake Co., Ltd.)Key words

Aspergillus oryzae, L-lactic acid, metabolic engineering, starch

238

代謝工学

3P-1a077 三種セルラーゼ共・強発現麹菌によるセルロースからのコウジ酸生産3P-1a079 二相培養法によるラン藻 Synechococcus elongatus
PCC7942 の脂肪酸生産性の向上○加藤 明宏 1, 高谷 信之 1,2, 鵜瀬 和秀 1, 前田 真一 1,2, 小俣 達男 1,2（1名大院・生命農学, 2JST CREST）
omata@agr.nagoya-u.ac.jp○若井 暁 1, 浅井 菜々実 1, 荻野 千秋 2, 堤 浩子 3, 秦 洋二 3,
近藤 昭彦 1
（1神戸大院・イノベ, 2神戸大院・工, 3月桂冠・総研）
wakaists@pegasus.kobe-u.ac.jp

麹菌 Aspergillus oryzae は、1000 年以上発酵食品分野で活躍してきた微生物である。また、A. oryzae は酵素生産性に優れ、商業用酵素の生産ホスト株としても産業応用されている。加えて、近年、遺伝子組換え麹菌により、様々な物質生産が行われている。我々は、この高い酵素生産性を利用して、非過食バイオマ
スからの物質生産を可能とする麹菌の開発を進めている。
麹菌は、co-transformation により複数の遺伝子をマルチコピーで同時に導入することが可能である。我々は、この co-transformation 時の導入遺伝子断片末端配列に依存して導入遺伝子コピー数に多形が出ることを明らかにした。この多形性とプロモーター強度を加味することで、三種セルラーゼの発現バランスをアレンジしたセルラーゼ発現麹菌を構築した。その後、コウジ酸の生産能を上げることが知られている kojR 遺伝子を高発現用プロモーターと共に導入した株を構築した。
構築した遺伝子組換え麹菌をペプトン抜き培地（3%[w/v]グルコース、0.5%[w/v]酵母エキス、2 g/L KCl、1 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgCl2・6H2O）で前培養し、10%（w/v）グルコース入りペプトン抜き培地、結晶性セルロースである Avicel
を炭素源としたペプトン抜き培地、および、グルコースも Avicel も添加していないペプトン抜き培地で培養した。グルコースあるいは Avicel を炭素源とした培地において、コウジ酸生産が確認できた。一方で、グルコースも Avicel も添
加していない培地では、コウジ酸の生産が確認できなかった。したがって、
Avicel を炭素源とした培地でのコウジ酸生産は、前培養のグルコースキャリー
オーバーではなく、Avicel 分解によるものである。
今回構築した株のセルロースからのコウジ酸生産量は既報の約 10 倍であり、セルロース分解能の改善がコウジ酸生産量の改善につながった。

＜背景と目的＞
光合成微生物を利用したバイオ燃料生産が近年注目されており、その中でもラン藻は生産した遊離脂肪酸（FFA）を細胞外へと放出するため、物質生産の有用 な ホ ス ト と し て 期 待 さ れ て い る 。 し か し 我 々 が 作 製 し た Synechococcus
elongatus PCC7942 の脂肪酸生産株は、FFA の細胞外への放出速度が生産速度に追いつかず、生産された FFA の 85％が細胞内に蓄積することでクロロフィル
や光合成活性が消失して死滅した。これは FFA の生産性を低下させる重大な問題である。そこで本研究では、FFA の放出速度を向上させるための方策を探索した。
＜結果＞
FFA の放出を妨げている原因を調べると、細胞から培地への FFA の受動拡散が培地中の FFA によって阻害されることが示唆された。そこで培地に蓄積したFFA を培養中に取り除くために、有機溶媒を用いた二相培養法を構築した。
PCC7942 の野生株は、デカン、ウンデカンといったアルカンやリン酸トリブチ
ルを添加した場合には生育できずに死滅したが、ミリスチン酸イソプロピルを添加した場合には通常の培地と同程度に生育した。そこでミリスチン酸イソプ
ロピルを使用して脂肪酸生産株を二相培養すると、コントロール条件と比べてクロロフィルや光合成活性の低下が緩和されただけでなく、細胞外への FFA の放出量と放出速度も増加して 0.5 g L-1 と 3 mg L-1 h-1 に到達した。この FFA の生
産性は、先行研究において他のモデルラン藻である Synechocystis sp. PCC6803
や Synechococcus sp. PCC7002 で報告されているものと比べても数倍高い値である。このことから、二相培養によって FFA の放出を促進することが、S. elongatusの FFA 生産性の向上に効果的であることが示された。

Direct production of kojic acid from cellulose by three cellulasescoexpressing Aspergillus oryzae

Two phase culture system improves the free fatty acid production using
genetically engineered Synechococcus elongatus PCC7942○Satoshi Wakai1, Nanami Asai-Nakashima1, Chiaki Ogino2, Hiroko Tsutsumi3,
Yoji Hata3, Akihiko Kondo1(1Grad. Sch. Sci. Tech. Innov., Kobe Univ., 2Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 3Res. Inst.,
Gekkeikan Sake Co., Ltd.)Key words

Aspergillus oryzae, cellulase, cellulose, kojic acid3P-1a078 アーキアを利用した炭化水素生産○佐藤 喬章 1,3, 福家 翼 1, Jha Savyasachee 1, Tansengco Myra 2,
跡見 晴幸 1,3
（1京大院・工, 2Dept. Sci. & Technol., ITDI, 3JST・CREST）
takaakisato@sbchem.kyoto-u.ac.jp○Akihiro Kato1, Nobuyuki Takatani1,2, Kazuhide Use1, Shin-ichi Maeda1,2,
Tatsuo Omata1,2(1Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2JST CREST)

Key words

cyanobacteria, fatty acid, biofuel

3P-1a080 藍藻 Synechococcus elongatus PCC 7942 代謝改変株の増殖特性と光合成特性○林原 加代子 1, 広川 安孝 2, 花井 泰三 2, 村上 明男 1
（1神戸大・自科・研究環, 2九大院・農）kayoko_h@people.kobe-u.ac.jp【背景・目的】アーキアは真核生物や細菌とは異なる第三のドメインを構成するが、その大きな特徴の一つに膜脂質の構造が挙げられる。アーキアの細胞膜脂質は他のドメインの生物とは異なりイソプレノイド型の疎水性部位を有しており、その基本構造は squalene や phytoene などの炭化水素と類似している。そこで本研究ではアーキアが有するイソプレノイド合成経路を利用した squalene や
squalene 様炭化水素である phytoene の合成を目指した。
【実験・結果】宿主としては、全ゲノム解析が完了しており、遺伝子破壊・導入系が確立されている超好熱性アーキア Thermococcus kodakarensis を用いた。ゲ
ノム解析および既知の膜脂質合成経路から、本菌における膜脂質生合成の中間
生 成 物 に は 、 炭 素 数 15 の farnesyl pyrophosphate (FPP) お よ び 炭 素 数 20 のgeranylgeranyl pyrophosphate (GGPP)が含まれると考えられた。一方、squalene
synthase (SS)の酵素反応により 2 分子の FPP が縮合し炭素数 30 の炭化水素
squalene が合成される。同様に、phytoene synthase (PS)により 2 分子の GGPP から炭素数 40 の phytoene が合成される。しかし T. kodakaranesis のゲノム上にはSS および PS をコードする遺伝子は見つかっていないため、これらの炭化水素は生合成していないと考えられた。そこで遺伝子導入技術によって他生物由来の phytoene/squalene synthase を 導 入 す る こ と で 、 phytoene を 産 生 す る T.
kodakarensis を創出することができた。

近年、藍藻などの光独立栄養微生物を活用した各種有用アルコールの生産のため、合成代謝経路を構築した代謝改変株の作製が盛んに進められている。しかし、藍藻によるアルコールの生産量は、大腸菌などの従属栄養微生物に比べまだ低くとどまっており、何らかの改善が必要である。加えて、藍藻が本来持たない代謝経路を構築するための遺伝子導入は、光合成エネルギー変換系やその環境応答能などにも何らかの影響を与えるため、これらの基礎特性を明らかにすることは藍藻によるアルコール生産の最適化において重要である。我々はイ
ソプロパノールや 1-ブタノール等の生産量の増強を目指し、藍藻のグリコーゲ
ン合成遺伝子破壊株などの代謝改変株を作製している。本発表では、これらの代謝改変が光合成エネルギー変換系や光合成活性の各種パラメータへ与える影
響について議論したい。
本研究は JST-CREST（藻類・水圏微生物の機能解明と制御によるバイオエネル
ギー創生のための基盤技術の創出）の支援を受け行った。

Hydrocarbon production with engineered Archaea

Photo-physiological characterization of metabolically engineered
Synechococcus elongatus PCC 7942

○Takaaki Sato1,3, Tsubasa Fuke1, Savyasachee Jha1, Myra Tansengco2,
Haruyuki Atomi1,3(1Grad. Sch. Eng., Kyoto Univ., 2Dept. Sci. & Technol., ITDI, 3CREST, JST)Key words

hydrocarbon, archaea, metabolic engineering○Kayoko Hayashihara1, Yasutaka Hirokawa2, Taizo Hanai2, Akio Murakami1(1Org. Adv. Sci. Technol. Kobe Univ., 2Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words

cyanobacteria, photosynthetic bacteria, metabolic engineering代謝工学

3P-1a081 Euglena gracilis における一次代謝産物の変化○冨田 結芙子, 吉岡 和政, 小山内 崇（明治大・農）tosanai@meiji.ac.jp239

3P-1a083 合成代謝経路を導入した Synechocystis sp. PCC 6803 による isopropanol 生産○山下 泰一, 広川 安孝, 花井 泰三（九大院・農）taizo@brs.kyushu-u.ac.jp

Euglena gracilis(E.gracilis)は真核微細藻類であり、光合成によって空気中の CO2と光と水さえあれば光独立栄養的に生育することができるが、酢酸やグルコースなどを単一炭素源として従属栄養的にも生育することもできる。
また E.gracilis は中性から酸性まで幅広い pH 環境下や高 CO2 濃度下など、他の水中生物が生育できないような環境下でも培養可能である。このような利点を利用してコンタミネ―ションなどの点から屋外での大量培養が難しいとされている藻類の中でも Euglena は大量培養が実用化している数少ない微細藻類の一つである。E.gracilis 藻体や抽出物は、健康食品や化粧品として商品化もされ、今後ジェット燃料への応用展開も期待されている。モデル藻類であるラン藻
Synechocystis や緑藻 Chlamydomonas などと比べ、E.gracilis の代謝解析の例は非常に少ない。
そこで本研究では E. gracilis NIES-48 株を用いて、培養温度、光の強さ、酸素濃度、外部炭素源などの培養条件を変化させ、細胞の代謝産物解析を行った。これらの培養条件変化 によって炭素の一次代謝産物が変化する可能性が得られた。

【背景・目的】光合成生物であるシアノバクテリアに異種生物由来の遺伝子からなる合成代謝経路を導入することで、空気中の CO2 から直接的な物質生産ができる。当研究室ではプラスチックの原料となる isopropanol (以下 IPA)をターゲッ
トとして、シアノバクテリアの一種である Synechococcus elongatus PCC 7942 (以下 7942)を用いた IPA 生産に成功している。この際、7942 に、Acetyl-CoA を基点とする IPA 生産経路(以下 IPA 経路)、および IPA 経路で必要な酢酸の生産に関わる酵素 phosphate acetyltransferase をコードする遺伝子 pta を導入した 7942IPA 株を構築し、密栓フラスコによる振とう培養で 0.55 mM の IPA 生産が行われている(2015 年度 本会にて報告)。一方、7942 とは別種のシアノバクテリアである Synechocystis sp. PCC 6803 (以下 6803)は、7942 より細胞内 Acetyl-CoA 量が6.7 倍多いと報告されており 1)、IPA 生産に有利であると考えられた。そこで本研究では IPA 経路および pta を 6803 に導入し、6803 での IPA 生産を行う。
【結果・考察】まず、6803 に pta を導入した 6803-pta 株を構築した。6803-pta 株
は、7942 で pta を導入した株よりも多い、14 mM の酢酸を生産した。酢酸はAcetyl-CoA を基点として生産されるので、同様に Acetyl-CoA を基点とする IPA
生産においても 6803 ではその生産量が増加すると期待された。そこで、6803pta 株に IPA 経路を追加導入した 6803-IPA 株を構築し、密栓フラスコでの振とう培養を行った。6803-IPA 株は 19 日間の培養で IPA 0.79 mM、酢酸 15 mM を生産し、7942-IPA 株と比べ IPA 生産量が 1.4 倍となった。その一方で、酢酸生産量が IPA 生産量に比べて著しく多かったため、現在は、IPA 経路を制御する
プロモーターを変更するなどして IPA 経路を強化し、IPA 生産量を増加させる
ことを試みている。
1) Dempo et al. Metabolites, 4(2), 499-516. (2014)

Change in primary metabolite in Euglena gracilis

Isopropanol production by Synechocystis sp. PCC 6803 with synthetic
metabolic pathway○Yuko Tomita, Kazumasa Yoshioka, Takashi Osanai(Sch. Agric., Meiji Univ.)

Key words

metabolic engineering, biomass

3P-1a082 プロモーター変更による合成代謝経路導入シアノバクテ
リアの 1,3-propanediol 生産性向上○Taiichi Yamashita, Yasutaka Hirokawa, Taizo Hanai(Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words

synechocystis sp. PCC 6803, synthetic biology, isopropanol

3P-1a084 桔梗抽出液により白色脂肪細胞から誘導したベージュ脂
肪細胞の特性○広川 安孝 1,2, 牧 佑紀 1,2, 花井 泰三 1,2（1九大院・農, 2JST・CREST）
taizo@brs.kyushu-u.ac.jp○塩見 尚史, 伊藤 茉莉絵, 渡邊 桂子（神戸女学院大・人間科学）
n-shiomi@mail.kobe-c.ac.jp【背景・目的】異種生物由来の複数の遺伝子から構成される合成代謝経路をシアノバクテリアに導入することで、二酸化炭素からの様々な化合物の合成が可能である。これまでに Synechococcus elongatus PCC 7942 に、炭酸固定経路である
カルビン回路中の Dihydroxyacetone phosphate（DHAP）を出発物質とし、4 段階の反応から構成される 1,3-Propanediol（1,3-PDO）生産経路を導入することで二酸化炭素からの 1,3-PDO 生産に成功している（2014 年度本会にて報告）。しかし、合成代謝経路での中間代謝産物である Glycerol が顕著に蓄積しており、本研究では経路の一部改変を行うことで 1,3-PDO 生産量の向上を試みた。
【方法・結果】1,3-PDO 生産経路は、IPTG 誘導型プロモーターである PLlacO1で制御した DHAP から Glycerol、Glycerol から 1,3-PDO に関わる酵素遺伝子群を分割してゲノム上に導入することで構築した。Luciferase をレポーターとして用いたプロモーターアッセイの結果、Ptrc の転写強度は PLlacO1 と比較して約100 倍の転写活性を示すことが確認された。Glycerol の蓄積を解消するために、
Glycerol から 1,3-PDO への変換に関わる酵素遺伝子群の制御プロモーターを Ptrc
へと変更した。新たに構築した生産株は IPTG 濃度依存的な生育悪化を示すようになったが、IPTG の添加タイミングを検討することで生育悪化を回避し、
1,3-PDO 生産量を向上させることに成功した（3.25→10.42 mM）。また、1,3-PDO生産が増殖連動型の挙動を示すことに着目し、培地組成の検討を行なったところ、最大生産量は 16.05 mM（1.22 g/L）まで向上した。

【目的】 ベージュ脂肪細胞（beige adipocytes）は、褐色脂肪細胞と類似の細胞として見いだされ、肥満や糖尿病を改善する働きが期待されている。ベージュ脂
肪細胞は白色脂肪細胞から分化すると考えられているが、詳細はほとんどわかっていない。そこで、本研究では、白色脂肪細胞が本当にベージュ脂肪細胞に分化するかを確認すること、および分化したベージュ脂肪細胞の性質を明らかにすることを目的に研究を行った。
【方法】 細胞はマウス白色脂肪細胞 3T3-L24 を用い、桔梗抽出液(20mg/mL)を培
地に 3.3μL/mL 添加して分化を誘導した。ミトコンドリアの量と活性は Molt Verw
Green と WST-1 を用いて測定し、タンパク質発現量は、蛍光顕微鏡と FACS により調べた。また。糖の取り込み速度は、Glucose Uptake Cell Based Assay により測定し、遺伝子発現はリアルタイム PCR により測定した。
【結果】 マウス白色脂肪細胞 3T3-L24 をベージュ脂肪細胞に変化させる誘導物
質を、PRDM16 及び UCP1 遺伝子の発現を指標として、防風通聖散の 16 成分から探した。その結果、桔梗抽出液に誘導活性が見られた。桔梗抽出液の誘導で得られた細胞 3T3-BA1 は、褐色脂肪細胞に特徴的な遺伝子の発現が増加していた。さらに、3T3-L24 よりも褐色がかっており、ミトコンドリアが増加し、
UCP1 タンパク質を発現していた。このことから、3T3-BA1 は、ベージュ脂肪細胞であると考えられた。さらに、得られたベージュ脂肪細胞 3T3-BA1 の性質を調べた。その結果、3T3-BA1 は、白色脂肪細胞 3T3-L24 よりも、脂肪合成及
び脂肪代謝能力が高かった。さらに、3T3-BA1 は、糖の取り込みを行う GLUT4の発現が増加し、インスリン依存の糖取り込み速度も増加した。このことから、
ベージュ脂肪細胞 3T3-BA1 は、高機能の脂肪細胞であり、桔梗抽出液には脂肪を燃焼しやすい体質に変える効果があることが明らかとなった。

Cyanobacterial 1,3-propanediol production improved by promoter change
in synthetic metabolic pathway

Characteristics of beige adipocytes induced from white adipocytes by Kikyo
extract○Yasutaka Hirokawa1,2, Yuki Maki1,2, Taizo Hanai1,2(1Fac. Agric., Kyushu Univ., 2JST・CREST)

Key words

cyanobacteria, 1,3-propanediol, synthetic metabolic pathway○Naofumi Shiomi, Marie Ito, Keiko Watanabe(Dept. Hum. Sci., Kobe Coll.)

Key words

beige adipocytes, UCP1, Insulin resistance, Obesity

240

代謝工学／オミクス解析

3P-1a085 Poly(3-Hydroxybutyrate-co-3-Hydroxy-2Methylbutyrate)の生合成

3P-1a087 腸内共生微生物代謝に注目した魚類飼料応答解析法の構築○坂田 研二 1, 坪井 裕理 1, 朝倉 大河 1,2, 伊達 康博 1,2, 菊地 淳 1,2,3（1理研 CSRC, 2横市院・生医, 3名大院・生命農）
jun.kikuchi@riken.jp○中崎 瞳, 古舘 祥, 廣江 綾香, 柘植 丈治（東工大院・総理工）
tsuge.t.aa@m.titech.ac.jp【背景・目的】
ポリヒドロキシアルカン酸(PHA)は安価な再生可能資源から作ることができる
ため、石油系ポリマーの代替材料として幅広い用途への展開が期待されている。
用途拡大に向けて課題の一つとなっているのが PHA の緩慢な結晶化挙動である。当研究室では 3-hydroxy-2-methylbutyrate (3H2MB)を含む PHA 共重合体が比較的速い結晶化速度を示すことを明らかにした。そこで、3H2MB の重合において基質特性の広い Aeromonas caviae 由来の PHA 重合酵素(PhaCAc)に着目した 。 本 研 究 で は PhaCAc の 作 用 に よ り 、 一 般 的 な PHA の 成 分 で あ る 3hydroxybutyrate (3HB)とともに 3H2MB を共重合体化した P(3HB-co-3H2MB)の生合成を試み、その物性を測定した。
【実験】
大腸菌に PhaCAc と PhaCAc(NSDG)、エノイル CoA ヒドラターゼ PhaJAc、 PHA
顆粒結合タンパク質 PhaPAc,、PhaPAc(D4N)、3HB 供給のために Ralstonia eutropha
由来の PhaARe および PhaBRe を導入した菌株を作製した。これらを培養し、菌体内にポリマーを蓄積させた。得られたポリマー組成をガスクロマトグラフィー(GC)により測定した。
【結果・考察】PhaCAc を導入した菌株でポリマーへの 3H2MB の取り込みが確認された。変異を加えた PhaPAc(D4N)と PhaCAc (NSDG)を導入した菌株で 3H2MB 分率の向上が見られた。大腸菌に PhaPAc (D4N)、PhaCAc (NSDG)、PhaJAc を導入したところ、93.5mol%の 3H2MB からなるポリマーが得られた。菌株に PhaARe および PhaBReを導入すると 3H2MB 分率は低下したがポリマーの収量が改善された。P(3HBco-3H2MB)の融点、冷結晶化温度を測定したところ、冷結晶化温度と融点の差が縮まる傾向が見られた。融点と冷結晶化温度の差は結晶化傾向の指標として用いられており、P(3HB-co-3H2MB)が結晶化しやすいことが示唆された。現在、
3H2MB 重合能に優れた PhaCAc 改変体の取得を試みており、その結果もあわせて報告したい。

[背景・目的]
近年世界的な養殖業生産量の増加に付随し、養殖用飼料の主成分である魚粉は高騰しており、魚粉の配合割合の低減に加え、高機能性、高付加価値飼料の需要が高まっている。そこで我々は魚粉に代用する新規飼料開発のために、魚類
腸内微生物叢における多糖類代謝反応に注目し、非侵襲的魚類評価法[1]および
魚類代謝プロファイリング法[2]を援用することにより、魚類飼料としての有用性に関する評価検討を行った。
[方法・結果]天然環境から採取したマダイ、ヒラメ、ブリの三大養殖魚に加え食性の異なる魚類の腸内容物と 13C ラベル化でんぷんを混ぜ合わせ、NMR 法を用いた有用物
質簡易スクリーニング法の構築を目的として代謝動態を評価した結果、反応時間が進むにつれ有機酸の増加、多糖類シグナルの減少及び低分子成分の増加傾向がみられた。また 13C ラベル化でんぷんと人工餌を混ぜ合わせた飼料を飼育
魚に摂食させた結果、腸内容物、筋肉ともに低分子成分由来の 13C シグナルが検出されたことから腸内細菌叢における代謝反応の追跡とそれに伴う魚類の代
謝応答の評価が可能であることが示唆された。加えて、新たな試みとして難溶性多糖類の解析技術高度化も推進しており[3]、本発表では難溶性多糖類等を魚類に摂食させた時の代謝効果についても議論したい。
Ref. [1] Asakura, T., et al. (2014) PeerJ, 2, e550, [2] Yoshida, S., et al. (2014) Sci.
Rep., 4, 7005. [3] Wei, F., et al. (2015) Anal. Chem. 87, 2819.

Biosynthesis of Poly(3-Hydroxybutyrate-co-3-Hydroxy-2-Methylbutyrate)

Response analysis to fish feed composition based on metabolisms of gut
symbiotic bacteria○Hitomi Nakazaki, Sho Furutate, Ayaka Hiroe, Takeharu Tsuge(Interdiscip. Grad. Sch. Sci. Eng., Tokyo Tech)○Kenji Sakata1, Yuuri Tsuboi1, Taiga Asakura1,2, Yasuhiro Date1,2, Jun Kikuchi1,2,3(1Riken CSRC, 2Grad. Sch. Med. Life Sci. Yokohama City Univ., 3Grad. Sch.
BioAgriSci., Nagoya Univ.)

Key words
Aeromonas caviae, polyhydroxyalkanoate, fatty acid metabolism, 3hydroxy-2-methylbutyrate

Key words

3P-1a086 Clostridium perfringens の毒素発現を制御する内在性ク

3P-1a088 メタボロミクスによる大腸菌による 1-ブタノール生産に

オラムクエンチングの実態解明

Polysaccharide, Fish, NMR, metabolic profilingおける重要因子の解明○安達 桂香 1, Ravindra Pal Singh 1, 大谷 郁 2, 園元 謙二 1,
中山 二郎 1
（1九大院・農, 2ミヤリサン製薬）
nakayama@agr.kyushu-u.ac.jp○中島 広裕 1, Sastia Prama Putri 1, Liao James C. 2, 福﨑 英一郎 1（1阪大院・工, 2Dept. Chem. Biomol. Eng., UCLA）
fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp〔背景〕微生物は同種または異種間でクオラムセンシング（QS）と称される菌
密度依存的コミュニケーションをして、毒素生産など特定の遺伝子発現を調節する。例えば、ウエルシュ菌 Clostridium perfringens の複数の病原性遺伝子の発現も VirSR 二成分制御系を介する QS により制御されている。ところが、QS 制御下にある溶血毒素遺伝子 pfoA の発現は一過的であり、本菌は自身の QS を下方制御する内在性クオラムクエンチング（QQ）機構を有していると考えられた。そこで、QQ 誘導物質の諸性質や QQ 誘導条件を解析することで、本菌の内在性 QQ 機構の実態解明を目指した。
〔方法・結果〕C. perfringens strain 13 の定常期馴化培養液を対数増殖期初期の菌体に添加し、37℃で 15 分間インキュベーションした結果、pfoA 発現が下方制
御されることが逆転写定量 PCR により確認された。本菌が産生する QQ 誘導物
質の諸性質を解析するため、限外ろ過により QQ 誘導物質を分子量ごとに分画後、それぞれの QQ 活性および pH を測定した。その結果、3 kDa 以下画分のQQ 活性が最も大きく、pH は最も低かった。さらに定常期馴化培養液を 121℃
で 15 分間加圧滅菌しても失活しなかった。また、これまでに行った培養液からの部分精製結果から、QQ 誘導物質は疎水性の低い酸性化合物であると示唆されていたため、本菌が特に多く産生する有機酸が QQ 誘導物質の 1 つであると考えられた。次に、菌体外の環境因子に着目して本菌の内在性 QQ を調査した。
その結果、QQ には培地成分が必要で、生育と同調した発酵において生成した有機酸による pH 低下によって誘導されることが示唆された。このような比較的単純な方法により QQ が誘導されることの発見は、低コストかつ簡便な臨床応用に繋がると期待され、QQ 誘導の分子機構の解明にも興味が持たれる。

メタボロミクスは生体における代謝産物を網羅的に解析する学術領域であり、生物工学、分析化学、情報科学などの複合分野となっている。代謝産物はゲノ
ム発現過程の結果として得られるため、転写や翻訳などの変化を経た細胞内の様子を表している。これらを解析するメタボロミクスでは微生物の成長速度や生産量などといった情報が得られるため、 メタボロミクスの利用は微生物生産に用いられる菌体の改善に有用 だと考えられる。そこで我々は、 1-ブタノール
生産経路を組み込んだ遺伝子改変大腸菌に着目した。この遺伝子改変大腸菌は、
添加グルコース量が同等の場合、酵母抽出物やタンパク質を含む完全培地である TB 培地で培養した際にのみ高い生産量を達成することが知られている。このことより培地組成に因る細胞内代謝状態の変化が 1-ブタノールの生産性に強い影響を及ぼしていると考えられている。本研究では、1-ブタノール生産を助ける栄養培地中の重要因子を発見するため、様々な培地で培養した 1-ブタノー
ル高生産株に対し、メタボロミクスに基づく分析および解析を行った。まず初めに比較実験から酵母抽出物中に重要因子が含まれると推定した 。その後、 最少培地にアミノ酸群を加えた CA 培地と酵母抽出物を加えた YE 培地を用いて培養を行い、菌体および培養後上清について主成分分析を用いて代謝産物の比較を行うことにより、1-ブタノール生産を助ける 4 種の重要因子を推定した。
推定された重要因子を CA 培地に添加したところ、1-ブタノール生産量を改善することができた。現在は添加物質の濃度の最適化を検討し、その生産量のさらなる改善を狙っている。また、この結果をもとにしたより高い 1-ブタノール
生産量を示す遺伝子改変大腸菌が得られることを期待している。

Elucidation of self-quorum quenching in Clostridium perfringens

Investigation of important factors for Escherichia coli 1-butanol production
by metabolomics○Keika Adachi1, Pal Singh Ravindra1, Kaori Ohtani2, Kenji Sonomoto1,
Jiro Nakayama1(1Fac. Agric., Kyushu Univ., 2Miyarisan Pharma. Co., Ltd.)Key words

Clostridium perfringens, quorum sensing, quorum quenching, pH○Kosuke Nakashima1, Sastia Prama Putri1, James C. Liao2, Eiichiro Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Dept. Chem. Biomol. Eng., UCLA)

Key words

metabolic analysis, butanol, Escherichia coli, mediumオミクス解析

3P-1a089 Rational and efficient selection of gene targets for strain
improvement using metabolomics approach

241

3P-1a091 南極産担子菌酵母 Mrakia blollopis の低温ストレス反応○辻 雅晴（国立極地研究所）
spindletuber@gmail.com○ Sastia Putri1, Toshiyuki Ohtake1, James C. Liao2,
Eiichiro Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Dept. Chem. Biomol. Eng., UCLA)
sastia_putri@bio.eng.osaka-u.ac.jp

Conventional metabolic engineering techniques have made tremendous progress inconstructing non-native organisms for the production of various useful chemicals.
Metabolomics, the total profiling of metabolites in a biological system, is a very useful
tool to improve the process of strain improvement. Snapshot metabolite profiling anddynamic profiling such as metabolic turnover analysis facilitate a systematic, highthroughput, and highly efficient strategy for selection of gene targets. Here, we show
the utility of metabolome analysis as a stand-alone platform for strain improvement of
1-butanol producing microorganisms. A combination of several mass spectrometrybased metabolome analysis was used to reveal rate-limiting steps in the CoA
dependent Clostridial pathway. Through the fine-tuning the expression level of thelimiting enzyme in the production pathway, we successfully improved the productivityof 1-butanol. Our results demonstrate the usefulness of metabolomics in formulating
successful metabolic engineering strategies.

南極のような極地に生息している菌類は氷点下でも細胞が凍る事無く、生存する事が可能なことから有機物の最終分解者として極地における物質循環に重要な役割を果たしている。
これまで極地から分離された菌類の低温下での生存戦略に関する研究は分離した菌類の菌体脂肪酸含有比率の変化や不凍タンパク質、細胞外多糖のような凍結防止剤を分泌しているかどうかなど生理学的特徴について注目されてきただ
けで、これらの菌類が氷点下でどのように細胞内凍結を防ぎながら成長しているのかは不明であった。そこで、昭和基地周辺で培養可能な菌類の優占種である Mrakia 属菌を至適生育温度と氷点下でそれぞれ培養した場合、培養時間の経
過と共にどのような代謝反応に影響が出るのかをメタボローム解析により調べた。
その結果、低温での生育に優れた M. blollopis SK-4 株は至適生育温度と氷点下
では全く異なる代謝反応を行っていたことが分かった。SK-4 株は特に氷点下で細胞分裂や細胞壁合成などの代謝経路が活発になるほか、低温下での成長に関与する芳香属アミノ酸など生合成するのに ATP を消費する物質を大量に生産していた。このことから、南極産菌類が氷点下で細胞を凍結させないために多大なコストを支払いながら成長していることを世界で初めて明らかにすることができた。

Rational and efficient selection of gene targets for strain improvement using
metabolomics approachCold-stress responses in the Antarctic basidiomycetous yeast Mrakia
blollopis○ Sastia Putri1, Toshiyuki Ohtake1, James C. Liao2, Eiichiro Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Dept. Chem. Biomol. Eng., UCLA)

Key words

metabolomics, metabolic engineering, butanol, Escherichia coli

3P-1a090 メタボローム解析を用いた大腸菌のバイオ燃料耐性関連物質の探索○Masaharu TSUJI(NIPR)

Key words
metabolic analysis, Antarctic basidiomycetous yeast, cold-adapted
microorganism, cold stress response

3P-1a092 代謝物解析を用いた微生物におけるメチルクエン酸回路の分布の検討○阿知和 弘樹, Theo Shao Thing, Sastia Prama Putri , 福﨑 英一郎（阪大院・工・生命先端）
fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp○田部井 仁美, 宮越 俊一（群馬高専）
miyako@nat.gunma-ct.ac.jp【背景】バイオ燃料分野では 1-ブタノールがポストバイオエタノールとして注目されている．近年，工業育種可能な大腸菌を用いて，1-ブタノール高生産性株が構築されている[1]．さらなる生産性向上の取り組みがなされている一方
で，1-ブタノールは細胞毒性を有するために，高濃度中では生育できないという問題点がある．本研究では，メタボローム解析に基づく菌株育種戦略を用いて，大腸菌の 1-ブタノール耐性向上に関連する代謝物探索をおこなった．当該戦略を用いて探索された代謝物は，表現型に高い相関をもつことが示されている．また，ランダムにおこる突然変異に依存せず，難解な分子機構解明を必要としないという利点も有する．
【方法・結果】GC/MS を用いて大腸菌細胞内の代謝物分析をおこなった．また，
1-ブタノール曝露下の大腸菌増殖速度より耐性指標を算出した．同様にイソブ
タノール，1-プロパノールを用いて，各アルコール曝露下の耐性指標を求めた．
代謝物情報と 1-ブタノール耐性度，さらにイソブタノール，1-プロパノールの耐性度を多変量回帰分析に供したところ，カダベリンやプトレッシン，スペル
ミジンがバイオ燃料耐性に共通して相関する代謝物と示された．この結果より
ポリアミン代謝が耐性向上に寄与していると考えられ，今後耐性株構築が期待される．
[1] Shen, C.R. et al., AEM, 77, (2011), 2905-2915【背景及び目的】 微生物代謝経路の分布について検討する手段として，これまでの酵素活性レベル，遺伝子レベルに加えて代謝物レベルの解析が普及しつつある。ここではメチルクエン酸回路を例に代謝物解析を試み，酵素活性との比
較・検討を行った。本回路はプロピオン酸代謝に関与する異化的代謝経路として，主に真菌類で報告があるほか，近年のゲノムの解読により細菌においても注目されるようになった。
【材料及び方法】 検討する微生物を 1/2 YPD 培地等で培養し，分離した菌体に緩衝液を加えて超音波処理または磨砕により無細胞抽出液を調製した。本研究では，酵素活性レベルの検討として主に真菌・細菌を対象として Ellman 試薬を用いた 2-methylcitrate synthase （MCS） の測定を行った。培養上清は限外ろ過処理，または Sep-Pak Accell Plus QMA による前処理・濃縮を行い，キャピラ
リー電気泳動－質量分析装置（CE-MS）を用いて，陰イオンモードで分離，TOF
MS により TIC 及び m/z = 205.0354 により 2-メチルクエン酸の存在を確認した。
【結果及び考察】酵素活性測定の結果，真菌だけでなく一部の細菌で新たに MCS
活性を確認することができた。また，微生物をプロピオン酸添加培地で培養後，その培養液の代謝物解析を行った結果，多くの酵母と糸状菌から 2-メチルクエン酸が確認され，実際にこれらではメチルクエン酸回路が C3 代謝経路として機能していることが確かめられた。これまでのところ，細菌類では代謝物としての 2-メチルクエン酸を確認できていないが，サンプル濃縮や部分精製によりこ
れらが改善される可能性がある。以上のことから，酵素活性と代謝物との間に一定の相関が認められ，メタボロミクスによる解析の可能性を示すことができた。

Search of metabolite related to bioalcohol tolerance in Escherichia coli
based on metabolome analysis

Investigation of distribution of methylcitric acid cycle among
microorganisms using a metabolic analyses○Hiroki Achiwa, Shao Thing Theo, Sastia Prama Putri, Eiichiro Fukusaki(Dept. Biotech., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

Escherichia coli, 1-butanol, metabolomics○Hitomi Tabei, Shunichi Miyakoshi(Gunma Natl. Coll. Technol.)Key words

microorganisms, metabolic analysis, CE-MS, methylcitric acid cycle

242

オミクス解析

3P-1a093 ラビリンチュラ類 Aurantiochytrium 属のメタボローム
解析による育種標的の探索

3P-1a095 13C 代謝フラックス解析法を用いた動物培養細胞のNADPH ターンオーバー速度の計測○渡邉 研志 1,3, Arafiles Kim Hazel V. 1, 岡村 好子 1,3, 田島 誉久 1,3,
松村 幸彦 2,3, 中島田 豊 1,3, 秋 庸裕 1,3（1広島大院・先端物質, 2広島大院・工, 3JST・CREST）
aki@hiroshima-u.ac.jp○岡橋 伸幸 1, 松田 史生 1, 河野 晋 2, 高橋 智聡 2, 清水 浩 1（1阪大院・情報, 2金沢大・がん進展制御研）
shimizu@ist.osaka-u.ac.jp【目的】ラビリンチュラ類 Aurantiochytrium 属は高度不飽和脂肪酸やカロテノイ
ドなどの高機能性脂質を著量蓄積する海洋性真核微生物である。本微生物によって高機能性脂質を持続的かつ安価に供給するための手段として、海洋及び陸上の余剰バイオマスや産業廃棄物系バイオマスの培養基質としての利用が挙げられる。そのためには、各種バイオマスの多種多様な組成物によって生じる代謝変動の把握と、それに応じた分子育種や培養条件の至適化が必要となる。本研
究では、異なる培地組成物が Aurantiochytrium 属の代謝に及ぼす影響をメタボ
ローム解析によって包括的に観察し、高機能性脂質の生産効率の向上をめざして育種標的を探索した。
【方法及び結果】演者らは、褐藻マンニトールを炭素源として酢酸菌
Gluconobacter によるフルクトースへの変換とドコサヘキサエン酸高生産性のAurantiochytrium sp. CB15-5 株による油脂発酵からなる二段階培養系を開発してきたが、グルコースを炭素源とした場合と比較してトリグリセリドの生産量が低下していた。そこで、細胞内の代謝物をトリメチルシリル誘導体化してガス
クロマトグラフ質量分析により解析した。その結果、クエン酸などの TCA 回路
関連物質の細胞内濃度に顕著な低下が見られたほか、リシンなどのアミノ酸代謝に大きな変動が観察された。このほか、各種培地組成物の違いや、ストレス負荷などの培養条件の違いによる代謝変動を解析しているので、その詳細について報告する。

[背景] 動物培養細胞の中心炭素代謝経路における酸化還元補酵素の再生、消費速度を測定することが、創薬スクリーニングや細胞の品質評価の有益な指針となると期待される。そこで、本研究では動物培養細胞に、13C 代謝フラックス
解析法を適用し、増殖に必須の補酵素 NADPH の再生、消費速度のバランスを計測した。
[方法] [1-13C]グルコースを含む培地で p53 欠損マウス軟部腫瘍由来細胞株を培養し、細胞内代謝物の 13C 標識割合をガスクロマトグラフ-質量分析装置で分析した。フラックス分布の推定には OpenMebius (Kajihata et al., 2014) を用いた。
[結果・考察] [1-13C]グルコース含有培地で p53 欠損マウス軟部腫瘍由来細胞株を培養し、中心炭素代謝経路のフラッックス分布を推定した。取り込まれたグ
ルコースの 94%は解糖系、5%がペントースリン酸経路で代謝されていた。一方、グルタミンは 72%が TCA サイクルで酸化的に代謝されている一方で、残りの 28%は還元的に代謝されていた。続いて、フラックス分布の情報からNADPH の再生、消費速度を算出した。その結果、全 NADPH の 36%がペントー
スリン酸経路で、64%が Malic enzyme の触媒する反応で再生されていたことから、Malic enzyme の重要性が示唆された。一方で、NADPH の消費先として、脂肪酸の生合成が 58％、アミノ酸生合成が 23%、還元的なイソクエン酸デヒド
ロゲナーゼの反応が 19%と、細胞構成成分の合成が 81%を占めた。今後、ＮＡ
ＤＰＨ再生反応を適切に制御することが、特定の細胞の増殖抑制や品質評価に繋がる可能性が示唆される。

Metabolomic analysis of marine oleaginous microorganism,
Aurantiochytrium sp.

Measurement of NADPH turnover rate in cultured mammalian cells using
13
C-metabolic flux analysis○Kenshi Watanabe1,3, Kim Hazel V. Arafiles1, Yoshiko Okamura1,3,
Takahisa Tajima1,3, Yukihiko Matsumura2,3, Yutaka Nakashimada1,3, Tsunehiro Aki1,3(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2Grad. Sch. Eng., Hiroshima Univ,
3
CREST, JST)Key words

metabolomics, lipid production, Aurantiochytrium

3P-1a094 Metabolic profiling of Drosophila melanogastermetamorphosis○Nobuyuki Okahashi1, Fumio Matsuda1, Susumu Kohno2, Chiaki Takahashi2,
Hiroshi Shimizu1(1Grad. Sch. IST, Osaka Univ., 2Cancer Res. Inst., Kanazawa Univ.)

Key words

C-metabolic flux analysis, NADPH, cultured mammalian cells

133P-1a096 D-アミノ酸の微量定量のための LC-MS/MS 分析法の開発

○Thuy An Phan Nguyen1, Masamitsu Yamaguchi2,
Eiichiro Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst.
Technol.)
an_phan@bio.eng.oaska-u.ac.jp○中野 洋介, 紺屋 豊, 谷口 百優, 福﨑 英一郎（阪大院・工）fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp

As a holometabolous insect, the development of Drosophila has to undergo
metamorphosis which requires a lot of energy to reconstruct the body into the adultform. The fat body is an important energy reservoir accounted for more than 80% of
total metabolism to support the animal through the subsequent pupation; however, how
the flies use this source to generate energy is not clearly understood. On the other hand,ecdysteroids control Drosophila metamorphosis by regulating the cell cycle, autophagy
and apoptosis, which can directly affect the metabolism of the body. Therefore in thepresent study, we aimed to investigate the effects of ecdysteroids on the metabolism.
First, we performed metabolic profiling using two platforms GC/MS and LC/MS. The
abundance of detected metabolites drastically changed and strongly correlated with thedevelopmental stages of Drosophila pupae. Moreover, a prediction model for pupal
stages based on metabolic profile by using partial least square projection to the latent
structure was successfully conducted. With the putative important metabolites revealed
from the prediction model, we found that the regulation of metabolite expression
patterns in the central metabolic pathways have been shown to be essential in thesynchronization of Drosophila metamorphosis. Finally, by using conditional mutant tocontrol the ecdysteroid titers, we investigated the connection between the level ofecdysteroids and the metabolism of Drosophila during metamorphosis.

D-アミノ酸は L-アミノ酸とは異なる生物学的機能を担うため，近年では医薬，臨床，食品業界を初めとして様々な分野で大きな注目を集めている．D-アミノ
酸と L-アミノ酸は物理化学的性質が近いため，通常の手法ではそれらの分離・分析が困難である．そのため，従来の鏡像体選択的アミノ酸分析手法では，ア
ミノ酸の誘導体化といった特殊な処理を行うことで，望ましい分離や感度を得ている一方，実際にはその煩雑性やスループットの点で改善すべき問題が多い．
そこで本研究では，液体クロマトグラフ－タンデム質量分析計（LC-MS/MS）を用いて，誘導体化を行わずに高感度にアミノ酸鏡像体を分離・分析できる手法の開発を目的とした． キラルクラウンエーテルを固定相に据えた光学分割カラムによるアミノ酸鏡像体分離を行い，さらに MS/MS パラメーターの最適化を行うことで，結果として高感度かつ高再現性を示す D-アミノ酸定量分析法の確 立 に 成 功 し た ． ま た ， 本 手 法 を 食 品 中 の D- ア ミ ノ 酸 定 量 分 析 に 供 し ，
nmol/mL レベルの極低濃度の D-アミノ酸の測定に成功した．これらの結果は，本手法が食品を初めとする様々なサンプル中の D-アミノ酸の定量分析に応用できる新規分析手法としての大きな可能性を有することを実証した．

Metabolic profiling of Drosophila melanogaster metamorphosis

Development of an LC-MS/MS method for quantitative analysis of trace Damino acids○Thuy An Phan Nguyen1, Masamitsu Yamaguchi2, Eiichiro Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)Key words

metabolism, Drosophila melanogaster, ecdysteroid○Yosuke Nakano, Yutaka Konya, Moyu Taniguchi, Eiichiro Fukusaki(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

D-amino acid, enantioselectivityオミクス解析／環境工学，廃水処理技術

3P-1a097 イオンクロマトグラフィー高分解能質量分析による陰イ
オン性代謝物分析手法の開発

243

3P-1a099 Streptomyces sp. KT 株の微生物農薬としての可能性○前田 みのり 1, 大池 達矢 2, 岡南 政宏 1,2, 松川 哲也 1,2,
梶山 慎一郎 1,2, 阿野 貴司 1,2（1近畿大・生物理工・生物工, 2近畿大院・生物理工・生物工）
tano@waka.kindai.ac.jp

和泉 自泰 1, 高橋 政友 1, 鈴木 隆弘 2, 押川 清孝 1, 木村 元一 2,
坂本 茂 2, 松本 雅記 1, ○馬場 健史 1
（1九大・生医研, 2サーモフィッシャー）
bamba@bioreg.kyushu-u.ac.jp

代謝主幹経路の中間体の多くは高極性，陰イオン性の特性を示す．これまで，
陰イオン性代謝物の網羅的測定には，CE/MS やイオンペア LC/MS が有用技術として使用されてきたが，分析再現性や安定性の観点において未だ課題が残っている．イオンクロマトグラフィー (IC) はイオン性成分の分離分析手段として古い歴史があるものの，メタボロミクスの分野にはこれまでほとんど応用されてこなかった．本研究では，イオンクロマトグラフィー高分解能質量分析(IC/Q Exactive) による陰イオン性代謝物の網羅的測定法について検討したので報告する．
IC/Q Exactive を使用して，有機酸，糖リン酸，ヌクレオチド，補酵素などの 200
種程度の親水性代謝物の分離分析条件を最適化し，保持時間や MS，MS/MS ス
ペクトルを格納したライブラリーを構築した．本分析手法は，クエン酸やイソ
クエン酸などの各種異性体のクロマト分離を達成し，ATP や NAD(P)+, NAD(P)Hなどの代謝物についても高感度の測定が可能であった．続いて，動物培養細胞や体液試料を用いて検証したところ，生体試料においても保持時間及びピーク
エリアの再現性は極めて高く，cAMP などの微量成分の検出にも成功した．本
分析手法は，メタボロミクス分野における実用的な代謝物測定法として広く活用されていくことが期待できる．

【背景と目的】農業において、植物病原菌の防除は生産性向上の観点から特に重要な課題である。近年、化学農薬に代わる新たな防除手段として、生物農薬が注目されている。微生物を用いて植物病原菌から作物を防除する微生物農薬では、大別すると細菌と糸状菌を使用した例が挙げられる。一方で、有用な抗生物質の生産菌として知られる放線菌を微生物農薬として利用する研究はあまり進められていない。そこで本研究では、放線菌を用いた微生物農薬の開発を目的とした。
【方法と結果】放線菌単離用の培地であるアルブミン培地で増殖した菌を単離し、植物病原菌 Rhizoctonia solani に対し抑制を示す KT 株を選抜した。KT 株は
和 歌 山 県 内 の 木 の 根 圏 か ら 回 収 し た 土 壌 か ら 単 離 さ れ 、 Streptomyceslavenduligriseus に近縁な Streptomyces sp. であると同定された。次に R. solani を始め全 8 種の植物病原菌と対峙培養を行い、成長抑制能の有無を調べた。その結果、KT 株は 8 種全ての植物病原菌に対して成長抑制能を示した。また、それぞれの植物病原菌に対して形成した阻止円の大きさで成長抑制能を 3 段階で評 価 し た と こ ろ 、 特 に Bipolaris oryzae 、 Colletotrichum echinochloae 、 C.
orbiculare、Fusarium oxysporum、Monilinia fructigena の 5 株に対して強い活性がみられた。さらに、KT 株を PDB 培地で 5 日間培養し、培養液を 100 μL 塗布した水寒天にキュウリを播種、5 日後に R. solani を植菌して植物への植物病原菌
感染防除試験を行った。結果として、20 日間に渡ってキュウリは枯死せず、KT株は植物病原菌に対して防除効果を持つことが示された。一方、KT 株の菌体を回収して抗菌活性物質を抽出、精製後 HPLC で分析した結果、抗菌活性物質
は eurocidin 類であると推測された。

Analysis of anionic polar metabolites by ion chromatography high resolution
mass spectrometry

Potential of a biocontrol agent by Streptomyces sp. strain KT, with broad
antifungal spectrum

Yoshihiro Izumi1, Masatomo Takahashi1, Takahiro Suzuki2, Kiyotaka Oshikawa1,
Motokazu Kimura2, Shigeru Sakamoto2, Masaki Matsumoto1, ○Takeshi Bamba1(1Med. Inst. Bioreg., Kyushu Univ.,, 2Thermo Fisher Scientific Japan)○Minori Maeda1, Tatsuya Ohike2, Masahiro Okanami1,2, Tetsuya Matsukawa1,2,
Shin'ichiro Kajiyama1,2, Takashi Ano1,2(1Dept. Biotechnol. Sci., Kindai Univ., 2Grad. Sch. BOST, Kindai Univ.)

Key words
Metabolomics, Ion chromatography, High-resolution mass
spectrometry, metabolic analysis

Key words

3P-1a098 アルボサイクリン生産放線菌を用いた微生物農薬の開発

3P-1a100 燻炭が Bacillus 属細菌 IA 株の生育を促進するメカニズ○大池 達矢 1, 前田 みのり 2, 松川 哲也 1,2, 岡南 政宏 1,2,
梶山 慎一郎 1,2, 阿野 貴司 1,2（1近畿大院・生物理工・生物工, 2近畿大・生物理工・生物工）
tano@waka.kindai.ac.jp

actinomycetes, biocontrol agent, soil born disease

ムの解明○江邉 正平, 大池 達矢, 岡南 政宏, 阿野 貴司（近畿大院・生物理工・生物工）
tano@waka.kindai.ac.jp【背景および目的】
近年、植物病原菌から作物を守る生物防除剤として微生物農薬が注目されている。これまでの微生物農薬は、主に Bacillus 属などの細菌や Trichoderma 属などの真菌が使用され、それらの研究が先行している。しかしながら、最近ではこれら以外の微生物を用いた微生物農薬に関する研究も行われるようになってきた。
放線菌は、抗生物質を生産する菌として周知されており、これまで発見された抗生物質のうち約 3 分の 2 は放線菌由来と言われている。それらの抗生物質からは、殺虫剤や動物薬として実用化された物質も少なくない。また、最近では
微生物農薬に関する研究報告も増加しつつあり、放線菌を利用した農薬も開発されている。そこで、微生物農薬の新たな候補となる放線菌の探索を試みた。
本研究では、アリの巣周辺土壌から単離した放線菌の植物病原菌に対する抗菌
スペクトルおよび抗真菌活性物質に関する研究を報告する。
【方法および結果】
環境中の土壌を採取し、抗生物質を添加したアルブミン培地を用いて希釈法にて放線菌を分離した。分離した放線菌は、抗真菌活性試験を行った。その結果、大学構内のアリの巣周辺土壌から採取した AR10 株が Rhizoctonia solani を始めとする 8 種の植物病原性真菌に対する強い抑制を示した。また、本菌株の生産する抗真菌活性物質を溶媒抽出し、精製後、LC/MS および NMR にて同定を行った結果、アルボサイクリンが検出された。これまでの研究において、放線菌がアルボサイクリンを生産することは既に知られているが、アルボサイクリ
ンにおける微生物農薬を試行した研究は行われておらず、今後の微生物農薬の研究において有用な知見になると考えられる。

イネの籾殻を焼成して得られる燻炭は古くから作物の成長促進をもたらす土壌改良剤として用いられてきた。その理由は燻炭の有する微細孔が微生物の住処として適することから VA 菌根菌や根圏微生物を活性化すると考えられているが、そのメカニズムはほとんど明らかにされていない。これまでに我々は炭素材料としての燻炭の有効利用を目的に、活性炭素を添加した寒天培地上で増殖が促進される微生物の探索を行い、さらに燻炭でも増殖が促進される Bacillus
属細菌 IA 株を単離した。また IA 株の液体培養において燻炭を添加することが増殖・胞子化・抗生物質生産を促進することを見出した。しかし活性炭素の添加では同様の効果が認められず、このことから燻炭と活性炭素で IA 株の代謝を促進するメカニズムが異なるのではないかと考えた。
燻炭の原料であるイネはケイ素を取り込み、体内で二酸化ケイ素として蓄積することが知られている。そこで焼成後の燻炭にも残存する二酸化ケイ素に着目した。本研究では燻炭が IA 株の増殖を促進するメカニズムの解明を目的に、二酸化ケイ素を構成成分とするケイ酸塩鉱物とそれら鉱物から構成される緑色凝灰岩を用いた実験を行い、微生物培養における二酸化ケイ素の影響について調べた。
IA 株における代謝促進メカニズムを調べるため、TSB 培地（Bacto-peptone
2.0%、glucose 0.25%、K2HPO4 0.25%、NaCl 0.5%）にケイ酸塩鉱物、もしくは緑色凝灰岩を 0.5%（w/v）添加した培地にて IA 株の培養を行った。培養 5 日目にそれら培地中に含まれる抗真菌活性物質 iturin A の定量を行った。
結果、ケイ酸塩鉱物、緑色凝灰岩を添加した培地において燻炭と同様に iturin A
生産の促進が認められた。この結果から二酸化ケイ素が IA 株の活性促進に関
わり、燻炭に含まれる二酸化ケイ素が微生物の活性促進において重要な役割を担うことが示唆された。

Development of biological control agent by albocycline producing
actinomycete

Mechanisms of growth enhancement of Bacillus sp. IA in the presence ofrice husk biochar○Tatsuya Ohike1, Minori Maeda2, Tetsuya Matsukawa1,2, Masahiro Okanami1,2,
Shin'ichiro Kajiyama1,2, Takashi Ano1,2(1Grad. Sch. BOST, Kindai Univ., 2Dept. Biotechnol. Sci., Kindai Univ.)

Key words

actinomycetes, biological control agent, albocycline○Shohei Ebe, Tatsuya Ohike, Masahiro Okanami, Takashi Ano(Grad. Sch. BOST, Kindai Univ.)

Key words
rice husk biochar, silicate minerals, bacterial growth enhancement,
biocontrol agent

244

環境工学，廃水処理技術

3P-1a101 ウレアーゼ生産菌の分離とそれを利用した土の強度改良
効果

3P-1a103 有機酸資化性細菌を用いたメタン発酵廃液中の有機酸除去○米光 裕 1, 高山 陽加 1, 林 和幸 2, 西本 真琴 1
（1和歌山高専・物質, 2和歌山高専・環境都市）
yonemitsu@wakayama-nct.ac.jp○中井 昇太 1,2, 高橋 宏和 1,2, 三浦 豊和 1,2, 秋 庸裕 1,2,
中島田 豊 1,2, 松村 幸彦 2,3, 岡村 好子 1,2（1広島大院・先端物質, 2科学技術振興機構, 3広島大院・工）okamuray@hiroshima-u.ac.jp【背景と目的】土中にウレアーゼ生産菌、尿素および塩化カルシウムを注入し、地盤強度を高める技術が提案されている。この技術は、地盤に注入された微生物が生産するウレアーゼにより尿素が加水分解され、そこで生じた炭酸イオンとカルシウムイオンとの沈殿反応で生成した炭酸カルシウムが砂粒子間を架橋し、地盤全体を固化するというものである。本研究では、地盤を 15 m ボーリ
ングして採取した土からウレアーゼ生産菌を分離し、それを用いて、実験室レ
ベルの砂の固化実験を行なったので報告する。
【方法と結果】土壌サンプルを生理食塩水に懸濁し、それをフェノールレッドを含む尿素寒天培地に播種し、30℃にて培養した。その結果、培養１日後に赤紫色のハロをもつコロニーが 4 個得られた。これら分離株を LB 培地で培養し、その培養上清のウレアーゼ活性（上清１ ml 当りの尿素分解量）を測定したところ、4 株のうち 2 株の活性が 61.8 μg/ml および 62.7 μg/ml で同等に高かった。
これら 2 株は 16S-rRNA 遺伝子解析の結果、それぞれ Ensifer 属および Bacillus
属と示唆された。これら 2 株の培養液、尿素、塩化カルシウムおよび砂の混合物をモールド（直径 5 cm×高さ 10 cm）に詰め、室温にて３週間放置して固化させた円柱供試体に対し一軸圧縮試験を実施した結果、いずれの株を利用した
砂供試体においても、一軸圧縮強さが菌無添加に比べて 20%程度高くなった。
これら砂固化物と塩酸をガス圧測定器に入れ、得られたガス圧から炭酸カルシ
ウムの析出量を求めたところ、2 株による砂固化物の析出量は菌無添加に比べて 24-28 倍高かったことから、その強度改善効果は析出した炭酸カルシウムによると示唆された。
【謝辞】本研究は JSPS 科研費 JP15K06218 の助成を受けたものです。感謝申し
上げます。

【目的】
有機酸資化性細菌 Nitratireducter sp.OM-1 株は廃水処理過程における余剰汚泥の蓄積、プロピオン酸等の毒性の強い有機酸の蓄積を解消することを目的として海洋中から分離された。この株は酢酸-プロピオン酸を炭素源としてトリアシ
ルグリセロールを合成する。また、酪酸、吉草酸、グリセロールといった基質
を油脂に変換することも確認されている。さらに、窒素飢餓条件で酢酸-プロピ
オン酸をクロトン酸イソプロピルに変換し細胞当たりで 50%蓄積してする。そこで本研究では大型海洋藻類を海洋複合メタン生成菌群によりメタン発酵後の低級有機酸が含まれる発酵廃液で OM-1 株を好気的に培養し、有機酸除去と油脂生産を行うことを目的とした。
【方法及び結果】
コンブを基質としたメタン発酵廃液に含まれている有機酸濃度を高速液体クロマトグラフィーによって分析を行い、Nitratireducter sp.OM-1 株に蓄積している油脂をガスクロマトグラフィーによって分析した。また、発酵廃液で OM-1 株
培養後の培養液中の化学的酸素要求量（COD）を分析することで水質浄化に対する有効性を評価した。発酵廃液の有機酸は酢酸が約 12 mM、プロピオン酸、酪酸が約 1 mM 含まれており、COD は 6393 mg/L であった。廃液のみを 7 日間振とうした場合、COD は 1619 mg/L に減り、廃液中の細菌叢が有機物分解に寄与していることが示された。また、ここに OM-1 株を植菌すると有機酸は完全に消費され、COD は 569 mg/L となり、OM-1 株とメタン生成菌の共培養によって COD を低下させることが明らかになった。さらに、OM-1 株に蓄積された油脂を測定した結果、培養液あたりで 13 mg/L 蓄積していた。好気的な排水処理
では有機物の約 50%を菌体に変換し余剰汚泥を生成してしまうが、OM-1 株は有機物を油脂合成に用いるため、菌体への変換率は 25%程度にまで抑えられた。

Sand binding and strengthening induced by urease producing bacteria
isolated from soil

Removal of organic acids in wastewater derived from methane fermentationby the organic acids assimilating bacterium○Hiroshi Yonemitsu1, Haruka Takayama1, kazuyuki Hayashi2, Makoto Nishimoto1(1Dept. Mater. Saci., Wakayama, NIT, 2Dept. Civ. Eng., Wakayama, NIT)

Key words

urease, bacteria, calcium carbonate, sand3P-1a102 リングレース担体を用いた固定床一槽式アナモックスプ
ロセス○上野 嘉之 1, 多田羅 昌浩 1, 柴田 晴佳 1, 石川 秀 2（1鹿島・技術研, 2鹿島・エンジ本部）
uenoyo@kajima.com○Shota Nakai1,2, Hirokazu Takahashi1,2, Toyokazu Miura1,2, Tsunehiro Aki1,2,
Yutaka Nakashimada1,2, Yukihiko Matsumura2,3, Yoshiko Okamura1,2(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2Japan Science and Technology
Agency, 3Grad. Sch. Eng., Hiroshima Univ.)

Key words

wastewater, biodiesel fuel, triglyceride, bacteria

3P-1a104 自家発酵熱型高温好気処理における主要細菌の体系的フィードバック分離と諸特性解析○福井 諒, 朝倉 侑弥, 田代 幸寛, 酒井 謙二（九大院・農）tashiro@agr.kyushu-u.ac.jp【背景と目的】アナモックスを用いた窒素除去では、廃水中のアンモニアの約半分が亜硝酸に酸化され，この亜硝酸が残りのアンモニアによって還元されることで窒素ガスを生成する。この二つの反応工程を同一の反応槽で行うプロセス
を一槽式と呼んでいる。本報では，リングレース状担体を用いた固定床一槽式
アナモックスリアクターによる連続窒素除去効果について報告する。
【方法】嫌気好気循環式廃水処理プロセスの活性汚泥を種菌として，アンモニアを唯一の窒素源とした人工廃水を，水理学的滞留時間（HRT）4.4h.，窒素負荷（NLR）1.9kg/m3/day でリアクター（5.5 Ｌ）に連続的に通水し，わずかに通気（20ml/min）しながら微生物を馴養した。この微生物バイオフィルムを種菌として，同様に醸造廃棄物のメタン発酵処理液を通水し，リアクターパフォーマン
スを評価した。バイオフィルムの菌叢は，16SrRNA 遺伝子を標的として 454 GSFLX (Roche) によるパイロシーケンシングにより解析を行った。
【結果と考察】人工廃水では，約 30 日間の培養で，アナモックス反応による窒素除去反応が観察され，80 日経過後には窒素除去率 80%を達成した。一方，実廃水では，通水直後より，窒素除去活性が観察され，約 1 年間の連続運転において，最大窒素除去速度 0.53kg-N/m3/day で，約 85％の窒素除去効果を示した。
いずれの系も，生成したバイオフィルムの深層部では，Candidatus Brocadia
anammoxidans の近縁種（99%）が，ほぼ唯一のアナモックス菌として存在した。また，アンモニア酸化細菌（AOB）は表層部で存在比が高いことか観察された。この好気性菌と嫌気性菌から構成されるバイオフィルムが、一槽式での反応を可能にするものと考察できた。

[背景と目的] 福岡県築上町では、屎尿を自家発酵熱型高温好気処理により液肥化し、農地に散布し使用している。液肥化過程における理化学的特性および次世代シーケンサーによる細菌群集構造解析に関する先行研究により、本過程は3 段階からなり、各段階で異なる主要細菌が液肥化に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。しかし、それらはいずれも未分離で機能も未解明である。そこで本研究では、液肥化第 1 段階における主要細菌 Acinetobacter towneri
近縁菌を体系的フィードバック分離法により取得し、その機能を明らかにすることを目的とした。
[方法] A. towneriT についての好適培養条件を論文等からフィードバックし、それらを基に CASO Agar および Trypticase Soy Broth Agar を用いて分離源希釈液
を 30℃で 1 日間、培養した。形成したコロニーに対して MALDI-TOF MS 分析を行い、それらのスペクトルを基に作製したデンドログラムから候補株の絞り込みを行った。絞り込んだ株について 16S rRNA 遺伝子のシーケンス解析を行い、得られた 3 株の候補株についてさらに特性を調べた。
[結果と考察] コロニー形態の違いを指標に CASO Agar から 23 株、Trypticase Soy
Broth Agar から 12 株を得た。コロニーレベルの MALDI-TOF MS スペクトル測定を行い、デンドログラムを作成し、A. towneriT と相同性の高い株を選抜し、それらを 16S rRNA 遺伝子シーケンス解析に供したところ、3 株が A. towneriTと高い相同性(99.5 %, 99.0 %, 98.9 %)を示した。またそれらは先行研究で得られた主要細菌の塩基配列と高い相同性(99.7 %, 98.5 %, 98.3 %)を示した。以上から体系的フィードバック分離法により目的菌 3 株の分離に成功した。分離菌は33℃で活発に増殖し、実際の液肥化過程の発酵温度とほぼ一致した。現在、さらなる特性解析を進めている。

Nitrogen Removal by a Single-stage Reactor Packed with Ring-laced StringMedia

Systematic feedback isolation and characterization of major bacterium fromautothermal thermophilic aerobic treatment system○Yoshiyuki Ueno1, Masahiro Tatara1, Haruka Shibata1, Shu Ishikawa2(1Kajima Tech. Res. Inst., 2Kajima Co. Div. Eng.)

Key words

anaerobic ammonium oxidation, nitritation, biofilm, nitrogen removal○Ryo Fukui, Yuya Asakure, Yukiro Tashiro, Kenji Sakai(Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words
Systematic feedback isolation, Autothermal thermophilic aerobic
treatment system, Acinetobacter towneri, MALDI-TOF MS

環境工学，廃水処理技術

3P-1a105 ラボスケールでの自家発酵熱型高温好気処理によるし尿の液肥化における諸要因の影響

245

3P-1a107 生物ろ過槽由来 Mn 酸化細菌群集の培養と硝酸濃度の影響○飯田 早紀 1, 鈴木 市郎 1, 三好 萌栄子 1, 杉田 龍兵 2, 武田 穣 1,
小泉 淳一 1
（1横国大院・工, 2横国大・理工）
suz-1@ynu.ac.jp○朝倉 侑弥, 河野 祥尚, 程 慧君, 田代 幸寛, 酒井 謙二（九大院・農）kensak@agr.kyushu-u.ac.jp【背景】福岡県築上町の有機液肥製造施設では，町内で回収したし尿を液肥に変換することで資源の循環を行っている．し尿は酵素製剤を添加した後，好気的条件下で自家発酵熱及び機械熱により約 50℃に上昇した高温状態で約 3 週間処
理されることから，このプロセスは自家発酵熱型高温好気処理と呼ばれる．本プロセスの解明・効率化を目指す上で，施設内発酵槽（実機）を用いた大規模な実験は困難であるため，本研究ではラボスケール発酵槽を用いた諸要因の検討を行った．
【方法】発酵槽には，かくはんにより空気を自発的に取り込む，自吸式通気かく
はん発酵槽を用いた（第 67 回日本生物工学会大会 3P-157）．発酵槽にし尿試料
1.0 L を張り込み，490 rpm で 10 日間培養した．この間，実機の温度変化を参考に温度を制御し，溶存酸素濃度（DO），酸化還元電位（ORP），pH を 30 min 毎に測定した．発酵 0-4，6，8，9 日に試料を採取し，アンモニア態窒素濃度変化の測定，及び変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）法による細菌群集構造変化の解析を行った．試料には酵素製剤かつ種菌として発酵終了後の液肥を 5%(v/v)で添加（a），液肥 5%（v/v）のみ添加（b），酵素製剤のみ添加（c）したし尿を用いた．
【結果】実機と a について DO，ORP，pH は類似した挙動をとったが，a ではアンモニア態窒素濃度が実機より減少した．また DGGE の結果，発酵後期の細菌群集構造が異なったことから，a では実機と異なる発酵が行われたと考えられ
た．a，b 間にはほぼ違いがなかったことから，酵素製剤が及ぼす影響は非常に小さいと考えられた．本プロセスは 3 段階を経て進行するが，c と比べ a の 2段階目へのシフトが早かったことから，実機に常在する主要細菌がプロセスの促進に寄与することが示唆された．現在，次世代シーケンサーにより詳細な細菌群集構造解析を行っている．

【目的】Fe・Mn を含む地下水を微生物複合系を用いて浄化する生物ろ過法は、
低コスト、低環境負荷の Fe・Mn 除去技術である。曝気で自然に酸化・除去される Fe とは異なり、Mn 酸化には微生物の関与が必要となるが、生物ろ過槽からの Mn 酸化細菌の単離は報告されていない。生物ろ過槽に生息する細菌群集
構造を解析した結果、Hyphomicrobium 属などの C1 化合物資化性細菌が多く存在していた。そこで本研究では C1 化合物資化性細菌に適した培地を用いて、生物ろ過槽より Mn 酸化能をもつ細菌群集を培養することを目的とした。
【方法】実稼働する２カ所の上水処理場の生物ろ過槽よりろ材を採取し、Hyphomicrobium 集積用培地中の硝酸濃度を 0-200 ppm とし、Mn を終濃度１ mMとなるように加えて、異なる炭素源を用いて 25℃で振とう培養した。サンプリ
ングした培養液より DNA を抽出し、16S rRNA 遺伝子を PCR で増幅し、DGGEで観察した。また、一部のサンプルについてさらに MiSeq による次世代シーケンス(NGS)解析に供した。得られた塩基配列について、解析ソフト Qiime を用いて操作的分類単位(OTU)を抽出し、優占度の高い OTU について培養期間中の経時変化をグラフ化した。
【結果・考察】２カ所の生物ろ過槽のろ材のどちらからも、Mn 酸化物濃度を示す細菌群集が得られた。また、硝酸濃度は低濃度側で Mn 酸化能を示す細菌群集が得られたのに対し、高濃度側では Mn 酸化能が低下した。細菌群集構造を
NGS で解析して各 OTU の動態を可視化した結果、Hyphomicrobium 属細菌の量の変動が Mn 酸化物の生成と似た挙動を示すことが判明した。

Influence of various factors for converting human feces to liquid fertilizer
on autothermal thermophilic aerobic treatment at laboratory scale

Effect of nitrate concentration on the culture of Mn-oxidizing bacterial
consortia

Key words
complex microbiological system, autothermal thermophilic aerobic
treatment, bacterial community structure, self-inducing fermenter

Key words

3P-1a106 複合微生物系であるコンポスト化で接種した微生物を生

3P-1a108 新規シデロフォアのスクリーニングと廃水からのニッケ○Yuya Asakura, Yoshihisa Kawano, Cheng Huijun, Yukihiro Tashiro, Kenji Sakai(Fac. Agric., Kyushu Univ.)

かして使う温度制御○Saki Iida1, Ichiro Suzuki1, Moeko Miyoshi1, Ryuhei Sugita2, Minoru Takeda1,
Jun-ichi Koizumi1(1Grad. Sch. Eng., Yokohama Natl. Univ., 2Coll. Eng. Sci., Yokohama Natl. Univ.)
nitrate, manganese, Hyphomicrobium, biological filtration

ル回収への利用平井 秀平, ○中崎 清彦（東工大・環境社会理工）
nakasaki@ide.titech.ac.jp

保里 明日香 1,2, 坪田 洸一郎 1, 袋布 昌幹 1, ○篠崎 由紀子 1（1富山高専, 2長岡技科大）shinozaki@nc-toyama.ac.jp【背景と目的】コンポスト化においては、有機質廃棄物がコンポスト化処理場搬入されるまでに、酸敗が進み、生成する有機酸によって pH が低下していることが多い。そしてこの低い pH がコンポスト化微生物の活性を抑制し、速やかな有機物分解を妨げている。本研究では、コンポスト原料の酸敗にともなって生成する有機酸を分解する微生物を接種し、接種した微生物の活性に適した温度に制御することで、コンポスト化における有機物分解を促進することを目的とした。
【方法】モデル的な有機質廃棄物として市販のラビットフードと米飯を 7：3 に混合したものを用いた。このモデル廃棄物に、おがくずと市販の種菌を乾燥重量比で 10:9:1 に混合し、酸敗した有機物に特徴的にみられる 4 種類の有機酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸、乳酸のそれぞれを 2.90、3.02、2.43、および 12.45g/L）を添加してコンポスト原料とした。コンポスト化は原料そのままの実験と、研究室で単離した有機酸分解活性が高い酵母 Pichia kudriavzevii RB1 株を接種した実験、および RB1 株を接種して温度上昇期の温度を制御した実験の 3 通
りをおこない。有機物分解速度を比較した。
【結果と考察】微生物 RB1 株を接種しないものでは、初期に含まれる有機酸の分解開始が遅く、一旦、始まった分解もコンポスト化で新たに生成する有機酸によって、微生物の活性が阻害され、コンポスト化は中断した。また、RB1 株を接種しても温度を制御しなければ、酸分解開始は促進されるが、コンポスト化中盤以降の酸の蓄積を抑制することはできなかった。一方、RB1 株を接種し40℃を 2 日間維持することで有機酸の蓄積は抑制され、活発な有機物分解がお
こって、酵母 RB1 株の接種と温度の制御が高速コンポスト化に有効であることが確かめられた。

[背景と目的] 微生物の多くはシデロフォアと総称される鉄結合性小分子を生産し、効率よく細胞内に鉄を取り込むことができる。また、シデロフォアには様々な種類が存在し、鉄以外の金属もキレートするシデロフォアが存在する。本研
究では、シデロフォアを利用した金属回収法の開発を最終目的として、有用な
シデロフォアの探索を行っている 1) 。今回は、めっき廃水中のニッケルに着目し、モデル廃水を用いて、シデロフォアを利用したニッケル回収法を検討した。
[方法と結果] ニッケルをキレートするシデロフォアの生産菌は、比較的高濃度のニッケル存在下でも生育可能と予想される。富山高専の敷地内など身近にある土壌を採取し、1 mM NiCl2 を添加した細菌用栄養培地 10 mL に土壌約 0.1 gを加え集積培養を行い、ニッケル耐性菌を取得した。この取得した菌株のシデロフォア生産性を、一般的な手法である CAS アッセイにより判定した。その結果、5 か所の土壌から 9 種類のニッケル耐性菌を取得し、そのうちの 5 菌株がシデロフォアを生産することが分かった。最もシデロフォア生産量が多かった菌株を用いて、水溶液からのニッケル回収を検討した。方法としては、NiCl2 を含む水溶液にシデロフォア粗抽出物を添加して室温で一定時間静置した後、この水溶液を疎水カラムに通し、カラム非吸着（素通り）画分および吸着（希塩酸で溶出）画分として回収し、それぞれのニッケルイオン濃度を測定した。その結果、添加したシデロフォア量に応じてニッケルイオンが疎水カラムに吸着し、そこに希塩酸を流すことで溶出・回収できることが分かった。
1)日本農芸化学会 2014 年大会、4A03a11

Temperature control for making an inoculum effective in the complex
microbial ecosystem, composting

Screening for novel siderophores and its potential use for nickel recovery
from wastewater

Hidehira Hirai, ○Kiyohiko Nakasaki(Sch. Environ. Soc., Tokyo Tech)

Key words

Pichia, composting, inoculum, acid degradation

Asuka Hori1,2, Kouichirou Tsubota1, Masamoto Tafu1, ○Yukiko Shinozaki1(1Natl.Inst.Technol.,Toyama Coll., 2Nagaoka Univ. Technol.)Key words

siderophore, nickel, wastewater treatment

246

環境工学，廃水処理技術

3P-1a109 トランスクリプトーム解析による Pseudomonas stutzeri
NT-I のセレン代謝関連遺伝子群の推定3P-1a111 Rhodococcus sp. Br-6 による複数の酸化還元メディエー
ターを介した臭素酸還元○櫻井 紫乃, 黒田 真史, 池 道彦
（阪大院・工）ike@see.eng.osaka-u.ac.jp○藤屋 寛子, 玉井 奈生子, 天知 誠吾（千葉大・園芸）
hiroko.0815.pyon@outlook.jp【背景と目的】セレンは工業材料として利用されるレアメタルである一方で、水相での形態であるセレン酸及び亜セレン酸は生体への毒性が強いため、廃水からのセレンの除去・回収技術の確立は重要である。本研究では、セレン酸還元菌を用いたセレン廃水の生物学的処理の合理的なデザインに向け、既報のセレン酸還元菌の中で最も高い還元能力を有し、揮発性のジメチルセレナイドを生成する Pseudomonas stutzeri NT-I のセレン代謝メカニズムを解明することを目的とし、トランスクリプトーム解析によってセレン代謝に関連する遺伝子の推定を行った。
【方法】P. stutzeri NT-I を前々培養、前培養した後、セレン酸 1 mM を含む TSB
培地 20 ml に OD600 = 0.6 となるように接種し、培養液を 0.5 時間後、1 時間後にそれぞれ採取した。培養液から RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いて total RNAを抽出し、RiboMinus (Life Technologies)を用いてリボソームを除去した後、Ion
Total RNA-Seq Kit v2 (Life Technologies)、Magnetic Beads Cleanup Module (LifeTechnologies)を用いてライブラリを作製した。続いて、エマルジョン PCR でテンプレートを作製し、Ion PGM (Life Technologies)を用いた RNA-Seq によりトラ
ンスクリプトーム解析を行った。
【結果と考察】P. stutzeri NT-I のセレン酸還元酵素遺伝子 serABDC、およびその制 御 遺 伝 子 serXSR の 転 写 量 増 加 が 見 ら れ た 。 ま た 、 Cysteine desulfurase 、
Cystathionine gamma-lyase など硫黄代謝に関連する遺伝子を含む２つのクラス
ターの転写量が顕著に増加していた。さらに、SAM-dependent methyltransferaseの転写量増加も見られ、その機能からセレンの揮発化に関わっていると推測された。以上より、P. stutzeri NT-I のセレン代謝関連遺伝子とその制御機構の一部が明らかとなり、セレン代謝メカニズムの全容解明のための知見が得られた。

【結果及び考察】Br-6 株による臭素酸還元は微好気条件下においてのみ進行し、酢酸の存在下で化学量論的に臭化物を生成した。この際、2,6-ジクロロインドフェノール(DCIP)などの酸化還元メディエーターが存在すると還元速度が約 4 倍に上昇した。Br-6株の無細胞抽出液中には NADH 依存的に DCIP を還元する酵素ジアホラーゼ活性が存在した。一方、還元型 DCIP と臭素酸は直接反応せず、鉄イオンが第 2のメディエーターとして介在することが強く示唆された。実際に還元型 DCIPと Fe(III)、Fe(II)と臭素酸は非生物的に反応することが確認された。Native-PAGEと活性染色よりジアホラーゼ活性と臭素酸還元活性の一致が確認され、両活性の直接的な関与が示された。以上のことから、Br-6 株の臭素酸還元において
DCIP と Fe(III)/Fe(II)はそれぞれ酸化還元メディエーターとして機能していることが明らかとなった。

Transcriptome analysis of genes involved in selenium metabolism inPseudomonas stutzeri NT-I.

Bromate reduction by Rhodococcus sp. Br-6 in the presence of multiple
redox mediators○Shino Sakurai, Masashi Kuroda, Michihiko Ike(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

selenium, transcriptome analysis, Pseudomonas stutzeri

3P-1a110 酵母の細胞表層多糖の改変と金属吸着○高橋 大地, 松川 真弓, 尾島 由紘, 東 雅之
（阪市大院・工・化生系）
azuma@bioa.eng.osaka-cu.ac.jp【背景と目的】
臭素酸(BrO3-)は浄水場で行われるオゾン処理により処理水中の臭化物(Br-)が酸化され発生する副生成物の一種であり、発癌性が報告されている。現状では、処理水中の有機物濃度に応じてオゾン注入量を制御するなどの対策法があるが、完全な臭素酸除去は困難である。一方近年、臭素酸還元能を有するいくつかの微生物が報告されているが、その還元速度は非常に遅く、メカニズムにも不明な点が多い。当研究室では、既知細菌と比較して 100 倍以上速い臭素酸還元速度を示す土壌細菌 Rhodococcus sp. Br-6 株の分離に成功している。本研究は Br-6株による臭素酸還元メカニズムの完全解明を目的とした。

○Hiroko Hujiya, Naoko Tamai, Seigo Amachi(Fac. Horticul., Chiba Univ.)

Key words

bromate, Rhodococcus, diaphorase, redox mediator

3P-1a112 硫黄酸化細菌を利用したタングステン含有コンクリート
中のタングステンの迅速分析○杉尾 剛 1, 杉尾 理恵 1, 根岸 敦規 2, 井川 秀樹 3
（1杉尾化学合成独立栄養細菌研, 2安藤ハザマ・技研, 3日本
ヒューム・技研）
tcmry-sugio@nifty.com

我々のグループでは、酵母の細胞壁構造に注目しその改変から新たな機能性酵母の構築に取り組んでいる。これまでに酵母の細胞壁多糖を化学的にリン酸化することにより、レアメタルを含む多くの金属の吸着が顕著に増加することを明らかにし、イオン交換樹脂に匹敵する生分解性吸着剤の開発を進めている。
ここではキトサンに注目する。酵母の細胞壁キチンの脱アセチル化により得られるキトサンは、カチオン性凝集剤としての利用だけでなく、重金属イオンとのキレート形成による吸着作用、マクロファージ活性化能や真正細菌に対する抗菌作用などが知られ、近年非常に有用な多糖体として活用されている。我々は、これまでにアルカリ処理により細胞壁キチンをキトサン化することで、カチオン性凝集剤としての機能を持たせることが可能であることを示した。しかし、アルカリ処理では酵母の回収率が低く実用的ではない。本研究では、キト
サン化酵母の金属吸着作用の詳細と新たなキトサン化酵母の構築方法について検討を進めた。アルカリ処理に代わる方法として、遺伝子組換えによる酵素的な手法を用いている。酵母の胞子細胞壁に作用する脱アセチル化酵素（Cda2p）を細胞壁キチンへ作用させるため、酵素分泌ベクターや細胞表層提示ベクターを使った組換え株の構築を進めている。発表では、これらキトサン化酵母の構
築と金属吸着能に関する結果について報告する。

【目的】浄化処理施設や下水管などのコンクリート構造物が硫黄細菌の作用で急速に腐食・泥状化する現象が社会問題になっている。この現象は、下水環境に存在する硫化水素が硫黄細菌によって硫酸に変換され、この硫酸がコンクリー
ト成分の水酸化カルシウムと反応して硫酸カルシウム（石膏）を生成するために起こる。演者らはコンクリート腐食を遅延させる目的で、硫黄細菌の増殖を強く阻害するタングステン（W）を混入させたコンクリートを開発している。
今回、コンクリート中の W を迅速に分析できる簡便法の開発を目指した。【方法及び結果】50 ml 容の蓋付透明容器に、20 ml の無機塩培地(pH 2.5)と 3.4 mlの酸性 buffer を加え、更に 0.2 ml の硫黄細菌培養液、EDTA(0.002 mmol)、元素
硫黄 250 mg、テトラチオン酸 (2 mg)、ブロモクレゾールグリーン溶液 1 ml を加えた（全容量, 25.5 ml）。微粉末状の W 無添加コンクリート、3 種類の W 添加コンクリート[4 、8 、20 kg W/m3]を各々 100 mg 添加する事によって反応を開始した。激しく撹拌後、反応溶液の pH と色調変化を 30 分毎、２時間に渡って測 定 し た 。 使 用 し た 硫 黄 細 菌 は 、 Acidithiobacillus thiooxidans 、 Thiomonasintermedia、Paracoccus versutus、Starkeya novella の 4 種類である。2 時間後の反応液の pH と色調は、W 無添加コンクリート（3.92、黄緑）、W 添加コンクリー
ト[4、8、20 kg W/m3;（4.22、緑青）、(4.57, 青）、(4.68、青）]であった。調製直後のコンクリートは pH12-13 で水に懸濁するとアルカリ性を示す。硫黄細菌の硫酸生成を強く阻害する W 添加コンクリートに比較して W 無添加コンクリー
トは、硫黄化合物の存在下、より多量の硫酸を生成するのでアルカリ化が遅れたと推定した。本分析法を用い反応 2 時間後の色調と pH を観察することで、コンクリート中に W が存在するか否かを迅速に判定することが可能である。

A modification of cell surface polysaccharide of Saccharomyces cerevisiae
and metal adsorption

A rapid analysis of tungsten in a tungsten-mixed portland cement by use of
sulfur-oxidizing bacteria○Daichi Takahashi, Mayumi Matsukawa, Yoshihiro Ojima, Masayuki Azuma(Dept. Appl. Chem.&Bioeng.,Osaka City Univ.)

Key words

yeast, cell surface, chitosan, metal adsorption○Tsuyoshi Sugio1, Rie Sugio1, Atsunori Negishi2, Hideki Igawa3(1Sugio Inst. of Chemolithoautotrophy, 2Hazama Ando Corp, Tech., 3Tech. Res. Lab.
Nippon Hume Corp.)

Key words

tungsten, portland cement, sulfur-oxidizing bacteria

環境工学，廃水処理技術／バイオマス，資源，エネルギー工学

3P-1a113 化学物質の微生物に対する毒性を評価するフロー式蛍光計測システムの開発

247

3P-1a115 Alginate degradation product of anaerobic bacterium
supports growth of oleaginous thraustochytrid,
Aurantiochytrium sp.

○櫻井 琢磨, 新谷 政己, 木村 元彦, 金原 和秀（静大・創科技院）
tkkimba@ipc.shizuoka.ac.jp○Kim Hazel V. Arafiles1, Yuri Eramoto1, Kenshi Watanabe1,
Akihisa Kita1, Yoshiko Okamura1,3, Takahisa Tajima1,
Yukihiko Matsumura2,3, Yutaka Nakashimada1,3, Tsunehiro Aki1,3(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2Grad. Sch. Eng.,
Hiroshima Univ., 3CREST, JST)aki@hiroshima-u.ac.jp【目的】化学物質の微生物の呼吸活性に対する影響を解析し、毒性を評価することは、環境中における化学物質の動態を考えるうえで重要な基盤情報である。
そこで、微生物の基本生命活動の一つである転写に着目し、mRNA 量から生理活性を計測することで、微生物に対する化学物質の毒性を評価する手法の開発を行った。
【方法】多流路型デバイスを用い、流路上の細胞の蛍光を簡易的かつ経時的に観察する計測装置を作製した。LED で励起させた蛍光を、フィルターを通して蛍光波長のみを取得し、フォトダイオードで検出した。蛍光試薬として mRNA を染色し、蛍光を発するチオフラビン T を用いた。E. coli DH5α の OD600 ＝ 0.6 に調整した菌液を同じ培地で 10 倍に希釈し、1 mL をシリンジで滅菌したデバイ
スに流し込み、1 時間静置させ、細胞を定着させた。定着後、デバイス一式を
蛍光計測装置に組み込み、37℃のインキュベータに入れた。培地を連続供給し、蛍光変化を 2 時間おきに 1 分間計測した。測定開始から 12 時間後に 0.1μm フィ
ルターを通して毒性物質を注入し、36 時間後まで継続して蛍光計測を行った。
データは Labview (National InstrumentsTM)を用いてプログラムを作成し、取得した。
【結果】毒性物質の添加が無い場合、培地供給開始 6 時間後から 24 時間後まで
蛍光強度は直線的に上昇した後、定常化した。培地供給開始から 12 時間後に毒性物質を添加すると、毒性物質添加後から蛍光強度の減少が見られた。また、添加する毒性物質の作用機作の違いにより蛍光強度の減少に違いが見られた。
特に mRNA 合成阻害剤のリファンピシンを添加すると、添加直後に蛍光強度の大きな低下が認められ、初期値近くまで減少した。よって、本手法で測定することで、流れを持つ環境を模しながら、連続的かつ経時的に微生物に対する毒性物質の影響を評価することが可能であると示唆された。

The use of seaweed biomass as fermentation substrates is revolutionizing the way
biofuels, chemicals, and other bioactive compounds are being made. Theircarbohydrate backbones, however, pose challenges to scientists to develop new waysof pre-treating them prior to feeding to productive strains. In this study, biocatalytic
conversion of alginate, a major sugar of brown seaweeds, using whole cells of ananaerobic bacterium isolated from a marine sediment consortium was employed due toits independence from the need of specialized equipment, and estimated lower runningcosts. Culture supernatants of this newly characterized anaerobe, Dysgonomonas
alginatilytica, after being supplemented to peptone-yeast extract-seawater media,
supported the growth of the oleaginous thraustochytrid Aurantiochytrium sp. Anionexchange chromatography of the supernatant has shown that one fraction supports thegrowth of the thraustochytrid. Chromatographic separation and mass spectrometricanalysis are ongoing to identify the bioactive compound. This work aims to giveinsight into the alginolytic pathway of D. alginatilytica, and give us further
understanding of the roles the thraustochytrids play in the marine carbon cycling
system.

Development of a flow-type of measuring device for evaluating microbial
toxicity of chemicals

Alginate degradation product of anaerobic bacterium supports growth ofoleaginous thraustochytrid, Aurantiochytrium sp.

○Takuma Sakurai, Masaki Shintani, Motohiko Kimura, Kazuhide Kimbara(Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ.)

Key words

toxicity, ThioflavinT, Fluorescence

3P-1a114 海洋底泥中における共生系アルギン酸分解メカニズムの解明と揮発性脂肪酸生産への応用○Kim Hazel V. Arafiles1, Yuri Eramoto1, Kenshi Watanabe1, Akihisa Kita1,
Yoshiko Okamura1,3, Takahisa Tajima1, Yukihiko Matsumura2,3,
Yutaka Nakashimada1,3, Tsunehiro Aki1,3(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2Grad. Sch. Eng., Hiroshima Univ.,
3
CREST, JST)Key words
macroalga, biomass conversion, biocatalysis, thraustochytrid

3P-1a116 コーンコブ糖化液中の発酵阻害物質に耐性を示す酵母のスクリーニング○石田 奨, 荒川 知子, 加藤 勇太, 小西 正朗（北見工大）
konishim@mail.kitami-it.ac.jp○喜多 晃久 1,3, 三浦 豊和 1,3, 岡村 好子 1,3, 秋 庸裕 1,3,
松村 幸彦 2,3, 田島 誉久 1,3, 加藤 純一 1, 西尾 尚道 1, 中島田 豊 1,3（1広島大院・先端物質, 2広島大院・工・エネ環, 3JST・CREST）
nyutaka@hiroshima-u.ac.jp【背景と目的】 褐藻類は海洋中に豊富に存在し、第 3 世代バイオマスとして注目されている。アルギン酸は褐藻類由来の有望な炭素源であり、近年ではエタ
ノール、ピルビン酸、そして揮発性脂肪酸（VFAs）の発酵生産基質としても利用されているが、その報告例はまだ少ない。VFAs は 6 個以下の炭素原子からなる短鎖脂肪酸であり、バイオプラスチックやバイオガス、バイオディーゼル生産などへ広く応用できる。これまで、VFAs の商業生産は主に化学合成によって行われてきたが、石油価格の高騰などにより、生物学的生産への関心が高まっている。一方、アルギン酸は難分解性多糖であり、褐藻類を微生物によって有用物質へ変換する際の律速因子となることが報告されているが、近年の我々の研究において、海洋底泥中の菌叢が、いとも簡単にアルギン酸を分解し得ることを見出してきた。しかしながら、これまでに、海洋底泥中の共生系によるア
ルギン酸分解メカニズムの詳細な報告例はない。そこで、本研究では海洋底泥中からアルギン酸分解菌叢を取得し、その共生系による分解機構に関する知見を得るとともに、アルギン酸から VFAs を高効率に生産することを目的とした。
【方法・結果】有明海および広島湾由来の底泥をアルギン酸培地（3% NaCl）に摂取し、30℃および 37℃で 7 日間培養ごとに継代培養（10%植菌）を行った。
継代が進むにつれ、約半数のサンプルで増殖が不安定となったが、残りの半数は安定して増殖し、主に酢酸を生産していた。5 世代継代培養後、Totla VFAs
yield (g/g carbon)が高く、酢酸生産量が 10mM 以上であった 4 サンプルを選択し、以降の実験に用いることとした。現在、菌叢解析およびリアクターによる
VFAs 生産の最適条件の検討を行っている。

【背景および目的】
リグノセルロースバイオマスは、燃料や化学製品生産のための再生可能な資源として、将来有望とされており、リグノセルロースが含む多糖を加水分解して得られる単糖を原料に、酵母によって有用物質を生産する試みが行われている。
ただし、単糖を得るためには、リグノセルロースが持つ強固な繊維構造を前処理によって破壊しなければならない。この時、微生物反応に悪影響を与える発酵阻害物質が発生することが大きな問題となっている。我々は、阻害物質に耐性を持つ酵母を宿主とし、合成生物学的手法による育種を組み合わせることで阻害を受けない微生物生産系の構築を着想した。本研究では、環境中から宿主として利用できる発酵阻害物質耐性酵母の取得を試みた。
【方法ならびに結果】
糖化液中の発酵阻害物質は HPLC と GC-MS により測定した。酢酸、フルフラー
ル、バニリン、ヒドロキシメチルフルフラールはそれぞれ 182、9.21、3.58、0.26 mM であった。北見工業大学屈斜路研究所周辺で土壌をサンプリングし、作製した糖化液中で増殖可能な酵母を集積培養した後、YM 寒天培地で酵母を分離した。糖化液中での増殖が確認できた単離株 KS47-1 株は、リボゾーマル
RNA の DNA 配列に基づいた系統解析ならびに形態観察、生化学的性状試験により Pichia membranifaciens と同定された。KS47-1 株とその近縁種 6 株ならびに Saccharomyces cerevisiae について、糖化液で再度培養特性を評価した。KS47-1
株は糖化液で良好な増殖を示したが、その他の株は増殖しなかった。KS47-1 株
はコーンコブ糖化液に含まれる発酵阻害物質により増殖阻害を受けないことがわかった。

Symbiotic alginate degradation mechanism in marine sediment and its
application to VFAs production

Isolation of yeast with resistibility against growth inhibitors in corncob
hydrolysate○Akihisa Kita1,3, Toyokazu Miura1,3, Yoshiko Okamura1,3, Tsunehiro Aki1,3,
Yukihiko Matsumura2,3, Takahisa Tajima1,3, Junichi Kato1, Naomichi Nishio1,
Yutaka Nakashimada1,3(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2Div. Ener. Environ., Inst. Eng.
Hiroshima Univ., 3JST・CREST)
Key words
alginate, volatile fatty acids, marine environment, symbiosis○Masashi Ishida, Tomoko Arakawa, Yuta Kato, Masaaki Konishi(Kitami Inst. Technol.)Key words

Pichia membranifaciens, growth inhibitor, hydrolysates, biorefinery248

バイオマス，資源，エネルギー工学

3P-1a117 高セルロース含有コーンコブ残渣を原料とした同時糖化
発酵による D-乳酸の効率的生産

3P-1a119 リグニン由来フェノール類を原料としたムコン酸生産○菊地 晟弘 1, 杉田 晴佳 1, 顔 昊 1, 高橋 健司 2,3, 上村 直史 2,3,
政井 英司 2,3, 園木 和典 1,3（1弘前大院・農生, 2長岡技科大院・工, 3ALCA, JST）
sonoki@hirosaki-u.ac.jp○谷口 麻菜美, 堀内 淳一, 熊田 陽一（京工繊大院・工芸科学）
horiuchi@kit.ac.jp[背景と目的]近年 L-乳酸から作られるポリ乳酸(PLLA)に D-乳酸由来のポリ乳酸(PLDA)を混合させることにより耐熱性等が向上することが明らかになり、D-乳酸の需要が高まっている。本研究室ではバイオマスを原料としてバイオプロセ
スにより有用化学物質を生産するバイオリファイナリー研究の一環として、コーンコブからヘミセルロース成分を抽出した後のセルロース含有率の高いコーン
コブ酸加水分解残渣(corn cob resides, CCR)を用いた同時糖化発酵(SSF)による L乳酸生産について報告した 1)。本研究では CCR を用いた D-乳酸の効率的生産方法の確立を目的とした。
[方法と結果] 乳酸発酵には Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii (JCM1012)を用いた。2L 容ジャーファーメンターを用い、pH、温度をそれぞれ 6.0、37℃に制御しグルコースを炭素源とした MRS 培地を用いて回分培養を行ったところ、初期グルコース濃度 20g/L～60g/L の条件で良好な乳酸生産が認められグル
コースはホモ乳酸発酵によりほぼ全量 D-乳酸へ変換されることが明らかになった。CCR はコーンコブを 1.5％H2SO4 により 120℃、60min の条件で処理し、ヘミセルロース成分を抽出後、洗浄し、乾燥させた。この CCR は約 60％のセル
ロースを含有する。次にこの CCR を単一炭素源とし、糖化酵素としてメイセ
ラーゼ (明治) を用いる SSF による D-乳酸生産を検討した。培養条件は回分培
養と同様としメイセラーゼ添加量 51.8FPU/g-CCR としたところ、50g/L の CCR
から 30.6g/L の D-乳酸が得られた。収率は 0.64g/g-CCR、生産性は 0.67g/L/h であった。次に CCR を逐次添加する SSF を行った。逐次添加を 1 回行ったとこ
ろ、収率を維持しつつ CCR100g/L から 64.5g/L の D-乳酸生産が達成された。現在、逐次添加量を増加させ D-乳酸生産のさらなる高濃度化について検討中である。
[参考文献] 1) 堀内淳一;化学工学, 77, 12, 845-848 (2013)【目的】
ムコン酸はポリアミドやポリエステルなどの多様なポリマーの合成原料である
アジピン酸やテレフタル酸などへと展開できる基幹化学品である．これまで再生可能である植物バイオマス由来の糖質を原料としたムコン酸生産が提案されてきたが，プロトカテク酸脱炭酸酵素の活性化が課題であった．我々はこの酵素活性を向上させるタンパク質 (KpdB) を同定し，KpdB の発現がムコン酸生産を効率化することを報告してきた．本研究では，プロトカテク酸がリグニンに由来する多様な芳香族化合物の中間代謝体であることに着目し，リグニン由来のフェノール類を原料としたムコン酸生産について検討した．
【方法・結果】
プロトカテク酸及びムコン酸の資化能を欠損させた Pseudomonas putida IDPC 株を宿主とし，Klebsiella pneumoniae 由来の protocatechuate decarboxylase (aroY,kpdB)，P. putida 由来の vanillate demethylase (vanA, vanB) および catechol-1,2dioxygenase (catA)，p-hydroxybenzoate hydroxylase (pobA) を発現する微生物株を作出し，複数のリグニンモデル化合物からのムコン酸生産能力を評価した．
本研究で作出した微生物株は，理論収量に対してバニリン酸からは102.1±2.37%，p-ヒドロキシ安息香酸からは 104.4±2.64%，p-クマル酸からは93.2±2.33%，フェルラ酸からは 100.0±1.13 %の収率にてムコン酸を生産可能な株であった．稲わら由来のフェノール類には主に p-クマル酸とフェルラ酸が含まれていた．そこで 5g の p-クマル酸とフェルラ酸を基質として試験した結果，それぞれ理論収量のムコン酸が生産された．さらに稲わらから抽出したリグニンに由来するフェノール類からもムコン酸が生産出来ることを確認した．

Efficient production of D-Lactic acid from cellulose enriched corn cob
residue by simultaneous saccharification and fermentation

Muconic acid production from lignin-related phenols○Manami Taniguchi, Jun-ichi Horiuchi, Yoichi Kumada(Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)Key words
D-lactic acidbiorefinery, simultaneous saccharification and fermentation, corn cob,

3P-1a118 ビフェニル/PCB 分解細菌のリグニン由来芳香族化合物代謝酵素の探索と同定

本研究は，戦略的創造研究推進事業先端的低炭素技術開発 (ALCA)，科学研究費補助金の支援を受けて実施した．
○Akihiro Kikuchi1, Haruka Sugita1, Kou Gan1, Kenji Takahashi2,3,
Naofumi Kamimura2,3, Eiji Masai2,3, Tomonori Sonoki1,3(1Grad. Sch. Agric. Life Sci., Hirosaki Univ., 2Grad. Sch. Eng., Nagaoka Univ.,
3
JST・ALCA)

Key words

muconic acid, lignin-related phenols, lignin

3P-1a120 酵素糖化残渣リグニンを原料としたリグノモノマーの生
産とその生物変換への応用○渡邊 崇人 1, 藤原 秀彦 2, 末永 光 3, 木村 信忠 3, 廣瀬 遵 4,
二神 泰基 5, 後藤 正利 6, 古川 謙介 2
（1京大・生存研, 2別府大・食物栄養, 3産総研・生物プロセス, 4宮
崎大・工, 5鹿大・農, 6佐賀大・農）takahito@rish.kyoto-u.ac.jp○落合 芋葉子 1, 仁宮 一章 2, 柘植 陽太 2, 高橋 憲司 1
（1金沢大院・自科, 2金沢大・新学術）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp【目的】自然界から供給される芳香族化合物の多くは植物リグニン由来である．
リグニンは木材腐朽菌等により部分分解されるとその分解生成物である芳香族化合物の多くは土壌中に供給される．土壌中には，リグニンから供給された芳香族化合物を分解して増殖する細菌が数多く存在する．我々は，これまでに土壌中より Pseudomonas 属や Rhodococcus 属を始めとするビフェニル/PCB 分解細菌を十数株単離し，それらの遺伝生化学的研究及びゲノム解析を行ってきた．
本研究では，これらの細菌の育種を通じて，木質バイオマス，特に，リグニン
分解生成物からの芳香族化合物を含む有用物質生産を最終目的とする．今回は，ビフェニル/PCB 分解細菌のゲノム情報やプロテオミクスの手法を用いて有用物
質生産に有用な酵素や遺伝子の探索と同定を試みた．
【方法・結果】最初に，リグニン分解生成物等に対する資化性が良好であるビ
フェニル/PCB 分解細菌を選抜した．次に，基質（芳香族化合物）を添加及び非添加の培養条件でその選抜した菌株を培養し，調製したタンパク質を異なる波長を持つ 2 種類の蛍光色素でそれぞれ標識・混合後，二次元電気泳動に供した．
泳動後，それぞれの蛍光波長でゲルイメージを異なる色で取得した．これらのイメージを重ね合わせると，色の違いから発現量の変化を視覚的に捉えることが可能となった．また，基質の添加によって誘導されるタンパク質のスポットも容易に特定でき，さらに，質量分析及びデータベースの検索によりタンパク質の同定が可能となった．一方，ゲノム解析を行ったビフェニル/PCB 分解細菌のゲノム情報を精査した結果，細菌由来のリグニンペルオキシダーゼ遺伝子と相同性の高い遺伝子が存在し，そのクローニングに成功したので合わせて報告
したい．

【目的】木質系バイオマスをイオン液体前処理・酵素糖化することにより得られる酵素糖化残渣リグニンは、複雑な構造であるリグニンを多く含むため有効な利用法が確立されていない。そこで本研究では、その利用法の一つとして、まずその酵素糖化残渣リグニンをリグニン酸化分解法の一つであるアルカリ酸化
分解法を用いて、さまざまな物質に変換可能なリグノモノマーへ分解した。その際、既存のリグニン製造法で得られたリグニンとリグノモノマー収率の比較を行った。
【方法および結果】アルカリ酸化分解法で原料に用いたユーカリは、主にバニリ
ンとシリンガアルデヒドという 2 つのリグノモノマーに分解されるため、その2 つを対象としてリグノモノマー収率を求めた。イオン液体前処理・酵素糖化で得られた酵素糖化残渣リグニンからのリグノモノマー収率は 48.0%であった。
また、アルカリ蒸解法で得られたソーダリグニン、希硫酸前処理・酵素糖化で得られた酵素糖化残渣リグニンからのリグノモノマー収率は、それぞれ 29.0%、
39.5%となった。よって、どの既存法で得られたリグニンよりもイオン液体前
処理・酵素糖化で得られた酵素糖化残渣リグニンからのリグノモノマー収率の方が高い結果となった。さらに、リグノモノマーから樹脂原料を得るために必要な遺伝子を導入した遺伝子組換え生物を用いた変換結果についても報告する。

Screening and identification of enzymes from biphenyl/PCB-degrading
bacteria that metabolize lignin-derived aromatic compounds

Lignomonomer production from enzymatic saccharification residue lignin
and application to the bioconversion○Takahito Watanabe1, Hidehiko Fujihara2, Hikaru Suenaga3, Nobutada Kimura3,
Jun Hirose4, Taiki Futagami5, Masatoshi Goto6, Kensuke Furukawa2(1RISH, Kyoto Univ., 2Fac. Food Nut., Beppu Univ., 3BPRI, AIST, 4Fac. Eng., Univ.
Miyazaki, 5Fac. Agric., Kagoshima Univ., 6Fac. Agric., Saga Univ.)

Key words

lignin, biphenyl/PCB, Pseudomonas, Rhodococcus○Kobako Ochiai1, Kazuaki Ninomiya2, Yota Tsuge2, Kenji Takahashi1(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Ints. Frontier Sci. Initiative,
Kanazawa Univ.)

Key words

Lignocellulosic biomass, Ionic liquid pretreatment, Lignin monomer

バイオマス，資源，エネルギー工学

3P-1a121 酵素糖化残渣リグニンを硬化剤として用いたエポキシ樹
脂の合成

249

3P-1a123 林地残材糖化液を原料とした乳酸発酵生産○荒井 隆益 1, 池 正和 2, 小杉 昭彦 1
（1国際農研セ, 2農研機構・食総研）
tkara@affrc.go.jp○井上 優里 1, 仁宮 一章 2, 柘植 陽太 2, 高橋 憲司 1
（1金沢大院・自科, 2金沢大・新学術）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp【目的】木質系バイオマスをイオン液体前処理・酵素糖化することによって得られる残渣は、分子量が大きい上に複雑且つ未知な構造であるリグニン(以下、糖化残渣リグニン)を多く含むため、有効な利用法が確立されていない。しかし、リグニンはフェノール性高分子であるため、材料学的視点から芳香族系化合物の原料として用いることができると考えられる。そこで本研究では、糖化残渣
リグニンからメタノール抽出によって低分子量化合物を得たのち、それをエポキシ樹脂の硬化剤として用いることができるか検討し、糖化残渣リグニンの有効利用を目指した。比較のためにクラフト蒸解リグニンも用いた。
【方法および結果】糖化残渣リグニンおよびクラフト蒸解リグニンにおいて、どちらもメタノール抽出によって 3,000 の低分子量化合物を得ることができた。
また、リグニン純度は糖化残渣リグニンのメタノール抽出物は 75%、クラフト
蒸解リグニンのメタノール抽出物は 100%となることがわかった。水酸基当量においてはそれぞれ 15.0 mmol/g、5.84 mmol/g となった。エポキシ樹脂硬化物
は、エポキシ樹脂と硬化剤、硬化促進剤を混合させ、加熱することにより得た。
コントロールのために一般的な硬化剤であるフェノールノボラックを用いた。
熱分解挙動を評価したところ、糖化残渣リグニンのメタノール抽出物ではコン
トロールよりも重量 5%分解温度が 10%ほど低いことがわかった。また、示差
走査熱量測定での発熱ピーク温度と活性化エネルギーは、糖化残渣リグニンのメタノール抽出物を硬化剤として用いたとき、コントロールよりも高い値となることがわかった。しかしながら、糖化残渣リグニンのメタノール抽出物とコントロールは大差なく、糖化残渣リグニンのメタノール抽出物はエポキシ樹脂
硬化物として機能することがわかった。

林地残材(間伐材)は国内最大の未利用資源であり、残材からリグニンを抽出し高付加価値製品への転換を目指しており、その抽出課程で排出される多糖類副産物 (セルロース、ヘミセルロース)の高度利用技術の開発を行っている。多糖類副産物由来の糖液を用い、乳酸製造技術を開発し、乳酸オリゴマー化による肥効調節型機能性肥料の被覆材の開発を最終目標に研究を行っている。発表では、リグニン抽出後に排出されるリグノセルロース残渣糖化液から乳酸の効率的生産方法の検討を行った。
乳酸発酵には Bacillus coaglans を使用した。林地残材を糖化した糖液は、グル
コースやキシロースが主要な単糖であるために、保存菌株から両糖を効率的に乳酸発酵する B. coaglans 169 菌株を選抜した。糖化液の原料は、林地残材からリグニン抽出後に排出されるヘミセルラーゼ残渣である。残渣は、リグニン抽
出工程で使用した化合物を蒸留水で洗浄した後、市販酵素を用いて酵素糖化した。林地残材糖化液の糖濃度は、総グルコース 62.5mg/ml、総キシロース 2.2mg/
ml であった。最適な培養条件で糖化液の乳酸発酵を行った。糖化液は、80℃、１時間インキュベートし糖化酵素を失活させたのち、pH6.0 に調製し、ミネラ
ル及び酵母エキスを加えた培地を作成して乳酸発酵を行った。発酵 72h 後に乳酸濃度 6.25%に達し、対糖収率 96%であった。高濃度の糖化液に対応できるかを調べるために濃縮した糖液を作成した。10.5%まで濃縮した糖化液を用いて乳酸発酵を行った結果乳酸の濃度は 9.4%であった。濃縮した糖液を用いた糖化液においても対糖収率 90%であった。このことから糖化液中に乳酸発酵を阻害する濃度の阻害物質は含まれていないものと思われた。また中和コストの削減のために酸耐性株の使用も検討しており、その結果についても報告する。

Synthesis of epoxy resin using saccharification residue lignin as curing agent

The lactic acid production from residual forest wood

○Yuri Inoue1, Kazuaki Ninomiya2, Yota Tsuge2, Kenji Takahashi1(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Ints. Frontier Sci. Initiative,
Kanazawa Univ.)

Key words

Saccharification residue lignin, Curing agent, Epoxy resin○Takamitsu Arai1, Masakazu Ike2, Akihiko Kosugi1(1JIRCAS, 2NFRI)

Key words

Bacillus coagulans, bioconversion, lactic acid3P-1a122 リグノセルロース系バイオマスのみからなるノボラック

3P-1a124 乳酸デヒドロゲナーゼを異種発現する白色腐朽菌による○山岡 幸太郎 1, 仁宮 一章 2, 柘植 陽太 2, 高橋 憲司 1
（1金沢大院・自科, 2金沢大・新学術）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp○加古 博子 1, 森 智夫 1, 河岸 洋和 1,2,3, 平井 浩文 1,2（1静大・農, 2静大グリーン研, 3静大・創科技院）
hirai.hirofumi@shizuoka.ac.jp【目的】フェノール樹脂は化石資源を原料として合成される熱硬化性のプラス
チックである。化石資源の枯渇化を考慮すれば、再生可能な植物由来の原料に置き換える必要がある。そこで本研究では、グルコースの分解生成物である 5hydroxymethyl-furfural (HMF)とバイオオイル（木質バイオマスの急速熱分解物）
中のリグノフェノールとを反応させフェノール樹脂プレポリマーとし、それをリグニンで硬化することで、完全にバイオマスのみが原料となったフェノール
樹脂の合成を目的とする。その際、バイオマスから純粋なグルコースを効率よく得る必要がある。近年、食物との競合がないリグノセルロース系バイオマスが注目されているが、強固なリグノセルロースを有しているため、その構造を緩和させるための前処理が必要である。本研究では酸性イオン液体（酸性 IL）
を用いる前処理でグルコース分画をする最適条件の検討も行った。
【方法および結果】酸性イオン液体 BmimHSO4 の水溶液と原料バイオマスのバ
ガスを混合し、前処理温度と酸性イオン液体濃度を変化させて 3h 糖化前処理を行なった。前処理温度について前処理残渣中に 160℃以上でヘミセルロース成分がほとんど残っていないこと、また 160℃で糖化液のグルコース純度が高い
ことより 160℃が適切であるとした。酸性 IL 濃度については、高濃度でセル
ロース糖化率が高いことより 3M が適切だとした。また、グルコースとバイオオイルを原料としてプレポリマーを合成し、リグニンを硬化剤としてフェノー
ル樹脂を作製したところ、Td5 ＝ 280.8℃、R600 ＝ 48.9％となり石油由来フェノー
ル樹脂と比較すると、それぞれ 20℃、15％程熱安定性に劣ることが分かった。
しかし、環境面を考慮すれば優れていると考える。

【目的】持続可能型社会の実現あるいは地球温暖化対策に向けた取り組みの一つとしてバイオマス由来プラスチックの研究が盛んに行われている。バイオマス
由来プラスチックの一つとしてポリ乳酸があるが、前処理技術や製造コストなどの問題から木質バイオマスを原料とした実用化には至っていない。白色腐朽菌は木質バイオマスの低コスト前処理法として期待される微生物である。本実験では白色腐朽菌に乳酸産生能を付与し、かつエタノール発酵の鍵酵素をノッ
クダウンした株を作出し、ブナ木粉からの直接的な乳酸産生を試みた。
【方法・結果】Bifidobacterium longum 由来乳酸デヒドロゲナーゼ（blldh）とマー
カー遺伝子をウラシル要求性変異株に共形質転換することで白色腐朽菌
Phanerochaete sordida YK-624 株の乳酸産生株を作出した。この乳酸産生株はグルコースを炭素源として含む液体培地において半嫌気条件下において乳酸を産生した。乳酸産生能は RNAi 法を用いたピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（Pspdc）のノックダウンにより改善され、さらに培地に CaCO3 を添加すること
で蓄積量が増加した。Pspdc ノックダウンかつ blldh 発現形質転換体をブナ木粉にて脱リグニンのために好気条件下で培養した後に、炭素源抜きの液体培地を加え半嫌気条件下で培養することで、木材からの単一微生物による乳酸生産を試みた。培養後、培地の培養上清を回収し HPLC 分析に供したところ、木材からの乳酸産生が確認された。半嫌気培養時のセルラーゼ添加は木粉からの乳酸産生（0.29 g/L）には必須ではなかったが、添加によって乳酸産生量は 1.44 g/Lにまで著しく改善した。

Synthesis of novolac phenol resin totally derived from lignocellulose biomass

Lactic acid production from woody biomass by white-rot fungus expressing
lactate dehydrogenase gene

フェノール樹脂の合成○Kotaro YAMAOKA1, Kazuaki NINOMIYA2, Yota TSUGE2,
Kenji TAKAHASHI1(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Ints. Frontier Sci. Initiative,
Kanazawa Univ.)

Key words

5-hydroxymethyl-furfural, bio-oil, novolac phenol resin

木質バイオマスからの乳酸産生○Hiroko Kako1, Toshio Mori1, HIrokazu Kawagishi1,2,3, Hirohumi Hirai1,2(1Fac. Agric., Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green sci. Technol., Shizuoka Univ.,
3
Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ.)

Key words
Phanerochaete sordida YK-624, woody biomass, lactate
dehydrogenase, pyruvate decarboxylase

250

バイオマス，資源，エネルギー工学

3P-1a125 白色腐朽菌 Trametes versicolor K-41 株による木質バイ

3P-1a127 Effect of Cassava Pulp Supplement on 1,3-propanediol○曽我 亜由美 1, 髙橋 沙綾 1, 有本 美沙 1, 森 智夫 1, 河岸 洋和 1,2,3,
平井 浩文 1,2
（1静大・農, 2静大・グリーン研, 3静大・創科技院）
hirai.hirofumi@shizuoka.ac.jp

Waraporn Apiwatanapiwat1,2, Pilanee Vaithanomsat2,○Akihiko Kosugi1,3(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Kasetsart Univ,
3
JIRCAS)akosugi@affrc.go.jp

オマスからの水素産生

Production by Clostridium butyricum【背景と目的】近年、地球温暖化や化石資源の枯渇問題から、利用段階で二酸化炭素を排出しないクリーンエネルギーである水素が注目されている。現在のところ、水素は
一般的に水の電気分解や化石燃料を原料とした水蒸気改質などにより製造されているが、製造過程で二酸化炭素が排出される等、環境負荷が問題となっている。そこで、低炭素循環型社会の実現のため、カーボンニュートラルなバイオマスからの水素産生に関する研究が展開されている。本研究では、自然界より分離した白色腐朽菌を用いた木質バイオマスからの水素産生を目標とし、水素産生特性の調査及び水素産生能向上を試みた。
【方法と結果】
自然界より分離した白色腐朽菌 Trametes versicolor K-41 株を、発酵液体培地を含むバイアル瓶に接種して密栓後、半嫌気条件下で 30 ℃、2 週間培養した。その結果、本培養条件下にて水素の産生が認められた。また、本培養系において得られた菌体より total RNA を抽出後、RT-PCR により発現解析を行ったとこ
ろ、ヒドロゲナーゼ遺伝子が発現していることが確認された。このことから、
T. versicolor K-41 株による水素産生にヒドロゲナーゼ遺伝子が関与していることが示唆された。さらに、スギ木粉に発酵液体培地を添加した木粉培地に T.
versicolor K-41 株を接種し、好気条件下で 1 週間前培養後、半嫌気条件下で 10日間培養した系と、菌体接種後即座に半嫌気条件下で 10 日間培養した系における水素産生量を測定した結果、どちらの系においても水素産生が認められ、前培養した系でより高い水素産生量および高い木材分解率を示した。以上の結果
より、T. versicolor K-41 株は木質バイオマスから水素産生が可能であることが証明された。

The three-carbon diol 1,3-propanediol (1, 3-PD) is an important organic substrate forbiopolymers such as polytrimethylene terephthalate. Glycerol is the main substrate of
1,3-PD production by fermentation with microorganisms such as Clostridium
butyricum. However, the yield and productivity of 1,3-PD on glycerol are low because
the growth and energy production are hampered by the low assimilation rate. To
improve its 1,3-propanediol (1,3-PD) production, C. butyricum was cultivated on
glycerol medium supplemented with cassava pulp (CP). At small concentrations, theCP improved the 1,3-PD productivity of C. butyricum from (0.25±0.01)g/L/h (glycerol
alone) to (0.43±0.02)g/L/h (glycerol+2g/L CP) after 24h fermentation [1]. Fiber as byproduct from cassava pulp is one of promising bioresources. C. butyricum I5-42 which
has high starch degradation ability could produce 1,3-PD yield 0.706 mol/mol glycerolwith production rate 0.14 g/L/h from 20 g/L glycerol. This study reports that
supplementation of cassava fiber to glycerol medium can significantly improve theproductivity and yield of 1,3-PD production by C. butyricum. Productivity rate andyield was increased to 0.66 g/L/h and 0.752 mol/mol glycerol from 20 g/L glycerol.
The productivity rate of 1, 3-PD was decreased when glycerol concentrations wereincreased from 20 to 60 g/L, while supplementation of cassava fiber could improve theproductivity rate.
[1] Apiwatanapiwat W. et al. J Biotechnol. 2016 doi: 10.1016/j.jbiotec.2016.05.016.

Hydrogen production from woody biomass by white-rot fungus Trametes
versicolor K-41

Effect of Cassava Pulp Supplement on 1,3-propanediol Production by
Clostridium butyricum○Ayumi Soga1, Saaya Takahashi1, Misa Arimoto1, Toshio Mori1,
Hirokazu Kawagishi1,2,3, Hirofumi Hirai1,2(1Fac. Agric., Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.,
3
Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ.)

Key words

white-rot fungi, hydrogen production, hydrogenase gene

3P-1a126 Clostridium cellulovorans および Clostridium

beijerinckii の共培養系によるシュガービートパルプからの有用物質生産

Waraporn Apiwatanapiwat1,2, Pilanee Vaithanomsat2, ○Akihiko Kosugi1,3(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Kasetsart Univ, 3JIRCAS)

Key words

lignocellulosic materials, 1,3-propanediol, glycerol, fiber

3P-1a128 乾式法を用いた下水汚泥と稲わらの混合消化における稲わらの効果と微生物叢の解析○野澤 太朔, 張 振亜, 雷 中方
（筑波大院・生命環境）
zhang.zhenya.fu@u.tsukuba.ac.jp

川出 雄二郎 1, ○富田 寿男 1, 岡﨑 文美 1,
López-Contreras Ana M. 2, 田丸 浩 1,3,4（1三重大院・生資, 2Wageningen UR・Food Biobased Res., 3三重
大・新産業, 4三重大・生命支セ）
ytamaru@bio.mie-u.ac.jp【背景と目的】 近年、化石資源の枯渇や大気中 CO2 濃度の上昇に伴う温暖化が地球規模の課題となっている。その解決策として、植物バイオマスを原料とした燃料や化学品などの生産技術であるバイオリファイナリーが注目されており、
特に非可食資源であるセルロース系バイオマスの利活用が求められている。そこで本研究では、甜菜糖業の副生物であるシュガービートパルプ（SBP）からの有用物質生産を目的とし、糖化能力に優れた Clostridium cellulovorans および発酵能力に優れた Clostridium beijerinckii の共培養系による有用物質生産の基盤技術確立を試みた。
【方法】 SBP を 2 ％(w/v)含む液体培地に、C. cellulovorans 743B 株（ATCC35296）および C. beijerinckii NCIMB8052 株（ATCC 51743）を植菌し 37 ℃で培養した。経時的に培養液をサンプリングし、OD600nm および pH を測定し、HPLC
により糖類、有機酸類、アルコール類の各濃度を定量した。
【結果と考察】 C. cellulovorans は酵素製剤の添加無しに、単独で SBP を分解し、セロビオースおよびアラビノースを培養液中に蓄積した。C. beijerinckii との共培養においては、培地中に遊離したこれらの糖を、C. beijerinckii が資化、増殖
し、酪酸およびブタノールを生産したことが示唆された。このことから、異なる糖化および発酵特性、糖利用性を有する C. cellulovorans および C. beijerinckiiの共培養系が、SBP からの有用物質生産に適していることが考えられた。

[背景・目的] 乾式メタン発酵法は含水率が低いことから、消化液処理が不要であり、発酵残さは肥料として利用できる可能性を秘めており、優れた利点をもつと期待される。しかし、乾式メタン発酵法では有機物濃度が高いため、 アン
モニアによるメタン発酵阻害が起こりやすい点や高温発酵のための加温方法、汚泥の供給方法や完全混合のための撹拌方法、最適な負荷量、スタートアップの迅速化、長期安定運転管理技術など様々な研究課題が残されている。さらに、汚泥のみ、稲わらのみ、混合汚泥とそれぞれを比較し、稲わら投入の効果や最適なメタン発酵条件を見出す研究は行われていない。従って、様々な処理条件
で乾式メタン発酵の特性を調べることが必要となる。特に、メタン発酵プロセスにおいて、炭素や窒素の挙動や微生物群集の解析が重要となるので本実験ではこれらに着目した研究を行った。
[方法・結果] 乾式メタン発酵効率を評価するために、異なる C/N 比 20:1、15:1、10:1 で基質を添加した際と稲わら、汚泥のみでのメタン発酵ポテンシャルをバ
イオガス生成量やガス組成などから分析した。稲わらを投入することで水素生産は向上した。一方、高い TS で発酵させたため、メタン生成量が伸びない結果となった。継いで遺伝子抽出キットを用い、汚泥中から DNA を抽出し、DNAを PCR にかけて増幅させ、DNA シーケンスにより塩基配列を決定した。その結果を用い、土壌中のバクテリアと古細菌の分布を分析する。さらに、バイオガス生産と微生物群集の関係を明らかにし、乾式メタン発酵に適した実験条件を検討していくことがこれからの課題である。

Production of useful chemicals from sugar beet pulp by co-culture of
Clostridium cellulovorans and Clostridium beijerinckii

Microbial community analysis and Effect of rice straw to the co-digestion of
sewage sludge and rice straw by solid-state anaerobic digestion

Yujiro Kawade1, ○Hisao Tomita1, Fumiyoshi Okazaki1, Ana M. López-Contreras2,
Yutaka Tamaru1,3,4(1Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ., 2Food Biobased Res., Wageningen UR, 3Ind.
Technol. Innov. Inst., Mie Univ., 4Life Sci. Res. Center, Mie Univ.)

