Photon Factory Activity Report 2014 #32(2015) B

AR-NW12A/2014G650

キナーゼタンパク質 DAPK と 2 種類の ATP 類似体複合体のX 線結晶構造解析
X-ray structure analyses of the complexes of kinase protein DAPK and 2 kinds ofATP-analog
松尾悠平 1・山口淳史１・田中伊知朗 2,3,*
1
茨城大学大学院理工学研究科, 〒316-8511 日立市中成沢町 4-12-1
2
茨城大工学部, 〒316-8511 日立市中成沢町 4-12-1
3
茨城大フロンティアセンター, 〒319-1106 東海村白方 162-1
Yuhei Matsuo1 and Atsushi Yamaguti1 and Ichiro Tanaka2,3＊
1
Graduate School of Sci. and Eng., Ibaraki Univ., 4-12-1, Naka-narusawa, Hitachi, 316-8511, Japan
2
College of Eng., Ibaraki Univ., 4-12-1, Naka-narusawa, Hitachi, 316-8511, Japan
3
Frontier Res. Center for Appl. Atomic Sci., Ibaraki Univ., 162-1, Shirakara, Tokai, 319-1106, Japan
1 はじめにDAPK(Death-associated-protein-kinase) は Ca2+/CaM活性型の Ser/Thr キナーゼである。このタンパク質は生体内で脱リン酸化されることで活性化し、アポトーシスを促進させる。これまでの研究で X 線結晶構造解析により DAPK のキナーゼドメインに含まれる ATP 結合領域の立体構造が明らかにされている[1]。 特筆すべき点は、ATP 結合領域には多数の水分子が存在しており、アナログ結合前後で内部に存在した水和水の半数以上がそのまま結合部位に保存されていることである。そのため、ATP 加水分解もしくはリン酸転移反応の際のエントロピーも含めたエネルギーの収支を議論するためのモデルに適している[2]。また、グリシンリッチループ(残基 20～25)と呼ばれる触媒作用に不可欠な領域において、ATPアナログとアミノ酸との相互作用により顕著な構造変化が見られ、これらが ATP の結合や ADP の放出に関与していると考えられている[3]。最終的には中性子解析による水素の有無や位置、そして水和構造における水分子の方位や結合状態を解明し、完全な立体構造を明らかにすることが目標であるが、X 線による非水素原子情報における阻害剤や基質の相互作用様式に関しての知見は、キナーゼそのもののリン酸基転移機構の詳細の解明や加水分解エネルギーの議論の発展や DAPK の阻害剤の開発などにも役立つものと期待される。そこで本研究では、DAPK と2 種類の ATP 類似体複合体の X 線結晶構造解析を行い、それぞれの ATP 結合部位の構造に着目した詳細な検討を行うことを目的とした。
2 実験
キナーゼドメイン(残基数 277)を大腸菌で大量発現させて精製した DAPK を使用した[2]。結晶化は、結晶化剤に(NH4)2SO₄、緩衝液に Tris-HCl (pH8.0)、ATP アナログに Sigma-Aldrich 製の ANP(AMP-PnP;
アデノシン 5’-(β,γ-イミド)三リン酸、A2647)とADP(アデノシン 5’-二リン酸、A2754)、そして金属として MgCl2 を用いて、293K の条件下でハンギン

グドロップ法により結晶化した。また、モル比がDAPK:アナログ：金属=1:6:60 になるように DAPK溶液にアナログと金属を加えて、それをタンパク質溶液とした。それぞれの結晶化条件を表 1 にまとめた。X 線回折実験は、KEK-PF AR-NW12A にて行い、不凍液は 30％エチレングリコール、温度は 100K で測定した。データ処理は HKL2000 により行い、また Phenix と Coot を用いてデータ解析を行った。
表 1. 2 種類の ATP アナログ複合体の結晶化条件
DAPK濃度(NH4 )2 SO4 濃度緩衝液
添加剤
ATPアナログ金属
DAPK:アナログ:金属(モル比)

結晶化方法
温度

5 [mg/ml]
5 [mg/ml]
1.25 [M]
1.0 [M]
20mM Tris-HCl (pH 8.0)150mM NaCl
ANP
ADPMg2+
1:6:60
ハンギングドロップ法
293 [K]

3 結果および考察
DAPK-ANP-Mg は 2.2Å 、 DAPK-ADP-Mg は
1.65Å の分解能のデータが得られた。
データ処理および解析の結果を以下の表 2 に記す。
表 2. データ処理・解析結果。（）は最外殻の値。
Space group
a [Å]
b [Å]
c [Å]
Resolution [Å]No. unique reflection
R mergeI/σCompleteness [％]R work [Å]R free [Å]No. waters
B-factors [Å2]

