第 71回（ 2019年）

日本生物工学会大会
講演要旨集
会

期

2019 年（令和元年）9 月 16 日（月・祝）～ 18 日（水）会場

岡山大学津島キャンパス

公益社団法人 日本生物工学会

第 71 回
日本生物工学会大会（2019）
一般講演・シンポジウム
会期2019 年 9 月 16 日（月・祝）〜 18 日（水）会場

岡山大学 津島キャンパス（岡山市北区津島中）授賞式典・受賞講演
日

時

会

場

2019 年 9 月 16 日（月）9：00 〜 11：30
岡山大学 津島キャンパス 創立 50 周年記念館（金光ホール）（K 会場）（生物工学奨励賞・アジア若手賞の講演日程については大会日程表をご覧下さい）

懇 親 会
日

時

会

場

2019 年 9 月 16 日（月）18：30 〜 20：30
岡山ロイヤルホテル 2 階 光楽の間

ランチョンセミナー期間2019 年 9 月 16 日（月）〜 18 日（水）会場

岡山大学 津島キャンパス

一般教育棟 A 棟・E 棟（S1, S4, S5 会場）

展 示 会
期

間

2019 年 9 月 16 日（月）〜 18 日（水）会場

岡山大学 津島キャンパス 大学会館

生物工学若手研究者の集い（若手会）総会・交流会／イブニングセッション日時

2019 年 9 月 17 日（火）18：00 〜 20：00

会場

岡山大学 津島キャンパス ピーチユニオン 3 階

公益社団法人日 本 生 物 工 学 会

TEL. 06-6876-2731 FAX. 06-6879-2034
E-mail: info@sbj.or.jp
https://www.sbj.or.jp

目

次

大会日程表 ………………………………………………………………………………………… （3）一般講演座長一覧 ………………………………………………………………………………… （6）実行委員会担当者表 ……………………………………………………………………………… （7）
会場案内図 ………………………………………………………………………………………… （8）受賞者一覧 …………………………………………………………………………………………（12）プログラム
第 1 日目

授賞式，受賞講演，シンポジウム・招待講演，
一般講演，ランチョンセミナー ………………………………………………（13）第 2 日目

シンポジウム・招待講演，一般講演，ランチョンセミナー ………………（30）

第 3 日目

シンポジウム・招待講演，一般講演，ランチョンセミナー ………………（58）

要旨
第 1 日目

受賞講演 …………………………………………………………………………（79）シンポジウム・招待講演 ………………………………………………………（83）一般講演 …………………………………………………………………………（98）

第 2 日目

シンポジウム・招待講演（午前の部） …………………………………… （139）
シンポジウム・招待講演（午後の部） …………………………………… （146）
一般講演（午前の部） ……………………………………………………… （164）
一般講演（午後の部） ……………………………………………………… （189）

第 3 日目

シンポジウム・招待講演（午前の部） …………………………………… （235）
シンポジウム（午後の部） ………………………………………………… （244）
一般講演（午前の部） ……………………………………………………… （251）
一般講演（午後の部） ……………………………………………………… （275）

人名索引 ………………………………………………………………………………………… （297）キーワード索引 ………………………………………………………………………………… （311）
ランチョンセミナープログラム ……………………………………………………………… （323）
ランチョンセミナー要旨 ……………………………………………………………………… （324）2019 年 8 月 21 日（水）～ 11 月 8 日（金）まで
大会 HP（https://www.sbj.or.jp/2019/abstract/）
で講演要旨集 E-PUB 版のダウンロードが可能になり
ます。

3

大会日程表
9 月 16 日（月・祝）
会場

午

前

9:00-11:30

午昼
12:00-12:50

後

13:15-17:30

18:30-20:30

授賞式・受賞講演
K 会場
五十周年記念館（功労賞，生物工学
金光ホール 賞，
功績賞，技術賞）
S1 会場
A21[L] ヒューマンメ
タボロームテクノ
ロジーズ株式会社[S] 世界を目指す日本の酒類【本部企画】（15:30-17:30）[S] 微生物ダークマターとマイクロ

S2 会場
A41

バイオータ研究が導く新しい生物工学（13:15-15:15）[S] 産業化を目指した生体分子工学の新たな潮流（15:00-17:30） ＊ KSBB 招待
講演 (Prof. Tae-Joon Jeon) を含む

S3 会場
B41
S4 会場
E11

[L] 東ソー株式
会社[S] 酵母におけるアミノ酸研究の

S5 会場
E21

[L] オンチップ・ [S] 動物細胞培養の新研究領域への挑
バイオテクノロ 戦〜学問の境界領域で起こるイノベー
ジーズ株式会社 ションを目指して〜（13:15-15:15）[S] 食品成分が腸内環境に及新展開（13:15-15:15）

ぼす影響（15:30-17:30）

A 会場
A36

酵素学，酵素工学（13:30-17:30）

B 会場
A37

バイオマス，資源，エネルギー工学（13:30-17:30）

C 会場
B21

環境浄化，修復，保全技術（13:30-17:18）

D 会場
B32

生物化学工学（13:30-17:30）

E 会場
D12

受賞講演
オミクス解析
（斎藤賞）（13:54-15:18）（13:30-13:50）

F 会場
D23

タンパク質工学（13:30-17:06）

G 会場
D25

受賞講演
発酵生理学，発酵工学（アジア若手賞）（13:54-15:42）（13:30-13:50）

H 会場
D32

培養工学（13:30-15:18）

I 会場
D34

受賞講演
（江田賞） 代謝工学（13:54-15:54）（13:30-13:50）

J 会場
E23

受賞講演
セル＆ティッシュエンジ（照井賞）
ニアリング（13:54-15:42）（13:30-13:50）

大学会館
岡山ロイヤルホテル

植物細胞工学，組織培養，育種工学（15:18-17:06）

遺伝子工学（15:42-17:30）

バイオプロセス（15:18-17:30）

展示会 (10:00-17:30)
懇親会

4

9 月 17 日（火）
会場

午

前

9:00-11:36

S3 会場
B41

A 会場
A36
B 会場
A37

＊ KSBB 招待講演（Prof.Hei Chan Lee）を含む[S] タンパク質工学におけるドライ−ウェッ
ト技術融合の新展開（9:30-11:30）
遺伝子工学（9:00-11:36）

バイオマス，資源，エネルギー工学（9:00-11:36）
代謝工学

D 会場
B32

（9:00-11:36）

E 会場
D12

（9:00-11:36）

F 会場
D23

（9:00-10:36）

生物化学工学

食品科学，食品工学

オミクス解析

セル＆ティッシュエン
ジニアリング（9:00-11:36）
醸造学，醸造工学（9:00-11:36）

I 会場
D34
J 会場
E23

大学会館
ピーチ
ユニオン
3階

[S] 複雑組織製造に必要な基盤技術を考える〜バイオリアク
イオ株式会社
ターの側から〜（13:15-15:15）（9:00-11:36）

H 会場
D32

18:00-20:00（13:15-15:45）＊ KSBB 招待講演（Prof. Jong Wook Hong）を含む[L] タカラバ

C 会場
B21

G 会場
D25

13:15-17:30[S] 次世代のバイオプロセス[S] 微生物による物質生産の新展開を拓く複合微生物系精密制 代議員会
（15:00-17:30）＊ KSBB 招待講演
御技術
（11:50-13:00）(Prof.Sung Ok Han）を含む（9:30-11:30）[IS] Development of Biosensing Technology Targeting[S] 食農工産業の持続的発展を牽引する次世代植物バイオ
Sustainability Development Goals「持続可能な開発
テクノロジー（9:00-11:30）
目標を目指したバイオセンシングの開発と展開」

S4 会場
E11
S5 会場
E21

後

[L] 株式会社 [S] 持続可能な開発目標（SDGs）を生物工学にどう活用する林原
か【本部企画】（13:15-17:15）

S1 会場
A21
S2 会場
A41

午

昼
12:00-12:50[L] 株式会社 [S] 物質生産や代謝制御におけ島津製作所

る呼吸鎖の役割（13:15-15:15）[S] 新しいデータ駆動型サイエンスによる複雑な生命現象の理解（15:30-17:30）[S] 微生物ポリアミンが支える高齢化社会の生活（15:30-17:30）

酵素学，酵素工学（13:30-17:30）

酵素学，酵素工学（13:30-17:30）
バイオマス，資源，エネルギー工学（13:30-14:42）

発酵生理学，発酵工学（14:54-17:06）

遺伝子工学（13:30-17:30）

分類，系統，遺伝学（13:30-16:30）

バイオセンシング，分析化学（13:30-17:18）

抗体工学（13:30-15:30）

セル＆ティッシュエ
ンジニアリング（15:30-17:06）

醸造学，醸造工学（13:30-17:30）

核酸工学 / 糖鎖工学 / 脂質工学 / ペプチド工学（13:30-17:30）
発酵生理学，発酵工学（9:00-11:24）

タンパク質工学（13:30-17:18）

展示会（9:00-17:30）
若手会総会・交流会／イブニングセッション

5

9 月 18 日（水）
午

会場

前

昼
12:00-12:50

9:00-11:30

S1 会場
A21

S2 会場
A41
S3 会場
B41

後

13:15-15:18[IS]Recent Topics on Cultivation andMeasurement: New Challenges by Start-Up
Companies「培養計測の最近のトピックス [L] 三洋貿易

〜スタートアップ企業による新たな取り組 株式会社
み〜」【本部企画】／特別招待講演（Prof.
Jochen Buechs) を含む（9:30-11:30）[S] 大規模な、遺伝子・ゲノムを扱うツー[S] 生合成工学における有用生体機能分子の次ルとしての接合伝達システムの開発と展望（9:30-11:30）

世代創製技術（13:15-15:15）[S] インシリコタンパク質設計で加速する[S] 日本におけるバイオジェット燃料生産技術

タンパク質工学・応用構造生物学（9:30-11:30）の最先端（13:15-15:15）[L] 天野エン[S] ペアで紹介します，Wet と Dry の融合研究
ザイム株式（13:15-15:15）
会社

S4 会場
E11
S5 会場
E21

午

[S] 生体と対話するナノ界面科学（9:30-11:30）

バイオマス，資源，エネルギー工学

A 会場
A36

（9:00-11:24）

B 会場
A37

遺伝子工学（9:00-11:24）

酵素学，酵素工学（13:30-15:18）

酵素学，酵素工学（13:30-15:18）

C 会場
B21

抗体工学（13:30-14:42）

D 会場
B32

生物化学工学（9:00-11:24）

生物化学工学（13:30-14:54）

E 会場
D12

生合成，天然物化学（9:00-11:24）

生合成，天然物化学 / 有機化学，高分子化学（13:30-15:18）

F 会場
D23

（9:00-10:48）（13:30-14:54）

G 会場
D25

生体医用工学 / セル＆ティッシュエンジニアリ
ング（9:00-11:24）（13:30-15:18）

H 会場
D32

醸造学，醸造工学（9:00-11:24）

培養工学（13:30-15:18）

I 会場
D34

生体情報工学，バイオインフォマティクス / シ
ステムバイオロジー（9:00-11:24）（13:30-15:18）

J 会場
E23

環境工学，廃水処理技術（9:00-11:24）

食品科学，食品工学

大学会館

IS：国際シンポジウム
S：シンポジウム
L：ランチョンセミナー

センサー，計測工学

展示会（9:00-14:00）

セル＆ティッシュエンジニアリング

発酵生理学，発酵工学

環境工学，廃水処理技術（13:30-15:18）

6

座長一覧
一般講演
9 月 16 日（月）会場 講演番号
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J

1Ap01–06
1Ap07–12
1Ap13–18
1Bp01–06
1Bp07–12
1Bp13–18
1Cp01–06
1Cp07–12
1Cp13–17
1Dp01–06
1Dp07–12
1Dp13–18
1Ep03–08
1Ep09–12
1Ep13–16
1Fp01–06
1Fp07–12
1Fp13–16
1Gp03–06
1Gp07–10
1Gp11–18
1Hp01–08
1Hp09–12
1Hp13–18
1Ip03–06
1Ip07–11
1Jp03–06
1Jp07–10時

9 月 17 日（火）間

13:30–14:42
14:54–16:06
16:18–17:30
13:30–14:42
14:54–16:06
16:18–17:30
13:30–14:42
14:54–16:06
16:18–17:18
13:30–14:42
14:54–16:06
16:18–17:30
13:54–15:18
15:18–16:06
16:18–17:06
13:30–14:42
14:54–16:06
16:18–17:06
13:54–14:42
14:54–15:42
15:42–17:30
13:30–15:18
15:18–16:06
16:18–17:30
13:54–14:42
14:54–15:54
13:54–14:42
14:54–15:42

座

長

西矢 芳昭
杉森 大助
畑中 唯史
岡村 好子
油井 信弘
池
道彦
笠井 大輔
杉山 友康
前田 勇
佐々木千鶴
梶山 博司
堀内 淳一
豊田 晃一
能年 義輝
加藤
晃
新井 宗仁
赤沼 哲史
堀
克敏
児玉 浩明
善藤 威史
赤澤 真一
中島田 豊
加藤 且也
田島 誉久
松田 史生
荻野 千秋
河邉 佳典
東
恒仁

吉田
吉田
森
田中
大槻
古屋
平井
中島
諸星
前田
金尾
前田
根本

豊和
裕美
光一
剛
隆司
俊樹
浩文
一紀
知広
淳史
忠芳
憲成
理子

神谷
伊藤

典穂
創平

秋
野田

庸裕
尚宏

花井

泰三

会場 講演番号
A
B
C
D
E
F
G
H
J

田中
三浦

瑞己
夏子

会場 講演番号

B
C

会場 講演番号
A
B
D
E
F
G
H
I
J

3Aa01–06
3Aa07–11
3Ba01–06
3Ba07–11
3Da01–06
3Da07–11
3Ea01–06
3Ea07–11
3Fa01–09
3Ga01–06
3Ga07–11
3Ha01–06
3Ha07–11
3Ia01–06
3Ia07–11
3Ja01–06
3Ja07–11時

D
間

9:00–10:12
10:24–11:24
9:00–10:12
10:24–11:24
9:00–10:12
10:24–11:24
9:00–10:12
10:24–11:24
9:00–10:48
9:00–10:12
10:24–11:24
9:00–10:12
10:24–11:24
9:00–10:12
10:24–11:24
9:00–10:12
10:24–11:24

座

小西
松崎
星田
石井
勝田
加藤
荒川
星野
小林
伊藤
長森
平良
片倉
兒島
三宅
東
滝口

長

正朗
浩明
尚司
純
知尚
竜也
賢治
一宏
拓嗣
大知
英二
東紀
啓雄
孝明
淳
雅之
昇

藤森 一浩
吉田 信行
横尾 岳彦
杉山 峰崇
久保
幹
佐藤あやの
小笠原泰志
山中 一也
福﨑英一郎
高木 昌宏
藤田 聡史
二神 泰基
渡部
潤
前田 和勲
八幡
穣
田代 幸寛
米光
裕

E
F
G
宮本

浩邦

9 月 18 日（水）
会場
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J

講演番号

3Ap01–09
3Bp01–09
3Cp01–06
3Dp01–07
3Ep01–09
3Fp01–07
3Gp01–09
3Hp01–09
3Ip01–09
3Jp01–09時

間

13:30–15:18
13:30–15:18
13:30–14:42
13:30–14:54
13:30–15:18
13:30–14:54
13:30–15:18
13:30–15:18
13:30–15:18
13:30–15:18

座

大西
岡㟢
青木
多賀
麻生
朴
金岡
青柳
井沢
久能

長

浩平
文美
航
直彦
祐司
龍洙
英徳
秀紀
真吾
樹

佐藤 喬章 和田大
倉掛 昌裕 炭谷 順一
梅津 光央
竹原 宗範
一瀬 博文 文谷 政憲
Jeffrey Harmon
河原 正浩 福田 展雄
金美海 村松 和明柘植 丈治 藥師 寿治
黒田 真史 佐々木建吾

時間

9:00–10:12
10:24–11:36
9:00–10:12
10:24–11:36
9:00–10:12
10:24–11:36
9:00–10:12
10:24–11:36
9:00–10:12
10:24–11:36
9:00–10:36
9:00–10:12
10:24–11:36
9:00–10:12
10:24–11:36
9:00–10:12
10:24–11:24

座

長

新谷 政己
鈴木 宏和
野田 正文
安枝
寿
阿野 貴司
菊川 寛史
浅田 元子
原
清敬
高木 博史
廣田 隆一
桐村光太郎
園木 和典
芦内
誠
熊田 陽一
藤原 伸介
吉野 知子
Sastia Prama Putri  
松崎 弘美
山崎 思乃
石川 森夫
相馬 悠希
小島 伸彦
福田 淳二
蟹江
慧
山田 真澄
北垣 浩志
倉橋
敦
尾関 健二
楠本 憲一
豊田 晃一
若井
暁
松下 一信
和田
大

山﨑

正夫

戸谷

吉博

中川

智行

中野

秀雄

9 月 17 日（火）A

9 月 18 日（水）2Aa01–06
2Aa07–12
2Ba01–06
2Ba07–12
2Ca01–06
2Ca07–12
2Da01–06
2Da07–12
2Ea01–06
2Ea07–12
2Fa01–08
2Ga01–06
2Ga07–12
2Ha01–06
2Ha07–12
2Ja01–06
2Ja07–11

HI
J

2Ap01–06
2Ap07–12
2Ap13–18
2Bp01–06
2Bp07–12
2Bp13–18
2Cp01–06
2Cp07–12
2Cp13–16
2Dp01–06
2Dp07–12
2Dp13–18
2Ep01–06
2Ep07–14
2Fp01–06
2Fp07–12
2Fp13–17
2Gp01–09
2Gp10–16
2Hp01–06
2Hp07–12
2Hp13–18
2Ip01–06
2Ip07–12
2Ip13–18
2Jp01–06
2Jp07–12
2Jp13–17時

間

13:30–14:42
14:54–16:06
16:18–17:30
13:30–14:42
14:54–16:06
16:18–17:30
13:30–14:42
14:54–16:06
16:18–17:06
13:30–14:42
14:54–16:06
16:18–17:30
13:30–14:42
14:54–16:30
13:30–14:42
14:54–16:06
16:18–17:18
13:30–15:30
15:30–17:06
13:30–14:42
14:54–16:06
16:18–17:30
13:30–14:42
14:54–16:06
16:18–17:30
13:30–14:42
14:54–16:06
16:18–17:18

座

長

古賀 雄一
有馬 二朗
田村
隆
池田
丈
加藤太一郎
亀谷 将史
喜多 晃久
川口 秀夫
外山 博英
金井
保
熊谷 孝則
新垣 篤史
阿座上弘行
川崎
健
菊地
淳
甲元 一也
新間 秀一
鬼塚 正義
加藤 竜司
中山 俊一
磯谷 敦子
五島 徹也
牧野 祥嗣
尾島 由紘
落合 秋人
上田
宏
小池あゆみ
座古
保

若山
守
鈴木
伸
松村 洋寿
戸田
弘
高橋 征司
末 信一朗
田丸
浩
本田 孝祐
渡邊
広岡
福居
川上
竹中
竹内
福谷
竹山
金山
中村
根来
稲留
渡辺
山崎
田中
清水
平
宮本
徳樂

崇人
和丈
俊昭
了史
慎治
俊文
洋介
春子
直樹
史
宏明
弘乃
大輔
智彦
祐圭
一憲
大輔
和英
清孝

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第 71 回日本生物工学会大会（2019）
実行委員会・業務分担（○：責任者）
実行委員長

稲垣 賢二

副実行委員長加藤 純一・滝澤 昇

総務○二見 淳一郎・今中 洋行・田村 隆・森 光一・岩井 良輔

会計○金山 直樹・曲 正樹

広報

○滝澤 昇

プログラム

〇滝澤 昇・今中 洋行・加藤 純一・多田 宏子・曲 正樹・金尾 忠芳・
二見 翠・根本 理子・山田 浩司・岩井 良輔・畑中 唯史・矢野 嵩典・
工藤 季之・森 光一・上村 一雄・金子 明裕・阿賀 創・山本 拓生・
渡邊 光・丸 勇史・佐藤 あやの・能年 義輝・冨田 秀太・三宅 剛史・
大城 隆・中島田 豊・田島 誉久・赤尾 健・小山 和哉・櫻谷 英治・
有馬 二朗・芦内 誠・山田 陽一

会場〇今中 洋行・多田 宏子・曲 正樹・金尾 忠芳・有馬 二朗・林 将也・
能年 義輝・佐藤 あやのシンポジウム〇田村 隆

ランチョンセミナー〇神崎 浩・多田 宏子

受付・クローク〇根本 理子・森 光一・田村 隆・辻野 義雄

授賞式〇金尾 忠芳展示〇神崎 浩・丸 勇史

懇親会〇谷 明生・三井 亮司・矢野 嵩典

若手交流会○今中 洋行・田島 誉久

託児所

〇二見 翠

顧問

中西 一弘・大森 斉・上村 一雄

8

会場への交通案内

9

会場案内＜津島キャンパス会場配置図＞

10＜講演会場配置図＞

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日本生物工学会 2019 年度受賞者

本年度の受賞者が決定しましたのでお知らせ申し上げます．
■第 38 回 生物工学賞 伊藤 伸哉（富山県立大学工学部・教授）「新規酸化還元系バイオプロセスの基盤技術開発とその応用」■第 13 回 生物工学功績賞 紀ノ岡正博（大阪大学大学院工学研究科・教授）「再生医療に資する細胞製造性に関する研究」■第 13 回 生物工学功労賞 今井 泰彦（キッコーマン株式会社環境部・部長）「未来社会を先導する技術開発研究の実現を目指した産学連携活動への貢献」■第 52 回 生物工学奨励賞（江田賞） 伊藤 一成（岡山県工業技術センター・研究員）「無通風箱培養法を利用した固体培養における麹菌の生育と酵素生産に関する研究」■第 55 回 生物工学奨励賞（斎藤賞） 佐々木建吾（神戸大学大学院科学技術イノベーション研究科・特命准教授）「持続可能・健康社会の構築に向けた複合微生物系の制御」■第 42 回 生物工学奨励賞（照井賞） 杉浦 慎治（産業技術総合研究所創薬基盤研究部門・上級主任研究員）「圧力駆動型 Microphysiological systems の開発」
■第 28 回 生物工学技術賞 小原聡 1*・寺島 義文 2・杉本
明 3・福島 康裕 4・菊池 康紀 51
2
（ アサヒクオリティ＆イノベーションズ株式会社， 国際農林水産業研究センター，3 サトウキビコンサルタント，
4東北大学，5 東京大学，* 現，東京大学）「選択的発酵酵母を利用した砂糖・バイオエタノール逆転生産プロセスの開発」■第 16 回 生物工学アジア若手賞（Young Asian Biotechnologist Prize） Li Tan（Chinese Academy of Sciences, China）「Recycling of municipal solid waste via ethanol and/or methane fermentation」■第 8 回 生物工学アジア若手研究奨励賞（The DaSilva Award） Han Xiao（Shanghai Jiao Tong University, China）「Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for eﬃcient biosynthesis of antitumor ganoderic acidHLDOA」■第 27 回 生物工学論文賞
1）Atchara Manowattana1・Charin Techapun1・渡辺 昌規 2・Thanongsak Chaiyaso1（1Chiang Mai University, Thailand，2 山形大学）

Bioconversion of biodiesel-derived crude glycerol into lipids and carotenoids by an oleaginous red yeast
Sporidiobolus pararoseus KM281507 in an airlift bioreactor
2）石井 友理 1*・赤坂 直紀 2・佐古田久雄 2・秀瀬 涼太 1**・藤原 伸介 1
（1 関西学院大学，2 マルカン酢株式会社，* 現，バーチャレクス・コンサルティング株式会社，** 現，神戸大学）
Leucine responsive regulatory protein is involved in methionine metabolism and polyamine homeostasis in acetic
acid bacterium Komagataeibacter europaeus3）鈴木伸・原 良太郎 *・木野 邦器（早稲田大学，* 現，京都大学）
Production of aminoacyl prolines using the adenylation domain of nonribosomal peptide synthetase with class III
polyphosphate kinase 2-mediated ATP regeneration4）菅沼 政俊 1*・野村
雄 1・比嘉友紀子 1・片岡由起子 1・船隈 俊介 1・岡﨑 博之 1・鈴木 健夫 1・藤山 和仁 2・
瀬筒 秀樹 3・立松謙一郎 3・田村 俊樹 3*（1 シスメックス株式会社，2 大阪大学，3 農業・食品産業技術総合研究機構，* 現，大日本蚕糸会）
N-glycan sialylation in a silkworm-baculovirus expression system
5）高橋 将人・青柳 秀紀（筑波大学）

Eﬀect of intermittent opening of breathable culture plugs and aeration of headspace on the structure of microbialcommunities in shake-ﬂask culture6）渡辺 大輔 1*・熊野 舞香 1・杉本 幸子 1・伊藤稔 1・大橋 正孝 2・砂田 啓輔 3・高橋 俊成 3・山田
翼 3・
高木 博史 1
（1 奈良先端科学技術大学院大学，2 奈良県産業振興総合センター，3 菊正宗酒造株式会社，* 現，京都大学）

Metabolic switching of sake yeast by kimoto lactic acid bacteria through the [GAR ＋ ] non-genetic element
7）米倉 円佳 1・青木 直大 2・廣瀬 竜郎 2,3*・大杉
立 2**・近藤
聡 1・大音徳1（1 トヨタ自動車，2 東京大学，3 農業・食品産業技術総合研究機構，* 現，高崎健康福祉大学，** 現，東京農業大学）
生きた植物から可溶性糖を取り出す：糖輸送体 SWEET と排水液による採取方法の検討■第 8 回 生物工学学生優秀賞（飛翔賞）
1）伊藤 智之（東北大学大学院工学研究科バイオ工学専攻）「情報科学と進化工学を組み合わせた分子認識タンパク質創出プロセスの開発」
力（筑波大学大学院生命環境科学研究科生物機能科学専攻）「SCF 法を活用した好酸性微生物や耐酸性微生物の高効率なスクリーニング系の開発」
3）本山 智晴（静岡県立大学大学院薬食生命科学総合学府食品栄養科学専攻）「l- アミノ酸を起点とするピラジン生合成機構の解明とその応用」
4）橋田 礼博（大阪大学大学院工学研究科生命先端工学専攻）「回転浮遊培養におけるヒト iPS 細胞集塊挙動の速度論的解釈」
5）大川 敦司（岡山大学大学院環境生命科学研究科農生命科学専攻）「PLP 依存性 l- メチオニン代謝関連酵素の構造機能解析と応用」
6）馬場嵩一朗（佐賀大学大学院農学研究科，現，鹿児島大学大学院連合農学研究科応用生命科学専攻）「清酒酵母の育種と醸造特性評価」

2）高野

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第 1 日（9 月 16 日）
太字の一般講演は今年度の生物工学学生優秀賞（飛翔賞）受賞者の発表です．
開始時間

講演番号

演

発表者氏名（所属）題○印は講演者を示す

授賞式・受賞講演（生物工学功労賞，生物工学賞，生物工学功績賞，生物工学技術賞）

K 会場 五十周年記念館 金光ホール（9:00～11:30）
授賞式
9:00

会長挨拶

9:05

韓国生物工学会（KSBB）会長挨拶

9:10

名誉会員，功労会員推戴

9:20

各賞授賞

9:55

1A-Ka01〈生物工学功労賞〉
生物工学功労賞受賞にあたって............................................................................................. ○今井 泰彦 1,2（1 キッコーマン, 2 野田産研）

10:05

1A-Ka02

座長：木野 邦器

〈生物工学賞〉

新規酸化還元系バイオプロセスの基盤技術開発とその応用...................................................................................................................... ○伊藤 伸哉（富山県大・工）10:40

1A-Ka03

座長：高木 昌宏

〈生物工学功績賞〉

再生医療に資する細胞製造性に関する研究...................................................................................................................... ○紀ノ岡 正博（阪大院・工）11:10

1A-Ka04

座長：今井 泰彦

〈生物工学技術賞〉

選択的発酵酵母を利用した砂糖・バイオエタノール逆転生産プロセスの開発....................................................................... ○小原 聡 1, 寺島 義文 2, 杉本 明 3, 福島 康裕 4, 菊池 康紀 5
（1 アサヒ Q&I, 2 国際農研セ, 3 サトウキビコンサルタント, 4 東北大院・工,5

東大・未来ビジョン研セ）受賞講演（生物工学奨励賞（江田賞・斎藤賞・照井賞），生物工学アジア若手賞）
I 会場
13:30

1A-Ip01〈生物工学奨励賞（江田賞）〉

D34（13:30～13:50）
座長：吉田 聡無通風箱培養法を利用した固体培養における麹菌の生育と酵素生産に関する研究.................................................................................................. ○伊藤 一成（岡山県工業技術センター）

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E 会場
13:30

1A-Ep01

D12（13:30～13:50）
座長：高木 博史

〈生物工学奨励賞（斎藤賞）〉

健康・持続可能社会の構築に向けた複合微生物系（ヒト腸管・バイオガス発酵槽内）の制御.................................................................................................. ○佐々木 建吾（神戸大院・科技イノベ）

J 会場
13:30

1A-Jp01

E23（13:30～13:50）〈生物工学奨励賞（照井賞）〉

座長：上平 正道

圧力駆動型 Microphysiological systems の開発.............................................................................................................. ○杉浦 慎治（産総研・創薬基盤）

G 会場 D25（13:30～13:50）
13:30

1A-Gp01〈生物工学アジア若手賞〉

座長：藤山 和仁Recycling of municipal solid waste via ethanol and/or methane fermentation....................................................................................................................................................... ○Li Tan 1,2（1 Chengdu Inst. Biology, Chinese Academy of Sciences, 2 Coll. Architect. Environ., Sichuan Univ.）

シンポジウム・招待講演

S1 会場 A21（15:30～17:30）
世界を目指す日本の酒類【本部企画】
はじめに............................................................................................................................................................ 山田 修

15:30

座長：山田 修15:33

1S-S1p01

日本ワインの戦略...................................................................... ○安蔵 光弘（メルシャン株式会社シャトーメルシャン）
座長：髙瀬 良和

16:11

1S-S1p02

酒造り 200 年、茨城の田舎の造り酒屋からジャパニーズクラフトビールの世界発信.............................................................................................................. ○木内 敏之（木内酒造合資会社）

16:42

1S-S1p03

日本酒を世界へ.......................................................................................................... ○宇都宮 仁（日本酒造組合中央会）

座長：堤 浩子

17:27

おわりに
............................................................................................................................................................ 堤 浩子

15

S2 会場 A41（13:15～15:15）
微生物ダークマターとマイクロバイオータ研究が導く新しい生物工学
はじめに........................................................................................................................................................ 花井 泰三

13:15

座長：石井 正治
13:20

1S-S2p01

微生物ダークマターへのアクセス：培養手法の革新と未知増殖制御メカニズムの解明.................................................................................................. ○青井 議輝（広島大院・統合生命科学）

13:45

1S-S2p02

物質循環・代謝におけるマイクロバイオータ機能の具現化ツール開発............................................................. ○小川 順, 岸野 重信, 安藤 晃規, 竹内 道樹, 原 良太郎, 上田 誠
（京大院・農）休憩

14:10

座長：青柳 秀紀
14:15

1S-S2p03

微生物ダークマターが創り出す未知物質の探索............................................................. ○中島 琢自, 松尾 洋孝, 高橋 洋子, 大村 智（北里大・生命研）

14:40

1S-S2p04

プラスチック分解細菌のエネルギー獲得戦略.......................................................................................................... ○吉田 昭介（奈良先端大・バイオ）
おわりに........................................................................................................................................................ 青柳 秀紀

15:05

S3 会場 B41（15:00～17:30）
産業化を目指した生体分子工学の新たな潮流／招待講演
15:00

1S-S3p01〈招待講演（韓国生物工学会）〉

座長：座古 保Nanopore technology for the detection of single bacterial spores...............................................................................................................................................○Tae-Joon Jeon
（Dept. Biol. Eng., Inha Univ.）
はじめに............................................................................................................................................................ 座古 保

15:30

座長：座古 保15:35

1S-S3p02

検査・診断用ペーパーデバイスの開発.......................................................................................................................... ○内村 浩美（愛媛大・セ）

16:00

1S-S3p03

ペプチド分子設計による人工ウイルスキャプシドならびに微小管内包分子の創製.......................................................................................................................... ○松浦 和則（鳥取大・工）

16:25

1S-S3p04

蚕を起点とする持続可能な高付加価値タンパク質生産プロセスの構築................................................................................................. ○神谷 典穂 1,2, 南畑 孝介 1,3, 日下部 宜宏 4

座長：上田 宏（1 九大・未来化セ, 2 九大院・工, 3 KAICO(株), 4 九大院・農）
座長：神谷 典穂
16:45

1S-S3p05

モノクローナル抗体迅速探索プラットフォーム技術の社会実装.................................................................................. ○中野 秀雄 1,2, 加藤 晃代 2, 大内 将司 2, 兒島 孝明 1（1 名大院・生命農学, 2 iBody 株式会社）

16

17:05

1S-S3p06

Beyond Q-body: 色素修飾が不要な新規免疫測定素子の構築....................................................................................... ○上田 宏 1, 安田 貴信 2, 上野 慶行 2, 井上 暁人 2,
髙橋 昌樹 2, 大室 有紀 1, 北口 哲也 1, 董 金華 1,3（ 東工大・化学生命研, 2 東工大・生命理工, 3 濰坊医学院）
1

おわりに............................................................................................................................................................ 上田 宏

17:25

S4 会場 E11（13:15～15:15）
酵母におけるアミノ酸研究の新展開
はじめに........................................................................................................................................................ 高木 博史

13:15

座長：高木 博史
13:20

1S-S4p01

アミノ酸による出芽酵母の寿命延長機構.................................................................................................. ○水沼 正樹（広島大院・統合生命科学）

13:42

1S-S4p02

アミノ酸（L-トリプトファン）による分裂酵母細胞の生育阻害............ ○北村 憲司 1,2, 永島 直翔 2（1 広島大・自然科学研セ・遺伝子, 2 広島大院・統合生命科学）
座長：水沼 正樹

14:04

1S-S4p03

液胞アミノ酸コンパートメンテーションの機構・生理・応用........................................ ○関藤 孝之 1, 河田 美幸 1,2（1 愛媛大院・農, 2 愛媛大・学術支援センター）

14:26

1S-S4p04

清酒醸造におけるアミノ酸高生産酵母の積極的活用...................................................................................................................... ○小高 敦史（月桂冠・総研）

14:48

1S-S4p05

アミノ酸の代謝制御・生理機能に着目した酵母の高機能開発.......................................................................................................... ○高木 博史（奈良先端大・バイオ）
おわりに........................................................................................................................................................ 水沼 正樹

15:10

S4 会場 E11（15:30～17:30）
食品成分が腸内環境に及ぼす影響
座長：中山 二郎
はじめに........................................................................................................................................................ 北垣 浩志

15:30

座長：北垣 浩志
15:32

1S-S4p06

スフィンゴ脂質の健康機能性.......................................................................................................................... ○菅原 達也（京大院・農）

15:50

1S-S4p07

植物・真菌由来スフィンゴ脂質の消化管への機能性.............................................................................................................. ○木下 幹朗（帯畜大・食品科学）

16:08

1S-S4p08

腸内細菌によるグルコシルセラミドの分解.......................................................................................................................... ○浅沼 成人（明治大・農）

16:26

休憩

17

座長：北垣 浩志
16:34

1S-S4p09

アジア人の食習慣と腸内細菌叢と健康に関する研究.......................................................................................................................... ○中山 二郎（九大院・農）
座長：中山 二郎

16:52

1S-S4p10

食物繊維と 腸内細菌叢.................................................................................................. ○徳井 教孝（中村学園大・薬膳科学研）

17:10

1S-S4p11

高齢者の食習慣と腸内細菌叢の多様性.............................................................................................................. ○三成 由美（中村学園大・栄養）
おわりに........................................................................................................................................................ 中山 二郎

17:28

S5 会場 E21（13:15～15:15）
動物細胞培養の新研究領域への挑戦～学問の境界領域で起こるイノベーションを目指して～はじめに............................................................................................................................................................ 蟹江 慧

13:15

座長：蟹江 慧
13:18

1S-S5p01

微小重力環境での細胞培養と再生医療への応用...................................................................................... ○河原 裕美 1, 猪村 剛史 2, 大塚 貴志 2, 弓削 類 1,2（1 スペース・バイオ・ラボラトリーズ, 2 広島大院・医系科学研究科）

13:37

1S-S5p02

閉鎖系自動培養システム：CELLAFORTE.................................................................................................................................. ○竹内 誠亮（ニプロ）

13:56

1S-S5p03

ヒト細胞の 3 次元培養によるがん微小環境の構築と解析.................................................................................................. ○高橋 治子（広島大院・統合生命科学）

座長：曽宮 正晴

座長：堀江 正信
14:15

1S-S5p04

細胞が発生する力のアッセイ...................................................................................................................... ○松井 翼（阪大院・基礎工）14:34

1S-S5p05

ディープラーニングとバイオメディカルイメージング技術................................................................. ○新岡 宏彦（大阪大学 データビリティフロンティア機構）

14:53

1S-S5p06

フレキシブルフィルム力分布センサシステムの開発：動物細胞計測に向けて............................................................... ○森脇 健司 1, 岩井 良輔 2, 太田 風輝 2, 藤崎 和弘 1, 笹川 和彦 1

座長：岩井 良輔

（1 弘前大院・理工, 2 岡山理大・フロンティア理工学研究所）
15:12

おわりに
........................................................................................................................................................ 岩井 良輔

一般講演

A 会場 A36（13:30～17:30）【酵素学，酵素工学】
13:18

接続チェック（12 分）

18

13:30

1Ap01

サルコシンオキシダーゼの各種環状イミノ酸に対する反応特異性および立体選択性........................................................ ○黒部 督惠 1, 松本 美徳 1, 山本 真由香 2, 中嶋 義隆 1,2, 西矢 芳昭 1,2（1 摂南大院・理工, 2 摂南大・理工）

13:42

1Ap02

リンゴ酸デヒドロゲナーゼの基質特異性と立体構造解析に基づく構造変化メカニズムの考察........................................................ ○下澤 勇弥 1,2, 西矢 芳昭 1, 佐々本 康平 1,2, 氷見山 幹基 2, 中村 努 2（1 摂南大院・理工, 2 産総研）

13:54

1Ap03

Pseudomonas sp. VT1B 株由来ポリビニルアルコール分解関連酵素の精製................................................................................. ○山中 章裕, 松尾 直紀, 森 哲也, 西本 友之（林原）

14:06

1Ap04

新奇スルホンアミド分解酵素の反応特性解析..................... ○柴田 幹哉 1, 満倉 浩一 2, 吉田 豊和 2（1 岐阜大院・自科技, 2 岐阜大・化学・生命工）

14:18

1Ap05

N-Cbz-アミノ酸を脱保護する微生物酵素の反応特性................................................. ○府川 祐太 1, 満倉 浩一 2, 吉田 豊和 2（1 岐阜大院・工, 2 岐阜大・工）

14:30

1Ap06

フタル酸類に作用する新奇脱炭酸酵素の探索.................................................................................... ○魚住 和輝 1, 奥村 直也 2, 満倉 浩一 3, 吉田 豊和 3
（1 岐阜大院・自科技, 2 岐阜大院・工, 3 岐阜大・工）
休憩・接続チェック（12 分）

14:42
14:54

1Ap07

好熱好酸性アーキア Sulfolobus tokodaii 由来糖エピメラーゼ ST2245 の反応機構.............................................................................. ○小野 真由子 1, 中野 祥吾 1, 河原林 裕 2,3, 伊藤 創平 1
（1 静県大院・薬食生命, 2 産総研, 3 次世代バイオ医薬品製造技術研究組合）

15:06

1Ap08

ニトリルヒドラターゼの中性子構造解析に向けた取り組み.................................................................. ○辻井 啓夢 1, 林 英輝 1, 松村 洋寿 1, 野村 高志 2, 當舎 武彦 3,
玉田 太郎 4, 日下 勝弘 5, 久保 稔 2, 城 宜嗣 3, 尾高 雅文 1
（1 秋田大院・理工, 2 兵庫県大院・生命理, 3 理研・SPring-8, 4 量子科学技術研究開発機構,
5

15:18

1Ap09

茨大・フロンティア応用原子科学研究センター）

クライオ電子顕微鏡によるロイシン脱水素酵素の高分解能構造を用いた耐熱化機構の解明...................... ○山口 浩輝 1, 亀川 亜希子 2, 中田 國夫 1, 柏木 立己 1, 水越 利巳 1, 藤吉 好則 2, 谷 一寿 3
（1 味の素バイオ・ファイン研, 2 東京医科歯科大・高等研究院・セスプル, 3 三重大・院医）

15:30

1Ap10

単糖合成を目指した高度好熱菌由来トランスケトラーゼの X 線結晶構造解析および諸性質の検討............. ○吉田 裕美 1,2,3, 吉原 明秀 3,4, 塚本 郁子 2, 秋光 和也 3,4, 何森 健 3,4, 増井 良治 5, 神鳥 成弘 1,2,3（1 香川大・総合生命研究セ, 2 香川大・医, 3 香川大・国際希少糖機構, 4 香川大・農, 5 阪市大院・理）

15:42

1Ap11

有機溶媒中における Tk-subtilisin の酵素活性の解析........................................................ ○宮田 大暉, 山野-足立 範子, 古賀 雄一, 大政 健史（阪大院・工）

15:54

1Ap12

コリン型リゾプラズマローゲン特異的ホスホリパーゼ D の基質特異性スイッチ................................................................................ 小山 貴之 1, 酒瀬川 信一 2, 村山 和隆 3, ○杉森 大助 1
（1 福島大・共生システム理工, 2 旭化成ファーマ, 3 東北大院・医工）
休憩・接続チェック（12 分）

16:06
16:18

1Ap13

卵殻膜分解活性を示す微生物由来エラスターゼの特性解析と加水分解物の生理活性評価................................................... ○今藤 嵩大 1, 横山 萌 2, 木村 行宏 2, 山下 陽子 2, 芦田 均 2, 竹中 慎治 2
（1 神戸大・農, 2 神戸大院・農）

16:30

1Ap14

白色腐朽菌 Phanerochaete chrysosporium NBRC101254 における xylanase 生産に与えるセルロースの影響................................................................................ ○正木 佑弥 1, 萩原 万貴 2, 有吉 由佳 2, 村上 周一郎 2（1 明治大院・農, 2 明治大・農）

16:42

1Ap15

補酵素 B12 関与ジオールデヒドラターゼの作用による 3,3,3‐トリフルオロ‐1,2‐プロパンジオー
ルからの脱フッ素化を伴うアセトアルデヒドの生成......................................................................... ○森 光一 1, Jiang Dong 2, Golding Bernard T. 2, 虎谷 哲夫 1（1 岡山大・工, 2 Sch. Nat. Environ. Sci., Newcastle Univ.）

19

16:54

1Ap16

好熱菌 Thermotoga maritima 由来 Encapsulin に内包されるフェリチン様タンパク質の発現系構築及び機能解析.......................................... ○竹原 直輝, 野中 衛, 松村 洋寿, 小川 信明, 尾高 雅文（秋田大院・理工）

17:06

1Ap17

シリカ重合酵素群で構成されるフィラメントの形成コントロール.................................................................................... ○岡本 淳之介, 中島 一紀, 川﨑 了（北大院・工）

17:18

1Ap18

味覚センサーを用いた放線菌由来アミノペプチダーゼの評価............................................................................................................. ○畑中 唯史 1, 石井 恵 2, 中東 良太 3
（1 岡山生物研, 2 岡山農研, 3 ナガセケムテックス(株)）B 会場 A37（13:30～17:30）【バイオマス，資源，エネルギー工学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

1Bp01

窒素源存在下で油脂を高蓄積する海洋性クラミドモナス変異株の選択的育種......................................... ○小山 智己 1, 加藤 悠一 2, 佐藤 勝也 3, 大野 豊 3, 蓮沼 誠久 1,2, 近藤 昭彦 1,2,4（1 神戸大院・科技イノベ, 2 神戸大・先端バイオ工, 3 量研高崎・放射線生物応用, 4 神戸大院・工）

13:42

1Bp02

海洋性クラミドモナス油脂高蓄積変異株における油脂・カロテノイド増産メカニズムの解明........................ ○加藤 悠一 1, 小山 智己 2, 佐藤 勝也 3, 大野 豊 3, 張 嘉修 4, 蓮沼 誠久 1,2, 近藤 昭彦 1,2,5（1 神戸大・先端バイオ工, 2 神戸大院・科技イノベ, 3 量研高崎・放射線生物応用, 4 国立成功大・化工,
5

13:54

1Bp03

神戸大院・工）Nitratireductor sp. OM-1 の窒素非感受性株の確立および油脂合成経路の解析.................. ○山下 瀬菜 1, 高橋 宏和 1, 渡邉 研志 1, Campanaro Stefano 2, Treu Laura 2, Angelidaki Irini 2,
秋 庸裕 1, 加藤 節 1, 中島田 豊 1, 松村 幸彦 3, 岡村 好子 1
（ 広島大院・統合生命科学, 2 デンマーク工科大, 3 広島大院・工）
1

14:06

1Bp04

焼酎粕を用いた油糧微生物ラビリンチュラの培養による DHA 生産............................................................................................ ○小玉 誠 1, 森谷 亜希 1, 高橋 克嘉 2, 林 雅弘 3
（1 宮崎・工技セ, 2 宮崎・食開セ, 3 宮崎大・農）

14:18

1Bp05

ゲノム編集を用いた TAG lipase ノックアウトによる海洋珪藻 Fistulifera solaris のオイル生産性向上............................................... ○屋部 佑介 1, 串山 夏望 1, 松本 光史 2, 野島 大佑 1, 吉野 知子 1, 田中 剛 1（1 農工大院・工, 2 電源開発）

14:30

1Bp06

海洋珪藻 Fistulifera solaris を用いたシクロオキシゲナーゼ遺伝子のオルガネラ特異的発現によるプロスタグランジン高生産......................................................... ○松本 奈々, 鶴 雄基, 野々山 智美, 前田 義昌, 吉野 知子, 田中 剛
（農工大院・工）
休憩・接続チェック（12 分）

14:42
14:54

1Bp07

気相条件における気生微細藻類 Coccomyxa sp. KGU-D001 の生育と脂質蓄積............................................................ ○川島 成貴, 油井 信弘, 藤井 克彦（工学院大・先進工・生化）

15:06

1Bp08

気相条件下での気生微細藻類 Coelastrella sp. KGU-Y002 のキサントフィルのエステル化における水分量の影響................................................................................ ○恩田 岳英, 油井 信弘, 藤井 克彦（工学院大・工）

15:18

1Bp09

Emticicia sp. EG3 による Euglena gracilis のバイオマスと油脂の生産促進.................................. ○遠山 忠 1, 花岡 翼 2, 山田 康嗣 3, 鈴木 健吾 3, 田中 靖浩 1, 森川 正章 4, 森 一博 1
（1 山梨大院・総研部, 2 山梨大院・医工農, 3 ユーグレナ, 4 北大院・環境）

15:30

1Bp10

炭化水素生産微細藻類 Botoryococcus braunii の共生細菌が生産する藻体生育促進物質の探索....................................................................... ○村山 拳午, 大槻 隆司（山梨大院・医工農・生命環境）

20

15:42

1Bp11

ユーグレナ低酸素下ワックスエステル合成におけるミトコンドリア電子伝達系の機能解明....................................................................... ○西本 歩紗 1, 中澤 昌美 1, 乾 博 2, 上田 光宏 1, 阪本 龍司 1
（1 阪府大院・生環科, 2 阪府大院・栄養）

15:54

1Bp12

有用油脂生産藻の特性分析と環境ストレス耐性評価........................................................................ ○高木 明香莉 1, 佐々木 美月 1, 佐々木 大作 2, 朝山 宗彦 1
（1 茨城大院・農, 2 Biox 化学工業）
休憩・接続チェック（12 分）

16:06
16:18

1Bp13

様々な有機物がウキクサの成長に及ぼす影響............................................... ○牧田 晟洋 1, 石澤 秀紘 1, 黒田 真史 1, 井上 大介 1, 森川 正章 2, 池 道彦 1
（1 阪大院・工, 2 北大院・地環科）

16:30

1Bp14

暗期パルス光照射によるアオサノリの２倍速生育...................... ○梶山 博司 1, 箕田 康一 1, 武田 真樹 1, 木村 祐太 1, 宇山 裕貴 1, 山崎 直人 2, 山本 博文 2
（1 徳島文理大院・工・ナノ物質工, 2 徳島文理大・薬）

16:42

1Bp15

組換え Ralstonia eutropha による糖質炭素源からのポリヒドロキシアルカン酸共重合体生合成におけるアセトアセチル-CoA 還元反応の改変効果............................ Zhang Mengxiao, 栗田 俊輔, 折田 和泉, 中村 聡, ○福居 俊昭（東工大・生命理工）

16:54

1Bp16

未活用資源を用いた PHA 生産および合成遺伝子の特定.................................................... ○張 傛喆 1, 中村 友綺 1, 小野寺 瑠依 1, Motakatla Venkateswar Reddy 2（1 室蘭工業大院・工・環境創生工学, 2 Inst. Mol. Microbiol. Biotech. Münster Univ.）

17:06

1Bp17

白色腐朽菌 Phanerochaete sordida YK-624 株のリグニン分解系を制御する転写因子の探索............................................................................... ○岸川 凜太郎 1, 森 智夫 2, 河岸 洋和 2,3,4, 平井 浩文 2,3（1 静大院・総合科技, 2 静大・農, 3 静大・グリーン科技研, 4 静大・創科技院）

17:18

1Bp18

リグニンモデル化合物のエーテル結合を切断する微生物の探索.................................................................................... ○大谷 早紀 1, 利根川 聡史 1, 羽部 浩 2, 古屋 俊樹 1
（1 東京理科大理工・応生, 2 産総研・環境管理）

C 会場 B21（13:30～17:18）【環境浄化，修復，保全技術】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

1Cp01

芳香族有機塩素化合物の微生物分解に及ぼす土壌の影響......................................................................... ○八田 貴, 久渡瀬 太一, 劉 昊, 周 法宇（岡山理大・工）

13:42

1Cp02

組換え大腸菌を用いた高効率リン酸トリス(2-クロロエチル)分解..................................................................... ○阿部 勝正, 篠原 輝, 高橋 祥司, 解良 芳夫（長岡技科大）

13:54

1Cp03

白色腐朽菌 Phanerochaete chrysosporium によるネオニコチノイド系殺虫剤の分解.................................................................. ○大野 遥 1, 一瀬 博文 2, 森 智夫 3, 河岸 洋和 3,4,5, 平井 浩文 3,4（1 静大院・総合科技, 2 九大院・農, 3 静大・農, 4 静大・グリーン科技研, 5 静大・創科技院）

14:06

1Cp04

Effect of Pseudomonas putida on toluene removal activity in the rhizosphere of Solanum lycopersicum L.
.......○Hak Jin Song 1, Yong-Keun Choi 1, Ji Eun Kim 1, Kwang Jin Kim 2, Yunjeong Yang 1, Eun Bin Lee 1,
Sang Hyun Lee 1, Yung-Hun Yang 1, Hyung Joo Kim 1（1 Dept. Biological Eng., Konkuk Univ., 2 Urban Agric. Res. Div., NIHHS, Rural Development
Administration）

14:18

1Cp05

Pseudomonas sp. PTH10 株における新規フタル酸代謝酵素遺伝子群の機能解析.............................................................. 儀武 菜美子 1, 岩崎 卓巳 2, 西 達也 2, ○笠井 大輔 1, 福田 雅夫 1,3（1 長岡技科大, 2 （株）ジナリス, 3 中部大・応生）

21

14:30

1Cp06

Rhodococcus 属細菌による低温条件下での A 重油分解の分子機構の解析...................................................................................... ○三好 佑奈 1, 岡田 丈 1, 新谷 政己 1,2, 金原 和秀 1
（1 静大院・総合科技, 2 静大・グリーン科技研）
休憩・接続チェック（12 分）

14:42
14:54

1Cp07

GFP を融合したイガイ由来接着タンパク質の作製と材料吸着挙動..................................................................... ○志賀 敏英, 中島 一紀, 岩田 至叡, 川﨑 了（北大院・工）

15:06

1Cp08

金属結合ペプチドを発現した大腸菌の金属固体への結合および微粒子凝集特性................................................ ○中島 一紀, 岩田 至叡, Aneksampant Apichaya, 川﨑 了（北大院・工）

15:18

1Cp09

鉄を電子源とする硫酸還元菌の単離とその腐食プロセスの電気化学的解析...................................................... ○平野 伸一 1, Irene Davidova 2, Joseph Suflita 2, 長岡 亨 1, 松本 伯夫 1

15:30

1Cp10

六価クロム還元細菌 Flexivirga alba ST13 株の六価クロム還元遺伝子の探索......................................................... ○桶田 凜, 広瀬 佑紀, 土井 晃一郎, 丸山 竜人, 松井 徹, 杉山 友康（1 電中研, 2 オクラホマ大）T（東京工科大院・バイオニクス）
15:42

1Cp11

開発途上国のヒ素汚染地下水を利用可能にするための微生物技術の開発......................................................... ○遠藤 銀朗, 石井 啓介, 高橋 森里, 宮内 啓介（東北学院大・工）

15:54

1Cp12

Different inactivation behaviors of Gram-positive and Gram-negative bacteria in TiO2 based photocatalytic
disinfection..................................................................... ○Na Liu 1, Cheng Zhang 1, Nobuaki Negishi 2, Yingnan Yang 1（1 Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2 Environ. Mgt. Res. Inst. AIST Tsukuba）
休憩・接続チェック（12 分）

16:06
16:18

1Cp13

種々の固体表面上における家電単離菌のバイオフィルム形成の評価................................................................... ○山本 克哉 1, 尾島 由紘 1, 下野 雅仁 2, 多久島 朗 2, 東 雅之 1
（1 阪市大院・工, 2 LG Japan Lab）

16:30

1Cp14

牛糞堆肥と竹パウダーを施用した水稲栽培土壌における細菌叢と窒素固定活性の季節変化................................................................ ○前田 勇, 稲場 克弘, Ao Zhalaga, 平井 英明（宇都宮大・農）

16:42

1Cp15

農耕地から放出される環境破壊ガス N2O を抑制するための、カビ脱窒を阻害する化合物の探索.................. ○松岡 真生 1,2, Ashutosh Kumar 3, Muhammad Muddassar 3, 松山 晃久 1,2, Kam Y. J. Zhang 3,
吉田 稔 1,2（ 理研・環境資源, 東大院・農生科, 理研・ライフサイエンス）
1

16:54

1Cp16

2

3

淡水サンプルから分離した Undibacterium 属細菌における生分解性プラスチック分解酵素の機能解析................................................. ○大井 太士郎 1, 佐藤 俊輔 2, 諸星 知広 1（1 宇都宮大院・工, 2 カネカ）

17:06

1Cp17

微生物発酵による BDF 廃液からのフマル酸生産法の検討.......................................... ○湯浅 一貴 1, 川西 琢也 1,2, 滝口 昇 1,2（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・理工）D 会場 B32（13:30～17:30）【生物化学工学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

1Dp01

植物の成長促進効果をもたらす光合成細菌の菌体成分の検討.......................................... ○林 修平, 岩本 康成, 森 康一, 中嶋 桃香, 平川 夕貴, 山本 進二郎, 宮坂 均

13:42

1Dp02

2 段階マイクロ波水熱処理を用いた稲わらからの糖生産............................................. ○宮本 上聖, 中村 嘉利, 浅田 元子, 佐々木 千鶴（徳島大院・先端技科）（崇城大・生物生命）

22

13:54

1Dp03

トマトの糖度に及ぼすパルス光照射の影響............................................................................... ○武田 真樹 1, 上田 愛巳 1, 神内 奈々子 2, 木村 祐太 1,
宇山 裕貴 1, 谷川 浩司 2, 前田 淳史 2, 梶山 博司 1,2（ 徳島文理大院・工・ナノ物質工, 2 徳島文理大・理工・ナノ物質工）
1

14:06

1Dp04

イチゴの着果と糖度に及ぼす暗期パルス光照射の影響.................... ○上田 愛巳 1, 武田 真樹 1, 木村 祐太 1, 宇山 裕貴 1, 谷川 浩司 2, 前田 淳史 2, 梶山 博司 1,2（1 徳島文理大院・工・ナノ物質工, 2 徳島文理大・理工・ナノ物質工）

14:18

1Dp05

レタスの代謝物産生に及ぼすパルス光照射の影響.................... ○米村 彩乃 1, 宇山 裕貴 1, 木村 祐太 1, 武田 真樹 1, 谷川 浩司 2, 梶山 博司 1,2, 前田 淳史 2
（1 徳島文理大院・工・ナノ物質工, 2 徳島文理大・理工・ナノ物質工）

14:30

1Dp06

レタスの生育に及ぼす青色パルス光照射の影響................................................................................... ○木村 祐太 1, 武田 真樹 1, 上田 愛巳 1, 米村 彩乃 1,
宇山 裕貴 1, 谷川 浩司 2, 前田 淳史 2, 梶山 博司 1
（ 徳島文理大院・工・ナノ物質工, 2 徳島文理大・理工・ナノ物質工）
1

休憩・接続チェック（12 分）

14:42
14:54

1Dp07

培養効率化へ向けた培地改善への Substratome アプローチ........................................................................................................... ○立花 成我, 小西 正朗（北見工大）

15:06

1Dp08

ＣＦＤ解析と生物反応モデル式を組み合わせた商業スケールバイオリアクターにおける物質生産シ
ミュレーション技術の開発.................................................................................................... ○沖野 祥平, 渡邉 実, 種田 大介（日揮）

15:18

1Dp09

下水汚泥中の Social cheater 様細菌群に対する電気培養の効果.................................................................... ○遠矢 将太郎, 高辻 義行, 前田 憲成（九工大院・生体工）

15:30

1Dp10

Haematococcus pluvialis を用いたアスタキサンチンの効率的生産................................................................ ○山本 麗奈, 堀内 淳一, 熊田 陽一（京工繊大院・工芸科学）

15:42

1Dp11

遺伝子組換え乳酸菌によるコーンコブを原料とした D-乳酸の高濃度・高収率生産............................................... ○内藤 秋花 1, 堀内 淳一 1, 熊田 陽一 1, 岡野 憲司 2, 近藤 昭彦 3, 田中 勉 3（1 京工繊大院・工芸科学, 2 阪大院・工, 3 神戸大院・工）

15:54

1Dp12

遺伝子組換えシアノバクテリアを用いた 1,3-プロパンジオール生産におけるグリセロール添加効果...................... ○武田 真由子 1, 端 瞭太 1, 広川 安孝 2, 花井 泰三 2, 村上 明男 3, 熊田 陽一 1, 堀内 淳一 1（1 京工繊大院・工芸科学, 2 九大院・農, 3 神戸大院・工）休憩・接続チェック（12 分）

16:06
16:18

1Dp13

組換え大腸菌を用いた DO-stat 流加培養による単鎖抗体の菌体外生産.............. ○井嶋 浩一朗, 坂本 祐一朗, 川見 菜実香, 熊田 陽一, 堀内 淳一（京工繊大院・工芸科学）

16:30

1Dp14

Enhanced production of anti-CRP single-chain variable fragment (scFv) antibody using Escherichia coli by
DO-stat fed-batch culture...................................... ○Nghia Nguyen Hieu, Michimasa Kishimoto, Yoichi Kumada, Jun-ichi Horiuchi（Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.）

16:42

1Dp15

微生物培養による平板培地の pH 変化挙動解析と利用....................................................................................... ○原田 玲奈, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）

16:54

1Dp16

微生物の振盪フラスコ培養中における培養栓の換気能評とその応用....................................................................................... ○高橋 将人, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）

17:06

1Dp17

セルロースメンブランを用いた植物生育促進細菌の評価・培養法の開発.................................................................................. 大矢 裕之 1, ○藤原 優人 2, 中村 真由 1, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大院・生命環境, 2 筑波大・生物資源）

17:18

1Dp18

pH 変動培養による有用金属回収微生物の新規スクリーニング法の開発..................................... ○高野 力 1, 村山 晃一 2, 青柳 秀紀 1（1 筑波大院・生命環境, 2 フタムラ化学）

23

E 会場 D12（13:54～15:18）【オミクス解析 】
接続チェック（12 分）

13:18
13:54

1Ep03

コリネ型細菌における ECF シグマ因子 SigE のレギュロン同定........................................................................○豊田 晃一 1, 乾 将行 1,2（1 RITE, 2 奈良先端大・バイオ）

14:06

1Ep04

超好熱菌の分岐鎖ポリアミン依存的に発現する遺伝子の温度依存性...................................... ○尾崎 守, 福田 萌子, 濱川 匡史, 福田 青郎, 藤原 伸介（関西学院大・理工）

14:18

1Ep05

Porphyromonas gingivalis のバイオフィルム形成におけるポリアミン類の影響の検討............................................................................ ○綿井 大輔 1, 坂中 哲人 2, 久保庭 雅恵 2, 福﨑 英一郎 1（1 阪大院・工, 2 阪大院・歯）

14:30

1Ep06

休憩・接続チェック（12 分）

14:42
14:54

Zygosaccharomyces rouxii の株間メタボローム解析による凍結耐性関連代謝物の探索........................................................................................ ○菊池 成真, 森本 一輝, 小西 正朗（北見工大）

1Ep07

不均衡変異導入法で単離されたリボフラビン高生産 Ashbya gossypii のゲノム解析................................................................ ○畔上 純也 1, 横森 愛美 1, 加藤 竜也 1,2, 道羅 英夫 2, 朴 龍洙 1,2（1 静大院・総合科技, 2 静大・グリーン科技研）

15:06

1Ep08

非モデル珪藻のトランスクリプトーム解析およびプロテオーム解析に基づく被殻形成関連タンパク質の同定....................................... 岩城 沙弥子 1, 小布施 祈織 1, 田村 隆 1, 稲垣 賢二 1, 真山 茂樹 2, ○根本 理子 1（1 岡山大院・環境生命, 2 東京学芸大・教）E 会場 D12（15:18～17:06）【植物細胞工学，組織培養，育種工学】
15:18

1Ep09

機械学習を用いた植物 mRNA 切断に関わる特徴の選抜..................................................... ○上野 大心, 山崎 将太朗, 出村 拓, 加藤 晃（奈良先端大・バイオ）

15:30

1Ep10

イネ、バラ、レタスにおける mRNA の内部切断に関わる配列的特徴の比較.................................. ○向田 尭史, 上野 大心, 山崎 将太朗, 出村 拓, 加藤 晃（奈良先端大・バイオ）

15:42

1Ep11

Droplet Digital PCR 法を用いた植物 mRNA の内部切断の定量的な測定法の確立.............................. ○成瀬 つきひ, 上野 大心, 山崎 将太朗, 出村 拓, 加藤 晃（奈良先端大・バイオ）

15:54

1Ep12

植物におけるリボソームの停止・停滞に影響を与えるｍ RNA の配列的特徴についての解析.................................. ○伊藤 光佑, 上野 大心, 山崎 将太朗, 出村 拓, 加藤 晃（奈良先端大・バイオ）休憩・接続チェック（12 分）

16:06
16:18

1Ep13

Production of recombinant β-glucocerebrosidase in Nicotiana benthamiana root culture induced by plant
hormones.......................................... ○Naphatsamon Uthailak 1,2, Takao Ohashi 1, Ryo Misaki 1, Kazuhito Fujiyama 1（1 ICBiotech, Osaka Univ., 2 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.）

16:30

1Ep14

植物免疫活性化能を持つ低分子環状ペプチド剤の探索とそれらを細胞内で生成させる遺伝子カセッ
トを導入した形質転換シロイヌナズナの病害抵抗性の解析.................. ○能年 義輝 1, 渡邉 恵 1, 守屋 綾子 1, 香西 雄介 2, 山中 由利恵 1, 木村 麻美子 2, 北松 瑞生 3
（1 岡山大院・環境生命, 2 理研・環境資源, 3 近畿大院・総合理工）

24

16:42

1Ep15

気孔開口を抑制する K チャネル阻害剤の同定とその構造活性相関......... ○鈴木 喬太 1, 遠藤 晃輔 1, 島田 友輝 1, 有澤 美枝子 2, 熊田 佳菜子 2, 一刀 かおり 3, 谷井 沙織 2,
古田 未有 2, 井坂 修久 4, 山口 利男 5, 浜本 晋 1, 石丸 泰寛 1, 魚住 信之 1
（ 東北大院・工, 東北大院・薬, 3 東北大院・生命, 4 新潟薬大・応生命, 5 新潟薬大・薬）
1

16:54

1Ep16

2

交流電場印加による植物種子の発芽および初期成長促進効果......................................................................... ○小山 純弘, 田村 泰之, 石川 元, 石川 陽一（エイブル）

F 会場 D23（13:30～17:06）【タンパク質工学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

1Fp01

新規活性型トランスグルタミナーゼ前駆体の触媒特性の評価.............................................................. ○有吉 龍太郎 1, 佐藤 崚 1, 南畑 孝介 2, 後藤 雅宏 1, 神谷 典穂 1,3（1 九大院・工, 2 KAICO, 3 九大・未来化セ）

13:42

1Fp02

酵素架橋反応を介したタンパク質装飾リポソームの調製とその特性評価........................ ○駒田 拓也 1, Razi Muhamad Alif 1, 高原 茉莉 2, 若林 里衣 1, 後藤 雅宏 1,3, 神谷 典穂 1,3（1 九大院・工, 2 北九州高専, 3 九大・未来化セ）

13:54

1Fp03

低温菌 Pseudoalteromonas nigrifaciens Sq02 を用いた外来タンパク質低温分泌生産システムの構築と分泌機構の解明............................. ○河合 総一郎, Puti Wanguyun Aken, 川本 純, 小川 拓哉, 栗原 達夫（京大・化研）

14:06

1Fp04

麹菌由来 hydrophobin RolA- Cutinase CutL1 間の相互作用における CutL1 側の新たな相互作用部位の探索...................................................................... ○金 允卿 1, 寺内 裕貴 1, 田中 拓未 1, 吉見 啓 2, 阿部 敬悦 1,2（1 東北大院・農, 2 東北大・未来研）

14:18

1Fp05

麹菌界面活性蛋白質ハイドロフォビン RolA の自己組織化機構の解析................................................. ○寺内 裕貴 1, 田中 拓未 1, 三ツ石 方也 2, 藪 浩 2, 吉見 啓 3, 阿部 敬悦 1,3（1 東北大院・農, 2 東北大・多元研, 3 東北大・未来研）

14:30

1Fp06

出芽酵母のピルビン酸キナーゼに含まれる G-body 局在化シグナル配列の探索....................................... ○内海 亮太郎 1, 吉村 柚紀 1, 大谷 優太 2, 三浦 夏子 1, 植田 充美 2, 片岡 道彦 1
（1 阪府大院・生環科, 2 京大院・農）休憩・接続チェック（12 分）

14:42
14:54

1Fp07

超好熱古細菌由来耐熱性セルラーゼの糸状菌での発現および更なる耐熱化........................................... ○仙波 弘雅 1, 山田 浩之 1, 坪井 宏和 1, 幸田 明生 1, 石川 一彦 2, 坊垣 隆之 1
（1 大関総研, 2 産総研・バイオメディカル）

15:06

1Fp08

生産性を劇的に向上させる蛋白質人工設計 ～難生産性 L-アミノ酸酸化酵素の改良と、D-アミノ酸
動的光学分割法への展開～.................................................................... ○南野 優季, 中野 祥吾, 伊藤 創平（静県大院・薬食生命）

15:18

1Fp09

離散的モチーフ様配列による酵素のインシリコ機能的分類法の開発と検証................................................. ○平松 希望, 本山 智晴, 中野 祥吾, 伊藤 創平（静県大院・薬食生命）

15:30

1Fp10

BRET を利用したホタルルシフェラーゼの発光色変換........................ ○金丸 愛望, 鶴田 篤弘, 有馬 一成, 伊東 祐二, 加藤 太一郎（鹿児島大院 理工 生化）

15:42

1Fp11

細胞内発光を利用したハイスループットスクリーニングにより得られた高活性変異体アシル ACP
還元酵素の評価................................................................ ○林 勇樹 1, 新井 宗仁 1,2（1 東大院・総合文化, 2 東大院・理）

15:54

1Fp12

好熱菌酵素の低温高活性化の実例と進化情報を用いた低温高活性化法の提案.................................................................................................................. ○赤沼 哲史（早大・人間科学）

25

休憩・接続チェック（12 分）

16:06
16:18

1Fp13

AFM を用いた高付着性細菌及びその細胞表層タンパク質の接着力測定............................................................................................ ○石井 慧, 吉本 将悟, 堀 克敏（名大院・工）

16:30

1Fp14

ニホンカブトムシ Trypoxylus dichotomus 上翅のプロテオーム解析.......................................................................... ○村田 智志 1, Rivera Jesus 2, Kisailus David 2, 新垣 篤史 1
（1 農工大院・工, 2 Dept. Chem. Environ. Eng., Univ. California at Riverside, U.S.A.）

16:42

1Fp15

VHH 抗体提示型分子認識素子を用いた AuNP のワンステップ機能化............................................................. ○池田 湧, 石田 尚之, 今村 維克, 今中 洋行（岡山大院・自科）

16:54

1Fp16

Methodical investigations for the efficient purification of recombinant proteins from silkworm compounds.........................○Robert Minkner 1, Jian Xu 2, Holger Zagst 3, Imke Oltmann-Norden 3, Hermann Wätzig 3,
Tatsuya Kato 1,2, Enoch Y. Park 1,2（ Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., 3 Inst. Medic. &1

2

Pharm. Chem., TU Braunschweig, Germany）

G 会場 D25（13:54～15:42）【発酵生理学，発酵工学 】
接続チェック（12 分）

13:18
13:54

1Gp03

放線菌スクリーニング用固／液界面培養法.............................................................. ○椎名 一樹 1, 小田 忍 2（1 金工大院・工, 2 金工大・ゲノム研）

14:06

1Gp04

様々な分離源からのバクテリオシン生産菌の探索とその構造解析................................................. ○善藤 威史, 山城 圭輔, 桑原 美空, 野見山 泰成, 大橋 千紘, 園元 謙二

14:18

1Gp05

オリゴエステル分泌生産における種々アルコール化合物の添加効果........................................................ ○水野 匠詞 1,3, 櫻井 徹生 1,3, 廣江 綾香 2,3, 田口 精一 2, 柘植 丈治 1,3（九大院・農）（1 東工大・物質理工, 2 東農大・生命科, 3 JST・MIRAI）
14:30

1Gp06

Acidomonas 属酢酸菌のレアアースによるグリセロール生育抑制...................................... 宇都宮 大貴, 西江 百加, 堀田 靖人, 稗田 莉奈, ○阿野 嘉孝（愛媛大院・農）

1Gp07「魔法の弾丸」アスコフランの全生合成経路の同定と高生産 ～アフリカ眠り病の根絶を目指して～............... ○荒木 康子 1, 淡川 孝義 2,3, 松崎 素道 4,5,6, 趙 理海 4, 松田 侑大 2, 星野 翔太郎 2, 篠原 靖智 1,

休憩・接続チェック（12 分）

14:42
14:54

山本 雅一 7, 城戸 康年 4,7,8, 稲岡 健ダニエル 4,5, 永宗 喜三郎 6, 伊藤 考太郎 1, 阿部 郁朗 2,3, 北 潔 4,5（1 キッコーマン, 2 東大院・薬, 3 東大・CRIIM, 4 東大院・医, 5 長崎大・TMGH, 6 国立感染研,
7

15:06

1Gp08

ミトコンドリア研, 8 阪市大・医）好熱菌発酵産物の施与による植物のシステミックな成長促進と防御応答の活性化がネコブセンチュ
ウの感染被害に与える影響................................................................ ○梅山 幸子 1, 栁瀬 裕介 1, 宮原 平 1, 宮本 浩邦 1,2,3, 児玉 浩明 1
（1 千葉大院・園芸, 2 サーマス（株）, 3 理研 IMS）

15:18

1Gp09

異担子菌酵母 Cryptococcus diffluens の L-ガラクトン酸変換経路の解明........................................................................................... 松原 健生, ○岸田 正夫（阪府大院・生環科）

15:30

1Gp10

黄麹菌 Aspergillus oryzae におけるアグマチン産生機構の解明............................................................... ○加藤 紗也 1, 赤坂 直紀 1, 五味 勝也 2, 福田 青郎 1, 藤原 伸介 1
（1 関西学院大院・理工, 2 東北大院・農）26

G 会場 D25（15:42～17:30）【遺伝子工学】
15:42

1Gp11

GUS リポーター遺伝子を用いた単細胞性緑藻 Coccomyxa のプロモーター活性評価..................................................... 大迫 香穂, ○笠井 由紀, 阿部 淳, 高木 さつき, 井出 曜子, 原山 重明（中央大・理工）

15:54

1Gp12

新規モデル生物を目指したミミズ形質転換技術の開発－hEPO 遺伝子導入法の検討－.......................................... ○神田 直輝, 山谷 竜大, 町田 悠, 竹内 綾, 赤澤 真一（長岡高専・物質工）
休憩・接続チェック（12 分）

16:06
16:18

1Gp13

グルコースによる麹菌アミラーゼ生産抑制におけるグルコキナーゼの関与......................................... ○田中 瑞己 1, 河原崎 泰昌 1, 五味 勝也 2（1 静県大・食栄, 2 東北大院・農）

16:30

1Gp14

Aspergillus aculeatus における ManR を介した選択的遺伝子発現制御に関わる転写因子の探索......................................................... ○角谷 朝香, 炭谷 順一, 谷 修治, 川口 剛司（阪府大院・生環科）

16:42

1Gp15

代謝産物解析と遺伝子解析によるクエン酸生産糸状菌のカビ毒非生産性の検証................................................................................ ○大越 佳乃 1, 吉岡 育哲 1, 中川 博之 2, 桐村 光太郎 1（1 早大・先進理工, 2 農研機構・食品）

16:54

1Gp16

クエン酸生産糸状菌 Aspergillus tubingensis (A. niger) WU-2223L における CRISPR/Cas9 システムを用いたハイスループット遺伝子ノックアウト法の構築........................................................................ ○吉岡 育哲, 脇本 紗梨, 桐村 光太郎（早大・先進理工）

17:06

1Gp17

好熱性放線菌 Streptomyces thermoviolaceus による物質生産............................................... ○三原 笑 1, 竹中 武藏 2, 柏木 紀賢 2, 曽田 匡洋 3, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 2
（1 神戸大・工, 2 神戸大院・科技イノベ, 3 長瀬産業）

17:18

1Gp18

CRISPR-Cas9 システムによるオーランチオキトリウム属の生産脂質の改質.................................................................. ○北堀 智希 1, 渡邉 研志 1, 青井 真人 1, 畑 浩介 1, 高橋 宏和 1,
岡村 好子 1, 松山 恵介 2, 黛 新造 3, 秋 庸裕 1
（ 広島大院・統合生命科学, 2 長瀬産業, 3 出光興産）
1

H 会場 D32（13:30～15:18）【培養工学 】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

1Hp01

固体培地上でコロニーを形成しない微生物の選択的獲得：未培養微生物への効率的アクセス..................... ○馬場 啓彰, Jung Dawoon, 加藤 節, 中島田 豊, 青井 議輝（広島大院・統合生命科学）

13:42

1Hp02

微生物間相互作用の促進は増殖の開始を誘導する：難培養性微生物の獲得に向けた新しいアプ
ローチ.......................................................................................... ○杉山 周 1, Eun Young 1, 鈴木 陸太 1, 加藤 節 1,
中島田 豊 1, 大橋 晶良 2, 金田一 智規 2, 青井 議輝 1
（ 広島大院・統合生命科学, 2 広島大院・工・四類）
1

13:54

1Hp03

新規回転振盪培養機構による微生物培養について....................................... ○小林 由衣乃 1, 川村 奈々 2, 竹園 恵 1, 中島 敏明 3, 茂野 俊也 4, 小野寺 正幸 1
（1 新潟工大院・工・生産開発工, 2 (株)プリス, 3 筑波大院・生命環境, 4 つくば環微研）

14:06

1Hp04

Water-in-oil ドロップレットを用いた腸内細菌培養手法の開発.......................................................................... ○村山 周平 1,2, 大田 悠里 2,3, 斉藤 加奈子 2,3, 松倉 智子 2,
森田 雅宗 2, 関口 勇地 2, 常田 聡 3, 野田 尚宏 1,2,3（1 東大院・新領域, 2 産総研・バイオメディカル, 3 早大院・先進理工）

27

14:18

1Hp05

RNase 活性を指標とした微生物増殖 water-in-oil ドロップレットの検出法 “FNAP-sort” の確立............... ○大田 悠里 1,2, 斉藤 加奈子 1,2, 髙木 妙子 2, 松倉 智子 2, 森田 雅宗 2, 常田 聡 1,2, 野田 尚宏 1,2（1 早大院・先進理工, 2 産総研・バイオメディカル）

14:30

1Hp06

エマルションドロップを用いた微生物の培養............................................................. ○川島 万凜, 村井 雄大, 川本 智也, 金 相完, 久原 哲, 田代 康介（九大院・生資環）
休憩・接続チェック（12 分）

14:42
14:54

1Hp07

G-body 形成に関わる因子のスクリーニングを目的とした低酸素培養系の確立.................. ○吉村 柚紀 1, 平山 伶奈 1, 大谷 優太 2, 内海 亮太郎 1, 三浦 夏子 1, 植田 充美 2, 片岡 道彦 1
（1 阪府大院・生環科, 2 京大院・農）

15:06

1Hp08

麹菌 Aspergillus oryzae 菌糸完全分散変異株の液体培養における流体特性の解析................................................. ○市川 暉 1, 宮澤 拳 1, 吉見 啓 2, 古明地 敬介 1, 加藤 好一 3, 阿部 敬悦 1,2（1 東北大院・農, 2 東北大・未来研, 3 佐竹化学機械工業）

H 会場 D32（15:18～17:30）【バイオプロセス】
15:18

1Hp09

大腸菌共培養に向けたリアクター制御プロセスの開発................................................................................ ○楠田 みのり, 戸谷 吉博, 清水 浩（阪大院・情報）

15:30

1Hp10

Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase（RubisCO）反応を経由したグリコール酸ポリマー生合成系構築とその応用.................................................................. 大潟 祥梧 1, 永田 暁洋 1, 齋藤 樹理 1, 横尾 俊憲 1, 工藤 悠希 1,
堀 千明 1, ○大井 俊彦 1, 田口 精一 2, 松本 謙一郎 1（1 北大院・工, 2 東農大院・農）

15:42

1Hp11

異なる人工遺伝子回路持つ二つの大腸菌による共培養系の構築.......................... 岩崎 建史朗 1, 本庄 宏 1, 相馬 悠希 2, 鶴野 圭悟 1, 盧 鎮栄 1, 濱田 浩幸 1, ○花井 泰三 1
（1 九大院・農, 2 九大・生医研）

15:54

1Hp12

休憩・接続チェック（12 分）

16:06
16:18

Efficient production of itaconic acid using a psychrophile-based simple biocatalyst..........○Gonglinfeng Luo, Takahisa Tajima, Junichi Kato（Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.）

1Hp13

Heterotrophic and Mixotrophic growth of Haematococcus pluvialis for the production of astaxanthin using
wastewater as a carbon source............................................................................... ○Nombuso Temalangeni Dlamini 1, John Chi-Wei Lan 2（1 Grad. Sch. Biotechnol. and Bioeng., Coll. Eng., Yuan Ze Univ., Taiwan, 2 Biorefin. Bioprocess Eng. Lab.,
Dept. Chem. Eng. Mater. Sci., Coll. Eng., Yuan Ze Univ., Taiwan）

16:30

1Hp14

分裂酵母 Schizosaccharomyces pombe を用いた遺伝子組換えヒトトランスフェリンの分泌生産....................................................................... ○渡部 貴大, 山中 祐実, 大前 俊昭, 山崎 翔子, 小島 千明,
久保田 進, 原 太志, 小谷 哲也, イディリス アリムジャン
（AGC）

16:42

1Hp15

抗体生産性及び品質の向上を目指した CHO 細胞における転写因子 TFE3 の機能解析....................................................................... ○黒田 昂輝 1, 山野-足立 範子 1,2, 古賀 雄一 1, 大政 健史 1,2（1 阪大院・工, 2 MAB 組合）

16:54

1Hp16

CHO 細胞バイオプロセスのための細胞自家蛍光情報の利用検討.............................................................................................................. ○長谷川 倫男（アズビル・技開）

28

17:06

1Hp17

新規プロテイン A 非含有セラミックス担体による血清中イムノグロブリン G の精製............................................................................ ○加藤 且也 1, 北村 昌大 1, 永田 夫久江 1, 笠原 真二郎 2（1 産総研・日特ラボ, 2 日本特殊陶業）

17:18

1Hp18

マルチモーダルクロマト担体に対するタンパク質の吸着挙動解析.................. ○大原 彩香 1, 栗山 尚浩 2, 黒田 典孝 2, 高橋 良輔 2, 迫田 裕美子 2, 堀内 淳一 1, 熊田 陽一 1（1 京工繊大院・工芸科学, 2 ワイエムシィ）

I 会場 D34（13:54～15:54）【代謝工学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:54

1Ip03

オーランチオキトリウム属における脂質生産関連遺伝子の発現解析...................... ○長谷川 真輝 1, 渡邉 研志 1, Marie Ting Perez Charose 1, 黛 新造 2, 角田 祐介 3, 秋 庸裕 1
（1 広島大院・統合生命科学, 2 出光興産, 3 中国電力）

14:06

1Ip04

麹菌 Aspergillus oryzae の不飽和化酵素遺伝子の共過剰発現化による遊離ジホモ-γ-リノレン酸の生産向上.................. ○玉野 孝一 1,2, 安中 優太 3, 伊藤 あやの 3, 三浦 愛 1, 菅 英一郎 4, 小山 泰二 4, 田村 具博 1,2（1 産総研・生物プロセス, 2 産総研・CBBD-OIL, 3 北海道ハイテク専門学校, 4 野田産研）

14:18

1Ip05

油性酵母 Lipomyces starkeyi によるトリテルペノイド生産....................................................... ○小島 基 1, 金本 拓也 2, 鈴木 宗典 1, 關 光 2, 村中 俊哉 2, 中村 克哉 1
（1 神戸天然物化学(株), 2 阪大院・工）

14:30

1Ip06

油脂酵母 Lipomyces starkeyi の遺伝子的改変による長鎖長脂肪酸の生産...................................... ○宮本 捺央 1, Amza Rezky Lastinov 1, Prihardi Kahar 2, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 2
（1 神戸大院・工, 2 神戸大院・科技イノベ）
休憩・接続チェック（12 分）

14:42
14:54

1Ip07

トランスオミクスによる出芽酵母の中心炭素代謝制御機構の解明......................................................... ○山崎 一輝, 丸山 正晴, 西野 駿佑, 岡橋 伸幸, 清水 浩, 松田 史生（阪大院・情報）

15:06

1Ip08

ロテノン処理に対するヒト乳がん細胞株 MCF-7 の代謝アダプテーション解析................................................................. ○辻 周真, 丸山 正晴, 岡橋 伸幸, 松田 史生（阪大院・情報）

15:18

1Ip09

13

15:30

1Ip10

蛍光式溶存酸素センサーを使用した呼吸活性の測定法.................................................................................... ○高寺 美砂都 1, 一瀬 涼 2, 山崎 思乃 1, 片倉 啓雄 1

C 代謝フラックス解析を用いた非上皮系細胞株の定量的代謝比較................................................................. ○島 知輝, 丸山 正晴, 岡橋 伸幸, 松田 史生（阪大院・情報）（1 関西大・化生工, 2 関西大院・理工）
15:42

1Ip11

乳酸菌の高密度培養のための好気的流加培養による乳酸生産の抑制.................................................................................... ○一瀬 涼 1, 高寺 美砂都 2, 山崎 思乃 2, 片倉 啓雄 2
（1 関西大院・理工, 2 関西大・化生工）

J 会場 E23（13:54～15:42）【セル＆ティッシュエンジニアリング】
13:18

接続チェック（12 分）

29

13:54

1Jp03

ROCK inhibitor の添加が hiPS 細胞集塊の細胞外マトリックスに与える影響.................................................................................... ○松本 崇揮, 金 美海, 紀ノ岡 正博（阪大院・工）

14:06

1Jp04

ラット間葉系幹細胞の分化に対して光増感反応による活性酸素刺激が及ぼす影響の解析........................................................................................................... ○森 英樹, 原 正之（阪府大院・理）

14:18

1Jp05

単一細胞トランスクリプトーム解析に基づく血中循環腫瘍細胞の上皮間葉転換状態の評価.................................. ○山川 ひとみ 1, 根岸 諒 1, 下山 達 2, 小泉 史明 2, 田中 剛 1, 松永 是 1, 吉野 知子 1
（1 農工大院・工, 2 がん・感染症センター都立駒込病院）

14:30

1Jp06

システイン誘導体による煙中の不飽和カルボニル化合物の解毒メカニズムの解明................... ○東 恒仁 1, Elmeligy Enas 1, 眞井 洋輔 1, 野矢 洋一 2, 真崎 雄一 1, 久下 裕司 2, 三輪 聡一 1
（1 北大院・医・細胞薬理, 2 北大・アイソトープ総セ）
休憩・接続チェック（12 分）

14:42
14:54

1Jp07

神経筋接合評価のための iPS 細胞を用いた筋収縮モデルの構築.................................................................................... ○吉岡 貫太郎 1, 井藤 彰 2, 河邉 佳典 1, 上平 正道 1
（1 九大院・工, 2 名大院・工）

15:06

1Jp08

マイクロラインパターンを用いた筋管細胞の配向制御によるアセチルコリン受容体の凝集促進.................... ○葛西 晴郎 1, 清水 一憲 1, 長島 拓則 1, 古谷 太樹 1, 前川 忠義 1, 山岡 奈央 1, 本多 裕之 1,2（1 名大院・工, 2 名大・予防早期医療創成セ）

15:18

1Jp09

生体内細胞位置を模倣した三次元神経筋共培養マイクロデバイスの開発.................................................................. ○中村 健人 1, 清水 一憲 1, 山岡 奈央 1, 長島 拓則 1, 今泉 裕 1,
古谷 太樹 1, 伊藤 卓治 2, 岡田 洋平 2, 本多 裕之 1,3（1 名大院・工, 2 愛知医大・神経内科, 3 名大院・創薬）

15:30

1Jp10

犠牲ファイバーを利用した細胞内包多孔性ハイドロゲルの作製と細胞機能評価........................................................................... ○蓑田 義将 1, 堀 有音 1, 鵜頭 理恵 2, 山田 真澄 2, 関 実 2（1 千葉大院・融合, 2 千葉大院・工）ランチョンセミナー
LS1-1 ヒューマンメタボロームテクノロジーズ株式会社
S1 会場

A21（12:00～12:50）

LS1-2 東ソー株式会社
S4 会場

E11（12:00～12:50）

LS1-3 オンチップ・バイオテクノロジーズ株式会社
S5 会場

E21（12:00～12:50）

30

第 2 日（9 月 17 日）
太字の一般講演は今年度の生物工学学生優秀賞（飛翔賞）受賞者の発表です．
開始時間

講演番号

演

発表者氏名（所属）題○印は講演者を示す

シンポジウム・招待講演（午前の部）

S2 会場 A41（9:30～11:30）
次世代のバイオプロセスを拓く複合微生物系精密制御技術
はじめに............................................................................................................................................................ 常田 聡

9:30

座長：常田 聡9:40

2S-S2a01

硝化微生物コンソーシアの制御と高機能化デザイン................................................................... ○安藤 晃規 1,2, 小川 順 1,2（1 京大・生理化学, 2 京大院・農）10:05

2S-S2a02

プラスミドによる複合微生物系の制御を目指して～複合微生物系におけるプラスミドの動態～................ ○新谷 政己 1,2,3（1 静大院・総合科技, 2 静大・グリーン科技研, 3 理研・バイオリソース）

10:30

2S-S2a03

大規模ネットワーク分析による菌叢動態の解明と制御...................................................................................................................... ○東樹 宏和（京大・生態研）

10:55

2S-S2a04

生態学は生物群集デザインに活用できるか？
............................................................. ○近藤 倫生, 東 豊浩, 加藤 広海, 川津 一隆, 長田 穣, 永田 裕二

座長：二又 裕之

（東北大院・生命）おわりに........................................................................................................................................................ 加藤 純一

11:20

S3 会場 B41（9:00～11:30）
食農工産業の持続的発展を牽引する次世代植物バイオテクノロジー／招待講演
はじめに........................................................................................................................................................ 岡澤 敦司

9:00

座長：田口 悟朗
9:05

2S-S3a01

フォトン検出を用いた光合成機能センシングによるシロイヌナズナの生理変化の早期診断..................................... ○本橋 令子 1,2, 深沢 知加子 1, 切岩 祥和 1, 明賀 史純 3, 篠崎 一雄 3, 勝又 政和 4
（1 静大・農, 2 静大・グリーン科技研, 3 理研・環境資源, 4 浜松ホトニクス.中央研）

9:27

2S-S3a02

食農産業における LED の利活用技術の開発.................... ○藤川 康夫 1, 鶴本 智大 1, 泉田 智史 2, 三島 俊介 3, 岡澤 敦司 4, 加藤 悠一 5, 蓮沼 誠久 5,6（1 日亜化学工業株式会社, 2 ヒューマン・チップス有限会社, 3 大塚電子株式会社,
4

阪府大院・生命環境, 5 神戸大・先端バイオ工, 6 神戸大院・科技イノベ）

31

座長：高橋 征司
9:49

2S-S3a03

大気圧空気プラズマを用いた低残留植物病害防除法の開発...... ○金子 俊郎, 二瓶 健司, 胡 玥, アハマドシャヒー アハマドノール, 高島 圭介（東北大院・工）10:11

2S-S3a04

任意の圃場環境に最適な作物の育種を可能に － データ科学に基づく作物設計基盤技術の開発..................... ○平山 隆志 1, 最相 大輔 1, 井藤 純 2, 高萩 航太郎 2, 香西 雄介 2, 鷲見 典克 3, 池田 陽子 1,
井上 小槙 4, 上原 由紀子 4, 清水 みなみ 4, 服部 公央亮 5, 梅崎 太造 3,5, 辻 寛之 2, 持田 恵一 1,2,4（1 岡山大・資源植物科研, 2 横浜市大・木原研, 3 名古屋工大院, 4 理研・環境資源研, 5 中部大・工）
座長：岡澤 敦司

10:33

2S-S3a05

おわりに........................................................................................................................................................ 高橋 征司

10:55
11:00

バイオエコノミーが引き起こす食農デジタル産業におけるゲームチェンジ.................................................................................................. ○齊藤 三希子（ルール形成戦略研究所）

2S-S3a06

座長：岡澤 敦司

〈招待講演（韓国生物工学会）〉

Effects of FIR emission and phytochemicals on Lymphedema alleviation..................................................................................................................... ○Hei Chan Lee, Dae Hoon Kim（Dept. Pharm. Eng. & Biotechnol., Sun Moon Univ.）

S5 会場 E21（9:30～11:30）
タンパク質工学におけるドライ－ウェット技術融合の新展開
はじめに........................................................................................................................................................ 今中 洋行

9:30

座長：梅津 光央
9:32

2S-S5a01

非抗体分子骨格を用いた人工結合タンパク質作製基盤の構築.............................................................................................................. ○安井 典久（岡山大院・医歯薬）

9:55

2S-S5a02

抗体医薬を代替する標的結合小型タンパク質デザイン.......................................................................................................... ○門之園 哲哉（東工大・生命理工）
座長：今中 洋行

10:18

2S-S5a03

機械学習と実験の融合によるタンパク質の高機能化....................................... ○齋藤 裕 1,4, 及川 未早来 2, 中澤 光 2, 亀田 倫史 1,4, 津田 宏治 3,4, 梅津 光央 2,4（1 産総研・人工知能, 2 東北大院・工, 3 東大院・新領域, 4 理研・革新知能）

10:41

2S-S5a04

人工タンパク質構造ライブラリーの創出................................................................ ○古賀 信康 1,2,3（1 自然・生命創成, 2 自然・分子研, 3 総研大）

11:04

2S-S5a05

理論と実験によるタンパク質デザイン................................................................................. ○新井 宗仁 1,2（1 東大院・総合文化, 2 東大院・理）

11:28

おわりに
........................................................................................................................................................ 今中 洋行

32

シンポジウム・招待講演（午後の部）

S1 会場 A21（13:15～17:15）
持続可能な開発目標（SDGs）を生物工学にどう活用するか【本部企画】
はじめに........................................................................................................................................................ 今井 泰彦

13:15

座長：今井 泰彦
13:20

2S-S1p01

SDGs に対する生物工学研究のあり方.................................................................................................................. ○木野 邦器（早大・先進理工）
座長：安原 貴臣

13:40

2S-S1p02

住友化学グループの SDGs の取組み.......................................................................................................................... ○冨ケ原 祥隆（住友化学）

14:15

2S-S1p03

SDGs と科学技術イノベーション.......................................................................... ○白木澤 佳子（国立研究開発法人科学技術振興機構）

座長：髙木 忍座長：田口 精一
14:50

2S-S1p04

大学は SDGs 達成にどのようにかかわれるか........................................................................................ ○狩野 光伸（岡山大学・SDGs 推進企画会議）
休憩

15:25

座長：児島 宏之
15:35

2S-S1p05

世界のバイオエコノミーと関連する合成生物学議論..... ○藤島 義之（新エネルギー・産業技術総合開発機構・技術戦略研究セ・ 海外技術情報ユニット）

16:00

2S-S1p06

世界最先端のバイオエコノミー社会の実現－我が国の戦略－.......................................................................................................................... ○服部 正（内閣府・科技）

座長：荒 勝俊

座長：荒 勝俊
16:20（総括）パネルディスカッション..................................................................................................................................................... 講演者全員

17:10

おわりに
........................................................................................................................................................ 安原 貴臣

S2 会場 A41（15:00～17:30）
微生物による物質生産の新展開／招待講演
はじめに............................................................................................................................................................ 清水 浩

15:00

座長：清水 浩
15:05

2S-S2p01

Oligosaccharide fermentation by engineered yeast to produce value-added products.............................................................................................................................................. ○Yong-Su Jin 1,2（1 Dept. Food Sci. & Human Nutrition., Univ. of Illinois, Urbana, IL, USA, 2 Carl R. Woese Institute for
Genomic Biology, Urbana, IL, USA）

33

15:30

2S-S2p02〈招待講演（韓国生物工学会）〉
Designer Corynebacterium glutamicum for advanced production from primary to high-valued chemicals.................................................... Young Jin Ko 1, Young-Chul Joo 1, Jeong Eun Hyeon 1,2, ○Sung Ok Han 1（1 Dept. Biotechnol., Korea Univ., 2 Dept. Food Sci. Biotechnol., Sungshin Women's Univ.）
休憩

15:55

座長：戸谷 吉博
16:05

2S-S2p03

ATP 生成の向上による物質生産の高度化.............................................................................................................. ○原 清敬（静岡県大院・食栄環）

16:30

2S-S2p04

シアノバクテリアのクエン酸回路を基盤としたバイオプラ原料の生産.......................................................................................................................... ○小山内 崇（明治大・農）

座長：原 清敬

座長：小山内 崇
16:55

2S-S2p05

光を利用した微生物の代謝の制御と可視化......... ○戸谷 吉博, タンダル セバスチャン トミ, 妹尾 幸枝, 鎌田 健太郎, 清水 浩（阪大院・情報）
おわりに............................................................................................................................................................ 清水 浩

17:20

S3 会場 B41（13:15～15:45）
Development of Biosensing Technology Targeting Sustainability Development Goals「持続可能な開発目標を目指したバイオセンシングの開発と展開」《国際シンポジウム》／招待講演
13:15

Opening Remarks...................................................................................................................................................Enoch Y. Park
座長：Enoch Y. Park

13:20

2S-S3p01

Electrical pulse induced electrochemical sensor for cancer cell detection..................................................................................... Akhilesh Babu Ganganboina 1,2, ○Ruey-an Doong 2,3（1 Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2 Dept. Biomed. Eng. & Environ. Sci., Natl Tsing Hua
Univ., 3 Inst. Anal. Environ. Sci., Natl Tsing Hua Univ.）
座長：Eiichi Tamiya

13:45

2S-S3p02

Patch-type biosignal monitoring system based on flexible electronics..... ○Takafumi Uemura 1,2, Tsuyoshi Sekitani 1,2（1 ISIR, Osaka Univ., 2 AIST-Osaka Univ. PhotoBIO-OIL）
座長：Enoch Y. Park

14:10

2S-S3p03

Crystallinity and morphology control of whitlockite nanocrystals synthesis in tri-solvent system............................................................................................ Caifeng Wang 1, Ki-jae Jeong 1, ○Jaebeom Lee 2（1 Dept. Cogno-Mechatronics Eng., Pusan National Univ., 2 Dept. Chem., Chungnam National Univ.）

14:35

Break
座長：Enoch Y. Park

14:45

2S-S3p04

Centrifugal microfluidics devices for bioassay............................ ○Masato Saito 1,2（1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 PhotoBIO Lab, AIST-Osaka Univ）

15:10

2S-S3p05〈招待講演（韓国生物工学会）〉

座長：Eiichi Tamiya

Exosome based theragnosis for future medicine.................. Kyusoon Shin 1, Ju Young Kim 1, Chang Hyun Lee 1, Kwang Sik Kim 1, ○Jong Wook Hong 1,2,3（1 Grad. Sch. Bionano. Eng. Hanyang Univ., 2 Dept. Bionano. Eng. Hanyang Univ., 3 Center of exosome andbioparticulate research, Hanyang Univ.）
15:35

Closing Remarks................................................................................................................................................... Eiichi Tamiya

34

S4 会場 E11（13:15～15:15）
複雑組織製造に必要な基盤技術を考える～バイオリアクターの側から～はじめに........................................................................................................................................................ 長森 英二

13:15

座長：長森 英二
13:20

2S-S4p01

動物細胞培養用バイオリアクターの研究を振り返って.......................................................................................................................... ○飯島 信司（愛工大・工）13:45

2S-S4p02

人工酸素運搬体（パーフルオロカーボンエマルジョン）の開発.............................................................................................. ○福島 昭二（神戸学院大・薬・臨床薬剤）

座長：伊藤 大知

休憩

14:10

座長：長森 英二
14:20

2S-S4p03

ヘモグロビンを封入した人工酸素運搬体（人工赤血球）.......................................................................................... ○伊藤 大知（東大院・医・疾患生命工学セ）
座長：伊藤 大知

14:45

2S-S4p04

複雑組織製造に必要な基盤技術を考える～バイオリアクターの側から～.......................................................................................................................... ○長森 英二（大工大・工）S4 会場 E11（15:30～17:30）
新しいデータ駆動型サイエンスによる複雑な生命現象の理解
座長：青木 航15:30

2S-S4p05

トランスオミクスビッグデータからＳＤＧ障害疾患に対する新薬発見..................................................................................................... ○植田 充美 1,2（1 京大院・農, 2 CREST）
座長：植田 充美

15:54

2S-S4p06

データ駆動型代謝数理モデル構築とシアノバクテリア代謝工学への応用...................................................................................................................... ○松田 史生（阪大院・情報）

16:18

2S-S4p07

質量分析を基盤としたシングルセル分子フェノタイプ解析................................................................................................... ○和泉 自泰, 馬場 健史（九大・生医研）

16:42

2S-S4p08

1 細胞セルオミックスによる多細胞ネットワークが織り成す生命現象の解明........................................................................................... ○青木 航 1,2（1 京大院・農, 2 JST・さきがけ）

17:06

2S-S4p09

逆強化学習による「動物の行動戦略」のデータ駆動的解読...................................................................................................................... ○本田 直樹（京大院・生命）

座長：青木 航S5 会場 E21（13:15～15:15）
物質生産や代謝制御における呼吸鎖の役割
13:15

はじめに
........................................................................................................................................................ 藥師 寿治

35

座長：川向 誠
13:16

2S-S5p01

Two tales of the respiratory chain: 呼吸鎖が物質生産に直接的に関わるお話と間接的に関わるお話.............................................................................................. ○藥師 寿治 1,2,3, 片岡 尚也 1,2,3, 松下 一信 1,2,3（1 山口大・院創成, 2 山口大・農, 3 山口大・中高温微セ）
座長：藥師 寿治

13:39

2S-S5p02

大腸菌の呼吸鎖欠損変異株が示す異常な糖代謝の解析.............................................................................................................................. ○横田 篤（北大院・農）
座長：川向 誠

14:03

2S-S5p03

ユーグレナの嫌気的呼吸鎖に共役したワックスエステル生産.............................................................................................................. ○中澤 昌美（阪府大院・生環科）

14:27

2S-S5p04

清酒酵母のミトコンドリア活性・ミトファジーがその醸造特性に及ぼす影響.......................................................................................................................... ○北垣 浩志（佐賀大・農）14:51

2S-S5p05

分裂酵母の物質代謝と呼吸鎖の関連.......................................................................................................... ○川向 誠（島根大・生資・生命科）

座長：藥師 寿治

おわりに............................................................................................................................................................ 川向 誠

15:14

S5 会場 E21（15:30～17:30）
微生物ポリアミンが支える高齢化社会の生活
座長：栗原 新はじめに........................................................................................................................................................ 藤原 伸介

15:30
15:35

2S-S5p06

微生物がつくる様々なポリアミン.............................................................................................................. ○藤原 伸介（関西学院大・理工）

15:50

2S-S5p07

ポリアミンと健康：ポリアミンによるグリコサミノグリカン合成促進機序.............................................................................................................................. ○東 恭平（東理大・薬）16:15

2S-S5p08

ポリアミン摂取による長寿の基礎的背景と消化管の役割......................................... ○早田 邦康（自治医大さいたま医療センター 循環器病臨床医学研究所）

16:40

2S-S5p09

健康長寿社会へ向けた腸内細菌由来ポリアミン産生促進技術の開発とその保健効果.................................................................................................. ○松本 光晴（協同乳業・研・技術開発）

17:05

2S-S5p10

ヒト腸内常在菌叢最優勢種のポリアミン合成・輸送経路の遺伝学的解明.............................................................................................................. ○栗原 新（近畿大院・生物理工）座長：藤原 伸介

17:25

おわりに
............................................................................................................................................................ 栗原 新

一般講演（午前の部）

A 会場 A36（9:00～11:36）【遺伝子工学】
8:48

接続チェック（12 分）

36

9:00

2Aa01

プラスミドが宿主に及ぼす負荷を軽減する因子の探索・同定............................................................ ○森 光矢 1, ファン チィー キム ユン 1, 金原 和秀 1, 新谷 政己 1,2（1 静大院・総合科技, 2 静大・グリーン科技研）

9:12

2Aa02

好気・微好気・嫌気条件下における接合伝達性の比較....................................... ○越智 健太郎 1, 柳谷 洸輔 1, 雪 真弘 2, 大熊 盛也 2, 金原 和秀 1, 新谷 政己 1,2,3（1 静大院・総合科技, 2 理研・バイオリソース, 3 静大・グリーン科技研）

9:24

2Aa03

同じ不和合性群に属しても塩基組成の違うプラスミドの宿主域は異なる...................... ○德田 真穂 1, 柳谷 洸輔 1, 井上 謙吾 2, 雪 真弘 3, 大熊 盛也 3, 金原 和秀 1, 新谷 政己 1,3,4（1 静大院・総合科技, 2 宮崎大・農, 3 理研・バイオリソース, 4 静大・グリーン科技研）

9:36

2Aa04

Geobacillus 属細菌における高度遺伝子発現を可能とするプラスミドベクター......................................... ○倉敷 凌太 1, 大城 隆 2, 鈴木 宏和 2（1 鳥取大院・持続創生, 2 鳥取大・工）

9:48

2Aa05

安価な青白スクリーニングが可能なクローニングベクターの開発........................................... ○鈴木 宏和 1,2, 栗山 克 1, 山﨑 竜次 2, 日野 智也 1,2, 永野 真吾 1,2, 大城 隆 1,2（1 鳥取大・工, 2 鳥取大院・工）

10:00

2Aa06

病原性細菌の毒素産生能力を阻害する物質の探索システムの開発とその利用.......... ○野田 正文 1, Sultana Nasrin 1, Danshiitsoodol Narandalai 1, 井上 裕介 2, 東川 史子 1, 杉山 政則 1（1 広島大院・医系科学, 2 三井製糖株式会社）
休憩・接続チェック（12 分）

10:12
10:24

2Aa07

組換え RNA 分子の高生産に向けたコリネ型細菌での発現系構築............................................................ 羽城 周平, 三橋 麻由, ○安枝 寿（味の素バイオ・ファイン研）

10:36

2Aa08

コリネ型細菌での転写ユニット増幅による組換え RNA 分子の高生産............................................................ ○羽城 周平, 三橋 麻由, 安枝 寿（味の素バイオ・ファイン研）

10:48

2Aa09

組織空間的トランスクリプトーム解析及びゲノム変異解析に向けた微量生体分子抽出法の開発................................... ○山崎 美輝 1,2, 細川 正人 3, 有川 浩司 4, 髙橋 清文 4, 松永 浩子 4, 竹山 春子 1,2,3,4（1 早大院先進理工, 2 産総研 CBBD-OIL, 3 早大理工総研, 4 早大ナノライフ創新研）

11:00

2Aa10

極微小組織切片からの単一細胞レベルトランスクリプトーム解析................................... ○松永 浩子 1, 髙橋 清文 1, 山崎 美輝 2,3, 有川 浩司 1, 細川 正人 4, 竹山 春子 1,2,3,4（1 早大ナノライフ創新研, 2 早大院先進理工, 3 産総研 CBBD-OIL, 4 早大理工総研）

11:12

2Aa11

遺伝子組換え技術を応用したオオミジンコにおける幼若ホルモン活性の可視化..................................................................... ○野田 彩乃, 加藤 泰彦, 松浦 友亮, 渡邉 肇（阪大院・工）

11:24

2Aa12

放線菌を用いたタンパク質発現量を調節する遺伝子配列設計手法の開発........................................................................................... ○田島 直幸 1, 北川 航 2, 齋藤 裕 1, 西宮 佳志 2,
玉野 孝一 2, 安武 義晃 2, 田村 具博 2, 亀田 倫史 1
（1 産総研・人工知能, 2 産総研・生物プロセス）

B 会場 A37（9:00～11:36）【バイオマス，資源，エネルギー工学】
接続チェック（12 分）

8:48
9:00

2Ba01

Bacillus 属細菌を用いた微生物発電の試み.............................. ○福本 悠地, 江邉 正平, 大池 達矢, 岡南 政宏, 阿野 貴司（近畿大院・生物理工）

9:12

2Ba02

Bacillus 属細菌 IA 株と燻炭を組み合わせた微生物資材の開発................................................. ○江邉 正平, 大池 達矢, 岡南 政宏, 阿野 貴司（近畿大院・生物理工）

9:24

2Ba03

新奇な好熱性放線菌 Streptomyces thermoviolaceus を用いたタンパク質生産株の開発.......................... ○齊藤 朱音 1, 三原 笑 1, 曽田 匡洋 3, 荻野 千秋 1, 柏木 紀賢 2, 竹中 武藏 2, 近藤 昭彦 2
（1 神戸大院・工, 2 神戸大院・科技イノベ, 3 長瀬産業）

37

9:36

2Ba04

コーヒー抽出残渣の発酵資源化.......................................................... ○水谷 友梨香 1, 加藤 愛理 2, 関川 貴寛 2,3, 菊川 寛史 2,3, 原 清敬 2,3（1 静県大院・薬食生命, 2 静県大・食栄, 3 静県大院・食栄・環）

9:48

2Ba05

油性酵母を用いた脱脂米糠加水分解物から機能性油脂生産......................................... ○渡辺 昌規 1, 窪田 健太 1, 佐久間 健輔 1, 竹中 慎治 2, Chaiyaso Thanongsak 3（1 山形大院・農, 2 神戸大院・農, 3 タイ・チェンマイ大・農産）

10:00

2Ba06

スギ由来セルロースナノファイバーを用いたバイオポリマーコンポジットの作製.................................................................... ○妹尾 政都, 中村 嘉利, 浅田 元子（徳島大院・先端技科）
休憩・接続チェック（12 分）

10:12
10:24

2Ba07

Xanthophyllomyces dendrorhous によるアスタキサンチン発酵生産への柑橘果皮抽出液の利用........................................................................ ○景山 裕也, 若林 敬二, 原 清敬（静県大院・薬食生命）

10:36

2Ba08

小松菜からの内生菌の単離および植物免疫活性化能の評価............................................................... ○黒川 摩利 1, 中野 正貴 1, 北畑 信隆 2, 朽津 和幸 1, 古屋 俊樹 1
（1 東京理科大理工・応生, 2 東大院・農生科）

10:48

2Ba09

土壌環境および植物成長を改善する資材の探索................................................................ ○富永 信一, 荒木 希和子, 久保 幹（立命館大院・生命科学）

11:00

2Ba10

Bacillus subtilis の土壌環境及び植物成長に及ぼす影響解析................................................................ ○東本 繰未, 荒木 希和子, 久保 幹（立命館大院・生命科学）

11:12

2Ba11

イオン液体で前処理した木質系バイオマス中の多糖およびリグニンのリファイナリー
............................................................... ○廣部 綾乃 1, 柘植 陽太 2, 荻野 千秋 3, 髙橋 憲司 1, 仁宮 一章 2
（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術, 3 神戸大院・工・応化）

11:24

2Ba12

鶏ふんからのリン回収技術の検討.......................................... ○野村 勇揮 1, 川西 琢也 1,2, 滝口 昇 1,2（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・理工）C 会場 B21（9:00～11:36）【代謝工学】
接続チェック（12 分）

8:48
9:00

2Ca01

Pseudomonas sp. LAB-08 株由来増殖抑制物質による解糖系抑制の可能性.................................................................................... ○本荘 雅宏 1, 鈴木 研志 1, 田代 陽介 2, 二又 裕之 3
（1 静大・創科技院, 2 静大・工, 3 静大・グリーン科技研）

9:12

2Ca02

ロドプシンを利用した大腸菌における光駆動 ATP 再生の物質生産への応用.................................................................. ○田中 涼 1, 鎌田 健太郎 1, 戸谷 吉博 1, 松田 史生 1, 石井 純 2,
柘植 謙爾 2, 弘埜 陽子 3, 原 清敬 3, 清水 浩 1（1 阪大院・情報, 2 神戸大院・科技イノベ, 3 静県大・食栄）

9:24

2Ca03

「アミノ酸機能工学」による大腸菌へのストレス耐性の付与....................................................................................... ○磯貝 章太, 高木 博史（奈良先端大・バイオ）

9:36

2Ca04

酸素をスイッチとしたコリネ型細菌中央代謝経路の切り換え....................................................................................... 小林 俊介 1, 村井 克輝 1, 川口 秀夫 2, 白井 智量 3,
仁宮 一章 1,4, 髙橋 憲司 1, 近藤 昭彦 2,3, ○柘植 陽太 1,4（1 金沢大院・自科, 2 神戸大院・科技イノベ, 3 理研・環境資源, 4 金沢大・新学術）

9:48

2Ca05

解糖系とペントースリン酸経路への代謝フラックスの分岐比が細胞内代謝プロファイルに及ぼす影響...................................................... ○村井 克輝 1, 佐々木 大介 2, 白井 智量 3, 内倉 寛斗 1, 佐々木 建吾 2,
仁宮 一章 1,4, 髙橋 憲司 1, 近藤 昭彦 2,3, 柘植 陽太 1,4（ 金沢大院・自科, 神戸大院・科技イノベ, 3 理研・環境資源, 4 金沢大・新学術）
1

2

38

10:00

2Ca06

バクテリアの還元型リン化合物輸送体 HtxBCDE における基質認識メカニズムの解析......................................................... ○廣田 隆一, 三好 克樹, 池田 丈, 石田 丈典, 舟橋 久景, 黒田 章夫（広島大院・統合生命科学）
休憩・接続チェック（12 分）

10:12
10:24

2Ca07

好熱性ホモ酢酸菌 Moorella thermoacetica 代謝改変株を用いたエタノール生産増強に向けた培養工
学的検討.................................................................. ○加藤 淳也 1, 竹村 海生 1, 岩崎 祐樹 2, 加藤 節 1, 青井 議輝 1,
和田 圭介 2, 村上 克治 2, 松鹿 昭則 2, 中島田 豊 1（1 広島大院・統合生命科学, 2 産総研・機能化学）

10:36

2Ca08

アコニット酸イソメラーゼ遺伝子とクエン酸輸送体遺伝子を共発現させた大腸菌生細胞によるクエン酸からの trans-アコニット酸の生産................................................. ○小田 祐之亮, 吉岡 育哲, 滝口 有沙, 桐村 光太郎（早大・先進理工）

10:48

2Ca09

Ochrobactrum sp. WU-1502 を利用したレブリン酸からの 2-オキソグルタル酸の生成........................................................... ○大浦 智之 1, 齋藤 慎太郎 1, 吉岡 育哲 1, 羽部 浩 2, 桐村 光太郎 1（1 早大・先進理工, 2 産総研・環境管理）

11:00

2Ca10

不均一なリグニン由来フェノールからの 4-ヒドロキシ安息香酸生産................................................................................ ○阿久津 美歩 1, 上村 直史 2, 政井 英司 2, 園木 和典 1
（1 弘前大院・農生, 2 長岡技科大・生物）

11:12

2Ca11

大腸菌の共培養によるイソプレノール合成経路のボトルネックの解消................................................................................ ○川井 隆太郎, 戸谷 吉博, 清水 浩（阪大院・情報）

11:24

2Ca12

Pseudomonas stutzeri NT-I のセレン代謝を促進する培地成分の検討................................................................. ○池田 美紗希, 黒田 真史, 井上 大介, 池 道彦（阪大院・工）D 会場 B32（9:00～11:36）【生物化学工学】
接続チェック（12 分）

8:48
9:00

2Da01

LAL 固定化ビーズ法を用いたグラム陰性菌の培養に伴うエンドトキシンの遊離特性の定量的解析（第 3 報）........................ 大瀧 賀也 1, ○徳永 成美 2, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大院・生命環境, 2 筑波大・生物資源）

9:12

2Da02

LAL 固定化ビーズ法を用いたエンドトキシンの高感度・迅速検出法の開発と利用（第 5 報）........................ 猪瀬 陽加 1, ○川﨑 芳美 2, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大院・生命環境, 2 筑波大・生物資源）

9:24

2Da03

イオンコンプレックス化技術を利用したポリ γ グルタミン酸の効率的な回収技術の開発........................................................................................ ○白米 優一, 山内 七海, 芦内 誠（高知大・農）

9:36

2Da04

酢酸菌を宿主とした異種タンパク質生産の試み.................................. ○植川 泰好, 繁 宥樹, 赤坂 直紀, 福田 青郎, 藤原 伸介（関西学院大院・理工）

9:48

2Da05

リン脂質組成を改変した膜受容体-マグネトソーム複合体の開発.......................................... ○藤本 一嗣, 田山 爽也華, 前田 義昌, 田中 剛, 吉野 知子（農工大院・工）

10:00

2Da06

細胞模倣膜を用いた界面活性剤刺激性評価に関する研究.......................................................... ○藤根 志帆 1, 佐々木 陽介 1, 下川 直史 1, 辻野 義雄 1,2, 高木 昌宏 1
（1 北陸先端大・マテリアル, 2 岡山理大・経営）
休憩・接続チェック（12 分）

10:12
10:24

2Da07

Characterization of Tryptamine-coupled resin for affinity purification of human IgG........................○Michelle Rakotondravao 1, Naohiro Kuriyama 2, Noritaka Kuroda 2, Ryosuke Takahashi 2,
Yumiko Sakoda 2, Jun-ichi Horiuchi 1, Yoichi Kumada 1（1 Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2 YMC）

39

10:36

2Da08

エクソソームのアフィニティ分離を目指した単鎖抗体固定化担体の開発..................................................... ○小林 巧, 新 裕太, 堀内 淳一, 熊田 陽一（京工繊大院・工芸科学）

10:48

2Da09

高親和性ウサギ scFv の開発とイムノクロマトグラフィへの応用.................. ○中尾 貴一 1, 岡西 崚輔 1, 高橋 浩一 2, 小笠原 真也 2, 権平 文夫 3, 堀内 淳一 1, 熊田 陽一 1（1 京工繊大院・工芸科学, 2 デンカ, 3 デンカ生研）

11:00

2Da10

ミックスモードクロマトグラフィを用いた治療用酵素ヒト Kynureninase の高効率分離.................................................................... ○杉山 友亮, 熊田 陽一, 堀内 淳一（京工繊大・工芸科学）

11:12

2Da11

空間的環境が細胞の凝集，分散に与える影響............................................................. ○瀬川 直矢, 上岡 惇也, 佐々木 啓, 紀ノ岡 正博（阪大院・工）

11:24

2Da12

FISH 法を用いたチャイニーズハムスター由来細胞における内部テロメア配列と染色体転座の解析.................................................... ○イ ジュンホ, 山野-足立 範子, 古賀 雄一, 大政 健史（阪大院・工）E 会場 D12（9:00～11:36）【食品科学，食品工学】
接続チェック（12 分）

8:48
9:00

2Ea01

質量分析イメージングによる発酵過程における紅麹二次代謝物の可視化技術の確立.................................................................................... ○南 牧歩 1, 比嘉 悠貴 2, 福﨑 英一郎 1, 新間 秀一 1（1 阪工大院・工, 2 小林製薬中央研究所）

9:12

2Ea02

メタボロミクスに基づくテンペ発酵過程における成分の経時的変動解析................................................ ○南部 洋輔, Putri Sastia Prama, 福﨑 英一郎（阪大院・工・生命先端）

9:24

2Ea03

Optimization of processing method to increase amino acid content in Tempe, an Indonesian fermented food........................................................................ ○Hadi Akbar Dahlan, Sastia Prama Putri, Eiichiro Fukusaki（Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.）

9:36

2Ea04

モンゴル乳製品由来乳酸菌がコレステロール代謝に与える影響.............................................................. ○宮本 侑子 1, 峯崎 美歌子 1, 李 怡然 2, 竹下 正彦 2, 有馬 勇夫 2,
Tsend-Ayush Chuluunbat 3, Oyunsuren Tsendsuren 4, 小川 健二郎 5, 西山 和夫 1, 山﨑 正夫 1
（ 宮崎大・農, 2 南日本酪農共同（株）, 3 蒙科技大, 4 蒙バイオ協会, 5 宮崎大・TT 推進機構）
1

9:48

2Ea05

焼酎粕を用いた麹菌培養物(FPS)がコレステロール代謝に及ぼす影響...................................................................... ○加藤 寛隆 1, 小境 敏揮 2, 章 超 2, 河野 邦晃 2, 岩井 謙一 2,
髙瀨 良和 2, 小川 健二郎 3, 西山 和夫 1, 山﨑 正夫 1
（ 宮崎大院・農, 霧島酒造, 3 宮崎大・テニュアトラック推進機構）
1

10:00

2Ea06

2

レスベラトロールおよびその重合体の血管保護作用........................................................................................ ○寺門 和奏 1, 里中 健太 1, 宮崎 均 2, 吉田 滋樹 2
（1 筑波大院・生命環境, 2 筑波大・生命環境系）
休憩・接続チェック（12 分）

10:12
10:24

2Ea07

Lactobacillus plantarum PUK6 が生産する多成分バクテリオシン生合成遺伝子の同定および分子解析....................................................................................................... ○河原 あい 1, 善藤 威史 2, 松崎 弘美 1,3（1 熊本県大院・環境共生, 2 九大院・農, 3 熊本県大・環境共生）

10:36

2Ea08

たくあん漬けから分離した Lactococcus lactis PJR24 が生産するバクテリオシンの特性.......................................................................... ○高橋 孝太郎 1, 如田 奈津美 2, 河原 あい 1, 松崎 弘美 1,2（1 熊本県大院・環境共生, 2 熊本県大・環境共生）

10:48

2Ea09

スサビノリ由来硫酸化多糖体ポルフィランの抗炎症作用に関する研究.................................................................... 柳戸 彩奈, 山口 健一, ○小田 達也（長崎大院・水産環境）

40

11:00

2Ea10

麹菌培養物に由来する腸炎に有効な機能性分子の探索.................................................................. ○Danshiitsoodol Narandalai, 野田 正文, 東川 史子, 杉山 政則

11:12

2Ea11

Lactobacillus antri が産生するメンブランベシクルの IgA 産生促進作用の解析.................. ○佐々木 晴菜 1, 仲田 真穂 1, 前田 新一 2, 雑賀 あずさ 3, 國澤 純 3, 片倉 啓雄 2, 山崎 思乃 2

（広島大院・医系学・未病予防医学共同研究講座）（1 関西大院・理工, 2 関西大・化生工, 3 医薬基盤研究所）
11:24

2Ea12

Lactobacillus sakei 由来メンブランベシクルによる IgA 産生促進メカニズムの解明............................................................................... ○三好 柚紀 1, 井谷 彩乃 2, 雑賀 あずさ 3, 長竹 貴広 3,
松永 安由 3, 國澤 純 3, 片倉 啓雄 2, 山崎 思乃 2（ 関西大院・理工, 関西大・化生工, 3 医薬基盤・健康・栄養研）
1

2

F 会場 D23（9:00～10:36）【オミクス解析】
接続チェック（12 分）

8:48

C 代謝フラックス解析に基づくシアノバクテリアの単波長光照射下に対する応答解析.......................................... ○山本 千晶, 北村 さや香, 豊島 正和, 戸谷 吉博, 清水 浩（阪大院・情報）

9:00

2Fa01

13

9:12

2Fa02

クラブトリー陽性および陰性の差異に基づく酵母代謝のプロファイルの比較................................................. ○井村 誠 1,2, 新田 克章 2, 岩切 亮 1, 松田 史生 3, 清水 浩 3, 福﨑 英一郎 2（1 三菱商事ライフサイエンス, 2 阪大院・工, 3 阪大院・情報）

9:24

2Fa03

LC-MS を用いたアミノ酸鏡像異性体の高速分析に資するクロマトグラフィー条件の改良............................................................. ○吉川 航平, 古野 正浩, 田中 信男, 福﨑 英一郎（阪大院・工）

9:36

2Fa04

GC/MS を基盤としたヒト血漿メタボロミクスにおける固相誘導体化法と従来誘導体化法の比較............................................................................ ○新川 翔也 1, 佐々野 僚一 2, 古野 正浩 1, 福﨑 英一郎 1（1 阪大院・工, 2 アイスティサイエンス）

9:48

2Fa05

親水性相互作用/陰イオン交換クロマトグラフィータンデム質量分析による親水性代謝物の一斉分
析法の開発........................................... 中谷 航太 1, 和泉 自泰 1, 高橋 政友 1, 櫻井 恵太 2, 佛願 道男 2, ○馬場 健史 1
（1 九大・生医研, 2 日立化成テクノ）

10:00

2Fa06

次世代定量メタボローム解析に資する安定同位体標識内部標準品群調製法の開発......................................................... ○相馬 悠希 1,2, 藤原 由梨 2, 高橋 政友 1, 後藤 麻衣子 1, 下平 武彦 1,
池田 明夏里 3, 寺内 勉 3, 和泉 自泰 1,2, 馬場 健史 1,2（1 九大・生医研, 2 九大院・シス生科, 3 大陽日酸株式会社）

10:12

2Fa07

クローン病自然発症モデル SAMP1/YitFc マウスの病状進行に伴う 腸内細菌叢および糞便メタボラ
イトの変動.............................. ○小松 陽介 1,2, 清水 由宇 1, 山野 めぐみ 1, 中村 公則 1,3, 綾部 時芳 1,3, 相沢 智康 1,3,4（1 北大院・生命科学, 2 森永乳業, 3 北大院・先端生命, 4 北大・国際連携研究教育局）

10:24

2Fa08

オミクスアプローチを適用した熟成チーズの細菌相多様性と品質の連関の検証.................................................................. ○海野 良輔 1, 志波 優 2,3, 佐藤 実穂 1, 鈴木 敏弘 1, 石川 森夫 1
（1 東京農大応生科・醸造, 2 東京農大生命科・分微, 3 東京農大・ゲノムセ）

41

G 会場 D25（9:00～11:36）【セル＆ティッシュエンジニアリング】
接続チェック（12 分）

8:48
9:00

2Ga01

マイクロキャリア培養した間葉系幹細胞のデキストラナーゼおよびキレート剤併用によるトリプシ
ンフリー回収法............................................................................................ 岡村 洋, ○藤原 政司, 高木 睦（北大院・工）

9:12

2Ga02

交流電場印加による非接触な足場依存性細胞の剥離法......................................................... 小山 純弘, 和田 昌憲, 田村 泰之, 石川 元, 小林 準次, ○石川 陽一（エイブル）

9:24

2Ga03

接着細胞の自己凝集化技術を用いたヒト間葉系幹細胞スフェロイドの作製精度と質の評価......................................... ○草加 直幸 1,2, 安部 菜月 3, 鈴木 康平 4, 広井 佳臣 4, 西野 泰斗 3, 岩井 良輔 2
（1 岡山理大院・工, 2 岡山理大・フロンティア理工学研, 3 日産化学・生物科学研,
4

日産化学・材料科学研）

9:36

2Ga04

接着細胞の自己凝集化技術を用いた 3 次元毛細血管集合体の作製と形状制御........ ○橋本 真悟 1,2, 滝澤 昇 1, 岩井 良輔 2（1 岡山理大院・工, 2 岡山理大・フロンティア理工学研）

9:48

2Ga05

In vitro 毛幹形成技術とこれを利用した毛髪の再生医療................................................................................. ○中嶋 陸満 1, 清水 亮啓 1, 景山 達斗 1,2, 福田 淳二 1,2（1 横国大院・工, 2 神奈川県産業技術総合研（KISTEC））

10:00

2Ga06

ヒト不死化筋芽細胞株 Hu5/KD3 を用いた三次元骨格筋組織の構築................................................. ○長島 拓則 1, 清水 一憲 1, Hadiwidjaja Stacy 1, 大隅 早紀 1, 本多 裕之 1,2（1 名大院・工, 2 名大・予防早期医療創成セ）
休憩・接続チェック（12 分）

10:12
10:24

2Ga07

コラーゲンチューブ培養法による肝細胞微小線形オルガノイドの作製......................................................... ○佐伯 琴音, 榎本 紗希子, 矢嶋 祐也, 鵜頭 理恵, 山田 真澄, 関 実（千葉大院・融合）

10:36

2Ga08

スフェロイド形成によるヒト iPS 細胞由来肝細胞の代謝機能向上........................................................ 田尾 文哉, 赤間 剛, ○小島 伸彦（横市大院・生命ナノシステム）

10:48

2Ga09

毛細血管構造を有するスフェロイドの内部構造の三次元的解析.................................................................................... ○小西 研吾 1, 稲垣 慶一 1, 髙橋 憲司 1, 仁宮 一章 2
（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術）

11:00

2Ga10

がん細胞を含む多細胞スフェロイドをバイオ 3D プリンターにより配置した三次元組織の作製とその非破壊的評価..................................... ○谷内 達彦 1, 髙橋 憲司 1, 仁宮 一章 2（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術）

11:12

2Ga11

近赤外光情報を用いたスフェロイドの非侵襲的品質評価........................ ○永井 美希 1, 山本 涼平 1, 渋田 真結 1, 蟹江 慧 1, 五十嵐 陽子 2, 菅沼 寛 2, 加藤 竜司 1,3（1 名大院・創薬, 2 住友電気工業, 3 名大・ナノライフシステム研究所）

11:24

2Ga12

多糖とペプチドを用いたハイブリッド細胞足場材料の最適化検証と評価...................................................................... ○王 悦 1, 蟹江 慧 1, 金子 喬士郎 1, 杉本 礼子 1, 成田 裕司 2,
緒方 藍歌 2, 宇都 甲一郎 3, 荏原 充宏 3, 加藤 竜司 1,4（1 名大院・創薬, 2 名大院・医, 3 物材機構, 4 名大・ナノライフシステム研究所）

42

H 会場 D32（9:00～11:36）【醸造学，醸造工学】
接続チェック（12 分）

8:48
9:00

2Ha01

日本の発酵食品の基盤、麹グリコシルセラミドは脂質代謝を改善する.......................................................................... ○北垣 浩志 1, 浜島 弘史 1, 光武 進 1, 田中 優 2, 宮川 幸 1,
西向 めぐみ 3, 中村 強 4, 柳田 晃良 5, 中山 二郎 2, 永尾 晃治 1
（ 佐賀大・農, 九大院・農, 3 岩手大院・連農, 4 福岡女子大学, 5 西九州大学）
1

9:12

2Ha02

2

麹由来グリコシルセラミドの腸内細菌への作用解析.......................... ○永留 真優 1, 阪本 真由子 1, 宮川 幸 1, 北島 悠花 1, 中村 強 2, 中山 二郎 3, 北垣 浩志 1
（1 佐賀大院・農, 2 福岡女子大, 3 九大院・農）

9:24

2Ha03

紅麹に含まれる抗炎症作用物質の解析....................................... ○小濵 可奈絵 1, 阪本 真由子 1, 柘植 圭介 2, 深見 裕之 3, 金 英寿 3, 北垣 浩志 1
（1 佐賀大・農, 2 佐賀工業技術センター, 3 小林製薬株式会社）

9:36

2Ha04

麹甘酒には食後血糖値及びインスリン量の上昇を抑制する成分が含まれる.............................. ○倉橋 敦 1, 中村 彩奈 1, 小黒 芳史 1, 渡辺 賢一 2, 尾崎 信紘 3, 後藤 博 4, 平山 匡男 4（1 八海醸造・研究開発, 2 新潟大院・医歯学総合, 3 (一社) 新潟県労働衛生医学協会,
4

新潟バイオリサーチパーク）

9:48

2Ha05

卵麹の開発
............................................. ○中川 拓郎 1, 山下 秀行 1, 宮本 哲也 2（1 樋口松之助商店, 2 キユーピー）

10:00

2Ha06

麹を用いて美味しさを引き出した卵黄、「熟成卵黄」の開発.................................................................................... ○宮本 哲也, 木原 明彦, 設樂 弘之（キユーピー）
休憩・接続チェック（12 分）

10:12
10:24

2Ha07

α-EG とレジスタントプロテイン高含有のどぶろく醸造法......................................................... ○高橋 雅弥, 内川 瞳, 町田 雅之, 尾関 健二（金工大・ゲノム研）

10:36

2Ha08

純米酒エキスに含まれる α-EG が真皮層のコラーゲンに与える影響................................................. ○三谷 恵一, 大浦 友紀, 原田 春佳, 根路銘 伸介, 奥田 伸哉, 坊垣 隆之（大関総研）

10:48

2Ha09

芋焼酎由来成分の脳機能改善作用................................................................................................ ○章 超, 河野 邦晃, 岩井 謙一（霧島酒造）

11:00

2Ha10

牛乳由来ホエイを原料とする食酢醸造とその機能性解析............................................................................................ ○河股 優輔 1, 若山 守 1, 林 順司 2, 豊竹 洋佑 1
（1 立命館大院・生命科学, 2 徳島大・生物資源）

11:12

2Ha11

熟成期黒酢発酵液由来乳酸菌の D-アミノ酸生成能について.................... ○星 南穂子 1, 藤井 暁 2, 橋口 和典 2, 長野 正信 2, 亀谷 将史 1,3, 新井 博之 1,3, 石井 正治 1,3（1 東大院・農生科, 2 坂元醸造, 3 東大微生物連携機構）

11:24

2Ha12

発酵食品データベースの構築と公開....................................................................................... ○楠本 憲一, 曲山 幸生（農研機構・食品部門）

J 会場 E23（9:00～11:24）【発酵生理学，発酵工学】
8:48

接続チェック（12 分）

43

9:00

2Ja01

日本酒生産にヒントを得た麹菌酵素カクテルと酵母を用いた高純度希少糖生産.......................................................................... ○若井 暁 1,2, 堤 浩子 3, 秦 洋二 3, 荻野 千秋 4, 近藤 昭彦 1（1 神戸大院・科技イノベ, 2 海洋研究開発機構, 3 月桂冠・総研, 4 神戸大院・工）

9:12

2Ja02

Implementation of different fermentation strategies to enhance the production of microbial carotenoids from
Gordonia terrae TWRH01....................................................................○Wai Leng Carmen Loh 1,2, John Chi-Wei Lan 1, Hui Suan Ng 2
（1 Biorefin. Bioprocess Eng. Lab., Dept. Chem. Eng. Mater. Sci., Coll. Eng., Yuan Ze Univ., Taiwan 32003,
R.O.C., 2 Faculty Appl. Sci., UCSI Univ., Kuala Lumpur 56000, Malaysia.）

9:24

2Ja03

Evaluation of γ-aminobutyric acid (GABA) production by Bacillus subtilis BBEL02 using alternative
carbon sources from wastes...................................................................... ○Arlene Cherilyn Asun 1, John Chi-Wei Lan 1, Hui-Suan Ng 2
（1 Biorefin. Bioprocess Eng. Lab., Dept. Chem. Eng. Mater. Sci., Coll. Eng., Yuan Ze Univ., Taiwan 32003,
R.O.C., 2 Dept. Food Sci. Nutr., F. Appl. Sci., UCSI Univ., UCSI Hts., 56000 Cheras, KL, MY）

9:36

2Ja04

Evaluation of polyhydroxyalkanoates (PHA) production by Ralstonia eutropha H16 in a single-chamberelectro-fermentation system............................................................................................................... ○Yuen Hing Lai, John Chi-Wei Lan（Biorefin. Bioprocess Eng. Lab., Dept. Chem. Eng. Mater. Sci., Coll. Eng., Yuan Ze Univ., Taiwan 32003,
R.O.C.）

9:48

2Ja05

高温の嫌気条件下で誘導されるコリネ型細菌のグルコース消費促進に伴う遺伝子発現・酵素活性の変動.......................... ○松沢 弘貴 1, 豊田 晃一 2, 水野 光 1, 仁宮 一章 1,3, 髙橋 憲司 1, 乾 将行 2, 柘植 陽太 1,3（1 金沢大院・自科, 2 RITE, 3 金沢大・新学術）

10:00

2Ja06

高温下におけるコリネ型細菌を用いた乳酸・コハク酸生産と酵素ターンオーバーの必要性................................................................................. ○内倉 寛斗 1, 仁宮 一章 1,2, 髙橋 憲司 1, 柘植 陽太 1,2（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術）
休憩・接続チェック（12 分）

10:12
10:24

2Ja07

グルコース消費速度と代謝遺伝子の発現レベルの関係...................................................................... ○山口 陽 1, 内倉 寛斗 1, 豊田 晃一 2, 乾 将行 2, 柘植 陽太 1,3（1 金沢大院・自科, 2 RITE, 3 金沢大・新学術）

10:36

2Ja08

増殖できない高温下におけるコリネ型細菌の代謝挙動................................................................................. ○小林 俊介 1, 仁宮 一章 1,2, 髙橋 憲司 1, 柘植 陽太 1,2（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術）

10:48

2Ja09

耐熱性コリネ型細菌による高温グルタミン酸発酵............................................................................... ○古賀 凌 2, 友広 いずみ 1, 曽川 沙希 1, 松谷 峰之介 2,
ナンタポン ナワラート 3, 片岡 尚也 1,2,4, 藥師 寿治 1,2,4, 松下 一信 1,2,4（ 山口大・農, 2 山口大院・医系, 3 スラナリー工科大, 4 中高温微生物セ）
1

11:00

2Ja10

ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の欠失が Corynebacterium glutamicum のリジン生産に与える影響................................................................................. ○新森 彰信, 郭 朕, 和田 大, 横田 篤（北大院・農）

11:12

2Ja11

糸状菌 Talaromyces cellulolyticus による抗体等バイオ医薬品製造技術の開発..... ○深田 寛朗 1, 十倉 充範 2, 臼田 佳弘 1（1 味の素バイオ・ファイン研, 2 味の素研究開発企画部）

44

一般講演（午後の部）

A 会場 A36（13:30～17:30）【酵素学，酵素工学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

2Ap01

組換え L-メチオニン脱炭酸酵素の迅速簡便な精製法の確立及び結晶構造解析....................................................................................... ○大川 敦司 1, 林 将也 1, 室田 昌輝 2, 志波 智生 2,
原田 繁春 2, 根本 理子 1, 田村 隆 1, 稲垣 賢二 1
（1 岡山大院・環境生命, 2 京工繊大院・工芸科学）

13:42

2Ap02

高基質特異性酵素 L-グルタミン酸オキシダーゼの活性中心アミノ酸残基の機能解析............................................................................... ○矢野 佳果 1, 松尾 慎作 1, 伊藤 菜奈子 2, 今田 勝巳 2,
日下部 均 3, 根本 理子 1, 田村 隆 1, 稲垣 賢二 1
（1 岡山大院・環境生命, 2 阪大院・理, 3 （株）エンザイムセンサ）

13:54

2Ap03

Geobacillus kaustophilus 由来グリシンオキシダーゼの基質阻害および基質特異性の改変........................................... ○東浦 優希 1, 小田 龍佑 1, 川崎 大志 1, 野村 隆臣 2, 新井 亮一 2, 西矢 芳昭 1
（1 摂南大・理工・生命科学, 2 信州大・繊維・応用生物）

14:06

2Ap04

安定性を向上したグリシン酸化酵素変異体を用いたグリシン測定法の構築...............................................○巽 萌美 1, 星野 亘 1, 小玉 優哉 1, Techawaree Ueatrongchit 2, 高橋 一敏 1,
山口 浩輝 1, 田上 宇乃 1, 宮野 博 1, 浅野 泰久 2, 水越 利巳 1
（1 味の素株式会社, 2 富山県大・生医工研セ）

14:18

2Ap05

超好熱古細菌（始原菌）由来プロテアーゼ（Tk-SP）の Pro ペプチドが成熟化に与える影響..................................... ○長尾 征秀, 前川 大樹, 山野-足立 範子, 古賀 雄一, 大政 健史（阪大院・工）

14:30

2Ap06

Protein trans-splicing を利用した耐熱性プロテアーゼ再構成の検討............................................................ ○巽 祐介, 山野-足立 範子, 古賀 雄一, 大政 健史（阪大院・工）休憩・接続チェック（12 分）

14:42
14:54

2Ap07

Elizabethkingia sp. TT1 由来組換え L-アミノ酸エステラーゼの高発現系の構築と菌体反応による ValGly 合成....................................................................... ○大西 敦也 1, 田中 貴大 1, 林 順司 2, 豊竹 洋佑 1, 若山 守 1（1 立命館大院・生命科学, 2 徳島大院・社会産理工）

15:06

2Ap08

アスパラギン合成酵素を用いた β-アスパルチル化合物合成法の検討............................................................................................ ○山田 泰蔵 1, 林 順司 2, 豊竹 洋佑 1, 若山 守 1（1 立命館大院・生命科学, 2 徳島大・生物資源）

15:18

2Ap09

Thermococcus kodakarensis 由来 β-アスパルチルトランスペプチダーゼ遺伝子のクローニング、発現および諸性質の解明........................................................................... ○深瀬 葵 1, 林 順司 2, 高木 一好 1, 豊竹 洋佑 1, 若山 守 1（1 立命館大院・生命科学, 2 徳島大院・社会産理工）

15:30

2Ap10

Pseudomonas aeruginosa PAO1 株由来 γ-グルタミルトランスペプチダーゼ II C 末端領域の活性および安定性に及ぼす影響............................................... ○八田 誠二 1, 野々村 祐輝 1, 林 順司 2, 高木 一好 1, 豊竹 洋佑 1, 若山 守 1（1 立命館大院・生命科学, 2 徳島大院・先端技科）

15:42

2Ap11

Pseudomonas nitroreducens 由来 γ-グルタミルトランスペプチダーゼの構造と機能に関する研究............................................................................................ ○池添 浩輝 1, 林 順司 2, 豊竹 洋佑 1, 若山 守 1（1 立命館大院・生命科学, 2 徳島大・生物資源）

45

15:54

2Ap12

Immobilization and site directed mutagenesis of Trp525 residue of γ-Glutamyltranspeptidase from
Pseudomonas nitroreducens (PnGGT) to improve Theanine production....................... ○Putthapong Phumsombat 1, Chiharu Sano 1, Takao Hibi 2, Takafumi Itoh 2, Junji Hayashi 1,
Yosuke Toyotake 1, Mamoru Wakayama 1（1 Coll. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2 Dept. Biosci. Fukui Prefectural Univ.）
休憩・接続チェック（12 分）

16:06
16:18

2Ap13

L-アミノ酸を起点とするピラジン合成酵素群の発見とその解析......................................... ○本山 智晴 1,2, 中野 祥吾 1, 山本 雄大 3, 常盤 広明 3, 浅野 泰久 4, 伊藤 創平 1
（1 静県大院・薬食生命, 2 日本学術振興会, 3 立教大・理, 4 富山県大・工）

16:30

2Ap14

trans-3-ヒドロキシプロリンの実用生産に向けたバイオプロセス開発............................................................ ○原 良太郎 1,4, 西川 健幸 2, 奥原 拓也 2, 纐纈 健人 3, 木野 邦器 1,2（1 早大・理工総研, 2 早大・先進理工, 3 協和発酵バイオ, 4 京大院・農）

16:42

2Ap15

D-アミノ酸含有ジペプチドの汎用的な酵素合成法の開発.................................................................... ○勝目 智也, 鈴木 伸, 木野 邦器（早大・先進理工・応化）

16:54

2Ap16

アデニル化酵素を利用したフェルラ酸アミド合成法の開発.................................................................... ○鈴木 伸, 早田 優理, 木野 邦器（早大・先進理工・応化）

17:06

2Ap17

Proteus vulgaris 由来 L-アミノ酸デアミナーゼの機能解析とアンモニア生産への応用............................................................ ○宮澤 沙哉佳, 梅澤 覚, 木野 邦器（早大院・先進理工・応化）

17:18

2Ap18

Bacillus sp.由来のシアン分解活性を示す新規ニトリラーゼの発現・精製と機能・構造解析........ ○佐々木 春弥 1, 小川 貴弘 2, 小松 大祐 2,3, 加賀谷 夏海 4, 松村 洋寿 1, 尾高 雅文 1, 養王田 正文 2
（1 秋田大院・理工, 2 農工大院・工, 3 アイ・エス・ソリューション, 4 秋田大・理工）B 会場 A37（13:30～17:30）【酵素学，酵素工学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

2Bp01

養菌性キクイムシと共生するセルロース資化性糸状菌が生産するセルラーゼの同定と機能解析....................................................................................... ○堤 星太郎 1, 酒井 杏匠 1, 山口 愛彩 1, 都築 翔 1,
鈴木 啓仁 2, 梶村 恒 2, 志水 元亨 1, 加藤 雅士 1
（1 名城大院・農, 2 名大院・生命農学）

13:42

2Bp02

α-1,3-glucanase を含む溶菌酵素溶液を利用した Aspergillus tubingensis (A. niger) からのプロトプラス
ト形成......................................................... ○石原 真奈, 楊 俐聡, 吉岡 育哲, 桐村 光太郎（早大・先進理工）

13:54

2Bp03

リゾクトニア属糸状菌の分泌酵素群による水稲伝染性糸状菌類の防除................................................................... 原 富次郎, 高塚 由美子, ○Da Xia, 関 未央（京大・エネ研）

14:06

2Bp04

真菌細胞壁分解酵素を基盤とした抗真菌システムの開発................................................................................ ○平良 東紀 1, 津波古 遥奈 1, 矢野 成和 2, 上地 敬子 1
（1 琉球大・農, 2 山形大院・理工）

14:18

2Bp05

Bacillus cereus が形成するシリカ層より発見された長鎖ポリアミンの合成メカニズムの解析........................................................ ○山本 光士郎 1, 池田 丈 1,2, 舟橋 久景 1,2, 廣田 隆一 1,2, 黒田 章夫 1,2（1 広島大院・先端物質, 2 広島大院・統合生命科学）

14:30

2Bp06

ホタル生物発光のアルパカ抗体による制御.................. ○小野 陽介 1, 鶴田 篤弘 1, 有馬 一成 1, 伊東 祐二 1, 赤澤 陽子 2, 中島 芳浩 2, 加藤 太一郎 1（1 鹿児島大学 理工学研究科 生命化学専攻, 2 産総研）

14:42

休憩・接続チェック（12 分）

46

14:54

2Bp07

シークワァーサー由来フラボノイドメチル化酵素の分子改変およびポリメトキシフラボノイド生産への応用....................................................................................... ○戸田 弘, 伊藤 伸哉（富山県大・生医工研セ）

15:06

2Bp08

二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼを利用したヒドロキシエクオールの合成............................................................... ○野澤 大樹 1, 橋本 貴史 1, 向井 克之 2, 松山 彰収 2, 古屋 俊樹 1
（1 東京理科大理工・応生, 2 （株）ダイセル）

15:18

2Bp09

パラゴムノキの天然ゴム生合成マシナリを構成するタンパク質の機能解析.................................................. 山口 真琴 1, 幸治 幸治 1, 廣森 美樹 1, 石井 智樹 1, 和氣 駿之 1, 山下 哲 2,
戸澤 譲 3, 山口 晴彦 4, 井之上 ゆき乃 4, 伏原 和久 4, 中山 亨 1, ○高橋 征司 1
（ 東北大院・工, 2 金沢大院・自科, 3 埼玉大院・理工, 4 住友ゴム工業（株））
1

15:30

2Bp10

スクアレン-ホペン環化酵素による Botryococcene の環化反応......................................................... ○金指 真菜 1, 久野 斉 1, 星野 力 2（1 デンソー, 2 新潟大院・自然）

15:42

2Bp11

Fe2+-chelate および ferric-chelate reductase を組み合わせたセスキテルペノイド合成法の開発.................................................... ○梅澤 覚 1,2, 木野 邦器 1（1 早大院・先進理工・応化, 2 長谷川香料）

15:54

2Bp12

4-メトキシサリチル酸を生成する 6-メトキシサリチル酸脱炭酸酵素の発見.......................................................................................... ○青野 陸 1, 森 弘樹 1, 原 良太郎 2, 木野 邦器 1,2（1 早大院・先進理工, 2 早大・理工総研）
休憩・接続チェック（12 分）

16:06
16:18

2Bp13

好熱性独立栄養性細菌 Hydrogenobacter thermophilus TK-6 の cysteine synthase と硫黄同化代謝........................................................................... ○亀谷 将史 1,2, 中山 宗一郎 1, 新井 博之 1,2, 石井 正治 1,2（1 東大院・農生科, 2 東大・微生物連携機構）

16:30

2Bp14

タンパク質酸化能を有する Penicillium citrinum AIU Z26-4-8 由来オキシダーゼ遺伝子のクローニン
グと異宿主による発現検討.............................. ○髙嶋 大輝 1, 前田 航 1, 土屋 高伸 1, 新谷 智子 2, 五味 勝也 2, 下飯 仁 1, 山田 美和 1
（1 岩手大院・連農, 2 東北大院・農）

16:42

2Bp15

電子伝達向上を目指した酵素分子-電極間の距離制御によるバイオデバイスの設計............................................................................. ○多喜 俊介 1, 中村 卓登 1, 高村 映一郎 1, 坂元 博昭 1,3,
里村 武範 2,3, 櫻庭 春彦 4, 大島 敏久 5, 末 信一朗 1,2,3（1 福井大学院・工・繊維, 2 福井大学院・工・生物応用化, 3 福井大学・生命セ, 4 香川大・農,
5

16:54

2Bp16

大工大・工）

分子揺動性を考慮した耐熱性酵素の配向固定による高性能バイオアノードの構築........... ○鈴木 治人 1, 高村 映一郎 1, 坂元 博昭 1,2, 里村 武範 2,3, 櫻庭 春彦 4, 大島 敏久 5, 末 信一朗 1,2,3（1 福井大院・工・繊維, 2 福井大学・ライフセ, 3 福井大学院・工・生物応用化, 4 香川大・農,
5

17:06

2Bp17

大工大・工）

酵素カスケードシステムとレドックスポリマーを用いたアミノ酸バイオ電池用アノード電極の開発.............. ○堀永 晃作 1, 里村 武範 1,2, 高村 映一郎 1, 坂元 博昭 1,2, 櫻庭 春彦 4, 大島 敏久 5, 末 信一朗 3（1 福井大院・工, 2 福井大・生命セ, 3 福井大, 4 香川大・農, 5 阪工大院・工）

17:18

2Bp18

高性能バイオデバイスに向けた部位特異的変異導入による 超好熱性アーキア由来マルチ銅オキシ
ダーゼの酸化還元電位改変........... ○高村 映一郎 1, 多喜 俊介 1, 坂元 博昭 1,3, 里村 武範 2,3, 櫻庭 春彦 4, 大島 敏久 5, 末 信一朗 1,2,3（1 福井大学院・工・繊維, 2 福井大学院・工・生物応用化, 3 福井大学・生命セ, 4 香川大・農,
5

大阪工大）

47

C 会場 B21（13:30～14:42）【バイオマス，資源，エネルギー工学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

2Cp01

Clostridium cellulovorans と Clostridium beijerinckii による温州みかん残渣からの IBE 発酵...................................................................................................... ○富田 寿男 1, 岡﨑 文美 1,2,3, 田丸 浩 1,2,3（1 三重大院・生資, 2 三重大・先端科学研支バイオインフォ, 3 三重大・スマートセルイノベ研）

13:42

2Cp02

Clostridium cellulovorans およびメタン生成菌の共培養によるシュガービートパルプからのバイオメ
タンガス生産...................................................................................................... 富田 寿男 1, ○岡﨑 文美 1,2,3, 田丸 浩 1,2,3（1 三重大院・生資, 2 三重大・先端科学研支セ・バイオインフォ,3

三重大・スマートセルイノベ研セ）

13:54

2Cp03

Enhanced methanogenesis of cellulose by addition of nanobubble water.............................................. ○Xuezhi Wang, Tian Yuan, Zhongfang Lei, Kazuya Shimizu, Zhenya Zhang

14:06

2Cp04

Efficient biomethane production from anaerobically digested ammonium-rich waste under optimal（Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba）
illumination condition........................................................................... ○Yunxin Zhu, Hanying Zheng, Nan Zhang, Yingnan Yang
（Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba）
14:18

2Cp05

雑草中の水溶性成分および非水溶性成分をそれぞれ基質としたメタン発酵における微生物相解析........................................................................................... ○松田 修平, 大槻 隆司（山梨大院・医工農）

14:30

2Cp06

河口底泥からの海洋性キチン分解菌叢の探索と VFAs 生産............................................................................................ ○脇 滉 1, 早瀬 伸樹 1, 中島田 豊 2, 喜多 晃久 1
（1 新居浜高専, 2 広島大院・統合生命科学）

C 会場 B21（14:54～17:06）【発酵生理学，発酵工学】
休憩・接続チェック（12 分）

14:42
14:54

2Cp07

Saccharomyces cerevisiae 由来のグリセロール資化性酵母の育種とグリセロールからのエタノール
発酵..... ○Zhang Kuan 1, 中西 昭仁 1,2, 軽部 征夫 1,2（1 東京工科大院・バイオニクス, 2 東京工科大・応生）

15:06

2Cp08

Quality improvement of terasi, Indonesian shrimp paste, by monitoring the microorganism composition
during controlled fermentation........................................... ○Arisa Sato 1,2, Dea Indriani Astuti 2, Sastia Prama Putri 1,2, Eiichiro Fukusaki 1（1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Biotechnol., Sch. of Life Sci. and Technol., Inst. of Technol. Bandung）

15:18

2Cp09

セルロース系バイオマスを原料とするカフェ酸発酵のためのゲノム編集による大腸菌代謝改変の作
製と培養法の検討............................ ○川口 秀夫 1, 宮崎 翔子 1, 寺本 潤 2, 西田 敬二 2, 南 博道 3, 佐塚 隆志 4, 近藤 昭彦 1,2（1 神戸大院・科技イノベ, 2 神戸大・先端バイオ工セ, 3 石川県大・生物資源研,
4名古屋大・生物機能セ）

15:30

2Cp10

発酵阻害物質に高い耐性を持つスリランカの酵母............................ ○外山 博英 1,2, Maduka Subodinee 2, 水谷 治 1,2（1 琉球大・農, 2 鹿児島大院・連農）

15:42

2Cp11

新奇キシロース資化性ラビリンチュラのキシロース代謝経路とメタボローム解析................................................................ ○林 雅弘 1, 松田 綾子 1, 長岡 綾 1,2（1 宮崎大・農, 2 林兼産業）

48

15:54

2Cp12

好熱菌プロバイオティクスを給与した豚における筋タンパク質の構成変化............................................... ○鷺 陽香 1, 高木 誠仁 2, 西内 巧 3, 宮本 浩邦 1,4,5, 佐藤 成樹 6, 児玉 浩明 1
（1 千葉大院・園芸, 2 千葉大院・融合, 3 金沢大・学際, 4 サーマス（株）, 5 理研・生命医科学,
6

休憩・接続チェック（12 分）

16:06
16:18

千葉大院・理学）2Cp13

好熱菌発酵産物の給与がブタ腸内の乳酸資化菌 Megasphaera elsdenii の有機酸代謝に与える影響............................................................................. ○板谷 かえで 1, 荒岡 亮祐 1, 宮本 浩邦 1,2,3, 児玉 浩明 1
（1 千葉大院・園芸, 2 サーマス, 3 理研・生命医科学）

16:30

2Cp14

好熱性アセトジェン Theromoanaerobacter kivui の代謝改変によるエタノール生産..................................................................... ○登木 耕陽, 佐藤 悠, 岡野 憲司, 本田 孝祐（阪大院・工）

16:42

2Cp15

有機性廃棄物の二次資源化に向けた天然菌叢とアセトジェンの共培養システムの開発........................................... ○佐藤 悠 1, 佐々木 由佳 1, 登木 耕陽 1, 岡野 憲司 1, 木村 浩之 2, 本田 孝祐 1
（1 阪大院・工, 2 静大・グリーン科技研）

16:54

2Cp16

C.necator 組換え株の化学合成独立栄養条件下での回分培養による 3-ヒドロキシ酪酸と 3-ヒドロキ
シヘキサン酸の共重合ポリエステルの CO2 からの生合成............................................................... ○鈴木 尚幸 1, 宮本 樹里 1, 折田 和泉 2, 福居 俊昭 2, 田中 賢二 1（1 近畿大・産理工, 2 東工大・生命理工）D 会場 B32（13:30～17:30）【遺伝子工学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

2Dp01

超好熱性アーキア由来キチナーゼ ChiC の細胞膜局在化に関与するアミノ酸配列の同定......................................... ○渡邉 大輔, Aslam Mehwish, 山田 将大, 金井 保, 跡見 晴幸（京大院・工）

13:42

2Dp02

超好熱性アーキア Pyrococcus chitonophagus がもつキチナーゼの遺伝学的機能解析......................................... 山田 将大, 中田 菜月, Aslam Mehwish, ○金井 保, 跡見 晴幸（京大院・工）

13:54

2Dp03

Pseudomonas sp. TB-97 株によるテレフタル酸からの有用物質生産................................................................... ○金森 拓 1, 中島 鈴佳 1, 岡村 匡浩 1, 内堀 孝博 2, 中島 敏明 1
（1 筑波大院・生命環境, 2 パナック工業株式会社）

14:06

2Dp04

コアグラーゼ陰性ブドウ球菌由来アシル化ホモセリンラクトン分解酵素の機能解析............................................. ○上村 哉生樹 1, 染谷 信孝 2, 諸星 知広 1（1 宇都宮大院・工, 2 農研機構）

14:18

2Dp05

納豆菌のポリ‐γ‐グルタミン酸生産に関与する高度に保存された Yj ｇ F/YER057 ｃ/UK114 ファ
ミリータンパク質..... ○木村 啓太郎 1, ル ティ トゥ ホン 1, 八谷 剛史 2,3, 長谷 純嵩 2, 志波 優 4, 吉川 博文 4,5, 榊原 康文 2
（1 農研機構・食品, 2 慶應大・理工, 3 岩手医大・メディカル・メガバンク, 4 東農大・応生科,
5

14:30

2Dp06

東農大・ゲノム）

ビフェニル/PCB 分解細菌 Rhodococcus wratislaviensis T301 株の色素脱色型ペルオキシダーゼの発現...................................................................... ○渡邊 崇人 1, 木村 信忠 2, 末永 光 3, 廣瀬 遵 4, 二神 泰基 5,
陶山 明子 6, 藤原 秀彦 6, 後藤 正利 7, 古川 謙介 6
（ 京大・生存研, 産総研・生物プロセス, 産総研・創薬基盤, 4 宮崎大・工, 5 鹿児島大・農,
1

2

3

6

休憩・接続チェック（12 分）

14:42
14:54

別府大・食物栄養, 7 佐賀大・農）2Dp07

D-サイクロセリン生産性放線菌のゲノムマイニング................................................................................ ○矢尾井 健人 1, 黒田 照夫 2, 森田 大地 2, 熊谷 孝則 2
（1 広大・薬, 2 広大院・医系科学）

49

15:06

2Dp08

プロモーターおよびターミネーターがビフィズス菌の遺伝子発現に与える影響........................................................................................ ○小酒井 智也 1, 下総 葉子 2, 野村 泉 3, 鈴木 徹 3（1 岐阜大院・連農, 2 岐阜大院・自科技, 3 岐阜大・応生科）

15:18

2Dp09

マクロピノサイトーシス誘起ペプチドを利用した海洋性紅色光合成細菌の新規形質転換系の開発........................................................................................... ○樋口 美栄子, 沼田 圭司（理研・環境資源）

15:30

2Dp10

Sphingomonas bisphenolicum AO1 株のビスフェノール A (BPA)分解能の不安定化評価法の構築........................... ○村上 将和 1, 仲野 育惠 1, 松村 吉信 2（1 関西大・生命生物工, 2 関西大・ORDIST）

15:42

2Dp11

放線菌線状プラスミドの接合伝達に対する ttrA の影響............................................................... ○深田 悠太 1, 大橋 沙季 1, 丸山 直也 1, 池田 治生 2, 片岡 正和 1
（1 信州大院・生命医工, 2 北里大・北里生命研）

15:54

2Dp12

休憩・接続チェック（12 分）

16:06
16:18

枯草菌を宿主とした低毒性物質で誘導可能なタンパク質発現系の開発.................................................................................................................. ○広岡 和丈（福山大・生命工）

2Dp13

ポリヒドロキシアルカン酸生産菌で機能する転写制御スイッチの確立................................................................... ○平山 歩夢 1, 折田 和泉 1, 中村 聡 1, 梅野 太輔 2, 福居 俊昭 1
（1 東工大・生命理工, 2 千葉大院・工）

16:30

2Dp14

Methylorubrum extorquens における C1 化合物代替資化経路の構築............................................... ○平林 翼 1, 折田 和泉 1, 新田 克章 2, 中村 聡 1, 福﨑 英一郎 2, 福居 俊昭 1
（1 東工大・生命理工, 2 阪大院・工）

16:42

2Dp15

枯草菌の正常株および発芽システム欠損株の混合培養系における発芽のための相補条件..... ○坂元 仁 1, 土戸 哲明 1, 古田 雅一 1,2（1 阪府大・微生物制御研究センター, 2 阪府大院・工・量子）

16:54

2Dp16

環境汚染物質依存性の生物学的封じ込めシステムの開発............................................................................................ ○石川 聖人, 飯尾 魁, 堀 克敏（名大院・工）

17:06

2Dp17

微生物細胞内 mRNA 直接検出法による遺伝子発現の可視化....................... ○堀尾 京平 1, 高橋 宏和 2, 加藤 節 1,2, 小堀 俊郎 3, 秋 庸裕 1,2, 中島田 豊 1,2, 岡村 好子 1,2（1 広島大院・先端物質, 2 広島大院・統合生命科学, 3 農研機構）

17:18

2Dp18

磁性細菌のマグネトソーム遺伝子領域の改変による磁気微粒子合成能の制御................................................................. ○新垣 篤史, 丸山 実菜, 依田 卓東, 松永 是（農工大院・工）E 会場 D12（13:30～16:30）【分類，系統，遺伝学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

2Ep01

Acer palmatum 樹皮からの未培養細菌の探索と Abditibacteriota 門に属する新規微生物の全ゲノム解析....................................................................................... ○小林 和輝, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）

13:42

2Ep02

大腸菌の実験室進化による金属イオン利用能の置換検討....................................... ○川上 了史 1, 堀内 祐貴 2, 大石 悠起子 2, 関田 美沙 2, 山口 紘武 2, 宮本 憲二 1（1 慶大・理工, 2 慶大院・理工）

13:54

2Ep03

16S rDNA 解析を用いたスサビノリ共在細菌叢の網羅的解析と地域性....................................... ○實野 佳奈 1, 井手 圭吾 1,2, 有川 浩司 3, 松永 浩子 3, 齋藤 寛 4, 竹山 春子 1,2,3,5（1 早大院・先進理工, 2 産総研 CBBD-OIL, 3 早大ナノライフ創新研, 4 東海大院, 5 先進生命動態研）

14:06

2Ep04

キノコ成分による歯周病原性細菌のバイオフィルム抑制成分の検索................................................................................................... ○阿座上 弘行 1, 飯田 亮平 1,2, 會見 忠則 3
（1 山口大院・創科・農, 2 鳥取大院・連農, 3 鳥取大・農）

50

14:18

2Ep05

ランタノイド Sm は Methylorubrum 属細菌の低栄養環境下での生育を促進させる..................................................... ○水野 洸介, 原田 雄斗, 岩本 悟志, 島田 昌也, 早川 享志, 中川 智行

14:30

2Ep06

乳酸菌の菌体脂肪酸に 10OH オクタデカン酸が出現する培養条件について.......................................................................................... ○鈴木 健一朗, 平塚 功尚, 柴野 麻由, 増子 穂,（岐阜大・院・自然科学）

宮崎 穂乃香, 茂木 太極, 中山 俊一, 門倉 利守（東農大・応生科）
休憩・接続チェック（12 分）

14:42
14:54

2Ep07

ホウレンソウのポストハーベストにおける菌叢変遷と鮮度劣化への PPFMs の関与........................................................................................ ○Wang Lun 1, 繁原 安美 2, 阪口 由佳 3, 谷 明生 4,
中野 浩平 1, 島田 昌也 2, 早川 享志 2, 中川 智行 2（ 岐阜大院・連農, 岐阜大・応生科, 岐阜大院・自然科学, 4 岡山大・資源植物科研）
1

15:06

2Ep08

2

3

エタノール発酵能の違いは種の違い？南極産担子菌酵母 Mrakia blollopis の全ゲノム解析による種の再検討........................................................................................ ○辻 雅晴 1, 石原 潤一 2, 高橋 弘喜 2, 野口 英樹 3
（1 国立極地研, 2 千葉大・医真菌研究セ, 3 データサイエンス共同利用基盤施設）

15:18

2Ep09

鰹節のかび付け工程で働く好乾性糸状菌の菌叢解析............................................................... ○中林 麗奈 1, 木村 行宏 1, 横田 仁子 2, 土居 幹治 2, 竹中 慎治 1
（1 神戸大院・農, 2 マルトモ）

15:30

2Ep10

鰹節カビ Aspergillus 属糸状菌が生産する加水分解酵素の解析.................. ○小川 千晶 1, 中林 麗奈 1, 上村 真理子 2, 木村 行宏 1, 横田 仁子 3, 土居 幹治 3, 竹中 慎治 1
（1 神戸大院・農, 2 神戸大・農, 3 マルトモ）

15:42

2Ep11

原油湧出地由来の異化的硫酸塩還元トルエン分解細菌の分離およびゲノム解析................................................................................ ○杉本 岳人, 佃 怜奈, 中村 浩平（岐阜大院・自科）

15:54

2Ep12

ジャンボファージ RSP13 と RSL28 の特殊なゲノム DNA の解析.................................................................... ○川崎 健, 大戸 駿弥, 山田 隆（広島大院・統合生命科学）

16:06

2Ep13

洗濯工程における衣類等に付着する微生物叢変動の解析と微生物細胞付着評価法の構築....................................... ○野田 浩史 1, 奥田 裕暁 1, 山中 優志 2, 冨岡 敏一 2, 脇田 克也 3, 松村 吉信 1,2,4（1 関西大院・理工, 2 関西大・化生工, 3 パナソニック・アプライアンス社, 4 関西大・ORDIST）

16:18

2Ep14

コシヒカリの頑健、大粒、早晩生同質遺伝子リソース「コシヒカリ駿河シリーズ」の開発...................................................................................................... ○富田 因則（静大・グリーン科技研）

F 会場 D23（13:30～17:18）【バイオセンシング，分析化学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

2Fp01

がん診断のための高感度で前処理不用なインタクトエクソソームセンシング.............................................................................................................. 森 貴翔, 清水 拓, 片山 航, 源 和晃,
高野 恵里, 砂山 博文, 北山 雄己哉, ○竹内 俊文（神戸大院・工）

13:42

2Fp02

新規 LC/ESI-MS/MS 定量法による 3 種の麹のエルゴチオネイン含量測定............ ○堀江 裕紀子 1,3, 後藤 綺花 2, 今村 梨子 2, 伊藤 麻里 3, 池川 繁男 4, 小川 祥二郎 1,2, 東 達也 1,2（1 東理大院・薬, 2 東理大・薬, 3 コーケン, 4 玄米酵素）

51

13:54

2Fp03

画像解析によるプローブ粒子の液中拡散挙動に基づいた MRSA DNA センサの開発........................................................................................... ○松島 雛子 1, 一木 啓志 1, 童 俞靜 2, 莊 漢聲 2,
高村 映一郎 1, 里村 武範 1, 坂元 博昭 1, 末 信一朗 1（ 福井大院・工, 2 台湾國立成功大學・生物醫學工程學系）
1

14:06

2Fp04

溶解度パラメータを NMR 記述子から予測するマテリアルズインフォマティクス戦略..................................................................................... ○黒谷 篤之 1, 柿内 俊文 2, 伊藤 研悟 1, 菊地 淳 1,3,4（1 理研・環境資源, 2 AGC 中央研究所, 3 横市院・生命医, 4 名大院・生命農学）

14:18

2Fp05

多角的分析データを用いたポリマー物性予測システムの構築........................... ○坂田 研二 1, 菊地 淳 1,2,3（1 理研・環境資源, 2 横市院・生命医, 3 名大院・生命農）

14:30

2Fp06

QCM を用いたベタイン型添加剤による ELISA の高感度化機構解析........................................................... ○三宅 子龍, 甲元 一也（甲南大院・フロンティアサイエンス）
休憩・接続チェック（12 分）

14:42
14:54

2Fp07

哺乳類嗅覚受容体発現細胞パネルによる気相中におい分子検出技術の開発と官能評価応用への展開.................................................. ○福谷 洋介 1,2, 木田 仁 2,3, Mainland Joel D 4, 養王田 正文 1, 松波 宏明 2
（1 農工大・院工・生命工, 2 デューク大・医・分子遺伝, 3 農工大・院工・機械システム,
4

15:06

2Fp08

モネル化学感覚研究所）

顕微ラマン分光法及び多変量スペクトル分解法を用いた生理活性物質 penicillin 及び avermectin の菌体内検出...................... ○堀井 俊平 1,2, 安藤 正浩 3,4, 中島 琢自 5, アショク サムエル 3, 松本 厚子 5, 高橋 洋子 5,
竹山 春子 1,2,3,6（1 早大院・先進理工, 2 産総研・CBBD-OIL, 3 早大・ナノライフ創新研, 4 JST・さきがけ,
5

15:18

2Fp09

北里大・生命科学研, 6 早大・理工総研）

微小液滴作製技術を応用したサンゴ共在微生物の高精度な単一細胞ゲノム解析技術の確立..................................................... ○西川 洋平 1,2, 細川 正人 3, 井手 圭吾 1,4, 小川 雅人 1,4, 竹山 春子 1,2,3,4（1 産総研・早大 CBBD-OIL, 2 早大・ナノライフ創新研, 3 早大・理工総研, 4 早大院・先進理工）

15:30

2Fp10

腸管組織内共生日和見細菌アルカリゲネス菌の形態変化に伴う、シトクロム c 蓄積と宿主細胞のアポトーシス誘導........................................................................ ○柴田 納央子 1,2, 國澤 純 2,3,4,5,7, 安藤 正浩 6,7, 細川 正人 8,
堀井 俊平 1,9, 細見 晃司 3, 竹山 春子 1,7,8,9, 清野 宏 2,10,11（ 早大院先進理工, 東大国際粘膜ワクチン開発研究セ, 3 医薬健栄研ワクチン・アジュバント研究セ,124

阪大院歯学, 5 神戸大院医学, 6 JST さきがけ, 7 早大ナノライフ創新研, 8 早大理工総研,
9

産総研 CBBD-OIL, 10 UCSD 医学, 11 千葉大院医学）

15:42

2Fp11

防腐作用のシングルセル解析............................................................................. ○宮原 佳子, 矢野 剛久, 久保田 浩美, 永井 智（花王）

15:54

2Fp12

結合タンパク質を用いたアスタキサンチン分離法の確立........................................................ ○八木 周和 1, 原 清敬 1,2（1 静県大院・薬食生命, 2 静県大・食栄）
休憩・接続チェック（12 分）

16:06
16:18

2Fp13

質量顕微鏡を用いたコムギ葉(Triticum aestivum)断面におけるアゾキシストロビンの経時的分布可視化法の開発................................................................... ○生田 宗一郎 1, 福﨑 英一郎 1,2, 新間 秀一 1,2（1 阪大院・工,2

阪大島津イノベーション共同研究講座）

16:30

2Fp14

質量イメージングによる組織内酵素活性可視化法の開発................................................................................ ○竹尾 映美, 福﨑 英一郎, 新間 秀一（阪大院・工）

16:42

2Fp15

グラフェン量子ドットー金ナノ粒子ーポリアニリンナノワイヤ複合体を用いた電気化学的バイオセ
ンサーによるカニクイザル糞便からのＨＥＶの検出.............................................. ○竹村 謙信 1, Dutta Chowdhury Ankan 2, 李 天成 3, 鈴木 哲朗 4, 朴 龍洙 1,2（1 静大・創科技院, 2 静大・グリーン科技研, 3 国立感染研, 4 浜医大・医・医学科）

52

16:54

2Fp16

ペプチドアレイを反応基盤とした、ミルク抗原ペプチド検出技術の開発........................................... ○久保 智里 1, 栗本 昌樹 1, 田中 祐圭 2, 越智 浩 1, 阿部 文明 1, 大河内 美奈 2
（1 森永乳業, 2 東工大・物質理工）

17:06

2Fp17

CD 型マイクロ流路を用いた食品中のサルモネラ菌迅速検出.................................................................................................................. ○久保 いづみ（創価大・理工）

G 会場 D25（13:30～15:30）【抗体工学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

2Gp01

CHO 細胞を用いたサメ由来重鎖抗体の全長発現と特性解析............................................................ ○江夏 朔, 山野-足立 範子, 古賀 雄一, 大政 健史（阪大院・工）

13:42

2Gp02

PDIa4 is responsible for the folding and assembly of antibody in CHO cell..................... ○Masafumi Yohda 1, Kei Komatsu 1, Kento Kumon 1, Mayuno Arita 1, Masayoshi Onitsuka 2,
Takeshi Omasa 3（ Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., Fac. Eng., Tokushima Univ., Grad. Sch. Eng., Osaka
1

2

3

Univ.）
13:54

2Gp03

Functional production of human antibody by the filamentous fungus Aspergillus oryzae................................ ○Hung Hiep Huynh 1, Takuya Katayama 1,2, Toshihiro Sakamoto 3, Reiko Shinkura 2,3,
Jun-ichi Maruyama 1,2（1 Dept. Biotechnol., The Univ. of Tokyo, 2 CRIIM, The Univ. of Tokyo, 3 Inst. Quant. Biosci., The Univ. ofTokyo）

14:06

2Gp04

再構成型無細胞タンパク質合成系を用いた抗体-酵素融合タンパク質(Zipbodyzyme)の効率的合成..............................................................○伊藤 玲奈 1, Almasl Alfi 1, 加藤 晃代 2, 兒島 孝明 1, 中野 秀雄 1
（1 名大院・生命農学, 2 iBody 株式会社）

14:18

2Gp05

タンパク質生産量を増大させる N 末端 SKIK ペプチドタグ配列に関する研究............................... ○古川 裕貴 1, 加藤 晃代 1,2, 中野 秀雄 1,2（1 名大院・生命農学, 2 iBody 株式会社）

14:30

2Gp06

ヒト免疫グロブリンは T 細胞受容体シグナルを抑制することで T 細胞を直接的に制御する................. ○堀 采音 1, 藤村 孝志 2, 河本 正次 2（1 広島大院・先端物質, 2 広島大院・統合生命科学）
休憩・接続チェック（12 分）

14:42
14:54

2Gp07

リポソームを用いたキンギョ免疫法による scFv 断片の取得............................................................................. 岡﨑 文美 1,3,4, 栗山 風貴子 1, 安達 優華 2, ○田丸 浩 1,3,4（1 三重大院・生資, 2 三重大・生資, 3 三重大・先端科支バイオインフォ,4

三重大・スマートセルイノベ研）

15:06

2Gp08

scFv 型抗体を発現するニワトリ B 細胞株 DT40 の樹立と利用...................................... ○岡 知里, 野田 凌太郎, 曲 正樹, 徳光 浩, 金山 直樹（岡山大院・統合科学）

15:18

2Gp09

ニワトリ B 細胞株 DT40 における scFv 型抗体の発現効率の改善...................................... ○野田 凌太郎, 岡 知里, 曲 正樹, 徳光 浩, 金山 直樹（岡山大院・統合科学）53

G 会場 D25（15:30～17:06）【セル＆ティッシュエンジニアリング】
15:30

2Gp10

間葉系幹細胞の画像品質判定におけるロバストモデル構築手法の開発...................................................................... ○竹本 悠人 1, 今井 祐太 1, 吉田 啓 1, 蟹江 慧 1, 加藤 竜司 1,2（1 名大院・創薬, 2 名大・ナノライフシステム研究所）

15:42

2Gp11

画像解析技術による浮遊系細胞の細胞形態プロファイリング
...................................................................................... ○久田 拓海 1, 藤谷 将也 1, 蟹江 慧 1, 加藤 竜司 1,2（1 名大院・創薬, 2 名大・ナノライフシステム研究所）

15:54

2Gp12

細胞形態情報解析による神経系モデル細胞の薬剤応答プロファイリング
..................................................... ○今井 祐太 1, 吉田 啓 1, 蟹江 慧 1, 飯田 円 2, 勝野 雅央 2, 加藤 竜司 1,3（1 名大院・創薬, 2 名大院・医学, 3 名大・ナノライフシステム研究所）
休憩・接続チェック（12 分）

16:06
16:18

2Gp13

がん幹細胞モデル miPS-LLCcm の細胞形態の深層学習法による解析................................................... ○杉山 友康 1, 相田 紗織 2, 西迫 栄 1, 笠井 智成 1, 佐藤 淳 1, 亀田 弘之 2
（1 東京工科大・応用生物, 2 東京工科大・コンピュータサイエンス）

16:30

2Gp14

がんの悪性度に関与するネスチンのテール領域とアクチン繊維の相互作用解析................................ ○水澤 愛衣 1, 須崎 萌 1, 山岸 彩奈 2, 長崎 晃 2, 貴嶋 紗久 3, 上田 太郎 4, 中村 史 1,2（1 農工大院・工, 2 産総研・バイオメディカル, 3 産総研・生物プロセス, 4 早大院・先進理工）

16:42

2Gp15

ナノニードルを用いた繰り返し引っ張り試験による中間径フィラメントの可動性解析................................................. ○中村 史 1,2, 須崎 萌 2, 水澤 愛衣 2, 山岸 彩奈 1, 飯嶋 益巳 3, 黒田 俊一 4（1 産総研・バイオメディカル, 2 農工大院・工, 3 東農大・応生科, 4 阪大・産研）

16:54

2Gp16

高転移性マウス乳がん細胞の浸潤機構に関わる塩素イオンチャネル Clic1 の機能解析......................................................................................... ○山岸 彩奈 1, 伊藤 文恵 2, 金 賢徹 1,3, 中村 史 1,3（1 産総研・バイオメディカル, 2 農工大, 3 農工大院・工）H 会場 D32（13:30～17:30）【醸造学，醸造工学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

2Hp01

醸造酵母からの異数性染色体株の新規選抜手法の開発................................................................... ○草場 裕貴 1, 山本 裕貴 1, 野口 英樹 2, 豊田 敦 2, 北垣 浩志 1
（1 佐賀大・農, 2 遺伝研）

13:42

2Hp02

酵母の染色体異数性が清酒醸造に与える影響と酵母育種への応用................................................................................... ○堀田 夏紀 1, 小高 敦史 1, 松村 憲吾 1, 杉山 峰崇 2,
笹野 佑 3, 原島 俊 3, 秦 洋二 1, 石田 博樹 1
（1 月桂冠・総研, 2 阪大院・工, 3 崇城大・生物生命）

13:54

2Hp03

出芽酵母における GID 複合体遺伝子の変異がリンゴ酸生成とタンパク質発現に与える影響................................................... ○根来 宏明 1, 松村 憲吾 1, 松田 史生 2, 清水 浩 2, 秦 洋二 1, 石田 博樹 1
（1 月桂冠・総研, 2 阪大院・情報）

14:06

2Hp04

清酒酵母の変異処理によるリンゴ酸高生産株の育種と醸造特性評価............. ○馬場 嵩一朗 1, 澤田 和敬 2, 永野 幸生 1,3, 木村 圭 1,4, 玉置 尚徳 1,5, 後藤 正利 1,4, 小林 元太 1,4（1 鹿児島大院・連農, 2 佐賀県工技セ, 3 佐大・分析セ, 4 佐賀大・農, 5 鹿児島大・農）

54

14:18

2Hp05

酵母において TTC 染色性に影響を及ぼす因子の探索............................................................................... ○田中 純平 1, 高須 耀子 1, 山元 翔太 1, 久保田 恵理 2,
兼崎 友 2, 門倉 利守 1, 鈴木 健一朗 1, 中山 俊一 1
（1 東農大・応生科, 2 東農大・ゲノムセ）

14:30

2Hp06

転写因子 RDS2 が清酒酵母と実験室酵母の発酵能に及ぼす影響................................................. ○大木 尭之, 桑山 翔一, 田中 純平, 門倉 利守, 鈴木 健一朗, 中山 俊一（東農大院・農）休憩・接続チェック（12 分）

14:42
14:54

2Hp07

ホップに含まれるアデノシン分解活性の発見とビール醸造への応用可能性.................................. ○太田 拓 1, 土屋 友理 1, 杉山 巧 2, 太田 惣介 1, 加藤 優 1, 今井 健夫 3, 稲留 弘乃 1
（1 キリンホールディングス（株）酒類技術研究所, 2 キリンビール（株）名古屋工場,
3

15:06

2Hp08

キリンホールディングス（株）ものづくり人材開発センター）

ホップのアデノシン分解活性を活用したプリン体オフのビール系飲料の開発.................................. ○土屋 友理 1, 太田 拓 1, 羽場 清人 2, 杉山 巧 3, 加藤 優 1, 今井 健夫 4, 稲留 弘乃 1
（1 キリンホールディングス(株)酒類技術研究所, 2 キリンビール(株)商品開発研究所,
3

15:18

2Hp09

キリンビール(株)名古屋工場, 4 キリンホールディングス(株)ものづくり人材開発センター）

革新的醸造・分析技術が示す次世代酒米で醸成した清酒の風味............................. ○小林 拓嗣 1, 岩橋 佑真 2, 小松 夕子 1, 熊崎 努 1, 水上 留以 1, 児玉 詩織 1, 劉 利雲 1,
上垣内 宏司 1, 包 紅彬 1, 大作 理文 1, 齊藤 亮太 1, 矢澤 彌 1, 髙橋 正之 1, 織田 健 1, 奥田 将生 1,
田中 淳也 3, 有馬 秀幸 3, 清野 珠美 4, 廣岡 青央 4, 岩下 和裕 1,2（1 酒総研, 2 広島大院・統合生命科学, 3 山口県産技セ, 4 京産技研）

15:30

2Hp10

協会系酵母と系統の異なる清酒酵母に見られる葉酸の高蓄積とそれを維持する機構................................ ○柴田 裕介 1, 山田 翼 1, 藤井 力 2,3, 赤尾 健 2, 五島 徹也 2, 高橋 俊成 1, 田中 伸哉 1
（1 菊正宗酒造, 2 酒総研, 3 福島大）

15:42

2Hp11

清酒酵母における老香を発生させにくい変異株の育種.......................... ○槇本 純 1, 井上 豊久 1, 池田 優理子 2, 神田 涼子 2, 磯谷 敦子 2, 藤井 力 2, 中江 貴司 1
（1 日本盛, 2 酒総研）

15:54

2Hp12

老香前駆体低生産性酵母からの自然突然変異カプロン酸エチル高生産性株の取得........................................... ○池田 優理子 1, 神田 涼子 1, 磯谷 敦子 1, 藤井 力 1, 井上 豊久 2, 中江 貴司 2
（1 酒総研, 2 日本盛）
休憩・接続チェック（12 分）

16:06
16:18

2Hp13

協会系酵母と近縁な広島 6 号酵母の特性解析及びその活用.......................................................... ○山﨑 梨沙 1,2,3, 五島 徹也 2, 大場 健司 3, 大土井 律之 3, 赤尾 健 1,2（1 酒総研, 2 広島大院・統合生命科学, 3 広島総合技術研・食品工業技術セ）

16:30

2Hp14

白神こだま酵母より分離した高い冷凍耐性を有する胞子クローンの解析................................. ○福田 まみ 1, 浅内 由佳 2, 芦崎 瑞稀 2, 柴田 友香莉 2, 高橋 慶太郎 3, 中沢 伸重 1,2（1 秋田県大院・生資, 2 秋田県大・生資, 3 秋田総食研）

16:42

2Hp15

清酒酵母育種に向けた 4-VG 非生成株の判別方法の開発と自然環境における非生成株の分布と遺伝的解析................................................................. ○奥村 真衣 1, 吉村 明浩 3, 澤井 美伯 3, 正木 和夫 3,4, 向田 潤 5,
三井 亮司 5, 島田 昌也 1,2, 早川 享志 1,2, 中川 智行 1,2（ 岐阜大院・自然科学, 岐阜大・応生科, 3 岐阜県食品科学研, 4 酒総研, 5 岡山理大・理）
1

16:54

2Hp16

2

分離酵母 AB2 および SUNF5 株の同定と醸造特性.................................................................................... ○野地 秀和 1, 本間 裕人 2, 徳田 宏晴 2, 數岡 孝幸 2
（1 東農大院・醸造, 2 東農大・醸造）

17:06

2Hp17

カプロン酸エチル高生産清酒酵母の育種と醸造特性の解析............................................................... ○大橋 正孝 1, 都築 正男 1, 清水 浩美 1, 渡辺 大輔 2, 高木 博史 2
（1 奈良産振セ・バイオ・食品グループ, 2 奈良先端大・バイオ）

55

17:18

2Hp18

ハイビスカス花から採取した泡盛酵母とその変異株の比較ゲノム解析を用いた特徴づけ............................................................... ○阿部 峻之 1, 豊川 洋一 2, 渡辺 大輔 2, 高木 博史 2, 塚原 正俊 1
（1 バイオジェット, 2 奈良先端大・バイオ）I 会場 D34（13:30～17:30）【核酸工学／糖鎖工学／脂質工学／ペプチド工学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

2Ip01

Baby Spinach アプタマーに対する三重鎖形成配列の付加による蛍光強度の増強および pH 応答性蛍光アプタマーの開発.................................. ○上野 絹子 1, 塚越 かおり 1, Porchetta Alessandro 2, Ricci Francesco 2, 池袋 一典 1
（1 農工大院・工, 2 Dept. Chemist., Univ. Rome Tor Vergata）

13:42

2Ip02

G カルテット構造による CpG ODN の免疫活性化能の向上....... ○山崎 智彦 1,2, 星 和明 1, Tu Thi Tram Anh 1,2, 塚越 かおり 3, 津川 若子 3, 早出 広司 4, 池袋 一典 3
（1 物材研・機能性材料, 2 北大院・生命科学, 3 農工大院・工,
4

13:54

2Ip03

Joint Dept. Biomed. Eng., Univ. North Carolina at Chapel Hill）

GMD-GFT 二重破壊によりフコース結合糖鎖を検出限界以下にした CHO 細胞の樹立と解析.................................................................. ○武智 大樹 1, 岩崎 将士 1, 三﨑 亮 1, 大橋 貴生 1,2, 藤山 和仁 1
（1 阪大・生工国際セ, 2 摂南大院・理工）

14:06

2Ip04

流路チップによるナノサイズダブルエマルジョンの連続生産系の構築および評価................................................................................ ○牧野 祥嗣, 佐野 七海, 伊藤 伸哉（富山県大・工）

14:18

2Ip05

ビタミンＥ疎水部構造の違いと膜相分離............................................................... ○中谷 祐将 1, 下川 直史 1, 浦野 泰臣 2, 野口 範子 2, 高木 昌宏 1
（1 北陸先端大・マテリアル, 2 同志社大・医生命システム）

14:30

2Ip06

カチオンの構造に依存した負電荷脂質膜の相分離........................................... ○永田 佳嗣 1, 引地 啓太 1, 秀瀬 涼太 2, 藤原 伸介 3, 下川 直史 1, 高木 昌宏 1
（1 北陸先端大・マテリアル, 2 神戸大院・科技イノベ, 3 関西学院大・理工）
休憩・接続チェック（12 分）

14:42
14:54

2Ip07

相模湾由来単離株 51-CS のメンブランベシクルの特性の解析...................... ○福井 瑞季 1, 倉田 淳志 2, 三好 柚紀 3, 山崎 思乃 4, 今井 友也 5, 栗原 達夫 6, 上垣 浩一 2
（1 近畿大院・農, 2 近畿大・農, 3 関西大院・理工, 4 関西大・化生工, 5 京大・生存研, 6 京大・化研）

15:06

2Ip08

大腸菌の nlpI 遺伝子が外膜小胞の生産量および特性に与える影響................................................................. ○尾島 由紘, 児波 克哉, 澤邊 朋美, 東 雅之（阪市大院・工）

15:18

2Ip09

変異導入 LEA ペプチドの発現による大腸菌の酸耐性の向上................... ○池野 慎也 1, メトワリー キャレド 1,2（1 九工大院・生体工, 2 アイン シャムス大・農）

15:30

2Ip10

光学的特性を選択可能な金ナノ粒子グリーン合成ペプチドの効率的探索..................................................... ○田中 祐圭, 林 美伶, 高橋 雄太, 大河内 美奈（東工大・物質理工）

15:42

2Ip11

爆発性芳香族化合物の簡便・迅速な検出に向けた TNT 認識ペプチド修飾量子ドットの作製............ ○児美川 拓実 1, Tamang Abiral 2, 田中 祐圭 1, Critchley Kevin 2, Evans Stephen 2, 大河内 美奈 1
（1 東工大・物質理工, 2 Sch. Phys. Astron., Univ. Leeds）

15:54

2Ip12

機能性高分子の epsilon-poly-L-lysine 修飾による細胞内送達法の確立........................................................... ○武内 大和 1, 牛丸 和乗 1, 加藤 康夫 2, 丸山 千登勢 1, 濱野 吉十 1
（1 福井県大院・生物資源, 2 富山県大・生医工研セ）

16:06

休憩・接続チェック（12 分）

56

16:18

2Ip13

生体膜透過性・水溶性の一挙改善を志向した機能性低分子化合物の oligo(beta-Lys)修飾........................................................... ○兼田 康平 1, 武内 大和 1, 加藤 康夫 2, 丸山 千登勢 1, 濱野 吉十 1
（1 福井県大院・生物資源, 2 富山県大・生医工研セ）

16:30

2Ip14

イネディフェンシンの Candida albicans に対するアポトーシス誘導効果の解析............................................................... ○小川 広大 1, 落合 秋人 1, 田中 孝明 1, 提箸 祥幸 2, 谷口 正之 1
（1 新潟大・自然研, 2 農研機構・北農研）

16:42

2Ip15

イネにおける新規な抗真菌タンパク質の探索........................................................... ○三井田 篤志 1, 落合 秋人 1, 田中 孝明 1, 提箸 祥幸 2, 谷口 正之 1
（1 新潟大・自然研, 2 農研機構・北農研）

16:54

2Ip16

ヒト iPS 細胞の未分化増殖を可能にする新規ペプチド化合物の分子進化工学的スクリーニング法による探索及び人工 FGFR アゴニストとしての機能解析.................................................................. ○佐藤 将 1, 大貫 喜嗣 1, 升井 伸治 1,2, 川上 隆史 1,3,4, 黒澤 尋 1（1 山梨大院・医工総, 2 山梨大学・発生研セ, 3 JST さきがけ, 4 MEXT 卓越研究員）

17:06

2Ip17

ペプチドアレイを利用した環状ペプチドの構造と配列の最適化.................................................................................. 小崎 一功 1, 鈴木 健弘 1, 清水 一憲 1, ○本多 裕之 1,2（1 名大院・工, 2 名大・予防早期医療創成セ）

17:18

2Ip18

ジスルフィド架橋によるヘテロ二量体ペプチド合成法の開発と細胞内機能性ペプチド探索系への応用........................ ○小崎 一功 1, 清水 一憲 1, 本多 裕之 1,2（1 名大院・工, 2 名大・予防早期医療創成セ）

J 会場 E23（13:30～17:18）【タンパク質工学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

2Jp01

新規人工タンパク質超分子 TIP60 のアセンブリ制御に向けたサブユニット間相互作用の解析............................. ○大原 直也 1, 川上 了史 2, 宮本 憲二 2（1 慶大院・理工, 2 慶大・理工・生命情報）

13:42

2Jp02

中空・多孔構造を有する人工タンパク質ナノ粒子 TIP60 の機能化......................... ○那須 英里圭 1, 川上 了史 2, 宮本 憲二 2（1 慶大院・理工, 2 慶大・理工・生命情報）

13:54

2Jp03

カイコ発現系を用いた White Spot Syndrome Virus（WSSV）抗原タンパク質の発現および評価....................................... ○中西 崇文 1, Boonyakida Jirayu 1, Xu Jian 2, 佐藤 純 3, 加藤 竜也 1,2, 朴 龍洙 1,2（1 静大・創科技院, 2 静大・グリーン科技研, 3 国立研究法人水産研究・教育機構）

14:06

2Jp04

外来タンパク質を内包するナノ粒子タンパク質発現系の構築......................................................... 石原 沙季, 立田 祐琳亜, 岡 拓二, ○平 大輔（崇城大・生物生命）

14:18

2Jp05

GroEL/GroES 複合体を利用した生細胞へのナノ粒子薬剤局所送達システムの検討....... ○根木 麻耶加 1, 依田 ひろみ 2, 小池 あゆみ 1,2（1 神奈川工大院 応用化学・バイオサイエンス,
2

14:30

2Jp06

神奈川工大 バイオメディカル研究センター）

可逆的カチオン化転写因子タンパク質の生細胞内導入における効率と経路の検討........................................................................................ ○中野 智貴 1, 周 伯揚 2, 二見 翠 2, 二見 淳一郎 1（1 岡山大院・統合科学, 2 岡山理大・工）
休憩・接続チェック（12 分）

14:42
14:54

2Jp07

自己ユビキチン化能を有する人工 RING finger の作製法............................................................................ ○宮本 和英, 中谷 有沙, 齋藤 一樹（姫路獨協大・薬）

15:06

2Jp08

YFP 断片融合抗体プローブを用いたヒストン翻訳後修飾検出系の構築................................................................. ○大室（松山） 有紀, 北口 哲也, 木村 宏, 上田 宏（東工大）

57

15:18

2Jp09

抗体の配列柔軟性を利用した部分構造移植による機能性タンパク質の創出............................................... ○阿久津 澪 1, 中澤 光 1, 二井手 哲平 1, 亀田 倫史 2, 宮田 健 3, 梅津 光央 1
（1 東北大院・工, 2 産総研・人工知能, 3 鹿児島大・農）

15:30

2Jp10

エピゲノム薬を用いた複合免疫療法における診断薬開発の基礎検討................................ ○勝河 祐希, Ahmadi Hannaneh, 本莊 知子, 二見 淳一郎（岡山大院・統合科学）

15:42

2Jp11

抗がん抗原抗体が認識するエピトープ解析とがん免疫サイクル活性化の評価................................................................................ ○吉岡 実咲 1, 本莊 知子 1, 木下 理恵 2, 二見 淳一郎 1（1 岡山大院・統合科学, 2 岡山大・医・細胞生物）

15:54

2Jp12

休憩・接続チェック（12 分）

16:06
16:18

部位特異的ビオチン化と refolding assay を組み合せた neo-antigen スクリーニング法の開発......... ○峯苫 智晴 1, 垣見 和宏 2, 二見 淳一郎 1（1 岡山大院・統合科学, 2 東大病院・免疫細胞治療）

2Jp13

触媒活性を有する新規タンパク質繊維の開発......................................................................................................... ○八木 創太 1, 赤沼 哲史 2, 山岸 明彦 3
（1 理研・生命機能, 2 早大・人間, 3 東薬大・生科）

16:30

2Jp14

量子ドットナノプローブを用いたアミロイド β オリゴマー形成阻害活性の評価法の開発............................................................................ ○髙木 翔梧, 倉賀野 正弘, 徳樂 清孝（室工大院・工）

16:42

2Jp15

自動化微量ハイスループットスクリーニングシステムによるシソ栽培品種のアミロイド β 凝集阻
害活性の詳細分析.................................. ○島森 圭弥, 倉賀野 正弘, 佐々木 里奈, 上井 幸司, 徳樂 清孝（室工大院・工）

16:54

2Jp16

ヘパリンによるアミロイド凝集促進効果に対するポリアミン由来８員環化合物の影響評価..................................................................... ○國富 理紗子 1, Pradipta Ambara R. 2, 田中 克典 2, 座古 保 1（1 愛媛大院・理工, 2 理研）

17:06

2Jp17

MIF スーパーファミリータンパク質に対する抗リウマチ薬メトトレキサートの構造・機能解析.............................. ○中垣 尊 1, 出茂 鮎美 2, 杉島 小雪 1, 面川 歩 3, 松村 洋寿 1, 尾高 雅文 1, 涌井 秀樹 1
（1 秋田大院・理工, 2 秋田大・理工, 3 秋田大院・医）ランチョンセミナー
LS2-1 株式会社林原
S1 会場 A21（12:00～12:50）

LS2-2 タカラバイオ株式会社
S4 会場

E11（12:00～12:50）

LS2-3 株式会社島津製作所
S5 会場 E21（12:00～12:50）

若手会総会・交流会／イブニングセッション
ピーチユニオン 3 階（18:00～20:00）

58

第 3 日（9 月 18 日）
太字の一般講演は今年度の生物工学学生優秀賞（飛翔賞）受賞者の発表です．
開始時間

講演番号

演

発表者氏名（所属）題○印は講演者を示す

シンポジウム・招待講演（午前の部）

S1 会場 A21（9:30～11:30）
Recent Topics on Cultivation and Measurement: New Challenges by Start-Up Companies「培養計測の最近のトピックス～スタートアップ企業による新たな取り組み～」【本部企画】《国際シンポジウム》／招待講演
はじめに........................................................................................................................................................ 児島 宏之

9:30
9:35

3S-S1a01

座長：児島 宏之

〈特別招待講演〉

Next generation bioprocess development..............................................................................................................................................○Jochen Buechs（AVT-Chair of Biochem. Eng., RWTH Aachen Univ., Germany）
座長：安原 貴臣
10:00

3S-S1a02

無細胞タンパク質合成系 -SDGs 実現の生産財として................................................................................................................ ○南 賢尚（NUProtein 株式会社）
休憩

10:25

座長：富田 悟志
10:35

3S-S1a03

High-resolution plant data for greenhouse agricultural production........ ○Kotaro Takayama 1,2, Hiroto Kitagawa 3（1 EIIRIS, Toyohashi Univ. Technol., 2 Fac. Agric., Ehime
Univ., 3 PLANT DATA Ltd.）
座長：今井 泰彦

11:00
11:25

3S-S1a04

Development of culture system using co-culture with food grade medium.......................................................................................................○Ikko Kawashima（IntegriCulture Inc.）
おわりに........................................................................................................................................................ 安原 貴臣

S2 会場 A41（9:30～11:30）
大規模な遺伝子・ゲノムを扱うツールとしての接合伝達システムの開発と展望
9:30

はじめに
........................................................................................................................................................ 板谷 光泰

59

座長：板谷 光泰
9:35

3S-S2a01

T4SS および放線菌接合伝達システムを如何に使うか.......................................................................................................... ○片岡 正和（信州大院・生命医工）

9:57

3S-S2a02

放線菌の特異な接合伝達と染色体移動.................................................................................................................. ○池田 治生（北里大・生命研）
座長：片岡 正和

10:19

3S-S2a03

大規模網羅解析への接合伝達システムの活用............................................................................................ ○森 浩禎 1,2, 藤田 愛 1,2, 片岡 正和 3, 牧 泰史 4,
田村 武幸 5, 松野 浩嗣 6, 高坂 智之 6, 山田 守 6（ 奈良先端大・データサイエンス, 奈良先端大・バイオ, 3 信州大・工, 4 大阪医大, 5 京大・化研,
1

2

6

山口大・創成科学）

10:41

3S-S2a04

接合伝達の分子機構の応用.................................................. ○金子 真也 1, 板谷 光泰 2（1 東工大・生命理工, 2 慶大・先端生命研）

11:03

3S-S2a05

ゲノム合成に必須な接合伝達系.......................................................................................................... ○板谷 光泰（慶應大学先端生命研）
おわりに........................................................................................................................................................ 板谷 光泰

11:25

S3 会場 B41（9:30～11:30）
インシリコタンパク質設計で加速するタンパク質工学・応用構造生物学
はじめに........................................................................................................................................................ 杉森 大助

9:30

座長：杉森 大助
9:32

3S-S3a01

蛍光バイオセンサーで解き明かす細胞内代謝...................................................................................................................... ○今村 博臣（京大院・生命）

9:55

3S-S3a02

人工タンパク質設計技術を用いたサメシングルドメイン抗体の高機能化.................................................................................................................... ○竹田 浩之（愛媛大・PROS）

10:18

3S-S3a03

In silico タンパク質設計を実現する分子シミュレーション手法の構築.................................................................................................................. ○原田 隆平（筑波大・計算セ）

10:41

3S-S3a04

Structure and engineering of CRISPR-Cas9................................................................................... ○Hiroshi Nishimasu（Grad. Sch. Sci., Univ. Tokyo）

11:04

3S-S3a05

演繹的学習と帰納的学習の融合:第四次革新的データマイニング法による蛋白質の人工設計....................................................................................... ○伊藤 創平, 中野 祥吾（静県大院・薬食生命）

座長：三原 康博

11:28

おわりに
........................................................................................................................................................ 三原 康博

S5 会場 E21（9:30～11:30）
生体と対話するナノ界面科学
9:30

はじめに
........................................................................................................................................................ 梅津 光央

60

座長：梅津 光央
9:32

3S-S5a01

体と対話するナノ界面科学： バイオとナノデバイスの共生、サイバー空間と生体のシームレスな会話に向けて.......................................................................................................................... ○山下 一郎（阪大院・工）座長：大河内 美奈

10:00

3S-S5a02

デバイスが理解できる言語を非天然アミノ酸として含むアプタマーの創製..................................... ○鵜澤 尊規 1,2（1 理研・開拓研究本部, 2 理研・創発物性科学研究センター）
座長：吉野 知子

10:30

3S-S5a03

細胞と対話をする足場材料による細胞機能のアクティブ制御.......................................................................................................................... ○松崎 典弥（阪大院・工）11:00

3S-S5a04

Plasmonic endoscopy for single cell interrogation........................ ○Hiroshi Uji-i 1,2（1 RIES, Hokkaido University, 2 Department of Chemistry, KU Leuven）
おわりに........................................................................................................................................................ 吉野 知子

11:28

シンポジウム（午後の部）

S2 会場 A41（13:15～15:15）
生合成工学における有用生体機能分子の次世代創製技術
はじめに.................................................................................................................................................... 丸山 千登勢

13:15

座長：荒川 賢治
13:17

3S-S2p01

抗生物質の生合成研究から見出した新規 tRNA 依存型アミド合成酵素の基質認識機構................................................................................... ○丸山 千登勢, 濱野 吉十（福井県大・生物資源）

13:40

3S-S2p02

試験管内人工生合成系で擬天然物を創る.......................................................................................................................... ○後藤 佑樹（東大院・理）

14:03

3S-S2p03

機能未知及び潜在的二次代謝遺伝子資源からの生理活性分子生産を実現する TAR Cloning............................. ○山中 一也 1, 老川 典夫 1, 濱野 吉十 2（1 関西大・化生工, 2 福井県大・生物資源）

14:26

3S-S2p04

精密解析に基づく多価不飽和脂肪酸生合成酵素の機能改変........................................................................................ ○林 祥平 1, 佐藤 康治 2, 小笠原 泰志 2, 大利 徹 2

座長：丸山 千登勢

（1 北大院・総合化学, 2 北大院・工）
14:49
15:12

3S-S2p05

制御因子・低分子シグナル分子による放線菌二次代謝の合理的人為制御.................................................................................................. ○荒川 賢治（広島大院・統合生命科学）
おわりに........................................................................................................................................................ 荒川 賢治

S3 会場 B41（13:15～15:15）
日本におけるバイオジェット燃料生産技術の最先端
13:15

はじめに
............................................................................................................................................................ 乾 将行

61

座長：乾 将行
13:20

3S-S3p01

バイオジェット燃料の普及への取り組み.............................................................................................................................. ○中島 陸博（日本航空）

13:42

3S-S3p02

微細藻類ユーグレナを活用したバイオ燃料事業化..................................................................................... ○鈴木 健吾 1,2（1 ユーグレナ, 2 理研・環境資源）

14:04

3S-S3p03

微細藻類を用いたバイオジェット燃料生産プロセスの構築............................ ○武藤 潤（ＩＨＩ ソリューション・新事業統括本部 藻類バイオ燃料グループ）
座長：鈴木 健吾

14:26

3S-S3p04

高性能噴流床ガス化と FT 合成による純バイオジェット製造パイロットプラントの研究開発........................................... ○山内 康弘 1, 篠田 克彦 1, 菱田 正志 1, 坂井 清彦 2, 小嶋 保彦 3, 水野 拓哉 4
（1 三菱日立パワーシステムズ, 2 ＪＥＲＡ, 3 東洋エンジニアリング, 4 JAXA）

14:48

3S-S3p05

100%グリーンジェット燃料の生産技術開発への挑戦............................................................................ ○乾 将行 1,2（1 RITE・バイオ, 2 奈良先端大・バイオ）
おわりに........................................................................................................................................................ 鈴木 健吾

15:10

S4 会場 E11（13:15～15:15）
ペアで紹介します，Wet と Dry の融合研究
座長：兒島 孝明
13:15

3S-S4p01

シンポジウム「ペアで紹介します，Wet と Dry の融合研究」開催趣旨.............................................................................................................. ○堀之内 貴明（理研・生命機能）

13:22

3S-S4p02

植物病原糸状菌を制御する菌類ウイルスの探索とゲノム解析の迅速化....... 水谷 行善 1, カラッサンチオ マッテオ 2, 太田 綺弥 1, 藤森 文啓 3, ○上坂 一馬 4, ○千葉 壮太郎 1（1 名大院・生命農学, 2 ボローニャ大・農環食科技, 3 名大・遺伝子, 4 東京家政大・家政）

13:49

3S-S4p03

プロトン共役型オリゴペプチド輸送体の基質多選択性解析.............................................................. ○伊藤 圭祐 1, ○河合 駿 2（1 静県大院・薬食生命, 2 住友化学）
座長：堀之内 貴明

14:16

3S-S4p04

麹菌摂取による宿主腸内細菌叢の改善および大腸炎の緩和........................................................... ○兒島 孝明 1, ○志水 元亨 2, 馬場 保徳 3, 中野 秀雄 1, 加藤 雅士 2
（1 名大院・生命農学, 2 名城大院・農, 3 石川県大・生物資源研）

14:43
15:10

3S-S4p05

集まると変わること：酵母のストレス応答，あるいは生物と物理の共同研究について....................................................................................... ○小田 有沙, ○畠山 哲央（東大院・総合文化）
おわりに........................................................................................................................................................ 兒島 孝明

一般講演（午前の部）

A 会場 A36（9:00～11:24）【バイオマス，資源，エネルギー工学】
8:48

接続チェック（12 分）

62

9:00

3Aa01

酸素ラジカル処理による植物バイオマスからのバイオエタノール生産量の改善....................................................... ○伊藤 奨 1, 酒井 杏匠 1, 伊藤 昌文 2, 堀 勝 3, 志水 元亨 1, 加藤 雅士 1
（1 名城大院・農, 2 名城大院・理工, 3 名古屋大・低温プラズマ研究セ）

9:12

3Aa02

セルロース系エタノール生産のための発酵阻害物質耐性馴養変異体における責任遺伝子変異の同定.................................................................. ○藤森 一浩 1, 小林 洋介 1,2, 佐原 健彦 1, 扇谷 悟 1, 鎌形 洋一 1
（1 産総研・生物プロセス, 2 Biomaterial in Tokyo）

9:24

3Aa03

好熱性ホモ酢酸菌 Moorella thermoacetica 代謝改変株によるリグノセルロース系バイオマスを基質とした高温エタノール発酵................................................................................. ○竹村 海生 1, Rahayu Farida 1, 岩崎 祐樹 2, 加藤 節 1,
田島 誉久 1, 青井 議輝 1, 加藤 純一 1, 中島田 豊 1（1 広島大院・統合生命科学, 2 産総研）