Key words
biorefinery

Clostridium cellulovorans, Clostridium beijerinckii, Sugar beet pulp,○Daisaku Nozawa, Zhenya Zhang, Zhongfang Lei(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

solid state fermentation, bioconversion, biomass, microbial community

バイオマス，資源，エネルギー工学／生合成，天然物化学

3P-1a129 雑草を原料とした高 C/N 比メタン発酵における微生物
群構成種の単離

251

3P-1a131 海洋性メタン発酵モデルの構築○矢野 友寛 1,3, 三浦 豊和 1,3, 喜多 晃久 1,3, 田島 誉久 1,3,
加藤 純一 1, 秋 庸裕 1,3, 岡村 好子 1,3, 松村 幸彦 2,3, 中島田 豊 1,3（1広島大院・先端物質, 2広島大院・工・エネ環, 3JST・CREST）
nyutaka@hiroshima-u.ac.jp○松田 修平, 大槻 隆司（山梨大院・医工総）tohtsuki@yamanashi.ac.jp【背景・目的】雑草は、河川や公園などの下草刈りによって生じる豊富なバイオマスであるが、C/N 比が高く難分解性であるため、単独でメタン発酵の原料とすることは難しいとされてきた。我々は、雑草(C/N 比 200)のみを原料とした高C/N 比条件で安定的にメタン生産可能な微生物群を、集積培養により複数取得することに成功している。本研究では、微生物群構成微生物の同定を行うとともに機能を精査し、メタン生産に至る作用機序を明らかにするために、平板培養による単離を試みた。
【方法】1 mm 以下に粉末化した雑草(ギョウギシバ)を 1%(w/v)含む、0.1 M リン
酸ナトリウムカリウム緩衝液(pH7.2)95 ml に、微生物群懸濁液 5 ml を接種、気相を窒素置換し、35℃で静置培養した。培養中、菌体を回収し DNA を抽出後、16S rDNA を標的とした PCR を経てクローニングし、サンガー法により配列決定した。単離操作は、雑草熱水抽出液、セルロース、キシラン、有機酸などをそれぞれ炭素源とした培地を用いて、希釈平板法により行った。
【結果・考察】16S rDNA のクローン解析の結果、真正細菌は Clostridium 属、Bacteroides 属、メタン菌は Methanobacterium 属、Methanomassiliicoccus 属などが検出された。一般的なメタン発酵の原料は C/N 比 20 前後だが、本研究で得た微生物群は、既知属種が主体であるにもかかわらず、はるかに高 C/N 比条件
でメタン発酵が行えることから非常に興味深く、これまで知られているメタン
発酵とは作用機序が異なる可能性が示唆された。単離操作を行った結果、雑草
熱水抽出液を炭素源とした培地から数十株を取得し、現在、そのほかの培地においても単離を行っている。単離株より得た情報をもとに、各微生物の微生物群内における動態を調べ、高 C/N 比に特徴的なメタン生成機構を見出すことを目指す。

【背景・目的】メタン発酵（嫌気消化）法は排水処理技術として、さらにエネル
ギー資源であるメタンを回収できる資源循環技術として利用されている。メタン発酵は多種多様な微生物が共存する系である。その複雑なプロセスの数式モ
デリングのために、嫌気消化モデル(Anaerobic Digestion Model No.1:ADM1)が国際水環境学会(IWA)によって 2001 年に提案された。現在、嫌気消化プロセスの開発・操作・最適化に ADM1 が広く用いられている。本研究室では海洋底泥を微生物源としたメタン発酵の研究を行っているが、それに含まれる塩分（2~3%）がメタン生成パフォーマンスに影響を及ぼすことがわかっている。しかし、
ADM1 にはメタン発酵プロセスへの塩の影響に関する記述はない。そこで本研
究では、塩分がメタン発酵プロセスに与える影響を動力学的に解析し、その効果を考慮したメタン発酵モデルの構築を目的とする。
【方法・結果】0~5%塩（NaCl）濃度条件下でのメタン発酵試験を実施した。微生物源として有明海産海洋底泥を、基質として天然マコンブ 0.7mm 粉砕物を用いた。この試験で得られた培養液の塩濃度と最大メタン生成速度との関係性をもとに、塩阻害式を考案した。次に、中間生成物質（酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、水素）を唯一の基質とした 0~5%塩濃度条件下でのメタン発酵試
験を実施した。実験データから、それぞれの基質を消費する各機能性微生物特有の塩阻害パラメータを解析・決定した。塩阻害式および塩阻害パラメータについて記述したプログラムコードを、既存のメタン発酵シミュレータに追加した。その結果、塩存在条件下におけるメタン発酵試験を、従来よりも高い精度で再現することができた。

Isolation of bacteria from methanogenic community degrading weed waste
in high C/N ratio condition.

The mathematical model for methane fermentation using marine biomass
resources○Shuhei Matsuda, Takashi Ohtsuki(Grad. Sch. Med. Eng., Univ. Yamanashi)

Key words

methane fermentation, weed waste, high C/N ratio

3P-1a130 褐藻の耐塩半連続メタン生産における固形分添加量増加による過負荷の影響○Tomohiro Yano1,3, Toyokazu Miura1,3, Akihisa Kita1,3, Takahisa Tajima1,3,
Junichi Kato1, Tsunehiro Aki1,3, Yoshiko Okamura1,3, Yukihiko Matsumura2,3,
Yutaka Nakashimada1,3(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2Div. Ener. Environ., Inst. Eng.,
Hiroshima Univ., 3CREST, JST)Key words
methane fermentation, macroalga, salt tolerance, mathematical model

3P-2a132 Citrobacter 属細菌におけるキトサン様バイオ凝集剤の多糖化・分泌関連遺伝子の探索○三浦 豊和 1,3, 喜多 晃久 1,3, 岡村 好子 1,3, 秋 庸裕 1,3,
松村 幸彦 2,3, 田島 誉久 1,3, 加藤 純一 1, 中島田 豊 1,3（1広島大院・先端物質, 2広島大院・工・エネ環, 3JST・CREST）
nyutaka@hiroshima-u.ac.jp○武尾 正弘 1, 池本 啓史 1, 宮本 弘毅 1, 木村 和幸 2, 柏 雅美 1,
加藤 太一郎 3, 根来 誠司 12
（1兵庫県大院・工, （株）
兵庫分析センター, 3鹿児島大院・理工）
takeo@eng.u-hyogo.ac.jp

これまでに、褐藻であるコンブを基質とした海洋底泥微生物の流加培養液を使用し、無加水生コンブに相当する 10 wt%固形分の基質から、1.7 g VS/kg/day のOLR（organic loading rate、有機物負荷）、46 日の HRT（hydraulic retention time、
水理学的滞留時間）で、定常状態に達した状態で半連続メタン生産を行った。
本研究では、10 wt%固形分の基質から調製した半連続培養液を使用し、高速処理のために、固形分添加量増加による OLR 上昇条件下で半連続メタン生産を行った。15 wt%固形分の基質を使用したメタン生産は、塩濃度が上昇する条件
下においても、300 mL/g VS を超えるメタン収量で、1.7 g VS/kg/day の OLR、
68 日の HRT で行うことができ、メタン生成速度は 1.3 倍に上昇した。続く 20
wt%固形分の基質を使用した、2.3 g VS/kg/day の OLR、68 日の HRT での培養において、3 本の培養液中 1 本の培養液が有機酸を蓄積し、メタン生産量が減少した。再度 15 wt%固形分の基質を使用することにより負荷を戻したが、1 本の培養液のメタン生産は完全に阻害された。プロピオン酸蓄積、一時的な水素蓄積、酢酸蓄積の後、酢酸と水素の蓄積を伴った完全なメタン生産不安定化に至った。いずれの条件においても、古細菌において、水素資化メタン生成菌の割合が優先していたことから、メタン生成は、酢酸酸化と水素資化メタン生成
によっても起こっている可能性が考えられた。よって、一時的な水素蓄積が酢
酸酸化に影響を与え、メタン生産不安定化を引き起こしたのかもしれない。真
正細菌において、加水分解／酸生成過程に関与するかもしれない細菌が不安定化時に増加していたことから、加水分解／酸生成過程と酸消費過程の不均衡化
により、不安定化が引き起こされた可能性が示唆された。

我々は、多くの Citrobacter 属細菌の菌株が酢酸から N-アセチルグルコサミン及びグルコサミンよりなるキトサン様バイオ凝集剤を培養液に分泌生産することを以前に報告した（Appl. Microbiol. Biotechnol, 97, 9569, 2013)。いくつかの凝集剤生産菌株のドラフトゲノム解析の結果、解析できた配列中に多糖化に関わると推定される複数の糖転移酵素の遺伝子を見出した。そこで、既に Citrobacter
属細菌で確立している相同組換え法を用いて、それらの遺伝子破壊を順次実施
し、バイオ凝集剤の分泌生産との関連を調べた。
いくつかの糖転移酵素の候補遺伝子について、その対象遺伝子の上下流各 0.5kb
領域でカナマイシン耐性遺伝子を挟んだ直鎖 DNA を PCR 法により合成し、これをバイオ凝集剤生産菌 C. freundii IFO13545 株などにエレクトロポレーション法で導入した。カナマイシン含有寒天培地で生育した遺伝子破壊候補株を取得
し、PCR 法及びサザンハイブリダイゼーションにより遺伝子破壊を確認した。
次に、取得した遺伝子破壊株を野生株とともに酢酸ナトリウムを炭素源とする無機塩培地で 30 度で 48 時間振盪培養し、その培養上清の凝集力価をカオリン懸濁法により測定した。
遺伝子破壊により、IFO13545 株に凝集活性を低下させるものと完全に欠失させるものの２つの遺伝子の存在が明らかとなった。後者の遺伝子については、別の凝集剤生産菌 C. freundii GTC09629 で同じ遺伝子破壊を実施したところ、同じ結果が得られた。これらの結果から、この遺伝子が凝集剤生産に必須である
ことがわかった。この遺伝子は、N-アセチルグルコサミンの多糖化に関わる
444 アミノ酸よりなる糖転移酵素の遺伝子と推定され、上下流の３つの遺伝子とクラスターを形成していた。

Influence of organic overloading in semi-continuous methane production
from brown algae

Search for Citrobacter genes involved in polymerization and secretion of
chitosan-like bioflocculant○Toyokazu Miura1,3, Akihisa Kita1,3, Yoshiko Okamura1,3, Tsunehiro Aki1,3,
Yukihiko Matsumura2,3, Takahisa Tajima1,3, Junichi Kato1, Yutaka Nakashimada1,3(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2Div. Ener. Environ., Inst. Eng.,
Hiroshima Univ., 3CREST, JST)Key words
overloading

semi-continuous methane production, brown algae, organic○Masahiro Takeo1, Keishi Ikemoto1, Kouki Miyamoto1, Kazuyuki Kimura2,
Masami Kashiwa1, Daiichiro Kato3, Seiji Negoro1(1Grad. Sch. Eng., Univ. Hyogo, 2Hyogo Anaysis Center Co. Ltd., 3Grad. Sch. Sci.
Eng., Kagoshima Univ.)

Key words
mechanism

Citrobacter, chitosan-like biopolymer, polymerization, secretion

252

生合成，天然物化学

3P-2a133 γ-ポリグルタミン酸の分子構造に関する一考察

栗田 あかね 1, 中野 太一 1, 高橋 良輔 2, 北村 進一 2, 山口 良弘 1,3,
荻田 亮 1,4, 田中 俊雄 1, ○藤田 憲一 1（1阪市大院・理, 2阪府大院・生環科, 3阪市大・複合先端, 4阪市
大・健康・研セ）
kfujita@sci.osaka-cu.ac.jp

3P-2a135 ストレプトスリシン類縁生合成遺伝子群に見出した AlatRNAAla 依存型ペプチド合成酵素の機能解析○松田 貫暉 1, 丸山 千登勢 1, 橋本 絢子 2, 新家 一男 3, 濱野 吉十 1（1福井県大・生物資源, 2JBIC, 3産総研）
hamano@fpu.ac.jp

納豆のネバネバの主成分である γ-ポリグルタミン酸（PGA）は、水質浄化作用や免疫賦活効果など興味深い活性を有するバイオポリマーである。しかしながら、PGA を長期間放置すると、粘性や分子量が低下し、それらの活性も失われていく。今回、PGA の分子量低下メカニズムとして次の二つの仮説を立てた。
PGA は一本鎖の超高分子で、低分子化の際、アミド結合がランダムに切断され、N 末端が増加していくという説、もう一方は、生合成の過程で低分子のPGA が会合してできた見かけの超巨大分子が解離するため N 末端は増加しないという説である。
本研究では、発酵生産された PGA に熱処理を加えて、分子量を低下させたときに、アミノ基の数が増加していないか、アミノ基ラベル化試薬 o-Phtalaldehyde(OPA)を用いる蛍光標識法を用いて調べた。その結果、熱処理によってアミノ基の増加は認められなかった。加えて、アミノ基の数をベースとした場合、PGAの数平均分子量は 25 k であると計算された。また、SEC-MALS 解析を行った結果、熱処理を施したサンプルでは高分子量のピークが減少し、逆に重量平均分
子量 28 k のピークが増加した。以上の結果より、PGA は約 28 k をベースとする会合体の形で発酵生産され、分子量の低下は会合体が解離することによっておこる可能性が非常に高まった。

【目的】抗生物質 streptothricin（ST）類縁化合物の 1 つである BD-12 は側鎖にglycine 誘導体を有しており、これまでの研究で、アミノ糖と glycine 側鎖のペプチド結合が FemAB family に相同性を示す Orf11 によって Gly-tRNAGly 依存的に触媒されることを見出した。従って Orf11 ホモログ酵素遺伝子の探索は、
glycine 以外のアミノ酸を基質にする tRNA 依存型ペプチド合成酵素の同定と新しいアミノ酸側鎖を有する ST 類縁化合物の創製につながると予想し、放線菌
ドラフトゲノムデータベースより Orf11 ホモログ酵素遺伝子の探索を行った。
【方法と結果】データベース検索の結果、新たな ST 類縁生合成遺伝子群（sba
遺伝子群）を見出し、Orf11 ホモログ酵素遺伝子である sba18 遺伝子を同定した。そこで Sba18 組換え酵素を構築し、本酵素の基質特異性を調べたところ、
Ala-tRNAAla を基質として認識することが判明した。これまでに、alanine を側鎖に有する ST 類縁化合物は報告されておらず、その生理活性は大変興味深い。
そこで酵素合成にて得られた alanine を側鎖に有する ST 類縁化合物の生理活性評価を行った。また本化合物の大量精製を目的に、これまでに当研究室で構築した ST 生合成中間体 streptothrisamine 生産菌に sba18 遺伝子を導入した異種発現株の構築を行っており、その詳細についても紹介する。

Studies on molecular structure of poly-gamma-glutamic acidAla-tRNAAla-dependent peptide synthase from streptothricin biosynthesisrelated gene clusters

Akane Kurita1, Taichi Nakano1, Ryosuke Takahashi2, Shinichi Kitamura2,
Yoshihiro Yamaguchi1,3, Akira Ogita1,4, Toshio Tanaka1, ○Ken-ichi Fujita1(1Grad. Sch. Sci., Osaka City Univ., 2Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref.
Univ., 3OCARINA, Osaka City Univ., 4Res. Center Urban Health & Sport, OCU)
Key words

poly(amino acid), poly-gamm-glutamate, Bacillus sp., aggregation

3P-2a134 polygodial の殺真菌活性における液胞膜障害の意義○荻田 亮 1,3, 近藤 拓也 1, 山口 良弘 1,2, 藤田 憲一 1, 田中 俊雄 1
（1阪市大院・理, 2阪市大・複合先端, 3阪市大・健康研セ）
ogita@sports.osaka-cu.ac.jp○Kanki Matsuda1, Chitose Maruyama1, Junko Hashimoto2, Kazuo Shin-ya3,
Yoshimitsu Hamano1(1Fac. Biotechnol., Fukui Pref. Univ., 2JBIC, 3AIST)

Key words

peptide synthase, aminoacyl-tRNA

3P-2a136 抗生物質 BD-12 生合成に関与する N-メチル基転移酵素の機能解析○新倉 春香 1, 丸山 千登勢 1, 新家 一男 2, 濱野 吉十 1（1福井県大・生物資源, 2産総研）
hamano@fpu.ac.jp【目的】殺真菌機序の１つとみなされる液胞膜障害作用は、これまで放線菌の二次代謝産物である niphimycin および amphotericin B (AmB) に加えて、Bacillus 属
細菌の二次代謝産物である polymyxin B にも見出だされている。真菌の液胞膜障害作用を発揮する植物由来の成分を探索したところ、ヤナギタデ破砕液中に目的とする活性を検出し、その活性成分が polygodial であることを同定した。
本研究においては、polygodial による殺真菌活性と液胞膜障害との関係を明らかにするとともに、数種の真菌に対する液胞膜障害作用の有効性について検討した。
【方法】 Saccharomyces cerevisiae および Aspergillus niger の培養は 2.5%麦芽末培
地、30℃の条件で行った。Candida albicans の培養は、RPMI 培地、37℃の条件で行った。また、生菌数の測定はコロニーカウント法によって行い、細胞内 K+の細胞外への漏出を細胞膜障害の指標として測定した。液胞膜の観察は蛍光試薬 FM4-64 にて処理した細胞を用いて行った。
【結果】polygodial は、古くから真菌において細胞内活性酸素種 (ROS) の産生を促進することや、細胞膜障害作用を発揮することが知られている。しかしながら、polygodial は ROS の産生を促進しない低濃度においても液胞膜障害作用を発揮した。さらに、K+および Mg2+ の添加により細胞膜障害を抑制し得る条件
においても、polygodial による殺真菌作用および液胞膜障害作用を抑制することはできなかったことから、液胞膜障害作用が殺真菌活性の主要因であるとみなされた。一方、polygodial は出芽酵母 S. cerevisiae だけでなく二形成の病原性酵母である C. albicans および糸状菌 A. niger に対しても液胞膜障害を伴う細胞死を誘発することが明らかになった。

【目的】Streptothricin（ST）は、放線菌によって生産される抗生物質であり、強力な抗菌活性を示す。しかし、真核生物への毒性も強いため医薬品としては利用されておらず、有機合成化学的な修飾による毒性緩和にも成功していない。
そこで我々は、生物工学的アプローチによる毒性緩和を最終目標として、ST お
よびその類縁抗生物質の生合成研究を進めている。ST 類縁抗生物質の 1 つである BD-12 は、放線菌 Streptomyces luteocolor NBRC13826 によって生産され、2つの N-メチル基を有している。本研究では、BD-12 生合成に関与する N-メチル基転移酵素の機能解析およびコンビナトリアル生合成による新規 ST 類縁化合物の創製を行った。
【方法と結果】BD-12 生合成遺伝子群に存在する 2 つの N-メチル基転移酵素遺伝子（orf 6 と orf 13）をそれぞれ ST 生産放線菌に導入し、生産された化合物
を LCMS で分析した。その結果、orf 6 と orf 13 遺伝子の導入株は、ST のラクタム構造とアミノ糖がそれぞれ N-メチル化された化合物を生産することが示唆された。また、両遺伝子の導入株は、ラクタム構造およびアミノ糖の両者が Nメチル化された新規 ST 類縁化合物であることが期待された。本発表では、これら研究成果および本化合物の単離精製と構造決定、そして、本化合物の生理活性について報告する。

Role of vacuole-disruption in fungicidal activity of polygodial

Functional analysis of the N-methyltransferases in the BD-12 biosynthesis○Akira Ogita1,3, Takuya Kondo1, Yoshihiro Yamaguchi1,2, Ken-ichi Fujita1,
Toshio Tanaka1(1Grad. Sch. Sci., Osaka City Univ., 2OCARINA, Osaka City Univ., 3Res. Center
Urban Health & Sports, Osaka City Univ.)

Key words

polygodial, fungicidal activity, vacuole○Haruka Niikura1, Chitose Maruyama1, Kazuo Shin-ya2, Yoshimitsu Hamano1(1Fac. Biotechnol., Fukui Pref. Univ., 2AIST)

Key words

antibiotics, biosynthesis, N-methyltransferase

生合成，天然物化学

3P-2a137 Photobacterium profundum 由来エイコサペンタエン酸
合成酵素の異種宿主発現253

3P-2a139 Cyclopenin 類を viridicatin 類へと変換する糸状菌由来
酵素シクロペナーゼの発見と精密機能解析○中 真以 1, 林 祥平 1, 佐藤 康治 2, 氏原 哲朗 3, 大利 徹 2（1北大院・総合化学, 2北大院・工, 3協和発酵バイオ）
dairi@eng.hokudai.ac.jp○岸本 真治, 石川 格靖, 山田 陽香, 平山 裕一郎, 渡辺 賢二（静岡県大・薬）kenji55@u-shizuoka-ken.ac.jp【背景と目的】 エイコサペンタエン酸 (EPA) やドコサヘキサエン酸 (DHA) に代表される多価不飽和脂肪酸 (PUFA) は機能性脂質と呼ばれ、様々な健康増進効果が報告されている。PUFA はある種の海洋性微生物により生産され、一部の菌株ではポリケチド合成酵素様のマルチドメインからなる PUFA 合成酵素により行われる。EPA 生産菌 Photobacterium profundum のゲノム配列中に PUFA 合成酵素遺伝子 (Pp-pfaABCD) が見出され、遺伝子破壊実験により EPA 生産に関与することが報告された。そこで本研究では、これら遺伝子の大腸菌を用いた異種宿主発現について検討した。
【方法と結果】 Pp-pfaABCD 遺伝子をそれぞれ PCR にて増幅後、大腸菌発現ベ
クターにクローニングした。しかしアシルキャリアプロテイン (ACP) のホロ化に必要な 4’-phosphopanteteinyl transferase (PPTase) をコードする pfaE 遺伝子オル
ソログをゲノム配列に見出せなかった。本 ACP は EPA 生産菌 Shewanella
oneidensis のもつ PUFA 合成酵素の ACP と非常に高い相同性を示すことから（84%）、S. oneidensis 由来 So-PfaE を用いてホロ化できると予想した。そこで SoPfaE を共発現させた結果、EPA 合成が確認できた。したがって、P. profundum
由来 PUFA 合成酵素を大腸菌で発現させることに成功し、さらにその ACP ドメ
インは S. oneidensis 由来 PfaE によってホロ化されることを明らかとした。

微生物が産生する天然物はポリケチド合成酵素、非リボソームペプチド合成酵素、テルペン合成酵素等で合成された母骨格に様々な酵素による修飾が加わる
ことで生合成される。それら修飾酵素の中でも基質化合物の骨格を変換する酵
素は天然物の多様性創出に大きく関わっている。このような基質化合物の骨格を変換する酵素の一つにシクロペナーゼがある。シクロペナーゼは cyclopeninから viridicatin への変換を担う酵素として Luckner らによってその存在が提唱された酵素である。しかし、シクロペナーゼは存在が提唱されたのみであり、どのような配列のタンパク質であるか長らく不明であった。そこで我々はシクロペナーゼの正体を明らかにするために viridicatin を生合成中間体とすると考えられる aspoquinolone 類、penigequinolone 類の生合成研究を開始した。
Aspoquinolone 類は Aspergillus nidulans が産生する。その構造を元にして必要な生合成遺伝子を推測し、A. nidulans のゲノム中からそれらを全て含む遺伝子ク
ラスターとして asq クラスターを見出した。一方、penigequinolone 類は Penicillium
属糸状菌 FKI-2140 株が産生する。FKI-2140 株のドラフトゲノム解読後、asq ク
ラスターと類似な遺伝子クラスターを探索した結果、png クラスターを見出した。化合物産生量の多い FKI-2140 株の菌体破砕液から酵素活性を指標にシクロペナーゼを探索し、見出したタンパク質の大きさ、必要補因子をもとに png ク
ラスター中で候補遺伝子を絞り込んだ。候補遺伝子を異種宿主で発現し酵素活性を測定したところ、ヘモシアニン様タンパク質 PngL がシクロペナーゼ活性を有していた。また、asq クラスター中の遺伝子で pngL と相同性のある asqI を異種発現させて得られた AsqI にもシクロペナーゼ活性を確認することができた。現在、これらシクロペナーゼの機能解析を進めている。

Heterologous expression of eicosapentaenoic acid synthase gene derived
from Photobacterium profundum

Cyclopenases catalyzing atypical reactions of cyclopenin to form viridicatinin fungal biogenesis

Key words
polyunsaturated fatty acid, Photobacterium, PUFA synthase,eicosapentaenoic acidKey words

3P-2a138 多価不飽和脂肪酸合成酵素におけるタンデムアシルキャ

3P-2a140 Penicillium purpurogenum における PP-V 生産と細胞内○Mai Naka1, Shohei Hayashi1, Yasuharu Satoh2, Tetsuro Ujihara3, Tohru Dairi2(1Grad. Sch. Chem. Sci. Eng., Hokkaido Univ., 2Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.,
3
Kyowa Hakko Bio)

リアプロテインの機能解明○Shinji Kishimoto, Noriyasu Ishikawa, Haruka Yamada, Yuichiro Hirayama,
Kenji Watanabe(Dept. Pharm. Sci., Univ. Shizuoka)
biosynthesis, Aspergillus nidulans, cyclopenase, hemocyanin

アンモニウム濃度の関連性○小嶋 涼 1, 新居 鉄平 1, 春見 隆文 1,2, 荻原 淳 1,2, 渡邉 泰祐 1,2（1日大院生資研究科・生資利用, 2日大・生資科）
j-ogihara@brs.nihon-u.ac.jp○林 祥平 1, 佐藤 康治 2, 氏原 哲朗 3, 大利 徹 2（1北大院・総合化学, 2北大院・工, 3協和発酵バイオ）
dairi@eng.hokudai.ac.jp[目的] 多価不飽和脂肪酸 (PUFA) には健康増進効果が知られており，その需要は年々増加している。現在の主な PUFA 供給源は魚油等の海洋資源であるが、海洋資源の枯渇や安定供給が問題となっており、新たな供給源として微生物発酵が期待されている。しかしその生産性は十分ではなく、その向上が望まれている。
PUFA は海洋性微生物により産生され，その生合成遺伝子が同定されている。
この PUFA 合成酵素はポリケチド合成酵素に似た構造を有し，複数の連続したアシルキャリアプロテイン (ACP) ドメインを持つという特徴がある。これまでに活性型 ACP ドメイン数の減少に伴い PUFA 生産性が低下することが報告されているが (Jiang ら, JACS 2008, p. 6336, 林ら, 第 67 回日本生物工学会大会 2015,
3P-265) 、ACP ドメイン数の増加効果に関する知見は無い。そこで本研究では、
ACP ドメイン数を人工的に増加させ生産能に対する影響を検証した。
[方法及び結果] Schizochytrium 属由来 PUFA 合成酵素には 9 個の連続した ACP
ドメインが存在する。そこで人工的に ACP ドメイン数を 10 と 11 個に増加させた遺伝子を構築、大腸菌にて異種宿主発現させ PUFA 生産能を評価した。その結果、ACP ドメイン数の増加に伴い、その生産性も増加することが明らかとなった。同様に ACP ドメインを 4 個もつ Shewanella oneidensis 由来 PUFA 合成
酵素についても、ACP ドメイン数を 5、6、7、8、および 9 個に増加させた遺伝子を構築し評価した。その結果、本酵素においても ACP ドメイン数に比例したPUFA 生産能の増加が認められた。以上より、PUFA 合成酵素の ACP ドメイン数の増加はその生産能向上に有効であることを明らかとした。

【背景・目的】Penicillium purpurogenum IAM15392 株は特定培地条件下で 、Azaphilone 系 Monascus 色素同族体を産生する。しかし、その生合成経路の詳細は明らかになっていない。本糸状菌は 4 種の色素を生産することが知られている。そのうち、主生産色素として、母核のピラン環に酸素原子を含む PP-O とそれがアミノ基に置換した PP-V が知られる。我々は、グルタミンの異化反応の過程で発生するアンモニウムが構造中に取り込まれることで、同色素が生産されると予想している。したがって本研究では、P. purpurogenum の細胞内アンモニウム濃度と色素生産との関連性を明らかにすることを目的とした。
【方法・結果】菌体をメタノールに浸すことで細胞内の色素を抽出し、TLC に
よって解析した。その結果、グルタミンを窒素源とした培地で P. purpurogenum
IAM15392 を培養したときに生産される PP-V は菌体内で生合成されていることが分かった。ネスラー試薬を用いて、このときの細胞内アンモニウムレベルを測定した。PP-O 生産条件下では、アンモニウム濃度に変化がなかったが、PPV 生産条件下では、PP-V 生産と共にアンモニウム濃度が PP-O 生産条件と同じくらいまで減少した。また、グルタミンを含む培地で培養された菌体を、グルタミンを含まない通常の PP-O 生産条件として用いられる培地に移して、さらに培養した。その結果、10 mM のグルタミンを含む培地で 72 時間培養後、培地置換された菌体だけが PP-V を生産し、そのときのアンモニウムレベルはこの条件のみ減少した。以上の結果から、我々は P. purpurogenum は細胞内のアンモニウムレベルを維持するために細胞内の余剰のアンモニウムを PP-V として排出すると考えた。

Functional analysis of tandem acyl carrier protein in polyunsaturated fatty
acid synthases

The relationship between the violet pigment PP-V production andintracellular ammonium level in Penicillium purpurogenum○Shohei Hayashi1, Yasuharu Satoh2, Tetsuro Ujihara3, Tohru Dairi2(1Grad. Sch. Chem. Sci. Eng., Hokkaido Univ., 2Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.,
3
Kyoto Hakko Bio Co., LTD)

Key words

acyl carrier protein, PUFA synthase, Schizochytrium, Shewanella○Ryo Kojima1, Teppei Arai1, Takafumi Kasumi1,2, Jun Ogihara1,2,
Taisuke watanabe1,2(1Dept. Biores. Util. Sci., Grad. Sch. Biores. Sci.,, 2Coll. Bioresour. Sci., Nihon
Univ.)

Key words
metabolism

Ammonium, Pigment, Penicillium purpurogenum, Secondary254

生合成，天然物化学

3P-2a141 Penicillium purpurogenum における citrinin 生産能の評価

3P-2a143 Cordyceps sphecocephala による蛍光物質の生産およびその特性評価○藤澤 祐哉 1, 高野 真希 2, 星野 一宏 2
（1富山大・工, 2富山大院・理工）khoshino@eng.u-toyama.ac.jp○荻原 淳 1,2, 茂木 美樹 2, 小嶋 涼 2, 新居 鉄平 1, 渡邉 泰祐 1,2,
春見 隆文 1,2
（1日大・生資科, 2日大院・生資科・生資利用）
j-ogihara@brs.nihon-u.ac.jp

目的）Monascus 色素は古来より利用される微生物由来天然物色素であり、現在日本で食品の着色料として認可される唯一の微生物由来天然物色素である。近年、Monascus spp.によって生産される赤色色素は、抗菌、抗がん、抗酸化などの生理活性を示すことが明らかにされたことで、改めて重要視されている。しかしながら、Monascus spp.はカビ毒である citrinin を副生することが明らかにされている。このため、欧米において食品への Monascus 色素の使用は認められておらず、国際的にも安全な微生物由来天然物色素の供給が求められている。
一方、糸状菌 P. purpurogenum IAM15392 株は可溶性でんぷん、酵母エキス、クエン酸緩衝液という極めて単純な培地にて、多様な Monascus 色素同族体を生産する。また現在までに本糸状菌において Monascus 色素生産時に citrinin の副生は確認されておらず、本糸状菌の生産する Monascus 色素同族体の天然色素として利用・応用を検討する上で citrinin 副生の有無を確認することは重要である。そこで本研究では、IAM に保存された P. purupurogenum 8 菌株におけるcitrinin 生産能の有無を確認することを目的とした。
方法及び結果）P. purpurogenum における citrinin 生産能の有無を確認するために Coconut Cream Agar 培地を用いた蛍光発光観察による簡易的な評価を行った。その結果、citrinin 生産菌として知られる M. purpureus と比較して、8 菌株
すべてで特徴的な蛍光発色は確認されず、塩酸添加による蛍光発色の増強も確認されなかった。さらに、P. purpurogenum において、M. purpureus 由来 citrinin
生合成遺伝子(pksCT)の有無を PCR 反応的に確認した。その結果、8 菌株において pksCT の増幅断片は確認されなかった。現在、P. purpurogenum の色素生産培
地における、citrinin 生産の確認を HPLC 分析を用いて行っている。

【背景・目的】現在、蛍光物質は主に化学合成で生産されている。一方、天然物
由来の蛍光物質は稀であり、大量生産は難しい。これまで冬虫夏草 Cordyceps
sphecocephala が生成する生理活性物質についての研究を行ってきたところ、培養液中に蛍光物質が存在することを発見した。このような天然物由来の蛍光物
質には、生体内蛍光プローブや食品添加物など様々な用途が期待できる。さらに C.sphecocephala は微生物であるため大量培養することで、この蛍光物質の安定的な生産の可能性がある。そこで、本研究では、C.sphecocephala を用いた蛍光物質の効率的な生産法の開発およびその特性評価を行った。
【方法・結果】14 種類の冬虫夏草を用い、YM 培地で静置培養した結果、
C.sphecocephala NBRC 101415 の培養液は赤色を呈し、蛍光励起することを発見した。そこで本菌株を選択し、この蛍光物質について検討を行った。この培養液について液液抽出および TLC を行った結果、少なくとも 2 種類の蛍光物質を生産していることがわかった。このうち強い蛍光強度を示す物質は、EX 407
nm、EM 470 nm を有していた。次に、この蛍光物質を効率的に生産するため、窒素源の検討を行った。28℃、Glucose 10 g/L、pH5.0、好気条件で 10 日間静置培養をした結果、Polypeptone、Beef extract、(NH4)2SO4、および(NH4)2HPO4 の場
合、培養液は高い蛍光強度を示した。特に (NH4)2SO4 と(NH4)2HPO4 のとき、得られた菌体は少なかったが、培養液は黄色を呈し、青緑色の強い蛍光が認められた。さらに菌糸にも蛍光が認められたため、菌体内でこの蛍光物質が生合成され、分泌していることが示唆された。現在、この蛍光物質の効率的な生産の検討、構造解析およびその特性評価を実施している。

Evaluation of the citrinin productivity in Penicillium purpurogenum

Production and characterizations of fluorescence materials by Cordyceps○Jun Ogihara1,2, Yoshiki Motegi2, Ryo Kojima2, Teppei Arai1, Taisuke Watanabe1,2,
Takafumi Kasumi1,2(1Coll. Bioresour. Sci., Nihon Univ., 2Grad. Sch. Bioresour. Sci., Nihon Univ.)

Key words
mycotoxin

Penicillium purpurogenum, citrinin, Monascus fermentation products,

3P-2a142 休眠型天然物生合成遺伝子を利用した機能性新規物質の探索とその生合成解明

sphecocephala○Yuya Fujisawa1, Maki Takano2, Kazuhiro Hoshino2(1Fac. Eng., Univ. Toyama, 2Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama)

Key words

Cordyceps sphecocephala, fluorescence material, nitrogen source

3P-2a144 卵菌による長鎖多価不飽和脂肪酸生産○吉田 磨仁 1, 松下 貴子 1, 東條 元昭 2, 永峰 賢 3（1北大院・地環科, 2阪府大院・生環科, 3ロム）
majin@ees.hokudai.ac.jp○恒松 雄太, 山本 剛, 横山 葵, 岸本 真治, 渡辺 賢二（静県大薬）
tsunematsu@u-shizuoka-ken.ac.jp

化学構造多様性に富む天然物は古くから創薬の探索源として重要な役割を担ってきた。しかし、現在、多数の製薬企業が天然物創薬部門を縮小廃止している。
新規物質獲得に多大な時間と労力が費やされる、獲得効率が悪い、生産性が低いなどがその一因と考えられる。一方、次世代シーケンサーにより、天然物生合成遺伝子クラスター(Biosynthetic Gene Cluster: BGC)情報、すなわち「天然物の設計図」が簡単に得られるようになった。同時に、多くの BGC が休眠型として存在しており、有効利用されていないことが明らかにされた。我々は天然物の設計図をもとに、遺伝子工学を利用して新規天然物を生産させること、加えてその代謝経路を化学的に解明し、応用利用することを目指して研究を行った。
さまざまな糸状菌株を対象に、機能未知かつ休眠型 BGC をゲノムデータベース上にて探索した。なかでも糸状菌 Aspergillus niger における pyn クラスターは
非リボソーム性ペプチド合成酵素-ポリケタイド合成酵素混合型酵素などから構成される、典型的な BGC であった。しかし、本 BGC が休眠型であること、機能未知酵素遺伝子を多数含むことから、その生合成産物は新規物質であると予想された。そこで遺伝子改変により本 BGC の活性化を行った。転写因子遺伝
子 pynR を強制発現させた変異体を培養すると、その培養液は明黄色を呈した。
本変異体の培養物より、各種分離操作・機器分析にて約 10 種の新規物質の単離・構造決定に成功した。続いて遺伝子破壊実験、精製酵素による in vitro 実
験、出芽酵母等による異種発現系を駆使してその生合成経路を解明した。二つの酵素の連続的酸化による γ-pyrone 構造の形成、プロテアーゼ様酵素 PynH によるエキソメチレン構造の形成など、これまで未知であった天然物部分構造の形成機構を明らかにした。

n-3 系多価不飽和脂肪酸(LC-PUFA)であるエイコサペンタエン酸(EPA)やドコサヘキサエン酸(DHA)は抗炎症作用や抗血栓作用などの様々な生理機能を持ち、
n-3 系 LC-PUFA の摂取は心血管疾患などの発症リスクの低減に寄与する。n-3
系 LC-PUFA は血中コレステロールや血清脂質レベルを下げる作用もあり、高脂血症の治療薬として EPA が用いられている。EPA や DHA の供給源は主に魚油であるが、漁獲高の不安定化や減少、食生活の変化などにより、EPA や DHAの摂取量は年々減少し、種々の疾患発症のリスクが高まっている。そこで、魚油に代わる供給源として、様々な微生物による EPA、DHA の生産研究が進められている。原生生物に属する卵菌(Pythium)のいくつかの種は EPA を作ることが知られている。また、Pythium は様々な加工食品の副産物を培地として増殖させることが可能であることから、Pythium を利用することで EPA の生産コストの削減が期待される。今回新たに、P. myriotylum の複数の株で EPA が産生されることを発見した。そこで、最も生育がよかった JK9 株を用い、EPA 生産を向上させることを目的に、培養条件の検討を行なった。その結果、50%の V8(野菜ジュース)培地で 20℃、7 日間、静置培養したところ、EPA の生産量は当初の約 7 倍の 93.6mg/L にまで増加することができた。しかしながら、この値は商業生産の目標値の約 10%に留まっており、培養条件や培養方法のさらなる改善が必要である。

Harnessing the biosynthetic pathway in filamentous fungus

Production of polyunsaturated fatty acids by necrotrophic oomycete,○Yuta Tsunematsu, Tsuyoshi Yamamoto, Mamoru Yokoyama, Shinji Kishimoto,
Kenji Watanabe(Dept. Pharm. Sci., Univ. Shizuoka)

Key words
cryptic natural products, silent gene cluster, Aspergillus niger,
transcriptional regulator

Pythium myriotylum○Kiyohito Yoshida1, Takako Matsushita1, Motoaki Tojo2, Tadashi Nagamine3(1Grad. Sch. Environ. Sci., Hokkaido Univ., 2Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka
Pref. Univ., 3ROM Co. Ltd.)Key words
fatty acidfilamentous fungi, Pythium, eicosapentaenoic acid, polyunsaturated

生合成，天然物化学

3P-2a145 メラニン生成キー酵素チロシナーゼの抑制物質の微生物からのスクリーニングとその細胞毒性

255

3P-2a147 フェニルプロパノイド類の抗酸化能力と構造との相関関係○横川 遥香, 松郷 誠一（金沢大院・自科）
haruside8133@stu.kanazawa-u.ac.jp○倉地 亜子, 塚本 義則, 車 炳允
（中部大院・応生）
mittsukamoto@isc.chubu.ac.jp

シミ・ソバカスの予防を目的として、メラニン生合成の初発段階に位置するキー酵素であるチロシナーゼの活性の阻害あるいは遺伝子発現の抑制活性を有する物質のスクリーニングが世界的に広く行われている。我々は特殊環境微生物のメタノール／クロロホルム抽出物をスクリーニング源として、ヒト悪性黒色腫
由来細胞株(HMV-II)とフォルスコリンを用いた系でのチロシナーゼ活性を有意に低下させる新規な物質のスクリーニングを行った。その結果、スクリーニン
グ対象とした数百種類の微生物の中から、イソフラボン資化性菌、オリゴ糖生
産菌、テルペン系炭化水素資化性菌のメタノール／クロロホルム抽出物の一部から細胞毒性を示さず、チロシナーゼ活性を有意に低下させる活性を有する物
質をスクリーニングすることができたので報告する。

フェニルプロパノイド類は、フェニルアラニンから生合成される植物の 2 次代
謝産物である。構造はベンゼン環に C3 の鎖のついた骨格を基本としており、様々な官能基を有する。生理活性を有する化合物も多く、例えば、カフェイン
酸は、抗発がん作用や抗炎症作用を示すという報告がある。フェニルプロパノ
イド類個々の抗酸化能力については多くの報告があるが、系統だった抗酸化能の報告は少ない。本研究では、フェニルプロパノイド類の抗酸化能力と構造との相関関係の解明を目的とした。生体に存在するラジカルには、O2・-や・OH、
H2O2 など様々なものがある。特に・OH は反応性が極めて高く、還元型金属イオンと過酸化水素の反応で発生する。
・OH 量は生体における還元型・酸化型金
属イオン量とある種の関連性が考えられている。我々はフェニルプロパノイド
類が金属イオンの酸化・還元に関わっている可能性に注目して実験を行った。
・OH 消去能に関しては、フェルラ酸よりカフェイン酸がより高い消去能を示した。カフェイン酸の IC50 はフェルラ酸の約 15 倍も低かったことから、OH
基が鉄イオンとの酸化・還元と関連していると考えた。Fe2+もしくは Fe3+との反応によりラジカル生成量の減少、増加が起こっていると仮定し、検討した。
Fe2+との反応では、カテコール構造を有する場合のみ pH7.2 の条件で 585nm に新たな吸収ピークがあらわれ、錯体形成を確認した。また、Fe3+還元力について Yen and Chen (1995) の方法に従って実験を行ったところ、OH 基によってFe3+が Fe2+に還元されることが分かった。還元力に関しては、OH 基の数が少ないほど高い能力を示した。以上の結果より、カテコール構造を有する物質は、
Fe3+を還元しラジカル生成量を増やすが、1 電子還元反応によるラジカル消去だ
けでなく錯体形成によりラジカル生成量を抑制し、高い抗酸化力を示すことが示唆された。

Screening of Substances Repressing Tyrosinase of Key Enzyme for Melanin
Synthesis from Microbe and its Cell Toxicity

Correlation of antioxidant activity and structure of phenylpropanoids○Ako Kurachi, Yoshinori Tsukamoto, Byung-Yoon Cha(Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Chubu Univ.)

Key words

Tyrosinase, Melanin, microbe

3P-2a146 Pseudomonas sp. C8 株が生産する増殖抑制物質の特定とその生産機構○Haruka Yokokawa, Seiichi Matsugo(Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ.)

Key words

antioxidant, phenylpropanoid, hydroxyl radical, chelate reaction

3P-2a148 Cordyceps sphecocephala を用いた新規神経突起伸長物
質の生産およびその特性評価○鈴木 研志 1, アズワニ ファティマ 2, 犬塚 友麻 3, 本荘 雅宏 4,
田代 陽介 3, 二又 裕之 1,3,5（1静大・創科技院, 2プトラ マレーシア大, 3静大院・工, 4静大・工, 5静大・グリーン研）
thfutam@ipc.shizuoka.ac.jp○西川 絢, 高野 真希, 星野 一宏（富山大院・理工）khoshino@eng.u-toyama.ac.jp

微生物が生産する様々な物質は食糧生産や医薬品の開発において、極めて重要な生物資源である。新規の抗菌あるいは静菌作用物質の発見は現在の医療分野を発展させると同時に、微生物生態系における微生物の生存戦略や共存を理解する重要な鍵となっている。これまでの研究で Pseudomonas sp. C8 株はフェノー
ルを唯一の炭素源とする連続集積培養系において様々な微生物の増殖を抑制する物質を生産することが明らかとなった。そこで、本研究では増殖抑制物質の特定とその生産機構の解明を目的とした。増殖抑制物質を特定するため、メタ
ノールによる抽出およびイオン交換樹脂を用いた分離を行った。その後、HPLC解析を実施し、増殖抑制物質の精製に成功した。また、マススペクトラム解析
により、分子量 1033 の物質であることが明らかとなった。現在、NMR 解析による構造決定を進めている。増殖抑制物質の生産機構を解明するため、フェノー
ルを唯一の炭素源とした C8 株連続集積培養系の解析を行った。その結果、増殖抑制物質は常に生産されているわけではなく、一定の条件を満たした時のみに生産されていることが推察された。次いで、グルコースあるいはスクロース
を唯一の炭素源として培養を行ったところ、両培養系において菌密度に依存した増殖抑制物質生産が確認された。このことから、quorum sensing (QS)様の機構により物質生産が制御されていることが推察された。そこで、QS のオート
インデューサーである N-acyl homoserine lactones (AHL)の生産を解析したとこ
ろ、少なくとも炭素鎖が 4 から 8 および 10 から 16 の AHL 生産は確認されなかった。また、C8 株のゲノム解析の結果 AHL の生産に関与する遺伝子は発見されなかった。以上のことから、C8 株増殖抑制物質は新規物質であると同時に、新しい QS 機構の発見が期待される。

【目的】冬虫夏草は昆虫等の体に寄生し育つ子嚢菌であり、民間療法に用いられた。また、抗がん作用や抗酸化作用が期待されている。一方、認知症治療薬として神経成長因子(NGF)があるが、高分子のため、脳血液関門を通過できない。
そのため、NGF 作用を有し、脳血液関門を通過できる新規物質が求められている。そこで、Cordyceps sphecocephala 培養液を神経細胞に添加したところ神経突起伸長を発見した。このことから、この新規神経突起伸長物質は認知症治療薬として期待できる。しかし、冬虫夏草は希少かつ高価であり、大量培養法の確立やこの物質の薬理学的機能が明らかにされていない。本研究では、認知症治療薬の開発を目的として、C.sphecocephala を用いた新規神経突起伸長物質の生産およびその特性を検討した。【方法・結果】本研究では C.sphecocephala
NBRC 101415 を用いた。培養は、3 種類の培地を用いて 28℃で 10 日間静置培養を行った。培養液の神経突起伸長作用を検討するために、PC12 細胞を用いた。神経突起伸長作用は、PC12 細胞に培養液を添加し、細胞分化率を評価した。その結果、YM 培地での培養液は最大の細胞分化率を示し、NGF と同様に
PC12 細胞直径以上の神経突起伸長 (1-3 本/cell) が確認された。このことから、
C.sphecoephala 培養液中の新規物質は NGF と同様な伸長メカニズムであると推察される。次に、本菌株の培養経過時間による PC12 細胞分化率を検討した。
菌体培養 6 日目から細胞分化率は上昇し、培養 10 日目で約 12.6%と最大の分化率を示した。さらに、新規物質の神経突起伸長メカニズムの解明として MEKや JNK 阻害剤を添加して PC12 細胞を培養すると、突起伸長は確認できなかった。したがって、この新規物質は NGF と同様に MEK や JNK 経路を介して伸長していると考えられる。現在、この神経突起伸長物質の大量生産法の確立や同定を試みている。

Characterization of a novel growth-repressing compound from
Pseudomonas sp. C8

Production and Characteristics of a New Nerve Growth Promoter by
Cordyceps sphecocephala○Kenshi Suzuki1, Fatma Azwani2, Yuma Inuzuka3, Masahiro Honjyo4,
Yosuka Tashiro3, Hiroyuki Futamata1,3,5(1Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 2Inst. Trop. Agri., Univ. Putra Malaysia,
3Grad. Sch. Eng., Shizuoka Univ., 4Fac. Eng. Shizuoka Univ., 5Res. Inst. Green Sci.
Technol., Shizuoka Univ.)
Key words
cell-cell interactions, growth, quorum sensing○Jun Nishikawa, Maki Takano, Kazuhiro Hoshino(Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama)

Key words

Cordyceps sphecocephala, NGF-like material, PC12

256

生合成，天然物化学

3P-2a149 放線菌 Streptomyces rochei 生合成制御系変異株の二次代謝プロファイル解析

3P-2a151 新規抗菌物質 demethyl-L-681,217 の単離とその生合成○小谷 真也 1, 菅井 翔吾 1, 小牧 久幸 2, 逸見 光 3（1静大院・農, 2NBRC, 3農研機構）
kodani.shinya@shizuoka.ac.jp

岩國 美由季, 高橋 譲, 鈴木 敏弘, 木梨 陽康, ○荒川 賢治（広島大院・先端物質）
karakawa@hiroshima-u.ac.jp【目的】
放線菌 Streptomyces rochei 7434AN4 株のもつ線状プラスミド pSLA2-L 上には、抗生物質ランカサイジン(LC)およびランカマイシン(LM)の生合成遺伝子クラス
ターがコードされており、その他に tetR 型リプレッサー遺伝子(srrA,srrB,srrC)、
SARP 型活性化遺伝子(srrY,srrZ,srrW)、さらに本菌のシグナル分子 SRB の生合成遺伝子 srrX など、抗生物質生産に関わる多くの制御遺伝子が存在している。
当研究室では、srrX→srrA→srrY(→LC)→srrZ→ LM という抗生物質制御カス
ケードの主要経路を明らかにした。本研究では、二次代謝生合成制御系の分子基盤の理解と物質生産への応用を目指した。
【方法および結果】(1) SrrA/SrrB/SrrY による二次代謝制御：まず、遺伝子発現およびゲルシフト解
析により、srrB が SrrA の制御下にあり、srrY 上流に結合して転写調節を行う可能性が示唆された。さらに srrB の抗生物質生産における影響を調べるため、親株、ΔsrrA 株、ΔsrrB 株、ΔsrrAsrrB 株を培養し、ゲル濾過およびシリカゲルク
ロマトグラフィーによる精製を行い、抗生物質の生産量を比較した。その結果、
LC に関して、ΔsrrA 株は 1.5 倍、ΔsrrB 株は 4.9 倍、ΔsrrAB 株は 8.7 倍も高生産していた。また、LM に関しても、srrB を破壊した ΔsrrB 株、ΔsrrAB 株において大量生産が確認された。転写量・抗生物質生産量の経時変化解析と考え合わ
せると、srrB は培養後期において抗生物質生産を負に制御していることが示唆された。
(2) 多重制御遺伝子変異による休眠二次代謝の覚醒：3 つ目のリプレッサー遺伝子 srrC を含めた多重制御遺伝子変異株を作成したところ、通常非生産の定極性分子 YT-02A, YT-02B を取得した。構造解析を行ったところ、ブチロラクト
ン骨格を有していた。本発表では Streptomyces 属放線菌のシグナル分子との比較を含め詳述する。

放線菌は、多様な二次代謝産物を生産することで、産業微生物として用いられている。また、近年、ゲノム解析によって放線菌のゲノムが解析されており、データベース上で利用することが出来る。また、ゲノム情報が明らかであれば生合成遺伝子の推定を行うことが出来、生物情報学に寄与できる。そのような背景から、全ゲノムの解析が終了している Streptomyces cattleya を用いて抗菌活性物質の探索を行った。S. cattleya NBRC 14057T を ISP2 寒天培地 5L で、7 日間培養を行った。気菌糸および胞子形成が確認されたのちに、スパーテルを用いて気菌糸および胞子細胞を回収した。回収した細胞に対し約 2 倍量のメタノー
ルを用いて抽出を行った。メタノール抽出物より、CHP20P を用いた溶媒分画を行い、抗菌活性画分を得た。最終的に HPLC を用いて、活性物質を単離・精製した。NMR および ESI-MS の解析によって、構造決定を行い、既知化合物のL-681,217 を同定した。さらにメチル基が１個少ない分子構造を有する新規抗菌物質 demethyl-L-681,217 を単離し、二次元 NMR スペクトラムの解析によって平 面 構 造 を 決 定 し た 。 ま た 抗 菌 活 性 試 験 の 結 果 、 demethyl-L-681,217 は 、Streptomyces antibioticus に対して抗菌活性を示した。L-681,217 に関しては、近縁株の S. cattleya ATCC 39203 から得られている（A.J. KEMPF, et al. J Antibiot
1983）が、その生合成は明らかにされていない。そこで、生合成遺伝子の明らかになっている Kirromycin の生合成遺伝子（T. Weber et al. Chem&Biol 2008）を参照し、L-681,217 および demethyl-L-681,217 の推定生合成遺伝子を明らかにした。

Analysis of secondary metabolite profiles in the regulatory mutants ofStreptomyces rochei

Isolation of a new antibacterial compound demethyl-L-681,217 and its
biosynthesis

Miyuki Iwakuni, Yuzuru Takahashi, Toshihiro Suzuki, Haruyasu Kinashi,○Kenji Arakawa(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)
Key words

regulation, Streptomyces, antibiotics, biosynthesis

3P-2a150 粘液細菌 Sorangium cellulosum の分離と有用物質の探索○Shinya Kodani1, Shogo Sugai1, Hisayuki Komaki2, Hikaru Hemmi3(1Grad. Sch. Int. Sci. Tech. Shizuoka Univ., 2NBRC, 3NFRI)

Key words

Streptomyces cattleya, antibacterial, polyketide, 1NMR

3P-2a152 ジスプロシウムで惹起される巨大菌のポリ-γ-グルタミ
ン酸増産現象と関連遺伝子分析○木村 義雄（香川大・農）kimura@ag.kagawa-u.ac.jp○白米 優一 1, 松村 歩梨 2, 芦内 誠 1,2（1愛媛大院・連合農, 2高知大・農）yuichi.haku@gmail.com[目的] 微生物由来の天然物から作られる医薬品は年々減少の一途を辿っている。
この一因として、これまで放線菌由来の医薬品が多く作られてきたが、近年、新規な放線菌の分離が困難になっていることが考えられる。しかし、天然物は新規な構造と強い生理活性を有することが多いため、放線菌に替わる新しい微生物資源が構築されると、新たな天然物由来の創薬の道が開けることが期待される。そこで、細菌の中で最も多くの遺伝子を有するものの、純化が難しいた
め、日本では分離されていない粘液細菌 Sorangium cellulosum の分離及び純化方法を確立し、本菌が生産する有用物質の探索を行うことを目的とした。
[結果及び考察] 我々は土壌から約 15％程度の割合で本菌を分離しており、この分離菌から様々な純化方法を用いて現在、135 菌株程度の粘液細菌の 1 種である Sorangium cellulosum を得ている。
これらの純化株を 2 種類の培地（疎水性化合物吸着樹脂 XAD-16 含有）で培養
後、菌体と XAD-16 にわけ、それぞれからアセントン抽出物を調製した。この抽出物を 3 種の細菌、２種の酵母及び 2 種のカビを指標菌として生育阻害を見たところ、半数以上のサンプルにおいてアスペルギルス症を引き起こす
Aspergillus 属の生育阻害が見られ、本菌は真菌に対して強い抗菌作用を有する化合物を多く生産することが判明した。
また、抽出物を LC/MS 解析により生産物の同定を行った結果、生産物の中には約 45 種の既知化合物のほか、未知化合物と考えられる物質も多く含まれており、これらの中から今後、有用物質の探索を行っていきたい。

【背景と目的】レアメタルは「先端産業のビタミン」と呼ばれ、現代産業に不可欠である。しかし、そのようなレアメタルを輸入に頼る現在の供給方法は多くの懸念材料を含んでいる。そのため、レアメタルの再利用・回収技術の発達・拡充は喫緊の課題である。最近、我々は古細菌型ホモキラルポリ γ グルタミン酸（ＰＧＡ）の優れたレアメタル吸着性に注目し、その高い吸着能に対する生理的意義に興味をもった。この生理的意義が解明することで、レアメタルの中でも特に性質の似通ったランタノイド元素の簡便かつ迅速な分別・効率回収にかかる重要な知見が得られるものと期待されている。
【方法】巨大菌呼ばれる環境微生物を対象とした。これは納豆菌とは異なり、立体規則性に優れたＰＧＡを生産する。今回、基本ＰＧＡ生産培地に、Ｄｙをはじめとする 5 つのランタノイド元素、あるいはレアメタルの代表格とされるＩｎを加えた修飾培地を用いた。ＰＧＡ合成量はサフラニン法で測定した。巨大菌のＰＧＡ合成オペロン（Ｃａｐ）はメチレンブルーを検出色素とするファンクショナルクローニング法を用いて同定した。
【結果と考察】巨大菌によるＰＧＡ生産に対し、Ｉｎは抑制的である一方、ラン
タノイド元素の多くが無応答であることが判明した。ただし、ランタノイドの中でもＤｙのみ特殊な応答性を誘導し、具体的には有意な増産効果が認められた。巨大菌にＤｙ特異的な認識機構が存在する可能性が示唆された。なお、Ｐ
ＧＡの生産種として有名な納豆菌ではＤｙによる増産効果というのは知られていない。そこで、今回同定した巨大菌Ｃａｐについてさらなる配列分析を進めた。既知の納豆菌Ｐｇｓとの比較から、該合成酵素をコードする構造遺伝子部の類似性が明らかになる一方、その遺伝子発現に係る制御領域に注目すべき相違点が見いだされた。

Isolation of Sorangium cellulosum and search of useful substances

Dysprosium-triggered increases in poly-γ-glutamate productivity of Bacillus
megaterium○Yoshio Kimura(Fac. Agric., Kagawa Univ.)

Key words

antifungal antibiotics, Sorandium cellulosum○Yuichi Hakumai1, Ayuri Matsumura2, Makoto Ashiuchi1,2(1United. Grad. Sch. Agric. Sci., Ehime Univ., 2Fac. Agric. Agric. Sci. Prog., Kochi
Univ.)

Key words

poly(amino acid), Bacillus megaterium, critical metals, production

生合成，天然物化学／有機化学，高分子化学／ペプチド工学

3P-2a153 新規分離培養手法を用いた海綿由来の有用化合物産出
菌の探索

257

3P-2a155 細胞親和性電子伝達ポリマーを介した生細胞への電子注入○金子 真大 1, 石川 聖人 2, 加藤 創一郎 3, 橋本 和仁 4, 中西 周次 5
（1東大院・工, 2名大院・工, 3産総研, 4物質材料機構, 5阪大・太陽
エネセ）
nakanishi@chem.es.osaka-u.ac.jp○町田 光史 1, Dawoon Jung 2, 青井 議輝 2, 中尾 洋一 1
（1早大院・先進理工・化・生化, 2広島大・ISSD）
ayocha@waseda.jp【背景と目的】天然物化合物の有望な探索源である海綿からは、これまでに多くの二次代謝産物が報告されている。これらの多くは海綿内に共生する微生物が生産していると考えられているが、環境中の微生物は 99％以上が分離培養不可能であるため、微生物が天然化合物の真の生産者であることを実証できた報告
例はごく限られている。難培養性微生物は環境中では密集して生存していることを鑑みれば、従来の分離培養で用いられてきた限界希釈法では微生物密度が極端に低いため、この低密度がほとんどの微生物を培養できない理由の一つであると考えた。そこで、本研究では密集した微生物間に存在するであろうケミ
カルシグナルによる相互作用を維持した培養を可能にするために、従来法とは異なるアプローチによる微生物の分離株獲得を試行し、新たな有用性微生物を探索することを目的とした。
【方法】海綿から微生物を採集した後、従来培養法である平板培養法と複数の新規分離培養手法（in situ 培養[(1)Diffusion Chamber 法、(2)i-tip 法]、(3)連続集積培養）を用いて１次培養を行った。その後に、それぞれ培養したサンプルを２次培養(寒天平板)に付し分離株を獲得した。獲得した分離株について、16s RNA
遺伝子解析を行い、それらの多様性および新規性について従来法と新規分離法の比較を行った。同時に、それぞれの分離株について抽出液を調整し、LC-MS
を用いてメタボローム解析を行った。
【結果と考察】手法ごとに獲得された分離株の種類は大きく異なることが判明した。さらに新規培養手法、特に Diffusion Chamber 法および連続集積培養を通じて獲得された分離株は、多様性および新規性の高い菌株（既存株に対する 16s
RNA 遺伝子の相同性が 97％以下）の割合が従来法のそれらと比べて著しく高いことが判明した。

一般に、生細胞における細胞内酸化還元状態は、その代謝経路・活性と密接に関係している。この事実に基づき、我々は細胞親和性の電子伝達ポリマーを開発し、これを用いた細胞内酸化還元種から細胞外電極への電子排出により、生細胞における細胞内酸化還元状態、ひいては代謝を電気化学的に制御することに成功してきた。この細胞親和性電子伝達ポリマーは、リン脂質極性基本模倣
分子(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine; MPC)と酸化還元活性分子の共重合体であり、高い分子設計自由度を有しているため、目的に応じて最適な電子伝達ポリマー構造をデザインすることが出来る。本研究では、生細胞への電子注入を第一の目的に、それに適した電子伝達ポリマーの設計と合成と大腸菌を用いた検証を行った。
酸化還元活性部位として十分に負の酸化還元電位を有するビオロゲン類を採用し、これを細胞親和性の MPC と共重合することで、電子伝達ポリマー PMBBVを新規合成した。PMBBV と大腸菌、電子受容体の硝酸を用いて電気化学測定を行ったところ、電子注入に由来する還元電流が検出された。また、MPC と共重合させない酸化還元活性部位モノマーと、共重合させた PMBBV の比較実験を行った結果、MPC と共重合させた場合において細胞毒性が低減されることが確認された。
上記と並行して、十分に正の酸化還元電位を有するフェロセンを MPC と共重合した別種の電子伝達ポリマー（PMF）を用いた細胞代謝制御にも取り組んだ。その結果、電子伝達ポリマーを介した細胞内の電子排出により、モデル微生物として使用した酵母の代謝が改変されることが明らかとなった。以上の結果は、電子伝達ポリマーの分子設計により、対象微生物の代謝の合目的的な制御が可能であることを示している。

Microbial discovery from marine sponge by new cultivation method

Electron injection into living microbial cells via cytocompatible redox-active
polymers○Koshi Machida1, Jung Dawoon2, Yoshiteru Aoi2, Yoichi Nkao1(1Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2ISSD Hiroshima Univ.)

Key words

marine sponge, uncultured bacteria, microbe, growth control

3P-2a154 Visualization of toluene-degrading Pseudomonas putida
using fluorescent in situ hybridization (FISH)○Masahiro Kaneko1, Masahirto Ishikawa2, Souichiro Kato3, Kazuhito Hashimoto4,
Shuji Nakanishi5(1Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo, 2Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 3AIST, 4NIMS,
5
Res. Center for Solar Energy Chem., Osaka Univ.)

Key words
electrochemical cultivation, extracellular electron transfer, polymeric
mediator, metabolic pathway modification

3P-2a156 切断リンカーを利用した細胞内機能性ペプチド探索系の確立○Hak Jin Song1, Kwang Jin Kim2, Yong-Keun Choi1, Minju Chang1,
Sok-young Shim1, Wu-Young Jeong1, Sang Hyun Lee1,
Yung-Hun Yang1, Hyung Joo Kim1
(1Dept. Biological eng., Konkuk Univ., 2Natl. Horticultural Res.
Inst., Rural Development Administration)
hyungkim@konkuk.ac.kr○小﨑 一功 1, 清水 一憲 1, 松本 凌 1, 田邊 智哉 1, 本多 裕之 1,2（1名大院・工・生物機能, 2名大・予防早期医療創成セ）
honda@nubio.nagoya-u.ac.jp

Active toluene-degrading Pseudomonas putida in soil samples were quantified byfluorescence in situ hybridization (FISH). FISH with a Texas red-labeledoligonucleotide probe based on 16S rRNA sequences was used for the specificdetection of P. putida at the single cell level. Analysis of the bacterial toluenedegrading activity in the soil samples that were incubated with 200ppm toluene as asole carbon source with the FISH probe indicated that the number of the bacteria wasdepended on the presence of toluene. Gas chromatography analysis of toluene in thesamples incubated with P. putida also showed that rapid decrease in toluene
concentration was observed. Results in this report suggested that in situ enumeration of
toluene-degrading bacteria using FISH might be of high potentials in the field ofbioremediation of hazardous organic solvent in terrene environments.

【背景と目的】我々は医薬品などへの応用が期待される細胞内機能性ペプチドの探索系を開発してきた[1]。本系はペプチドアレイの各スポットに光切断リンカー、膜透過性ペプチド（CPP）と候補ペプチドを順に合成したものであり、多種類の CPP-ペプチド複合体の細胞内機能を効率よく評価できる。しかし、細胞内導入を目指した CPP の付与や細胞特異性を指向した CPP 配列の改変により、ペプチドの機能が低下したり失われる可能性がある。そこで本研究では、
CPP の影響なしに機能性ペプチドを探索可能にする系の確立を目指した。細胞内で切断されるリンカーを CPP とペプチド間に挿入し、細胞内導入後にそれぞれが解離するシステムを利用した。
【方法】切断リンカーとして、細胞内アゾレダクターゼで分解されるアゾリン
カーを使用した。セルロースメンブレン上に光切断リンカー、CPP、アゾリン
カー、候補ペプチドの順に合成したペプチドアレイを作製した。UV 照射でペプチド複合体を切り出し、各スポットのペプチド複合体を培地に溶出して細胞に添加し、WST-8 アッセイで細胞生存率を算出した。
【結果と考察】既報の細胞死誘導ペプチドで本系の検証を行った。アゾリンカー
有無で細胞死誘導効果を比較したところ、アゾリンカーを切断できる肝がん細胞ではアゾリンカー有で細胞死誘導効果が高かった。一方、切断できない乳がん細胞では、リンカー有無で細胞死誘導効果に違いはなかった。このことから、細胞内で CPP とペプチドが解離することで CPP による機能阻害を解消できた
ことが示唆された。さらに本系を用いて、既報の細胞死誘導ペプチドよりも高活性のペプチドを取得することに成功した。
[1] Matsumoto, R. et al., Scientific Reports, 5: 12884 (2015)

Visualization of toluene-degrading Pseudomonas putida using fluorescent insitu hybridization (FISH)

Establishment of screening system for intracellular functional peptides using
a cleavable linker.

○Hak Jin Song1, Kwang Jin Kim2, Yong-Keun Choi1, Minju Chang1,
Sok-young Shim1, Wu-Young Jeong1, Sang Hyun Lee1, Yung-Hun Yang1,
Hyung Joo Kim1
(1Dept. Biological eng., Konkuk Univ., 2Natl. Horticultural Res. Inst., Rural
Development Administration)
Key words
Pseudomonas putida, FISH, toluene degradation○Ikko Kozaki1, Kazunori Shimizu1, Ryo Matsumoto1, Tomoya Tanabe1,
Hiroyuki Honda1,2(1Grad. Sch. Eng., Nagoua Univ., 2PME. Nagoya Univ.)

Key words
systempeptide chip, cell penetrating peptide, cleavable linker, screening

258

ペプチド工学3P-2a157 短鎖ペプチドの物理化学特徴に基づく長鎖機能性ペプチ

3P-2a159 病原性微生物を対象としたプログラム細胞死誘導物質の○岩田 晋明 1, 久米 暁子 1, 河合 駿 2, 加藤 竜司 2, 清水 一憲 1,
本多 裕之 1,3
（1名大院・工, 2名大院・創薬科学, 3名大・予防早期医療創成セ）
honda@nubio.nagoya-u.ac.jp○大田 悠里 1,2, 宮本 龍樹 1,2, 横田 亜紀子 2, 常田 聡 1, 野田 尚宏 1,2（1早大・先進理工, 2産総研・バイオメディカル）
stsuneda@waseda.jp【背景と目的】生体内分子に特異的に結合するペプチドは分子標的薬等への応用が期待されており、このような機能性ペプチドの探索は重要な課題である。ペプチドは残基数に応じて膨大な候補配列をもつ。一般的に特異性の高いペプチ
ドは長鎖となるため、評価を行う候補配列を絞ることは探索の効率化につながる。我々は過去にアミノ酸の電荷と疎水度の指標に基づき 20 種のアミノ酸を 4グループに分類することで配列候補を絞り、標的分子に高い結合性を示す 4 残基ペプチドの性質解析を行っている[1]。しかしこの手法を用いても、より長いペプチドを対象に探索を行う場合は膨大な実験データが必要となる。そこで我々
は 4 残基ペプチドで得られた結果を元に、標的分子に高い結合性を示す 8 残基ペプチドの探索に挑戦した。
【方法と結果】512 配列の 4 残基ペプチドをアミノ酸の電荷、疎水度、極性など
特徴量を用いた指標値で表し、主成分分析（PCA）によって各ペプチド配列を2 成分 PCA 平面上にプロットした。使用した PCA 指標は、特徴量ごとの平均、最大、最小値など、8 残基に拡張可能な指標である。ペプチドアレイ（4 残基、512 配列）に IL-2 を作用させ、抗原抗体反応を利用して各ペプチドと IL-2 の結合性を数値化した。2 成分 PCA 平面上で IL-2 との結合性が上／下位 20 配列のペプチドがプロットされる領域をそれぞれ高／低結合領域とした。640 配列の8 残基ペプチドを合成して IL-2 との結合評価実験を行い同一平面上にプロットしたところ、高結合領域に含まれる 8 残基ペプチドの結合強度値の平均が低結合領域と比較して約 3 倍高くなった。これより、高結合性の短残基ペプチドの物理化学特徴を利用して、より長鎖の高結合性ペプチドを取得できることが示唆された。
[1] Kume, A., et al., Biotechnology and Bioprocess Engineering, 21(1): 119-127(2016)【目的】腐敗や感染症を引き起こす有害微生物を根絶する方法として主に抗生物質が使用されているが、薬剤耐性菌の出現や有益な菌に対してまで生育阻害を引き起こすといった問題も残されており、新しい作用機序を持つ抗菌技術が希求されている。Toxin-antitoxin(TA)機構は毒性タンパクである Toxin と抗毒性タ
ンパクである Antitoxin から成る微生物の自死機構である。通常 Toxin の毒性
は、Antitoxin 分子が Toxin 分子と複合体を形成することで抑制されている。そこで本研究では Toxin と Antitoxin の結合を阻害することで人為的に特定の微生物の細胞死を誘導できるのではないかという発想に至り、これら分子の結合を阻害するペプチドの探索・同定、標的微生物の細胞死を誘導することを目的とした。
【方法】本研究では病原性微生物の一種である Staphylococcus aureus をモデルとし、ファージディスプレイ法を用いて、本微生物が保持する Toxin に特異的に結合するペプチドを探索した。Toxin と Antitoxin の結合阻害活性を評価するた
めの蛍光消光現象を用いた手法を構築し、実際に TA 結合阻害活性評価を行った。
【結果・考察】ファージディスプレイ法により 109 種類のペプチドライブラリから 235 種類のペプチド配列に絞り込むことに成功した。選定したペプチドをク
ラスタリングした結果、極性や電荷の異なる多様な化学特性を持つペプチドが含まれていたことが明らかとなった。濃縮率の高いペプチドに関して TA 結合阻害活性は検出されなかったものの、超並列シーケンシングを用いることで従来のファージディスプレイ法では不可能だった濃縮されたペプチドの特性といった情報を得ることが可能となった。

Design and analysis of protein binding octamer peptides by physicochemical
characteristics of tetramer peptides

Screening of peptides inducing programmed cell death system in apathogenic bacterial strain

ドの探索とデザイン○Iwata Shinmei1, Kume Akiko1, Kawai Shun2, Kato Ryuji2, Shimizu Kazunori1,
Honda Hiroyuki1,3(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2Grad. Sch. Pha. Nagoya Univ., 3PME. Nagoya
Univ.)

Key words

peptide, binding analysis, peptide array, principal component analysis

3P-2a158 AuNP-tag を用いた生体分子修飾による金ナノ粒子の高機能化

探索○Yuri Ota1,2, Tatsuki Miyamoto1,2, Akiko Yokota2, Satoshi Tsuneda1,
Naohiro Noda1,2(1Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2Biomed. Res. Inst., AIST)

Key words

Staphylococcus aureus, phage display, programmed cell death, peptide

3P-2a160 気生微細藻類 Vischeria helvetica 由来プロテアーゼによって生成した カゼインオリゴペプチドの ACE 阻害
活性○的場 晴香 2, 前原 康秀 1, 重森 陽士郎 2, 石田 尚之 2, 今村 維克 2,
今中 洋行 2
（1岡山大・工, 2岡山大院・自科）
imanaka@okayama-u.ac.jp○井上 悠希, 油井 信弘, 阿部 克也（工学院大・先進工・生化）
bt10335@ns.kogakuin.ac.jp

目的：金ナノ粒子（AuNP)は，高い化学的安定性，生体適合性や局在表面プラ
ズモン共鳴（LSPR）に起因する強い可視光の吸収などの優れた特性を有することから，生物学や医学の分野で広く利用されている．また，粒子の凝集状態による色調の変化を利用した特定・微量物質の比色検出への応用も期待されている．その際，粒子の分散安定性を維持しつつ AuNP 表面を生体分子で機能的に修飾することが重要となる．本研究室では，遺伝子工学的手法により任意の部
位に連結・挿入可能であり，配向制御および機能維持を可能とする固体表面親和性ペプチドをタグとした生体分子の固定化法を確立してきた．本研究では，新たに同定した AuNP への高い親和性ならびに固定化後の分散安定性を担保す
るペプチド（AuNP-tag）を用いた，多様な機構，親和性を有するリガンド-アナ
ライト間相互作用の比色検出システムの検証を目的とした．
方法と結果：リガンド生体分子として，ビオチン，Strep-tag II（STII）及び OAcetylserine sulfhydrylase(OASS) を ， ア ナ ラ イ ト 生 体 分 子 と し て Streptavidin(SA)，Serine acetyltransferase (SAT)をそれぞれ用いた．AuNPs 懸濁液とリガンド
生体分子溶液を混合し，AuNP に固定化後，アナライト溶液を混合した．そして Aggregation Index (=Abs. at 780 nm/Abs. at 530 nm）を測定し，相互作用を評価した．その結果，ビオチン，STII および OASS のいずれの分子をリガンドとして用いた場合でも AuNP は安定に分散し，アナライト分子の添加により相互作用による AuNP の凝集が生じた．また，OASS については AuNP-tag の連結末端を変えることにより固定化配向を制御できることがわかった．これらの検討を通じ，生体分子による AuNP の簡便なワンステップ機能化が AuNP-tag の連結により可能であることが示された．

【目的】岩の表面やコンクリート塀などの栄養源が少ない環境下で生活している
気生微細藻類はユニークな生物機能を有している。コンクリート塀から採取した気生微細藻類 Vischeria helvetica KGU-Y001 はプロテアーゼを産生し、タンパ
ク質分解物を窒素源として細胞内に取り込むことで増殖することが分かっている。本研究では、V. helvetica によって異なる光培養条件で産生される細胞外プ
ロテアーゼを利用したカゼインオリゴペプチドの生理活性について評価した結果を述べる。
【方法】V. helvetica はカゼイン添加 BB 培地を光強度 0 あるいは 40 μmol photons
m-2 s-1 の条件下で 7 日間振とう培養した。培地を経時的に回収し、乾燥細胞重量の測定、Bradford 法による培地中のタンパク質量の測定を行った。細胞外プ
ロテアーゼはザイモグラフィにより検出し、それらの分子量は FPLC を用いて分析した。また、カゼインオリゴペプチドの加水分解度は OPA 法により求め、生理活性能は血圧上昇抑制作用を示す ACE 阻害活性法によって評価した。
【結果と考察】V. helvetica をカゼイン添加 BB 培地で 7 日間振とう培養した結果、培地中で検出されたプロテアーゼは光条件によって分子量が異なることが分かった。細胞外プロテアーゼを用いてカゼインを加水分解したところ、明所下で産生されたプロテアーゼは暗所下で産生されたものより高い ACE 阻害活性を示すオリゴペプチドを生成することが認められた。したがって、産生された
細胞外プロテアーゼは光条件によって異なる酵素活性を有することが分かった。

Preparation of Highly Functionalized Gold Nanoparticles via One-step
Modification by AuNP-tag Conjugated Biomolecules

Bioactive oligopeptides produced by extracellular proteases photoinduced
from the aerial microalga○Haruka Matoba2, Yasuhide Maehara1, Yojiro Shigemori2, Naoyuki Ishida2,
Koreyoshi Imamura2, Hiroyuki Imanaka2(1Fac. Eng., Okayama Univ., 2Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Okayama Univ.)

Key words

biosensor, immobilization, peptide, gold colloid○Yuki Inoue, Nobuhiro Aburai, Katuya Abe(Dept. Chem., life sci., Sch. Eng., Kogakuin Univ.)

Key words

aerial microalgae, protease, casein, oligopeptide

ペプチド工学

3P-2a161 環状バクテリオシン enterocin NKR-5-3B の生合成における環状化部位アミノ酸残基の影響

259

3P-2a163 ペプチド修飾ポアセンサによる微生物検出○大河内 美奈 1,2, イルファ ハヌン ハルリサ 1, 武藤 正記 1,2,
田中 祐圭 1,2, 横田 一道 2,3, 筒井 真楠 2,3, 谷口 正輝 2,3, 川合 知二 2,3（1東工大・物質理工学院, 2ImPACT, 3阪大・産研）
okochi@chemeng.titech.ac.jp○善藤 威史 1, 杉野 春貴 1, Perez Rodney Honrada 1, 石橋 直樹 1,
中山 二郎 1, 園元 謙二 1,2（1九大院・農, 2九大・バイオアーク）
zendo@agr.kyushu-u.ac.jp

細菌によってリボソーム上で合成される抗菌ペプチドであるバクテリオシンは、主に生産菌の近縁種に対し強い抗菌活性を示す。とくに、N 末端と C 末端がペプチド結合した構造をもつ環状バクテリオシンは、高い安定性を有し、食品保存料や医薬品をはじめとする様々な分野への利用が期待される。発酵食品より分離された乳酸菌 Enterococcus faecium NKR-5-3 によって生産される環状バクテ
リオシン enterocin NKR-5-3B（Ent53B）は、様々なグラム陽性細菌に対して抗菌活性を示す。Ent53B は 64 アミノ酸残基で構成され、その直鎖状の前駆体は
23 アミノ酸残基のリーダー配列を N 末端側に有する [1,2]。環状バクテリオシンの生合成は、リーダー配列の切断、環状化、菌体外排出の 3 つの過程を経ると考えられるが、その詳細は未だ明らかとなっていない。そこで本研究は Ent53B
生合成機構の解明を目的とし、ここではとくに Ent53B の環状化部位のアミノ酸残基に着目し、生合成への影響について評価した。
環状化部位の Leu1 と Trp64 を種々のアミノ酸に置換した発現用プラスミドを作成し、それぞれを異種発現用宿主 Enterococcus faecalis JH2-2 に導入した。各変
異株の変異 Ent53B 生産能を抗菌活性試験と精製・質量分析による変異体の検出によって評価した。その結果、Leu1 と Trp64 のいずれの場合にも、この領域の α へリックス構造の維持が予想される変異の場合のみで変異 Ent53B が検出され、この α へリックス構造の維持が生合成に必要と考えられた。また、同様にして、リーダー配列に種々の変異を加え、その生合成への影響についても評価を進めている。
[1] Himeno K. et al., Biochemistry, 54, 4863-4876 (2015); [2] Perez R.H. et al., J.
Bacteriol., 198, 291-300 (2015).

ペプチドは低分子でありながら、標的分子に対して親和性を有することから、
マイクロ・ナノシステムにおける検出用プローブとして優れた特性を有する。
本研究では、溶液中の微生物、粒子をはじめ単一分子検出において注目される
ポアセンサに着目し、細菌結合性を示すペプチドを修飾した小型・安価な細菌検出デバイスの構築を目的とした。微生物認識受容体である Toll 様受容体、特にリポ多糖認識分子として機能する TLR4 のアミノ酸配列に基づいたペプチドアレイを作製し、グラム陰性菌である大腸菌に結合性を示すペプチドを探索した。大腸菌との結合試験の結果、高い結合性を示す領域が３つ見出された。また、これらの蛍光標識ペプチドを作製し、リポ多糖との結合性をドットブロッ
ト法により比較した結果、高結合性を示す配列の同定に成功した。そこで、ポア内にペプチドを固定化した電極を用いたイオン電流波形を解析したところ、
ペプチド修飾により大腸菌の通過時間が顕著に増加することが示された。ペプ
チドの修飾により、未修飾の場合と比較して細菌との相互作用が増し、ポアセ
ンサ内を通過する時間が増加したものと考えられる。これらの結果より、ペプチド修飾により多様な混入物の存在下においても細菌の検出が可能となるものと期待される。

Characterization of amino acid residues involved in circularization ofenterocin NKR-5-3B

Microbial detection using peptide modified-pore sensor○Takeshi Zendo1, Haruki Sugino1, Rodney Honrada Perez1, Naoki Ishibashi1,
Jiro Nakayama1, Kenji Sonomoto1,2(1Fac. Agric., Kyushu Univ., 2Bio-Arch., Kyushu Univ.)

Key words

bacteriocin, lactic acid bacteria, biosynthesis, circular peptide

3P-2a162 金ナノ粒子合成に寄与する二機能性ペプチドのキャラク
タリゼーション

○田中 祐圭 1,2, 大河内 美奈 1,2（1東工大・物質理工学院, 2JST・ImPACT）
okochi@chemeng.titech.ac.jp○Mina Okochi1,2, Ilva Hanun Harlisa1, Masaki Muto1,2, Masayoshi Tanaka1,2,
Kazumichi Yokota2,3, Makusu Tsutsui2,3, Masateru Taniguchi2,3, Tomoji Kawai2,3(1Dept. Chem. Sci. & Eng., Tokyo Tech., 2ImPACT, 3ISIR, Osaka Univ.)

Key words

peptide, pore sensor, bacteria

3P-2a164 大豆タンパク質由来カチオン性ペプチドの抗菌・抗炎症・創傷治癒活性の解析○齊藤 健吾, 野本 貴史, 落合 秋人, 田中 孝明, 谷口 正之（新潟大・自然研）
mtanig@eng.niigata-u.ac.jp

ペプチドは、生体分子やナノ材料など幅広い物質に親和性を持つことが知られ、標的生体分子とバイオセンサ素子を繋ぐ界面形成やナノ粒子合成の形態制御に利用される。本研究では、センサの電極材料としても利用される金に着目し、ペプチドアレイを利用した金ナノ粒子(AuNPs)結合性ペプチドの同定、並びにこれらの配列のキャラクタリゼーションを行うことを目的とした。
600 種類のペプチドからなるペプチドアレイを作製し、AuNPs との結合試験を行った。ここで高い結合性を示したペプチド中に存在するアミノ酸出現頻度を解析し、当該アミノ酸が優先的に存在するペプチド配列から構成されたペプチ
ドアレイを再設計し、結合試験を再度実施した。この結合試験とペプチドアレ
イの設計を３回繰り返すことで、優れた金結合性を示すペプチドのスクリーニ
ングを行なった。
その結果、AuNPs 結合能を示す多数のペプチドのスクリーニングに成功した。
最も高い AuNPs 結合能を示したペプチド(AuP1, 2, 3)のペプチドアレイを作成
し、AuNPs 溶液並びに AuCl4-溶液に浸漬したところ、これらの配列は、AuNPs
結合能だけでなく、金イオンを還元し多様な形態を持つナノプレートを合成できる二機能性ペプチドであることが示された。また AuP1, 2, 3 ペプチドの断片化ライブラリー対する結合試験の結果から、複数の AuNPs 結合や金イオン還元
モチーフが同定された。今後、これらのペプチドを利活用することで、溶液中に限らず基板表面においても温和な条件で緻密に制御されたナノ粒子を合成・配置可能な新たな技術を創出できると期待される。

【目的】大豆タンパク質由来ペプチドには、血中コレステロールや中性脂肪の低下、抗糖尿病などの効果があることが報告されている。そこで、代表的な大豆
タンパク質であるグリシニンおよび β-コングリシニンの α サブユニットと β サ
ブユニットのアミノ酸配列に着目し、抗菌ペプチドに共通する特徴に基づいて、カチオン性ペプチドを探索し、7 種類のペプチドを見出した。本研究では、異なるタンパク質由来の 3 種類のカチオン性ペプチドを選択し、4 種類のヒト病
原微生物に対する抗菌活性、LPS 中和活性、および血管新生促進活性を解析した。
【方法】歯周病菌 Porphyromonas gingivalis，日和見感染真菌 Candida albicans，
アクネ菌 Propionibacterium acnes、およびう蝕菌 Streptococcus mutans に対する抗菌活性を，生菌数に由来する ATP を測定することで評価し，50％増殖阻害濃度（IC50）を算出した。また、リムルステストによってリポ多糖（LPS）中和活性を検討し、50％反応阻害有効濃度（EC50）を算出した。さらに、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）をマトリゲル上で培養し、血管新生(管腔形成)促進作用を検討した。
【結果】３種類のペプチドは、歯周病菌と日和見感染真菌に対して抗菌活性を発揮した。そのときの IC50 は、30～65μM であった。また、３種類のペプチドは、いずれも強い LPS 中和活性を示したことから、抗炎症作用があることが示唆された。今後、血管新生促進作用について検討する予定である。

Characterization of bi-functional peptide responsible for gold nanoparticle
synthesis

Evaluation of antimicrobial, anti-inflammatory, and angiogenic activities ofcationic peptides derived from soy proteins○Masayoshi Tanaka1,2, Mina Okochi1,2(1Sch. Mater. Chem. Tech., Tokyo Tech, 2JST・ImPACT)

Key words

gold colloid, peptide chip

○Kengo Saito, Takahumi Nomoto, Akihito Ochiai, Takaaki Tanaka,
Masayuki Taniguchi(Grad. Sch. Sci. Technol., Niigata Univ.)

Key words
soy bean peptide, antimicrobial peptide, anti-inflammatory peptide,
angiogenic peptide

260

ペプチド工学3P-2a165 アミノ酸置換によるコメ抗菌ペプチドの抗炎症活性の増強とその機構の解明

3P-2a167 ローヤルゼリー酵素加水分解物からの生理活性ペプチドの精製と同定およびその機能解析○豊田 竜, 金子 陽徳, 落合 秋人, 田中 孝明, 谷口 正之（新潟大・自然研）
mtanig@eng.niigata-u.ac.jp○平塚 祐也, 川部 純弥, 落合 秋人, 田中 孝明, 谷口 正之（新潟大・自然研）
mtanig@eng.niigata-u.ac.jp【 目的 】 当研究室ではコメ α-アミラーゼ由来ペプチド（Amy I-1-18）が, 抗菌,
抗炎症, 創傷治癒などの多彩な生体防御機能を有することを見出している。そこで本研究では, 本ペプチドの抗炎症活性を増強するために, 5 種類の 1 残基アミノ酸置換体を化学合成し, リポ多糖（LPS）刺激によって誘導されるマクロファー
ジの一酸化窒素（NO）産生に対する抑制効果について検討した。また, LPS の作用の抑制に関わるこれらのペプチドが有する機構を解明するために, リムルス
テストを用いて各ペプチドと LPS の相互作用を解析した。
【 実験方法 】 18 残基のアミノ酸からなる Amy I-1-18 中の 1 残基のアミノ酸をアルギニン, またはロイシンに置換した 5 種類の置換体を化学合成した。マウス
マクロファージ細胞（RAW264 細胞）をコンフルエントな状態まで培養した
後, 各濃度のペプチドと 100 ng/ml の Escherichia coli 由来 LPS を添加し, 産生される NO 量を, Griess 試薬を用いて測定した。また, ペプチドによるエンドトキ
シン中和活性を, リムルステスト（生化学工業 （株））を用いて測定し, 50%有効濃度（EC50）を求めた。
【 結果 】 4 種類の置換体の抗炎症作用は, Amy I-1-18 に比べて高くなり, エンド
トキシン中和活性も 3 種類の置換体において向上した。したがって, 3 種類の置
換体は LPS に結合して抗炎症活性を発揮していると考えられる。現在, Biacoreを用いて各置換体と LPS の相互作用を解析中である。

【目的】これまでに本研究室では，米や大豆などの食品タンパク質から抗菌，抗炎症，創傷治癒などの機能を有する生体防御ペプチドの探索，精製および同定を行ってきた。それらのペプチドに共通する特徴として，分子量が 1,000～3,000
Da であること，正味の正電荷を有すること，等電点が 8 以上のカチオン性であることが挙げられる。そこで本研究では，ローヤルゼリー酵素加水分解物を等電点電気泳動によって，20 の画分に分画し，得られた画分の抗菌活性を測定
し，活性を確認できた画分に含まれるペプチドを同定した。

Effect of amino acid substitution on anti-inflammatory activity andmechanism of action of an octadecapeptide derived from rice.

Purification, identification, and characterization of bioactive peptides fromenzymatic hydrolysate of royal jelly

Key words
cationic peptide, anti-inflammatory peptide, antimicrobial peptide,
LPS-neutralizing activity

Key words

3P-2a166 アミノ酸置換によるコメ抗菌ペプチドの創傷治癒活性の3P-2a168 大豆タンパク質酵素加水分解物からの生理活性ペプチド○Ryu Toyoda, Akinori Kaneko, Akihito Ochiai, Takaaki Tanaka,
Masayuki Taniguchi(Grad. Sch. Sci. Technol., Niigata Univ.)増強とその機構の解明○生江 俊樹, 豊田 竜, 落合 秋人, 田中 孝明, 谷口 正之（新潟大・自然研）
mtanig@eng.niigata-u.ac.jp【方法】ローヤルゼリー酵素加水分解物((株)山田養蜂場本社)を，調製用等電点
電気泳動装置（Rotofor, BioRad）を用いて 20 の画分に分画した。各画分の歯周病菌，アクネ菌，う蝕菌，および日和見感染真菌に対する抗菌活性を，生菌に由来する ATP を測定することによって算出した。活性を検出できた画分から逆
相クロマトグラフィーを用いてペプチドを精製し，得られたピーク画分に含まれるペプチドを MALDI TOF-MS を用いて同定した。
【結果】ローヤルゼリー酵素加水分解物を，等電点電気泳動によって 20 画分に分画した結果，いくつかの等電点の高い画分に，強い抗菌活性が確認された。
そこで，特に塩基性の高い画分 No.19 と No.20 に含まれるペプチドを，逆相ク
ロマトグラフィーを用いて精製し，MALDI TOF-MS を用いて同定した。現在までに，画分 No.20 から 10 種類のペプチドを同定できている。

○Yuya Hiratsuka, Jun-ya Kawabe, Akihito Ochiai, Takaaki Tanaka,
Masayuki Taniguchi(Grad. Sch. Sci. Technol., Niigata Univ.)

antimicrobial peptide, royal jelly protein, cationic peptideの精製と同定およびその機能解析○野田 悠輔, 川部 純弥, 落合 秋人, 田中 孝明, 谷口 正之（新潟大・自然研）
mtanig@eng.niigata-u.ac.jp【目的】当研究室ではコメ α-アミラーゼ由来ペプチド（AmyI-1-18）が，抗菌、抗炎症、創傷治癒などの多彩な生体防御機能を有することを見出している。そこで、本研究では、AmyI-1-18 とその 3 種類のアルギニン置換体と 2 種類のロ
イシン置換体の創傷治癒活性を、血管新生促進作用と細胞遊走促進作用に関して比較し、アミノ酸置換の効果を検討した。また，阻害剤を用いて、AmyI-1-18とその置換体の作用機構を解析した。
【実験方法】創傷治癒作用を評価するために、血管新生（管腔形成）促進試験
を、次のようにして行った。予め 96 ウェルプレートに Matrigel を添加し、人工基底膜を作製し、その上にヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）とペプチドをそれぞれ添加した。一定時間培養した後に、顕微鏡で管腔構造を形成した細胞を観察し、その細胞の長さの合計を測定した。細胞遊走促進（スクラッチ）試験では、24 ウェルプレートに HUVEC をコンフルエントな状態まで培養した後、スティックによって一定の幅の創傷を作製した。その直後にペプチドを添加して、創傷の面積を 24 時間ごとに測定した。
【結果】AmyI-1-18 またはロイシン置換体（N3L）を添加した場合に、血管構造をした細胞がより密な状態となり、その細胞の長さの合計がコントロールに比べて増加した。また、AmyI-1-18 または N3L を添加した場合に、細胞遊走が促進され、創傷閉鎖がコントロールと比べて促進された。現在、各種阻害剤を用いて作用機構について検討している。

【目的】当研究室では，これまでにコメタンパク質加水分解物や納豆抽出物から抗菌、抗炎症、創傷治癒などの生理活性を有するカチオン性ペプチドを見出している。それらのペプチドは，分子量が 1,000～3,000 Da 程度であること，正味の正電荷を持つこと，等電点が８以上のカチオン性であることなどの共通の特性を有していた。そこで本研究では，大豆タンパク質加水分解物を等電点電気泳動によって分離し，等電点の異なるペプチドを調製した。また，各画分の抗菌活性を測定し，活性を検出できた画分からペプチドを精製し、同定した。
【実験方法】本研究では，大豆タンパク質加水分解物(不二製油グループ本社(株))から高分子成分と低分子成分を除去した後，得られた酵素加水分解物を，等電点電気泳動装置（Rotofor, BioRad）を用いて分画した。得られた各画分の歯周病菌，アクネ菌，う蝕菌，および日和見感染真菌に対する抗菌活性を，生菌に由来する ATP を定量することによって測定した。活性を検出できた画分から逆
相クロマトグラフィーを用いてペプチドを精製し，得られたピーク画分に含まれるペプチドを MALDI TOF-MS を用いて同定した。
【結果】大豆タンパク質加水分解物を，等電点電気泳動によって 20 画分に分画した。いくつかの画分は，歯周病菌とアクネ菌に対して抗菌活性を発揮した。
抗菌活性は等電点が高い画分ばかりでなく，中性付近に等電点を有する画分からも検出できた。現在、各画分からペプチドを同定している。

Effect of amino acid substitution on wound healing activity and mechanismof action of an octadecapeptide derived from rice.

Purification, identification, and characterization of bioactive peptides fromenzymatic hydrolysate of soybeans.

Key words
substitution of amino acids, wound healing, angiogenic activity,
migration-promoting peptide

Key words
soybean peptide, antimicrobial peptide, host defense peptide,isoelectric focusing○Toshiki Namae, Tayoda Ryu, Ochiai Akihito, Tanaka Takaaki,
Taniguchi Masayuki(Grad. Sch. Sci. Technol., Niigata Univ.)○Yuusuke Noda, Jyunya Kawabe, Akihito Ochiai, Takaaki Tanaka,
Masayuki Taniguchi(Grad. Sch. Sci. Technol., Niigata Univ.)

ペプチド工学／脂質工学

3P-2a169 コメ糠タンパク質酵素加水分解物からのカチオン性ペプ
チドの精製と同定およびその生理活性の解明

261

3P-2a171 マイクロ流路による water-in-oil エマルジョンの調製○池田 奈央, 岩上 千華, 伊藤 伸哉, 牧野 祥嗣（富山県大・工）makino@pu-toyama.ac.jp○谷口 正之, 亀田 光裕, 落合 秋人, 田中 孝明（新潟大・自然研）
mtanig@eng.niigata-u.ac.jp【目的】本研究では，コメ糠タンパク質の酵素加水分解液を等電点電気泳動によって分離し，カチオン性ペプチドを調製した。得られた画分の生理活性を明らかにするために，ヒト病原微生物に対する抗菌活性を測定した。また，抗菌活性を有する画分に含まれるペプチドを精製し，質量分析計を用いて同定した。
さらに，同定したペプチドを化学合成し，それらの抗菌活性，LPS 中和活性，および血管新生促進活性について検討した。
【実験方法】本研究では，プロテアーゼを用いてコメ糠タンパク質を加水分解
し，ペプチドサンプルを調製した。得られたペプチドサンプルを，調製用等電点電気泳動装置（BioRad, Rotofor）を用いて 20 の画分に分画した。各画分の歯周病菌，アクネ菌，う蝕菌，および日和見感染真菌に対する抗菌活性を測定した。次に，逆相クロマトグラフィーを用いて活性を検出できた画分からペプチドを精製し，MALDI TOF-MS を用いて各画分に含まれるペプチドを同定した。
同定したペプチドを化学合成し，それらの抗菌活性，LPS 中和活性，および血管新生促進活性を測定した。
【結果】ペプシンを用いてコメ糠タンパク質を加水分解した後，等電点電気泳動によって 20 画分に分画した。等電点が高い 3 つの画分から，等電点が 9 以上の27 種類のペプチドを同定できた。同定したペプチドのうち 9 種類を化学合成
し，それらの抗菌活性，LPS 中和活性，および血管新生促進活性を測定した結果，5 種類のペプチドは 3 つの生理活性を兼ね備えていた。

【目的】経口、経静脈などの非局所投与では、薬物は全身に到達する。すなわ
ち、薬物は患部以外の正常組織へも作用する。そのため、例えば抗がん剤のよ
うな細胞毒性の高い薬剤が投与されると、患者はひどい副作用に悩まされることになる。この問題を解決するため、DDS（ドラッグデリバリーシステム）の開発が進められてきた。DDS は、患部のみに薬物を送達して作用させるための重要技術である。我々は、DDS キャリアとして有用なリポソームの、マイクロ
流路チップ上での連続生産の実現を目指している。本研究では、脂質二重層からなるリポソームへ変換するための単層エマルジョンを、マイクロ流路チップ上で作製した。
【方法】まず、各流路幅が 50μm のマイクロ流路に水系緩衝液と有機溶媒を流し、それら 2 流路の合流点で water-in-oil（w/o）エマルジョンを作製した。水相と油相の流速比と脂質の種類を検討し、エマルジョンの直径を小さくするよう試みた。また、チップ貼り合わせ面へのオイルの浸透を抑制させるために流路の加工法を検討し、流路の耐油性を高めた。
【結果】水相と油相の流速比と脂質の種類を検討し、直径 20～30 μm の w/o エ
マルジョンを作製した。オレイン酸や 1-ヘキサノールなどの有機溶媒を油相として、またメチレンブルー含有の水系緩衝材を水相として用いたところ、内水相が青色のエマルジョンの生成が顕微鏡下で観察された。w/o エマルジョンの生成は、有機溶媒内の脂質の有無に影響されなかった。各液相の流速、リポソー
ム生成のための脂質、調製時の温度等の詳細な結果を報告する。

Purification, identification, and characterization of cationic peptides fromenzymatic hydrolysate of rice bran protein

Production of water-in-oil emulsion on microfluidic chip

○Masayuki Taniguchi, Mitsuhiro Kameda, Akihito Ochiai, Takaaki Tanaka(Grad. Sch. Sci. Technol., Niigata Univ.)

Key words
peptiderice bran protein, bioactive peptide, multifunctional peptide, cationic

3P-2a170 納豆水抽出物中のカチオン性ペプチドの精製と同定およびその生理活性の解析○Nao Ikeda, Chika Iwakami, Nobuya Itoh, Yoshihide Makino(Fac. Eng., Toyama Pref. Univ.)

Key words

drug delivery system, water-in-oil emulsion, microfluidic chip, lipid

3P-2a172 蜂の子に含まれるグリコシルセラミドの免疫細胞に対する活性の解析

○野本 貴史, 幡本 晃太, 落合 秋人, 田中 孝明, 谷口 正之（新潟大・自然研）
mtanig@eng.niigata-u.ac.jp○酒谷 真以 1, 濱 侑紀 2, 松永 陽香 1, 藤川 彩美 1, 門脇 真史 1,
鶴田 裕美 3, 吉賀 豊司 1, 浜島 弘史 1, 柘植 圭介 3, 北垣 浩志 1
（1佐賀大院・農, 2株式会社正栄, 3佐賀工技セ）
ktgkhrs@cc.saga-u.ac.jp【目的】大豆たんぱく質由来ペプチドにはコレステロール代謝改善，抗肥満，食欲抑制効果などの機能があることが報告されている。そこで本研究では，大豆
タンパク質由来の新たな生理活性ペプチドを探索するために，納豆に着目した。
納豆水抽出物中に含まれるペプチドを等電点電気泳動によって分画し，抗菌活性を検出できた画分からペプチドを精製し，同定した。さらに，同定したペプ
チドを化学合成し，それらの生理活性を解析した。
【実験手法】本研究では，等電点電気泳動装置(Rotofor：Bio-Rad)を用いて，納豆水抽出物を 20 の画分に分画した。各画分の歯周病菌，アクネ菌，および日和見感染真菌に対する抗菌活性を測定した。活性を検出できた画分に含まれるペプチドを逆相クロマトグラフィーにより精製し，各ピークに含まれるペプチドを MALDI-TOF/MS を用いて同定した。同定したペプチドの中から 12 種類のカ
チオン性ペプチドを化学合成した。合成したペプチドの抗菌，LPS 中和，および血管新生促進の各活性を測定した。
【結果】画分 No.16 と No.17 は歯周病菌に対して，画分 No.18～No.20 はアクネ菌に対して，それぞれ抗菌活性を発揮した。抗菌活性を検出した画分からペプ
チドを精製した結果，88 種類のペプチドを同定できた。この中から 12 種類のカチオン性ペプチドを化学合成し，それらの生理活性を測定した結果，いくつかのペプチドが抗菌活性と血管新生促進活性を有することがわかった。現在，
LPS 中和活性を測定中である。

【背景・目的】蜂の子は永い食経験がある伝統食であるが、機能性に関する報告はほとんどない。そこで蜂の子由来の機能性成分が見つかれば、養蜂業者が多い九州地方において新たな産業シーズとなることが期待される。また近年スズメバチの被害が拡大しており、こうした取り組みは駆除に繋がる可能性もある。これまで人体には存在しない α-ガラクトシルセラミドが CD1d 受容体に結合し、癌細胞に対する攻撃性を持つ iNKT(invariant natural killer T)細胞を活性することが報告されている。そこで本研究では、蜂の子には多くの機能性の報告があるグリコシ
ルセラミド(GC)が存在するのか、存在するとすれば免疫細胞に対する活性を持っているのかの検証を行った。
【実験方法】
蜂の子脂質を Bligh-Dyer 法で抽出し、オープンカラムクロマトグラフィーで粗精製後、TLC 上で展開した目的脂質を掻き取り有機溶媒で溶解し精製した。得られた分画は LPS 刺激により炎症性メディエーターを誘発したマウス由来マクロファー RAW264.7 株に添加し、Griess 反応を用いた一酸化窒素(NO)産生量、
ELISA による炎症性サイトカイン(TNF-α,IL-6)産生量の測定を行った。
【結果・考察】蜂の子から GC と思われる脂質分子を見つけ精製した後、ESI-MS/MS によるフラグメントイオン解析を行った結果、Caenorhabditis elegans で既に報告がある
GC の MS フラグメントパターンと一致した。このことから、蜂の子にも無脊動物に存在する GC が存在していると考えられた。次に精製した蜂の子 GC を
LPS の刺激を受けた RAW264.7 細胞株に添加したところ、添加濃度に応じた NO
産生量の抑制が確認された(無添加区に比べ 1.5μg/mL 添加区で最大 20%の抑制率,p<0.001)。また、炎症性サイトカインでも同様の傾向が確認された。さらに
細胞毒性は確認されず、蜂の子 GC には細胞傷害性のない抗炎症作用があることが示唆された。

Purification, identification, and characterization of cationic peptides fromwater extract of natto

Immunosuppression activity of glycosylceramide contained in the larva ofbees○Takafumi Nomoto, Kota Hatamoto, Akihito Ochiai, Takaaki Tanaka,
Masayuki Taniguchi(Grad. Sch. Sci. Technol., Niigata Univ.)

Key words

natto, soy bean peptide, bioactive peptide, multifunctional peptide○Mai Sakatani1, Yuki Hama2, Haruka Matsunaga1, Ayami Fujikawa1,
Masafumi Kadowaki1, Yumi Tsuruta3, Toyoshi Yoshiga1, Hiroshi Hamajima1,
Keisuke Tsuge3, Hiroshi Kitagaki1(1Fac.Agric., Saga Univ., 2Shoei Corp., 3Industrial Technology Center of Saga)

Key words

functionality, larvae, bee

262

脂質工学／生物工学若手研究者の集い（若手会）

3P-2a173 局所麻酔薬による膜ラフト模倣構造熱安定性の低下○菅原 恒, 下川 直史, 高木 昌宏（北陸先端大・マテリアル）
takagi@jaist.ac.jp

背景
近年の研究で局所麻酔薬(local anesthetic(LA))の作用メカニズムについて、膜チャネルへの直接的な結合の他に、生体膜の物性変化の重要性が示唆されている。
これまで我々は、膜ラフト構造のモデル系である Liquid-ordered(Lo)/Liquiddisordered(Ld)とに相分離したリポソームにおいて、各相間における流動性の差
が、局所麻酔薬の添加によって小さくなり相分離形成が阻害されることを報告した。過去の研究に基づき、膜ラフト模倣構造の熱安定性に対する局所麻酔薬の影響を解析した。
方法
脂質として飽和脂質(DPPC)、不飽和脂質(DOPC)、コレステロール(Chol)を用いた。DPPC/LA 膜および DPPC/Chol/LA 膜の各温度(25~42℃)の流動性を、Laurdan
蛍光スペクトルの GP 値より解析した。DOPC/DPPC/LA および DOPC/DPPC/
Chol/LA における膜の相分離構造の形成率を温度ごと(20~32℃)に観察し、相分離構造の消失温度（形成率が 50%になる温度：miscibility temperature (Tm)）を測定した。観察には、蛍光顕微鏡を用いた。
結果と考察
GP 値解析より DPPC/LA、および DPPC/Cholesterol/LA 双方の系で、脂質の転移に対応する GP 値の急激な減少が DPPC のみよりも低い温度で見られ、その温度は両者で差が無い事が解った。この結果は、DPPC からなる Solid-ordered (So)相、および DPPC/Chol からなる Lo 相の熱安定性が LA により低下する事を示唆している。しかし DOPC/DPPC/LA 膜に比べ、DOPC/DPPC/Chol/LA では、Tmが顕著に低下していた。これらの結果は、(1)DOPC/DPPC(So/Ld)系で LA は、
DOPC(Ld)領域に存在し、DPPC 領域(So)に分配されない事、(2)DOPC/DPPC/
Chol(Lo/Ld)系では、LA の DPPC/Chol 領域(Lo)への分配が促進される事、(3)LAは DOPC/DPPC/Chol におけるラフト模倣構造である Lo/Ld 相分離構造の熱安定性を低下させる事、が解った。

Decrease in thermostability of membrane raft-model structures by additionof local anesthetics○Ko Sugahara, Naofumi Shimokawa, Masahiro Takagi(Sch. Mater. Sci., JAIST)

Key words

local anesthetic, liposome, lipid raft, thermostability

3P-2a174 浸透圧印加による荷電脂質膜の張力誘起相分離○山本 遼太, 下川 直史, 高木 昌宏（北陸先端大・マテリアル）
takagi@jaist.ac.jp

3P-2a175 リン脂質組成非対称リポソームにおける膜内外層間相互作用と相分離挙動○大井 克仁, 下川 直史, 高木 昌宏（北陸先端大・マテリアル）
takagi@jaist.ac.jp[背景]
リン脂質分子から成る二重膜構造は細胞膜のモデル系として注目されており、多成分リン脂質膜の膜面で起こる相分離現象は細胞におけるラフトモデルとの関係から興味が持たれている。しかし、細胞膜は二重膜の内層と外層で異なる
脂質組成を有しているにもかかわらず、多くの細胞モデル膜であるリポソームを用いた研究では、脂質組成の非対称性は考慮されてこなかった。さらに、細胞膜の内膜に多く存在する負電荷脂質は膜電位に関係しており、荷電脂質を含む非対称膜の挙動を明らかにすることは重要である。そこで我々は脂質組成非対称二重膜を作成し相分離挙動を観察した。特に、二重膜内外層間の相互作用に注目し、その役割を解明することを目的とした。
[実験方法]
中性不飽和脂質(DOPC)、負電荷不飽和脂質(DOPG)、中性飽和脂質(DPPC)、負
電荷飽和脂質(DPPG)を用いた。非対称リポソームは液滴法により作成した。塩として 1 価の NaCl を、相分離構造を蛍光顕微鏡で観察するために不飽和脂質を染色する Rhodamine-DHPE を用いた。
[結果]
脂質組成非対称リポソームにおいて、外膜が飽和脂質で構成されたリポソーム
は、外膜が不飽和脂質で構成されたものよりも多くの相分離形成が観察された。
これは、内膜に形成される飽和脂質に富んだ固体ドメインは外膜が脂質の場合に安定化されることを示している。さらに、二重膜内外層で荷電脂質の量が異なるリポソームの作成に成功した。内膜に DPPG を含む場合に相分離が促進される結果を得た。これは脂質組成が対称のリポソームで得られた結果と一致している。さらに、塩濃度がリポソーム内外で非対称の場合の相挙動についても議論する。

Role of Interleaflet interaction in phase separation of asymmetric lipid
membranes○Katsuhito Ooi, Naofumi Shimokawa, Masahiro Takagi(Sch. Mater. Sci., JAIST)

Key words
interaction

phase separation, biomimetic membrane, charged lipid, interleaflet

3P-2a176 振盪フラスコ培養中の気相および液相の CO2 と O2 の挙動解析○高橋 将人, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp[背景と目的] リン脂質は水中で自発的に脂質二重膜構造を形成し、これが閉じた構造をリポソームという。リポソームは細胞膜のモデル系として注目されており、特に多成分の脂質から成るリポソームでは組成の不均一な構造が形成される。これは相分離として理解され、細胞膜におけるラフトと対応付けられている。リポソームの構造制御は、基礎的な細胞機能の理解だけではなく、応用的にも、ドラッグデリバリーシステムの開発等と関連して重要である。しかし、リポソームの構造は、安定であるために外部からの擾乱が必要となる。そこで、本研究では塩や電場に応答する荷電脂質膜の基礎的な相分離制御を目指し、リ
ポソームに浸透圧を印加することによる張力誘起相分離の観察を行った。
[実験方法] 脂質は DOPG(負電荷不飽和脂質)、DPPC(中性飽和脂質)、Cholesterolを用いた。また蛍光試薬として Rhodamine DHPE を用いた。リポソームは静置
水和法で作製し、リポソーム内の溶液濃度が高くなるようにグルコースを用いてサンプルを調製した。観察は蛍光顕微鏡を用いて行った。
[結果・考察] 先行研究では、中性脂質から成るリポソームへ浸透圧による張力を印加した際、相分離ドメインの誘起が報告されている。本研究における荷電脂質から成るリポソームへの浸透圧による張力の印加においても、濃度勾配の上昇に伴う相分離ドメインの出現が観察された。荷電脂質を含む三成分系リポ
ソームの各組成比を変化させ、浸透圧による張力を加えることで、相分離ドメ
イン形成の誘起やその相状態について総合的に議論する。特に、張力印加に伴いコレステロールの局在に変化が現れるかに注目する。

【目的】
我々は、“環境試料の振盪フラスコ培養中に、適切な方法（無菌的な培養栓の開封、通気、吸引操作）で気相環境を間欠的に変化させると、集積される培養微生物群集が大きく変化する”という新奇な現象を見出した 1~3)。本研究では、この新奇な現象の解明を目指し、振盪培養中のフラスコの気相と液相（培養液）のガス成分（CO2 と O2）のモニタリングを試みた（これまで振盪培養中のフラ
スコの気相や液相のガス成分の挙動は十分に解析されていない）。また、得られた結果に基づき、振盪フラスコ培養法の問題点の把握と解決策の提案を試みた。
【方法および結果】
従来の測定法の問題点を排除し、振盪を中断せずに培養液の採取ができ、振盪
フラスコ培養中の気相や液相の CO2 と O2 の濃度を連続測定できるシステムを開発した。Escherichia coli K12 を三角フラスコ（EF）、坂口フラスコ（SF）および我々が開発した特殊円筒型フラスコ（S-CF）で振盪培養し、開発したシス
テムを用いて培養中の気相と液相のガス成分を比較解析した。気相部の初発
CO2 濃度は約 0.06%であったが、培養に伴い EF、SF、SCF でそれぞれ、3.5%、
5.5%、0.33%まで増加した。培養液中の最大 CO2 濃度は EF、SF、S-CF でそれ
ぞれ 39 mg/L、62 mg/L、3.5 mg/L であった。S-CF は EF や SF と比べて CO2 濃
度を低く抑えることができた。気相部の初発 O2 濃度は 20.9%であったが、培養に伴い EF、SF でそれぞれ、17.2%、13.9%まで減少し、S-CF では 20%を維持した。一方、培養液中の O2 濃度はどのフラスコも同様な経過で減少した。本研
究は振盪フラスコ培養中の気相と液相の CO2 と O2 の挙動を連続的に把握した初めての報告である。現在、振盪フラスコ培養中の CO2 と O2 が種々の微生物の生理活性に及ぼす影響について検討中である。
1）H24 生物工学会要旨集 p. 156, 2）H26 生物工学会要旨集 p. 248, 3）H27 生物工学会要旨集 p. 138

Tension-induced phase separation by osmotic stress in charged lipid
membranes

Behavior analysis of CO2 and O2 in gas-liquid phases of shake flask during
cultivation○Ryota Yamamoto, Naofumi Shimokawa, Masahiro Takagi(Sch. Mater. Sci., JAIST)

Key words

liposome, charged lipid, membrane tension, phase separation○Masato Takahashi, Hideki Aoyagi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

carbon dioxide, gas-liquid phases, oxygen, shake flask culture生物工学若手研究者の集い（若手会）

3P-2a177 組換え大腸菌を用いたラムノースを出発基質とする 1-プ
ロパノール発酵生産

263

3P-2a179 油脂生産と菌体内油脂回収に適した Lipomyces 酵母のスクリーニング○柳場 まな 1, 正木 和夫 2, 南アルプス市 3＊, 長沼 孝文 1
（1山梨大院・医工総・生命, 2(独)酒類総研, 3南アルプス市）
tnaganuma@yamanashi.ac.jp○松原 充, 浦野 信行, 鳴滝 藍, 山田 尚平, 片岡 道彦（阪府大院・生環科）
kataoka@biochem.osakafu-u.ac.jp【目的】1-プロパノールは代表的な汎用ポリマーであるポリプロピレンの単量体であるプロピレンへ容易に変換できるため，ポリマー原料としての価値が注目されている．ポリマー原料としての 1-プロパノールをバイオマスから生産することが可能となれば，より長期間の CO2 固定という面において大きな効果が期待できる．一方，ラムノースは未利用バイオマスの 1 つであるペクチンの主要な構成糖であり，その有効な利用法が求められている．そこで本研究では，ラムノースを出発基質とする 1-プロパノール発酵生産について，組換え Escherichia
coli を用いて検討を行った．
【方法と結果】E. coli はラムノースを資化する内在性経路を有しており，細胞内に取り込まれたラムノースは，ジヒドロキシアセトンリン酸とラクトアルデヒ
ド (LA) に分割され，LA はさらに 1,2-プロパンジオール (1,2-PD) へ変換される．
そこで E. coli に対し，1,2-PD から 1-プロパノールへの変換反応を触媒する
Klebsiella pneumoniae 由来の酵素遺伝子群の導入を試みた．得られた株を用いて，ラムノースを炭素源とする培地で嫌気的に培養を行ったところ，ラムノー
スの消費とともに 1-プロパノールの生成が認められた．
さらに，1-プロパノールへ至る経路内の中間生成物の分解代謝あるいは副産物生成に関わる酵素遺伝子の破壊株を宿主として用いることで，1-プロパノール
収率の向上を試みた．まず，野生株および 12 種類の遺伝子破壊株 (1-プロパノー
ル合成能未導入) を使用し，ラムノースからの 1,2-PD 収率を指標として検討した．その結果，LA を分解代謝する酵素遺伝子である aldA の破壊を含む 5 種類の株において，野生株よりも高い 1,2-PD 収量・収率が得られた．さらにこれらの株に対して 1-プロパノール合成能を賦与したところ，野生株よりも高い 1-プ
ロパノール収量・収率が得られた．

【背景と目的】 我々は、油脂生産酵母 Lipomyces を用いて低価値な再生可能資源からバイオディーゼル燃料(BDF)の原料となる油脂の生産に関する研究をおこなっている。この研究を実用化するためには、原料炭素源を高効率で油脂に変換でき、かつ菌体内油脂を低コストで回収できる菌株の取得が最優先されると考えた。本報告は分譲および野外分離菌株を用いて、これらの目的に見合う菌株を取得するための解析をおこなうと共に、菌株の決定を試みた。
【結果と考察】 多数の菌株の油脂生産能力を効率良く調べるために、顕微鏡を用いて Oil globule size(μm3)を測定する方法を用いた。得られた値の定量的数値への読み替えをおこなう目的で Oil content(mg/108cells)を測定し、Oil globule sizeとの比較をおこなった。この size が大きい場合には、Oil content との間に相関性が高いことがわかった。
Oil content は Fat coefficient (g oil/100g sugar used)と関係があり、Oil content が多いものは Fat coefficient も高かった。Oil produced(g/ℓ)に対しても Oil content の高いものが有利であることがわかった。また、Oil content (=Oil globule size)の高いものの方が、簡単な処理で容易に菌体内油脂が漏出される傾向がみられた。
Lipomyces を用いた BDF 用油脂の生産には、再生可能資源の廃棄モモ果汁と残炊飯米を用いることを当面は想定していることから、この研究に利用可能な Fatcoefficient と油脂の回収し易さを重点に、これに Oil produced を加えた三つを選択指標としてスクリーニングをおこなった。廃棄モモ果汁において得られた菌株は、Fat coefficient と Oil produced は高いが菌体内油脂回収に難点があった。
残炊飯米では Fat coefficient と Oil produced は高いが油脂回収がし難い菌株と、前者二つはそれほど高くないが油脂回収がし易い菌株が得られた。

Fermentative production of 1-propanol from L-rhamnose using
recombinant Eshcerichia coli

Screening of yeast Lipomyces for oil production and intracellular oil
recovery○Mitsuru Matsubara, Nobuyuki Urano, Ai Narutaki, Shohei Yamada,Michihiko Kataoka(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Key words

Escherichia coli, metabolic engineering, fermentation, 1-propanol

3P-2a178 精製プロセスを伴わない低分子抗体の定量的薬効・蛋白質間相互作用スクリーニング＊

著者からの希望により自治体名を記載しています。

○Mana Yanagiba1, Kazuo Masaki2, Minami-Alps City3＊, Takafumi Naganuma1(1Grad. Sch. Med. Eng., Univ. Yamanashi, 2NRIB, 3Minami-Alps City)

Key words

Lipomyces screening, oil production, intracellular oil recovery

3P-2a180 ミジンコにおける 2A ペプチドを用いたバイシストロ
ニック発現システムの構築○杉山 在生人 1, 梅津 光央 1, 中澤 光 1, 浅野 竜太郎 2,
二井手 哲平 1, 服部 峰充 1, 熊谷 泉 1（1東北大院・工, 2農工大院・工）mitsuo@prn.che.tohoku.ac.jp○熊谷 仁志, 加藤 泰彦, 松浦 友亮, 渡邉 肇
（阪大院・工）hawatana@gmail.com

がん細胞および T-リンパ球表面蛋白質を標的とする 2 種類の抗体の可変領域断片のみから構成される低分子型の二重特異性抗体(ディアボディ)は、T 細胞を用いたがん細胞への傷害機構や腫瘍に対する高い浸透力等、IgG 型抗体にはない利点を有しており次世代型の抗体医薬として期待されている。
しかし、その薬効は可変領域断片の組合せによって 1000 倍以上変化してしまう
ことが分かっており、高い薬効を示すディアボディ開発には網羅的に可変領域
断片を組み合わせ、それらディアボディ群をハイスループットにスクリーニン
グする手法開発が重要だと我々は考えている。そのため、我々はこれまでに遺伝子設計を出発点とした発現ベクターの効率的作製法およびワンステップ精製を介する薬効評価法を開発してきたが、精製プロセスを伴うため迅速性に課題があった。そこで、本研究では未精製段階でディアボディ濃度を定量することで精製プロセスが不要な薬効スクリーニング法を開発し、遺伝子設計から薬効の網羅的評価までの一貫したスクリーニングプロセスの構築を目指した。
まず、ディアボディの C 末端に付加した 2 種のペプチドタグを介した sandwich
ELISA 法を構築することで、未精製な培地上清中に含まれるディアボディの濃度を定量した。これに既開発の薬効スクリーニングを組み合わせることで、100種を超えるライブラリから高薬効型ディアボディ 8 種を簡便にスクリーニング
できた。また、表面プラズモン共鳴法との組み合わせによって標的分子に対する簡易的な結合活性評価も試みたため合わせて報告する。

バイシストロニック発現システムとは、1 つのプロモーターから 2 つのタンパ
ク質を発現させるシステムのことで、原核生物で一般に用いられている。この手法を真核生物に導入することで、遺伝子組み換え個体を作製した際にレポーター遺伝子と目的遺伝子の共発現が可能になり、スクリーニングが簡便になる。
これを可能にする配列が「2A ペプチド」である。2A ペプチドはリボソームのトランスフェラーゼ活性を阻害し、ポリペプチド鎖の連結を抑制する。これにより、2A ペプチドの上流と下流の遺伝子が共発現する。
オオミジンコ(Daphnia magna)は淡水系に広く生息しており、毒性学、進化学、生態学などのモデル生物として長年利用されてきた。近年では、TALEN、
CRISPR/Cas9 を用いたゲノム編集も可能になっている。しかしながら、ミジン
コにおける共発現システムはまだ確立してない。そこで本研究では、ミジンコ
における 2A ペプチドの機能と活性を調べた。
2A ペプチドレポーターミジンコを作製し、その切断活性を調べた。切断活性を調べるため、2A の上流と下流で異なる蛍光タンパク質遺伝子を発現させ、蛍光顕微鏡下での観察と Western Blot 法を行うことにした。ミジンコの全身で機能する EF1a プロモーターの制御下で、細胞膜で赤色、核で緑色蛍光タンパク質を発現するプラスミド(Myr-mCherry-2A-H2B-GFP)を設計した。それを Cas9 タ
ンパク質と一緒にマイクロインジェクションを用いてミジンコの卵に導入した。
その結果、1 種類の遺伝子組換え個体の創出に成功した。この個体を蛍光顕微鏡で観察したところ、赤色と緑色蛍光タンパク質の異所的な発現を確認することができた。それに加えて、mCherry と GFP が切断されていることを GFP 抗体を使用した Western Blot を用いて確認した。これらの結果はミジンコにおいて
2A ペプチドが機能していることを示唆している。

Quantitative cytotoxicity screening of antibody and protein-protein
interaction without purification process

Use of the bicistronic expression involving viral 2A peptide in Daphnia○Aruto Sugiyama1, Mitsuo Umetsu1, Hikaru Nakazawa1, Ryutaro Asano2,
Teppei Niide1, Takamitsu Hattori1, Izumi Kumagai1(1Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 2Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words

Cancer Therapy, Bispeific antibody, high-throughput screening

magna○Hitoshi Kumagai, Yasuhiko Kato, Tomoaki Matsuura, Hajime Watanabe(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

Daphnia magna, 2A-peptide, CRISPR/Cas9

264

生物工学若手研究者の集い（若手会）

3P-2a181 核酸医薬原料となるヌクレオシドアナログ生産に有用な
微生物触媒の探索と機能解析

3P-2a183 生体制御分子硫酸体の生理機能評価技術開発○下平 武彦 1, 黒木 勝久 1, Liu Ming-Cheh 2, 榊原 陽一 1,
水光 正仁 1
（1宮崎大院・農工総合, 2トレド大・薬）ysakaki@cc.miyazaki-u.ac.jp○光川 侑輝, 日比 慎, 松谷 成裕, 堀之内 伸行, 高橋 里美, 小川 順
（京大院・農）ogawa@kais.kyoto-u.ac.jp【背景と目的】
核酸医薬は低分子医薬や抗体医薬に続く新たな分子標的医薬であり、その高い標的特異性と低い抗原性に期待が集まる一方、積極的な酵素的分解に曝されることから患者体内での安定性に課題が残っている。この解決策として考えられているのが、2’-O-methylribonucleoside (2’-OMe-NR)をはじめとした修飾型ヌク
レオシドアナログの RNA 鎖への導入による酵素耐性の付与である。ただ、こうしたヌクレオシドアナログ、特にプリンアナログの有機化学合成には多段階の反応が必要となり、コスト及び環境負荷が産業生産上の大きな課題となっている。そこで本研究室では酵素法による温和かつ効率的なプリンアナログ合成法の開発、及び利用可能なヌクレオシドアナログのバリエーションの拡大を目
指し、産業的に有用な微生物触媒の探索を行っている。
【結果】
保存菌株及び土壌分離菌のスクリーニングにより 2’-O-methyluridine (2’-OMeUR)の変換活性を持つ微生物として乳酸菌 1 株と放線菌 1 株を得た。また、これらの菌株より新規な nucleoside hydrolase を単離、同定した。これらの酵素は2’-OMe-NR に対する加水分解活性に加えて糖転移活性も保有し、2’-OMe-UR とAdenine を基質とする 2’-O-methyladenosine (2’-OMe-AR)の酵素的合成が初めて可能となった。本酵素を用いた 2’-OMe-AR 合成には基質及び生成物の加水分解による収率低下が課題となったが、各種条件検討より、適当濃度のグリセロー
ルの添加によって加水分解活性のみを選択的に抑制し収率の改善を達成することができた。現在、加水分解との競合下における糖転移反応の速度論的解析を行っており、さらなる収率向上への応用を検討している。また、この他にもス
クリーニングから新規な 2’-OMe-NR 代謝酵素を持つ微生物を得ており、その詳
細な機能および生理学的背景についても調査を進めている。

【背景・目的】 生体制御分子の一種であるポリフェノール化合物は、抗ガン作用等の様々な生理機能を持つ。これらの化合物は摂取されると肝臓や腸管で硫酸転移酵素(SULTs)などの薬物代謝第二相酵素により代謝される。近年、このようなポリフェノールの代謝産物が、様々な細胞応答に関与し、多くの疾病に関わる G タンパク質共役型受容体(GPCR)に作用し機能することが報告された。硫酸体においても同様に GPCR へ作用する可能性が考えられるが、機能性も未だ解明されていない。そこで本研究では生体制御分子硫酸体の GPCR への作用に焦点をあて、GPCR に対する機能評価系の構築および、硫酸体の生理機能解明を目的に研究を行った。
【方法】 様々な生体制御分子硫酸体は、SULT を発現させた大腸菌により遺伝子工学的に調製した。得られた生体制御分子硫酸体は HPLC 解析、質量分析、
NMR 解析にて構造決定した。次に、調製した硫酸体を用いて、ヒト肝がん由来細胞株（HepG2）に対する増殖抑制効果を確認した。さらに、各種 GPCR を強発現させたヒト胎児腎細胞(293T)に、GPCR シグナルの下流の転写応答に関与する応答配列を組み込んだルシフェラーゼレポーターベクターを遺伝子導入
し、GPCR を介した機能評価系を構築した。この評価細胞を用いて、調製した
生体制御分子硫酸体の GPCR に対する機能評価を行った。
【結果・考察】 様々な生体制御分子硫酸体にガン細胞増殖抑制効果があることが確認できた。さらに GPCR の機能評価系にて、いくつかの硫酸体において硫酸体未処理区と比較しルシフェラーゼ活性の変化が確認できた。以上の結果から、生体制御分子硫酸体の GPCR を介したシグナル伝達系への関与が示されたので、今後更なる作用メカニズム解明を行う。

Novel 2’-O-methylribonucleoside-metabolizing enzymes promising for the
nucleic acid drug production

Functional analysis of sulfated bioregulatory molecules

Key words
2'-O-methylribonucleoside, nucleoside hydrolase, transribosylation,
nucleic acid drug

Key words

3P-2a182 スイホウガンによる抗原特異的な抗体生産系の開発

3P-2a184 mRNA から構成される多入力 microRNA 応答性人工遺○Yuuki Mitsukawa, Makoto Hibi, Narihiro Matsutani, Nobuyuki Horinouchi,
Satomi Takahashi, Jun Ogawa(Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)○額田 夏生 1, アヴシャル 恵利子 1, 中井 沙織 1, 都築 祥子 1,
田丸 浩 1,2,3（1三重大院・生資, 2三重大・生命支セ, 3三重大・新産業）
ytamaru@bio.mie-u.ac.jp○Takehiko Shimohira1, Katsuhisa Kurogi1, Ming-Cheh Liu2, Yoichi Sakakibara1,
Masahito Suiko1(1Interdiscip. Grad. sch. Agric. and Eng., Univ. Miyazaki., 2Dept. Pharm., Coll.
Pharm. and Pharm. sci., Univ. Toledo.)
Sulfotransferase, Sulfated polyphenol, GPCR, CRE-luciferase assay

伝子回路の構築

○松浦 理史 1,2, 藤田 祥彦 2, 齊藤 博英 2
（1京大院・医, 2京大・iPS細胞研）
hirohide.saito@cira.kyoto-u.ac.jp【背景】7 回膜貫通型タンパク質 GPCR を含む膜タンパク質は、既存および開発中の医薬品のほぼ半数が標的としており、治療・診断薬やタンパク質の結晶化に用いる有用抗体の新規開発が期待されている。しかし、従来のマウスやラビットといった哺乳動物を用いた方法では、抗原タンパク質の相同性が高いと免疫寛容によって有用な抗体が作製できない場合がある。このような問題を克服するために、脊椎動物の源流に位置しており、自然免疫系に加えて獲得免疫系を保有する魚類を用いた抗体生産系の開発を目指した。本研究では、スイホウガ
ン（水泡眼）という眼下に角膜が肥大化した水泡を有するキンギョを免疫動物として抗体生産系の開発を行った。
【方法】スイホウガンの水泡液中に含まれる goldfish Immunoglobulin M（gIgM）を検出するために大腸菌を用いて gIgM 重鎖の CH3 領域の組換えタンパク質を作製し、ウサギへ免疫することによって抗 gIgM ウサギポリクローナル抗体を作製した。また、投与した抗原タンパク質に特異的な抗体が産生されたかどうか調べるために、Enhanced Green Fluorescent Protein（EGFP）を抗原タンパク質として水泡液中に複数回注入して免疫を行った。免疫したスイホウガンから水泡液を採取し、標的タンパク質 EGFP に対する抗体産生の有無を ELISA 法を用いて確認した。
【結果・考察】作製した抗 gIgM ウサギポリクローナル抗体を用いて、水泡液中の gIgM を ELISA 法によって定量的に検出することができた。さらに、EGFPを抗原として免疫した個体の水泡液中に EGFP 特異的抗体が産生されていることが確認された。以上の結果、スイホウガンを免疫ホスト動物として利用して抗原特異的抗体のスクリーニングおよびライブラリーを構築し、特異性や親和性の高い抗体の単離およびキンギョ抗体の特性解析をして抗体医薬に応用した
いと考えている。

microRNA はノンコーディング RNA の一種であり、標的遺伝子の下方制御を通じて分化、発生、腫瘍形成、等様々な細胞プロセスに関わっている。その発現
プロファイルは細胞種によって異なることが知られている。それゆえに、特定の microRNA に応答して導入遺伝子の発現を制御できるような人工遺伝子回路
は細胞種特異的な機能制御システムとして有用である。しかしながら、既存のmicroRNA 応答性遺伝子回路は DNA から構成されているため、回路を導入した細胞のゲノムへ挿入される可能性があり、安全上問題がある。そこで我々の研究室では近年、DNA と比べて安全な人工 RNA から成る遺伝子回路を提唱して実際にヒト細胞内で機能することを実証した。その仕組みとしては RNA 結合
タンパク質を利用した転写後制御を基盤としており、検出したい microRNA の発現に応じて出力遺伝子の発現が ON となるシステムである。しかしながら、
RNA から成る遺伝子回路は DNA から成るそれに比べてダイナミックレンジ(出力レベルの ON、OFF 比率)が低いという問題がある。また、複数の microRNAを同時検出できるような多入力回路はまだ実現していない。本研究では、ダイ
ナミックレンジの改善、多入力応答回路の実現という 2 つの課題に取り組んだ。
評価はフローサイトメーターを用いた蛍光定量アッセイにより行った。今回、
我々は microRNA に対する感受性を高めることでダイナミックレンジを改善できることを実証する。更に、基本的な論理回路として多入力応答性の AND 回路や OR 回路が細胞内でプログラム通りに作動できることも実証する。本研究により、RNA を基盤とした、より精密でかつ安全な細胞運命制御システムが実現するであろう。応用例としては分化誘導の際に生じる、未分化細胞の除去などが挙げられる。

Research and development of specific antibody production by goldfish

The construction of multi-input microRNA-responsive synthetic genetic
circuit with mRNAs○Natsuki Nukada1, Eriko Avsar1, Saori Nakai1, Shoko Tsuzuki1, Yutaka Tamaru1,2,3(1Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ., 2Life Sci. Res. Center, Mie Univ., 3Ind. Technol.
Innov. Inst., Mie Univ.)

