主要アレルゲン Mal d 1 の日本産リンゴ品種における定量および経口負荷試験結果を基にした食事指導への展開

研究課題名

主要アレルゲン Mal d 1 の日本産リンゴ品種における定量および経口負荷試験結果を基にした食事指導への展開

フリガナ

オキシマ

代表者名

沖嶋ナオコ

直子

所属機関（機関名）松本大学人間健康学部健康栄養学科准教授（役職名）専任講師
氏

共同研究者

名（フリガナ）

小池 由美（コイケ ユミ）
小林 克彦（コバヤシ カツヒコ）
近藤 康人（コンドウ ヤスト）

所属機関・役職名

役割分担

長野県立こども病院
アレルギー科長

経口負荷試験、Mal d 1 定量

小林耳鼻咽喉科医院

経口負荷試験

藤田医科大学

経口負荷試験

本 助 成金 によ る 発
第 70 回日本アレルギー学会学術大会（ELISA のみ）
表論文，学会発表

研究結果要約日本において、リンゴ PFAS の原因となる主要なアレルゲンコンポーネントは PR-10 に属する Mald 1 である。研究代表者がこれまで明らかにしてきたウェスタンブロット（WB）による Mal d 1 発現量をもとに、Mal d 1 低発現リンゴと日本で生産、消費量が圧倒的に多いサンふじを用いて経口負荷試験および ELISA による定量を実施した。
市販されている抗体を用いて Mal d 1 を定量できる ELISA を構築し、WB で分析済みの試料を定量することでその性能を評価した。その結果、WB にて Mal d 1 低発現だった多くの品種では WB とELISA の結果が相関していた。次いで経口負荷試験に用いたリンゴ品種に含まれる Mal d 1 を ELISAにて定量した。その結果、サンふじは他品種よりも高い定量値を示す傾向にあった。経口負荷試験では、
Mal d 1 量の少ない品種であっても VAS では陽性だった品種があったにも関わらず、Mal d 1 量が多い
サンふじでは経口負荷試験が実施できた 2 名中 1 名が陰性であった。
本研究の遂行途中に Mal d 1 量や口腔症状の起こしやすさへの Flavan-3-ols の関与が Romer M.らにより発表された。今回の結果から、Mal d 1 量が少なくても口腔症状を示す品種があったり、サンふじのように Mal d 1 量が高くても全ての被験者が症状を示したりするわけではなかった理由の一つとして考えられ、今後の検討課題となった。

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主要アレルゲン Mal d 1 の日本産リンゴ品種における定量および経口負荷試験結果を基にした食事指導への展開

研究目的

求点として「アレルギーを起こしにくいリンゴ」

近年花粉-食物アレルギー症候群（以下 PFAS）

品種の開発にもつなげていけることが期待されによるバラ科果物アレルギー患者が増加している。

る。一旦 PFAS と診断されると原因食材の除去以外に治療法はなく、その食品を好む患者にとって研究計画及び研究手法

は食関連 QOL が低下する。また、果物の産地で1. Maｌ d 1 特異的サンドイッチ ELISA の構築は消費量の低迷にもつながりかねない。欧州ではMal d 1 に対するモノクローナル抗体は販売さ

リンゴ主要アレルゲン Mal d 1 の定量や経口負れていなかったため、Mal d 1 と交差する市販の荷試験結果から、PFAS を起こしにくい品種が明

抗 Bet v 1 マウスモノクローナル抗体と抗 Mal dらかとなっているが、日本では欧州と大半の栽培1 ポリクローナル抗体を組み合わせて、Mal d 1品種が異なることから日本産品種のアレルゲンを測定するサンドイッチ ELISA を構築した。

性は不明であった。研究代表者は、これまでに長初めに、抗 Bet v 1 マウスモノクローナル抗体

野県産リンゴ 28 品種の Mal d 1 量をウェスタン(BV16, Absolute Antibody, Wilton, UK)が Mal dブロット(以下 WB)法により分析し、日本での生1 と交差することを確認するために、WB にて分産・消費量が最も多く、PFAS を発症しやすいと析した。その結果、レコンビナント Mal d 1（以考えられているサンふじと比較して、Mal d 1 量

下 rMal d 1, CUSABIO, Wuhan, China）や Malが有意に少ない品種を 14 品種見出した。

d 1 高発現品種であるホワイトスイートの抽出液

本研究では、WB 結果をもとに Mal d 1 低発現が抗 Mal d 1 ウサギポリクローナル抗体を用いリンゴの経口負荷試験を実施するとともに、て検出した結果と同様に検出できたため、交差性ELISA を構築して Mal d 1 低発現リンゴにおけありと判断した。