9:36

3Aa04

バイオマス糖化液の成分分析データからのバイオエタノール生産予測........................................................................................ ○小西 正朗, 渡辺 一樹, 立花 成我（北見工大）

9:48

3Aa05

酵母カルチャーコレクションからのバイオエタノール生産のための優良酵母の選抜と評価........................... ○荻野 千秋 1, Kahar Prihardi 1, 近藤 昭彦 2（1 神戸大・工, 2 神戸大院・科技イノベ）

10:00

3Aa06

細胞表層提示システムに適した宿主酵母の開発......................................... ○猪熊 健太郎, 北田 雄基, 蓮沼 誠久, 近藤 昭彦（神戸大院・科技イノベ）
休憩・接続チェック（12 分）

10:12
10:24

3Aa07

酵母 Saccharomyces cerevisiae へのセルラーゼ生産能の付与............................................................................ ○松崎 浩明, 渡邉 翔介, 秦野 琢之（福山大・生命工）

10:36

3Aa08

デルタロドプシンによる ATP 再生を伴う物質生産性の向上..................................... ○塩澤 優稀 1, 弘埜 陽子 2, 原 清敬 1（1 静県大院・薬食生命, 2 静県大・食栄）

10:48

3Aa09

スルファニル酸分解微生物への亜硫酸イオンの影響................................................................. ○東山 明広, 喜多 晃久, 中川 克彦, 早瀬 伸樹（新居浜高専）

11:00

3Aa10

Rhodococcus erythropolis N9T-4 株の aldA による低栄養性の付与................................................. ○加藤 弘将, 池ヶ谷 凌士, 新谷 政己, 吉田 信行（静大院・総合科技）

11:12

3Aa11

Talaromyces cellulolyticus におけるセルラーゼの発現誘導機構の解析と、その育種開発と培養手法への応用........................................................... ○矢萩 大貴 1, 吉田 エリカ 1, 深田 寛朗 1, 十倉 充範 2, 臼田 佳弘 1
（1 味の素バイオ・ファイン研, 2 味の素研究開発企画部）

B 会場 A37（9:00～11:24）【遺伝子工学】
接続チェック（12 分）

8:48
9:00

3Ba01

メタノール資化性酵母 Ogataea minuta におけるアルコールオキシダーゼ遺伝子 AOX1 の発現解析.............................................. ○横尾 岳彦 1, 吉原 瑛梨奈 1,2, 小松崎 亜紀子 1, 梅村 真理子 2, 千葉 靖典 1（1 産総研・創薬基盤, 2 東薬大・生科）

9:12

3Ba02

デルタロドプシン発現が出芽酵母の代謝に及ぼす影響....................................................................................... ○大塚 健介 1, 弘埜 陽子 2, 石井 寛子 3, 石井 純 3,
岡橋 伸幸 1, 戸谷 吉博 1, 原 清敬 2, 松田 史生 1
（ 阪大院・情報, 2 静県大・食栄, 3 神戸大院・科技イノベ）
1

9:24

3Ba03

RNA-seq による発酵阻害物質耐性酵母 KS47-1 株の耐性機構の解明............................................................... ○竹内 健人 1, 加藤 勇太 1, 荒川 知子 1, 堀内 淳一 2, 小西 正朗 3
（1 北見工大院・バイオ環境, 2 京都工繊院・分子化学, 3 北見工大・地域未来デザイン）

63

9:36

3Ba04

Pichia pastoris において分泌シグナル配列の１アミノ酸置換はタンパク質分泌生産量を劇的に増大させる...................... ○伊藤 洋一郎 1, 石上 美佐 2, 橋場 倫子 2, 中村 泰之 1, 蓮沼 誠久 1, 石井 純 1, 近藤 昭彦 1（1 神戸大院・科技イノベ, 2 高機能遺伝子デザイン技術研究組合）

9:48

3Ba05

イントロンによる発現増強を受けるルシフェラーゼコーディング領域内配列の解析.................................................................................................. ○菊田 浩希 1, 星田 尚司 1,2,3, 赤田 倫治 1,2,3（1 山口大院・創成科学・化学系, 2 山口大・中高温セ, 3 山口大・生命医工セ）

10:00

3Ba06

出芽酵母の実験室進化により導入された遺伝子変異のグリセロール資化能への影響...................................................................... ○曽根 政人 1, 高橋 駿輔 1, 河合 一輝 1, 古澤 力 2,3, 平沢 敬 1（1 東工大・生命理工, 2 理研・生命機能, 3 東大・生物普遍性）
休憩・接続チェック（12 分）

10:12
10:24

3Ba07

酵母とヒト培養細胞で扱えるプラスミドでのヒトヒストン遺伝子の解析.................................................................................................. ○小野 嵩弘 1, 星田 尚司 1,2,3, 赤田 倫治 1,2,3（1 山口大院・創成科学・化学, 2 山口大・中高温セ, 3 山口大・生命医工セ）

10:36

3Ba08

Saccharomyces cerevisiae SPY3 の高温ストレス適応機構.......................................................磯崎 日奈子 1, 山崎 真澄 1, 澤田 俊 1, 工藤 大喜 1, Devanadera Allad 2,
Grace Pait Ivy 2, Pajares Irene 2, Nayve Jr. Fidel Rey P. 2, ○杉山 峰崇 1
（ 阪大院・工, フィリピン大ロスバニョス校・国立分子生物学バイオテクノロジー研究所）
1

2

10:48

3Ba09

出芽酵母における任意領域の染色体外環状 DNA 化技術の開発................................................................. ○生田 宗一郎, 久富 歩, 笹野 佑, 田口 久貴（崇城大院・工）

11:00

3Ba10

Cloning and expressing recombinant glutamate decarboxylase (GAD) for boost of GABA production inbeer-producing yeast............................................................................................................... ○Pik Kuan Low, John Chi-Wei Lan（Biorefin. Bioprocess Eng. Lab., Dept. Chem. Eng. Mater. Sci., Coll. Eng., Yuan Ze Univ., Taiwan 32003,
R.O.C.）

11:12

3Ba11

陽性/陰性選択マーカーと蛍光タンパク質から成る 3 機能性新規融合タンパク質を用いた酵母遺伝
子スイッチの開発................................................................ ○能崎 健太 1, 冨永 将大 1, 梅野 太輔 2, 近藤 昭彦 1,3, 石井 純 1,3（1 神戸大院・科技イノベ, 2 千葉大院・工, 3 神戸大・先端バイオ工）

D 会場 B32（9:00～11:24）【生物化学工学】
接続チェック（12 分）

8:48
9:00

3Da01

芝生土壌における細菌および Bacillus subtilis の挙動解析....................................................................................... ○柴田 徹 1, 平野 皓巳 1, 鈴木 宏佳 2, 服部 新吾 3,
岩田 卓也 2, 早川 敏広 3, 荒木 希和子 1, 久保 幹 1（ 立命館大院・生命科学, 2 理研グリーン, 3 ケイアイ化成株式会社）
1

9:12

3Da02

芝生土壌における土壌成分及び細菌の解析....................................................................................... ○平野 皓巳 1, 柴田 徹 1, 鈴木 宏佳 2, 岩田 卓也 2,
早川 敏広 2, 服部 新吾 3, 荒木 希和子 1, 久保 幹 1（ 立命館大院・生命科学, 株式会社理研グリーン, 3 ケイアイ化成株式会社）
1

9:24

3Da03

2

ブタ糞から単離された優占乳酸菌 Lactobacillus amylovorus 由来の S-Layer Protein の 探索と機能性評価........................................... ○浅野 風斗 1, 吉川 翔太 1, 宮原 平 1, 大野 博司 3, 宮本 浩邦 1,2,3, 児玉 浩明 1
（1 千葉大・園芸, 2 サーマス, 3 理研・生命医科学）

64

9:36

3Da04

ウグイス糞の諸特性と細菌叢の解析とその利用.................... 藤茂登 遥香 1, ○石本 弥子 2, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大院・生命環境, 2 筑波大・生物資源）

9:48

3Da05

抗菌性物質が皮膚常在菌の生理活性に及ぼす影響の解析（第 2 報）....................................................................................... ○菊田 実花, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）

10:00

3Da06

マイクロ波（非熱効果）が微生物の生理活性に及ぼす影響の解析（第 2 報）..................................... ○松田 将典 1, 堀越 智 2, 青柳 秀紀 1（1 筑波大院・生命環境, 2 上智大・理工）

3Da07

Strategic formulation of spray dried synbiotic and kinetics study to prevent hyperphosphatemia...................................................................................................................... ○Ajeeta Anand, Hideki Aoyagi

休憩・接続チェック（12 分）

10:12
10:24

（Faculty Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba）
10:36

3Da08

模擬微小重力環境が腸内有用細菌の諸特性に及ぼす影響の解析と利用................................................................................... ○増田 亜理沙, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）

10:48

3Da09

コレラトキシン B サブユニットを利用した、機能性ペプチドの細胞小器官への送達............................................................................ 吉井 優也, 是石 真友子, ○佐藤 あやの（岡山大・工）

11:00

3Da10

昆虫細胞を用いた MERS コロナウイルス様ナノ粒子の調製........................................... 高見 佳宏 1, 町田 佑樹 1, デオ ヴィピン クマル 2, ○加藤 竜也 1,3, 朴 龍洙 1,3（1 静大院・総合科技, 2 静大・国際連携, 3 静大・グリーン科技研）

11:12

3Da11

微細藻の細胞分裂に及ぼす培養温度・光強度の周期的制御の影響............................................................. ○勝田 知尚, 森本 高章, 桑井 仁葵, 山地 秀樹（神戸大院・工）E 会場 D12（9:00～11:24）【生合成，天然物化学】
接続チェック（12 分）

8:48
9:00

3Ea01

含窒素生理活性化合物 maniwamycin の生合成経路の解析......................................... ○藤田 昂大 1, 達川 綾香 2, 岸本 拓也 2, 福本 敦 3, 安齊 洋次郎 3, 荒川 賢治 1,2（1 広島大院・統合生命科学, 2 広島大院・先端物質科学, 3 東邦大・薬）

9:12

3Ea02

放線菌 Streptomyces rochei のポリケチド抗生物質 LM の生合成に関与する P450 水酸化酵素の機能解析......................................... ○手島 愛子 1, 近藤 寿志 1, 殿川 亜未 1, 小中 勇二 1, 板倉 康浩 1, 荒川 賢治 1,2（1 広島大院・先端物質, 2 広島大院・統合生命科学）

9:24

3Ea03

ブテノライド型シグナル分子の構造多様性およびゲノムマイニングへの応用.................................................................................. ○江口 雄聡 1, 住吉 美保 2, 手島 愛子 2, 荒川 賢治 1,2（1 広島大院・統合生命科学, 2 広島大院・先端物質科学）

9:36

3Ea04

Streptomyces 属放線菌における二次代謝制御因子改変による 物質生産性プロファイルの解析..................................................... ○見崎 裕也, 岩國 美由季, 高橋 譲, 鈴木 敏弘, 木梨 陽康, 荒川 賢治

9:48

3Ea05

抗腫瘍抗生物質マイトマイシンの生合成解析............................................. ○中川 陽 1, 小笠原 泰志 2, 大利 徹 2（1 北大院・総合化学, 2 北大院・工）

10:00

3Ea06

ポリグルタミン酸生合成における新規エピメリ化反応....................................................... ○佐藤 将太 1, 重松 真由子 1, 加藤 陽菜多 1, 小笠原 泰志 2, 大利 徹 2（広島大院・統合生命科学）（1 北大院・総合化学, 2 北大院・工）10:12

休憩・接続チェック（12 分）

65

10:24

3Ea07

放線菌 Streptoalloteichus hindustanus が生産する新規カチオン性ホモポリアミノ酸の構造決定及びその抗菌活性評価........................................... ○福本 響 1, 戸口 梨那 2, 荒川 賢治 3, 濱野 吉十 4, 老川 典夫 1,2, 山中 一也 1,2（1 関西大院・理工, 2 関西大・化生工, 3 広島大院・統合生命科学, 4 福井県大・生物資源）

10:36

3Ea08

放線菌 Streptoalloteichus hindustanus に見出した新規 PLP 非依存型 Diaminobutyric acid ラセマーゼの機能解析....................................................................... ○尾崎 僚 1, 福本 響 1, 濱野 吉十 2, 老川 典夫 1, 山中 一也 1
（1 関西大院・理工, 2 福井県大・生物資源）

10:48

3Ea09

ポリ-D-ジアミノブタン酸生産放線菌 Streptoalloteichus hindustanus に見出した新規 D-ペプチド分解
酵素の同定................................................................... ○宮脇 大輝 1, 福本 響 1, 濱野 吉十 2, 老川 典夫 1, 山中 一也 1
（1 関西大院・理工, 2 福井県大・生物資源）

11:00

3Ea10

藍藻のバイオフィルム形成に関与するプトレシン合成酵素の機能解析............................................................... ○木花 将 1, 解良 康太 1, 植村 武史 2, 五十嵐 一衛 2, 魚住 信之 1
（1 東北大院・工, 2 アミンファーマ研）

11:12

3Ea11

卵菌 Saprolegnia による生理活性多価不飽和脂肪酸 Arachidonic acid 生産................................. ○高野 真希 1, 吉村 英莉 2, 星野 一宏 1（1 富山大院・理工, 2 富山大・工・生命）

F 会場 D23（9:00～10:48）【食品科学，食品工学】
接続チェック（12 分）

8:48
9:00

3Fa01

清涼飲料水中に添加した殺菌乳酸菌体の菌株判別 RNA-MLSA 法の開発.......................................................................................................... ○青山 冬樹（アサヒ飲料・技術研）

9:12

3Fa02

深海底泥由来食肉加工用プロテアーゼ生産菌の探索..................................... ○寺内 美結, 藤井 大樹, 衛藤 晋一, 飯田 章博（三菱商事ライフサイエンス）

9:24

3Fa03

家畜の腸内機能の in vivo 評価モデルとしての家畜フローラマウスの開発........................ ○宮本 浩邦 1,2,3, 須田 亙 3, 朝倉 三貴 3, 加藤 完 3, 児玉 浩明 1,2, 服部 正平 3, 大野 博司 3
（1 千葉大・園芸, 2 (株)サーマス, 3 理研・生命医科学）

9:36

3Fa04

Metabolic profiling of cocoa cake from Forastero cacao beans by GC/MS analysis............................................... ○Abu Hanifah 1, Hendy Firmanto 2, Sastia Prama Putri 1, Eiichiro Fukusaki 1（1 Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Indonesian Coffee and Cocoa Res. Inst.）

9:48

3Fa05

Untargeted GC/MS-based metabolomic approach of coffee beans obtained from different altitude andvarious post-harvest processing................................... ○Sastia Putri 1, Fitri Amalia 1,2, Yusianto 3, Pingkan Aditiawati 2, Eiichiro Fukusaki 1（1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Sch. Life. Sci. Tech., ITB,
3

10:00

3Fa06

ICCRI）

Untargeted metabolomics approach to monitor metabolite changes during pineapple ripening process............ ○Muhammad Maulana Malikul Ikram 1, Sobir Ridwani 2, Sastia Prama Putri 1, Eiichiro Fukusaki 1（1 Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Dept. Agronom. Hort. Bogor Agricultural Univ.）

10:12

3Fa07

GC/MS に基づくメタボロミクスを用いた品種と生息環境による食用エビの分類.................. ○大戸 優妃奈, Putri Safira Latifa Erlangga, Putri Sastia Prama, 福﨑 英一郎（阪大院・工）

10:24

3Fa08

Non-targeted metabolomics approach for size-based prediction of Litopenaeus vannamei (white leg shrimp)............................. ○Safira Latifa Erlangga Putri 1, Felicia Irene Saputra 2, Magdalena Lenny Situmorang 2,
Gede Suantika 2, Sastia Prama Putri 1, Eiichiro Fukusaki 1（ Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Sch. Life Sci. and Tech., Institute Teknologi Bandung）
1

66

10:36

3Fa09

Metabolomics-based research for the evaluation of post-harvest quality of white leg shrimp (Litopenaeus
vannamei) cultured in different salinity......................................................... ○Sri Hayati 1, Sastia Prama Putri 1, Julie Ekasari 2, Eiichiro Fukusaki 1（1 Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Faculty of Fisheries and Marine Sci., Bogor
Agricultural Univ）

G 会場 D25（9:00～11:24）【生体医用工学／セル＆ティッシュエンジニアリング】
接続チェック（12 分）

8:48
9:00

3Ga01

ビタミンナノエマルションの角膜細胞浸透性を利用した新規点眼薬の開発.............................................................. ○高木 昌宏 1, 三宅 深雪 2, 栗岡 昌利 3, 辻野 義雄 1,4, 下川 直史 1
（1 北陸先端大・マテリアル, 2 ライオン・先進解析科学研, 3 ライオン・薬品研, 4 岡山理大・経営）

9:12

3Ga02

Gel-in-Oil ナノエマルション開発による機能性分子の安定送達................................................................. ○井嶋 博之, 山本 惠美子, 重栖 佑次, 堺 裕輔（九大院・工）

9:24

3Ga03

共培養マイクロデバイスを搭載した微小電極アレイチップによる iPS 由来運動神経・骨格筋細胞評
価プロセスの開発.............................................................. ○古谷 太樹 1, 清水 一憲 1, 伊藤 卓治 2, 岡田 洋平 2, 本多 裕之 1,3（1 名大院・工, 2 愛知医大・神経内科, 3 名大・予防早期医療創成セ）

9:36

3Ga04

インジェクタブル金属イオン架橋コハク酸修飾キトサンハイドロゲルによる術後腹膜癒着防止効果の検討........................................................................... ○三橋 健斗 2, 戚 蟠 2, 高橋 彬 1, 太田 誠一 2, 伊藤 大知 2
（1 東大院・工, 2 東大院・医）

9:48

3Ga05

過酸化チタンナノ粒子 (PAA -TiOx )の 細胞内傷害................................................................................ ○小寺澤 翔太 1, 荻野 千秋 1, 西村 勇哉 2, 近藤 昭彦 2
（1 神戸大院・工, 2 神戸大院・科技イノベ）

10:00

3Ga06

超音波応答性とがん細胞標的性を有するナノ液滴を用いた超音波力学的がん細胞殺傷法.......................................................... ○加藤 慎也 1, 仁宮 一章 2（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術）
休憩・接続チェック（12 分）

10:12
10:24

3Ga07

アルギン酸カルシウムとゼラチンの混合ハイドロゲルの性質............................................................................................................... 森 英樹, ○原 正之（阪大院・理）

10:36

3Ga08

UV 架橋コラーゲンゲル上で共培養したマウス神経幹細胞/前駆細胞と血管内皮細胞の観察........................................................................................ ○白岩 侑馬, 森 英樹, 原 正之（阪府大院・理）

10:48

3Ga09

中皮細胞選択的接着ペプチドを利用した癒着防止シートの開発................ ○杉山 亜矢斗 1, 蟹江 慧 1, 宇都 甲一郎 2, 荏原 充宏 2, 緒方 藍歌 3, 成田 裕司 3, 加藤 竜司 1,4（1 名大院・創薬, 2 物材機構, 3 名大院・医, 4 名大・ナノライフシステム研究所）

11:00

3Ga10

高濃度スペルミンによる体細胞から多能性幹細胞への脱分化.................................................................................................. ○塩見 尚史（神戸女学院大・人間科学）

11:12

3Ga11

新規イミダゾリウム系カチオン性ラジカル重合開始剤による抗菌性樹脂の応用可能性............................................. ○辻 俊一 1, 前田 知貴 2,3, 實廣 亜希子 1, 此枝 優希 1, 小泉 英樹 1, 堀田 篤 2（1 キリン HD・基盤研, 2 慶大・理工・機械工, 3 茨大・F 応用原子科研セ）

67

H 会場 D32（9:00～11:24）【醸造学，醸造工学】
接続チェック（12 分）

8:48
9:00

3Ha01

Aspergillus luchuensis におけるフェノール酸脱炭酸酵素遺伝子破壊による 4-VG 生成への影響....... ○眞榮田 麻友美 1,2, 本底 麻綸 2, 渡嘉敷 建孝 3, 後藤 正利 1,4, 水谷 治 1,2, 上地 敬子 2, 平良 東紀 1,2（1 鹿児島大院・連農, 2 琉球大・農, 3 石川種麹店, 4 佐賀大・農）

9:12

3Ha02

麹菌 Aspergillus oryzae における新規ピリチアミン耐性マーカー遺伝子 thiI の同定とゲノム編集への応用............................................................. ○戸所 健彦, 坂東 弘樹, 小高 敦史, 堤 浩子, 秦 洋二, 石田 博樹（月桂冠・総研）

9:24

3Ha03

Mapping hazekomi on rice koji grains using β-glucuronidase expressing Aspergillus oryzae and mass
spectrometry imaging....... ○ Adinda Putri Wisman 1, Yoshihiro Tamada 2, Shuji Hirohata 2, Katsuya Gomi 3, Eiichiro Fukusaki 1,
Shuichi Shimma 1（ Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., Hakutsuru Sake Brewing Co., Ltd., Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku
12

3

Univ.）
9:36

3Ha04

黄麹菌が生産する難消化性澱粉分分解酵素の探索およびその応用................................................. ○伊藤 俊彦, 臼井 俊晴, 藤田 直子, 橋爪 克己（秋田県立大・生資科）

9:48

3Ha05

白麹菌 Aspergillus kawachii における laeA ホモログ遺伝子の機能解析................................................................. ○門岡 千尋 1, 池田 萌 2, 森 一樹 3, 奥津 果優 2, 吉﨑 由美子 1,2,
髙峯 和則 1,2, 後藤 正利 1,4, 玉置 尚徳 1,2, 二神 泰基 1,2（1 鹿児島大院・連農, 2 鹿児島大・農, 3 鹿児島高専・専攻科, 4 佐賀大・農）

10:00

3Ha06

白麹菌 Aspergillus kawachii における α-アミラーゼ AmyB の機能解析............................................................................. ○山口 正晃 1, 門岡 千尋 2, 奥津 果優 1, 吉﨑 由美子 1,2,
髙峯 和則 1,2, 後藤 正利 1,3, 玉置 尚徳 1,2, 二神 泰基 1,2（1 鹿児島大・農, 2 鹿児島大院・連農, 3 佐賀大・農）
休憩・接続チェック（12 分）

10:12
10:24

3Ha07

醤油乳酸菌 Tetragenococcus halophilus の凝集機構の解析.................................................................... ○白川 大地, 脇中 琢良, 渡部 潤（ヤマサ醤油・製造本部）

10:36

3Ha08

醤油酵母 Zygosaccharomyces rouxii の産膜制御機構の解析....................................................................................... ○茂木 亮介, 渡部 潤（ヤマサ醤油・製造本部）

10:48

3Ha09

ビール類醸造時に亜鉛濃度が酵母発酵に及ぼす影響の解析..................... ○沓掛 登志子, 高橋 沙織, 伊藤 一恵, 稲留 弘乃（キリンホールディングス・酒類研）

11:00

3Ha10

キシロースを資化する Saccharomyces cerevisiae の非組換え育種の試み........................................... ○平松 孝太郎 1, 頓名 洋 1, 今野 紗希 2, 東原 成美 2, 山崎 思乃 2, 片倉 啓雄 2
（1 関西大院・理工, 2 関西大・化生工）

11:12

3Ha11

レアメーティングにより造成した酵母の耐熱性とエタノール耐性の評価........................................................................................ ○高橋 葵 1, 海道 直生 1, 山崎 思乃 2, 片倉 啓雄 2
（1 関西大院・理工, 2 関西大・化生工）

I 会場 D34（9:00～11:24）【生体情報工学，バイオインフォマティクス／システムバイオロジー】
8:48

接続チェック（12 分）

68

9:00

3Ia01

基質酵素反応予測のための 機械学習に基づく予測モデルの構築方法の探索と評価.............................................................. ○渡邉 直暉 1, 村田 昌浩 2, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 3, 荒木 通啓 2,3（1 神戸大院・工, 2 京大院・医, 3 神戸大院・科技イノベ）

9:12

3Ia02

データ・マイニングを駆使した糸状菌由来転写因子の結合配列環境と発現応答の関連性の解析................................................................... ○岡 大椰 1, 兒島 孝明 1, 井原 邦夫 2, 小林 哲夫 1, 中野 秀雄 1
（1 名大院・生命農学, 2 名大・遺伝子解析施設）

9:24

3Ia03

転写制御ネットワーク網羅的解析技術を用いたイネ側根メリステムサイズの 調節機構の解明.................................................................................... ○安福 航希 1, 兒島 孝明 1, 犬飼 義明 2, 中野 秀雄 1
（1 名大院・生命農学, 2 名大・農学国際セ）

9:36

3Ia04

大腸菌アンモニア輸送-同化ネットワークの定量的動力学モデルの構築......................................................... ○前田 和勲 1, Westerhoff Hans V. 2,3,4, 倉田 博之 1, Boogerd Fred C. 2
（1 九工大, 2 VU Univ. Amsterdam, 3 Univ. Manchester, 4 Univ. Amsterdam）

9:48

3Ia05

FBA シミュレーションによる単波長光照射下におけるシアノバクテリアの光合成電子伝達経路のフラックス状態の解析................................................................. ○豊島 正和, 山本 千晶, 戸谷 吉博, 清水 浩（阪大院・情報）

10:00

3Ia06

休憩・接続チェック（12 分）

10:12
10:24

ボトムアップジェネティクスによる生命現象のハイスループット再構成............................................................................................ ○中原 航, 青木 航, 植田 充美（京大院・農）3Ia07

ディープラーニングによるヒト・ミトコンドリア DNA の分類と解析........................................................................................ ○三宅 淳 1, 馬場 俊輔 1, 中村 隼雄 1, 新岡 宏彦 2
（1 大阪大学・国際医工情報センター, 2 大阪大学・データビリティーフロンティア機構）

10:36

3Ia08

ホログラフィック顕微鏡から得られる画像情報を活用した細胞解析...................... ○岡田 光加 1, 山川 倫誉 1, 澤田 隆二 1,4, 今井 祐太 2, 岡田 真衣 2, 江連 徹 1, 加藤 竜司 2,3（1 島津製作所, 2 名大院・創薬, 3 名大・ナノライフシステム研究所,
4

10:48

3Ia09

パーソル パナソニック HR パートナーズ株式会社）

微生物による物質生産のための文献検索支援ツールの開発...................... ○山田 洋平 1, 宮澤 せいは 2, 細山 哲 2, 梶原 茂樹 1, 飯田 順子 1, 川﨑 浩子 2, 白井 智量 3
（1 島津製作所, 2 NITE・NBRC, 3 理研・CSRS）

11:00

3Ia10

動物の表現型材料として捉える体毛の物性特徴抽出............................................................................................................. ○塚本 楓 1, 坂田 研二 2, 菊地 淳 1,2,3（1 横市大院・生命医, 2 理研・環境資源, 3 名大院・生命農学）

11:12

3Ia11

自家蛍光シグネチャーに基づく新規スクリーニング技術の開発: 酵母の油脂生産性を一細胞レベルで評価する.................. ○平山 智弘 1, 八幡 志央美 2, 高部 響介 2, 風間 春香 3, 高久 洋暁 3, 野村 暢彦 2,4, 八幡 穣 2,4（1 筑波大院・生命環境, 2 筑波大・生命環境系, 3 新潟薬大・応生科,
4

微生物サステイナビリティ研究センター）

J 会場 E23（9:00～11:24）【環境工学，廃水処理技術】
接続チェック（12 分）

8:48
9:00

3Ja01

Self-Growth Inhibiting Mechanism of Comamonas testosteroni R2 grown on phenol................... ○JABIR Mohd 1,2, Tomoka Nishimura 1, Ayaka Minoura 1, Kenshi Suzuki 1, Masahiro Honjo 1,
Kensei Masuda 1, Yosuke Tashiro 1,3, Hiroyuki Futamata 1,3,4（1 Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 2 Innov. Cent. Agric. Adv. Bioprocess, Univ. Technol. Malaysia,
3Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 4 Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.）

69

9:12

3Ja02

Resource-competitive microbes can stably coexist by flexible metabolic network in a synthetic microbial
ecosystem....................... ○ Fatma Azwani 1,2, Kenshi Suzuki 2, Masahiro Honjo 2, Kensei Masuda 3, Yasuhisa Saito 4,
Yosuke Tashiro 3, Hiroyuki Futamata 2,3,5（1 Inst. Tropical Agric. Food Security., Univ. Putra Malaysia., 2 Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ.,
3

Dept. Appl. Chem. Biochem. Eng. Grad. Sch. Sci. and Technol., Shizuoka Univ., 4 Dept. Mat., Shimane
Univ., 5 Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.）

9:24

3Ja03

モデル微生物生態系における時空間的不均一性と生態系機能維持機構............................................................... ○鈴木 研志 1, 本荘 雅宏 1, ファティマ アズワニ 2, 増田 健誠 3,
ジャビエル モハマド 1, 天野 光喜 4, 田代 陽介 3, 二又 裕之 1,3,5（1 静大・創科技院, 2 Universiti Putra Malaysia, Inst. Tropical Agric., 3 静大院・総合科技, 4 静大・工,
5

9:36

3Ja04

静大・グリーン科技研）

特異な自家熱型高温好気消化プロセスにおける劇的な細菌群集構造の変遷機構の解明..................................................................................... ○田代 幸寛, Cheng Huijun, 河野 祥尚, 朝倉 侑弥,
神田 晃佑, 福井 諒, 奥川 友紀, 酒井 謙二（九大院・農）

9:48

3Ja05

微細藻類 Acutodesmus acminatus におけるユウロピウム吸着に及ぼす代謝機能の影響................................................................................... ○古橋 康弘 1, 本多 了 2, 原-山村 宏江 2, 長谷川 浩 2（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・理工）

10:00

3Ja06

Nutrients removal and auto-aggregation capabilities of two microalgal strains isolated from algal-bacterial
aerobic granular sludge................................................○Marjangul Nuramkhaan, Zhongfang Lei, Kazuya Shimizu, Zhenya Zhang（Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba）
休憩・接続チェック（12 分）

10:12
10:24

3Ja07

Methylobacterium sp. FD1 株のホルムアルデヒド代謝系酵素遺伝子とホルムアルデヒド培地での発現........................................................................................ ○島本 真奈, 米光 裕, 楠部 真崇（和歌山高専）

10:36

3Ja08

Methylobacterium sp. FD1 株由来ホルムアルデヒドジスムターゼ (Fdm1) の特性解析............................................................................................ ○井元 誠志, 米光 裕, 岸本 昇（和歌山高専）

10:48

3Ja09

対流型水処理装置における窒素浄化能の向上................................................................ ○早坂 洋輝, 荒木 希和子, 久保 幹（立命館大院・生命科学）

11:00

3Ja10

リン酸基修飾酵母による鉱物化誘導の解析........................................... ○吉田 真実 1, 木原 摩耶 1, 尾島 由紘 1, 五十嵐 幸一 1, 吉田 朋子 2, 東 雅之 1
（1 阪市大院・工, 2 阪市大・複合先端研究機構）

11:12

3Ja11

Rhodotorula mucilaginosa が形成するバイオフィルムを用いた水溶液中からの金属回収........................................................................................ ○菅 道哉, 尾島 由紘, 東 雅之（阪市大院・工）一般講演（午後の部）

A 会場 A36（13:30～15:18）【酵素学，酵素工学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

3Ap01

Comparative enzymological characterization of l-asparaginases from lactic acid bacteria................○Kodchakorn Phetsri, Makoto Furukawa, Risa Yamashiro, Yuka Kawamura, Yosuke Toyotake,
Mamoru Wakayama（Coll. Life Sci.,Dept. Biotechnol.,Ritsumeikan Univ.）

70

13:42

3Ap02

アラレマイシン合成酵素から 5-アミノレブリン酸合成酵素 ALAS への機能改変......................................................... ○川口 潤, 森 ひかる, 岩井 伯隆, 和地 正明（東工大・生命理工）

13:54

3Ap03

ビフィズス菌の含硫アミノ酸代謝に関与する C-S リアーゼの解析.......................................................... ○黒瀧 空, 松本 菜々恵, 吹谷 智, 横田 篤, 和田 大（北大院・農）

14:06

3Ap04

Sulfolobus tokodii 由来色素依存性 L-乳酸脱水素酵素の大腸菌を宿主とした発現系の構築............................................................ ○宇野 紘平 1, 里村 武範 1,2, 黒沢 則夫 3, 櫻庭 春彦 4, 末 信一朗 1,2（1 福井大院・工, 2 福井大ライフ, 3 創価大, 4 香川大・農）

14:18

3Ap05

分岐鎖ポリアミンが超好熱菌の RNA ポリメラーゼ複合体に及ぼす影響........................................... ○福田 萌子 1, 家森 優佳 1, 濱川 匡史 1, 秀瀬 涼太 2, 福田 青郎 1, 藤原 伸介 1
（1 関西学院大・理工, 2 神戸大院・科技イノベ）

14:30

3Ap06

好塩性アーキアにおけるグリコールアルデヒド代謝酵素の同定と解析........................................................................................ ○佐藤 喬章 1, 平田 晃右 1, 南 瞭子 2, 跡見 晴幸 1
（1 京大院・工, 2 京大・工）

14:42

3Ap07

PL14 ファミリーに属する新規ウルバンリアーゼ................................................................. 佐藤 嶺, 小林 慎太郎, 籾山 健太, ○大西 浩平（高知大・農）

14:54

3Ap08

生細胞内分子クラウディング環境の再構成への試み........................................................................................ ○田中 遼治, 青木 航, 植田 充美（京大院・農）

15:06

3Ap09

ラン藻 Synechocystis sp. PCC 6803 の酵素フマラーゼ(FumC)の生化学解析................................................................................................... ○片山 徳賢, 小山内 崇（明治大院・農）B 会場 A37（13:30～15:18）【酵素学，酵素工学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

3Bp01

Domain structure and function of α-1,3-Glucanase from Streptomyces thermodiastaticus HF3-3.............................. ○Niphawan Panti 1, Vipavee Cherdvorapong 1, Wassana Suyotha 2, Kazuyoshi Takagi 3,
Shigekazu Yano 4, Yosuke Toyotake 1, Mamoru Wakayama 1（ Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., Dept. Indust Biotechnol., Fac. Agro Indust., Prince of Songkla
1

2

Univ., 3 Dept. Applied Chem., Fac. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 4 Dept. Biochem. Engineer., Grad. Sci
Engineer., Yamagata Univ.）
13:42

3Bp02

Characterization of catalytic α-1,3-glucanase isozymes from Paenibacillus glycanilyticus FH11 by using
Brevibacillus system; Essential for suppression and degradation of Streptococcus mutans biofilms........................ ○Rattanaporn Intuy 1, Takao Hibi 2, Takafumi Itoh 2, Wassana Suyotha 3, Shigekazu Yano 4,
Mamoru Wakayama 1（1 Coll. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2 Dept. Biosci. Fukui Prefectural Univ., 3 Dept. Indus. Biotech. Fac.
Agro-indus. Prince of Songkla Univ., 4 Grad. Sch. Sci. Eng., Yamagata Univ.）

13:54

3Bp03

Spirochaeta thermophila 由来 β-1,3 オリゴグルカンホスホリラーゼの諸性質......................................................... ○藤野 早瑛, 谷 修治, 炭谷 順一, 川口 剛司（阪府大院・生環科）

14:06

3Bp04

麹菌 Aspergillus oryzae が生産するヘミセルラーゼの協調的作用................................................................................... ○松沢 智彦, 矢追 克郎（産総研・生物プロセス）

14:18

3Bp05

Talaromyces cellulolyticus 由来グルクロノキシラナーゼの機能解析........................................ ○中道 優介, Fouquet Thierry, 伊藤 祥太郎, 渡邊 真宏, 松鹿 昭則, 井上 宏之

14:30

3Bp06

好冷性海洋細菌 Psychroflexus torquis 由来 β-1,3-キシラナーゼの酵素化学的諸性質........................ ○谷口 瑞季 1, 工藤 基徳 2, 荻野 千秋 3, 近藤 昭彦 2,3, 田丸 浩 1, 青木 恭彦 4, 岡﨑 文美 1

（産総研・機能化学）（1 三重大院・生資, 2 神戸大院・科技イノベ, 3 神戸大院・工, 4 三重大院・地域イノベ）

71

14:42

3Bp07

κ-カラギナーゼ生産菌の分離およびその酵素の性質...................................... ○倉掛 昌裕, 石本 圭亮, 山岡 美桜, 筒井 莊周, 長岡 洋大（福山大・生命工）

14:54

3Bp08

糸状菌 Aspergillus nidulans がペクチン応答的に生産する細胞外酵素の解析............................................................................... ○木島 尚輝 1, 山口 愛彩 1, 大堀 沙貴子 1, 鈴木 裕満 1,
高須賀 太一 2, 堀 千明 3, 志水 元亨 1, 加藤 雅士 1
（1 名城大院・農, 2 北大院・農, 3 北大院・工）

15:06

3Bp09

微生物由来耐熱性 β-アミラーゼの性質と X 線結晶構造解析...................................... ○田中 真奈, 西村 重徳, 谷 修治, 炭谷 順一, 川口 剛司（阪府大院・生環科）

C 会場 B21（13:30～14:42）【抗体工学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

3Cp01

天然構造特異的認識モノクローナル抗体の作製とその評価................................................................................ ○磯﨑 勇志, 湊元 幹太, 冨田 昌弘（三重大院・工）

13:42

3Cp02

抗体断片の熱安定性向上を目的としたバイオ情報を活用したライブラリーデザインサイクルの提案...................................... ○服部 修平, 本田 亜由美, 二井手 哲平, 中澤 光, 梅津 光央（東北大院・工）

13:54

3Cp03

DlagArt 法を用いた T-cell recruiting 抗体取得のための迅速確実スクリーニング............................................................. 杉山 在生人, ○中澤 光, 伊藤 智之, 梅津 光央（東北大院・工）

14:06

3Cp04

機能的ナノボディ探索に向けた酵母表層提示システムの最適化................................................. ○梶原 果穂 1,2, 青木 航 1,2, 植田 充美 1,2（1 京大院・農, 2 JST・CREST）

14:18

3Cp05

ペプチドバーコードを付加した抗体の結合能の定量評価............................. ○松崎 友星 1,2, 青木 航 1,2, 植田 充美 1,2（1 京大院・農・応用生命, 2 JST・CREST）

14:30

3Cp06

アルカリフォスファターゼ融合 scFv を用いたモノクローナル抗体樹立...................................... ○加藤 三恵子 1, 羽生 義郎 2（1 バイオピーク, 2 産総研・バイオメディカル）

D 会場 B32（13:30～14:54）【生物化学工学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

3Dp01

超音波処理を用いて低分子化した Schizophyllan の抗アレルギー活性............................................................ ○湯浅 凌我, 高野 真希, 星野 一宏（富山大院・理工・生命工）

13:42

3Dp02

カチオン性ペプチド Poly(ε-L-lysine) のカルボジイミド架橋反応による修飾： 構造解析および抗菌性分散剤としての特性評価............................................................................... ○武内 正輝, 竹原 宗範（滋県大院・工・材料科学）

13:54

3Dp03

N-アシル化ポリ(ε-L-リシン)誘導体の合成と抗菌活性の評価....................................................... ○吉田 修 1, 松井 旺大 1, 永田 智 1, 竹原 宗範 1, 野村 亘 2, 井上 善晴 2
（1 滋県大院・工・材料科学, 2 京大院・農・応用生命）

14:06

3Dp04

Enterococcus sp.の生産するバクテリオシン........................................................................... ○竹内 諒, 西野 智彦（東京工科大院・バイオニクス）

14:18

3Dp05

低濃度オゾン水の生成と殺菌効果の評価............................................................................................ 松郷 誠一 1, ○滝口 昇 2, 平野 一哉 2, 靜 良治 3
（1 金沢大・VBL, 2 金沢大・理工, 3 レネロファーマ（株））

72

14:30

3Dp06

天然物由来成分による皮膚常在菌の増殖への影響................................................................................ ○多賀 直彦, 本脇 那々子, 石黒 悠生（東海大・農）

14:42

3Dp07

粉末消石灰の「待ち受け消毒」条件下における消毒効果の評価............................................................. ○松崎 慎史, 上井 幸司, 山中 真也, 徳樂 清孝（室工大院・工）E 会場 D12（13:30～15:18）【生合成，天然物化学／有機化学，高分子化学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

3Ep01

糸状菌シトクロム P450 の潜在機能を活用した トリテルペノイド生合成............................................. ○大園 昂貴 1, 北岡 卓也 2, 一瀬 博文 2（1 九大院・生資環, 2 九大院・農）

13:42

3Ep02

担子菌が有するセスキテルペン合成酵素の機能解明と利用.................................................................................... ○増永 夏輝 1, 筌場 将太 1, 北岡 卓也 2, 一瀬 博文 2（1 九大院・生資環, 2 九大院・農）

13:54

3Ep03

褐色腐朽担子菌 Postia placenta のシトクロム P450 を利用したプロトイルデン誘導体の合成............................................. ○木村 紘也 1, 北岡 卓也 2, 一瀬 博文 2（1 九大院・生資環, 2 九大院・農）

14:06

3Ep04

ナギラクトン E とアネトールの併用によって生じる相乗的抗真菌メカニズム.................................................................. ○上田 裕貴 1, 山口 良弘 1, 荻田 亮 1,2, 田中 俊雄 1, 藤田 憲一 1（1 阪市大院・理, 2 阪市大・健康研セ）

14:18

3Ep05

梨幼果の水およびエタノール抽出成分が出芽酵母の寿命延長およびその関連遺伝子の発現に及ぼす影響.......... ○村田 和加惠 1,2, 長谷川 真梨菜 1, 藤井 雄三 1, 藤田 憲一 2, 山口 良弘 2, 田中 俊雄 2, 荻田 亮 2,3（1 米子高専, 2 阪市大院・理, 3 阪市大・健康研セ）

14:30

3Ep06

線虫を用いた Candida glabrata 感染症のハイスループットな解析系の開発............................................................... ○竹葉 惇貴 1, 箕田 康一 1, 前田 淳史 2, 水野 貴之 1, 文谷 政憲 1
（1 徳島文理大院・工, 2 徳島文理大・理工）

14:42

3Ep07

Aspergillus sp. S17-5 の産生するヒドロキシヘキシルイタコン酸の構造解析と生理活性評価........................................... ○野村 友佑 1, 佐野 芽生 1, 小原 仁実 1, 和田 一仁 2, 松本 圭司 2, 麻生 祐司 1
（1 京都工繊大院・工芸科学, 2 (株)カネカ・R&B 企画部）

14:54

3Ep08

Concentration of chitosan-like polysaccharide from the cultures of Citrobacter spp. and its crystalline nano/microfiber formation.
..................................................................................... ○Priyanka Baranwal, Seiji Negoro, Masahiro Takeo（Dept. Appl. Chem., Grad. Sch. Eng., Univ. Hyogo）

15:06

3Ep09

ベタイン型添加剤による酵素活性化と水和分子間相互作用の相関........................................................... ○青木 拓真, 甲元 一也（甲南大院・フロンティアサイエンス）

F 会場 D23（13:30～14:54）【センサー，計測工学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

3Fp01

改変型ストレプトリジン O を用いた ASO 試薬の調製方法に関する開発............................................................................. ○角田 洋輔, 北澤 宏明, 川井 淳, 岸本 高英（東洋紡）

73

13:42

3Fp02

Quantification of intracellular crowding level in Bacillus subtilis................................................................................. ○Yuki Kitahara, Enno Oldewurtel, Sven van Teeffelen

13:54

3Fp03

A plant microbial fuel cell based biosensor for the indoor greenA plant microbial fuel cell based sensor for（Dept. Microbiology, Pasteur Inst.）
the indoor green plants monitoring plants monitoring...... ○Ji Eun Kim 1, Tae Hang Yoon 1, Hak Jin Song 1, Wu-Young Jeong 1, Yunjeong Yang 1, Eun Bin Lee 1,
Kwang Jin Kim 2, Ho Hyun Kim 3, Hyung Joo Kim 1（ Dept. Biological Eng., Konkuk Univ., Urban Agric. Res. Div., NIHHS, Rural Development
12

Administration, 3 Dept. Integr. Environ. Syst., Pyeongtaek Univ.）
14:06

3Fp04

Monitoring of an enzymatic reaction using broadband coherent anti-stokes Raman spectroscopy.
........................................................................ ○Jeffrey Harmon, Ryo Imai, Naoko Senda, Tomoyuki Sakai（Hitachi Ltd., Res. and Dev. Group - Bio. Syst. Res. dept.）

14:18

3Fp05

A biosensor for Influenza virus detection, controlling distance dependent LSPR between AuNPs and
CdZnSeS quantum dots............................... ○Fahmida Nasrin 1, Ankan Dutta Chowdhury 2, Kenshin Takemura 1, Enoch Y. Park 1,2（1 Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 2 Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.）

14:30

3Fp06

Controlling Size, Concentration and Distance of Surface Plasmon Resonance, Application of Virus
Detection by LSPR Regulated Biosensor............................... ○Ankan Dutta Chowdhury 1, Fahmida Nasrin 2, Kenshin Takemura 2, Enoch Y. Park 1,2（1 Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2 Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ.）

14:42

3Fp07

Fluorescent-labeled liposomal amplified biosensor for the ultrasensitive detection of virus....................................................................... ○Sabrina Sharmin, Ankan Dutta Chowdhury, Enoch Y. Park
（Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.）

G 会場 D25（13:30～15:18）【セル＆ティッシュエンジニアリング】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

3Gp01

Cre 組換え酵素を用いたミニサークル DNA ベクター調製法の開発...................................................................... ○久野 晶生 1, 河邉 佳典 1, 羽田 毅 1, 井藤 彰 1,2, 上平 正道 1
（1 九大院・工, 2 名大院・工）

13:42

3Gp02

温熱誘導型遺伝子発現システムの遺伝子発現挙動解析....................................... ○波多江 有輝 1, 井藤 彰 1,2, 増本 新也 1, 小野 章彦 3, 河邉 佳典 1, 上平 正道 1,3（1 九大院・工, 2 名大院・工, 3 九大院・シス生科）

13:54

3Gp03

ニワトリシアル酸転移酵素の解析とインフルエンザワクチン生産効率化への応用........................................... ○金岡 英徳 1, 加藤 万貴 1, 牧田 芳隆 1, 佐野 観月 1, 飯島 信司 2, 西島 謙一 1（1 名大院・工, 2 愛工大・工）

14:06

3Gp04

ニワトリ始原生殖細胞の分化・培養に関わるサイトカインの解析................ 奥嵜 雄也 1, 萩原 遥太 1, 中山 裕貴 1, 村上 晴太郎 1, 飯島 信司 1,2, 金岡 英徳 1, ○西島 謙一 1（1 名大院・工, 2 愛工大・工）

14:18

3Gp05

細胞死受容体を利用した結合部位特異的抗体選択系の構築....................................................................................................... ○河原 正浩, 江口 晃弘（東大院・工）

14:30

3Gp06

バイオ医薬品生産のためのチャイニーズハムスター腎臓組織由来細胞株の構築..................................................................................... ○河邉 佳典 1,2, 巖 流征 1, 山中 寛子 1, 上平 正道 1,2（1 九大院・工, 2 次世代バイオ医薬品製造技術研究組合（MAB 組合））

74

14:42

3Gp07

医療タンパク質の高生産化に向けたチャイニーズハムスター卵巣細胞の改変...................................................................................... ○嶋田 順太 1, 三﨑 亮 1, 大橋 貴生 1,2, 藤山 和仁 1
（1 阪大・生工国際セ, 2 摂南大院・理工）

14:54

3Gp08

HCP 混入リスクの低減を目的とした Anxa2、Ctsd ノックアウト CHO 細胞株の樹立.................................................... ○福田 展雄, 千賀 由佳子, 本田 真也（産総研・バイオメディカル）

15:06

3Gp09

抗体医薬品生産細胞の高度化を目指した高機能化因子迅速同定システムの開発........................................................ ○鬼塚 正義 1,2, 嶋津 敦子 2, 天羽 宏枝 2（1 徳島大院・社会産理工,2

次世代バイオ医薬品製造技術研究組合）

H 会場 D32（13:30～15:18）【培養工学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

3Hp01

ITO 電極システムと試料の前処理を活用した新規微生物培養化法の開発............................................. ○名取 暁 1, 小山 純弘 2, 青柳 秀紀 1（1 筑波大院・生命環境, 2 エイブル）

13:42

3Hp02

腸上皮細胞と腸内細菌の共培養法の開発........................................................................................... ○遠藤 輪, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）

13:54

3Hp03

Silver nanoparticles biosynthesis from extracellular pigment of Talaromyces purpurogenus and theirbiomedical applications..............................................................................○Sharad Bhatnagar 1, Toshiro Kobori 1,2, Hideki Aoyagi 1（1 Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2 Food Res. Inst., Natl. Agric. Food Res. Org., Tsukuba）

14:06

3Hp04

生体物質付着抑制材 prevelex®は細胞増殖因子の非特異的付着を抑制し効率的な細胞培養を可能とする.................................................. ○中嶋 宏之, 安部 菜月, 鈴木 康平, 広井 佳臣, 西野 泰斗（日産化学）

14:18

3Hp05

吸着剤を用いた培地再生方法の試み....................................... ○北川 文彦 1, 菊池 晴菜子 2, 近藤 昌幸 1, 神保 陽一 1, 亀田 知人 2, 吉岡 敏明 2
（1 日機装・技術開発研, 2 東北大院・環境）

14:30

3Hp06

複雑な流体環境は単球の生理的機能を亢進する............................................................... ○小田 彰恭 1, 池田 光悦 1, 高橋 美裕 1, 野辺 善仁 2, 村松 和明 1
（1 電機大院 ・理工, 2 大洋技研）

14:42

3Hp07

回転浮遊培養におけるヒト iPS 細胞集塊挙動の速度論的解釈......... ○橋田 礼博 1, 植村 壽公 2, 紀ノ岡 正博 1（1 阪大院・工・生命先端, 2 阪大院・工・精科応物）

14:54

3Hp08

ヒト人工多能性幹細胞の無菌閉鎖系における塑性流体を用いた 1 L 規模の培養工程の構築.................................................................................... ○長谷 洸輝, 山本 陸, 紀ノ岡 正博（阪大院・工）

15:06

3Hp09

ヒト iPS 細胞培養における播種密度が分化ポテンシャルに与える影響.................................................................................... ○金 美海, 秋山 真一, 紀ノ岡 正博（阪大院・工）I 会場 D34（13:30～15:18）【発酵生理学，発酵工学】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

3Ip01

ソルビトールストレスが酵母 OC-2 株の脂肪酸構成に与える影響.............................................................................................................. ○三木 健夫（山梨大院・医工総）

75

13:42

3Ip02

有機溶媒に対する酵母の応答：キシレンによる酸化的ストレスと翻訳抑制の惹起.................................................................................. 河合 孝朗 1, 芳本 奈々 1, 吉田 雅偲 2, ○井沢 真吾 1,2（1 京工繊大院・工芸科学, 2 京工繊大・工芸科学）

13:54

3Ip03

出芽酵母における自然発生型の新規マルチストレス耐性変異株の分離と解析....................................... ○田中 桃未 1, 中川 洋史 2, 小林 日花梨 1, 小久保 晋 2, 山村 英樹 2, 早川 正幸 2
（1 山梨大院・医工総, 2 山梨大院・総研部）

14:06

3Ip04

Komagataeibacter medellinensis NBRC3288 の高温育種株の耐熱性メカニズム............................................................................... ○水町 優希 2, 小田 みすず 2, 伊藤 光平 2, 松本 奈実 2,
松谷 峰之介 2, 片岡 尚也 1,2,3, 藥師 寿治 1,2,3, 松下 一信 1,2,3（1 山口大・農, 2 山口大院・医系, 3 中高温微セ）

14:18

3Ip05

酢酸菌 Acetobacter pasteurianus NBRC3283 株における酸化ストレス応答因子 Dps の機能解析............................................... ○小林 聖弥 1, 鈴木 敏弘 1, 宮平 響子 1, 勝木 浩平 1, 岸 幹也 2, 石川 森夫 1
（1 東京農大応生科・醸造, 2 Mizkan Holdings・中研）

14:30

3Ip06

Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 における spo0A 遺伝子が胞子形成とブタノール生産に及ぼす影響..............................○古屋 一彦 1, 清 啓自 2, Panjuy Chaophaya 2, 門倉 利守 1, 鈴木 健一朗 1, 中山 俊一 1
（1 東農大院・農, 2 宮崎大・農）

14:42

3Ip07

1-ブタノールの添加が大腸菌細胞に与える影響................................................................... ○川畑 龍司 1, 荒木 勇登 2, 青井 議輝 1, 中島田 豊 1, 加藤 節 1（1 広島大院・統合生命科学, 2 広島大・工）

14:54

3Ip08

ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素活性部位における変異導入の影響........................................................................................... ○南部 友香, 柘植 丈治（東工大・物質理工）

15:06

3Ip09

P(3H2MB)生合成量増強のためのモノマー供給酵素の探索............................................................................ ○木原 崇博, 古舘 祥, 柘植 丈治（東工大・物質理工）

J 会場 E23（13:30～15:18）【環境工学，廃水処理技術】
接続チェック（12 分）

13:18
13:30

3Jp01

微生物由来蓄電性 Mackinawite による嫌気バイオコンバージョン活性の向上.......................................................... ○安池 一貴 2, 片桐 美紀 1, 工藤 優輝 2, 田代 陽介 2,3, 二又 裕之 2,3,4（1 静大・工, 2 静大院・総合科技, 3 静大・創科技院, 4 静大・グリーン科技研）

13:42

3Jp02

微生物燃料電池：アノード電極上のバイオマス量および細胞内グルタミン酸濃度と電流生成の相関............................................................................ ○佐々木 大介 1, 佐々木 建吾 1, 柘植 陽太 2, 近藤 昭彦 1（1 神戸大院・科技イノベ, 2 金沢大・新学術）

13:54

3Jp03

バイオ電気化学的システムによる複合微生物系の制御....................................................... ○佐々木 建吾 1, 佐々木 大介 1, 森田 仁彦 2, 柘植 陽太 3, 近藤 昭彦 1（1 神戸大院・科技イノベ, 2 電中研, 3 金沢大・新学術）

14:06

3Jp04

好気的硫黄代謝細菌を活用した重金属除去............................................................................................ ○黒田 真史 1, 小林 慎 1, 高山 一也 2, 池 道彦 1
（1 阪大院・工, 2 日東電工(株)）

14:18

3Jp05

Pseudomonas stutzeri NT-I によるセレン化物半導体ナノ粒子の合成......................................................................... ○佐藤 守, 黒田 真史, 井上 大介, 池 道彦（阪大院・工）

14:30

3Jp06

1,4-ジオキサン分解菌による多様な環状エーテル類の分解能の評価..................................................................... ○中澤 昌俊, 井上 大介, 黒田 真史, 池 道彦（阪大院・工）

76

14:42

3Jp07

Leptothrix 属細菌の分泌ナノ繊維は連鎖状菌体に環境適応性を付与する...................... ○久能 樹 1,2, 森永 花菜 2,3,4, 杉本 真也 2,5, 豊福 雅典 1,2,6, 野村 暢彦 1,2,6, Utada Andrew 1,2,6（1 筑波大・生命環境, 2 JST・ERATO, 3 筑波大院・生命環境, 4 産総研, 5 慈恵医大,
6

筑波大・微生物サスティナブル セ）

14:54

3Jp08

Investigation of solar-driven Linear Fresnel Photocatalytic Reactor (LFP) for wastewater treatment.................................................................. ○Cheng Zhang, Na Liu, Qiansu Ma, Akiho Yagi, Yingnan Yang

15:06

3Jp09

Mass spectrometry imaging reveals the correlation between the production of quorum sensing metabolites（Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba）
and the biofilm development in Pseudomonas putida biofilms......................................................................... ○Pitchapa Rattanaburi, Eiichiro Fukusaki, Shuichi Shimma（Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.）

ランチョンセミナー
LS3-1 三洋貿易株式会社
S1 会場 A21（12:00～12:50）

LS3-2 天野エンザイム株式会社
S4 会場 E11（12:00～12:50）

79

1A-Ka01

生物工学功労賞受賞にあたって○今井 泰彦 1,2（1キッコーマン, 2野田産研）
yimai@mail.kikkoman.co.jp

この度、図らずも第 13 回生物工学功労賞を頂くことになり、身に余る光栄でございます。これもひとえに、諸先輩方や、学会役員を始め関係する皆様方のご指導と、ご支援のたまものと深く感謝しております。
この度の受賞は、私個人と申しますよりも、これまで、また現在も一緒に産学連携を進めて下さっている諸先輩方や皆様を代表して頂いたものと受け止めております。
キッコーマンに入社後、初めて参加させて頂いた学会が日本醗酵工学会の年次大会でした。まだ中之島の日本生命の研修所で開催されていた頃です。狭い会
議室に大勢の参加者で熱気溢れる情景が未だに思い出されます。研修所に宿泊し、朝は食堂で一緒に朝食を摂り、その後は会議室で研究発表を聴講する、缶詰状態でのまるで合宿のような学会でした。その後、発表の機会も何回か頂きましたが、発表の準備中に新たな発見があったり、発表時の質疑応答が大変有意義な事に繋がったこともありました。
このような場を提供して頂いた学会には大変感謝しておりましたところ、2003
年に東日本支部で副支部長として木野支部長の下で支部活動をお手伝いすることになり、木野先生が主導的に進められていた産学連携の在り方を議論する活動に参加させて頂きました。お陰様で、支部委員の皆様をはじめ、大学、公的機関、科学装置・機械メーカー関係者、など多くの方々の協力を得て講演会やパネルディスカッションを通じて活発な議論が行われ、産学連携の在り方について共有化することができました、さらにその後の広範囲な方々が集まる賀詞
交換会に結び付いたのではないかと思っております。
その後、2013 年からは、産学連携理事として再び学会活動に参加することになりました。園元会長、五味会長、木野会長の下で、色々な経験をさせて頂きました。特に、園元会長の提唱された、「イノベーティブな産学連携活動の推進」のため、大会でのシンポジウムでは新たな切り口として「食のおいしさを極める生物工学」「地球の未来資源に貢献する生物工学」「新しい農業と未来の食料のための生物工学」など、食を基軸として、学会員でない産官学の識者にご講演を依頼し、会員の皆様に、これからの未来社会に向けた方向性を提供することを心掛けました。
日本生物工学会は学問の進展、産業界の発展に大いに貢献してきた学会だと思います。学会の名称が醗酵工学から生物工学に変わり、対象も微生物から細胞へ拡大する中でも、醗酵という生物と人間を結び付ける中で生まれた、学会の風土や文化は時代を経ても引き継がれているのではないでしょうか。そして、これからも、その大きな原動力の一つが産学連携となって欲しいと思っております。現在、大学や官と産業界の会員で学会に期待するものが必ずしも一致しないことがあるかと思いますが、SDGs など世界的な目標を共有したり、お互いに情報交換を続けることで、次の時代に対する方向性が出てくるのでは無いかと期待しています。
現在まで 6 年間理事を務めさせて頂き、さらに 2 年間、理事としてお世話になることになりました。この栄えある賞を励みとしまして、今後とも学会の発展に貢献できますよう微力ながら誠実に努めて参りたいと存じます。
最後になりますが、これまでそして現在も、ご指導、ご支援頂いた多くの方々に心より御礼申し上げます。

1A-Ka02

新規酸化還元系バイオプロセスの基盤技術開発とその応用○伊藤 伸哉（富山県大・工）nbito@pu-toyama.ac.jp

この度の生物工学賞の受賞は、ご指導いただいた諸先生方、共同研究者の皆様、研究室の新旧スタッフと学生諸氏など、すべての関係の皆様のご協力の賜物であり、ここに厚く感謝申し上げます。
バイオプロセスを用いる有用物質生産には多くの報告例があるが、酸化還元酵
素が工業的プロセスとして利用されている例は必ずしも多くない。これは他の酵素系と比較すると、反応に NADH/NADPH などの補酵素再生系を必要とする
こと、酵素の基質特異性が狭く汎用性に劣ること、目的とする基質や生成物が水難溶性のものが多く生体触媒が有機溶媒系で不安定であり、十分な生成物濃度が得られないこと、などの要因が考えられる。我々の研究室では、これらの問題に果敢に取り組み、さまざまな有用酵素触媒の微生物やメタゲノムからの探索、進化分子工学的手法による酵素触媒の改良、有機溶媒-水系における酸化
還元プロセスの最適化、有機溶媒耐性菌の宿主・ベクター系開発と利用、メタ
ゲノミクスと進化分子工学の融合技術の開発、更にこれらの技術を統合することにより効率的なバイオプロセスの研究開発を行ってきた。
【1】水素移動型不斉還元反応による光学活性アルコールの生産
ガス状スチレン資化性菌 Rhodococcus sp.由来のフェニルアセトアルデヒド還元
酵素（PAR）及び Leifsonia sp.由来アルコール脱水素酵素（LSADH）を用いる
E. coli 菌体反応により、各種ケトンから 100％に近い収率で高濃度に(R)/(S)-体のキラルアルコール（100-350 g/L、96->99％ e.e.）を生産するバイオプロセスの開発に成功した。LSADH と PAR は、いずれも数十種類のケトンから高い光
学純度でキラルアルコールを生産することができる画期的な酵素触媒であり、同時に 2-プロパノールを水素源として補酵素の再生が可能なことから補酵素再生系を追加する必要がない。また、当該反応で高濃度のキラルアルコールを合成するためには、2-プロパノールのような極性有機溶媒を含有する反応系で高活性な触媒が必要であるが、進化分子工学的手法による改変酵素の開発により、この問題を克服するとともに、これら酵素の詳細な解析を行った。また、天然由来シクリトールの一種である(-)-vibo-クエルシトールなど各種環状キラルポリ
オールの実用レベルでの合成にも成功している。
【2】不斉酸化反応による光学活性エポキシド、インディルビン誘導体の生産
スチレン資化性菌由来のスチレンモノオキシゲナーゼ（SMO）系（StyA：FAD
依 存 性 モ ノ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ , StyB: FAD:NADH 酸 化 還 元 酵 素 ） を 使 用 し 、
FADH2 の再生に LSADH を共役することにより、各種スチレン誘導体のみならず n-アルケンからも(S)-体のエポキシドを高光学純度で合成できることを世界で初めて報告した。さらに、これら酵素を Kocuria などの有機溶媒耐性菌に導入し、有機溶媒-水二相系において、汎用性の高いキラルエポキシドの合成プロセスを創製した。当該反応はエポキシ化のみならずスルフィド類のスルホキシ
ドへの不斉酸化やインディルビンや同誘導体の合成反応にも応用できることを見出している。インディルビンは漢方薬に含まれる天然色素成分であり、最近、
抗がん性のみならず潰瘍性大腸炎の治療効果が注目されている。
【3】酸化酵素の二量体化反応によるエピテアフラガリン類の生産と機能解析
ラッカーゼが没食子酸存在下、緑茶エキスの主要成分であるエピガロカテキン(EGC)やエピガロカテキンガレート(EGCg)を選択的に酸化し、紅茶の極微量成分であるエピテアフラガリンやエピテアフラガリン 3-O-ガレート（ETFGg）を合成できることを報告した。さらに、ETFGg が、膵臓リパーゼやマトリックス
メタロプロテアーゼ(MMP)阻害活性など、肥満や歯周病などを抑制する優れた機能を有する食品素材であることを発見した。その他のデータも、ETFGg がEGCg よりも優れた健康機能を有する食品素材であることを示している。我々は、当該反応に適したラッカーゼの探索と同酵素の糸状菌での分泌生産、同酵
素による効率的な ETFGg 生産にも成功している。
【4】メタゲノムからの効率的な酵素遺伝子の単離とその解析
Screening of Gene-specific Amplicons from Metagenomes(S-GAM)法と命名した
PCR を基本技術とするメタゲノムからの効率的な酵素遺伝子のライブラリー構築技術を開発し、工業的に利用できる有用生体触媒を発見した。現在、同法の改良と汎用性の検証に取り組んでいる。特に、97-99％の相同性を有する酵素ライブラリーが、酵素の機能改変に有用なアミノ酸配列情報を提供できることを世界で初めて示し、この情報を用いて酵素の耐熱化などを行った。また酵素反応が困難である嵩高い置換基を持つケトン類の不斉還元に利用できる還元酵素の発見にも成功するなど、S-GAM 法の有用性を証明した。
以上、キラル化合物を中心に精密化学品のバイオプロセスによる生産、植物・食品に含まれる微量成分の天然素材からの酵素合成技術など、バイオプロセスに関する幾つかの基盤研究を行ってきたが、これらの技術や成果はグリーンケ
ミストリーやバイオエコノミーのコンセプトに合致するものであり、今後の産学連携の進展による実用化が期待できる。

Acceptance Speech of Meritorious Service Award○Yasuhiko Imai1,2(1Kikkoman Corp., 2Noda Inst. Sci. Res.)

Key words

industry-academia collaboration

Research and development of novel biocatalysis focusing on oxidationreduction reactions○Nobuya Itoh(Fac. Eng., Toyama Pref. Univ.)

Key words

biocatalysis, chiral alcohols, chiral epoxides, metagenome

80

1A-Ka03

再生医療に資する細胞製造性に関する研究○紀ノ岡 正博（阪大院・工）kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp

再生医療や細胞治療が注目されるなか，細胞製造に関する技術開発が重要視されております．私は，これまで，ヒト幹細胞を育む技術を中心とした，マルチ発生レベルを有する発生工学プラットフォームに対する培養工学および細胞製
造プラットフォームの創成を目指し，学問体系化を行ってまいりました．iPS細胞などの幹細胞の出現とそれらの培養技術の発展により，多種多様な分化細胞を大量に調製することが可能となってきました．さらに，人体を模擬した組
織・臓器の形成への技術構築が一歩ずつ進んでおり，これらの新技術は，再生医療，細胞治療，創薬スクリーニング，人体機能解明など新しい医療・産業分
野へ展開されるものと期待されております．展開の実現化には，細胞レベルから人体レベルまでのマルチスケールで，発生学の知識に基づき組織・臓器の構造・機能形成を目指した発生工学的プラットフォームが不可欠で，多くの研究者が本分野を牽引しております．これらの達成の効率化には，生物化学工学者の主たる領域である培養工学プラットフォームとの協働が基盤的技術の進展を加速すると考えてきました．
現状のプラットフォーム形成の多くは，発生工学的研究と培養工学的研究の進展において，細胞レベル（微視的レベル）から，集塊レベル（中視的レベル），
培養組織（巨視的レベル）レベル，臓器，人体レベルへとマルチスケールでの技術開発，生物的へテロ（不均質性）解析によるデータ蓄積によって進められると考え，反応場である培養フォーマットと解析場である解析フォーマットに分け，発生工学プラットフォームの進展の段階を経ております．我々は，iPS
細胞の大量培養並びに細胞挙動に注目した運命制御を目指し，未分化状態での増幅工程の確立，シミュレーション，さらに未分化状態からの逸脱現象に注目
し，anomaly な発生メカニズムの理解と逸脱細胞の除去，発生抑制の構築を行ってきました．また，網膜分化細胞の成熟培養においては，細胞挙動制御により均一な成熟過程を導く方法開発や間葉系幹細胞の運命制御，筋芽細胞組織内の流動性と血管新生についての研究を行ってきました．
培養工学的プラットフォームの構築に伴い，社会実装として細胞製品の製造を目指した，細胞製造プラットフォームも必要不可欠な領域と考えられます．そこで，細胞製造プラットフォームでの課題抽出として，製品製造における既成概念として「製造性（manufacturability）（製造における種々の変動を考慮する
際の製造設計の容易性）」を参考に，「細胞製造性（Cell manufacturability）」を新たに「生物的見地と工学的見地を理解し橋渡した工程による，細胞の製造に対する可能性」と定義しました．特に，生物的見地に関する単位系の欠如が，本領域を難しくしていると考え，度量衡学（メトロロジー）の考え方をもとに細胞応答に対する入力に関する単位系を見出すことが不可欠であると考えております．製造プロセスの構築にむけ，細胞製造性設計を「顧客に対する安心と製品品質に対する安定を得つつ，製造所内外（原材料調達，搬送や病院での調製も含む）での簡易・安全・安価なプロセスにて，如何に簡単に製造するかを考える細胞製品の製造設計」と定義しました．この細胞製造性の体系化を目指し，細胞製造の固有な特徴を捉え，工程の不安定性要因および細胞の質的変動機構について，入力変動の影響として細胞株間の影響，外乱として無菌操作，
内なる乱れとして操作による遅発性，時間依存性についての検討を行ってきました．
これらの学問体系化を基に開発された再生医療に資する細胞製造技術を，社会実装の実現に向け，エコシステムの構築に向けた活動を行っております．社会
実装へ向けて，「一人ではできない」ことを肝に銘じ，大阪大学大学院工学研究科内で，「細胞製造コトづくり拠点」を 2016 年から始動し，モノづくり，ルー
ルづくり，ヒトづくりからなるコトづくり（エコシステムの構築）を実践しております．モノづくりでは，無菌環境の堅牢性に優れたアイソレータシステム
をモジュール化し，柔軟にモジュール同士の組み合わせにより製造工程を効率よく実施できるフレキシブルモジュラープラットフォームを提案し，iPS 細胞
由来の網膜色素上皮細胞の製造工程の機械化に成功しました．これらの技術の実装に向け，ルールづくりとして，規制当局や日本再生医療学会と連携し，無菌操作の考え方に関するガイドラインを発表してまいりました．さらに，アイ
ソレータシステムについては，ISO TC198/WG9 内で，細胞製造性については，
ISO TC276/WG4 内で，本邦メンバーとともに国際標準化に向けて調整を行っております．また，ヒトづくりとしては，社会人教育を立ち上げ，教科書の存在しない細胞製造分野における教育活動を通し，細胞製造のセンスを広げて，再生医療に資する細胞製造のためのコトづくりを行っております．
最後に，これらの研究やコトづくり活動は，数多くの産官学の先生方のご協力のもとで行っており，この場をお借りして御礼申し上げます．

1A-Ka04

選択的発酵酵母を利用した砂糖・バイオエタノール逆転
生産プロセスの開発○小原 聡 1, 寺島 義文 2, 杉本 明 3, 福島 康裕 4, 菊池 康紀 5
（1アサヒQ&I, 2国際農研セ, 3サトウキビコンサルタント, 4東北大院・工, 5東大・未来ビジョン研セ）
ohara@platinum.u-tokyo.ac.jp【開発の背景】
世界的な人口増加に伴う将来的な食料・エネルギー不足が予測される中，植物資源を用いた食料とバイオ燃料の増産が望まれる。サトウキビは単位収量が高く，主に砂糖原料となるショ糖と，エタノール原料となる還元糖（ブドウ糖，果糖）を蓄積するため，小面積で多くの砂糖（食料）とエタノール（バイオ燃料）の生産が期待できる作物である。地球上の優良農地が減少するなか，世界の研究機関が多収性サトウキビ品種を開発している。しかしながら，サトウキ
ビの多収化に伴い，土地あたりの糖生産量が増加する一方で，還元糖（砂糖結
晶化阻害物質）含有率が増加することから原料あたりの砂糖回収率が低下する。
その結果，砂糖を増産できず，糖蜜およびエタノールばかりが増産するため，多収性サトウキビは製糖産業に受容されず産業上利用されてこなかった。そこ
で 2002 年に砂糖・エタノールの同時的増産を目標とした革新的な還元糖の選択的エタノール変換プロセスの開発に着手した。
【技術の特徴】
開発した技術の特徴を以下に示す。
(1)還元糖のみを選択的にエタノールに変換する特殊な酵母（ショ糖非資化性酵母）を用いて，第一段階でサトウキビ搾汁中の還元糖のみを選択的にエタノー
ル変換・回収し，第二段階で還元糖除去後の高純度のショ糖液から砂糖を高効率に生産する。砂糖とエタノールの生産順序を従来法（製糖→糖蜜からのエタ
ノール製造）とは逆転させた世界初のプロセス（搾汁からの選択的エタノール
製造→製糖）である。
(2)発酵後の搾汁に含まれるエタノールは製糖工場の濃縮工程において回収可能であり，新たな分離回収装置も熱源も不要である。
(3)還元糖の選択的変換・除去により，結晶化工程における砂糖回収率が約 1.5から 2 倍（多収性サトウキビの場合）に向上する。
(4)既存の製糖工場に選択的発酵槽と熱交換器を挿入するのみで実施できるため，社会実装が容易である。
(5)ショ糖非資化性と凝集性（酵母分離機が不要）を併せ持った Saccharomyces
cerevisiae 属（食品工場で利用可能）の選択的発酵酵母を利用する。
【本技術がもたらす効果】
人口増加と優良農地の不足が共存する状況下，現在の製糖技術では，今後の食料・エネルギー供給の不足は必至である。逆転生産プロセスと多収性サトウキ
ビ等との組み合わせにより，食料競合の解消（砂糖・エタノールの同時的増産）が可能になり，物質循環型の高収益産業が展開できるようになる。また，従来，還元糖比率の高い夏季はサトウキビの収穫・砂糖生産が実施されてこなかったが，本技術によって夏季の工場稼働も可能となるため，収穫期間の大幅な延長が世界的に可能になる。その結果，工場・収穫機械の稼働率，土地・労働力の利用効率が向上し，原料および製品の生産コストの低減および農業経営の高度化が図れる。環境影響評価の結果，本技術を国内製糖工場（種子島）に導入した場合の温室効果ガス排出削減ポテンシャル量は 4.45 t-CO2.eq/ha と算出され，現状（5.94 t-CO2.eq/ha）と比較して 25%の温室効果ガスの排出削減効果が得られることが分かった。また経済性評価では，フィリピンの製糖工場（4,500 t/d 規模）に導入された場合，砂糖生産量が 9.7 万 t/y（現状比 1.95 倍）、エタノール
生産量が 2.7 万 kL/y（現状ゼロ）に増加し，事業性評価指標となる内部利益率（IRR）が 14.9％，投資回収年数が 6.4 年という結果が得られた。本技術は，従来，バイオエタノール生産において指摘されてきた社会的課題（食料競合回避、
温室効果ガス削減）を事業課題（経済性）の追究を通して解決している。
【今後の展望】
本技術は世界の製糖工場に導入可能であり、従来のサトウキビにおいても砂糖増産が可能となる。現在，オーストラリアの製糖工場に導入予定でプロジェク
トが進行中である。今後，更なる技術開発を行い，日本発のイノベーションとして世界の食料・再生可能エネルギー生産に貢献していきたい。

Study on cell manufacturability contributing to regenerative medicine

Development of the inversion process using selective-fermentation yeast

Key words
cell manufacturability, regenerative medicine, stem cell culture,biochemical engineering

Key words○Masahiro Kino-oka(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)○Satoshi Ohara1, Yoshifumi Terajima2, Akira Sugimoto3, Yasuhiro Fukushima4,
Yasunori Kikuchi5(1Asahi Q&I, 2JIRCAS, 3Cane Consult., 4Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 5Inst.
Future Init. Univ. Tokyo)
yeast, selective fermentation, sugar, ethanol

81

1A-Ip01

無通風箱培養法を利用した固体培養における麹菌の生育と酵素生産に関する研究

1A-Ep01○伊藤 一成（岡山県工業技術センター）
kazunari_itou@pref.okayama.lg.jp

醸造において麹造りに代表される固体培養は、物質の低移動性による培養状態の不均一性とそれに伴う再現性の低さ、培養管理制御の難しさなど、産業的利用を目指す場合に致命的な欠点を有している。これらは、培養基質の均一な攪拌が容易でなく、物質の低移動性から、発酵熱の生成拡散による品温状態の勾配と変動、水蒸気の発生拡散や結露による水分状態の勾配と変動、局所的な生育による栄養源の勾配と変動などが培養基質に生じることに起因する。この欠点を克服するべく、装置の複雑さや培養時の不安定要素を排除するため攪拌（手入れ）や通風を必要としない、簡便な培養システムの構築を目指した。
1. 新規固体培養法の考案と構築
固体培養中の発酵熱によって生じる水蒸気に着目、この水蒸気の移動を緩やかに制御できれば基質の均一性が達成できるのではないかと考えた。木箱の上下に空気を通さず水蒸気を通す延伸多孔質ポリテトラフルオロエチレン（ePTFE）
膜を装着し、内部に一定の緩衝部（空間）を設けた培養器を作製した。この培養器を恒温恒湿槽に入れ培養器外部の温湿度を制御し培養（小麦ふすまと麹菌を利用）を行った。従来の堆積式培養と比較して、バッチ内のどの場所においても極めて均一で再現性の高い品温経過と水分状態になっていた。これは酵素生産においても同様であった。この新たな固体培養を無通風箱培養（non-airflow
box (NAB) culture）法と名付けた。
2. NAB 法の特性
培養開始時の水分量を変えて NAB 法で培養すると、どの水分量でも基質が良く乾くことがわかった。酵素の発現・生産において水分は重要なパラメータであり、酵素によって水分要求性が異なる。従って、培養開始時の水分量を調節すれば水分要求性の異なる酵素を、複数同時かつ効率的に生産させることが可能であることがわかった。
水分量と酵素生産の関係を明らかにするため、乾燥する経過における酵素生産および麹菌の生育の詳細な解析を行った。どの酵素でも生産開始時期が早く、このときの生産速度が短時間で急激に上昇しており、おおよそ菌体の増殖経過と相関していた。水分状態の解析から、基質が徐々に乾くことで対数増殖期に最適な水分活性となり、菌体増殖が活発になることに起因すると考えられた。
効率的な酵素生産のためには、菌体増殖に適した水分と目的とする酵素の生産に適した水分のバランスを考慮し、最適培養条件の設定が必要である。
NAB 法では、培養中に培養器外部の湿度（水蒸気分圧）を変えることにより、従来の固体培養では極めて困難だった培養制御が可能であることがわかった。
さらなる酵素生産向上を目的とし、培養初期に菌体量を十分確保した後、基質の乾燥具合を制御した。菌体量は同じでも、乾く程度の違いにより酵素生産量が変化し、比較的緩やかに乾かした場合に増加した。また、どの酵素でも菌体あたりの生産が向上したことから、より効率的な複数同時の酵素生産が実現できることが示された。
NAB 法は中規模スケールの簡便な培養システムのため、実験室レベルでも手軽に実施でき、大規模スケールへの応用も容易である。また、環境の温湿度を適切に制御することで、品温と水分状態の管理が可能である。NAB は、再現性・作業性・制御性に優れた固体培養の基盤技術として、多様な物質生産の発展に大きく貢献できると考えている。
3. NAB 法の応用
清酒製造において目的にあった品質の麹を製造するためには、様々な条件で試験を行い、その品質を確認していく必要があるが、製造現場とスケールが大きく異なる実験室レベルでの試験では、生じる様々な培養状態の違いから、試験結果を製造現場に反映できないことが多い。そこで、培養制御が可能な NAB
法を利用し、現場での製麹経過を参考に米の試験製麹法の確立を目指した。できあがった米麹は正常な麹としての状貌をなし、しっかりと破精込み、局所的な不均一さは見られず、高い酵素力価と適度な酵素バランスを有していた。製造現場と遜色のない麹の再現を可能にした NAB 法は米の試験製麹法として、実際の製麹工程で系統だった解析が困難な麹の評価（破精の解析や遺伝子発現の解析等）に利用している。
併せて、目的とする品質の麹を造るために必要な制御（作業）と品温・水分経
過の科学的な知見を得ることを目的とし、培養器内の発熱および熱と水分の空間動態について評価を行っている。例えば、発熱に伴い培養器内部の緩衝部で対流が生じ、培養器外への効率的な水蒸気の拡散が起こっていることが明らかになった。また、発熱を増やし緩衝部の体積を減少させると対流が少なくなり、潜熱を持った水蒸気の拡散が減少、水分量が多く品温の高い製麹経過になることがわかった。このように現場での適切な製麹工程の管理のために、NAB 法を利用した様々な製麹条件での計測データの蓄積を行っている。

健康・持続可能社会の構築に向けた複合微生物系（ヒト
腸管・バイオガス発酵槽内）の制御○佐々木 建吾（神戸大院・科技イノベ）
sikengo@people.kobe-u.ac.jp

発酵食品を製造し、または天然資源から再生可能な化合物／燃料を生産するための工業的なバイオプロセスの多くは単一の微生物で行われてきた。しかし自然界に目を向ければ、多種多様な複合微生物群、すなわち複合微生物系として存在している。近年の分子遺伝学的解析手法の進展により、複合微生物系中の大半の微生物は未分離であることが理解されてきている。また、複合微生物系内においては、微生物間で相互作用しながらエネルギー源を消費している。例
えば嫌気生態系において、ある種の化合物分解は吸エルゴン反応であるために単一の微生物では分解が進まないものの、2 種類の微生物が共生する事によって発エルゴン反応となり分解が進行する事が知られており、栄養共生関係（syntrophic association）と呼ばれている。栄養共生関係を利用すれば、基質をより効率的に代謝して、生成物の収率を上げられると期待される。複合微生物系を使用する利点として、コストの掛かる滅菌を省けることが挙げられる。また、下水汚泥等の未利用バイオマス資源を利用する事が可能であることも利点であり、このような複雑な基質で培養することにより効率的な微生物触媒を集積することが可能である。複合微生物系は工業プロセスとして、食品の機能性向上、廃水の嫌気処理、バイオガスの生産等に利用されている。このように複合微生物系の持つ機能を最大限に利用するために、筆者らが進めてきた以下の 2 つの制御方法を紹介する。
(1) In vitro ヒト大腸細菌叢モデル
ヒト腸管内は数百種類以上、約 100 兆個の腸内細菌が生息している。通常は腸管内の恒常性が保たれて宿主の健康維持に貢献しているが、ヒト腸内細菌叢の乱れは様々な疾病に関与することが知られてきている。一方、昨今の市場に流通している機能性食品は、経口摂取後にヒト腸内細菌叢中の有益細菌の生育を促し、ヒトの免疫賦活・疾病予防などの作用を有して宿主の健康を促進している。そのため腸内環境を整える治療方法の一つとして、プレバイオティクスや
プロバイオティクスを投与することが注目されてきている。しかし、ヒト腸内細菌叢に対する評価は動物給餌試験やヒト介入試験による in vivo 系で行われてきたが、前者は腸内細菌叢や消化物の腸内滞留時間がヒトと異なること、後者は倫理的制限が指摘されている。そのため反復実験や時系列での評価が可能となる in vitro 系が求められていたが、複雑なヒト腸内細菌叢を保持し、その多様性を維持することは困難とされていた。そこで筆者らは、実際のヒト腸内細菌叢を近似してデザイン化している、いわゆる Kobe University Human Intestinal
Microbiota Model (KUHIMM)を構築してきた。KUHIMM は既存のプレバイオ
ティクスに対する応答や疾患患者の腸内細菌叢の特徴を再現しており、患者の腸内環境異常を検出することに成功している。また KUHIMM を利用して、ヒト腸内細菌叢に対するテーラーメイド治療技術基盤の構築に向けた取り組みを紹介する。
(2) バイオ電気化学的システム
バイオ電気化学的システムは、電極上での酸化還元反応を利用して微生物の代謝を改変できることが知られている。一方、嫌気性消化（メタン発酵）の原料として廃棄物を利用することが可能であり、微生物の作用により分解されてメタンと二酸化炭素が生成される。メタン発酵は複数の過程を経て進行し、加水分解・酸生成・酢酸生成・メタン生成に分けられる。すなわち、酸生成細菌・酢酸生成細菌・メタン生成菌の少なくとも 3 種類の微生物群が共存する生態系を維持する必要がある。筆者らは、導電性の微生物付着担体を充填している固定床型リアクターに対して、バイオ電気学的システムを適用することによりメタン発酵を高効率化することに成功している。さらに、バイオ電気化学的シス
テムを水素発酵に適用して、水素・メタン二段発酵に与える効果を調べた知見についても紹介する。

このように NAB 法は、従来の固体培養で最大の欠点だった不均一性や低再現性を補うだけでなく、多様かつ積極的な固体培養制御も実現可能にした。今後、この方法が固体培養のスタンダードとなりうるだけでなく、これまでにない麹菌の潜在能力も引き出すことができるのではないかと期待している。

Studies on mycelial growth and enzyme production of Aspergillus oryzae insolid-state fermentation using non-airflow box culture method○Kazunari Ito(Indusrtial Technolgy Center of Okayama Prefecture)

Key words

non-airflow box, Aspergillus oryzae, uniform culture, Koji making

Control of microbial community in the human intestine or biogas fermenterfor construction of healthy and sustainable society○Kengo Sasaki(Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

microbial consortia, gut, electrochemical cultivation, fermentation

82

1A-Jp01

圧力駆動型 Microphysiological systems の開発○杉浦 慎治（産総研・創薬基盤）
shinji.sugiura@aist.go.jp

近年、微細加工技術を用いた生体模倣デバイス microphysiological systems (MPS)に対する注目が集まっている。類似の概念としてマイクロ流体デバイス上に臓器モデルを再構成した Organ-on-a-chip (OOC)や、動物の個体応答をモデル化す
る Body-on- a-chip (BOC)がある。OOC はマイクロ流体デバイス上で臓器特有の三次元組織構造や血流、動きを再現し、インビトロで臓器機能を再現する新しい培養法として注目されている(1-3)。複数の臓器モデルを連結した Multiorganson-a-chip (MOC)や BOC は、通常であれば動物実験や臨床試験が必要とされる「動物の個体としての応答」を検出しうる細胞培養技術として期待されている(4, 5)。演者は所属する産業技術総合研究所（産総研）に 2004 年に入所以来、マイクロ流体デバイスを用いた細胞培養の産業化を目指して研究開発を行ってきた。本公演ではこの概略について紹介したい。
演者は 2004 年に産総研に入所し、マイクロフルイディクスを用いた細胞アッセ
イに関する研究の立ち上げを行うことになった。当時の産総研は吉川弘之理事
長が「本格研究」を研究所の命題のひとつとして掲げ、特許出願や論文を書くための基礎技術開発（第一種基礎研究）だけでなく、産業応用のための研究（第二種基礎研究）にも積極的に取り組むことが要求されていた。また、2004 年頃
はマイクロフルイディクスを用いた細胞培養に関する研究が少しずつ報告されるようになってきた時代であった。入所後、マイクロ流体デバイスの研究環境を整備しつつ予備実験をする中で、大学ではできない、産総研らしい研究を模索した。当時は、学生時代より扱ってきたマイクロフルイディクスの面白さを感じつつも、細胞培養に応用し、特に、産業利用されるようになるためには、多数のチューブ接続やシリンジポンプによる送液に代表されるような、流体ハ
ンドリングの煩雑さを解決する必要があると感じていた。このような状況の中で発案したのが「圧力駆動型マイクロ流体培養デバイス」である（6）。空気圧は配管を通じて分配することができる点がポイントであり、これにより、複数の薬液を同時に送液するマルチスループット化が容易となります。また、エアフィルターを使うことで無菌空間の管理も容易となります。
近年では、Organs-on-a-chip へ世界的な着目が集まる中、演者らは「圧力駆動型
マイクロ流体培養デバイス」をベースとしてとして複数得臓器連結培養を行う
ことのできる「圧力駆動型マルチスループット Organs-on-a-chip」を開発している(7)。これは、上述のデバイスと同様、クリーンベンチの中で培養チャンバー
を組み立てた後、通常の細胞培養に使用するようにマイクロピペットを用いて試薬や細胞、培地を添加することができるものである。クリーンベンチ内で蓋をした後、専用の接続ユニットを介して圧力制御装置に接続し、スタートボタ
ンを押すと循環培養が開始される構成となっている。循環培養の途中や終了した段階で、接続ユニットから切り離し、クリーンベンチ内に持ち込んで培養液を交換・サンプリングしたり、細胞を染色・回収したりすることも可能である。
つまり、マイクロプレート用に市販されている様々なキットを用いた解析も可能となっており、生物系の研究者がチュートリアルを受ければ MPS を使用できるところまで開発が進んでいる。現在、この「圧力駆動型マルチスループッ
ト MPS」をプラットフォームとして、創薬産業へ応用すべく関連企業と連携しつつ、製造技術開発から、用途開発までを進めており、今後も MPS の普及を目指した研究活動を続け、本学会に貢献していきたいと考えている。

1A-Gp01

Recycling of municipal solid waste via ethanol and/or
methane fermentation○Li Tan1,2(1Chengdu Inst. Biology, Chinese Academy of Sciences, 2Coll.
Architect. Environ., Sichuan Univ.)
tanli@cib.ac.cn

Municipal solid waste (MSW) consists of >70% biodegradable materials.
Mismanagement of the MSW causes serious environmental pollution. On the other
hand, rapid consumption of fossil fuels and increasing demand of energy lead toserious energy crisis. Waste-to-energy is recognized as an option for sustainable MSW
management and as one of the most significant renewable energy sources in future.
Aiming at reducing emission of organic compounds and maximizing energy recovery,
we systematically studied ethanol and/or methane fermentation to recycle MSW. We
established an ethanol-methane two-stage fermentation approach to recycle
carbohydrate-rich MSW. Waste paper is rich in cellulose. Process ofpresaccharification and simultaneous saccharification and fermentation (PSSF) was
developed for efficient conversion of waste paper to ethanol with pH adjustment andnutrients supplementation, reaching ethanol yield, concentration and productivity of
90.8%, 45.3 g/L, and 0.54 g/L/h, respectively. The ethanol concentration was above thecritical value of 40 g/L for economical distillation. Kitchen waste is acidulous and richin starch and nutrients. Two processes, repeated-batch PSSF and continuous PSSF,
were developed to convert kitchen waste to ethanol. Both processes produced ethanol
higher than 40 g/L. Repeated-batch PSSF resulted to ethanol yield of 88.9%-91.2%,
which was slightly higher than that of continuous PSSF (82.8%). On the other hand,continuous PSSF showed greater productivity of 11.5 g/L/h than repeated-batch PSSF
of 3.3-3.5 g/L/h. A process of successive liquefaction, presaccharification, andsimultaneous saccharification and fermentation (L+PSSF) was developed for cofermentation of waste paper and kitchen waste. The ethanol yield, concentration, andproductivity were similar to those of individual fermentation of each substrate, but cofermentation was superior in free of pH adjustment and nutrients supplementation.
Stillage eluted from the ethanol fermentation was subjected to methane fermentation.
Biochemical methane potential (BMP) test showed that the stillage was biodigestible.
However, methane fermentation was susceptible to NH4+ and/or S2- inhibition due tothe richness of nitrogen and sulfur in the stillage. Therefore, we investigated andelucidated the inhibitory laws of NH4+ and/or S2- on methane production and methane
production rate under thermophilic and mesophilic conditions. Based on this, NH4+ andS2- inhibition to methane fermentation was alleviated by applying micro-aeration andbiogas recirculation. Thus, stable performance of methane fermentation was achieved
at very high organic loading rate 14 g/L/d. Microbial community analysis revealed thathydrolysis of cellulose was the critical step for methane fermentation of the stillage.
Integrating ethanol fermentation with methane fermentation, energy of approximately
80% containing in the materials was recovered as ethanol and methane.

(1) Bhatia, S. N. et al. Nat. Biotechnol., 32, 760 (2014)(2) Marx, U. et al. Altex, 33, 272 (2016)(3) Esch, E. W. et al. Nat. Rev. Drug Discovery, 14, 248 (2015)(4) Abaci, H. E. et al. Integr. Biol., 7, 383 (2015)(5) Sung, J. H. et al. Anal. Chem., 91, 330 (2019)(6) Sugiura, S. et al., Biotechnol. Bioeng., 100, 1156 (2008).
(7) Satoh, T. et al. Lab Chip, 18, 115 (2018)

Development of pressure driven microphysiological systems○Shinji Sugiura(BRD, AIST)

Key words

Microphysiological systems, Organ-on-a-chip, microfluidic device

Recycling of municipal solid waste via ethanol and/or methane fermentation○Li Tan1,2(1Chengdu Inst. Biology, Chinese Academy of Sciences, 2Coll. Architect. Environ.,Sichuan Univ.)

Key words
fermentation

municipal solid waste, bioenergy, ethanol fermentation, methane83

1S-S1p01 日本ワインの戦略○安蔵 光弘（メルシャン株式会社シャトーメルシャン）
anzo-m@mercian.co.jp

ここ数年、日本ワインは日本のマーケットで注目を集めており、ワイナリーの数も増えている。2018 年 10 月 30 日から、日本ワインの表示に関する法律がス
タートし、表示の基本的なルールが制定された。醸造専用ブドウの栽培を開始する人も増えており、今後もワイナリーの数、ブドウ畑の面積とも増加傾向と思われる。その中で、フランスやカリフォルニアをはじめとしたワイン生産国で行われている、コスト削減策を、積極的に取り入れることが必要と思われる。
ワイン生産にかかわるコストのうち、果汁やワインを圧搾するプレス機、ワイン用の瓶詰めライン、貯蔵用のオーク樽など、そのほとんどが輸入に頼っている。その分、輸入のコストや、消耗品のリードタイムが最短でも数ヶ月あることなど、日本ワインが置かれている状況は簡単ではない。ワインは、果物を原料としているため、醸造はブドウが熟す時期に集中する。その分、プレス機や破砕機などは、秋の 2 ヶ月ほどしか使用しない。こういう機材は、購入費用がかかるため、年間に 2 ヶ月の使用では、減価償却に時間がかかる。諸外国では、こういった季節性の高い機材を共同で保持したり、アウトソーシングしている例も多い。国内でワイナリーの数が増えている現在、海外ワイン産地の戦略を参考にして、日本ならではのコスト削減策を議論する時期が来ていると思われる。

1S-S1p02 酒造り 200 年、茨城の田舎の造り酒屋からジャパニーズ
クラフトビールの世界発信○木内 敏之（木内酒造合資会社）
kiuchi@mwc.biglobe.ne.jp

日本で酒類を製造する為には、酒類の種類ごとに製造免許が必用であり酒税法で決められた最低製造数量以上の製造が必須である。ビールに関しては、2000KLと規定され、事実上大手ビール製造会社のみの独占状態になっていた。しかし1994 年酒税法が改正され最低製造数量が 60KL に引き下げられ、地域のリゾー
ト開発、地方公共団体の地域振興、さらには当社の様な酒類製造会社の新規参入等々 300 社もの企業がビール製造に参入しまさに地ビールバブルとなったのである。このブームは 2000 年頃まで続くものの、製造者の技術の未熟さによる品質問題、設備投資に比しての少ない製造数量ゆえの高原価、さらには、日本の食とのミスマッチ等の要因が相重なり、地ビールバブルは崩壊し製造者数は減少、2010 年には 208 社にまで下がった。
日本酒の製造会社であった当社は、企業規模の拡大と収益率の向上の為に 1995
年に新規にビール製造免許を取得し、「常陸野ネストビール」の製造を開始した。当時ほとんどの地ビール製造会社が、自社のレストランでの消費を目的に事業を行う「パブブルワリー型」で事業を行っていたが、当社は、先進地のアメリアに習い、瓶詰めを中心としたいわゆる「マイクロブルワリー」型クラフ
トビールをモデルに事業を考え、充填設備の導入、微生物管理の徹底により瓶詰めビールの販売をおこなった。
事業開始当時は、「地ビールバブル」の真っ最中であり、追加の設備投資をおこないながら 400KL ほどの製造まで達していた。しかし、当社でも前述の地ビー
ルバブルの終焉と共に売上数量が低下、年間製造数も 100KL ほどまで落ち込んでしまった。
その様な中で着目したのが、小規模ビール醸造者をクラフトビールと称するアメリカの市場であった。アメリカのクラフトビールは、1980 年代よりブームとなり、1998 年当時は、2000 社ものクラフトビール製造会社が その個性を競い合っていた。
幸いにも当社では、何度かアメリカで最大のビールコンテストであるワールド
ビアカップで賞を得ており、アメリカのクラフトビール愛好家の中で日本に「常陸野」というクラフトビールがあるらしいと話題になっていたのである。1999
年 に は ア メ リ カ の 輸 入 ク ラ フ ト ビ ー ル の 仕 掛 人 と も い え る B.UNITEDINTERNATIONAL 社（コネチカット州）よりアメリカへの輸出のオファーが舞
い込みその第一歩としてコンテナ一台約 2 万本の常陸野ネストビールを輸出したのであった。
発売当初は、日本からの初のクラフトビールの輸入という珍しさもあり、驚くほどのスピードで販売され、それに伴い当社のビール工場もフル生産の状況となるのである。しかし、珍しさから真の日本発のクラフトビールとして定着させる事は、日本からの輸送コスト、製造規模による原価の高さ等を総合的に考えると、容易では無いであろうとの想像がついた。
そこで常陸野ネストビールの位置づけを、日本でしかできない真の日本のクラフトビールと位置づけ将来を見据えた商品開発に取り掛かったのである。
幸いにも、当社には、200 年近い日本酒製造の歴史や考え方がある。また、偶然にも当社の所在する茨城県那珂市は昭和初期よりビール麦の一大産地であり、ビール麦栽培の歴史があるのである。また、茨城は、暖地のミカン、寒地のリンゴが同じ畑で栽培できる気候であり、様々なビール用の素材が地域にある事が判明した。
それから約 20 年の歳月が過ぎ、今当社の製造するフクロウマークの常陸野ネス
トビールは、日本のクラフトビールとして世界 40 カ国以上で親しまれている。
常陸野ネストビール NIPPONIA には、地元農家の手で復元された日本最古のビール麦「金子ゴールデン」と日本生まれのホップ「ソラチエース」を使用。
DaiDai には、茨城の筑波山麓に自生する日本の原種と言われる福来みかんをフ
レバ―付けに使用。また、Saison Du Japon は、麦芽の糖化プロセスに、日本酒造りの米麹を加えさらには清酒酵母で醗酵させている。古代米を使った赤米エー
ルは、その鮮やかな色合いと柑橘系のフレバ―が人気である。
茨城の田舎の造り酒屋の地ビールからジャパネーズクラフトビールとして海外への挑戦、そこには、日本、酒造り 200 年、さらには酒蔵の歴史と伝統が必須であった。

A strategy for japan wine making○Mitsuhiro ANZO
(Mercian corporation , Chateau Mercian)Key words

wine

Brewing for 200 years, from a sake brewery in the countryside of Ibaraki todispatching Japanese craft beer around the globe.
○TOSHIYUKI KIUCHI(Kiuchi Shuzou Goushi Kaisya)

Key words

craft beer

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1S-S1p03 日本酒を世界へ○宇都宮 仁（日本酒造組合中央会）
h.utsunomiya@japansake.or.jp

日本酒の輸出が好調である。2018 年の輸出金額は 222 億を超え、2007 年と比較
すると金額で約 3 倍、数量で約 2.5 倍となり、価格の高い純米吟醸酒等特定名
称酒の輸出が好調であることを示している。また、マイクロブルワリーを含む
海外生産も増加している。
日本酒の消費は日本食レストランの普及とともに伸びたといえるが、それ以外の要因として、①品質向上及び②認知度や理解度の向上がある。①品質向上には、香気成分高生産酵母や高グルコース生産麹菌の育種など生物工学会会員が果たした役割が大きい。また、プロセスや生産・流通体制の改善により、生産段階から酸化を防ぐとともに低温流通が行われるようになったことで、海外のレストランでも国内と変わらない品質で楽しんでいただけるようになった。②
認知度や理解度の向上には、2007 年に世界的なワインコンペティション（International Wine Challenge）に日本酒部門が開設され、審査時に外国人と日本人が評価のポイントについてディスカッションを行っていることや、ワイン専
門家等への日本酒教育が貢献している。ディスカッションや日本酒教育を支える科学的知見には、近年の熟成やオフフレーバーに関する研究や料理との相性
研究の成果が生かされている。日本酒は日本で独自の発展を遂げた醸造酒であり、ワインやビールと並ぶ世界の酒として認知されるようになるには、今後も、日本から様々な情報を発信し続けていく必要がある。

1S-S2p01 微生物ダークマターへのアクセス：培養手法の革新と未知増殖制御メカニズムの解明○青井 議輝（広島大院・統合生命科学）
yoshiteruaoi@hiroshima-u.ac.jp

微生物のほとんどは培養困難であることが知られており、未解明・未利用のま
ま広大なフロンティアが残されている。近年の培養非依存的な網羅的解析手法の著しい進展により広大な未知領域の存在が明らかになったが、「鍵」となる微生物が培養できないため本質的な理解（因果関係など）や利用拡大に制限がかけられている状況でもある。そこで、多くの微生物は培養困難な普遍的な理由
やメカニズムを解明できれば、現状では有効技術のない難培養性の未知微生物を培養化するための画期的な新戦略を導き出せるかもしれない。しかし，難培養性を説明可能な普遍的な理由は全く明らかになっていない。また、通常の培養法で容易に獲得（分離培養）できる微生物を解析しても「なぜ培養できないのか」という問いに対する答えには到達しないというジレンマが存在する。さらに、従来法に替わる画期的な分離培養手法もほとんど登場していない。
【新しい分離培養手法】
そこで、我々の研究グループでは、新規分離培養手法を開発してその有効性を実証しつつ、さらにそれらの手法を通じて得られた難培養性微生物を用いて未知なる増殖制御機構の解明に取り組んでいる。以下にその一部を挙げる。
１）微生物の罠：ナノメートルオーダーの構造体をデザインすることで、現場に設置するだけで自動的に複数の菌株をサンプリング・分離・培養する全く新しいタイプの分離培養手法。本手法は、人為的に微生物を分離・植菌するのではなく、「微生物自身が能動的に分離し、隔離した状態で増殖する」という点で既存の方法論に対して大きく異なる。
２）対象微生物の選択的分離：セルソーターを用いて形態学的な情報に基づいて対象微生物を生きたまま選択的に分離する方法。
３）in situ 培養：微生物は通過しない膜を用いた独立した培養チャンバーで構成された培養デバイスを用いた、実環境を模擬する培養手法（in situ 培養法）。
４）超高密度植菌法：培養初期の菌体密度を従来の方法の１万倍以上に高めることができ、培養期間中お互いに混在しないで分離した状態で増殖させる方法。
培地条件は同一にもかかわらず従来法の 10 倍程度高い培養効率（コロニー形成率）を示すことが判明した。
【難培養性微生物とは何か】
なぜ多くの微生物はなぜ培養できないのか？そもそも普遍的な要因が存在するかどうかも定かではない。つまり、常識的には、多くの微生物が培養できない
理由は「培地組成など培養条件が適合しない」こと（だけ）が原因ではないかと考えられる傾向にある。しかし我々は、このような「培養条件の不適合性」
以外に、まだ十分に検討されていない普遍的な要因があり得ると仮定して検討した結果、実際に以下のような性質を見出している。
性質１）休眠と覚醒：多くの環境中の微生物は好ましくない条件下では容易に非増殖状態（休眠状態）に移行する。環境状況が好転しても休眠状態からは容易に脱却せず、そこから脱却するためには、シグナル様物質（覚醒因子）が必要である。そしてそれは増殖状態の特定の微生物（異種・同種）から分泌される。
性質２）多くの難培養性微生物（未培養微生物）は、自身が産出する代謝物（代謝副産物）に増殖を顕著に阻害され、コロニー形成が不可能であるなど従来法では容易に分離できない。また上記の１）および２）の性質を両方併せ持つような微生物種は極めて分離培養が困難である。実際に、上記に挙げた新規培養手法で得られた新規性の高い微生物の多くは、上記の性質をどちらか、または両方持っていることが判明した。
【まとめ】
これまでに得られた結果は、「個々の微生物種の適合性」だけではなく、普遍的に環境微生物の難培養性をコントロールするメカニズムが存在することを示唆している。また、微生物の「難培養性」について本質的な理解を得ること，すなわち増殖という微生物の活動の本来根幹となる部分を理解することに直結する。さらに、分離培養手法の革新や培養可能な微生物の拡充，そして環境微生
物の「難培養性」を解明することにより、直接利用できるバイオリソースの大幅な拡大が見込まれることも期待できる。

Sake to the World○Hitoshi Utsunomiya(Japan Sake and Shochu Makers Association)

Key words

sake

Accessing to microbial dark-matter: innovation for microbial cultivationand discovering unrevealed growth controlling mechanism○Yoshiteru Aoi(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)

Key words
awakening

uncultured bacteria, isolation, microbial dormancy, microbial

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1S-S2p02 物質循環・代謝におけるマイクロバイオータ機能の具現化ツール開発1S-S2p03 微生物ダークマターが創り出す未知物質の探索○中島 琢自, 松尾 洋孝, 高橋 洋子, 大村 智
（北里大・生命研）
takuji@lisci.kitasato-u.ac.jp○小川 順, 岸野 重信, 安藤 晃規, 竹内 道樹, 原 良太郎, 上田 誠
（京大院・農）ogawa@kais.kyoto-u.ac.jp

自然界において、微生物は、単一種であっても集団で、また、多数種が共存したコミュニティとして存在し、機能を発現している。さらには、微生物間のみならず、植物、動物といった異種生物間のインターフェースにおける多彩な集団としての微生物の機能が、生態系における様々なマクロな物質循環を駆動している。このような生物間インターフェースにおける集団としての微生物、すなわち「微生物生態系」が発揮する機能（マイクロバイオータ機能）は、健康増進における腸管の科学、作物生産における根圏の科学、化学工業におけるバ
イオプロセス開発、環境保全の科学など、持続的社会、健全な物質循環の実現に欠かせない多様な産業領域に関わるものと考えられる。微生物生態系を解析するオミクス技術を軸に、マイクロバイオータ機能を具現化する化合物、酵素、代謝といった個々の機能担体を統合化し、マイクロバイオータ機能を効率的に活用する技術を、健康医療、作物生産、物質生産における取り組みを例に紹介する。
１） 健康医療／腸内細菌脂質代謝研究
腸管微生物系の機能制御に役立つ化合物の発見を目指し、生活習慣病予防の観点から脂質にフォーカスした代謝解析に取り組んだ。その結果、食事脂質に由来する不飽和脂肪酸が腸内細菌により飽和化されることを見いだし、水酸化脂
肪酸、オキソ脂肪酸、部分飽和脂肪酸、共役脂肪酸を代謝中間体として同定した。また、これらの脂肪酸の宿主組織における存在の確認、ならびに腸管上皮
バリア保護や脂肪酸合成抑制などの多彩な生理機能を見いだした。焦点を絞っ
た代謝解析から見いだされた化合物を起点として腸管複合微生物系機能の作用機序が明らかとなり、オミクス情報利用の方向性を明確化した成果と言えよう。
２） 作物生産／植物根圏細菌窒素代謝研究
資源循環型農業に重要な窒素循環においては、アンモニア酸化細菌や亜硝酸酸化細菌という単離培養し難い微生物群が機能している。したがって、これらの菌株を含む集団を対象にマネージする必要がある。集団の中でのアンモニア酸化細菌や亜硝酸酸化細菌のバランスを、環境制御によりどうやって管理可能かを解析した結果、栄養・酸素量をバランスよく調節することが重要だと判明した。この開発過程にオミクス技術を活用することで、環境変化と菌叢変化の関連を明確にとらえることができた。また、本成果を脱窒も含めた水質浄化研究へと展開している。ある化合物の代謝に着目した取り組みから、窒素循環複合
微生物系を制御する環境要因が特定された好例であるといえよう。
３） 物質生産／複合微生物機能を活用したバイオプロセス開発
多様な化学反応（酸化反応・縮合反応など）や反応場（有機溶媒中など）に対応しうる次世代バイオプロセスとして、還元力やエネルギーを供給する微生物、
環境耐性微生物、触媒活性微生物をカップリングした複合微生物系の開発に取り組んだ。例えば、ATP を供給する酵母とデオキシリボヌクレオシド分解代謝系を部分的に発現した微生物群を用いて、核酸医薬や抗ウイルス薬の中間体となるデオキシリボヌクレオシドの効率的生産系を構築した。
このように、応用を目指した具体性を持った取り組みにより、複合微生物系機能の解析・開発に有用な化合物、環境因子や微生物を提供することが可能となったと考える。

ゲノム解析技術の進展により、微生物は多種多様な二次代謝産物を作り出すことあきらかとなった。1) その二次代謝生合成経路はポリケチド, メバロン酸・非メバロン酸, アミノ酸, 糖質, シキミ酸経路の 5 つに大別でき、単独もしくは複数の代謝系が関わって二次代謝産物（天然物）の複雑・多様な構造を生み出している。そこには二次代謝の基質となる原料の違いや修飾酵素など様々な要因が関わっており、同じ類縁体でもわずかな構造的な違いにより全く異なる生物活性を示すなど、微生物が生産する二次代謝産物の有効利用を考えると天文学的な数になる。
一方、これまで製薬企業を主導に、微生物の二次代謝産物から薬の素となる有用物質を見いだす研究がなされていたが、天然物創薬から撤退する動きが相次いだ。その理由は、天然物探索研究は時間と労力を要し、費用対効果が低いことがあげられる。しかし、微生物が作り出す天然物の魅力はユニークな構造にあり、最近天然物を利用した創薬へと回帰する動きも見られている。
抗生物質の発見は Tyndall、Pasteur や北里柴三郎による微生物間の拮抗作用の観察から始まり、Fleming および Florey らのペニシリン発見により、抗生物質の実在を明らかにした。その後、Waksman が放線菌から抗生物質の探索を行い、Streptomyces griseus よりストレプトマイシンを発見し、抗生物質探索の幕開けとなった。ストレプトマイシンの発見を期に、多くの製薬企業や研究者は微生物が生産する抗生物質の探索研究を行った。しかし、近年は微生物の代謝産物
から新規物質の発見報告数は減少していった。
演者らは、分離されてきた微生物の化合物生産能力を最大限に生かすために、特定の生物活性ではなく、化合物の物理化学的性状を指標に探索（physicochemical (PC) screening2)）を行った。PC screening とは、培養液に含まれる化合物の質量分析値や UV スペクトルなどの情報を天然物データベースで検索し、新規性を予測して単離・精製および構造決定を行う手法である。構造決
定後、生物活性を評価する。
北里大学大村創薬グループは微生物代謝産物から 500 以上の新規化合物を発見し、その生産菌を長期保存している。そのうち、エバーメクチン、スタウロス
ポリンやその他の有用物質を生産する放線菌約 330 菌株を復元し、4 種類の生産培地を用いて培養液抽出物ライブラリーを作製した。
そのライブラリーを用いて PC screening を行い、新規骨格を含む約 80 の新規物質を発見した。イミニマイシン 3,4)は放線菌 S. griseus OS-3601 株の培養液から発見した新規物質である。OS-3601 株は 40 年前、阿蘇の土壌から分離された放線菌で、ストレプトマイシン生産菌株として長期保存されていた。S. griseus は放線菌のモデル生物であり、ゲノム解析も終了している。イミニマイシンは弱い抗菌活性を示したが、その培養液には強力な抗菌活性を示す複数のシクロヘキ
シミド類縁体やストレプトマイシンも含まれており、抗菌活性を指標とする探索では見いだせなかった化合物である。PC screening は、このような有名な放線菌株からも新規物質を発見できる手法である。イミニマイシン A3) は放線菌では初めての知見となるイミニウムイオンを持つインドリジン化合物、イミニ
マイシン B4) はピリジニウムイオンを持つ類縁体であった。
PC screening の応用として、生体低分子をシリカに修飾し、新しい樹脂を作製した。生体低分子はエルゴステロールを用いた。エルゴステロール修飾シリカ（ES シリカ）を用いて PC screening を行い、放線菌 Amycolatopsis sp. K16-0194
株の培養液から新規物質ジピリマイシンを発見した。5) ジピリマイシンは A 物
質がカルボン酸で B 物質はアミドの側鎖を有し、ES シリカに B 物質は結合す
るが、A 物質は結合しなかった。この結果から ES シリカはアミドを認識していることがわかった。また、ES シリカに結合する既知物質の約 8 割は窒素を含む化合物であった。
PC screening は生物活性を指標としたスクリーニングと比べ、高い確率で新規物質を発見できる。さらに、生体低分子修飾シリカや質量分析を用いた硫黄化
合物スクリーニングで新規物質が見つかってきている。これまで分離されてこなかった微生物ダークマターを活用し、PC screening と組み合わせることで多くの新規物質が発見できることを期待する。
参考文献
1)Alexander C. C., et al., Nature, 558: 440-444 (2018)2)Nakashima T., et al., Biochem Pharmacol. 134: 42-55 (2017)3)Nakashima T., et al., J. Antibiot., 69: 611-615 (2016)
4)Nakashima T., et al., Tetrahedron Lett., 30, 3284-3286 (2016)5)Izuta S., et al., J. Antibiot., 71: 535-537 (2018)

Development of implementation tool for microbiota function in material
circulation and metabolism

What is presents from Darkmatter Microorganisms?

○Jun Ogawa, Shigenobu Kishino, Akinori Ando, Michiki Takeuchi, Ryotaro Hara,
Makoto Ueda
(Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)

Key words

microbiota, gut microbiota, rhyzosphere, bioprocess○Takuji Nakashima, Hirotaka Matsuo, Yokō Takahashi, Satoshi Ōmura
(Kitasato Inst. Life Sci., Kitasato Univ.)

Key words
compounds

physicochemical screening, secondary metabolites, actinomycetes, new

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1S-S2p04 プラスチック分解細菌のエネルギー獲得戦略○吉田 昭介（奈良先端大・バイオ）ssk-yoshida@bs.naist.jp

1S-S3p01〈招待講演（韓国生物工学会）〉
Nanopore technology for the detection of single bacterial
spores○Tae-Joon Jeon
(Dept. Biol. Eng., Inha Univ.)
tjjeon@inha.ac.kr

プラスチックは機能性とコストパフォーマンスを兼ね備えた素材である。しかし便利さの反面、現在のプラスチック経済は石油を原資とした非循環型であり、持続性を伴っていない。ポリエチレンテレフタレート (PET)は、ペットボトル
や衣服の繊維などに汎用される主要なプラスチックのひとつである。廃棄された PET の一部はリサイクルされているが、従来のリサイクル手法は膨大なエネ
ルギーを消費し、激烈な薬剤を使用するなど、高コスト・高環境負荷となっている。また、環境に流出した PET は、化学的に安定で生分解されないため、景観を破壊し、生態系に悪影響を与えている。
我々は、リサイクル工場から採取したサンプルを PET フィルムを唯一の炭素源として集積培養することにより、世界で初めて PET を分解・代謝するマイクロ
バイオ―タを得た。さらに、本マイクロバイオ―タから、PET を資化性新種細菌 Ideonella sakaiensis を分離することに成功した。その後の研究で、PET を高活性、且つ高特異性に加水分解する酵素 PET hydrolase (PETase)、続いて PETase
により PET から分解産物として遊離されるモノヒドロキシエチルテレフタレート（MHET）を特異的に加水分解する酵素 MHET hydrolase（MHETase）を同定した。また、(1) PETase が細胞外、MHETase が外膜の内側に存在すること、(2)I. sakaiensis はテレフタル酸とエチレングリコールを共に資化可能であること、などが判明した。I. sakaiensis は PET 資化に必要な因子をすべて備え、かつ適材
適所に酵素を配置することで、PET を効率的に資化していることがわかってきた。
ゲノムが明らかにされている生物において、PETase、MHETase、テレフタル酸
ジオキシゲナーゼ、プロトカテク酸ジオキシゲナーゼといった PET 代謝に必須と考えられる酵素のホモログをすべて備えた生物は見い出されない。このこと
から自然界に PET 代謝系をもちうる生物が非常にまれであることがわかる。
Blastp によるデータベース検索では PETase ホモログが Actinobacteria 門に偏在しているのに対し、それ以外の遺伝子は Proteobacteria 門に偏在していた。よって MHET ア ナ ロ グ 代 謝 系 の 成 立 の の ち に PETase を コ ー ド す る 遺 伝 子 がProteobacteria 門の細菌に水平伝播することにより代謝系の拡張がなされたと考えている。

Biomimetic membranes and their analogs are used in a variety of scientific andengineered applications and have also been explored as a platform for highly sensitiveand rapid single molecule sensing. Furthermore, a number of functional membraneproteins and ion channels incorporated into such biomimetic membrane have provided
many applications and potential uses including water purification, biosensors, drug
screening, and biophysical studies. Either protein nanopore or solid state nanopore
provides very versatile platform for single molecule studies or detection. However,
nanopore technology has a significant hurdle that molecules larger than the nanopore
cannot be translocated through the nanopore, precluding wide applications of thenanopore technology. Although the detection of bacteria and spores is important tomaintain human health and safety, detection systems using a nanopore have not beenreported. To overcome the current limitations, we designed the DNA hairpin that iscomplement to the aptamers and the aptamers are recognition elements for target
molecules. The aptamers were characterized using alpha-hemolysin nanopores after thereaction of spores and aptamers and subsequent reaction with the complementary
DNAs. As a result, we were able to detect Bacillus thuringeinsis HD-73 spores withthe detection limit as low as 1.2 × 101 CFU/mL. Since aptamers can be selected for
virtually almost any target molecule, our system is applicable to any target. In thispresentation, along with our nanopores technology, I will present other representative
membrane-based technologies including aquaporin based water purification system.
Our work shows biomimetic membrane platforms for water purification and improved
performance of the membranes by employing a novel substrate and chemical
conjugation techniques. The other application with biomimetic membrane forbiosensing applications will be also shown as a potential use as biosensors with rapid
and accurate detection of biomolecules.

Energy acquisition strategies of a plastic-degrading bacterium

Nanopore technology for the detection of single bacterial spores○Shosuke Yoshida(Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)

Key words

PET, esterase, microbial consortium, evolution○Tae-Joon Jeon
(Dept. Biol. Eng., Inha Univ.)

Key words

biomimetic membrane, nanopore, ion channel

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1S-S3p02 検査・診断用ペーパーデバイスの開発○内村 浩美（愛媛大・セ）uchimura.hiromi.mb@ehime-u.ac.jp

１．はじめに近年、日本国内においては高齢化が進んでおり、健康維持のためには適切な疾病治療法の提供に加えて、予防医療による健康維持増進や疾患の早期診断が重要である。このため、医療技術の発達に伴い、病気の同定のために様々な診断デバイスが開発・導入されている。先進国においては精密機器を用いた検査や診断が行われており、血液等を精密機器にかけることによって、糖尿病や悪性腫瘍等の定性評価が可能であるが、いずれも測定機器が高価であり、機器自体も大きいため持ち運びが難しい等の問題点を有している。また、発展途上国や被災地等においても病気の診断・早期発見が必要であることから、持ち運びが簡便で衛生的に使用でき、また、電力等の外部エネルギーを必要とせず、低コストで利用可能な診断機器が求められている。
そこで、本研究では、印刷技術を活用して耐水性紙基材の上に繊維等の親水性材料を意図した形状に転写することにより、転写された繊維部分を流路とする
新たな紙製バイオチップの作製方法について検討を行った。
２．印刷技術を応用したバイオチップの作製
凸版印刷やオフセット印刷、インクジェット印刷等の印刷技術では、インキ転移量が少ないことから、親水性の繊維を印刷することは不可能である。また、インクの転写量が多く、比較的大きな顔料も印刷可能なスクリーン印刷を用いてバイオチップを作製する方法が Sun らによって報告されているが、これは疎水性物質の転写を目的としたものであり、これ自体を流路とするものではない。
一方、本研究で提案するバイオチップは、基材となる「紙上に繊維を印刷」することで流路を形成するため、紙中に流路を形成する従来の手法とは一線を画するものである。
初めに、独自の印刷技術による繊維転写の可否について検証した。転写する繊維としてパルプ繊維を用い、蒸留水にパルプ繊維や増粘剤、バインダー、助剤を添加してインクを作製した。ここで、助剤を用いた理由は、インキ特性、印刷適性、流路となる印刷物の強度及び紙層構造、並びに吸液特性を制御する役割を担えると考えたからである。
耐水性の紙基材に独自の方法で繊維等を印刷し、その後、105℃で 15 分間乾燥させ流路を作製した。用いる繊維の繊維長を制御することで、繊維のように粗大な物質も印刷により転写可能であった。作製した流路に水を滴下したところ、
水は流路のみを浸透し、基材や流路外への濡れ拡がりは確認されなかった。この結果から、独自の印刷技術により、従来の紙製バイオチップとは異なる新たなバイオチップの作製が可能であることが示された。
３．流路の構造と液体浸透量の制御
液体は毛管現象により流路を浸透するため、流路を構成する繊維の親水性や繊維間空隙等が液体の浸透性に影響すると考えられる。そこで、流路の構成材料
やインクの配合条件が、液体の浸透に与える影響を調査した。流路の空隙構造を制御するため、パルプ繊維に加えて、副資材として 2 種類の繊維（A 繊維、
B 繊維）を配合して印刷を行った。流路の吸水性を評価する手法としては、垂直給水度測定法を用いた。短冊状（幅 5 mm×長さ 110 mm）にカットした流路の端部を染料溶液に浸し、毛管現象により吸い上げられる染料溶液の高さを測定した。
副資材である A 繊維及び B 繊維を配合して作製した流路の液体浸透性を、垂直給水度測定法により評価した結果、A 繊維及び B 繊維のいずれにおいても、配合量が増えるに従って浸透高さが大きくなる、すなわち、液体の浸透性が向上
することが示された。
A 繊維及び B 繊維の配合量を変えた際の流路断面の電子顕微鏡観察結果から、繊維の種類や配合量の違いにより、流路の構造に明らかな違いが確認され、A
繊維及び B 繊維を配合することで、流路内部に繊維間空隙が多く形成されていた。液体の流路となる空隙が多く形成されたことで、液体浸透性の向上につながったと考えられる。また、流路表面には、バインダーや助剤が流路壁を形成している様子が確認された。以上の結果より、流路の空隙構造や、流路を構成する素材の液体への親和性を変化させることで、液体の浸透性に違いが生じると推測される。すなわち、流路構造の制御により、液体の浸透性を制御可能であることが示唆された。
４．まとめ
本稿では、
「繊維を印刷する」という、一見、印刷分野では邪道とも思われる手法を用いたバイオチップの作製方法について検討した。また、流路の構造により液体浸透性が変化することも確認された。イムノクロマト法等に代表される
ように、バイオチップでは液体の浸透性を制御し、検体が流路を通過する時間を調整することも必要とされる。今回実施した特殊な印刷法では、使用する繊維の種類やインクの調製条件、繊維の転写量を調整することが可能であり、従来の紙製バイオチップと比較して流路設計の自由度が高いため、用途に応じた
バイオチップを提供可能であるといえる。

Developments of paper-based diagnostic devices○Hiromi Uchimura(Paper Ind. Innov. Center, Ehime Univ)

Key words

paper devices, diagnostic

1S-S3p03 ペプチド分子設計による人工ウイルスキャプシドならびに微小管内包分子の創製○松浦 和則（鳥取大・工）ma2ra-k@tottori-u.ac.jp

近年、タンパク質・ペプチドの自己集合構造を合理的に設計することで、様々な人工のナノ構造体を構築することが可能となってきている。本講演では、ペプチドの合理的分子設計による人工ウイルスキャプシドおよび微小管内部結合ペプチドの創製に関する最近の研究を紹介する。
我々は 2010 年に、天然のトマトブッシースタントウイルス(TBSV)のキャプシ
ドの内部骨格モチーフである beta-Annulus 構造を構成する 24 残基ペプチドを合成し、そのペプチド単独で水中で自己集合することで、TBSV キャプシドと同等の 30-50 nm の中空ナノカプセル（人工ウイルスキャプシド）を選択的に形成することを、DLS 測定・TEM 観察・SAXS 測定により見出した[1, 2]。この人工ウイルスキャプシドの zeta-電位の pH 依存性より、C 末端がキャプシド表面に、N 末端がキャプシド内部に配向していることが示唆された。つまり、酸性〜中性 pH においては、人工ウイルスキャプシド内部はカチオン電荷に富んでおり、
キャプシド表面は両性イオン性であることが考えられる。そのため、人工ウイ
ルスキャプシドのカチオン性内部には、アニオン性色素や M13 phage DNA を内包することができた。また、アニオン性 CdTe 蛍光ナノ粒子の内包挙動を、蛍光相関分光(FCS)法により解析し、ペプチドの臨界会合濃度以上において蛍光粒子が内包されることを明らかにした。また、N 末端を Ni-NTA 錯体で修飾する
ことにより、His-tagged GFP を人工ウイルスキャプシドに内包できることも明らかとしている。さらに、ペプチドナノカプセル表面に配向している C 末端側の化学修飾によりキャプシド表面への金ナノ粒子、DNA、コイルドコイル突起、ヒト血清アルブミンなどの表面提示 が可能であることを示してきた。さらに最近、キャプシド表面でリボヌクレアーゼ S (RNase S)を再構成することにより、酵素活性を有する RNase S を表面提示した人工ウイルスキャプシドを創製することにも成功している。
微小管はチューブリンダイマーが重合して形成される内径 15 nm のチューブ構造体であり、ナノデバイスへの応用が注目されている。微小管外部表面への分子修飾による機能化は確立されているものの、その内部空間への分子導入は殆ど注目されていなかった。本研究では、微小管関連タンパク質 Tau の繰り返し配列から 4 つのペプチド 1N, 1C, 2N, 2C を設計し、微小管内部への分子導入を試みた。テトラメチルローダミン（TMR）ラベルした全てのペプチドの微小管への結合が共焦点レーザー蛍光顕微鏡（CLSM）で確認された。特に、1N, 1C,
2C が微小管外部表面に結合するのに対し、2N は微小管内側の疎水性ポケットに結合することが明らかとなった。また、2N を金ナノ粒子（AuNP）に修飾することで、微小管への内包が透過電子顕微鏡（TEM）で確認された[3]。
さらに、2N を用いて微小管内部空間への緑色蛍光タンパク質（GFP）の導入を検討した。そのために、GFP の発色団形成に関与している N 末端から 11 番目
までの β-ストランド（GFP11）と残りのタンパク質（GFP1-10）が再構成して蛍光が回復する Split-GFP を用いた。2N と GFP11 を連結した 2N-GFP11 とGFP1-10 を再構成させることで 2N-GFP を調製し、チューブリンと複合化後にGTP 誘導体により重合することで微小管を作製した。共焦点レーザー顕微鏡（CLSM）により 2N-GFP の微小管への局在が確認された。2N-GFP 複合化微小管に蛍光標識抗 GFP 抗体を添加した結果、抗 GFP 抗体由来の蛍光がほとんど確認できなかった。従って、2N-GFP が微小管に内包されていることが示唆された。興味深いことに、2N-GFP 内包微小管は微小管に比べ 1.5 倍全長が長く、剛直性を表す持続長は 4.3 倍増加した。更に、運動速度は 1.5 倍増加していることが明らかとなった。
以上より、微小管内部に結合する Tau 由来ペプチドの開発に成功し、このペプチドを用いることで微小管内部への機能分子導入を達成した。
[1] K. Matsuura, K. Watanabe, K. Sakurai, T. Matsuzaki, N. Kimizuka, Angew. Chem.
Int. Ed., 49, 9662 (2010).
[2] K. Matsuura, Chem. Commun. (Feature Article), 54, 8944 (2018).
[3] H. Inaba, T. Yamamoto, A. M. R. Kabir, A. Kakugo, K. Sada, K. Matsuura, Chem.
Eur. J., 24, 14958 (2018).

Creation of artificial viral capsids and functional molecule-encapsulated
microtubules by peptide design○Matsuura Kazunori(Fac. Eng., Tottori Univ.)

Key words

peptide, self-assembly, artificial viral capsid, microtubules

88

1S-S3p04 蚕を起点とする持続可能な高付加価値タンパク質生産プ
ロセスの構築

1S-S3p05 モノクローナル抗体迅速探索プラットフォーム技術の社
会実装○神谷 典穂 1,2, 南畑 孝介 1,3, 日下部 宜宏 4
（1九大・未来化セ, 2九大院・工, 3KAICO(株), 4九大院・農）kamiya.noriho.367@m.kyushu-u.ac.jp

生体分子工学（Biomolecular Engineering）という用語は、意図する機能を発現する生体由来分子の設計と評価、さらには社会実装の観点から設計された分子の効率的生産プロセスの構築までを広く包含しており、特に機能評価に時間と労力を要するタンパク質集合系では、分子設計とプロセス工学の共奏が重要視されている [1]。現在、ラボでの基礎研究からバイオリアクターによる商業生産に至る各階層で様々な組換えタンパク質生産系を選択できるようになっているが、微生物発現系では発現困難なタンパク質への適用性と簡便なスケールアップの両立は容易ではない。そのような観点から、我々は蚕−バキュロウイルス
発現系に注目した農工連携共同研究開発を進めている。
例えば診断薬で汎用される西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）は大腸菌での効率的発現が困難な酵素の１つであるが、九州大学農学部の高生産性蚕系統−
バキュロウイルス発現系を利用することで、抗体結合タンパク質（protein G）との融合タンパク質としての発現と、ヘミンの導入による活性化が可能となる[2]。さらに、ビオチンと強く結合する４量体タンパク質である Streptavidin と
HRP との融合タンパク質の発現ならびに活性化も可能であった [3]。これらの結果は、人工補欠分子族が導入された複合タンパク質や、新規多量体型酵素・タンパク質の設計に繋がる可能性を示唆している。
このように、多様な組換えタンパク質にアクセスできるようになると、さらなる高付加価値化の可能性が拡がる。例えば、酵素触媒によるタンパク質架橋反応と組み合わせることで、高分子量のタンパク質重合体を得ることができる。
そこで、チロシン残基を配列中に含むペプチドタグ（Y-tag）を起点とするタンパク質重合体調製法 [4] を利用して、HRP を構成成分とする酵素ポリマー（HRPpolymer）の調製を試みた。Y-tag 導入組換え HRP 水溶液に過酸化水素を適量添加すると、自己架橋反応により高分子量化が進行した。一方、過酸化水素の代
わりにラッカーゼを適量添加しても重合反応は進行し、生成酵素ポリマーの比活性が向上したことから、分子状酸素を酸化剤として利用するより温和な条件下でのタンパク質架橋反応の利点が示された [5]。
蚕−バキュロウイルス発現系は、広い観点からは昆虫機能を活用したタンパク質生産系であり、また、再生可能な植物資源を利用したタンパク質生産系でもある。他の宿主では発現困難なタンパク質を基材とした、より社会的価値の高い機能性タンパク質の生産に繋げていくためには、さらなる分野横断型の共同研究が必要である。

○中野 秀雄 1,2, 加藤 晃代 2, 大内 将司 2, 兒島 孝明 1（1名大院・生命農学, 2iBody株式会社）hnakano@agr.nagoya-u.ac.jp

我々は単一 B 細胞由来の抗体遺伝子とそれがコードする抗体タンパク質を、Fabとして迅速に得られるシステムを開発し、「Ecobody 技術」と称している。まず動物あるはヒトの血液やリンパ節などから B 細胞を取得し、セルソーターや磁気ビーズなどを用いて、目的としている抗原等に結合する細胞を濃縮する。その後一細胞由来の RT-PCR と PCR により、抗体 cDNA の L 鎖と H 鎖の Fab 領
域を増幅し、大腸菌無細胞タンパク質合成系での発現に必要な DNA 配列を付加した後、直ちに無細胞タンパク質合成系により抗体を Fab として合成し、
ELISA 等でのアッセイを行い目的モノクローナル抗体の取得ができる技術である。B 細胞の取得からの一連の操作に必要な時間はわずか２日であり、また全て試薬を加えて混合する簡便な操作の連続であるため、自動化・機械化が容易であり、モノクローナル抗体取得のスループットを飛躍的に高めることが可能である。
一見するとできて当たり前のように思える技術だが、実は抗体を Fab として発現させるところにいくつかのキー技術がある。一般にタンパク質の機能でスクリーングするためには、合成量のばらつきを補正しなければならない。我々は、N 末端の開始コドンの直後に SKIK という短いペプチドタグ配列を挿入すると、合成量が顕著に増大することを見出した。元来大量に合成できるタンパク質の場合にはそれほど増大させるは大きくないが、少ないものほどより合成量の増大効果が顕著であった。このことより Fab 抗体の合成量がほぼ一定になり、クローンごとの差がほぼ消失した。さらに Fa ｂの L 鎖と H 鎖の C 末端にペアとなるロイシンジッパー配列を付加することで、それぞれの可変領域に依存する
Fab の L 鎖と H 鎖との会合が顕著に促進された。主にはこの２つの効果により、一細胞由来の僅かな mRNA から増幅した DNA より、無細胞タンパク質合成系で直接合成した Fab 抗体を用いて、ELISA や免疫染色での機能評価が可能になった。
この技術の社会実装をめざし、名古屋大学発スタートアップとして iBody 株式会社を設立し、活動を開始した。本技術の特性を活かし、マウスでは得ることの困難な小分子に対するウサギモノクローナル抗体や、ヒト健常人や患者サンプルからのヒトモノクローナル抗体開発を行っている。

References[1] A.P.J. Middelberg et al., Trend. Biotechnol., 2005, 23, 523-529.
[2] Patmawati et al., Biotechnol. J., 2018, 13, 1700624.
[3] Patmawati et al., J. Biotechnol., 2019, 297, 28-31.
[4] D. Permana et al., J. Biosci. Bioeng., 2018, 126, 559-566.
[5] D. Permana et al., Biotechnol. J., DOI: 10.1002/biot.201800531.

Sustainable biomolecular engineering based on a silkworm-baculovirous
expression system○Noriho Kamiya1,2, Kosuke Minamihata1,3, Takahiro Kusakabe4(1CFC, Kyushu Univ., 2Fac. Eng., Kyushu Univ., 3KAICO Co.,Ltd., 4Fac. Agric.,
Kyushu Univ.)

Key words

baculovirus, protein expression, sustainability, silkworm

Social implementation of a high-throughput monoclonal antibody screening
platform technology.
○Hideo Nakano1,2, Teruyo Kato2, Shoji Ohuchi2, Takaaki Kojima1(1Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2iBody Inc.)

Key words

high-throughput screening, monoclonal antibody, single cell

89

1S-S3p06 Beyond Q-body: 色素修飾が不要な新規免疫測定素子の構築

1S-S4p01 アミノ酸による出芽酵母の寿命延長機構○水沼 正樹（広島大院・統合生命科学）
mmizu49120@hiroshima-u.ac.jp○上田 宏 1, 安田 貴信 2, 上野 慶行 2, 井上 暁人 2, 髙橋 昌樹 2,
大室 有紀 1, 北口 哲也 1, 董 金華 1,3（1東工大・化学生命研, 2東工大・生命理工, 3濰坊医学院）
ueda@res.titech.ac.jp【背景：Q-body とは】我々は近年，抗体の抗原結合部位を構成する可変領域のアミノ末端近傍にリンカーを介して部位特異的に蛍光色素を修飾することで，抗原不在時にはその蛍光がタンパク内の Trp 残基などにより消光（クエンチ）
しているが，抗原を加えるとクエンチが解消し濃度依存的に蛍光を回復するク
エンチ抗体(Quenchbody, Q-body)が構築できることを見いだした 1,2)。無細胞タン
パク質合成系を用いた非天然アミノ酸導入法，あるいは Cys 残基を持つタグを付加した組み換えタンパク質の色素修飾により構築した Q-body により，これまで各種ホルモンや違法薬物，農薬，ペプチドなどの低分子からインフルエン
ザ HA やアミロイド β オリゴマー 3)など各種高分子タンパク質を高感度に検出することに成功している。しかしこれまで，遺伝子構築から色素修飾まで多くの手間をかけて構築した Q-body から必ずしも良い蛍光応答が得られない，用いる色素によって応答が異なるといった問題の克服が実用上の課題となっていた。今回，これらの課題の回答となりうる方法論をいくつか見いだしたので報告する。
【PM Probe】抗体可変領域の構造はクローン毎にまちまちであり，Q-body への適性（色素の可変領域への入りやすさ，Trp の含量など）はそもそも異なると考えられる。我々は，抗体タンパク質レベルで Q-body への適性を調べるため，
最近報告された抗体結合タンパク質 Protein M4)に注目した。Protein M は多くの抗体の L 鎖に強く結合し，抗体の抗原結合部位近傍にその C 末が位置する。そこで，Protein M の C 末端をリンカーを介して蛍光色素修飾した PM probe を構築し，これと抗体を混ぜるだけで Q-body 化できないか，検討した。この結果，
モデル抗体以外に複数の低分子認識抗体が抗原依存的な蛍光強度変化を示し，適性の高い抗体の簡便なスクリーニング法として機能する事が示唆された。
【CoiledBody】Q-body 構築にあたっては，いずれかの時点でタンパク質に色素を導入する必要があるが，未修飾色素を完全に除去する必要があり，その収率は必ずしも高くない。そのため，色素修飾用のタグの代わりにコイルドコイル
形成ペプチド E45)を付加し，これと強く結合(Kd~4 nM)する K4 ペプチドの C 末を TAMRA で修飾し，両者を混合するだけで Q-body を構築出来ないか検討した。この結果，E4 修飾抗オステオカルシン Fab，および E4 修飾抗メトトレキ
サート VHH ともに Q-body として機能した。さらに K4-TAMRA ペプチドに FITCを導入して用いた所，抗原添加により色素間の FRET 効率が向上し，より高い蛍光応答を示した。また E4 標識抗体断片を酵母表面に提示し，２色標識 K4 ペ
プチドを加えて抗原依存的な蛍光色変化をフローサイトメトリーで識別・選別できることも判明した。
【HiBody】以上は，直接ではないが蛍光色素を抗体に付加してセンサーとして用いている点では Q-body の派生物と言える。最近我々は，Q-body における色
素修飾用タグの代わりに発光酵素 Nanoluc の C 末断片由来 11 アミノ酸からなるタグ配列(HiBiT)を一本鎖抗体 scFv あるいは Fab 断片の N 末に付加し，これに Nanoluc の残りの部分(LgBiT)と基質を添加した場合，抗原の有無により発光値が最大 4 倍変化する現象を見出した。すなわち，Trp による蛍光色素のクエンチでなく，ペプチド配列の抗原依存的な抗原内外への移動を検出するだけで，むしろ Q-body より高い感度で抗原検出を行えることが判明した。ある程度疎水性の高い配列と二つの可変領域断片(VH/VL)間相互作用が弱い抗体であれば抗体内の Trp の数に関わらず同様の現象が見られる可能性があり，新たな免疫検出原理として今後解析を進める所存である。
Reference
1) Abe et al., J. Am. Chem. Soc. 133, 17386-94 (2011).
2) Abe, Jeong, et al. Sci. Rep. 4, 4640 (2014).
3) Dong, et al. Anal. Biochem. 550, 61-67 (2018).
4) Grover et al. Science 343, 656-61 (2014).
5) Litowski et al., J. Biol. Chem. 277, 37272-9 (2002).

アミノ酸は単なる生体分子としてのみならず、発生、代謝、ストレス耐性、老化・寿命など多彩な生理機能を有することが分かってきた。アミノ酸やグルコースなどの細胞内エネルギーは栄養・代謝センシング経路によりモニターされており、本経路はエネルギー代謝恒常性を維持している。栄養・代謝センシング
経路として、IIS（インスリン/IGF-1 シグナル）経路、mTORC1（mammaliantarget of rapamycin complex 1）経路、AMPK（AMP 依存性プロテインキナーゼ）などが著名である。興味深いことに、これら三つの経路は栄養・代謝に関与す
るのみならず、酵母・線虫・ショウジョウバエ、マウスなどのモデル生物の寿命制御にも深く関与することが分かってきた。
この 20 年間のモデル生物を用いた研究から、食餌制限による寿命延長の基本的な仕組みが明らかになり、生物種を問わず共通点が多いことがわかった。食餌制限の中でも、アミノ酸の役割も明らかにされ、特に必須アミノ酸であるメチ
オニン制限は酵母・線虫・ショウジョウバエなどの寿命が延長することが分かってきた。
我々は、新規寿命延長メカニズムを明らかにするため、酵母を使って野生株よりも顕著に寿命が延長した変異株の取得に成功し(変異を SSG1 と命名)、SSG1の機能解析を進めてきた。SSG1 変異株の解析から、寿命延長にアミノ酸の一種であるメチオニン代謝産物・S-アデノシルメチオニン(SAM)が関与することを世界に先駆けて見出した。具体的には、SAM の合成を促進させると、ATP を消費し(SAM は ATP とメチオニンから生合成される)、AMP 依存性キナーゼ
AMPK が活性化し寿命延長する、これまでにない寿命延長メカニズムを提唱した。興味深いことに、SAM の拮抗阻害物質である S-アデノシルホモシステイン(SAH)を添加しただけでも、先と同様のメカニズムにより寿命延長することが分かった。古くから清酒酵母は SAM を高蓄積することが知られていたがこの原因や意義は不明であった。最近の研究から、清酒酵母では、SSG1 が SAM 高
蓄積の一要因であることが判明した。また、SSG1 変異株は酸化ストレスや高温ストレスに対して耐性を獲得したことから、清酒酵母は SAM 合成とカップルした形で清酒醸造中の過酷なストレス環境下に適応していると想像される。即ち、メチオニン代謝はエタノール発酵にも重要な役割を果たすことが予想された。
Ssg1 タンパク質は、薬剤排出トランスポーター MATE ファミリーと相同性を有したことから、Ssg1 は SAM 濃度調節に関わることが予想された。まず、Ssg1の細胞内局在を調べた結果、Ssg1 は液胞膜に局在した。さらに、SSG1 変異株
は SAM/SAH を液胞に高蓄積した。このことから、Ssg1 は SAM/SAH の生合成や液胞輸送に関与するタンパク質であることが示唆された。本シンポジウムでは、Ssg1 タンパク質の機能を通してわかってきた寿命制御における SAM/SAHの役割やその生理的意義などついて議論したい。

Beyond Q-body: Fabrication of immunosensor protein without dye labelingRoles of methionine metabolism in lifespan extension in yeast○Hiroshi Ueda1, Takanobu Yasuda2, Yoshiyuki Ueno2, Akihito Inoue2,
Masaki Takahashi2, Yuki Ohmuro1, Tetsuya Kitaguchi1, Jinhua Dong1,3(1CLS, Tokyo Tech, 2Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech, 3Weifang Med. Univ.)

Key words

biosensor, antibody, flow cytometry, nanoluc○Masaki Mizunuma(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)

Key words

amino acid, yeast, lifespan90

1S-S4p02 アミノ酸（L-トリプトファン）による分裂酵母細胞の生育阻害

1S-S4p03 液胞アミノ酸コンパートメンテーションの機構・生理・応用○北村 憲司 1,2, 永島 直翔 2
（1広島大・自然科学研セ・遺伝子, 2広島大院・統合生命科学）
kkita@hiroshima-u.ac.jp○関藤 孝之 1, 河田 美幸 1,2（1愛媛大院・農, 2愛媛大・学術支援センター）sekito@agr.ehime-u.ac.jp

分裂酵母 S. pombe のユビキチンリガーゼ Ubr11 の機能欠損変異株はオリゴペプ
チドの取り込みと利用ができず、その原因がオリゴペプチド輸送体（Ptr2 とIsp4）の遺伝子発現不全のためであることを報告している。ubr11 欠損株の形質を抑圧する変異の解析から、Ubr11 が分解誘導する基質蛋白質は DNA 結合蛋白
質の Upa1 であることが示唆され、実際に upa1 変異株ではオリゴペプチド輸送体の発現制御が破綻していた。
POT ファミリー輸送体(酵母の Ptr2)はバクテリアからヒトまで保存されたペプ
チド輸送体で、非常に多様な配列のジ・トリペプチドを幅広く輸送できるが、単純なペプチドのみならず複雑な構造の化合物も基質とし、ヒトではペプチド輸送体(PepT1, PepT2)を介して細胞に取り込まれる疾病の治療薬も少なくはない
ため、drug delivery system の観点でも注目されている。我々も、酵母では blasticidin
S などいくつかの抗生物質がペプチド輸送体 Ptr2 を介して取り込まれる必要があることを示している。オリゴペプチドは構成アミノ酸とは異なる生理作用が期待されることから、様々なオリゴペプチドが S. pombe の増殖や生理機能を変化させるかについて調べる過程で、L-トリプトファン(Trp)を含む直鎖ジペプチドが S. pombe の増殖を強く阻害すること、アミノ酸単量体の L-Trp も弱いながら類似の効果を持つことを見つけた。増殖を阻害するアミノ酸は他にもあったが、様々な生物で、Trp は各種生理活性物質の前駆体であるとともに、寿命との関係も示唆されるため、本研究では Trp を中心にその作用機構について調べた。
S. pombe の増殖阻害には Trp ジペプチドが細胞内に取り込まれる必要があり、Trp に関連する数種の物質も阻害効果を示した。Trp は蛋白質合成に利用される
他、出芽酵母 S. cerevisiae では、キヌレニン経路によってキノリン酸（NAD の
de novo 合成の基質）に、またはエールリッヒ経路でトリプトフォールに代謝される。S. pombe はキヌレニン経路を持たないが、エールリッヒ経路で最初に働く ARO8 及び類似の ARO9 に相同性を示す S. pombe の３つの遺伝子(aro8a, b, cと命名)の各々を破壊すると、aro8a の破壊株のみフェニルアラニン要求性を示すものの、いずれも生育自体には大きな影響はなかった。フェニルアラニン要求性は S. cerevisiae の ARO8 遺伝子の強制発現で相補され、ARO9 遺伝子も弱いながら相補した。S. pombe の aro8a 株は Trp に高感受性化したが、３つの相同遺伝子の同時破壊でも相乗効果や致死性は見られず、aro8a は他の２つの相同遺伝子(aro8b, aro8c)とは協調せず独自に機能していた。
アミノ酸の Trp による S. pombe の増殖阻害は培地の窒素源に影響を受け、質的に劣るプロリンが窒素源だと強い増殖阻害効果があるが、アンモニアでは弱く、
またプロリン使用時の感受性を緩和するアミノ酸もあった。Trp の効果は殺菌的ではなく、生存率の極端な減少は認められない。Trp 存在下で液体培養を続けると徐々に生育が回復したが、生育後も Trp には依然として感受性を示すため、耐性変異が生じた細胞が生育したわけではない。更に、増殖阻害が強い条
件では色素が生産されて培地が褐変した。着色には aro8a が必須で、エールリッ
ヒ経路の後半で働く出芽酵母の ARO10 を強制発現すると、色調が薄くなるとともに、増殖阻害も弱まった。aro8a の発現増強でも阻害が緩和されたので、増殖阻害は Trp 自体か、（存在の証拠はないが）エールリッヒ経路以外の反応で代謝・生成された何らかの物質が原因と考えられる。増殖停止時の細胞周期進行への影響などを含め、Trp の細胞生育阻害の詳しい機構について調べている。

出芽酵母において、栄養豊富条件ではアミノ酸が液胞内へ能動的に取り込まれ、細胞内の約 50%が液胞内に存在する。また、飢餓条件でオートファジータンパ
ク質分解によって液胞内に生じたアミノ酸は速やかにサイトゾルへと排出される。液胞内のアミノ酸は細胞内で大きな割合を占め、オートファジー欠損株の生存率は飢餓条件で大きく低下することから、液胞内外へのアミノ酸輸送は生理的に重要な役割を担うと考えられる。また応用面においても、液胞アミノ酸
コンパートメンテーションの強化・改変は効率的な物質生産に向けての新たなアプローチとなりうる。我々は液胞アミノ酸輸送を担う分子装置の同定解析を進め、AVT トランスポーターファミリーに属する Avt1 がヒスチジンと中性ア
ミノ酸全般を液胞内へと取り込む一方で、Avt3、Avt4、Avt6、Avt7 がいずれも幅広い基質特異性を有し、アミノ酸を液胞外へと排出することを明らかにした。
さらに、TOG ファミリーの Ypq1、Ypq2、Ypq3 がそれぞれリジン／アルギニ
ン、アルギニン、ヒスチジンを液胞膜小胞に取り込むことを見出した。しかし依然未同定のトランスポーターが存在すると考えられ、1984 年に報告されたア
ルギニンとヒスチジンの交換輸送活性も長らくその実体が不明であった。我々は塩基性アミノ酸輸送に関わる AVT1 および YPQ1、YPQ2、YPQ3 遺伝子破壊株の交換輸送活性を検討し、Ypq2 を欠損すると活性が大幅に低下することを見出した。さらに、Ypq タンパク質間に保存された PQ モチーフに変異を導入しても、活性が大幅に低下した。これらは Ypq2 がアルギニンとヒスチジンの交換
輸送活性の本体であることを示唆している。我々は、こうしたトランスポーターの同定と並行してその調節機構についても研究を進めている。以前のマイクロアレイ解析では AVT1、AVT4、AVT7 の発現は飢餓条件において GATA 転写因子に依存して誘導されることが示唆されていた。GATA 転写因子はプロリンのような資化しにくい窒素源を代謝する酵素およびトランスポーターの遺伝子発現を誘導し、窒素源の効率的な利用に重要な役割を果たす。我々はリアルタイム
定量 PCR によって AVT ファミリー全７種の発現を再検討し、マイクロアレイと一致した結果を得るとともに、AVT6 の発現が GATA 転写因子に依存することを新たに見出した。また、AVT4 の発現がプロモーター中の GATA 認識配列への変異導入によって抑えられたことから、GATA 転写因子が直接 AVT4 を転写することが示唆された。こうした転写段階での調節に加え、Avt や Ypq タン
パク質のうちいくつかは翻訳後段階での調節も示唆されており、液胞アミノ酸輸送の活性は細胞膜でのアミノ酸取り込みと同様に様々な段階で調節されることが分かってきた。
液胞アミノ酸トランスポーターの生理機能を理解する上で、欠損もしくは過剰発現による表現型は有効な手がかりを与えてくれるはずである。我々はプロリ
ンを窒素源とした培地（SD+Pro）にリジンを添加すると、avt4Δ 株の生育が著しく阻害されることを見出した。またこの条件で avt4Δ 株の液胞内にはリジンが高度に蓄積していた。プロリンを細胞内に取り込むトランスポーター Put4 はグルタミンのような資化しやすい窒素源の存在下では、TORC1 の活性化が引き金となって液胞内へと移行、分解される。出芽酵母はリジンを窒素源として利用できないにも関わらず、avt4Δ 株では、TORC1 の基質である Sch9 のリン酸化と Put4 の液胞内への移行がともに野生株より長期間持続することが分かった。このことは液胞内に蓄積したリジンが TORC1 の活性に作用する可能性を示す。近年、動物細胞ではリソソーム内のアミノ酸が mTOR に作用し、活性を制御するとのモデルが提唱されている。我々の結果もこれと一致し、液胞内のアミノ酸が単なる栄養源としてではなく、シグナル分子としてアミノ酸代謝調節の根幹を担う可能性を示している。
液胞など内膜系のトランスポーターの研究は端緒についたばかりである。我々を含め最近の研究によって液胞膜では細胞膜と同様に多くのトランスポーターが厳密な制御を受け、アミノ酸を輸送することが分かってきた。さらに、液胞膜ではアミノ酸だけでなく多様な物質が液胞内外へと輸送される。将来、液胞
膜局在性トランスポーターの機能や局在の改変により、有用物質の高度蓄積や細胞外排出能を賦与した新規有用酵母株の開発が可能と考えている。

L-tryptophan-induced inhibition of cell growth in fission yeast S. pombe

The mechanism, physiology and application of vacuolar amino acidcompartmentation○Kenji Kitamura1,2, Naoto Nagashima2(1Gene Sci., N-BARD, Hiroshima Univ., 2Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima
Univ.)

Key words

Schizosaccharomyces pombe, growth inhibition, dipeptide, tryptophan○Takayuki Sekito1, Miyuki Kawano-Kawada1,2(1Grad. Sch. Agr., Ehime Univ., 2ADRES, Ehime Univ.)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, vacuole, amino acid transporter, autophagy

91

1S-S4p04 清酒醸造におけるアミノ酸高生産酵母の積極的活用○小高 敦史（月桂冠・総研）
a_kotaka@gekkeikan.co.jp

清酒の味に寄与する成分として，糖，有機酸，アミノ酸などがある．糖は甘味，
有機酸は酸味，アミノ酸は甘味・苦味・旨味などを呈する．糖や有機酸のバラ
ンスを変えることによって甘口・辛口など様々なタイプの清酒が造られる．それに対し，アミノ酸は多すぎると雑味と感じられるため，低く抑えられることが多い．清酒もろみにおけるアミノ酸の生成は，麹の酵素による米タンパク質の分解によるものと，酵母の生合成によるものがある．また，酵母が死滅することによって，菌体内のアミノ酸が清酒もろみ中に放出される．このようなことから，プロテアーゼ活性の低い麹菌株の使用や，酵母の死滅を抑えるような発酵管理などにより，清酒もろみ中でのアミノ酸の生成を抑えている．一方，個々のアミノ酸に目を向けてみると，呈味性の良いアミノ酸や，生理機能を持ったアミノ酸がある．このようなアミノ酸のみを清酒もろみ中で増やすことができれば，差別化された清酒および酒粕を製造することができる．
この目的を達成するために我々は，アミノ酸高生産酵母を積極的に活用することにした．まず，アミノ酸アナログ耐性を指標にアミノ酸高生産酵母の選抜を試みた．各種アミノ酸アナログ耐性株を取得し，小仕込み試験にて評価したと
ころ，プロリンアナログであるアゼチジン-2-カルボン酸（AZC）に耐性を示した株の中から高頻度でプロリン高生産株を見出すことができた．得られた変異
株の変異点を調べたところ，多くの変異株は α-グルタミルキナーゼをコードする PRO1 に変異が入っていることが確認できた．このような変異株は，プロリンによるフィードバック阻害が解除されていると報告されている 1)．また，変異型 PRO1 がホモに導入されている株は，変異型 PRO1 がヘテロに導入されている株と比べて，AZC 含有培地での増殖が良好であり，清酒小仕込み試験でプ
ロリンをより高生産した．
一方，プロリン高生産株の多くがコハク酸低生産となっていた．α-ケトグルタ
ル酸からプロリンへのフラックスが増大し，α-ケトグルタル酸からスクシニルCoA，コハク酸の合成が減少したのではないかと推察している．プロリンは甘味，コハク酸は旨味のある酸味であることが知られている．そこで，本菌株は淡麗辛口清酒の呈味性改良への応用が考えられた．小仕込み試験を行ったところ，変異株は親株に比べて α-ケトグルタル酸，コハク酸，グルタミン酸の含量が低く，リンゴ酸含量がやや高く，ピログルタミン酸，プロリンの含量が高く推移した．上槽酒の日本酒度，アルコール分，アミノ酸度は親株とほぼ同じであったが，変異株は親株より酸度が低く，官能的にも酸味が抑えられた淡麗辛口な酒質であると評価された．また，実地醸造においても同様の結果が得られ，本菌株が産業上有用であることが示された 2)．
現在，酒粕についての解析や，他のアミノ酸アナログ耐性株についての詳細な検討を行っている．
1) Takagi, Biosci. Biotechnol. Biochem., doi: 10.1080/09168451.2019.1576500
2) Kotaka et al., J. Brew. Soc. Japan, in press

1S-S4p05 アミノ酸の代謝制御・生理機能に着目した酵母の高機能開発○高木 博史（奈良先端大・バイオ）hiro@bs.naist.jp

微生物におけるアミノ酸代謝とその制御機構は生育環境や代謝様式などで異なり、複雑かつ頑強なネットワークを形成し、様々な代謝経路・産物やシグナル分子の制御系とのクロストークも存在する。学術的には、それらの仕組みを解明し、生命現象を理解することが重要である。一方、細胞内アミノ酸含量を人為的に制御することで、発酵食品・エタノール・有用物質などの生産性改善、食品の高付加価値化（味・風味の差別化、健康機能性の向上など）が期待できる。本講演では、酵母に見出したアミノ酸の代謝制御機構と生理機能に関する基盤的知見および得られた知見を酵母の高機能開発に応用した例を紹介する 1)。
プロリン（Pro）・アルギニン（Arg）2)-11)
酵母 Saccharomyces cerevisiae において、Pro が種々のストレスから細胞を保護すること、γ-グルタミルキナーゼ GK のアミノ酸置換（D154N, I150T など）により、フィードバック阻害感受性が低下し、Pro が過剰合成されることを明らかにした。また、パン酵母で Pro を蓄積させると、冷凍・高糖生地の発酵力が向上し、Pro の有用性が実証できた。一方、Pro の生理機能としては、ROS レベ
ルの制御、リボファジーへの関与、細胞寿命の延長などが示唆された。さらに、
N-アセチルトランスフェラーゼ Mpr1 を介して合成される Arg からフラボタン
パク質 Tah18 依存的に一酸化窒素（NO）が合成されること、Dre2 タンパク質が NO 合成を制御することを見出した。NO は転写因子 Mac1 を活性化し、Cu+
輸送体 Ctr1 の発現誘導による細胞内 Cu+の増加とスーパーオキシドディスム
ターゼ Sod1 の活性上昇により、高温ストレス耐性に寄与すると考えられる。
同様の機構はパン酵母にも存在し、Pro と NO の合成系強化により、製パンス
トレス（冷凍、乾燥）に対する耐性と発酵力が向上した。
ロイシン（Leu）12)
沖縄の蒸留酒「泡盛」は香りと味に特徴があり、それらの生成には酵母が関与する。清酒、パンの主要香気成分（吟醸香、バナナ香）である酢酸イソアミル
は、前駆物質のイソアミルアルコールがエステル化して生成される。酢酸イソ
アミルの生成に必須であるロイシン（Leu）の合成は、α-イソプロピルリンゴ酸
シンターゼ IPMS の活性が Leu によるフィードバック阻害を受けることで制御されている。我々は泡盛の高付加価値化を目指し、泡盛酵母の Leu アナログ
（TFL）耐性変異株から Leu 蓄積株を分離した。また、小仕込み試験を行い、親株に比べて酢酸イソアミル含量が増加した菌株を取得し、IPMS のアミノ酸置換（S542F, A551V）がフィードバック阻害解除、TFL 耐性および Leu 高生産の原因であることを明らかにした。本研究は泡盛酵母の育種に関する初の成果であり、本菌株で製造した泡盛は香味性向上と特徴的風味が認められ、2016 年に商品化された（HYPER YEAST 101）。
バリン（Val）13),14)
必須アミノ酸として、またイソブタノール前駆体として重要な Val の高生産を目的に、大腸菌の情報をもとにアセトヒドロキシ酸シンターゼ（AHAS）の調
節サブユニット Ilv6 にアミノ酸置換（N86A, G89D，N104H）を導入したところ、Val による AHAS フィードバック阻害が解除され、細胞内 Val 含量が著しく増加した。また、2 種類の分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（Bat1,
Bat2）を解析した結果、両酵素自身の活性や機能に差はなく、ミトコンドリア
局在が効率的な Val 合成や細胞の生育に重要であることが示された。
Takagi, Biosci. Biotech. Biochem., in press. doi: 10.1080/09168451.2019.1576500.
Sekine et al., Appl. Environ. Microbiol., 73, 4011, 2007. 3)Kaino et al., Appl. Environ.
Microbiol., 74, 5845, 2008. 4)Sasano et al., Int. J. Food Microbiol., 152, 40, 2012.
5)
Tsolmonbaatar et al., Int. J. Food Microbiol., 238, 233, 2016. 6)Takagi et al., Yeast, 33,355, 2016. 7)Nasuno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110, 11821, 2013. 8)Nishimura
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 430, 137, 2013. 9)Nasuno et al., PLoS One, 9,
e113788, 2014. 10)Yoshikawa et al., Nitric Oxide, 57, 85, 2016. 11)Sasano et al., Microb.
Cell Fact., 11:40 doi:10.1186/1475-2859-11-40, 2012. 12)Takagi et al., J. Boiosci.
Bioeng., 119, 140, 2015. 13)Takpho et al., Metab. Eng., 46, 60, 2018. 14)Takpho et al.,Microb. Cell, 5, 293, 2018.
1)
2)

Utilization of the sake yeast strains producing large amounts of amino acids○Atsushi Kotaka(Res. Inst., Gekkeikan Sake Co., Ltd.)Key words

sake yeast, amino acid, amino acid analogue

Functional amino acid engineering in yeast focused on metabolic regulations
and physiological functions○Hiroshi Takagi(Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)

Key words

yeast, amino acid, metabolic pathway modification, functional property

92

1S-S4p06 スフィンゴ脂質の健康機能性

1S-S4p07 植物・真菌由来スフィンゴ脂質の消化管への機能性

植物由来グルコシルセラミドや牛乳由来スフィンゴミエリンなどの「スフィンゴ脂質」が、「食品セラミド素材」として注目されてきている。セラミドとはス
フィンゴイド塩基に脂肪酸がアミド結合した構造であり、スフィンゴ脂質の基本骨格ともなる。皮膚の最外層である表皮にセラミドが多く存在し、皮膚バリ
ア機能に深く関わっていることから、スフィンゴ脂質の経口摂取による皮膚バ
リア向上作用が期待されており、実際に多くの効果が報告されている。しかしながら、「どんな食品に、どんな化学構造のスフィンゴ脂質がどれくらい含まれているのか」、「どのように消化されて、体内に吸収されるのか」、「どのように
体に（皮膚に）作用するのか」といった、食品成分や栄養素としての情報は、他の脂質成分に比べて極めて乏しい。そこで我々は、スフィンゴ脂質の定量法
や化学構造の解析法を検討し、それらを応用することで、スフィンゴ脂質の健康機能性の評価を進めている。
ヒトを含むほ乳動物において、セラミド骨格を担う主要なスフィンゴイド塩基
は、炭素数 18 のスフィンゴシンである。しかしながら自然界には、炭素数や二重結合の数が異なるスフィンゴイド塩基分子種も数多く存在し、その組成や構造は生物種によって異なることが知られている。高等植物においては、ジヒド
ロキシ型の 8-スフィンゲニンや 4, 8-スフィンガジエニン、トリヒドロキシ型の4-ヒドロキシ-8-スフィンゲニンといった 8 位に不飽和結合をもつスフィンゴイ
ド塩基分子が主要である。また、キノコや酵母といった真菌類の一部には、9メチル-4,8-スフィンガジエニンが、海産無脊椎動物には 17 や 19 といった奇数の炭素鎖や、二重結合を 3 つもつスフィンゴイド塩基が確認されている。食品中の主要なスフィンゴ脂質は、畜産物に含まれるスフィンゴミエリンと、穀類や豆類、野菜類などの農産物に含まれるグルコシルセラミドである。農産物のグルコシルセラミド含有量を測定したところ、可食部 100 g あたり 1〜10 mg 程度であり、穀類や豆類では 10〜40 mg/100 g と比較的多く含まれていることがわかった（Lipids, 34, 1231, 1999）。また、海産物では、魚類の脳にスフィンゴ脂質が多いことや棘皮動物であるナマコにグルコシルセラミドが多く含まれていることも示された（J Oleo Sci 59, 509, 2010）。
経口摂取されたスフィンゴ脂質は、極性基（リン酸コリンや糖）、脂肪酸、ス
フィンゴイド塩基といった構成単位に消化された後、それぞれが小腸上皮細胞から体内へと吸収される。動物細胞に主要なスフィンゴイド塩基であるスフィ
ンゴシンは、小腸上皮細胞に取り込まれた後、一部はスフィンゴ脂質に再利用されるが、大部分は脂肪酸に代謝変換されることが示されている。一方、我々は植物型スフィンゴイド塩基は、スフィンゴシンと比べて小腸上皮細胞から吸収されにくいことを見出した（J Nutr 133, 2777, 2003; J Lipid Res 51, 1761,
2010）。スフィンゴシン以外のスフィンゴイド塩基は、薬物排出トランスポー
ターである P-糖タンパク質によって、細胞外へ排出されることも示唆された（Biosci Biotechnol Biochem 68, 2541, 2004; J Nutr Sci Vitaminol 63, 44, 2017）。セラ
ミドがそのまま吸収されるか否かはこれまでに直接的には示されていなかったが、スフィンゴミエリン投与後のラットリンパ液から、その組成に類似したセラミド分子種が検出され（Lipids 50, 987, 2015）、さらに菌体由来の遊離セラミドを経口投与したマウスの血中からも、その組成に類似したセラミド分子種が検出されたことから、セラミドの一部は、分解を受けずに直接吸収される可能性が高いと考えられる。
植物由来グルコシルセラミドや牛乳由来スフィンゴミエリンの摂取による皮膚バリア改善作用が報告されており、我々もまたその効果を動物実験にて確認している（Exp Dermatol 21, 448, 2012; J Dermatol Sci 78, 224, 2015）。前述のようにスフィンゴ脂質の吸収率は極めて低く、経口摂取されたスフィンゴ脂質が皮膚に到達して再利用されている可能性は考えにくい。さらには、摂取されたスフィ
ンゴ脂質と表皮に含まれるセラミドの化学構造は、厳密には異なるにも関わらず、皮膚に対する効果が認められている。ナマコ由来グルコシルセラミドでも同様の効果が確認され（J Agric Food Chem 64, 7014, 2016）、異なる化学構造のスフィンゴ脂質でも皮膚に対する効果に大きな違いがないことから、直接的な影響ではないことが考えられる。スフィンゴ脂質摂取による表皮セラミド合成
酵素の発現上昇が確認され、内因性スフィンゴ脂質の合成を促進することが皮膚バリア機能向上作用の機構の一つとして推測される。一方で、ナマコ由来グ
ルコシルセラミドの摂取による盲腸内短鎖脂肪酸の増加も確認しており、スフィ
ンゴ脂質の摂取が腸内環境に与える影響にも興味がもたれる。

スフィンゴ脂質は真核生物の生体膜の構成脂質として普遍的に存在している,各種クロマトグラフ法並びに質量分析法等の分析技術の進歩によって,これらの脂質群の化学組成が明らかになりつつある。近年では医学生物学の分野においてこれらの脂質群の重要性が認識されてきた。特に,１９９０年代 Merrill らの研究グループが発がんに関わるプロテインキナーゼ C の特異的阻害剤という報告(その後特異的の部分は否定されました。) から始まり、その後、当時話題となっていたプログラム細胞死（アポトーシス）誘導へのセラミドのセカンドメッセ
ンジャーとしての関与、スフィンゴシン１リン酸と細胞増殖並びに遊走への関与並びに受容体の発見等、細胞内情報伝達物質としての機能が注目され始めた。
また,農学的な機能性食品としての可能性については,Merrill らの研究グループの Schemltz らが哺乳類由来のスフィンゴ脂質で大腸がん予防効果を実験動物で初めて証明した。また,マイコトキシンである fumonisin はスフィンゴイドからセラミドへの生合成を阻害することが認められた 5。以上のことから,スフィン
ゴ脂質の各種生物活性について,現在多くの知見が集まりつつある。しかしながらグリセロリン脂質が様々な生物現象に,セカンドメッセンジャーなどのシグナ
ル分子として作用している点や,プロスタグランジンをはじめとする脂肪酸の生理機能はかなりの部分明らかになっているが,スフィンゴ脂質がこれらに比較す
るといまだに不明な点が多い本シンポではではスフィンゴ脂質の中でも哺乳類と構造が異なる植物由来のスフィンゴ脂質の化学特性を哺乳類と比較しつつ解説したのち,食品機能性、特に,消化器官に対する機能性について,最近の知見を交えつつ発表する。
１. 大腸腺腫(ポリープ)への機能(１)
Schemltz らが哺乳類由来のスフィンゴ脂質を発表したことから,筆者らは植物や真菌由来のスフィンゴ脂質の大腸がんへの効果について調べた。また,セラミドやスフィンゴイド塩基には食餌性植物並びに真菌（酵母）由来グルコシルセラ
ミド(GlcCer)は 1,2 ジメチルヒドラジン塩酸塩(DMH)誘導大腸腺腫発症を抑制す
ること見出した。上の細胞系での研究と実験動物による研究の結果より,スフィ
ンゴ脂質は,大腸ガンに対して,１. 発症予防,２. 大腸ガン自体の排除（がん細胞の排除）、の２つの機能が考えられる。すなわち,動物実験の成績より,大腸ガンの前段階である,ACF の発症を抑制し,スフィンゴイド塩基やセラミドが大腸ガン細胞に対して,アポトーシスを誘導することである。今後実験動物系での大腸ガン発症系での長期投与実験を行うことも重要である。また,最近問題化している de novo 型大腸ガン（腺腫を経ずに直接癌が粘膜に生じる）への効果についても今後の課題である。
２. 腸管炎症に対する機能(2.3.4)
DMH 投与大腸ガンモデルマウスにおいて大腸腺腫発症抑制効果を見出し,この実験中に観察した大腸表面部の形態より食餌性スフィンゴ脂質は,大腸発ガン予防効果のみならず,抗炎症作用も期待できる所見を得た。そこで,デキストラン硫
酸ナトリウム(以降 DSS)を用いた腸管炎症モデル動物系での,食餌性グルコシル
セラミドの影響を調べた。その結果,グルコシルセラミド摂取は,DSS による大腸の炎症に伴う体重の減少を抑制することを見出し, またこの時,食餌性グルコ
シルセラミドは炎症性サイトカイン並びにケモカインを抑制することを報告した。すなわち食餌性グルコシルセラミドは腸管の炎症を抑制するので,そのメカニズムを解明する目的で,この機能の詳細を解明する目的で腸管モデル細胞である分化型 Caco-2 細胞を用いて炎症性ストレスを与えた場合のスフィンゴ脂質の影響を研究した。すなわち Caco-2 細胞を 3 週間コンフルエント状態で培養し，分化 型 Caco-2 細胞 を誘導し た。これ に炎症 性刺激 として LPS (0〜50 μg/mL),TNF-α (0〜50 ng/mL)を用いた。スフィンゴ脂質 (グルコシルセラミド[GlcCer],ガラクトシルセラミド [GalCer]等)を 0〜50 μM 添加し,細胞数の変動,細胞核の DAPI 染色による核の形態観察 4),抗体アレイを用いたサイトカインの変化,TLC 分析等を詳細に調査した。分化型 Caco-2 細胞において LPS 及び TNF-α
添加群では細胞増殖の抑制並びにアポトーシス細胞の有意な増加が観察された。
一方,スフィンゴ脂質の添加がこれらの現象を抑制しました。すなわち,スフィン
ゴ脂質は細胞外からの炎症ストレスを緩和する可能性が示唆されました。また,
サイトカインについて抗炎症性サイトカイン及びその他因子に関して顕著な差は確認されなかったが,一方で炎症性刺激によって誘導された炎症性サイトカイ
ン並びにケモカインはスフィンゴ脂質添加により抑制傾向を示しました。また,
この傾向は MIF,IL-6, IL-8, IL-18, ICAM-1 で顕著であった。さらに TLC 分析の結果ではスフィンゴ脂質が細胞表面においてその存在が確認され,この炎症緩和作用の作用箇所が細胞表面であることが示唆された。1. J Oleo Sci|, 2005, 54,
45-49. 2. J Oleo Sci 2017, 66, 1337-1342. 3. J. Oleo Sci. 2015, 64, 737-742, 4. J. Oleo
Sci. 66 1337-1342

Function of dietary sphingolipids for health

Effect of plant/fungi origin sphingolipid in diigestive tract○菅原 達也（京大院・農）sugawara@kais.kyoto-u.ac.jp○Tatsuya Sugawara(Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)

Key words

food function, intestinal absorption, skin, sphingolipids○木下 幹朗（帯畜大・食品科学）
kinosita@obihiro.ac.jp○Mikio Kinoshita(Dept. Food Sci., Obihiro Univ. Agric. Vet. Med.)Key words

sphingolipid, cerebroside, inflammation

93

1S-S4p08 腸内細菌によるグルコシルセラミドの分解

1S-S4p09 アジア人の食習慣と腸内細菌叢と健康に関する研究

スフィンゴ脂質の摂取は、抗大腸癌、抗炎症性腸疾患、抗アトピー性皮膚炎、美肌効果などの多様な作用を持つことが報告されている。天然のスフィンゴ脂質の給源としては、動物性のスフィンゴミエリンと植物性のグルコシルセラミ
ド(GluCer)が代表であるが、これらを摂取した場合はいずれもセラミドやスフィ
ンゴイド塩基に分解されてから吸収されると考えられている。近年は、多くの植物性食品に含まれていることから GluCer が注目されているが、GluCer は小腸で分解されにくく、摂取した GluCer の多くが大腸にまで流下すると考えられる。このことは、宿主の分解酵素の活性が低いことだけでなく、スフィンゴシ
ン以外の化学構造のスフィンゴイド塩基は P-糖タンパク質による排出を受けやすいことも関係している。しかし、大腸には多種多様な腸内細菌が生息しているので、その中には GluCer 水解能を持つものが存在する可能性がある。腸内細菌の利用により GluCer からセラミドへの水解を増強すれば、食事性の GluCerの生理効果が更に高まると予想し、GluCer 水解能を持つ腸内細菌の探索を行ったので、その結果を報告する。ヒトの腸内細菌やラットの盲腸内細菌の中にグ
ルコシルセラミダーゼ活性を持つものが存在することが報告されているが、我々が調べた限りでは、ヒトやラットの消化管内に GluCer 水解菌が必ずしも存在す
るわけではなく、これはイヌ、ネコ、ブタ、ウシ等の他の動物でも同様であった。むしろ、消化管内に GluCer 水解菌を保有する個体の方が希少であった。このことは、食事性 GluCer がほとんど分解や吸収を受けずに糞中に排泄されるという報告と一致する。動物の糞便より単離された GluCer 水解菌としては、Blautia
glucerasea と Glucerabacter canisensis があり、どちらも Clostridium クラスター
XIVa に属する菌であり、GluCer をセラミドに水解したが、セラミドからスフィ
ンゴイド塩基への分解は行わなかった。また、ある動物個体の糞中混合細菌には、B. glucerasea も G. canisensis も存在しないにもかかわらず、GluCer の分解活性を示すものがあることから、これら以外の GluCer 水解菌も存在すると考えられ、動物個体によっては複数種の GluCer 水解菌が消化管内に生息する可能性もある。GluCer または GluCer 含有食品を給与したマウスに、G. canisensis を経口投与したところ、糞中に排泄される GluCer の量が低下した。このような
GluCer 水解菌を腸管内で増やすことができれば、消化管内での GluCer からのセラミド産生が増加すると考えられる。デキストラン硫酸 Na を用いて腸炎を発症させたマウスに、G. canisensis を用いて調製したセラミドを供与したとこ
ろ、血便や軟便といった症状は改善され、その程度は GluCer を供与した場合よりも大きかった。このことは、食事性 GluCer よりも食事性セラミドの方が生理効果が高い事を示しており、より分解された形であるセラミドの方が吸収されやすいのであろう。従って、GluCer を含む植物性食品を摂取した場合に、GluCer
水解菌をプロバイオティクスとして使用することで、GluCer 利用量が増加すると考えられ、今後はその機能を応用することが期待される。

ヒト腸内に共生する数百種・数十兆個から成る腸内フローラと呼ばれる細菌群
集は、宿主が摂取する食物の消化残渣を大腸にて代謝し、宿主の健康に大きな影響を与えている。よって、腸内フローラはヒトの第三の臓器とも言われており、医学分野を始め、多くの研究が最近盛んになされている。特に、食との関係については、「何を食すると、どのような腸内細菌叢が構築され、それがどのように宿主の健康に影響を与えるか？」という疫学的な調査も盛んに行われている。そのような中、我々は、多様でユニークな食文化と健康長寿を誇るアジ
ア人の腸内フローラに興味を持ち、アジア 10 か国の共同研究者と研究コンソー
シアム（Asian Microbiome Project）を設立し、その調査を行ってきた。その結果、(1)アジア人の腸内フローラは発展途上国型と先進国型の二つに大きく分かれること、(2)国の食習慣を反映した特徴が腸内フローラに見られること、(3)中でも日本人の腸内フローラはビフィズス菌を多く保有するなど特徴的であること、(4)発展途上国では、食の西欧化とともに短鎖脂肪酸の腸内発酵量が低減す
るなど、野菜・穀類を中心としていた頃に保持していた優良な腸内フローラの機能が失われつつあること、(5)アジア伝統食品の中には腸内フローラを優良化する成分が含まれること、以上が示された。総じて、アジアの優良な食習慣が腸内フローラに反映されているものの、食の近代化によりその崩壊が始まって
おり、レトロスペクティブにアジアの伝統食を研究しながら、食育と食創を展開させることの重要性が明確に示された。
一方、日本人の腸内細菌叢はアジアの中においても、いち早く近代化を成し遂げた先進国の側面と、世界で一二を争う長寿国としての両側面から大変興味が持たれる。我々は、最近、116 名の日本人成人の糞便細菌叢を、細菌組成に基づいてクラスタリングすると、7 つの特徴的な細菌組成を有するグループが構成され、各グループがそれぞれ特徴的な食習慣や生活習慣とリンクしていることを見出した。特に、高脂肪食、低食物繊維食、多飲酒や日々の服薬、等が特定のグループに相関していた。また、さらにそれらの食習慣や生活習慣に相関するグループは、糞便中の一次胆汁酸の比率が高く、逆に酪酸量が少なく、腸内フローラの重要な機能である胆汁酸代謝能と酪酸発酵能が減弱していることが示された。このように腸内フローラについて、構造と機能の両面から集団においてきちんと観察することにより、食が腸内フローラに与える影響について
俯瞰的に捉えることが可能となることが明示された。
近代化が着々と進むアジア各国において、アジア人が現代食と向き合いながらどのように健康をどのように維持していくべきか、腸内フローラの研究から一つの解決の糸口が見出されると期待される。

Degradation of glucosylceramide by intestinal bacteria

Asian Microbiome Project: Study on gut microbiota as interface between
diet and health○浅沼 成人（明治大・農）asanuma@meiji.ac.jp○Narito Asanuma(Sch. Agric., Meiji Univ.)

Key words

intestinal bacteria, ceramide, glucosylceramide, probiotics○中山 二郎（九大院・農）nakayama@agr.kyushu-u.ac.jp○Jiro Nakayama(Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words

microbial flora, Asia, gut, diet

94

1S-S4p10 食物繊維と 腸内細菌叢

1S-S4p11 高齢者の食習慣と腸内細菌叢の多様性

はじめに
日本の食文化の要となる米の消費量は減少し、小麦文化の象徴であるパン食が増加している。また現在では糖尿病患者の増加に伴い、低炭水化物食の流行の兆しがみられ、米への関心がさらに揺らいでいる。戦前には 1 日当たり 25g 以上を示した食物繊維摂取量は米の消費量低下とともに減少し、1970 年頃には 1
日当たり約 15g となり、現在までほぼこの値（平成 29 年の国民健康・栄養調査
結果では、20 歳以上の男女の１日平均食物繊維摂取量は男性が 15.2g、女性が14.8g）で推移している 。食物繊維摂取量の目標量（生活習慣病の予防が可能となる摂取量であり、2015 年版食事摂取基準の目標量は、18 歳から 69 歳まで男性は 20g、女性は 18g、70 歳以上では男性 19g、女性 17g ）を満たすためには、
１日当たり 4g から 5g の食物繊維量を増やす必要がある。
最近の食物繊維摂取と健康に関する疫学研究では、食物繊維はまだまだ未知の機能性を保有していることを示唆している。例えば食物繊維を 1 日当たり 30g
以上摂取している高齢者はがんや心臓病、脳卒中、糖尿病、肺炎などの呼吸器疾患、抑うつや認知障害などの罹患リスクが低く、高齢になっても元気な老人でいる可能性が高い（J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 2016）。また動物実験によると、認知能力の低下を招く脳の免疫細胞の慢性的炎症を抑制する作用が水
溶性食物繊維に存在することが示唆されている（Front. Immunol.,2018）。このよ
うに、食物繊維は便通改善や血糖・脂質代謝を改善するばかりでなく、長寿要因の１つとなることが明らかにされつつある。

【目的】現在、我が国は超高齢社会に突入し、要介護認定者数が年々増加している。通所リハビリテーションは高齢者の心身機能、活動、社会参加を最大限に発揮できるように支援する介護予防サービスであり、介護予防の中で栄養も重要視されている。本研究は、通所リハビリテーション施設に通う高齢者の食習
慣、生活習慣や排便習慣の実態について明らかにし、その評価として対象者の便検体を分析し、高齢者の食事や生活習慣と腸内細菌叢との関連について検討したので報告する。
【方法】調査期間は 2018 年 9〜10 月、調査対象者は福岡県 O 市の同意の得られた通所リハビリテーション施設に通う高齢者 80 名（男性 23 名、女性 57 名）である。調査内容は食事や生活習慣、排便習慣、体質と健康、腸内細菌叢である。
腸内細菌叢の分析は(株)テクノスルガ・ラボに依頼し、次世代シーケンサー・
アンプリコン解析で行った。腸内細菌の種数（多様性）は 129 属において各対象者に検出された腸内細菌をカウントし、中央値で低多様性群、高多様性群の2 群に分け解析を行った。解析には統計解析ソフト「IBM SPSS Statistics ver.22」を用いた。食事や生活習慣、排便状況、腸内細菌叢の結果は χ2 検定を行い、有意水準は 5%未満とした。本研究は中村学園大学の倫理委員会からの承諾を得て実施された。
【結果】対象者の BMI は、18.5 未満の割合が男性、女性それぞれ 13.0％、28.6％であった。排便習慣では便秘薬服用者が男性、女性それぞれ 39.1％、35.1％であり、便秘薬服用有り、無しにおいて排便回数 1 日 1 回未満は男性、女性それぞれ 41.4％、29.4％であった。生活習慣と排便習慣との関連では 1 日の水分摂
取量がコップ 5 杯以上とコップ 5 杯未満で比較した結果、「排便の量」をバナナに例え中バナナ 1 本(約 100g)以上はそれぞれ 50.0％、22.2％であり（p ＜ 0.05）、
現在歯数が 10 本以上と 10 本未満で比較した結果、中バナナ 1 本以上はそれぞれ 52.6％、21.4％であった（p ＜ 0.05）。食習慣と排便量との関連では、中バナ
ナ 1 本以上の排便量は「ヨーグルト」を毎日食べる、毎日食べないがそれぞれ64.3％、23.5％であり（p ＜ 0.05）、「海藻類」を 1 日 1 回以上食べると食べないがそれぞれ 59.1％、14.8％であった（p ＜ 0.05）。対象者の腸内細菌の種数（多様性）については、「要介護度」で要支援、要介護の高多様性群はそれぞれ
71.4％、26.3％であり（p ＜ 0.05）、「朝食タイプ」で和食タイプと和洋折衷タイ
プでそれぞれ 58.3％、11.1％であった（p ＜ 0.05）。食品において「海藻類」で
1 日 1 回以上食べると食べないの高多様性群はそれぞれ 61.1％、26.7％であった（p ＜ 0.05）。
【考察】通所リハビリテーション施設に通う高齢者は BMI が低いという問題点が抽出され、3 人に 1 人が便秘であることが示唆されたため、低栄養予防と腸内環境改善の食事の支援が重要であると考えられる。特に、腸内細菌の多様性を高める朝食は和食でプレバイオティクス食品である海藻類やプロバイオティ
クス食品であるヨーグルトを取り入れることが重要であり、現在、中医学を基本とした潤腸通便作用のある食材も取り入れた日本型薬膳メニューの開発に取り組んでいる。さらに、要介護に比べ要支援が腸内細菌の種数が多様であった
ことから、高齢者の自立を支援するための食のサポートも重要であると考えられる。

○徳井 教孝（中村学園大・薬膳科学研）
yakuzen2010@nakamura-u.ac.jp

長期食生活調査における食物繊維摂取量の算定
日常の食生活における食物繊維摂取量を検討した研究が少ないため、福岡県在住の女性を対象に四季 16 週間の食事記録を実施して食物繊維摂取量を算定した。食事記録データが有効であった 34 名のデータを用いて、総食物繊維、水溶性食物繊維、不溶性食物繊維の摂取量を算出した。また、どの食品から食物繊維を摂取しているかを明らかにするため、各食品からの食物繊維摂取量の全食
物繊維摂取量に対する寄与率を上位 50 まで求めた。16 週間の総食物繊維、水溶性食物繊維、不溶性食物繊維の 1 日平均摂取量は、それぞれ、9.5±4.9g、
1.6±1.1g、7.7±3.8g であり、総食物繊維摂取量は 10g 未満の低い値を示した。食品別食物繊維摂取量は、総食物繊維では精白米が全総食物繊維摂取量の 10.3%と最高の割合を示し、上位 50 食品で全体の 86.7%を占めた。水溶性食物繊維においては、温州みかんの割合が 9.3%を示し、上位 50 食品で 89.9%を占めた。
不溶性食物繊維は総食物繊維と同様に精白米が 12.7%と最も高い値を示し、上位 50 食品で 88.9%であった。これら累積割合はどの繊維も上位 100 食品あたり
でプラトーに達した。これらの結果から、食物繊維摂取量は予想以上に低かったが、寄与率の高い 50 食品程度を摂取することで摂取量の増加が期待されることが明らかとなった。
食物繊維高含有米摂取と腸内細菌叢の変化
食物繊維摂取量を 1 日当たり約 5g 程度増加させるには、個人の食習慣を変えることが必要となるが長期間実施することは困難と考えられる。そこで、日常摂取している米を食物繊維高含有米に変えることで、食習慣を大きく変えることなく食物繊維摂取量を増加させることが可能と考え、食物繊維高含有米摂取による食物繊維増加、および腸内細菌叢への影響を検討した。2016 年 2 月、福岡
県 K 町、F 市の住民を対象に、無作為に 3 群（D 群：食物繊維高含有米摂取群
54 名、O 群：オリゴ糖高含有米摂取群 53 名、C 群：精白米を摂取する群 54名）に分けた。試験摂取期間は 4 週間とし、摂取前後に健康調査、排便調査、腸内細菌叢分析を行い、試験期間中は毎日ご飯の摂取量、排便回数を記録してもらった。解析は摂取前後のビフィズス菌構成割合の増加率を算出し増加率が０を超える人の割合を、C 群を対照群として D 群、O 群と比較した。その結果、食物繊維高含有米の各週の摂取頻度は１日お茶碗 2 杯程度で精白米摂取群に比べ 4.5g 程度多く食物繊維が摂取していた。増加率が０を超える人の割合
は、D 群は 44.44%、O 群は 48.72%、C 群は 22.22%で、D 群、O 群とも C 群と比較してビフィズス菌の構成割合が増加した人の割合が有意に高かった。以上
から、食物繊維高含有米、オリゴ糖高含有米を摂取することにより、ビフィズ
ス菌の増加が示唆された。

○三成 由美（中村学園大・栄養）
yoshimi@nakamura-u.ac.jp

結語
日本人の食物繊維摂取量は現在目標量に約 5g 程度不足しており、これを補うた
めには、食物繊維の多い米を摂取することが解決策の１つである。超高齢社会の日本では食物繊維摂取量増加は生活習慣病のみならず、認知機能障害に対してもその予防策として重要な保健政策と考えられる。

Intake of dietary fiber and improvement in gut microbiota○Noritaka Tokui(Inst. Prev. Med. Diet., Nakamura Univ.)

Key words

microbial flora, dietary fiber, rice, epidemiology

The influence of elderly dietary habits on the diversity of gut microbiota○Yoshimi Minari(Dept. Nutr. Sci., Nakamura Gakuen Univ.)

Key words

elderly, dietary habits, gut microbiota

95

1S-S5p01 微小重力環境での細胞培養と再生医療への応用

1S-S5p02 閉鎖系自動培養システム：CELLAFORTE

私達は、物理的刺激に対する細胞応答に関する研究を行ってきた。特に重力は、
人類の進化にも影響を与えた物理的刺激である。クリノスタットとは、回転により重力の方向を変えることのできる装置の総称で、重力生物学の実験手段として百数十年以上前から利用され、主に植物の重力による影響などの研究に使われてきた。私達は、このクリノスタットを細胞培養実験に応用するため、重力制御装置 Gravite（スペース・バイオ・ラボラトリーズ社製）を開発、製品化した。Gravite は、直行二軸のまわりに試料を 360°回転させ、重力ベクトルを時間軸で積分することにより宇宙ステーションと同じ 1000 分の 1G の微小重力環
境をつくるだけでなく、3G までの過重力環境を作り出すことができる特徴がある。発売以来、NASA・ケネディー宇宙センターでも宇宙実験の予備実験に使う装置として活用されるなど、国内外の大学等の研究機関で Gravite を使った研究が行われている。
宇宙飛行士が宇宙へ行くと、筋萎縮や骨萎縮が起こることはよく知られている。
宇宙の微小重力環境では、筋や骨の細胞の分化が抑制されることがこの一因と考えられている。Gravite による微小重力環境で筋芽細胞を培養すると、1G 環
境下の静置培養と比較して筋の分化が抑制された。一方、過重力環境で筋芽細胞を培養すると、静置培養と比較して筋の分化が促進された。このように、重力は細胞の分化に影響を与えることが分かった。
細胞分化を抑制するという微小重力環境の特性を逆手にとり、近年、弊社では広島大学と共同で幹細胞培養と再生医療の研究に力を入れている。その結果、Gravite で培養した幹細胞は、通常の静置培養した幹細胞と比較して、分化が抑制されるだけでなく、増殖が早いことが分かった。さらに、Gravite で培養した幹細胞は、抗炎症効果を示すサイトカインの発現が高く、培養した幹細胞を中枢神経系疾患モデル動物に移植すると、運動機能の回復が早いことも分かった。
国内外で幹細胞の培養技術の開発、再生医療の治験が進む中、遺伝子操作をすることなく、また、過剰な薬品を使用することなく、微小重力環境の特性を利用して幹細胞を培養するだけで幹細胞の機能が向上した私達の研究成果は、質の高い幹細胞が培養できる培養技術として、再生医療の発展に寄与できるものと考えている。
宇宙開発が進む昨今、宇宙生物学など様々な研究分野で、重力をキーワードとして研究が加速的に進むことが予想される。昨年は、幹細胞に関する研究論文
雑 誌 （ Stem Cell and Development ） で 、 幹 細 胞 （ stem cell ） と 微 小 重 力（microgravity）をキーワードにした特集号が 2 巻も組まれる程、世界的にも研究が活発な分野の一つになっている。本シンポジウムでは、私達のこれまでの研究成果の一部を紹介する。

【目的】ES/iPS 細胞や体性幹細胞などの幹細胞は、細胞治療や創薬開発の分野への貢献が大きく期待されている。ヒト幹細胞を産業利用に繋げるためには、細胞の効率的な確保方法、品質を維持・管理しつつ培養する培養方法の確立など、「品質の確保されたヒト幹細胞の安定的な大量供給」を可能にする基盤技術の開発が極めて重要である。
そこで当社は、これまで NEDO 委託研究プロジェクト「ヒト幹細胞実用化に向けた評価基盤技術開発」 、経済産業省委託研究事業「iPS 細胞等自動培養装置
開発加速事業」 、AMED 委託研究プロジェクト「再生医療の産業化に向けた細胞製造・加工システムの開発」 に参画し、閉鎖系培養容器である培養バッグを用いた自動培養システムを開発した。
【方法】当社の自動培養装置では、培養容器としてシャーレ等ではなく、当社が技術開発を続けてきた閉鎖系培養容器である培養バッグの技術をベースとして開発した。培養バッグの特長は、ガス透過性の高いフィルムを採用した閉鎖系の容器であり、シャーレなどの開放系の培養容器と比較して培養中の汚染リスクが低減できる。またバッグ内の培養液の蒸発が低いため培養環境を高湿度に設定する必要がなく、機械化が容易になるといった点が挙げられる。この培養バッグを装置に搭載するバッグ回路の一部として、システムの開発を行った。
自動培養装置の機能としては、培地交換、継代、細胞観察など一連の培養行程を実施することができ、１ロットの最大培養面積：2000cm2 まで大量培養が可能である。装置は、培地・試薬を充填したバッグを保管する冷蔵／常温保管ユ
ニット、バッグ回路を搭載して細胞培養する培養ユニット、培養プログラム入
力設定・細胞観察・培養環境制御を行う制御ユニットにて構成される。
開発した自動培養システムを用いて幹細胞の自動大量培養を実施した。
【結果・考察】自動培養システムを用いて、ヒト iPS 細胞の自動培養を実施した
結果、106 オーダーから培養を開始し、培養終了時には 108 オーダーまでの培養が可能であることを確認した。
当システムは、2016 年 4 月に幹細胞用自動培養装置「CELLAFORTE(セラフォ
ルテ)」の製品名にて、再生医療等の研究用として受注生産にて販売開始した。
また幹細胞に限らず接着細胞全般で利用可能であることから、各種細胞の培養評価を検証中である。

Cell culture system under microgravity for regenerative medicine

Closed automated cell culture system ： CELLAFORTE○河原 裕美 1, 猪村 剛史 2, 大塚 貴志 2, 弓削 類 1,2（1スペース・バイオ・ラボラトリーズ, 2広島大院・医系科学研究科）
yumi@spacebio-lab.com○Yumi Kawahara1, Takeshi Imura2, Takashi Otsuka2, Louis Yuge1,2(1Space Bio-Laboratories Co., Ltd, 2Grad. Bio. Med. Sci. Hiroshima Univ.)

Key words

microgravity, cell differentiation, regenerative medicine○竹内 誠亮（ニプロ）
takeuchi-masakatsu@nipro.co.jp○Masakatsu Takeuchi(NIPRO)Key words

closed system

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1S-S5p03 ヒト細胞の 3 次元培養によるがん微小環境の構築と解析

1S-S5p04 細胞が発生する力のアッセイ

がん組織内にはがん細胞だけでなく、間葉系細胞(間葉系幹細胞や線維芽細胞)、
免疫細胞、血管やリンパ管などの種々の細胞が存在し、特殊ながん特有の微小環境(がん微小環境)を形成している。このがん微小環境は、がん細胞が発生・増殖する過程に密接に関わっており、がん微小環境を構成する細胞は、正常状態とは異なり、がんの悪性化を促進する様に機能が変化している事が報告されている。そのため、がん治療においてもがん微小環境全体を標的とする重要性が示されている。特に、がん微小環境に豊富に存在している線維芽細胞はがん
関連線維芽細胞(cancer-associated fibroblasts; CAF)と呼ばれ、正常組織や炎症組
織内の線維芽細胞とは異なる性質を獲得し、がん組織へ向けた血管新生やがんの浸潤・転移などに関わっていることから、がん微小環境形成において重要な因子となっている。さらに、近年がん微小環境構成細胞として新たに神経が報告され、がん組織に神経軸索が投射されており、神経細胞から分泌される神経伝達物質によりがん化を促進していることが明らかとなりつつある。
これらのがん微小環境中のがん関連細胞の機能については、これまで主に生体内(in vivo)において検討されてきた。これらの検討により、各がん微小環境構成
細胞のがん組織中での役割が明らかになってきたものの、がん細胞とがん微小環境細胞との相互作用の時空間変化等については、未だ解明されていない点が多い。例えば、がん細胞によって周囲に存在する正常な線維芽細胞が CAF へ変化する過程や、がん細胞と近接している軸索末端と細胞体が遠く離れて存在しているヒトの末梢神経における、神経細胞全体の変化を詳細に解析することは生体モデルでは非常に困難である。
そこで我々は、がん微小環境中の細胞ががん細胞との相互作用により変化する
動態を補足し、解析することを目的とし、ヒト細胞を 3 次元的に in vitro で培養するがん微小環境モデルの構築を試みている。さらに、構築したがん微小環境モデルから細胞を回収し、トランスクリプトーム解析などを行うことにより、その動的な変化による細胞の性質の変容について解析している。本シンポジウ
ムでは、特に線維芽細胞や神経細胞とがん細胞との相互作用に着目し、正常な線維芽細胞や神経細胞とがん細胞を共培養を行い、がんの周辺に存在する細胞
ががん細胞によって変化し、がん微小環境の形成に寄与する様子について、時
空間的なイメージングや、遺伝子発現解析等から検討した結果に関して報告する。

接着細胞が発生する力は、細胞の分化、増殖、自死、運動などの基本的な生命機能に重要な役割を果たしていることが明らかにされている。この力は細胞内
アクトミオシン収縮によるものであり、常に細胞内で発生している力学的因子である。またこの細胞が発生する力は病理・生理においても重要な因子として認識されつつある。たとえば、がん腫瘍は一般的に正常組織と比較して硬くなる。このとき、腫瘍内部のがん細胞は強い力を発生していると考えられている。
強い力はがん細胞が接着している細胞外基質の硬化を促進し、腫瘍を取り巻く力学的な環境を変化させる。これにより周囲の間質細胞とがん細胞自身の機能変化が惹起され、悪性化にもつながっていると考えられている。このように、細胞が発生する力を制御するシグナル伝達経路は新たな創薬ターゲット候補である。しかしながら、力を対象とした評価技術、とりわけ高効率に膨大数のサンプルを評価可能なアッセイ法が未整備なため、広がりを見せていないのが現状である。そこでこの問題点を克服するために、著者が所属する研究グループ
では、生命科学系のラボであれば利用可能なコンベンショナルな位相差顕微鏡
で力を評価できる技術の開発を行ってきた。
力は見ることができないため、細胞が発生する力により、接着している基質の変形を可視化する手法が考案され研究レベルで用いられている。その代表例の一つに Traction Force Microscopy (TFM) が挙げられる。TFM では、ハイドロゲ
ル基質内に変形マーカーとして蛍光ビーズを包埋し、共焦点レーザー顕微鏡でスキャンし、力発生時と、細胞を剥離した状態で撮影する無負荷時状態の参照
画像から、力を計算している。しかしながら、高価な装置を用い、かつ複雑な解析技術が要求される。
一方、私たちが開発した手法では、無負荷状態の参照画像が不要であり、位相差顕微鏡で観察可能な技術である。細胞培養基質として PDMS ゲルを用いる。
PDMS ゲル表面を酸素プラズマ処理し、表面に酸化薄膜を形成する。またプラ
ズマ処理により PDMS 表面が親水化されるため、細胞外基質タンパク質が吸着しやすくなり細胞は接着できるようになる。細胞が接着し、力が基質へと伝達されると、酸化薄膜が座屈する。つまり、基質表面に凹凸構造が生じ、位相差顕微鏡で観察すると明線（凸部）となってあらわれ、シワ構造が形成される。
このシワは細胞が発生する力と正の相関がある。したがって、薬剤投与前後、
遺伝子ノックダウン、変異体導入などの介入実験におけるシワの長さを比較し、力と標的シグナル経路との関係を解析することが可能となる。本発表では、これまでに本手法を用いて行ってきた細胞発生力アッセイの実施例を示す。

○高橋 治子（広島大院・統合生命科学）
harukot@hiroshima-u.ac.jp○松井 翼（阪大院・基礎工）
ts.mat29@me.es.osaka-u.ac.jp

参考文献
Fujiwara S, Matsui TS, Ohashi K, Deguchi S, Mizuno K. Solo, a RhoA-targeting
guanine nucleotide exchange factor, is critical for hemidesmosome formation andacinar development in epithelial cells. PLoS One 13: e0195124, 2018.
Ichikawa T, Kita M, Matsui TS, Nagasato AI, Araki T, Chiang S-H, Sezaki T, Kimura
Y, Ueda K, Deguchi S, Saltiel AR, Kioka N. Vinexin family (SORBS) proteins playdifferent roles in stiffness-sensing and contractile force generation. J Cell Sci 130:3517-3531, 2017.
Fukuda SP, Matsui TS, Ichikawa T, Furukawa T, Kioka N, Fukushima S, Deguchi S.
Cellular force assay detects altered contractility caused by a nephritis-associatedmutation in nonmuscle myosin IIA. Dev Growth Differ 59: 423-433, 2017.

Development and analysis of tumor microenvironment by 3D in vitro
human cell culture○Haruko Takahashi(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)

Key words

tumor, tissue engineering, three dimension

Assay for contractile force generated by nonmuscle cells○Tsubasa S. Matsui(Grad. Sch. Eng. Sci., Osaka Univ.)

Key words

mechanobiology, contraction, assay

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1S-S5p05 ディープラーニングとバイオメディカルイメージング
技術

1S-S5p06 フレキシブルフィルム力分布センサシステムの開発：動物細胞計測に向けて○新岡 宏彦（大阪大学 データビリティフロンティア機構）
niioka@ids.osaka-u.ac.jp

深層学習(Deep Learning)は 2012 年の画像認識コンペティション(ILSVRC2012)にて優勝したトロント大のチームが使用していたのを発端とし、爆発的に全世界に広がった。その背景には、大きく分けて 3 つの要素があるとされる。1 つ目
はビッグデータが得られるようになったこと、2 つ目は GPU などの高速計算が可能なハードの登場、3 つ目は深層学習アーキテクチャの進化である。応用範囲は画像認識だけではなく、物体検出、音声認識、画像生成、翻訳、囲碁 AI、
ロボット制御など様々である。バイオや医療のデータも対象であり、様々な応用が報告されている。例えば画像認識では、病理画像から癌細胞を認識すること[1]や、皮膚の写真から皮膚ガンを認識すること[2]、レントゲン画像から肺炎を認識すること[3]などが可能となっている。これまで、長年の経験を積んだ医師でなければできなかったことが深層学習によって可能なってきており、画像認識という分野において深層学習は人やこれまでの技術を圧倒する結果が示されている。
本講演では、バイオメディカル画像データを対象とし、1.培養細胞の分化認識に応用した研究[4]、2.レーザー硬性内視鏡画像のノイズリダクションについての研究について報告する。
1 では、iPS 細胞の自動細胞培養技術を背景とし、再生医療に用いる細胞のクオ
リティーチェックを目的としている。実際に用いた細胞は C2C12(マウス筋芽細胞)であり、筋管細胞への分化を深層学習により自動検出した。分化のレベルを
分化開始日からの日数を基準に 3 段階に設定したところ、画像分類の正答率はおよそ 91.3%となった。さらに、実際の顕微鏡画像にマッピングを行った。画
像取得において、位相差顕微鏡を用いており、非侵襲かつ高速な計測が可能である。
2 では、CARS(Coherent Anti-stokes Raman Scattering)硬性内視鏡を用いた。CARS
は非線形ラマン散乱過程の一つであり、化学結合の情報を画像として取得することが可能となる。試料はウサギ前立腺筋膜を用いた。有髄神経は脂質を豊富に含むミエリン鞘が軸索を覆っており、脂質の CH2 分子振動(2845 cm-1)の計測により、神経を特異的にイメージングできる。しかしながら、S/N が低く、画像を得るには数分程度の露光が必要であった。1scan(２秒)で得た神経の画像を入力データとし、同じ場所の画像を 100 回積算して得た S/N の良い画像を教師データとして学習を行った。結果として 1scan の画像から、およそ 7〜10 回積算した場合と同等の画像を得ることに成功した。
参考文献[1] Ehteshami Bejnordi B et al., JAMA, 318(22), 2199-2210 (2017)[2] Esteva A et al., Nature, 542(7639), 115-118 (2017)[3] Rajpurkar P et al., arXiv:1711.05225 (2017)[4] Niioka H et al.，Human cell，31(1), 87-93 (2018)

Deep learning and biological imaging technology○Hirohiko Niioka(IDS, Osaka Univ)

Key words

deep learning, bio-imaging, object recognition, noise reduction○森脇 健司 1, 岩井 良輔 2, 太田 風輝 2, 藤崎 和弘 1, 笹川 和彦 1
（1弘前大院・理工, 2岡山理大・フロンティア理工学研究所）
moriwaki@hirosaki-u.ac.jp【背景と目的】 力を通して細胞の機能の解明や評価を行うメカノバイオロジー
はここ１０年で急速に進展してきている。一般的な評価は、原子間力顕微鏡や
光／磁気ピンセット、せん断流れなど、外部から力をあたえた際の細胞の応答から行われている。また、細胞が能動的に生み出す力を評価するため、マイク
ロピラープレートが開発されている。ピラーのたわみ量を観察することで、細胞がプレートにあたえる牽引力の分布が評価できるが、ピラーにより凹凸のある特殊表面で培養する必要がある。一方、フィルム型応力センサが開発されている。電極対で感圧層を挟んだシンプルな三層構造からなり、薄くフレキシブ
ルであるため曲面にも利用できる。また、電極はフォトリソグラフィ技術によってマイクロレベルで任意設計できるため、形状を工夫することで多点分布計測や滑り方向も含めた三次元的な力の計測に応用できる。我々はこのセンサを採血手技における熟練者の力覚計測や内壁に作用する力が計測できるカテーテル
シミュレータなどバイオメカニクス分野への応用を進めてきた。
これまで接触界面に作用する圧縮力に着目して計測を行ってきたが、細胞の評価においては接着力などの引張力も計測できる必要がある。本センサは、力が加わると感圧層が変形し電気抵抗値が変化することでその力を検出できる。これまで本センサは、電極／感圧層／電極の三層構造をカバーフィルムによって封止していただけであり、引張方向の力がセンサ表面に作用すると電極と感圧層が分離し導電経路が遮断されてしまうため引張力は計測できなかった。そこで、本研究では電極と感圧層を十分に密着させたセンサを作製し、本センサシ
ステムによる引張力の計測可能性を検討し、その力検出能を調べた。
【方法】 導電性ペーストによる接着（Bonded sensor）と圧縮状態での貼り合わせ（Compressed sensor）という 2 種類の方法で電極と感圧層を密着させ、従来のセンサ（Separated sensor）と比較した。各センサとも、電極材には銅／ポリイミド積層フィルムを、感圧材には導電性ゴムを用いた。測定領域である上下電極の重複領域は直径 3mm の円で、Bonded sensor では 1μl の銀ペーストで銅電極と導電ゴムを接合した後、Compressed sensor では測定領域以外にスプレー糊を塗布し圧縮状態で貼り合わせた後、接着性防水ポリウレタンフィルムで封止した。
センサの校正は材料試験機を用い、ゴム板（10×10 mm、厚さ 2.5 mm）を介してセンサに引張／圧縮荷重を負荷した。微小な圧力を測定するため、定格 5 Nのロードセルを試験機のチャックに固定した。センサをビニルテープで固定した後に、ロードセル−ゴム板−センサ間の各界面を両面テープで接合した。センサの電気抵抗値変化はブリッジ回路により電圧値変化に変換した。センサ抵
抗値が著しく大きい場合センサ電圧はほぼゼロとなり，センサ抵抗値が減少するとともにセンサ電圧は入力電圧 5V に近づく。センサとロードセルの出力値
はデータロガーを用いて計測した。
【結果と考察】 校正結果について、Separated sensor は、圧縮応力の増加に応じてセンサ電圧は変化したが、引張応力を印加した場合はほぼゼロであった。
Bonded sensor は、圧縮／引張に関わらず印加圧力に対しセンサ電圧が変化した。電極−感圧層間を接着しているため、引張力が検出できたと考える。しかし、約 7 kPa までの引張応力を印加したところでセンサ電圧はほぼゼロとなり、除荷後もほぼゼロのままであった。銀ペーストが剥離してしまったことにより絶縁したと考えられる。一方、Compressed sensor では、20 kPa を超える比較的大きな引張応力を印加しても、センサが壊れることなくその応力を計測可能であった。電極−感圧層間は接着していないため、引張領域でのセンサ抵抗の変化は、センサ作製時に押し潰されていた導電ゴムの抵抗、もしくは、電極と感圧層間の接触抵抗の変化によると考えられる。
Compressed sensor について、低応力域における電圧応答特性を調べたところ、
圧縮／引張領域ともにセンサ電圧はほぼ直線的に変化し、ノイズも小さいため
サブ kPa オーダ以下の力検出分解能を有していた。また、サブ秒オーダ以下の応答速度を有しており、多点計測も可能であった。
【まとめ】 フィルム型センサの電極と感圧層を密着させることで引張力の測定が可能となった。微弱な接着力のモニタリングが可能であり、細胞と培養基板間にはたらく力分布の定量計測に応用できると考える。

Development of film-type force distribution sensor system: for evaluation ofanimal cells○Takeshi Moriwaki1, Ryosuke Iwai2, Fuki Ohta2, Kazuhiro Fujisaki1,
Kazuhiko Sasagawa1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Hirosaki Univ., 2Inst. Front. Sci. Technol., Okayama
Univ. Sci.)