Key words

antibody, immunity, goldfish○Satoshi Matsuura1,2, Yoshihiko Fujita2, Hirohide Saito2(1Grad. Sch. Med. Kyoto Univ., 2CiRA, Kyoto Univ.)

Key words
microRNA, post-translational regulation, synthetic genetic circuit,synthetic biology

酒類製造における革新技術【本部企画】

3S-Ap01

未利用資源のエネルギーを利用した焼酎製造○奥村 隆享（霧島酒造）
takayuki-okumura@kirishima.co.jp

3S-Ap02265

清酒醸造を支える酵母開発技術○中原 克己, 稲橋 正明（日本醸造協会）
labo@jozo.or.jp

芋焼酎は、大地の恵みである農産物（サツマイモ、米）が原料です。当社は、その大地の恵みを余すことなく最大限利用するために、焼酎製造工程から排出される焼酎粕や芋くずを未利用資源として捉え、メタン発酵によりガスを回収し、エネルギー源として利用しています。焼酎粕とは、発酵した焼酎もろみを蒸留した後に残った粕のことです。また、芋くずとは、選別工程で傷ついていたり、大きさを整える時に出た切れ端などの取り除かれた部分のことです。芋
焼酎の場合、出来上がる焼酎の約 2 倍の焼酎粕が発生し、1 日約 650 トンになります。従来のメタン発酵方法では、焼酎粕の液部のみしかメタン発酵できませんでした。そのため、ガス回収率が低く、焼酎粕の固液分離が律速となっていました。更に残った固体部分の処理も大きな課題でした。現在では、固定床式高温メタン発酵システムを採用することで、効率的にガス回収が行えるようになりました。固定床式は微生物を保持する担体がメタン発酵槽内で固定されているため、微生物の流出が起こりにくく効率的にガス回収が行えます。また、微生物の反応が速い高温発酵（約 55℃）により粘性があり固形物が多い焼酎粕
の高速処理を可能にしています。メタン発酵により有機物 80％以上、固形分60％以上が分解されてバイオガスが発生します。このバイオガスは、焼酎粕１
トン当たり約 40Nm3 発生し、メタン濃度 60％、硫化水素濃度 1,000ppm であり、脱硫塔で硫化水素を除去し、ガスホルダを経由して焼酎製造工程のボイラーへ供給されます。バイオガスは 24 時間連続的に発生し、焼酎製造工程に優先的に供給されますが、バイオガスの需要は原料の種類、工程、時間帯毎に大きく変動するため、余剰ガスが発生します。この余剰ガスは余剰量を確認しながら３基のガスエンジン発電機を台数制御し、無駄なくバイオガスを使い切るように運転パターンを工夫しています。バイオガスを 100％使い切る事が、大地の恵みを余すことなく最大限利用することに繋がっていきます。これら一連の取組を紹介します。

清酒酵母は矢部規矩治により 1895 年（明治 28 年）初めて報告された。それ以来、多くの清酒酵母が優良な仕込み（醪）から分離されてきた。これらの優良清酒酵母を全国の清酒製造蔵元へ広めるために、1906 年に醸造協会（現、日本醸造協会）は設立された。優良酵母には番号がつけられ、きょうかい○号酵母として頒布されている。
研究者の創意・工夫による清酒酵母の開発は、1960 年代に国税庁醸造試験所の秋山らによる「泡なし」酵母から始まった。それまでの清酒酵母には高泡を形成する特徴があり、清酒の仕込み時に大量の泡を発生させるため、タンクに半分の量しか仕込みを行うことができなかった。1963 年、島根県の一酒造場で清酒の仕込みに泡の発生しない現象が連続して見られた。この現象をもとに泡を発生させない優良清酒酵母の開発が試みられた。高泡を形成する酵母には空気の泡に吸着する性質が見られることが分かり、この性質を利用して、泡に吸着しない酵母を自然変異の中から見つけ出し、「泡なし」酵母は誕生した。「泡なし」酵母は、仕込み作業の効率があがるなどメリットが多いため、今では販売されているきょうかい酵母の約 85%が「泡なし」酵母である。
1973 年をピークに清酒の消費量は下がりはじめた。平成の時代に入り、清酒業
界では品質の多様化による消費拡大として吟醸酒や純米酒への取り組みが進んだ。そのため、特徴ある清酒酵母の開発が多方面で行われた。中でも吟醸酒特有の香りの高い酵母の開発が数多く行われ、各地で各県開発吟醸酵母として利用され始めた。また、特徴的な香気を高生成する酵母や機能性を有する酵母の開発が行われた。
我々は清酒の品質に大きな影響をおよぼす有機酸に着目した。清酒製造は並行
複発酵といわれ、麹による糖化と酵母によるアルコール発酵が同時に行われる。
糖化と発酵のバランスをコントロールすることが清酒醸造においてとても重要である。しかし、多数の仕込みを行っていれば中には糖化と発酵のバランスを崩し、多酸傾向になってしまうこともある。この問題を解決するために、既存の各種きょうかい酵母と比較して、大幅に酸生成の少ない清酒酵母を開発した。
また、清酒の味の多様化として、酸味に特徴がある清酒を目指した。清酒中に含まれる主な有機酸は乳酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸である。酸に特長のある清酒をつくるには有機酸を直接添加する方法を除くと、微生物を利用する方法が考えられ、乳酸菌を利用して乳酸を高める方法とクエン酸生成の多い
焼酎用の麹を利用してクエン酸を高める方法などが知られていた。そこで従来の方法では高められなかった酸、中でもリンゴ酸に注目した。リンゴ酸の割合を高め、かつ全体としても酸生成の多い清酒酵母を開発した。
さらに各県による吟醸酵母の開発の時流に乗り、先に開発した少酸・多酸性酵
母のそれぞれに、カプロン酸エチルを多く作り出す特性を付け加えた。このため酸生成が少ない・多い、香気生成が高い・低い、の合計 4 タイプの酵母を開発した。
上記の 4 タイプのうち、少酸性高香気生成酵母の利用が進んだが、各県の吟醸酵母と比較される中で、この酵母は欠点として味が重いとの指摘が多くなされるようになった。原因に当たる成分を調べたところ、イソアミルアルコールを多く生成することが分かった。イソアミルアルコールは官能評価で嫌われるムレ香の主成分であるイソバレルアルデヒドの前駆物質でもあり、ムレ香の発生を抑えるために貯蔵管理を難しくさせる。そのためイソアミルアルコールが少なく、少酸性高香気生成の長所を生かした酵母を新たに開発した。
これらの清酒醸造のニーズに合わせた酵母の開発を紹介する。

The manufacturing of sweet potato shochu utilizing the biomass energy

Yeast breeding techniques to support the sake brewing○Takayuki Okumura(Kirishima Shuzou Co.,Ltd.)Key words

shochu, biomass, energy○Katsumi Nakahara, Masaaki Inahashi(Brewing Society Japan)

Key words

sake yeast, Saccharomyces cerevisiae, sake brewing

266

酒類製造における革新技術【本部企画】

3S-Ap03

泡盛の商品展開における基盤研究の活用○塚原 正俊（バイオジェット）tsuka@biojet.jp

3S-Ap04

酒類製造における革新技術；まるごと果実瞬間凍結粉砕
浸漬製法 Freeze-Crush-Infusion (FCI)○藤原 裕之（サントリースピリッツ）
Hiroyuki_Fujiwara@suntory.co.jp

泡盛は、沖縄で独自に発展した約 600 年の歴史を有する日本最古の蒸留酒である。原材料は米（主にタイ米）、水、黒麹菌、酵母であり、蒸留は古来からの手法である単式蒸留に限定されている。さらに、伝統的に年単位の熟成により風味が豊かになった「古酒（くーす）」が珍重され、泡盛における重要な付加価値となっている。しかしながら、これまでに泡盛を対象とした研究報告例は他の酒類と比較して少なく、多面的に研究開発を進める意義は大きい。我々は、これまで多くの機関と連携し、研究シーズを産業応用につなげる取り組みを通じて、泡盛のバラエティー化に資する研究や新商品開発に取り組んできた。今回、学術的な分析結果や評価技術を産業化につなげた成果について紹介したい。
＜泡盛黒麹菌＞
現在の泡盛醸造では、限られた黒麹菌株が用いられている。これは、戦前、各酒造所は独自菌株を用いていたものの、第 2 次世界大戦における沖縄戦の壊滅的な被害でほぼ全ての菌株が失われた後、醸造特性が高い菌株が採取・実用化
され、泡盛の復興につながったという歴史的背景が要因となっている。一方、新たな泡盛黒麹菌の開発を目指す上では、黒麹菌の系統分類が長年の間混とんとしていたことが実用化研究のハードルとなっていた。近年、黒麹菌が Aspergillus
luchuensis として再分類されたことで（Yamada et al., J. Biosci. Bioeng., 112,233-237, 2011）、泡盛黒麹菌の新たな研究開発の道が開かれた。我々は、泡盛黒麹菌の詳細な解析に取り組み、現在の泡盛醸造に用いられている黒麹菌が全てAspergillus luchuensis であること、泡盛醸造に用いられている株は様々な遺伝的差異が認められ泡盛の香味に影響を与えること、などを明らかにした。さらに、
泡盛醸造において混合して用いられてきた２菌株（ISH1、ISH2）について、混合比を変えて製麹することで風味の異なる泡盛醸造が可能であることを見出すと共に、本技術を用いた泡盛銘柄の商品化につなげることができた。
＜泡盛酵母＞
泡盛醸造に用いられている酵母は、泡盛黒麹菌と同様に第 2 次世界大戦の影響で、ほとんどの銘柄で 101 号酵母が用いられている。我々は、新たな泡盛酵母を開発する試みとして、自然界から複数の泡盛酵母を確立し、目標とする香気成分の特徴を有する複数の泡盛銘柄を商品化することができた。一方、101 号
酵母が泡盛醸造に適した特性を多く有していることを活用しつつ新たな泡盛酵母の開発につなげる取り組みとして、101 号酵母を親株として新たな酵母を育種する取り組みを進め、泡盛醸造に適した基本的特性を維持し、異なる風味の泡盛を醸造しうる酵母「101H 酵母」を確立し（Takagi et al., J. Biosci. Bioeng.,
119, 140-147, 2015; 生物工学論文賞）、商品化につなげることができた。
＜香味解析＞
新商品開発における評価や、販売店や飲食店における商品アピールに用いるデー
タ取得を目的として、泡盛の総合的な風味の特徴を科学的に評価する手法の構築を進めてきた。官能評価法は、特にアルコール飲料では困難さが伴うため、泡盛を対象として迅速かつ精度の高い評価技術を検討してきた。香りの評価としてフラッシュ GC ノーズ HERACLES II、味分析として電子味覚システム
ASTREE を用いた。各測定条件を泡盛に至適化し、市販されている約 200 銘柄の泡盛について網羅的な解析を行った。さらに、官能評価との統合解析の結果、香り及び味の 2 軸からなる泡盛風味プロファイルを作成した。得られた「泡盛味わいマップ」のデータの応用例として、那覇空港で 6 店舗を展開するエアポー
トトレーディング社と連携し、泡盛の小売りの現場での活用を開始した。本シ
ステムは泡盛の販促に活用され、来客者及び販売者から良好な反響を得ている。
弊社は基盤技術から応用までの一貫性を重視した対応を中心的業務としている。
その上で、得られた基盤情報を様々な産業界で具体的に応用し成果につなげる
ことが、産業振興はもちろん基盤研究の再評価や発展につながると確信し、企業や大学、研究機関とのネットワークを駆使した迅速な連携による新たな価値の創出を目指している。泡盛は沖縄という一地域の特産品であるものの、その特性は不明な点が多く、今後の泡盛振興、あるいは、他の酒類への波及しうる技術として貢献できると考えている。
この場をお借りして、これまでの取り組みに尽力していただいた琉球大学、奈良先端科学技術大学院大学、酒類総合研究所、農研機構食品研究部門、および多くの泡盛酒造所の皆様、および社員に深く感謝します。

日本の酒類総市場は、人口減少などの影響で全体に縮小傾向にある一方で、缶チューハイやハイボールなどの低アルコール（3～9％）飲料は大きく伸長を続けている。当社ではこれらの低アルコール飲料を Ready-to-drink (RTD)と呼んでいるが、RTD は従来より、ニュートラルなアルコールと果汁（ストレートまたは濃縮）をブレンドして製造されるタイプのものが市場のほとんどを占めていた。当社は 2005 年に新技術「まるごと果実瞬間凍結粉砕製法; Freeze-CrushInfusion (FCI)」を開発し、「‐196℃」というブランド名の RTD を発売した。
FCI 製法（特許取得済）の概要は次の通りである。まるごと果実を液体窒素で瞬間凍結し、数 10μm の大きさまで粉砕する。パウダー状に粉砕された果実をニュートラル・アルコールに浸漬し、不溶物をろ過することによって「FCI 原料酒」が完成となる。
FCI 製法には技術的に 3 つのキーポイントが存在する。すなわち、まるごと果
実・凍結粉砕・アルコール浸漬である。第一に、まるごと果実を使用することによって、多くの成分を FCI 原料酒中に含ませることができる。果実の芳香性成分は一般に果皮や内膜、種に多く存在するが、これらは通常の果汁には含まれない。第二に、凍結粉砕加工は一切の加熱や酸化を伴わない工程であるが、これもまた通常の市販果汁と異なる点である。第三に、アルコールに浸漬することによって、親水性と親油性の両方の成分を FCI 原料酒に溶け込ませることができるが、これもまた果汁とは異なる点となる。
この新技術「FCI 製法」によって、当社は現在 RTD 市場のリーディングカンパ
ニーとなっている。（2016 年 5 月現在）
当日は直近の国内外の酒類市場についても紹介する。

Application of scientific research to product development of Awamori

Development of new technology in spirits: Freeze-Crush-Infusion method○Masatoshi Tsukahara(Biojet)Key words

Awamori, yeast, Aspergillus luchuensis○Hiroyuki Fujiwara(Suntory Spirits Ltd.)Key words

spirits, fruits, ready-to-drink (RTD), Freeze-Crush-Infusion (FCI)

酒類製造における革新技術【本部企画】／生命ビッグデータ の利活用による生物工学のイノベーション

3S-Ap05

研究開発の知見を生産技術に活用する事例紹介○伊藤 義訓（アサヒビール・ 研究開発本部）
yoshinori.ito@asahibeer.co.jp

3S-Bp01267

グローバル化時代と地球温暖化に適した晩生コシヒカリの NGS 解析に基づく開発○富田 因則 1, 岩瀬 雄大 1, 石井 一夫 2
（1静岡大・グリーン科学技術研究所, 2農工大）omtomit@ipc.shizuoka.ac.jp

ビール製品に影響を及ぼす化合物の数は数千といわれている。またその一つ一つの化合物の生成に及ぼす要因も数多くありまたそれらの要因がお互いに影響を及ぼしている。
すなわち小スケールの実験系で得られたファクトをそのまま現業に応用することはできない。一方、生産の現場では日々均一の品質の商品を製造していくことが必須となっている。我々は研究所の知見を工場での生産技術に展開するうえにおいて、目標の品質を工場で日々作りこむためのコントロールポイントを生産現場に提案しそのコントロールポイントを現場での生産工程に落しこむ業
務を日々行っている。本報告ではこの活動の一部を報告する。

[背景]地球温暖化により、イネの主要品種「コシヒカリ」に高温障害が発生するとともに、多発化する台風による倒伏で深刻なダメージを被っている。加えて、環太平洋連携協定（TPP）の妥結に伴い、「コシヒカリ」が既に生産されている米国と豪州に新たにコメの輸入枠を設けたため、安価な外国産コシヒカリの流入が必至となった。従って、高温登熟を避けるとともに、より低コストで多収生産が可能な「スーパーコシヒカリ」を育成する必要がある。これまで、「コシヒカリ」に足りない遺伝子を付与するため、DNA マーカー選抜によって「コシヒカリ」への目的遺伝子の戻し交雑移入を進めてきた。さらに、次世代シーケンサー（NGS）による全ゲノムの解読によって、目的遺伝子が入っているかどうか、その他の配列が元の品種と同じかどうかが一目瞭然となれば、目的遺伝子以外は「コシヒカリ」のゲノムからなる新品種の早期開発が期待される。
[実験材料及び方法]本研究では、伊勢神宮の神田で発見された変異種で「コシヒカリ」より 6 日晩生の「イセヒカリ」を高温登熟回避の遺伝子給源として期待し、遺伝子解析を試みた。まず、「コシヒカリ」と「イセヒカリ」との交雑
F2 および F3 において、「イセヒカリ」よりもさらに晩生の遺伝子型が分離し、固定した。続いて、F3 で固定した晩生系統を 1 回親、「コシヒカリ」を反復親にして「コシヒカリ」への 4 回の戻し交雑を行った結果、「イセヒカリ」に由来
し、「コシヒカリ」の遺伝的背景で 12 日の晩生効果をもつ不完全優性の 1 個の遺伝子 Hd-i の存在が明らかとなった。
以上のように、「コシヒカリ」に「イセヒカリ」に由来する晩生遺伝子 Hd-i を
4 回の戻し交雑で移入した「コシヒカリ Hd-i」(BC4F2)と「コシヒカリ」の全ゲノムを解読するため、Nextera トランスポソームでゲノム DNA をタグ付けしつ
つ断片化し、PCR で両末端にシーケンスプライマーとなる配列を含むアダプ
ターを合成後、磁性ビーズで DNA 断片をサイズ選択して、定性・定量分析し、NGS 解析用の DNA ライブリーを作製した。これを次世代シーケンサー HiSeq
によりペアエンドリード条件で解読し、得られたリード配列を「日本晴」のゲノムをリファレンス配列として、ソフトウェア BWA を用いてマッピングした。
[結果]次世代シーケンサーによるリシーケンス解析の結果、「コシヒカリ Hd-i」
でカバー率が 99.1％、平均 depth が 61.52 となり、「コシヒカリ」ではカバー率
が 99.0％、平均 depth が 35.68 となった。さらに、全ゲノムの vcf ファイルを作成し、「コシヒカリ」の仮想ゲノムを構築して「コシヒカリ Hd-i」のゲノム配列と比較した結果、第 3 染色体の 33046628～34376629 の約 1.3 Mb の領域に
SNP、INDEL が集中して存在する他は、ほぼ「コシヒカリ」のゲノムに置換されていた。この 1.3 Mb 領域の中にある、Hd16 遺伝子の第 9 エキソンに 1 個のSNP が検出されたことから、Hd-i は Hd16 と同じアリルと考えられる。本研究によって開発した、コシヒカリより 12 日晩生化し、約 99%コシヒカリのゲノムを持つ「コシヒカリ Hd16」は、これまで「コシヒカリ」一辺倒といえる我が国の稲作において、8 月の猛暑期の開花、登熟を避けるとともに、適地適作を可能にする「コシヒカリ型晩生品種」として期待できる。
本研究は、JST 研究成果最適展開支援プログラム A-STEP 産学共同促進ステー
ジハイリスク挑戦タイプ「グローバル化時代と地球温暖化に適した超多収・大粒・早晩生イネの次世代シーケンサー・ゲノムワイド解析による開発：研究責
任者 富田因則」による成果である。

Case studies on exploiting knowledge of R&D for industrial technology

NGS-based development of late-flowering rice suitable for the globalized
world and global warming○Yoshinori Ito(R&D Div., Asahi Breweries, Ltd.)Key words

beer, production, technology○Motonori Tomita1, Yuta Iwase1, Kazuo Ishii2(1Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words

whole genome sequencing, genome integration, rice, Oryza sativa

268

生命ビッグデータ の利活用による生物工学のイノベーション

3S-Bp02

網羅的遺伝子発現情報から重要遺伝子群を選択する方法の確立

3S-Bp03○Deden Derajat Matra1,2,4, Toshinori Kozaki3, Kazuo Ishii3,
Eiichi Inoue4(1Plant Prod. Div., Dept. Agro. Hort., Fac. Agric., Bogor
Agricultural Univ., 2United Grad. Sch. Agric. Sci., Tokyo Univ.
Agric. Technol., 3Grad. Sch. Agric., Tokyo Univ. Agric. Technol.,4
Coll. Agric., Ibaraki Univ.)
dedenmatra@apps.ipb.ac.id○小林 拓嗣 1, 古崎 利紀 2, 石井 一夫 2, 有江 力 3, 山形 洋平 1,3（1農工大院・連農, 2農工大院・農学系ゲノム人材育成プログラム, 3農工大院・農）s143821z@st.go.tuat.ac.jp【バックグラウンド】 ある遺伝子の機能を調べるために、遺伝子欠損株の遺伝
子発現変化を次世代シーケンサー (RNA-Seq) やマイクロアレイで網羅的に解析することが一般的に行われている。得られた網羅的遺伝子発現情報から、コントロール株との発現変動比の大きさや統計処理による有意差検定により発現変動遺伝子 (DEGs) を抽出する。DEGs を Gene Ontology (GO) 解析やパスウェイ解析により生物学的意義付けを行うことで、どのような機能を持つ遺伝子の発現が変動していたかを調べる。これらの解析により、欠損させた遺伝子の機能を推測することになる。上記の方法では、DEGs がどのような機能を持っているか、何のタンパク質をコードしているのかといった情報が必要である。しかし、生物種によってはこの情報が充実していないものがあり、BLAST 検索でも機能を推定できずに predicted protein のままであるものの割合が多い場合がある。
【チャレンジ】 この predicted protein を詳細に解析すれば、目的の遺伝子の機能解析に有用な情報を得ることができるが、重要な（=目的の遺伝子との関係が深い）順に数を絞る必要がある。重要な遺伝子を絞り込む指標として、発現変動比やスチューデント t 検定の p 値を用いることが考えられるが、これらの順番が重要な遺伝子順になるとは限らない。また、ある遺伝子が関わる生命現象
や表現型には、複数の遺伝子がグループとして働くため、遺伝子の絞り込みもグループとして評価する必要があると考えられる。
【ソリューション】 そこで我々は、判別分析を用いてより重要な遺伝子群を探索することにした。判別分析は、属する群がわかっている標本を“ある複数項目”でどの群に属するかを判定する方法である。この方法により、“ある複数項
目”＝“ある遺伝子群の発現変動”が欠損株とコントロール株を区別することができるかを判定することができる。つまり、すべての DEG の組み合わせで判別分析を行い、より両株を区別するのに適した遺伝子群を探索することができれば、より重要な遺伝子群として絞り込むことが可能になる。しかし、DEG から
2 個、3 個、4 個…と説明変数を選択する組み合わせは指数関数的に増加するため、膨大な計算が必要になり、通常の手法では困難である。例えば、1,000 個のDEG から 5 個を選択する場合、8×1012 回の計算が必要である。我々は、この問題を解決するために、統計解析ソフト R で 100,000 回の判別分析を行うためのプログラムを作成し、バッチ処理により 250 個を並列計算することで、説明変数ごとに最大 25,000,000 回の判別分析を行う手法を確立した。実際の計算では、説明変数 2 個および 3 個は組み合わせの数が少ないため全組み合わせを、説明
変数 4 個以上は無作為抽出により 25,000,000 個の組み合わせについて判別分析を行った。計算の結果、説明変数 2 ~ 7 個のうち説明変数 5 個を最適と判断し、重点的に計算することで計 125,000,000 回の判別分析を行った。得られた結果を判別分析で出力されるウィルクスのラムダ統計量で評価することで最適な遺伝子の組み合わせを絞り込んだ。さらに、この遺伝子の組み合わせについて判別関数（数理モデル）を作成することができた。
【ベネフィット】 以上より、欠損株とコントロール株を区別するのに最適な遺伝子の組み合わせを絞り込む手法を確立することができた。また、興味深いことに、絞り込んだ 5 遺伝子の組み合わせの判別分析結果をプロットしたところ、スチューデント t 検定の p 値が小さい 5 遺伝子よりも明確に両株を区別できる
ことがわかった。本手法により、網羅的遺伝子発現情報から遺伝子機能情報の有無に関わらずに、より重要な遺伝子群を選択することが可能になった。加えて、本手法は網羅的遺伝子発現情報の解析に限定されるものではなく、その他のオミックス解析にも適用することができることから、生命ビッグデータの利活用に有用であると言える。

Understanding the gene control mechanism ofphysiological disorders in mangosteen using RNA-seq

Mangosteen (Garcinia mangostana L.) is one of the most important Indonesiantropical fruits because it has high economic value and a pleasing taste, and a richaroma as well as abundance of anti-oxidants. However, incidence of two physiologicaldisorders namely, gamboge disorder (GD) and translucent flesh disorder (TFD),
respectively is affecting to low grade of fruit quality. Limitation of genomic
information and lack of studies on transcriptomics level in the mangosteen has
restricted our understanding of gene control mechanism of these physiologicaldisorders. Herein, we conducted RNA sequencing analysis to identify the differential
expression genes between normal tissue and physiological disorder-affected tissue
from two part of fruits including rind and aril and also investigated effect ofenvironmental condition.
Two experimental conditions, natural and land surface-covering, were used to treating
mature mangosteen tree from 6 weeks after anthesis (WAA) up to harvesting. We
collected 4 types of the tissues including GD-affected rind (GDR), normal rind (NR),
TFD-affected aril (TFDA) and normal aril (NA). All tissues for RNA extraction werecollected and stored at RNALater® stabilization solution. Total RNA was extractedusing modified hot-borate method (Wan and Wilkins,1994). Intact polyadenylated(PolyA) mRNA using the Dynabeads® mRNA DIRECTTM Micro Purification Kit. The
isolated mRNA was processed as sequencing library and performed sequencing using
Ion ProtonTM System.
Total libraries generated a total of 760.92 million reads (81.04 Gb pairs of bases). The
high quality reads were produced by trimming and filtering with specific parametersand produced a total of 520.70 million reads (51.96 Gb pairs of bases). The de novo
assembly was performed with optimized reads normalization by 30x coverage and 300
bp in minimum length (Haas et al. 2013). The assembly produced 211 005 transcripts
with an average of 649.89 bp (N50 = 722 bp) in length ranging between 301 - 13 767
bp. The high quality of reads were aligned individually into the assembled-transcripts
by Bowtie2 and estimated by eXpress software to be further analyzed in the differential
gene expression (DGE). All of selected-113 821 unigenes were searched against the Nr(60 610), Nt (33 915), SwissProt (40 843), and TrEMBL (60 308) databases (subset toviridiplantae) using the BLAST algorithm (E-Value < 10-5). The functional annotationof unigenes with blast hits were further classified by Gene Ontology (GO) analysis ofBlast2GO software. Within annotated unigenes, 22 370 unigenes were matched in the
GO database and classified into 3 functional categories: molecular function, biologicalprocess, and cellular component. KEGG metabolic pathway analysis assigned to 141
pathways. In total, DEG were discovered between NR and GDR as well as NA andTFDA under two different environmental conditions. Furthermore, the DEG oftranscripts will validate through qRTPCR in the future work.
In this study, we analyzed through bioinformatics method to predict gene control
mechanism from the quantitative expression values of differentially expressed genes
based on RNA-Seq transcriptome data of fruit tissues in different types and conditions
in mangosteen. We provided our perspective on future developments in plant gene
control mechanism related to under various environmental condition in horticultural
crops.
Acknowledgement:This research was supported in part by the Special Expenditure of Ministry of
Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT, Japan) for the “Human
Resource Development Program in Agricultural Genome Sciences, Tokyo Universityof Agriculture and Technology”
References:
Haas BJ et al, Nat Protoc. 8(8):1494-512 (2013).
Wan, CY and TA Wilkins, Anal. Biochem. 223 7-12(1994).

Establishment of the method for selection of gene combinations by
discrimination analysis○Takuji Kobayashi1, Toshinori Kozaki2, Kazuo Ishii2, Tsutomu Arie3,
Youhei Yamagata1,3(1United Grad. Sch. Agric. Sci., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Hum. Resour.
Development Program in Agricultural Genome Sci., Tokyo Univ. of Agric. Technol.,3
Grad. Sch. Agric., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words
gene combination, discrimination analysis, RNA-Seq

Understanding the gene control mechanism of physiological disorders inmangosteen using RNA-seq○Deden Derajat Matra1,2,4, Toshinori Kozaki3, Kazuo Ishii3, Eiichi Inoue4(1Plant Prod. Div., Dept. Agro. Hort., Fac. Agric., Bogor Agricultural Univ., 2United
Grad. Sch. Agric. Sci., Tokyo Univ. Agric. Technol., 3Grad. Sch. Agric., Tokyo
Univ. Agric. Technol., 4Coll. Agric., Ibaraki Univ.)

Key words

RNA-Seq, transcriptome, mangosteen, physiological disorder生命ビッグデータ の利活用による生物工学のイノベーション

3S-Bp04

担子菌ウシグソヒトヨタケ子実体形成過程の Strandspecific RNA-seq 解析

3S-Bp05269

昆虫のバキュロウイルスに対する抵抗性メカニズムの解明○村口 元 1, 梅澤 究 2, 新倉 舞 2, 吉田 誠 2, 古崎 利紀 2,
石井 一夫 2, 酒井 杏匠 3, 志水 元亨 3, 中堀 清 4, Choi Cindy 5,
Ngan Chew Yee 5, Lindquist Erika 5, Lipzen Anna 5, Tritt Andrew 5,
Haridas Sajeet 5, Barry Kerrie 5, Grigoriev Igor V. 5,
Pukkila Patricia J. 6
（1秋田県大院・生資, 2農工大院・農, 3名城大院・農, 4岡山大院・
自科, 5JGI, 6Dept. Biol., Univ. North Carolina）
muraguchi@akita-pu.ac.jp○岩田 賢人 1, 石井 一夫 2, 古崎 利紀 2, 水谷 哲也 3, 大松 勉 3,
長井 誠 3, 齋藤 康将 1, 井上 真紀 1, 仲井 まどか 1（1農工大院・農, 2農工大・農学系ゲノム人材育成プログラム, 3農工大・国際家畜感染症防疫研究教育センター）
s150494t@st.go.tuat.ac.jp

キノコの子実体形成の分子機構は断片的にしか分かっていないのが現状であるが、その解明は食用キノコ等の安定供給の為に極めて重要である。キノコの子実体形成を分子レベルで理解する手掛かりを得るために、モデルきのこ「ウシグソヒトヨタケ」 1) の子実体形成過程について Strand-specific RNA-seq 解析を行った 2)。
一核性子実体形成株#326 の子実体形成過程の 13 点（[1]栄養菌糸、[2]菌糸塊、[3]小子実体原基、[4]0hr 子実体原基、[5]12hr 子実体原基、[6]24hr 子実体傘、[7]24hr 子実体柄、[8]30hr 子実体傘、[9]30hr 子実体柄、[10]36hr 子実体傘、[11]36hr 子実体柄、[12]39hr 子実体傘、[13]39hr 子実体柄）（示している hr は子実体成熟開始の光刺激を 0hr とした時のサンプル採取時期）から Total RNA を抽出して（各点 2 サンプル、計 26 サンプル）、アメリカの Joint Genome Institute（JGI）に送り、Strand-specific RNA-seq 用ライブラリーを構築し、HiSeq にて
cDNA の塩基配列を決定した。JGI がアセンブルした 14,245 の Gene models に対して、Bowtie2 を使って R1 と R2 を別々にマップし、リード数を Strand 別に数え、RPKM 値を算出した。ステージ間の DEG（Differentially expressed gene）
はフィッシャー検定である iDEGES/edgeR（R パッケージ TCC）を用いて検出した。
各点２サンプル間の類似度を評価したところ、[2]菌糸塊でばらつきが大きかった。この時期には急速に発生が進行するために同一状態の組織採取が難しかったのが原因だろうと思われる。
[8-10]の傘で Up-regulated DEG（uDEG）が最も多く、[5-7]の柄で Down-regulated
DEG（dDEG）は最も多かった。また、[4-5]と[5-6]の移行期には uDEG 数より
dDEG 数が上回っていた。
DAVID を使って各ステージ間の DEG の GO 解析を行い、ステージ移行における特徴的な DEG を抽出した。[1-2]の移行期には細胞膜成分や細胞外成分に変化をもたらすと推定される合成系酵素の遺伝子発現が上昇する一方、P450 酵素のような分解系酵素の遺伝子発現は低下する。
転写調節因子候補（TFC）に着目してその変動を調べた。まず、転写因子のタ
イプ分けを行い、各タイプの中で発現量の多い Top 4 の変動を調べた。特定の時期に発現が上昇する TFC がどんな遺伝子の発現を調節しているのか興味深い。
全 read 中の逆鎖 read の割合は[1-6]のステージで高く（5～15%）、[8-12]の傘や[7-13]の柄では 5%以下であった。
発生の進行に伴う RPKM 値の変化が鎖間で相関しない遺伝子には、違う発現制御を受けている anti-sense 転写物があると考え、そのような特徴を持つ遺伝子を選んで、IGV で発現状況を確認したところ、確実に anti-sense 転写物が存在していると言える遺伝子をいくつか見つけることができた。これらの anti-sense 転
写物が子実体形成過程においてどのような役割を担っているのかを今後詳しく調べていく必要がある。
今回の RNA-seq 解析から 14,245 個の遺伝子モデルが作られたが、その中には、
ゲノム解読から予測された遺伝子に対応しない転写物もあった（計 1,089 個）。
このような転写物がタンパク質をコードしているのか、あるいは、Non-coding
RNA として何らかの働きを担っているのかについても、今後の解析が必要である。
上記のように、さらなる解析を待つデータを含むものの、モデルきのこの子実体形成過程における遺伝子発現情報は、食用キノコ等の有用キノコにおける子実体形成分子機構の解明や有用物質生産、担子菌の利活用に向けた基盤情報となり得るだろう。子実体形成分子機構がある程度明らかになれば、その応用として、食用キノコ等の子実体形成の人為的制御や機能性を持つキノコの安定供給が可能になると期待される。
[ 謝辞 ]この研究は、農水省実用化事業(23053)、JGI（the Office of Science of the
US Department of Energy under Contract No. DE-AC02-05CH11231）および文部科
学省特別経費「農学系ゲノム科学領域における実践的先端研究人材育成プログ
ラム」の支援を受けて実施した。

【バックグラウンド】 農業生産の現場では化学合成農薬の過剰使用は好まれず、人や環境にやさしい害虫防除法の開発が望まれている。生物的防除は、天敵昆
虫や昆虫病原微生物を用いた害虫防除法であり近年上記のような状況から関心が高まっている。昆虫病原微生物とは、昆虫に病気を引き起こす病原体を指す
が、その一種であるバキュロウイルスは昆虫に特異的に感染する二本鎖 DNA
ウイルスであり、その病原性や宿主特異性の高さから既に世界中で生物的防除資材として利用されている。近年、このバキュロウイルス製剤の利用拡大と共に、連続使用による害虫個体群の抵抗性の発達が報告され問題となっている。
しかしながら、昆虫のバキュロウイルスに対する抵抗性メカニズムの全容は明らかにされていない。
【チャレンジ】日本では、茶の主要害虫であるチャノコカクモンハマキ（Adoxophyeshonmai：チョウ目ハマキガ科）の防除にバキュロウイルス製剤が用いられている。そこで、演者らは野外で採集したチャノコカクモンハマキ個体群に対して
核多角体病ウイルス（Adoxophyes honmai nucleopolyhedrovirus；AdhoNPV：バキュロウイルス科）による選抜を繰り返すことで抵抗性研究のモデル系を確立した。すなわち、70％致死濃度の AdhoNPV を接種し生き残った個体の次世代に再度ウイルスを接種するという選抜を繰り返した。その結果、選抜をせずに継代した感受性の系統（S 系統）にくらべて、1 万倍以上の抵抗性を持つ系統（R 系統）が確立された。本研究では、この R 系統と S 系統を用いた比較研究
により、バキュロウイルスの抵抗性メカニズムの解明に取り組んだ。
【ソリューション】 本研究においては、R 系統におけるウイルス感染の進行をS 系統と比較した。バキュロウイルスは、ウイルス粒子を包み込んだ包埋体という構造を持つが、宿主昆虫が包埋体を飲み込むところから感染がはじまる。
ウイルス粒子は、幼虫宿主の中腸（消化管）の上皮細胞に結合し、膜融合によって細胞内へ侵入する。中腸上皮細胞で複製したウイルス粒子は、血体腔（解放血管系である昆虫の体腔）内の全身の組織に感染を拡大する。感染細胞では、
ウイルス遺伝子が発現し、ウイルスゲノムが複製され、次世代のウイルス粒子が生産される。この過程に基づき次の 3 点、1）幼虫全身におけるウイルス増殖
量（定量 PCR）、2）幼虫中腸における網羅的遺伝子発現解析（RNA-Seq 及びRT-PCR）、3）中腸細胞に対するウイルス粒子の結合・融合実験（Fluorescencedequenching assay）を調査した。
【ベネフィット】 R 系統幼虫全身においてウイルスの増殖は検出されず、R 系
統中腸でのウイルス遺伝子の発現が非常に低いことが示された。そこで、中腸細胞へのウイルス粒子の結合能・融合能を調べたところ、ウイルス粒子の結合・融合量が R 系統幼虫の中腸上皮細胞では S 系統にくらべて著しく低かった。このことから、AdhoNPV に対する抵抗性機構として、中腸細胞におけるウイルス
粒子の結合あるいは融合の抑制、すなわちウイルス受容体の欠損など、を仮説として示すことができた。
本研究は、東京農工大学農学系ゲノム人材育成プログラム、及び国際家畜感染症防疫研究教育センターの支援を受け実施された。

【引用文献】
1. Stajich JE, Wilke SK, Ahren D, Au CH, Birren BW, Borodovsky M, et al. Insights
into evolution of multicellular fungi from the assembled chromosomes of themushroom Coprinopsis cinerea (Coprinus cinereus). PNAS. 2010;107(26):11889-94.
2. Muraguchi H, Umezawa K, Niikura M, Yoshida M, Kozaki T, Ishii K, et al. Strandspecific RNA-seq analyses of fruiting body development in Coprinopsis cinerea. PloS
One. 2015;10(10):e0141586.

Strand-specific RNA-seq analyses of fruiting in Coprinopsis cinerea○Hajime Muraguchi1, Kiwamu Umezawa2, Mai Niikura2, Makoto Yoshida2,
Toshinori Kozaki2, Kazuo Ishii2, Kiyota Sakai3, Motoyuki Simizu3,
Kiyoshi Nakahori4, Cindy Choi5, Chew Yee Ngan5, Erika Lindquist5, Anna Lipzen5,
Andrew Tritt5, Sajeet Haridas5, Kerrie Barry5, Igor V. Grigoriev5, Patricia J. Pukkila6(1Grad. Sch. Bioresour. Sci., Akita Pref. Univ., 2Grad. Sch. Agric., Tokyo Univ.
Agric. Technol., 3Grad. Sch. Agric., Meijyo Univ., 4Grad. Sch. Nat. Sci. Technol.,Okayama Univ., 5JGI, 6Dept. Biol., Univ. North Carolina)
Key words
basidiomycetes, fruiting, RNA-seq, transcriptome

Elucidation of mechanisms of insect resistance to a baculovirus○Kento Iwata1, Kazuo Ishii2, Toshinori Kozaki2, Tetsuya Mizutani3,
Tsutomu Omatsu3, Makoto Nagai3, Yasumasa Saito1, Maki N. Inoue1,
Madoka Nakai1(1Grad. Sch. Agric., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Human Resource Development
Program in Agricultural Genome Science, Tokyo Univ. Agric. Technol., 3Researchand Education Center for Prevention of Global Infectious Diseases of Animals,
Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words
baculovirus, resistance, RNA-Seq, pest management

270

生命ビッグデータ の利活用による生物工学のイノベーション

3S-Bp06

材料の異なる堆肥の生物脱臭効果および微生物叢に関する研究○北村 里香 1, 石井 一夫 2, 古崎 利紀 2, 前田 勇 3, 飯郷 雅之 3,
黒倉 健 3, 岩渕 和則 4, 齋藤 高弘 3（1宇都宮大・バイオセ, 2農工大, 3宇都宮大・農, 4北大院・農）kitamura.rika1229@gmail.com

3S-Bp07

機械学習システムによる人工知能の生物工学への応用○石井 一夫 1, 古崎 利紀 1, 中村 和敬 2, 當仲 寛哲 2
（1農工大院・農, 2USP研究所）
kazuoishii2014@gmail.com

堆肥化は農業副産物や食品残飯をリサイクルすることで持続的な食品生産に貢献している。しかしながら、堆肥化の際には環境に悪影響を及ぼす悪臭の発生も伴う。そこで堆肥化時悪臭を少ないエネルギーで除去する生物脱臭技術についての検討を行った。生物脱臭は、微生物の分解および同化によって悪臭を除去する技術である。しかし、脱臭効果は脱臭媒体によって不安定であり、その理由は明確にはなっていない。有用な微生物の増殖を促進するために、その微生物が必要とする条件が必要である。微生物にとっての条件とは，温度、光、
酸素量、水分量、pH および圧力、さらに酸素、窒素、塩分、栄養成分および微生物による産生物質（微生物相互関係）などである。そこで、微生物がどんな条件を必要としているのかを明確にしていく必要がある。ここでは生物脱臭を行う微生物、特にアンモニアを分解する微生物に焦点を当てた。アンモニアに関する生物脱臭の作用機構は硝化細菌などが関与しているが、これを細菌叢レベルで詳細に調べた例はない。本研究では NGS を用いた 16S rRNA メタゲノム
解析によって、原材料の異なる堆肥(牛糞堆肥および残飯堆肥)を脱臭媒体として用い、微生物叢および成分組成の比較、さらにアンモニア暴露前後の微生物叢を明確にし、生物脱臭の効果の検討を行った。
本研究によって堆肥を使用した生物脱臭に関与する細菌群が明確となった。堆肥の成分組成、系統分類などの結果は、同材料を用いた堆肥毎に特徴を有していた。牛糞堆肥には Proteobacteria が多く、残飯堆肥には Firmicutes が多く検出された。主に Proteobacteria または Nitrospira に属している硝化細菌は、アンモニア酸化に強く関わっている。乳酸菌が属する Firmicutes は他の微生物の増殖を妨げ，微生物多様性を減少させる。Proteobacteria に属するアンモニア酸化細菌(AOB) は、高濃度のリン、加里および塩によって成長が阻害されることが既存文献により示されており、これらの物質は残飯堆肥に多く含まれていた。これらの知見から、堆肥化材料が堆肥化中および完熟堆肥の微生物叢へ影響を及ぼしている可能性が示唆された。さらに、牛糞堆肥における高い α 多様性は、豊富な微生物叢を有していることを意味し、牛糞堆肥 MCU1 および MCK1 間の低い β 多様性および同材料(MCU および MCK、または FCU および FCN)の堆
肥の持つ微生物叢が近縁種で成り立っていることは、牛糞のような家畜糞の堆肥化への利用は単一材料として品質の管理が容易であり、似ている微生物叢を持つための安定した環境を持ち得ていると考えられた。これらの結果は原材料が微生物叢の形成に重要であり、堆肥化の際に異なった発酵環境を与えていることを示している。牛糞堆肥の高い α 多様性、アンモニア脱臭に寄与している
AOB および amoA 遺伝子が確認されたことによって、悪臭を除去する生物脱臭媒体として牛糞堆肥が適している可能性を示唆した。
脱臭実験の結果として、牛糞堆肥で脱臭効果が得られ、残飯堆肥では脱臭効果が得られなかった。メタゲノム分析では真性細菌および古細菌について検討を行った。真性細菌の replicate 間による β 多様性は、牛糞堆肥 MCU においてア
ンモニア暴露前に約 5 割の微生物が一致していたのに対し、暴露後に約 9 割が一致し、微生物叢がアンモニアのある環境に適応したと言える。微生物の Phylumによる系統分類においても MCU1-3 の各 Phylum の割合がほぼ一致し、硝化細菌の属する Proteobacteria の割合が増加していた。古細菌の replicate 間による β多様性の結果は、牛糞堆肥 MCU においてアンモニア暴露前後で微生物叢に大きな変化はなく、Phylum による系統分類でも変化が無かった。牛糞堆肥 MCUの古細菌には硝化細菌である Thaumarchaeota が約 60%存在しており、メタン生成菌である Methanosarcina sp.が約 15%で 2 位につけていた。アンモニア暴露前後において、これらの存在割合は変化していなかった。Mendez et al.(2015)が微
生物に影響を与える要因として特にリン酸を挙げていること、生物脱臭媒体として効果の認められている黒ぼく土では活性アルミニウムによってリン酸が固定されており微生物や植物が利用しにくい状態であることから、硝化細菌にとってリン酸の存在は苦手であることが推察された。そこで、牛糞堆肥 MCU にリン酸が少ない事が、硝化細菌が増殖し易い環境であったことが示唆された。
このように次世代シーケンサーを使用した 16S rRNA メタゲノム分析は、存在量の少ない微生物の検出、材料中微生物の経時的変化、そして存在比などの細かい情報を得るために非常に有効であり、本研究では脱臭効果を示した堆肥の微生物叢が明らかとなった。今後、その細菌群が産生する酵素などの作用機序が解明されることにより、成分組成や微生物相互関係などを合わせた生物脱臭
媒体の脱臭効果の評価やその作用の制御が可能となり、堆肥の有効活用の促進というイノベーションが起こることが期待される。
謝辞・・・本研究は、東京農工大学農学系ゲノム人材育成プログラムの支援を受け実施された。

背景： 次世代シーケンサーやマイクロアレイの普及により、生物分野におけるビッグデータ分析は日常的なものとなっている。これら生物学ビッグデータの利活用促進により、従来では困難であった生物機能の解明とその生物工学への応用が可能となる。これらのデータは、多数の遺伝子発現や DNA のメチル化などの説明変数からなる超多次元データである。従来は生体現象の理解には少数の因子による生化学的解析が主流であったが、これら超多次元データを組み合わせることによるビッグデータの利活用で、複数の要因により数理予測モデ
ルを作成し表現型などの生体現象の高精度な予測が可能となる。これら高精度予測モデルは、臨床診断や農作物の生育予測、環境アセスメントなど生物工学分野へのあらゆる分野への波及効果が期待される。近年の機械学習システムの技術的進歩により、これらの予測システムへの精度向上などの改善が期待される。しかし、これらの超多次元データによる数理予測モデルの作成においては、候補となる説明変数（例えば、遺伝子発現など）が膨大であり、これらの組み合わせの中から適切な説明変数を選択し、予測モデルを作成することは困難を伴う。
問題点： 我々は、多数の組み合わせの中からモンテカルロ法による無作為抽出と並列処理を組み合わせて、近似的な最適化予測モデルを作成することを検討してきた（本シンポジウム、小林らの発表）。これらの検討により、超多次元データから数理予測モデルを作成する方法が確立され、従来の t 検定などの古典的な統計学的手法では見つけることのでなかった生物学的機能の解析が可能となった。しかし、この方法は完全なものではなく、未だ様々な問題点を抱えている。例えば、数理モデルの作成には大量の計算を必要とする。また、特に、
次世代シーケンサーデータのような離散型を用いた場合、多重共線性などが原因となる大量のエラーが生じ、計算が困難な場合がしばしば生じる。また、最適化モデルは試験した集団に依存し過学習などのために、得られたモデルが必ずしも予測モデルとして最適ではない可能性も考えられた。したがって、超多次元データによる予測モデルの作成には様々な問題が残っており、改善の余地が多く残されている。本研究では、上記のような様々な問題を洗い出し、超多次元データによる予測モデルの効率的な作成法を確立するために、様々な工夫を凝らし、機械学習による人工知能を適用した予測システムを構築することを試みた。
解決策とその効果： まず、並列分散処理の効率化のためには C ライブラリとシェルスクリプトによる高速化を行った。多重共線性などが原因となる大量のエラーへの対応には、Lasso 回帰や Ridge 回帰などの正則化処理を行った。過学
習に対しては、各種の機械学習システムを検討した。 これらの検討を組み合わせることで、よりパフォーマンスの高いシステムの構築が可能となった。本講
演では、超多次元データを用いた表現型予測システムを構築する際の様々な問題点とその解決策をまとめ、よりパフォーマンスの高いシステム構築の方法を示すことで、機械学習システムの生物工学への応用の可能性を議論したい。
謝辞： 本研究は、東京農工大学「農学系ゲノム科学人材育成プログラム」及び科研費基盤研究（C）「研究課題番号 26330325」の支援により実施された。また、本研究の一部は、（有）ユニバーサル・シェル・スクリプティング研究所、
アマゾンウェブサービス（AWS in Education Research Grant Award）、日本ヒュー
レット・パッカード、文部科学省 HPCI 戦略プログラム分野１「予測する生命科学・ 医療および創薬基盤」SCLS 計算機システムの支援により実施された。

Studying biofiltration effect and bacterial communities in different types ofcompostIntroducing of artificial intelligence with machine learning applications tobiotechnology○Rika Kitamura1, Kazuo Ishii2, Toshinori Kozaki2, Isamu Maeda3, Masayuki Iigo3,
Takeshi Kurokura3, Kazunori Iwabuchi4, Takahiro Saito3(1C-Bio, Utsunomiya Univ., 2Tokyo Univ. Agric. Technol., 3Fac. Agric., Utsunomiya
Univ., 4Grad. Sch. Agric., Hokkaido Univ.)

Key words

biofiltration, 16S rRNA, bacteriome, nitrifying bacteria○Kazuo Ishii1, Toshinori Kozaki Kozaki1, Kazutaka Nakamura2, Nobuaki Tohnaka2(1Grad. Sch. Agric., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2USP Lab.)

Key words
Artificial Intelligence, Predictive Analysis, Machine Learning,
Mathematical ModelingGap Filling of Metabolic Pathway and Application to Producing Valuable Compounds〈国際シンポジウム〉

3S-Cp01

Discovery of valuable genes by massive sequencing andtime lapse analysis of environmental RNAs

3S-Cp02271

Transcriptome and translatome of the model antibiotic
producer Streptomyces coelicolor A3(2)○Byung-Kwan Cho(Dept.Biol.Sci., KAIST, South Korea)
bcho@kaist.ac.kr○Nobutaka Nakashima, Yuya Nakamura(Sch. Life Sci. Technol.)nnakashima@bio.titech.ac.jp

Breaking free from fossil fuels and establishing the sustainable society are the urgent
task, and production of industrially important compounds by means of biological
functions (bio-based processes) attracted much attention recently. Manybiotechnologists keep on proposing novel ways to produce compounds from biomass
feedstock using organisms (in particular, microorganisms) as host cells. However, evenwhen the target compound is known to be produced in microorganisms, it frequently
happens that the only part of the metabolic pathway for the target compound frombiomass feedstock is revealed. Accordingly, such compounds can not be produced inpractical amounts. We call this situation “the presence of metabolic gap” and would
like to fill-in the gap by finding the responsible metabolic genes.
We suppose that there are three reasons why metabolic gaps remain. First, if one
microorganism is known to have the metabolic pathway of interest, identifying enzyme
genes which are responsible for the metabolic pathway is not so easy. Second, even if
the metabolic pathway of interest is revealed to exist in a microorganism hidden in theenvironment, many microorganisms are not able to be isolated and cultured in thelaboratory. Generally, 95% or more of the microorganisms on the earth is in the “viable
but not culturable (VBNC)” state. Third, the metabolic pathway of interest may bepresent separately over multiple microorganisms. When the above three problems are
solved, the number of compounds that can be produced in a microorganism will
increase dramatically.
In order to solve the above problems, it is considered to use a technique called“metagenome”. In the metagenomic technique, DNAs/RNAs are extracted fromenvironmental microbial populations without isolating individual microbes, and
DNA/RNA libraries are constructed. Then, genes of interest are screened from thelibraries by hybridization experiments based on sequence homology or by evaluating
enzyme activities of proteins. Therefore, using bacteria such as Escherichia coli as hostcells is necessary, but manipulating recombinant DNAs in bacteria is time-consuming
and leads to loss of specific DNA species, resulting in low throughout and decreased
accuracy in screening. Success in gene discovery with metagenomics relies on highthroughput and accuracy at the screening step.
We here propose a new screening method depending on massive RNA sequencing and
an index of expression induction by the precursor compounds. The method is named“TIme Lapse Analysis of Massive RNA Sequences (TILAMS)”. TILAMS isdeveloped based on the fact that expression of bacterial metabolic genes is frequently
induced with corresponding substrates. In TILAMS, two microbial populations areprepared; one sample is treated with a precursor of the target compound and the otheris untreated. RNAs are extracted from both samples over time, and RNA sequences areread massively using the next generation sequencer. Then, RNA species that are
increased after addition of the substrate are found in silico. False positive RNAs are
eliminated through bioinformatics analyses, identifying candidate enzyme genes whose
products act on the precursor.
Since TILAMS can screen large numbers of genes without using microbial cells, it isexpected that the bottleneck in the metagenomic technique will be eliminated. The
Nagoya Protocol was signed in 2010, which regulates access to genetic resources
between countries, and it is important to facilitate rapid access to such resources.

Streptomyces produce various secondary metabolites including antibiotics, and manyof these are used in medical and agricultural fields. The production of thesecompounds occurs after passing through the transition from primary metabolism tosecondary metabolism, and involves complex morphological differentiation. Despite
the significant attributions of Streptomyces to biotechnological area, their complex
organizational structures and gene regulation mechanisms are not fully discovered.
Here we show the architecture of Streptomyces coelicolor genome and gene expression
patterns at transcriptional and translational level along with different developmental
phases, by integrating genome-wide data of transcription start sites (TSSs), mRNA
abundance and ribosome-protected mRNA fragment (RPF) abundance. Over 3,000
TSSs of genes were identified, and significant portion of them represented leaderlessgenes. Based on the identified TSSs, the length distribution of 5’ untranslated regions(UTRs) was calculated and conserved promoter motif was elucidated. We also foundnovel transcripts, some of which exhibited translational expression, indicating novel
open reading frames (ORFs). Analyses of transcriptional and translational expression
at four different growth phases showed increasing expression pattern of genes insecondary metabolism to the later developmental stages. Using clustering analysis wewere able to find genes that have same expression patterns with secondary metabolite
genes. Finally, expression level comparison of protein complex subunits revealed
strong correlation between protein stoichiometry and translational expression. Thus,
we offer comprehensive information on genome architecture, and transcriptional andtranslational gene expression patterns that allows better understanding of Streptomyces
coelicolor.

Discovery of valuable genes by massive sequencing and time lapse analysisof environmental RNAs

Transcriptome and translatome of the model antibiotic producer
Streptomyces coelicolor A3(2)○Nobutaka Nakashima, Yuya Nakamura(Sch. Life Sci. Technol.)Key words

metabolic engineering, transcriptome, RNA-seq, metagenomic libraries○Byung-Kwan Cho(Dept.Biol.Sci., KAIST, South Korea)

Key words

genome, transcriptome, Streptomyces, translation

272

Gap Filling of Metabolic Pathway and Application to Producing Valuable Compounds〈国際シンポジウム〉

3S-Cp03

Genome-mining based natural product discovery○Pei-Yuan Qian
(Division of Life Science and Environmental Science Programs,
Hong Kong University of Science and Technology)
boqianpy@ust.hk

With rapid increase in genome information of marine microbes in public domain,
genome mining allows us to extract substantial amount information on metabolic
process and secondary metabolites of microbes, which can aid the bioactive compound
discovery as well as the understanding of ecological function of microbes. In thepresent study, I will present our recent work on genome-mining based bioactive
compound discovery from marine microbes, which was triggered by our discovery of adidemnins-producing marine bacterium from the Red Sea. Analysis of T. mobilis
genome has not only allowed us to characterize the biosynthesis pathways ofdidemnins but also led to discovery a group of calpian inhibitors and relevant
biosynthesis pathways. Using genome mining methods, we revealed chemical diversity
and genome diversity. As we have also developed a method to clone entire
biosynthesis pathways of marine bioactive compounds, it became possible for us tomanipulate biosynthesis pathways to generate more analogous for screening andstudying mode of action of compounds in near future.

3S-Cp04

Current Status of CBD and Nagoya Protocol on ABS,
including the Synthetic Biology［生物多様性条約および名古屋議定書に関する最新情報と 合成生物学に関する国際的な動き］○Mutsuaki Suzuki(National Institute of Genetics)
msuzuki@nig.ac.jp

Genetic Resources, which are plants, animals and microorganism and their derived
parts including DNA extracts, are used as essential elements widely in academic
research area. The Convention on Biological Diversity (CBD) entered into force on 29
December 1993. It has three main objectives. １）The conservation of biologicaldiversity; ２）The sustainable use of the components of biological diversity; ３）The
fair and equitable sharing of the benefits arising out of the utilization of genetic
resources.
The Nagoya Protocol on Access to Genetic Resources and the Fair and Equitable
Sharing of Benefits Arising from their Utilization to the Convention on Biological
Diversity is an international agreement which aims at sharing the benefits arising fromthe utilization of genetic resources in a fair and equitable way. The Protocol was
adopted on 29th of October 2010 in Nagoya, Japan, and entered into force on 12th ofOctober 2014. It has been ratified by 60 parties, which including the European Union.
The Access and Benefit-sharing Clearing-House (ABS Clearing-House) is a platform
for exchanging information on access and benefit-sharing established which aims at
sharing the benefits arising from the utilization of genetic resources in a fair andequitable way. The ABS Clearing-House is a key tool for facilitating theimplementation of the Nagoya Protocol, by enhancing legal certainty and transparency
on procedures for access and benefit-sharing, and for monitoring the utilization ofgenetic resources along the value chain, including through the internationallyrecognized certificate of compliance. By hosting relevant information regarding ABS,
the ABS Clearing-House will offer opportunities for connecting users and providers ofgenetic resources and associated traditional knowledge.
In the COP12, Synthetic Biology issues came to surface, as new emerging issues.
Some parties concern that living organism, component and products, have negativesocio-ecological effect , using DNA sequence information. Japan opined that digital
sequence information falls beyond the CBD’s scope in SBSTTA20 meeting. I will
explain current status about discussion under CBD. From the view from scientificcommunity, we have to keep watch and propose appropriate opinion.
研究分野において、海外にて植物・動物・微生物などを採取、また商品などを入手し、研究用として日本に持ち込む機会は多い。これらは、科学的な研究材料として利用される場合は、生物多様性条約１）において、すべて遺伝資源と見なされる。
遺伝資源が国家に属するという考え方は、1993 年に発効された生物多様性条約の発効にて明確にされた。生物多様性条約における３つの柱として、（1） 生物
多様性の保全（2） 生物多様性の構成要素の持続可能な利用（3） 遺伝資源の利用から生ずる利益の公正かつ衡平な配分、が掲げられている。特に(3)は Accessand Benefit Sharing の頭文字から ABS と呼ばれている。
2010 年に名古屋の COP10 にて、名古屋議定書が採択され、2014 年 10 月 COP12の会期中に発効された。名古屋議定書の内容は、従来からある流れに法的拘束力を持たしたものである。従来からあるスキームは下記のとおりである。(1) 利
用者は政府に事前届出を行い許可を受ける(事前同意,PIC)。(2) 提供者と利益配分などの規定を含む相互合意(MAT)を結ぶ。(3) 遺伝資源を利用国に移転する。
(4)利益配分を行う。名古屋議定書は上記の従来からある流れに、提供国における情報の透明性を上げる仕組みとして ABS クリアリングハウス、及び利用国の遵守をモニタリングする仕組みとしてチェックポイントを設置することが決められている。 現状提供国での法的整備が行われている。
最近のホットな話題は、DNA 塩基配列の取り扱いである。合成生物学（主に、天然物相当品をバイオテクノロジーで製造すること）の課題として、2015 年 9月の専門家会合で事前同意なしの移転がおこり、利益配分が行われないとアフリカグループから主張され、DNA 塩基配列も名古屋議定書の対象すべきという動きが顕在化してきた。専門家会合が開始され、2016 年 4 月に開催された第２０回科学技術助言会合(SBSTTA20)において、合成生物学の定義、範囲、リスク
アセスメント案と伴に、DNA 塩基配列の取り扱いについて、討論がなされ、その結果は決定が保留状態となり、本年 12 月の COP13 にて、今後の進め方などが決定される。DNA 塩基配列が名古屋議定書の対象となることをとても学術・産業界に対する影響は大きく、今後、学術界からの意見要望を基に対応を行っていかなければならない。

Genome-mining based natural product discovery○Pei-Yuan Qian
(Division of Life Science and Environmental Science Programs, Hong Kong
University of Science and Technology)

Key words

genome minning

Current Status of CBD and Nagoya Protocol on ABS, including theSynthetic Biology○Mutsuaki Suzuki(National Institute of Genetics)

Key words

nagoya protocol, biodiversity, genetic resources, synthetic biology

Gap Filling of Metabolic Pathway and Application to Producing Valuable Compounds〈国際シンポジウム〉

3S-Cp05

Prediction and identification of sequences coding fororphan enzymes○Takuji Yamada(Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Tech)takuji@bio.titech.ac.jp

3S-Cp06

273

Elucidation of gene regulatory network by structural
equation modelling○Sachiyo Aburatani(AIST)
s.aburatani@aist.go.jp

Despite the current wealth of sequencing data, one third of all biochemicallycharacterized metabolic enzymes lack a corresponding gene or protein sequence andare thus not amenable to modern systemic analyses. As 555 of these orphan enzymes
operate in pathways, we developed a global framework to integrate pathway adjacencyand (meta)genomic neighborhood information for the inference of candidate sequences
to orphan enzymes. For 131 of them (37% of those for which (meta) genomic
neighbors are available), we associate sequences to the orphan enzymes with morethan 70% accuracy, implying functional annotation of 16,278 gene sequences innumerous (meta)genomes. As a case in point, two of these candidate sequences wereexperimentally validated to encode the predicted activity.

One of the essential systems in a living cell is gene expression which is controlled forsurviving and adapting to various conditions by translating proteins when needed. The
system of gene expression is usually started by transcription, which is the process ofcreating complementary RNA copies of a protein-coding gene. Thus, clarifying thetranscriptional control system is an important task for uncovering the cellularmechanism.
Inference of gene regulatory network is a useful approach to understand the control
systems in living cells. To obtain the better insights into the gene regulation, I
developed statistical approach, based on Structural Equation Modeling (SEM) in
combination with factor analysis and improved four-step procedure. The significant
features of SEM are the inclusion of latent variables within the constructed model andthe ability to infer the network, including its cyclic structure. Furthermore, the SEM
approach allows us to strictly evaluate the inferred model by using fitting scores. In theconstructed model, linear relationships among variables are assumed to minimize thedifferences between the fitted covariance matrix and the calculated sample covariancematrix. Some fitting indices are defined for evaluating the model adaptability, and thus
the most suitable model can be selected by SEM.
To assume the model structure, I selected the optimal number of factors for inclusionin the network model as latent variables, by performing Exploratory Factor Analysis(EFA) with the Kaiser criterion. After the decision of optimal number of factors, an
initial network structure should be assumed before the SEM analysis. Thus, I improved
and modified four-step procedure to connect models as follows,
Step1: Determination of the number of latent variables
Step2: Solution of the regulatory relationships between the observed and latentvariables by CFA
Step3: Establishment of the regulatory relationships between the observed and latentvariables by SEM
Step4: Construction of all possible interactions between latent variables.
After the assumption of an initial model, I applied the SEM calculation to determine
the relationships between all variables. There are four possible relationships between
the variables: relationships between latent variables, regulatory relationships between
observed variables, causal relationships from observed variables to latent variables,and regulatory relationships from latent variables to observed variables. SEM is basedon a covariance analysis defined as S=Smodel, where S is the covariance matrix
calculated from the observed data and Smodel is the matrix-valued function of theparameter. Each element of the covariance matrix Smodel is expressed as a function of
the parameters that appear in the model. The unknown parameters were estimated, inorder to minimize the difference between the model covariance matrix Smodel and thesample covariance S. I utilized the Maximum Likelihood (ML) method to minimize thedifference between S and Smodel, The network structures are evaluated according to thegoodness of fit between the constructed model and the measured data by using somescores. I developed an iteration algorithm, which using the inverse matrix of the Fisher
information matrix of parameters, for fitting the constructed model to the measured
data. In my algorithm, all parameters should be re-calculated from the reconstructed
model, and the similarity of the network structure should also be re-calculated.
Furthermore, a new causal edge is added by the Modification Index scores.
In this presentation, I’ll show you the details of my SEM statistical approach and someexamples for detecting the causality and constructing a network model between genes
and other cellular components. This approach will allow us to clarify the long distanceeffect for producing valuable compounds.

Prediction and identification of sequences coding for orphan enzymes

Elucidation of gene regulatory network by structural equation modelling○Takuji Yamada(Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Tech)

Key words

enzyme reaction○Sachiyo Aburatani(AIST)

Key words
gene expression analysis, structural equation modelling, network
identification

274

和食の機能性のメカニズム～生活習慣病予防、腸内細菌へのインパクト～

3S-Dp01

日本食の健康機能性○都築 毅（東北大院・農）tsudukit@m.tohoku.ac.jp

日本人の平均寿命は伸び続け、世界有数の長寿国として知られている。日本人
は寿命が長いだけでなく、自立して生活できる期間を示す健康寿命も長い。日
本人が健康長寿である理由は、欧米人と異なる特徴的な食生活に起因すると考えられている。日本人の食事「日本食」は、米を主食とし、魚、野菜、大豆な
どの食素材、味噌や醤油といった調味料が伝統的に使われ、近年では、肉、牛乳、油脂、果実も加わり、多様な食素材を使用し、健康維持に有効な成分を数多く含んでいると考えられている。本講演では、日本食の健康有益性について、我々の知見を中心に紹介する。
日本食中の特徴的な食品に含まれる個々の成分が生体に与える影響を検討した
試験は、これまでにも数多くあったが、食事のメニューまるごとを総合して検討した研究はなかった。日本食の健康有益性は、健康維持に有効な食素材を数多く摂取していることによると考えられる。そこで我々は、現在の日本食と米国食を再現し、ラットに一定期間これらの食事を与えた後、食事内容の違いによる生体への影響の差異を調べ、日本食はストレス性が低く、エネルギー消費を促進し、健康維持に有益であることを示した[1]。
現在の日本食は欧米の影響を受け「食の欧米化」が進行し、また、生活習慣病の罹患率が増加している。よって、どの時代の日本食が健康維持に有益かを詳細に検討した。様々な年代の食事献立を作成し、それらを試験飼料としマウスに４週間摂食させたところ、1975 年の日本食摂取により、内臓脂肪が減少し、エネルギー消費が亢進することを示した[2]。長期摂食させた試験でも、1975 年
日本食は、肥満抑制効果を有し、さらに、老化による脂質・糖質代謝調節機能の低下を防いで脂肪肝や糖尿病の発症リスクを低減し、寿命も延伸することが示され、1975 年頃の伝統的日本食は、高い健康有益性を持つことが明らかとなった[3, 4]。
この要因を探るべく様々な検討を行ったところ、何か 1 つの成分の効果で良い効果を得るのは難しく、複数成分の相互作用が重要であると示唆された。1975
年の日本食は他の年代の日本食と比較して豆類、野菜類、果実類、藻類、魚介類、卵類、発酵調味料の使用量が多く，使用している食材の種類が豊富であった。これらの点を考慮に入れて食習慣を見直せば，1975 年の日本食の成分の健康有益性を実生活に取り入れることができると考えられた．最近、1975 年の食事の特徴を強化した食事を用いてヒト試験を行い、その結果も合わせて紹介したい。
・文献[1]. 都築毅ら、日本栄養・食糧学会誌, 2008; 61: 255-264.
[2]. Y. Kitano, T. Tsuduki, et al., J. Jpn. Soc. Nutr. Sci., 2014; 2: 73-85.
[3]. 本間太郎，都築 毅ら，日本食品科学工学会誌. 2013; 60: 541-553.
[4]. K. Yamamoto, T. Tsuduki, et al. Nutrition. 2016; 32: 122-128.

Healthy functionality of Japanese diet○Tsuyoshi Tsuduki(Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)

Key words

Japanese diet, long life, longevity, Japanese food

3S-Dp02

アジア人の食と腸内細菌叢の関連性○中山 二郎 1, 本田 倫子 2, Kisuse Juma 2, 百田 理恵 2, 田中 優 2,
園元 謙二 1, Lee Yuan-Kun 3（1九大院・農, 2九大院・生資環, 3Dept. Microbiol., Natl. Univ.
Singapore）
nakayama@agr.kyushu-u.ac.jp

近年の腸内細菌学の発展により、数百種の細菌コミュニティーで構成される腸内細菌叢は、食と健康を繋ぐインターフェースとして人体において非常に重要な役割を果たしていることが分かってきている。例えば、肥満者と痩身者ではファーミキューテスとバクテロイデテスの腸内占有率が異なり、この差から、食事から抽出し吸収するエネルギー量に差が生じているとされている(Turnbaugh
et al., Nature 2006)。また、欧州を中心とした国際共同研究(MetaHIT)の発表で、ヒトの腸内細菌叢は大きく 3 つのタイプ“エンテロタイプ”に分けられることが示された。これら 3 つのエンテロタイプはそれぞれ、バクテロイデス、プレボ
テラ、ルミノコッカスを優占属としており、食習慣の違いとエンテロタイプの相関も報告されている (Arumugan et al., Nature 2011 / Wu et al., Science 2011)。さらに近年、欧州、米国、アフリカの共同研究で欧州人とアフリカ人の間で高タンパク質・高脂肪の西欧食と高炭水化物のアフリカ食を 2 週間交換し、腸内細菌叢と代謝物の解析が行われている。その結果、腸内の短鎖脂肪酸や二次胆汁酸などの発ガンリスクマーカーに大きな変化が見られたと報告されている（O’Keefe et al., Nat. Commun. 2015）。アフリカ人は欧米に移民することで大腸がんの発ガン率が 10 倍以上高まることが知られており、西欧食の影響から、アフ
リカ系アメリカ人は腸内細菌叢が変化し、その細菌叢コミュニティーの代謝が偏倚し、大腸がんのリスクとなっている可能性が指摘されている。これらの研究を背景とし、食と健康のインターフェースである腸内細菌叢の研究への興味が日々高まっている。
我々は、アジア諸外国・計 10 ヶ国の研究グループと共同で Asian Microbiome
Project (AMP) を設立し、アジア各地域における食と腸内細菌叢ついての情報収集を行っている。AMP は現在、第３期を迎えている。第１期は、各国の食習慣を反映した食生活を営んでいると期待される、小学児童を対象に調査を行った。
第２期は、新生児から高齢者まですべての年齢層のデータを広く集めることを目標に調査を行っている。そして第３期では、特定地域を対象として、より詳
細に食と腸内細菌叢の関連性を調査している。
第一期研究の結果として、①欧米人では準優占菌であるビフィズス菌がアジア人の腸内では優占菌の一つとなっていること、②アジア人には 2 つの腸内細菌型（エンテロタイプ）が存在すること、③エンテロタイプに加えて各国特有の特徴が細菌叢に見られること、以上が見出された (Nakayama et al., Sci.Rep.
2015)。中でも、日本人の腸内細菌叢は非常に特徴的で、善玉菌であるビフィズ
ス菌が非常に多く、逆に一般的に悪玉菌と言われる大腸菌群の細菌数が低い。
一方、タイ人は日本人の 10 倍以上の大腸菌群を保有していた。また、各国内における地域比較コホート研究においても興味深いデータが得られている。例えば、タイの大都市バンコクと地方都市のコンケンの子どもは異なるエンテロタ
イプを有していた。両エンテロタイプの細菌叢コミュニティーをショットガン
メタゲノム解析によりゲノムレベルで比較解析すると、両者の関係は、アメリ
カ人とアフリカ人の関係(Yatsunenko et al., Nature 2012)に類似していた。つまり東南アジアにおいても欧米化の影響が腸内細菌叢に現れていると考えられる。
第二期研究の結果では、①第一期研究で見られた国ごとの特徴は成人でもある
程度維持されていること、②各国にほぼ共通して、年齢とともに、ビフィズス菌の占有率が減少し、逆に大腸菌の占有率が増加する傾向が見られること、③
しかし②で見られる年齢の傾向から逸脱する被験者も多く、これらの被験者の健康状態との関係に興味が持たれること、が報告されている。
第三期研究では、①タイ・バンコクと日本・福岡の比較コホート研究において。
日本食を食するタイ人の腸内細菌叢が日本人の腸内細菌叢に近似してきている
こと、②フィリピンレイテ島の都市部と農村部の小学児童の食と腸内細菌叢の調査研究において、都市部の児童の一部は米国の子どもに匹敵する高脂肪食を摂取しており、腸内細菌叢も農村部の子どもと大きく異なってきていること、などが示されている。
以上のように、アジア人の腸内細菌細菌叢は、食の欧米化の影響を受けながら、
現在進行形で変動していることが示された。今後、この腸内細菌叢の変化が、宿主の健康に与える影響を注意深く追跡していくことが重要であると考えられる。

Link between diet and gut microbiota in Asians○Jiro Nakayama1, Noriko Honda2, Juma Kisuse2, Rie Momoda2, Masaru Tanaka2,
Kenji Sonomoto1, Yuan-Kun Lee3
(1Fac. Agric., Kyushu Univ., 2Grad. Sch. Bioresour. Bioenviron. Sci., Kyushu Univ.,
3
Dept. Microbiol., Natl. Univ. Singapore)

Key words

gut, microbial flora, Asia, diet

和食の機能性のメカニズム～生活習慣病予防、腸内細菌へのインパクト～

3S-Dp03

麹菌プロテアーゼの腸内細菌叢への影響○加藤 範久
（広島大院・生物圏）
nkato@hiroshima-u.ac.jp

3S-Dp04275

麹グルコシルセラミドの腸内細菌叢への影響
藤川 彩美 1, 佐藤 友哉 1, 浜島 弘史 1, 柳田 晃良 2, 光武 進 1,
永尾 晃治 1, 中山 二郎 3, ○北垣 浩志 1
（1佐賀大・農, 2西九州大学, 3九大院・農）ktgkhrs@cc.saga-u.ac.jp

麹菌は古来より味噌や醤油、清酒、漬物などの我国の発酵食品の製造に広く利用されてきた。しかしながら、機能性食品の開発への麹菌の応用研究は非常に限られている。最近、我々は麹菌で発酵させたごぼうをラットに摂取させるとごぼうと比較して盲腸内の Bifidobacterium が著しく増加し、発酵産物の有機酸も顕著に増加することを見出した（Okazaki et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 77:
53-57, 2013）。同様な現象が米麹や多穀麹を摂取させた場合でも見られた。さらに、発酵ごぼうの水抽出物をラットに摂取させたときも同様な効果が見られ、加熱するとその効果が消失した。そこで、菌体外の成分のプロテアーゼなどの消化酵素が関与しているのではないかと考え、食品加工用の様々なプロテアー
ゼ剤についても検討を行なった。その結果、麹菌由来のプロテアーゼ剤 protease
A ‘Amano’ SD（Aspergillus oryzae 由来、天野エンザイム）（アマノプロテアー
ゼ）をラットに摂取させた場合に、腸内の Bifidobacterium が著しく増加することが見出された（Yang et al. Biomedical Rep. 3: 715-720, 2015）。このアマノプロ
テアーゼには複数のプロテアーゼや低分子物質が含まれている。そこで、その活性本体を特定する研究を行なっている。これまでの解析の結果、その中に含まれる酸性プロテアーゼが腸内 Bifidobacterium を著しく増加させることが明らかとなった。さらに、酸性プロテアーゼを失活させて摂取させるとビフィズス菌の増加効果は消失した。驚くべきことに従来のオリゴ糖などのプレバイオ
ティックスよりはるかに少ない摂取量（100 分の 1 程度）で顕著な効果が見られた。こうした特徴から従来のプレバイオティックスとは全く異なる作用機構が考えられ、プレバイオティックスの基本概念を変える可能性がある。今後はその詳細な作用機構を解明する必要がある。また、麹菌由来のプロテアーゼは
医療用医薬品の消化酵素剤にも含まれている。そのため、米麹菌に由来する酸性プロテアーゼの機能性食品や医薬品への応用が期待できる。本研究は麹菌発
酵食品の効能を探るうえで新たな突破口を開くものである。

医療レベルがほぼ同じ主要先進国の中でも日本人の平均寿命は世界トップレベ
ルであり、日本人の健康長寿の原因として医療レベル以外の要因があると考えられる。その原因のひとつとして、日本人が 1000 年以上受け継いできた和食を考えることは充分な根拠がある。和食は繊維質が多い、多価可不飽和脂肪酸が多い、飽和脂肪酸が少ないなど健康によい要因が知られているが、そうした栄養成分だけでは説明できない未解明の要因もあると考えられている。
和食の特徴のひとつは発酵食品を多く含むことである。味噌、醤油、お酢、黒酢、日本酒、酒粕、焼酎などの日本の発酵食品の多くの製造工程においてはでんぷんの糖化剤・酵素源として麹を使うことから、麹は日本の発酵食品の、そして和食の基盤であると言える。従って、麹の機能性を明らかにすれば日本の発酵食品の、ひいては和食全体の機能性として訴求できることになる。
麹は、蒸した米に麹菌 Aspergillus oryzae もしくは A. luchuensis を生やしたものである。これらの菌は長年日本で種麹菌企業・技術者集団により育種・培養されてきたことから、米国 FDA からも GRAS (Generally Regarded As Safe)と認定されている。
麹はこれまで酵素源としての役割が想定されており、酵素源としての研究は多く行われてきたが、腸内細菌叢を制御するプレバイオティクスとしての研究はほとんど行われてこなかった。そこで本研究では、麹のプレバイオティクスとしての役割を調べるため、麹に含まれる成分を探索し、その腸内細菌叢に及ぼす影響を調べることとした。
麹に含まれる成分を調べた結果、麹には 0.5-3.0 mg/g の濃度で独自構造のグリ
コシルセラミドが含まれることを見出した。グリコシルセラミドはスフィンゴ脂質の一種であり、スフィンゴイド塩基に脂肪酸がアミド結合し、さらに一位の水酸基にグルコースもしくはガラクトースが結合した分子種である。スフィ
ンゴイド塩基や脂肪酸、結合している糖の組成などで、麹菌の生産するグリコ
シルセラミドは N-2’-hydroxyoctadecanoyl-l-O-beta-D-glucopyranosyl-9-methyl-4,8sphingadienine (69.7%) と N-2’-hydroxyoctadecanoyl-l-O-beta-D-galactopyranosyl-9methyl-4,8-sphingadienine (30.3%)であり、他の生物種のグリコシルセラミドとは構造が異なり、独自構造を持つと言える。麹に含まれるグリコシルセラミドの濃度は他の食品と比べても最も多いもののひとつであった。日本人の摂取する発酵食品の量から考えると、日本人は平均で一日あたり 26-77mg のグリコシル
セラミドを食べてきたと推定される。これらのことから、独自構造のグリコシ
ルセラミドの摂取が多いことは、和食のひとつの特徴と言える。そこで麹に含まれるグリコシルセラミドの影響を調べるために、麹からグリコシルセラミドを大量に抽出・粗精製し、0.5%w/w の割合で餌に混ぜてマウスに一週間摂食させ、その糞便のゲノムを抽出して Illumina miseq で解析し細菌叢を調べた。その結果、グリコシルセラミド添加区の一部の細菌に統計的に有意な変化が観察された。グリコシルセラミド添加区で統計的に有意に増えていた細菌のひとつに、健康への寄与が近年提唱されている Blautia coccoides が含まれていた。B.
coccoides は特に日本人の糞便に多く含まれていることが報告されており、精神を落ち着かせたり制御性 T 細胞の腸管への集積を誘導することが報告されている。さらに、B. coccoides は肝硬変や大腸がん、大腸炎、乳がん、I 型糖尿病、急性下痢などで減少することが報告されており、健康との関連が近年強く示唆されている腸内細菌である。また、麹グリコシルセラミドは B. coccoides の増
殖を in vitro でも刺激した。これらの結果から、和食が日本人の健康に寄与するメカニズムのひとつは麹グリコシルセラミドを介した B. coccoides の腸内での増加である可能性が示唆された。
麹は日本人が和食として 1000 年以上食べてきた食材であることから、麹は独自のグリコシルセラミドを通じて日本人の腸内細菌叢を制御するプレバイオティ
クスとして歴史的に機能してきており、健康のみならず、日本人の精神性にも影響してきたことが考えられる。

Effect of protease derived from Aspergillus on intestinal microflora

Influence of glycosylceramide of Japanese koji Aspergillus oryzae on theintestinal microbial flora○Norihisa Kato
(Grad. Sch. Biosphere Sci., Hiroshima Univ.)

Key words

Aspergillus oryzae, fermentation, probiotics, protease

Ayami Fujikawa1, Tomoya Sato1, Hiroshi Hamajima1, Teruyoshi Yanagita2,
Susumu Mitsutake1, Koji Nagao1, Jiro Nakayama3, ○Hiroshi Kitagaki1(1Fac. Agric., Saga Univ., 2Nishikyushu Univ, 3Fac. Agric., Kyushu Univ.)
Key words

Koji making, microbial flora, Aspergillus oryzae, lipid

276

和食の機能性のメカニズム～生活習慣病予防、腸内細菌へのインパクト～ ／セルフリー（無細胞）タンパク質合成技術の新展開

3S-Dp05

麹グリコシルセラミド分解物の PPAR への影響
○浜島 弘史, 光武 進, 北垣 浩志（佐賀大・農）hamajima@cc.saga-u.ac.jp

3S-Ep01

ヒト因子由来無細胞タンパク質合成系の開発と応用○町田 幸大 1,2, 重田 友明 1, 今高 寛晃 1,2（1兵庫県大院・工, 2理研・ライフサイエンス）
machida@eng.u-hyogo.ac.jp

PPAR （Peroxisome Proliferator-Activated Receptor）は、ペルオキシソーム増殖剤によって細胞小胞器官ペルオキシソームを誘導する核内レセプターとして報告
され、脂肪酸の β 酸化を活性化させることから、脂肪酸代謝の調節機構の重要な転写因子として注目された。その後の研究から、PPAR は脂肪酸代謝のみならず、糖やタンパク質の代謝、免疫系の調節や細胞分化など様々な働きに関与すると考えられている。PPAR には 3 種類のサブタイプ、PPARα、PPARδ(β)、PPARγ の存在が確認され、PPARγ にはさらに選択的スプライシングによる
PPARγ1、γ2、γ3 の 3 つアイソフォームが存在することが知られている。核内レセプターは基本的な構造が共通し、リガンド非依存的転写活性化領域(AF-1)を持つ A/B ドメイン、Zn+フィンガー構造を有する DNA 結合領域を持つ C ドメ
イン、構造可変に関与するヒンジ領域の D ドメイン、リガンドの結合とリガン
ド依存的転写活性化領域の AF-2 を持つ E/F ドメインから構成される。PPAR では、リガンドの結合により活性化してレチノイド X 受容体(Retinoid X Receptor;
RXR)とヘテロダイマーを形成し、コアクチベーターと共に転写活性を発揮する。PPARα は、肝臓、腎臓、心臓、筋肉、脂肪組織などで多くの組織で発現しており、フィブラート系薬剤によって活性化される。高脂血症改善薬の主要な標的であり、脂肪酸の β 酸化・ω 酸化の促進、脂肪酸トランスポーター・アシ
ル CoA シンテターゼの活性増加、アシル CoA カルボキシラーゼ・脂肪酸シンテターゼの活性抑制やアポ蛋白 A-I と A-II の発現増加による HDL 産生促進などに関与する。PPARγ はチアゾリジン系薬剤によって活性化されてインスリン抵抗性の改善を示すことから抗糖尿病薬に用いられる。PPARγ1 は心臓、筋肉、消化器官を含む多くの組織で、γ2 は主に脂肪組織に、γ3 は免疫細胞、大腸、白色脂肪組織で多く発現している。アディポネクチンの産生促進や小型化脂肪細胞の分化誘導によるアディポネクチン産生亢進と炎症性アディポサイトカイン
産生抑制を促し、インスリン抵抗性の改善に寄与する。また、マクロファージの脂質輸送タンパクの発現を調節して泡沫細胞への分化を抑制することなどに関与する。PPARδ は、多くの組織で発現するが特に脳、脂肪組織、皮膚や骨格筋で発現が見られる。多価不飽和脂肪酸などで活性化され、骨格筋において脂肪酸の輸送タンパク及びミトコンドリア造成などの遺伝子発現調節を介して、脂肪酸の取り込みや β 酸化代謝を亢進して抗肥満作用を示すことが報告され、インスリン抵抗性の改善などに寄与すると考えられる。PPAR のリガンドであるペルオキシソーム増殖剤は一般に疎水性の化合物であり、天然リガンドも同様に脂溶性である脂質メディエーターが同定されている。アラキドン酸から生成されるプロスタグランジン代謝物やイコサノイドが PPAR の天然リガンドとして活性を持つほか、脂肪酸そのものやスフィンゴ脂質も PPAR の天然リガン
ドの候補である。
麹は日本の発酵食品を製造するのに欠かせない素材であり、日本古来からの洗練された製造技術を受け継いできた日本が誇る食文化である。米、麦、大豆などの穀物に食品発酵に有益なコウジカビ(Aspergillus)を繁殖させたもので、日本
では 700 年以上の食経験をもつ伝統食品である。麹菌はカビや真菌の一種であることから、一般の食品とは違う栄養成分が期待され、その中で我々は麹の持
つスフィンゴ脂質に着目して解析を行ってきた。その結果、麹に含まれるスフィ
ンゴ脂質には高濃度でグルコシルセラミドが含まれることを見出した。また、
そのグルコシルセラミドの中には、植物由来や動物由来とは異なり、スフィン
ゴイド塩基の 9 位にメチル基を持つカビや真菌を由来とするグルコシルセラミ
ド、9-methylsphingadienine が存在することを報告した。そこで我々は、一般食品とは違う特徴的なスフィンゴ脂質を含む麹脂質が、脂質メディエーターをリガンドとする PPAR にどのような影響を与えるか解析を行った。
麹から抽出精製した麹セラミドを酸加水分解によりスフィンゴイド塩基に変換した。麹セラミドは、複数のセラミドが混在しており多様なスフィンゴイド塩
基を構成成分としていることから、含まれるスフィンゴイド塩基の種類を LCMS/MS に て 解 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 麹 ス フ ィ ン ゴ イ ド 塩 基 に は 、 9methylsphingadienine(30%) だ け で な く 、 phytosphingosine (PHS, 22%) や
sphingadienine(27%)が含まれていることが明らかになった。次に麹スフィンゴ
イド塩基が PPAR の活性に与える影響をレポーターアッセイにより解析を行った。転写因子 PPARγ を強制発現した CHOP 細胞において、麹スフィンゴイド
塩基による PPARγ 活性を解析した結果、DMSO 溶媒添加(刺激なし)に比べ約 3倍の PPARγ の活性が認められ、その活性量は麹スフィンゴイド塩基に含まれる
PHS 相当であった。
これらの研究結果から、麹に含まれるスフィンゴ脂質には、セラミドのスフィ
ンゴイド塩基を介して PPARγ の活性を促進することが示唆された。麹は和食の多くに使われていることから、和食にも PPARγ の活性化能があることになり、日本人に心疾患、脳血管疾患の患者数が少ないことの理由のひとつである可能性がある。

近年、真核細胞の翻訳調節に関わる真核生物特異的な機構と翻訳関連因子が明らかにされると共に、ヒトの疾患に関連する遺伝子の修飾やプロセシングや
フォールディング等の諸反応が、翻訳のどの段階（開始→伸長→終結）でどの様に起こっているのか？あるいはどのように制御されているのか？を詳細に解析するための研究ツールの開発が急務になっている。この様な社会のニーズに応えるために、我々の研究グループでは、「HeLa S3 細胞抽出液をベースとした
セルフリータンパク質合成系」とヒトのタンパク質合成に必要な因子のみを試
験管内で混合した「ヒト因子由来再構成型タンパク質合成系」の開発を行ってきた。HeLa S3 細胞抽出液をベースとしたセルフリータンパク質合成系は、細胞膜と核を除いた細胞内容物を含有する無細胞（in vitro）翻訳系として樹立しており、より細胞に近い状態でタンパク質合成（翻訳反応）を再現することが可能である。一方、ヒト因子由来再構成型タンパク質合成系は、精製したヒトのリボソーム、翻訳開始因子群（eIF）、翻訳伸長因子群（eEF）、翻訳終結因子群（eRF）、tRNAs、20 種類のアミノアシル tRNA 合成酵素（ARSs）を、アミノ酸、ATP などのエネルギー源と共にエッペンドルフチューブ内で混合したシン
プルな無細胞翻訳系であり、(1)翻訳開始因子を必要とする cap 依存型およびEMCV-IRES 依存型の翻訳系と、(2)翻訳開始因子を必要としない HCV-IRES 依存型の翻訳系の樹立に成功している。このため、最初に紹介したヒトの翻訳反応（開始→伸長→終結）の個々の反応段階に焦点を当てた解析を行うために最適なツールとなっている。現在、我々は上記の無細胞翻訳系を使い分けて、ヒトの翻訳開始に関与する PABP の作用機構の解析、翻訳伸長の過程で生じる
EMCV ウイルスタンパク質のプロセンシング解析、翻訳終結後に起こるハンチ
ントン病原因タンパク質 polyQ の凝集機構の解析および凝集抑制因子のスクリーニング、さらに、リポソーム化による人工ヒト細胞の創出に向けた研究を進めている。本講演では、我々が開発したヒト因子由来無細胞翻訳系の詳細と有用性ついて紹介する。

Regulation of the PPAR by koji glycosylceramide degradation products

Establishment and applications of human cell free translation systems○Hiroshi Hamajima, Susumu Mitsutake, Hiroshi Kitagaki(Fac. Agric., Saga Univ.)

Key words

Koji, glycosylceramide, PPAR, sphingoid base

○Kodai Machida1,2, Tomoaki Shigeta1, Hiroaki Imataka1,2(1Grad. Sch. Eng., Univ. Hyogo, 2CLST, RIKEN)

Key words
human cell

cell free translation, protein folding, protein aggregation, artificial

セルフリー（無細胞）タンパク質合成技術の新展開

3S-Ep02

昆虫嗅覚受容体の機能的再構成系の構築と匂いセンサへの応用

3S-Ep03○櫻井 健志, 光野 秀文, 神崎 亮平（東大・先端研）
sakurai@brain.imi.i.u-tokyo.ac.jp277

再構成型無細胞タンパク質合成システムを利用した新規タンパク質定量法「MS-QBiC」による体内時刻の測定○清水 義宏, 鳴海 良平, 上田 泰己（理研・生命システム）
yshimizu@riken.jp

近年、われわれの生活の安全・安心や快適さの向上、危機安全管理の観点から、
ごく微量の匂い物質をリアルタイムに検出する技術に対する社会的ニーズが高まってきている。また、匂いを手掛かりにした被災地での救助活動、匂い情報の疾病診断への利用など匂いセンサの幅広い活用が期待されている。このような多様なニーズに応えるために、金属酸化物半導体や水晶振動子などをセンサ素子とする工学的技術に基づいた匂いセンサの開発が進められており、一部は実用化されている。しかしながら、これらのセンサは、感度や選択性が十分でない、センサ素子の素材の制約で検出できる匂い物質が限定される、検出に要する時間が長いといった問題点がある。これらの問題点を克服するために、検出可能な匂い物質の種類に制限がなく、高い検出感度、高い選択性を兼ね備え
リアルタイムに匂いを検出できる、革新的な検出原理に基づく匂いセンサの開発が望まれている。
生物の中でも昆虫は嗅覚が発達しており、環境中に存在する多様な匂い物質を
既存の匂いセンサをはるかに凌ぐ高感度でリアルタイムに検出する。最近になり、昆虫の高性能な匂い検出機能が、触角に存在する嗅覚受容細胞の樹状突起膜で発現する嗅覚受容体の機能によって達成されていることが明らかにされてきた。昆虫では、匂い選択性を決定する嗅覚受容体が共受容体とヘテロ複合体を形成し、匂い作動性のイオンチャネル型受容体として機能するため、G タン
パク質共役型として機能する脊椎動物の嗅覚受容体と比較して応答速度が速い、
ヘテロ発現系での再構成が比較的容易という特徴がある。さらに昆虫種ごとに数十種以上の匂い選択性の異なる嗅覚受容体をもつことが報告されており、多様な匂い物質に対する匂いセンサ素子として利用可能性があるといえる。そこ
で、われわれは昆虫の嗅覚受容体に着目し、そのセンサ機能を再現した再構成系を構築することで、多様な匂い物質を既存の匂いセンサの性能を越える性能で検出可能な匂いセンサ素子の開発を進めている。
これまでにわれわれは、ガ類昆虫の一種であるカイコガ生体の嗅覚受容細胞、昆虫培養細胞における嗅覚受容体の再構成系を確立し、匂いセンサ素子としての性能を評価してきた。さらに、匂いの検出に細胞内の代謝系を必要としない
昆虫嗅覚受容体の特性を活かし、無細胞翻訳系を利用したジャイアントベシク
ル内での嗅覚受容体合成による機能再構成系を構築してきた。本講演では、これらの再構成系における昆虫嗅覚受容体の機能を比較検討し、個々の再構成系の長所と短所を匂いセンサとしての利用への展望を含めて議論する。

細胞中に含まれる特定の酵素や因子などのタンパク質の量を正確に測定することにより、その細胞が今どのような状態にあり、どのような機能を担っているかを知る手掛かりとなりうる。また、細胞中の特定の生体システムをターゲッ
トにし、その構成要素の定量を経時的に行い、動的・量的な情報を得ることにより、その生体システムの役割や、細胞間の役割の違いなどを明らかにすることで、そのシステムの包括的な理解へとつながると考えられる。こうした観点から、近年、質量分析装置を用いた定量プロテオミクスや、より高感度な三連四重極質量分析装置を利用したターゲットプロテオミクスなどの手法が確立されつつある。
質量分析装置を利用した定量プロテオミクスにおいては、目的タンパク質を含むサンプルのトリプシン消化物に対し、濃度既知の安定同位体標識した参照ペプチドを投入し、質量分析により得られたシグナル強度の比較を元に、目的タ
ンパク質の定量を行うことが一般的である。これまで、安定同位体標識したアミノ酸を基質として用いた化学合成や、同アミノ酸を含む培地などを利用して生体試料から取得するなどの方法により、参照ペプチドの合成が行われてきたが、高価な安定同位体標識アミノ酸の大量使用や、生体中にある代謝酵素によるアミノ酸の置換などにより、安定して多種類のペプチドを調達することが困難なため、複数種類のタンパク質を効率よく定量するための障壁となっていた。
本研究では、再構成型無細胞タンパク質合成システム、PURE system を利用してこれら参照ペプチドを安価かつ迅速に調製する手段を構築し、質量分析装置
によるタンパク質定量法「MS-QBiC」として開発を行った。MS-QBiC 法をマウスの概日時計タンパク質ネットワークの定量に利用し、20 種類の概日時計タン
パク質に対して時系列変化の測定を行ったところ、16 種類の定量解析に成功した。うち、14 種類は概日周期で増減するという結果が得られ、さらに、これら増減するタンパク質の定量値そのものがマウスの体内時刻を示しているという結果からタンパク質定量による体内時刻の測定が可能であることを明らかにした。本研究により確立された MS-QBiC 法は概日時計タンパク質ネットワーク
だけでなく、膜タンパク質などの困難なターゲットを含む生体内の様々なタン
パク質ネットワークの定量解析に応用可能であると考えている。

Functional reconstitution of insect odorant receptors and application toodorant sensors

Body time detection by a novel protein quantification method using cell-freetranslation system○Takeshi Sakurai, Hidefumi Mitsuno, Ryohei Kanzaki(RCAST, Univ. Tokyo)

Key words

odorant receptor, insect, sensor, reconstruction○Yoshihiro Shimizu, Ryohei Narumi, Hiroki Ueda
(QBiC, RIKEN)

Key words

protein, proteomics, amino acid278

セルフリー（無細胞）タンパク質合成技術の新展開

3S-Ep04

セルフリータンパク質合成系を用いた特殊ペプチド創薬○窪田 規一（ペプチドリーム株式会社）k-kubota@peptidream.com

3S-Ep05

無細胞合成抗原を用いた抗膜タンパク質抗体作製技術○竹田 浩之, 澤崎 達也（愛媛大・PROS）
takeda.hiroyuki.mk@ehime-u.ac.jp

1969 年に発見され、移植医療の成功率を大幅に増加させたシクロスポリンは、
通常のペプチドとは異なり D-アミノ酸や N-メチルアミノ酸が組み込まれた構造をもった 11 のアミノ酸からなる特殊ペプチドであった。天然由来の特殊ペプチドの例などから、特殊ペプチドは創薬候補物質として大きな期待を持たれていたものの、創薬開発システムに組み込むためのライブラリー作成が困難であった。
特殊ペプチドライブラリーを創製させるには、一つの手段として固相合成法を基盤とした有機化学的アプローチがある。しかし、この方法ではライブラリーの多様性が樹脂ビーズの個数に左右されるため、多様性に限りがあり大規模ライブラリーの構築は困難であった。
また、リボソームを利用した無細胞翻訳合成系は大きな多様性を持った大規模ライブラリーの構築が可能ではあるが、従来の無細胞翻訳合成系では 20 種類のタンパク質性アミノ酸にしか対応できず、特殊な構造を持つ特殊ペプチドの合成は不可能であった。
我々はこの問題を解決するために、アミノアシル化 RNA 触媒（リボザイム）
を人工的に改変してフレキシザイム（Flexizyme）を開発した。フレキシザイム
は tRNA の３′末端を強制的にアミノアシル化することにより結果として、あらゆるアミノ酸すなわち、多様な非タンパク質性アミノ酸をアミノアシル化することができるようになった。
そして、フレキシザイムによるアミノアシル tRNA 合成系と、無細胞翻訳合成系を統合することにより、新しい無細胞翻訳合成系を開発することに成功した。
これが、FIT システム(Flexible In-vitro Translation system)である。
さらに、FIT システムにより創製できる 10 兆種類にも及ぶ特殊アミノ酸から創薬ターゲットタンパクに特異的なものを選択するために、独自のディスプレイ
選択系 RAPID（Random Peptide Integrated Discovery）システムを開発し、組み合わせることにより特殊ペプチド創薬プラットフォームシステム：PDPS（Peptide
Discovery Platform System）を完成させた。
PDPS によって創出される特殊ペプチドは、分子量 1,500 程度でありながら抗体に匹敵する特異性と結合力を持っており、細胞内を含めタンパク-タンパク相互作用（PPI）阻害剤などの機能を有することができる。
今後、開発が進むことにより多くの次世代医薬品が提供できると確信している。
本シンポジウムでは特殊ペプチド創薬プラットフォームシステム：PDPS（Peptide
Discovery Platform System）の開発秘話を含め、PD-1/PDL-1 特殊ペプチドなどの実例を踏まえた特殊ペプチド創薬の可能性に関してその片鱗を紹介できればと考えている。

生体膜上に局在する膜タンパク質はシグナル伝達や物質輸送、物質代謝などの役割を担っており、重要な創薬ターゲットである。膜タンパク質を特異的に認識する抗体が膜タンパク質の機能解明のためには欠かせない。特異性や親和性が高い抗体、高次構造認識抗体、あるいは多様なアプリケーションに適した抗体など特徴のある抗体が求められている。しかし、高品質の抗膜タンパク質抗体の開発は困難であり、膜タンパク質研究の大きな足かせになっている。最近、我々は無細胞タンパク質合成技術を用いて抗膜タンパク質抗体作製のための技術開発を行ったので報告する。
抗膜タンパク質抗体作製の大きな問題点の一つが、免疫や抗体選抜に必要な膜タンパク質の大量調製である。複数の膜貫通ドメインを持つ膜タンパク質は構造が複雑で不安定であり発現の過程で容易に凝集・失活してしまうこと、また膜タンパク質を過剰発現させると細胞内の恒常性が撹乱されることなどから、従来の細胞タンパク質発現系では大量調製が困難である。また、可溶化や精製のような複雑な工程が必要であり、その過程で標的膜タンパク質の収率の低さや失活が問題になることがしばしばある。また、アミノ酸変異や T4L、BRIL 挿入により膜タンパク質の安定性を高めることが可能であるが、変異導入した膜タンパク質を抗原に用いると変異導入箇所に対する抗体ができることがある。
そのため野性型の膜タンパク質を安定かつ大量に生産する方法が求められていた。
近年、無細胞タンパク質合成系に人工脂質小胞・リポソームや界面活性剤を添加することで膜タンパク質を安定に合成する手法が複数報告されている。我々はリポソームを添加したコムギ無細胞タンパク質合成系を改良し、透析法と重層法を組み合わせた透析重層法を開発した。透析重層法では、カップ型透析デバイスの内部で合成反応液と基質液を重層し、さらにカップ自体も基質液に浸漬することで、透析膜と重層界面の両面において基質供給を円滑に行う。その結果、従来法に比べてコムギ胚芽抽出液あたりの生産量が４倍から８倍に高まり、mg オーダーの膜タンパク質を容易に合成することが可能になった。G タン
パク質共役型受容体（GPCR）を用いた合成試験を実施した。A, B, C の全てのクラスから代表的な 25 種類の GPCR を選択し透析重層法を用いて合成したと
ころ、すべての GPCR の合成を確認した。コムギ胚芽抽出液 1mL あたりの合成量についても数百 μg から最大 8 mg と非常に良好であった。
機能性抗体の取得のためには、高速かつ高感度な抗原抗体反応検出法も必要である。ごく稀にしか得られない機能性抗体の取得のためには、多くのハイブリ
ドーマ母集団から効率的な抗体選抜を行う必要がある。また、変性抗原のみに結合する配列認識抗体は早い段階で除外できるほうが望ましい。我々はビオチ
ン化脂質を構成脂質に添加したビオチン化プロテオリポソームと、AlphaScreen
を用い、Biotinylated Liposome-based Interaction assay（BiLIA 法）を開発した。
BiLIA 法ではビオチン化リポソーム上に合成した膜タンパク質と抗体の相互作用を２種類のビーズで検出する。本手法は洗浄課程を必要としないホモジニア
スアッセイであり、少ない工程で短時間に抗体スクリーニングを実施することができる。そのため抗原膜タンパク質の変性が起きにくく、未変性タンパク質に結合する抗体の選抜に適している。
これまでに我々は無細胞合成プロテオリポソーム抗原と BiLIA 法を用いて、様々な膜タンパク質の大量調製とモノクローナル抗体の取得に成功している。
最初の抗体作製例であるドーパミン D1 受容体(DRD1)に対するモノクローナル抗体作製では、通常のハイブリドーマ系を用いたマウスモノクローナル抗体と、
ISAAC 法によるウサギモノクローナル抗体を作製した。マウスへの免疫には1mg、ウサギへの免疫には 5mg の DRD1 を合成した。得られた 35 クローンのマウス抗体は親和性の高いグループと低いグループの２群に分かれた。ウサギ
抗体 6 クローンはすべて高親和性抗体であった。DRD1 オーソログを用いた
BiLIA では、全ての抗体が DRD1 以外のヒトのドーパミン受容体には結合せず、また 1/3 の抗体はマウス Drd1 にさえ反応しなかった。親和性と特異性が高いこ
れらの抗体は特に免疫染色で高い性能を示した。BiLIA 法を応用したエピトー
プ解析の結果、ほとんどの抗体は DRD1 の細胞内 C 末端領域に結合したが、マ
ウス抗体１種とウサギ抗体１種が DRD1 の細胞外第二ループに結合していた。
FACS 解析の結果、マウスの細胞外第二ループ認識抗体が膜透過処理をしていない DRD1 発現細胞に結合することを確認した。
このように、無細胞技術を抗体作製に応用することで、これまで生産性が低く免疫することさえ困難だった膜タンパク質に対する抗体作製が可能になってきている。本発表ではこれらの技術の紹介と、これまでの抗体作製で判明した利点や問題点、改善のための取り組みなどについて説明する。

The constrained peptides innovative drug development using a cell freetranslation systems.

Production of monoclonal antibodies against membrane proteins using cellfree technology○Kiichi Kubota(PeptiDream Inc.)

Key words

peptide○Hiroyuki Takeda, Tatsuya Sawasaki(PROS, Ehime Univ.)

Key words
monoclonal antibody, membrane protein, cell-free protein synthesis,
proteoliposome

遺伝子工学3P-1p001 慢性皮膚疾患である乾癬関連遺伝子群の酵母を利用し
た解析

279

3P-1p003 Expression of an AT-biased Rhizopus glucoamylase genein Aspergillus oryzae○辻 竜海（山口大学院 創成科学研究科 化学系専攻）
rinji@yamaguchi-u.ac.jp○Dalia Zaouil, Mizuki Tanaka, Takahiro Shintani, Katsuya Gomi
(Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)
dalia.zwl@gmail.com

乾癬とは全身に赤い発疹や鱗屑と呼ばれるかさぶたができ、ポロポロと剥がれ落ちる慢性の炎症性皮膚疾患であり、欧米圏での疾患率は 3％と高いがその根本的な治療法が確立されていない難病の１つである。乾癬患者の遺伝子解析の結果から IL36RN の遺伝子に家族性変異が見つかったので IL36RN が乾癬の発症に関わる。IL36RN は抑制性のインターロイキンであり、IL1 受容体のリガンドであると考えられているが、免疫系のリガンドと受容体の相互作用を解析す
ることは容易ではない。ヒト培養細胞にて乾癬関連受容体遺伝子を発現させたが、安定な発現自体ができなかった。そこで IL36RN 及び乾癬に関与する遺伝子を解析するにために、酵母 Saccharomyces cerevisiae を使用する新たな実験系の開発を試みた。まず、IL36RN に加えて、活性型の IL36α、IL36β、IL36γ 等のリガンド遺伝子群とそれらの受容体である IL1RL2 遺伝子を合成し、GFP と融合させて酵母細胞内で発現させた。すると IL36RN 及びその受容体 IL1RL2 は酵母内にてドット状局在することがわかった。そこで、もし IL36RN と IL1RL2が酵母内でも結合するならドットが共局在を示すと考えた。そこで IL1RL2 に
GFP を、IL36RN に RFP を融合させて同時に発現させ、2 つのタンパク質の挙動を観察した。その結果、2 つのタンパク質は同一カ所にてドットとして共局在することがわかった。このことは、酵母内でヒト細胞膜上でのリガンドと受容体の相互作用を可視化できるようになったことを示唆している。次に IL36RNの家族性変異を導入し、共局在を観察したところ、いくつかは共局在しなくなった。抑制性リガンドが受容体へ結合できなくなったり、活性が強まり皮膚の炎症が起こると想像できた。多くの病気やその治療のために受容体とリガンドとの反応性を調べることが求められている。本研究では酵母を利用した新しい方法を提案する。

Glucoamylase (EC 3.2.1.3) hydrolyzes α(1,4)- and α(1,6) glucan links inpolysaccharides. It also removes successive glucose units from the non-reducing endsof the chains and is useful in saccharifying starch in commercial alcohol production. In
particular, glucoamylase from Rhizopus oryzae highlu in biotechnological applications
because of its strong hydrolyzing activity toward raw starch compared to otherglucoamylases. However, despite such an advantage of Rhizopus glucoamylase, R.
oryzae produces low amounts of glucoamylase in submerged cultures. To overcome
some of the obstacles of mass production of Rhizopus glucoamylase, we try to produce
it at high level using Aspergillus oryzae as a host. A. oryzae is quite the candidate fortransformation as it is produces large amounts of enzymatic proteins, considered a safe
microorganism and is capable of heterologous protein expression.
Working with two organisms of different GC content, however, codon optimization is amust to be able to efficiently produce glucoamylase, according to our previous studies(1, 2) suggesting that AT-biased heterologous gene transcripts tend to bepolyadenylated prematurely and rapidly degraded. Hence, we first compare theproduction level of Rhizopus glucoamylase overexpressed in A. oryzae and in the yeast
Saccharomyces cerevisiae. So far we have succeeded in transforming the Rhizopus
glucoamylase in both yeast and A. oryzae. Proceedingly we are checking thetransformants for activity and transcript level by northern blot analysis.
1) Tokuoka et al, Appl. Environ. Microbiol., 74, 6538-6546 (2008)
2) Tanaka et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 96, 1275-1282 (2012)

Analysis of genes relating to chronic disease psoriasis in yeast

Expression of an AT-biased Rhizopus glucoamylase gene in Aspergillus○Tatsumi Tsuji(GraduateSchool of Science and Technology for Inovation, Yamaguchi Univ)

Key words

Saccharomyces cerevisiaeoryzae○Dalia Zaouil, Mizuki Tanaka, Takahiro Shintani, Katsuya Gomi
(Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)

Key words

Aspergillus oryzae, Rhizopus glucoamylase, codon usage, mRNA

3P-1p002 高温耐性酵母 Ogataea polymorpha による乳酸生産

3P-1p004 Cas9 タンパク質を用いた麹菌のゲノム編集技術の開発

環境負担のより少ない新たな資源として、植物由来のポリ乳酸プラスチックが注目されている。その原料となる乳酸の発酵生産に向けて様々な微生物宿主が開発されているが、本研究では、バイオマスが豊富であるが年中温暖な熱帯地域での効率的な発酵生産に向けて重要となり、バイオマスの糖化と発酵を同時に行なう並行複発酵プロセスでも重要となる高温耐性を備え、かつキシロース
資化性も備えた酵母 Ogataea polymorpha による乳酸生産について検討した。O.
polymorpha は乳酸をほとんど生産せずエタノールを生産することから、まず、
乳酸生産収率の向上を狙って、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（OpPDC1）を欠失させることによりエタノールの生産を停止できるかどうか検討した。その結果、Oppdc1 破壊の導入により、エタノールの生産をほぼ完全に停止できることがわかった。次に、ウシ由来の L-乳酸脱水素酵素遺伝子（L-LDH）を導入し、45℃の高温かつ非中和条件下で乳酸生産を行わせた。その結果、73%の対グル
コース収率で乳酸を生産させることができた。さらに、L-LDH を 2 コピー導入
することによって、乳酸の生産性を 1.7 倍向上させることができた。一方、45℃の高温かつ中和条件下では、97%の対グルコース収率で乳酸を生産させることができた。したがって、O. polymorpha は乳酸生産のためのプラットフォーム菌株として高いポテンシャルを有するが、中和コストの低減などさらなる発酵生
産の低コスト化に向けて、今後、乳酸耐性の向上が必要であることがわかった。

【目的】 麴菌はその優秀なタンパク質分泌能や、安全性から醸造などの産業で広く利用されている微生物で、宿主・ベクター系や相同組換え系の開発により部分的な遺伝子改変も可能になっている。こうした技術や、突然変異処理による育種は煩瑣である上、オフターゲットな変異が産業株ではしばしば問題となる。そこで近年、標的の部位を迅速かつ簡便に編集できるゲノム編集技術の
CRISPR/Cas9 システムが注目されている。このシステムは Streptococcus 属のエンドヌクレアーゼ Cas9 を用いたもので、動物や植物で利用されている。このシステムは、構築した Cas9 プラスミドベクターを導入することで用いられている。この場合外来 DNA を入れる必要があり遺伝子組換体となる。そこで本研
究では in vitro で Cas9 タンパク質を直接細胞内に導入することで標的遺伝子を編集できる技術の開発をした。
【方法・結果】今回、ウラシル生合成に必要かつ 5-FOA によりポジティブセレ
クション出来る pyrG 遺伝子をターゲットとし、Cas9 タンパク質によるゲノム編集を行う事とした。標的遺伝子に対しガイド RNA を設計し Cas9 タンパク質とガイド RNA の複合体を形成させ、プロトプラスト-PEG 法により形質転換した。その結果、ウラシル要求性の pyrG 変異株を多数得た。得られた変異株のpyrG 遺伝子領域をシーケンスしたところ、約半数が標的配列を起点に 1 塩基欠
失しており、その他も標的配列を起点に最大 1781 bp までの塩基の欠失が確認された。本研究により、 Cas9 タンパク質直接導入によるゲノム編集が可能であることが示された。

Genetic engineering of the thermotolerant yeast Ogataea polymorpha for
lactic acid production

Development of genome editing using Cas9 protein in Aspergillus oryzae○杉山 峰崇 1, 加藤 謙斗 1, 深谷 健 1, 橋本 晋弥 1, 笹野 佑 1,
金子 嘉信 1, 原島 俊 2（1阪大院・工, 2崇城大・生物生命）
sugi2@bio.eng.osaka-u.ac.jp○Minetaka Sugiyama1, Kento Kato1, Takeru Fukaya1, Shinya Hashimoto1,
Yu Sasano1, Yoshinobu Kaneko1, Satoshi Harashima2(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Fac. Biotechnol. Life Sci., Sojo Univ.)

