小麦アレルギーの包括的ゲノム関連解析と T 細胞エピトープの同定

研究課題名

小麦アレルギーの包括的ゲノム関連解析と T 細胞エピトープの同定

フリガナ

ノグチ

代表者名

野口エミコ
恵美子

所属機関（機関名）筑波大学医学医療系（役職名）教授

氏
共同研究者

名（フリガナ）

矢上 晶子（ヤガミ アキコ）

所属機関・役職名

役割分担

藤田医科大学ばんたね病 患者サンプルを使用した免疫院総合アレルギー科・教授 応答性解析

Fukunaga K, Chinuki Y, Hamada Y, Fukutomi Y, Sugiyama A, Kishikawa R,Fukunaga A, Oda Y, Ugajin T, Yokozeki H, Harada N, Suehiro M, Hide M,
本 助 成金 によ る 発 Nakagawa Y, Noguchi E, Nakamura M, Matsunaga K, Yagami A, Morita E,
表論文，学会発表 Mushiroda T. Genome-wide association study reveals an association between theHLA-DPB1*02:01:02 allele and wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis.
Am J Hum Genet, 2021 DOI: 10.1016/j.ajhg.2021.06.017

研究結果要約
我々はこれまで、国内多施設共同研究により世界初となる経皮感作加水分解小麦アレルギーの疾患感受性遺伝子を HLA-DQ 領域と RBFOX1 の２遺伝子座に同定した(Noguchi et al,

J Allergy ClinImmunol, 2019）。さらに、非加水分解型の成人小麦アレルギーについても網羅的遺伝要因の探索を行った。非加水分解型の小麦アレルギー遺伝要因の研究の国内多施設共同研究に参加し、非加水分解型の小麦アレルギーのリスクアレルとして HLA-DPA1*01:02-DPB1*02:01 ハプロタイプ、抵抗性と関連するハプロタイプとして HLA-DPA1*02:01-DPB1*09:01 を検出した。本研究ではさらに、非加水分解型の小麦アレルギーの易罹患性と抵抗性に関連する HLA アレル情報と、in vitro assay である HLA クラス
II 結合ペプチド探索法を組み合わせた解析法を用いて小麦アレルゲンの T 細胞エピトープ領域の探索を行い小麦アレルギー感受性 HLA が提示しうる領域を検出した。

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小麦アレルギーの包括的ゲノム関連解析と T 細胞エピトープの同定域を含む全ゲノム関連解析による疾患感受性・抵

研究目的

抗性アレルの探索(野口)

小麦は食物アレルギーの原因として鶏卵、牛乳に次ぎ第 3 位であり、小麦の消費量の増加にともない増加傾向にある。欧米では小麦に対する不耐

1-1 非加水分解型小麦アレルギーのゲノム解析症であるセリアック病や非セリアックグルテン非加水分解型小麦アレルギー患者検体の収集

感受性疾患の罹患率が高く、小麦タンパク質主成は藤田医科大学病院および関連施設で行った。本分であるグルテンの除去食材や啓蒙活動なども研究に参加同意を得られた患者から血液サンプ盛んにおこなわれている。本邦における食物依存ルを収集し、抽出した DNA を使用して SNP ア性運動誘発アナフィラキシーの約 60％が小麦にレイによる遺伝子型決定を行った。SNP アレイよるものであり、また、マスメディアの影響で医はイルミナ社の Asian Screening Array（ASA）学的必要のないと思われる人々にもグルテンフを使用した。コントロールは自施設で保有する一リーダイエットが人気となっていることから、小般健常人サンプルを使用した。本研究は筑波大学、

麦に対する不耐性を生じうる個人を同定するこ藤田医科大学、および関連施設の倫理委員会の承と、エビデンスに基づいた適切な治療法を提供す認を経て行われた。HLA 領域および HLA アレることが求められている。

