国⽴病院機構⼤阪南医療センターの臨床研究部免疫異常疾患研究室、⾼松漂太室⻑が⼤阪⼤学在籍中に取り組んでいた、厚⽣労働省が難病認定している「ベーチェット病」という免疫疾患の病態解明に関する論⽂が、The EMBO Journal 誌に掲載されました。研究内容は以下の通りです。

ベーチェット病の病態解明
研究の背景と仮説
1.

ベーチェット病の病態と治療

ベーチェット病は、主に⼝腔粘膜のアフタ様潰瘍、外陰部潰瘍、⽪膚の結節性紅斑、眼のぶどう膜炎といった症状が繰り返す炎症性疾患で、ほかにも、関節や精巣、消化管、神経、⾎管などに症状を認めることもある、厚⽣労働省が認定する指定難病の⼀つです。トルコのHulsi Behçet 教授が初めて報告したことからベーチェット病（ベーチェット症候群）と呼ばれ、トルコや地中海沿岸諸国から極東アジアにかけて患者が多く、その分布からシルクロード病とも⾔われています。発症原因は分かっていませんが、病気になりやすい遺伝的素因に加えて、細菌や喫煙、⾷習慣などの環境要因が合わさって病気が発症すると考えられています。ベーチェット病の病変部では、⽩⾎球の⼀つである好中球の異常活性化と⾎管炎が認められ、⾃然免疫系と獲得免疫系の異常の両⽅が重なり合ってベーチェット病の病態を形成しているものと考えられていますが、その詳細なメカニズムは未だ分かっていません。
治療は、好中球の遊⾛を抑えるコルヒチンが第⼀選択薬で、重症度や病変部位に応じてステロイドや免疫抑制剤による治療を⾏うこともあり、重要臓器病変や難治例には TNF-a阻害抗体の注射薬（レミケードやヒュミラ）を使⽤することもあります。また、難治性⼝内炎に対して PDE4 阻害薬（オテズラ）を投与することもあります。TNF-a阻害薬が使えるようになってぶどう膜炎により失明してしまう患者さんの数は減少しましたが、未だに難治な症例が存在し、病態に即した分⼦標的治療薬の開発が求められています。
参考：
厚⽣労働省難病情報センター https://www.nanbyou.or.jp/entry/187
⽇本リウマチ学会 https://www.ryumachi-jp.com/general/casebook/behcet/
⼤阪⼤学医学部呼吸器・免疫内科 http://www.imed3.med.osaka-u.ac.jp/disease/d-immu051.html
2.

ミトコンドリア DNA (mtDNA) と炎症

ミトコンドリアは細胞内⼩器官（オルガネラ）の⼀つで、ミトコンドリアには他のオルガネラには⾒られない、核とは独⽴したゲノム（ミトコンドリア DNA）や⼆重膜構造があり、エネルギー産⽣能があり、細胞外に漏れ出ると強い炎症誘導活性を有することなどから、ある好気性細菌が真核細胞の前⾝となる細胞に寄⽣し、その後の共⽣進化したものと考えられています（細胞内共⽣説）。細胞内におけるミトコンドリアの役割は、呼吸によるエネルギー（アデノシン三リン酸；ATP）の産⽣、熱産⽣、細胞内カルシウムイオン濃度の調節、脂質の酸化など、エネルギー代謝の中⼼的役割を担っていますが、近年、アポトーシスの誘導、炎症性シグナル分⼦の活性化プラットフォーム、活性酸素種（ROS）の産⽣、インフラマソームの活性化など、免疫応答においても重要な機能を有していることが分かってきました。
ミトコンドリア DNA（mtDNA）は、環状構造をしていて、ミトコンドリアの機能を司る分⼦の DNA やトランスファーRNA などの遺伝情報がコードされています。mtDNA は細胞傷害時の宿主由来の炎症性物質（DAMPs）としても知られ、ミトコンドリアから細胞質内に漏れ出ると、⾃然免疫受容体である Toll 様受容体（TLR9）や、⼆本鎖 DNA のセンサーである cGAS、インフラマソームの構成分⼦である NLRP3 などに認識されて、様々なサイトカインの産⽣を誘導します（図 1）。
刺激(LPS, ATP, etc.)