Key words

force monitoring, film sensor, adhesion, spheroid

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1Ap01

サルコシンオキシダーゼの各種環状イミノ酸に対する反
応特異性および立体選択性

1Ap03○黒部 督惠 1, 松本 美徳 1, 山本 真由香 2, 中嶋 義隆 1,2,
西矢 芳昭 1,2
（1摂南大院・理工, 2摂南大・理工）
nishiya@lif.setsunan.ac.jp

Pseudomonas sp. VT1B 株由来ポリビニルアルコール分
解関連酵素の精製○山中 章裕, 松尾 直紀, 森 哲也, 西本 友之（林原）
tomoyuki.nishimoto@hb.nagase.co.jp【背景および目的】 サルコシンオキシダーゼ（Sox; EC 1.5.3.1）はサルコシンの酸化的脱メチル化を触媒する酵素である。本酵素はサルコシンと構造的に類似する環状イミノ酸である L-プロリンに対しても非常に微弱な反応性を有する。
本酵素は分析用途に利用されるため、高い基質特異性が求められている。そこで当研究室では、Sox の立体構造に基づく酵素機能の改変、特に基質特異性に関与する残基の特定を進めている。本研究では種々の環状イミノ酸に対する反応性に関わるアミノ酸残基の特定を試みた。Sox の野生型および変異体の環状イミノ酸に対する反応特異性および立体選択性を調べると共に、ドッキングシ
ミュレーションとの相関を見たので報告したい。
【結果および考察】 Bacillus 属由来 Sox(SoxB)と環状イミノ酸との結合モデルより、活性中心近傍の Y254 が環状イミノ酸との反応性に関わると推察した。Y254のアミノ酸置換変異体を作成し、野生型と比較したところ、Y254A および Y254G
が環状イミノ酸に対して高い反応性を示した。特に、Y254A の L-チオプロリン
に対する触媒効率は野生型の約 580 倍に向上した。基質結合のエネルギースコ
アを算出したところ、その傾向に実験結果との相関が認められた。一方、
Chloroflexus aurantiacus 由来 Sox(SoxCa)は SoxB よりも環状イミノ酸に対する反応性が高く、特に L-プロリンに対する反応性が約 8 倍高かった。また、L-プロリンおよび D-プロリンに対する触媒効率比より SoxB と SoxCa の立体選択性は逆であった。両酵素の配列相同性は約 37%であり、活性中心構造の差異に興味が持たれる。
【今後の方針】 SoxB と SoxCa の環状イミノ酸に対する立体選択性の違いを理解するために、SoxCa の結晶構造解析を行う。また、Sox の構造と環状イミノ酸
に対する反応性の相関について更なる検討を行うと共に、基質特異性向上の方策へと繋げたい。

【背景と目的】ポリビニルアルコール (PVA)の分解には、Secondary alcohol oxidase(SAO)と β-diketone hydrolase (BDH)の 2 つの酵素が関与することが知られている。SAO は PVA 分子内の水酸基の酸化と β-ジケトンの生成、BDH は β-ジケト
ンの加水分解を触媒する。しかしながら SAO と BDH の遺伝子配列は明らかになっていなかった。本研究では両酵素活性を保有しているとの報告がある
Pseudomonas sp. VT1B 株を入手し、SAO と BDH の遺伝子配列を明らかにすることを目的とした。
【方法】 VT1B 株の培養上清から硫安分画および各種クロマトグラフィーにより精製した。酵素活性の測定は、PVA 酸化により生成される過酸化水素を指標とした SAO 活性および PVA の粘度低下を指標とした PVA 分解活性を用いた。精
製タンパク質の N 末端アミノ酸配列解析と VT1B 株の全ゲノム解析から目的遺伝子配列を同定した。
【結果と考察】 酵素精製の結果、SAO 活性と PVA 分解活性の両方の活性を示す
約 100 kDa の単一タンパク質を 2 種類 (PVA-A、PVA-B)得た。VT1B 株の全ゲノ
ム解析の結果、PVA-A と PVA-B の N 末端アミノ酸配列と一致する遺伝子配列がゲノム上に一つずつ存在することがわかった。遺伝子配列にコードされるタ
ンパク質は約 100 kDa であり、N 末端側約 50 kDa の配列は既存の PVA 脱水素
酵素、C 末端側約 35 kDa の配列は既存の酸化 PVA 加水分解酵素とそれぞれ高い相同性を示した。以上の結果から PVA-A、PVA-B は一つのタンパク質に SAOと BDH の 2 つの触媒ドメインを有するハイブリッド酵素であると考えられた。

Reaction specifity and stereoselectivity of sarcosine oxidase for cyclic iminoacids

Purification of polyvinyl alcohol degrading enzyme from Pseudomonas sp.
VT1B○Masae Kurobe1, Minori Matsumoto1, Mayuka Yamamoto2, Yoshitaka Nakajima1,2,
Yoshiaki Nishiya1,2(1Grad. Sch. Sci. Eng., Setsunan Univ., 2Fac.Sch.Sci.Eng.,Setsunan Univ)○akihiro yamanaka, naoki matsuo, tetsuya mori, tomoyuki nishimoto(Hayashibara Co., Ltd.)Key words

sarcosine oxidase, proline, thioproline, stereoselectivity

Key words

polyvinyl alcohol, degradation, hybrid enzyme, enzyme purification

1Ap02

リンゴ酸デヒドロゲナーゼの基質特異性と立体構造解析に基づく構造変化メカニズムの考察

1Ap04

新奇スルホンアミド分解酵素の反応特性解析○下澤 勇弥 1,2, 西矢 芳昭 1, 佐々本 康平 1,2, 氷見山 幹基 2,
中村 努 2（1摂南大院・理工, 2産総研）
nishiya@lif.setsunan.ac.jp○柴田 幹哉 1, 満倉 浩一 2, 吉田 豊和 2
（1岐阜大院・自科技, 2岐阜大・化学・生命工）
toyosida@gifu-u.ac.jp【背景・目的】 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（MDH）は、優れた基質親和性と本来の基質であるオキサロ酢酸（OAA）に対する高い基質特異性を併せ持ち、臨
床検査薬酵素として広く利用されている酵素である。また、MDH は、基質の結合により活性中心の可動ループが Open 構造から Closed 構造へコンフォメー
ション変化することが知られている。そのため、構造変化は MDH の基質特異性と密接に関連していると考えられる。しかし、MDH の構造変化メカニズム
は未だ明らかになっていない。そこで、熱安定性に優れた中等度好熱菌
Geobacillus stearothermophilus 由来の MDH（gs-MDH）を対象として、変異導入
による基質特異性の変化および立体構造解析から、構造変化メカニズムの考察を試みた。
【結果・考察】 ホモロジーモデリングにより予測した gs-MDH の Open 構造および Closed 構造から、ジカルボキシ化合物である OAA による Arg86 と Arg155の架橋が構造変化に重要であると推察された。そこで、Arg86 変異体を作成、評価したところ、OAA に対する触媒効率が約 1/250 に低下した。しかし、変異体はピルビン酸等のモノカルボキシ化合物に対する反応性が観察されたことか
ら、構造変化には OAA による架橋以外の要因が存在することが示唆された。
そこで、結晶構造解析を行い Open 構造（Apo 型）の結晶構造（分解能 1.95Å）を決定した。その結果、活性中心の 3 つの Arg（Arg86、92、155）による正電
荷ポケット形成が観察された。以上より、基質結合ポケットにおける正電荷の中和が、構造変化のドライビングフォースとなることを示唆している。また、その構造変化メカニズムが、gs-MDH の優れた基質特異性を実現していると考えられる。

【背景と目的】 スルホンアミドはサルファ剤や利尿剤などの医薬品の骨格に含まれる有用な化合物の一つであり、水産養殖や畜産などでも利用されている。
しかし、化学的に安定で生体内で分解代謝を受けにくいため、環境へ排出されると蓄積しやすく、環境汚染や耐性菌の出現に繋がる可能性がある。スルホン
アミドの化学的な分解は高熱、長時間の反応を必要とする。一方、これまでに報告されているスルホンアミドの酵素的分解は、分解活性が低いという問題がある。我々の研究室では、種々のスルホンアミド類を単一窒素源とした培地を用いて集積培養を行い、4-スルファモイル安息香酸(4-SBA)を分解して生育する
微生物 Achromobacter sp. SA25 を見出している。そこで本研究では、SA25 株を用いた休止菌体反応の最適条件と基質特異性を調査した。
【方法と結果】Achromobacter sp. SA25 の菌体懸濁液を調製した後、休止菌体反応の反応温度と pH を検討したところ、30℃で pH6.5 のリン酸カリウム緩衝液を用いたとき最大活性を示した。この反応条件で 4-SBA 分解を経時的に調べた
ところ、4-SBA の減少に伴って 3,4- ジヒドロキシ安息香酸が生成し、72 時間後には 4-SBA の分解率が 96%に達した。また、市販及び合成したスルホンアミド類を用いて休止菌体反応を行い、基質特異性を調べた。その結果、4-スルファ
モイル安息香酸と 3-スルファモイル安息香酸のみに分解活性を示し、合成した
2-スルファモイル安息香酸、4-スルファモイル安息香酸メチルには作用しなかった。この結果、安息香酸の o 位にスルファモイル基がなく、カルボキシ基が保護されていない化合物を SA25 株の分解酵素が基質として受け入れることが示唆された。

Discussion of structural change mechanism based on substrate specificity
and structural analycis of malate dehydrogenase.

Characterization of novel sulfonamide-degrading enzymes○Yuya Shimozawa1,2, Yoshiaki Nishiya1, Kohei Sasamoto1,2, Tomoki Himiyama2,
Tsutomu Nakamura2(1Grad. Sch. Sci. Eng., Setsunan Univ., 2AIST)

Key words

structural change, substrate recognition, malate dehydrogenase○Mikiya Shibata1, Koichi Mitsukura2, Toyokazu Yoshida2(1Grad. Sch. Eng., Gifu Univ., 2Fac. Eng., Gifu Univ.)

Key words

sulfonamide, Achromobacter sp., 3, 4-dihydroxybenzoic acid

99

1Ap05

N-Cbz-アミノ酸を脱保護する微生物酵素の反応特性○府川 祐太 1, 満倉 浩一 2, 吉田 豊和 2
（1岐阜大院・工, 2岐阜大・工）
toyosida@gifu-u.ac.jp

1Ap07

好熱好酸性アーキア Sulfolobus tokodaii 由来糖エピメ
ラーゼ ST2245 の反応機構○小野 真由子 1, 中野 祥吾 1, 河原林 裕 2,3, 伊藤 創平 1（1静県大院・薬食生命, 2産総研, 3次世代バイオ医薬品製造技術
研究組合）
itosohei@u-shizuoka-ken.ac.jp【背景・目的】ベンジルオキシカルボニル (Cbz) 基は、アミノ基の保護基として利用され、その脱保護は一般的に Pd/C 触媒を用いた水素化分解によって行われる。化学的 Cbz 基の脱保護は有機溶媒中で行われるため、反応系に酵素反応を組み合わせることは困難である。そこで、カルバメート系保護基を脱保護する酵素に着目した。Cbz 基に対して選択的に作用する酵素を見出すことができ
れば、温和な条件下で Cbz 化合物を脱保護することができる。Cbz 基を脱保護する酵素は以前より研究されているが、報告例は少なく、反応特性に関する知見は乏しい。本研究では N-Cbz-DL-alanine をモデル化合物として用いて、Cbz
基を選択的に脱保護する微生物酵素を探索し、その反応特性を評価した。
【方法・結果】 N-Cbz-DL-alanine を単一炭素・窒素源として用いて土壌試料から資化性菌を探索し、活性菌として U21 および U31 の 2 株を取得した。N-CbzDL-alanine を用いて緩衝液中で休止菌体反応を行うと、反応の進行に伴ってベンジルアルコールおよび安息香酸が生成し、脱保護は加水分解によって起こる
ことが示唆された。活性菌の菌株同定より、U21 は Burkholderia 属、U31 は
Cupriavidus 属の細菌であることが判明した。U31 菌体を用いた反応では 10 mM
N-Cbz-DL-alanine が全て分解されたのに対し、U21 菌体では、N-Cbz-DL-alanine
が 5 mM 程度まで分解されると反応速度が低下したことから、U21 はエナンチオ選択的な酵素を有すると考えた。そこで、N-Cbz-DL-alanine のアナログである N-Cbz-DL-2-aminobutyric acid を用いて、反応を経時的に調べた結果、U21 菌体を用いた脱保護反応は S 体選択的に進行し、2-Aminobutyric acid (2-ABA) の光
学純度は反応 9 時間後に 89% ee となった。一方、U31 菌体は中程度の S 体選択性 (31% ee) を示した。

【目的】アーキアゲノム情報中には、必要な酵素をコードする遺伝子が見出されてこない事がある。好熱好酸性アーキア Sulfolobus tokodaii 由来の ST2245 タン
パク質は、細胞抽出液から精製された、グルコサミン 6 リン酸 (GlcN6P) をガラ
クトサミン 6 リン酸 (GalN6P) に変換する新規糖エピメラーゼである。これまでに、6 単糖の 4 位炭素の水酸基を異性化する酵素の報告例はなく、EC 番号
5.1.3.42 を 2019 年 2 月に取得している。ST2245 タンパク質の反応機構は相同性から推定出来ない全く新規なものであるため、Ｘ線結晶構造解析や等温滴定型
熱量測定 (ITC) を通じて、この新規酵素の反応機構の解明を試みた。
【方法】ST2245 の結晶化条件のスクリーニングは蒸気拡散法にて行った。得られたネイティブ結晶を用いて GlcN6P との共結晶を作製し、X 線結晶構造解析
により基質複合体構造を取得した。なお、ST2245 は新規酵素であり類似構造が存在しないため、初期位相はヨウ素 SAD 法により決定した。基質複合体構造より活性部位残基を推定し、部位特異的変異体 (S75A、R294A) を作製した。変異体の ITC 解析と合わせて ST2245 が GlcN6P を GalN6P に変換する反応機構を推定した。
【結果と考察】X 線結晶構造解析の結果、ネイティブ結晶については 1.6Å、基質複合結晶については 1.1Å の分解能での構造決定に成功した。ITC 解析より、野生型の ST2245 は鎖状のグルコン酸 6 リン酸 (GlcA6P) を認識していたが、変異体 S75A および R294A では、いずれも GlcA6P の認識能力を失っていることが確認された。したがって S75 および R294 は反応を触媒する残基であることが示された。本研究において決定した新規構造および ITC 解析の結果から、
ST2245 が GlcN6P を GalN6P に変換する過程で、環状糖から直鎖糖への変換を経由していることが推測された。本発表ではこれらの結果の詳細について報告する。

Characterization of microbial enzymes for deprotecting N-Cbz-amino acid

Reaction Mechanism of the Glucosamine 6-Phosphate 4-epimerase, ST2245
protein, isolated from acidothermophilic archaeon Sulfolobus tokodaii○Yuta Fukawa1, Koichi Mitsukura2, Toyokazu Yoshida2(1Grad. Sch. Eng., Gifu Univ., 2Fac. Eng., Gifu Univ.)○Mayuko Ono1, Shogo Nakano1, Yutaka Kawarabayashi2,3, Sohei Ito1
(1Grad. Sch. Integr. Pharm. Nutr. Sci., Univ. Shizuoka, 2AIST, 3MAB)

Key words

benzyloxycarbonyl group, enzymatic deprotection

Key words

archaea, enzyme reaction, structural analysis, X-ray crystallography

1Ap06

フタル酸類に作用する新奇脱炭酸酵素の探索

1Ap08

ニトリルヒドラターゼの中性子構造解析に向けた取り組み○魚住 和輝 1, 奥村 直也 2, 満倉 浩一 3, 吉田 豊和 3（1岐阜大院・自科技, 2岐阜大院・工, 3岐阜大・工）
toyosida@gifu-u.ac.jp○辻井 啓夢 1, 林 英輝 1, 松村 洋寿 1, 野村 高志 2, 當舎 武彦 3,
玉田 太郎 4, 日下 勝弘 5, 久保 稔 2, 城 宜嗣 3, 尾高 雅文 1
（1秋田大院・理工, 2兵庫県大院・生命理, 3理研・SPring-8, 4量子科学技術研究開発機構, 5茨大・フロンティア応用原子科学研究センター）
modaka@gipc.akita-u.ac.jp【背景と目的】芳香族カルボン酸の脱炭酸酵素の酵素群の中には、反応条件を設定すると効率的に炭酸固定反応を触媒する酵素活性が報告されている。この反応を利用すれば芳香族化合物にカルボキシル基を位置選択的に導入できること
から、芳香族カルボン酸の生産に応用できる可能性を秘めている。我々がこれまで行ってきた芳香族カルボン酸脱炭酸酵素に関する研究は、ベンゼン環にカルボキシ基を一つもつ安息香酸類を用いてきた。一方、ベンゼン環にカルボキシ基を二つもつフタル酸類に作用する脱炭酸酵素は、これまでに 4,5- または 3,4dihydroxyphthalic acid (EC.4.1.1.55 and 69) に関する研究に限られており、報告例もわずかである。そこで本研究では、新奇のフタル酸類脱炭酸酵素を取得する
目的で、2,4-あるいは 4,6-dihydroxyisophthalic acid (2,4- or 4,6-DHIPA) を用いて土壌から脱炭酸酵素活性を有する微生物を探索した。
【方法と結果】フタル酸類に作用する新奇脱炭酸酵素を取得するため、2,4-または 4,6-DHIPA を炭素源とする培地に土壌サンプルを加えて、微好気性条件下で集積培養を行った。分離した微生物を培養したのち、培養液上清を TLC および
HPLC 分析し、脱炭酸酵素活性を評価した結果、2,4-DHIPA に対して活性を示す微生物 UK8 株を見出した。16S rRNA 遺伝子を解析したところ、UK8 株はPseudomonas sp.に属することが判明した。UK8 株の培養条件を検討したところ、2,4-DHIPA をインデューサーとして含む培地で培養したとき脱炭酸酵素活性を検出した。また、種々のフタル酸誘導体を用いて、休止菌体反応で基質特異性を調査した。

[緒言] ニトリルヒドラターゼ(NHase)は、アクリルアミドの工業生産などに利用されている産業的に重要な酵素である。先行研究により、結晶構造をもとにした理論計算から活性中心近傍の水素結合ネットワークが、水和反応に重要であることが予測されている。そこで、我々は活性中心近傍の水素結合ネットワー
クを正確に決定することを目標に、NHase の中性子構造解析をすすめている。
本発表では、大型結晶の作成条件並びに予備的な中性子回折実験の結果を報告する。
[実験] X 線結晶構造解析の NHase 結晶化条件である NHase 濃度 20 mg/mL、母液(100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM MgCl2, 20% PEG8000)、結晶成長温度 10 ℃
をもとに、
(1)NHase 濃度のみを 20〜60 mg/mL、(2) PEG8000 濃度のみを 2〜20%と変化させ、冷凍保存した NHase を用いてそれぞれ結晶化を行った。次に、(3)NHase 濃度(20, 30, 40, 50 mg/mL)と PEG8000 濃度(10, 15.5 20%)を、それぞれ組み合わせて計 12 通りの条件で、精製直後の NHase を用いて、結晶化を行った。条件(1)〜(3)の結果をふまえ、(4)NHase 濃度(40, 50, 60, 70 mg/mL )と PEG8000 濃度(11,12, 13, 14, 15%)をそれぞれ組み合わせて計 20 通りの条件で結晶化を行った。
PEG8000 濃度 15.5%、NHase 濃度(20 と 30 mg/mL)の条件で作成した大型結晶を、重水置換を行った後に、中性子線による測定を行った。
[結果と考察] 条件(1)〜(3)の結晶化の結果、PEG8000 濃度 15.5%、NHase 濃度 20mg/mL の条件において、結晶が最も大型化することが分かった。また、沈殿の原因に、NHase の品質の劣化が示唆された。
中性子測定については、0.07 mm3 と小さい結晶の大きさにもかかわらず、きれ
いな回折スポットが観測されたことから、結晶の大型化により、より良い分解能が期待される。今後は、タンパク質の総量を増やすことによる結晶の大型化の更なる条件検討を行っていく。

Screening of novel decarboxylase acting on phthalate derivatives

Approaches toward neutron crystallography of nitrile hydratase○Kazuki Uozumi1, Naoya Okumura2, Koichi Mitsukura3, Toyokazu Yoshida3(1Grad. Sch. Eng., Gifu Univ., 2Grad. Sch. Eng., Gifu Univ., 3Fac. Eng., Gifu Univ.)

Key words

phthalate derivatives, decarboxylase, Pseudomonas sp.

○Hiromu Tsujii1, Hideki Hayashi1, Hirotoshi Matsumura1, Takashi Nomura2,
Takehiko Tosha3, Taro Tamada4, Katsuhiro Kusaka5, Minoru Kubo2,
Yoshitsugu Shiro3, Masafumi Odaka1(1Grad. Sch. Eng., Sci., Akita Univ., 2Grad. Sch. Life Sci., Univ. Hyogo., 3SPring-8,
RIKEN, 4Natl, QST, 5Frontier Res. Ctr. Appl. Atomic Sci., Ibaraki Univ.)

Key words
catalisis

nitrile hydratase, neutron crystallography, hydrogen bond network,

100

1Ap09

クライオ電子顕微鏡によるロイシン脱水素酵素の高分解能構造を用いた耐熱化機構の解明

1Ap11○山口 浩輝 1, 亀川 亜希子 2, 中田 國夫 1, 柏木 立己 1, 水越 利巳 1,
藤吉 好則 2, 谷 一寿 3
（1味の素バイオ・ファイン研, 2東京医科歯科大・高等研究院・セスプル, 3三重大・院医）
toshimi_mizukoshi@ajinomoto.com【背景と目的】ロイシン脱水素酵素(LDH, EC 1.4.1.9)は分岐鎖アミノ酸の脱アミノ化を触媒す
る、NAD+依存型の酸化還元酵素である。Geobacillus stearothermophilus 由来の
LDH (GstLDH)は耐熱性が極めて高いため、分岐鎖アミノ酸の定量や生産に有用である。しかしながら、GstLDH の立体構造は決定されておらず、その耐熱性機構や補酵素認識機構は不明であった。そこで、我々は GstLDH の立体構造解
析を通じ、これらの構造メカニズムを解明した(1)。
【方法】
GstLDH アポ体と NAD ＋複合体について、クライオ電子顕微鏡(JEM-3000SFF,
JEOL 社)による単粒子解析を実施した。また、耐熱性機構を考察するために、より耐熱性の低い近縁種の LDH との配列比較で見出されたアミノ酸残基の変異・欠損により、GstLDH の耐熱性に与える影響を解析した。
【結果と考察】単粒子解析の結果、GstLDH アポ体と NAD ＋複合体の密度マップをそれぞれ分解能 3.0Å、3.2Å で取得した。既知の近縁種由来の LDH と同様に、GstLDH の立体構造は 8 量体を構成しており、単量体は NAD ＋結合ドメインとコアドメインを形成していた。両者の立体構造を比較したところ、補酵素 NAD ＋の結合に伴う全体構造の変化は見られなかった。また、Ser147 と NAD ＋の相互作用によって部分的な構造変化が惹起され、142-144 残基が disorder していたほか、コアドメインにおける新たな相互作用の形成が見られた。NAD ＋複合体は 80°C,
10 分間の熱処理後の残存活性がアポ体と比較して約 3 倍高く、NAD ＋結合によって GstLDH のコアドメイン界面の安定化が起こることが推定された。更に、近縁種の LDH との配列比較で見出されたアミノ酸残基の置換体および欠損体の解析から Ala94, Tyr127 および C 末端領域が GstLDH の高い耐熱性に寄与していることが示唆された。
Journal of Structural Biology 205, 11-21 (2019）(1)

有機溶媒中における Tk-subtilisin の酵素活性の解析○宮田 大暉, 山野-足立 範子, 古賀 雄一, 大政 健史（阪大院・工）kogay@mls.eng.osaka-u.ac.jp【背景・目的】 Tk-subtilisin は超好熱古細菌（始原菌）Thermococcus kodakarensis
由来サチライシン様セリンプロテアーゼである。本酵素は極めて高い熱安定性を示し、化学変性剤に対しても安定であるという特徴を有する。しかしながら、一般的に酵素は有機溶媒によって容易に変性し、本酵素が有機溶媒に対する耐性を有するかは解明されていない。そこで本研究では Tk-subtilisin の有機溶媒中での反応を加水分解反応と逆反応のペプチド合成反応の 2 点から解析した。
【方法・結果】 Tk-subtilisin は Pro 配列と活性ドメイン（成熟化ドメイン）から構成される。大腸菌発現系から成熟化前の Pro 配列を保持した Pro-Tk-subtilisin（Pro 体）として調製した。Pro 体は 80℃30 分の加熱により活性型 Tk-subtilisin（成熟体）に成熟化する。本研究では、Pro 体と成熟体それぞれについて、9 種
類の有機溶媒中での酵素活性を測定し、各溶媒に対する耐性の比較を行った。
有機溶媒は高沸点と水溶性の 2 点を考慮した。
Pro 体については、50％濃度のすべての有機溶媒に対して 60％以上の残存活性を示した。これは分子内シャペロン活性を持つ Pro 配列の存在により一度有機溶媒で変性した構造が巻き戻ったと考えられる。成熟体は、多くの有機溶媒において残存活性は 50％以下となり、一方でエチレングリコールでは約 80％の残存活性を示し、耐性があると示唆された。したがって、ペプチド合成はエチレ
ングリコールと先行研究で用いられていたアセトニトリルを使用した。エチレ
ングリコールでの合成は確認されなかったが、アセトニトリルでは合成が確認された。本発表では、Tk-subtilisin の溶媒中での安定性およびペプチド合成反応の詳細について報告する。

Structural insights into thermostabilization of leucine dehydrogenase by
cryo-electron microscopy

Study of the enzymatic activity of Tk-subtilisin in organic solvents

Key words
leucine dehydrogenase, cryo-electron microscopy, thermal stability,
Geobacillus stearothermophilus

Key words

subtilisin, thermostable enzyme, organic solvent

1Ap12

コリン型リゾプラズマローゲン特異的ホスホリパーゼ Dの基質特異性スイッチ○Hiroki Yamaguchi1, Akiko Kamegawa2, Kunio Nakata1, Tatsuki Kashiwagi1,
Toshimi Mizukoshi1, Yoshinori Fujiyoshi2, Kazutoshi Tani3(1Res. Inst. Biosci. Prod. Fine Chem., Ajinomoto Co., Inc., 2CeSPL, ARIS, TMDU,
3
Grad. Sch. Med. Univ. Mie)

1Ap10

単糖合成を目指した高度好熱菌由来トランスケトラーゼの X 線結晶構造解析および諸性質の検討○Hiroki Miyata, Noriko Yamano-Adachi, Yuichi Koga, Takeshi Omasa(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)○吉田 裕美 1,2,3, 吉原 明秀 3,4, 塚本 郁子 2, 秋光 和也 3,4,
何森 健 3,4, 増井 良治 5, 神鳥 成弘 1,2,3（1香川大・総合生命研究セ, 2香川大・医, 3香川大・国際希少糖機構, 4香川大・農, 5阪市大院・理）h.yoshi@med.kagawa-u.ac.jp

小山 貴之 1, 酒瀬川 信一 2, 村山 和隆 3, ○杉森 大助 1
（1福島大・共生システム理工, 2旭化成ファーマ, 3東北大院・医工）
sugimori@sss.fukushima-u.ac.jp【目的】トランスケトラーゼはペントースリン酸経路において，チアミン二リン酸（TPP）を補酵素とし，5 炭糖のケトース（キシルロース 5-リン酸）からケ
ト基を含む 2 つの炭素を受け取り，5 炭糖のアルドース（リボース 5-リン酸）に転移させ，7 炭糖のケトース（セドヘブツロース 7-リン酸）を形成する。また，2 つめの反応として，キシルロース 5-リン酸とエリトロース 4-リン酸から，フルクトース 6-リン酸とグリセルアルデヒド 3-リン酸を形成する。トランスケ
トラーゼは通常リン酸糖を基質とするが，リン酸基を持たない単糖を基質とできるトランスケトラーゼが近年報告され，7 炭糖をはじめ様々な単糖の合成に応用できる可能性が示されている。今回,高度好熱菌 Thermus thermophiles HB8
由来トランスケトラーゼ（TtTK）について，その単糖合成酵素としての可能性を探るため，諸性質の検討および X 線構造解析を行った。
【方法】理研バイオリソースセンターより提供された TtTK の構造遺伝子を
pET15b に組込み，N 末端に His タグを持つ組換体として大腸菌で発現させた。
アフィニティーカラムを用いて精製後，TPP との共結晶化を行い，高エネルギー
加速器研究機構 PF BL5A にてデータ収集を行った。
【結果と考察】TtTK/TPP 複合体の構造を 2.09Å 分解能で決定することができた。
全体構造は他生物由来の TK の構造と良く似ていた。TtTK はダイマー構造をとっており，TPP はダイマーの界面に結合していた。近傍に MES 分子（緩衝試薬）が結合しており，その硫酸基は，R352，H415，R515 により塩橋を形成していた。これらの残基は，基質であるリン酸糖のリン酸を認識していると考えられ，リン酸を含まない単糖合成への分子設計の指針が得られた。

【緒言】
リポタンパク質関連ホスホリパーゼ A2（Lp-PLA2）は血小板活性化因子 PAF を加水分解する酵素であり，心血管疾患と脳卒中のリスク評価にその活性測定が利用されている。ところが，既存法には様々な課題があるため，本酵素の反応生成物であるリゾ PAF を特異的に簡易測定できる酵素の開発が期待されている。Thermocrispum sp.由来コリン型リゾプラズマローゲン（LyPlsCho）特異的PLD（LyPlsCho-PLD）はリゾ PAF にも活性を示すため，Lp-PLA2 活性測定への応用が期待できる。しかしながら，野生型酵素のリゾ PAF に対する相対活性は
LyPlsCho の約 50%である。そこで我々は，リゾ PAF に対する活性を増強させるとともに，本酵素の基質認識メカニズムを明らかにすることを目指し，合理的設計による部位特異的アミノ酸置換を行った。
【方法】
LyPlsCho-PLD の立体構造モデルと基質類似化合物との docking simulation の結果から，基質認識に関与すると考えられる F211 を他のアミノ酸に飽和変異させた。各変異体は pET24a と BL21(DE3)を用いて細胞内に可溶性発現させ，HisTrap HP カラムで精製した。精製変異体に関して基質特異性および速度論試験を行い，構造活性相関について考察した。
【結果と考察】F211 変異体は一様に LyPlsCho に対する活性が大幅に低下し，アミノ酸側鎖のサイズが小さい L, A 等に置換するとリゾ PAF に対する活性が著しく増加した。
一方，極性あるいは嵩高い側鎖を持つ R, D, W 等に置換すると，両基質に対して活性が著しく低下した。変異体のうち特に変化が大きかった F211L 変異体に至っては，リゾ PAF/LyPlsCho 比が野生型の約 0.5 から 13 まで向上した。速度論解析の結果から，F211 は基質 sn-1 位エーテル鎖の認識に大きく関与しており，基質が酵素の疎水ポケットに結合する過程と生成物解離過程に深く関与す
ると結論づけた。

X-ray structure analysis and preliminary characterization of Thermus
thermophilus HB8 transketolase

Switch of substrate specificity of choline lysoplasmalogen-specificphospholipase D○Hiromi Yoshida1,2,3, Akihide Yoshihara3,4, Ikuko Tsukamoto2, Kazuya Akimitsu3,4,
Ken Izumori3,4, Ryoji Masui5, Shigehiro Kamitori1,2,3(1Life Sci. Res. Center, Kagawa Univ., 2Fac. Med., Kagawa Univ., 3Int'l Inst. Rare
Sugar Res. and Educ., Kagawa Univ., 4Fac. Agric., Kagawa Univ., 5Grad. Sch. Sci.,
Osaka City Univ.)
Key words
Thermus thermophilus, transketorase, monosaccharide, X-ray structure

Takayuki Oyama1, Shin-ichi Sakasegawa2, Kazutaka Murayama3,○Daisuke Sugimori1(1Fac. Symbio. Syst. Sci., Fukushima Univ., 2Asahi Kasei Pharma Corp., 3Grad. Sch.
Biomed. Eng., Tohoku Univ.)

Key words

phospholipase D, lysoplasmalogen, LP-PLA2, Lyso PAF

101

1Ap13

卵殻膜分解活性を示す微生物由来エラスターゼの特性解
析と加水分解物の生理活性評価

1Ap15○今藤 嵩大 1, 横山 萌 2, 木村 行宏 2, 山下 陽子 2, 芦田 均 2,
竹中 慎治 2
（1神戸大・農, 2神戸大院・農）stakenaka@people.kobe-u.ac.jp

補酵素 B12 関与ジオールデヒドラターゼの作用による
3,3,3‐トリフルオロ‐1,2‐プロパンジオールからの脱フッ素化を伴うアセトアルデヒドの生成○森 光一 1, Jiang Dong 2, Golding Bernard T. 2, 虎谷 哲夫 1
（1岡山大・工, 2Sch. Nat. Environ. Sci., Newcastle Univ.）mori-ko1@okayama-u.ac.jp【背景と目的】 卵殻膜は皮膚の保湿効果やコラーゲン合成の促進作用といった生理作用を示すと報告されており、化粧品、医薬品、健康食品などの分野において魅力のある天然素材であるが、あまり利用されていない。その要因として、卵殻膜が水に不溶な生体膜であることが挙げられる。微生物酵素による可溶化
法は温和な条件で限定分解も期待されることから、分解に特化した微生物酵素の検索とその特性解析を行ってきた。本研究では、既報の P. Aeruginosa 由来エラ ス タ ー ゼ （ LasB_ ME4 ） を 基 に 見 出 し た P. indica 由 来 エ ラ ス タ ー ゼ（rLasB_indica）を用いて卵殻膜加水分解条件の最適化、卵殻膜由来ペプチドの生理活性評価を行なった。
【方法】 rLasB_indica は、E. coli-pET28b(+) 発現系にて発現し、アセトンによる再活性化後、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。組換え酵素を用いた卵殻膜加水分解条件の最適化後、同条件で卵殻膜由来可溶性ペプチドをゲ
ル濾過クロマトグラフィーにて分画し、チロシナーゼ阻害活性試験、ABTS ラ
ジカル消去活性試験、DPPH ラジカル消去活性試験および第二鉄還元力試験を行った。
【結果及び考察】rLasB_indica は LasB_ME4 と 69％と比較的類似性が高かった
が、rLasB_indica は試験した有機溶媒のうち 7 種に対して 1 週間以上安定で、LasB_ME4 とは有機溶媒耐性が全く異なっていた。LasB_ indica による卵殻膜加水分解は「卵殻膜（15 mg/ml）-7 mM Na2SO3-LasB_indica（17 U）を含む 20 mM
Tris-HCl buffer (pH 8.0) にて 45℃で 15 時間の反応」が最適であった。同条件で卵殻膜を分解することで得られた可溶性ペプチド・タンパク質量は、LasB_ME4
による調製物と比較して 10 倍以上となった。ゲル濾過で分画したペプチド画分
は、チロシナーゼ阻害活性および抗酸化活性を示し、卵殻膜由来可溶性ペプチ
ドの機能性を明らかにできた。

補酵素 B12 関与ジオールデヒドラターゼ（DD）は 1,2-プロパンジオール（PDO）
からプロピオンアルデヒドを生成する反応を触媒する。今回、3,3,3‐トリフル
オロ‐1,2‐プロパンジオール（F3PDO）を基質として反応を行ったところ、反応速度は PDO を基質にした場合の約 1/22 であったが、DD に依存したアルデヒ
ド生成が確認された。生成物としては 3,3,3‐トリフルオロプロピオンアルデヒド（F3PA）を想定していたが、生成アルデヒドを 2,4-ジニトロフェニルヒドラ
ゾン 誘導体化して TLC や NMR で分析したところ、予想に反してアセトアルデ
ヒドであった。そこで、酵素反応に伴ってフッ素の脱離が起きているのではな
いかと考えて調べたところ、F-の生成が確認された。しかし、反応の経時変化を調べたところ、アルデヒドと F-の生成比率は一定ではなく、時間に伴って Fの比率が増加する結果が得られた。さらに、F3PA 標品をバッファー中で加温したところ、DD の有無に関係なく、F- とアセトアルデヒドが生成した。また、
F3PDO を基質にした酵素反応で、DD の量や反応時間を振って調べたところ、
アセトアルデヒドに加えて F3PA が検出される場合もあった。また、F3PA から
アセトアルデヒドへの変換を HPLC で追跡したところ、F3PA の減少に伴って未同定化合物が一旦増加し、その減少に伴ってアセトアルデヒドが増加することが示された。これらの結果から、F3PDO からの直接の酵素反応生成物は当初想定していた F3PA であるが、非酵素的な脱フッ素化で何らかの中間体が生成し、それに引き続く反応によってアセトアルデヒドが生成すると結論した。F3PA からアセトアルデヒドへの変換には C-C 結合の開裂も必要になるが、F3PA の段階
的な脱フッ素化でマロン酸セミアルデヒドが生じ、それに続く脱炭酸反応によってアセトアルデヒドが生成するものと予想している。

Characterization of an organic-solvent-stable elastase from Pseudomonas
indica and its potential use in eggshell membrane hydrolysis

The action of coenzyme B12-dependent diol dehydratase on 3,3,3trifluoro-1,2-propanediol results in unexpected formation of acetaldehyde
accompanying defluorination○Kodai Imafuji1, Moe Yokoyama2, Yukihiro Kimura2, Yoko Yamashita2,
Hitoshi Ashida2, Shinnji Takenaka2(1Fac. Agri. Kobe Univ., 2Grad. Sch. Agri., Kobe Univ.)○Koichi Mori1, Dong Jiang2, Bernard T. Golding2, Tetsuo Toraya1(1Fac. Eng., Okayama Univ., 2Sch. Nat. Environ. Sci., Newcastle Univ.)

Key words

Eggshell membrane, elastase, Pseudomonas indica, bioactive peptide

Key words

dehalogenation, defluorination, vitamin B12, cobalamin

1Ap14

白色腐朽菌 Phanerochaete chrysosporium NBRC101254
における xylanase 生産に与えるセルロースの影響

1Ap16

好熱菌 Thermotoga maritima 由来 Encapsulin に内包されるフェリチン様タンパク質の発現系構築及び機能解析○正木 佑弥 1, 萩原 万貴 2, 有吉 由佳 2, 村上 周一郎 2（1明治大院・農, 2明治大・農）smura@meiji.ac.jp○竹原 直輝, 野中 衛, 松村 洋寿, 小川 信明, 尾高 雅文（秋田大院・理工）
modaka@gipc.akita-u.ac.jp【背景・目的】バイオエタノールは、「カーボンニュートラル」な燃料として近年大量に製造されているが、その原料はトウモロコシ等のデンプン質であり、食糧との競合が問題とされている。そのため、非食用である木質系バイオマスに含まれるセルロースが発酵原料として注目されているが、難分解性
hemicellulose や lignin と複雑に結合した状態（lignocellulose）で存在するため、酵素による糖化が難しい。そこで本研究では、lignin を強力に分解する白色腐朽菌 Phanerochaete chrysosporium に着目し、hemicellulose の主成分である xylan
を加水分解する xylanase の生産を向上させる培養条件を検討した。
【方法と結果】 炭素源として 0.4％xylan を含む基本培地に、0.87%の可溶性
cellulose (CMC)、不溶性 cellulose (avicel)、および lignin を加えた培地にて 30℃
で振盪培養し、経日的にサンプリングした培養上清に含まれる xylanase 活性を測定した。その結果、基本培地と比較し、CMC や avicel を添加した培地では、培養 3 日で約 3 倍の xylanase(1.5 U/mL)が生産された。また、lignin の添加によって xylanase 活性の増加はほとんど見られなかった。Cellulose 類の添加による
xylanase 活性の増加の要因を調べるために、20 mL の培養上清を透析後、陰イ
オン交換カラムに供し xylanase を分画することで分析した。その結果、基本培地の培養上清は、素通り画分 (11.6 U)、またカラムに吸着した画分からはピー
ク 1 (0.39 U)およびピーク 2 (3.03 U)に分画された。一方 avicel を添加した培地
からも、素通り画分 (39.77 U)、また同じ塩濃度で溶出されたピーク 1 (1.47 U)、
およびピーク 2 (8.68 U)が得られた。以上の結果から、avicel の添加による
xylanase 活性の増加は、基本培地で生産されている xylanase の種類が増加した
訳ではなく、各々の酵素活性量が増加したためであることが明らかになった。

【研究背景】Encapsulin (Enc)は、分子量約 30 kDa のサブユニットのホモ 60 量体から成る、粒径約 25 nm の正二十面体構造の中空ナノカプセル型タンパク質であり、真正細菌から古細菌までに広く存在している。Enc の生体内での役割は、
Enc 認識シグナル配列を有している酵素を内包することで、プロテアーゼ等の分解酵素から保護することと考えられているが、詳細は不明である。当研究室
では、これまでに Thermotoga maritima 由来 Enc (TmEnc)のバイオマテリアルとしての応用を目指して、生化学的性質、構造化学的性質を明らかにしてきた。
本研究では、TmEnc の生体内での役割を明らかにするために、天然の内包タン
パク質であるフェリチン様タンパク質(Flp)の大腸菌発現系を構築し、機能解析を行った。
【方法】Flp 遺伝子を大腸菌発現ベクター pET30b に挿入し大腸菌 BL21(DE3)を形質転換し発現させた。疎水性相互作用カラムとイオン交換カラムを用いて、Flp を精製した。
サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱検出器(SEC-MALS)
により、精製した Flp の絶対分子量を測定した。Fe(II)SO4 と Flp のモル比が 5:1になるように混合し、UV-vis スペクトル測定により 315 nm の吸光度を測定することで、フェロキシダーゼ活性を追跡した。
【結果及び考察】SEC-MALS の結果、130 kDa に光散乱のピークが観測された。
Flp のアミノ酸配列から計算される分子量は 13 kDa であることから、10 量体であることが示唆された。また、フェロキシダーゼ活性測定では、Flp と Fe(II)SO4を混合すると 315 nm の吸光の増加が観測されたことから、Flp がフェロキシ
ダーゼ活性を有することが示された。

Effects of cellulose on xylanase production by Phanerochaete chrysosporium
NBRC101254

Overexpression and functional analysis of ferritin-like protein encapsulated
in Encapsulin from Thermotoga maritima○Yuya Masaki1, Maki Hagihara2, Yuka Ariyosi2, Syuitirou Murakami2(1Grad. Sch. Agric., Meiji Univ., 2Sch. Agric., Meiji Univ.)

Key words

xylanase, Phanerochaete chrysosporium, cellulose○Naoki Takehara, Mamoru Nonaka, Hirotoshi Matsumura, Nobuaki Ogawa,
Masafumi Odaka(Grad. Sch. Eng., Sci., Akita Univ.)

Key words

Encapsulin, Ferritin like protein, Overexpression

102

1Ap17

シリカ重合酵素群で構成されるフィラメントの形成コン
トロール

1Bp01

○岡本 淳之介, 中島 一紀, 川﨑 了
（北大院・工）nakashima@geo-er.eng.hokudai.ac.jp

窒素源存在下で油脂を高蓄積する海洋性クラミドモナス
変異株の選択的育種○小山 智己 1, 加藤 悠一 2, 佐藤 勝也 3, 大野 豊 3, 蓮沼 誠久 1,2,
近藤 昭彦 1,2,4（1神戸大院・科技イノベ, 2神戸大・先端バイオ工, 3量研高崎・
放射線生物応用, 4神戸大院・工）hasunuma@port.kobe-u.ac.jp【緒言】
海綿動物 Suberites domuncula の骨針内にはシリカ重合活性を示す silicatein α，silicatein β，足場タンパク質 silintaphin-1 が存在し，これらの酵素群（以下，silicatein 群とする）は疎水性相互作用により水溶液中で自己凝集し，フィラメ
ント状構造体を形成することが知られている。この構造体が足場となりシリカ骨格が形成されると考えられているが，一方でこの凝集性が silicatein 群の工学的応用における障壁となっている。そこで，凝集の制御が可能になれば，silicatein
群を利用したナノファイバー状の機能性材料作製などへ応用可能になると考えられる。本研究では，silicatein α 及び silicatein β の N 末端側に粘性細菌由来 可
溶性タンパク質である ProS2 を融合し，プロテアーゼによる ProS2 部位の切断によるフィラメント形成の制御を検討した。
【実験方法】
ProS2 を融合した silicatein（ProS2-Silα および ProS2-Silβ）を E. coli を宿主として大量 発現し，リフォールディングを行った。また，silintaphin-1 は mature タ
ンパク質として発現した。これら 3 種類の酵素からなる silicatein 群を室温で静置し安定性を観察するとともに，溶液に部位特異的プロテアーゼを添加してProS2 部位を切断し，添加前後の溶液を目視と 透過型電子顕微鏡 TEM により
観察した。
【結果】
ProS2-Silα，ProS2-Silβ はいずれも不溶性画分に発現したが，リフォールディングによる可溶化に成功した。ProS2-を融合した silicatein 群は長時間凝集することなく可溶性を維持したが，プロテアーゼ添加後には速やかに凝集体が形成され，溶液が白濁した。また TEM 観察により，プロテアーゼ添加後にはフィラ
メント状構造体が形成されることが確認された。以上より，可溶性タンパク質
ProS2 の融合と切断による silicatein 群の凝集制御が可能であることが示された。

【背景と目的】 地球温暖化や化石燃料の枯渇の懸念から微細藻類を用いたバイ
オ燃料生産が注目を集めている．海洋性緑藻 Chlamydomonas sp. KOR1 株はこれまで報告されてきた微細藻類と比較して旺盛な増殖性とオイル生産性を示し，
バイオ燃料生産者として有望である．KOR1 株を含む一部の微細藻類は培地中の窒素源が枯渇すると細胞内にオイルを多量に蓄積する．しかし窒素源枯渇条
件では細胞増殖が抑制されるとともに細胞状態が悪化する．本研究ではオイル
蓄積が窒素源枯渇条件でしか行われない事を生産プロセス上の問題と捉え，窒素源存在下でもオイルを蓄積する藻株を選択的育種により創出する．その株を用いてバイオマス生産とオイル蓄積を同時に行う新規培養プロセスを開発することを目的とした．
【方法】 炭素イオンビーム照射により KOR1 株の細胞集団にランダムな突然変異を導入した．窒素源存在下で培養した変異細胞集団から蛍光活性セルソーター
でオイル高蓄積細胞を分取した．獲得株を独立栄養・窒素源存在下で培養し，オイルの含有率・生産性を評価した．
【結果と考察】 KOR1 を親株とした選択的育種により，窒素源存在下でもオイ
ルを高蓄積する変異株 KAC1710 及び KAC1801 を獲得した．窒素源が残存する
培養 5 日目の細胞内オイル含有率は，KOR1 株で約 12.5%であったのに対し，KAC1710 株では約 19.1%，KAC1801 株では約 26.6%であった．培養 0〜5 日目の KAC1710 株と KAC1801 株のオイル生産性は約 121 mg/L/Day と約 162 mg/L/
Day であり，KOR1 株の約 92 mg/L/Day を大きく上回った．現在，次世代シーケンサーを用いた変異解析などにより変異株のオイル蓄積機構の解明を進めている．オイル蓄積に関する学術的知見は，遺伝子工学的手法による優良株の創出にも有用であり，効果的にオイルを生産する培養技術の開発にも繋げる事が期待できる．

Control of filament formation of silica-polymerizing enzymes

Selective breeding of marine Chlamydomonas mutants for improving oil
accumulation under nitrogen-replete condition.

○Junnosuke Okamoto, Kazunori Nakashima, Satoru Kawasaki(Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.)○Tomoki Oyama1, Yuichi Kato2, Katsuya Satoh3, Yutaka Oono3,
Tomohisa Hasunuma1,2, Akihiko Kondo1,2,4(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2Adv. Bio. Eng. Res. Cen., Kobe
Univ., 3Dept. Rdiation-Appli. Biol. QST Takasaki., 4Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)

Key words

silica-forming protein, biomineralization, self-assembly

Key words

Chlamydomonas, biodiesel fuel, Selective breeding, Nitrogen-replete

1Ap18

味覚センサーを用いた放線菌由来アミノペプチダーゼの
評価

1Bp02

海洋性クラミドモナス油脂高蓄積変異株における油脂・カロテノイド増産メカニズムの解明○畑中 唯史 1, 石井 恵 2, 中東 良太 3
（1岡山生物研, 2岡山農研, 3ナガセケムテックス(株)）hatanaka@bio-ribs.com○加藤 悠一 1, 小山 智己 2, 佐藤 勝也 3, 大野 豊 3, 張 嘉修 4,
蓮沼 誠久 1,2, 近藤 昭彦 1,2,5（1神戸大・先端バイオ工, 2神戸大院・科技イノベ, 3量研高崎・
放射線生物応用, 4国立成功大・化工, 5神戸大院・工）hasunuma@port.kobe-u.ac.jp【背景および目的】放線菌は、様々なタンパク質を菌体外に分泌することが知られ、タンパク質生産の有用宿主として、近年注目を集めている。我々は、従来から放線菌由来ペプチダーゼの研究を行っており、ホスホリパーゼ D を分泌する放線菌 Streptomyces cinnamonues TH-2 株が、M28 ファミリーに属するアミノペプチダーゼ（M28AP）を分泌することを見出している。本発表では、M28AP
および同じく放線菌由来 M24 ファミリーに属するアミノペプチダーゼ XPO
DUET（ナガセケムテックス(株)製）によるタンパク質消化物の味覚に及ぼす評価結果を報告する。
【方法および結果】M28AP および XPO DUET は、Streptomyces lividans を宿主に分泌生産させたリコンビナント酵素を用いた。これらアミノペプチダーゼの評価を行う目的で、大豆タンパク質（不二製油(株)社製フジプロ E）の枯草菌由来プロテアーゼ（ナガセケムテックス(株)製, ビオプラーゼ SP）消化物を基質に、M28AP および XPO DUET を作用させ、得られた消化物を、味覚センサー（(株)インテリジェントセンサーテクノロジー社製, SA402B）による評価を行った。その結果、M28A あるいは XPO DUET を単独で作用させた場合では、後味の旨味コクの値が、コントロール（アミノペプチダーゼ処理無し）と比較して著しく増強された。M28A および XPO DUET を併用した場合、後味の旨味コクの値は、コントロールよりも低下し、先味の旨味の値が若干向上した。現在、これら消化物について、遊離アミノ酸を分析中である。

【背景と目的】 微細藻類由来バイオ燃料生産の実用化に向けて様々な試みがなされている。海洋性緑藻 Chlamydomonas sp. JSC4 は光独立栄養・海水塩濃度条
件において高い増殖性と油脂含有率を両立するが、明暗周期条件での油脂含有率低下が課題となっていた。これまでにイオンビーム変異誘発とフローサイト
メトリーを用いた選抜育種を実施し、明暗周期条件でも高い油脂含有率を示す
油脂高蓄積変異株 KOR1 の獲得に成功している。本研究では KOR1 の油脂蓄積メカニズムを代謝レベルで解明することを目的とした。
【方法】 明暗周期条件において培養した野生株 JSC4 と油脂高蓄積変異株 KOR1の比較解析を実施した。ガスクロマトグラフィー質量分析、高速液体クロマト
グラフィーにより細胞の油脂、炭水化物、カロテノイドの含有率を測定するとともに、透過型電子顕微鏡解析により細胞内構造を観察した。細胞内代謝物を抽出し、キャピラリー電気泳動-飛行時間型質量分析により網羅的な代謝プロ
ファイリングを実施した。
【結果と考察】 明暗周期条件において、KOR1 は細胞内に多数の油滴を形成し、JSC4 の 2 倍以上の油脂含有率を示した。一方、JSC4 が有する大きなデンプン
粒を KOR1 は形成せず、炭水化物含有率が著しく低下していた。KOR1 の油脂蓄積がデンプン関連の変異に起因することが示唆される。また KOR1 ではカロテノイドであるルテインと β カロテンの含有率も増加していた。デンプン合成
経路、油脂合成経路、およびカロテノイド合成経路の上流に位置する非メバロン酸経路の代謝プロファイリングにより、各経路の中間代謝物量が KOR1 において全体的に増加していることを見出した。デンプン蓄積の異常が各経路における中間代謝物量の増加を引き起こし、合成基質の増加を介して油脂・カロテ
ノイド含有率の向上に寄与した可能性が考えられる。

Evaluation of Streptomyces aminopeptidases by electric tangues

Metabolic profiling and morphological analysis of an oil-rich
Chlamydomonas mutant○Tadashi Hatanaka1, Megumi Ishii2, Ryota Nakahigashi3(1RIBS, Okayama, 2RIA, Okayama, 3Nagase ChemteX Corporation)

Key words

Streptomyces, aminopeptidase○Yuichi Kato1, Tomoki Oyama2, Katsuya Satoh3, Yutaka Oono3, Jo-Shu Chang4,
Tomohisa Hasunuma1,2, Akihiko Kondo1,2,5(1Eng. Bio. Res. C., Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.,
3
Dept. Radiat.-Appl. Biol., QST Takasaki, 4Dept. Chem. Eng., Natl. Cheng Kung
Univ., 5Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)
Key words
biodiesel fuel, pigment, microalgae, metabolic analysis

103

1Bp03

Nitratireductor sp. OM-1 の窒素非感受性株の確立および油脂合成経路の解析

1Bp05○山下 瀬菜 1, 高橋 宏和 1, 渡邉 研志 1, Campanaro Stefano 2,
Treu Laura 2, Angelidaki Irini 2, 秋 庸裕 1, 加藤 節 1, 中島田 豊 1,
松村 幸彦 3, 岡村 好子 1
（1広島大院・統合生命科学, 2デンマーク工科大, 3広島大院・工）okamuray@hiroshima-u.ac.jp

ゲノム編集を用いた TAG lipase ノックアウトによる海洋珪藻 Fistulifera solaris のオイル生産性向上○屋部 佑介 1, 串山 夏望 1, 松本 光史 2, 野島 大佑 1, 吉野 知子 1,
田中 剛 1（1農工大院・工, 2電源開発）
tsuyo@cc.tuat.ac.jp＜背景と目的＞Nitratireductor sp.OM-1 株は廃液中の低級有機酸を資化し、窒素飢餓条件下では細胞重量あたり約 70 %の油脂を蓄積する。その油脂組成の半分以上がブテン酸エステルであることから、バイオディーゼル燃料への応用が期待できる。しかし、実際の廃液中には高濃度の窒素源が存在し、OM-1 株の油脂合成が阻害されることもわかっている。そこで本研究では、ゲノム情報から油脂合成経路を推定し、窒素豊富、窒素飢餓の両方の条件で油脂生産を行い、遺伝子発現を比較した。さらに、実廃液中での油脂生産能の向上を目指し、窒素非感受性株の確立を試みた。
＜方法・結果＞
OM-1 の油脂合成に関わる遺伝子について、窒素源の有無による発現の変化を解析した結果、窒素存在下では脂肪酸合成遺伝子は発現が促進されるが、ブテン酸合成に関わる遺伝子の発現が抑制されていた。このことから、短鎖エステ
ル合成経路が直接、窒素による阻害を受けることが示された。次に、窒素非感
受性株の取得のためにメタン発酵廃液再現培地（含 344 mg/L NH4Cl）で馴化培
養を繰り返し行ったところ、馴化前には細胞重量あたり 17 %だった油脂量が38 %まで増加した。馴化培養後の細胞を Nile Red で染色し蛍光顕微鏡で観察す
ると一部の細胞に強い蛍光が見られたため、窒素存在下でも油脂を多く生産できる自然変異体が出現したことが示唆された。そこで、96 well プレートで単一
コロニーごとに培養を行い、ハイスループットスクリーニングによって有望株の選抜を行った。選抜した株の油脂量は細胞重量あたり 40 %まで増加し、培養液あたり約 1 g/L の油脂生産性を示した。今後はこの株と野生株の比較発現解析を行い、油脂合成経路の窒素感受性に関わる遺伝子の解明を目指すとともに、未知のエステル化酵素の探索を試みる。

【背景と目的】微細藻類が蓄積する脂質はバイオ燃料や医薬品原料などへの応用が期待されている。海洋珪藻 Fistulifera solaris JPCC DA0580 株は脂質としてトリアシルグリセロール (TAG)を高蓄積することが可能であり屋外での大量培養系も確立されているが、実用化に向けては更なる生産性の向上が求められる。
これまでに当該株の機能向上に向けて、高精度な遺伝子改変技術である CRISPR/
Cas9 システムによるゲノム編集法の確立を試みてきた。本研究では CRISPR/
Cas9 を用いて TAG 分解に関与する TAG lipase 遺伝子をノックアウトすること
で、有用株の作出を試みた。
【方法】TAG lipase を標的にしたガイド RNA、及び Cas9 遺伝子を発現するベクターを構築し、パーティクルガン法により F. solaris 野生株へ導入した。得られた形質転換体について High resolution melting 解析を行うことで、ノックアウト
株をスクリーニングした。選別したクローンについて TAG lipase 遺伝子のディー
プシークエンス解析を行い、標的遺伝子上の配列変異の検出を試みた。また、選別したクローンを貧栄養条件で培養することで TAG 蓄積を誘導した。その後、富栄養培地にクローンを播種することで TAG の分解を誘導した。24 時間
毎に共焦点顕微鏡により TAG が蓄積しているオイルボディの体積を測定し、TAG 分解の抑制を評価した。
【結果と考察】ノックアウトクローンの TAG lipase 遺伝子のシークエンス解析の結果、相同組み換えにより修復されたと考えられる CRISPR/Cas9 システム由来の配列変異が検出された。また、TAG 分解条件における共焦点顕微鏡観察の結果、ノックアウトクローンは野生株と比較してオイルボディの分解が有意に抑制された。以上より、CRSIPR/Cas9 システムにより F. solaris の内在性遺伝子のノックアウトが可能であり、TAG 生産性を向上した機能改変株の作出に有用であることが示唆された。

Establishment of nitrogen insensitive strain and analysis of lipid synthesis
pathway of short-chain ester producing bacterium Nitratireductor sp. OM-1

Improvement of oil productivity in Fistulifera solaris by knocking out TAG
lipase gene using CRISPR/Cas9 system○Sena Yamashita1, Hirokazu Takahashi1, kenshi watanabe1, Stefano Campanaro2,
Laura Treu2, Irini Angelidaki2, Tsunehiro Aki1, Setsu Kato1, Yutaka Nakashimada1,
Yukihiko Matsumura3, Yoshiko Okamura1(1Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 2Technical Univ. Denmark, 3Grad.
Sch. Eng., Hiroshima Univ.)
Key words
biodiesel fuel, biomass, volatile fatty acids

1Bp04

焼酎粕を用いた油糧微生物ラビリンチュラの培養による
DHA 生産○Yusuke Yabu1, Natsuno Kushiyama1, Mitsufumi Matsumoto2, Daisuke Nojima1,
Tomoko Yoshino1, Tsuyoshi Tanaka1(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2J-POWER)

Key words

Fistulifera solaris, diatom, CRISPR/Cas9, TAG lipase

1Bp06

海洋珪藻 Fistulifera solaris を用いたシクロオキシゲナー
ゼ遺伝子のオルガネラ特異的発現によるプロスタグランジン高生産○小玉 誠 1, 森谷 亜希 1, 高橋 克嘉 2, 林 雅弘 3
（1宮崎・工技セ, 2宮崎・食開セ, 3宮崎大・農）kodama-makoto@pref.miyazaki.lg.jp○松本 奈々, 鶴 雄基, 野々山 智美, 前田 義昌, 吉野 知子, 田中 剛
（農工大院・工）tsuyo@cc.tuat.ac.jp【背景と目的】宮崎県の本格焼酎出荷量は日本一である。一方で、焼酎製造時の副生成物である焼酎粕が県内で約 30 万 t/年も発生している。飼肥料やメタン発
酵によるガス化などにより活用されているが、その処理コストは大きく、より
高付加価値な用途開発が望まれている。これまでに我々は、焼酎粕が乳酸菌や麹菌の培地として優れた性質を有することを見出している。今回は、優れた増殖性・脂質蓄積性を持つ油糧微生物「ラビリンチュラ」を対象として、DHA 高
生産株を用いることにより、各種焼酎粕による培養適性や脂質生産性などを評価した。
【方法】芋・麦・米・ソバを原料とした焼酎の焼酎粕を固液分離することにより、それぞれの焼酎粕清澄液（CL）を得た。培養液は、CL にグルコースを添加し、人工海水が 1/2 濃度、pH 6.8 とし、滅菌処理した。ラビリンチュラは宮崎大学から供与された mh1913 株（Aurantiochytrium sp.）を用い、28℃で 72 時
間振とう培養したのちに培養菌体を回収した。菌体は乾燥後、クロロホルム／
メタノールにより菌体内脂質を抽出し、さらにメチルエステル化することにより GC で分析し、脂肪酸生産量を測定した。
【結果と考察】最も窒素含量が高い麦 CL について培養に最適な濃度を検討した
ところ、芋 CL と窒素濃度が同じとなるように希釈した場合に、最も脂質生産量が高くなった。他 CL も同様であったことから、全ての CL を芋 CL と同窒素濃度となるように希釈し、グルコース 3%添加により培養したところ、菌体収量はほぼ一定となった。ただし、脂質生産量は芋 CL が他より約 2 割高かった。
ラビリンチュラ類は従属栄養性であり、培養には多量の栄養源が必要であるが、培地の窒素源として CL を利用可能であり、酵母エキスを用いた場合よりも脂質生産量を高めることができたことから、焼酎粕によるラビリンチュラ培養の低コスト化の可能性が見いだされた。

【背景と目的】 プロスタグランジン (PG)は C20 脂肪酸を前駆体として合成される生理活性物質であり、医薬品原料としての需要が高い。PG の生合成はシク
ロオキシゲナーゼ (COX)が触媒する C20 脂肪酸への酸素付加反応から始まる。
近年、モデル植物に外来 cox 遺伝子を導入し、PG を生産する試みがなされているが、前駆体である C20 脂肪酸の含有量が低いことが課題である。そこで、本研究では C20 脂肪酸を高蓄積する海洋珪藻 Fistulifera solaris JPCC DA0580 株(F. solaris)を用いて PG 生産を試みた。さらに PG の高生産に向けて前駆体の蓄積部位である小胞体への COX の特異的発現を試み、その影響を評価した。
【方法】紅藻 Grancilaria vermiculophylla 由来の cox 遺伝子 （gvcox）、および小胞体シグナルペプチドを融合した gvcox 遺伝子を含むベクターをそれぞれ構築し、
F. solaris にパーティクルガン法により導入した。得られたネオマイシン耐性株のうち、gvcox 遺伝子の導入が確認された形質転換体を選抜した。さらに、藻体から PG 抽出画分を調製し、LC-MS/MS 及び抗 PG 抗体を用いた競合法に基づく免疫測定によって、藻体内の PG を定量した。
【結果と考察】PG 定量解析の結果、形質転換体において、アラキドン酸を前駆体とした PG 4 種 （PGD2、PGE2、PGF2α、15-keto PGF2α）とエイコサペンタエン
酸 （EPA）を前駆体とした PG 3 種 （PGD3、PGE3、PGF3α）の生産が確認された。さらに、シグナルペプチドの融合により生産量の向上が確認され、シグナ
ルペプチド融合による COX の小胞体輸送が PG 生産量向上に有効であることが示唆された。以上より、海洋珪藻 F. solaris において紅藻由来の cox 遺伝子の機能発現が有効であり、PG 生産ホストとして有用であることが示された。

DHA production by cultivation of oleaginous microorganisms,
Thraustochytrid using shochu distillation remnants

Highly efficient production of prostaglandins in Fistulifera solaris byexpression of cyclooxygenase with cell organelle-specific targeting○Makoto Kodama1, Aki Moritani1, Katsuyoshi Takahashi2, Masahiro Hayashi3(1Miyazaki Pref. Ind. Technol. Center, 2Miyazaki Pref. Food R & D Center, 3Fac.
Agric., Univ. Miyazaki)

Key words

Aurantiochytrium, DHA, shochu distillery wastewater○Nana Matsumoto, Yuki Tsuru, Tomomi Nonoyama, Yoshiaki Maeda,
Tomoko Yoshino, Tsuyoshi Tanaka(Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words
engineering

microalgae, prostaglandin, physiologically active substance, genetic

104

1Bp07

気相条件における気生微細藻類 Coccomyxa sp. KGUD001 の生育と脂質蓄積

1Bp09○川島 成貴, 油井 信弘, 藤井 克彦（工学院大・先進工・生化）
bt13347@ns.kogakuin.ac.jp

Emticicia sp. EG3 による Euglena gracilis のバイオマスと油脂の生産促進○遠山 忠 1, 花岡 翼 2, 山田 康嗣 3, 鈴木 健吾 3, 田中 靖浩 1,
森川 正章 4, 森 一博 1
（1山梨大院・総研部, 2山梨大院・医工農, 3ユーグレナ, 4北大院・環境）
ttohyama@yamanashi.ac.jp【目的】気相では CO2 を効率的に供給できるため、培養装置を省スペース化でき、微生物の脱水や回収も容易にする。気生微細藻類 Coccomyxa sp. KGU-D001
は、気相条件下で油滴形成に伴う脂質蓄積量の増加を引き起こすことがわかってきた。栄養源を供給することで生育でき、オイル生産性の向上が期待できる。
本研究では、液相条件と気相条件で比較し、栄養源供給時の生育と脂質蓄積を検討した結果を述べる。
【方法】トレボクシア藻綱 Coccomyxa sp. KGU-D001 を 21 日間で前培養した後、窒素源が枯渇した藻体を以下の 3 通りの方法で培養した。(1)偏平フラスコを用い Bold’s Basal 液体培地で 17 日間通気培養した。(2)偏平フラスコを用い Bold’s
Basal 液体培地で 10 日間通気培養した後、細胞フィルムを作成し純水を含む綿上で 7 日間シャーレ内にて気相条件で静置培養した。(3)細胞フィルムを作成しBB 培地を含む綿上で、17 日間シャーレ内にて気相条件で静置培養した。その他の培養条件（温度 25℃、光強度 40 μmol photons m-2 s-1）は揃えて行った。藻体のバイオマス量を測り、脂肪酸含有量は GC により測定した。
【結果・考察】培養 17 日後の Coccomyxa sp.のバイオマス量は、培養(1)と比べ培養(2)と(3)ではそれぞれ 4.6 と 3.6 倍増加した。脂肪酸含有量は、培養(1)が 154
mg/g dwc、培養(2)では 280 mg/g dwc、培養(3)では約 243 mg/g dwc であった。すなわち培養(1)、(2)および(3)のオイル生産性は、それぞれ 0.26、0.67 および 0.60mg/g day となり、培養(1)と比べ培養(2)と(3)の生産性は約 2.5 倍高かった。以上のことより、Coccomyxa sp.は気相条件でも十分に生育可能であり、窒素源枯渇のストレスを与えつつ気相条件で CO2 を供給すれば、効率的に脂質生産できることがわかった。今後は、気相条件における藻細胞の脂質代謝を明らかにし、細胞増殖や光合成活性についても分析する。

【目的】Euglena gracilis（以下、Euglena）は、バイオディーゼルの原料となる
ワックスエステルや種々の生理学的効果が期待されているパラミロンを合成し、それらを細胞内に高蓄積する微細藻類である。Euglena を原料とした燃料生産の社会実装や機能性食品の普遍化に向けて、バイオマスの収量を向上させる
Euglena 培養法の開発は重要な課題である。一方、近年、微細藻類と共生する細菌が宿主藻類の増殖に有益な効果を発揮することが報告されている。そのような共生細菌を利用することで、Euglena のバイオマス生産性を大幅に向上させることが期待できる。そこで本研究では、Euglena の増殖を促進する細菌を探索し、その増殖促進細菌を利用した新しい培養法によって Euglena のバイオマス生産性を向上させることを目的とした。
【方法および結果】下水処理水で培養した Euglena に共生する細菌を分離培養した後、分離菌株を個々に Euglena と共培養した。その結果、分離した Euglena
共生細菌の多くが宿主 Euglena の増殖を有意に促進した。その中でも EG3 株
は、下水処理水中においても Euglena に対する高い増殖促進効果を示した。16S
rRNA 遺伝子配列の解析から、EG3 株は Emticicia 属細菌と同定された。EG3 株と一時的に共培養して増殖活性を高めた Euglena を 15L の下水処理水が入った容器に接種して培養した。その結果、通常の Euglena 培養と比較して、Euglenaのバイオマス生産速度と総脂質生産速度が 3 倍程度向上した。

Growth and lipid accumulation in the aerial microalga Coccomyxa sp.
KGU-D001 biofilm under aerial condition

Enhancement of biomass and lipid productivity of Euglena gracilis by
Emticicia sp. EG3○Naritaka Kawashima, Nobuhiro Aburai, Katsuhiko Fujii(Dept. Chem. Life Sci., Sch. Adv Eng., Kogakuin Univ.)○Tadashi Toyama1, Tsubasa Hanaoka2, Koji Yamada3, Kengo Suzuki3,
Yasuhiro Tanaka1, Masaaki Morikawa4, Kazuhiro Mori1(1Grad. Fac. Interdisc. Res. Univ. Yamanashi, 2Sch. Med. Eng. Agr., Univ.
Yamanashi, 3euglena Co., Ltd., 4Grad. Sch. Environ. Sci., Hokkaido Univ.)

Key words

aerial microalgae, biofilm, lipid accumulation, nutrient source

Key words

Euglea graclis, Emticicia sp., growth promotion, biomass

1Bp08

気相条件下での気生微細藻類 Coelastrella sp. KGUY002 のキサントフィルのエステル化における水分量の
影響

1Bp10

炭化水素生産微細藻類 Botoryococcus braunii の共生細菌が生産する藻体生育促進物質の探索○村山 拳午, 大槻 隆司（山梨大院・医工農・生命環境）
tohtsuki@yamanashi.ac.jp○恩田 岳英, 油井 信弘, 藤井 克彦（工学院大・工）bt13347@ns.kogakuin.ac.jp【背景と目的】水酸基を有するカロテノイド(キサントフィル)はエステル化する
ことでより有用な生理活性が付与される可能性がある。陸上の基物表面から単離した気生微細藻類 Coelastrella sp. KGU-Y002 は多種のエステル型キサント
フィルを蓄積する性質をもち、液体培地中だけではなく、大気に晒されても(気相条件)キサントフィルを合成できることがわかってきた。しかし、藻体の水分がキサントフィルのエステル化に影響するかは明らかになっていない。本研究では、Coelastrella sp. のキサントフィルのエステル化について気相条件下での水分量を検討した。
【方法】直径 88 mm のシャーレ中に脱脂綿を敷いて 2.5、5.0、または 10.0 mL の純水をそれぞれ添加し、その上にメンブレンフィルターを用いて作成した藻体の細胞フィルム(1 mg/filter)9 枚置いた。培養温度 25℃、光強度 100 μmol photons
m-2 s-1 の条件で 7 日間静置培養した。藻体のカロテノイド含有量は HPLC を用いて測定した。
【結果と考察】7 日間で、シャーレ内の水分量は約 3.5 mL 減少した。純水を添加しなかった場合には、藻体のバイオマス量とカロテノイド含有量は培養開始時から変化しなかった。純水 2.5 mL を添加したときには藻体のバイオマス量は培養開始時と比べてそれぞれ 1.8 倍増加し、純水 5.0、10.0 mL では約 2.9 倍に増加した。藻体は水分の供給が十分であれば、気相条件下でも光合成を行うことができ、炭素を固定できると考えられる。2.5 mL 以上の純水添加によって、培養開始時と比べて、カロテノイド含有量は 2.0 倍に増加した。また水分量が増えるにつれてエステル型キサントフィルの含有量は増加し、10 mL の純水添
加では培養開始時と比べて約 2.5 倍に増加した。一定の水分量の供給がキサン
トフィルのエステル化に影響を与えることがわかった。今後はエステル化反応と光合成活性の関係を検討する。

【背景・目的】
地球温暖化が深刻化する中、Botoryococcus braunii が生産する炭化水素は石油代替資源として注目されている。B.braunii の炭化水素生産量は他の藻類と比較して著しく多いが、生育が遅く単位時間当たりの生産量が少ない。生育の改善に繋がる現象として、我々は B.braunii 藻体表面から単離した共生細菌が生産する物質が B.braunii の生育を促進する可能性を見出した 1)。B.braunii 藻体表面の共生細菌の報告例は少なく、さらに生育を促進する物質の報告例はない。本研究では単離した No.13 株の培養上清の限外濾過により得た画分を無菌化した
B.braunii に添加し、生育を比較することで生育促進物質の特定に繋がる情報を得ることを目的とした。
【方法】
No.13 株を 3 L の AF-6 培地(0.3% Glucose)で 5 日間、25℃にて振盪培養した。培
養液を遠心した上清をフィルターで濾過し、タンジェンシャルフローシステム
を用いて分子量 100 kDa 以上の画分 A と 100 kDa 以下 10 kDa 以上の画分 B を得た。AF-6 培地にタンパク質換算で終濃度が 1 μg/mL となるように画分 A あ
るいは B を添加し、B.braunii NIES836 株を OD660=0.1 となるように接種して全量 80 mL で培養を行い、7 日ごとに乾燥重量の測定を行った。
【結果・考察】21 日間培養を行なった結果、14 日目から 21 日目間の比増殖速度は画分物質を添加していない試験区と比較して画分 A 添加試験区では約 3.1 倍、画分 B では
約 2.8 倍になった。また、画分 A、B をそれぞれ Native-PAGE で解析した結果、一本のバンドが確認でき、SDS-PAGE では画分 A から 200 kDa 以上のタンパク
質、画分 B からは 100 kDa 以下のタンパク質が複数存在することが見出され、これらのタンパク質が会合して複合体を形成していることが推察された。今後は生育促進に携わると考えられるタンパク質を分離し、N 末端配列解析を行い、No.13 株から遺伝子クローニングを試みる。

Influence of water for xanthophyll esterification in the aerial microalgae
Coelastrella sp. KGU-Y002 under aerial conditions

Search for factors promoting growth of Botoryococcus braunii produced by
the commensal bacterium.

○Takahide Onda, Nobuhiro Aburai, Katsuhiko Fujii(Fac. Eng., Kogakuin Univ.)

Key words

aerial microalgae, water, xanthophyll, esterification○Kengo Murayama, Takashi Ohtsuki(Grad. Sch. Life Environ Sci.,Univ Yamanashi)

Key words

Botoryococcus braunii, Commensal bacterium, Growth promotion

105

1Bp11

ユーグレナ低酸素下ワックスエステル合成におけるミト
コンドリア電子伝達系の機能解明

1Bp13○西本 歩紗 1, 中澤 昌美 1, 乾 博 2, 上田 光宏 1, 阪本 龍司 1
（1阪府大院・生環科, 2阪府大院・栄養）
mami@biochem.osakafu-u.ac.jp

様々な有機物がウキクサの成長に及ぼす影響○牧田 晟洋 1, 石澤 秀紘 1, 黒田 真史 1, 井上 大介 1, 森川 正章 2,
池 道彦 1（1阪大院・工, 2北大院・地環科）
ike@see.eng.osaka-u.ac.jp

微細藻類ユーグレナは好気状態で貯蔵多糖パラミロンを細胞内に蓄積する。パラミロンは低酸素曝露により分解され、ワックスエステル (WE) へと変換される。WE の主成分はミリスチン酸ミリスチルであり、バイオディーゼル燃料やバイオジェット燃料の原料としての利用が期待されている。ユーグレナの WE
蓄積量は細胞乾燥重の約 30%に達するが、実用化にはさらなる生産量向上が望まれている。その達成には、未だ不明な点が多い WE 合成メカニズムの解明が必須である。当研究グループでは、低酸素状態での WE 合成および細胞内 ATP
レベルがミトコンドリア電子伝達系複合体 I 阻害剤の存在下で大幅に低下することを明らかにしてきた。しかし、WE 合成における電子伝達系の具体的な機能は不明であった。本研究では、ユーグレナのミトコンドリア電子伝達系の構成要素である電子伝達タンパク質 (ETF)、ETF 酸化還元酵素 (ETFOR)、さらに
アシル-CoA への還元反応を担うと予想されるトランスエノイル-CoA 還元酵素
(TER) およびアシル-CoA 脱水素酵素 (ACD) についてそれぞれ発現抑制を行い、低酸素状態でのユーグレナ代謝におけるミトコンドリア電子伝達系の寄与を詳細に調べた。
ETF、ETFOR の各発現抑制群ではコントロールと比べ WE 合成量が約 20%まで減少した。このことから、低酸素状態のユーグレナはミトコンドリア電子伝達系で生じた還元力を WE 合成に利用していると示唆された。また、従来アシ
ル-CoA への還元反応を担うと考えられてきた NADH 依存型 TER の発現抑制では WE 合成が全く変化しなかった。これに対し、フラビン依存型 ACD の 2 種のアイソザイムを同時に発現抑制すると WE 合成が大幅に低下した。これらの結果から、低酸素状態のユーグレナ代謝における WE 合成は、ミトコンドリア
電子伝達系で生じた還元力を β-酸化の完全逆行反応に利用することで達成されていることが示唆された。

【背景・目的】ウキクサ亜科植物は、無性生殖で増殖する水生植物であり、好適条件下では植物界で最大級の増殖速度を誇る。また、デンプンやタンパク質の含有率が高いことから、有望なバイオマス資源として注目を集めている。資源価値の高いウキクサを効率的に栽培するためには、最適な培養条件の探索が必要であり、光・温度条件や培養液中の無機成分がウキクサ亜科植物の成長に及ぼす影響については、これまでの研究で明らかにされつつある。しかし、培養
液中の有機物がウキクサ亜科植物の成長やバイオマス組成に及ぼす影響については、不明な部分が多い。そこで、本研究では、様々な有機物が、ウキクサ亜科植物の一種であるコウキクサ(Lemna minor)の成長速度および有用物質の含有量に及ぼす影響を評価することを目的とした。
【方法・結果】滅菌した無機塩培地(対照系)と、そこに様々な有機物を添加した培養液を用意し、8 日間コウキクサ(Lemna minor)を培養した。その結果、対照
系と比較し、D-グルコース、スクロース、L-グルタミン、L-アスパラギンを添加した系でコウキクサの成長促進が見られ、培養液中から吸収された D-グル
コース、スクロースは炭素源、L-グルタミン、L-アスパラギンは窒素源として、
コウキクサに利用されたものと考えられた。また、対照系のデンプン含有率
9.7%に対し、D-グルコース、スクロース添加系では、それぞれ 18.4 %、17.7 %と高いデンプン含有率が得られたことから、吸収されたこれらの糖の一部は、デンプン合成にも利用されたことが示唆された。
【謝辞】本研究は、科学技術振興機構先端的低炭素技術開発(ALCA)「共生微生物を活用した水生バイオマスの効率生産」(JPMJAL1108)の一環として実施した。

Contribution of mitochondrial anaerobic respiration in wax ester
production under hypoxia in Euglena

Influence of various organic compounds on the production of duckweedbiomass○Ayusa Nishimoto1, Masami Nakazawa1, Hiroshi Inui2, Mitsuhiro Ueda1,
Tatsuji Sakamoto1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ., 2Dep. Nutri., Osaka Pref. Univ.)○Akihiro Makita1, Hidehiro Ishizawa1, Masashi Kuroda1, Daisuke Inoue1,
Masaaki Morikawa2, Michihiko Ike1
(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Grad. Sch. Environ. Sci., Hokkaido Univ.)

Key words

Euglena, wax ester, mitochondria, electron transfer system

Key words

duckweed, biomass, organic compounds

1Bp12

有用油脂生産藻の特性分析と環境ストレス耐性評価

1Bp14

暗期パルス光照射によるアオサノリの２倍速生育○高木 明香莉 1, 佐々木 美月 1, 佐々木 大作 2, 朝山 宗彦 1
（1茨城大院・農, 2Biox 化学工業）
munehiko.asayama.777@vc.ibaraki.ac.jp【目的】 新奇緑藻パラクロレラ BX1.5 株を、異なる培養条件に晒した場合の細胞形態変化および脂質生産能の違いを分析するとともに環境ストレス耐性を調べ、屋内外培養技術のさらなる向上の礎とすることを目的とした。
【方法】 BX1.5 株を２%炭酸ガス充満式インキュベーター内で BG11、窒素欠乏
BG11−N、および リン欠乏 BG11−P 培地を用いた栄養条件下で培養し、光学顕微鏡により細胞形態を観察した。次に、細胞から全脂質を抽出し、メチルエ
ステル化させた化合物を FID 分析して、脂質の組成と生産量を調べた。また、各培養条件下での培地 pH 変化や細胞内クロロフィル a 量を測定した。更に、十分に生育させた本株細胞を強酸・強アルカリ、高温、乾燥、高浸透圧など８条件のストレス下に一定時間晒した後、寒天培地にスポットし、生育を観察した。
【結果と考察】 本株を BG11−N/−P 培地で培養した場合、C16 飽和脂肪酸（燃料向き）ならびに C18 不飽和脂肪酸（食用油向き）を主成分とするトリアシル
グリセロール（TAG）が BG11 培地で培養するより単位乾燥重量あたりで高生産されていたが、培養液あたりに換算するとバイオマス量そのものが低減する
ことに伴い相対的に低下していた。よって、高濃度炭酸ガス条件下の BG11 培
地で培養すると、培養液あたりの TAG 生産量が最も高くなることが明らかとなった。また細胞サイズは、BG11 のそれと比べて BG11−N 培養では小さく、
BG11−P 培養では相対的に大きくなっており、培養条件により変化していた。
一方、本株は、様々な環境ストレス耐性を示すことから、屋外培養にも適していると考えられた。更に、BG11−N/−P 培地由来細胞間で一部異なる耐性パ
ターンを示したことから、培地 pH に加え、細胞内の脂質やクロロフィル a 蓄
積量などの差もストレス耐性へ影響している可能性が示された。

Useful lipid production and stress resistance of a novel green alga

○Akari Takagi1, Mitsuki Sasaki1, Daisaku Sasaki2, Munehiko Asayama1(1Grad. sch. Agric., Ibaraki Univ., 2BioX Chem. Ind. Co., Ltd.)Key words

lipid, microalgae, Parachlorella, stress resistance○梶山 博司 1, 箕田 康一 1, 武田 真樹 1, 木村 祐太 1, 宇山 裕貴 1,
山崎 直人 2, 山本 博文 2
（1徳島文理大院・工・ナノ物質工, 2徳島文理大・薬）kajiyama@fst.bunri-u.ac.jp【背景と目的】アオサノリ(Monostroma latissimum)は佃煮などの原料として重宝されているが、近年の海水温度上昇や水質変化により収穫量は減少傾向にある。そのため、安定した周年栽培が可能な陸上養殖技術が望まれている。アオサノリの単胞分裂や葉体形成に必須であるサルーシン（thallusin）の人工合成技術が徳島文理大学
薬学部により確立されたことで、陸上養殖に道が拓けた。本研究の目的は、レタスの高速栽培で実績がある暗期パルス光技術をアオサノリに応用して、その生育促進効果を明らかにすることである。
【実験方法】
青色パルス光は、ピーク波長=449nm、パルス周波数<10 kHz、デューティー比< 0.2、光合成有効量子束密度（PPFD）<1.0 に設定した。明期の照明には蛍光灯(PPFD=130)を用いた。パルス光照射の効果を調べるために、次の手順で参照
試験をおこなった。アオサノリの単細胞と滅菌した海水が入ったフラスコをふたつ用意し、双方に適量のサルーシンを添加した。蛍光灯は１２時間点灯(明期)と１２時間消灯(暗期)を繰り返した。一方のフラスコには明期の蛍光灯のみ
を、残りのフラスコには暗期にパルス光を８時間照射した。栽培期間は４２日間であった。収穫までの葉体の生育過程は、重量、粒径分布、形状により評価した。重量は遠心分離機で脱水したのちに計測した。葉体の粒径はミー散乱ス
ペクトルから求めた。葉体形状は光学顕微鏡で観察した。
【結果】
パルス光照射開始から１４日程度で生育に差が現れた。４２日後の収穫重量はパルス無しに比べておよそ２倍まで増加した。パルス無しの収穫重量には、パルス照射によって２週間程度早く到達していた。葉体数には、パルス光の有無による違いはなかった。一方、パルス光により、葉体の平均粒径は、１．８倍に増加し、葉体は全体に広がった形状に成長していた。

Double speed growth of Monostroma latissimum by using pulsed lighting
during dark period○Hiroshi Kajiyama1, Koichi MIta1, Masaki Takeda1, Yuta Kimura1, Hiroki Uyama1,
Naoto Yamasaki2, Hirofumi Yamamoto2(1Dept. nano Mater., Grad. Sch. Eng., Tokushima Bunri. Univ., 2Fac. Pharm.,
Tokushima Bunri Univ.)

Key words

Monostroma latissimum, aquaculture, thallusin, pulsed lighting

106

1Bp15

組換え Ralstonia eutropha による糖質炭素源からのポリヒドロキシアルカン酸共重合体生合成におけるアセトア
セチル-CoA 還元反応の改変効果

1Bp17○岸川 凜太郎 1, 森 智夫 2, 河岸 洋和 2,3,4, 平井 浩文 2,3（1静大院・総合科技, 2静大・農, 3静大・グリーン科技研, 4静大・
創科技院）
hirai.hirofumi@shizuoka.ac.jp

Zhang Mengxiao, 栗田 俊輔, 折田 和泉, 中村 聡, ○福居 俊昭（東工大・生命理工）tfukui@bio.titech.ac.jp【目的】 C4 および C6 ユニットからなるポリ((R)-3-ヒドロキシブタン酸-co-(R)-3ヒドロキシヘキサン酸) [P(3HB-co-3HHx)] は柔軟性に優れた生分解性プラスチッ
クとして普及が期待されている。我々はこれまでに Ralstonia eutropha の改変に
より糖質炭素源から P(3HB-co-3HHx)を生合成可能な株を作製した。高い 3HHx
組成での生合成には NADPH 依存型アセトアセチル-CoA レダクターゼ（PhaB1）の欠失が必要であったが、この PhaB1 欠失により生産量が減少した。本研究ではアセトアセチル-CoA が C4 モノマーと C6 モノマーの生合成経路の分岐点であることに着目し、その還元ステップの改変による PHA 共重合体生合成への影響を検討した。
【方法および結果】 R. eutropha P(3HB-co-3HHx)生合成株において PhaB1 を高基
質親和性・低活性のパラログ PhaB2 に置換したところ、グルコースから 3HHx
分率 6~7 mol%の共重合体を乾燥菌体重量あたり 71~72 wt%で生合成した。この組成は PhaB1 欠失株と PhaB1 保持株の中間であり、アセトアセチル-CoA の(R)特異的還元と(S)-特異的還元のバランスによるフラックス分配を変化させることで共重合組成の制御が可能であった。低基質親和性の PhaB1 変異酵素では大きな効果は見られなかった。また NAD 依存型(S)-3HB-CoA デヒドロゲナーゼおよびクロトナーゼの遺伝子導入により逆 β-酸化経路を強化し、かつ短鎖特異的
R-ヒドラターゼを導入した株はグルコース炭素源から P(3HB-co-12 mol% 3HHx)
を蓄積率 75 wt%で生合成した。このことからクロトニル-CoA を分岐点としたフラックス再分配も組成・蓄積率の決定に重要な要因であると考えられた。

白色腐朽菌 Phanerochaete sordida YK-624 株のリグニン分解系を制御する転写因子の探索【背景・目的】
白色腐朽菌は、木材の主要成分であり難分解性芳香族高分子であるリグニンを単独で高度に分解可能な唯一の微生物である。リグニン分解には様々な酵素、低分子化合物が関与することは既に明らかにされているが、リグニン分解には多種多様な分子種が複雑に関わっているため、その全貌は未だに解明されていない。また、リグニン分解系全体の制御因子なども見つかっておらず、その特性を大幅に改善する分子育種法などは確立されていない。
当研究室では、これまでにトランスクリプトーム解析により高活性リグニン分
解菌 Phanerochaete sordida YK-624 株が、リグニン非存在時と比較してリグニン
存在時に発現が増減する転写因子様遺伝子を数種得ており、これらが真にリグ
ニン分解に関与しているかどうか、調査を行った。
【方法・結果】
ブナ木粉及び脱リグニン処理ブナ木粉（ホロセルロース）にて P. sordida YK-624を培養し、total RNA を得て発現解析を行った。その結果、nitrogen assimilationtranscription factor NIT-4 様遺伝子が、トランスクリプトーム解析の結果と一致
してリグニン存在下で高発現していた。nit-4 は、アカパンカビにおいては窒素制限下で発現し、硝酸／亜硝酸レダクターゼ遺伝子の発現を誘導する転写因子であるが、本腐朽菌由来 NIT-4 様遺伝子の相対発現量は、硝酸アンモニウム添加に影響されなかった。以上の結果より、NIT-4 様遺伝子は培地中の窒素濃度に関らず、リグニンに応答して高発現していると推測された。

Modification of acetoacetyl-CoA reduction in Ralstonia eutropha forbiosynthesis of polyhydroxyalkanoate copolymers from structurally
unrelated compounds

Identification of transcription factors regulating lignin degradation in whiterot fungus Phanerochaete sordida YK-624

Key words
biodegradable plastic, polyhydroxyalkanoate, Ralstonia eutropha,
metabolic engineering

Key words

white-rot fungi, lignin degradation, transcription factor, nit-4

1Bp18

リグニンモデル化合物のエーテル結合を切断する微生物の探索

Mengxiao Zhang, Shunsuke Kurita, Izumi Orita, Satoshi Nakamura,○Toshiaki Fukui(Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)

1Bp16

未活用資源を用いた PHA 生産および合成遺伝子の特定○張 傛喆 1, 中村 友綺 1, 小野寺 瑠依 1,
Motakatla Venkateswar Reddy 2（1室蘭工業大院・工・環境創生工学, 2Inst. Mol. Microbiol.
Biotech. Münster Univ.）
ychang@mmm.muroran-it.ac.jp○Rintaro Kishikawa1, Toshio Mori2, Hirokazu Kawagishi2,3,4, Hirofumi Hirai2,3(1Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Fac. Agric., Shizuoka Univ.,
3
Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., 4Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka
Univ.)○大谷 早紀 1, 利根川 聡史 1, 羽部 浩 2, 古屋 俊樹 1
（1東京理科大理工・応生, 2産総研・環境管理）
tfuruya@rs.tus.ac.jp[背景および目的] ポリヒドロキシアルカン酸（PHA）はバイオマスを原料として微生物により生産される生分解性プラスチックである。しかし、高価格のため広範囲での実用化には至っておらず、生産コストの削減のため廃棄物を原料とした生産や、遺伝子組み換え技術を利用した生産量向上に向けた研究が行われている。その中、本研究では有機系廃水の利用可能性を評価した後、PHA の生産に関与する合成遺伝子の同定を行った。
[方法] 下水、濃縮下水、チーズホエー、希釈チーズホエー、チーズホエーの酢
酸発酵液を用いた５つの条件において PHA 生産を行った。このうち酢酸発酵液を用いた条件では、第１段階反応としてチーズホエーを酢酸生産菌株と培養し、基質となる酢酸へ転換した。続く第２段階で、この酢酸発酵液を基質としたBacillus sp. CYR1 株による PHA 生産を行った。一方 CYR1 株の PHA 合成経路を推定するため、CYR1 株の PHA 合成酵素をコードする遺伝子領域を PCR 法
により増幅させ、得られた産物の配列解析を行った。
[結果] 下水およびチーズホエーから PHA が生産可能であることが示された。1H
NMR および 13C NMR 解析により、得られた PHA は 3-ヒドロキシ酪酸（3HB）
を主要な構成モノマーとすることが分かった。また、本研究で得られた最大
PHA 生産量は、チーズホエーの酢酸発酵液を基質とした条件であった。２段反応での PHA 生産が生産量の向上に効果的であることが示された。一方、遺伝子配列解析の結果、CYR1 株は既報の PHA 合成酵素の遺伝子配列と高い類似性を有することが示唆された。

【背景・目的】原油由来の芳香族化合物は化学製品の合成原料などに利用されているが、原油は有限の資源であり将来的に枯渇してしまう恐れがある。そこで近年、バイオマス資源のリグニンが芳香族化合物の供給源として注目されている。リグニンはモノリグノールと呼ばれる芳香族化合物が酸化重合した高分子化合物であり、多くのエーテル結合が含まれている。その中でも β-O-4 結合が最も多く含まれており、この結合を切断できればリグニンを低分子化することが可能と考えられる。本研究では、リグニンの β-O-4 結合に対するモデル化合物として 2-フェノキシアセトフェノン（2-PAP）を用い、本化合物のエーテル結合を切断可能な新規微生物の探索を実施した。

PHA production using unused resources and identification of synthetic
genes

Search for microorganisms that cleave ether bond in a lignin modelcompound○Young Cheol Chang1, Yuki Nakamura1, Rui Onodera1,
Motakatla Venkateswar Reddy2(1Grad. Sch. Eng., Muroran Inst. Technol., 2Inst. Mol. Microbiol. Biotech. Münster
Univ.)

Key words

PHA, PHB, biodegradable polymer, bioresources【方法・結果】日本各地から採取した 540 の土壌サンプルを生理食塩水に懸濁し、リグニン様の構造を含むニトロフミン酸を炭素源とする固体培地に塗布して生育可能な微生物を選択した。その結果、1183 株の微生物が取得された。つ
ぎに、これらの微生物を 2-PAP を含む溶液に懸濁し、30℃で 72 時間振とうす
ることにより反応を行った。2-PAP のエーテル結合が切断されるとフェノールを生成することが予想されるため、フェノールを検出可能なギブス試薬を反応液の分析に用いた。その結果、9 株の微生物で反応液がギブス試薬の添加により呈色した。1 株の微生物の反応液について、HPLC により分析したところ、保持時間からフェノールと推定されるピークを含むいくつかのピークが検出された。このことからエーテル結合が切断されていることが示唆された。現在、二次スクリーニングで陽性を示した微生物について、属種同定や反応生成物の詳細な解析を進めているところである。

○Saki Oya1, Satoshi Tonegawa1, Hiroshi Habe2, Toshiki Furuya1(1Dept. Appl. Biol. Sci., Fac. Sci. Tec., Tokyo Univ. Sci., 2AIST, EMRI)

Key words

ether bond, lignin, biodegradation, screening

107

1Cp01

芳香族有機塩素化合物の微生物分解に及ぼす土壌の
影響

1Cp03

○八田 貴, 久渡瀬 太一, 劉 昊, 周 法宇
（岡山理大・工）thatta@bme.ous.ac.jp

白色腐朽菌 Phanerochaete chrysosporium によるネオニ
コチノイド系殺虫剤の分解○大野 遥 1, 一瀬 博文 2, 森 智夫 3, 河岸 洋和 3,4,5, 平井 浩文 3,4（1静大院・総合科技, 2九大院・農, 3静大・農, 4静大・グリーン
科技研, 5静大・創科技院）
hirai.hirofumi@shizuoka.ac.jp【背景と目的】ダコニール [2,4,5,6,-tetrachloroiso phthalo nitrile (TPN)] は農薬として世界的に使用され、中国では有機塩素系殺菌剤として最も多く使われている。
Paraburkholderia fungorum は TPN を土壌成分が存在する場合のみ分解することを明らかにしている。特にバーミュキュライト、カオリナイトの存在下で分解が促進することを明らかにしている。今回の報告では、液体培養下での Ralstonia
pickettii の 2,4,6-trichlorophenol (2,4,6-TCP) 分解に対する種々土壌の効果を調べた。
【方法】 培養はバッフル付き三角フラスコを用い、無機塩培地に畑土、鹿沼土、
赤玉土、バーミキュライト、カオリナイト、パーライト等の土壌を加え TPN あ
るいは 2,4,6-TCP の分解を調べた。土壌の濁りでの生育測定が難しいため、各化合物の分解は遊離塩素イオン濃度をチオンシアン酸水銀法により求めた。
【結果と考察】 TPN の分解は、無機塩培地のみではの場合殆ど分解しないが、培養液中に畑土、バーミキュライト、カオリナイトを 5％程度添加することにより分解が著しく促進された。一方、2,4,6-TCP の分解はバーミキュライト、カオリナイトでは抑制されたが、鹿沼土、パーライト存在下で分解が促進され
TPN 分解に対する反対の効果を示した。培養液中に鹿沼土を加えた場合では非常に高濃度の 2,4,6-TCP 分解を示した。現在までに 0.1％以上の 2,4,6-TCP の分
解の報告はなく、土壌が何らかの影響を及ぼしていると考えられた。

世界で広く使用されている殺虫剤の一つであるネオニコチノイド系殺虫剤（NEOs）は、1990 年代に開発された比較的新しい農薬である。NEOs はニコチ
ン性アセチルコリン受容体のアゴニストであり、昆虫の中枢神経系を攪乱する
ことによって選択的な生物学的毒性を発揮する。最近では、その残効性や植物
浸透移行性に由来する環境やヒトに対する悪影響が懸念されている。そのため、NEOs 汚染環境の浄化・無毒化技術の開発は喫緊の課題である。
我々はこれまでに代表的な白色腐朽菌 Phanerochaete chrysosporium によってNEOs の一種であるアセタミプリド（ACE）が分解可能であり、その分解反応にはシトクロム P450（CYP）が関与しており、P. chrysosporium 由来 CYP 酵母
異種発現スクリーニングシステムにより、ACE 分解には CYP5147A3 が関与していることを明らかにしている。この CYP を異種発現させた酵母を用いて NEOs
分解実験を行ったところ、ACE に対し高い分解活性を示した一方で、チアクロ
プリド、ニテンピラム、ジノテフランなど他の NEOs に対しても分解活性を示すことが明らかになった。一方で P. chrysosporium の in vivo における ACE 分解
活性は低く、ジノテンフランはほとんど分解しなかった。この様に in vivo とCYP 組換酵母で NEOs の分解挙動が大きく異なることから、P. chrysosporium による NEOs 分解は、CYP5147A3 の発現量に大きく依存していること、またCYP5147A3 以外の酵素が関与していること等が予想された。

Effect of soils on chlorinated aromatic compounds degradation by Bacteria

Degradation of neonicotinoid insecticides by white-rot fungus
Phanerochaete chrysosporium○Takashi Hatta, Taichi Kudose, Hao Liu, Fayu Zhou
(Fac. Eng., Okayama Univ. Sci.)

Key words

biodegradation, soil, aromatic ring compound, fungicide

1Cp02

組換え大腸菌を用いた高効率リン酸トリス(2-クロロエチル)分解○阿部 勝正, 篠原 輝, 高橋 祥司, 解良 芳夫（長岡技科大）katsuabe@vos.nagaokaut.ac.jp○Haruka Ono1, Hirofumi Ichinose2, Toshio Mori3, Hirokazu Kawagishi3,4,5,
Hirofumi Hirai3,4(1Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Fac. Agric., Kyushu Univ., 3Fac.
Agric., Shizuoka Univ., 4Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., 5Grad. Sch.
Sci. Technol. Shizuoka Univ.)
Key words
bioremediation, neonicotinoid, cytochrome P450, white-rot fungi

1Cp04

Effect of Pseudomonas putida on toluene removal activity
in the rhizosphere of Solanum lycopersicum L.
○Hak Jin Song1, Yong-Keun Choi1, Ji Eun Kim1, Kwang Jin Kim2,
Yunjeong Yang1, Eun Bin Lee1, Sang Hyun Lee1, Yung-Hun Yang1,
Hyung Joo Kim1
(1Dept. Biological Eng., Konkuk Univ., 2Urban Agric. Res. Div.,NIHHS, Rural Development Administration)
hyungkim@konkuk.ac.kr

Tris(2-chloroethyl) phosphate (TCEP) は，有機リン酸トリエステルの中でも塩素を含むハロアルキル系有機リン酸トリエステルであり，ヒトを含む生物に対する毒性を有する．本研究室では微生物による含塩素難分解性有機リン化合物分解処理技術を開発するために，TCEP の分解能を有する Sphingobium sp. TCM1
株を自然界から単離し，TCEP 分解に必須である 3 つの酵素，ホスホトリエス
テラーゼ (HAD)，ホスホジエステラーゼ(PDE)，モノエステラーゼ(PME)の同定にも成功している．TCM1 株を用いた TCEP 分解系に関する研究も行ってきたが， 20 μM の TCEP を完全分解するのに 96 時間も要することから，今後，微生物を TCEP 環境浄化に用いるためにはより効率的な TCEP 分解微生物の創出が必要であると考えられる．そこで本研究では，異種細胞発現系の中でも最も研究されており，遺伝子工学的手法も確立されている大腸菌中で TCEP 分解酵素群を発現させ，その分解挙動や効率を詳細に解析することとした.
まず，大腸菌が PDE，PME の関連酵素を有していることから HAD のみを発現させることで TCEP の完全分解が可能となるか解析を行った．しかし，HAD のみの発現では TCEP を完全に分解できないことが明らかとなり，HAD に続く分解を担う PDE を共発現させた場合の分解挙動について再度検討した．pET-Duet
ベクターを用いて HAD と PDE 共発現系を構築し，共発現大腸菌を用いて，無機塩培地中の TCEP 分解挙動について解析した．その結果，本菌は TCM1 株を用いた分解より 12 倍早い 8 時間程度で 50 μM の TCEP 完全分解できること，
また，50 μM 以下の TCEP であれば IPTG 添加なしで完全分解可能であることが明らかになった．100 μM 以上の高い TCEP 濃度の場合に関しても培養液への
IPTG 添加が必須ではあるが，72 時間で TCEP を完全分解しており，本菌は高濃度の TCEP 分解にも対応可能であることが示された．

In this study, toluene-degrading rhizobacteria were isolated and identified for the
toluene reduction in indoor air. The isolated bacteria were applied to the rhizosphere of
Solanum lycopersicum L. and their toluene degrade activity was investigated. Soilfrom toluene-contaminated rhizosphere of Ardisia pusilla A. DC. were used asbacterial samples for the enrichment culture (toluene as a sole carbon source). Amongthe samples, a bacterial strain which showed the highest growth rate with toluene
removal activity was isolated and identified as Pseudomonas putida. Complete
degradation of toluene in the cultivation medium was achieved in 24 h with amaximum rate of degradation of 8.3 mg/L/h. In the presence of 200ppm of toluene, theisolated strain (P. putida (0 ~ 1 x 106 CFU/ml)) in the rhizosphere of Solanum
lycopersicum L. showed high toluene removal activity (maximum 1.5947 μg・m-3).
FISH and FE-SEM results showed that the isolated bacteria were successfully
maintained in the rhizosphere of the plant root. These results suggest that the
combination of toluene-degrading bacteria with plant (plant rhizosphere) has great
potential for the indoor air quality control.

Efficient degradation of tris(2-chloroethyl) phosphate by recombinant
Escherichia coli.

Effect of Pseudomonas putida on toluene removal activity in the rhizosphereof Solanum lycopersicum L.

Key words
Sphingobium, recombinant Escherichia coli, biodegradation,organophosphorus compounds

Key words
Pseudomonas putida, Solanum lycopersicum L., plant rhizosphere,
toluene-degrading bacteria○Katsumasa Abe, Hikaru Shinohara, Shouji Takahashi, Yoshio Kera
(Nagaoka Univ. Technol.)○Hak Jin Song1, Yong-Keun Choi1, Ji Eun Kim1, Kwang Jin Kim2, Yunjeong Yang1,
Eun Bin Lee1, Sang Hyun Lee1, Yung-Hun Yang1, Hyung Joo Kim1
(1Dept. Biological Eng., Konkuk Univ., 2Urban Agric. Res. Div., NIHHS, Rural
Development Administration)

108

1Cp05

Pseudomonas sp. PTH10 株における新規フタル酸代謝酵
素遺伝子群の機能解析

1Cp07

儀武 菜美子 1, 岩崎 卓巳 2, 西 達也 2, ○笠井 大輔 1, 福田 雅夫 1,3（1長岡技科大, 2（株）ジナリス, 3中部大・応生）
dkasai1@vos.nagaokaut.ac.jp

GFP を融合したイガイ由来接着タンパク質の作製と材料吸着挙動○志賀 敏英, 中島 一紀, 岩田 至叡, 川﨑 了
（北大院・工）nakashima@geo-er.eng.hokudai.ac.jp【目的】Pseudomonas sp. PTH10 株はフタル酸を唯一の炭素源、エネルギー源として生育する。これまでの解析により、PTH10 株はフタル酸を 2,3-ジヒドロキ
シ安息香酸 (23DHB)へと変換し代謝する新規のフタル酸代謝経路を有することが示された。本研究では、PTH10 株のフタル酸代謝経路の全容を明らかにすることを目的として、本株のフタル酸代謝遺伝子群の同定と酵素の機能解析を行った。
【方法】遺伝子産物の機能を明らかにするために、大腸菌を宿主として各遺伝子を発現させた。各組換えタンパク質の酵素活性を測定することで、各遺伝子の機能を推定した。また、各遺伝子の破壊株を作製しフタル酸資化能を評価するとともに、各遺伝子の転写誘導性を明らかにした。
【結果】芳香環開裂酵素遺伝子の推定アミノ酸配列の相同性を基に PTH10 株のゲノムデータベースを検索した結果、既知の芳香環開裂ジオキシゲナーゼと約30%の相同性を示す 1 つの ORF (opaC)を見出した。さらにその近傍には、芳香族化合物の水酸化に関わると考えられる水酸化酵素をコードする遺伝子群(opaAabcd)とデヒドロゲナーゼ遺伝子 (opaB)、そして amidohydrolase_2 family に属す加水分解酵素と相同性を示す opaD の存在が認められた。異種宿主発現により得られた各遺伝子産物の機能解析を行なった結果、これら opa 遺伝子が23DHB を経由したフタル酸代謝経路に関与することが示唆された。さらに、各
種遺伝子破壊株の解析から、opa 遺伝子群が PTH10 株のフタル酸代謝に必須であることが示された。また、各遺伝子の転写誘導性を評価した結果、opa 遺伝
子群は、フタル酸代謝時に複数のプロモーターから誘導的に転写されることが示唆された。

【背景・目的】
環境負荷の小さい新たな接着材料として、イガイ由来の接着タンパク質（Mussel
Adhesive Proteins: MAPs） が 提 案 さ れて い る 。 MAPs の 一 つ で あ る Mytilus
galloprovincialis foot protein type 5 (Mgfp-5)をコードする cDNA が単離され、大腸菌系での発現が報告されている。組換え Mgfp-5 は十分な接着能力を有し、生体接着剤料として有用であることが示されているが、吸着挙動やメカニズムの詳細は不明な点が多い。本研究では、緑色蛍光タンパク質（GFP）を Mgfp-5 に融合させることにより、吸着の可視化および機能解析の向上を目的とした。
【実験方法】
Mgfp-5 および GFP の融合遺伝子を Overlap PCR により作製し、In-Fusion 法に
より pET-22b(+)ベクターに挿入した。大腸菌 BL21(DE3)株を形質転換し、37℃の条件下で発現を行った。変性条件下で His タグ精製を行った後、4℃で 24 時
間透析をすることによってリフォールディングを行い、融合タンパク質（GFPMgfp-5）を作製した。精製 GFP-Mgfp-5 を蒸留水に溶かした溶液に固体サンプル（銅・ガラス・セルロース）を加え、25℃で 24 時間穏やかに振盪させることによって吸着実験を行った。
【結果】
SDS-PAGE により GFP-Mgfp-5 の発現が確認された。発現した GFP-Mgfp-5 は不溶性であったが、リフォールディングによって可溶化に成功した。吸着実験において，固体サンプルを蛍光顕微鏡で観察した結果、ガラスおよびセルロースに関しては表面に緑色蛍光が見られ GFP-Mgfp-5 の吸着が示唆されたが、銅に関しては蛍光が見られなかった。また、GFP のみを加えた溶液ではいずれの固体サンプルにおいても吸着が見られなかったことから、吸着が Mgfp-5 によるものであることが示された。以上より、Mgfp-5 の可視化が可能となり，吸着挙動の解析やメカニズム解明がより簡便になると考えられる。

Characterization of a novel o-phthalate catabolic gene cluster inPseudomonas sp. strain PTH10

Preparation and material adsorption behavior of mussel adhesive protein
fused with GFP

Namiko Gibu1, Takumi Iwasaki2, Tatsunari Nishi2, ○Daisuke Kasai1,
Masao Fukuda1,3(1Nagaoka Univ. Technol., 2Genaris inc., 3Coll. Biosci. Biotechnol., Chubu Univ.)○Hayahide Shiga, Kazunori Nakashima, Yoshiaki Iwata, Satoru Kawasaki(Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.)

Key words

aromatic ring compound, dioxygenase, decarboxylase

Key words

mussel adhesive proteins, immobilization, GFP

1Cp06

Rhodococcus 属細菌による低温条件下での A 重油分解の分子機構の解析

1Cp08

金属結合ペプチドを発現した大腸菌の金属固体への結合および微粒子凝集特性○三好 佑奈 1, 岡田 丈 1, 新谷 政己 1,2, 金原 和秀 1
（1静大院・総合科技, 2静大・グリーン科技研）
kimbara.kazuhide@shizuoka.ac.jp○中島 一紀, 岩田 至叡, Aneksampant Apichaya, 川﨑 了
（北大院・工）nakashima@geo-er.eng.hokudai.ac.jp【背景と目的】バイオオーグメンテーションは，分解微生物を汚染環境中に投入し，汚染を浄化する手法である．当研究室は， Rhodococcus erythropolis に属す
る 2 種の油分解菌を用いた液体培養において，30°C に比べ 15°C で高い A 重油
分解率を示すことを報告している 1)．また，回転型スラリーバイオリアクターを用いることで，15°C の低温条件下における，高濃度 A 重油汚染土壌の迅速な浄化を達成した．しかし，その分子機構は不明である．本研究では，中鎖アルカン分解への関与が報告されている，アルカンモノオキシゲナーゼをコードする alkB 遺伝子に着目し，30，15°C の液体培養条件での遺伝子発現を解析することで，低温での分解メカニズムの解明を目指した．
【方法】2 種の菌株 A，C のドラフトゲノムシークエンスより，alkB 遺伝子のホモログがそれぞれ 5 または 4 個存在することがわかっている．本研究では，A株を対象とし，A 重油を炭素源として，30，15°C で液体培養し，RNA を抽出
後，qRT-PCR を行い，発現量を比較した．また，異なる炭素数のアルカンを単一炭素源として用いて，培養し，温度による生育と alkB 遺伝子の発現の違いを比較した．
【結果と考察】液体培養での A 重油分解で，3 日後に温度による分解率に差はな
いが，9 日後の分解率は 15°C では 90％，30°C では 60％と，15°C で高い結果となった．また，alkB 遺伝子のホモログの発現を比較した結果，培養 2 日目で15°C において著しく大きい発現を示すホモログが存在した．このことから，これらが 15°C における A 重油分解の進行に関与している可能性が考えられた．
また，鎖長の異なるアルカンにおいて，温度による分解率の違いがみられた．
現在，alkB 遺伝子の役割を解明するため，各ホモログの破壊株の作製を試みている．
1．Shintani et al., 2019, J. Biosci. Bioeng., 127:197-200【緒言】 微生物細胞を生きたまま無機固体表面に選択的に固定化することができれば，バイオセンサーやバイオデバイス，微生物燃料電池，バイオリーチン
グやレアメタルの回収に応用できる。これまで様々な金属結合ペプチドが報告されており，抗体や酵素を主としたタンパク質分子の材料表面への固定化には用いられてきた。一方，それらを生きた微生物細胞の選択的な結合に利用した例は僅少である。本研究では，チタンおよびヘマタイト（Fe2O3）をモデル金属
材料とし，外膜タンパク質に金属結合ペプチドを組み込んだ E. coli を作製し，金属プレートへの結合特性および金属微粒子の凝集性について検討した。
【方法】 E.coli 由来の外膜タンパク質 OmpA の膜外突出部分（Loop1 あるいはLoop1+Loop3）にチタン結合ペプチド（RKLPDAPGMHTW）およびヘマタイト
結合ペプチド（STVQTISPSNH）をそれぞれ組み込んだ金属結合性 OmpA 遺伝子を作製した。これらの遺伝子を pET システムにより過剰発現した E. coli
BL21(DE3)株を作製し，金属プレート（チタン，銅，ガラス，ヘマタイト等）
への吸着実験を行った。蛍光顕微鏡によりプレート表面を観察し，細胞の吸着性および生細胞の評価を行った。
【結果と考察】 SDS-PAGE により，いずれのタンパク質においても十分な発現が確認された。金属プレートへの吸着実験では，コントロールの E. coli がいずれの金属にも吸着性を示さないのに対し，金属結合性 OmpA を過剰発現した E.
coli はターゲットの金属プレートに吸着した。また，Loop1+Loop3 の両方に金属結合ペプチドを導入した株の方がより高い結合性を示した。さらに，チタン
結合性を付与した E. coli はチタン微粒子の沈降速度を大きく増加させた。

Comparisons in transcriptional levels of alkB genes under different
temperature conditions during degradation of A-fuel oil by Rhodococcus
erythropolis strain A.

Adsorption and particle aggregating property of E. coli expressing metalbinding peptides○Yuna Miyoshi1, Jo Okada1, Masaki Shintani1,2, Kazuhide Kimbara1(1Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci. Technol.,Shizuoka Univ.)

Key words
bacteria

alkane 1-monooxygenase, transcription, low temperature, oil degrading○Kazunori Nakashima, Yoshiaki Iwata, Apichaya Aneksampant, Satoru Kawasaki(Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.)

Key words

immobilized bacteria, membrane protein, metal-binding peptide

109

1Cp09

鉄を電子源とする硫酸還元菌の単離とその腐食プロセスの電気化学的解析

1Cp11○平野 伸一 1, Irene Davidova 2, Joseph Suflita 2, 長岡 亨 1,
松本 伯夫 1
（1電中研, 2オクラホマ大）
s-hirano@criepi.denken.or.jp

開発途上国のヒ素汚染地下水を利用可能にするための微生物技術の開発○遠藤 銀朗, 石井 啓介, 高橋 森里, 宮内 啓介（東北学院大・工）gendo@mail.tohoku-gakuin.ac.jp【背景及び目的】金属腐食が化学的に起こりづらい環境 (嫌気、中性、常温・常圧) においても微生物が腐食を促進し、設備劣化を引き起こすことが明らかとなってきている。我々は、これまでに硫酸イオンを含む海水環境より長鎖炭化水素 (C25-C50) の存在下、鉄腐食活性を示し、原油関連施設において腐食被害を引き起こす微生物群集 SDB-culture を獲得している。長鎖炭化水素を電子供与体とした硫酸還元菌 (SRB) の代謝によって発生した硫化水素による腐食が推定されたが、長鎖炭化水素非存在下においても SDB-culture は高い腐食活性を示すため、異なる腐食メカニズムの存在が示唆された。そこで、本研究では SDBculture より腐食微生物を単離し、その腐食過程の電気化学的な解析を行うこと
で腐食メカニズムを推定することを目的とした。
【方法及び結果】SDB-culture より鉄を単一電子供与体、CO2/HCO3-を単一炭素源
として 2 株の SRB (Desulfovibrio, Desulfobulbus) を単離することに成功した。両株とも有機物非存在下、金属表面に腐食生成物を含むバイオフィルムを形成しながら腐食を引き起こし、特に Desulfobulbus は無菌区の 24 倍高い腐食活性 (鉄材料の重量減損) を示した。これらの腐食プロセスを電気化学的手法にて解析した結果、無菌区の 4〜50 倍の腐食電流が検出されるとともに、cathode 電流の利用反応促進による腐食電位の上昇が確認された。また、電気化学解析から鉄表面に形成されたバイオフィルムには導電性の高い腐食生成物や、SRB に由来する鉄-細胞間の電子伝達に関わる酵素類が含まれていることが示唆された。以上の結果より、単離された SRB が鉄を電子源として利用しながら増殖すること
で、腐食反応を促進していることが推定された。本発表では、これら SRB 単離
株の SDB-culture による腐食における役割についても合わせて議論する。

[背景] 南アジアや東南アジアの開発途上国の大河デルタ地帯には深刻な地下水
ヒ素汚染問題が存在しており、利用できる水資源が限られることにより経済発展が制約されている。これらの地下水中のヒ素は、溶解度の高い亜ヒ酸イオンとして存在している。そのため、微生物が持つヒ素酸化能力を活用して亜ヒ酸イオンを溶解度の低いヒ酸イオンに酸化した後に、同時に地下水に存在する金属イオンの酸化沈殿物と共沈させて除去する方法が有効と考えられる。
[方法]亜ヒ酸イオン吸着能を有しヒ酸イオン吸着能を有さない特別な性質を持
ちかつ普遍的工業原料として安価に入手可能な担体としてコークスをろ材とす
る散水ろ床方式の微生物バイオリアクターを開発し、ヒ素酸化と鉄酸化を同時進行させかつ後段に水酸化鉄沈殿槽を設けることによりヒ酸イオンを共沈回収
する連続処理実験を行った。
[結果] ヒ素酸化のための散水ろ床微生物付着担体としてコークスを用いること
により、亜ヒ酸イオンのヒ酸イオンへの酸化が効率よく行われ、酸化産物のヒ酸イオンはコークスに吸着されずに担体から溶脱することが分かった。この効率的ヒ素酸化はコークスが亜ヒ酸イオンを吸着し担体表面ヒ素濃度を高めることによると推察された。コークス散水ろ床は鉄イオンの酸化にも効果的であった。この結果、コークス担体散水ろ床の採用と後段に水酸化鉄沈殿装置を組み合わせることによって、初期濃度 800μg/L (800ppb)のヒ素は、50μg/L (50ppb)以
下となるまで連続的に除去できることが知られた。これらの結果より、コーク
スをろ材として散水ろ床方式のバイオリアクターを構成することにより、建設コスト、エネルギーコストおよびメンテナンスコストをできるだけ必要としな
い、開発途上国に適合する地下水ヒ素除去技術が実現できると考えられた。

Isolation and electrochemical analysis of sulfate-reducing bacteria using ironas electron donor

Development of microbial technology for arsenic removal from groundwaterin developing countries○Shin-ichi Hirano1, Irene Davidova2, Joseph Suflita2, Nagaoka Toru1,
Matsumoto Norio1(1CRIEPI, 2Dept. Microbiol. and Plant Biol., Oklahoma Univ.)○Ginro Endo, Keisuke Ishi, Moriasato Takahashi, Keisuke Miyauchi(Fac. Eng., Tohoku Gakuin Univ.)

Key words

sulfate reducing bacteria, bio-corrosion, electron donor, iron

Key words
processarsenic removal, ground water, bacterial oxidation, trickling filter

1Cp10

六価クロム還元細菌 Flexivirga alba ST13T 株の六価クロム還元遺伝子の探索

1Cp12

Different inactivation behaviors of Gram-positive andGram-negative bacteria in TiO2 based photocatalytic
disinfection○桶田 凜, 広瀬 佑紀, 土井 晃一郎, 丸山 竜人, 松井 徹, 杉山 友康（東京工科大院・バイオニクス）
tsugiyama@stf.teu.ac.jp○Na Liu1, Cheng Zhang1, Nobuaki Negishi2, Yingnan Yang1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Environ. Mgt. Res.
Inst. AIST Tsukuba)yo.innan.fu@u.tsukuba.ac.jp【背景と目的】六価クロムには強い発癌性があり、産業利用による環境汚染が問題となっている。いくつかの微生物にはこの六価クロムを減少させることのできる遺伝子が報告されており、遺伝子ごとに様々なプロセスが存在する。また、
六価クロムの還元には酵素が関わっており、単離することができれば酵素を用いた環境浄化も可能となる。我々の研究室が発見した新属新種の放線菌
Flexivirga alba ST13 株にも六価クロムを還元して無害な三価クロムにする性質が存在したが、ST13 株の六価クロム還元の作用機構は未だ判明しておらず、六価クロム還元遺伝子も不明である。そこで我々は ST13 株の六価クロム還元の作用機構を明らかにすることを目的として ST13 株の六価クロム還元遺伝子の探索を行った。
【方法と結果】ISOPLANT を使用して ST13 株のゲノム DNA 抽出を行い、次世代シーケンス受託企業「北海道システムサイエンス」に依頼して塩基配列を決定した。その結果、約 1400 万リード、4.5 ギガ塩基対のデータが得られた。塩
基配列はゲノムアセンブラ Velvet を使用してコンティグの作成を行った。六価
クロム還元に関わる遺伝子として他の細菌で chrR、chrA、yieF、nemA、azoR、
nfsA が知られている。そこで、それらのアミノ酸と ST13 株との tblastn 相同性解析を行った結果、六価クロム還元酵素遺伝子 chrR において 60%という有為な相同性が確認された。現在、PCR で ST13 株の chrR の領域の増幅を行い、キャピラリーシーケンサーのフラグメント解析で確認を進めている。

Photocatalytic disinfection technology has attracted a great attention in order toprocess microbial contamination due to its superior oxidation ability and nontoxicity.
However, most of the reported studies have only used one model bacteria group.
Considering that some differences in photocatalytic inactivation response have beenreported for different type of microorganisms, more efforts should be focused on theestablishment of possible differences in the photocatalytic disinfection efficiency
depending on the selected indicator microorganism. Moreover, in real water
environment, Gram-negative and Gram-positive bacteria are usually coexistent, while
few related researches have been conducted to study the interaction between them in
one photocatalytic system. According to the previous studies, a novel P/Ag/Ag2O/
Ag3PO4/TiO2 photocatalyst, firstly synthesized by our lab, has been demonstrated as apromising material for decomposing organic matter. Hence, in this study, thedisinfection efficiency of P/Ag/Ag2O/Ag3PO4/TiO2 on different types microorganisms
was comparably investigated. The results showed that the novel composite could
effectively inactivate both Gram-negative and Gram-positive bacterium either in single
or mixed bacteria system. Due to the structural differences of these two types bacteria,
the inactivation efficiency between them was also different. The present study results
made an important foundation for future scaling up application of this novel
photocatalyst in practical water disinfection.

Genome analysis of Flexivirga alba ST13T for hexavalent chromium
reducing gene

Different inactivation behaviors of Gram-positive and Gram-negative
bacteria in TiO2 based photocatalytic disinfection○Rin Oketa, Yuki Hirose, Koichiro Doi, Ryuto Maruyama, Toru Matsui,
Tomoyasu Sugiyama(Grad. Sch. Bionics., Tokyo Univ. Technol.)Key words

Flexivirga alba ST13, hexavalent chromium, gene, enzyme○Na Liu1, Cheng Zhang1, Nobuaki Negishi2, Yingnan Yang1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Environ. Mgt. Res. Inst. AIST
Tsukuba)

Key words
P/Ag/Ag2O/Ag3PO4/TiO2 photocatalyst, disinfection, Gram-positive,
Gram-negative

110

1Cp13

種々の固体表面上における家電単離菌のバイオフィルム
形成の評価

1Cp15

○山本 克哉 1, 尾島 由紘 1, 下野 雅仁 2, 多久島 朗 2, 東 雅之 1
（1阪市大院・工, 2LG Japan Lab）
ojima@bioa.eng.osaka-cu.ac.jp

農耕地から放出される環境破壊ガス N2O を抑制するための、カビ脱窒を阻害する化合物の探索○松岡 真生 1,2, Ashutosh Kumar 3, Muhammad Muddassar 3,
松山 晃久 1,2, Kam Y. J. Zhang 3, 吉田 稔 1,2（1理研・環境資源, 2東大院・農生科, 3理研・ライフサイエンス）
masaki.matsuoka@riken.jp【背景と目的】バイオフィルムは、微生物が固体表面に接着して作り出す生存形態の一つである。生活環境中では、ぬめりとして知られており、病原菌の感染源となり得るため問題視されている。家電に形成したバイオフィルムはブラッ
シングなどである程度除去できるが、一度形成されると完全な除去は難しい。
そこで我々は、バイオフィルム形成の初期段階である微生物と固体表面の接着に着目し、種々のプラスチック材質上におけるバイオフィルム形成の評価とその阻害を目的とした。本研究では、生活環境中におけるバイオフィルムを評価するため、実際に家電 (加湿器)から単離した 3 種の菌株、Acidovorax sp.、
Brevundimonas sp.、Sphingobium sp.を用いた。
【方法と結果】バイオフィルムを定量する手法としてクリスタルバイオレットによる染色法を用いた。本研究では 96well プレートの各 well に菌液を分注し、そこにプラスチックプレートを立てかけ、24 h 培養することでプラスチック上にバイオフィルムを形成させた。これをクリスタルバイオレットにより染色し、エタノールによる溶出後、595 nm の吸光度を測定することで、バイオフィルム
量を評価した。ポリカーボネート (PC)、ポリスチレン (PS)、ポリエチレン(PE)、ポリテトラフルオロエチレン (PTFE) 製のプレートを用いて評価を行った
結果、Acidovorax sp.、Brevundimonas sp.において、PTFE 上ではバイオフィルム形成が阻害された。PTFE の高撥液性がバイオフィルム形成を阻害したと考え、
凹凸撥液処理を施したポリプロピレン (PP)を実験に用いたところ、未処理の PP
製プレート上に比べて Sphingobium sp.を含めた 3 種すべての単離菌のバイオフィ
ルム形成を阻害した。以上の結果より、凹凸撥液処理が家電単離菌のバイオフィ
ルム形成阻害に有効であることがわかった。

近年、化学窒素肥料の農耕地への大量投与が重大な環境問題を引き起こしている。そのなかでも、強力な温室効果ガスでありオゾン層破壊物質でもある亜酸
化窒素 N2O の農耕地からの放出は、その対策の緊急性を要する深刻な問題である。農耕地からの N2O 産生の主たる原因は土壌微生物による脱窒であり、N2O産生に関与する土壌微生物のなかでもカビの脱窒による影響は極めて大きい。
その要因は、カビには N2O 還元酵素が存在しないためにカビ脱窒による最終産
物が N2O である、ということにある。そこで、本研究では、農耕地からの N2O削減を目指し、カビの脱窒の鍵酵素である亜硝酸還元酵素 NirK の活性を阻害する化合物のスクリーニングを行なった。
まず、96 穴マイクロプレートで簡便に阻害化合物を識別できるように、糸状菌
Fusarium oxysporum 由来の NirK 酵素を用いて酵素活性の阻害度を評価する invitro のアッセイ系と、F. oxysporum を用いて脱窒活性の阻害度を評価する細胞
ベースのアッセイ系を構築した。続いて、カビの NirK の立体構造は明らかになっていないため、カビの NirK とアミノ酸配列の相同性の高く立体構造既知である細菌の NirK の立体構造を鋳型としたホモロジーモデリングを行ない、その構造を基に実行された in silico スクリーニングにより得られたヒット化合物に関して in vitro のアッセイ系並びに細胞ベースのアッセイ系を用いて阻害評価を行なった。結果として、化合物 2 種がカビ脱窒阻害剤として同定された。
今後、本研究のスクリーニングにより得られたヒット化合物を基に、より効果的でかつ安全なカビ脱窒阻害剤を開発し、化学窒素肥料と共に阻害剤を農耕地に投与することができれば、N2O の大気中への放出を抑制すると同時に、化学窒素肥料を効率的に植物に取り込ませ、投与する肥料を削減することが期待できる。

Biofilm formation of bacteria isolated from home electronics on the various
solid surfaces

Screening of compounds inhibiting fungal denitrification toward preventionof environmentally-harmful N2O emitted from agricultural soils○Katsuya Yamamoto1, Yoshihiro Ojima1, Masahito Shimono2, Akira Takushima2,
Masayuki Azuma1(1Grad. Sch. Eng., Osaka City Univ., 2LG Japan Lab Inc.)○Masaki Matsuoka1,2, Ashutosh Kumar3, Muhammad Muddassar3,
Akihisa Matsuyama1,2, Kam Y. J. Zhang3, Minoru Yoshida1,2(1CSRS, RIKENS, 2Grad. Sch. Agric. Life Sci., Univ. Tokyo, 3CLST, RIKEN)

Key words

biofilm, plastic surface, liquid repellant

Key words

denitrification, N2O, inhibitor

1Cp14

牛糞堆肥と竹パウダーを施用した水稲栽培土壌における細菌叢と窒素固定活性の季節変化

1Cp16

淡水サンプルから分離した Undibacterium 属細菌における生分解性プラスチック分解酵素の機能解析○前田 勇, 稲場 克弘, Ao Zhalaga, 平井 英明（宇都宮大・農）i-maeda@cc.utsunomiya-u.ac.jp○大井 太士郎 1, 佐藤 俊輔 2, 諸星 知広 1
（1宇都宮大院・工, 2カネカ）
morohosi@cc.utsunomiya-u.ac.jp

水稲栽培土壌における生物学的窒素固定活性の向上を目的として、高 CN 比の竹粉に着目し炭素源として竹粉、窒素源として牛糞堆肥を土壌に供給すること
で、窒素固定細菌による窒素固定が促進されるか否かを検討した。大学附属農場の圃場にて化学肥料施肥区画、牛糞堆肥施肥区画、牛糞堆肥・竹粉施肥区画の 3 試験区画を設定し、4 月、7 月、11 月の計 3 回について各区画から 3 箇所
ずつ土壌のサンプリングを行った。無窒素固体培地にて形成されたコロニー数
より窒素固定細菌生菌数を評価した。その結果、7 月採取土壌では 4 月あるいは 11 月採取土壌と比較し 2~3 倍多い細菌数が確認された。試験区画間の比較
では 4 月と 7 月に採取した土壌では有意な差が認められなったのに対し、11 月
採取土壌では牛糞堆肥施肥区画と牛糞堆肥・竹粉施肥区画で化学肥料施肥区画と比較し有意な増加が認められた。牛糞堆肥・竹粉施肥区画の土壌に於いて牛糞堆肥施肥区画の土壌よりも細菌数が多い傾向が認められた。窒素固定を触媒するニトロゲナーゼの活性を測定したところ、7 月採取土壌では 4 月あるいは11 月採取土壌と比較し 2~3 倍高い活性が確認された。夏場の高温と水田底泥のより嫌気的な環境が窒素固定細菌生菌数とニトロゲナーゼ活性に寄与したものと推察される。試験区画間の比較では 4 月と 7 月に採取した土壌では同程度の活性が認められ、11 月採取土壌では牛糞堆肥・竹粉施肥区画、牛糞堆肥施肥区
画、化学肥料施肥区画の順に高い傾向となった。サンプル土壌から DNA を抽出し 16S rRNA 遺伝子を標的としたアンプリコンシークエンスを行い菌叢の変化を解析中である。これらの結果から稲作土壌への竹粉供給による土壌窒素固定能への影響として、非栽培期における土壌への窒素源供給が増加し次期の稲作に向けた土壌改質に結び付く可能性が示唆された。

【目的】水圏に廃棄され、微細化したマイクロプラスチックが大きな環境問題となっている。本問題の解決策として、生分解性プラスチックの使用が注目を集めているが、本研究グループでは、生分解性プラスチックの一種であるポリ 3ヒドロキシブチレート-co-3-ヒドロキシヘキサノエート（PHBH）を淡水サンプ
ルに浸漬すると、バイオフィルム形成を伴いながら分解されることを報告している。本研究では、淡水サンプル中で PHBH 表面に形成したバイオフィルムから単離した Undibacterium 属細菌から PHBH 分解遺伝子（phaZ）をクローニン
グするとともに、精製 PhaZ における酵素活性の諸性質を解析することを目的とした。
【方法及び結果】河口湖および山中湖から単離した PHBH 分解性 Undibacterium
sp. KW1 株および YM2 株を使用し、PacBio RS II を用いて全ゲノム配列を決定した。その結果、両菌株共に約 6.5 Mbp の染色体と 1 つの内在性プラスミドから構成されることが明らかとなった。次に、BLAST プログラムにより既知の
PHA デポリメラーゼ遺伝子（phaZ）と相同性を示す配列を検索したところ、Massilia 属細菌のゲノムに存在する phaZ 様遺伝子と高い相同性を示す配列が存在していた。PhaZ の N 末端側にはシグナルペプチドが存在しており、PhaZ をヒスチジンタグ融合タンパク質として発現させたところ、培養上清から PhaZを精製することに成功した。精製酵素と PHBH 粉末を混合してインキュベートしたところ、PHBH 粉末の分解がみられ、至適反応温度は 30〜40℃付近であることが明らかになった。

Seasonal changes in bacterial flora and nitrogen fixation activity in paddy
field soil applied with cow manure compost and bamboo powder

Characterization of biodegradative plastic-degrading enzyme from
Undibacterium sp. isolated from fresh water○Isamu Maeda, Katsuhiro Inaba, Zhalaga Ao, Hideaki Hirai(Fac. Agric., Utsunomiya Univ.)

Key words

soil, nitrogen fixation, environmental bacteria○Taishiro Oi1, Shunsuke Sato2, Tomohiro Morohoshi1(1Grad. Sch. Eng., Utsunomiya Univ., 2Kaneka Corp.)

Key words

biodegradable plastic, Undibacterium, degradation, freshwater

111

1Cp17

微生物発酵による BDF 廃液からのフマル酸生産法の
検討

1Dp02

○湯浅 一貴 1, 川西 琢也 1,2, 滝口 昇 1,2（1金沢大院・自科, 2金沢大・理工）
tackey@se.kanazawa-u.ac.jp

2 段階マイクロ波水熱処理を用いた稲わらからの糖生産○宮本 上聖, 中村 嘉利, 浅田 元子, 佐々木 千鶴（徳島大院・先端技科）
ynakamu@bio.tokushima-u.ac.jp【背景】フマル酸は、ポリエステル樹脂や染料の媒染剤、酸味料などの食品添加物として利用されている。フマル酸は従来、石油由来のベンゼンを原料としてきたが、資源の枯渇の観点から近年では、微生物を利用して糖からフマル酸を生産する製法が注目されている。しかし近年、糖の価格高騰の影響を受け、より安価な原料が求められている。そこで、バイオディーゼル燃料(BDF)を製造する際に、排出される BDF 廃液に着目した。BDF 廃液は、グリセリンを約 50%
含有する粘性の液体である。しかし、強塩基性であることや夾雑物を多く含有していることが原因で処理コストが高く、より安価な処理法が求められている。
そこで本研究では、この廃液を原料としたフマル酸生産が可能ではないかという作業仮説を立て、廃液を含有した培地において、フマル酸生産が可能か検討を行った。
【方法及び結果】100 倍希釈した廃液中のグリセリン濃度を高速液体クロマトグ
ラフ(HPLC)にて測定した。本研究では、Rhizopus delemar(NBRC5441)をフマル酸生産菌とした。PDA 培地にて培養した菌体胞子を生理食塩水で懸濁させ、胞
子懸濁液とした。グリセリン濃度 150g/L となるよう適宜希釈した廃液を唯一炭素源とした液体培地 30mL に対して 1mL の胞子懸濁液を植菌し、25℃、150rpm
で振盪培養した。12 時間おきに HPLC を用いて培地中のグリセリン及びフマル酸の濃度の測定を行った。また、沈殿を洗浄および乾燥させ、乾燥菌体重量を測定した。純グリセリンを用いた際の結果と比較を行い、廃液による菌体増殖への影響を評価した。BDF 廃液を用いた培養においてフマル酸の生産が確認されたが、純グリセリンと比較して、増殖菌体量およびフマル酸生産量が抑制された。今後、プロセスの改良と共に、原因物質の特定および除去により、フマル酸の高効率生産を検討していく。

本研究では未利用バイオマスを原料とし、グルコースとキシロースの生産を目的とした。グルコースとキシロースは熱分解される温度が異なるため、一度の処理ではどちらかの収量が減少する。多糖の加水分解反応によるグルコース、
キシロースの収量を増加させるために加熱温度を２段階に変化させ処理することにした。低温での前段階でキシロースを、温度を上昇させた後段階でグルコー
ス生成を行う２段階処理を検討し、実験を行った。比較と温度検討のために 1段階での方法も検討した。
原料とした稲わらにまず 1 分間粉砕処理を行った。この粉砕試料 1 ｇあたり15ml の反応溶媒を添加し、マイクロウェーブ発生装置を用いてマイクロ波水熱処理を行った。
・1 段階法…反応溶媒として 1wt%硫酸水溶液を用いた。120℃〜180℃で 10℃
毎に条件を変化させ、30min でマイクロ波処理を行った。上清中のキシロース、グルコース生産量を測定した。さらに残渣の酵素糖化を行いグルコース生産量を測定した。
・2 段階法…１段階法の結果をもとに、最もキシロース生成量が多かった条件の残渣を用いた。反応溶媒として 1wt%硫酸、2wt%硫酸を使用し、180℃〜200℃
で 10℃毎に変化させ、5min でマイクロ波処理を行った。上清中または残渣を酵素糖化して得られたグルコース生成量を測定した。
1 段階法では 0.497 g/(g-未処理稲わら)の糖〈キシロース 0.317g/(g-未処理稲わら)、グルコース 0.180 g/(g-未処理稲わら)〉が得られた。
2 段階法では 0.737 g/(g-未処理稲わら)の糖〈キシロース 0.317g/(g-未処理稲わら)、グルコース 0.420 g/(g-未処理稲わら)〉が得られ、1 段階法より多くの糖が生成されたため 2 段階法の有用性が示唆された。

Fumaric acid production from BDF effluent by microbial fermentation

Sugar production from rice straw using two-step microwave hydrothermal
treatment○Kazuki Yuasa1, Takuya Kawanishi1,2, Noboru Takiguchi1,2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Coll. Sci. Eng., Kanazawa Univ.)○Masatoshi Miyamoto, Yoshitoshi Nakamura, Chikako Asada, Chizuru Sasaki(Grad. Sch. Adv. Technol. Sci., Tokushima Univ.)

Key words

Rhizopus sp., glycerol, biodiesel fuelKey words

Microwave, Glucose, Xylose

1Dp01

植物の成長促進効果をもたらす光合成細菌の菌体成分の
検討

1Dp03

トマトの糖度に及ぼすパルス光照射の影響○林 修平, 岩本 康成, 森 康一, 中嶋 桃香, 平川 夕貴,
山本 進二郎, 宮坂 均
（崇城大・生物生命）
shayashi@life.sojo-u.ac.jp○武田 真樹 1, 上田 愛巳 1, 神内 奈々子 2, 木村 祐太 1, 宇山 裕貴 1,
谷川 浩司 2, 前田 淳史 2, 梶山 博司 1,2（1徳島文理大院・工・ナノ物質工, 2徳島文理大・理工・ナノ物
質工）kajiyama@fst.bunri-u.ac.jp

光合成細菌（紅色非硫黄細菌）は、農業・畜産業・水産業において、成長促進
効果や病害抑制効果を示す微生物として利用されている。植物の成長促進効果
においては、光合成細菌が産生する 5-アミノレブリン酸（クロロフィル前駆体）やインドール-3-酢酸（植物ホルモン）による効果と、光合成細菌の窒素固定による効果の両方と考えられてきた。光合成細菌の窒素固定による効果を検討するために、光合成細菌を超音波により破砕した状態（死菌）で植物に投与したところ、生菌と同等の成長促進効果を示した。さらに、水に可溶である 5アミノレブリン酸やインドール-3-酢酸による効果を検討するために、超音波破砕した光合成細菌を遠心分離により上清（可溶成分）とペレット（不溶成分）に分けて別々に植物に投与したところ、上清だけでなく、薄く希釈したペレットを投与した場合でも成長促進効果を示した。光合成細菌の菌体を構成する不溶成分としてリン脂質やリポ多糖、ペプチドグリカンが考えられるが、その中でも動物や植物において自然免疫応答を引き起こす物質として知られているリ
ポ多糖に注目して検討を行った。その結果、低濃度で成長促進効果を示すことがわかった。現在、この植物成長促進効果が他の微生物種のリポ多糖でも見られるのかどうか検討を行っている。

【目的】
近年、トマトのビニールハウス栽培が盛んになっている。しかし、サラダ需要が多い夏場の生産が少ない。トマトの夏秋での栽培の課題は、高温期の草勢低下とそれに伴う減収である。また、高糖度トマトの需要が年々高まっている。
これまでは、水分量を絞ったり、塩分濃度を高めたりして、糖度を高めている
が、この方法だと小玉トマトしか栽培できないという問題がある。本研究の目
的は、光が当たっていない暗期に微弱なパルス光を照射し、トマトの成長を促進させることで草勢低下を防ぎ、実に流れる養分を増加させ、糖度トマトの栽
培技術を確立することである。
【実験方法・結果】
青色パルス光照射の有無による生育の対象実験をおこなった。青色パルス光の
光質は、発光ピーク波長：449nm、パルス周波数＜ 10 kHz、デューティー比＜0.2、光合成有効量子束密度（PPFD）＜ 1.0 であった。明期に蛍光灯(PPFD ＝130)を照射した。蛍光灯は 12 時間点灯(明期)と 12 時間消灯(暗期)を繰り返した。比較として、暗期に 8 時間パルス光を照射した。試験期間は 90 日であった。糖度は糖度屈折計の Brix％値から求めた。蛍光灯のみで栽培したトマトの花、蕾、実の総数と糖度を測定して、得られた結果や外観を基準に、パルス光照射の効果を調べた。
トマトの木の高さは 1.5 倍近くにまでなっていた。花、蕾、実の総数は、パルス光照射により 2 倍近くに増加した。糖度は平均して 1.5 度高くなった。本研
究と同じようなパルス光をレタス栽培に応用したところ、生育速度が速くなるという結果が得られている。トマトの場合には、生育が促進されるだけでなく、実の数が増えて、糖度が高くなることが明らかになった。暗期のパルス光照射の生理学的な影響は不明であり、今後の研究課題である。

Cell components of photosynthetic bacteria that have a growth promoting
effect on plants

Effects of pulsed lighting during dark period on the sugar content○Shuhei Hayashi, Yasunari Iwamoto, Koichi Mori, Momoka Nakashima,
Yuki Hirakawa, Shinjiro Yamamoto, Hitoshi Miyasaka(Fac. Biotechnol. Life Sci., Sojo Univ.)

Key words

photosynthetic bacteria, growth stimulation, plant, lipopolysaccaride○Masaki Takeda1, Aimi Ueda1, Nanako Jinnai2, Yuta Kimura1, Hiroki Uyama1,
Kouji Tanikawa2, Atsushi Maeda2, Hiroshi Kajiyama1,2(1Dept. Nano Mater. Bioeng., Grad. Sch. Eng., Tokushima Bunri Univ., 2Dept. Nano
Mater. Bioeng., Fac. Sci. Eng., Tokushima Bunri Univ.)

Key words

pulsed lighting, sugar content, tomato

112

1Dp04

イチゴの着果と糖度に及ぼす暗期パルス光照射の影響○上田 愛巳 1, 武田 真樹 1, 木村 祐太 1, 宇山 裕貴 1, 谷川 浩司 2,
前田 淳史 2, 梶山 博司 1,2（1徳島文理大院・工・ナノ物質工, 2徳島文理大・理工・ナノ物
質工）kajiyama@fst.bunri-u.ac.jp

1Dp06

レタスの生育に及ぼす青色パルス光照射の影響○木村 祐太 1, 武田 真樹 1, 上田 愛巳 1, 米村 彩乃 1, 宇山 裕貴 1,
谷川 浩司 2, 前田 淳史 2, 梶山 博司 1
（1徳島文理大院・工・ナノ物質工, 2徳島文理大・理工・ナノ物
質工）kajiyama@fst.bunri-u.ac.jp【背景と目的】近年、イチゴはその味だけではなく、美白効果・シミ・シワ予防などの美容成分も注目されており、食用以外に化粧品などにも取り入れられている。イチゴ
は冬のクリスマスから旬の春までが生産のピークであり夏秋は国内では四季成
り性のイチゴ、または海外からの輸入などの糖度・味ともに品質の低い割にその希少性から値段の高いものが主流となっている。しかし、イチゴはケーキや加工品など季節を問わず需要がある。本研究の目的は、光が当たっていない暗期に微弱なパルス光を照射することで、イチゴの着果促進、高糖度化、栽培期間短縮のための基本技術を確立することである。
【方法】
ワイルドストロベリーは水耕方式で 6 ヶ月栽培した。青色パルス光照射の有無による生育の対象実験をおこなった。青色パルス光の光質は、発光ピーク波長：
449nm、パルス周波数＜ 10 kHz、デューティー比＜ 0.2、光合成有効量子束密度（PPFD）＜ 1.0 であった。明期には蛍光灯(PPFD=80)照射した。蛍光灯は 12 時
間点灯(明期)と 12 時間消灯(暗期)を繰り返した。比較として、暗期に 8 時間パルス光を照射した。試験期間は 181 日であった。糖度は糖度屈折計の Brix%値から求めた。
【結果と考察】
パルス照射により着果数は 15％増加、根の湿重量は 1.5 倍に増加し、糖度はパルス照射により１度程度高くなったが、実の重量はほとんど同じであった。このことより、暗期パルス光照射により、イチゴの生育が促進され、着果数、糖度が増加することが明らかになった。
本研究と同じパルス光照射により、レタスの収穫重量は 1.5 倍程度増えると報告されている。レタスの場合、パルス光と同じ PPFD の連続光を照射しても、生育促進効果はないことが明らかになっている。このことから、本来は光合成に全く寄与しない光量でも、パルス光にすることで生育が促進していることがわかる。

[背景・目的]安心で安全な農作物の周年栽培を目的に LED や蛍光灯などの人工光を用いる植物工場が増えている。多くの植物工場では照明や空調のための光熱費が収益を圧迫している。そのため、収穫回数を増やせる高速栽培技術が望まれている。本研究の目的は、暗期に微弱な青色パルス光を照射することで、レタスの生育速度を向上できる光照射技術を開発することである。
[実験方法] レタスは、室温 22℃、湿度 40〜50％、水耕方式で定植後 28 日間栽培した。蛍光灯(光合成有効光量子束密度(PPFD):100〜110)を 12 時間照射（明期）と 12 時間消灯（暗期）を繰返した。暗期に①青色パルス光（449nm）、②
青色連続光(449nm)を照射して、青色光照射無しの場合との生育比較試験をおこなった。青色パルス光は、周波数＜ 10 kHz、デューティー比＜ 0.2 に設定した。
同じ PPFD 値のパルス光と連続光を８時間照射した。収穫後に、葉と根の湿重量と葉の形状と枚数を計測した。
[結果と考察]蛍光灯照射のみに比べて、①青色パルス光照射と②青色連続光照
射では、それぞれ湿重量は 1.58 倍と 0.97 倍になっていた。このことから、同じ
PPFD 値であっても、パルス光照射にはレタスの生育促進効果があることが明らかになった。さらに、レタスのビタミン C 量はパルス光照射により最大で５０％程度増加することが明らかになっている。同じパルス光をイチゴに照射した場合、着果数と糖度が向上するという結果が得られている。このことから、パルス光には、成長促進だけでなく、内在成分の増加効果があると結論できる。
パルス光照射の生理学的な作用については今後の研究課題である。

Effects of pulsed lighting during dark period on the fruit bearing and sugar
content

Effects of pulsed blue lighting on the cultivation of Lactuca sativa○Aimi Ueda1, Masaki Takeda1, Yuta Kimura1, Hiroki Uyama1, Kouji Tanikawa2,
Atsushi Maeda2, Hiroshi Kajiyama1,2(1Dept. Nano Mater. Bioeng., Grad. Sch. Eng., Tokushima bunri Univ., 2Dept. Nano
Mater. Bioeng., Fac. Sci. Eng., Tokushima bunri Univ.)○Yuta Kimura1, Masaki Takeda1, Aimi Ueda1, Ayano Yonemura1, Hiroki Uyama1,
Kougi Tanikawa2, Atsushi Maeda2, Hiroshi Kajiyama1(1Dept. Nano mater. Bioeng., Grad. Sch. Eng., Tokushima bunri Univ., 2Dept. Nanomater. Bioeng., Fac. Sci. Eng., Tokushima bunri Univ.)

Key words

pulsed ligting, sugar content, fruit bearing, strawberry

Key words

Lactuca sativa, pulsed lighting, lettuce, cultivation

1Dp05

レタスの代謝物産生に及ぼすパルス光照射の影響

1Dp07

培養効率化へ向けた培地改善への Substratome アプ
ローチ○米村 彩乃 1, 宇山 裕貴 1, 木村 祐太 1, 武田 真樹 1, 谷川 浩司 2,
梶山 博司 1,2, 前田 淳史 2
（1徳島文理大院・工・ナノ物質工, 2徳島文理大・理工・ナノ物
質工）
maeda@fst.bunri-u.ac.jp○立花 成我, 小西 正朗（北見工大）
Konishim@mail.kitami-it.ac.jp【目的】植物は光が当たっている明期に光合成と呼吸をするが、光が無い暗期は呼吸のみをしている。この暗期に微弱なパルス光を照射すると生育速度が 1.5倍程度増加するという報告がある。生育速度が増加するのであれば、植物内の代謝物生産にも何らかの影響を及ぼすはずである。そこで、レタス内のビタミ
ン C などの代謝物生産に暗期パルス光照射が及ぼす影響を明らかにすることが本研究の目的である。
【方法・結果】レタスは屋内で水耕栽培を行い、栽培 4 週間後に収穫し各代謝物量を測定した。明期の光源には LED 光(赤色(660 nm)、青色(450 nm))または蛍光灯を用い、パルス光を照射する際は、LED 光(青色(450 nm)、デューティー比＜0.2、光合成量子束密度(PPFD)＜ 0.1)の光源を用いた。レタス内のビタミン Cは、2,4-ジニトロフェニルヒドラジンを用いた誘導体化を利用し、波長 530 nmの UV 吸収より含有量を求めた。
パルス光照射の影響を調べるために、まず明期(LED 光)にのみパルス光照射を行なった場合と暗期にのみパルス光照射を行なった場合を比較した。ビタミンC 含有量はレタス 100g 中に、それぞれ 1.30 mg (明期)、1.98 mg (暗期)となった。暗期にパルス光照射を行うことで、生育速度だけでなくビタミン C 含有量が増加する傾向が見られた。次に明期の光源として蛍光灯を用いてレタス栽培を行なったところ、ビタミン C 含有量はレタス 100g 中に 1.91 mg であったが、これに加えて暗期にパルス光を照射したところ、ビタミン C 含有量は 2.53 mgに増加した。この結果から、明期の光源によらず暗期のパルス光照射によりビ
タミン C 量が増加することが明らかになった。
レタスの主な栄養素であるビタミン C で増加が見られたことから、他の代謝物生産も大きく変化している可能性が示唆された。そこで、他の代謝物も含めて暗期パルス光照射が代謝物生産に与える影響を併せて報告する。

酵母エキス (YE) は、微生物培養をはじめ，細胞培養やタンパク質生産などバイ
オプロセスにおける原料として頻繁に使用される。その組成は生産方法の差異に影響され変化する。この組成の違いは、多くの場合、バイオプロセスの収率に影響を与える。我々は、非標的分析と統計解析を用いた、メタボロミクスア
プローチによる評価モデルに着目した。本研究では、バイオプロセスの実験的モデルとして、YE 成分組成から大腸菌の増殖を予測する統計モデルを検討した。酵母エキス成分をさまざまな濃度の YE を含む培地から抽出し、ガスクロ
マトグラフィー質量分析計を用いて分析した。酵母エキスを主成分分析 (PCA)
により 3 つのクレードに分類した。酵母エキスを用いた大腸菌増殖は、同等量の添加で約 30% の差を示した。培地中の細菌増殖を、部分最小二乗回帰分析(PLS − R) によって成分プロファイルから推定した。細菌増殖 (目的変数) と成分プロファイル (説明変数) との関係から予測モデルを作成し、相関係数を算出した。予測モデルは良好な培養結果予測を示した。相関係数は培地のアミノ酸のほとんどを増殖促進効果、メチオニンは増殖に負の効果を持つことを推定した。添加培養検証において、Tyr、Ser、Ile、Asp、Lys、Phe、Leu、Thr、およびGly は増殖促進に有意な影響を示さなかった。Asp、Val、Glu、Trp は細菌増殖を促進し、Met、Ala は阻害した。影響のある成分は Ala を除き推定された効果と一致した。この結果は、メタボロミクスアプローチによって有益なフィード
バック情報を提供し、培養を改善できることを示す。

Effect of pulsed lighting during dark period on metabolite production in
Lactuca sativa

Substratome approach to improve medium compositions for bacterial
growth.

○Ayano Yonemura1, Hiroki Uyama1, Yuta Kimura1, Masaki Takeda1,
Kouji Tanikawa2, Hiroshi Kajiyama1,2, Atsushi Maede2(1Dept. Nano mater. Bioeng., Grad. Sch. Eng., Tokushima Bunri Univ., 2Dept. Nanomater. Bioeng., Fac. Sci. Eng., Tokushima Bunri Univ.)

Key words

Lactuca sativa, metabolite production, pulsed lighting○Seiga Tachibana, Masaaki Konishi(Kitami Inst. Technol.)Key words

yeast extract, Escherichia coli, Substratome, predictive modeling

113

1Dp08

ＣＦＤ解析と生物反応モデル式を組み合わせた商業ス
ケールバイオリアクターにおける物質生産シミュレー
ション技術の開発

1Dp10

Haematococcus pluvialis を用いたアスタキサンチンの効率的生産○山本 麗奈, 堀内 淳一, 熊田 陽一（京工繊大院・工芸科学）
horiuchi@kit.ac.jp○沖野 祥平, 渡邉 実, 種田 大介（日揮）
okino.shohei@jgc.com

微生物による有用物質生産の研究開発の多くは、フラスコやジャーファーメン
ターなどの実験室スケールのリアクターを用いて、温度や基質濃度などの生産性に及ぼす因子を均一に維持した条件にて行われる。一方で商業生産においては、数十〜数百立米スケールの巨大なリアクターが用いられるため、リアクター
内の温度や基質濃度を常に均一に維持することは難しく、リアクター内には温度分布や濃度分布が発生する。この商業スケールリアクター内における温度や各種濃度の分布は、スケールアップの際に生じる商業スケールにおける生産性の低下の一つの原因となりうる。
そこで本研究では、商業スケールリアクター(800 m3)における酵母を用いたエタ
ノール生産に及ぼす温度分布の影響を例として取り上げ、CFD (Computational
Fluid Dynamics）解析と、増殖、糖消費、エタノール生成の温度依存反応モデル
式、及び発酵熱モデル式とを組み合わせたメソッドで、商業スケールリアクター
内における不均一性が微生物の生産性に及ぼす影響をシミュレーションした。
その結果、リアクター内には温度分布が発生し、完全均一系と比較してエタノー
ル最終濃度が低下することが推定された。さらに、CFD 解析で得られた商業ス
ケールリアクター内の温度分布を実験室スケールにて再現可能なスケールダウ
ンシミュレータのデザインを試み、本装置にて実際に発酵試験を行うことで、実験室スケールにおいて商業スケールのシミュレーション結果が検証可能か検討している。
本研究は国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構(NEDO)の委託研究として実施した。

【背景・目的】強い抗酸化作用をもつ赤色カロテノイド色素であるアスタキサン
チンは、主に Haematococcus pluvialis を用いて生産されている。H. pluvialis によるアスタキサンチン生産では、増殖期とアスタキサンチン生産期を分ける二段
階培養が行われるが、生産性が低く、せん断応力に弱い、アスタキサンチン生
産期に細胞死が生じる等の課題があり、効率的培養方法の確立が求められている。本研究では、H. pluvialis によるアスタキサンチンの効率的生産を目的とした培養工学的検討を行った。
【方法】H. pluvialis NIES-144, NIES-2263, NIES-2892 を使用した。培地には複合
培地 1)を用い、フラスコ, ジャーファーメンター及びエアリフト型バイオリアク
ターにより種々の条件で回分培養を行った。
【結果・考察】アスタキサンチン生産に適した菌株を選択するため静置培養を行ったところ、いずれもほぼ同様の増殖を示し、OD730 は約 1.0 になり最大ア
スタキサンチン濃度は 0.6 mg/L であったので、NIES-144 を用いて更に検討を進めた。次にフラスコ培養により増殖特性を検討したところ、振とうにより本菌株の増殖が抑制される現象が認められ、撹拌強度が菌体増殖に大きな影響を及ぼすことが明らかになった。次に H. pluvialis の工業的培養法を検討するためにジャーファーメンターを用いて回分培養を行ったところ、せん断応力の小さなセラミックス製プロペラ撹拌子を用い撹拌条件を 60rpm としてもアスタキサン
チン生産は低下し、ジャーファーメンターによる効率的アスタキサンチン生産は難しいと考えられた。そこで現在、せん断応力の小さなエアリフト型バイオリアクターを用いた培養工学的検討を進めている。
1)M. Kobayashi et al. J Ferment Bioeng 71: 335-339(1991)

Simulation of ethanol production in a commercial-scale bioreactor using
computational fluid dynamics simulation including biological equations
analysis

Astaxanthin production by Haematococcus pluvialis○Shohei Okino, Minoru Watanabe, Daisuke Taneda(JGC Corp.)○Rena Yamamoto, Jun-ichi Horiuchi, Yoichi Kumada(Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)Key words

modeling, simulation, computational fluid dynamics, scale-up

Key words

Haematococcus pluvialis, astaxanthin, Air-lift bioreactor

1Dp09

下水汚泥中の Social cheater 様細菌群に対する電気培養
の効果

1Dp11

遺伝子組換え乳酸菌によるコーンコブを原料とした D乳酸の高濃度・高収率生産○遠矢 将太郎, 高辻 義行, 前田 憲成（九工大院・生体工）
toshi.maeda@life.kyutech.ac.jp○内藤 秋花 1, 堀内 淳一 1, 熊田 陽一 1, 岡野 憲司 2, 近藤 昭彦 3,
田中 勉 3（1京工繊大院・工芸科学, 2阪大院・工, 3神戸大院・工）horiuchi@kit.ac.jp【背景と目的】下水汚泥中の微生物群は、排水処理プロセスにおいて重要な役割を果たしており、多様な好気性細菌群が分解反応に関わっていることは報告されている。近年、単一菌のクォーラムセンシング阻害の環境適応から、Social
cheater と呼ばれる、クォーラムセンシング阻害を受けて本来生育できない細菌
でも、クォーラムセンシング阻害の影響を受けない細菌と共存させた際、阻害の影響を受けない細菌から栄養物を得て生存できるようになるという仕組みが報告されている。このような生存戦略は、下水汚泥のような複合微生物系でも、共生関係などの相互作用として知られているが、下水汚泥中の Social cheater 様細菌群に関する知見は少ない。本研究では、下水汚泥中の Social cheater 様細菌群について調査すること、また微生物の生体反応では、電子授受が密接に関係していることから、通電によって Social cheater 様細菌群への影響を調査することを目的とした。
【方法】滅菌した 50 mM リン酸緩衝液により汚泥濃度を 1%に調整したのち、この汚泥(100 g)を 100 mL のビーカーに入れた。電気刺激の効果を検証するに当たって、ポテンシオスタットを用いた三電極系を使用した。ポテンシオスタッ
トの設定電位を-500 mV にし、攪拌しながら通電操作を行った。通電後、試料を段階希釈し、スキムミルクを含んだ LB 培地に塗布し、37℃で培養した。培養後、溶解斑を形成しないコロニーを Social cheater 様細菌群として計測した。
【結果と考察】電気刺激を与えた試料での Social cheater 様細菌群の生菌数は、Control の試料と比べ 10 倍多いことが確認でき、溶解班を有する分解菌の生菌数も増加することが確認できた。このことから、電気刺激を加えると Social
cheater 様細菌群が利用する代謝物を生成する微生物群の活性が増加したことで、間接的に生育が促進されることが示唆された。

【背景と目的】当研究室ではバイオマス中のセルロース成分を原料とした L/D乳酸生産を検討してきたが、バイオマス中のヘミセルロース成分も活用できればバイオマス当たりの乳酸生産収率を大幅に向上できる。近年遺伝子組換え技
術により、乳酸菌にキシロース資化能を付与した D-乳酸生産菌が開発されている(1)。 本研究ではこの乳酸菌を活用し、コーンコブ（とうもろこしの穂軸）から得られるグルコース・キシロースをともに利用した D-乳酸生産プロセスの開発を目指した。
【 方 法 】 菌 株 と し て Lactobacillus plantarum(L. plantarum) NCIMB 8826
Δldhl1::PxylAB-xpk1::tktΔxpk2::PxylAB を用いた(1)。本菌はグルコースおよびキ
シロースをともに資化し D-乳酸を選択的に生産するよう代謝改変されている。
原料のコーンコブは 1.5 %希硫酸で酸加水分解し、その後酵素糖化することによりキシロース及びグルコース成分を得た。このコーンコブ加水分解液に MRS
培地成分を添加し、有効容量 2 L のジャーファーメンターにより、pH6.0、
37 ℃、200 rpm の条件で回分培養を行った。更に生産性向上を図るため酸加水分解処理のみを行ったコーンコブを用いて同時糖化発酵(SSF)を検討した。
【結果と考察】93.7 g/L のコーンコブを処理して得られた加水分解液を用いて回分培養を行ったところ乳酸濃度 43.5 g/L 対コーンコブ収率は 50.6％が得られ、コーンコブを原料とした D-乳酸生産が可能なことが明らかになった。
次に、SSF を試みた結果、乳酸濃度 46.8 g/L 収率 61％が得られ、生産性は 1.1
g/L/h となり大幅に向上した。さらにコーンコブ濃度を 250 g/L まで増加させ pH調整剤として炭酸カルシウムを用いた SSF において最大乳酸濃度 143 g/L が得られ、対コーンコブ収率 67.5％、生産性 2.9 g/L/h を達成した。
1) Kenji Okano et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 101:1869-1875 (2017)

Effect of Electrochemical Cultivation for Social Cheater-like Bacteria in
Sewage Sludge

High yield production of high-titer D-lactic acid from corn cobs bygenetically engineered Lactobacillus plantarum

Key words
environmental bacteria, electrochemical cultivation, growth
stimulation, social cheater

Key words
lactic acid bacteria, biomass, D-lactic acid, Simultaneous
Saccharification and Fermentation○Shotaro Toya, Yoshiyuki Takatsuji, Toshinari Maeda(Grad. Sch. Life Sci. Syst. Eng., Kyushu Inst. Technol.)○Shuka Naito1, Jun-ichi Horiuchi1, Yoichi Kumada1, Kenji Okano2,
Akihiko Kondo3, Tsutomu Tanaka3(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.,
3
Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)

114

1Dp12

遺伝子組換えシアノバクテリアを用いた 1,3-プロパンジ
オール生産におけるグリセロール添加効果

1Dp14○武田 真由子 1, 端 瞭太 1, 広川 安孝 2, 花井 泰三 2, 村上 明男 3,
熊田 陽一 1, 堀内 淳一 1（1京工繊大院・工芸科学, 2九大院・農, 3神戸大院・工）horiuchi@kit.ac.jp

Enhanced production of anti-CRP single-chain variablefragment (scFv) antibody using Escherichia coli by DOstat fed-batch culture○Nghia Nguyen Hieu, Michimasa Kishimoto, Yoichi Kumada,Jun-ichi Horiuchi(Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)horiuchi@kit.ac.jp【背景・目的】これまで光合成細菌シアノバクテリア（藍藻）に 1,3-プロパンジ
オール(1,3-PDO)合成代謝経路を導入し、光合成により炭酸ガスから直接 1,3PDO を生産する研究を進めてきた。1) 本菌株を用いた 1,3-PDO 生産では中間代
謝物のグリセロールが培養液中に顕著に蓄積するため、1,3-PDO の生産が抑制されることが課題であった。本研究では、予めグリセロールを添加することで1,3-PDO 生産が向上する可能性があると考え、グリセロール添加が 1,3-PDO 生
産に及ぼす影響およびグリセロール添加培地を用いた 1,3-PDO の連続生産について検討を行った。
【方法】菌株には Synechococcus elongatus PCC7942 に 1,3-PDO 合成代謝経路を導入した TA2984 株 2)を使用した。培地には抗生物質と誘導物質を添加した BG-11培地を用い、必要に応じてグリセロールを添加した。2.0 L 容量のエアリフト型
バイオリアクターを用いた連続培養では光源に蛍光灯を用い、炭酸ガスを供給
し pH を制御する pH-stat システムを導入した。
【結果・考察】BG-11 に 26 mM のグリセロールを添加した培地を用いてフラス
コ培養を行ったところ、グリセロールの排出が抑制され 1,3-PDO 生産が約 3 倍の 0.92 mM/day に向上した。この結果に基づき、グリセロール添加培地を用いてエアリフト型バイオリアクターによる連続培養を行ったところ、約 100 日の運転において 1,3-PDO の生産量が約 2.4 倍に向上した。
1)端瞭太ら, 第 69 回日本生物工学会大会, 3P-N187, 20182)Hirokawa et al. Metab. Eng. 34, 97-103, 2016

Recombinant proteins expressed in E. coli are frequently misfolded into insoluble
aggregates called inclusion bodies, which require a complicated process for
purification including a refolding step. Therefore, the increase of solubility of
expressed proteins has been a critical issue in recombinant protein production using E.
coli. In this study, we developed a DO-stat fed-batch culture system, which allows
maintaining DO in a fermenter constant by glucose feeding. Using the DO-stat fedbatch system, anti-CRP scFv production by E. coli employing the pET expression
system was investigated. By employing a PID control to determine glucose feeding
rate, DO in a fermenter was successfully maintained. The results of the fed-batch
operation at DO=40% showed the solubility of anti-CRP scFv improved from 23-29%
by flask and batch cultures to approximately 100%. The anti-CRP scFv production also
increased from 0.14 g/L by a batch culture to 2.6 g/L. DO in a fermenter significantly
influenced on the solubility and production of scFv and the optimal DO level was
found to be between 40-60% for successful scFv production. It was also found that theincreased addition of yeast extract in feeding medium was effective stabilize anti-CRP
scFv production during fed-batch cultivation. Thus, it was found that the DO-stat fedbatch culture system greatly improves the solubility and production of anti-CRP scFv
using E. coli.

Effective 1,3-PDO production by genetically engineered cyanobacteria.

Enhanced production of anti-CRP single-chain variable fragment (scFv)
antibody using Escherichia coli by DO-stat fed-batch culture○Mayuko Takeda1, Ryota Hashi1, Yasutaka Hirokawa2, Taizo Hanai2,
Akio Murakami3, Yoichi Kumada1, Jun-ichi Horiuchi1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2Fac. Agric., Kyushu Univ., 3Grad.
Sch. Eng, Kobe Univ.)○Nghia Nguyen Hieu, Michimasa Kishimoto, Yoichi Kumada, Jun-ichi Horiuchi(Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)Key words

cyanobacteria, 1, 3-propanediol, airlift bioreactor

Key words

scFv, Solubility, fed-batch culture, DO-stat

1Dp13

組換え大腸菌を用いた DO-stat 流加培養による単鎖抗体の菌体外生産1Dp15

微生物培養による平板培地の pH 変化挙動解析と利用○井嶋 浩一朗, 坂本 祐一朗, 川見 菜実香, 熊田 陽一, 堀内 淳一（京工繊大院・工芸科学）
horiuchi@kit.ac.jp○原田 玲奈, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp【背景と目的】 組換え大腸菌によるタンパク質生産では、目的タンパク質を菌体外に効率的に分泌生産させることは難しいとされてきたが、本研究室ではペリプラズム分泌シグナルを導入した大腸菌を用い、溶存酸素濃度(DO)を指標とした DO-stat 流加培養を行うことで、単鎖抗体(scFv)を効率的に菌体外生産できることを報告した。本研究では、DO-stat 流加培養における DO 条件が scFv の菌体外生産に及ぼす影響を検討することを目的とした。
【方法】
N 末端側にペリプラズム分泌シグナル（pelB leader）、C 末端側に精製用 His タグを導入した anti-CRP scFv 遺伝子を pET-22b(+)発現ベクターを用いて大腸菌
Rosseta2(DE3)株を形質転換した。この組換え大腸菌を用いて、2L 容 Jar-fermenter
により DO=10, 30, 40, 60, 80 %の条件で DO-stat 流加培養を行い、約 100 時間流加培養を継続した。
【結果と考察】DO=10, 30 %条件では、培養後期から発現 scFv の分解が起こり、急激に scFv の生産量が減少した。DO=10%条件において、最終的に OD600 は約 181 に達し、scFv 生産では、最高で 0.5g/L の活性型 scFv を培養液中に分泌した。DO=30%
条件において、最終的な OD600 は約 122 に達し、scFv 生産では、最高で活性型
scFv を 0.35g/L 蓄積した。DO=40, 60, 80 %条件では、培養終了まで scFv を継続的に生産することができた。DO=40 %条件では、最終的な OD600 は約 94 に達し、scFv 生産では、活性型 scFv を 5.5g/L 蓄積した。DO=60 %条件では、最終的な OD600 は約 115 に達し、scFv 生産では、活性型 scFv を 4.9g/L 蓄積した。
DO=80 %条件では、最終的な OD600 は約 113 に達し、scFv 生産では、活性型
scFv を 4.1g/L 蓄積した。
一連の実験を通し、最も可溶化率が高く、活性型 scFv の生産量が高かった培養
条件は DO=40%であった。一方で、流加培地量当たりの生産性が最も高かった
培養条件は、DO=80 %条件であった。

【目的】 寒天平板（AP）培地などの平板培地は、微生物の単離培養に国内外で広く使用されているが、現在、培養できる微生物は自然界の全微生物の 1%程度であるとされ、その限界が指摘されている。この問題を解消するためには、その基礎として、微生物培養に伴う平板培地の培養環境の変化や特性を把握することが重要である。本研究では、微生物培養に伴う平板培地の pH 変化挙動の把握と、得られた知見の利用について検討した。
【方法と結果】 pH 指示薬の Bromothymol Blue（BTB）と R2A 培地（R2A）あるいは 20 倍希釈した Davis 培地（0.05 Davis）を含む AP 培地を作製した（BTBR2A-AP 培地、BTB-0.05Davis-AP 培地）。種々の pH に調整した培地を用い、pHと BTB が呈する培地の色の対応表を作成した結果、AP 培地上の pH 分布の可視化（pH 値の推測）が可能となった。土壌試料懸濁液を BTB-R2A-AP 培地で培養した結果、培養初期は緑色（中性）を呈するが、培養の進行に伴いコロニー
周辺が青色を呈し、最終的に培地のほぼ全範囲が青色（pH 8 以上）を示した。
一方、BTB-0.05Davis-AP 培地で培養した結果、培養初期は同様に緑色（中性）を呈するが、培養が進行するとコロニー周辺は R2A と反対に、黄色を呈し、最終的に培地のほぼ全範囲が黄色（pH 6 以下）を示した。AP 培地上の pH 分布を
等高線で表現した結果、培養経過に伴い pH が全体的に上昇あるいは低下（一部低下あるいは上昇）し、pH の不均一な分布が生じることが示された。pH の
不均一な分布を解消するために、pH 変化を生じる菌を培養 6 h 毎に AP 培地から排除して培養した結果、培養微生物群集構造が変化し、新たな微生物を培養化できる可能性が示唆された。現在、ゲランガム平板培地についても同様に検討中である。

Extracellular production of single chain antibody by DO-stat fed-batch
culture with recombinant E. coli

Monitoring the pH changes on the plate medium during microbial culture
and its application○Koichiro Ijima, Yuichiro Sakamoto, Namika Kawami, Yoichi Kumada,Jun-ichi Horiuchi(Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)Key words

Escherichia coli, scFv, fed-batch culture, DO-stat○Reina Harada, Hideki Aoyagi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

agar plate, microbial dark matter, pH

115

1Dp16

微生物の振盪フラスコ培養中における培養栓の換気能評
とその応用

1Dp18

○高橋 将人, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp

pH 変動培養による有用金属回収微生物の新規スクリー
ニング法の開発○高野 力 1, 村山 晃一 2, 青柳 秀紀 1
（1筑波大院・生命環境, 2フタムラ化学）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp【目的】 従来の振盪フラスコ培養法（batch 型）は様々な細胞で用いられている。現在、batch 型に囚われない次世代の振盪フラスコ培養法などが登場している中、従来法を深く理解することは、培養実験の高い再現性につながるだけでなく、次世代の振盪フラスコ培養法との互換性への詳細な検証も期待できる。
我々は、従来の振盪培養中のフラスコ気相部に意図せず充満する CO2 の重要性を述べてきた 1-3)。そこで、気相部のガス形成の要因の一つである通気性を有した培養栓が微生物培養に及ぼす影響を解析した。
【方法と結果】本研究では、我々が独自に開発したバイパス型のモニタリングデ
バイス（Circulation Direct Monitoring and Sampling System：CDMSS）1, 4)を用いて、微生物の振盪培養中にフラスコ内に充満する CO2 を指標に、培養栓を評価しながら、微生物に及ぼす影響を調べた。その結果、培養栓（換気能）の変更
のみで増殖挙動が異なる微生物種が認められた。さらに、振盪培養を中断せずにフラスコ気相部に様々なガスを通気できるシステム（Automatic Aeration Flask
System：AAFS）2)と CDMSS を、Proportional Integral Differentia ｌ（PID）制御装置に接続し、培養栓をつけたフラスコ気相部の CO2 濃度を一定に制御する培養法を開発した。開発した PID 制御培養と従来の振盪フラスコ培養の比較実験を実施した結果、従来法では培養時間に伴い菌体の凝集が観察された Pelomonassaccharophila の凝集頻度を抑制でき、増殖が改善された（他の微生物種においても検討中）。本研究は、振盪培養中に通気性を有した培養栓によって形成されるフラスコ気相部のガス環境が微生物に影響を及ぼすこと初めて示した研究である。
1）AMB express, 7, 163 (2017).
2）JBB, 126, 96-101 (2018).
3）AMB, 102, 6637-6645 (2018).
4）AMB, 102, 4279-4289 (2018).

【緒言】 電子機器等の都市鉱山廃棄物に含まれる有用金属を再利用するため、微生物を用いた様々な有用金属の回収技術が開発されてきたが、優れた特性（耐酸性や耐金属性など）を有する有用金属回収微生物を探索、取得するには課題が多い。既に我々は、Specialized Cellulose Film (SCF) 法を用いて、培養中に pHを変動させることで、環境中から耐酸性微生物をスクリーニングする pH 変動
培養法を開発している 1)。本研究では pH 変動培養法を活用した、有用金属回収
微生物の効率的なスクリーニング系の構築と、優れた特性を有する有用金属回収微生物の取得を試みた。
【方法と結果】 最適化した pH 変動培養法を用いて pH を 7→1→7 と変化させ、環境試料から耐酸性微生物をスクリーニングした結果、土壌試料からEnterobacter ludwigii (16S rRNA 遺伝子シーケンス解析で同定) の単離培養に成功した。本菌は比較的高い耐酸性を示した (E. ludwigii は芽胞形成による休眠状態をとらず、耐酸性に関する報告はない) 。有用金属のモデルとして銅に着目し、硫酸銅を添加した培地で、pH を 7→1.5→7 と変動させる培養系を構築した。0.01% (w/v) 硫酸銅を用いて、pH 7 (2 days) →1.5 (2 days) →7 (1 day) の条件
で本系を適用した。この結果、細菌の単離培養に成功し、16S rRNA 遺伝子シー
ケンス解析の結果、シデロフォア生産能を持つ Paenibacillus sinopodophylli と推定された（銅回収能力を評価中）。現在、様々な環境試料に本法を適用し、銅回収能力を持つ微生物のスクリーニングを検討中である。 1) H29 日本生物工学会
要旨 p. 161

Evaluation and application of culture-plug during shake-flask culture withmicroorganism

Development of novel pH shift screening system for microbes capable ofurban mining○Masato Takahashi, Hideki Aoyagi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)○Chikara Takano1, Kouichi Murayama2, Hideki Aoyagi1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Futamura Chemical Co., Ltd.)Key words

aerobic culture, carbon dioxide, culture-plug, shake-flask culture

Key words
miningacid tolerance, specialized cellulose film, uncultured bacteria, urban

1Dp17

セルロースメンブランを用いた植物生育促進細菌の評
価・培養法の開発

1Ep03

コリネ型細菌における ECF シグマ因子 SigE のレギュロン同定

大矢 裕之 1, ○藤原 優人 2, 中村 真由 1, 青柳 秀紀 1,2（1筑波大院・生命環境, 2筑波大・生物資源）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp○豊田 晃一 1, 乾 将行 1,2（1RITE, 2奈良先端大・バイオ）mmg-lab@rite.or.jp【目的】
植物の生育を促進する細菌（Plant Growth Promoting Bacteria: PGPB）の利用は、
持 続 可 能な 農資 源 利 用 に 重 要 で あ る 。 PGPB を 探 索 す る 際 、 Plant Growth
Promoting Activity（PGPA）が評価されるが、従来法は PGPA の項目ごとに個別の評価培地を用意し、それぞれに菌を播種する必要があり、操作が非常に煩雑である。また、PGPB の培養化においても、従来の寒天平板（AP）培養法では自然界の全細菌の 1％程度しか培養できず、多様な PGPB が取得できないという問題がある。この現状を踏まえ本研究では、セルロースメンブラン（UCM）
を用いた PGPB の評価・培養法の開発をおこなった。
【方法と結果】
AP 培地に設置した UCM 上で培養した細菌を、UCM ごと新しい評価培地に順次移動することで、多項目の PGPA が評価できる系を考案、開発した（UCM 評価系）。シデロフォア（S）生産能とリン酸（P）可溶化能を持つ Pseudomonas
tolaasii NBRC103163 や土壌試料などから分離培養した IAA 生産能を有する
PGPB を用いて種々検討した結果、UCM 評価系では煩雑な操作が解消し、多項
目の PGPA を評価できた。また、AP 培養法の問題点を解消するために、UCM
を AP 培地に設置する培養系（UCM 法）を考案した。KBM 培地を用いて UCM
法と AP 培養法で根圏土壌試料を培養し、得られた培養微生物群集を PCRDGGE 法で比較解析した結果、UCM 法で特異的に培養化される細菌が存在した。また、孔径 0.45 μm のフィルターで濾過した根圏土壌試料を UCM 法で培養した結果、AP 培養法では得られなかった種々の PGPB が単離培養でき、高い S 生産能が認められた。

【目的】シグマ因子は RNA ポリメラーゼホロ酵素におけるプロモーター認識に関わるサブユニットである。extracytoplasmic function(ECF)シグマ因子ファミリーに属するものは、様々な環境ストレス応答に関与することが知られている。ア
ミノ酸生産菌 Corynebacterium glutamicum のゲノム上には 5 つの ECF シグマ因子 SigC、SigD、SigE、SigH、SigM がコードされている。本菌における分子レ
ベルでのストレス応答機構の解明を目的にこれら ECF シグマ因子の機能解明を進めており、SigC、SigD、SigH については標的遺伝子群(レギュロン)、認識プ
ロモーターを同定している。SigE については 1) SigD、SigH と同様にアンチシ
グマ因子と複合体を形成し不活性化されること、2) 細胞表層ストレスへの耐性に関与すること、3) 認識プロモーター配列が SigH のものと類似していることがすでに報告されている。一方、SigE に制御される遺伝子としては group 2 シ
グマ因子 SigB をコードする sigB のみが知られている。本研究では SigE レギュ
ロンの同定により、詳細な SigE 認識プロモーター配列およびその生理学的機能の解明を目的とした。
【方法と結果】ChIP-chip 解析によりゲノム上の SigE 結合領域 18 か所を同定した。結合領域内の保存配列から SigE の認識プロモーター配列を予測するとともに、結合領域下流遺伝子の転写開始点から、この配列がプロモーターとして機能することを確認した。SigH の認識配列と一部重複していたが、SigE 特異的な特徴が見られた。また、アンチシグマ因子遺伝子の破壊により、同定した
SigE 認識プロモーターの下流に位置する遺伝子群の発現が野生株よりも上昇したことから、これらの遺伝子が SigE レギュロンであると結論付けた。SigE レ
ギュロンのうち sigB を含む 8 遺伝子は SigH レギュロンにも含まれていた。本
研究の一部は JSPS 科研費 17K15256 の助成を受けて実施された。

Development of method for evaluation and cultivation of plant growthpromoting bacteria using cellulose membrane

Identification of the regulon of the ECF sigma factor SigE in
Corynebacterium glutamicum

Key words
plant growth promoting bacteria, plant growth promoting activity,
cellulose membrane

Key words

Hiroyuki Oya1, ○Yuto Fujiwara2, Mayu Nakamura1, Hideki Aoyagi1,2(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Coll. Agro-bio. Resour. Sci., Univ.
Tsukuba)○Koichi Toyoda1, Masayuki Inui1,2(1RITE, 2Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)

Corynebacterium glutamicum, sigma factor, promoter, stress response

116

1Ep04

超好熱菌の分岐鎖ポリアミン依存的に発現する遺伝子の
温度依存性

1Ep06

○尾崎 守, 福田 萌子, 濱川 匡史, 福田 青郎, 藤原 伸介（関西学院大・理工）
fujiwara-s@kwansei.ac.jp

Zygosaccharomyces rouxii の株間メタボローム解析による凍結耐性関連代謝物の探索○菊池 成真, 森本 一輝, 小西 正朗（北見工大）
konishim@mail.kitami-it.ac.jp【背景】ポリアミンは核酸をはじめとする生体分子との相互作用により様々な生命現象に関与している(1)。85℃を生育至適温度とする超好熱性アーキア
Thermococcus kodakarensis は一般的な直鎖のポリアミンであるスペルミジンに加え、分岐鎖構造の N4-ビス（アミノプロピル）スペルミジンを有する。この
分岐鎖ポリアミンは本菌の高温（93℃）での生育に必須であることがわかっている(2)。本研究では超好熱菌の分岐鎖ポリアミンの生理機能解明を目指し、特に翻訳に与える影響に着目して、培養温度の異なる培養を行い、分岐鎖ポリア
ミンに依存して発現量が変化するタンパク質網羅的な同定し、これらの温度依存性を検証した。
【方法と結果】分岐鎖ポリアミンを合成可能な T. kodakarensis KU216 株と分岐鎖
ポリアミン合成酵素遺伝子の破壊株（DBP1 株）をそれぞれ栄養培地にて 85℃と 90℃で培養し、細胞抽出液を得た。これらに含まれるタンパク質を SDS-PAGEにより分画した後、LTQ Orbitrap LC-MS を用いてタンパク質の同定、及びカタ
ログ化を行った。90℃及び 85℃で培養した菌体を解析した結果、様々なタンパ
ク質の発現が分岐鎖ポリアミンの有無に影響を受けることがわかった。特に細胞質型ヒドロゲナーゼの発現は、90℃及び 85℃で分岐鎖ポリアミンの存在に依存することがわかった。また 90℃で培養した DBP1 株からは鞭毛タンパク質の発現がほとんど確認されなかった。その一方で野生株や 85℃で培養した DBP1
株からは鞭毛タンパク質が検出された。これらの結果から、分岐鎖ポリアミン
は超好熱菌の特定のタンパク質の翻訳に影響を与えるが、その寄与はタンパク質の種類や培養温度とも関連することが示唆された。
【参考文献】(1) Muramatsu, A., et al., J. Chem. Phys., 145(23):230103. (2016)(2) Okada, K., et al., J. Bacteriol., 196(10):1866-76. (2014)オホーツク圏の自然環境中から分離した環境酵母の一部が既存の凍結耐性酵母
より強い凍結耐性を持つことを明らかにしている。しかし、それらの酵母の凍結耐性機構はわかっていない。先行研究では、Saccharomyces cerevisiae が細胞内に二糖や糖アルコールなどの低分子代謝物を蓄積することで凍結ストレスを緩和することが知られているが、その他の環境酵母については研究例がほとん
どない。本研究では、凍結耐性に関与する代謝物に着目し、代謝産物組成と凍結耐性の関連性について解析することで凍結耐性に関係する成分について調査した。
独自に分離した Zygosaccharomyces rouxii SRT88 株、それらと同種の対照株(Z.
rouxii NBRC0740, NBRC1733)を用いた。凍結耐性試験は、YM 培地で培養後、濁度(OD600)を 1 に合わせ、凍結融解操作前後で生菌数変化から半致死凍結回数(LF50)を算出することにより評価した。メタボローム解析では代謝物の変化を防
ぐため、菌体を回収後に素早く凍結乾燥した。凍結乾燥菌体を合わせ、抽出溶
媒、内部標準物質を加えてホモジナイズした。上清に超純水を加えて遠心後、上層を凍結乾燥した。乾燥物を誘導体化し、GC/MS で分析を行い、OPLS 法で解析した。
Z.rouxii SRT88 株とコントロール株(NBRC0740, NBRC1733)の半致死凍結回数
LF50 はそれぞれ 3.75 回、0.90 回、2.39 回であり、凍結耐性に明らかな違いが認められた。OPLS 解析の結果、代謝物組成と凍結耐性間で相関性の高いモデリングができた（R2 >0.95，Q2>0.90）。OPLS モデルにより算出された VIP 値と p値から統計的に有意差が有り、重要度の高い代謝物をフィルタリングした(VIP≥ 1.0，p ≤ 0.05)した。その結果、Z.rouxii SRT88 株は対照株 2 種に比べ、Mannitol
や L-aspartic acid、citric acid を多く蓄積しており、これら多く含むことで凍結耐性を高めている可能性が示唆された。

Temperature dependency of expression of branched-chain polyamine
dependently expressed genes in hyperthermophile.

Metabolome analysis among strains in Zygosaccharomyces rouxii toestimate metabolites associated to frozen resistance.

○Mamoru Osaki, Moeko Fukuda, Masafumi Hamakawa, Wakao Fukuda,
Shinsuke Fujiwara(Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ.)○Narumi Kikuchi, Kazuki Morimoto, Masaaki Konishi(Kitami Inst. Technol.)Key words
proteomics

hyperthermophilic archaeon, Thermococcus kodakarensis, Polyamine,

Key words

freeze tolerant, taxonomy, metabolomics

1Ep05

Porphyromonas gingivalis のバイオフィルム形成におけるポリアミン類の影響の検討

1Ep07

不均衡変異導入法で単離されたリボフラビン高生産
Ashbya gossypii のゲノム解析○綿井 大輔 1, 坂中 哲人 2, 久保庭 雅恵 2, 福﨑 英一郎 1（1阪大院・工, 2阪大院・歯）fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp○畔上 純也 1, 横森 愛美 1, 加藤 竜也 1,2, 道羅 英夫 2, 朴 龍洙 1,2（1静大院・総合科技, 2静大・グリーン科技研）
kato.tatsuya@shizuoka.ac.jp

臨床研究において，ポリアミンに分類される複数の物質が歯周病の重症度を示
すバイオマーカーになることがこれまでに示唆されている．しかし，ポリアミンの歯周病への直接的影響に関する報告は未だにない．そこで本研究では，歯周病菌の中で最も高い病原性を示すことで知られるキーストン病原菌である
Porphyromonas gingivalis の培養過程にポリアミンを添加することで，その影響を調べることを目的とした．共焦点レーザー顕微鏡を用いて，ポリアミン（ Putrescine ， Spermidine ， Spermine ， Cadaverine ） 添 加 に よ る Porphyromonas
gingivalis のバイオフィルム形成の変化を観察したところ，Putrescine，Cadaverineを添加したことにより，有意にバイオフィルム形成が亢進することを実証した．
次に，LC-MS/MS を用いてバイオフィルム形成に伴う菌体内アミン代謝物の経時的変化を分子レベルで裏付けた．その結果，培養過程で Putrescine を添加した際，ポリアミン（Agmatine，Spermidine）やその代謝上流にあるアミノ酸（Arginine，Citrulline，Ornithine，Glutamic acid）が減少することが分かった．この結果より，Putrescine によるこの代謝変動は Porphyromonas gingivalis バイオ
フィルム形成と何らかの関係があることが示唆された．

【目的】リボフラビンは、生体内において電子伝達系酸化還元酵素の補酵素であるフラビンモノヌクレオチド（FMN）やフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）の前駆体であり、必須の栄養素である。糸状菌 Ashbya gossypii はリボフラビン生産菌として知られており、現在工業的なリボフラビン生産に利用されている。
当研究室では、ラギング鎖の複製エラー頻度を上げた改良型ポリメラーゼを利用した不均衡変異導入法により、野生株である A. gossypii ATCC10895 株に比べリボフラビン生産性が約 9 倍高い A. gossypii W122032 株の単離に成功している１。そこで、この野生株とリボフラビン高生産株のゲノム配列を解析し、A.
gossypii のリボフラビン生産の新たな知見を得ることを目的とした。 【方法及び結果】 A. gossypii ATCC10895 株と W122032 株のゲノム DNA を Illumina 社のMiseq に共し、リードデータを取得した。すでに報告のある ATCC10895 株のゲ
ノム DNA 配列を参照配列とし、リードデータのマッピングを行った。各遺伝
子 内 の SNP お よ び Indel 解 析 を 行 っ た と こ ろ 、 今 回 使 用 し た A. gossypii
ATCC10895 株において、既存の ATCC10895 株の AGR073C 遺伝子において、
アミノ酸置換を伴うヘテロザイガス変異が 1 つ確認された。W122032 株では 32個のホモザイガス変異と 1377 個のヘテロザイガス変異がアミノ酸置換を伴う変異として確認された。これらヘテロザイガス変異において、W122032 株で変異が生じている割合が 21〜75%であった。W122032 株の単核胞子を単離し培養したところ、菌糸の増殖は確認できなかった。このことから、A. gossypii の多核性や倍数性がこの結果を反映していると推測された。また W122032 株において、rDNA 領域のコピー数の増加も確認された。

Investigation of effects of polyamines on biofilm formation by
Porphyromonas gingivalis

Genomic analysis of riboflavin-overproducing Ashbya gossypii mutant
isolated by disparity mutagenesis○Daisuke Watai1, Akito Sakanaka2, Masae Kuboniwa2, Eiichirou Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Grad. Sch. Dent., Osaka Univ.)

Key words
profiling

Porphyromonas gingivalis, polyamine, biofilm formation, metabolite○Junya Azegami1, Ami Yokomori1, Tatsuya Kato1,2, Hideo Dohra2, Enoch Y Park1,2(1Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci. Technol.,Shizuoka Univ.)

Key words

Ashbya gossypii, riboflavin, disparity mutagenesis, genomic analysis

117

1Ep08

非モデル珪藻のトランスクリプトーム解析およびプロテ
オーム解析に基づく被殻形成関連タンパク質の同定

1Ep10

岩城 沙弥子 1, 小布施 祈織 1, 田村 隆 1, 稲垣 賢二 1, 真山 茂樹 2,○根本 理子 1（1岡山大院・環境生命, 2東京学芸大・教）mnemoto@okayama-u.ac.jp

イネ、バラ、レタスにおける mRNA の内部切断に関わる配列的特徴の比較○向田 尭史, 上野 大心, 山崎 将太朗, 出村 拓, 加藤 晃
（奈良先端大・バイオ）kou@bs.naist.jp

珪藻のシリカ被殻は、現在の微細加工技術では合成困難なナノ微細構造を有しており、その微細構造に由来する特性を生かし、太陽電池、ガスセンサー、分子フィルター、などナノテクノロジー分野への応用が報告されている。珪藻の被殻形成機構を明らかにできれば、上記分野への応用が可能な新しいセラミッ
クス材料を開発できる可能性がある。珪藻の被殻形成機構解明に向けて、これまでは主に、ゲノム解読された特定のモデル珪藻を用いた解析が行われてきた。
複数の被殻形成関連タンパク質が報告されているが、その多くが、モデル珪藻のみでしか存在が確認されておらず、珪藻に共通する被殻形成因子は不明である。本研究では、珪藻に共通する被殻形成機構を明らかにするため、3 種の非モデル珪藻のトランスクリプトームデータを新たに取得し、ゲノム解読された珪藻の遺伝子情報と共に網羅的な比較解析を行った。さらに、取得したトランスクリプトームデータを用いて、被殻局在タンパク質のプロテオーム解析を行った。
まず、Nitzschia 属、Achnanthes 属、Pseudoleyanella 属の３種の珪藻の RNA を、
次世代シーケンサーを用いて解析し、トランスクリプトームデータを取得した。
取得したトランスクリプトームデータとデータベース上に登録されている 5 種の珪藻の遺伝子情報を比較し、珪藻のみに保存された 880 個の遺伝子を抽出した。その中からさらに、既知の被殻形成関連タンパク質が持つ ER 輸送シグナ
ル配列を持つものに絞り込んだ。被殻局在タンパク質のプロテオーム解析を行った結果、Nitzschia 属珪藻の被殻から ER 輸送シグナル配列を有し、特徴的な繰
り返し配列を有する新規タンパク質が同定された。現在、本研究で同定したタンパク質について、遺伝子発現解析を用いて、被殻形成との関連を解析している。

導入遺伝子を発現させる上で、mRNA の安定性は蓄積 mRNA 量を制御する重要な要因の一つであると考えられる。この安定性を制御する機構として mRNAの分解機構が挙げられる。mRNA の分解機構はポリ A 鎖の短縮に依存する分解機構とエンドヌクレアーゼ等の内部切断に依存する分解機構に大別できる。ポリ A 鎖の短縮依存的な分解機構に関しては酵母において詳細な解析が行われているものの、エンドヌクレアーゼ等の切断に依存する分解機構に関しては不明な点が多い。植物では、シロイヌナズナにおいてゲノムワイドに切断部位を解析できる TREseq (Truncated RNA end sequencing) 法が確立し、G リッチな配列がmRNA の切断に関与していることが報告されている。しかし、これらの内部切断に関わる配列的特徴が、異なる植物種においても類似する傾向が見られるかどうかは不明である。
本研究では、イネ、バラ、レタスを対象に TREseq 法を用いて mRNA の内部切断部位を網羅的に同定した。そして、各切断部位での切断のされやすさの指標として、各切断部位のリード数をその遺伝子の mRNA 蓄積量で補正した値をcleavage score（CS 値）と定義し、解析を行った。その結果、シロイヌナズナと同様に切断部位周辺には G リッチな配列が認められた。このことは、異なる植物種において、共通の配列モチーフが mRNA の内部切断に関与していることを示唆している。

Identification of proteins involved in frustule formation by transcriptome
and proteome analyses of non-model diatom species

Comparison of sequence features related to mRNA degradation in rice, rose,and lettuce

Sayako Iwaki1, Kiori Obuse1, Takashi Tamura1, Kenji Inagaki1, Shigeki Mayama2,○Michiko Nemoto1(1Grad. Sch. Environ. Life Sci., Okayama Univ., 2Fac. Educ., Tokyo Gakugei Univ.)○Takafumi Mukuta, Daishin Ueno, Shotaro Yamasaki, Taku Demura, ko Kato
(Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)

Key words

proteome, transcriptome, diatom, biomineralization

Key words

plant mRNA, mRNA degradation, comprehensive analysis

1Ep09

機械学習を用いた植物 mRNA 切断に関わる特徴の選抜

1Ep11

Droplet Digital PCR 法を用いた植物 mRNA の内部切断の定量的な測定法の確立○上野 大心, 山崎 将太朗, 出村 拓, 加藤 晃
（奈良先端大・バイオ）kou@bs.naist.jp○成瀬 つきひ, 上野 大心, 山崎 将太朗, 出村 拓, 加藤 晃
（奈良先端大・バイオ）kou@bs.naist.jp

外来遺伝子を細胞内で発現させる上で、mRNA の安定性は重要である。この安定性を制御する機構の一つとして、mRNA の分解機構が挙げられる。中でも内部配列の切断に依存する分解機構に関しては、動植物を問わず詳細な解析は行われていない。植物においては、切断部位を網羅的に同定する手法が報告されているが、実験手法、解析手法上の問題が存在していた。そのため、各切断部位の切断のされやすさ（切断率）を正確に数値化することができず、mRNA の切断に関わる配列等の特徴は不明であった。我々は、これらの問題点を改善した truncated RNA end sequencing (TREseq) をシロイヌナズナにおいて確立し、網羅的に切断部位を同定した。この手法を用いて解析を行ったところ、切断部位
周辺には顕著な塩基の偏りが確認された。また、遺伝子単位の切断率と mRNA上のリボソーム存在量には正の相関が認められ、翻訳過程が mRNA 切断に強く関与することが示唆された。酵母における先行研究において、翻訳過程は切断個所の決定にも強い影響を与えていることが知られているが、その詳細な知見
は植物において不明である。そこで、これらの切断に関わる複数の要因（RNAの特徴）を想定し、機械学習 (random forest classifier) を用いてその切断に関わる重要な特徴の選抜を行った。特に重要な特徴を見ると、そのほとんどは配列的特徴であり、翻訳過程に関わる特徴はごくわずかであった。これらの結果は、配列依存的に mRNA の切断個所が決定されることを強く示唆している。将来的には、これらの解析を基に、導入する外来遺伝子について切断率が高い配列を除去するなど、導入外来遺伝子の安定的発現に寄与すると考えられる。

導入遺伝子発現を理解する上で、転写、転写後、翻訳、翻訳後における様々な調節機構を解明することは重要である。なかでも転写後調節の一つであるｍ
RNA の分解はｍ RNA の蓄積量を制御する重要な調節機構の一つとされている。
このｍ RNA の分解には二つの機構がある。一つ目は、ポリ A 鎖の短縮に起因する分解であり、脱キャップに引き続き、5’-3’もしくは 3’-5’のエキソヌクレ
アーゼにより分解が引き起こされる。二つ目は、ｍ RNA 内部配列の切断 (エンドヌクレアーゼ等) が起因となり、それに引き続く 5’-3’もしくは 3’-5’エキソヌ
クレアーゼにより分解される。ポリ A 鎖の短縮に依存する分解機構に関しては、いくつかのタンパク質因子が同定され詳細な解析が酵母を中心に行われているが、ｍ RNA 内部配列の切断に依存する分解機構に関しては、生物種を問わず詳細は不明である。
当研究室では、ｍ RNA の内部切断部位を網羅的に解析できる Truncated RNA
End sequencing（TRE seq）法を確立し、シロイヌナズナ培養細胞を対象として、切断部位に関する情報を取得している。本研究では、実際に切断される部位を含む DNA 断片をレポーター遺伝子内に挿入したキメラ遺伝子を構築し、一過的に植物細胞内で発現させ、転写されたｍ RNA の内部切断を Droplet Digital
PCR（ddPCR）を用いて定量的に解析する実験系を確立した。今後は、切断部位周辺配列を置換することで、内部切断に関わる配列的特徴を明らかにする。
将来的には、これらの解析によって得られた知見を基に、導入遺伝子から不安定化に作用する配列を除去するなど、導入される外来遺伝子の安定的な発現に応用できると考えられる。

Selection of features related to mRNA cleavage in plant

Establishment of quantitative measurement method of internal cleavage ofplant mRNA by Droplet Digital PCR○Daishin Ueno, Shotaro Yamasaki, Taku Demura, Ko Kato
(Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)

Key words
degradation

Arabidopsis thaliana, bioinformatics, cleavage sites, mRNA

○Tsukihi Naruse, Ueno Daishin, Shotaro Yamasaki, Taku Demura, Ko Kato
(Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)

Key words

mRNA degradation, plant mRNA, Arabidopsis thaliana

118

1Ep12

植物におけるリボソームの停止・停滞に影響を与えるｍ
RNA の配列的特徴についての解析

1Ep14○伊藤 光佑, 上野 大心, 山崎 将太朗, 出村 拓, 加藤 晃
（奈良先端大・バイオ）kou@bs.naist.jp

植物免疫活性化能を持つ低分子環状ペプチド剤の探索とそれらを細胞内で生成させる遺伝子カセットを導入した
形質転換シロイヌナズナの病害抵抗性の解析○能年 義輝 1, 渡邉 恵 1, 守屋 綾子 1, 香西 雄介 2, 山中 由利恵 1,
木村 麻美子 2, 北松 瑞生 3（1岡山大院・環境生命, 2理研・環境資源, 3近畿大院・総合理工）noutoshi@okayama-u.ac.jp

近年、有用遺伝子を植物に導入し、有用タンパク質（医療用ワクチンや抗体）などを植物において生産する試みが行われている。導入された遺伝子は、転写、翻訳過程を経て、タンパク質となる。この中でも、mRNA をタンパク質へと変換する翻訳過程は、導入遺伝子を高発現させる上で、特に重要なステップであると考えられる。mRNA がタンパク質へと翻訳される効率（翻訳効率）に影響を与える要因として、リボソームの翻訳伸長反応が挙げられる。先行研究において、tRNA 量が豊富である最適コドンが mRNA 上に多く存在する場合、リボソームの翻訳伸長速度が早い（翻訳効率が高い）ことが真核生物の酵母において報告されている。その反対に、最適ではないコドン（rare codon)が多い場合
は、リボソームの翻訳伸長速度は遅くなることが知られている。しかし、植物については、リボソームの翻訳伸長速度とコドンの関係性について、その詳細な知見は明らかとなっていない。本研究ではシロイヌナズナ培養細胞を対象として、リボソームプロファイリング法を用いることで、リボソームの停止・停滞に関するゲノムワイドな情報を取得した。遺伝子内におけるリボソームの停止・停滞部位の分布に着目すると、開始、終始コドンの近傍に多く見られ、コード領域内において 3 塩基単位の周期性が認められた。また、コドン、アミノ酸に着目した解析を行ったところ、プロリンに対応するコドンにおいて、動物等の先行研究で報告されている、顕著なリボソームの停止・停滞が観察された。
今後、これらの解析を進めることにより、リボソームが停止・停滞する配列を特定する。

抵抗性誘導剤は植物が本来持っている免疫力を活性化することで病害防除効果を示す農薬である。我々は独自に確立した植物免疫の定量評価系を利用し、これまでに市販の化合物ライブラリーの網羅的探索から植物免疫活性化剤を多数単離・解析してきた。病原体に直接作用しない抵抗性誘導剤には薬剤耐性菌が出現しないため、利用拡大が期待される。しかし、濃度依存性が出にくく、殺菌剤との競合により商品化に至りにくい。この欠点を補う方策として、抵抗性誘導剤を植物体に作らせることにより、耐病性品種として防除効果を享受する手法を考案した。現段階で本構想を実現しうる素材として環状ペプチドに着目した。そこで、7 残基の天然アミノ酸で構成される低分子環状ペプチドのライ
ブラリー（8,000 分子種）を有機合成した。そして、そのうち 1,600 個を探索し、植物免疫応答を亢進する働きを持つ 10 個の環状ペプチドを得た。これらはシロイヌナズナおよびミナトカモジグサに投与すると、それぞれ斑葉細菌病、紋枯病に対する病害抵抗性を誘導した。これらの環状ペプチドには、植物への投与によって防御関連遺伝子を発現誘導するものもあったが、耐病性付与の程度との相関はなかった。次に、これら生理活性環状ペプチドのうち 3 種を選抜し、SICLOPPS (Split-Intein Circular Ligation Of Peptides and ProteinS)法を用いてこれらの環状ペプチドを細胞内で生成しうる遺伝子カセットを構築し、アグロ
バクテリウム法によりシロイヌナズナに導入した。これらの形質転換体は、病害抵抗性の向上を示し、本構想の実効性が示された。本遺伝子カセットは様々な作物種へ適用できる。また、ペプチドの探索指標を変えることにより、様々な植物機能の改変への応用も期待できる。

Sequence features related to ribosome stall/pausing in plant mRNA

Transgenic Arabidopsis plants expressing gene cassettes for production of
immune-activating small cyclic peptides exhibited increased disease
resistance○Kosuke Ito, Daishin Ueno, Shotaro Yamasaki, Taku Demura, Ko Kato
(Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)

Key words

Arabidopsis thaliana, ribosome profiling, mRNA

1Ep13

Production of recombinant β-glucocerebrosidase inNicotiana benthamiana root culture induced by plant
hormones○Naphatsamon Uthailak1,2, Takao Ohashi1, Ryo Misaki1,
Kazuhito Fujiyama1(1ICBiotech, Osaka Univ., 2Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)
fujiyama@icb.osaka-u.ac.jp○Yoshiteru Noutoshi1, Megumi Watanabe1, Ayako Moriya1, Yusuke Kouzai2,
Yurie Yamanaka1, Mamiko Kimura2, Mizuki Kitamatsu3(1Grad. Sch. Environ. Life Sci., Okayama Univ., 2CSRS, RIKEN, 3Grad. Sch. Sci.
Eng., Kindai Univ)
Key words
Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon, Plant activator, Small
cyclic peptides

1Ep15

気孔開口を抑制する K チャネル阻害剤の同定とその構
造活性相関○鈴木 喬太 1, 遠藤 晃輔 1, 島田 友輝 1, 有澤 美枝子 2,
熊田 佳菜子 2, 一刀 かおり 3, 谷井 沙織 2, 古田 未有 2, 井坂 修久 4,
山口 利男 5, 浜本 晋 1, 石丸 泰寛 1, 魚住 信之 1
（1東北大院・工, 2東北大院・薬, 3東北大院・生命, 4新潟薬大・応生命, 5新潟薬大・薬）uozumi@biophy.che.tohoku.ac.jp

Enzyme replacement therapy has been used as the most effective treatment for
Gaucher disease, a lysosomal storage disorder caused by the lack of βglucocerebrosidase (GCase) activity. The most used commercial recombinant GCase isproduced in mammalian cells. Compared to mammalian cells, plants provide
advantages on pharmaceutical protein production including the low cost for production
and no risk of the contamination by human pathogens. This study aimed to produce therecombinant GCase as an active enzyme in Nicotiana benthamiana root culture
induced by plant hormones. Root of transgenic GCase-producing plants were induced
and cultured in liquid medium supplemented with plant hormones [Indole-3-acetic acid(IAA) or Indole-3-butyric acid (IBA)]. The optimal condition for GCase production
was determined under different concentrations of plant hormones and cultivation times.
GCase production was analyzed using GCase activity assay, dry root weight andWestern blot. Recombinant GCase was successfully produced in root culture with the
enzyme activity 88.81± 2.98 Units/mg total protein at 5 weeks after induced by IBA(0.1 mg/L), which is higher than that induced by IAA from previous study (81.40± 17.99 Units/mg total protein). Purification and N-glycan analysis of GCase would be
the next step in this study. This research provides the alternative plant system forrecombinant GCase production. This system might be applied on the otherrecombinant proteins production in the future.