ルの推定については SNP2HLA 1)を用いた HLAインピュテーションにより行った。

これらの背景から、本研究では、小麦アレルギー及び関連形質のゲノム解析による包括的な疾1-2 小麦アレルゲン感作のゲノム解析

患関連遺伝子を同定すること、また、非加水分解型の一般的な小麦アレルギーの主要小麦アレル臨床症状とゲノム情報を統合させたバイオバ

ゲンの T 細胞エピトープを同定することを目的ンクである東北メディカルメガバンク機構 2) にとして研究を行った。ヒト遺伝要因の探索と、小おいて蓄積されているデータを用いて、小麦特異麦アレルゲン上の抗原領域の情報を統合するこ的 IgE 陽性に関連するゲノム領域を解析した。筑とで、食物のアレルゲンとヒト免疫系との相互作

波大学倫理委員会の承認後に東北メディカルメ用をこれまでにない形で俯瞰することが可能とガバンク機構にデータ利用申請を行った。データ

なり、新しい治療薬・免疫療法アプローチの開発

利用申請承認後に分譲されたデータを使用して、につながると期待される。これらの研究により、小麦アレルゲン感作と関連する遺伝子型の検出

将来的には小麦アレルギーの免疫療法開発へのを行った。小麦特異的 IgE については多項目アレ基盤となると期待される。

ルゲン特異的 IgE 測定法である MAST-33 により得られたデータから小麦特異的 IgE について研究計画及び研究手法抽出し、ルミカウント 2.78 以上を感作陽性、2.77[１]各種小麦アレルギーに対する HLA class II 領以下を感作陰性とした。分譲された遺伝子型情報と小麦アレルゲン感作について関連解析をロジ

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小麦アレルギーの包括的ゲノム関連解析と T 細胞エピトープの同定

結合親和性を予測するソフトウェア HLA-BAP 4)スティック回帰分析により行った。

を用いて、小麦アレルギー感受性と関連する[2] HLA アレル型の関連解析情報と HLA ペプチ

HLA クラス II アレルに強く結合しうる領域を対ド結合アッセイを用いて免疫原性ペプチドを検象抗原中に探索した。また、近年、結合予測アル出する (野口)ゴリズムの開発が進展し、特定の HLA アリルに抗原提示細胞に取り込まれた食物アレルゲンついては比較的高精度に結合ペプチドを予測しはペプチドに分解され、自己の HLA class II とうることが明らかになりつつある。そこで本研究

ともに T 細胞へ提示され、免疫応答が開始されでは代表的な結合予測アルゴリズムる。HLA class II は個人間での多様性が大きく、(NetMHCIIpan4.0)5)(http://www.cbs.dtu.dk/ser保有する HLA クラス II アリルにより、抗原提示vices/NetMHCIIpan/)を用いて、小麦アレルギーしやすいペプチドが個人間で異なる。そのため、感受性 HLA クラス II が結合しうる領域を対象

食物アレルゲンの T 細胞エピトープを同定する抗原中に探索した。

ことは免疫療法などの脱感作を目指す治療法開2-2: HLA と小麦抗原の結合アッセイ発の第一歩となる。本研究では、ゲノム解析で得られた疾患感受性・抵抗性 HLA アレル情報を基上記で予測した HLA 結合領域および、非加水に、研究協力者である宮寺が開発した HLA 発現分解小麦アレルギーの研究において関連が示唆系を利用した結合アッセイ法を用いて小麦アレされている抗原部位を対象として、HLA 結合アルゲンコンポーネントの T 細胞エピトープ候補ッセイを行った。HLA 結合アッセイは研究協力の探索を行った。オメガ 5 グリアジンを含む、複者の宮寺が確立した HLA 発現アッセイを用いて数の小麦コンポーネントを対象として、以下の方行った。この測定系では HLA クラス II β 鎖と、法で免疫原性ペプチド候補領域のスクリーニン解析対象となる抗原ペプチドとの融合タンパクグを行った。

