最近のトピックス

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最 近 の ト ピ ッ ク ス
イ法では，高感度で多量の遺伝子のデータを数値としてDNAマイクロアレイを用いた口腔腫瘍の診断
Diagnosis of the Oral Tumor UsingDNA Microarray得ることができます。

DNAチップ-マイクロアレイの用途
１．遺伝子発現解析
前述のごとく，マイクロアレイを用いると，一回の分

新潟大学大学院医歯学総合研究科 顎顔面口腔外科学分野

析で数千の遺伝子発現を調べることが出来ますので，い一わばグローバルな遺伝子発現解析を可能にします。たとDivision of Oral and Maxillofacial Surgery, Niigata Graduate

えば最近，ヒトの全ゲノム配列がほぼ決定し，今後はゲ

School of Medical and Dental Sciences

ノムから作り出される全ての蛋白質を調べあげること

Masaki Nagata, Ritsuo Takagi,Hideyuki Hoshina, Hajime Fujita

が，次の段階でのプロジェクトとして世界的に進められ

永田昌毅，高木律男，星名秀行，藤田ていくことになります。マイクロアレイはゲノムの中からエクソンの探索や転写産物の多様性解明にも用いられ

最近ゲノム．． ということばがよく聞かれます。研

究者がゲノムを正面切って扱うようになりたか？ていくでしょう2）。その他，薬物などの刺激に対する細何がかわっ胞の遺伝子発現変化の分析，トランスジェニックマウスという問いには，いろいろ答えがあると思いまやノックアウトマウスの遺伝子発現を調べることによっ

すが，最も基本的なことは情報量の爆発的増加と言えるて，ある遺伝子の変化に連動して動く遺伝子群の探索，のではないでしょうか。その変化に対応し，最近は遺伝病巣の遺伝子発現のプロファイルから診断や治療法，病子解析技術の高速，高効率化が様々な方面で進行してい因解明の糸口を探す，などの目的に多くの可能性をもっます。既に高速のシークエンサー，DNAチップ-マイクています。

アレイといった技術が実用域にありますし，さらに進化した小さな基盤上に血液などからの遺伝子抽出，増幅，２．遺伝子の多型解析による原因遺伝子の検索

シークエンシング，電気泳動，遺伝子多形や蛋白の検出

人の遺伝子には，蛋白の構造に直接影響を与える領域など，多機能を集積した臨床検査技術の開発がはじめらと，その蛋白の遺伝子の転写に影響を与える領域，無機れています。話が遠くに行き過ぎましたが，本稿では，能または機能が不明な領域が存在します。そのゲノムの今後様々な分野で一般化し活用されていくであろうマイ

す べ て の 範 囲 で 140万 ヶ 所 の single nucleotide

クロアレイ技術の紹介とともに，当科で現在進行中の遺polymorphism（SNP：単一塩基の違いによる多様性を伝子発現解析に基づいた口腔癌診断の試みについて話し示す個所）が存在し，うち6万程度がエクソンの中に，ます。

全エクソンの85%は近傍の5kb以内にSNPを有するといわれます3）。SNPには遺伝子の機能に直接影響しないもDNAチップ-マイクロアレイとは？のも多いはずですが，それによって近傍の遺伝子領域を型別に分類することができます。もちろんSNPの中には，名前のとおりガラスなどの基盤上にDNAプローブ

機能的あるいは構造的に遺伝子産物の機能に関与してい（配列のわかったDNA鎖）が数十ミクロンのスポットとる場合も考えられます。具体的にいえば，ある病気であして碁盤の目状に配置されていて，これに検出したいる酵素の遺伝子領域近傍のSNPが病気に耐性をもつ人でDNAを蛍光物質でラベルしてハイブリダイゼイション

はA型，かかりやすい人ではT型といった傾向として現（相補的に結合）させます。基盤上で各スポットのプロれるとします。この傾向を調べ上げることによってそのーブに結合した検体DNAをレーザー光で励起し，光の酵素が病気の原因遺伝子，あるいは関連する因子である強度として遺伝子の存在を検出します1）。ノーザンブロ