【背景・目的】 植物の二酸化炭素の吸収や蒸散の調節は気孔の開閉によって行われる．気孔の開閉は孔辺細胞の体積変化によって生じる．シロイヌナズナの孔辺細胞には，K+を細胞内に取り込む KAT1 と KAT2 という K+チャネルが発現している．この K+チャネルが開孔すると孔辺細胞内の K+濃度が増大し，水が流入することによって孔辺細胞の体積が増大するため気孔が開口する．これまで植物 K+チャネルに特異的な阻害剤は報告されていなかった．私たちは低分子化合物の中から，KAT1 を選択的に阻害する尿素系化合物を見出したことを報告している．今回は，その化合物の類似化合物を用いて，KAT1 阻害における構造活性相関を検討した．さらに，KAT1 を阻害する尿素系化合物が，植物の生理的機能におよぼす影響を調査した．
【方法・結果】 KAT1 の RNA を導入したアフリカツメガエルの卵母細胞の外液に，尿素系化合物の 41 種類の類似化合物を添加して，膜電位固定法による K+
電流の測定を行った．その結果，芳香族置換基や数種類のハロゲン基を水素に置換した化合物では阻害活性が見られなかったが，ハロゲン基は，電子求引性・置換基サイズ共に同程度であれば，別のハロゲン基に置換しても阻害活性が維持された．次に，シロイヌナズナの葉から気孔を単離したのち，暗所で一度気孔を閉じさせた．その後明所に移し，尿素系化合物を添加して気孔の開度を調べたところ，無添加と比較して約 60 ％気孔の開口を阻害した．また，尿素系化合物を添加した培地上でのシロイヌナズナ生育試験を行ったが，根の伸長や葉の成長に影響は見られなかった．以上の結果から，尿素系化合物は気孔の開閉に特異的に作用することが示唆された．

Production of recombinant β-glucocerebrosidase in Nicotiana benthamianaroot culture induced by plant hormones

Identification of K channel inhibitors that mediate stomatal opening andtheir structure-activity relationships○Naphatsamon Uthailak1,2, Takao Ohashi1, Ryo Misaki1, Kazuhito Fujiyama1(1ICBiotech, Osaka Univ., 2Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
Human glucocerebrosidase, Nicotiana benthamiana, Root culture,
Plant-made pharmaceuticals○Kyota Suzuki1, Kosuke Endo1, Tomoki Shimada1, Mieko Arisawa2,
Kanako Kumada2, Kaori Itto3, Saori Tanii2, Miu Furuta2, Nobuhisa Isaka4,
Toshio Yamaguchi5, Shin Hamamoto1, Yasuhiro Ishimaru1, Nobuyuki Uozumi1(1Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 2Grad. Sch. Pharm., Tohoku Univ., 3Grad. Sch.
Life Sci., Tohoku Univ., 4Fac. Appl. Life Sci., Niigata Univ. Pharm. Appl. Life Sci.,
5
Fac. Pharm., Niigata Univ. Pharm.)
Key words
transporter, inhibitor, Arabidopsis thaliana

119

1Ep16

交流電場印加による植物種子の発芽および初期成長促
進効果

1Fp02

○小山 純弘, 田村 泰之, 石川 元, 石川 陽一（エイブル）
koyama@able-biott.co.jp

酵素架橋反応を介したタンパク質装飾リポソームの調製とその特性評価○駒田 拓也 1, Razi Muhamad Alif 1, 高原 茉莉 2, 若林 里衣 1,
後藤 雅宏 1,3, 神谷 典穂 1,3（1九大院・工, 2北九州高専, 3九大・未来化セ）kamiya.noriho.367@m.kyushu-u.ac.jp【目的】植物種子の発芽と初期生育を促進向上させることは、農作物を生産する上で極めて重要である。本研究では、誘電損失（発熱）がほとんどない 1~300
MHz の交流電場に着目し、ルッコラ種子、小松菜種子、えんどう豆への交流電場印加による発芽および初期成長への影響について調査した。
【方法】1%寒天シャーレに植物の種子 50 粒を置床し、種子の 2/3 までの高さに蒸留水を加えた。えんどう豆の場合は 1%寒天シャーレに 30 粒を置床し、種子の半分までの高さに蒸留水を加えた。上下の平板電極で発生させた交流電場の間にシャーレを保持しながら種子の発芽を調べた。シャーレの水を補給しながら、温度 25℃、えんどう豆は 20℃のインキュベーターの暗所で実験した。3 種類の植物種子をそれぞれ 3 回反復実験し、発芽率を調べた。幼根の長さが 2 mm
以上に伸長した種子を発芽したものとし、48 時間までの発芽数から発芽率をそれぞれ算出した。また、交流電場印加開始から 3 日後に、交流電場印加サンプ
ルと対照区（Control）から茎長の長い各種植物を 10 本ずつサンプリングし、茎長を測定した。
【結果と考察】ルッコラ種子を 1 Vpp/cm (peak to peak voltage/cm), 10 MHz から
100 MHz の交流電場で処理すると統計的に有意な発芽率の増加が確認され、高周波数側で発芽率促進効果が強くなる傾向を見出した。1 Vpp/cm, 100 MHz の交流電場を 10 時間、ルッコラ種子、小松菜種子、えんどう豆に印加することにより、顕著な発芽促進効果があった。また、各種植物種子に対して、1 Vpp/cm,
100 MHz の交流電場を 10 時間印加すると、3 日後には茎長が Control の 1.4 倍に伸長することを見出した。

【背景と目的】リン脂質の自己集合より形成されるリポソームは、薬剤封入や脂質膜の装飾が可能なキャリアとして薬物送達（DDS）分野において汎用されている。本研究では、リポソームをタンパク質で装飾する手法として、脂質修飾
タンパク質の利用に着目した。微生物由来トランスグルタミナーゼ(MTG)が触媒するグルタミン(Q)とリジン(K)残基の側鎖間架橋反応を利用した脂質修飾法
により、緑色蛍光タンパク質(EGFP)の C 末端に MTG 認識基質 Q ペプチド配列を付加した組換え EGFP (EGFP-Q) と、反応性 K を有する脂質ペプチド(lipid-K)から脂質修飾 EGFP (EGFP-lipid) を調製した。その後、リポソームへの提示と培養細胞との相互作用を検討した。
【方法】EGFP-Q、lipid-K 及び MTG を補助界面活性剤共存下で混合、インキュベートした。高速液体クロマトグラフィー (HPLC) による精製と共に修飾率を算出した EGFP-lipid を、表面電荷の異なる市販リポソーム製剤と混合し、動的光散乱法により粒径変化を評価した。また、EGFP 装飾リポソームを細胞培養
上清に添加し、蛍光顕微鏡を用いてリポソーム共存下における脂質修飾タンパ
ク質と細胞との相互作用を評価した。
【結果と考察】HPLC による分析から高反応率で脂質修飾タンパク質の調製が可能なこと、リポソームの蛍光観察から EGFP 由来の蛍光が球状に局在していることが確認された。また、負あるいは中性に荷電したリポソームに比べ、正電
荷リポソームとの組み合わせにおいて EGFP 由来の蛍光の細胞への顕著な移行が確認され、細胞膜との静電相互作用に基づきタンパク質の取り込みを促進可
能なタンパク質装飾リポソームとしての可能性が示唆された。

Acceleration of germination and early growth of plant seeds by alternating
electric field applications

Enzymatic preparation and characterization of protein-decorated liposomes○Sumihiro Koyama, Yasuyuki Tamura, Gen Ishikawa, Yoichi Ishikawa(ABLE)○Takuya Komada1, Muhamad Alif Razi1, Mari Takahara2, Rie Wakabayashi1,
Masahiro Goto1,3, Noriho Kamiya1,3(1Fac. Eng., Kyushu Univ., 2Kitakyushu Natl. Coll. Technol., 3CFC, Kyushu Univ.)

Key words

Seed germination, Early growth, Alternating electric field

Key words
cross-linking

drug delivery system, lipid-protein conjugate, liposome, enzymatic

1Fp01

新規活性型トランスグルタミナーゼ前駆体の触媒特性の
評価

1Fp03

低温菌 Pseudoalteromonas nigrifaciens Sq02 を用いた外来タンパク質低温分泌生産システムの構築と分泌機構の解明○有吉 龍太郎 1, 佐藤 崚 1, 南畑 孝介 2, 後藤 雅宏 1, 神谷 典穂 1,3（1九大院・工, 2KAICO, 3九大・未来化セ）kamiya.noriho.367@m.kyushu-u.ac.jp○河合 総一郎, Puti Wanguyun Aken, 川本 純, 小川 拓哉,
栗原 達夫（京大・化研）kurihara@mbc.kuicr.kyoto-u.ac.jp

微生物由来トランスグルタミナーゼ (Microbial Transglutaminase, MTG) は、タン
パク質中の Gln 残基と Lys 残基の側鎖間架橋を触媒し、タンパク質同士を連結させる酵素として食品分野で広く活用されてきた産業用酵素である。近年では多様なバイオコンジュゲートの調製のための酵素として、例えば Antibody Drug
Conjugates (ADCs) の調製における有用性が報告されている。MTG はプロペプ
チドが付加した前駆体として発現した後、限定分解を経て成熟型酵素となる。
プロペプチドは分子シャペロンとして機能し、プロペプチドが欠損した活性型
MTG の可溶性発現は極めて困難であることから、微生物を宿主とした異種タン
パク質発現系において必須の部分構造となる。一方、我々は、活性型 MTG の取得に際して、プロペプチド部位に変異を導入するという新たな観点で、限定分解を必要としない活性型 MTG 前駆体の取得に成功した。そこで本研究では、
新規活性型 MTG 前駆体の基質特異性と活性の相関を評価した。
MTG 前駆体立体構造の解析情報に基づき、活性部位と強く相互作用している
Tyr 残基 (Y12) を選択した。さらに基礎検討の過程において、MTG によって認識されることが明らかとなった Lys 残基 (K10) を選択し、それを Arg 残基に置換した K10R/Y12X MTG 二重変異体を作製した。Gln 基質である Z-QG と 1 級
アミン基質である Cadaverine および反応追跡のための NADH、GLDH、α-KGを含む溶液を調製し、NADH 由来吸光度の経時的測定から、Y12 の飽和変異体の MTG の触媒特性を評価した。その結果、アミノ酸の種類による初期活性の違い、活性と発現量の間のトレードオフの関係が明らかとなり、特に疎水性相互作用の解消と柔軟性の向上が触媒活性に影響を与えることが示唆された。現在は、異なる構造のアミン基質を用いて特異性の違いについて検討中であり、その結果についても報告する。

[目的]低温菌を宿主としたタンパク質低温生産系は、目的タンパク質の熱変性を緩和すると同時に、活性を抑制することで、宿主細胞への毒性を軽減することが期待される。本研究では、ハマチ (Seriola quinqueradiata) の腸管由来の低温性グラム陰性細菌を宿主としたタンパク質分泌生産システムの開発とその機構解明に取り組んだ。
[方法]ハマチの腸管から 4 ℃での生育速度と分泌タンパク質生産能に秀でた低温菌を単離し、16S rRNA 解析と average nucleotide identity 解析により同定した。
培養上清に多量に分泌される機能未知タンパク質 P320 の分泌能を利用するため、発現用ベクターである、pJRD-Cm に P320 をコードする遺伝子とその C 末
端側に好冷菌 Desulfotalea psychrophila DSM12343 由来の温度感受性の高いタン
パク質 PepF、LAP、PepQ、BglA をコードする遺伝子を組み込んだ。このプラ
スミドを本菌へ導入し、融合タンパク質の発現を確認した。さらに、P320 の分
泌機構を解明するために、遺伝子破壊株作製用ベクター pK18mobsacB-Em を利用することで P320 遺伝子とその周辺遺伝子の破壊株の作製を行った。
[結果と考察]単離した菌体は Pseudoalteromonas nigrifaciens と同定され、P.
nigrifaciens Sq02 と命名された。本菌は、終濃度 3%の塩化ナトリウムを含む LB培地で 18 ℃から 4 ℃で良好に生育し、培養上清に機能未知の分泌タンパク質
P320 を分泌することが見出された。この P320 の分泌能を利用した融合タンパ
ク質分泌発現系において各融合タンパク質が培養液上清から検出された。また、
P320 遺伝子の周辺遺伝子群がコードする II 型分泌装置(T2SS)のホモログである
P309、P310、P311、P315、および P319 について、それらの遺伝子を破壊することで P320 の上清への分泌量が顕著に減少することが見出された。

Evaluation of catalytic properties of novel active zymogen oftransglutaminase

Secretory production of recombinant proteins at low temperatures by usinga psychrotrophic bacterium, Pseudoalteromonas nigrifaciens Sq02, andelucidation of the secretion mechanism○Ryutaro Ariyoshi1, Ryo Sato1, Kosuke Minamihata2, Masahiro Goto1,
Noriho Kamiya1,3(1Fac. Eng., Kyushu Univ., 2KAICO Ltd., 3CFC, Kyushu Univ.)

Key words

cross-linking, propeptide, substrate specificity, zymogen○Kawai Soichiro, Puti Wanguyun Aken, Kawamoto Jun, Ogawa Takuya,
Kurihara Tatsuo(Inst. Chem. Res., Kyoto Univ.)

Key words
cold-adapted microorganism, protein expression, secreted protein,secretory production

120

1Fp04

麹菌由来 hydrophobin RolA- Cutinase CutL1 間の相互作用における CutL1 側の新たな相互作用部位の探索

1Fp06○金 允卿 1, 寺内 裕貴 1, 田中 拓未 1, 吉見 啓 2, 阿部 敬悦 1,2（1東北大院・農, 2東北大・未来研）
kabe@biochem.tohoku.ac.jp

出芽酵母のピルビン酸キナーゼに含まれる G-body 局在化シグナル配列の探索○内海 亮太郎 1, 吉村 柚紀 1, 大谷 優太 2, 三浦 夏子 1, 植田 充美 2,
片岡 道彦 1（1阪府大院・生環科, 2京大院・農）miura.natsuko@biochem.osakafu-u.ac.jp

Aspergillus oryzae は, 生分解性プラスチック polybutylene succinate-co-adipate(PBSA)を唯一の炭素源として培養すると hydrophobin RolA と PBSA 分解酵素である cutinase CutL1 を共発現する。hydrophobin は糸状菌特有の両親媒性タンパ
ク質で，PBSA に吸着した RolA は CutL1 と相互作用し PBSA 表面に CutL1 を濃縮することで PBSA の分解を促進する。これまでの研究によって，RolA と
CutL1 の相互作用にはイオン的相互作用が関与し, RolA 側の正電荷残基(H32,
K34, K41, K46, K51)と CutL1 側の負電荷残基(D30, E31, D73, D142, D171)が協奏的に作用することを明らかにした。しかし, 分子間相互作用解析装置 QCM(Quartz Crystal Microbalance)を用いた解析において, CutL1 側には既知の残基以外にも相互作用に寄与する残基が存在する可能性が示唆された。
本報告では，RolA との相互作用に寄与する新たな CutL1 側の残基を探索し, 相互作用機構をより詳細に解明することを目的とした。まず, CutL1 の立体構造モ
デルと CutL1 ホモログ間のアラインメント解析から相互作用に寄与すると推測される候補部位を選抜した。立体構造モデルから D117 を, ホモログ間のアラインメント解析から E109, D145, D203 を選択し, これらの残基をセリン残基に置換した点変異体を作製した。各 CutL1 変異体を麹菌発現系を用いて生産・精製
し, QCM による RolA との親和性解析を行った。
その結果, RolA との相互作用の Kd 値は, D117S, D145S では野生株と大差なく,
E109S, D203S では野生株に対して有意に大きな値を示した。このことから, E109,
D203 は RolA との相互作用に寄与する新たな残基であることが示唆された。

【背景と目的】酵母は低酸素下において、解糖系酵素などがつくるタンパク質集合体である G-body を形成して代謝調節を行う(1)。G-body を形成する代謝酵素
は 20 以上存在するが、G-body の形成機構は不明である。本研究では、低酸素下での代謝に必須な役割を果たす解糖系酵素が G-body 形成に特に重要であると仮定し、解糖系 最終産物 のピルビン酸を合成するピルビン 酸キナーゼ（Cdc19p）の集合体形成に寄与するアミノ酸配列の解明を目的とした。【方法】
我々は以前の研究で、G-body 構成酵素の一つであるエノラーゼ（Eno2p）のア
ミノ酸配列断片化により G-body 局在化シグナル配列を見出した(1)。そこで、
Cdc19p についても同様にアミノ酸配列を断片化し、Cdc19p に含まれるアミノ酸配列のうち G-body 形成に関与するものを探索した。まず二次構造等を考慮
し、Cdc19p の断片化部位を設計した。設計した各 CDC19 断片のヌクレオチド
配列を高コピーのベクタープラスミドに組み込み、酵母に導入して、G-body 様の局在変化を示す CDC19 断片を探索した。CDC19 断片の局在変化は、各 CDC19
断片と融合発現した GFP を蛍光顕微鏡で観察し、顕微鏡の視野内に捉えた 50〜400 細胞のうち、局在変化を示した細胞の割合を数値化して確認した。次に、得られた CDC19 断片配列をさらに 30〜40 アミノ酸まで絞り込んだ。最後に、得られた CDC19 断片が G-body と同様の局在を示すかを調べるために、G-body
形成タンパク質と CDC19 断片にそれぞれ融合させた蛍光タンパク質の共局在を検証した。
【結果と考察】本研究により、新たに G-body 様の局在変化を示す
4 つのアミノ酸配列を得た。以前に得られた Eno2p に含まれるアミノ酸配列との比較により、G-body 形成に寄与するアミノ酸配列の性質について検討したので、まとめて発表する。(1)Miura et al. 2013 Eukaryot. Cell.

Analysis of cutinase CutL1 amino acid residues involving in the interaction
between Aspergillus oryzae hydrophobin RolA and CutL1

Investigation of signal sequences responsible for G-body formation by
pyruvate kinase in Saccharomyces cerevisiae○Yoonkyung Kim1, Yuki Terauchi1, Takumi Tanaka1, Akira Yoshimi2,
Keietsu Abe1,2(1Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ., 2NICHe, Tohoku Univ.)○Ryotaro Utsumi1, Yuki Yoshimura1, Yuta Ohtani2, Natsuko Miura1,
Mitsuyoshi Ueda2, Michihiko Kataoka1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ., 2Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)

Key words

Aspergillus oryzae, hydrophobin, cutinase, RolA

Key words

G-body, hypoxia, subcellular localization, signal sequence

1Fp05

麹菌界面活性蛋白質ハイドロフォビン RolA の自己組織化機構の解析

1Fp07

超好熱古細菌由来耐熱性セルラーゼの糸状菌での発現および更なる耐熱化○寺内 裕貴 1, 田中 拓未 1, 三ツ石 方也 2, 藪 浩 2, 吉見 啓 3,
阿部 敬悦 1,3
（1東北大院・農, 2東北大・多元研, 3東北大・未来研）
kabe@niche.tohoku.ac.jp○仙波 弘雅 1, 山田 浩之 1, 坪井 宏和 1, 幸田 明生 1, 石川 一彦 2,
坊垣 隆之 1
（1大関総研, 2産総研・バイオメディカル）
hironori.senba@ozeki.co.jp

糸状菌が特異的に分泌する低分子界面活性蛋白質ハイドロフォビンは、保存された８個のシステイン残基からなる４つの S-S 結合を有し (システインループ)、
固体表面に吸着して β-アミロイド様の棒状自己組織化構造 rodlet を形成する。
麹菌 Aspergillus oryzae ハイドロフォビン RolA は生分解性ポリエステル PBSAに吸着し、その後 PBSA 分解活性を持つ酵素クチナーゼ CutL1 と相互作用してCutL1 を PBSA 表面に濃縮することで PBSA 分解を促進する。ハイドロフォビ
ンが固体表面吸着後に形成する自己組織化構造や生物学的機能については研究されてきているが、自己組織化の分子機構に関する研究はシステインループ中のアミノ酸配列の関与が示唆されている他は不明である。また、我々は RolAと CutL1 の相互作用が主にイオン的相互作用に依存することを明らかにしたが、一方で、CutL1 が固体表面上の RolA 自己組織化膜を通り抜けて下層の固体基質に到達する分子機構は未だ不明である。
本報告では、RolA-CutL1 間相互作用の分子機構の可視化を目指すため、まず、界面化学的手法を用いて RolA の自己組織化の過程を可視化・解析することを目的とした。最初に、RolA の自己組織化単層膜（Langmuir 膜；L 膜）を様々なpH 条件で作製し、RolA の自己組織化構造形成過程を解析した。次に、相転移前後の RolA L 膜を、UV-O3 洗浄で親水化した Si 基板またはシランカップリン
グ剤で疎水化した Si 基板に転写して、原子間力顕微鏡で RolA 自己組織化 L 膜を観察した。その結果、RolA は 2 段階の相転移を経て緻密な自己組織化膜を形成すること、自己組織化構造の形成は pH に影響を受けることが明らかになった。

【背景及び目的】
耐熱性の高いセルラーゼはバイオマスの高温下での糖化やナノセルロースの製造など過酷な条件での使用が可能であり、産業的に幅広い応用が期待される。
しかし、現在市販されている耐熱性セルラーゼは少なく、また 90℃以上の高温で長時間活性を維持するものは市販されていない。そこで我々は超好熱古細菌
Pyrococcus horikoshii 及び P. furiosus 由来エンドグルカナーゼに着目し、これらの酵素の糸状菌での大量発現と、90℃以上の高温に長時間耐え得る、さらなる耐熱化を目的として研究を行った。

Analysis of self-assembly mechanism of Aspergillus oryzae surfactant
protein hydrophobin RolA

Heterologous expression of thermophilic cellulase from hyperthermophilicarchaea in filamentous fungi and its further thermophilization.

○Yuki Terauchi1, Takumi Tanaka1, Masaya Mitsuishi2, Hiroshi Yabu2,
Akira Yoshimi3, Keietsu Abe1,3(1Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ., 2IMRAM, Tohoku Univ., 3NICHe, Tohoku
Univ.)

Key words
monolayer

Aspergillus oryzae, hydrophobin, Atomic force microscopy, Langmuir【方法及び結果】
P. horikoshii 由来エンドグルカナーゼ（EGPh）遺伝子および耐熱性の向上を目
的 に 一 箇 所 の ア ミ ノ 酸 点 変 異 を 加 え た 7 系 統 の 変 異 型 EGPh 遺 伝 子（EGPh_M1~M7）を糸状菌用発現ベクターに導入し、Aspergillus niger にて発現させた。発現した酵素について 98℃、30 分間加熱後の残存セルラーゼ活性を測定し、熱安定性を比較した結果、3 箇所の点変異において熱安定性の有意な向上が見られた。熱安定性の向上した EGPh は 90℃、1 時間加熱後も活性の低下が見られなかった。
また、P. furiosus 由来エンドグルカナーゼ遺伝子（EGPf）を同様に A. niger で異種発現させた結果、発現した酵素には糖鎖付加が確認された。そこで、大腸菌にて糖鎖付加されていない同酵素を発現させ、100℃、1 時間加熱後の残存セル
ラーゼ活性から熱安定性を比較した結果、A. niger 発現 EGPf の方が有意に熱安定性に優れ、糖鎖付加により耐熱性が向上したことが示唆された。

○Hironori Semba1, Hiroyuki Yamada1, Hirokazu Tsuboi1, Akio Koda1,
Kazuhiko Ishikawa2, Takayuki Bogaki1(1Gen. Res. Lab., Ozeki Corp., 2Biomed. Res. Inst., AIST)

Key words

cellulase, thermostable enzyme, biomass, protein engineering

121

1Fp08

生産性を劇的に向上させる蛋白質人工設計 〜難生産性
L-アミノ酸酸化酵素の改良と、D-アミノ酸動的光学分割法への展開〜

1Fp10○南野 優季, 中野 祥吾, 伊藤 創平（静県大院・薬食生命）
itosohei@u-shizuoka-ken.ac.jp

BRET を利用したホタルルシフェラーゼの発光色変換○金丸 愛望, 鶴田 篤弘, 有馬 一成, 伊東 祐二, 加藤 太一郎（鹿児島大院 理工 生化）
k0035454@kadai.jp【背景・目的】 海洋性細菌である Pseudoalteromonas 属において、L-アルギン酸化酵素のパラログと考えられる L-アミノ酸酸化酵素様遺伝子を発見した。しかし異種発現が困難な遺伝子であったので、人工 L-アルギニン酸化酵素 1) の設計で用いた蛋白質設計法をこの L-アミノ酸酸化酵素様遺伝子に適用し異種発現を試みた。結果、既知の L-アミノ酸酸化酵素 (LAAO) と 20 種類のアミノ酸に対する反応性が類似していた。LAAO は L 体のアミノ酸をケト酸や D 体のアミノ酸変換する酵素であり、ラセミ化合物の光学分割への応用が長年検討されてきた。しかし大量調整可能な LAAO が存在しないためベンチスケールの段階で頓挫している。本発表では世界で初めて大量調整に成功した ArtLAAO (人工設計
LAAO) 2) による、アミノ酸誘導体の動的光学分割を中心に紹介する。
【結果・考察】 独自の in silico 選抜法 1,3) で選抜したライブラリーより設計した
ArtLAAO は、最も相同な Pseudoalteromonas citrea 由来 L-アミノ酸酸化酵素様遺伝子と比較し、655 残基中 96 点変異が入っていた。大腸菌を宿主とした異種発現において、Aplysia californica 由来 LAAO の 150 倍である 30 mg/L の高収量を示し、LAAO が難生産性であるという常識を覆す結果となった。また、複数の L-アミノ酸に対して反応性を示し、kcat 値は 6.4−33.0 と高値であった。そこで、ファインケミカル生合成への足掛かりとして、ラセミ体アミノ酸誘導体、
特に DL-Phe 誘導体、DL-Trp 誘導体の動的光学分割も検討した。結果、10 種類
以上の誘導体で光学純度 99％以上、収率 70％以上で D 体を得ることができた。
以上の結果より、AncLAAO はファインケミカル製造への応用が期待できる。
1) S. Nakano, et al., Appl. Environ. Microbiol., 2019、2) 特願 2019-62177、 3) S.
Nakano, et al., Biochemistry【研究目的】発光酵素は、蛍光タンパク質と融合することで発光エネルギーが蛍光タンパク質へと転移する「生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)」という現象が生じることがある。本現象は、これまで海洋産ルシフェラーゼについて知られていたが、ホタルルシフェラーゼを利用した BRET は報告されていなかった。今回我々は、ゲンジボタル由来ルシフェラーゼ(LUC-G)をある蛍光タンパ
ク質と融合させることによって、高効率な BRET が生じることを見出したので報告する。また本現象を生物発光センサーに利用できるかの検討も行った。
【研究材料と方法】ゲンジボタル由来のルシフェラーゼタンパク質と蛍光タンパ
ク質を、ペプチドリンカーを介して融合し、その発光スペクトルを測定することで BRET の存在を確認した。次にペプチドリンカーの長さと BRET 効率の関係を調査した。またペプチドリンカーにいくつかのプロテアーゼ切断認識配列を導入した融合タンパク質を作製し、これをプロテアーゼと反応させた際の変化を SDS-PAGE と発光スペクトルを測定することにより追跡した。
【結果と考察】LUC-G の N 末端に蛍光タンパク質を融合させた場合に、強い
BRET シグナルが観察された。また 2 つのタンパク質を繋ぐリンカーは 7 アミノ酸の場合が最も BRET 効率が高かった。プロテアーゼ切断配列を挿入した融合タンパク質では、プロテアーゼ処理によってタンパク質の分断が確認でき、切断度合いによって BRET 効率も変化することが分かった。また様々なプロテアーゼに対する切断選択性を比較することで、生物発光センサーへの可能性を見出すこともできた。

Breaking the mirror: a highly productive and active artificial L-amino acidoxidase, a novel stereoselective biocatalyst

BRET induced bioluminescent color change of firefly luciferase

Key words
L-amino acids oxidase, dynamic kinetic resolution, Sequence based
protein design, Ancestral reconstruction

Key words

firefly luciferase, fluorescent protein, BRET, peptidase

1Fp11

細胞内発光を利用したハイスループットスクリーニングにより得られた高活性変異体アシル ACP 還元酵素の評価○Yuki Minamino, Shogo Nakano, Sohei Ito(Grad. Sch. Integr. Pharm. Nutr. Sci., Univ. Shizuoka)

1Fp09

離散的モチーフ様配列による酵素のインシリコ機能的分類法の開発と検証○平松 希望, 本山 智晴, 中野 祥吾, 伊藤 創平（静県大院・薬食生命）
itosohei@u-shizuoka-ken.ac.jp○Narumi Kanemaru, Atsuhiro Tsuruta, Kazunari Arima, Yuji Itou, Dai-ichiro Kato
(Grad. Sch. Sci. Eng., Kagoshima Univ.)○林 勇樹 1, 新井 宗仁 1,2（1東大院・総合文化, 2東大院・理）
arai@bio.c.u-tokyo.ac.jp【背景】40%程度の相同性があれば、蛋白質の構造と機能は保存されるとされている。しかし、産業利用上重要な、生産性、安定性、反応の至適温度、活性化
エネルギーといった機能は保存されていない。我々は、配列の保存性の相関を網羅的に解析し、離散的モチーフ様配列を定義している。このモチーフ様配列で選抜し設計することで、人工設計蛋白質は高機能化する 1,2)。そこで、このモチーフ様配列が、蛋白質の多様な機能と相関があると仮説を立てた。解析ライ
ブラリーのモデルとして L-スレオニン脱水素酵素 (TDH) と相同な 2284 配列を用い、検証した。
【方法】Cupriavidus necator 由来の TDH (CnTDH) と相同な 5000 配列を Blast により取得し、配列の重複、ギャップを持つ配列等を削除し、2284 配列を解析対象とした。この配列を機械学習法で解析、離散的モチーフ様配列を定義した。
143V/174L/188Y/214M を有する 403 配列を選抜、完全コンセンサス設計法でFcTDH-VLYM を設計した。同様に、143M/174L/188Y/214M、143M/174I/188Y/
214M、143I/174L/188Y/214M、143I/174I/188Y/214M を有する配列を選抜、それぞれで完全コンセンサス TDH を設計、機能解析を行った。
【結果・考察】FcTDH-MLYM 以外の 4 つの酵素は可溶性画分にて発現、いずれも TDH であった。更に FcTDH-IIYM では、L-Thr に対する Km 値が CnTDH と比較して約 30 倍低く、L-Thr のアナログである (R) -3-ヒドロキシ酪酸への反応性を有していた。FcTDH-VLYM の T1/2 値は CnTDH より約 20℃上昇し、耐熱性に優れていた。FcTDH-VLYM の NAD ＋への Km 値は CnTDH の 1/15 であった。
また、FcTDH-MIYM は反応の活性化エネルギーが 38 kJ/mol と最も低く、低温適応型の酵素であった。以上より、離散的モチーフ様配列は酵素の”多様な機能”と相関している事を確認した。
1) S. Nakano, Appl. Env, Microbio. 2019、2) S. Nakano, Biochemistry, 20182010 年に藻類でアルカン合成に関わる２つの酵素、アシル ACP 還元酵素
（AAR）とアルデヒド脱ホルミル化オキシゲナーゼ（ADO）が同定された。このため、遺伝子組み換え微生物を用いて、バイオエネルギーの１つであるアルカン（軽油相当）の生成が可能となった。しかし、AAR の酵素活性は非常に低いため、微生物によるアルカン生産を実用化するためには、AAR 高活性化が必要不可欠である。タンパク質を高活性化する方法の１つとして進化分子工学的手法があげられる。多数の変異体を作成し、各変異体の活性を迅速に評価する。
この変異と選択を繰り返すことで、タンパク質を高活性化する手法である。しかし、これまで AAR の活性を調べるには、菌体培養液の破砕、有機溶媒による抽出、ガスクロマトグラフィー質量分析計（GC-MS）による定量という多段階プロセスが要していた。しかし、発表者は、大腸菌内で発現した AAR の活性（菌体内アルデヒド生成量）に応じて発光する大腸菌を開発した。本手法を用いる事で、変異体 AAR を発現する大腸菌のコロニー、あるいは大腸菌培養液の発光を外部からモニターするだけで変異体 AAR の活性をハイスループッ
トで評価できるようになった。そこで本評価法を用いた進化分子工学的手法により、2000 種を超える変異体 AAR ライブラリから、コロニーアッセイにより約 400 種にしぼりこみ、液体培養により 68 種の高活性変異体 AAR を取得し、その塩基配列を解析した。その結果、38 種の新規変異体 AAR の塩基配列が明らかとなった。これらの高活性変異体を用いて大腸菌でアルカン生成を行い、得られた活性について報告する。

In silico enzyme classification and consensus protein design using dispersed
motif-like sequences.

Evaluation of highly active acyl-(ACP) reductase selected by in vivo
luminescence-based high-throughput screening

Key words
in silico protein sequence analysis, in silico classification/screening,
dispersed motif-like sequence, consensus protein design

Key words
Acyl-(ACP) reductase, Alkane biosynthesis, Directed evolution,
Bioluminescence○Nozomi Hiramatsu, Tomoharu Motoyama, Shogo Nakano, Sohei Ito(Grad. Sch. Integr. Pharm. Nutr. Sci., Univ. Shizuoka)○Yuuki Hayashi1, Munehito Arai1,2(1Grad. Sch. Arts Sci., Univ. Tokyo, 2Grad. Sch. Sci., Univ. Tokyo)

122

1Fp12

好熱菌酵素の低温高活性化の実例と進化情報を用いた
低温高活性化法の提案

1Fp14○赤沼 哲史（早大・人間科学）
akanuma@waseda.jp

ニホンカブトムシ Trypoxylus dichotomus 上翅のプロテ
オーム解析○村田 智志 1, Rivera Jesus 2, Kisailus David 2, 新垣 篤史 1（1農工大院・工, 2Dept. Chem. Environ. Eng., Univ. California atRiverside, U.S.A.）
arakakia@cc.tuat.ac.jp

優れた耐熱性を持つ好熱菌酵素は高い潜在的工業用途を有するが、一方で、高温に比べて常温では著しく活性が低下するという欠点を持つ場合も多い。我々は、これまでの長年の研究で、進化分子工学手法により多くの好熱菌由来イソ
プロピルリンゴ酸脱水素酵素（以下 IPMDH）の低温高活性化変異体を獲得した。しかし、どの変異体の 25℃の比活性も、常温生物が持つ IPMDH と比べると小さく、複数のアミノ酸置換を導入しても、低温活性の更なる改善は見られなかった。本研究では、好熱菌 IPMDH に常温菌型のアミノ酸をアミノ酸置換によって導入した 29 変異体を作製し、解析した。その結果、約半分の変異体の25℃の比活性が向上した。さらに、アミノ酸置換の組み合わせを検討したところ、３アミノ酸置換によって、25℃の比活性が好熱菌野生型 IPMDH の 14 倍に向上した変異体が得られた。反応速度論解析および熱力学解析から、変異体は常温菌 IPMDH と類似した触媒特性を示した。一方、変異体の変性温度は好熱
菌野生型酵素からわずかに２℃低下しただけであった。さらに、IPMDH の進化
系統解析をおこない、祖先型 IPMDH のアミノ酸配列を推定した。系統樹の最も古い分岐点のアミノ酸配列（共通祖先配列）と、本研究で用いた好熱菌 IPMDHのアミノ酸配列を比較したところ、共通祖先配列と好熱菌酵素の配列とでアミノ酸が一致し、常温菌酵素ではアミノ酸が異なる部位のアミノ酸を置換することによって、好熱菌 IPMDH の低温活性に２倍以上の向上が見られる確率が高かったことが明らかとなった。この結果は、今後の好熱菌酵素の低温高活性化のための理論化につながる可能性がある。

甲虫表皮は主にキチンと表皮タンパク質で構成されており、部位によって強度や特性が異なるなど幅広い機械的特性を持っている。体の外側に存在し、外敵から身を守り飛行時には翼として使用される上翅は、軽量かつ高い強度を持つことから、生体を模倣した新素材開発への応用が期待されており、その形成機構の解明が求められている。モデル甲虫であるコクヌストモドキの上翅を用いた先行研究において、数種類のキチン結合モチーフを持つ表皮タンパク質が同定され、機能解析がなされている。その中で、キチンナノ繊維のアッセンブリに関与するタンパク質や、キチン分解の阻害によって表皮形成過程に関わるタ
ンパク質の存在が明らかになっている。しかし、上翅に存在するタンパク質の全体像は明らかにされておらず、その詳細な形成機構は未だ解明されていない。
本研究では、個体が大きく扱いが容易なニホンカブトムシを用いて、上翅に存在するタンパク質を網羅的に解析することを目的とした。ニホンカブトムシ上翅は羽化直後から時間経過とともに硬化していく特性を持つ。そこで、各成熟段階の上翅からタンパク質を抽出し SDS-PAGE を行った。その結果、硬化に伴い、上翅中のタンパク質のプロファイルが変化することが明らかとなった。次に、羽化直後の未成熟上翅と羽化後 8 日以上経過した成熟上翅に存在する表皮タンパク質を抽出し、質量分析計を用いて同定した。未成熟上翅・成熟上翅それぞれから特異的な表皮タンパク質が同定され、キチン結合モチーフを持つ表皮タンパク質が複数確認された。本研究では、これらの表皮タンパク質の上翅硬化過程における機能及び局在についての考察を行った。

Improvement of the low-temperature activity of a thermophilic enzyme andproposal of a new strategy for low-temperature activation using
evolutionary information

Proteome analysis of elytra from Japanese rhinoceros beetle, Trypoxylus
dichotomus○Satoshi Akanuma(Dept. Hum. Sci., Waseda Univ.)○Satoshi Murata1, Jesus Rivera2, David Kisailus2, Atsushi Arakaki1(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Dept. Chem. Environ. Eng., Univ.
California at Riverside, U.S.A.)

Key words

thermostable enzyme, mutagenesis, kinetics, thermostability

Key words

beetle, proteomics, cuticular proteins, chitin

1Fp13

AFM を用いた高付着性細菌及びその細胞表層タンパク
質の接着力測定

1Fp15

VHH 抗体提示型分子認識素子を用いた AuNP のワンステップ機能化○石井 慧, 吉本 将悟, 堀 克敏
（名大院・工）khori@chembio.nagoya-u.ac.jp○池田 湧, 石田 尚之, 今村 維克, 今中 洋行（岡山大院・自科）
imanaka@okayama-u.ac.jp

多くの細菌は固体表面に付着し、細胞と細胞外マトリクスから構成されるバイオフィルムを形成する。バイオフィルムの形成は、排水処理技術に利用される
一方で医療器具の汚染や分離膜のバイオファウリングの原因となるなど、様々な分野で重要な現象である。バイオフィルム形成は主に細胞外多糖の分泌によって促進されるが、表面への最初のアプローチである初期付着は細菌表層に提示されたアドヘシンと総称されるタンパク質によって起こる。初期付着はアドへ
シンによる表面接着と細胞のブラウン運動による表面からの脱離が競合する可
逆的な付着過程であるとされる。初期付着はバイオフィルム形成全体を左右する重要な過程であるが、どのようなパラメータが初期付着を支配するかは十分に明らかになっていない。
Acinetobacter 属細菌 Tol 5 株は表層のファイバー状アドヘシン AtaA を介し、卓越した初期付着能を示すことが報告されている。細胞外マトリクスの分泌を抑制した休止状態において、様々な表面に対してわずか数秒のうちに付着を達成することができる。これは、本来可逆的であるとされる初期付着過程を不可逆にするほど、AtaA が Tol 5 細胞に強力な接着力を与えていることを示唆している。しかしながら、Tol 5 及び AtaA の接着力の強さは定量可能な物理量で調べられていない。本研究では、高い初期付着能を示す Tol 5 及び AtaA の接着力を
原子間力顕微鏡（AFM）を用いて定量的に測定した。
共有結合によってガラス表面に固定化した Tol 5 の細胞表面上を様々なプロー
ブを用いて走査したところ、Tol 5 は、同じグラム陰性細菌である大腸菌や、接着性が報告されている Bartonella henselae と比較してはるかに高い細胞接着力を示した。さらに AtaA 単分子の接着力を調べたところ、既報の細菌アドヘシンよりも倍以上高い接着力を示した。

【目的】
金ナノ粒子（AuNP）は LSPR（局在表面プラズモン共鳴）という特徴的な光学特性を有しており，サイズや溶媒中における分散・凝集の有無によってそれぞ
れ異なる色調を呈する．この性質を生かし，AuNP は体外診断薬や細胞内プローブなどバイオ，医学分野で幅広く利用されている．本研究では，AuNP の分散
安定性を維持しつつ表面を生体分子で機能的に修飾する簡便な手法の開発を目的とし，固定化対象の分子認識素子の足場として超好熱菌由来の三量体タンパ
ク質 CutA1，リガンド分子としてラクダ科動物由来の単ドメイン抗体である
VHH 抗体 (VHHegfp)，そして独自に取得した金表面親和性ペプチドタグ (Au10tag) を用い，分子デザインの可能性ならびに機能評価を行った．
【方法・結果】
まず，VHH 抗体を CutA1 に挿入する際のスペーサー長が発現に及ぼす影響を調べ，十分に可溶化が可能なスペーサー長を見出した．また，異なる様式の分子として VHHegfp を CutA1 に連結した素子の調製も進めた．続いて，CutA1を足場としてデザインした各種 VHHegfp 提示型分子認識素子と AuNP 表面のブ
ロッキング剤を兼ねた VHH 抗体非挿入の Au10-tag 連結 CutA1 を所定のモル濃度比で混合し，AuNP 表面へリガンドタンパク質を固定化した．各種 VHHegfp
で修飾した AuNP の懸濁液に標的分子である緑色蛍光タンパク質 EGFP を添加
し，蛍光強度の差異を指標に相互作用および機能的固定化の評価を行った結果，足場として CutA1 を用い，VHH 抗体を挿入あるいは連結することにより，低い固定化密度の場合においても相互作用量の顕著な増加がみられた．したがって Au10-tag と CutA1 を用いることで VHH 抗体の金ナノ粒子表面への機能的ワ
ンステップ修飾が可能であることが示された．

The adhesion force measurement of sticky bacteria and their cell surface
proteins using atomic force microscopy

Functionalization of AuNPs by one-step immobilization of VHH-displaying
designer molecular recognition elements○Satoshi Ishii, Shogo Yoshimoto, Katsutoshi Hori
(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

Key words

adhesion, autotransporter, atomic force microscopy, bacterial adhesion○Yu Ikeda, Naoyuki Ishida, Koreyoshi Imamura, Hiroyuki Imanaka(Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Okayama Univ.)

Key words

VHH, scaffold, molecular recognition, AuNP

123

1Fp16

Methodical investigations for the efficient purification ofrecombinant proteins from silkworm compounds

1Gp04○Robert Minkner1, Jian Xu2, Holger Zagst3, Imke Oltmann-Norden3,
Hermann Wätzig3, Tatsuya Kato1,2, Enoch Y. Park1,2(1Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci.
Technol., Shizuoka Univ., 3Inst. Medic. & Pharm. Chem., TU
Braunschweig, Germany)park.enoch@shizuoka.ac.jp

様々な分離源からのバクテリオシン生産菌の探索とその構造解析○善藤 威史, 山城 圭輔, 桑原 美空, 野見山 泰成, 大橋 千紘,
園元 謙二（九大院・農）zendo@agr.kyushu-u.ac.jp

We are using the silkworm Bombyx mori as a promising bioreactor for the productionof recombinant proteins, instead of the widely used Escherichia coli-based expression
system. The latter has relatively low production cost and is easily handled, yet posttranslational modifications are limited, but the silkworm can produce foreign proteins
with high expression level and post-translational modifications as well as insect cells
do. However, it is difficult to purify recombinant proteins expressed in silkworm
compared to cell culture systems. It is a challenge to purify expressed proteins from thesilkworm compartments such as haemolymph and fat body. Up to date there is no
systematically approach to purify recombinant proteins from the silkworm and mostly
purifications are done with an affinity tag or with sucrose gradient centrifugations.
Here, we purified mCherry from the haemolymph as a model recombinant protein
aiming for development of up scalable methods. To reduce the amount of impurities
before using chromatography, different kind of pre-treatments were investigated. The
key point is a heat precipitation step with followed chromatography steps. Afterinvestigation of several chromatography methods, we decided for hydrophobic
interaction, size exclusion and heparin affinity chromatography. The final purity andrecovery were comparable to those of Strep-tag affinity purification. For further
characterization the purified proteins were analysed using capillary electrophoresis.

【背景と目的】抗菌ペプチドであるバクテリオシンは、抗菌物質としての応用が期待され、とくに乳酸菌由来のものは安全性が高いと考えられる。その構造や性質は多様であり、種々のバクテリオシンを適材適所に用いることで、より高い効果が期待される。そこで、様々な分離源からバクテリオシン生産菌を探索し、バクテリオシンの構造決定を試みた。
【方法】野菜や花、土壌など約 30 種の試料を分離源とし、乳酸菌が生育しやすい条件で集積培養を行い、炭酸カルシウム含有 MRS 寒天培地上で乳酸菌様のコロニーを単離した。Spot-on-lawn 法などの抗菌活性試験によって分離株のバ
クテリオシン生産能およびその抗菌スペクトルを調べ、代表的な分離株を選抜し、16S rRNA 遺伝子配列によって菌種を同定した。特徴的な抗菌活性を示した
ものについては、逆相 HPLC 等で精製し、分子量およびアミノ酸配列を解析した。さらに必要に応じて、バクテリオシン遺伝子を解析し、その構造を推定した。
【結果と考察】様々な分離源から約 150 株の乳酸菌様分離株が得られ、20 株程
度にバクテリオシン様の抗菌活性が認められ、選抜した 8 株は乳酸菌である
Lactococcus 属や Enterococcus 属のほか、Staphylococcus epidermidis と同定された。Lactococcus 分離株のうち、3 株は nisin Z、lactococcin A、lacticin Q をそれぞれ生産し、1 株は garvieaecin Q、garvicin ML とともに新奇性の高いバクテリ
オシンを生産していた。Enterococcus の 3 株はバクテリオシンよりも大きな抗菌性タンパク質（クラス III バクテリオシン、バクテリオリシン）を生産していた。また、味噌から分離された S. epidermidis は nukacin ISK-1 を生産していた。

Methodical investigations for the efficient purification of recombinant
proteins from silkworm compounds

Screening and structural analysis of bacteriocins produced by new isolates
from various sources○Robert Minkner1, Jian Xu2, Holger Zagst3, Imke Oltmann-Norden3,
Hermann Wätzig3, Tatsuya Kato1,2, Enoch Y. Park1,2(1Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka
Univ., 3Inst. Medic. & Pharm. Chem., TU Braunschweig, Germany)○Takeshi Zendo, Keisuke Yamashiro, Miku Kuwahara, Taisei Nomiyama,
Chihiro Ohashi, Kenji Sonomoto(Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words

Chomatogrphy, haemolymph, purification, silkwom

Key words

bacteriocin, lactic acid bacteria, antibacterial peptide, bacteriolysin

1Gp03

放線菌スクリーニング用固／液界面培養法

1Gp05

オリゴエステル分泌生産における種々アルコール化合物の添加効果○椎名 一樹 1, 小田 忍 2（1金工大院・工, 2金工大・ゲノム研）
odas@neptune.kanazawa-it.ac.jp○水野 匠詞 1,3, 櫻井 徹生 1,3, 廣江 綾香 2,3, 田口 精一 2,
柘植 丈治 1,3
（1東工大・物質理工, 2東農大・生命科, 3JST・MIRAI）
tsuge.t.aa@m.titech.ac.jp【目的】現在、微生物が生産する生理活性物質として発見されている化合物の約3 分の 2 は、放線菌による生産物である。放線菌は、特に抗生物質生産菌として天然物創業において重要視されており、多くのスクリーニングが行われてきた。しかし、従来のスクリーニング法による新規な抗生物質の発見例は、縮小する傾向にある。筆者らは最近、新規な二次代謝物生産システムとして、固／液界面培養法（S/L-IFC）を構築した。S/L-IFC では、寒天平板上に形成させた菌マットの上に疎水性有機溶媒を重層することで、菌が生産する疎水性二次代
謝物を自動的に抽出することができる。そのため、従来の液体培養法とは異なる二次代謝物プロファイルを得ることができる。本研究では S/L-IFC による放線菌のスクリーニング法について、関連因子を標準化することで、プロトコルを構築することを目的とした。
【方法・結果】 土壌から分離した放線菌の懸濁液を調整し、寒天平板上に植菌した。数日の前培養を通じて培地上に菌マットを形成させた。その後、低沸点ジメチルシリコンオイル（KF-96L-1CS あるいは 0.65CS, 信越化学）を菌マット上に重層し、所定の日数静置培養を行った。培養後、有機層を回収し、HPLCPDA で二次代謝物の解析を行った。本培養系について、培地種や有機溶媒種、培養期間、溶存酸素等の各因子の標準化を図った。その結果、特に影響を与えた因子は、有機溶媒種と溶存酸素量であった。有機溶媒種では KF-96L-1CS を適用した場合、菌マットの胞子形成が活発になり、二次代謝物が多く生産される傾向にあった。シリコンオイルは、他の溶媒に比べて微生物毒性が低く、脱溶媒も容易なためスクリーニングに最適な溶媒であると考えられる。結論として、S/L-IFC は有用放線菌のスクリーニングに有効であることが示唆された。

【背景・目的】現在、石油由来のプラスチックは身の回りの幅広い用途に利用されている。しかしながら、石油プラスチックは、焼却処分されると地球温暖化の原因となる二酸化炭素の濃度増加を生じ、環境中に流出するとマイクロプラ
スチックとなり海洋汚染を引き起こす。これらの問題を解決するために、植物資源から微生物により生合成でき、生分解性能をもつ微生物ポリエステルの研究が盛んに行われている。近年、ポリエステル生合成時にアルコール化合物を培地に添加すると、重合過程においてモノマーの代わりにアルコールが取込まれ、かつ、通常時に合成されるポリマーよりも低分子量化したオリゴエステルが菌体外に分泌されることが報告された（Utsunomia et al., ACS Sustain Chem
Eng, 5, 2360, 2017）。本研究では、種々アルコール化合物の添加効果を検証することで、オリゴエステル生産量の向上を目的とした。
【実験】大腸菌 BW25113 株内で、モノマー供給酵素および重合酵素を発現させることで、オリゴエステルを分泌生産させた。炭素源にはグルコースを用いた。
アルコールの添加効果は、ポリオールを中心に炭素鎖数 2〜4 程度の化合物を調べた。培養上清中に分泌されたオリゴエステルは、溶媒を用いて回収し、NMR
および ESI TOF-MS により構造解析を行った。
【結果・考察】種々アルコールの添加効果を調べた結果、アルコールの構造に依存してオリゴエステルの分泌量が大きく異なることが分かった。これは、各ア
ルコールにおいて細胞内への取込効率や重合酵素による認識に差異があるためと考えられる。これらオリゴエステルは精製した後に構造解析に供し、添加したポリオールに対応したジオール末端構造を有することを確認した。よって、本研究で生産したオリゴエステルは、末端官能基を反応起点とすることで様々な材料の合成に利用することができる。

Novel interfacial screening system of antibiotic-producing actinomycetes

Effect of addition of various alcohols on fermentative production ofoligoesters○Kazuki Shiina1, Shinobu Oda2
(1Grad. Sch. Eng., Kanazawa Inst. Technol., 2Genome Biotechnol. Lab., Kanazawa
Inst. Technol.)Key words

actinomycetes, antibiotics, secondary metabolite, interfacial culture○Shoji Mizuno1,3, Tetsuo Sakurai1,3, Ayaka Hiroe2,3, Seiichi Taguchi2,
Takeharu Tsuge1,3(1Sch. Mater. Chem. Technol., Tokyo Tech, 2Fac. Lif. sci., Tokyo Univ. Agric.,
3
MIRAI, JST)Key words

polyhydroxyalkanoate, secretory production, oligoester, diol end group

124
Acidomonas 属酢酸菌のレアアースによるグリセロール
生育抑制

1Gp06

1Gp08

宇都宮 大貴, 西江 百加, 堀田 靖人, 稗田 莉奈, ○阿野 嘉孝（愛媛大院・農）anoy@agr.ehime-u.ac.jp

好熱菌発酵産物の施与による植物のシステミックな成長促進と防御応答の活性化がネコブセンチュウの感染被害に与える影響○梅山 幸子 1, 栁瀬 裕介 1, 宮原 平 1, 宮本 浩邦 1,2,3, 児玉 浩明 1
（1千葉大院・園芸, 2サーマス（株）, 3理研IMS）
kodama@faculty.chiba-u.jp【背景と目的】 細胞外酸化系が発達した酢酸菌では、グルコースなどの糖質は細胞外で酸化され、不完全酸化物を培地中に蓄積する。したがって、糖質は炭素源として細胞内に取り込まれず、他の細菌に比べ貧弱な生育を示す。酢酸菌にとって、グリセロールは生育を大幅に改善させる基質であり培養によく用いられてきた。ところが、我々は Acidomonas 属酢酸菌で、レアアースの一種 La3+の存在下でグリセロール培地での生育が著しく抑制されることを見出した。近年、
レアアースを要求するさまざまな“正”の微生物応答が報告されている中、これは“負”の応答と言える。本研究では、La3+応答性のグリセロール生育抑制に着目し、そのメカニズムを明らかにすることを目的とした。
【方法】 これまでに Ac. methanolica において、PQQ 依存性アルコール脱水素酵素（PQQ-ADH）がグリセロールの細胞外酸化に寄与していること、La3+存在下
で PQQ-ADH 活性が大きく低下すること、を見出している。そこで、グリセロー
ル培地での生育と PQQ-ADH 活性の関係を考慮し PQQ-ADH 破壊株（ΔadhA）
を作製し細胞応答を調査した。また、2 つの La3+要求性酵素についても破壊株を作製し調査した。
【結果と考察】 野生株において、La3+による生育阻害は 10 nM で十分であり、PQQ-ADH 活性が低下しているにもかかわらず反応生成物の蓄積が向上していた。ΔadhA 株においても生育抑制が観察されたことから、PQQ-ADH によるグリセロール酸化活性の低下が生育抑制の要因ではないと結論づけた。一方、
La3+要求性酵素の破壊株では生育抑制が解除され良好な生育が観察されたことから、これらの酵素が La3+の検知にも機能していることが示唆された。

未利用海産資源を好熱菌によって発酵させた好熱菌発酵産物（以下、Compost）
は発酵菌叢が安定しており（JGAM, 2008）、当研究室では堆肥のモデルとして機能性を評価している。Compost は多くの農家で使用されており、作物の収量増加や病害軽減といった効果に加え、ネコブセンチュウ（RKN）による作物の被害が低減したという報告が寄せられている。RKN は、植物絶対寄生性で、農作物の収量低下を招く難防除性の害虫である。タバコを用いた実験においても、
Compost を用いると RKN による根瘤形成が抑制されるとともに、植物体の重量が増加した。Compost は RKN の根への接近、侵入には影響を及ぼさないため、植物体の防御応答を高めていると考えられた。植物根圏―土壌微生物間では様々な相互作用が起こっており、Compost を施与した際の RKN による被害の軽減効
果もまた、微生物が関与すると仮説を立てている。そこで、Compost を懸濁し、100 μm のメッシュでろ過した抽出液（compost extract; CE）施与区と、0.2 μmのポアサイズのフィルターで滅菌した Compost 抽出液（sterilized compost extract;
SCE）施与区を比較し、植物体の生長や根瘤形成に与える影響を調べた。Controlと比較すると CE 区で形成したネコブ数は約 40％にまで減少し、SCE 区では約90％となった。根の重量は、Control と比較して、CE 区でのみ有意に増加した。
このことから、CE に含まれる微生物が根瘤形成の抑制と植物根の成長促進に寄与していることが示された。さらに、root-split-system を用いた実験により、CE を施与することで植物のシステミックな防御応答が高まり、RKN による根瘤形成が抑制された。本研究では Compost による根の成長促進効果も Compostに含まれる微生物による植物側のシステミックな応答であるのか、さらにシス
テミックな応答に関わる遺伝子について検討したので報告する。

Growth inhibition on glycerol medium by the presence of rare-earth elementin Acidomonas methanolica

A thermophile-fermented compost systemically enhances the root growthand defense responses against the root-knot nematodes

Daiki Utsunomiya, Momoka Nishie, Yasuhito Horita, Rina Hieda, ○Yoshitaka Ano(Grad. Sch. Agric., Ehime Univ.)○Yukiko Umeyama1, Yusuke Yanase1, Taira Miyahara1, Hirokuni Miyamoto1,2,3,
Hiroaki Kodama1(1Grad. Sch. Horticul., Chiba Univ., 2Sermas Corp., 3Riken Center for Integr. Med.
Sci.)

Key words

acetic acid bacteria, lanthanides

Key words

compost, root-knot nematode, growth

1Gp07「魔法の弾丸」アスコフランの全生合成経路の同定と高生産 〜アフリカ眠り病の根絶を目指して〜

1Gp09

異担子菌酵母 Cryptococcus diffluens の L-ガラクトン酸
変換経路の解明○荒木 康子 1, 淡川 孝義 2,3, 松崎 素道 4,5,6, 趙 理海 4, 松田 侑大 2,
星野 翔太郎 2, 篠原 靖智 1, 山本 雅一 7, 城戸 康年 4,7,8,
稲岡 健ダニエル 4,5, 永宗 喜三郎 6, 伊藤 考太郎 1, 阿部 郁朗 2,3,
北 潔 4,5（1キッコーマン, 2東大院・薬, 3東大・CRIIM, 4東大院・医, 5長崎
大・TMGH, 6国立感染研, 7ミトコンドリア研, 8阪市大・医）yaaraki@mail.kikkoman.co.jp

松原 健生, ○岸田 正夫（阪府大院・生環科）
masyksd@biochem.osakafu-u.ac.jp

アスコフラノン(AF)は糸状菌 Acremonium egyptiacum から単離された２次代謝産物であり、これまでに抗炎症作用や脂質低下作用など様々な生理活性を有する
ことが報告されている。その中でも、AF はアフリカ眠り病（動物ではナガナ病と呼ばれる）の病原体アフリカ型トリパノソーマの寄生時の呼吸に必須である TAO(trypanosome alternative oxidase)を強く阻害することから、抗寄生虫薬としての応用が期待されている。また、最近になって、AF がエキノコックス症や、低栄養・低酸素条件下で増殖するある種の癌細胞に対しても効果的である
ことが報告され、AF の大量生産系の構築が強く望まれている。
しかしながら、AF を工業的に大量生産するためには、A. egyptiacum は AF 生産
量が低いこと、さらに、AF の類似化合物であり細胞毒性を有するアスコクロ
リン(AC)も同時に生産することが課題となっていた。そこで我々は、AF 生産量の異なる２つの培養条件下における発現差解析により、AF 及び AC の全生合成遺伝子を同定した。そして、AF と AC は途中までは同じ経路を経由して生合成された後、互いに離れた染色体位置にコードされている２つのテルペン環化
酵素によって作り分けられていることを明らかにした。また、A. egyptiacum に
おいて AC のテルペン環化酵素をコードする遺伝子を破壊することで、AF のみを生産する株を取得することができた。さらに、AF の生合成において律速となっていた反応を強化することで AF の生産量を向上させることにも成功した。

「目的」D-ガラクチュロン酸 (D-GalUA) はペクチンを構成するウロン酸化合物
であり、我々は異担子菌酵母 Cryptococcus diffluens からこの D-GalUA を L-ガラクトン酸（L-GalA）に還元する D-ガラクチュロン酸還元酵素の単離に成功している。しかしながら、C. diffluens が L-GalA をさらに変換する代謝経路はまだ解明されておらず、今回はその代謝経路の解明のため、C. diffluens の持つ L-GalA
変換反応とその反応産物の解明を目的とした。
「方法と結果」C. diffluens OPU-FC11 株を D-GalUA 存在下で培養し、無細胞抽出液（Cell-free extract: CFE）を調製した。L-ガラクトノ-1, 4-ラクトンを開裂させて調製した L-GalA を C. diffluens 無細胞抽出液と反応させその反応産物を高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（HPAEC）により解析し他ところ、LGalA の減少に伴って増加する化合物のピークを検出した。この化合物の検出
ピークはすでに報告された D-GalUA 代謝に関連する市販化合物のピークとは一致せず、新たな化合物を生産している可能性が示唆された。HPAEC により検出された新たなピークを示す化合物を分画精製し、MASS 解析を行った結果、得られた化合物の分子量は 177.06 であった。本化合物を、13C-NMR 解析に供した
ところ、すでに報告例がある L-スレオ-3-デオキシヘキソウロソン酸（L-2-ケ
ト-3-デオキシガラクトン酸）と類似のケミカルシフト値を示した。このことか
ら酵母 C. diffluens においてデヒドラターゼ反応により L-GalA が L-スレオ-3-デオキシヘキソウロソン酸へと変換されることが示唆された。

Elucidating the complete biosynthetic pathway and improving productivityof ascofuranone 〜aiming to eliminate sleeping sickness〜

Analysis for L-galacturonic acid exchange pathway in Basidiomycotic yeast
Cryptococcus diffluens○Y Araki , T Awakawa , M Matsuzaki , R Cho , Y Matsuda , S Hoshino ,Y Shinohara1, M Yamamoto7, Y Kido4,7,8, D.K Inaoka4,5, K Nagamune6, K Ito1,
I Abe2,3, K Kita4,5(1Kikkoman Corp., 2Pharm. Sci., Univ. of Tokyo, 3CRIIM, Univ. of Tokyo,
4
Medicine, Univ. of Tokyo, 5Sch. of Tropical Medicine & Global Health, Nagasaki
Univ., 6Natl. Inst. of Infectious Diseases, 7Inst. of Mitochondrial Science Co., Ltd.,
8
Medicine, Osaka City Univ.)
Key words
ascofuranone, African trypanosomiasis, secondary metabolism,ascochlorin
1

2,3

4,5,6

4

2

2

Takeo Matsubara, ○Masao Kishida(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Key words

yeast, L-galactonic acid, Cryptococcus diffluens

125

1Gp10

黄麹菌 Aspergillus oryzae におけるアグマチン産生機構
の解明

1Gp12

○加藤 紗也 1, 赤坂 直紀 1, 五味 勝也 2, 福田 青郎 1, 藤原 伸介 1
（1関西学院大院・理工, 2東北大院・農）fujiwara-s@kwansei.ac.jp

新規モデル生物を目指したミミズ形質転換技術の開発−
hEPO 遺伝子導入法の検討−○神田 直輝, 山谷 竜大, 町田 悠, 竹内 綾, 赤澤 真一（長岡高専・物質工）s-akazaw@nagaoka-ct.ac.jp

アグマチン（Agm）は、アルギニン（Arg）の脱炭酸反応により生成する、ポリアミン生合成における中間代謝物である。近年の解析から、Agm はインスリ
ン耐性や体重増加を緩和・抑制するなど、多岐に渡る生理活性機能を発揮することが示されている (1)。これより、Agm を著量含有する食品は、種々の健康増
進作用を発揮することが期待される。清酒は Agm に富む事が知られており、先行研究によって清酒製造に関わる微生物である黄麹菌 Aspergillus oryzae RW1 株が主たる Agm 産生微生物であることが明らかにされた。さらに、固相培地特異的に Agm を産生し、低 pH 依存的に Agm 産生量が増大することがわかった。
しかしながら、A. oryzae のタイプ株である RIB40 株のゲノム解析からは、Arg
から Agm を産生するアルギニン脱炭酸酵素（ADC）遺伝子は見つかっておらず、Agm 産生の機構の詳細は不明であった。本研究では、A. oryzae のアグマチン産生機構の解明を目的とする。まず RIB40 株においても固相培地特異的かつ低 pH 依存的な Agm 産生が確認された。さらにアルギニン脱炭酸活性も検出された。そこで構造が類似するオルニチン（Orn）やリジン（Lys）を基質とする
Orn 脱炭酸酵素（ODC）および Lys 脱炭酸酵素（LDC）に着目した。A. oryzae
は、4 つの ODC オルソログおよび 2 つの LDC オルソログを有している (2)。これらの発現動態を RT-PCR にて確認したところ、固相培地で 1 種の LDC（LDC1）が発現していることが確認できた。そこで、LDC1 が ADC の機能を代替している可能性が高いと予測し、同遺伝子の転写量解析、および組換えタンパク質を用いた解析を行っている。
(1)Nissim., et al., J. Biol. Chem., 289:9710. (2014)(2)Machida, M., et al., Nature., 438, 1157 (2005)【目的】近年，遺伝子組換え生物を用いて治療薬を生産するバイオ医薬が注目されており，特に動植物個体を用いた生産法は高額な生産設備を必要としないため次世代型生産法として注目されている 1)．そこで我々は，新規宿主としてミ
ミズ Eisenia fetida 及び Eisenia andrei に注目し，異種遺伝子発現系の構築を目指してきた．両ミミズは経済協力開発機構（OECD）から生物毒性試験のモデル生物として認定されているため，本技術の進展により分子生物学的研究が加速化される事も期待される．これまでの研究で，切断した両ミミズ尾部への遺伝子導入に成功し，遺伝子導入に最適な培地及びエレクトロポレーション条件等を明らかにしてきた 2)．しかしながら，糖タンパク質を含むヒトタンパク質の発現は未だ行っていない．そこで，本研究では形質転換効率向上条件をさらに検討すると共に腎性貧血のバイオ医薬品であり糖タンパク質である hEPO（human
Erythropoietin）が発現可能か調査した．
【方法】マイクロシリンジやガラスキャピラリーを用いた遺伝子導入法を検討した．また，E. andirei 尾部を 24 h 培養した後，組織再生面に hEPO 遺伝子を導入した．遺伝子導入の確認は，EPO ELISA キットを用いて行った．
【結果】形質転換効率は 48%にまで向上した．また，E. andrei 尾部から hEPO の産生が検出され，人遺伝子の発現がミミズで可能である事が明らかとなった．
本研究は JSPS 科研費挑戦的萌芽研究（15K14713），基盤研究 C（17K07767）の助成を受けて実施された．
[1]赤澤真一．古くて新しいミミズ研究．
アグリバイオ．北隆館．2(11): 62-64 (2018)．
[2]山谷竜大他．日本農芸化学会．2018 年 3 月．3A22a04．

The mechanism of Agmatine production in Aspergillus oryzae

Application of earthworm transformation method as a novel modelorganism development -Investigation of hEPO gene injection method-○Saya Kato1, Naoki Akasaka1, Katsuya Gomi2, Wakao Fukuda1,
Shinsuke Fujiwara1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ., 2Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku
Univ.)○Naoki Kanda, Tatsuhiro Yamaya, Yu Machida, Aya Takeuchi, Sin-ichi Akazawa(Dept. Material Eng., Natl. Inst. Technol., Nagaoka Coll.)

Key words

Aspergillus oryzae, agmatine, decarboxylase, rice syrup

Key words

Biological medicine, Earthworm, Transformation, Eisenia sp.

1Gp11

GUS リポーター遺伝子を用いた単細胞性緑藻
Coccomyxa のプロモーター活性評価

1Gp13

グルコースによる麹菌アミラーゼ生産抑制におけるグルコキナーゼの関与

大迫 香穂, ○笠井 由紀, 阿部 淳, 高木 さつき, 井出 曜子,
原山 重明（中央大・理工）ykasai@kc.chuo-u.ac.jp○田中 瑞己 1, 河原崎 泰昌 1, 五味 勝也 2
（1静県大・食栄, 2東北大院・農）mizuki.tanaka@u-shizuoka-ken.ac.jp

我々は単細胞性緑藻 Coccomyxa 属の分子育種による油脂生産性の改良に取り組んでいる。Coccomyxa 属は窒素欠乏（−N）条件下で油脂を蓄積するので、油脂生産遺伝子を-N 条件下で高発現させるためのプロモーターの探索を行った。
トランスクリプトーム解析から、多くの遺伝子の発現は−N 条件下で減少するが、アンモニアトランスポーター遺伝子（AMT1）は、−N 条件下でも高発現することが示された。AMT1 プロモーター活性を定量的に測定するために、ゼオ
シン耐性遺伝子（ble）と β-glucuronidase 遺伝子（GUS）とを自己切断アミノ酸配列（2A）を介して結合したレポーター遺伝子カセットを、AMT1 プロモーター（Ap）とターミネーター（At）との間、および RBCS プロモーター（Rp）とター
ミネーター（Rt）との間にそれぞれ挿入した発現コンストラクト（Ap_ble-2AGUS_At および Rp_ble-2A-GUS_Rt）を作製した。これらの発現コンストラクトが導入された Coccomyxa 株で作られる Ble-2A-GUS ペプチドは、細胞質で Ble-2Aと GUS とに切断され、Ble-2A は核に移行しゼオシン耐性（Zeor）を示す。このことから予想されるように、Rp_ble-2A-GUS_Rt 形質転換株では Zeor と GUS 活
性とに相関が認められた。一方、Ap_ble-2A-GUS_At 形質転換株では、ゼオシン耐性を示しても GUS 活性は低かった。Real-time PCR で GUS mRNA の定量を行ったところ、Ap_ble-2A-GUS_At 形質転換株では GUS mRNA は 3’側から分解され易く、Rp_ble-2A-GUS_R 由来の GUS mRNA に比べ著しく不安定であった。
この mRNA の不安定性が At に起因する可能性を検討中である。

麹菌のアミラーゼ遺伝子の発現はマルトースにより誘導されるが、グルコースが存在するとカーボンカタボライト抑制により強く抑制される。また、細胞膜上のマルトーストランスポーター (MalP) は、グルコースが存在するとエンドサ
イトーシス依存的に液胞に輸送されて分解される。我々は最近、カーボンカタ
ボライト抑制を制御する転写因子 CreA が、アミラーゼ生産条件では核内から細胞質に排出されて分解されることを明らかにした。出芽酵母においては、カーボンカタボライト抑制を制御する Mig1 の細胞内局在が、ヘキソキナーゼによって制御されることが報告されている。本研究では、グルコース存在時における麹菌のアミラーゼ生産抑制におけるヘキソキナーゼ (HxkA) とグルコキナーゼ(GlkA) の関与について解析した。
麹菌の hxkA 破壊株と glkA 破壊株を作成した結果、hxkA の破壊により分生子形成が著しく抑制されたのに対し、glkA 破壊による生育への影響は見られなかった。グルコース混合デンプン培地におけるハロー形成能を比較した結果、いずれの破壊株も野生株より明瞭なハローを形成し、glkA 破壊株はより大きなハ
ローを形成した。細胞内の CreA 存在量を調べた結果、glkA 破壊株ではグルコー
ス存在条件における CreA 量が野生株および hxkA 破壊株と比較して著しく減少していた。また、GFP 融合 MalP の分解を調べた結果、glkA 破壊株においてグ
ルコース添加後の GFP-MalP タンパク質の分解が顕著に抑制されていた。さらに、MalP のグルコース誘導性エンドサイトーシスに必要なアレスチン様タンパ
ク質 CreD はグルコースの存在により速やかに脱リン酸化されるが、glkA 破壊
株では CreD の脱リン酸化が顕著に抑制された。以上の結果から、麹菌におけるグルコースによるアミラーゼ生産抑制においては、GlkA が重要であることが示唆された。

The GUS-reporter-aided analysis of the RBCS and AMT1 promoter
activities in Coccomyxa under nitrogen-replete and-deplete conditions.

Involvement of glucokinase in glucose-induced repression of amylolytic
enzymes production in Aspergillus oryzae.

Kaho Osako, ○Yuki Kasai, Jun Abe, Satsuki Takagi, Yoko Ide, Shigeaki Harayama(Fac. Sci. Eng., Chuo Univ.)

Key words

Coccomyxa, ammonium transporter gene, promoter, GUS reporter gene

○Mizuki Tanaka1, Yasuaki Kawarasaki1, Katsuya Gomi2(1Sch. Food Nutr. Sci., Univ. Shizuoka., 2Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)

Key words
transporter

Aspergillus oryzae, gene expression, transcriptional regulation,

126

1Gp14

Aspergillus aculeatus における ManR を介した選択的遺伝子発現制御に関わる転写因子の探索

1Gp16○角谷 朝香, 炭谷 順一, 谷 修治, 川口 剛司（阪府大院・生環科）
shuji@biochem.osakafu-u.ac.jp

クエン酸生産糸状菌 Aspergillus tubingensis (A. niger)
WU-2223L における CRISPR/Cas9 システムを用いたハ
イスループット遺伝子ノックアウト法の構築○吉岡 育哲, 脇本 紗梨, 桐村 光太郎（早大・先進理工）
kkohtaro@waseda.jp【背景と目的】Aspergillus aculeatus のセルロース、ガラクトマンナンに応答した
セルラーゼ遺伝子 (cel7b, cbhI )、マンナン分解酵素遺伝子 (manG, mndD ) の発現
は正の転写因子 ManR によって制御されている。ガラクトース資化に関わる
UDP-glucose 4-epimerase 遺伝子 (uge5) 欠損株において、manG, mndD のガラク
トマンナンに応答した発現量は変化がなかったが cel7b, cbhI のセルロースに応答した遺伝子発現量は減少した。この Uge5 が直接/間接的に関わる ManR を介した選択的遺伝子発現制御機構を解明することを目的とし、本制御に関わる転写因子を探索した。
【方法】ガラクトース資化に関わる転写因子 GalX に着目
し、Aspergillus nidulans GalX のオルソログ遺伝子破壊株（A. aculeatus ΔgalX ）を作出した。コントロール株 (MR12) と ΔgalX を誘導条件下（1% Avicel、或いは 1% locust bean gum）または非誘導条件下（0.1% Bacto Tryptone）で 4 h、6 h
培養した際の cbhI, cel7b, manG, mndD の発現量を qRT-PCR 法により定量した。
【結果と考察】Avicel 誘導条件下では cbhI, cel7b の誘導率のみが galX 破壊により 1/3 まで減少した。一方、locust bean gum 誘導条件下では各遺伝子の誘導率が galX 破壊により 150 倍以上増加した。以上より、 ManR を介した選択的遺伝
子発現制御に GalX が直接あるは間接的に関与していることが示された。

【目的】
クエン酸は糸状菌 Aspergillus niger を用いた工業的発酵により生産されている。
演者らは、100 g/L を超えるグルコースから高収量（>50% (w/w)）でクエン酸を生産する WU-2223L 株を供試菌として研究を進めている [1]。供試菌はゲノム解析により A. tubingensis（以前は A. niger）と再同定された。一方、糸状菌の育種では、遺伝子ノックアウト効率が低いことや選択マーカーが限定されることが課題となることが多い。そこで、演者らはゲノム編集ツールとしての CRISPR/
Cas9 システムを利用し、WU-2223L 株におけるハイスループット遺伝子ノック
アウト法を構築した。
【方法および結果】
演者らは、A. tubingeisis WU-2223L の推定 U6snRNA 配列をクローニングし、オ
リゴヌクレオチドを任意のプロトスペーサー配列として挿入可能な gRNA 発現
カセットを構築した。また、ATP-sulfurylase をコードする sC 遺伝子をターゲッ
トとして設計した gRNA 発現カセットを DNA の状態で Cas9 タンパクと共形質転換し、セレン酸耐性株を取得した。取得したセレン酸耐性株については、sC
遺伝子のプロトスペーサー配列の周辺に Indel 変異を確認した。さらに、マイクロホモロジー媒介末端結合を利用してハイスループット遺伝子ノックアウト法を確立した。具体的には、sC 遺伝子の推定 Cas9 切断部位と相同な 15 bp の配列を付加したピリチアミン（PT）耐性遺伝子（ptrA）をノックインドナーとして用いて形質転換株を PT 耐性を指標に選択し、セレン酸含有培地上で 3 回継代培養した。無作為に選択した 30 個の PT 耐性株では、すべて sC 遺伝子がノックアウトされていた。以上より、演者らは CRISPR/Cas9 システムを用いたハイスループット遺伝子ノックアウト法の構築に成功した。
[1] Kirimura, K., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 83, in press (2019).
(DOI: 10.1080/09168451.2019.1574205) 他

Screening for a transcription factor involved in ManR-dependent selective
gene expression in Aspergillus aculeatus

High-throughput gene knockout method for citric acid produicing
Aspergillus tubingensis (A. niger) WU-2223L by CRISPR/Cas9 system○Asaka Kakutani, Jun-ichi Sumitani, Shuji Tani, Takashi Kawaguchi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)○Isato Yoshioka, Sari Wakimoto, Kohtaro Kirimura(Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words

cellulase, gene expression analysis, enzyme production, biomass

Key words
systemAspergillus niger, Aspergillus tubingensis, citric acid, CRISPR/Cas9

1Gp15

代謝産物解析と遺伝子解析によるクエン酸生産糸状菌のカビ毒非生産性の検証

1Gp17

好熱性放線菌 Streptomyces thermoviolaceus による物質
生産○大越 佳乃 1, 吉岡 育哲 1, 中川 博之 2, 桐村 光太郎 1（1早大・先進理工, 2農研機構・食品）
kkohtaro@waseda.jp【目的】
クエン酸は Aspergillus niger によって工業的に発酵生産されており、食品や飲料の酸味料、工業用薬品として使用されている。しかし、一部の Aspergillus Section
Nigri に属する菌株にはカビ毒生産性が見られ、安全性が懸念されている[1]。
クエン酸生産糸状菌 WU-2223L 株[2] は A. tubingensis に再同定されたが (未発表) 、A. niger と同様 Section Nigri に属する。本研究では、代謝産物解析と遺伝
子解析の両面から WU-2223L 株のカビ毒非生産性を示し、クエン酸生産糸状菌としての安全性について検証した。

○三原 笑 1, 竹中 武藏 2, 柏木 紀賢 2, 曽田 匡洋 3, 荻野 千秋 1,
近藤 昭彦 2
（1神戸大・工, 2神戸大院・科技イノベ, 3長瀬産業）
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp【方法および結果】
Aspergillus 糸状菌により生産される可能性があるカビ毒としては、アフラトキ
シン、フモニシン、オクラトキシン、パツリンがある。そこで、培地組成を含めて数種の培養条件を設定し、培養液について代謝産物解析を行った。
WU-2223L 株の培養液についての LC-MS 分析では、各カビ毒は検出限界未満であった。さらに、PCR を利用して各カビ毒の生合成遺伝子クラスターが存在す
るかどうかを検証した。すなわち、既報にある各カビ毒生産菌と非生産菌のゲノム情報を利用して、各カビ毒の生合成クラスター遺伝子あるいはその近傍の保存された遺伝子座間を PCR で増幅可能かどうかを検討した。A. tubingensis
WU-2223L においては検討したカビ毒の生合成遺伝子クラスターについて欠失が認められ、カビ毒非生産性であることを明らかにした。以上より、代謝産物
解析と遺伝子解析より、A. tubingensis WU-2223L はカビ毒非生産性で安全性の高いクエン酸生産糸状菌であることを明らかにした。
[1] Susca, A., et al., Frontiers in Microbiol., 282, 1-15 (2016).
[2] Kirimura, K., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 83, in press (2019).

近年環境汚染が懸念されているため、本研究では微生物を用いた環境に優しい
物質生産法を開発している。微生物の中でも放線菌は様々な二次代謝物や酵素を合成・分泌することが特徴で、それらを工業生産する宿主としても着目されている。しかし、培養温度が常温付近のものが多く、雑菌繁殖や、発酵熱の冷却コストが課題である。それらを解決すべく本研究では、好熱性放線菌の一種
で あ る Streptomyces thermoviolaceus (S. thermoviolaceus) に 着 目 し た 。 S.
thermoviolaceus は先行研究が極めて少ないため、本研究では基礎研究の培養特性解析から行い、それらの結果を踏まえて外来遺伝子導入による物質生産への応用を試みた。
培養特性解析にあたり、S. thermoviolaceus の増殖速度を、研究対象としてよく用いられる放線菌 Streptomyces lividans や Streptomyces albu と比較した。その結果、S. thermoviolaceus は増殖速度が速いという物質生産に有利な特徴が確認できた。さらに、資化可能な糖の探索を行い、グルコース、グリセロール、キシ
ロース、スクロースを資化することを確認した。その後、接合伝達法によって様々な放線菌ベクターの導入を試みることで遺伝子組み換え法の確立を行い、外来遺伝子導入に成功した。
以上の結果を基に、外来遺伝子導入による物質生産を目指した。目的物質には3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸(3,4-AHBA) を選択した。3,4-AHBA は高強度、難溶性のプラスチックの原料で、現在は石油資源から化学プロセスで合成されている。バイオプロセスで合成することで、資源の枯渇化や多段階のプロセスによる高コストの改善が期待できる。本研究では、Streptomyces murayamaensis
由来の nspI, nspH の 2 つの遺伝子を導入することで、3,4-AHBA の生産に成功
し、S. thermoviolaceus で初の外来遺伝子導入による物質生産を確認することができた。</i>

Evidences for Mycotoxin Non-Production by a Citric Acid-Producing
Filamentous Fungus Based on Metabolite and Genetic Analyses

Substance production by thermophilic actinomycete, Streptomyces
thermoviolaceus○Kano Okoshi1, Isato Yoshioka1, Hiroyuki Nakagawa2, Kohtaro Kirimura1(1Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2NFRI)

Key words
mycotoxin

Aspergillus tubingensis, biosynthetic gene cluster, LC-MS analysis,○Emi Mihara1, Musashi Takenaka2, Norimasa Kashiwagi2, Masahiro Sota3,
Chiaki Ogino1, Akihiko Kondou2(1Fac. Eng., Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 3Nagase &Co., Ltd)Key words
Streptomyces, Thermophilic actinomycetes, Streptomyces
thermoviolaceus

127

1Gp18

CRISPR-Cas9 システムによるオーランチオキトリウム
属の生産脂質の改質

1Hp02○北堀 智希 1, 渡邉 研志 1, 青井 真人 1, 畑 浩介 1, 高橋 宏和 1,
岡村 好子 1, 松山 恵介 2, 黛 新造 3, 秋 庸裕 1
（1広島大院・統合生命科学, 2長瀬産業, 3出光興産）
aki@hiroshima-u.ac.jp

微生物間相互作用の促進は増殖の開始を誘導する：難培
養性微生物の獲得に向けた新しいアプローチ○杉山 周 1, Eun Young 1, 鈴木 陸太 1, 加藤 節 1, 中島田 豊 1,
大橋 晶良 2, 金田一 智規 2, 青井 議輝 1
（1広島大院・統合生命科学, 2広島大院・工・四類）
m183861@hiroshima-u.ac.jp【背景・目的】海洋性の真核微生物ラビリンチュラ類 Aurantiochytrium 属は高度
不飽和脂肪酸や長鎖脂肪酸、炭化水素、カロテノイドなど様々な分野で需要の高い脂質を細胞内に蓄積する。また、増殖性も高いため、各脂質の効率的生産への利用が期待される。当研究室では独自に開発した相同組換え法で本微生物の脂質生合成機構解明や脂質生産性の向上を試みてきたが、新たにゲノム編集
技術 CRISPR-Cas9 による遺伝子ノックアウト及びノックインを試みた。
【方法・結果】カロテノイド高生産性でコロニーが赤橙色を呈する
Aurantiochytrium sp. RH-7A 株に Cas9 ヌクレアーゼ遺伝子発現プラスミドを導入した RH-7A-CH 株に対して、β-カロテン合成酵素遺伝子 crtIBY を標的とする
guide RNA（gRNA）を導入してノックアウトを試みた結果、コロニーの色が白く変化した Wc1、Wc2 および Wc4 株を取得した。また、in vitro で形成した
gRNA-Cas9 複合体（RNP）を RH-7A 株に導入した結果、白色の Wc3 株を取得した。これらの株の crtIBY の塩基配列を解析した結果、Cas9 による標的部位の二重鎖切断に由来する非相同末端連結やヌクレアーゼによる塩基の欠失が生じたことが示唆され、本システムによる crtIBY のノックアウトに成功した。さらに、ゼオシン耐性遺伝子発現カセットを crtIBY 上の二重鎖切断導入部位付近の相同領域で挟んだドナー DNA を作成し、RNP とともに RH-7A 株へ導入した結果、ノックインで生じたと思われる白色コロニーとゼオシン耐性を示す株を単離した。現在、この株の解析を進めるとともに、各脂質生産性向上のための育種に CRISPR-Cas9 の適用を試みている。

【目的】地球上に存在する膨大な種類の微生物のほとんどは培養できない（培養困難）ことが知られている。また、難培養性微生物は「なぜ従来の培養法では培養困難なのか」という理由も解明されていない。もし、難培養性の原因の一端を明らかにして培養可能な微生物種を大幅に拡大することができれば、学術的および産業的な波及効果は極めて大きい。しかし従来法に替わる画期的な分離培養手法の開発にはほとんど進展がないといっても過言ではない。そこで本研究では、微生物間の相互作用が休眠状態の微生物を覚醒させる可能性に着目し、培養開始初期から超高菌体密度を実現する新規培養手法を開発した。また
本手法の開発を通じて未培養微生物の未知なる増殖制御機構を明らかにしつつ、未培養微生物へのアクセス方法を確立することを目的とした。
【方法及び結果】本研究で提案する新規分離培養手法（ゲル微粒子凝集培養）は多数の直径 10-30μm のゲル微粒子(GMD)に細胞を 1 つずつ封入し、それを油相中で凝集させてそのまま培養する方法である。これにより「各々のクローンは培養期間中分離状態を保つ条件で、従来法の 1 万倍以上の初期植菌密度」を実現する。本研究では、様々な環境サンプルを用いてゲル微粒子凝集培養を行った結果、従来法とは異なる微生物種が獲得可能であること、未培養微生物の獲得に有効であることが示唆された。また、得られた分離株を用いて増殖特性の評価を行ったところ、異種間・同種間の相互作用により増殖の開始が誘導される現象が確認されたため、自然環境中では、複雑な微生物間相互作用により各々の微生物の増殖が制御されている「増殖制御ネットワーク」が形成されている可能性が示唆された。

Modification of lipid product of Aurantiochytrium sp. using CRISPR-Cas9
systemPromotion microbial interactions induces the onset of growth: a new
approach towards the acquisition of uncultivable microorganisms○Tomoki Kitahori1, Kenshi Watanabe1, Masato Aoi1, Kosuke Hata1,
Hirokazu Takahashi1, Yoshiko Okamura1, Keisuke Matsuyama2, Shinzo Mayuzumi3,
Tsunehiro Aki1
(1Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 2NAGASE & CO., LTD., 3Idemitsu
Kosan Co., Ltd.)Key words
Aurantiochytrium sp., genome editing, carotenoid

1Hp01

固体培地上でコロニーを形成しない微生物の選択的獲得：未培養微生物への効率的アクセス○Shu Sugiyama1, Young Eun1, Rikuta Suzuki1, Sestu Katou1,
Yutaka Nakashimada1, Akiyoshi Ohashi2, Tomonori Kindaichi2, Yoshiteru Aoi1
(1Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 2Grad. Sch. Eng.Hiroshima)

Key words

uncultured bacteria, microbial interaction

1Hp03

新規回転振盪培養機構による微生物培養について○馬場 啓彰, Jung Dawoon, 加藤 節, 中島田 豊, 青井 議輝（広島大院・統合生命科学）
yoshiteruaoi@hiroshima-u.ac.jp○小林 由衣乃 1, 川村 奈々 2, 竹園 恵 1, 中島 敏明 3, 茂野 俊也 4,
小野寺 正幸 1（1新潟工大院・工・生産開発工, 2(株)プリス, 3筑波大院・生命環
境, 4つくば環微研）
onodera@acb.niit.ac.jp【背景と目的】環境中に存在する微生物のほとんどは未培養であり、多くの微生物は従来法では培養困難（できない）ことが広く知られている。これら未知微生物にアクセスすることは有用微生物資源の利用や環境微生物の理解の上で必要不可欠であるが、これまでに従来法に替わる新規な分離培養手法の開発には大きな発展がない。一方で、環境中から微生物を分離培養する際には、寒天など固体培地上でコロニーを形成させて分離する方法が一般的である。したがって、固体培地上でコロニーを形成できない微生物の多くは未だ分離されたことのない未培養微生物である可能性が高い。そこで本研究では、固体培地上でコロニーを形成しない微生物を選択的に分離培養可能な手法を確立すること、未培養微生物の獲得という観点において同アプローチの有効性を明らかにすることを目的とした。
【方法】コロニー形成をしない微生物の選択的獲得法は、液体培地で増殖した菌株のうち寒天平板培地上で増殖しない微生物のみ選択するというスクリーニン
グを鍵とする手法である。本研究では、本手法以外に、寒天平板培養、in situ
培養（実環境中での培養）、および in situ 培養と本手法を組み合わせた各方法を同時に行い、得られた分離株の多様性および新規性について比較評価した。また各手法で得られた分離株の増殖特性を比較評価した。
【結果と考察】新規手法により、実際にコロニーを形成しない微生物を選択的に獲得することが可能であることが示された。また、本手法を通じて獲得した分離株の多くは新規性の高い未培養微生物であり、従来法（寒天平板培養）に比
べて新規性の高い分離株の獲得効率が顕著に高かった。またコロニーを形成しない微生物の多くは自身の代謝（副）産物により増殖が阻害されやすいという特性を持っていることが示唆された。

微生物培養において三角フラスコを用いた回転振盪が広く用いられている。我々
は、使用済み天ぷら油に代表される廃食用油の有効活用として、廃食用油を炭素源（C 源）に、安価な窒素源（N 源）と無機塩の添加により微生物を培養し、その菌体を家畜並びに養魚用飼料とすることを目指しており、油脂資化性酵母
Meyerozyma guilliermondii TY-89（TY-89）を用いて植物油を C 源に回転振盪培養を行っている。そのような中で、非水溶性の食用油の微細化は菌体の生育に有効であり、微細化促進の為にバッフル付き三角フラスコでの回転振盪培養が有効であること明らかにした。しかし、バッフル付き三角フラスコは通常のものよりも洗浄が困難、価格も高価であり、通常の三角フラスコでの培養が望ましいと考えられる。そこで回転振盪に反転を伴わせ、反転時に急激な流れの変化を起こすことで液体培地表面の乱れが増大し非水溶性 C 源を微細化させることが可能であると考え、通常の三角フラスコでもバッフル付きのものと同等の生育が得られるものと期待した。C 源として市販の植物油 10g/L、N 源として硫安 2g/L、その他無機塩からなる無機塩培地とし 500ml 容三角フラスコ（培地量 100ml）で、30℃、120rpm で TY-89 の回転振盪培養を行った。時計方向から
反時計方向、反時計方向から時計方向に回転している時間を反転時間と定め、反転時間を 3 秒間〜30 秒間として検討を行った。反転時間が 3 秒間の場合、通常の三角フラスコを用いてもバッフル付き三角フラスコでの従来の条件で培養した場合と同程度の生育挙動を認めた。また、反転時間を 30 秒間とした場合でも、バッフル付き三角フラスコでの一方向回転振盪を行った場合と同程度であった。以上、反転を伴う回転振盪は、微生物培養に有効であることを認めた。
本研究は、新潟工科大学 風・流体工学研究センターの研究課題として行われた。

A new method for selective isolation of microbial types unable to formcolonies on the solid medium: accessing to previously uncultivatedmicroorganisms

Cultivation of microorganisms using a novel rotary shaking mechanism○Hiroaki Baba, Dawoon Jung, Setsu Kato, Yutaka Nakashimada, Yoshiteru Aoi(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)

Key words

uncultured bacteria, microbial cultivation, liquid medium○Yukino Kobayashi1, Nana Kawamura2, Satoshi Takesono1, Toshiaki Nakajima3,
Toshiya Shigeno4, Masayuki Onodera1(1Grad. Sch. Eng., Niigata Inst. Technol., 2PRECi Co., Ltd., 3Grad. Sch. Life
Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 4Lab. Tsukuba Env. Microb.)

Key words

Meyerozyma guilliermondii TY-89, rotary shaking, yeast, waste

128

1Hp04

Water-in-oil ドロップレットを用いた腸内細菌培養手法
の開発

1Hp06

○村山 周平 1,2, 大田 悠里 2,3, 斉藤 加奈子 2,3, 松倉 智子 2,
森田 雅宗 2, 関口 勇地 2, 常田 聡 3, 野田 尚宏 1,2,3（1東大院・新領域, 2産総研・バイオメディカル, 3早大院・先進
理工）noda-naohiro@aist.go.jp

エマルションドロップを用いた微生物の培養○川島 万凜, 村井 雄大, 川本 智也, 金 相完, 久原 哲, 田代 康介（九大院・生資環）
ktashiro@grt.kyushu-u.ac.jp【背景と目的】腸内細菌と疾患の関連性を解明するためにはメタゲノム解析のみ
ならず、腸内細菌の分離培養も重要である。Water-in-oil ドロップレット培養法
は油中に分散した微小水滴内に細胞を封入して培養する手法である。ドロップ
レットは短時間で大量に作製可能な上、区画化されているため、競合に弱い腸内細菌のハイスループット培養が可能になると考えた。腸内細菌の多くは嫌気性細菌であり、ドロップレットを用いた腸内細菌の嫌気培養例は報告されていない。本研究では、ドロップレットを用いた新規嫌気培養法の確立およびそれによる腸内細菌の培養を行った。
【方法】ドロップレットが嫌気環境であるか確認するために、酸素濃度に応じて蛍光寿命が変化する酸素感受性ナノプローブを分散させた培地を水相に、界面活性剤を含むフッ素オイルを油相に、直径約 130 μm のドロップレットを作製した。N2/CO2 (80:20) 混合ガスで置換したフッ素オイルが入ったバイアル瓶に作製したドロップレットを封入し、ドロップレットの蛍光を測定することでドロップレット内酸素濃度を算出した。次に、Lactobacillus acidophilus を封入したドロップレットを作製し、ガス置換したバイアル瓶に封入し、37℃で培養を行い、顕微鏡観察で細胞の増殖を確認した。
【結果】酸素感受性ナノプローブと L. acidophilus を封入したドロップレットは
共に、バイアル瓶封入前後で形状の変化はほとんど確認されなかった。ガス置換したバイアル瓶中のドロップレット内酸素濃度は飽和溶存酸素濃度の 20%程度だった。L. acidophilus を封入したドロップレットでは細胞の増殖が観察された。これらの結果は腸内細菌培養への可能性を示唆していると考え、今後は本手法の複合サンプルへの適用を試みる。

【背景】地球上には膨大な数の微生物が存在し、物質循環や発酵食品の製造など、我々は様々な面でその恩恵を受けている。しかし、単離・培養できる菌種
はその 1%以下と考えられており、多くの微生物は未培養のままである。そこ
で、我々はエマルションドロップを用いた微生物の培養法を構築してきた。エマルションドロップとは界面活性剤を用いて油中に微細な水滴を封入させたものであり、各ドロップレットが個々の培養系として使用される。我々はドロップレット培養を用いて土壌環境微生物を培養し、菌叢の比較を行うことで、ドロップレット培養の特性を検討した。
【方法】Droplet Generator (On-Chip Biotechnologies)を用いてエマルションドロッ
プを作製し、大腸菌や酵母などの菌株、及び土壌から採取した土壌細菌の培養を行った。一定期間培養後、DNA を抽出し、16SrDNA 領域を対象として次世
代シーケンサーによって分析し、菌叢を解析した。
【結果・考察】ドロップレット培養と従来の培養法において DNA の増加量を比較すると、従来の培養法では 48 時間後に急激に増加したが、ドロップレット培
養では 7 日間を通して緩やかに増加した。また、従来の培養法では菌叢が大きく変化していたが、ドロップレット培養においては土壌の菌叢が比較的保存されていることが分かった。それぞれの OTU 数を比較すると、ドロップレット
培養は従来の方法の約 2 倍であり、今まで培養できなかった菌種も培養できる可能性が示唆された。また、異なる培地で培養したサンプルを比較すると、異なる菌種が増殖することが判明し、現在様々な培養条件において、ドロップレットで培養される菌叢の違いを検討している。

Development of a culture method for gut microbes using water-in-oil
droplets

Culture of micro-organisms by emulsion droplet○Shuuhei Murayama1,2, Yuri Ota2,3, Kanako Saito2,3, Satoko Matsukura2,
Masamune Morita2, Yuji Sekiguchi2, Satoshi Tsuneda3, Naohiro Noda1,2,3(1Grad. Sch. Frontier Sci., Univ of Tokyo, 2Biomed. Res. Inst., AIST, 3Grad. Sch.
Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)○Marin Kawashima, Yuta Murai, Tomoya Kawamoto, Sangwan Kim,
Tetsu Kuhara, Kosuke Tashiro(Grad. Sch. Bioresour. Bioenviron. Sci., Kyushu Univ.)

Key words

droplet microfluidics, , gut microbes, anaerobic, bacterial cultivation

Key words

uncultured bacteria, environmental bacteria, emulsion

1Hp05

RNase 活性を指標とした微生物増殖 water-in-oil ドロップレットの検出法 “FNAP-sort” の確立

1Hp07

G-body 形成に関わる因子のスクリーニングを目的とした低酸素培養系の確立○大田 悠里 1,2, 斉藤 加奈子 1,2, 髙木 妙子 2, 松倉 智子 2,
森田 雅宗 2, 常田 聡 1,2, 野田 尚宏 1,2（1早大院・先進理工, 2産総研・バイオメディカル）
noda-naohiro@aist.go.jp○吉村 柚紀 1, 平山 伶奈 1, 大谷 優太 2, 内海 亮太郎 1, 三浦 夏子 1,
植田 充美 2, 片岡 道彦 1
（1阪府大院・生環科, 2京大院・農）miura.natsuko@biochem.osakafu-u.ac.jp【背景・目的】近年，droplet microfluidics technology は，シングルセル解析，酵素スクリーニング，細胞培養など様々な用途で利用されている。マイクロ流路
により water-in-oil ドロップレットを数十万単位で作製し，セルソーターを用いて高速かつ大量にドロップレットを解析できる特徴を活かし，本研究ではドロップレット内で微生物培養を行った。従来，ドロップレット内の微生物の増殖の検出には細胞生存マーカーである蛍光分子レゾルフィンが使用されてきたが，レゾルフィンはドロップレット間を移動するため，数時間経過すると細胞が増殖したドロップレットと空ドロップレットを区別できなくなる問題があった。
そこで，長期的に微生物増殖ドロップレットを検出することを目的として，細胞が持つ RNase 活性を指標とした Fluorescent nucleic acid probe in droplets forbacterial sorting (FNAP-sort)を開発した(Ota et al., PLOS One, 2019)。
【方法】純菌株として大腸菌と根粒菌，複合微生物系として土壌微生物を，それぞれ蛍光RNA プローブと共に 1 nL のドロップレットに封入した。ドロップレット内で培養を行い，顕微鏡観察およびフローサイトメトリーにより蛍光強度を評価し，セルソーターを用いて蛍光強度に基づくドロップレットの分取を行った。【結果】純菌株を封入したドロップレットでは最長 7 日経過後も微生物増殖ドロップレットと空ドロップレットを蛍光に基づいて区別できた。土壌微生物を封入したドロップレットでは，蛍光強度の高いドロップレットを分取した結果，微生物増殖ドロップレットが濃縮され，RNase を指標とすることで微生物増殖ド
ロップレットの検出に成功した。

【背景と目的】 細胞内におけるタンパク質集合体の形成は、生物において様々な環境の変化に適応するための新たな機構として注目を集めている。我々は以前の研究で、酵母 Saccharomyces cerevisiae の細胞質内に散在する代謝酵素（主に解糖系酵素）が低酸素条件下で集合体を形成することを見出した（1）。この集合体は、近年 “Glycolytic body” または “G-body” と名付けられ、低酸素条件下における細胞の生存に重要であることが示唆された（2）。一方で、G-body 形成に必要な低酸素条件等の因子の解明は進んでいない。その理由として、従来の低酸素培養法では 1 サンプルあたりに要する培地量（100 ml）が多く、多数のサンプルを同時に扱うことが困難であるという問題があった。そこで本研究では、G-body 形成に関わる因子のスクリーニングを目的とした小容量低酸素培養系の確立を目指した。
【方法】小スケール低酸素培養を行い、酵母が細胞質内に G-body を形成できる条件を検討した。具体的には従来の 1/50 から 1/1000 の培地量で、市販の酸素吸収剤やマルチガスインキュベーターを用いた低酸素培養を行った。G-body を形成する細胞の割合は、顕微鏡画像の解析により算出した。さらに、G-body の形成を抑制する薬剤を用いて、新しく構築した低酸素培養法のスクリーニングへの利用を検討した。
【結果と考察】今回検討を行った低酸素培養法の全てで G-body の形成を確認できた。また、一部の薬剤を添加することにより G-body 形成が遅延することを新規な小容量低酸素培養系で確認できたことから、スクリーニングへの利用が可能であることが示唆された。
（1）Miura et al. 2013 Eukaryot. Cell.
（2）Jin et al. 2017 Cell Rep.

A detection method, named as "FNAP-sort", for droplets containing
bacteria based on RNase activity

Establishment of hypoxic culture system for screening of factors in G-bodyformation○Yuri Ota1,2, Kanako Saito1,2, Taeko Takagi2, Satoko Matsukura2,
Masamune Morita2, Satoshi Tsuneda1,2, Naohiro Noda1,2(1Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2Biomed. Res. Inst., AIST)

Key words

bacteria, droplet microfluidics, RNase, FRET

○Yuki Yoshimura1, Reina Hirayama1, Yuta Ohtani2, Ryotaro Utsumi1,
Natsuko Miura1, Mitsuyoshi Ueda2, Michihiko Kataoka1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ., 2Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)

Key words

G-body, hypoxia, culture system, small scale

129

1Hp08

麹菌 Aspergillus oryzae 菌糸完全分散変異株の液体培養における流体特性の解析

1Hp10○市川 暉 1, 宮澤 拳 1, 吉見 啓 2, 古明地 敬介 1, 加藤 好一 3,
阿部 敬悦 1,2
（1東北大院・農, 2東北大・未来研, 3佐竹化学機械工業）
kabe@niche.tohoku.ac.jp

Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase（RubisCO）反応を経由したグリコール酸ポリマー生合成系構築とその応用
大潟 祥梧 1, 永田 暁洋 1, 齋藤 樹理 1, 横尾 俊憲 1, 工藤 悠希 1,
堀 千明 1, ○大井 俊彦 1, 田口 精一 2, 松本 謙一郎 1（1北大院・工, 2東農大院・農）mken@eng.hokudai.ac.jp【背景及び目的】糸状菌の液体培養では, 菌糸同士が接着集合することで菌糸の塊を形成するために高密度培養ができないことが課題である。我々は, 産業用糸状菌の麹菌において,菌糸接着因子を探索し、菌糸が全く塊を作らない菌糸完全
分散株の作製に成功した 1)。これまでに菌糸完全分散株はジャー型発酵槽培養において野生株よりも高い酵素生産能と低培養液粘度を示すことが分かっている 2) 。 と こ ろ で ， 培 養 槽 内 の 物 理 的 作 用 や 流 体 解 析 を 行 う 手 法 と し てComputational Fluid Dynamics (CFD)シミュレーション（数値流体解析）がある。
本研究では, 野生株と菌糸完全分散株のジャー型発酵槽を用いた培養と同一条件
下での CFD シミュレーションを実施し，両株の培養槽内におけるフローパター
ン，流速分布，せん断応力分布を明らかにすることで，各々の特性を把握する。
【方法及び結果】培養には麹菌の野生株, 菌糸完全分散株それぞれに生産モデル
酵素クチナーゼの遺伝子 cutL1 を 1 コピー導入した株を用いた。佐竹化学機械工業(株)製 3 L 容ジャー型発酵槽に 1.5 L の培地を張り込み，30℃, 660 rpm, 60
時間培養を行った。培地中の分泌 CutL1 量は SDS-PAGE で定量評価した。その結果，CutL1 生産量はこれまでの結果が再現され，菌糸完全分散株で野生株に比べて高かった。次に，乱流モデルに Realizable k-e を用い CFD シミュレーショ
ン解析を行った。その結果，非ニュートン性の強い野生株の流動は，翼周りを中心としており培養槽上部まで培養液流動が形成されなかったが，同じ非ニュートン性流体でも粘性が低い菌糸完全分散株では培養槽内全域に渡る流動を形成していた。現在，両株の酵素生産性と培養時の流動性の関係について解析中であり，その結果についても議論したい。
1)阿部ら, 特願 2017-91734
2)古明地ら, 2018 年度日本生物工学会 2Fa06

ポリヒドロキシアルカン酸は微生物産生ポリエステルであり、改変型重合酵素を用いることにより、非天然モノマーである GL ユニットをポリマー中に取り込んだ共重合体の合成が可能である。グリコール酸は、植物や藍藻などの炭酸固定経路（CBB サイクル）の鍵酵素である Ribulose 1,5-bisphosphate (RuBP)
carboxylase/oxygenase（RubisCO）が、酸化反応により生成する 2-phosphoglycolate（2PG）を経由して合成可能であることが知られる。これらの知見から、CBB
サイクルを GL ポリマーのモノマー供給系として利用できる可能が示された。
そこで本研究では、RubisCO 経路を GL 供給系として利用したグリコール酸ポリマー合成系を構築した。
宿主として GL 酸化酵素欠損株（ΔglcD）Escherichia coli JW2946 株を用いた。
本代謝経路の構築には、酸化反応に対する基質特異性が高い酵素の方が適していると考えられたため、CO2/O2 基質特異性が比較的低い Rhodosprillum ruburum
由来の RubisCO を用いた。RubisCO、RuBP を供給するリン酸化酵素（PrkA）、
GL-CoA・3-ヒドロキシブチリル（3HB）CoA 供給酵素群および重合酵素の遺伝子を導入した組換え大腸菌を作成した。本組換え株を 2 % xylose を含むミネラ
ル培地で培養して得られたポリマーをガスクロマトグラフィーおよび 1H-NMR
によって解析した結果、合成されたポリマーは GL と 3HB を含む共重合体であることが確認された。次に、いくつかの光合成細菌から単離した 2PG 脱リン酸化酵素（PGPase）遺伝子を導入したところ、いくつかの条件では、ポリマー生
産性、GL 分率が上昇することが分かった。これらの結果から、RubisCO 経路を利用した GL ポリマーの合成が可能であることが示された。

Computational fluid dynamics simulation of Aspergillus oryzae mutant of
which hyphae fully disperse under liquid culture conditions.

Glycolate-based polyhydroxyalkanoate synthesis using ribulose 1,5bisphosphate carboxylase/oxygenase in engineered Escherichia coli

○Hikaru Ichikawa1, Ken Miyazawa1, Akira Yoshimi2, Keisuke Komeiji1,
Yoshikazu Kato3, Keietsu Abe1,2(1Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ., 2NICHe, Tohoku Univ., 3Mixing Technol.
Lab., Satake Chem. Equipment)

Shougo Ohgata1, Akihiro Nagata1, Jyuri Saitou1, Toshinori Yokoo1, Yuuki Kudou1,
Chiaki Hori1, ○Toshihiko Ooi1, Seiichi Taguchi2, Ken'ichiro Matsumoto1(1Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ., 2Grad. Sch. Agric., Tokyo Univ. Agric.)

Key words
simulation

Aspergillus oryzae, filamentous fungi, enzyme production, CFD

Key words

biosynthesis, polyhydroxyalkanoate, RubisCO

1Hp09

大腸菌共培養に向けたリアクター制御プロセスの開発

1Hp11

異なる人工遺伝子回路持つ二つの大腸菌による共培養系の構築○楠田 みのり, 戸谷 吉博, 清水 浩
（阪大院・情報）shimizu@bio.eng.osaka-u.ac.jp

岩崎 建史朗 1, 本庄 宏 1, 相馬 悠希 2, 鶴野 圭悟 1, 盧 鎮栄 1,
濱田 浩幸 1, ○花井 泰三 1
（1九大院・農, 2九大・生医研）
taizo@brs.kyushu-u.ac.jp【背景・目的】
微生物による有用物質の生産速度低下の原因の１つに、多数の遺伝子の過剰発現による代謝への負荷があげられる。その対策として、目的物質までの代謝経路を異なる株で分担し、それらを共培養することによって細胞当たりの負荷を軽減させるという方法がある。しかし、培養中に各株の菌体比が変動するという問題があり、最適な菌体比を維持するための培養プロセスの制御が必要である。本研究では、各菌株に異なる蛍光タンパク質を発現させることで細胞を区別し、菌体比を測定できると考えた。マイクロコンピューター Arduino Uno R3(Arduino Holding) を用いて、リアルタイムで蛍光強度を計測できる装置を開発し、異なる蛍光タンパク質を発現する大腸菌の共培養において菌体比のモニタ
リングを目指した。
【方法・結果】
大腸菌 MG1655(DE3)株を宿主とし、metB もしくは argH 遺伝子を欠失したアミノ酸要求性株を構築した。次に、緑色蛍光タンパク質 (GFP) もしくは赤色蛍光タンパク質 (RFP) を発現させるためのプラスミドをメチオニン要求性株とアルギニン要求性株にそれぞれ導入し、met-GFP 株と arg-RFP 株を構築した。そして、Arduino Uno R3、LED 光源、光センサーを用いて、GFP および RFP の蛍光強度を測定するための装置を開発した。連続培養中に供給する培地のアミノ酸濃度を変化させながら met-GFP 株を単一培養し、蛍光強度を自作の装置でモニタリングした結果、アミノ酸濃度の変化に伴った蛍光の増減が確認された。同様に arg-RFP 株の単一培養を行った結果、アミノ酸濃度が増加した際に菌体濃度の増加は確認されたが、蛍光強度の増加は見られなかった。この原因を明らかにするため、蛍光タンパク質の発現による負荷の影響を検討し、結果の改善を試みた。

【背景・目的】バイオマスから化学物質を生産する際には、バイオマスからグルコースなどの単糖を得る糖化プロセスが必要となる。糖化プロセスには、一般
的に糖化酵素が必要となるが、糖化酵素の生産、精製に多大なコストが必要となる。もし、バイオマスの糖化・発酵を同時に行う効率的なプロセスが構築できれば、バイオエネルギーの社会実装に応聞く貢献できると考えられる。
【方法・結果】本研究では、微生物の菌体密度をセンシングする仕組みであるク
オラムセンシングと呼ばれる機構を、大腸菌を溶かすファージが持つ溶菌遺伝
子の発現に利用した。この機構を溶菌遺伝子の発現に利用することで、菌体が十分に増殖した時に、溶菌する人工生体分子ネットワークを構築することが可能となる。この人工遺伝子回路を、糖化酵素生産大腸菌に導入することで、糖化酵素を十分に生産した後（つまり十分に菌体が増殖した時）に、糖化酵素を放出する大腸菌（糖化・溶菌株）を構築した。この糖化・溶菌株と目的の物質を生産する大腸菌株を共培養すると、バイオマス（実際はモデル物質であるセルビオース）から単糖が生成され、目的生産物質が生産された。

Development of reactor control process for co-culture of Escherichia coli

Coculture system using engineered E. colis with different synthetic genetic
circuits○Minori Kusuda, Yoshihiro Toya, Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words

Escherichia coli, coculture, fluorescent protein, bioreactor

Kenshiro Iwasaki1, Hiroshi Honjyo1, Yuki Soma2, Keigo Tsuruno1, Jinyeoung Rho1,
Hiroyuki Hamada1, ○Taizo Hanai1(1Fac. Agric., Kyushu Univ., 2Med. Inst. Bioreg., Kyushu Univ.)

Key words

synthetic biology, coculture, bioproduction

130

1Hp12

Efficient production of itaconic acid using a
psychrophile-based simple biocatalyst

1Hp14○Gonglinfeng Luo, Takahisa Tajima, Junichi Kato
(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)
jun@hiroshima-u.ac.jp

分裂酵母 Schizosaccharomyces pombe を用いた遺伝子
組換えヒトトランスフェリンの分泌生産○渡部 貴大, 山中 祐実, 大前 俊昭, 山崎 翔子, 小島 千明,
久保田 進, 原 太志, 小谷 哲也, イディリス アリムジャン（AGC）
takahiro.t.watanabe@agc.com

Easy preparation and coenzyme recovery make the whole-cell catalyst a more
promising approach than purified enzyme to be applied in industrial fields in a large
scale. However, the cell membrane can sometimes remain an obstacle for substrate
uptake of the whole-cell catalyst resulting a poor efficiency of biotransformation. In
this study, a whole-cell catalyst based on psychrophile Shewanella livingstonesis Ac10
was constructed. Psychrophiles are microorganisms which are able to survive andpropagate at a very low temperture close to the ice point. Their cell membrane ishighly flexible to maintain the substance exchange with environment, and its
permeability can be improved via heat treatment at a moderate temperature. In thisresearch, two enzyme genes were heterologously expressed in our biocatalyst toconvert citric acid to itaconic acid, which is a potential platform replacing thepetroleum-based counterparts in chemical industry. The membrane permeability of the
biocatalyst was improved by heat treatment at 45°C for 15 min and the productivity of
the cells after heat treatment was over 8-fold higher than those without heat treatment.
We are currently working on maintaining the membrane integrity of this biocatalyst fora long time to aquire a high final titer of the product.

【背景・目的】
トランスフェリン(Tf)はヒトや動物の血漿中に含まれる鉄結合性糖タンパク質
で、生体内では鉄イオンの貯蔵、運搬の役割を担っている。このような重要な生理活性から、Tf は幹細胞など様々な培養細胞の基本培地に添加する必須成分として知られている。一般的には、ヒトや動物の血清由来の Tf もしくは血清そのものを培地に添加する方法がよく用いられている。しかし、細胞治療や再生医療等の臨床応用の際には、ヒトや動物由来成分を用いることは安全上好まし
くなく、動物由来成分不含の製造プロセスにより生産された遺伝子組換え Tf を用いることが望まれている。そこで、我々は遺伝子組換えヒト Tf（hTF）の生産を目的に、AGC 保有の分裂酵母 Schizosaccharomyces pombe（S. pombe）を宿主としたタンパク質発現技術を用い、hTF 分泌生産系を構築した。今回、hTF
発現株作製、及びフェドバッチ培養の検討結果について報告する。
【方法・結果】
hTF 発現 S. pombe 株作製に際して、最適なプロモーター、分泌シグナル、及び宿主株を各々検討した結果、プロモーターとして hCMV プロモーターを、分泌シグナルとしてヒト PDI1 由来配列を、宿主株としてプロテアーゼ遺伝子 8 重
破壊株を選択した。更に宿主株については、1,3-β-glucanosyltransferase をコードする gas2 遺伝子を削除する事で、hTF の生産性及び純度が向上した。また、
hTF 発現ベクターの宿主株染色体への多コピー導入を検討し、更なる分泌量向上を実現した。得られた hTF 発現株を用い、フェドバッチ培養による高密度培養を行った結果、hTF 分泌生産量はバッチ培養時より約 10 倍向上した。イオン
交換カラムにて培養上清から hTF の高純度精製を実施し、精製品の鉄イオンの結合活性を確認できた。

Efficient production of itaconic acid using a psychrophile-based simple
biocatalyst

Secretory production of recombinant human transferrin using the fission
yeast Schizosaccharomyces pombe○Gonglinfeng Luo, Takahisa Tajima, Junichi Kato
(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)○Takahiro Watanabe, Yumi Yamanaka, Toshiaki Oomae, Shoko Yamazaki,
Chiaki Kojima, Susumu Kubota, Futoshi Hara, Tetsuya Kotani, Alimjan Idiris(AGC Inc.)

Key words

psychrophile, membrane permeability, itaconic acid, heat treatment

Key words

yeast, fed-batch culture, secreted protein

1Hp13

Heterotrophic and Mixotrophic growth of
Haematococcus pluvialis for the production ofastaxanthin using wastewater as a carbon source

1Hp15

抗体生産性及び品質の向上を目指した CHO 細胞における転写因子 TFE3 の機能解析○黒田 昂輝 1, 山野-足立 範子 1,2, 古賀 雄一 1, 大政 健史 1,2（1阪大院・工, 2MAB組合）
omasa@bio.eng.osaka-u.ac.jp○Nombuso Temalangeni Dlamini1, John Chi-Wei Lan2
(1Grad. Sch. Biotechnol. and Bioeng., Coll. Eng., Yuan Ze Univ.,
Taiwan, 2Biorefin. Bioprocess Eng. Lab., Dept. Chem. Eng. Mater.
Sci., Coll. Eng., Yuan Ze Univ., Taiwan)
tembusonkhosi@gmail.com
Haematococcus pluvialis (chlorophyceae) is a fresh water microalgae studied for its
adaptive response to harsh environmental conditions and is known as the “king ofantioxidant”. In this study, the microalgae were grown in either heterotrophic or
mixotrophic conditions using wastewater as a medium for the production ofastaxanthin. Mixotrophic microalgae showed higher specific growth rate, final biomass
concentration and production of astaxanthin than microalgae cultivated underheterotrophic conditions. Moreover, supplementation of the inorganic culture medium
with wastewater led to significant improvement in microalgal biomass production
when compared with the culture enriched with sodium acetate due to the presence ofgrowth promoting nutrients in wastewater. Furthermore, the dried biomass was
extracted using generally recognized as safe solvents (acetone, ethanol and a mixtureof the two solvents at different ratios). The amount of extracted astaxanthin wasdetermined by HPLC analysis. Mixotrophic cultivation of H. pluvialis using
wastewater could be considered a feasible alternative to reduce the costs of microalgal
biomass production, since it does not require the addition of expensive nutrients to theculture medium.

【背景・目的】ゴルジ体は主にタンパク質の糖鎖修飾を主とする、翻訳後修飾の役割を担う細胞小器官である。翻訳後修飾は生体内生理活性に必須であることから、ゴルジ体の活性化は抗体の生産性や品質の向上に繋がると考えられる。そこで、我々はゴルジ体を包括的に制御する転写因子 TFE3 に着目した。抗体生産細胞において、TFE3 の発現量を適切に制御すれば、ゴルジ体の機能を最大限に引き出すことができ、抗体の生産性や品質を向上させることができると考えた。TFE3の機能は HeLa 細胞などにおいては確認されているが、抗体医薬品生産の代表的な宿主細胞である CHO 細胞においては一切研究されておらず、その機能は未知である。そこで本研究では CHO 細胞における TFE3 の機能を解明することを目的とした。
【実験方法・結果・考察】
CHO 細胞培養時に、ゴルジ体へストレスを誘導する薬剤モネンシンを終濃度
10 μg/ml となるよう、培地に添加し、数時間培養後の TFE3 の局在変化及びゴルジ体関連タンパク質の発現量変化を解析した。蛍光免疫染色により TFE3 の局在を解析した結果、モネンシン添加前は TFE3 が細胞に一様に広がっていたのに対し、添加 4 時間後には、TFE3 の核との共局在が観察され、ゴルジ体へのストレスにより TFE3 が核へ移行していると推定された。また、添加 24 時間
後にゴルジ体構造タンパク質である GM-130 の mRNA 発現量を調べたところ、添加前の約 1.6 倍に上昇していた。すなわち、ゴルジ体へのストレスによりゴルジ体関連タンパク質の発現が誘導されていると考えられ、TFE3 は HeLa 細胞内におけるものと同様の役割を CHO 細胞内でも有していることが示唆された。

Heterotrophic and Mixotrophic growth of Haematococcus pluvialis for the
production of astaxanthin using wastewater as a carbon source

Functional analysis of TFE3 in CHO cells aiming to improve antibody
productivity and quality○Nombuso Temalangeni Dlamini1, John Chi-Wei Lan2
(1Grad. Sch. Biotechnol. and Bioeng., Coll. Eng., Yuan Ze Univ., Taiwan, 2Biorefin.
Bioprocess Eng. Lab., Dept. Chem. Eng. Mater. Sci., Coll. Eng., Yuan Ze Univ.,
Taiwan)

Key words

Haematococcus pluvialis, astaxanthin, mixotrophic, heterotrophic○Kouki Kuroda1, Noriko Yamano-Adachi1,2, Yuichi Koga1, Takeshi Omasa1,2(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2MAB)

Key words
TEF3

Chinese hamster ovary cells, Therapeutic antibody, Golgi apparatus,

131

1Hp16

CHO 細胞バイオプロセスのための細胞自家蛍光情報の
利用検討

1Hp18

○長谷川 倫男（アズビル・技開）
n.hasegawa.om@azbil.com【背景と目的】
抗体医薬品製造のバイオプロセスにおいては、一般的に CHO 細胞が使用されている。効率的に抗体を生産できるように、細胞の状態をモニタリングしプロ
セスを制御することを目的として、CHO 細胞培養中の、細胞の自家蛍光変化を調べた。一般的に細胞は、可視光域において、NADH やフラビンに由来する自家蛍光を呈する。このような蛍光の蛍光強度は、概して、グルコース代謝や酸素呼吸と相関することが報告されている。今回、CHO 細胞において、自家蛍光スペクトルから、プロセス管理に有用な情報が抽出できるかを検討した。

マルチモーダルクロマト担体に対するタンパク質の吸着挙動解析○大原 彩香 1, 栗山 尚浩 2, 黒田 典孝 2, 高橋 良輔 2, 迫田 裕美子 2,
堀内 淳一 1, 熊田 陽一 1
（1京工繊大院・工芸科学, 2ワイエムシィ）
kumada@kit.ac.jp【方法と結果】
CHO 細胞をフラスコにて培養し、細胞集団の 3D 蛍光スペクトルを測定した。
また、粒子を計測する装置で、一細胞ごとの蛍光強度を測定した。その結果、トリパンブルー法による細胞の生存率に応じて、スペクトルピークが長波長側にシフトすることが観察された。また、この変化は、測定波長を固定した場合、蛍光強度の変化として測定できた。3D 蛍光スペクトルを主成分分析したとこ
ろ、概ね培養の初期・中期・後期と分けられると見ることができ、生存率が変化し始める段階から、細胞集団の 3D 蛍光スペクトルの変化が検出されていたと考えている。一方、これらの変化は培地中のグルコース濃度変化やアンモニ
ア、乳酸生成とは相関がみられなかった。さらに、アンチマイシン A により酸
化的リン酸化を阻害したときの蛍光変化を測定した。その結果、蛍光強度等に若干の変化が観察された。従って、CHO 細胞においても、生存率だけではな
く、代謝変化に関連した蛍光変化が認められたと考えている。細胞の蛍光スペ
クトルの解析から、工業的に利用できる指標が得られないか探っている。

【背景・目的】マルチモーダルクロマト担体は、静電相互作用や疎水性相互作用など、複数の相互作用の組合せが可能な構造のリガンドを有し、従来のクロマ
ト担体では分離が困難な高次構造を有するタンパク質やポリマーの選択的な分離に適している。一方でそのターゲット分子に対する吸着性は、ターゲット分子の分子量やリガンドの構造に基づき、pH やイオン強度によって大きく異なる
ことが知られているが、これらの吸着性への影響についてはほとんど詳細が明らかになっていない。本研究では、市販のマルチモーダルクロマト担体に対し、ターゲット分子の吸着性を評価し、リガンドの分子構造や担体の素材特性との因果関係を明らかにすることを目的とした。
【方法】モデルとなるターゲット分子としてヒト IgG を用いた。またクロマト
担体として、GE 社製の Capto adhere を用い、クロマト担体を、異なる NaCl 濃度の緩衝液(pH 2〜pH 10.8)で平衡化したのち、同じ緩衝液中に希釈したヒト IgGと混合し、室温で緩やかに撹拌しながらインキュベーションした。上清中のヒト IgG 濃度を吸光度法で定量し、担体上に吸着したヒト IgG 量を逆算した。
【結果・考察】代表的なマルチモーダルクロマト担体の Capto adhere のヒト IgGに対する吸着性を異なる pH 及び異なる塩濃度で評価した。その結果、Capto
adhere の吸着範囲は、既存の陰イオン交換体よりも吸着範囲が広く、また 300
mM 以上の NaCl 存在下においてもヒト IgG の吸着性を維持できることが明らかとなった。この結果は Capto adhere のヒト IgG に対する吸着性が単に静電的相互作用のみならず、疎水性相互作用や水素結合等の寄与も大きいことが示された。発表では他のマルチモーダルクロマト担体についても報告し、また、カラムを用いたクロマト担体の評価についても述べる。

Study of autofluorescence spectrum of CHO cell cultivation for bioprocessmonitoring.

Adsorption characteristics of proteins against multimodal chromatographic
resins○Norio Hasegawa(Technol. Devel. Hdqrs., Azbil Corp.)○Ayaka Ohara1, Naohiro Kuriyama2, Noritaka Kuroda2, Ryosuke Takahashi2,
Yumiko Sakoda2, Jun-ichi Horiuchi1, Yoichi Kumada1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2YMC CO., LTD.)

Key words

CHO cell, autofluorescence, fluorescence spectra, bioprocess

Key words

multimodal chromatography, resin

1Hp17

新規プロテイン A 非含有セラミックス担体による血清
中イムノグロブリン G の精製

1Ip03

オーランチオキトリウム属における脂質生産関連遺伝子の発現解析○加藤 且也 1, 北村 昌大 1, 永田 夫久江 1, 笠原 真二郎 2（1産総研・日特ラボ, 2日本特殊陶業）
katsuya-kato@aist.go.jp○長谷川 真輝 1, 渡邉 研志 1, Marie Ting Perez Charose 1, 黛 新造 2,角田 祐介 3, 秋 庸裕 1
（1広島大院・統合生命科学, 2出光興産, 3中国電力）
aki@hiroshima-u.ac.jp【目的】近年、副作用が少ない次世代の医薬品として抗体医薬品が注目されている。抗体の分離・精製過程で用いられる従来の抗体精製カラム用粒子では、プロテイン A の様な抗体と特異的に結合する高価なタンパク質が用いられている。また、粒子に結合した抗体の回収時に用いる pH2〜4 の酸性溶液が、回収後の抗体の凝集や変性を引き起こす原因ともなり、より安価で酸性溶液を用いずに抗体を精製できるカラム用粒子の開発が課題となっていた。そこで、本研
究では、プロテイン A を含有せず、かつ血清中のイムノグロブリン G に対して高い選択的吸着特性を示すセラミックス粒子の開発を行った。
【方法と結果】今回作製した多孔質セラミックス粒子は、高い比表面積(100m2/g以上)を持ち、抗体（I ｇ G）の分子サイズに適合するメソ孔(〜10nm)を有することが特徴である。本粒子を用いて血清中に含まれる主成分タンパク質である
抗体（イムノグロブリン G :I ｇ G）、アルブミン、トランスフェリンを同量含む混合溶液から、抗体（IgG）の選択的な回収を試みた。従来のプロテイン Aを用いたクロマトグラフィー用担体と同程度の時間で処理可能であった。3 種類のタンパク質のうちで、抗体（IgG）だけが、多孔質セラミックス粒子に対して非常に高い吸着量（143 ug/mg）を示し、アルブミン（12 ug/mg）やトラン
スフェリン（6 ug/mg）の吸着量の 10 倍程度であったことから、多孔質セラミッ
クス粒子が、抗体（IgG）に対して優れた吸着選択能力を示すことが分かった。

【背景・目的】ラビリンチュラ類オーランチオキトリウム属は従属栄養条件下で高度に増殖し、高度不飽和脂肪酸やカロテノイドなどの脂質類を著量蓄積する。
その応用範囲を安価な化成品やバイオ燃料の生産へ拡張するには、より安価な原料を培養基質として利用することが望まれる。そこで、当研究室では本微生物の酢酸資化性に着目し、様々な未利用・廃棄バイオマスや排気ガスから酢酸生成菌によって生産した酢酸を炭素源とした油脂発酵を試みている。本研究では、オーランチオキトリウム属の酢酸資化時における遺伝子発現プロファイルを解析し、脂肪酸生産性の向上に向けた育種標的を探索した。
【方法・結果】Aurantiochytrium limacinum SR21 株を酢酸を単一炭素源として培養したところ、グルコースの場合と比較して増殖と脂肪酸生成の遅延が認められた。そこで、対数増殖期の中期と終期に回収した菌体より抽出した mRNA から cDNA を合成し、リアルタイム PCR で中心代謝系遺伝子の発現レベルを比較した。その結果、対数増殖期中期では酢酸を脂肪酸合成の基質であるアセチル
CoA に変換するアセチル CoA シンテターゼの遺伝子発現が酢酸資化時に有意に高かった。一方、脂肪酸生成に必須な補酵素 NADPH を供給するリンゴ酸酵素及び 6-ホスホグルコン酸脱水素酵素の遺伝子発現レベルが酢酸資化時には低く、NADPH 供給強化の必要性が示唆された。以前に行ったメタボローム解析
において、リンゴ酸酵素の基質であるリンゴ酸が酢酸資化時の細胞内に蓄積していたことから、同酵素遺伝子の発現増強が NADPH 供給を改善することが期待され、脂肪酸の生産強化のための標的となりうることが示唆された。

Purification of immunoglobin G in serum using novel non-protein A
ceramics particles

The expression analysis of lipid production-related genes in the genus
Aurantiochytrium○Katsuya Kato1, Masahiro Kitamura1, Fukue Nagata1, Shinjiro Kasahara2(1AIST-NGK Labo., AIST, 2NGK Spark Plug Co., Ltd.)Key words

antibody, purification, protein A, IgG○Masaki Haegawa1, Kenshi Watanabe1, Charose Marie Ting Pere1,
Sinzou Mayuzumi2, Yusuke Sumita3, Tsunehiro Aki1
(1Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 2Idemitsu Kosan Co., Ltd, 3The
Chugoku Electric Power Co., Inc.)

Key words
Eukaryote

Aurantiochytrium, Lipid production, marine microorganisms,

132

1Ip04

麹菌 Aspergillus oryzae の不飽和化酵素遺伝子の共過剰発現化による遊離ジホモ-γ-リノレン酸の生産向上

1Ip06○玉野 孝一 1,2, 安中 優太 3, 伊藤 あやの 3, 三浦 愛 1, 菅 英一郎 4,小山 泰二 4, 田村 具博 1,2（1産総研・生物プロセス, 2産総研・CBBD-OIL, 3北海道ハイテ
ク専門学校, 4野田産研）
tamano-k@aist.go.jp

油脂酵母 Lipomyces starkeyi の遺伝子的改変による長鎖長脂肪酸の生産○宮本 捺央 1, Amza Rezky Lastinov 1, Prihardi Kahar 2, 荻野 千秋 1,
近藤 昭彦 2
（1神戸大院・工, 2神戸大院・科技イノベ）
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp

微生物の生産する遊離脂肪酸（FFA）やその誘導体には、医薬品・健康補助食
品やその原料として有用なものがある。そこで、FFA の高生産化と機能改良を、物質生産に優れた麹菌 Aspergillus oryzae を代謝工学的に改変することで、取り組んできた。これまでの研究で、アシル CoA 合成酵素遺伝子 faaA の破壊
により、FFA 生産性を野生株の 9.2 倍に増大させることができた。さらに faaA破壊株で、リノール酸からアラキドン酸への変換に働く 3 種類の遺伝子をモル
ティエレラ菌から単離して異種発現させた ARA1 株を構築した。この ARA1 株
は、アラキドン酸の一反応前の生合成物質であるジホモ-γ-リノレン酸（DGLA）
まで、遊離型で生産できることを明らかとした。そこで今回は、ARA1 株の遊
離 DGLA 生産を向上させるため、生合成の中間反応であるステアリン酸からリ
ノール酸への変換に働く麹菌本来の不飽和化酵素の強化に取り組んだ。
麹菌ゲノムには、10 種類の不飽和化酵素遺伝子の存在が予測されている。これ
らの一部はステアリン酸からオレイン酸への変換に働く Δ9-不飽和化酵素、残りはオレイン酸からリノール酸への変換に働く Δ12-不飽和化酵素をコードしている。しかし、この 10 個の中でどれが Δ9 型でどれが Δ12 型なのか解明されていない。さらに、それぞれの型において、最も機能している不飽和化酵素遺伝
子はどれであるのかも、不明である。そこで、ARA1 株よりこれらの不飽和化
酵素遺伝子を個別に過剰発現させた株をそれぞれ構築し、遊離脂肪酸組成を解析した。その結果、過剰発現化により、Δ9-不飽和化と Δ12-不飽和化を最も促進させる不飽和化酵素遺伝子を、1 個ずつ選出することができた。そこで次に、
これらの選出された遺伝子を共に過剰発現させた株を構築した結果、以前の生産株と比べて、遊離 DGLA の割合を 8.1%から 12.9%に、生産性を約 1.5 倍に、高めることができた。

【背景と目的】近年、C20 以上の長鎖長脂肪酸がアルツハイマー病・がんの予防など、人の健康の維持や改善に繋がる報告が数多くされており、長鎖長脂肪酸の需要は高まってきている。そこで、再生可能資源を基質とした微生物からの生産が期待されている。本研究で使用した油脂酵母 L. starkeyi は、C11〜C24 まで
幅広い炭素数の脂肪酸を合成することができ、食料と競合しない植物バイオマ
スを糖源として脂肪酸合成が可能である。以上の特徴から、希少価値の高い長
鎖長脂肪酸の生産での利用が期待されている。本研究では長鎖長脂肪酸の増加に向けた遺伝子組み換え方法の確立を試みた。
【実験方法】qPCR を用いて、酵母内の代謝経路を触媒する酵素の活性を測定した。そこから L. starkeyi 由来のプロモーターを選択した。発現モデル遺伝子として蛍光タンパク(GFP)をコードするプラスミドの設計と構築を行った。作成したプラスミドを酢酸リチウム法 1 によって導入した。得られた遺伝子導入株と野生株について、FACS を用いて GFP の発現量を指標にして発現系の評価を行った。
【結果と考察】遺伝子導入株と野生株を比較すると、遺伝子導入株の蛍光強度が比較的に高い結果となった。このことから、構築した遺伝子発現系の有効性は
GFP の発現の比較により確認できた。本研究では、L. starkeyi 由来遺伝子を基づいてゲノム組み込み型プラスミドを作製し、L. starkeyi のゲノムに特定の遺伝子を破壊さらに導入することも確認できたので、当株における遺伝子組み換え方法の確立は成功した。また、当株の脂肪酸代謝における代謝改変を行い、長鎖長脂肪酸の生産を行っている。
【参考文献】
1
Christopher H. Calvey Laura B. Willis Thomas W. Jeffries 2014 Curr Genet
60:223-230 An optimized transformation protocol for Lipomyces starkeyi

Increased production of free dihomo-γ-linolenic acid by co-overexpression ofdesaturase genes in Aspergillus oryzae

Production of long-chain fatty acids by genetic modification of theoleaginous yeast Lipomyces starkeyi○Koichi Tamano1,2, Yuta Yasunaka3, Ayano Itoh3, Ai Miura1, Eiichiro Kan4,
Yasuji Koyama4, Tomohiro Tamura1,2(1BPRI, AIST, 2CBBD-OIL, AIST, 3Hokkaido High Technol. Coll., 4Noda Inst. Sci.
Res.)

○Nao Miyamoto1, Lastinov Amza Rezky1, Kahar Prihardi2, Chiaki Ogino1,
Akihiko Kondo2(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

Aspergillus oryzae, fatty acid, production, metabolic engineering

Key words

Lipomyces starkeyi, oleaginous yeasts, long-chain fatty acids

1Ip05

油性酵母 Lipomyces starkeyi によるトリテルペノイド
生産

1Ip07

トランスオミクスによる出芽酵母の中心炭素代謝制御機構の解明○小島 基 1, 金本 拓也 2, 鈴木 宗典 1, 關 光 2, 村中 俊哉 2,
中村 克哉 1（1神戸天然物化学(株), 2阪大院・工）m_kojima@kncweb.co.jp

油性酵母は一般的な出芽酵母に比べ脂肪酸の生産量が多いことから、近年、バイオディーゼル生産宿主として盛んに研究されている。演者らは油性酵母の特性に着目し、15 種の油性酵母の二次代謝産物の網羅的な解析を行い、脂肪酸生産性の高い Lipomyces starkeyi を物質生産宿主として選定した 1)。脂肪酸生合成と同様の前駆体アセチル CoA から生産されるテルペノイドに着目し、弊社にて確立した形質転換法を利用してヨモギ属植物が生産する抗マラリア治療薬アル
テミシニン(セスキテルペノイド)の前駆体生産に成功している 2)。本研究では、様々な生理活性が報告されているトリテルペノイド、β-アミリン及びルペオー
ルの生産を検討した。最も重要な漢方原料植物の一種であるウラルカンゾウ由来の β-アミリン合成酵素(bAS)及びルペオール合成酵素(LUS)遺伝子を L. starkeyi
由来 TEF プロモーター制御下で発現させるプラスミドを作製し、L. starkeyi ゲ
ノム上へ導入した。RT-PCR により、これらの遺伝子転写産物が検出されたことから、bAS 及び LUS 遺伝子の発現を確認した。そこで、代謝産物を GC-MSにより分析した結果、bAS 発現株及び LUS 発現株において、標準品と保持時間が同じピークが検出された。さらに、フラグメントパターンを比較したところ一致したことから、それぞれ β-アミリンとルペオールと同定した。これまで L.
starkeyi を宿主としたトリテルペノイド生産報告例は無く、世界初の報告となる。
1) 小島基ら 第 66 回日本生物工学会大会講演要旨集2) 小島基ら 日本農芸化学会 2017 年度大会講演要旨集

Production of triterpenoids, β-amyrin and lupeol, by the recombinantoleaginous yeast, Lipomyces starkeyi.
○Motoki Kojima1, Takuya Kanamoto2, Munenori Suzuki1, Hikaru Seki2,
Toshiya Muranaka2, Katsuya Nakamura1(1KNC Laboratories Co., Ltd., 2Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
metabolites

oleaginous yeast, Lipomyces starkeyi, triterpenoid, secondary○山崎 一輝, 丸山 正晴, 西野 駿佑, 岡橋 伸幸, 清水 浩, 松田 史生（阪大院・情報）
fmatsuda@ist.osaka-u.ac.jp【背景と目的】
出芽酵母は食品産業やバイオリファイナリーの重要な宿主であり、中心炭素代
謝の詳細な理解と制御が求められている。そこで本研究では、これまで取得してきた細胞内代謝物量、酵素タンパク量、代謝フラックスのデータを統合した
トランスオミクス解析を行い、増殖や代謝摂動に関与する代謝制御機構の解明
を試みた。
【方法】
Saccharomyces cerevisiae 野生株 (S288C) と中心炭素代謝の 1 遺伝子破壊株 11 種の計 12 種を synthetic dextrose 培地で培養し、対数増殖期の菌体をプロテオー
ム、メタボローム解析に供した。加えて、補酵素は専用キットで測定した。13C
代謝フラックス解析では、[1-13C]glucose 培地で菌体を培養し、たんぱく質由来
アミノ酸の 13C 標識割合からフラックス分布を決定した。フィードバック制御に関与する代謝物は反応速度式のパラメータフィッティングにより推定した。
【結果と考察】S. cerevisiae 12 株について、35 反応のフラックス値、43 個の代謝物、92 個の酵
素タンパク量データを取得した。相関解析を行った結果、増殖速度は解糖系酵素群と負の相関、アミノ酸合成/クエン酸回路酵素群と正の相関が見出され、このような制御を担う分子として Gcn2/Gcn4 が関与する可能性が示唆された。さらにペントースリン酸経路の 6-phosphogluconate dehydrogenase のフラックスは反応に関与する NADP/NADPH 比との間に明確な相関がみられなかった。そこ
で、数理モデルを用いて候補代謝物の推定したところ、代謝物からアロステリッ
ク制御を受けている可能性が示唆された。

Elucidation of regulation mechanism of central carbon metabolism in
Saccharomyces cerevisiae by transomics○Kazuki Yamasaki, Masaharu Maruyama, Syunsuke Nishino, Nobuyuki Okahashi,
Hiroshi Shimizu, Fumio Matsuda(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, central metabolism, transomics

133

1Ip08

ロテノン処理に対するヒト乳がん細胞株 MCF-7 の代謝
アダプテーション解析

1Ip10○辻 周真, 丸山 正晴, 岡橋 伸幸, 松田 史生（阪大院・情報）
fmatsuda@ist.osaka-u.ac.jp

蛍光式溶存酸素センサーを使用した呼吸活性の測定法○高寺 美砂都 1, 一瀬 涼 2, 山崎 思乃 1, 片倉 啓雄 1
（1関西大・化生工, 2関西大院・理工）
katakura@kansai-u.ac.jp【背景】
がん細胞が持つ特異的な代謝状態の実態を、代謝工学的なアプローチに基づいて解析することで、抗がん剤を処理したがん細胞が示す代謝適応過程に新たな知見をもたらすことが期待される。これまでに呼吸鎖複合体 I 阻害剤をモデルとした 13C-代謝フラックス解析を行い、ロテノン処理 24 時間後の代謝リワイ
アリングを明らかにした。そこで、本研究では細胞内代謝物プロファイルの時
系列データを取得することで、より動的な代謝適応メカニズムの推定を試みた。
【方法】
ヒト乳がん由来細胞株 MCF-7 を 6cm プレートに播種し、15 時間培養後、100nM ロテノンを含む培地に交換した。その後 3, 6, 9, 24 時間の生細胞数測定と細胞回収を行った。細胞内代謝物はメタノール・クロロホルム・水法で抽出後、GC-MS と LC-MS（イオンペア法、PFPP 法）で分析を行った。
【結果・考察】MCF-７に 100 nM ロテノンを処理した際の増殖挙動を確認したところ、処理後
3 時間は生細胞数が 0.77 倍に減少し、その後細胞増殖が回復した。これは、代謝を変化させることで、ロテノンの呼吸鎖阻害による ATP 産生の低下に適応したためであると推測された。この時の詳細な代謝変化を捉えるために、細胞内代謝物量を GC-MS と LC-MS で計測したところ、ロテノン処理後 24 時間目ではクエン酸、が 0.33 倍、イソクエン酸が 0.51 倍に減少し、乳酸が 2.6 倍に増加することが分かった。これはロテノン 100 nM 処理による酸化的な TCA サイクルの不活化と解糖系の活性化の結果と考えられ、主に解糖系で ATP を産生する
代謝状態に移行したことが示唆された。さらに、細胞増殖に必要な核酸の前駆体量を観測したところグアノシン、アデニン、シチジン、イノシンがロテノン
処理後 9 時間でそれぞれ、7.8, 1.7, 2.4, 2.0 倍に増加しており、de novo 核酸生合成が活性化していると推察され、増殖の再開に寄与した可能性が示唆された。

【背景と目的】呼吸は生物が生存するためのエネルギーを得る過程で非常に重要な代謝である。微生物の呼吸活性の測定法として、通気と排気の酸素濃度の差から求める方法、培養液中の酸素濃度の減少速度から求める方法が知られているが、何れもジャーファーメンタースケールで培養する必要がある。そこで、蛍光式溶存酸素センサーを用いて、サンプリングした少量の菌体の呼吸活性を測定する方法を考案した。
【方法】培養液中の酸素濃度 C [mol/L] の変化速度は dC/dt = kLa (C*−C) −QO2X
で与えられる。ただし、kLa は酸素移動容量係数[1/h]、C*は飽和酸素濃度 [mol/L]、QO2 [mol/(g-cell・h)] は酸素比消費速度、X [g-cell/L] は細胞濃度である。通気を停止すると右辺第 1 項はゼロになるので dC/dt = −QO2X となる。従って溶
存酸素濃度の変化速度 dC/dt と細胞濃度 X から QO2 を求めることができる。溶存酸素濃度の測定には Able-Biott 社の蛍光式溶存酸素センサーを用いた。
【結果と考察】4 ODunits の細胞を遠心分離で回収し、1 g/L のグルコースを含む
MRS 培地 3 ml に懸濁した。内壁に蛍光膜 (Biott) を貼り付けた試験管 (16 mm×
105 mm) に入れ、ボルテックスして酸素飽和させた後、静置して溶存酸素濃度を経時的に測定した。蛍光膜に微細な泡が付着すると異常値を与えるため、培地には消泡剤を添加する必要があった。乳酸菌は通性嫌気性菌であるが、MRS
培 地 で 通 気 回 分 培 養 し た Leuconostoc mesenteroides NBRC 100496 の QO2 は15.9±0.7 mmol/(g-cell・h) であり、パン酵母に匹敵する呼吸活性があることがわかった。

Metabolic adaptation analysis of rotenone-treated MCF-7 breast cancer cells

Measurement of respiratory activity using fluorometric dissolved oxygen
sensor○Shuma Tsuji, Masaharu Maruyama, Nobuyuki Okahashi, Fumio Matsuda(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)○Misato Takatera1, Ryou Ichinose2, Shino Yamasaki-Yashiki1, Yoshio Katakura1(1Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ., 2Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ.)

Key words

rotenone, metabolic adaptation, MCF-7

Key words
respiratory activity, dissolved oxygen, fluorescent film, Leuconostoc
mesemteroides

1Ip09

C 代謝フラックス解析を用いた非上皮系細胞株の定量
的代謝比較

1Ip11

13

○島 知輝, 丸山 正晴, 岡橋 伸幸, 松田 史生（阪大院・情報）
fmatsuda@bio.eng.osaka-u.ac.jp

乳酸菌の高密度培養のための好気的流加培養による乳酸生産の抑制○一瀬 涼 1, 高寺 美砂都 2, 山崎 思乃 2, 片倉 啓雄 2
（1関西大院・理工, 2関西大・化生工）
katakura@kansai-u.ac.jp[背景・目的]13
C 代謝フラックス解析法は、さまざまな生物種の細胞内代謝反応速度を計測できる。活発に増殖するがん細胞で中心炭素代謝が活性化していること着目し、これまでに、上皮系細胞株の解析を行い、代謝工学的な観点からその特徴を明らかにしてきた。本研究では非上皮系細胞株に 13C 代謝フラックス解析を適用し、代謝フラックス分布の比較解析を試みた。
[方法]
ヒト神経膠芽腫由来細胞株 YKG-1 は 1.0×106 個、ヒト繊維芽肉腫由来細胞株
HT-1080 は 5.0×105 個の細胞を 10 cm プレートに播種し、[1-13C]グルコース含有培地で培養した。0, 12, 16, 20, 24 時間後の細胞数を画像解析ソフトで、培地成分中の変化を HPLC で計測した。細胞内代謝物はメタノール・クロロホルム・
水法で抽出し、tert-ブチルジメチルシリル化後、GC-MS で 13C 標識割合を測定した。代謝フラックス分布は専門ソフトウェア mfapy で推定した。
[結果・考察]YKG-1、HT-1080 細胞の比増殖速度、物質収支、細胞内代謝物の 13C 標識割合の計測を行い、代謝フラックス分布を推定することに成功した。2 株のフラックス分布を比較すると、取り込まれたグルコースの 80%以上を乳酸として排出するワールブルク効果が観察されること、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ反応の代謝フラックスが低く保たれていることなどが分かった。これらの代謝的特徴は、上皮系細胞株とも共通であった。一方、解糖系からペントースリン酸経路への分岐する反応および、細胞外から取り込んだグルタミンを TCA サイクル
へ流入させる反応の代謝フラックスはがん種間で異なっており、フラックスレ
ベルでの代謝計測の重要性が明らかとなった。

【背景と目的】 乳酸菌は増殖に伴い著量の乳酸を生産し、培地の pH は低下する。例え pH の低下を抑えても、乳酸自体による阻害のため、乳酸菌の高密度培養や高効率の物質生産は難しい。乳酸菌が乳酸を生産するのは、解糖系で消費した NAD+を乳酸脱水素酵素（LDH）の反応で再生するためであるから、LDH
以外の代謝で NAD+を再生できれば乳酸の生産を抑制できるはずである。そこ
で NAD+再生系として、 膜結合型オキシダーゼによる呼吸代謝に注目した。更に、流加培養によって解糖系のフラックスを制限することで、乳酸生産の抑制を試みた。本研究の目的は好気的流加培養による乳酸生産の抑制によって、乳酸菌の高密度培養を実現することである。
【方法】 Lactococcus lactis MG1363 を 1 L h-1 の通気で好気的に 30℃で培養した。
前培養液から回収した菌体を 800 mL のエキス類とグルコースを含まず、ヘムを 2.5 mg L-1 含む MRS 培地に植菌し、グルコース 1.1〜33.4 g L-1 とヘムを 2.5
mg L-1 含む MRS 培地を、ある比増殖速度を与えるよう指数的に流加した。
【結果と考察】回分培養では最大の比増殖速度が 0.77±0.14 h-1、その間の乳酸の比生産速度 ρは 1.2±1.5 g g-cell-1 h-1 であり、増殖菌体あたりの乳酸生産量 YL/X は 1.80±0.03 g
g-cell-1 、菌体収率 YX/S は 0.22±0.04 g-cell g-glucose-1 であった。これに対し、
μ=0.38±0.02 h-1 の流加培養では、ρ は 0.11±0.02 g g-cell-1 h-1 にとどまり、YL/X は
0.29±0.07 g g-cell-1 に低下し、YX/S は 0.38±0.07 g-cell g-glucose-1 に向上した。流
加培養では回分培養に比べて、菌体収率が向上すると共に、YL/X は回分培養の約 6 分の 1 に低下した。μ を 0.16〜0.46 h-1 の範囲で変更して乳酸生産を検討したところ、0.38 h-1 以下で乳酸生産が抑制された。発表では乳酸を抑制した長時間の流加培養でどこまで菌体濃度が増加したかを報告する。

Quantitative metabolic profiling of non-epithelial cancer cells using 13CMetabolic flux analysis

Suppression of lactic acid production by aerobic fed-batch culture for highdensity culture of lactic acid bacteria○Tomoki Shima, Masaharu Maruyama, Nobuyuki Okahashi, Fumio Matsuda(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words
cancer13

C-metabolic flux analysis, central carbon metabolism, non-epithelial○Ryo Ichinose1, Misato Takatera2, Shino Yamasaki-Yashiki2, Yoshio Katakura2(1Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ., 2Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ.)

Key words
lactateLactococcus lactis, fed-batch culture, metabolic analysis, repression of

134

1Jp03

ROCK inhibitor の添加が hiPS 細胞集塊の細胞外マトリックスに与える影響

1Jp05○松本 崇揮, 金 美海, 紀ノ岡 正博（阪大院・工）kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp

単一細胞トランスクリプトーム解析に基づく血中循環腫
瘍細胞の上皮間葉転換状態の評価○山川 ひとみ 1, 根岸 諒 1, 下山 達 2, 小泉 史明 2, 田中 剛 1,
松永 是 1, 吉野 知子 1
（1農工大院・工, 2がん・感染症センター都立駒込病院）
y-tomoko@cc.tuat.ac.jp【背景と目的】人工多能性幹細胞 (iPS 細胞) の培養法では，低コストで大量細胞を得るために集塊培養が用いられている．ヒト iPS 細胞の集塊培養の課題の 1
つとして，同様の手法で培養を行ったとしても，様々な細胞株と培地の組み合
わせによって得られる細胞数や細胞集塊の形状が大きく異なり，目的の細胞を安定して供給することが難しい点が挙げられる．この問題を解決するために，
ア ポ ト ー シ ス な ど の 細 胞 挙 動 に 関 連 し て い る Rho-associated protein kinase(ROCK) に着目し，ROCK 経路を阻害する ROCK inhibitor を用いることで，ヒト iPS 細胞の集塊形成と細胞増殖に影響を与えていることが分かった．そこで，
本研究では ROCK inhibitor が細胞生存や増殖だけでなく，集塊の安定性など細胞集塊において重要な役割を果たす細胞外マトリックス (ECM) に影響があるかを検討した．
【方法】iMatrix-511 を用いて培養したヒト iPS 細胞 (Tic，1383D2) のコロニーを分散した後，ROCK inhibitor を添加した培地を用いて，バイオリアクターに細胞を播種した．播種から 24 時間後に ROCK inhibitor 無添加培地に切り替えた培養と ROCK inhibitor 添加培地を使用し続けた培養を行った．培養後，細胞集塊を回収し，ECM マーカー (CollagenI) と増殖マーカー (ki67) による免疫染色と，走査型電子顕微鏡を用いた ECM の構造の確認を条件間で比較した．
【結果】ROCK inhibitor 無添加条件と ROCK inhibitor 添加条件を比較すると，免疫染色では CollagenI と ki67 の発現に差異は見られなかった．一方，走査型電子顕微鏡を用いると ROCK inhibitor 無添加条件では細胞集塊表面上に線維状の構造が見られるのに対し，ROCK inhibitor 添加条件では粒子状の構造がみられた．これにより，細胞集塊表面上の ECM の構造に違いがあった．以上より，ROCK inhibitor の添加が ECM の構造に影響を及ぼすと考えられた．

【背景と目的】血中循環腫瘍細胞 (Circulating tumor cell: CTC)は、がん組織から血管内に浸潤した細胞である。これまでに、一部のがん種において血液中のCTC 数が患者の予後と相関することがわかっており、近年では単一細胞遺伝子
解析によって転移メカニズムの理解や治療標的因子の探索への応用が期待されている。当研究室は、希少な CTC の高効率な回収及び単一細胞分離に向け、
MCA/GCM (Microcavity array/Gel-based cell manipulation)法を開発してきた。本研
究では、MCA/GCM 法を用いて転移性がん患者 CTC の上皮間葉転換 (Epithelial
Mesenchymal Transition: EMT)状態を評価することを目的とした。
【方法】胃がん患者及び膵臓がん患者血液 1 ml から、MCA/GCM 法により CTC
候補(CellTracker Green+, Hoechst+, CD45-)を分離し、Quartz-seq 法にて全トラン
スクリプトーム増幅を行った。キャピラリー電気泳動にて増幅産物の収量及び平均鎖長の評価を行い、qPCR にて GAPDH の増幅を確認できた細胞に対し
RNA-seq によるトランスクリプトーム解析を行った。
【結果】胃がん患者 10 症例、膵臓がん患者 3 症例から分離した CTC 候補 27 細胞(胃がん: 15 細胞, 膵臓がん:12 細胞)に対して RNA-seq 解析を行った結果、23細胞から単一細胞由来のトランスクリプトームデータを取得した。解析結果か
ら、いずれの細胞においても血球系の特徴を持たず、また一般的に CTC の特徴とされる上皮性に関連する遺伝子群の発現は弱い傾向が見られた。さらに EMTの誘導に関連する遺伝子の発現が確認され、発現レベルは細胞間で不均一であった。このことから、本研究で得られた CTC は EMT が進み上皮性を失ったがん細胞であり、細胞によって進行状態に差異があることが示唆された。

Effect of rho-associated protein kinase inhibitor on extracellular matrix ofhuman induced pluripotent stem cell cells

Evaluation of epithelial mesenchymal transition-status of circulating tumor
cells by single-cell transcriptome analysis

Key words
extracellular matrix, rho-associated protein kinase inhibitor, humaninduced pluripotent stem cell, aggregate suspension culture

Key words

Circulating tumor cell, single-cell analysis, transcriptome

1Jp06

システイン誘導体による煙中の不飽和カルボニル化合物の解毒メカニズムの解明○Takaki Matsumoto, Mee-Hae Kim, Masahiro Kino-oka(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

1Jp04

ラット間葉系幹細胞の分化に対して光増感反応による活性酸素刺激が及ぼす影響の解析○Hitomi Yamakawa1, Ryo Negishi1, Tatsu Shimoyama2, Fumiaki Koizumi2,
Tsuyoshi Tanaka1, Tadashi Matsunaga1, Tomoko Yoshino1(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Tokyo Metropolitan Cancer Ctr.
Infect. Dis. Ctr. Komagome Hosp.)○森 英樹, 原 正之
（阪府大院・理）
morihide@b.s.osakafu-u.ac.jp○東 恒仁 1, Elmeligy Enas 1, 眞井 洋輔 1, 野矢 洋一 2, 真崎 雄一 1,
久下 裕司 2, 三輪 聡一 1
（1北大院・医・細胞薬理, 2北大・アイソトープ総セ）
thigashi@med.hokudai.ac.jp【背景】近年、活性酸素種（ROS）が神経幹細胞や間葉系幹細胞といった幹細胞の分化傾向に影響を与えることが報告されている。それらの報告の多くは過酸化水素やアミノレブリン酸を用いた細胞内ミトコンドリアにおける ROS 刺激によるものである。このような分化誘導調節を細胞外からの刺激によって引き起こすことができれば、ROS 発生源の細胞内残留を考慮しなくてもよい分化誘導法として幹細胞分化培養技術への応用が期待できる。本研究では光増感色素を固定したガラス基板を用いて、細胞外の細胞接着面から ROS 刺激を与えること
により間葉系幹細胞の分化傾向に影響を与えられるかについて検討した。
【方法と結果】アミノ基が付加されたスライドグラス表面に、カルボジイミド（EDC）とスクシンイミド（NHS）の反応を用いて光増感色素のヘマトポルフィリン（HP）を固定した。HP 固定化スライドグラス基材に細胞培養のためにチャンバーを取り付け、基材上でラット間葉系幹細胞（rMSC）を培養した。ROS
刺激を与えるために平面照射型 LED による白色光を基材下面から照射した。照射は 1 分間の照射と 3 分間の消灯を 1 回、5 回、25 回の何れかの条件で行い、照射後 24 時間培養した後、細胞を回収し分化傾向を調べるために定量的 RTPCR 法を用いて分化マーカー遺伝子の発現を調べた。骨分化マーカーとして
Runx2 と Alpl、軟骨分化マーカーとして Col2a1 と Acan、脂肪分化マーカーとして Pparg と Cebpa を用いた。いずれのマーカーも照射回数に応じて変化したが、特に光照射 25 回の条件で Alpl や Cebpa の発現量の変化が光照射を行わない条件に比べて大きかった。また、更に 2 週間培養した細胞の組織化学的染色による解析も行った。ROS 刺激を与えた条件ではオイルレッド染色で染まった細胞が対照条件と比べて多い様子が見られた。

【背景と目的】アクロレインやメチルビニルケトンに代表される不飽和カルボニ
ル化合物は、有機物が燃焼した際の煙や高温に熱せられた食物油等に含まれる
他、工業材料としても用いられており、ヒトが容易に暴露されうる環境化学物質である。不飽和カルボニル化合物は、高い細胞毒性を有することが報告されているため、人体への影響が懸念されている。我々は以前、還元型グルタチオ
ンや N-アセチルシステインなどのシステイン誘導体が、不飽和カルボニル化合物の細胞毒性を抑制できることを見出したが、そのメカニズムについては不明であった。本研究では、システイン誘導体による不飽和カルボニル化合物の細
胞毒性の抑制メカニズムの解明を目的とした。
【方法】細胞傷害は、PI 染色とフローサイトメトリーを組み合わせた手法で評価した。システイン誘導体と不飽和カルボニル化合物の分析には高速液体クロマトグラフィー（HPLC）と質量分析計（MS）を用いた。タンパク質のカルボニル化は免疫沈降法とウエスタンブロッティングで検出した。
【結果と考察】システインやシステイン誘導体は、側鎖のチオール基を介して不飽和カルボニル化合物の細胞毒性を抑制した。システイン誘導体と不飽和カル
ボニル化合物の混和物を HPLC および MS で解析したところ、システイン誘導
体は、不飽和カルボニル化合物と直接反応することが判明した。実際の煙抽出物中でも同等の反応物が生じていた。更に、システイン誘導体は、細胞内のタンパク質のカルボニル化を抑制した。以上の結果から、システイン誘導体は、
不飽和カルボニル化合物と直接反応することで、細胞内のタンパク質をはじめとする生体内分子のカルボニル化修飾を防ぐことで細胞傷害を抑制しているものと考えられる。

Effect of reactive oxygen species generated by phtotosensitizer on the
differetiation of rat mesenchymal stem cells

Elucidation of molecular mechanism for detoxification of unsaturated
carbonyl compounds in the smoke by cysteine derivatives

Key words
mesenchymal stem cell, reactive oxygen species, differentiation,
photosensitizer

Key words○Mori Hideki, Hara Masayuki(Grad. Sch. Sci., Osaka Pref. Univ.)○Tsunehito Higashi1, Enas Elmeligy1, Yosuke Mai1, Yoichi Noya2, Yuichi Mazaki1,
Yuji Kuge2, Soichi Miwa1(1Dept. Cell. Pharm., Grad. Sch. Med., Hokkaido Univ., 2Central Inst. Isotope Sci.,
Hokkaido Univ.)
toxicity, antioxidant, cysteine, unsaturated carbonyl compounds

135

1Jp07

神経筋接合評価のための iPS 細胞を用いた筋収縮モデル
の構築

1Jp09

○吉岡 貫太郎 1, 井藤 彰 2, 河邉 佳典 1, 上平 正道 1
（1九大院・工, 2名大院・工）kamihira@chem-eng.kyushu-u.ac.jp

生体内細胞位置を模倣した三次元神経筋共培養マイクロデバイスの開発○中村 健人 1, 清水 一憲 1, 山岡 奈央 1, 長島 拓則 1, 今泉 裕 1,
古谷 太樹 1, 伊藤 卓治 2, 岡田 洋平 2, 本多 裕之 1,3（1名大院・工, 2愛知医大・神経内科, 3名大院・創薬）
shimizukazunorichembio@gmail.com[目的]
近年、iPS 細胞を利用した薬剤スクリーニングが注目されている。その一例として筋委縮性側索硬化症 (ALS)患者由来の iPS 細胞から運動神経細胞へ分化誘導し、薬剤添加後の細胞生存率や遺伝子発現解析をすることで薬剤評価を行った報告がある。しかし、既存の報告では運動神経細胞が本来有している筋肉を収縮させる機能については詳細に調べられてはいない。本研究では、運動神経細胞の筋肉を収縮させる機能を調べるために、マウス iPS 細胞由来運動神経細胞とマウス筋芽細胞株 C2C12 細胞からなる平面培養および三次元組織培養での
神経筋接合を介した筋収縮モデルの構築を目指した。また、筋収縮モデルとしての有用性を高めるために、ヒト iPS 細胞由来運動神経細胞および筋芽細胞の利用を試みた。
[結果と考察]初めに、iPS 細胞由来運動神経細胞が C2C12 細胞由来筋管と神経筋接合を形成するかを調べるため、マウス iPS 細胞由来運動神経細胞と C2C12 細胞の平面共培養を行った。共培養 7 日目に神経伝達物質であるグルタミン酸を添加すると、筋管の収縮が見られたことから、iPS 細胞由来運動神経が筋管と神経筋接合を形成していることが分かった。また複合三次元筋組織において、グルタミン酸
添加により筋組織の収縮力の上昇が認められた。これらのことから三次元筋組織において神経筋接合が形成できたものと考えられ、収縮力を指標とした iPS細胞を用いた新たな筋収縮モデルとして薬剤スクリーニングなどへの利用が期待できる。さらにヒト iPS 細胞由来筋芽細胞を用いてヒト iPS 細胞由来運動神経細胞との共培養を行った。共培養 10 日目に電気刺激を与えたところ、収縮する筋管の割合が上昇した。このことから、ヒト iPS 細胞を用いた実験系においても神経筋接合が形成されたことが示唆され、筋収縮モデルとしての有用性を高めることができたと考えられる。

【背景と目的】様々な神経筋関連疾患は、運動神経細胞や骨格筋細胞の変性ある
いは神経筋接合部の異常により発症し、生命をも脅かす進行性の運動機能障害がもたらされる。しかしながら、こうした神経筋関連疾患の発症メカニズムはわかっておらず、有効な治療法や薬はほとんどない。本研究では、神経筋関連疾患の in vitro モデルへの応用を目指し、運動神経細胞に支配された三次元培養
筋組織構築のためのマイクロデバイスを開発した。
【方法と結果】これまでに開発した培養筋組織収縮力測定デバイス[1]や運動神経・骨格筋細胞平面共培養デバイス[2]の要素技術を応用し、ポリジメチルシロ
キサンでデバイスを作製した。デバイスには収縮を発揮する三次元筋組織を培養するウェルと運動神経細胞を培養するチャンバーがあり、これらは運動神経細胞から伸びた軸索だけが通過可能な複数のマイクロ流路でつながっている。
デバイス上でヒト iPS 由来運動神経細胞を培養後、ヒト不死化筋芽細胞株で三次元筋組織を構築し、一定期間共培養を行った。その後、神経用チャンバーの運動神経細胞体に対して選択的に刺激を負荷したところ、軸索と連結した三次元筋組織が収縮した。また、ナトリウムイオンチャネル阻害剤を神経用チャン
バーに添加することで、その収縮が停止した。さらに免疫染色を行い、三次元
筋組織内に神経筋接合部が形成されていることを確認した。これらの結果より、デバイス上の三次元筋組織は、軸索で連結した培養した運動神経細胞の支配を受けていることが示された。
[1] Shimizu, et al., Bioengineering (Basel), 4(2):56 (2017)[2] Yamaoka, et al., BioChip J., in press.(2019)

A muscle contraction model using iPS cells for evaluation of neuromuscularjunction

Development of microdevices for culturing three-dimensional innervatedskeletal muscle tissues○Kantaro Yoshioka1, Akira Ito2, Yoshinori Kawabe1, Masamichi Kamihira1(1Fac. Eng., Kyushu Univ., 2Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)○Kento Nakamura1, Kazunori Shimizu1, Nao Yamaoka1, Takunori Nagashima1,
Yu Imaizumi1, Taiki Furutani1, Takuji Ito2, Youhei Okada2, Hiroyuki Honda1,3(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2Dept. Neurol., Aichi Med. Univ., 3Grad. Sch.
Pharm. Sci., Nagoya Univ.)

Key words

iPS cell, neuromuscular junction, tissue engineering, coculture

Key words
junction

three-dimensional tissue, microdevice, iPS cell, neuromuscular

1Jp08

マイクロラインパターンを用いた筋管細胞の配向制御によるアセチルコリン受容体の凝集促進

1Jp10

犠牲ファイバーを利用した細胞内包多孔性ハイドロゲルの作製と細胞機能評価○葛西 晴郎 1, 清水 一憲 1, 長島 拓則 1, 古谷 太樹 1, 前川 忠義 1,
山岡 奈央 1, 本多 裕之 1,2（1名大院・工, 2名大・予防早期医療創成セ）
honda@chembio.nagoya-u.ac.jp【背景と目的】生体骨格筋内の筋管細胞は一方向に配向し、運動神経細胞と神経筋接合部（neuromuscular junction:NMJ）を介してつながっている。NMJ は運動神経細胞の軸索末端で筋管細胞膜上のアセチルコリン受容体が凝集した構造である。ALS やサルコペニアなどの創薬を目指し、in vitro で運動神経細胞と骨格筋細胞が共培養されるが、NMJ の形成効率が低いことが大きな問題である。本
研究では、生体内を模倣し筋管細胞の配向をそろえて培養することで、NMJ 形成に重要なアセチルコリン受容体の凝集が亢進するかどうかを検証した。
【方法と結果】微細加工技術を用いて幅 5〜20 μm、高さ 0.5〜1 μm のマイクロラインパターンをもつポリジメチルシロキサン製のマイクロラインパターン培
養基板を複数作製した。表面処理により細胞接着性を向上させ、ヒト不死化骨格筋細胞を培養した。作製したラインパターン基板を用いてヒト筋管細胞の配向制御が可能であった。分化培養 5 日目に FITC 標識ブンガロトキシンを用いてアセチルコリン受容体の凝集を定量した。その結果、配向制御ありの筋管細胞上で、配向なしの筋管細胞に比べて有意に多くのアセチルコリン受容体の凝集が観察された。筋管細胞の分化度が影響したと考え、分化度の指標となる筋管細胞の太さや一細胞あたりの核の数などを定量したところ、配向させた筋管細胞の分化度が向上していることがわかった。以上のことから、筋管細胞の配向制御を行うことで、筋管細胞の分化度が向上し、アセチルコリン受容体の凝集が多く観察されたと示唆される。

Alignment of myotubes using the micro-line patterned surface and its effects
on clustering of acetylcholine receptors○Haruo Kassai1, Kazunori Shimizu1, Takunori Nagashima1, Taiki Furutani1,
Tadayoshi Maekawa1, Nao Yamaoka1, Hiroyuki Honda1,2(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2PME, Nagoya Univ.)

Key words

micro device, skeletal muscle, alignment, acetylcholine receptor○蓑田 義将 1, 堀 有音 1, 鵜頭 理恵 2, 山田 真澄 2, 関 実 2（1千葉大院・融合, 2千葉大院・工）m-yamada@faculty.chiba-u.jp【背景と目的】 近年，動物細胞をハイドロゲルに内包して培養し，人工的な組織や臓器モデルを構築する研究が注目を集めている。ハイドロゲル内部において，生体組織と同程度の密度で細胞を培養する場合，内部に酸素や栄養分を供給するための，血管網のように連続した管腔構造を形成させる必要がある。しかし，毛細血管のような，直径数〜数 10 μm 程度の制御された管腔構造をハイ
ドロゲル内に精密に形成する技術はいまだ発展途上にある。本研究では，孔径の制御されたアルギン酸 Ca マイクロファイバーをハイドロゲル内に犠牲材料として包埋し，溶解させることで，連続的な管腔構造の制御を可能とする手法を提案する。実際に，マイクロ流路を用いて作製したマイクロファイバーを利用し，作製した多孔性ハイドロゲルを用いて動物細胞を培養し，連通孔の形成が細胞の生存率や機能に与える影響を評価した。
【方法】 マイクロ流体デバイスを用いて，直径 20 μm 程度のアルギン酸 Ca ファ
イバーを作製し，2 mm の長さで断片化した後，ファイバーとコラーゲンある
いは光架橋性ゼラチン（GelMA）水溶液を混合し，さらにヒト肝がん細胞（HepG2細胞）を一定の比率で混合し，ゲル化させた後，クエン酸処理によってファイバーのみを溶解させることで，多孔性ハイドロゲルを作製した。ハイドロゲルの凍結切片を作製し，断面を観察し，さらに，内包した細胞の生存率や機能を評価した。
【結果と考察】 ハイドロゲルの凍結切片を観察したところ，ファイバー径に相当する空隙がハイドロゲル内部に均一に存在している様子が確認された。また，ファイバーの混合比を適切に調節することで，ゲル内部の空隙が連通することを確認した。さらに，細胞を内包した多孔性ハイドロゲルでは生存率及び機能が向上することが確認された。

Preparation of cell-encapsulating porous hydrogels using sacrificial
microfibers and cell function analysis○Yoshimasa Minoda1, Aruto Hori1, Rie Utoh2, Masumi Yamada2, Minoru Seki2(1Grad. Sch. Adv. Integr. Sci., Chiba Univ., 2Grad. Sch. Eng., Chiba Univ.)

Key words

tissue engineering, cell, collagen139

2S-S2a01 硝化微生物コンソーシアの制御と高機能化デザイン○安藤 晃規 1,2, 小川 順 1,2（1京大・生理化学, 2京大院・農）aando@kais.kyoto-u.ac.jp

自然環境における窒素循環では、微生物群が果たす役割は大きい。特に硝化反応ならびに脱窒反応に関しては大部分を微生物が担う。これまでにコンポスト
化や、排水処理などにおいて環境制御によりこれらの微生物群機能は利用されてきたが、難培養性微生物を含む極めて複雑な微生物群のため詳細な解析や制御などは困難であった。そこで本講演では、自然環境におけるこれらの複合微生物群機能を単純化することで、再構築、制御、デザインの可能性を検討した。
土壌における有機廃棄物は、従属栄養微生物による分解を受けアンモニアとなり、さらに硝化細菌により亜硝酸イオン（NO2-）、硝酸イオン（NO3-）へと酸化される。硝化細菌は、主にアンモニア酸化菌群と亜硝酸酸化菌群により構成され、硝酸化成において鍵となる菌群として知られている。土壌中では、これらの微生物群が協調的に働くことで、作物への硝酸態窒素の供給を実現している。
しかし、独立栄養細菌である硝化細菌が難培養性であること、大量培養が困難であること、また、硝化反応自体が制御困難な複合微生物系であることなどが、基礎的な解析や応用展開へのボトルネックとなっていた。そこで、これらのボトルネックに関して、難培養性の硝化細菌と複合微生物系の制御に焦点を当てた土壌微生物群の解析とモデル硝化微生物群の再構築の取り組みを紹介する。
・硝化微生物群の馴養と有機質肥料活用型溶液栽培
有機態窒素の硝化に必須な土壌微生物群の馴養培養法と、構築した硝化微生物群を活用する有機質肥料活用型養液栽培が開発されている。本栽培法は有機物の栽培系への利用が可能であり、加えて、高施肥性や根圏病害抑制効果などの
従来の水耕栽培では見られなかった特徴などを示す。
・硝化反応における窒素動態と微生物群の解析
硝化工程中の窒素動態と菌叢の推移を解析し、有機物の無機化に関わる３つの役割（有機物の分解、アンモニア化成、硝酸化成）を担う菌群が、比較的単純な菌群で構成されていることを明らかにし、単純な細菌群のみで再現できる可能性を明らかにした。
・難培養性硝化細菌の分離培養の検討
実栽培現場では多様な環境が想定され、さまざまな環境に適した硝化細菌が必要となる。これまでは、硝化細菌のコロニー化に１ヶ月以上の培養期間を要していたが、培養条件を精査することで短期間でのコロニー化に成功した。
・硝化反応に関わる微生物生態機能の再構築
自然土壌中での有機物の無機化に関して、硝化に関わる代表的な微生物を活用し、有機態窒素のアンモニア化成と硝酸化成を同時に実現する微生物群集の再構築に成功した。また、微生物群をデザインすることで、多様な環境下において硝化反応を実現できる可能性を提示した。

Design and control of nitrifying bacterial consortia○Akinori Ando1,2, Jun Ogawa1,2(1Res. Unit Physiol. Chem., Kyoto Univ., 2Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)

Key words

nitrification, nitrifying bacteria, microbial consortia

2S-S2a02 プラスミドによる複合微生物系の制御を目指して〜複合
微生物系におけるプラスミドの動態〜○新谷 政己 1,2,3（1静大院・総合科技, 2静大・グリーン科技研, 3理研・バイオリ
ソース）
shintani.masaki@shizuoka.ac.jp

プラスミドは，接合伝達という現象によって，それを保有する供与菌から，保有しない受容菌へと移動する．プラスミドを受け取った受容菌は，プラスミド
上の遺伝子のはたらきによって，その形質を大きく変えるため，プラスミドは微生物の急速な進化・適応能を担う重要な遺伝因子とされる．しかし，自然界の複合微生物系内で，どのプラスミドが，いつ，どの微生物に接合伝達するのかという情報は驚くほど少ない．演者らは，このような情報が明らかになれば，複合微生物系内におけるプラスミドの伝播現象の人為制御につながることを期
待し，土壌や水圏など，様々な環境下におけるプラスミドの動態について研究を行ってきた．
演者らは以前，土壌の複合微生物系をモデル受容菌として，プラスミドを受け取った微生物を細胞レベルで検出・分離・解析する手法を確立した．接合伝達の検出には，GFP を接合完了体でのみ発現するシステムを用い，緑色蛍光を指標にしたセルソーターによって接合完了体を一細胞ずつ検出・分離した．得られた細胞を，培養せずに phi29 ポリメラーゼによって直接全ゲノムを増幅後，PCR でプラスミドの保有を確認するとともに 16S rRNA 遺伝子を増幅して接合完了体の属種の同定を行った．その結果，従来の培養法に依存する手法では，宿主として得られなかった微生物を得ることに成功した 1)．
プラスミドの好気条件下における接合伝達現象については研究が進められてきたが，地球上に広く分布する，微好気・嫌気条件下の接合伝達性についてはほ
とんど調べられていない．こうした条件下では，プラスミドの動態が変化する可能性がある．そこで異なる種類のプラスミドや供与菌・受容菌を用い，酸素濃度の違いによってそれらの接合伝達性に変化が生じるか検証した．その結果，
プラスミド・供与菌・受容菌の種類によらず，プラスミドの接合伝達頻度は好気条件と比べて微好気・嫌気条件下では 1/10〜1/100 に低下した．また接合伝
達頻度の違いは，各菌株の生育の違いには依らないことも示唆された．さらに，複合微生物系を受容菌群とし，好気・微好気条件下で得られる接合完了体について，セルソーターを用いて分離し，その種類を比較したところ違いが認められた．この結果は，酸素条件の違いによって，プラスミドのみかけの宿主域が変化することを示唆していた．
また，プラスミドの接合伝達能を指標にした収集法により，環境中の複合微生物系で実際に伝播している新たな自己伝達性プラスミドを複数取得した 2)．これまでに，下水処理場の嫌気処理槽，牛糞堆肥，湖沼底泥由来の 15 本のプラス
ミドの全塩基配列を明らかにしており，そのうち 7 本は報告例の少ない，PromA群というプラスミド群に属する新規性の高いプラスミドであった（全 15 本のうち演者らが 7 本を決定）．また，2 本はプラスミド群が同定されていない新規なプラスミドであった．これらのことは，自然界には，未だ見過ごされている，
実際に遺伝子の伝播を担うプラスミドが存在することを示唆している．興味深いことに，上述した PromA 群プラスミドのうち，塩基組成（GC 含量，コドン
使用頻度，連続塩基の出現頻度）が大きく異なるプラスミドが存在した（例えば GC 含量は 10%も異なる）．これらのプラスミドの宿主域について，セルソー
ターを用いた手法で比較したところ，互いに異なっていた 2)．このことは，プラスミドの塩基組成の違いが，その宿主域を変化させる要因であることを示唆している．
以上，プラスミドの伝播の実態を知ることで，複合微生物系におけるプラスミ
ドの挙動を人為的に制御するための手がかりを得られると考えている．講演ではこうした知見を利用した，複合微生物系の制御の可能性についても議論した
い．
1. Shintani et al., 2014, Appl. Environ. Microbiol. 80:138-145.
2. Yanagiya et al., 2018, Front. Microbiol. 9:2602.

Behaviors of plasmids in various microbial community○Masaki Shintani1,2,3(1Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci. Technol.,Shizuoka Univ., 3BRC, RIKEN)

Key words

plasmid, gene transfer, microbial community, bacteria

140

2S-S2a03 大規模ネットワーク分析による菌叢動態の解明と制御

2S-S2a04 生態学は生物群集デザインに活用できるか？

DNA メタバーコーディングによる生物叢分析が標準ツールとなった現在、これまで観察が困難だった生物間の関わりを「ネットワーク」という形で解き明かせるようになってきた。これまで、植物−真菌共生ネットワーク、細菌−真菌共存ネットワーク、腸内細菌ネットワークなどの解明を進めてきたが、技術開発によってさらにこの研究対象を拡大中である。また、そうした研究で得られた知見を基に、微生物叢の設計と制御を行うことを目指している。

特 定 の 生 息 地 に 共 存 す る 生 物 種 の セ ッ ト の こ と を 生 物 群 集 （ ecologicalcommunity）と呼ぶ。生物群集は、多数の生物・非生物要素が相互作用する複雑系である。その駆動原理を理解することは基礎科学上の重要課題であるのみ
ならず、生態系保全や生物資源管理、水質管理や病害虫管理などの様々な分野への波及効果を持つ。しかし、生態系の複雑性、時空間スケールの大きさ・多様性と観測の難しさから、生態系動態の理解、特にその予測や制御を可能にするような理解、は決して容易ではない。この話題提供では、生態学における種間相互作用論に着目し、生物群集デザインに向けた群集研究の一つの枠組み、方向性を提案する。
群集生態学（community ecology）は、生物群集の構造や成り立ち、あるいはその動態を研究する分野である。群集生態学において、生物群集は相互作用によって互いに関係し合う多種のネットワークとして捉えられる。個々の種間相互作用やそのネットワーク構造は生物種間の効果の伝わり方を規定するので、それぞれの個体群の動態やその総体である群集動態はその影響を受けることになる。
実際、群集生態学では種間相互作用ネットワークのあり方によって、個体群の維持や多種共存の可能性が大きく変化することが理論予測されてきた。例えば、Robert May をはじめとする理論研究者は、種数や種間相互作用の密度で評価される「生物群集の複雑性」が高まると、ある閾値を超えた途端、群集動態が急激に不安定化することを予測している。他方、この理論予測は種間相互作用の密度依存性や柔軟性などといった現実の群集ネットワークの構造を考慮に入れることで逆転できる（複雑性による安定化）ことも予測されてきた。これらは種間相互作用が群集動態と密接に関わることを示す好例であろう。
群集動態や種間相互作用に関する理論予測の実証には、しかし、いくつもの壁がある。第一に、種間相互作用を検出・評価することの困難がある。種間相互作用が存在するとは、生物 A の個体群密度の時間変化が他の生物 B の密度の影
響を受けることを意味している。生態学においては、生物種の人為的な取り除きや導入に対する群集の動的反応を見ることで種間相互作用を検出してきた。
しかし、多種間に非常に多くの種観相互作用があったり、それらが時間変動する時、一つ一つの相互作用の量的評価には非常に大きな努力が求められる。第二に、群集安定性の評価における困難である。生物群集は常に撹乱の影響を受けており、個々の個体群密度はその影響で時間変動を見せることが通常である。
この外力による変動それ自体は生物群集の安定性を表していない。種間相互作用によって生じる内生的な動態を評価してやる必要があるが、ここにも内生的な動態を外生的な動態から分離する難しさがある。また種間相互作用と安定性の両方が評価できたとして、両者の間の因果関係を検出することも容易ではないだろう。さらに生物群集の予測や制御、デザインが目標となるとき、種間相互作用や動態、両者の関係性がどのような状況依存性を持つかの把握が求められるようになる。生態系の構成要素やそれらの間の相互作用に関する情報が欠けた状態で、これを実現するのはほとんど不可能のようにも思える。
近年になって、非線形力学理論に基づいて時系列データから生態系情報を取り出そうとする、Empirical Dynamic Modeling（EDM）と呼ばれる時系列解析手法が注目されるようになってきた。この手法は、生態系構成要素や相互作用に関する情報が欠けた状態でも、特定の要素の時系列データから他の相互作用する要素に関する情報を取り出すことで、生物群集の状態や状態間の推移のルール
把握を可能にしている。本講演では、この EDM を利用して種間相互作用やその特徴、さらには群集動態との関係を明らかにしようとする私たちの最近の試みを紹介し、このアプローチが生態学にもたらす新しい展開を考察する。さらに私たちが最近取り組んでいる細菌群集の実験系を利用した群集動態研究について紹介し、好ましい特徴を備えた生物群集のデザインを可能にする技術発展への道筋について議論したい。

○東樹 宏和（京大・生態研）
hiro.toju@gmail.com

特に注目しているのが、持続可能な農業における微生物叢の設計である。陸上への進出が始まったごく初期（4 億 6000 万年前）より、植物は地下部で真菌類と精緻な共生系を構築し、多様化を遂げてきた。地球上で現在生育する植物種の 9 割は、「菌根菌」と呼ばれる真菌たちの関わりを通じて、リンや窒素の供給を受けている。その一方で、根圏や葉圏にはまだその機能が知られていない、「内生菌」と呼ばれる細菌や真菌が生息している。
こうした無数の内生菌の中から、微生物叢や植物生理の動態に特に強い影響を与える「コア微生物」の探索を進めている。環境中には優れた機能を発揮する
微生物種が数多く存在する。しかし、そうした機能の高い微生物を単離・増殖
し、農地に投入しても、対象農地の土着微生物との競合に敗れ、定着しないことが多い。また、機能の異なる複数の微生物種を同時に利用しようとしても、微生物種どうしの相性が障壁となることがある。こうした、「機能性は高いが応用しにくい」微生物種の集合体を安定的に制御するため、「コア微生物種」を探索するアルゴリズムを開発した。
現在、植物共生微生物や土壌微生物の系を対象として、選び出された「コア微生物種」の効果検証を行うとともに、機能性を最適化した「コア微生物叢」の設計を進めている。一連の技術は、腸内細菌叢や水圏生物叢にも適用可能で、多様な産業分野における利用に向けて並行して実験を進めている。
本講演では、植物-微生物、および、微生物-微生物関係の複雑な相互作用ネッ
トワークに関するインフォマティクスについて紹介しながら、微生物叢の制御に向けた展望を語りたい。
Toju H, Peay KG, Yamamichi M, Narisawa K, Hiruma K, Naito K, Fukuda S, Ushio
M, Nakaoka S, Onoda Y, Yoshida K, Schlaeppi K, Bai Y, Sugiura R, Ichihashi Y,
Minamisawa K, Kiers ET. (2018) Core microbiomes for sustainable agroecosystems.
Nature Plants 4:247-257
Toju H, Tanabe AS, Sato H (2018) Network hubs in root-associated fungal
metacommunities. Microbiome 6:116
Toju H, Yamamichi M, Guimarães PR Jr, Olesen JM, Mougi A, Yoshida T, Thompson
JN (2017) Species-rich networks and eco-evolutionary synthesis at the metacommunity
level. Nature Ecology & Evolution 1:0024
Toju H, Yamamoto S, Tanabe AS, Hayakawa T, Ishii HS (2016) Network modules andhubs in plant-root fungal biomes. Journal of the Royal Society Interface 13:20151097.
Toju H, Guimarães PR Jr, Olesen JM, Thompson JN (2015) Below-ground plantfungus network topology is not congruent with above-ground plant-animal network
topology. Science Advances 1:e1500291○近藤 倫生, 東 豊浩, 加藤 広海, 川津 一隆, 長田 穣, 永田 裕二（東北大院・生命）
michio.kondo.b8@tohoku.ac.jp

Toju H, Guimarães PR Jr, Olesen JM, Thompson JN (2014) Assembly of complex
plant-fungus networks. Nature Communications 5:5273
Kitada Y, Muramatsu K, Toju H, Kibe R, Benno Y, Kurihara S, Matsumoto M (2018)
Bioactive polyamine production by a novel hybrid system comprising multiple
indigenous gut bacterial strategies. Science Advances 4:eaat0062

Network science for managing microbiomes○Hirokazu Toju
(Center for Ecological Research, Kyoto University)

Key words
coculture

microbial community, microbial consortia, micobiome design,

What contribution can ecological approach make to community design?
○Michio Kondoh, Toyohiro Azuma, Hiromi Kato, Kazutaka Kawatsu,
Yutaka Osada, Yuji Nagata(Grad. Sch. Life Sci., Tohoku Univ.)

Key words

microbial diversity, microbial community, stability, time series analysis

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2S-S3a01 フォトン検出を用いた光合成機能センシングによるシロ
イヌナズナの生理変化の早期診断

2S-S3a02 食農産業における LED の利活用技術の開発○藤川 康夫 1, 鶴本 智大 1, 泉田 智史 2, 三島 俊介 3, 岡澤 敦司 4,
加藤 悠一 5, 蓮沼 誠久 5,6（1日亜化学工業株式会社, 2ヒューマン・チップス有限会社, 3大塚電子株式会社, 4阪府大院・生命環境, 5神戸大・先端バイオ工, 6神戸大院・科技イノベ）
yasuo.fujikawa@nichia.co.jp○本橋 令子 1,2, 深沢 知加子 1, 切岩 祥和 1, 明賀 史純 3,
篠崎 一雄 3, 勝又 政和 4
（1静大・農, 2静大・グリーン科技研, 3理研・環境資源, 4浜松ホトニクス.中央研）
motohashi.reiko@shizuoka.ac.jp
生物微弱発光やバイオフォトンと呼ばれる微弱な発光が細胞内の様々な代謝反応過程から放出されると考えられている。植物には遅延発光という分のオーダーで起こる比較的微弱な蛍光が検出される。光合成を行う藻類や植物はクロロフィ
ルなどの光合成色素により光エネルギーを吸収する。吸収した光エネルギーにより、反応中心で電荷分離反応が起こり、反応中心クロロフィル p680 を介し、電子が電子伝達経路へと流れていく。光化学系 II のこの過程で余剰な光エネル
ギーは蛍光と熱として放出され、クロロフィルから放出される蛍光をクロロフィ
ル蛍光と呼び、励起光の照射を停止するとナノ秒オーダーで消光する。しかし、励起光照射停止後、電子伝達の逆反応により、電荷分離したエネルギーの高い電荷（光化学系の酸化側に生じた正電荷と還元側に生じた負電荷）が再結合することでクロロフィル P680 が再励起状態になり、それが基底状態に落ちる際に放出される蛍光があるが、それが遅延発光である(Berden-Zrimec et al., 2011)。
つまり、遅延発光を効率的に検出し、その減衰波形を解析することで、即時ク
ロロフィル蛍光解析では得られていなかった酸素発生系を中心とした光化学系
自身や光合成反応全体に関する情報を得ることが可能になる。
遅延発光の測定には光電子増倍管などの光子（フォトン）検出レベルの高度な微弱光計測技術が必要となるため、まだ商業的な活用事例はほとんどないが、
浜松ホトニクス株式会社は、世界最高レベルの高感度・高精度の光検出技術を持ち、「光」の研究とその成果を活かしフォトン検出を用いた“光合成機能センシング”機器(TYPE-6100)を開発した。浜松ホトニクス社は、藻類の遅延発光を計測することで、有害化学物質による藻類の生長阻害を早期診断する迅速バイ
オアッセイ手法「藻類発光法」を開発し (Katsumata et al., 2017a)、サンゴにおける２種の除草剤の影響についても遅延蛍光により調査した(Katsumata et al.,2017b)。早期診断の原理提案、専用の測定装置、ソフトウェア、試薬類を合わせたシステム全体を開発し、遅延発光により藻類などの生長阻害を“早期診断する”ことの有効性の実証に取り組んでいる。現在は、水質検査業などのユーザー
より、工場排水などの有害性評価での実用性検証が進んでいる。我々は上記のような研究内容を学会で知り、工場排水などの有害性評価だけでなく、高等植
物の“光合成機能センシング”の研究に応用出来ないかと考えた。
モデル植物であるシロイヌナズナはほとんどの遺伝子の破壊株が整備され、ゲノム情報も集積し、栽培も簡単で、植物体サイズも小さく、一度に複数の実験が可能である。シロイヌナズナの葉緑体には、3500 以上のタンパク質が存在しているが、我々は葉緑体への局在が予測されたタンパク質の遺伝子破壊株を整備し、約 2500 ラインを保有している(Myouga et al., 2010)。明賀らはクロロフィ
ル蛍光測定法（PAM 蛍光法）を用いて、葉緑体タンパク質の破壊株の中から光合成（光化学系 II 反応の量子収率）に関与するタンパク質の探索を行ない、多くの変異体を単離できたが、その多くがすでに論文として公表されているものであった(Myouga et al., unpublished data)。
我々は約 1900 の核ゲノムコードの葉緑体タンパク質遺伝子破壊株の遅延発光（蛍光）を測定し、野生型と異なる遅延発光減衰波形を示す葉緑体タンパク質遺伝子破壊株をスクリーニングした結果、25 変異株を得ことができた。得られた変異体の一部は野生型よりも生育が遅く、植物体のサイズが小さかったが、多くは野生型と表現型の違いは観察されず、表現型に表れない植物の生理的な変化を遅延発光によって検出できることが示された。25 の遺伝子破壊株の原因遺伝子と遅延発光減衰波形の類似性から、遅延発光の異常を遺伝子に結び付けることが可能であることもわかった。変異体の遅延発光減衰波形は大きく 4 タイプのグループに分けられ、各グループの原因遺伝子の機能の共通性が確認でき、最も大きなグループの原因遺伝子の機能は、NDH 複合体(NADH dehydrogenaselike complex)や NDH 構成するタンパク質 RNA の編集やフェレドキシン（Fd）
を含む循環的電子伝達経路に関するものであった。また、２成分法により減衰波形を解析した場合、循環的電子伝達経路という類似の機能を持つ（NDH、Fd）タンパク質の遺伝子破壊株は、遅延発光減衰波形が類似していることが示された。
さらに、10 日間通常の MS 培地で栽培したシロイヌナズナの幼苗を N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B 欠乏の MS 培地に移植し、経時的 (１〜７日間)に遅延発光データを取得し、MS 培地で栽培したシロイヌナズナの遅延発光データと比較し、栄養欠乏の影響を遅延発光で検出できるか調べた結果、N、P、Fe 欠乏の影響を検出する事ができた。また、高温ストレスは 42 度で１.5 時間処理後に、22 度で１日栽培し、遅延蛍光を測定した結果、光合成の遅い反応の蛍光が減少する結果を得、高温ストレスの影響は１.5 時間から顕著な違いを検出可能である事がわかった。本研究により、フォトン検出を用いた光合成機能センシング
によるシロイヌナズナの生理変化の早期診断が可能である事がわかったので成果を報告する。

日本フォトニクス協議会（JPC）関西アグリバイオフォトニクス産業化研究会
では、食農産業における LED の利活用技術の開発を目標に、光制御による植物・微細藻類の生育促進および有用物質生産の原理・プロセスについて、産学連携体制で基礎的に研究を行っている。
本講演では、その研究成果の一部を紹介する。
1 つ目は、収穫後の作物に紫外線 LED 光を照射しフェノール性有用物質の含量を高める研究である。これは、陸上植物が持つ UVR8 光受容体を介したポリフェノール生合成酵素の発現誘導に着目した技術である。具体的には、収穫後の作物に数分オーダーで紫外線 LED 光を照射した後、単に作物を貯蔵するだけ
で生体反応が誘導され、ポリフェノールを増産させることが出来る。ポリフェ
ノールは強い抗酸化作用を持つため、ポリフェノール含有食品は機能性食品として注目を集めている。特に、ブドウを丸ごと発酵・熟成させた赤ワインは多くのポリフェノールを含み、動脈硬化予防、アルツハイマー予防、高血圧予防などの健康効果が期待される。現在は、本研究の応用として、醸造用ブドウ果
皮のポリフェノール含量の増進を検討している。
2 つ目は、緑色 LED を用いた微細藻類バイオマス増産の研究である。これは、緑色 LED 光がクロロフィルに吸収されにくく、培養槽の深部まで届くことに着目した技術である。具体的には、緑色 LED を用いて培養槽内の照度分布の均一化を図りつつ、培養槽受光面の過度な光吸収による光酸化ストレスを抑制させることで、微細藻類の細胞密度や増殖速度を高めることが出来る。現在は、さらなる高い生産性を目指して光照射条件の最適化などを検討している。昨今、微細藻類は栄養バランスのよい植物性食品や、微細藻類由来のサプリメントとして注目を集めている。
今後，食品加工業者などと共同で本技術の実用化を進め，分野横断型産学連携による科学的根拠に基づいたオープンイノベーションの好例としたいと考えている。

Early diagnosis of physiological changes by the photosynthetic sensing using
photon detection in Arabidopsis thaliana

Development of LED technology in food and agriculture industries○Reiko Motohashi1,2, Chikako Fukazawa1, Yoshikazu Kiriiwa1,
Fumiyoshi Myouga3, Kazuo Shinozaki3, Masakazu Katumata4(1Fac. Agric., Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.,
3
CSRS, RIKENS, 4Hamamatsu Photonics)

Key words

Arabidopsis thaliana, photosynthesis, tag lines, chloroplast○Yasuo Fujikawa1, Tomohiro Tsurumoto1, Satoshi Izuta2, Shunsuke Mishima3,
Atsushi Okazawa4, Yuichi Kato5, Tomohisa Hasunuma5,6(1Nichia Co., Ltd., 2HumanChips Inc., 3Otsuka Electronics Co., Ltd., 4Grad. Sch.
Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ., 5Eng. Biol. Res. C., Kobe Univ., 6Grad. Sch.
Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

food and agriculture industries, LED, polyphenol, microalgae

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2S-S3a03 大気圧空気プラズマを用いた低残留植物病害防除法の開発

2S-S3a04 任意の圃場環境に最適な作物の育種を可能に − データ
科学に基づく作物設計基盤技術の開発○金子 俊郎, 二瓶 健司, 胡 玥, アハマドシャヒー アハマドノール,
高島 圭介（東北大院・工）kaneko@tohoku.ac.jp○平山 隆志 1, 最相 大輔 1, 井藤 純 2, 高萩 航太郎 2, 香西 雄介 2,
鷲見 典克 3, 池田 陽子 1, 井上 小槙 4, 上原 由紀子 4, 清水 みなみ 4,服部 公央亮 5, 梅崎 太造 3,5, 辻 寛之 2, 持田 恵一 1,2,4（1岡山大・資源植物科研, 2横浜市大・木原研, 3名古屋工大院, 4理
研・環境資源研, 5中部大・工）hira-t@okayama-u.ac.jp

近年，プラズマを農業に応用する研究が注目を集めており，特に大気圧プラズ
マを照射した溶液を植物の病害防除に用いる研究が盛んに行われている．大気圧プラズマで生成された電子，イオン，活性種が溶液に照射されることで，溶液中に新たな活性種が生成され，その殺菌効果を利用するものである．このとき，殺菌に作用する活性種の寿命が非常に短い（分オーダー以下）ため，植物に残留する量が極めて少ないことから，低残留の植物病害防除法として期待されている．本研究では，プラズマを照射する溶液として導電性液体および精製水を用いて，また大気圧プラズマを生成するガス種や生成電力等を変化させる
ことで，低残留で植物への侵襲が少なく，かつ高効率の植物病害防除法を開発することを目的としている．
実験では，まず導電性液体としてプラズマ中に液体肥料の成分である硝酸カリ
ウム溶液を高速で射出し，導電性であることから液体自体を電極として用い，
プラズマと液体の接触を誘導する，新たなプラズマ照射溶液直接噴霧装置を作製した．本実験の目的は，プラズマ照射溶液（PES）噴霧により，短時間でイ
チゴ炭疽病菌分生子の発芽を抑制することである．プラズマ照射溶液直接噴霧装置で生成された PES には，プラズマ中を導電性液体が通過する機構により，プラズマ気液界面における液相短寿命活性種の高効率な生成が期待される．そこで，テレフタル酸（TA）を用いた化学プローブ法によって液相短寿命活性種の一種である OH ラジカルの計測を行った．実験結果を TA と OH ラジカルの反応速度と OH ラジカル同士の反応速度から定義した反応効率でフィッティン
グした結果，本装置で作製した PES には，気液界面付近（〜10 nm）に局在す
る反応により，液相短寿命活性種である OH ラジカルが高濃度（30 mM）で生成されていることが分かった．
PES のイチゴ炭疽病菌分生子の発芽抑制効果を検証するために，液体導入量 Fsol
を変化させて生成した PES を分生子に対して 5 秒間直接噴霧する実験を行い，それぞれの場合について発芽率を算出した．実験の結果， Fsol ~ 4 mL/min および 8 ~ 14 mL/min において，高い発芽抑制効果を示すことが分かった．また，装置へ導入するガスを空気からプラズマ活性ガス（大気圧プラズマ中を通過させた空気）に変更することで，Fsol ~ 18 mL/min の高流量域で発芽率が低くなる
ことが観測された．
化学プローブを用いて PES 中の活性種を計測した結果，低流量（Fsol ~ 4 mL/min）の場合において，高濃度の H2O2aq（約 1 mM）, NO2-aq（約 0.3 mM）が観測された．しかし，それぞれの試薬による比較実験の結果，発芽抑制には不十分な濃度であったため，低流量域では H2O2aq と NO2-aq の液相における化学反応
で殺菌性を有すると報告されている液相短寿命活性種の過酸化亜硝酸 HOONOaqが生成され，それが発芽抑制に寄与していたと考えられる．一方で，高流量域（Fsol = 8 ~ 14 mL/min）ではいずれの活性種濃度も低下しており，液中の反応によらない短寿命活性種生成が関与していると考えられる．高流量域の発芽抑制効果を考察するために，気相活性種を FT-IR を用いて計測した結果，NO2gas が多く観測された．したがって，この領域においては気相から供給される NO2gasと液相表面に生成される OH ラジカルの気液界面における化学反応によりHOONOaq が生成され，発芽抑制に寄与していると考えられる．また，さらなる高流量の Fsol = 18 mL/min においては，プラズマ活性ガス中の N2O5gas と OH 由
来で液面に局在する H2O2aq が気液界面において化学反応し，殺菌性を有すると報告されている液相短寿命活性種の過硝酸 HO2NO2aq の生成も考えられ，高流量域における発芽抑制効果には複数の因子が存在し，いずれもプラズマ気液界面における化学反応に起因している可能性が示唆された．
次に硝酸カリウムの代わりに精製水を噴霧する装置を開発した．ここでは，プ
ラズマ「生成部」とプラズマにより生成された活性種を精製水と接触・溶解させて高速で噴霧する「溶解・噴霧部」を分離した「プラズマ生成活性種溶解液噴霧装置」を用いて行った．その結果，プラズマで生成されたオゾンが精製水に溶解して殺菌（イチゴ炭疽病菌分生子の発芽抑制）に作用することと，そのオゾンがプラズマで生成された活性窒素種との精製水中での反応により短時間で消失し，1 分以内に検出限界以下の濃度になること，大気中にも安全基準の0.1 ppm 以上は放出されないことが分かった．さらに，このプラズマ生成活性種溶解液をモデル植物に噴霧し，植物細胞からの電解質漏出率の測定により植物へのダメージを評価したところ，殺菌効果を示す噴霧時間 10 秒においては，ダメージが観測されないことが分かった．
以上の結果より，プラズマ照射溶液直接噴霧装置（導電性液体）およびプラズ
マ生成活性種溶解液噴霧装置（精製水）を用いて，プラズマおよび活性種を液体に照射することで，液相短寿命活性種を短時間・高濃度で生成することに成功し，短い噴霧時間でイチゴ炭疽病菌分生子の発芽を抑制できることを示した．
このときの発芽抑制には液相短寿命活性種が寄与していることが示唆され，プ
ラズマ気液界面における化学反応が重要な因子であることが示された．

地球規模での温暖化が進む中、世界の各地で気象の変化が確認されている。また、国際的な気象観測機関によれば、今後も更にこの傾向が続き、３０年後の２０５０年には、現在とは大きく異なる気象状況になっていると予測されている。このような気象状況の変化は、当然のことながら農業生産、生活さらに経済活動に大きく影響するであろうと警告している。特に、農業生産への影響は深刻であり、何らかの対応が迫られている。将来気温が上昇することを見越して、すでに日本の各地で高温に耐性を示すイネや他の作物の品種改良が進められている。
環境の変化に耐性を持つ植物あるいは作物の作成、育種は、農耕に依存する人
類の夢であり、それを目指し作物の育種学、さらにはこの数十年は分子生物学を基盤とした植物分子生物学が進展してきた。特に、演繹法に立脚した分子生物学による環境ストレス応答の理解は目覚ましいものがあり、これにより我々は、まだ大雑把ではあるが、植物がどのように環境の変化を認識し、それにどのように対応しているかを理解することができるようになった。しかしながら、得られた分子レベルの知見を圃場の作物の育種に適応させるには、まだ壁がある。何故なのか。一つには、注目する生命現象を詳細に捉えるために特定の条件のみを短時間変化させる一般的に用いられる実験条件と、様々な環境の変化が同時に且つ生育過程にわたり随時起きている圃場の環境条件の間に大きな違いがあるためではないか、と考えられている。もっと端的に言えば、圃場環境での遺伝要因と環境要因の相互作用が理解できていないためといえるだろう。
もちろん、農業形質を指標にした QTL 解析や GWAS によって関連する遺伝要因が抽出されている。しかし、多くの場合、環境要因は考慮されておらず、遺伝要因と環境要因の相互作用を考慮しての育種はまだ難しいのが現状である。
この問題の解決には、農業形質に関係する遺伝要因と環境要因の相互作用を記述することが必要である。しかし、遺伝要因と環境要因は、互いに影響し合い変化する複雑な関係であるため、その理解、記述は容易ではない。一般に作物のライフコースの後半で見られる農業形質は、その形質が現れる時点の相互作用だけではなく、生育の過程で構築された遺伝要因と環境要因の相互作用の積算に大きく影響されると考えられる。現在、圃場作物の遺伝要因と環境要因の相互作用を明らかにしようと、世界各国で圃場作物の詳細な表現型データの取得方法の開発、得られたデータの解析方法、それらを利用して、遺伝要因と環境要因から作物の生育または収量予測モデルの構築が試みられている。
我々は、作物のライフコースで農業形質に大きく影響する様々な生物的指標の変化（これを状態形質と定義）を捉え、その変化に関わる遺伝要因を特定するとともに影響する環境要因を抽出し、それらによって農業形質を説明するモデルを構築することが可能と考えた。現在、この考えに基づき、圃場オオムギの出穂期を農業形質の例として、圃場オオムギの時系列オミックスデータの収集、それらを利用した状態形質の抽出、状態形質を利用したモデルの構築、モデルとゲノム情報からの出穂時期の予測を中心とした研究プロジェクトを進めている。具体的には、出穂期の環境応答性が異なるオオムギ系統複数を実験圃場で生育し、経時的に画像を取得する一方、週ごとの形態測定、トランスクリプトー
ム、ホルモノーム、エピゲノム解析を行い、生長および生理的な情報をライフコースに沿って収集している。これらのデータを、人工知能を利用した非線形的分類法により構造化し、出穂期の系統間差や年次間差に関連した状態形質の抽出およびモデルの構築を進めている。また、出穂への生長相転換をより詳細に捉えるためメリステムの解析や圃場作物の画像解析の取り組みなどを含め、研究プロジェクトの概要と、これまでに得られた知見について紹介し、議論する予定である。

Development of plant pathogen control method with low residual pesticides
using atmospheric pressure air plasmas

Data driven crop design technology

Key words
air plasma, reactive oxygen nitrogen species, plant pathogen control,
low residual pesticide

Key words○Toshiro Kaneko, Kenji Nihei, Hu Yue, Ahmad Shahir Ahmad Nor,
Keisuke Takashima(Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ.)○Takashi Hirayama1, Daisuke Saisho1, Jun Ito2, Kotaro Takahagi2, Yusuke Kouzai2,
Norikatsu Sumi3, Yoko Ikeda1, Komaki Inoue4, Yukiko Uehara4, Minami Shimizu4,
Koosuke Hattori5, Taizo Umezaki3,5, Hiroyuki Tsuji2, Keiichi Mochida1,2,4(1IPSR., Okayama Univ., 2KIBR, Yokohama City Univ., 3NITech., 4CSRS, RIKEN,
5Coll. Eng., Chubu Uni.)
phenome, life-course multi-omics data, data science, Barley143

2S-S3a05 バイオエコノミーが引き起こす食農デジタル産業におけるゲームチェンジ

2S-S3a06〈招待講演（韓国生物工学会）〉
Effects of FIR emission and phytochemicals on
Lymphedema alleviation○齊藤 三希子（ルール形成戦略研究所）
Mikiko.Saito@jp.ey.com○Hei Chan Lee, Dae Hoon Kim(Dept. Pharm. Eng. & Biotechnol., Sun Moon Univ.)
heichan@sunmoon.ac.kr

緑の革命以降、イノベーションが生まれていなかった食・農業分野において、
近年、ロボット技術や深層学習、バイオテクノロジー等の著しい技術革新により、フードバリューチェーン全体にテクノロジーを導入する“アグリフードテック（AgriFoodTech）”やバイオエコノミーが注目を集めている。 AgriFoodTech の普及・拡大やバイオエコノミーの取組みは、気候変動や食料問題、環境負荷低減など、企業の経営活動や食文化に対しても大きな影響を及ぼしている世界的な社会課題解決だけでなく、新たなイノベーションが創出されることを期待されている。日本は化石燃料資源が乏しい国だが、化石燃料に変わる技術と自然資源を持っている。 しかし、日本企業が技術はあるのに世界で勝てない現状が続いている。一方、欧米各国は新たな技術開発やイノベーションの創出と同時に、規制・制度構築等のルール形成に取り組むことで、社会解決と経済成長の両立を図っている。AgriFoodTech やバイオエコノミーは、まだ世界でも始まったばかりであり、日本企業がゲームチェンジを引き起こせる可能性が残っている。本企業が技術はあるのに世界で勝てない現状から脱却するためには、民間主導の技術革新とルール形成戦略の両面から取り組む体制整備を構築することが急務である。本シンポジウムでは、気候変動による世界の食料及び食文化への影響を概説し、解決策として注目されている AgriFoodTech やバイオエコノ
ミーの動向を紹介するとともに、ルール形成の重要性に関して言及する。

Lymphedema is caused by the lymphatic vessel dysfunction mainly due to microbial
infection, inflammation or lymph node dissection. Recently, thermal therapy using a
Far Infrared Ray (FIR) and phytochemicals has been recognized as a medicine
therapies. Especially, FIR treatment has been widely applied to the patients sufferingfrom body fluid circulation system related diseases, such as hypertension,
lymphedema, cardiovascular disease, ischemia and so on. Also, phytochemicals inessential oils (EOs) extracted from the plants have been utilized as another therapy
against microbial infection, inflammation, oxidative stress, etc. Despite of these twotherapies being used actively, the combination treatment of FIR and phytochemicals
has not been studied yet. Thus, the main goal of this research is to analyze and abridge
the previous studies for each therapy, and suggests a new hypothesis for the combined
therapy on lymphedema. In conclusion, FIR therapy and phytochemicals alleviate therisk factors of Lymphedema through the regulation of specific cytokines and enzymes
influencing to the chronic inflammation and blood flow. Additionally, essential oils
from the plant extracts inhibit the activity of the micro-organisms including
Staphylococcus aureus and Group A Streptococcus.