Key words

Ogataea polymorpha, lactic acid fermentation○嶋本 孝平 1,2, 齊藤 亮太 1, 和田 悠作 3, 織田 健 1, 奥田 将生 1,2,
岩下 和裕 1,4
（1酒総研, 2広島大院・生物圏, 3ファスマック, 4広島大院・先端物質）
iwashitact@nrib.go.jp○Shimamoto Kouhei1,2, Ryouta Saitou1, Yusaku Wada3, Ken Oda1, Masaki Okuda1,2,
Kazuhiro Iwashita1,4(1NRIB, 2Grad. Sch. Biosphere Sci., Hiroshima Univ., 3Fasmac Co., Ltd., 4Grad.
Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words

Aspergillus oryzae, genome editing, CRISPR/Cas9

280

遺伝子工学

3P-1p005 非相同末端結合に関与する遺伝子破壊株における麹菌のTALENs を用いたゲノム編集

3P-1p007 麹菌マルトーストランスポーター MalP 分解に関わる
CreD-HulA 間の相互作用解析○水谷 治 1, 荒添 貴之 2, 利田 賢次 1, 林 梨咲 1, 大里 修一 2,
佐久間 哲史 3, 山本 卓 3, 桑田 茂 2, 山田 修 1（1酒総研, 2明治大院・農, 3広島大院・理）mizutani@nrib.go.jp

麹菌は古くから醸造・発酵現場で用いられている産業微生物であり、我々は、麹菌の有用菌株育種を目指して、様々なアプローチで研究を進めている。TALENs
は、Transcription Activator-Like Effector Nucleases の略で、植物病原菌キサント
モナス属が有する任意の塩基配列を認識する DNA 結合ドメインに、2 量体時にDNA 切断活性を示す酵素 FokI のヌクレアーゼドメインを融合させた人工キメ
ラタンパク質であり、人工ヌクレアーゼとも呼ばれている。TALENs によりゲ
ノム上の任意の位置に 2 本鎖切断を引き起こすと、切断された DNA は、非相同末端又は、相同末端結合により修復されるが、この時に修復エラー等により目的の遺伝子を改変すること、即ちゲノム編集が可能となる。我々は、TALENを用いた麹菌育種の可能性を探るために、糸状菌コドン使用頻度に最適化された高活性型 Platinum-Fungal TALENs(1) を用いて非相同末端結合 (Nonhomologous
end-joining : NHEJ) 修復エラーを引き起こすコンストラクトでゲノム編集を行った。その結果、得られた欠失株の半分程度が 1 kb 以上の大規模欠失が引き起こされたことを報告してきた (2)。そこで本研究では、この大規模欠失が引き起こされるメカニズムを探る最初のとりかかりとして、NHEJ に関与する遺伝子破壊株を宿主にゲノム編集を行った。その結果、NHEJ の末端結合に必要な ligase(ligD) 破壊株でゲノム編集を行うと、野生株と比較して、大規模欠失の割合が大きく減少した。

○多田 日菜子, 田中 瑞己, 平本 哲也, 新谷 尚弘, 五味 勝也（東北大院・農）gomi@biochem.tohoku.ac.jp

麹菌のデンプン分解酵素生産において、誘導基質であるマルトースの細胞内取
り込み系が重要である。その取り込みを担っているマルトーストランスポーター
MalP は、グルコース存在下で転写抑制を受けるとともに、タンパク質レベルでも細胞膜上からエンドサイトーシス依存的な取り込み・分解を受けることが明らかになっている。我々はこれまでに、アレスチン様タンパク質 CreD が、HECT
ユビキチンリガーゼ HulA による MalP のユビキチン化をアダプターとして介在することを明らかにした。CreD-HulA 間の相互作用は、CreD の PY モチーフ
(PPXY,PXY)と HulA の WW ドメインを介して行われると予想される。そこで、
PY モチーフに変異を導入した株において、GFP-MalP の細胞内局在、WW ドメ
インとの相互作用解析を行った。
CreD の PPLY モチーフに変異を導入した株、また三箇所ある PXY モチーフのうち二箇所に変異を導入した株において解析を行った。GFP-MalP の局在解析を行ったところ、すべての変異株においてエンドサイトーシスの遅延が観察された。また、プルダウンアッセイによる相互作用解析を行ったところ、PPLY
モチーフおよび PXY モチーフの双方が WW ドメインとの相互作用に関与していること、PXY モチーフの寄与がより大きいことが示された。現在、三箇所のPXY モチーフに単独で変異を導入した株において同様の解析を進めており、その結果についても報告する予定である。

(1) Arazoe T et al., Biotechnol. bioeng., (2015)(2) 水谷ら、第 67 回生物工学会大会要旨集 1P011

Genome editing of A. oryzae disruptant which involved in nonhomologous
end-joining using TALENs○Osamu Mizutani1, Takayuki Arazoe2, Kenji Toshida1, Risa Hayashi1,
Shuichi Ohsato2, Tetsushi Sakuma3, Takashi Yamamoto3, Shigeru Kuwata2,
Osamu Yamada1(1NRIB, 2Grad. Sch. Agric., Meiji Univ., 3Grad. Sch. Sci., Hiroshima Univ.)

Key words

Aspergillus oryzae, TALENs, genome editing, NHEJ

3P-1p006 HMG-CoA reductase inhibitor FR901512 生産菌における生産性向上 UV 変異株の変異点解析○伊東 広哉 1,3, 松井 真 1, 熊谷 俊高 2,3, 町田 雅之 3,4, 柴田 孝 1,3（1アステラス製薬, 2ファームラボ, 3TRAHED, 4産総研）
takashi.shibata@astellas.com

Analysis of interaction between CreD and HulA involved in degradation of
maltose transporter MalP in Aspergillus oryzae.
○Hinako Tada, Mizuki Tanaka, Tetsuya Hiramoto, Takahiro Shintani,
Katsuya Gomi
(Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)

Key words

Aspergillus oryzae, transporter, endocytosis, protein interaction

3P-1p008 麹菌におけるカーボンカタボライト抑制関連因子 CreBの細胞内局在解析○一瀬 桜子, 田中 瑞己, 新谷 尚弘, 五味 勝也（東北大院・農）sakurako.ichinose.q2@dc.tohoku.ac.jp

微生物を工業的に利用する際には、目的物質の生産性の高い株や各種ストレスに耐性を持つ株など工業的製造時に有利な形質をもつ菌株を得ることを目的として様々な育種が行われる。育種の方法として UV や NTG を用いた突然変異法がよく用いられているが、次世代シークエンサー（NGS）の登場により簡便にゲノム解析を行うことが出来るようになったことから、今後は遺伝子工学的手法を用いた分子育種が主流になっていくことが予想される。遺伝子組換えによる育種法では、特定の形質のみを付与・除去することが出来るために突然変異法と比較して育種の効率が大幅に向上することが期待できる。本手法を効果的に利用するため、当社で取得した高生産株について、リバースエンジニアリン
グ技術を利用して高生産化・工業生産菌の育種への鍵となる遺伝子の探索を実施している。
Fungus No. 14919 は、HMG-CoA reductase inhibitor である FR901512 を生産する。
本菌は、FR901512 の生産性の向上を目的として UV による変異導入によって育種が行われており、4 株の生産性向上株が得られている。まず本菌において NGSを用いたゲノムシークエンスとアセンブルを実施した。得られたゲノム情報から、Aspergillus terreus の Lovastatin 生合成遺伝子クラスターと相同性の高い遺伝子クラスターが見出された。また、各変異株について UV によって生じた変異点の解析を実施した。得られた変異点情報と、RNA-Seq による変異株間の転写情報の比較から生産性向上の鍵と思われる遺伝子についての検証を実施しており、本内容について報告する。
本研究は、経済産業省委託事業『革新的バイオマテリアル実現のための高機能化ゲノムデザイン技術開発』の一部として実施された。

麹菌は多様な多糖類分解酵酵素遺伝子を有するものの、その発現はグルコースによるカーボンカタボライト抑制（CCR）を受ける。モデル糸状菌 Aspergillus
nidulans において CCR 制御因子として、脱ユビキチン化酵素 CreB が同定されており、これまでに麹菌において creB 遺伝子を破壊することで、CCR が解除されることを明らかにした。しかし、CreB がグルコース抑制の制御にどのように関与するかは未だ不明である。そこで本研究では、CreB の細胞内局在観察を通じて、CreB による CCR の制御機構を解明することを目指した。
チアミン添加により発現抑制可能な thiA プロモータを用いて、C 末端に GFP を融合した CreB を発現させた。フルクトースを炭素源とする最小培地で培養後、チアミンを添加して発現を抑制させた状態でグルコースまたはマルトースを含む培地に移し、蛍光顕微鏡で CreB の細胞内局在を観察した。その結果、CreB
は炭素源の種類にかかわらず細胞質に局在していることが観察された。さらに、共免疫沈降法により CreB は WD40 リピートタンパク質である CreC と相互作用しており、さらに creC 遺伝子破壊株では CCR が解除されることが観察された。
現在は、CreC との相互作用が CreB の機能にどのように作用するのか明らかにするために、CreC 欠損条件下での CreB の細胞内局在を解析している。

Mutational analysis of fungus No.14919 producing HMG-CoA reductase
inhibitor FR901512

Subcellular localization of deubiquitinase CreB involved in glucose
repression in Aspergillus oryzae○Hiroya Itoh1,3, Makoto Matsui1, Toshitaka Kumagai2,3, Masayuki Machida3,4,
Takashi Shibata1,3(1Astellas Pharma. Inc., 2Fermlab, 3TRAHED, 4AIST)

Key words

secondary metabolite, genome analysis, RNA-seq, filamentous fungi○Sakurako Ichinose, Mizuki Tanaka, Takahiro Shintani, Katsuya Gomi
(Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)

Key words
Aspergillus oryzae, carbon catabolite repression, subcellular
localization, deubiquitinase

遺伝子工学3P-1p009 麹菌カーボンカタボライト抑制制御因子 CreA の分解におけるカルボキシ末端領域の関与

281

3P-1p011 Aspergillus aculeatus セルラーゼ誘導発現における sepM
遺伝子破壊の影響○田中 瑞己, 新谷 尚弘, 五味 勝也（東北大院・農）mizuki.tanaka.a7@tohoku.ac.jp○津村 亮輔, 谷 修治, 炭谷 順一, 川口 剛司（阪府大院・生環科）
shuji@biochem.osakafu-u.ac.jp

糸状菌の加水分解酵素遺伝子の発現は、グルコースが存在するとカーボンカタ
ボライト抑制（CCR）によって強く抑制される。昨年度の本大会では、麹菌において CCR を制御する転写因子 CreA が、CCR 非誘導条件下において核内から細胞質に移行し、速やかに分解されることを報告した。本発表では、CreA の分解に関わる領域について解析した結果を報告する。
カルボキシ末端にタグを融合した CreA の安定性を調べた結果、アミノ末端にタグを融合した CreA と比較して半減期が長くなった。このことから、CreA のカルボキシ末端領域に分解に重要な領域が存在する可能性が考えられた。そこ
で、カルボキシ末端を欠失させた CreA 変異体を作成したところ、末端の 40 ア
ミノ酸を欠失させることで CCR の誘導・非誘導条件にかかわらず半減期が著しく長くなった。一方、末端の 20 アミノ酸を欠失した変異体では半減期の大きな変化は観察されなかった。以上の結果から、カルボキシ末端から 40-20 アミノ酸の領域が CreA の分解において非常に重要であることが示された。この領域内に存在するプロリン-rich な配列をアラニンに置換したところ、CCR 誘導条
件における半減期が長くなったことから、このプロリン-rich 配列が核内における構成的な分解に関わっていることが示唆された。現在、分解に重要な領域のさらなる絞り込みを行っている。
(本研究は「農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業」の支援を受けて行われた。)【目的】糸状菌におけるセルラーゼ遺伝子の発現は、基質存在下において正の制御因子を介した機構により誘導される。本研究では、糸状菌 Aspergillus aculeatus
におけるセルロース誘導を調節する新規制御因子の同定を目的とした。
【方法・結果】本研究では、主要セルラーゼ FIII-avicelase 遺伝子 (cbhI) のプロモーター
制 御 下 で orotidine-5’-monophosphate decarboxylase 遺 伝 子 (pyrG) 及 び βglucuronidase 遺伝子 (uidA) を発現する 2 つの独立したレポーターシステムを有する宿主を用いて制御因子を探索した。アグロバクテリウム形質転換法 (AMT)により宿主を形質転換し、構築した約 10,000 株の変異ライブラリから、5fluoroorotic acid 耐性を獲得及び GUS 活性・セルロース資化能が低下した株を選択し、セルラーゼ誘導調節因子が欠損されたと推測される 7 株の一次候補株を獲得した。一次候補株において、サザンブロッティング解析によりシングルロー
カスに T-DNA が挿入されていた 4 株を選抜後、inverse PCR により T-DNA 周辺
配列を増幅し、シークエンス解析により T-DNA 挿入座位を特定した。それら 4株について qRT-PCR 解析を行い、cbhI 発現量が宿主に比べて有意に低下した株を二次候補株とした。各候補株において、T-DNA 挿入により機能が低下したと推測された遺伝子の破壊株を新たに相同組み換え法を用いて作製した。qRT-PCR
解析により cbhI 発現量を定量した結果、S. pombe cdc14 ortholog の sepM 遺伝子
欠損株において cbhI 発現量がコントロール株に比べ三分の一に低下していた。
現在、SepM のセルラーゼ・ヘミセルラーゼ遺伝子発現誘導における機能をより詳細に解析している。

Involvement of C-terminal region of Aspergillus oryzae glucose repressor
CreA in its degradation.

The effect of the sepM disruption on the induction of the cellulase genes inAspergillus aculeatus

Key words
Aspergillus oryzae, transcriptional regulation, transcriptional regulator
gene, amylase gene

Key words

3P-1p010 糸状菌の鉄恒常性維持を担う転写因子 HapX のシステ

3P-1p012 Aspergillus aculeatus におけるセルロース系バイオマス○Mizuki Tanaka, Takahiro Shintani, Katsuya Gomi
(Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)

インリッチ領域の機能解析○Ryosuke Tsumura, Shuji Tani, Jun-ichi Sumitani, Takashi Kawaguchi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Aspergillus aculeatus, cellulase induction, sepM, regulator

分解酵素生産調節因子の探索○白柳 英俊, 谷 修治, 炭谷 順一, 川口 剛司（阪府大院・生環科）
takashi@biochem.osakafu-u.ac.jp○村田 俊輔, 小森 誠也, 志水 元亨, 加藤 雅士（名城大・農）hahahashun@gmail.com【背景と目的】HapX は、我々の研究グループが初めて見出した CCAAT-box 結合因子 (HapB/C/
E 複合体) と相互作用する真菌類に特有の転写因子である。HapX は鉄欠乏時に鉄を含むタンパク質の転写を抑制することから、鉄の恒常性維持機構の中心的な役割を果たしている。我々はすでに、HapB/C/E 複合体存在下での HapX のDNA 結合様式について詳細に研究を進めてきた。その結果、HapX の N-末端側に存在するアミノ酸モチーフが HapX と HapB/C/E 複合体との相互作用に関与していることを明らかにした。一方、C-末端側ドメインにはオルソログ間で保存されたシステイン残基が連続する 4 つのモチーフ (cysteine-rich region A-D; Crr
A-D) が存在しているが、その機能については不明である。そこで本研究では、
糸状菌 Aspergillus nidulans の HapX の C-末端側ドメインの機能解明を目的とした。
【結果・考察】野生型のリコンビナント HapX (HapXWT) の紫外可視吸収スペクトルを測定しところ、波長 420 nm 付近に鉄硫黄クラスターに特有のピークが検出された。このことから、HapXWT は鉄硫黄クラスターを保持していることが示唆された。さらに、HapX の C-末端側ドメイン中に存在する CrrA, B, C, D を欠損させた 4 種の変異型 HapX (HapXCrrA, HapXCrrB, HapXCrrC, HapXCrrD) の吸収スペクトルを測定したところ、HapXCrrA および HapXCrrB では吸収強度が HapXWT に比べてそれぞ
れ 30% まで低下しており、鉄硫黄クラスターの含有量の低下が示唆された。
HapXCrrC および HapXCrrD の吸収強度は HapXWT と同程度であった。これらのことから、鉄硫黄クラスターの保持には CrrA および CrrB が重要であると示唆された。

【目的】Aspergillus aculeatus におけるセルラーゼ系酵素は、誘導性基質に応答して生産される。本研究では A. aculeatus における新規セルラーゼ系酵素生産調節
因子を遺伝学的手法により同定し、その機能を解明することを目的とした。
【方法と結果】セルラーゼ系酵素生産調節因子は、アグロバクテリウム形質転換法(AMT) を用いて作出した T-DNA 挿入変異株ライブラリーから探索した。AMTの宿主には、セルロースにより遺伝子発現が誘導される FIII-avicelase 遺伝子(cbhI) のプロモーター制御下で orotidine-5’-monophosphate decarboxylase 遺伝子(pyrG) と β-glucuronidase 遺伝子(uidA) をそれぞれ発現する株を使用し、これまでにセルラーゼ生産調節因子破壊候補株を二株 (No. 79, No. 68) 取得した。各株とコントロール株におけるセルロース資化能と GUS 生産量を比較すると共に、
cbhI 発現量と菌体外タンパク質生産量を qRT-PCR 法 および SDS-PAGE, 二次元電気泳動により解析した。セルロース資化能と GUS 生産量が低下していた No.
79 株では、cbhI 発現量がコントロール株の約 30% に低下しており、セルロー
ス性基質を炭素源とした場合、約 70 kDa のタンパク質のみが消失していた。
No. 68 株ではセルロース資化能が低下しており、cbhI 発現量はコントロール株の約 40% に低下していた。また、本株では GUS 生産量が増加している一方で、
2% Avicel、4% 小麦フスマを炭素源とした時には変化が無いものの、2% ガラク
トマンナンを炭素源とした場合には培養上清中のタンパク質量が著しく減少していた。現在、各株において二次元電気泳動を行い、peptide mass fingerprinting
解析により消失したタンパク質を同定をしている段階である。

Functional analysis of the cysteine-rich regions of HapX, a regulator of ironhomeostasis

Screening for the factor regulating the production of cellulosic biomass
degrading enzymes in Aspergillus aculeatus○Shunsuke Murata, Masaya Komori, Motoyuki Shimizu, Masashi Kato
(Meijo Univ. Agric.)

Key words

HapX, iron-sulfur cluster, CCAAT, Aspergillus○Hidetoshi Shiroyanagi, Shuji Tani, Jun-ichi Sumitani, Takashi Kawaguchi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Key words

Aspergillus aculeatus, cbhI, AMT, T-DNA

282

遺伝子工学

3P-1p013 Aspergillus 属糸状菌の細胞壁 alpha-1,3-グルカンの二次代謝物生産に及ぼす影響

3P-1p015 麹菌のプロテアーゼ低生産および細胞壁構成因子破壊による異種タンパク質生産量への影響○張 斯来, 田中 瑞己, 新谷 尚弘, 五味 勝也（東北大院・農）gomi@biochen.tohoku.ac.jp○新庄 梨沙, 渡邊 崇健, 田中 瑞己, 新谷 尚弘, 五味 勝也（東北大院・農）gomi@biochem.tohoku.ac.

コウジ酸 (5-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-4-pyrone) は麹菌の重要な二次代謝産物の一つであり、食品・医療薬剤・化粧品などに広く利用されている。麹菌はコウジ酸生合成に関わる遺伝子 koiA、トランスポーター遺伝子 kojT、転写因子遺伝
子 kojR のクラスターを持ち、コウジ酸は最適な窒素や炭素源濃度を維持し長時間培養することで生産される(1)。我々は alpha-1,3-グルカン生合成酵素遺伝子
agsB の欠損株におけるコウジ酸生産性を解析した結果、生産性が著しく低下す
ると同時に、kojA、kojT、kojR の発現量も低下したことを明らかにした(2)。agsB
欠損株に野生型 agsB を導入した株は野生株と同様のコウジ酸生産とコウジ酸生合成遺伝子の発現量に回復した。このことから、細胞壁 alpha-1,3-グルカンの欠損はコウジ酸生合成に関与する遺伝子の発現を抑制しているものと考えられる。
一方、alpha-1,3-グルカン欠損株は最小寒天培地で分生子形成効率が著しく低下
し、コウジ酸生産用培養条件で二次代謝産物の生産制御に関わる代表的な因子としてよく知られている laeA の発現量も著しく低下していることが認められた。このことは、細胞壁 alpha-1,3-グルカンはコウジ酸以外の二次代謝産物の生産にも関与している可能性を示している。そこで、現在は Aspergillus nidulans
においても alpha-1,3-グルカン欠損における二次代謝産物の生産について解析を行っており、その結果について報告する予定である。
(1) Terabayashi et al., Fungal Genet. Biol., 47, 953-951 (2010)(2) 張ら、2016 年度 日本農芸化学会大会講演要旨集、4F153

麹菌 Aspergillus oryzae は、安全性が高いことやタンパク質の分泌能力に優れていることから、異種タンパク質生産の有用な宿主としての利用が期待されている。しかし、麹菌自身の産生するプロテアーゼによる分解が、異種タンパク質を生産させる際のボトルネックとなっており、高等動植物由来のタンパク質の生産量は期待されるほどの量には至っていない。そこで、プロテアーゼ遺伝子の破壊による生産量増加が期待されるが、ゲノム解析の結果から 134 種類存在
することが知られており、これらすべての破壊は難しい。そこで、本研究では、菌体外プロテアーゼを広く制御する転写因子 PrtR に着目した。この遺伝子破壊
株では、菌体外プロテアーゼ活性の顕著な低下が観察され、すでに液体培養時に異種タンパク質の生産量が増加することが確認されている。加えて、PrtR 支配下にない液胞プロテアーゼと考えられている PepE の遺伝子もあわせて破壊したところ、さらなる生産量の増加が認められた。
一方、糸状菌の細胞壁構成因子である α-1,3-グルカンの合成酵素遺伝子を破壊することによって、タンパク質の生産量が増加することが報告されている(1)。
そこで、先述のプロテアーゼ低生産株において、α-1,3-グルカン合成酵素遺伝子
agsB も併せて破壊し、異種タンパク質の生産量を調べたところ、生産量が増加する傾向が認められた。

Effect of cell wall alpha-1,3-glucan on secondary metabolites production in

Effect of combination of mutations in protease regulator PrtR and α-1,3glucan synthase AgsB on heterologous protein production in Aspergillus

Aspergillus○Silai Zhang, Mizuki Tanaka, Takahiro Shintani, Katsuya Gomi
(Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)(1)吉見、阿部、バイオサイエンスとインダストリー、73 ページ(2015)

oryzae○Shinjo Risa, Takayasu Watanabe, Mizuki Tanaka, Takahiro Shintani,
Katsuya Gomi
(Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)

Aspergillus, alpha-1, 3-glucan, secondary metabolism

Key words
Aspergillus oryzae, heterologous production, protease, alpha-1, 3glucan synthase

3P-1p014 麹菌のアミラーゼ生産に関与する転写因子 MalR の核局

3P-1p016 有用糸状菌 Trichoderma reesei 日本型変異株の網羅的

Key words

在シグナル変異体の機能解析

表現型解析○平沢 大樹 1, 志田 洋介 1, 田代 康介 2, 久原 哲 2, 小笠原 渉 1（1長岡技科大, 2九大院・農）owataru@vos.nagaokaut.ac.jp○今野 友維, 鈴木 空太, 田中 瑞己, 新谷 尚弘, 五味 勝也（東北大院・農）gomi@biochem.tohoku.ac.jp

MalR は麹菌のマルトース取り込みと資化を直接制御する転写因子であるだけ
でなく、アミラーゼ生産にも深く関与している。これまでの研究により、MalRが誘導基質の有無にかかわらず構成的に核局在しており(1)、安定性が極めて高いことが明らかになっている。そこで本研究では MalR の核局在シグナル (NLS)に変異を導入した株を作製し、細胞内局在と安定性などについて解析した。
MalR は RRK (NLS1)、PTERARR (NLS2) という 2 種類の推定 NLS を持っており、NLS1 は Zinc finger motif 内に、NLS2 は C 末端領域に存在している。それぞれに変異導入した株を作製し細胞内局在解析を行ったところ、NLS1 に変異導入した sGFP-MalR-NLS1pm と NLS2 に変異導入した sGFP-MalR-NLS2pm では比較的強い蛍光が核に認められるものの菌糸全体に蛍光が観察された。一方、
NLS1 と NLS2 の両方に変異導入した sGFP-MalR-NLS1/2pm では核内に蛍光は観察されなかった。このことから NLS1 および NLS2 の両配列に変異導入することで MalR の核局在能が失われることが明らかになった。また、NLS1 が Zincfinger motif 内に存在していることから、NLS1 に変異導入した株は DNA 結合能が失われることが予想された。そこでハローアッセイを行った結果、NLS1 に変異導入した株ではアミラーゼ生産能が失われていることが確認された。しかし、C 末領域に存在する NLS2 の変異導入株ではアミラーゼ産生能への影響は見られなかった。これらの株の安定性についても現在解析中である。
本研究は「農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業」の支援を受けて行われた。

糸状菌 Trichoderma reesei はリグノセルロースを単糖へと分解するために必要な
多種多様なセルラーゼ・ヘミセルラーゼを多量に分泌生産することが知られている。産業上の有用性から、世界中の研究機関で突然変異導入を用いてセルラー
ゼ高生産変異株が作出されてきた。日本においても、標準株 QM9414 より複数回の変異導入によって高生産変異株 PC-3-7 が作出されている。PC-3-7 はセロビオースによるセルラーゼ誘導能の劇的な増加、ソルボースによるセルラーゼ
誘導能の獲得といった特徴を持つ。これまでのゲノム解析によって、これら日本型変異株群に蓄積された変異点が明らかとなっているのに対し、表現型の解析についてはセルラーゼ生産性を評価したものに限られている。そのため、産業への応用を考えると、セルラーゼ生産性の評価だけでなく、生育など種々の表現型を解析する必要がある。本研究では、網羅的に表現型を解析し、日本型変異株の進化について新たな知見を得ることを目的とした。
日本型変異株に対し、フェノタイプマイクロアレイを用いて炭素、窒素、リン、硫黄および pH に対する生育能を網羅的に評価した。その結果、変異株のセルラーゼ生産性が増加するにつれ、一部の炭素源での生育能が減少する傾向が観察された。また、培地 pH に対する評価を行った結果、高 pH になるにつれて、生育が減少した。さらに、pH における生育能は変異株によって最適条件が異なっていた。種々の pH におけるセルラーゼ生産性を評価した結果、変異株によって pH 応答性が劇的に変化することを明らかとした。

(1) Suzuki et al., Appl Microbiol Biotechnol. 99: 1805-1815 (2015)

Functional analysis of Aspergillus oryzae MalR that has mutations in its
putative nuclear localization signals.
○Yui Konno, kuta Suzuki, Mizuki Tanaka, Takahiro Shintani, Katsuya Gomi
(Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)

Key words

MAL activator, Aspergillus oryzae, nuclear localizasion

Comprehensive phenotype analysis of Japanese mutants in Filamentous
fungus Trichoderma reesei○Hiroki Hirasawa1, Yosuke Shida1, Kosuke Tashiro2, Satoru Kuhara2,
Wataru Ogasawara1(1Nagaoka Univ. Technol., 2Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words

Comprehensive phenotype analysis, Trichoderma reesei, cellulase

遺伝子工学3P-1p017 白色腐朽菌 Phanerochaete chrysosporium が有するセス
キテルペン合成酵素の同定および機能解析

283

3P-1p019 ランダム変異による超好熱菌糖代謝変異株の単離と解析○東 健弘 1, 二石 涼平 1, 折田 和泉 1, 中村 聡 1, 今中 忠行 2,
福居 俊昭 1（1東工大・生命理工学院, 2立命館大・生命科学）
tfukui@bio.titech.ac.jp○筌場 将太 1, 北岡 卓也 2, 一瀬 博文 2（1九大院・生資環, 2九大院・農）ichinose@agr.kyushu-u.ac.jp【背景と目的】テルペノイドは、イソプレン単位の倍数で形成される多種多様な天然化合物群である。中でもセスキテルペノイドは構造多様性に富み、多彩な生物活性を有するなど創薬シード化合物の探索資源として期待される。生合成
では、共通基質であるファルネシルピロリン酸が合成酵素により環化されることで基本骨格が形成され、さらにシトクロム P450 による酸化修飾を経ること
で、さらに多様な構造へと導かれる。すなわち、テルペノイド合成において重要な役割を担う合成酵素と P450 の生化学的理解により、セスキテルペノイドの高度利用が促進されると考えられる。本研究では、白色腐朽菌 Phanerochaetechrysosporium が有するセスキテルペン合成酵素の同定と機能解析を試みた。
【方法】3～21 日間培養した P. chrysosporium より totalRNA を抽出した。既存の合成酵素に配列相同性を示す遺伝子を P. chrysosporium のゲノムデータベースより網羅的に探索し、PCR プライマーを設計した。抽出した totalRNA より合成
した cDNA を鋳型として PCR を行い、候補遺伝子を増幅した。遺伝子を pET
ベクターに連結した後、大腸菌にて異種発現させ、抽出した揮発性代謝物をGC/MS 分析に供した。
【結果・考察】P. chrysosporium のゲノムデータベースを精査したところ、11 種の候補遺伝子が見出され、9 種の遺伝子を cDNA として獲得した。また、大腸菌を宿主とする異種発現を行い、代謝物を GC/MS 分析に供したところ、9 種中8 種の形質転換体にてセスキテルペン合成が示唆される結果が得られ、候補遺伝子が大腸菌内で活性型酵素として発現したことが示された。

【背景・目的】絶対嫌気性超好熱アーキア Thermococcus kodakarensis はピルビン酸やデンプンを基質として元素硫黄非依存的に水素を発生して生育することができる。本菌の糖代謝には変型 Embden-Meyerhof (EM)経路が機能しているが、ピルビン酸基質では糖新生方向、デンプンやマルトオリゴ糖では解糖方向に代謝が制御されている。この変型 EM 経路には多くの研究がなされ、転写および酵素レベルでの制御が報告されているが、その代謝フラックスの維持や切り替
えには未だ同定されていない関連酵素・代謝や制御機構が存在すると推測される。本研究では超好熱菌の糖代謝制御に関与する未知遺伝子の同定と機能解明を目指し、最近確立した T. kodakarensis ランダム変異による糖代謝変異株の単離と解析を行った。
【方法および結果】T. kodakarensis アグマチン要求性株 (ΔpdaD)を pdaD マーカーを含むトランスポゾン転移 gDNA ライブラリーで形質転換することによりランダム変異ライブラリーを作製した。ランダム変異体モノコロニーをピルビン酸
またはマルトオリゴ糖を含む液体培地を分注した 96 穴プレートでそれぞれ85℃、12 時間培養して増殖を比較し、いずれかの基質での生育能が低下した変異株を選抜した。約 1,200 クローンからピルビン酸生育能低下株を 2 株、マルトオリゴ糖生育能低下株を 6 株取得した。単離株における変異部位を同定した
ところ、マルトオリゴ糖生育能低下株からは変型 EM 経路に固有の酵素である
ADP 依存型ホスホフルクトキナーゼ遺伝子 pfk が同定され、本スクリーニング
系の有用性が示された。さらに翻訳後成熟への関与が推定される酵素遺伝子などが同定され、これらについて相補実験や機能解析を行っている。

Identification and characterization of sesquiterpene synthases from

Identification of genes related to sugar metabolisms in hyperthermophilicarchaeon by random mutagenesis

Phanerochaete chrysosporium○Shota Ukeba1, Takuya Kitaoka2, Hirofumi Ichinose2(1Grad. Sch. Bioresour. Bioenviron. Sci., Kyushu Univ., 2Fac. Agric., Kyushu Univ.)○Takehiro Azuma1, Ryohei Futatsuishi1, Izumi Orita1, Satoshi Nakamura1,
Tadayuki Imanaka2, Toshiaki Fukui1(1Sch. Life Sci. & Technol., Tokyo Tech, 2Coll. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

secondary metabolism, basidiomycetes, sesquiterpene

Key words
hyperthermophile, ramdom mutagenesis, modified Embden-Meyerhof
pathway, Thermococcus kodakarensis

3P-1p018 超好熱性アーキア由来ヘリカーゼの PCR 反応への影響

3P-1p020 光化学系 II 耐熱性 D1/D2 タンパク質と D1 プロセシン

Key words○川戸 克展 1, 秀瀬 涼太 1, 保川 清 2, 藤原 伸介 1
（1関西学院大院・理工, 2京大院・農）fujiwara-s@kwansei.ac.jp

グプロテアーゼの中温性シアノバクテリアでの発現

鶴田 開生, 田中 誠, 原口 典久, 中山 泰宗, 長濱 一弘, ○松岡 正佳（崇城大・生物生命）
matsuoka@bio.sojo-u.ac.jp

ヘリカーゼは ATP 依存的に核酸の二本鎖をほどく酵素である。そのアミノ酸配列から 6 つのスーパーファミリー (SF1-6)に分類される。これまでに、SF2 ヘリ
カーゼ TK0566（Tk-EshA）が PCR の連鎖反応の段階で非特異的に結合したプライマーを 3′突出型から剥がし、PCR 誤増幅を低減する効果（ノイズ低減効果）を有することを示した（１）。本研究では、超好熱菌 Thermococcus kodakarensisの SF2 ヘリカーゼ TK0306、TK0460 及び SF1 ヘリカーゼ TK0178 に着目し、これらヘリカーゼの酵素性質を調べ、PCR 反応時のノイズ低減効果を検証した。
組換え TK0306、TK0460、TK0178 を大腸菌で発現させ、精製した。一本鎖または二本鎖ヌクレオチドを基質として、TK0306、TK0460、TK0178 の ATPase 活性の至適温度はそれぞれ 50℃、60℃、100℃以上であった。TK0460 は 3′突出型
二本鎖 DNA にアンワインド活性を示し、TK0306、TK0178 は 5′突出型二本鎖DNA にアンワインド活性を示した。次に、PCR による T. kodakarensis 由来 16S
rDNA の増幅におけるこれら酵素のノイズ低減効果を検証した。TK0306 やTK0460 にノイズ低減効果は認められなかった一方、TK0178 を添加することで非特異的増幅産物の減少が確認された。Tk-EshA は 80℃に ATPase 活性の至適温度をもつ。これらことから PCR におけるヘリカーゼによるノイズ低減は、酵素の基質に対する特異性ではなく、高温での活性または耐熱性に依存していると推察される。
(1) Fujiwara, A. et al. (2016) Appl. Environ. Microbiol., 82:3022-31.

葉緑体やシアノバクテリアでの光エネルギーに依存した水からプラストキノン
への電子伝達反応はチラコイド膜にある光化学系 II（PSII）複合体によって触媒される。２つの水分子の分解による４プロトンと１酸素分子の生成は、PSII
複合体の中心に位置する D1/D2 ヘテロダイマーの D1 タンパク質に結合したマンガンとカルシウムを含む酸素発生複合体 (OEC)で起こる。好熱性シアノバク
テリアから結晶解析された PSII のデータより、OEC には D1 タンパク質の C 末端がプロセシングされて生じる Ala344 の C 末端カルボキシル基を含む７つのアミノ酸側鎖が配位結合している。水分子の酸化反応を in vitro で解析するため、私達は中温性シアノバクテリア Synechococcus elongatus PCC 7942 の D1/D2
タンパク質を好熱性シアノバクテリア由来の耐熱性 D1/D2 で置換した組換え株
GRPS971 を作成した。28 および 38℃において低光強度下 BG11 培地で培養した GPRS971 株の比増殖速度は親株 GRPS810 の約 70%に低下していたが、両者の酸素発生活性は同程度であった。チラコイド膜タンパク質および精製した
PSII 複合体の耐熱性 D1/D2 タンパク質のウェスタン分析より、GRPS971 株では耐熱性 D2 タンパク質は PSII 複合体に取り込まれていたが、耐熱性 D1 タン
パク質は取り込まれていなかった。また GRPS971 株のチラコイド膜には C 末
端プロセシングされていない前駆型の耐熱性 D1 タンパク質が検出された。この結果より D1 プロセシングが遮断されていると考え、好熱性シアノバクテリ
アより D1 プロセシングプロテアーゼの ctpA 遺伝子をシャトルベクターにクローン化し、GRPS971 株に導入して現在解析中である。またプロセシング部位
Ala344 の C 末端側のアミノ酸配列を PCC 7942 と同じ配列に改良した耐熱性 D1タンパク質がプロセシングを受けるか検討している。

Effect of thermostable archaeal helicases on PCR.

Expression of thermostable photosystem II D1/D2 proteins and D1processing protease in a mesophilic cyanobacterium○Katsuhiro Kawato1, Ryota Hidese1, Kiyoshi Yasukawa2, Shinsuke Fujiwara1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ., 2Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)

Key words

hyperthermophile, Helicase, PCR, Noise-reduction

Kaisei Tsuruda, Makoto Tanaka, Norihisa Haraguchi, Yasumune Nakayama,Kazuhiro Nagahama, ○Masayoshi Matsuoka(Fac. Biotechnol. Life Sci., Sojo Univ.)
Key words

photosystem II, cyanobacteria, protein expression, thermostability

284

遺伝子工学

3P-1p021 水面浮遊性微細藻類 FFG039 株における遺伝子組換え技術の確立

3P-1p023 Heterologous Gene Expression as A tool to Obtain Some
Chemical Compound from Bifidobacteria○櫻井 美季 1, 野島 大佑 1, 若田 裕一 2, 細川 隆史 2, 邑上 健 2,
吉野 知子 1, 田中 剛 1（1農工大院・工, 2富士フイルム株式会社）
tsuyo@cc.tuat.ac.jp○Hend Altaib1, Izumi Nomura2, Tohru Suzuki2(1Grad. Sch. Fac. Appl. Biol. Gifu Univ., 2Fac. Appl. Biol. Sci., Gifu
Univ.)
suzuki@gifu-u.ac.jp【背景と目的】効率的なバイオマス回収プロセスの開発に向けて、水面でバイオ
フィルム形成する微細藻類に着目したスクリーニングを実施し、これまでに水面浮遊性微細藻類 FFG039 株を獲得している。FFG039 株は水面に非常に強固なバイオフィルムを形成する為、ポリエチレンフィルムを用いて簡便に回収することが可能である。しかし更なる脂質生産性の向上や、効率的なバイオフィル
ム形成を促進する為にはその代謝改変や形成機構の解析が必須となるが、当該株においてはその解析の基盤技術となる遺伝子組換え法が確立していない。そこで本研究では、当該株における遺伝子組換え技術の確立を目的とした。
【方法】Neomycin phosphotransferase II (nptII)を選択マーカーとしたベクターを
FFG039 株にエレクトロポレーション法により導入を行った。エレクトロポレー
ション条件として印加電圧、DNA 添加量を検討し、得られたコロニー数から形
質転換効率を算出した。また遺伝子保持安定性の評価として形質転換体から抽出したゲノムに対して ntpII の保持を確認した。
【結果】エレクトロポレーションの各条件を検討し、遺伝子組換えを行った結果、形質転換効率は約 50 colonies/106 cells であった。この効率は、緑藻におけるエレクトロポレーションを用いた遺伝子組換えの効率と同等である。形質転換体の継体培養を行い、外来遺伝子の保持安定性を評価した。その結果、5 ヵ
月間の継代培養においても、ゲノム中での ntpII の保持が確認された。以上のことから、水面浮遊性微細藻類 FFG039 株においてエレクトロポレーションを用いた安定的な遺伝子組換え技術が確立できたと結論づけた。

Bifidobacteria is a G (+) anaerobic bacteria normally inhabitant of mammalianintestinal tract; thus it can be considered as a good candidate for large scale productionof some chemical compounds; it is supposed to reduce the risk of toxic byproduct such
as E. coli. Also, it can save the running coast because of its anaerobic nature. Further
more, the knowledge is increasing about Bifidobacteria genome, which opens the way
for metabolic engineering to get some special function of interest or to increase
productivity of some chemical. Heterologous gene expression is an important tool forsuch purpose. In the present study, we are applying heterologous gene expression ofsome pyrimidine pathway genes to enhance the productivity of some metabolites. The
first metabolite of interest is Orotate. At least 6 genes are involved in its production;
pyrB,pyrC,pyrK and pyrD are essential genes for Orotate production. pyrI is afeedback inhibitory gene and pyrE converets orotate to orotidine. Therefore, first 4
genes were included in our PKO403 expression vector, using multiple fragment
ligation technique. Three promoters from B.longum 105A are to be used, two of them
are constitutive hup,gap and one inducible promoter FruEKFG. For now, we
succeeded to construct a big shuttle vector with 6 genes inside and electroporate it
successfully inside Bifidobacteria. In a word, this study is considered the first trail touse Bifidobacteria as a cell factory. We hope that our technique can offer a useful tool
for wide scale production.

Establishiment of transformation in floating microalgae strain FFG039

Heterologous Gene Expression as A tool to Obtain Some ChemicalCompound from Bifidobacteria○Miki Sakurai1, Daisuke Nojima1, Yuichi Wakata2, Takafumi Hosokawa2,
Takeshi Murakami2, Tomoko Yoshino1, Tsuyoshi Tanaka1(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2FUJIFILM Corporation)

Key words

floating microalgae, biofilm, biofuel production, transformation

3P-1p022 シマミミズ Eisenia fetida を用いた異種遺伝子発現系の構築○Hend Altaib1, Izumi Nomura2, Tohru Suzuki2(1Grad. Sch. Fac. Appl. Biol. Gifu Univ., 2Fac. Appl. Biol. Sci., Gifu Univ.)

Key words
expression

bifidobacterium, transcriptional regulation, gene knockout, gene

3P-1p024 SUMO2 変異体ライブラリからの HER2 親和性選択○河上 佳奈, 伊藤 春佳, 伊藤 伸哉, 牧野 祥嗣（富山県大・工）makino@pu-toyama.ac.jp○町田 悠, 伊佐 猛, 圡田 喜野, 赤澤 真一（長岡高専・物質工）s-akazaw@nagaoka-ct.ac.jp【目的】近年，遺伝子組換え生物を用いて治療薬を生産するバイオ医薬が注目されており，様々な生物を用いた異種遺伝子発現系が開発されている．我々は，新規宿主生物として糖鎖修飾が可能で，タンパク質分泌生産も可能なシマミミ
ズ Eisenia feida に注目し，異種遺伝子発現系の構築を目指してきた．本ミミズは生物毒性試験のモデルとして世界的に認められているため，本技術の進展により分子生物学的研究が加速化される事も期待される．これまでの研究で，我々はマイクロインジェクションとエレクトロポレーションを併用することにより
E. fetida の遺伝子導入に世界で初めて成功し，遺伝子導入に最適な培地条件等を明らかにしてきたが 1)2)，エレクトロポレーションの条件については詳細に検討していなかった．そこで本研究では本条件について詳細に検討し，さらにこれまで課題であった E. fetida 頭部断片への遺伝子導入を試みた．
【方法】E. fetida への遺伝子導入は，切断した尻尾側の切断面に，ルシフェラー
ゼ遺伝子をマイクロインジェクションとエレクトロポレーションを併用することによって行った．遺伝子導入の確認は，破砕・溶解し，ルシフェラーゼの発光強度を計測することにより行った．また，遺伝子導入を行った E. fetida 頭部からゲノムを抽出し，ルシフェラーゼ遺伝子の確認を PCR 法で検証した．
【結果】エレクトロポレーションの条件を最適化した結果，生存率は約 6 倍，形
質転換効率は 4 倍に向上した．また，PCR により再生尾部部位に遺伝子が組込まれている事を確認した．頭部については現在実施中である．本研究の一部はJSPS 科研費挑戦的萌芽研究 15K14713 の助成を受けて実施された．
[1]赤澤真一他．日本生物工学会．2015 年 10 月．ポスター番号 1P-028．鹿児島．
[2]町田悠他．日本農芸化学会．2016 年 3 月．ポスター番号 2G059．北海道．

【目的】乳がんの 20～25％を占める HER2 陽性乳がんでは、細胞表面に HER2が過剰に発現しているため、大量の細胞増殖シグナルが発生している。HER2は二量体化することで細胞増殖を活性化する。その抗体医薬にペルツズマブがあり、HER2 に結合し二量体化を抑えることでがん細胞の増殖を抑える。しかし、抗体医薬品は動物培養細胞を用いて生産されるためコストがかかる。本研
究では、HER2 の二量体化を抑える抗体医薬品と同等の薬効を持ち、動物培養細胞を用いなくても生産することが可能な抗体代替タンパク質の探索を目的としている。抗体ではないタンパク質をランダムに変異させてファージライブラ
リを作製し、変異させたタンパク質から HER2 に親和性のあるものを探す。
【方法】SUMO2（small ubiquitin-related modifier 2)の表面で互いに近接した 5 ア
ミノ酸残基を選び、そのコドンを NNK または NNB でランダムに置換した遺伝子を合成した。合成遺伝子が組み込まれたファージミドで大腸菌 TG1 を形質転換した。回収したコロニーにヘルパーファージ M13KO7 を感染させ、培養上清から得られたファージを集めてファージディスプレイライブラリとした。HER2に親和性があるファージを濃縮するために、HER2 固定化磁性粒子を用いたパ
ニングを繰り返し行った。
【結果】NNK 置換ライブラリで 6.0×107 cfu 、NNB 置換ライブラリで 4.0×107 cfuのライブラリサイズが得られた。また、パニングの回数を重ねるごとに回収
ファージ数、S/N 比ともに高くなった。シークエンス解析の結果、同じアミノ酸配列を持つものが複数確認できたため、HER2 に親和性のあるタンパク質が濃縮されたと推定される。クローンの親和性解析等を行った結果を合わせて報告する。

Construction of heterologous gene expression system in the earthworm,
Eisenia fetida

Selection of HER2 binding protein from SUMO2 mutant library○Yu Machida, Takeru Isa, Kino Tsuchida, Shin-ichi Akazawa(Dept. Material Eng., Natl. Inst. Technol., Nagaoka. Coll.)

Key words

Biological medicine, Earthworm, transformation, Eisenia fetida○Kana Kawakami, Haruka Itoh, Nobuya Itoh, Yoshihide Makino(Fac. Eng., Toyama Pref. Univ.)

Key words

HER2, affinity selection, phage display library, SUMO2

遺伝子工学3P-1p025 大腸菌による抗結核薬 D-サイクロセリンの高レベル異
種生産

285

3P-1p027 シャペロン共発現がポリヒドロキシアルカン酸分子量へ与える影響○熊谷 孝則 1, 小澤 智紀 2, 青田 達明 1, 谷本 桃子 2, 的場 康幸 1,
野田 正文 1, 杉山 政則 1
（1広大院・医歯薬保健学, 2広大・薬）tkuma@hiroshima-u.ac.jp○南部 友香 1, 百武 真奈美 2, 廣江 綾香 1, 柘植 丈治 1
（1東工大院・総理工, 2理研・バイオマス）
tsuge.t.aa@m.titech.ac.jp【目的】 私たちは, これまで, 抗結核薬 D-サイクロセリン (D-CS) の生合成遺伝子(dcsC, dcsD, dcsE および dcsG) を連結したベクター pET-21a(+)/dcsEDCG と, 4 遺伝子の下流に自己耐性遺伝子である dcsJ を連結したベクター pET-21a(+)/
dcsEDCGJ を作製し, 大腸菌 BL21(DE3) 株を宿主とした D-CS 生産を行い, 第 66回大会で報告した。本研究では, 硫化水素の生成および L-セリンの代謝に関与する遺伝子 (cysJ および cysK) の二重破壊大腸菌株を宿主とした結果, D-CS の生産性向上に成功したので報告する。
【方法および結果】 大腸菌 BL21(DE3) を親株とし, Red/ET recombination により,cysJ および cysK 遺伝子の二重破壊大腸菌 (ΔcysJΔcysK) を作製した。ΔcysJΔcysK
株, および, 単独破壊株 (ΔcysJ および ΔcysK )のそれぞれに上記 2 種類のベクターをそれぞれ導入し, D-CS 生産性を評価した。その結果, pET-21a(+)/dcsEDCG 導入株については, ΔcysJ および ΔcysK では親株と比べ, D-CS 生産の有意な上昇は認められなかったものの, ΔcysJΔcysK 株では有意に増加した。pET-21a(+)/
dcsEDCGJ 導入株については, ΔcysJ および ΔcysK では親株と比べ, D-CS 生産量の有意な上昇は認められかったものの, 上昇傾向が観察された。一方, ΔcysJΔcysK
株では親株と比べ, D-CS 生産量が有意に増加した。pET-21a(+)/dcsEDCGJ を導入した ΔcysJΔcysK 株の D-CS 生産量は, D-CS 生産性放線菌に匹敵するものであった。

【背景と目的】微生物により生産されるポリヒドロキシブタン酸[P(3HB)]は、重合酵素によって重合されるが、先行研究より Bacillus cereus YB-4 の重合酵素
は、アルコールによりポリマー鎖を切断するアルコーリシス活性を有し、P(3HB)
を低分子量化することが確認された。低分子量 P(3HB)は、結晶核剤やブレンド
体として、従来の P(3HB)とは異なる用途が期待できる。本研究では、このアルコーリシス反応によって分子量 1 万以下の P(3HB)を合成することを目指している。今回は、シャペロンを利用して、細胞内で働く重合酵素量を増加させることで、ポリマーの分子量制御を試みた。
【方法】Escherichia coli BL21(DE3)に重合酵素遺伝子を有するプラスミド pET3aphaRCYB4AB を導入し、さらに 5 種類のシャペロン発現プラスミド（dnaK-dnaJgrpE,groES-groEL(pG-KJE8), groES-groEL (pGro7), dnaK-dnaJ-grpE (pKJE7),
groES-groEL-tig (pG-Tf2), tig (pTf16)）をそれぞれ導入し組換え株を作製した。
それらの株を培養し、コントロール株との比較を行った。
【結果と考察】コントロール株が分子量約 30 万に対し、シャペロンを発現した株では約 10 万未満であり、3 万にまで低分子量化しているものもあった。このことから、シャペロンと共発現させることで重合酵素の発現量が高まり、低分
子量化が進んだことが推察された。今後は、重合酵素活性測定により各組換え
株の重合酵素発現量の確認し、シャペロンによる重合酵素量への影響を調べ、さらなる分子量制御を試みる。

High level heterologous production of an anti-tubercular agent Dcycloserine by Escherichia coli

Molecular Weight Control of Polyhydroxyalkanoate by Co-Expression ofChaperone and PHA synthase○Takanori Kumagai1, Tomoki Ozawa2, Tatsuaki Aota1, Momoko Tanimoto2,
Yasuyuki Matoba1, Masafumi Noda1, Masanori Sugiyama1(1Grad. Sch. Biomed. & Health Sci., Hiroshima Univ., 2Faculty of Pharm. Sci.,
Hiroshima Univ.)

Key words

D-cycloserine, heterologous production, metabolic engineering

3P-1p026 認知症を引き起こす神経変性疾患原因タンパク質の酵母を用いた凝集性解析○Yuka Nanbu1, Manami Hyakutake2, Ayaka Hiroe1, Takeharu Tsuge1(1Interdiscip. Grad. Sch. Sci. Eng., Tokyo Tech, 2BMEP, RIKEN)

Key words

polyhydroxyalkanoate, Molecular weight, chaperonin, PHA synthase

3P-1p028 Stenotrophomonas maltophilia エステラーゼの遺伝子ク
ローニングと大量発現○鳥居 誉 1, 奥野 圭祐 2, 朝倉 紗也栞 1, 大浦 麻里 2, 阿野 貴司 1,2,
岡南 政宏 1,2
（1近畿大・生物理工, 2近畿大院・生物理工）
okanami@waka.kindai.ac.jp○浦野 大樹 1, 鈴木 絢子 1,2, 星田 尚司 1, 赤田 倫治 1
（1山口大院・創成科学・化学系, 2現大分大・工・応化）
hoshida@yamaguchi-u.ac.jp

現在、認知症の治療薬の開発が大きな課題となっている。認知症を引き起こす
神経変性疾患において、アルツハイマー病ではアミロイド β、パーキンソン病
では α シヌクレインと呼ばれるタンパク質の凝集が主な原因と考えられている。しかし、これらが凝集するメカニズムは分かっていない。そこで本研究では、アミロイド β と α シヌクレインの凝集に重要な配列を明らかにするために酵母を用いた。アミロイド β 全長（43 aa）の C 末に緑色蛍光タンパク質 GFPを融合させて酵母で発現させると細胞内で凝集が見られた。そこで、C 末端からアミノ酸を削除してみると 8 アミノ酸削除すると凝集が消え、細胞質局在を示した。この削除した C 末端は疎水性アミノ酸で構成されており、どの疎水性アミノ酸が凝集に重要か調べるために、単一の疎水性アミノ酸で構成した人工配列を 35 aa に付加した。その結果、バリン（V）の連続した配列を付加したもので凝集が多く見られた。そこで、C 末端の疎水性をモデル化するために、C末端側の 14 アミノ酸を除き、バリンの連続配列に置換したところ、6 アミノ酸でも凝集が見られた。この結果から、アミロイド β の凝集において、C 末端は単純な疎水性配列でよいことが分かった。現在 N 末端側の変異体を作製し、凝集に必要なアミノ酸を調べている。次に、α シヌクレインも酵母で全長を発現させると凝集が見られたので、C 末端から削除した。C 末端の酸性アミノ酸リッ
チな配列を削除すると凝集が増え、さらに、その N 末端側にある疎水性アミノ酸が多く存在する領域を部分的に削除すると、凝集が減った。α シヌクレイン
においても、疎水性アミノ酸配列が凝集に必要な配列であることが示唆された。

【背景と目的】生分解性プラスチック製農業用品の効率的分解は、農業の環境負荷および従事者負担を軽減するための重要な課題の一つになっている。細菌が産生するエステラーゼは、一般的に動植物が産生する酵素より安定性が高く、生分解性プラスチックの分解への利用が期待できる。これまでに高いエステラー
ゼ活性を示す Stenotrophomonas maltophilia 4A 株を環境中より単離している。そこで本研究では、4A 株が産生するエステラーゼの特性解析や、4A 株のエステ
ラーゼ遺伝子の単離およびエステラーゼの大量発現を試みた。
【方法と結果】4A 株が産生するエステラーゼについて、様々な誘導条件および様々な反応条件での活性を測定した。その結果、熱安定性が高く、至適 pH が中性付近であり、至適反応温度が中温付近であることが分かった。また、生分解性プラスチックを 4A 株によって分解した後の溶液の植物の生長に対する影響を調べた。PBS 系生分解性プラスチックを分解した 4A 株の培養液をキュウ
リの苗に与えたところ、キュウリの生長は全く阻害されなかった。以上の結果
は、4A 株が産生するエステラーゼが農業での利用に適していることを示唆した。そこで、エステラーゼを大量発現させるために、エステラーゼ遺伝子の単離を試みた。4A 株のゲノム DNA ライブラリーを構築し、大腸菌にライブラリーを導入した結果、エステラーゼ活性を有する形質転換体が得られた。その形質転換体が保持するプラスミドには、エステラーゼ産生遺伝子を含む約 5kbpの DNA 断片が挿入されていた。本大会では、エステラーゼの推定されるアミノ酸配列や大量発現、発現調節機構について報告する予定である。

Yeast as a model for analyses of protein aggregation leading toneurodegenerative diseases

Molecular cloning and overexpression of a Stenotrophomonas maltophilia
esterase○Daiki Urano1, Ayako Suzuki1,2, Hisashi Hoshida1, Rinji Akada1(1Dept. Chem., Grad. Sch., Yamaguchi Univ., 2Dept. Appl. Chem., Fac. Eng., Oita
Univ.)

Key words

amyloid beta, alpha synuclein, protein aggregation, yeast○Takashi Torii1, Keisuke Okuno2, Sayaka Asakura1, Mari Ooura2, Takashi Ano1,2,Masahiro Okanami1,2(1Fac. Biol. Ortd. Sci. Technol., Kindai Univ., 2Grad. Sch. Biol. Ortd. Sci. Technol.,
Kindai Univ.)

Key words

biodegradable plastic, esterase, Stenotrophomonas maltophilia

286

遺伝子工学／植物細胞工学，組織培養，育種工学

3P-1p029 蛍光タンパク質を利用した白色腐朽菌 Phanerochaete
sordida YK-624 株の交配技術開発

3P-1p031 キク科 Flaveria 属形質転換系と遺伝子発現誘導系の確立○近藤 旺次郎 1, 隅谷 友紀 1, 森 智夫 1, 河岸 洋和 1,2,3, 平井 浩文 1,2（1静大・農, 2静大グリーン研, 3静大・創科技院）
hirai.hirofumi@shizuoka.ac.jp○岡 美慧, 谷口 幸美, 宗景 ゆり（関西学院大院・理工）
munekage@kwansei.ac.jp【背景と目的】 高活性リグニン分解菌 Phanerochaete sordida YK-624 株への遺伝子導入法はすでに確立されており、遺伝子高発現株の取得が可能であるが、導入し高発現する遺伝子数には限界がある。一方で、個々の遺伝子を導入した形
質転換株を交配させることで、さらに優良な株が獲得可能であると考えられるが、P. sordida YK-624 株の交配方法・条件は未だ確立されていない。そこで本研究では、交配により作成される二核菌糸体の有無の判別を容易にするため、2 種の蛍光タンパク質 Enhanced Green Fluorescent Protein 遺伝子（egfp）もしく
は mCherry 遺伝子導入株をそれぞれ作出し、細胞内での蛍光の状態により交配の成否が判断できる評価系の確立を目指して検討を行った。
【方法・結果】 egfp 発現プラスミド pPsact0 pro-egfp 及び mCherry 発現プラスミ
ド pPsgpd-mCherry を構築し、P. sordida YK-624 株由来のウラシル要求性変異株である UV-64 株に ura5 マーカープラスミドと構築した上記発現プラスミドをPEG 法により共形質転換を行い、緑色蛍光を発する共形質転換体 egfp 発現株及び赤色蛍光を発する共形質転換体 mCherry 発現株をそれぞれ取得した。得られた egfp 及び mCherry 発現株を用いて PDA 培地上で対峙培養を行い、境界付近の菌糸を採取し蛍光顕微鏡にて各タンパク質に適した波長で観察し、それぞれの結果の写真を重ね合わせたところ、緑色蛍光及び赤色蛍光の混在によって黄色になる細胞が得られ、簡便に交配の成否を判別可能な評価法の確立に成功したと結論づけた。また、対峙培養株から単離した胞子から egfp 及び mCherry 双方の蛍光を示す株が得られ、交配により双方の特性を獲得した株の単離が可能であった。

トウモロコシやサトウキビ等の C4 型作物は、葉内に CO2 を濃縮する機構を持つため、乾燥高温条件下での生育に有利である。一方、イネや小麦といった作
物はこのような濃縮機構を持たない C3 型作物であるため、乾燥高温条件下での生育が厳しい。C4 型植物は C3 型植物から進化し発生しており、この進化の過程から C4 化に必須の因子が解明できれば、作物の C4 化分子育種技術へ応用できると考えている。当研究室では研究材料として同属内に C3 種および C4 種が複数存在し、進化過程の解析が容易であるキク科 Flaveria 属を用いている。C4種における形質転換体作出技術は数種に限定されており、形質転換効率は低い。
本研究では C4 型 Flaveria bidentis の形質転換において、アグロバクテリウム培
養液条件やカルス化誘導時の光条件などを改良した、効率的な形質転換方法について報告する。また C3 型 Flaveria の形質転換系の立ち上げについても着手している。この系の確立ができれば、C3 型植物を C4 化もしくは C4 型植物を C3化するという双方向の解析が可能になると考える。カルスやシュート誘導時の培地中ホルモン濃度を調節し、最適濃度を調べた結果についても報告する。
さらに Flaveria bidentis における GVG 転写誘導系を導入した誘導型遺伝子発現
制御系についても報告する。GVG 転写誘導系には、酵母の転写因子 GAL4 のDNA 結合ドメイン、ヘルペスウイルス由来の転写活性化ドメイン VP16、グル
ココルチコイドホルモン結合ドメインを用いている。この系は遺伝子発現制御が随意に可能であることから、遺伝子の一過的な応答について解析ができると考える。

Development of crossbreeding method in white-rot fungus using fluorescentproteins.

Establishment of transformation system and inducible gene expression
system in genus Flaveria○Ojiro Kondo1, Tomoki Sumiya1, Toshio Mori1, Hirokazu Kawagishi1,2,3,
Hirofumi Hirai1,2(1Fac. Agric., Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.,
3
Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ.)

Key words

Phanerochaete sordida YK-624, fluorescent proteins, crossbreeding

3P-1p030 Identification of beta-amyrin 28-oxidase in Glycyrrhiza
uralensis○Keita Tamura1, Hikaru Seki1, Hideyuki Suzuki2,
Mareshige Kojoma3, Toshiya Muranaka1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Kazusa DNA Res. Inst., 3Fac.
Pharm. Sci., Health Sci. Univ. Hokkaido)
muranaka@bio.eng.osaka-u.ac.jp

Glycyrrhiza uralensis (licorice) is one of the important medicinal plants belonging to
the Fabaceae. An oleanane-type triterpenoid saponin produced by licorice plants,
glycyrrhizin, is widely used as medicine and natural sweetener. Although glycyrrhizinis the most prominent triterpenoid in licorice plants, they also produce other types oftriterpenoids such as oleanolic acid, betulinic acid, and soyasaponins. Several
cytochrome P450 monooxygenases (P450s) regarding to the biosynthesis ofglycyrrhizin and soyasaponins have been reported from licorice, however, P450s forthe biosynthesis of oleanolic acid and betulinic acid are unknown. Here, we performed
RNA-seq of tissue cultured stolons of licorice and identified a novel P450,
GuCYP716A, that could not be identified in our previous transcriptome data obtained
from intact roots, stolons, or leaves. Enzymatic activities of GuCYP716A towards
three triterpene skeletons, beta-amyrin, alpha-amyrin, and lupeol were analyzed inengineered yeast, and the production of oleanolic acid, ursolic acid, and betulinic acidwas confirmed respectively. Comparative analysis of intact roots and tissue cultured
stolons has revelaed that gene transcript level of GuCYP716A in tissue cultured
stolons was more than 100 times higher than that in intact roots. Furthermore,oleanolic acid and betulinic acid were detected only in tissue cultured stolons. These
results provide a better understanding of the molecular mechanisms of tissue-type
specific biosynthesis of triterpenoids in licorice.

Identification of beta-amyrin 28-oxidase in Glycyrrhiza uralensis○Keita Tamura1, Hikaru Seki1, Hideyuki Suzuki2, Mareshige Kojoma3,
Toshiya Muranaka1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Kazusa DNA Res. Inst., 3Fac. Pharm. Sci., HealthSci. Univ. Hokkaido)

Key words

Glycyrrhiza uralensis, terpenoid, P450, transcriptome○Misato Oka, Yukimi Taniguchi, Yuri Munekage(Grad. Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ.)

Key words

transformation, gene expression

3P-1p032（講演中止）

植物細胞工学，組織培養，育種工学／酵素学，酵素工学

3P-1p033 シロイヌナズナのディフェンシンに関する組換えタンパ
ク質の調製と解析

287

3P-1p035 Aspergillus oryzae RIB40 由来ギ酸オキシダーゼにおける Tyr99, Phe405 の役割○田邊 直人, 道林 泰樹, 沖 昌也, 内田 博之（福井大院・工）uchida@u-fukui.ac.jp○角谷 茜, 柳川 大樹, 今井 博之（甲南大院・自然科学・生物）
imai@konan-u.ac.jp

植物の身の周りには微生物や昆虫が棲みついているが、植物は動物のように移動が出来ず免疫細胞のような特殊な細胞は持っていない。そのため、植物は自身を守る特殊な構造や成分を持ち、感染細胞が全身へ危険信号を送り未感染組
織も抵抗性を獲得できるという機構を持っている。このような植物の防御応答
は大まかに 2 つに分けられる。1 つが静的抵抗性と呼ばれ、植物が元々持つ構
造（表皮やクチクラ層）や化学物質（カテキンやタンニン酸）による抵抗性である。もう 1 つは動的抵抗性と呼ばれ、病原菌が植物体にアタックして初めて動き始める。動的抵抗性には、過敏感反応や感染特異的タンパク質（PR タンパ
ク質）の産生、ファイトアレキシン（抗菌性物質）の産生などが挙げられる。
そして前述したように、感染細胞が未感染組織に危険信号を送るシグナル伝達経路が知られている。このシグナル伝達経路は、伝達物質としてサリチル酸、
エチレン、ジャスモン酸などがある。このエチレンとジャスモン酸が関わる経路で、PR タンパクの一種である抗菌性の植物ディフェンシンが産生され、病原菌をアタックするということが分かっている。しかし、この機構は詳しく解明されていない。そこで本研究では、シロイヌナズナを用いて植物ディフェンシ
ンと病原菌との関係性を調べることとした。
まず、シロイヌナズナの植物ディフェンシン遺伝子（AtPDF1.1）を、上流にGST タグがくるよう pDEST15 発現ベクターを設計し、大腸菌 BL21AI に形質転換した。その後組換えタンパク質精製を試みたところ、大腸菌に対して精製されたディフェンシンタンパクが毒性を持つことが確認された。そのため、温度や大腸菌の濃度を変更し条件検討を行った。結果、低温でのタンパク質誘導を行うことで安定して組換えタンパク質を精製でき、GST 抗体を用いたイムノブ
ロットでバンドを確認することができた。

【目的】ギ酸オキシダーゼ (FOD) は、ギ酸を二酸化炭素に酸化し、酸素を電子受容体として過酸化水素を産生する酵素で、Aspergillus sp.や Debaryomyces sp.で確認されている。 FOD は GMC オキシドレダクターゼファミリーに属するが、他の酵素と違い、8-formylFAD をコファクターとし、セミキノン体で高い安定性を示すといった特徴がある。X 線結晶解析で構築した Aspergillus oryzae RIB40
由来ギ酸オキシダーゼの活性部位には 3 つの芳香族残基 (Tyr99, Phe405, Phe510)
がコファクターのフラビン環を挟んで存在しており、Tyr99 と Phe405 はギ酸と酸素が活性部位に侵入する位置に存在する。本研究では、Tyr99 と Phe405 をそれぞれ Ala,又は Trp に置換し、これらの変異体酵素の性質の検討を行った。
【方法と結果】大腸菌で生産した Aspergillus oryzae RIB40 由来 FOD を用い、変異導入は inverse PCR 法で行った。酵素は、Ni-SepharoseTM と Hi-Trap Q カラム
クロマトグラフィーにより精製した。精製後の Y99A と Y99W ではコファクターとして 8-formylFAD を持ち、そのセミキノン体特有のスペクトルを示した。
Y99A と Y99W の見かけの Vmax は、ワイルドタイプ (WT) に比べて、それぞれ 2 桁と 1 桁小さく、Y99W のギ酸に対する見かけの Km は、WT に比べて、4倍大きかった。F405A はコファクターとして FAD を持ち、活性を示さなかった。F405W には 8-formylFAD が存在し、見かけのギ酸に対する Km と Vmax
は、WT に比べて、それぞれ約 10 分の 1 と約 3 分の 1 であった。これらの結果
は、Tyr99 と Phe405 は酵素活性発現に重要な役割を果たしていること、またPhe405 は FAD の修飾に関与していることを示している。

Expression of an Arabidopsis recombinant defensin in E. coli

Roles of Tyr99 and Phe405 in formate oxidase of Aspergillus oryzae RIB40○Akane Kakutani, Daiki Yanagawa, Hiroyuki Imai
(Dept. Biology., Grad. Sch. Sci., Konan Univ.)

Key words

Arabidopsis thaliana, defensin○Naoto Tanabe, Daijyu Doubayashi, Masaya Oki, Hiroyuki Uchida(Grad. Sch. Eng. Fukui Univ.)

Key words

formate oxidase, 8-formylFAD, catalysis, aromatic amino acid

3P-1p034 土壌肥沃度指標に基づく薬用植物の有機栽培

3P-1p036 ラン藻 Synechocystis の乳酸脱水素酵素の生化学解析【背景と目的】 薬用植物は二次代謝産物などとして生産される含有成分に薬効がある植物の総称である。薬用に利用するには特に安全性が重要であり、化学
肥料や農薬を用いない有機栽培による薬用植物の収量・品質の向上が求められている。しかし、有機栽培は経験に基づく手法が多く、正しい施肥量の判断が難しいという課題がある。したがって、土壌環境を正確に把握し、適切な施肥を行うことが重要である。土壌肥沃度指標(SOFIX)は微生物の数や活性に着目した土壌分析の指標であり、指標に基づき土壌成分を調整すると、土壌の微生物活性が上がり、物質循環が高まることが確認されている。また、この物質循
環を基盤とした有機栽培が作物の生育にも効果的であることが示唆されている。
本研究では薬用植物の有機栽培法の確立を目的とし、SOFIX に基づいて土壌環
境と薬用植物の収量、品質の関係性を解析した。
【方法】 実験に使用する土壌の SOFIX 分析を行ったところ、微生物活性が低かった。そこで、炭素源および窒素源を適切に供給するように土壌改良を行った。最適条件の検討のため、窒素源については、A：高、B：中、C：低の 3 条件を設定した。その後、4 ヶ月の栽培後に収穫を行い、土壌分析、作物の収量測定と含有成分量の定量を行った。
【結果と考察】 施肥後、土壌のバイオマスが増加し、それに伴って微生物活性は向上した。栽培後、収量、含有成分共に条件 A が最も高かった。このことから、SOFIX に基づいた土壌調整で、薬用植物の収量と品質が向上することが示唆された。しかし、栽培後、土壌の総細菌数、物質循環活性は全ての条件で減少した。その原因として、根酸が細菌に作用し、菌数と土壌微生物の多様性が変化したことが推測された。したがって、薬用植物を継続的に適切な土壌環境で栽培するためには、施肥の量とタイミングが重要であると考えられた。

ラン藻 Synechocystis sp. PCC 6803 は、酸素発生型の光合成を行う淡水性の単細胞性球菌で乳酸脱水素酵素(Ddh)を持つ。最近の研究により、Synechocystis は、
乳酸を始めとする有機酸を細胞外に放出する能力を有することが明らかになった。
大腸菌コンピテントセル[BL21 (DE3), Takara Bio]に Synechocystis の Ddh の GST
融合組換えタンパク質の発現ベクターを導入した。形質転換後にアンピシリン
入りの LB 寒天培地でコロニーを選別した。
2 L の大量培養時に 2 μM の IPTG で ddh 遺伝子の転写を 20 時間誘導した。集菌後、VC-750（Sonics & Materials, Inc.）で超音波破砕(Intensity 20%、20 秒間)を
10 回行い、遠心分離(4℃、8000 rpm、2 分間)した。可溶性タンパク質を含む上清にグルタチオンセファロースビーズ（GE ヘルスケア）を加え、30 分間振盪
して GST 融合タンパク質をビーズに結合させた。その後、再び遠心分離(4℃、8000 rpm、2 分間)し、GST 融合 Ddh タンパク質を含む画分を得た。その画分にPBS-T を加え、よく撹拌後、遠心分離(4℃、5000 rpm、1 分間)し、上清を捨てる作業を 3 回行った。最後に 10 mM 還元グルタチオンを含む GST-Elution Bufferを用いて、GST 融合 Ddh タンパク質を溶出した。
精製したタンパク質を、スピンカラム VIVASPIN 500【分画分子量：50000】（Sartorius）を用いて遠心分離(4℃、15000 rpm、2 分間)を繰り返し、濃縮した。
電気泳動の結果、63~64 kD 付近に最も濃いバンドが検出された。これは予想される GST 融合 Ddh タンパク質の分子量に一致する。精製した GST 融合 Ddh タ
ンパク質に対して生化学解析を行った。

Organic cultivation of medical plants based on Soil Fertile Index

Biochemical analysis of lactate dehydrogenase from Synechocystis○山﨑 透 1, 荒木 希和子 1, 上野 省一 2, 久保 幹 1（1立命館大院・生命科学, 2ノエビア・研究開発部）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp○Toru Yamasaki1, Kiwako S. Araki1, Shoichi Ueno2, Motor Kubo1(1Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2R&D Dept., NOEVIR Co., Ltd.)Key words

organic cultivation, medical plant, soil condition, soil bacteria○伊東 昇紀, 竹屋 壮浩, 小山内 崇（明治大・農）tosanai@meiji.ac.jp○Shoki Ito, Masahiro Takeya, Takashi Osanai(Sch. Agric., Meiji Univ.)

Key words

lactate dehydrogenase, cyanobacteria

288

酵素学，酵素工学

3P-1p037 海洋細菌由来マルチ銅オキシダーゼを用いた塩基性色素の脱色

3P-1p039 超好熱古細菌由来 glycerol 代謝酵素の酵素活性調整の分子機構○海老原 京太 1, 吉川 潤 2, 堀口 博文 2, 天知 誠吾 1
（1千葉大院・園芸, 2合同酒精(株)）amachi@faculty.chiba-u.jp【背景と目的】染色工場等から排出される人工色素を含んだ排水による環境汚染が問題となっている。特に crystal violet をはじめとする塩基性色素には発癌性が報告されている。その対策として物理化学的処理が行われているが、高コストと毒性を有する副産物の生成という課題がある。そこで現在、マルチ銅オキシダーゼ（MCO）
を用いた生物的処理が注目されている。当研究室では、天然ガスかん水中からヨウ素酸化能を有する MCO を生産する細菌 Q-1 株を単離し、その構造遺伝子の特定に成功している。また、本 MCO を用いた酸性色素の脱色にも成功している。そこで本研究では、Q-1 株由来 MCO を用いた塩基性色素の脱色を検討した。さらに染色工場の実排水の脱色も試みた。

○古賀 雄一, 高野 築, 小西 佳菜子, 小林 淳, 大政 健史（阪大院・工）kogay@mls.eng.osaka-u.ac.jp【結果及び考察】
塩基性色素及び工場排水に対し KI 無添加で MCO と反応させた場合、脱色能は見られなかった。しかしながら、KI 添加により脱色が進行し、塩基性色素に関しては沈殿物の生成も認められた。また KI 濃度依存的に脱色率は上昇し、
methylene blue 及び crystal violet は 1 mM、malachite green は 2 mM で 98％以上の脱色率を示した。さらに至適 pH は中性付近に存在していた。一方、工場排水においても KI 濃度依存的に脱色率の向上が見られ、1 時間の反応で 0.5 mM
KI では 47.4％、1 mM KI では 59.5％の脱色が確認された。工場排水の pH は8.82 と高かったため、本 MCO は塩基性条件で活性を持たない糸状菌由来 MCOと差別化できると共に、適切な pH 制御により、さらに効率的な脱色に繋がる可能性が示唆された。

Glycerol はリン脂質の炭素骨格となる Glycerol 3-phosphate や、解糖系の代謝中
間代謝物 Dihydroxyacetone phosphate（DHAP）に代謝される重要な化合物である。大腸菌等でよく研究されており、Glycerol から DHAP までの二通りの代謝経路や Glycerol 代謝のキーステップであるリン酸化反応が、Glucose 関連タン
パク質（Protein IIIglc）や解糖系中間代謝物（fructose 1,6-bisphosphate）によって、アロステリック制御されていることがわかっている。
本研究では超好熱性古細菌（始原菌）Thermococcus kodakarensis KOD1 の glycerol
kinase (Tk-GK) と glycerol 3-phosphate dehydrogenase (Tk-G3PDH)の構造と機能の特性を解析し、古細菌（始原菌）における glycerol 代謝酵素の調整メカニズムについて考察する。
Glycerol kinase は分子量約 55kDa のタンパク質で一般的に 4 量体を形成しているのに対し、Tk-GK は特異な 6 量体構造と 2 量体構造の平衡状態をとっていた。この平衡は glycerol の結合によって 6 量体側にシフトすること、その際にATP の親和性が 10 倍良くなることから、酵素機能の調整に関連があることが示唆された。Tk-GK と基質の複合体の X 線結晶構造解析の結果、本酵素は基質結合にともなって 6 量体を形成し、ATP 結合に有利なコンフォメーションを安定化していることが考えられた。
一方、Tk-G3PDH は、NADH oxydase、molybdopterin oxidoreductase と遺伝子レベルでオペロンを形成しており、タンパク質としては特異な複合体を形成することが分かった。Tk-G3PDH においても単量体と複合体の形成時で Glycerol 3phosphate を酸化した際に生じる電子の受容体が変わるなど機能が変化することが示唆された。
両酵素は遺伝子レベルでの発現調整や、解糖系からのフィードバック制御は受けていないが、酵素分子レベルでの単純な調整機能があることが明らかとなった。

Decolorization of basic dyes by multicopper oxidase produced by a marine
bacterium strain Q-1

Molecular mechanism of regulation of glycerol metabolism enzymes from a
hyper-thermophilic archaeon【方法】
Q-1 株を Marine broth 2216 で２日間振盪培養し、上清を粗酵素液とした。粗酵
素液と 0.3 mM 塩基性色素（methylene blue, malachite green, crystal violet）または
工場排水を、ヨウ化カリウム（KI）と共に 30℃で反応させ吸光度の減少から脱色率を評価した。

○Kyota Ebihara1, Jun Yoshikawa2, Hirohumi Horiguchi2, Seigo Amachi1(1Grad. Sch. Horticul., Chiba Univ, 2GODO SHUSEI Co., Ltd.)Key words

multicopper oxidase, iodine, decolorisation, marine bacterium

3P-1p038 サルコシンオキシダーゼの L-チオプロリンに対する反応性評価○Yuichi Koga, Takano Kizuku, Kanako Konishi, Atsushi Kobayashi,
Takeshi Omasa(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

archaea, glycerol, enzyme, regulation

3P-1p040 D-サイクロセリン生合成に関わる新規ヘムタンパク質
DcsA の構造と性質○岡島 奨, 吉田 知左, 西矢 芳昭（摂南大・生命科学）
nishiya@lif.setsunan.ac.jp○的場 康幸 1, 古川 裕貴 1, 柳澤 幸子 2, 宇田 成利 1, 熊谷 孝則 1,
小倉 尚志 2, 杉山 政則 1
（1広島大院・医歯薬保健, 2兵庫県大院・生命理）ymatoba@hiroshima-u.ac.jp【背景および目的】 クレアチニンは、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、サルコシンオキシダーゼ（Sox）によりクレアチニンを過酸化水素に導き、発色定量する。診断の有効性をより高めるため、クレアチニン測定酵素法のさらなる精度向上が期待されている。
Sox（EC1.5.3.1）はサルコシンの酸化的脱メチル化を触媒する。Sox は反応性に優れた酵素だが、基質であるサルコシンと構造的に類似性のある L-プロリンに対し、非常に微弱な反応性を有する。
今回は L-プロリン類似物質である L-チオプロリンを取り上げ、Sox の反応にどのような影響を与えるかの評価を行ったので報告したい。
【実験方法および結果】 まず、Sox の構造モデルを基に、基質のドッキングシ
ミュレーションを実施した。その結果、酵素との親和性は L-プロリンよりも Lチオプロリンの方がずっと高いと推測された。
活性測定により、Sox が L-チオプロリンに反応することを確認できたため、反応速度定数を求めた。結果として、Sox は L-チオプロリンに対して L-プロリンよりも低い K ｍ値を示し、Km 値に関してドッキングシミュレーションでの推測が証明された。
次に、各種基質の有酸素条件での酵素反応と無酸素条件での酵素反応の吸収ス
ペクトル解析を行った結果、各基質の反応速度に対応する吸収スペクトルの変化が認められた。
現在、Sox の変異体を作成し各基質と反応させ、変異体の特性を評価しており、報告したい。
【結論】 ドッキングシミュレーションより、L-チオプロリンが Sox と反応すると予測し、そのことを実験的に確認した。L-チオプロリンに対する反応は、従来の基質とはかなり異なる特徴を示した。

【目的】当研究グループでは, これまでに, 抗結核薬 D-サイクロセリンの生合成
機構の解明に取り組んできた。その成果のひとつとして, DcsA と名付けた酵素
は新規性の高いヘムタンパク質であり, L-アルギニン水酸化酵素として働くことを明らかにした。ちなみに, DcsA の反応産物である Nω-ヒドロキシ-L-アルギニ
ンは, 一酸化窒素合成酵素 (NOS) の酵素反応における中間体である。また, 一段
階目で窒素原子を水酸化する NOS は, 様々な基質の炭素原子を水酸化する P450と同じく, システイン残基のチオール基を近位配位子とするヘムタンパク質であることが知られている。本研究では, DcsA の触媒機構を明らかにするため, X 線
結晶構造解析とラマンスペクトル解析を行った。
【結果】X 線結晶構造解析の結果, DcsA は NOS や P450 と同じくチオール基を近位配位子とするヘムタンパク質であるが, 新規の構造をもつことが明らかとなった。特に, DcsA の基質結合ポケットは, NOS のものに比べて明らかに小さかった。一方, 共鳴ラマンスペクトル解析からは, Fe(III)型 DcsA は高スピン状態
であるものの, L-アルギニンや Nω-ヒドロキシ-L-アルギニンを添加することにより低スピン状態に変化しうることが明らかになった。また, CO と結合した Fe(II)型 DcsA のラマンスペクトル解析から, DcsA は単一のコンフォメーションをとること, および, チオール基から鉄への電子供与性が弱いことが示唆された。こ
れらの情報をもとに, DcsA の反応機構を予測した。

Reactivity evaluation of sarcosine oxidase for L-Thioproline

Structure and property of a novel heme protein DcsA

○Tasuku Okajima, Tisa Yoshida, Yoshiaki Nishiya(Life Sci.,Setsunan Univ.)

Key words

Sarcosine oxidase, Mutagenesis, L- Thioproline, Kinetic paramater○Yasuyuki Matoba1, Yuki Furukawa1, Sachiko Yanagisawa2, Narutoshi Uda1,
Takanori Kumagai1, Takashi Ogura2, Masanori Sugiyama1(1Grad. Sch. Biomed. Sci., Hiroshima Univ., 2Grad. Sch. Life Sci., Univ. Hyogo.)

Key words

crystallographic study, hydroxylase, heme protein, biosynthesis酵素学，酵素工学

3P-1p041 イオン液体による酵素の耐熱化 ： 安定化剤、反応溶媒
への展開

289

3P-1p043 Toxin-antitoxin 分子認識機構：病原菌由来 RNA イン
ターフェレンスの特異的認識配列の同定○金子 恒太郎, 河合 功治（ミヨシ油脂）kanekok@so.miyoshi-yushi.co.jp

横田 亜紀子 1, 宮本 龍樹 1,2, 大田 悠里 1,2, 常田 聡 2, ○野田 尚宏 1,2（1産総研・バイオメディカル, 2早大・先進理工）
akiko-yokota@aist.go.jp【背景と目的】常温で液体のイオン液体は、不揮発性、高極性、低融点等の特異的な物性を有し、材料からバイオまで幅広い分野での応用が期待される中、タンパク質保存液への応用が検討されている。我々は、特定官能基を導入した４級アンモニウ
ム型イオン液体が、化学構造に依存してタンパク質、酵素等の生体高分子を高濃度で溶解し、長期にそれらの活性を保持することを見出した。今回、本イオ
ン液体の酵素安定化剤及び酵素反応溶媒への展開を指向し、イオン液体水溶液
における酵素の保存温度ならびに反応温度への影響について実験を行い、イオ
ン液体による酵素の耐熱化について評価した。
【結果と考察】特定官能基を導入した４級アンモニウム塩型イオン液体の１０～７０％水溶液に酵素を溶解し、２５、４０℃で一定期間保存した後、酵素の活性（イオン液体による酵素の安定化効果）を測定した。いずれの温度においても、イオン液体の系は、バッファー及び各種安定化剤の水溶液等のリファレンスより酵素の活性が高く、イオン液体が酵素の安定化効果に優れることを示した。次に、イ
オン液体水溶液を反応場として、３０、４０、５０℃の反応温度で酵素反応を試みた。上記と同様に、イオン液体の系は、各温度において、バッファー、安定化剤水溶液より反応率は良好で、優位な結果が得られた。特に、反応温度を３０℃から４０及び５０℃へ上げた際、リファレンスの系は反応率の低下が認められたのに対して、イオン液体の系は反応率が上昇する傾向を示し、イオン液体による酵素の耐熱性向上の効果を確認した。
つまり、本イオン液体は、化学構造の調整により酵素の活性保持効果、さらには耐熱性を高めることを可能とし、酵素をはじめとする生体高分子の安定化剤、酵素反応溶媒への応用が期待される。

【背景と目的】 原核生物においては、トキシン-アンチトキシンン（TA; toxinantitoxin）というプログラム細胞死に関与するシステムが存在する。平常時には antitoxin が toxin に結合して、その毒性を無毒化しているが、飢餓等のスト
レス条件下では、その結合様式が崩壊する。そして、フリーとなった toxin が細胞内の標的分子を攻撃し、結果的に細胞の成長阻害・致死を誘導する、という作用機序である。この TA システムを上手く利用し、病原菌自身の持つ toxinの活性を何らかの方法で促進することで細胞死を誘導できれば、多剤耐性菌等に対して有効な次世代抗生物質の創製に繋がる可能性がある。そこで、本研究においては、病原菌由来の TA システムに焦点を当て、RNA を標的として配列
特異的に認識・切断する toxin である MazF（RNA interferase）と、その標的
RNA ならびに antitoxin（MazE）との分子認識機構について考察し、細胞応答制御に応用することを目的とした。
【方法と結果】 病原菌由来 TA システムの中で、腹痛や下痢などを引き起こす
ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）の toxin である MazF-CPE に着目し、その発現ベクターを構築した。大腸菌 BL21(DE3)を用いて培養と発現誘導を行い、回収した菌体の超音波破砕液の上清をアフィニティクロマトグラフィで精製し、高純度 MazF-CPE の調製に成功した。取得した MazF-CPE を基質 RNAと反応させ、当研究グループで開発した手法により、次世代シークエンサーで切断部位を解読し、MazF-CPE の認識 RNA 配列を同定した。さらに、蛍光消光
アッセイにより配列特異的な RNA 切断活性を確認し、同定した認識配列に対する特異性が高いことを明らかにした。今後は、MazF-CPE と標的 RNA、そして antitoxin MazE-CPE との相互作用について解析を進め、細胞増殖抑制因子（細胞外致死因子）の探索を目指す予定である。

Thermostabilization of enzyme by ionic liquids : Development to stabilizers
and reaction solvents

Identification of specific RNA sequences cleaved by a MazF from apathogenic organism○Kotaro Kaneko, Koji Kawai(Miyoshi Oil & Fat Co.,Ltd.)Key words
solvent

ionic liquid, thermostability, enzyme stabilizing agent, enzyme reaction

3P-1p042 クマモリシンのカルシウムイオン結合部位特異的変異体の作製と熱安定性の解析

Akiko Yokota1, Tatsuki Miyamoto1,2, Yuri Ota1,2, Satoshi Tsuneda2,○Naohiro Noda1,2(1Biomed. Res. Inst., AIST, 2Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)
Key words
Toxin-antitoxin system, RNA interferases, Massively Parallel
Sequencing, Molecular recognition

3P-1p044 合成生物学的手法により構築したシアノバクテリアによる CO2 からバイオエチレンへの変換効率に関する研究○洲鎌 勇太 1, 尾山 廣 2, 伊東 昌章 1
（1沖縄高専, 2摂南大・理工）
ma-itou@okinawa-ct.ac.jp○神藤 定生 1, 林 茉依 2, 細田 晃文 2, 田村 廣人 2
（1名城大・理工, 2名城大・農）sjindou@meijo-u.ac.jp【背景と目的】クマモリシンは、好熱菌 Bacillus novosp. MN-32 株が産生するプ
ロテアーゼ(反応最適条件:pH3.0,70℃)であり、セリンプロテアーゼのセリン-カ
ルボキシプロテアーゼ群に分類される。本研究では、触媒活性や安定性に寄与すると考えられるカルシウムイオンの機能を明らかにすることを目的とし、カルシウム結合部位の Asp を Ala あるいは Asn に置換した部位特異的変異体を無細胞タンパク質合成系にて調製し、それらの熱安定性を調べた。
【方法】無細胞タンパク質合成には昆虫培養細胞由来の系を用いた。その発現ベ
クター pTD1 にプロクマモリシン遺伝子を挿入した野生型プロクマモリシン発
現プラスミドをもとに、変異型プロクマモリシン発現プラスミド 4 種(D316A,D316N,D338A,D338N)を構築した。常法にて無細胞合成を行い、合成反
応液に、5 倍量の 1mM CaCl2 を含む 50mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH.3.8)を加え、4℃、1 時間インキュベートした(活性化処理液)。活性は、2μM 基質（Nma-Lys-Pro-Ile-Pro-Arg-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-NH2）を含む 50mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH3.8)に活性化処理液を添加し、25℃で反応を行い、Arg-Phe 間の加水分
解により生じる蛍光強度の増加より算出した。熱安定性は、各活性化処理液を50℃から 90℃まで 5℃ごとにそれぞれ 10 分間熱処理した後の残存活性より評価した。
【結果と考察】ウェスタンブロット解析から、活性化処理により野生型、変異型
クマモリシンが成熟型へと移行したことと、活性測定より成熟型クマモリシンが活性を有することを確認した。熱安定性の評価より、野生型は 80℃まで活性の低下が認められなかった。一方、D316A,D316N,D338N は 75℃、D338A は70℃まで安定であり、熱安定性の低下が見られた。これらのことから、カルシ
ウム結合部位における Asp がクマモリシンの熱安定性に寄与していることが分
かった。

【目的】
脱石油依存社会を可能にする新規なエチレン製造法を確立するため、我々は二酸化炭素から光合成的にエチレンを生産するシアノバクテリアを構築した。すなわち、植物由来の 1-アミノシクロプロパン-l-カルボン酸(ACC)合成酵素(ACS)および ACC 酸化酵素(ACO)を複合体化させ、Ethylenome とし、これをシアノバ
クテリアへ導入した結果、本細菌はバイオエチレンを 3.4 nl/ml/O.D.730/h の効率で生産した 。さらなるバイオエチレン生産効率の向上を目的として、①基質 Sアデノシルメチオニン(SAM)供給量を増やすため、SAM 合成酵素(SAMS)を、②メチルチオアデノシン(MTA)による ACS の活性阻害を回避させるため、MTA
ヌクレオシダーゼ(MTAN)を、それぞれ Ethylenome へ導入したので、その成果を報告する。
【方法および結果】① Arabidopsis thaliana 由来 cDNA クローンから MTAN 遺伝子を、Clostridium
josui ゲノム DNA から Cel8A 由来ドックリン遺伝子を、それぞれ PCR 法で増幅させ、これらを融合させたキメラサブユニット AtMTAN-Cjdoc を構築した。②
Streptomyces avermitilis ゲ ノ ム DNA か ら SAMS 遺 伝 子 を 、 Clostridium
thermocellum ゲノム DNA から CipA 由来タイプ II ドックリン遺伝子を、それぞれ PCR 法で増幅させ、これらを融合させたキメラサブユニット SaSAMS-CtdocIIを構築した。③ ①、②で得たキメラサブユニットを保持する 2 種のキメラ骨格
タンパク質、Cip3C および Cip4、をそれぞれ構築した。①～③で構成される
Ethylenome による、シアノバクテリアのバイオエチレン生産効率、およびこれ
ら組換え体の CO2 固定化能をガスクロマトグラフィーで定量したので、その詳細を報告する。

Mutational analysis of the calcium ion binding site of kumamolisin

Improved enzyme complex expression for higher bio-ethylene production bya cyanobacterium○Yuuta Sugama1, Hiroshi Oyama2, Masaaki Ito1
(1Nati.Inst.Technol.,Okinawa.Coll., 2Sch.Sci.Technol.,Setunan Univ.)

Key words
Kumamolisin, Calcium binding site, Aspartic acid, Cell-free protein
synthesis system○Sadanari Jindou1, Mai Hayashi2, Akifumi Hosoda2, Hiroto Tamura2(1Fac. Sci. Technol., Meijo Univ., 2Fac. Agric., Meijo Univ.)

Key words

ethylene, cellulosome, Synechococcus

290

酵素学，酵素工学

3P-1p045 ジアホラーゼ内包硫化カドミウムナノ粒子の作製と水系/非水系における特性評価

3P-1p047 Pseudomonas nitroreducens 由来 γ-グルタミルトランス
ペプチダーゼの構造と機能に関する研究○安田 信幸, 油井 信弘, 阿部 克也（工学院大・先進工・生化）
bt10335@ns.kogakuin.ac.jp○佐野 千晴, 岡住 脩平, 今岡 大士, 若山 守
（立命館大院・生命科学）
wakayama@sk.ritsumei.ac.jp【目的】生体分子とナノ材料をハイブリットすると単体とは異なるユニークな特性を示す。近年、このようなナノバイオテクノロジーが環境や医療分野、新規触媒等に応用されている。これらは一般的に生体分子をナノ材料表面へ修飾する方法を用いる。一方、ナノ材料に酵素を内包した場合、従来とは異なる特性を示す可能性がある。本報告では逆ミセル法によりジアホラーゼ内包硫化カド
ミウムナノ粒子(DA-CdSNP)の作製を試み、CdSNP に内包された酵素の特性を
水系/非水系における触媒活性により評価した結果を述べる。
【方法】常温常圧下で逆ミセル法により DA-CdSNP を作製し、その表面に 2-ジメチルアミノエタンチオールで正電荷処理を施した(DA-CdSNP-N ＋)。形成した粒子は粉末 X 線回折(XRD)を用いて解析した。DA-CdSNP-N ＋ の触媒活性はNADH あるいは BNAH の光酸化反応により評価した。反応系は 25℃に制御し、リン酸緩衝液中で光照射サイクル(Dark/Light)において反応液を経時的に回収し、NADH あるいは BNAH の減少を分光学的に測定した。また、DA の酵素阻害剤(Warfarin)を用いることで DA-CdSNP-N ＋の触媒活性を評価した。
【結果と考察】得られた黄色粉末は、XRD パターンより立方晶の CdS からなるナノ粒子であることが分かった。作製した CdSNP-N ＋は水系において NADH の酸化は光依存性を示し、DA を内包した場合に酸化率は約 26％向上した。また
DA-CdSNP-N ＋の触媒活性について、熱処理による影響は見られず、DA の阻害剤の添加による低下が見られたことから、CdSNP に内包された DA は構造的に安定であり、活性部位が基質と親和できる位置で存在していることが示唆された。

【目的】γ-グルタミルトランスペプチダーゼ（GGT）は、細菌から哺乳類に至る
多くの生物が有する酵素であり、γ-グルタミル化合物の γ-グルタミル基を他のアミノ酸やペプチドなどの γ-グルタミル基受容体へ転移する反応と、γ-グルタ
ミル化合物の加水分解を触媒する。本研究では、テアニンの合成に優れ、既報の GGT とは異なる特性を示す Pseudomonas nitroreducens 由来の GGT（PnGGT）に着目した。この酵素の反応特性に関わるアミノ酸残基を、PnGGT の立体構造に基づき、W385、F417 および W525 と推定した。本研究では、W385、F417 お
よび W525 における変異型酵素を作製し、より詳細な反応特性を解析することを目的とした。
【方法および結果】１アミノ酸変異型である W385T、F417Y および W525A、2
アミノ酸変異型である W385T&F417Y および F417Y&W525A、そして 3 アミノ酸変異型である W385T&F417Y&W525A を作製後、それぞれ精製を行い酵素の単一化に至った。活性測定の結果、全変異型酵素において野生型酵素と比較す
ると加水分解活性が減少し、転移活性が増大した。また、酵素活性への金属イオンの影響も野生型酵素と各変異型酵素では異なるものであった。さらに基質の立体選択性を比較したところ、W525A のみ野生型酵素や他の変異型酵素とは異なる性質を示した。基質認識における W525 の役割をより詳細に検討するため、W525A に加えて W525G、W525V を作製し、活性測定や基質特異性の比較を行ったところ、これら 3 種類の変異型酵素は互いに似た性質を示した。現在
さらに W525 における変異型酵素を作製し、諸性質の検討を行っている。

Development of a novel enzyme-CdS nanoparticle hybrid system

Structure and characteristic of γ-glutamyltranspeptidase from Pseudomonas○Nobuyuki Yasuda, Nobuhiro Aburai, Katsuya Abe(Dept. Chem. Life Sci., Sch. Adv. Eng., Kogakuin Univ.)

nitroreducens○Chiharu Sano, Shuhei Okazumi, Masashi Imaoka, Mamoru Wakayama(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words
CdS nanoparticles, enzyme-semiconductor hybrid, photocatalyst,
NADH oxidation

Key words

3P-1p046 D-erythro-3-ヒドロキシアスパラギン酸デヒドラターゼ

3P-1p048 Exiguobacterium acetylicum 由来ポリ乳酸分解活性を有の機能解析および光学分割への応用

するプロテアーゼの精製と諸特性解析○柴野 可菜, 長野 弘幸, 横田 篤, 和田 大
（北大院・農・微生物生理学）
wada@chem.agr.hokudai.ac.jp【背景・目的】アスパラギン酸アナログである 3-ヒドロキシアスパラギン酸（HA）
は分子内に 2 つの不斉炭素を持ち、4 種の光学異性体（D-threo-HA、L-threoHA、D-erythro-HA、L-erythro-HA）が存在する。我々はこれまでに報告のなかった D-erythro-HA を分解する酵素 D-erythro-HA デヒドラターゼ（D-EHA DH）を
Pseudomonas sp. N99 より発見し、様々な生化学的な解析を行ってきた。しかし類縁酵素との触媒特性の比較が不十分でありこの解明を第一の目的とした。また、神経生理学分野においては長い間 L-threo-HA が注目されていたが、近年
L-erythro-HA が真核生物のセリンラセマーゼを阻害すると判明し、高次脳機能解明のため光学的に純粋な L-erythro-HA が必要とされている。有機合成法による立体選択的合成は困難であるが、本酵素の基質特異性の高さから、酵素的光学分割法を用いればこれが可能になると考えられた。そこで、本酵素を用いて光学活性な HA を調製することを第二の目的とした。
【方法・結果】D-EHA DH をコードする遺伝子を大腸菌において高発現させ、精製タンパク質を調製し触媒特性の比較を行った。その結果、本酵素の主反応
は L-threo-HA と D-erythro-HA に対するデヒドラターゼ反応である一方、微弱ながら類縁酵素から予測される L-セリンへのデヒドラターゼ活性も示した。次に 精 製 D-EHA DH を 、 DL-threo-HA お よ び DL-erythro-HA に 作 用 さ せ 、 Dthreo-HA と L-erythro-HA をそれぞれ調製したところ、理論最大収率 50%に対しそれぞれ単離収率 37.4%、35.1%で両異性体を取得した。これら異性体の光学純
度は HPLC により、化学純度は 1H-および 13C-NMR により確認した。この結果、既報 1 と合わせて 4 種類の HA 異性体を酵素的光学分割法により調製することが可能となった。

gamma-glutamyltranspeptidase, mutants, substrate specificity○田所 花菜, 杉森 大助（福島大院・理工）
sugimori@sss.fukushima-u.ac.jp【背景・目的】ポリ乳酸 (PLA)は生分解性プラスチックであるものの、環境中における分解性は決して高いとは言えない。さらに、分別回収やマテリアルリサ
イクルコストの面でも課題があり、PLA の約 8 割が焼却処分されている現状にあ る 。 我 々 は 、 常 温 で PLA 分 解 活 性 が 極 め て 高 い グ ラ ム 陽 性 細 菌
Exiguobacterium acetylicum Z153-3 株を見出した。そこで本研究では、PLA のバ
イオリサイクル法の開発を目指し、PLA 分解酵素の精製と諸特性解析を行った。
【方法・結果】Z153-3 株を 28℃、24 h 培養し、遠心分離上清をアセトン粗分画、
カラムクロマトグラフィーにより目的酵素を精製した。精製酵素サンプルを用いて至適温度、pH や阻害剤の影響などの諸特性解析を行った。培養上清 920
mL（約 2 U/mg-protein）から比活性約 370 U/mg-protein のプロテアーゼ活性（基質アゾカゼイン）を有する精製酵素サンプルを得た。SDS-PAGE 分析の結果、本酵素の分子質量は 32 kDa であることがわかった。本酵素は pH 8.2、37℃で最大活性を示した。阻害剤の影響を調べた結果、EDTA、EGTA により失活し、
Ca2+添加により活性が増強したことから本酵素は Ca2+要求性であると考えられる。また、PMSF、TPCK により活性が低下したことから、本酵素はセリンプロ
テアーゼであると推定した。次世代シーケンサーにより Z153-3 株のドラフトゲ
ノムシーケンスの取得が完了し、現在は遺伝子クローニングを行うため本酵素の N 末端および内部アミノ酸配列解析を進めている。

1) Matsumoto Y. et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 99, 7137-7150 (2015).

Functional analysis and utilization of D-erythro-3-hydroxyaspartate
dehydratase○Kana Shibano, Hiroyuki Nagano, Atsushi Yokota, Masaru Wada(Lab. Microbial Physiol., Grad. Sch. Agric., Hokkaido Univ.)

Key words
compound3-hydroxyaspartate, enzyme reaction, asymmetric hydrolysis, chiral

Purification and characterization of PLA-degrading protease from
Exiguobacterium acetylicum○Kana Tadokoro, Daisuke Sugimori(Grad. Sch. Symbio. Sys. Sci. Tech., Fukushima Univ.)

Key words

Exiguobacterium acetylicum, protease, purification, characterization酵素学，酵素工学

3P-1p049 Synechocystis sp. PCC 6803 由来のホスホエノールピル
ビン酸カルボキシラーゼの精製と特徴

291

3P-1p051 ジペプチド Val-Gly 合成能を有する L-アミノ酸エステ
ラーゼのクローニングと精製および諸性質の検討○竹屋 壮浩, 小山内 崇（明治大・農）tosanai@meiji.ac.jp○田中 貴大 1, 高木 一好 2, 若山 守 1（1立命館大院・生命科学・生工, 2立命館大院・生命科学・応化）
wakayama@sk.ritsumei.ac.jp

Synechocystis sp. PCC 6803 は、酸素発生型光合成の単細胞藻類である。形質転換の容易さ、増殖の迅速さなどの多くの特徴を有することから、光合成研究のモデル生物として広く利用される藻類である。
最近、地球温暖化や食糧問題の解決の一助として藻類が注目を集めている。なぜなら藻類は炭酸固定と有機資源の再生という二役をひとつの系の中で果たし、その過程で必要とされるものは無尽蔵ともいえる太陽光や二酸化炭素のみであるからだ。例えば、藻類はとうもろこしよりも約 700 倍のオイル生産効率があり、将来のエネルギー資源として高い評価を得ている。したがって藻類の炭素代謝を理解することは、基礎・応用研究の両分野において、非常に重要なことである。
Synechocystis sp. PCC 6803 が 有 す る 炭 酸 固 定 酵 素 に Phosphoenolpyruvatecarboxylase (PEPC)がある。PEPC は、ホスホエノールピルビン酸(PEP)と炭酸水
素イオンから、オキサロ酢酸と無機リン酸を発生させる反応を触媒する。生理学的に PEPC は、解糖系で生じた PEP に炭素を固定して TCA 酸回路にオキザ
ロ酢酸を供給するという役割をしている。特にラン藻では本酵素のアナプレロ
ティックな役割が重要となる、なぜならラン藻の TCA 酸回路は不完全(α ケト
グルタル酸デヒドロゲナーゼとスクシニル COA シンセターゼの欠損)であると知られており、代謝エネルギーが TCA 回路の回転によっては再供給されないからである。
PEPC はラン藻が行う炭酸固定の 20~25%を行い、また PEPC は動力学的に最も効率の良い酵素であることから、PEPC がラン藻の炭素代謝に非常に重要であることが分かる。それにも関わらず、その特徴はこれまでにほとんど明らかにされてこなかった。この発表は Synechocystis sp. PCC 6803 由来 PEPC の特徴を解明することにより、Synechocystis sp. PCC 6803 の代謝の理解に貢献するものとなるだろう。

【目的】 γ-Glu-Val-Gly は非常に高活性なコク味物質であり、食品添加物や調味料として有用なトリペプチドであるが、酵素合成基質であるジペプチド Val-Glyを効率的に合成する方法が確立されておらず、広く普及するに至っていない。
そこで、本研究では、L-アミノ酸エステラーゼにより、バリンのメチルエステ
ルとグリシンから、効率的に Val-Gly を合成する方法を確立することを目的とした。我々はこれまでに、土壌微生物のスクリーニングを行い、Elizabethkingia
sp. TT1 由来 L-アミノ酸エステラーゼ(TT1LAE)が高い Val-Gly 合成能を持つことを見出した。今回は、TT1LAE のクローニングおよび精製と諸性質を検討したことを報告する。
【方法・結果】Elizabethkingia sp. BM10 由来 Cocaine esterase からプライマーを設計し、Elizabethkingia sp. TT1 のゲノムより PCR によって目的遺伝子の増幅を行った。シークエンス解析の結果、取得した遺伝子のアミノ酸配列と既報の Lアミノ酸エステラーゼのアミノ酸配列に高い相同性(70%)が確認されたため、
TT1LAE 遺伝子の取得に成功したと判断した。そこで、TT1LAE 遺伝子を
pET22b(+)ベクターに組込み、大腸菌 Rosetta-gami B(DE3)株に導入した。さらに、陰イオン交換、陽イオン交換、疎水性クロマトグラフィーにより、酵素の精製を行った。最終精製酵素は、精製倍率 69.1 倍、比活性 26.67μmol/min/mg(60mM バリンメチルエステル、500 mM グリシン、25℃、pH 9.0、30 分反応)を示した。本酵素の至適 pH は 9.0、至適温度は 25℃、安定温度は 25℃~40℃、安定pH は 5.0~9.0 であった。

Purification and Characterization of Phosphoenolpyruvate Carboxylasefrom Synechocystis sp. PCC 6803

Gene cloning, purification and characterization of L-amino acid esterase
catalyzing synthesis of dipeptide Val-Gly○Masahiro Takeya, Takashi Osanai(Sch. Agric., Meiji Univ.)

Key words

enzyme purification, enzyme activity, enzyme inhibitors

3P-1p050 Flavobacterium aquatile 由来 β-1,3-oligoglucan
phosphorylase 遺伝子の発現○Takahiro Tanaka1, Kazuyoshi Takagi2, Mamoru Wakayama1(1Biotechnol., Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Applied. Chem., Grad. Sch.
Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words

dipeptide, Val-Gly, L-amino acid esterase, gene cloning

3P-1p052 ジペプチド Trp-His 合成能を有する L-アミノ酸エステ
ラーゼの精製と諸性質の検討○中越 麻里菜, 谷 修治, 炭谷 順一, 川口 剛司（阪府大院・生環科・応生科）
takashi@biochem.osakafu-u.ac.jp○牧 慶子 1, 田中 貴大 1, 高木 一好 2, 若山 守 1（1立命館大院・生命科学・生工, 2立命館大院・生命科学・応化）
sb0032si@ed.ritsumei.ac.jp【背景と目的】グルコース (Glc) が β-1,3 結合したオリゴ糖 (ラミナリオリゴ糖，LO) には様々な生理活性が認められており，安価な合成法が望まれている。本
研究では，LO を酵素的に合成する方法としてホスリラーゼに注目した。β-1,3グルカンに作用するホスホリラーゼとして一般的に知られている Laminaribiose
phosphorylase (LBP) は ラ ミ ナ リ ビ オ ー ス (Lam2) に ， β-1,3-oligoglucan
phosphorylase (LOP) は三糖以上の LO に対する加リン酸分解とその逆反応を触媒する酵素である。
Euglena gracilis Z 由来の LOP (EgLOP) は LBP 活性を有する LOP であることか
ら単独で安価な Glc からの LO 合成が期待できるが，安定性に問題がある。最近，当研究室において EgLOP をコードする遺伝子が同定された。EgLOP の推定されるアミノ酸配列は既知のホスホリラーゼとの相同性を示さなかったが，存在が推定されている機能未同定のタンパク質群と相同性が確認された。そこで本研究では，Flavobacterium aquatile に見出した EgLOP オルソログについて
大腸菌を用いて異種発現を行い，発現産物の機能解析を行うことを目的とした。
【方法と結果】F. aquatile から PCR により目的遺伝子を取得した。C 末端側にHis-tag が付加されるよう構築した発現プラスミドを用いて大腸菌 BL21 (DE3)株を形質転換し培養することで目的遺伝子が可溶性タンパク質として発現した。
無細胞抽出液を用いて，リン酸存在下で LO を加リン酸分解すること，α-D-グ
ルコース-1-リン酸の存在下で Glc，Lam2 から脱リン酸合成を行うことを TLC
により確認した。アフィニティ精製を行った発現産物について糖受容体特異性を検討したところ，Glc に対する Lam2 からの脱リン酸合成活性は 86%であり，本酵素が Glc と Lam2 に対して同程度の糖受容体特異性を有することが明らかとなった。

[目的] Trp-His は細胞内の Ca2+濃度を調節する Ca2+チャネルブロッカーであり、唯一の血管拡張作用ジペプチドとして、アテローム性動脈硬化の発症を防止する。これまでにテトラペプチド Lys-Arg-Glu-Ser の抗アテローム性動脈硬化に関する研究が報告されているが、トリペプチドより長いペプチド鎖は、小腸の上皮細胞の粘膜に吸収されない。一般的なアテローム性動脈硬化治療薬である
Ca2+チャネル拮抗薬では心臓疾患が忌避されるが、Trp-His は併発していても使用可能である。Trp-His が非常に高価であることから、健康食品や医薬品への利用が進みにくいのが現状である。そこで本研究では、L-アミノ酸エステラーゼを用いて Trp-OMe および His から Trp-His の効率的な酵素的合成の確立を目的とし、土壌中から合成能を有する L-アミノ酸エステラーゼを生産する菌のスクリーニング、菌の同定、酵素の生産条件及び酵素の精製について検討を行った。
[方法・結果] 比色法および HPLC を用い、日本各地の土壌より、Trp-His 合成能を有する微生物のスクリーニングを行った。その結果、単離・同定した 8 種類の菌株のうち、Pseudomonas sp. KM1 に最も強い活性が見られた。Pseudomonas
sp. KM1 の菌体より、陰イオン交換、疎水性、アフィニティークロマトグラ
フィーを用いて L-アミノ酸エステラーゼを精製した。最終精製酵素は、精製倍率 176 倍、比活性 1.33 μmol/min/mg(50 mM トリプトファンメチルエステル、300mM ヒスチジン、40℃、pH 9.0、60 分反応)を示した。本酵素の至適 pH は 10.0、至適温度は 40℃、安定温度は 30℃~40℃、安定 pH は 9.0~10.0 となり、Ag ＋よって反応が阻害された。

Expression of β-1,3-oligoglucan phosphorylase gene from Flavobacterium
aquatile

Purification and characterization of L-amino acid esterase catalyzing
synthesis of dipeptide Trp-His○Marina Nakagoshi, Shuji Tani, Jun-ichi Sumitani, Takashi Kawaguchi(Dep. Appl. Life Sci., Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Key words

Flavobacterium, phosphorylase, laminaribiose, laminarioligosaccharide○Keiko Maki1, Takahiro Tanaka1, Kazuyosi Takagi2, Mamoru Wakayama1(1Biotechnol., Graduate School of Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Applied. Chem.,
Graduate School of Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words

dipeptide, Trp-His, L-amino acid esterase, purification

292

酵素学，酵素工学

3P-1p053 L-アミノ酸エステラーゼによるイミダゾールペプチドの3P-1p055 糸状菌および放線菌由来 GH134 に属する β-1,4-マンナ○小塩 茂々子 1, 高木 一好 2, 若山 守 1（1立命館大院・生命科学・生工, 2立命館大院・生命科学・応化）
wakayama@sk.ritsumei.ac.jp○木本 紗蘭 1, 酒井 杏匠 1, 新沢 祐大 1, 嶺澤 美帆 1, 山田 みゆき 1,
望月 麻衣 1, 神藤 定生 2, 志水 元亨 1, 加藤 雅士 1
（1名城大・農, 2名城大・理工）
masharan0206@gmail.com【背景と目的】イミダゾールペプチドとは、イミダゾール基を含むペプチドのことであり、本研究では、カルノシン(β-アラニルヒスチジン)及びホモカルノシン(GABA-ヒスチジン)に注目した。カルノシンは、哺乳動物の筋肉や脳、心臓中に多く存在しており、抗酸化作用や疲労回復効果、抗老化作用を有している。
ホモカルノシンは、哺乳動物の骨格筋や脳、脳髄液中に存在しており、抗酸化剤や神経伝達物質、金属キレート剤としての機能を有している。イミダゾール
ペプチドの既知の生産法では、食料との競合や、低い合成効率といった欠点がある。そこで、本研究では、L-アミノ酸エステラーゼにより β-アラニンのメチ
ルエステルもしくは γ-アミノ酪酸のメチルエステルとヒスチジンからそれぞれ
カルノシンとホモカルノシンを酵素合成する方法を確立することを目的とし、土壌からイミダゾールペプチド合成能を有する L-アミノ酸エステラーゼを生産する菌のスクリーニング、菌の同定、及びイミダゾールペプチドの生産性について検討を行った。
【方法と結果】比色法、および HPLC を用い、日本各地の土壌よりイミダゾー
ルペプチド合成能を有する微生物のスクリーニングを行った。その結果、単離した菌株のうち、Chryseobacterium 属菌の一種に最も高い合成活性が見られた。
Chryseobacterium sp. MK-4 由来の L-アミノ酸エステラーゼにおける合成活性は、ホモカルノシンよりもカルノシンの方が高かった。最適培地は、炭素源として
D-グルコース、窒素源として硫酸アンモニウムを用いた場合だった。また、最適反応条件は、温度は 25℃、pH は 9.5 になった。

【背景と目的】
我々は、β-マンナンを唯一の炭素源とした際に糸状菌 Aspergillus nidulans が細胞外に分泌する新規 GH ファミリー 134 に分類される β-1,4-マンナナーゼ(AnMan134A) を発見した。本酵素は Glycoside Hydrolase (GH) ファミリー 5(GH5) および GH26 に属する既知の β-1,4-マンナナーゼのみならず、既知の糖質
加水分解酵素と全く相同性を有していないために、AnMan134A の立体構造および活性部位残基については推定できなかった。また、GH134 に属するタンパ
ク質は植物病原菌を含む糸状菌および放線菌の一部にのみ分布していた。本研
究では、AnMan134A および糸状菌 A. oryzae、放線菌 Streptomyces sp. が有する
AnMan134A オルソログ (それぞれ AoMan134A, StMan134A) の機能を解析した。
さらに、GH134 で高度に保存されているアミノ酸残基を選抜して部位特異的変異を導入することで、AnMan134A の活性に必要なアミノ酸残基を探索した。
【方法と結果】
AnMan134A および AnMan134A オルソログのリコンビナントタンパク質を異種発現させ調製した。それぞれの基質特異性を解析したところ、AoMan134A(AnMan134A と identity 70％) および StMan134A (AnMan134A と identity 61％)の ど ち ら も β-1,4- マ ン ナ ナ ー ゼ 活 性 を 有 し て い た 。 ま た 、 AnMan134A とAoMan134A を 70~90 ゜ C で 0~120 分間インキュベート後、β-1,4-マンナナーゼ
活性を測定した結果、AnMan134A および AoMan134A どちらも高い熱安定性を有していた。さらに AnMan134A の 9 種類のアミノ酸変異タンパク質を作製したところ、61 番目のグルタミン酸をアラニンに置換した AnMan134A E61A では活性が消失した。このことから、61 番目のグルタミン酸は β-1,4-マンナナー
ゼ活性に必須の残基であることが示唆された。

Enzymatic synthesis of imidazole peptides using L-amino acid esterase

Characterization of novel β-1,4-mannanases and identification of active site
residues of AnMan134A

酵素合成に関する研究○Momoko Koshio1, Kazuyoshi Takagi2, Mamoru Wakayama1(1Biotechnol., Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Applied Chem., Grad. Sch.
Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words

carnosine, homocarnosine, L-amino acid esterase

3P-1p054 糸状菌 Aspergillus nidulans が有する GH134 ファミリーに属する糖質加水分解酵素の生理学的役割の解明○新沢 祐大 1, 酒井 杏匠 1, 木本 紗蘭 1, 嶺澤 美帆 1, 望月 麻衣 1,
神藤 定生 2, 志水 元亨 1, 加藤 雅士 1
（1名城大・農, 2名城大・理工）
n6d1j7@gmail.com【背景・目的】
糸状菌 Aspergillus nidulans を β-マンナンを唯一の炭素源として生育させると、細胞外に Glycoside Hydrolase family 5 (GH5) および GH26 に属する β-1,4-マンナ
ナーゼが生産されることが知られている。これまでに我々は、これらの酵素と全く相同性を有さない新規 GH family 134 に分類される β-1,4-マンナナーゼ(Man134A) を見出した。さらに、A. nidulans のゲノム中には Man134A と 50%以上の相同性を有する遺伝子が Man134A の他に 2 種類存在していた。本研究では、Man134A および 2 種類のパラログ (Man134B、Man134C) の機能および生理学的な役割を解明することを目的とした。
【方法・結果】
Man134A およびそのパラログである Man134B および Man134C (Man134A との
identity がそれぞれ 71%, 54%) のリコンビナントタンパク質を大腸菌にて異種発現させ精製した。β-マンナンおよび他の多糖類（セルロース、キシラン、キチンなど）と反応後、TLC および HPLC にて反応生成物を分析することで基質特異性を解析した。その結果、Man134B および Man134C はどちらも β-1,4-マンナ
ナーゼ活性を有していたが、Man134A と比較して β-マンナンやマンノオリゴ糖に対する酵素学的パラメーターおよび分解産物の生成パターンは異なっていた。
Man134A の in vivo で の 機 能 を 解 明 す る た め man134A の 遺 伝 子 破 壊 株(Δman134A 株) を作製し、β-マンナンのみを炭素源として生育させたところ、野生株 (WT 株) と比較して Δman134A 株の生育が顕著に低下したことから、
Man134A は、β-マンナンの資化に関与していることが明らかとなった。現在、
man134B および man134C の遺伝子破壊株を作製し表現型を解析することで、それらの生理学的役割についても検討している。

Physiological roles of β-1,4-mannanases belonging to GH134 in Aspergillus

nidulans○Yuta Shinzawa1, Kiyota Sakai1, Saran Kimoto1, Miho Minezawa1,
Mai Mochizuki1, Sadanari Jindou2, Motoyuki Shimizu1, Masashi Kato1(1Meijo Univ., 2Meijo Univ.)

Key words

GH134, Man134B, Man134C, Aspergillus nidulans

ナーゼの機能解析と活性部位残基の探索○Saran Kimoto1, Kiyota Sakai1, Yuta Shinzawa1, Miho Minezawa1,
Miyuki Yamada1, Mai Mochizuki1, Sadanari Jindou2, Motoyuki Shimizu1,
Masashi Kato1(1Meijo Univ., 2Meijo Univ.)

Key words

GH134, beta-1, 4-mannanase, thermostability, active site residues

3P-1p056 好アルカリ性細菌 Cellvibrio sp. WU-0601 由来ネオアガ
ロビオース加水分解酵素の酵素的特徴○渡辺 輝彦, 樫村 佳奈, 桐村 光太郎（早大・先進理工・応化）
kkohtaro@waseda.jp【目的】 ネオアガロビオース(NA2)は保湿性や美白作用を有する機能性二糖であり[1]、ネオアガロビオース生成型の β-アガラーゼによる寒天(アガロース)からの効率的生産が可能である[2]。一方、GH117 に属するネオアガロビオース加水分解酵素(EC 3.2.1.159; NAH)については極めて研究例が少ない。演者らは、非海洋性の好アルカリ性細菌 Cellvibrio sp. WU-0601 由来の NAH を精製して諸性質を検討し、Escherichia coli BL21 (DE3)を宿主として NAH 遺伝子の高発現を可能にしている[3]。本研究では、NAH の基質特異性などの酵素的特徴を明らかにした。
【方法および結果】 E. coli BL21 を宿主として WU-0601 株由来の NAH 遺伝子を組み込んだ E. coli BL21 (DE3)/pNAH を作製し、ヒスチジンタグを付与した組換え His-tagged NAH を研究に利用した。NA2 を基質とした際の当該酵素が触媒する反応の最適温度は 25℃、最適 pH は 6.0 であり、native NAH と同一の性質を示した。また、動力学定数の算出を行い、Km = 5.77 mM, Vmax = 59.9 U/mg と決定した。さらに、当該酵素が NA2 だけでなくネオアガロテトラオース(NA4)とネオアガロヘキサオース(NA6)にも作用することを明らかにした。ネオアガロ
オリゴ糖を基質とした際の加水分解産物を TLC 分析および LC-Q-TOFMS 分析
により同定し、加水分解産物が単糖である 3,6-アンヒドロ-L-ガラクトース(ALG)とアガロオリゴ糖であることを明らかにした。したがって、当該酵素は ALGを認識し、非還元末端の α-1,3 結合を特異的に加水分解する酵素であることが示唆された。
[1] R. Kobayashi, et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, 162-163 (1997).
[2] K. Kirimura, et al., J. Biosci. Bioeng., 87, 436-441 (1999).
[3] 渡辺 輝彦, 他, 2015 年度日本生物工学会大会講演要旨集, p. 105 (2015).

Characterization of a Neoagarobiose Hydrolase from an Alkalophilic
Bacterium Cellvibrio sp. WU-0601○Teruhiko Watanabe, Kana Kashimura, Kohtaro Kirimura(Dept. Appl. Chem., Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words
agarase, Cellvibrio sp. WU-0601, GH117 family enzyme,
neoagarobiose hydrolase酵素学，酵素工学／タンパク質工学

3P-1p057 Aspergillus niger NRRL 328 由来 III 型ポリケタイド合成酵素の機能解析

293

3P-1p059 Selfassembling supramolecular nanostructures createdby de novo extender protein nanobuilding blocks○丸海老 純也, 渡邉 昭太郎, 小林 慶一, 桐村 光太郎（早大・先進理工・応化）
kkohtaro@waseda.jp

Naoya Kobayashi1, Kouichi Inano1, Takaaki Sato1,
Keisuke Miyazawa2, Takeshi Fukuma2, Michael H. Hecht3,○Ryoichi Arai1(1Fac. Textile Sci. Technol., Shinshu Univ., 2Coll. Sci. Eng.,
Kanazawa Univ., 3Dept. of Chem., Princeton Univ.)
rarai@shinshu-u.ac.jp【目的】ポリケタイドはポリフェノールやフラボノイドを代表例とする二次代謝産物であり、ポリケタイド合成酵素 (PKS) による脂肪酸アシル CoA の縮合反応によって合成される。PKS は構造上の違いから 3 つに分類されているが、糸状菌由来の III 型 PKS についての報告例は少ない。本研究では、ゲノム解析株
Aspergillus niger NRRL 328 由来 III 型 PKS ホモログ遺伝子 (An-csyA) を大腸菌を宿主として異種発現させ、組換え An-CsyA を用いて in vitro での機能解析を行った [1]。
【方法および結果】An-CsyA は 52 bp のイントロンを含む 1231 bp から成る。AncsyA の cDNA を大腸菌 Escherichia coli BL21(DE3) を宿主として異種発現させ、His-tag が付加した組換え酵素 (以下、His-tagged An-CsyA) の生産を可能にした。
精製 His-tagged An-CsyA を用い、種々の脂肪酸 acyl-CoA を開始基質、malonylCoA を伸長基質とした in vitro での酵素反応を行った。生成物については HPLC
および LC-Q-TOFMS で分析した。C2-C14 の脂肪酸 acyl-CoA を開始基質とした
場合に生成物が検出され、使用した全ての基質に対して triketide pyrone が検出された。これらに加えて、C2-C10 に対して tetraketide pyrone が、C10-C14 に対して pentaketide resorcinol が検出された。以上より、An-CsyA は A. niger CBS
513.88 由来 III 型 PKS (AnPKS) のアミノ酸配列と 84 %の相同性を示すものの、
基質特異性や生成物が異なることを明らかにした。また、既知の糸状菌由来 III
型 PKS と異なり、An-CsyA は malonyl-CoA を開始基質および伸長基質として利用可能で、さらに acetyl-CoA や acetoacetyl-CoA, malonyl-CoA などの短鎖の脂肪酸 acyl-CoA より tetraketide pyrone を合成した [1]。
[1] K. Kirimura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 473, 1106-1110 (2016).