質を作成し、培養細胞株での表面発現量を定量する 6)。HLA class II α 鎖の安定発現株に候補ペプ

2-1: HLA 結合領域候補の絞り込み

チドと HLA class II β 鎖のトランスフェクショ候補となる小麦抗原は高分子タンパク質であンを行い 7)、小麦抗原に含まれるペプチドと疾患るため、これらのすべての領域を対象としてＨ感受性・中立性・抵抗性アレルとの結合実験を実LA 結合測定を実施することは現実的ではない。

施した。この HLA 結合アッセイ法では、従来のそこで、まずドッキング・シミュレーションによHLA-ペプチド相互作用解析で測定困難な疎水性る HLA 結合領域探索を行った。ドッキング・シ領域の結合解析も可能である。小麦アレルゲンはミュレーションソフトウェア MOE (MOLSIS

疎水性アミノ酸残基を多く含み、同一のアミノ酸Inc.)に搭載された HLA の立体構造予測用ソフト残基の繰り返し配列から構成されるため、合成ペウェア HLA modeler 3)及び HLA とペプチドのプチドを用いた従来の HLA 結合アッセイの実施

44小麦アレルギーの包括的ゲノム関連解析と T 細胞エピトープの同定は困難であり、本手法では従来法で検出が難しいに多く、さらに男性では 40 代以降に感作率が上T 細胞エピトープを見出せる可能性がある。

昇する傾向が観察された。全ゲノム関連解析では有意水準（P < 5×10-8）を満たす関連については[3]患者サンプルの収集と非加水分解小麦アレル検出されなかった。

ギーの免疫応答性の解析 (矢上)非加水分解型の成人小麦アレルギーの免疫原[2] HLA アレル型の関連解析情報と HLA ペプチ性の解析のため、患者血清を用いた小麦の 2D-ド結合アッセイを用いて免疫原性ペプチドを検Western Blotting を施行するとともに、小麦由来出する (野口)リコンビナントアレルゲンを ELISA と好塩基球
2-1: HLA 結合領域候補の絞り込み活性化試験で評価した。

ドッキング・シミュレーションおよび、結合予結果と考察

測[１]各種小麦アレルギーに対する HLA class II 領(NetMHCIIpan4.0)5)(http://www.cbs.dtu.dk/ser

域を含む全ゲノム関連解析による疾患感受性・抵

vices/NetMHCIIpan/)を用いて、小麦アレルゲン抗性アレルの探索(野口)結合候補領域を予測した。1-1 で明らかになった、

アルゴリズ

ム

小麦アレルギー感受性・抵抗性と関連する HLA
1-1 非加水型小麦アレルギーのゲノム解析

ク ラ ス II （ リ ス ク ア レ ル HLA-DPA1*01:03-

非加水分解型の成人小麦アレルギー患者サン

DPB1*02:01、抵抗性アレル HLA-DPA1*02:01-

プ ル を 使 用 し て 全 ゲ ノ ム 関 連 解 析 と HLA

DPB1*09:01）および、東アジア集団に高頻度にimputation を行い、疾患感受性アレルとして存在し、小麦アレルギーとは関連しない中立性ア

DPB1*02:01 を検出した。非加水分解型小麦アレレル（HLA-DPA1*02:02-DPB1*05:01）を解析対

ルギーは罹患者の少ない希少疾患であり、単独施

象 と し た 。 リ ス ク ア レ ル HLA-DPA1*01:03-

設による解析では限界があることを考慮して国

DPB1*02:01 に強く結合することが予測された内多施設共同研究に参加した。リスクアレルとし

上位 11 種類のペプチドについて結合解析を行うて HLA-DPA1*01:03-DPB1*02:01 ハプロタイプ、こととした。

抵抗性と関連するハプロタイプとして HLADPA1*02:01-DPB1*09:01 が検出された 8)。

2-2: HLA と小麦抗原の 結合アッセイ
2-1 で選択した 11 種類の小麦アレルゲンペプ

1-2 小麦アレルゲン感作のゲノム解析

チドのうち、6 本のペプチドについて結合解析を解析対象となった 18,755 例のうち、MAST-33実施した。まず、ペプチドに相当する部分につい小麦 IgE 陽性例は 615 例、陰性例は 18,140 例であった。年齢別、性別による特徴としては、男性