るアレルゲンタンパク質量を定量すること、さら抗 Bet v 1 マウスモノクローナル抗体をキャプに、これらの結果を統合することで、リンゴチャー抗体に、抗 Mal d 1 ウサギポリクローナル

PFAS 患者が症状を示す Mal d 1 量の閾値を求抗体（CUSABIO）を検出抗体に用い、HRP 標識め、リンゴ PFAS 患者への食事指導に活用するこ抗ウサギ IgG（CeraCare, MA, USA）、基質はとを目的とした。

TMB（CeraCare）を用い、マイクロプレートリ

本研究の進展により、Mal d 1 の定量結果から、ーダー（SH-1300Lab, コロナ電気株式会社, 茨

経口負荷試験を行わなくても PFAS の起こしや城）にて検出した。標準品として rMal d 1 を用すさを推定することができるようになる。さらに、

いてダイナミックレンジおよび測定上限およびMal d 1 低発現リンゴ品種の情報は、リンゴの育下限を求めた。各実験条件は、平均値および標準種にも活用できることが期待される。これは、日偏差、さらにそこから求められる変動係数を用い、本におけるリンゴ消費量が伸び悩む中、新たな訴感度良くかつ変動係数が小さくなる条件、かつ標35

主要アレルゲン Mal d 1 の日本産リンゴ品種における定量および経口負荷試験結果を基にした食事指導への展開

準品各濃度を用いた検量線を求め、MBL が無償小さ目の果実であれば 6 等分)である 25g を負荷提供している 4 パラメータロジスティック解析した。そのレシピを表 1 に示す。

を行える Excel シートにて、標準品各濃度のデー経口負荷試験に用いたリンゴ各品種は、長野県タを推定モデルの差異が最小となる条件を検討

松本市及びその周辺地域の小売店ならびに JA 等した。の直売所にて 1 品種あたり 5 個以上購入し、その構築した ELISA を用いて、WB にて分析済み中から傷が少なく果皮や果肉に異常のないものの検体を ELISA にて定量し、WB と ELISA とを選択し、1 品種当たり 5 個を用いた。

で結果を比較した。詳細な方法を図 1 に示す。

スムージーの調理については、以下の通りであった。

2. 経口負荷試験

リンゴは傷や果皮の異常がない部分を選んでWB 結果から Mal d 1 が低発現であった品種

用いて 2 ㎝程度まで刻み、キャベツも同様の大きのうち、2020 年度秋季に入手することができたさに刻んで市販のリンゴジュース（クリアアップ

9 品種、およびサンふじを試料とした経口負荷試

ル, 原田乳業株式会社, 新潟）とともにブレンダ験を実施した。

ー（クイジナート, パワーブレンダー, SPB-650J,試験食には、Hansen らによる二重盲検法の試

Stanford, CT, USA）に固形物がなくなるまでか料の検討結果 2）のうち、モデル II(リンゴとキャけ、試料を調製した。調製したスムージーは、速ベツを刻んでピタパンにはさんだもの)を参考と

やかに 1 回投与量ずつ耐冷性プラスチックカッして、小麦アレルギー患者でも参加できるよう、プに分注し、ラップで口を覆い使用するまで-ピタパンを使わない、リンゴとキャベツのスムー60℃で保存した。残りは ELISA 用の抽出を行う

ジーを考案した。1 品種あたり、皮と芯を除いたまで-80℃で保存した。なお、プラセボには加熱滅

可食部 1 切れ相当(大きな果実であれば 8 等分、菌され Mal d 1 が失活していることを WB にて36

主要アレルゲン Mal d 1 の日本産リンゴ品種における定量および経口負荷試験結果を基にした食事指導への展開確認した市販のリンゴジュースを用いることで、被験者の負担や苦痛減のため、プリックテストの食味を似せた。

実施を取りやめ、経口負荷試験のみに変更した。

試料は経口負荷試験実施前日の夜から冷蔵庫で解凍し、投与するまで氷冷するなど低温を保っ3. 経口負荷試験に用いたリンゴ品種を試料とした。1 回の試験につき 3～5 回の投与を行い、各た Mal d 1 の ELISA による定量回に 1 個以上のプラセボを混ぜて実施した。投与項目 1 で構築したサンドイッチ ELISA を用順は被験者によって変え、投与順や同じ被験食をいて、経口負荷試験に用いたリンゴ各品種の Mal投与することでの症状の有無への周囲の影響をd 1 を定量した。