The design of novel proteins that self-assemble into supramolecular complexes is an
important step in the development of synthetic biology and nanotechnology. Recently,
we designed and created a protein nanobuilding block (PN-Block), WA20-foldon, by
fusing an intermolecularly folded dimeric de novo protein WA20 and a trimeric foldon
domain of T4 phage fibritin (Kobayashi, et al., JACS, 2015). The WA20-foldon formed
several distinctive types of self-assembling nanoarchitectures in multiples of 6-mer (6,12, 18, 24-mer). In this study, to construct self-assembling chain-extended
nanostructures, we designed de novo extender protein nanobuilding blocks (ePNBlocks) as the second series of PN-Blocks. The ePN-Blocks were constructed byfusing tandemly two de novo WA20 proteins with various linkers. The purified ePNBlocks migrated as ladder bands in native PAGE, suggesting that the ePN-Blocks form
several homooligomeric states, probably circular chain structures, in the soluble
fraction. Then, we reconstructed heteromeric complexes from extender and stopper
PN-Blocks by denaturation and refolding. SEC-MALS and SAXS analyses suggestthat the heterocomplexes formed several types of linear chain structures. Moreover,observation by AFM in liquid revealed the heterocomplexes with metal ion further
self-assembled into supramolecular nanostructures on mica surface. These results
suggest that the PN-Block approach using the de novo proteins is a powerful strategy
to create novel self-assembling supramolecular nanostructures.

Functional analysis of a type III polyketide synthase from Aspergillus niger
NRRL 328

Selfassembling supramolecular nanostructures created by de novo extender
protein nanobuilding blocks○Junya Maruebi, Shotaro Watanabe, Keiichi Kobayashi, Kohtaro Kirimura(Dept. Appl. Chem., Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Naoya Kobayashi1, Kouichi Inano1, Takaaki Sato1, Keisuke Miyazawa2,
Takeshi Fukuma2, Michael H. Hecht3, ○Ryoichi Arai1(1Fac. Textile Sci. Technol., Shinshu Univ., 2Coll. Sci. Eng., Kanazawa Univ., 3Dept.
of Chem., Princeton Univ.)

Key words
Aspergillus niger, polyketide synthase, type III, polyketide, pyroneand resorcinol-type

Key words
de novo protein, protein nanobuilding block, supramolecularnanostructure, protein engineering

3P-1p058 嗅覚受容体膜輸送機構の解明に向けた RTP の機能構造

3P-1p060 カイコ由来糖転移酵素 GnTII 及び GalT オルソログの機

解析

能解析

○玉木 良平 1, 福谷 洋介 1, 池上 健太郎 1, 松波 宏明 2,
養王田 正文 1（1農工大院・工, 2デューク大・メディカルセンター）
yohda@cc.tuat.ac.jp○宮下 龍之介 1, 宮崎 剛亜 1,2, 加藤 竜也 1,2, 朴 龍洙 1,2（1静大・創科技院, 2静大・グリーン科技研）
park.enoch@shizuoka.ac.jp

嗅覚は食物や交配相手の発見、捕食者からの逃避など生命活動に重要な役割を担う感覚である。数十万種類存在するといわれる大気中の匂い分子を特異的に識別するのが、嗅神経細胞に発現している嗅覚受容体（Odorant Receptor; OR）
である。7 回膜貫通型の GPCR である OR が匂い分子を特異的に受容し、そのシグナルが脳に伝わることによって、匂いとして感じることができる。多くのOR は Receptor Transporting Protein(RTP)の補助によって細胞膜に局在する。1 回膜貫通型の膜タンパク質である RTP が細胞膜上で OR と相互作用していること、脂質ラフトにおける局在化に関わることが分かっている。しかし RTP の立体構造は未解明であるため、OR との相互作用状態、さらには、RTP による OR
膜輸送の詳細な機構についてはいまだ多くが不明である。
本研究では OR の機能的発現に重要な RTP に注目し、RTP の機能構造解析による OR 膜輸送機構の解明、さらには RTP を利用した新規リガンド検出方法の開発を目指した。今回は RTP の中でも OR の機能的発現に特に寄与する RTP1S を対象に研究を進めた。
RTP1S のタンパク質立体構造解析を行うため RTP1S を大腸菌組換え体で発現させたところ、亜鉛が RTP1S の構造形成に必要であることが明らかとなり、アミノ酸配列からも新規のジンクフィンガー様タンパク質であることが示唆された。
また、HEK293T 細胞に RTP と OR を共発現させ、匂い分子添加の有無における RTP と OR の局在変化を免疫染色で調べた。RTP の細胞膜表層への局在には影響がないことが確認され、OR 活性化後も OR のエンドサイトーシスに影響を受けない可能性が示唆された。現在、分割ルシフェラーゼを利用した RTPOR の相互作用解析、およびそれを利用した匂い分子検出システムの構築を目指しており、その進捗についても報告する予定である。

【目的】カイコで発現させた組換えタンパク質には、哺乳動物細胞で認められる複合型糖鎖ではなく、昆虫特有のパウチマンノース型糖鎖が付加される。カイコで発現させた糖タンパク質を医薬品として利用するためには複合型糖鎖を付加 さ せ る 必 要 が あ る 。 カ イ コ に は 複 合 型 糖 鎖 合 成 に 必 要 な Nacetylglucosaminyltransferase II (GnTII)、β-1,4-galactosyltransferase (GalT)と相同性を有する遺伝子が内在するが、複合型糖鎖が合成されない。本研究では、カイコ内在のそれぞれの遺伝子発現を調べ、GnTII と GalT オルソログについて組換
え酵素の活性測定を行い、複合型糖鎖形成の可能性を追求した。
【方法】1 齢から 5 齢幼虫と蛹から mRNA を抽出し、RT-PCR でそれぞれの遺伝
子発現を確認した。また、カイコ由来 GnTII 及び GalT 遺伝子をそれぞれ BmNPV
バクミドに挿入し、カイコ幼虫で過剰発現させた。カイコ体液から GnTII 及び
GalT を精製後、HPLC 分析のピークから活性測定を行った。
【結果】1 齢から 5 齢幼虫と蛹で GnTII 及び GalT の遺伝子の発現が確認された。
カイコ由来 GalT の活性測定において、GlcNAc-β-pNP と GlcNAcβ (1-3)GalNAcα-pNP をアクセプター基質として反応を行ったところ、UDP-GalNAc からのGalNAc 転移反応が確認された。現在カイコ由来 GnTII の活性確認を行っており、今後カイコ由来 GnTII 及び GalT の詳細な特性を明らかにしていく予定である。

Structural and functional characterization of receptor transporting protein
for elucidation of the olfactory receptor membrane transport mechanism

Characterization of GnTII and GalT ortholog of the silkworm○Tamaki Ryohei1, Yousuke Fukutani1, Kentaro Ikegami1, Hiroaki Matsunami2,
Masafumi Yohda1(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Duke Univ. Medical center)

Key words

receptor, protein interaction, transmembrane domain○Ryunosuke Miyashita1, Takatsugu Miyazaki1,2, Tatsuya Kato1,2, Enoch Y. Park1,2(1Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci. Technol. Shizuoka
Univ.)

Key words

glycosyltransferase, Bombyx mori, N-glycosylation, ortholog

294

タンパク質工学

3P-1p061 乳酸オキシダーゼのタンパク質工学による基質特異性の改変

3P-1p063 脂肪酸アシル-ACP 還元酵素の in vivo 迅速活性評価法の開発○林 勇樹, 新井 宗仁（東大院・総合文化）hayashi@bio.c.u-tokyo.ac.jp○比留田 美咲, 西矢 芳昭（摂南大院 生命科学）
nishiya@lif.setsunan.ac.jp【目的】Enterococcus 属由来乳酸オキシダーゼ（LoxL）は、乳酸測定用として血液検査やバイオセンサに応用されている。本研究では、LoxL の変異体をデザインすることで、本来反応性の乏しい嵩高い基質に反応する変異酵素の開発を目指す。今回そのような基質として、マンデル酸とグリセリン酸を取り上げることとした。本改変が成功すれば、医薬品原料の光学分割法による生成や分析分野に貢献できる可能性がある。
【方法及び結果】Aerococcus viridans 由来乳酸オキシダーゼ（LoxA）の構造を基に、ホモロジーモデリングを行うことで、LoxL の立体構造を構築した。そして、マンデル酸とのドッキングを行うことにより、野生型 LoxL とマンデル酸との間に生じる立体障害を確認した。この立体障害を軽減すると予想される単変異（A88G、Y117A）、二重変異（M2:A88G+Y117A）、および三重変異（M2+V206Aなど）をデザインした。Inverse PCR により各変異体を作成し、精製後、L-乳酸
に対するマンデル酸、グリセリン酸の活性比率及び比活性を求めた。その結果、野生型ではマンデル酸の活性比率が検出限界以下であり、嵩高い基質に対する反応性は著しく低いことが実証された。一方、二重変異では活性比率が約 1.9、三重変異 M2+Y207V では約 9.5 と著しく高まった。このことから、活性部位周辺のポケットを広げ、嵩高い基質との立体障害を軽減する程、マンデル酸の L乳酸に対する活性比率が大幅に増加する傾向が分かった。また、グリセリン酸の L-乳酸に対する活性比率も同様の傾向が見られ、二重変異では野生型の約 12倍、三重変異 M2+Y207V では約 36 倍向上した。
【結論】以上の結果より、嵩高い基質に対してより高い反応性を示す新たな変異体を作成することに成功した。今後は、反応速度定数を求めてさらなる改変および応用に繋げたい。

微生物が生成するアルカン（軽油相当）は、バイオ燃料の候補として注目を集めている。2010 年に藻類でアルカン合成を担う 2 つの酵素、脂肪酸アシル ACP
還元酵素（AAR）とアルデヒド脱ホルミル化酸化酵素（AD）が同定された。
AAR は脂肪酸合成経路の代謝産物である脂肪酸アシル ACP を基質として脂肪酸アルデヒドを生成し、AD がこれをアルカンへと変換する。しかし、AAR の活性は非常に低いため、微生物を利用したアルカン生産を実用化するためには
AAR の高活性化が必要である。
タンパク質の高活性化を行う手法として、進化分子工学があげられる。進化分
子工学は、変異と選択を繰り返すことにより、目的の機能を有するタンパク質を創出する手法である。通常、AAR の活性を測定するためには、大腸菌内でAAR と AD を共発現し、生成された不安定なアルデヒドを AD により安定なア
ルカンへと変換後、大腸菌培養液を超音波破砕し、細胞破砕液に含まれるアルカンを有機溶媒で抽出して、ガスクロマトグラフ質量分析計（GC-MS）によりアルカンの定量分析を行っている。しかし、この方法では 1 つの変異体の活性を調べるために、多段階のプロセスを経るため多くの時間と労力を要する。そこで本研究では、大腸菌培養液の状態で、菌体内で発現した 103 種以上の変異
型 AAR の活性を発光強度として評価できる系を構築した。この系では、大腸菌内で AAR とともにバクテリアルシフェラーゼ（BL）を共発現する。発現した AAR によって脂肪酸アルデヒドが生成されるが、共発現した BL によって脂肪酸アルデヒドが脂肪酸へと変換される際に生物発光が起きる。そのため、大腸菌の発光強度から、AAR の活性を評価できる。ポスター発表では、本評価法の構築に向けた条件検討と、本評価法による野生型 AAR と変異体 AAR の活性比較の結果について議論する。

Improvement of the substrate specificity of a lactate oxidase by protein
engineering

Development of a high-throughput method to evaluate the in vivo activity of
Acylan acyl-(acyl-ACP) reductase○Misaki Hiruta, Yoshiaki Nishiya(Life Sci,Setsunan Univ.)

Key words
engineeringlactate oxidase, substrate specificity, homology modeling, protein

3P-1p062 N 末端蛍光標識抗体プローブを用いた抗原の蛍光検出○福永 圭佑 1, 渡邉 貴嘉 1, Novitasari Dian 1, 阿部 亮二 2,
大橋 広行 2, 芳坂 貴弘 1
（1北陸先端大・マテリアル, 2ウシオ電機）
hohsaka@jaist.ac.jp○Yuuki Hayashi, Munehito Arai
(Grad. Sch. Arts Sci., Univ. Tokyo)

Key words
evolutionacyl-ACP reductase, alkane biosynthesis, bacterial luciferase, directed

3P-1p064 シグナル伝達分子の特異的活性化を目的とした新規受容体の開発○Kongkrongtong Tatphon, 長棟 輝行, 河原 正浩（東大院・工）kawahara@bio.t.u-tokyo.ac.jp

一本鎖抗体 scFv の N 末端領域に TAMRA などを持つ蛍光非天然アミノ酸を導入することで蛍光基が scFv 内部のトリプトファン残基による消光を受ける一方、抗原結合に伴って蛍光消光が解消され、その結果、溶液中の抗原を蛍光強度の変化として定量的に検出できるという知見が報告されている（J. Am. Chem.
Soc. 133, 17386 (2011); Bull. Chem. Soc. Jpn. 89, 573 (2016); J. Biosci. Bioeng., inpress）。しかしながら、遺伝暗号拡張技術を用いた蛍光アミノ酸の導入には無細胞タンパク質合成系を用いた多段階の実験操作が必要とされ、またタンパク
質の合成量が少ないという問題があった。このため、N 末端蛍光標識抗体を簡便に作製する新規技術の開発が望まれている。
そこで我々は、市販のモノクローナル IgG の N 末端 α-アミノ基を選択的に蛍光標識することで抗原依存的な蛍光増強を示す蛍光標識 IgG の新規合成法の開発を試みた。N 末端 α-アミノ基は Lys 側鎖 ε-アミノ基と比べて pKa が低いため、弱酸性バッファー中で蛍光色素アルデヒド誘導体を用いた還元的アルキル化反応を行うことで N 末端選択的な蛍光標識が可能になる。実際に本手法で合成した蛍光標識 IgG の酵素消化物をタンデム質量分析法で解析したところ、蛍光色
素が N 末端 α-アミノ基に付加していることが確認された。さらに、蛍光標識した IgG は抗原濃度依存的な蛍光増強を示し、抗体型蛍光プローブを作製する方法として IgG の N 末端蛍光標識が有効であることが明らかとなった。

【背景と目的】 細胞内シグナル伝達機構においては、膜上の受容体が細胞外からの情報をシグナル伝達分子に伝達し、次々とシグナルを受け渡しながら、最終的に遺伝子の発現を制御することによって細胞運命が決定される。このシグナル伝達パターンを人為的に制御することができれば、シグナル伝達メカニズ
ムの解明や細胞運命の制御等が期待できる。そこで、本研究ではシグナル伝達
分子が結合するチロシン残基とその周囲の数アミノ酸残基（チロシンモチーフ）に着目した。さらに、改変型受容体チロシンキナーゼとチロシンモチーフを融合することで、キナーゼからリン残基を受けたチロシンモチーフが特定のシグ
ナル伝達分子を活性化できると考えた。以上のアイデアを元に、本研究ではシグナル伝達分子を特異的に活性化できる新規受容体の開発を目的とした。
【方法】融合したチロシンモチーフと改変型受容体チロシンキナーゼの N 末端に、リガンド依存的にキナーゼを活性化できるように FKBP を連結したキメラ受容体をコードするプラスミドを構築して、レトロウイルスベクターでマウス
由来 Ba/F3 細胞に導入した。抗生物質選択後、キメラ受容体が発現している細胞をリガンドで 37℃、15 分間刺激した。次に細胞のライセートを調製し、標的シグナル伝達分子の活性化をウエスタンブロッティングで確認した。
【結果と考察】モデルとして STAT1,STAT3 及び STAT5 の結合モチーフをそれぞれ挿入したキメラ受容体において、標的シグナル伝達分子のリン酸化を確認でき、特異的活性化に成功した。今後、オフターゲット効果を検証しつつ、さらにチロシンモチーフを複数個に増やし、二つ以上のシグナル伝達分子を活性化できる受容体を開発していく。

Fluorescence detection of antigens by using N-terminally fluorescent-labeled
antibody probes

Constructing novel chimeric receptors for activating on-target signaling
molecules○Keisuke Fukunaga1, Takayoshi Watanabe1, Dian Novitasari1, Ryoji Abe2,
Hiroyuki Ohashi2, Takahiro Hohsaka1(1Sch. Mater. Sci., JAIST, 2USHIO Inc.)

Key words

antibody, chemical modification, fluorescence spectra○Tatphon Kongkrongtong, Teruyuki Nagamune, Masahiro Kawahara(Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)

Key words

signal transduction, chimeric receptor, c-kit, tyrosine phosphorylation

タンパク質工学

3P-1p065 細胞死シグナルを利用したタンパク質間相互作用阻害分子選択法の開発

295

3P-1p067 CutA1 及び VHH 抗体を利用した高感度バイオセンシン
グシステムのデザイン○江口 晃弘, 長棟 輝行, 河原 正浩（東大院・工）kawahara@bio.t.u-tokyo.ac.jp○伊達 弘輝, 石田 尚之, 今村 維克, 今中 洋行（岡山大院・自科）
imanaka@okayama-u.ac.jp

細胞内ネットワークは、多数のタンパク質間相互作用によって成り立っている。
このため、細胞内ネットワーク解析のための方法としてその相互作用を阻害す
ることは極めて有効である。
そのような阻害分子を選択するために、本研究では、多量体化により細胞死シ
グナルを発する受容体 Fas に注目し、抗原タンパク質を細胞外ドメインに持ち、そこに Fas の細胞内ドメインと、FKBP (F36V)というリガンド依存的に二量体化するタンパク質を融合した細胞死シグナル伝達受容体を作製した。また、抗体として、scFv と FKBP (F36V)を融合した二量体化抗体を作製した。抗原抗体
間に相互作用がある場合、この２つのタンパク質を共発現させた細胞に対して二量体化リガンドを加えると、２つの二量体化ドメインが協調して多量体化し、発現細胞に細胞死シグナルを伝達する。次に、更にこの細胞に対して阻害分子
候補のタンパク質を発現させる。そのタンパク質が抗原抗体相互作用を阻害す
る場合は、細胞死シグナルが伝達されなくなるために細胞の生存が見られ、阻害しない場合は細胞死が誘導される。このようにして、細胞の生存を指標とした阻害分子の選択が可能である。
本系が機能するかを調べる為に、受容体チロシンキナーゼの一種である ErbB2という膜タンパク質を抗原として、また ErbB2 に特異的な scFv を抗体として用いて、リガンド依存的に細胞死が誘導されるかどうかを調べた。その結果、若干ではあるが細胞死を誘導することに成功した。
今後の展望として、細胞死シグナル伝達受容体を発現させることによるバック
グラウンドの細胞死が減少するようにエンジニアリングすることで、細胞死に対して感度の高い細胞集団を保持できる系を探索する。

目的： 生体分子間相互作用の検出技術は，バイオセンサー，薬剤スクリーニン
グや医療診断など幅広く応用されており，バイオ分子の固体表面への固定化技術が重要な基盤要素として挙げられる．我々のグループでは，固体表面への生体分子の機能的固定化技術の開発を進めてきた．本研究では，固定化分子に親
水性ポリスチレン親和性ペプチド(PS-tag)あるいは金表面親和性ペプチド(Au-tag)
をタグとして連結し，固定化の配向を制御する方法に着目した．さらに超好熱菌由来タンパク質 CutA1 を固体表面との相互作用を緩和するクッションタンパ
ク質として利用し，リガンドの固定化後の機能維持ならびに，相互作用検出の高感度化を図ることを目的とした．
方法と結果： 固定化リガンドタンパク質として抗 EGFP の VHH 抗体，親和性
ペプチドとして PS-tag 及び Au-tag , そしてスペーサーとして E/K coiled-coil を用い様々にデザインした各種リガンドバイオ分子の発現・精製を行った．アナ
ライトタンパク質として Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)を用い，PS
表面上では ELA, 金表面上では QCM で相互作用を評価した．その結果，リガン
ドを物理吸着させた場合に比べ，タグの連結により相互作用検出量が向上した．
CutA1 内に VHH を挿入すると更に検出量が向上し，VHH の構造が CutA1 内である程度維持されたと考えられた．また，C 末端に VHH を連結する分子デザ
インを施した結果，相互作用検出量が顕著に向上した．これらの検討を通じて，リガンドと表面との直接的な相互作用を CutA1 が緩和し，リガンドの機能維持が可能であることが示された．

A system to select protein-protein interaction inhibitors utilizing a deathsignalDesign of highly sensitive biosensing system by utilizing CutA1 and VHH
antibody○Akihiro Eguchi, Teruyuki Nagamune, Masahiro Kawahara(Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)

Key words

protein interaction, Cell death, chimeric receptor

3P-1p066 シリカ粒子形成促進タンパク質“グラシン”の機能を利用した GFP のシリカへの固定化○Koki Date, Naoyuki Ishida, Koreyoshi Imamura, Hiroyuki Imanaka(Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Okayama Univ.)

Key words

affinity peptide, immobilization, biosensing, vhh antibody

3P-1p068 アクセサリータンパク質を標的とした抗センダイウイル
ス薬の開発○小林 大起 1, 天野 太郎 2, 有馬 二朗 1, 清水 克彦 3
（1鳥取大・農, 2鳥取大院・農, 3鳥取大産学）
arima@muses.tottori-u.ac.jp○小田 康祐, 的場 康幸, 入江 崇, 坂口 剛正（広大院・医歯薬保健学）
kosuke-81@hiroshima-u.ac.jp【目的】シリカを主成分とする骨格を持つガラスカイメン類カイロウドウケツ
は、その骨格内にシリカ粒子形成促進タンパク質“グラシン”を持つ。グラシン
は、室温、中性 pH 条件下でケイ酸からシリカを形成させる機能を有しており、自信は形成されたシリカに埋め込まれるという性質を持つ。これまでに、組換えグラシンの生産系が構築されたため、本研究では、緑色蛍光タンパク質（GFP）
を使用して、グラシンと有用タンパク質との融合による、有用タンパク質のシ
リカへの固定化の利用可能性を検証した。
【方法】カイロウドウケツの全ゲノム DNA 配列解析により得られたグラシンの遺伝子配列を基に合成した遺伝子、及び緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子を融合させ、グラシン融合 GFP の発現プラスミドを構築した。続いて E. coli Rosetta(DE3)を使用してグラシン融合 GFP を調製した。このグラシン融合 GFP に対して、ケイ酸を混合して GFP のシリカへの固定化を試みた。
【結果】発現させたグラシン融合 GFP の SDS-PAGE の結果、組換えグラシンと比較して発現量の増加が確認された。また、グラシン融合 GFP 溶液にケイ酸を添加すると、組換えグラシンと同等のシリカ形成能を示し、得られたシリカ粒
子からは GFP 特有の蛍光色が観察された。また、もともと GFP のために蛍光色を示していたグラシン融合 GFP 溶液は、シリカ形成後には無色となった。一方で、GFP に対しケイ酸を添加しても、シリカは形成されず、上清も蛍光色のままであった。これらの結果から、GFP はグラシンと融合することで、シリカ粒子近傍に固定化されたと考えられた。現在は、工業的に利用が考えられる酵
素タンパク質をシリカ固定化し、諸性質を検討中である。

【背景と目的】病原ウイルスの多くは、細胞内での増殖や感染性粒子産生のために、宿主因子と結合し、その機能を阻害もしくは利用する。呼吸器疾患の原因であるヒトパラインフルエンザウイルス (hPIV) においては、アクセサリータン
パク質のひとつである C タンパク質が病原因子として知られており、宿主因子
Signal Transducers and Activator of Transcription 1 (STAT1) と結合することで自然免疫を回避する。その一方で、Endosomal Sorting Complexes Required for Transport(ESCRT) 関連因子 Alix と結合すると、細胞膜表面より感染性ウイルス粒子が産生される。最近、当研究グループは、マウス PIV であるセンダイウイルス (SeV)
を用いて、C タンパク質の構造を、X 線結晶構造解析より明らかにした。本研究では、C タンパク質とこれら宿主因子 (STAT1 および Alix) との結合を阻害する化合物を探索し、C タンパク質に対する構造活性相関を明らかにすることで、SeV や hPIV に対する薬剤を開発することを目的とした。
【方法】C タンパク質と STAT1 との間の結合を阻害する化合物を探索するため、それぞれのペプチド末端に蛍光タンパク質を結合させ、蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) を利用したアッセイ法を開発し、バリデーションを実施した。この
アッセイ法を用い、東京大学創薬機構が保有する化合物ライブラリーから、阻害剤をスクリーニングした。
【結果と考察】FRET に基づくアッセイ法は、有色化合物を用いたスクリーニン
グには適さないが、極めて高い精度をもつことから、非有色化合物に対する優れたアッセイ方法であることが示された。また、このスクリーニングにより 20個の候補化合物が得られた。今後は、それぞれの化合物の結合様式を明らかにし、より強力な阻害剤開発を行う予定である。

Application of silica particle formation promoting protein '' Glassin '' toimmobilization of GFP to silica

Development of an anti-Sendai virus drug targeting on the accessary protein○Hiroki Kobayashi1, Taro Amano2, Ziro Arima1, Katsuhiko Shimizu3(1Fac. Agric., Tottori Univ., 2Grad. Sch. Agric., Tottori Univ., 3Org. Reg. Ind. Acad.
Coop., Tottori Univ.)

Key words
aspergillum

immobilization, silica particle formation protein, Euplectella○Kosuke Oda, Yasuyuki Matoba, Takashi Irie, Takemasa Sakaguchi(Grad. Sch. Biomed. Sci., Hiroshima Univ.)

Key words

inhibitor, screening, antivirus

296

発酵生理学，発酵工学

3P-1p069 4-aminocinnamic acid の発酵生産システムの構築○皆川 一, 桝尾 俊介, 周 勝敏, 高谷 直樹（筑波大・生命環境）
takaya.naoki.ge@u.tsukuba.ac.jp

3P-1p071 タンデム酵素反応を利用した S-アルキルシステインス
ルフォキシド生産のためのバイオプロセス開発

日比 慎, ○松岡 智里, 飯星 貴幸, 小園 祥子, 高橋 里美, 小川 順
（京大院・農）ogawa@kais.kyoto-u.ac.jp【背景】芳香族アミンは、色素、医薬品あるいはポリマーの原料などとして広く利用できる産業上有用な化合物である。本研究室では、芳香族アミンの一種である 4-aminophenylalanine (4APhe)の発酵生産及び 4APhe から 4-aminocinnamic
acid (4ACA)へのバイオコンバージョンに成功している。また、この 4ACA を原料として既存のバイオポリマーよりも優れた耐久性及び耐熱性を示す新たなバ
イオポリマーを開発した。本研究では、このバイオポリマーの産業上の利用可能性をさらに高めることを目指して、ジャーファーメンターを用いた大量培養によって 4APhe 及び 4ACA の大量生産を試みた。
【方法・結果】（１）4APhe の発酵生産：Pseudomonas fluorescens 由来 の papABC
遺伝子を高発現させた大腸菌をジャーファーメンターを用いて 100 L スケールで培養したところ、グルコースを原料として 280 g の 4APhe を培養上清中に生産できた。得られた 4APhe を陽イオン交換樹脂に吸着・回収・濃縮することによって、4APhe の結晶（108 g、収率 39％）及び濃縮液（96 g、収率 34％）を得ることができた。
（2）4APhe から 4ACA へのバイオコンバージョン：濃縮液の一部を逆相カラムでさらに精製し、23.4 g の 4APh を得た。これを Rhodotorula
glutinis 由来の Phenylalanine ammonia lyase を高発現させた大腸菌の休止菌体
300 g （湿菌体重量）とジャーファーメンター内で反応させ、反応後の上清中に22.5 g の 4ACA を得た（収率 96％）。さらに、溶媒抽出・再結晶により純度の高い結晶を得ることができた。得られた 4ACA はポリアミドとポリイミドへの重合も可能であった。

ネギ属やアブラナ属の食用植物に著量含まれる S-アルキルシステインやそのス
ルフォキシドは抗酸化・抗肥満・疾病改善作用など多彩な機能性を秘めた含硫アミノ酸である。これらの含硫アミノ酸の産業的な生産法としては植物体からの抽出が挙げられるが、その含有率の低さに起因する高い生産コストや低い純度が問題点である。そこで新規なバイオプロセスによる含硫アミノ酸の産業的な生産法の確立が必要とされる。本研究室で見出した Bacillus thuringiensis 2e2
株由来のジオキシゲナーゼ IDO は、S-アルキルシステインの立体選択的なスルフォキシド化を触媒するが、S-アルキルシステインが原料として高価である点が問題となっている。一方で S-アルキルシステインに関しては、cysteine
desulfhydrase（CD）が触媒する加水分解反応の逆反応の利用によって、ピルビ
ン酸・アンモニア・アルキルメルカプタンから生成可能であるが、その効率は非常に低い（S-アリルシステインの場合で 0.36 mM）。そこで本研究では CD と
IDO のタンデム酵素反応による新たなバイオプロセスを考案した。本バイオプ
ロセスにおいては、まず CD の作用により安価な化合物から S-アルキルシステ
インがキラル合成され、次いで速やかに IDO の作用を受けてキラルスルフォキ
シド化される。通常加水分解側に片寄る CD 反応を、不可逆な IDO 反応と共役することで、本バイオプロセス全体では S-アルキルシステインスルフォキシドの合成側へと反応を進行させることが可能となる。これまでにピルビン酸・ア
ンモニア・アリルメルカプタンを基質としたタンデム酵素反応によって、光学活性 S-アリルシステインスルフォキシド（(+)-alliin）を 11 mM 生産することができた。今後は基質特異性の異なる CD を探索・利用する事で、生産可能な Sアルキルシステインスルフォキシドの分子種多様化を進めていく。

Fermentative production of 4-aminocinnamic acid

Bioprocess development of S-alkyl cysteine sulfoxides by the tandem enzyme
reaction○Hajime Minakawa, Shunsuke Masuo, Shengmin Zhou, Naoki Takaya(Faculty of Life & Environ. Sci., University of Tsukuba)

Key words

aromatic amine, biopolymer, fermentation

3P-1p070 光学活性ジカルボン酸モノアミド生産に有用な新規微生物イミダーゼ

Makoto Hibi, ○Chisato Matsuoka, Takayuki Iihoshi, Shoko Kozono,
Satomi Takahashi, Jun Ogawa(Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)

Key words

cysteine desulfhydrase, dioxygenase, S-alkyl cysteine sulfoxides, alliin

3P-1p072 出芽酵母における褐藻類由来糖質（アルギン酸とマンニ
トール）の代謝機序○間中 千尋, 光川 侑輝, 志澤 宏明, 日比 慎, 高橋 里美, 小川 順
（京大院・農）ogawa@kais.kyoto-u.ac.jp

松岡 史也 1, 柏原 貴幸 1, 平山 誠 1, 田中 秀樹 1, 佐薙 潤季 1,
橋本 渉 1, 村田 幸作 2, ○河井 重幸 1
（1京大院・農, 2摂南大・理工）
kawais@kais.kyoto-u.ac.jp【背景と目的】
光学活性ジカルボン酸モノアミドは医薬品合成において重要なキラル原料として利用されており、その実用的生産法としてイミド代謝酵素を用いたバイオプ
ロセスが検討されてきた。例えば、環状イミドの開環加水分解反応を触媒してジカルボン酸モノアミドを生成する酵素としてイミダーゼが知られている。立
体選択性や部位特異性の高いイミダーゼを利用することで、プロキラルな環状イミドより光学活性ジカルボン酸モノアミドの生産が可能となる。本研究ではイミダーゼを触媒として用いる事で、抗癌剤など複数の医薬品の原料となる
cis-5-norbornene-exo-2,3-dicarboxylic acid monoamide（NDM）の生産法の開発を
目指した。
【結果】
cis-5-norbornene-exo-2,3-dicarboximide（NDI）を基質とするイミダーゼ活性を持った微生物を探索した。約 1,300 株の土壌分離微生物を用いたスクリーニン
グの結果、Mesorhizobium sp. A9-2-3 株において NDI に対するイミダーゼ活性が確認できた。本菌株は立体選択的なイミダーゼ活性を保持しており、最大で97% e.e.の光学活性 NDM を生成することが確認された。また本菌株のイミダー
ゼ活性は培養時に環状イミド化合物を添加することで特異的に誘導発現された。
Mesorhizobium sp. A9-2-3 株の保持するイミダーゼを同定するため、本菌株のドラフトゲノム解析とプロテオーム解析を実施した。誘導時と非誘導時における発現タンパク質の差を比較する事で、N-methylhydantoinase（N-MH）のサブユ
ニットをコードする 2 つの遺伝子が候補として選別された。N-MH の組換え大腸菌を用いた反応において NDI から NDM の生成が確認されたことから、このN-MH が NDI イミダーゼ活性の本体であることが明らかになった。現在、N-MHの詳細な機能解析を目指し、精製酵素を用いた基質特異性や補酵素要求性など
に関して調査を行っている。

海洋バイオマスのうち、藻体が巨大で生育速度も速く著量の糖質（マンニトー
ルと高分子アルギン酸）を含む褐藻類は、広大な海域を有する我が国にとって有望な糖質（微生物発酵の基質）源である。他方、出芽酵母 Saccharomyces
cerevisiae は優良な発酵微生物であるが、そもそも出芽酵母はアルギン酸とマンニトールを資化しない。
我々は、出芽酵母によるアルギン酸とマンニトール代謝に焦点を当てた研究を進めている。マンニトール資化に関しては、出芽酵母が Tup1-Cyc8 コリプレッ
サー遺伝子への自然変異に依存した経路、あるいは非依存経路によりマンニトー
ル資化能を自然に獲得する現象を見出している 1)。また、マンニトール資化に必要な HXT17/DSF1 の強制発現によってもマンニトール資化能を付与できることが報告されている 2)。
アルギン酸代謝に関しては、DEH（エキソ型アルギン酸リアーゼによるアルギン酸の分解産物）の資化に要する４つの遺伝子の出芽酵母ゲノム DNA への導入により、DEH 資化酵母を作出した。HXT17/DSF1 の強制発現によるマンニ
トール資化能の付与法の優位性を確認した上で、本法によりマンニトールとDEH の両方を資化できる株を構築した。さらに、DEH 培地での馴養により、DEH 資化能の増強した Mtl+DEH++株を取得した。他方、Tup1-Cyc8 非依存経路によるマンニトール資化能獲得におけるプリオンの関与も示した。現在、Mtl+DEH++株を用いて、DEH 代謝ならびに DEH 資化能増強（馴養）機序の解明、DEH からエタノール等の生産、エキソ型アルギン酸リアーゼの細胞外発現によるアルギン酸を資化できる出芽酵母株の構築などを目指している。本発表では、
これらに関して現状と課題を報告する。また、プリオンによるマンニトール資化能の獲得にも触れる。

Novel microbial imidase useful for the production of optically active
dicarboxylic acid monoamide

Metabolism of alginate and mannitol, sugars from brown macroalgae, in○Chihiro Kenchu, Yuuki Mitsukawa, Hiroaki Shizawa, Makoto Hibi,
Satomi Takahashi, Jun Ogawa(Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)

Key words

Mesorhizobium sp., N-methylhydantoinase, chiral cyclic monoamide

1)

Appl. Environ. Microbiol. 81:9-16 (2015). 2)Nature 505:239-243 (2014).

Saccharomyces cerevisiae
Fumiya Matsuoka1, Takayuki Kashihara1, Makoto Hirayama1, Hideki Tanaka1,
Hiroki Sanagi1, Wataru Hashimoto1, Kousaku Murata2, ○Shigeyuki Kawai1(1Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 2Fac. Sci. Eng., Setsunan Univ.)
Key words

Saccharomyces cerevisiae, manniol, alginate, prion

発酵生理学，発酵工学

3P-1p073 Effect of fixed-bed bioreactor on higher bio-hydrogenproduction

297

3P-1p075 バイオマスを原料としたフェニルプロパノイドの発酵
生産○Chenyu Zhao, Nan Zhang, Mishma Silvia Stanislaus,
Yingnan Yang
(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)yo.innan.fu@u.tsukuba.ac.jp○佐々倉 有麻 1, 桝尾 俊介 2, 高谷 直樹 2
（1筑波大院・生命環境, 2筑波大）
takaya.naoki.ge@u.tsukuba.ac.jp

Over the last few decades, the rising global warming and crisis of fossil fuels haveincreased the usage of alternative fuels. Hydrogen gas is a clean alternative energy andgenerates only water vapor as by-product of combustion and has drawn attention
worldwide. Biological hydrogen production through anaerobic digestion is an
attractive process because of its environmental-friendly and economical nature.
Nevertheless, it has certain drawbacks like low hydrogen production, availability andcost of substrates. On the other hand, conventional fixed-bed was used in methane
fermentation, which improved the efficiency of methane production effectively.
However, the research about the usage of fixed-bed in the hydrogen fermentation islimited. Therefore, in this study, a series of experiment with three different bedding
materials including loofah sponge (LS), chlorinated polyethylene (CPE) and porous
nylon (PN) and without bedding materials as the control was carried out. Fermentation
was set at pH 5 and 35 °C under anaerobic conditions. As the result, CPE bioreactor
showed the best performance compared to PN, LS and control reactor. Conclusively,
the CPE fixed-bed bioreactor has the capacity to show better performance compared toreactor without fixed-bed and it could be could be a promising system for higher biohydrogen production.

【目的】フェニルアラニンを前駆体として生合成される 2-phenylethanol (2-PE)やcinnamic acid (CA)などの芳香族化合物は香料や医薬品などとして広く利用されている産業上重要な化合物である。これら化成品をバイオマスから生産するバ
イオリファイナリー技術は資源の枯渇や環境問題への対応策として期待される。
そこで、本研究では発現宿主として汎用性の高い Escherichia coli と安全でタン
パク質高分泌能を持つ Aspergillus oryzae とを用いこれらの化合物をバイオマスから生産することを目的とした。
【方法・結果】異種タンパク高生産菌である A. oryzae NSlD-ΔP10 および A. oryzae
AUT1-lD-v10-sD にフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする
Rhodotorula glutinis の PAL 遺伝子を導入した形質転換体を得た。これらをフェニルアラニンを含む培地を用いて培養したところ、最大で 0.12 g/L の CA が培
地中に生産された。同じ A. oryzae 宿主に 2-PE 生合成に関わるフェニルピルビ
ン酸脱炭酸酵素(PPD)をコードする A. oryzae の ppdA を高発現させ、フェニル
アラニンを含む培地で培養した場合には、2-PE の生産はみられなかった。一方、フェニルアラニン生産菌である NST37(DE3)に Saccharomyces cerevisiae の
PPD (ARO10)およびシキミ酸経路に関わる E. coli 由来の aroG と pheA を導入し高発現させ 2-PE 生産菌を得た。さらにこの菌株による 2-PE の生産性を向上させるため、フェニルアラニンの生合成に関わるアミノトランスフェラーゼ遺伝
子の遺伝子破壊株(ΔtyrB, ΔtyrBΔaspC, ΔtyrBΔaspCΔilvE) を作製し培養した。その結果、ΔtyrB 株を用いた場合に最も多くの 2-PE の生産が見られた。この株をジャーファーメンターを用いて流加培養したところ、グルコースを原料として
1.45 g/L の 2-PE を生産することができた。これは、大腸菌を用いた 2-PE 生産としては最大の値であった。

Effect of fixed-bed bioreactor on higher bio-hydrogen production

Fermentative production of phenylpropanoid from biomass○Chenyu Zhao, Nan Zhang, Mishma Silvia Stanislaus, Yingnan Yang
(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

fixed-bed bioreactor, bio-hydrogen production, fermentation

3P-1p074 Semi-continuous anaerobic digestion under illumination
condition for mitigating ammonia inhibition○Yuma Sasakura1, Shunsuke Masuo2, Naoki Takaya2(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Univ. Tsukuba)

Key words

Aspergillus oryzae, Escherichia coli, fermentation, phenylethyl alcohol

3P-1p076 Study on the intermittent illumination to mitigate
ammonia inhibition under mesophilic condition○Nan Zhang, Mishma Silvia Stanislaus, Chenyu Zhao,
Haoyuan Gao, Yingnan Yang
(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)yo.innan.fu@u.tsukuba.ac.jp○Haoyuan Gao, Nan Zhang, Mishma Silvia Stanislaus,
Chenyu Zhao, Yingnan Yang
(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)yo.innan.fu@u.tsukuba.ac.jp

Anaerobic digestion is a promising method to deal with livestock waste. However,ammonia acts as a strong inhibitor during anaerobic digestion. Conventional anaerobic
digesters are operated under dark conditions, but it has been reported that optimal
illumination time on anaerobic reactor activates methanogens efficiently. In ourprevious study, intermittent illumination method proved to be efficient in mitigating
ammonia inhibition with batch operation. Therefore, in this study, a long-term 118-day
semi-continuous anaerobic digestion with illuminated system under ammonium-richcondition was carried out under thermophilic condition (55℃) to discuss the practicaleffect of intermittent illumination on mitigating ammonia inhibition. The results
showed that the illuminated bioreactor achieved higher and more stable methane
concentration and methane yield than dark condition during anaerobic digestion. The
ATP value and microscopic study revealed that illumination improved the activity andthe immobilization ability of the microorganisms, respectively. The results indicatedthat the optimal intermittent process contributed to high efficiency and stability of theammonia-rich anaerobic digestion process with long-term operation.

With the boom of population, the demand for meat is increasing, and the quantity oflivestock waste is also on the rise. Anaerobic digestion is proved to be effective
method to deal with livestock waste. Normally, anaerobic digestion is operated underdark conditions, but some researchers have shown that intermittent illumination for 60
min/d in anaerobic digestion can increase the biogas production significantly.
However, until now, these researches have been carried out only under thermophilic
conditions. Therefore, the objective of this research is to investigate intermittent
illumination in anaerobic digestion under mesophilic condition. Batch experiments
were carried out in fixed bed bioreactor. From the results intermittent illumination
increased the methane production by 20% comparing with control. The ammonia
inhibition could be mitigated effectively with the assistance of intermittent
illumination. Moreover, ATP value of microorganism in bioreactor and VS removal
was higher under intermittent illumination condition. The results indicate that,intermittent illumination of anaerobic digestion was also effective under mesophilic
condition in terms of methane production and mitigation of ammonia inhibition.

Semi-continuous anaerobic digestion under illumination condition for
mitigating ammonia inhibition

Study on the intermittent illumination to mitigate ammonia inhibition undermesophilic condition

Key words
Ammonia inhibition, intermittent illumination, semi-continuous
anaerobic digestion

Key words○Nan Zhang, Mishma Silvia Stanislaus, Chenyu Zhao, Haoyuan Gao,
Yingnan Yang
(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)○Haoyuan Gao, Nan Zhang, Mishma Silvia Stanislaus, Chenyu Zhao,
Yingnan Yang
(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)
Illumination, ammonia inhibition, mesophilic condition

298

発酵生理学，発酵工学／オミクス解析

3P-1p077 Development of bioprocess with designed biomass:

Design of rice straw hydrolysate for efficient butanol
production without carbon catabolite repression

3P-1p079 Widely targeted metabolic profiling for improvement of
1-butanol-producing Synechococcus elongatus○Artnice Mega Fathima1, Walter Lavina1, Sastia Prama Putri1,
James Liao2, Eiichiro Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Dept. Chem. Biomol. Eng., UCLA)
artnicemega@bio.eng.osaka-u.ac.jp○Tao Zhao1, Yukihiro Tashiro1, Takuya Noguchi1, Jin Zheng2,
Kenji Sakai1, Kenji Sonomoto1,3(1Fac. Agric., Kyushu Univ., 2Univ. Sci. Technol. Beijing, 3BioArch., Kyushu Univ.)sonomoto@agr.kyushu-u.ac.jp
Designed biomass study is defined as an approach to design biomass substrates to fit
an established efficient fermentative process(1). To date, there is no report on
implementing this approach for butanol fermentation. Previously, we have establisheda butanol fermentation process without carbon catabolite repression (CCR) by using
cellobiose and xylose(2). Thus, we aimed to design rice straw hydrolysate for efficientbutanol production without CCR.
The effects of pretreatment (NaOH and H2SO4) and hydrolysis [cellulase mixture, βglucosidases (β-G)] on sugar compositions in rice straw hydrolysates were
investigated. Pretreatment using H2SO4 yielded higher concentrations of both pentose(xylose, arabinose) and hexose (glucose, cellobiose) sugars in hydrolysate than thatusing NaOH. In addition, cellobiose-rich hydrolysate with glucose and xylose wereobtained by only cellulase mixture while hydrolysis by cellulase mixture andadditional β-G gave glucose-rich hydrolysate with xylose. Cellobiose-rich hydrolysate
successfully eliminated CCR in butanol fermentation but glucose-rich hydrolysate did
not. Furthermore, by optimizing a dosage of cellulase mixture, butanol yield based on
enzyme dosage was improved drastically from 0.00182 g/unit enzyme in glucose-richhydrolysate to 0.174 g/unit enzyme in cellobiose-rich hydrolysate. Thus, we
successfully designed rice straw hydrolysate for efficient butanol production.
Ref. (1) J Biotechnol, 156, 286-301, 2011. (2) J Biosci Bioeng, 116, 716-721, 2013.

Direct conversion of CO2 to biofuel using cyanobacteria is a promising alternative
solution of an energy supply for a carbon neutral society. Recently, 1-butanol hasreceived significant attention to displace gasoline for its high energy density, and isless corrosive for current infrastructure. Synechococcus elongatus, capable ofproducing 1-butanol, BUOHSE strain, was already developed by means of molecularbiological tactics. However, the current production titer is still low, thus further
optimization of the pathway is needed. Previous analysis of BUOHSE strain using
quantitative target analysis and kinetic profiling of acyl-CoAs by LCMS revealed oneof the rate limiting step in 1-butanol biosynthesis pathway. This result strongly
demonstrated the power of metabolomics as a tool for seeking the bottleneck in thepathway. In order to broaden the coverage of metabolites that can be analyzed, widely
targeted profiling of central metabolism has been performed. By using IP-RP-LC/
QqQ-MS system, 74 metabolites in central metabolism were successfully annotated.
Based on widely targeted analysis, TCA cycle is up-regulated in BUOHSE strain
compared to low 1-butanol producing strain (EL22). Increasing acetyl-CoA pool tomalonyl-CoA in 1-butanol biosythesis pathway may lead to another strain
improvement strategy. The metabolic information obtained in this study will be usefulfor future studies on 1-butanol production or other important chemicals production
using engineered cyanobacteria.

Development of bioprocess with designed biomass: Design of rice strawhydrolysate for efficient butanol production without carbon catabolite
repression

Widely targeted metabolic profiling for improvement of 1-butanolproducing Synechococcus elongatus○Tao Zhao1, Yukihiro Tashiro1, Takuya Noguchi1, Jin Zheng2, Kenji Sakai1,
Kenji Sonomoto1,3(1Fac. Agric., Kyushu Univ., 2Univ. Sci. Technol. Beijing, 3Bio-Arch., Kyushu
Univ.)
Key words
designed biomass, carbon catabolite repression, rice straw, butanol
fermentation

3P-1p078 実験室進化とオミックス解析によるイソプロパノール耐性大腸菌の育種○堀之内 貴明 1, 酒井 亜希 1, 田辺 久美 1, 古澤 力 1,2（1理研・生命システム, 2東大院・理）takaaki_horinouchi@riken.jp○Artnice Mega Fathima1, Walter Lavina1, Sastia Prama Putri1, James Liao2,
Eiichiro Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Dept. Chem. Biomol. Eng., UCLA)

Key words

cyanobacteria, butanol, metabolomics

3P-1p080 酢酸菌 Komagataeibacter europaeus 由来転写因子 Lrpの標的遺伝子の網羅的探索○石井 友理 1, 赤坂 直紀 2, 佐古田 久雄 2, 秀瀬 涼太 1, 阿部 達明 3,
兼崎 友 4, 石川 森夫 3, 貝沼（岡本） 章子 3, 藤原 伸介 1
（1関西学院大院・理工, 2マルカン酢, 3東京農大・応生科醸造, 4東京農大・ゲノムセンター）
fujiwara-s@kwansei.ac.jp【目的】近年、環境調和型生産技術として微生物によるバイオアルコール生産に関する研究が盛んにおこなわれている。中でもイソプロパノール（IPA）はプ
ロピレン原料として有望であり、微生物による生産が試みられているが、IPAの蓄積は生育や生産の阻害を引き起こすことが問題となる。そこで本研究では大腸菌を用い、IPA 存在下での実験室進化による耐性株の取得と、オミックス
解析による耐性化に寄与する情報の取得を行い、親株への IPA 耐性の賦与を目指した。
【結果】本研究では複数の IPA 濃度の培地を用意し、それら全てに大腸菌を植菌し、増殖可能であった最大 IPA 濃度の菌体を選択して次の培地に植菌するというサイクルを繰り返すことにより IPA 耐性菌を取得した。こうした進化実験
を 6 つの系列について 24 日間行ったところ、全ての系列において増殖速度ならびに増殖可能 IPA 濃度の上昇が観察された。次にこれらの株について全ゲノム
変異解析とトランスクリプトーム解析を実施した。その結果、relA と marC への変異が 6 株中 3 株において見出された。このうち marC について、変異があった 3 株のうち 2 株では ORF 全域が欠損しており、残り 1 株ではフレームシフト
変異が生じていたことから、marC の機能欠失が IPA 耐性と関係していると考え、親株の marC を欠損させたところ、IPA 耐性能が向上した。またトランス
クリプトーム解析の結果からいくつかのアミノ酸生合成経路の発現量上昇が観察され、培地中へのそれらのアミノ酸の添加により IPA 耐性能の向上が見られた。これらの知見を組み合わせ、marC 欠損株にアミノ酸を添加したところ、IPA 耐性能がさらに向上した。marC への変異はブタノールなど他の短鎖アルコール類の耐性への関与が報告されていることから、我々が取得した株のさま
ざまなアルコールに対する耐性能も解析しており、ポスターではその結果についても議論する。

食酢製造工程において、酢酸菌は細胞膜結合型脱水素酵素によりエタノールを酸化し、食酢主成分である酢酸を産生する。このエタノール酸化は酢酸菌における電子伝達系であり、エネルギー生産の大部分を同代謝に依存する酢酸菌にとって、極めて重要な基幹代謝である。これまでに、酢酸菌 Komagataeibacter
europaeus 由来 Lrp(KeLrp, 大腸菌 Leucine responsive regulatory protein のオルソロ
グ)が分岐鎖アミノ酸およびメチオニン代謝遺伝子群の発現を制御し、細胞内における同アミノ酸群やポリアミンの恒常性維持に関与することが明らかにされた 1, 2, 3)。また、Kelrp 完全欠損株は野生株と比較して著しい生育遅延を示すが、転写量解析により生合成の停滞および不足が予測された代謝産物(分岐鎖アミノ酸、メチオニンおよびスペルミジン等)を培養液に添加しても、同株の生育遅延
は完全には解消されなかった。このことから、KeLrp は上記代謝経路だけでなく、中枢代謝や電子伝達系等、酢酸菌の生存にとって必須な基幹代謝の調節にも関与することが示唆された。これらを踏まえ、本研究では、KeLrp 標的遺伝
子群を網羅的に同定し、同転写因子制御下にある代謝経路を解明するため、K.
europaeus 野生株および Kelrp 完全欠損株の mRNA を供試し、次世代シーケンサーを用いた mRNA-seq 法を実施した。現在、完全欠損株において顕著な発現量変動が見られた遺伝子群を絞り込み、それらの発現動態変化に伴う代謝変動を特定する事で、KeLrp の機能を包括的に解析している。

Breeding of iso-propanol tolerant Escherichia coli by experimental evolution
and omics approach

Screening for genes under the control of a leuine responsive regulator in
acetic acid bacteria○Takaaki Horinouchi1, Aki Sakai1, Kumi Tanabe1, Chikara Furusawa1,2(1QBiC, RIKEN, 2Grad. Sch. Sci., Univ. Tokyo)

Key words
analysis

Escherichia coli, iso-propanol, evolutionary engeneering, omics

1)Akasaka, N. et al., J. Biosci. Bioeng. 118, 607-615 (2014)
2)Ishii, Y. et al., Appl. Environ. Microbiol. 81, 2265-2273 (2015)3)石井ら：2015 年度日本生物工学会大会○Yuri Ishii1, Naoki Akasaka2, Hisao Sakoda2, Ryota Hidese1, Tatsuaki Abe3,
Yu Kanesaki4, Morio Ishikawa3, Akiko Okamoto-Kainuma3, Shinsuke Fujiwara1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ., 2Marukan Vinegar Co., Ltd.,
3
Dept. Ferment. Sci., Tokyo Univ. Agric, 4Genome Res. Center, Tokyo Univ. Agric)

Key words
acetic acid bacteria, leucine responsive regulatory protein, RNA-seq,
metabolic pathwayオミクス解析

3P-1p081 担子菌 Coprinopsis cinerea の子実体形成初期に発現するタンパク質の探索およびその機能解析について

3P-1p083 ゲノミクスとトランスクリプトミクスを用いた麹菌変異
株の変異点の同定と解析○酒井 杏匠 1, 相島 奈央 1, 村口 元 2, 吉田 誠 3, 志水 元亨 1,
加藤 雅士 1
（1名城大院・農, 2秋田県立大・生物資源, 3東京農工大・農）kiyota9356@gmail.com【目的】
担子菌は、光や温度など環境変化に応じて菌糸体から子実体への形態変化を行う。このため、細胞分化および形態形成機構を解明するにあたり、担子菌は極めて興味深いターゲットであると考えられる。しかしながら、担子菌の子実体形成機構については完全に解明されていない。担子菌 Coprinopsis cinerea は、
ゲノムプロジェクトが完了していることや短期間で子実体が形成されることか
ら、担子菌類のモデル生物として用いられている。本研究では、プロテオーム
解析で子実体に特異的に発現するタンパク質を探索し、さらにそれらの機能について解析した。
【方法・結果】
C. cinerea を MYG 培地に接種して 3 日間 (30℃) 暗所下にて培養した。既報に従い 4 日目からは 12 時間の明暗サイクルで培養し子実体形成を誘導した。菌糸体および形成初期の子実体からそれぞれタンパク質を抽出し、二次元電気泳動を行なったところ、それぞれ 300 を超えるスポットが検出された。それらの中で菌糸体に特異的に発現するものを 30 スポット、子実体に特異的に発現するもの
を 41 スポット見出した。これらのスポットを切り出しトリプシン処理後、
MALDI-TOF/TOF-MS によって得られた質量スペクトルから、MASCOT サーチを行なうことでタンパク質の同定を行った。形成初期の子実体で同定されたものには、子実体特異的に発現することが知られているセプチンやガレクチンが含まれていた。さらに、形成初期の子実体に特異的に発現していた機能未知のタンパク質についてはリコンビナントタンパク質を調製した。現在、その機能を解析している。

Proteome analysis at the different developmental stages of Coprinopsis

cinerea○Kiyota Sakai1, Nao Aishima1, Hajime Muraguchi2, Makoto Yoshida3,
Motoyuki Shimizu1, Masashi Kato1(1Meijo Univ., 2Akita Prefectural Univ., 3Tokyo Univ. of Agric. and Technol.)Key words

Coprinopsis cinerea, fruiting body, proteomics

3P-1p082 メタボロミクスに基づく Saccharomyces cerevisiae の連
続培養におけるエタノール生産の低減

299○吉村 太郎 1,2, 和田 洋樹 1,2, 松田 俊文 2, 佐藤 敦史 1,
小川 真弘 1,3, 松島 健一朗 1, 小山 泰二 1,3, 伊藤 考太郎 1（1キッコーマン, 2キッコーマン食品, 3野田産研）
tyoshimura@mail.kikkoman.co.jp

しょうゆ製造における麹菌の主な役割は、諸味中でタンパク質や糖質を可溶化させるために必要な糖質・タンパク質の加水分解酵素を生産することである。
近年では、この高い加水分解酵素の生産性がバイオマス利用の分野でも注目されている。このため、麹菌における加水分解酵素分泌能の向上は、しょうゆの利用率向上のみならずバイオマス利用分野への展開においても重要である。我々は、当社保有の麹菌変異株ライブラリーの中に、様々な加水分解酵素の分泌量が増加する変異株を見出した。一方、近年は次世代シーケンサーの発達によりゲノム解読が迅速・安価に行えるようになっている。当社でも 2011 年に A. sojae
NBRC4239 のゲノム解読を実施している。そこで、先の変異株のゲノム配列を解読し比較することで、加水分解酵素の分泌量が増加する原因解明を試みた。
変異株のゲノム解析を実施し、変異株特有の遺伝子機能の欠損や喪失を招く可能性が高い変異点を抽出して、変異の再現を行った。その結果、ある遺伝子のアミノ酸置換を伴う変異を再現すると、変異株と同様にプロテアーゼやアミラー
ゼ等、各種加水分解酵素の活性が向上した。本遺伝子は、様々な分泌型の加水分解酵素の活性に関与する特徴から Regulator of Secretory Enzymes A （RseA）と命名した。続いて、rseA 遺伝子を破壊した結果、破壊株でも同様に加水分解酵素活性が対照株と比べて増加した。これらの効果は、A. oryzae でも同様であった。次に、変異再現株の遺伝子発現解析を行った結果、様々な加水分解酵素の遺伝子発現量が向上しており、さらに、それらを制御する転写因子の発現も上昇していた。以上の結果から、RseA の機能欠失は、各転写制御因子の転写量を上昇させ、その下流の酵素タンパク質の遺伝子発現が誘起されることにより、各種加水分解酵素活性が向上することを明らかにした。

Analysis of genomic mutation site in Aspergillus sojae mutant using
comparative genomics and transcriptomics○Taro Yoshimura1,2, Hiroki Wada1,2, Toshifumi Matsuda2, Atsushi Sato1,
Masahiro Ogawa1,3, Kenichiro Matsushima1, Yasuji Koyama1,3, Kotaro Ito1
(1Kikkoman Corp., 2Kikkoman Food Products Company, 3Noda Inst. Sci. Res.)

Key words

Aspergillus sojae, comparative gemomics, hydrolase, gene regulation

3P-1p084 バイオ医薬生産に向けた CHO 細胞培養情報データ解析
システムの構築○井村 誠 1, 岩切 亮 1, 馬場 健史 2,3, 福﨑 英一郎 3（1興人ライフサイエンス, 2九大・生医研, 3阪大院・工）fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp○許 漢修, 荒木 通啓, 蓮沼 誠久, 河野 愛子, 近藤 昭彦（神戸大院・科学技術イノベーション）
akondo@kobe-u.ac.jp

出芽酵母である Saccharomyces cerevisiae は食品分野において必要不可欠な微生物である。しかしながら、この酵母はクラブツリー効果が陽性であるため、十分に酸素を供給しているにも関わらず、高い増殖速度では副生成物としてエタ
ノールを生産する。加えて、このクラブツリー効果について詳細な機構は未だ明らかになっていない。そのため、物質生産の現場ではエタノールを生産させないために、糖の流入を制限した流加培養や希釈率を制限した連続培養が行われてきたが、これらの培養方法では生産量が低下してしまう。そこで、本研究で は 代 謝 物 を 網 羅 的 に 解 析 す る メ タ ボ ロ ミ ク ス に 基 づ い て S. cerevisiae
NBRC101557 における連続培養でのエタノール生産の低減に取り組んだ。連続培養中の S. cerevisiae は希釈率 (D) を 0.05 から 0.30 まで上昇させると、バイオマス形成 (D≦0.20) からエタノール生産 (D ＝ 0.30) へと表現型が変わるので、この表現型の変化に応じて代謝物のプロファイルも異なることが予測できた。
これより、様々な希釈率より取得した酵母抽出物におけるメタボローム解析を
GC/MS によって実施した。希釈率に応じて一様に増減している代謝物や表現型の変化に伴い蓄積に差が見られる代謝物がエタノール生産を低減できる可能性があるので、得られた分析結果からいずれかの条件を満たしていたトレハロー
ス、オルニチン、フマル酸、リンゴ酸をそれぞれ培地中に 100 mg/L となるように添加し、連続培養の定常期にて培養上清中のエタノール濃度を測定した。その結果、無添加の培地の場合と比較して、フマル酸やリンゴ酸を添加した培地では培養上清中のエタノール濃度をそれぞれ 5.9、3.4%低減することに成功した。

【背景と目的】次世代バイオ医薬である抗体医薬の実用化に向けて、Chinese
hamster ovary (CHO) 細胞を用いたバイオ医薬の大量生産技術の開発が求められている。単一細胞の有効蛋白産生量の向上が期待されており、そのために外来
蛋白質の生産の場である細胞の代謝を解析することは重要であると考えられる。
本研究では CHO 細胞培養の培地内、細胞内、そして遺伝子発現の情報を統合的な解析を行った。
【方法】LC/MS、HPLC、および次世代シーケンサー(NGS) 解析を用い、基盤情報としての迅速に統合・解析する情報解析プラットフォーム並びにデータベース構築から、CHO 細胞の培養条件の改良や高生産化に関わる分子機構の解明を目的とした解析・評価を行った。高精度なハイスループットのオミクスデータ
解析基盤を構築するため、時系列データの相関係数計算を行い、公共データを併用し、抗体生産並びに細胞増殖に関わる糖・アミノ酸・エネルギー代謝を中心にした代謝経路マップを作製した。得られた結果を当研究室独自開発の代謝
パスウェイ上に視覚化し、トランスクリプトーム・メタボロームの時系列デー
タの統合解析システムを構築した。
【結果と考察】データベースの高度化を行い、システム解析を通じて生産性指標・プロファイルの同定ならびに遺伝子・代謝物の相関を明らかにした。網羅的システム解析をもとにしたデータ駆動型のアプローチにより、様々な培養条
件下におけるトランスクリプトーム・メタボロームの特徴を抽出することができた。実際に、各濃度の乳酸添加の培地で培養した CHO 細胞内部及び外部（培地内）の代謝物、遺伝子発現、アミノ酸などの時間的な変化を解析した。このアプローチは、統合解析システムとしてプラットフォームの開発を可能にし、新たな作業仮説を産み出していく上で意義あるものと考えられる。

Metabolomics approach toward ethanol reduction in continuous culture ofDevelopment of an integrative data analyzing system for bio-pharmaceutical
CHO cell culture profile

Saccharomyces cerevisiae○Makoto Imura1, Ryo Iwakiri1, Takeshi Bamba2,3, Eiichiro Fukusaki3(1KOHJIN Life sciences Co., Ltd., 2Med. Inst. Bioreg., Kyushu Univ.,, 3Grad. Sch.
Eng., Osaka Univ.)

Key words

metabolic analysis, continuous culture, Crabtree effect○Han-Hsiu Hsu, Michihiro Araki, Tomohisa Hasunuma, Aiko Kono,
Akihiko Kondo(Sci. Tech. Innov., Grad. Sch., Kobe Univ.)

Key words
sequencing

CHO cell, Biopharmaceutics, Omics analysis, Next-generation

300

オミクス解析／生体情報工学，バイオインフォマティクス

3P-1p085 ハッサク葉のストレス応答反応における二次代謝物質の変動解析○伊佐木 芳 1, 松川 哲也 1,2, 梶山 慎一郎 1（1近畿大院・生物理工・生物工, 2近畿大・附属農場）
kajiyama@waka.kindai.ac.jp

3P-1p087 Staphylococcus aureus に注目したアトピー性皮膚炎の重症化メカニズムの理解○沖野 凪沙 1, 稲垣 瑞穂 1, 佐藤 綾子 1, 澤野 博之 1, 坪内 芙美香 1,
林 将大 2, 田中 香お里 2, 兼崎 友 3, 吉川 博文 3, 鈴木 徹 1（1岐阜大・応生科, 2岐阜大・生命科学総合研究支援センター, 3東農大・応生科）
suzuki@gifu-u.ac.jp[目的] カンキツ類は古くから世界的に栽培されている商業的価値の高い果樹で、果実の保存環境や，果実に含まれる代謝産物に関する研究が数多く行われてきた。 一方で，果実以外の葉や枝に関する研究は少なく，特にこれらのストレス応答に関する研究はあまり例がない。 我々はこれまでに、数種のカンキツ類の葉において、ストレス応答時に香気成分や一次代謝成分が変動することを見出すとともに，ハッサクの葉からは新規傷害誘導性物質を単離・同定してきた。
今回は，ハッサク葉に対する物理的傷害処理および，ストレス関連植物ホルモ
ン処理を行い，これを LC/TOFMS を用いて分析することにより，防御応答に最も直接的に関与すると考えられる不揮発性二次代謝物質の傷害応答時における代謝変動を網羅的に解析することを目的とした。
[方法および結果] 近畿大学附属農場にて栽培されているハッサクの成熟葉を採取し，6 mm 間隔で刺傷を与えた。これを蒸留水に浮かべて 25℃、常光下で一定時間培養した試料を傷害処理葉とした。また、採取直後に 0.2 mM の SA および JA 溶液に切断部を浸した状態で培養した試料を SA および JA 処理葉とした。各処理葉を液体窒素中で破砕した後、メタノールを加えて懸濁した。懸濁
液を遠心分離し、上清を回収して粗抽出液とした。各処理葉の抽出液を LC/
TOFMS に供して得られたピークデータを多変量解析に供し、数種のストレス
応答性ピークを見出した。現在、各処理に応答していると考えられるピークの解析を進めており、その結果も併せて報告する。

【目的】近年、皮膚微生物叢と皮膚疾患との関係が注目されている。黄色ブドウ球菌 Staphylococcus aureus はアトピー性皮膚炎 (AD) の炎症部に高頻度で検出され、多数の炎症性外毒素遺伝子を持つ株が多いことから、AD は S.aureus の感染症であると仮説を立てた。AD 患者と健常者の皮膚菌叢を解析し、さらにS.aureus の外毒素遺伝子の構成を明らかにすることで、AD の重症化と S.aureusとの関係を解明することを目的とした。
【方法】AD 患者を含む学内外の約 150 名のボランティアに対し、肘の裏側を生
理食塩水に浸した綿棒で拭き取り皮膚常在細菌を採取した。好気および嫌気条
件で菌を生育し、MALDI TOF-MS による菌種の同定を行った。さらに、S.aureusと同定された株について比較ゲノム解析を行った。
【結果・考察】MALDI-TOF MS の結果、AD 軽症者からは S.aureus が検出されなかった。AD は S.aureus の感染症であると予想したが、軽症者が感じる痒みは微生物が関与する経路とは異ったメカニズムで生じている可能性が高い。一
方、中等症以上では高い保有率を示したことから、痒みの原因が S.aureus の感染症に切り替わり、症状が悪化していると考えられる。また、24 株の S.aureusのゲノムについて毒素遺伝子について調べたところ、高いスーパー抗原活性を持ち、重篤なショック症状を引き起こすと言われている細胞外毒素 TSST-1 をコードする遺伝子 (tst-1) について、すべての健常株で tst-1 保存されていたが、重症株は一切保有していなかった。TSST-1 同様にスーパー抗原活性を有すると言われているエンテロトキシンについてその遺伝子数を調べたところ、重症株
では比較的少ないことがわかった。このことから、AD 重症株は健常者で検出されるような一般的な株よりも、むしろ弱毒化している傾向があり、ヒト皮膚への長期の定着と、AD 症状の慢性化に関与している可能性がある。

Metabolomic analysis of stress related secondary metabolites in Citrus
hassaku leaf

The mechanism of advancing severity in atopic dermatitis in the scope ofgenomics of Staphylococcus aureus.

○Kaoru Isaki1, Tetsuya Matsukawa1,2, Shin'ichiro Kajiyama1(1Div. Biotechnol. Sci., Grad. Sch. Biol. Oriented Sci. and Technol., Kindai Univ.,
2
Experimental Farm, Kindai Univ.)

Key words

C. hassaku, stress related compounds, metabolic analysis○Nagisa Okino1, Mizuho Inagaki1, Ayako Sato1, Hiroyuki Sawano1,
Fumika Tsubouchi1, Masahiro Hayashi2, Kaori Tanaka2, Yu Kanesaki3,
Hirofumi Yoshikawa3, Tohru Suzuki1(1Fac. Appl. Biol. Sci., Gifu Univ., 2Life Sci.Res.Center,Gifu Univ., 3Fac. Appl.
Biosci., Tokyo Univ. Agric.)
Key words
atopic dermatitis, Staphylococcus aureus, human skin microbiome

3P-1p086 和食固有素材摂食による生体応答プロファイリング

3P-1p088 Aspergillus section Flavi の比較ゲノム解析【背景と目的】世界有数の長寿国である日本には和食文化が存在し、栄養バラン
ス等の点から健康の維持・増進に寄与していると考えられている。一方、腸内細菌叢は宿主の免疫系にとって重要であり、食生活により多大な影響を受けることは周知の事実であるが、食生活の多様化とそれに応じた代謝変動の関係性については不明な点が多く、有用な評価法も乏しいのが現状である。そこで本研究では、和食固有素材の成分評価と、これらの摂食が腸内細菌叢をはじめとする体内環境に及ぼす影響を統合的に評価可能な生体応答評価法の構築を目的とした。
【方法】和食固有素材であるワラビ・コゴミを一般的な方法で灰汁抜きし、凍結
乾燥後に破砕したもの、およびこれらの構成成分であるセルロースを生理食塩水に懸濁させた。固形物懸濁液と生理食塩水投与群を設定し、週 3 回の経口強制給餌を 2 週間行った。給餌前・中・後それぞれ 2 週間で採取した糞便・尿・血液、およびワラビ・コゴミを NMR により含有成分を解析した。また、ELISA
法により、検体中の IgA・IgG 等の抗体量の解析をした。
【結果と考察】和食固有素材中に含まれる低分子および細胞壁成分を NMR により網羅的に解析するとともに、それらを摂取した時の免疫および代謝応答を評価した。その結果、陰性対照群と和食固有素材投与群とで尿中成分に違いが生じ、その変化は摂食期間終了後も維持された。これらの代謝変化は、摂食変化に伴う腸内細菌叢の変動に起因し、期間後も元の状態には戻らない為、尿中代謝物にこのような影響を与えたという可能性が推測できる。さらに糞便中代謝変動、和食固有素材中成分および尿中代謝変動との関係性を統合的に評価する
ことにより得られた最新の知見についても本会で議論したい。

Aspergillus section Flavi に分類される種には、醸造や発酵に広く利用されている
産業上有用な A. sojae (As) と A. oryzae (Ao) が含まれる一方で、アフラトキシンなどのマイコトキシンを生合成する有害な A. parasiticus (Ap) と A. flavus (Af) が含まれる。産業利用においてこれらの種を区別することは重要であるが、これらの種を形態学と生理学のみで区別することは難しい。そのため、分子生物学的アプローチが産業利用上の区別に利用され、これら 4 種の起源について様々な議論がなされてきた。我々は、これら 4 種の関係を DNA の違いにより明らかにするため、As NBRC 4239 のリシークエンスを実施し、比較ゲノム解析を実施した。DNA 1kb ごとに相同性を比較した結果、As のゲノムは Ap と高い相同性を示し、Af あるいは Ao との相同性は低かった。As の染色体サイズ (39.4Mb)
は Ap (39 Mb) とほぼ同じで、Af (36.8 Mb) あるいは Ao (37.2 Mb) よりも大きかった。As の染色体には、大規模な DNA の挿入や重複は見つからず、Af あるいは
Ao と相同性の低い領域が染色体全体に分散していた。As の全予測遺伝子を
section Flavi の他の 3 種にアライメントした結果、As は Ap と最も高い相同性を示した。しかしながら二次代謝合成に関与する遺伝子では、As に欠損や配列変化が起こっていた。これらの結果から、これら 4 種は Ap と Af の 2 グループに分けることができ、Ap から As が、Af から Ao が其々マイコトキシン生産能を失って進化していることが推測された。

Metabolic profiling in biological responses induced by Washoku intake

Genome-wide comparative analysis among Aspergillus section Flavi.

metabolism, microbiome, multivariate analysis

Key words
Aspergillus section Flavi, Aspergillus sojae, Aspergillus oryzae,comparative genome

益田 静香 1, ○嶋 秀明 1, 伊達 康博 2,3, 篠 阿弥宇 2, 梶川 瑞穂 1,
井上 能博 1, 石戸 聡 1, 菊地 淳 2,3,4（1昭和薬大・薬, 2理研・環境資源科学研究セ, 3横市大院・生医,
4
名大院・生命農学）
shima@ac.shoyaku.ac.jp

Masuda Shizuka1, ○Hideaki Shima1, Yasuhiro Date2,3, Amiu Shino2,
Mizuho Kajikawa1, Yoshihiro Inoue1, Satoshi Ishido1, Jun Kikuchi2,3,4(1Dept. pharmacy, Showa Pharmaeutical Univ., 2CSRS,RIKEN, 3Grad. Sch. Med.
Life Sci., Yokohama City Univ., 4Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)

Key words○佐藤 敦史 1, 松島 健一朗 1, 伊藤 考太郎 1, 服部 正平 2,3,
光山 統泰 4
（1キッコーマン, 2東大院・新領域, 3早大・先進理工, 4産総研）
a.sato@mail.kikkoman.co.jp○Atsushi Sato1, Kenichiro Matsushima1, Kotaro Ito1, Masahira Hattori2,3,
Toutai Mituyama4(1Kikkoman Corp., 2Grad. Sch. Front. Sci., Univ. Tokyo, 3Sch. Adv. Sci. Eng.,
Waseda Univ., 4AIST)

生体情報工学，バイオインフォマティクス

3P-1p089 糖質系高分子に対する分子動力学計算のためのパラメー
ター設定支援プログラム

3P-1p091 ディープラーニングを用いた生体分子解析○三宅 淳, 金下 裕平, 浅谷 学嗣, 東 侑之介, 田川 聖一, 新岡 宏彦（阪大院・基礎工）
jun_miyake@bpe.es.osaka-u.ac.jp○園部 智彩 1, 矢部 誠 2, 上田 一義 1, 近藤 敬子 3, 片平 正人 3,
武田 穣 1（1横国大院・工, 2横浜市大院・生命医科, 3京大・エネルギー理工研）
mtake@ynu.ac.jp【背景と目的】 Molecular Dynamics（MD）の実行に必須の結合角や電荷などのパラメータセット（力場）がライブラリに存在しない場合、力場を量子化学計
算で算出する方法がある。しかし、高分子の場合には計算コスト過多で算出は容易でない。例外的に繰り返し単位を有する高分子の場合には、最低３単位（両末端部と中央部）を含むオリゴマーの力場を算出し、それを高分子構造に対応した形式（両末端部＋中央部×n）に変換するという手法が可能である。しかしながら、変換は手作業であり、多大な時間を必要とすると共に信頼性に欠ける。
そこで、繰り返し単位を持ち力場の存在しない高分子に対する MD を簡便かつ確実に実行すべく、力場変換半自動化ツールの開発を目指した。
【方法】 本ツールで変換する力場ファイルは、オリゴマーの構造ファイルを元に Antechamber により生成したものである。まず開発したツールの構造ビュー
ワ機能により、オリゴマーの構造ファイルから高分子の繰り返し構造の中央部
および末端部に相当する部分を分割・帰属する。次に、開発ツールの自動変換機能により、高分子の構造に対応した形式（両末端部＋中央部×n）へ力場ファ
イルの自動変換を行う。最後に、任意の重合度（2 ＋ n）を持つ構造ファイルと共に力場ファイルを出力する。検証計算はアミロースに対して行った。
【結果と考察】GUI を採用したことで、作業負荷の低減と時間短縮が実現した。
さらに、複雑なファイル変換過程を自動化したことからヒューマンエラーを一掃できた。ノナン中のアミロース分子を想定した系で MD を実行したところ、ライブラリに基づく力場を与えた場合と同様の規則構造が得られ、ツールの有効性が確認できた。複雑な構造の高分子に対する MD 実行における本ツールの有効性を確認すべく、キサンタンに対する計算に適用中である。

A software which assists parameter setup for molecular dynamics
simulation of saccharic polymers○Chisaya Sonobe1, Makoto Yabe2, Kazuyoshi Ueda1, Keiko Kondo3,
Masato Katahira3, Minoru Takeda1(1Grad. Sch. Eng., Yokohama Natl. Univ., 2Grad. Sch. Med. Life Sci., Yokohama
City Univ., 3Adv. Energy Inst., Kyoto Univ.)

Key words

molecular dynamics, polysaccharide

3P-1p090 Effect of d-and l-menthol on stability of membrane
heterogeneity○Pooja Gusain1, Kunihide Hoshino1,2, Yoshio Tsujino1,2,
Naofumi Shimokawa1, Masahiro Takagi1(1Sch. Mater. Sci., JAIST, 2Takasago International Corporation)
takagi@jaist.ac.jp

301

多層パーセプトロンの中間層を多層化させた Deep Learning(DL)は、自動的な特徴表現の学習を可能としており、獲得された特徴表現の理解が、観測データの本質的な情報の抽出へ繋がると考えられる。しかし、バイオ分野では、生命分子や 組織の複雑さ故に、解析方法が確立されて来なかった。創薬技術への応用を考えれば、生体分子の構造から、特性や細胞内での分子間の関係、そして細胞の状態の評価などに用いられることが期待される。 研究開発には、当該分野に特化したプログラムと、高速計算が可能なコンピューターの適用が不可欠である。当グループでは独自に、C 言語を用いた DL である「Sigma」と GPU コ
ンピューター（演算速度約 15TFlops）を制作して用いている。
これまでの研究結果から考えられる可能性について紹介する。アミノ酸シーク
エンスが得られているヒト抗体約 6000 本の H 鎖可変領域(100 アミノ酸)について、ディープラーニング(スタックドオートエンコーダー)を用いた解析を試み、ウイルス結合抗体の二次元圧縮プロットを得た。対 HIV、Influenza、Rotovirus
抗体 H 鎖について、それぞれ特徴的な分布が得られた。
mtDNA の塩基配列と抗体可変領域のアミノ酸シークエンスという生体分子に対して Deep Learning による解析を行い、生体分子に内在する情報的特性を抽出できるか検討した。Stacked Autoencoder を用いて mtDNA を二次元平面にプロットした結果、起源とするハプログループ毎に分布の傾向に違いが見られた。また抗体を用いた場合、抗原ごとに分布の偏りが見られた。CNN によりハプログ
ループを教師として学習したところ 90%以上の精度で mtDNA ハプログループの分類・識別が出来る可能性が示唆された。

Deep Learning for Biomolecules○Jun Miyake, Yuhei Kaneshita, Satoshi Asatani, Yunosuke Azuma, Seiichi Tagawa,
Hirohito Niioka(Grad. Sch. Eng. Sci., Osaka Univ.)

Key words

Deep Learning, DNA, Antibody, Virus

3P-1p092 シェルスクリプトを用いたパラレルモンテカルロ法の構
築と生物工学への応用○石井 一夫 1, 中村 和敬 2, 當仲 寛哲 2
（1農工大・農, 2USP研）
kazuoishii2014@gmail.com

Menthol activates TRPM8, a cold activated Transient Receptor Potential ion channel.
l-Menthol induces cooling sensitization whereas d-menthol induces irritation. It isbelieved that cell membrane including a large variety of components has compositional
heterogeneity called Raft. Our interest is to clarify stability of two isomers d- and lmenthol on membrane heterogeneity. Binary (DOPC/DPPC) and ternary (DOPC/
DPPC/Chol) systems were examined by fluorescent microscopy. Miscibility
temperature Tm is defined as temperature at which heterogeneous phase (50%) isformed. In binary system without cholesterol, stripe like solid-ordered (So) domains
formed predominantly surrounded by liquid-disordered (Ld) phase. Liposomes withhomogeneous phase were increased in the presence of l-menthol i.e the phaseseparation was suppressed leading to destabilization of So phase. On the other hand dmenthol did not affect So formation, indicating that d-menthol interact with unsaturated
DOPC lipid. In binary system, l-Menthol (Tm=36℃) did not show significant change in
miscibility temperature compared to control (Tm=35.7℃) while d-menthol showeddecline in miscibility temperature (Tm=32.8℃). Whereas, in ternary system, l-menthol
increased the miscibility temperature (Tm=30.9 ℃) compared to control (Tm=28.1℃)
and d-menthol (Tm=28.3℃). Therefore, it was suggested that raft like structure wasstabilized by l-menthol.

次世代シーケンサーやマイクロアレイの普及により、生物分野におけるビッグデータ分析は日常的なものとなっている。これらのデータは、多数の遺伝子発現や DNA のメチル化などの説明変数からなる超多次元データである。従来までの生体現象の理解には少数の因子による生化学的解析が主流であったが、これら超多次元データを組み合わせることによるビッグデータの利活用で、複数の要因により数理予測モデルを作成し表現型などの生体現象の高精度な予測が可能となる。しかし、これらの超多次元データによる数理予測モデルの作成においては、候補となる説明変数（例えば、遺伝子発現など）が膨大であり、これらの組み合わせの中から適切な説明変数を選択し、予測モデルを作成することは困難を伴う。我々は、多数の組み合わせの中からモンテカルロ法による無作為抽出と並列処理を組み合わせて、近似的な最適化予測モデルを作成することを検討してきた（本大会シンポジウム 3S-Bp 小林、石井らの発表）。しかし、この方法は完全なものではなく、未だ様々な問題点を抱えている。例えば、数理モデルの作成には大量の計算を必要とし、並列分散処理を用いて高速化を図っていく必要がある。今回、並列分散処理の効率化のために C ライブラリとシェ
ルスクリプトによる高速化を行った（本大会シンポジウム）。これにより、より簡便でパフォーマンスの高いシステムの構築が可能となった。本発表では、C
ライブラリとシェルスクリプトによるソフトウェアのこの効率化と高速化に関するアプローチについて紹介する。
謝辞： 本研究は、東京農工大学「農学系ゲノム科学人材育成プログラム」の支援により実施された。

Effect of d-and l-menthol on stability of membrane heterogeneity

Introducing of Parallel Monte Carlo methods with shell scripting tobiotechnology○Pooja Gusain1, Kunihide Hoshino1,2, Yoshio Tsujino1,2, Naofumi Shimokawa1,
Masahiro Takagi1(1Sch. Mater. Sci., JAIST, 2Takasago International Corporation)

Key words
Miscbility Temperature Tm, Solid-ordered So, Liquid-disordered Ld,cholesterol (Chol)○Kazuo Ishii1, Kazutaka Nakamura2, Nobuaki Tounaka2(1Grad. Sch. Agr., Tokyo Univ. of Agr. Eng, 2USP Lab.)

Key words
Monte Carlo methods, Shell scripting, Mathematical Modeling,
Parallel computing

302

生体情報工学，バイオインフォマティクス

3P-1p093 糖残基を指標とする抗菌性化合物探索のためのゲノム情報解析ツールの開発

3P-1p095 環境試料 RNA の大量シーケンシングと経時解析による有用遺伝子の大規模検索○木村 明音, 笹川 真稚, 市川 夏子, 藤田 信之（NITE・NBRC）
kimura-akane@nite.go.jp○中村 祐哉 1, 森 宙史 1, 黒川 顕 2, 中島 信孝 1
（1東工大院・生命理工, 2東工大・地球生命研）
nnakashima@bio.titech.ac.jp

微生物が産生する二次代謝産物は医薬、農薬等に利用されており、生物活性物
質の探索源として工業的に極めて重要である。近年、次世代シーケンサーの登場によりゲノム解析が簡便になり、ゲノム情報に基づき二次代謝産物合成酵素を探索する手法（ゲノムマイニング）が注目されている。糖残基が付加された
天然二次代謝産物は、アグリコン（非糖部分）と糖残基から成り、糖ユニットはしばしば化合物の生物活性に直接影響することが知られている。そのため、糖残基の合成に関与する酵素を指標にしたゲノムマイニングは生物活性を有す
る二次代謝産物の探索に有用であると考えられる。ポリエン系抗真菌薬ナイス
タチンの糖残基であるマイコサミン（3,6-dideoxy-3-aminomannnose）は抗菌活性に寄与することが報告されている。本研究ではマイコサミン基を有する抗菌性化合物探索のためのゲノム情報解析ツールの開発を行った。
マイコサミンは、GDP-マンノースから脱水反応、異性化反応、アミノ基転移反応を経て合成され、糖転移酵素によってアグリコンへ付加される。異性化反応を担う酵素は見つかっておらず自発的に起こると推定されている。本研究では、
マイコサミン合成に関与する脱水酵素、アミノ基転移酵素、糖転移酵素について、論文情報から既知の酵素を調査し、収集した既知の遺伝子配列の系統解析等を行い、遺伝子の特徴を定義することで、ゲノム中から遺伝子を検索するた
めアルゴリズムを決定した。それぞれの遺伝子に応じたプロファイルデータベースを準備し、マイコサミン合成に関与する酵素遺伝子群をゲノム中から検索するツールを開発した。本ツールは、微生物遺伝子機能検索データベース MiFuP（http://www.bio.nite.go.jp/mifup/）にて利用可能である。現在、本ツールを用いて放線菌ゲノムから新規抗菌性化合物の探索を実施している。

現代の医薬品製造や化成品生産において、酵素タンパク質の利用は欠かせない。
新規に有用酵素遺伝子を探索する際、メタゲノムと呼ばれる手法がよく用いられる。これは、環境などから取得してきた微生物群集を培養せずに、その DNA/RNA だけを抽出し、ライブラリ化して利用するものである。ライブラリ化後は、DNA/RNA 配列の相同性を指標にハイブリダイゼーションや、組換えタン
パク質を発現させ酵素活性を指標にスクリーニングすることが多い。しかし、それらの方法では多大な時間を要することから、より簡易なスクリーニング方法が求められていた。そこで本研究では、新たなスクリーニング方法として、
大量 RNA 配列経時解析法（TILAMS）を提唱する。TILAMS ではまず、環境から取得した微生物群集に、着目する基質を添加した物としない物を用意し、両試料から経時的に RNA を抽出する。そして、次世代シーケンサーを用いて得られた RNA を大量に配列解読し、基質添加によって量が変動した RNA 配列を探し出す。そこに、バイオインフォマティクスによる各種解析を与えることによって、擬陽性の RNA 配列を除去し、基質に作用する酵素遺伝子の RNA 候補を探しだす。TILAMS によれば、微生物細胞を使用せずに大量にスクリーニン
グを行うことができるため、メタゲノムからの有用酵素遺伝子探索のボトルネッ
クを解消することができる。本研究においては、化成品として利用価値の高い
レブリン酸を基質として用い、その代謝を担うレブリン酸分解酵素遺伝子を取得することを目指し、講演では研究の過程と成果について発表する。

Development of genome-mining tool for antibiotics containing the sugar
moietyDiscovery of valuable genes by massive sequencing and time-lapse analysisof environmental RNAs

○Akane Kimura, Machi Sasagawa, Natsuko Ichikawa, Nobuyuki Fujita(NBRC, NITE)

Key words

genome-mining, mycosamine, MiFuP, antibiotics

3P-1p094 アンチセンス核酸による配列特異的な殺菌○木野 裕太, 中島 信孝（東工大院・生命理工）nnakashima@bio.titech.ac.jp○Yuya Nakamura1, Hiroshi Mori1, Ken Kurokawa2, Nobutaka Nakashima1(1Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Tech, 2ELSI, Tokyo Tech)

Key words

Rna-Seq, metagenome, levulinic acid, environmental bacteria

3P-1p096 細胞画像情報解析による抗がん剤プロファイリング技術の開発○河合 駿 1, 岡田 法大 1, 湯澤 勝浩 2, 佐々木 寛人 2, 蟹江 慧 1,
清田 泰次郎 3, 清水 一憲 2, 本多 裕之 2, 加藤 竜司 1
（1名大院・創薬科学, 2名大院・工, 3ニコン）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp

現在、抗生物質として利用されているものの多くは、抗菌スペクトルが広く、我々の健康や、環境を維持している多くの共生細菌まで殺してしまう。また、抗生物質の乱用は薬剤耐性細菌の出現を誘発するため問題視されている。そこ
で我々は、アンチセンス核酸を用いることにより、細菌群集の中から標的とする細菌だけを特異的に殺すことを目的とした本研究を立ち上げた。アンチセン
ス核酸は、人工的に合成したオリゴ DNA やオリゴ核酸類似体などを指し、細菌内の mRNA に特異的に結合し、その翻訳を阻害する。この性質を利用して、標的細菌の生育に必須な遺伝子の mRNA のリボソーム結合領域（Shine-Dalgarno配列）周辺を標的としたアンチセンス核酸を設計することにより、目的の細菌だけを殺すことが可能になる。そこで、我々は、環境から採取したサンプルに大腸菌を混ぜて、モデル系としての実験を行った。また、目的を達成するアン
チセンス核酸の設計方法を確立するために、ツールを作成した。
将来的にはバイオフィルムや皮膚細菌叢等などの複雑な集団に存在する細菌のうち、目的とする 1 種類だけを、作成したツールを用いて簡単に設計したアンチセンスを用いて、配列特異的に殺菌することを目指している。

【背景と目的】新薬開発の初期段階では多様な化合物スクリーニングが行われているが、その中で新薬開発の成功率を上げるため、効率的に探索するハイスループットスク
リーニング（HTS）技術の研究が重要になってきている。
近年、HTS 技術の中でも細胞を利用したセルベースアッセイが注目されている。セルベースアッセイはヒト細胞の挙動に基づいて評価することで、生体内反応に近い情報が得られる。歴史的には、画期的な新薬はセルベースアッセイから得られることも多く、その有効性が近年再注目されている。しかし、従来のセルベースアッセイは免疫染色などを必要としスループット性に課題があった。さらにエンドポイントアッセイの多くは細胞を破壊するため経時的な作用を評価することも難しかった。
本研究室では細胞形態に基づく薬効評価技術の開発を試みている。細胞形態は、現在の細胞の遺伝子発現等により変化し、先行研究では形態と薬効に相関があることが報告されている。また本研究室では、位相差画像のみで細胞を経時的にモニタリングする細胞形態情報解析を開発しており、免疫染色などを必要しないため、従来の問題を解決できる可能性を持つ。本研究では、抗がん剤を細胞形態情報解析によって評価することで、薬効評価技術としての有効性を検証することを目的とした。
【方法と結果】
具体的には 5 種類の細胞を 9 種類の抗がん剤に暴露し、形態によるプロファイ
リングを行った。結果として位相差顕微鏡中の細胞を定量化し、それを統計解析することで、形態プロファイルが阻害する標的分子によって異なることが示唆された。さらに上記以外の異なる抗がん剤にも応用し、形態のみから標的を評価することで、実用性も含めた本手法の有効性も同様に検証した。

Sequence-specific sterilization by antisense nucleic acid

Development of Anti-cancer Drug Profiling Method by Image-based
Cellular Morphological Analysis○Yuta Kino, Nobutaka Nakashima(Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Tech)

Key words

antibiotics, microbial flora, bioinformatics, peptide nucleic acid○Shun Kawai1, Norihiro Okada1, Katsuhiro Yuzawa2, Hiroto Sasaki2, Kei Kanie1,
Yasujiro Kiyota3, Kazunori Shimizu2, Hiroyuki Honda2, Ryuji Kato1(1Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 3Nikon
Corp.)

Key words
based assay

high-throughput screening, cell morphology, anti-cancer drug, cell-生体情報工学，バイオインフォマティクス／システムバイオロジー／環境工学，廃水処理技術

3P-1p097 乳化を指標とした細胞壁形成阻害剤の新規スクリーニン
グ法の検討

303

3P-1p099 フローサイトメーターを用いた、長期冷蔵保存した海水中における微生物細胞の膜損傷状態の評価○根路銘 伸介, 尾島 由紘, 東 雅之
（阪市大院・工・化生系）
azuma@bioa.eng.osaka-cu.ac.jp○高橋 裕里香 1, 古澤 之裕 2, 畠 俊郎 1, 西田 洋巳 1（1富山県大・工, 2富山県大・教養）
t-yurika@pu-toyama.ac.jp

ヒトと真菌の細胞構造は類似しており、選択毒性の点で抗真菌薬の開発は抗細菌薬に比べ困難である。現在も有効な薬剤は数少なく、また耐性菌の出現も問題となっており、新たな薬剤が求められている。我々は、酵母を用いてヒトにはない真菌特有の構造体である細胞壁の研究を進めてきた。昨年度の本大会では、酵母変異株の細胞から遊離する乳化物質とそれら変異株の解析を進めその成果を報告した。本研究では、細胞壁形成に作用する化合物の検出に、酵母の乳化現象を適用できると考え、以下について検討した。
乳化物質は、これまでの解析から細胞壁から遊離する高分子物質と考えられた。
そこで、細胞壁の主要成分である β-1,3-グルカンの分解と乳化の関係を調べた。
Saccharomyces cerevisiae を用い、浸透圧保護下で β-1,3-グルカナーゼを作用させ、細胞遊離物の乳化活性を測定した。乳化はケロシンと試料の混合により評価した。その結果乳化が検出され、乳化物質は β-1,3-グルカンに結合していることが示唆された。病原真菌である Candida albicans においても同様の現象が観察された。さらに、浸透圧保護下で β-1,3-グルカン合成阻害薬 Micafungin を作用させ、培養上清の乳化活性を測定した。ここでも乳化が検出され、乳化による β-1,3-グルカン阻害剤の検出が可能であることが強く示唆された。他の細胞壁に作用する薬剤の影響についても評価しており、乳化が細胞壁形成に作用する薬剤検出の指標として使用できるか議論する。

[背景・目的] 海水中の微生物の計数には、SYBR Green I 染色を行って落射蛍光
顕微鏡で観察する方法（Nature Protocols, 2007, 2:269-276.）が広く用いられている。SYBR Green I は細胞膜の状態に関わらず細胞内(またはウィルス粒子内)に入り込み二本鎖 DNA に結合するため、この方法によって真核微生物、細菌、ウィルスを同時に計数できる。しかし一方で、全菌数に占める生菌の割合は不明であり、計数値が観察者によって変動しやすいという欠点もある。そこで本研究では、海水中の生菌と死菌を染め分けてフローサイトメーター（FACS）に
よって計数することで、長期冷蔵保存した海水中の菌数及び生菌の割合を測定することを目的とした。 [方法・結果] 富山湾及び日本海の複数の地点で採取した海水(表層水)を 4℃で静置保存した。保存した海水 50 mL を φ0.2 μm フィル
ターで濾過し、フィルターを 500 μL の染色バッファー（Phosphate-buffered saline,
1 mM EDTA, 0.2% Pluronic F-68, 0.1% sodium azide）に懸濁した。懸濁液に、細胞膜への透過性の異なる 2 種類の染色試薬｛thiazole orange (TO、全菌を染色)とpropidium iodide (PI、死菌を染色)｝を添加して 15~60 分静置した後、BD Liquid
Counting Beads を加え、FACS Canto（BD）を用いて分析した。２年間保存した
海水中の全菌数は 10 3 ~104 cells/mL であり、その中で損傷していない膜を保持する生菌の割合は 5~8 割であった。本研究は、JSPS 科研費 26892024 及びクリ
タ水・環境科学財団の助成を受けて行われた。

Study on a new screening method of cell wall formation inhibitors using
emulsification as a detection index

Bacterial enumeration and live/dead discrimination in long-preserved
seawater by flow cytometry○Shinsuke Nerome, Yoshihiro Ojima, Masayuki Azuma(Dept. Appl. Chem. Bioeng., Grad. Sch. Eng., Osaka City Univ.)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, cell wall, antifungal agent, emulsification

3P-1p098 海洋微生物群集による有機化合物の変換過程：NMR を用いた網羅型解析○Yurika Takahashi1, Yukihiro Furusawa2, Toshiro Hata1, Hiromi Nishida1(1Fac. Eng., Toyama Pref. Univ., 2Dept. liberal arts, Toyama Pref. Univ.)

Key words

bacterial counting, flow cytometry, seawater, Toyama Bay

3P-1p100 家庭内使用タオルに生息する細菌によるバイオフィルム形成の解析○内宮 万里央 1, 伊達 康博 1,2, 坪井 裕理 1, 菊地 淳 1,2,3（1理研CSRS, 2横市大院・生命医, 3名大院・生命農）
mario.uchimiya@riken.jp○諸星 知広, 池谷 謙太, 池田 宰
（宇都宮大院・工）morohosi@cc.utsunomiya-u.ac.jp

海洋における従属栄養性の微生物群集は、水中に供給される有機化合物の約半分を消費する。そのため、微生物群集による有機化合物の変換過程を詳細に明らかにすることは、海洋の物質循環像を高度化する上で必要不可欠である。しかしながら、現場環境における有機化合物の変換過程は極めて多様であり、方法論的な制約からその全容を捉える試みは乏しかった。本研究では、近年急速に発達する核磁気共鳴(NMR)法による代謝物の網羅型解析手法を導入し、現場環境における有機化合物の変換過程を明らかにすることを目的とした。現場海水を採取し、海洋微生物が利用する主要な化合物として知られるグルコース（安定同位体炭素標識物）を添加したのち（終濃度 1 mmol C/L）、暗所・現場水温条件下で培養を行った。培養完了後、微生物画分を回収し、菌体内に含まれる代謝物を網羅解析した。その結果、培養開始から１日後には菌体内にグルコースおよびグルタミン酸の存在が検出され、微生物に取り込まれたグルコースが、解糖系および TCA 回路を経たのち、グルタミン酸まで変換されたことが示唆された。また、その１日後には、グルタミン酸の生産がさらに強まる（前日比 4.9倍）と共に、アルギニンに代表される他のアミノ酸も合成されていることが確認された。さらに、チミジンに代表される核酸構成種も検出され、微生物の細胞分裂に関わる化合物も合成されていることが確認された。以上のことは、
NMR 法を用いた解析手法を導入することで、現場環境における有機化合物の変換過程を網羅的に追跡することが可能であることを示しており、今後、本手法を様々な環境へ展開することで、海洋における有機物の変換過程に関する理解が飛躍的に高まることが期待される。

家庭で使用されるタオルに付着した細菌は、悪臭の原因となるなど日常生活において様々な悪影響を及ぼしている。しかしながら、タオル中に生息する細菌の菌種や付着メカニズムに関しては、ほとんど解明がなされていないのが現状である。本研究では、家庭で使用されたタオルから細菌を単離し、付着に関わるバイオフィルム形成を解析することを目的とした。まず、5 戸の家庭で使用したタオルから菌株を単離するとともに、培養を介さずに直接 DNA を抽出し、実際の細菌構成を解析した。その結果、培養可能な菌株と実際のタオル内の細菌構成には共通性が見られ、この中から Micrococcus 属細菌 4 株、Paracoccus
属細菌 2 株、Williamsia 属細菌 1 株、Brevundimonas 属細菌 2 株、Sphingomonas
属細菌 2 株をモデル細菌として選定した。これらのモデル菌株が形成するバイ
オフィルムについて、96 穴マイクロタイタープレートを用いた静置法により定量した。その結果、バイオフィルム形成量は菌株により大きく異なることが明らかとなった。次に、モデル細菌による複合バイオフィルム形成を調べるため、2 菌株を混合してバイオフィルムの定量を行った。その結果、モデル菌株の中でも Brevundimonas sp. AB1 株を特定の菌株と組み合わせることにより、それぞれ単独の場合と比較してバイオフィルム形成量が大幅に向上することが明らかとなった。さらに、蛍光顕微鏡による観察の結果、複合バイオフィルムは単独の場合と比較して非常に高密度で形成されていることが明らかとなった。

Microbial transformations of organic substrates using environmental
marine water analyzed by NMR metabolomics

Characterization of biofilm formation by isolates from towels for household
use○Mario Uchimiya1, Yasuhiro Date1,2, Yuuri Tsuboi1, Jun Kikuchi1,2,3(1RIKEN CSRS, 2Grad. Sch. Med. Life Sci., Yokohama City Univ., 3Grd. Sch.
Bioagr. Sci., Nagoya Unv.)

Key words

marine environment, microbe, metabolism, NMR○Tomohiro Morohoshi, Kenta Ikeya, Tsukasa Ikeda(Grad. Sch. Eng., Utsunomiya Univ.)

Key words

biofilm

304

環境工学，廃水処理技術

3P-1p101 テレフタル酸分解菌の取得とその性質○中島 鈴佳 1, 野中 大輔 1, 森田 穂 1, 内堀 孝博 3, 清 啓自 2,
中島 敏明 2
（1筑波大, 2筑波大院・生命環境, 3パナック工業）
nakajima.toshiaki.ga@u.tsukuba.ac.jp

3P-1p103 高濃度脂肪酸を効率的に分解する酵母の単離と挙動解
析法の検討○仲山 真美, 綾部 里美（SGラボラトリー）
info_sglab@ybb.ne.jp

PET 製品の処理等において、モノマーを含む廃液がしばしば生じる。その主成分はテレフタル酸とエチレングリコールであるが、活性汚泥による廃液処理においてテレフタル酸が残存し、その処理が特に問題となっている。テレフタル酸は市場価値が安く、精製及び再利用は採算が合わないため現在はコストをかけて処分されている。
本研究では、テレフタル酸を効率よく分解する微生物の取得およびこれを用いた廃水処理の効率向上を目的とする。
テレフタル酸を単一炭素源とする液体培地中に活性汚泥を加え、30 ℃、180 rpm
で数日間培養を行った。培養液の一部を同液体培地に再度植菌し、同条件で数日間培養した。これを同じくテレフタル酸を単一炭素源とする寒天平板培地に植菌し、テレフタル酸分解菌を二株単離した。このテレフタル分解菌を用いてテレフタル酸分解能の測定、16S rDNA 遺伝子解析を用いた簡易同定、最適塩濃度の検討を行った。
本実験ではテレフタル酸分解能を有する株のスクリーニングに成功した。得られた二株はともに 1 %のテレフタル酸 2 ナトリウムを 36 時間でほぼすべて分解することが可能であった。また簡易同定の結果、Pseudomonas 属であることがわかった。今後さらに pH、温度の最適条件を検討し、テレフタル酸分解量の向上を目指す。

【背景・目的】食品工場や飲食店等では、大量の食用油脂が排出されているが、自然分解しにくいため、排管の詰まりや悪臭を引き起こし、深刻な問題となっている。これまで当社では、微生物を廃油脂処理に応用するために、油脂（トリグリセリド）分解菌を取得し研究を行ってきたが、油脂濃度が上がるにつれて分解速度は低下することが分かっている。一般的に、反応生成物としての脂肪酸は、油脂分解反応を停滞させるのみならず、脂肪酸自体も濃度が高ければ油脂と変わらず問題を引き起こす原因となる。よって、高濃度油脂の分解を効率的に行うには、同時に積極的な脂肪酸分解を行う必要がある。しかし脂肪酸の存在は、廃水を酸性にするうえに、殺菌作用により通常の微生物の生育を困難にする。本研究では、高濃度脂肪酸存在下でも生育と分解が可能な微生物をスクリーニングした。
【方法・結果】各地の土壌サンプルについて複数種の液体培地を用いて集積培養
し、候補株の選抜を繰り返した結果、福岡県内のツバキの木の下の土壌より、
オレイン酸分解菌 HFA40-c 株を分離した。分離株を用いて、5%オレイン酸を含む液体培地にて２８℃で３日間培養後、Bligh-Dyer 法により油脂と脂肪酸を抽出し、薄層クロマトを行ったところ、油脂類は検出されず、完全分解したことが示された。菌体も同時に抽出しているため、菌体内への蓄積ではないと考えられる。分離株は、26S rDNA-D1/D2 の塩基配列により、 酵母の Candida
orthopsilosis と同定された。また、オレイン酸を唯一炭素源とする培地でも十分に増殖できることが分かっている。現場で応用するために,他の脂肪酸および分解の経時変化について試験し、分解を加速させる因子を探索した。さらに、環境中に投入した時に挙動を解析するためのリアルタイム PCR 法を用いた特異的検出方法の検討を行った。

Isolation and characterization of terephthalate-digrading bacteria

Isolation of high concentration fatty acid -degrading yeast and constructionof behavior analysis○Suzuka Nakajima1, Daisuke Nonaka1, Minori Morita1, Takahiro Uchibori3,
Keiji Kiyoshi2, Toshiaki Nakajima-Kambe2(1Univ. Tsukuba, 2Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 3Panac Ind. Inc.)

Key words

terephthalate, biodegradation, characterization, isolation

3P-1p102 P. pseudoflava および P. palleronii による芳香族化合物の生物分解に関する研究○Mami Nakayama, Satomi Ayabe(SG Laboratory Co., Ltd)Key words

yeast, fatty acid, degradation, wastewater treatment

3P-1p104 産業用リパーゼによる新規コポリエステルの生分解○廣田 泰志 1, 川西 琢也 1,2, 滝口 昇 1,2（1金沢大院・自科, 2金沢大・理工）
tackey@se.kanazawa-u.ac.jp○中屋 江梨花, モタカトラ ベンカテスワーレディ, 矢島 由佳,
張 傛喆（室工院・工・環境創生）
ychang@mmm.muroran-it.ac.jp[目的] バイオプラスチックをより安価な方法で生産するために毒性芳香族化合物を基質とした生産方法が提案されている。そこで、本研究ではバイオプラス
チック生成能を有する Pseudomonas pseudoflava 株（NBRC102511）および P.
palleronii 株 （ NBRC102513 ） の ア ル キ ル フ ェ ノ ー ル 類 お よ び Phenol 、 4chlorophenol、Naphthalene、Phenanthrene に対する分解能を検討した。これら化
学物質は、ヒトの健康や生態系に有害な影響を及ぼすことが知られている。
[方法] Phenol、4-chlorophenol、Naphthalene、Phenanthrene においては Mineral Salt
培地（MS 培地）、アルキルフェノール類については MS 培地に酵母エキスを少量加えた MSY 培地で 6 日間培養し、経時的に培養液を採取し、高速液体クロマトグラフ（HPLC）に供した。分解率を算出した後、分解率が 30％以下の化
学物質に対しては、非イオン性界面活性剤 Tween-80 を添加し同条件で再度実験を行った。Tween-80 は生物に対する影響が少なく、疎水性有機化合物の低い水
溶性を打消し、分解効率を高めることで知られている。
[結果および考察] P. pseudoflava 株を用いた場合、アルキルフェノール類、Phenol、Naphthalene、4-chlorophenol、Phenanthrene の分解率は 30％以下であった。一方、P. palleronii 株の場合は、Phenol と Phenanthrene をそれぞれ 88％と42％まで分解した。Phenol 分解における最適条件は、初発菌体濃度が OD600 で0.01、pH は 7.0、至適温度は 30 ℃、そして至適初発 Phenol 濃度は 100 mg/L であった。さらに P. palleronii 株がバイオプラスチックを生産しているかどうか確認するために透過型電子顕微鏡（TEM）により観察した結果、細胞内のバイオ
プラスチックが確認できた。以上の結果から P. palleronii 株が Phenol を用いてバイオプラスチックを産生していることが示唆された。

【背景と目的】PET に有機酸を共重合させた新規コポリエステルとして、デュポン社は APEXA(R)を開発した。APEXA(R)は、長期間における特定堆肥中での生分解が確認されており、PLA 等と比較して高い強度と耐熱性を有することから、CFRP 母材等の新しい工業分野に適用可能な生分解性樹脂である。一方で、芳香族環に起因する結晶構造により酵素分解を受けにくく、実用的な生分解速度は得られていないため、前処理を含めた新しい生分解プロセスが求められている。本研究では、Alcaligenes sp. 由来の産業用リパーゼを使用することで、
APEXA(R)の生分解を試みた。
【実験方法】樹脂としてペレット状の APEXA(R)4027、酵素として lipase QLM（名糖産業）を使用した。15 mL 遠心チューブに、ペレット 1 g と 0.1 M Tris-HCl
バッファー 4.5 mL を加えた後、5 g/L の酵素溶液 0.5 mL を添加して、各条件で反応を開始した。カルシウムイオンの効果として、バッファーに各濃度のCaCl2 を加えて同様に反応を行い、コントロールと比較した。分解度評価として、HPLC により分解生成物であるテレフタル酸（TPA）量を測定した。
【結果と考察】産業用リパーゼによる APEXA(R)の生分解が確認できた。カルシ
ウムイオンの添加により、APEXA(R)の加水分解が促進された。酵素の添加によって、コントロールの約 2 倍量の TPA が検出された。

A study on biodegradation of aromatic compounds with P. pseudoflava andBiodegradation of the new copolyester with industrial lipase

P. palleronii○Erika Nakaya, M Venkateswar Reddy, Yuka Yajima, Young-Cheol Chang(Grad. Sch. Eng., Muroran Inst. Technol.)Key words

P. palleronii, Bioplastics, Phenol○Yasushi Hirota1, Takuya Kawanishi1,2, Noboru Takiguchi1,2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Coll. Sci. Eng., Kanazawa Univ.)

Key words

biodegradable polymer, lipase, hydrolysis

環境工学，廃水処理技術

3P-1p105 都市排水を利用した微細藻類のバイオ燃料生産に向けた新規候補株の探索

305

3P-1p107 環境中の微生物群集がコウキクサの成長に及ぼす影響の評価○星川 優美子 1, 野島 大佑 1, 高野 博幸 2, 田中 剛 1（1農工大院・工, 2太平洋セメント）
tsuyo@cc.tuat.ac.jp○黒田 真史 1, 石澤 秀紘 1, 玉木 秀幸 2, 森川 正章 3, 池 道彦 1
（1阪大院・工, 2産総研・生物プロセス, 3北大院・環境）
kuroda@see.eng.osaka-u.ac.jp【背景と目的】バイオ燃料生産における培養プロセスの低コスト化を目的とし、多量の栄養源を含む排水の利用が注目されている。しかしながら、排水中では様々な生育阻害を受けることから、培養可能な株が制限されている。また排水中で生育可能な微細藻類のオイル含有量は他のバイオ燃料生産候補株と比べて低く、排水を用いたバイオ燃料生産を目的とした場合、既報の排水中で培養可能な株ではオイル生産性が不十分である。そこで本研究では、排水中で培養可能な新規のオイル高生産株の探索と生産性向上に向けたキャラクタリゼーションを目的とした。
【方法】オイル高蓄積株を含むカルチャーコレクション及び各種排水サンプル中から、高いバイオマス量及びオイル生産性を有する株のスクリーニングを実施した。更に最も高いオイル生産性を示した株について培養温度、光量、CO2 流
量などの培養条件の検討を行い、生産性向上を試みた。
【結果】スクリーニングの結果、カルチャーコレクション中より NKG 021201 株を獲得した。本株は 18S rDNA に基づく系統解析により Chlorella 属に属することが示唆された。またオレイン酸 (C18:1)を主成分とし、バイオ燃料生産候補株として十分に利用可能であることが示唆された。更に本株において培養条件を検討した結果、オイル生産性 は 57 mg/l/day、窒素及びリンの除去率は共に 80%以上となり、既報の株と比べて優位に高いことが確認された。本結果より都市排水を用いたバイオ燃料生産に向けた候補株となりえる NKG 021201 株を獲得し、オイル生産だけでなく、窒素及びリンの除去との統合プロセス設計への利用性が示唆された。今後、更に培養検討を行うことにより排水を利用したオイル生産株として期待できる。

【背景・目的】浮遊性の水生植物であるウキクサ亜科植物は、水中から窒素やリンを吸収して成長し、リグニン含量が低くタンパク質・デンプン含量が豊富な
良質のバイオマスを生産することから、資源生産を伴う植生浄化プロセスへの適用が期待されている。実環境中でのウキクサ亜科植物の栽培において、環境
微生物群集は植物の成長に大きく影響し得ることから、その作用を理解することは不可欠である。本研究では、環境中の微生物群集がコウキクサ（Lemna
minor）の成長に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。
【方法・結果】１５ヶ所の池や川から採取した環境水から回収した微生物群集をコウキクサに付着させ、培地中でコウキクサ成長への影響を調べたところ、7日後のコウキクサ個体数は、対照系である無菌コウキクサに対してそれぞれ-24%～14%に変化した。この実験系から単離した 3 株の成長促進細菌と 4 株の成長阻害細菌に、これまでに単離している成長促進細菌 Pelomonas saccharophila
MRB3 を加えた 8 株を、2 株ずつ組み合わせて懸濁した培地中でそれぞれコウ
キクサの成長を調べたところ、成長促進細菌と成長阻害細菌を組み合わせた場
合のほとんどでコウキクサの成長は阻害されたことから、環境中で成長阻害細菌は促進細菌に優先してコウキクサの成長を制御していることが示唆された。
また、本試験に用いた成長促進細菌のうち唯一、Aquitalea sp. H3 はいずれの成長阻害細菌と組み合わせた場合でも成長促進効果を発揮したことから、植生浄化プロセスへの適用が有望な細菌であると考えられた。

Screening of the candidate microalgae for biofuel production using
municipal wastewater

Effect of environmental microbial communities on the growth of duckweed
Lemna minor○Yumiko Hoshikawa1, Daisuke Nojima1, Hiroyuki Takano2, Tsuyoshi Tanaka1(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Taiheiyo Cement Corp.)

Key words
algae

Biofuel production, municipal wastewater, nutrient removal, green

3P-1p106 Pelomonas saccharophila MRB3 によるコウキクサ成長促進効果の検討○加地 由季子 1, 黒田 真史 1, 玉木 秀幸 2, 池 道彦 1
（1阪大院・工, 2産総研・生物プロセス）
ike@see.eng.osaka-u.ac.jp○Masashi Kuroda1, Hidehiro Ishizawa1, Hideyuki Tamaki2, Masaaki Morikawa3,
Michihiko Ike1
(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2BRI. AIST, 3Grad. Sch. Environ. Sci., Hokkaido
Univ.)

Key words

microbial community, biomass, duckweed, wastewater treatment

3P-1p108 FISH 法と定量 PCR 法による国内下水処理施設におけるバルキング関連糸状性細菌の探索○新田見 匡 1, 庄司 仁 2, 野口 愛 3, 押木 守 4, 黒田 真史 5,
金田一 智規 6, 福田 淳二 1, 栗栖 太 7（1横国大院・工, 2成蹊大・理工, 3金沢大・理工, 4長岡高専・環境都市, 5阪大院・工, 6広島大院・工, 7東大院・工）nittami@ynu.ac.jp【背景と目的】Pelomonas saccharophila MRB3 は、コウキクサ（Lemna minor）と共生し、その成長を促進する Plant Growth-Promoting Bacteria（PGPB）候補菌株として、ミソハギ（Lythrum anceps）根圏から単離された。コウキクサはウキク
サ亜科植物の一種であり、その成長過程で富栄養化の原因となる水中の窒素・リンを吸収するうえ、バイオマスとしても有用な水生植物である。したがって、
コウキクサと MRB3 株の共生関係を利用することで、コウキクサによる水中の窒素・リン除去及びバイオマス生産プロセスを効率化できると考えられる。本
研究では、MRB3 株がコウキクサの成長に与える影響を種々の条件下で調べ、そのウキクサ亜科植物 PGPB としての有用性を評価することを目的とした。
【方法と結果】MRB3 株を懸濁した A&H 培地中でコウキクサを 14 日間栽培した場合、葉状体数の増加量が無菌の系と比べ約 1.9 倍となり、コウキクサに対し高い成長促進効果を発揮することが示された。また、培養液中の硝酸イオン
濃度の経時変化を測定した結果、MRB3 株を懸濁した系で除去速度が上昇した。
培養液中のリン酸イオンについては、MRB3 株を懸濁した系において実験開始
直後に一時的な濃度の上昇がみられた。これは、MRB3 株のリン可溶化能により、培養液中の難溶性リンが可溶化されたためと推測された。さらに、実験終了時の植物体中の全窒素、全リン含有率についても、MRB3 株を懸濁した系においてそれぞれ無菌の系の約 1.3 倍、1.7 倍となり、コウキクサが吸収した窒素・リンが植物体中に高濃度で蓄積されることが示された。以上の結果から、
MRB3 株によるコウキクサの成長促進、及び窒素・リンの吸収促進効果を確認することができた。

【背景と目的】 糸状性細菌により誘引される活性汚泥のバルキングは、廃水処
理施設における未解決問題の一つである。糸状性細菌の多くは FISH 法などの顕微鏡観察によりその特定が可能となってきた。しかし各種糸状性細菌によるバルキングへの寄与を定量的に調べた研究は少ない。本研究では、国内の都市下水処理施設を対象に、バルキングに関連する主要な糸状性細菌を選別し、同細菌とバルキングの指標である汚泥容量指標（SVI）との定量的な関係について調べることを目的とした。
【方法】 都市下水処理場 4 施設より活性汚泥試料を採取し、既存のプローブを使った FISH 法により各種糸状性細菌を観察した。次に FISH 法による観察で
SVI との関連がみられた糸状性細菌を対象に、PCR プライマーをデザインし、
FISH 法に供した試料を含む 9 道府県の都市下水処理 13 施設の試料に対して定量 PCR を行った。
【結果と考察】 4 施設を対象とした FISH 調査において、その出現数が SVI の高低と関連する Kouleothrix 属糸状性細菌を特定した。次に 13 施設を対象とした
Kouleothrix の定量 PCR を行ったところ、Kouleothrix の遺伝子コピー数が 105
copies/ng-DNA を超える場合には、汚泥の SVI がほぼ 200 mL/g-sludge 以上の高い値を示す結果を得た。これは Kouleothrix の増殖がバルキングを誘引することを示す定量的な情報であった。しかし解析した汚泥試料の中には、Kouleothrixの遺伝子コピー数が 103 copies/ng-DNA 程度と少ないにも関わらず、200 mL/gsludge 以上の高い SVI を示すものもあった。単一の糸状性細菌の定量のみでバルキングの発生を説明する難しさを示す結果であった。

Growth promotion of Lemna minor by an aquatic plant rhizobacterium
Pelomonas saccharophila MRB3

Exploration of filamentous bacteria associated with bulking in Japanese
WWTPs by FISH and qPCR

○Yukiko Kaji1, Masashi Kuroda1, Hideyuki Tamaki2, Michihiko Ike1
(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2BRI. AIST)

Key words
biomass

Plant Growth-Promoting Bacteria, Duckweed, phytoremediation,○Tadashi Nittami1, Tadashi Shoji2, Mana Noguchi3, Mamoru Oshiki4,
Masashi Kuroda5, Tomonori Kindaichi6, Junji Fukuda1, Futoshi Kurisu7(1Grad. Sch. Eng., Yokohama Natl. Univ., 2Fuc. Sci. Tech., Seikei Univ., 3Inst. Sci.
Eng., Kanazawa Univ., 4Dept. Civil Eng., Nat. Inst. Technol. Nagaoka Coll., 5Grad.
Sch. Eng., Osaka Univ., 6Grad. Sch. Eng., Hiroshima Univ., 7Grad. Sch. Eng., Univ.
Tokyo)
Key words
activated sludge bulking, Kouleothrix filamentous bacteria, qPCR,
wastewater treatment

306

環境工学，廃水処理技術／バイオマス，資源，エネルギー工学

3P-1p109 Development of P/Ag/Ag2O/Ag3PO4/TiO2thin film

modified by polyethylene glycol for water treatment

3P-1p111 Inactivation of Escherichia coli using P/Ag/Ag2O/

Ag3PO4/TiO2 photocatalyst under LED irradiation○Na Liu, Qi Zhu, Ruida Xiao, Yingnan Yang
(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)yo.innan.fu@u.tsukuba.ac.jp○Qiansu Ma, Zetao Dong, Qi Zhu, Xiaohong Hu, Yingnan Yang
(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)yo.innan.fu@u.tsukuba.ac.jp

Currently, TiO2 has drawn worldwide attention for water treatment due to its highefficiency and low toxicity. Many researchers have studied the modification of TiO2 bydoping with nonmetal elements, metals and semiconductors, in order to enhance its
photocatalytic ability. In our previous study, an efficient P/Ag/Ag2O/Ag3PO4/TiO2
photocatalyst thin film was developed. Polyethylene glycol (PEG), known as binder,
dispersant and structure-directing reagent, to prepare nano-crystalline particles wasused to further improve the stability of thin film by creating smaller particle size andenhancing light absorbance under visible irradiation. The synthesization of PEG
modified thin film was optimized by investigating the effects of dosage, calcination
temperature, calcination time and number of coating layers. The result indicated that
1.0 g/L of PEG modified thin film with two coating layers; calcinated under 350℃ for
2 hours had the highest photocatalytic ability. Comparing with non-modified thin film,
the PEG modified composite film exhibited wider visible light absorption spectrum,
higher stability and photocatalytic activity, which can be used for practical applicationsof water treatment.

Nowadays, water pollution by pathogenic microorganisms has become a big problem.
Unfortunately, all of conventional water disinfection methods, including chlorination,ozonation and ultraviolet treatment have some disadvantages, such as high cost andformation of by products with potential carcinogenicity. Among the processes indeveloping, semiconductor photocatalysis has emerged as a very attractive technology
for water disinfection due to its superior oxidation ability, low cost, nontoxicity andstability. According to our previous studies, a novel P/Ag/Ag2O/Ag3PO4/TiO2
photocatalyst has demonstrated promising aspects with remarkable efficiency indecomposing organic matter. In this study, the efficiency of photocatalytic inactivationof Escherichia coli under LED irradiation by using the novel photocatlyst and normal
TiO2 photocatalyst was examined. P/Ag/Ag2O/Ag3PO4/TiO2 photocatalyst showed
higher bactericidal activity than other photocatalysts and could completely inactivate
107 cfu mL-1 of Escherichia coli in just 5 min. The present results suggest that this new
photocatalyst material could greatly facilitate water disinfection effectively.