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小麦アレルギーの包括的ゲノム関連解析と T 細胞エピトープの同定

図１

HLA と小麦アレルゲンペプチドの結合解析

ゲノム解析により同定した小麦アレルギーリスクアレル(DP0201 (HLA-DPA1*01:03-DPB1*02:01)),
中 立 性 ア レ ル （ DP0501 (HLA-DPA1*02:02-DPB1*05:01) ） , 抵 抗 性 ア レ ル (DP0901 (HLADPA1*02:01-DPB1*09:01))について、小麦アレルゲン中のペプチド(#1-6)の結合能を測定した(mean±SD, n ≧ 3 (DP0201, DP0501), n≦2 (DP0901))。て一本鎖 DNA を外部委託により合成した。次に、ている可能性が示唆された。結合が認められたペ一本鎖 DNA を鋳型として PCR を行い、DPβ鎖プチドのうち、最も強く結合したペプチド（#6)は、をコードする発現用プラスミドに挿入した。構築

ネ ガ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル (g9 ペ プ チ ド ：した発現プラスミドを用いて、HLA-DPα 鎖安定GGGGGGGGG）および 抵抗性アリル（ HLA-発現株に導入し、HLA の表面発現量を測定した。

DPA1*02:01-DPB1*09:01)、中立性アレル（HLA-

6 種類のペプチドのうち、2 本がリスクアレル

DPA1*02:02-DPB1*05:01）と比較して約 4 倍のHLA-DPA1*01:03-DPB1*02:01 と強く結合した。

細胞表面発現量を示した（図１）。以上の結果か

こ れ ら の 2 本 は 抵 抗 性 ア リ ル （ HLA-ら、ペプチド#4 が DP0201 拘束性 T 細胞エピト

DPA1*02:01-DPB1*09:01)、中立性アレル(HLA-ープである可能性が示唆された。

DPA1*02:02-DPB1*05:01）とは強い結合を示さ

上記に示すように本研究では 6 種類の候補ペ図１）。一方、6 種類のペプ

プ チ ド 中 、 ２ 種 類 が HLA-DPA1*01:03-

チドのうち、3 種類は結合予測上位であったにもDPB1*02:01 と強く結合することを見出した。今関 わ ら ず 、 リ ス ク ア レ ル HLA-DPA1*01:03-

回、解析対象としたペプチド領域は小麦アレルゲ

DPB1*02:01 を含むいずれのアリルについてもン中のごく一部である。そのため今後、より多く結合が認められず、ネガティブコントロール(g9の候補ペプチドについて解析を行うことにより、ペプチド：GGGGGGGGG）よりも低値を示した。

T 細胞エピトープ候補領域を多数、見出すことがそのため、これらのペプチド(#1-3)は HLA との出来る可能性がある。

なかった（添付資料

結合能を持たない、もしくは、ペプチドに含まれる配列が HLA の正常なフォールディングを妨げ46

小麦アレルギーの包括的ゲノム関連解析と T 細胞エピトープの同定

図２ 小麦の免疫ブロットと小麦タンパク質の免疫原性の解析
免疫ブロットで複数例に共通の IgE 抗原タンパク質を同定し、精製抗原を用いた ELISA 法で IgE結合性が評価された。好塩基球活性化試験を行い、タンパク質 A 及びオメガ 5 グリアジンの抗原性が確認された。