ことを絞り込んでいくことができます。ヒトのゲノムは，ットやサザンブロットといった従来の検出法では，分析全ての遺伝子領域における多型（遺伝子部品タイプのバしたい遺伝子をメンブレン上に固定し，それに一種類のリエーション）の組み合わせによって組み立てられていラベルした遺伝子プローブをハイブリダイズして遺伝子るといえます。となりのK君と僕はMSX1遺伝子のタイの存在を検出しました。それに対し数千におよぶ多数のプは共通で，そのまたとなりのSさんとはFGFR2遺伝子DNAプローブが微細な碁盤の目状に並ぶマイクロアレのタイプが同じだ，というようなことが起こっています。

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新潟歯学会誌

31（1）
：2001

すなわち，その遺伝子領域に限って，お互い共通の先祖（コントロールの正常粘膜標識cDNAとともに）ハイブを持っているということですが，それらは人の発生からリダイズし，遺伝子発現解析を行います。結果的に，図

成長，老化，罹患の過程で何かしらの影響を及ぼしてい１のような蛍光の強弱としての画像データが得られまるはずです。それが顔や背たけの違いや，かかってします。蛍光の強さは遺伝子の発現量に対応し，赤い色は癌った病気の違いに反映してきます。となりのK君と僕は組織で発現が高い遺伝子，緑色は正常組織で高いものを親戚でもないのになぜか鼻の形が似ている。Sさんとは表しています。黄色い発色は二つの組織が同じように発子供の頃喘息だったことが共通だ。というような形で反現している場合です。このシグナルの強弱はコンピュー映しているかもしれません。

タ解析ソフトで数値化され，両者の遺伝子発現比のデー

従来はこの遺伝子多型を制限酵素断片長（RFLP）やタが算出されます。図２は発現比（Cy3＝癌組織／繰り返し配列の長さ（ミニサテライト，マイクロサテラ

Cy5＝正常粘膜組織）の分布を示すヒストグラムです。

イト）の違い，DNA鎖がつくる高次構造の違い（SSCP）

対数表示でshadowingした右が増加，左が減少したグルで検出してきましたが，分析は多大な労力を要していまープを示し，これら発現比が2倍以上，あるいは2分の１した。もし前述のSNPをDNAチップで検出することが以下に変化した遺伝子を有意として選定します。図3は一般化すれば，ある患者の全ゲノム的SNP情報を一晩で腫瘍組織と正常粘膜の遺伝子発現比の分布を示すプロッ得ることが可能で，しかも一気に数千塩基の範囲まで，トです。中央のラインは1：1をあらわし，β-actinの発何かの形質に関連する遺伝子領域を絞り込むことも可能現量が一定と仮定して標準化に用いました。これらのになるかもしれません。その効率の差は徒歩とロケット

Dataを臨床診断や経過，病理組織所見と照らし合わせほどの差に匹敵します。もちろん，実現までには今後もることによって，一定の傾向を抽出していきます。

多大な時間と努力が必要になるはずですが，その対象と結果：様々の遺伝子が，口腔扁平上皮癌症例の間で共通なり得る疾患は，う蝕や歯周炎，口腔癌のリスクファクに増加，あるいは減少していることが見出されました。

ター，抗生剤や抗癌剤の代謝能，患者の顔の形や成長パ

その中で悪性腫瘍の予後に重要な意味をもつ転移に関連ターンの傾向など，私たちが臨床で直面するあらゆる疑して，従来盛んに研究されてきているmatrix問と関係しています。

metalloproteinase（MMP）について，転移や再発の有無との関係を検討してみましたので，一例として紹介し3．私たちが行っている口腔癌組織での遺伝子発現解析ます。結果を付表に示します。表中の数値は正常粘膜に身近な例として私達が実際に始めている研究を紹介し対する癌組織での遺伝子発現の倍率です。ここで示す8ます。