排除した。投与間隔は 30 分とし、投与後 25 分で試料からの Mal d 1 の抽出は、L.S.Hsieh ら

VAS により主観的症状の評価を、口腔内の診察との方法 1）にて抽出した。試料 2g に対し氷冷した写真撮影にて客観的評価を行った。なお、申請時

抽出バッファー（1 mmol / L ショ糖, 2% PVPP,には松本大学で実施予定だった経口負荷試験を、

2

安全性を期すため小林耳鼻咽喉科医院での実施

Diethyldithiocarbamic acid）3mL を添加し、氷に変更した。

冷 し た 状 態 で ホ モ ジ ナ イ ザ ー （ ULTRA-mmol/

LEDTA,1mmol/L

リンゴに対して口腔症状に限局した PFAS のTURRAX, IKA-WERKE, Merck, Darmstadt,既往のある患者を対象とした。申請時には、Germany）で果実の塊が目視できなくなるまで 1～3 分均一化した。次いで医療用ガーゼでろ過し、ImmunoCap にて Mal d 1 陽性、Mal d 3 陰性を被験者の条件としていたが、サーモフィッシャー

ろ液を 21,100×g, 4℃, 1 時間遠心分離し、上清ダイアグノスティックス社の分析サービスが受を取った。この上清をそのまま、あるいは付停止をしていたことから、松本大学実施分およAmicon-Ultra10K

び藤田医科大学実施分は、藤田医科大学にて分析

Germany）にて 10～20 倍濃縮し、1.3％BSA 溶した結果から被験者を選定し、長野県立こども病液で 4 倍希釈して ELISA 定量用の試料とした。

院では病歴から判断して被験者とした。

これを項目 1 にて示した ELISA で定量した。

（Merck,Darmstadt,

各施設で最大 10 名ずつ計 30 人の被験者を想定していたが、新型コロナ感染症の蔓延により、結果と考察

長野県立こども病院 1 名、松本大学 2 名、藤田医1. Maｌ d 1 特異的サンドイッチ ELISA の構築
rMal d 1 の希釈系列を用いて抗体濃度、反応時

科大学 1 名、計 4 名の実施に留まった。
2019 年秋季に経口負荷試験とプリックテスト間と温度を複数条件検討した。一般的な ELISAを行った結果、この 2 つの検査の間の相関性が低キットにおいては、1 日で分析が終わるよう、各く、経口負荷試験陽性でもプリックテスト陰性、反応条件を室温 1 時間などに設定されているこまたはその逆となる品種が見受けられた。そこで、とが多いが、今回の分析はで最大感度を得、かつノイズを低くすることを目的とし、サンプル添加37

主要アレルゲン Mal d 1 の日本産リンゴ品種における定量および経口負荷試験結果を基にした食事指導への展開

後の反応時間を室温 1 時間から 6 時間、4℃一夜、続いて、この ELISA を実際の検体にて評価す抗体との反応時間を室温 1 時間から 4 時間と複るため、WB で分析が終了している試料中の Mal数条件にて検討した。

d 1 を定量した。定量結果を図 3 に示すが、サンその結果、方法で示した条件（図 1）で最大感ふじを対照として他品種全てが有意に低い結果度を得、かつ変動係数を最小にでき、4 パラメーとなった。この結果は、WB ではジョナゴールド、タロジスティック解析にて各濃度の実測値とモ

こうとく、ホワイトスイートはサンふじと有意差デル値の差を最小にすることができた。標準品となしの同レベルの定量値であったことと矛盾しして SUMO-His tagged rMal d 1（CUSABIO）

たが、WB にてサンふじと比較して有意に低かっの希釈系列を用いて定量した結果の例を図 2 にた 14 品種は、その順序に差異はあったが、有意示す。に低かった中でもとくに低い範囲にあるものが38

主要アレルゲン Mal d 1 の日本産リンゴ品種における定量および経口負荷試験結果を基にした食事指導への展開

1 名（同 21C-01）の結果から、Mal d 1 高発現品大半であった。
WB においては、Mal d 1 量の少ない検体も確種であるサンふじにおいて、VAS の結果が 0 あ実に検出できるよう、HRP の基質に ECL Primeるいは低い結果となった。これは、2019 年度秋

を 用 い 、 ImageQuamtLAS4000 に て High季に実施した結果と同様であり（経口負荷試験をresolution にて 1 分という高感度な条件で検出実施した 6 名全員が VAS 陰性で、プリックテスしていたため、サンふじの分析結果は化学発光のトは 1 名のみ陽性）、2019 年度は台風の長野県通強度がプラトーになっていた可能性が今回過に伴い収穫期を早めたことによる Mal d 1 量