Development of P/Ag/Ag2O/Ag3PO4/TiO2thin film modified by polyethylene
glycol for water treatment

Inactivation of Escherichia coli using P/Ag/Ag2O/Ag3PO4/TiO2 photocatalyst
under LED irradiation

Key words
photocatalysis, P/Ag/Ag2O/Ag3PO4/TiO2 thin films, photocatalytic
stability, polyethylene glycol

Key words

3P-1p110 Improvement of silver modified TiO2 solar-light-driven

3P-1p112 気生微細藻類 Vischeria helvetica の脂質生合成を制御す○Qiansu Ma, Zetao Dong, Qi Zhu, Xiaohong Hu, Yingnan Yang
(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

photocatalyst by hydrothermal method○Na Liu, Qi Zhu, Ruida Xiao, Yingnan Yang
(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

P/Ag/Ag2O/Ag3PO4/TiO2 photocatalyst, Escherichia coli, disinfection

るストレス応答 シグナル伝達○油井 信弘, 阿部 克也（工学院大・先進工・生化）
bt10335@ns.kogakuin.ac.jp○Zhu Qi, Xiaohong Hu, Mishma Silvia Stanislaus, Yingnan Yang
(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)yo.innan.fu@u.tsukuba.ac.jp

TiO2-based photocatalysis has been attracting enormous interest as one of the mostpromising technologies for environmentally benign water purification owing to its
relatively high photocatalytic activity, non-toxicity and low cost. Nevertheless, somedrawbacks have been found in practical application: the fast recombination ofphotogenerated electron-hole pairs, large band gap, low utilization of solar light andsmaller specific surface area. In this study, silver salts were used to modify TiO2 todevelop a solar-light-driven photocatalyst, and hydrothermal method was use forfabrication. The activity of photocatalyst was evaluated by structure analysis anddegradation effect of organic waste. Compared to the TiO2-based photocatalysts
prepared by other method, hydrothermal synthesized material exhibited larger specificsurface area and much higher photocatalytic activity under solar light. The present
work shows hydrothermal method could be an effective way for the development ofhighly efficient solar-light-driven photocatalysts on water purification.

【目的】微細藻類には、窒素源欠乏が引き金となりシストを形成するとともに脂質（カロテノイドや脂肪酸）を高濃度に蓄積する種が存在する。演者らは、脂質蓄積能が高い気生微細藻類に対し、生物活性物質を用いたカロテノイド生合
成と脂肪酸生合成との代謝スイッチングによる物質生産について検討している。
本報告では、気生微細藻類の脂質生合成を制御するストレス応答シグナル伝達について、生物活性物質を用いて検討した結果を述べる。
【方法】気生微細藻類は、真正眼点藻綱 Vischeriahelvetica KGU-Y001 を用いた。
窒素源添加または無添加の Bold’s Basal 培地に MAPK（p38、JNK または ERK）
阻害剤を添加し、光強度 40（通常光）または 200（強光） μmol photons m-2 s-1
で振とう培養した。生物活性物質の輸送体としてサポニンを用い、濃度を 0.1％とした。有機溶媒で脂質成分を十分に抽出し、HPLC と分光光度計でカロテノ
イドとクロロフィルを、GC で脂肪酸をそれぞれ分析した。
【結果と考察】生育条件下（窒素源添加、通常光）で MAPK 阻害剤を添加し１日間培養した後に、７日間ストレス培養（窒素源無添加、強光）したところ、
ERK を添加した場合に脂質蓄積量の顕著な変化が示された。すなわち、コント
ロールと比べ、カロテノイドとクロロフィル含有量はそれぞれ 82 と 98％減少
し、脂肪酸含有量は 500％増加した。一方、p38 阻害剤を添加した場合にはカロ
テノイド含有量は 50％増加し、脂肪酸含有量は 23％減少することが分かった。
おそらく、藻細胞の増殖時期と環境ストレスによってカロテノイドと脂肪酸の生合成に関わるストレス応答シグナル伝達が切り換わったと考えられる。今後
は、細胞内タンパク質のリン酸化状態とその経時変動を定量解析し、細胞周期やシスト形成と脂質の代謝との関係について調べる。

Improvement of silver modified TiO2 solar-light-driven photocatalyst byhydrothermal method

Regulation of lipid biosyntheses by stress response signaling in aerial
microalgae○Zhu Qi, Xiaohong Hu, Mishma Silvia Stanislaus, Yingnan Yang
(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

photocatalysis, Ag modified TiO2, hydrothermal method○Nobuhiro Aburai, Katsuya Abe(Dept. Chem. Life Sci., Sch. Adv. Eng., Kogakuin Univ.)

Key words

aerial microalgae, lipid, bioactive compound, stress response signalingバイオマス，資源，エネルギー工学

3P-1p113 低温・弱光において生育可能な気生微細藻類の探索と特
徴づけ

307

3P-1p115 Effects of photocatalytic pretreatment on Chlorella
vulgaris to enhance biohydrogen production○Mishma Silvia Stanislaus1, Qi Zhu1, Chenyu Zhao1,
Nobuaki Negishi2, Yingnan Yang1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2AIST)
yo.innan.fu@u.tsukuba.ac.jp○西田 章弘, 油井 信弘, 阿部 克也（工学院大・先進工・生化）
bt10335@ns.kogakuin.ac.jp【目的】屋外における微細藻類の大型培養法は、一年中温暖な気候ではない場合
や培養槽の深さによっては光強度が不足する場合において問題が生じる可能性がある。そこで演者らは、山岳地帯の基物表面上で生活する気生微細藻類に注目した。その光合成微生物は温度・光ストレスを受けるため厚いビロード状のコロニーを形成し、内側には光が当たりにくい部分が存在すると考えられる。
そのため、低温・弱光で生育できる種が期待される。本報告では、低温・弱光において生育可能な気生微細藻類の探索と特徴づけについて述べる。
【方法】気生微細藻類は東京都奥多摩地区の壁面上から採集した。採集したビロード状のコロニーを寒天培地に植菌し、コロニーが形成するまで静地培養した。培養後、コロニーを滅菌水で希釈し、マイクロピペット法によって顕微鏡下で藻細胞を 1 個体に分けた。単離した藻細胞は、48 穴マイクロプレートを用いて光強度 15 μE m-2 s-1、温度 15±1℃の条件下で 1 週間培養した。細胞増加度は分光学的に測定した濁度から求めた。脂肪酸分析はガスクロマトグラフィー
を用いて行った。
【結果と考察】マイクロピペット法によって単離操作を行った結果、直径 10 μm程度の球状や楕円の藻細胞が 5 種得られた。それらの藻細胞を低温・弱光において培養したところ、すべて増殖することが分かった。中には細胞増加度が 2.5倍を示すものもあった。細胞増加度が最も高かった藻株の脂肪酸蓄積量は、3週間培養で 11％、5 週間培養で 24％に達した。興味深いことに、エイコサペン
タエン酸が 3 週間培養で 15％含まれていた。また脂肪酸組成については、5 週間培養でパルミトレイン酸とパルミチン酸の割合が 2 倍、オレイン酸が 30 倍高
くなることが分かった。

Biohydrogen being a clean energy has drawn worldwide attention and researches havebeen carried out to make it a sustainable energy for the future. Biohydrogen frombiomass has drawn particular interest due to its eco-friendly and cost effective nature.
However, pretreatment and availability of biomass are a few constraints. Thermal,acid, alkali and ultrasonic pretreatment methods have been investigated as pretreatment
methods of Chlorella, but all of them are energy intensive processes. Therefore, in thisresearch we propose to use a newly developed photocatalyst material (P/Ag/Ag2O/
Ag3PO4/TiO2), which has shown high photocatalytic ability under simulated solar light.
This material was coated on glass tubes and used for photocatalytic pretreatment of
Chlorella vulgaris for enhanced hydrogen production. On treating Chlorella vulgaris(150 ml) the protein and carbohydrate concentration increased exponentially in 60 hr.
This showed that the photocatalytic pretreatment was effective in breaking down thealgal cell walls and releasing the components into the solution. Also, on subjecting thephotocatalytic pretreated algae to fermentation generated higher hydrogen than thealgae with no pretreatment. Conclusively, P/Ag/Ag2O/Ag3PO4/TiO2 photocatalyst canserve as an appropriate material for photocatalytic pretreatment of biomass like
Chlorella. Furthermore, photocatalysis can be used as a cost effective pretreatment
method for practical application.

Isolation of aerial microalgae grown under lower temperatures and lightintensities.

Effects of photocatalytic pretreatment on Chlorella vulgaris to enhancebiohydrogen production○Akihiro Nishida, Nobuhiro Aburai, Katsuya Abe(Dept. Chem. Life Sci., Sch. Adv. Eng., Kogakuin Univ.)

Key words
fatty acidaerial microalgae, lower temperatures and light intensities, isolation,

3P-1p114 塩ストレス下におけるウキクサデンプン合成代謝の特徴とそのデンプン増産への応用○Mishma Silvia Stanislaus1, Qi Zhu1, Chenyu Zhao1, Nobuaki Negishi2,
Yingnan Yang1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2AIST)

Key words
Biohydrogen, Chlorella vulgaris, photocatalytic pretreatment, P/Ag/
Ag2O/Ag3PO4/TiO2 photocatalyst

3P-1p116 オイル高蓄積海洋珪藻 Fistulifera solaris におけるオイル
ボディタンパク質の解析○野島 大佑, 吉野 知子, 田中 剛
（農工大院・工）tsuyo@cc.tuat.ac.jp○高木 航平, 李 彦, 遠山 忠, 森 一博
（山梨大院・医工総）ttohyama@yamanashi.ac.jp【背景と目的】ウキクサ亜科植物は生成速度が高く、食糧食物と競合しないこと、そしてデンプン含有率が比較的高いことから次世代のデンプン系バイオマ
スとして近年注目されている。ウキクサのデンプン含有率をさらに向上させることができれば、高効率で魅力的なデンプン資源生産が可能になる。一方、貧栄養や低塩などの環境ストレス下でウキクサのデンプン蓄積が誘導されることが知られている。本研究では塩ストレス下でのウキクサ（Spirodela polyrhiza）の生育特性とデンプン蓄積特性を検討した。
【方法と結果】ウキクサを 0～300 mM NaCl が含まれた培養液に浮かべて生育させ、デンプン含有率、クロロフィル含有率、バイオマス生産を経時的に測定した。その結果、NaCl 存在下においてウキクサは生育 24 時間以内にデンプン蓄積を誘導した。そのデンプン蓄積率は、200 mM NaCl 濃度までは NaCl 濃度依
存的に高まった。200 mM NaCl 存在下のウキクサは生育 2 日後にデンプン含有率が 37%に達し、これは NaCl 非存在下ウキクサの約 2 倍であった。一方、NaCl
存在下ではウキクサの生育や光合成が阻害され、特に 200 mM NaCl 以上では著しい生育阻害が確認された。このような塩に対する応答を経て、200 mM NaCl
存在下でウキクサを生育させることによって、デンプン生産性を 2 倍以上高めることを実証した。現在は、塩ストレス下でウキクサのデンプン合成代謝遺伝
子群の発現解析を実施し、分子基盤解明を進めている。

【背景と目的】オイル高蓄積珪藻 Fistulifera solaris は、最大で 65%のオイル含有量を有し、バイオ燃料生産候補株として非常に有用である。細胞内で合成されたオイルはオイルボディと呼ばれるオルガネラに保存される。このオルガネラ
上には多数のタンパク質が存在し、その形成やオイルの分解に関与していることが報告されているが、微細藻類における知見はほとんどない。そこで本研究では F. solaris からこれらタンパク質を分離・同定し、その機能解析を行った。
【方法】培養した F. solaris からガラスビーズを用いて細胞破砕を行い、オイル
ボディを単離した。単離したオイルボディ中からタンパク質を分離し、nanoLCMS を用いてタンパク質の同定を行い、in silico 解析によりオイルボディ関連タ
ンパク質の予測を行った。続いて GFP を融合したタンパク質を発現するベクターを構築し、細胞内での局在観察を行った。更に予測された機能に関連する阻害剤を用いて、オイルボディ形成に与える影響を評価した。
【結果】オイルボディを単離し、nanoLC-MS により同定を行った結果、全 73 オ
イルボディ関連タンパク質候補を獲得した。この中から更にオイルボディ上に局在している可能性の高いタンパク質を絞り込み、GFP 融合による局在解析を実施した。その結果、2 つのタンパク質においてオイルボディ上に GFP 蛍光を観察することが出来た。また複数の膜輸送関連タンパク質が同定され、これらのタンパク質がオイルボディ形成に関与している可能性が示唆された。

Starch synthesis by duckweed under salt stress and its application forenhancing starch production

Identification of oil body proteins from Fistulifera solaris for elucidation oilbody formation○Kohei Takagi, Yan Li, Tadashi Toyama, Kazuhiro Mori
(Grad. Sch. Med. Eng., Univ. Yamanashi)

Key words

duckweed, salt, starch-production○Daisuke Nojima, Tomoko Yoshino, Tsuyoshi Tanaka(Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words

Fistulifera solaris, Oil body, proteomics, biodiesel fuel308

バイオマス，資源，エネルギー工学

3P-1p117 明暗周期下で効率的に油脂を生産するための海洋性緑藻培養技術の開発

3P-1p119 ミトコンドリア電子伝達系制御によるユーグレナ低酸素
下ワックスエステル生産の調節○藤原 悠右 1, 加藤 悠一 1, 賀 詩欣 2, 蓮沼 誠久 1, 近藤 昭彦 1
（1神戸大院・科学技術イノベーション, 2Harbin Institute ofTechnology, China）
akondo@kobe-u.ac.jp○中澤 昌美 1,2, 太田 剛志 1, 石川 孝博 2,3, 上田 光宏 1, 阪本 龍司 1,
乾 博 2,4, 中野 長久 1, 宮武 和孝 1,5（1阪府大院・生環科, 2JST・CREST, 3島根大院・生資科, 4阪府大院・総リハ, 5帝塚山学院大・人間科）
mami@biochem.osakafu-u.ac.jp

近年、微細藻類を用いた液体燃料・有用物質生産技術の開発が進められている。
我々は油脂蓄積能の高い海洋性緑藻 Chlamydomonas sp. JSC4 株を用い、バイオディーゼルの原料となるトリアシルグリセロールのラボスケールでの生産試験を実施してきた。しかし、これまでは連続的に光を照射する条件（継続光）で生産試験を行ったのみであり、昼夜（明暗周期）が存在する場合に油脂生産がどのような影響を受けるかは明らかではなかった。本研究は屋外での培養を想定し、明暗周期下での油脂生産の検証と培養条件の最適化を目的とした。
【結果】
12 時間明期の明暗周期下で JSC4 株の培養を行い、バイオマス生産量・油脂含有率・炭水化物含有率を測定した。24 時間明期の条件と比較すると、明暗周期
条件では油脂含有率および油脂生産量が低下し、一方で炭水化物含有率は増加した。明暗周期による油脂含有率低下を克服する手段の一つとして、我々は暗期における弱光照射の技術を開発した。暗期において弱光を継続的に照射することで油脂含有率が増加し、炭水化物含有率が低下した。加えて、明暗周期による油脂含有率の低下のメカニズムを解明するため、代謝物量および遺伝子発現量の網羅的解析を現在行っており、本発表で報告する予定である。
【考察】
本研究は、明暗周期下での油脂生産における課題の抽出を行い、それに対する解決策のひとつを見出した。屋外で油脂生産培養を実施する際には、暗期弱光照射が有効な手段として期待できる。

微細藻類ユーグレナは好気条件において、余剰の炭素を貯蔵多糖パラミロン（β-1,3 グルカン）として蓄積する。低酸素状態に曝露すると、パラミロンを速やかに分解し、脂肪酸‐脂肪アルコールエステルであるワックスエステル（WE）
へと変換する。ユーグレナ WE を輸送用燃料として実用化するには、生産量およびコスト面の改善が不可欠である。我々は、WE 生産を向上させる因子を獲得すること、およびそれを可能とする代謝メカニズムの解明を通じて、WE 高生産への新たな方法論を確立することを目指した。WE を構成する脂肪酸・ア
ルコールは主に炭素長が 10 から 16 の飽和化合物であり、炭素数が奇数の分子も多く含まれている。従来の代謝予測において、奇数鎖脂肪酸・アルコール合
成起点となるプロピオニル-CoA 合成には、ミトコンドリア電子伝達系の関与が必要であることが示唆されてきた。本研究では、ミトコンドリア電子伝達系を薬剤により調節し、ユーグレナの低酸素下代謝に及ぼす影響を調べた。
ミトコンドリア電子伝達系複合体 I 阻害剤ロテノン、低酸素下での複合体 II 阻
害剤パモ酸ピルビニウム、複合体 III 阻害剤アンチマイシン、および膜のプロトン勾配を解消する脱共役剤 CCCP を作用させ、低酸素処理後のパラミロンの分解および WE 生産を解析した。アンチマイシンは低酸素下パラミロン、WE 代
謝に全く影響しなかった。ロテノン、パモ酸ピルビニウム、CCCP 添加は、低酸素下パラミロン分解を亢進した。このとき、ロテノンおよびパモ酸ピルビニ
ウム添加群では、WE 生産量が低下しており、パラミロン由来の炭素が WE 以
外の経路で代謝されていることが示唆された。これに対して、CCCP 添加群ではコントロール群と比べ WE 生産量が 2 倍以上に増加していた。現在、これらの現象の原因となる細胞内代謝変動理解のために、細胞内 ATP および酸化還元
バランスの解析を進めている。

Development of lipid production strategy using the oceanic green alga underlight and dark cycles

Regulation of mitochondrial ET system improved wax ester production in○Yusuke Fujihara1, Yuichi Kato1, Shih-Hsin Ho2, Tomohisa Hasunuma1,
Akihiko Kondo1(1Grad. Sch. Technol. Innov., Kobe Univ., 2Harbin Institute of Technology, China)

Key words

Light dark cycles, microalgae, Lipid production, Metabolomics

3P-1p118 海藻由来好熱菌を用いた海藻分解プロセスの検討

藤井 健太 1, 奥中 淳平 2, 冨永 有里絵 1, 八木 寿梓 3, ○大城 隆 1,
鈴木 宏和 1
（1鳥取大院・工・化生応工, 2鳥取大・工・生応工, 3鳥取大・工・GSC）
hirokazusuzuki@bio.tottori-u.ac.jp

Euglena gracilis○Masami Nakazawa1,2, Tsuyoshi Ohta1, Takahiro Ishikawa2,3, Mitsuhiro Ueda1,
Tatsuji Sakamoto1, Hiroshi Inui2,4, Yoshihisa Nakano1, Kazutaka Miyatake1,5(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ., 2CREST, JST, 3Grad. Sch. Life
Environ. Sci., Shimane Univ., 4Grad. Sch. Compr. Rehabil., Osaka Pref. Univ.,
5
Tezukayama Gakuin Univ.)
Key words
Euglena gracilis, biofuel, wax ester, mitochondria

3P-1p120 ラン藻スピルリナからの高生産エタノール変換プロセスの開発○藍川 晋平 1, 猪熊 健太郎 1, 若井 暁 1, 佐々木 建吾 1, 蓮沼 誠久 1,
近藤 昭彦 1,2
（1神戸大院・イノベ, 2神戸大院・工）akondo@kobe-u.ac.jp【目的】バイオマスを糖化する好熱菌は，高温糖化プロセスに利用できると考えられ，また高温プロセスには病原菌増殖抑制などといった長所がある。このことから我々は好熱菌を基盤とした高温バイオマス分解系の開発に取り組んでおり ， 以 前 の 研 究 に お い て 褐 藻 多 糖 類 を 資 化 で き る 好 熱 菌 Geobacillus
thermodenitrificans OS27 を海藻から単離した。本大会では，OS27 株および OS27
遺伝子改変体の海藻分解能について報告する。
【実験】市販ワカメを褐藻材料として使用した。培養は 60°C で好気的に行った。Geobacillus-E. coli シャトルプラスミドにセルラーゼ遺伝子をクローニング
し，得られたプラスミドで OS27 株を形質転換した。培養液中の糖質は，フェノール硫酸法を用いて定量した。
【結果と考察】粉砕ワカメを含む最少培地中で OS27 を培養したところ，細胞濃度が 100 倍程度増加した。その際の細胞密度は LB 培地中での増殖と比べると1/1000 程度であったが，本結果は OS27 株がワカメを栄養源として増殖できることを示す。興味深いことに，培養過程において培地中ワカメは半分程度の大きさに微粒子化していた。OS27 株を含まない培養液においても，若干の微粒子化が見られたが，OS27 を含む培地中での微粒子化が顕著であった。OS27 株
は，アルギン酸と可溶化セルロースを資化できることから，当該ワカメ分解は
褐藻多糖類の分解を通じて起こっていると考えられる。細胞増殖が向上した場
合のワカメ分解を調べるために，カザミノ酸とワカメ粉砕物を含むリン酸バッ
ファー中で培養したところ，ワカメの微粒子化は更に加速した。その過程では可溶化糖質も増加した。以上の結果は，OS27 株が褐藻バイオマスの高温糖化プロセスに有用である可能性を示唆している。現在，セルラーゼ遺伝子を高発現する OS27 株組換え体を用いた海藻分解も検討している。

新たなバイオマス資源として，ラン藻や微細藻類が注目され，その光合成産物であるグリコーゲンやデンプンを糖質源としたエタノール生産プロセスが開発されてきた．しかし，従来法では，発酵工程の前に，細胞内からデンプンやグ
リコーゲンを抽出し，それらを微生物に資化させるためにグルコースへと糖化する必要があった．我々は細胞破砕が容易なラン藻 Arthrospira platensis（スピルリナ）に注目した．そして，細胞内からのグリコーゲンの抽出を促進するリゾチームとグリコーゲンを糖化し，利用できるアミラーゼ発現酵母を用いることで，スピルリナをエタノールへと直接変換するプロセスを開発した．従来法で必要であったグリコーゲンの抽出と糖化の工程を発酵工程に統合することに成功した．しかし，グリコーゲンの抽出に時間がかかり，酵母へのグルコースの供給が遅いため，エタノール生産速度が低いことが問題であった．これまでに大腸菌では金属塩により細胞外多糖を除去することで，細胞内で生産された
組換えタンパク質の分泌量が増加することが報告されている．我々は，スピル
リナからのグリコーゲン抽出も細胞外多糖の除去により促進されるのではないかと考え，金属イオンがスピルリナの細胞外多糖の除去およびグリコーゲンの抽出に及ぼす影響を調べた．その結果，100 mM CaCl2 により，細胞外多糖が剥離し，グリコーゲン抽出が促進された．そして， CaCl2 とリゾチーム存在下でアミラーゼ発現酵母によるスピルリナからの直接エタノール生産を行ったところ，エタノール生産速度が 1 g/L/h まで向上し，48 g/L のエタノールを理論値の93%の収率で生産できた．金属塩による細胞外多糖の除去により，エタノール
生産速度を大幅に向上させることに成功し，従来法と比べて，高収率，高収量，
高生産速度のエタノール生産プロセスを開発できた．

Evaluation of seaweed degradation processes using a thermophile

High-productive conversion of cyanobacteria Arthrospira platensis toethanol

Kenta Fujii1, Jyumpei Okunaka2, Yurie Tominaga1, Hisashi Yagi3,○Takashi Ohshiro1, Hirokazu Suzuki1(1Dept. Chem. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Tottori Univ., 2Dept. Biotechnol.,Tottori Univ., 3GSC, Faculty of Eng., Tottori Univ.)
Key words

macroalga, degradation, Geobacillus thermodenitrificans, thermophile○Shimpei Aikawa1, Kentaro Inokuma1, Satoshi Wakai1, Kengo Sasaki1,
Tomohisa Hasunuma1, Akihiko Kondo1,2(1Grad. Sch. Sci. Tech. Innov. Kobe Univ., 2Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)

Key words

Glycogen, cyanobacteria, calcium, ethanol

バイオマス，資源，エネルギー工学

3P-1p121 藍藻 Synechocystis sp. PCC 6803 hox 遺伝子変異株のコ
ントロールされた培養条件における有機酸生産309

3P-1p123 II-VI 族化合物半導体結晶を合成する光合成細菌のスク
リーニング○清水 稜, 富永 依里子, 岡村 好子（広島大院・先端物質）
okamuray@hiroshima-u.ac.jp○中島 満晴 1, 飯嶋 寛子 1, 白井 智量 2, 岡本 真美 2, 蓮沼 誠久 3,
近藤 昭彦 2,3, 平井 優美 2, 小山内 崇 1,2（1明治大・農, 2理研・CSRS, 3神戸大院・工）tosanai@meiji.ac.jp

シアノバクテリアは双方向触媒性の[NiFe]型ヒドロゲナーゼを有し、同酵素は水素生産に関わっていることが知られている。シアノバクテリアにおけるヒド
ロゲナーゼの生理学的役割はよくわかっていないが、これまでの研究により嫌気培養条件下においては、電子伝達の調節する役割を有することが示唆されている。また、このヒドロゲナーゼは HoxEFUYH の５つのサブユニットから構成される。これらのサブユニットのうち、HoxEFU はジアフォラーゼ反応、
HoxYH はヒドロゲナーゼ反応に関与していることが明らかになっており、HoxH
は触媒活性に必須であることが知られている。そこで、本研究では、非窒素固定型単細胞藍藻 Synechocystis sp. PCC 6803（Synechocystis 6803）で hoxH の発現量が低下した hoxH 変異株を、暗所、嫌気条件下で培養し、同株における代謝物の解析と遺伝子の転写解析を行った。その結果、コハク酸をはじめとする有機酸と、 糖リン酸の生産量の増加が見出された。さらに、糖代謝に関わる RNA
ポリメラーゼシグマ因子である SigE と 6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの転写量・タンパク質量が、野生株よりも増加していた。このことから、hoxH遺伝子が Synechocystis 6803 の糖代謝の制御と有機酸生産に重要な役割を果たしていることが明らかになった。

[目的]
化合物半導体は、電子移動度がシリコンより高く、現在需要の高まりつつある
半導体である。この化合物半導体の生産では、材料入手過程や結晶精製過程にかかるコストが高いことが知られている。これにより資源豊富で安価なシリコン半導体がしばしば用いられていた。微生物の中には、金属イオンを最終電子供与体あるいは最終電子受容体に利用可能なものが知られており、生成物として CdS や CdSe のような化合物半導体結晶粒子も見られている。このことから、微生物培養によって半導体結晶の合成が可能になれば、温和な条件での結晶合成が期待でき、さらに低コスト化、環境フレンドリーな生産システムが期待される。よって本研究では、化合物半導体結晶を合成する微生物のスクリーニン
グを目的とした。
[方法及び結果]
広島県、愛媛県、福岡県沿岸で採取した海水、計 40 サンプルについて、光合成
細菌用培地で培養することで、光合成細菌を集積した。40 サンプル中 20 サン
プルで光合成細菌が集積された。集積した光合成細菌に II-VI 族元素（Pb- S,CdS,Zn-S）を終濃度 1 mM で添加し培養した結果、II-VI 族両イオンを回収していることを確認した。X 線回折分析を行った結果、結晶由来のピークが確認され、PbS の結晶が存在していることが示唆された。現在、TEM/EDS を用いてその結晶形態を検討している。

Organic acid production under controlled culturing condition in
Synechocystis sp. PCC 6803 hox mutant

Screening of photosynthetic bacteria synthesizing crystal of group II-VI
compound semiconductor○Mitsuharu Nakajima1, Hiroko Iijima1, Tomokazu Shirai2, Mami Okamoto2,
Tomohisa Hasunuma3, Akihiko Kondo2,3, Masami Yokota Hirai2, Takashi Osanai1,2(1Sch. Agric., Meiji Univ., 2RIKEN, CSRS, 3Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)

Key words
condition

cyanobacteria, hydrogenase, metabolic engineering, anaerobic

3P-1p122 Analysis of light response mechanisms in carotenoid
synthesis of the yeast Rhodosporidium toruloides○Ryo Shimizu, Yoriko Tominaga, Yoshiko Okamura(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words

biomineralization, photosynthetic bacteria, compound semiconductor

3P-1p124 ヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した大腸菌を用いた無機バイオハイブリッド光触媒による水からの水素製造○Dung Pham Khanh1, Atsushi Miyata1, Yosuke Shida1,
Harutake Yamazaki2, Kazuo Masaki3, Kazuki Mori4, Kosuke Tashiro4,
Satoru Kuhara4, Hiroaki Takaku2, Wataru Ogasawara1(1Nagaoka Univ. Technol., 2Fac. Appl. Life Sci., Niigata Univ.
Pharm. Appl. Life Sci., 3NRIB, 4Fac. Agric., Kyushu Univ.)owataru@vos.nagaokaut.ac.jp○本田 裕樹 1, 渡邊 源規 1, 萩原 英久 1,2, 伊田 進太郎 1,2,
石原 達己 1,2
（1九大カーボンニュートラル・エネルギー国際研, 2九大院・工）yhonda@i2cner.kyushu-u.ac.jp

In recent years, carotenoids have received increasing attention as they have extensive
use in medicine, cosmetic, chemistry, food and feed industry as an antioxidant, vitamin
A precursor and food colorants. Carotenoids widely distribute in diverse
microorganisms including the bacteria, the algae, fungi and the yeasts. Among them,
the yeast Rhodosporidium toruloides is convenient for large-scale fermentation due toits unicellular nature and high growth rate. However, the biotechnological synthesis ofcarotenoids is influenced by many factors such as carbon source, light, temperature,
aeration, metal ions and salts. Light is an important factor to considerate during the
production of microbial carotenoids; hence, it improves carotenogenesis. This is wellknown response for R. toruloides but molecular mechanism of light response has been
unknown. The purpose of this study is to obtain insight of light response forcarotenoids biosynthesis in R. toruloides. To carry out comparative analysis with wild
type, carotenoids non-producing mutants were created.
To obtain carotenoid non-producing mutant, UV-mutagenesis was carried out. After 3cycles of mutation and screening, white mutants were successfully obtained.
Carotenoid production, oil production, and other growth parameter under the light anddark were analyzed. Now, transcription response of genes encoding carotenoid
biosynthesis are analyzing.

【目的】光触媒反応を用いた水の分解反応による水素生産が注目されている。演者らは、無機半導体による電子メディエータ（methylviologen, MV）の光触媒還元（反応(1)）と、生体触媒による還元型 MV からの水素生産（反応(2））の 2段階の反応から成る、無機-バイオハイブリッド光触媒による水素生産系について検討している。本研究では、無機半導体 TiO2、MV、生体触媒として[FeFe]ヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した大腸菌の休止菌体を組み合わせた反応系による水素生産について検討した。
【方法および結果】TiO2 (anatase)が、Tris-HCl (pH7)緩衝液中において、アスコルビン酸を犠牲試薬として光照射下で MV を還元することを確認した（反応(1)）。
続いて、Clostridium acetobutylicum 由来[FeFe]-ヒドロゲナーゼおよび修飾タンパ
ク質の遺伝子 4 種を Escherichia coli BL21(DE3)へ導入し組換え大腸菌を作製した。本組換え大腸菌を培養し得られた休止菌体を触媒として細胞破砕や酵素精製等の煩雑な操作をせずに直接反応に供したところ、還元型 MV を電子供与体
として水素生成が可能であることを確認した（反応(2)）。これらの結果をもとに、TiO2、MV、組換え大腸菌菌体を含む反応溶液を調整し、犠牲試薬としてア
スコルビン酸を添加した条件において光照射下における水素生成を確認し、無機-バイオハイブリッド光触媒による水素生産に成功した[1]。さらに、反応(1)を効率的に進行する反応条件、無機半導体を探索することで、当該反応系による水素生成能の向上について検討している。
[1] Y Honda, et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2016, doi:10.1002/anie.201600177

Analysis of light response mechanisms in carotenoid synthesis of the yeast

Hydrogen production by inorganic-bio hybrid photocatalyst using whole-cellof recombinant E. coli

Rhodosporidium toruloides○Dung Pham Khanh1, Atsushi Miyata1, Yosuke Shida1, Harutake Yamazaki2,
Kazuo Masaki3, Kazuki Mori4, Kosuke Tashiro4, Satoru Kuhara4, Hiroaki Takaku2,
Wataru Ogasawara1(1Nagaoka Univ. Technol., 2Fac. Appl. Life Sci., Niigata Univ. Pharm. Appl. Life
Sci., 3NRIB, 4Fac. Agric., Kyushu Univ.)
Key words
Rhodosporidium toruloides, Carotenoids biosynthesis, light response
mechanism○Yuki Honda1, Motonori Watanabe1, Hidehisa Hagiwara1,2, Shintaro Ida1,2,
Tatsumi Ishihara1,2(1WPI-I2CNER, Kyushu Univ., 2Fac. Eng., Kyushu Univ.)

Key words

hydrogen, hydrogenase, photocatalyst, whole cell biocatalyst

310

バイオマス，資源，エネルギー工学

3P-1p125 光合成細菌と枯草菌の共培養による酸素ガス共存下の窒素固定

3P-1p127 銀ナノ粒子・ボロン樹脂・クレイからなる新規光触媒の暗所と可視光照射下におけるカビ胞子に対する殺菌効果○前田 勇, 久下沼 匠（宇都宮大院・農）i-maeda@cc.utsunomiya-u.ac.jp○深野木 伸太 1, 宮﨑 愛 1, 山本 幸次郎 1, 伊東 謙吾 2, 田中 賢二 1
（1近大院・産理工・生還化, 2伊都研）
tanaka@fuk.kindai.ac.jp

生物学的窒素固定はニトロゲナーゼによって触媒される、窒素ガスをアンモニアに変換する過程である。生化学反応は一般的に、常温・常圧の温和な条件で進行するため、窒素固定反応はエネルギー消費の少ない窒素肥料生産に結び付く可能性を秘めている。窒素固定を考える上でニトロゲナーゼ活性の酸素ガス
あるいはアンモニアによる失活は考慮されなければならない特性である。本研
究では、細菌による窒素固定を農業生産へ役立てるための新たな手法を考案することを目的として、光合成細菌の培養方法に関する研究を行った。多くの光合成細菌は酸素非発生型の光合成と、窒素固定を行うことができる。しかしながら、酸素ガスからニトロゲナーゼを防護する仕組みを持たないため、大気中窒素ガスを基質とした窒素固定を考える場合に、活発に呼吸を行う従属栄養細菌との共培養により、酸素ガスを取り除き反応を持続させることが可能か否かを検討した。光合成細菌は Rhodopseudomonas palustris CGA009 を、従属栄養細菌は枯草菌 Bacillus subtilis ATCC6633 をそれぞれ用いた。ガラス製培養容器中に入れた無機態・有機態窒素を含まない培地に、両細菌を移植しタングステン
ランプの光を照射して培養を行った。検鏡により培養液中に形成されたバイオフィルム内に光合成細菌と枯草菌が互いに近接して増殖する様子が観察された。
両細菌 DNA を特異的に検出するプライマーを用いた定量 PCR により無機態・有機態窒素非存在下において両細菌が増殖することが確認された。また、共培
養液中にアンモニアは検出されなかった。また、共培養時のみ菌体を含む培養
液中の無機態・有機態窒素含量が増加することがミクロケルダール法により確認された。これらの結果より、光合成細菌を枯草菌と共培養することで大気中の窒素ガスを基質とした窒素固定が持続されることが明らかとなった。

【背景と目的】我々は、銀ナノ粒子(AgNPL)・ボロン樹脂(B)・クレイ(C)から構成される新規な光触媒を開発した。この ABC 光触媒は、UV 応答型光触媒として広く用いられている二酸化チタンとは異なり可視光の吸収が強いため、屋内でも使用できる光触媒として期待されている。今回、組成が異なる 2 種類のABC 光触媒のカビ胞子に対する暗所および可視光照射下での殺菌効果について比較検証した。
【方法】抗菌試験は、JIS R1705「ファインセラミックス-光照射下での光触媒抗カビ加工製品の抗カビ性試験方法」を参考に、一部方法を適宜修正して実施した。すなわち、表面をバインダーでコートした PET フィルムに光触媒を吸着させ 、 所 定 の 胞 子 濃 度 (5.6×106 CFU/ml) に 調 整 し た Aspergillus niger お よ び
Penicillium pinophilum、Trichoderma virens の胞子液を塗布し、素の PET フィル
ムを被せ、暗所および LED 光照射下(照度 1000lx)で 8 時間放置した。その後、胞子液を回収し、1/10 濃度のポテトデキストロー平板培地にて培養後のコロ
ニー形成数を比較することにより胞子の生残率を測定した。
【結果】本光触媒への曝露により、A.niger、P.pinophilum、T.virens の 3 菌種ともに暗所においてもコントロール試験区に較べて胞子の生残数は大きく減少した。
しかし、暗所と LED 光照射下での胞子数に大きな差は認められなかった。そこで ABC 光触媒の組成を変えて試験を行ったところ、暗所に較べて LED 光照射
下では胞子の生残数が少なくなっており、可視光照射下により殺菌効果がさらに向上することが分かった。可視光の波長、バインダーへのコートの方法、異なる種類のカビを用いて、更なる抗菌活性の向上について現在、検証している。

N2 fixation by co-culture of photosynthetic bacterium and Bacillus subtilis in
the presence of O2

Antifungal effect of novel photocatalyst against pathogenic bacteria underdark and visible light○Isamu Maeda, Takumi Kugenuma(Grad. Sch. Agric., Utsunomiya Univ.)

Key words

nitrogen fixation, coculture, photosynthetic bacteria, Bacillus subtilis

3P-1p126 Is Archaerhodopsin a powerful photosensitizer of the
TiO2 based solar energy conversion system ?

○Shinta Fukanoki1, Megumi Miyazaki1, Kojiro Yamamoto1, Kengo Ito2,
Kenji Tanaka1(1Grad.Sch.Humanity-Oriented Sci.&Eng.,Kindai Univ, 2Ito Laboratory)

Key words

visible-light responsible photocatalyst, antifungal effect, nanosilver

3P-1p128 銀ナノ粒子・ボロン樹脂・クレイからなる新規光触媒の暗所と可視光照射下における病原細菌殺菌効果○Luomeng Chao1, Gang Dai2, Xiong Geng3, Tatsuo Iwasa1,3(1Grad. Sch. Eng., Muroran Ins. Technol., Japan,, 2Coll. Chem.
Environ. Sci., Inner Mongolia Normal Univ., China, 3Div. Eng.,
Muroran Ins. Technol., Japan)
iwasat@mmm.muroran-it.ac.jp○宮﨑 愛 1, 深野木 伸太 1, 山本 幸次郎 1, 伊東 謙吾 2, 田中 賢二 1
（1近畿大院・産理工・生環化, 2伊都研）
tanaka@fuk.kindai.ac.jp

Solar energy is the primary energy source of our planet. Titanium dioxide (TiO2) is a
widely utilized semiconductor for transforming the solar energy. The TiO2-based
system has been utilized in solar cell, photocatalytic hydrogen production andphotocatalytic degradation of organic pollutants. Bacteriorhodopsin (BR) was shown tobe able to enhance the performance of TiO2 materials in TiO2-based solar cell,
photocatalytic water splitting and photocatalytic degradation of pollutants. However,high cost of the preparation of the protein restricts its industrial application. Althoughnumerous attempts have been made, E.coli-expression system of the protein has notbeen developed yet. Recently we found a BR homolog, Archaerhodopsin (AR) of aHalorubrum species isolated from Ejinoor salt lake of China. The protein showedsimilar photoreaction properties as that of BR and most importantly the E.coliexpression of the protein was achieved. The protein might be an excellent candidate fora photosensitizer of the TiO2-based solar energy conversion system. In the present
study, the photochemical properties and the performance as a photosensitizer of AR arepresented and compared with those of BR.

【目的】光電池や建築外装材、抗菌剤等として実用化されている光触媒の多くは二酸化チタンのような紫外線応答型である。このため、太陽光の当たらない室
内でも利用できる可視光応答型の光触媒が求められている。伊都研究所が開発した ABC 光触媒は可視光や近赤外光を吸収することから、本研究では数種の病原細菌に対する本光触媒の殺菌効果をフィルム密着法により検証した。
【方法】ABC 光触媒は水に不溶であるため、予備試験として ABC 光触媒の希釈液を平板培地に直接塗布して検定菌の増殖阻害効果を検証した。その結果、可視光を照射しない暗所下でも O157:H7 のコロニー数を 7 桁から 8 桁減少させ、黄色ブドウ球菌や緑膿菌に対する効果も確認された。また、可視光照射により抗菌効果がさらに向上するほか、可視光の波長によって効果が異なることが分かった。その後、ABC 光触媒を固定化させるバインダーを開発したことから、
JIS R 1752 に基づき、フィルム密着法による抗菌試験を実施した。表面をバインダーでコートした PET フィルムに ABC 光触媒原液（40mg/ml）の希釈液を吸着させ、検定菌液を塗布した。素の PET フィルムで挟み込み、暗所および白色
光照射下（照度 1000 lx）で 8 時間静置した後、菌液を回収した。この菌液を溶
融寒天培地と混合させた平板を 30℃で培養し、生残菌数を計数することで ABC
光触媒の殺菌効果を検証した。
【結果】ABC 光触媒 500 倍希釈液を用いた場合、O157:H7 に関しては暗所下で約 2 桁、可視光照射下で約 4 桁の菌数減少が認められた。希釈倍率を増やして試験したところ、15000 倍までは殺菌効果が認められたものの、20000 倍希釈液
では効果が得られなかった。現在、黄色ブドウ球菌に対しても 1000 倍希釈液で効果が確認されており、緑膿菌や病原性大腸菌に関しても検証を行っていく。

Is Archaerhodopsin a powerful photosensitizer of the TiO2 based solar
energy conversion system ?

Bactericidal effect of novel photocatalyst against pathogenic bacteria underdark and visible light

Key words
Bacteriorhodopsin, Archaerhodopsin, TiO2 nanoparticles,
Photocatalytic degradation

Key words○Luomeng Chao1, Gang Dai2, Xiong Geng3, Tatsuo Iwasa1,3(1Grad. Sch. Eng., Muroran Ins. Technol., Japan,, 2Coll. Chem. Environ. Sci., Inner
Mongolia Normal Univ., China, 3Div. Eng., Muroran Ins. Technol., Japan)○Megumi Miyazaki1, Shinta Fukanoki1, Kojiro Yamamoto1, Kengo Ito2,
Kenji Tanaka1(1Grad.Sch.Humanity-Oriented Sci.&Eng.,Kindai Univ., 2Ito Laboratory)
bactericidal effect, visible-light photocatalyst, nanosilver

バイオマス，資源，エネルギー工学／生物化学工学

3P-1p129 銀ナノ粒子・ボロン樹脂・クレイからなる新規光触媒の近赤外光照射下における殺菌効果

3P-2p133 LAL 固定化ビーズ法を用いたグラム陰性菌の培養に伴うエンドトキシンの遊離特性の定量的解析○山本 幸次郎 1, 深野木 伸太 1, 宮﨑 愛 1, 伊東 謙吾 2, 田中 賢二 1
（1近畿大院・産業理工・生環化, 2伊都研）
tanaka@fuk.kindai.ac.jp【目的】 現在実用化されている光触媒の多くは二酸化チタンのように紫外線のみを吸収・利用するため、可視光応答型の光触媒の開発が近年盛んである。伊
都研究所が開発した平板状銀ナノ粒子(A)・ホウ素樹脂(B)・クレイ(C)からなる
ABC 光触媒は、可視光のみならず近赤外線領域の吸収も強いため、新規な光触媒として屋内でも利用可能な光電変換素子や抗菌剤として期待される。近赤外
光応答型光触媒は世界的にも報告例が無い。これまでの研究により、ABC 光触媒は微量で暗所下でも O157 や黄色ブドウ球菌、緑膿菌などの病原細菌や黒カビに対して強い殺菌能を有し、室内灯程度（1000 lx）の可視光照射による殺菌能の向上が認められた。今回、近赤外光照射が ABC 光触媒の殺菌能に及ぼす影響について検証することとした。
【方法】 『ファインセラミックス-可視光応答形光触媒抗菌加工製品の抗菌性試験方法』である JIS R1752 法を参考に、本光触媒の近赤外光照射下での殺菌能を評価した。すなわち、表面を吸着剤でコートした PET フィルムに光触媒を吸着させ、所定の菌数に調整した大腸菌液を塗布し、そこへ素の PET フィルムを被せ暗所もしくは自作の近赤外光照射装置内に放置した。8 時間後に菌液を回収し、平板コロニー形成計数法で大腸菌の生残菌数の減少を調べることにより殺菌能を評価した。
【結果】 フィルムへの吸着量にも依るが、ABC 光触媒存在下では大腸菌の生菌
数は暗所で 4 桁以上減少し、近赤外光照射下ではさらにその 1 桁ないし数分の1 に減少した。ただし、塗布状態や光触媒の組成による影響も小さくなく、これらの点を改善すればより大きな抗菌活性が期待できると思われた。暗所下での殺菌作用は、銀ナノ粒子と他の成分との相乗効果によるものと考えられる。
現在、黄色ブドウ球菌などの病原細菌やカビにおける近赤外光照射下での殺菌能を調べている。

Bactericidal effect of near infrared ray-responsible photocatalyst○Kojiro Yamamoto1, Shinta Fukanoki1, Megumi Miyazaki1, Kengo Itou2,
Kenji Tanaka1(1Grad.Sch.Humanity-Oriented Sci.&Eng.,Kindai Univ, 2Ito Laboratory)

Key words
nanosilver

bactericidal effect, near infrared ray-responsible photocatalyst,

3P-2p132 LAL 固定化ビーズを用いたエンドトキシンの高感度・迅速検出法の開発と利用（第３報）○猪瀬 陽加 1, 飯島 綾 2, 青柳 秀紀 1,2（1筑波大・生物資源, 2筑波大院・生命環境）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp311○大瀧 賀也 1, 飯島 綾 2, 青柳 秀紀 1,2（1筑波大・生物資源, 2筑波大院・生命環境）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp【目的】 エンドトキシン（ET）はグラム陰性菌の外膜構成成分の一種で、血中へ混入すると人体に重篤な症状を引き起こす。腸内の ET は腸管膜を通じて血中に入り、腸内細菌由来の ET が様々な疾患に関与する可能性が指摘されている。一般的に、ET は菌体に安定に保持され、菌体外への漏出は溶菌によってのみ生じるとされている。しかしながら、我々が開発した ET の高感度、迅速測定法（LAL 固定化ビーズ法）を用い、培養に伴う Escherichia coli の ET の挙動を定量的に解析した結果、増殖に伴い培養液中への ET 遊離量が増加し、“溶菌だけではなく、菌体の分裂に伴い ET が顕著に遊離する”という新規な現象を見出した 1, 2)。本研究では、この現象の普遍性の有無を明らかにするために、E.
coli と他のグラム陰性菌のエンドトキシンの遊離特性の定量的な比較解析を試みた。
【方法と結果】802 培地を用い Pseudomonas aeruginosa PAO1、Serratia marcescens
Bizio 1823、E. coli の培養を行い、LAL 固定化ビーズ法を用いて経時的に菌体内と培養液中の ET 濃度を測定した。また、U.O.D.600 と生菌数も同時に測定した。
種々検討した結果、菌種により総 ET 量（菌体内の ET ＋培養液中へ遊離したET）は大幅に異なり、S. marcescens、E. coli、P. aeruginosa の順に高い値を示した。また、総 ET 量に対する遊離 ET 量の割合（遊離率）にも大きな差が見られた。特に、S. marcescens と E. coli で高い遊離率が認められた。なお、YPD 培地を用いた場合でも同様の傾向が認められた。以上の結果より、E. coli 以外にも“溶菌だけではなく、菌体の分裂に伴い ET が顕著に遊離する” タイプのグラム陰性菌が存在することが示された。現在、他のグラム陰性菌の ET の遊離特性の定量的解析についても検討中である。
1) H26 生物工学会要旨集 p. 249. 2) H27 生物工学会要旨集 p. 138.

Application of LAL-conjugated-microbeads method for quantitative
analysis of endotoxin-releasing characteristics of gram-negative bacterial
cultures○Kaya Ohtaki1, Aya Iijima2, Hideki Aoyagi1,2(1Col.Agro-bio.Resource.Sci.,Univ.Tsukuba, 2Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ.
Tsukuba)

Key words
lysatecultivation, endotoxin, gram-negative bacteria, Limulus amebocyte

3P-2p134 Development of a novel co-culture-cell bioreactor systemfor bioethanol production from rice straw○Yu-Kuo Liu, Yi-Chieh Lee(Grad. Inst. Biochem. Biomed. Eng., ChangGung Univ., Taiwan,
ROC)
ykliu@mail.cgu.edu.tw【目的】 注射薬や輸液などの医薬品の品質管理において、発熱の代表的なパイロジェンであるエンドトキシン（ET）の検査が義務づけられており、ET の高感度測定は重要である。また臨床現場では、敗血症などの ET ショック症状を示す救急患者に対して、血中の ET 濃度の迅速かつ正確な測定が求められている。この現状を踏まえ、我々は LAL 固定化ビーズ法を開発し、ET の高感度・迅速測定を実現した 1)。本研究では、開発した LAL 固定化ビーズ法を用い、従来法では測定が困難であった種々の試料中の ET 濃度の測定を行い、本法の汎用性と実用性を評価した。
【方法と結果】 前報 1)に従い、LAL 固定化ビーズを作成した。LAL 固定化ビー
ズ法により、ET 測定に影響を与える夾雑物である胆汁酸などを含む、種々のモデル溶液の系や市販の透析液や経腸栄養剤を対象に、ET の添加回収試験をおこなった。その結果、従来法では添加した ET 濃度と大きく異なる値を検出したのに対し、LAL 固定化ビーズ法では正確な ET 濃度の測定が可能であり、本法の幅広い汎用性と有用性が示された。さらに本法を用い、約 30 名のヒトの血清試料中の ET 濃度の測定を行った結果、試料を適切に希釈することで、簡便、迅速かつ精度よく測定が可能であり、本法の実用性が示唆された。
1) H25 生物工学会要旨 p.152.

Demanding of alternative energy sources has received attention due to petroleum
shortage recently. Bioethanol is one of the most cost-effective products with a clean
environment, sustainable regeneration benefits. There were more than 1600 thousand
tons of rice straw agricultural wastes produced in Taiwan every year. Fermentative
production of ethanol from renewable resources has prompted interest in immobilized
microbial cell systems for conversion of biomass to fuels. Bioethanol production fromrice straw not only regenerates the agriculture waste into bioenergy, but also solves the
problem of environmental pollution by rice straw burning. For the last two decades,
ethanol production from agriculture waste by the co- immobilized-cell system has beenstudied extensively. An efficient bioreactor is the key for a profitable co-immobilized
aerobic/anaerobic mixed process of bioethanol production from lignocellulosic
biomass. The aim of this study is to develop a novel vertical mass-flow type bioreactor(VMFB) with space for both aerobic and anaerobic reaction, and investigate its
feasibility to co-immobilized saccharification strains (T. reesei & A. niger) andfermentation strains (Z. mobilis & Pichia stipitis) for bioethanol production throughsimultaneous saccharification and fermentation of acid-pretreated rice straw using
calcium-alginate beads as the immobilization carrier.

Development of a rapid and sensitive method for assessing endotoxin byusing LAL-conjugated-microbeads and it's application (part 3)

Development of a novel co-culture-cell bioreactor system for bioethanol
production from rice straw○Haruka Inose1, Aya Iijima2, Hideki Aoyagi1,2(1Col. Agro-bio. Resource. Sci., Univ. Tsukuba, 2Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ.
Tsukuba)

Key words

bile acid, endotoxin, Limulus amebocyte lysate, serum sample○Yu-Kuo Liu, Yi-Chieh Lee(Grad. Inst. Biochem. Biomed. Eng., ChangGung Univ., Taiwan, ROC)

Key words
agricultural waste, co-immobilization system, co-immobilizedbioreactor VMFB

312

生物化学工学3P-2p135 有機溶媒非耐性菌による疎水性物質生産を目的とした隔壁二相培養系の提案

3P-2p137 タンパク質のアミロイド化を利用した機能性材料の開発○大島 立樹 1, 迫野 昌文 2
（1富山大・工, 2富山大院・理工）msakono@eng.u-toyama.ac.jp○滝口 昇 1, 穴田 侑也 2, 川西 琢也 1
（1金沢大・理工, 2ダイト株式会社）tackey@se.kanazawa-u.ac.jp【目的】バイオプロセスは環境負荷の少ない持続可能な反応プロセスとして近年注目されているが、疎水性物質生産への適用にはその毒性抑制が課題となる。
対策のひとつとして二相培養系が提案されているが、撹拌による二相の混合（乳化）のため有機溶媒耐性菌への適用に限られており、生産物も限定的であった。
我々は、水相と有機相の間に隔壁を設置した隔壁二相培養系において、二相の分離を維持し乳化を抑制できることを確認している。本研究では、疎水性物質
生産への有機溶媒非耐性菌の利用を目指し、隔壁二相培養系の有機溶媒非耐性菌の増殖に対する効果を評価することとした。
【方法および結果】使用菌株として Escherichia coli DH5α を用い、2 L ファーメ
ンターを用いて水相のみの培養、二相培養、隔壁二相培養を行い、①隔壁の有無による培養への影響、②撹拌回転数の変更による培養への影響の 2 項目について検討をおこなった。隔壁二相培養では水相のみの場合と同様に基質が枯渇するまで増殖を続いたのに対し、通常の二相培養では培養初期から増殖活性が低下し、基質が残っているにも関わらず増殖が停止した。これは乳化により菌体が有機溶媒と直接接触することで細胞膜へのダメージが蓄積し、生命活動を維持できなくなったためだと考えられる。次に隔壁二相培養において撹拌回転数の影響を調べたところ、200 ~ 400 rpm の間では、基質残存条件では増殖活性に顕著な差は無かった。維持定数を算出したところ、培養液の乳化後に増大し、菌体の維持活動に利用される基質量が大幅に増加していることが分かった。菌体は、排出ポンプにより細胞膜内に蓄積された有機溶媒を体外へ排出することで、毒性を軽減することが知られており、ポンプ駆動のエネルギー源として基質が利用されたためだと考えられる。

【背景と目的】 タンパク質のアミロイド凝集体は、分子間ベータシート形成により自己組織的に形成することが知られている。近年、アミロイド繊維をナノワイヤーとして機能性材料に応用する試みがなされている。アミロイドに機能を付与するには、アミロイド繊維への機能性分子の固定が必要となるが、いまだ調製に困難が多い。本研究では、ペプチド転移酵素を用いたペプチド連結反応を機能性分子固定法として用い、任意の分子を固定可能なアミロイドの構築を試みる。
【方法】 PCR および制限酵素を用いて定法に従い、アミロイド性タンパク質ト
ランスサイレチン（TTR)、機能性タンパクとして緑色蛍光タンパク質(GFP)、
ペプチド転移酵素として SortaseA(SrtA)の、ヒスタグ配列融合発現ベクタープラ
スミドを調製した。また、SrtA 認識配列タグを持つ TTR(TTR-LPETGG)およびGFP(G5-GFP)のプラスミドを調製した。各々、大腸菌を用いたタンパク質の発現・精製を行った。TTR のアミロイド化および SrtA によるペプチド連結反応
は既報にしたがった。アミロイド繊維形成はチオフラビン T (ThT)を用いて評価した。
【結果と考察】 発現タンパク質はニッケルカラムを用いて精製し、SDS-PAGE
によりタンパク質発現を確認した。GFP および G5-GFP は、プロテアーゼ
FactorXa を用いてヒスタグ配列を消化し、カラムで精製した。SDS-PAGE より
加水分解反応が定量的に行われたことを確認した。次に精製した TTR のアミロイド化反応を行ったところ、インキュベート後の ThT 蛍光増加がみられたことから、リコンビナント TTR のアミロイド化が示唆された。また、SrtA によるタグ付きタンパク質の連結反応が認められた。これらの知見をもとに TTR アミ
ロイドへのタンパク質固定化について検討を行う。

Application of two phase partitioning bioreactor on organic solvent
intolerant bacteria

Development of amyloid-based functional materials.

○Noboru Takiguchi1, Yuya Anada2, Takuya Kawanishi1(1Coll. Sci. Eng., Kanazawa Univ., 2Daito Pharmaceutical Co.,Ltd.)Key words

two-phase partitining bioreactor, Escherichia coli

3P-2p136 負電荷脂質を含む生体模倣膜での多価カチオン添加による相分離構造形成○Tatsuki Oshima1, Masahumi Sakono2(1Fac. Eng., Univ. Toyama, 2Grad. Sch. Sci. Eng. Educ., Univ. Toyama)

Key words

amyloid, transthyretin, SortaseA, functional material

3P-2p138 バイオナノカプセルとリポソームの複合粒子による invivo での抗腫瘍効果○西村 勇哉 1, 鈴木 貴弘 2, 森田 健太 2, 荻野 千秋 2, 近藤 昭彦 1
（1神戸大・科学技術イノベーション, 2神戸大院・工）akondo@kobe-u.ac.jp○古田 一夢, 下川 直史, 高木 昌宏（北陸先端大・マテリアル）
takagi@jaist.ac.jp[背景]細胞膜の構造は様々な脂質分子で構成される二分子膜であり、膜面上でコレステロールと飽和脂質に富んだ脂質ラフトを形成していると考えられている。現在までのラフトの性質や形成メカニズムに関する研究では、中性脂質から成る脂質膜での相分離として理解されてきた。しかし、細胞膜には負電荷脂質が含まれ、その静電的な効果が相分離に及ぼす影響は未だ明らかになっていない。本研究では、脂質膜へ添加するカチオンの価数に注目した。金属イオン
のみならず、カチオン性ペプチドであるポリアミン類にも注目した。ポリアミン類は DNA との相互作用についてよく知られるが、荷電脂質膜との相互作用に関する研究は少なく、金属イオンとは異なる振る舞いを示す可能性がある。
[方法]本研究では、負電荷不飽和脂質(DOPG)と中性飽和脂質(DPPC)を混合し、静置水和法を用いて脂質膜を作成した。作成した負電荷脂質膜に、1 価(NaCl)、
2 価(MgCl2)の金属イオン及び 3 価(Spermidine)、4 価(Spermine)のポリアミンを加えた場合の相分離構造の変化を、室温にて蛍光顕微鏡で観察した。蛍光試料として Rho-DHPE を用いた。緩衝溶液として Tris buffer(pH 7.4)を用いた。
[結果・考察] カチオン無添加の場合は一様である DOPG/DPPC の 2 成分系へ、
1 価の金属イオン NaCl を加えた場合 10mM の濃度で初めて相分離の形成が確認された。これは DOPG 間の静電反発が塩の添加により遮蔽されたためと考えられる。2 価の金属イオン MgCl2 や 3 価や 4 価のポリアミンを添加した際には、NaCl に比べ大幅に低い濃度で相分離が観察された。これより、多価カチオ
ンには荷電脂質との強い引力が存在し、相分離を形成することが示唆された。
また、相分離を引き起こす濃度に MgCl2 とポリアミンで違いが見られ、相分離の形成はカチオンの価数だけでなく、カチオンの電荷密度が重要な要素となっていると考えられる。

癌治療において副作用を軽減し、効果的に薬理効果を発現させるために、ドラッ
グデリバリーシステム（DDS）という技術が注目されている。この DDS のキャリアとして、B 型肝炎ウイルスの表面抗原 L タンパク質から成るバイオナノカ
プセル（BNC）が開発されている。これまでに本研究グループでは、BNC の L
タンパク質中の肝細胞認識部位を Affibody（ZHER2）に置換することで、Affibody
提示 BNC（ZHER2-BNC）を開発し、乳癌や卵巣癌細胞などに発現している HER2受容体を特異的に認識することに成功している。また、薬剤を封入したリポソー
ム（LP）の表面に BNC を融合することで、細胞標的能力と高い薬剤封入効率をもつ複合粒子（BNC/LP）の開発にも成功している。本研究では、ZHER2-BNC/
LP 複合粒子を用いて HER2 発現癌細胞へ特異的に抗癌剤や放射線増感剤を送達し、抗腫瘍効果を発現させることを目指した。まず、doxorubicin（dox）を封入した ZHER2-BNC/LP 複合粒子（ZHER2-BNC/LP(dox)）を 5 日おきに尾静脈投与した担癌マウスの腫瘍体積を測定した。その結果、コントロールとして投与した PBS、dox 単体、ZHER2-BNC を融合していない LP(dox)の群はほぼ同等の腫瘍
体積の増加が見られた。それに対し、ZHER2-BNC/LP(dox)では腫瘍体積の増加が著しく抑制された。また、X 線照射によってラジカルを発生させ、抗腫瘍効果を示すポリアクリル酸修飾過酸化チタンナノ粒子（PAATiOx）を放射線増感剤として封入した ZHER2-BNC/LP(PAATiOx)を担癌マウスの尾静脈から投与し、一日後に X 線を照射した。その結果、PBS、PAATiOx 単体や LP(PAATiOx)と X 線の併用では、照射後しばらくして腫瘍体積の増加が見られた。ZHER2-BNC/
LP(PAATiOx)の群では、25 日目辺りまで目立った増加が確認されなかった。これらの結果から、抗癌剤や放射線増感剤を標的の腫瘍に送達し、抗腫瘍効果を示すことに成功した。

Phase separation by addition of multivalent cation in negatively charged
lipid membranes

Anticancer efficacy in vivo using bio-nanocapsule/liposome complex○Kazumu Furuta, Naofumi Shimokawa, Masahiro Takagi(Sch. Mater. Sci., JAIST)

Key words

liposome, Charged lipid, phase separation, polyamine○Yuya Nishimura1, Takahiro Suzuki2, Kenta Morita2, Chiaki Ogino2,
Akihiko Kondo1(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)

Key words

drug delivery system, antitumor

生物化学工学

3P-2p139 ショウジョウバエ株化神経細胞 BG2-c6 を用いたアミロ
イド β 神経細胞毒性評価

313

3P-2p141 Corynebacterium glutamicum を用いたヘミセルロース
系バイオマスからのカダベリン生産○山下 涼太 1, 板田 鉄平 1, 中川 裕之 2, 上井 幸司 1, 徳楽 清孝 1
（1室工大院・工・環境創生, 2福岡大・理・地球圏科学）
tokuraku@mmm.muroran-it.ac.jp○今尾 健太, 山口 理絵, 田中 勉, 近藤 昭彦（神戸大院・工）tanaka@kitty.kobe-u.ac.jp【背景と目的】アルツハイマー病（AD）は、アミロイド β（Aβ）と呼ばれるペプチドが脳内で凝集・蓄積することによって発症すると考えられているため、
Aβ 凝集阻害物質は AD の治療・予防に有用であると期待されている。マウス由来 PC12 細胞を用いた一般的な Aβ の神経細胞毒性評価法は、細胞の培養温度
37 ℃かつ 5 ％CO2 が必要であるため、ハイスループット解析には不向きである。それに対し、ショウジョウバエ中枢神経由来の BG2-c6 細胞は培養に CO2が不要で、ほぼ常温（25 ℃）で培養できるため、サンプル調製中に細胞の活性が低下する可能性が低く、PC12 細胞よりもハイスループット解析に適しているといえる。本研究では、Aβ 神経細胞毒性のハイスループット評価法の確立を目指し、BG2-c6 細胞に対するヒト Aβ42 の神経細胞毒性および凝集阻害物質による毒性緩和能を評価した。
【方法】本研究では代表的な細胞毒性評価法である MTT アッセイによって、神経化した BG2-c6 細胞および PC12 細胞に対するヒト Aβ42 の毒性を評価した。
また、Aβ 凝集阻害効果が知られている様々なポリフェノール類や、新たに我々の研究室で Aβ 凝集阻害効果が見いだされた植物抽出物など、様々な Aβ 凝集阻
害物質による神経細胞毒性緩和能を BG2-c6 細胞および PC12 細胞を用いて評価した。
【結果と考察】Aβ42 の添加によって、いずれの細胞でも Aβ 神経細胞毒性が確認
され、BG2-c6 細胞をヒト Aβ42 神経細胞毒性の評価に用いることができることが確認できた。また、様々な Aβ 凝集阻害物質の神経細胞毒性緩和能を評価した結果、チリメンアオジソ粗抽出物は Aβ 凝集阻害活性がすでに知られている
ロスマリン酸やクルクミンの純品よりも高い毒性緩和能を有していることが示唆された。

【背景と目的】カダベリンはナイロンや医薬など様々な化成品の原料となるジアミンであり、従来、化石燃料から作られてきた。しかし環境への配慮からバイオマスを用いた、バイオプロセスによる生産法が求められている。そこで本研
究ではカダベリン生産の原料にヘミセルロースを、宿主に Corynebacterium
glutamicum を選択した。C. glutamicum はカダベリンの前駆体であるリジン生産に優れている一方で、バイオマス分解能、キシロース資化能、リジン脱炭酸能を有さない。そこで本研究ではキシラン（ヘミセルロースの主成分）の分解物であるキシロオリゴ糖資化に向けて b-xylosidase（XYL）および Xylose isomerase（XylA）の共発現を行い、キシロオリゴ糖資化性の取得を行った。
【実験方法】まず、枯草菌由来の XYL 遺伝子と C. glutamicum 由来のアンカータ
ンパク質である PorH 遺伝子を融合させたプラスミドを構築した。次にそのプラスミドに対して大腸菌由来の XylA 遺伝子を導入することで、XYL・XylA 共発現プラスミドを作製した。そのプラスミドを用いてエレクトロポレーション法により C. glutamicum を形質転換した。得られた形質転換体を、試験管中 BHI
液体培地で前々培養および前培養を行った後、同じく試験管中キシロオリゴ糖
20 g/L を含む MMYE 培地で本培養を行った。そして培養液の OD600 、培養上清のキシロオリゴ糖およびリジン濃度を測定した。
【結果と展望】XYL・ XylA 共発現株において培養 72 時間で 12.0 g/L の糖消費が見られ、OD600 は 11.8 まで増大した。それと同時に、15.3 mM のリジン生産が確認された。この結果から、キシロオリゴ糖資化性株の取得に成功したと言える。今後は、XYL・XylA に加えてリジン脱炭酸酵素（LDC）を同時発現させることによりキシロオリゴ糖からのカダベリン生産を目指す。

Evaluation of amyloid β toxicity by Drosophila neural cell line BG2-c6

Cadaverine production from hemicellulose using Corynebacterium
glutamicum○Ryota Yamashita1, Teppei Itada1, Hiroyuki Nakagawa2, Koji Uwai1,
Kiyotaka Tokuraku1(1Grad. Sch. Sustain, Environ. Eng., Muroran Inst. Technol., 2Division of Biology,
Faculty of Science, Fukuoka University)

Key words

Amyloid beta, BG2-c6 cell, PC12 cell, MTT assay

3P-2p140 Fish-killing activities and possible toxic factors of
Chattonella marina and Chattonella antiqua○Kenta Imao, Rie Yamaguchi, Tsutomu Tanaka, Akihiko Kondo(Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)

Key words

Corynebacterium glutamicum, xylosidase, xylose isomerase

3P-2p142 カバノアナタケの液体表面培養による抗酸化物質の生産○藏本 彩加, 高柴 則子, 櫻井 明彦（福井大院・工）a_sakura@u-fukui.ac.jp

Daekyung Kim2, Kichul Cho2, ○Tatsuya Oda1
(1Grad. Sch. Fish. Sci. Environ. Stud., Nagasaki Univ., 2Jeju Center,
KBSI, Korea)
t-oda@nagasaki-u.ac.jp

We conducted comparative study on two Chattonella species, which are known as
harmful red tide phytoplankton with potent fish-killing activity. Chattonella antiqua
isolated in 2010 showed extremely more potent fish-killing activities against red sea
bream, Japanese horse-mackerel, and blue damselfish than those of C. marina isolated
in 1985. At a cell density of 10,000 cells/ml, nearly 80% of these fish species weredied within 7 h exposure to C. antiqua, whereas C. marina showed no significant
toxicity on these fish species. Fish-killing activity of ultrasonic-ruptured ruptured C.
antiqua against red sea bream decreased significantly.Chemiluminescence and electron
spin resonance (ESR) analyses suggested greater reactive oxygen species (ROS)producing activity of C. antiqua than that of C. marina. In addition,
chemiluminescence response level in ultrasonic-ruptured C. antiqua was almost
negligible level. Sodium benzoate, a hydroxyl radical scavenger, significantly
suppressed the fish-killing activity of C. antiqua on blue damselfish. The chlorophyll
level in the gill tissue of blue damselfish exposed to flagellate cells increased alongwith the exposure time, and the cell count of gill-associated C. antiqua estimated withchlorophyll level was higher than that of C. marina. These results suggest that the
ROS-producing activity and affinity of Chattonella cells to the gill surface may be
important factors influencing the fish-killing activity of Chattonella species.

【緒言】耐寒性の白色腐朽菌であるカバノアナタケは、菌核にポリフェノールや
beta-グルカン、エルゴステロールなどを含み、抗腫瘍や血糖降下などの生理活性を示すことが知られている。中でもポリフェノールは強い抗酸化活性を示す
ことが分かっており、赤ワインに含まれるレスベラトロールと同様に寿命延長作用が期待されている。しかし、天然のカバノアナタケの存在数が少なく、また増殖速度が低いことから人工培養技術の開発が望まれている。本研究ではカバノアナタケの液体表面培養によるポリフェノールの高生産条件を検討し、得られたポリフェノール画分の抗酸化特性を評価した。
【方法】評価に用いたカバノアナタケ(Inonotus obliquus NY-1)は、天然菌核及び30 日間の液体表面培養により取得した培養菌糸体である。カバノアナタケの天然菌核及び培養菌糸体は凍結乾燥した後、エタノールで抽出し上清をエタノー
ル抽出物とした。残渣を熱水で抽出し、多糖とポリフェノールに分画した各画分の抗酸化活性を DPPH、SOD、ORAC、ABTS、FRAP 法により測定した。
【結果・考察】培養菌糸体のポリフェノール画分は、天然菌核のポリフェノール
画分よりも ORAC、FRAP、ABTS 法において低い抗酸化活性だったが、SOD法においては高い値を示した。天然菌核及び培養菌糸体の各画分の抗酸化特性が異なることから、生産される抗酸化物質の構造や組成が異なると考えられる。
また、培養条件により菌糸体のポリフェノール含有量が変化し、抗酸化特性も変化した。現在、ポリフェノール画分をさらに分画し、抗酸化特性を評価しているところである。

Fish-killing activities and possible toxic factors of Chattonella marina andChattonella antiqua

Production of antioxidants by liquid surface culture of Inonotus obliquus

Daekyung Kim2, Kichul Cho2, ○Tatsuya Oda1
(1Grad. Sch. Fish. Sci. Environ. Stud., Nagasaki Univ., 2Jeju Center, KBSI, Korea)

Key words

red tide control, plankton, reactive oxygen species, toxicity○Ayaka Kuramoto, Noriko Takashiba, Akihiko Sakurai(Grad. Sch. Eng. Fukui Univ.)

Key words

Inonotus obliquus, polyphenol, antioxidant, liquid surface culture

314

生物化学工学3P-2p143 σ 因子欠損放線菌の 3,4-AHBA 生産への影響○釜我 圭 1, 柏木 紀賢 2, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 2
（1神戸大院・工, 2神戸大院・科学技術イノベーション）
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp

3P-2p145 Sortase A を用いた大腸菌体内での代謝酵素の連結とその影響○松本 拓也 1, 田中 勉 2, 近藤 昭彦 1
（1神戸大院・科イノ, 2神戸大院・工）t_matsu@rabbit.kobe-u.ac.jp【背景・目的】本研究で着目した 3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸(3,4-AHBA)は芳香環を有しているため、そのポリマーであるポリ 2,5-ベンゾオキサゾールは高強度かつ難燃性という特徴を持つ。これは微生物が作る新たな種類のポリマーとしての応用が期待できる。
本研究では、Streptomyces griseus 由来の 3,4-AHBA 生合成遺伝子 griH、griI を宿主(Streptomyces lividans)に導入することで 3,4-AHBA 生産能を持たせ、複数の糖源からの生産を検討した。さらに各遺伝子群の転写に関わる σ 因子を欠損させることにより大幅な代謝機構の改変を試み、3,4-AHBA の更なる向上を目指した。
【方法】
放線菌 S. lividans に 3,4-AHBA 合成遺伝子 griH, griI (S. griseus 由来)を導入する
ことで 3,4-AHBA 生産能を持たせ、複数の炭素源(グルコース、フルクトース、
キシロース、グリセロール等)からの 3,4-AHBA 生産を行った。さらに各遺伝子群の転写に関わる σ 因子を欠損させ、得られた形質転換体でも同様に 3,4-AHBAの発酵生産検討を行った。
【結果】
S. lividans に 3,4-AHBA 生産能を付与することに成功し、複数の炭素源を資化することも確認した。特にグルコース、フルクトースを用いた発酵生産で高い生産性を示した。また、幾つかの σ 因子欠損株を用いて発酵生産を試みたとこ
ろ、野生株の形質転換体と比較して各炭素源からの 3,4-AHBA 生産量に変化が見られる株が存在した。この結果より、σ 因子を欠損させることで中央代謝経路に変化が起きた可能性が示唆される。

持続可能な低炭素化社会の構築に向け、地球上に豊富に存在し、再生可能な資源であるバイオマスの有効利用の開発は急務である。バイオリファイナリーは、バイオマスを原料に燃料や化成品原料などを製造する技術や産業のことであり、このようなバイオリファイナリーを担う技術の一つとして微生物代謝を利用した物質生産が挙げられる。しかしながら、微生物を用いたバイオプロセスでは反応速度が遅いなどの、克服すべき課題が多数存在し、これらを解決するためには、目的物質の生産に適した微生物を新たに設計・創製するといった発想が必要になる。
代謝改変微生物を用いた有用物質生産は、上記課題を克服する上で重要な技術である。代謝経路上の遺伝子を予め破壊することで、競合する経路を遮断し、代謝フラックスを目的物質の生産に最適化する手法がよく用いられるが、本研究においては、代謝経路上の酵素を近接させることで、代謝中間体の局所濃度を上げることができる「代謝チャネリング」に着目した。本研究では、大腸菌
細胞内において代謝酵素を近接させるために Sortase A と呼ばれるペプチド転移
酵素を「酵素ステープラー」として用いることで、代謝経路上の酵素を連結した。このことにより、「代謝チャネリング」を引き起こすことが可能かどうか検討した。具体的には、アセチル CoA を代謝分岐点と捉え、その代謝の前後の酵
素（ピルビン酸ギ酸リアーゼおよびリン酸アセチルトランスフェラーゼ）にSortase A の認識配列を付与することで、それらを連結させ、代謝経路に与える影響を調査した。

Effect of sigma factor disruption in Streptomyces lividans on 3,4-AHBA
production

Sortase A-mediated metabolic enzyme ligation in Escherichia coli

○Kei Kamaga1, Norimasa Kashiwagi2, Chiaki Ogino1, Akihiko Kondo2(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci, Tech, Innov, Kove Univ.)

Key words

Streptomyces lividans, metabolic engineering, sigma factor, 3,4-AHBA

3P-2p144 固定化フォトバイオリアクターを用いた合成代謝経路導入シアノバクテリアによる 1,3 プロパンジオール生産○Takuya Matsumoto1, Tsutomu Tanaka2, Akihiko Kondo1(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)

Key words
modification

3P-2p146 黄麹菌 hydrophobin-cutinase 間相互作用における
hydrophobin N 末端側の寄与○田中 拓未 1, 深谷 愛衣 2, 佐藤 大貴 1, 對馬 裕誠 1, 上原 健二 1,
高橋 徹 3, 阿部 敬悦 1,2,3（1東北大院・農, 2東北大・農・応生化, 3東北大・未来研）
kabe@niche.tohoku.ac.jp○端 瞭太 1,2, 堀内 淳一 1,2, 熊田 陽一 1,2, 広川 安孝 2,3,
花井 泰三 2,3, 村上 明男 2,4（1京工繊大院・工芸科学, 2JST・CREST, 3九大院・農, 4神戸大院・工）horiuchi@kit.ac.jp[背景・目的]我々は CREST プロジェクトにより、光合成細菌シアノバクテリア（藍藻）に新たな代謝経路を導入し、炭酸ガスから光合成により各種化学物質を生産する研究を進めている。本発表では 1,3 プロパンジオール(1,3PDO)合成代
謝経路を導入したシアノバクテリアを用い、フォトバイオリアクターシステム
により 1,3PDO の連続生産について検討した結果を報告する。
[方法・結果]菌株として Synechococcus elongates PCC7942 に 1,3PDO 合成代謝経路を導入した TA2984 株を用いた。培地には 20 μg/ml kanamycin spectinomycin,
20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM IPTG を含んだ BG11 培地を用いた。2.0 L 容量のエアリフト型バイオリアクターを用いて 30℃、蛍光灯照射により回分培養を行い、培養 10 日目から一定量の培地の追加と引き抜きを同時に行う半連続培養を行った。その結果、増殖と連動した 1,3PDO 生産が認められ、25 日目で 1,3PDO
濃度は 1.44 mM まで増加し、1,3PDO の連続生産の可能性が示された。次に連続バイオリアクターに適用する目的で菌体を高い希釈率でも高濃度に維持できる菌体固定化法を用いて、最適な担体及び条件を検討したところ、アルギン酸
ナトリウム固定化法で良好な増殖が認められた。この固定化菌体を用い、エアリフト型バイオリアクターによる回分培養を行ったところ、良好な増殖と 10 日
目で 0.63 mM の 1,3PDO 生産が得られ、連続培養の可能性が示された。現在、固定化菌体を用いたエアリフトバイオリアクターにおける連続培養実験を進めている。

Escherichia coli, metabolic engineering, acetate, metabolic pathway【背景】 hydrophobin は糸状菌に広く保存された低分子量の分泌型両親媒性タンパク質である。黄麹菌 Aspergillus oryzae の hydrophobin RolA はポリエステル
PBSA 等の疎水性固体表面に吸着し、その後 cutinase CutL1 と相互作用して固体表面にリクルートする(1)。これまでに、RolA N 末端側の複数の正電荷残基と、CutL1 分子表面の複数の負電荷残基が協奏的にイオン的相互作用することを明らかにした(2)。しかし、双方に未特定のイオン的相互作用部位が存在することも示唆されており、相互作用機構の完全な解明には至っていない。本報告ではRolA の N 末端側に着目し、この部位の相互作用への寄与を定量的に解析することを目的とした。
【方法】 CutL1 野生型と RolA の N 末端側変異体を用い、PBSA 微粒子の分解促
進試験、テフロン微粒子への CutL1 リクルート量定量、分子間相互作用解析装
置 QCM による相互作用の定量的解析を行った。
【結果】 RolA の N 末端側正電荷残基（H32, K34, K41, K46, K51）のうち、既知の相互作用部位 H32, L34 と、それ以外の Lys 残基を Ser に置換した RolA 多重
変異体を作製した。QCM により RolA 三重変異体（H32/K34/K41S, H32/K34/
K46S, H32/K34/K41S）と CutL1 の間の結合解離定数 KD 値（160～250 nM）は、RolA 二重変異体（H32/K34S）を用いた場合（46.1 nM）より大きく、Lys 残基を化学修飾した RolA を用いた場合（276 nM）に近い値を示した。ここから、
K41, K46, K51 も CutL1 とのイオン的相互作用に関与する可能性が示唆された。
現在、RolA 三重変異体を用いてさらなる解析を行っている。さらに、RolA 四重変異体、五重変異体（H32/K34/K41/K36/K51S）、RolA 荷電増加変異体（H22S,
H33S）を作製し、これらを用いた親和性解析を行っている。
1. Takahashi T, et al., Mol. Microbiol. 57:1780-1796 (2005)
2. Takahashi T, et al., Mol. Microbiol. 96:14-27 (2015)

1,3PDO production by photobioreactor using immobilized recombinantcyanobacteria○Ryota Hashi1,2, Jun-ichi Horiuchi1,2, Yoichi Kumada1,2, Yasutaka Hirokawa2,3,
Taizo Hanai2,3, Akio Murakami2,4(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2JST・CREST, 3Fac. Agric., Kyushu
Univ., 4Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)

Key words

cyanobacteria, photobioreactor, immobilized cell, continuous culture

Contribution of N-terminal of Aspergillus oryzae hydrophobin in thehydrophobin-cutinase interaction○Takumi Tanaka1, Ai Fukaya2, Daiki Sato1, Yusei Tsushima1, Kenji Uehara1,
Toru Takahashi3, Keietsu Abe1,2,3(1Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ., 2Dept. Agric., Appl. Biol. Chem., Tohoku
Univ., 3NICHe, Tohoku Univ.)

Key words

Aspergillus oryzae, hydrophobin, cutinase, quartz crystal microbalance生物化学工学

3P-2p147 腸内有用細菌のストロンチウム除去特性の解析（第 2 報）
○遠藤 輪, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp315

3P-2p149 大腸菌フロック上での組換えタンパク質固相発現系の構築○尾島 由紘 1, 布上 翔太 2, 東 雅之 1, 田谷 正仁 2（1阪市大院・工・化生系, 2阪大院・基礎工）ojima@bioa.eng.osaka-cu.ac.jp【目的】 原子力発電所の事故などが発生した際に放出された放射性元素が食品などを介して消化管内に侵入した場合、適切に体外へ排出させる必要がある。
特に、放射性 Sr が体内に取り込まれ、一旦、骨に沈着してしまうと体外への排出は困難であり、長期間にわたり内部被曝を受け続けるため深刻な問題となる。
我々は、副作用のない新規な放射性元素の消化管からの排出法として乳酸菌の利用を考案し、その可能性を示してきた 1）。本研究では、乳酸菌の Sr 除去量の向上が可能な培養条件の探索をおこなった。また、腸上皮の培養細胞を用いて
Sr の腸管透過性評価を行い、乳酸菌を用いた Sr 体外排出法の有効性について検討を行った。
【方法と結果】 乳酸菌の Sr 除去量を向上させるため、種々の培養条件を検討した。その結果、培地成分により Sr 除去量が大きく変化することが明らかになり、検討をおこなった中ではクエン酸添加培地で培養した乳酸菌で単位菌体量あたりの Sr 除去量が最大となった。また、ヒト結腸ガン由来の Caco-2 細胞をセルカルチャーインサート上で 3 週間培養し、腸管上皮の透過性評価モデルとして使用した。このモデルの管腔側に Sr 濃度を 10 mg/L に調整した HBSS（pH7.4）を加え、基底膜側への Sr の移行量を ICP-MS により測定した。乳酸菌（Lactobacillus delbrueckii、L. gasseri、L. casei）を加熱処理することで遊離した成分を管腔側に添加したところ、無添加の場合と比較して Sr の移行量は 10～40％程度減少した。この結果から、乳酸菌から遊離した成分が Sr を吸着することで腸管上皮での Sr 透過量を減少させることができる可能性が示唆された。
1）H27 生物工学会要旨集 p.139【目的】 本研究グループは，これまで大腸菌のセルロース生合成関連遺伝子である bcsB の過剰発現により，浮遊型バイオフィルムであるフロックが自発的に形成されることを報告している．また，フロックの主構成成分はタンパク質であること，さらに LC-MS/MS 解析により，翻訳因子の１つである Elongation
factor Ts (TSF)と呼ばれるタンパク質の存在比率が最も高いことを明らかにしてきた．本研究では，大腸菌フロック上に多く存在する TSF を起点とし，フロッ
ク上での組換えタンパク質固相発現系の構築を行った．
【方法および結果】bcsB 遺伝子を導入した大腸菌に対して，さらに TSF-GFP 融
合タンパク質を発現するプラスミドを導入し，グルコースを含む LB 培地を用
いて 37℃で培養し，目視観察により数 mm 程度のフロック形成を確認した．さらに蛍光顕微鏡による観察で，フロック構造全体に GFP が発現していることを確認した．ここで，融合タンパク質 TSF-GFP のリンカーとしてトロンビン認識
配列を挿入しており，フロックに対してトロンビン処理を行ったところ，フロッ
ク上に発現した GFP が溶液中に遊離することが蛍光強度測定ならびに SDSPAGE によって確認でき，組換えタンパク質がトロンビン処理により回収可能であることが示された．
以上の結果より，TSF タンパク質を起点として大腸菌のフロック上に組換えタ
ンパク質の固相発現が可能であることを明らかにした．

Analysis of strontium removal characteristics of probiotics (part 2)

Solid-state expression of recombinant protein on the flocs formed byEscherichia coli cells○Rin Endo, Hideki Aoyagi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

Caco-2 cells, lactic acid bacteria, probiotics, strontium

3P-2p148 模擬微小重力培養が腸内細菌の生理活性に及ぼす影響の解析と利用（第 2 報）○Yoshihiro Ojima1, Shota Nunogami2, Masayuki Azuma1, Masahito Taya2(1Dept. Appl. Chem. & Bioeng., Grad. Sch. Eng., Osaka City Univ., 2Grad. Sch.
Eng. Sci., Osaka Univ.)

Key words

3P-2p150 菌体表面疎水性とバイオフィルム形成量との関係解明○谷川 絢美 1, 小田 忍 2, 大箸 信一 2
（1金工大院・工, 2金工大・ゲノム研）
odas@neptune.kanazawa-it.ac.jp○長谷川 文香, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp【諸言】 従来法で培養可能な微生物は、自然界に存在する微生物の 1％前後であることが示唆され、新たな培養法が求められている。我々は微小重力場を形成し、優れた拡散や低剪断力環境を有する模擬微小重力（LSMMG）培養に着目し、ヒトと綿密な相互作用がある種々の腸内細菌（乳酸菌やビフィズス菌など）の生理活性に及ぼす影響を解析した。その結果、通常重力（NG）培養とは異なる挙動が認められた 1）。今回は、検討する腸内細菌株の範囲を拡げ、LSMMG
培養が腸内細菌の生理活性に及ぼす影響を比較解析した。
【方法と結果】 HARV bioreactor を用いて、乳酸菌 10 株、ビフィズス菌 9 株をNG と LSMMG の条件で比較培養した。乳酸菌株の多くは LSMMG 培養で増殖が促進した（Lactobacillus acidophilus では、NG 培養の約 2.7 倍高い増殖を示した）。また、顕微鏡観察により、L. acidophilus の LSMMG 培養で特異的に、NG培養では見られなかった菌体同士の接着、凝集が認められた。ビフィズス菌や他の腸内細菌についても検討した結果、LSMMG に対する感受性や応答性には多様性があることが示唆された（タイプ別の分類を検討中）。NG 条件下では腸内細菌の増殖を促進する様々な prebiotics（PB）が報告されているが、LSMMG
条件下での効果は未解明である。モデル PB として大豆組成物を用いて B. breve
を LSMMG 培養した結果、増殖促進効果が認められた。現在、LSMMG 培養における PB の他の腸内細菌への効果や有効な PB の探索を検討中である。
1）H27 生物工学会要旨集 p. 139

flocculation, recombinant protein production, Escherichia coli

【目的】 従来のバイオフィルム定量法は試験管中に試験片と菌体懸濁液を入れ振とう培養を行う方法か 6 穴マルチプレートの底面にバイオフィルムを形成させる方法が主流であった。だがこれらの方法では振とう培養中にバイオフィル
ムが剥離する、polystyrene しか計測できないといった問題点があった。これらの問題点を解決し、バイオフィルムを正確かつ汎用的に定量し得る方法として、
Plate-hanging 法の確立を目的とした。その上で、菌体表面疎水性、試験片の疎水性、バイオフィルム形成能との関連性を調べた。
【方法】 6 穴マルチプレートに菌体懸濁液を分注し、ふたに設置した試験片を懸濁液に接する形で 24 時間又は 48 時間振とう培養した。その後試験片を洗浄し、超音波処理でバイオフィルムを剥離させた。剥離液を寒天プレートに塗布し、48 時間培養後にコロニー数をカウントした。菌体表面疎水性の定量に関しては
菌体懸濁液を振とう培養し、3 回遠心分離を行い洗浄と集菌を行った。その後
リン酸緩衝液に懸濁させて有機溶媒とボルテックスし、OD400 を計測すること
で菌体表面疎水性を求めた。
【結果】Staphylococcus epidermidis NBRC 12993、Pseudomonas putida NBRC 14164のバイオフィルム形成量を Plate-hanging 法で確認したところ、S. epidermidis
NBRC 12993 は疎水性の低い試験片に多く付着し、P. putida NBRC 14164 は疎水性の高い試験片に多く付着した。疎水性の試験でも 2 種の菌を比較したところ、
S. epidermidis NBRC 12993 の表面疎水性は低く P. putida NBRC 14164 の表面疎
水性は高い結果が得られた。同様の試験を酵母についても実施した。

Analysis of the effect of low shear and modeled-microgravity culture on thephysiological activities of enteric bacteria (part 2)

Relationship elucidation of biofilm formation amount and the cell surfacehydrophobicity

Key words
bifidobacterium, enteric bacteria, lactic acid bacteria, low shear andmodeled-microgravity culture

Key words○Fumika Hasegawa, Hideki Aoyagi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)○Ayami Tanikawa1, Shinobu Oda2, Shinichi Ohashi2(1Grad. Sch. Eng., Kanazawa Inst. Technol., 2Genome Biotechnol. Lab., Kanazawa
Inst. Technol.)biofilm, Hydrophobicity of the cell surface

316

生物化学工学3P-2p151 変異原性ヌクレオシド dP による細胞死誘発に関与する遺伝子の特定と, その集積によって構築された高効率ネ
ガティブ選択系

3P-2p153 凝集性酵母における新規な阻害剤耐性機構の解明○糸見 明穂 1, 紀平 和枝 1, Kahar Prihardi 1, 荻野 千秋 1,
近藤 昭彦 2
（1神戸大院・工, 2神戸大院・科学技術イノベーション）
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp○河合（野間） 繁子, 佐伯 和哉, 湯本 達弥, 斎藤 恭一,
梅野 太輔（千葉大院・工）kawai-noma@chiba-u.jp
外来遺伝子のゲノムへの導入，そして導入する遺伝子（機能）の発現調節系の機能選抜のために，数多くのポジティブおよびネガティブ選択系が試されてきた．ポジティブ選択系は十分な性能を持つものが多数知られるのに対し，ネガ
ティブ選択系のラインナップは少なく，それらの性能にも多くの技術的問題が残っている。
当研究室には, 変異原性非天然ヌクレオシド dP とチミジンキナーゼ HsvTK を用いたネガティブ選択系が存在している（Tashiro, NAR, 39, e12 (2011)）。この選択
系は，わずか 0.1-1μM の dP を培地に添加するだけで，HsvTK を発現している
大腸菌細胞だけを, 高速かつ高効率に死滅させることができる。しかし, dP は変異原性化合物であるため, 現行の 0.1μM という添加濃度では，細胞ゲノムの自然突然変異頻度が１桁ほど高まる。更に一桁低い作用濃度（0.01μM）では細胞の突然変異頻度は変化しないことが分かったため，本研究では，dP によるネガ
ティブ選択をこの低濃度領域で実施可能とすることを目標とした。
各種ヌクレオシドの取り込みや代謝に関与する（あるいはし得る）遺伝子を文
献情報をもとに洗い出し, それらの欠損株，および過剰発現株を作製した。これ
らの大腸菌株内で HsvTK を発現させ，その dP による致死性に対する影響を調べた。ヌクレオシド取り込みに関わる内膜トランスポーター，NupC と NupGの欠損は大腸菌の dP 感受性を低下させ，逆に過剰発現によって dP 感受性は高まった。dP の細胞内取り込みに大きく関与することが示唆された。また、外膜
トランスポーター Tsx やヌクレオシドキナーゼ Ndk の過剰発現も dP 感受性を大いに高め，0.01μM（目標値）の dP 添加で十分な致死性を実現できた。本講
演では，これらの遺伝因子を組み合わせ, さらに高効率で変異フリーなネガティ
ブ選択系構築の試みについても紹介する。

微生物である酵母を用いた発酵に関する研究は、近年多くの研究者によって行われているが、バイオマスの前処理後に副生成物として生成される、酢酸やフルフラールといった阻害剤によって発酵が妨げられているというのが現状である。製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（NBRC）の酵母ライ
ブラリーから約 2,000 株の網羅的スクリーニングおよび改良を行った結果、極めて高い発酵阻害剤耐性を示す株として凝集性 Saccharomyces cerevisiae F118 株（以下、F118）を獲得した。さらに F118 の変異処理および順化により、35℃で増殖・発酵できる F118S8-8 株（以下、S8-8）を獲得した。この株は、30℃では凝集するが 35℃では凝集しないという特有な温度感受型凝集性も示した。
本研究では、S8-8 の発酵阻害剤耐性および温度感受型凝集性の機構解明を試みた。そこで、S8-8 の凝集遺伝子破壊株（S8-8ΔFlox）および凝集遺伝子再導入
株（S8-8ΔFlox/FF）を作製してエタノール発酵試験を行った。次に qPCR を用いることでこれらの酵母株における遺伝子の発現量を比較し、発酵阻害剤耐性機構に関連する遺伝子の決定とその相関関係を検討してみた。
その結果、S8-8ΔFlox でエタノール発酵が行われず、S8-8ΔFlox/FF で元の株 S8-8と同様のエタノール発酵が行われることから、阻害剤存在下での S8-8 の発酵能には凝集遺伝子 Flox が関与していることがわかった。さらに qPCR の結果より、細胞膜貫通 ATP 結合型トランスポーター遺伝子の発現が阻害剤耐性に影響を与えることがわかった。

Identification of the genes that boost the cell death mediated by non-natural
nucleoside dP for the development of highly effective negative selection
platform.

Study on the new tolerance mechanism of flocculating yeast to fermentative
inhibitor○Kawai-Noma Shigeko, Sake Kazuya, Yumoto Tatsuya, Saito Kyoichi,
Umeno Daisuke(Grad. Sch. Eng., Chiba Univ.)

Key words

Directed evolution, Non-natural nucleoside, Negative selection

3P-2p152 LEA peptide - confer tolerance to salinity andtemperature in E.coli.

○Akiho Itomi1, Chie Kihira1, Prihardi Kahar1, Ogino Chiaki1, Kondo Akihiko2(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Innovation. Kobe Univ.)

Key words
fermentation

Saccharomyces cerevisiae, chemical inhibitor, flocculating yeast,

3P-2p154 ストロンチウムがツバキ花粉の生理活性に及ぼす影響の解析

山下 綾子 1, ○中村 真由 2, 望月 玲於 1, 青柳 秀紀 1,2（1筑波大院・生命環境, 2筑波大・生物資源）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp○Nishit Pathak, Shinya Ikeno(Grad. Sch. Life Sci. Syst. Eng., Kyushu Inst. Technol.)ikeno@life.kyutech.ac.jp

Late embryogenesis abundant (LEA) proteins are a family of hydrophilic proteins, playa protective role under different abiotic stresses. Then, we constructed, characterized
and generated novel peptide with 13 mer motif for the expression of the target protein
in E.coli through the co-expression system. Our previous study the LEA peptide has
increased the cellular expression of the target protein in E.coli as comparison tocontrol. Most of the in vivo studies demonstrate a protective function of LEA proteinsin relation to abiotic stress. The differential accumulation profiles of the LEA protein
suggest different roles in cell, correlating with salt, heat and cold tolerance. However,mostly researcher work on the LEA protein function that lead to stress protection has
become known. On the basis of the previous research, we try to abiotic stressexperiment against our constructed LEA peptide. Salt and temperature tolerance assayof E.coli harboring on Luria broth medium at 37°C, growing at 4 h after the with orwithout induction of IPTG. Further, LEA peptide expressing E. coli cells exhibited
extreme after salt treatment was 4-fold higher than that of control cells. These results
showed that LEA peptide can enhance the cellular tolerance to temperature and salt
stresses in E.coli cells. This study provides a detailed repository of LEA peptide that
accumulates in relation to the survival in the salt state and represents an important step
towards the analysis of their functional properties.

【目的】 東日本大震災により、福島原発から環境中に飛散した放射性ストロンチウム（Sr2+）は大きな問題となっている。汚染地域の大部分は森林域であり、現在、そこに生息する生物や土壌などを対象に、Sr2+の動態・影響評価が行われている。しかしながら、森林域に多く存在する花粉の生理活性に Sr2+が及ぼす影響は十分に解析されておらず未解明な部分が多い。花粉は極性成長をする
細胞のモデルであり、培養期間が短いという長所もある。これらの背景を踏まえ、本研究では Sr2+が花粉の生理活性に及ぼす影響の解析を試みた。
【方法と結果】 モデルとしてツバキ（Camellia japonica）の花粉を実験に用いた。従来法の問題点を排除し、Sr2+がツバキ花粉の生理活性に及ぼす影響を適切に解析するために、高純度セルロースシートを用いた培養法（UCS 法）を独自に開発した。Sr2+ はアルカリ土類金属類と類似した動態を示すため、任意の濃度の SrCl2、CaCl2、MgCl2 を用い種々検討した結果、Sr2+は Ca2+や Mg2+と比べて低濃度で、ツバキ花粉の発芽率を大幅に低下させ、花粉管の伸長を顕著に阻害するとともに、花粉管先端部にカロースの沈着が認められた。UCS 法を活用
し、Sr2+が生育状態の異なるツバキ花粉の生理活性に及ぼす影響を検討した結果、Sr2+は花粉の発芽前に強く作用することが示唆された。Sr2+による阻害効果の緩和を目指し、Ca2+と Sr2+を同時に添加してツバキ花粉を培養した結果、Ca2+量の増加に伴い Sr2+による阻害の緩和効果の増大が認められた。現在、花粉粒の細胞壁における Ca2+と Sr2+の挙動や役割について解析中である。

LEA peptide - confer tolerance to salinity and temperature in E.coli.

Effect of strontium on the physiological activities of Camellia japonica
pollen grains○Nishit Pathak, Shinya Ikeno(Grad. Sch. Life Sci. Syst. Eng., Kyushu Inst. Technol.)Key words

salt tolerance, LEA peptide, abiotic stress, co-expression

Ayako Yamashita1, ○Mayu Nakamura2, Reo Mochizuki1, Hideki Aoyagi1,2(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Col. Agro-bio. Resource. Sci., Univ.
Tsukuba)

Key words

calcium, novel culture method, pollen, strontium

培養工学

3P-2p155 強化平板法と発育遅延解析法を併用した「固液培地生存性差分(DiVSaL)法」による微生物の新規損傷菌数評価

317

3P-2p157 細胞間相互作用を利用した新規微生物制御法の開発○勝亦 雄太, 豊福 雅典, 小川 和義, 野村 暢彦（筑波大院・生命環境）
nomura.nobuhiko.ge@u.tsukuba.ac.jp○岩田 吏世 1, 坂元 仁 2, 土戸 哲明 2, 古田 雅一 1,2（1阪府大院・工, 2阪府大・21科研機構・微制研セ）
mfuruta@b.s.osakafu-u.ac.jp[目的]
一般に、殺菌処理を比較的温和な条件で行うと損傷菌が発生するため、その計数や評価が問題となる。一般の微生物栄養細胞の損傷菌の計数・評価は通常 2つの異なる方法によって検出された生存数の差によって行われることが多い。
演者らは、加熱や薬剤によって発生する損傷菌の特性について検討してきており、損傷菌数測定法として「固液培地生存性差分法」（Difference in Viabilities
between Solid and Liquid Media－DiVSaL－法）を提唱している 1)。この方法は、殺菌処理後の生存率測定法として液体培地を用いる発育遅延解析法 2)（理論基盤となる損傷細胞集団の発育遅延時間分布関数を導入し、損傷による遅延時間を生存数低下に換算して評価）と、想定可能な最良の培養条件で計数する強化
寒天平板法（十分な時間を与え、損傷菌を極力蘇生させて CFU を計数）の２つの方法によって得た生存率の差を損傷菌数として測定・評価する方法である。
今回は大腸菌をモデルに用いて加熱損傷における損傷菌数評価について適用した結果を報告する。
[方法及び結果]
大腸菌 OW6（NBRC106482）を EM9 液体培地中、30℃で培養し、対数増殖期の細胞を集菌、洗浄後、50mM リン酸カリウム緩衝液（KPB）中、50℃で加熱処理した。加熱処理中の損傷菌数は、加熱時間とともに減少した。平板上でのコロニー形成の時間差から損傷度を亜集団ごとに評価し、その平均の遅延時間を評価した。得られた結果から、この新しい定義による損傷菌数評価法は、細胞集団レベルでの液体・固体培地での発育特性の原理の違いを利用したもので、食品のシェルフライフの概念に適合し実用的なものと言える。
1)土戸:防菌防黴学会要旨集, p. 213 (2015).
2) Takano, M. and Tsuchido, T.: J. Ferment. Technol., 60, 189 (1982).

近年，実環境中の微生物の多くはバイオフィルムのような集団を形成して存在することが知られるようになってきた．加えて，このような集団中では微生物が互いにコミュニケーションを行うことも明らかとなってきた．中でも Quorum
Sensing (QS)と呼ばれるコミュニケーションは，呼吸や毒素生産，抗生物質耐性といった多くの活性を制御しており，QS を対象とした微生物制御は幅広い産業分野への応用が期待できる．QS は菌体密度依存的なシステムであるため，菌体密度を意図的に調節することで発現制御が可能になると考えられる．そこで本研究では，菌体密度の調節による QS 制御法の開発を目指した．
菌体密度制御素材として，我々は poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPA)に着目した．PNIPA は 32°C を境に伸縮する性質を持つため，温度刺激により菌体密度の制御が可能になると考えた．まず，QS モデル細菌である緑膿菌 Pseudomonas
aeruginosa PAO1 (野生株)を包括した PNIPA 担体を異なる温度条件で培養し，包括菌体の増殖挙動を観察した．結果，収縮した PNIPA 担体特異的に菌体数が増加することが分かった．この挙動に QS が関与するか確かめるため，続いて
ΔlasIΔrhlI (シグナル物質非生産株)を用い同様の実験を行った．結果，ΔlasIΔrhlI
では野生株に見られた菌体数の増加は確認されなかった．加えて，収縮しない担体においては，いずれの温度条件でも細胞数の変化は観察されなかった．以上の結果から，収縮した PNIPA 担体が作り出す高い菌体密度条件が，P.
aeruginosa の QS 発現を誘導する効果を持つことが示唆された．本研究により，菌体密度の調節によって QS が制御できる可能性が示された．

A novel method for enumeration of injured microbial cell population bydifferential viabilities

A new method to control bacteria by applying a cell-cell interaction○Riyo Iwata1, Jin Sakamoto2, Tetsuaki Tsuchido2, Masakazu Furuta1,2(1Dept. Grad. Sch. Eng., Osaka Pref. Univ., 2RCMC, Res. Org. 21st Century. Osaka.
Pref. Univ.)

Key words
plate countdifferental viability, injured microorganism, growth delay analysis,

3P-2p156 大腸菌細胞質内における ssrA タグ認識プロテアーゼ活
性評価のためのレシオメトリックセンサーの開発○Yuta Katsumata, Masanori Toyofuku, Kazuyoshi Ogawa, Nobuhiko Nomura(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words
transduction

bacteria, quorum sensing, Pseudomonas aeruginosa, signal

3P-2p158 白色腐朽菌によるマンガンペルオキシダーゼの高効率生産に向けた pH シフト条件の検討○坂元 仁 1,2, 古田 雅一 1,2,3, 土戸 哲明 1
（1阪府大・21科研, 2阪府大・放研セ, 3阪府大院・工・量子）
sakamoto.jj@gmail.com○嶋田 亮, 森本 康介, 櫻井 明彦（福井大院・工）a_sakura@u-fukui.ac.jp【目的】大腸菌において停止コドンを持たない分解 mRNA からタンパク質が翻訳される際、ssrA 遺伝子がコードする tmRNA によって 11 残基のペプチドが C末端に付加され、これが細胞内で合成された異常タンパク質の標識として働き、細胞質では ClpA、ClpX プロテアーゼ系によって特異的に分解除去される。
tmRNA は細胞内のタンパク質の品質維持に必要なシステムである。半致死的な
外的ストレスに曝された細胞での分解代謝が回復に相関するならば、この機能を細胞の健全性の指標として活用できると考えられる。そこで ssrA タグ標識タ
ンパク質の分解挙動を解析するための蛍光タンパク質を用いたアッセイ系の構築を試みた。
【方法と結果】GFP への ssrA タグ標識システムが、Farrell ら(2005)により報告されている。しかしながら蛍光タンパク質の発現量や蛍光団形成の成熟速度は、宿主の遺伝的背景や培養条件など細胞内環境の違いに影響され、絶対量と蛍光量が必ずしも一致しない等の問題を内包している。そこで我々はこの問題の解決を試みた。構成プロモーター PlacUV5 下流に EGFP 遺伝子または mCherry 遺伝子を連結したベクターを構築し、さらに mCherry の C 末端側に通常のssrA(AA)タグと、末端 2 箇所の L-Ala を L-Asp に置換した分解を免れる ssrA(DD)
タグを付加し、pKK232-8 ベクターを基盤に EGFP と mCherry-ssrA を互いに逆向きに連結した pTwoFP-ssrA(AA)および pTwoFP-ssrA(DD)を構築した。同じベクター内かつ同じプロモーターで EGFP と mCherry が誘導されるため、細胞環
境が異なり、プラスミドコピー数、発現量、蛍光団成熟速度が異なってもネガ
ティブコントロールベクター保持株の赤：緑の蛍光比で割ることで ssrA タグ標
識タンパク質の分解能の評価が可能となった[赤(AA)/緑]/[赤(DD)/緑]。今回はこれを用いた各種ストレス条件下での ssrA タグ認識プロテアーゼ活性評価を報告する。

【緒言】 白色腐朽菌が生産するマンガンペルオキシダーゼ(MnP)は基質特異性が低く、酸化力が強いことから、バイオリファイナリーやバイオレメディエーショ
ンなどへの応用が期待されている。しかしながら、MnP の生産性は低く、工業レベルには達していない。当研究室のこれまでの実験から、培養途中に培地のpH を低下させること(pH シフト)により、MnP の生産性が向上することが分かっている。そこで本研究では、pH のシフト値とシフト時期の MnP 生産性に対する影響について検討した。
【方法】 MnP 生産菌には Bjerkandera sp. L-25 株を用いた。培養は振盪培養法(30℃、150 rpm)で行い、500 mL バッフル付き三角フラスコ内の培地 100 mL に、前培養(30 ℃、5 日間)した菌糸体を接種して開始した。培地組成は Potato Dextrose
Broth 24 g/L、Polypepton (Fine granules) 45 g/L、MnSO4・5H2O 0.241 g/L とし、
オートクレーブ前の pH を 7.0 に調整した。培養途中の pH は 3.0～5.5 にシフトさせ、シフト時期は 2.5～6.5 日目に設定し、応答曲面法により最適条件を探索した。また、得られた最適条件を用いて pH シフトを繰り返した(12 時間毎)。
MnP 活性は、Mn3+マロン酸錯体法で測定した。
【結果と考察】 応答曲面法による解析結果から、最大 MnP 活性は pH を低い値にシフトし、シフト時期を遅くするにつれて上昇する傾向を示し、最適条件は
シフト値が 4.6、シフト時期が 5.5 日目と予測された。得られた最適条件で培養を行ったところ、Control と比較して最大 MnP 活性は約 40 ％上昇し、増殖量は約 10 ％上昇した。また、pH シフトを繰り返したところ、Control と比較して最大 MnP 活性が約 90 ％上昇し、増殖量は約 50 ％上昇した。現在、pH シフトによる代謝の変化などを解析している。

Ratiometric sensor for ssrA tagged protein specific protease activity assay in

Enhanced production of manganese peroxidase by white rot fungus with pH
stimulation

Escherichia coli

○Jin Sakamoto1,2, Masakazu Furuta1,2,3, Tetsuaki Tsuchido1(121Res.Osaka Pref. Univ., 2Rad. CRes.Osaka Pref. Univ., 3Dept. Quantum, Grad.
Sch. Eng., Osaka Pref. Univ.)

Key words

Escherichia coli, ssrA, protein-quality control, GFP○Ryo Shimada, Kosuke Morimoto, Akihiko Sakurai(Grad. Sch. Eng. Fukui Univ.)

Key words
methodwhite-rot fungi, manganese peroxidase, pH shift, response surface

318

培養工学

3P-2p159 イオンビーム照射によるリグニンペルオキシダーゼ高生
産株の育種

3P-2p161 酵母 Kluyveromyces marxianus によるキシロース条件下
でのタンパク質分泌生産○三木 紀彦 1, 杉浦 康友 1, 畑下 昌範 2, 櫻井 明彦 1
（1福井大院・工, 2若狭エネ研）
a_sakura@u-fukui.ac.jp○星田 尚司 1,3,4, 木寺 研太 1, 瀧下 竜太 2, 藤岡 経久 1, 深川 泰紀 2,
赤田 倫治 1,3,4（1山口大院・創成科学, 2山口大・工, 3山口大・中高温微生物セ,
4
山口大・生命医工セ）hoshida@yamaguchi-u.ac.jp【緒言】白色腐朽菌が生産するリグニン分解酵素の一つであるリグニンペルオキ
シダーゼ(LiP)は、他のリグニン分解酵素に比べて酸化力が強く、リグニン分解能力が高いためバイオリファイナリーへの応用が期待されている。本研究では、
Bjerkandera 属の白色腐朽菌にイオンビームを照射することにより LiP 高生産株の作出を検討した。また、得られた変異株の培養条件を検討した。
【方法】野生株である Bjerkandera sp. L-25 にプロトン(LET 0.5 KeV/μm)とカーボン(LET 42.0 KeV/μm)のビームを照射した。照射線量はプロトンでは 1000～3500
Gy、カーボンでは 750～1500 Gy に設定した。照射後の菌糸は、PDA(Potato
Dextrose Agar)培地にリグニン 2 g/L を加えたリグニンプレートと、PDA にRBBR(レマゾールブリリアントブルー R)0.1 g/L を加えた RBBR プレートの両方に植菌した。両プレートでの増殖の様子から生存率と変異率を算出し、脱色具合からリグニン分解能力の簡易的な評価を行った。さらに、得られた有望株の LiP 生産性を振盪培養(30 ℃、150 rpm)により確認し、候補をしぼりこんだ。
また、選択した有望株に対して、LiP 生産に及ぼす窒素源(Bacto Yeast Extract)濃度の影響を検討した。なお、LiP 活性はベラトリルアルコールの酸化により生成するベラトリルアルデヒドの吸光度(310 nm)を測定することで算出した。
【結果と考察】プロトンビームを用いた場合では、生存率は照射線量 1500 Gy 付
近から低下し始め、2000 Gy 付近で急激に低下した。変異率は 2000 Gy 以上で上昇した。一方、カーボンビームを用いた場合では、生存率は照射線量が 1000
Gy を超えると急激に低下し変異率も上昇した。得られた変異株は BYE 濃度が45 g/L で最も高い LiP 活性の値を示し、その値は野生株の約 2 倍であった。

【背景と目的】 組換えタンパク質生産宿主として多くの微生物でタンパク質発現系が開発されている。一般的に酵母はタンパク質の分泌生産能が低い。しかし，増殖速度や培養の容易さ，さらには遺伝子操作の点では優位性があり，分泌生産能の高い酵母，あるいはそのための培養条件が明らかになれば，タンパ
ク質生産に適した宿主となり得る。そこで，酵母 K. marxianus がタンパク質分泌生産宿主として利用可能かどうかを調べた。
【方法，結果，考察】K. marxianus は比較的広い糖資化能を持つ酵母である。
DMKU3-1042 株を 8 つの異なる糖を炭素源とする培地を用いて培養し，培養上
清中のタンパク質を SDS-PAGE で解析すると，キシロース条件下で強く分泌生
産されるタンパク質が存在した。N 末アミノ酸配列解析，および，そこから推測された候補遺伝子の破壊により，そのタンパク質がイヌリナーゼであることが分かった。DMKU3-1042 株を含む 16 の K. marxianus 株のグルコースおよび
キシロース培地での分泌を比較すると，グルコース培地でも比較的多くイヌリ
ナーゼを分泌する株も存在し，ほとんどの株でキシロースにより分泌生産が増加した。中でも NBRC1777 株は高い分泌生産量を示した。NBRC1777 株を用いてイヌリナーゼ分泌生産のための培養条件を調べたところ，酸素供給が影響することを示唆する結果を得た。そこで，発酵槽を用いて撹拌数を変えて培養す
ると，高い撹拌数で溶存酸素を高く保った培養条件でイヌリナーゼ分泌生産量が高かった。組換えタンパク質として分泌性ルシフェラーゼを NBRC1777 株に導入し，キシロース培地で培養すると，ルシフェラーゼも溶存酸素濃度が高い
条件で多く分泌された。これらの結果は，K. marxianus がタンパク質分泌生産のための宿主として有用であることを示している。

Breeding of white rot fungus with high lignin peroxidase productivity by ion
beam irradiation

Secretory protein production by the yeast Kluyveromyces marxianus inxylose medium○Norihiko Miki1, Yasutomo Sugiura1, Masanori Hatashita2, Akihiko Sakurai1(1Grad. Sch. Eng. Fukui Univ., 2Wakasa Wan Energy Res. Center)

Key words

white-rot fungus, lignin peroxidase, mutation, ion beam

3P-2p160 新規酢酸耐性酵母 KS47-1 株における耐性機構に関する基礎検討○Hisashi Hoshida1,3,4, Kenta Kidera1, Ryota Takishita2, Nobuhisa Fujioka1,
Taiki Fukagawa2, Rinji Akada1,3,4(1Grad. Sch. Sci. Tech. Innov., Yamaguchi Univ., 2Fac. Eng., Yamaguchi Univ.,
3
YURC-TMR, Yamaguchi Univ., 4YUBEC, Yamaguchi Univ.)

Key words

Kluyveromyces marxianus, xylose, secretory production, inulinase

3P-2p162 CHO 細胞培養における予測制御技術を応用したグルコース濃度制御法

生田目 哲志 1, 中村 幸弘 1, 伊﨑 文晃 1, 平野 明成 1,○下田 聡一郎 1, 大政 健史 2（1横河電機・イノベーションセンター, 2阪大院・工）Souichirou.Shimoda@jp.yokogawa.com○加藤 勇太, 荒川 知子, 石田 奨, 小西 正朗（北見工大）
konishim@mail.kitami-it.ac.jp【背景】
現在、食糧・飼料と拮抗しない原料、草木・木質由来のリグノセルロース系バ
イオマスを用いた微生物発酵の確立が求められている。しかし、リグノセルロー
ス系バイオマスから有用物質を生産する際に発酵阻害物質が副生成されることが知られており、その除去処理によるコストの増加が問題となっている。当研
究グループは、北見工業大学屈斜路研究所周辺の土壌から発酵阻害物質存在下でも良好に増殖する酵母 Pichia membranifaciens KS47-1 株の分離に成功している。また、KS47-1 株の持つ発酵阻害耐性は基準株や近縁種には見られない
KS47-1 株特有のものであることがわかっている。そこで、既知の発酵阻害物質に対する KS47-1 株の耐性を培養工学的に評価し、発酵阻害耐性機構について検討した。
【方法・結果】
KS47-1 株の培養特性を検討したところ、酢酸に対し既知の耐性菌より強い耐性を示し、350 mM 酢酸存在下でも良好に増殖することがわかった。そこで Illumina
HiSeq を用いて KS47-1 株のドラフトゲノムを解析し、アノテーションデータに対して既知の酢酸耐性に関する遺伝子について相同解析した。これにより酢酸の細胞内への流入チャネル Fps1 の欠損、プロトンポンプ Pma1、アニオン排出に関わる膜輸送タンパク質 Pdr12 の存在が推定された。一方、KS47-1 株の酢酸に対する資化性試験を行った結果、炭素源が酢酸のみでも増殖が見られ、酢酸を資化していることがわかった。このことから、非 Fps1 酢酸取り込み能を有することが示唆された。

【背景と目的】
動物細胞培養におけるグルコース濃度は、細胞代謝活性の指標として有用であり、適切に濃度制御することで細胞の生産性、安定性を向上する培養が期待できる。しかしながら、通常は限られた回数のサンプリング分析により、一定期間の必要量を間欠的に流加する方法となり、細胞代謝を考慮した濃度制御は行
われていない。本研究では、CHO 細胞を対象として、インライン計測とグルコース消費量の予測に基づいて、設定濃度の維持に必要なグルコース投入量を適切に制御するシステムの開発を行った。

Investigating acetate-tolerance mechanism of Pichia membranifaciens
KS47-1

Advanced Glucose Control Method Applying Predictive Control Technology
in CHO Cell Culture○Yuta Kato, Tomoko Arakawa, Masashi Ishida, Masaaki Konishi(Kitami Inst. Technol.)Key words
sequencing

acetate, fermentation inhibitors, Pichia membranifaciens, draft genome【方法】
抗体産生 CHO 細胞株と無血清培地である BalanCD 培地を用いた 2L スケールのバッチ培養下で、2g/L のグルコース濃度制御を行った。インラインで取得した
近赤外吸光スペクトルと交流インピーダンスを基に、30 分周期でグルコース濃度の推定と消費量予測を行い、2g/L を維持するようにグルコースを自動流加した【結果及び考察】
構築した制御システムを用いて 2g/L のグルコース濃度自動制御を行った結果、死滅期に入る培養 7 日目まで、グルコース濃度のインライン推定値はオフラインの測定値に良く一致し、2g/L±10％精度の濃度制御を実現した。本システム
は、リアルタイムなデータ収集と解析によりグルコース比消費速度など細胞代
謝活性の指標を随時把握出来るため、細胞状態の理解に基づいた培養条件検討を可能にする。今後は、本グルコース濃度制御技術を搭載した培養装置開発を、
連続プロセス向けを視野に入れて検討する予定である。

Tetsushi Namatame1, Yukihiro Nakamura1, Fumiaki Izaki1, Akinari Hirano1,○Soichiro Shimoda1, Takeshi Omasa2(1Innovation Center, Yokogawa Electric Corp., 2Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)
Key words
cell culture

in-line monitoring, predictive feed control, glucose concentration, CHO

培養工学

3P-2p163 軟培養面によるヒト iPS 細胞増殖への影響○堀江 正信 1, 藤田 英明 2,3（1京大・RIRC・生化工, 2理研・生命システム, 3阪大・免疫）
horie.masanobu.4z@kyoto-u.ac.jp319

3P-2p165 神経分化工程の非破壊評価に向けた細胞画像情報解析法の開発○藤谷 将也 1, Binti Huddin Noor Safika 2, 河合 駿 1, 蟹江 慧 1,
清田 泰次郎 3, 清水 一憲 2, 本多 裕之 2, 加藤 竜司 1
（1名大院・創薬科学, 2名大院・工, 3ニコン）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp【背景と目的】 ヒト人工多能性幹細胞 (ヒト iPS 細胞)はヒトから採取した体細胞へ特定の因子を導入することで樹立され、体を構成する様々な細胞に分化す
る多分化能と、無限に増殖する自己複製能を併せ持った細胞である。ヒト iPS
細胞にはドナーの遺伝情報を保存することが知られており、病態を体外で再現することができるため、創薬分野における利用が期待されている。さらに再生医療分野及び組織工学分野の著しい発展により、ヒト iPS 細胞由来細胞から作成した組織を移植する臨床試験なども行なわれており、今後ヒト iPS 細胞の需要が拡大することは自明である。しかしヒト iPS 細胞は人工的に作成した細胞であるために株間差が大きく、製造におけるパラメーターの設定が煩雑である。
本研究ではまず、未分化維持培養でのヒト iPS 細胞増殖制御を目的とし、様々な軟らかさの培養面上におけるヒト iPS 細胞増殖の評価を行った。
【方法】 アクリルアミドゲルの重合度を変化させることで様々な軟らかさの培
養面を作成し、ヒト iPS 細胞(253G1 株)を 1.0×104 cells/cm2 で播種した。 培養
24 h における接着率 α 及び、24-120 h における見かけの比増殖速度 μ を評価した。さらに、未分化性を評価するために、未分化細胞マーカー遺伝子である
Oct3/4, Sox2, Nanog, Rex1 の発現を評価した。
【結果と考察】 軟培養面上においては全ての条件において α が低くなったものの、μ に関しては通常の硬さの培養面よりも高くなる条件が存在した。また、培養 120 h において軟培養面上で培養したヒト iPS 細胞は未分化性を維持しており、軟培養面を用いて増殖を制御できる可能性が示唆された。

【目的】近年、筋委縮性側索硬化症（ALS）やアルツハイマー病などの神経疾患に対する治療として幹細胞の利用が注目されている。特に神経幹細胞（Neuralstem cell: NSC）はニューロンとグリア細胞に分化できる幹細胞であり、臨床応用に向けた培養法や品質評価法が開発されている。しかし NSC の品質評価には長期の培養に加え、各分化マーカーによる染色評価が必要であり、評価するタ
イミングも評価者の判断に委ねられているといった課題がある。我々はこれまで位相差画像を用いて幹細胞の分化状態を非破壊的に定量評価する画像解析手法を開発してきた。本研究では、本手法を NSC に応用し将来の分化度をリアルタイムに評価できる手法の構築を目的とした。
【方法】ヒト NSC 及びマウス NSC を 3 種類の神経分化培地を用いて分化培養
し、培養中の位相差画像を連続的に取得して形態情報を抽出した。その後、培養最終日に 2 種類の免疫染色にて分化評価データを取得した。抽出した形態情報と分化評価データを解析することで、細胞の形と神経分化度の対応を評価した。
【結果】NSC を各分化培地で分化培養した結果、培地ごとに細胞形態や分化度に違いが生じることが確認された。また、分化培養中の細胞画像から得られる
形態パラメータを用いることで分化培養時期の NSC の変化を非破壊的に定量化
し、神経分化度を従来の 1/2 の期間で検出可能であることが明らかにした。
【考察】今回の結果から分化培養時期の細胞画像により、将来の神経分化度をリ
アルタイムに予測でき、細胞画像情報による神経分化評価の有効性を示唆する結果となる。

Effect of substrate stiffness on human induced pluripotent stem cellproliferation

Image-based analysis for non-invasive quantitative evaluation of neuraldifferentiation

Key words
Human induced pluripotent stem cells, Soft substrate,
Mechanotransduction, Actin filament

Key words

3P-2p164 コロニー形態情報解析を用いた iPS 細胞における培養工

3P-2p166 Muse 細胞の非侵襲的・迅速な濃縮法の開発○Masanobu Horie1, Hideki Fujita2,3(1Div. Bio. Chem. Eng., RIRC., Kyoto Univ., 2QBiC, RIKEN, 3IFReC, Osaka Univ.)

