第 31 回（平成 25 年度）大阪科学賞表彰式・記念講演「化学プローブのデザイン・合成による分子イメージング」
きく ち

大阪大学大学院工学研究科教授

菊地 和也 氏

本日は「化学プローブのデザイン・合成によ

これはラジオ波を使います。ラジオ波は非常にる分子イメージング」というタイトルで話をさエネルギー状態が弱い電磁波を使うので、我々せていただきます。の体への影響が比較的少なく、装置が簡単です。

私の行っている研究は、簡単に言いますと化

しかし、非常に感度が悪いという問題点があり学プローブを用いまして体の中の見えないものます。蛍光に比べても 1,000 倍ぐらい感度が悪を見えるようにするものです。この研究を進めいですので、外から化学プローブを入れて可視ることで、動物や細胞をばらばらにしないで、化をするときは、蛍光プローブと比べ 1,000 倍そのまま分子の動態を分子が機能しているそのぐらい高濃度の分子を使わなければいけない。

場で明らかにしてきました。この目的の実施例

これはあまり現実的ではないです。その現実的として本日は、動物個体の応用例としましてはではないところをどのように工夫して可視化す

MRI に化学技術をどのように使うか、そして、ることができるかという話、試みについて説明

後半では、細胞内の分子動態を調べる蛍光イします。

メージングのためにどのように分子をデザインできるかという話をしたいと思います。

先ほどからスイッチ機能と言っているのですが、MRI プローブでは Tom Meade という人

まず、蛍光とは何かという話を簡単にします

がガドリニウムの造影剤にスイッチを入れるが、蛍光とは、励起光を分子あるいは組織に当ということに成功しました。ただ、この場合てまして、そこから光を測定するものです。この問題点は、このプローブは水を検出していの蛍光分子を生体内分子にさまざまに導入するますので、その水のシグナルが高いバックグことによりまして、見えないものを見えるようラウンドになりまして、そのバックグラウンにすることができます。

ドの上にこの酵素反応によって切れてガドリ

さて大阪大学に来てから行ってきた研究なニウムにくっつくようになった水のシグナルのですが、最初にはフッ素の MRI プローブ、というのが上昇するわけです。つまり、ほと次にはたんぱく質のラベル化の話をしていきんどのシグナルが生体内に存在する水のシグたいと思います。

ナルに隠れてしまいます。

まずは MRI プローブですが、特に常磁性緩

そこで、どのようにバックグラウンドを下げ和促進というものを用いまして、フッ素をもとるかを考えると、水ではなくてフッ素を測定対に横緩和時間をどのように変化させることがで象にすれば、我々の体の中には骨と歯に少ししきるかという話をしたいと思います。

か沈着していませんので、バックグラウンドのMRI は核磁気共鳴を使った可視化でして、

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かず や

● the OSTEC

2014 Winter ●シグナルが低く測定できると考えました。

Eric Ahrens らが報告した例では、このフッなピークが観測されます。次に、ガドリニウム

素をネズミの足に注射しますと、外から入れたをプローブに配位させますとピークはブロード

このフッ素化合物のシグナルだけが見えるとい化します。さらに、このプローブを標的酵素でうことを示されています。
そこで、私はこのフッある Caspase-3 で切ってやりますと、NMR の素プローブというものにスイッチ機能を組み込ピークが長くなりまして、T2 も長くなります。

もうと考えました。

この分子の活性を測定してやりますと、このよスイッチ機能で変化させる分光ファクター

うに Caspase-3 があるところでは MRI によっというのは横緩和時間、T2 です。この横緩和てコントラストが白く上がるということが示さ

時間、T2 を横軸にとりまして、縦軸には MRIれました。のシグナルの強さをとりますと、特に T2 は短

Caspase-3 はアポトーシスに関係する酵素くなりますとシグナルは暗くなります。そこですので、アポトーシスを検出しようとしたで、あらかじめ T2 を短くしておきまして、このですが、さらに遺伝子発現を検出するためれを酵素反応で長くしてやりますと、酵素反に、遺伝子発現の指標となります酵素、β－応をもとに遺伝子発現などで出てきた酵素がガラクトシダーゼやβ－ラクタマーゼで切るあるところが白く見える、コントラストが上ことができる基質をつくりました。このプローがるようなプローブができるに違いないと考ブをつくりまして、生細胞に発現したβ－ラえました。