ELISA にて定量した結果から明らかとなり、今の低減が理由であったと考えていたが、2020 年回のような結果が得られた理由の主なものであ

度は気候も良く熟した状態で収穫されていたとると考えられた。その他、WB では抗 Mal d 1 ウ考えられたことから、それ以外の理由があることサギポリクローナル抗体 1 種で検出していたのが示唆された。さらに、シナノプッチやシナノスに対し、ELISA では吸着抗体に抗 Bet v 1 マウ

イートのように Mal d 1 量が少ないにも関わらスモノクローナル抗体を使用しており、Mal d 1ず全員あるいは過半数が VAS 陽性である品種ものサブタイプによりこのモノクローナル抗体とあった。
本研究遂行中に Romer らにより Flavan-3-olsの親和性に差があったため結果に差異が出た可が多い品種では Mal d 1 量が多くても症状が出能性も考えられた。

にくいことが示され 3）、これが、サンふじが Mal
2. 経口負荷試験

d 1 量が多いにも関わらず、経口負荷試験結果が9/15 現在で集計が終わった結果について表 2

陰性や陽性であっても VAS の数値が低かったり、に示す。全ての結果が出そろっているわけではな

Mal d 1 量が少なくても VAS 陽性者が多くなっ

いが、松本大学(小林耳鼻咽喉科医院)2 名（被験たりした理由であると考えられ、今後の課題とな

者 ID 21M-04 および 05）、長野県立こども病院った。

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3. ELISA 法による、Mal d 1 の定量

トは 1 名のみ陽性）、2021 年度に経口負荷試験を上述した ELISA にて、経口負荷試験に用いた

実施するまでは、千曲川が決壊し長野県に多大なリンゴ品種の Mal d 1 を定量した結果、シナノプ被害をもたらした台風 19 号の通過に伴い、収穫ッチが 0.33±0.03 ng / g が最小値で、サンふじ期を早めたことによる Mal d 1 量の低減が理由の 11.8±9.77 ng / g が最大であった。これまでのと考えられていたが、それ以外の理由があること分析で Mal d 1 量が少ないとされていたトキにが示唆された。

関しては、今回はサンふじと近い 9.17±5.11 ng

本研究遂行中の 2020 年に、Romer らにより/ g であったが、その理由は不明であった。

Mal d 1 量とｔlavan-3-ols 量が正の相関を示す
こと、Flavan-3-ols が多い品種では Mal d 1 量が今後の発表予定

多くても口腔症状が出にくいことが明らかとな

国内で開催される学会では、日本食品化学学会

った 3）。これが、サンふじが Mal d 1 発現量が高第 26 回総会・学術大会（2022 年 6 月頃、開催地いにも関わらず、経口負荷試験結果が陰性や陽性不明）、第 76 回日本栄養・食糧学会大会（2022 年であっても VAS の数値が低かったこと、シナノ6 月、西宮）、第 69 回日本栄養改善学会学術総会

プッチのように Mal d 1 量は低くても被験者全（2022 年 9 月、倉敷）第 71 回日本アレルギー学員が VAS 陽性であったことの理由であると考え会学術大会（2022 年 10 月、東京）、第 22 回国際られ、今後 Mal d 1 だけでなく Flavan-3-ols の栄養学会議（2022 年 12 月、東京）に、国際学会定量が必要であることが判明した。そこで、新たでは WAC2022（2022 年 11 月、イスタンブール）に星薬科大学教授である穐山浩先生にも本研究あるいは 2023 Hawaii Symposium(2023 年 5 月、に参画いただき、次年度以降 Mal d 1 およびハワイ)への発表を予定している。

Flavan-3-ols の定量、および経口負荷試験を行い、今後も 2021 年秋季に調製し、-60℃で保存してリンゴ PFAS の症状の軽重への Flavan-3-ols のいる検体を使い切るまでは経口負荷試験を継続関与について研究を進めていきたい。

し、結果を取りまとめて Allergol.Int.他国際誌へ

さらに、研究期間を過ぎてしまうが、9 月末より 2 名が小林耳鼻咽喉科医院での経口負荷試験投稿する。

を予定している。被験食は 2020 年秋季のリンゴ今後の研究活動についての収穫期に購入後速やかに調製後、-60℃で凍結結果と考察で示したように、Mal d 1 高発現品保存しており、各施設で希望者が出次第、本申請種であるサンふじにおいて、VAS の結果が 0 あにおける研究期間終了後も経口負荷試験を続けるいは低い結果となった。これは、2019 年度秋る予定である。

季に実施した結果と同様であり（経口負荷試験を実施した 6 名全員が VAS 陰性で、プリックテス

参考文献

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