Game change in agriculture caused by bioeconomy

Effects of FIR emission and phytochemicals on Lymphedema alleviation○Mikiko Saito(Center for Rule-making Strategies)

Key words

bioeconomy, agriculture, secureeconomy○Hei Chan Lee, Dae Hoon Kim(Dept. Pharm. Eng. & Biotechnol., Sun Moon Univ.)

Key words

lymphedema, far infrared, phytochemicals

144

2S-S5a01 非抗体分子骨格を用いた人工結合タンパク質作製基盤の構築○安井 典久
（岡山大院・医歯薬）
nyasui@okayama-u.ac.jp

2S-S5a02 抗体医薬を代替する標的結合小型タンパク質デザイン○門之園 哲哉（東工大・生命理工）
tetsuyak@bio.titech.ac.jp

抗体分子は，特異的な分子認識能を有するため，種々の研究での用途は広く，
検査・診断試薬や医薬品としても利用されている。一方で，分子量が大きいこと，複数のポリペプチド鎖から構成されること，ジスルフィド結合を有すること，といった抗体の分子特性がしばしば利用上の問題となる。特異的な分子認識能の発揮に必要な抗体分子の構造的特徴は，安定な構造の免疫グロブリンド
メインを骨格として，アミノ酸配列が多様性に富む相補性決定領域を分子表面に提示していることである。この構造的特徴を満たせば，免疫グロブリンドメ
インでなくとも抗体様の分子認識能を発揮できることが示されてきた。実際に，抗体分子の特異的な分子認識能を模倣し，かつ抗体の欠点を補うために，様々なタンパク質ドメインを非抗体分子骨格として用いた人工結合タンパク質の作製とそれらの利用が活発に行われている。
私たちは，任意の標的分子を特異的に認識する人工結合タンパク質を，生物工学領域を含む様々な研究において利用するために，それらを進化分子工学の手法を用いて作製する基盤を構築することを目指して研究に取り組んできた。具
体的には，甘味タンパク質の人工改変体である一本鎖モネリンに着目し，その非抗体分子骨格としての有用性を検討した。
一本鎖モネリンは，97 アミノ酸残基から構成され，シスタチン様フォールドを形成する。一本鎖モネリンの局所的な 2 本のループのアミノ酸配列を多様化した変異体ライブラリーを作製した。ループのアミノ酸配列の多様化に際しては，
アミノ酸組成にバイアスをかけ，標的分子に結合する人工結合タンパク質を取得する成功率の向上を図った。ライブラリーサイズが 1×109 以上の大規模なファージディスプレイライブラリーを作製し，その選別をモデル標的タンパク質 green fluorescent protein 変 異 体 (GFPuv) お よ び yeast small ubiquitin-like
modifier (ySUMO) に対して実施した。その結果，GFPuv と ySUMO それぞれに結合する一本鎖モネリン変異体を得ることができた。それらのうち，GFPuv に結合する人工結合タンパク質 (GBP-1) に着目し，その分子特性を解析した。精製サンプルを調製し，ゲルろ過クロマトグラフィーによる溶液挙動を解析した
結果，GBP-1 が単分散することを確認した。また，表面プラズモン共鳴測定により，相互作用の解離定数を見積もることができた。さらに，GBP-1 と GFPuvの共結晶構造解析を行い，GBP-1 は設計通り，アミノ酸配列を多様化させた 2
本のループを用いて GFPuv を認識していることを明らかした。以上のことより，一本鎖モネリンは，人工結合タンパク質の有望な非抗体分子骨格となることが示された。
本講演では，タンパク質工学におけるウェット技術に軸足を置く研究者の立場から，上述の新規な非抗体分子骨格に基づく人工結合タンパク質作製基盤の構築過程の詳細を，通常では論文に記載されず表に出てこないデータをも含めて紹介する。それにより，タンパク質工学，特に進化分子工学におけるウェット技術の限界とドライ技術の貢献が求められる点をあらためて認識するきっかけを提供したい。

がんや様々な自己免疫疾患の分子標的治療において、標的に強く結合する小型タンパク質は安価な抗体医薬代替分子としての利用が期待される。このような小型の抗体代替分子は化学合成により製剤コストを抑えることが可能であり、また抗体よりも組織浸透効率や体外排出効率が高く、細胞膜に発現する分子に限らず細胞内に局在する分子も標的として利用できるため、従来の抗体医薬の薬効を凌ぐ治療薬を開発することも可能である。そのため、新たな創薬モダリ
ティとしての臨床応用を目指し、抗体代替小型タンパク質のデザイン技術の高度化が進められている。
従来のデザイン技術のほとんどは directed evolution （指向性進化法）に基づくものである。つまり、特定の小型タンパク質を足場骨格として選択し、それらの分子表面に存在するアミノ酸残基を他のアミノ酸へとランダム置換した変異体ライブラリーを作成し、その中から各種迅速スクリーニング法によって標的に強く結合する分子を取得する。この場合、網羅性に優れたスクリーニングが実現できるものの、ランダム化する残基が 1 つ増えるごとにライブラリーサイ
ズが 20 倍になるため、各スクリーニング方法のライブラリーサイズの限界に依存して、必然的にランダム化できる残基の数は限られてしまう。また、結合領域（エピトープ）を選択できないため期待する場所に結合するとは限らず、標的結合分子を取得できたとしても薬効を示さないことがある。近年、スーパーコンピューターの高性能化と計算科学的手法の進歩により、構造計算で標的との結合構造をデザインし、合理的に標的結合分子を取得することが可能になりつつある。しかし、分子間の結合構造を正確に予測できる一般的な方法がまだ確立されていないため、計算技術の高精度化による汎用性の拡大が課題となっている。
そこで我々は、計算科学的手法と迅速スクリーニング法を組み合わせた標的結合小型タンパク質の半合理的デザイン技術“smart protein design”を提案し、基盤技術の構築を進めている。この場合、広大な分子空間を効率よく探索するため、構造計算を利用して小規模な小型タンパク質ライブラリーをデザインし、迅速スクリーニングによって全ての候補分子を評価することが特徴である。これにより、現段階での構造計算技術の不完全性をカバーすることが可能になる。そこで本講演では smart protein design の例として、ペプチドの構造ゆらぎ制御に着目した標的結合小型タンパク質デザインを紹介したい。

Design and generation of synthetic binding proteins using a non-antibody
molecular scaffold

A design strategy for creating antibody mimetic small proteins

Key words
non-antibody molecular scaffold, protein engineering, phage display,
directed evolution

Key words
protein engineering, smart protein design, antibody mimetics, small
biopharmaceuticals○Norihisa Yasui(Grad. Sch. Med. Dent. Pharm, Sci., Okayama Univ.)○Tetsuya Kadonosono(Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)

145

2S-S5a03 機械学習と実験の融合によるタンパク質の高機能化

2S-S5a04 人工タンパク質構造ライブラリーの創出

機械学習（人工知能）の流行はタンパク質工学の分野においても顕著である。
ここ１年間で、タンパク質の機能改変に機械学習を利用した研究が国内外のグループから続々と発表されている。昨年、我々は機械学習とウェット実験を組み合わせることで、タンパク質の機能改変を大幅に効率化する技術を開発した（Saito et al. ACS Synth Biol. 2018）。本手法では、まず飽和変異法やランダム変異法によって少数の変異体を調製して実験を行い、機械学習のための学習デー
タを取得する。次に、機械学習の一種であるベイズ最適化によって、どのような変異を導入すれば目的の機能を有するタンパク質が得られるか予測を行う。
これにより、目的の機能を有するタンパク質を豊富に含み、なおかつ安価に実験を行える小規模な変異体群（スマートホットライブラリー）を提案することが可能となる。我々は本技術の有効性を蛍光タンパク質の機能改変において実証した後、現在は酵素などの様々な機能性タンパク質に対して応用展開を開始している。
本発表では、機械学習の利用において考慮すべき様々な事項について、我々の研究で得られた最新の結果を例に紹介する。例えば、学習データとして何個の変異体を取得するのか。特徴量には何を用いるのか。改変したい機能が複数ある場合（例えば蛍光タンパク質の蛍光強度と蛍光波長）、それらを同時に学習させるにはどうするか。学習データとして既にある程度性能の良い変異体が得られている場合と、ほとんどネガティブデータしかない場合で、機能改変の方向
性はどのように変化するのか。予測を行う配列空間はどの程度まで大きくできるのか。欠損値や解釈の難しい実験データをどのように扱うのか。これらの問題には明確な答えが出ないことも多いが、我々の研究での取り組みや、既存研究において提案された方法について紹介する。以上を通して、タンパク質工学
における機械学習の可能性と現状での課題について議論したい。

生命は悠久な進化の歴史の中でタンパク質分子を開発し，これらを用いて様々な生命現象を生み出している．望みの機能を持ったタンパク質分子を自在に設計することが可能になれば，細胞の制御・設計や医療への貢献，加えて新規酵
素やマテリアル開発による産業への応用が期待される．我々は，タンパク質分子を主鎖構造を含めてゼロからデザインすることで，望みのタンパク質分子を創成する技術の構築を行っている．タンパク質を合理的にデザインする試みは1980 年代後半から行われてきたが，2000 年以降，計算機の性能向上と構造生物学の発展によるタンパク質立体構造の理解にともない，その技術が急速に発展している．この技術を用いて，自然界のタンパク質を改変することで，様々な機能性タンパク質の合理的デザインが現在盛んに行われている．しかしながら，
タンパク質は進化の歴史の中で，自身の機能を発現することに構造を最適化してきており，これらを多少改変するだけでは新しい機能を付与することは難し
い．また，多くの場合において天然のタンパク質構造の安定性は低く，少しの改変でも構造が壊れることが非常に多い．そこで我々は，機能デザインのための鋳型構造となる，安定で多種多様な形状の構造で構成される人工タンパク質構造ライブラリーの創出に向けて，計算機を用いて特定の立体構造に折りたた
むアミノ酸配列を，主鎖構造を含めて完全にゼロから設計する手法の開発を行ってきた．その結果，タンパク質を主鎖構造からデザインするためのルールを発見し，これらを用いて様々な形状のタンパク質構造を原子レベルの精度でデザインすることに成功した．本講演では，これら研究成果の紹介に加えて，タン
パク質設計技術の発展における，生化学実験結果の計算機デザインへのフィー
ドバックの重要性について議論する．

Improving protein functions with machine learning and experiments

Generation of de novo protein structure library○齋藤 裕 1,4, 及川 未早来 2, 中澤 光 2, 亀田 倫史 1,4, 津田 宏治 3,4,
梅津 光央 2,4
（1産総研・人工知能, 2東北大院・工, 3東大院・新領域, 4理研・
革新知能）
yutaka.saito@aist.go.jp○Yutaka Saito1,4, Misaki Oikawa2, Hikaru Nakazawa2, Tomoshi Kameda1,4,
Koji Tsuda3,4, Mitsuo Umetsu2,4(1AIRC, AIST, 2Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 3Grad. Sch. Front. Sci., Univ.
Tokyo, 4AIP, RIKEN)

Key words

machine learning, artificial intelligence, protein engineering○古賀 信康 1,2,3（1自然・生命創成, 2自然・分子研, 3総研大）nkoga@ims.ac.jp○Nobuyasu Koga1,2,3(1NINS, ExCELLS, 2NINS, IMS, 3SOKENDAI)

Key words

protein engineering

146

2S-S5a05 理論と実験によるタンパク質デザイン

2S-S1p01 SDGs に対する生物工学研究のあり方

産業や医療などに役立つタンパク質を計算機で自由自在に設計できれば、私たちの生活は豊かなものになるだろう。タンパク質デザイン研究の最近の進展は目覚ましく、近い将来、自然界における生物進化を人類が超越する可能性もある。しかし、現在はタンパク質のフォールディング問題が未解決であるため、タンパク質の合理的設計法は未完成であり、進化分子工学などの実験が必要である。また、さまざまな理論的設計法でデザインされたタンパク質を実際に作製し、理論的手法を改良することも必要である。ここでは、我々が最近、実験と理論の両面から取り組んでいるタンパク質デザイン研究の例をいくつか紹介したい。

18 世紀後半からの産業革命以降、科学技術は著しい発展を遂げ、人々に豊かな生活を提供してきたが、一方で、食料問題や資源・エネルギー問題、炭酸ガス排出増大に伴う気候変動など地球規模での課題が山積している。このような状況にあって、国連は 2015 年 9 月に開催された国連サミットにおいて「持続可能な開発のための 2030 アジェンダ」を全会一致で採択し、「誰一人として取り残さない（leave no one behind）」持続可能で多様性と包摂性のある社会を実現するために、2030 年までを期限とする持続可能な 17 の開発目標（SDGs：Sustainable
Development Goals）を掲げた。全世界はこの目標の達成に向けて積極的な取り組みを展開しているが、我が国においても、少子・超高齢化社会を背景に、健康・医療をはじめ、モノづくり技術や環境・エネルギー、農業・食料供給などの面で多くの課題を抱えており、その解決は今を生きる我々が担うべきものと考えている。持続可能な世界を実現するための 17 のゴールのうち 10 項目以上
でバイオテクノロジーが貢献できるとされており、その意味で解決の鍵を握る
バイオテクノロジーへの期待は大きい。
政府は第 5 期科学技術基本計画において、人々に豊かさをもたらす「超スマート社会（Society 5.0）」を未来社会の姿として、IoT やビッグデータ解析、人工知能などのサイバー空間とフィジカル空間（現実世界）を高度に融合させる取り組みを推進することでその実現を目指そうとしている。一方、OECD は生物
資源とバイオテクノロジーを用いて地球規模の課題の解決と経済発展の共存を目指す「バイオエコノミー（Bioeconomy, Biobased Economy）」を提唱している。
バイオテクノロジーに関連する産業市場は 2030 年には OECD 加盟国の全 GDPの 2.7%（約 200 兆円規模）に拡大し、このうち工業分野が 39%、農業分野が36%を占めると OECD は予測している。これを契機に世界各国では具体的な戦
略やビジョンを立案し、国家主導型の研究開発プログラムが積極的に進められている。生物工学にとっては今がチャンスと捉えるべきで、その使命を果たす
時を迎えている。
公益社団法人日本生物工学会は、生物工学に関する研究の進捗普及を図り、もって我が国の学術・科学技術の発展に寄与することを目的に 1923 年に設立された
大阪醸造学会に端を発する学術団体で、醸造・発酵工学をはじめ、酵素工学、
生物工学、細胞工学、生命工学さらには環境工学など多彩な領域の研究者や技術者によって構成され、産業や社会との密接な連携によって発展を続けている
バイオテクノロジーの学会である。科学技術の発展や新たな技術との融合によって知のフロンティアが拡大すると、従来のように知識や技術の全てを個人や一つの組織で産み出すことは困難になってくる。企業では新しい価値の創出に向けてオープンイノベーションを推進しているが、特化した専門領域を扱いながら多様な専門性を有する人材を結集させることができる学会は、産学官連携の展開の場として相応しいと考える。生物工学会では、新たな知識や価値の創出を促す取り組みを模索・実施しており、未知の可能性を有する生物機能に基づ
くバイオエコノミー戦略を推進することで超スマート社会に立脚する持続的な社会の実現に貢献したいと考えている。
進展著しいゲノム解析技術や編集技術、オーミックス研究やビッグデータ処理
技術は、合成生物学をはじめ生体情報工学や細胞工学などを展開する生物工学における基盤技術であり、前述の革新的な情報通信技術を核とする高度な研究
インフラの導入や異分野との連携や組み合わせを推進することで、モノづくり
技術の開発研究は多様化し、化学工業・健康・医療・食料分野におけるビジネ
ス創出の可能性はますます大きくなると期待される。
一方、「超スマート社会(Society 5.0)」では人々が快適で活力に満ちた質の高い生活を享受する人間中心の社会が達成できるとしているが、個としての人という概念が抜け落ちているように思われる。人の内面をインサイド空間とすれば、現実/仮想空間はアウトサイド空間として捉えることができ、それらが繋がることで、本来の人を中心とする社会のあり方が見えてくると思う。人の感性や意
識空間をアウトサイド空間と繋げる研究は、人が昔から追い求めている究極的な問いに対する答えを我々に与えてくれるように思う。
その世界を我々は「Society
5.0 ＋」として提唱しているが 1), 2) 、最近話題の脳腸相関をはじめ、人の五感（視覚・聴覚・嗅覚・味覚・触覚）に関わる脳科学や感性工学などに対しても生物工学は多くの関わりを持つことができると考える。
生物工学には、人が求める真の豊かさや幸せを実現するための研究として牽引的な役割を担い、未来社会にインパクトを与える領域としてその方向性を見失わずに使命を果たしていくことを期待したい。

○新井 宗仁 1,2（1東大院・総合文化, 2東大院・理）
arai@bio.c.u-tokyo.ac.jp

シアノバクテリアは、アシル ACP 還元酵素（AAR）とアルデヒド脱ホルミル
化オキシゲナーゼ（ADO）という 2 つの酵素を用い、光合成で軽油相当のアルカンを合成できることから、カーボンニュートラルな再生可能バイオエネルギーの生産源として注目されている。しかし AAR と ADO の活性は低いため、両酵素の高活性化が急務である。そこで我々は、AAR と ADO の酵素活性を向上させた変異体の創出を目的として、網羅的なアミノ酸置換変異解析や進化分子工学的実験などを進めている。これまでに AAR と ADO のアラニンスキャン変異
解析を完了し、高活性化しうる変異導入部位を見出した。それらの変異部位において飽和変異解析を行うことにより、ADO の酵素活性を向上させた変異体を得ることができた。
抗体医薬品などの精製には、プロテイン A を用いたアフィニティークロマトグ
ラフィーが用いられるが、抗体をプロテイン A から解離させるためには溶液を酸性条件にしなければならず、抗体が酸変性して凝集体を形成するリスクがある。それゆえ、pH 5.5 以上で抗体を解離可能なアフィニティーリガンドの創出が必要である。そこで我々は抗体結合領域と pH 制御領域の 2 つを連結させた
新規キメラタンパク質を合理的に設計した。さらに、pH 制御領域の pH 応答性を改善するようなアミノ酸置換変異を合理的に設計して導入した結果、pH 7 で抗体と結合し、pH 5.5 で抗体を解離できるアフィニティーリガンドを開発できた。
天然変性タンパク質である c-Myb は未分化造血細胞の増殖や分化を制御する転写因子であり、転写コアクチベーター CBP の KIX ドメインと相互作用して転写を促進させるが、その過剰な発現は白血病の原因となる。したがって、c-MybKIX 間相互作用を阻害できれば白血病の新しい治療薬開発に貢献しうる。本研
究では、c-Myb の転写活性化ドメイン TAD の断片に変異を導入することにより、c-Myb-KIX 間相互作用を阻害しうるペプチドを設計した。TAD は天然変性領域であるがヘリックス形成能が高く、N 末端側はヘリックスを形成してから標的分子と結合する「構造選択機構」によって KIX と結合する。そこで、アミノ酸配列からヘリックス形成能を予測する理論的手法を用いて TAD 断片の変異体を設計した結果、KIX との結合が野生型 c-Myb と比べて約 3 倍強いペプチドの創製に成功した。
近年目覚ましい発展を遂げているのが Rosetta ソフトウェアを用いた理論的なタ
ンパク質設計である。新しい構造のデザインや結合タンパク質の結合能強化などの成功例は多いが、酵素活性を向上させた報告例は少ない。これは、酵素の場合には反応サイクルを考えた複合的な設計が必要になるからであろう。我々は最近、この問題を解決するために、Rosetta を用いてジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）の高活性化を試みた。DHFR の酵素反応サイクルにおける律速段階の反応を加速しうるような変異体を、理論的な網羅的変異解析によって探索し、実験で検証した結果、1 アミノ酸置換のみで活性を 2.5 倍向上させた DHFR 変
異体の作製に成功した。本研究の手法は今後、酵素活性を理論的に向上させる
上での一般的な手法となりうると期待される。

○木野 邦器（早大・先進理工）kkino@waseda.jp

1) 荒勝俊, 木野邦器：生物工学, 96, 720 (2018).
2) 木野邦器：化学と工業, 72, 105 (2019).

Experimental and theoretical design of proteins○Munehito Arai1,2(1Grad. Sch. Arts Sci., Univ. Tokyo, 2Grad. Sch. Sci., Univ. Tokyo)

Key words

protein engineering, protein interaction, enzyme

Direction of biotechnology research to SDGs
○Kuniki Kino
(Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words

SDGs, Society 5.0, bioeconomy

147

2S-S1p02 住友化学グループの SDGs の取組み

2S-S1p03 SDGs と科学技術イノベーション

1. 住友化学の企業理念
住友化学の企業理念の中心をなす、住友の事業精神「自利利他 公私一如」（じ
りりた こうしいちにょ）とは、「住友の事業は自らを利するとともに社会を利するものでなければならない」という考え方である。
住友化学の事業は、約 1 世紀前、別子銅山の銅の製錬から生じる亜硫酸ガスによる環境問題に対し、亜硫酸ガスを回収して肥料にするという、環境問題を克服するとともに、地域の農産物の貢献にもつながる「ソリューション」を生み出すことで始まった。

2015 年に国連が全会一致で採択した「持続可能な開発目標（SDGs）」は、気候
変動対策や防災、生物多様性、人間の安全保障など地球的かつ人類的課題をすべて包摂して掲げた目標です。この壮大かつ挑戦的な 17 の目標を 2030 年までに達成するためには、既存の分野、組織、業界等の枠組みを超えて、統合的に取り組むことが不可欠です。採択から約 4 年が経過し、SDGs について様々なところで見たり聞いたりする機会が増えてきています。その一方で、SDGs の達成を目指して、具体的に何をすればよいのかという声も多く聞きます。昨年の４月に「持続可能な社会推進室」を立ち上げた JST の取り組みや国内外の動向等を紹介しながら、科学技術イノベーションと SDGs について皆さんと考えたいと思います。

○冨ケ原 祥隆（住友化学）
tomigahara@sc.sumitomo-chem.co.jp

2. 「オリセット® ネット」事業による SDGs への貢献
住友化学は、MDGs（Millennium Development Goals）から継続して、「オリセッ
ト® ネット」（殺虫剤を練りこんだ樹脂製の蚊帳）事業を通じたマラリア対策に統合的に取り組んでいる。
「オリセット® ネット」は樹脂に練りこんだ薬剤が徐々に表面に染み出すことで長期間効果が持続することが特長であり、2001 年に世界で初めて「長期残効型蚊帳」としての推奨を受け、特にアフリカにおける蚊帳の普及に貢献してきた。
マラリアは経済成長を阻む要因としても指摘されており、アフリカでは貧困や財政難のために十分な対策がとれず、マラリアに罹患することによって就業や教育の機会を失い貧困から脱却できないという悪循環が指摘されている。
そこで、世界保健機関（WHO）からの要請に応える形で、2003 年にタンザニ
アの現地企業に無償で技術供与し、アフリカでの「オリセット® ネット」生産を開始（現在は JV）し、ピーク時には 7000 人もの雇用を創出した。また、従業員の 85％以上が女性であることから、託児所や女子寮を整備するなど、女性の経済活動への参画にもつながっている。
さらに社会貢献活動として、NGO と共に、2005 年からアフリカの小・中学校の建設支援を中心とした教育支援も行っており、12 か国で 22 プロジェクトを実施し、総受益者数は 1 万 2000 人を超える。
「オリセット® ネット」事業を通じた感染症対策のみならず、貧困、ジェンダー平等、教育といった経済・社会・環境への統合的貢献は、今後の SDGs ビジネスの一つのモデルとなると考える。

○白木澤 佳子（国立研究開発法人科学技術振興機構）
m5abe@jst.go.jp

3. 住友化学グループでの SDGs 推進活動
2015 年に SDGs が採択され、開発途上国の支援から地球全体の目標となった。
気候変動など環境分野や技術革新分野、経済成長などの経済分野も盛り込まれ、「世界を変える 17 目標」とのスローガンが掲げられた。
企業に期待されるのはイノベーションである。地球課題を解決するソリューションの提供、それは創業の DNA そのものであり、企業理念と一致している。そこで、SDGs の達成に向けて、いち早くグループ全体で「TSP」、即ち、トップ
コ ミ ッ ト メ ン ト （ T:Top ） の も と 、 事 業 を 通 じ て （ S:Solution ）、 全 員 参 加（P:Participation）による取り組みを開始。具体的には、2016 年から「Sumika
Sustainable Solutions」と「サステナブルツリー」を開始した。
（1）Sumika Sustainable Solutions（SSS）
SSS は、環境面から SDGs に貢献する製品・技術を認定し、達成目標を掲げて実効的に取り組むものである。認定要件を外部専門家の意見も取り入れ設定し、これまでに温暖化対策、環境負荷低減などに貢献する合計 34 製品・技術を認定した。
（2）サステナブルツリー「誰ひとり取り残さない」という理念に則り、3 万 3 千人のグループ全役職員
が、SDGs への貢献の主体は自分たちであると気づき、主体的に取り組みを進めることを目的に開始した。具体的には、SDGs17 目標に対して、グループ役
職員一人一人が「仕事や職場での取り組みを通じての貢献」を専用ウェブに投稿し宣言する。英語を母国語としない人たちにも「ジブンゴト」として捉えられるよう、11 か国語で SDGs の解説をマンガで配信。期間は 100 日間で、全世
界から 9000 件を超える投稿が集まった。
4. 今後に向けて
持続可能な社会の実現のために、これから社会は大きな変革を遂げなければならない。大きな変革の時代だからこそ、創業の DNA である「住友の事業精神」
を決して変わることのない経営の根幹とし、SDGs を道標「コンパス」とし、短期的な利益だけでなく長期的に社会を利するソリューションを提供するために、変革に挑み続けていく。

Sumitomo Chemical Group's initiatives for SDGs
○Yoshitaka Tomigahara(Sumitomo Chemical Co., Ltd.)Key words

SDGs, WHO, Olyset Net

Science, Technology and Innovation (STI) for SDGs
○Yoshiko Shirokizawa(Japan Science and Technology Agency, JST)Key words
SDGs, Sustainable Development Goals, Science, Technology andInnovation (STI), STI for SDGs

148

2S-S1p04 大学は SDGs 達成にどのようにかかわれるか

2S-S1p05 世界のバイオエコノミーと関連する合成生物学議論

大学セクターは SDGs 達成にどう関われるか。大学セクターの特徴は研究と教育である。
まず研究について考察する。SDGs のための研究とは、つまり SDGs として与えられた課題の範囲で研究しないといけないと思っておられる方々にお会いする。本当にそうか。私は、SDGs は、医学でいう臨床研究に似たものと見る。
すなわち、病気（課題）があり、それを治したい（解決したい）。しかし、病気（課題）だけ見ていてもわからないことがある。例えば大気汚染による喘息（ぜんそく）。見える症状（課題）は息苦しさ、咳などである。体内の原因だけを注目すれば免疫反応と思われる。免疫を抑える治療をする。だがこれは根治ではない。治療が切れれば症状が再発する。そもそもなぜ起きているか。大気汚染によるのではないか。では大気汚染はそもそもなぜ起きているのか。
・・・このようにして日本の公害疾患は解決されてきたであろう。対処のわからない病気（課題）に取り組もうとすれば、患者（現場）を自分の目でよく見て、「そもそも」を問うしかない。この、現場をよく観察し「そもそも」を問う活動は、当座の金銭的利益や、もしかすると論文も即時には産めない。直近には製品やサー
ビスを生まないし、世の中で今は注目されていないと思いを同じくする学術誌や査読者も今はいないかもしれないからである。しかしいつしか治療（解決）に結びつくことができると期待される。この活動ができる場は、世の中でどこかといえば、結論として大学になろう。一般に研究活動は、課題認識→問い→
仮説構築→検証→共有という 5 段階を踏むと表現できる。であると、SDGs は
1 段階目にあたる。身近な対象のどこに、SDGs とつながる事象が見出されるのか。それはどんな問いを生むのか。その問いにどんな仮説（当座の答え）を、どれだけたくさん、たてられるのか。そのうちのどれは、科学的方法の範疇で検証できるのか。あるいは検証のための新たな方法を開発できるのか。こうした考えや試みを地道に進めていく役割を、大学はその役割の一端として果たすべきだろう。道のりは遥かだが、本学では一歩を踏み出した。
次に教育はどうか。例えば本学の入学者数は学部で年間 2000 人程度である。これだけの数の若い人たちに一度に関与できるセクターというのはそう多くはない。これらの人たちに、今は何を教えているのか。まずは専門。入学前に高校での興味または（どちらかというと）成績で学部入学時には専門が決まっている。入学後は専門で知られている範囲の課題と、既知の解決法を学ぶ。その後に、その専門の範囲から類推あるいは取り組み可能な課題に取り組む。これはもちろん専門の深化のためには必要である。ただしそれらの「専門」からこぼれてしまったところに SDGs が存在している。誰がどのように取り組めるのか。
少なくともそうした専門で取り扱えていない課題というものが存在することは若い人々に伝える必要があるのではないか。それを伝えようとするときに、
SDGs は力を持つ。一つ一つの目標に、既存の専門はどこまでできているのか、どこに専門間の協力の余地があるのか、協力してもまだ足りぬところはどこにあるのか。これを学生の皆さんにも考えてもらう必要があるのではないか。本
学はまず今年度から、学部入学生全員に、各人には一時間だけだが、一種の「教養」としてこうした SDGs 的な観方を伝える試みを始めた。今後どこまで効果が出るだろうか。少なくとも数人、SDGs のために何かできることをしたいという学生が現れていると聞く。
さて大学の役割は研究と教育のみか。地域とのきずなはどうか。例えば本学は
戦後すぐの創設の時に地域から当時 3 億円もの寄附が集まって始まったという。
こうした期待にどれだけこたえようとしてきたか。即時的に応えることはできないかもしれない。だが、長期的にでも応えようとできているか。そしてその方法は。SDGs に対する取り組みを始めてみて、本当は地域の皆様から大学は期待いただいていたということが幸い見出されてきた。そしてその発揮の仕方
として、まずできることは、SDGs を共通言語に変化をもたらしたい様々なセクターの方々を、中立性と根拠ある新しい考えの提案で結ぶことである。岡山の地の利も、もちろんある。初の庶民のための学校は 1600 年代に岡山で起こった（閑谷学校）。
「自らの名誉のために成したことであるなら、たとえ驚天動地の功績があっても、本人のために過ぎない」という意味の言葉もある幕末の改革家、山田方谷。西洋医学を広め東大の基礎も担った津山藩医。労働者、農民の改善のために企業立の研究所を作った大正の大原孫三郎。そして近年では持続的発展のための教育（ESD）を推進し、ユネスコからの受賞もある岡山。
SDGs 未来都市に選定された岡山市と真庭市。本学と、これらを含めた地方自治体や地元の経済同友会あるいは商工会議所との連携も進みつつある。また、学内には、学内外の広範な関係者をまとめる窓口となる「国際学都おかやま創生本部」も設立された。この地だからこれだけの仲間が増えてきたこともあるだろうが、ありがたいことである。
これらの取り組みから、SDGs 達成に向けてどんな新たな取り組みがこれから現れるか、期待したい。

バイオエコノミーとは何か？2009 年の OECD が発表したレポート“Bioeconomy
to 2030, Designing a Policy Agenda”をきっかけとして世界に広まり、現在では 50か国の国々で脱化石資源依存社会を実現するための戦略が作られている。世界
でもコンセンサスを得た定義は存在しないが、化石資源をベースとした経済活動をサステイナブルなバイオ素材をベースとした経済活動に変えていこうとする世界的な流れであるといえる。
欧 米 の 活 動 に 目 を 向 け る と 、 欧 州 は 2012 年 の 政 策 発 表 、 2014 年 か ら のHorizon2020 に基づき、Biobased Industry Consortium という業界団体のまとめた
産業ニーズに対し、Biobased Industry Joint Undertaking と呼ばれる公的資金団体が予算を投じ、欧州のバイオエコノミーバリューチェーンを作っている。米国
についても 2012 年に National Bioeconomy Blueprint を発表し、バイオフュール
やバイオケミカル等の産業化を産学官で強力に進めてきている。
バイオマスを活用するという考えは日本にも存在し、2002 年に作られたバイオ
マス・ニッポン総合戦略に基づき行われたバイオマスタウン（2005〜2012 年）
や、その後により地域のバイオマスを産業として定着させようとするバイオマ
ス産業都市（2013 年〜）の政策が地域のエネルギーやモノづくり産業を興す考えとして存在する。一方バイオテクノロジーについては、2002 年にバイオテクノロジー戦略大綱、2008 年にはドリーム BT ジャパンが発表されて、バイオテ
クノロジーによりモノづくりの進化、薬に頼らない健康の実現、環境の改善などが語られており、これらは実質的に日本が進めているバイオエコノミー戦略だったと言える。日本でも過去の戦略でもそれなりに技術開発では成功していたと言えると思われるが、化石資源ベースの経済活動を置き換えるという事にはつながっていない。
一方生物工学に目を向けると、BioFoundry という言葉の基に、世界の合成生物学を進めるアカデミアが Global BioFoundry Alliance を作り、バイオエコノミー
におけるモノづくりへの貢献をするという事で鋭意調整が進められている。日本も経済産業省・NEDO プロジェクトとして 2016 年から 5 年計画でスマート
セルプロジェクトが進められ、様々な要素技術が作られてきており Global
Biofoundry Alliance に対する貢献も行われてきている。
SDGs やパリ協定をきっかけに世界のバイオエコノミー戦略も脱化石資源社会の実現に向けて動いている。日本の生物工学会も日本と世界のバイオエコノミー実現に対し、期待されているところは大きい。6 月に作成される新バイオ戦略を解説し、生物工学会の可能性を議論したい。

How can we achieve the SDGs in the higher education sector?

Bioeconomy and related engineering biology global discussions○狩野 光伸（岡山大学・SDGs推進企画会議）
mitkano@okayama-u.ac.jp○Mitsunobu R. Kano
(SDGs initiatives promoting committee, Okayama Univ.)

Key words

SDGs, Science Technology and Innovation, higher education○藤島 義之（新エネルギー・産業技術総合開発機構・技術戦略研究セ・ 海外技術情報ユニット）
fujishimaysy@nedo.go.jp○Yoshiyuki Fujishima(TSC, NEDO)

Key words

bioeconomy, BioFoundry, SDGs, Paris Agreement

149

2S-S1p06 世界最先端のバイオエコノミー社会の実現−我が国の戦略−

2S-S2p01 Oligosaccharide fermentation by engineered yeast to
produce value-added products○服部 正（内閣府・科技）○Yong-Su Jin1,2(1Dept. Food Sci. & Human Nutrition., Univ. of Illinois, Urbana, IL,
USA, 2Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, Urbana, IL,USA)
ysjin@illinois.edu

本年 6 月、重要分野の一つとしてバイオを位置づけた統合イノベーション戦略
2019 が閣議決定されるとともに、11 年ぶりのバイオ分野における政府の戦略となる「バイオ戦略 2019」が統合イノベーション戦略推進会議において決定された。統合イノベーション戦略 2019 の概略をご紹介するとともに、国内外の情勢にも触れつつ、バイオ戦略 2019 の策定の背景、狙い及び内容について概説した
い。
はじめに、今般策定したバイオ戦略 2019 の前提となる「バイオエコノミー」について改めて認識を共有したい。2009 年に経済協力開発機構（OECD）が「バ
イオエコノミー」に関する報告書において、「2030 年にバイオテクノロジーを利活用した産業が OECD 加盟国の GDP の約 2.7%（約 1 兆ドル）に拡大する」との予測を示し、特に、農業・工業分野におけるバイオテクノロジーの軽視から転換すべきとの強いメッセージを発した。これが、バイオエコノミーを世界的に認知させた転換点と言えよう。その後、欧州連合、米国等各国がバイオエコノミー戦略を策定するが、共通することはいずれもバイオを単なるバイオテ
クノロジーの利活用と狭く捉えることなく、各々の国家戦略応じ、バイオテク
ノロジーや再生可能な生物資源を基盤としていかに競争力のある経済社会を実現するかという視点が貫かれている点にある。欧米各国はもはやバイオを技術の一分野としてではなく、これからの経済社会の前提として捉えていることを我々は認識しておくべきである。2015 年の持続可能な開発目標（SDGs）及びパリ協定の採択以降、その流れはより一層加速され、欧州においては「循環型経済（circular economy）」「健全な生態系（health ecosystems）」といった表現を用いてバイオエコノミー戦略を更新し、米国は「世界的な産業転換（The global
industrial transition）」という表現でバイオエコノミーを定義し、展開されている
取組について報告書としてとりまとめている。さらに、中国は国家戦略として
農業、材料、医薬品・医療機器の分野を重点分野に位置づけ、マレーシア、タイ、インドネシアといったアセアン諸国もバイオエコノミー戦略を策定しており、バイオエコノミーを受け入れる世界的気運が高まっている。
このような世界の潮流も踏まえ、昨年 6 月に閣議決定された「統合イノベーション戦略」において、「医療・非医療分野が一体となった新たなバイオ戦略」を策定することが明記され、この度バイオ戦略 2019 が策定された。本戦略の策定に当たっては、中間とりまとめに加え、政府に設けた有識者会議における検討、省庁の担当者により構成されたタスクフォースの検討に民間、アカデミア、地方自治体の方々にも参画いただくことを通じて、過去の戦略の振り返りとバイ
オエコノミーを巡る世界と我が国のギャップを理解することに多くの時間を割き、主に①過去の戦略の反省②研究③データ④産業・事業化の観点から整理した。
バイオ戦略 2019 は戦略の第一弾として、我が国が伝統的に潜在力を有するバイオ分野に再度光を当て、対応をこれまでの分散型から集約型へと移行させつつ、国内のヒト・モノ・カネだけでなく世界の優秀な人材、投資を呼び込みことにより、国際的にも魅力ある一大イノベーションを起こせる国へと変貌を遂げることが狙いである。本戦略は、一言で要約すれば「国内外からの人材、投資を呼び込むための戦略」であり、これまでのような「バイオテクノロジーの利活用」を中心とする考え方から脱却し、我が国としてはじめて、持続可能な新しい社会経済システムの要素として欠かすことができないバイオエコノミーをいかに形成するかという戦略として策定されたことをご理解いただければ幸いである。
今後、バイオ戦略 2019 で提示された 9 つの市場領域ごとのロードマップの策
定、国際拠点都市圏の形成などに向けて具体的な検討が進められる。日本生物工学会の会員の皆様の参画と行動を呼びかけさせていただきたい。

Conventional microbial fermentation to produce biofuels and chemicals has utilized
monomeric sugars from renewable biomass as substrates. The monomericsugars―glucose, fructose, galactose, and xylose―are produced from the enzymatichydrolysis of poly or di-saccharides―cellulose, hemicellulose, starch, sucrose, or
lactose―present in agricultural products. The enzymatic hydrolysis processes not only
require hydrolytic enzymes, but also are often inhibited by monomeric sugars. As analternative strategy to use the poly or disaccharides economically, direct utilization of
the oligosaccharides by engineered yeast has been proposed. In this new scheme,
oligosaccharides are transported into cells and hydrolyzed intracellularly instead ofbeing consumed as a monomeric sugar after extracellular hydrolysis. Direct
fermentation of oligo or di-saccharides―intermediates of polysaccharide degradation
into monosaccharides―offers many advantages in converting renewable biomass intovalue-added products. I will discuss several examples of employing engineered yeast
strains to produce biofuels, chemicals, and food ingredients through direct
fermentation of the oligosaccharides.

A challenge to the world’s most advanced bioeconomy: The bioeconomy
strategy for Japan 2019

Oligosaccharide fermentation by engineered yeast to produce value-added
products○Masashi Hattori(CSTI Secretariat)

Key words

bioeconomy, SDGs, circular economy○Yong-Su Jin1,2(1Dept. Food Sci. & Human Nutrition., Univ. of Illinois, Urbana, IL, USA, 2Carl R.
Woese Institute for Genomic Biology, Urbana, IL, USA)

Key words

oligosaccharide, Saccharomyces cerevisiae, tagatose, lactose

150

2S-S2p02〈招待講演（韓国生物工学会）〉

2S-S2p03 ATP 生成の向上による物質生産の高度化○原 清敬（静岡県大院・食栄環）
k-hara@u-shizuoka-ken.ac.jp

Designer Corynebacterium glutamicum for advanced
production from primary to high-valued chemicals
Young Jin Ko1, Young-Chul Joo1, Jeong Eun Hyeon1,2,○Sung Ok Han1
(1Dept. Biotechnol., Korea Univ., 2Dept. Food Sci. Biotechnol.,Sungshin Women's Univ.)samhan@korea.ac.kr
In the field of metabolic engineering with synthetic biology, Corynebacterium
glutamicum is one of attractive biosystems for production from essential primarymetabolites to high-valued chemicals such as L-cysteine, taurine, heme, porphyrin andbiliverdin, because it can produce various amino acids and is being used in industry.
Thus, designing metabolic pathways of this industrial microbe to tailor the final
product production is a key biotechnology and can be alternative process for largescale and high-yield production. The production of L-cysteine, which is importantsulfur-containing amino acid used in food additives, animal feed and agriculture, wasincreased in C. glutamicum by the combinatorial overexpression of the transcriptional
regulator activating sulfur metabolism with major target genes in L-cysteine
metabolism. For advanced production of food additive taurine from L-cysteine, Lcysteine producing strain was engineered by creating a new pathway from mammalianand deleting transcriptional repressor of L-cysteine metabolism. In this resulting strain,sulfur accumulation, L-cysteine biosynthesis as well as taurine production wereenhanced, which is higher than in previously reported other strains. Also, deep
understanding about the complex heme biosynthesis pathway and introduction ofprotein engineering and system metabolic engineering can contribute to production ofhigh valued products derived from porphyrin. 5-aminolevulinic acid, which is the firstcompound in heme pathway and biomedical and agricultural agent, was first producedin C. glutamicum by heterologous expression of bottleneck enzymes of C5 pathway.
And then, production of Zn-porphyrin, organic solar cell photosensitizer, was enhanced
in C. glutamicum overexpressing the transcriptional regulator upregulating heme
operon with bottleneck enzymes. Finally, for production of antioxidant agent
biliverdin, unrevealed heme pathway in C. glutamicum was investigated anddeveloped. This engineered strain successfully produced biliverdin, while heme
producing strain showed negligible production. Therefore, customized engineering of
C. glutamicum has drawn considerable attention as an attractive strategy for productionof a variety of high valued products.

現在、増殖速度が速い大腸菌や出芽酵母等の発酵微生物に、遺伝子組換え技術を用いた代謝工学的な改良を施し、医薬品や食品、化粧品、燃料、ポリマー原料等の様々な有用物質の発酵生産性を向上させるバイオプロダクションの研究が盛んに行われている。しかし、目的物質の生産性が向上するにつれ、自然界での暮らしでは考えられない偏った重労働を課せられたこれらの発酵微生物が、しばしば細胞内エネルギー（ATP）不足に陥り、生育の低下や目的物質の生産性の頭打ちを引き起こすことは少なくない（参考文献）。これは、発酵そのもの
がインプットである資源（Resource）を「細胞自身の材料（Cell）」、「細胞内エ
ネルギー（Energy）」、「目的生産物（Product）」の３つのアウトプットに振り分
けるプロセスであり、これらがトレードオフの関係にあることに、根本的な原因が存在すると考えられる。今回の講演では、この発酵のジレンマを具体的に解決する方法として、我々が行った 2 つのアプローチについて紹介する。
一つ目は、細胞の増殖が終わった段階で、細胞膜の透過処理を行い、目的生産
物の基質を供給する方法であり、酵素法や休止菌体法と呼ばれる。この方法を用いることで、バイオプロセスを細胞増殖フェーズと物質生産フェーズの 2 つに分け、細胞増殖フェーズにおいては、目的生産物へのエネルギー供給を抑え、細胞を十分に増殖させることができる。ただし、この方法のデメリットは、透過処理を行うことで、細胞膜に存在する呼吸鎖電子伝達系が機能しなくなり、ATP の供給力が低下してしまうことである。そこで、我々は、解糖系の ATP 再
生力を向上させることでこの問題を解決した。
二つ目は、本来は光エネルギーを利用できない細胞に光エネルギー利用能を付与する方法である。大腸菌を含む原核生物では、呼吸鎖電子伝達系が細胞膜に存在するのに対し、出芽酵母を含む真核生物ではミトコンドリアに存在する。
我々は、大腸菌の細胞膜や出芽酵母のミトコンドリア内膜に光リン酸化能を人工的に賦与することで、光エネルギーを利用して ATP の供給を可能にする新しい光駆動型宿主細胞を開発した。具体的には、高度好塩菌が有する光駆動プロ
トンポンプであるデルタロドプシンを大腸菌の細胞膜や出芽酵母のミトコンド
リア内膜に発現させることで、これらの宿主に本来の酸化的リン酸化能に加え、光リン酸化能を付与した。
以上のように細胞内エネルギー供給に着目した宿主改良を施すことにより、実際にいくつかの有用物質の生産性の向上がみられた。このように従来行われている目的生産物に応じた代謝改変だけでなく、細胞内エネルギー供給という細胞の根源的なシステムの改良は、様々な有用物質の生産性の向上につながると考えられる。
（参考文献）
Hara KY, Kondo A. ATP regulation in bioproduction. Microb Cell Fact. 2015;14(1):198.

Designer Corynebacterium glutamicum for advanced production fromprimary to high-valued chemicals

Improvement of ATP generation in bioproduction

Young Jin Ko1, Young-Chul Joo1, Jeong Eun Hyeon1,2, ○Sung Ok Han1
(1Dept. Biotechnol., Korea Univ., 2Dept. Food Sci. Biotechnol., Sungshin Women's
Univ.)

Key words
biliverdin

Corynebacterium glutamicum, taurine biosynthesis, Zn-porphyrin,○Kiyotaka Hara
(Grad. Sch. Nutri. Environ. Sci. Univ. Shizuoka)

Key words

ATP, rhodopsin, cell factory, energy metabolism

151

2S-S2p04 シアノバクテリアのクエン酸回路を基盤としたバイオプ
ラ原料の生産

2S-S2p05 光を利用した微生物の代謝の制御と可視化○戸谷 吉博, タンダル セバスチャン トミ, 妹尾 幸枝,
鎌田 健太郎, 清水 浩
（阪大院・情報）ytoya@ist.osaka-u.ac.jp○小山内 崇（明治大・農）tosanai@meiji.ac.jp

シアノバクテリアは、酸素発生型光合成を行う最も単純な生物である。光合成メカニズムの基礎研究だけでなく、増殖の速さから、二酸化炭素をベースとした物質生産への応用も期待されている。
我々のグループでは、単細胞性シアノバクテリアである Synechocystis sp. PCC
6803（以下シネコシスティス）の代謝制御メカニズムの解明と、物質生産への応用のための研究を行なっている。これまでの研究により、シネコシスティスを暗・嫌気条件で発酵させると、細胞外にコハク酸や乳酸を放出することがわ
かっている（Osanai et al. 2015）。これらの物質は、生分解性プラスチックの原料となる。これまでの研究によって、RNA ポリメラーゼシグマ因子 SigE 過剰発現や、酢酸合成酵素の１つである酢酸キナーゼの破壊、水素の合成酵素であるヒドロゲナーゼサブユニット H の発現抑制によって、発酵時のコハク酸、乳酸生産量が増加することが明らかになっている（Osanai et al. 2015; Iijima et al.
2016）。また、コハク酸増産株の発現パターンを解析し、糖代謝酵素遺伝子の発現が、２グループに分かれて制御されていることも明らかになった（Takeya et
al. 2017）。
シネコシスティスのコハク酸、乳酸生産量をさらに増大させるために、酵素の生化学解析を通した代謝メカニズムの解明を進めている。コハク酸生産の律速酵素と言われているホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PEPC）の生
化学解析を行ったところ、シネコシスティスの PEPC は、典型的な阻害剤であるリンゴ酸やアスパラギン酸で活性阻害を受けないことがわかった（Takeya et
al. 2017）。また、オキサロ酢酸とリンゴ酸の可逆反応を触媒するリンゴ酸デヒ
ドロゲナーゼ（MDH）の生化学解析から、シネコシスティスの MDH が極端にオキサロ酢酸からリンゴ酸への変換反応に偏っていることが明らかになった（Takeya et al. 2018）。これらの結果は、シネコシスティスがコハク酸生産に適した代謝酵素を有していることを意味している。さらに、シネコシスティスの乳酸脱水素酵素（Ddh）がピルビン酸から乳酸を合成するだけでなく、MDH と同様にオキサロ酢酸からリンゴ酸を合成することが可能なことや、クエン酸シンターゼ（GltA）がホスホエノールピルビン酸によって活性阻害を受けることなどが明らかになっている（Ito et al. 2017, 2019）。一連の研究より、シネコシス
ティスの代謝酵素は他のバクテリアとは異なる生化学的特性を有していることがわかりつつある。また、これらの事実から、シネコシスティスはコハク酸、乳酸生産に関わる酵素が独自の制御を受けており、他のバクテリアでわかっている酵素改変を適用するだけでは、さらなる増産は困難であることを示している。
我々は、シネコシスティスで分かったコハク酸、乳酸生産を真核微細藻類でも試しており、真核生物であるユーグレナも発酵によってコハク酸を細胞外に放出することを明らかにしている（Tomita et al. 2016）。さらにユーグレナは、発酵時にグルタミン酸をはじめとするアミノ酸も細胞外に放出することがわかり、発酵時の pH が重要であることも明らかになった（Tomita et al. 2019）。
本発表では、これら微細藻類の発酵による有機酸生産についての研究成果を発表し、さらなる増産に向けた展望を紹介する予定である。
Reference
Iijima et al. 2016 Algal Res. 18, 305-313
Ito et al. 2017 Sci. Rep. 7, 15052
Ito et al. 2019 Sci. Rep. 9, 6038
Osanai et al. 2015 Front. Microbiol. 6, 1150
Takeya et al. 2017 Plant Cell Physiol. 59, 72-81
Takeya et al. 2017 Sci. Rep. 7, 41080
Takeya e tal. 2018 Front. Plant Sci. 9, 947
Tomita et al. 2016 Front. Microbiol. 7, 2050
Tomita et al. 2019 Algal Res. 126, 139-144

Bioplastic production using cyanobacteria based on knowledge of the TCA
cycle enzymes○Takashi Osanai(Sch. Agric., Meiji Univ.)

Key words

lactic acid, succinate, Synechocystis, TCA cycle

様々な有用化合物が微生物の代謝を利用して生産されているが，生産速度や収率の低さが実用化への課題となっていることが多い．目的物質の生産性の向上には，代謝経路における炭素フラックスの最適化が必要であり，特に NADPHなどの補酵素を生合成に必要とする化合物の生産では，補酵素の物質収支の考慮が重要である．例えば，3 分子のアセチル CoA と 2 分子の NADPH を使って合成されるメバロン酸の生産では，解糖系とペントースリン酸 (PP) 経路のフラックス比が収率に影響する．大腸菌は取り込んだグルコースを解糖系やペン
トースリン酸 (PP) 経路によってアセチル CoA に異化する．解糖系では 1 分子のグルコースから 2 分子のアセチル CoA を作ることができる．一方，PP 経路
では 1 分子のグルコースから 5/3 分子のアセチル CoA と 2 分子の NADPH が作られる．つまり，PP 経路はアセチル CoA の供給には不利であるが，NADPH を生産できる．我々は、メバロン酸の生産において、解糖系と PP 経路のフラッ
クス比を人為的に操作することで，フラックス比がメバロン酸収率に及ぼす影響を明らかにした (1)．このように NADPH を必要とする物質を高生産するためには、フラックス比のファインチューニングが重要である．
代謝を理想的な状態に維持するためには，フラックスを動的に制御する技術が必要である．上記の研究では，解糖系と PP 経路の分岐点に反応を触媒するホスホグルコースイソメラーゼをコードする pgi をイソプロピル-β-チオガラクト
ピラノシド (IPTG) 誘導プロモーターで制御することで，フラックス比を IPTGの添加量によって人為的に操作した．しかし，IPTG などの薬剤の添加による遺伝子発現の制御は，一度添加した薬剤を培養系から除去することが難しいため，
動的な On−Off 制御ができないという問題点がある．そこで本研究では，シアノバクテリアの遺伝子発現制御系 CcaS/CcaR を利用したオプトジェネティック
スイッチを大腸菌に導入することで，光照射による代謝フラックスの制御技術の開発を目指した．CcaS/CcaR は二成分制御系であり，緑色光を吸収するとセンサータンパク質の CcaS がリン酸化し，リン酸基転移反応により転写因子のCcaR をリン酸化する．リン酸化された CcaR は cpcG2 プロモーターに結合し，下流の遺伝子発現を促進する．一方，赤色光を吸収すると CcaS/CcaR は脱リン
酸化し，cpcG2 プロモーター下の遺伝子発現を抑制する．すなわち，緑色・赤
色光の照射により On−Off 切替可能な発現制御系である．本発表では，緑色および赤色光の光照射による大腸菌における解糖系と PP 経路のフラックス比や解糖系とメチルグリオキサール経路のフラックス比の制御について報告する．
また，培養中にフラックスの情報をモニタリングできれば，その情報をフラックスの制御に利用できる．近年，大腸菌が解糖系フラックスについて転写因子
Cra を介して検知していることが報告されている．そこで，Cra の転写因子活性を蛍光タンパク質によって可視化できることを確認した．このシステムを利用することで，解糖系フラックスを蛍光強度によってモニタリングし，オプトジェ
ネティックスイッチによって適切に制御する新しいバイオプロセスが構築できると考えている．
1) Kamata K. et al., Biotechnol. Bioeng., 116:1080-1088 (2019).

Control and visualization of metabolic flux in microorganism using lightillumination○Yoshihiro Toya, Sebastian Tommi Tandar, Sachie Senoo, Kentaro Kamata,Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words

Escherichia coli, optogenetics, glycolysis, NAD(P)H152

2S-S3p01 Electrical pulse induced electrochemical sensor forcancer cell detection

2S-S3p02 Patch-type biosignal monitoring system based on flexible
electronics

Akhilesh Babu Ganganboina1,2, ○Ruey-an Doong2,3(1Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Dept. Biomed.
Eng. & Environ. Sci., Natl Tsing Hua Univ., 3Inst. Anal. Environ.
Sci., Natl Tsing Hua Univ.)radoong@mx.nthu.edu.tw○Takafumi Uemura1,2, Tsuyoshi Sekitani1,2(1ISIR, Osaka Univ., 2AIST-Osaka Univ. PhotoBIO-OIL)
uemura-t@sanken.osaka-u.ac.jp

Facile and efficient detection of cancer cells at their preclinical stages is one of thecentral challenges in cancer diagnostics. A direct, rapid, highly sensitive and specificbiosensor for detection of cancer biomarkers is desirable in early diagnosis andprognosis of cancer. In this presentation, a pulse-triggered ultrasensitiveelectrochemical sensor has been fabricated by using angiopep conjugated gold
nanoparticles (Au NPs) onto carbon sphere (Agp@Au-C) as the sensing probe. The
microstructural characterization clearly indicates the homogeneous distribution of Au
NPs onto carbon sphere, which provide large reactive sites fo angiopep conjugation.
The introduction of external electrical pulse during the cancer cell accumulation stepon the sensing electrode shows higher affinity towards cancer cells in comparison withthe tradition method due to the expanded surface of cancer cells. The sensitive as wellas the limit of detection can be significantly enhanced in comparison with conventional
electrochemical sensors. Under the optimal electrochemical pulse condition, theproposed sensor has demonstrated its capability of detecting cancer cells in a wide
linear range of concentration. The validated impedimetric parameters for the sensing
electrode in different pulsed condition even in human serum can pave an avenue forthe development of high performance and robust sensing probes for cancer cell
detection.

The internet of things (IoT) is a broadly attractive topic in many research fields related
to clinical, automotive, infrastructure, wearable, and agricultural application. In the IoT
systems, analog signals monitored by a sensor in real space are transferred tocyberspace via the internet. In this presentation, I will introduce the technology ofpatch-type biosignal monitoring system, which we have developed recently. And I will
briefly mention about the technology of flexible electronics for a wearable
biomonitoring system.
In this study, we have developed a wireless biosignal monitoring system with bioconformable organic voltage amplifier circuits. The organic circuits were fabricated ona flexible 1-μm-thick polymer foil with p-type organic transistors, thin-film resistors,
and capacitors. Therefore, the circuits are showing highly mechanical conformability
to attach on soft human skin. Here, we will introduce two types of voltage amplifier
circuits. One is a pseudo-CMOS inverter based single-end amplifier, which shows asignal gain over 60 dB. And the other is a differential amplification circuit, which has acapability of amplifying input signals while suppressing common-mode noise. To
demonstrate the potential of improving signal integrity for biosignal monitoring, wehave wirelessly recorded human electroencephalogram (EEG) or electrocardiogram(ECG) signal.
Organic thin-film transistors (OTFTs) are promising electrical components forbiomedical applications because of their unique properties for lightweight,
mechanically flexible and cost-effective processability. For example, to realize aprecise biosignal detection, flexible and large area electrodes should be tightly placed
to the target biological surface. Besides, it is desired to amplify the detected small
biosignals nearby the electrodes for minimizing incoming noise. For this reason,
flexible organic amplifier circuits integrated with biocompatible electrodes are suitable
for a reliable biosignal sensing.
In the developed system, sheet-type flexible electrodes combined with amplifiers wereconnected with a palm-sized wireless voltage measurement module. The flexible
hybrid system enables wireless biomonitoring with high signal integrity. As a result,using the single-end organic amplifier, the small EEG signal in the micro-volt range
can be amplified to mV level, which would be readily measured with an inexpensive
system. In another case, using the differential amplifier, the environmental artifacts
such as 60 Hz electrical harmonic noise and human motion artifacts of the input signal
was suppressed by approximately 60 times, yielding ECG signals with an improved
signal-to-noise-ratio of 34.0 dB.

Electrical pulse induced electrochemical sensor for cancer cell detection

Patch-type biosignal monitoring system based on flexible electronics

Akhilesh Babu Ganganboina1,2, ○Ruey-an Doong2,3(1Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Dept. Biomed. Eng. & Environ.
Sci., Natl Tsing Hua Univ., 3Inst. Anal. Environ. Sci., Natl Tsing Hua Univ.)

Key words

electrochemical, cancer cell, sensing, impedance○Takafumi Uemura1,2, Tsuyoshi Sekitani1,2(1ISIR, Osaka Univ., 2AIST-Osaka Univ. PhotoBIO-OIL)

Key words

biosensor, wearable, organic circuits

153

2S-S3p03 Crystallinity and morphology control of whitlockite
nanocrystals synthesis in tri-solvent system

2S-S3p04 Centrifugal microfluidics devices for bioassay○Masato Saito1,2(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2PhotoBIO Lab, AIST-Osaka Univ)
saitomasato@ap.eng.osaka-u.ac.jp

Caifeng Wang1, Ki-jae Jeong1, ○Jaebeom Lee2
(1Dept. Cogno-Mechatronics Eng., Pusan National Univ., 2Dept.
Chem., Chungnam National Univ.)
nanoleelab@cnu.ac.kr

Bone regenerative materials in bio-ceramics have been developed in recent decades,
focusing especially on hydroxyapatite (HAP, Ca10(PO4)6(OH)2) and β-tricalcium
phosphate (TCP, Ca3(PO4)2) due to their high biocompatibility and osteoconductivity.
In recent years, whitlockite (WH, Ca18Mg2(HPO4)2(PO4)12) has attracted attention
as a bone regenerative material. As the second most abundant biominerals in humanbone, WH has been proven to be osteoinductive for the promotion of osteogenesis, incomparison to HAP, which is simply an osteoconductive material. The most criticaldifference between WH and HAP is the existence of Mg2+ ions in their crystal
structures. Mg2+ is stored >50% in bone tissue and plays an essential role in ourskeletal system, as well as nervous and muscular systems. For example, it has beenreported that the Mg2+ ions released from WH in the vicinity of implants placed inosteoporotic bone can stimulate human turbinate-derived mesenchymal stem cells(hTMSCs) to induce osteogenic differentiation, while preventing osteoclastdifferentiation from monocytes. Further release of Mg2+ induces rapid bone formationand the expression of anabolic markers in peri-implant bone. Owing to the differencesin the atomic radius of Mg2+ ions from Ca2+, WH crystals are composed underlimited conditions, with a different morphology, crystallinity, and growth rate than
HAP, and are thermodynamically less stable than HAP crystals. Due to the difficulty inthe detection in living metabolisms, as well as its artificial synthesis, WH crystals havebeen relatively neglected in bone regeneration research. However, owing to Rowles’
pioneer work on the preparation of WH, a number of reports have appeared in recent
years. For example, Jang et al. introduced a new synthesis route of pure WH
nanoparticles (NPs) that were precipitated under Mg2+-rich and physiologically
relevant conditions. Its biological compatibility was evaluated, in which the pH wasfound to be a vital control factor in the reaction system. Qi et al. introduced a novel
microwave-assisted method for the synthesis of WH microspheres. The microsphereshowed high biocompatibility and an excellent ability to promote adhesion andspreading of MC-3T3 osteoblasts. Guo et al. studied hydrothermal growth of WH
coating on β-TCP surfaces with the aim to enhance osteogenesis. However, theinvestigation of parameters for the synthesis of homogeneous WH remains a challenge,
in particular for composition, size, and shape control, the mechanism of crystal
formation, and its related biological study. In this study, we developed a novel
methodology for the synthesis of different morphologies of pure WH using the solidliquid-solution (SLS) tri-solvent process, based on the phase transfer and separation
process across the liquid, solid, and solution interfaces. Key synthesis factors,
including the ratio of precursors, interface between surfactants and atoms were
optimized to grow WH nanocrystals with tunable sizes and morphologies, as well as
different surface properties. In the experiment, HAP nanowires with high aspect ratio
was also synthesized. In addition, molecular dynamics (MD) simulations were used todetermine the growth mechanism of WH nanoplates (M1.5). Computational
simulations through the finite element method (FEM) were carried out to reveal thesolvent effect in the reaction. Biological suitability was evaluated in MG63 cells
treated with 0.16 to 100 μg mL-1 of M0, M1.5 and P10 up to 7 days. Cell proliferation
and ALP activity assays were carried out for hTMSCs and indicated that WH canenhance the proliferation and osteogenic differentiation of stem cells.

In recent years, construction of the rapid and highly sensitive biosensor device by
inducing efficient micro-scale reaction is actively studied. Application of biosensors
encompasses a broad area specially in human health management through diagnosis
and prevention of lifestyle-related diseases (food poisoning bacteria and livestock
epidemics in agricultural fields, etc.) by daily monitoring. As advancement to themerits of biosensors, chip devices that has point-of-care testing (POCT) performancefor on-site (simple, quick, and sensitive) utility is highly desired and gradually being
developed. The author has been energetically engaged in research on biosensing chip
devices using nano / micro structures, and an example is introduced below.
The PCR remains an important technology and often used in molecular biology andtesting. By placing the reaction site in a minute space, unique effects such as rapid heatexchange and prevention of molecular diffusion occur. The author exploited theseeffects and developed a reciprocating micro-channel PCR chip, showing rapid
amplification and detection of the new influenza virus gene in just 9.5 minutes [1-4].
However, from the viewpoint of practicality, these devices should be easy andstraightforward to operate and mass-producible. Conventionally, a syringe pump isused for liquid flow control in microchannel that complicates the system management
and operation. To address this concern, a PCR solution driven by a self-propelled chip
device has been developed that utilizes thermal convection generated in the
microchannel assisted by centrifugation.
We focused on thermal convection to run the PCR solution by itself. Here, looking at
the basic equation representing the Benard convection, a gravity-dependent variable
exists. This means, if the magnitude of gravity can be changed, it is thought that theconvection velocity can be controlled. To induce the gravity required to the desired
thermal flow, a rotating platform has been utilized; rotating speed and radial position
affects the artificial gravity. However, both the temperature and artificial gravity
should be controlled in the desired system. In order to demonstrate this, we fabricated aring-shaped microchannel (5 mm in diameter, channel width 500 μm) made by COP
and a device capable of simultaneously controlling temperatures from two separate
heaters (95℃ and 60℃). For a 5 G load, the convection lap time in the ring channel
flow path was about 12 seconds. When evaluated using human β-ACT DNA (120 pg)
as a model target, rapid DNA amplification was possible within 10 minutes only [5]. In
addition, in order to overcome the complexity of PCR solution preparation, we also
developed a functional and convenient chip device that the automatically meters theamount of solution necessary for PCR using capillary action and centrifugal transfer.
This enables PCR to be performed simply by just dropping an arbitrary amount ofsolutions without trained pipetting skill. The author tried to detect the drug resistancegene (IMP-6) in human stool samples using the developed device in collaboration with
Prof. Dr. Tomono and co-workers, Medical School, Osaka University. It was possible
to detect IMP-6 DNA simply and quickly from the sample solution withoutcomplicated sample preparation; boiling and dilution only without direct extraction [6].
Currently, the development is continuing for the headway of infection control.
In addition to the above, the author is also working on the development ofcentrifugation-assisted microdroplet PCR for rapid digital gene detection [7], anddevelopment of a portable multi-sensing system [8], etc. By promoting theseresearches and developments, a meaningful contribution to medical, biochemical
research and social implementation is greatly envisioned.
References:
1) Analyst, 2011, 136, 2064-2068
2) Anal Bioanal Chem, 396(1), 457-464, 2010
3) Sensors and Actuators B: Chemical, 206, 303-310 (2015)
4) Biosensors and Bioelectronics 74 (2015) 725-730
5) Anal. Chem., 2017, 89 (23), pp 12797-12804
6) MicroTAS2017, p1244-1245
7) MicroTAS2017, p13-14.
8) Microsystems & Nanoengineering 4, Article number: 17083 (2018)

Crystallinity and morphology control of whitlockite nanocrystals synthesisin tri-solvent system

Centrifugal microfluidics devices for bioassay

Key words
whitlockite, magnesium, solid-liquid-solution systems, osteogenic
differentiation

Key words

Caifeng Wang1, Ki-jae Jeong1, ○Jaebeom Lee2
(1Dept. Cogno-Mechatronics Eng., Pusan National Univ., 2Dept. Chem., Chungnam
National Univ.)○Masato Saito1,2(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2PhotoBIO Lab, AIST-Osaka Univ)

centrifugal-assisted thermal convection PCR, microfluidics

154

2S-S3p05〈招待講演（韓国生物工学会）〉

2S-S4p01 動物細胞培養用バイオリアクターの研究を振り返って○飯島 信司（愛工大・工）iijimarecdna@aitech.ac.jp

Exosome based theragnosis for future medicine
Kyusoon Shin1, Ju Young Kim1, Chang Hyun Lee1, Kwang Sik Kim1,○Jong Wook Hong1,2,3(1Grad. Sch. Bionano. Eng. Hanyang Univ., 2Dept. Bionano. Eng.
Hanyang Univ., 3Center of exosome and bioparticulate research,
Hanyang Univ.)
jwh@hanyang.ac.kr
Exosomes are extracellular vesicles that are secreted from cells. They consist of lipid
bilayer shell and the size of exosomes is in the range of 50 to 200 nm in diameter.
Exosomes contain genetic material such as proteins and nucleic acids which reflect thecharacteristics of the cells from which the exosomes are derived. Exosomes wereconsidered to play a role of disposal of cellular waste at the time of their discovery, but
recent studies have shown that exosomes are involved in cell-cell communication suchas cancer metastasis. Currently the research has some limitations related to separationof exosomes from extracellular fluid due to their small size and the density (1.13 - 1.19
g / mL) inherent in exosomes.1)
Common methods used for exosome separation include ultracentrifugation, filtration,and precipitation. Ultracentrifugation is applicable to various body fluids, but it has alimitation that it causes damage to exosomes due to high centrifugal force which issevere, and exosomes are aggregated as a result. The yield of exosomes is remarkably
low in ultracentrifugation method. In the case of filtration method, the purification of
the exosome by the virtue of the pore size of the porous membrane causes damage tothe exosomes. This method also suffers from low treatment capacity limit. The
precipitant-based separation method can be easily used, but impurities other than
exosomes are precipitated together, resulting in low purity, including incubation, andlong separation time. 2)
In this lecture, we will report the development of a micro-system-based exosome
separation technology which keeps exosome intact by separating them through acontinuous flow process3). This technique is suitable for nondestructive separation of
biomaterials including exosomes by precisely controlling the physical fluid behavior. It
solves several problems such as low purity, throughput and long separation time.
Furthermore, we will discuss the application of exosomes as a new biomarker for
diagnosis of various disease states including cancer and its application as a new
therapeutic system to replace or supplement cell therapy.

微生物や動物細胞培養のためのバイオリアクターは古い研究の歴史を持ち、本会においてもかつては多くの研究者がしのぎを削った研究テーマであった。特に微生物培養では酸素供給が律速となることが多いため、pH センサーと並んで新たに開発された溶存酸素センサーの特性とそれを利用した培養制御の研究が数多く行われ、DO スタットによる基質の添加と酢酸など増殖阻害物質の生産抑制による高濃度培養の効率化など華々しい成果をあげた。さらに、培養基質であるグルコース濃度のオンライン測定と制御も試みられた。一方、動物細胞の培養においては、攪拌や通気に起因する剪断応力などによる細胞のダメージ
や、基質であるグルコース、グルタミンから生成する増殖阻害物質の乳酸やアンモニアの蓄積が大きな問題となった。このためバイオリアクターの攪拌翼の形状の改良や濾過型バイオリアクターの利用さらに連続培養などが試みられるとともに、前述のグルコースを始めアミノ酸などのオンライン測定なども行われた。これらの研究の歴史は複雑組織の構築を考えるときの一つのモデルになるものと考えられる。

Exosome based theragnosis for future medicine

History of research on animal cell bioreactor

Kyusoon Shin1, Ju Young Kim1, Chang Hyun Lee1, Kwang Sik Kim1,○Jong Wook Hong1,2,3(1Grad. Sch. Bionano. Eng. Hanyang Univ., 2Dept. Bionano. Eng. Hanyang Univ.,
3
Center of exosome and bioparticulate research, Hanyang Univ.)

Key words

exosome, separation, microsystem, future medicine○Shinji Iijima(Fac. Eng., Aichi Inst. Technol.)Key words

bioreactor, oxygen sensing, sensor

155

2S-S4p02 人工酸素運搬体（パーフルオロカーボンエマルジョン）の開発

2S-S4p03 ヘモグロビンを封入した人工酸素運搬体（人工赤血球）○伊藤 大知（東大院・医・疾患生命工学セ）
taichi@m.u-tokyo.ac.jp○福島 昭二（神戸学院大・薬・臨床薬剤）
fukusima@pharm.kobegakuin.ac.jp

パーフルオロカーボン ( PFC ) は酸素をはじめとした気体の溶解性が高く、化学的・生物学的に不活性であると考えられたことから人工酸素運搬体として有力視されてきた。PFC が酸素運搬を行うには、当然のことながら循環血中に存在しなければならないが、PFC は水に全く溶解しない液体であるため、血管内に投与する場合には O/W 型エマルジョン製剤とする必要がある。また血中で長時間循環することが重要である。しかし、血中に投与されたエマルジョン粒子は
RES を中心とした組織内に取り込まれ、速やかに血中から消失するため、酸素運搬能は数時間しか保つことが出来ない。我々はエマルジョン表面へ PEG 化リ
ン脂質を導入することにより RES への取り込みを回避し、血中滞留性を向上させることを試みた。
【 実 験 方 法 】 PFC と し て Perfluorodecalin (PFD) 、
perfluorotributylamine (FC-43)、および perfluorooctylbromide (PFOB)を使用し、乳化剤に精製卵黄レシチン、乳化補助剤としてパーフルオロアルコール脂肪酸エ
ステル、および PEG 修飾 distearyl phosphatidyl ethanolamine (PEG−DSPE) を用
い、また、新規に開発した高圧ジェット流型乳化機を用いて、 エマルジョンを調製した。wistar 系雄性ラットを用い、ペントバルビタール麻酔下で全血液に対し 30%相当のエマルジョンを i.v. 投与し、経時的にヘマトクリット管に採血し、遠心処理により全血液に対する PFC の体積比 (フルオロクリット値) を測定した。また、輸血代替を想定し、高濃度酸素吸入下でヘマトクリット値が約10% になるまで血液と PFC エマルジョンを交換し、経時的に血液ガスおよびイ
オン濃度を測定した。【結果・考察】PFC エマルジョンの単回投与において、投与直後のフルオロクリット値は約 10%を示したが、PEG 非修飾型 PFC エマ
ルジョンの場合、いずれの PFC においても投与後 2 時間で約 2%に低下した。
それに対し、PEG 修飾型エマルジョンの場合、投与後 4 時間においてもフルオ
ロクリット値は 7%以上を示し、血中滞留性が大幅に延長した。これは、PEG
化リン脂質により粒子表面に水和相が形成されたことで、RES による取り込みが減少したためと考えられる。血液交換では、ヘマトクリット値を約 10% とした時フルオロクリット値は約 30%であり、24 時間後において約半分の 15% に低下した。血液分析では交換後 6 時間から pH の上昇が見られたが、それ以外には大きな異常は認められず、人工酸素運搬体としての本製剤の有用性を示す
データであると思われる。これらのデータに加え、その他の酸素運搬体の開発についても述べる。

輸血用の赤血球製剤代替物として、多くの酸素運搬体が開発されてきた。これらは大別して、ヘモグロビンを用いたタイプと、PFC（パーフルオロカーボン）を用いた酸素運搬体に分類される。今後は新たに 3 次元組織を構築する培養プ
ロセスにおいて、酸素運搬体が重要になってくると予想される。この場合は、体内に大量に投与が必要な人工血液としての酸素運搬体よりも開発のハードルは低くなると期待している。
ヘモグロビンは一つの分子に４つのサブユニットを持ち、各サブユニットにあるヘム鉄を酸素分子とグロビンタンパク質のイミダゾール基を配位することで、酸素を運搬することができる。このため酸素分圧と酸素飽和度の関係を示す酸
素解離特性は、各ユニットの協奏的な効果によって、低酸素分圧で急激に酸素を吸収する S 字カーブを描く。このため空気の酸素濃度 21%、健常人のヘマト
クリット値（血液中の赤血球体積分率）45%で、全身に酸素を供給する必要不可欠な酸素を運ぶことができる。
筆者らは、赤血球の同じサイズを持つシングル μm レンジの新しい酸素運搬体の開発に取り組んでいる。SPG（Shirasu Porous Glass）膜は、非常に均一な膜細孔径を持ち、異なった細孔径の膜を選択することで、非常に均一な膜乳化を行うことができる。ウシ血液から抽出したヘモグロビン(bHb)のみでは乳化したエマルションが安定分散しないが、ウシ血清アルブミン(BSA)を一定量以上混合することで、均一な乳化を可能とし、さらにグルタルアルデヒドで架橋することでヘモグロビンーアルブミン粒子(bHb-BSA 粒子)を得ることに成功した。bHb
が 10wt%に対して、BSA が 5〜20wt%の間で安定した膜乳化を実現した。この微粒子は、架橋により共同性は失われ、p50 の値は低酸素分圧側にシフトしているものの、高い酸素親和性と酸素解離曲線を示した。
凍結保存安定な材料であり、-80℃の保存で、少なくとも年単位で活性が維持される。今後の灌流培養系の構築に活用して頂けることを期待している。

Praparation and evaluation of perfluorocarbon emulsion as artificial oxygen
carrier

Hemoglobin-based oxygen carriers (Artificial red blood cells)○Shoji Fukushima(Dept. Clinic. Pharmaceut., Pharm. Sci.,Kobegakuin Univ.)

Key words

perfluorocarbon, emulson, oxygen, carrier○Taichi Ito(CDBIM, Univ Tokyo)

Key words

Oxygenation, hemoglobin, PFC, membrane emulsification

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2S-S4p04 複雑組織製造に必要な基盤技術を考える〜バイオリアク
ターの側から〜

2S-S4p05 トランスオミクスビッグデータからＳＤＧ障害疾患に対する新薬発見

○長森 英二（大工大・工）eiji.nagamori@oit.ac.jp

はじめに（本シンポジウムの開催主旨）
次世代を担う再生医療・細胞治療技術として，複数の細胞種から構成され複雑構造（血管ネットワークや神経ネットワークなど）を有した機能的組織製品の実現が予期される．これを実現に導くには，対象とする臓器の成立ちを参考にしつつ，試験管内環境にて実現可能な方法により複雑組織構造を作り上げる高度な組織工学技術（I），試験管内で作製した複雑組織を十分な栄養や酸素の供給が可能な状態にて生かしつつ，生体内にて未成熟組織が機能的に成熟する環境を試験管内に実現（生体内環境模倣培養）することで機能的に育む技術（II），
作製し育んだ組織の機能面を適切に評価可能な高度なアッセイ技術（III），の一連が求められると予想される．このように作製・評価が可能な機能的な組織は，創薬や安全性評価等の細胞アッセイにも活用可能と考えられる．同タイトルのシンポジウムは，ここに記述したような将来技術を思い描き，実現に導くための要素技術を考えると共に，解決すべきボトルネックを明確化・発信することを意図している．2018 年度大会では主に，上記の（I）複雑組織を作り上げるための技術群に着目して先進的な試みをシンポジストにご紹介頂いた．本大会
では第 2 弾として，このような組織を育む装置としてバイオリアクター側に求められる仕様や要素技術について議論をしたい．
酸素運搬体を用いた超高密度かつ機能的な細胞培養
発表者を含む研究グループは，これまでに培養骨格筋組織を題材として，上記の（I）から（III）の要素技術開発に取り組んできた．中でも（II）において，生体組織並み（109 個/mL 以上）の超高密度な組織培養を可能とするために酸素律速の問題は深刻になると当初から予想され，酸素運搬体を用いた細胞培養の可能性を検討してきた．具体的には，PBS 緩衝液中でエマルジョン化された
パーフルオロカーボン ( PFC エマルジョン ) を用い，酸素供給速度を高める効
果による超高密度培養に対する取り組み，酸素が豊富な環境で培養することで導かれる細胞の構造や機能の変化 1)，のそれぞれについて検討状況をご紹介したい．
参考文献
１）Fujita, H., Shimizu, K., Morioka, Y., Nagamori, E., Enhancement of C2C12
differentiation by perfluorocarbon mediated oxygen delivery. J. Biosci. Bioeng. 110(3), 359-362. (2010)

Considering complexed tissue-engineering techniques in all aspects forindustrial tissue manufacturing○Eiji Nagamori(Fac. Eng., Osaka Inst. Technol.)Key words

tissue culture, perfluorocarbon emulsion, skeletal muscle○植田 充美 1,2（1京大院・農, 2CREST）
miueda@kais.kyoto-u.ac.jp

ＳＤＧ障害疾患の問題となっている感染症疾患の 1 つであるカンジダ症は、常在性真菌 Candida albicans によって引き起こされる日和見感染真菌症である。健常者においては、免疫細胞マクロファージが C. albicans の病原性を抑制する。
しかし、抗生物質の過剰摂取や高齢化や AIDS 疾患などにより免疫力が低下す
ると、それを契機として C. albicans は病原性を発揮する。豹変した C. albicans
は形態変化し病原性タンパク質を生産することで、マクロファージに貪食されずに脱出し、血流を通して全身の臓器に感染が広がっていく。このカンジダ症に有用な診断薬・抗真菌薬はほとんどないに等しい状況である。特に全身性カンジダ症の致死率は、敗血症、あるいは多臓器不全として 50%にも達する。
こういった問題を克服するためには、新規な機構を持つ抗真菌薬剤の開発が必要である。本シンポジウムでは、トランスオミクスビッグデータを活用したミックスドプロテオミクスを構築することにより、C. albicans のマクロファージ破壊機構の解明を試み、免疫療法の適用により、カンジダ症を完全に制御できる新薬を発見し実証した。
C. albicans のマクロファージ破壊脱出機構を詳細に解析するため、相互作用させた後、そのまま分離せずに高分離能ロング・モノリスカラム装備ナノ LC-MS/
MS による 2 種生物由来のタンパク質群をオンラインで高速・精密に分離し、MS/MS による網羅的なタンパク質の同定とそれぞれの生物のゲノム情報を基にした帰属解析を行った結果、次のことが推定された。
1. マクロファージ内では、C. albicans は、グルコース飢餓状態が生じ、β 酸化とグリオキシル酸回路を働かせて、枯渇しているグルコースを自ら作り出している。さらに、プロテアソーム系により自身のタンパク質を分解し、アミノ酸合成も行っている。
２．マクロファージ内のストレスに対処するため、C. albicans は酸化ストレス、イオン欠乏ストレス、低 pH ストレスなどに対処するタンパク質を生産していることが分かった。
3．マクロファージに対して、C. albicans は病原性に関連していると報告されている、菌糸関連タンパク質、接着タンパク質、プロテアーゼ等を生産している。
多くの機能未知タンパク質も同定され、これらも、マクロファージ内に分泌され、C. albicans のマクロファージ破壊脱出機構に重要な役割を担っていることが期待される。
4. マクロファージタンパク質としては、シャペロンタンパク質やアポトーシス
関連タンパク質など 2 つのタンパク質が顕著に減少していた。C. albicans はこ
れらマクロファージタンパク質を分解することで、マクロファージ活性の低下を誘導し、破壊脱出しているのではないかと考えられた。
上記のミックスドプロテオミクスにより、C. albicans は、マクロファージのグ
ルコース枯渇戦略をかいくぐるため、自らの脂肪酸の β―酸化により、形態を糸状タイプに変え、グリオキシル酸回路を稼働させ、グルコースを新生させエネルギーを得て、マクロファージの攻撃を撃破して、血管網へと浸潤しているものと考えられた。したがって、この中で、グリオキシル酸回路を遮断すれば、感染症を防御できると考えられた。そこで、グリオキシル酸回路の酵素である
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Mdh1p）に着目して、これに抗原性があることも知られているので、有望なワクチン候補になると期待される。C. albicans のMDH1 遺伝子をクローニングし、MDHp を大腸菌で発現させた、これからエン
ドトキシンを除去したのち、マウスに皮下、並びに経鼻投与を行った。血清中の抗体価上昇を確認後、致死量の C. albicans を接種して生存率を観察したとこ
ろ、35 日目での生存率は、100％という結果を得た。この結果より、この戦略は、C. albicans に対するこれまでにない有望な未病・予防療法となった。
本疾患は、高齢化社会で現在増加してきており、早急な予防や早期診断法が求められているが、この新しいミックスドプロテオミクスにより、グリオキシル酸回路系の酵素に対する分子標的薬の開発や、抗原の事前投与による免疫力強化が有効であることが提唱された。
文献
植田充美ら、「ミックスドプロテオミクスの展開拡大」、p.78-87, 「バイオイノ
ベーションに向けて」(シーエムシー出版) 2019 刊行

Discovery of novel medicines specific for diseases with damages to SDGs
from big data based on transomics○Mitsuyoshi Ueda1,2(1Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 2CREST)

Key words

transomics, SDG, mixed proteomics, infectious disease

157

2S-S4p06 データ駆動型代謝数理モデル構築とシアノバクテリア代
謝工学への応用

2S-S4p07 質量分析を基盤としたシングルセル分子フェノタイプ
解析○松田 史生（阪大院・情報）
fmatsuda@ist.osaka-u.ac.jp○和泉 自泰, 馬場 健史（九大・生医研）
izumi@bioreg.kyushu-u.ac.jp

はじめに：近年、ビッグデータの取得と活用が活発化している。しかし、生物を使ったものづくりに応用可能な数万点のデータセットが氾濫している状況とはいいがたい。そこで、我々は微生物代謝工学への利用を目的として、少数の培養条件から得た 3 種の定量データ(代謝物含量、酵素タンパク発現量、代謝フラックス）用いた、データ駆動型の代謝数理モデル構築を試みている。
代謝工学は、有用物質生産能を指標とする代謝経路の最適化問題に取り組んでいるともいえる。フラックスバランス解析に基づく代謝シミュレーション法の登場で、大域最適解がある領域を推定できるようになった。次なる課題は、局
所最適化のため勾配評価である。現状の有用物質生産株周辺の地形を調べてもっとも勾配の大きな方向を探すこと、すなわち有用物質生産能に活性変化が最も影響する代謝反応を特定する感度解析の実現である。計算機シミュレーション
で感度解析を行うには、「なんでも予測できる代謝数理モデル」は必ずしも必要なく、少なくとも①現状の有用物質生産株の代謝状態が再現でき、②代謝反応の活性増減が有用物質生産能に及ぼす影響を予測可能できればよい。しかし、
代謝数理モデルのパラメタ（ミカエリス定数など）の情報が不足しているため、データ駆動型のパラメタ推定に期待が集まっている。
必要なデータの種類：感度解析のための代謝数理モデルはミカエリスメンテン型の速度式で記述されることが多い、したがって、代謝物含量 [S]、酵素タンパ
ク質発現量 [E]、代謝フラックス v の実測データがあれば、残りのパラメタである k と KM が推定できるのではないかと考えた。また、代謝物含量 [S]はメタボ
ローム分析で取得できる相対定量値では不十分である。そこで代謝物濃度を測定可能の手法を構築した (Nishino et al. JBB. 2015)。
データ駆動型のシアノバクテリア代謝数理モデル構築：我々はまず、「光独立栄
養条件下で培養したシアノバクテリア Synechocystis sp. PCC 6803 (PCC 6803)の代謝状態を再現可能な代謝数理モデルの構築」を目指した。また、予測力の高いモデルを１つ作ることはあきらめ、そこそこの予測力を持つモデル 100 個の集団（アンサンブル）を作成することを試みた。
まず、PCC 6803 の中心代謝 39 反応を、k と KM などのパラメタが未定のままミ
カエリスメンテン型の速度式で記述した。つぎに、光独立栄養条件下の PCC
6803 から取得した[S], [E], v の実測値を式に代入した。残りの k と KM のうち、KM をランダムサンプリング(範囲は 0.01-10mM) し、式に代入すると、k は自動的に計算で決まる。39 反応について同様の操作を行い、速度式＋ランダムな KM＋計算で求めた k からなる代謝数理モデルを１つ生成した。この代謝数理モデ
ルは、①光独立栄養条件下の PCC 6803 の代謝状態を再現できる。モデル生成を繰り返し、k と KM が異なる代謝数理モデルを 1,000,000 個生成した。
次に、1,000,000 個のモデルに練習問題を解かせ、成績の良いものを選抜した。
異なる条件（混合栄養条件）で培養した PCC 6803 から[S]、[E]、v の実測データを得た。酵素タンパク質発現量[E]を上記で作成した代謝数理モデルに代入
し、定常に達するまで時間展開すると、混合栄養条件の代謝物含量と代謝フラックスの予測値が得られる。実測値に近い予測値を出したモデルが、②代謝反応の活性が増減した時の代謝状態を予測する能力が高いモデルであるといえる。
本研究では予測能力の高いモデルトップ 100 個を選抜し、予測用のモデル集団（アンサンブル）とした。
エタノール生産能向上に寄与する代謝反応の予測：構築したモデルでエタノー
ル生産速度の向上のための合理的な代謝改変箇所を予測した。まず、モデルア
ンサンブル 100 個をそれぞれで、感度解析（代謝コントロール解析）を行った。
得られた結果も 100 個あるため、予測値にはばらつきがある。最低 90 個のモデルで同じ予測が得られた反応を調べたところ（アンサンブル予測）、PYK、PGKと PRK の 3 反応が過剰発現の候補として特定された。実際に、エタノール生産
株に、これらの酵素を追加で過剰発現した株を作成したところ、PGK の過剰発現株ではエタノール生産量が 1.4 倍に向上していた (Nishiguchi et al. Metab Eng2019)。
データ駆動型代謝数理モデル構築の更なる活用に向けて：ミカエリスメンテン型の速度式に登場する、代謝物含量、酵素タンパク発現量、代謝フラックスを実測データが網羅できたことが、2 条件と少ないデータ点数でも、予測力の高
い代謝数理モデルが構築できた鍵であると考えられた。さらに、アンサンブル
予測をおこなうことで、予測精度の推定が可能となった。データ駆動型サイエ
ンスをさらに展開させるには、データの量に加えてバリエーションの重要性をよく吟味していく必要があると考えられた。

生命の最小単位である細胞は特異的な機能を持つ細胞集団に分類することができるが，近年の研究から同一細胞集団であっても多様性・不均一性を有することが知られている．この多様性が環境適応や疾患発症の過程において極めて重要な役割を担っていると考えられ注目されている．プロテオームおよびメタボ
ロームは，生命システムを理解するための重要分子であると同時に，ゲノム情報の実行の結果，すなわち高解像度のフェノタイプとしても捉えることができる．一方，近年の次世代シーケンサーの技術革新に伴い，ゲノムおよびトランスクリプトーム情報は 1 細胞レベルで取得できるようになってきた．しかし，
メタボロームおよびプロテオーム分析は，PCR のような観測対象物の増幅操作ができないため，細胞内に存在する膨大な種類の分子種をそのまま検出する必
要 が あ る ． 2016 年 の Nature 誌 に 掲 載 さ れ た 論 文 「 Technology feature:
Metabolomics Small molecules, Single cells (Fessenden M., Nature, 2016)」では，「質
量分析計 (MS) の高感度化と細胞サンプリング技術の発展により 1 細胞での代謝解析が可能となりつつあるがこの研究分野はまだ発達初期段階 (infancy) である」と結論づけられた．この主な理由は，これまで 1 細胞メタボローム解析に適応されてきた細胞種がアフリカツメガエルの初期胚 (直径 1 mm，523 nL) な
ど細胞サイズの大きいものが大半であり，さらに細胞内での存在量の多い 40 種
程度の代謝物しか検出できないためであった (Rosemary M. et al., PNAS, 2015)．
一般的な動物細胞の体積 (直径 20 μm，4 pL) は，上記の細胞の 100 万分の 1 程度である．したがって，一般的な動物 1 細胞のメタボローム解析を実施するた
めには，100 万倍の検出感度の向上および周辺技術の開発が必要不可欠である．
そこで本研究では，一般的な動物細胞を測定試料として，ナノ液体クロマトグ
ラフィータンデム質量分析 (nano-LC/MS/MS) を基盤とした代謝物あるいはタン
パク質の高感度計測技術および試料調製・試料導入技術を連携・連動させた「高感度分子フェノタイプ解析システム」の開発に取り組んだ．
我々はこれまで，一般的な動物 1 細胞からのメタボローム解析およびプロテオー
ム解析 (ショットガンプロテオミクス) を実施するために，(1) 顕微鏡下で標的とする生細胞を迅速に単離・回収する技術，(2) サンプルロスを低減させた微小空間内での前処理および微量試料導入技術，(3) nano-LC/MS/MS による超高感度分析技術を開発してきた．さらに，これらの要素技術を融合させた「1 細胞分子フェノタイプ解析法」を用いることで，HeLa 1 細胞 (直径 20 μm，4 pL) から，100 種の代謝物 (50 種の親水性代謝物および 50 種の疎水性代謝物) あるいは 100 種のタンパク質 (リボソームや細胞骨格タンパク質，一部の酵素など) の検出に成功した．また，開発した nano-LC/MS/MS システムの検出感度は，おおよそ 10 amol〜1 fmol (化合物によって異なる) であり，メタボロミクスおよび
プロテオミクス分野では世界最高感度の分析系である．そのため，一般的な動物細胞の 1 細胞解析にも適応可能であった．しかし，本分析系の検出感度は限界の域に達しつつあり，細胞内に微量に存在する分子群の検出は困難であると予想される．また，メタボローム分析とプロテオーム分析は，nano-LC/MS/MS
分析系により測定を行うものの，カラム担体の種類や移動相条件，あるいは測定のための前処理法 (トリプシン消化の有無など) が大きく異なるため，同一細胞からのメタボローム・プロテオーム同時測定は不可能である．以上のことから，現時点においては，「ライブセルイメージング」と「高感度分子フェノタイ
プ解析」の融合こそが新たな生命システムを紐解く現実的かつ効果的な解析手段であると結論づけた．すなわち，ライブセルイメージングによってヘテロな生細胞集団から蛍光等を指標に細胞特性を定義し，細胞特性の異なる少数細胞
集団 (〜50 cells) を迅速に回収し，高感度分子フェノタイプ解析を実施する．さらに, 細胞特性が同じ少数細胞集団のメタボロームおよびプロテオーム情報を統合して解析することで，生命システムの理解や新たな発見に貢献できると考えた．現在，がん細胞の細胞周期と代謝の差異を明らかにするために，ヘテロながん生細胞集団から細胞周期をリアルタイムに観測できる蛍光プローブ (Fucci:
Fluorescent Ubiqutination-based Cell Cycle Indicator) を指標に，細胞周期の異なるがん細胞を回収し，分子フェノタイプ解析を進めているところである．
謝辞：本研究は科学技術振興機構 (JST) CREST 「統合 1 細胞解析のための革新的技術基盤 (研究課題番号 JPMJCR15G4)」の支援を受け実施した．

Trans-omics data driven ensemble modeling of cyanobacteria metabolism
using metabolic flux, metabolite concentration, and enzyme expression data

Mass spectrometry-based molecular and phenotypic analysis at single-cellresolution

Key words
dynamic metabolic model, metabolic engineering, cyanobacteria,
metabolic flux analysis

Key words○Fumio Matsuda(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)○Yoshihiro Izumi, Takeshi Bamba(Med. Inst. Bioreg., Kyushu Univ.)

single-cell analysis, metabolomics, proteomics, living cell

158

2S-S4p08 1 細胞セルオミックスによる多細胞ネットワークが織り成す生命現象の解明

2S-S4p09 逆強化学習による「動物の行動戦略」のデータ駆動的解読○青木 航 1,2
（1京大院・農, 2JST・さきがけ）
aoki.wataru.6a@kyoto-u.ac.jp○本田 直樹（京大院・生命）honda.naoki.4v@kyoto-u.ac.jp

近年、生命科学の方法論が hypothesis-driven から data-driven へと大きく変わりつつある。その背景にあるのが、高性能な次世代シーケンサーや質量分析器の出現である。これらの技術的革新によりトランスオミックスデータの取得が比較的簡便になるとともに、バイオインフォマティクスパイプラインも整備され、従来考えられなかった規模でビッグデータの蓄積とその解釈が進みつつある。
このようなオミックス解析（ゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオ
ミクス、メタボロミクス）は非常に強力だが、課題も存在する。それは、複雑な多細胞生物が、どのように細胞―細胞ネットワークを構築して高次生命現象を創発させるのか、といった組織レベルの問題に対してはアプローチしにくいことである。
そこで我々は、多細胞ネットワークが織り成す生命現象の理解を目指して、セルオミックスと名付けた新しい方法論の開発を進めてきた。具体的には、多数のニューロンが相互に接続して高次機能を創発する「脳」をモデルとして選択し、その動作原理を細胞ネットワークレベルで理解するための新規方法論“functional cellomics”を提案している[1]。“Functional cellomics”の核となる技術のひとつが、オプトジェネティクスである。オプトジェネティクスとは、ニューロンにオプシンを発現させ、光照射によりニューロンの活性を自在に ON/OFFする技術である。オプトジェネティクスは強力な手法であるが、仮説を必要とするため完全に新しい発見は生まれにくく、また、それぞれの仮説に合わせた遺伝子組み換え生物を作製する必要があるためスループットが低いという弱点がある。そのためオプトジェネティクスは、神経ネットワークレベルの datadriven science を実現するための基盤技術にはなりえていない。そこで、オプトジェネティクスに Cre/lox ゲノム組換えシステムを組み合わせることで、神経ネットワークを構成するひとつひとつのニューロンにおいてオプシンが発現するか否かを“stochastic”に決定するシステムを構築した。このアプローチは従来のオプトジェネティクスに対して相補的特徴を持っており、仮説を必要とせず、
ハイスループットに、各ニューロンの機能をネットワークレベルで評価可能である。この手法を用いると、さまざまなパターンでオプシンが発現した生物集団を簡単に創出することができ、この集団に対して光照射下で行動実験を行う
ことで、さまざまな表現型を示す個体を一度の実験で得ることが可能になる。
この手法は仮説を立てずに網羅的な cellomics データが取得可能なため、細胞ネットワークの網羅的解析に貢献できると期待される。
[1] W. Aoki et al. 8, 10380 (2018)

動物は外界の状況に応じて、より多くの報酬が期待できる行動戦略を持って行動していると考えられている。しかし、報酬には食べ物やお金など実態の伴うものだけでなく、間接的にそれらに結びつくものも含まれているため、自由に行動している動物を単に観察しているだけでは、「動物が何を報酬として、また何に価値を置いて行動しているのか？」を知ることは困難であった。そこで我々は、自由行動下の動物の行動時系列から「報酬によって規定される行動戦略」
をデータ駆動的に解読する機械学習的手法（逆強化学習法）を考案した。
逆強化学習法の応用先として、線虫の温度走性行動に注目した。一定の温度で培養した線虫は、その培養温度を記憶し、温度勾配下では培養温度を目指して移動し、逆に一定の温度で餌のない飢餓状態を経験した線虫は、温度勾配下で飢餓温度を避けることが知られている。しかし、線虫がどのような戦略にしたがって行動して いるのかは全くの不明であった。線虫を温度勾配において追尾することで、行動時系列データを取得し、 そして逆強化学習法により、線虫にとっての報酬を推定した。 その結果、餌が十分ある状態で育った線虫は、「絶対温度」および 「温度の時間微分」に応じて報酬を感じていることを明らかにした。この報酬に基づく戦略は２つの異なるモードから構成されており、一つは効率的に成育温度に向かう移動、もう一つは同じ温度の等温線に沿った移動を説明するものであった。また飢餓を経験した線虫は 「絶対温度」のみに依存した報酬により、飢餓温度を避ける戦略を持っていることを明らかにした。さらには、推定された報酬を用いて線虫行動をシミュレーションすると温度走性行動が再現され、逆強化学習法の妥当性が示された。
この手法は行動とそれに伴う状態変化が定量的に観測可能な場合、線虫に限らず他の動物へも適用可能であることから、神経科学や行動生態学の基盤技術になることが期待される。

Elucidation of biological phenomena of multicellular organisms byfunctional cellomics

Data-driven identification of animal behavioral strategies by inverse
reinforcement learning○Wataru Aoki1,2(1Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 2PRESTO, JST)Key words

Caenorhabditis elegans, cellomics, functional cellomics, optogenetics

参考文献：Identification of animal behavioral strategies by inverse reinforcement
learning. Yamaguchi S, Honda N* et al., PLoS Computational Biology (2018)○Naoki Honda(Grad. Sch. Biostud., Kyoto Univ.)

Key words

machine learning, behavioral analysis, reward, Caenorhabditis elegans

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2S-S5p01 Two tales of the respiratory chain: 呼吸鎖が物質生産に直接的に関わるお話と間接的に関わるお話○藥師 寿治 1,2,3, 片岡 尚也 1,2,3, 松下 一信 1,2,3（1山口大・院創成, 2山口大・農, 3山口大・中高温微セ）
juji@yamaguchi-u.ac.jp

呼吸鎖電子伝達系は化学的には NADH とコハク酸の酸化が酸素の還元と共役することではあるが，膜電位とプロトン濃度勾配の形成として細胞のエネルギー生産に重要な役割を持つ。今回，呼吸鎖が酢酸菌による物質生産に直接的に関わるお話と間接的に関わるお話を提供して，応用展開の可能性や残された課題を議論する場になることを期待する。
【直接的に関わるお話】呼吸鎖には，電子受容体が酸素でないものや汲み出されるイオンがプロトンでないものなど，生物界には様々なバリエーションがある。
酢酸菌の場合，様々な糖やアルコールを酸化する脱水素酵素が細胞膜に存在し，これらを電子供与体とする呼吸鎖電子伝達系が発達している。これら脱水素酵
素は細胞質膜の外側に存在しており，培地中の基質を細胞内に取り込むことなく酸化することができる。加えて酢酸菌はそのようにして生じる酸化産物をしばらく消費することなく蓄積する。この特徴が物質生産に利点となり，酢酸発酵やソルボース発酵に利用される。このように酢酸菌は，物質を酸化するためだけにこのような呼吸鎖を発達させてきたように見える。しかし，この物質酸化系呼吸鎖であっても膜電位とプロトン濃度勾配を形成できるので，その生理学的意義は十分に理解できる。例えば，グリセロールはグリセロール脱水素酵
素（GLDH）によってジヒドロキシアセトンにほぼ定量的に酸化され，グルコー
スはグルコース脱水素酵素（GDH）によってグルコン酸へほぼ定量的に酸化される。私たちは GLDH と GDH の基質特異性を再調査した。GLDH では幾つかのアルドペントースが基質となり，アルドペント酸を生じることを提案した。
L-リボースの酸化については詳細に解析し，L-リボン酸が生じることを NMRで確認した（Yakushi et al., 2018）。GDH では，グルコースと比べるとほとんど酸化できないに等しいラクトースを酸化してラクトビオン酸を効率よく生産させることを試みた。GDH を酢酸菌で過剰発現することによって，ラクトース酸化系呼吸鎖の「入り口」を広くすることを試みた。酸化速度を上昇させることができたが，課題も見えてきた。
【間接的に関わるお話】呼吸鎖が補酵素のレドックスや細胞のフィットネスに関わることで，間接的に物質生産に影響する。酢酸菌 Gluconobacter oxydans はEmbden-Meyerhof-Parnas 経路と TCA 回路の 1 部が遮断されており，解糖はペン
トースリン酸経路あるいは Entner-Doudoroff 経路に依存し，酢酸を主な最終代
謝産物とする。TCA 回路は回らないが，解糖系で NADH は生産されるので，これを NADH 脱水素酵素（NDH）で酸化しなければならない。さらに解糖に加えて，酢酸を生じるアルデヒド脱水素酵素が NADP+ 依存であるがゆえに，
NADPH の酸化も必要になることが期待される。しかしながら，膜画分の NADH
酸化能（酸素を電子受容体とする）は十分に高いものの，酸素を電子受容体とする NADPH 酸化能は極めて低い。公開されている酢酸菌ゲノムを網羅的に解析してみると，酢酸菌には I 型と II 型の NADH 脱水素酵素（NDH）が見られるが，Gluconobacter 属には一種の例外を除き，II 型しか持たない。また，G.
oxydans のほとんどの菌株が２種類の II 型 NDH を持つのに対して，より解析が進められている ATCC621H 株は例外的に１種類の II 型 NDH しか持たない（Matsutani et al., 2019）。以降，621H 株が持っている II 型 NDH を c-NDH とし，もう一方を s-NDH と呼んで両者を識別する。以前，ドイツのグループから２種の II 型 NDH を持つ G. oxydans DSM 3504 の s-NDH 遺伝子を破壊して 621H 株のような遺伝型にすると，生育が悪くなることが報告された（Kostner et al.,2015）
。この結果は，s-NDH が c-NDH には無い特性を持つ事を示唆している。
c-NDH と s-NDH をそれぞれ大腸菌で発現させ，酵素活性を調べたところ，cNDH は NADH に高い特異性を示し NADPH をほとんど酸化しなかった。一方，
s-NDH は両者をほぼ同程度酸化した。ここで，グルコース脱水素酵素遺伝子欠損株（ΔgdhM 株）を実験に用いた。ΔgdhM 株は野生株よりも生育速度が低かった。野生株がグルコースではなくグルコン酸を細胞内に取り込んで酢酸まで代謝するのに対し，ΔgdhM 株ではグルコースからグルコン酸へと変化させるルートを遮断しているため，細胞内にグルコースを取り込んで代謝する。この過程
で NADPH を産出する。すなわち，グルコン酸の場合に比べて，グルコースの方が 1 分子 NADPH を多く生産する。そこで，NADPH を酸化できる s-NDH を導入することで NADPH レベルの低下を試みた。ΔgdhM 株と生育速度を比べると s-NDH を導入した株は生育速度が上昇した。この結果から，ΔgdhM 株の生育能低下の原因の一つが NADPH の蓄積と考察することができる。酢酸菌はおそらく，細胞外の物質酸化系呼吸鎖を発達させてきたため，細胞内での NADPH
酸化能に注力することなく進化してきたものと考えられる。
参考文献：
Yakushi et al. (2018), Appl Microbiol Biotechnol. 102: 3159.
Matsutani et al. (2019), Microbiology 165: 287.
Kostner et al. (2015), Appl Microbiol Biotechnol. 99: 375.

Two tales of the respiratory chain: a direct and indirect relationship tobioproduction○Toshiharu Yakushi1,2,3, Naoya Kataoka1,2,3, Kazunobu Matsushita1,2,3(1Grad. Sch. Innov., Yamaguchi Univ., 2Fac. Agric., Yamaguchi Univ., 3RCTMR,
Yamaguchi Univ.)

Key words

NAD(P)H, oxidation, cell membrane

2S-S5p02 大腸菌の呼吸鎖欠損変異株が示す異常な糖代謝の解析○横田 篤（北大院・農）yokota@chem.agr.hokudai.ac.jp

１． 背景と目的大腸菌の呼吸鎖はプロトン駆動力（pmf）形成を通じた酸化的リン酸化によるATP 合成や NADH の再酸化に関与し，細胞内のエネルギーレベル(ATP/ADP比)や酸化還元バランス(NAD+/NADH 比)を通じて中枢代謝に影響を与えている。
しかし，呼吸鎖と中枢代謝の相互関係は不明な点が多く，発酵生産菌育種のための基盤知見としてもさらなる理解が求められている。我々はこの相互関係を検証するために呼吸鎖酵素の欠損株を構築し，代謝解析を行ってきた。
具体的には，呼吸鎖酵素のうち pmf 形成能が高い NADH 脱水素酵素 I（NDH-I）とシトクロム bo3 オキシダーゼ（Cytbo3）に注目し，Escherichia coli W1485（野生株）を親株として、その片方を欠失させた株（ΔNDH-I 株，ΔCytbo 株），および両方を欠失させた株（ΔΔ 株）を構築して解析した。各株の pmf 形成能は，親株＞ ΔNDH-I 株≒ΔCytbo 株＞ ΔΔ 株と推定される。その結果，全ての欠損株
で酢酸が著量生成されたが，ΔΔ 株では野生株や ΔNDH-I 株，ΔCytbo 株では生成されないグルタミン酸（Glu）が，50 g/L のグルコースから約 7 g/L も生成される異常な糖代謝が観察された 1)。また，ΔΔ 株では NADH の蓄積による細胞内の還元化も観察された。ΔΔ 株に見られるこのような異常な細胞外代謝産物の蓄積には，pmf 形成能が他株に比べて著しく低いことや，細胞内還元化の影響が推測されたが，その機構は不明であった。
そこで，本研究では呼吸鎖酵素の欠損が糖代謝に与える影響を包括的に明らかにするために，単欠損株と ΔΔ 株についてトランスクリプトーム解析，および
メタボローム解析を行い野生株と比較した。さらに酸化還元バランスが呼吸鎖酵素欠損株の代謝に与える影響を解析するために，pmf 形成能を持たない NADH
脱水素酵素 II（NDH-II）を IPTG 誘導型のプラスミドで発現させる系を構築し，ΔΔ 株に導入して（ΔΔ/NDH+株）その培養特性を解析した。
２． 方法
親株 E. coli W1485 と単欠損株（ΔNDH-I 株，ΔCytbo 株）および ΔΔ 株をジャー
ファーメンターで無機塩発酵培地を用いてバッチ培養し，対数増殖期後期の菌体を回収した。回収した菌体を用いて RNA-Seq およびメタボローム解析を行い，遺伝子発現と細胞内代謝物の動態を網羅的に調べた。ΔΔ/NDH+株は IPTG
を添加して同様にバッチ培養を行い，IPTG 無添加の場合と生育，糖消費，細胞外代謝産物を比較した。
３． 結果と考察
呼吸鎖酵素欠損株では転写・細胞内代謝物の両方で変化がみられた。その程度
は単欠損株よりも ΔΔ 株で大きく，pmf 形成能の異なると考えられる一連の変異株を用いることで，エネルギー欠乏の度合いと大腸菌の応答の関連が明瞭に示された。特に酢酸生成と Glu 代謝に大きな変化がみられた。すなわち、ピルビン酸から酢酸を生成する pyruvate oxidase をコードする poxB の転写量が，ΔΔ
株＞単欠損株の順で増大していた。PoxB は呼吸鎖の電子伝達体であるユビキノ
ンに電子を供与し，ユビキノールを生成させる。ユビキノールは末端酸化酵素
によって再びユビキノンへと酸化され，その過程で pmf が形成される。ΔΔ 株
では PoxB による酢酸生成を活性化させ，pmf 形成能の低下を補っていると推測した。また，ΔΔ 株で Glu の脱炭酸反応を担う gadA，gadB の転写量が増大
し，細胞内の γ-アミノ酪酸（GABA）濃度も上昇しており，Glu 脱炭酸反応系の促進が示唆された。本反応系は TCA サイクルを 2-オキソグルタル酸からコハク酸へバイパスする反応とサイクル反応を形成し，Glu 脱炭酸反応により細胞内 H+が消費されることで pmf を形成する。ΔΔ 株では pmf 形成能の低下を補完するために本サイクル反応が促進され，それに伴い Glu が大量に生成されたと考えられた。
一方、ΔΔ/NDH+株は IPTG 添加により生育が増加したことから，細胞内還元化の影響で生育が低下する可能性が示された。細胞外代謝産物では IPTG 添加でピルビン酸や酢酸の生成量が減少し、2-オキソグルタル酸の生成量が増加した。
このことから，NDH-II の導入で NADH レベルが低下し，TCA サイクル方向への炭素流量が増大したことが示唆された。一方で Glu の菌体あたりの生成量は変化せず，細胞内酸化還元バランスの Glu 生成への影響は限定的と考えられた。
以上より，大腸菌は pmf 形成能の低下の程度に応じて，酢酸生成や上記の Glu
代謝を促進させる新奇な恒常性維持機構を有していることが示唆された。
参考文献
1) Kihira, C., et. al., Alterations of glucose metabolism in Escherichia coli mutants
defective in respiratory-chain enzymes, J. Biotechnol., 2012, 158:215-223

Analysis of unique glucose metabolism in Escherichia coli mutants defective
in respiratory-chain enzymes○Atsushi Yokota(Grad. Sch. Agric., Hokkaido Univ.)

Key words
respiratory chain, glutamic acid, gamma-aminobutyric acid,
Escherichia coli

160

2S-S5p03 ユーグレナの嫌気的呼吸鎖に共役したワックスエステル
生産

2S-S5p04 清酒酵母のミトコンドリア活性・ミトファジーがその醸造特性に及ぼす影響○中澤 昌美（阪府大院・生環科）
mami@biochem.osakafu-u.ac.jp○北垣 浩志（佐賀大・農）ktgkhrs@cc.saga-u.ac.jp

ユーグレナ（和名ミドリムシ）は淡水に生息する単細胞真核光合成生物である。
光合成により独立栄養的に生育するとともに、多種の単糖・アミノ酸の資化能を有しており従属栄養的にも生育することができる。余剰の光合成産物や外部
炭素源由来の炭素は、細胞内に貯蔵多糖パラミロン（β-1,3-グルカン）として蓄積される。パラミロンを蓄積した細胞を嫌気・低酸素環境に曝露すると、速やかにパラミロンを分解し、脂肪酸−脂肪アルコールエステルであるワックスエ
ステルを合成する。主生成物はミリスチン酸ミリスチル（C14:0-C14:0Alc）である。ユーグレナによる低酸素下ワックスエステル生産は 1982 年に発見され、その代謝に関する研究が進められてきた。一般的な生物においては、脂肪酸はマロニル-CoA を経由して合成される。そのため、アセチル-CoA カルボキシラー
ゼによる反応に ATP が必要であり、解糖系での基質レベルのリン酸化によるATP 獲得を含めても、低酸素下でのエネルギー獲得は不可能である。しかし、ユーグレナにはミトコンドリアにアセチル-CoA 依存型の脂肪酸合成系が存在する。この反応によって、ワックスエステル合成に伴うエネルギー獲得が可能であると考えられてきた。
演者らは、ユーグレナによるワックスエステル生産をバイオ燃料として活用することを目指し、実用化に向けてワックスエステル生産を向上させることを目的として、代謝系を詳細に解析してきた。その中で、ミトコンドリア電子伝達系複合体 I の阻害剤であるロテノンの存在下でユーグレナを低酸素処理すると、
ワックスエステル生産量が大幅に低下するとともに、細胞内の ATP/ADP 比が大きく低下することを見出した。このことを基盤として、ユーグレナの低酸素
下ワックスエステル生産にはミトコンドリア電子伝達系が寄与しているという仮説を立てた。ユーグレナは、低酸素下では電子伝達体としてロドキノンという、ユビキノンと比べ低い酸化還元電位を有するキノンを利用することが示唆されてきた。そこで、複合体 I による NADH 酸化によって生じた還元力がロド
キノンへ伝達され、電子伝達タンパク質（ETF）-ロドキノン酸化還元酵素（OR）、ETF を介して脂質合成系に渡される代謝モデルを構築した。そこで、ETF-OR、ETF の発現抑制を RNAi により行ったところ、コントロールと比べ約20％にまでワックスエステル生産量が低下した。さらに、嫌気性光合成細菌
Rhodospirillum rubrum で発見されたロドキノン合成に関与する遺伝子 rquA のユーグレナオルソログと予想された遺伝子を発現抑制したところ、細胞内ロドキノン量がコントロールの約 2%程度まで低下した細胞の作出に成功した。このとき、ワックスエステル量は約 30％程度まで低下していた。電子を受容する
脂質合成系の反応の候補としては、trans-エノイル-CoA からアシル-CoA への還元反応を想定した。脂肪酸の分解を担う β 酸化系においては、アシル-CoA の酸化反応にアシル-CoA 脱水素酵素（ACD）が機能する。本反応は一般的に不可逆反応であり、ユーグレナの脂肪酸合成系では機能しないと考えられてきた。
しかし、本研究においてユーグレナ EST データベース上に存在する ACD アイ
ソザイム（少なくとも 7 種存在）のうち最も発現量の高いものをノックダウン
すると、ワックスエステル生産量が約 70%に低下することを見出した。これに対して、従来本反応を触媒すると考えられてきた trans-エノイル-CoA 還元酵素の発現抑制ではワックスエステル生産は全く変化しなかった。これらの結果から、ユーグレナは低酸素・嫌気条件下で、β 酸化完全逆行による長鎖脂肪酸合成と共役した嫌気的呼吸鎖によりエネルギーを獲得し、生存を維持していることが明らかとなった。これは、生物界で初めての発見となった。
最後に、電子伝達の調節とワックスエステル合成に関する知見を紹介する。脱共役剤である CCCP が存在すると、ユーグレナの低酸素下での ATP/ADP 比は大きく低下する。このとき、ワックスエステル生産量はコントロールの約 2 倍に増加していた。詳細なメカニズムは不明であるが、電子伝達の調節が物質生産能力に大きな変化を及ぼす例として今後さらなる解析を行う予定である。

清酒などの大規模化した発酵産業において、酸素はごく初期でほぼなくなることから、清酒酵母などの醸造酵母におけるミトコンドリアの役割の解析は進んでいなかった。我々は清酒醸造における清酒酵母におけるミトコンドリアの存
在と構造、役割、それに影響を及ぼす遺伝的因子について研究してきた。
その結果、ミトコンドリアは清酒醸造の初期だけではなく、中期以降も観察されるが、その大きさは酸素濃度よりもむしろ発酵開始以降の出芽回数に依存していることを明らかにした。
清酒醸造中にミトコンドリアの分解であるミトファジーも起きているようであり、特に栄養の少ない吟醸酒でその傾向ははっきりしており、ミトファジーに
よりカーボンフローをエタノールの生産から細胞数の増殖に振りむけていると考えられた。
清酒醸造中にもミトコンドリアは存在することからミトコンドリアに着目した
酵母育種も可能であると考え、ピルビン酸のミトコンドリア輸送阻害剤への耐性株を分離してピルビン酸低減株を取得できることを示した。
このピルビン酸低減株は 14 番染色体が通常の 2 本から 3 本に増加しており、この部分染色体の増加がピルビン酸の低減を引き起こしていた。14 番染色体上のミトコンドリアに局在するシトクローム c オキシダーゼをコードする CCP1 を
3 個から 2 個に減らすとピルビン酸が増加したことから、14 番染色体上の CCP1の増加がピルビン酸低減のメカニズムの一端だと考えられた。
これらのことから、ミトコンドリアが清酒酵母、醸造酵母の育種の新たなター
ゲットになると考えられた。

Anaerobic respiration coupled with mitochondrial wax ester production in
Euglena gracilis

Effects of mitochondrial activity and mitophagy on the brewing profiles ofsake yeast○Masami Nakazawa(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Key words

Euglena gracilis, wax ester, anaerobic respiration

1 Kadowaki et al., Appl Environ Microbiol. 2017 Dec 1;83(24).
2 Kitagaki H, Takagi H. J Biosci Bioeng. 2014 Apr;117(4):383-93.
3 Agrimi et al., FEMS Yeast Res. 2014 Mar;14(2):249-60.
4 Shiroma et al., Appl Environ Microbiol. 2014 Feb;80(3):1002-12
5 Horie et al., Biosci Biotechnol Biochem. 2010;74(4):843-7.
6 Kitagaki H, Shimoi H. J Biosci Bioeng. 2007 Sep;104(3):227-30.

○Hiroshi Kitagaki(Fac. Agric., Saga Univ.)

Key words

mitochondria, sake yeast

161

2S-S5p05 分裂酵母の物質代謝と呼吸鎖の関連

2S-S5p06 微生物がつくる様々なポリアミン

分裂酵母は出芽酵母と約１ 0 億年前に分岐したと推定されており、進化上２つの酵母は大きく離れている。分裂酵母は細胞の中央に隔壁が入ることから、通常多くの細胞が増殖する様式で分裂し、芽を出して増殖する出芽酵母と細胞分裂上の違いが顕著である。分裂酵母は、真核生物の基本的な代謝経路や増殖機構が保持されていることから、真核生物の細胞内制御の分子メカニズを理解する上で優れたモデル真核微生物である。分裂酵母は Schizosaccharomyces 属に分類され、現在 S. pombe, S. cryophilus, S. octosporus, S. japonicus の４種類が知られている。その中でも S. pombe が遺伝学、分子生物学、細胞生物学、生化学的な基礎研究において最が進んでいる。S. pombe は petiite negative 株と呼ばれるよ
うに、ミトコンドリア DNA を欠損させることができず、増殖におけるミトコ
ンドリア機能に依存する程度が高い。
ミトコンドリアの機能のうち、呼吸鎖（電子伝達系）は、エネルギー獲得系で重要な役割を果たす。その中でも、ユビキノン（コエンザイム Q）は呼吸鎖の成分として、グラム陽性菌がメナキノンを有していることなどを除き、ほとん
どの生物が保持している。大腸菌はユビキノンとメナキノンを両方有するが、ユビキノンを合成できなくとも、メナキノンを有することから増殖できるが、ユビキノンとメナキノンを両方合成できないと致死的になる。出芽酵母ではユビキノンを合成できなくとも解糖系でエネルギーを獲得する能力が高く、グルコースを糖源とした培地で、通常程度に増殖できる。一方、分裂酵母 S. pombe
では、ユビキノン欠損株は最少培地での生育は著しく低下しており、増殖能力は低い。最少培地にシステインやグルタチオンを添加すると増殖能力が回復する。システインはサルファイドから合成され、グルタチオンの合成へと繋がる。
呼吸欠損株においては、このシステインの合成力が低下していることが、S.
pombe の１つの特徴である。S. pombe のユビキノン欠損株は、サルファイドキ
ノンレダクターゼ活性が低いことから、硫化水素臭がする。加えてユビキノン
は、オロチジン酸デヒドロゲナーゼの活性にも必要で、UMP 代謝経路への影響が出る。アンチマイシンにより呼吸鎖を阻害するとグルコースが低濃度である
時、増殖が低下する。グルコースのシグナルは Gpa2−cAMP-PKA 経路によって伝達されるが、pka1 欠損株ではユビキノンの合成量が増加する。これはグル
コース量の低下を感知して、電子伝達系の能力を更新している応答と考えられる。
S. japonicus は野生株が呼吸欠損株になっている日本で発見された分裂酵母である。日本国内の各地で単離されており、少なくとも弘前、長野、東京、三重、松江で単離されている。いずれの株もユビキノンの合成が著しく低く、S. pombeの２００分の１程度で、酸素消費量も著しく低く、天然の呼吸欠損株の性質を示している珍しい酵母である。S. japonicus では自然界に存在する中で呼吸鎖の能力を低下させた酵母で、我々はその代謝系に興味持っている。S. japonicus の代謝物を質量分析器で測定したところ、特徴的な化合物の合成が見られた。これらの分裂酵母の呼吸鎖の役割と応答について討論したい。

プトレッシン、スペルミジン、スペルミンに代表されるポリアミンは全ての生物に普遍的に含まれる低分子の塩基性物質であり、細胞の増殖分化と密接に関わっている。最近の研究から発酵食品には多量のポリアミンが含まれており、人の健康と長寿に深く関係することが明らかになってきた。微生物発酵液の作るポリアミンは、自然界では飛翔昆虫の誘因にも関与し、生物間をつなぐ重要な物質でもある。アーキア、バクテリアは多様なポリアミンを作る（1）。特に原始的な微生物のポリアミンは、価数の多い特殊構造をもつ分子であったと予想される。この点はアミノプロピル基の転移酵素を用いた分子系統的な解析からもうかがえる(2, 3)。生命の起源は高温環境で生まれたと考えられるが、高度好熱菌（超好熱菌）はアーキア、バクテリアを問わず、分岐型構造のポリアミンか直鎖の長鎖ポリアミンを持つ(1)。つまり、価数の大きなポリアミンは、高温環境での生命機能に必須であったと予想される。実際、分岐鎖ポリアミンを合成できなくさせた超好熱菌の変異株は、生育上限温度が下がる(2)。分岐鎖ポリアミンが作用すると DNA の構造は濃度に応じて B 型構造から A 型構造へ、さらには C 型構造へと転移する(4)。特に高温環境下では、DNA 鎖上にユニー
クなループ構造が点在し(4)、このことからも高温での遺伝子発現調節に分岐鎖
ポリアミンが関与していることが強く示唆された。分岐鎖ポリアミンの合成能を欠いた変異株を用いたオミックス解析では、発現量が変動した遺伝子は多数認められた。大腸菌 Escherichia coli では、ポリアミンが mRNA を介してする遺伝子の発現を調節するポリアミンモジュロンが見出されており(6)、同様の機構
は酵母 Saccharomyces cerevisiae においても確認された。超好熱菌においては、
分岐鎖ポリアミンが核酸の構造変化を介して、遺伝子の発現を制御していると予想される。真核微生物においては、本学会でも馴染みの深い麹菌 Aspergillus
oryzae が、健康長寿に関与するポリアミンを作り出すことがわかってきた。麹菌は主にアジアの発酵食品において、糖化を行う微生物である。麹菌が作り出す糖を効率的にアルコールに変換する微生物が酵母であり、これら２種は並行複発酵しながらアルコールを生産する。酵母が添加されないと、アルコールを作らない糖化液（甘酒）となる。麹菌は一般的に蒸米という固相培地で菌糸を伸ばしながら繁殖し、このときにアグマチンというポリアミンが分泌生産される。アグマチンは認知症の防止や、筋力の低下を抑えるポリアミンである(7)。
麹菌を固相培地で培養する際に、乳酸などで pH を下げるとアグマチンが大量に生産される。これは酸に対する適応応答と考えられるが、この酸誘導は液体培地でのみ起こる点が興味深い(7)。アグマチンの合成を支配するアルギニン脱炭酸酵素が、麹菌では液体培養では発現せず、固相培地特異的に作られているのであろう。ただ、麹菌にはアルギニン脱炭酸酵素のオルソログは存在しない。
おそらくオルニチンやリジンの脱炭酸酵素がアルギニンを許容し、pH 依存的にアグマチン合成を制御していると予想される。麹菌の糖化液は日本酒、味噌、醤油など伝統的日本食に関与する微生物である。本シンポジウムでは微生物の作るポリアミンの役割に焦点をあて、最新の知見、特に「ひとの暮らしの向上」に繋げる情報を提供したい。
(1) Michael, A.J., J. Biol. Chem 293, 18693 (2018) (DOI:10.1074/jbc.TM118.005670)(2) Okada, K. et al., J. Bacteriol., 196, 1866 (2014) (DOI: 10.1128/JB.01515-14.) (3)Hidese et al., FEBS J., 284, 3684 (2017) (DOI:10.1016/j.bbrc.2017.12.053) (4)Muramatsu, A. et al., J. Chem. Phys. 145, 235103 (2016) (DOI: 10.1063/1.4972066)(5) Nishio, T. et al., Chem. Phys. Chem. 19, 2299 (2018) (DOI: 10.1002/cphc.
201800396R1) (6) Igarashi, K. and Kashiwagi, K., J. Biol. Chem. 293, 18702 (2018)(DOI: 10.1074/jbc.TM118.003465) (7) Akasaka, N. and Fujiwara, S., Amino acids(Nature Springer) (2019) in press (DOI:10.1007/s00726-019-02720-7) (8) Akasaka, N.
et al., Appl. Environ. Microbiol., 84, e00722-18 (2018) (DOI: 10.1128/AEM.
00722-18)○川向 誠（島根大・生資・生命科）
kawamuka@life.shimane-u.ac.jp

参考文献
１）戒能智宏、川向 誠：コエンザイム Q １０基礎と応用（山本順寛編）：pp.
199-224, 丸善, (2015)２）Kawamukai, M.： Biosynthesis of coenzyme Q in eukaryotes. Biosci. Biotechnol.
Biochem. 80:23-33 (2016)
３ ） Kaino, T., K. Tonoko, S. Mochizuki, Y. Takashima, M. Kawamukai.
Schizosaccharomyces japonicus has low levels of CoQ10 synthesis, respiration
deficiency, and efficient ethanol production at high temperature. Biosci. Biotechnol.
Biochem. 82:1031-1042 (2018)4) Nishida, I., K. Yokomi, K. Hosono, K. Hayashi, Y. Matsuo, T. Kaino, M.
Kawamukai. CoQ10 production in Schizosaccharomyces pombe is increased by
reduction of glucose leveles or deletion of pka1 . Appl. Microbiol. Biotechnol. on line
(2019)

Metabolic relation with respiration in fission yeast○Makoto Kawamukai(Dep. Life Sci., Fac. Life & Env. Sci., Shimane Univ.)

Key words

coenzyme Q, ubiquinone, fission yeast○藤原 伸介（関西学院大・理工）
fujiwara-s@kwansei.ac.jp

Various polyamines produced by microbes○Shinsuke Fujiwara(Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ.)

Key words

archaea, agmatine, polyamine, thermophile

162

2S-S5p07 ポリアミンと健康：ポリアミンによるグリコサミノグリ
カン合成促進機序

2S-S5p08 ポリアミン摂取による長寿の基礎的背景と消化管の役割○早田 邦康（自治医大さいたま医療センター 循環器病臨床医学研究所）
soda@jichi.ac.jp○東 恭平（東理大・薬）higase@rs.tus.ac.jp

グリコサミノグリカン [コンドロイチン硫酸 (CS)、デルマタン硫酸 (DS)、ヒア
ルロン酸 (HA)、ヘパリン、ヘパラン硫酸 (HS)およびケラタン硫酸]はウロン酸(ケラタン硫酸の場合はガラクトース)とアミノ糖が交互に結合し、各糖水酸基の一部に硫酸基が付加した直鎖の酸性多糖類である。グリコサミノグリカンはコアタンパク質と共有結合したプロテオグリカン (PG)として(HA は遊離の状態
で)細胞膜表面や細胞外マトリックスに存在し、タンパク質と相互作用すること
で結合組織の保護・保湿の他、分化・形態形成、神経軸索伸長、細胞接着、免疫制御、創傷治癒および抗血液凝固といった多彩な生理作用を発揮する[1]。例
えば、HA および CSPG であるアグリカンはコラーゲンと共に軟骨組織の主要な構成成分であり、HSPG であるシンデカンは皮膚組織においては創傷治癒に重要な役割を果たす。グリコサミノグリカンとタンパク質との相互作用には、二糖ユニットにおける硫酸基の数・位置、イズロン酸の有無、二糖ユニット配列、分子量などが重要であるが、糖鎖構造や発現量は老化と共に変化することが知られている。例えば、HS は発現量が、CS は 4 硫酸化が老化と共に減少することが報告されているが、その詳細なメカニズムはほとんど明らかとなっていない。
ポリアミン (プトレッシン、スペルミジン、スペルミン)は生物に普遍的に存在する生理活性アミンであり、細胞増殖・分化に必須の因子である。ポリアミンの特徴として、1) ポリアミンは細胞内では主として RNA に結合して存在し、ホルモンによる刺激や細胞の状態変化などに応じてその濃度が著しく変化する
こと、2) ポリアミンは特定の RNA 構造を変化させることで翻訳効率の低い
mRNA のタンパク質合成を円滑にし、細胞増殖や生存率を促進することが知られている[2]。私達は、ポリアミンにより翻訳レベルで発現制御される遺伝子群を「ポリアミンモジュロン」と定義し、大腸菌、酵母、動物細胞におけるモジュロンを同定することでポリアミンの生理的意義を解明してきた[2]。組織ポリア
ミン量は老化と共に減少することから[3]、老化による糖鎖構造の変化にポリアミンが関与するのではないかと仮説を立て、新たなポリアミンモジュロンを同定すべく検討を行った[4,5]。
はじめに、ヒト皮膚中に含まれる GAG (DS、HS および HA)とポリアミンを測定した結果、HS 量とポリアミン量に正の相関があることを見出した[4]。次に、マウスの背中にパンチ生検創傷を施すと約 10 日間で傷は完治するが、ポリアミン生合成阻害剤を塗布すると治癒が遅れることが分かった。HS とポリアミンの関連性を明確にすべく、ポリアミン生合成阻害剤を用いて細胞内ポリアミン
量を減少させたところ、HS の発現量が約半分に減少した。そこで、ポリアミンに感受性を示す HS 伸長酵素を探索した結果、HS 伸長酵素である Exotosin-1(EXT1)および EXT2 を同定した。また、CS とポリアミンの関連性についても
動物細胞を用いて調べた結果、細胞内ポリアミン量を減少させると CS の分子量および 4 硫酸化の減少が認められた[5]。そこで、ポリアミン感受性を示す
CS 伸長酵素と 4 硫酸化酵素を探索したところ、Chondroitin sulfate synthase 1(CHSY1)および Chondroitin 4-O-sulfotransferase 2 (C4ST2)を同定した。ポリアミンによる合成促進機構を調べたところ、EXT1、EXT2、CHSY1 はポリアミンにより翻訳レベルで、C4ST2 は転写レベルで合成促進を受けていた。レポーター
遺伝子を用いて、ポリアミンによる EXT1、EXT2 および CHSY1 の合成促進機構を調べた。その結果、EXT1、EXT2 および CHSY1 の翻訳開始は miRNA や
5’-非翻訳領域に存在する 4 重鎖 RNA (G-quadruplex)により負に調節されており、ポリアミンは負の制御を解除することでタンパク質合成を円滑にすることが明らかになった。ポリアミンによる C4ST2 の転写促進については、その転写因子
がポリアミンモジュロンの可能性が高いと考え、現在検討中である。
高ポリアミン食投与によるポリアミンの動態に関する研究により、ポリアミンは経口投与すると腸管に速やかに吸収され、全身の臓器や組織に移行することが明らかとなっている。また最近では、腸内細菌を利用したポリアミン供給に関する研究が活発になってきた。ポリアミンを継続的に摂取することで、組織CS や HS の機能維持に伴う QOL の向上、ひいては健康寿命の伸長を期待している。
[1] Esko JD. et al. Essentials of Glycobiology. 3rd edition. Chapter 38, 2017 [2]Igarashi K. et al. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 107: 104,2019. [3] Nishimura K. et al. Journal of Chemistry (Tokyo) 139: 81, 2006. [4]Imamura M. et al. Scientific Reports 21: 33549, 2016. [5] Yamaguchi K. et al.
Biochemical Journal 475: 3797, 2018.

Polyamines in Health: Polyamines stimulate the glycosaminoglycan
synthesis through the enhancement of the synthesis of their biosynthetic
enzymes at the level of translation.
○Kyohei Higashi(Fac. Pharm. Sci., Tokyo Univ. Sci.)

Key words

Heparan sulfate, Chondroitin sulfate, Polyamines, translation

合成ポリアミン（スペルミン、スペルミジンおよびプトレスシン）を加えて大豆の３倍程度のポリアミン濃度に調整した餌でマウスを飼育すると、老化が抑制され寿命が延長することを我々は世界で最初に報告した。また、高ポリアミン餌で飼育を続けた BALB/c マウスに少量（20 mg/kgBW）の発癌刺激（1,2demethylhydrazine）を毎週１回１２週間繰り返した検討では、高ポリアミン餌群のマウスの大腸癌の発症率が低下した。ポリアミンには抗炎症・抗酸化作用、細胞や遺伝子を外的刺激から保護する作用、オートファジー誘導作用などの生
理活性がある。しかし、類似の生理活性を有するポリフェノール類などの抗酸化物質と呼ばれている物質が動物の寿命を延長できないことを考慮すると、これらの生理活性が動物の寿命を延長し発癌を抑制していることは考え難い。
近年、癌を含む生活習慣病の発症と遺伝子メチル化異常には密接な関係のあることが報告されている。遺伝子メチル化とはメチル基が DNA のシトシンに付与されることによって遺伝子発現を調整する機構である。さらにメチル化は必
ずしも固定されたものではなく、生活環境や生活習慣が変化することによってメチル化状態が変化することも報告されるようになってきた。ポリアミン合成と遺伝子メチル化は極めて密接な関係がある。すなわち、ポリアミン合成に必要な Aminopropyl 基は Decarboxylated S-adenosylmethionine（dcSAM）から供給
さ れ る が 、 dcSAM は メ チ ル 基 の 供 給 源 で あ る S-adenosylmethionine がAdenosylmethionine decarboxylase（AdoMetDC）の作用を受けたものである。
我々が Jurkat 細胞を用いた検討では、ポリアミン合成の律速酵素である Ornithine
decarboxylase (ODC)）の活性を 2-(difluoromethyl)ornithine (DFMO)を用いて抑制すると、dcSAM 濃度が上昇し、メチル化を制御する DNA メチルトランスフェ
ラーゼ（DNMT １、３ a、および３ b）活性が低下し、DNA 全体の異常メチル化（脱メチル化と別の部位での高メチル化の進行）が生じた。ポリアミン合成を阻害した Jurkat 細胞にスペルミンを加えると、DNMT ３ a および３ b が活性化されて、異常メチル化の状態が改善された。ポリアミン濃度の異なる餌で飼育したマウスの腎臓の DNA でも同様の変化を確認した。すなわち、加齢とともに DNA 全体の異常メチル化が生じるが、高ポリアミン餌で飼育したマウス
では加齢ともに進行する異常メチル化が抑制されていた。ポリアミンによる遺伝子メチル化に係る生理活性を検討したところ、スペルミンは強い活性を有しており、生体内でもその作用を確認できるが、スペルミジンは活性が弱く、生体内ではその作用を確認できない。
ポリアミン合成能、とくにポリアミン合成の律速酵素である ODC の活性は加齢とともに低下する。その結果、ポリアミン合成が活発な成長期における体内のポリアミン濃度は急速に減少する。しかし、成長が止まった個体では、組織内や血液中のポリアミン濃度および尿中ポリアミン排泄量の減少は認めらない
ことが多くの研究で明らかにされている。人とマウスが高ポリアミン食を摂取すると、数か月という単位で徐々に血中スペルミン濃度が上昇するが、とくにヒトではスペルミジン濃度は全く変化しない。ポリアミンは直ちに腸管から吸収され全身の臓器や組織に移行することがわかっている。また、日常的に摂取している食品中に含まれるスペルミン/スペルミジン比は 1：1.5〜2 とスペルミ
ジン量が多く、
マウスに投与した餌のスペルミン/スペルミジン比は 1：4 であった。
増殖の活発な癌細胞ではスペルミジン濃度が高く、スペルミジン濃度は細胞増殖を反映すると理解されている。実際に、癌患者においては、活発な増殖能を有する癌組織から移行したスペルミジン濃度が上昇し、癌の治療によりスペル
ミジン濃度が減少することが報告されている。すなわち、体内ポリアミン濃度は局所で合成されるポリアミンの全身血流への供給の影響を強くうける。このことから、高ポリアミン食（スペルミジン＞スペルミン）の継続による血中ス
ペルミンの上昇は、消化管系からスペルミンが供給されていることを示唆する。
すなわち、腸管から吸収されたポリアミンが腸管の血管を介して肝臓内に運ばれ、腸肝循環を介して再び腸内細菌などの作用を経て、全身循環には主にスペルミンを供給する機構が存在する可能性がある。腸内細菌を含めた腸内環境が体内ポリアミン供給へ及ぼす役割とその機序が明らかにされることが期待され
ている。
参考文献
Soda K. (2019) Polyamine metabolism and gene methylation in conjunction with onecarbon metabolism. Amino acids 47(8):1665-1665. https://doi.org/10.1007/
s00726-019-02733-2
Soda K. (2018) Spermine and gene methylation: a mechanism of lifespan extension
induced by polyamine-rich diet. Int.J.Mol.Sci. 19(10):3106. https://doi.org/10.3390/
ijms19103106

Biological background of life-span extension by increased polyamine intake
and the importance of intestinal environment.
○Kuniyasu Soda
(Cardiovascular Res. Inst., Saitama Med. Center, Jichi Med. Univ.)

Key words

lifespan, epigenetic, spermine, polyamine

163

2S-S5p09 健康長寿社会へ向けた腸内細菌由来ポリアミン産生促進技術の開発とその保健効果

2S-S5p10 ヒト腸内常在菌叢最優勢種のポリアミン合成・輸送経路の遺伝学的解明○松本 光晴（協同乳業・研・技術開発）
m-matumoto@meito.co.jp○栗原 新（近畿大院・生物理工）
skurihara@waka.kindai.ac.jp

腸管上皮細胞から吸収され、血中に移行し全身の細胞へ作用する可能性が高い
腸内細菌叢由来の低分子化合物（代謝産物）は腸内細菌叢と健康を論じるに当たり重要因子である。演者らは、同腹仔から無菌マウスと通常菌叢定着マウスを作製し、それらの結腸内容物をメタボローム解析し、腸内細菌叢の影響を受ける代謝産物が多種類存在し、その一部は血中に移行し直接的に、また別の一部は吸収後、別の化合物に変換されて全身系に移行している知見を得て来た[1,2]。
数多く存在する腸内細菌叢が放出している代謝産物の中でも、多岐に渡る機能を有し、全生物種の細胞内に普遍的に存在する生理活性物質ポリアミン（プトレッシン、スペルミジン、スペルミン．内プトレッシンとスペルミジンは腸内細菌叢が産生していることを確認済み）は注目に値する。ポリアミンは様々なストレスから核酸を保護し細胞増殖や分化に重要な役割を果たすことから、細胞の健全性を維持する物質と述べても過言ではないと考えられる、しかし、成長期の終わりと共に加齢に伴い生体内生合成能が低下し、演者らはこれが老化と関わっていると考えている。分子メカニズムは解明されたとは言い難いが、複数のグループより、モデル生物への外因性ポリアミンの供給（動物は飼料を介した経口投与）で寿命伸長効果が報告され、近年、アンチエイジングに効果的な生体への介入の一つとしてハイインパクト・ジャーナルに紹介されるなど注目されている[3]。我々は、外因性ポリアミンとして食餌由来ポリアミン以外に、恒常的に腸管腔内で生合成され生体へ供給されると考えられる腸内細菌叢
由来ポリアミンに着目しており、「腸内細菌叢のポリアミン産生誘導により生体にポリアミンを供給すれば、細胞の健全化が維持され、老年病の予防や軽減に繋がる」と仮説を立案し、そのための技術開発と効果検証を進めて来た。具体的には、統一食事を摂取したヒト糞便のメタボロミクス解析データからスクリー
ニングし、腸内ポリアミン（特にスペルミジンとスペルミンの前駆体で腸管腔内濃度が高いプトレッシンに着目した）産生誘導物質としてアルギニン（Arg）
を見出した。また、Arg とビフィズス菌（Bifidobacterium animalis subsp. lactis
LKM512）の混合摂取がプトレッシン産生を強く誘導し、頸静脈カニューレラッ
トにて血中ポリアミン濃度を測定した結果、投与 4〜8 時間後に血中スペルミジ
ン濃度が有意に増加し、スペルミンも増加傾向を示し、大腸内プトレシンが生体ポリアミンの供給源となっていることが認められた[4]。更に、14 ヶ月齢より
マウスにこれらの長期混合投与を行った結果、対照群と比較して、血中炎症マー
カー等の抑制効果および寿命伸長効果を認めた[4]。この腸管内プトレッシン産
生機序は、ビフィズス菌が Arg からプトレッシンを生合成し環境中に放出していると推測し実験を繰り返したものの、この現象は認められなかった。また、
上述の通り、安定的にポリアミンを合成する腸内細菌は見つからなかったことから、特定のプトレッシン産生菌が存在するのではなく、複数の腸内細菌の相互作用で合成・放出されていると考えるに至った。そこで、ヒト腸内主要細菌
グループから各々の代表細菌を選出し、Arg を含む培養液で 2 菌種毎の組合せで混合培養した結果、 Escherichia coli と Enterococcus faecalis の組合せが最も強く、各単独培養時の約 8 倍以上のプトレッシンを培養液中に放出することが認められた。更にこの産生量はビフィズス菌の添加で有意に増強された。これらの現象、培養液中の物質解析および文献情報により仮説を立案し、さらに E. coliと E. faecalis 遺伝子欠損菌株および相補菌株を用いた実験の結果、ビフィズス菌の産生する酸をトリガーとして、E. coli 等が保有する Arg を利用した耐酸性機構（副産物としてアグマチンを放出）と、E. faecalis が保有するアグマチンを利用した ATP 産生機構により、副産物としてプトレッシンが腸内環境中に放出されるという、異菌種間の独立した代謝経路が合わさったハイブリッド・ポリ
アミン合成機構を発見した[5]。
演者らは、この技術の社会への還元を目指している。既に、ヒト消化管下部でプトレッシン濃度を上昇させるために有効な Arg およびビフィズス菌（LKM512
菌株）の摂取量検討やコーティング技術等を開発済みで、ヒトでの効果判定試
験を実施中である。BMI が高めの健常成人（平均年齢 45 歳）を対象に実施した 12 週間の経口投与試験では、Arg とビフィズス菌を含む試験食投与群で対照群と比較して、便中プトレッシン濃度が有意に高かったのに加え、血清中のス
ペルミジン濃度が有意に高い結果が得られた。これは、本開発技術（開発食）
がヒトにおいても効果を発揮し、超高齢社会に突入した我が国において健康寿
命の伸長に有効である可能性を強く示唆している。
[1] Scientific Reports 2: 233, 2012. [2] Fronteers in Systems Neuroscience 7: 9, 2013.
[3]Cell 157: 1515-1526, 2014. [4] Scientific Reports 4: 4548, 2014. [5] Science
Advances 4: eaat0062, 2018

21 世紀初頭に行われた次世代シーケンサーの開発以降、様々な健康状態にある
ヒトの糞便の菌叢解析（マイクロビオーム研究）が精力的に行われ、腸内細菌
が肥満、糖尿病、自閉症、うつ病などの全身の疾患や健康状態に大きく影響を与えていることが明らかとなり、腸内細菌叢は「もう一つの臓器」とも呼ばれ
はじめている。これらの知見を基礎として今後行われる「ポストマイクロビオー
ム研究」においては、我々人類は腸内細菌の適切な制御を目指すべきであり、腸内環境制御への期待が高まっている。
食餌を変化させた場合の腸内細菌叢とトランスクリプトームの変化の比較から、
腸内環境制御に重要なのは腸内細菌の遺伝子機能の制御であることが示唆されている。しかしながら、ヒト腸内細菌叢のメタゲノムデータから得られる塩基配列に含まれるコーディング領域のうち、機能予測が可能なものは現状わずか
20-30%であり、この機能予測が正確でない場合も多いと考えられる。したがって、腸内細菌叢の遺伝子機能の制御による腸内環境の制御は、制御の標的が明らかでないために困難である。この状況を打破するためには腸内細菌の遺伝子機能の実験的な同定が重要であると考えられる。
我々は、腸内細菌の遺伝子機能の解明を通じた腸内環境制御を最終目標として、
ヒト腸内常在菌叢最優勢種の一斉培養系を構築した。この中で、共通培地として Gifu anaerobe medium (GAM) を用いればヒト腸内常在菌叢最優勢 56 種のうち、入手可能な 45 種の 7 割超に相当する 32 種が培養可能であることを示した。
この培養系は 96 穴プレート上に構築されているために、ヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種による特定の物質の資化性、特定の物質の変換性、特定の物質に対する抵抗性、特定の代謝産物の生産性について、培養条件によるバイアスを排除してハイスループットで解析が可能である。
ポリアミンはほぼ全ての生物がその細胞内に持ち、細胞増殖促進作用を始めとした様々な役割を果たす生理活性アミンである。ポリアミンの主要なものには、
プトレッシン、スペルミジン、スペルミンがある。2009 年以降、世界中の研究者からポリアミン摂取がいくつかの動物の健康寿命伸長に著効を示すことが報告されている。生物はポリアミンを自ら合成する。また、食品は生物由来であるためこの中にはポリアミンが含まれる。一方で、細胞内のポリアミン濃度は加齢とともに減少するため、動物は食物中に含まれるポリアミンを小腸から積極的に吸収する。このため、小腸より下流の消化管にはポリアミンが存在しないことが予想されるが、消化管における最下流の臓器である大腸の内腔にも数100 μM〜数 mM というかなりの高濃度でポリアミンが存在し、このポリアミン
は腸内細菌叢由来であることが報告されている。また、安定同位体を用いた実験により、ポリアミンは大腸粘膜を通じて血中に取り込まれることがわかっている。以上を総合すると、腸内細菌叢由来のポリアミンを大腸粘膜を通じて効
率よく吸収すれば、加齢に伴う体内のポリアミン減少が補われ、ヒトの健康寿
命を伸長させることが出来ると期待できる。大腸内では様々な老廃物の影響により、しばしば慢性炎症が生じ、これが様々な疾病につながっていると考えられている。ポリアミンは強い炎症抑制作用を持つことから、大腸腸管内のポリアミン濃度を適正に保つことは、腸内環境の改善を通じた健康増進に役立つと考えられる。しかし、ヒト腸内常在菌叢最優勢種のポリアミン生産能についてはわかっていないことが多く、その制御には多くの課題が存在する。
この問題を解決する目的で、培養条件によるバイアスを除去してハイスループッ
ト解析が可能となった上記のヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種について、培養した菌体と培養上清中のポリアミンを解析することで、輸送の有無、合成の有無を判定し、各菌種のゲノム情報に基づいた in silico 解析の結果と比較したところ、全く新規な配列を持つポリアミン合成酵素や輸送タンパクの存在が示唆された。
次に、ヒト腸内常在菌叢最優勢 7 位の Bacteroides thetaiotaomicron のポリアミン
合成系遺伝子 の一 つであるカルボキシスペルミジ ンデカルボキシラーゼ（CASDC）遺伝子について、遺伝子破壊株・相補株を用いた実験的な解析を行った。この結果、B. thetaiotaomicron の CASDC がスペルミジンの合成に必須であり、その生育に寄与していることを示していた。
ここまでの研究結果は一種類の腸内細菌を純粋培養して得られたものであるが、実際の腸内細菌は複雑な細菌叢を形成しているため、細菌叢を構成する細菌間で代謝産物の授受を行っていると考えられている。そこで、遺伝子操作した大腸菌および Enterococcus faecalis を共培養し、複数菌種にまたがるポリアミン合成系の存在を遺伝子レベルで証明した。
以上の研究により、ヒト健康に重要な影響を与えていると考えられる腸内環境を決定する因子の一つであるポリアミンの腸内常在菌叢による生産機構の一端が明らかとなった。

Enhancement of polyamine production in intestinal microbiomes bycontrolling its metabolism, and the subsequent benefits to the health andlongevity of society

Genetic elucidation of polyamine synthetic enzymes and transporters inmost dominant bacterial species in the human gut microbiota.

○Mitsuharu Matsumoto(Kyodo Milk Industry Co. Ltd.)Key words

intestinal microbiome, putrescine, Bifidobacterium, functional food○Shin Kurihara(Grad. Sch. BOST, Kinki Univ.)

Key words

polyamines, gut microbiota, enzyme, transporter

164

2Aa01

プラスミドが宿主に及ぼす負荷を軽減する因子の探索・
同定

2Aa03

○森 光矢 1, ファン チィー キム ユン 1, 金原 和秀 1, 新谷 政己 1,2（1静大院・総合科技, 2静大・グリーン科技研）
shintani.masaki@shizuoka.ac.jp

同じ不和合性群に属しても塩基組成の違うプラスミドの宿主域は異なる○德田 真穂 1, 柳谷 洸輔 1, 井上 謙吾 2, 雪 真弘 3, 大熊 盛也 3,
金原 和秀 1, 新谷 政己 1,3,4（1静大院・総合科技, 2宮崎大・農, 3理研・バイオリソース, 4静大・グリーン科技研）
shintani.masaki@shizuoka.ac.jp【背景・目的】プラスミドは，宿主細菌に「負荷」を与え，その適応度（fitness）
を減少させる．我々の先行研究で，Pseudomonas putida KT2440 株と，その派生
株 で あ る PpY101 株 を ， 2 種 類 の 異 な る プ ラ ス ミ ド ， pBP136::gfp ま た は
pCAR1::gfp の宿主とした場合，KT2440 株の fitness は減少したのに対し，PpY101
株の fitness は増大した．2 株の全ゲノム配列の比較結果から，PpY101 株では，
KT2440 株上の 4 つのプロファージ領域（P1-P4）のうち，P1 領域が欠損していること，プロファージ領域外の遺伝子に変異が入っていることが判明した．また pBP136::gfp をもつ両宿主のトランスクリプトーム解析の結果から，PpY101
株では，KT2440 株と比較して，プラスミドの有無によらず，P4 領域上の遺伝子（群）の発現量が増大していた．従って，プロファージ領域または変異が確認された遺伝子に，宿主の fitness に変化をもたらす因子が存在することが示唆され，我々はこの因子の探索・同定を試みた．
【方法・結果・考察】本研究では，プロファージ領域を欠損させた KT2440 株を準備し，それらがプラスミドをもつことで，fitness がどのように変化するかを競合試験により評価した．その結果，プロファージ領域を欠損させた KT2440
株を pBP136::gfp の宿主とした場合は fitness が減少し，pCAR1::gfp の宿主とした場合は fitness が増大した．この結果から，PpY101 株を 2 種類の異なるプラ
スミドの宿主とした場合に fitness が増大した原因は，pCAR1::gfp の場合はプロファージ領域の欠損であり，pBP136::gfp の場合はプロファージ領域の欠損でないことが示唆された．現在は，PpY101 株で変異が確認された遺伝子を KT2440
株から欠損させ，同様に競合試験を行っている．

【背景・目的】PromA 群に属するプラスミド pSN1104-11 と pSN0729-62 は，同一細胞内で共存することができない不和合性を示す．それにも関わらず，GC
含量が 10%異なるほか，連続塩基の出現頻度，コドンの使用頻度等の塩基組成が異なるプラスミドである 1)．また，同様に IncP-1 群に属する，pBP136 と pDS1
も塩基組成に違いが認められ，GC 含量が 18%も異なる．プラスミドと宿主染
色体の GC 含量は類似することが多い 2)という報告があることから，上記プラ
スミドの宿主域が異なる可能性が示された．本研究では上記のプラスミドの宿主域を比較することで，塩基組成の違いが宿主域に及ぼす影響を調べることを目的とした．
【方法・結果・考察】pSN1104-11 と pSN0729-62 を保持した供与菌を用い，牛糞
堆肥や土壌中の微生物群集を受容菌候補として接合実験を行った．GFP とセルソーターを利用して接合完了体を収集し，16S rRNA 遺伝子の配列に基づき属レベルの同定を行った．その結果，pSN1104-11 をもつ 11 属と pSN0729-62 をもつ
8 属の接合完了体を取得し，そのうち 7 属，3 属は各プラスミドに特有の属であった．また，各接合完了体の基準種となる菌株の染色体ＧＣ含量は，
pSN1104-11 の接合完了体の 7 属が 60%以上であるのに対し，pSN0729-62 については 6 属が 60%以下であった．従って，同じ不和合性群に属するにも関わらず，塩基組成の違いによって宿主域が異なり，プラスミドと宿主染色体の塩基組成に相関があることが示唆された．現在は，他の不和合性群でも同様の検証を行うため，pBP136 と pDS1 の宿主域の比較を行っている．
1)Yanagiya et al., 2018, Front. Microbiol. 9:2602.
2)Shintani & Suzuki, 2019, Shintani M., Suzuki H. (2019) Plasmids and Their Hosts.
In: Nishida H., Oshima T. (eds) DNA Traffic in the Environment. Springer, Singapore

Identification of factor(s) that reduces the burden of plasmids on the host

Host range of the same incompatiblity group plasmids could change withdifferent base conpositions○Mitsuya Mori1, Dung Pham Thi Kim1, Kazuhide Kimbara1, Masaki Shintani1,2(1Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci. Technol.,Shizuoka Univ.)○Maho Tokuda1, Kosuke Yanagiya1, Kengo Inoue2, Masahiro Yuki3,Moriya Okuma3, Kazuhide Kimbara1, Masaki Shintani1,3,4(1Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Fac. Agric., Univ. Miyazaki,
3
BRC, RIKEN, 4Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)

Key words

fitness cost, plasmid, Pseudomonas

Key words

plasmid, host range, base composition

2Aa02

好気・微好気・嫌気条件下における接合伝達性の比較

2Aa04

Geobacillus 属細菌における高度遺伝子発現を可能とするプラスミドベクター○越智 健太郎 1, 柳谷 洸輔 1, 雪 真弘 2, 大熊 盛也 2, 金原 和秀 1,
新谷 政己 1,2,3（1静大院・総合科技, 2理研・バイオリソース, 3静大・グリーン
科技研）
shintani.masaki@shizuoka.ac.jp○倉敷 凌太 1, 大城 隆 2, 鈴木 宏和 2
（1鳥取大院・持続創生, 2鳥取大・工）hirokazusuzuki@tottori-u.ac.jp【背景と目的】プラスミドは，供与菌から受容菌へと接合伝達する遺伝因子で，多くの場合，好気条件下の接合伝達性について研究が進められてきた．一方，環境中に多く分布する微好気・嫌気条件の接合伝達性や宿主域については，ほとんど解明されていない．本研究では，異なる種類のプラスミドや供与菌・受容菌を用い，酸素濃度の違いによってそれらの接合伝達性に変化が生じるかを検証した．
【方法】 供与菌には絶対好気性細菌の Pseudomonas putida SMDBS 株と，通性嫌気性細菌の P. stutzeri JCM 5965 株を用い，プラスミドには pBP136（IncP-1 群）を使用した．受容菌には 3 種類の通性嫌気性細菌を用いた．好気および嫌気条
件で培養した供与菌・受容菌を，嫌気チャンバー内で接合させた場合を微好気および嫌気条件下の接合実験とした．いずれの条件についても，接合後の懸濁液を選択培地に塗布し，コロニーの出現を認めた後，酸素に曝露し，GFP に由来する蛍光を示すかどうかを指標にして接合完了体の検出を行った．得られた完了体から伝達頻度を算出し，各条件下で比較した．さらに，モデル微生物群集（牛糞など）を受容菌候補として好気・微好気条件下の接合実験を行い，接合後の懸濁液をセルソーターに供することで接合完了体を単離した．その後，得られた接合完了体を 16S rRNA 遺伝子解析によって同定し，各条件下における宿主域の比較を行った．
【結果と考察】接合伝達頻度は，微好気・嫌気条件下において好気条件下よりも1/101〜1/104 に低下し，酸素濃度の違いが接合伝達の効率に影響することが示唆された．宿主域の比較では，好気条件でのみ得られた完了体が 13 属，微好気条件でのみ得られた完了体が 1 属検出されたことから，既知の宿主域に加えて，
未だ知られていない宿主の存在が示唆された．現在は土壌中の微生物群集を対象に宿主域の比較を試みている．

【目的】Geobacillus 属細菌は環境に広く分布した中等度の好熱菌で，優れた増殖性やタンパク質生産能から，様々な分野への応用が期待される。本研究では，
Geobacillus 属細菌の遺伝学的ツールの拡張を目的とし，Geobacillus kaustophilus
HTA426 由来のマルトース誘導型プロモーター（Pgk704）を基盤とした新規発現
ベクターの開発を行った。
【方法】Pgk704 および T7 ターミネーター配列を含む発現カセットを大腸菌Geobacillus シャトルプラスミドに導入することで，プラスミド pKR01 を得た。
Pgk704 の下流に，さらに異種タンパク質（Venus，BgaB，および Cat）の遺伝子を挿入し，HTA426 の派生株（MK244）や他 Geobacillus 属細菌を形質転換した。得られた形質転換体を様々な温度で培養し，細胞内に産生された異種タン
パク質を分析した。
【結果と考察】Venus 生産株を 60°C で培養したところ，培養 2 日目において細胞蛍光強度が急激に上昇した。よって本ベクターからの遺伝子発現は，培養後期において自己誘導的に起こると考えられる。細胞内タンパク質を分析したところ，明確な Venus バンドが確認できた。50°C と 55°C で培養すると，Venus
産生量はさらに増加した。その際の Venus 量は，全タンパク質中の 20〜30％程
度と概算できた。MK244 から構築した BgaB 生産株では，幅広い温度範囲（50〜60°C）で産生が見られた。65°C 培養においては BgaB 産生量が減少したが，
マルトース存在下で培養することで産生量が 5 倍ほど上昇した。MK244 から構築した Cat 生産株では，50°C 培養において明確な生産が確認できた。生産量の温度依存性は，タンパク質の熱安定性やフォールディング効率の違いに起因すると思われる。さらに他 Geobacillus 属においても，pKR01 は Venus の高生産を指揮した。

Comparisons of conjugation frequency of plasmids under aerobic,
microaerobic and anaerobic conditions

A plasmid vector that directs substantial expression of heterologous genes inGeobacillus species○Kentaro Ochi1, Kosuke Yanagiya1, Masahiro Yuki2, Moriya Okuma2,
Kazuhide Kimbara1, Masaki Shintani1,2,3(1Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2BRC, RIKEN, 3Res. Inst. Green
Sci. Technol., Shizuoka Univ.)

Key words
host range

horizontal gene transfer, bacterial conjugation, anaerobic condition,○Ryota Kurashiki1, Takashi Ohshiro2, Hirokazu Suzuki2(1Dept. Eng., Grad. Sch. Sust. Sci., Tottori Univ., 2Fac. Eng., Tottori Univ.)

Key words

Geobacillus, gene expression, maltose promoter, plasmid

165

2Aa05

安価な青白スクリーニングが可能なクローニングベク
ターの開発

2Aa07

○鈴木 宏和 1,2, 栗山 克 1, 山﨑 竜次 2, 日野 智也 1,2, 永野 真吾 1,2,
大城 隆 1,2（1鳥取大・工, 2鳥取大院・工）hirokazusuzuki@tottori-u.ac.jp

組換え RNA 分子の高生産に向けたコリネ型細菌での発現系構築
羽城 周平, 三橋 麻由, ○安枝 寿（味の素バイオ・ファイン研）
hisashi_yasueda@ajinomoto.com【緒言】大腸菌を宿主とした分子クローニングを迅速に行うためのツールとして，様々なクローニングベクターが開発されている。そのほとんどが，DNA 断片の挿入を簡便に判別できるようになっており，その際には LacZ の α 相補性と指示薬 X-gal を利用した青白スクリーニングが広く利用される。X-gal の呈色は明瞭だが，やや高価で，プレート 1 枚当たり約 30 円のコストがかかる。本研
究では，その代替システムとしてインドール酸化酵素 BdsC に着目し，それを利用した新規クローニングベクターを開発した。
【実験と結果】bdsC 遺伝子を pUC19 の HindIII-XbaI サイト間に挿入し，得られたプラスミドで大腸菌を形質転換した。インドール誘導体を含む培地で生育させたところ，5-ブロモインドール（5Br）で最も鮮明なコロニー呈色が見られた。呈色条件を検証したところ，2 倍希釈した LB に 25 μg/ml の 5Br を混合させた培地が呈色に適していた。5Br は X-gal より安価であるが（プレート 1 枚
当たり 0.2 円），呈色が遅く，その判別に 36 時間以上の培養が必要であった。
そこで error prone PCR と飽和変異導入を用いて，活性が向上した BdsC をコードする変異遺伝子を作製した。BdsC の X 線立体構造解析から，見出された変異点は活性中心にあることがわかった。さらに本遺伝子にマルチクローニング
サイト（12 種）を導入し，得られたプラスミド（pKBlue）の実用試験を行った。呈色は，培養 20 時間から 24 時間で確認できた。呈色がなかったコロニー
由来のほぼ全てのプラスミドには何らかの DNA 断片が挿入されており，短いDNA 断片（54 bp）の挿入も検出できた。その一方で，呈色があったコロニー
由来のプラスミドには全く断片挿入が見られなかった。従来システムと異なり，
pKBlue はあらゆる大腸菌を宿主にできるとも考えられる。本ベクターは，クローニングベクターとして有用と期待できる。

【背景・目的】近年、RNA 分子の医療分野や農業領域への応用に期待が高まっている。従来、中長鎖長の RNA は酵素法により生産されているが、さらに大量かつ安価な製法として、目的配列をもつ長鎖核酸 RNA の微生物による発酵生産について検
討した。
【方法】
発現のためのモデル RNA として、mRNA スプライシングに関与する U1A-RNAの部分 RNA（約 160 nt； U1A*-RNA と命名）等を用いた。アミノ酸発酵菌である Corynebacterium glutamicum の rnc （RNase III）欠損株を宿主に、ベクター
は pAM330N 由来のシャトルベクター pVC7N1)にて、強力な転写活性をもつプ
ロモーターを検索した。そして、U1A*-RNA の発現菌を培養後に、菌体から全RNA 画分を調製し PAGE にて展開することで目的 RNA 分子の生産性を評価した。
【結果・考察】目的 RNA である U1A*-RNA を強力に転写するためのプロモーターとして、コリネ型細菌に感染するファージ由来の F1 プロモーターが適していることがわかった。そしてターミネーターもファージ由来のものを採用し組換え RNA の基本的な発現系をコリネ型細菌で構築した。その系にて、U1A*-RNA が、内在の 5S rRNA 量と同程度で著量に生産できることがわかった 2)。
1) J. Biosci. Bioeng., vol. 127, 529-538 (2019)2) J. Biosci. Bioeng., In press

Development of bdsC-based cloning vectors to screen DNA insersion using
an inexpensive substrate

Construction of a fundamental over-expression system of target RNA
molecule in Corynebacterium glutamicum○Hirokazu Suzuki1,2, Katsumi Kuriyama1, Ryuji Yamasaki2, Tomoya Hino1,2,
Shingo Nagano1,2, Takashi Ohshiro1,2(1Fac. Eng., Tottori Univ., 2Grad. Sch. Eng., Tottori Univ.)

Shuhei Hashiro, Mayu Mitsuhashi, ○Hisashi Yasueda(Res. Inst. Biosci. Prod. Fine Chem., Ajinomoto Co., Inc.)

Key words

Escherichia coli, plasmid, indigo, cloning

Key words
promoter

Corynebacterium glutamicum, RNA production, corynephage,

2Aa06

病原性細菌の毒素産生能力を阻害する物質の探索システ
ムの開発とその利用

2Aa08

コリネ型細菌での転写ユニット増幅による組換え RNA
分子の高生産○野田 正文 1, Sultana Nasrin 1, Danshiitsoodol Narandalai 1,
井上 裕介 2, 東川 史子 1, 杉山 政則 1
（1広島大院・医系科学, 2三井製糖株式会社）sugi@hiroshima-u.ac.jp○羽城 周平, 三橋 麻由, 安枝 寿
（味の素バイオ・ファイン研）
hisashi_yasueda@ajinomoto.com【目的・背景】 細菌が増殖する際、自身の細胞密度を感知し、細胞数が閾値を超えると、特定物質の生産にスイッチを入れるシステムを quorum sensing (QS)と呼ぶ。例えば, 細菌のバイオフィルム形成や抗菌物質産生などは QS による制御を受けている。当研究グループでは、優れた保健機能性を示す植物由来乳酸菌 (植物乳酸菌) をターゲットとして、QS 阻害物質を探している。
今回は、QS に関わる auto-inducer-3 (AI-3) に着目し、先ず、大腸菌の宿主・ベクター系を用いた QS 阻害物質のスクリーニングシステムの開発を目指した。
次に、これまでに取得した 700 株以上から構成される「植物乳酸菌ライブラリー」に保存されている、QS 阻害物質を産生する乳酸菌株をスクリーニング
した。
【方法・結果】 AI-3 を認識する二成分制御系 QseBC および QseEF によってそれぞれ調節を受ける flhDC および recA 遺伝子のプロモーターの支配下に、beta-ガ
ラクトシダーゼ構造遺伝子 (beta-gal) を配置するよう、乳酸菌と大腸菌間のシャ
トルベクター (pLES003-b) を基に、組換えベクター pLES-AQSA および pLESAQSA2 を構築した。この組換えベクターを E. coli DH5alpha に導入することにより、QS 阻害剤スクリーニング用大腸菌宿主・ベクター系 (E. coli DH5alpha[pLES-AQSA] および E. coli DH5alpha [pLES-AQSA2]) を創出した。スクリーニ
ング対象の各菌株の培養液上清を X-gal を含む LB 培地に加え、E. coli DH5alpha[pLES-AQSA] および E. coli DH5alpha [pLES-AQSA2] を培養し、青色素産生阻害の有無を観察した。
その結果、植物乳酸菌株 250 株について調査した結果、29-2E 株の培養液上清中に QseBC 系に対する阻害活性を見出した。他方、9-1A、27-2A2、27-2F、および 28-2A 株は、QseEF 系に対する阻害物質を産生する可能性が示された。

【背景・目的】
コリネ型細菌を宿主とした目的 RNA 分子の高発現系の構築を目指している。
そのために、発現させるべき目的 RNA の転写ユニットを菌体内で増幅させる
べく、RNA 転写系を搭載するプラスミドの高コピー数変異体を取得し、そのRNA 発現性に及ぼす効果を検証した。
【方法】
発現のためのモデル RNA として、mRNA スプライシングに関与する U1A-RNAの部分 RNA（U1A*-RNA）を用いた。一方、RNA 転写系を搭載する pVC7N プ
ラスミドの高コピー数変異体は、プラスミドの不和合性を利用した自然突然変異スクリーニングにより取得した。次に、その変異点（cop1 変異)を同定し、コピー数制御機構を解析すると共に、さらなる高コピー数変異体を取得した。
それらのベクターに、U1A*-RNA の転写系を搭載し、コリネ型細菌での組換え
RNA 分子の生産性向上を検討した。
【結果・考察】
高コピー数変異体として pVC7H1 を取得できた。そのコピー数は pVC7N の約10 倍であった。cop1 変異は、複製開始タンパク質 Rep の ORF 上流に位置する
一塩基変異であり、cop1 領域から転写される低分子 RNA が rep-mRNA との相互作用を介して Rep 発現量を調整するといったコピー数制御モデルが推定された。そのモデルに基づき、新たな変異体 pVC7H2（約 320 コピー/染色体）を取得することができた。そこで、pVC7H2 に U1A*-RNA 転写系を搭載したところ、転写ユニットの増加に伴って目的 U1A*-RNA が著量菌体内に蓄積し、バッ
チ培養においてその組換え RNA の生産量は約 300 mg/L-培地となった。

Establishment of a system to explore the functionl molecules inhibiting thevirulence of pathogenic bacteria

Overproduction of recombinant RNA by the expression-unit amplificationin Corynebacterium glutamicum○Masafumi Noda1, Nasrin Sultana1, Narandalai Danshiitsoodol1, Yusuke Inoue2,
Fumiko Higashikawa1, Masanori Sugiyama1(1Grad. Sch. Biomed. Health Sci., Hiroshima Univ., 2Mitsui Sugar Co., Ltd.)Key words

lactic acid bacteria, quorum sensing○Shuhei Hashiro, Mayu Mitsuhashi, Hisashi Yasueda(Res. Inst. Biosci. Prod. Fine Chem., Ajinomoto Co., Inc.)

Key words
RNA production, Corynebacterium glutamicum, corynephage, highcopy number plasmid

166

2Aa09

組織空間的トランスクリプトーム解析及びゲノム変異解
析に向けた微量生体分子抽出法の開発

2Aa11○山崎 美輝 1,2, 細川 正人 3, 有川 浩司 4, 髙橋 清文 4, 松永 浩子 4,竹山 春子 1,2,3,4（1早大院先進理工, 2産総研 CBBD-OIL, 3早大理工総研, 4早大ナノライフ創新研）
haruko-takeyama@waseda.jp

遺伝子組換え技術を応用したオオミジンコにおける幼若
ホルモン活性の可視化○野田 彩乃, 加藤 泰彦, 松浦 友亮, 渡邉 肇
（阪大院・工）watanabe@bio.eng.osaka-u.ac.jp

生体組織は様々な表現型の細胞で構成されている。そのため、生体組織の生命現象を理解するには、組織内の空間情報を用いて細胞の種類や機能を解析することが重要である。組織内の空間情報を用いた生体組織解析は、特にがん研究への応用が期待されている。がん組織は、形態や増殖性、薬剤耐性の異なる細胞集団で形成されており、細胞型の特定が治療の指針や予後因子となりうるか
らである。
近年の研究では、生体組織を構成する細胞型の検出法として、組織空間で異なる遺伝子発現変動を検出し、組織内での細胞の機能分布を特定する空間的トラ
ンスクリプトーム解析が多く行われている。しかし、細胞型を詳細に理解するには、トランスクリプトーム解析による表現型の検出に加え、ゲノム解析による変異の検出を行うことが重要となる。トランスクリプトーム解析では、サンプル間における遺伝子発現の変動に加え、一部の変異遺伝子の配列も検出可能であるが、検出可能な変異配列は比較的発現量の多い遺伝子に限られる。そのため、遺伝子の変異を網羅的に検出するには、ゲノム解析が必要となる。しかし、従来の方法では、ゲノムと RNA の分離工程における損失量が多く、微小組織に含まれる微量なゲノム及び RNA を同時に抽出し解析することは困難であった。
当研究室では、微小生体組織からの再現性のトランスクリプトーム解析に向け、
タンパク質分解酵素を用いた細胞溶解、磁気ビーズによる RNA 精製を行う微小組織からの効率的な微量 RNA 抽出法を開発した。当処理は、磁気ビーズを使用して RNA を捕獲するため、磁気ビーズ溶液の上清から他の生体分子の抽出が可能となる。そこで本研究では、この方法を応用して同一の微小組織から効率的に RNA とゲノムの両方を同時に抽出・精製し、組織空間的なトランス
クリプトーム解析及びゲノム変異解析を行う方法の検討を行った。

[背景と目的] ホルモン活性を可視化する遺伝子組換え動物は生体の内分泌系の理解に有用である。幼若ホルモン (Juvenile Hormone: JH) は節足動物にとって、胚発生、脱皮・変態、性決定などの多くの生理現象の調節に関与する重要なホルモンであるにも関わらず、その作用機序の詳細は明らかになっていない。節足動物の中で甲殻類に属するオオミジンコは古くから毒性試験に利用され、JHに鋭敏に応答することが知られており、近年ゲノムが解読されゲノム編集技術も利用可能であることから本研究に適していると考えられる。そこで本研究では JH 応答性の蛍光タンパク質遺伝子を構築し、オオミジンコに導入すること
で JH 応答を可視化する遺伝子組換え体を作出することを目的とした。
[方法と結果] 昆虫およびミジンコで JH に応答することが知られている複数の遺 伝 子の 発現 量 の 変化 を 体内 で JH が分 泌 され る 脱皮 間 で 調べ 、 Daphnia
Hemoglobin 7(DHb7)遺伝子が最も鋭敏に応答することを発見した。さらに、その上流に昆虫類の JH 応答配列に類似性の高い配列を見出し、これを緑色蛍光タンパク質遺伝子の上流に連結したレポーター遺伝子を構築した。レポーター遺伝子を有するプラスミドをミジンコ卵に注入し、ミジンコ内在性の JH に応答して緑色蛍光を示すことを確認した。また、JH 類似物質の曝露や、JH 受容体ノックダウンを行い、JH に応じて緑色蛍光の強度が変化する事を確認した。
今後はゲノム編集によりレポーター遺伝子をノックインし、JH 活性を経時的にモニタリングできる組換え体の作製を行い、体内に蓄積された JH による脱皮抑制機能や性攪乱への影響の解明を目指す。

Development of biomolecules purification method for transcriptome andgenomic analysis of micro tissue

Visualization of juvenile hormone activities using an encoded reporter genein Daphnia magna○Miki Yamazaki1,2, Masahito Hosokawa3, Koji Arikawa4, Kiyofumi Takahashi4,
Hiroko Matsunaga4, Haruko Takeyama1,2,3,4(1Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2CBBD-OIL, AIST-Waseda Univ., 3Res.
Inst. Sci. Eng., Waseda Univ., 4Res. Org. Nano Life Innov., Waseda Univ.)○Ayano Noda, Yasuhiko Kato, Tomoaki Matsuura, Hajime Watanabe(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

RNA-seq, Biological tissue, transcriptome, Genome

Key words
analysis

Daphnia magna, Juvenile Hormone, biosensor, gene expression2Aa10

極微小組織切片からの単一細胞レベルトランスクリプ
トーム解析

2Aa12

放線菌を用いたタンパク質発現量を調節する遺伝子配列設計手法の開発○松永 浩子 1, 髙橋 清文 1, 山崎 美輝 2,3, 有川 浩司 1, 細川 正人 4,
竹山 春子 1,2,3,4（1早大ナノライフ創新研, 2早大院先進理工, 3産総研 CBBD-OIL,
4
早大理工総研）haruko-takeyama@waseda.jp○田島 直幸 1, 北川 航 2, 齋藤 裕 1, 西宮 佳志 2, 玉野 孝一 2,
安武 義晃 2, 田村 具博 2, 亀田 倫史 1
（1産総研・人工知能, 2産総研・生物プロセス）
kameda-tomoshi@aist.go.jp

遺伝子の発現状態は、生体組織内において位置特異的に異なるとされている。
すなわち、組織のどこから採取されたのかが明らかである微小組織切片の遺伝
子発現分布情報と、顕微鏡下で得られる組織の形態情報を関連づけることができれば、より解像度を深めた空間的な組織構成の理解につながることが期待される。この技術は、生物学的機能の解明や、病理学における病因解明などへの幅広い応用が見込まれる。我々はこれまでに、顕微鏡下で対象組織を観察しな
がら極微小領域を高スループットで採取できる装置の開発を進めてきた。本装
置では、先端がナイフ様の加工が施された針を使用し、試料を針先端でパンチングする要領で高速に採取する。針の内径は 110 μm で、5 分で 48 サンプルの
高速試料採取を達成している。採取された組織切片には、概ね数十の細胞が含まれている（20μm 厚）。
我々の研究室では、上記微小組織切片を用いたトランスクリプトーム解析を進めている。微小組織切片は、組織内のどの部位から採取されたかが明確である。
この微小組織切片に含まれる細胞群がどのような多様性を有するかという解析を実現することは、組織内での細胞の機能分布のより詳細な理解につながる。
そこで本報告では、微小組織切片を単一細胞レベルでバラバラにし、それぞれを対象としたトランスクリプトーム解析を実施した。あらかじめ対象を絞って採取された微小組織切片由来の単一細胞レベルでのトランスクリプトーム解析
は、高効率かつ高分解能な解析手法であり、生体組織の機能の理解や医療分野への幅広い応用が期待できる。

タンパク質遺伝子内の塩基配列は、翻訳効率に影響を与えることが知られている。最新の翻訳制御研究によると、コドン使用頻度や mRNA の二次構造形成
度、翻訳に用いられる tRNA の種類など様々な配列特徴量が翻訳効率に寄与することが分かってきた。翻訳効率を配列改変により調節することで、目的とする酵素や抗体など機能性タンパク質の生産量を増加させることや、より効率的に流れる代謝経路の作成が可能となる。翻訳効率を調節する配列設計手法の開発を目的とし、放線菌ロドコッカス属(Rhodococcus erythropolis)を宿主とするタンパク質発現データと配列特徴量の関係を解析した。同一のベクター系を用いた 204 遺伝子の発現データと配列特徴量の関係を解析した結果、転写開始点から遺伝子の N 末端側 11 コドンまでの mRNA 二次構造形成傾向が特に発現量と関係することが明らかになった。遺伝子配列改変による発現調節の効果を確かめるため、12 種類の遺伝子について、それぞれ N 末端側 11 コドン分の取りうる全ての同義置換配列を生成し、最も mRNA 二次構造形成傾向が低いと予想された配列を実際に R. erythropolis に導入し、発現量を調べた。その結果、7 遺伝
子は天然の遺伝子配列より発現量が増加した。さらに、N 末付近のコドン頻度やレアコドンの有無を考慮した配列を設計したところ、コドン頻度の相乗平均
値が一定以上高く、レアコドンを含まない条件で最も形成傾向が低いと予想された配列では、9 遺伝子で天然の遺伝子配列の場合よりも発現量が増加した。
特に、今回の遺伝子配列設計手法を用いることで、天然の遺伝子配列では発現量がほとんどない、もしくは発現量が少ない遺伝子は、すべて発現量を向上させることができ、本手法の有用性が示された。

Transcriptome analysis derived from a small tissue section broken apart intoa single cell

Development of gene sequence designing method regulating protein
expression level using actinomycetes○Hiroko Matsunaga1, Kiyofumi Takahashi1, Miki Yamazaki2,3, Koji Arikawa1,
Masahito Hosokawa4, Haruko Takeyama1,2,3,4(1Res. Org. Nano Life Innov., Waseda Univ., 2Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda
Univ., 3CBBD-OIL, AIST-Waseda Univ., 4Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words

transcriptome, single cell, Biological tissue, gene expression○Naoyuki Tajima1, Wataru Kitagawa2, Yutaka Saito1, Yoshiyuki Nishimiya2,
Koichi Tamano2, Yoshiaki Yasutake2, Tomohiro Tamura2, Tomoshi Kameda1(1AIRC, AIST, 2BPRI, AIST)

Key words
usage

Rhodococcus, mRNA secondary structure, synonymous codon, codon

167

2Ba01

Bacillus 属細菌を用いた微生物発電の試み○福本 悠地, 江邉 正平, 大池 達矢, 岡南 政宏, 阿野 貴司（近畿大院・生物理工）
tano@waka.kindai.ac.jp

2Ba03

新奇な好熱性放線菌 Streptomyces thermoviolaceus を用いたタンパク質生産株の開発○齊藤 朱音 1, 三原 笑 1, 曽田 匡洋 3, 荻野 千秋 1, 柏木 紀賢 2,
竹中 武藏 2, 近藤 昭彦 2
（1神戸大院・工, 2神戸大院・科技イノベ, 3長瀬産業）
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp

微生物燃料電池（Microbial Fuel Cell：MFC）は、微生物を触媒として用いる事
により、有機物の化学結合における化学エネルギーを電気エネルギーに変換する装置である。MFC は、廃水中の有機物を微生物の栄養源にする事で、廃水処
理と電力生産を同時に行う事ができる。Geobacter 属、Shewanella 属細菌をはじめ多くの微生物が土壌から単離され、MFC に利用できる事が報告されている。
そこで、土壌中に広く分布している Bacillus 属細菌に着目した。Bacillus 属細菌
は胞子、バイオフィルムを形成する事で、生育に不利な環境に耐性があると報告されている。先行研究において、抗生物質を生産する Bacillus subtilis RB14株を用いた MFC の作製を行い、電力と抗生物質の生産が認められた。バイオ
フィルム形成と抗生物質生産は培養 1 日目に認められたのに対し、電力生産は培養 7 日目以降に認められた。発電が認められた MFC から回収した培養液を新しい装置に移したところ発電が認められた。このことから培地中に蓄積した代謝物が RB14 株における発電に関与していると考えられた。抗生物質生産と電力生産の時期のずれ、発電への代謝産物の関与が RB14 株に特有のものかを調べるため、他の Bacillus 属細菌である IA 株を用いて MFC の作製を行ったと
ころ、IA 株においても電力と抗生物質の生産が認められた。また、IA 株は、
燻炭の添加により増殖が促進され、抗生物質生産も増加する事が明らかになっている。この性質を利用し、MFC に燻炭を添加する事により IA 株における電力、抗生物質生産に関する研究を行っている。

【目的】本研究では、CBP への応用が期待できる特長をもつ新奇な好熱性放線菌 Streptomyces thermoviolaceus (S. thermoviolaceus)に着目し、物質生産株としての開発を試みた。
【実験方法】異種タンパク発現遺伝子を S. thermoviolaceus に導入してタンパク
分泌生産能を確認することにより、S. thermoviolaceus が CBP を含めた有用な工業的物質生産プロセスの宿主となりうるか検証を行った。タンパク質生産系を構築するにあたって、目的物質に Aequorea victoria 由来の緑色蛍光タンパク質(GFP)と Thermobifida fusca 由来の β-グルコシダーゼを選択した。初めに GFP 遺伝子を接合伝達法により S. thermoviolaceus に導入することで、S. thermoviolaceusを宿主として異種タンパク質発現が可能であるか検証した。
【結果】ゲノム組み込み型プラスミドの pTYM18-ermEp-xcsig-GFP 導入株で GFPの生産を確認することが出来た。次に同様の方法で β-グルコシダーゼを導入した結果、培養時間 24 h において最大酵素活性 7.53[Unit/L]の β-グルコシダーゼが分泌生産されていることが確認できた。S. thermoviolaceus の早い物質生産能は、別種の放線菌でタンパク生産の最大値が培養 72 h 後であると報告されている S. lividans と比較しても生産サイクル効率化の観点から工業的に大きく優れている。一方で、一過性多コピー型プラスミド pL99 を S. thermoviolaceus に導入したところ、GFP とグルコシダーゼともに生産はほとんど認められなかった。
CBP を含めた工業的物質生産に S. thermoviolaceus を応用するためには、基質分
解酵素の分泌生産量を増加させる必要がある。今後はプロモーター改変や組み込み数の増加など、遺伝子組み換えツールの検討を行うことで生産性の向上をはかっていく。

Power generation by microbial fuel cell of Bacillus sp.

Development of a protein production strain using a novel thermophilic
actinomycete,Streptomyces thermoviolaceus○Yuji Fukumoto, Shohei Ebe, Tatuya Ohike, Masahiro Okanami, Takashi Ano(Grad. Sch. BOST, Kinki Univ.)○Akane Saito1, Emi Mihara1, Msahiro Sota3, Chiaki Ogino1, Norimasa Kashiwagi2,
Musashi Takenaka2, Akihiko Kondo2(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 3Nagase& Co., Ltd)Key words

Bacillus sp., antibiotics, microbial fuel cell

Key words

Streptomyces, thermophile

2Ba02

Bacillus 属細菌 IA 株と燻炭を組み合わせた微生物資材
の開発

2Ba04

コーヒー抽出残渣の発酵資源化○江邉 正平, 大池 達矢, 岡南 政宏, 阿野 貴司（近畿大院・生物理工）
ebe.microbiotech@gmail.com○水谷 友梨香 1, 加藤 愛理 2, 関川 貴寛 2,3, 菊川 寛史 2,3, 原 清敬 2,3（1静県大院・薬食生命, 2静県大・食栄, 3静県大院・食栄・環）
kmr.suny.ms98p@gmail.com

燻炭とはイネの籾殻を比較的低温で焼成することで作製される炭であり、日本
では作物栽培での土壌改良材として古くから利用してきた。燻炭が作物生産を向上させる理由として土壌構造の改良といった物理的な要因が示されているが、それだけでなく土壌中の植物生長に関与する微生物の数を増加させるといった生物的な要因の存在も予想されていた。そこでこれまでの研究では炭存在下で増殖が促進される微生物の探索を試みた。その結果、燻炭を添加した液体培地
で培養を行うことで燻炭非添加の培地よりも菌数が増加する Bacillus 属細菌 IA株の単離に成功した。その上、燻炭を添加して培養を行うことで抗真菌活性物
質の生産量が増加することを見出した。このことから IA 株と燻炭を組み合わせることで病原菌の植物への感染を防除可能な微生物資材を開発することが出来るのではないかと考えた。本研究では IA 株と燻炭を組み合わせた微生物資材の開発を目的とした。
初めに IA 株による植物病原菌からの感染防除能を評価するため、IA 株を植菌した土壌でキュウリを栽培し植物病原菌である Rhizoctonia solani K1 を接種した。その結果、IA 株を植菌した土壌で栽培したキュウリの病害レベルは IA 株
非植菌の土壌で栽培したキュウリよりも低下し、IA 株が植物病原菌からの感染を防除できる可能性が示された。続いて微生物資材を作製する際のコストを抑えるため、IA 株の培養基質として籾殻と同様に稲作において排出される米糠に着目した。燻炭と米糠を組み合わせた培地を開発し IA 株の培養を試みた結果、乾燥重量 1 g 当たり 108 cfu を上回る菌数の培養物の作製に成功した。本研究により Bacillus 属細菌 IA 株と燻炭、米糠を組み合わせることで植物病原菌からの感染を防除可能な微生物資材の開発出来る可能性を示した。

【目的】日本のコーヒー輸入量は約 50 万トン（生豆換算,2016 年）であり、コー
ヒー飲料製造会社やカフェ、近年ではコンビニエンスストアなどから大量のコー
ヒー抽出残渣（コーヒー粕）が排出されている。本研究は、糸状菌等を利用してコーヒー粕の低分子化、酵母発酵阻害物質の分解を行い、高付加価値品を生産する酵母の培養に利用することで、コーヒー粕の有効利用を目的とする。
【方法】数種類の糸状菌をコーヒー粕含有培地で培養し、全有機炭素、全糖、カ
フェイン、フェノール類濃度などを分析し、その分解特性を評価した。また、コーヒー粕はアラビカ豆およびロブスタ豆を用い、コーヒー粕の粒度の検討も行った。さらに、コーヒー粕含有培地に多量に含まれるフェノールおよびカフェ
インによる酵母の生育の阻害特性を試験した。
【結果と考察】コーヒー粕の粉砕粒度が小さい方が、糸状菌により低分子化されやすかった。フェノール類については試験した全ての糸状菌で培養後減少し、カフェインについては数種類の糸状菌で減少した。また、フェノール耐性は酵母の種類によって異なり、カフェイン分解活性の高い糸状菌を用いることで、その後の酵母の培養における細胞濃度の高まりがみられた。さらに、コーヒー
豆の種類と用いる糸状菌の組み合わせが、その後の酵母の発酵に関与することがわかった。これらのことから、コーヒー粕を糸状菌等により微生物処理することで、低分子化や酵母等の発酵微生物の増殖を阻害する物質の分解を行い、微生物発酵による有用物質生産の原料として有効利用できると考えられる。

Development of a microbial inoculant using rice husk biochar with Bacillus
sp. IA

Conversion of coffee ground to resources for fermentation○Shohei Ebe, Tatsuya Ohike, Masahiro Okanami, Takashi Ano(Grad. Sch. BOST, Kinki Univ.)

Key words

Bacillus sp., rice husk biochar, microbial inoculant○Yurika Mizutani1, Airi Kato2, Takahiro Sekikawa2,3, Hiroshi Kikukawa2,3,
Kiyotaka Hara2,3(1Grad. Sch. Integr. Pharm. Nutr. Sci., Univ. Shizuoka, 2Sch. Food Nutr. Sci., Univ.
Shizuoka., 3Grad. Sch. Nutri. Environ. Sci. Univ. Shizuoka)

Key words

coffee grounds, fungi, yeast, fermentation

168

2Ba05

油性酵母を用いた脱脂米糠加水分解物から機能性油脂
生産

2Ba07

○渡辺 昌規 1, 窪田 健太 1, 佐久間 健輔 1, 竹中 慎治 2,
Chaiyaso Thanongsak 3（1山形大院・農, 2神戸大院・農, 3タイ・チェンマイ大・農産）
mwata@tds1.tr.yamagata-u.ac.jp

Xanthophyllomyces dendrorhous によるアスタキサンチ
ン発酵生産への柑橘果皮抽出液の利用○景山 裕也, 若林 敬二, 原 清敬
（静県大院・薬食生命）
k-hara@u-shizuoka-ken.ac.jp【背景と目的】世界的な人口増加による食用油脂およびバイオ燃料原料としての
新規油脂の需要増に伴い、国際的な油脂価格の高騰が問題となっている。しかしながら、国内で消費されている油脂のその殆どを海外からの輸入に頼っており、持続可能な油脂供給を可能にする新規油脂資源の開発が急務とされている。
そこで本研究では、米油製造時に副生される脱脂米糠を単一炭素源とした微生物プロセスによる油脂生産の可能性について検討を行った。
【方法】本研究の油脂生産菌として、タイのドイ・インタノン国立公園中に自生する花、葉のサンプルから新規に分離された油性酵母である Rhodotorula sp. C7（C7 株）、Rhodosporidium paludigenum C10（C10 株）、同 TC32（TC32 株）の 3株を用いた。油脂生成は、脱脂米糠の酸加水分解物を単一炭素源とした油脂生産培地に上記油性酵母を接種後、好気条件において、120 時間培養を実施した。
培養後の菌体は集菌後、菌体増殖量、菌体内油脂含量及び脂肪酸組成の評価を実施した。
【結果と考察】油性酵母を用いた脱脂米糠からの油脂生産を実施した結果、C7株において、乾燥菌体重量の約 60-70％程度の油脂を細胞内に蓄積するとともに、油脂生成収率は 30.5±4.4（%w/w、g 生成油脂重量/g 糖消費量）にまで達した。併せて、構成単糖であるグルコース、キシロース、アラビノースの同時資化が認められた。また、生成油脂の脂肪酸組成の解析の結果、C10 株由来の油
脂は、米油とほぼ同等の脂肪酸組成（主要脂肪酸：オレイン酸、リノール酸）を示した。これらの結果より、新規に分離された油性酵母により脱脂米糠から米油相当の機能性油脂生産の可能性が示唆された。

[目的] 柑橘類は、飲料、食品や香料として私達の生活に根付いた果物の一つである。しかし、ほとんどは果実のみが利用され、果皮に関しては有効活用されていないのが現状である。本研究では、抗酸化力が高いことで知られるアスタ
キサンチン（ASX）の生産能力を有する唯一の酵母である、Xanthophyllomyces
dendrorhous (赤色酵母)の発酵に柑橘果皮抽出液を用い、生育と ASX 生産への影
響を調べ、柑橘果皮の発酵原料としての利用の可能性について検討を行った。
[方法]乾燥柑橘果皮粉末を蒸留水に添加し、オートクレーブ抽出液を柑橘果皮抽出液として、赤色酵母を 22℃, 250 rpm の条件で 72 時間培養を行った。24 時
間毎にサンプリングを行い、分光光度計による細胞濃度(OD600)の測定と HPLC
による菌体内の ASX 量の測定を行った。
[結果及び考察]最小培地である SD 培地を基準とし、そこに柑橘果皮抽出液を添加した培地では、その量が増すごとに細胞濃度が高くなった。次に、柑橘果皮抽出液の栄養評価のため、柑橘果皮が SD 培地の炭素源であるグルコースおよび窒素・ミネラル源である Yeast Nitrogen Base(YNB)の代替としてなりうるかについて検証した。その結果、柑橘果皮抽出液には酵母の増殖に利用可能な炭素源および窒素・ミネラル源が含まれていることを確認した。さらに、柑橘果皮
中の多くを占める多糖類のペクチンが酵母の炭素源として利用可能であることがわかり、特にペクチンに含まれる単糖であるアラビノースが最も赤色酵母の増殖に寄与している可能性が高いことがわかった。柑橘果皮を利用した ASX 生
産は発展の余地が多く残されているが、今回の研究では、食品廃棄物である柑
橘果皮が赤色酵母の発酵資源として利用可能であることを示すことができた。

Microbial lipid production from defatted-rice bran hydrolysate by using
newly isolated oleaginous yeast.

Development of astaxanthin production using citrus peel extract by
Xanthophyllomyces dendrorhous○Masanori Watanabe1, Kenta Kubota1, Kensuke Sakuma1, Shinji Takenaka2,
Chaiyaso Thanongsak3(1Grad. Sch. Agric. Sci., Yamagata Univ., 2Grad. Sch. Agric. Sci., Kobe Univ.,
3
Dept. Agro-Ind., Chiang Mai Univ.)○Yuya Kageyama, Keiji Wakabayashi, Kiyotaka Hara
(Grad. Sch. Integr. Pharm. Nutr. Sci., Univ. Shizuoka)

Key words

oleaginous yeast, defatted-rice bran, oleic acid, linoleic acidKey words

Xanthophylloyces dendrorhous, citrus peel, astaxanthin

2Ba06

スギ由来セルロースナノファイバーを用いたバイオポリ
マーコンポジットの作製

2Ba08

小松菜からの内生菌の単離および植物免疫活性化能の評価○妹尾 政都, 中村 嘉利, 浅田 元子（徳島大院・先端技科）
ynakamu@tokushima-u.ac.jp○黒川 摩利 1, 中野 正貴 1, 北畑 信隆 2, 朽津 和幸 1, 古屋 俊樹 1
（1東京理科大理工・応生, 2東大院・農生科）
tfuruya@rs.tus.ac.jp

スギは成長速度が速く、国内人工林の 18 % となる 448 万 ha を占め利用可能な状態にもかかわらず放置された状況にある。そこで、本研究ではスギを用いて水蒸気蒸煮処理、ミル処理を行い、セルロースナノファイバー(CNF)にまで解繊し、これをポリ乳酸と混合することでバイオポリマー強度の向上を試みた。
スギを水蒸気蒸煮(処理条件 水蒸気圧力 10 , 15 , 20 , 25 atm 、蒸煮時間 5 min )、ミル処理(処理時間 10 sec )により処理を行った。ホロセルロース含有率が最も高かったものは 10 tm で処理したもので 69%であった。しかしリグニンの残存が確認された 15 atm で処理を行った際の 53 % を最高ホロセルロース含有率とした。続いて種々の水蒸気蒸煮処理条件で生成された処理物を水抽出、アセト
ン抽出、漂白処理、グラインダー処理を行い CNF 化した。これらとポリ乳酸を
50 wt% でコンポジットし、試験片を作製した。処理条件別に引張試験を行った
結果、15 atm 処理条件物が最高値 58.1 Mpa/(g/cm3) とった。ポリ乳酸単体と強度を比較すると 1.76 倍の高い値を示した。また市販 CNF との比較実験としてBiNFi-s(スギノマシン開発 CNF)を用い同様の方法で試験片を作製し、強度を比較したところ同様かそれ以上の結果が出たことから、水蒸気蒸煮処理、ミル処理で生産される CNF の有用性が明らかとなった。

【背景・目的】植物の内部に共生する植物内生菌には、植物免疫を活性化して病害抵抗性を高める作用を示す微生物の存在が知られている。この種の微生物は、植物内に安定に定着してその効果を発揮することから、微生物農薬への応用に期待が寄せられている。本研究では、植物免疫を亢進する新規微生物の取得を目的として、内生菌の研究がほとんどされていない小松菜に着目し、内生菌を収集した。また、微生物の植物免疫活性化能を簡便に評価する手法として、植物培養細胞の活性酸素種（ROS）生成を指標とした手法を確立し、取得株を評価した。さらに、この一次評価で陽性を示した株について、植物体を用いた病害抵抗性試験を実施した。
【方法・結果】有機農法により栽培された小松菜から 31 株の内生菌を単離し、16S rRNA 遺伝子配列をもとに属種同定を行った。取得株は Proteobacteria 門、Actinobacteria 門、Firmicutes 門に分類された。4 株は既報の微生物との相同性が 96%以下であり、属レベルで新規な微生物である可能性が示唆された。つぎに、取得株をタバコ培養細胞 BY-2 と共培養後、タンパク質性エリシターのク
リプトゲインを添加して、植物免疫の指標のひとつである ROS 生成を測定した。その結果、いくつかの取得株は BY-2 細胞のクリプトゲイン誘導性の ROS
生成を亢進した。さらに、この一次評価で陽性を示した株を、シロイヌナズナ
植物体と軟腐病菌を用いた病害抵抗性試験に供したところ、内生菌 Delftia sp.
BR1R-2 および Arthrobacter sp. BR2S-6 をシロイヌナズナに接種した際にその病害抵抗性が著しく向上した。

Preparation of biopolymer composite using cedar-derived cellulose
nanofibers

Isolation of endophytes from Brassica rapa var. perviridis and evaluation of
their plant immune-activating ability○Masato Seno, Nakamura Yoshitoshi, Chikako Asada(Grad. Sch. Adv. Technol. Sci., Tokushima Univ.)

Key words

cellulose, composting, steam treatment○Mari Kurokawa1, Masataka Nakano1, Nobutaka Kitahata2, Kazuyuki Kuchitsu1,
Toshiki Furuya1(1Dept. Appl. Biol. Sci., Fac. Sci. Tec., Tokyo Univ. Sci., 2Dept. Appl. Biol. Chem.,
Univ. Tokyo)

Key words

biocontrol agent, endophyte, plant immunity, reactive oxygen species

169

2Ba09

土壌環境および植物成長を改善する資材の探索○富永 信一, 荒木 希和子, 久保 幹
（立命館大院・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp

2Ba11

イオン液体で前処理した木質系バイオマス中の多糖およびリグニンのリファイナリー
○廣部 綾乃 1, 柘植 陽太 2, 荻野 千秋 3, 髙橋 憲司 1, 仁宮 一章 2（1金沢大院・自科, 2金沢大・新学術, 3神戸大院・工・応化）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp【背景と目的】 現代では農薬や化学肥料を用いる農法が主流となっているが、環境負荷や農産物の安心・安全の観点から、農薬や化学肥料を低減することが求められている。我々は有機農法においても同等の高収量かつ高品質な農産物を栽培するため、再現性がある有機土壌を作製した。本有機土壌は、土壌中の全炭素、全窒素、全リン、および全カリウム量が、18,000 mg/kg、1,000 mg/kg、800 mg/kg、および 1,000 mg/kg 以上に調整されている。含水率を 30％程度に調整すると、土壌中の物質循環や微生物活性が向上し、良好な植物成長を与える
ものである。本研究では、この有機土壌の性能をさらに向上させるため、土壌
環境と植物成長をさらに向上させる資材の探索を行った。
【方法および結果】 市販のミネラル資材、高濃度窒素含有資材、微生物資材、および植物活性化剤を用いた。有機土壌に濃度を変え資材を投入し、栽培を行った。栽培作物にはコマツナを使用し、植物育成室において 5 週間栽培した。栽
培開始 1 週間後に総細菌数、5 週間後に地上部重量の測定を行い、資材の効果を評価した。
各資材を投入した土壌は含水率調整後、総細菌数が増加する傾向を示した。特に窒素含有資材では、資材無投入土壌と比較して約 4 倍高い総細菌数が認められた。植物成長において、特にミネラル資材を添加することで約 60%地上部重量が増加した。このように、ミネラル資材、窒素含有資材、微生物資材、および植物活性化剤のいずれの資材においても、微生物の活性化と植物成長への効
果が認められた。これらの結果は、異なるメカニズムにより引き起こされると考えられ、各資材の最適濃度や最適な組み合わせやがより効果的であると考えられた。リン循環活性や窒素循環活性に及ぼす各資材の影響や最適有機土壌の作製についても発表する予定である。

【目的】カーボンニュートラルな資源である木質系バイオマスは、セルロース、
ヘミセルロース、リグニンが複雑に結合した構造である。そのため、糖化・発酵に用いるためには、この複雑な構造を緩和する効率的な糖化前処理が必要となる。そこで、本研究では木質系バイオマスを、イオン液体前処理、希硫酸前処理、アルカリ蒸解前処理の 3 つの前処理法でそれぞれ前処理し、糖液と糖化
残渣リグニンを作製した。糖液においては発酵によりエタノールを生産し、糖化残渣リグニンにおいては、酸化的解重合によりリグニンモノマーを作製した。
これらにおいて、それぞれの前処理法を比較した。
【方法および結果】イオン液体による前処理で得られたバイオマスは、希硫酸前処理およびアルカリ蒸解前処理の際に起こるヘミセルロースの消失は見られなかった。前処理バイオマスを酵素糖化し、糖液を調整した。グルコース濃度は、
イオン液体前処理において 46.8 g/L、アルカリ蒸解前処理において 51.8 g/L の糖液が得られた。一方、キシロース濃度は、イオン液体前処理が 19.8 g/L とな
り、グルコース、キシロースいずれにおいても高い濃度を得たのはイオン液体
前処理のみであった。キシロース資化能を付与した酵母株 YPF499/(XR-XDH)株
でエタノール発酵を行ったところ、グルコース、キシロースいずれにおいても、
24 時間でほぼ完全に消費され、エタノール収率はいずれの前処理法においても8 割程度を達成した。エタノール濃度は、イオン液体前処理において 15.6 g/Lと最大となった。糖化残渣リグニンを酸化的解重合することで、リグニンモノ
マーを作製することに成功した。イオン液体前処理は、検討した前処理方法の中では、木質系バイオマスの前処理・糖化・発酵・リグニン利用の一貫したプ
ロセスにおいて最も適していた。

Search for materials that improve soil environment and plant growth

Ionic liquid-assisted pretreatment for biorefinery of polysaccharides andlignin○Shinichi Tominaga, Kiwako S. Araki, Motoki Kubo
(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)○Ayano Hirobe1, Yota Tsuge2, Chiaki Ogino3, Kenji Takahashi1,
Kazuaki Ninomiya2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Ints. Frontier Sci. Initiative,
Kanazawa Univ., 3Dept. Chem. Sci. Eng., Grad. Sch. Eng., Kobe Univ.)