T 細胞エピトープは脱感作を誘導するうえで[3]患者サンプルの収集と非加水分解小麦アレル重要であり、小麦アレルギーに対する T 細胞エピギーの免疫応答性の解析 (矢上)2D-Western Blotting で複数例に共通して IgEトープが同定されれば難治性の成人発症小麦ア抗体が結合したタンパク質の ELISA では、非加レルギーに対して将来的なアレルゲンペプチド水分解小麦アレルギー症例に特異的な IgE 抗体免疫療法等への展開が期待できる。本研究では、の反応が認められた。また、好塩基球活性化試験

小麦アレルゲン中に HLA 結合領域を高確率で見の結果、当該タンパク質およびオメガ 5 グリアジ出すことができた。今後、さらに広範囲の領域にンは複数例において活性化（CD203c の発現）をついて同様の解析を行うことで、多数の HLA 提認めた。これにより、当該タンパク質が小麦アレ示領域を同定できる可能性がある。ヒト個体ではルギー症状の誘発に関与していることが強く示複数種類の HLA アレルが発現されているため、唆された(図２)。

病態の分子機序をさらに突き止めるためには、多様な研究手法により研究を展開する必要がある。

今後の研究活動について

例えば、特定の抗原領域によりアレルギーが誘発

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小麦アレルギーの包括的ゲノム関連解析と T 細胞エピトープの同定される分子機序を解明するためには、患者検体をInformatics Journal, 2020 (20): 1-4.

用いたＴ細胞解析や、特定の HLA を発現するマ

5) Reynisson B, Barra C, Kaabinejadian S,ウスモデルの開発などが必要である。また、免疫

Hildebrand W H, Peters B, Nielsen M.

解析により B 細胞エピトープ、T 細胞エピトープImproved Prediction of MHC II Antigen
Presentation through Integration and Motifが明らかになれば、これらの知見を基に、植物のDeconvolution of Mass Spectrometry MHC

バイオテクノロジー技術を応用しエピトープ部

Eluted Ligand Data. J Proteome Res, 2020

位を改変した新たな食物資源の開発や、リコンビ(19): 2304-2315.

ナントアレルゲンなどの医薬品開発など、実用性

6) 宮寺浩子, 野口恵美子, 溝上雅史, 徳永勝士.の高い新規治療・予防戦略の開発が可能になるこHLA クラス II 結合ペプチドの探索・同定法とが期待される。の開発. 日本臨床免疫学会会誌, 2017 (40):35-39.

参考文献

7) Miyadera H, Ohashi J, Lernmark A,

1) Jia X, Han B, Onengut-Gumuscu S, ChenKitamura T, Tokunaga K. Cell-surface

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Fukutomi Y, Sugiyama A, Kishikawa R,

2) Fuse N, Sakurai-Yageta M, Katsuoka F,

Fukunaga A, Oda Y, Ugajin T, Yokozeki H,Danjoh I, Shimizu R, Tamiya G, Nagami F,Harada N, Suehiro M, Hide M, Nakagawa

Kawame H, Higuchi S, Kinoshita K, Kure

Y, Noguchi E, Nakamura M, Matsunaga K,S, Yamamoto M. Establishment ofYagami A, Morita E, Mushiroda T. Genome-

Integrated Biobank for Precision Medicine

wide association study reveals anand Personalized Healthcare: The Tohoku

association between the HLA-

Medical Megabank Project. JMA J, 2019

DPB1( *)02:01:02 allele and wheat-(2): 113-122.

dependent exercise-induced anaphylaxis.

3) Amari S, Kataoka R, Ikegami T, Hirayama

Am J Hum Genet, 2021

N. HLA-Modeler: Automated Homology
Modeling of Human Leukocyte Antigens.

本研究の一部は東北メディカルメガバンク

Int J Med Chem, 2013 (2013): 690513.といわてメディカルメガバンクよりデータ分

4) Kataoka R, Amari S, Ikegami T, Hirayama

譲を受けて行われました（2018-0040）

N. HLABAP: HLA Class I-Binding
Antigenic Peptide Predictor. Chem-Bio48