クタマーゼ活性を検出することで細胞におけそれでは、この T2 の制御をどのように行うかということですが、測定したい核種はフッ素る遺伝子発現を MRI で可視化できることを示しました。

ですので、フッ素のそばにガドリニウム錯体をさらにこれをネズミの脳に利用しまして、マ結合させたプローブを作ります、これは磁石をウスの胎児における遺伝子発現を計測しようと2 つ近くに置くような状態をつくることになりトライしましたが、感度を上げなければ短い時ます。そうしますと常磁性緩和促進（PRE）

間で遺伝子発現の場所を正確に測定できないとという 2 つの磁石の相互作用によりまして、近いうことがわかってきました。

い状態では T2 は短くなりますし、この距離がそこで、フッ素プローブを高感度化する手法

長くなると T2 は長くなります。このとき MRIを考えることにしました。高感度化を単純に考のピークを測定すると、近い状態ではブロードえると測定元素の数を増やせば良いのですが、化しますし、遠くの状態ではシャープになりま

MRI プローブの場合は単純に数を増やします

す。そして、コントラストは近いと暗いですし、と分子の運動性が悪くなりまして、シグナルが遠いと白くなります。

消えてしまうということがわかりました。そこ

そこで、このガドリニウムとフッ素の間を酵で、分子の運動性を確保しながら数を増やす方素で切ることができるリンカーで結びまして、法としまして、シリカのナノ粒子の中にフッ素この間を酵素で切ってやると酵素のあるところ

化 合 物 を 内 包 す る こ と に し ま し た。 こ れ はだけ白く見える、こういうプローブができるにPFCE という磁性的に単一のフッ素を数多く違いないと考えました。

した分子を多数ナノ粒子の中にくるみまして、まず、ガドリニウムをくっつけない分子をつこれを安定で存在化させる手法です。この手法

くり NMR のピークを測定しますと、シャープを使いますと、ナノ粒子の中ではフッ素の元素● the OSTEC

2014 Winter ● 7

の運動性はほとんど阻害されず、長い T2 と機合成した化合物を結合させまして、特異的にシャープなピークが確保できるということが示

ラベル化を行うことで調べたい分子のみを可視されました。

化するということを試みています。
通常の標識技術は常に光っている蛍光プロー

ON
H
1H

O19F

ブを入れますが、私どもの研究室では、たんぱO
n1H/19F

く質に貼りついた後だけ光るような蛍光プロー
ブをつくることができれば、簡単な実験で標的2h分子だけを光らせることができるだろうと考えました。その試みとしまして PYP とβ－ラクタマーゼという 2 つのたんぱく質を使って研究

1 weekを行っているのですが、今日は時間の関係上、フッ素含有ナノシリカ粒子を用いたがん組織のMRI画像PYP は 何 か と い い ま す と、 こ れ は

そこで次に、担がんマウスを用いまして、がPhotoactive Yellow Protein というたんぱく質ん組織への集積性を調べました。これは、生体の省略形でして、小さいというのが利点です。

適合性を有しますペグ化をしたナノ粒子を用いそれから、我々などの哺乳類の細胞には PYPることでオプソニン化を逃れまして、生体内をが結合する基質は存在しないので、非常に特異循環することでこのようにがん組織が検出でき性が高いと考えました。

ました。

このようなたんぱく質を用いまして幾つかプ

現在では、例えば樹状細胞やマクロファージローブを作製してきたのですが、これから素早などの免疫担当細胞を MRI で追跡する。あるく標的たんぱく質をラベル化する手法について

いは酵素反応を追いかけるという試みを行って話したいと思います。

いるのですが、中に含みますフッ素化合物の構

PYP はクマリンの類縁体を取り込みます。

造を変えますと多色で染め分けをすることがでクマリンという分子は強く蛍光性がある分子なきます。あるいは、これはメソ多孔のシリカをのですが、通常はヒドロキシ基を有しています。