Key words

soil bacteria, fertilizer, plant growth, material cycle

Key words

biomass, ionic liquid pretreatment, biorefinery

2Ba10

Bacillus subtilis の土壌環境及び植物成長に及ぼす影響
解析

2Ba12

鶏ふんからのリン回収技術の検討○東本 繰未, 荒木 希和子, 久保 幹
（立命館大院・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp○野村 勇揮 1, 川西 琢也 1,2, 滝口 昇 1,2（1金沢大院・自科, 2金沢大・理工）
tackey@se.kanazawa-u.ac.jp【背景と目的】 B. subtilis の植物栽培土壌への接種は、窒素循環を円滑にすることによって、土壌中の無機態窒素を増加させ、植物成長へ寄与することが期待される。特に微生物の活動が活発で、有機物が豊富な有機栽培土壌では、B.
subtilis が土壌への影響を介して植物成長を行う可能性がある。しかし、B. subtilisの植物体への直接的な作用により、植物の養分吸収を促したりストレス耐性を向上させたりする例は多く報告されているが、植物栽培土壌への影響は解明されていない。本研究では、B. subtilis を微生物数が豊富な植物栽培土壌に接種し、植物体、植物栽培土壌に与える影響の解析を試みた。
【方法】 植物育成室において、ブロッコリー 10 株を 14 週間有機栽培した。土
壌に B. subtilis を接種した。接種回数の異なる 5 条件を用意し、接種頻度による影響の違いを解析した。1 週間ごとに、植物成長の評価と総細菌数の測定を行った。植物成長は、葉の面積合計値及び SPAD 値を用いて評価した。最終週の土
壌を用いて、PCR-DGGE 法による菌叢解析を行った。
【結果】 B. subtilis を最も接種した条件では、未接種条件よりも葉の面積が約20%増加した。SPAD 値はいずれも 60~70 の範囲であり、B. subtilis 接種による変化は認められなかった。よって、B. subtilis の接種は植物の品質を保ったまま
バイオマスを増加させる可能性があると考えられた。総細菌数の経時変化には、
B. subtilis 接種による差が見られなかった。B. subtilis を最も多く接種した条件と未接種条件をクラスター解析した結果、相同性は約 48%であった。PCR-DGGE
バンド数は、未接種条件よりも B. subtilis を最も多く接種した条件で増加した。
よって、B. subtilis は多量に投入しても総細菌数を保ち、菌叢の豊かさを保つことで物質循環を促進する可能性が示唆された。

【背景と目的】リンは生物に不可欠な元素であり、世界で生産されるリン鉱石の約 9 割が肥料用として使用されている。そのためリン鉱石は世界各国において食料政策に直接かかわる重要な戦略物質と位置付けられている。特にリン鉱石輸入依存国である日本は国内のリン資源からリンを回収し再利用する技術が求められている。下水汚泥や鉄鋼スラグ等様々な二次リン資源が候補にある中で、私は家畜糞尿特に鶏ふんに注目した。鶏ふんは重金属を含まず、リンが豊富であるという特徴がある。そのため、私は鶏ふんから肥料用に使える形のリンとして回収するプロセスを検討した。リン回収のプロセスは第一段階の鶏ふんの溶出と第二段階のリン化合物の晶析がある。鶏ふんの溶出では、より効果的に溶出させることが期待される phytase の効果を調べた。晶析では水酸化カルシ
ウムによるリン酸の回収効果を確認した。
【方法】10 g の鶏ふんに 2 wt%のクエン酸水溶液 100 g を加えたものを二つ用意
し、40 ℃、200 rpm の条件で 15 min 常時かく伴した。15 min 後、一方に酵素
phytase を 5000 U/L 加え、40 ℃、200 rpm で 45 min 常時かく伴した。その後、鶏ふんから得られたリン酸抽出液に水酸化カルシウムを加え、25 ℃、400 rpmの条件で 60 min 常時かく伴しリンを沈殿させた。
【結果と考察】phytase 無添加のものはリン酸濃度が 48 mM だったのに対し、phytase を添加のものは 58 mM のリン酸が溶出していた。よって phytase の添加により、リン酸の溶出量が増加することが分かった。またリン酸抽出液に水酸化カルシウムを加えることで phytase 無添加のものは 48 mM から 7 mM、phytase
添加のものは 58 mM から 12 mM までリン酸濃度が下がっていた。実験全体ではクエン酸、phytase、水酸化カルシウムしか使わずにリンを約 40 %回収することができた。

Influences of Bacillus subtilis on soil environment and plant growth

Study on recovery technology of phosphorus from poultry manure○Kurumi Higashimoto, Kiwako S. Araki, Motoki Kubo
(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words

Bacillus subtilis, PCR-DGGE○Yuki Nomura1, Takuya Kawanishi1,2, Noboru Takiguchi1,2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Coll. Sci. Eng., Kanazawa Univ.)

Key words

phosphate, poultry manure, recovery

170

2Ca01

Pseudomonas sp. LAB-08 株由来増殖抑制物質による解糖系抑制の可能性

2Ca03○本荘 雅宏 1, 鈴木 研志 1, 田代 陽介 2, 二又 裕之 3
（1静大・創科技院, 2静大・工, 3静大・グリーン科技研）
futamata.hiroyuki@shizuoka.ac.jp「アミノ酸機能工学」による大腸菌へのストレス耐性の付与○磯貝 章太, 高木 博史（奈良先端大・バイオ）hiro@bs.naist.jp

微生物利用産業の飛躍的発展のために、微生物を選択的に制御し複合微生物系を好適に制御する技術の確立が求められている。これまでに当研究室では環境細菌の一種である Pseudomonas sp. LAB-08 株による増殖抑制物質の生産を発見した。本増殖抑制物質は LAB-08 株自身の増殖には影響を与えないものの、異属微生物の増殖を抑制することが確認されている。従って、本物質を用いることで複合微生物系の好適制御が実現可能であると考えられた。しかし、本物質の詳細については不明であるため、本研究では増殖抑制物質の作用機序を解明することを目指す。
Escherichia coli BW25113 株は増殖抑制物質によって抑制を受けるものの、培養数十時間で増殖を復活させ適応を示した。そこで BW25113 株の一遺伝子欠損
ライブラリである KEIO コレクションを用いて増殖抑制物質に対する耐性株の探索を行った。増殖抑制物質存在下で野生株と比較して有意に増殖を示した株
を耐性株としたところ、抑制期間が短くなった複数の耐性株取得に成功した。
これら耐性株は増殖抑制物質に適応するバイパス経路の迅速な形成が示唆され、耐性株の欠損遺伝子から抑制されている代謝経路が解糖系であることが推測された。そこで解糖系糖新生関連遺伝子の転写量を解析したところ、1,3-ジホス
ホグリセリン酸から 3-ホスホグリセリン酸へ変換する酵素遺伝子 pgk の転写量が著しく抑制されていた。従って増殖抑制物質による pgk 遺伝子の転写抑制、あるいはこの上流の代謝を担う GapA の酵素阻害が推測された。Pseudomonas
属細菌は解糖系の一部をバイパスしピルビン酸まで代謝を行うエントナー・ド
ウドロフ経路を有しており、このため増殖抑制物質による抑制を受けないことが考えられた。従って本増殖抑制物質はこのエントナー・ドウドロフ経路の有無による選択的抑制が可能であると示唆された。

【背景・目的】我々は、細胞にストレス耐性を付与するプロリン・アルギニン・
リジン・グルタミン酸（機能性アミノ酸）を高生産させることにより、有用物
質の生産性向上を図る育種手法を「アミノ酸機能工学」と命名し、大腸菌に適用して研究を行っている。これまでに、機能性アミノ酸を高生産する大腸菌変異株のスクリーニングによりプロリン・リジンを高生産する変異株を取得し、リジン高生産株が野生型株よりも高いストレス耐性を示すことを明らかにした。
しかしながら、機能性アミノ酸が大腸菌にストレス耐性を付与する機構については不明である。本研究は「アミノ酸機能工学」による大腸菌へのストレス耐性の付与およびその機構の解明を目的としている。
【方法・結果】プロリン高生産変異株について、プロリン代謝関連酵素の遺伝子配列を解析したところ、γ-glutamyl kinase (GK) をコードする proB 遺伝子に変異があり、アミノ酸置換（D107N または A117T）が導入されていることを見出した。D107A や A117V のアミノ酸置換によって GK はプロリンによるフィード
バック阻害非感受性になることが報告されており、我々の取得した変異株も GKの活性制御が解除され、プロリンが高生産されたと考えられる。また、リジン
高生産に寄与する変異について解析した結果も報告する。さらに、今回同定した変異や高機能化の報告がある変異を導入した遺伝子を発現させることで、プ
ロリンやリジンの代謝を人為的に改変した株を作製し、各アミノ酸の生産量および各ストレス（高温・低 pH）に対する表現型を調べた。本発表では、これらの解析結果についても発表する予定である（本研究は、国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構（ＮＥＤＯ）の委託業務で行われた）。

Growth-repressing compound produced by Pseudomonas sp. LAB-08 would
repress a part of glycolysis

Improvement in stress tolerance of Escherichia coli by "functional aminoacid engineering"○Masahiro Honjo1, Kenshi Suzuki1, Yosuke Tashiro2, Hiroyuki Futamata3(1Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 2Fac. Eng. Shizuoka Univ., 3Res. Inst.
Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)○Shota Isogai, Hiroshi Takagi(Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)

Key words

metabolism, growth, glycolysis

Key words

Escherichia coli, amino acid, stress tolerance

2Ca02

ロドプシンを利用した大腸菌における光駆動 ATP 再生の物質生産への応用

2Ca04

酸素をスイッチとしたコリネ型細菌中央代謝経路の切り換え○田中 涼 1, 鎌田 健太郎 1, 戸谷 吉博 1, 松田 史生 1, 石井 純 2,
柘植 謙爾 2, 弘埜 陽子 3, 原 清敬 3, 清水 浩 1（1阪大院・情報, 2神戸大院・科技イノベ, 3静県大・食栄）shimizu@ist.osaka-u.ac.jp

小林 俊介 1, 村井 克輝 1, 川口 秀夫 2, 白井 智量 3, 仁宮 一章 1,4,
髙橋 憲司 1, 近藤 昭彦 2,3, ○柘植 陽太 1,4（1金沢大院・自科, 2神戸大院・科技イノベ, 3理研・環境資源, 4金
沢大・新学術）ytsuge@staff.kanazawa-u.ac.jp【背景と目的】近年環境問題などへの対策から微生物による有用物質の生産が注目されている。
しかし、バイオプロセスによる物質生産は収率が低いという課題がある。様々な有用物質の生合成にエネルギー物質として ATP が必要とされるが、ATP は主に二酸化炭素の排出を伴う TCA 回路を介して再生されるため、これが収率低下の要因であると考えられる。そこで、ロドプシンを用いた光駆動 ATP 再生に着目した。ロドプシンは、光の照射により細胞内のプロトンを細胞外へくみ出す能力を持つ。そのため、ロドプシンを大腸菌細胞膜で発現させれば、呼吸を介さずに ATP を再生できる。本研究では、2 種類のロドプシンのプロトンポンプ能力を比較し、物質生産への応用に向けた検討を行った。
【方法と結果】
高度好塩菌由来のデルタロドプシンと海洋微生物由来のプロテオロドプシンの遺伝子をそれぞれ導入した EcDR 株、EcPR 株を構築した。培養は単一炭素源として 5 g/L グルコース含む M9 最小培地を用いて好気条件下で行った。プロト
ンポンプ能力は菌体を非緩衝溶液に懸濁し、光の点灯・消灯を繰り返したときの細胞外 pH の変化によって評価した。細胞内 ATP 濃度はルシフェラーゼ発光法で測定した。グルタチオン濃度は酵素法による DTNB 定量に基づいて測定した。明条件では 50 μE/m2/sec の白色光を照射して培養を行った。細胞外 pH 測定の結果から、2 株とも光照射時にのみ pH が減少し、ロドプシンが大腸菌細胞膜で発現していることが確認された。また、プロトンポンプ能力は EcPR 株の
ほうが EcDR 株より高かった。生合成の過程で ATP の消費が起こる有用物質としてグルタチオンを目的物質に設定し、明条件と暗条件で培養を行った際の細胞内グルタチオン濃度を比較した結果、両株とも明条件でグルタチオン濃度が向上し、EcPR 株において増加量が大きいことが示された。

【背景と目的】グルコースは代謝される際、グルコース-6-リン酸で解糖系とペントースリン酸経路（PPP）に分岐する。コリネ型細菌は代謝改変により好気条件下でジアミンのカダベリンを、嫌気条件でジカルボン酸のコハク酸を生産する。グルコースを単一炭素源とした場合、1 分子のカダベリンの生産のためには 4 分子の還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）が必要なため、NADPH の主要な供給源である PPP に多くの炭素を流す必要がある。本発表では酸素を代謝スイッチとして用いることで中央代謝経路の切り換えを行い、好気条件下でカダベリンを、嫌気条件下でコハク酸を生産する菌株の作製を目的とした。
【方法と結果】Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 株に代謝改変を施しカダ
ベリン・コハク酸生産株を作製した。初めにコハク酸生産の際の副生成物である乳酸と酢酸の生合成遺伝子を欠損させた。リジンのフィードバック阻害解除のため、アスパルトキナーゼ遺伝子に一塩基置換を導入するとともに、大腸菌由来のリジン脱炭酸酵素遺伝子を導入した。また、ピルビン酸カルボキシラー
ゼ遺伝子をプロモーター置換により高発現した。好気条件下で解糖系を OFF にして炭素を PPP により多く流すため、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ（PGI）
遺伝子のプロモーターを嫌気条件下で特異的に働く ldhA 遺伝子のプロモーターに置換したところ、カダベリン生産量は約 4.7 倍に増加した。一方、コハク酸
生産量は約 24%減少した。そこで PldhA-pgi 遺伝子セットをもう一コピーゲノ
ムに導入したところ、コハク酸生産量は回復した。好気条件下における細胞内のグルコース-6-リン酸濃度は PGI 活性が低下するほど増加した。また、それぞれの生産株における解糖系への代謝フラックスの分岐比は PGI の比活性に比例しており、代謝経路の切り換えが確認できた。

Application of light-driven ATP regeneration to production of usefulmaterials by rhodopsin in Escherichia coli

Bidirectional switching of carbon flux between central metabolic pathwaysby oxygen level in Corynebacterium glutamicum○Ryo Tanaka1, Kentaro Kamata1, Yoshihiro Toya1, Fumio Matsuda1, Jun Ishii2,
Kenji Tsuge2, Yoko Hirono3, Kiyotaka Hara3, Hiroshi Shimizu1(1Grad. Sch. IST, Osaka Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 3Sch.
Food Nutr. Sci., Univ. Shizuoka.)

Key words

Escherichia coli, rhodopsin, ATP regeneration, glutathione

Shunsuke Kobayashi1, Murai Katsuki1, Hideo Kawaguchi2, Tomokazu Shirai3,
Kazuaki Ninomiya1,4, Kenji Takahashi1, Akihiko Kondo2,3, ○Yota Tsuge1,4(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov.,
Kobe Univ., 3CSRS, RIKENS, 4InFiniti, Kanazawa Univ.)

Key words
engineering

Corynebacterium glutamicum, metabolic switch, oxygen, metabolic

171

2Ca05

解糖系とペントースリン酸経路への代謝フラックスの分岐比が細胞内代謝プロファイルに及ぼす影響

2Ca07○村井 克輝 1, 佐々木 大介 2, 白井 智量 3, 内倉 寛斗 1,
佐々木 建吾 2, 仁宮 一章 1,4, 髙橋 憲司 1, 近藤 昭彦 2,3, 柘植 陽太 1,4（1金沢大院・自科, 2神戸大院・科技イノベ, 3理研・環境資源, 4金
沢大・新学術）ytsuge@staff.kanazawa-u.ac.jp

好熱性ホモ酢酸菌 Moorella thermoacetica 代謝改変株を用いたエタノール生産増強に向けた培養工学的検討○加藤 淳也 1, 竹村 海生 1, 岩崎 祐樹 2, 加藤 節 1, 青井 議輝 1,
和田 圭介 2, 村上 克治 2, 松鹿 昭則 2, 中島田 豊 1（1広島大院・統合生命科学, 2産総研・機能化学）
nyutaka@hiroshima-u.ac.jp【背景と目的】グルコースは代謝される際、グルコース-6-リン酸で解糖系とペントースリン酸経路（PPP）に分岐する。この分岐比は下流の代謝産物の合成に大きな影響を与える。本発表では、アミノ酸生産菌であるコリネ型細菌を用いて、解糖系と PPP への分岐比が解糖系や TCA サイクル、アミノ酸を中心とした細胞内の代謝プロファイルにどのような影響を与えるかについて網羅的に検証した。
【方法と結果】Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 株に代謝改変を施すこと
で C5 のジアミンであるカダベリンの生産株を作製し、親株として用いた。解糖系と PPP の分岐比はグルコース-6-リン酸イソメラーゼ遺伝子（pgi）のプロ
モーターを置換することで変動させた。代謝フラックス解析により、PGI の比活性と解糖系への代謝フラックスの分岐比が比例関係にあることを確認した。
pgi 欠損株では増殖が著しく減退したが、各種プロモーター置換株では PGI 比
活性と解糖系への分岐比が増加するに伴い、増殖速度・グルコース消費速度が増加した。しかし、両者の値が一定値を超えると増殖速度・グルコース消費速
度に違いが見られなかったことから、pgi 遺伝子は野生型のプロモーターでは必要以上に発現誘導されていることが示唆された。細胞内のグルコース-6-リン酸濃度は解糖系への分岐比が減少するほど増加した一方、下流の解糖系代謝物の濃度は減少した。また、TCA サイクルのリンゴ酸、フマル酸、コハク酸の濃度は解糖系への分岐比が増加するほど増加した。アミノ酸ではアラニン、バリン、ロイシンの濃度が解糖系への分岐比が増加するほど増加した。以上のように解糖系と PPP への代謝フラックスの分岐比が代謝プロファイルに与える影響を明らかにした。

＜背景と目的＞バイオマス利用においてガス基質発酵は糖発酵に代わる技術として期待されている。我々は、水素、一酸化炭素、二酸化炭素を利用して独立栄養的に生育することができる好熱性ホモ酢酸菌 Moorella thermoacetica を用いたガス基質発酵
によるエタノール生産の研究を進めてきた。これまでに、M. thermoacetica
ATCC39073 株のホスホトランスアセチラーゼ（pduL1, pduL2）の破壊およびア
ルデヒドデヒドロゲナーゼ（aldh）導入による代謝改変を行うことで最終代謝産物の酢酸の代わりにエタノールを生産する株を取得している。しかし、代謝改変株によるガス基質からのエタノール生産は見られなかった。そこで、本研
究では、代謝改変株のガス基質資化性の消失原因を探るとともに、その回復手法に関わる検討を行った。
＜方法と結果＞
これまでに、酢酸生成が完全にエタノール生成に向かう、pduL1, pduL2 をともに破壊し aldh を導入した株を用いて検討したが、水素分圧の高低に関わらず菌体増殖そのものがみられなかった。そこで、水素と二酸化炭素、または水素と一酸化炭素の混合ガスを基質とした代謝モデルを作成し、細胞内酸化還元バラ
ンスを化学量論的に検討したところ、水素と二酸化炭素では酸化還元バランス
が合わないが、水素と一酸化炭素では満たされることと考えられた。そこで、
水素と一酸化炭素の混合ガスを用い、酢酸は副生するものの ATP 供給低下が比較的少ないと考えられる pduL2 破壊 aldh 導入株を培養したところ、菌体の増殖およびエタノールの生産が確認された。以上の結果は、酸化還元バランスおよび ATP 供給の最適化により、ガス基質からでもエタノール生産が可能であることを示している。

Effect of split ratio between glycolysis and pentose phosphate pathway on
metabolic profile in Corynebacterium glutamicum

Study on the ethanol production via gas fermentation by the geneticallyengineered strains of the thermophilic acetogen Moorella thermoacetica○Katsuki Murai1, Daisuke Sasaki2, Tomokazu Shirai3, Hiroto Uchikura1,
Kengo Sasaki2, Kazuaki Ninomiya1,4, Kenji Takahashi1, Akihiko Kondo2,3,
Yota Tsuge1,4(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov.,
Kobe Univ., 3CSRS, RIKENS, 4InFiniti, Kanazawa Univ.,)
Key words
metabolic engineering, glycolysis, pentose phosphate pathway,
metabolic flux

2Ca06

バクテリアの還元型リン化合物輸送体 HtxBCDE における基質認識メカニズムの解析○廣田 隆一, 三好 克樹, 池田 丈, 石田 丈典, 舟橋 久景, 黒田 章夫（広島大院・統合生命科学）
hirota@hiroshima-u.ac.jp【目的】バクテリアにはリン酸（PO(OH)3：リンの酸化数+5）のみならず、亜リン酸（H-PO(OH)2 ）およびホスホン酸（R-PO(OH)2 ：酸化数+3）、次亜リン酸（H2PO(OH)：酸化数+1）など、酸化状態が異なるリン化合物を利用する多様な代謝機構が存在する。これらの特殊なリンの代謝機構は、抗生物質を利用しない微生物の選択的培養や、特定の還元型リン化合物に生育を依存させる生物学的封じ込めなど、従来のコンセプトとは異なる特徴を有する新しいバイオ技術の開発ツールとして利用できる。還元型リン化合物を含めた多くのリン化合物
は極性分子であり、輸送体による取り込みが代謝の初段階となる。HtxBCDE は
Pseudomonas stutzeri において見出された次亜リン酸輸送体であり、リン酸には特異性を示さず還元型の無機リン酸である亜リン酸および次亜リン酸のみを輸送する。この性質は還元型リン化合物に生育を依存させる生物学的封じ込めにおいて必須のツールであるが、その分子認識機構は不明である。本研究では、
HtxBCDE の変異体を作製し基質特異性の解析を行った。
【方法・結果】HtxBCDE は binding protein-dependent 型の ATP-binding cassette（ABC）輸送体であり、基質結合タンパク質（HtxB）、膜貫通タンパク質（HtxC）、ヌクレオチド結合タンパク質（HtxD）から構成される。HtxBCDE を利用して作製した亜リン酸依存性株を、高濃度リン酸と亜リン酸が共存する培地で培養したところ、リン酸を利用することができる変異株が得られた。変異株の解析を行ったところ HtxC の Phe210 が Cys あるいは Ser に置換する変異が見出された。そこで HtxC の Phe210 を他のアミノ酸に置換した変異体を作製しリン酸および亜リン酸輸送能を評価した結果、Phe 以外にも亜リン酸特異性を維持できるアミノ酸が見出された。

Analysis of the substrate recognition mechanism of the bacterial reduced
phosphorus compound transporter HtxBCDE○Ryuichi Hirota, Katsuki Miyoshi, Takeshi Ikeda, Takenori Ishida,
Hisakage Funabashi, Akio Kuroda(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)

Key words
compoundphosphate, transporter, substrate specificity, reduced phosphorus○Junya Kato1, Kaisei Takemura1, Yuki Iwasaki2, Setsu Kato1, Yoshiteru Aoi1,
Keisuke Wada2, Katsuji Murakami2, Akinori Matsushika2, Yutaka Nakashimada1(1Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 2Res. Inst. Sustainable Chemistry,
AIST)

Key words

biomass, ethanol production, bacteria, gas fermentation

2Ca08

アコニット酸イソメラーゼ遺伝子とクエン酸輸送体遺伝
子を共発現させた大腸菌生細胞によるクエン酸からのtrans-アコニット酸の生産○小田 祐之亮, 吉岡 育哲, 滝口 有沙, 桐村 光太郎（早大・先進理工）
kkohtaro@waseda.jp【目的】
trans-アコニット酸 (tAA) は可塑剤や機能性樹脂原料などに利用可能な有用有機酸である。現在、tAA の生産法は高温、高圧条件を必要とする化学合成によるものが主流で、環境負荷低減型の tAA 生産法が望まれている。演者らは、tAA資化性細菌 Pseudomonas sp. WU-0701 の細胞内に cis-アコニット酸と tAA の異性化反応を触媒するアコニット酸イソメラーゼ (AI; EC 5.3.3.7)を見出し、その遺伝子を世界で初めて同定した [1]。さらに、AI 遺伝子を高発現させた大腸菌を用いて常温常圧下におけるクエン酸からの tAA の生産に成功した [2]。本研
究では、糸状菌 Aspergillus niger のクエン酸発酵液を原料とし、AI 遺伝子と CitT
遺伝子 (後述) を高発現させた大腸菌生細胞による tAA 生産について検討した。
【方法および結果】
大腸菌のクエン酸輸送体 (CitT) は細胞膜に局在し、コハク酸などのジカルボン
酸とクエン酸の対向輸送を行う。演者らは、大腸菌で CitT 遺伝子を発現させる
ことで、基質であるクエン酸の取り込みが促進されることを予想し、AI 遺伝子と CitT 遺伝子を共発現させた大腸菌を作製した。60 g/L (312 mM) のクエン酸を含む基質溶液を原料に、当該組換え大腸菌生細胞を利用して tAA 生産を行なったところ、AI 遺伝子のみを発現させた大腸菌を用いた場合と比較して最大収量が増大することを見出し、さらに生菌体での反応の最適 pH を 7 と決定した。pH 7 に調節した A. niger のクエン酸発酵液を基質溶液として生産試験に供したところ、2 日間の反応で 57 g/L (296 mM) のクエン酸から 64.9 mM の tAAの生産に成功した。
(本研究は「早稲田大学理工総研-JXTG 若手研究奨励研究」の助成を受けて実施した。)[1] K. Yuhara, et al., FEBS J., 282, 4257-4267 (2015).
[2] K. Koboyashi, et al., Chemistry Select, 6, 1467-1471 (2016).

Bioproduction of trans-Aconitic Acid from Citric Acid by Living Cells ofEscherichia coli Co-expressing Genes Encoding Aconitate Isomerase andCitrate Carrier Protein○Yunosuke Oda, Isato Yoshioka, Arisa Takiguchi, Kohtaro Kirimura(Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words
trans-aconitic acid, aconitate isomerase, citrate carrier protein CitT,Aspergillus niger

172

2Ca09

Ochrobactrum sp. WU-1502 を利用したレブリン酸からの 2-オキソグルタル酸の生成

2Ca11○大浦 智之 1, 齋藤 慎太郎 1, 吉岡 育哲 1, 羽部 浩 2, 桐村 光太郎 1（1早大・先進理工, 2産総研・環境管理）
kkohtaro@waseda.jp

大腸菌の共培養によるイソプレノール合成経路のボトル
ネックの解消○川井 隆太郎, 戸谷 吉博, 清水 浩
（阪大院・情報）shimizu@ist.osaka-u.ac.jp[1] H. Habe, et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 79, 1552-1555 (2015).

【背景と目的】
イソプレノールは燃料や化成品などの原料であり、微生物によるバイオマス資源から発酵生産が望まれている。大腸菌に外来のイソプレノール合成経路を導入した先行研究が報告されているが、その生産性はまだ低く、実用化には更なる改善が必要である。低生産性の原因として、多数の外来遺伝子の過剰発現による代謝への負荷や、メバロン酸生産とイソプレノール生産に最適な細胞内環
境が異なることが考えられる。本研究では、イソプレノール合成経路を２つに分け、それぞれの経路に関する酵素を発現した大腸菌株を共培養することで、生産性の向上を目指した。
【方法と結果】
大腸菌 MG1655（DE3）株を宿主として、グルコースからメバロン酸の合成を担うメバロン酸生産株（cMVA 株）と、メバロン酸からイソプレノールの合成を担うイソプレノール生産株（cIP 株）を構築し、培地中の代謝物濃度をHPLC、GC を用いて測定した。cMVA 株と cIP 株の菌体比を変えて植菌し、増殖停止期での培養を行った結果、共培養によるイソプレノール生産が可能であり、菌体比によってイソプレノール収率が変化することが確認された。また、
cIP 株においてメバロン酸の取り込みが律速となっていることが示唆されていたため、細胞外にメバロン酸を添加して cIP 株を培養したところ、メバロン酸の濃度が増加するほどイソプレノールへの変換速度は増加し、最大で 0.33 mmol/
g-DCW/h の比生産速度が実現された。その際の細胞内 ATP 濃度は 0.05 mM と非常に低く、イソプレノール合成に必要な ATP の供給不足が示唆された。イソ
プレノール合成経路のボトルネックを解消することで、メバロン酸からイソプ
レノールへの変換効率を向上し、共培養におけるイソプレノールの生産性向上が実現されると期待される。

Formation of 2-oxoglutaric acid from levulinic acid by Ochrobactrum. sp
WU-1502

Elimination of bottlenecks in the isoprenol synthetic pathway by co-cultureof Escherichia coli cells【目的】
レブリン酸 (以下 LA) は木質系バイオマスからハイブリッド酸触媒を利用して安価に合成可能な炭素数 5 の α-ケト酸である [1]。LA は将来的には種々の有用化合物の基幹物質となりうる化合物で、LA を原料とした有用化合物生産に期待が寄せられている。しかし、LA はポルフィリン合成を阻害するため、微生物による LA の代謝や変換に関する報告は少ない。演者らは、LA 資化性微生物を探索し、LA からの有用化合物の生成について検討した。
【方法および結果】
土壌を試料として単離した WU-1502 株は、LA 20 g/L を唯一の炭素源とする合成培地において旺盛な生育を示し、7 日間の培養で OD600 は 20 に達した。
WU-1502 株は形態観察から好気条件下で生育を示すグラム陰性桿菌であることが明らかになった。また、16S rRNA 解析から Ochrobactrum lupini, O. cytisi, O.
anthropi に近縁の細菌であることが判明し、便宜上 Ochrobactrum sp. と同定した。WU-1502 株は LA 資化性を示す Ochrobactrum 属細菌として初めてのものである。さらに、Ochrobactrum sp. WU-1502 を用いて LA を基質とした whole cell
reaction を行い、その反応液上清について HPLC 分析を行った。酢酸、コハク
酸、ピルビン酸、2-オキソグルタル酸 (以下 2-OG) などの多くのトリカルボン
酸回路中間体と推定されるピークが検出され、とくに 20 mM LA から 0.79 mM
2-OG の生成が確認された。以上より、微生物を利用して LA からの 2-OG 生産の可能性を見出した。

○Tomoyuki Oura1, Shintaro Saito1, Isato Yoshioka1, Hiroshi Habe2,
Kohtaro Kirimura1(1Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2Environ. Manage. Res. Inst., AIST)○Ryutaro Kawai, Yoshihiro Toya, Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words
acid

levulinic acid, Ochrobactrum sp, tricarboxylic acid cycle, 2-oxoglutaric

Key words

Escherichia coli, isoprenol, mevalonate, co-culture

2Ca10

不均一なリグニン由来フェノールからの 4-ヒドロキシ安
息香酸生産

2Ca12

Pseudomonas stutzeri NT-I のセレン代謝を促進する培地
成分の検討○阿久津 美歩 1, 上村 直史 2, 政井 英司 2, 園木 和典 1
（1弘前大院・農生, 2長岡技科大・生物）
sonoki@hirosaki-u.ac.jp○池田 美紗希, 黒田 真史, 井上 大介, 池 道彦
（阪大院・工）ike@see.eng.osaka-u.ac.jp【目的】我々の研究グループでは需要の多い糖質を使用することなく、リグニン
だけを炭素源としてポリマー原料等の有用物質を生産できる微生物株の開発を進めている。これまでに S-、G-、H-リグニン由来のフェノール類であるシリン
ガ酸 (SA)、バニリン酸 (VA)、4-ヒドロキシ安息香酸 (HBA) を炭素源として良好に生育する Pseudomonas sp. NGC7 株を単離し、その代謝経路を利用すること
でリグニン由来のフェノール類だけを炭素源として、基幹化合物の一つである
cis,cis-ムコン酸を生産できることを明らかにした 1)。本研究では液晶ポリマー原料である HBA の生産に資する微生物株の作出を目的とした。
【方法と結果】相同組換えにより NGC7 株の 4-hydroxybenzoate hydroxylase 遺伝
子 (pobA)を破壊した NGC704 株は、SA と VA の資化能は保持していたが、HBAの資化能を失った。SA、VA および HBA の混合物を炭素源とした条件下では、
SA と VA を炭素源として良好に増殖し HBA だけを蓄積した。また市販のサルファイトリグニンから酢酸エチルで抽出される画分を炭素源としても良好に増殖し、HBA を蓄積することが確認できた。そこでバガスリグニンの分解物モデ
ル [シリンガアルデヒド (29.9%)、SA (3.6)、バニリン (33.5)、VA (2.4)、4-ヒド
ロキシベンズアルデヒド (29.3)、HBA (1.2) ] を逐次添加する Fed-batch 培養を行った結果、NGC704 株は 10 g/L の HBA を生産できた。
本 研 究 は JST 戦 略 的 創 造 研 究 推 進 事 業 先 端 的 低 炭 素 化 技 術 開 発 (ALCA,JPMJAL1506) の支援を受けて実施した。
1)
特願 2018-196001【背景・目的】セレン (Se) は半導体原料等に利用されるレアメタルである一方で、その水溶性化合物は毒性が高いことから、廃水からの効率的な除去及び回収が求められている。Pseudomonas stutzeri NT-I は、水溶性のセレン酸および亜セレン酸を、不溶性の元素態 Se や揮発性の有機 Se 化合物に高効率で還元できることから、Se の生物学的処理技術への適用が期待されている。しかし NT-I
株は、高コストな天然培地中では高い Se 代謝活性を示すものの、無機塩培地中
では Se 代謝活性が低く安定しないことから、Se 代謝を促進する培地成分の解明が求められる。本研究では、NT-I 株を用いた実用的かつ安定した廃水処理技術の確立に向けて、Se 代謝を促進する培地成分を解明することを目的とした。
【方法・結果】1 mM の亜セレン酸及びアミノ酸等の種々の成分を添加した乳酸
無機塩培地で NT-I 株を好気条件下で培養 (28℃、120 rpm) した。経時的に培養液中の Se 濃度を分析し、添加した成分が NT-I 株の亜セレン酸還元能に及ぼす影響を評価した。アミノ酸等の成分を添加していない乳酸無機塩培地では、培養開始 24 時間後に初期添加 Se の 36 ％が培地中に残存していたのに対し、天然
培地の成分でもあるカザミノ酸を 1 g/L 以上添加した系では、ほぼ全量の Se が除去された。続いて、カザミノ酸に含まれる各種アミノ酸による影響を評価した結果、メチオニンの添加による亜セレン酸の還元の促進が確認され、0.1 g/L
以上のメチオニンを添加した系において、培養開始から 24 時間で初期添加 Seのほぼ全量が除去された。この結果より、NT-I 株のセレン代謝には含硫アミノ酸代謝が関連していることが示唆された。

Sugar-free 4-hydroxybenzoate production from heterogeneous lignin-related
phenols

Nutrients accelerating selenium metabolism of Pseudomonas stutzeri NT-I

○Miho Akutsu1, Naofumi Kamimura2, Eiji Masai2, Tomonori Sonoki1(1Grad. Sch. Agric. Life Sci., Hirosaki Univ., 2Dept. Bioeng., Nagaoka Univ. Tech.)

Key words

Pseudomonas, lignin, 4-hydroxybenzoate, Bio-based monomer○Misaki Ikeda, Masashi Kuroda, Daisuke Inoue, Michihiko Ike(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

Pseudomonas stutzeri, selenium, reduction, methionine

173

2Da01

LAL 固定化ビーズ法を用いたグラム陰性菌の培養に伴うエンドトキシンの遊離特性の定量的解析（第 3 報）

2Da03

大瀧 賀也 1, ○徳永 成美 2, 青柳 秀紀 1,2（1筑波大院・生命環境, 2筑波大・生物資源）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp【目的】 エンドトキシン（Endotoxin: ET）はグラム陰性菌の外膜構成成分の一種で、血中へ混入すると人体に重篤な症状を引き起こす。先に演者らは、“溶菌だけではなく、菌体の分裂に伴い ET が菌体外へ顕著に遊離する”タイプと、“溶菌の際にのみ ET が菌体外へ遊離する”タイプのグラム陰性菌が存在することを報告した 1, 2）。演者らは、ET の遊離現象の機構の解明を最終目的とし、本研究では、（1）ET の遊離挙動の解析、（2）菌体内の ET と菌体外に遊離した ET の特性の比較、（3）遊離した ET の形態の解析、について検討をおこなった。
【方法と結果】前報 1, 2）と同様に ET の高感度迅速測定が可能な LAL 固定化ビー
ズ法を用いて、Klebsiella pneumoniae NBRC 3512、Pseudomonas aeruginosa NBRC
106052 など 6 種類のグラム陰性菌の培養（増殖）に伴う ET の遊離挙動を解析した結果、菌株間で遊離量、遊離率、単位菌体当たりの ET 活性（増殖ステー
ジによっても異なる）が大きく異なった。また、SDS-PAGE を用いて種々解析した結果、ET の遊離現象に糖鎖の長さは関係ない（特定の構造の ET が遊離してくるのではない）ことが示唆された。遊離した ET の形態を調べるために、
対数増殖期における ET の遊離率が高い K. pneumoniae を改変 802 培地で培養し、対数増殖期後期の培養液を用いて、密度勾配遠心分離法による分画をおこない、遊離した ET の浮遊密度の解析と透過型電子顕微鏡（TEM）を用いた観察をおこなった。その結果、遊離した ET はベシクル様の形態で存在することが示唆された。現在、他の菌株についても検討中である。
1）H28 生物工学会要旨集 p. 311
2）H29 生物工学会要旨集 p. 243

Application of LAL-conjugated-microbeads method for quantitative
analysis of endotoxin-releasing characteristics of gram-negative bacterial
cultures (part 3)

Kaya Ohtaki1, ○Narumi Tokunaga2, Hideki Aoyagi1,2(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Col. Agro-bio. Resource. Sci., Univ.
Tsukuba)

イオンコンプレックス化技術を利用したポリ γ グルタミン酸の効率的な回収技術の開発○白米 優一, 山内 七海, 芦内 誠
（高知大・農）yuichi.haku@gmail.com【背景と目的】ポリ γ グルタミン酸（ＰＧＡ）の回収にはＰＧＡ産生微生物の培養液に約３倍量のアルコールを必要とする。ただし、この方法では、ＰＧＡ純度が低いため、さらなる精製分離の工程も要する。回収効率の抜本的な改良が求められていた。２０１３年当初より、当研究室で開発されたＰＧＡイオンコ
ンプレックス（ＩＣ）化技術を介してＰＧＡの効率回収技術の実用化に向けた検討が進んでいた。他方、異なる研究グループでもＩＣ化技術になぞらえてジェ
ミニ型界面活性剤を利用していたが、いまだ多くの課題が多く残っている。今回、ＰＧＡＩＣ経由のＰＧＡ効率回収技術に関する有益な情報を得たので報告する。
【方法・結果】便宜上、当方の回収技術をＨＤＰ法、異なる研究室から提案されたジェミニ型回収技術をＢＤＰ法と呼ぶ。両回収法を比較した。前者はＰＧＡ
ＩＣをごく少量のエタノールに溶解後、想定イオン結合数と等モル量のＨＣｌを添加することで結合部を解除させ（事実上のイオン低用量法）、アルコール不溶の沈殿物（ＰＧＡ‐Ｈ）を回収する。これに炭酸ナトリウム溶液を添加、得られた溶液はほぼ１００％のＰＧＡ回収率を示すことを明らかにした。ＢＤＰ
法では、ＨＣｌの代わりに高濃度ＮａＣｌ溶液を用いる（イオン大過剰法）。この場合、①回収率が〜８０％、②大過剰の塩を除く作業が必須、③ジェミニ型
界面活性剤は極めて高価な薬剤で低コスト化に逆行する等、の問題があった。
本件のＰＧＡＩＣを介した新たなＰＧＡ回収技術において最も注意すべきは水分の混入であることが判明した。実際、ＨＤＰ法においてもＢＤＰ法と同じく、人為的に水分混入をさせたモデル回収系を設計した。さらに、水分用量を種々変化させたところ、該混入量が増加するに伴い、高い相関性をもってＰＧＡの回収効率が低下することが明らかになった。

Efficient recovery of poly-γ-glutamate via formation of its polyion complex,
PGAIC○Yuichi Hakumai, NaNami Yamauchi, Makoto Ashiuchi(Fac. Agric. Agric. Sci. Prog., Kochi Univ.)

Key words
lysatecultivation, endotoxin, gram-negative bacteria, Limulus amebocyte

Key words
poly-gamma-glutamate, polyion complex, efficient recovery,
hexadecylpyridinium

2Da02

LAL 固定化ビーズ法を用いたエンドトキシンの高感度・迅速検出法の開発と利用（第 5 報）

2Da04

猪瀬 陽加 1, ○川﨑 芳美 2, 青柳 秀紀 1,2（1筑波大院・生命環境, 2筑波大・生物資源）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp

酢酸菌を宿主とした異種タンパク質生産の試み○植川 泰好, 繁 宥樹, 赤坂 直紀, 福田 青郎, 藤原 伸介（関西学院大院・理工）
fujiwara-s@kwansei.ac.jp【目的】
臨床現場では血液中のエンドトキシン（Endotoxin: ET）濃度の迅速で正確な測定が必須であるが、血液中の ET 濃度は非常に低いと共に、血液中には測定を阻害する夾雑物があるため、ET の正確な測定は困難であった。演者らは ET の測定法として LAL 固定化ビーズ（LAL-B）法を開発し、公定法では困難であった血清試料中の ET 濃度の測定を、正確、迅速かつ高感度におこなうことに成功した 1)。本研究では、従来は測定が困難であった、LAL 反応に影響を与える
因子（夾雑物、界面活性作用、濁度など）を含む種々の試料中の ET 濃度の測定に LAL-B 法を適用し、本法の有用性の評価と利用性の拡大について検討をおこなった。
【方法と結果】
前報 1)に従い LAL-B を作製した。LAL-B 法を用いて、有色で濁度の高い経腸栄養剤中の ET や界面活性作用を有する胆汁酸を含む試料中の ET の濃度を測定した結果、従来は測定不能だった ET 濃度の正確な測定ができた。腸内環境を模倣した系として経腸栄養剤中で大腸菌を培養した系について検討した結果、大腸菌からの ET の遊離が促進される場合があることが示唆された。一方、胆汁酸を含む培地で大腸菌を培養すると培養液中の ET の活性が減少した。種々検討した結果、胆汁酸は大腸菌からの ET の遊離を抑制するのではなく、ET を不活化していることが示唆された。また、胆汁酸に ET を添加した試料を希釈した場合、ET の活性が復活しなかったのに対し、一般的に ET の不活化剤として知られる polymyxin
B では希釈により ET の活性が一部回復した。現在、両者の不活化機構の違いについて解析中である。
1） H29 生物工学会要旨 p. 242.

[目的] 酢酸菌 Komagataeibacter europaeus KGMA0119 は、食酢醸造用の酢酸菌として利用されてきた。本菌の菌体収量は大腸菌と同等に高く、細胞内の pHは他の酢酸菌ほど低くならない（1）。また、培地に酢酸を放出するため雑菌も繁殖しない。３種の共存可能なプラスミドも存在する(2)。これらの性質は本菌の物質生産用宿主微生物としての可能性を示す。本研究では酢酸菌を利用する
高発現系の確立に向けて、高い転写活性を有するプロモーター、物質生産に活用できる制御系の探索を行った。
[結果と考察] 高発現を実現するために、細胞内での発現量の高い遺伝子に注目した。まず、RNA-seq 解析により、候補選別を行ったところ、分子シャペロニン groES 遺伝子の転写量が多く確認された。K.europaeus において、groES は構成的に発現しており、高い転写活性とともに安定な発現持続性が期待された。
次に GFP をレポーターに用い、β-ラクタマーゼ遺伝子プロモーター（Pbla）を比較対象として、groES プロモーター（PgroES）の活性を評価した。蛍光強度を比較したところ PgroES を用いた場合 Pbla と比較し、蛍光強度で約 4 倍以上の活性増強が認められた。このことから PgroES は酢酸菌において高い転写活性を有すると考えられた。次に制御系についての検証をおこなった。先行研究で、アセトイン合成関連遺伝子 aldC の転写が、乳酸添加依存的に転写誘導されることが推察された。乳酸は添加剤として安価であり、安全性も高いことが知られている。
そこでこの PaldC プロモーター活性の乳酸依存性を検証した。L-乳酸ナトリウムを培地に添加し、転写量の変動を定量 RT-PCR により測定した。L-乳酸ナトリ
ウムの添加量に応じて転写産物量の増加が確認された。最適な制御条件については、現在検討中である。
(1) 繁ら 2017 年度生物工学会(2) Akasaka et al., J.Biosci.Bioeng., 119, 661 (2015)

Development of a rapid and sensitive method for assessing endotoxin byusing LAL-conjugated-microbeads and its application (part 5).

Trial of heterogeneous gene expression in acetic acid bacteria

Haruka Inose1, ○Yoshimi Kawasaki2, Hideki Aoyagi1,2(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Coll.Agrobio.Resour.Sci.,Univ.Tsukuba)

Key words

bile acid, endotoxin, Limulus amebocyte lysate, polymyxin B○Yasuyoshi Uekawa, Yuki Shige, Naoki Akasaka, Wakao Fukuda,
Shinsuke Fujiwara(Grad. Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ.)

Key words
acetic acid bacteria, Komagataeibacter europaeus, expression system,
bio-production

174

2Da05

リン脂質組成を改変した膜受容体-マグネトソーム複合
体の開発

2Da07

○藤本 一嗣, 田山 爽也華, 前田 義昌, 田中 剛, 吉野 知子（農工大院・工）y-tomoko@cc.tuat.ac.jp

Characterization of Tryptamine-coupled resin for affinity
purification of human IgG○Michelle Rakotondravao1, Naohiro Kuriyama2, Noritaka Kuroda2,
Ryosuke Takahashi2, Yumiko Sakoda2, Jun-ichi Horiuchi1,
Yoichi Kumada1(1Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2YMC)
kumada@kit.ac.jp【背景と目的】磁性細菌 Magnetospirillum magneticum AMB-1 は細胞内にリン脂質二重膜で覆われた磁気微粒子（マグネトソーム）を合成する。これまでに、複数種類のヒト由来膜受容体のマグネトソーム膜上への発現に成功している。
しかし、動物細胞膜上で発現する膜受容体と比較して、マグネトソーム膜上の膜受容体はリガンドとの親和性が低いことが分かっている。この原因の一つとして、原核生物である磁性細菌と動物細胞との膜組成の違いが考えられた。磁性細菌が合成する脂質膜には、動物細胞膜に豊富に含まれるホスファチジルコ
リン (PC)が存在しない。そこで、PC を含有するマグネトソームを生合成し、マグネトソーム上に発現した膜受容体の活性向上への寄与を評価した。
【方法】Legionella pneumophila 由来 PC 合成遺伝子 (pcs)、または Azospirillum
brasilense Az39 由来 PC 合成遺伝子 (pmt)を磁性細菌で異種発現させた。獲得した形質転換体の乾燥菌体およびマグネトソームから脂質を抽出し、膜脂質解析を行った。また、膜受容体の 1 種である Thyroid Stimulating Hormone Receptor(TSHR)合成遺伝子と pcs を含むベクターを M. magneticum AMB-1 に導入し、PC合成による TSHR のリガンド結合能への影響を評価した。
【結果と考察】M. magneticum AMB-1 への PC 合成遺伝子の導入により、細胞およびマグネトソームの膜脂質中に PC が含有されていることを確認した。また、
PC 含有率は pcs 導入株で全脂質中の 30 ％、pmt 導入株で 20 ％程度であった。
また、野生株をホストとした TSHR 発現株から抽出したマグネトソーム膜上のTSHR のリガンド結合能は、Kd ＝ 1.25×10-7 M であったのに対し、PC 含有マグ
ネトソーム上では Kd ＝ 2.50×10-8 M であった。以上より、マグネトソーム膜上へ PC を合成し、リン脂質組成の改変を行うことで TSHR のリガンド結合能が向上することが示された。

The most exclusively utilized ligand is Protein A while it has shown somedisadvantages such as its instability under alkaline condition, which lead in thisresearch to develop a new alternative chemical ligand, Tryptamine. Previous
researches have already demonstrated that the interaction occurs on the nucleotide
binding site located on the Fab region of human IgG and indole group of Tryptamine.
As the properties of Tryptamine against any matrix still remain unveiled, Epoxyactivated Sepharose 6B as well as CM Sepharose Fast Flow are chosen as support.
Tryptamine coupled Sepharose 6B showed binding affinity of 13 mg/cm3 resin at pH 8.
In the presence of 0.5 M of NaCl in the binding buffer, the maximum binding capacityof human IgG is 27 mg/cm3resin with a dissociation constant (Kd) of 4.4x10-6 M.
Compared to those of Protein A-resin, these values are relatively low but we could
admit that Tryptamine can be used as affinity ligand for binding of human IgG. As thisperformance is not yet satisfying, some modification of parameters as well as the IgG
species will be investigated.

Functional analysis of membrane receptor-magnetosome complexes bymodifying phospholipid compositions

Characterization of Tryptamine-coupled resin for affinity purification ofhuman IgG

○Kazushi Fujimoto, Sayaka Tayama, Yoshiaki Maeda, Tsuyoshi Tanaka,
Tomoko Yoshino(Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)○Michelle Rakotondravao1, Naohiro Kuriyama2, Noritaka Kuroda2,
Ryosuke Takahashi2, Yumiko Sakoda2, Jun-ichi Horiuchi1, Yoichi Kumada1(1Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2YMC)

Key words
receptormagnetotactic bacteria, membrane modification, phosphatidylcholine,

Key words

Affinity Ligand, Tryptamine, human IgG

2Da06

細胞模倣膜を用いた界面活性剤刺激性評価に関する
研究

2Da08

エクソソームのアフィニティ分離を目指した単鎖抗体固定化担体の開発○藤根 志帆 1, 佐々木 陽介 1, 下川 直史 1, 辻野 義雄 1,2,
高木 昌宏 1
（1北陸先端大・マテリアル, 2岡山理大・経営）
takagi@jaist.ac.jp【背景・目的】
界面活性剤の刺激性評価方法として、ウサギの眼に界面活性剤を点眼するドレイズ試験があるが、定量性は低く、動物愛護の面でも代替法の開発が望まれている。ここでは、生体模倣膜リポソームに界面活性剤を作用させ、リポソームの膜形態変化のダイナミクスを観察し、その変形パターンを通して刺激性評価の指標を見出す研究を行い、膜脂質と界面活性剤の相互作用と刺激性の相関について界面活性剤の分子形状に基づいて考察した。
【方法】
不飽和リン脂質 Dioleoyl-Phosphatidylcholine(DOPC)からなるリポソームを作製し、共焦点レーザー顕微鏡を用い、リポソームの変形過程を観察した。界面活性剤は構造を系統的に変化させることができるポリオキシエチレンアルキルエー
テル（POE）CH3(CH2)x(OCH2CH2)yOH(x が疎水基、y が親水基を示す)の中から( x, y ) = ( 15, 20 ), ( 17, 20 ), ( 21, 5 ), ( 21, 10 ), ( 21, 20 ), ( 21, 30 )計 6 種を使用した。膜変形ダイナミクスを解析し、膨張・収縮速度の測定を行った。
【結果・考察】親水基が小さいとリポソームが膨張し、大きいとリポソームが収縮した。また、疎水基が小さいとリポソームが破裂し、大きいとリポソームが収縮した。先行研究より、膜面積（余剰面積）が増加するダイナミクスは高刺激性で、リポソー
ムが収縮するダイナミクスは低刺激性であることがわかっている。疎水基と親水基がともに大きい場合に刺激性が低くなることが予想される。また、Flip-Flop
しやすい界面活性剤は刺激性が強いと考えられ、疎水基が大きい場合は強い分
子間力により、大きな親水基は疎水部を通過する際の障害となるため、Flip-Flopが阻害されると考えられる。これらの結果から界面活性剤の分子構造と刺激性の相関について分子の動きに基づき議論する。

Evaluation of irritation induced by surfactants using model cell membrane○Shiho Fujine1, Yosuke Sasaki1, Naofumi Shimokawa1, Yoshio Tsujino1,2,Masahiro Takagi1(1Sch. Mater. Sci., JAIST, 2Dept. Man., Okayama Univ. Sci.)

Key words

cell membrane, surfactant, membrane lipids○小林 巧, 新 裕太, 堀内 淳一, 熊田 陽一（京工繊大院・工芸科学）
kumada@kit.ac.jp【背景と目的】エクソソームなどに代表される細胞外小胞は、次世代バイオマー
カーとしての利用が期待されており、エクソソームの特異的分離方法の開発が必要となっている。本研究では、単鎖抗体（ｓｃ F ｖ）を用いる安価かつ高効率なエクソソームのアフィニティ分離技術の開発を目的とし、担体へ対する
scFv 固定化手法、さらには scFv 固定化担体の抗原結合活性ならびに、それらを用いたエクソソーム分離性能について検討した。
【方法】エクソソーム膜上の CD ９を標的抗原とする scFv を使用した。物理吸
着法、アミンカップリング法を利用して scFv をポリスチレンラテックス粒子上へ固定化し、それらの吸着挙動と、担体の分散性に対する影響を評価した。また、SPR センサーを用いて、作成した scFv 固定化担体の抗原結合活性およびエ
クソソーム分離性能についても評価を行った。
【結果と考察】物理吸着法またはアミンカップリング法により、scFv 固定化後、溶液中に残存している scFv 濃度を測定することによって、固定化された scFv
量を決定した。また、アミンカップリング法では、溶液の pH を変化させることにより最適な scFv 固定化条件を決定した。さらに、SPR センサーの結果から、固定化方法によって抗原結合活性に関しても差が生じることが明らかとなった。本発表では、作成した scFv 固定化担体を用いるエクソソーム分離の性能についても発表する。

Affinity separation of Exosomal vesicles using single-chain Fv-immobilized
micro particles○Takumi Kobayashi, Yuta Atarashi, Jun-ichi Horiuchi, Yoichi Kumada(Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)Key words

Exosome, scFv, affinity separation, immobilization

175

2Da09

高親和性ウサギ scFv の開発とイムノクロマトグラフィ
への応用

2Da11

○中尾 貴一 1, 岡西 崚輔 1, 高橋 浩一 2, 小笠原 真也 2, 権平 文夫 3,
堀内 淳一 1, 熊田 陽一 1
（1京工繊大院・工芸科学, 2デンカ, 3デンカ生研）
kumada@kit.ac.jp[緒言] 現在 Whole 抗体の代替物として検査薬への利用に scFv が期待されている。この scFv のスクリーニングは Phage display 法に基づくバイオパニング操作
によって通常行われるが、経験的要素の大きなファクターが結果に大きく影響するため、検査に利用可能な scFv の選定には多大な労力を要する。そこで本研
究では、多重膜リポソーム (MLVs) 及びポリスチレンチューブを利用した 3 種類の抗原固定化担体を用いてバイオパニング操作を行い、各 Round 毎の濃縮度合を評価した。さらに、単離された scFv のイムノクロマトグラフィへの利用可能性を考察した。
[実験] scFv Phage library (Library size= 2.14×107) を調製し，3 種類の抗原固定化
担体を用いてバイオパニング操作を 4 Round 行った。各 Round 毎に間接 ELISAを行い、特異 scFv の濃縮を確認した。単離された 22 種類の scFv クローンを組換え大腸菌を用いて生産し、Ni-NTA カラムを用いて精製した。さらに、scFv
を PS plate (Maxisorp) 及び NC 膜上に固定化し、固定化後の抗原結合活性をSandwich ELISA 及び Dot-Blot Assay により評価した。
[結果と考察] 3 種類の分離担体全てにおいて 3 回以上のバイオパニング操作で特異ファージを濃縮でき、アミノ酸配列を網羅的に解析した結果、22 種類の異なる CDRH3 配列を有する scFv が単離されている事が確認された。得られた 22
種類の scFv クローンを組換え大腸菌を用いて生産・精製を行った結果、20 種
類の scFv を回収可能であった。得られた 20 種類の scFv を NC 膜上に固定化
し、抗原結合活性を評価した結果、イムノクロマトグラフィに利用可能な 7 種類のリガンド用 scFv を単離できた事が明らかとなった。

Development of high-affinity rabbit scFv for immunochromatography○Kiichi Nakao1, Ryosuke Okanishi1, Koichi Takahashi2, Shinya Ogasawara2,
Fumio Gondaira3, Jun-ichi Horiuchi1, Yoichi Kumada1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2Denka, 3Denka Seiken)

空間的環境が細胞の凝集，分散に与える影響○瀬川 直矢, 上岡 惇也, 佐々木 啓, 紀ノ岡 正博（阪大院・工）kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景及び目的】細胞挙動は，細胞基質間接着や細胞間接着に影響を受け，これらの空間的環境の違いによって，細胞分化の成熟度や幹細胞の分化指向性が変化する．例えば，間葉系幹細胞においては，ポリスチレン面上にポリアミドア
ミン鎖構造の分岐回数（世代数）5 のデンドリマーを提示した培養面（G5 面）において培養することで，遊走が活性化され，伸縮を繰り返す形態変化や細胞集塊の形成が確認されている．また，形成された集塊を新たな G5 面に集塊のまま播種すると，細胞が集塊から遊離，遊走，再集塊形成を経て，cardiac troponin
T （cTnT） 陽性細胞率が上昇することが確認されている．上記の細胞集塊の分散，凝集は，細胞が通過した後の培養面上の基質の劣化が原因と考えられている．今回，シミュレーションの観点から細胞基質間接着と細胞間接着とこれらの挙動との関係を明らかにすることを目的とした．
【方法】我々は細胞の挙動（細胞基質間接着，細胞間接着，遊走）をモデル化した細胞培養シミュレータを構築している．これを用いて初期の細胞配置（集塊の状態，まばらに細胞が存在する状態）と細胞基質間接着と細胞間接着の強さを表すパラメータを様々な組み合わせでシミュレーションを行った．
【結果及び考察】初期条件ごとに定常状態における細胞群の配置がいくつかのパターンに分けられることが確認された．ここから，凝集体が形成される際と，凝集体が分散する際では，細胞基質間接着と細胞間接着のバランスが大きく異なり，G5 面で，細胞が集塊から遊離，遊走，再集塊形成する挙動には，基質の劣化や細胞間接着能の上昇の影響を受けていることが示唆された．

Influence of spatial environment on formation and collapse of cellaggregates○Naoya Segawa, Junya Kamioka, Kei Sasaki, Masahiro Kino-oka(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

scFv, Influenza virus, Biopanning, Immunochromatography

Key words
connection

simulation, cell morphology, cell-cell connection, cell-substrate

2Da10

ミックスモードクロマトグラフィを用いた治療用酵素ヒ
ト Kynureninase の高効率分離

2Da12

FISH 法を用いたチャイニーズハムスター由来細胞における内部テロメア配列と染色体転座の解析○杉山 友亮, 熊田 陽一, 堀内 淳一（京工繊大・工芸科学）
kumada@kit.ac.jp○イ ジュンホ, 山野-足立 範子, 古賀 雄一, 大政 健史（阪大院・工）omasa@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景と目的】ヒト Kynureninase(KYNase)は血中の L-Kynurenine を分解し、免疫系の働きを正常化することから新規癌治療薬として期待されている。1)本研究では KYNase の大量生産のために、大腸菌菌体内可溶性画分からの高効率分離プロセスの開発を目的とした。特に lysate 中の KYNase のキャプチャーステッ
プにおいて、これまでの研究で実績の高いハイドロキシアパタイト(HA)を吸着
分離担体として選定した。2)さらに、pH や塩濃度といった緒条件が KYNase の
HA に対する吸脱着性に与える影響を評価し、操作条件の最適化を行った。
【方法】N 末端に 6xHis-tag を融合した野生型 KYNase をモデルとし、発現ベク
ターで形質転換した大腸菌 C43(DE3)株を得た。得られた形質転換体を用いてフラスコ培養を行い、菌体内に活性型の KYNase を生産した。pH 及び塩濃度(NaCl
及び NaPO4)などの条件を種々に変化させ、各条件において大腸菌 lysate を HAと混合し、KYNase を吸着させた。吸着前後の酵素活性を測定し、その差と担体の体積から KYNase の吸着密度を求め、比較した。
【結果】HA と KYNase が共に安定な pH 範囲(6.5〜9.0)で吸着密度を比較したところ、低 pH ほど増大することが明らかになった。また、pH6.5 において塩濃度(NaCl, NaPO4)を 0〜1000 mM の範囲で変化させ、同様の実験を行った。その結果 NaCl 及び NaPO4 共に高濃度ほど KYNase の吸着密度は低下した。しかし、NaPO4 と比較して NaCl の影響は小さいことが明らかになった。今後は、HA 充
填カラムを用いた精製操作を実施し、動的吸着容量の流速依存性、さらには夾
雑成分の影響も評価する予定である。
1)Harold A. Walsh and Nigel P. Botting (2002)
2)Eur. J. Biochem. 269, 2069-2074【背景・目的】近年、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞は抗体生産の宿主として汎用されている。しかし、生産株構築には CHO 細胞のゲノム不安定性により長期間を要しているのが実情である。不安定の要因の一つが染色体転座による導入遺伝子の欠失であるが、転座が起こる CHO 細胞の染色体上の位置は明らかになっておらず、この解明が細胞株構築時間の短縮に繋がると考えられる。モデル生物における先行研究によると、内部テロメア配列（ITS）で染色体が転座する可能性が報告されている。そこで、本研究ではチャイニーズ
ハムスター由来細胞における転座と ITS の関係性を解析し、転座が起こる染色体上の位置を解明することを目的とした。
【実験方法】培養期間が把握できていない CHO 細胞の代わりに当研究室にて樹立されたチャイニーズハムスター肺由来 CHL 細胞を用い、CHL 細胞の長期培養により細胞樹立後の ITS と転座の関係性を解析した。解析では、二種類のfluorescence in situ hybridization（FISH）法、multicolor FISH（mFISH）、one color
FISH（FISH）で転座と ITS の観察を行い比較した。
【結果及考察】培養期間が上がるにつれて、CHL の染色体と ITS の数に変化が見られなかったにもかかわらず転座の数は急激に上昇した。同様に、転座が発生した場所の ITS が増加したことから、CHL 細胞において ITS にて多くの転座が発生し、これがゲノム安定性のカギとなっていることが示された。比較のために長期培養した CHO 細胞株では、CHL 細胞と同様に多くの転座が ITS で発生していることが明らかとなった。しかし、ITS により発生した転座の比率はCHO 細胞株ごとに異なり、ITS が転座に与える影響は細胞株によって異なることが示唆された。

Efficient separation of therapeutic enzyme, human Kynureninase by mixmode chromatography

Analysis of the interstitial telomeric sequences and chromosomaltranslocations in Chinese hamster-derived cell lines using fluorescence insitu hybridization○Yusuke Sugiyama, Yoichi Kumada, Jun-ichi Horiuchi(Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)Key words

Kynureninase, hydroxyapatite, mix-mode chromatography, purification○Junho Lee, Noriko Yamano-Adachi, Yuichi Koga, Takeshi Omasa(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
Chinese hamster ovary cells, chromosomal translocation, FISH,
Chinese hamster lung cells

176

2Ea01

質量分析イメージングによる発酵過程における紅麹二次代謝物の可視化技術の確立

2Ea03○南 牧歩 1, 比嘉 悠貴 2, 福﨑 英一郎 1, 新間 秀一 1（1阪工大院・工, 2小林製薬中央研究所）
sshimma@bio.eng.osaka-u.ac.jp

Optimization of processing method to increase aminoacid content in Tempe, an Indonesian fermented food○Hadi Akbar Dahlan, Sastia Prama Putri, Eiichiro Fukusaki(Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)
sastia_putri@bio.eng.osaka-u.ac.jp

紅麹は，中国や台湾などのアジア圏で 1000 年以上発酵食品の原料として使用されてきた非常に歴史のある食材である．また紅麹菌は有用な二次代謝物を豊富に生産しており，紅麹は食品用色素としての利用だけでなく栄養補助食品や健康食品としても注目を集めている．
発酵が進むにつれて紅麹が赤色を呈色する理由は，紅麹菌の有性生殖の際に生じた子嚢胞子が成熟するにつれて赤く呈色することに由来する．子嚢胞子が呈色する際に二次代謝物が生成されると考えられているが，実際に発酵過程の紅麹菌において，どこで，どのように二次代謝物が生成されるのかは未だ明らかになっていない．
そ こ で ， 本 研 究 で は ， 質 量 分 析 イ メ ー ジ ン グ 法 （ MSI: mass spectrometry
imaging）を用いて紅麹米における二次代謝物（モナコリン K，モナスシン，ル
ブロパンクタミン）の局在情報の時間変動を観測することを最終目標として当該物質群の組織内の局在可視化技術を確立すること目的とする．
イメージング質量分析法（MSI）は，標識を用いずに一度の測定で複数の化合物を同時に検出できることから，複数の二次代謝物の局在を一斉可視化することに有用であると考えられる．そこで本研究では，MSI を用いて紅麹米における発酵過程での二次代謝物の可視化を行った．
その結果，モナコリン K は発酵が進むにつれて表面から内部へと蓄積されていく様子が観測された一方で，色素成分（モナスシン，ルブロパンクタミン）は
紅麹菌の子嚢胞子が多く存在する部分に蓄積しており，モナコリン K と色素成分との間で局在に違いが見られるということが判明した．このことから，紅麹
米の発酵過程における二次代謝物の生成には子嚢胞子が深くかかわっており，
今後子嚢胞子周辺において MSI を用いた可視化を行うことで紅麹菌の二次代謝メカニズムが明らかになると考えられる．

Tempe is a solid-state fermented soybean food originated from Indonesia. It is famous
for its ability to provide complete amino acid nutrition at a low cost. Tempe has beenreported to promote several health benefits, such as lowering of cholesterol andtriglyceride levels and decrease blood sugar levels. To further improve nutritional
benefits of tempe, it is important to optimize tempe processing methods. The objectiveof this study is to improve amino acid content in tempe by modifying the processing
method. In this study, 3 factors (sonication time, initial soaking temperature andfermentation time) were selected as possible factors in improving tempe’s production
process. Response surface methodology was used to describe possible interaction
between the 3 factors in improving amino acid content. Untargeted analysis using
GC/MS was firstly conducted and the result was validated with targeted amino acidanalysis via LC-QTOF/MS. Based on the result, the interaction between the 3 factors
was able to increase selected amino acids . Among the three factors, fermentation time
was able to improve histidine, alanine, glutamine and tyrosine in tempe with statisticalsignificance.

Establishment of the techniques for vizualization of secondary metabolites
in beni-koji during fermentation using mass spectrometry imaging

Optimization of processing method to increase amino acid content in Tempe,
an Indonesian fermented food

○Makiho Minami1, Yuki Higa2, Eiichiro Fukusaki1, Shuichi Shimma1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Inst. Technol., 2R&D Center, Kobayashi PharmaceuticalCo., Ltd,)○Hadi Akbar Dahlan, Sastia Prama Putri, Eiichiro Fukusaki(Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
fermentation

MALDI-imaging mass spectrometry, beni-koji, secondary metabolite,

Key words

tempe, amino acid, processing, metabolomics

2Ea02

メタボロミクスに基づくテンペ発酵過程における成分の経時的変動解析

2Ea04

モンゴル乳製品由来乳酸菌がコレステロール代謝に与える影響○南部 洋輔, Putri Sastia Prama, 福﨑 英一郎（阪大院・工・生命先端）
fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp○宮本 侑子 1, 峯崎 美歌子 1, 李 怡然 2, 竹下 正彦 2, 有馬 勇夫 2,
Tsend-Ayush Chuluunbat 3, Oyunsuren Tsendsuren 4, 小川 健二郎 5,
西山 和夫 1, 山﨑 正夫 1
（1宮崎大・農, 2南日本酪農共同（株）, 3蒙科技大, 4蒙バイオ協会, 5宮崎大・TT推進機構）
myamasaki@cc.miyazaki-u.ac.jp

テンペは, 皮を剥き, 茹でた大豆にクモノスカビ(Rhizopus spp.)と呼ばれる糸状菌を繁殖させたインドネシアの伝統発酵食品である. テンペは, 18 世紀からジャワ島で始まり, 今日に至るまで生産されているが, インドネシアでは主なタンパク源として親しまれてきた. 近年, そのタンパク含量の高さから, 肉の代用品としても注目されており, 現在では様々な国で製造されている. テンペには, 製造過程と発酵状態の微細な違いによって様々な種類が存在し, それらは質感や味といった特徴が異なると考えられ, 発酵過程では 食品の品質に寄与する様々な代謝物が生成されると言われている. 現在, テンペの健康的な効能についての研究が数多く報告されているが, 製造過程や発酵状態の違いに着目した研究は無い.
メタボロミクスは食品科学において, 製品の品質や安全性, そして製造過程が与える影響を評価するためのツールとして広く用いられており, これまで醤油や味噌といった大豆発酵食品において, メタボロミクスを用いた成分プロファイリン
グに関する研究が報告されている.
よって本研究では, テンペの発酵過程におけるメタボロームの経時的変動を GC/
MS 分析により追跡し, テンペの発酵過程における代謝物変化の特徴を明らかにすることを目的とした.
その結果, クエン酸回路や糖類の代謝に関する化合物が発酵の後期に多く含まれていることが分かり, Rhizopus 種の発酵過程における異化代謝が見られた. また,食品の味や機能に寄与する成分が発酵中に増加することが確認でき, テンペの製造過程において, 発酵が品質に関わる重要な段階の一つであることが示唆された.

【背景・目的】
コレステロール低下作用を持つ機能性素材の一つとして乳酸菌が注目されている。これまでに我々はモンゴルの伝統的な乳製品から分離したプロバイオティ
クス性を持つ乳酸菌株のコレステロール吸着能、胆汁酸吸着能および胆汁酸脱抱合能を評価してきた。本研究ではこれらの試験で有用性を認めた株がコレス
テロール代謝に与える影響についてマウスを用いて評価した。
【方法】
Balb/c マウスを 1 週間の予備飼育の後、通常食群（NC）、通常食に Lactobacillus
plantarum 06CC2 株（5%）を添加した群（NC+L）、高コレステロール（0.5％）
負荷群（HC）と HC に 06CC2 株を添加した群（HC+L）と未添加群を設定した
合計 4 群に分けた。食餌は AIN-93G に準拠して調製し、3 週間飼育の自由摂食とした。屠殺後、肝障害を血清 AST, ALT 活性を指標に測定し、血清および肝臓コレステロール、HDL-コレステロール（血清のみ）、トリグリセリドを測定した。また、糞中コレステロール、胆汁酸を酵素比色法、短鎖脂肪酸を GC 法
にて測定した。
【結果・考察】血中コレステロールは高コレステロール (HCD) 群で上昇したが、HCD と HCD+L 群間に有意差は認められなかった。肝臓コレステロールは HCD 群より HCD+L 群で有意に低く、肝臓トリグリセリド及び肝障害の程度は HCD 群より HCD+L 群で低い傾向が認められた。一方、糞中コレステロールおよび総胆汁酸排泄
量は HCD 群より HCD+L 群で有意に低かった。また、HCD+L 群では糞中酪酸濃度が有意に上昇していたが、酢酸、プロピオン酸濃度には影響が認められなかった。これらの結果から、06CC2 株は体内コレステロールプールを低下させることが示唆されたが、コレステロール排泄系の亢進に起因するものではない
ことが示唆された。

Metabolomics-based time-course analysis of the component changes during
tempe fermentation

Effect of Lactobacillus plantarum derived from Mongolian dairy product on
the cholesterol metabolism in mice.

○Yosuke Nambu, Sastia Prama Putri, Eiichiro Fukusaki(Department of Biotechnology, Graduate School of Engineering, Osaka University,
Osaka, Japan)

Key words

food analysis, fermentation, metabolomics, GC/MS○Yuko Miyamoto1, Mikako Minezaki1, Yiran Li2, Masahiko Takeshita2,
Yuo Arima2, Chuluunbat Tsend-Ayush3, Tsendsuren Oyunsuren4, Kenjiro Ogawa5,
Kazuo Nishiyama1, Masao Yamasaki1(1Fac. Agric., Univ. Miyazaki, 2Minami Nippon Dairy CO-OP Co. Ltd., 3Mongolian
Univ. Sci. Technol., 4Mongolian Biotechnology Association, 5Organization for
Promotion of Tenure Track, Univ. of Miyazaki)
Key words
lactic acid bacteria, cholesterol, bile acid

177

2Ea05

焼酎粕を用いた麹菌培養物(FPS)がコレステロール代謝に及ぼす影響2Ea07○加藤 寛隆 1, 小境 敏揮 2, 章 超 2, 河野 邦晃 2, 岩井 謙一 2,
髙瀨 良和 2, 小川 健二郎 3, 西山 和夫 1, 山﨑 正夫 1
（1宮崎大院・農, 2霧島酒造, 3宮崎大・テニュアトラック推進機構）
myamasaki@cc.miyazaki-u.ac.jp

Lactobacillus plantarum PUK6 が生産する多成分バクテ
リオシン生合成遺伝子の同定および分子解析○河原 あい 1, 善藤 威史 2, 松崎 弘美 1,3（1熊本県大院・環境共生, 2九大院・農, 3熊本県大・環境共生）
matusaki@pu-kumamoto.ac.jp【背景と目的】焼酎は宮崎県の特産品の一つであり、焼酎粕は焼酎の製造工程において生成される副産物である。これまでに我々は、焼酎粕から固液分離した液体で麹菌を培養させた麹菌培養物(fermented products : FPS)が通常食飼育下でマウスのコレステロール低下作用を持つことを示した（小境ら、2019）。そこで、本研究では高コレステロール食負荷下での FPS 摂食がコレステロール代謝に及ぼす影響を検証した。
【方法】AIN-93G に準拠した通常食および 10％FPS 混合食、また、それらに0.5％コレステロールを混合したものを C57BL/6N マウスに給餌して 8 週間飼育した。屠殺後、臓器重量、血漿中の脂質および肝臓脂質、肝機能、糞中のコレ
ステロール排泄に関するパラメーターを測定した。また、肝臓でのコレステロー
ル代謝に関連するタンパク質の発現を評価した。
【結果と考察】通常食摂取マウスにおいて FPS により体重増加抑制と血漿コレ
ステロールの有意な減少が認められた。一方で、FPS は高コレステロール食摂取マウスにおいては血漿および肝臓総コレステロールを有意に増加させたが、コレステロール代謝に関わるタンパク質の発現には影響しなかった。高コレス
テロール食摂取マウスにおいて FPS はコレステロールの排泄を促進しており、コレステロール蓄積の亢進作用とは矛盾していた。また、FPS による肝臓でのトリグリセリドレベルの減少効果が明らかとなった。
これらの結果から、FPS 摂食によるコレステロールの排泄促進効果が認められたが、有用素材としての利用法にはさらなる作用機序の解明が必要と考えられた。

【目的】乳酸菌が生産するバクテリオシンは、その安全性の高さから天然の食品
保存料として期待されている。熊本県の伝統的発酵食品「味噌漬け豆腐」から分離した Lactobacillus plantarum PUK6 が生産する多成分バクテリオシン生合成
遺伝子の同定と解析を行うことを目的とした。
【方法および結果】L. plantarum PUK6 の培養液上清から硫安沈殿、透析、SepPak Plus tC18 および逆相 HPLC を行ってバクテリオシンを精製した。HPLC で抗菌活性を示すピークのアミノ酸配分析を行った結果、既知バクテリオシンのplantaricin A, NC8β および F と相同性を示したので、これらに特異的なプライマーを用いて PCR を行い、増幅産物の塩基配列を決定した。その結果、plantaricin
A, NC8 および EF の構造遺伝子を見出した。これらの遺伝子の位置や BLAST
検索の結果から、PUK6 株の多成分バクテリオシン生合成遺伝子は、L. plantarumの 8P-A3 株および J51 株の pln locus と同様の遺伝子クラスターを有していると考えられた 1) 。そこで、それらのゲノム情報を参考にプライマーを設計し、primer walking を行い、PUK6 株の plantaricin 遺伝子群 pln locus（約 20 kb）の塩
基配列を決定した。また、InterPro を用いたドメイン解析を行った結果、このpln locus 上に推定のバクテリオシン様遺伝子およびその免疫タンパク質様遺伝
子をさらに見出した。現在、各遺伝子の機能解析を進めている。
1) Tsapieva A, et al. (2011) Structure of plantaricin locus of Lactobacillus plantarum
8P-A3. Benef. Microbes, 2, 255-261

Effect of dietary fermented products (FPS) derived from shochukasu on thecholesterol metabolism in mice

Identification and molecular analysis of the biosynthesis genes of themultiple bacteriocins produced by Lactobacillus plantarum PUK6.

○Hirotaka Kato1, Toshiki Kosakai2, Cho Sho2, Kuniaki Kawano2, Ken-ichi Iwai2,
Yoshikazu Takase2, Kenjiro Ogawa3, Kazuo Nishiyama1, Masao Yamasaki1(1Grad. Sch. Agric., Univ. Miyazaki., 2Kirishima Shuzo, 3TT. univ. Miyazaki.)○Ai Kawahara1, Takeshi Zendo2, Hiromi Matsusaki1,3(1Grad. Sch. Environ. Sym. Sci., Pref. Univ. Kumamoto, 2Fac. Agric., Kyushu Univ.,
3Fac. Environ. Sym. Sci., Pref. Univ. Kumamoto)Key words

Aspergillus luchuensis, FPS, cholesterol

Key words

bacteriocin, Lactobacillus plantarum, lactic acid bacteria

2Ea06

レスベラトロールおよびその重合体の血管保護作用

2Ea08

たくあん漬けから分離した Lactococcus lactis PJR24 が生産するバクテリオシンの特性○寺門 和奏 1, 里中 健太 1, 宮崎 均 2, 吉田 滋樹 2
（1筑波大院・生命環境, 2筑波大・生命環境系）
yoshida.shigeki.gf@u.tsukuba.ac.jp○高橋 孝太郎 1, 如田 奈津美 2, 河原 あい 1, 松崎 弘美 1,2（1熊本県大院・環境共生, 2熊本県大・環境共生）
matusaki@pu-kumamoto.ac.jp【背景と目的】動脈硬化は血管内皮細胞(EC)が生活習慣の悪化により発生する活性酸素種によって障害を受けることで発症する。すなわち、EC の酸化ストレ
ス抵抗性、創傷治癒能を高めることが動脈硬化の予防に繋がる。ブドウ葉中に含まれるレスベラトロール(Res)はガン細胞の増殖抑制効果や、抗炎症作用などの生物活性を有していることが報告されている。Res は EC においても酸化ス
トレス抵抗性、創傷治癒能を高めるという報告がなされている。一方、その重合体に関しては、その作用について十分に研究されていない。本研究では、Res重合体を精製し、EC に対する血管保護作用を明らかにすることを目的とした。
【方法】ブドウ葉抽出物(Vineatrol®)を DIAION HP20 カラムクロマトグラフィー
で粗分画した後、各重合体をシリカゲル 60 および、HPLC(ODS)を用いて精製した。精製後、 1H-NMR、LC-MS を用いて構造を確認した。細胞保護機能は
H2O2 による酸化ストレス条件下での細胞生存率にて評価した。EC を各化合物存在下で培養した後に化合物含有培地を除去した。次いで H2O2 を添加した培地でさらに 24 時間培養を行った。培養後全細胞を回収し、トリパンブルー染色にて細胞生存率を測定した。創傷治癒能は疑似傷を作成し、24 時間後の傷中の細胞数を測定することで評価した。
【結果と考察】各化合物を 1〜30 μM の濃度で添加し、最も効果的な濃度を検討した結果、酸化ストレス抵抗性および創傷治癒能どちらにおいても Res および二量体は 10 μM、三、四量体は 1 μM で最も有効に作用した。すべての化合物を各々の最も効果的な濃度で作用させると、酸化ストレス抵抗性、創傷治癒能
共に化合物の重合度が大きいほど血管保護作用が高まることが明らかとなった。

【目的】乳酸菌が生産する抗菌性物質バクテリオシンは、安全な天然の食品保存料として期待されている。バクテリオシンの中で唯一食品保存料として使用が認められているナイシン A は、酸性領域でのみ安定で、グラム陰性菌に対しては単独では抗菌活性を示さない。そのため、新たな特徴をもつ新規バクテリオ
シンの探索が重要である。本研究では、日本の伝統的発酵保存食品のたくあん
漬けから分離した乳酸菌が生産するバクテリオシンの特性を調べることを目的とした。
【方法および結果】たくあん漬けからバクテリオシン生産乳酸菌を 4 株分離した。これらの株の培養液上清の抗菌スペクトル、16S rRNA 遺伝子解析、ナイシ
ン構造遺伝子に特異的なプライマーによる PCR の結果から、4 株のうちの 3 株をナイシン Z 生産菌 Lactococcus lactis と同定した。残り 1 株についても 16S
rRNA 遺伝子解析により Lactococcus lactis PJR24 と同定・命名した。PJR24 株はナイシン以外のバクテリオシンを生産すると予想されたため、L. lactis が生産する代表的な 10 種類のバクテリオシン構造遺伝子（lacticin 3147, Q, RM およびlactococcin A, B, 972, 513, M, G, Q）に特異的なプライマーを用いた PCR を行ったが、特異的増幅は見られなかった。そこで、PJR24 株のバクテリオシンを同定するため、本株の培養液上清について、硫安沈澱、透析、逆相 HPLC などによるバクテリオシンの精製を進めている。

Effects of resveratrol and its oligomers on vascular endothelial cell

Characterization of the bacteriocin produced by Lactococcus lactis PJR24
from pickled Japanese radish○Wakana Terakado1, Kenta Satonaka1, Hitoshi Miyazaki2, Shigeki Yoshida2(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Faculty Life Environ. Sci., Univ.
Tsukuba)

Key words

resveratrol, endothlial cell, wound healing, oxidative stress○Koutaro Takahashi1, Natsumi Nyota2, Ai Kawahara1, Hiromi Matsusaki1,2(1Grad. Sch. Environ. Sym. Sci., Pref. Univ. Kumamoto, 2Fac. Environ. Sym. Sci.,
Pref. Univ. Kumamoto)Key words

bacteriocin, lactic acid bacteria, Lactococcus lactis

178

2Ea09

スサビノリ由来硫酸化多糖体ポルフィランの抗炎症作用に関する研究2Ea11

柳戸 彩奈, 山口 健一, ○小田 達也（長崎大院・水産環境）
t-oda@nagasaki-u.ac.jp

Lactobacillus antri が産生するメンブランベシクルの IgA
産生促進作用の解析○佐々木 晴菜 1, 仲田 真穂 1, 前田 新一 2, 雑賀 あずさ 3, 國澤 純 3,
片倉 啓雄 2, 山崎 思乃 2
（1関西大院・理工, 2関西大・化生工, 3医薬基盤研究所）
shino.ya@kansai-u.ac.jp【背景と目的】スサビノリ(Pyropia yezoensis)は海苔の原料であるが，ノリ養殖現場では環境の栄養塩不足等に起因する商品価値の無い色落ちノリ問題がしばしば発生している。色落ちノリの有効利用との観点から、色落ちノリに含まれる
硫酸化多糖体ポルフィランの生理活性について検討した結果、色落ちノリ由来
ポルフィランは LPS 刺激マウスマクロファージ RAW264.7 細胞からの一酸化窒
素(NO)産生を抑制する事を見出している。本研究では，ポルフィランの in vivoの効果を検討すると共にラジカル分解による低分子化と分解物の生理作用についても検討した。
【方法】乾燥ノリ粉末から熱水抽出したポルフィラン画分は DEAE イオン交換
クロマトにより精製した。in vivo の効果はマウス(ddY, 5 w)に対する LPS 致死
作用抑制効果で検討した。一酸化窒素(NO)は Griess assay により、tumor necrosis
factor (TNF)-α は ELISA により測定した。RAW264.7 細胞の破骨細胞への誘導はreceptor activator of nuclear factor κB ligand (RANKL)を用いた。ラジカル分解はア
スコルビン酸と過酸化水素により行った。
【結果と考察】LPS と共にポルフィラン尾静脈投与したマウスの生残率は LPS
単独投与に比べ顕著に上昇し、ポルフィラン投与群の血漿 TNF-α も低下した。
生育状態が異なる４種色落ちノリから得られたポルフィランの分子量分布及び抗炎症作用は異なり、低分子画分がより強い活性を示す傾向であった。ラジカ
ル分解により、いずれのポルフィランも低分子化し、それに伴い抗炎症活性が上昇した。RANKL による RAW264.7 細胞の破骨細胞への誘導抑制効果も低分子化により上昇し、最も低分子量のポルフィランのラジカル分解物が最も強い
抑制 l を示した。以上の結果から、ポルフィランの抗炎症作用には分子サイズが重要であると推定された。

【背景と目的】 細菌が放出するメンブランベシクル（MV）と呼ばれる膜小胞は、細菌間の情報伝達のみならず、宿主の免疫調節に関与するが、既往の MV
研究はグラム陰性菌や病原性のグラム陽性菌で先行しており、プロバイオティ
クスによる MV 産生の理解は進んでいない。我々は乳酸菌 Lactobacillus antri
JCM 15950 の菌体が、マウスパイエル板細胞からの IgA 産生を促進することを見出しており、本研究では、本菌株の MV の産生とその IgA 産生促進作用について解析した。
【方法】 L. antri JCM 15950 は MRS 培地で 24 時間、37℃で静置培養した。培養
液を遠心分離（8,500×g, 5 min, 4℃）し、上清をフィルターろ過（0.22 μm）した。超遠心分離（100,000×g, 1 h, 4℃）により得られた沈殿を 45% (w/v) OptiPrep
で懸濁し、40〜10%(w/v)の OptiPrep を重層して、密度勾配超遠心分離（100,000
×g, 6 h, 4℃）により MV を精製した。IgA 産生促進作用は、BALB/c マウスの小腸からパイエル板を採取し、コラゲナーゼ処理にて分離したパイエル板細胞を用い、37℃で 4 日間培養した後、上清中の IgA 産生量を ELISA 法で定量することで評価した。
【結果と考察】 密度勾配超遠心分離により得られた各画分を透過型電子顕微鏡で観察したところ、ある画分に直径 50〜200 nm の二重膜に覆われた中空の球状構造体が見られた。また、この画分はタンパク質および核酸を含み、本菌株
は MV を産生することがわかった。また、IgA 産生促進作用は、MV が集積した画分にのみ認められた。一方、本菌株の IgA 産生促進作用はグラム陽性菌の細胞壁成分をリガンドとする toll-like receptor 2 を介してもたらされることから、
MV にもこれらの菌体成分が存在していると推測される。現在、リポテイコ酸
およびリポタンパク質を精製し、その免疫賦活作用の検証と MV における局在の解析を進めている。

Anti-inflammatory activities of sulfated polysaccharide porphyran isolated
from red alga Pyropia yezoensis

Analysis of IgA-enhancing effects of membrane vesicles produced by
Lactobacillus antri

Ayana Yanagido, Kenichi Yamaguchi, ○Tatsuya Oda(Grad. Sch. Fish. Sci. Environ. Stud., Nagasaki Univ.)○Haruna Sasaki1, Maho Nakada1, Shin-ichi Maeda2, Azusa Saika3, Jun Kunisawa3,
Yoshio Katakura2, Shino Yamasaki-Yashiki2(1Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ., 2Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ.,
3
NIBIO)

Key words

inflammation, macroalga, marine environment, mechanism

Key words

immunostimulation, membrane vesicle, IgA, lactic acid bacteria

2Ea10

麹菌培養物に由来する腸炎に有効な機能性分子の探索

2Ea12

Lactobacillus sakei 由来メンブランベシクルによる IgA
産生促進メカニズムの解明○Danshiitsoodol Narandalai, 野田 正文, 東川 史子, 杉山 政則（広島大院・医系学・未病予防医学共同研究講座）
sugi@hiroshima-u.ac.jp○三好 柚紀 1, 井谷 彩乃 2, 雑賀 あずさ 3, 長竹 貴広 3, 松永 安由 3,
國澤 純 3, 片倉 啓雄 2, 山崎 思乃 2
（1関西大院・理工, 2関西大・化生工, 3医薬基盤・健康・栄養研）
shino.ya@kansai-u.ac.jp【背景と目的】日本には, 麹菌や酵母などを利用した醗酵食品がある。
「麹菌」を始めとする醸造微生物は, 味噌, 醤油などを生み出し, 日本人の食生活と健康に大きく貢献してきた。このため, Aspergillus (A.) oryzae のほか, A. sojae や A.
luchuensis などの製造に利用される麹菌は国の宝物として 2006 年に「国菌」と呼ぶことを提唱した。
本研究では, これらの麹菌株の培養培地と培養条件を詳細に検討した結果, 液体
培養液や固体培養物の水抽出液中に, きわめて高い保健機能性を持つ代謝産物の存在が確認された。
一方で、病原細菌による食中毒や腸炎の発生件数は増加の一途を辿っており, それらの病態の深刻さも問題となっている。本研究では, 細菌性腸炎モデル細胞を用い、麹菌を固体培養したのちの水抽出物中に, その感染・炎症を抑制する活性があるか否か、調査した。
【方法】A. oryzae S-03, A. sojae No. 9, A. luchuensis SH-41 をそれぞれ穀類や豆類を培地として固体培養し, 得られた各種麹に 3 倍量の蒸留水を加え, 室温にて抽出し, フィルター除菌したものを評価用サンプルとした。
腸管上皮細胞モデルとして, ヒト結腸癌由来の Caco-2 細胞を用いた。1 x 106cells/
ml の Caco-2 細胞を 24 well plate に播種し 10% FBS を含む DMEM 培地で培養した。72h 培養後, 5%の麹エキスを含む DMEM 培地で 30 min インキュベートした
のち, 病原性サルモネラ菌もしくは黄色ブドウ球菌で腸管炎症を誘発させた。さらに, 24h 培養を続けたのち, Caco-2 細胞の生存率を測るとともに, 炎症サイトカインである IL-8 の分泌量を ELISA 法で評価した。
【結果と考察】A. oryzae S-03 や A. sojae No. 9 を用いた米、麦、そら豆麹の抽出液には, IL-8 の発現を阻害する活性が認められた。なお, A. oryzae S-03 麹抽出に含まる IL-8 の発現を抑制する物質は熱処理（100rpm℃, 10min）に不安定であった。

【背景と目的】細菌の多くはタンパク質や核酸、細胞壁成分などを含むメンブラ
ンベシクル（MV）と呼ばれる膜小胞を産生する。我々は、日本酒生酛由来の
乳酸菌 Lactobacillus sakei subsp. sakei NBRC 15893 の産生する MV が、TLR2 を介してマウスパイエル板細胞からの IgA 産生を促進することを見出し、腸管での感染防御や腸内フローラの維持に影響する可能性を指摘した。本研究では、
MV がパイエル板細胞から IgA 産生を促進するメカニズムを解明することを目的とし、MV の標的細胞と IgA 産生促進に関与するサイトカイン類の特定を試みた。
【方法】L. sakei は 30℃で 24 時間培養した。培養上清をフィルターろ過（0.45μm）後、超遠心分離（100,000×g, 1 h）により MV を回収し、OptiPrep を用いた
密度勾配超遠心分離（100,000×g, 6 h）で精製した。パイエル板細胞は、BALB/
c マウスの小腸からパイエル板を採取し、コラゲナーゼ処理により調製した。
骨髄由来樹状細胞（BMDC）は、マウスの大腿骨および脛骨より採取した骨髄細胞から 20 ng/mL GM-CSF で誘導した。細胞培養は 5%CO2 存在下、37℃で行った。
【結果と考察】MV の標的細胞を特定するため、磁気ビーズ標識抗 CD11c 抗体を用いたネガティブセレクション法により樹状細胞（DC）をパイエル板細胞から除去して MV を添加すると、IgA 産生促進作用は消失した。これより、パイエル板細胞からの IgA 産生促進には DC の TLR2 を介した MV の認識と DC の活性化が重要であることがわかった。次に、IgA 産生を促進するサイトカイン
類を特定するため、BMDC に MV を添加し、関連遺伝子の発現量をリアルタイ
ム PCR により調べた。その結果、IL-6、IL-10、誘導型一酸化窒素合成酵素、レチナール脱水素酵素 2 の発現量が増加し、MV がパイエル板細胞で IgA クラス
スイッチ組換えおよび抗体産生細胞への分化を促進することが示唆された。

Koji-derived substances effective to the pathogen induced gastroenteritis invitro

Analysis of IgA-enhancing mechanism by membrane vesicles derived from
Lactobacillus sakei○Narandalai Danshiitsoodol, Masafumi Noda, Fumiko Higashikawa,
Masanori Sugiyama(Dept. Probiotic Sciences for Prev. Med, ., Grad Sch. Biomed. and Health Sc.,
Hiroshima Univ.)

Key words

Aspergillus oryzae, Caco-2 cells, IL-8

○Yuki Miyoshi1, Ayano Itani2, Azusa Saika3, Takahiro Nagatake3, Ayu Matsunaga3,
Jun Kunisawa3, Yoshio Katakura2, Shino Yamasaki-Yashiki2(1Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ., 2Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ.,
3
NIBIOHN)

Key words

membrane vesicles, lactic acid bacteria, immunoglobulin A

179

2Fa01

13
C 代謝フラックス解析に基づくシアノバクテリアの単波長光照射下に対する応答解析

2Fa03○山本 千晶, 北村 さや香, 豊島 正和, 戸谷 吉博, 清水 浩
（阪大院・情報）shimizu@ist.osaka-u.ac.jp

LC-MS を用いたアミノ酸鏡像異性体の高速分析に資す
るクロマトグラフィー条件の改良○吉川 航平, 古野 正浩, 田中 信男, 福﨑 英一郎（阪大院・工）fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景と目的】シアノバクテリアは照射光の波長に応じてエネルギー移動プロセスを調節している。よって、光波長の変化により光合成による ATP と NADPHの合成速度が変化するが、代謝状態を変化させることで細胞内の ATP と NADPHの割合を一定に保っていると考えられる。本研究では様々な波長の照射光条件下において生育した細胞の 13C 代謝フラックス解析を行うことで、光波長の変化に対する ATP と NADPH の合成と消費速度の変化を明らかにし、ATP と
NADPH を一定に保つための代謝と光合成の応答を定量的に理解することを目指した。
【方法と結果】Synechocystis sp. PCC 6803 を研究対象とし、5 mM[1,2-13C]グル
コースを添加した改変 BG11 培地(50 mL)で培養した。光条件は 100 μE/m2sec 白
色光、青色光(470 nm)、赤色光(630 nm, 680 nm)とした。菌体のタンパク質構成
アミノ酸を GC-MS により分析し、代謝フラックス分布を OpenMebius [Kajihata
2014]により決定した。100 μE/m2sec の各色光下で酸素電極を用いて酸素発生速度を計測した。
13
C 代謝フラックス解析の結果より、青色光条件と赤色光(680 nm)条件におけるCO2 固定反応のフラックスは他の光条件に比べて低かった。酸化的ペントース
リン酸経路のフラックスが青色光条件と赤色光(680 nm)条件のみにおいて見られた。青色光条件と赤色光(680 nm)条件では光合成からの NADPH 供給が減少したことで CO2 固定反応のフラックスが低下し、不足分を補うために酸化的ペントースリン酸経路が活性化されたことが示唆された。代謝フラックス分布から暗反応全体での ATP と NADPH の生産と消費速度を算出し、生産速度と消費速度の差分から光合成による ATP と NADPH の生産速度を推定した。酸素発生速度から推定した光合成による ATP と NADPH の生産速度と比較することで、光合成における電子のフラックス状態を推定した。

【背景】
アミノ酸には L-アミノ酸，D-アミノ酸と呼ばれる鏡像異性体が存在する．近年のキラル分離，分析技術の進展によって，D-アミノ酸の生理機能の研究が医療，食品を初めとする様々な分野で始められている．D-アミノ酸の生理機能を効率よく検証し，これら研究を更に進捗させていくためには，D-アミノ酸分析
手法のスループットの向上が期待される．当研究室ではこれまでに，キラルカ
ラ ム CROWNPAK CR-I(3.0 mm i.d.×15 cm ， 5 μm particle size) (Daicel CPI ，
Osaka，Japan) 及び液体クロマトグラフィー-飛行時間型質量分析計 (LC-TOFMS)を用い，誘導体化することなく，アミノ酸の鏡像体分離・分析を行い，グリシン及び 18 種タンパク質構成アミノ酸鏡像異性体の一斉分析を 10 分以内で達成することに成功した[1]．そこで本研究では，本分析法を改良してスループットの更なる向上を試みた．
【方法】
カラム長を 15 cm から 5 cm に短縮することにより，スループットの向上を試みた．しかしカラム長の縮小は分離度の低下を招く．これを解決するために充填
剤粒子径を直径 5 μm から 3 μm に微小化，さらにカラム外体積に起因する分散を軽減するために配管径を縮小した．
【結果】
充填剤粒子径の縮小によりカラム効率が向上され，各分析種（Analyte）の分離が改善された．また，カラム外分散の低減は，充填剤粒子径縮小の効果が小さ
かった，早期に溶出する分析種の分離の改善に特に貢献した．結果として，グリシン及び 15 種タンパク質構成アミノ酸鏡像異性体の一斉分析を 1 分以内で，グリシン及び 18 種タンパク質構成アミノ酸鏡像異性体の一斉分析を 3 分以内で行うことが可能となった．
【引用文献】[1] Y. Konya, T. Bamba, E. Fukusaki.: Extra-facile chiral separation of amino acidenantiomers by LC-TOFMS analysis, J. Biosci. Bioeng., 121, 349-353 (2016).

Response analysis of Synechocystis sp. PCC 6803 under single-wavelength
light by 13C Metabolic flux analysis

Improvement of LC conditions for high-throughput analysis of amino acidenantiomers by LC-MS○Chiaki Yamamoto, Sayaka Kitamura, Masakazu Toyoshima, Yoshihiro Toya,
Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)○Kohei Yoshikawa, Masahiro Furuno, Nobuo Tanaka, Eiichiro Fukusaki(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

cyanobacteria, metabolic flux analysis

Key words

D-amino acid, LC/MS, high-throuput, chiral separation

2Fa02

クラブトリー陽性および陰性の差異に基づく酵母代謝のプロファイルの比較

2Fa04

GC/MS を基盤としたヒト血漿メタボロミクスにおける固相誘導体化法と従来誘導体化法の比較○井村 誠 1,2, 新田 克章 2, 岩切 亮 1, 松田 史生 3, 清水 浩 3,
福﨑 英一郎 2（1三菱商事ライフサイエンス, 2阪大院・工, 3阪大院・情報）
fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp○新川 翔也 1, 佐々野 僚一 2, 古野 正浩 1, 福﨑 英一郎 1（1阪大院・工, 2アイスティサイエンス）
fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp

クラブトリー効果とはグルコースが一定濃度以上存在する場合，十分な溶存酸
素濃度があっても酸素を最終電子受容体として利用せずに解糖系のみを利用するエネルギーマネージメントであり，Saccharomyces cerevisae で顕著に観察される．クラブトリー効果が発生すると対糖菌体収率が低下するため，生産現場ではクラブトリー効果をいかに回避するかが重要な課題である．回分培養の結果，クラブトリー陽性の S. cerevisiae は陰性の Candida utilis に比べ，比グルコース
消費速度が高いにも関わらず，菌体収率が低下し，大量のエタノールを生産した．これらの現象による代謝レベルの影響を調べるために，LC-MS/MS と GCMS を用いて，回分培養の各増殖段階での両酵母のメタボローム解析を実施した．代謝物量が表現型と密接に関係していることから，メタボロミクスは精密
表現型解析に用いられ，異なる表現型の代謝物の比較により，その表現型を反映する代謝メカニズムの理解につながる．主成分分析の結果，PC1 に沿って S.
cerevisiae と C. utilis の違いで分かれた．PC1 の分離はクラブトリー効果が酵母に与えた影響と考察でき，この分離には解糖系や TCA サイクル中の NADH 生
成に関連する代謝物が貢献しており，これらの代謝物量は S. cerevisiae は C. utilis
より低くなった．一方で，比グルコース消費速度を高く維持するためには、グルコース利用に必須の NAD+を枯渇させてはいけない．そのために S. cerevisiae
はエタノールを生産し，NADH を酸化していることが解析結果から改めて支持された。結果として，S. cerevisiae と C. utilis の間で NADH の比生産速度に違いが見られなかった．本研究において，クラブトリー効果によって崩れた NAD+/
NADH が中央代謝に与える影響を明らかにし，S. cerevisiae ではエタノールを生産することで NAD+/NADH の比率を調整している可能性を示した．

ガスクロマトグラフィー質量分析法（GC/MS）によるメタボロミクス分析においては，誘導体化（トリメチルシリル化）が必要不可欠である．しかし多くの誘導体化された代謝物は不安定であり，オートサンプラーでの待機時間中に他の化合物へと変化するため，GC/MS を用いた多検体分析において解決すべき大きな問題である．加えて従来法では，サンプル抽出，遠心濃縮，凍結乾燥，誘導体化といった一連の煩雑な前処理工程を行う必要があり，各工程で誤差が蓄積されるため，作業者の技量がデータの質に大きく反映される．この課題を解決するために，我々は固相誘導体化法を用いたオンライン GC/MS システムを提案している．本発表では当システムの概要に加え，従来の誘導体化法と固相誘導体化法を比較した当該メソッドの有用性について報告する．
固相誘導体化法を用いた前処理手順は以下のとおりである．サンプルとしてヒト血漿を用いた．はじめに血漿サンプルに抽出溶媒（水およびアセトニトリル）
を加え，その抽出溶液を陽イオン・陰イオン交換複合固相担体に注入し，有機酸・アミノ酸・糖類などを保持させた．50％水/アセトニトリル溶液で糖類を除去した後，残存水をアセトニトリルで除去した．その後，誘導体化試薬を含浸させ，固相上で誘導体化反応を行った．最後にトルエンで溶出した液を胃袋型
インサートへ直接注入し GC/MS 分析を行った．当手法におけるサンプル抽出
後から GC/MS 分析開始までの前処理時間は約 10 分であった．これは従来法での処理時間（10 時間以上）と比較して非常に短い処理時間であった．前処理時間の短縮により GC/MS のバッチ分析中に誘導体化を行うことが可能となり，誘導体化後の待機時間をゼロに統一することができる．また，本分析法は従来法と比較して少量・低濃度のサンプルを高感度に分析することが可能である．

A comparison of metabolic profiles of yeasts based on the difference of the
Crabtree positive and negative

Comparison between conventional derivatization and solid phase analyticalderivatization method of human plasma metabolomics based on GC/MS○Makoto Imura1,2, Katsuaki Nitta2, Ryo Iwakiri1, Fumio Matsuda3,
Hiroshi Shimizu3, Eiichiro Fukusaki2(1Mitsubishi Corporation Life Sciences Ltd., 2Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 3Grad.
Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words

metabolomics, Crabtree effect, NAD+/NADH, batch culture○Shoya Arakawa1, Ryoichi Sasano2, Masahiro Furuno1, Eiichiro Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Aisti Sci.)

Key words

metabolic analysis, GC/MS, pretreatment, plasma

180

2Fa05

親水性相互作用/陰イオン交換クロマトグラフィータン
デム質量分析による親水性代謝物の一斉分析法の開発

2Fa07

中谷 航太 1, 和泉 自泰 1, 高橋 政友 1, 櫻井 恵太 2, 佛願 道男 2,○馬場 健史 1（1九大・生医研, 2日立化成テクノ）
bamba@bioreg.kyushu-u.ac.jp

クローン病自然発症モデル SAMP1/YitFc マウスの病状進行に伴う 腸内細菌叢および糞便メタボライトの変動○小松 陽介 1,2, 清水 由宇 1, 山野 めぐみ 1, 中村 公則 1,3,
綾部 時芳 1,3, 相沢 智康 1,3,4（1北大院・生命科学, 2森永乳業, 3北大院・先端生命, 4北大・国際連携研究教育局）
yo-komatsu@morinagamilk.co.jp

解糖系，クエン酸回路，アミノ酸代謝，核酸代謝など，生命活動を担う主幹代謝経路の中間代謝物は，イオン性 (親水性) 代謝物である．これまで親水性代謝物の測定は，主にキャピラリー電気泳動質量分析，イオンペア逆相液体クロマ
トグラフィー質量分析，親水性相互作用液体クロマトグラフィー質量分析(HILIC/MS) によって実施されてきた．しかし，親水性代謝物は極性，電荷特性，分子量といった物性の範囲が広いため，単一手法での包括的測定には至っておらず，第一選択となる分析法の開発は未だ発展途上の段階にある．本研究では，1~3 級アミンおよび 4 級アンモニウム基を修飾したメタクリレートポリ
マー粒子を充填したカラム (GL-HilicAex) を設計し，親水性相互作用や陰イオン交換作用を組み合わせた親水性相互作用/陰イオン交換クロマトグラフィータン
デム質量分析法 (HILIC/AEX/MS/MS) を開発したので報告する．
本研究は，陽イオン性 (ヌクレオシド，塩基)，両イオン性 (アミノ酸)，陰イオ
ン性 (有機酸，糖リン酸，ヌクレオチドなど) 代謝物を測定対象として，各種分
析条件における各代謝物の分離挙動及びその分離メカニズムを理解することで新規分析法の開発を行った．本手法は，ポリマー粒子系アミノカラムを用いて移動相 pH (塩基性) や添加剤の種類と濃度を最適化し，固定相の電荷，分析物の解離状態を変化させることで，HILIC (陽イオン性および両イオン性代謝物の保持分離) と AEX (陰イオン性代謝物の保持分離) の分離モードを有機的かつ段階的に働かせることのできる新しいクロマトグラフィーである．開発した新規
HILIC/AEX/MS/MS 分析法は次世代のメタボローム解析のツールとして，有効な活用が期待される．

【背景と目的】
クローン病（CD）は、回腸を中心として消化管のあらゆる部位に非連続性の炎症病変を生じる原因不明の難病である。近年、CD の発症と症状の悪化には、
環境的要因と遺伝的要因だけでなく、宿主の腸内細菌叢の破綻が関係していることが報告されている。腸内細菌の構成変化により、その代謝産物（メタボライト）のパターンが変化し、CD の病態形成の要因となっている可能性が考えられるが、その詳細は不明である。もし、CD の病態形成に関連する腸内細菌
およびそのメタボライトの変動パターンが明らかとなれば、CD のステージ診断に応用でき、早期治療が可能となるかもしれない。本研究の目的は、CD の病状と関連する腸内細菌および腸内細菌に由来する糞便中メタボライトを探索することである。
【方法と結果】
CD 自然発症モデルとして SAMP1/YitFc マウスを用い、経時的に採取した糞便の菌叢解析を実施した。その結果、慢性期における菌叢の多様性は、発症初期と比較して有意に減少した。さらに、慢性期において、Bacteroidetes 門細菌の増加と Firmicutes 門細菌の減少が見られた。続いて、糞便のプロトン NMR メ
タボローム解析を行ったところ、短鎖脂肪酸である酪酸や吉草酸をはじめとするいくつかのメタボライトの糞便中濃度は、発症初期から中期において、対照群と比較して有意に低かったが、慢性期には高い値を示した。一方で、タウリ
ンは CD の経過を通して常に、有意に高い値を示した。
【結論】
本検討の結果、Bacteroidetes 門や Firmicutes 門などの腸内細菌および短鎖脂肪酸やタウリンなどのいくつかのメタボライトは、CD の発症や進行を評価するた
めのバイオマーカーとして有用であることが示された。これら変動を示した細菌やメタボライトについて、病態との直接的な関連性を確かめるために、今後
さらなる検討を進めたい。

Novel metabolomic analytical system for comprehensive and simultaneous
analysis of hydrophilic metabolites by hydrophilic interaction/anion
exchange liquid chromatography tandem mass spectrometry

Alteration of gut microflora and fecal metabolites in the SAMP1/YitFc
mouse, a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis

Kohta Nakatani1, Yoshihiro Izumi1, Masatomo Takahashi1, Keita Sakurai2,
Michio Butsugan2, ○Takeshi Bamba1(1Med. Inst. Bioreg., Kyushu Univ., 2Hitachi Chem. Techno)

Key words
exchangemetabolomics, next-generation metabolome analysis, HILIC, anion

2Fa06

次世代定量メタボローム解析に資する安定同位体標識内部標準品群調製法の開発○Yosuke Komatsu1,2, Yu Shimizu1, Megumi Yamano1, Kiminori Nakamura1,3,
Tokiyoshi Ayabe1,3, Tomoyasu Aizawa1,3,4(1Grad. Sch. Life Sci., Hokkaido Univ., 2Morinaga Milk Industry Co., LTD., 3Adv.
Life Sci., Grad. Sch., Hokkaido Univ., 4Global Institution for Collaborative Researchand Education, Hokkaido Univ.)
Key words
NMR metabolome, Crohn's disease, microbe

2Fa08○相馬 悠希 1,2, 藤原 由梨 2, 高橋 政友 1, 後藤 麻衣子 1,
下平 武彦 1, 池田 明夏里 3, 寺内 勉 3, 和泉 自泰 1,2, 馬場 健史 1,2（1九大・生医研, 2九大院・シス生科, 3大陽日酸株式会社）y-soma@bioreg.kyushu-u.ac.jp

オミクスアプローチを適用した熟成チーズの細菌相多様性と品質の連関の検証○海野 良輔 1, 志波 優 2,3, 佐藤 実穂 1, 鈴木 敏弘 1, 石川 森夫 1
（1東京農大応生科・醸造, 2東京農大生命科・分微, 3東京農大・
ゲノムセ）
m1ishika@nodai.ac.jp【目的】代謝物の包括的解析を旨とするメタボローム解析は，医薬・食品・環境等の幅広い分野において利用されており，各種クロマトグラフィー質量分析結果に基づく代謝物量比の相対比較や統計的解析が一般的に普及している．一方で，質量分析は諸所の分析条件や試料中の夾雑物の違いによって感度が大きく変動するため，定量分析が極めて難しく，異なる条件下で得られたデータの比
較や統合が困難となっている．質量分析での定量を可能とする手法として「安定同位体希釈法」が知られているが，内部標準として高価な安定同位体標識化合物を解析対象ごとに用意する必要があり，解析対象が多岐に渡るメタボロー
ム解析では，現状としてコスト・労力的に日常的な運用が困難である．本研究では，定量メタボローム解析に必要不可欠な「安定同位体ラベル化内部標準群(SILIS)」を日常的に運用可能なコストで調製するための技術開発に取り組んだ．
【方法および結果】U-13C6-Glucose を単一炭素源とする最小培地を用いて大腸菌を複数回継代培養し， 13C 標識化された大腸菌から代謝物を抽出することで
SILIS を取得した．各種クロマトグラフィーと高分解能質量分析を組み合わせ
たメタボローム解析によって SILIS 中の親水性代謝物約 200 種について同位体
分子存在比を取得し，13C 標識化率を詳細に解析した．その結果，継代回数を増すごとに 13C ラベル化率が向上し，中央代謝系代謝物において 13C ラベル化
率 95%以上を担保することに成功した．一方で，一部の代謝物においては炭素骨格の 1 つないしは 2 つの原子が 12C のまま置換されずに残存した．これら 12Cが残存する同位体分子は培養系中の 12CO2 に由来することが示唆された．そこで次に 12C 残存を低減し，13C 標識化率の高い SILIS を取得するために，代謝工学的手法と培養工学的手法の双方から SILIS 調整法の改善に取り組んだ．

【目的】ナチュラルチーズの製造には、スターター乳酸菌が人為的に添加される
一方、これら以外の乳酸菌（非スターター乳酸菌）や乳酸菌以外の多様な細菌が熟成中に自然発生的に増殖する。しかし、チーズは原産国や種類、製法が多様であるが故、その品質と熟成時の細菌相の相関については不明な点が多い。
そこで、本研究では、ナチュラルチーズの 16S rRNA メタゲノム解析および各
種成分分析を行い、細菌相と成分分析結果の相関の有無について検証を行った。
【方法および結果】白カビ熟成チーズおよび細菌熟成チーズ計 5 点から抽出した
DNA について、16S rRNA 遺伝子 V3-V4 領域を増幅したライブラリを構築し、Illumina Miseq および QIIME2 による解析に供した。得られた結果を階層的クラスタリングに供したところ、白カビ熟成チーズは種類に依らず、類似した OTUの構成を示した一方、細菌熟成チーズではそれぞれが特有の構成を示した。乳酸菌相については、スターター乳酸菌の Lactococcus 属がいずれのチーズでも優占していたが、その他のスターター乳酸菌（Leuconostoc, Lactobacillus）と好塩
性・好アルカリ性の非スターター乳酸菌（Marinilactibacillus, Alkalibacterium,
Vagococcus）の占有率が逆相関の関係にあることが示された。さらに、各チーズの有機酸分析または香気成分分析結果と菌相解析結果との間で Spearman の
順位相関分析を行ったところ、スターター乳酸菌および非スターター乳酸菌がOTU リード数の上位を占める場合と好塩性・好アルカリ性乳酸菌および海洋細菌が上位を占める場合では、成分組成が大きく異なり、逆相関の関係を示した。
以上、チーズに自然発生的に存在する固有の細菌群はチーズの風味の形成に密接に関与することが統計的手法を適用することにより示された。

Development of production method of the stable isotope labeled internal
standards mixture "SILIS" for next generation quantitative metabolome
analysis.

Verification of relationship between bacterial diversity and quality ofripened cheese applying omics approach○Yuki Soma1,2, Yuri Fujiwara2, Masatomo Takahashi1, Maiko Goto1,
Takehiko Shimohira1, Akari Ikeda3, Tsutomu Terauchi3, Yoshihiro Izumi1,2,
Takeshi Bamba1,2(1Med. Inst. Bioreg., Kyushu Univ., 2Grad. Sch. Syst. Life Sci., Kyushu Univ.,
3
TAIYO NIPPON SANSO Co.)
Key words
metabolic analysis, stable isotope, quantification, Escherichia coli

○Ryosuke Unno1, Yuh Shiwa2,3, Minori Sato1, Toshihiro Suzuki1, Morio Ishikawa1(1Dept. Ferment. Sci., Tokyo Univ. Agric., 2Dept. Mol. Microbiol., Tokyo Univ.
Agric., 3Genome Res. Center, Tokyo Univ. Agric.)

Key words

cheese, metagenome, bacterial diversity, correlation analysis

181

2Ga01

マイクロキャリア培養した間葉系幹細胞のデキストラ
ナーゼおよびキレート剤併用によるトリプシンフリー回
収法

2Ga03

接着細胞の自己凝集化技術を用いたヒト間葉系幹細胞
スフェロイドの作製精度と質の評価○草加 直幸 1,2, 安部 菜月 3, 鈴木 康平 4, 広井 佳臣 4, 西野 泰斗 3,
岩井 良輔 2
（1岡山理大院・工, 2岡山理大・フロンティア理工学研, 3日産化学・生物科学研, 4日産化学・材料科学研）
iwai@ifst.ous.ac.jp

岡村 洋, ○藤原 政司, 高木 睦
（北大院・工）takagi-m@eng.hokudai.ac.jp【目的】間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell: MSC）を同種再生医療に利用す
るには、MSC の大量培養法の確立が重要である。当研究室において大量培養のためにマイクロキャリア（MC）を用いた培養が可能であることを確認したが、MC 表面に接着した細胞の回収において従来のトリプシン処理では細胞回収率が低いという問題点があった。さらに、トリプシン自身が培養細胞の品質を低下させることも知られているので、MC に接着した MSC をトリプシンフリーで高効率に回収する手法の検討を本研究の目的とした。
【方法と結果】ヒト骨髄由来 MSC をデキストラン製 MC ビーズ（CytodexTM1）
上に接着させ、スピナーフラスコを用いて撹拌培養した。培養終了後、細胞を従来のトリプシン処理で回収した場合、細胞回収率が約 20％と低かったが、代りにデキストラナーゼ処理した場合、MC がほとんど溶解して細胞が凝集して遊離した。そこで、凝集に関わるカルシウムイオンのキレートを狙って EDTA
または EGTA（1 mM）で処理した後、デキストラナーゼ処理で MC を溶解させ、さらに細胞分散促進のためにトリプシン溶液で処理した。その結果, 細胞の凝集体は減少し、特に EGTA を用いた場合約 60％の細胞を単離回収できた。次に、細胞品質を保つために、EGTA 溶液洗浄とデキストラナーゼ処理に続き、最後のトリプシン処理の代りに EGTA 溶液処理を用いた結果、凝集体の大部分が分散され、約 80％の細胞を単離回収することができた。また、この手法で得た細胞は CD90 陽性率が約 86％と、従来のトリプシン法で得た細胞の約 38％よりも高く、MSC として高品質であることも示唆された。

【目的】我々は、接着細胞の自発的な凝集化を誘導する技術（CAT）を開発し、新規のスフェロイド作製法としての応用可能性を昨年度の本学会にて報告した。
本研究では、再生医療用途を指向した、CAT を用いたスフェロイド作製法におけるヒト骨髄由来間葉系幹細胞（hMSC）スフェロイドのサイズ均一性（作製精度）と未分化性及び多分化能（質）を評価することを目的とした。
【方法と結果】CAT 用のポリマーを細胞非接着性の培養皿に 0.4-2.5 mm2 の面積
でドット印刷し、hMSC を 30×104 cells/cm2 で播種した。細胞は CAT ポリマーの印刷面にのみ接着した後に凝集化し、印刷面積に応じて理論値カーブに沿った
約 250-500 μm の任意の異なるサイズのスフェロイドを形成した。ここで、スフェロイドの直径に対するサイズ誤差を計測したところ、約 2-7％とバラつきが生じ、従来の浮遊細胞の凝集化方法の約 6％と比べて精度が低い条件もあった。そこで、10-30×104 cells/cm2 の異なる播種密度において細胞を播種すると、概ね 20±2×104 cells/cm2 の播種密度帯で従来法より高い 6％以下の精度でスフェロイドを作製できることが分かった。一方で、得られたスフェロイドは、hMSC
マーカーである CD90 及び CD105 を 95％以上の割合で発現し、未分化性を維持していることが分かった。また、脂肪、骨及び軟骨分化誘導培地によって約3 週間培養すると、脂肪、骨及び軟骨基質を豊富に蓄えた組織へと成熟化した。
【結論】CAT を用いたスフェロイドの作製法において、播種密度を至適化することで従来法より高い精度で hMSC のスフェロイドを作製でき、それらは未分化性を維持するとともに、分化誘導によって成熟度の高い脂肪、骨及び軟骨組織に分化することが確かめられた。本法の再生医療用の hMSC スフェロイドの作製法としての高い利用可能性が示された。

Trypsin-free harvest of mesenchymal stem cells on microcarriers by
dextranase and chelate agents

Evaluation of the size uniformity and quality of multicellular spheroids ofhuman mesenchymal stem cells prepared by using adhered cell selfaggregation technology (CAT)Hiro Okamura, ○Masashi Fujiwara, Mutsumi Takagi(Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.)

Key words

mesenchymal stem cell, microcarrier, harvest, trypsin

2Ga02

交流電場印加による非接触な足場依存性細胞の剥離法

小山 純弘, 和田 昌憲, 田村 泰之, 石川 元, 小林 準次, ○石川 陽一（エイブル）
ishikawa@able-biott.co.jp○Naoyuki Kusaka1,2, Natsuki Abe3, Kohei Suzuki4, Yoshiomi Hiroi4,
Taito Nishino3, Ryosuke Iwai2(1Grad. Sch. Eng., Okayama Univ. Sci., 2Inst. Front. Sci. Technol., Okayama Univ.
Sci., 3Biol. Res. Lab., Nissan Chemical, Co., 4Materials. Res. Lab., Nissan
Chemical, Co.)
Key words
tissue engineering, spheroid, regenerative medicine, cell selfaggregation technology (CAT)2Ga04

接着細胞の自己凝集化技術を用いた 3 次元毛細血管集合体の作製と形状制御○橋本 真悟 1,2, 滝澤 昇 1, 岩井 良輔 2
（1岡山理大院・工, 2岡山理大・フロンティア理工学研）
iwai@ifst.ous.ac.jp【目的】本研究では、誘電損失（発熱）がほとんどない 1~300 MHz の交流電場を用いることにより、容器内で培養した足場依存性細胞を、非接触かつ消化酵素を用いずに、剥離・継代する手法について検討した。
【方法】T-25 カルチャーフラスコに 7 割以上のサブコンフルエントまで培養した足場依存性細胞を室温条件にて PBS(-)に置換し、上下または側面方向から交流電場を平行平板電極で印加した。交流電場印加後、10 回のピペッティングにより細胞を剥離し、剥離率および生存率について調査した。Thermo Fisher
Scientific 社製の 2 段 1264 cm2 Cell Factory で培養した CHO-K1 細胞についても同様に、剥離率および生存率を調べた。
【結果と考察】0.062~2 Vpp/cm (peak to peak voltage/cm)、10~30 MHz の高周波交流電場を 10 分間印加すると、PBS(-)に置換した容器内の CHO-K1 細胞およびBALB/3T3 細胞が剥離する現象を発見した。ピークとなる細胞剥離率は 0.25 Vpp/
cm, 20 MHz, 10 分で、99.5±0.1%(平均値±標準誤差, n=6) の CHO-K1 細胞、99.8±0.2%の BALB/3T3 細胞がそれぞれ剥離した。交流電場印加は、上下および側面方向の双方において、培養基板上からの剥離が確認された。これら足場依
存性細胞は、Ca2+含有 PBS や培地中では剥離できなかった。交流電場印加による細胞剥離はほとんど細胞毒性が無く、90%以上の細胞が生細胞であることをトリパンブルー染色による生死判別テストで確認した。また、各種交流電界強度で 90 分間処理により剥離した CHO-K1 細胞は、遅延期(Lag phase)がほとんど存在せず、すぐに対数増殖期に入ることを明らかとした。

【背景】血管毒性試験の培養モデルや再生医療用の複雑な立体組織構築には毛細血管構造が集合した組織体の利用が有効と考えられるが、それらを用途に応じて大量かつ任意の形状で作製する方法は確立されていない。我々は、接着細胞の自己凝集化技術（CAT）を開発した。独自に合成した CAT 用のポリマーを任意の数・形状で印刷した培養皿に細胞播種すると、細胞は CAT ポリマーの印刷
表面にのみ接着した後、一体凝集化することで印刷形状に応じた 3 次元の細胞凝集塊が任意の数だけ得られる。本研究では、CAT を用いた組織作製法を 3 次
元毛細血管集合体の作製へ応用することを目的とした。
【方法と結果】96 穴プレートの底面全体に CAT ポリマーを印刷した後、ヒト臍
帯静脈内皮細胞（HUVEC）を 10-80％の比率でヒト間葉系幹細胞（hMSC）と混ぜ合わせた細胞混合液を 20×104 cells/well で播種した。細胞群は HUVEC の混合比率に関わらず CAT ポリマー印刷表面への接着を経て well の外周から剥離、一体凝集化し、HUVEC の含有率が 20％以下では球状の凝集塊が、40％以上では脆弱な円盤状の凝集塊が形成した。ここで、これらの凝集塊の断面の組織分析を行ったところ、円盤状凝集塊においては毛細血管構造はほとんど見られなかったが、球状凝集塊においては全体に緻密な毛細血管様の管腔構造の構築が認められた。そこで、長方形状（8 mm×20 mm）に CAT ポリマーを印刷し、
HUVEC を 20％以下の割合で混ぜ合わせた MSC 混合液を播種すると上記と同様に一体凝集化が生じ、棒状の毛細血管集合体が形成した。
【結論】CAT を用いた新規の組織作製法において、HUVEC の含有率が 20％以下の混合条件にて 3 次元の毛細血管集合体を作製することに成功し、その形状を制御することも可能であった。このような 3 次元毛細血管集合体の血管毒性試験モデルや複雑な立体組織構築への応用を目指している。

Alternating electric field application induced non-contact and enzyme-freecell detachment of anchorage-dependent cells

Shape-controlled preparation of three-dimensional blood capillary
aggregated tissues by using adhered cell self-aggregation technology (CAT)Key words
cell detachment, Alternating electric field, Stack plates, Anchoragedependent cells

Key words
tissue engineering, cell self-aggregation technology (CAT), 3D culture,
capillary vessels

Sumihiro Koyama, Masanori Wada, Yasuyuki Tamura, Gen Ishikawa,
Junji Kobayashi, ○Yoichi Ishikawa(ABLE Corp.)○Shingo Hashimoto1,2, Noboru Takizawa1, Ryosuke Iwai2(1Grad. Sch. Eng., Okayama Univ. Sci., 2Inst. Front. Sci. Technol., Okayama Univ.
Sci.)

182

2Ga05

In vitro 毛幹形成技術とこれを利用した毛髪の再生医療○中嶋 陸満 1, 清水 亮啓 1, 景山 達斗 1,2, 福田 淳二 1,2（1横国大院・工, 2神奈川県産業技術総合研（KISTEC））
fukuda@ynu.ac.jp

2Ga07

コラーゲンチューブ培養法による肝細胞微小線形オルガ
ノイドの作製○佐伯 琴音, 榎本 紗希子, 矢嶋 祐也, 鵜頭 理恵, 山田 真澄, 関 実（千葉大院・融合）
m-yamada@faculty.chiba-u.jp【目的】 近年、脱毛症の新しい治療法として、毛包原基と呼ばれる移植組織を生体外で作製し、これを脱毛部に移植する毛髪再生医療が注目されている。我々は、この毛包原基が発生過程において、上皮系細胞と間葉系細胞の相互作用により自発的に形成される現象を、生体外で再現することで毛包原基を大量調製する技術を開発し、これを移植することで毛周期を繰り返す毛髪を再生する方法を報告してきた (T. Kageyama et al. Biomaterials, 154, 291-300, 2018)。今後実用化を進めるうえで、患者のニーズを考えると、毛包原基の移植部からほぼ確実に毛髪を再生させる必要がある。そこで本研究では、毛包原基を長期間培養することで、in vitro で毛髪を再生できる条件を見出し、さらに発毛した毛包原基を選別し、これを移植することで高効率で毛髪を再生させる技術の開発に取り組んだ。
【方法・結果】 マウス胎児から採取した上皮系細胞と間葉系細胞の混合液を、
細胞非接着の丸底ウェル培養器に播種した後、マトリゲルを含む培地で培養を行った。2 種類の細胞は、数時間で 1 つの凝集体を形成した後、2 日間の培養中に各種細胞が自発的に分離することで毛包原基を形成し、培養 4 日目に毛包様組織を形成した。さらに培養を行うと、毛髪が伸長する様子が観察され、形成した毛髪は特徴的なキューティクル構造を有していた。そこで、この再生毛包組織をヌードマウスの背部に移植したところ、移植 8 日後には、移植部位から毛髪の再生が確認され、その毛髪再生効率は、毛包原基を移植する場合と比較して、優位に向上していた。以上より、本手法は高い再生効率で毛髪を再生するのに適した新たな毛髪再生法として有用である可能性が示された。

【背景と目的】 肝臓は多くの薬剤を代謝する臓器であり，生体外において作製した「肝臓模倣組織」は，たとえば薬剤の評価ツールとしての応用が期待されている。しかし，肝臓の主要な細胞である「肝細胞」を生体から単離し培養す
ると，その機能や生存率が急速に低下してしまう。そこで本研究では，生体の肝臓における「肝細胞が線形に配列しており」，「肝細胞がコラーゲンなどの細胞外マトリックス成分によって囲まれている」という 2 つの特徴を再現する培養系として「微小なコラーゲンチューブを用いたオルガノイド培養法」を提案
し，細胞機能の評価を試みた。
【方法】 まず，上下 2 層から成るマイクロ流路構造を設計し，精密機械加工技
術によって実際に作製した。下層の流路構造からマイクロノズルアレイ構造を通して周縁部にコラーゲン水溶液，中心部に細胞（肝細胞株）懸濁液が流れるように配置し，上層の流路構造においてコラーゲン水溶液をゲル化させることでヒト培養肝細胞（HepG2 細胞）を内腔に導入したコラーゲンチューブを形成した。最長で 1 週間程度細胞培養を行い，細胞の生存率や機能の評価を行った。
【結果と考察】 流路内において直径数 10 μm のコラーゲンチューブを連続的に作製することができた。チューブ内腔に導入された細胞は生存率を高く維持しており，培養するに従い細胞がチューブ内腔において増殖し，線形の組織体（オルガノイド）を形成する様子が観察された。本研究において作製した細胞導入
コラーゲンチューブは，生体の肝組織の単位構造を形態的に模倣する上で有用であることが示唆された。

In vitro hair regeneration for regenerative medicine

Formation of linear micro-organoids of liver cells by collagen tube-based
cultivation○Rikuma Nakajima1, Akihiro Shimizu1, Tatsuto Kageyama1,2, Junji Fukuda1,2(1Grad. Sch. Eng., Yokohama Natl. Univ., 2Kanagawa Inst. of Ind. Sci. and Technol.
(KISTEC))○Kotone Saeki, Sakiko Enomoto, Yuya Yajima, Rie Utoh, Masumi Yamada,
Minoru Seki
(Grad. Sch. Adv. Integr. Sci., Chiba Univ.)

Key words

hair regeneration, hair follicle germ

Key words

tissue engineering, collagen tube, cell culture, liver cell

2Ga06

ヒト不死化筋芽細胞株 Hu5/KD3 を用いた三次元骨格筋
組織の構築

2Ga08

スフェロイド形成によるヒト iPS 細胞由来肝細胞の代謝機能向上○長島 拓則 1, 清水 一憲 1, Hadiwidjaja Stacy 1, 大隅 早紀 1,
本多 裕之 1,2
（1名大院・工, 2名大・予防早期医療創成セ）
shimizu@chembio.nagoya-u.ac.jp

田尾 文哉, 赤間 剛, ○小島 伸彦（横市大院・生命ナノシステム）
nobuhiko@yokohama-cu.ac.jp【背景と目的】骨格筋は運動だけでなく、代謝や分泌も担う重要な器官である。
マウス株化筋芽細胞 C2C12 を分化誘導した筋管細胞は再現よく収縮能を発現するため、筋研究の細胞材料として汎用される。一方、種差による生理反応の違いが懸念されることから、ヒト由来細胞材料に対する需要が大きい。ヒト初代やヒト iPS 細胞由来骨格筋細胞の利用が進みつつあるが、ロット差や継代劣化、煩雑な分化誘導プロセスのため、再現よく収縮能を発現する筋管細胞を得ることが難しい。本研究では、ヒト不死化筋芽細胞株 Hu5/KD3[1]に注目した。Hu5/
KD3 の収縮能の有無は未だ明らかになっていない。我々は Hu5/KD3 で三次元組織を構築し、収縮能の有無を評価した。さらに薬剤添加による筋萎縮モデルへの応用を検討した。
【方法と結果】作製した収縮力測定マイクロデバイス[2]上で Hu5/KD3 を三次元培養した。種々の条件で電気刺激を行った際の筋収縮力を測定し、免疫染色や遺伝子発現解析を行った。構築した三次元組織は、電気刺激に応答して収縮力を発現し、最大収縮力は約 400 μN に達した。これは C2C12 由来筋組織の約 5倍の大きさの収縮力であった[2]ことから、Hu5/KD3 由来筋組織は収縮力を指標とする細胞アッセイに十分応用可能であると考えられた。そこで、収縮力を指標とした筋萎縮モデルへの応用を検討した。それぞれ異なる経路で萎縮を誘導するロバスタチン、デキサメタゾン、TNF-α を三次元筋組織に作用させたとこ
ろ、いずれの薬剤を加えた場合でも筋収縮力が有意に減少し、筋萎縮マーカーの Atrogin-1 や MuRF-1 の発現が亢進した。以上の結果から、Hu5/KD3 は再現
よく収縮力を発現するヒト由来筋細胞材料として有用であり、三次元筋萎縮モ
デルとしての応用も可能であると考えられる。
[1] Hashimoto et al., (2006)[2] Shimizu et al., Bioengineering (2017)【背景と目的】ヒト凍結肝細胞は創薬において必要不可欠な細胞であるが、ロットによって大きく性状が変化するために再現性よく実験を行うことができない。
ヒト iPS 細胞から分化誘導した肝細胞はこの問題を解決できると期待されているものの、ヒト凍結肝細胞と比較すると代謝機能が低いため、さらなる成熟をもたらす培養技術の開発が望まれている。本研究では、３次元スフェロイド培
養によってヒト iPS 細胞由来肝細胞の代謝機能、特に CYP 遺伝子群の発現を向上させることを目的とした。
【材料と方法】ヒト iPS 細胞由来肝細胞としてリプロセル社の ReproHepato を用いた。スフェロイド形成にはメチルセルロース法（Kojima et al., Biomaterials,2012）を用いた。比較として平面培養および 96 穴 U 底プレートを用いたスフェロイド形成法を用いた。専用培地を用いて 3%の濃度となるようにメチルセル
ロース培地を作製し、2x106 cells/ml の細胞密度に調製した細胞懸濁液を 1 ul ず
つ吐出した。吐出後、3%メチルセルロース培地の膨潤によって細胞は一点に集まり、その後細胞同士が接着することでスフェロイドが形成された。吐出から２日後にスフェイドを低接着処理された 24 穴プレートに移して培養を続けた。
【結果と考察】ReproHepato は凝集能力が低く、96 穴 U 底プレートでは効率よくスフェロイドを作製できなかった。一方、メチルセルロース法では安定的にスフェロイドを作製することができた。スフェロイドの CYP3A4、CYP1A2 お
よび CYP2B6 遺伝子発現量を平面培養と比較したところ、培養 6 日目ではほとんど変化しなかったが、培養 14 日目ではそれぞれ 30 倍から 100 倍程度の発現増強が見られた。CYP3A4 については酵素活性も向上していた。以上の結果か
ら、ヒト iPS 細胞由来肝細胞はスフェロイド培養によって CYP 遺伝子群の発現が向上することがわかった。

Development of in vitro skeletal muscle tissues using immortalized humanskeletal muscle cell line Hu5/KD3

Functional enhancement of human iPS cell-derived hepatocytes by thethree-dimensional spheroid culture○Takunori Nagashima1, Kazunori Shimizu1, Stacy Hadiwidjaja1, Saki Osumi1,
Hiroyuki Honda1,2(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2PME, Nagoya Univ.)

Key words

3D culture, skeletal muscle, atrophy, drug screening model

Fumiya Tao, Takeshi Akama, ○Nobuhio Kojima(Grad. Sch. Nanobiosci., Yokohama City Univ.)

Key words

human iPS cell, hepatocyte, spheroid, metabolism

183

2Ga09

毛細血管構造を有するスフェロイドの内部構造の三次元
的解析

2Ga11

○小西 研吾 1, 稲垣 慶一 1, 髙橋 憲司 1, 仁宮 一章 2（1金沢大院・自科, 2金沢大・新学術）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp

近赤外光情報を用いたスフェロイドの非侵襲的品質評価○永井 美希 1, 山本 涼平 1, 渋田 真結 1, 蟹江 慧 1, 五十嵐 陽子 2,
菅沼 寛 2, 加藤 竜司 1,3（1名大院・創薬, 2住友電気工業, 3名大・ナノライフシステム研
究所）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp【目的】ヒト細胞のみから作製される三次元組織においては、組織内部に毛細血管様構造がない場合、酸素や栄養の供給不足による組織の深部での細胞死が懸念されている。これまで、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)などを混合した多細胞スフェロイドとすることで、三次元組織内部に毛細血管構造が構築され、細胞生存率が改善されたという報告がされている。しかしながら、既往の研究では、作製したスフェロイドの切片を用いた二次元的な評価手法が一般的であったため、組織内部の毛細血管構造の三次元的な分布について把握した例はほとんどなかった。そこで本研究では、毛細血管様構造を有する多細胞スフェロイドを作製し、その三次元組織の内部の生・死細胞及び毛細血管構造を空間的に捉え、その局在を評価することを目的とした。
【実験方法】解析対象には「ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)と HUVEC を 8:2 で混合し作製した、毛細血管構造を持つ直径 500 μm のスフェロイド」を用いた。
そして、それぞれのサンプル作製後、培養 1〜3 日における、サンプル内部の生・死細胞分布及び毛細血管構造を調べた。サンプル内部の死細胞および分裂細胞の染色には、それぞれ PI および PCNA を用いた。また、サンプル内部の毛細血管構造の検出には、CD31 抗体を用いた。染色後、SeeDB2G 法を用いてサンプルの透明化を行い、多光子走査型レーザー顕微鏡で深部観察し、単一ス
フェロイドの全体の 3 次元画像を取得した。そして 3D 画像解析ソフトを用いて生・死細胞数の分布と毛細血管構造の分布の定量化を行った。

近年の細胞培養技術の発展から、3 次元的な細胞凝集塊（スフェロイド）として細胞を培養することで、生体に近い高機能な状態を作り出せる可能性が示されている。スフェロイドは、大量生産のための容器や培養技術が高度に進化してきており、創薬分野における In vitro ヒト細胞モデルや再生医療分野における組織構築の基礎部品として、様々な応用が期待されている。
しかし、ヒト細胞は 2 次元で平面的に培養している状態であっても、その品質の維持は難しい。さらに複雑な培養系であるスフェロイドは、スフェロイド作
製における機能性の再現は難しい。創薬分野での評価やスクリーニングで利用されるためには、スフェロイドごとの品質の同等性評価や薬剤応答能の担保が重要となり、再生医療などでスフェロイドが治療用組織医薬品として利用される場合には、治療効果や組織修復効果につながる機能性の評価や管理が重要となる。このため、非破壊的かつ定量的なスフェロイド評価技術の開発が求められている。
本研究では、このような課題を解決する技術として近赤外イメージセンサーを用いたスフェロイドの機能性の非破壊評価の可能性と有効性を検証した。本研
究では、これまで顕微鏡画像情報解析で得られた高次元の画像情報の特徴量化とモデリングの技術を応用し、近赤外イメージ情報を解析した例を紹介する。

Analysis of distribution of viable cells, dead cells, and capillary structure
inside micro-vascularized multicellular spheroid

Non-invasive quality evaluation of spheroids using near-infrared lightimager○Kengo Konishi1, Keiichi Inagaki1, Kenji Takahashi1, Kazuaki Ninomiya2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Inst. Frontier Sci. Initiative,
Kanazawa Univ.)○Miki Nagai1, Ryohei Yamamoto1, Mayu Shibuta1, Kei Kanie1, Yoko Igarashi2,
Hiroshi Suganuma2, Ryuji Kato1,3(1Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2Sumitomo Electric Industries, Ltd., 3Inst.
Nano-Life-Sci., Nagoya Univ.)

Key words

bio-3D printer, micro vascular structure, 3D image analysis

Key words

spheroids, quality evaluation, near-infrared light imager

2Ga10

がん細胞を含む多細胞スフェロイドをバイオ 3D プリン
ターにより配置した三次元組織の作製とその非破壊的
評価

2Ga12

多糖とペプチドを用いたハイブリッド細胞足場材料の最適化検証と評価○王 悦 1, 蟹江 慧 1, 金子 喬士郎 1, 杉本 礼子 1, 成田 裕司 2,
緒方 藍歌 2, 宇都 甲一郎 3, 荏原 充宏 3, 加藤 竜司 1,4（1名大院・創薬, 2名大院・医, 3物材機構, 4名大・ナノライフシ
ステム研究所）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp○谷内 達彦 1, 髙橋 憲司 1, 仁宮 一章 2（1金沢大院・自科, 2金沢大・新学術）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp【目的】現在、薬剤評価系として、培養細胞や動物個体が用いられている。しかし、細胞と動物では代謝や細胞間の相互作用の有無などの違いから薬剤評価の結果に大きな差が生まれることが知られている。そのような評価の差を補完するための、細胞と動物の中間にあたる薬剤評価系として、培養細胞から作製される三次元組織の利用が注目されている。一方、バイオ 3D プリンターはビル
ディングブロックである多細胞スフェロイドを所定の位置に配置することが可能であり、要望に応じた三次元組織を作製することが可能である。そこで、本研究では、正常な細胞のみからなるスフェロイドとがん細胞を含んだスフェロ
イドを配置した三次元組織の作製を行った。また、同一の三次元組織を非破壊的・経時的に評価するため、画像解析による評価を行った。
【 方 法 お よ び 結 果 】 ヒ ト 皮 膚 線維 芽 細 胞 (NHDF) ・ ヒ ト 臍 帯 静 脈 内 皮 細 胞(HUVEC)・GFP 発現ヒト乳腺がん細胞株(MCF-7/GFP Cell Line)の 3 種の細胞を用いて、がん細胞を含むスフェロイドを作製した。次に、バイオ 3D プリンター
を用いて合計 9 個のスフェロイドからなる(3×1×3)の三次元組織を作製した。こ
こで、中心にがん細胞を含むスフェロイドを、それ以外にはがん細胞を含まないスフェロイドを配置した。作製した三次元組織について、所定の時間ごとに、非破壊評価と破壊評価とを行った。非破壊評価としては、撮影した三次元組織の蛍光画像から、画像解析によりがん細胞に由来する蛍光の指標の経時変化を得た。一方、破壊評価としては、三次元組織をシングルセル化し、セルカウン
トとフローサイトメトリーを行うことで、生細胞数やがん細胞割合の経時変化を得た。これら両評価指標の相関性を調べた。

生体内への移植のためのバイオマテリアルには、治療効果をもたらす細胞の培
養性能と機能性を引き出す効果と共に、患部での生体親和性や機能補助のための力学特性などが求められる。バイオマテリアルの基材となる合成高分子は、極めて高度な機能設計が可能であり、強度や分解性を自在にデザインできる柔軟性を有する半面、生体由来分子に比べて細胞との親和性や生体機能性が付与
しにくい面がある。逆に、タンパク質などの生体由来高分子は、高い生体機能性を付与することが容易だが、強度や分解性の自在な設計は難しく、工業的な生産においてもコストが高い。ペプチドなどの生体由来低分子は、工業的生産
コストは低いが、多くの高分子が持つ成形マテリアルとしての物性（強度や弾性など）にペプチド単体では限界がある。即ち、移植用再生医療促進素材には、化学合成可能な合成高分子の利点と生体機能性を有する生体高分子の利点とをハイブリッドした足場材料の開発が求められている。
我々はこれまで、細胞接着ペプチドをはじめとした細胞機能を制御する生体由
来短鎖ペプチドの探索を行い、目的細胞と目的外の細胞のバランスを制御する
ような細胞選択的ペプチドなどを報告してきている。本研究では、多糖ゲルを基材とした高分子材料の構築・最適化を目指した。多糖は生体適合性が高く、バイオマテリアル応用としても多く使用されており、低コストと言う利点も有する。本発表では、多種類存在する多糖高分子の中から、移植材料として必要な機能性を持つ多糖高分子を選出し、高分子の持つ物性値と機能との関連性に関して議論する。また、使用する多糖高分子の割合、機能性ペプチドとの組合
せ等、ハイブリッド材料の最適化検証を実施し、評価したので報告する。

Fabrication and non-invasive evaluation of 3D tissue assembled by bio-3D
printer using cancer cell-containing multicellular spheroids as buildingblock

Optimization and evaluation of peptide-functionalized polysaccharideprotein hybrid material○Tatsuhiko Taniuchi1, Kenji Takahashi1, Kazuaki Ninomiya2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Ints. Frontier Sci. Initiative,
Kanazawa Univ.)

Key words

bio-3D printer, cancer cells, 3D tissue○Yue Wang1, Kei Kanie1, Kyoshiro Kaneko1, Reiko Sugimoto1, Yuji Narita2,
Aika Ogata2, Koichiro Uto3, Mitsuhiro Ebara3, Ryuji Kato1,4(1Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2Grad. Sch. Med. Nagoya Univ., 3Natl. Inst.
Mat. Sci., 4Inst. Nano-Life-Sci., Nagoya. Univ.)

Key words

cell-selective peptide, polysaccharide, biomaterial

184

2Ha01

日本の発酵食品の基盤、麹グリコシルセラミドは脂質代謝を改善する

2Ha03○北垣 浩志 1, 浜島 弘史 1, 光武 進 1, 田中 優 2, 宮川 幸 1,
西向 めぐみ 3, 中村 強 4, 柳田 晃良 5, 中山 二郎 2, 永尾 晃治 1
（1佐賀大・農, 2九大院・農, 3岩手大院・連農, 4福岡女子大学, 5西九州大学）
ktgkhrs@cc.saga-u.ac.jp

紅麹に含まれる抗炎症作用物質の解析○小濵 可奈絵 1, 阪本 真由子 1, 柘植 圭介 2, 深見 裕之 3, 金 英寿 3,
北垣 浩志 1
（1佐賀大・農, 2佐賀工業技術センター, 3小林製薬株式会社）
ktgkhrs@cc.saga-u.ac.jp[背景]
日本の発酵食品の多くには糖化剤として麹を使うが、その特異的な健康成分の報告は多くない。我々は日本の発酵食品、特に甘酒、濁り酒、塩こうじ、味噌、酒粕、大麦発酵エキスには共通して、他の食品素材には含まれない、特異的な構造を持つ麹グリコシルセラミド(KGC)が多く含まれることを明らかにしてきた。そこで KGC を肥満マウスに給餌しその栄養状態を調べた。
[実験方法]KGC を抽出、粗精製し、１％容量（対照は AIN-76）で 6 匹の健常マウス（C57BL/
6N）と肥満マウス(db/db マウス）に３週間給餌した。
解剖後、肝臓の脂質や糞の胆汁酸を測定した。肝臓から total RNA を抽出しmRNA の発現量を qRT-PCR を用いて解析した。
[実験結果]
実験の結果、KGC 給餌マウスでは肝臓コレステロールが統計的に有意に低下
し、糞中の胆汁酸が統計的に有意に増えていた。KGC 給餌マウスでは肝臓においてコレステロールから胆汁酸を合成分泌する CYP7A1 や ABCG8 の遺伝子が統計的に有意に増加していた。これらのことから、麹グリコシルセラミドは肝臓でのコレステロールから胆汁酸への変換を促し、肝臓のコレステロールを低下させ、脂質代謝を改善することが示された。
[考察]
この研究により、麹グリコシルセラミドの新たな健康効果として脂質代謝の改善効果が初めて明らかになり、この健康効果は日本の発酵食品全般に敷衍できると考えられた。
[発表論文]
Biosci Biotechnol Biochem. 2018 Dec 30:1-9. doi: 10.1080/09168451.2018.1562877.

【背景・目的】紅麹は主に米を紅麹菌（Monascus spp.）で発酵させたもので、約500 年前から血行促進や臓器機能改善といった効能が認められており、近年ではコレステロール抑制作用や炎症抑制作用をもつ物質が報告されている。これ
らの報告は M. purpreus についてものであることから、広く食品に使用されている M. anka, M. pilosus 由来の有用物質を探すため、炎症を抑える物質の探索とその構造決定を行った。
【方法】紅麹菌 M.anka から脂質を抽出し、分取 TLC にて脂質を分離・精製した（1〜5 画分）。精製した脂質をマウスマクロファージ由来 RAW264.7 細胞に添加し、リポポリサッカライド(LPS)を用いて炎症を誘発させ、24 時間培養した。
培養後、一酸化窒素(NO)産生量と生細胞率を測定した。有用脂質については、
1H-NMR (CDCl3)、GC-MS を用いて構造解析を行った。また、M. pilosus を用いて作製された紅麹からも脂質を抽出し同細胞試験を行った。
【結果・考察】M. anka から精製した 5 画分（脂質１〜5 とする）の脂質のうち、
脂 質 1 が RAW264.7 細 胞 の NO 産 生 を 最 も 大 き く 減 少 さ せ た ( 無 添 加 群
34.8±0.4μM, 脂質 1 添加群 6.2±0.5μM, n=2, Tukey HSD 検定, p<0.05)。脂質 1 の構
造解析を行ったところ、ergosterol と推測された。M. anka の類縁種である M.
pilosus を用いて作製された紅麹由来の脂質にも NO 産生の有意な減少が確認された（無添加群 55.5±0.3μM, 脂質添加群 29.8±0.5μM, n=2, Tukey HSD 検定,
p<0.05）。M. pilosus にも ergosterol に相当する極性を持った脂質があることをTLC で確認できたことから、現在、この脂質が ergosterol であることを 1H-NMR(CDCl3)、GC-MS を用いて検証している。
本研究により、紅麹菌 M. anka 及び M. pilosus の炎症抑制効果をもつ脂質成分が明らかとなり、紅麹の健康機能性のメカニズムの一端を解明することにつながると考えている。

Koji glycosylceramide commonly contained in Japanese fermented foods
improves obesity.

Structural determination of anti-inflammatory substance derived from red
yeast rice.

○Hiroshi Kitagaki1, Hiroshi Hamajima1, Susumu Mitsutake1, Masaru Tanaka2,
Miyuki Miyagawa1, Megumi Nishimukai3, Tsuyoshi Nakamura4,
Teruyoshi Yanagita5, Jiro Nakayama2, Koji Nagao1(1Fac. Agric., Saga Univ., 2Fac. Agric., Kyushu Univ., 3United Grad. Sch. Agric.
Sci., Iwate Univ., 4Fukuoka Womens' College, 5Nishikyushu University)
Key words
Koji making, liver, fermentation, fungus

2Ha02

麹由来グリコシルセラミドの腸内細菌への作用解析○永留 真優 1, 阪本 真由子 1, 宮川 幸 1, 北島 悠花 1, 中村 強 2,
中山 二郎 3, 北垣 浩志 1
（1佐賀大院・農, 2福岡女子大, 3九大院・農）ktgkhrs@cc.saga-u.ac.jp○Kanae Kohama1, Mayuko Sakamoto1, Keisuke Tsuge2, Hiroyuki Fukami3,
Young-Soo Kim3, Hiroshi Kitagaki1(1Fac. Agric., Saga Univ., 2Industrial Technology Center of Saga prefecture,3
KOBAYASHI Pharmaceutical Co., Ltd.)Key words

anti-inflammatory, red yeast rice, Monascus spp.

2Ha04

麹甘酒には食後血糖値及びインスリン量の上昇を抑制する成分が含まれる○倉橋 敦 1, 中村 彩奈 1, 小黒 芳史 1, 渡辺 賢一 2, 尾崎 信紘 3,
後藤 博 4, 平山 匡男 4（1八海醸造・研究開発, 2新潟大院・医歯学総合, 3(一社) 新潟県
労働衛生医学協会, 4新潟バイオリサーチパーク）
a.kurahashi@hakkaisan.jp【背景・目的】 発酵食品の製造に用いられる麹は、セラミドと単糖が結合してできたグリコシルセラミド(GC)を含んでいる。当研究室では、麹 GC が腸内細菌叢やコレステロール代謝を改善することを報告している 1,2)。しかしそのメカ
ニズムは解明されていない。現代の日本人は、高脂肪食の摂取により胆汁酸の分泌が増大し、その一部が腸内細菌によりデオキシコール酸(DCA)などの二次胆汁酸に変換され、腸内細菌叢の乱れにつながると考えられている。そこで本研究では、GC が二次胆汁酸から腸内細菌を保護するという仮説を立て、体内で起こる腸内細菌叢の変化を in vitro で解析する実験系の確立を試みた。
【方法・結果】 培地及び培養アンプルを嫌気性にし、LB 培地で大腸菌、GAM
培地で腸内細菌を培養し、それぞれの菌体から抽出した DNA を混合してリア
ルタイム PCR 解析を行った。その結果、分析する DNA 量に応じたサイクル数を検出することが出来た。次に、DCA 濃度 1％(w/v)に調製した GAM 培地で腸内細菌を培養し、Bacteroides と Clostridium の DNA 量をリアルタイム PCR により解析したところ、DCA 添加群は、無添加群と比較してサイクル数が有意に増加していた(p<0.05)。さらに、DCA 濃度 1％(w/v)に調製した GAM 培地に GC を
20 μg/mL または 40 μg/mL 添加して腸内細菌を培養し、代表的な腸内細菌のDNA 量をリアルタイム PCR により解析したところ、GC 添加群は無添加群と比較して、サイクル数が減少する傾向が見られた。このことから GC が腸内細菌
を二次胆汁酸から保護する可能性が考えられた。以上の結果より、体内で起こる腸内細菌叢の変化を解析する実験系の確立に成功した。この実験系は、麹 GCの腸内細菌制御作用のメカニズム解析の糸口になると期待される。
1)Hamajima et al.,Springer Plus,5,1321(2016)2)Hamajima et al.,Biosci Biotechnol Biochem,1-9(2018)【背景】麹甘酒は，我が国伝統の甘味飲料である．近年，麹甘酒の成分や機能性の研究が進みつつあり，単なる嗜好飲料から健康飲料としての認知が広がって
いるが，その主成分はグルコースであることから，体重増加や血糖値上昇への懸念の声が存在する．これまで我々は，麹甘酒の過剰摂取試験 1)及び長期摂取試験 2)から，1 日あたり麹甘酒 118 g 程度を継続摂取することは，安全性に問題がないことを報告している．本発表では，麹甘酒飲用後の血糖値及びインスリ
ン量のモニタリングから，麹甘酒にはそれらを抑制する有用物質が含まれることが示唆されたので報告する．
【方法】本研究は，新潟バイオリサーチパーク研究倫理委員会の承認を得て，UMIN-CTR に事前登録の上で実施した(UMIN000033478)．事前検査によって選抜した成人 18 名を被験者に，無作為化，単盲検，3 群 3 期クロスオーバー試験
として試験食-1 として麹甘酒 118 g，試験食-2 としてその 1/3 量の 39g，対照食として麹の原料である蒸米を麹甘酒と同等のグルコース量及びカロリーになる
ように酵素糖化した米糖化液 118 g を摂食させ，血糖値及びインスリン量を測定した．
【結果】対照食と比較して摂食量の少ない試験食-2 のみならず，対照食と同量である試験食-1 においても食後血糖値及びインスリン量の上昇の抑制が認められた．さらに，ラット反転小腸を用いた ex vivo 試験の結果からも麹甘酒からのグルコース吸収は，同濃度のグルコース水溶液に比べて低いことが示され，麹甘酒中には食後血糖値及びインスリン量の上昇を抑制する成分が含まれていることが示唆された．
1) 倉橋, 米井：日本醸造協会誌(2019)(印刷中), 2) 中村ら：日本農芸化学会 2019年度大会 3B2p01

Effect of koji glycosylceramide on the intestinal bacteria

K oji amazake contains ingregients suppressing the postprandial increase inblood glucose and insulin level○Mayu Nagadome1, Mayuko Sakamoto1, Miyuki Miyagawa1, Yuka Kitajima1,
Tsuyoshi Nakamura2, Jiro Nakayama3, Hiroshi Kitagaki1(1Grad. Sch. Agric., Saga Univ., 2Fukuoka women's Univ., 3Grad. Sch. Agric.,
Kyushu Univ.)

Key words

glycosylceramide, intestinal bacteria, bile acid

○Atsushi Kurahashi1, Ayana Nakamura1, Yoshifumi Oguro1, Kenichi Watanabe2,
Nobuhiro Ozaki3, Hiroshi Goto4, Masao Hirayama4(1R&D Dept. Hakkaisan Brewery Co. LTD., 2Grad. Sch. Med. Dent. Sci. Niigata
Univ., 3Niigata Assoc. of Occ. Health, Inc., 4Niigata Bio-Res. Park Inc.)

Key words

koji, amazake, blood glucose, insulin

185

2Ha05

卵麹の開発

○中川 拓郎 1, 山下 秀行 1, 宮本 哲也 2
（1樋口松之助商店, 2キユーピー）
t.nakagawa@higuchi-m.co.jp

2Ha07

α-EG とレジスタントプロテイン高含有のどぶろく醸
造法○高橋 雅弥, 内川 瞳, 町田 雅之, 尾関 健二（金工大・ゲノム研）
ozeki@neptune.kanazawa-it.ac.jp

鶏卵(卵)は準完全食品であり様々な調理方法が存在する一方で、その栄養成分
はそのまま利用しており、微生物を利用した伝統的な食品はない。そこで古来より様々な醸造食品に利用されてきた麹菌を用いて卵の麹化を試みた。麹化する事で原料成分が変化し、調理では成し得ない風味を実現できると予想される。
更に麹菌の酵素生産は基質によって変化する事から、卵の分解に適した酵素の生産が期待される。実際に卵麹で卵黄液を消化試験した際には、米麹とは異なる好ましい風味となった。卵と炭水化物源の混合原料では麹化した報告があるが、我々は様々な卵素材と種麹を組み合わせ、原料処理を工夫する事で卵と麹菌のみを用いる卵麹の製造方法を開発した。
【原料選定】散水及び製麴試験を行なった。ポリ袋内での散水時にダマを形成しにくく、かつ均一に分散する卵素材が数種類見つかった。更に麹菌を接種して麹化し、生育が良好で酵素力価が高い原料 1 種類を見出した。
【種麹選抜】10g 程度の小スケールで製麴試験を行い、生育が良好で過剰な胞子着生が起こらず、更に卵黄液の消化試験で風味が良好であった味噌用種麹
Aspergillus oryzae M-01 株を選んだ。
【スケールアップ】細菌汚染リスクを避ける為に M-01 株が良好に生育する最低限の水分量を決定した。原料処理として小さな固いダマが形成されない均一な散水混合と風味を損なわない加熱殺菌工程の検討を重ねた結果、10g から数十kg までスケールアップを達成した。
【卵麹の酵素力価バランス】一般的な麹の原料である米や麦、大豆(醤油)の麹と比較すると卵麹は α アミラーゼが低く、pH6 の中性プロテアーゼが高い特徴的な酵素力価のバランスであることが分かった。

【背景・目的】日本酒とどぶろくの製造法の違いはもろみを濾すか濾さないかの違いである。日本酒の仕込みに使用する蒸米や麹米は精米歩合 70%であるのに対し、どぶろくの仕込みでは、精米歩合 90%の一般的な炊飯米と麹米を使用する。これらの原料の違いがある中で、ethyl alpha-D-glucoside（以下 α-EG）とResistant protein（以下 RP）の両者を高める醸造法の検討を目的とした。
【方法】どぶろくは掛米に炊飯したコシヒカリ・低グルテリン米、麹米に味噌醤
油麹米・焼酎麹米を使用した。発酵温度は 15℃で発酵期間は 20 日間である。
どぶろくの仕込み配合は掛米 29.9 g、麹米 4.5 g、水 13.9 mL、α-amylase（以下AA） 0 or 50 mg、α-glucosidase（以下 AG） 0 or 2 mg である。α-EG は HPLC で定量した。RP はタンパク質を抽出後、SDS-PAGE により、サプリメントの 13
kDa のプロラミン量から定量した。
【結果・考察】味噌醤油麹米を使用したどぶろくでは、AG を添加することで、
α-EG 濃度が 1%と高含有などぶろくを製造することができた。また、原料米の種類を変えたどぶろくでもほぼ同様な傾向がみられた。α-EG の有効量は 320-600mg/日であるので、1 日 100 mL の飲用で、コラーゲンが増え、更に角質水分量が高い状態を維持できると推察できる。RP 量については AA、AG の添加の有無で大きな変化はなく、コシヒカリを使用したどぶろくでは 110-120 mg /100mL
含有することが分かった。また、低グルテリン米を使用したどぶろくでは 5 倍以上の RP を含有しており、一番高いもので 710 mg /100 mL 含有していた。RP
の有効量が 113 mg /日であるので、1 日 100 mL 飲用で、便通改善、肥満抑制に効果があると推察できる。従って、α-EG・RP ともに 100 mL の飲用で有効量を超えるどぶろくが醸造できることが分かった。

Development of the egg-koji

Method for brewing α-EG and resistant protein rich doburoku○Takuro Nakagawa1, Hideyuki Yamashita1, Tetsuya Miyamoto2(1Higuchi Matsunosuke Shoten Co. Ltd, 2Kewpie Corp.)○Masaya Takahashi, Hitomi Uchikawa, Masayuki Machida, Kenji Ozeki(Genome Biotechnol. Lab., Kanazawa Inst. Technol.)Key words

Aspergillus oryzae, egg, Koji making

Key words

ethyl alpha-D-glucoside, Resistant protein, Prolamine, Doburoku

2Ha06

麹を用いて美味しさを引き出した卵黄、「熟成卵黄」の開発

2Ha08

純米酒エキスに含まれる α-EG が真皮層のコラーゲンに与える影響○宮本 哲也, 木原 明彦, 設樂 弘之（キユーピー）tetsuya_miyamoto@kewpie.co.jp【目的】
卵は古代から世界中で食べられているにもかかわらず、チーズやみそなどのよ
うに、微生物をそのまま利用し風味を向上した伝統的な食品はない。卵の風味の基盤である卵黄について現代の食品工業を見渡しても、微生物由来の酵素により機能性や風味を向上した製品はあるものの、微生物をそのまま利用した製品はない。そこで、本研究では和食の礎を築いている微生物である「麹」に着目し、卵黄を麹で加工することでおいしさを引き出した新しい食品の開発を試みた。

○三谷 恵一, 大浦 友紀, 原田 春佳, 根路銘 伸介, 奥田 伸哉,
坊垣 隆之（大関総研）
keiichi.mitani@ozeki.co.jp

本研究の結果、麹を利用した熟成卵黄には、新しい食品としての大きな可能性があることが示唆された。今後はこの熟成卵黄の風味以外での可能性を調べるとともに、熟成卵黄独自の美味しさを追究することで食文化の多様化に貢献していきたいと考えている。

【背景及び目的】
演者らはこれまでにエチル α-D-グルコシド(α-EG)がヒト皮膚線維芽細胞に対して増殖促進効果やコラーゲン，エラスチンなどの生産促進効果を有すること 1)，
皮膚に塗布することによって短期的な保湿効果があることを報告している 2)．
また α-EG 含有純米酒やそのエキスの継続飲用により真皮層のコラーゲン密度
スコアが増加することが報告されている 3)．
本研究では純米酒エキスの飲用による真皮層のコラーゲン密度スコアの増加がα-EG によるものであるか，純米酒に含まれるその他成分によるものであるかを明らかにすることを目的とした．
【方法】
20〜59 歳の男女 49 名を①α-EG 2%含有 純米酒エキス，②α-EG 1%含有 純米酒
エキス，③α-EG 非含有 純米酒エキス，④飲用サンプルなしの 4 群に分けた．
サンプル飲用群については被験者に毎朝飲用させ，飲用は 12 週間続けた．飲用
終了後 4 週間は経過観察とし，摂取前，摂取中及び摂取後（2 週間毎）での両前腕のコラーゲン密度スコア（Derma Lab）を測定した．
（二重盲検プラセボ対
照並行群間比較試験）【結果】①②α-EG 含有 純米酒エキス飲用群では、③α-EG 非含有 純米酒エキス飲用群と比較し，摂取 4 週目以降で真皮層のコラーゲン密度スコアが有意に増加しており，効果は α-EG 摂取中 12 週目までは維持されていた．また，③α-EG 非含有
純米酒エキス飲用群と④飲用サンプルなしの群のコラーゲン密度スコアには差が見られなかった．この結果より，純米酒エキスの飲用による真皮層のコラー
ゲン密度スコアの増加は α-EG に起因することが明らかとなった．
1) T.Bogaki et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2017 Sep;81(9):1706-1711.
2) 坊垣ら,2015 年度日本農芸化学会大会講演要旨集 p.933
3) 尾関ら,第 69 回日本生物工学会大会要旨集 p.225

Development of delicious Koji-aged egg yolks.

Effect of α-EG contained in sake extract on collagen in the dermal layer【試験方法】
麹菌 Aspergillus oryzae を卵素材で生育させた卵麹（（株）樋口松之助商店製）と食塩を卵黄に添加し加温熟成させ「熟成卵黄」を得た。
① 得られた熟成卵黄について風味の評価を行った。
② ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動と液体クロマトグラフ法でタンパク質の分解を測定した。
③ 揮発成分をＳＰＥＣ−ＧＳ／ＭＳ法により測定した。
【結果】①熟成卵黄の風味は、卵黄らしさを残したままコクやうまみが増強され特有の美味しさが付与されていた。
「卵麹」の代わりに米麹や微生物由来の酵素を用いた場合には卵黄らしさを損なう風味が発生し、卵黄としての美味しさの喪失が確認された。
②熟成卵黄では卵黄タンパク質の分解が認められた。また、遊離アミノ酸の総量は未処理の卵黄の 5 倍に増加していた。
③熟成卵黄で生成した揮発成分としてはジメチルトリスルフィド、メチオナー
ルといったコクや熟成香にかかわるものや、３−メチルブタノールやフェニル
アセトアルデヒドといった甘い香りの成分が認められた。

○Tetsuya Miyamoto, Akihiko Kihara, Hiroyuki Shidara(Kewpie Corp.)

Key words

egg, Aspergillus oryzae, Koji, aging○Keiichi Mitani, Yuki Oura, Haruka Harada, Shinsuke Nerome, Shinya Okuda,
Takayuki Bogaki(Gen. Res. Lab., Ozeki Corp.)

Key words

alpha-EG, sake, collagen

186

2Ha09

芋焼酎由来成分の脳機能改善作用○章 超, 河野 邦晃, 岩井 謙一（霧島酒造）
zhang_chau@kirishima.co.jp【背景・目的】芋焼酎には高級アルコール、脂肪酸エステル、モノテルペンアルコール等の微量成分が含まれており、これまでにストレスの軽減作用や血栓溶解酵素の活性化作用等が報告されている。これらのストレス改善や血行促進の効果等により、脳機能の改善効果にも期待できるのではないかと考えた。そこで、芋焼酎蒸留
後の冷却ろ過工程にて除去され廃棄される油性成分の焼酎油に着眼し、その有効利用の一貫として生理活性の探索を行った。本研究ではアミロイド β 誘発自発的交替行動障害モデルマウスに対する芋焼酎由来の油性成分の改善作用について検討し、遺伝子発現の解析によりその作用機序を考察した。

2Ha11

熟成期黒酢発酵液由来乳酸菌の D-アミノ酸生成能について○星 南穂子 1, 藤井 暁 2, 橋口 和典 2, 長野 正信 2, 亀谷 将史 1,3,
新井 博之 1,3, 石井 正治 1,3（1東大院・農生科, 2坂元醸造, 3東大微生物連携機構）
amishii@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp【結果・考察】迷路試験の結果、アミロイド β の投与により惹起されたマウスの自発的交替行
動率が減少したのに対し、芋焼酎及びその焼酎油投与群では有意な増加が見ら
れ、アミロイド β の脳室内投与で誘発されるマウスの自発的交替行動の障害を改善することが明らかになった。DNA マイクロアレイでの遺伝子発現の解析結果では、芋焼酎及びその焼酎油が炎症による機能障害の緩和、異常タンパク質蓄積の改善、免疫応答の制御ならびにタウタンパク質リン酸化の緩和を介して、アミロイド β 投与で惹起した脳・神経細胞障害が緩和され、記憶・学習の機能低下を改善することが示唆された。

壺造り純米黒酢醸造において、発酵過程初期から継続的に乳酸菌が検出される。
乳酸は発酵液の pH を低下させ酢酸発酵に不要な細菌の繁殖を防ぎ、乳酸菌が生産するその他の物質は黒酢の呈味性などに関与している。乳酸菌が生産する
その他の物質の一つとして、D-アミノ酸に着目した。D-アミノ酸は呈味性に関与するだけでなく、人体内で重要な生理機能を担っていることが報告されている。黒酢は食酢の中でも D-アミノ酸を多く含むものとして知られている。過去に我々は D-アミノ酸高含有の熟成期黒酢発酵液について菌叢解析を行い、Lactobacillus 属の乳酸菌が優占化していたことを示している。この結果から、黒酢由来の乳酸菌は高い D-アミノ酸生成能を持つ可能性が考えられた。
熟成時期、期間の異なる 3 壺の熟成期黒酢発酵液から乳酸菌の単離を行った。
単離された 17 株について 16S rRNA 配列を解析したところ、得られた部分の塩基配列に関しては 17 株全てでお互いに 100％一致し、Lactobacillus 属細菌と推定された。このうち 9 株と、比較対象として分譲菌株 L. plantarum NBRC
15891、L. fermentum NBRC 3071、L. fermentum NBRC3956 の 3 株を、初発菌体量を揃えて乳酸菌用天然培地で培養し、培養液中の DL-Ala、Ser、Glu、Asp を定量したところ、D-Ala、D-Ser、D-Asp が黒酢由来単離株で多量に蓄積していることが示された。特に D-Ala について、現在までに試した培養条件では、分譲菌株のうち D-Ala の蓄積量が最も多いものと比較しても、単離株では最大 4倍程度の D-Ala の蓄積が見られた。培養前後の培地中の DL アミノ酸量を比較すると、いずれのアミノ酸種でも D 体の増加量と同等以上の L 体の減少が見られた。この事実より、L 体のラセミ化により D 体が生成されていると考えられる。発表においては、培養時間や培地の組成の違いによる D 体アミノ酸の蓄積
量の変化も合わせて報告する。

Brain function improving effect of the sweetpotato shochu derived
ingredients

D-amino acids productivity of lactic acid bacteria isolated fromfermentation broth of rice black vinegar -during the aging process

Key words
sweetpotato shochu, sweetpotato shochu oil, brain function
improvement

Key words

black vinegar, vinegar fermentation, D-amino acid, lactic acid bacteria

2Ha12

発酵食品データベースの構築と公開【方法】
試料は芋焼酎及びその焼酎油を使用した。焼酎油は芋焼酎原酒を冷却し、表面に浮いた物質を採取し、液液分離して回収した油性成分とした。マウスに芋焼
酎及びその焼酎油を 2000 mg/kg の用量にて 15 日間経口投与し、投与 8 日目に
10 nmol/mouse のアミロイド β を左側脳室内に投与した。最終経口投与の 24hr
後に Y 字迷路試験によりマウスの自発的交替行動を測定した。迷路試験後にマウスの海馬を採取し、DNA マイクロアレイで遺伝子発現解析を行った。

○Cho Sho, Kuniaki Kawano, Ken-ichi Iwai
(Kirishima Shuzo)

2Ha10

牛乳由来ホエイを原料とする食酢醸造とその機能性解析○河股 優輔 1, 若山 守 1, 林 順司 2, 豊竹 洋佑 1
（1立命館大院・生命科学, 2徳島大・生物資源）
wakayama@sk.ritsumei.ac.jp○Naoko Hoshi1, Akira Fujii2, Kazunori Hashiguchi2, Masanobu Nagano2,
Masafumi Kameya1,3, Hiroyuki Arai1,3, Masaharu Ishii1,3(1Grad. Sch. Agric. Life Sci., Univ. Tokyo, 2Sakamoto Kurozu, Inc., 3CRIIM, Univ.
Tokyo)○楠本 憲一, 曲山 幸生（農研機構・食品部門）
kusumoto@affrc.go.jp

チーズ生産時、ホエイと呼ばれる水溶性成分が副産物として多量に排出される。
ホエイは多様なタンパク質を含み、筋量増幅や認知症予防といった保険的機能をもつことが知られる。しかし、ホエイはラクトースと灰分成分の含量が高い
ことから、嗜好性と保存性に課題があり、食品素材としての開発は進んでいない。本研究では、ホエイの新たな利用法として、ホエイを原料とした食酢酵造を行い、嗜好性と保存性を改善すると共に従来の食酢に新たな機能性を加味することを検討した。
牛乳由来の脱塩ホエイ水溶液に、小麦ふすまもしくはナタネ粕で製麹したAspergillus oryzae を添加することで、ホエイを糖化処理した。得られた糖化液
を Zymomonas mobilis によるアルコール発酵、Acetobacter pasteurianus による酢
酸発酵の順に供し、酢酸終濃度 4.2%となる食酢「ラクトー酢」の醸造に成功した。アミノ酸組成分析を行ったところ、ラクトー酢には穀物酢や黒酢よりもア
ミノ酸が豊富に含まれていた。特に Ala や Glu 含量が多く、ラクトー酢の強い
甘味や旨味を引き出していることが示唆された。また穀物酢や黒酢と比較して、ラクトー酢に強いアンジオテンシン変換酵素阻害活性が認められたため、ラクトー酢の血圧降下作用が示唆された。ラジカル消去能を指標に抗酸化能を評価した結果、ラクトー酢が最も高い活性を示した。同様の手法を用いて醸造段階
別に抗酸化能を評価したところ、ホエイ液のオートクレーブ処理及び糖化処理によって抗酸化能が上昇した。A. oryzae 無添加では抗酸化能に変化がなかったことから、A. oryzae 由来の麹成分が抗酸化物質の生成に関与していることが示唆された。さらに、ナタネ粕を用いた方が小麦ふすまを用いた場合よりも約 4倍の抗酸化能を示すことから、ナタネ粕自体が抗酸化成分の生成に深く関わっていることが示唆された。

【目的】
日本人の食生活の変化と経済状況の悪化が重なり、バブル景気崩壊後から、主要な発酵食品である、味噌、醤油、漬物、清酒の消費量は減少し続けてきた。
しかし、伝統発酵食品の魅力は、独特な香りと味、多様な栄養成分、そして長年にわたって日本人の生活と密着して形成された食文化にある。日本の豊かな
食生活の一翼を発酵食品が担っている。近年、「和食文化」がユネスコ文化遺産に登録されたことを受けてその魅力を見直す機運が高まっており、業界の努力も加わり、上述した発酵食品の消費量も持ち直してきている。
本研究では、発酵食品の研究開発、生産、流通、教育の関係者が発酵食品の情報を簡便に収集するためのポータルサイトとして、データベースを提供することを目的とした。
【方法】
下記の環境でシステム開発をおこなった。
・DB サーバ：PostgreSQL、Web サーバ：Apache+PHP
登録するデータは、信頼できる文献に記載されたものに限定するという原則を設けた。これまでに、みそ文化誌、納豆沿革史、関係原著論文等をもとに登録作業をおこなった。
【結果】
食品（派生製品、成分等を含む）、微生物、原材料、食文化と、それが記載されている文献、問合せ先、ファイル、生理機能のデータと、それぞれの間の関連付け情報を登録したデータベースを構築した。現時点で、登録した食品数が約2,600 件 、 文 献 数 が 約 2 万 件 で あ る 。 閲 覧シ ス テ ム は 公 開 中 （ https://ffdbweb.dc.affrc.go.jp/）であり、公開から約 1 か月間のアクセス解析の結果についても発表する予定である。

Vinegar production using cow's milk whey and its functional analysis

Construction and release of a fermented food database○Yusuke Kawamata1, Mamoru Wakayama1, Junji Hayashi2, Yosuke Toyotake1(1Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Fac. Bioresource., Tokushima Univ.)

Key words

whey, Aspergillus oryzae, vinegar fermentation, antioxidant○Ken-Ichi Kusumoto, Yukio Magariyama(NARO(NFRI))

Key words

database, fermentation, fermented foods, food culture

187

2Ja01

日本酒生産にヒントを得た麹菌酵素カクテルと酵母を用いた高純度希少糖生産

2Ja03○若井 暁 1,2, 堤 浩子 3, 秦 洋二 3, 荻野 千秋 4, 近藤 昭彦 1
（1神戸大院・科技イノベ, 2海洋研究開発機構, 3月桂冠・総研, 4神
戸大院・工）
wakais@jamstec.go.jp

Evaluation of γ-aminobutyric acid (GABA) production
by Bacillus subtilis BBEL02 using alternative carbon
sources from wastes○Arlene Cherilyn Asun1, John Chi-Wei Lan1, Hui-Suan Ng2(1Biorefin. Bioprocess Eng. Lab., Dept. Chem. Eng. Mater. Sci.,
Coll. Eng., Yuan Ze Univ., Taiwan 32003, R.O.C., 2Dept. Food Sci.
Nutr., F. Appl. Sci., UCSI Univ., UCSI Hts., 56000 Cheras, KL,MY)arlenecherilyn96@gmail.com

機能性オリゴ糖は、整腸作用や免疫賦活活性などの様々な生体調節機能が見出されており、生活習慣病等の予防効果があるとして期待されている。日本は超高齢化社会に向かい、医療費負担による社会保障制度の破綻への危惧からも、
健康寿命の延長は持続的な社会システムの構築に欠かせない一つの課題であり、機能性オリゴ糖はその一助になり得る食品補助成分と位置付けることができる。
機能性オリゴ糖様の働きをすることが示唆されているイソプリメベロース（IP）
は、キシログルカンを原料として複数の酵素処理を生産することが可能である。
これまでに、我々は、遺伝子組み換え麹菌を用いて IP 生産に必要な酵素を大量生産し、これらを酵素カクテルとして用いることで、短時間で高濃度の IP を生産することに成功している。一方で、生産した糖液中には、副産物であるグル
コースとガラクトースが著量残留しており、IP としての糖純度を上げる課題が残っていた。
本研究では、これまで使用していた異種由来セルラーゼの代替として麹菌由来
エンドグルカナーゼをセルフクローニングして高発現することでオール麹菌酵
素カクテルを調製した。麹菌エンドグルカナーゼを用いた酵素カクテルにおいても IP の高生産は可能であった。次に、副産物として必ず生じる、植物バイオ
マスキシログルカン由来の Glc や Gal の除去を目指した。日本酒生産にヒントを得て、糖消費に酵母を使用した結果、Glc や Gal をほぼ完全に消費することができ、長期間のインキュベーション後にも IP が消費されないことを確認した。
本研究において、日本の発酵生産技術の知の蓄積から生み出された日本酒生産を参考にし、麹菌酵素カクテルと酵母の併用により、食品補助成分やサプリメ
ントとしての経口摂取も可能な安全性を兼ね備えた高純度 IP を数日間中に g 単位で供給可能なシステムを構築することに成功した。

The γ-aminobutyric acid (GABA) is a major inhibitory neurotransmitter in the central
nervous system, commonly biosynthesized from decarboxylation of glutamic acid byglutamate decarboxylase (GAD). GAD can be expressed by human, animals andcertain microorganisms, such as Bacillus subtilis used in this study. However, thebioproduction of GABA is inhibited by production cost mainly originated from media
compositions. The increasing commercial demand for GABA in food andpharmaceutical industries demanded that an economical production of GABA bymedium optimization and sourcing for alternative raw materials need to be established.
In this study, the potential of industrial wastes, namely Brewers Spent Grain (BSG)and Microalgal Biomass (MB) as an alternative carbon source for GABA production
was evaluated. BSG and MB were subjected to physical pretreatment coupled withchemothermal hydrolysis prior to fermentation to solubilize and de-structure thebiomass to yield nutrients potentially used for fermentation. As a result, 0.14 g and0.12 g of glucose were obtained per gram of BSG and MB, respectively. In addition,
Total Kjedahl Nitrogen (TKN) of the hydrolysate was recorded to be 0.20 g and 0.22 g,
respectively. Preliminary trials on the cultivation of Bacillus subtilis BBEL02 forbioproduction of GABA using media employing BSG and MB hydrolysate as carbon
source had demonstrated promising outcomes thus far.

Production of rare-oligosaccharide isoprimeverose by Japanese sakebrewing-like method

Evaluation of γ-aminobutyric acid (GABA) production by Bacillus subtilis
BBEL02 using alternative carbon sources from wastes

Key words
Aspergillus oryzae, rare sugar, Saccharomyces cerevisiae,
oligosaccharide

Key words

Bacillus subtilis, waste, GABA, carbon source

2Ja04

Evaluation of polyhydroxyalkanoates (PHA) production
by Ralstonia eutropha H16 in a single-chamber electrofermentation system○Satoshi Wakai1,2, Hiroko Tsutsumi3, Yoji Hata3, Chiaki Ogino4, Akihiko Kondo1(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2JAMSTEC, 3Res. Inst., Gekkeikan
Sake Co., Ltd., 4Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)

2Ja02

Implementation of different fermentation strategies toenhance the production of microbial carotenoids from
Gordonia terrae TWRH01○Arlene Cherilyn Asun1, John Chi-Wei Lan1, Hui-Suan Ng2(1Biorefin. Bioprocess Eng. Lab., Dept. Chem. Eng. Mater. Sci., Coll. Eng., Yuan Ze
Univ., Taiwan 32003, R.O.C., 2Dept. Food Sci. Nutr., F. Appl. Sci., UCSI Univ.,
UCSI Hts., 56000 Cheras, KL, MY)○Wai Leng Carmen Loh1,2, John Chi-Wei Lan1, Hui Suan Ng2(1Biorefin. Bioprocess Eng. Lab., Dept. Chem. Eng. Mater. Sci.,
Coll. Eng., Yuan Ze Univ., Taiwan 32003, R.O.C., 2Faculty Appl.
Sci., UCSI Univ., Kuala Lumpur 56000, Malaysia.)
carmenwl94@gmail.com○Yuen Hing Lai, John Chi-Wei Lan(Biorefin. Bioprocess Eng. Lab., Dept. Chem. Eng. Mater. Sci., Coll.
Eng., Yuan Ze Univ., Taiwan 32003, R.O.C.)
yhing0829@gmail.com

Carotenoids serve as one of the most important group of natural lipid-soluble pigments
exhibiting great biological activities such as antioxidant, anti-inflammatory andprovitamin A activities. Owing to their advantageous health effects, carotenoids arewidely applied in various industries. Due to the increasing demand for natural
carotenoids, attention has been raised by industries and academia in the production of
microbial carotenoids which could be a promising alternative source of natural
carotenoids to substitute the synthetic carotenoids. In present study, a carotenoidproducing strain, Gordonia terrae TWRH01 originally isolated from seawater innorthern Taiwan was used by employing different fermentation strategies such as
medium compositions comprising different concentrations of carbon and nitrogensources, sodium chloride and pH as well as the different cultivation environment suchas exposed to light or in dark. Ultrasound-assisted extraction was used to disrupt the
intracellular pigments and the types of carotenoids were identified by GC-MS. The
total carotenoid concentrations were quantified through HPLC and expressed as βcarotene equivalent. Besides, antioxidant capacity of the extract was evaluated through
DPPH radical scavenging assay. Results revealed that the optimization of fermentation
yielded 15.29 g L-1 dry biomass and 10.58 μM relative β-carotene concentration.
Therefore, the new bacterial strain is a potential bioresource for the commercial
production of natural carotenoids.

One of the keys to the success of optimizing bio-products production is to balance thepotential limitations for the bio-molecules formation in microbial metabolism. The
electro-fermentation, a system integrates an electrochemical system with conventional
fermentation by introducing electrodes, serves as a novel fermentation strategy. The
introduction of electrodes as an additional electron donor or acceptor influences theelectron balances within the fermentation environment and microbial metabolism
which can potentially decrease the amount of by-products and increase the carbon
yield throughout fermentation. This study aims to improve polyhydroxyalkanoates(PHA) production by Ralstonia eutropha H16 by electro-fermentation. A singlechamber bioreactor coupled with two graphite electrodes is utilized to grow R.
eutropha H16 in order to investigate the impacts of supplied electric current on cell
growth, PHA accumulation and substrate consumption. The electrodes act as a nonsoluble electron donor (cathode) or acceptor (anode) which are connected to a direct
current supply that applies electric current to the bioreactor. The yield of PHA could be
increased as the metabolism pathway is facilitated by the electrodes, hence, electrofermentation can be employed as a new fermentation strategy to accumulate target
product with improved selectivity, enhanced microbial growth while reducing the useof additives for redox balances or pH control and increasing carbon efficiency.

Implementation of different fermentation strategies to enhance theproduction of microbial carotenoids from Gordonia terrae TWRH01

Evaluation of polyhydroxyalkanoates (PHA) production by Ralstonia
eutropha H16 in a single-chamber electro-fermentation system○Wai Leng Carmen Loh1,2, John Chi-Wei Lan1, Hui Suan Ng2(1Biorefin. Bioprocess Eng. Lab., Dept. Chem. Eng. Mater. Sci., Coll. Eng., Yuan Ze
Univ., Taiwan 32003, R.O.C., 2Faculty Appl. Sci., UCSI Univ., Kuala Lumpur
56000, Malaysia.)

Key words

Gordonia terrae, fermentation, carotenoids○Yuen Hing Lai, John Chi-Wei Lan(Biorefin. Bioprocess Eng. Lab., Dept. Chem. Eng. Mater. Sci., Coll. Eng., Yuan Ze
Univ., Taiwan 32003, R.O.C.)

Key words

Ralstonia eutropha H16, electro-fermentation, polyhydroxyalkanoate

188

2Ja05

高温の嫌気条件下で誘導されるコリネ型細菌のグルコー
ス消費促進に伴う遺伝子発現・酵素活性の変動

2Ja07○松沢 弘貴 1, 豊田 晃一 2, 水野 光 1, 仁宮 一章 1,3, 髙橋 憲司 1,
乾 将行 2, 柘植 陽太 1,3（1金沢大院・自科, 2RITE, 3金沢大・新学術）
ytsuge@staff.kanazawa-u.ac.jp

グルコース消費速度と代謝遺伝子の発現レベルの関係○山口 陽 1, 内倉 寛斗 1, 豊田 晃一 2, 乾 将行 2, 柘植 陽太 1,3（1金沢大院・自科, 2RITE, 3金沢大・新学術）
ytsuge@staff.kanazawa-u.ac.jp【背景と目的】コリネ型細菌はアミノ酸生産菌として工業的に広く利用されている有用細菌である。本菌を嫌気条件下で培養すると、増殖は停止するが代謝活性は維持され、乳酸とコハク酸を生産する。我々はこれまでに、好気条件下では増殖できない 42.5°C において嫌気条件下ではグルコース消費速度が向上し、
乳酸・コハク酸の生産速度が増加することを報告した 1,2)。本発表ではこの高温下におけるグルコース消費の促進を誘導する遺伝子発現と酵素活性の変動について検証した。
【方法と結果】試験菌株は野生株 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 株を使用した。嫌気条件下で菌株を 42.5°C と 30.0°C で培養し、DNA マイクロアレ
イを用いた転写解析の結果、グルコース消費速度が促進される 42.5°C ではヒー
トショック遺伝子群を含む 382 遺伝子の発現量が 2 倍以上に増加し、346 遺伝
子の発現量が半分以下に低下した。グルコース消費に関わる遺伝子ではグルコー
ストランスポーター遺伝子とグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子の発現量が 42.5°C で 2 倍以上に増加した。一方、グルコー
ス-6-リン酸イソメラーゼやホスホフルクトキナーゼ、GAPDH、ピルビン酸キナーゼの比活性が温度の上昇と共に増加した。以上により、高温下におけるグ
ルコース消費速度の促進効果はグルコース取り込みや解糖系の遺伝子の発現誘
導と、酵素活性の増加に起因すると考えられた。
1)
水野ら、第 69 回日本生物工学会大会 (2017)2)
水野、柘植、アグリバイオ 1:91-93 (2017)【背景と目的】有用化合物生産においては高い対糖収率とともに高い生産速度が重要である。生産速度の向上には糖消費速度の増加が必要であるため、代謝遺伝子の高発現など代謝改変が試みられている。しかし、そもそも糖消費速度と代謝遺伝子群の発現レベルの関係は不明である。本発表ではアミノ酸生産菌であるコリネ型細菌を用いてグルコース消費速度と代謝遺伝子の発現レベルの関係を検証した。
【方法と結果】コリネ型細菌は嫌気条件下で培養すると、増殖は停止するが代謝活性は維持され、著量の乳酸と少量のコハク酸を生産する。従って嫌気条件下
では細胞増殖を考慮する必要がなく、中央代謝経路のみに集中して糖消費速度と代謝遺伝子の発現レベルを検証できる利点がある。試験菌株として野生株である Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 株と乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ldhA）欠損株を使用した。グルコースを単一炭素源とした最少培地を用いて生産反応を行った結果、ldhA 欠損株は野生株と比較してグルコース消費速度が 41%低下した。リアルタイム PCR で代謝遺伝子の発現量を測定した結果、グ
ルコース消費速度が低い ldhA 欠損株ではグルコース取り込みに関わるホスホト
ランスフェラーゼシステムや、解糖系、アナプレロティック経路など、多くの遺伝子で発現レベルが低下した。ldhA 欠損株では乳酸生産によるニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドの再酸化ができないためにピルビン酸が蓄積する。
従って、グルコース消費速度の低下かピルビン酸の蓄積により、代謝遺伝子群の発現レベルが低下した可能性が考えられた。

Modulation of gene expression and enzyme activity at high temperature in
Corynebacterium glutamicum under anaerobic conditions

Correlation between glucose consumption rate and expression level ofmetabolic genes○Hiroki Matsuzawa1, Koichi Toyoda2, Hikaru Mizuno1, Kazuaki Ninomiya1,3,
Kenji Takahashi1, Masayuki Inui2, Yota Tsuge1,3(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2RITE, 3InFiniti, Kanazawa Univ.)○Akira Yamaguchi1, Hiroto Uchikura1, Koichi Toyoda2, Masayuki Inui2,
Yota Tsuge1,3(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2RITE, 3InFiniti, Kanazawa Univ.)

Key words
consumption

gene expression, enzyme activity, high temperature, glucose

Key words

gene expression, glucose consumption, metabolic flux, glycolysis

2Ja06

高温下におけるコリネ型細菌を用いた乳酸・コハク酸生
産と酵素ターンオーバーの必要性

2Ja08

増殖できない高温下におけるコリネ型細菌の代謝挙動○内倉 寛斗 1, 仁宮 一章 1,2, 髙橋 憲司 1, 柘植 陽太 1,2（1金沢大院・自科, 2金沢大・新学術）
ytsuge@staff.kanazawa-u.ac.jp○小林 俊介 1, 仁宮 一章 1,2, 髙橋 憲司 1, 柘植 陽太 1,2（1金沢大院・自科, 2金沢大・新学術）
ytsuge@staff.kanazawa-u.ac.jp【背景と目的】コリネ型細菌はアミノ酸生産菌として工業的に広く利用されている有用細菌である。本菌は 30°C を増殖至適温度とし、40°C を超えると増殖が停止する。本菌を嫌気条件下で培養すると、増殖は停止するが代謝活性は維持され、乳酸とコハク酸を生産する。我々はこれまでに、嫌気条件下では、本菌が増殖できない 40°C を超える高温条件でグルコース消費速度が向上し、乳酸・コハク酸の生産速度が増加することを報告した 1,2)。高温下では酵素が不安定になることが予想されるため、本発表では乳酸・コハク酸生産反応における酵素のターンオーバーの必要性について検証した。
【方法と結果】乳酸生産株としてホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の欠損株を、コハク酸高生産株としては副生成物である乳酸や酢酸の生合成遺伝子を欠損させ、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子をプロモーター置換により高発現した株を用いた。作製した代謝改変株を用いて、30°C、36°C、
42°C、45°C で嫌気反応を行った結果、乳酸生産では 42°C で生産速度が最大となった。コハク酸生産では 36°C で生産速度が最大となったが、42°C でも増殖
至適温度である 30°C より 23%高い生産速度を示した。次に酵素のターンオー
バーの必要性を調べるため、新規のタンパク質合成を停止させるクロラムフェ
ニコールの添加実験を 42°C で行った結果、乳酸はクロラムフェニコールの添加の有無に関わらず生産速度は同等であったが、コハク酸では 6 h 以降、生産が停止した。30°C でも同様に 6 h 以降はコハク酸生産が停止したことから、ピルビン酸からコハク酸に至るアナプレロティック経路か TCA サイクルに温度に関わらずターンオーバーが速い酵素が存在することが示唆された。
1)
水野ら、第 69 回日本生物工学会大会 (2017)2)
水野、柘植、アグリバイオ 1:91-93 (2017)【背景と目的】微生物は増殖に際し、炭素源や窒素源、微量元素などを取り込んで自らの構成成分を生合成するとともに染色体を複製して二つの娘細胞に分裂する。一連の酵素反応からなる増殖の速度は温度によって大きく左右され、最適な温度が増殖至適温度と規定される。近年、物質生産菌を中心に実験室内進化により高温耐性を示す変異株の取得が進んでおり、次世代シークエンサーを用いて変異源の特定も行われているが、野性株の増殖至適温度がどのように決定されているのかは不明である。我々は代謝の観点から高温下における微生物の挙動に注目しており、増殖至適温度を決める因子を探索する一環として、本発表では増殖できない高温下における微生物の代謝挙動について検証した。
【方法と結果】モデル微生物としてアミノ酸生産菌であるコリネ型細菌を用いた。野生株である Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 株は 30°C を増殖至適温度とし、40°C を超えると増殖を停止する。ジャーファーメンターを用いて本菌を 30°C と 42°C で初期 OD600 をそれぞれ 0.8 と 10 で培養した。培地はグルコースを単一炭素源とした最少培地を用い、飽和酸素濃度の 20%以上を保つよ
うに通気・撹拌を行った。30°C における比増殖速度は 0.30 h-1 であり、42°C では細胞は増殖しなかった。しかし、増殖できない 42°C でもグルコースは消費され、単位菌体量あたりのグルコース消費速度は 30°C の 60%を示した。42°C
では通常は嫌気条件下でのみ見られる乳酸の生産が確認され、消費したグルコー
スの 18%が乳酸に変換された。以上により、増殖できない高温下においてもグ
ルコースは消費されるが、増殖至適温度とは大きく異なる代謝状態にあることが示唆された。遺伝子発現・酵素活性の解析結果と合わせて報告する。

Production of lactate and succinate by Corynebacterium glutamicum athigh temperature and involvement of enzyme turnover

Metabolic alteration in Corynebacterium glutamicum at non-proliferatinghigh temperature○Hiroto Uchikura1, Kazuaki Ninomiya1,2, Kenji Takahashi1, Yota Tuge1,2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2InFiniti, Kanazawa Univ.)

Key words

high temperature, enzyme turnover, lactic acid, succinic acid○Shunsuke Kobayashi1, Kazuaki Ninomiya1,2, Kenji Takahashi1, Yota Tsuge1,2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2InFiniti, Kanazawa Univ.)

Key words
Corynebacterium glutamicum, high temperature, metabolic response,
glucose consumption

189

2Ja09

耐熱性コリネ型細菌による高温グルタミン酸発酵○古賀 凌 2, 友広 いずみ 1, 曽川 沙希 1, 松谷 峰之介 2,
ナンタポン ナワラート 3, 片岡 尚也 1,2,4, 藥師 寿治 1,2,4,
松下 一信 1,2,4（1山口大・農, 2山口大院・医系, 3スラナリー工科大, 4中高温微生物セ）kazunobu@yamaguchi-u.ac.jp

2Ja11

糸状菌 Talaromyces cellulolyticus による抗体等バイオ医
薬品製造技術の開発○深田 寛朗 1, 十倉 充範 2, 臼田 佳弘 1
（1味の素バイオ・ファイン研, 2味の素研究開発企画部）
hiroaki_fukada@ajinomoto.com【背景と目的】Corynebacterium glutamicum は、グルタミン酸やリジンなどのアミノ酸生産を行うグラム陽性菌である。この細胞増殖およびグルタミン酸発酵
は熱を発生させ、それが増殖を妨げ、そしてその生産効率を低下させる。この問題を克服するために、発酵槽の温度は冷却システムによって３０℃未満に保たれてきたが、そのシステムには多大なコストがかかることが問題となっている。そこで私達は、温度に依存することなく様々な温度環境下でグルタミン酸を生産する株の創成を目的としており、これまでいくつかの耐熱性 C. glutamicumの取得や耐熱化育成を試みてきた。今回、得られた耐熱性株を用いて、様々な温度条件下でのペニシリン添加によるグルタミン酸生産性を比較し、有用な耐熱性株の検索を行うとともに、その有効性の解析を行った。
【使用菌株および結果】フラスコ培養の結果より耐熱性株であると考えられる分
離株 PP80 と N24 株、そしてコントロール株である KY9002 株を Jar fermentor
を用いて 30, 37, 39℃条件下でグルタミン酸生産量を比較した。その結果、
KY9002 は温度が上昇するごとに生産量が低下したのに対して、耐熱性株である PP80 と N24 は高温条件下でも高いグルタミン酸生産性を示した。特に、PP80
はどの温度条件下でも最も高いグルタミン酸生産性を示し、39℃でも 30℃に近い生産性を示した。さらに、PP80 株の各温度条件下での培養における消費電力についても解析したので、併せて報告する。
（本研究は協和発酵バイオ・生産技術の協力を得て、JST-ALCA の支援のもと行われた。）【背景と目的】糸状菌 Talaromyces cellulolyticus はセルラーゼ生産菌として分離され、高いタンパク質分泌能を持つことが知られている。我々は、T. cellulolyticusの細胞外プロテアーゼ活性が低いなど、異種タンパク質生産に適した性質を有することを見出し、抗体などのバイオ医薬品生産の発現宿主としての可能性を検討した。
【結果と考察】T. cellulolyticus のゲノムにヒト血清アルブミン（HSA）遺伝子を相同組換えにより導入し、異種タンパク質発現能を検討した。セルラーゼ発現系を利用することで HSA の分泌生産に成功したが、セルラーゼなどの宿主由来の高発現分泌タンパク質と比較して低い分泌発現量であった。また、弱いながらプロテアーゼ活性が認められ、分泌発現された HSA の分解も課題となった。
分泌発現量に関しては、宿主由来のセルラーゼ遺伝子の一部を融合タグとして用いることで大幅に改善し、融合タグを分泌発現過程でプロセシングすることにも成功した。プロテアーゼ活性についても、RNA-seq によるトランスクリプ
トーム解析から同定されたプロテアーゼ遺伝子を欠損することで抑制することができた。改良した発現系を用い、抗体の分泌発現を検討したところ、サブク
ラスの異なる複数種の抗体の分泌発現が可能であった。また、本発現系で生産した抗体の機能や性質についても確認をしており、T. cellulolyticus が抗体などのバイオ医薬品生産の分泌発現系となることを示した。

Optimization of glutamic acid fermentation in thermo-tolerant
Corynebacterium glutamicum

Development of secretory protein expression system for biopharmaceuticals
using Talaromyces cellulolyticus○Ryo Koga2, Izumi Tomohiro1, Saki Sogawa1, Minenosuke Matsutani2,
Nawarat Nantapong3, Naoya Kataoka1,2,4, Toshiharu Yakushi1,2,4,
Kazunobu Matushita1,2,4(1Fac. Agric., Yamaguchi Univ., 2Grad. Sch. Med., Yamaguchi Univ., 3Suranaree
University of Technology, 4Research Center for Thermotolerant Microbial
Resources, Yamaguchi Univ)
Key words
Corynebacterium glutamicum, glutamate fermentation,
Thermotolelance

2Ja10

ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の欠失がCorynebacterium glutamicum のリジン生産に与える
影響○新森 彰信, 郭 朕, 和田 大, 横田 篤
（北大院・農）yokota@chem.agr.hokudai.ac.jp○Hiroaki Fukada1, Mitsunori Tokura2, Yoshihiro Usuda1(1Res. Inst. Biosci. Prod. Fine Chem., Ajinomoto Co., Inc., 2R&D Planning Dept.,
Ajinomoto Co., Inc.)

Key words

Talaromyces cellulolyticus, antibody, biopharmaceutical, albumin

2Ap01

組換え L-メチオニン脱炭酸酵素の迅速簡便な精製法の確立及び結晶構造解析○大川 敦司 1, 林 将也 1, 室田 昌輝 2, 志波 智生 2, 原田 繁春 2,
根本 理子 1, 田村 隆 1, 稲垣 賢二 1
（1岡山大院・環境生命, 2京工繊大院・工芸科学）
kinagaki@okayama-u.ac.jp【背景と目的】Corynbacterium glutamicum は，様々な物質生産に利用されており，本菌の代謝経路に関する基盤知見の獲得は重要である．本研究では，リジンの前駆体であるオキサロ酢酸（OAA）の供給経路に関する知見を得ることを目指した．OAA は主にピルビン酸カルボキシラーゼ（PC）とホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼ（PEPC）によるアナプレロティック反応で供給される．過去には，フラックス解析により PC がアナプレロティック反応の 90%を担っているとした報告や，PC の過剰発現によりリジン生産が向上したという報告がある．一方で，リジン生産時の PC 反応のフラックスはほぼ 0 であると推測した報告もある．このように PC の重要性については相反する報告が存在する．今回は，C. glutamicum に PC 欠損を導入してリジン生産試験を行い，リジン生産における PC の重要性を改めて評価した．
【方法】C. glutamicum ATCC13032 にアスパラギン酸キナーゼのフィードバック
阻害解除変異（AKfbr ）を導入したリジン生産株（P 株）と，P 株に PEPC のフィードバック阻害解除変異（PEPCfbr）を導入した株（R 株）の 2 株を親株として二重相同組換え法により PC をコードする pyc 遺伝子を欠失させた．Westernblotting により PC タンパク質が存在しないことを確認した後，これらの株を 2L
ジャーファーメンターを用いて培養した．
【結果と考察】両 PC 欠損株において，生育，糖消費およびリジン最大生産量はそれぞれの親株に比べて変化しなかったが，リジン生産の遅れが観察された．
また，PEPCfbr は PC 欠損によるリジン生産の遅れを緩和した．両 PC 欠損株で，PEPC 活性は PC 欠損により変化しなかった．これらの結果は，PC がアナプレ
ロティック反応の大半を担うという報告とは相反しており，PC の重要性はそれほど高くないと考えられた．

【目的】放線菌 Streptomyces sp. 590 由来 L-メチオニン脱炭酸酵素(MetDC)は補酵素として, ピリドキサール 5’リン酸(PLP)を持つ酵素で, L-Met の脱炭酸反応を触媒する。本酵素は, L-Met への高い基質特異性を持つため, L-Met 飢餓による抗腫瘍活性を持つ酵素である。MetDC の高い基質特異性は抗腫瘍活性だけでなくL-Met の定量用酵素として利用できることを明らかにしてきた。しかし, 放線菌における MetDC の生産量は極微量であるため, 大腸菌を用いた異種発現系によって MetDC の大量精製系の構築を行った。また, 本酵素の構造と機能の相関解析を目指して MetDC の結晶構造解析を行った。
【方法】MetDC 発現用プラス
ミド pET MetDC-KanR を用いて大腸菌 E. coli BL21(DE3)を形質転換し, MetDCを発現させた。精製は金属アフィニティーカラムを用いた。得られた結晶はSpring-8 BL41XU で解析データを収集し, 重原子置換法によって位相を決定した。【結果及び考察】大量精製法によって得られた MetDC は 1 ステップで精製
度をおよそ 130 倍にまで向上することが出来た。その回収率は約 60％であり，非常に効率の良い精製法が確立できた。結晶化はタンパク質濃度と PEG＃1500の濃度を検討することによって 2.2Å の分解能の結晶を得ることが出来た。得られた結晶は白金の単波長異常分散法（SAD 法）により位相決定に成功し, MetDCの全体構造や活性中心構造を明らかにした。得られた結晶はサブユニットあた
り 1 分子の PLP が存在しており, 内部アルジミン構造をとった状態で得られた。
ヒト由来の L-ヒスチジン脱炭酸酵素(HisDC)との相同性があり, 活性中心残基も類似していることが明らかとなった。また HisDC の基質認識に重要な残基として報告のある S349 が MetDC でも保存されていることが明らかとなり, MetDC
でも基質認識に重要な役割を持つことが考えられる。現在, 変異導入実験を行っている。

The effects of pyruvate carboxylase gene deletion on lysine production in
Corynebacterium glutamicum.

Quick and simple purification and structural analysis of recombinant Lmethionine decarboxylase.

Key words
Corynebacterium glutamicum, lysine production, pyruvatecarboxylase, oxaloacetate

Key words
L-methionine decarboxylase, pyridoxal-5'-phosphate, enzyme
purification, crystal structure○Akinobu Shinmori, Zhen Guo, Masaru Wada, Atsushi Yokota(Grad. Sch. Agric., Hokkaido Univ.)○Atsushi Okawa1, Masaya Hayashi1, Masaki Murota2, Tomoo shiba2,
Shigeharu Harada2, Michio Nemoto1, Takashi Tamura1, Kenji Inagaki1(1Grad. Sch. Environ. Life Sci., Okayama Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto
Inst. Technol.)