程の評価○Masaya Fujitani1, Noor Safika Binti Huddin2, Shun Kawai1, Kei Kanie1,
Yasujiro Kiyota3, Kazunori Shimizu2, Hiroyuki Honda2, Ryuji Kato1(1Grad. Sch. Pharma. Sci., Nagoya Univ., 2Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 3Nikon
Corp.)Morphological profiling, Non-invasive, Neural stem cell

○江橋 具 1,3, 冨田 悠一 2, 𠮷田 健祐 3, 山地 秀樹 3
（1神戸大・自科・研究環, 2神戸大・工, 3神戸大院・工）yamaji@kobe-u.ac.jp○吉田 啓 1, 長坂 理紗子 1, 蟹江 慧 1, 清田 泰次郎 2,
古江-楠田 美保 3, 清水 一憲 4, 本多 裕之 4, 加藤 竜司 1
（1名大院・創薬科学, 2ニコン, 3医薬基盤研究所, 4名大院・工）kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp

iPS 細胞は、創薬スクリーニング、再生医療など様々な利用が期待されている
有用なツールである。今後、iPS 細胞の産業化に向けては、未分化な状態を維持した高品質な細胞を大量に生産し、供給する必要がある。現状 iPS 細胞の品
質管理は、日々の培養状態の観察に基づき行われているが、このような細胞培
養は今後、機械化・自動化することが求められてきている。しかしながら、細胞製品の製造工程には未だに原因不明のバラツキをもたらす変動要因が存在しており、特に細胞として極めてデリケートな一面を持つ iPS 細胞は、多くの外的変動要因の影響を受け、培養の途中で品質が変化してしまう可能性が高いが、これまで何の影響が小さく、何の影響が大きいかという定量的なデータ化を報告した例は少なかった。そのため、培養工程に潜む変動要因の影響の大きさを定量的に把握し、管理することが望まれていた。これまで我々のグループは、培養中の iPS 細胞の状態（iPS 細胞コロニーの増殖や形態変化）について画像
情報処理技術を用いてデータ化・可視化することを試みてきている。本研究では本技術を応用することで、iPS 細胞の培養方法（細胞、手技、コーティング剤）の違いによる細胞品質への影響をスコア化する品質管理技術について開発したので報告する。

間葉系幹細胞 (MSC: mesenchymal stem cell) に含まれている Muse (multilineagedifferentiating stress enduring) 細胞は高い多能性を有し、MSC 移植による治療に
おいて組織修復に直接貢献する有用な細胞である。しかしながら、培養 MSC
中でも数パーセント以下しか含まれないことから、Muse 細胞を効率よく取得する方法の開発が必要である。従来法であるセルソーターや酵素処理による細胞の濃縮法では、細胞への侵襲や長時間の培養が伴うことから、本研究では、さまざまな pH に調整した緩衝液で MSC を処理することにより、非侵襲的かつ迅
速に Muse 細胞を濃縮する方法を検討した。
培養 MSC をさまざまな pH に調整したリン酸緩衝液中に懸濁し、37oC にて 20
分間静置した。その後、非接着性培養皿による浮遊培養を行い、多能性幹細胞のマーカーとして知られる SSEA-3 を指標として、全細胞中に含まれる Muse 細胞の割合をフローサイトメトリーにて経日的に測定した。その結果、リン酸緩衝液が pH 4.5－7.4 の場合に溶液の pH が低くなるほど、Muse 細胞の割合が増加した。未処理の MSC 中の Muse 細胞は 0.6% であったのに対し、最も割合が増加した pH4.5 の場合では、培養 1 日目における割合は 1.2% となり、5 日目には 27% にまで増加した。以上の結果から、MSC を低 pH の緩衝液にて処理する
方法により、非侵襲的かつ短期間で、Muse 細胞を濃縮することに成功した。

Image-based evaluation of cell culture protocols in iPSC processing

Novel method for noninvasive and rapid enrichment of Muse cells○Kei Yoshida1, Risako Nagasaka1, Kei Kanie1, Yasujiro Kiyota2,
Miho Furue-Kusuda3, Kazunori Shimizu4, Hiroyuki Honda4, Ryuji Kato1(1Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2Nikon Corp., 3NIBIO, 4Grad. Sch. Eng.,
Nagoya Univ.)

Key words

iPSC, undifferentiation status, image-based analysis○Tomo Ehashi1,3, Yuichi Tomita2, Kensuke Yoshida3, Hideki Yamaji3(1Org. Adv. Sci. Technol. Kobe Univ., 2Fac. Eng., Kobe Univ., 3Grad. Sch. Eng,
Kobe Univ.)

Key words

Muse cell, enrichment, noninvasive method, pH

320

培養工学／バイオプロセス

3P-2p167 遺伝子導入による皮膚細胞から肺細胞への分化転換

3P-2p169 ピルビン酸高生産大腸菌を利用したピルビン酸の生産

肺は人間が生存する上で必須の臓器の一つであるが、肺線維症、肺がん、肺炎、気管支拡張症、肺結核など様々な病気が発生し、多くの方が肺疾患により命を落としている。なかでも慢性閉塞性肺疾患 (chronic obstructive pulmonary disease,
COPD) は不可逆的な肺組織の破壊が生じるため、慢性的な呼吸困難による QOLの低下を伴う不治の病である。現在 COPD の根本的な治療法は肺移植以外にな
いが、ドナー肺不足は深刻で一部の患者しか肺移植治療を受けられないため、多くの患者がこの疾患で命を落としている。また、肺がんや肺結核などの肺疾患後の後遺症に苦しむ患者も数多く存在することから、肺疾患に対する根本的な治療法が開発される事が強く期待されている。現在多能性幹細胞から肺細胞を作製することは可能であるが、肺組織の細胞のみを特異的に分化誘導することは困難である。
本研究では数種類の遺伝子を導入することで、皮膚細胞を肺細胞の元となる肺の前駆細胞へと特異的に転換させる事を試みた。

【背景と目的】ピルビン酸は、様々な方法により、多様な化学品原料に変換できる。そのため、ピルビン酸を高生産する大腸菌の作製は、バイオマスを利用した有用物質生産のための基盤技術の構築を可能にする。本研究では、大腸菌内に存在する数種のピルビン酸代謝関連遺伝子をテトラサイクリン誘導性プロモー
ター制御下に置くとともに破壊して、それら遺伝子の発現量を著しく低下させ、ピルビン酸を高生産可能な大腸菌を作製した。
【方法】必須遺伝子である accBC 遺伝子をテトラサイクリン誘導性プロモーター
制御下に置き、ドキシサイクリンの添加が生育におよぼす影響を確認した。さらに、aceE 遺伝子をテトラサイクリン誘導性プロモーター制御下に置き、数種類のピルビン酸代謝関連遺伝子を破壊して、ピルビン酸生産株を作製した。また、ピルビン酸生産の高効率化を図るため、培養温度・pH、攪拌速度および空気供給量について検討し、生産条件の最適化を行った。
【結果と考察】accBC 遺伝子制御株は、ドキシサイクリンの添加に依存した生育を示した。また、ピルビン酸生産条件を最適化させることで、生産収率の向上が確認された。本法で得られるピルビン酸の理論収率は、既存の方法に比べて高いことから、より経済的なピルビン酸生産が可能となることが示唆された。

Direct reprogramming of fibroblasts into lung progenitor-like cells

Pyruvate production using engineered Escherichia coli

○二宮 直登 1,2,3, 野口 隆明 1, 関根 麻莉 1, 道上 達男 2, 浅島 誠 3,王 碧昭 1, 栗崎 晃 3（1筑波大院・生命環境, 2東大院・総合文化, 3産総研）
a.ninomiya@aist.go.jp○Naoto Ninomiya1,2,3, Takaaki Noguchi1, Mari Sekine1, Tatuo Michiue2,
Makoto Asashima3, Pichao Wang1, Akira Kurisaki3(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Grad. Sch. Arts Sci., Univ. Tokyo,
3
AIST)

Key words

Lung cell

3P-2p168 コリネ型細菌によるパラアミノ安息香酸の高生産○久保田 健 1, 渡邉 彰 1, 須田 雅子 1, 小暮 高久 1, 平賀 和三 1,
乾 将行 1,2（1RITE・バイオ, 2奈良先端大・バイオ）mmg-lab@rite.or.jp○秋田 紘長 1, 中島 信孝 2,3, 星野 保 1,3（1産総研・機能化学, 2東工大院・生命理工, 3産総研・生物プロセス）
h-akita@aist.go.jp○Hironaga Akita1, Nobutaka Nakashima2,3, Tamotsu Hoshino1,3(1ISC. AIST, 2Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Tech., 3BRI. AIST)

Key words

Escherichia coli, pyruvate, promoter regulation, doxycycline

3P-2p170 Pyruvate decarboxylase 遺伝子を発現した微生物による
シンナムアルデヒドからの光学活性ジオールの生産○大竹 遥, 關谷 悠介, 井野口 諒太, 根岸 佑香里, 宮越 俊一（群馬高専）
miyako@nat.gunma-ct.ac.jp【目的】 パラアミノ安息香酸(PABA)は医薬品やポリマーの原料となる芳香族化合物であり、産業的価値が高い。現在 PABA は石油を原料として多段階の化学反応により合成されている。一方、PABA は多くの微生物が有する葉酸生合成
経路上に位置する代謝産物である。そのため、石油に依存しない代替製造法として低環境負荷型のバイオプロセスを利用した PABA 生産法が有望である。本
研究ではアミノ酸等の生産に広く利用される有用工業微生物、コリネ型細菌を用い、PABA の発酵生産検討を行った。
【方法と結果】 高い生産性を達成するためには高濃度の生産物存在下でも活性を維持できる宿主を選ぶことが重要である。一方で、いくつかの芳香族化合物
は細胞毒性を示すこと知られている。そこで、コリネ型細菌の増殖におけるPABA の影響を調べることで宿主の生産物に対する耐性を評価した。その結果、培養液中に 200 mM の PABA が存在すると、PABA の生産が報告されている他宿主微生物の増殖は強く阻害された。これに対してコリネ型細菌は培養液中に400 mM の PABA が存在しても増殖可能であった。そのため、コリネ型細菌は他の代表的な生産菌よりも高い PABA 耐性を示すことが分かった。次に、生成経路上の中間体であるコリスミ酸を PABA に変換する酵素のスクリーニングを行い、高活性な遺伝子を得た。この遺伝子を高発現させることで培地中に PABAを蓄積する組換え菌株を得た。さらにシキミ酸経路上の遺伝子を高発現させる等の改変を加えることにより、PABA 生産能が顕著に向上した組換え菌株を構築した。また、PABA 生産時に著量の未同定副生成物が現れることを確認した。
今回は PABA の生産結果に加え、生産過程で発生する副生成物について考察する。

【 目 的 】 Saccharomyces cerevisiae は シ ン ナ ム ア ル デ ヒ ド か ら (2S,3R) 5phenylpent-4-ene-2,3-diol への立体特異的な還元を行う。われわれは，この反応を触媒すると考えられる pyruvate decarboxylase 遺伝子 (PDC1 ) を S. cerevisiae からシャトルベクター pAUR123 にクローニングした。Escherichia coli 及び S.
cerevisiae に形質転換して，ジオール化合物の生成メカニズムを明らかにした1)。ここでは，組換え微生物によるシンナムアルデヒドの変換及び得られた目的
化合物の構造確認と，変換の効率化を目的とした。
【方法】酵母とその組換え株は前培養を行い，20 ml の GPY 培地に 5 % 接種した。24 時間培養後，10 mg のシンナムアルデヒドを加え，48 時間培養を行った。変換物質を当量の酢酸エチルで抽出，濃縮後，TLC 及び HPLC (カラム：
Shim-pack FC-ODS) で確認を行った。変換の効率化のため，培地に添加するグ
ルコース量及び，添加方法の検討を行った。大腸菌においても LB 培地で変換培養の検討を行った。
【結果と考察】PDC1 を発現した酵母によるシンナムアルデヒドの変換では，目的のジオールの蓄積量が 23 % 増加し，副成物が 13 % 抑制されることを確認できた。培養条件の検討では糖濃度 2 % で生育後，10 % のグルコースとともに基質を添加し培養を行うことで変換率は向上した。組換え酵母では宿主より 39 %
多く目的化合物を生産した。また，目的のジオール体の構造を確認するため旋光度の測定を行う予定である。組換え大腸菌では，ピルビン酸とシンナムアル
デヒドの縮合反応後の還元が進行しないため，代謝中間体が蓄積する。中間体への変換効率は基質と共に 2 % グルコースを添加することにより大幅に向上した。
1) S. Miyakoshi et al. ，J. Biosci. Bioeng. ，121，265-267，(2016).

Production of para-aminobenzoic acid by metabolically engineered
Corynebacterium glutamicum

Production of an optically active diol compound from cinnamaldehyde bymicroorganisms expressing pyruvate decarboxylase gene

Corynebacterium glutamicum, shikimate pathway, byprodct

Key words
cinnamaldehyde, pyruvate decarboxylase, Saccharomyces cerevisiae,
diol compound○Takeshi Kubota1, Akira Watanabe1, Masako Suda1, Takahisa Kogure1,
Kazumi Hiraga1, Masayuki Inui1,2(1RITE, 2Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)

Key words○Haruka Oodake, Yusuke Sekiya, Ryota Inoguchi, Yukari Negishi,
Syunichi Miyakoshi(Gunma Natl. Coll. Technol.)バイオプロセス

3P-2p171 有機溶媒耐性菌を宿主とした SMO-LSADH 共発現シス
テムによる光学活性エポキシド生産

321

3P-2p173 Biotransformation of 3’-hydroxydaidzein by Escherichia
coli expressing O-methyltransferase○Te-sheng Chang, Xin-Yi Huang, Ya-Ting Tsai, Dong-Sheng Wang
(Dept. Biotechnol., NUTN, Taiwan)
mozyme2001@gmail.com○戸田 弘 1, 小栁 喬 2, 榎本 俊樹 2, 伊藤 伸哉 1
（1富山県大・生工研セ, 2石川県大・生資環）
htoda@pu-toyama.ac.jp【目的】
光学活性エポキシドは医農薬中間体や高分子材料として多用される有用化合物である。我々はこれまでに、Rhodococcus sp. ST-10 由来スチレンモノオキシゲ
ナーゼ(RhSMO)を利用した環境調和型バイオプロセスによる光学活性エポキシ
ド生産について研究を行ってきた。その過程で、有機溶媒耐性菌 K. rhizophila
DC2201 を宿主としたときに、優れた生産性を示すことを明らかにしている 1）。
そこで本研究では、K. rhizophila DC2201 を SMO 発現宿主として用い、光学活
性エポキシ化合物の生産条件を検討した。また新規に開発した大腸菌-Kocuria
シャトルベクターを用いて、Leifsonia sp. S749 由来アルコール脱水素酵素(LSADH)を NADH 再生系とするバイオプロセス構築を試みた。
【実験方法・結果】
RhSMO を導入した K. rhizophila DC2201 形質転換体を用いて、スチレンオキシド生産試験を行った。各種炭素源を用いて変換試験を行った結果、2%グルコー
スおよびマルトースを用いた時に良好な生産性を示し、菌体培養から変換時まで一貫してマルトースを炭素源として用いた場合に最も高い生産性を示すことが明らかとなった。
次いで RhSMO-LSADH 共発現菌体の構築および 2-プロパノールを水素供与体としたスチレンオキシド生産プロセスの構築を試みた。K. palstris 野生株より単離した内在性プラスミドを用いて新規な大腸菌-Kocuria シャトルベクターを構築し、GAPDH プロモーター下流に LSADH を組み込んだ発現カセットを導入した。構築したプラスミドを RhSMO 発現菌体に導入し、RhSMO-LSADH 共発
現菌体を構築した。2-プロパノールを用いたスチレン変換試験を行った結果、有意なスチレンオキシド生産を示した。現在これらの菌体を用いたスチレンオ
キシド生産条件の最適化を検討中である。
H. Toda, T. Ohuchi, R. Imae, N. Itoh, Apple. Environ. Microbiol., 81, 1919-1925(2015)

Two metabolites were produced from biotransformation reaction from 3’hydroxydaidzein by recombinant Escherichia coli, which expressed Omethyltransferase (OMT) SpOMT2884 from Streptomyces peucetius. The two
methoxy-isoflavones metabolites were isolated by using preparative high-pressureliquid chromatography (HPLC). Anti-melanogenesis activity of both methoxyisoflavones metabolites were determined using cultured B16 melanoma cells. The
results showed that one (metabolite 2) of the two methoxy-isoflavones metabolites
dose-dependently inhibited melanogenesis under non-toxic conditions. Using NMR
and Mass spectral analysis to resolve the chemical structure of the active compound
was undertaken in our laboratory. The present study highlights the production andapplication of methoxy-isoflavones in the cosmetics industry.

Bioproduction of enantiopure epoxides by combination of SMO-LSADH
expressed in organic solvent-tolerant microorganism

Biotransformation of 3’-hydroxydaidzein by Escherichia coli expressing Omethyltransferase○Hiroshi Toda1, Takashi Koyanagi2, Toshiki Enomoto2, Nobuya Itoh1(1Biotechnol. Res. Center, Toyama Pref. Univ., 2Fac. Bioresour. Environ. Sci.,
Ishikawa Pref. Univ.)

Key words

styrene, monooxygenase, organic solvent, Kocuria rhizophila

3P-2p172 単細胞生物用液／液界面バイオリアクターによるシトロ
ネロールの変換○Te-sheng Chang, Xin-Yi Huang, Ya-Ting Tsai, Dong-Sheng Wang
(Dept. Biotechnol., NUTN, Taiwan)

Key words

3P-2p174 インドアイ（マメ科）からの固体藍染料の微生物○常盤 豊 1, 角 寿子 2, 世嘉良 宏斗 3
（1グリーン・プロダクツ・ラボ, 2北の藍染織工房, 3沖縄県工技セ）
y.tokiwa@grplab.co.jp○石川 麻子 1, 小田 忍 2, 大箸 信一 3
（1金工大院・工, 2金工大・ゲノム研, 3金工大・ゲノム研）
odas@neptune.kanazawa-it.ac.jp【目的】カビを用いて医薬品原料や高級香料を効率よく生産できる液／液界面バ
イオリアクターでは菌糸を作らない微生物は強固な複合マット形成が不可能である。本研究では適用微生物を酵母、放線菌、単細胞微生物に拡大させることを目的に、水／有機溶媒界面における新規な界面培養システムの構築を行った。
【方法】液体培地に中空マイクロスフェアー（MS）とバインダー材（CMC、ブ
チラール樹脂）を混合すると、液面に浮上しながら菌体をトラップできる。MS
とバインダー材の配合比と MS／バインダー材複合マット耐久性との関係を調べた。本リアクターを Pichia kluyveri NBRC 1165 のアセチル転位反応におけるcitronellyl acetate の微生物変換試験、 Candida viswanathii NBRC 10321 の酸化における citronellic acid の微生物変換試験に適用し、その有用性を検証した。
【結果】MS／バインダー材複合マット耐久性試験では MS に対しバインダー材
を 8.5%以上配合することで崩壊を防いだ。最も MS 層を強固にしたバインダー
材はブチラール樹脂であった。Pichia kluyveri NBRC 1165 による citronellyl acetateの生産量は、10% citronellol における 3.25 g/L (15 d) であった。Candida viswanathii
NBRC 10321 による citronellic acid の生産量は 10% citronellol における 14.9 g/L(15 d) であった。

Hydroxydaidzein, Methyltransferase, Biotransformation【目的】伝統的な藍染めは、Alkalibacterium 属や Amphibacillus 属などの好アルカ
リ性微生物の作用で、藍染料のインジゴを還元することにより行われている
1,2)。我々は、天然の藍染料に由来する微生物と藍染めとの関係に興味を持ち、すでに、リュウキュウアイ（キツネノマゴ科）、タデアイ（タデ科）およびイン
ドアイからの沈澱藍やタデアイからのスクモの微生物について報告した。今回、世界中で広く使われてきたインドアイからの固体状の藍染料の微生物について調べたので報告する.
【方法】インドアイからの固体藍染料は、インドタミル・ナードゥ州産を 2012年 12 月 21 日、2013 年 4 月 22 日および 2013 年 7 月 11 日に入手して用いた。
微生物の分離は、グルコース、酵母エキス、ペプトン等を含む寒天平板培地を用いて、30 ℃で培養して行った。分離した微生物については、16SrRNA 遺伝子
解析による簡易同定を行った。
【結果】2012 年入手の固体藍染料の生菌数は、pH10、好気条件の寒天平板におい て 1.4 × 109 CFU g-1 で あ り 、 Cellulosimicrobium 属 や Brevibacterium 属 、Brachybacterium 属の細菌が分離された。2013 年 4 月入手の固体藍染料の生菌数
は、1.0 × 108 CFU g-1 であり、 Bacillus 属、Citricoccus 属の細菌が分離された。
また、2013 年 7 月入手の固体藍染料からは、Bacillus 属、Kocuria 属、Citricoccus
属などの細菌が分離された。さらに、天然の藍染料である沈澱藍やスクモの微生物と固体藍染料の微生物との比較を行い、藍染めへの影響について考察した。
1) 沖縄県工業技術センター研究報告書, 15, 13-21 (2013)2) 日本農芸化学会大会講演要旨集, 2F-205, p653 (2016)

Citronellol bioconversion in a novel interface bioreactor with unicellulor
microorganism○Asako Ishikawa1, Shinobu Oda2, Shinichi Ohashi3(1Grad. Sch. Eng., Kanazawa Inst. Technol., 2Genome Biotechnol. Lab., Kanazawa
Inst. Technol., 3Genome Biotechnol. Lab., Kanazawa Inst. Technol.)Key words

bioconversion, bioreactor

Microbes in solid indigo dyes made from Indigofera sp.

○Yutaka Tokiwa1, Hisako Sumi2, Hiroto Yokaryo3(1Green Products Labo, 2North-Indigo Textile Arts Studio, 3Okinawa Ind. Technol.
Center)

Key words

indigo, microbe, alkaliphilic, dye322

バイオプロセス

3P-2p175 好気発酵による (R)-3-ヒドロキシ酪酸生産

3P-2p177 Settatia 属細菌による BDF 廃液代謝に対する pH の影響【背景】(R)-3-ヒドロキシ酪酸（R3HB）は生分解性樹脂等の原料となるほか、認知機能改善効果等の生理活性機能も注目されている。光学活性化合物である
R3HB の生産方法については微生物を用いた発酵法等による検討が行われてきた。発酵法では R3HB を構成単位とする高分子（PHB）を細胞内に蓄積する好気性細菌を用いて、好気的に PHB を蓄積させた後、これを加水分解して R3HBを得る方法がいくつか検討されており、近年では著しく生産性の高い菌株が報告されている。しかし、これらの方法で得られる R3HB は細胞内に蓄積する
PHB の量以上に生産量を増やすことは困難である。そこで、R3HB を高効率に生産するため、好気条件で R3HB を細胞外へ生産する菌株を探索した。
【方法】沖縄県内の様々な試料から分離・収集した約 1,000 株のうち有望な菌株について、好気条件下における R3HB の生産性を評価した。グルコース又はス
ク ロ ー ス を 含 む 培 養 液 3mL に 菌 株 を 接 種 し 、 3-4 日 間 好 気 培 養 （ 30 ℃ 、200rpm）したあと、培養液上清の R3HB と菌体内に蓄積された PHB を定量した。卓上型培養装置を用いた発酵試験では、無機塩類と糖類で構成される培養液 2L を用いて培養条件を一定に保ちながら好気培養した（撹拌速度 600rpm、通気量 5 L min-1、pH8.5）。
【結果と考察】分離株のうち PHB 生産菌として知られる Halomonas 属細菌を中心に R3HB の生産性を調べた結果、PHB を細胞内に蓄積するのと同時に R3HBを培地中に生産する特異な性質の菌株（OITC1261 株）を見いだした。このOITC1261 株による 2L スケールの培養試験では、スクロースを基質とする培地で好気培養した結果、89 時間後に 58g L-1 の R3HB と 27g L-1 の PHB を生産した。好気条件下で R3HB と PHB を同時に生産する野生株はこれまで報告がな
く、R3HB の生産性も高いことから、OITC1261 株を用いることで効率的な
R3HB/PHB 生産が期待できる。

【背景と目的】化石燃料の代替燃料としてバイオディーゼル燃料（BDF）が注目されている。BDF の主要な製造法であるアルカリ触媒法においては、グリセ
ロール含有廃液（BDF 廃液）が副生成物として生成されるが、現状では強アルカリ性の産業廃棄物として廃棄されている。そこで BDF 廃液の利用方法としてバイオプロセスに注目した研究がおこなわれている。我々のこれまでの研究か
ら、Serratia 属細菌による BDF 廃液を基質とした回分培養では、pH の変化によって代謝が大きく変化することが分かっている。本研究では、BDF 廃液の処理の効率化を目的として、BDF 廃液代謝に対する pH の影響について評価を行った。
【実験方法】1.5 L ジャーファンターを用いてそれぞれ pH 7.0, 6.3, 5.6 に制御した好気培養を 30 時間行った。微生物の代謝変化を評価するために、菌体濃度および細胞外代謝物、細胞内代謝物を測定し経時変化の比較を行った。細胞外代
謝物の濃度は HPLC、細胞内代謝物の蓄積量は LC-MS および GC-MS を用いて測定した。
【結果と考察】pH が弱酸性寄りであるほど菌体収率が高くなることが確認された。細胞外代謝物の測定では全ての実験において酢酸が生成され、pH 5.6 のときのみギ酸が生成されていた。純グリセロールを基質とした回分培養では、pHが弱酸性寄りであるほど菌体収率が下がることが明らかとなっている。このことから、BDF 廃液中のグリセロール以外の物質も微生物の代謝に影響を与えていることが考えられる。細胞内代謝物の測定では、ピーク強度のブレが非常に大きく傾向が読み取れなかったため現在正確な評価に至っていない。サンプルの不純物の除去が不十分であり実験誤差が大きくなったと考えられたため、前処理方法を含めて検討中である。

Production of (R)-3-hydroxybutyric acid by aerobic fermentation

Effect of pH on BDF waste metabolism with Serratia sp.

○世嘉良 宏斗 1, 花城 隆二 1, 合田 雅浩 1, 照屋 盛実 1, 楽 隆生 2,
常盤 豊 3（1沖縄県工技セ, 2甲南化工, 3グリーン・プロダクツ・ラボ）
yokryouh@pref.okinawa.lg.jp○Hiroto Yokaryo1, Ryuji Hanashiro1, Masahiro Goda1, Morimi Teruya1,
Takao Raku2, Yutaka Tokiwa3(1Okinawa Ind. Tech. Cent., 2Konan Chemical Ind. Co., Ltd., 3Green Products Lab.)

Key words

3-hydroxybutyric acid, aerobic culture, Halomonas, fermentation

3P-2p176 デザインドバイオマス研究：好熱性乳酸菌による混合糖
代謝系の解析とエナジーケーンからの高効率乳酸生産○沼口 真緒 1, Tan Jiaming 1, Abdel-Rahman Mohamed Ali 1,2,
田代 幸寛 1, 善藤 威史 1, 酒井 謙二 1, 園元 謙二 1,3（1九大院・農, 2Al-Azhar University, 3九大・バイオアーク）sonomoto@agr.kyushu-u.ac.jp【背景】本研究室においてエジプトの土壌より単離された乳酸菌 Enterococcus
faecium QU 50（以下 QU 50）は、50℃という高温条件で増殖し、キシロースを基質としてホモ発酵を行い、高純度 L-乳酸を生産することができる 1)。木質系
バイオマスの糖化に用いる酵素の最適温度は 50℃付近であることから、QU 50の同時糖化発酵への応用を見据えた解析を行った。
【方法・結果】グルコース／キシロース混合糖（GX）、セロビオース／キシロー
ス混合糖（CX）を用い、50 ℃で乳酸発酵を行った。その結果、GX において緩やかなカーボンカタボライト抑制（CCR）が見られるものの、QU 50 はグルコースの資化と同時にキシロースを資化することができた。また、CX においてはCCR を回避することができ、GX の場合と比較して 3.6 倍のキシロース比消費速度を示した。一方、CX において GX と比較しキシロース初期代謝酵素の活性は 3.2 倍に増加しており、これがキシロース比消費速度に寄与していることが示唆された。次に、エナジーケーンの加水分解物と同じ組成の混合糖（グルコース 5 g/L／セロビオース 40 g/L／キシロース 20 g/L）を用いたところ、全ての糖源を同時に資化する乳酸発酵に成功した。さらに、同組成の混合糖を基質とした固定化増殖菌体を用いた繰り返し発酵では、非殺菌・開放発酵条件下でも乳酸生産速度 3.60 g/L/h、対糖収率 100%を維持した、非常に高い操作安定性と高速発酵を達成できた。
1) Mohamed Ali Abdel-Rahman et al, FEMS Microbiology Letters, 362(2), 1-7, 2014

Designed biomass study: Establishment of highly efficient lactic acidproduction by using thermophilic lactic acid bacterium.

○Mao Numaguchi1, Jiaming Tan1, Mohame Ali Abdel-Rahman1,2,
Yukihiro Tashiro1, Takeshi Zendo1, Kenji Sakai1, Kenji Sonomoto1,3(1Fac. Agric., Kyushu Univ., 2Al-Azhar University, 3Bio-Arch., Kyushu Univ.)

Key words
fermentation

lactic acid, mixed sugars, carbon catabolite repression, repeated○内山 佳祐 1, 川西 琢也 1,2, 滝口 昇 1,2（1金沢大院・自科, 2金沢大・理工）
tackey@se.kanazawa-u.ac.jp○Keisuke Uchiyama1, Takuya Kawanishi1,2, Noboru Takiguchi1,2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Coll. Sci. Eng., Kanazawa Univ.)

Key words

BDF waste, pH, Serratia sp.

323

人名索引

A
Abdel-Rahman Mohamed Ali 3P-2p176
Aburatani Sachiyo
3S-Cp06
Adegoke Oluwasesan
1P-2p183,
1P-2p184
Aki Tsunehiro
3P-1a115
Akita Hironaga
1S-Cp03
Altaib Hend
3P-1p023
Annisyia Zarina Putri
2P-1p066
Apiwatanapiwat Waraporn 3P-1a127
Araﬁles Kim Hazel V.
3P-1a093,
3P-1a115
Arai Ryoichi
2S-Ca03, 3P-1p059
Asano Yasuhisa
1S-Dp02, 1S-Dp04
Aslam Mehwish
1P-1p013
Atomi Haruyuki
1P-1p013
Auesukaree Choowong
2A-Dp01

B
Balijinova Tsetseg
Barry Kerrie
Beak KeangOK
Binti Huddin Noor Saﬁka
Boonchird Chuenchit

3P-1a001
3S-Bp04
1P-1p028
3P-2p165
2A-Dp01C
Cabrera-Ostertag Ignacio
2P-1p093
Cai Wei
1P-1p131
Chang Minju
2P-1p039, 3P-2a154
Chang Te-sheng
3P-2p173
Chao Luomeng
3P-1p126
Chen Jie
1S-Dp03
Chen Ziyu
2P-2p151
Cho Byung-Kwan
3S-Cp02
Cho Kichul
3P-2p140
Choi Cindy
3S-Bp04
Choi Jeong-Woo
2S-Da02
Choi Yong-Keun 2P-1p039, 3P-2a154
Chung Junho
2S-Ca02
Cordonier Christopher E.J. 1P-2p152

D
Dahl Christiane
Dai Gang
Dawoon Jung
Dong Zetao

1P-1p063
3P-1p126
3P-2a153
3P-1p109

E
Ellen
Eramoto Yuri

2P-1p017
3P-1a115F
Farida Rahayu
Fathima Artnice Mega

1P-1p047
3P-1p079

Fui Seung Clament Chin
1S-Cp04
Fukuma Takeshi
3P-1p059
Fukusaki Eiichiro 3P-1a089, 3P-1a094,
3P-1p079

G
Gao Haoyuan
3P-1p074, 3P-1p076
Gautieri Alfonso
2P-2p169
Geng Xiong
3P-1p126
Glieder Anton
1S-Dp01
Gomi Katsuya
3P-1p003
Grigoriev Igor V.
3S-Bp04
Gruber Karl
1S-Dp01
Guan Yue
3P-1a067
Gusain Pooja
3P-1p090

H
Hamamoto Shin
2P-1p017
Han Sung Ok
2S-Dp04
Harada Kazuo
1P-2p175
Harashima Satoshi
2A-Dp01
Haridas Sajeet
3S-Bp04
Hassan Mohd Ali 1S-Cp02, 1S-Cp04,
1S-Cp05
Hayakawa Takashi
2P-1p066
Hecht Michael H.
3P-1p059
Hegazy Adel
1P-1p130
Hida Akiko
3P-1a016
Hirata Kazumasa
1P-2p175
Horiuchi Ayumi
1P-1p013
Hoshi Naomi
2P-1p017
Hoshino Kunihide
3P-1p090
Hoshino Tamotsu
1S-Cp03
Htet April N
2P-2p135
Hu Xiaohong
3P-1p109, 3P-1p110
Huang Song-Yan
3P-1a039
Huang Weiwei
1P-1p131
Huang Xin-Yi
3P-2p173
Hwang Minji
2S-Da06
Hyeon Jeong Eun
2S-Dp04

I
Ikawa Yoshiya
Ikeno Shinya
Inano Kouichi
Inoue Eiichi
Ishida Yuko
Ishii Kazuo
Iwasa Tatsuo
Iwasaki Yuki

2S-Ca06
3P-2p152
3P-1p059
3S-Bp03
1S-Dp02
3S-Bp03
3P-1p126
1P-1p047

J
Jambaldorj Ulziichimeg
3P-1a001
Jannatul Ferdouse
2P-1p075
Jeong Wu-Young 2P-1p039, 3P-2a154

Jha Savyasachee
Jiao Song
Jusakulvjit Piradee

3P-1a078
1S-Dp03
1P-1p128

K
Kaboli Saeed
3P-1a027
Kahar Prihardi
3P-2p153
Kanai Tamotsu
1P-1p013
Kang Dongwon
2S-Da06
Kato Junichi
1P-1p047, 3P-1a016
Kawai Auto
1P-1p047
Kawamoto Haruo
2P-1p120Ki Mi Ran
2S-Ca04
Kim Daekyung
3P-2p140
Kim Dong Hyun
2S-Bp02
Kim Dong Sup
2S-Dp01
Kim Hyroi
2S-Ca02
Kim Hyung Joo 2P-1p039, 3P-2a154
Kim Jong Ki
2S-Ca04
Kim Jungwook
2S-Da06
Kim Kwang Jin 2P-1p039, 3P-2a154
Kim Mee-Hae
2P-2p151
Kim Seung Wook
2S-Dp01
Kim Soohyun
2S-Ca02
Kim Sung Ho
2S-Ca04
Kim Youhwan
2S-Da04
Kimura Naoya
2S-Ca03
Kino-oka Masahiro
2P-2p151
Kishi Hiroyuki
2S-Da05
Kisuse Juma
3S-Dp02
Kita Akihisa
1P-1p047, 3P-1a115
Kobayashi Naoya 2S-Ca03, 3P-1p059
Koide Shohei
2S-Ca01
Kojima Takaaki
3P-1a058
Kojoma Mareshige
3P-1p030
Kongkrongtong Tatphon
3P-1p064
Kosugi Akihiko 2S-Dp03, 3P-1a127
Kozaki Toshinori
3S-Bp03
Kruatrachue Maleeya
2A-Dp01
Kubota Nodoka
2P-1p066
Kuhara Satoru
3P-1p122
Kuroda Kouichi
2S-Dp02
Kusumah Dewi
3P-1a068

L
Lanfranchi Elisa
Lavina Walter
Lee Hyun Ho
Lee Ju Hun
Lee Keelyong
Lee Sang Hyun
Lee Sanghoon
Lee Serin
Lee Soo Kweon
Lee Yi-Chieh

1S-Dp01
3P-1p079
2S-Ca07
2S-Dp01
2S-Da04
3P-2a154
2S-Ca02
2S-Da04
2S-Dp01
3P-2p134

324

Lee Yuan-Kun
Lei Zhongfang
Liao James

3S-Dp02
1P-1p131
3P-1p079, 3P-1a088,
3P-1a089
Lindquist Erika
3S-Bp04
Lipzen Anna
3S-Bp04
Liu Chi-Hsien
1P-2p186
Liu Ming-Cheh
3P-2a183
Liu Na3P-1p111
Liu Yu-Kuo
3P-2p134
López-Contreras Ana M.
3P-1a126

M
Ma Qiansu
3P-1p109
Maeda Isamu
3P-1a068
Maeda Toshinari
1S-Cp05
Masaki Kazuo
3P-1p122
Matra Deden Derajat
3S-Bp03
Matsumura Yukihiko3P-1a115
Matsuura Hideyuki
1P-2p175
Menton John
2P-1p093
Metzner Richard
1S-Dp04
Minami Eiji
2P-1p120
Miyake Hideo
2S-Dp02
Miyata Atsushi
3P-1p122
Miyazawa Keisuke
3P-1p059
Mohd Yusoff Mohd Zulkhairi 1S-Cp03
Mohd-Nor Diana
1S-Cp05
Mori Kazuki
3P-1p122Mori Tetsushi
2S-Dp02
Muraguchi Atsushi
2S-Da05
Muranaka Toshiya
3P-1p030
Muraoka Misa
1P-2p175

N
Nagai Satomi
Nakagawa Tomoyuki
Nakamura Yuya
Nakamura Gouvea Natalia
Nakano Hideo
Nakashima Nobutaka

3P-1a058
2P-1p066
3S-Cp01
2P-1p084
3P-1a058
1S-Cp03,
3S-Cp01
Nakashimada Yutaka
1P-1p047,
3P-1a016, 3P-1a115
Nam Sojung
2S-Da04
Nanatani Kei
2P-1p017
Nath Suman Chandra
2P-2p160
Nawarat Nantapong
1P-1p043
Negishi Nobuaki
3P-1p115
Nemoto Naoto
2S-Ca05
Ngan Chew Yee
3S-Bp04
Nguyen Dung Van
2P-1p120
Nguyen Kho My
2S-Ca04
Nguyen Trinh TM
2P-1p049
Niamatullah Sidiq
2P-1p115
Noguchi Takuya
3P-1p077
Nomura Izumi
3P-1p023
Novitasari Dian
3P-1p062

Shimokawa NaofumiO
Oda Tatsuya
Ogasawara Wataru
Ohtake Toshiyuki
Ojima-Kato Teruyo
Okamura Yoshiko
Ondiba Hesborn Andole
Ozawa Tatsuhiko3P-2p140
3P-1p122
3P-1a089
3P-1a058
3P-1a115
1P-1p131
2S-Da05

P
Pack Seung Pil
Palaniveloo Kishneth
Park Enoch Y.
Park Hyun Gyu
Park Sungjo
Pathak Nishit
Pavkov-Keller Thea
Perez Rodney Honrada
Pham Van
Pham Khanh Dung
Phan Huong Thi Thanh
Phan Nguyen Thuy An
Pokethitiyook Prayad
Pukkila Patricia J.

2S-Ca04
1S-Cp06
1P-2p184
2S-Da07
1P-1p030
3P-2p152
1S-Dp01
3P-2a161
2S-Ca04
3P-1p122
1P-1p028
3P-1a094
2A-Dp01
3S-Bp04

Q
Qi ZhuQian Pei-Yuan

3P-1p110
3S-Cp03

R
Rabemanolontsoa Harifara 1P-1p128,
2P-1p120
Ramli Norhayati
1S-Cp05
Ravindra Pal Singh
3P-1a086
Reuss Daniel
3P-1a014
Rimbach Gerald
2P-1p094
Ritthisan Panwad
3P-1a058

S
Sahoo Soubhagya Laxmi
1P-2p186
Saka Shiro
1P-1p128, 2P-1p120
Sakai Kenji
1S-Cp04, 1S-Cp05,
1S-Cp06, 3P-1p077
Sastia Prama Putri 3P-1a088, 3P-1a090,
3P-1p079
Sastia Putri
3P-1a089
Sato Takaaki
3P-1p059
Savangsuksa Aulaphan
1P-1p029
Seelan Jaya
1S-Cp06
Seki Hikaru
3P-1p030
Seng Tin- Hoe
1S-Cp06
Sethapokin Pinthep
2P-1p120
Sharma Neha
1P-1p028
Sharuddin Siti Suhailah
1S-Cp05
Shen Zhongyao
1S-Dp03
Shibata Toshiyuki
2S-Dp02
Shida Yosuke
3P-1p122
Shim Sok-young 2P-1p039, 3P-2a154

1P-1p028,
3P-1p090
Shin Kwangin
2S-Da06
Shin Kwanwoo
2S-Da04
Shintani Takahiro
3P-1p003
Shirai Yoshihito 1S-Cp01, 1S-Cp02,
1S-Cp05
Song Hak Jin
2P-1p039, 3P-2a154
Sonomoto Kenji
3P-1p077
Stanislaus Mishma Silvia 3P-1p073,
3P-1p074, 3P-1p076,
3P-1p110, 3P-1p115
Su Yi-Hsin
2P-1p017
Sun Hongyi
2P-1p096
Suyotha Wasana
1P-1p014
Suzuki Hideyuki
3P-1p030
Suzuki Mutsuaki
3S-Cp04
Suzuki Tohru
3P-1p023

T
Tajima Takahisa 1P-1p047, 3P-1a016,
3P-1a115
Takagi Masahiro 1P-1p028, 3P-1p090
Takagi Toshiyuki
2S-Dp02
Takahashi Mami
2S-Dp02
Takaku Hiroaki
3P-1p122
Takamura Yuzuru
2S-Da03
Takeyama Haruko
2S-Dp02
Tama Jeremy
2P-1p026
Tamiya Eiichi
2S-Da01
Tamura Keita
3P-1p030
Tan Jiaming
3P-2p176
Tanaka Mizuki
3P-1p003
Tanaka Reiji
2S-Dp02
Tansengco Myra
3P-1a078
Tashiro Kosuke
3P-1p122
Tashiro Yukihiro 1S-Cp04, 1S-Cp06,
3P-1p077
Terzic Andre
1P-1p030
Theeragool Gunjana
1P-1p042
Theo Shao Thing
3P-1a090
Tran Duyen
1P-2p175
Tritt Andrew
3S-Bp04
Tsai Ya-Ting
3P-2p173
Tsao Min-Han
1P-2p186
Tsuda Masashi
2S-Ep02
Tsujino Yoshio
3P-1p090
Tunchai Mattana
3P-1a016

U
Ueda Mitsuyoshi
Ujiie Kazuki
Ulanova Dana
Uozumi Nobuyuki

2S-Dp02
1P-2p175
2S-Ep02
2P-1p017

V
Vairappan Charles
Vaithanomsat Pilanee
Vangnai Alisa S.

1S-Cp06
3P-1a127
1P-1p058

325

Voet Arnout

2P-1p026

W
Wan KunWang Dong-Sheng
Wang Jin
Wang Lun
Watanabe Kenshi
Winkler Margit
Won Jong-In

1P-1p011
3P-2p173
1P-2p185
1P-1p055
3P-1a115
1S-Dp01
2S-Bp02X
Xiao Ruida
Xie Yucheng

3P-1p111
2P-2p177

Y
Yamada Takuji
3S-Cp05
Yamada Yumiko
2S-Dp02
Yamaguchi Masamitsu
3P-1a094
Yamazaki Harutake
3P-1p122
Yang Ji
1S-Dp03
Yang Yingnan
3P-1p073, 3P-1p074,
3P-1p076, 3P-1p109,
3P-1p110, 3P-1p111, 3P-1p115
Yang Yung-Hun
3P-2a154
Yeo Ki Baek
2S-Ca04
Yoo Duck-kyun
2S-Ca02
Yoo Hah Young
2S-Dp01
Yoon Aerin
2S-Ca02
Yu Huimin
1S-Dp03
Yu Hyeonji
2S-Da06
Yuan Tian
1P-1p131
Yuan Xi
2P-1p096

Z
Zaouil
Zhang
Zhang
Zhang

Dalia
3P-1p003
Jing
1S-Dp03
Mengxiao
2P-1p131
Nan
3P-1p073, 3P-1p074,
3P-1p076
Zhang Y.-H. Percival
3P-1a039
Zhang Zhenya 1P-1p131, 2P-1p096,
3P-1a067
Zhao Chenyu
3P-1p073, 3P-1p074,
3P-1p076, 3P-1p115
Zhao Tao
3P-1p077
Zhao Ziwen
1P-1p131
Zheng Jin
3P-1p077
Zhong JianJiang
3P-1a039
Zhu Qi 3P-1p109, 3P-1p111, 3P-1p115

あ
藍川 晋平
相島 奈央
會田 悠人
アヴシャル
青井 議輝
青木 直大
青木 大

恵利子

3P-1p120
3P-1p081
2P-1p111
3P-2a182
3P-2a153
1P-1p118
2P-2p148

青田
青柳

達明
秀紀

3P-1p025
2P-2p136, 2P-2p137,
2P-2p138, 3P-2a176,
3P-2p132, 3P-2p133,
3P-2p147, 3P-2p148, 3P-2p154
赤尾 健
1P-1p075, 2P-1p047
赤坂 直紀
1P-1p050, 3P-1p080
赤澤 真一
3P-1p022
明石 貴裕
1P-1p080, 2P-1p073
明石 満
2S-Cp06
赤田 倫治
3P-1a032, 3P-1p026,
3P-2p161
赤塚 愛里
2P-2p152
赤松 隆
1P-1p127
秋 庸裕
3P-1a093, 3P-1a103,
3P-1a114, 3P-1a130, 3P-1a131
秋田 紘長
3P-2p169
秋光 和也
2P-1p013
秋山 佳丈
2P-2p158, 2S-Cp03
淺井 聖也
1P-2p165
浅井 拓也
1P-1p080, 2P-1p073
浅井 菜々実3P-1a076, 3P-1a077
朝岡 義晴
2P-2p148
阿座上 弘行
3P-1a003
浅川 賢史
1P-1p029
朝倉 紗也栞
3P-1p028
朝倉 大河
3P-1a087朝倉 侑弥
3P-1a104, 3P-1a105
浅島 誠
3P-2p167
浅谷 学嗣
2P-2p173, 3P-1p091
浅野 行蔵
1P-1p105浅野 泰久
2P-1p004, 2P-1p009
浅野 雄哉
2P-1p094
浅野 竜太郎3P-2a178
浅見 幸夫
1P-1p039
芦内 誠
3P-2a152
東 隆行
1P-1p093
東 健弘
3P-1p019
東 春奈
1P-1p082
東 雅之
2P-1p123, 3P-1a110,
3P-1p097, 3P-2p149
東 侑之介
3P-1p091
アズワニ ファティマ
3P-2a146
安達 桂香
3P-1a086
安達 基泰
2P-1p023, 3P-1a044
阿知和 弘樹3P-1a090
跡見 晴幸
1P-1p007, 3P-1a078
穴田 侑也
3P-2p135
阿野 貴司
3P-1a018, 3P-1a036,
3P-1a098, 3P-1a099,
3P-1a100, 3P-1p028
安彦 弦太
3P-1a012
油井 信弘
3P-1p045, 3P-1p112,
3P-1p113, 3P-2a160
阿部 克也
3P-1p045, 3P-1p112,
3P-1p113, 3P-2a160
阿部 敬悦
3P-2p146阿部 達明
3P-1p080
阿部 文明
1S-Bp05

阿部
阿部
阿部
天笠
天知
天野
天野
綾部
荒井
新居
新井
新井
荒井
荒井
新井
荒岡
荒川
荒川
荒木

荒木
荒木
荒木
荒添
有江
有馬
有本
粟津
安藤
安藤
安藤
安藤

幸浩
吉邦
亮二
翼
誠吾
太郎
由貴
里美
隆益
鉄平
博之
宗仁
雄貴
佑哉
亮一
亮祐
賢治
知子
希和子

2P-1p004
2P-1p093
3P-1p062
2P-2p154
3P-1a111, 3P-1p037
3P-1p066
1P-2p137
3P-1p103
3P-1a123
3P-2a140, 3P-2a141
1P-1p059, 1P-1p063
3P-1p063
2P-1p1252P-1p102
2P-1p025
2P-1p124
2S-Ep05, 3P-2a149
3P-1a116, 3P-2p160
1P-1p121, 1P-1p122,
1P-1p124, 2P-1p107,
2P-1p114, 2P-1p115, 3P-1p034
康祐
1P-2p172, 2P-2p149
朋洋
2P-1p079
通啓
3P-1p084
貴之
3P-1p005
力
3S-Bp02
二朗
2P-1p008, 3P-1a046,
3P-1p066
美沙
3P-1a125茜
1P-2p182
勝彦
3P-1a001
周輝
1P-1p074
翔太
2P-1p126
祐人
1P-1p037

い
飯郷
飯島
飯島
飯嶋
飯嶋

雅之
綾
信司
寛子
益巳

飯田 早紀
飯野 亮太
飯星 貴幸
猪狩 直樹
井川 善也
井川 秀樹
生田 幸士
生田 直子
池 正和
池 道彦
池内
池内
池上
池田
池田
池田

暁紀
真志
健太郎
一史
丈
宰

3S-Bp06
3P-2p132, 3P-2p133
1P-2p165, 1P-2p166
3P-1p121
1P-2p133, 1P-2p179,
2P-2p178
3P-1a107
2P-2p150
3P-1p071
2P-1p095
2P-2p182, 2P-2p183
3P-1a112
1P-2p142
2P-1p094
3P-1a123
1P-1p111, 3P-1a109,
3P-1p106, 3P-1p107
3P-1a028
1P-2p142
2P-1p111, 3P-1p058
2P-2p179
3P-1a015, 3P-1a043
3P-1p100

326

池田 奈央
池野 慎也
池本 啓史
池谷 謙太
伊佐 猛
伊佐木 芳
伊﨑 文晃
井沢 真吾
石井 一夫

3P-2a1712P-2p141
2P-1p063, 3P-2a132
3P-1p1003P-1p022
3P-1p085
3P-2p162
2P-1p048, 2P-1p049
3P-1p092, 3S-Bp01,
3S-Bp02, 3S-Bp04,
3S-Bp05, 3S-Bp06, 3S-Bp07
石井 純
2P-1p068, 2P-1p089
石井 大輔
2P-1p129石井 寛子
1P-1p061
石井 正治
1P-1p059, 1P-1p063
石井 友理
1P-1p050, 3P-1p080
石神 夏実
3P-1a019
石川 輝
2P-1p103
石川 麻子
3P-2p172
石川 一彦
1P-1p026
石川 周
3P-1a014, 3P-1a023
石川 秀
3P-1a102
石川 孝博
3P-1p119石川 格靖
3P-2a139
石川 聖人
2P-1p019, 3P-1a017,
3P-2a155
石川 森夫
1P-1p049, 3P-1p080
石倉 幹大
1P-1p037
石崎 真章
1P-1p030
石澤 秀紘
3P-1p107
石田 尚之
3P-1p067, 3P-2a158
石田 秀樹
2P-2p187
石田 奨
3P-1a116, 3P-2p160
石田 陽子
2P-1p049
石戸 聡
3P-1p086
石野 良純
2S-Ea03
石橋 直樹
3P-2a161石原 達己
3P-1p124
井嶋 博之
1P-2p139石渡 晟
1P-2p135
泉田 森
1P-2p150
泉 厚志
2P-1p009
和泉 自泰
3P-1a097
何森 健
2P-1p013
伊勢 孝太郎1P-1p082
磯﨑 勇志
3P-1a063
磯部 正治
3P-1a056, 3P-1a060,
3P-1a061
磯山 純子
2P-2p185, 2P-2p186
伊田 賢吾
2P-1p068
伊田 進太郎3P-1p124
板田 鉄平
3P-2p139
板谷 光泰
2S-Ea04
市川 夏子
3P-1p093
一小路 貴士1P-1p002
一瀬 桜子
3P-1p008
一瀬 博文
1P-1p023, 3P-1p017
市原 佐保子
1S-Bp01市原 拓巳
2P-1p018, 2P-1p029

井出 輝彦
2P-2p148
伊藤 秋実
2P-1p104, 2P-1p105
井藤 彰 1P-2p157, 1P-2p158, 2P-2p179
伊藤 圭祐
1S-Bp03伊東 謙吾
3P-1p127, 3P-1p128,

3P-1p129
2A-Ap01, 3P-1p083,
3P-1p088
伊東 昇紀
3P-1p036
伊藤 大知
1P-2p137
伊藤 俊彦
2P-1p072
井藤 俊行
2P-1p038, 2P-1p124
伊藤 伸哉
3P-1p024, 3P-2a171,
3P-2p171伊藤 春佳
3P-1p024
伊東 広哉
3P-1p006
伊東 昌章
3P-1p042
伊東 雅人
2P-1p014, 2P-1p015
伊藤 茉莉絵3P-1a084
伊藤 みさご1P-1p103, 1P-1p104
伊藤 通浩
1P-2p176
伊藤 康広
1P-1p008
伊藤 義訓
3S-Ap05
糸見 明穂
3P-2p153
稲垣 瑞穂
3P-1p087
稲葉 知大
1P-1p113
稲橋 正明
3S-Ap02
乾 博
3P-1p119
乾 将行 1P-1p045, 3P-1a009, 3P-2p168
犬飼 忠彦
3P-1a059
犬塚 友麻
3P-2a146
伊野 浩介
2P-2p180
井上 大介
1P-1p111
井上 達也
1P-1p059
井上 千弘
1P-1p107, 2P-1p125
井上 宏之
1P-1p026
井上 真紀
3S-Bp05
井上 瑞葉
1P-1p001
井上 悠希
3P-2a160
井上 優里
3P-1a121
井上 能博
3P-1p086
井野口 諒太3P-2p170
猪熊 健太郎2P-1p051, 2P-1p052,
3P-1p120
猪瀬 陽加
3P-2p132
井原 弘絵
1P-2p180
今井 健太郎1P-1p049
今井 伸二郎2P-1p083
今井 博之
3P-1p033
今尾 健太
3P-2p141
今岡 大士
3P-1p047
今田 隆介
2P-2p179
今高 寛晃
3S-Ep01
今中 忠行
3P-1p019
今中 洋行
3P-1p067, 3P-2a158
今村 維克
3P-1p067, 3P-2a158
井村 誠
3P-1p082
伊豫田 智典
2P-2p159
入江 崇
3P-1p068
伊藤考太郎

イルファ ハヌン ハルリサ
3P-2a163
岩井 和也
2P-1p090
岩井 謙一
2P-1p081
岩井 伯隆
3P-1a012
岩井 宏徒
2S-Bp03
岩井 良輔
1P-2p149
岩上 千華
3P-2a171
岩城 隼
2P-2p187
岩木 宏明
3P-1a011
岩切 亮
3P-1p082
岩國 美由季3P-2a149
岩倉 遼
3P-1a070
岩越 亮汰
3P-1a035
岩崎 将士
2P-2p184
岩崎 雄吾
2P-1p011
岩下 和裕
2P-1p074, 3P-1p004
岩下 小太郎2P-1p079
岩瀬 雄大
3S-Bp01
岩田 賢人
3S-Bp05
岩田 菖子
3P-1a073
岩田 晋明
3P-2a157
岩田 忠久
2P-1p129岩田 悠志
2P-1p045
岩田 吏世
3P-2p155
岩渕 和則
3S-Bp06
岩間 千草
1P-2p155
岩水 岳教
2P-2p141岩谷 和輝
1P-1p096う
上杉 大智
2P-1p090
上田 一義
3P-1p089
上田 賢一
1P-1p116
上田 紗季子2P-1p064
上田 泰己
3S-Ep03
上田 宏 1P-2p185, 2P-1p035, 2S-Bp03
上田 光宏
3P-1p119植田 充美
1P-2p167, 3P-1a040
上田 由佳
3P-1a075
植月 英智
2P-1p028
上野 明
2P-2p158
上野 省一
3P-1p034
植野 真伍
2P-2p161
上野 泰
1P-2p171
植野 陽平
1P-1p032
上野 嘉之
3P-1a102
上原 健二
2P-1p076, 3P-2p146
植松 君夫
1P-1p045
卯川 裕一
2P-2p167
鵜川 眞也
1P-1p098
筌場 将太
3P-1p017
宇治家 武史2S-Ea06
氏原 哲朗
2S-Ep03, 3P-2a137,
鵜瀬
宇田
内田
内田
内堀

和秀
成利
菜月
博之
孝博

3P-2a138
3P-1a079
3P-1p040
2P-1p103
3P-1a035, 3P-1p035
3P-1p101

327

内宮
内山
内山
内山
馬越
海野
梅尾
梅澤
梅津

万里央
佳祐
進
博文
智也
智史
美幸
究
光央

3P-1p098
3P-2p177
3P-1a054
3P-1a064
2P-1p103
3P-1a008
2P-1p074
3S-Bp04
2P-1p033, 2P-1p036,
3P-1a050, 3P-1a062, 3P-2a178
梅根 輝来人3P-1a047
梅野 太輔
1P-1p025, 3P-1a021,
3P-2p151
梅本 穂乃香
2P-1p109
裏 佳織
2P-1p116
裏地 美杉
1P-1p011, 1P-1p123,
2P-1p099
浦野 大樹
3P-1p026
浦野 信行
3P-2a177
上井 幸司
3P-2p139
海野 源人
2P-1p128

え
江口 晃弘
江口 夏帆
榎本 詢子
榎本 俊樹
江橋 具
海老原 章郎
海老原 京太海老原 哲男
江邉 正平
遠藤 銀朗
遠藤 浩
遠藤 政幸
遠藤 力也
遠藤 輪

3P-1p065
1P-1p076
2P-2p166, 2P-2p169
3P-2p1713P-2p166
1P-1p056
3P-1p037
3P-1a026
3P-1a1001P-1p107, 2P-1p102
3P-1a026
2P-2p183
2P-1p044
3P-2p147

お
老沼 研一
汪 亜運
黄 毅
王 碧昭
王 倫
扇谷 悟
大井 克仁
大井 宏紀
大池 達矢
大岩 達郎
大浦 麻里
大江 正剛
大江 知行
大川 博志
大川 祐也
大城 沙織
扇谷 悟
大久保 由布大熊 盛也

2P-2p140
3P-1a037
1P-1p107
2P-2p152, 3P-2p167
1P-1p056
1P-1p114
3P-2a175
2P-2p183
3P-1a098, 3P-1a099,
3P-1a1002P-2p134
3P-1a018, 3P-1p028
2P-2p148
3P-1a062
2S-Ba04
3P-1a049
2P-1p091
1P-1p115
1P-2p164
2P-1p044

大河内美奈

1P-2p185, 3P-2a162,
3P-2a163
大阪 朝美
2P-1p072
大里 修一
3P-1p005
大澤 果穂
2P-1p054
大澤 朗
2P-1p085
大島 淳
1P-1p117
大島 悟
2P-1p098
大島 立樹
3P-2p137
大城 隆
3P-1p118
大杉 立
1P-1p118
太田 邦史
3P-1a028
太田 誠一
1P-2p137
太田 剛志
3P-1p119太田 愛美
2P-1p028
大田 悠里
3P-1p043, 3P-2a159
大瀧 賀也
3P-2p133
大竹 敦子
1P-2p156
大竹 遥
3P-2p170
大谷 郁
3P-1a086
大津 厳生
1P-1p060, 1P-1p061,
1P-1p062
大塚 裕斗
2P-1p014
大塚 光雄
2P-1p050
大塚 祐一郎2P-1p058, 2P-2p135,
2P-2p139
大槻 隆司
1P-1p120, 2P-1p122,
3P-1a129
大音 徳
1P-1p118
大友 敬太郎2P-1p072
大中 佳三
1S-Bp01
大西 希咲
2P-2p166
大西 昇
2S-Ba04
大貫 慎輔
1P-1p069
大貫 喜嗣
1P-2p146, 1P-2p147,
2P-2p167
大沼 広宜
3P-1a025
大野 博司
2P-1p038, 3P-1a073
大庭 将矢
2P-1p007
大箸 信一
2P-1p054, 3P-2p150,
3P-2p172
大橋 貴生
2P-2p184, 2P-2p185
大橋 広行
3P-1p062
大橋 正孝
1P-1p070
大原 佑介
1P-1p073
大東 功承2P-1p073
大東 寛典
2P-2p173
大政 健史
1P-1p031, 1P-2p144,
1P-2p155, 1P-2p159, 1P-2p160,
1P-2p161, 1P-2p162, 1P-2p163,
2P-1p030, 3P-1p039, 3P-2p162
大松 勉
3S-Bp05
大本 貴士
2P-1p123大森 謙司
2P-1p018, 2P-1p029
大森 俊昂
1P-2p172
大矢 禎一
1P-1p069
岡 修司
1P-1p004
岡 拓二
1P-1p015
岡 美慧
3P-1p031

岡 裕也
岡井 直子
岡崎 秀明
岡﨑 文美
小笠原 渉
岡島 奨
岡住 脩平
岡田 法大
岡田 秀紀
尾形 駿介
緒方 法親
緒方 博之
尾形 慎
尾形 善之
岡南 政宏

2P-1p035
1P-1p041
2P-1p015
3P-1a126
1P-1p008, 3P-1p016
3P-1p038
3P-1p047
3P-1p096
1P-1p084
3P-1a010
1P-2p160, 1S-Bp04
3P-1a007
2P-1p016
2S-Ba023P-1a018, 3P-1a036,
3P-1a098, 3P-1a099,
3P-1a100, 3P-1p028
岡野 憲司
1P-1p001
岡橋 伸幸
3P-1a095
岡林 雪乃
3P-1a059
岡部 満康
3P-1a064
尾上 貴俊
1P-1p081
岡村 好子
2P-1p103, 3P-1a093,
3P-1a103, 3P-1a114,
3P-1a130, 3P-1a131, 3P-1p123
岡本 晃充
1P-2p135, 1P-2p150,
2P-2p145, 2P-2p150
岡本 正宏
2P-1p062
岡本 真美
3P-1p121
岡本 優太
3P-1a054
岡山 真哉
2P-1p110
小川 亜希子2P-2p156小川 和義
3P-2p157
小川 浩一
2P-1p070
小川 順
1P-1p048, 2P-1p044,
3P-1p070, 3P-1p071, 3P-2a181
小川 博
2P-1p093
小川 真弘
3P-1p083
小川 祐樹
1P-2p145
沖 昌也
3P-1a035, 3P-1p035
荻田 亮
3P-2a133, 3P-2a134
荻田 信二郎2S-Ba03, 3P-1a072
沖野 凪沙
3P-1p087
荻野 千秋
1P-1p041, 1P-2p136,
2P-2p140, 2P-2p142, 3P-1a077,
3P-2p138, 3P-2p143, 3P-2p153
荻野 博康
2P-2p132
荻原 淳 2P-1p045, 3P-2a140, 3P-2a141
荻原 侑莉恵2P-2p146, 2P-2p147
荻山 大輝
2P-1p078
奥嵜 雄也
1P-2p165, 1P-2p166
奥田 将生
1P-1p083, 3P-1p004
奥津 果優
2P-1p080, 2P-1p091
奥中 淳平
3P-1p118
奥野 圭祐
3P-1a036, 3P-1p028
奥村 隆享
3S-Ap01
奥村 晴美
1P-2p172
奥山 正幸
1P-1p011
小倉 一将
1P-1p063

328

小倉 尚志
小栗 秀俊
小黒 芳史
生越 大輔
尾崎 愛子
小山内 崇

3P-1p040
1P-1p108
1P-1p089
2P-1p015
3P-1a030
2P-1p064, 3P-1a081,
3P-1p036, 3P-1p049, 3P-1p121
小澤 智紀
3P-1p025
小澤 幸央
1P-1p096
押川 清孝
3P-1a097
押木 守
3P-1p108
尾島 由紘
2P-1p123, 3P-1a110,
3P-1p097, 3P-2p149
尾関 健二
2P-1p069, 2P-1p090
織田 健
2P-1p074, 3P-1p004
小田 康祐
3P-1p068
小田 沙織
3P-1a033
小田 忍 2P-1p054, 3P-2p150, 3P-2p172
小田切 正人3P-1a026
小田巻 俊孝1S-Bp05
越智 大起
2P-1p079
落合 秋人
2P-1p027, 3P-2a164,
3P-2a165, 3P-2a166, 3P-2a167,
3P-2a168, 3P-2a169, 3P-2a170
落合 芋葉子3P-1a120
落合 佑香
2P-1p080
鬼塚 正義
1P-2p144, 1P-2p159,
1P-2p160, 1P-2p162,
1P-2p163, 2P-1p030
小野 拓人
1P-2p173
小野 智博
1P-1p001
小野 浩
1P-1p096
小野寺 武
1P-2p185
小野寺 瑠依2P-1p109
尾花 望
1P-1p113
小原 優季
2P-2p143
小俣 達男
3P-1a079
尾山 廣
3P-1p042
折田 和泉
2P-1p128, 2P-1p130,
2P-1p131, 3P-1p019
オリベイラ サヌエ
1P-1p117
恩田 浩幸
1P-1p092か貝沼（岡本） 章子 1P-1p049, 3P-1p080
加川 健一
2P-2p172香川 元気
1P-2p138
香川 悠馬
1P-2p162
角谷 茜
3P-1p033
景山 達斗
1P-2p151
加古 博子
3P-1a124
笠井 拓哉
1P-1p065
笠井 尚哉
1P-1p085, 1P-1p097
加地 由季子3P-1p106
梶川 瑞穂
3P-1p086
梶田 真也
2P-1p058, 2P-2p135,
柏原
鹿島

貴幸
大揮

2P-2p139
3P-1p072
3P-1a045

鹿島
樫村
梶山

諒人
佳奈
慎一郎

2P-1p016
3P-1p056
1P-1p130, 3P-1a098,
3P-1a099, 3P-1p085
柏 雅美
2P-1p063, 3P-2a132
柏木 紀賢
2P-2p142, 3P-2p143
数岡 孝幸
1P-1p074
春見 隆文
2P-1p045, 3P-2a140,
3P-2a141片岡 健
1P-2p151
片岡 尚也
1P-1p042, 1P-1p043,
1P-1p044, 1P-1p058
片岡 道彦
3P-2a177
片倉 啓雄
1P-1p101, 2P-1p098
片平 正人
3P-1p089
片山 義博
2P-1p058, 2P-2p135,
2P-2p139
勝亦 雄太
3P-2p157
加藤 明宏
3P-1a079
加藤 謙斗
3P-1p002
加藤 晃
2P-1p040
加藤 沙枝
2P-1p048
加藤 彩織
1P-1p050
加藤 純一
2P-1p056, 2P-1p057,
2P-1p100, 3P-1a114,
3P-1a130, 3P-1a131
加藤 創一郎1P-1p105, 3P-1a017,
3P-2a155
加藤 太一郎1P-1p057, 2P-1p108,
3P-2a132加藤 竜也
1P-1p005, 1P-1p030,
2P-1p016, 3P-1a064, 3P-1p060
加藤 晃代
2P-1p024, 2P-1p031,
2P-1p034
加藤 紀彦
1P-1p099加藤 範久
3S-Dp03加藤 雅士
1P-1p027, 3P-1p010,
3P-1p054, 3P-1p055, 3P-1p081
加藤 昌彦
3P-1a050
加藤 三恵子2P-1p037
加藤 康夫
2S-Ba03, 3P-1a072
加藤 泰彦
2P-1p020, 3P-2a180
加藤 悠一
3P-1p117加藤 勇太
3P-1a116, 3P-2p160
加藤 幸成
2P-1p036
加藤 竜司
1S-Bp03, 2P-2p170,
2P-2p174, 3P-1p096,
3P-2a157, 3P-2p164, 3P-2p165
門倉 利守
1P-1p051, 1P-1p074,
1P-1p077, 1P-1p078, 1P-1p079
門脇 真史
2P-1p075, 3P-2a172
金井 宗良
1P-1p095
金井 里紗
1P-1p074
金尾 忠芳
2P-1p012, 3P-1a071
金木 達朗
1P-2p140
金田 祥宜
1P-1p105
金森 敏幸
2P-2p170
金山 直樹
2P-1p028
蟹江 慧
1S-Bp03, 2P-2p170,

2P-2p174, 3P-1p096,
3P-2p164, 3P-2p165
金岡 英徳
1P-2p165, 1P-2p166
金桶 光起
2P-1p082
金子 亜紀江1P-1p069
金子 陽徳
3P-2a165
金子 恒太郎3P-1p041
金子 真大
3P-2a155金子 美華
2P-1p036
金子 嘉信
3P-1a029, 3P-1p002
兼崎 友
1P-1p049, 1P-1p077,
3P-1p080, 3P-1p087
兼﨑 祐介
2S-Ea05
金下 裕平
3P-1p091
加納 周作
2P-1p001
椛田 聖孝
2P-1p079
加畑 眞人
1P-2p171
蕪 卓弥
1P-1p078
加部 泰三
2P-1p129
釜我 圭
3P-2p143
鎌形 洋一
1P-1p105, 1P-1p114,
1P-1p115
鎌田 健一
2P-1p026
蒲池 沙織
1P-1p026, 1P-1p115
上條 知昭
3P-1a004, 3P-1a005
上平 正道
1P-2p155, 1P-2p156,
1P-2p157, 1P-2p158,
1S-Ep03, 2P-2p179
上村 一雄
2P-1p012, 3P-1a071
上村 直史
3P-1a119神谷 典穂
1P-2p138
神𠮷 菜摘
3P-1a057
亀田 光裕
3P-2a169
狩山 美沙紀2P-1p104, 2P-1p105
河合 功治
3P-1p041
河井 重幸
3P-1p072
河合 駿 3P-1p096, 3P-2a157, 3P-2p165
川合 知二
3P-2a163
河合（野間） 繁子
1P-1p025,
3P-1a021, 3P-2p151
河上 佳奈
3P-1p024
川上 賀代子2P-1p099
川上 晃司
2P-1p099
河上 春樹
2P-1p090
河岸 洋和
3P-1a124, 3P-1a125,
3P-1p029
川口 剛司
1P-1p004, 1P-1p017,
3P-1p011, 3P-1p012, 3P-1p050
川口 秀夫
2P-2p140
川口 祐加
2P-1p028
川﨑 了
1P-1p108
川﨑 俊輔
2P-2p181川崎 健
3P-1a007
川崎 寿
3P-1a008
川﨑 浩子
3P-1a002, 3P-1a004,
3P-1a005
川嶋 草平
1P-1p051
川瀬 貴斗
2P-1p087
川瀬 三雄
3P-1a059

329

川添
河田
川出
河出
川戸
川西

直樹
悦和
雄二郎
来時
克展
琢也

1P-1p084
1P-1p046
3P-1a126
3P-1a045
3P-1p018
3P-1p104, 3P-2p135,
3P-2p177
河野 邦晃
2P-1p081
河野 高徳
2P-2p167
河野 祐介
1P-1p060, 1P-1p061,
1P-1p062
河野 祥尚
3P-1a105
川端 潤
1P-1p001, 1P-1p022
川原 浩治
1P-2p140
河原 正浩
1P-2p150, 1S-Ep04,
2A-Cp01, 3P-1a045,
3P-1a047, 3P-1p064, 3P-1p065
川部 純弥
3P-2a167, 3P-2a168
河邉 佳典
1P-2p156, 1P-2p157,
1P-2p158, 1S-Ep03, 2P-2p179
川村 優樹
2P-1p064
河目 裕介
1P-1p109
河本 哲宏
1P-1p096
官 羽
3P-1a066
姜 貞勲
1P-2p134
顔 昊
3P-1a119神崎 亮平
3S-Ep02神田 健
3P-1a012
菅野 弘樹
1P-1p107
神戸 悠輝
2P-1p091

き
木内 愛海
黄川田 隆洋
菊地 晟弘
菊地 淳
菊池
岸田
岸野
岸本
岸本
喜多
北内
北岡
北岡
北垣

北川
北川
北辻
木溪
北村
北村
北村
北村
北本

1P-1p022
1P-2p163
3P-1a119
1P-2p178, 1P-2p181,
3P-1a087, 3P-1p086, 3P-1p098
輝美
2P-2p186
正夫
2P-1p118
重信
2P-1p044
真治
3P-2a139, 3P-2a142
高英
2P-1p042
晃久
3P-1a114, 3P-1a130,
3P-1a131健太
2P-1p021
卓也
1P-1p023, 3P-1p017
本光
2P-1p002, 2P-1p041
浩志
1P-1p075, 1P-1p081,
2P-1p075, 2P-1p077,
3P-2a172, 3S-Dp04, 3S-Dp05
学
1P-1p093
航
1P-1p105
早希
1P-1p020
俊介
1P-2p166
進一
3P-2a133
整一
1P-1p081
智彬
1P-1p009里香
3S-Bp06
宏子
3P-1a006

吉川
橘田
木寺
木梨
衣笠
木野

史隆
和美
研太
陽康
凌
邦器

2P-2p176
2P-1p041
3P-2p161
3P-2a149
2P-1p014
1P-1p020, 1P-1p021,
1P-1p022, 1P-1p024,
2P-1p005, 2P-1p006
木野 貴仁
3P-1a072
木野 裕太
3P-1p094
紀ノ岡 正博1P-2p145, 2P-2p160,
2P-2p161, 2P-2p162,
2P-2p175, 2P-2p177
木下 敬太
1P-2p143
木原 崇博
3P-1a013
紀平 和枝
3P-2p153
金 美海
1P-2p145, 2P-2p160,
2P-2p162, 2P-2p175, 2P-2p177
木村 明音
3P-1p093
木村 淳夫
1P-1p011
木村 和幸
2P-1p063, 3P-2a132
木村 恒太
3P-1a017
木村 駿太
3P-1a027
木村 哲哉
1P-1p019, 1P-1p129
木村 尚弥
2P-1p025
木村 信忠
3P-1a118
木村 遥奈
1P-2p139
木村 元一
3P-1a097
木村 元彦
3P-1a113
木村 義雄
3P-2a150
木本 紗蘭
3P-1p054, 3P-1p055
木本 裕
2P-1p070
許 漢修
3P-1p084姜 林涛
1P-1p125
清 啓自
1P-1p051, 1P-1p052,
1P-1p053, 1P-1p054,
1P-1p077, 2P-1p050, 3P-1p101
清田 泰次郎3P-1p096, 3P-2p164,
3P-2p165
清野 珠美
2P-1p071
切明 研人
2P-2p153
切田 勝久
1P-2p137
桐村 光太郎3P-1a075, 3P-1p056,
3P-1p057
金田一 智規3P-1p108
金原 和秀
2P-1p121, 3P-1a022,
3P-1a113
金兵 知毅
2P-2p145

く
久下沼 匠
楠 信行
楠本 憲一
工藤 勇人
國澤 純
久原 哲
久保 廣海
久保 幹

3P-1p1252P-1p117
2P-1p010
2P-1p113
1P-1p101
3P-1p016
2P-1p090
1P-1p121, 1P-1p122,
1P-1p124, 2P-1p107,

2P-1p114, 2P-1p115, 3P-1p034
1P-1p077
3S-Ep04
1P-1p109
3P-2p168
1P-2p155
2P-1p033, 2P-1p036,
3P-1a050, 3P-2a178
孝則
3P-1p025, 3P-1p040
拓也
2P-1p013
俊高
3P-1p006
仁志
3P-2a180浩樹
1P-2p168祐也
1P-1p011
陽一
1P-1p125, 3P-1a055,
3P-1a057, 3P-1a059,
3P-1a117, 3P-2p144
暁子
3P-2a157
健人
2P-1p030
つぐみ
2P-2p155亜子
3P-2a145
隆一郎
1P-1p110, 1P-1p119
敦
1P-1p089
健介
1P-1p103, 1P-1p104
彩加
2P-1p088, 3P-2p142
純平
2P-1p108
晃3P-2p167
太
3P-1p108
あかね
3P-2a133
喬
2P-1p082
麻里
1P-1p024
顕
3P-1p095
良太
2P-1p023, 3P-1a044
勝久
3P-2a183
健
3S-Bp06信幸
3P-1a056, 3P-1a061
尋 1P-2p146, 1P-2p147, 2P-2p167
章夫
1P-2p173, 3P-1a015,
3P-1a043
浩一
1P-2p167俊一
1P-2p132, 1P-2p133,
1P-2p179, 2P-1p032, 2P-2p178
真史
1P-1p111, 3P-1a109,
3P-1p106, 3P-1p107, 3P-1p108
浩幹
2P-1p052
信幸
3P-1a060
茂
3P-1p005
広明
1P-1p041
修司
2P-1p092

久保田 恵理窪田 規一
久保田 謙三
久保田 健
窪田 みち
熊谷 泉
熊谷
熊谷
熊谷
熊谷
熊谷
熊谷
熊田

久米
公文
倉島
倉地
倉根
倉橋
倉橋
藏本
栗岡
栗崎
栗栖
栗田
栗林
黒岩
黒川
黒木
黒木
黒倉
黒澤
黒澤
黒田
黒田
黒田
黒田
黒野
黒澤
桑田
桑原
桑村

け
間中
弦間

千尋
里歩

3P-1p070
2P-2p168こ胡 宏海
小池 あゆみ小池 至人
小池 祥悟

1P-1p076
2P-1p022
1P-1p111
1P-1p093

330

小池 英明
2P-1p042, 3P-1a006
小泉 淳一
2P-1p084, 3P-1a107
小板橋 基夫
3P-1a006
小出 静代
1P-2p163
小出（吉田） 静代
2P-1p018
高 未麗
2P-1p106
河口 礼佳
3P-1a019
高坂 哲也
1P-1p030
晃佑 垣田
2P-1p118
合田 雅浩
3P-2p175合田 亮
1P-1p103, 1P-1p104
高妻 篤史
1P-1p065
河野 愛子
3P-1p084河野 晋
3P-1a095
河野 弘美
1P-1p083
鴻池 史憲
2P-2p146
高屋 朋彰
2P-1p086
古賀 雄一
1P-1p031, 1P-2p159,

1P-2p160, 1P-2p162,
1P-2p163, 3P-1p039
小川 雅人
1P-2p176, 1P-2p177
小暮 高久
3P-2p168
小暮 敏博
2P-1p126
古在 豊樹
1S-Ap01
小坂 恵
2P-1p012
小境 敏揮
2P-1p081
小酒井 智也
3P-1a020
小﨑 一功
3P-2a156
古崎 利紀
3S-Bp02, 3S-Bp04,
3S-Bp05, 3S-Bp06, 3S-Bp07
小里 孟
2P-1p074
小塩 茂々子3P-1p053
兒島 孝明
1S-Bp02, 2P-1p031,
2P-1p034
小島 康弘
1P-1p005
小嶋 涼
3P-2a140, 3P-2a141
五島 徹也
2P-1p119小杉 昭彦
3P-1a123
古関 明彦
2P-2p159
小園 祥子
3P-1p071
小高 敦史
1P-1p071
小谷 真也
3P-2a151
児玉 知大
1P-1p042
児玉 浩明
2P-1p038, 2P-1p124,
3P-1a073
後藤 成暁
2P-2p144後藤 正利
3P-1a118
後藤 雅宏
1P-2p138後藤 友規
2P-2p168
小西 佳菜子3P-1p039
小西 智之
3P-1a008
小西 正朗
3P-1a031, 3P-1a116,
3P-2p160
小橋 興次
2P-1p104, 2P-1p105
小林 淳
3P-1p039
小林 和輝
2P-2p138
小林 和也
1P-1p089, 1P-1p094
小林 慶一
3P-1a075, 3P-1p057
小林 拓嗣
2P-2p134, 3S-Bp02

小林 直也
小林 秀峰
小林 大起
小林 美穂
小林 優香
小林 夕香
小林 洋介
駒 大輔
小牧 久幸
小松 圭
小松 将大
小松 眞也
小松 大祐
五味 勝也

米田
小森
小栁
小山
小山
小山
権平
近藤

近藤
近藤
近藤
近藤
近藤
近藤
今野
今野
紺屋

2P-1p025
2P-2p149
3P-1p066
1P-1p087
1P-2p152
1P-2p1711P-1p114, 1P-1p115
2P-1p123
3P-2a151
2P-1p030
1P-2p157
1P-2p157
2P-1p112
1P-1p006, 3P-1p007,
3P-1p008, 3P-1p009,
3P-1p013, 3P-1p014, 3P-1p015
英伸
2P-1p009
誠也
3P-1p010
喬
1P-1p076, 3P-2p171
純弘
1P-2p174正浩
2P-1p095
泰二
3P-1p083
文夫
3P-1a055, 3P-1a057,
3P-1a059
昭彦
1P-1p034, 1P-1p041,
1P-2p136, 2P-1p051,
2P-1p052, 2P-1p055, 2P-1p059,
2P-1p068, 2P-1p085, 2P-1p089,
2P-1p127, 2P-2p140, 2P-2p142,
3P-1a030, 3P-1a076, 3P-1a077,
3P-1p084, 3P-1p117, 3P-1p120,
3P-1p121, 3P-2p138, 3P-2p141,
3P-2p143, 3P-2p145, 3P-2p153
旺次郎
3P-1p029
敬子
3P-1p089
聡
1P-1p118
拓也
3P-2a134伸彦
2P-2p162
雅子
1P-2p156, 1P-2p158
博行
1P-1p012
友維
3P-1p014
豊 1P-2p169, 1P-2p170, 3P-1a096

さ
雜賀
西條
齋藤
斎藤

あずさ
雄介
勝一
恭一

齊藤
齋藤
齊藤
齊藤
齋藤
齋藤
齊藤
佐伯
酒井
酒井

健吾
高弘
博英
正輝
雅典
康将
亮太
和哉
亜希
杏匠

2P-1p042, 3P-1a006
2S-Ap02
1P-1p088, 1P-1p090
1P-1p025, 3P-1a021,
3P-2p151
3P-2a164
3S-Bp06
2P-2p181, 3P-2a184
3P-1a010
1P-1p106
3S-Bp05
3P-1p004
3P-1a021, 3P-2p151
3P-1p078
3P-1p054, 3P-1p055,

酒井

謙二

坂井 沙織
境 慎司
坂井 華美
阪井 康能
坂上 吉一
榊原 昇一
榊原 陽一
坂口 剛正
阪口 利文
坂口 正明
酒瀬川 信一
坂田 研二
酒谷 真以
阪中 幹祥
坂本 沙祐里
坂本 茂
坂元 仁
阪本 龍司
坂本 裕希
阪本 真由子
阪本 泰光
佐川 岳人
佐久間 哲史
櫻井

明彦

櫻井 紫乃
櫻井 琢磨
櫻井 健志
櫻井 美季
提坂 裕子
佐古田 久雄
迫野 昌文
笹川 真稚
佐々木 建吾佐々木 大樹佐々木 大介佐々木 寛人笹倉 直也
佐々倉 有麻笹野 佑
佐々野 僚一粟冠 和郎
粟冠 真紀子
佐藤 敦史
佐藤 綾香
佐藤 綾子
佐藤 伊純
佐藤 香枝
佐藤 圭悟
佐藤 舜
佐藤 大貴
佐藤 喬章

3P-1p081, 3S-Bp04
3P-1a104, 3P-1a105,
3P-2p176
3P-1a008
2S-Cp04
1P-2p180
3P-1a033
2P-1p104, 2P-1p105
2P-2p150
3P-2a183
3P-1p068
2P-1p103
1A-Aa01
2P-1p003
3P-1a087
1P-1p081, 2P-1p077,
3P-2a1723P-1a019
1P-1p036
3P-1a097
3P-2p155, 3P-2p156
3P-1p119
1P-2p139
1P-1p081, 2P-1p077
1P-1p008
1P-1p092
1P-2p157, 1S-Ep01,
3P-1p005
2P-1p088, 3P-2p142,
3P-2p158, 3P-2p159
3P-1a109
3P-1a113
3S-Ep02
3P-1p021
2P-2p167
1P-1p050, 3P-1p080
1P-1p038, 2P-1p021,
2S-Bp05, 3P-2p137
3P-1p093
2P-1p085, 2P-1p127,
3P-1p120
1P-1p049
2P-1p085, 2P-1p127
2P-2p170, 3P-1p096
3P-1a076
3P-1p075
3P-1a027, 3P-1p002
1P-1p092
1P-1p019, 1P-1p129
1P-1p019, 1P-1p129
3P-1p083, 3P-1p088
2P-2p163
3P-1p087
2P-1p040
1P-2p150
2P-2p185
2P-1p102
3P-2p146
1P-1p007, 3P-1a078

331

佐藤
佐藤
佐藤
佐藤
佐藤
佐藤
佐藤

駿
琢
友哉
豊三
弘晃
文彦
康治

佐藤 陽子
佐藤 陽治
佐薙 潤季
眞田 英明
佐野 創太郎
佐野 千晴
佐原 健彦
澤崎 達也
澤田 和敬
澤田 祥子
猿渡 通代
澤野 博之
澤登 美空
殘華 智子
三本木 至宏残間 寿美香1P-1p1102P-2p170
2P-1p075, 3S-Dp04
3P-1a006
3P-1a038
2S-Ba05
2S-Ep03, 3P-2a137,
3P-2a138
1P-1p006
1S-Ep06
3P-1p072
3P-1a050
2S-Ea05
3P-1p047
1P-1p114, 1P-1p115
3S-Ep05
1P-1p075, 2P-1p075
3P-1a018
1P-1p073
3P-1p087
1P-2p146
1P-1p017
1P-1p063
1P-1p012

し
塩田
塩野
塩見
敷中

英史
忠彦
尚史
一洋

珠玖 仁
重田 友明
重田 育照
重藤 元
茂野 俊也
茂本 亮輔
重森 陽士郎
茂里 康
志澤 宏明
志田 洋介
志津田 有成信田 亮太
篠 阿弥宇
篠崎 由紀子
篠瀬 真人
柴田 晃
柴田 孝
芝田 猛
柴田 敏行
柴田 晴佳
柴田 真実
柴田 泰宏
柴野 可菜
渋田 真結
島 純
嶋 秀明
島田 麻里奈嶋田 亮

2P-2p145
2P-1p117
3P-1a084
2P-1p058, 2P-2p135,
2P-2p139
2P-2p180
3S-Ep01
2P-1p014
1P-2p173
2P-1p050
1P-1p040
3P-2a158
1P-1p009
3P-1p070
1P-1p008, 3P-1p016
2P-2p139
1P-1p095
1P-2p181, 3P-1p086
3P-1a1082P-2p158
1P-1p097
3P-1p006
2P-1p079
1P-2p167, 3P-1a040
3P-1a102
3P-1a050
1P-1p098
3P-1p046
2P-2p170
2P-1p044
3P-1p086
2P-1p080
3P-2p158

島谷
島袋
嶋本
清水

雅文
美波
孝平
一憲

3P-1a003
1P-1p033
3P-1p004
1P-2p141, 2P-2p168,
2P-2p174, 2P-2p176,
3P-1p096, 3P-2a156,
3P-2a157, 3P-2p164, 3P-2p165
清水 克彦
3P-1p066
清水 金忠
1S-Bp05
清水 桂太
2P-2p178
清水 浩
1P-1p064, 1P-1p066,
2P-1p053, 2P-1p060, 2P-1p061,
2P-1p068, 3P-1a010, 3P-1a095
志水 元亨
1P-1p027, 3P-1p010,
3P-1p054, 3P-1p055,
3P-1p081, 3S-Bp04
清水 康子
2P-2p167
清水 義宏
3S-Ep03
清水 稜
3P-1p123
清水 瑠美
2P-1p023, 3P-1a044
下川 直史
1P-2p164, 3P-2a173,
3P-2a174, 3P-2a175, 3P-2p136
下坂 誠
3P-1a038
下澤 勇弥
3P-1a034
下田 聡一郎3P-2p162
下田 博司
2P-1p099
下平 潤
3P-1a004, 3P-1a005
下平 武彦
3P-2a183
蒋 天翼
2P-1p114
周 勝敏
3P-1p069
城 斗志夫
2P-1p082
正元 晃平
3P-1a048
庄司 仁
3P-1p108
庄司 光男
2P-1p004
庄司 有理
2P-1p102
鄭 熙陳
2P-1p035
白井 智量
1P-1p034, 2P-1p055,
3P-1p121
白木 孝典
1P-1p064
白木川 奈菜1P-2p139
白坂 憲章
2P-1p007, 3P-1a025
城田 裕介
2P-2p165
白柳 英俊
3P-1p012
城山 真恵加
1P-1p062
新沢 祐大
3P-1p054, 3P-1p055
新庄 梨沙
3P-1p015
新谷 尚弘
3P-1p007, 3P-1p008,
3P-1p009, 3P-1p013,
3P-1p014, 3P-1p015
新谷 政己
2P-1p121, 3P-1a022,
3P-1a113
神藤 定生
3P-1p044, 3P-1p054,
3P-1p055
新間 秀一
1P-2p187
新名 俊行
2P-1p038
新家 一男
3P-2a135, 3P-2a136

す
蘇 九龍
水光 正仁
末永 光
末野 和男
菅井 翔吾
菅井 寛
菅沼 宗矢
菅原 恒
菅原 宏祐
洲鎌 勇太
菅原 一輝
杉浦 慎治
杉浦 康友
杉尾 剛
杉尾 理恵
杉田 愼之助
杉田 隆
杉田 晴佳
杉田 龍兵
杉立 久仁代
杉野 春貴
杉本 和之
杉本 幸子
杉森 大助
杉山 在生人
杉山 和哉
杉山 成
杉山 弘
杉山 政則
杉山 峰崇
洲崎 悦子
鈴木 淳巨
鈴木 絢子
鈴木 市郎
鈴木 恵利香
鈴木 空太
鈴木 渓
鈴木 惠介
鈴木 健一朗
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木

2S-Bp03
3P-2a183
3P-1a118
1P-1p073
3P-2a151
2P-1p027
1P-1p055, 1P-1p056
3P-2a173
1S-Bp05
3P-1p042
1P-1p107
2P-2p170
3P-2p159
3P-1a112
3P-1a112
1P-1p031
2P-1p044
3P-1a119
2P-1p084, 3P-1a107
1P-1p092, 1P-1p100
3P-2a161
2S-Cp01
1P-1p069
2P-1p003, 3P-1p048
3P-2a178
2P-1p113
1P-1p036
2P-2p183
3P-1p025, 3P-1p040
3P-1a027, 3P-1p002
1P-1p036
2P-1p019
3P-1a032, 3P-1p026
2P-1p084, 3P-1a107
2P-1p081
3P-1p014
2P-1p126
1P-2p156
1P-1p051, 1P-1p074,
1P-1p077, 1P-1p078, 1P-1p079
研志
3P-2a146
聡
2P-1p010
伸
2P-1p005
紳一郎
1P-1p025
崇2P-2p172貴弘
1P-2p136, 3P-2p138
隆弘
3P-1a097
哲朗
1P-2p183
徹
3P-1a020, 3P-1p087
俊宏
1P-1p115, 1P-1p126,
2P-1p119敏弘
1P-1p049, 1P-1p053,
3P-2a149
智子
1P-2p150
秀幸
2S-Ba02宏和
3P-1p118勇輝
2P-2p183

332

鈴木 義之
鈴木 里沙
須田 彰一郎
須田 雅子
須田 亙
須藤 孝一
角 寿子
炭谷 順一

1P-1p008
3P-1a041
1P-2p176
1P-1p045, 3P-2p168
2P-1p038, 3P-1a073
2P-1p125
3P-2p174
1P-1p004, 1P-1p017,
3P-1p011, 3P-1p012, 3P-1p050
隅谷 友紀
3P-1p029
陶山 友彰
1P-1p037

せ
清 和成
清 菜都実
清木 俊雄
戚 蟠
關 光
関 兵馬
関 実
関口 桂
関根 麻莉
関根 由璃子
關谷 悠介
瀬田 幸平
善藤 威史
仙波 弘雅

1P-1p111
3P-1a069
2P-1p028
1P-2p137
2S-Ba01
1P-1p129
1P-2p143, 1P-2p148
1P-1p1003P-2p167
2P-1p097
3P-2p170
1P-1p053, 1P-1p054
3P-2a161, 3P-2p176
1P-1p018

そ
曾 芳琴
相馬 悠希
曽我 亜由美
十川 直也
曽田 匡洋
曾根 輝雄
園木 和典
園部 智彩
園元 謙二

3P-1a052
1P-1p067, 1P-1p068
3P-1a1252P-2p144
2P-2p142
1P-1p105
3P-1a119
3P-1p089
1A-Aa03, 3P-1a086,
3P-2a161, 3P-2p176, 3S-Dp02
曽宮 正晴
1P-2p132

たターナー ピーター
2P-1p093
大利 徹 2S-Ep03, 3P-2a137, 3P-2a138
多賀 直彦
2P-1p079
高木 一好
1P-1p014, 3P-1p051,

3P-1p052, 3P-1p053
3P-1p114
2P-1p029
2P-1p065
1P-2p167
2P-2p170
1P-2p150
1P-1p060, 1P-1p061,
1P-1p062, 1P-1p069,
1P-1p070, 2S-Aa04
高木 昌宏
1P-2p164, 3P-2a173,
3P-2a174, 3P-2a175, 3P-2p136
髙木 睦 2P-2p153, 2P-2p154, 2P-2p155
高木
高木
高木
高木
高木
高木
高木

航平
大地
哲史
俊幸
俊之
智子
博史

高木
高桑
高柴
高島
高瀬
高田
高谷
高野
高野
高野
高野

理沙
雄一
則子
昌子
良和
真由
信之
築
力
博幸
真希

2P-2p150
2P-2p1712P-1p088, 3P-2p142
2P-1p044
2P-1p081
1P-1p110
3P-1a079
3P-1p039
2P-2p136
3P-1p105
2P-2p133, 3P-1a065,
3P-1a069, 3P-1a070,
3P-2a143, 3P-2a148
髙橋 伊織
2P-2p154
高橋 圭
1P-1p083
高橋 健司
3P-1a119高橋 憲司
1P-2p153, 1P-2p154,
2P-1p058, 2P-2p135, 2P-2p139,
3P-1a120, 3P-1a121, 3P-1a122
高橋 浩一
3P-1a055, 3P-1a057,
3P-1a059
髙橋 沙綾
3P-1a125
高橋 里美
1P-1p048, 3P-1p070,
3P-1p071, 3P-2a181
髙橋 太雅
1P-1p107
高橋 大地
3P-1a110高橋 智聡
3P-1a095
高橋 徹
3P-2p146
高橋 俊成
1P-1p073
高橋 仁志
1P-1p120
高橋 宏和
3P-1a103
高橋 将人
3P-2a176
高橋 雅俊
2P-2p172高橋 政友
3P-1a097
高橋 譲
3P-2a149
高橋 裕里香
3P-1p099
高橋 佳江
2P-2p187
高橋 良輔
3P-2a133
高原 沙里
3P-1a003
髙原 順子
1P-2p182髙峯 和則
2P-1p080, 2P-1p091
高村 岳樹
2P-1p022
高谷 直樹
1P-1p040, 2P-2p140,
3P-1p069, 3P-1p075
高山 征也
3P-1a030
高山 陽加
3P-1a101
田川 聖一
2P-2p173, 3P-1p091
滝口 昇 3P-1p104, 3P-2p135, 3P-2p177
瀧下 竜太
3P-2p161
田口 和典
2P-1p103
田口 耕造
1P-1p072
田口 悟朗
3P-1a038
田口 精一
2P-1p129田口 誠我
1P-1p075, 2P-1p075
田口 久貴
1P-1p127
武 慶太郎
1P-1p014
竹内 道雄
2P-2p134
武尾 正弘
1P-1p057, 2P-1p014,
2P-1p015, 2P-1p063,

2P-1p108, 3P-2a132

竹川
竹嶋
竹田
竹田
竹田
武田
竹中

薫
1P-1p015, 1P-1p016
康誠
1P-1p041
裕貴
1P-2p176
浩之
3S-Ep05
正久
1P-1p074
穣 2P-1p084, 3P-1a107, 3P-1p089
慎治
1P-1p018, 3P-1a014,

竹原一起

3P-1a023
1P-1p057, 2P-1p014,
2P-1p015
竹村 謙信
1P-2p183
竹本 淳一
2P-1p001
竹屋 壮浩
3P-1p036, 3P-1p049
竹山 春子
1P-2p176, 1P-2p177
田島 誉久
2P-1p056, 2P-1p057,
2P-1p100, 3P-1a093,
3P-1a114, 3P-1a130, 3P-1a131
田代 康介
3P-1p016
田代 幸寛
3P-1a104, 3P-1a105,
3P-2p176
田代 陽介
2P-1p113, 2P-1p126,
3P-2a146多田 孝清
1P-1p093
多田 千佳
1P-1p106
多田 日菜子3P-1p007
多田羅 昌浩3P-1a102
立木 隆
1P-1p012
伊達 弘輝
3P-1p067
伊達 修平
2P-1p101
伊達 康博
1P-2p178, 1P-2p181,
3P-1a087, 3P-1p086, 3P-1p098
立松 健司
1P-2p133
田所 花菜
3P-1p048
田中 香お里3P-1p087
田中 賢二
2P-1p130, 3P-1p127,
3P-1p128, 3P-1p129
田中 謙也
3P-1a017
田中 耕生
1P-1p018, 1P-1p041,
3P-1a014, 3P-1a023
田中 沙季
1P-1p119田中 純平
1P-1p079
田中 翔
1P-2p160
田中 正太郎2P-2p171田中 孝明
2P-1p027, 3P-2a164,
3P-2a165, 3P-2a166, 3P-2a167,
3P-2a168, 3P-2a169, 3P-2a170
田中 貴大
3P-1p051, 3P-1p052
田中 拓未
3P-2p146
田中 達也
3P-1a015
田中 勉
2P-1p059, 3P-1a030,
3P-2p141, 3P-2p145
田中 剛 3P-1p021, 3P-1p105, 3P-1p116
田中 亨
2P-2p148, 2P-2p149
田中 俊雄
3P-2a133, 3P-2a134
田中 尚人
1P-1p074
田中 信忠
1P-1p008
田中 信行
1P-2p182田中 秀樹
3P-1p072

333

田中
田中
田中
田中

秀典
宏昌
誠
祐圭

3P-1a028
2P-2p176
3P-1p020
1P-2p185, 3P-2a162,
3P-2a163
田中 優
3S-Dp02
田中 瑞己
3P-1p007, 3P-1p008,
3P-1p009, 3P-1p013,
3P-1p014, 3P-1p015
田中 美知留1P-1p003
田中 三男
1P-1p002, 1P-1p003
田中 雄士
2P-2p156田中 裕也
3P-1a017
田中 雄也
3P-1a018
田中 陽
1P-2p182田中 良拓
3P-1a053
田中 礼士
1P-2p167, 3P-1a040
田辺 久美
3P-1p078
田邊 智哉
3P-2a156
田邊 直人
3P-1a035, 3P-1p035
谷 明生 1P-1p002, 1P-1p055, 1P-1p056
谷 修治
1P-1p004, 1P-1p017,
3P-1p011, 3P-1p012, 3P-1p050
谷 龍典
1P-1p127
谷 敏夫
1P-2p180谷川 絢美
3P-2p150
谷口 正輝
3P-2a163
谷口 正之
2P-1p027, 3P-2a164,
3P-2a165, 3P-2a166, 3P-2a167,
3P-2a168, 3P-2a169, 3P-2a170
谷口 克
2P-2p159
谷口 麻菜美3P-1a117
谷口 百優
1P-2p169, 1P-2p170,
3P-1a096
谷口 幸美
3P-1p031
谷端 怜奈
3P-1a055
谷村 あゆみ2P-1p044
谷本 桃子
3P-1p025
谷本 悠樹
1P-1p057
田端 和仁
2P-2p150
袋布 昌幹
3P-1a108
田部井 仁美3P-1a092
玉井 奈生子3P-1a111
玉置 尚徳
2P-1p080
玉木 秀幸
3P-1p106, 3P-1p107
玉木 友理
1P-1p012
玉木 良平
3P-1p058
玉田 太郎
2P-1p012
玉田 佳大
1P-1p080, 2P-1p073
玉村 朋大
1P-1p098
田丸 浩
3P-1a126, 3P-2a182
田村 廣人
3P-1p044
田村 磨聖
2P-2p170
田村 亮太
2P-1p108
田谷 正仁
2S-Cp04, 3P-2p149

ち
程 慧君
近成 直斗

3P-1a105
2P-1p108

近本 啓太
知田 真之介
千葉 真奈美
千葉 靖典
車 炳允
張 傛喆
張 振亜
張 斯来
張 琳
長南 圭介

2P-1p094
2P-1p116
3P-1a042, 3P-1a043
2P-2p187
3P-2a145
2P-1p109, 3P-1p102
3P-1a066, 3P-1a128
3P-1p013
2P-1p122
2P-1p003

鶴海

泰久て
出来島 康方
出村 拓
寺尾 啓二
寺尾 陽介
寺田 彩音
照屋 盛実
天保 美咲

つ
塚原
塚本
塚本
塚本
塚本
月岡
柘植
柘植

正俊
薫
啓介
佳也
義則
祐一郎
圭介
丈治

1P-1p082, 3S-Ap03
3P-1a060
2P-1p023
2S-Cp01
1P-1p098, 3P-2a145
2P-1p076
3P-2a1722P-1p129, 3P-1a013,
3P-1a085, 3P-1p027
柘植 陽太
1P-1p045, 2P-1p058,
2P-1p127, 2P-2p135, 2P-2p139,
3P-1a120, 3P-1a121, 3P-1a122
辻 明彦 2P-1p018, 2P-1p029, 2P-1p092
辻 竜海
3P-1p001
辻 雅晴
3P-1a091
辻 勇祐
2P-1p020
辻川 正人
2S-Aa01
辻野 義雄
1P-2p164對馬 裕誠
3P-2p146
圡田 喜野
3P-1p022
土田 将大
1P-2p165
土戸 哲明
3P-2p155, 3P-2p156
筒井 聡志
1P-2p178
筒井 真楠
3P-2a163
都築 祥子
3P-2a182
都築 毅
3S-Dp01
堤 浩子
3P-1a076, 3P-1a077
常田 聡
3P-1p043, 3P-2a159
恒松 雄太
3P-2a142
角田 貴一
2P-2p133角田 達朗
3P-1a042, 3P-1a043
角田 翼
1P-1p111
鍔田 仁人
1P-1p081
坪井 誠二
2P-1p099
坪井 宏和
2P-1p090
坪井 裕理
3P-1a087, 3P-1p098
坪内 泰志
1P-2p174
坪内 芙美香
3P-1p087
坪田 洸一郎3P-1a108
坪田 潤
1P-1p046
津村 亮輔
3P-1p011
湊元 幹太
3P-1a063
鶴岡 愛
1P-1p060, 1P-1p061
鶴岡 直樹
1P-1p009
鶴田 裕美
3P-2a172
鶴田 開生
3P-1p020
鶴野 圭悟
1P-1p068

3P-1a001
1P-1p001
2P-1p040
2P-1p094
2P-2p148
2P-1p112
3P-2p175
1P-1p109

と
土井 和博
土居 幹治
土井 遼平
戸井田 力
董 金華
東海 彰太
東條 繁郎
東條 元昭
當仲 寛哲
道林 泰樹
道羅 英夫
遠山 忠
土岐 麻菜
常盤 豊
徳田 茜
徳田 耕二
徳光 浩
徳本 勇人
徳山 健斗
都倉 知浩
徳楽 清孝
都甲 潔
利田 賢次
戸田 修二
戸田 弘
土肥 浩二
泊 直宏
冨尾 紋子
富田 淳美
冨田 理
富田 尚樹
富田 寿男
冨田 昌弘
富田 因則
冨田 悠一
冨田 結芙子
冨永 有里絵富永 依里子
冨本 和也
戸谷 吉博
外山
豊田
豊田
豊田
豊田
豊田

博英
早紀
敦
健一
晃一
竜

2P-1p057
1P-1p018
2P-1p067
1P-2p134
2P-1p035, 2S-Bp03
2P-1p008
1S-Ap03
3P-2a144
3P-1p092, 3S-Bp07
3P-1a035, 3P-1p035
3P-1a064
3P-1p114
2P-2p163
3P-2p174, 3P-2p175
3P-1a032
2P-1p069
2P-1p028
1P-1p103, 1P-1p104
2P-1p060, 2P-1p061
2P-2p160
3P-2p139
1P-2p185
3P-1p005
1P-1p081
3P-2p1712P-2p185, 2P-2p186
1P-1p009, 1P-2p180
1P-1p086
2P-1p053
1P-1p088, 1P-1p090
2P-1p102
3P-1a126
3P-1a063
3S-Bp01
3P-2p166
3P-1a081
3P-1p118
3P-1p123
2P-1p047
1P-1p064, 1P-1p066,
2P-1p060, 2P-1p061
1P-1p082
1P-1p015
1P-1p075
2P-2p1723P-1a009
3P-2a165, 3P-2a166

334

豊福
寅本
鳥居

雅典
拓
誉

3P-2p157
1P-1p101
3P-1a036, 3P-1p028

な
内藤 翔乃
内藤 卓人
中 真以
中井 沙織
中井 昇太
中井 大志
中井 貴久
仲井 まどか
中井 裕
永井 暉
長井 誠
中尾 仁美
仲尾 祐輝
中尾 洋一
永尾 晃治
中岡 知規
長岡 亨
中川 拓弥
中川 智行

1P-2p138
2P-2p182
3P-2a137
3P-2a182
3P-1a103
3P-1a027
1P-1p122
3S-Bp05
1P-1p106
1P-1p066
3S-Bp05
1P-1p038
2P-1p028
3P-2a153
3S-Dp04
3P-1a018
1P-1p112
1P-1p068
1P-1p002, 1P-1p055,
1P-1p056, 2P-1p065,
2P-1p067, 2P-1p087
中川 裕之
3P-2p139中川 美樹
3P-1a015
中越 麻里菜3P-1p050
長坂 理紗子
3P-2p164
中崎 清彦
3P-1a106
中崎 瞳
3P-1a085
中澤 光
2P-1p033, 2P-1p036,
3P-1a050, 3P-1a062, 3P-2a178
中澤 昌美
3P-1p119
長澤 宏器
3P-1a027
中島 一紀
1P-1p108
中島 広裕
3P-1a088
中島 信孝
3P-1a024, 3P-1p094,
3P-1p095, 3P-2p169
中島 鈴佳
3P-1p101
中島 敏明
1P-1p052, 1P-1p053,
1P-1p054, 2P-1p050, 3P-1p101
中島 春紫
1P-1p037
中島 満晴
3P-1p121
中島 悠太
1P-1p021
長島 拓則
2P-2p176
中島田 豊
2P-1p056, 2P-1p057,
2P-1p100, 3P-1a093, 3P-1a103,
3P-1a114, 3P-1a130, 3P-1a131
永瀬 史憲
1P-2p152
仲田 裕貴
3P-1a022
中谷 茂
1P-2p172, 2P-2p149
仲谷 豪
1P-1p060
中谷 肇
2P-2p143
中杤 昌弘
1S-Bp01
中西 周次
3P-1a017, 3P-2a155
中西 豪
1P-1p091
中西 智美
2P-1p018

中西
長沼
中野
中野
中野
中野

里菜
孝文
祥平
太一
智貴
秀雄

1P-1p044
3P-2a179
2P-1p001
3P-2a133
3P-1a052
1S-Bp02, 2P-1p011,
2P-1p024, 2P-1p031, 2P-1p034
中野 宏軌
1P-1p037
中野 洋介
3P-1a096
中野 義勝
1P-2p176
中野 長久
3P-1p119中野 喜之
2P-2p146
長野 弘幸
3P-1p046
長野 由梨子
1P-2p174
長濱 一弘
3P-1p020
中原 克己
3S-Ap02
中堀 清
3S-Bp04
永峰 賢
3P-2a144
長棟 輝行
1P-2p135, 1P-2p150,
2P-1p023, 3P-1a041,
3P-1a044, 3P-1a045,
3P-1a047, 3P-1p064, 3P-1p065
中村 和敬
3P-1p092, 3S-Bp07
中村 浩蔵
2P-1p095
中村 貞夫
1P-1p100
中村 聡 2P-1p128, 2P-1p131, 3P-1p019
中村 崇裕
1P-2p157
中村 隆宏
3P-1a028
中村 史
2P-2p178
中村 敏英
1P-1p088, 1P-1p090
中村 真人
2S-Cp01, 2S-Cp04
中村 雅哉
2P-1p058, 2P-2p135,
2P-2p139中村 真由
3P-2p154
中村 真理子
1P-1p107
中村 祐哉
3P-1p095
中村 幸弘
3P-2p162
中村 里沙
3P-1a028
中村 龍貴
1P-1p035
仲本 準
3P-1a051
中屋 江梨花3P-1p102
長屋 英和
3P-1a050
中山 俊一
1P-1p051, 1P-1p074,
1P-1p077, 1P-1p078, 1P-1p079
中山 純一
2P-1p036
中山 二郎
3P-1a086, 3P-2a161,
3S-Dp02, 3S-Dp04
中山 久之
2P-1p012
仲山 真美
3P-1p103
中山 泰秀
1P-2p149
中山 泰宗
3P-1p020
名倉 由起子2S-Ea02
那須 博光
1P-2p182
生井 智仁
1P-1p040
生江 俊樹
3P-2a166
生越 克典
2P-1p043
生田目 哲志
3P-2p162
並木 禎尚
1P-1p106
成田 純也
1P-2p156

成瀬
鳴滝
鳴海
難波
南部

美樹
藍
良平
孝行
友香

1P-1p107
3P-2a177
3S-Ep03
1P-1p012
3P-1p027

に
新岡 宏彦
新倉 春香
新倉 舞
二井手 哲平

2P-2p173, 3P-1p091
3P-2a136
3S-Bp04
2P-1p033, 3P-1a062,
3P-2a178
新土居 奈緒美3P-1a048, 3P-1a049
新納 俊
1P-1p042
仁木 大輔
3P-1a046
西 真郎
1P-2p174西尾 翔子
1P-1p096
西尾 知樹
3P-1a052
西尾 尚道
3P-1a114
西岡 雅都
2P-2p142西川 康太
3P-1a046
西川 絢
3P-2a148
西川 弘樹
2P-1p059
西川 麻裕
2P-2p157
西川 洋平
1P-2p176, 1P-2p177
西口 みゆ
1P-1p060, 1P-1p062
西澤 尚樹
1P-1p124
西島 謙一
1P-2p165, 1P-2p166
西田 章弘
3P-1p113
西田 洋巳
3P-1p099
西出 真也
2P-2p153
西野 泰斗
1P-2p140
西野 智彦
2P-1p083
西八條 正克2P-2p146, 2P-2p147
西部 洋晴
1P-1p109
西村 重徳
1P-1p017
西村 拓
1P-1p046
西村 実
2P-1p112
西村 泰央
2P-1p073
西村 勇哉
1P-2p136, 3P-2p138
西本 遼
2P-1p073
西本 真琴
3P-1a101
西本 完
2P-1p002
西森 大貴
1P-1p078
西矢 芳昭
1P-2p180, 2P-1p001,
3P-1a034, 3P-1p038, 3P-1p061
西山 航生
2P-1p117
西山 しずか2P-2p148
西山 由美子2P-1p028
西脇 俊和
1P-1p089
新田見 匡
3P-1p108
仁宮 一章
1P-2p153, 1P-2p154,
2P-1p058, 2P-2p135,
2P-2p139, 3P-1a026,
3P-1a120, 3P-1a121, 3P-1a122
二宮 直登
3P-2p167ぬ額田夏生

3P-2a182

335

布上
沼口
沼本

翔太
真緒
穂

3P-2p149
3P-2p176
3P-1a029

ね
根冝
根岸
根岸
根来

香奈子
敦規
佑香里
誠司

根来 宏明
根来 雄哉
鼠尾 まい子根本 泰
根路銘 伸介2P-1p119
3P-1a112
3P-2p170
1P-1p057, 2P-1p014,
2P-1p015, 2P-1p063,
2P-1p108, 3P-2a132
1P-1p071
2P-1p086
1P-1p082
1P-2p149
3P-1p097

の
野川
能木
野北
野口
野口
野口
野口
野口
野口
野口
野口
野崎
野澤
野地
野島

優洋
裕一
昂志
明徳
恵一
隆明
巧実
秀樹
洋文
正宏
愛
智帆
太朔
博行
大佑

野島
野田
野田
野田
野田
野田
野中
野中

良太
修平
尚宏
勝紀
正文
悠輔
浩一
大輔

野濱
信木
野村
野村
野村
野村
野村
野本
野本
野本
則武

元輝
公介
泉
泰治
暢彦
将
嘉紀
健太
健斗
貴史
ちあき

3P-1a038
1P-2p174
1P-1p023
1P-1p076
1P-1p033
3P-2p167
2P-1p072
1P-1p075
1P-2p142
3P-1a004
2P-2p135, 3P-1p108
2P-2p144
3P-1a128
2P-2p150
3P-1p021, 3P-1p105,
3P-1p116
1P-1p035
2P-1p055
3P-1p043, 3P-2a159
3P-1a054
3P-1p025
3P-2a168
1P-2p155
1P-1p052, 1P-1p053,
1P-1p054, 3P-1p101
2P-1p107
1P-1p051
3P-1a020
2S-Ba03, 3P-1a072
1P-1p113, 3P-2p157
1P-1p087
1P-2p162
1P-1p104
2P-1p003
3P-2a164, 3P-2a170
3P-1a004

は
萩 達朗
萩原 英久
白 至桓

1P-1p087
3P-1p124
2P-1p084朴龍洙

1P-1p005, 1P-1p030,
1P-2p183, 2P-1p016,
3P-1a064, 3P-1p060
白米 優一
3P-2a152
端 瞭太
3P-2p144
橋爪 克己
2P-1p072
橋本 明里
3P-1a036
橋本 和仁
3P-2a155橋本 恭兵
1P-1p085
橋本 賢一
3P-1a008
橋本 絢子
3P-2a135
橋本 晋弥
3P-1p002
橋本 智代
1P-1p126, 2P-1p119
橋本 弓加
2P-1p069
橋本 渉
3P-1p072
蓮沼 誠久
2P-1p051, 2P-1p052,
3P-1p084, 3P-1p117,
3P-1p120, 3P-1p121
蓮實 凉子
2P-1p067
長谷 英理菜1P-2p171長谷 成記
2P-1p012
長谷川 智弘2P-2p137
長谷川 文香
3P-2p148
長谷川 喜衛3P-1a011
秦 信子
1P-2p144
畠 俊郎
3P-1p099
秦 洋二 1P-1p071, 3P-1a076, 3P-1a077
羽田 圭吾
2P-1p014
羽田 毅
1P-2p158
畠山 真由美1P-1p023
畑下 昌範
3P-1a065, 3P-1a069,
3P-2p159
秦田 勇二
1P-2p174
畑中 唯史
1P-1p011, 1P-1p123,
2P-1p099
秦野 琢之
1P-1p116
畑林 邦忠
2P-2p172
幡本 晃太
3P-2a170
蜂須賀 真一1P-1p007
服部 修平
3P-1a062
服部 峰充
2P-1p033, 2P-1p036,
3P-1a062, 3P-2a178
服部 菜月
2P-1p011
服部 正平
2P-1p038, 3P-1a073,
3P-1p088
服部 領太
2P-1p010
花井 泰三
1P-1p067, 1P-1p068,
2P-1p062, 3P-1a080,
3P-1a082, 3P-1a083, 3P-2p144
花方 寛
1P-1p032
花城 隆二
3P-2p175羽生 義郎
2P-1p037
馬場 知哉
3P-1a042
馬場 保徳
1P-1p106, 2P-1p116
濱 侑紀
3P-2a172
浜垣 秀平
2P-1p029
浜口 慎也
1P-1p033
浜島 弘史
1P-1p075, 1P-1p081,
3P-2a172, 3S-Dp04, 3S-Dp05

濱田
濵野
濱野
早川
早川

浩幸
雄大
吉十
あすか
享志

2P-1p062
2P-1p058
3P-2a135, 3P-2a136
1P-1p099
1P-1p055, 1P-1p056,
2P-1p065, 2P-1p067, 2P-1p087
早川 文代
1P-1p086
早坂 大亮
2P-1p104, 2P-1p105
林 和幸
3P-1a101
林 衆治
1P-2p142
林 祥平 2S-Ep03, 3P-2a137, 3P-2a138
林 司
2S-Ea06
林 寿人
1P-2p140
林 秀謙
1P-1p102
林 茉依
3P-1p044
林 将大
3P-1p087
林 優花
2P-1p003
林 勇樹
3P-1p063
林 優佑
2P-1p054
林 梨咲
3P-1p005
林原 加代子3P-1a080
原 正之
2P-2p157, 2P-2p163,
2P-2p164, 2P-2p165
原 良太郎
1P-1p020, 1P-1p021,
1P-1p022, 2P-1p005, 2P-1p006
原口 典久
3P-1p020
原島 俊
3P-1a027, 3P-1p002
原田 涼之介1P-2p163
春園 嘉英
1P-2p182
春野 玲弥
1P-1p093
盤若 明日香1P-1p046
坂野 聡美
2P-1p060
馬場 健史
3P-1a097, 3P-1p082

ひ
日尾 彰宏
曳野 隆之
樋口 裕次郎
久 景子
久田 一輝
緋田 安希子秀瀬 涼太
日比 慎
日比野 歩美百武 真奈美
平井 健吾
平井 秀平
平井 浩文
平井
平岡
平賀
平川
平沢
平沢
平田
平田
平塚

優美
修
和三
秀彦
敬
大樹
章悟
善彦
祐也

1P-1p106
3P-1a052
1P-1p015, 1P-1p016
1P-1p099
1P-1p111
2P-1p1003P-1p018, 3P-1p080
1P-1p048, 3P-1p070,
3P-1p071, 3P-2a181
1P-1p056
3P-1p027
2P-1p006
3P-1a106
3P-1a124, 3P-1a125,
3P-1p029
3P-1p121
1P-1p036
3P-2p168
3P-1a041
3P-1a010
3P-1p016
2P-1p074
2P-1p043
3P-2a167

336

平等
平野
平野
平野
平林
平間
平松
平丸
平本
平山
平山
平山

清夏
明成
伸一
澪
淳
知之
久卓
大介
哲也
誠
裕一郎
良朗

比留田 美咲
晝間 敬
廣江 綾香
廣岡
広川

青央
安孝

廣重
廣瀬
廣瀬
廣瀬
廣田
廣田

竜太
修一
遵
竜郎
泰志
隆一

3P-1a019
3P-2p162
1P-1p059, 1P-1p112
1P-1p027
2P-2p187
2P-1p102
1P-2p148
2P-2p172
3P-1p007
3P-1p072
3P-2a139
3P-1a055, 3P-1a057,
3P-1a059
3P-1p061
2S-Ap02
2P-1p129, 3P-1a013,
3P-1a085, 3P-1p027
2P-1p071
3P-1a080, 3P-1a082,
3P-1a083, 3P-2p144
2P-1p019
2P-2p142
3P-1a118
1P-1p118
3P-1p104
3P-1a015

ふ
深浦 恵梨
深川 泰紀
深野木 伸太
深谷
深谷
吹谷
福井
福井
福居
福井
福岡
福﨑

福島
福田
福田
福田

福田
福田
福田
福田
福田
福谷
福永
福成

2P-2p153
3P-2p161
3P-1p127, 3P-1p128,
3P-1p129愛衣
3P-2p146
健
3P-1p002
智3P-1a019
希一
3P-1a054
早紀
2P-1p123俊昭
2P-1p128, 2P-1p130,
2P-1p131, 3P-1p019
諒
3P-1a104
徳馬
2P-1p042
英一郎
1P-1p086, 1P-1p092,
1P-2p169, 1P-2p170, 3P-1p082,
3P-1a088, 3P-1a090, 3P-1a096
エリ オデット
2S-Ba01泰久
2P-1p007, 3P-1a025
あかね
1P-1p105
淳二
1P-2p151, 1P-2p152,
1S-Ap02, 2P-2p166,
2P-2p169, 3P-1p108
真嗣
3P-1a073
展雄
2P-1p089
央
2P-1p047
雅夫
2P-1p102康弘
1P-1p106洋介
1P-1p029, 2P-1p030,
3P-1a053, 3P-1p058
圭佑
3P-1p062
聖也
1P-1p042

福家 翼
藤 聡志
藤井 謙吾
藤井 健太
藤井 智
藤井 眞一郎
藤井 力
藤井 翼
藤井 玲央奈
藤江 誠
藤岡 経久
藤川 彩美

3P-1a078
3P-1a061
2P-1p007
3P-1p118
1P-2p1722P-2p159
1P-1p095
1P-1p057
1P-2p167
3P-1a007
3P-2p161
1P-1p081, 2P-1p077,
3P-2a172, 3S-Dp04
藤木 英寿
1P-1p014
藤澤 祐哉
3P-2a143
藤田 明子
2P-1p099
藤田 憲一
3P-2a133, 3P-2a134
藤田 聡史
1P-2p134, 2S-Cp02
藤田 純孝
2P-1p062
藤田 大介
2P-2p183藤田 直子
2P-1p072
藤田 夏美
1P-1p037
藤田 信之
3P-1p093
藤田 英明
3P-2p163藤田 雅徳
2P-2p164藤田 祥彦
2P-2p181, 3P-2a184
藤谷 将也
3P-2p165
藤波 友樹
1P-1p130
藤原 秀彦
3P-1a118
藤原 悠右3P-1p117
藤丸 裕貴
2P-1p075
藤村 夏紀
3P-1a046
藤本 拓哉
1P-1p009
藤本 佳則
2P-1p070
藤森 一浩
1P-1p114, 1P-1p115
藤屋 寛子
3P-1a111
藤山 秋佐夫
1P-1p075
藤山 和仁
2P-2p184, 2P-2p185,
2P-2p186
藤原 伸介
1P-1p050, 3P-1p018,
3P-1p080
藤原 裕之
3S-Ap04藤原 政司
2P-2p153藤原 由梨
1P-1p068
二神 泰基
2P-1p080, 3P-1a118
二石 涼平
3P-1p019
二又 裕之
2P-1p113, 2P-1p126,
3P-2a146
二見 淳一郎3P-1a048, 3P-1a049,
3P-1a052
二見 翠
3P-1a052
鮒 信学
2S-Ep04
船木 正大
2P-2p146, 2P-2p147
舟橋 久景
1P-2p173フリート ジョージ W.J.
2P-1p013
古市 圭介
1P-1p039
古江 - 楠田 美保
3P-2p164
古川 謙介
3P-1a118
古川 裕貴
3P-1p040

古澤
古澤
古田
古田
古舘
古屋

力
之裕
一夢
雅一
祥
俊樹

3P-1a010, 3P-1p078
3P-1p099
3P-2p136
3P-2p155, 3P-2p156
3P-1a085
1P-1p024

へ
白 京玉
逸見 光

1P-2p164
3P-2a151

ほ
賀 詩欣
坊垣 隆之
芳坂 貴弘
保坂 毅
保坂 浩章
星 英之
星川 優美子
星田 尚司

3P-1p117
2P-1p090
3P-1p062
2S-Ep01
2P-2p156
1P-1p103, 1P-1p104
3P-1p105
3P-1a032, 3P-1p026,
3P-2p161
星野 一宏
2P-2p133, 3P-1a065,
3P-1a069, 3P-1a070,
3P-2a143, 3P-2a148
星野 邦秀
1P-2p164
星野 孝幸
1P-1p025
星野 保
1P-1p026, 1P-1p115,
1P-1p126, 2P-1p119, 3P-2p169
細川 隆史
3P-1p021
細川 正人
1P-2p176, 1P-2p177
細田 晃文
3P-1p044
堀田 秋津
1S-Ep02
保里 明日香
3P-1a108堀 綾香
1P-2p148
堀 克敏 2P-1p019, 2P-2p143, 3P-1a017
堀 勝
2P-2p176
堀井 悠一郎1P-1p094
堀内 淳一
1P-1p125, 3P-1a055,
3P-1a057, 3P-1a059,
3P-1a117, 3P-2p144
堀内 貴之
1P-2p155堀江 正信
3P-2p163
堀木 雅文
1P-1p048
堀口 博文
3P-1p037
堀米 綾子
1S-Bp05
堀之内 貴明3P-1p078
堀之内 伸行
3P-2a181
本荘 知子
3P-1a048, 3P-1a049
本荘 雅宏
3P-2a146
本田 憲昭
2P-1p079
本田 孝祐
1P-1p001
本田 真也
2P-1p089
本田 倫子
3S-Dp02
本多 裕之
1A-Aa04, 1P-2p141,
1S-Bp03, 2P-2p168, 2P-2p174,
2P-2p176, 3P-1p096, 3P-2a156,
3P-2a157, 3P-2p164, 3P-2p165
本田 裕樹
3P-1p124本多 了
2P-2p135