DAPK-ANP-Mg
DAPK-ADP-Mg
P 2 12 12 1
47.19
47.18
63.02
62.31
88.83
88.84
2.21.6514024
32376
0.1 (0.352)
0.071 (0.352)
32.3 (8.99)
46.0 (7.53)
99.6 (100.0)
88.5 (100.0)
17.48
20.67
23.31
23.44
11811622.17
21.14

Photon Factory Activity Report 2014 #32 (2015) B

DAPK-ADP-Mg の構造は、先行研究[1,3]とほぼ同様であったが、DAPK-ANP-Mg の構造において、先行研究[3]には見られない結果が得られた。
先行研究[4]において、ANP のα、β、γリン酸基が直鎖上になっているところは似ていたが、γリン酸基の Occupancy が 1 でかつ、B-factor が 50 前後と一様に大きいところが異なっていた。本研究で得られた構造の Occupancy や B-factor を表 3 に記す。
表 3.ANP のγリン酸基の Occupancy および B-factor

O1GO2GO3GOccupancy B-factor
0.4229.410.3826.190.8534.31

注目すべきは、O3G だけ他に比べて Occupancy がかなり高い点である。図 1 のように O3G は、GLN23 の N 原子および PHE 24 の N 原子と水素結合している。水素結合距離はそれぞれ、O3G と GLN 23 のN が 2.85Å、O3G と PHE 24 の N が 2.26Åで、後者は直線状(~170°)で特に強い水素結合となっている。
このようなグリシンリッチループの二つの主鎖上のアミドの N-H との水素結合により Occupancy が高くなっており、ATP 類似体である ANP をしっかりつかまえる構造的な機構が確認できた。

図 2. γリン酸基の O1G,O2G の水素結合
また、結晶化条件の pH8.0 において ATP や ADPのリン酸基は、プロトネーションしていないことが標準的な pKa 値(約 4.0、約 6.5)から予想できる。これは、ATP 類似体である ANP においても同じことが言えるであろう。本研究で得られた DAPK-ANPMg 構造では、先行研究[4]と同様にαリン酸とβリン酸の O 原子が Mg2+と結合して中和されている。
しかし、X 線ではγリン酸基の O 原子についた水素原子位置やプロトネーション状態がはっきりとは分からない。そこで、中性子構造解析により水素原子位置情報を知ることで、酵素の基質認識として ATPや ADP のイオン化状態の解明や DAPK の阻害剤の開発につながることが期待される。
4 まとめ
今回の構造解析により、2.2Åの DAPK-ANP-Mgの構造および 1.65Åの DAPK-ADP-Mg の構造を得ることが出来た。DAPK-ADP-Mg の構造は、先行研究と同様であったが、DAPK-ANP-Mg の構造では違いが見られた。ANP のγリン酸とグリシンリッチループの二つの N 原子との水素結合により、DAPK がANP としっかり結合していることが分かった。

図 1. γリン酸基の O3G の水素結合
一方、O1G や O2G も水分子や N 原子と水素結合しているにもかかわらず、Occupancy は低い値になっている。図 2 のように、O1G と H2O 7 の O との水素結合距離は 3.08Åで、O2G と GLN,B 23 の NE2 とは 2.45Åである。O1G における水素結合は、結合距離が遠いため弱い水素結合であり、Occupancy が低くなったのではないかと考えられる。また、O2G においては、GLN,B 23 の NE2 と距離が比較的近いのにもかかわらず Occupancy が低くなっているのは、ダブルコンフォメーションで GLN 23 自体のOccupancy が 0.44 と低いためだと考えられる。

謝辞
この研究は、京都大・茶竹俊行准教授、富山大・横山武司博士、茨城大・新村信雄特任教授と当時の4 年生だった丹佑太君にお世話になりました。
参考文献[1] K.Temmerman et al. FEBS Journal. 280. 55335550(2013).
[2] A.Yamaguchi, N.Niimura, S.Nakamura, S.Kidokoro,T.Chatake, T.Yokoyama, and I.Tanaka, JPS
Conference Proc. (Proceedings of the J-PARC
Symposium 2014) (2015) in press[3] L.K. McNamara et al.Acta Cryst. D. 65. 241248(2009).

Photon Factory Activity Report 2014 #32 (2015) B[4] V.Tereshko, M.Egli et al . Nat. Struct. Biol. 8(10),899-907 (2001).
* i.tanaka@mx.ibaraki.ac.jp