Photon Factory Activity Report 2014 #32(2015) B

BL-10C/2012G571

溶液中での翻訳開始因子の相互作用の研究
Studies on the interaction of translation initiation factors in solution
姚閔 1,2,*, Zouqi Gai2, 田中 良和 1,2, 清水 伸隆
1
北海道大学大学院先端生命科学研究院、2 北海道大学大学院生命科学研究院〒060-0810 北海道札幌市北区北 10 条西 83
物質構造科学研究所 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構
Min Yao1,2,*, Zouqi Gai2, Tanaka Yoshikazu1,2, Nobutaka Shimizu3

Faculty of Advanced Life Science, 2Graduate School of Life Science, Hokkaido University, Kita-ku,
Kita-10, Nishi-8, Sapporo 060-0810, Japan
3
Institute of Materials Structure Science, High Energy Accelerator Research Organization (KEK),Tsukuba, Ibaraki 305-0801, Japan1

1 はじめに	  翻訳反応は、リボソームが mRNA 上の遺伝情報から蛋白質を合成するプロセスであり、開始、伸長、終了段階の 3 段階からなる。真核生物の翻訳反応の制御は、栄養欠乏やストレス、発生や分化、老化や病気などの状態での遺伝子調節に対してとても重要であり、ほとんど翻訳開始段階で行われている[1][2]。
翻訳の 3 段階の中で最も複雑である真核生物の翻訳開始は、多くの翻訳開始因子(eIFs)が MettRNAiMet (開始 tRNA)、mRNA、リボソームと協調的に進行する。そのうち、eIF2 は、α、 β、 γサブユニットから構成され、他の翻訳開始因子eIF1、eIF1A、eIF3、eIF5 と結合した MFC (multifactor complex) を 形 成 し 、 GTP 依 存 的 に 開 始tRNA を 40S サブユニットに運搬する中心的な役割を果たす[3]。MFC が 40S サブユニットと結合してから、GAP (GTPase activating protein) である
eIF5 が eIF2 に結合している GTP の加水分解を刺激し、開始 tRNA と mRNA の間で開始 codonanticodon 塩基対が形成される際、eIF2 は eIF5eIF2-GDP 複合体としてリボソーム 40S サブユニットから解離する。その後、リボソームの 40Sが 60S サブユニットに結合し、80S リボソームが形成され、タンパク質合成の伸長段階が開始される。解離された eIF2-GDP は不活性型であり、
翻 訳 反 応 に 再 利 用 さ れ る に は 、 GEF (guaninenucleotide exchange factor) である eIF2B（サブユニットα、β、γ、δ、εの複合体）によって eIF2GTP へと変換する必要がある [4] 。そのときに、
eIF2B が eIF5-eIF2-GDP 複合体の eIF5 を置換して、eIF2B-eIF2-GDP 複合体を形成し、 eIF2-GDPを eIF2-GTP への変換反応を行う。これまでの研究により、eIF2β のＮ末端ドメイン (eIF2β-NTD)に K-box 領域（3 つのリジンリッチな領域）が、翻訳開始の異なる段階で eIF5 の C 末端ドメイン（ eIF5-CTD ） と eIF2Bε の C 末 端 ド メ イ ン（eIF2Bε-CTD）の AA box 領域（２つの芳香族/酸性残基リッチな領域）と相互作用することが知られている [5]。また、既報の eIF5-CTD（PDBID： 2FUL）と eIF2Bε-CTD（PDB ID：1PAQ）の構造比較から、この二つのタンパク質はよく似た二次構造とトポロジーを持っているが、三次構造の配向や AA box の領域の表面が異なってい る こ と が 分 か っ た 。 よ っ て 、 eIF5-CTD とeIF2Bε-CTD は、異なる結合様式で eIF2β-NTD のK-box 領域に結合することが示唆される。しかし、異なる標的タンパク質 eIF5 もしくは eIF2Bεはどのように eIF2βの同じ結合部位と相互作用するかはまだ解明されていない。そこで、我々はSaccharomyces cerevisiae 由来のこれらのタンパク質が溶液中に複合体を形成する状態を小角 X 線散乱により解析した。
2 実験
まず、大腸菌を用いてそれぞれのタンパク質の単体 eIF5-CTD、eIF2Bε-CTD、eIF2β-NTD)を発現し、各種クロマトグラフィーにより高純度に精製した。そして、精製した eIF2β-NTD、eIF5-CTD、eIF2Bε-CTD を混合し、ゲルろ過 クロマトグラフ
ィーで精製して eIF5-CTD)-(eIF2β-NTD)と(eIF2BεCTD)-(eIF2β-NTD) 複合体を再構築した。小角 X線散乱（SAXS）実験を行うため、各サンプル
eIF2β-NTD 、 eIF5-CTD 、 eIF2Bε-CTD 、 (eIF5CTD)-(eIF2β-NTD)、(eIF2Bε-CTD)-(eIF2β-NTD)を測定用の緩衝液(20 mM HEPES (pH 7.5), 30 mM
NaCl, 10% Glycerol, 1 mM DTT)に透析した。SAXSの測定を PF の BL10C にて行い，20℃で X 線損