337

本間
本間
本間

研一
さと
英夫

2P-2p153
2P-2p153
1P-2p152

ま
前川 裕美
前田 勇
前田 真一
前田 憲成
前田 浩
前田 真美
前田 瑞夫
前田 みのり
前原 康秀
曲 正樹
牧 慶子
牧 佑紀
牧野 祥嗣
政井 英司
正木
桝尾

和夫
俊介

増田
増田
増田
益田
町田
町田
町田
町田
松井
松井
松井
松浦
松浦
松浦
末永
松尾
松岡
松岡
松岡
松岡
松川

亜美
兼治
光平
静香
光史
幸大
雅之
悠
和彦
裕史
真
理史
俊一
友亮
智一
俊介
智里
友洋
史也
正佳
哲也

松川
松郷
松崎
松﨑
松崎
松崎
松沢
松鹿

真弓
誠一
典弥
千秋
浩明
祐二
智彦
昭則

松下
松下

功
一信

松下
松島

貴子
健一朗

3P-1a029
3P-1p125, 3S-Bp06
3P-1a079
2P-1p1102P-2p134
3P-1a036
2S-Bp01
3P-1a098, 3P-1a099
3P-2a158
2P-1p028
3P-1p052
3P-1a082
3P-1p024, 3P-2a171
2P-1p058, 2P-2p135,
2P-2p139, 3P-1a119
3P-2a179
1P-1p040, 3P-1p069,
3P-1p075
2P-1p060
1P-2p155
3P-1a026
3P-1p086
3P-2a153
3S-Ep01
3P-1p006
3P-1p022
1A-Aa02
2P-2p170
3P-1p006
3P-2a184
3P-1a042, 3P-1a043
2A-Ep01, 3P-2a180
2P-2p180
1P-1p092
3P-1p071
2P-1p121
3P-1p072
3P-1p020
1P-1p130, 3P-1a098,
3P-1a099, 3P-1p085
3P-1a110
2P-1p094, 3P-2a147
2S-Cp06
1P-1p099
1P-1p116
2P-2p187
1P-1p010
1P-1p026, 1P-1p115,
1P-1p126, 2P-1p119
1P-1p046
1P-1p042, 1P-1p043,
1P-1p044, 1P-1p058
3P-2a144
3P-1p083, 3P-1p088

松田
松田
松田
松田

貫暉
修平
俊文
史生

3P-2a135
3P-1a129
3P-1p083
1P-1p066, 2P-1p053,
2P-1p068, 3P-1a095
松田 靖
2P-1p079
松谷 成裕
3P-2a181
松谷 峰之介1P-1p042, 1P-1p043,
1P-1p044
松永 淳
3P-1a062
松永 恵美子
1P-1p015
松永 陽香
1P-1p081, 2P-1p077,
3P-2a172
松波 宏明
1P-1p029, 3P-1p058
松原 拓哉
1P-1p049
松原 達昭
1S-Bp01
松原 充
3P-2a177
松原 悠紀
3P-1a056
松藤 仁美
1P-1p016
松原 佳史
2P-2p175松村 歩梨
3P-2a152
松村 憲吾
1P-1p071
松村 茂祥
2P-2p182, 2P-2p183
松村 幸彦
3P-1a093, 3P-1a103,
3P-1a114, 3P-1a130, 3P-1a131
松村 吉信
2P-1p106
松本 明日香
3P-1a014
松本 健司
1P-1p099
松本 貴良
1P-1p102
松本 拓也
3P-2p145
松本 伯夫
1P-1p059, 1P-1p112
松本 帆南
1P-1p119松本 雅記
3P-1a097
松本 恵
2P-2p174
松本 雄太
2P-2p178
松本 凌
2P-2p176, 3P-2a156
松山 友香
3P-1a038
的場 晴香
3P-2a158
的場 康幸
3P-1p025, 3P-1p040,
3P-1p068
真野 潤一
2P-1p041
間宮 愛
1P-1p019
間宮 幹士
2S-Ba04
丸海老 純也
3P-1p057
丸尾 浩希
2P-1p130
丸尾 昭二
1P-2p152
丸山 千登勢3P-2a135, 3P-2a136
万 クン
1P-1p123, 2P-1p099
萬年 一斗
2S-Ba02

み
三浦

豊和

三浦
三木
三木
三崎
三澤
水谷

広己
健夫
紀彦
亮
龍志
治

3P-1a103, 3P-1a114,
3P-1a130, 3P-1a131
3P-1a063
2P-1p046
3P-2p159
2P-2p184, 2P-2p185
1P-2p150
3P-1p005

水谷
水野
水野
三田
道上
三井

哲也
康平
正明
麻友華
達男
亮司

3S-Bp05
3P-1a013
2P-2p176
2P-1p098
3P-2p167
1P-1p002, 1P-1p003,
1P-1p056
三ツ井 良輔2P-2p132光川 侑輝
3P-1p070, 3P-2a181
光武 進
3S-Dp04, 3S-Dp05
光野 秀文
3S-Ep02
光山 統泰
3P-1p088
水戸 光昭
1P-1p107
皆川 一
3P-1p069
水口 和信
2P-2p146, 2P-2p147
南 淳一
1S-Bp05
南アルプス市3P-2a179
南畑 孝介
1P-2p135, 1P-2p138,
2P-1p023, 3P-1a044
三縄 由希子
1P-1p129
嶺澤 美帆
3P-1p054, 3P-1p055
峰野 純一
1S-Ep05
三原 知子
3P-1a007
宮内 明
1P-1p032
宮内 啓介
1P-1p107, 2P-1p102
宮川 寛規
2P-2p140
宮川 博士
2P-1p081
宮川 幸
2P-1p077
三宅 克英
1P-1p106, 2P-1p116
三宅 淳
2P-2p173, 3P-1p091
三宅 英雄
1P-2p167, 3P-1a040
三宅 良磨
1P-1p022
宮越 俊一
3P-1a092, 3P-2p170
宮崎 剛亜
2P-1p016, 3P-1p060
宮崎 均
2P-1p097
宮﨑 愛 3P-1p127, 3P-1p128, 3P-1p129
宮下 龍之介3P-1p060
宮田 篤郎
2P-1p091
宮武 和孝
3P-1p119
宮地 雄大
1P-1p027
宮野 恵
3P-1a023
宮野 泰征
1P-1p113
宮本 弘毅
2P-1p063, 3P-2a132
宮本 重彦
2S-Ea05
宮本 龍樹
3P-1p043, 3P-2a159
宮本 浩邦
2P-1p038, 2P-1p124,
3P-1a073
宮本 義孝
1P-2p142三好 孝則
1P-1p041
三好 萌栄子3P-1a107
三輪 京子
2S-Ap03
三輪 秀和
2P-1p043

む
武藤
宗景
村上
村上
邑上

正記
ゆり
明男
淳
健

1P-2p185, 3P-2a163
3P-1p031
3P-1a080, 3P-2p144
2S-Bp04
3P-1p021

338

村口
村澤
村澤
村瀬
村田
村田
村田
村田
村田
村中
村松
村本
村山

元
裕介
友紀恵
祥光
幸作
俊輔
大
達郎
龍太郎
俊哉
昇
伸彦
晃一

村山

亮太

3P-1p081, 3S-Bp04
2P-2p152
2P-1p106
3P-1a040
3P-1p072
3P-1p010
2P-2p147
2P-1p079
1P-1p043
2S-Ba01
2P-1p046
3P-1a028
2P-2p136, 2P-2p137,
2P-2p138
3P-1a027

め目良恒2P-2p154

も
茂木 喜信
モタカトラ

2P-1p076

ベンカテスワーレディ

3P-1p102

望月 和樹
2P-2p167
望月 麻衣
3P-1p054, 3P-1p055
望月 玲於
3P-2p154
茂木 美樹
3P-2a141
本村 圭
3P-1a015
百田 理恵
3S-Dp02
森 昭博
2P-1p031
森 一博
3P-1p114
森 慶太
1P-1p122
森 舜也
2P-1p130
森 翔太郎
1P-2p153
モリ テツシ
1P-2p167, 3P-1a040
森 智夫 3P-1a124, 3P-1a125, 3P-1p029
森 英樹
2P-2p157, 2P-2p163,

2P-2p164, 2P-2p165
3P-1p095
2P-1p104, 2P-1p105
1P-1p034
2S-Ap03, 3P-1p107
1P-2p144
2P-1p034
2P-1p068
1P-2p136, 3P-2p138
1P-1p052, 1P-1p053,
1P-1p054
森田 友岳
2P-1p042, 3P-1a006
森田（松下） 真由美
2P-1p010
森田 穂
3P-1p101
守谷 智恵
2P-1p099
森本 兼司
2P-2p144
森本 康介
3P-2p158
守屋 繁
3P-1a026
森谷 千星
1P-1p074
森山 幸祐
1P-2p138
森脇 脩一郎1P-2p165
森脇 丈治
3P-1a006
森 宙史
森 美穂
森 裕太郎
森川 正章
森下 明彦
森下 しおみ
森田 啓介
森田 健太
森田 峻秀

諸星
門間

知広
聖子

3P-1p1001P-1p107

や
八色
矢追
矢木
八木
八木
藥師

奈央
克郎
修身
透
寿梓
寿治

1P-1p015
1P-1p010
2P-1p111
1P-2p142
3P-1p118
1P-1p042, 1P-1p043,
1P-1p044, 1P-1p058
矢澤 彌
2P-1p074
矢嶋 俊介
1P-1p077
矢嶋 祐也
1P-2p148
矢島 由佳
2P-1p109, 3P-1p102
保川 清
2S-Ea01, 3P-1p018
安田 伸
2P-1p079
安田 信幸
3P-1p045
安田 竜馬
2P-2p136
矢内 健太郎1P-2p185
柳井 清治
2P-1p116
柳川 大樹
3P-1p033
柳澤 幸子
3P-1p040
柳沢 真澄
2P-2p170
柳沢 美貴
2P-1p033
柳田 晃良
3S-Dp04
柳場 まな
3P-2a179
柳原 格
2S-Ea02
矢野 成和
1P-1p012
矢野 友寛
3P-1a131矢野 裕之
1P-1p002, 1P-1p003
薮内 里実
1P-2p164
矢部 誠
3P-1p089
山内 雪菜
2P-1p048
山岡 幸太郎3P-1a122
山縣 海
1P-1p020, 1P-1p022
山形 洋平
2P-2p134, 3S-Bp02
山口 有朋
3P-1a042, 3P-1a043
山口 哲志
1P-2p135, 1P-2p150,
2P-2p145, 2P-2p150
山口 修一
2P-2p158, 2S-Cp05
山口 翔平
2P-1p095
山口 千尋
1P-2p147
山口 良弘
3P-2a133, 3P-2a134
山口 理絵
3P-1a030, 3P-2p141
山崎 思乃
1P-1p101, 2P-1p098
山崎 将太朗2P-1p040
山﨑 新平
1P-1p116
山﨑 透
3P-1p034
山崎 敦史
3P-1a001, 3P-1a002
山地 秀樹
3P-2p166
山下 綾子
3P-2p154
山下 聖樹
3P-1a065
山下 純平
2P-1p018
山下 泰一
3P-1a083
山下 伸雄
1P-1p080, 2P-1p073
山下（鮫島） 結香
3P-1a006
山下 涼太
3P-2p139
山田 綾華
1P-1p110

山田
山田
山田
山田
山田
山田
山田
山田
山田
山田
山田
山名
山中
山根
山野

修
尚平
大輔
隆
翼
陽香
真澄
南実
みゆき
康伸
亮祐
良正
直紀
健司
範子

山畑
山平
山本
山本
山本
山本
山本

3P-1p005
3P-2a177
2P-2p159
3P-1a007
1P-1p073
3P-2a139
1P-2p143, 1P-2p148
1P-1p093
3P-1p055
2P-1p083
2P-2p132
1P-2p156, 1P-2p158
2P-2p148
2P-1p070
1P-2p159, 1P-2p160,
1P-2p161, 1P-2p162, 1P-2p163
直樹
1P-1p072
真也
1P-2p135, 1P-2p150
恵理
1P-1p039
佳奈子
1P-1p078
健
1S-Bp01
憲ニ
1P-1p099
幸次郎
3P-1p127, 3P-1p128,
3P-1p129脩幾
3P-1a074
周平
2P-1p042
修平
1P-2p141
省吾
1P-1p045
翔太
1P-1p077
泰誠
3P-1a011
卓
1P-2p157, 3P-1p005
竜也
1P-1p027
剛
3P-2a142奈緒
3P-1a024
哲史
1P-1p111
眞知
2P-1p001
有紀
1P-1p049
佳宏
1P-1p009, 1P-2p180,
2S-Aa02
陸
2P-2p160理奈
2P-1p098
遼太
3P-2a174昭1P-1p084

山本
山本
山本
山本
山元
山本
山本
山本
山本
山元
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山森

ゆ
湯浅

恵造

由井 嵐士
行平 大地
湯澤 勝浩
湯下 佳和
弓岡 仁美
湯本 達弥
由里本 博也

2P-1p018, 2P-1p029,
2P-1p092
2P-1p126
1P-1p091, 1P-1p100
3P-1p096
1P-1p119
2P-2p185, 2P-2p186
3P-1a021, 3P-2p151
3P-1a033

よ養王田正文
1P-1p029, 1P-1p033,
1P-1p035, 2P-1p030, 2P-1p111,
2P-1p112, 3P-1a053, 3P-1p058

339

世嘉良 宏斗横川 遥香
横川 裕紀
横田 亜紀子
横田 篤
横田 一道
横田 充弘
横山 葵
吉岡 育哲
吉岡 和政
吉岡 潤一
吉賀 豊司
吉川 勝徳
吉川 潤
吉川 翔太
吉川 博文
吉川 裕之
吉﨑 由美子
吉田 磨仁
吉田 啓
吉田 健一
𠮷田
吉田
吉田
吉田
吉田
吉田
吉田
吉田
吉田
吉田
吉田
吉田
吉冨
吉野
吉野
吉原
吉宗
吉村
吉村
吉村
吉本
良元
義盛
依田
依田
米倉
米田
米田
米光

健祐
佐和子
滋樹
重信
慎一
知左
真人
信行
誠
将也
優太
稜
耕太
永里子
知子
明秀
一晃
太郎
知紗
芳修
将悟
伸男
光代
伸生
ひろみ
円佳
有紗
任伸
裕

3P-2p174, 3P-2p175
2P-1p094, 3P-2a147
2P-2p180
3P-1p043, 3P-2a159
3P-1a019, 3P-1p046
3P-2a163
1S-Bp01
3P-2a142
3P-1a075
3P-1a081
1P-1p102
3P-2a1722P-1p060, 3P-1a010
3P-1p037
2P-1p038
1P-1p049, 3P-1p087
1P-2p167
2P-1p080, 2P-1p091
3P-2a144
3P-2p164
1P-1p018, 1P-1p041,
3P-1a014, 3P-1a023
3P-2p166
2P-1p016
2P-1p097
2S-Ap01
2P-2p147
3P-1p038
2S-Cp01
2P-1p121
3P-1p081, 3S-Bp04
1P-1p049
3P-1a031
1P-1p129
1P-2p159
3P-1a071
3P-1p021, 3P-1p116
2P-1p013, 2P-2p144
1P-2p1713P-1p083
1P-2p151
2S-Ea02
2P-1p019
2P-1p032
1P-1p074
2P-1p098
2P-1p022
1P-1p118
3P-1a072
2P-1p088
3P-1a101

ら
羅
雷
楽

宮臨風
中方
隆生

2P-1p056
3P-1a128
3P-2p175り李昊

1P-2p133

李
李
劉
林

宣和
彦
秋実
理希

3P-1a062
3P-1p114
1P-2p132
1P-1p018

わ
若井
若田
若林
若山

暁 3P-1a076, 3P-1a077, 3P-1p120
裕一
3P-1p021
里衣
1P-2p138
守
1P-1p012, 1P-1p014,

1P-1p072, 2P-1p078, 3P-1p047,
3P-1p051, 3P-1p052, 3P-1p053
脇谷 滋之
2P-2p154
脇屋 香
2P-1p104, 2P-1p105
和田 亜樹
1P-2p154
和田 洋樹
3P-1p083
和田 大
3P-1p046
和田 悠作
3P-1p004
渡部 昭
1P-1p006
渡辺 旭
2P-1p095
渡邉 彰
3P-2p168
渡邉 和史
2P-1p027
渡邉 一哉
1P-1p065
渡部 邦彦
1P-1p009
渡邊 桂子
3P-1a084
渡邉 研志
3P-1a093
渡辺 賢二
3P-2a139, 3P-2a142
渡辺 剛
1P-1p102
渡辺 聡
1P-1p094
渡辺 哲
2S-Ap04
渡部 潤
2P-1p076
渡邉 昭太郎3P-1p057
渡邉 泰祐
1P-1p082, 2P-1p045,
3P-2a140, 3P-2a141
渡辺 大輔
1P-1p069, 1P-1p070
渡邊 崇人
3P-1a118
渡邊 崇健
3P-1p015
渡邉 貴嘉
3P-1p062
渡辺 輝彦
3P-1p056
渡辺 敏郎
2S-Aa03
渡邉 肇
2P-1p020, 3P-2a180
渡邊 仁
1P-1p033
渡辺 宏紀
1P-1p113
渡辺 昌規
2P-1p117渡邊 美紀
1P-1p027
渡邊 源規
3P-1p124
渡部 玲子
1P-1p039
和地 正明
3P-1a012
汪 雪
1P-2p158

340

キーワード索引A
a functional amino acid accumulation
1P-1p070
2A-peptide
3P-2a180
abiotic stress
3P-2p152
1P-1p066
absolute quantiﬁcation
accumulation
1P-1p102
accumulative gene integration
1P-2p156, 1P-2p158, 1S-Ep03
acetaldehyde
2P-1p065, 2P-1p066
acetate 1P-1p047, 3P-2p145, 3P-2p160
acetate kinase
2P-1p002
acetate overoxidation
1P-1p049
acetic acid
1P-1p128, 2P-1p120
acetic acid bacteria
3P-1p080
acetic acid fermentation
1P-1p049
Acetobacter1P-1p049
Acetobacter pasteurianus
1P-1p042,
1P-1p044, 1P-1p050
Acetoin
1S-Cp03acetonitrile
1P-1p034
1P-1p049
acetyi-CoA synthetase
acetylcholinesterase
1P-1p009
acid and bile tolerance
2P-1p086
acid carboxypeptidase
1P-1p080
acid degradation
3P-1a106acid hydrolysis
1P-1p117, 2P-2p136
acid sensing ion channels
1P-1p098
acid tolerance
1P-1p014, 2P-1p119,
3P-1a012
Acidithiobacillus ferrooxidans 2P-1p012
Acidithiobacillus thiooxidans 3P-1a071
acidophilic bacteria
2P-2p136
Acidovorax sp.
2P-1p103
Acinetobacter2P-2p143, 3P-1a004
Acinetobacter calcoaceticus P23
2S-Ap03
Acinetobacter towneri
3P-1a104ACP
2S-Ep03acryl acid
2P-1p090
acrylamide
2P-1p090
Actin ﬁlament
3P-2p163
1P-1p011, 1P-1p102,
actinomycetes
2S-Ep01, 2S-Ep02,
3P-1a098, 3P-1a099
activated sludge bulking
3P-1p108
activation
1A-Aa01
active site residues
3P-1p055
activity assay
3P-1a013
acyl carrier protein
3P-2a138acyl-ACP reductase
3P-1p063
acyl-CoA synthetase
2P-1p006
acyltransferase
3P-1a031
ADAM
2P-2p134adhesin2P-1p019
adhesion
2P-1p019
adipocytes
2P-2p167
Adipose-derived stem cell
1P-2p142
Adipose-like Microtissues
1P-2p142
ADP-ribose
1P-1p007
aerial microalgae 3P-1p112, 3P-1p113,
3P-2a160
aerobic culture
3P-2p175
Aeromonas caviae
3P-1a085
afﬁnity chromatography
1P-2p172,2P-2p146, 2P-2p147
afﬁnity peptide
3P-1p067
afﬁnity resin
2P-2p148
afﬁnity selection
3P-1p024
Ag modiﬁed TiO2
3P-1p110
Ag-AuNPs
1P-2p183
agar
2P-2p136
agar plate2P-2p137
agarase3P-1p056
aggregation
1P-2p145, 3P-2a133
agitation
2P-2p154
agmatine
1P-1p050
agricultural waste
3P-2p134
3P-2p143
3,4-AHBA
air pollution
1P-1p109
airlift bioreactor
1P-1p125
albocycline
3P-1a098
alcohol oxidase
2P-1p067
1P-1p069
alcoholic fermentation
aldehyde dehydrogenase
1P-1p042
aldoxime dehydratase
1S-Dp04
alfa-EG
2P-1p069
alginate 3P-1a040, 3P-1a114, 3P-1p072
alginate lyase
3P-1a040
Alginate unsaturated oligosaccharides
1P-2p167
alkalinity
1P-1p131
alkaliphilic
3P-2p174alkane biosynthesis
3P-1p063
Allergen-free culture media 2P-1p093
allergy2P-1p083
alliin3P-1p071
allosteric
1P-1p006
alpha synuclein
3P-1p026
alpha-1,3-glucan
3P-1p013
3P-1p015
alpha-1,3-glucan synthasealpha-1,3-glucanase
1P-1p012
Alzheimer’s desease2P-1p021
amazake
1P-1p089
amidase2P-1p009
amide bond
2P-1p006
amine coupling
3P-1a062
1P-1p039, 1P-1p084,
amino acid
1P-2p168, 2P-1p009,

2P-1p071, 3S-Ep03
amino acid index
1S-Bp03aminoacyl proline
2P-1p005
3P-2a135
aminoacyl-tRNA
1P-1p057
6-aminohexanoate
aminolysis
2P-1p010
aminopeptidase
2P-1p008, 3P-1a003
Ammonia inhibition
3P-1p074,
3P-1p076
Ammonium
3P-2a140
AMT
3P-1p012
amylase2P-1p027
amylase gene
3P-1p009
amyloid3P-2p137
1P-1p028, 2P-1p021,
amyloid beta
3P-1p026, 3P-2p139
amylolytic lactic acid bacteria 3P-1a074
anaerobic ammonium oxidation
3P-1a102
anaerobic bioremediation
2P-1p111
anaerobic condition
3P-1p121
Anaerobic fermentation
1P-1p104
AND-gate
2P-2p182
3P-2a166
angiogenic activity
angiogenic peptide
3P-2a164
Angiotensin I Converting Enzyme
inhibitor
1P-1p093
Antarctic basidiomycetous yeast
3P-1a091
anthocyanin
2P-1p079
anti-cancer drug
3P-1p096
anti-inﬂammatory drug
2P-1p027
anti-inﬂammatory effect
2P-1p091
anti-inﬂammatory peptide
3P-2a164,
3P-2a165
anti-TNT antibody
1P-2p185
anti-virus
1P-2p166
antibacterial
3P-2a151
2P-1p054, 2S-Ep01,
antibiotics
3P-1a024, 3P-1p093,
3P-1p094, 3P-2a136, 3P-2a149
antibody
1P-2p133, 1P-2p144,
1P-2p156, 1S-Ap03,
2P-1p028, 2P-1p031,
2P-1p032, 2P-1p033, 2P-1p035,
2P-2p146, 2P-2p148, 2P-2p178,
2P-2p187, 2S-Bp03, 2S-Ca02,
3P-1a054, 3P-1a055, 3P-1a056,
3P-1a057, 3P-1a060, 3P-1a061,
3P-1p062, 3P-1p091, 3P-2a182
antibody aggregation
1P-2p163
antibody fragments 2P-2p147, 2P-2p149
antibody immobilization
3P-1a059
Antibody production
2P-1p030
antibody productivity
1P-2p159

341

antibody-drug conjugate
3P-1a062
anticancer drug
2P-1p110
antifungal agent
3P-1p097
antifungal antibiotics
3P-2a150
antifungal effect
3P-1p127antihypertension
2P-1p095
antimicrobial peptide
3P-2a164,
3P-2a165, 3P-2a167, 3P-2a168
antioxidant
2P-1p096, 3P-1a068,
3P-2a147, 3P-2p142
antioxidation
2P-1p079
antitumor
3P-2p138
antivirus
3P-1p068
AOD isozymes
2P-1p067
aptamaer
2P-2p169
aptamer2P-2p181
Arabidopsis thaliana
3P-1a018,
3P-1p033
arachidonic acid3P-1a072
archaea 1P-1p013, 3P-1a078, 3P-1p039
Archaerhodopsin
3P-1p126
aromatic amine
1P-1p040, 3P-1p069
aromatic amino acid3P-1a035,
3P-1p035
aromatic ring compound
2P-1p055,
2S-Ep04
arsenic
2P-1p102
arsenic hyperaccumulator plant Pteris
1P-1p107
vittata
Arthrobacter1P-1p057
artiﬁcial human cell
3S-Ep01
Artiﬁcial Intelligence
3S-Bp07
artiﬁcial protein
2P-1p026
Asia
3S-Dp02
aspartic acid
2P-1p056, 3P-1p042
Aspergillus
3P-1p010, 3P-1p013
Aspergillus aculeatus
1P-1p004,
3P-1p011, 3P-1p012
Aspergillus flavus
3P-1a005
Aspergillus glaucus
1P-1p018
Aspergillus kawachii
1P-1p081,
2P-1p072
Aspergillus luchuensis
1P-1p082,
3S-Ap03
Aspergillus nidulans 1P-1p027, 1S-Bp02,
3P-1p054, 3P-2a139
Aspergillus niger 3P-1a075, 3P-1p057,
3P-2a142
Aspergillus oryzae 1P-1p006, 1P-1p010,
1P-1p037, 1P-1p080,
2P-1p010, 2P-1p040,
2P-1p090, 2P-2p134, 3P-1a005,
3P-1a076, 3P-1a077, 3P-1p003,
3P-1p004, 3P-1p005, 3P-1p007,
3P-1p008, 3P-1p009, 3P-1p014,
3P-1p015, 3P-1p075, 3P-1p088,
3P-2p146, 3S-Dp03, 3S-Dp04
Aspergillus section Flavi
3P-1p088
Aspergillus sojae 2A-Ap01, 3P-1p083,

3P-1p088
Aspergillus sp.
1P-1p015
Aspergillus terreus
3P-1a069
aspertic protease
1P-1p018
Assay
1P-2p180
asymmetric hydrolysis
3P-1p046
asymmetric synthesis
1S-Dp04
ATF1
1P-1p073
atopic dermatitis
3P-1p087
ATP regeneration
2P-1p002
Aurantiochytrium
3P-1a093
Aureobasidium pullulans
3P-1a064
authentication
2P-1p082
autothermal thermophilic aerobic
treatment
3P-1a105
Autothermal thermophilic aerobic
treatment system
3P-1a104
autotransporter
2P-1p019
Awamori 1P-1p082, 2S-Aa04, 3S-Ap03
awamori yeast
1P-1p074

B
B cell
2P-1p034
Bacillus cereus
3P-1a015
Bacillus coagulans
3P-1a123
Bacillus megaterium
3P-2a152
Bacillus sp.
1P-1p016, 2P-1p084,
3P-1a013, 3P-1a073, 3P-2a133
Bacillus subtilis
2P-1p107, 2S-Ea04,
3P-1a014, 3P-1a023, 3P-1p125
Bacillus thuringiensis
2S-Ap01
bacteria 2P-1p114, 2P-1p115, 3P-1a101,
3P-1a103, 3P-2a163, 3P-2p157
bacterial community structure 3P-1a105
bacterial consortium
1S-Cp06
bacterial counting
3P-1p099
bacterial growth enhancement 3P-1a100
bacterial luciferase
3P-1p063
bactericidal effect 3P-1p128, 3P-1p129
bacteriocin
3P-2a161
bacteriome
3S-Bp06
Bacteriorhodopsin
3P-1p126
baculovirus
3P-1a050, 3S-Bp05
bagasse1P-1p117
Bakanae disease
2S-Ap04
bamboo cultured cells
2S-Ba03basidiomycetes
3P-1p017, 3S-Bp04
BDF waste
3P-2p177bee
3P-2a172
beer
1P-1p100, 2P-1p070, 3S-Ap05
beige adipocytes
3P-1a084
beta-1,3-glucan
3P-1a064
beta-1,4-mannanase3P-1p055
beta-galactofuranose
1P-1p015
beta-galactofuranosidase
1P-1p015
beta-glucosidase
3P-1a025
BG2-c6 cell
3P-2p139
biﬁdobacterium
1S-Bp05, 3P-1a020,
3P-1p023, 3P-2p148

Bifidobacterium longum
3P-1a019
bile acid
3P-2p132
binding
1P-1p031
binding analysis
3P-2a157
binding competition
3P-1a021
Bio-3D printer
1P-2p153, 1P-2p154
bio-artiﬁcial organ
2S-Cp01
bio-ethanol
1P-1p117
bio-hydrogen production
3P-1p073
bio-nanocapsule
1P-2p132, 1P-2p179
bio-oil
3P-1a122
bioactive compound
3P-1p112
bioactive peptide 3P-2a169, 3P-2a170
bioactive substances
2P-1p088
bioassay
2P-1p098
biocatalysis
3P-1a115
biochemicals
2S-Dp01
biocontrol agent
3P-1a099, 3P-1a100
bioconversion
1S-Dp01, 3P-1a039,
3P-1a123, 3P-1a128, 3P-2p172
biodegradable plastic
3P-1a006,
3P-1a036, 3P-1p028
biodegradable polymer
3P-1p104
biodegradation
2P-1p014, 2P-1p106,
2P-1p108, 2P-1p109,
2P-1p110, 3P-1p101
biodiesel fuel1P-1p052, 3P-1a103,
3P-1p116
biodiesel waste
1P-1p053
biodistribution
1P-2p136
biodiversity
1S-Cp06, 3S-Cp04
bioelectronics
2S-Ca07, 2S-Da02
bioethanol
1P-1p126, 3P-1a028
bioethics
2S-Ba05
biofabrication
2S-Cp01
bioﬁlm1P-1p113, 3P-1a102,
3P-1p021, 3P-1p100, 3P-2p150
bioﬁltration
3S-Bp06
bioﬂoccurant
2P-1p063
biofuel1P-1p118, 3P-1a002,
3P-1a079, 3P-1p119
Biofuel production 3P-1p021, 3P-1p105
Biohydrogen
3P-1p115
bioimaging
2S-Da01
bioinformatics
1S-Bp02, 2P-2p174,
3P-1p094
biological arsenic removal fromcontaminated water
1P-1p107
biological control agent
3P-1a098
biological ﬁltration
3P-1a107
Biological medicine
3P-1p022
biological sacchariﬁcation
2S-Dp03
bioluminescence
2P-1p039
biomarker
3P-1a004
biomass
1P-1p047, 1P-1p123,
1P-1p129, 1S-Cp01,
2P-1p059, 2P-1p116, 2P-1p131,
2S-Dp01, 3P-1a081, 3P-1a128,
3P-1p106, 3P-1p107, 3S-Ap01342

biomass conversion
3P-1a115
biomaterial
1P-2p138, 2S-Cp01
biomaterials
2S-Cp05
biomimetic membrane
3P-2a175
biomineral
1P-1p108
Biomineralization 2P-1p103, 2P-1p126,
3P-1a015, 3P-1p123
biopesticide
2S-Ap01
Biopharmaceutics
3P-1p084
Bioplastics
3P-1p102
biopolymer
1P-1p040, 3P-1p069
bioprinting
2S-Cp01
bioprocess
2P-2p172, 2S-Dp01
bioprocessing device
2S-Da02bioreactor
2S-Ba04, 3P-2p172
bioreﬁnery
2S-Dp01, 2S-Dp04,
3P-1a116, 3P-1a117, 3P-1a126
bioreﬁnery enzymes
2S-Dp02bioremediation
1P-1p035, 1P-1p103,
1P-1p111, 2P-1p111, 2P-1p112
bioresources
2S-Dp04
biosensing
3P-1p067
biosensor
1P-2p175, 2P-1p035,
2P-1p102, 2S-Bp03, 2S-Da01,
2S-Da03, 2S-Da07, 3P-2a158
Biosilica
2S-Ca04
biosroption
2P-1p118
biosurfactant
1P-1p037, 2P-1p043
biosynthesis
2S-Ba01, 2S-Ba03,
2S-Ep04, 2S-Ep05,
3P-1p040, 3P-2a136,
3P-2a139, 3P-2a149, 3P-2a161
Biotransformation
3P-2p173
biphenyl/PCB
3P-1a118
Bispeiﬁc antibody
3P-2a178
bisphenol A
2P-1p106bisphenol S
2P-1p108
Black pepper
1P-1p092
BmNPV
1P-1p030
Bombyx mori
3P-1p060
Boolean logic gate
3P-1a021
boric acid
2P-1p100
Botulinum Haemagglutinin
2P-2p175brackish lake
2P-1p113
Bradyrhizobium diazoefficiens
1P-1p048, 1P-1p056
BRET
1P-2p173
Brevibacillus choshinensis
1P-1p032
bromate3P-1a111
brown algae
3P-1a1302P-1p080
brown sugar shochu
BTN2
2P-1p048
Burkholderia sp.
1P-1p009
butanol 1A-Aa03, 1P-1p051, 3P-1a088,
3P-1a089, 3P-1a090, 3P-1p079
butanol fermentation
3P-1p077
butyrate
1P-1p058
byprodct3P-2p168

C
c-kit
13C-metabolic ﬂux analysis
C. hassaku
Caco-2 cells
Caenorhabditis elegans

3P-1p064
3P-1a095
3P-1p085
3P-2p147
1P-1p103,
2P-1p088
calcium
3P-1p120, 3P-2p154
Calcium binding site
3P-1p042
calcium carbonate
3P-1a101
Calnexin
1P-1p038cAMP
1P-1p065
Cancer2P-2p170cancer cell
2P-2p155
Cancer cells
2P-1p035
Cancer Therapy
3P-2a178
Candida antarctica lipase A 2P-1p011
capillary electrophoresis
2S-Bp02
capsaicin
1P-2p164
capturing
3P-1a022
carbon catabolite repression 3P-1p008,
3P-1p077, 3P-2p176
carbon dioxide
3P-2a176
carbon starvation
2P-2p134
carbon steel
1P-1p112
carbonyl reductase
1P-1p001
cardiomyocyte differentiation 1P-2p147
cardiomyocytes
1P-2p146
carnosine
3P-1p053
Carotenoids biosynthesis
3P-1p122
casein3P-2a160
catabolite repression
1P-1p061
catalysis
3P-1p035
Cathepsin
2S-Ca04
cationic peptide
3P-2a165, 3P-2a167,
3P-2a169
cbhI
3P-1p012
CCAAT
3P-1p010
CD90
2P-2p154
cDNA
2S-Ea01
cDNA display
2S-Ca05
CdS nanoparticles
3P-1p045
CE-MS
3P-1a092
cell behaviors
1P-2p145
Cell death
3P-1p065
cell fate control
2A-Cp01
cell free translation
3S-Ep01
cell fusion
1P-1p072
Cell image analysis
2P-2p170cell immobilization 1P-2p138, 1P-2p150
cell line development
1P-2p161
cell line establishment
1P-2p155
cell membrane
1P-2p150, 2P-1p017
cell microenvironments
2S-Cp06
cell migration
2S-Cp02
cell migratory dispersion
2P-2p151
cell morphology
3P-1p096
cell penetrating peptide
3P-2a156

Cell quality
2P-2p162
cell separation
2P-2p178
cell sheet
1P-2p152
cell surface
3P-1a110cell surface display 2P-1p032, 2P-1p052
cell surface engineering
2P-1p059
cell wall
3P-1p097
cell wall components
1P-1p101
cell-based assay
1P-2p141, 3P-1p096
cell-cell interactions
3P-2a146
cell-cell adhesion 2P-2p151, 2P-2p160
cell-free protein synthesis
3S-Ep05
Cell-free protein synthesis system
3P-1p042
cellobiohydrolase
1P-1p026
cellulase
1P-1p051, 1P-1p097,
1P-1p116, 3P-1a026,
3P-1a077, 3P-1p016
cellulase induction
3P-1p011
cellulose
3P-1a077
cellulose nanowhisker
1P-1p120
cellulosic biomass 1P-1p118, 2S-Dp03
Cellulosimicrobium 1P-1p120, 3P-1a046
cellulosome
2S-Dp03, 3P-1p044
Cellvibrio sp. WU-0601
3P-1p056
central metabolism
2P-1p053
cesium1P-1p102, 1P-1p105
cesium recovery
1P-1p106
Chamberlinius hualienensis
1S-Dp02chaperonin
3P-1p027
characterization
3P-1p048, 3P-1p101
charged lipid
3P-2a174, 3P-2a175,
3P-2p136
charged-peptide
3P-1a044
chelate reaction
3P-2a147
chemical inhibitor
3P-2p153
chemical modiﬁcation
3P-1p062
chemical sensor
2S-Bp01
chemotaxis
2P-1p100, 3P-1a016
chicken
1P-2p166
chimeric antigen receptor
1S-Ep05
chimeric protein
3P-1a045
chimeric receptor 2A-Cp01, 3P-1p064,
3P-1p065
Chinese hamster
1P-2p161
Chinese hamster ovary
1P-2p155,
2P-1p030, 2P-2p184
Chinese Hamster Ovary (CHO) cells
1P-2p162, 1P-2p163
Chinese hamster ovary cells 1P-2p144,
1P-2p160
chiral compound
3P-1p046
chiral cyclic monoamide
3P-1p070
Chiromantes haematocheir
2P-1p116
chitin1P-1p013, 3P-1a038
chitin binding protein
3P-1a046
chitinase 1P-1p013, 1P-1p014, 3P-1a038,
3P-1a046
chitosan3P-1a110

343

chitosan-like biopolymer

2P-1p063,
3P-2a132
Chlorella vulgaris
3P-1p115
CHO
1P-2p156
CHO cell
1S-Ap03, 3P-1p084
CHO cell culture
3P-2p162
CHO cells
1P-2p157, 1P-2p159,
1S-Ep03cholesterol (Chol)
3P-1p090
choline ester
2P-1p095
chorismate pyruvate lyase
1P-1p041
chromium2P-2p156
Chromosomal aneuploidy
1P-2p160
Chromosome engineering
3P-1a027
chromosome stability
1P-2p159
cinnamaldehyde
3P-2p170
circadian oscillation
2P-2p153
circular peptide
3P-2a161
citric acid3P-1a075
citrinin
3P-2a141
Citrobacter1P-1p052, 1P-1p053,
3P-2a132
Citrobacter braakii
1P-1p054
Citrobacter freundii
2P-1p063
cleavable linker
3P-2a156
clock gene
2P-2p153
Clonal culture
2P-2p162
closest packed
1P-2p179
Clostridium
1P-1p051
Clostridium beijerinckii
3P-1a126
Clostridium cellulovorans
3P-1a126
Clostridium paraputrificum
1P-1p129
Clostridium perfringens
3P-1a086
Clostridium thermocellum
1P-1p128,
2S-Dp03co-compost
1S-Cp04
co-crystallization
2P-1p023
co-expression
3P-2p152
co-fermentation
3P-1a067
co-immobilization system
3P-2p134
co-immobilized-bioreactor VMFB
3P-2p134
CO2 ﬁxation
1P-1p128
CO2ﬁxation
2P-1p130
coculture
3P-1p125codon usage
3P-1p003
coenzyme regeneration
3P-1a043
coenzyme speciﬁcity
1P-1p126
cofactor regeneration
1P-1p023,
3P-1a041
cohesin
1P-1p023
cold stress response
3P-1a091
cold-adapted microorganism 3P-1a091
collagen
2P-2p163
colony assay
2P-1p037
combinatorial protein library 2S-Ca01
comparative gemomics
3P-1p083
comparative genome
3P-1p088
compatible solute
2P-1p045

complementarity determining region
1P-2p185
complex microbiological system
3P-1a105
compost2P-1p038, 2P-1p124
composting
3P-1a106
compound semiconductor
3P-1p123
Comprehensive phenotype analysis
3P-1p016
computational design2P-1p026
confocal microscopy
2P-2p171
conjugation
3P-1a023
contamination
2P-1p084
continuous culture 3P-1p082, 3P-2p144
Convolutional Neural Network 2P-2p173
cooperation with industry
2S-Aa01
Coprinopsis cinerea
3P-1p081
coral associated bacteria
1P-2p176
Cordycepin
1P-1p005
Cordyceps militaris
1P-1p005
Cordyceps sphecocephala
3P-2a143,
3P-2a148
corn cob
3P-1a117
corrosion
1P-1p112
Corynebacterium glutamicum 1P-1p041,
1P-1p043, 1P-1p045, 3P-1a009,
3P-1a010, 3P-2p141, 3P-2p168
cost reduction
1S-Ap01
Crabtree effect
3P-1p082
Cre-loxP
1S-Ep03
CRE-luciferase assay
3P-2a183
Cre/LoxP system
1P-2p158
Creatinine assay
2P-1p001
CRIS-PITCh
1P-2p157
CRISPR
1S-Ep02
CRISPR Cas9 system
3P-1a030
CRISPR-Cas9
1S-Ep01
CRISPR-PCS
3P-1a027
CRISPR/Cas
2P-2p132
CRISPR/Cas9
1P-2p159, 3P-1a027,
3P-1a029, 3P-1p004, 3P-2a180
critical metals
3P-2a152
crossbreeding
2P-1p089, 3P-1p029
cryopreservation
2P-2p158, 2S-Cp03
cryoprotectant-free2P-2p158
cryptic natural products
3P-2a142
crystal structure analysis
1P-1p017
crystallization
1P-1p036, 3P-1a044
crystallographic study
1S-Dp01,
3P-1p040
137Cs
1P-1p104
Cu2+
3P-1a010
cultivation
3P-2p133
cultured mammalian cells
3P-1a095
Curing agent
3P-1a121
cutinase
3P-1a006, 3P-2p146
cyanide2P-1p112
cyanobacteria
3P-1a079, 3P-1a080,
3P-1a082, 3P-1p020, 3P-1p036,

3P-1p079, 3P-1p120,
3P-1p121, 3P-2p144
cyclopenase
3P-2a139
cylindrical digestor
1P-1p131
cylindroid
2P-2p166
cysteine
1P-1p061, 1P-1p062
cysteine biosynthesis
1P-1p060
cysteine desulfhydrase
3P-1p071
cytochrome P450 1P-1p023, 1P-1p029,
1S-Dp04, 3P-1a041
cytoskeleton
1P-2p164
cytotoxicity
2P-1p110D
3D culture

1P-2p140, 1P-2p142,
2P-2p180
3D structure
2P-2p180
D-alanine
1P-1p084
D-amino acid
1P-1p048, 1P-2p169,
3P-1a096
D-amino acid oxidase
2P-1p004
D-amino acids
1P-2p170
D-amino peptidase
2P-1p010
D-cycloserine
3P-1p025
D-lactate dehydrogenase
1P-1p006
D-lactic acid
1P-1p006, 3P-1a117
D-pipecolic acid
1P-1p048
D-tagatose 3-epimerase
2P-1p013
D-xylose
1P-1p127, 3P-1a001
dairy products
2P-1p086
Daphnia magna
2P-1p020, 3P-2a180
data mining
1P-2p178
data mining technique
2S-Ba02
DDS
2P-1p022
de novo protein
2S-Ca03, 3P-1p059
de novo protein design2P-1p025
decarboxylase
1P-1p024
decellularization
1P-2p139
decolorisation
3P-1p037
Decontamination
1P-1p104
Deep Learning
2P-2p173, 3P-1p091
Deep-sea sediment
1P-2p174
defensin
3P-1p033
degradation
1P-1p120, 3P-1a011,
3P-1p103, 3P-1p118
DEH
3P-1a040
Dehalococcoides
2P-1p111
denitriﬁcation
2P-1p124, 2P-1p125
deoxy-ketohexose
2P-1p013
4-Deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronicacid
1P-2p167
deoxyribonucleses
2S-Ea04
designed biomass 1A-Aa03, 3P-1p077
Desulfovibrio
2P-1p126
detection
1P-2p183
deubiquitinase
3P-1p008
DHM
2P-2p155
diabetes
2P-2p152
diagnostic technology
2S-Bp04344

diaphorase
3P-1a111
diet
3S-Dp02differental viability
3P-2p155
differentiation
2P-2p157, 2P-2p165,
2P-2p173
differentiaton propensity
1P-2p145
difﬁcult-to-express protein
2P-1p024
digital PCR
2S-Ea02
dimorphism
3P-1a070
dinotefuran
2P-1p104
diol compound
3P-2p170
1,4-dioxane
1P-1p110, 1P-1p111
dioxygenase
1P-1p022, 3P-1p071
dipeptide
3P-1p051, 3P-1p052
Dipeptidyl peptidase
1P-1p008
Diploid sake yeast
1P-1p071
directed evolution 1P-1p001, 1P-1p025,
2S-Ca01, 3P-1p063, 3P-2p151
discrimination analysis
3S-Bp02
disinfection
3P-1p111
disruption of cell aggregate
2P-2p160
distillation method
2P-1p080
distribution
1P-1p083
disulﬁde bond
1S-Dp03
DNA
3P-1p091
DNA aptamer
2S-Da07
DNA binding
2S-Ea03
DNA chip
2S-Ea05
DNA hybridization
3P-1a059
DNA methylation
1S-Bp01
DNA nanomaterial
2S-Bp01
DNA polymerase
2S-Da07, 2S-Ea01,
2S-Ea05, 3P-1a042
DNA separation
1P-2p186
DNA switch
2S-Da07
DNA-binding protein
2S-Ea03
DNP-NMR
2S-Ep02
DNRA
2P-1p124
docosahexaenoic acid
2S-Ep03
dough fermaton
1P-1p088
Down-ﬂow Hanging Sponge reactor
2P-1p113
doxycycline
3P-2p169
draft genome sequencing
3P-2p160
drag-tag
2S-Bp02
Drainage from soil dumping site
1P-1p107
droplet digital PCR
1P-2p176
Drosophila melanogaster3P-1a094
drug carrier
1P-2p134
drug delivery system
1P-2p133,
1P-2p134, 3P-2a171, 3P-2p138
drug testing
2P-2p179
dry anaerobic digestion
1P-1p131
duckweed
3P-1p106, 3P-1p107,
3P-1p114dye
3P-2p174
dysprocium
2P-1p118

E
Earthworm
3P-1p022
EB formation
1P-2p146
ecdysteroid
3P-1a094
ecology
3P-1a002
EGFP
2P-1p052
eicosapentaenoic acid
2S-Ep03,
3P-2a137, 3P-2a144
Eikenella corrodens
3P-1a003
Eisenia bicyclis
2P-1p092
Eisenia fetida
3P-1p022
elastin-like polypeptide
2S-Bp02
Electrical retrieval
1P-2p174
electrical stimulation
2P-2p168
electrochemical activities
2P-1p039
electrochemical cell detachment
1P-2p152, 2P-2p169
electrochemical cultivation
3P-2a155
electrochemical measurement 3P-1a017
electroporation
3P-1a037
electrostatic interaction
2P-1p023,
3P-1a044
ELISA
2S-Da03emulsiﬁcation
3P-1p097
enantiomer
1P-2p168
enantioselectivity
3P-1a096
enantioseparation 1P-2p169, 1P-2p170
endobacteria
2P-2p133
Endocytosis
1P-1p028, 3P-1p007
endophytic microbes
2S-Ap02
Endoplasmic reticulum
2P-1p021
endosymbiont
2P-2p133
endothelial cell
2P-2p163
endotherial cell
2P-1p097
endotoxin
3P-2p132, 3P-2p133
endotoxin neutralizing
2P-1p027
energy3S-Ap01
energy production
1P-1p121
enrichment
3P-2p166
enteric bacteria
3P-2p148
environmental bacteria
3P-1a022,
3P-1p095
enzymatic epimrization
2P-1p013
enzymatic conversion
2P-1p056
enzyme 2P-1p014, 2P-1p031, 2S-Ba01,
2S-Cp04, 3P-1p039
enzyme activity
2S-Aa02, 3P-1p049
enzyme engineering
2S-Ca01
enzyme inhibitors 2P-1p092, 3P-1p049
enzyme production
1S-Dp01
enzyme puriﬁcation
3P-1p049
enzyme reaction
2S-Ea03, 3P-1a039,
3P-1p046, 3S-Cp05
enzyme reaction solvent
3P-1p041
enzyme sensor
2S-Bp03
enzyme stabilizing agent
3P-1p041
enzyme-semiconductor hybrid 3P-1p045
2-epi-5-epi-valiolone
3P-1a039

epigallocatechin gallate
2P-2p167
epigenetic
1S-Bp01
Epoxy resin
3P-1a121
epsilon-viniferin
2P-1p097
ER stress
1P-1p028
ERp57
1P-1p038
Escherichia coli 1P-1p032, 1P-1p058,
1P-1p060, 1P-1p061, 1P-1p062,
1P-1p064, 1P-1p066, 1P-1p067,
1P-1p068, 1S-Cp03, 2P-1p011,
2P-1p017, 2P-1p029, 2P-1p031,
2P-1p055, 2P-1p058, 2P-1p059,
2P-1p060, 2P-1p061, 2P-1p062,
2P-1p123, 2P-1p129, 2P-2p140,
2P-2p141, 2S-Ep04, 3P-1a012,
3P-1a088, 3P-1a089, 3P-1a090,
3P-1p075, 3P-1p078, 3P-1p111,
3P-2a177, 3P-2p135, 3P-2p145,
3P-2p149, 3P-2p156, 3P-2p169
esterase
3P-1a036, 3P-1p028
ethanol 1P-1p114, 2P-1p051, 3P-1p120
ethanol fermentation
1P-1p047,
1P-1p115, 1P-1p116, 1P-1p117,
1P-1p124, 2A-Dp01, 2P-1p119
ethanol production
3P-1a070
ethanol stress
2P-1p048
ethylene
3P-1p044
Euglena gracilis
3P-1p119
Euplectella aspergillum
3P-1p066
eutrophication
2P-1p113
evolution technology
2P-1p033
evolutionary engeneering
2P-1p061,
3P-1a028, 3P-1p078
evolutionary molecular engineering
2S-Ca05
Exiguobacterium acetylicum 3P-1p048
exopolysaccharide
1P-1p099
expression
1P-1p114, 2P-2p174
extracellular matrix
1P-2p148,
2P-2p152, 2S-Da04
extracellular electron transfer 3P-2a155
extracellular matrix
2S-Cp06
extracellular metabolomics
1P-2p153

FFab
2P-2p149
FAD modiﬁcation
3P-1a035
FAD-dependent glucose dehydrogenase
1P-1p004
Falsirhodobacter3P-1a040
family S46
1P-1p008
fatty acid
2P-1p129, 3P-1a079,
3P-1p103, 3P-1p113
fatty acid amide
2P-1p006
fatty acid metabolism
3P-1a085
fatty acyl-AMP ligase
2P-1p006
Fc receptor
2P-2p148
fermentable sugar
2P-1p070
fermentation
1P-1p040, 1P-1p044,

345

1P-1p060, 1P-1p062, 1P-1p127,
2P-1p043, 2P-1p044, 2P-1p085,
2S-Aa03, 3P-1a066, 3P-1a068,
3P-1a072, 3P-1a074, 3P-1p069,
3P-1p073, 3P-1p075, 3P-2a177,
3P-2p153, 3P-2p175, 3S-Dp03
fermentation inhibitors
3P-2p160
fermentation process
2P-1p074
fermented beverage of plant extracts
1P-1p084
fermented food2P-1p078, 2P-1p087
fermented milk
1P-1p087
fermented soybean
1P-1p094
feruloyl esterase
1P-1p019, 1P-1p123
ﬁber
2P-2p164, 2S-Da04, 3P-1a127
ﬁbroblast
1P-2p161
ﬁbronectin
2S-Da04
ﬁlamentous fungi 1P-1p124, 3P-1p006,
3P-2a144
Fish
3P-1a087, 3P-2a154
Fistulifera solaris
3P-1p116
ﬁxed-bed bioreactor
3P-1p073
ﬂash freezing
2P-2p158
Flavobacterium
3P-1p050
ﬂavoprotein
1P-1p033
ﬂavor compounds
1P-1p100
ﬂoating microalgae
3P-1p021
ﬂocculating yeast
3P-2p153
ﬂocculation
2P-1p117, 3P-2p149
ﬂow cytometry
3P-1a060, 3P-1a061,
3P-1p099
Fluorescence
3P-1a113
ﬂuorescence material
3P-2a143
ﬂuorescence spectra
3P-1p062
ﬂuorescent proteins
3P-1p029
ﬂuorine ion
2P-1p110ﬂux analysis
2P-1p060
FMO
2P-1p004
folding mechanism
3P-1a051
food
1P-1p091
forest soil
1S-Cp06
formate oxidase
3P-1p035
formate oxidaze
3P-1a035
formic acid
1P-1p054
8-formylFAD
3P-1a035, 3P-1p035
Freeze-Crush-Infusion (FCI) 3S-Ap04
fruiting
3S-Bp04
fruiting body
3P-1p081
fruits
3S-Ap04
fucosylation
2P-2p184
functional material
3P-2p137
functional peptide
1A-Aa04
functionality
3P-2a172
fungicidal activity
3P-2a134
fungus
1P-1p082, 2P-1p109
furfural
2P-1p049
Fusarium
1P-1p124

GGABA

1P-1p046, 1P-1p068,
1P-1p084, 1P-1p087, 2P-1p086
gamma-glutamyltranspeptidase
3P-1p047
Ganoderma lucidum
3P-1a067
gas-liquid phases
3P-2a176
GC-FID2P-1p075
GC/MS
1P-1p100, 1P-1p130
gelation
2P-2p180, 2S-Cp04
gene cloning
3P-1p051
gene combination
3S-Bp02
gene disruption
1P-1p079, 2P-1p063,
3P-1a031
gene expression
2P-1p089, 3P-1a019,
3P-1a033, 3P-1p023,
3P-1p031, 3P-1p032
gene expression analysis
3P-1a038,
3S-Cp06
gene knockout
1P-1p039, 3P-1p023
gene regulation
3P-1p083
gene therapy
1S-Ep02, 1S-Ep05,
1S-Ep06
gene transfer
3P-1a023
genetic epidemiology
1S-Bp01
genetic resources
3S-Cp04
genome1P-1p075, 1S-Bp04,
2P-1p106, 2S-Ea03, 3S-Cp02
genome analysis
3P-1p006
genome editing
1S-Ep06, 3P-1a029,
3P-1p004, 3P-1p005
genome editing tools
1P-2p157
genome engineering 1S-Ep01, 1S-Ep02,
2P-2p132, 2S-Ea04, 3P-1a028
genome integration
3S-Bp01
genome mapping
2P-1p122
genome minning
3S-Cp03
genome synthesis
2S-Ea04
genome-mining
3P-1p093
Geobacillus stearothermophilus
3P-1a034
Geobacillus thermodenitrificans
3P-1p118
Geobacter spp.
2P-1p127
geographical origin
2P-1p082
GFP
2P-2p171, 3P-2p156
GH117 family enzyme
3P-1p056
GH134
3P-1p054, 3P-1p055
ginger
2S-Aa03
glmS ribozyme
2P-2p182
glomeruli
2P-2p152
glucose1P-1p121, 1P-1p122
glucose concentration
3P-2p162
Glucose consumption rate
1P-1p045
glucose dehydrogenase
3P-1a043
glucose repression
2P-1p067
glutamate fermentation
3P-1a010
glutaminase
2A-Ap01

glycerol

1P-1p052, 1P-1p053,
3P-1a127, 3P-1p039
glycoengineering
2P-2p184
Glycogen
3P-1p120glyconeogenesis
2P-1p094
glycosidase
1P-1p016, 2S-Bp05
glycoside hydrolase
1P-1p011
glycosylation
2P-2p186
glycosylceramide 1P-1p081, 2P-1p077,
3S-Dp05
glycosyltransferase 1P-2p165, 2P-2p186,
2S-Bp05, 3P-1p060
glycosynthase
2P-2p187
Glycyrrhiza uralensis
3P-1p030
gnetin C
2P-1p097
gold colloid
3P-2a158, 3P-2a162
gold plating
1P-2p152
goldﬁsh
3P-2a182
GPCR
3P-1a063, 3P-2a183
gram-negative bacteria
3P-2p133
green algae
3P-1a072, 3P-1p105
green ﬂorescent protein
2S-Bp02
green wall
1P-1p109
GroEL
2P-1p022
GroES
2P-1p022
groundwater
1P-1p111
group I intron
2S-Ca06
Group I ribozyme
2P-2p183
growth3P-2a146
growth control
3P-2a153
growth delay analysis
3P-2p155
growth inhibitor
1P-1p054, 3P-1a116
growth stimulation
1P-1p076
gut
3S-Dp02
gut microbiota
2P-1p038, 3P-1a073

H
H4IIEC3
2P-1p094
hair follicle germ
1P-2p151
hair regenerative medicine
1P-2p151
Half-adder
3P-1a021
Halomonas
1P-1p046, 3P-2p175
Hansenula polymorpha3P-1a029
HapX
3P-1p010
heat lytic ﬁlamentous fungi
1P-1p121
heat lytic fungi
1P-1p122
heat of decomposition
1P-1p122
heating process
3P-1a068
HEK293
1P-2p140
HEK293T cell
1P-1p029
helicase 2S-Ea01, 2S-Ea02, 3P-1p018
hemagglutinin
2P-1p016
heme protein
3P-1p040
HEMF
2P-1p076
hemicellulose
1P-1p119
hemocyanin
3P-2a139
Hemoglobin A1C
1P-2p171
hemolytic factor
3P-1a003
heparan sulfate proteoglycan 1P-2p132

346

hepatitis B virus
1P-2p132
hepatocyte
3P-1a052
HER2
3P-1p024
herbaceous biomass
1P-1p121
Heterogeneity
2P-2p162
heterologous production
2P-1p003,
3P-1a026, 3P-1p015, 3P-1p025
HiCEP
1P-2p160high amylose content rice
2P-1p072high C/N ratio
3P-1a129high cell density
2P-2p161high density culture
2P-2p160high mannose enzyme
1P-1p018
high speciﬁc activity
2P-1p003
High-resolution mass spectrometry
3P-1a097
high-throughput screening
1P-2p141,
1S-Bp02, 3P-1p096, 3P-2a178
histone deacetylase
2P-1p047
homocarnosine
3P-1p053
homogeneous glycan
2P-2p187
Homology modeling3P-1a034,
3P-1p061
homorogous recombination
1P-2p156
Homozygous mutation
1P-1p071
hormesis
2S-Ep01
host defense peptide
3P-2a168
HPLC
1P-2p168, 1P-2p172
HPLC-ELSD
1P-2p167
HSP70
3P-1a051
Hsp90
3P-1a051
human induced pluripotent stem cell
2P-2p160, 2P-2p161
Human induced pluripotent stem cells
2P-2p175, 3P-2p163
human intestine
2P-1p085
human iPS cells
2P-2p167
human iPSCs
2P-2p176
human mesenchymal stem cells
1P-2p145
human milk oligosaccharide
1S-Bp05
Human retinal pigment epithelial cells
2P-2p177
human skin microbiome
3P-1p087
hyaluronic acid
1P-2p137
hybrid material
2S-Da02
hybridoma technology
3P-1a063
hydrocarbon
3P-1a078
hydrogel
1P-2p137, 1P-2p138,
1P-2p143, 2S-Da06
hydrogen
3P-1p124hydrogen production
1P-1p129,
3P-1a125hydrogen-oxidizing bacteria 1P-1p059,
1P-1p063, 2P-1p130
hydrogenase
1P-1p059, 3P-1p121,
3P-1p124hydrogenase gene
3P-1a125
Hydrogenobacter thermophilus 1P-1p063

hydrolase
3P-1p083
hydrolysates
2P-2p135, 3P-1a116
hydrolysis
3P-1p104hydrophobic core
2P-1p025
Hydrophobicity of the cell surface
3P-2p150
hydrophobin
1P-1p037, 3P-2p146
hydroponics treatment
1P-1p107hydroquinone
2P-1p108hydrothermal method
3P-1p1103-hydroxy-2-methylbutyrate 3P-1a085
3-hydroxyaspartate
3P-1p046
3-hydroxybutyric acid
3P-2p175hydroxycinnamic acid amide 2S-Ba03
Hydroxydaidzein
3P-2p1733-hydroxyhistidine
1P-1p021
hydroxyl radical
3P-2a147
hydroxylase
1P-1p020, 1P-1p021,
3P-1p040
hydroxylysine
1P-1p022
5-hydroxymethyl-furfural
3P-1a122hydroxynirile lyase
1S-Dp023-hydroxyornithine
1P-1p020
hyperthermophile 1P-1p007, 1P-1p013,
3P-1p018, 3P-1p019
Hyphomicrobium
3P-1a107I
identiﬁcation
3P-1a005
IDH1/2
2P-1p036
IgA
1P-1p101
IgG
1P-2p172, 3P-1a057
Illumina Miseq
1S-Cp05
Illumination
3P-1p076
Image analysis
1P-2p154, 2P-2p173
image-based analysis
3P-2p164
imaging
1P-2p186
imaging mass spectrometry
1P-2p187
imidacloprid
2P-1p105
iminodiacetic acid
1P-2p137
immobilization
1P-1p125, 1S-Dp04,
2P-1p090, 2P-2p143, 3P-1a055,
3P-1a057, 3P-1p066, 3P-1p067,
3P-2a158
immobilized cell
3P-2p144
immobilized enzyme
1P-1p024,
3P-1a042, 3P-1a043
immunity
3P-2a182
immuno-assay
2S-Da01
immunoelectron microscopy 2P-1p052
Immunoglobulin New Antigen Receptor
1P-2p162
impact assessment 2P-1p104, 2P-1p105
in situ hybridization
1P-1p029
in vitro analysis
1P-2p150
in vitro cancer model
1P-2p141in vitro coupled transcription/translation
2A-Ep01
in vitro diagnostic
2S-Bp04

in vitro molecular evolutionary
engineering
2A-Ep01
in vitro selection
2S-Ca05
in vitro synthetic biology
3P-1a039
in-line monitoring
3P-2p162
in-SPE derivatization method 1P-1p092
inclusion body
1P-1p032, 3P-1a058
indigo3P-2p174
induced pluripotent stem cell 2P-2p159
induction system
1P-1p025
industry-academia collaboration
1A-Aa02industry-government-university
2S-Aa04
inﬂammation
1P-2p134, 2P-2p152
inﬂuenza virus
2P-1p016
informational analysis
1A-Aa04
inhibitor
3P-1p068
initial viable cells
2P-1p081
injured microorganism
3P-2p155
inkjet2S-Cp05
inkjet cell printing
2P-2p158
inkjet head
2S-Cp05
inkjet printing
2S-Cp02, 2S-Cp03
inoculum
3P-1a106
Inonotus obliquus
2P-1p088,
2P-1p096, 3P-2p142
inositol
3P-1a014
insect3S-Ep02
insoluble glucan
1P-1p012
Insulin resistance
3P-1a084
insulin secretion
1P-2p173
Insulin-like peptide
1P-1p030
integrin
2P-2p163
interface bioreactor
2P-1p054
interface screening system
2P-1p054
interleaﬂet interaction
3P-2a175intermittent illumination
3P-1p074
intracellular metabolites
1P-1p066
intracellular oil recovery
3P-2a179
intracellular redox state
3P-1a017
inulinase3P-2p161
iodine3P-1p037
ion beam
3P-2p159
Ion chromatography
3P-1a097
ion-beam
3P-1a065, 3P-1a069
ionic liquid
3P-1p041
Ionic liquid pretreatment
2P-2p139,
3P-1a120
iPS cells
1P-2p146, 1P-2p147,
1S-Ep02, 2P-2p162, 2P-2p172
iPSC
3P-2p164
iron respiration
2P-1p057
iron-sulfur cluster
3P-1p010
ISAAC
2S-Da05
ISFET
1P-1p009
iso-propanol
3P-1p078
isoamyl acetate
1P-1p073, 2P-1p047
isobutanol
2P-1p068

347

Isochorismatase superfamily 2P-1p122
isoelectric focusing
3P-2a168
isolation 1P-1p120, 3P-1p101, 3P-1p113
isopropanol
3P-1a083
isoquinoline alkaloids
2S-Ba05
Issatchenkia orientalis
2P-1p119itaconic acid3P-1a069
ITO electrode
1P-2p174

JJapanese dietJapanese foodJapanese sake
Japanese sake yeast
Joint development
jojobaJunmai-shu

3S-Dp01
3S-Dp01
1P-1p083
1P-1p070
2S-Aa01
1P-1p1302P-1p069

K
K+ homeostatis
keratinkinasekinetic modeling
Kinetic paramater
Kluyveromyces lactis
Kluyveromyces marxianus

2P-1p017
1P-1p031
2P-1p002
2P-1p062
3P-1p038
1P-1p072
1P-1p126,
3P-2p161
Kocuria rhizophila
3P-2p171
Koji
1P-1p089, 2P-1p077,
2P-1p091, 3S-Dp05
Koji making
2S-Aa03, 3S-Dp04
kojic acid3P-1a077
Kouleothrix ﬁlamentous bacteria
3P-1p108
Kumamolisin
3P-1p042

L
L- Thioproline
3P-1p038
L-amino acid esterase
3P-1p051,
3P-1p052, 3P-1p053
L-arabinose
2P-2p141
L-glutamate
1P-1p046, 2A-Ap01
L-glutamate oxidase
2P-1p003
L-lactic acid3P-1a076
lab on paper
2S-Da03lactate dehydrogenase
3P-1a009,
3P-1a124, 3P-1p036
lactate oxidase
3P-1p061
lactic acid3P-1a065, 3P-1a123,
3P-2p176
lactic acid bacteria
1P-1p096,
1P-1p099, 1P-1p101,
2P-1p038, 2P-1p081, 2P-1p083,
2P-1p086, 2P-1p087, 2P-1p093,
3P-2a161, 3P-2p147, 3P-2p148
lactic acid fermentation
1P-1p089,
1P-1p090, 1P-1p096, 3P-1p002
Lacto-vinegar
2P-1p078
Lactobacillus plantarum
2P-1p087

1P-1p089
1P-1p039,
1P-1p087, 2P-1p098
laminaribiose
3P-1p050
laminarioligosaccharide
3P-1p050
larvae3P-2a172
laser phase shift
2P-2p155
LC-MS
1P-1p093, 1P-2p167
LC-TOFMS
1P-2p169
LC/MS
1P-1p130, 2P-1p071
LDH activity assay
2P-2p156
LEA peptide
2P-2p141, 3P-2p152
Lectin AAL
1P-2p171
leguminous bacteria
1P-1p048
Lemna minor
2S-Ap03leucine responsive regulatory protein
3P-1p080
Leuconostoc mesenteroides 1P-1p012
levulinic acid
3P-1p095
library selection
2A-Cp01
life span
2P-1p088
lifestyle disease
1S-Bp01
Light dark cycles
3P-1p117
light response mechanism
3P-1p122
lignin2P-1p116, 3P-1a118, 3P-1a119
lignin degradation
2P-1p116
Lignin monomer
3P-1a120
lignin peroxidase
3P-2p159
lignin-related phenols
3P-1a119
Lignocellulosic biomass
2P-2p139,
3P-1a120
lignocellulosic materials
2P-1p049,
3P-1a127
Limulus amebocyte lysate
3P-2p132,
3P-2p133
lipase2P-1p042, 3P-1p104
lipid
2P-1p041, 2P-1p044,
3P-1a001, 3P-1a072,
3P-1p112, 3P-2a171, 3S-Dp04
lipid production
3P-1a093, 3P-1p117
lipid raft
3P-2a173
lipoic acid
2P-1p094
Lipomyces
3P-1a002
Lipomyces screening
3P-2a179
Liposome
2S-Da04, 3P-2a173,
3P-2a174, 3P-2p136
Liquid chromatography-mass
spectrometry
2P-2p172
liquid culture
2P-1p121
liquid surface culture
3P-2p142
Liquid-disordered Ld
3P-1p090
live cell response
1P-2p173liver failure rat
1P-2p139liver regeneration 1P-2p139, 1S-Ap02
living cell
1P-2p173, 2P-2p171
local anesthetic
3P-2a173
long life
3S-Dp01
longevity
3S-Dp01
low molecular weight drug
2P-2p179
Lactobacillus sakei
Lactococcus lactis

low shear and modeled-microgravity
culture3P-2p148
lower temperatures and light intensities
3P-1p113
LPS-neutralizing activity
3P-2a165
luciferase
2P-2p153
Lung cell
3P-2p167
lyase
1S-Dp01
lymphocyte-microarray chip 2S-Da05
lysine hydroxylase
1P-1p022
lysozyme
1S-Bp05

M
M. thermoacetica
1P-1p128
Machine Learning 1P-2p181, 3S-Bp07
Mackinawite
2P-1p126
macroalga
3P-1a115, 3P-1a131,
3P-1p118
macroalgae
2S-Dp02
macrophage
1P-2p134
magnetite nanoparticle
1P-2p141
maintenance culture
1P-2p146,
2P-2p175
MAL activator
3P-1p014
Malate dehydrogenase
3P-1a034
MALDI-TOF MS
3P-1a004,
3P-1a005, 3P-1a104
maleate3P-1a016
malic acid
1P-1p071, 2P-1p101
malic enzyme
2P-1p056
malonyl-CoA
2S-Ep04
maltooligosaccharide-forming amylase
1P-1p017
maltotriose
1P-1p017
mammalian cell
2P-1p032
mammalian cytoplasm
3P-1a045
Man134B
3P-1p054
Man134C
3P-1p054
mandelonitrile oxidase
1S-Dp02
manganese
3P-1a107
manganese peroxidase
3P-2p158
mangosteen
3S-Bp03manniol
3P-1p072
mannosylerythritol lipid
2P-1p042
Mannosylerythritol lipids
3P-1a031
marine3P-1a071
marine bacterium
3P-1p037
marine environment 3P-1a114, 3P-1p098
marine microbe
2P-1p103
marine sponge
3P-2a153
mass culture
1P-2p151
mass microscope
1P-2p187
mass spectrometry 1P-1p030, 1P-1p091
Massively Parallel Sequencing 3P-1p043
mathematical model
3P-1a131
Mathematical Modeling
3P-1p092,
3S-Bp07
mechanical property
1P-2p182
mechanobiology
2S-Da06

348

Mechanotransduction
3P-2p163
media optimization
2P-1p093
mediator
3P-1a017
medical plant
3P-1p034
medium
1S-Ap03, 3P-1a088
medium-chain-length homopolymer
2P-1p129
Melanin
3P-2a145
membrane protein
3S-Ep05
membrane tension
3P-2a174
Memory device
2S-Ca07
mesenchymal stem cell
2P-2p154,
2P-2p165, 2P-2p174
Mesocarp ﬁber
1S-Cp03
mesophilic condition
3P-1p076
mesoporous silica
3P-1a042
Mesorhizobium sp.
3P-1p070
metabolic analysis 1S-Ap03, 2P-1p127,
3P-1a088, 3P-1a091, 3P-1a092,
3P-1a097, 3P-1p082, 3P-1p085
metabolic engineering
1P-1p064,
2P-1p055, 2P-1p058, 2P-1p059,
2P-1p068, 2P-1p128, 2P-1p131,
2S-Ba05, 2S-Dp04, 3P-1a030,
3P-1a076, 3P-1a078, 3P-1a080,
3P-1a081, 3P-1a089, 3P-1p025,
3P-1p121, 3P-2a177, 3P-2p143,
3P-2p145, 3S-Cp01
metabolic pathway
3P-1p080
metabolic pathway modiﬁcation
1P-1p064, 3P-2a155, 3P-2p145
metabolic proﬁling
3P-1a087
metabolic simulation
2P-1p061
metabolism
1P-1p057, 1P-1p063,
1P-1p065, 2P-1p123,
3P-1a094, 3P-1p086, 3P-1p098
metabolites
1P-1p100
metabolome
1P-1p087, 1S-Bp04,
2P-1p074, 2P-1p075
metabolome analysis 1P-1p092, 2S-Ba02
metabolomics
1P-1p086, 1P-1p088,
1P-1p090, 1P-1p091, 2P-1p094,
3P-1a089, 3P-1a090, 3P-1a093,
3P-1a097, 3P-1p079, 3P-1p117
metabonomics
1P-2p178
metagenome
3P-1p095
metagenomic libraries
3S-Cp01
metagenomics
2S-Dp02
metal adsorption
3P-1a110
metallo protease2P-1p007
metalloprotein
2S-Da02
Metchnikowia
3P-1a001
methane fermentation
3P-1a129,
3P-1a131
methane oxidation
3P-1a017
methanogen
1P-1p112
methanol2P-1p128
methanol dehydrogenase
1P-1p002,
1P-1p055, 1P-1p056

methyl-accepting chemotaxis protein
2P-1p100
methylcitric acid cycle
3P-1a092
Methylobacterium extorquens 2P-1p128
Methylobacterium extorquens AM1
1P-1p002, 1P-1p003
Methylobacterium zatmanii
1P-1p055
methylotroph
1P-1p002, 1P-1p003
methylotrophic yeast
3P-1a029,
3P-1a033
Methyltransferase
3P-2p173
mevalonate
1P-1p066
mevalonic acid
2P-1p060
MGA2
1P-1p073
Micro vascular structure
1P-2p154
micro-well
2P-2p150
microalgae
2P-2p135, 3P-1p117
microarray
1P-2p151
microarray transfection
2S-Cp02
microbe3P-1p098, 3P-2a145,
3P-2a153, 3P-2p174
microbial community
1S-Cp01,
1S-Cp05, 2P-1p115,
2P-1p127, 3P-1a128, 3P-1p107
microbial dark matter
2P-2p137,
2P-2p138
microbial diversity
2P-1p124
microbial ﬂora
1S-Bp05, 3P-1p094,
3S-Dp02, 3S-Dp04
microbial fuel cell 2P-1p123, 2P-1p127
Microbial Fuel Cells
2P-1p125
Microbially Inﬂuenced Corroson
1P-1p113
microbiome
1P-2p178, 3P-1p086
microbiota
2P-1p085
microcarrier
2P-2p154
microdevice
2P-2p168
microﬁber
1P-2p148
microﬂuidic chip
3P-2a171
microﬂuidic device
1P-2p148,
1P-2p176, 1P-2p177,
2S-Da03, 2S-Da06
microorganisms
3P-1a092
microRNA
3P-2a184
Microscopy
1P-1p113
MiFuP
3P-1p093
migration-promoting peptide 3P-2a166
milk
2P-1p050
mini-tomato
1P-1p086
Miscbility Temperature Tm
3P-1p090
Miso
1P-1p093
mitochondria
1P-1p079, 2P-1p068,
3P-1p119
Mitochondrial targeting sequence
3P-1a032
mixed sugars
3P-2p176
modiﬁcation
3P-1a066
modiﬁed Embden-Meyerhof pathway
3P-1p019

molecular chaperone

2P-1p021,
2S-Bp05, 3P-1a051
Molecular design
1P-2p162
molecular dynamics
3P-1p089
molecular evolution
1P-1p105
Molecular recognition
3P-1p043
Molecular weight
3P-1p027
Monascus fermentation products
3P-2a141
Moniliella megachiliensis
2P-1p045
monoclonal antibody
2P-1p034,
2P-1p037, 2S-Da05, 3S-Ep05
monomer supply
3P-1a013
monooxygenase
3P-2p171
Monte Carlo methods
3P-1p092
Moorella thermoacetica
2P-1p120morphological change
2P-2p174
Morphological proﬁling
3P-2p165
mouse
1P-2p136, 3P-1a073
mRNA
3P-1p003
mRNA ﬂux
2P-1p048
mRNA-seq
1P-2p160
MsMab-1
2P-1p036
MTT assay
2P-2p156, 3P-2p139
muconic acid3P-1a119
Mucor circinelloides
3P-1a070
multi-functional bacteria
1S-Cp04
multicopper oxidase
3P-1p037
multifunctional peptide
3P-2a169,
3P-2a170
multiplex PCR
2S-Ea05
multivariate analysis
1P-2p181,
3P-1p086
municipal wastewater
3P-1p105Muse cell
3P-2p166
Mutagenesis
2P-1p001, 3P-1p038
mutant1P-1p051
mutants
1P-1p034, 3P-1p047
mutation
3P-2p159
MxaFI
1P-1p055
mycosamine
3P-1p093
mycotoxin
3P-2a141

N
N-acetylglucosamine
2P-1p051
N-glycans
2P-2p185
N-glycosylation
3P-1p060
N-linked oligosaccharides
1P-1p018
N-methylhydantoinase
3P-1p070
N-methyltransferase
3P-2a136
Na-taurocholate cotransporting
polypeptide
1P-2p132
NAD(P)H
3P-1a041
1P-1p007
NAD+
NADH dehydrogenase
1P-1p045
NADH oxidation
3P-1p045
NADPH
3P-1a095
nagoya protocol
3S-Cp04
nano biotechnology
2S-Da01

349

nano magnetic particle
1P-1p106
nanocapsule2P-1p022
nanocrystal
1P-2p184
nanoﬁlms
2S-Cp06
nanoneedle
2P-2p178
nanoparticle
1P-2p136, 2S-Bp01,
2S-Ca07
nanoparticles
1P-2p186
nanosilver
3P-1p127, 3P-1p128,
3P-1p129
Narezushii
2P-1p087
NASBA
2S-Ea06
natto
1P-1p094, 3P-2a170
natural killer T cell
2P-2p159
near infrared ray-responsible
photocatalyst
3P-1p129
Negative selection
3P-2p151
neoagarobiose hydrolase
3P-1p056
neonicotinoid peticide
2P-1p105
neonicotinoide pesticide
2P-1p104
network identiﬁcation
3S-Cp06
Neural stem cell 2P-2p157, 2P-2p164,
3P-2p165
new action and promotion
1A-Aa01
Next Generation Sequencer
3P-1a008
next generation sequencing
2P-1p084
Next-generation sequencing 3P-1p084
NGF-like material
3P-2a148
NGS
1P-1p075, 3P-1a008
NHEJ
3P-1p005
nickel
3P-1a108
Nicotiana tabacum
2P-2p186
NIH shift2P-1p108
nipa sap
2P-1p120
nisin
1P-1p039, 2P-1p098
nitrate3P-1a107
nitrifying bacteria 2P-1p113, 3S-Bp06
nitrilase
2P-1p112
nitrile hydratase
1S-Dp03
nitritation
3P-1a102
nitrocellulose
3P-1a059
nitrogen ﬁxation
3P-1p125
nitrogen removal
3P-1a102
nitrogen source
3P-2a143
NKT
2P-2p159
NMR
1P-1p088, 1P-1p090,
1P-1p093, 1P-2p178,
3P-1a087, 3P-1p098, 3P-2a151
NMR metabolomics
1P-2p181
nocodazole
1P-2p147
Noise-reduction
3P-1p018
non-fermentable sugar
2P-1p070
Non-invasive
3P-2p165
Non-natural nucleoside
3P-2p151
noninvasive discrimination
2P-2p155
noninvasive method
3P-2p166
Norovirus
1P-2p183
novel culture method
3P-2p154
novolac phenol resin
3P-1a122

NRPS
2P-1p005
nuclear localizasion
3P-1p014
nucleic acid chromatography 2S-Ea06
nucleic acid drug
3P-2a181
nucleoside hydrolase
3P-2a181
Nucleus density
2P-2p177
nucleus labeling
1P-2p186
nukadoko
1P-1p096
nutrient removal
3P-1p105
Nylon
2P-1p014, 2P-1p015

O
2’-O-methylribonucleoside
3P-2a181
Obesity
3P-1a084
odorant receptor
3S-Ep02
odorant response 1P-1p029, 3P-1a053
Ogataea minuta
2P-2p187
Ogataea polymorpha
3P-1p002
Oil body
3P-1p116
Oil palm biomass
1S-Cp02, 1S-Cp03
oil production
3P-2a179
oleaginous yeast
2P-1p044
oligopeptide
1P-1p083, 3P-2a160
oligosaccharide
1P-1p010
oligotroph
2P-1p121
Omics analysis
3P-1p078, 3P-1p084
optically pure lactic acid
1A-Aa03organ on a chip
1P-2p143
organic acid
1P-1p077, 3P-1a030
organic acid transporter
3P-1a075
organic cultivation
3P-1p034
organic overloading
3P-1a130
organic solvent
3P-2p171
organic-solvent tolerance
1P-1p001
oriented immobilization
1P-2p179
ortholog
3P-1p060
Oryza sativa
2P-1p027, 3S-Bp01
osmotic pressure
1P-1p043
osmotic stress
2P-1p045
oxalic acid3P-1a075
oxidation
2P-1p008
Oxidative Stress
2P-2p1762-oxoglutarate-dependent dioxygenase
1P-1p020, 1P-1p021
oxygen3P-2a176
oxygenase1P-1p024, 1P-1p033
oxysterol
1P-1p028

P
P(3HB-co-3HHx)
2P-1p130
P. palleronii
3P-1p102
P/Ag/Ag2O/Ag3PO4/TiO2 photocatalyst
3P-1p111, 3P-1p115
P/Ag/Ag2O/Ag3PO4/TiO2 thin ﬁlms
3P-1p109
P450
1P-1p034, 3P-1p030
Paecilomyces tenuipes
2S-Ap01
palm oil 1S-Cp01, 1S-Cp04, 1S-Cp06
palm oil mill efﬂuent
1S-Cp05

palm oill mill
1S-Cp02
palmitic acid
2P-1p091
pancreas2P-2p166
Parallel computing
3P-1p092
Paraphoma
3P-1a006
Passiflora edulis
1S-Dp02PC12
3P-2a148
PC12 cell
3P-2p139
PCA
1P-1p130, 2P-1p075
PCR
3P-1p018
PCR-DGGE
1S-Cp05, 2P-2p138
PDMS
2P-2p166
Pedobacter2P-1p112
PEGylation
2P-2p145
Penicillium purpurogenum
3P-2a140,
3P-2a141
pentose2P-1p044
pentose phosphate pathway
1P-1p115
peptide 2P-1p099, 3P-2a157, 3P-2a158,
3P-2a159, 3P-2a163, 3S-Ep04
peptide aptamer
2S-Ca05
peptide array
1S-Bp03, 3P-2a157
peptide chip
3P-2a156, 3P-2a162
peptide informatics
1S-Bp03
peptide medicines
2P-1p033
peptide nucleic acid
3P-1p094
peptide probe
1P-2p185
peptide synthase
3P-2a135
peptide synthesis
2P-1p010
peptide tag
2P-1p024Per2
2P-2p153
perfusion culture
1P-2p143
periodontopathogenic bacteria 3P-1a003
peritoneal adhesion
1P-2p137
peroxidase
1P-2p138, 1P-2p180
pest management
3S-Bp05PGPB
2S-Ap03pH
3P-1a086, 3P-2p166, 3P-2p177
pH shift
3P-2p158
PHA
3P-1a013
PHA synthase
3P-1p027
phage
3P-1a007
phage display
2P-1p033, 2S-Ca02,
3P-2a159
phage display library
3P-1p024
Phanerochaete sordida YK-624
3P-1a124, 3P-1p029
phase separation 3P-2a174, 3P-2a175,
3P-2p136
Phenol
3P-1p102
phenylethyl alcohol
3P-1p075
Phenyllactic acid
2P-2p140
phenylpropanoid
3P-2a147
phlorotannin
2P-1p092
Pho13p2P-1p065
phosphate
2P-1p114
phosphorylase
3P-1p050
Photo irradiation
2P-2p145
photo-responsive hydrogel
2P-2p150

350

Photobacterium
3P-2a137
photobioreactor
3P-2p144
photocatalysis
3P-1p109, 3P-1p110
photocatalyst
3P-1p045, 3P-1p124
Photocatalytic degradation
3P-1p126
photocatalytic pretreatment
3P-1p115
photocatalytic stability
3P-1p109
photodynamic reaction
2P-2p165
Photoresponsive polymer
2P-2p170
photosynthetic bacteria
3P-1a080,
3P-1p123, 3P-1p125
photosystem II
3P-1p020
phylogenetic analysis
1P-1p011,
1P-1p082, 3P-1a006
physiological disorder
3S-Bp03
phytoremediation
3P-1p106
Pichia3P-1a106
Pichia membranifaciens
3P-1a116,
3P-2p160
Pichia methanolica
2P-1p067
Pigment
3P-2a140
piperidine
3P-1a011
planar membrane
1P-2p179
plankton
3P-2p140
Plant
2S-Ba01
plant biopharmaceutical
2P-2p185
plant factory
1S-Ap01
Plant growth promoting bacteria
1S-Cp04
plant growth promotion
3P-1a018
plant growth-promoting bacteria
2S-Ap03, 3P-1p106
plant immunity
2S-Ap02
plant secondary metabolite
2S-Ba03
plant symbiotic bacteria
1P-1p002,
1P-1p003
plant-microbe interactions
2S-Ap02
Plasma2P-2p176
plasmid
3P-1a022
Plasmodium falciparum
1P-1p036
plate count3P-2p155
Pleurotus eryngii
2P-1p008
PLS
2P-1p073, 2P-1p075
POCT
2S-Ea05
pollen3P-2p154
pollutant
2A-Dp01
poly (ADP-ribose)
1P-1p027
poly (ADP-ribose) glycohydrolase
1P-1p027
poly(3-hydroxybutyrate)
1P-1p046
poly(amino acid) 3P-2a133, 3P-2a152
poly-gamm-glutamate
3P-2a133
polyamide
2P-2p164
polyamine
1P-1p003, 1P-1p050,
1P-1p094, 3P-2p136
polyethylene glycol
3P-1p109
polygodial
3P-2a134
Polyhydroxyalkanoate
2P-1p128,
2P-1p129, 2P-1p131,

3P-1a085, 3P-1p027
polyketide
3P-2a151
polyketide synthase, type III 3P-1p057
polyketide, pyrone- and resorcinol-type
3P-1p057
polymeric mediator
3P-2a155
polymerization
3P-2a132
polyphenol
3P-2p142
polyphosphate kinase
2P-1p005
Polysaccharide
3P-1a066, 3P-1a067,
3P-1a087, 3P-1p089
polysaccharides
2P-1p096
polyunsaturated fatty acid
2S-Ep03,
3P-2a137, 3P-2a144
pore sensor
3P-2a163
portland cement
3P-1a112
positional speciﬁcity
2P-1p011
positive selection
3P-1a045
post-translational regulation 3P-2a184
potassium
1P-1p043, 1P-1p105
PPAR
3S-Dp05
Predictive Analysis
3S-Bp07predictive feed control
3P-2p162
pretreatment
2P-2p137
primary metabolism
2S-Ep02
principal component analysis 3P-2a157
prion
3P-1p072
probiotics
1P-1p099, 2P-1p038,
3P-2p147, 3S-Dp03
process simulation
2P-1p120
production
3P-2a152, 3S-Ap05
production of therapeutic proteins
1P-2p155
programmed cell death
3P-2a159
proliferation
3P-1a047
proline2P-1p046
promoter 1P-1p114, 2P-1p057, 3P-1a020
promoter engineering
1P-1p069
promoter regulation
3P-2p169
1,3-propanediol
1P-1p052, 1P-1p053,
1P-1p054, 3P-1a082, 3P-1a127
1-propanol
3P-2a177
protease
2P-2p134, 3P-1p015,
3P-1p048, 3P-2a160, 3S-Dp03
protease for food processing 2P-1p117
protein
1P-1p085, 1P-2p135,
1P-2p148, 2P-1p023, 3P-1a048,
3P-1a049, 3P-1a052, 3S-Ep03
Protein A
1P-2p172, 2P-2p146
protein aggregation 3P-1a048, 3P-1p026,
3S-Ep01
protein displacement
3P-1a021
Protein disulfide isomerase 1P-1p038,
2P-1p030
Protein drug
2P-2p145
protein engineering
1P-1p026,
2P-1p035, 2S-Bp03, 2S-Ca01,
2S-Ca03, 2S-Dp04, 3P-1a048,
3P-1a049, 3P-1p059, 3P-1p061

protein expression 1P-1p035, 1P-1p036,
2P-2p141, 3P-1a049, 3P-1p020
protein folding
3S-Ep01
Protein G
2P-2p147
Protein hydrolysates
2P-1p093
protein interaction 3P-1a045, 3P-1p007,
3P-1p058, 3P-1p065
protein L
2P-2p147, 2P-2p149
Protein localization
3P-1a032
protein nano-building block (PN-Block)2P-1p025
protein nanobuilding block
2S-Ca03,
3P-1p059
protein refolding
1P-1p035
protein secretion
2P-1p019
protein vaccine
1P-2p140
protein-protein interaction
1P-1p038,
1S-Ep04
protein-quality control
3P-2p156
proteoliposome
3S-Ep05proteome
2S-Aa02
proteomics
3P-1p081, 3P-1p116,
3S-Ep03
protist3P-1a026
protocatechuic acid
1P-1p041
Pseudomonas
3P-1a011, 3P-1a018,
3P-1a118
Pseudomonas aeruginosa
3P-2p157
Pseudomonas cichorii
2P-1p013
Pseudomonas putida
3P-2a154
Pseudomonas stutzeri
3P-1a109
Pseudozyma hubeiensis SY62 3P-1a031
Pseudozyma tsukubaensis
2P-1p042
psychrophile
2P-1p056, 2P-1p057
PUFA synthase
3P-2a137, 3P-2a138
puriﬁcation
2P-2p149, 3P-1p048,
3P-1p052
2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid
2P-1p058, 2P-2p135, 2P-2p139
pyrophosphatase2P-1p005
pyruvate
1P-1p075, 3P-2p169
pyruvate decarboxylase
3P-1a124,
3P-2p170
pyruvate oxidase
2P-1p002
pyruvylated galactose
1P-1p016
Pythium
3P-2a144

Q
QM/MM
2P-1p004
qPCR
3P-1p108
Quantum dots
1P-2p183, 1P-2p184
quantum yield
1P-2p184
quartz crystal microbalance
3P-2p146
quorum quenching
3P-1a086
quorum sensing
1P-1p067, 3P-1a086,
3P-2a146, 3P-2p157

R
R-IVET

3P-1a019

351

rabbit2P-1p034
radiation-polluted biomass
1P-1p106
Radioactive substances
1P-1p103
raft domain
1P-2p164
Ralstonia eutropha 2P-1p130, 2P-1p131
Ralstonia solanacearum
2P-1p100,2P-1p101, 3P-1a007, 3P-1a016
ramdom mutagenesis
3P-1p019
rare earth elements
1P-1p056
rare metal
2P-1p118
rare sugar
2P-2p144
Rate variable control
1S-Ap01
reaction mechanism
2P-1p004
reactive oxygen species
2P-2p165,
3P-2p140
ready-to-drink (RTD)
3S-Ap04
receptor
3P-1p058
Rechargeable material
2P-1p126
recombinant protein 1P-1p032, 2P-2p142
recombinant protein production
2P-1p020, 3P-2p149
reconstruction
3S-Ep02
red tide control
3P-2p140
redox balance
2P-1p062
redox mediator
3P-1a111
Redox state
1P-1p045
reductase
1P-1p033
reductive dehalogenase
1P-1p035
refolding
1P-1p108, 3P-1a058
regenerative medicine
1P-2p149,
2P-2p176
regulation
3P-1p039, 3P-2a149
regulator
3P-1p011
repeated batch culture
1P-1p125
repeated fermentation
3P-2p176
repressor
2S-Ep05
residual pesticides
1P-1p009
resistance
3S-Bp05
Resource use efﬁciency
1S-Ap01
response surface method
3P-2p158
response surface methodology 2P-1p096
restriction endonuclease3P-1a037
resveratrol
2P-1p097
Retinal toxicity assay
2P-2p177
reverse transcriptase
2S-Ea01
Rhizopus glucoamylase
3P-1p003
Rhizopus microsporus
2P-2p133
Rhizopus oryzae
3P-1a065
Rhodococcus
2P-1p102, 2P-1p107,
3P-1a111, 3P-1a118
Rhodococcus erythropolis
2P-1p121
Rhodosporidium paludignum 2P-1p041
Rhodosporidium toruloides
3P-1p122
Ribonucleotide reductase
1P-1p005
ribosomal protein
3P-1a004
ribozyme
2P-2p182, 2S-Ca06
rice
2P-1p099, 3S-Bp01
rice bran protein
3P-2a169
rice husk biochar
3P-1a100rice protein
rice seedborne diseases
rice straw
rice vinegar
RIM15
RNA
RNA interferases
RNA nanostructure
RNA nanotechnology

1P-1p083
2S-Ap04
3P-1p077
1P-1p050
1P-1p069
2S-Ca06
3P-1p043
2P-2p183
2P-2p183,
2S-Ca06
RNA switch
2P-2p181
RNA-RNA interaction
2P-2p183
RNA-seq
1P-1p077, 3P-1p006,
3P-1p080, 3P-1p095,
3S-Bp02, 3S-Bp03,
3S-Bp04, 3S-Bp05, 3S-Cp01
ROS genration
2P-1p045
royal jelly protein
3P-2a167
RPD3
2P-1p047
rumen bacteria
1P-1p106
Ruminiclostridium josui
1P-1p019,
1P-1p129, 3P-1a037

S
16S rRNA
1P-2p176, 3S-Bp06
S-adenosylmethionine
1P-1p095
S-alkyl cysteine sulfoxides
3P-1p071
sacchariﬁcation
1P-1p118, 1P-1p119
Sacchariﬁcation residue lignin 3P-1a121
Saccharomyces cerevisiae
1P-1p072,
1P-1p073, 1P-1p076, 1P-1p077,
1P-1p078, 1P-1p079, 1P-1p095,
1P-1p114, 1P-1p115, 1P-1p116,
1P-1p124, 1P-1p127, 2A-Dp01,
2P-1p052, 2P-1p053, 2P-1p065,
2P-1p066, 2P-1p068, 2P-2p132,
3P-1a027, 3P-1a028, 3P-1p001,
3P-1p072, 3P-1p097, 3P-2p153,
3P-2p170, 3S-Ap02
safety1S-Ep06sake
1P-1p080, 1P-1p095, 2P-1p073,
2P-1p074, 2P-1p082
sake brewing
3S-Ap02sake lees
2S-Aa03sake yeast
1P-1p074, 1P-1p075,
2P-1p047, 2P-1p071, 3S-Ap02
salt
3P-1p114
salt bridge
1S-Dp03salt tolerance
2P-1p119, 3P-1a131,
3P-2p152sand
3P-1a101
Sarcosine oxidase 2P-1p001, 3P-1p038
scaffold
2P-1p036
scFv
2P-1p029, 2P-1p037, 3P-1a050
scFv-Fc
1P-2p158
Scheffersomyces stipitis
2P-1p051
Schizochytrium
3P-2a138
Schizosaccharomyces pombe 3P-1a030
scp
2P-1p050

screening 1A-Aa04, 1S-Ep04, 2P-1p037,
2P-1p054, 2P-1p083, 2P-1p089,
2P-1p098, 3P-1a047, 3P-1p068
screening system
3P-2a156
seawater
3P-1p099
secondary metabolism
2S-Ep01,
2S-Ep02, 3P-1p013,
3P-1p017, 3P-2a140
secondary metabolite 2S-Ep05, 3P-1p006
secretion mechanism
3P-2a132
secretory production
2P-1p018,
2P-1p029, 3P-2p161
sedimentation
2P-1p117
selective cell attachment
2P-2p169
Selective removal of deviation 2P-2p175
selenate reduction
2P-1p103
selenium
3P-1a109
self-assembled peptide
2P-2p169
self-assembling
2P-1p026
self-assembly
1P-1p108
self-inducing fermenter
3P-1a105
semi-continuous anaerobic digestion
3P-1p074
semi-continuous methane production
3P-1a130
sensor
1P-2p182, 2S-Aa02, 3S-Ep02
sensory evaluation
1P-1p086
sepM
3P-1p011
serine protease
1P-1p031
Serratia marcescens 2P-1p018, 2P-1p122
Serratia sp.
3P-2p177
serum sample
3P-2p132
serum-free culture
1P-2p161
sesquiterpene
3P-1p017
shake ﬂask culture
3P-2a176
shark antibody
1P-2p162
Shell scripting
3P-1p092
Shewanella
3P-2a138
Shewanella oneidensis MR-1 1P-1p065
Shikimate pathway 2P-2p140, 3P-2p168
shochu 1P-1p078, 2P-1p081, 3S-Ap01
shochu distillery wastewater 2P-1p079
shochu yeast
1P-1p074
siderophore
3P-1a108
sigma factor
3P-2p143
Signal accumulation
1P-2p180
signal peptide
2P-1p020
signal transduction
1P-1p065,
1P-2p150, 1S-Ep04,
3P-1a047, 3P-1p064, 3P-2p157
silent gene cluster
3P-2a142
silica1P-1p108, 3P-1a015
silica particle formation protein
3P-1p066
silica-binding protein
3P-1a043
silicate minerals
3P-1a100
Silicatein
2S-Ca04
silkworm
1P-1p030, 2P-1p016
silkworm express system
3P-1a050

352

simple biocatalysis
2P-1p057
Simulation
3P-1a034
simultaneous sacchariﬁcation andfermentation
3P-1a117
single aggregate culture
2P-2p161
single cell
1P-2p177, 2P-2p150,
3P-1a056, 3P-1a060, 3P-1a061
Single cell analysis
2P-2p170
single cell printer
2S-Cp05
single-cell analysis
2P-1p032
Single-Cell-Protein
2P-1p050
single-molecule PCR
3P-1a042
skeletal muscle
2P-2p179
skeletal muscle atrophy
2P-2p168
skin barrier
1P-1p081
smart fermentation technology 1A-Aa03
SNP typing
2S-Bp01
Soft substrate
3P-2p163
software development
2S-Ba02soil
3P-1a008
soil bacteria
3P-1a024, 3P-1p034
soil born disease
3P-1a099
soil condition
3P-1p034
soil environment
1P-1p109
soilborne disease
2S-Ap01
solid state fermentation
3P-1a128
Solid-ordered So
3P-1p090
solubilization
3P-1a058
somatic hypermutation
2P-1p028
Sorandium cellulosum
3P-2a150
sortase A
1P-1p023
SortaseA
3P-2p137
soy bean peptide
3P-2a164, 3P-2a170
soy sauce
2A-Ap01, 2P-1p076
soybean 1P-1p085, 1P-1p094, 3P-1a068
soybean peptide
3P-2a168
spatial measurement of nuclei density
2P-2p151
specialized cellulose ﬁlm
2P-2p136,
2P-2p137, 2P-2p138
Speciﬁc substrate
1P-1p111
spheroid
2P-2p166
sphingoid base
3S-Dp05
Sphingomonas
2P-1p106
spirits
3S-Ap04
splicing factor
2P-1p028
SPME-GC/MS
1P-1p088, 1P-1p090
spore
3P-1a015
ssrA
3P-2p156
stability
1S-Dp03
Stabilization of protein
2P-2p145
stable isotope
2P-1p082
Staphylococcus aureus
3P-1p087,
3P-2a159
starch3P-1a069, 3P-1a076
starch-production
3P-1p114
stationary phase2P-1p060
statistical analysis
1P-1p091
Stb5p
2P-1p065

Stenotrophomonas maltophilia 3P-1a036,
3P-1p028
stereolithography
1P-2p152
stereospeciﬁc antibody
3P-1a063
strain engineering
2P-2p142
streptavidin
2P-1p023, 3P-1a044
Streptomyces
1P-1p014, 1P-1p123,
2S-Ep05, 3P-2a149, 3S-Cp02
Streptomyces cattleya
3P-2a151
Streptomyces lividans
2P-2p142,
3P-2p143
Streptomyces sp.
1P-1p015, 1P-2p174
stress2P-1p046, 3P-1a010
stress related compounds
3P-1p085
stress resistance
2P-1p081
stress response
1P-1p069, 2A-Dp01
stress response signaling
3P-1p112
strontium
3P-2p147, 3P-2p154
structural analysis 2P-2p171, 3P-1a054
structural equation modelling 3S-Cp06
styrene3P-2p171
sub-critical water pretreatment 3P-1a066
subcellular localization
3P-1p008
subcritical water pretreatment 3P-1a067
substitution of amino acids
3P-2a166
Substrate speciﬁcity
1P-1p008,
2P-1p001, 2P-1p008,
3P-1p047, 3P-1p061
succinate
1P-1p064, 2P-1p061
Sugar beet pulp
3P-1a126
sugar chain
1P-2p144, 2P-2p148
sugar extraction
1P-1p118
sulfate reducing bacteria
1P-1p112
Sulfated polyphenol
3P-2a183
Sulfotransferase
3P-2a183
sulfur
1P-1p061
sulfur metabolism 1P-1p060, 1P-1p062,
1P-1p063, 2P-1p012
sulfur-oxidizing bacteria
3P-1a112
sulphury ﬂavour
2P-1p070
SUMO2
3P-1p024
supramolecular nanostructure 2S-Ca03,
3P-1p059
surface display
2P-2p143
surfactant
3P-1a062
swine manure
1P-1p131
symbiosis
3P-1a114
Synechococcus
3P-1p044
Synechocystis
2P-1p064
synechocystis sp. PCC 6803 3P-1a083
synthetic biology 1P-1p025, 1P-1p068,
2P-2p181, 2P-2p182,
2S-Ba05, 3P-1a032,
3P-1a083, 3P-2a184, 3S-Cp04
synthetic genetic circuit
3P-2a184
synthetic metabolic pathway 1P-1p058,
3P-1a082
Systematic feedback isolation 3P-1a104

T
T-DNA
3P-1p012
TAA
2P-2p143
Talaromyces cellulolyticus
1P-1p026
TALEN
1S-Ep01
TALENs
3P-1p005
Tapered stencil for cluster culture(TASCL)
1P-2p142
targeted integration 1P-2p157, 1S-Ep03
targeted proteome analysis
2P-1p053
tartaric acid
2P-1p101
taxonomy
1P-1p074, 3P-1a002
TCA cycle
1P-1p067, 2P-1p123
TCR
1S-Ep05
technology
3S-Ap05
telemetry2P-1p095
temperature
1P-2p164
terephthalate
3P-1p101
termite3P-1a026
terpenoid
2S-Ba01, 3P-1p030
4-tert-butylphenol
2P-1p109
tetrathionate hydrolase
2P-1p012
therapeutic antibody
3P-1a063
thermal adaptation
1P-1p044
thermal degradation
1P-1p007thermal stability
1P-1p001, 2P-1p025
thermo-torerance
1P-1p043
Thermococcus kodakarensis 3P-1p019
thermophile
1P-1p031, 3P-1a073,
3P-1p118
thermophilic
1P-1p047
thermostability
1P-1p011, 1P-1p026,
2P-1p003, 3P-1p020,
3P-1p041, 3P-1p055, 3P-2a173
thermostable enzyme
1P-1p014,
3P-1a041
thermotolerance
1P-1p044
Thi7
2P-1p066
thiamine
2P-1p066
ThioﬂavinT
3P-1a113
thiosulfate dehydrogenase
3P-1a071
thraustochytrid
3P-1a115
three dimension
2P-2p164
three-electrode system
2P-1p039
Tight junction
2P-2p177
time series analysis
1P-2p181
TiO2 nanoparticles
3P-1p126
tissue culture
2S-Ba04
tissue engineering 1P-2p149, 1P-2p182,
1S-Ap02, 2P-2p168,
2P-2p179, 2S-Cp04, 2S-Cp06
titanium dioxide
1P-2p136
TLR2
1P-1p101
toggle switch
1P-1p067, 1P-1p068
TolC
3P-1a012
tolerance
2P-2p132
toluene degradation
3P-2a154
total metabolite pool analysis 1S-Bp04

353

toxicity
3P-1a113, 3P-2p140
Toxin-antitoxin system
3P-1p043
Toyama Bay
3P-1p099
traditional fermented food2P-1p084
trans-3-hydroxyproline
1P-1p020
transcription
1P-2p165transcription factor
2P-2p142transcriptional factor
1P-1p025
transcriptional regulation
3P-1a009,
3P-1a033, 3P-1p009, 3P-1p023
transcriptional regulator
3P-2a142transcriptional regulator gene 3P-1p009
transcriptome
1S-Bp02, 1S-Bp04,
3P-1a064, 3P-1p030,
3P-1p032, 3S-Bp03,
3S-Bp04, 3S-Cp01, 3S-Cp02
transcriptome analysis
2S-Ba02,3P-1a109transfection
1P-2p133transformation
3P-1a037, 3P-1p021,
3P-1p022, 3P-1p031
transgene expression
2P-1p040
transgenic chicken
1P-2p165transgenic tobacco
2P-2p185transglycosylation
1P-1p010
Transistor
1P-2p180translation
2P-1p024, 2P-1p040,
3S-Cp02translation repression
2P-1p048,
2P-1p049
Translational Regulation
2P-2p181transmembrane domain
3P-1p058
transporter
1P-1p105, 2P-1p017,
3P-1a012, 3P-1p007
transribosylation
3P-2a181transthyretin
3P-2p137
tree bark2P-2p138
trehalose
1P-2p163, 2P-1p053
Tret1
1P-2p163
triacylglycerol
2P-1p011
trichloroethylene
2P-1p111
Trichoderma reesei
3P-1p016
Trichoderma sp.
2S-Ap04
tricholoma matsutake
3P-1a025
triglyceride
3P-1a103
Trp-His3P-1p052
TTC staining
1P-1p079
tumor immunotherapy
2P-2p159
tumor spheroid
1P-2p153
tungsten
3P-1a112
twitching motility
2P-1p101
two-dimensional gas chromatography
2P-1p073
two-phase partitining bioreactor
3P-2p135
type 1 secretion system
2P-1p018,
2P-1p029
Tyrosinase
3P-2a145
tyrosine phosphorylation
3P-1a047,

3P-1p064

Uubiquinol oxidase
3P-1a071
UCP1
3P-1a084
ultrasound irrdatiation
1P-1p076
ultraviolet
2P-2p163
uncultured bacteria
3P-2a153
undifferentiation status
3P-2p164
university-industry collaboration
1A-Aa01
urease3P-1a101
useful compounds
2S-Ba04
5’-UTR
2P-1p040

V
vacuole3P-2a134
Val-Gly
3P-1p051
valuable chemicals production 2P-1p062
vanillin
1P-1p024, 2P-1p049
vascular tissue
1P-2p143
vector
1S-Ep05
vhh antibody
3P-1p067
Vibrio fischeri
2P-1p039
VID24
1P-1p071
vimentin
2P-2p178
vinegar fermentation
1P-1p042
Virus
1P-2p133, 3P-1p091
visible-light photocatalyst
3P-1p128
visible-light responsible photocatalyst
3P-1p127
vitellogenin
2P-1p020
volatile explosive
1P-2p185
volatile fatty acids
3P-1a114W
wastewater
3P-1a103
wastewater treatment
2P-1p125,
3P-1a108, 3P-1p103,
3P-1p107, 3P-1p108
water-in-oil emulsion
3P-2a171
wax ester
3P-1p119
weed waste
3P-1a129
wettability
1P-2p182
wheat bran
1P-1p097
wheat noodle manufacturing 2P-1p117
Whey
1P-1p072, 2P-1p078
white-rot fungi
3P-1a125, 3P-2p158
white-rot fungus
3P-2p159
whole cell biocatalyst
3P-1p124
whole genome ampliﬁcation 1P-2p177
whole genome sequence
3P-1a025
whole genome sequencing
3S-Bp01
whole organ engineering
1P-2p139
woody biomass
3P-1a124
wound healing
3P-2a166

X
X-ray crystallography

2P-1p009

xylanase
1P-1p019
xylitol
1P-1p125, 1P-1p127
xyloe fermentation
1P-1p126
xyloglucan
1P-1p010
xylose1P-1p119, 3P-2p161
xylose fermentation
3P-1a065
xylose isomerase 1P-1p115, 3P-2p141
xylosidase
3P-2p141Yyeast

1P-1p076, 1P-1p095, 1P-1p096,
2P-1p046, 2P-1p050, 2P-1p051,
2P-1p076, 2P-1p089, 2P-1p118,
2S-Aa02, 2S-Aa04, 3P-1a001,
3P-1a032, 3P-1a053, 3P-1a110,
3P-1p026, 3P-1p103, 3S-Ap03
YNL134C
2P-1p076

Z
zero emission
zinc
zymography
Zymomonas mobilis

1S-Cp02
2P-2p157
3P-1a046
2P-1p078

355

ランチョンセミナー
本大会でのランチョンセミナーは事前予約制で行います．申し込み締め切りは，9 月 14 日（水）です．あらかじめ大会ホームページより希望日のランチョンセミナーを予約してください（定員になり次第締切ります）．
事前登録をされた方は，登録後に送られる通知メールを印刷してご持参ください．当日は，10:30 までに大会受付で通知メールをご呈示の上，整理券をお受け取りください．混乱を避けるため 11:35（30 日は 11:20）までには各ランチョンセミナー会場へお越しください．10:30 までに整理券に引き換えなかった場合，事前予約された
ランチョンセミナーに参加できなくなる可能性があります．あらかじめご了承ください．なお，当日空席がある場合に限り，予約なしでも入場できる可能性がありますので，10:30 〜 11:30 までは大会受付，11:30（30 日
は 11:15）以降は講演会場にお越しください．

9 月 28 日（水）（11：45 ～ 12:45）
1LA1

タカラバイオ株式会社

富山国際会議場

3 階  A 会場−クローニングから発現・精製まで−
タンパク実験を強力に押し進めるツールのご紹介

1LC2

株式会社島津製作所

ANA クラウンプラザ富山 3 階  C 会場

メタボロミクスを用いた食品及び培養プロセス評価法の紹介

1LE3

株式会社エービー・サイエックス ANA クラウンプラザ富山 3 階  E 会場

State-of-the Art Characterization of Biopharmaceuticals Using High Speed and High Resolution
Mass Spectrometry（高速・高分解能 MS による最新のバイオ医薬品の特性解析 )9 月 29 日（木）（11：45 ～ 12:45）
2LC1

株式会社シクロケムバイオANA クラウンプラザ富山 3 階  C 会場

Inﬂuence of gamma cyclodextrin encapsulated nutraceuticals on energy expenditure,
mitochondrial function and glucose metabolism（シクロデキストリン包接技術の可能性）
2LD2

アジレント・テクノロジー株式会社

ANA クラウンプラザ富山 3 階  D 会場

バイオ医薬品の多角的な特性解析

2LE3

ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社
ANA クラウンプラザ富山 3 階  E 会場
物質生産におけるメタボロミクスの活用例

9 月 30 日（金）（11：30 ～ 12:30）
3LA1

東ソー株式会社

富山国際会議場

3 階 A 会場

ファージライブラリを使った機能性抗体・ペプチドの分子設計と抗体精製、医薬品創製への展開

3LC2

サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社
ANA クラウンプラザ富山 3 階  C 会場
標的成分の効果的な分離と検出：低分子から高分子まで分析システム一挙公開

3LE3

日本ウォーターズ株式会社

ANA クラウンプラザ富山 3 階  E 会場

次世代インフォマティクスプラットホームによるバイオ医薬品の特性解析

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第68回日本生物工学会大会

1LA1-クローニングから発現・精製まで-タンパク質実験を強力に押し進めるツールのご紹介
タカラバイオでは、目的遺伝子のクローニングからタンパク質発現、精製まで、タンパク質実験をトータルサポートする関連製品を取り揃えています。
クローニングでは制限酵素不要のクローニングキット『In-Fusion』があり、タンパク質発現では大腸菌や昆虫細胞・ヒト細胞を使用したシステムから無細胞タンパク質合成システムまで、様々な発現系を取り揃えています。
Hisタグ融合タンパク質の精製には、次世代メンブレン技術を用いて迅速に精製できる革新的なキット『Capturem His-Tagged Puriﬁcation Kit』が威力を発揮します。
『Capturem His-Tagged Puriﬁcation Kit』は、バクテリアと哺
乳類細胞ライセートの両方に使用でき、室温、最速 5 分で精製が完了します。
また、従来の金属レジンでは対応が難しい幅広い条件に適用でき、変性条件下での使用も可能で、EDTA、還元剤、グリセロールなどの添加剤を含む条件下でも優れた性能を発揮します。
本セミナーでは、タカラバイオが提供するタンパク質実験を強力にサポートするユニークな関連製品についてご紹介します。

日 時：9 月28日（水）11：45-12：45

会 場：富山国際会議場 3F A 会場（メインホール）
演 者：井上 晃一（タカラバイオ 営業部）

東京支店
TEL 03-3271-8553 FAX 03-3271-7282
関西支店
TEL 077-565-6969 FAX 077-565-6995
テクニカルサポートライン
TEL 077-565-6999 FAX 077-565-6995
Websitehttp://www.takara-bio.co.jp
Facebook
http://www.facebook.com/takarabio.jp

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第68回 日本生物工学会大会

株式会社島津製作所

ランチョンセミナー
日時場所

9月 28日（水）11：45～12：45

C 会場（ANAクラウンプラザホテル富山 3F）1LC2

メタボロミクスを用いた食品及び培養プロセス評価法の紹介
生体中の代謝物を網羅的に解析するメタボロミクスは、食品機能性の評価や細胞培養プロセスの有効な解析手法としても期待されています。本講演では、質量分析装置と代謝物分析用データベースを用いた効果的メタボロミクス手法と食品解析及び、培養プロセス評価への応用事例を紹介いたします。

演者渡辺 淳／中西 豪
株式会社島津製作所 分析計測事業部
ライフサイエンス事業統括部 MSビジネスユニット

豊田 健一
株式会社島津製作所 分析計測事業部
ライフサイエンス事業統括部 細胞事業開発室

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第 68 回日本生物工学会大会
サイエックス ランチョンセミナー
日時

9 月 28 日（水） 11：45-12：45
会場 富山国際会議場 -ANA クラウンプラザ富山

SCIEX

QTOF システムと BioPharmaView™ソフトウェアを使用したバイオ医薬品特性解析例
横山 亮（サイエックス）
バイオ医薬品の分析では、メジャーなピーク中からマイナーなピークの構造解析や定量解析が求められため、その複雑性に対応するための広いダイナミックレンジ、定量再現性、データ取得スピードが必要となります。
また、膨大なデータをマニュアルで解析をすることは非生産的であり、専門的なノウハウを詰め込んだ専用の解析ソフトウェアが必要となります。今回のセミナーでは、QTOF システムと BioPharmaView™ソフトウェアを活用したバイオ医薬品の不均質性を解析するワークフローをご紹介いたします。

招待講演

State-of-the Art Characterization of Biopharmaceuticals Using
High Speed and High Resolution Mass Spectrometry
Head of R&D Division and Director of Center for Biomedical Mass Spectrometry,
Diatech Korea Co., Ltd., Seoul, Korea

Je-Hyun Baek
Mass Spectrometr y has been increasingly recognizing as a critical tool for structuralcharacterization of biopharmaceuticals such as er y thropoietin (EPO), antibody- drug
conjugates, and new protein drugs. Full characterization of biopharmaceuticals is essential
for the CMC (Chemistry, Manufacturing, and Controls) process in the biologics development.
In general, protein characterization is achieved by mass spectrometry and includes various
qualitative analyses: intact protein, amino acid sequence, enzymatic peptides, disulfide
linkages, carbohydrates, various post translational modifications, and so on. Several
applications based on high resolution mass spectrometry is increasingly in high demandowing to their greater reliability, assessment, and safety (e.g. contamination of host-cell
proteins) for developing drugs in the CMC process. Here, I would like to introduce good
examples of protein characterization, and how it can be completed by high resolution mass
spectrometry in advance of clinical trials.
本社：〒140 - 0001 東京都品川区北品川 4 -7- 35

株式会社エービー・サイエックス

御殿山トラストタワー 21 F

TEL：0120（318 ）551 FAX：0120（318）040
大阪：〒531- 0072 大阪府大阪市北区豊崎 3 -19 - 3 ピアスタワー

http:www.sciex.jp

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MKT13- 403A

360

第 68 回日本生物工学会大会（2016）

2LC1

株式会社シクロケムバイオ ランチョンセミナー～シクロデキストリン包接技術の可能性～
Ｒ‐αリポ酸‐γ‐ＣＤ包接体のエネルギー産生促進δ‐トコトリエノール‐γＣＤ包接体の脳機能改善2016 年 9 月 29 日（木） 11:45 ～ 12:45

座長

松郷

Ｃ会場

誠 一 先生

金沢大学
理工研究域

自然システム学系

教授

講演者 Prof.Dr.Gerald RimbachInstiute of Human Nutrition and Food Science University of Kiel

Ｒ‐α‐リポ酸やδ‐トコトリエノールなどの機能性成分は安定性や吸収性が低いといった理由により食品への応用が困難ですが、環状オリゴ糖の 1 つである

「γ‐シクロデキストリン包接」
により問題を解決できる事例があります。
本セミナーではそのような包接化された食品素材が発揮する機能性についてご紹介いたします。
また、ブラジル産グリーンプロポリスの最新研究成果も加えてご紹介いたします。

-シクロデキストリンの機能を最大限に発揮する-

株式会社シクロケムバイオ
URL:www.cyclochem.com/cyclochembio

東京本社 :Tel.03-5614-7147
神戸本社 :Tel.078-302-7073

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2LD2

第68回 日本生物工学会大会

アジレント・テクノロジー
ランチョンセミナー
共催:第68日本生物工学会大会／アジレント・テクノロジー株式会社

日 時：2016年9月29日（木）会 場：D会場（ANAクラウンプラザホテル富山 3階）
バイオ医薬品の多角的な特性解析
アジレント・テクノロジー株式会社
アプリケーションセンター 瀬崎 浩史
HPLC、LC/MSおよびCE/MSを用いたバイオ医薬品の特性解析事例を紹介いたします。
具体的には以下の3点になります。
① 2D-LC（イオン交換-SEC、HIC-逆相）とQ-TOFを組み合わせたオンライン脱塩自動化ソリューション
② アナライザ感覚で誰もが簡単にADCのDAR (Drug Antibody Ratio)をレポート可能な
Walkup LC/Q-TOF③ジスルフィド結合の掛け違いを容易に見い出す新BioConfirmソフトウェア
アジレントは核酸医薬の受託製造設備を持っています。
核酸医薬をはじめとした中分子分析事例、核酸配列を同定するユニークなソフトウェア
Agilent Oligonucleotide Sequencer (AOS)にも触れます。
Keyword: 抗体医薬、バイオ医薬品、ADC、糖鎖、核酸医薬、中分子、ジスルフィド結合
Key technology: HPLC, LC-MS, CE-MS, 2D-LC、脱塩Key point: 特性解析、省力化、自動化、Walkup

アジレント・テクノロジー株式会社

Tel:0120-477-111
email_japan@agilent.com

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第６８回

日本生物工学会

ヒューマン･メタボローム･テクノロジーズ社

2ＬＥ3
ランチョンセミナー

物質生産における
メタボロミクスの活用例
29 （木）11：45～12：45

2016年9月

講演者

日

味の素株式会社
バイオ・ファイン研究所
福井 啓太様植物プラスチックの原料として注目されているコハク酸は、安価な糖蜜から微生 物の力を利用した発酵によって生産することができます。コハク酸発酵では、好 気条件下で菌体を生成し、嫌気条件下でコハク酸発酵を行うプロセスを採用して います。発酵生産では、糖蜜から目的物を効率的、且つ安定的に生産することが 重要ですが、コハク酸発酵は培養が安定しないことが課題でした。
今回のランチョンセミナーでは、発酵におけるメタボロー
ム解析の活用例とし て、トランスクリプトーム解析と組み合わせた、コハク酸発酵における安定化因 子の探索・同定と、菌株改良への利用について報告します。

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第 68 回日本生物工学会
日本ウォーターズ株式会社

ランチョンセミナー
日時： 9 月30 日（金）11：30 ～12：30
会場： E 会場（ANA クラウンプラザホテル富山 3F）
講演番号：3LE3

次世代インフォマティクス
プラットホームによるバイオ医薬品の特性解析
信頼性の高いインタクトタンパク解析、ペプチドマッピング、遊離糖鎖解析などによるバイオ医薬品の特性解析を効率的に行うための次世代のインフォマティクスツールである UNIFI バイオ医薬品システム
ソリューションは、UPLC/MS を用いた頑健性の高い特性解析のために必要な機能を包括的に統合した、システムソリューションです。
本 セ ミ ナ ーで は、UNI F I バイオ 医 薬 品 シス テム シ
リューションのコンセプトおよび、UPLC/MS を用いた
バイオ後続品の特性解析について実際の測定例を交えながらご紹介します。

日本ウォーターズ株式会社 www.waters.com
東京本社 〒140 -0001 東京都品川区北品川 1-3-12 第 5 小池ビル TEL 03-3471-7191（代表） FAX 03-3471-7118
大阪支社 〒532-0011 大阪市淀川区西中島 5-14-10 新大阪トヨタビル 11F TEL 06-6304-8888（代表） FAX 06-6300-1734
ショールーム東京

大阪

サービス拠点

東京

大阪

札幌

福島

静岡

富山

名古屋

徳島

福岡

第
回

68

2 0 16（平成 28 年度）

日本生物工学会大会講演要旨集

第 68 回

日本生物工学会大会
講演要旨集


二〇一六（平成会期2016 年 9 月 28 日（水）～ 30 日（金）会

場 富山国際会議場（富山市大手町 1 番 2 号）

ANA クラウンプラザホテル富山（富山市大手町 2 番 3 号）

第 68 回日本生物工学会大会講演要旨集
2016 年 8 月 25 日発行
発行所◦ 表紙写真について（左より）◦

おわら風の盆 , 黒部峡谷鉄道 , 雨晴海岸 , 雷鳥 , みくりが池 , 黒部ダム

日本生物工学会

公益社団法人 日本生物工学会〒 565-0871 大阪府吹田市山田丘 2-1
大阪大学工学部内
TEL. 06-6876-2731 FAX. 06-6879-2034
E-mail: info@sbj.or.jp
http://www.sbj.or.jp

年度）

28

公益社団法人日本生物工学会