ミトコンドリア傷害mtDNA
ミトコンドリアcGAS

Sting

IFN-a/b
TLR9

インフラマソーム

チトクロム C

NLRP3
ASC

アポトーシス
細胞死

炎症性サイトカイン

cGAMP

TNF-a
IL-6
IL-12
IL-23

ProCaspase-1

Caspase-3/7/9

ミトファジー

ピロトーシスGasdermin-D

IL-1b
IL-18
Caspase-1Pro-IL-1b, Pro-IL-18

図1：ミトコンドリア傷害による、炎症と細胞死
ヒト疾患において mtDNA は DAMPs として、外傷後の急性呼吸促迫症候群（ARDS）、⼼不全、全⾝性エリテマトーデス（SLE）などの増悪に寄与することが報告されていますが、どのような機序で、細胞内や細胞外に漏出するのか、また、SLE 以外の免疫系疾患における意義については分かっていませんでした。
参考：
Mitochondrial DNA in innate immune responses and inflammatory pathology. A. Phillip West& Gerald S. Shadel. Nat Rev Immunol. 17, 363‒375 (2017)

当研究グループでは、「ベーチェット病の病態に mtDNA が関与しているのではないか」、との仮説を⽴て、それを実証して有効な治療法の開発に繋げる研究に取り組んでいます。

成果：
1. ベーチェット病における⾎清 mtDNA の増加とそのメカニズム

⾼松らは、⼤阪⼤学医学部呼吸器・免疫内科にて、ベーチェット病患者さんの⾎清を収集し、⾎清中 mtDNA 量を PCR 法にて定量し、他の膠原病患者の⾎清中 mtDNA 量と⽐較しました。すると、ベーチェット病患者⾎清で著しく増加していることを⾒出しました。また、⾎清 mtDNA 量はベーチェット病の症状がある患者さんに⾼く、同じ患者さんでも、やはり症状が出ている時に⾼いことが分かりました（図 2）。さらに、⾎清中の mtDNA は DNA分解酵素（DNase）にて分解されず、膜に包まれて存在していることが分かりました。そこ
で、どのような膜に mtDNA が存在しているのか検討すると、エクソソームと呼ばれる直径100nm 程の⾮常に⼩さい細胞外膜⼩胞中に存在していることが分かりました。

4002000HCBSRASLESjS

AAV PM/DMSSc

BS患者のエクソソーム中にmtDNAが存在する

600

エクソソーム中mtDNA量(103 copies)

血清中mtDNA量 (copy)

血清中mtDNA量 (Copy)

膠原病別の血清中mtDNA量と、BS症状の有無とmtDNA量6004002000−● 抗dsDNA抗体+*

543210

症状+−
症状

HC：健常ドナー、BS：ベーチェット病、RA：関節リウマチ、SLE：全身性エリテマトーデス、
SjS：シェーグレン症候群、AAV：ANCA関連血管炎、PM/DM：多発性筋炎/皮膚筋炎、SSc：強皮症

図2：ベーチェット病患者は、血清中mtDNA量が増加している

LPS + ATP

野生型

野生型

mtDNAて調べてみると、細胞に刺激が加わると、無刺激

ミトコンドリアによって細胞外に放出される機序につい刺激細胞

mtDNA

ら細胞質に漏出し、それがエクソソーム

ILV (Tsg101)

そこで、mtDNA がミトコンドリアか

LPS + ATPLPS + ATPカスパーゼ-1-KO ガスダーミンD-KO

カスパーゼー1 の活性化によりインフラ
マソームの活性化とそれに引き続くピロトーシスという細胞死が誘導されますが、その際に Gasdermin-D という分⼦によってミトコンドリアの膜に⽳が開けられて mtDNA がミトコンドリアから細胞質に漏出すること、また、カスパーゼ-1 に20min

21min

22min

図3：mtDNAの漏出とILVによる取り込みよ り 細 胞 内 膜 ⼩ 胞 （ MVB: multi-vesicular body ） の 中 に さ ら に 微 ⼩ の 膜 ⼩ 胞 （ ILV:intraluminal vesicle）が形成され、その過程で細胞質内の mtDNA が ILV に取り込まれることが分かりました（図 3）。その後 MVB が細胞膜と融合し、MVB 内の ILV が細胞外に放出され、それらがエクソソームとして⾎流に乗って全⾝に運ばれることが分かりました。実際にベーチェット病患者さんの単球系細胞では、カスパーゼ-1 の活性が⾼まっていることも確認されました。
2. ベーチェット病患者⾎清由来の mtDNA を内包したエクソソームによる炎症誘導

エクソソームはエンドサイトーシスと呼ばれる貪⾷により、放出細胞に由来する様々な分⼦や DNA/RNA を別の細胞に伝える役割をしていることが知られています。そこで、
mtDNA を内包したエクソソームがベーチェット病に特徴的な炎症を誘導するかについてマウスを使って実験しました。先ず、ヒトの末梢⾎由来の単核球（PBMCs）にベーチェット病患者から単離したエクソソームを振りかけると、TNF-a、IL-1b、IL-23 といった炎症性サイトカインが産⽣されました。さらにマウスの腹腔に投与すると、激しい好中球や炎症性単球の浸潤を認め、マウスの関節腔に投与すると、炎症性細胞の浸潤により関節が腫脹しました。また、⾃⼰免疫性ぶどう膜炎のモデルマウスに投与すると、網膜ぶどう膜炎が増悪し、ベーチェット病患者エクソソームの強い炎症誘導活性によりベーチェット病に特徴的な炎症を惹起することが分かりました（図 4）。
腹腔内投与による炎症細胞浸潤の誘導 関節腔内投与による関節炎の誘導 血管内投与による網膜脈絡膜炎の増悪
HC10BS410HCBS4HC
Ly6G10310030101102103104105101102103104105BS