190

2Ap02

高基質特異性酵素 L-グルタミン酸オキシダーゼの活性
中心アミノ酸残基の機能解析

2Ap04○矢野 佳果 1, 松尾 慎作 1, 伊藤 菜奈子 2, 今田 勝巳 2, 日下部 均 3,
根本 理子 1, 田村 隆 1, 稲垣 賢二 1
（1岡山大院・環境生命, 2阪大院・理, 3（株）エンザイムセンサ）
kinagaki@okayama-u.ac.jp

安定性を向上したグリシン酸化酵素変異体を用いたグリ
シン測定法の構築○巽 萌美 1, 星野 亘 1, 小玉 優哉 1, Techawaree Ueatrongchit 2,
高橋 一敏 1, 山口 浩輝 1, 田上 宇乃 1, 宮野 博 1, 浅野 泰久 2,
水越 利巳 1
（1味の素株式会社, 2富山県大・生医工研セ）
moemi_tatsumi@ajinomoto.com【目的】L-グルタミン酸オキシダーゼ(LGOX)は，L-Glu の酸化的脱アミノ化反応を触媒する L-アミノ酸オキシダーゼの一種である．LGOX の基質特異性は極めて厳格であり，様々なバイオセンサーに利用されている．我々は LGOX の活性中心残基のうち，Trp564 が活性中心の空間保持に寄与すること，Arg305 が
LGOX の L-Glu 認識に最も重要であることを明らかにした．この検討過程で作製した R305X 変異酵素は HisOX，TyrOX，および ArgOX といえるような酵素に基質特異性が変化していた．R305E 変異 LGOX (ArgOX)の X 線結晶構造解析の結果から，新たに Glu617 残基が基質と相互作用している可能性が考えられた．Glu617 の機能解明を目的として同残基への部位特異的変異導入を行い，E617X 変異 LGOX を作製し，精製及び性質検討を行った．
【方法】LGOX 発現用ベクター pGOx を鋳型として部位特異的変異導入を行うことにより変異遺伝
子を作製後，E. coli JM109 を形質転換，発現させて，精製，および性質検討を行った．酵素活性は酵素反応で生成する過酸化水素を 4-アミノアンチピリン法
で定量し測定した．
【結果】作製した変異酵素の中で E617K 変異 LGOX は興味深いことに L-Tyr を最も良い基質とし，厳格な基質特異性を示した．L-Tyr に対する Km は 2.5 mM であり，これまでに R305X 変異で作製した TyrOX (R305H
変異 LGOX)とほぼ同程度の基質親和性を示した．現在，Lys 以外のアミノ酸を導入した E617X 変異酵素の作製，性質検討を行っている．

【背景と目的】 アミノ酸は生命にとって必須の化合物であり、生体内の濃度は食事や様々な疾患によって変動するため、アミノ酸濃度を測定することは食品科学、生理学研究、臨床領域など幅広い分野において重要な意義を有する。本
発表で対象となるグリシンは、その血中濃度が肥満や糖尿病など様々な疾病と関連が示唆されている。従来、アミノ酸の測定には液体クロマトグラフィー法
や質量分析法などが広く用いられてきたが、複数のアミノ酸を高い精度と正確性で網羅的に測定できる一方、大型かつ高額な装置とそれを扱える高い専門性を必要とするため、アミノ酸測定の機会は非常に限られていた。この課題解決のため我々は、アミノ酸代謝酵素を用いた酵素法によるアミノ酸濃度測定法の検討を進めてきた。しかし、既にトリプトファン酸化酵素やヒスチジン脱炭酸酵素などの例で報告したように、野生型のアミノ酸代謝酵素には活性や特異性、長期保存安定性など性質が不十分な酵素も多い。そこで、分子構造を参考に酵
素工学により合理的改変を行い、高い活性や基質特異性、保存安定性を持つ酵
素への高機能化を達成してきた。本発表では安定性の低いグリシン酸化酵素について、高い保存安定性の獲得に成功したので紹介する。
【結果】 Bacillus subtilis strain 168 由来グリシン酸化酵素について、システイン
残基および補酵素 FAD 結合に関与する残基に注目して変異体をデザイン・評価
した。その結果、野生型酵素は 4 ℃保存 1 ヶ月で 50％失活するのに対し、同温度で 1 年間保存しても 80％以上の活性を保つ安定な変異体を創出した。当該変異体を用いてヒト血漿中のグリシン濃度を比色検出により定量した結果、機器分析の測定値と比較して、定量値の乖離は 5.3％以下であり、添加回収率や再現性も良好な分析法を構築できた。

Functional analysis of active site residues of L-glutamate oxidase

Enzymatic glycine analysis method using a stable glycine oxidase mutant○Yoshika Yano1, Shinsaku Matsuo1, Nanako Itou2, Katsumi Imada2,
Hitoshi Kusakabe3, Michiko Nemoto1, Takashi Tamura1, Kenji Inagaki1(1Grad. Sch. Environ. Life Sci., Okayama Univ., 2Grad. Sch. Sci., Osaka Univ.,
3
Enzyme Sensor Co. Ltd.)○Moemi Tatsumi1, Wataru Hoshino1, Yuya Kodama1, Techawaree Ueatrongchit2,
Kazutoshi Takahashi1, Hiroki Yamaguchi1, Uno Tagami1, Hiroshi Miyano1,
Yasuhisa Asano2, Toshimi Mizukoshi1(1Ajinomoto Co., Inc., 2Biotechnol. Res. Center, Toyama Pref. Univ.)

Key words

L-glutamate oxidase, active site residue, biosensor, substrate specificity

Key words

amino acid analysis, enzyme assay, protein engineering

2Ap03

Geobacillus kaustophilus 由来グリシンオキシダーゼの基質阻害および基質特異性の改変

2Ap05

超好熱古細菌（始原菌）由来プロテアーゼ（Tk-SP）の
Pro ペプチドが成熟化に与える影響○東浦 優希 1, 小田 龍佑 1, 川崎 大志 1, 野村 隆臣 2, 新井 亮一 2,
西矢 芳昭 1
（1摂南大・理工・生命科学, 2信州大・繊維・応用生物）
nishiya@lif.setsunan.ac.jp○長尾 征秀, 前川 大樹, 山野-足立 範子, 古賀 雄一, 大政 健史（阪大院・工）kogay@mls.eng.osaka-u.ac.jp【背景と目的】 グリシンオキシダーゼ（Gox）は、Bacillus subtilis のゲノムデー
タに基づき発見された、グリシンの酸化的脱アミノ化を触媒する酵素である。
本酵素は分析用途での応用が期待されている。複数のグラム陽性桿菌由来 Goxの酵素特性が解明された結果として、Geobacillus kaustophilus 由来 Gox（GoxGk）
は基質阻害特性というユニークな特徴を示すことが分かった。そこで GoxGk のX 線結晶構造解析が行われ、分解能 2.2 Ǻ での構造決定に成功した（PDB ID:
4YSH）。本研究では GoxGk の立体構造を基に基質阻害低減や基質特異性向上変異をデザインし、作成した変異酵素の特性評価を行った。
【方法】 立体構造解析は統合計算化学ソフトウェア MOE を使用した。変異体遺伝子は Inverse PCR 法にて作成し、His-tag 融合タンパク質として発現させた酵
素をキレートカラムにて精製した。Gox 活性は、4-アミノアンチピリン−ペルオキシダーゼ系により測定した。
【結果と考察】 GoxGk の結晶構造情報より、活性中心ポケットにリガンドとしてグリシンが 2 分子入っており、基質阻害の要因と考えられた。そこで基質が複数結合しない様、ポケットが狭まった変異酵素を 3 種デザインした。各酵素のキネティック・パラメーターを比較したところ、変異酵素は基質阻害を低減できた。また、変異酵素の比活性は野生型の 2〜8 倍向上した。したがって、本研究により GoxGk の機能向上が果たされ、実用化への貢献も期待された。また、活性中心の R336 残基近傍に位置する E55 の静電的相互作用に着目し、E55Qを調製した。野生型に比して E55Q は触媒効率が低下したが、基質特異性が高まると共に基質阻害が低減した。これら特性変化は、静電的相互作用の変化に
より R336 のフレキシビリティが増加し、結果として活性中心ポケットの空間が変化したためと考えられる。

【背景・目的】Tk-SP は超好熱古細菌 Thermococcus kodakarensis 由来のサチライ
シン様プロテアーゼである。本酵素は産業用酵素として期待されているが、大腸菌での発現量が限られている。Tk-SP の前駆体（Pro-Tk-SP）は Pro ペプチドが阻害剤として働き、プロテアーゼの自己分解を抑制することで成熟化効率を高めている。本研究では、Pro ペプチドと酵素活性ドメイン間の相互作用が成熟化に及ぼす影響を調査した。
【方法・結果】Pro-Tk-SP に、ドメイン間に静電相互作用の形成が見込める変異を 4 種類（G218D、F103R、S223K、N227D）、ドメイン間の界面の α ヘリック
ス上の Trp を除去する変異を 2 種類（W231Y、W268Y）導入し、計 6 種類の変異体を構築した。本研究では、これらの変異体について Pro ペプチドの Tk-SP
に対する阻害能（IC50）と、バイオレイヤー干渉法によりドメイン間の結合力を測定した。これらの値が野生型と比較して特に上昇した 2 つの変異体（S223K
変異体、W231Y 変異体）について阻害剤である Tk-Pro との共発現系を構築し、総活性と比活性から成熟化の効率を評価した。Tk-SP の活性を 50％阻害する
Pro ペプチドの濃度（IC50）が野生型では 6.43 μM であるのに対し、S223K 変異体と W231Y 変異体はそれぞれ 0.24 μM と 0.70 μM であった。またドメイン間の相互作用（KD ）は野生型が 6.83×10-7 M であるのに対し、S223K 変異体とW231Y 変異体はそれぞれ 5.97×10-8 M と 1.34×10-7 M であった。また酵素活性測定を行ったところ、野生型の総活性と比活性はそれぞれ 4.36×104 Units と 9.75
Units/mg であるのに対し、S223K 変異体と W231Y 変異体はそれぞれ 7.88×103
Units と 1.97 Units/mg、7.60×104 Units と 23.57 Units/mg であった。この結果より、ドメインの間の相互作用を強化することにより Tk-SP の自己分解が抑制されることが示唆された。

Improvement of substrate inhibition and substrate specificity of glycine
oxidase from Geobacillus kaustophilus

The effect of propeptide binding affinity on maturation process of theprotease from a hyperthermophilic archaeon○Yuki Higashiura1, Ryusuke Oda1, Taishi Kawasaki1, Takaomi Nomura2,
Ryoichi Arai2, Yoshiaki Nishiya1(1Dept. Life Sci., Setsunan Univ. Sci. Eng., 2Dept. Appl. Biol., FTST, Shinshu Univ.)

Key words

glycine, oxidase, protein engineering, crystal structure○Nagao Masahide, Maegawa Daiki, Yamano-Adachi Noriko, Koga Yuichi,
Omasa Takeshi(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

subtilisin, thermostable enzyme, enzyme maturation

191

2Ap06

Protein trans-splicing を利用した耐熱性プロテアーゼ再
構成の検討

2Ap08

○巽 祐介, 山野-足立 範子, 古賀 雄一, 大政 健史（阪大院・工）kogay@mls.eng.osaka-u.ac.jp

アスパラギン合成酵素を用いた β-アスパルチル化合物合
成法の検討○山田 泰蔵 1, 林 順司 2, 豊竹 洋佑 1, 若山 守 1（1立命館大院・生命科学, 2徳島大・生物資源）
wakayama@sk.ritsumei.ac.jp【背景・目的】Tk-SP は超好熱古細菌 (始原菌) T. kodakarensis KOD1 のゲノム上にコードされた至適温度 100°C, 100°C における半減期が 100 分の耐熱性に優れた subtilisin-like serine protease である. この酵素は通常の酵素が変性, 失活してしまう条件下で安定性を維持できるため, 医療用酵素洗浄剤などへの応用が期待されている. しかし, Tk-SP を大腸菌で発現させると, そのタンパク質分解活性により増殖が妨げられ, 大量調製が困難である. そこで, protein trans-splicing (PTS) を触媒する split intein を用いた発現系を構築した. Tk-SP を二つに分割して, 一方に N-intein, もう一方に C-intein を付与し, ベクターを構築した. 発現後, split inteinの PTS により, Tk-SP を再構成することを目的とした.
【実験方法・結果】Nostoc punctiforme 由来の Npu-PCC73102 DnaE intein は, 極めて高い PTS 効率と反応速度 (t1/2 = 60 sec at 37°C ) を持つ split intein である. また挿入するアミノ酸配列の前後三つのアミノ酸残基 (隣接配列) によってスプライ
シング効率が変化することが知られている. Tk-SP を N 末端側タンパク質, C 末
端側タンパク質で分割して発現するときにフォールディングがうまく行われる
ように, 表面のループ部分にある V168, Y199, Y239, D307 を Npu DnaE intein の挿入箇所として設定した. これらの断片の発現を行ったところ, どの断片も増殖阻害を起こさず発現できた. Y239, D307 については N 末端側と C 末端側の断片のどちらも可溶性発現した. これらの断片について, カラム上で PTS を行う, PTS
on-column により Tk-SP を再構成し, 酵素活性を測定した. その結果, Y239 で再構成された Tk-SP が野生型と同程度の活性を示した. Tk-SP において, Npu DnaE
intein を利用した再構成系の構築に成功し, Y239 は PTS に適した挿入箇所であることが示唆された.

【背景】β-アスパルチル化合物は、アスパラギンの β カルボニル基がアミノ酸やアミンでアミド化された化合物である。β-L-Asp-L-Lys や β-L-Asp-L-Arg が肌や髪に対して保湿効果を有することは報告されているが、そのほか生理活性をもつ β-アスパルチル化合物は知られていない。しかしテアニンやグルタチオンなど、生理活性をもつ γ-グルタミル化合物は多く報告されており、β-アスパルチ
ル基と γ-グルタミル基はメチレン基１つの差異だけで構造が類似していることから、新規の生理活性を有する β-アスパルチル化合物の存在が期待される。この可能性を検討するには、まず β-アスパルチル化合物の生産法を確立する必要がある。そこで本研究では、Streptococcus thermophilus LMG 18311 株由来アス
パラギン合成酵素 (StAS) に着目し、L-アスパラギン酸のアミド化を利用した βアスパルチル化合物生産法を検討した。
【方法・結果】StAS 遺伝子を pET-28a(+)ベクターに組み込んだ発現プラスミド
を大腸菌 BL21(DE3)株に導入し、StAS の発現を誘導した。細胞破砕液をアフィ
ニティ精製および陰イオン交換精製に供した結果、高純度の StAS を得た。本酵素の最終精製倍率は 35.9 倍、収率は 43.4%であった。StAS の諸性質について調べたところ、至適温度が 37℃、安定温度が 30 ~ 40℃、至適 pH が pH 7.5、安定 pH が pH 5.5 ~ 9.0 であった。補因子の検討を行ったところ、本酵素の補因子は Mg2+が最適であった。StAS はドナー基質として L-アスパラギン酸を認識したが、D-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、D-グルタミン酸は認識しなかった。アクセプター基質としては、オリジナルの基質であるアンモニアだけでな
く、ヒドロキシルアミンおよびメチルアミンに対しても活性を示した。このことから、StAS を用いて様々なアミン由来の β-アスパルチル化合物を生産できる可能性が示された。

Studies on reconstruction of a thermostable protease using protein transsplicing

Synthesis of β-aspartyl compound using asparagine synthetase○Yusuke Tatsumi, Noriko Yamano-Adachi, Yuichi Koga, Takeshi Omasa(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)○Taizo Yamada1, Junji Hayashi2, Yosuke Toyotake1, Mamoru Wakayama1(1Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Grad. Sch. Bioresource, Tokushima
Univ.)

Key words

split intein, subtilisin, thermostable enzyme

Key words

asparagine synthetase, beta-aspartyl compound, amidation

2Ap07

Elizabethkingia sp. TT1 由来組換え L-アミノ酸エステ
ラーゼの高発現系の構築と菌体反応による Val-Gly 合成

2Ap09

Thermococcus kodakarensis 由来 β-アスパルチルトラン
スペプチダーゼ遺伝子のクローニング、発現および諸性質の解明○大西 敦也 1, 田中 貴大 1, 林 順司 2, 豊竹 洋佑 1, 若山 守 1（1立命館大院・生命科学, 2徳島大院・社会産理工）
wakayama@sk.ritsumei.ac.jp○深瀬 葵 1, 林 順司 2, 高木 一好 1, 豊竹 洋佑 1, 若山 守 1（1立命館大院・生命科学, 2徳島大院・社会産理工）
wakayama@sk.ritsumei.ac.jp【目的】
短鎖ペプチドはアミノ酸単体にはない優れた生理機能を有することなどから、
近年、酵素を利用したペプチド合成法に関する様々な研究が行われており、塩味、甘味、こく味など味覚に関わるものから血圧降下作用、疲労回復作用など
健康に関わるペプチドなど、幅広く研究成果が報告されている。本研究室では、
コク味物質として知られる γ-Glu-Val-Gly の構成成分である Val-Gly に着目し、本ペプチドの効率的合成法を確立することを目的として Val-OMe と Gly から
Val-Gly 合成能を持つ Elizabethkingia sp. TT1 由来 L-アミノ酸エステラーゼ(TT1LAE)を見出した。今回は、組換え TT1LAE の精製と諸性質、高発現系の構築及び Val-Gly の菌体反応を検討した。
【方法・結果】
Elizabethkingia sp. BM10 由 来 Cocaine esterase か ら プ ラ イ マ ー を 設 計 し 、Elizabethkingia sp. TT1 のゲノムより PCR によって目的遺伝子の増幅を行った。
シークエンス解析の結果、取得した遺伝子のアミノ酸配列と既報の L-アミノ酸
エステラーゼのアミノ酸配列に高い相同性(70%)が確認されたため、TT1LAE 遺伝子の取得に成功したと判断した。そこで、TT1LAE 遺伝子を pET22b(+)ベク
ターに組込み、大腸菌 BL21(DE3)株に導入した。酵素の精製を行い、諸性質を検 討 し た 結 果 、 本 酵 素 の 至 適 pH は 9.0 、 至 適 温 度 は 25℃ 、 安 定 温 度 は
25℃~40℃、安定 pH は 5.0~9.0 であった。続いて、結晶化に向けた大量発現系
として、pCold-TF ベクターに組込むことで、trigger factor との共発現による可溶性画分への高発現が確認でき、本酵素は TF の切断除去に関わらず Val-Gly 合
成活性を有することが分かった。また、将来的な生産系の検討として、pUC18
ベクターに組込み、Val-Gly の菌体内合成における培養条件を検討した。

【背景・目的】β-アスパルチルトランスペプチダーゼ（以下 BAT）は、L-アスパラギンとアミノ酸やアミンとの反応で β-アスパルチル化合物を合成する転移反応を触媒する酵素である。β-アスパルチル基とメチレン基１つのみ異なる構造をもつ γ-グルタミル基化合物は γ-グルタミルトランスペプチダーゼ（以下 GGT）によって合成され、有用な生理活性をもつ化合物の報告も多く、GGT について盛んに研究されている。一方、β-アスパルチル基と γ-グルタミル基の構造には類似性があるものの、生理活性を有する β-アスパルチル化合物の報告は少なく、BAT を用いた β-アスパルチル化合物の合成に関する報告は未だない現状である。本研究では安定性の高い BAT の取得を目的として、Thermococcus kodakarensis 由来
BAT（TkBAT）に着目した。TkBAT の遺伝子クローニング、大腸菌での発現および化学的諸性質について検討した。
【方法・結果】
T. kodakarensis のゲノムを鋳型として TkBAT 遺伝子を PCR により増幅した。増
幅 TkBAT 遺伝子を含む DNA 断片を pCold-TEV ベクターの NdeI と EcoRI サイ
ト へ 挿 入 し 、 発 現 プ ラ ス ミ ド pCold-TEV/TkBAT を 作 製 し た 。 pCold-TEV/
TkBAT で Escherichia coli BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL 株を形質転換し、TkBATを高発現させた。超音波破砕により無細胞抽出液を得たのちに、熱処理（70℃,
20 分間）、Ni2+アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを行い、精製酵素を得た。TkBAT の化学的諸性質について精製酵素を用いて検討した。TkBAT を 15 分間各温度で処理した結果、30℃処理の比活性を対照とした場合、50〜90℃においても 80 %以上の残存活性を維持することが分かった。TkBAT の至適温度、至適 pH、pH 安定性について E. coli K-12 株由来 BAT（EcBAT）との比較検討も行った。

High expression system of recombinant L-amino acid esterase from
Elizabethkingia sp. TT1 and Val-Gly synthesis in cell reaction

Cloning, expression and characterization of β-aspartyl transpeptidase genefrom Thermococcus kodakarensis○Atsuya Onishi1, Takahiro Tanaka1, Junji Hayashi2, Yosuke Toyotake1,
Mamoru Wakayama1(1Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Grad. Sch. Biosci. Bioind, Tokushima
Univ.)

Key words

dipeptide, Val-Gly, L-amino acid esterase○Aoi Fukase1, Junji Hayashi2, Kazuyoshi Takagi1, Yousuke Toyotake1,
Mamoru Wakayama1(1Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Grad. Sch. Biosci. Bioind, Tokushima
Univ.)

Key words

characterization, cloning, expression

192

2Ap10

Pseudomonas aeruginosa PAO1 株由来 γ-グルタミルトラ
ンスペプチダーゼ II C 末端領域の活性および安定性に
及ぼす影響

2Ap12

Immobilization and site directed mutagenesis of Trp525
residue of γ-Glutamyltranspeptidase from Pseudomonas
nitroreducens (PnGGT) to improve Theanine production○Putthapong Phumsombat1, Chiharu Sano1, Takao Hibi2,
Takafumi Itoh2, Junji Hayashi1, Yosuke Toyotake1,
Mamoru Wakayama1(1Coll. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Dept. Biosci. Fukui Prefectural
Univ.)
wakayama@sk.ritsumei.ac.jp○八田 誠二 1, 野々村 祐輝 1, 林 順司 2, 高木 一好 1, 豊竹 洋佑 1,
若山 守 1（1立命館大院・生命科学, 2徳島大院・先端技科）
wakayama@sk.ritsumei.ac.jp

γ-グルタミルトランスペプチダーゼ (GGT) は微生物から哺乳類に至るまで幅広く存在する酵素であり、γ-グルタミル基の転移反応と γ-グルタミル結合の加水分解反応を触媒する。近年、Helicobacter pylori の病原性について GGT の関与が報告され、病原性微生物由来 GGT の研究が盛んに行われている。当研究室
では、日和見感染症の原因菌である Pseudomonas aeruginosa PAO1 株の GGT に着目し、酵素化学的諸性質および生理的意義の解明を目的として研究を進めてきた。Gene Data Bank に登録されているゲノム解析情報から P.aeruginosa PAO1
株には GGT 遺伝子が３つ存在していると明らかになった。中でも PaGGT II は元の状態では発現および活性の確認が困難であったが、C 末端に His タグ配列を含むアミノ酸 25 残基を付加 (PaGGT II 25 a.a.) すると発現、活性を確認できた。立体構造予測を行うと、PaGGT II は C 末端ペプチド鎖が不自然に絡みつく構造が予測された一方で、PaGGT II 25 a.a.は絡みつきが解消された安定な構造が予測された。
本研究では PaGGT II の C 末端領域の修飾が酵素の活性および安定性に与える影響の評価を目的として、C 末端に付加するアミノ酸数の検討および特徴的な二次構造をもつ様にアミノ酸を付加し、酵素化学的諸性質の比較を行った。
C 末端に付加するアミノ酸数を変化させた PaGGT II を作製し、活性を評価すると 25 残基付加 PaGGT II が最も高い活性を示した。次に PaGGT II 25 a.a.の C 末
端が、α-Helix (Ala 19 残基)および Random coil (Gly 19 残基) をそれぞれ取るような PaGGT II で高い活性を示した。活性を確認できた 3 種の変異型 PaGGT II (25a.a.、Ala 19 残基、Gly 19 残基) の精製を行い、反応特性を比較したが有意な差はなかった。PaGGT II の C 末端は酵素活性に直接影響せず、フォールディング
および自己触媒プロセッシングに影響していると示唆された。

γ-Glutamyltranspeptidase (GGT) is a ubiquitous enzyme that catalyzes the hydrolysisof the γ-glutamyl linkage of γ-glutamyl compounds and the transfer of their γ-glutamyl
moiety to acceptor substrates. GGT is found in various organisms from bacteria tomammals and plays a key role in the metabolism of extracellular reduced glutathione.
Currently, bacterial GGT have been interested in their use in synthesis of various γglutamyl compounds in the food and pharmaceutical industries such as γ-glutamyl
DOPA, γ-glutamyltaurine and especially food additive which gives an Umami taste,
Theanine produced by Pseudomonas nitroreducens (PnGGT). In our previous study,site direct mutagenesis by substituting various amino acids for Trp525 residue of
PnGGT revealed that Trp525 is a key amino acid residue in determining the degree of
involvement of water molecules in the reaction. Moreover, mutant enzyme (W525D)
exhibited the highest transfer activity with lowest hydrolysis activity and also bestproduction of theanine from ethylamine and L-glutamine. This study aims at applying
W525D mutant E. coli recombinant strain to immobilization by using immobilizers
such as calcium-alginate to improve efficiency of theanine production. The catalytic
properties of immobilized cells have been evaluated in pH and thermal stability andreusability. As a result, it has been indicated that immobilized cells of W525D showed
the optimal production of theanine at pH 11 and 50 °C with substrate molar ratio of
1:10, L-glutamine : ethylamine.

Effect on activity and stability of γ-glutamyl transpeptidase II C-terminal
region from Pseudomonas aeruginosa PAO1 strain

Immobilization and site directed mutagenesis of Trp525 residue of γGlutamyltranspeptidase from Pseudomonas nitroreducens (PnGGT) to
improve Theanine production○Seiji Hatta1, Yuki Nonomura1, Junnji Hayashi2, Kazuyoshi Takagi1,
Yosuke Toyotake1, Mamoru Wakayama1(1Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Grad. Sch. Adv. Technol. Sci.,
Tokushima Univ.)○Putthapong Phumsombat1, Chiharu Sano1, Takao Hibi2, Takafumi Itoh2,
Junji Hayashi1, Yosuke Toyotake1, Mamoru Wakayama1(1Coll. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Dept. Biosci. Fukui Prefectural Univ.)

Key words

gamma-glutamyltranspeptidase, Pseudomonas aeruginosa, C-terminal

Key words
Theanine, immobilization, Pseudomonas nitroreducens, gammaglutamyltranspeptidase

2Ap11

Pseudomonas nitroreducens 由来 γ-グルタミルトランス
ペプチダーゼの構造と機能に関する研究

2Ap13○池添 浩輝 1, 林 順司 2, 豊竹 洋佑 1, 若山 守 1（1立命館大院・生命科学, 2徳島大・生物資源）
wakayama@sk.ritsumei.ac.jp

L-アミノ酸を起点とするピラジン合成酵素群の発見とその解析○本山 智晴 1,2, 中野 祥吾 1, 山本 雄大 3, 常盤 広明 3, 浅野 泰久 4,伊藤 創平 1（1静県大院・薬食生命, 2日本学術振興会, 3立教大・理, 4富山県
大・工）itosohei@u-shizuoka-ken.ac.jp【背景】γ-グルタミルトランスペプチダーゼ (GGT) は、γ-グルタミル化合物の γグルタミル基を他のアミノ酸へ転移する反応と、γ-グルタミル化合物を加水分解する反応を触媒する。茶の旨味成分として知られるテアニンは γ-グルタミル
エチルアミドであり、産業的には Pseudomonas nitroreducens 由来 GGT (PnGGT)
によって酵素合成される。テアニン合成能をさらに効率化するためには、PnGGTの触媒反応を決定づける構造的要因や基質認識に関わる構造的基盤を明らかにする必要がある。X 線結晶構造解析の結果、PnGGT は活性部位周辺に存在する
3 種のアミノ酸残基 (Trp385、Phe417、Trp525) が触媒反応に関与することが示唆された。本研究ではこのうちの Trp385 に着目し、触媒反応における本残基の役割を解析した。
【方法、結果】Trp385 を 4 種のアミノ酸 (Ala、Ser、Asp、Lys) それぞれに置換し、変異型 GGT (W385A、W385S、W385D、W385K) を得た。このうち、W385A
は酵素前駆体として不溶性画分に発現し、W385D は可溶性画分、不溶性画分ともに発現がみられなかった。このことから、Trp385 は本酵素の発現や成熟に寄与することが示唆された。一方、W385S および W385K は可溶性画分に発現した。p-nitroaniline および γ-L-glutamyl hydroxamate を指標に、これら変異型の活性を測定した結果、野生型 GGT とは逆に転移活性が加水分解活性を上回ることが示された。このことから、Trp385 は本酵素の加水分解反応において、水分子との相互作用に重要な役割を担うことが示唆された。次に、受容体基質特異性について検討したところ、変異型は野生型と比較してメチルアミンにおける基質特異性が高く、イソプロピルアミン、Gly、Ala、Cys、Glu、Tyr および Lys
に対しては活性が著しく低かった。このことから、Trp385 は本酵素の基質認識機構にも寄与していることが示唆された。

【目的】生物に広く存在し、医薬品や香料でもあるピラジン化合物は、非酵素的に産生されると考えられてきた。しかし、いくつかの細菌で、L-スレオニン (LThr) からピラジンが生合成されることが示唆されている。我々は、短鎖型 L-ス
レオニン脱水素酵素 (TDH) に加え、新たにピラジン合成に関与する酵素 (PyrS)
を複数の細菌のゲノム上に見出し、PyrS が TDH の代謝物からピラジンを合成することを発見した。本研究では、ピラジン合成に関与するこの酵素群の各種解析を行い、L-Thr を起点とする新規ピラジン合成機構の解明を試みた。
【方法】TDH に関しては、高分解能 X 線結晶構造、量子化学計算、変異体解析
により分子レベルで生成物脱離機構を解明した。PyrS に関しては、GC/MS により基質や生成物の検討を行った。加えて、立体構造を決定し、活性中心の同定を行った。
【結果・考察】TDH の X 線結晶構造解析の結果、生成物である 2-amino-3ketobutyrate (AKB) 結合構造を含む計 4 つの構造を分解能 1.2−1.9 Å にて決定した。構造比較の結果、基質の結合による D179 側鎖の構造変化に連動し、活性部位が開構造から閉構造へ切り替わることが示唆された。また、超高分解能構造を用い、量子化学計算フラグメント分子軌道法により、AKB とその周辺のアミノ酸との相互作用エネルギーを求めた。結果、基質に対して誘導適合した
D179 側鎖が AKB に対して強い反発的な相互作用を持つことが見出された。つ
まり D179 側鎖が、基質の結合に伴い活性部位を閉構造にする機能と、反応産物を感知し、活性部位を再び開構造にする機能を合わせ持つことを見出した。
PyrS に関しては GC/MS を用いた分析により、TDH の代謝物からピラジンを合成することが示された。さらに活性中心をアラニンに置換した変異体の活性が著しく低下したことから、ピラジン合成が酵素反応によるものであることを確認した。

Studies on structure and function of the γ-glutamyltranspeptidase from
Pseudomonas nitroreducens

Discovery of pyrazine synthesis enzymes originating from L-amino acids
and its analysis

Key words
gamma-glutamyltranspeptidase, Pseudomonas nitroreducens, gammaglutamyl compounds, substrate recognition

Key words○Hiroki Ikezoe1, Junji Hayashi2, Yosuke Toyotake1, Mamoru Wakayama1(1Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Fac. Bioresource, Tokushima Univ.)○Tomoharu Motoyama1,2, Shogo Nakano1, Yuta Yamamoto3, Hiroaki Tokiwa3,
Yasuhisa Asano4, Sohei Ito1
(1Grad. Sch. Integr. Pharm. Nutr. Sci., Univ. Shizuoka, 2JSPS, 3Rikkyo Univ., 4Fac.
Eng., Toyama Pref. Univ.)
L-threonine 3-dehydrogenase, reaction mechanism, pyrazine

193

2Ap14

trans-3-ヒドロキシプロリンの実用生産に向けたバイオ
プロセス開発2Ap16○原 良太郎 1,4, 西川 健幸 2, 奥原 拓也 2, 纐纈 健人 3, 木野 邦器 1,2（1早大・理工総研, 2早大・先進理工, 3協和発酵バイオ, 4京大院・農）kkino@waseda.jp【目的】ヒドロキシプロリン（Hyp）は医薬原料として有用である。天然の LHyp には、4 種類の位置・立体異性体があり、このうち 3 種類（trans-4-Hyp、
cis-4-Hyp、cis-3-Hyp）はプロリンを直接水酸化する酵素を用いた工業生産が可能である。しかし、trans-3-Hyp には工業生産に対応する酵素が無い。最近、糸状菌由来プロリン水酸化酵素に trans-3-Hyp 合成活性が報告されたが、検討した
ところヒドロキシ基の位置選択性が低く、主生成物は trans-4-Hyp であった。一方、我々は L-プロリンを trans-3-Hyp に変換可能な水酸化酵素を見出している
1)。本発表では、当該酵素を利用した実用的な trans-3-Hyp 生産のためのプロセス開発を報告する。
【方法・結果】好塩菌および放線菌由来のエクトイン水酸化酵素（EctD）遺伝
子を PCR で増幅し、ベクターに連結後、大腸菌で発現させた。組換え酵素を精製し、基質特異性を検討したところ、L-プロリンを水酸化して trans-3-Hyp を生成したが、trans-4-Hyp などの異性体の副生は全く見られなかった。この結果はEctD と trans-3-Hyp のドッキングシミュレーションにより妥当と考えられた。
また、構造類似体である 3,4-デヒドロ-L-プロリンや、2-メチル-L-プロリン、Lピペコリン酸に対する水酸化活性も認められた。続いて、ectD 遺伝子発現大腸菌を触媒とした L-プロリンから trans-3-Hyp への変換反応を検討した。その結果、共基質である 2-オキソグルタル酸の枯渇に起因する反応停止が見られた。
そこで、2-オキソグルタル酸の分解経路を遮断した株を造成し、同反応に供したところ、予想通り trans-3-Hyp 合成収率が向上した 2)。
1) 原ら、日本生物工学会 2014 年度大会講演要旨集、1P-103
2) R. Hara et al., Appl Microbiol Biotechnol, DOI: 10.1007/s00253-019-09868-y, inpress

アデニル化酵素を利用したフェルラ酸アミド合成法の開発○鈴木 伸, 早田 優理, 木野 邦器（早大・先進理工・応化）
kkino@waseda.jp【背景・目的】フェルラ酸は植物細胞壁の構成成分であり、自然界に豊富に存在する再生可能資源である。このフェルラ酸と各種アミン類との縮合化合物であるフェルラ酸アミドは、植物種子の発芽抑制作用やインスリン分泌促進作用な
どの有用な生理活性を示すことが報告されている。フェルラ酸アミドは有機合
成化学的手法により合成可能であるが、多段階反応で煩雑、副生成物の生成、有毒試薬や有機溶媒による環境負荷等の課題がある。一方我々は、基質のカルボキシ基をアデニル化する酵素反応とアミンによる求核置換反応を組み合わせたアミド結合形成反応を見出している 1)。そこで、フェルラ酸をアデニル化可能な酵素を探索・利用することで、簡便かつ環境調和性の高い新規合成法を開発できると考えて検討した。
【方法・結果】目的酵素の候補として Pseudomonas putida KT2440 由来 feruloylCoA synthetase (FCS)および Arabidopsis thaliana 由来 4-coumarate: CoA ligase(At4CL1, At4CL2)に着目した。これら遺伝子を大腸菌にて異種発現させ、その精製酵素を用いて検討を行った。まず比色分析 2)による基質特異性評価を行ったところ、いずれの酵素もフェルラ酸とその類縁体であるクマル酸および桂皮酸に対して活性を示した。そこで、フェルラ酸に対する活性が最も高い At4CL2を用いてフェルラ酸アミドの合成を試みた。フェルラ酸に対して 5 種類のアミン(メチルアミン、ジメチルアミン、ピペリジン、L-Pro、D-Pro)を ATP およびMg2+存在下で反応させたところ、HPLC 分析において、すべての反応液で新規ピークを検出した。さらに生成物の分取・精製後の MS 分析では推定されるアミド化合物の分子量と一致するピークが検出され、フェルラ酸アミドの合成が確認できた。
1) Hara, R., et al., Sci. Rep., 8:2950 (2018)
2) Hara, R., et al., Anal. Biochem., 477, 89-91 (2015)

Development of bioprocess for practical trans-3-hydroxyproline production

Synthesis of ferulic acid amides by a novel chemoenzymatic process

Key words
trans-3-hydroxyproline, 2-oxoglutarate, ectoine hydroxylase, selectivehydroxylation

Key words

ferulic acid, adenylation enzyme, amide bond formation

D-アミノ酸含有ジペプチドの汎用的な酵素合成法の開発

2Ap17

Proteus vulgaris 由来 L-アミノ酸デアミナーゼの機能解析とアンモニア生産への応用○Ryotaro Hara1,4, Takeyuki Nishikawa2, Takuya Okuhara2, Kento Koketsu3,
Kuniki Kino1,2(1Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ., 2Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 3KYOWA
HAKKO BIO CO., LTD., 4Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)

2Ap15○勝目 智也, 鈴木 伸, 木野 邦器（早大・先進理工・応化）
kkino@waseda.jp○Shin Suzuki, Yuri Hayata, Kuniki Kino
(Dept. Appl. Chem., Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)○宮澤 沙哉佳, 梅澤 覚, 木野 邦器（早大院・先進理工・応化）
kkino@waseda.jp【目的】 D-アミノ酸含有ペプチドは、L-アミノ酸のみで構成されるペプチドに比べて、機能増強や新規生理活性を発現する可能性が示されているが、その効率的な合成法は開発されていない。我々は、非リボソーム型ペプチド合成酵素のアデニル化ドメイン（A ドメイン）によるアミノ酸のアデニル化とアミノ基による求核置換反応により、多様なジペプチドが合成可能であることを報告している 1)。本法では、ジペプチドの N 末端側にはアデニル化基質となるアミノ酸が、C 末端側には求核剤となる任意のアミノ酸が導入可能になり、これまでに D-アミノ酸からなるジペプチドの合成に成功している 2)。本研究では、合成可能な D-アミノ酸含有ジペプチドの種類拡張を目的とし、D-アミノ酸をアデニル化可能な酵素の探索とジペプチド合成への利用を検討した。
【方法・結果】 D-アミノ酸を基質とするアデニル化酵素として、Bacillus subtilis
168 由来の DltA に着目した。DltA においては、複数の D-Xaa （Xaa=Ala, Cys,
Ser, Thr, Val） を認識し、L-Cys の化学的特性を利用した D-Xaa-L-Cys の合成が報告されている 3)。この反応にはチオール基の存在が不可欠と考えられてきたが、我々の開発した合成法のコンセプトを踏まえると C 末端側に任意のアミノ酸が導入可能と推測した。そこで DltA の基質 D-Xaa に対して、求核剤としてチオール基を持たない D-Pro を用いて検証を行った。LC/MS 分析から、予想されるジペプチド D-Xaa-D-Pro の生成が確認された。本研究によって、我々の合成プロセスの汎用性が示され、D-アミノ酸含有ジペプチド合成の種類拡張にも成功した。
1) R. Hara, et al., Sci. Rep., 8:2950 (2018)2) S. Kano, et al., Appl. Environ. Microbiol., DOI: 10.1128/AEM.00120-19 (2019)3) T. Abe, et al., J. Biol. Chem., 291, 1735-1750 (2016)【背景・目的】L-アミノ酸デアミナーゼ（LAAD）は、L-アミノ酸のアミノ基を酸化的に脱離して α-ケト酸およびアンモニアを生成する酵素で、Proteus 属細菌
においては幅広いアミノ酸に対する脱アミノ反応が報告されている。P. mirabillisには基質特異性の異なる 2 種類の LAAD が存在し、脂肪族および芳香族アミノ酸に作用する type1 と塩基性アミノ酸に作用する type2 の 2 種類が報告されている 1)。一方、P. vulgaris は高い LAAD 活性を有するが、詳細な検討は type2 のみであり、type1 の機能は明らかになっていない。本研究では、pvLAAD type1を新たに取得し、基質特異性解析と反応条件の最適化を行った。一方、多くのアミノ酸に対して活性を有する LAAD は、クリーンなエネルギー源である水素のキャリアとして注目されるアンモニアの、常温・常圧で効率的な生産が可能であり、持続可能な社会の実現に資すると考えている。
【方法・結果】既報 2)の pvLAAD type2 をクエリーとして、P. vulgaris IAM12003
株のゲノム配列に対する BLAST 検索から type1 を見出し、同ゲノムを鋳型として目的遺伝子を取得した。当該酵素を大腸菌の膜結合型組換え酵素として発現
させ、L-Ile を基質として脱アミノ化反応における至適反応条件を検討した。その結果、25℃、pH 9.0 において最も高い活性を示し、1 hr の反応で 10 mM の LIle をほぼ完全に脱アミノ化した。続いて、20 種類の L-アミノ酸に対する基質
特異性を調べた結果、L-Ile や L-Tyr 等の脂肪族および芳香族アミノ酸に対して高活性を示した。pvLAAD をはじめ、多様なアミノ酸を基質とする LAAD を組み合わせることで、効率的なアンモニア生産プロセスの開発が可能であることが示された。
1) J.-Oh Baek, et al., J. Basic Microbiol., 51, 129-135, (2011).
2) E. Takahashi, et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 63, 2244-2247, (1999).

Development of an enzymatic method for production of D-amino acidcontaining dipeptides

Characterization of L-amino acid deaminase from Proteus vulgaris andapplication to ammonia production○Tomoya Katsume, Shin Suzuki, Kuniki Kino
(Dept. Appl. Chem., Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words
adenylation

D-amino acid-containing dipeptide, chemoenzymatic synthesis, DltA,○Sayaka Miyazawa, Satoru Umezawa, Kuniki Kino
(Dept. Appl. Chem., Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words

L-amino acid deaminase, Proteus vulgaris, ammonia, alpha-keto acid

194

2Ap18

Bacillus sp.由来のシアン分解活性を示す新規ニトリラー
ゼの発現・精製と機能・構造解析

2Bp02○佐々木 春弥 1, 小川 貴弘 2, 小松 大祐 2,3, 加賀谷 夏海 4,
松村 洋寿 1, 尾高 雅文 1, 養王田 正文 2
（1秋田大院・理工, 2農工大院・工, 3アイ・エス・ソリューション, 4秋田大・理工）
modaka@gipc.akita-u.ac.jp

α-1,3-glucanase を含む溶菌酵素溶液を利用した
Aspergillus tubingensis (A. niger) からのプロトプラスト形成○石原 真奈, 楊 俐聡, 吉岡 育哲, 桐村 光太郎（早大・先進理工）
kkohtaro@waseda.jp【目的】
Aspergillus 属糸状菌の細胞壁にはグルカンやキチンなどが含まれており、これを浸透圧調整条件下で溶菌酵素を用いて除去することによってプロトプラストが形成される。演者らは、クエン酸生産糸状菌 Aspergillus niger WU-2223L（注：現在は A. tubingensis に再同定）等を供試菌としてプロトプラスト融合や遺伝子工学による育種を行ってきた[1]。しかし、β-1,3-glucanase と chitinase のみでは不十分で、高収量プロトプラスト形成にはさらに別種の酵素が必須である[2]。
本研究では、第 3 の溶菌酵素成分として α-1,3-glucanase (EC 3.2.1.59) に着目し、Aspergillus Section Nigri 糸状菌の菌糸からのプロトプラスト形成条件について検討した。

【概要と目的】シアン化合物はメッキ工場や金属表面加工工場等、産業的に様々な用途で使われている。しかし、シアン化合物は、細胞内呼吸阻害を引き起こす毒性の高い物質であり、安定であるため、生分解、化学的分解を受けにくい。
そのため、土壌や地下水に漏洩すると長期間環境中に残留してしまう問題があり、土壌汚染対策法の第二種特定有害物質に指定されている。そのため、汚染された土壌では、主として掘削による物理的除去が行われているが、膨大な費用を要するため、原位置における微生物分解による浄化が期待されている。これまでにシアン分解活性を示す酵素はいくつか報告されているが、詳しい構造・機能は明らかにされていない。近年、小松と養王田らは、シアン汚染地下水からシアン分解活性を示す Bacillus 属の菌株を単離した。本研究では、Bacillus
sp.由来シアン分解酵素の組換え体を大腸菌で発現させて大量調製し、その生化学的特性と構造解析を試みたので、報告する。
【結果及び考察】 一次構造の相同性から、シアン分解酵素はニトリラーゼであることがわかった。Bacillus sp.由来ニトリラーゼ遺伝子を pET23 に挿入した発
現系プラスミドを大腸菌 BL21(DE3)に導入して大量培養した。菌体を超音波破砕し、弱及び強陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー
等を組み合わせて、Bacillus sp.由来ニトリラーゼを単一精製した。シアン分解
活性は、シアンイオンをクロラミン T と反応させたあと、ピリジン−バルビツ
ル酸との反応で生じる紫色色素を比色定量する方法で評価した。また、現在、精製酵素の結晶化に取り組んでいる。講演では、得られた最新のデータを含めて紹介する。

【方法および結果】
演者らは、大腸菌を宿主として Paenibacillus humicus NBRC 102415T 由来 α-1,3glucanase の組換え酵素を作製し実験に使用した。A. tubingensis WU-2223L 菌糸に β-1,3-glucanase (Zymolyase-20T)と chitinase とともに作用させ、プロトプラストの形成数を指標に α-1,3-glucanase の効果を検討した。湿重量 100 mg の菌糸に3 mL の溶菌酵素溶液を作用させた場合、2 h 後のプロトプラスト数は β-1,3glucanase と chitinase の場合は 106/mL 以下であったが、α-1,3-glucanase をさらに添加した場合は 2.9×107/mL に増大した。また、A. niger を含む他の Aspergillus
Section Nigri 糸状菌についてもプロトプラスト形成条件を検討し、α-1,3-glucanaseが高収量プロトプラスト形成に必須な酵素であることを明らかにした。
[1] Kirimura, K. and Yoshioka, I., Bio-based chemicals, citric acid., in: Murray M. Y.
(Ed.), Comprehensive Biotechnology, vol. 3., Elsevier, London, in press (2019).
[2] Kirimura, K., and Usami, S., Sci. Engineer. Res. Lab., 115, 1-5 (1986).

Recombinant expression, purification, and biochemical and structuralcharactrization of novel nitrilase degrading cyanide ion.

Protoplast Formation from Aspergillus tubingensis (A. niger) Mycelia Using
Lytic Enzyme System Containing α-1,3-Glucanase○Haruya Sasaki1, Takahiro Ogawa2, Daisuke Komatu2,3, Natsumi Kagaya4,
Hirotoshi Matumura1, Masafumi Odaka1, Masafumi Yohda2(1Grad. Sch. Eng., Sci., Akita Univ., 2Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.,3
IS-solution Co.,, 4Faculty of. Sci. and Eng., Akita Univ.)○Mana Ishihara, Licong Yang, Isato Yoshioka, Kohtaro Kirimura(Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words

bioremediation, cyanide ion, biodegradation, nitrilase

Key words
protoplast

Aspergillus niger, Aspergillus tubingensis, alpha-1, 3-glucanase,

2Bp01

養菌性キクイムシと共生するセルロース資化性糸状菌が生産するセルラーゼの同定と機能解析

2Bp03

リゾクトニア属糸状菌の分泌酵素群による水稲伝染性糸状菌類の防除

○堤 星太郎 1, 酒井 杏匠 1, 山口 愛彩 1, 都築 翔 1, 鈴木 啓仁 2,
梶村 恒 2, 志水 元亨 1, 加藤 雅士 1
（1名城大院・農, 2名大院・生命農学）
mkato@meijo-u.ac.jp

原 富次郎, 高塚 由美子, ○Da Xia, 関 未央
（京大・エネ研）
t-hara@iae.kyoto-u.ac.jp【目的】
養菌性キクイムシの一種であるアイノキクイムシ Euwallacea interjectus は菌類と共生関係を築いている。すなわち、樹木に穿孔して坑道を形成する際に、マイカンギアと呼ばれる胞子貯蔵器官内に貯蔵している菌類を坑道に接種し、生育した菌類を摂食する。これまでに、養菌性キクイムシが形成する坑道内の微生物叢を網羅的に解析した例はほとんどなく、共存するそれぞれの微生物の役
割は未解明である。本研究では、アイノキクイムシが穿入したイチジク坑道内の菌叢を網羅的に解析し、その中からセルロース資化性菌の単離および、同菌が生産するセルラーゼを同定し機能を明らかにすることを目指した。
【方法・結果】
我々は、DGGE 解析によりアイノキクイムシが穿入したイチジク坑道内から 15
種類の細菌と 1 種の真菌を見出した。また、アイノキクイムシを破砕後、セル
ロースを唯一の炭素源にした培地にて共生する菌を集積培養することで、セルロース資化性菌 Fusarium oxyspoum EI 株を単離した。この EI 株は DGGE 解析で同定された真菌と同一であった。EI 株が生産する主要なセルラーゼを同定するため、セルロースを唯一の炭素源とする培地で培養し、培養ろ液中のセルラー
ゼを活性染色にて検出した。25 kDa 付近に高いセルラーゼ活性を持つバンドが検出され、このバンドを MALDI-TOF-MS にて解析したところ、Glycoside
Hydrolase 12 ファミリーに属する酵素であった。この酵素を Pichia pastoris にて異種発現させ、その機能を解析したところ、キシログルカンに対して高い加水分解活性を有していたため、この xyloglucanase を FoXEG12A と命名した。現在、詳細な酵素学・生理学的解析を進めている。

我が国の稲作における病害の多くが植物伝染性糸状菌によるものであることは良く知られる。以前に、原と髙塚らは本学会にて、バシラス綱細菌群が分泌するグリコシダーゼ類を有効成分とする複合微生物触媒が、トマト菌核病を高い奏功で防除することを報告した（２０１５年・鹿児島）。今回我々は、植物伝染性糸状菌の一種であるリゾクトニア属菌株が分泌する複合酵素群（以下、「粗酵素」）が、水稲伝染性糸状菌であるフザリウム属、ピシウム属、リゾプス属、トリコデルマ属、リゾクトニア属、ピリキュラリア属の６株のうち、２株の菌糸生長と、さらに１株の分生子形成を阻害したので報告する。本研究で使用した
粗酵素は、リゾクトニア・ソラニＤ１３８株をふすま（麩）培養し、その麩麹から水抽出をおこなった後、ＭＦ膜濾過、ＵＦ膜濃縮、アセトン沈殿を経て、減圧真空乾燥で粉末化して調製した。本粗酵素は、β-グルカンであるパキマン、
ラミナラン、酵母由来グルカンに対して分解活性を示す他、プロテアーゼ活性も示す複合反応型の加水分解酵素群で構成される。本粗酵素と水稲伝染性糸状菌とを９６穴プレート内で混和反応（ウエルアッセイ法）させた結果、30mg/ml 以上の濃度でトリコデルマ・ビリデＮＢＲＣ３０５４６株とピリキュラ
リア・グリセアＭＡＦＦ１０１５１８株の菌糸生長を阻害し、トリコデルマ菌株に対しては顕著な溶菌作用が確認できた。また、フザリウム・フジクロイＭ
ＡＦＦ２３５９４９株に対しては、分生子形成の遅延あるいは抑制が観察された。現在、ウエルアッセイ法による抗糸状菌活性を指標として酵素の分画精製を行っている。複数の活性画分を認めており、水稲伝染性糸状菌に対する抗菌性が加水分解活性のみによるものか、あるいは他の酵素活性が関与しているか等について、詳細を検討している。

Identification and characterization of cellulase from the cellulose-degrading
ectosymbiotic fungus Fusarium oxysporum strain EI cultured by theambrosia beetle

The enzymes derived from Rhizoctonia solani inhibit the growth of riceinfectious filamentous fungi

Key words
ambrosia beetle, Fusarium oxysporum strain EI, ectosymbiotic fungi,
xyloglucanase

Key words
fungi○Seitaro Tsutsumi1, Kiyota Sakai1, Aya Yamaguchi1, Syo Tsuzuki1,
Yoshihito Suzuki2, Hisashi Kajimura2, Motoyuki Shimizu1, Masashi Kato1(1Grad. Sch. Agric., Meijo Univ., 2Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)

Tomijiro Hara, Yumiko Takatsuka, ○Xia Da, Mio Seki
(IAE, Kyoto Univ.)

biocontrol, enzyme, hydrolysis reaction, rice infectious filamentous

195

2Bp04

真菌細胞壁分解酵素を基盤とした抗真菌システムの開発○平良 東紀 1, 津波古 遥奈 1, 矢野 成和 2, 上地 敬子 1
（1琉球大・農, 2山形大院・理工）
tokey@agr.u-ryukyu.ac.jp

2Bp06

ホタル生物発光のアルパカ抗体による制御○小野 陽介 1, 鶴田 篤弘 1, 有馬 一成 1, 伊東 祐二 1, 赤澤 陽子 2,
中島 芳浩 2, 加藤 太一郎 1（1鹿児島大学 理工学研究科 生命化学専攻, 2産総研）
kato@sci.kagoshima-u.ac.jp

植物は病原性真菌の感染を防ぐための因子として真菌細胞壁分解酵素を持つ。
また，細菌類には真菌細胞壁の資化分解のための酵素を持つものがある。真菌
細胞壁の主な構成多糖であるキチンおよびグルカンを分解する酵素の一部が抗真菌活性を示すことが知られている。これら真菌細胞壁分解酵素は，細胞膜や細胞質内に作用点を持つ抗菌性ペプチドおよび抗真菌剤の細胞膜へのアクセスや膜透過性を促進する効果が期待される。本研究では真菌細胞壁分解酵素を基盤とする新奇抗真菌システムの開発を目指し，作用点の異なる複数の真菌細胞壁分解酵素同士の組合せおよび市販の抗真菌剤との相乗効果について検討した。
キチナーゼは熱帯樹木ガジュマル（Ficus microcarpa）乳液由来キチナーゼ-B（GlxChiB）を，β-1,3-グルカナーゼは Zymolyase（MC フードスペシャリティー
社製）を，α-1.3-グルカナーゼは Paenibacillus 14B 株由来 PbAgl-B を用いた。抗真菌剤としては β-1,3-グルカン合成酵素阻害剤であるミカファンギン（Toronto
Research Chemicals 社製）を用いた。供試菌株としては，Trichoderma viride，Aspergillus luchuensis，Candida glabrata を用いた。
キチナーゼは単独で，T. viride に対して強い抗真菌活性を示した。A. luchuensis
に対して，キチナーゼ，β-1,3-グルカナーゼおよび α-1.3-グルカナーゼ単独では抗真菌活性を示さなかったが，これら 3 種の酵素を混合し作用させることによって，強い抗真菌活性を示すことが分かった。キチナーゼのみでは C. glabrate の生育を抑制することはできなかったが，キチナーゼとミカファンギンを併用した場合，ミカファンギンの最少阻止濃度を 4 分の 1 にまで減少させることができた。

【研究目的】 ホタル生物発光は酵素ホタルルシフェラーゼの触媒活性により基質 D-ルシフェリンが励起状態のオキシルシフェリンへと変換されることで生じる。本反応は ATP の定量や in vivo イメージング時のバイオマーカーとしてライフサイエンス分野にて幅広く利用されている。バイオマーカーとして利用する際に細胞内で発光活性を制御する一般的な方法は、遺伝子レベルで酵素タン
パク質の発現量を調節することである。しかし私は、このような既存の方法とは異なる、タンパク質レベルでの酵素機能制御法を確立したいと考え、この活性制御にアルパカ由来抗体 VHH を用いることを計画した。つまり、発現している酵素タンパク質の量は一定でありながら、抗体によってその機能が制御できれば、既存の方法とは異なる作用機序の発光活性制御法を提案できると考えた。よって本研究では、ホタルルシフェラーゼに特異的に結合し、かつその発光活性を阻害する抗体の探索を行うとともにその特性を調べた。さらに、得られた阻害抗体を二量化することにより、さらなる阻害能力の向上を試みた。
【研究材料と方法】 ファージディスプレイ法により、ヒカリコメツキムシ由来
ルシフェラーゼ(E-luc)に特異的に結合する 9 種の VHH 抗体が得られた。これらを大腸菌 HB2151 株にて発現・精製し、E-luc に対する発光阻害実験を行った。
また、Biacore による結合力測定、ELISA による結合ドメインの特定、速度論解
析による阻害様式の確認を行った。さらに、抗体の二量化により、阻害能力能力の向上を試みた。
【結果と考察】9 種の VHH を用いた発光阻害実験の結果、E-luc の発光量を 20%以下に抑える#6 が得られた。また、結合力、結合ドメイン、阻害様式を確認した。得られた知見を基に、抗体の二量化を行い、結合力と阻害能力の向上が確認された。

Development of antifungal system based on fungal cell wall degrading
enzymes

The controlling of the bioluminescent activity of firefly luciferase by alpaca
VHH antibody○Toki Taira1, Haruna Tsuhako1, Shigekazu Yano2, Keiko Uechi1(1Fac. Agric., Univ. Ryukyus, 2Grad. Sch. Sci. Eng., Yamagata Univ.)○Yosuke Ono1, Atsuhiro Tsuruta1, Kazunari Arima1, Yuji Ito1, Yoko Akazawa2,
Yosihiro Nakajima2, Daiichiro Kato1(1Dept.Bioscience,Grad.Sch.Sci. Eng.,Kagoshima Univ., 2AIST)

Key words

antifungal, chitinase, alpha-1, 3-glucanase, beta-1, 3-glucanase

Key words

firefly luciferase, bioimazing, alpaca VHH antibody, phage display

2Bp05

Bacillus cereus が形成するシリカ層より発見された長鎖ポリアミンの合成メカニズムの解析

2Bp07

シークワァーサー由来フラボノイドメチル化酵素の分子改変およびポリメトキシフラボノイド生産への応用○山本 光士郎 1, 池田 丈 1,2, 舟橋 久景 1,2, 廣田 隆一 1,2,
黒田 章夫 1,2
（1広島大院・先端物質, 2広島大院・統合生命科学）
ikedatakeshi@hiroshima-u.ac.jp○戸田 弘, 伊藤 伸哉（富山県大・生医工研セ）
htoda@pu-toyama.ac.jp【目的】当研究室では、Bacillus cereus が可溶性のケイ酸(Si[OH]4)を取り込み、細胞内で重合して胞子表面に不溶性のシリカ(SiO2)の層を形成することを発見した。シリカ層の形成メカニズムの解明に向けて、シリカ層の内部に存在する有機物の解析を行ったところ、長鎖ポリアミン(long-chain polyamine; LCPA)が存在することを発見した。一般的なポリアミンはアミノ基が 4 個以下であるのに対し、発見された LCPA にはアミノ基の数が 50 を超える非常に長いものも存在した。真核生物である珪藻や海綿が形成するシリカの内部からもよく似た構造の LCPA が発見されていることから、LCPA はシリカの形成において重要な役割を担っていることが示唆された。LCPA の合成メカニズムは未だ不明である
ため、本研究ではその解明を目指した。
【方法・結果】LCPA の化学構造より、アミノプロピル基転移反応が繰り返されることで LCPA が伸長されると予想された。相同性検索により、LCPA 合成に関与すると予想されるアミノプロピル基転移酵素の候補遺伝子 BC5213 を発見した。BC5213 は下流の BC5214 遺伝子とオペロンを形成しており、BC5214 はアミノプロピル基供与体として働く dcAdoMet の合成を担う酵素 AdoMetDC をコードしていると予想された。そこで本オペロンの破壊株を作製したところ、LCPA が検出されなくなったことから、予想通り本オペロンが LCPA 合成に必須であることが確認された。続いて、大腸菌にて組換えタンパク質の発現を試みた。大腸菌には内在性の AdoMetDC が存在するため、BC5214 は LCPA 合成に必須ではないと予想していたが、実際には BC5213 を単独で発現させた場合では LCPA の合成は認められず、BC5213 と BC5214 を共発現させた場合でのみ細胞内での LCPA の合成が認められた。現在、この点についてさらなる解析を進めている。

【背景・目的】近年、メチル化フラボノイド類(PMF)が様々な生理活性を有する
ことが報告されており、予防医療などへの応用が期待されている。しかし、植物等に含まれる PMF は微量であり、試薬として高価なものが多く研究利用の障害となっている。植物体内において、PMF は SAM-依存型フラボノイドメチ
ル化酵素(FOMT)の作用により生成・蓄積されていることから、これらの酵素を利用することにより効率的に PMF の生産を行うことができればその利用が大きく発展すると期待される。我々はこれまでに、柑橘植物であるシークワァー
サー(Citrus depressa)から複数の FOMT 遺伝子を取得し、その特性を解析している。その一つである CdFOMT5 は、ケルセチンを基質としたときに最大 3 ない
し 4 ヶ所の水酸基をメチル化する稀有な酵素であった。そこで進化分子工学的手法により本酵素のメチル化部位特異性を改変し、様々な PMF 生産への応用を検討した。
【実験方法・結果】CdFOMT5 と高い相同性(95.1%)を示すオレンジ由来 FOMT
を異宿主発現させ CdFOMT5 と比較した結果、両者はメルセチンに対して異なるメチル化パターンを示した。両酵素は 17 アミノ酸残基の相違を示すことか
ら、これらのアミノ酸残基がメチル化部位特異性に寄与していると推測された。
そこで CdFOMT5 のアミノ酸残基をオレンジ型へと置換した変異体をそれぞれ作成し、ケルセチンに対するメチル化パターンの変化を検討した。その結果、
N121V や L126F 変異体において、メチル化パターンの大きな変化が確認された。またその他の変異体においても、特定の水酸基に対する活性の低下など、蓄積する PMF のパターンが変化することが明らかとなった。これらのアミノ酸残基は ClassII FOMT のフラボノイド認識に関与すると思われる領域に位置することから、これらの残基が基質認識及び水酸化部位の制御に大きく関与することが示唆された。

Analysis of biosynthetic pathway of long-chain polyamines in Bacillus cereus

Molecular engineering of flavonoid O-methyltransferase of Citrus depressa
and utilization for producing polymethoxyflavonoids○Kohjiro Yamamoto1, Takeshi Ikeda1,2, Hisakage Funabashi1,2, Ryuichi Hirota1,2,
Akio Kuroda1,2(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2Grad. Sch. Integr. Sci. Life,
Hiroshima Univ.)

Key words

Bacillus cereus, long-chain polyamine, silica, biomineralization○Hiroshi Toda, Nobuya Itoh
(Biotechnol. Res. Center, Toyama Pref. Univ.)

Key words

flavonol, S-adenosylmethionine, methyltransferase, protein engineering

196

2Bp08

二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼを利用したヒドロキシエクオールの合成

2Bp10○野澤 大樹 1, 橋本 貴史 1, 向井 克之 2, 松山 彰収 2, 古屋 俊樹 1
（1東京理科大理工・応生, 2（株）ダイセル）
tfuruya@rs.tus.ac.jp

スクアレン-ホペン環化酵素による Botryococcene の環化反応○金指 真菜 1, 久野 斉 1, 星野 力 2（1デンソー, 2新潟大院・自然）
hitoshi_kuno@denso.co.jp【背景・目的】大豆イソフラボンの腸内細菌による代謝物として得られるエクオールは、抗酸化作用やエストロゲン様作用などの有用な生理活性を有している。一方、ポリフェノール類の生理活性は水酸基の位置や数に大きく左右されるため、エクオールの水酸化体では生理活性の変化が予想され、その向上も期待できる。すでにエクオールの生産手法は確立されており、その水酸化により
簡便にヒドロキシエクオールを合成できれば、応用展開も広がると考えられる。
本研究では、二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ HpaBC に着目してそのエクオールに対する活性を評価し、ヒドロキシエクオールの合成を試みた。
【方法・結果】Pseudomonas aeruginosa 由来の HpaBC は、レスベラトロール等のポリフェノールに対して水酸化活性を示す 1)。そこでまず、HpaBC のエクオー
ルに対する活性を、本酵素を発現させた大腸菌細胞を利用して評価した。しかしながら、変換活性は微弱であった。そこで、一酸素添加反応を担う HpaB コ
ンポーネントのホモログ酵素には活性の高いものも存在することを予想し、アミノ酸配列で 50〜75%の相同性を有する酵素を 7 種選択して活性を評価した。
その結果、興味深いことに位置選択性の異なる 2 つの酵素が取得され、Rhodococcus opacus 由来の酵素はエクオールの 3’位を、Photorhabdus luminescens
由来の酵素は 6 位を水酸化する活性を有していた。これらの酵素を利用してフラスコスケールでの反応を検討したところ、3’位水酸化体、6 位水酸化体ともに数 100 mg/L で合成できた。
1) T. Furuya, K. Kino, Tetrahedron Lett., 55, 2853-2855 (2014).

【背景と目的】スクアレン-ホペン環化酵素(SHC)はトリテルペンである Squaleneを基質として、5 環性の Hopene と Hopanol を合成することが知られている。一方、Botryococcene(Bc)は微細藻類である Botryococcus braunii が細胞内外に蓄積するトリテルペンとして知られている。この Bc は歯車駆動に替わる低騒音の駆動方式である、トラクション駆動で動力の伝達を担うトラクションオイルとして市販品と同等のトラクション性能を有している。これまでの検討により、トラクションオイルは分子内に環状構造が存在することで、さらに性能が向上することが明らかとなっている。今回、Bc と SHC との酵素反応により、Bc 環化物が得られるか試みた。
【方法】基質の Bc は、B.braunii の Bc 合成酵素遺伝子を導入した組換え酵母で生産した。SHC を発現した大腸菌の破砕液を酵素源とし、反応に用いた。酵素
反応液のヘキサン抽出物を SiO2 カラムで粗分画した後に、逆相 HPLC で精製した。取得した、Bc 変換物を NMR 解析にて構造決定した。
【結果】2 種類の Bc 変換物の精製に成功した。いずれの変換物も水酸基を有す
る、単環性構造であることが明らかとなった。

Biocatalytic synthesis of hydroxyequols by two-component flavin-dependent
monooxygenases

Cyclization of Botryococcene by Squalene hopene cyclase○Daiki Nozawa1, Takafumi Hashimoto1, Katsuyuki Mukai2, Akinobu Matsuyama2,
Toshiki Furuya1(1Dept. Appl. Biol. Sci., Fac. Sci. Tec., Tokyo Univ. Sci., 2Daicel Corp.)○Mana Kanazashi1, Hitoshi Kuno1, Tsutomu Hoshino2(1DENSO CORP., 2Grad. Sch. Sci. Technol., Niigata Univ.)

Key words

biocatalysis, equol, hydroxylation, monooxygenase

Key words

terpenoid, microalgae, yeast, biodiesel fuel2Bp09

パラゴムノキの天然ゴム生合成マシナリを構成するタン
パク質の機能解析

2Bp11

Fe2+-chelate および ferric-chelate reductase を組み合わせたセスキテルペノイド合成法の開発

山口 真琴 1, 幸治 幸治 1, 廣森 美樹 1, 石井 智樹 1, 和氣 駿之 1,
山下 哲 2, 戸澤 譲 3, 山口 晴彦 4, 井之上 ゆき乃 4, 伏原 和久 4,
中山 亨 1, ○高橋 征司 1
（1東北大院・工, 2金沢大院・自科, 3埼玉大院・理工, 4住友ゴム工業（株））
takahasi@seika.che.tohoku.ac.jp○梅澤 覚 1,2, 木野 邦器 1
（1早大院・先進理工・応化, 2長谷川香料）
kkino@waseda.jp

天然ゴム（NR）は，タイヤ生産をはじめとするゴム工業には不可欠な天然ポリマーである．NR の主骨格は cis-1,4-ポリイソプレンであり，その生合成は，cis型プレニルトランスフェラーゼ（cPT）により触媒される．パラゴムノキの乳管細胞の細胞質（ラテックス）内においては，NR はゴム粒子（RP）と呼ばれる脂質一重膜構造のオルガネラ内に蓄積していることから，RP 膜上の cPT が可溶性のモノマー単位であるイソペンテニル二リン酸を連続的に縮合し，それにより生成する疎水性ポリイソプレン鎖（すなわち NR）が RP 内に収容されると考えられている．我々はこれまでに，パラゴムノキのラテックス特異的な
cPT である HRT1 は，RP に適切に組み込まれたときにのみ in vitro で NR 生合
成活性を示すことを示した．また，HRT1 と相互作用する RP 膜タンパク質 HRBPを同定し，さらに，HRBP が別の RP 膜タンパク質である REF とも相互作用することを示した．REF と HRBP の共発現は HRT1 の活性を安定化したため，この三者複合体を核とする NR 生合成マシナリが提唱された．本研究では，天然
ゴム生合成における HRBP や REF の機能解析を行った．HRT1，REF はいずれ
も HRBP の N 末端側膜貫通領域近傍で相互作用すること，また，HRT1 の活性安定化には，この領域のみの共発現で十分であることが分かった．一方，HRBP
は，NR 生合成には寄与しない別の cPT とも相互作用した．これらの結果から，パラゴムノキでは，cPT-HRBP 複合体が HRBP を介して REF と相互作用することで RP 膜上において安定化され，その結果として，cPT が NR を生合成できる様になったと考えられる．

【背景・目的】多様な分子構造を有するセスキテルペノイドは、抗ストレス、抗腫瘍等の生理活性に加え、それぞれが特徴的な香気を有する化合物群であり、その産業有用性が高く注目されている。しかし、その多くは天然含量が少なく、工業的利用には効率的な合成プロセスの開発が求められている。我々はこれま
でに、Fe2+-chelate と ferric-chelate reductase を用いた新規合成法を構築し、黒胡椒の香気成分である(−)-ロタンドンの合成に成功している 1)。Fe2+-chelate による酸素添加反応と ferric-chelate reductase による Fe2+-chelate の還元的供給および再生システムによって構成される当該プロセスは、幅広い酸化反応に適用可能であると考えられる。そこで、触媒として機能する Fe2+/Fe3+-chelate の種類と合成可能なセスキテルペノイドとの関係を精査し、当該プロセスの有用性を検証した。
【方法・結果】大腸菌由来 ferric-chelate reductase(YqjH)を用いた Fe3+-chelate の還元において、リガンド構造の異なる各種 Fe3+-chelate の還元活性を検証した。その結果、YqjH はカテコール等の酸素配位、EDTA 等の酸素窒素混合配位、oフェナントロリン等の窒素配位構造を有する Fe3+-chelate を幅広く還元した。引
き続いてセスキテルペノイド合成を検証した結果、とくに窒素を含む Fe3+chelate(Fe(III)-nitrilotriacetic acid や Fe(III)-tris(2-pyridylmethyl)amine)を用いた場
合に高い酸素添加効率が得られた。また、(−)-ロタンドンに加え、グレープフ
ルーツの重要香気成分である(+)-ヌートカトンの酸化的合成も可能となった。
この結果より、本反応プロセスは鉄触媒分子種および基質選択の面で柔軟性を有し、多様なセスキテルペノイド合成に応用可能であることが明らかになった。
1) 梅澤ら, 日本農芸化学会 2019 年度大会, 講演番号 1D7p03, ポスター番号 P091

Functional analyses of component proteins of the natural rubber
biosynthetic machinery in Hevea brasiliensis

Development of the synthesis method of sesquiterpenoids using Fe2+-chelate
catalyst and ferric-chelate reductase

Makoto Yamaguchi1, Kouji Kojima1, Miki Hiromori-Suenaga1, Tomoki Ishii1,
Toshiyuki Waki1, Satoshi Yamashita2, Yuzuru Tozawa3, Haruhiko Yamaguchi4,
Yukino Inoue-Miyagi4, Kazuhisa Fushihara4, Toru Nakayama1, ○Seiji Takahashi1(1Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 2Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ.,
3
Grad. Sch. Sci. Eng., Saitama Univ., 4Sumitomo Rubber Ind., Ltd.)Key words
rubber biosynthesis, polyisoprene, prenyl transferase, Hevea
brasiliensis○Satoru Umezawa1,2, Kuniki Kino1(1Dept. Appl. Chem., Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2T. Hasegawa Co.,LTD.)

Key words

sesquiterpenoid, Fe2+-chelate, ferric-chelate reductase, oxygenation

197

2Bp12

4-メトキシサリチル酸を生成する 6-メトキシサリチル酸
脱炭酸酵素の発見

2Bp14○青野 陸 1, 森 弘樹 1, 原 良太郎 2, 木野 邦器 1,2（1早大院・先進理工, 2早大・理工総研）
kkino@waseda.jp

タンパク質酸化能を有する Penicillium citrinum AIU
Z26-4-8 由来オキシダーゼ遺伝子のクローニングと異宿主による発現検討○髙嶋 大輝 1, 前田 航 1, 土屋 高伸 1, 新谷 智子 2, 五味 勝也 2,
下飯 仁 1, 山田 美和 1
（1岩手大院・連農, 2東北大院・農）myamada@iwate-u.ac.jp【背景・目的】我々は、低炭素化社会の実現に向け、二酸化炭素を固定して汎用性のある有用化合物を生産する技術開発と、それを光合成の暗反応により二酸化炭素を吸収して生育する植物性バイオマスを原料とする有用化合物生産に展開させる検討を行っている。具体的には、非酸化的炭酸固定活性を有する微生物由来の可逆的脱炭酸酵素に着目し、これまでに、バイオマス資源であるリグ
ニン由来芳香族化合物を原料として芳香族カルボン酸を合成する可逆的脱炭酸酵素を見出している 1)。本研究では、合成可能な芳香族カルボン酸の多様性の拡張を目的として、新規基質特異性を有する可逆的脱炭酸酵素の探索を行った。
【方法・結果】芳香族カルボン酸の一種である 6-メトキシサリチル酸(6MSA)を炭素源とする培地において集積培養を行い、6MSA を脱炭酸して 3-メトキシフェ
ノール(3MP)を生成する Cupriavidus sp. TK を取得した。本株のゲノムライブラ
リーを構築し、6MSA に対する分解活性を指標としたショットガンクローニングを行ったところ、当該活性を担う酵素 6MSDC をコードする遺伝子の取得に成功した。大腸菌で発現させた組換え型タンパク質を用いて、6MSA に対する
可逆的脱炭酸活性を評価したところ、6MSA を脱炭酸して 3MP を生成するものの、3MP への炭酸固定反応では 6MSA ではなくカルボキシ基の配置が異なる
4-メトキシサリチル酸(4MSA)が生成した。6MSDC は 4MSA に対する脱炭酸活性も示したが、既に取得している 4MSA に対して可逆的脱炭酸活性を示す
Arthrobacter sp. K8 由 来 オ ル セ リ ン 酸 脱 炭 酸 酵 素 1) と の 相 同 性 は 低 く 、Burkholderia sp. Strain BC1 由来 2-ヒドロキシ-1-ナフトエ酸脱炭酸酵素 2)と高い相同性を示した。
1) 村瀬ら, 日本農芸化学会, 2A10p19 (2018)
2) Pal Chowdhury P, et al., J. Bacteriol., 198, 1755-1763 (2016)【背景と目的】タンパク質の物性改変などへの応用を期待し、我々はタンパク質中のアミノ基を酸化的脱アミノ化する酵素を Penicillium citrinum AIU Z26-4-8 より取得した。本酵素は、タンパク質の他に、L, D-アミノ酸やアミンに対してもオキシダーゼ活性を示し、新規な基質特異性を有する。さらなる本酵素の諸性
質解明を目指し、本研究では、本酵素の遺伝子クローニングと異宿主における発現を試みた。
【方法】本酵素の N 末端アミノ酸配列と P. citrinum のゲノム配列を参照して設計したプライマーを用い、ゲノム DNA および cDNA のクローニングを試みた。
得 ら れ た 遺 伝 子 に つ い て は 、 大 腸 菌 BL21(DE3) 、 Saccharomyces cerevisiae
BY4743、および Aspergillus oryzae niaD300 に導入後、それぞれ発現誘導した。
さらに、各組換え菌体を破砕して調製した粗酵素液と組換え麹菌の培養液上清を、SDS-PAGE と β-ラクトグロブリンを基質としたオキシダーゼ活性測定に供した。
【結果および考察】Z26-4-8 株由来ゲノム DNA と cDNA より得られた PCR 産物の塩基配列を解析した結果、プレプロ配列を含む 2,040 bp の ORF が見出され、イントロンは含まれていなかった。ORF を大腸菌で発現させた際、粗酵素液では活性が検出されず、不溶化した。酵母では、100 mL 培地当たり 4.2 mU の活性が得られた。麹菌では培地上清において 100 mL 培地当たり 60 mU の活性が得られ、菌体破砕粗酵素では 100 mL 培地当たり 283 mU と原株の約 80 倍の酵素生産量となった。よって、麹菌は本酵素の発現宿主として適していることが示された。

Discovery of 6-methoxysalicylic acid decarboxylase carboxylating 3methoxyphenol to 4-methoxysalicylic acid

Cloning and heterologous expression of a novel oxidase gene with proteinoxidizing activity from Penicillium citrinum AIU Z26-4-8

Key words
aromatic acid decarboxylase, carboxylation, methoxysalicylic acid,
low-carbon society

Key words
Aspergillus oryzae, heterologous production, Penicillium citrinum,
amino acid oxidase○Riku Aono1, Hiroki Mori1, Ryotaro Hara2, Kuniki Kino1,2(1Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ.)

2Bp13

好熱性独立栄養性細菌 Hydrogenobacter thermophilus
TK-6 の cysteine synthase と硫黄同化代謝○亀谷 将史 1,2, 中山 宗一郎 1, 新井 博之 1,2, 石井 正治 1,2（1東大院・農生科, 2東大・微生物連携機構）
akameya@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp○Daiki Takashima1, Wataru Maeda1, Takanobu Tsuchiya1, Tomoko Shintani2,
Katsuya Gomi2, Hitoshi Shimoi1, Miwa1 Yadama1(1United Grad. Sch. Agric. Sci., Iwate Univ., 2Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)

2Bp15

電子伝達向上を目指した酵素分子-電極間の距離制御によるバイオデバイスの設計○多喜 俊介 1, 中村 卓登 1, 高村 映一郎 1, 坂元 博昭 1,3,
里村 武範 2,3, 櫻庭 春彦 4, 大島 敏久 5, 末 信一朗 1,2,3（1福井大学院・工・繊維, 2福井大学院・工・生物応用化, 3福井大学・生命セ, 4香川大・農, 5大工大・工）suyeb10@u-fukui.ac.jp

Cysteine synthase (CS)は、Ser を前駆体とする化合物に硫化物イオンを転移してCys を合成する、多くの生物の Cys 合成および硫酸同化代謝に必須な酵素である。一般的なバクテリアの CS は、O-acetylserine (acetyl-Ser)を基質として用いる。
Hydrogenobacter thermophilus はバクテリアでもっとも古くに他から分岐した
Aquificae 門 に 属 す 好 熱 性 の 独 立 栄 養 性 細 菌 で あ る 。 本 菌 か ら は 、 新 規
phosphoserine phosphatase による O-phosphoserine (P-Ser)の脱リン酸化で Ser 合成が行われる（Chiba, JBC, 287:11934）など、アミノ酸代謝をはじめとする多くの代謝で新規機構が見つかってきた。
本研究では、H. thermophilus 由来 CS の酵素学的解析を通じ、本菌の硫黄同化代
謝の解明を目指した。本菌由来 CS を大腸菌で異種発現・精製し、各種酵素学的解析に供した。基質として硫化物イオンと acetyl-Ser を加えたときに反応性を示したが、acetyl-Ser を P-Ser に代えたときにそれ以上の活性を示した。この結果から、本菌は一般的な微生物とは異なり、acetyl-Ser ではなく P-Ser を前駆体とした Cys 合成経路を有することが強く示唆された。また、P-Ser を基質とする CS の報告例は他の生物種でも少ないながらもあるが、本菌の CS はそれらいずれよりも高い反応性を有することが動力学的解析で示され、本酵素の産業利用における有用性も期待される。また、本菌は硫酸の代わりにチオ硫酸を唯一の硫黄源としても生育することから、本 CS が硫酸同化だけでなくチオ硫酸
同化代謝にも寄与するかを検討した。

[緒言]
近年、資源の枯渇や地球温暖化の問題から、クリーンな次世代エネルギーとしてバイオ電池 (Biofuel cell:BFC)の実用化が期待されているが、酵素の安定性や電池の出力の低さなどが課題である。一般に BFC のカソード用酵素としてマルチ銅オキシダーゼ (MCO) がよく用いられている。MCO は補因子として 4 つの銅原子をもち、それぞれタイプ 1 (T1)、タイプ 2 (T2)、そして 2 つのタイプ 3(T3) に分類され、T1Cu で電子を受け取り、T2/T3Cu に伝達し、O2 の 4 電子還元反応を行う。電子授受を行う T1Cu と電極表面との距離はバイオカソードの性能に大きく影響し、酵素-電極間距離の制御によってバイオカソードの出力向上が期待できる。本研究では、超好熱性アーキア Pyrobaculum aerophilum 由来
MCO (McoP)をカソード触媒として、長さの異なるリンカーを用いて酵素分子の電極表面への固定化を行った。それぞれの電極を電気化学的に評価し、酵素電極間距離の効果について解析した。
[方法]
グラッシーカーボン電極 (GCE)上に修飾した MWCNT にニトリロ三酢酸を修飾
し、Ni イオンを配位させた。同様に GCE 上の MWCNT に N-(1-Pyrenyl) maleimideを修飾した。His-tag を C 末端に導入した McoP His と His-tag 末端にシステインを導入した McoP Cys を His-tag と Ni イオンのアフィニティ及び Cys の SH 基とマレイミド基の結合を利用し、酵素分子を配向的に固定した。それぞれの電極をサイクリックボルタンメトリー (CV)により電気化学的に評価した。
[結果]
O2 飽和条件下での 2 種類の McoP 修飾電極の CV 測定を行った結果、0 V(vs. Ag/
AgCl)における O2 の還元電流は、McoP His および Cys 修飾電極では、それぞれ368 μA/cm2、439 μA/cm2 であった。これは McoP Cys 修飾電極は McoP His 修飾
電極と比べ酵素-電極間距離は約 0.7 nm 短いので電子移動効率が向上したことに起因するものと考えられる。

Cysteine synthase from a thermophilic and autotrophic bacterium,
Hydrogenobacter thermophilus TK-6, and its sulfur anabolism

Improvement of electron transfer between an electrode and enzyme bydistance control of enzyme molecule○Masafumi Kameya1,2, Soichiro Nakayama1, Hiroyuki Arai1,2, Masaharu Ishii1,2(1Grad. Sch. Agric. Life Sci., Univ. Tokyo, 2CRIIM, Univ. Tokyo)

Key words

cysteine biosynthesis, sulfur assimilation, sulfate, thiosulfate○Shunsuke Taki1, Takuto Nakamura1, Eiichiro Takamura1, Hiroaki Sakamoto1,3,
Takenori Satomura2,3, Haruhiko Sakuraba4, Toshihisa Ohshima5, Shin-ichiro Suye1,2,3(1Dept. Front. Fib. Tech. Sci., Grad. Sch. Eng., Univ. Fukui, 2Dept. Appl. Chem.
Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Univ. Fukui, 3Res. Edu. Prog. Life Sci., Univ. Fukui,
4Fac. Agric., Kagawa Univ., 5Fac. Eng., Osaka Inst. Technol.)Key words
biofuel cell, multicopper oxidase, orientation, direct electron transfer

198

2Bp16

分子揺動性を考慮した耐熱性酵素の配向固定による高性能バイオアノードの構築

2Bp18○鈴木 治人 1, 高村 映一郎 1, 坂元 博昭 1,2, 里村 武範 2,3,
櫻庭 春彦 4, 大島 敏久 5, 末 信一朗 1,2,3（1福井大院・工・繊維, 2福井大学・ライフセ, 3福井大学院・工・
生物応用化, 4香川大・農, 5大工大・工）suyeb@u-fukui.ac.jp

高性能バイオデバイスに向けた部位特異的変異導入による 超好熱性アーキア由来マルチ銅オキシダーゼの酸化還元電位改変○高村 映一郎 1, 多喜 俊介 1, 坂元 博昭 1,3, 里村 武範 2,3,
櫻庭 春彦 4, 大島 敏久 5, 末 信一朗 1,2,3（1福井大学院・工・繊維, 2福井大学院・工・生物応用化, 3福井大学・生命セ, 4香川大・農, 5大阪工大）
e_takamr@u-fukui.ac.jp[緒言]
酵素を触媒とするバイオ電池は環境負荷が小さいなどの利点から、バイオマスの有用な利用法の一つとして注目されている。しかし、酵素の長期安定性や出力の問題から実用化には至っていない。本研究室では、長期安定性を有する超好熱性アーキア Aeropyrum pernix 由来の L-プロリン脱水素酵素（LPDH）に着目してバイオアノードを作製してきた。近年、構造自由度の高い高分子を導入したメディエーター分子の電極上での揺動性を利用した電極では、得られる触媒電流値が増大することが報告されている。そこで本研究では電極上での酵素の揺動性に着目し、メディエーターとするフェロセンカルボン酸（Fc-COOH）
を酵素と共に電極に固定化して酵素分子密度を変化させ、酵素分子の配向及び揺動を制御したバイオアノードの構築を目的とした。
[方法]
MWCNT を固定化したグラッシーカーボン電極を Pyr-NH2, PBSE 混合液に浸漬させた後、電極上の Pyr-NH2 に Fc-COOH を固定化した。その後、電極を ABNTA, NiCl2, LPDH 溶液の順に浸漬し、His-tag を介して LPDH を電極上に固定化した。作製した電極の評価は 3 電極方式にてサイクリックボルタンメトリー(CV)にて行った。
[結果]
まず物理吸着によって LPDH とメディエーターを固定化した電極の CV を基質存在下で測定したところ、酵素反応に伴うフェロセン由来のピーク電流の増大（17.0 μA/cm2 ）が見られた。一方で His-tag を介して LPDH を配向固定する際に、スペーサーにより LPDH 間の分子密度を小さくした電極では 35.7 μA/cm2の増大が確認された。His-tag を介して LPDH を配向固定化することで酵素の触媒活性部位が基質との反応に有利な位置に配位し、さらに酵素分子密度を制御することでペプチドタグを介して酵素分子が電極上で揺動し、基質との接触性が高まったためであると考えられる。

［緒言］
酵素を電極触媒とするバイオ電池（Biofuel cell:BFC）は次世代エネルギーの一つとして注目されている。しかし、酵素の長期安定性や電池電圧の低さの問題から、実用化には至っていない。本研究では電池電圧の低さの改善を目指している。BFC の電池電圧は、酵素およびメディエータの酸化還元電位に依存する。我々は、長期安定性を有する超好熱菌 Pyrobaculum aerophilum 由来マルチ
銅オキシダーゼ (McoP) を BFC のカソード触媒として用いてきた。しかし、McoP は酸化還元電位の低い MCO（~ +0.45 V（vs. SHE））に分類されるため、BFC を構築した際の電池電圧の低さが問題であった。本研究では、McoP の酸化還元部位である T1Cu の軸配位子（Met）を Leu もしくは Phe へ置換すること
で McoP の酸化還元電位の正側へのシフトを試みた。
［実験］
McoP の 470 番目の Met を遺伝子工学的に Leu もしくは Phe へ置換した変異型
McoP（M470L, M470F）は組換体より精製した。各 McoP 修飾電極を作製し、作製した各 McoP 修飾電極を作用極とする 3 電極方式によりサイクリックボル
タンメトリー(CV)を行い、各 McoP の酸化還元電位を評価した。
［結果と考察］CV による酸化還元電位評価の結果、酸化還元電位は野生型、M470L、M470Fの順に 388、476、466 mV（vs. SHE）であった。2 つの変異体ともに酸化還元電位が野生型と比較して約 90 mV 正側へシフトした。これは、T1Cu と配位結合を形成する Met が Leu、Phe に置換されることで配位結合が形成されず T1Cuの酸化状態が不安定になるためである。一方、野生型が 95℃まで安定であるのに対して、M470F の熱安定性が 80℃まで低下していることから、嵩高い側鎖を有する Phe へ置換されることで McoP の熱安定性に寄与する構造への影響が大きくなってしまった可能性が考えられる。今後、M470 変異体をカソード触媒として用いた BFC の構築を行っていく。

Construction of high performance bioanode by orientated immobilization ofthermostable enzyme in consideration of molecular fluctuation

Redox potential shift of multicopper oxidase from hyperthemophilic archaea
using site-directed mutagenesis for high-performance biodevice○Haruto Suzuki1, Eiichiro Takamura1, Hiroaki Sakamoto1,2, Takenori Satomura2,3,Haruhiko Sakuraba4, Toshihisa Ohsima5, Shin-ichiro Suye1,2,3(1Dept. Front. Fib. Tech. Sci. Eng., Grad. Sch. Eng., Fukui Univ., 2Life Sci. Innov.,
Fukui Univ., 3Dept. Appl. Chem. Biotech., Grad. Sch. Eng., Fukui Univ., 4Fac.
Agric., Kagawa Univ., 5Fac. Eng., Osaka Inst. Technol.)Key words
biofuel cell, hyperthermophilic archaeon, fluctuation, orientatedimmobilization

2Bp17

酵素カスケードシステムとレドックスポリマーを用いた
アミノ酸バイオ電池用アノード電極の開発○堀永 晃作 1, 里村 武範 1,2, 高村 映一郎 1, 坂元 博昭 1,2,
櫻庭 春彦 4, 大島 敏久 5, 末 信一朗 3（1福井大院・工, 2福井大・生命セ, 3福井大, 4香川大・農, 5阪工大
院・工）satomura@u-fukui.ac.jp○Eiichiro Takamura1, Shunsuke Taki1, Hiroaki Sakamoto1,3, Takenori Satomura2,3,Haruhiko Sakuraba4, Toshihisa Ohshima5, Shin-ichiro Suye1,2,3(1Dept. Front. Fib. Tech. Sci., Grad. Sch. Eng., Univ. Fukui, 2Dept. Appl. Chem.
Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Univ. Fukui, 3Res. Edu. Prog. Life Sci., Univ. Fukui,
4
Kagawa Univ., 5Osaka Inst. Tech.)
Key words
biofuel cell, multicopper oxidase, redox potential, site-directedmutagenesis

2Cp01

Clostridium cellulovorans と Clostridium beijerinckii による温州みかん残渣からの IBE 発酵○富田 寿男 1, 岡﨑 文美 1,2,3, 田丸 浩 1,2,3（1三重大院・生資, 2三重大・先端科学研支バイオインフォ, 3三
重大・スマートセルイノベ研）
ytamaru@bio.mie-u.ac.jp[目的]
バイオ電池は次世代のクリーンエネルギーの一つとして注目されているが、酵素の安定性や活性の低さに起因する電池の耐久性や低出力という課題を抱えている。我々は、これらの課題を解決するために高い安定性を有する好熱菌由来
酵素を電極用素子としたバイオ電池の開発を進め長期間可動可能なバイオ電池の開発には成功している。しかしながら低電池出力の課題の解決には至っていない。そこで、我々は 4 種の脱水素酵素（色素依存性 L-プロリン脱水素酵素(LPDH)、NAD ＋依存性ピロリン-5-カルボン酸脱水素酵素(P5CDH)、NAD ＋依存性グルタミン酸脱水素酵素(GDH)、色素依存性 NADH 脱水素酵素(DI)）を組み合わせた基質の多段階酸化反応経路を設計し、電池出力向上を目指したアノードの開発を進めている。本研究では、多段階酸化反応を行う酵素群と本反応に必要な NAD ＋とフェロセンを高分子化合物に修飾したレドックスポリマーを用いたアノード電極の構築を行った。
[実験・結果]LPDH、P5CDH、GDH、DI の 4 種類の好熱菌由来酸化還元酵素とアルギン酸に修飾した NAD ＋、カーボンナノチューブに修飾したフェロセンをグラッシー
カーボン電極上に固定化した電極を作製した。作製した電極を用いてサイクリッ
クボルタンメトリー測定を行った。その結果、作製した電極において基質の多段階酸化反応を確認することができた。このことから、高分子化合物に修飾した NAD ＋、フェロセンは遊離の状態で用いた場合と同様に設計した基質の多段階酸化反応の電子伝達物質として機能していることが確認できた。現在、構築した電極をアノードとしたバイオ電池の構築を進めている。

国連主導の二酸化炭素排出量削減にむけ、カーボンニュートラルであり、かつ、
食料と競合しない第二世代バイオ燃料の研究が進められている。その実用化にむけて、高価な酵素購入を必要としない糖化酵素生産と糖からの発酵を同時に行う CBP（consolidated bioprocessing）が注目されている。本研究では、セルロソーム生産菌として C. cellulovorans を、IBE（isopropanol-butanol-ethanol）発酵菌として C. beijerinckii を用いた CBP を構築した。一方、オレンジジュース工場では外果皮や絞り粕が残渣として大量に発生しており、果皮に含まれるリモ
ネ ン に よ る 生 育 阻 害 の た め 、 0.2 ％ (v/v) 以 上 の リ モ ネ ン 含 有 培 地 で はSaccharomyces cerevisia 野生株ではエタノール生産量が優位に減少していたのに対し、C. cellulovorans および C. Beijerinckii の生育を調べた結果、0.5％(v/v) のリモネンを含む液体培地においても C. beijerinckii はリモネンを含まない液体培地と同様に IBE 発酵することが明らかとなった。一方、C. cellulovorans もリモ
ネン濃度 0.5％(v/v)以下であれば、セルロース分解能に影響がないことが判明した。さらに、日本において広く生産されている温州みかん外果皮と搾汁粕を原料として、C. cellulovorans と C. beijerinckii からなる CBP を構築した結果、C.
cellulovorans は前処理をしない外果皮ならびに搾汁粕に対して、全糖量の 85％が分解され、搾汁粕乾燥重量に対するブタノール収率は最大で 0.046 (g/g)が得られた。

Development of an anode electrode for amino acid powered fuel cells using
multi-enzyme cascade system and redox polymer

IBE fermentation from mandarin orange wastes by consolidated
bioprocessing with Clostridium cellulovorans and Clostridium beijerinckii○Kousaku Horinaga1, Takenori Satomura1,2, Eiichirou Takamura1,
Hiroaki Sakamoto1,2, Haruhiko Sakuraba4, Toshihisa Ohshima5, Shin-ichiro Suye3(1Grad. Sch. Eng. Fukui Univ., 2Life Sci. Fukui Univ., 3Fukui Univ., 4Fac. Agric.,
Kagawa Univ., 5Grad. Sch. Eng., Osaka Inst. Technol.)Key words

biofuel cell, oxidoreductase, thermophile○Hisao Tomita1, Fumiyoshi Okazaki1,2,3, Yutaka Tamaru1,2,3(1Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ., 2Mie Univ. ASRC, 3Mie Univ. SCIC)

Key words
Clostridium cellulovorans, Clostridium beijerinckii, agricultural waste,
IBE fermentation

199

2Cp02

Clostridium cellulovorans およびメタン生成菌の共培養によるシュガービートパルプからのバイオメタンガス
生産

2Cp04

富田 寿男 1, ○岡﨑 文美 1,2,3, 田丸 浩 1,2,3（1三重大院・生資, 2三重大・先端科学研支セ・バイオイン
フォ, 3三重大・スマートセルイノベ研セ）
ytamaru@bio.mie-u.ac.jp

Efficient biomethane production from anaerobicallydigested ammonium-rich waste under optimal
illumination condition○Yunxin Zhu, Hanying Zheng, Nan Zhang, Yingnan Yang
(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)yo.innan.fu@u.tsukuba.ac.jp【目的】有機系廃棄物からの再生可能エネルギーの生産手法としてメタン発酵があるが、セルロース系バイオマスからの生産効率には課題がある。そこで、本研究ではセルロース糖化能力に優れた嫌気性細菌 Clostridium cellulovorans とメタン生成菌との共培養によるシュガービートパルプ（SBP）からのバイオメタ
ンガス生産系の構築を試みた。
【方法】乾燥粉砕した SBP を炭素源とし、メタン生成菌および C. cellulovoransの単独培養および共培養下における、糖化効率およびガス、有機酸の生産性を比較した。メタン生成菌の接種源にはメタン発酵消化液を用い、次世代シーケンサにより菌叢を解析した。
【結果】メタン発酵消化液中の主要なメタン生成菌として Methanosarcina mazei（存在比率 1.34%）が検出された。メタン生成菌のみの培養においては、SBP 中に含まれる不溶性多糖の顕著な分解は見られなかった。一方、C. cellulovoransとの共培養においては、SBP 中の不溶性多糖の 87.3%が分解され、乾燥重量 1
kg の SBP から約 34 L のメタンガスを生成した。また、共培養条件下において、水素ガスが蓄積しなかったことから、C. cellulovorans が生成した水素ガスが、メタン生成菌により代謝されたことが示唆された。

Anaerobic digestion is an environmentally attractive strategy to recover renewableenergy from livestock waste. However, high concentration of ammonia is the major
toxicant during livestock biodegradation process and inhibits bio-methane production
seriously. Recent year, intermittent illumination strategy has been reported as a novel
approach to mitigate ammonia inhibition and improve digestion performance.
Considering further utilization of illumination technology, identifying the optimal
illumination condition is essential for highly efficient anaerobic treatment process. This
study focused on optimizing illumination condition for improving bio-methane
production from ammonia-rich waste. According to experimental design proposed byresponse surface methodology (RSM), 13 batch experiments were carried oat NH4+-N
concentration of 2500 mg/L under various illumination conditions. With optimized
combination of light intensity and illumination time, a two-fold increase in methane
yield could be achieved comparing to control (dark condition). The analysis ofvariance (ANOVA) showed a statistically significant interaction of light intensity andillumination time on methane yields. Model validation proved the high adequacy of themodel and exhibited the necessity of optimizing illumination condition for efficientanaerobic digestion process under ammonium-rich environment.

Biomethane production from sugar beet pulp under cocultivation with
Clostridium cellulovorans and methanogens

Efficient biomethane production from anaerobically digested ammoniumrich waste under optimal illumination condition

Key words
Clostridium cellulovorans, methanogen, methane fermentation,
agricultural waste

Key words
anaerobic digestion, ammonium-rich waste, illumination condition,
statistical experimental design

Hisao Tomita1, ○Fumiyoshi Okazaki1,2,3, Yutaka Tamaru1,2,3(1Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ., 2Adv. Sci. Res. Support Center, Mie Univ.,
3
SCIC, Mie Univ.)

2Cp03

Enhanced methanogenesis of cellulose by addition of
nanobubble water○Yunxin Zhu, Hanying Zheng, Nan Zhang, Yingnan Yang
(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

2Cp05○Xuezhi Wang, Tian Yuan, Zhongfang Lei, Kazuya Shimizu,
Zhenya Zhang(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)zhang.zhenya.fu@u.tsukuba.ac.jp

雑草中の水溶性成分および非水溶性成分をそれぞれ基質としたメタン発酵における微生物相解析○松田 修平, 大槻 隆司（山梨大院・医工農）
tohtsuki@yamanashi.ac.jp

Nano-bubble water (NBW) with high mass transfer efficiency and hydrophobic
property contains fine bubbles with diameters < 1 μm, which has been widely used inagricultural and biomedicine fields and many industries. Nowadays, much attention
has been paid to the security and sustainability of lignocellulosic biomass in agroindustrial wastes containing high cellulose content. However, the complex structure ofcellulose has limited its efficient utilization. Thus, this study aims to investigate theaddition of different NBW (Air-NBW, N2-NBW, O2-NBW) during anaerobic digestion(AD) of cellulose. The accumulative CH4 yields from the reactors with Air-NBW, N2NBW and O2-NBW addition reached 228.2, 247.5 and 274.1 L/kg-VSadded, which werehigher than that from the control (210.2 L/kg-VSadded). In addition to increase incellulose removal by 15% and electron transport by 1.3 times, the maximum
cumulative CH4 yield was obtained from the O2-NBW reactor, increasing by 30%
compared to the control. The cellulase activity during AD was increased by 10-18%
after NBW addition. The substrate-related bacteria like Synergistetes, Thermotoga andChloroflexi showed higher relative abundance in the NBW-added. Moreover,methanogenic archaea including Methanobacterium, Methanomassiliicoccus,
Methanolinea, Methanosaeta, and Methanospirillum likely contributed to the CH4
production from AD of cellulose. This study provided an understanding of themechanisms in the bioconversion of cellulose to CH4 by AD under NBW addition.

【背景・目的】雑草は豊富なバイオマスであり化石燃料に代わるエネルギー源の一つとなりうる。我々はギョウギシバという雑草のみを基質としてメタン生産
可能な微生物群を取得しており、これまでの研究で培地作成時のオートクレー
ブにより雑草成分の約 50%が溶出し、メタン生産に影響を与えると考えられた。本研究は雑草中の水溶性成分および非水溶性成分をそれぞれ単独で基質としてメタン発酵を行い、各基質を資化する微生物群の動態を調べメタン生成機序に関する知見を得ることを目的とした。
【方法】粉末化し目抜き 100 μm の篩を通過したギョウギシバを 1%(w/v)でイオ
ン交換水に懸濁後オートクレーブし吸引濾過を行った。得られた濾液を水溶性
画分、濾紙上に回収された固体を非水溶性画分とした。0.1 M リン酸ナトリウ
ムカリウム緩衝液(pH7.2)に基質としてギョウギシバ 0.2 g、ギョウギシバ 0.1 g相当の水溶性画分、非水溶性画分 0.1 g のいずれかを添加し培地とした。ギョウ
ギシバ基質で継代維持しているメタン発酵微生物群の培養液 1 mL を加え全量
20 mL とし、気相を窒素置換後 35℃で静置培養した。メタン生産量の測定を行うとともに、培養中回収した菌体の 16S rRNA 遺伝子をナノポアシーケンサー
MinION を用いて解析し微生物群を構成する微生物を推定した。
【結果・考察】80 日間培養した結果、基質 1 g あたりのメタン生産量はギョウギ
シバ：184.5 mL、水溶性画分：96.8 mL、非水溶性画分：26.5 mL だった。16S
rRNA 遺伝子解析の結果、全ての試験区で真正細菌は Proteiniphilum 属、古細菌
は Methanobacterium 属の構成割合が最も高かったが、基質ごとに構成割合が明らかに異なる微生物が見出された。従って、水溶性画分、非水溶性画分をそれぞれ資化する微生物群間の相互作用がギョウギシバを基質とした場合のメタン
生産量の増大に大きく寄与すると考えられた。

Enhanced methanogenesis of cellulose by addition of nanobubble water

Analysis of microbial populations in methane fermentation using watersoluble fraction and water insoluble fractions from weed as substrates○Xuezhi Wang, Tian Yuan, Zhongfang Lei, Kazuya Shimizu, Zhenya Zhang(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words
community

cellulose, anaerobic degradation, methane fermentation, microbial○Shuhei Matsuda, Takashi Ohtsuki(Univ.Yamanashi)

Key words

methane fermentation, microbial community, weed

200

2Cp06

河口底泥からの海洋性キチン分解菌叢の探索と VFAs
生産

2Cp08

○脇 滉 1, 早瀬 伸樹 1, 中島田 豊 2, 喜多 晃久 1
（1新居浜高専, 2広島大院・統合生命科学）
kita@chem.niihama-nct.ac.jp

Quality improvement of terasi, Indonesian shrimp paste,by monitoring the microorganism composition duringcontrolled fermentation○Arisa Sato1,2, Dea Indriani Astuti2, Sastia Prama Putri1,2,
Eiichiro Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Biotechnol., Sch. of Life Sci. andTechnol., Inst. of Technol. Bandung)
fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景・目的】近年、世界中でエビやカニの消費量が伸び、それらの水産加工の際に膨大な量のキチン含有廃棄物が発生している。キチンは、自然界においてセルロースに次ぐ二番目に豊富なポリマーであるが、非常に硬度な構造を持つ難分解性ポリマーであるため、大腸菌や酵母などの一般的に工業利用されている微生物では分解ができない。よって、キチン含有廃棄物の処理が深刻な問題になっている。
そのような中、過去の研究で、河口底泥中から未処理のキチン及びキチン含有廃棄物をいとも簡単に分解し、効率的にメタンを生成し得る海洋性キチン分解菌叢が発見された。そこで本研究は、メタン生産プロセスの第 1 段階で生産される酢酸やプロピオン酸などの揮発性脂肪酸（VFAs）を効率的に生産する海洋性キチン分解菌叢の探索と、その菌叢の性質について検討することを目的とした。
【方法・結果】
本研究では、まず新居浜近辺で採取した河口底泥を、5g/l のキチンを単独基質とし 30g/l の NaCl を含む液体培地に接種して、35℃で嫌気的に継代培養することによって、海洋性キチン分解菌叢の探索を行なった。その結果、河口底泥 2
サンプル（S-1 および H-1）からキチン分解菌叢が得られた。両菌叢は、VFAs
としてそれぞれ主に酢酸を生産していた。その後、得られた菌叢の最適 pH と最適温度を検討したところ、両菌叢とも最適 pH は 7.5 付近で、最適温度は S-1
が 40℃、H-1 が 35℃であった。現在は採取した海洋性キチン分解菌叢の微生物構造を明らかにするために、菌叢解析を行っている。

Terasi is a traditional fermented shrimp paste used in Indonesian dish as condiments.
Due to its affordability, the paste is widely consumed among the general population,and thus has a great impact in Indonesia. Currently, small-scale or home industry iscommon for terasi production, and natural fermentation process is the traditional
method. Fermentation process is considered finish when desired aromatic odors are
obtained. But this makes the fermentation process subjective, because the decision issolely dependent on the producer. Additionally, natural fermentation poses a higher
risk for contamination of microbial pathogens. As a result, the food safety and foodtaste quality of the final product varies greatly from region to region. Therefore, it isnecessary to improve the quality of terasi by means of controlled fermentation. Quality
improvement can yield safer products, and can change the terasi production processfrom small-scale to large-scale. Hence, the objective of the research is to improve thequality of terasi by determining the most optimal fermentation starter culture. Optimal
fermentation conditions were determined by analyzing the effect of the various starter
inoculum on the inner microbial community, and results indicated that mixed culture of
Staphylococcus saprophyticus, Bacillus subtilis, and Lactobacillus murinus with ratioof 1:2:2 was the most effective for suppressing the growth of unwanted
microorganisms.

Exploration of marine chitin degrading bacterial consortium from estuarine
bottom mud and VFAs production

Quality improvement of terasi, Indonesian shrimp paste, by monitoring the
microorganism composition during controlled fermentation○Akira Waki1, Nobuki Hayase1, Yutaka Nakashimada2, Akihisa Kita1(1Niihama Natl. Coll. Technol., 2Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)○Arisa Sato1,2, Dea Indriani Astuti2, Sastia Prama Putri1,2, Eiichiro Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Biotechnol., Sch. of Life Sci. and Technol., Inst. ofTechnol. Bandung)

Key words

chitin, bacterial consortium, symbiosis, volatile fatty acids

Key words
fermentation

quality improvement, terasi, Indonesian shrimp paste, controlled

2Cp07

Saccharomyces cerevisiae 由来のグリセロール資化性酵
母の育種とグリセロールからのエタノール発酵

2Cp09

セルロース系バイオマスを原料とするカフェ酸発酵のためのゲノム編集による大腸菌代謝改変の作製と培養法の検討○Zhang Kuan 1, 中西 昭仁 1,2, 軽部 征夫 1,2（1東京工科大院・バイオニクス, 2東京工科大・応生）
nakanishiah@stf.teu.ac.jp○川口 秀夫 1, 宮崎 翔子 1, 寺本 潤 2, 西田 敬二 2, 南 博道 3,
佐塚 隆志 4, 近藤 昭彦 1,2（1神戸大院・科技イノベ, 2神戸大・先端バイオ工セ, 3石川県大・生物資源研, 4名古屋大・生物機能セ）
kawaguchi_h@port.kobe-u.ac.jp

酵母 Saccharomyces cerevisiae は古くから産業微生物として注目を集め研究されており、発酵による物質生産株として広く利用されている。現在までに S.
cerevisiae の安定かつ安全な培養法や遺伝子解析・遺伝子組換え技術等が成熟してきており、S. cerevisiae を細胞工場として用いた各種有用物質の生産が強く期待されている。しかしながら、S. cerevisiae ではグルコースを炭素源とした発酵生産が主に行われるが、グリセロールを炭素源とした発酵生産はあまり知られていない。グリセロールはグルコースに比べ安価であるため、S. cerevisiae でグ
リセロールを有効に物質生産に活用できる系を構築できれば産業上大きなインパクトとなると考えた。そこで本研究では、はじめに S. cerevisiae からグリセ
ロール資化性株の育種を狙った。具体的には、S. cerevisiae を 段階的に炭素源を限制した培地で複数回かつ長時間継代培養することで、最終的にはグリセロー
ルを炭素源として有意に利用できるグリセロール資化性株の育種に成功した。
その上で、単離されたグリセロール資化性株について、各種培地における増殖能評価や、 グリセロールからのエタノール直接生産能を定性・定量評価をするなど各種評価を行った。以上の通り、本研究ではグリセロール資化性株の単離・取得と、当該株のグリセロールからのエタノール生産について評価したので、本発表にてこれらを併せて報告する。

【背景と目的】植物由来成分であるカフェ酸は植物由来成分は生理活性物質や芳香族ポリマー原料として多様な用途展開が期待される。我々はこれまでに、紙パルプをモデルセルロース系バイオマス原料とする組換え大腸菌によるカフェ
酸の発酵生産を研究してきたが、グルコースを基質とする場合と比べて生産速度及び終濃度の低さが課題であった（1）。そこで本研究では、バイオマス植物として注目されるイネ科の C4 植物ソルガムのバガスからカフェ酸を効率的に生産するために、ソルガムの酵素糖化液を原料とする発酵生産法を最適化し、さらにゲノム編集により宿主大腸菌を代謝改変した。
【結果と考察】ソルガムのバガスを酵素糖化した糖化液を基質とする発酵生産では、グルコース標品よりも高いカフェ酸終濃度が得られた（100 mg/L）。一方
で、カフェ酸収率は初期グルコース濃度と負の相関関係を示し、また糖化液では副生物である酢酸が増加していた。そこで、生産性を改善するために、Jar を用いたグルコースの逐次添加培養を行い、さらに培養期間中の溶存酸素濃度（DO）の影響を評価した。グルコース濃度を 17 g/L 以下で制御した 150 時間の培養後では、高 DO 条件と比べて低 DO 条件ではカフェ酸濃度が約 2 倍に増加することを明らかにした（360 mg/L）。しかし、低 DO 条件では副生物である酢
酸及び乳酸の蓄積も２倍以上に増加していた（各 6 g/L, 3 g/L）。そこで、副生物の生成を抑えてカフェ酸収率を増加させるために、Target-AID 法（2）によるゲノム編集で宿主大腸菌の酢酸および乳酸生合成能を欠損させたカフェ酸生産第2 世代株を作製した。
【謝辞】本研究は、JST「未来社会創造事業」の支援を受けて実施した。
<References>
1. Kawaguchi, et al., Appl Microbiol Biotechnol. 101:5279-5290 (2017).
2. Banno, et al., Nat Microbiol. 3:423-429 (2018).

Generation of a glycerol-assimilating strain of Saccharomyces cerevisiae andits direct ethanol production from glycerol

Genome editing and bioprocessing for enhanced caffeic acid production
from cellulosic biomass by metabolically engineered Escherichia coli

○Kuan Zhang1, Akihito Nakanishi1,2, Isao Karube1,2(1Grad. Sch. Bionics., Tokyo Univ. Technol., 2Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Univ.
Technol.)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, glycerol, ethanol fermentation○Hideo Kawaguchi1, Shoko Miyazaki1, Jun Teramoto2, Keiji Nishida2,
Hiromichi Minami3, Takashi Sazuka4, Akihiko Kondo1,2(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2Eng. Biol. Res. Cent., Kobe Univ.,
3
Res. Inst. Bioresour. Biotechnol., Ishikawa Pref. Univ., 4Biosci. Biotechnol. Cent.,
Nagoya Univ.)
Key words
Escherichia coli, caffeic acid, biomass, genome editing

201

2Cp10

発酵阻害物質に高い耐性を持つスリランカの酵母○外山 博英 1,2, Maduka Subodinee 2, 水谷 治 1,2（1琉球大・農, 2鹿児島大院・連農）
toyama@agr.u-ryukyu.ac.jp

2Cp12

好熱菌プロバイオティクスを給与した豚における筋タン
パク質の構成変化○鷺 陽香 1, 高木 誠仁 2, 西内 巧 3, 宮本 浩邦 1,4,5, 佐藤 成樹 6,
児玉 浩明 1
（1千葉大院・園芸, 2千葉大院・融合, 3金沢大・学際, 4サーマス（株）, 5理研・生命医科学, 6千葉大院・理学）
kodama@faculty.chiba-u.jp

スリランカのトッディーから Saccharomyces cerevisiae 酵母を 18 株単離した。それらは 45℃でもアルコール発酵できた。高い塩耐性を示したので、発酵阻害物
質に対する耐性も高いと期待して、バニリンなどの発酵阻害物質に対する耐性について調べた。すべての株が 18 mM バニリン存在下でも生育でき、1 株（SLY-10）は 21 mM でも生育可能であった。5 つの株（SLY-3, SLY-4, SLY-8, SLY-9,
SLY-10）は 24 mM バニリン存在下でアルコール発酵することができた。バニリ
ンはバニリルアルコールに還元されていた。さらに 4-ヒドロキシ安息香酸（24mM）
、フルフラール（30 mM）、5-ヒドキシメチル 2-フルフラール（5-HMF、30mM）、酢酸（75 mM）およびギ酸（26 mM）存在下でもアルコール発酵できた。これらの発酵阻害物質の混合物（0.81 mM バニリン、9 mM フルフラール、
9 mM 5-HMF、22.5 mM 酢酸、22.5 mM ギ酸）存在下でも 16.2-32.7 gL-1 のエタ
ノールを生産することが可能であった。バニリン単独では SLY-10 が最も高い耐性を示したのに対し、混合物に対しては他の 4 つの株の方が高い耐性を示した。これらの株は木質バイオマスからのバイオエタノール生産に有用な菌株であると考えられた。

【背景・目的】未利用の海産資源を好熱菌群によって発酵させた資材（以下、好熱菌発酵産物）を含む飼料を豚に給与すると、腸内フローラが改変し、子豚の成長促進や母豚の死産率の低下、脂肪蓄積の軽減、肉中の遊離アミノ酸の増加など、様々な有益な効果が確認されている。さらにこのような有益な効果をもたらすプロバイオティクスとして、好熱菌発酵産物由来の新菌種 Bacillus hisashii
N-11T(国際寄託番号 BP-863)が単離されている。本研究では BP-863 株の給与による肉質の変化に着目し、筋タンパク質の構成の特性を明らかにする事を目的とした。
【方法】２つの系統、三元交配豚 LDB と LDK を対象として、BP-863 株を子豚の育成段階より給与し、最長筋を採取した上で、SDS-PAGE、ウエスタンブロッ
ティング、二次元電気泳動および質量分析により、筋タンパク質の構成を網羅的に解析した。
【結果・考察】SDS-PAGE により、BP-863 の給与によって両系統で変化するバ
ンドパターンが確認され、当該タンパク質の質量分析の結果より、筋収縮に関与するタンパク質として知られる速筋型トロポニン I (fTnI)と同定された。そこ
で抗 fTnI 抗体を作製し、ウエスタンブロッティングにより fTnI を定量的に検出できる系を確立した。さらに二次元電気泳動で調べたところ、BP-863 の給与によって fTnI の等電点が変化していたが、質量分析の結果より、当該等電点の変化はリン酸化によるものではないと判明した。また、筋タンパク質のショッ
トガンプロテオーム解析を実施した結果、fTnI 以外のタンパク質としては、
Calsarcin-3 や Fatty acid synthase 等が有意に増加する事が明らかになった。以上の結果から、豚の系統の違いを超えてプロバイオティクスが筋タンパク質の構成に影響する事が示唆された。プロバイオティクスによる筋タンパク質の構成
変化は、他に類を見ない初めての知見と言える。

Yeast strains showing high tolerance against fermentation inhibitors

Muscle protein composition is changed by feeding thermophilic probiotics topigs○Hirohide Toyama1,2, Subodinee Maduka2, Osamu Mizutani1,2(1Fac. Agric., Univ. Ryukyus, 2United Grad. Sch. Agric. Sci., Kagoshima Univ.)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, fermentation, vanillin

2Cp11

新奇キシロース資化性ラビリンチュラのキシロース代謝
経路とメタボローム解析○Haruka Sagi1, Akihito Takagi2, Takumi Nishiuchi3, Hirokuni Miyamoto1,4,5,
Naruki Satoh6, Hiroaki Kodama1(1Grad. Sch. Horticul., Chiba Univ, 2Grad. Sch. Adv. Integr. Sci., Chiba Univ.,
3
Ad.Sci.Res.Cent, Kanazawa Univ., 4Sermas co.ltd., 5IMS,RIKEN, 6Grad. Sch. Sci.,
Chiba Univ.)
Key words
muscle protein, pig, probiotics, troponin I

2Cp13○林 雅弘 1, 松田 綾子 1, 長岡 綾 1,2（1宮崎大・農, 2林兼産業）
hayash-m@cc.miyazaki-u.ac.jp

好熱菌発酵産物の給与がブタ腸内の乳酸資化菌
Megasphaera elsdenii の有機酸代謝に与える影響○板谷 かえで 1, 荒岡 亮祐 1, 宮本 浩邦 1,2,3, 児玉 浩明 1
（1千葉大院・園芸, 2サーマス, 3理研・生命医科学）
kodama@faculty.chiba-u.jp【背景と目的】 従属栄養性油糧微生物ラビリンチュラによりバイオ燃料を生産するためには、多量の有機炭素源が必要となる。カーボンニュートラルでかつ安価な炭素源として検討されている、植物性バイオマス糖化液はヘミセルロー
ス由来のペントースを多量に含有し、その資化性及び利用効率が技術的課題となる。本研究では、キシロース資化性ラビリンチュラを天然海より分離し、キ
シロース代謝経路の推定、キシロース代謝能の強化を行った。さらに中心代謝のメタボローム解析で脂質合成に関わる補酵素の供給バランス、分子育種ター
ゲットとしてのボトルネック酵素を探索した。
【方法】キシロースを単一炭素源として沖縄県石垣島からキシロース資化性ラビ
リンチュラを分離した。分離株の 18SrRNA 遺伝子の塩基配列に基づき分離株の系統解析を行った。さらに分離株を、キシロースを単一炭素源とする培地で約3 年間継代培養してキシロースに馴化することでキシロース消費速度の向上を図った。また、キシロース代謝関連酵素活性を測定することによりキシロース
代謝経路を推定し、GC-MS、LC-MS/MS により中心代謝関連のメタボライトや脂質合成関連補酵素を分析した。
【結果及び考察】分離株の mh1915 株を Aurantiochytrium sp. と属レベルまで同定した。また、mh1915 株には xylose reductase 活性が認められず、xylose isomerase（XI） 活性、xylulokinase（XK） 活性が認められ mh1915 株は XI-XK 経路でキシロースを代謝していると推察された。さらにメタボローム解析の結果、mh1915
株はキシロース馴化により NADPH の再生系が円滑に働きかつ FAS の活性化に
より総脂肪酸含量も上昇していた。

【背景と目的】海産資源を 70~80℃の高温下で発酵させた飼料(以下、好熱菌発酵産物)をブタに給与すると、死産率の低下、成長促進、筋肉中の余分な脂肪分の減少など様々な生理作用が認められる。この時、排泄糞中の乳酸含量が低下することから、乳酸代謝に関わる腸内細菌叢の変化が示唆された。実際に菌叢を解析すると、好熱菌発酵産物の給与によって、腸内で優占する乳酸菌種が L乳酸産生菌から DL-乳酸産生菌へ変化することが確認された。また、乳酸から
短鎖脂肪酸を産生する乳酸資化菌である Megasphaera elsdenii が有意に増加していた。本研究では、好熱菌発酵産物の給与区・非給与区のブタ排泄糞から M.
elsdenii を単離し、その乳酸代謝に関する特性や腸内の乳酸菌との相互作用を明らかにすることを目的とした。
【方法と結果】好熱菌発酵産物の給与区・非給与区から各 4 頭の豚の排泄糞を回収し、当該糞サンプルを M. elsdenii 選択培地に塗布した。給与区・非給与区からそれぞれコロニーを単離し、5 株の M. elsdenii
代表菌株を選抜した。代表菌株の有機酸産生能を調べたところ、給与区、非給
与区の単離源の違いに関わらず乳酸資化能や産生する有機酸種に大きな違いはみられなかった。しかし、好熱菌発酵産物給与区から単離された代表菌株は L乳酸よりも DL-乳酸を基質とした際に約 1.3 倍と有意に多くの吉草酸を産生し、
また、L-乳酸よりも D-乳酸の資化速度が速いことも確認された。これらの結果
から、好熱菌発酵産物の給与によってブタ腸内の DL-乳酸産生菌が増加することで、M. elsdenii がより生育しやすい環境となり、特に基質が DL-乳酸である
場合に吉草酸産生能がより高くなるような M. elsdenii 株がブタ腸管内で増加すると考えられた。

Xylose metabolic pathway and metabolome analysisi of a novel xylose
assimilating thraustochytrid

Organic acid metabolism of lactate-utilizing bacterium Megasphaera
elsdenii isolated from feces of pigs fed with a thermophile-fermented
compost○Masahiro Hayashi1, Ayako Matsuda1, Aya Nagaoka1,2(1Fac. Agric., Univ. Miyazaki, 2Hayashikane Co. Ltd.)Key words

xylose, biodiesel fuel, metabolic analysis, Auranchytrium○Kaede Itaya1, Ryosuke Araoka1, Hirokuni Miyamoto1,2,3, Hiroaki Kodama1(1Grad. Sch. Horticul., Chiba Univ., 2Sermas, 3IMS,RIKEN)

Key words
microbiota

Megasphaera elsdnii, lactate-utilizing bacterium, compost, gut

202

2Cp14

好熱性アセトジェン Theromoanaerobacter kivui の代謝改変によるエタノール生産

2Cp16○登木 耕陽, 佐藤 悠, 岡野 憲司, 本田 孝祐（阪大院・工）honda@bio.eng.osaka-u.ac.jp

C.necator 組換え株の化学合成独立栄養条件下での回分培養による 3-ヒドロキシ酪酸と 3-ヒドロキシヘキサン酸の共重合ポリエステルの CO2 からの生合成○鈴木 尚幸 1, 宮本 樹里 1, 折田 和泉 2, 福居 俊昭 2, 田中 賢二 1
（1近畿大・産理工, 2東工大・生命理工）
tanaka@fuk.kindai.ac.jp[背景と目的] 一般的なバイオリファイナリーにおいて原料であるバイオマスは、
物理的破砕や糖化処理を経て、発酵による物質生産へと供される。一方、前処理に要するコストの低減やその過程で生じるフルフラール類などによる発酵微生物への阻害作用の回避が、バイオリファイナリー分野における長年の課題となっている。そこで、熱分解によりバイオマスを水素や二酸化炭素等からなる混合ガスに変換した後、生じたガスを資化可能な微生物の作用でこれらを燃料や化学品へと変換する合成ガス発酵法が近年注目を集めている。合成ガス発酵
法では、水素と二酸化炭素などの混合ガスの異化代謝により酢酸を生成するア
セトジェンが汎用される。本研究では、既知のアセトジェンのうち、最も高い耐熱性と倍化速度を有する好熱性アセトジェン Thermoanaerobacter kivui に代謝改変を施し、混合ガスからエタノールを生産可能な株の育種に取り組んだ。
[方法と結果]はじめに、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(pyrE)を欠損させた T. kivui のウラシル要求性株を作製した。次に、pyrE をマーカーとして、ウラシル要求性株のゲノム上に Pyrococcus furiosus 由来のアルデ
ヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼおよび Thermoanaerobacter sp. X514
株由来のアルコールデヒドロゲナーゼをコードした遺伝子を組み込むことで、ATP 合成能を損なうことなく混合ガスをエタノールへと変換可能な T. kivui 代謝
改変株を作製した。同株を用いることで現在までに、水素・二酸化炭素混合ガ
ス雰囲気下の栄養培地で 2 g/L/day の速度でエタノールを生産することに成功している。

3-ヒドロキシ酪酸（3HB）と 3-ヒドロキシヘキサン酸（3HHx）の共重合ポリエ
ステルである PHBH は、柔軟性等に優れた微生物産生型の生分解性プラスチッ
クとして期待されている。我々は、糖から PHBH を生合成する水素酸化細菌
Cupriavidus necator の遺伝子組換え株を用いた化学合成独立栄養条件下でのPHBH 生合成について研究しており、フラスコ培養試験では 3HHx モル分率に富む PHBH を CO2 から高菌体内含有率で生合成することを明らかにした。今回、ジャー発酵槽を用いた回分培養試験を行い、菌体生成と PHBH 生合成効率化における問題点を検証した。C.necator の換え株４種類について、無機塩合成
培地、混合基質ガス（H2/O2/CO2 ＝ 8：1：1）、およびガラスジャー発酵槽を備えた閉鎖循環ガス発酵システムを用いて、回分培養試験を実施した。培地量は600mL とし、pH は 7.0 に維持した。結果として、回分培養における菌体生成量と PHBH 蓄積率ともにフラスコ培養のそれよりも高く、とくに MF01/JAc 株では培地窒素源である塩安濃度を 2.42g/L とした時に DCW で約 70g/L の菌体生成量が得られた。菌体合成を高めるため、さらに塩安濃度を増やして培養を行ったが、菌体生成量はむしろ低下した。また、回分培養では PHBH 中の 3HHx モ
ル分率がフラスコ培養に較べて低くなったが、これは培地 DO の不足が原因ではないかと考えられた。現在、酸素移動速度容量係数 kLa の高い撹拌翼・発酵槽を導入することにより、菌体生成と PHBH 生合成の改善を試みている。

Metabolic engineering of thermophilic acetogen, Thermoanaerobacter kivui,
for ethanol production from H2 and CO2

Biosythesis of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) from CO2 bybatch culture of the genetically engineered R.eutropha inchemolithoautotrophic condition○Koyo Noboki, Yu Sato, Kenji Okano, Kohsuke Honda(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)○Naoyuki Suzuki1, Jyuri Miyamoto1, Izumi Orita2, Toshiaki Fukui2, Kenji Tanaka1(1Fac. Humanity-Oriented. Sci. Eng., Kinki Univ., 2Sch. Life Sci. Technol, Tokyo
Tech)

Key words

syngas fermentation, ethanol, Thermoanaerobacter kivui

Key words

Ralstonia eutropha, PHBH, hydrogen-oxidizing bacteria, CO2 fixation

2Cp15

有機性廃棄物の二次資源化に向けた天然菌叢とアセト
ジェンの共培養システムの開発

2Dp01

超好熱性アーキア由来キチナーゼ ChiC の細胞膜局在化に関与するアミノ酸配列の同定○佐藤 悠 1, 佐々木 由佳 1, 登木 耕陽 1, 岡野 憲司 1, 木村 浩之 2,
本田 孝祐 1
（1阪大院・工, 2静大・グリーン科技研）
honda@bio.eng.osaka-u.ac.jp○渡邉 大輔, Aslam Mehwish, 山田 将大, 金井 保, 跡見 晴幸（京大院・工）atomi@sbchem.kyoto-u.ac.jp[背景と目的] 有機性廃棄物の二次資源化プロセスであるメタン発酵では、多様な微生物の作用により有機物が段階的に分解され、水素・二酸化炭素を経てメタンが生成される。しかし、メタンは安価であるため小規模な事業所では設備投資や運転にかかるコストの回収が困難であり、メタンよりも高付加価値な物
質を生産可能なプロセスの開発が望まれる。共同発表者である静岡大学の研究グループは、培養温度の制御により地下温水由来のメタン発酵菌叢中のメタン
生成アーキアを特異的に阻害し、前駆体である水素と二酸化炭素を生成することに成功している。この現象をもとに我々は、「菌叢」と「水素と二酸化炭素からの物質生産を行えるアセトジェン」を組み合わせ、有機物からメタン以外の有用物質を生産する新システムを考案した。本研究では、(i)実験室レベルで水素と二酸化炭素を生成する「菌叢」を取得し、(ii)「水素と二酸化炭素からの物
質生産が可能なアセトジェン」と組み合わせることで、上述の新システムの構築に向けた取り組みを行ったので報告する。
[結果] 静岡県川根温泉からサンプルを採水し、地下温水の組成を再現した合成培地にて菌叢の培養を試みた。その結果、60℃での培養時に約 4 mmol/L/day で水素と二酸化炭素を生成する菌叢を取得した。また、取得した菌叢の継代培養を行い、半年以上にわたり水素と二酸化炭素の生成能を損うことなく菌叢の安定した培養を行うことに成功した。さらに、ここで生じた水素と二酸化炭素を生育基質とした好熱性アセトジェン Thermoanaerobacter kivui の培養にも成功している。現在、T. kivui の代謝改変株を用いることで、菌叢が生成する水素と二酸化炭素からのエタノール生産試験を実施中である。

【目的】
超好熱性アーキア Pyrococcus chitonophagus のキチナーゼ ChiC は、C 末端領域に推定膜局在ドメインがあり細胞膜への局在が予想されるが、アーキアの膜局在性タンパク質の膜局在化機構の解析はほとんど行われていない。本研究ではChiC の膜局在化に関わるアミノ酸配列の同定を行った。
【方法・考察】ChiC の膜局在ドメインは、疎水性アミノ酸に富む領域に続いて、塩基性アミノ酸に富む配列をもつ。また疎水性アミノ酸配列内には膜結合が予想される同様のタンパク質においても保存されている配列が存在する。これらの配列の重要性を確かめるために、遺伝子組換えが可能な超好熱性アーキア Thermococcus
kodakarensis を用いて、野生型 ChiC、および五種類の変異型 ChiC 発現プラスミドを作製した。変異型 ChiC のうち三種は C 末端領域の欠失変異体であり、二種は保存配列の部位特異的変異体である。これらの発現プラスミドをもつ T.
kodakarensis 株を培養し、各培養液を培養液上清画分・細胞質画分・膜画分に分画し、各画分について抗 ChiC 抗体を用いた Western blot 解析を行った。その結果、野生型 ChiC が主に細胞膜に局在すること、および ChiC の膜局在ドメイン
内の各領域がその膜局在化に大きく寄与することが示唆された。

Development of a co-cultivation system of natural microbial consortium andthermophilic acetogen toward the recycling of organic wastes

Identification of amino acid sequences involved in cell membrane
localization of the chitinase ChiC in hyperthermophilic archaea

Key words
syngas fermentation, methane fermentation, Thermoanaerobacterkivui, synthetic microbial consortium

Key words○Yu Sato1, Yuka Sasaki1, Koyo Noboki1, Kenji Okano1, Hioryuki Kimura2,
Kohsuke Honda1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)○Daisuke Watanabe, Mehwish Aslam, Masahiro Yamada, Tamotsu Kanai,
Haruyuki Atomi(Grad. Sch. Eng., Kyoto Univ.)
hyperthermophile, archaea, chitinase, membrane localization

203

2Dp02

超好熱性アーキア Pyrococcus chitonophagus がもつキチナーゼの遺伝学的機能解析

2Dp04

山田 将大, 中田 菜月, Aslam Mehwish, ○金井 保, 跡見 晴幸（京大院・工）atomi@sbchem.kyoto-u.ac.jp

コアグラーゼ陰性ブドウ球菌由来アシル化ホモセリンラ
クトン分解酵素の機能解析○上村 哉生樹 1, 染谷 信孝 2, 諸星 知広 1
（1宇都宮大院・工, 2農研機構）
morohosi@cc.utsunomiya-u.ac.jp【目的】Pyrococcus chitonophagus（前の名称は Thermococcus chitonophagus）はキチンを主有機物源とした培地により単離された超好熱性アーキアである。本菌のゲノム上には、３つのキチナーゼ遺伝子（chiA, chiC, chiD）が存在する(1)。
本菌のキチン分解過程において、各キチナーゼが果たす役割の解明を目的として、本菌における遺伝子組換え系の構築とそれを用いたキチナーゼ遺伝子破壊株の作製を行った。
【方法・考察】前年度の大会において、P. chitonophagus の pyrE 破壊株を単離し（CHU1 株）、本菌を用いた chiC 破壊株と chiD 破壊株の単離を報告した。しかしながら、CHU1 株の形質転換効率は極めて低く、実用的な系とは言えなかった。そこで、制限修飾系（TypeI）遺伝子群をさらに破壊した株（CRU1 株）を作製し、本菌をホスト株として、各キチナーゼ遺伝子破壊株の作製を進めた。
その結果、全てのキチナーゼ遺伝子の破壊株、CRDA1 株(CRU1:ΔchiA)、CRDC1
株 (CRU1:ΔchiC) 、 CRDD1 株 (CRU1:ΔchiD) が 作 製 で き た こ と か ら 、 P.
chitonophagus において実用的な遺伝子組換え系を構築したと考えた。作製したキチナーゼ遺伝子破壊株を用いて、膨潤キチンの分解試験を行った結果、CRDA1株において、ホスト株や他の遺伝子破壊株よりも、有意に低い swollen chitin の分解が観察された。以上のことから、本菌のキチン分解において、ChiA が主要な役割を果たしていることが考えられた。
1) Horiuchi A, Aslam M, Kanai T, Atomi H. 2016. A structurally novel chitinase fromthe chitin-degrading hyperthermophilic archaeon Thermococcus chitonophagus. Appl
Environ Microbiol 82: 3554 -3562【目的】グラム陰性細菌の多くは、アシル化ホモセリンラクトン（AHL）を介した Quorum Sensing により、病原性の発現やバイオフィルム形成等を制御している。これらの細菌が生産する AHL を人為的に分解することで、Quorum Sensingに制御される病原性発現を抑制可能である。コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（CNS）は、臨床的危険度が低い皮膚などの常在菌である。本研究では、CNSから新規 AHL 分解遺伝子をクローニングするとともに、AHL 分解遺伝子を用いた病原性抑制効果について検討を行った。
【方法及び結果】CNS の一種である Staphylococcus carnosus, S. haemolyticus, S.
sciuri の全ゲノム配列中に、ジャガイモ葉から単離した Solibacillus silvestris 由
来の AHL ラクトナーゼ（ahlS）相同遺伝子が存在することが明らかになった。
これらの CNS 菌株の染色体から ahlS 相同遺伝子をクローニングし、大腸菌へ形質転換したところ、様々な構造のアシル鎖を有する AHL に対して分解活性を示し、特にアシル鎖長が短い AHL に対して高い分解活性を有することが明らかになった。次に、AhlS をマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として発現するプラスミドを作成し、融合タンパク質をアミロースレジンカラムで精製したところ、融合タンパク質は高い AHL 分解活性を有していた。さらに、融合タンパク質を緑膿菌 Pseudomonas aeruginosa PAO1 株に投与したとこ
ろ、Quorum Sensing に制御されるエラスターゼ活性を抑制可能であることが明らかとなった。

Genetic analysis of chitinase gene deletion mutants of the hyperthermophilicarchaea, Pyrococcus chitonophagus

Characterization of N-acylhomoserine lactone-degrading enzyme from thecoagulase-negative staphylococci

Masahiro Yamada, Natsuki Nakada, Mehwish Aslam, ○Tamotsu Kanai,
Tamotsu Kanai(Grad. Sch. Eng., Kyoto Univ.)○Yaoki Kamimura1, Nobutaka Someya2, Tomohiro Morohoshi1(1Grad. Sch. Eng., Utsunomiya Univ., 2NARO)

Key words

hyperthermophile, archaea, chitinase, gene disruption

Key words

quorum sensing, acyl homoserine lactone, staphylococci, lactonase

2Dp03

Pseudomonas sp. TB-97 株によるテレフタル酸からの有
用物質生産

2Dp05

納豆菌のポリ‐γ‐グルタミン酸生産に関与する高度に保存された Yj ｇ F/YER057 ｃ/UK114 ファミリータンパク質○金森 拓 1, 中島 鈴佳 1, 岡村 匡浩 1, 内堀 孝博 2, 中島 敏明 1
（1筑波大院・生命環境, 2パナック工業株式会社）
nakajima.toshiaki.ga@u.tsukuba.ac.jp○木村 啓太郎 1, ル ティ トゥ ホン 1, 八谷 剛史 2,3, 長谷 純嵩 2,
志波 優 4, 吉川 博文 4,5, 榊原 康文 2
（1農研機構・食品, 2慶應大・理工, 3岩手医大・メディカル・メ
ガバンク, 4東農大・応生科, 5東農大・ゲノム）
keitarou@affrc.go.jp【背景と目的】フィルム処理工場において PET フィルムをリサイクルする際、安価な化合物であるテレフタル酸 (TPA) が生成、蓄積してしまい、その処理が課題となっていた。そこで当研究室では TPA を効率よく分解する菌株 (TB-97株) を取得、TPA が蓄積する課題は解決した。しかし、TPA を単に TB-97 株に分解・消失させるだけではもったいない。本研究では、TB-97 株の TPA 分解過程で生じる代謝中間体で、種々の化成品の前駆体として用途があり付加価値が高いプロトカテク酸 (PCA) に着目し、生産と蓄積を目的とした。TB-97 株はPCA 分解遺伝子 (pca3,4) を 2 セット保持しており PCA を蓄積できない状態であるため、遺伝子操作でこれらを破壊した菌株 (2 重破壊株) を取得し、PCA を蓄積させる。
【方法】pca3,4 破壊プラスミドを設計・構築し、大腸菌ケミカルコンピテントセ
ルにヒートショック法で導入した。これと TB-97 株をメンブレン上で接合伝達、相同組換えさせた。1 セット目 (1 重破壊株) は pca3,4 を抗生物質耐性マー
カーと組み替えることで、2 セット目 (2 重破壊株) は 1 重破壊株の遺伝子に対して、pca3,4 を全てくり抜くことで、それぞれ pca3,4 を破壊した。取得した破壊株を TPA 基本培地 (TPA が唯一炭素源) や TPA 基本培地 (+1%リンゴ酸：
TB-97 株の TPA 分解を阻害しない補助炭素源) で振盪培養し、TPA, PCA 濃度をHPLC で測定した。
【結果と考察】取得した 2 重破壊株を TPA 基本培地で培養した結果、若干の
PCA 蓄積が見られ、確かに pca3,4 の破壊に成功した。また、TPA 基本培地 (+1%リンゴ酸) での培養実験では、TPA 分解と PCA 蓄積 (5.5 g/L) が見られ、リンゴ酸の添加量次第で PCA の生産、蓄積もさらに向上すると考えられた。今後はPCA 高生産条件の検討及び、他菌株の有用物質生産経路を導入し他の有用物質生産を検討する。

【背景と目的】納豆菌のポリ‐γ‐グルタミン酸（γPGA）生産は細胞密度による制御を受け，定常期に観察される。そのため、細胞内情報伝達の鍵因子である
degQ 遺伝子の破壊により γPGA 生産能は失われる。γPGA 生産制御に関わる新たな因子を探索するため、degQ 遺伝子破壊株の γPGA 生産を回復させる抑制変異のスクリーニングを試みた。
【方法】納豆菌（Bacillus subtilis(natto)）の degQ 遺伝子破壊株をエチルメタンス
ルホン酸で変異処理し，γPGA 生産が回復した抑制変異株を選抜した。次いで、得られた抑制変異株の全ゲノム塩基配列をゲノムアナライザー（Illumina IIx）
で解析して変異を検出した。γPGA 合成遺伝子の発現は pgsB-lacZ 融合遺伝子の発現量（β‐galactosidase 活性）を指標として、既報に従い測定した（Kimura etal., 2009）。相補試験等の遺伝学的実験は定法に従って行った。
【結果と考察】独立に取得した 3 株の抑制変異株には其々３〜４個の変異が検出され、その内 yabJ 遺伝子の一塩基変異が 3 株に共通する変異であった。原因変異を特定するため、変異型 yabJ 遺伝子を親株（degQ 遺伝子破壊株）に導入し、γPGA 生産と γPGA 合成遺伝子の発現が回復することを確認した。興味深いことに、変異型 yabJ は野生型に対して優性であり、変異型を持つ株では γPGA 合成を直接制御する転写因子 DegU の発現量が大きく増加していた。YabJ は高度に保存された Yj ｇ F/YER057 ｃ/UK114 ファミリーに属するエナミン・イミン
代謝物の解毒（脱アミノ反応） 酵素であるとされている。しかし、異説も多くその機能には不明な点が多く残されている（Niehaus et al., 2015）。今回得られた実験結果から、抑制変異により yabJ 遺伝子産物が脱アミノ反応以外の何らかの機能を獲得して DegU の発現量を増加させたと推定された。

Production of useful substrate by Pseudomonas sp. TB-97 strain.

The highly conserved YjgF/YER057c/UK114 family gene is involved in polyγ-glutamatic acid synthesis of Bacillus subtilis (natto)○Taku Kanamori1, Suzuka Nakajima1, Masahiro Okamura1, Takahiro Uchibori2,
Toshiaki Nakajima1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Panac ind, inc)

Key words
terephthalic acid, protocatechuic acid, Pseudomonas, homologous
recombination○Keitarou Kimura1, Le Thi Thu Hong1, Tsuyoshi Hachiya2,3, Sumitaka Hase2,
Yuh Shiwa4, Hirofumi Yoshikawa4,5, Yasubumi Sakakibara2(1NFRI, 2Dept. Biosci. Inf., Keio Univ., 3Iwate Med. Meg., Iwate Med. Univ, 4Fac.
Appl. Biosci., Tokyo Univ. Agric., 5Genome Res. Center, NODAI Res. Ins., Tokyo
Univ. Agric.)
Key words
Bacillus subtilis, poly(amino acid), gene expression, fermentation

204

2Dp06

ビフェニル/PCB 分解細菌 Rhodococcus wratislaviensis
T301 株の色素脱色型ペルオキシダーゼの発現

2Dp08○渡邊 崇人 1, 木村 信忠 2, 末永 光 3, 廣瀬 遵 4, 二神 泰基 5,
陶山 明子 6, 藤原 秀彦 6, 後藤 正利 7, 古川 謙介 6
（1京大・生存研, 2産総研・生物プロセス, 3産総研・創薬基盤, 4宮
崎大・工, 5鹿児島大・農, 6別府大・食物栄養, 7佐賀大・農）takahito@rish.kyoto-u.ac.jp

プロモーターおよびターミネーターがビフィズス菌の遺伝子発現に与える影響○小酒井 智也 1, 下総 葉子 2, 野村 泉 3, 鈴木 徹 3（1岐阜大院・連農, 2岐阜大院・自科技, 3岐阜大・応生科）
suzuki@gifu-u.ac.jp【目的】自然界から供給される芳香族化合物の多くは植物リグニン由来である．
リグニンは木材腐朽菌等により部分分解されるとその分解生成物である芳香族化合物の多くは土壌中に供給される．土壌中には，リグニンから供給された芳香族化合物を分解して増殖する細菌が数多く存在する．我々は，これまでに土壌中より Pseudomonas 属や Rhodococcus 属を始めとするビフェニル/PCB 分解細菌を十数株単離し，それらの遺伝生化学的研究及びゲノム解析を行ってきた．
その結果，これらの細菌においては，ビフェニル/PCB 等の環境汚染物質だけではなく，様々なリグニン由来の芳香族化合物の分解代謝を担うと予想される遺伝子を数多く有していることが分かった．その内，今回は，ビフェニル/PCB 分
解細菌 R. wratislaviensis T301 株の色素脱色型ペルオキシダーゼに注目し，その遺伝子の単離と発現を試みた．
【方法・結果】T301 株のゲノム情報を精査した結果，本菌のゲノム上には，3種類の色素脱色型ペルオキシダーゼ遺伝子が存在することを確認した．また，これらの遺伝子産物は，強力なビフェニル/PCB 分解細菌 R. jostii RHA1 株由来のリグニンペルオキシダーゼ DypB と高い相同性を有していた．PCR にて増幅
後，大腸菌の宿主ベクター系を用いて発現を試みたが，ほとんど可溶化発現しなかった．次に，Rhodococcus 属細菌の宿主ベクター系を用いてチオストレプ
トン誘導下で発現を試みたところ，可溶化発現及び高発現した．N 末端，C 末
端及び両末端にヒスチジンタグをそれぞれ付加して精製した酵素は，ヘムの再構成やマンガンの添加によって活性が増加することが分かった．現在，本酵素の諸性質を調べている．

【背景と目的】 プロモーターおよびターミネーターは、それぞれ転写の開始と終結に対して主要な役割を担っている。これらの構造は原核生物に共通して存在するが、その機能や性質は、大腸菌や枯草菌などを除くほとんどの生物種では詳しく検証されていない。また、近年、次世代シーケンサーの普及により、非常に多くの菌種のゲノム配列が決定され、ゲノム情報に基づく研究が活発化している。そのため、プロモーターやターミネーターが遺伝子発現に与える影
響を、菌種ごとに検証する必要があると考えた。本研究においては、ヒト腸内フローラを構成するビフィズス菌に着目し、プロモーターやターミネーターの基本構造や機能を明らかにすることを目的とした。
【方法】 Bifidobacterium longum NCC2705 より得られた RNA-Seq 解析から、プロモーターの構成要素である-10 領域と-35 領域のコンセンサス配列をそれぞれ推定した。 次に、これらの推定配列から最適化配列を検証した。このとき、コン
センサス配列に 1 塩基ずつ変異を加えたプロモーターを用い、レポーターアッ
セイを行った。さらに、二つの領域間のスペーサー長の特徴についても検証を行った。一方、ターミネーターに関しては、本菌株のもつ 20 種類以上のターミ
ネーターをレポーター遺伝子の下流に組込み、それらの機能性を評価した。プ
ラスミドの構築では、pKO403 をベクターとし、プロモーター、レポーター遺伝子、ターミネーターを組込んだ。
【結果と考察】 -35 領域と-10 領域のコンセンサス配列および最適化配列は、それぞれ TTGTGC/TTGNNN と TACAAT/TATAAT だった。また、スペーサー長としては 11 bp と 17 bp が本菌で機能し、大腸菌とは異なる特徴を示した。一方、ターミネーターの種類によって遺伝子発現に 4 倍以上の差がみられ、機能に違いがあることが示唆された。

Expression of dye-decolorizing peroxidases from a biphenyl/PCB-degrader,
Rhodococcus wratislaviensis T301

An influence to gene expression in Bifidobacterium by promoter andterminator○Takahito Watanabe1, Nobutada Kimura2, Hikaru Suenaga3, Jun Hirose4,
Taiki Futagami5, Akiko Suyama6, Hidehiko Fujihara6, Masatoshi Goto7,
Kensuke Furukawa6(1RISH, Kyoto Univ., 2BPRI, AIST, 3BRD, AIST, 4Fac. Eng., Univ. Miyazaki, 5Fac.
Agric., Kagoshima Univ., 6Fac. Food Nut. Sci., Beppu Univ., 7Fac. Agric., Saga
Univ.)
Key words
lignin, biphenyl/PCB, Rhodococcus, dye-decolorizing peroxidase

2Dp07

D-サイクロセリン生産性放線菌のゲノムマイニング○矢尾井 健人 1, 黒田 照夫 2, 森田 大地 2, 熊谷 孝則 2
（1広大・薬, 2広大院・医系科学）
tkuma@hiroshima-u.ac.jp【目的】 Streptomyces (S.) lavendulae ATCC11924 は結核治療薬である D-サイクロ
セリン (D-CS) の生産菌として知られており, 私たちの研究により, その生合成遺伝子クラスター (BGC) や生合成経路はすでに明らかとなっている。ATCC11924
株のゲノムを解読したところ, 本菌株には, 依然として 20 個以上の BGCs が眠っていることが判明したため, 本研究では, ゲノム解析の結果に加え, 新規二次代謝産物の獲得を目的とした BGCs の異種発現について報告する。
【方法・結果】ATCC11924 株のゲノムシークエンスは PacBio RSII を用いて行った。約 74,000 のリードをアッセンブリーした結果, 7.32 Mb, 443 Kb および 295
Kb から成る 3 つのコンティグが得られ, これらを順にコンティグ 1, 2, 3 と命名した。続いて ATCC11924 のゲノムに対して antiSMASH 解析を行った結果, 本株には D-CS の BGC を含め 23 個の BGCs が存在していた。これらのうちコンティ
グ１中に含まれるクラスター 5 を対象として PCR による増幅を行い, EcoRV により処理した pSET152 と NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix を用いてライゲーションし pSET-1-5 を作成した。構築したベクターを接合伝達により S.
avermitilis SUKA17 へと形質転換することで, 異種発現株である S. avermitilis
SUKA17::pSET-1-5 の獲得に成功した。この菌株を培養することにより得られる二次代謝物については, HPLC を利用し今後さらに解析を進める予定である。同様にして, コンティグ 1 中のクラスター 13, コンティグ 2 中のクラスター 1 についても S. avermitilis SUKA17 を宿主として異種発現させ, 新規二次代謝産物の獲得を目指す。

Genome mining of D-cycloserine-producing microorganism○Kento Yaoi1, Teruo Kuroda2, Daichi Morita2, Takanori Kumagai2(1Sch. Pharm. Sci., Hiroshima Univ., 2Grad. Sch. Biomed. and Health Sci.,
Hiroshima Univ.)

Key words
lavendulae

D-cycloserine, genome mining, heterologous production, Streptomyces○Tomoya Kozakai1, Yoko Shimofusa2, Izumi Nomura3, Tohru Suzuki3(1United Grad. Sch. Agric. Sci., Gifu Univ., 2Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Gifu
Univ., 3Fac. Appl. Biol. Sci., Gifu Univ.)

Key words

Bifidobacterium, promoter, terminator, gene expression

2Dp09

マクロピノサイトーシス誘起ペプチドを利用した海洋性
紅色光合成細菌の新規形質転換系の開発○樋口 美栄子, 沼田 圭司（理研・環境資源）
keiji.numata@riken.jp

マクロピノサイトーシスは、細胞外液をマクロピノソームという小胞により細胞内に取り込む現象であり、細胞内デリバリーの手法の一つとして注目されている。我々は、代表的な細胞透過性ペプチドであり、マクロピノサイトーシスを誘導することが知られている Tat ペプチドとマクロピノソームから細胞質への放出能を有する EED ドメインを、サルコシンリンカーで融合した dTat-EEDペプチドを開発し、DNA デリバリー能について検証した。ホスト生物としては、窒素固定や光合成能を有する海洋性紅色光合成細菌を用いた。紅色光合成
細菌への外来遺伝子の導入には接合法が広く使われており、培養液に添加するだけで DNA が取り込まれる自然形質転換についてはほとんど報告されていな
い。DNA のデリバリーには、カナマイシン耐性遺伝子を持つプラスミドをポリ
カチオン性ペプチドと混合したペプチド-プラスミド DNA 複合体を用いた。
dTat-EED ペプチド（10 - 500 μM）を濃縮した紅色光合成細菌の培養液に添加することによりマクロピノサイトーシスを誘導した後、ペプチド-プラスミド DNA
複合体を培養液に加え 1 時間反応させた。反応液を除去した後、生育培地のみ
で一晩前培養し、カナマイシンを含む寒天培地で培養した。その結果、ペプチ
ド濃度に依存してカナマイシン耐性コロニーが出現し、50 ・100 μM でより多くの耐性コロニーが得られた。500 μM では dTat-EED ペプチド処理直後に紅色
光合成細菌は溶菌し、耐性コロニーが得られなかった。これらの結果から、マクロピノサイトーシスを誘起するペプチドにより紅色光合成細菌への DNA のデリバリーが可能であることがわかった。現在は、他の細菌種やペプチドの種
類・DNA との量比などの最適化を進めている。

Development of a novel transformation method of marine purple
photosynthetic bacteria using micropinocytosis-inducing peptide○Mieko Higuchi-Takeuchi, Keiji Numata(CSRS, RIKENS)

Key words

transformation, peptide, photosynthetic bacteria, gene transfer

205

2Dp10

Sphingomonas bisphenolicum AO1 株のビスフェノール
A (BPA)分解能の不安定化評価法の構築

2Dp12○村上 将和 1, 仲野 育惠 1, 松村 吉信 2
（1関西大・生命生物工, 2関西大・ORDIST）
ymatsu@kansai-u.ac.jp

枯草菌を宿主とした低毒性物質で誘導可能なタンパク質
発現系の開発○広岡 和丈（福山大・生命工）
hirooka@fukuyama-u.ac.jp【背景】 ビスフェノール A (BPA) はポリカーボネート樹脂などの原料として利用される物質で、発がん作用や内分泌撹乱作用を示すことが確認されている。
そこで当研究室では、BPA 汚染環境の修復に利用可能な BPA 分解菌の探索を試
み、BPA を約 6 時間で分解できる Sphingomonas bisphenolicum AO1 株を単離した。本株はビフェニル類化合物等も分解でき、合成化合物全般の環境浄化に利用できるものと考えている。一方、本株は BPA 分解時に一時的な増殖能の低下
や BPA 非分解菌 (AO1L 等) の出現などゲノム構造の不安定性が実用化への問題点となっている。そこで、本研究では AO1 株の BPA 分解能の不安定化評価法の構築とゲノム構造解析を行い、ゲノム不安定化の頻度や要因を調べることを目的とした。
【方法と結果】AO1 株不安定化頻度は BPA 非分解細胞の出現率で評価した。
様々な条件で培養した AO1 株細胞を BPA (115 μg/mL) とカザミノ酸 (1 g/l)、グ
ルコース (1 g/l) を含む BSM 改変培地 (以下 BPA-BSM 改変培地) と BPA を含まない BSM 改変培地で培養した。30℃、3 日間培養を行い、BPA-BSM 改変培地で生育しなかった AO1 株の割合を BPA 非分解細胞出現率とした。まず、AO1
株を BPA 存在下の BPA-BSM 改変培地で培養した場合では不安定化頻度は 7%に対して、BPA 非存在下の BSM 改変培地で培養した場合の不安定化頻度は約40%であった。このことは、BPA が AO1 株の BPA 分解能力を安定化させていることを示唆している。また、生育しなかった株の BPA 分解遺伝子の存在量をリアルタイム PCR 法で調査したところ、一部の BPA 分解遺伝子の存在量が非常に高い値となっていた。このことは、一部の BPA 分解遺伝子がプラスミドより遊離した状態で細胞内に多数存在していることを示唆しており、この状態がAO1 株の不安定性に関わっていると予想している。現在、遊離領域とその遊離頻度の特定を試みている。

【目的】タンパク質の異種発現系の微生物宿主としては大腸菌が一般的であるが、哺乳類に毒性を示すリポ多糖類を含むため医薬品・食品製造に関わるタン
パク質を生産する場合にはこれらの有害物質を除去する必要が生じる。枯草菌
は納豆などの発酵食品製造に用いられ安全性が認められているので、これを宿主とし、植物由来低毒性物質を誘導物質とするタンパク質高発現系の開発を試みている。その一例としてラムノースとグルコースで制御可能な枯草菌宿主タ
ンパク質高発現系を構築し、評価を行なった。
【方法・結果】枯草菌のラムノース異化オペロンの制御領域 (PrhaEW) と、発現量のさらに高めるために、恒常的に発現する cdd 遺伝子の制御領域 (Pcdd) と、定常期に高発現する ylbP 遺伝子の制御領域 (PylbP) を組み合わせて連結し、種々のハイブリッド型発現誘導系を構築した。各構築を改変型 GFP 遺伝子 (egfp) と融合させて染色体中に導入した枯草菌株を作製し、それらをグルコースまたは
ラムノースを炭素源とした培地で培養し、蛍光強度を定量した。その結果、SD
配列を除いた PrhaEW と ylbP 遺伝子の SD 配列の連結 (PrhaEWylbP) を保持した菌株において最も厳密に発現制御が可能であることがわかり、SD 配列を除いた Pcdd と ylbP 遺伝子の SD 配列の連結 (PcddylbP) を保持した菌株をグルコー
ス存在下で培養した場合に EGFP 発現量が最大となった。グルコース存在下での発現量のさらなる向上を目指し、PcddylbP にカタボライト活性化する ackAと pta の各遺伝子の制御領域を組み込んだ各構築を作製して同様に評価したがグルコース存在下での発現量の上昇は認められず、制御領域の配置が重要であると考えられた。

Establishment of the destabilization evaluation method on the degradation
ability of bisphenol A in Sphingomonas bisphenolicum AO1Bacillus subtilis protein expression system inducible by non-toxic substances○Masakazu Murakami1, Ikue Nakano1, Yoshinobu Matsumura2(1Dept. Life science & Biotech., Kansai Univ, 2ORDIST. Kansai Univ)○Kazutake Hirooka(Fac. Life Sci. Biotechnol., Fukuyama Univ.)

Key words
compounds

gene disruption, bioremediation, genome stability, xenobiotic

Key words

Bacillus subtilis, protein expression, rhamnose, glucose

2Dp11

放線菌線状プラスミドの接合伝達に対する ttrA の影響

2Dp13

ポリヒドロキシアルカン酸生産菌で機能する転写制御ス
イッチの確立○深田 悠太 1, 大橋 沙季 1, 丸山 直也 1, 池田 治生 2, 片岡 正和 1
（1信州大院・生命医工, 2北里大・北里生命研）
mars@shinshu-u.ac.jp○平山 歩夢 1, 折田 和泉 1, 中村 聡 1, 梅野 太輔 2, 福居 俊昭 1
（1東工大・生命理工, 2千葉大院・工）tfukui@bio.titech.ac.jp【目的】
Streptomyces 属の伝達性プラスミドには環状と線状の２形態がある。巨大線状
プラスミドの存在から、線状プラスミドは環状プラスミドより巨大な DNA を運搬できる利点がある。S. avermitilis 由来線状プラスミド SAP1 の接合伝達にはtraA、traB、ttrA の３遺伝子領域が必要である。これらの内、ttrA は線状プラス
ミドに特有のものである。本研究では ttrA と線状プラスミドの接合伝達の関連を調べた。
【方法と結果】
SAP1 由来の ttrA(SAP1ttrA)を組み込んだプラスミドを作成した。環状、あるいは線状のこれらのプラスミドを S. lividans TK21 に導入し、S. lividans TK24（str-6;
StrR）と接合させ、その伝達効率を測定した。さらに線状プラスミドの接合伝達に対する ttrA の作用が cis または trans かを確認するため、ttrA ORF の開始コ
ドン直後に終始コドンを挿入し、TtrA の生成を停止させたプラスミドを作成し、通常の ttrA を含むプラスミドの伝達効率と比較した。
【結果と考察】ttrA を含まない線状プラスミドは、ttrA を含むプラスミドに比べて伝達効率が大きく低下したが、環状プラスミドでは ttrA の有無による伝達効率の差異はな
かった。この結果から ttrA は線状プラスミドの効率的な接合伝達に必要である
ことが確認できた。また、SAP1 由来の traA、traB と SLP ２由来の ttrA(SLP2ttrA)を組み込んだ線状プラスミドにおいて伝達効率の大幅な低下が見られたことか
ら、ttrA は由来を同じくする traA、traB を特異的に認識していると考えられる。
さらに TtrA の生成を停止させた ttrA を組み込んだ線状プラスミドは伝達効率が大きく低下した。これにより線状プラスミドの伝達は TtrA に依存していることが判明した。

【目的】ポリヒドロキシアルカン酸 (PHA) は微生物が生産するポリエステルであり、生分解性を示すため環境調和型材料として注目されている。PHA の生産性向上には PHA 生産方向と細胞増殖方向の代謝フラックス制御が重要である。
一方、近年の合成生物学研究では野生型 (WT) リプレッサーを用いて誘導剤添加により標的遺伝子の転写を誘導する ON スイッチに加え、逆表現型 (RP) の変
異リプレッサーを用いて転写を抑制する OFF スイッチが開発されている。この技術の PHA 生合成制御への適用が考えられるが、PHA 生産菌で使用できる転写制御スイッチは開発途上である。本研究では PHA を多量に蓄積する Ralstonia
eutropha、メタノールから PHA を生産する Methylorubrum extorquens で機能する
転写制御スイッチの確立を目指した。
【方法】GFP 発現ベクターの gfp 上流にオペレーターを挿入し、リプレッサー遺伝子 (WT または RP) を導入した。リプレッサーは Escherichia coli 由来のコリン
誘導性 BetI とアンヒドロテトラサイクリン (aTc) 誘導性 TetR を使用し、Bet ON/
OFF スイッチおよび Tet ON/OFF スイッチを構築した。形質転換体は誘導剤非添加条件と添加条件で培養し、GFP 蛍光強度から発現制御を評価した。
【結果】R. eutropha に Bet ON スイッチを導入した株では E. coli 由来のコリン特異的トランスポーターを異種発現させることでコリン添加による GFP の発現誘導が観察された。M. extorquens に Tet ON スイッチおよび Bet OFF スイッチを導入した株では誘導剤添加に伴う GFP の発現誘導と発現抑制がそれぞれ観察されたが、変化量や応答速度に改善の余地が見られた。現在はオペレーターの挿入
位置やリプレッサー発現量の最適化に加え、標的遺伝子上流からのリードスルーを防ぐためのターミネーター挿入によるスイッチの制御能の向上を検討している。

Role of ttrA on conjugal transfer of linear plasmid SAP1 in Streptmyces

Establishment of transcriptional switches for Polyhydroxyalkanoateproducing microorganisms○Yuta Fukada1, saki Ohasi1, Naoya Maruyama1, Haruo Ikeda2, Masakazu Kataoka1(1Grad. Sch. BioMedical Eng. Shinshu Univ., 2Kitasato Inst. Life Sci., Kiatasato
Univ.)

Key words

conjugation, linear plasmid, Streptomyces, transfer genes○Ayumu Hirayama1, Izumi Orita1, Satoshi Nakamura1, Daisuke Umeno2,
Toshiaki Fukui1(1Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech, 2Grad. Sch. Eng., Chiba Univ.)

Key words
transcriptional regulation, polyhydroxyalkanoate, Ralstonia eutropha,
methylotroph

206

2Dp14

Methylorubrum extorquens における C1 化合物代替資化
経路の構築

2Dp16

○平林 翼 1, 折田 和泉 1, 新田 克章 2, 中村 聡 1, 福﨑 英一郎 2,
福居 俊昭 1（1東工大・生命理工, 2阪大院・工）tfukui@bio.titech.ac.jp

環境汚染物質依存性の生物学的封じ込めシステムの開発○石川 聖人, 飯尾 魁, 堀 克敏
（名大院・工）ishikawa.masahito@chembio.nagoya-u.ac.jp【背景と目的】 Methylorubrum extorquens は安価かつ持続供給可能な次世代資源であるメタノールを単一炭素源として生育可能なメタノール資化性菌である。
本菌はセリン回路によってメタノールを酸化して生じたギ酸を固定し、エチル
マロニル-CoA (EMC) 経路によって C1 受容体であるグリオキシル酸を再生、補充して資化代謝を維持している。各種 CoA チオエステルを代謝中間体とする
EMC 経路は有用物質生産用経路として利用できるが、本経路はメタノール資化に共役した必須経路であるため、EMC 経路を物質生産に利用することでメタ
ノール生育能が低下するという問題がある。本研究では、EMC 経路遮断によってメタノール生育能が欠失した M. extorquens 組換え株に代替資化経路を構築することで、メタノール生育能が相補された株を取得することを目的とした。
【方法と結果】 代替資化経路としてホルムアムデヒドをリブロース-5-リン酸に固定するリブロースモノリン酸経路 (RuMP) 経路を利用した。M. extorquens EMC
経路遮断株に Mycobacterium gastri に由来する RuMP 経路の２つの鍵酵素 3-ヘキスロース-6-リン酸シンターゼ (HPS)、6-ホスホ-3-ヘキスロイソメラーゼ (PHI)の融合酵素遺伝子をプラスミドベクターで導入したところ、顕著な HPS-PHI 活性を検出したが、メタノール単一炭素源では生育しなかった。この組換え株をメタノール添加培地で振とうしてメタボローム解析に供したところ、コントロー
ル株と比較して種々の糖リン酸の細胞内濃度が顕著に低く、リブロース-5-リン酸の再生が不十分であるために RuMP 経路を維持できていない可能性が考えられた。現在、ペントースリン酸経路強化株の作製と解析を進めている。

[背景・目的]
遺伝子工学や代謝工学のめざましい発展により、遺伝子組換え微生物（GEMs）
を利用することへの期待は日々高まっている。環境浄化においても、汚染物質の分解能力を高めた GEMs が開発され、より効果的な汚染物質除去が可能になると期待されている。しかし、環境浄化における GEMs 利用は生物多様性への影響が懸念されることから、現状は制限されている。
「生物学的封じ込め」とは、遺伝子工学的手法を用いて微生物を特定の条件においてのみ増殖可能にする拡散防止措置である。汚染物質の分解能力を持ちながらも、その生育を汚染物質に依存するような GEM は汚染物質の除去が完了した後は増殖できなくな
るはずである。我々は、このような GEM を構築できば、環境浄化に適用可能な生物学的封じ込めシステムとなるのではないかと考えた。本研究では、トルエンを汚染物質のモデル化合物、トルエン分解菌である Acinetobacter sp. Tol 5をモデル微生物として設定し、コンセプトの実現可能性を検証した。
[方法・結果]生育に必須である外膜蛋白質 BamA のコード遺伝子を Tol 5 の染色体から破壊し、代わりにトルエン応答プロモーターの制御下にある bamA 遺伝子をプラス
ミドによって相補した。これにより、トルエン存在時のみ bamA 遺伝子は発現可能となる。得られた変異株は野生株と同等のトルエン分解活性を示しながらも、トルエン分解後にトルエンの無い環境に移すと生育が著しく抑制された。
ただし、完全に生育を抑制できたわけではなく、トルエン非存在下でも生育可能となったエスケープ株が 5.3×10-7 の頻度で出現した。エスケープ株の発生要因を理解するために、プラスミドを抽出し、プロモーター周辺の解析を行った。
発表当日はエスケープ株の主たる発生原因とその対策についても報告する。

Construction of an alternative C1-assimilation pathway in Methylorubrum
extorquens

Development of a biocontainment system depending on environmental
pollutants○Tsubasa Hirabayashi1, Izumi Orita1, Katsuaki Nitta2, Satoshi Nakamura1,
Eiichiro Fukusaki2, Toshiaki Fukui1(1Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech, 2Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)○Masahito Ishikawa, Kai Iio, Katsutoshi Hori
(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

Key words
pathway

Methylorubrum extorquens, methanol, methylotroph, C1 assimilation

Key words

Acinetobacter , biodegradation, biocontainment

2Dp15

枯草菌の正常株および発芽システム欠損株の混合培養系における発芽のための相補条件

2Dp17

微生物細胞内 mRNA 直接検出法による遺伝子発現の可視化○坂元 仁 1, 土戸 哲明 1, 古田 雅一 1,2（1阪府大・微生物制御研究センター, 2阪府大院・工・量子）
sakamoto.jj@gmail.com○堀尾 京平 1, 高橋 宏和 2, 加藤 節 1,2, 小堀 俊郎 3, 秋 庸裕 1,2,
中島田 豊 1,2, 岡村 好子 1,2（1広島大院・先端物質, 2広島大院・統合生命科学, 3農研機構）
okamuray@hiroshima-u.ac.jp〔背景〕細菌胞子は加熱や化学薬剤に対して高い耐性を示し、その不活性化は殺菌効率やその安全性に関する指標として利用されている。一方、発芽機能が損傷を受けた場合、見かけ上の死菌として判断され、食品の生物学的安全性を脅かしかねない問題を含んでいる。一般に生菌数評価は寒天培地による CFU 法が用いられるが、固体培養では正常胞子と損傷胞子が共存しても、液体中での共存と比較して、分泌される化学物質や酵素との接触確率が極めて低く影響を受けにくい。そこで液体培養系において、正常株とその発芽損傷株と見立てた発芽機能欠損株を混合培養することにより、正常胞子が発芽機能欠損株の発芽を幇助可能かを調査した。
〔方法と結果〕供試菌として正常株として枯草菌 168 株とその発芽機能欠損株として、コルテックス分解酵素欠損株、発芽レセプター欠損株、ペプチドグリカ
ン分解物による発芽関連因子 prkC および表層バリアであるスポアコートタンパ
ク質がほぼ存在しなくなる cotE gerE の二重欠損も上記の多重欠損株に多重化させ、DSM 培地で胞子を調製した。欠損株側にはネオマイシン耐性マーカーを保持させ、発芽機能欠損株が発芽しない限り、増殖反応が起こらない薬剤選択
圧下で発芽培養を行った。今回実験に用いた既知の主要発芽関連因子の多重欠損株で 1/10^6 の割合で発芽する規格外発芽胞子が存在した。正常胞子の存在は、sleB cwlJ ydhD yaaH gerA gerB gerK prkC 株の発芽を幇助しなかったが、sleB
cwlJ ydhD yaaH gerA gerB gerK cotE gerE の発芽は幇助した。これより現実の殺菌処理でもコートタンパク質が損傷して正常株の発芽関連因子が接触できる場
合には、発芽を幇助できる可能性が示唆された。

【目的】微生物の可視化は、これまで 16S rRNA を標的とした Fluorescence in situ
hybridization (FISH)により行われている。しかしゲノム上の遺伝子や mRNA は
コピー数が少ないため、メタ解析データに基づいたプローブによる標識が難しかった。昨年我々は、任意の RNA 配列を cDNA の合成を必要とせず、直接検出を可能にする RNase H-assisted RCA (RHa-RCA)法を報告した。RHa-RCA 法により微生物細胞内で mRNA を増幅し、増幅産物を FISH 法により検出すれば、視覚的に遺伝子発現を捉えることが可能になる。そこで本研究では、RHa-RCA法に基づく微生物細胞内 mRNA 直接検出法の確立と遺伝子発現の可視化を行うことを目的とした。
【方法・結果】初めに、細胞内に反応に必要な酵素やプローブを導入するため、細胞壁・細胞膜に適度な透過性を与える方法を検討し、モデルとして大腸菌に発現させた GFP mRNA に対して RHa-RCA と FISH を行った。その結果、ター
ゲット mRNA を in situ で検出することに成功し、細胞数全体の 80%以上が検出できた。次に、栄養共生系の細菌を識別することを目的に、ヨーグルト中の乳酸菌 Streptococcus thermophilus を検出対象とした。共生関係に関わっているピ
ルビン酸−ギ酸リアーゼ活性化酵素遺伝子 pflA を検出標的とし、特異的な
Padlock probe と FISH probe を設計して検出を行ったところ、S. thermophilus から特異的蛍光を得ることに成功した。
【考察】微生物コンソーシアムの相互関係に関わる mRNA を複数の蛍光プロー
ブで検出することにより、遺伝子特異的にコンソーシアムを可視化することが可能になるだろう。

Complementary conditions for germination in a mixed culture system ofnormal strain and germination system deficient mutants in Bacillus subtilis.

Visualization of gene expression by in situ direct detection method of mRNA

○Jin Sakamoto1, Tetsuaki Tsuchido1, Masakazu Furuta1,2(1Microorganism control Res. Center, Osaka Pref. Univ., 2Dept. Quantum, Grad.
Sch. Eng, Osaka Pref. Univ.)

Key words

spore, germination, Bacillus subtilis, injured microbes○Kyohei Horio1, Hirokazu Takahashi2, Setsu Kato1,2, Tishiro Kobori3,
Tsunehiro Aki1,2, Yutaka Nakashimada1,2, Yoshiko Okamura1,2(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat. Hiroshima Univ., 2Grad. Sch. Integr. Sci. Life,
Hiroshima Univ., 3NARO)

Key words

mRNA, detection, microbial consortium

207

2Dp18

磁性細菌のマグネトソーム遺伝子領域の改変による磁気微粒子合成能の制御

2Ep02○新垣 篤史, 丸山 実菜, 依田 卓東, 松永 是
（農工大院・工）arakakia@cc.tuat.ac.jp

大腸菌の実験室進化による金属イオン利用能の置換検討○川上 了史 1, 堀内 祐貴 2, 大石 悠起子 2, 関田 美沙 2, 山口 紘武 2,
宮本 憲二 1
（1慶大・理工, 2慶大院・理工）
norikawakami@bio.keio.ac.jp

磁性細菌は、細胞内にマグネタイト (Fe 3 O4)から成る磁気微粒子を合成し、磁場に応答する性質を持つ細菌である。磁性細菌の合成する磁気微粒子はリン脂質及びタンパク質から成る薄膜で覆われていることからマグネトソームとも呼
ばれ、水溶液中での分散性が高く、医療・計測分野への応用が期待されている。
Magnetospirillum magneticum AMB-1 株におけるこれまでの研究から、磁性細菌
は細胞内に膜小胞を形成し、この中に鉄イオンの取込み、結晶化することで磁気微粒子を合成することがわかっており、この合成プロセスに関わる約 30 種類のタンパク質とその遺伝子（マグネトソーム遺伝子）が同定されている。本研究では、磁性細菌ゲノム中のマグネトソーム遺伝子の組合せとコピー数を改変することで、磁性細菌が合成する磁気微粒子のサイズや数の制御を行うことを目的とした。
マグネトソーム遺伝子の欠損により磁気微粒子合成能を失った突然変異株に、マグネトソーム遺伝子を機能毎に分類し、プラスミドとして再導入した。その結果、マグネトソーム遺伝子のうち、18 遺伝子の導入によって、磁気微粒子合成能が回復することがわかった。この時、細胞に導入したマグネトソーム遺伝
子がゲノムに挿入される新しい現象を見出した。結晶成長に関わる遺伝子の追加導入によっては、細胞が合成する磁気微粒子の粒径が大きくなることが確認された。また、マグネトソーム遺伝子を 2 セット持つ遺伝子組換え株は、野生株の約 2 倍に相当する約 40 個の磁気微粒子を合成した。細菌に導入するマグネ
トソーム遺伝子の組合せやコピー数の改変により、粒子サイズや合成量の制御が可能なことが示された。

金属イオンは生物にとって重要な働きをしている。例えば、触媒の活性中心や呼吸における電子伝達、あるいはシグナル伝達などである。興味深いことに、同じ呼吸にしても、用いる金属イオンの種類は必ずしも生物種を超えて共通しているわけではない。これは、生物が自分の生育環境にある金属イオンを利用できるように適応的に進化してきた結果であると考えられている。このような生物の金属イオン利用能の獲得に関する知見から、我々は、生物の生育環境を人為的に制御してやることで、通常は利用することができない金属イオンを利用するように進化させられる可能性があるのではないかと考えた。我々が着目したのは、生物の進化の歴史で元素利用の置換が生じたことが予想されているモリブデン酸とタングステン酸である。我々は、本来はモリブデン酸を利用する大腸菌 DH5alpha 株を、高濃度のタングステン酸に暴露し長期間の継代培養を行えば、タングステン酸利用能を獲得する可能性があると考えた。実際に、2000 世代の実験室進化を検討した結果、タングステン酸を添加することで、効率的な増殖をするようになる大腸菌株の単離に成功した。
この大腸菌株は、モリブデン酸よりも十倍程度高い親和性をタングステン酸に示すことから、タングステン酸要求株であることが示唆された。ゲノム解析を行ったところ、生理機能との相関は不明であるが、モリブデン関連酵素群に変異も認められており、これらの変異が元素利用能に変化を及ぼした可能性が示
唆されている。

Regulation of magnetic particle biosynthesis by modification ofmagnetosome gene region in magnetotactic bacteria

Tungstate requiring strain of E. coli isolated from long term evolution
experiment○Atsushi Arakaki, Mina Maruyama, Takuto Yoda, Tadashi Matsunaga(Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)○Norifumi Kawakami1, Yuki Horiuchi2, Yukiko Oishi2, Misa Sekita2,
Hiromu Yamaguchi2, Kenji Miyamoto1(1Keio. Univ. Faculty. Sci. Tech., 2Keio.Univ. Grad. Sch. Sci. Tech.)

Key words

bacteria, genome integration, genome engineering, biosynthesis

Key words

Escherichia coli, Metal ions, long term evolution experiment

2Ep01

Acer palmatum 樹皮からの未培養細菌の探索とAbditibacteriota 門に属する新規微生物の全ゲノム解析

2Ep03

16S rDNA 解析を用いたスサビノリ共在細菌叢の網羅的解析と地域性○小林 和輝, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp○實野 佳奈 1, 井手 圭吾 1,2, 有川 浩司 3, 松永 浩子 3, 齋藤 寛 4,竹山 春子 1,2,3,5（1早大院・先進理工, 2産総研 CBBD-OIL, 3早大ナノライフ創新研, 4東海大院, 5先進生命動態研）
haruko-takeyama@waseda.jp【緒言】
植物の樹皮は、樹冠により降水や UV 照射による攪乱が遮られることから、共生微生物にとって安定した環境であり、単離培養される微生物の多様性が高い
ことや、難培養、未培養の微生物門を他の器官と比較して多く宿していることが報告されている。そのため、樹皮は未培養微生物の分離源として有望である
可能性があるが、微生物群集構造解析や網羅的単離を行った例は非常に少なく、明らかにされていない。本研究では、日本に自生する落葉広葉樹である、Acerpalmatum（イロハモミジ）の樹皮に着目し、単離される微生物の系統的新規性の評価と、獲得された Abditibacteriota 門に属する新規微生物である IAD-21 株の全ゲノム解析を行った。
【方法と結果】
A. palmatum 樹皮とその周囲の土壌試料を、新技術開発財団植物研究園（静岡県熱海市）で採取し、DR2A 培地を用いて 2 週間培養し、コロニーを単離、16S
rDNA の配列相同性により系統的新規性を評価した。樹皮試料からは、既存の種との相同性 95%以下の株が全体の 17.6%（6 株/34 株）獲得されたのに対し、土壌試料からは獲得できなかった。複数回の検討の結果、樹皮由来の単離株は相同性 95%以下の株が 30 ~ 40%を占める場合もあり、新規微生物の分離源として有望であることが示唆された。また、A. palmatum 樹皮より獲得された IAD-21
株の全ゲノム解析を、MinION と MiSeq を用いて行った。7.4 Mb、102 kb の 2
つのコンティグが環状化され、染色体とプラスミドであると考えられた。prokka
によるオートアノテーションの結果、CDS 6,384 個、rRNA 遺伝子 6 個、tRNA
遺伝子 73 個であった。現在、A. palmatum の他の器官との単離株の系統的新規性の比較や、IAD-21 株の生理性状解析について検討中である。
※本研究の一部は「先進ゲノム支援」の支援を受けて実施された。

海苔は日本において非常に馴染み深い食材の一つである。日本で養殖されている多くは紅藻類のウシケノリ科アマノリ属に分類されるスサビノリ(学名：Pyropia
yezoensis)であり、水産業界において重要な水産物となっている。先行研究でス
サビノリの殻胞子を無菌培養すると正常に葉状体を形成しないことや、成長因子を産生する細菌や病気に関わる細菌が発見されており、宿主と共在細菌の相互作用が注目されるようになった。本研究では日本近海の３箇所で養殖されたスサビノリの共在細菌叢を 16S rDNA シーケンスにより網羅的に解析し、細菌叢の地域特異性を検討した。
サンプリングは千葉県の東京湾養殖場（千葉海苔）、有明海の養殖場（佐賀県サイトの佐賀海苔と熊本県サイトの熊本海苔）で行なった。スサビノリ（葉状体）
から抽出されたゲノム DNA を用いて１６ S rDNA の可変領域である V3V4 領域のシーケンスを実施した。得られた配列情報の９割が宿主のスサビノリ葉緑体
由来であり、解析対象である細菌叢のリード数は全体の１割以下となることか
ら、増幅条件の検討を行った。すでに報告のある葉緑体配列を増幅しないようなプライマー配列では、増幅産物の多様性が低下することからプライマーは、
V3V4 領域とし、葉緑体配列のブロッキングをペプチド核酸（Peptide Nucleic
Acid：PNA）を用いて行った。結果、葉緑体配列の増幅を全体の１割未満に抑えることが可能であった。
有明海に面している佐賀海苔と熊本海苔では、千葉海苔と比べて比較的に細菌叢の類似性があり、共通の細菌の出現も見られた。また、葉状体に成長する前の糸状体の共在細菌叢も解析した結果、細菌叢が異なることから成長に従って変化することが示された。本発表では、より詳細な地域差等に関して議論する。

Exploration of uncultured bacteria from Acer palmatum bark and wholegenome sequencing of novel bacteria belonging to phylum Abditibacteriota

Comprehensive 16S rDNA analysis of P. yezoensis related microbe and theirregional characteristics○Kazuki Kobayashi, Hideki Aoyagi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

Abditibacteriota, Acer palmatum, tree bark, uncultured bacteria○Kana Jitsuno1, Keigo Ide1,2, Koji Arikawa3, Hiroko Matsunaga3, Hiroshi Saito4,
Haruko Takeyama1,2,3,5(1Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2CBBD-OIL, AIST-Waseda Univ., 3Res.
Org. Nano Life Innov., Waseda Univ., 4Dept. Fisheries, Tokai Univ., 5Inst. Adv. Res.
Biosyst. Dynam., Waseda Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ.)
Key words
macroalga, genetic diversity, marine environment, bacteria

208

2Ep04

キノコ成分による歯周病原性細菌のバイオフィルム抑制
成分の検索

2Ep06

○阿座上 弘行 1, 飯田 亮平 1,2, 會見 忠則 3
（1山口大院・創科・農, 2鳥取大院・連農, 3鳥取大・農）azakami@yamaguchi-u.ac.jp

乳酸菌の菌体脂肪酸に 10OH オクタデカン酸が出現する
培養条件について○鈴木 健一朗, 平塚 功尚, 柴野 麻由, 増子 穂, 宮崎 穂乃香,
茂木 太極, 中山 俊一, 門倉 利守（東農大・応生科）
ks206184@nodai.ac.jp

Eikenella corrodens は歯周病患者の病変部から頻繁に分離され、無菌動物への単一感染により歯周病を引き起こす歯周病原性細菌である。本研究では、種々のキノコ抽出物から E. corrodens のバイオフィルム抑制成分を検索することを目的とした。
先の研究で、市販の食用キノコの抽出物からバイオフィルム抑制を示すシイタ
ケメタノール抽出物とヤマブシタケ水抽出物について、それらに含まれるバイ
オフィルム抑制成分の同定を試みた。シイタケの子実体を粉砕後メタノールで抽出したものを逆相薄層クロマトを行い、分画後バイオフィルム抑制画分を得た。極性の高い低分子化合物がバイオフィルムの抑制をすることが示唆された。
また、ヤマブシタケ子実体を粉砕後、水で抽出したものを、硫安分画、イオン
交換クロマトで分画し、バイオフィルム抑制成分を得た。2 種のタンパク質画分を混合することでバイオフィルムの抑制を示すことを明らかにした。
さらに、鳥取大学農学部附属菌類きのこ遺伝資源研究センターで作成されたキ
ノコ抽出物ライブラリーからバイオフィルム抑制を示すものを検索したところ、ホシダケ属の Asterostroma macrosporum の培養濾液から抑制活性を見つかった。
そこで、同センターより A. macrosporum の菌株を購入し、培養を行った。菌糸体をメタノール抽出したものと培養濾液についてバイオフィルム抑制活性を調べた。その結果、培養濾液のみから抑制活性が示された。

【目的】細菌の菌体脂肪酸組成は脂肪酸種の多様性や、細胞膜を構成する極性脂質への局在による安定性などから、分類群を特徴づける分類指標として有効である。Lactobacillus acetotolerans は食酢醸造の有害菌として分離され、高度な酢
酸耐性を有する。通常の MRS 培地では、菌体脂肪酸は C16:0、C18:1、シクロ
プロパン C19:0 から構成されているのに対し、酢酸存在下で培養すると、菌体
脂肪酸の 50％以上が 10OH オクタデカン酸(10OH-C18:0)となることが見いだされた。また、この現象が現れるためには酢酸とともに Tween80 が必要であることも明らかとなった。そこで、このような現象はほかの乳酸菌でも起こるのか、培養条件とともに調べた。
【方法と結果】いくつかの乳酸菌株について、0 - 5%の酢酸ナトリウムを添加した MRS 培地（Tween80 の含量は 1 g/L）で培養した菌体から菌体脂肪酸メチル
エステルを調整し、その組成を調べた。Lactobacillus 属では L. mali NRIC 1692
が同様の応答をしたのに対し、L. gasseri NRIC 1546 では当該ピークの出現は見られなかった。Pediococccus damnosus NRIC 0216 では 2 - 9%の微量の増加が見られた。C18:1 がオレイン酸であることが特徴である Carnobacterium 属では、調べた C. divergens NRIC 1629、C. maltaromaticum NRIC 1691 は、ともに L.
acetotolerans NRIC 0322 と同様、培地酢酸濃度とともに、10OH-C18:0 の顕著な増加が見られた。10OH-C18:0 の増加とともに、オレイン酸の組成が減少し、
cis-バクセン酸の組成は少量であり、変化はなかった。10OH-C18:0 の出現は、菌種によって異なることが明らかになったので、この結果に基づき出現の条件を検討している。

Screening of inhibitor of biofilm by periodontopathogenic bacteria frommushroom

Occurrence of 10OH-octadecenoic acid in the cellular fatty acids of lactic
acid bacteria○Hiroyuki Azakami1, Ryohei Iida1,2, Tadanori Aimi3(1Dept. Biol. Chem., Grad. Sch. Sci. Tech. Inov., Yamaguchi Univ., 2United Grad.
Sch. Agric. Sci., Tottori Univ., 3Fac. Agri., Tottori Univ.)○Kenichiro Suzuki, Noritaka Hiratsuka, Mayu Shibano, Minori Masuko,
Honoka Miyazaki, Taichi Moteki, Shunichi Nakayama, Toshimori Kadokura(Fac. Appl. Biosci., Tokyo Univ. Agric.)

Key words
bacteria

biofilm, mushroom, Eikenella corrodens, periodontopathogenic

Key words

lactic acid bacterial diversity, fatty acid

2Ep05

ランタノイド Sm は Methylorubrum 属細菌の低栄養環境下での生育を促進させる

2Ep07

ホウレンソウのポストハーベストにおける菌叢変遷と鮮度劣化への PPFMs の関与○水野 洸介, 原田 雄斗, 岩本 悟志, 島田 昌也, 早川 享志,
中川 智行（岐阜大・院・自然科学）
t_nakaga@gifu-u.ac.jp○Wang Lun 1, 繁原 安美 2, 阪口 由佳 3, 谷 明生 4, 中野 浩平 1,
島田 昌也 2, 早川 享志 2, 中川 智行 2
（1岐阜大院・連農, 2岐阜大・応生科, 3岐阜大院・自然科学, 4岡
山大・資源植物科研）
t_nakaga@gifu-u.ac.jp【目的】
低栄養細菌が持つ低栄養環境下への適応能力は、バイオレメディエーションなど様々な分野への応用が期待できるため、その適応機構は非常に強い関心を集めている。一方、メチロトローフ細菌は水道水中にも存在するなど、低栄養環境に適応できることが知られている。これまで私たちのグループでは、M.
extorquens GM97 株が低栄養環境下でランタノイド（Ln）の一種 Sm に応答し、そのコロニー径を増大させる現象を見いだした。しかし、Sm に対する応答はメチロトローフ細菌において普遍的なのか、またその分子メカニズムは不明なままである。そこで本研究では、低栄養環境下での Ln 応答のメチロトローフ
細菌における普遍性、さらにその分子メカニズムの解明を目的とした。
【方法・結果】
自然界より獲得したメチロトローフ細菌 75 株について、低栄養培地（1/100 普通栄養培地）でのコロニーの形態を観察した。そのうち 15 株は Sm の添加によりコロニー径が増大した。よって Sm への応答はメチロトローフ細菌に普遍的な性質ではないものの、特定の菌株が保持する特性であることが示された。さらに GM97 株を用いてコロニー径増大の原因解明を目指した。モルフォロジー
解析では、Sm の有無に関わらず細胞の大きさに差異は見られなかった。一方、
1 コロニー当たりの細胞数が Sm 添加により約 20 倍に増加したことから、Sm
は GM97 株の増殖を促進することが示された。また、増殖に対する Ln 特異性を観察したところ、メタノール脱水素酵素の補因子 La や Ce では増殖が促進されず、より原子量が大きい Eu などが Sm と同様の応答を示した。これらのことから GM97 株は低栄養環境では比較的原子量が大きい Ln に、メタノール環境
では La、Ce に応答するなど、生育環境に応じて Ln を使い分けていることが示
唆された。

【目的】
青果物は収穫後も呼吸・代謝を行ない、それに伴い鮮度劣化・外見悪化を引き起こすとされる。一方、青果物の葉上には様々な微生物が生息し、共生関係を結んでいる。特に植物腐敗の要因とされる微生物群のみならず、植物生長促進
微生物群も青果物の代謝を促進することで保蔵に対してマイナス効果を示すと考えられ、収穫後のホウレンソウにおける菌叢変化がその保蔵に大きな影響を及ぼすと思われる。そこで、本研究では収穫後ホウレンソウの 20℃保蔵環境下でのホウレンソウ鮮度劣化における植物葉上微生物群の関与について解析した。
【方法・考察】20℃で保蔵したホウレンソウの葉上に生息する微生物群を 16S rRNA アンプリ
コンシーケンスにて菌叢を解析した。その結果、保蔵 3 日目には植物腐敗菌
Erwinia 属 が 増 加 し 、 そ の 後 、 Pseudomonas 属 が 支 配 的 に な っ た 。 一 方 、Methylobacterium 属細菌を Pink-Pigmented Facultative Methylotrophs（PPFMs）として単離し、MALDI-TOF/MS により同定/クラスター解析を行ったところ、0 日
目の PPFMs は季節や個体により菌叢が異なるものの、保蔵 6 日目にはほぼ M.
fujisawaense と M. extorquens に集約された。また、保蔵したホウレンソウの鮮度評価として、ビタミン C 含量を定量したところ、単離した M. fujisawaense を
ホウレンソウへ定植した結果、ビタミン C 含有量が有意に減少した。これらのことから、青果物の鮮度劣化には Erwinia 属のみならず、PPFMs も青果物の鮮度劣化において重要な因子の一つと考えられ、これら細菌群の制御が青果物の鮮度保持技術に繋がるものと考えられる。

Lanthanide Sm enhances the oligotrophic growth of Methylorubrum strain

Changes in spinach phylloepiphytic bacteria communities and Involvementof PPFMs in reduced freshness○Kosuke Mizuno, Yuto Harada, Satoshi Iwamoto, Masaya Shimada,
Takashi Hayakawa, Tomoyuki Nakagawa(Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Gifu Univ.)

Key words

lanthanide, methylotroph, oligotroph, Samarium○Lun Wang1, Ami Shigehara2, Yuka Sakaguchi3, Akio Tani4, Kohei Nakano1,
Masaya Shimada2, Takashi Hayakawa2, Tomoyuki Nakagawa2(1United Grad. Sch. Agric. Sci., Gifu Univ., 2Fac. Appl. Biol. Sci., Gifu Univ., 3Grad.
Sch. Nat. Sci. Technol., Gifu Univ., 4IPSR., Okayama Univ.)

Key words

phylloepiphytic bacteria, PPFMs, spinach, Methylobacterium

209

2Ep08

エタノール発酵能の違いは種の違い？南極産担子菌酵母
Mrakia blollopis の全ゲノム解析による種の再検討

2Ep10

鰹節カビ Aspergillus 属糸状菌が生産する加水分解酵素の解析○辻 雅晴 1, 石原 潤一 2, 高橋 弘喜 2, 野口 英樹 3
（1国立極地研, 2千葉大・医真菌研究セ, 3データサイエンス共同利用基盤施設）spindletuber@gmail.com○小川 千晶 1, 中林 麗奈 1, 上村 真理子 2, 木村 行宏 1, 横田 仁子 3,
土居 幹治 3, 竹中 慎治 1
（1神戸大院・農, 2神戸大・農, 3マルトモ）
stakenaka@people.kobe-u.ac.jp

担子菌酵母の 1 種である Mrakia 属菌は南極域の中でも特に環境の厳しい大陸性
南極では菌類の優先種であり、この地域から報告されている菌類の中で、唯一エタノール発酵が可能な菌類として知られている。昭和基地から約 60km 離れたスカルブスネス露岩域では、Mrakia 属菌の中でも Mrakia blollopis という種の分離頻度が最も高かった[1]。我々はスカルブスネス露岩域から分離した Mrakia
blollopis について低温での成長能やエタノール発酵について報告してきた[2]。
その中で M.blollopis の中にはエタノール発酵能が高い系統と低い系統が存在していること、低温での成長能はエタノール発酵能と関連があること、さらにこれらの能力は ITS 領域を用いた系統解析により予想できることを発見した[2]。
このように M.blollopis には大きく特徴が異なる２つの系統が存在するが、両系
統とも M.blollopis のタイプである CBS8921 株と ITS 領域では 99.5%以上の相同性があり、現在の分類の基準では同種の扱いとなっている。そこで、本講演では同種ではあるが大きく異なる特徴を持った M.blollopis の２つの系統、各 6 株ずつについて全ゲノム解析を行い、種の再検討を行ってみた。
その結果、高エタノール発酵系統のゲノムサイズは約 29Mb、低エタノール発
酵系統のゲノムサイズは 33Mb となり、高エタノール発酵性の株の方が低エタ
ノール性の株よりゲノムサイズが約１割小さかった。全ゲノム配列によるマッ
ピング率は高エタノール発酵系統の株と低エタノール発酵系統の株では 86~89%であった。このことから、エタノール発酵能、低温での成長能など特徴が大きく異なる両系統は全ゲノム配列での相同性が低いことから、別種と考えることが妥当だと考えている。 今後、菌類の新種報告には、ITS 領域などによる系統解析だけでなく、全ゲノム解析も必要とする方向で提案していきたい。

【背景と目的】 鰹節のかび付け発酵に関わる好乾性 Aspergillus 属の菌叢を PCRDGGE 解析によって調べた結果、5 種の Aspergillus 属糸状菌を見出すことができた。かび付け工程では、脂質の分解、香味の付与、色相の変化がもたらされることから、鰹節カビが分泌生産する種々の菌体外加水分解酵素が働いていると予想される。本研究では、主に A. chevalieri 種について脂質分解やタンパク質の分解に関わるリパーゼやペプチダーゼなどの菌体外加水分解酵素について
特性を明らかにすることを目的とした。
【方法】 粗酵素液の調製：試験菌株を鰹節（荒節）粉を用いて固体培養（30℃、10 日間）行い、緩衝液 (pH 5.0) にて抽出液を得た。酵素の精製：粗酵素液を緩衝液 (pH 7.5) にて透析後、各種クロマトグラフィーにより精製した。酵素活性
測定：リパーゼ（カルボキシエステラーゼ）活性測定には pNP-butyrate や pNPpalmitate 等の人工基質を用い、ペプチダーゼ活性測定には Leucine p-nitroanilideを用いた。
【結果及び考察】2 番および 4 番枯節より調製した鰹節ライブラリーについて加
水分解酵素の生産特性を調べた結果、pNP-butyrate に対して高活性を示す株が多く見られた。一方、カゼインやヘモグロビンに対して活性を示した株は 5 株の み で あ っ た 。 つ づ い て 、 試 験 菌 株 A. amstelodami 、 A. chevalieri 、 A.
pseudoglaucus、A. ruber、A. sydowii の 5 種について得られた粗酵素液について
イオン交換クロマトグラフィーを行ったところ、リパーゼ（カルボキシエステ
ラーゼ）の溶出パターン（クロマトグラム）は互いに相違が見られた。特に、A. chevalieri 種由来サンプル中にはイオン交換クロマトグラフィーにて荷電や分子量の異なる複数のリパーゼが見られたことから、すべてのタンパク質（リパー
ゼ/カルボキシエステラーゼ）同定を目指し、精製を進めている。

Reclassification of Antarctic Basidiomycetous yeast Mrakia blollopis bywhole genome analysis

Characterization of extracellular hydrolytic enzymes from katsuobushi
mold, Aspergillus spp

Key words
Antarctic yeast, ethanol fermentation, whole genome analysis,
reclasification

Key words

Katsuo bonito, xerophilic Aspergillus, lipase, peptidase

2Ep11

原油湧出地由来の異化的硫酸塩還元トルエン分解細菌の分離およびゲノム解析○Masaharu Tsuji1, Junichi Ishihara2, Hiroki Takahashi2, Hideki Noguchi3(1NIPR, 2MMRC., Chiba Univ., 3ROIS-DS)

2Ep09

鰹節のかび付け工程で働く好乾性糸状菌の菌叢解析○中林 麗奈 1, 木村 行宏 1, 横田 仁子 2, 土居 幹治 2, 竹中 慎治 1
（1神戸大院・農, 2マルトモ）
stakenaka@people.kobe-u.ac.jp○Chiaki Ogawa1, Reina Nakabayashi1, Mariko Uemura2, Yukihiro Kimura1,
Satoko Yokota3, Mikiharu Doi3, Shinji Takenaka1(1Grad. Sch. Agri., Kobe Univ., 2Fac. Agri., Kobe Univ., 3Marutomo Co., Ltd.)○杉本 岳人, 佃 怜奈, 中村 浩平（岐阜大院・自科）
knak2007@gifu-u.ac.jp【背景と目的】 日本の伝統食品である鰹節には、大きく分けて荒節と枯節の 2
種類が存在する。原料のカツオをおろし、煮熟・焙乾したものが荒節、さらにAspergillus 属糸状菌（鰹節カビ）を使ってかび付け発酵・熟成させたものが枯節である。かび付け工程は、脂質の分解、香味の付与、色調の変化などをもたらす。鰹節カビは、A. glaucus およびその類縁種と言われてきたが、節の水分含量が約 20％から 15％まで減少していく過程で、どのような Aspergillus 属糸状菌が発酵・熟成を担っているかその詳細は明らかではない。本研究では菌叢解析法を検討するとともに、かび付け工程やサンプルの違いによる好乾性糸状菌の優占種やそれらの構成比を明らかにしたので報告する。
【方法】 「同じ製造元から入手した１番から 4 番枯節」と「製造元の異なる 4番枯節」を鰹節カビ分離源とし、菌糸体・胞子懸濁液を MY20 平板培地にて培養して得られた菌糸体から混合ゲノム DNA を得た。β-tubulin 遺伝子（benA 部
分断片、約 400 bp）を増幅できるプライマーを用い、PCR-DGGE（変性剤濃度5％から 35％、60℃で 3 時間）にて解析を行った。分離・選抜した優占種について鰹節（荒節）粉にて固体培養を行い、各種加水分解酵素活性を調べた。
【結果と考察】 鰹節表面から単離した糸状菌を同定しながら、A. amstelodami 、
A. chevalieri 、A. pseudoglaucus 、A. ruber 、A. sydowii の 5 種を PCR-DGGE 法にて同時に検出できる条件を確立できた。
「同じ製造元から入手した１番から 4 番
枯節」では、1 番枯節の段階での構成比に関わらず、かび付け発酵が進むと構成比が変わり、4 番枯節では A. pseudoglaucus および A. chevalieri がおおよそ 1:1の比率で収束していた。一方、「製造元が異なる 4 番枯節」については、上述の2 種の他に A. amstelodami、A. ruber、A. sydowii も優占種となっていた。

【背景・目的】 BTEX は毒性や拡散性から土壌汚染の観点で注目され、その動態を調査するうえで嫌気的 BTEX 分解細菌の理解が不可欠である。そこで、原油湧出地の産生水を植菌源として、トルエンと硫酸塩をそれぞれ電子供与、受容体とする培養条件で継代を繰り返し、半固体培地で得られたコロニーから異化的硫酸塩還元（Dissimilatory Sulfate Reducing, 以下 DSR）トルエン分解細菌
TSK を分離した。TSK のゲノム解析から嫌気的トルエン分解に関わる遺伝子群の知見を得た。
【結果・考察】 トルエン-硫酸塩の集積培養で、トルエン分解に伴う硫酸塩の減少を確認した。集積培養系のメタ 16S rDNA 解析から、Syntrophobacteraceae 科
細菌が優占種であることが明らかになった。この Syntrophobacteraceae 科細菌
OTU に近縁な 16S rDNA を含むコロニーからゲノム解析を行った。DSR 反応に関わる遺伝子群(sat、aprBA、dsrAB)を検出し、その配列は Syntrophobacteraceae
科細菌に近縁であった。嫌気的トルエン分解関連遺伝子群に注目すると、TSK
は Desulfobacteraceae 科細菌に近縁な遺伝子群(bss、bbs)を有し、一部の遺伝子が欠けていたが Syntrophaceae 科に近縁なベンゾイル CoA から芳香環の開裂に関わる遺伝子群、および Desulfobacteraceae 科に近縁な開裂後のアセチル CoAまでの代謝に関わる遺伝子群が存在した。さらに、TCA 回路およびアセチル
CoA 経路に関わる遺伝子群の存在から、トルエンの嫌気的完全酸化が示唆された。また、硫酸塩還元関連遺伝子群、TCA 回路およびアセチル CoA 経路に関わる遺伝子のほとんどが Syntrophobacteraceae 科細菌に近縁であった。した
がって Syntrophobacteraceae 科細菌に嫌気的トルエン分解に関わる遺伝子群が水平伝播した可能性が示唆され、本研究により Syntrophobacteraceae 科細菌の嫌気的トルエン代謝遺伝子群とその代謝機構を明らかとした。

Fungal community dynamics during fermentation and ripening of
katsuobushi bonito

Isolation and genomic analysis of dissimilatory sulfate-reducing toluenedegrading bacteria from production water of oil field○Reina Nakabayashi1, Yukihiro Kimura1, Satoko Yokota2, Mikiharu Doi2,
Shinji Takenaka1(1Grad. Sch. Agri. Kobe Univ., 2Marutomo Co., Ltd.)Key words
Aspergillus

fungal community, katsuobushi bonito, PCR-DGGE, xerophilic○Taketo Sugimoto, Reina Tsukuda, Kohei Nakamura(Grd. Sch. Nat. Sci. Technol., Gifu Univ.)

Key words
Syntrophobacteraceae, Metagenome analysis, sulfate-reducing,toluene-degrading bacteria

210

2Ep12

ジャンボファージ RSP13 と RSL28 の特殊なゲノム DNA
の解析

2Ep14

○川崎 健, 大戸 駿弥, 山田 隆
（広島大院・統合生命科学）
takeru@hiroshima-u.ac.jp

コシヒカリの頑健、大粒、早晩生同質遺伝子リソース「コシヒカリ駿河シリーズ」の開発○富田 因則（静大・グリーン科技研）
tomita.motonori@shizuoka.ac.jp【目的】メタゲノミクスの確立によって難培養性微生物のゲノム情報が解読・利用可能となったが、自然環境中には未だ取得できない遺伝情報も存在するらしい。今回、一般的なシークエンシング法では塩基配列を取得できない特殊なゲノムを有するジャンボファージ（ゲノムサイズが 200kbp を超える巨大ファージ）RSP13 と RSL28 を発見した、これを報告する。異常な電気泳動の遅れを示し、制限酵素での切断が確認できない RSP13 ゲノムに対し、RSL28 ゲノムは通常の電気泳動速度であり、一部の制限酵素に対して感受性を示すことから、これらファージのゲノム修飾メカニズムは大きく異なると予想された。本研究はこれらファージの塩基配列解読を目的とした。
【方法・結果】以前の研究により RSP13 ファージゲノムを urea 処理することで、異常な泳動遅れの改善が報告されていた。そこで両ファージゲノムについて
urea 処理、guanidine 処理、プロテアーゼ処理、加熱処理等を行った後、ゲノム増幅試薬（GenomiPhi、REPLI-g）による DNA 増幅を行い、得られた産物について次世代シークエンス解析を行なった。その結果、RSL28 については 2 つのcontig 配列を取得できた。PCR により gap sequence を取得し、全ゲノム配列取得に成功した。十分な冗長度でのシークエンスにも関わらず gap が生じたことから、この領域は特に高度に修飾されているものと予想された。一方、この方法では RSP13 ファージのゲノム情報は取得できなかったことから、RSP13 ファー
ジに対し UV を用いた変異導入を行い、通常の DNA ポリメラーゼによる複製が可能になった変異体の取得を行なっている。
当研究室では、現在までに 14 株のジャンボファージを単離しているが、6 株については塩基配列データが取得できていない。環境中には難読性ゲノムを持つ
巨大ファージが、予想よりも高頻度で存在すると思われる。

世界のイネの単収は 20 世紀後半の緑の革命に代表される短稈化によって約 2 倍に向上したが、現在は頭打ちである。さらに、地球温暖化で激化する気候変動の下で、西日本豪雨、大型台風をはじめ農業生産への被害が相次いでおり、イネを丈夫に頑健に改良する必要がある。加えて、自由貿易化の流れの中で国際競争力を高めるため、低コスト・多収化させる必要がある。本研究では、頑健、バイオマス増大、大粒、早晩生などの未同定形質について、連続戻し交雑でコシヒカリのゲノムに取込む過程で遺伝子分析を行い、次世代シーケンス解析で遺伝子を同定しつつ、同質遺伝子系統を開発した。その結果、粒重を 34%増加
させる大粒遺伝子 Gw、頑健・強稈で穂数を 2.3 倍に増加させるバイオマス増大
遺伝子 Bms、背丈を 15-20cm 短縮して倒伏を防止する短稈遺伝子 d60、d65、晩生遺伝子 Hd16、2 週間開花を早める極早生遺伝子 e1 を単独移入するとともに、大粒＋短稈 Gw+d60、Gw+sd1、バイオマス増大＋短稈 Bms ＋ sd1、Bms ＋ d60、
Bms ＋ d65 など 50 組合せの遺伝子をコシヒカリゲノムに集積し、気候変動下で生産が安定する同質遺伝子リソースを開発した。5 回以上の戻し交雑毎に当該遺伝子を NGS で診断するスマートゲノム育種によって、従来の緑の革命による短稈に加えて頑健、バイオマス増大、大粒、早晩生をコシヒカリゲノムに統合したスーパーコシヒカリ 9 品種「コシヒカリ駿河 Gg、d60Gg、e1Gg、Hd16、d60Hd16、Bms、d60Bms、d65Bms、sd1Bms」を品種登録出願した。食味、品質
は新潟コシヒカリと遜色なかった。気候変動により地球規模で作物に損害が生じており、「新・緑の革命」が望まれている。本研究では、多様な短稈遺伝子に加えて大粒、バイオマス増大等頑健・多収化に有効な遺伝子を付与・統合する
ことにより、1 種類の短稈に依存する従来育種から脱却し、新・緑の革命の基盤を築いた。

Analysis of odd genomic DNA from jumbo phage RSP13 and RSL28

Development of robust, large grain, early or late-maturing isogenic
resources "Koshihikari Suruga Series"○Takeru Kawasaki, Syunya Ooto, Takashi Yamada(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)○Motonori Tomita(Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)

Key words

phage

Key words

rice, genome, gene, expression

2Ep13

洗濯工程における衣類等に付着する微生物叢変動の解析と微生物細胞付着評価法の構築

2Fp01

がん診断のための高感度で前処理不用なインタクトエク
ソソームセンシング○野田 浩史 1, 奥田 裕暁 1, 山中 優志 2, 冨岡 敏一 2, 脇田 克也 3,
松村 吉信 1,2,4（1関西大院・理工, 2関西大・化生工, 3パナソニック・アプライ
アンス社, 4関西大・ORDIST）
ymatsu@kansai-u.ac.jp

森 貴翔, 清水 拓, 片山 航, 源 和晃, 高野 恵里, 砂山 博文,
北山 雄己哉, ○竹内 俊文（神戸大院・工）takeuchi@gold.kobe-u.ac.jp〔目的〕近年、洗濯工程における抗菌処理に関心が高まり、抗菌剤配合の洗剤がよく使用されている。しかし、微生物細胞が原因と考えられる洗濯後衣類の異臭低減にはつながっていない。これまでの我々の研究で、洗濯乾燥後の綿布にも多くのバクテリア細胞が付着していること、綿布に付着しやすいバクテリアが存在することが予想されていた。そこで本研究では、綿布付着バクテリア叢
やその由来、洗濯時の付着細胞数の変動調査、さらには微生物細胞付着モデル
系を構築し、付着バクテリア細胞数軽減に向けた手法構築を目的とした。
〔方法/結果〕実験には家庭環境で使用されていた綿布を使用し、洗濯工程における付着細胞数変動を調べるため、付着細胞はストマッカ処理で回収した。細胞数は顕微鏡観察法とコロニーカウント法で測定し、死細胞数割合は蛍光染色法で測定した。その結果、洗剤を用いた洗濯では、洗剤を用いない洗濯に比べて細胞は脱離しやすかったが、洗濯によって十分な脱離効果は得られず、残存付着細胞に対して顕著な殺滅効果も認められなかった。付着細胞から DNA を抽出し、16S rRNA 遺伝子領域を増幅後、次世代シーケンサーで塩基配列を決定
し、OTU 解析を行った。その結果、Moraxellaceae 科が多く見られた。異臭綿布から脱離しにくい菌（吸着菌）や洗濯水で検出されやすい菌（通過菌）を単離し、16S rRNA 遺伝子による簡易同定を行なった。単離した吸着菌や通過菌の細胞表面構造を SEM によって観察した結果、吸着菌の方が小さい傾向があった。
また、吸着菌、通過菌の綿布に対する付着評価系も構築した。今後、付着評価系を用いて菌が綿布に付着する要因を探索するとともに、脱離モデル実験系を構築し、綿布に付着しにくい条件の特定を試みる。また、綿布付着真菌類叢解
析も行う。

エクソソームは、細胞から分泌される 100 nm 程度の大きさの細胞外小胞で、唾液、血液、尿などの体液中で観察される。エクソソームには、細胞由来のタンパク質や microRNA などが含まれており、生体内で細胞間コミュニケーショ
ンやがん増殖・転移のための微小環境形成に関連することが報告[1]されて以来、その関連研究は、爆発的に進展している。
我々は、これまで分子インプリンティング技術を用いて、様々な分子を選択的に認識可能な分子認識材料（分子インプリントポリマー：MIPs）を報告してきた。MIPs は，鋳型分子と機能性モノマーを複合化し、架橋剤を加えてポリマー化し，鋳型分子を取り除くことで，鋳型分子写し取った空間を高分子内に形成した分子認識材料である。最近では、MIPs 作製後、インプリント空間内のみに化学修飾を施すポストインプリンティング修飾（PIM）も開発し、MIPs に対して高度な機能を付与することができるようになった[2]。
本研究では、エクソソームの結合空間内に、PIM による抗体と蛍光レポーター
分子を導入し、インタクトのエクソソームを超遠心などの前処理なしで高感度蛍光検出可能な新規エクソソームセンシング材料を創製した[3]。このセンシン
グ材料のエクソームに対する応答を蛍光顕微鏡により観察したところ、エクソー
ム添加量依存的に蛍光強度が変化し、10-17 M オーダーでエクソームが検出できることがわかった。また、認識空間内に導入する抗体の種類を変化させること
で、癌患者由来エクソソームの特異的な検出を試みたところ、エクソソームをバイオマーカーとしたがん診断の可能性が示されたので報告する。
[1] Hoshino, A. et al., Nature 2015, 527, 329-335.
[2] Takeuchi, T. et al., Chem. Commun. 2018, 54, 6243-6251.
[3] Mori, K., et al., Angew Chem. Int. Ed. 2019, 58, 1612.