Photon Factory Activity Report 2014 #32 (2015) B

傷による凝集を生じない測定条件を検討した上で、eIF2β-NTD、eIF5-CTD、eIF2Bε-CTD、(eIF5CTD)-(eIF2β-NTD)、(eIF2Bε-CTD)-(eIF2β-NTD)のそれぞれの溶液中の回折データを得た。また、
I(0)ref/cref の見積に標準サンプル Ovalbumin を用いた。それらのデータから Kratky プロットを計算した[6][7]。
3 結果および考察
タンパク質のフォールディング状態を反映する
Kratky プロットは図１に示している。eIF5-CTD、
eIF2Bε-CTD 、 (eIF5-CTD)-(eIF2β-NTD) 、 (eIF2BεCTD)-(eIF2β-NTD)の Kratky プロットは Q=0.050.1 の辺りにピークがある（フォールディング状態）ことに対して、 eIF2β-NTD の Kratky プロッ
トは Q>0.08 の領域に水平状態となり、unfolding状態を示している。また、eIF5-CTD と eIF2BεCTD のプロットは(eIF2β-NTD)との複合体と似てい る 形 と な っ て い る 。 よ っ て 、 eIF5-CTD とeIF2Bε-CTD の構造は、単体の状態と複合体の状態で変化が見られなかったのに対し、eIF2β-NTD
は、単体の状態では構造をとっておらず、そのパートナータンパク質（eIF5-CTD または eIF2BεCTD）に結合することによって構造が形成されたと い う 事 が 分 か っ た 。 つ ま り 、 eIF2β-NTD はIntrinsically disordered domain であり、同じ結合部位を用いて異なる反応段階で異なるタンパク質に図１.SAXS データにより計算した Kratky プロット結合することが示唆されている。	 	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	 	  	 * yao@castor.sci.hokudai.ac.jp	  	  	  	  	  	 4 まとめ我々は、溶液中の SAXS 小角 X 線散乱により、翻訳開始因子 eIF2β-NTD が同じ結合部位を用いて異なるパートナータンパク質 eIF5 もしくはeIF2Bεと相互作用するメカニズムを明らかにし、今後の翻訳開始メカニズムの研究に新たな知見を提供するることができた[8]。
謝辞
本研究は，北海道大学の北川弓枝さん，薦田圭介
博士，田中勲教授の協力によりこの場を借りてお礼申し上げます．
参考文献[1] G.Hernandez, et. al,Trends Biochem Sci, 35,63 (2009)[2] N. Sonenberg, A.G.Hinnebusch, Cell, 136,731 (2009).
[3] K. Asano, et. al, Genes Dev, 14, 2534 (2000).
[4] S.S. Mohammad-Qureshi, et. al, Biochem Soc Trans,36, 658 (2008).
[5] P.V. Alone, T.E. Dever, J Biol. Chem, 281, 12636(2006).
[6] M. Kataoka, et. al, J Mol Biol, 249 , 215 (1995).
[7] O. Glatter, O. Kratky, Academic Press, New York
[8] Z-q, Gai, et. al, BBRC 423, 515 (2012).