用いることで、薬物放出系にもこのナノ粒子をこのヒドロキシ基をアミノ基に置きかえますと用いることができます。これは薬物を放出する環境依存的な色素に変わります。この色素は有ナノ粒子の動態を MRI で追いかけながら調べ機溶媒の中では強く光るのですが、水の中ではるという手法です。

全然光らない分子です。たんぱく質の結合サイ

このように、
特に私は現在、免疫学フロンティ

トは有機溶媒のように非常に脂溶性が高い環境

ア研究センターで免疫学の先生たちとこれらのですので、このアミノ基がついたクマリン類縁共同研究を推進しているところであります。

対を水に溶かしておく、つまり細胞培養液に入ここまでが MRI の話で、最後に蛍光プローれた状態では全然蛍光が出ないのですが、たんブ、特にたんぱく質のラベル化プローブについぱく質に結合すると脂溶性の環境になり光るよてどのような試みを行っているかという話をしうになると考えました。

たいと思います。
うちの研究室では、発現したたんぱく質に有8PYP の紹介だけをしたいと思います。

● the OSTEC

2014 Winter ●貼りつける分子は、負電荷を持ったカルボン酸を持った脱離基、あるいは正電荷を持ったアミノ基を持った脱離基を有した分子、の 2 つをこのようにケミカルにトリックを入れた分子つくりました。そして、この反応速度を調べてを使うことによりまして、ほかの技術では見えみますと、正電荷があったものではほとんどないものを見えるようにしようという試みを幾

20 秒ぐらいで反応が終わってしまうのですが、つも行っております。

負電荷のものは非常に遅いということがわかり最後ですが、我々ケミストは、試験管の中で機能する分子を出すだけでなく、実際に使うこました。
ならば、この正電荷を持ったものを使えばいとができる分子をつくる必要があると考えていいんじゃないかと考えられるかもしれません

ます。まだまだ発展途上ですが、これから先、が、正電荷を持った化合物はミトコンドリアなもっともっと自分の道を切り開いていきたいとどの特定の細胞内オルガネラに局在しやすいと考えています。

いう問題があります。そこで、負電荷を持ったどうもありがとうございました。
（拍手）

基質を速く反応させる必要があります。
ここで、たんぱく質の結合サイトにも負電荷を持ったアミノ酸があることが問題点となります。つまり、基質とたんぱく質のマイナスとマイナス同士が反発するので速く結合しないと考えました。
この問題点を解決するため、まずたんぱく質側の 3 つの負電荷を持ったアミノ酸を、アルギニンに置きかえてやると反応が速くなる、つまりマイナスをプラスにすると反応が速くなるということがわかりました。基質結合時に放出される部分の pKa 値を少し小さくしますと、脱離する速度が速くなり、早く結合する基質ができることがわかりました。
そうしますと、無洗浄のラベル化は、細胞培養液にこの蛍光分子を入れてやるとほぼ 2 分で核内に発現したたんぱく質をきれいに染める、しかも強く光らせることができることがわかりました。
O OOONO HOOOOHNOSOO
NO2EsteraseOHOFCANB-Ac

PYPと細胞膜透過性基質を用いた細胞内たんぱく質タグ化【講師紹介】 菊地 和也 氏
大阪大学大学院工学研究科 教授

昭和63年 3月
東京大学薬学部卒業
平成 6年 3月
東京大学大学院薬学系研究科修了
平成 6年 4月〜平成6年7月
日本学術振興会特別研究員PD
平成 6年 7月〜平成7年6月	カリフォルニア大学サンディエゴ校化学科及び薬理学科	R.Y.Tsien教授研究室ポストドクトラルフェロー
平成 7年 7月〜平成8年12月
スクリプス研究所化学科	D. Hilvert教授研究室ポストドクトラルフェロー
平成 9年 1月〜平成12年11月
東京大学大学院薬学系研究科助手
平成12年12月〜平成17年6月
東京大学大学院薬学系研究科助教授
平成17年 7月〜現在
大阪大学大学院工学研究科教授
平成21年 8月〜現在	大阪大学免疫学フロンティア研究センター教授（兼任）● the OSTEC

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