症例は歯肉癌，舌癌，口底癌，頬粘膜癌を含み，病期も背景と目的：癌の治療では，初期の診断で腫瘍の増殖性10㎜以下の小さなものから進展癌を含む雑多なものでや発育の傾向，転移性，抗癌剤や放射線治療に対する感す。左のグループはリンパ節転移あるいは局所再発が見受性などの判定が，できるだけ正確に行われることがられた症例，右のグループは転移や再発のなかった症例

QOLの向上と良い予後を得るために重要です。しかし，です。差は一目瞭然で転移・再発群のMMP1とMMP3に現時点では同じ癌であっても，悪性度の判定や治療に対数十倍の発現の亢進があります。これらの遺伝子の発現する感受性についての完璧な予測は困難です。私たちは，

量は，病期の進展との間に明らかな相関は無さそうです

臨床の場でそういった疑問に，常に直面しなければなりので，腫瘍の進展に伴う間質誘導など組織構築の変化や，ません。腫瘍発生や病期の進行は，種々の癌抑制遺伝子新たな遺伝子変異の付加などには関係しておらず，むしの不活性化，癌遺伝子の活性化の結果であると言われてろ腫瘍そのものの固有の性質といえるかもしれません。

います。しかもそれぞれの変化は，一つ一つの癌で個別対照的に，従来リンパ節転移や腫瘍血管新生に関与するな様相を呈しているはずです。私たちはそれら癌関連遺とされているMMP2の発現量と転移の関連は見られず，伝子の発現プロファイルの変化を実際の腫瘍組織で解析腫瘍組織での増加傾向もあきらかでありません。また，

し，全ての癌にみられる共通の変化，あるいは特定の臨膜結合型のMMPsや，MMPを抑制しその機能と密接に床経過や組織所見と関係した遺伝子の動きをとらえるこ関わるとされるTIMPsも癌組織での量的変化は見られとによって，口腔腫瘍の分子レベルでの診断技術を開発ませんでした。

し，将来臨床の場で活用することをめざしています。

培養系などの実験と比較して，臨床癌を扱った研究の研究の対象と方法：口腔腫瘍の治療を受けた患者さんを難しい点は，対象としてみているのが腫瘍細胞だけでな対象とし，生検試料，手術時摘出物の一部を検体としてく，それを取り巻く雑多な間質細胞を含んでいる点です。

採取します。腫瘍組織から抽出したmRNAを逆転写反

しかし，マイクロアレイによる発現解析の利点は，従来応によって蛍光標識し，合成された標識cDNAを癌関連の分析の方法とは比べ物にならない多数の遺伝子発現情遺伝子約500種類をスポットしたマイクロアレイ上に報が得られることですので，今後それらの酵素の基質特−36−最近のトピックス

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異性や発現部位，あるいは作用部位などを考慮しつつ，

文

癌組織をじっくり検討することが必要です。それによっ献て，実際の臨床癌からしか得られない新しい所見を示すことができると考えています。加えて，今後より多くの

1）David J. Duggan, et al. Expression profiling using

症例の解析をすることによって，臨床検査としての有用cDNA microarrays. Nature genetics supplement

性についても検討を進めていきます。

21, 10-14, 1999
2）D.D. Shoemarker et al. Experimental annotationof the human genome using microarraytechnology. Nature 409 922-927 20013）The international SNP map working group, Amap of human genome sequence variation
containing 1.42 million single nucleotide
polymorphisms. nature 409 928-933 2001

図１付表
再発・転移症例
T2N1M0

T3N1M0T1N0M0T1N0M0

MMP１

47.0

49.4

52.5

35.2

MMP３

21.3

22.1

17.9

14.3

MMP２

1.60.4

1.1

1.0

MMP15

1.3

0.5

1.00.7

図２
再発・転移しなかった症例
T4N0M0T2N0M0T1N0M0T1N0M0

MMP１

10.9

5.9

7.2

13.7

MMP３

6.2

6.3

5.2

12.0

MMP２

2.2

0.40.5

1.2

MMP150.8

1.6

0.70.8

図３−37−