Ly6C

図４：BSエクソソームにより、ベーチェット病の症状が誘導される
そして、ベーチェット病由来エクソソームによる炎症は、MLRP3 と TLR9 というmtDNA の受容体を介していることが分かり、エクソソーム中の mtDNA が重要であることが分かりました。また、膜に包まれた mtDNA は mtDNA 単体に⽐べて炎症誘導活性が⾮常に強いことが分かり、エクソソームに内包されることにより細胞内の mtDNA センサーに mtDNA が効率よく認識され、強い炎症が惹起されるものと思われました。
以上から、ベーチェット病は、まだ分かっていない理由によりカスパーゼ-1 が活性化しやすく、それにより、ガスダーミン D が活性化してミトコンドリア膜に⽳を開けてミトコンドリア内の mtDNA が細胞質に漏出し、細胞質内の mtDNA は ILV に取り込まれエクソソームとして細胞外に放出されます。mtDNA を内包したエクソソームは、マクロファージなどの細胞に取り込まれ、NLRP3、TLR9 を介して炎症性サイトカイン産⽣を誘導しま

す。mtDNA 内包エクソソームおよびサイトカインにより、好中球の異常活性化というベーチェット病の病態が形成され、特徴的な臨床症状が⽣じるものと考えられました（図 5）。
mtDNA内包エクソソームの分泌
PAMPs/DAMPs
インフラマソーム

mtDNA内包エクソソームによる炎症
マクロファージ

mtDNA内包エクソソームの分泌

TLR9

NLRP3
インフラマソーム

ぶどう膜炎
口内炎

サイトカイン産生

カスパーゼ-1の活性亢進

mtDNA

ベーチェット病の症状

IL-1b

IL-23

関節痛
消化管潰瘍

ILVs

外陰部潰瘍

IL-17
BS患者の単球系細胞

結節性紅斑IL-17産生細胞

好中球

好中球の活性化

図5： mtDNA内包エクソソームによる炎症が、ベーチェット病の病態形成に重要

3.

mtDNA 内包エクソソーム産⽣を標的とした治療の可能性

ベーチェット病は、コルヒチン、ステロイド、TNF-a阻害抗体等で治療されますが、mtDNA が細胞外に放出される過程を標的とした治療について検討しました。カスパーゼ-1阻害薬は、予想通り mtDNA の漏出や細胞外への放出、IL-1b等のサイトカイン産⽣を抑制しますが、カスパーゼ-1 は細胞にとって必要不可⽋な機能を担うため副作⽤も強くなることが予想されます。そこで、エクソソーム（ILV）の産⽣を阻害する dimethylamine（DMA)という薬剤に着⽬し、mtDNA 内包エクソソームによる関節炎を抑制できるか検討しました。
DMA 投与群では関節炎がカスパーゼ-1 阻害剤と同程度に抑制されることが分かりました。
DMA はカスパーゼ-1 阻害剤とは異なりインフラマソームによる IL-1b産⽣は抑制しないことから、mtDNA 内包エクソソームが炎症の誘導に重要であることと、⼀連のエクソソームによる mtDNA 内包過程がベーチェット病の新たな治療標的となることが⽰唆されました。
エクソソームなし

刺激なし

阻害薬

なし

あり
尿酸なし

DMA

カスパーゼ-1阻害剤

DMA

図6：DMAのエクソソーム放出抑制による関節炎の改善

今後、mtDNA を内包してエクソソームによる炎症というベーチェット病の病態に即した分⼦標的治療法開発への発展が期待されます（図 6）。
本研究成果は、2023 年 The EMBO Journal https://doi.org/10.15252/embj.2022112573に掲載されました。
Konaka H, Kato Y, Hirano T, Tsujimoto K, Park JH, Koba T, Aoki W, Matsuzaki Y, Taki M, KoyamaS, Itotagawa E, Jo T, Hirayama T, Kawai T, Ishii KJ, Ueda M, Yamaguchi S, Akira S, Morita T, MaedaY, Nishide M, Nishida S, Shima Y, Narazaki M, Takamatsu H (*Correspondece author), andKumanogoh A. Secretion of mitochondrial DNA via exosomes promotes inflammation in Behçet'ssyndrome. EMBO J. 2023 Sep 4;e112573. doi: 10.15252/embj.2022112573.