Evaluation of microflora attached on clothing through the washing process
and construction of the microbial cell attachment evaluation method.

Highly sensitive pretreatment-free intact exosome sensing for cancer
diagnosis○Hirofumi Noda1, Hiroaki Okuda1, Masashi Yamanaka2, Toshikazu Tomioka2,
Katsuya Wakita3, Yoshinobu Matsumura1,2,4(1Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ., 2Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ.,
3
Panasnonic co. Ltd., 4ORDIST, Kansai Univ.)

Key words

biofilm, malodor, house laundry

Kisho Mori, Taku Shimizu, Wataru Katayama, Kazuaki Minamoto, Eri Takano,Hirobumi Sunayama, Yukiya Kitayama, ○Toshifumi Takeuchi(Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)

Key words

exosomes, sensor, cancer diagnosis, molecular imprinting

211

2Fp02

新規 LC/ESI-MS/MS 定量法による 3 種の麹のエルゴチ
オネイン含量測定

2Fp04○堀江 裕紀子 1,3, 後藤 綺花 2, 今村 梨子 2, 伊藤 麻里 3,
池川 繁男 4, 小川 祥二郎 1,2, 東 達也 1,2（1東理大院・薬, 2東理大・薬, 3コーケン, 4玄米酵素）
horie@genmaikoso.co.jp

溶解度パラメータを NMR 記述子から予測するマテリア
ルズインフォマティクス戦略○黒谷 篤之 1, 柿内 俊文 2, 伊藤 研悟 1, 菊地 淳 1,3,4（1理研・環境資源, 2AGC 中央研究所, 3横市院・生命医, 4名大院・
生命農学）
jun.kikuchi@riken.jp【背景・目的】 エルゴチオネイン (EGT) は強い抗酸化作用を有するアミノ酸であり，その積極的な摂取による健康増進が注目されている．黄麹菌 (Aspergillus
oryzae) は EGT の産生能力を有しており，EGT 高含有食品開発への利用が期待される．そこで本研究では LC/ESI-MS/MS を用いた麹中 EGT の新規定量法を開発し，原料の異なる麹の EGT 含量の比較と，発酵による EGT 含量の変化を追跡した．
【実験・結果】 EGT は逆相 LC における保持が極めて弱く，さらに ESI-MS/MS
応答性も十分ではなかった．そこで，疎水性かつプロトン親和性の高い 2-iodoN-(8-quinolinyl)acetamide による誘導体化を導入した．反応はジエチルアミン存
在下，60°C，5 分で完結した．得られた誘導体は ODS カラムに十分な保持を示
し，また，正イオン検出 ESI-MS における高い応答性と MS/MS における特徴的
プロダクトイオン (m/z 167) の生成から，誘導体化前の 100 倍の感度を示した．
本法は発酵過程の EGT 含量の追跡に十分な検出感度 (定量限界：0.080 μg/g) を有し，日内・日間変動試験 (RSD ≤ 7.8%)，添加回収試験 (94.9−100.0%) の結果も良好であった．本法を用いて白米，玄米または米糠を A. oryzae で発酵させた
3 種の麹 (各 3 ロット) を分析したところ，米糠麹の EGT 含量が最も多く (139−217 μg/g)，米糠が EGT 産生に適した原料であることが示された．さらに，米糠試料の EGT 含量を追跡したところ，発酵開始 12 時間後から急激に増加し，45時間の発酵により，原料の約 140 倍まで増加することが明らかとなった．

【概要】物質の溶解度は、物質の特徴理解等の為に重要な物性値の１つである。
特に分散項(dD)、水素結合項(dH)、極性項(dP)の 3 成分の定量性を数値化したハ
ンセン溶解度パラメータ(HSPs)は、その特性から薬物の吸収性評価、高分子化
合物と溶媒等間の相溶性評価等様々な場面で利用されている。主な HSPs 値の予測法の１つとして既知データからの機械学習による計算法があり、これまでに分子構造の線形表記法である SMILES 記法等から取得した分子記述子群を訓練データとして回帰予測をした報告はあるが(B.S. Lengeling et al, 2018, etc)、NMRのスペクトルデータ自体を記述子群の訓練データとして HSPs を回帰予測する報告は未だ無い。これが可能になれば、高分子化合物等の開発時に NMR デー
タから材料設計指針が得られることが期待されるため、左記機械学習による新たな HSPs 値の回帰予測法の確立を検討した。
【方法】まず、各 HSPs 値(dP, dH, dD)を目的変数とし、13C-NMR データ、又はこれに SMILES 記法からの分子情報等を加えたデータを説明変数とした訓練デー
タおよびテストデータのセットを作成した。次に、R 言語の機械学習用パッケー
ジ(caret)を利用して訓練データから多数の予測モデルの候補群を作成し、適正条件の検討から最適な HSPs 値の予測モデルを選抜した。更に、選抜したモデルを利用し、テストデータによる予測値と実測値の関係等から精度を確認した。
また、このモデルを利用して高分子化合物の HSPs 予測に適用できるかを検証した。
【まとめ】上記の NMR のスペクトルデータ、又はこれと組み合わせたデータセットに基づいた機械学習による HSPs 値予測でも一定の精度が得られた。また、本報告では、HSPs 予測モデルの高分子化合物への応用等、予測モデルの効
果的な利用戦略にも展開する。

Determination of EGT contents in three Aspergillus oryzae-fermented riceproducts by newly developed LC/ESI-MS/MS method.

Materials Informatics Strategy for Prediction of Solubility Parameters fromNMR Descriptors○Yukiko Horie1,3, Ayaka Goto2, Riko Imamura2, Mari Itoh3, Shigeo Ikegawa4,
Shoujiro Ogawa1,2, tatsuya Higashi1,2(1Grad. Sch. Pharm. Sci., Tokyo Univ. Sci, 2Fac. Pharm. Sci., Tokyo Univ. Sci.,
3
Koken Co., Ltd., 4Gemai Koso Co., Ltd.)○Atsushi Kurotani1, Toshifumi Kakiuchi2, Kengo Ito1, Jun Kikuchi1,3,4(1CSRS, RIKEN, 2AGC Res. Cent., 3Grad. Med. Life Sci., Yokohama City Univ.,
4Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)

Key words

ergothioneine, Aspergillus oryzae, rice malt, LC/ESI-MS/MS

Key words

Solubility, NMR, Prediction, Polymer

2Fp03

画像解析によるプローブ粒子の液中拡散挙動に基づいた
MRSA DNA センサの開発

2Fp05

多角的分析データを用いたポリマー物性予測システムの構築○松島 雛子 1, 一木 啓志 1, 童 俞靜 2, 莊 漢聲 2, 高村 映一郎 1,
里村 武範 1, 坂元 博昭 1, 末 信一朗 1（1福井大院・工, 2台湾國立成功大學・生物醫學工程學系）
suyeb10@u-fukui.ac.jp○坂田 研二 1, 菊地 淳 1,2,3（1理研・環境資源, 2横市院・生命医, 3名大院・生命農）
jun.kikuchi@riken.jp【背景と目的】メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)は弱毒性であるため健常者には無害であるが、抗生物質に耐性を持っているため免疫力が低下している
患者は日和見感染し重症化してしまう。そこで、MRSA の拡散を防ぐために
は、MRSA を迅速・簡便に検出する必要がある。現在の検出法には阻止円、凝集塊、電気泳動法などがあるが、いずれの方法も時間・手間を要し、その場分
析は困難である。
以前我々は、MRSA 固有の相補的 DNA 断片と電子メディエータをシグナル分子として固定化したナノ粒子（プローブ修飾ナノ粒子）により、MRSA に由来
する DNA を選択的に捕捉し、ピコモルレベルの高感度なバイオセンシングシ
ステムを構築した。しかし、一方で B/F 分離の工程が必要であること、複数検体の同時計測が不可能であるといった課題があった。
そこで本研究では、溶液中におけるナノ粒子の拡散率を計測する技術に着目した。拡散率とは、溶液中で物体がブラウン運動により生じた運動性の指標である。生体分子が粒子と複合体を形成した場合、体積増加により拡散率が低下することが予想される。本研究では、プローブ修飾ナノ粒子が DNA と複合体を形成する際の粒子の拡散率を画像解析から検出する新規バイオセンサを検討した。
【方法】MRSA の全ゲノムの内、薬剤耐性能を示す遺伝子領域の 25bp を MRSA
遺伝子捕捉用のプローブとして蛍光粒子表面へ固定化した。そのプローブナノ
粒子と MRSA の DNA をハイブリダイゼーションさせ、その溶液を蛍光顕微鏡
で１秒を 15 フレームで 20 秒間撮影し、その画像からその拡散率を算出した。
【結果と考察】標的 DNA が存在する場合、粒子の拡散率が減少することが確認された。これは、粒子が DNA とハイブリダイゼーションし複合体を形成し、体積増加をすることで、拡散率が減少したと考えられる。これらの結果より
MRSA 検出システムの可能性が示された。

【背景・目的】ポリマー物性には電子的特性なら量子化学計算、機械的特性なら分子動力学計算、さらには既存の物性データベースと分子記述子との機械学習で予測できる物性もあるが、生分解性のように高次構造が支配的な物性や、高次構造を左右する製造プロセス等に関しては、分析データを記述子とした機械学習により、材料設計指針が得られると期待できる。そこで本研究では当研究室で開発したピーク分離 1・機械学習解析ツール 2 等を用いて材料設計、品質評
価に関わる物性予測システムの確立を目指した。
【方法】予測する物理データの目的変数として、熱重量示唆熱分析装置、示差走
査熱量計を用いて市販のポリマー試料の融点、ガラス転移点等の物理データを取得した。説明変数として時間領域 NMR、固体 NMR を用いて緩和減衰曲線、
1
H 異方性・等方性スペクトルを取得し、これらのスペクトルデータを機械学習
により物理データの予測モデルを作成し、モデル精度の検証を行った。
【結果】各種ポリマーにおける異方性・等方性スペクトルを数値化し、ランダム
フォレストによりポリマー試料の融点予測回帰モデルを作成し、モデル精度を比較した結果、等方性スペクトルのモデル精度の方が少し優れていたが、異方性スペクトルで作成したモデルも同等の精度が得られた。数値化した緩和減衰
曲線データを用いて 89 種の機械学習により融点回帰モデルの精度を比較した結果、xgbDART が最も適したアルゴリズムであることが抽出され、また回帰曲線に関わる重要変数から緩和時間の短い成分と融点との関係性が示唆された。これらの結果から異方性・等方性スペクトル、緩和減衰曲線は機械学習を組み合わせることで、物理データの予測が可能であることが示唆された。

Development of a novel MRSA DNA sensor based on in-liquid Diffusibility
analysis of probe particles by image processing

Physical property prediction of polymer based on various chemical
approaches

biosensor, MRSA, image processing, brownian motion

Key words
Solid-state NMR, Physicochemical property, Machine learning,
Materials informatics○Hinako Matsushima1, Keishi Ichiki1, Yujing Tong2, Hansheng Zhuang2,
Eiichirou Takamura1, Takenori Satomura1, Hiroaki Sakamoto1, Shin-ichiro Suye1(1Grad. Sch. Eng. Fukui Univ., 2Dept. Biomed. Eng.,NCK Univ)

Key words【参考文献】[1] Yamada et al. (2019) ACS Omega 4, 3361-3369.
[2] Ito et al. (2018) Chem Sci. 9, 8213-8220.

○Kenji Sakata1, Jun Kikuchi1,2,3(1CSRS, RIKENS, 2Grad. Sch. Med. Life Sci., Yokohama City Univ., 3Grad. Sch.
BioAgriSci., Nagoya Univ.)

212

2Fp06

QCM を用いたベタイン型添加剤による ELISA の高感度化機構解析

2Fp08○三宅 子龍, 甲元 一也（甲南大院・フロンティアサイエンス）
koumoto@konan-u.ac.jp

顕微ラマン分光法及び多変量スペクトル分解法を用いた生理活性物質 penicillin 及び avermectin の菌体内検出○堀井 俊平 1,2, 安藤 正浩 3,4, 中島 琢自 5, アショク サムエル 3,
松本 厚子 5, 高橋 洋子 5, 竹山 春子 1,2,3,6（1早大院・先進理工, 2産総研・CBBD-OIL, 3早大・ナノライフ
創新研, 4JST・さきがけ, 5北里大・生命科学研, 6早大・理工総研）
haruko-takeyama@waseda.jp【目的と背景】
酵素免疫測定法（ELISA）は、病気の診断や、食品の衛生管理、環境分析など幅広く利用されている。我々の研究室では、研究室で開発したベタイン型添加剤を用い、その検出感度の向上や抗体使用量の削減に成功し、日本農芸化学会
2019 年度大会にて報告した。しかし、ELISA の各ステップでベタイン型添加剤
がどのように働いているのか、その作用機構については不明な点も多かった。
そこで本研究では、水晶発振子マイクロバランス(QCM)測定法を用い、ベタイ
ン型添加剤の作用機構について、評価、検討した。
【結果と考察】ELISA プレートのウェル表面を模倣するため、スピンコーターでポリスチレン
を表面に被覆した水晶振動子を用意し、ベタイン型添加剤として、炭素鎖が１から５の５つの誘導体を用いた。まず一次抗体の吸着について評価したところ、ベタイン型添加剤の表面への吸着と一次抗体の吸着がそれぞれ確認された。洗浄バッファで洗浄すると、一次抗体は吸着したままでベタインは速やかに洗い流された。実際、洗浄後の一次抗体の吸着量は分光学的に得られた結果と同じ
2 倍の吸着量の増加を示した。一方で、ベタイン型添加剤が競争的に表面へ吸着するため、速度は遅くなる傾向があった。同様に QCM を用いて、一次抗体と抗原との結合、その複合体と二次抗体との結合、標識酵素の導入に対するベタイン型添加剤の効果についても評価した。発表では、それらについても詳細を報告する。

顕微ラマン分光法は、非標識・低侵襲に物質の分子構造を明らかにできるため、
蛍光ラベリングや遺伝子操作などの行程を踏まずに生体分子の細胞内分布を可視化できる。我々の研究グループでは、顕微ラマン分光計を用いることで、放線菌内における抗生物質 amphotericin B の生産を非破壊・非標識で検出可能であることを示した(Miyaoka et al., 2014)。しかし、生体成分と重複した位置にラマンバンドが存在する生理活性物質の検出は難しい。そこで、本研究では、多変量スペクトル分解法(MCR-ALS)を用いて、単一ラマンバンド解析が困難な生理活性物質の in situ 検出を試みた。
カビ Penicillium chrysogenum KF425 株及び放線菌 Streptomyces avermitilis KA325
株を液体培地にて培養を行った。培養後の菌体について、顕微ラマン分光計を用いてラマンスペクトルを測定し、MCR-ALS により解析を行った。MCR-ALS
により、重畳したラマンスペクトルから単一物質に由来するスペクトル成分の抽出及び各成分の強度変化を算出できる。MCR-ALS 解析の結果、複雑なマッ
ピングデータから生体成分及び抗生物質に由来するラマンスペクトルをそれぞれ抽出することができ、抗生物質の菌体内検出及び局在の可視化に成功した。
また、Streptomyces avermitilis を寒天培地で培養した場合、気菌糸から胞子鎖が形成される。この形態変化における avermectin の生体内動態を顕微ラマン分光計により経日的にモニタリングしたところ、avermectin が胞子鎖に局在することが明らかとなった。以上より、本研究より、MCR-ALS により従来では困難であった化合物に対して in situ 検出が可能となり、本手法を抗生物質の生体モニタリングや生理活性物質生産菌体のスクリーニングへ適用できることが示唆された。

Mechanism of improved sensitivity on ELISA by addition of betaine-typeadditives using QCM measurements

In situ Detection of Penicillin and Avermectin in Microbes by Raman
Spectroscopic Multivariate Analysis○Shiryou Miyake, Kazuya Koumoto(FIRST, Konan Univ.)

Key words

ELISA, QCM, Betaine, High sensitivity

2Fp07

哺乳類嗅覚受容体発現細胞パネルによる気相中におい分
子検出技術の開発と官能評価応用への展開○Shumpei Horii1,2, Masahiro Ando3,4, Takuji Nakashima5, Samuel Ashok3,
Atsuko Matsumoto5, Yoko Takahashi5, Haruko Takeyama1,2,3,6(1Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2CBBD-OIL, AIST-Waseda Univ., 3Res.
Org. Nano Life Innov., Waseda Univ., 4PRESTO, JST, 5Kitasato Inst. for Life Sci.,
Kitasato Univ., 6Inst. Adv. Res. Biosyst. Dynam., Waseda Res. Inst. Sci. Eng.,
Waseda Univ.)
Key words
Raman microspectroscopy, MCR-ALS, Bioactive compounds,
screening

2Fp09

微小液滴作製技術を応用したサンゴ共在微生物の高精度な単一細胞ゲノム解析技術の確立○福谷 洋介 1,2, 木田 仁 2,3, Mainland Joel D 4, 養王田 正文 1,
松波 宏明 2
（1農工大・院工・生命工, 2デューク大・医・分子遺伝, 3農工大・院工・機械システム, 4モネル化学感覚研究所）
fukutani@cc.tuat.ac.jp○西川 洋平 1,2, 細川 正人 3, 井手 圭吾 1,4, 小川 雅人 1,4,
竹山 春子 1,2,3,4（1産総研・早大 CBBD-OIL, 2早大・ナノライフ創新研, 3早大・理工総研, 4早大院・先進理工）
haruko-takeyama@waseda.jp

哺乳類の嗅覚は、数百種類のにおい受容体(Odorant receptors; ORs)を介した分子認識により、周囲に漂う多様なにおいを高感度に感じることができる。鼻腔に入り込んだにおい分子が嗅粘液に溶け込んだ後、嗅覚神経細胞に発現している
ORs と結合が生じることが全ての嗅覚反応の基盤となる。
これまで、我々は OR 発現培養細胞で気相中の匂い分子を検出する Vapor
stimulation 法を開発してきた。本手法は、複数のマウス由来 OR を個々に発現させた培養細胞に対し、気化したにおい分子によって刺激する。cAMP 依存的な発光を示す Glosensor を用いることで、刺激したにおい分子に対した OR 毎の異なる応答をリアルタイムで検出することが可能である。
分子構造が類似した匂い分子に対しても複数の OR の応答を総合的に評価することで、メチル基 1 つの違いの識別が可能であった。試験したにおい分子の中には、0.000001%という非常に低濃度の匂い溶液からの揮発成分に対しても応答を示す OR が見られた。今回開発した新規の OR 発現細胞アッセイ法は、匂い分子溶液を OR 発現細胞に直接添加する従来の手法と異なり、匂い分子の自発的な溶解で細胞を刺激するため、本来の嗅粘液中により近い状態を模倣できる。そのため、嗅粘液中に発現している代謝酵素などの関連因子の機能解析においても、非常に有効な手法だと考えられる。
これまで単一のにおい分子に対したアッセイを主に行っていたが、現在は 2 種
類以上の混合物や合成香料に対する試験も行っている。本発表では、気相アッセイ法の最新のデータなどを交えて今後の展望についても報告する予定である。

環境微生物の 99%以上は実験室環境下での培養が困難であるとされており、これら難培養微生物の特徴や生態を明らかにするためには、単一細胞レベルでの
ゲ ノ ム 解 析 が 有 用 で あ る と 考 え ら れ る 。 近 年 で は 、 Multiple displacement
amplification (MDA)に代表される全ゲノム増幅法の開発および次世代シーケンサーの発展により、様々な環境中に生息する微生物の単一細胞ゲノム情報の取得が可能となりつつある。一方、従来までの単一細胞ゲノム解析手法では、細胞の分取、溶菌、全ゲノム増幅の効率が低く、特に環境微生物を用いた検証においては目的外 DNA の混入やキメラ配列の生成により、効率的なゲノム解析を行うことが困難であった。
そこで本研究では、単一細胞由来のゲノム情報をより高精度に取得するための技術開発を目的とし、ピコリットル容量の油中水滴型(W/O)微小液滴を反応場として用いたゲノム解析手法を開発した。マイクロ流体デバイスにより作製される均質な微小液滴を用いることにより、一度に 105 個以上の単一細胞に対して網羅的な全ゲノム増幅が可能となった。また、目的外 DNA の混入リスクを抑制することによって高精度なゲノム情報の解析を可能とした。さらに本研究
では、開発した技術を環境サンプルに応用し、サンゴ組織内に共在する微生物を対象とした単一細胞ゲノム解析を実施した。解析の結果、組織懸濁液からサンゴ共在微生物として近年注目を集めている Endozoicomonas 属に分類される細菌の高精度なゲノム情報が新規に獲得され、得られた配列情報を用いて遺伝子の機能解析や系統解析が可能であることが実証された。本手法は幅広い種類の環境微生物に適用が可能であり、新しい単一細胞ゲノム解析技術としての応用が期待できる。

Vapor detection with a panel of mammalian odorant receptors toward
sensory evaluation applications

Development of an accurate single-cell genome sequencing method for coralcommensal bacteria with droplet microfluidics○Yosuke Fukutani1,2, Hitoshi Kida2,3, Mainland Joel D4, Masafumi Yohda1,
Hiroaki Matsunami2(1Dept. of Biotech. and Lifesci., Tokyo Univ. of Agric. and Technol., 2Dept.
Mol.Gen. & MicroBiol., Duke Univ. Med. Center, 3Dept. of Mechanic. System Eng.,Tokyo Univ. of Agric. and Technol.,, 4Monell Chemical Senses Center)
Key words
Odorant receptors, Vapor stimulation, Sensor, Olfactory mucosa○Yohei Nishikawa1,2, Masahito Hosokawa3, Keigo Ide1,4, Masato Kogawa1,4,
Haruko Takeyama1,2,3,4(1CBBD-OIL, AIST-Waseda Univ., 2Res. Org. Nano Life Innov., Waseda Univ.,
3
Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ., 4Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words

single-cell analysis, microfluidic device, environmental bacteria

213

2Fp10

腸管組織内共生日和見細菌アルカリゲネス菌の形態変化に伴う、シトクロム c 蓄積と宿主細胞のアポトーシス
誘導○柴田 納央子 1,2, 國澤 純 2,3,4,5,7, 安藤 正浩 6,7, 細川 正人 8,
堀井 俊平 1,9, 細見 晃司 3, 竹山 春子 1,7,8,9, 清野 宏 2,10,11（1早大院先進理工, 2東大国際粘膜ワクチン開発研究セ, 3医薬健栄研ワクチン・アジュバント研究セ, 4阪大院歯学, 5神戸大院
医学, 6JSTさきがけ, 7早大ナノライフ創新研, 8早大理工総研,
9
産総研 CBBD-OIL, 10UCSD医学, 11千葉大院医学）haruko-takeyama@waseda.jp
我々の研究グループでは、腸管における主要な免疫誘導組織であるパイエル板
内部において、日和見細菌の一種であるアルカリゲネス菌が樹状細胞内に定常的に共生し、樹状細胞を介した IgA 産生の促進に寄与することを示してきた(PNAS., 2010、Mucosal Immunol., 2018)。
一方で、宿主免疫系の機能不全等によりアルカリゲネス菌との共生関係が破綻すると、アルカリゲネス菌が全身性炎症を誘起するが(Science, 2012)、その共生破綻機序は明らかではない。そこで本研究では、宿主免疫系の機能不全に伴う、
アルカリゲネス菌の共生破綻機序の解明を目指した。
アルカリゲネス菌を過剰増殖させると、桿状からフィラメント状への形態変化を起こす事が判明した。さらに、フィラメント状への形態変化に伴いアルカリ
ゲネス菌の菌体内にシトクロム c が蓄積し、一部のシトクロム c は菌体外へ放出されることを見出した。シトクロム c は通常、細菌細胞膜や動物細胞のミト
コンドリア内膜において、好気呼吸電子伝達系の電子供与体として機能しているが、ミトコンドリアからシトクロム c が細胞質へ放出されると、アポトーシ
ス促進因子として作用することが知られている。これらの報告と一致し、アルカリゲネス菌が定常的に共生している樹状細胞に、形態変化後のアルカリゲネ
ス菌を感染させることで、樹状細胞の細胞質におけるシトクロムｃが増加し、それと連動しアポトーシスが高率に誘導されることが明らかになった。
以上の解析結果から、アルカリゲネス菌の共生破綻機序として、アルカリゲネ
ス菌の形態変化に伴う菌体内シトクロム c の蓄積及び、シトクロム c の樹状細胞の細胞質での増加と、それに起因したアポトーシス誘導機構の存在が示唆された。

Morphological changes of the gut intra-tissue symbiotic opportunistic
bacteria, Alcaligenes, are accompanied by cytochrome c accumulation andinduction of host 1,2cell apoptosis 2,3,4,5,7
6,7
8○Naoko Shibata , Jun Kunisawa, Masahiro Ando , Masahito Hosokawa ,Shunpei Horii1,9, Koji Hosomi3, Haruko Takeyama1,7,8,9, Hiroshi Kiyono2,10,11
2(3 1Grad.Sch.Adv.Sci.Eng.,WasedaUniv,
Int.Res.Dev.Cent.MucosalVac.,TokyoUniv,
4
Lab.Vac.Mat.,NIBIOHN,
Grad.Sch.Dent.,OsakaUniv, 85Grad.Sch.Med.,KobeUniv,
6
7
PRESTO,JST,
Res.Org.NanoLifeInnov.,WasedaUniv,
Res. Inst. Sci. Eng., Waseda
Univ, 9CBBD-OIL,AIST,WasedaUniv, 10Dep.Med.,UCSD,
11
Grad.Sch.Med.,ChibaUniv)
Key words
peyers patches, dendritic cells, symbiotic bacteria

2Fp11

防腐作用のシングルセル解析○宮原 佳子, 矢野 剛久, 久保田 浩美, 永井 智
（花王）
nagai.satoshi@kao.com

2Fp12

結合タンパク質を用いたアスタキサンチン分離法の確立○八木 周和 1, 原 清敬 1,2（1静県大院・薬食生命, 2静県大・食栄）k-hara@u-shizuoka-ken.ac.jp[背景と目的] アスタキサンチンは強力な抗酸化作用を持ち近年、医・薬・食・化粧品等の分野にて広く応用されている。しかし、アスタキサンチンの分離には超臨界抽出等のコストがかかるプロセスが必要であり、エネルギーの消費が少なく、より精製度の高い分離法が求められている。そこで本研究では、ロブスター由来アスタキサンチン結合タンパク質であるクラスタシアニンのサブユ
ニットを用い、アスタキサンチンを結合させて分離する方法の確立を目的とした。具体的には、大腸菌に組換えタンパク質として結合サブユニットを発現させ、精製後、アスタキサンチンとの結合を試みた。
[方法] pET ベクターを用いてクラスタシアニンのアスタキサンチン結合サブユ
ニットが発現するように大腸菌 Origami B を形質転換した後、抗生物質を含む
LB 培地にて培養し IPTG による誘導を行った。誘導後、菌体を超音波にて破砕し、アスタキサンチン結合タンパク質を精製した。次に、アセトンに溶解させたアスタキサンチンと結合タンパク質を混和し、これらの複合体の形成を試みた。
[結果と考察] 水系において疎水性物質のアスタキサンチンは析出するが、アス
タキサンチン結合タンパク質を加えると、この析出は見られなくなったことからアスタキサンチンの結合タンパク質への結合が確認できた。また、今回用いた結合タンパク質は、複合体を形成すると吸収ピーク波長がシフトすることから、他のカロテノイド等の夾雑物質が存在するサンプル中のアスタキサンチンの特異的な定量にも応用ができ、高速液体クロマトグラフィー等を用いる従来の測定法とは異なる迅速で多サンプル同時分析が可能になると考えられる。

Development of astaxanthin separation method using its binding protein○Yagi Shuwa1, Kiyotaka Hara1,2(1Grad. Sch. Integr. Pharm. Nutr. Sci., Univ. Shizuoka, 2Sch. Food Nutr. Sci., Univ.
Shizuoka.)

Key words

Escherichia coli, astaxanthin, separation

2Fp13

質量顕微鏡を用いたコムギ葉(Triticum aestivum)断面におけるアゾキシストロビンの経時的分布可視化法の開発○生田 宗一郎 1, 福﨑 英一郎 1,2, 新間 秀一 1,2（1阪大院・工, 2阪大島津イノベーション共同研究講座）
sshimma@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景と目的】化粧品等の製品中には防腐剤以外に界面活性剤等の防腐剤を不活性化する成分や糖・アミノ酸・植物エキス等の微生物を賦活化する成分が含まれる。しかし防腐剤の作用解析は単純な水溶液系でなされる場合が多く、特に賦活成分共存下での防腐剤の作用特性はわかっていない。マイクロデバイスとTime-lapse 蛍光顕微鏡を組み合わせたシングルセル解析は、複雑な系での個々の細胞の多様な挙動の解析に有効である。本研究では賦活成分と防腐剤が共存する系での防腐作用をシングルセルレベルで解析し、各防腐剤の作用特性を明らかにすることを目的とした。
【方法】化粧品の防腐剤に用いられるフェノキシエタノール（PE）と防腐助剤として用いられるエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を使用し、モデル賦活成分として SCD 培地を用いた。菌株は PE に対してやや高い耐性を示した環境分
離株 Staphylococcus sp. KMC153 を用いた。PE と EDTA の最小殺菌濃度（MBC）
及び最小生育阻止濃度（MIC）における生残菌数の減少挙動及び両者を併用した際の生残菌数の減少挙動を確認した。さらに、PE 単独使用時及び PE・EDTA併用時の細胞の挙動をシングルセルレベルで解析した。
【結果と考察】PE は MIC においても殺菌性を示したが、EDTA は MIC の 30 倍以上の濃度でも菌数減少は緩やかだった。一方で、PE と EDTA を併用すると殺菌性が向上し、より速やかに生残菌数が減少した。そこで死滅速度が同じになるよう濃度を調整して PE 単独使用時と PE・EDTA 併用時のシングルセルレ
ベルでの細胞挙動を比較した結果、前者では死滅する細胞と分裂する細胞が共存していたが、後者は分裂せずに時間とともに死細胞が増加していた。本研究で得られた結果から、シングルセル解析は菌数変化からは得られない各細胞の挙動をとらえることができ、菌数変化が同じでも作用性は異なる場合があることが示された。

アゾキシストロビンはストロビルリン系殺菌剤の一種であり，1996 年に商業販売が開始され，現在もなお世界中で広く用いられている。ミトコンドリアのチ
トクロム bc1 複合体の QO 部位に結合することで電子伝達系を阻害し、細菌や一部の菌類の呼吸を阻害することで効果を発揮する。さらに浸透性が高いことも知られている。しかし葉の表面に施与した際に，裏側までどのように浸透す
るかは知られていない。そこで本研究はマトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)を搭載した質量顕微鏡(Mass Microscope)を用いて，コムギ葉断面におけるアゾキシストロビン浸透の可視化法を開発することを目的とした。
本研究では，コムギ葉断面の切片作製法を最適化した。その後，質量顕微鏡を用いてコムギ葉における経時的な薬剤浸透の可視化をおこなった。コムギ葉の切片作製のための包埋剤として 10％ゼラチンが最適であることがわかった。葉
の表側に塗布した薬剤の包埋剤への流出を防ぐため、薬剤を塗布した裏側のみを包埋剤で固定し，液体窒素による凍結後，ミクロトーム内で厚さ 30 μm の凍結切片を作製した。続いて，アゾキシストロビン標準品を用いて MALDI によるイオン化の確認をおこなった。その後，コムギの最も穂に近い葉にアゾキシ
ストロビンを塗布し，1 時間後，1 週間後，2 週間後のコムギ葉をサンプリングした。それらの試料に対し，最適化した切片作製法を用いて切片を作製し，質量顕微鏡を用いて解析をおこなった。その結果，アゾキシストロビンのコムギ
葉における浸透の空間分布情報を取得可能となり，アゾキシストロビンが 1 時間であっても葉の裏側に到達することや維管束への浸透はほぼ見られないことが明らかになった。今回開発した手法を用いることで，コムギ葉におけるアゾ
キシストロビン以外の農薬の浸透可視化に応用することが可能であると考えられる。

Analyses of preservative efficacy at single-cell level

Development of azoxystrobin visualization procedure in wheat leaves(Triticum aestivum) using Mass Microscope○Yoshiko Miyahara, Takehisa Yano, Hiromi Kubota, Satoshi Nagai(Kao Corp.)

Key words

single-cell analysis, Staphylococcus, preservative○Soichiro Ikuta1, Eiichiro Fukusaki1,2, Shuichi Shimma1,2(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Osaka University Shimadzu Innovation Analytical
Laboratory)

Key words

mass microscope, leaf cross section, fungicide, plant

214

2Fp14

質量イメージングによる組織内酵素活性可視化法の開発○竹尾 映美, 福﨑 英一郎, 新間 秀一（阪大院・工）fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp

2Fp16

ペプチドアレイを反応基盤とした、ミルク抗原ペプチド
検出技術の開発○久保 智里 1, 栗本 昌樹 1, 田中 祐圭 2, 越智 浩 1, 阿部 文明 1,
大河内 美奈 2（1森永乳業, 2東工大・物質理工）
chisato-kubo981@morinagamilk.co.jp

生体内もしくは組織内で酵素活性を見る方法は限定的であり拡張性が担保されていない。例えば、免疫染色や GFP では特定の酵素（タンパク質）の局在を見ることが出来る。しかし、それらの酵素が実際に活性を持っているか、さらにはその場所で機能を発揮しているかを判別することは出来ない。また、酵素活
性を見る方法として酵素活性が働いた時にのみ呈色したり発光基質を用いる方法があるが、特殊な基質を作製するのが煩雑であるだけでなく、応用範囲が限られるといった問題がある。特に、低分子が基質の場合、基質への標識を導入の問題から、この手法を適用した例はほんのわずかしかない。
そこで着目されるのが、質量イメージング（MSI:mass spectrometry iamging）を用いた酵素活性測定方法である。MSI は、組織切片上で二次元的にイオン化及び質量分析を行うことで、分子の局在イメージを取得する手法である。本発表
では、低分子を基質とする酵素活性可視化手法として MSI を応用した例を報告する。MSI を用いて酵素による代謝反応を可視化することは、これまでペプチド分解酵素については Grobe らにより報告されている。しかし、低分子に対して本手法を適用した例は報告がない。その理由として、以下の 2 点が挙げられる：（1）対象の物質（基質および生成物）が内在性かつ高濃度で存在する、（2）低分子物質は水に溶けやすいため、既に報告のある基質溶液への浸漬による基質の供給では組織切片上に残る水分量が多く、反応の際に基質および生成物の非局在化が起きる可能性がある。この問題を解決するため、アセチルコリン代謝を対象とし低分子基質における MSI による酵素活性測定方法の検討を行った
ところ、特徴的な酵素活性分布が再現性良く得ることができた。本発表では、
新規手法と分布結果を報告し、議論したい。

【背景・目的】近年、食の安心安全に対する消費者の意識が非常に高まっており、食物アレル
ギーもその一例である。食品衛生法では、消費者の食品アレルギーによる健康危害の発生を防止する観点から、食品原材料のアレルゲン表示を一部義務化および推奨している。このような実情のもと、食品の維持管理や突発的な事故を予防する観点から、食品中のアレルゲンを迅速かつ簡便に検出する技術が求められている。更に、消費者を保護するという安全性を考慮すると、その検出には高い感度が要求される。本研究では、アレルゲンをペプチド単位で分離して検出し、各抗原ペプチドを高感度に検出する技術の開発を目的とし、ペプチドアレイを反応基盤とした新規ツールの評価検討を行った。

In situ enzyme-activity visualization by mass spectrometry imaging

Development of technology to detect antigenic peptides of milk on the basisof reaction with peptide array○Emi Takeo, Eiichiro Fukusaki, Shuichi Shimma(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)【方法】
Fmoc 固相合成法によりセルロースメンブレン上にペプチドを合成し、乳タン
パク質（β-ラクトグロブリン、または αS1-カゼイン）の配列を網羅したペプチ
ドアレイを 16-mer、3〜5-mer ずらしで作製し、反応基盤とした。乳ペプチドが配合された様々な育児用ミルクと、各乳タンパク質の抗体をプレインキュベー
ションさせサンプルを調製した。このサンプルと前述のアレイを反応させ、競合的イムノアッセイを行った。
【結果】
各種育児用ミルクの乳アレルゲンタンパク質量を評価したところ、新規法にて従来法と同等の検出結果を得ることができた。さらに、乳アレルゲンを抗原ペプチド毎に評価したところ、従来法では乳アレルゲンタンパク質が検出されないほど低抗原なミルクに対しても、新規法では一部抗原ペプチドを再現性高く検出することに成功した。このことから、新規法は従来法よりも高い感度でアレルゲン検出可能であることが確認できた。本検出法を実用化することで、食品の品質を高いレベルで管理可能となるだけでなく、品質の高い製品開発・製品設計への活用も期待できる。

○Chisato Kubo1, Masaki Kurimoto1, Masayoshi Tanaka2, Hiroshi Ochi1,
Fumiaki Abe1, Mina Okochi2(1Morinaga Milk Industry CO., LTD., 2Sch. Mater. Chem. Technol., Tokyo Tech)

Key words

mass spectrometry imaging, enzyme, metabolite, acetylcholine

Key words

peptide array, allergen, milk, sensor

2Fp15

グラフェン量子ドットー金ナノ粒子ーポリアニリンナノ
ワイヤ複合体を用いた電気化学的バイオセンサーによる
カニクイザル糞便からのＨＥＶの検出

2Fp17

CD 型マイクロ流路を用いた食品中のサルモネラ菌迅速検出○久保 いづみ（創価大・理工）kubo@soka.ac.jp○竹村 謙信 1, Dutta Chowdhury Ankan 2, 李 天成 3, 鈴木 哲朗 4,
朴 龍洙 1,2（1静大・創科技院, 2静大・グリーン科技研, 3国立感染研, 4浜医大・医・医学科）
park.enoch@shizuoka.ac.jp【目的】 E 型肝炎ウイルス（HEV）は E 型肝炎の原因ウイルスであり、その臨床症状は A 型肝炎に似通るが、致死率は 10 倍の高い。主にブタ、イノシシの未加熱肉摂食により感染が確認され、例年数百件の感染事例が報告され、食生活の安心・安全を脅かしている。その検出法には PCR 法に頼っているが、設備と熟練した技術を要し、ウイルス拡散防止のための高感度かつ迅速な検出法の開発が喫緊の課題である。本研究では、高導電性グラフェン量子ドットー金ナ
ノ粒子ーポリアニリンナノワイヤ（GQD-AuPAni）ナノ複合体上に HEV 特異的抗体を修飾し、インピーダンス法によるＨＥＶの検出を行った。
【方法】 Au-PAni は水層と有機層を用いて界面重合法により合成し、ポリアニ
リンナノワイヤー中に 5〜10 nm の金ナノ粒子（AuNP）を均一に配置した。
GQD-AuP Ａ ni に N,S 分子をドープした後、HEV 特異的抗体（Ab）を化学的修飾し Ab-GQD-AuPani 複合体を作製した。
【結果】 HEV が電極上の Ab-GQD-AuPani 複合体に特異的に結合すると、電気抵抗（Rct）が上昇し、Rct の測定により、HEV を検出することかできた。HEV様粒子（HEV-LP）を用いた検出試験では検出限界 0.8 fg/ml と高い感度を示し、ヒト血清中の HEV-LPs 検体からも HEV-LP の検出ができた。臨床検体からのHEV 検出の可能性を評価するために、HEV に感染されたサル糞便を感染後４日目から４３日目まで採取し、本検出系と RT-qPCR によるＨＥＶ検出を行い、両者の結果を比較した。本検出系は糞便からのＨＥＶが検出され、その感度は
RT-qPCR に比べやや低感度であったが、同様の傾向が示された。この結果は、
本検出系が臨床検体からのＨＥＶの検出には有用であることが示唆された。

食品中のサルモネラ菌の検査では複数回の培養を行うことで細菌の分離と同定を行っている。培養は時間がかかり同定に至るまでに 4-7 日間を要する。本研
究室ではディスクの回転によって生じる遠心力で溶液を簡便に送液して、チャンバーに細胞を捕捉し、PCR による細胞固有遺伝子を PCR できる細胞単離ディスクを開発している。そこで、本研究では食品中のサルモネラ菌の検出に際し固有遺伝子である invA の増幅により検出するため、食品由来の成分の除去のための前処理から検出までの迅速な方法の確立を目的とし、食肉試料からのサル
モネラ菌の抽出と検出を試みた。
本研究では、鳥挽肉中のサルモネラ菌をフィルターバッグと遠心処理による回収をし、菌を invA 遺伝子の増幅用 PCR 試薬とともに細胞単離ディスクに流して分離し、このディスク上で PCR した。PCR 増幅産物は蛍光プローブで検出した。また、低濃度の菌は回収後培養して検出を行った。
まず、1 チャンバーに 1 個以上のサルモネラ菌が存在する際の蛍光強度比の閾値をリアルタイム PCR の結果をもとに確認した。PCR 後この閾値以上の蛍光強度比が増加したチャンバーにはサルモネラ菌が存在し、invA の増幅産物が存在したと判断することにした。これに基づき、鳥挽肉中の 4.6×104-107 CFU/g のサルモネラ菌を細胞単離ディスクでの検出を行い、4.6×105 CFU/g までは閾値以
上のチャンバーが確認され、そのチャンバー数が濃度に依存して増加した。また、4.6×104 CFU/g 未満の濃度のサルモネラ菌を検出する際には培養が必要であると考え、Nutrient Broth 培地を用いて 37℃で 4 時間振盪培養後、検出を行った。4 時間培養することにより、1.7×104 CFU/g まで検出することができ、濃度に依存して閾値以上のチャンバー数も増加した。また、培養時間を 8 時間にすることで、30 CFU/g 以上の菌を検出できることが確認された。

Electrochemical detection of Hepatitis E virus of fecal specimen samples
collected from HEV-infected monkey using GQD-AuPAni nanocomposite

Rapid detection of salmonella enterica in food utilizing a microfluidic device○Kenshin Takemura1, Ankan Dutta Chowdhuly2, Tensei Li3, Tetsuro Suzuki4,
Enoch Y. Park1,2(1Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka
Univ., 3Natl. Inst. Infect. Dis., 4Hamamatsu Univ. Sch. Med.)Key words

virus, detection, electrochemical, nano-bio sensor○Izumi Kubo
(Faculty of Sci. Eng., Soka Univ.)

Key words

pathogen, gene, PCR

215

2Gp01

CHO 細胞を用いたサメ由来重鎖抗体の全長発現と特性
解析

2Gp03

○江夏 朔, 山野-足立 範子, 古賀 雄一, 大政 健史（阪大院・工）omasa@bio.eng.osaka-u.ac.jp

Functional production of human antibody by thefilamentous fungus Aspergillus oryzae○Hung Hiep Huynh1, Takuya Katayama1,2, Toshihiro Sakamoto3,
Reiko Shinkura2,3, Jun-ichi Maruyama1,2(1Dept. Biotechnol., The Univ. of Tokyo, 2CRIIM, The Univ. ofTokyo, 3Inst. Quant. Biosci., The Univ. of Tokyo)
amarujun@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp【背景・目的】ヒト由来 IgG 抗体医薬品が医薬品市場において大きな割合を占める中で、サメ由来重鎖抗体である Immunoglobulin new antigen receptor (IgNAR)が高い安定性を有する新たな抗体様タンパク質として注目されている。IgNAR
は 1 つの可変ドメイン (VNAR) と 5 つの定常ドメイン (C1~C5) からなる。VNARと C1-C4 ドメインは先行研究において発現され、高い熱安定性が示されている。一方、分子間ジスルフィド結合や 4 か所の糖鎖修飾部位を有する C5 ドメ
インは大腸菌や昆虫細胞を用いて発現させた報告例があるが、フォールディン
グやアッセンブリは確認されておらず、IgNAR の全長発現や特性解析は未だ行
われていない。そこで本研究では高度な翻訳後修飾が行える CHO 細胞を用いて IgNAR 全長発現を行い、特性解析を試みた。
【実験手法】IgNAR 全長にプロテアーゼ切断配列 (P.C.S.) を介して精製用のタグとしてヒト IgGFc 領域を付加したコンストラクト (IgNAR-Fc) を抗体発現用ベク
ターに挿入した。無血清馴化 CHO-K1 細胞にエレクトロポレーション法によってベクターを導入し IgNAR-Fc 安定発現株を取得した。安定発現株を浮遊培養し培養上清を Protein A カラムを用いて精製し、Fc 領域をプロテアーゼによって切断し、Protein A カラムとサイズ排除クロマトグラフィーによって除去し、IgNAR を精製した。精製した IgNAR を用いて、バイオレイヤー干渉法とサーマルシフトアッセイにより親和定数や融点測定を試みた。
【結果・考察】SDS-PAGE による解析の結果、IgNAR は糖鎖修飾された二量体構造を形成していた。従って、CHO 細胞を用いた発現系は IgNAR の全長発現に適していると考えられた。また、融点測定により IgNAR は IgG よりも高い熱安定性を示した。現在、発現させた IgNAR の抗原に対する親和定数を測定している。

Monoclonal antibodies (mAbs) as one of the biopharmaceuticals take a pivotal role inthe current therapeutic application. Generally, mammalian cell lines such as Chinese
hamster ovary (CHO) are used to produce the recombinant antibody. However, there
are still concerns about the high cost and the risk of pathogenic contamination whenusing mammalian cells. Aspergillus oryzae, the filamentous fungus considered as a
GRAS (Generally Regarded As Safe) organism, has a great ability to secrete a large
amount of proteins into the culture supernatant, and thus the fungus has been used as
one of cost-effective microbial hosts for heterologous protein production. Pursuing thisstrategy, human anti-TNF alpha antibody adalimumab, one of the world’s best-selling
antibodies for treatment of immune-mediated inflammatory diseases including
rheumatoid arthritis, was chosen to attempt for producing the full length of mAbs by A.
oryzae. The nucleotide sequences for adalimumab heavy and light chains were
optimized, fused with the coding sequence for alpha-amylase AmyB as “carrier
protein”, and then introduced into A. oryzae host. The tetramer form of recombinantadalimumab was successfully produced in the culture supernatants, and its antigen
binding activity was detected by ELISA assay. These results demonstrated analternative low-cost platform for human antibody production by using A. oryzae,
possibly offering a reasonable expenditure for patient’s welfare.

Expression and characterization of full-length shark derived antibody byusing CHO cells

Functional production of human antibody by the filamentous fungus
Aspergillus oryzae○Hajime Enatsu, Noriko Yamano-Adachi, Yuichi Koga, Takeshi Omasa(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)○Hung Hiep Huynh1, Takuya Katayama1,2, Toshihiro Sakamoto3, Reiko Shinkura2,3,
Jun-ichi Maruyama1,2(1Dept. Biotechnol., The Univ. of Tokyo, 2CRIIM, The Univ. of Tokyo, 3Inst. Quant.
Biosci., The Univ. of Tokyo)

Key words

CHO cell, Shark antibody, IgNAR, Heavy chain antibody

Key words
adalimumab

Aspergillus oryzae, monoclonal antibody, biopharmaceutical,

2Gp02

PDIa4 is responsible for the folding and assembly ofantibody in CHO cell

2Gp04

再構成型無細胞タンパク質合成系を用いた抗体-酵素融合タンパク質(Zipbodyzyme)の効率的合成○Masafumi Yohda1, Kei Komatsu1, Kento Kumon1, Mayuno Arita1,
Masayoshi Onitsuka2, Takeshi Omasa3(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Fac. Eng.,
Tokushima Univ., 3Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)
yohda@cc.tuat.ac.jp○伊藤 玲奈 1, Almasl Alfi 1, 加藤 晃代 2, 兒島 孝明 1, 中野 秀雄 1
（1名大院・生命農学, 2iBody株式会社）hnakano@agr.nagoya-u.ac.jp

Therapeutic monoclonal antibodies are produced by mammalian cells, mostly CHO
cells, because antibody formation requires intra- and inter-chain disulfide bondformation and glycosylation. Folding and assembly of antibody polypeptide chainstake place in the ER. In its oxidative environment, protein disulfide isomerases (PDIs)
catalyze disulfide bonds formation. In the antibody-producing plasma cell, ER is
significantly expanded to meet the high antibody production. Thus, to enhance theantibody production by CHO cell, it seems necessary to improve the folding andassembly system in CHO cells. There exist various PDIs in mammalian cells.
However, it is unknown which PDI is responsible for antibody production. When ER
stress is induced by tunicamycin or thapsigargin, expression-level of pdia4
significantly increased in the antibody-producing CHO cell. Knockdown of pdia4 in
the antibody-producing CHO cell caused significantly affected the production andmaturation of antibody. PDIa4 could assist folding and assembly of the reduced anddenatured antibody in vitro. Therefore, we concluded that PDIa4 takes an essential rolein the folding and assembly in CHO cells.

【背景と目的】 酵素修飾抗体は、ELISA、ウエスタンブロッティング、免疫染
色などのさまざまなアッセイに広く使用されている。抗体は一般に酵素と化学的に結合しているが、このような抗体の化学修飾は、1)抗原結合能を低下させる、２）抗体と酵素の量比が一定でない、などの欠点を有している。遺伝的に酵素を抗体に融合させることで、これらの欠点を克服し、煩雑な修飾実験を省略することができる。当研究室では、遺伝的に酵素をロイシンジッパーが付加された Fab 抗体に融合させた、抗体-酵素融合タンパク質（Zipbodyzyme）を開発した。この二機能性タンパク質は、抗原結合と酵素活性の両方を保持しており、二次抗体を必要とせずに直接 ELISA に適用することが可能であった。本研
究では、この Zipbodyzyme を Fab 抗体のハイスループットスクリーニングに使用することを目的とし、大腸菌再構成系無細胞タンパク質合成系による効率的な合成条件を調べた。
【方法と結果】SKIKm6Fab-LZ-HcNanoLuc はマウス由来抗 E. coli O157 抗体とルシフェラーゼの融合タンパク質にタンパク質発現量を増大させる SKIK ペプチ
ドタグを付加した Zipbodyzyme である。このタンパク質を再構成型無細胞タン
パク質合成キットである PUREfrex を用い、原核生物ジスルフィド結合イソメラーゼである DcbC の種々の濃度条件下において発現させた。二次抗体を用いた ELISA およびルシフェラーゼの発光測定によって Zipbodyzyme の発現量を比較したところ、DsbC の濃度が高いほどその発現量は増加することが明らかとなった。現在、二次抗体を用いずにルシフェラーゼの活性によって抗原抗体反応を検出する One step ELISA に加え、タンパク質中のジスルフィド結合の架替を促進する Protein disulfide-isomerase（PDI）の添加効果を検討中である。

PDIa4 is responsible for the folding and assembly of antibody in CHO cell

Efficient synthesis of antibody-enzyme fusion protein (Zipbodyzyme) byusing PURE system○Masafumi Yohda1, Kei Komatsu1, Kento Kumon1, Mayuno Arita1,
Masayoshi Onitsuka2, Takeshi Omasa3(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Fac. Eng., Tokushima Univ., 3Grad.
Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

antibody, protein folding, disulfide isomerase○Reina Ito1, Alfi Almasl1, Taruyo Kato2, Takaaki Kojima1, Hideo Nakano1(1Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2iBody inc)

Key words

antibody, fusion protein, DsbC, PDI

216

2Gp05

タンパク質生産量を増大させる N 末端 SKIK ペプチド
タグ配列に関する研究

2Gp07○古川 裕貴 1, 加藤 晃代 1,2, 中野 秀雄 1,2（1名大院・生命農学, 2iBody株式会社）hnakano@agr.nagoya-u.ac.jp

リポソームを用いたキンギョ免疫法による scFv 断片の取得

岡﨑 文美 1,3,4, 栗山 風貴子 1, 安達 優華 2, ○田丸 浩 1,3,4（1三重大院・生資, 2三重大・生資, 3三重大・先端科支バイオイ
ンフォ, 4三重大・スマートセルイノベ研）
ytamaru@bio.mie-u.ac.jp【背景と目的】大腸菌や酵母は組換えタンパク質発現のために最もよく用いられているが、発現させたいタンパク質によって難発現である場合がある。当研究グループは、目的タンパク質をコードする遺伝子の開始コドン直後に Ser-LysIle-Lys の 4 つのアミノ酸からなる SKIK ペプチド配列を付加することにより、タンパク質生産量を増大可能であることを発見した。しかし、そのメカニズム
は未だ明らかになっていない。そこで本研究では、N 末端 SKIK ペプチドタグ
付加によるタンパク質生産量増大のメカニズムを解明するため、SKIK ペプチ
ドタグをコードするコドンの影響を調べた。
【方法と結果】ウサギ由来の scFv の開始コドンの直後にコドンパターンの異なる 24 種類の SKIK ペプチドタグ配列を付加し、大腸菌発現プラスミドを構築した。それらのプラスミドを用いて、大腸菌無細胞タンパク質合成系、大腸菌
SHuffle T7 Express 株による IPTG 誘導およびオートインダクションによる 3 つの方法でタンパク質発現を行った。SDS-PAGE 解析の結果、タグ無と比較し、3 つの方法すべてにおいて 24 種類の SKIK ペプチドタグ付きタンパク質の合成
量が増大しており、コドンの違いによる大きな差異は認められなかった。このことから、SKIK ペプチドタグ配列のコドンによる影響はないことが示唆された。今後、未解析のコドンの影響とともに、SKIK を他のアミノ酸配列に置換したときの影響を検討し、開始コドン付近の塩基配列と翻訳産物（アミノ酸配列）がどのようにタンパク質生産量増大に寄与しているのかを解明していく予定である。

【目的】抗体（Immunoglobulin：Ig）は，Ｂ細胞によって産生される糖タンパク質であり，免疫系の中でも獲得免疫において主要な役割を果たす分子である。
また近年，抗体医薬や CAR-T 細胞治療法をはじめ，検査診断薬や分析試薬，基礎生物学の研究ツールなど幅広く利用される必要不可欠な分子である。当研究室では，スイホウガンという眼下に水泡を有するキンギョを免疫動物として，
抗原特異的抗体の産生を行ってきた。本研究では，従来のアジュバントではな
くドラッグデリバリーシステムにも利用されるリポソームを用いた新規免疫法を試みた。
【方法】中性リン脂質ホスファチジルコリン（DOPC）および酸性リン脂質ホス
ファチジルセリン（DOPS）またはホスファチジルグリセロール（DOPG）をそれぞれ DOPC/DOPG ＝１：１および DOPC/DOPS ＝ 1：1 の組成で調製した巨
大リポソーム（GUV）に抗原タンパク質として蛍光タンパク質（EGFP）を封入して，スイホウガンに免疫した。各種の免疫個体から産生された抗体遺伝子の PCR 条件を検討し，キンギョ scFv（single chain Fv）遺伝子ライブラリーを構築した。免疫前後の水泡液から total RNA を抽出し、これを鋳型として goldfish
Immunoglobulin M（gIgM）遺伝子に対する cDNA から scFv 断片を合成し、invitro パッケージングしたファージディスプレイ法を用いて EGFP に対してバイ
オパニングを行った。
【結果】各種の免疫個体から産生された抗体遺伝子の PCR 条件を検討し，キン
ギョ scFv（single chain Fv）遺伝子ライブラリーを構築した。さらに，構築したライブラリーからバイオパニングによって EGFP に対する親和性の高いクローンを選択し，ELISA 法によって最終的に EGFP に対する scFv クローンの取得に成功した。

Study on N-terminal SKIK peptide tag to increase protein production

Aquisition of scFv fragments from goldfish by using liposome-inclusion
antigen○Yuki Furukawa1, Teruyo Ojima-Kato1,2, Nakano Hideo1,2(1Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2iBody Inc.)

Fumiyoshi Okazaki1,3,4, Fukiko Kuriyama1, Yuka Adachi2, ○Tamaru Tamaru1,3,4(1Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ., 2Facult. Bioresour., Mie Univ., 3Mie Univ.
ASRC, 4Mie Univ. SCIC)

Key words

protein expression, translation, peptide tag

Key words

scFv, goldfish, liposime-inclusion antigen, phage display

2Gp06

ヒト免疫グロブリンは T 細胞受容体シグナルを抑制することで T 細胞を直接的に制御する

2Gp08

scFv 型抗体を発現するニワトリ B 細胞株 DT40 の樹立と利用○堀 采音 1, 藤村 孝志 2, 河本 正次 2
（1広島大院・先端物質, 2広島大院・統合生命科学）
d183513@hiroshima-u.ac.jp○岡 知里, 野田 凌太郎, 曲 正樹, 徳光 浩, 金山 直樹（岡山大院・統合科学）
nkanayam@okayama-u.ac.jp【目的】 難治性炎症疾患の治療法として、献血健常者由来の IgG 画分を主成分とする免疫グロブリン製剤 (IVIg) を大量投与する免疫グロブリン療法が行われている。本治療法は著明な治療効果を示すにもかかわらず、その作用機序は未だに謎に包まれている。そこで本研究では、様々な炎症病態において関与が認められる T 細胞に着目し、IVIg 製剤が T 細胞に与える免疫制御機構を解明することを目的とした。
【方法及び結果】マウス由来脾細胞に対する増殖抑制を指標とした IVIg 製剤の免疫抑制効果を検討したところ、本分子が T 細胞賦活剤による T 細胞増殖を抑制することを明らかとした。本抑制作用は T 細胞を精製した条件下でも消失しなかったことから、IVIg 製剤が T 細胞に対して直接的に作用し、その増殖を抑制することが示唆された。そこで次に、制御性 T 細胞 (Treg) の関与を調査する
ため、精製 T 細胞から内在性 Treg を除去した条件下で IVIg 製剤の増殖抑制能を確認するとともに、刺激に伴って出現する誘導性 Treg の存在量を解析した。
その結果、内在性 Treg を除去しても IVIg 製剤の増殖抑制能は保持されたままであり、出現した誘導性 Treg の存在量はコントロール群と有意な差は認められなかった。そこで、IVIg 製剤がエフェクター T 細胞の活性化を直接的に抑制すると推測し、T 細胞受容体 (TCR) シグナルの停止箇所をシグナル分子のリン酸化・分解・核移行を指標に確認した。その結果、IVIg 製剤により TCR シグナ
ルのカルシニューリン/NFAT、Ras-MAPK/AP-1、IKK/NF-κB 経路のいずれも停止していることが明らかになった。以上の結果から、IVIg 製剤は T 細胞の TCR
シグナルを停止させることで、T 細胞の活性化を直接的に抑制することが判明した。本作用は、従来報告されている抗原提示細胞を介した T 細胞活性化抑制とは異なる新規な免疫制御機構である。

我々は、抗原に結合することでその排除を担う抗体に注目し、新規なタンパク
質改変システムを構築することで、既存抗体の機能改良を目指している。本研
究で用いているニワトリ B 細胞株 DT40 は、自身の抗体遺伝子に変異を導入することができ、培養のみで抗体ライブラリを作成することが可能である。これまでに DT40 細胞の抗体遺伝子座を改変し、任意のタンパク質を抗体 Fc 融合タ
ンパク質として発現させ、DT40 細胞の変異能力によって改変する系を構築している。本研究では、低分子化抗体の改良への DT40 細胞の利用を目的とし、一本鎖(scFv)抗体に着目した。ヒトの乳がんマーカーである HER2/neu 抗原に特異的なモノクローナル抗体 (Trastuzumab)を scFv-Fc 融合タンパク質として DT40細胞に発現させることを試みた。Trastuzumab の重鎖可変部(VH)と軽鎖可変部(VL)を VH-VL あるいは VL-VH の順にリンカーで連結した scFv をコードする
DNA を設計し、抗体 Fc 発現型 DT40 細胞の抗体重鎖遺伝子の可変部領域と置換した。樹立した細胞株は、VH-VL および VL-VH いずれの場合も scFv を Fc
融合タンパク質として DT40 細胞表面に発現可能であった。DT40 細胞の変異能
力によって導入した scFv 遺伝子への変異導入頻度を評価したところ、頻度は低
いものの変異導入は可能であることが示された。DT40 細胞において変異頻度の低い標的 DNA への変異頻度向上法についてはこれまでに開発しており、DT40細胞を用いて Trastuzumab scFv への変異導入と HER2/neu 抗原への親和性向上を試みる予定である。

Human immunoglobulin directly regulates T cell proliferation by
suppressing T cell receptor signaling

Establishment of scFv-expressing chicken B cell line

○Ayane Hori1, Takashi Fujimura2, Seiji Kawamoto2(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2Grad. Sch. Integr. Sci. Life,
Hiroshima Univ.)

Key words

intravenous immunoglobulin, T cell, immunosuppression○Oka Chisato, Noda Ryotaro, Magari Masaiki, Tokumitsu Hiroshi,
Kanayama Naoki(Grad. Sch. ISEHS., Okayama Univ.)

Key words

DT40 cells, antibody, somatic hypermutation

217

2Gp09

ニワトリ B 細胞株 DT40 における scFv 型抗体の発現効
率の改善

2Gp11

○野田 凌太郎, 岡 知里, 曲 正樹, 徳光 浩, 金山 直樹（岡山大院・統合科学）
nkanayam@okayama-u.ac.jp

画像解析技術による浮遊系細胞の細胞形態プロファイリ
ング○久田 拓海 1, 藤谷 将也 1, 蟹江 慧 1, 加藤 竜司 1,2（1名大院・創薬, 2名大・ナノライフシステム研究所）
hisada.takumi@k.mbox.nagoya-u.ac.jp

我々は、抗体遺伝子への体細胞突然変異の導入を任意に ON/OFF 制御可能なニワトリ B 細胞株 DT40-SW を用いて、外来抗体や Fc 融合タンパク質を細胞表面に発現させ親和性成熟を行うことに成功している。現在、低分子型抗体として
anti-EGFR mAb (セツキシマブ)と anti-HER2/neu mAb (トラスツズマブ)を scFv 化
して DT40 細胞に発現させ、改良することに試みている。各 scFv をコードする
人工 DNA を設計し、DT40 細胞ゲノム上の抗体遺伝子可変部と置換した細胞を樹立したところ、anti- HER2/neu scFv -Fc 融合タンパク質は細胞表面に発現が確認できたが、anti-EGFR scFv-Fc は細胞表面への発現が確認できなかった。転写産物を解析すると、anti-EGFR scFv をコードする領域をスキップした異常転写産物が多く生成していた。anti-EGFR scFv をコードする人工 DNA 断片には、基となった抗体可変部 germline 配列と比べてアミノ酸の変異を伴わないサイレン
ト変異を 12 ヶ所導入していた。このサイレント変異による Exonic Splicing
Enhancer (ESE)分布の変化を ESEfinder3.0 (1)を用いて解析したところ、5’末端における高スコアの ESE がサイレント変異によって消失していた。Splicing acceptor
近傍の ESE の変異はスプライシング異常の原因となりうることから、anti-EGFR
scFv DNA 断片上のこの ESE の消失により scFv が細胞表面に発現しなかったと推測した。この 5’末端の ESE を保持した人工 scFv をコードする DNA 断片を設計し、anti-EGFR scFv を発現する DT40 細胞株の樹立を試みている。
(1) krainer01.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi?process=home

創薬探索の工程における候補化合物の絞り込みには、様々なスクリーニング手法が用いられる。細胞の表現型の変化に注目したスクリーニング法は「Phenotypebased screening」と呼び、特定の受容体や酵素との相互作用情報に基づく「Targetbased screening」に対して、First-in-class の薬剤開発実績が高いことが知られる。
また、近年注目される複雑な疾患や脳・神経などの疾患のように分子メカニズ
ムが解明されていない疾患に向けた薬剤探索においては、幹細胞研究の進歩とともにヒト細胞の応答性を直接評価する Phenotype-based screening に改めて注目が集まっている。
一般的に、Phenotype-based screening では増殖率や染色や抽出によるマーカー分子のエンドポイント評価が行われている。しかし、これらの方法は破壊的であるため、化合物が細胞に及ぼす経時的な効果の観察や、経時的な応答変化の情報は失われてしまう。また、エンドポイントの評価はコスト的に極めて大きいことも課題の一つとなっている。
我々はこれまで上記課題解決のため、平面培養細胞に対する非破壊的な評価技
術としての細胞画像評価技術を開発しており、化合物スクリーニングにおいて有効であることを報告してきた。本研究では、これらの技術を浮遊系細胞に対して応用し、細胞形態情報解析による薬剤への応答性のスクリーニングの可能性について評価したので、これを報告する。

Improvement of scFv expression efficiency in the chicken B cell line

Morphology-based drug response profiling of suspension cells○Ryotaro Noda, Chisato Oka, Masaki Magari, Hiroshi Tokumitsu,
Naoki Kanayama(Grad. Sch. ISEHS., Okayama Univ.)○Takumi Hisada1, Masaya Fujitani1, Kei Kanie1, Ryuji Kato1,2(1Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2Inst. Nano-Life-Sci., Nagoya Univ.)

Key words

DT40 cells, antibody, somatic hypermutation

Key words
high-throughput screening, Morphological profiling, Drug screening,
Suspension cells

2Gp10

間葉系幹細胞の画像品質判定におけるロバストモデル構
築手法の開発

2Gp12○竹本 悠人 1, 今井 祐太 1, 吉田 啓 1, 蟹江 慧 1, 加藤 竜司 1,2（1名大院・創薬, 2名大・ナノライフシステム研究所）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp

細胞形態情報解析による神経系モデル細胞の薬剤応答プ
ロファイリング○今井 祐太 1, 吉田 啓 1, 蟹江 慧 1, 飯田 円 2, 勝野 雅央 2,
加藤 竜司 1,3
（1名大院・創薬, 2名大院・医学, 3名大・ナノライフシステム研
究所）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp

ヒト細胞は、従来の医薬品では治療不可能であった疾患に対して治療効果が期待される次世代の医薬品である。間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell, MSC）
は、その多分化能の他に、損傷部位修復能や免疫調節能が知られ、他家由来細胞医薬品として各国で承認されるなど、世界的に最も臨床実績のある細胞源である。しかし、生きた細胞そのものが治療効果をもたらす細胞医薬品の製造において、従来の遺伝子解析やマーカーの染色評価など破壊的な評価方法では品質管理を行うことが難しく、現状では熟練者の顕微鏡観察の感覚に依存している。
我々の研究グループは、このような課題解決に向けて、細胞画像から得られる
形態情報を高次元情報として、細胞品質を非破壊的に予測するための機械学習モデルの構築の可能性と有効性を報告してきている。このような細胞品質予測のコンピュータモデルの最終形態は、構築されたモデルが複数の施設で利用できることであるが、ヒト細胞には大きな個体間のバリエーションがあることが知られており、どの程度のデータ量でどれだけロバストなモデルを構築できるかを示した報告や検証例はこれまで無い。
本研究は、複数のロット・メーカーの MSC から得られる細胞形態情報という高次元バイオデータのバリエーションと特徴を解析し、ここから得られる機械
学習モデルの特性やロット間のバイアスについて比較検討することで、いかにロバストな品質評価モデルを構築できるかを検証したのでここに報告する。

近年の細胞培養技術の発展から、様々なヒト細胞が創薬開発の現場で広く応用されるようになってきている。特に創薬探索において、ヒト細胞の表現型に着目したスクリーニング法は、標的などの分子のみに着目したスクリーニング法に比べて First-in-class の医薬品開発成功率が高いとされ、注目を集めている。
このような技術を用いて、神経変性疾患の治療に向け、神経系細胞を用いた神経再生メカニズムの解明や神経細胞の保護機能を有する薬剤の探索のための評
価系の構築が近年進んでいる。
神経系の細胞は培養環境にデリケートであり、集団内のヘテロ性が高く集団全体の分化効率が低い。即ち、細胞集団としての薬剤応答にバラツキが大きく、集団全体のバルク評価結果を用いては薬剤感受性などの評価が難しいという課題がある。また、神経変性疾患の発症時には既に疾患の進行度がすでに大きく進んでいることが多く、治療による改善効果を最大化しにくい点がある。このため、疾患早期の状態に近い細胞評価系の構築が期待されており、少ないポピュ
レーションの変性細胞に対する薬剤効果を検出する技術や、ヘテロ性が高い状
態での神経系細胞の変化や応答を安定に評価する技術に期待が持たれている。
我々の研究グループではこれまで、細胞形態の画像情報処理を大量のライブイ
メージに対して適応することで、容器内に存在する大量の細胞のヘテロ性の定量化や品質評価が可能なことを検証し報告して来ている。本研究では、神経系細胞によく生じる「少数の集団の形態変化」を検出し、モデル系の細胞を識別する画像解析評価方法を検証したのでこれを報告する。このような細胞集団におけるヘテロ性解析は、創薬のための細胞アッセイにとどまらず、神経系細胞の薬剤応答や再生効果の評価に活用できると期待される。

Development of robust model for image-based cell quality evaluation ofmesenchymal stem cells

Drug response profiling of neuronal cells by morphology analysis○Yuto Takemoto1, Yuta Imai1, Kei Yoshida1, Kei Kanie1, Ryuji Kato1,2(1Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2Inst. Nano life syst. Nagoya Univ.)

Key words
robustness

mesenchymal stem cell, Image analysis, cell morphology, Model○Yuta Imai1, Kei Yoshida1, Kei Kanie1, Madoka Iida2, Masahisa Katsuno2,
Ryuji Kato1,3(1Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2Grad. Sch. Medicine. Sci., Nagoya Univ.,
3Inst. Nano-Life-Sci., Nagoya Univ.)

Key words
Drug screening, Phenotypic assay, high-throughput screening,Morphological profiling

218

2Gp13

がん幹細胞モデル miPS-LLCcm の細胞形態の深層学習法による解析

2Gp15

ナノニードルを用いた繰り返し引っ張り試験による中間径フィラメントの可動性解析○杉山 友康 1, 相田 紗織 2, 西迫 栄 1, 笠井 智成 1, 佐藤 淳 1,
亀田 弘之 2
（1東京工科大・応用生物, 2東京工科大・コンピュータサイエンス）
tsugiyama@stf.teu.ac.jp○中村 史 1,2, 須崎 萌 2, 水澤 愛衣 2, 山岸 彩奈 1, 飯嶋 益巳 3,
黒田 俊一 4
（1産総研・バイオメディカル, 2農工大院・工, 3東農大・応生科,
4
阪大・産研）
chikashi-nakamura@aist.go.jp【はじめに】 画像の識別に人工知能（AI）技術を応用する研究が急速に高まっている。AI が細胞形態を識別できれば、極めて有用である。一方我々はがん幹細胞の培養細胞を利用した細胞評価系の構築を行っている。この細胞はマウス
iPS 細胞から樹立された細胞 miPS-LLCcm であり、マウス個体への細胞移植によって悪性腫瘍を形成する点で、正常 miPS 細胞とは全く異なる性質を持つ。
しかし幹細胞に特徴的な nanog 遺伝子の発現が認められ、その発現の消失は細胞形態の大きな変化を伴うことが知られている。そこで本研究は miPS-LLCcmの細胞形態を識別する AI の構築を目的とした。
【方法】 miPS-LLCcm 細胞の培養は論文（PLoS ONE 2012, 7: e33544）に記載の方法に従った。細胞画像は位相差画像と蛍光画像（nanog-GFP レポーター遺伝
子の発現を示す）をペアで取得した。ペアの画像は形式を整えて、深層学習ソ
フトウェアに入力した。深層学習ソフトウェアは論文（2017 IEEE Conference on
Computer Vision and Patrern Recognition ） に 記 載 の Conditional Genearative
Adversarial Nets (CGAN) を実装した pix2pix を使用した。計算用のハードウェア
は DGX-1 を使用した。
【結果と考察】 miPS-LLCcm 細胞はゼラチンでコートしたディッシュで培養した結果、細胞の一部は nanog-GFP レポーター遺伝子の緑色蛍光が失われていた。そこで蛍光を維持した細胞と失った細胞が混在した条件で培養を続け、その位相差細胞画像と蛍光細胞画像のペアを 10,221 セット取得した。次に、位相差細胞画像を見て蛍光細胞画像を予測する深層学習を行った。その結果、計算時間はデータ数に比例した。学習済み AI がテスト用に用意した位相差細胞を見て蛍光細胞画像を予測する精度は、学習のエポック数の影響が少なかった。
現在さらに検討を進めている。

我々は、AFM 探針を直径 200 nm 長さ 10 μm の針状に加工したナノニードルの挿入操作により、生きた細胞を低侵襲に解析する技術を開発してきた。その中で、抗体を修飾したナノニードルを用いて、標的の細胞骨格タンパク質と抗体の結合破断にかかる力を解析することにより、これを検出する技術を開発した。
例えば、中間径フィラメントネスチンが高発現であるがん細胞では転移性が高いことが知られているが、マウス乳がん細胞株においてネスチン発現量の違いを生きたまま半定量的に評価することが可能である。この手法により、ネスチ
ン欠損株の解析を行う中で、我々はナノニードル抜去時のフォースカーブの形
状が大きく異なることに気づき、中間径フィラメントの機械的特性を評価する
新手法を着想するに至った。
ネスチンは単独で繊維形成できず、同じ中間径フィラメントのビメンチンと共重合繊維を形成する。野生株、およびネスチン欠損株に対して、抗ビメンチン
抗体修飾ナノニードルを挿入し、ビメンチン繊維と結合させ、結合を維持した状態で、振幅 2 μm で上下することで、繊維の繰り返し引っ張り試験を行った。
連続 5 回上下したカーブを平均化した上で、ベースラインの交点で引っ張り時のカーブの傾きを評価した結果、ネスチン欠損株では傾きが有意に増大していた。この結果は、①引っ張られた繊維の量が多い、②繊維そのものが固い、③繊維が動きにくい、この 3 つの可能性を示唆する。ニードル抜去時の全結合破断仕事は引っ張った繊維の量を反映する。この値に有意差は無いので、繊維量の違いの可能性は否定される。ネスチンによる繊維そのものの柔軟化の可能性は現時点で否定されないが、ネスチンによりビメンチン−アクチン結合が阻害されるという別に実験結果から、傾きの違いはビメンチン繊維の可動性を反映すると考えている。

Analysis of miPS-LLCcm, a model of cancer stem cell, morphology using
deep-learning of cell images

Analysis of mobility of intermediate filament by repeated tensile test using
antibody-functionalized nanoneedle○Tomoyasu Sugiyama1, Saori Aida2, Sakae Nishisako1, Tomonari Kasai1,
Atsushi Sato1, Hiroyuki Kameda2(1Sch. Biosci. Biotech., Tokyo Univ. Tech., 2Sch. Comp. Sci., Tokyo Univ. Tech.)○Chikashi Nakamura1,2, Moe Susaki2, Mei Mizausawa2, Ayana Yamagishi1,
Masumi Iijima3, Shun'ichi Kuroda4(1Biomed. Res. Inst., AIST, 2Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 3Fac.
Appl. Biosci., Tokyo Univ. Agric., 4Inst. Sci. Ind. Res., Osaka Univ.)

Key words
cells

cell morphology, artificial intelligence, cancer stem cell, miPS-LLCcm

Key words

intermediate filament, nestin, nanoneedle, AFM

2Gp14

がんの悪性度に関与するネスチンのテール領域とアクチ
ン繊維の相互作用解析

2Gp16

高転移性マウス乳がん細胞の浸潤機構に関わる塩素イオ
ンチャネル Clic1 の機能解析○水澤 愛衣 1, 須崎 萌 1, 山岸 彩奈 2, 長崎 晃 2, 貴嶋 紗久 3,
上田 太郎 4, 中村 史 1,2（1農工大院・工, 2産総研・バイオメディカル, 3産総研・生物プ
ロセス, 4早大院・先進理工）chikashi-nakamura@aist.go.jp○山岸 彩奈 1, 伊藤 文恵 2, 金 賢徹 1,3, 中村 史 1,3（1産総研・バイオメディカル, 2農工大, 3農工大院・工）chikashi-nakamura@aist.go.jp

中間径フィラメントの一種であるネスチンは、近年、悪性度の高いがん細胞で高発現であることが報告されている。我々は、マウス乳がん細胞株 FP10SC2 を用いてがん悪性度に対するネスチンの構造的機序について調査を行ってきた。
ネスチンは 170 kDa もの巨大なテール領域を持ち、単独で繊維形成出来ないた
め、FP10SC2 ではビメンチンと共重合している。ビメンチンはテール領域でア
クチン繊維と結合することが報告されており、繊維タンパク質間の結合により細胞骨格の安定なネットワーク構造が形成されると考えられている。我々は、
FP10SC2 においてビメンチン−アクチン結合を確認しており、ネスチン遺伝子
破壊によりその結合点が増加し、細胞弾性が上昇することを見出している。この結果より、我々は、ネスチンの巨大なテール領域は立体障害によりビメンチ
ン−アクチン結合を阻害し、細胞を柔軟化することでがんの浸潤性に寄与すると考えているが、一方でネスチン自身もアクチン繊維に結合する可能性が示唆されており、単に柔軟化するのみではなく、そのテール領域には何らかの機能を有した構造が潜んでいるものと推察している。
そこで本研究では、ネスチンテール領域とアクチン繊維の結合に関するさらなる調査を行った。ネスチンテール領域（NTD）を 4 分割し、N 末端側に GFP を融合したタンパク質を作製した。4 分割したタンパク質を N 末端側からそれぞれ Q1NTD, Q2NTD, Q3NTD, Q4NTD とした。APTES でシラン化修飾したガラス
基板にローダミンファロイジン染色アクチン繊維を吸着させ、Q1〜4NTD をそれぞれ添加し、結合の様子を観察した。蛍光顕微鏡で観察した結果、Q4NTD
がアクチン繊維と共局在している様子が確認された。このことから、ネスチン
テール領域の最も C 末端側のドメイン 352 残基が、アクチン繊維と相互作用することが明らかとなった。

塩素チャネルは細胞膨張時に塩素イオンの排出を行うことで細胞内浸透圧を減少させ、調節性容積減少(Regulatory Volume Decrease; RVD)機構を誘導する。これまでに、高転移性マウス乳がん細胞 FP10SC2 (SC2)と中間径フィラメントネ
スチンのノックアウトにより浸潤性が低下した変異株(KO)における塩素チャネ
ルの mRNA 発現量を解析したところ、Clic1 (Chloride intracellular channel protein1)の発現量が KO 株において顕著に減少していることが明らかになった。Clic1はがん細胞の浸潤能に寄与することが示唆されているが、その詳細な機能は不明である。そこで本研究では、SC2 株及び KO 株を用いて Clic1 発現量及び塩
素イオン排出能の評価を行い、がん細胞の浸潤性と Clic1 の関係について調査した。
SC2 株はマウス乳がん細胞 4T1E 株から獲得した高転移性の細胞株である。そこで 4T1E、SC2、及び KO 株の Clic1 発現量をウェスタンブロットにより評価したところ、浸潤性の低い 4T1E 及び KO 株と比較して SC2 株における Clic1
発現量が高いことが確認され、Clic1 発現量とがん細胞の浸潤性に相関があることが示唆された。次に、ハロゲンイオンの結合で消光する蛍光タンパク質 YFPを細胞で発現させ、塩素イオン排出能の評価に用いた。あらかじめヨウ素イオ
ンを細胞内に取り込ませ、YFP 由来の蛍光強度が減少した細胞を低張条件下に置いた結果、SC2 株では YFP の蛍光回復が認められた。一方、KO 株では蛍光の回復が確認されなかったことから、SC2 株では KO 株と比較して塩素イオン
排出能が高いことが見出された。がん細胞の転移過程では、細胞や組織の小さな隙間を通過する際に細胞が圧縮され内圧が上昇することで移動が阻害されると考えられるが、Clic1 は塩素イオンを細胞外に排出することで狭窄された細胞の膨張を緩和し、浸潤を促進する機能を有すると推察している。

Analysis of interaction between actin filament and tail domain of nestin
attributed to cancer malignancy

Functional analysis of chloride intracellular channel protein 1 which is
involved in invasion mechanism of highly metastatic mouse breast cancer
cell○Mei Mizusawa1, Moe Susaki1, Ayana Yamagishi2, Akira Nagasaki2, Saku Kijima3,
Taro Uyeda4, Chikashi Nakamura1,2(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Biomed. Res. Inst., AIST, 3BPRI,
AIST, 4Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words

intermediate filament, nestin, actin, protein interaction○Yamagishi Ayana1, Ito Fumie2, Kim Hyonchol1,3, Nakamura Chikashi1,3(1Biomed. Res. Inst., AIST, 2Tokyo Univ. Agric. Technol., 3Grad. Sch. Eng., Tokyo
Univ. Agric. Technol.)Key words

chrolide ion, chrolide channel, cancer cell, invasion

219

2Hp01

醸造酵母からの異数性染色体株の新規選抜手法の開発○草場 裕貴 1, 山本 裕貴 1, 野口 英樹 2, 豊田 敦 2, 北垣 浩志 1
（1佐賀大・農, 2遺伝研）
ktgkhrs@cc.saga-u.ac.jp

2Hp03

出芽酵母における GID 複合体遺伝子の変異がリンゴ酸
生成とタンパク質発現に与える影響○根来 宏明 1, 松村 憲吾 1, 松田 史生 2, 清水 浩 2, 秦 洋二 1,
石田 博樹 1
（1月桂冠・総研, 2阪大院・情報）
negoro@gekkeikan.co.jp【背景・目的】醸造酵母の一部は異数性染色体を持つことが近年世界中で報告されているが、その意義は解明されてこなかった。これに対し我々は醸造酵母の染色体の異数性がその醸造特性を支配することを初めて明らかにした 1)。この知見は遺伝子組換え技術を使わずに染色体を操作できる技術の開発につながるが、異数性染色体を持つ醸造酵母の選抜手法についてはこれまで報告されていない。そこで本研究では、効率的に異数性染色体株を選抜する手法の開発を試みた。
【方法】正倍数体である焼酎酵母(S-3)を微小管重合阻害剤である nocodazole 含
有の YPD 培地で 4 時間振盪培養し、染色体の不分離を誘導した。次にミトコン
ドリア活性を反映する TTC(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride)染色を行い、ミトコンドリア活性が向上したと考えられる株を選抜した。選抜した株は生育速度調査により生育速度が低い株を選抜した。核型解析にはリアルタイム PCR を用いた。
【結果】nocodazole 処理した S-3(3000cells)に対して TTC 染色と生育速度調査による選抜を行い、核型解析した結果、6.7×10-4cells の頻度で異数体を確認した。
続いて nocodazole 処理した S-3(5000cells)に対して同条件で実験を行ったところ、1.4×10-3cells の頻度で異数体を確認した。実験室酵母の異数体出現頻度は
2.0×10-5cells であることから 2)、本手法を用いれば効率的に異数性染色体株を選抜できることがわかった。また獲得した 9 株の異数体のうち 5 株は 9 番、12 番の染色体のいずれかに異数性を示した。現在、獲得した異数体の醸造特性を調査している。この新たな手法により異数性染色体を持った醸造酵母を効率よく取得できるようになった。
1)Kadowaki et al., Appl. Environ. Microbiol., 83(24) (2017)2)Hartwell et al., Yeast, 1:28-38 (1982)【背景・目的】 清酒中のリンゴ酸は呈味に寄与する成分であり、様々なリンゴ
酸高生産酵母が育種されている。我々は取得したリンゴ酸高生産酵母の解析を行った結果、GID4（alias VID24）の変異が高生産をもたらす要因であることを報告した 1)。Gid4p はグルコースの存在に応答して糖新生酵素を分解する GID複合体の構成要素であることが知られている 2)。一方、GID4 変異株がどのようにリンゴ酸高生産能を獲得するのか不明な点が多い。今回 GID4 変異株が高生産となる機構の解析を行った。さらに各種 GID 欠損株を用い、GID 複合体がリンゴ酸生産およびタンパク質発現に与える影響を評価した。
【方法・結果】 GID4 野生株および変異株を宿主として、糖新生酵素の欠損株を作製しリンゴ酸生成能を調べると、MDH2 の関与が推察された。Gid4p が糖新生酵素を分解に導く際には、N 末端側プロリンを認識するとされる 2)。Mdh2pの N 末端プロリンを変異させると、GID4 野生株でも変異株と同程度のリンゴ酸生成能を示したため、GID4 変異株は Mdh2p を細胞内に蓄積することでリンゴ酸高生産になったと考えられた。GID4 野生株および欠損株のターゲットプ
ロテオームを行うと、変異株で Mdh2p の蓄積が確認されたと同時に、他の中心代謝酵素についても発現強度の変動が見られた。次に、各種 GID 欠損株（gid1〜9Δ）について培養上清の代謝物測定と、細胞内のターゲットプロテオームを行った。gid1, 2, 3, 4, 5, 8, 9Δ は対照株よりリンゴ酸生産能が高く、エタノール
生産が低かった。これらの株ではグルコースをピルビン酸まで代謝する解糖系
酵素が亢進している一方で、ピルビン酸をエタノールへ変換する経路の酵素発現強度が低く、代謝物生成の変化を反映していると考えられた。
1) H. Negoro et al., J. Biosci. Bioeng., 121, 665 (2016)2) S. J. Chen et al., Science, 355, 6232 (2017)

Development of a new screening method of aneuploids from brewer's yeast

Effects of mutations of GID protein-coding genes on malate production andenzyme expression profiles in Saccharomyces cerevisiae○Yuki Kusaba1, Yuki Yamamoto1, Hideki Noguchi2, Toyoda Atushi2,
Kitagaki Hiroshi1(1Fac. Agric., Saga Univ., 2NIG)○Hiroaki Negoro1, Kengo Matsumura1, Fumio Matsuda2, Hiroshi Shimizu2,
Yoji Hata1, Hiroki Ishida1(1Res. Inst., Gekkeikan Sake Co., Ltd., 2Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, aneuploidy, nocodazole, TTC staining

Key words

GID complex, malic acid, Saccharomyces cerevisiae, proteome2Hp02

酵母の染色体異数性が清酒醸造に与える影響と酵母育
種への応用

2Hp04

清酒酵母の変異処理によるリンゴ酸高生産株の育種と醸
造特性評価○堀田 夏紀 1, 小高 敦史 1, 松村 憲吾 1, 杉山 峰崇 2, 笹野 佑 3,
原島 俊 3, 秦 洋二 1, 石田 博樹 1
（1月桂冠・総研, 2阪大院・工, 3崇城大・生物生命）
hotta@gekkeikan.co.jp【背景・目的】ゲノム工学技術は、個々の遺伝子に着目し組換え操作を繰り返す
従来の遺伝子工学による育種技術とは異なり、ゲノムスケールで多数の遺伝子を一挙に操作することが可能である。染色体操作技術のひとつに、出芽酵母を
対 象 と し た 、 任 意 の 染 色 体 領 域 を 重 複 で き る PCR-mediated chromosome
duplication (PCDup) 法がある 1)。染色体の異数性や部分異数性によってそのコ
ピー数が変化することで表現型が変化することが知られていることから、PCDup法により作製された染色体部分重複株を用いて部分異数性と有用形質の関係について研究が進められている。そこで今回、染色体の部分異数性が清酒醸造にどのような影響を与えるのか明らかにするため、この染色体部分重複株を用いて清酒醸造試験を行った。さらに、異数性に着目して酵母育種を行った結果を報告する。
【方法・結果】実験室酵母 BY4742 を親株とし、16 本の染色体を 100〜200 kb 毎に重複させた染色体部分重複株 50 株を、総米 50 g の清酒醸造試験に供した。
上槽酒を分析したところ、2 番染色体の右腕部分を重複させた株でリンゴ酸が低生産になっていた。次に、エチルメタンスルホン酸で処理した清酒酵母から、シクロヘキシミド(CHX) に耐性を示す変異株を選抜した。CHX はタンパク質合成阻害剤であり、CHX を用いた有機酸組成が変化した株や異数体株の取得法が報告されている。変異株を用いて清酒醸造試験を行ったところ、リンゴ酸が低生産となっている株が得られた。また、異数性を解析した結果、リンゴ酸が低生産となっていた株は 2 番染色体が増加していた。以上の結果より、2 番染色体の異数性がリンゴ酸の生産性に影響を与えることが示唆された。また、異数
性を変化させるという育種方法を用いて、リンゴ酸低生産酵母を取得できる可能性が示された。

○馬場 嵩一朗 1, 澤田 和敬 2, 永野 幸生 1,3, 木村 圭 1,4,
玉置 尚徳 1,5, 後藤 正利 1,4, 小林 元太 1,4（1鹿児島大院・連農, 2佐賀県工技セ, 3佐大・分析セ, 4佐賀大・農, 5鹿児島大・農）gentak@cc.saga-u.ac.jp

1)W.Natesuntorn et al., Sci. Rep., 5, 12510 (2015)【背景・目的】佐賀大学では清酒『悠々知酔』を県内の酒蔵と共同で醸造している。本研究では、悠々知酔の酒質の幅を広げるために有明海から分離した清酒
酵母の育種改良を行い、良好な酸味を呈するリンゴ酸を高生産する株の取得を目的とした。さらに比較ゲノム解析によりリンゴ酸の高生産能獲得に関与する
原因変異遺伝子の特定を試みた。
【方法および結果】有明海干潟から 5 株の Saccharomyces cerevisiae を分離した。
小仕込試験と製成酒の成分分析の結果、5 株とも発酵経過は良好であったが悠々
知酔酵母 Y52 株よりもリンゴ酸生産量が低かった。分離株のうち官能的に評価が高かった H3-1 株を親株とし、変異剤 EMS により変異を誘発した。得られた6000 の変異株からコハク酸ジメチル感受性株（DMSS）を 236 株取得し、麹エ
キスで発酵試験を行った。その結果、親株の 2 倍以上のリンゴ酸を生成する 11株の中から総有機酸生成を指標に 5 株を選抜した。小仕込試験の結果、いずれの 株 も 親 株 の 3 倍 以 上 の リ ン ゴ 酸 を 生 成 し て お り 、 特 に DMSS233 株 とDMSS167 株のリンゴ酸生成能が高かった。総米 1kg にスケールアップした小仕込試験の結果、DMSS167 株はリンゴ酸生産量が多く、官能的な評価も高かった。さらに、分離株 H3-1 のドラフトゲノムを MinION と HiSeq を併用して決定した。決定したドラフトゲノムを参照ゲノムとし DMSS233 株と DMSS167 株に対して比較ゲノム解析を行った結果、DMSS233 株と DMSS167 株の CDS に導入された変異点をそれぞれ 510 カ所と 429 カ所同定した。これらのうち、リンゴ酸生産に関与する可能性があり、塩基置換によりアミノ酸の性質が大きく変化した 25 の変異遺伝子を選抜した。今後は、リンゴ酸高生産変異株由来の一倍体を取得し、リンゴ酸高生産能を維持した一倍体に共通する変異遺伝子を同定することで、リンゴ酸高生産能獲得に関与する原因遺伝子の特定を試みる。

Effect of yeast chromosomal aneuploidy on sake brewing and its application
to sake yeast breeding

Breeding of malate hyperproducing mutants from isolated sake yeasts andevaluation of the brewing characteristics.

○Natsuki Hotta1, Atsushi Kotaka1, Kengo Matsumura1, Minetaka Sugiyama2,
Yu Sasano3, Satoshi Harashima3, Yoji Hata1, Hiroki Ishida1(1Res. Inst., Gekkeikan Sake Co., Ltd., 2Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 3Fac.
Biotechnol. Life Sci., Sojo Univ.)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, aneuploid, sake, cycloheximide○Shuichiro Baba1, Kazutaka Sawada2, Yukio Nagano1,3, Kei Kimura1,4,
Hisanori Tamaki1,5, Masatoshi Goto1,4, Genta Kobayashi1,4(1United Grad. Sch. Agric. Sci., Kagoshima Univ., 2Ind. Technol., Cen. Saga., 3Cen.
Ana., Saga Univ., 4Fac. Agric., Saga Univ., 5Fac. Agric., Kagoshima Univ.)

Key words

sake yeast, breeding, malic acid, NGS analysis

220

2Hp05

酵母において TTC 染色性に影響を及ぼす因子の探索○田中 純平 1, 高須 耀子 1, 山元 翔太 1, 久保田 恵理 2, 兼崎 友 2,
門倉 利守 1, 鈴木 健一朗 1, 中山 俊一 1（1東農大・応生科, 2東農大・ゲノムセ）
s3nakaya@nodai.ac.jp

2Hp07

ホップに含まれるアデノシン分解活性の発見とビール醸造への応用可能性○太田 拓 1, 土屋 友理 1, 杉山 巧 2, 太田 惣介 1, 加藤 優 1,
今井 健夫 3, 稲留 弘乃 1
（1キリンホールディングス（株）酒類技術研究所, 2キリンビー
ル（株）名古屋工場, 3キリンホールディングス（株）ものづ
くり人材開発センター）
Hironori_Inadome@kirin.co.jp【背景・目的】2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride（TTC）染色試験とは、還元されることで赤色を呈する化合物 TTC を用いて生体活性を測定する簡便な方法であり、醸造分野においては主に酵母の識別で用いられている。清酒醸造においては、清酒酵母は TTC 染色性を示し野生酵母は示さないことから、清酒醪の品
質管理に重用されている。しかし、その有用性に反し酵母においてどの様な遺伝子が TTC 染色性に影響するかは明らかになっていない。そこで、本研究では酵母の遺伝子を破壊することで TTC 染色性に関与する遺伝子を探索した。
【結果】TTC 染色性を示さないウラシル要求性実験室酵母 BY4741 にウラシル
生合成遺伝子 URA3 を導入した株 BY4741U は TTC 染色性を示すようになった。
この BY4741U を親株として電子伝達系の Complex III や IV を破壊すると TTC
染色性が低下すること、各破壊株の Complex III と IV の酵素活性の測定結果から、TTC は電子伝達系の Complex IV において還元され、Complex III も TTC 染
色性に関与していることを明らかにした。また、実験室酵母 BY4743 と BY4743U（URA3 相補株）について RNA-Seq 法により網羅的転写解析を行ったところ、ミトコンドリアのピルビン酸トランスポーター遺伝子群の転写量が増加していた。BY4741U を親株としてこれらの遺伝子を破壊したところ、JEN1 と MPC2の破壊株において TTC 染色性が低下したことから、電子伝達系に至る代謝経路を破壊することでも TTC 染色性は失われることが示された。さらに、各破壊株の生育能やグルコース消費能およびエタノール生成能を YM10 培地にて比較したところ親株との差異が見られなかったことから、TTC 染色性を示さなくても生育能や発酵能は維持されることが示唆された。

【背景・目的】プリン体とは、細胞中の核酸を構成する成分の一つで、様々な食品に含まれている。プリン体が肝臓で分解されると尿酸がつくられるが、尿酸が一定の濃度以上になると血中で結晶化し体に悪影響を及ぼすことがある。これまでにビー
ル類のプリン体オフを商品化しているが、現製法では香味の幅が限定されることから、新たなプリン体低減方法の開発が望まれていた。発酵前の麦汁に含まれるプリン体成分は、アデニン等のプリン塩基や、アデノシン・グアノシン等のプリンヌクレオシドがある。麦汁中のアデニンは発酵中にビール酵母によって消費されるが、ビール酵母はアデノシン・グアノシンを資化できないため製品に残存する。そこで、本研究では新たなプリンヌクレオシド低減法を開発することを目的とした。

The disruption of genes encoding pyruvate transporter leads to decrease of
TTC staining ability in yeast

Discovery of adenosine degradation activity contained in hops and its
application to brewing○Jumpei Tanaka1, Yoko Takasu1, Shota Yamamoto1, Eri Kubota2, Yu Kanesaki2,
Toshimori Kadokura1, Kenichiro Suzuki1, Syunichi Nakayama1(1Fac. Appl. Biosci., Tokyo Univ. Agric., 2Genome Res. Center, Tokyo Univ. Agric.)

Key words
Saccharomyces cerevisiae, TTC staining, pyruvate transporter,
mitochondria

2Hp06

転写因子 RDS2 が清酒酵母と実験室酵母の発酵能に及ぼす影響○大木 尭之, 桑山 翔一, 田中 純平, 門倉 利守, 鈴木 健一朗,
中山 俊一
（東農大院・農）s3nakaya@nodai.ac.jp【結果・考察】低減方法の手がかりを得るため、市販製品のプリン体成分を分析したところ、
非加熱のホップを発酵液中に浸漬させる製法の商品において、アデノシンが低い傾向があることを見出した。そこで、ホップにアデノシンを分解する作用があるとの仮説を立て、麦汁へホップペレットを添加し、プリン体成分を分析したところ、アデノシンが完全に分解され、アデニンの生成が見られた。この分解は、ホップペレットを熱処理すると観察されなくなったことから、ホップに含まれる酵素の作用と考えられた。一方、グアノシンは熱処理の有無に関わらず変化は見られなかった。以上より、ホップにはアデノシン分解活性が含まれ、非加熱のホップを麦汁に処理することで、アデノシンをアデニンに分解できる
ことが明らかとなった。発酵工程でアデニンをビール酵母に消費させることでプリン体を低減できるため、プリン体オフビールの新たな製法への応用が期待される。

○Taku Ota1, Yuri Tsuchiya1, Takumi Sugiyama2, Sosuke Ota1, Masaru Kato1,
Takeo Imai3, Hironori Inadome1(1Res. Lab. for Alcoholic Beverage Technol., Kirin Holdings. Co. Ltd., 2Kirin
Brewery Nagoya, Kirin Brewery Co. Ltd., 3Technical Talent Development Center,
Kirin Holdings. Co. Ltd.)Key words
purine body, hop, brewing, enzyme

2Hp08

ホップのアデノシン分解活性を活用したプリン体オフのビール系飲料の開発○土屋 友理 1, 太田 拓 1, 羽場 清人 2, 杉山 巧 3, 加藤 優 1,
今井 健夫 4, 稲留 弘乃 1
（1キリンホールディングス(株)酒類技術研究所, 2キリンビール(株)商品開発研究所, 3キリンビール(株)名古屋工場, 4キリン
ホールディングス(株)ものづくり人材開発センター）
Hironori_Inadome@kirin.co.jp【目的】清酒醸造に用いられる清酒酵母は、低温生育能やアルコール発酵能など
において他の醸造用酵母とは異なる性質を有することが知られており、これら清酒酵母を特徴付ける多くの遺伝子が報告されている。先の研究により、転写因子に着目し核タンパク質を比較したところ糖新生などを制御する RDS2 の発現量が清酒酵母においては実験室酵母に比べ 34 倍高いことが明らかとなった。
そこで本研究では清酒酵母と実験室酵母において RDS2 遺伝子を破壊し RDS2が生育能や発酵能に与える影響を調べた。
【方法・結果】清酒酵母 K701 由来の一倍体 H3(MAT alpha)と H12(MAT a)、実験
室酵母の一倍体である BY4741 と BY4742 に URA3 遺伝子を導入した BY4741Uと BY4742U においてオーレオバシジン耐性遺伝子を用いた相同組換えによりそれぞれ RDS2 遺伝子破壊株を取得した後、接合により二倍体 RDS2 遺伝子破壊株を取得した。また、コントロール株として K701 と BY4743U にそれぞれ
オーレオバシジン耐性遺伝子を挿入したプラスミドを導入した株を用いた。
RDS2 破壊株とコントロール株それぞれをグルコース 10％を炭素源とする YM10培地にて 30℃にて培養したところ、清酒酵母の RDS2 破壊株はコントロール株と比較して生育能が低下したが、実験室酵母の RDS2 破壊株は生育に変化はみられなかった。清酒酵母の RDS2 破壊株はコントロール株と比較して有機酸生
成量に変化がみられたが実験室酵母においては変化がみられなかった。これらの事より RDS2 は清酒酵母の生育や発酵に関与しているが、実験室酵母においては関与していないことが示唆された。

【背景、目的】
我々はこれまでに、プリン体の含量が少ない原料を選抜し、酵母によるプリン体生成を抑える発酵法を用いることで、プリン体オフのビール系飲料を開発し商品化してきた。本開発では、ホップがアデノシン分解活性を持ち、麦汁やビー
ル中のアデノシンをアデニンに分解できることを新たに発見したことを受けて、ホップを活用したプリン体オフのビール系飲料の製造方法の開発を行うことを目的とした。

The effect of RDS2 on a fermentation ability in sake and laboratory yeasts

Development of purine-off low malt beer utilizing hop's adenosine
degradation activity.

○Takayuki Ohki, Syoichi Kuwayama, Jumpei Tanaka, Toshimori Kadokura,
Kenichiro Suzuki, Syunichi Nakayama(Grad. Sch. Agric., Tokyo Univ. Agric.)

Key words

sake yeast, Saccharomyces cerevisiae, RDS2, organic acid

【方法・結果】
ホップのアデノシン分解活性を活用して、プリン体を低減したビール系飲料を製造する方法の検証を行った。製造設備の制約により、ホップを麦汁の糖化工程より前に添加することが難しいため、発酵開始時にホップを添加する方法を検討した。その結果、麦汁に含まれる非資化性のアデノシンが資化性のアデニンに変換され、酵母によりアデニンが資化されることによって発酵液のプリン体を低減できることが明らかになった。このアデノシン分解効果は、煮沸したホップを用いると認められなかったことから、ホップに由来する酵素の活性によるものと示唆された。ホップを発酵開始時に添加する方法は、ミルセン等のホップの樹脂様の香りを低減し、リナロール等の華やかな香りを付与できる製法であり、苦味を抑えて華やかなホップ香気を付与することができる。本製法
をプリン体オフのビール系飲料の製造に応用することにより、プリン体を低減しつつ、ホップ由来の香味の優れたビール系飲料を製造する新たな技術を確立することができた。
○Yuri Tsuchiya1, Taku Ota1, Kiyoto Haba2, Takumi Sugiyama3, Masaru Kato1,
Takeo Imai4, Hironori Inadome1(1Research Laboratories for Alcoholic Beverage Technologies, Kirin Holdings Co.,
Ltd., 2Laboratory for New Product Development, Kirin Brewery Co., Ltd., 3Kirin
Brewery Nagoya, Kirin Brewery Co., Ltd., 4Technical Talent Development Center,
Kirin Holdings Co., Ltd.)Key words
purine, hop, beer brewing

221

2Hp09

革新的醸造・分析技術が示す次世代酒米で醸成した清酒
の風味

2Hp11

○小林 拓嗣 1, 岩橋 佑真 2, 小松 夕子 1, 熊崎 努 1, 水上 留以 1,
児玉 詩織 1, 劉 利雲 1, 上垣内 宏司 1, 包 紅彬 1, 大作 理文 1,
齊藤 亮太 1, 矢澤 彌 1, 髙橋 正之 1, 織田 健 1, 奥田 将生 1,
田中 淳也 3, 有馬 秀幸 3, 清野 珠美 4, 廣岡 青央 4, 岩下 和裕 1,2（1酒総研, 2広島大院・統合生命科学, 3山口県産技セ, 4京産技研）
iwashitact@nrib.go.jp

清酒酵母における老香を発生させにくい変異株の育種○槇本 純 1, 井上 豊久 1, 池田 優理子 2, 神田 涼子 2, 磯谷 敦子 2,
藤井 力 2, 中江 貴司 1
（1日本盛, 2酒総研）
jun.makimoto@nihonsakari.co.jp【背景と目的】 我々は、次世代酒米（兵庫錦、Hyogo Sake 85、石川酒 68 号、夢ささら、祝、京の輝き）と山田錦について、小仕込みや試験醸造酒の高度な分析と比較解析を行ってきた。本発表では、試験醸造酒の各種分析値から官能評
価得点を予測するモデルの構築とその応用について報告する。
【方法】 H29BY 次世代酒米及び山田錦を用いて、小仕込み試験（精米歩合 70%
及び 50%）と各府県製造場及び酒総研にて試験醸造を行った。製成酒は、一般
成分・香気成分と味覚センサーを用いた分析、ターゲット・ノンターゲットメ
タボローム分析を行った。さらに、試験醸造酒については、定量的記述分析法（QDA 法）による官能評価を行った。これらのデータにより orthogonal projections
to latent structures (OPLS) 回帰分析を行い、各官能評価項目に対する分析値からの予測モデルを構築した。
【結果】 試験醸造酒の官能評価得点の予測値と実測値を比較したところ、「カプ
ロン酸エチル：R2 = 0.72」や「甘味：R2 = 0.81」、「渋・刺激味：R2 = 0.61」など
13 項目中 11 項目において R2 > 0.6 でモデル化できた。このモデルを用いること
で、各種分析値から次世代酒米で醸成した清酒の風味を表現可能であることが示された。加えて、OPLS 回帰以外にもサポートベクターマシン回帰など他の機械学習手法についても検討を行った。また、一般に、小仕込みによる清酒は官能評価も難しく、酒造技術者に製成酒の特徴を分かりやすく伝えることが難しい。そこで、本モデルを小仕込みに応用した例についても紹介する。
本研究は、農研機構生研支援センター「革新的技術開発・緊急展開事業（うち地域戦略プロジェクト）」の支援を受けて実施した。

老香は清酒の貯蔵劣化臭であり、その主成分はジメチルトリスルフィド(DMTS)である。磯谷らは清酒における DMTS の主要な前駆物質として 1,2-dihydroxy-5(methylsulfinyl) pentan-3-one (DMTS-P1)を同定し 1)、酵母のメチオニン再生経路の遺伝子である MRI1, MDE1 のいずれかを破壊した株を用いることで清酒中のDMTS-P1 及び DMTS 生成ポテンシャル（清酒を 70℃で 7 日間貯蔵後の DMTS量）が顕著に減少することを明らかにした 2)。これまでに我々は mri1, mde1 変
異株のスクリーニング方法を確立し、清酒酵母協会 701 号(K701)の一倍体からDMTS-P1 生産能の低い mri1, mde1 変異株を各１株ずつ取得している 3）。さらに、mde1 変異株については、戻し交雑により、mde1 ホモ変異型の交雑株を取得した 4）。
今回は、発酵能の良い mri1 変異株の取得を目的とし、戻し交雑によって mri1
ホモ変異型二倍体株の取得を試みた。 その結果、5 株のホモ変異型の交雑株を取得し、これらについて清酒小仕込試験を実施したところ、K701 と遜色のない清酒が得られた。 製成酒の DMTS-P1 濃度、DMTS 生成ポテンシャルは対照のK701 の製成酒と比べて顕著に低かった。さらに、取得した株の中で小仕込結果の良好であった 1 株を用いて全ゲノムシーケンスを実施し、MRI1 以外に FAS2,
ARO9, KGD1 などいくつかの遺伝子にホモ接合型の変異が生じていることがわ
かった。

Progressive brewing and analytical techniques reveal flavor of sake madefrom next generation sake rice

Cross breeding of sake yeast mutants which resist generating thedeterioration○Takuji Kobayashi , Yuma Iwahashi , Yuko Komatsu , Tsutomu Kumazaki ,Rui Minakami1, Shiori Kodama1, Liyun Liu1, Hiroshi Kamigakiuchi1, Hongbin Bou1,
Tadafumi Ohsaku1, Ryota Saito1, Hisashi Yazawa1, Masayuki Takahashi1, Ken Oda1,
Masaki Okuda1, Junya Tanaka3, Hideyuki Arima3, Tamami Kiyono4,
Kiyoo Hirooka4, Kazuhiro Iwashita1,2(1NRIB, 2Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 3Yamaguchi prefectural
Industrial Technol. Inst., 4KITC)
Key words
next generation sake rice, metabolome, sensory analysis, machinelearning
1

2Hp10

2

1

1

協会系酵母と系統の異なる清酒酵母に見られる葉酸の高蓄積とそれを維持する機構

1)磯谷ら, 日本醸造協会誌, 104(12), 919 (2009)2) Wakabayashi et al., J. Biosci. Bioeng., 116, 475 (2013)3)若林ら, 日本農芸化学会 2017 年度大会, 講演番号 3C23a07
4)若林ら, 第 69 回生物工学会大会, 講演番号 4P-H086○Jun Makimoto1, Toyohisa Inoue1, Yuriko Ikeda2, Ryoko Kanda2, Atsuko Isogai2,
Tsutomu Fujii2, Takashi Nakae1(1Nihonsakari Co.,Ltd., 2NRIB)

Key words

dimethy trisulfide, hineka, sake yeast, mutant

2Hp12

老香前駆体低生産性酵母からの自然突然変異カプロン
酸エチル高生産性株の取得○柴田 裕介 1, 山田 翼 1, 藤井 力 2,3, 赤尾 健 2, 五島 徹也 2,
高橋 俊成 1, 田中 伸哉 1
（1菊正宗酒造, 2酒総研, 3福島大）
y-shibata@kikumasamune.co.jp○池田 優理子 1, 神田 涼子 1, 磯谷 敦子 1, 藤井 力 1, 井上 豊久 2,
中江 貴司 2
（1酒総研, 2日本盛）isogai@nrib.go.jp【目的】全国の清酒粕の成分分析の結果、協会系酵母と系統が異なる清酒酵母
Km67 株を使用した清酒粕には葉酸が豊富に含まれていることが明らかとなった。葉酸は水溶性ビタミン(B9)に分類され、核酸の合成やアミノ酸代謝に関与
し、貧血、鬱病、大腸ガンなどの発症リスクを軽減することが知られている。
当社ではこれまでに、Km67 株の HMT1 遺伝子が酒粕中の葉酸高含有に関与していることや、Km67 株の場合、醗酵が停止してからも醪中の葉酸含量が減少
せずに維持されていることを明らかにしてきた 1)。今回は店頭に並んでいる酒粕を想定し、Km67 株の酒粕を 4℃で保存した際の葉酸の保存性や葉酸代謝関
連物質含量の変化を調べたので報告する。
【方法及び結果】Km67 株と K701 株でそれぞれ仕込んだ醪を上槽し、得られた酒粕を 4℃で保存し続け、1 週間ごとに葉酸含量を測定した。その結果、K701
株に関しては、上槽後から 4℃での保存期間が長くなるにつれて次第に酒粕の葉酸含量が減少し、12 週間の保存で検出されなくなった。一方、Km67 株の場
合、4℃での保存期間が 6 週間になっても葉酸含量がほとんど減少せず、12 週間の保存後も乾燥酒粕 100g あたりまだ約 400μg の葉酸が残っていた。このKm67 株の高蓄積した葉酸を維持する機構の解明のため、同じ酒粕中の葉酸代
謝関連物質であるメチオニン、S-アデノシルメチオニン(SAM)、S-アデノシルL-ホモシステイン(SAH)、ホモシステインの含量を測定し、比較した。その結果、メチオニン、SAM、ホモシステイン含量の変遷に菌株間で違いが見られ、特に Km67 株の酒粕では、K701 株と比べて、4℃保存中にホモシステインが多く蓄積していた。このことから、Km67 株はホモシステインをメチオニンに変換するために必要な葉酸も多く蓄積し続けているのではないかと推察される。
1）柴田ら： 日本生物工学会大会講演要旨集 p143 (2017)

清酒の貯蔵劣化臭である老香（ひねか）の主要成分はジメチルトリスルフィド（DMTS）であり、その前駆体（DMTS-P1）の生成には、酵母の MRI1 及び MDE1
遺伝子が関与する。本研究では、老香を生じにくい吟醸酒用酵母の取得を目的として、前演者の取得した K701 由来の mri1 ホモ変異型二倍体株を用い、自然突然変異によるカプロン酸エチル高生産株の育種を行った。
YPD 培地の C 源をグリセロールに置換し、セルレニン（1 μg/mL）を添加した培地に mri1 ホモ変異型二倍体株（親株）を播種し、セルレニン耐性株を 16 株取得した。このうち 14 株は、液体培養において K1801 よりカプロン酸エチル
生産性が高かった。醸造特性を確認するために、これらの候補株と親株、
K701、K1801 を用いて小規模醸造試験を行った。試験は α 米と乾燥麹を用いて2 回行い、１回目は候補株 14 株を用いて一段仕込みを、2 回目は候補株 6 株を用いて三段仕込みを行った。2 回目の試験では 45℃42 日間貯蔵前後の官能評価も行った。
候補株は、発酵経過、製成酒の一般成分（アルコール度、日本酒度、酸度、アミノ酸度）、有機酸及びアミノ酸組成が親株とほぼ変わらず、DMTS-P1 濃度及び DMTS 生成ポテンシャル（清酒を 70℃で 7 日間貯蔵後の DMTS 量）も、親株と同様に大幅に低減していた。候補株の製成酒は、親株や K701 はもちろん、カプロン酸エチル高生産株である K1801 の製成酒に比べてもカプロン酸エチル
濃度が高かった。官能評価では、貯蔵前の製成酒は味、香り、総合評価ともに有意差は見られなかったが、貯蔵後、候補株は親株と同様、製成酒の老香や硫黄様の香りが K701 と K1801 に比べ有意に低く、総合評価も良い傾向であった。

Mechanism of accumulating and holding large amounts of folates in sakeyeast not belonging to Kyokai yeasts

Breeding of Ginjo sake yeasts which resist generating the deterioration
flavor hineka during the storage○Yusuke Shibata1, Tasuku Yamada1, Tsutomu Fujii2,3, Takeshi Akao2,
Tetsuya Goshima2, Toshinari Takahashi1, Nobuchika Tanaka1(1Kiku-Masamune Sake Brewing Co., Ltd., 2NRIB, 3Fukushima Univ.)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, folate, pressed sake cake, methionine cycle○Yuriko Ikeda1, Ryoko Kanda1, Atsuko Isogai1, Tsutomu Fujii1, Toyohisa Inoue2,
Takashi Nakae2(1NRIB, 2Nihonsakari Co., Ltd.)Key words

dimethyl trisulfide, ethyl caproate, hineka, sake yeast

222

2Hp13

協会系酵母と近縁な広島 6 号酵母の特性解析及びその
活用

2Hp15

清酒酵母育種に向けた 4-VG 非生成株の判別方法の開発と自然環境における非生成株の分布と遺伝的解析○山﨑 梨沙 1,2,3, 五島 徹也 2, 大場 健司 3, 大土井 律之 3, 赤尾 健 1,2（1酒総研, 2広島大院・統合生命科学, 3広島総合技術研・食品工業技術セ）
akao_t@nrib.go.jp○奥村 真衣 1, 吉村 明浩 3, 澤井 美伯 3, 正木 和夫 3,4, 向田 潤 5,
三井 亮司 5, 島田 昌也 1,2, 早川 享志 1,2, 中川 智行 1,2（1岐阜大院・自然科学, 2岐阜大・応生科, 3岐阜県食品科学研, 4酒総研, 5岡山理大・理）t_nakaga@gifu-u.ac.jp【背景・目的】広島県ではこれまでに，温暖な気候に適した独自の清酒酵母が分離・選抜され，清酒醸造に用いられている。最古の分離株として，大正 15 年に県内酒造会社の醪から分離された広島 6 号（H6）酵母がある。昭和 2 年より頒布をされていたとの記録があるが，現在は使用されていない。以降は日本醸造協会より頒布されている協会 7 号酵母（K7）を代表とする優れた特性を持った協会系酵母が広まり，現在も主流となっている。H6 の遺伝的背景の調査や協会系酵母との特性比較を行い，清酒醸造に活用できるよう改良を行うことを目的として研究を行っている。
【方法・結果】
出芽酵母の中での H6 の系統的な位置付けを明らかにするために，全ゲノム解
析結果を用いて系統樹を作成したところ，H6 は，協会系酵母群と同じ枝に位置し，少し離れて分岐していた。協会系酵母の高発酵性の原因とされている機能
欠 失 変 異 rim155055insA 及 び msn4C1540T に つ い て タ イ ピ ン グ を 行 っ た と こ ろ ，
msn4C1540T のみを有していた。2 つの変異の片方のみを有する菌株の初めての例である。
さらに，清酒小仕込み試験を行ったところ，協会系酵母と比較してやや緩慢な発酵経過を取ったが，清酒醸造に十分に使用できる発酵力を有していた。興味深いことに，清酒の貯蔵劣化臭である老香の主要成分である DMTS の既知前駆体の生成が少なく，製成酒の DMTS 生成ポテンシャルも低いという特徴が見られた。
一方，多くの協会系酵母では，胞子形成能を持たず，ごくまれに生成した胞子もほとんど発芽しないことが知られている。H6 の胞子形成能について調べたところ，正常な胞子を形成し，四胞子分離が可能であった。
現在， これまで明らかになった H6 の特性の詳細な解析を行うと同時に，他の菌株にない特性を生かし，遺伝子組換えや変異処理に頼らない，新規清酒酵母
菌株の育種を行っている。

【目的】
4-ビニルグアイアコール（4-VG）は、煙様・スパイス様の香りをもつことから、清酒のオフフレーバーの一つに数えられる。一般に、4-VG はフェルラ酸の脱炭酸反応で生成されるが、本反応は主に出芽酵母の Pad1p/Fdc1p により触媒される。きょうかい酵母は FDC1 のナンセンス突然変異のため 4-VG 生成能をもたないが、野生酵母による清酒醸造ではしばしば 4-VG 生成がみられ、その品質を著しく低下させている。つまり 4-VG 生成は野生酵母の清酒醸造の能力を左右する最重要因子の一つである。しかし、野生酵母における 4-VG 生成
株の見分け方や自然界における分布などの知見はほとんどない。そこで、本研
究では野生酵母の 4-VG 生成の判別方法、さらには 4-VG 生成能の分布と遺伝系統を示すことを目指した。
【結果・考察】まず、4-VG 生成能の簡易的な判別法の開発を行った。フェルラ酸の吸収極大である 322 nm にて YNB 培地中のフェルラ酸の定量を行うことで、その分解量から 4-VG 生成能を推測できた。また、Pad1p/Fdc1p 遺伝子欠損株が桂皮酸に対する感受性を示したことから、4-VG 非生成株の桂皮酸に対する感受性を観察したところ、桂皮酸存在下ではプチコロニーを形成した。このように、桂皮酸に対する感受性により 4-VG 非生成株を判別できる可能性を示した。一方、野生酵母における 4-VG 生成能を観察したところ、59 株中 50 株が 4-VG 生成能をもち、非生成株は 9 株であった。そこで、4-VG 非生成株における FDC1 の変異点を観察したところ、ナンセンス突然変異を生じている 2 株と変異点がない
7 株が存在した。これらより、自然界において fdc1 欠損による 4-VG 非生成株
は少数であり、その他因子の変異による 4-VG 非生成株も存在する可能性が示された。

CCharacterization of sake yeast strain Hiroshima no.6 that is closely-related
to Kyokai sake yeast strains .

Development of method for detection of 4-VG non-producing sake yeast
strain and their distribution in natural environment○Risa Yamasaki1,2,3, Tetsuya Goshima2, Kenji Oba3, Ritsushi Ohdoi3,
Takeshi Akao1,2(1NRIB, 2Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 3Hiroshima Prefectural
Res.Inst.Food Technol. Res.Center)

Key words

sake yeast, phylogenetic tree, sporulation

2Hp14

白神こだま酵母より分離した高い冷凍耐性を有する胞子クローンの解析○Mai Okumura1, Akihiro Yoshimura3, Yoshinori Sawai3, Kazuo Masaki3,4,
Jun Mukaida5, Ryoji Mitsui5, Masaya Shimada1,2, Takashi Hayakawa1,2,
Tomoyuki Nakagawa1,2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Gifu Univ., 2Fac. Appl. Biol. Sci., Gifu Univ., 3Gifu
Pref. Res. Inst. Food Sci., 4NRIB, 5Fac. Sci., Okayama Univ. Sci.)
Key words
Saccharomyces cerevisiae, sake, 4-VG, ferulic acid2Hp16

○福田 まみ 1, 浅内 由佳 2, 芦崎 瑞稀 2, 柴田 友香莉 2,
高橋 慶太郎 3, 中沢 伸重 1,2（1秋田県大院・生資, 2秋田県大・生資, 3秋田総食研）
nnakazawa@akita-pu.ac.jp

分離酵母 AB2 および SUNF5 株の同定と醸造特性○野地 秀和 1, 本間 裕人 2, 徳田 宏晴 2, 數岡 孝幸 2
（1東農大院・醸造, 2東農大・醸造）
t3kazuok@nodai.ac.jp

1997 年に白神山地の腐葉土から採取された白神こだま酵母の胞子クローンである IB1411 株は、高い冷凍耐性を示すことを見出した。本研究では IB1411 株の冷凍耐性メカニズムの解析を試みた。
冷凍処理により転写が上昇すると報告されている CTT1、TPS1 および HSP104
遺伝子の転写量を調べたところ、冷凍処理により全ての遺伝子の転写量は実験室株のそれの 2〜5 倍であった。次に、IB1411 株を種々のストレス耐性試験に供し、高い熱ショック耐性を有していることを明らかにした。そこで、熱ショッ
ク耐性に関与している HSP104 あるいは BTN2 遺伝子の破壊株の冷凍条件下での生存率を調べた。どちらの破壊株も野生型株に比べ、生存率が 30〜50％低下
した。Hsp104 タンパク質は熱ショックを与えると顆粒を形成することが報告されている。冷凍処理下で Hsp104 タンパク質が顆粒を形成しているかを観察した結果、IB1411 株の顆粒形成率は実験室株のそれの約 2 倍であった。このこと
より、冷凍耐性に対して Hsp104 タンパク質が関与していることが示された。
HSP104 遺伝子の転写因子である Msn2 タンパク質の核局在率の観察により、冷凍処理の有無に関わらず核局在率は約 80％と非常に高いことが分かった。また、Msn2 タンパク質は PKA 経路によって負に制御されていることから、PKA
活性が低下しているかを検討した。その結果、冷凍解凍後の IB1411 株の PKA
活性は実験室株のそれと比較して低く、このことは、PKA 活性の低下が IB1411
株の高い冷凍耐性の一因であることを示している。

【目的】清酒製造用酵母として、日本醸造協会から頒布されているきょうかい酵
母が広く用いられている。きょうかい酵母は、醪からの分離や育種によって取得された優れた醸造特性を有している酵母である。一方で、近年の消費者の嗜好の多様化に伴い、酒質の多様化が求められている。それに対応するため、新規清酒製造用酵母の分離や既存酵母からの育種が試みられている。本研究では、自然界からの分離株であり、清酒醪で高いアルコール発酵性を示す AB2 株および SUNF5 株の同定とそれらの醸造特性解明を目的としている。
【方法】AB2 株および SUNF5 株の糖の発酵性および資化性、硝酸塩資化性、ビ
タミン要求性、TTC 還元性、Yeastcidin 耐性などの生理学的諸性質を試験するとともに、26S rDNA-D1/D2 領域と ITS 領域の塩基配列を用いた分子系統解析を行い、同定を行った。次に、総米 600 g の三段仕込み（麹歩合 23%、汲水歩合 150%）を行ない、醪育成中の有機酸濃度および香気成分濃度の推移を対照
株きょうかい 901 号（K901）株と比較することで醸造特性を調査した。
【結果】生理学的性質をきょうかい 9 号（K9）株と比較すると、AB2 株およびSUNF5 株は α-メチル-D-グルコシドを資化しないが、試験した他の性質は K9株と同じであった。また分子系統解析の結果、K9 株と AB2 株および SUNF5 株
は同じ系統枝に位置したことから、AB2 株および SUNF5 株はともに S. cerevisiaeと強く推定された。次に醪育成過程における有機酸組成変化を調査したところ、SUNF5 株は醪育成全期間において K901 株よりもピルビン酸およびリンゴ酸が低濃度で推移した。一方で、AB2 株は K901 株よりもリンゴ酸、コハク酸および乳酸が低濃度で推移した。香気成分については K901 株と比較して AB2 株はカプロン酸エチル高生成であり、酢酸エチル、酢酸イソアミル、酢酸イソブチ
ルおよびイソブチルアルコール低生成であった。

Mechanism of high tolerance to freeze-thaw stress in a spore clone isolated
Shirakami kodama yeast

Identifications and brewing characteristics of the isolates, AB2 and SUNF5○Mami Fukuda1, Yuka Asanai2, Mizuki Ashizaki2, Yukari Shibata2,
Keitaro Takahashi3, Nobushige Nakazawa1,2(1Grad. Sch. Bioresour. Sci., Akita Pref. Univ., 2Biotech Biore., Akita Pref. Univ.,
3
ARIF)

Key words

Shirakami kodama yeast, freeze-thaw, Hsp104○Hidekazu Noji1, Hiroto Homma2, Hiroharu Tokuda2, Takayuki Kazuoka2(1Dept. Brewing and Fermentation, Grad. Sch., Tokyo Univ. Agric., 2Dept. Brewing
and Fermentation, Tokyo Univ. Agric.)

Key words

sake yeast, sake

223

2Hp17

カプロン酸エチル高生産清酒酵母の育種と醸造特性の
解析

2Ip01

○大橋 正孝 1, 都築 正男 1, 清水 浩美 1, 渡辺 大輔 2, 高木 博史 2
（1奈良産振セ・バイオ・食品グループ, 2奈良先端大・バイオ）
m-oha-niid@von.jp

Baby Spinach アプタマーに対する三重鎖形成配列の付加による蛍光強度の増強および pH 応答性蛍光アプタ
マーの開発○上野 絹子 1, 塚越 かおり 1, Porchetta Alessandro 2,
Ricci Francesco 2, 池袋 一典 1
（1農工大院・工, 2Dept. Chemist., Univ. Rome Tor Vergata）
ikebu@cc.tuat.ac.jp【背景と目的】我々は清酒の消費低迷を打破するために、従来の清酒酵母との差別化が可能な奈良県独自の菌株開発を目指している。これまでの研究で、野生酵母から清酒の醸造に適した酵母の分離（山乃かみ酵母）や、遺伝子組換え技
術を用いずに、アルコール性疲労の抑制や肝機能の促進などの機能性を有する
オルニチンを細胞内に高蓄積する変異株（オルニチン蓄積酵母）の取得に成功している。山乃かみ酵母は、奈良県桜井市大神神社境内のささゆりの花から分離した酵母で、その酵母で醸造した清酒には、協会酵母で醸造した清酒よりも、
リンゴ酸、イソアミルアルコールを約 2 倍多く含んでおり、また、オルニチン
蓄積酵母で醸造した清酒には、オルニチンを約 3 倍多く含んでいる。これらの酵母は、それぞれ特徴を持つが、清酒の良い香りとされる吟醸香の成分である
カプロン酸エチルの生産性は高くない。そこで、酵母の付加価値を高めるために、これらの酵母を親株として、セルレニンをスクリーニングに使用し、カプ
ロン酸エチルの前駆物質であるカプロン酸を細胞内に高蓄積する変異株の分離することによって、カプロン酸エチル高生産清酒酵母の育種を検討した。
【方法及び結果】山乃かみ酵母を培養し、セルレニン及びプロリンアナログ（アゼチジン-2-カルボン酸：AZC）を含有する最少（SD）寒天培地で生育できる株を分離した。一方、オルニチン蓄積酵母は、EMS 処理後、セルレニン及び AZCを含む SD 寒天培地で生育できる株を分離した。次に、各株を SD 液体培地で30℃、2 日間培養後、細胞内のカプロン酸含量をキャピラリー電気泳動装置で測定した。その結果、親株よりも細胞内カプロン酸含量が増加した株を 8 株分離した。現在、この変異株を用いて、総米 46g の小仕込み試験を行い、清酒中の香気成分などを含む醸造特性を解析している。

アプタマーとは標的分子に対して特異的に結合可能な核酸リガンドである。その中でも Baby Spinach アプタマーは 3’5’-ジフルオロ-4-ヒドロキシベンジリデン
イミダゾリノンに対し結合し、その微弱な蛍光を増強する RNA アプタマーである。このような蛍光発光アプタマーは、細胞内において持続的に転写させ続けることで特定の物質や核酸配列の挙動を継時的に観察することが可能である。
しかし、正確に標的を追跡するには蛍光強度の増強が求められている。また、
pH をはじめとする細胞内環境により蛍光強度が変化するアプタマーを設計することで、細胞内環境の詳細な解析が可能になる。
これまでに、Baby Spinach アプタマーがグアニン四重鎖構造 (G4) という 4 つのグアニンから形成される G-カルテット構造が重なった構造を有することが明らかとなっている。一方、核酸の高次構造のひとつである三重鎖構造は低い pH
環境下においてフーグスティーン塩基対を介して安定に形成される構造であり、pH に応答した構造変化を引き起こすことができる。また、これまでに G4 と三重鎖構造の両方を有するアプタマーが獲得されており、G4 が三重鎖構造により安定化される可能性があると考えられる。
そこで本研究では、G4 形成アプタマーである Baby Spinach アプタマーに対し三重鎖形成配列を融合し、蛍光発光強度の増強および pH 応答性の付与を試みた。最初に Baby Spinach アプタマーに対して種々の三重鎖形成配列を融合し評価した結果、アデニンとウラシルをそれぞれ 10 塩基あるいは 20 塩基含む三重鎖形成配列を融合した場合に蛍光強度が 5 倍程度増強した。次に、pH6~pH10の環境下における蛍光強度を評価した結果、pH の上昇に伴う蛍光強度の減少が確認された。これより Baby Spinach アプタマーに対して三重鎖形成配列を融合することで、蛍光発光強度の増強および pH 応答性の付与に成功した。

Breeding of Japanese sake yeast mutants with enhanced ethyl caproate
productivity and analysis of their fermentation profiles

Development of pH-responsible fluorescence aptamer by fusing triplex
forming sequence to Baby Spinach aptamer○Masataka Ohashi1, Masao Tsuduki1, Hiromi Shimizu1, Daisuke Watanabe2,
Hiroshi Takagi2(1Nara Pref. Inst. Ind. Dev., 2Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)○Kinuko Ueno1, Kaori Tsukakoshi1, Alessandro Porchetta2, Francesco Ricci2,
Kazunori Ikebukuro1(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Dept. Chemist., Univ. Rome Tor
Vergata)

Key words

Japanese sake yeast, Ethyl caproate production

Key words

aptamer, Fluorescence aptamer, G-quadruplex, triplex

2Hp18

ハイビスカス花から採取した泡盛酵母とその変異株の比
較ゲノム解析を用いた特徴づけ

2Ip02

G カルテット構造による CpG ODN の免疫活性化能の向上○阿部 峻之 1, 豊川 洋一 2, 渡辺 大輔 2, 高木 博史 2, 塚原 正俊 1
（1バイオジェット, 2奈良先端大・バイオ）tsuka@biojet.jp

泡盛は 600 年を超える歴史を持つ日本最古の蒸留酒であり、沖縄県の代表的な伝統食品である。我々は、泡盛風味のバラエティー化を目指した取り組みとして新たな泡盛酵母の確立を目指している。これまでに、南国のイメージである
ハイビスカス花を試料として泡盛製造に実用可能な酵母 HC02-5-2 株を単離し、さらに HC02-5-2 を親株として特定の香気成分を多く産生する T25 株を得た。
今回、HC02-5-2 と T25 の特徴を明らかにするために次世代シーケンサーを用いた解析を行った。HC02-5-2 株の詳細な系統解析を目的として得られた配列についてデータベース（Sequence Read Archive）より酵母株のリード配列情報を取得し、比較ゲノム解析に供した。S288c 株を参照配列とした変異情報から Single
Nucleotide polymorphisms (SNPs) を抽出しこれらを比較することにより系統樹を作成した。その結果、パン酵母やワイン酵母など単離源が類似する酵母株は系
統樹上でクレードを作る傾向にあることが確認できた。系統樹において、泡盛
101 号酵母は清酒酵母のクレードに含まれる一方、HC-02-5-2 および T25 はワイン酵母のクレードに含まれた。一方、S288c 株を参照配列として、泡盛 101 号、HC02-5-2 および T25 のゲノム配を比較したところ、香気成分の特徴を説明しうる変異が遺伝子上に見出された。以上のことから、比較解析によりそれぞれの酵母株が有する醸造特性の背景となりうるゲノムの特徴づけが可能であることが分かった。本研究において用いられた手法は単離された産業微生物株の分類や特徴づけにおいて、酵母にとどまらず応用可能である。
Abe et al., Front Genet (2019) (in press)○山崎 智彦 1,2, 星 和明 1, Tu Thi Tram Anh 1,2, 塚越 かおり 3,
津川 若子 3, 早出 広司 4, 池袋 一典 3
（1物材研・機能性材料, 2北大院・生命科学, 3農工大院・工, 4Joint
Dept. Biomed. Eng., Univ. North Carolina at Chapel Hill）
yamazaki.tomohiko@nims.go.jp
細菌やウィルスの DNA に存在する非メチル化シトシン-リン酸-グアニン配列（CpG）モチーフを含む合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ODN）は自然
免疫受容体であるトール様受容体 9（TLR9）のアゴニストとして機能し、B 細
胞や樹状細胞からの炎症性サイトカインや I 型インターフェロン(IFN)の発現を誘導し、免疫系を活性化する。ODN は核酸分解酵素により容易に分解されることから、ワクチンアジュバントなどの免疫賦活剤としての体内での利用に問題がある。そのため、現在までに報告されている CpG ODN の大部分は、ホスホジエステル（PD）骨格をホスホロチオエート（PS）化することにより、核酸分
解酵素に対する耐性が増強されている。しかしながら、PS 化による急性毒性やタンパク質への非特異的吸着による副作用が懸念される。
我々は CpG ODNs の安定性を増強させるため、グアニン四重鎖（G4）構造に着目した。
G4 構造を形成する配列はテロメアなどに存在し、核酸の修飾や分解を防ぐ役割がある。CpG ODNs に G4 構造を形成させるため、CpG モチーフ間にポリグア
ニン配列を導入した G4-CpG ODN を開発した。我々の開発した G4-CpG ODN
は円二色性スペクトル測定、ポリアクリルアミドゲル電気泳動ならびに融解曲線解析から、パラレル型の分子間 G4 構造を形成することが示唆された。G4CpG ODN は G4 構造を形成しない ODN と比較して血清中での高い安定性を示し、またヒト B 細胞株への取込量が増加した。免疫沈降法により G4-CpG ODNが TLR9 に結合すること、レポーターアッセイにより TLR9 を介して NF-ｋ B
シグナルを活性化することが示された。G4-CpG ODN の免疫活性化能を B 細胞株と末梢血単核球細胞を用いて評価した結果、G4-CpG ODN は免疫活性化の指標となる IL-6 と IFN ガンマを高く誘導することが示された。
Ref) K. Hoshi, T. Yamazaki* et.al., Nucleic Acid Therapeutics (in press)

Comparative Genomics of a New Saccharomyces cerevisiae Isolated from
Hibiscus Flower and Its Mutant for Awamori Brewing○Takayuki Abe1, Yoichi Toyokawa2, Daisuke Watanabe2, Hiroshi Takagi2,
Masatoshi Tsukahara1(1Biojet, 2Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, Awamori, genome

G-quadruplex structure improves the immunostimulatory effects of CpG
oligonucleotides○Tomohiko Yamazaki1,2, Kazuaki Hoshi1, Thi Tram Anh Tu1,2, Kaori Tsukakoshi3,
Wakako Tsugawa3, Koji Sode4, Kazunori Ikebukuro3(1RCFM, Natl. Inst. Mater. Sci. (NIMS), 2Grad. Sch. Life Sci., Hokkaido Univ.,
3
Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 4Joint Dept. Biomed. Eng., Univ.
North Carolina at Chapel Hill)
Key words
adjuvant, oligodeoxynucleotides, G-quadruplex, toll like receptor

224

2Ip03

GMD-GFT 二重破壊によりフコース結合糖鎖を検出限界以下にした CHO 細胞の樹立と解析

2Ip05○武智 大樹 1, 岩崎 将士 1, 三﨑 亮 1, 大橋 貴生 1,2, 藤山 和仁 1
（1阪大・生工国際セ, 2摂南大院・理工）fujiyama@icb.osaka-u.ac.jp

ビタミンＥ疎水部構造の違いと膜相分離○中谷 祐将 1, 下川 直史 1, 浦野 泰臣 2, 野口 範子 2, 高木 昌宏 1
（1北陸先端大・マテリアル, 2同志社大・医生命システム）
takagi@jaist.ac.jp【背景および目的】
近年バイオ医薬品の市場が拡大し続けている。バイオ医薬品の多くが翻訳後修飾によりタンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質であり、その糖鎖構造がタンパク質の安定性、免疫原性、生理活性に多大な影響を及ぼすことが知られている。特に、バイオ医薬品の代表である抗体では、Fc 領域に付加した N-結合型
糖鎖への α-1,6-フコース結合を除去することで抗体依存性細胞障害(ADCC)活性が大きく上昇することが知られている。そこで我々は、組換えタンパク質生産のプラットフォームであるチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を用いて、ゲノム編集技術を利用してフコシル化糖鎖を持たない CHO 細胞を構築した。しかし、糖鎖のフコシル化阻害が細胞の性質にどのような影響を与えるのかよく分かっていないため、当該変異株の糖鎖構造、生育速度、他の糖鎖修飾
関連酵素発現量の解析を行った。
【方法および結果】
CRISPR/Cas9n ゲノム編集技術を用いて、GDP-フコースを合成する GDP-マン
ノース-4,6-デヒドラターゼ(GMD)遺伝子をノックアウトした単独破壊株(CHOK1-D20 株)および当該基質をゴルジ体内に輸送する GDP-フコーストランスポー
ター(GFT)遺伝子を破壊した二重破壊株(CHO-K1-D20T16 株)を構築した。接着型および浮遊型の野生株、CHO-K1-D20、D20T16 の細胞株よりそれぞれ全可溶性タンパク質糖鎖を調製し、HPLC および質量分析器を用いて糖鎖構造を解析した結果、フコシル化糖鎖が検出されない CHO-K1-D20T16 株の樹立に成功した。また初期細胞数を均一にして生育速度を計測した結果、遺伝子破壊による影響は見られなかった。また、qRT-PCR を行い mRNA の発現量を比較した結果、細胞の浮遊化により個々のフコシル化関連酵素発現量が変化することが分かった。
本研究は、AMED「次世代治療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業」の助成を受けて行われた。

【背景と目的】ビタミンＥは、生体内で α-tocopherol(toc)として最も多く存在する。構造上類似する α-tocotrienol(toc3)も存在するが、機能に違いがある。Toc
は小胞体ストレス関与の神経細胞死を抑制する効果があり、toc3 にはガン細胞の増殖抑制効果がある。Toc と toc3 は、脂質部分の構造のみが異なるため、機能の差に膜相互作用が関係していると考えられた。生体膜には、飽和脂質とコレステロール(Chol)を含む相分離構造（ラフト）が存在し、細胞信号伝達に重要である考えられている。本研究では生体模倣膜で再現した相分離構造（液体
秩序相、固体秩序相）に対する toc と toc3 の影響の違いを明らかにすることを目的としている。
【方法】飽和脂質、不飽和脂質、コレステロールにビタミンＥ（toc, toc3）を添加し、生体模倣膜を作成し、顕微鏡観察結果に基づいて、相分離構造形成率の測定をおこなった。相分離構造の揺らぎのデータを画像解析し、線張力を測定した。リン脂質とビタミンＥの親和性を定量的に解析するために、示差走査熱測定を行った。
【結果と考察】ビタミンＥ添加により chol を含まない固体秩序相の形成率の低下がみられ、示差走査熱測定では相転移温度の低下が認められたため、ビタミ
ンＥは固体秩序相に入り、不安定化させることがわかった。さらに、toc は toc3
より、強く固体秩序相形成を阻害することがわかった。小胞体膜ではコレステ
ロール含量が少なく、固体秩序相が存在すると考えられ、また変性タンパク質
は、固体秩序相に蓄積する。このことは、toc が toc3 よりも小胞体ストレスによる細胞死を抑制できる事と関連していると考えられた。また、toc は、chol を含む液体秩序相の形成には影響しないが、線張力を低下させていることがわかった。

Fucosylated N-glycan structures undetected in the characterization of newly
established GMD-GFT double knockout CHO cell line

Effect of vitamin E (tocopherol and tocotrienol) on membrane phaseseparation○Hiroki Takechi1, Masashi Iwasaki1, Ryo Misaki1, Takao Ohashi1,2,
Kazuhito Fujiyama1(1ICBiotech, Osaka Univ., 2Grad. Sch. Sci. Eng., Setsunan Univ.)○Yusuke Nakatani1, Naofumi Shimokawa1, Yasuomi Urano2, Noriko Noguchi2,Masahiro Takagi1(1Sch. Mater. Sci., JAIST, 2Dept. Med Life Systems., Doshisha Univ.)

Key words

Chinese hamster ovary, Fucose, Glycan

Key words
alpha-tocopherol, alpha-tocotrienol, Liquid-ordered domain, Solidordered domain

2Ip04

流路チップによるナノサイズダブルエマルジョンの連続
生産系の構築および評価

2Ip06○牧野 祥嗣, 佐野 七海, 伊藤 伸哉（富山県大・工）makino@pu-toyama.ac.jp

カチオンの構造に依存した負電荷脂質膜の相分離○永田 佳嗣 1, 引地 啓太 1, 秀瀬 涼太 2, 藤原 伸介 3, 下川 直史 1,
高木 昌宏 1
（1北陸先端大・マテリアル, 2神戸大院・科技イノベ, 3関西学院
大・理工）
takagi@jaist.ac.jp【目的】リポソームまたはダブルエマルジョンは、ドラッグデリバリーシステム（DDS）担体として優れる。その表面特性、サイズ等を制御すれば、より高い機能性の付与が可能である。表面をポリエチレングリコール（PEG）等により修飾すれば、生体内の排除系を回避するステルス能が備わる。また、表面に組織、細胞特異的な分子を修飾すれば、病巣への特異的送達を実現するアクティブター
ゲティング（AT）型とできる。そして、がんターゲティング担体を指向する場
合には、EPR 効果（Enhanced Permeability and Retention effect）が期待できるサ
イズへの制御が有効である。これらの複数の特性制御が可能な、簡単かつ連続的な粒子生成系の構築により、機能性リポソームの開発促進が期待される。そこで我々は、流路チップを用いて高機能性リポソームまたはダブルエマルジョ
ンを連続的に生成する系の構築を試みた。
【方法・結果】まず、water-in-oil（w/o）エマルジョンから water-in-oil-in-water（w/o/w）エマルジョンを段階的に作成する方法の検討を行った。その結果、直径 100〜300 nm の w/o/w エマルジョンの簡単が操作（ピペッティング）で生成でき、高い水溶性試薬の内包率も確認された。そこで、この条件をもとに w/o/
w エマルジョンの生成までを連続的に行えるようなチップを作成した。w/o エ
マルジョン構築用チャンバーの下流に w/o/w エマルジョン構築用チャンバーを配置した流路チップを、加工したアクリル板を重層し圧着して作成した。内水相、油相、外水相を一定流速で流したところ、ピペッティング操作時と同様の
外径 100〜300 nm の粒子を確認することができた。さらに、修飾官能基を持つものを含む PEG 修飾脂質を溶解した外水相を使用したところ、w/o/w エマル
ジョン表面への修飾が確認された。

[背景]
リン脂質が形成する二重膜が球状に閉じた構造は、リポソームと呼ばれ、細胞膜のモデル系として用いられる。リポソームでの相分離構造は、生体膜のラフト構造と類似しており、相分離における荷電脂質の役割が広く議論されている。
本研究では荷電脂質膜において相分離を誘起する塩（金属イオン、ポリアミン等）に注目し、様々な価数や構造を持つ塩を添加した際の相分離挙動を観察した。
[実験方法]
脂質は中性飽和脂質 DPPC、負電荷不飽和脂質 DOPS、コレステロール(Chol)を用い、組成は DOPS/DPPC/Chol=40:40:20 に固定した。また、塩としてポリアミン(プトレシン二塩酸塩(+2)、スペルミジン三塩酸塩(+3)、スペルミン四塩酸塩(+4) 、 N4-bis(aminopropyl)spermidine (+5)) を 添 加 し た 。 ま た 比 較 の た め 、NaCl(+1)、NH4Cl(+1)、プロピルアミン塩酸塩(+1)、MgCl2(+2)、CaCl2(+2)、エチ
レンジアミン塩酸塩(+2)、ヘキサメチレンジアミン二塩酸塩(+2)も用いた。蛍光顕微鏡観察によって相分離構造を観察し、相分離形成率の違いを調べた。
[結果・考察]リポソームに塩を加えない場合は、負電荷脂質間の静電反発により室温で相分離は観察されないが、いずれの塩を添加した場合においても相分離が観察された。これはカチオンが負電荷脂質に吸着することによって脂質の頭部基の電荷を遮蔽することによるものだと考えられた。価数が大きい場合、またはカチオ
ンサイズが小さい場合に、より低濃度で相分離が観察される傾向があることが分かった。依存性としては価数依存性が非常に強いことがわかった。相分離形
成は静電遮蔽だけでなく、膜面へカチオンが吸着した際の、カチオン間の立体反発などに依存していることが示唆された。

Evaluation of double emulsion formation by continuous flow fluidic devices

Phase separation of negatively charged lipid membranes depending on the
structure of the cation○Yoshihide Makino, Nanami Sano, Nobuya Itoh(Fac. Eng., Toyama Pref. Univ.)

Key words
emulsion

lipid vesicle, microfluidic device, drug delivery system, double○Yoshitsugu Nagata1, Keita Hikichi1, Ryota Hidese2, Shinsuke Fujiwara3,
Naofumi Shimokawa1, Masahiro Takagi1(1Sch. Mater. Sci., JAIST, 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 3Sch. Sci.
Technol., Kwansei Gakuin Univ.)

Key words

lipid vesicle, membrane potential, lipid

225

2Ip07

相模湾由来単離株 51-CS のメンブランベシクルの特性の
解析

2Ip09

○福井 瑞季 1, 倉田 淳志 2, 三好 柚紀 3, 山崎 思乃 4, 今井 友也 5,
栗原 達夫 6, 上垣 浩一 2
（1近畿大院・農, 2近畿大・農, 3関西大院・理工, 4関西大・化生工, 5京大・生存研, 6京大・化研）
kurata090401@nara.kindai.ac.jp

変異導入 LEA ペプチドの発現による大腸菌の酸耐性の向上○池野 慎也 1, メトワリー キャレド 1,2（1九工大院・生体工, 2アイン シャムス大・農）ikeno@life.kyutech.ac.jp【背景と目的】細胞外膜小胞（メンブランベシクル:MV）は、細菌が生産する小胞であり、細胞膜や細胞壁、タンパク質、核酸などが含まれる。現在、我々は乳酸菌やビフィズス菌の MV の構成成分を分析し、免疫細胞に対する生理活性を解明している。本研究では深海底泥由来の細菌群集に注目した。海洋表層から深度 500 m まで MV が存在するが、海洋由来 MV 生産菌はほとんど探索されておらず、MV の特性は検討されていない。そこで MV 生産菌を探索し、得られた単離株の MV を用いて特性の解明を試みた。
【方法】相模トラフ（深度 246 m - 928 m）由来の細菌群集 61 種類を、蛍光色素
FM4-64 を用いて培養液上清中の MV 生産量を比較し、MV 生産菌を探索した。
分画遠心分離、限外ろ過、フィルター濾過（0.2 μm）、サイズ排除クロマトグラ
フィーで単離株の培養液から MV を回収した。電気抵抗ナノパルス法によりMV の粒径と個数を測定した。MV 画分中のタンパク質と DNA を、それぞれ N
末端アミノ酸解析と次世代シーケンサーで分析した。免疫細胞を用いて MV 画
分により誘導されるサイトカインや抗体を分析した。
【結果と考察】深海由来の細菌群集から MV 生産菌として単離株 51-CS 株、51WL 株を得た。51-CS 株のゲノム DNA（4,095,040 bp）を解析し、16S rRNA 遺伝子（1551 bp）から 51-CS 株は Bacillus subtilis に分類できた。MV の粒径は平均 85.8 ± 35.7 nm で、培養液中には 3.8×1010 MVs/mL の MV が含まれた。MV 画
分中にはスメアー状の DNA（11,309〜100 bp）を検出できた。タンパク質を分析した結果、Serine protease Vpr、Triose phosphate isomerase を MV 画分中に特徴的に見出した。さらに、Raw264 細胞を用いた MV 画分による IL-6 産生の促進、マウスパイエル板細胞を用いた MV 画分による IgA 産生の促進を見出した。本菌株の MV や構成成分をアジュバントとして活用できる可能性が示唆された。

【背景と目的】LEA(Late Embryogenesis Abundant) タンパク質は植物の種子や一部の動物から発見された天然変性タンパク質であり、細胞内のタンパク質等を保護する機能を有している。当研究室ではこの LEA タンパク質内の繰り返し配列をモチーフとして LEA ペプチドを設計し、大腸菌内で目的タンパク質と共発現させると目的
タンパク質の発現量が増大することを報告してきた。元来、LEA タンパクは
様々なストレス耐性に関与するタンパク質である。LEA タンパクの発現により塩・熱ストレス耐性が向上する報告があることから、LEA ペプチドも同様に耐性を向上させるのではないかと仮説をたて実験・検証を行ったところ、LEA ペ
プチドの発現により塩・熱ストレス・紫外線耐性が向上することを見出してきた。本研究では、変異を導入した LEA ペプチドを大腸菌に発現させることにより、大腸菌に対する酸耐性の評価をおこなう。
【実験方法と結果】
pET 系の発現ベクターに各 LEA ペプチド遺伝子を導入し、発現ベクターを構築した。その形質転換大腸菌に発現誘導剤（IPTG）を添加し、細胞内に各 LEAペプチドを発現させた。4 時間培養した形質転換大腸菌を回収し、異なる pH の
LB 培地で培養し、その後コロニーカウント法および WST を用いた細胞活性測
定により酸耐性を評価した。その結果、塩基性アミノ酸を導入した変異 LEA ペ
プチドの発現株において優位にコロニー数および細胞活性が増加した。本結果
より、LEA ペプチドが塩、熱ストレス、紫外線ストレスのみならず酸への耐性も強化し、様々な細胞ストレスに対して耐性を向上させることを示した。現在、その耐性が向上するメカニズムの解明を研究している。

Characteristic analysis of membrane vesicles of a bacterial isolate 51-CS
from Sagami Bay

In vivo expression of LEA peptide for enhancing acid tolerance in
Escherichia coli

○Mizuki Fukui1, Atsushi Kurata2, Yuki Miyoshi3, Shino Yamasaki-Yashiki4,
Tomoya Imai5, Tatsuo Kurihara6, Kouichi Uegaki2(1Grad. Sch. Agric. Kinki Univ., 2Fac. Agric., Kinki Univ., 3Grad. Sch. Sci. Eng.,
Kansai Univ., 4Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ., 5RISH, Kyoto Univ., 6Inst.
Chem. Res., Kyoto Univ.)
Key words
membrane vesicles, deep-sea sediment, Bacillus subtilis 51-CS, IgAenhancing effect2Ip08

大腸菌の nlpI 遺伝子が外膜小胞の生産量および特性に与える影響○Shinya Ikeno1, Khaled Metwally1,2(1Grad. Sch. Life Sci. Syst. Eng., Kyushu Inst. Technol., 2Fac. Agric. Ain Shams
Univ.)

Key words

Escherichia coli, abiotech stress, LEA peptide, acid tolerance

2Ip10

光学的特性を選択可能な金ナノ粒子グリーン合成ペプチドの効率的探索○尾島 由紘, 児波 克哉, 澤邊 朋美, 東 雅之
（阪市大院・工）ojima@bioa.eng.osaka-cu.ac.jp○田中 祐圭, 林 美伶, 高橋 雄太, 大河内 美奈（東工大・物質理工）
okochi@chemeng.titech.ac.jp【目的】近年，大腸菌を含むグラム陰性細菌が生産し、外膜やペリプラズムタン
パク質から構成される外膜小胞(outer membrane vesicles; OMVs)と呼ばれる細胞
外小胞に注目が集まっている．大腸菌の nlpI 遺伝子は外膜に存在するリポタン
パク質をコードしており，欠損によりペプチドグリカンの分解が促され，OMVs
生産量を増加させる事が報告されている．そこで本研究では，nlpI 欠損が OMVsの量的および質的に与える影響について調べた．
【方法および結果】BL21(DE3)と nlpI 欠損株の培養上清から超遠心分離により
OMVs を回収し，含まれるタンパク質量とリン脂質量を基準として生産量を評価した．タンパク質量は SDS-PAGE に基づく外膜タンパク質のバンド強度から，リン脂質量は蛍光染色試薬 FM4-64 を用いて蛍光強度から比較したところ，
タンパク質基準で野生株の約 4 倍，脂質基準では約 2 倍の OMVs 生産量となった．この結果から nlpI 遺伝子の欠損が OMVs のタンパク質と脂質の組成に影響を与えた可能性が考えられる．また TEM 観察やナノ粒子マルチアナライザーを用いた分析によって，nlpI 欠損株が生産した OMVs は粒子径が小さくなる傾向が示された．以上より，nlpI 遺伝子の欠損は大腸菌 OMVs の生産量を増加させるだけでなく，構成成分や粒子径などの特性にも影響を与えることがわかった．

環境負荷のかからないナノ粒子合成（グリーン合成）技術の開発が求められている。近年、多様性に富むペプチドライブラリーから、温和な条件でナノ粒子合成を触媒する配列が同定されている。そこで本研究ではペプチドアレイ技術を利用し、スポットの色調により合成される粒子の光学特性情報を取得できる、新たな金ナノ粒子合成触媒ペプチドの探索技術の開発を実施した。
これまでに取得している金粒子結合性をもつ 200 配列のペプチドアレイを金イオン溶液に浸漬することで、各ペプチドの粒子合成触媒活性を評価した。本手法では各ペプチドにより合成された粒子が同スポットに沈着し、画像解析により合成された粒子の光学物性情報を取得が期待される。そこで、得られたアレイの画像解析を Image J により行い、粒子合成に伴い各スポットが示す色調をもとに、各ペプチド配列を赤(R)、青(B)、緑(G)に分類した。特徴的な色調を示
す粒子を合成するペプチドについては粉末合成し、溶液中で金イオン溶液と混合することでナノ粒子を合成し、紫外可視分光法、透過型電子顕微鏡（TEM）
によって粒子のキャラクタリゼーションを行った。
色調の分類により選択されたペプチドを用いて合成された金ナノ粒子の粒径は、R、G、B ペプチドでそれぞれ 8.9±1.9 nm、2.6±1.2 nm、34.7±6.7 nm であり、吸収スペクトルからも形状やサイズが異なることが確認された。また、各色調を示す金ナノ粒子を合成するペプチド配列内のアミノ酸出現頻度の結果から、触媒ペプチド内のヒスチジンの存在により、合成される粒子サイズを規定できる可能性が示唆された。今後、取得したペプチドライブラリーの解析を詳細に実施することで、粒子合成制御のメカニズムを理解することで温和な条件での緻
密な粒子合成に向けたペプチド配列のデザインが可能になることが期待される。

Effects of nlpI gene on the production and properties of outer membrane
vesicles of Escherichia coli

Effective peptide screening for optical property selective gold nanoparticle
green-synthesis○Yoshihiro Ojima, Katsuya Konami, Tomomi Sawabe, Masayuki Azuma(Grad. Sch. Eng., Osaka City Univ.)

Key words

Escherichia coli, outer membrane vesicles, nlpI

○Masayoshi Tanaka, Mirei Hayashi, Yuta Takahashi, Mina Okochi(Sch. Mater. Chem. Technol., Tokyo Tech)

Key words

gold colloid, peptide, biosynthesis

226

2Ip11

爆発性芳香族化合物の簡便・迅速な検出に向けた TNT
認識ペプチド修飾量子ドットの作製

2Ip13○児美川 拓実 1, Tamang Abiral 2, 田中 祐圭 1, Critchley Kevin 2,
Evans Stephen 2, 大河内 美奈 1
（1東工大・物質理工, 2Sch. Phys. Astron., Univ. Leeds）
okochi@chemeng.titech.ac.jp

生体膜透過性・水溶性の一挙改善を志向した機能性低分子化合物の oligo(beta-Lys)修飾○兼田 康平 1, 武内 大和 1, 加藤 康夫 2, 丸山 千登勢 1, 濱野 吉十 1（1福井県大院・生物資源, 2富山県大・生医工研セ）
hamano@fpu.ac.jp

昨今のテロ事件の増加を受けて、爆発物の迅速かつ簡便なオンサイト検出の需要が高まっている。これまでに、表面プラズモン共鳴や電気化学インピーダン
スセンサを用いたオンサイト検出デバイスが開発されてきたが、いずれも装置の校正および検出に時間が要するなど、実用化に向けた問題が指摘されている。
そこで本研究では、対象を代表的な爆発性化合物である 2,4,6-Trinitrotoluene（TNT）とし、量子ドットを用いた蛍光による迅速かつ簡便な検出法の開発を目指した。具体的には、以前探索した TNT 結合性ペプチドを表面に固定化した
CdTe/CdS コアシェル型量子ドットを使用し、TNT 添加時の蛍光変化からの検出を試みた。また、類似構造を持つ分子に対する選択性についても評価した。
まず、CdTe/CdS コア/シェル型量子ドットを合成し、透過型電子顕微鏡による粒径分布の取得、および蛍光分光光度計による蛍光スペクトル測定を行った。
次に、TNT 抗体からペプチドアレイ技術を用いてスクリーニングした TNT 結合性ペプチド(ARGYSSFIYWFFC)を量子ドット表面にリガンド交換反応によって固定化し、動的光散乱および表面電荷からペプチドの固定化を確認した。その後、量子ドットに対して TNT 溶液を滴下した際の蛍光スペクトルの変化を測定した。この結果から、TNT 滴下後 1 分以内に量子ドットの蛍光が消光することが確認され、検出限界は 228 ppb であった。また、他の類似化合物に対する一定の選択性も確認された他、感度は劣るもの UV ランプ下での肉眼での検出も可能であった。これらの結果より本技術は、新たなオンサイトでの迅速かつ簡便な爆発物検出法としての可能性を持つことが示唆された。

【目的】化合物の水溶性を確保しつつ生体膜透過性を改善する新しい化学修飾技術を開発できれば、現在の創薬スピードを加速させることができる。そこで、我々は放線菌 Streptomyces rochei NBRC12908 が生産する抗生物質 streptothricin（ST）の beta-lysine oligopeptide [oligo(beta-Lys)] 構造に着目した。oligo(beta-Lys)
構造は、1~7 残基の beta-Lys がイソペプチド結合で直鎖状に結合したポリカチ
オン性ペプチドであり、ST の高い水溶性と生体膜透過性に寄与する構造モチー
フであると考えられる。そこで本研究では、oligo(beta-Lys)構造の生体膜透過性を検証するとともに、種々低分子化合物を oligo(beta-Lys)修飾するための基盤技術を構築した。
【方法と結果】oligo(beta-Lys)にはアミノ基が多数存在し、有機化学的な手法にて低分子化合物を部位特異的に oligo(beta-Lys)で修飾するには極めて高度な合成技術が必要である。そこで本研究では、oligo(beta-Lys)の生合成酵素である Orf19の応用利用を試みた。ST の生合成において、Orf19 はフリーの beta-Lys（伸長基質） と Orf18 に結合した beta-Lys（アクセプター基質）を基質としてオリゴ
マー化（ペプチド合成）を触媒する。そこで、アクセプター基質の構造アナロ
グとして、beta-Lys-PEG3-azide を用いて酵素反応を行ったところ、興味深いことに、beta-Lys のオリゴマー合成活性を検出した。さらに、beta-homoLys-PEG3azide、alpha-Lys-PEG3-azide をアクセプター基質に用いて酵素反応を行ったとこ
ろ、驚くべきことに、beta-homoLys-PEG3-azide を用いた場合に最も効率良く
beta-Lys の鎖長伸長が進行した。現在、本法で合成した oligo(beta-Lys)n-PEG3azide 化合物を用いたクリックケミストリー法にて、蛍光色素の oligo(beta-Lys)
修飾を行っており、その生体膜透過性と水溶性の結果について報告する。

TNT binding peptide modified quantum dots fabrication for the simple andrapid detection of the explosive aromatic compounds.

Chemical modification of the bioactive small molecules with oligo(beta-Lys)for improving cell membrane permeability and water solubility.

○Takumi Komikawa1, Abiral Tamang2, Masayoshi Tanaka1, Kevin Critchley2,
Evans Stephen2, Mina Okochi1(1Sch. Mater. Chem. Technol., Tokyo Tech, 2Sch. Phys. Astron., Univ. Leeds)○Kohei Kaneda1, Yamato Takeuchi1, Yasuo Kato2, Chitose Maruyama1,
Yoshimitsu Hamano1(1Grad. Sch. Biosci. Biotec., Fukui pref. Univ., 2Biotechnol. Res. Center, Toyama
Pref. Univ.)

Key words

peptide, explosive detection, quantum dots

Key words

drug delivery system, enzyme production, peptide, Streptomyces sp.

2Ip12

機能性高分子の epsilon-poly-L-lysine 修飾による細胞内送達法の確立2Ip14

イネディフェンシンの Candida albicans に対するアポトーシス誘導効果の解析○武内 大和 1, 牛丸 和乗 1, 加藤 康夫 2, 丸山 千登勢 1, 濱野 吉十 1（1福井県大院・生物資源, 2富山県大・生医工研セ）
hamano@fpu.ac.jp○小川 広大 1, 落合 秋人 1, 田中 孝明 1, 提箸 祥幸 2, 谷口 正之 1
（1新潟大・自然研, 2農研機構・北農研）
ottie@eng.niigata-u.ac.jp【目的】放線菌 Streptomyces albulus が生産する epsilon-poly-L-lysine（e-PL）は、
25~35 残基の L-lysine が直鎖状につながった天然の塩基性ペプチドである。これまでに我々は、e-PL の生合成機構を解明しており（Nat. Chem. Biol., 4, 766,
2008）、e-PL 合成酵素の基質特異性を応用し、e-PL のカルボキシ末端に種々官能基を導入できることを見出した。例えば、e-PL 生産菌を HO-PEG4-azide 含有培地で培養するだけでクリックケミストリーに利用可能な e-PL-PEG4-azide が生産される。e-PL は、その化学的特性から生体膜透過性が期待され、実際にクリックケミストリーにて蛍光色素を e-PL 修飾したところ、e-PL は速やかに動物細胞内に送達することを確認した。そこで本研究では、e-PL-PEG4-azide が機能性高分子に生体膜透過性を付与する化学修飾分子として利用できるか検証した。
【方法と結果】タンパク質や酵素、抗体などの高分子化合物はその大きな分子サ
イズが足枷となり、生体膜を透過しない。そこで、これらを e-PL 修飾すること
で生体膜透過性を付与できるか、蛍光タンパク質 monomeric Azami Green（mAG）をモデル高分子化合物として検証した。組換え酵素として得た mAG の酵素表面に化学的に dibenzocyclooctyne (DBCO)基を導入し、azide/DBCO のク
リックケミストリーを介して mAG の e-PL 修飾を行った。得られた e-PL 修飾
mAG の生体膜透過性を HeLa 細胞で確認したところ、未修飾の mAG と比較して、顕著な生体膜透過性が確認された。また、ATP 依存的な能動輸送が抑制される低温環境下においても細胞内への取り込みが観察されたことから、他の塩
基性ペプチドと同様に能動輸送とは異なる経路でも細胞内に送達されることが示唆された。さらに現在、e-PL 修飾した酵素が細胞内で正常に機能するか、Cre
recombinase をモデルとして検証を進めており、その結果についても報告する。

【目的】近年、真菌感染症においても薬剤耐性菌の増加が問題となっており、新薬の開発が求められている。当研究室では、多段階の作用機序により耐性菌を発現しにくいと期待されるディフェンシンに着目した。これまでに、イネ由来
ディフェンシン OsAFP1 が、ヒト病原性真菌 Candida albicans に対してアポトー
シスを誘導することにより抗真菌活性を示すことを見出した。本研究では、カスパーゼの活性化を評価することにより、アポトーシス誘導における主要経路を明らかにした。また、真菌の細胞膜を構成する脂質との結合特異性を評価することにより、アポトーシス誘導における OsAFP1 の具体的な標的分子を探索した。
【方法と結果】使用する OsAFP1 は、大腸菌発現系を用いて組換えタンパク質として大量調製した。まず、開始型であるカスパーゼ 8 および 9、実行型である
カスパーゼ 3 の活性化を評価した。C. albicans 細胞（OD650 = 0.0125）に終濃度
16 μM の OsAFP1 を処理し、各カスパーゼの活性化を検出する FITC 標識 FLICAを処理後、蛍光顕微鏡を用いて観察した。その結果、カスパーゼ 9 および 3 の蛍光が強く観察され、カスパーゼ 8 の蛍光が観察されなかったことから、OsAFP1
は内因性経路によってアポトーシスを誘導していることが明らかになった。次に、細胞膜を構成する脂質をニトロセルロース膜上に固定した PIP Strip に
2.5μg/ml の OsAFP1 を処理して結合させ、抗体反応後、化学発光法を用いてOsAFP1 の局在性を検出することにより標的分子を探索した。その結果、OsAFP1
はホスファチジルイノシトール 3 リン酸（PI(3)P）に強く結合したことから、
C. albicans 細胞の細胞膜に存在する PI(3)P の 3 位のリン酸基を標的としてアポトーシスを誘導する可能性が示唆された。現在、標的分子の認識メカニズムの解明を目指し、X 線結晶構造解析を進めている。

Intracellular delivery of macromolecules modified with epsilon-poly-Llysine

Analysis of apoptosis induction of rice defensin against Candida albicans○Yamato Takeuchi1, Kazunori Ushimaru1, Yasuo Kato2, Chitose Maruyama1,
Yoshimitsu Hamano1(1Grad. Sch. Biosci. Biotec., Fukui pref. Univ., 2Biotechnol. Res. Center, Toyama
Pref. Univ.)

Key words

drug delivery system, click chemistry, polycation○Kodai Koudai1, Akihito Ochiai1, Takaaki Tanaka1, Yoshiyuki Sagehashi2,
Masayuki Taniguchi1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Niigata Univ., 2HARC/NARO)

Key words

defensin, apoptosis, caspase, lipid binding

227

2Ip15

イネにおける新規な抗真菌タンパク質の探索○三井田 篤志 1, 落合 秋人 1, 田中 孝明 1, 提箸 祥幸 2, 谷口 正之 1
（1新潟大・自然研, 2農研機構・北農研）
ottie@eng.niigata-u.ac.jp

2Ip17

ペプチドアレイを利用した環状ペプチドの構造と配列の最適化
小崎 一功 1, 鈴木 健弘 1, 清水 一憲 1, ○本多 裕之 1,2（1名大院・工, 2名大・予防早期医療創成セ）
honda@chembio.nagoya-u.ac.jp【目的】ディフェンシンは、約 50 残基のアミノ酸からなる抗菌タンパク質の一種である。当研究室では、長い食経験を持つイネ由来ディフェンシン OsAFP1に着目した。これまでに、OsAFP1 はヒト病原性真菌 Candida albicans に対して強力な抗真菌活性を有することを明らかにし、断片ペプチドを用いた解析により、OsAFP1 の抗真菌活性に関わる部位を明らかにした。最近、OsAFP1 の活性部位において高い相同性を示すホモログタンパク質 OsAFP1p をイネゲノム中に見出した。そこで本研究では、OsAFP1p の組換えタンパク質を調製し、C. albicansに対する抗真菌活性を測定することにより、OsAFP1p の抗真菌薬としての可能性を検証した。
【方法と結果】 OsAFP1p の発現プラスミドを大腸菌 Rosetta-gami (DE3)株に導入することにより組換えタンパク質の大量発現系を構築した。この組換え大腸菌を 2000 mL の LB 培地において 16℃, 48 時間培養したときに OsAFP1p は最も高純度で安定的に発現した。発現させた組換えタンパク質は、2 段階のステップ
により高純度に精製した。C. albicans に対する抗真菌活性は、濁度と CFU を測定することにより評価した。前者は、終濃度 0.25 μM〜16 μM に調整した
OsAFP1p と終濁度 OD650 ＝ 0.01 の C. albicans と混合して 12 時間培養し、濁度を測定することにより評価した。後者は、同様に処理した菌液を寒天培地に散布し、コロニー形成単位(CFU)を計測することにより評価した。その結果、
OsAFP1 と類似して、OsAFP1p は終濃度 8 μM において抗真菌活性を示すことが明らかになった。既存の抗真菌薬の MIC は 0.1 μM 程度であることから、抗真菌薬としての利用には、その活性の強化が必要であるかもしれない。また、
OsAFP1 と配列相同性を示さない 33％のアミノ酸残基が抗真菌活性に関与しな
いことも示唆された。

【背景と目的】環状ペプチドは高い分子認識能、酵素分解耐性などの特徴をもち、新薬開発の候補分子として注目されている。本研究では、活性の高い環状ペプチドを取得する新規探索手法の開発を目指した。ペプチドアレイ技術を利用して、環状ペプチドの環の長さと構成するアミノ酸の 2 点に注目して、ペプチドの最適化を試みた。
【方法と結果】セルロースメンブレン上に配列中に Cys (C)を 2 つ含むペプチドを合成し、酸化反応によってジスルフィドを形成させてペプチドの環化を行った。ペプチドを合成したメンブレンを切り出し、96 ウェルプレートに入れてCalcein で染色した細胞を播種し、ペプチドに対する細胞接着量を蛍光値で評価した。本研究では、新生血管やがん細胞の細胞膜に存在する CD13 に結合する
NGR 配列を含む環状ペプチドを設計し、CD13+の細胞であるヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の接着を評価した。まず、Ala (A)で長さを調節したアミノ酸 5~13残基からなる環状ペプチドを合成し、最適なペプチド骨格を検討したところ
8~10 残基のペプチドが比較的高い細胞接着能を示した。このため 9 残基のCAANGRAAC を骨格として選択し、ペプチドのアミノ酸配列の最適化を行った。まず、配列中の A を 1 つずつ C 以外のアミノ酸 18 種に置換したところ、
N 末端から 3, 7 残基目を His (H)に置換したペプチドが高い接着能を示した。次に、3, 7 残基目を H に置換した 3 種のペプチド CAX1NGRX2AC (X1:X2=H:H, H:A,
A:H)を元に、残りの A 部分の最適化を行った。アミノ酸を構造や物性を元に 8グループに分け、2 箇所の A を同時に網羅置換したペプチド 64 種を評価した。
その結果、既報の高接着ペプチド(KCNGRC）の約 2.6 倍の接着能を示すペプチ
ド配列の取得に成功した。
[1] Soudy, R., et al., ACS Comb. Sci., 14, 11 (2012)

Screening of novel antifungal proteins from rice

Optimization of cyclic peptide structure and sequence using peptide arraysystem.

○Atsushi Miida1, Akihito Ochiai1, Takaaki Tanaka1, Yoshiyuki Sagehashi2,
Mayayuki Taniguchi1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Niigata Univ., 2HARC/NARO)

Ikko Kozaki1, Takehiro Suzuki1, Kazunori Shimizu1, ○Hiroyuki Honda1,2(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2PME. Nagoya Univ.)

Key words

defensin, antifungal activity, Candida albicans, rice

Key words

peptide array, cyclic peptide, peptide screening, NGR peptide

2Ip16

ヒト iPS 細胞の未分化増殖を可能にする新規ペプチド化
合物の分子進化工学的スクリーニング法による探索及び人工 FGFR アゴニストとしての機能解析

2Ip18

ジスルフィド架橋によるヘテロ二量体ペプチド合成法の開発と細胞内機能性ペプチド探索系への応用○小崎 一功 1, 清水 一憲 1, 本多 裕之 1,2（1名大院・工, 2名大・予防早期医療創成セ）
honda@chembio.nagoya-u.ac.jp○佐藤 将 1, 大貫 喜嗣 1, 升井 伸治 1,2, 川上 隆史 1,3,4, 黒澤 尋 1（1山梨大院・医工総, 2山梨大学・発生研セ, 3JSTさきがけ, 4MEXT
卓越研究員）
kurohiro@yamanashi.ac.jp

ヒト iPS 細胞などの多能性幹細胞は再生医療や創薬への応用が期待されており、分化させた目的細胞を大量に調製するために多能性幹細胞を試験管内で効率よく増殖させる研究が進められている。現在ヒト iPS 細胞の未分化維持培養には塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）が汎用されている。bFGF は線維芽細胞増
殖因子受容体（FGFR）のリガンドタンパク質であり、細胞膜上の糖鎖である
ヘパラン硫酸への結合を介して bFGF が二量体化することにより、FGFR の二量体化・自己リン酸化が引き起こされ、下流のシグナル伝達が促される。しかし、bFGF はプロテアーゼ分解や熱失活を受け易く、37℃の培養条件下において短時間で失活してしまうという欠点がある。そのため、新鮮な bFGF を繰り返し培地へ添加して細胞培養を行う必要があり、操作繁雑性やコストの増加という問題点が存在している。従って、ヒト iPS 細胞の未分化維持培養を可能にする bFGF の機能を模倣しつつ、かつ、より安定性の高い代替分子の開発が現在求められている。
本研究では、人工 FGFR アゴニストの開発を目的とし、ペプチド化合物ライブ
ラリーからの分子進化工学的スクリーニング法を用いて、FGFR の細胞外ドメインに特異的に結合する新規人工ペプチド化合物の探索を行い、同定することに成功した。得られた新規人工ペプチド化合物は bFGF と同等の結合力で FGFRと結合することが機能解析の結果判明した。
本発表では、新規人工ペプチド化合物の更なる機能解析の結果と、それを用いてヒト iPS 細胞の未分化維持培養を試みた結果について発表する。

【背景と目的】我々は細胞膜透過性ペプチド(CPP)とペプチドアレイ技術を組み合わせた細胞内機能性ペプチド探索系の構築に成功してきた[1, 2]。しかし、
CPP の付加は機能性ペプチドの活性に影響を与えることが懸念される。本研究では、細胞内の還元環境で分解されるジスルフィド結合で CPP と機能性ペプチ
ド間を架橋できる合成法を開発し、CPP の影響を排除した新規細胞内機能性ペプチドの探索系構築を目指した。
【方法と結果】セルロースメンブレン上に Fmoc-Lys(ivDde)-OH を合成し、主鎖に光切断リンカー、システイン(C)、CPP を、側鎖に光切断リンカー、C、機能性ペプチドをそれぞれ合成した。酸化反応により主鎖、側鎖間でジスルフィドを形成させ、UV 照射で CPP-機能性ペプチド複合体を切り出した。質量分析により、目的ペプチドの選択的な合成と、還元剤処理によるジスルフィドの分解を確認した。また、既報[3]の細胞死誘導ペプチド(WELVVLGKL)と CPP をジス
ルフィドで架橋し、HeLa 細胞に添加して WST-8 assay による細胞生存率評価
で、ペプチドの細胞死活性評価を行った。合成ペプチドは高い細胞死活性を示したことから、開発した系を用いてペプチドの細胞内機能評価が可能であることが示された。最後に、1 アミノ酸置換体(162 種)を合成し、活性評価を行った。その結果、アミノ酸置換による細胞死活性の変化を確認し、有意に細胞死活性の高い複数のペプチド配列を取得した。また、アミノ酸の位置と性質が細胞死活性と関連することが示唆された。
[1] Matsumoto, R., et al., Scientific Reports, 5, 12884 (2015)[2] Kozaki, I., et al., J. Biosci. Bioeng., 124, 2 (2017)[3] Araujo, C. et al., J. Biol. Chem., 289, 24 (2014).

Ultra-high-throughput screening and function analysis of novel cyclic Nalkyl peptides for the proliferation of human iPS cells in undifferentiatedstate as artificial FGFR agonists.

Development of heterodimeric peptide synthesis method by disulfide bridge
and application to intracellular functional peptide screening systems.

○Masashi Sato1, Yoshitugu Ohnuki1, Shinji Masui1,2, Takashi Kawakami1,3,4,
Hiroshi Kurosawa1(1Grad. Sch. Med. Eng., Univ. Yamanashi, 2ABC, Yamanashi Univ, 3JST, PRESTO,
4
MEXT, LEADER)
Key words
bFGF, FGFR agonist, human iPS cells, peptide○Ikko Kozaki1, Kazunori Shimizu1, Hiroyuki Honda1,2(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2PME. Nagoya Univ.)

Key words
bondpeptide array, cell penetrating peptide, peptide screening, disulfide

228

2Jp01

新規人工タンパク質超分子 TIP60 のアセンブリ制御に向けたサブユニット間相互作用の解析

2Jp03○大原 直也 1, 川上 了史 2, 宮本 憲二 2
（1慶大院・理工, 2慶大・理工・生命情報）
kmiyamoto@bio.keio.ac.jp

カイコ発現系を用いた White Spot Syndrome Virus（WSSV）抗原タンパク質の発現および評価○中西 崇文 1, Boonyakida Jirayu 1, Xu Jian 2, 佐藤 純 3,
加藤 竜也 1,2, 朴 龍洙 1,2（1静大・創科技院, 2静大・グリーン科技研, 3国立研究法人水産研究・教育機構）
park.enoch@shizuoka.ac.jp

ウイルスキャプシドやフェリチンのようなタンパク質によるケージは、幅広い応用が期待される。これまで、オリゴマータンパク質の融合や計算機を用いた方法により多くのタンパク質超分子が人工的に作られてきた。我々のグループ
では、多面体の幾何学に基づき 5 回対称タンパク質 Lsm と 2 回対称タンパク質
MyoX の融合タンパク質を設計し、アニオン性切頂二十面体型中空タンパク質
超分子、TIP60(Truncated Icosahedral Protein 60-mer)の構築に成功した。TIP60 は高い対称性、均一性を持ち、内外に導入されたシステイン残基は化学修飾が可能である。またカチオン性タンパク質や金属イオンの添加に応答してさらなる巨大な構造を形成する。このことから、TIP60 はタンパク質ケージとして、あるいはナノビルディングブロックとしての利用が期待できる。さらに、最近我々
は外部因子の添加により TIP60 のアセンブリを in vitro で可逆的に制御することを目指し、まず変異導入により TIP60 のアセンブル機構について詳細に解析した。その結果、サブユニット界面に位置する少数の電荷を持つアミノ酸残基が水素結合ネットワークを形成し、アセンブルに大きく寄与していることが明らかとなった。また、いくつかの変異体は電気泳動による解析で、完全な 60-merに加えて 15-mer や 30-mer と推測される複数の構造が共存していることを確認
し、in vitro での可逆的アセンブルの実現可能性が示唆された。本研究の進展に
より構造のダイナミクスを組み込んだ新規なタンパク質超分子の設計を示すことができると考える。

【目的】White Spot Syndrome Virus (WSSV）とは、ニマウイルス科ウィスポウイ
ルス属に属するウイルスであり、ロッド状のヌクレオカプシドに VP15、VP24
および VP26 タンパク質が存在し、その外側のエンベロープに VP19、VP28 タ
ンパク質が存在する。このウイルスは主にエビやその他甲殻類に感染し、感染したエビは２週間で死に至る。現在クルマエビの養殖に莫大な被害を及ぼしているが、未だにこのウイルスに対しての効果的な対策がない。本研究では、これらウイルス抗原タンパク質をカイコ発現系を用いて発現して精製を行い、クルマエビへのウイルス感染実験でワクチンとしての評価を行った。
【方法及び結果】C 末端に FLAG タグを挿入した、上記 5 つの抗原タンパク質を発現する組換えカイコ核多角体病ウイルスバクミドを作製し、カイコ培養細胞で組換えウイルス調製を行った。組換えウイルスをカイコ幼虫または蛹に注射し、３日後脂肪体を回収した。回収した脂肪体から、Anti-FLAG ビーズを用いて抗原タンパク質を精製した。5 つの抗原タンパク質 VP15、VP19、VP24、
VP26、VP28 をそれぞれ 245 μg、313 μg、278 μg、332 μg、381 μg 精製できた。
またそれら抗原タンパク質をクルマエビに筋肉注射 21 日後(20μg/g エビ) に人為攻撃を行い、その後 15 日間エビの観察を行った。対照群の死亡率が 60%であったのに対し、構造タンパク質の 1 つである VP15、VP26 の死亡率はそれぞれ40%、44%であった。この結果から VP15、VP26 で WSSV に対するワクチン効
果が示唆された。

Analysis of the interaction mechanism of newly designed protein
supramolecule TIP60

Production of Five Antigens of White Spot Syndrome Virus (WSSV) in
Silkworm and Evaluation○Naoya Ohara1, Norifumi Kawakami2, Kenji Miyamoto2(1Grad. Sch. Sci. Tech., Keio Univ., 2Dept. Biosci. Info., Keio Univ.)

Key words

protein supramolecule, self-assembly, mutagenesis

2Jp02

中空・多孔構造を有する人工タンパク質ナノ粒子 TIP60の機能化○Takafumi Nakanishi1, Jirayu Boonyakida1, Jian Xu2, Jun Sato3, Tatsuya Kato1,2,Park Enoch Y1,2
(1Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka
Univ., 3National Research Institute of Aquaculture, Japan Fisheries Research and
Education Agency)
Key words
White spot syndrome virus, Shrimp, Silkworm, Recombinant Protein

2Jp04○那須 英里圭 1, 川上 了史 2, 宮本 憲二 2
（1慶大院・理工, 2慶大・理工・生命情報）
kmiyamoto@bio.keio.ac.jp

外来タンパク質を内包するナノ粒子タンパク質発現系の構築
石原 沙季, 立田 祐琳亜, 岡 拓二, ○平 大輔（崇城大・生物生命）
hira@life.sojo-u.ac.jp【背景・目的】 人工タンパク質ナノ粒子は、高い構造の均質性や生体適合性が見込まれ、変異導入による設計的な機能化が可能なことから、有用なナノ分子材料となることが期待されている。当研究グループは近年、中空の球状人工タ
ンパク質ナノ粒子 TIP60 の設計・構築に成功した。TIP60 は、5 角形を形成する
5 量体タンパク質 LSm protein と、それらを繋ぐ 2 量体タンパク質 Myosin X
coiled-coil を結合した融合タンパク質が自己組織化することで、六角形面に孔の空いたサッカーボール様の構造を形成する。TIP60 は、その中空で多孔構造を有するという特徴から、化合物を内包するナノカプセルとして機能すると期待される。そこで本研究では、TIP60 の構造を維持したまま、可逆的に化合物を内包・放出する系の構築を行った。
【方法・結果】 変異導入により、TIP60 の内側と外側にそれぞれ選択的にシステインを導入した変異体を作製した。まず、マレイミドを有する化合物で修飾実験を行い、TIP60 の内外のシステインがそれぞれ修飾可能であることを明らかにした。さらに、添加する化合物の大きさと TIP60 内部への侵入可能性の関係
を分子量の異なる 4 種類の Methyl-PEGn-Maleimide で修飾実験を行い、その修飾率を内外のシステインで比較することで明らかにした。その結果、化合物の分子量の増加に伴って内側のシステインは外側のシステインと比較して顕著に修飾率が低下し、TIP60 内部への化合物の侵入可能性が TIP60 表面の孔を通過できる化合物の大きさに依存することが示唆された。また、内側にシステインを導入した変異体で、チオールを有する化合物による修飾を行い、ジスルフィ
ド結合の形成と解離で化合物が可逆的に内包・放出できることを明らかにした。

ナノ粒子タンパク質エンカプスリンは、1 種類のタンパク質の多量体化によって形成されたナノカプセルである。 60 または 180 量体が知られており、直径20〜30 nm 程度の正二十面体粒子が形成されると報告されている。さらに、エンカプスリンはその粒子の内部に別のタンパク質（荷物タンパク質）を特異的に封入するという性質を持っている。封入される荷物タンパク質は、その N 末端または C 末端に特有の十から数十残基のアミノ酸配列（標的ペプチドと呼ばれる）を有する。標的ペプチドが認識されることによって、荷物タンパク質はエンカプスリン粒子に特異的に組み込まれ、その荷物タンパク質が粒子内で機能して、鉄貯蔵および活性酸素の除去などに働くと考えられている。また、エンカプスリンを用いたドラッグデリバリーシステムへの応用も試みられているが、粒径制御や荷物タンパク質の封入量の制御は実現されていない。
そこで本研究では、好熱菌 Geobacillus kaustophilus 由来のエンカプリン（GkEnc）
について大腸菌発現系を構築し、ナノ粒子形成を調べた。さらに荷物タンパク質のモデルとしてミオグロビン、緑色蛍光タンパク質（GFP）等を用いて、これらの遺伝子に標的ペプチドを融合した上で共発現させることで、GkEnc 粒子に封入できるかどうかを調べた。GkEnc を単独で発現精製した試料を電子顕微鏡で観察したところ、直径約 40 nm のナノ粒子の形成が確認できた。また、
GkEnc とミオグロビンや GFP 等との共発現を SDS-PAGE で確認したところ、
GkEnc に加えて荷物タンパク質のバンドも明確に確認された。これらのことか
ら、GkEnc ナノ粒子に荷物タンパク質を高効率に封入することが可能であると考えられた。さらに、荷物タンパク質に融合する標的ペプチドを変異させることで、GkEnc に封入される荷物タンパク質量の制御が可能であることが示唆された。

Functionalization of a Porous Hollow Artificial Protein Nanoparticle TIP60

Construction of expression system of protein nanoparticle capsulating atarget protein○Erika Nasu1, Norifumi Kawakami2, Kenji Miyamoto2(1Grad. Sch. Sci. Tech., Keio Univ., 2Dept. Biosci. Info., Keio Univ.)

Key words

protein nanoparticle, chemical modification, nanocapsule

Saki Ishihara, Yuria Tatta, Takuji Oka, ○Daisuke Hira
(Fac. Biotechnol. Life Sci., Sojo Univ.)

Key words

encapsulation, protein expression, expression system

229

2Jp05

GroEL/GroES 複合体を利用した生細胞へのナノ粒子薬剤局所送達システムの検討

2Jp07○根木 麻耶加 1, 依田 ひろみ 2, 小池 あゆみ 1,2（1神奈川工大院 応用化学・バイオサイエンス, 2神奈川工大 バ
イオメディカル研究センター）koike@bio.kanagawa-it.ac.jp

自己ユビキチン化能を有する人工 RING finger の作製法
○宮本 和英, 中谷 有沙, 齋藤 一樹（姫路獨協大・薬）miyamoto@himeji-du.ac.jp

GroEL/GroES 複合体は、カプセル構造をしたタンパク質で、細胞内の変性タン
パク質を GroEL が捕捉し、続いて ATP と GroES が結合すると、直径 5 nm の閉鎖空間に変性タンパク質を落とし込みフォールディングを介助する。ATP が加水分解され ADP になると、GroES が解離することに伴い内包物が放出される。
このため、ATP 加水分解活性低下型変異体は GroEL/GroES 複合体維持時間を延長することも分かっている。我々は、GroEL/GroES 複合体が生細胞へのナノ粒
子薬剤局所送達システムに利用できると考え、複合体を１２日間維持できる
GroELD52,398A 変異体と、核移行シグナル（AhR）を N 末端に融合した GroES 変
異体である GroESN-AhR の複合体を作製した。蛍光色素で標識した GroELD52,398A/
GroESN-AhR 複合体に GFP を内包し、CHL 細胞に添加したところ、GroELD52,398A/
GroESN-AhR/GFP は 24 時間以内で細胞質に、48 時間以内で核に到達した。そこで今回、細胞膜透過効率を向上する目的で、Arg に富んだ膜透過ペプチド（PTD）
を GroESN-AhR の N/C 末端に融合し、複合体安定性と細胞膜透過性を比較した。
精製した PTD 融合 GroES 変異体は、野生型 GroES と混合して一晩おくことでヘテロ７量体を形成し、GroELD52,398A と安定な複合体を形成することがゲル濾
過クロマトグラフィーによる解析でわかった。そこで、蛍光標識した
GroELD52,398A/ PTD 融合 GroESN-AhR 複合体を CHL 細胞に添加したところ、N 末端
PTD 融合 GroESN-AhR では、細胞添加後 5 時間以内に細胞質に、4〜7 時間で核に到達したことが顕微鏡観察で確認できた。シグナル配列と PTD を組み合わせることで、簡単に効率的局所送達が可能になると考えられる。

【背景】生体内では、構造異常などが原因で不要となったタンパク質を分解・管理等する品質管理機能であるユビキチン化がある。ユビキチン化は、基本的にユビキチン活性化酵素(E1)、ユビキチン結合酵素(E2)およびユビキチンリガー
ゼ(E3)の 3 つの酵素が関与しており、ユビキチンが E1 から E2 に転移し、そして E3 を介して基質に付加される。ユビキチン化は、細胞の機能維持に重要な働きをしている他、乳がん、白血病などの疾患に関わることが報告されている。
これら疾患に罹患すると E2 酵素の発現量が変化する。しかしながら、ユビキ
チン化反応は E2-E3-基質の組み合わせが複数あることで多様性を示すので、複雑なカスケード反応となっている。この理由により、これまで E2 活性を定量的に計測するのは困難であるとされてきた。そこで、我々は、人工 RING finger(ARF)を作製し、それを活用する E2 活性の検出法を検討してきた。
【方法・結果】オリジナルの E3 は、その活性部位を通して、特異的に E2 と結合しユビキチンを基質に転移することができる。この E3 が有する E2 との特異的結合部位のみ（5 残基：PKLTC）を 38 残基のペプチドに移植して、ARF の設計・作製を行ってきた。ARF を活用することで、ユビキチン化に関連する
E2 活性の検出を行うことができる手法を開発してきた。今回、ヒト急性前骨髄性白血病細胞株の培養上清をサンプルとして、その中に含有される E2 活性の検出・測定を行ったので報告する。

Nanoparticle delivery system using GroEL/GroES complex to access theirtarget sites in living cell

Creation of artificial RING finger with auto-ubiquitination activity○Mayaka Negi1, Hiromi Yoda2, Ayumi Koike-Takeshita1,2(1Dept. Appl. Chemi. Biosci., Grad. Sch. Eng., Kanagawa Inst. of Tech., 2Biomed.
Res. Ctr., Kanagawa Inst. of Tech.)

1.K. Miyamoto et al., Protein Science, 28, 448-453 (2019).
2.K. Miyamoto et al., Methods in Molecular Biology, 1867, 75-87(2018).
3.K. Miyamoto et al., Protein Science, 27, 987-992(2018).
4.K. Miyamoto et al., Protein Science, 27, 1354-1363(2018) [Review]
5.K. Miyamoto et al., Protein Science, 27, 1704-1709(2018).
○Kazuhide Miyamoto, Arisa Nakatani, Kazuki Saito(Pharm. Sci., Himeji Dokkyo University)

Key words

GroEL/GroES, chaperonin, nanocarrier, delivery system

Key words

ubiquitination, ubiquitin ligase, peptide, ubiquitin

2Jp06

可逆的カチオン化転写因子タンパク質の生細胞内導入における効率と経路の検討

2Jp08

YFP 断片融合抗体プローブを用いたヒストン翻訳後修飾
検出系の構築○中野 智貴 1, 周 伯揚 2, 二見 翠 2, 二見 淳一郎 1（1岡山大院・統合科学, 2岡山理大・工）
p2uv6qh1@s.okayama-u.ac.jp○大室（松山） 有紀, 北口 哲也, 木村 宏, 上田 宏（東工大）
ueda@res.titech.ac.jp

本研究では細胞機能の制御を司る転写因子タンパク質の細胞内導入法の改善を目的とした。転写因子タンパク質は構造的にゆらぎが大きく凝集しやすい物性から、変性状態のタンパク質の SH 基を可逆的にカチオン化・可溶化して細胞内に送達し、細胞質内の還元的環境下で活性構造に巻き戻す in cell folding 法の最適化を進めた。肝臓特異的転写因子 HNF-4α タンパク質と人工転写因子
GAL4-VP16 タンパク質をモデルとして、各可逆的カチオン化タンパク質を調製し、カチオン化法と細胞導入時の添加物の検討、および細胞内導入経路を解析した。タンパク質のカチオン化条件としては、HNF-4α では平均分子量 1200 以
上のポリエチレンイミンの付加により導入効果が改善した一方で、GAL4-VP16の場合は、１価の一級アミンの付加でも十分な導入が確認された。この結果か
らタンパク質の細胞内導入の効率化にはカチオン化量だけでなく、タンパク質
自身の物性も関わることが示唆された。また GAL4-VP16 を用いた細胞内導入
実験では、阻害剤を用いた実験よりクラスリン依存性エンドサイトーシス経路
により取り込まれることが明らかとなった。さらに GAL4-VP16 の導入では、両親媒性ペプチドである Endo-PORTER との共導入により導入効率が劇的に改善した。蛍光標識した GAL4-VP16 を用いた実験では、Endo-PORTER の効果でエンドソーム内の GAL4-VP16 が生細胞内の細胞質に拡散する様子が確認された。以上の結果から、in-cell folding 法による転写因子タンパク質の細胞内導入
は、各タンパク質の物性に応じたカチオン化条件と添加剤の条件をそれぞれ最適化することで、細胞内導入効率が大幅に変動することが示唆された。

【背景】 タンパク質は、リン酸化・アセチル化等の様々な翻訳修飾により、その生理機能や局在が調整される。本研究では、細胞のがん化に関わるヒストン
H3 の 9 番目のリジン残基のアセチル化（H3K9ac）を認識する抗体に、YFP 断
片を融合させることによって、核内での YFP 再構成によるアセチル化反応の高感度検出を狙った。
【方法】 YFP を C 末 β ストランド（FP11）と残りの部分（FP1-10）に２分割す
ると、２断片が近接した時、元の全長 YFP の構造が形成される。本研究では、
H3K9ac を認識し、細胞内で機能的発現ができる１本鎖抗体（intrabody）1)にFP11 を融合させ、COS-7 細胞に、核移行シグナル（NLS）を融合させた FP1-10と共発現させた。ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤の添加によって、
H3K9 のアセチル化を誘導した時、FP11 融合 intrabody が H3K9ac に結合し、核内に局在している NLS-FP1-10 と近接することを期待して、再構成した YFP の蛍光検出を試みた。
【結果と考察】 HDAC 阻害剤であるトリコスタチン A、バルプロ酸、ボリノス
タットを COS-7 細胞に添加すると、核内に YFP の蛍光が観察された。さらに、各阻害剤の濃度依存的に、蛍光強度の増加が見られた。本系は、非可逆的な
YFP の再構成を原理とするため、脱アセチル化反応を検出できない反面、高感度に HDAC 阻害剤の効果を測定できることから、抗がん剤スクリーニング系として有用である可能性がある。
参考文献 1) Sato, Y et al. Sci. Rep. 3:2436 (2013).

study on rate limiting factor for intracellular delivery of reversibly
cationized transcription factor into mammalian cells

Development of post-translational modification detection system using YFP
fragment fused antibody

Key words
protein engineering, protein folding, transcriptional regulator gene,mammalian cell

Key words○Tomoki Nakano1, Hakuyo Shu2, Midori Futami2, Junichiro Futami1(1Grad. Sch. ISEHS., Okayama Univ., 2Fac. Eng., Okayama Univ. Sci.)○Yuki Ohmuro-Matsuyama, Tetsuya Kitaguchi, Hiroshi Kimura, Hiroshi Ueda
(Tokyo Tech)

post-translation, antibody, intrabody, fluorescent protein

230

2Jp09

抗体の配列柔軟性を利用した部分構造移植による機能性タンパク質の創出

2Jp11○阿久津 澪 1, 中澤 光 1, 二井手 哲平 1, 亀田 倫史 2, 宮田 健 3,
梅津 光央 1
（1東北大院・工, 2産総研・人工知能, 3鹿児島大・農）mitsuo@tohoku.ac.jp

抗がん抗原抗体が認識するエピトープ解析とがん免疫サ
イクル活性化の評価○吉岡 実咲 1, 本莊 知子 1, 木下 理恵 2, 二見 淳一郎 1（1岡山大院・統合科学, 2岡山大・医・細胞生物）
futamij@okayama-u.ac.jp

組換えタンパク質合成に用いる宿主細胞は様々であるが、中でも大腸菌発現系
は遺伝子操作が簡便かつ安価である。一方で、複雑な構造を持つタンパク質は大腸菌での発現が難しく、変異導入をするタンパク質の機能解析や産業応用に困難を伴う場合がある。そこで本研究では、難発現のタンパク質の機能部分構
造を、大腸菌でも発現しうる足場タンパク質に移植して、大腸菌発現可能な機
能性タンパク質を創出することを試みた。足場タンパク質としては、配列相同性が低くアミノ酸の変化に寛容な部分領域を持つ、抗体の可変領域断片に着目した。この領域は相補性決定領域（CDR）と呼ばれており、標的タンパク質に対する特異性に関与する。移植により CDR 領域へ機能構造を再構築する技術の開発を目指す。
まず X 線結晶構造解析を用いて移植する機能領域と交換される CDR 領域候補を選出し、双方の移植領域末端の距離差を考慮して数種のキメラ抗体を設計した。そしてこれらを大腸菌で発現させた結果、多くの変異体は野生型と同程度以上に発現した。円偏光二色性測定からは、調製した変異体の多くは野生型と大きく構造が変わらないことが分かった。また、その機能を ELISA で評価した
ところ、機能の付与に成功したことが分かった。これらの結果より、配列柔軟性の高い抗体に対して本移植設計を行うことで、機能化組換えタンパク質を創出しうることが示された。

【背景と目的】がん免疫サイクルの活性化ががん免疫治療の鍵となる．この際，がん細胞内に含まれる異常蛋白質が「がん抗原」が目印となり免疫応答が活性化し，細胞性免疫応答（腫瘍の殺傷）と同時に液性免疫応答も誘導され，複数の抗がん抗原抗体が血中で上昇する．この後者の自己抗体の変動は
pharmacodynamic（PD）バイオマーカーとなることが期待される．がん検出に用いられている各種の腫瘍関連蛋白質も健常人の血液中には存在しない蛋白質
であり，がん抗原として機能する可能性が示唆されている．これらの血中遊離抗原の特徴は、複数の SS 結合や糖鎖付加を有する剛直な構造タンパク質が多く、これらの抗原に対する自己抗体のエピトープ解析は、がん免疫サイクルを考察する上で非常に重要なデータとなる。
【方法】各種抗原をコードする cDNA 断片を PCR 法で取得し，Hek293 細胞での一過的な高発現が可能な SGE ベクターにクローニングし，FreeStyle293F 細胞
で分泌発現と精製を行った．Native 構造の抗原の一部は Cys 残基特異的な S-カチオン化修飾を施した変性・可溶化抗原も調製した.一部の抗原は Multiplex 磁
気ビーズに固定化する MUSCAT-Assay（Multiple S-cationized antigen beads array
assay）法により抗体価の測定に用いた．
【結果と考察】がん患者の血清中に存在する腫瘍関連抗原に対する自己抗体は多種多様であり、個人差が大きかった。また、同一抗原に対する反応性を比較す
ると、native 構造の構造エピトープではなく，変性抗原の配列エピトープを強く認識する抗体価が有意に上昇する例が大半であった．がん免疫サイクルの活性化に付随する液性免疫応答の機構から考察すれば本結果は合理的であり，全
配列エピトープを露出した MUSCAT-Assay 法で鋭敏にがん免疫サイクルの活性化がモニタリングできる可能性が示唆された．

Application of flexible sequence on antibody for chimeric functional protein.

Epitope analysis of anti-tumor antibody and evaluation of anti-tumor
immune cycle○Mio Akutsu1, Hikaru Nakazawa1, Teppei Niide1, Tomoshi Kameda2,
Takeshi Miyata3, Mitsuo Umetsu1(1Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 2AIRC, AIST, 3Fac. Agric., Kagoshima Univ.)○Misaki Yoshioka1, Tomoko Hojo1, Rie Kinoshita2, Junichiro Futami1(1Grad. Sch. ISEHS., Okayama Univ., 2Dept. cell biol. Med., Okayama Univ.)

Key words

protein engineering, antibody, CDR

Key words
biomarker

protein engineering, tumor associated antigen, antibody, cancer

2Jp10

エピゲノム薬を用いた複合免疫療法における診断薬開発
の基礎検討

2Jp12

部位特異的ビオチン化と refolding assay を組み合せた
neo-antigen スクリーニング法の開発○勝河 祐希, Ahmadi Hannaneh, 本莊 知子, 二見 淳一郎（岡山大院・統合科学）
pk060wia@s.okayama-u.ac.jp○峯苫 智晴 1, 垣見 和宏 2, 二見 淳一郎 1（1岡山大院・統合科学, 2東大病院・免疫細胞治療）
futamij@okayama-u.ac.jp

免疫チェックポイント阻害剤の登場でがん免疫サイクルの活性化が確実なオプションの 1 つとなった．がん免疫サイクルを活性化するためには，がんの「抗原性」が高い方が当然有利である．このがんの抗原性を規定する因子には体細胞変異に由来する変異抗原が知られているが，がん細胞でしばしば発現が認められる精巣特異的なタンパク質群である「Cancer-Testis(CT)抗原」も重要な共通がん抗原である．我々はがん免疫治療が奏功する際のバイオマーカーとして，末梢血で CT 抗原をはじめとした様々な自己抗体に着目し，これらの抗体価を高感度に定量評価する抗体検査診断薬を開発中である．現在，免疫チェックポ
イント阻害剤単独では奏功しない cold-tumor に対して，様々な複合免疫療法の開発が期待されている．その一例として，DNA 高メチル化などのエピジェネ
ティック異常を制御するエピゲノム薬には，がん抗原の発現を向上させる効果もあり，免疫チェックポイント阻害剤との併用が提唱されている．本研究では各種のがん細胞株に対してエピゲノム薬処理により発現誘導されやすいがん抗原を特定することから着手した．メチル基転移酵素阻害剤の decitabine 処理では，細胞増殖レベルにほぼ影響がない decitabine 処理条件で複数のがん抗原の発現が亢進する例が mRNA レベルおよびタンパク質レベルで確認された．同条
件で培養されたヒト正常繊維芽細胞ではがん抗原遺伝子の発現変化は確認されなかった．これは体細胞変異が蓄積したがん細胞のゲノム不安定性と強く相関していることが示唆された．個別化医療が必要な複合免疫治療において，末梢血の抗がん抗原抗体検査でがんの抗原性が評価できるかの可能性についても議論したい．

【背景と目的】がん細胞表面には、体細胞変異に由来する neo-antigen が MHC-Iと複合体を形成して存在し抗原提示を行っており、これを T 細胞が認識・活性化することでがん細胞を傷害する。各 neo-antigen のがん化や免疫応答への貢献度は未知であるため個別化医療(ペプチドワクチン)実現のためにはより抗原性の高い neo-antigen の迅速なスクリーニング法の開発が必要であり、本研究では効率的な手法を探索している。
【方法】このアッセイでは、MHC-I 分子には抗原ペプチドと複合体を形成してrefolding する特徴と、多量体を形成させると低親和性の T 細胞受容体との結合が検出できる特徴を利用する。具体的には、まず MHC-I 分子の α 鎖の細胞外ドメインを Avitag 付加型で生産し、β 鎖と UV により開裂する人工ペプチドとともに refolding・精製する。さらに Avitag 部分を biotin 化し streptavidin を用いて四量体を形成して安定化し、UV 照射によって抗原候補ペプチドとのペプチド交換を行い、CTL と共培養して活性化を測定する手順となる。MHC-I 分子を構
成 す る α 鎖 は 多 型 で あ り 、 本 研 究 で は マ ウ ス α 鎖 (2Db,2Kb) と ヒ ト α 鎖(hA2,hA24)の 4 種類を調製した(β 鎖は共通)。
【結果と考察】現時点までに本アッセイ系では マウス α 鎖 2Db を用いた refoldingと精製、UV 照射によるペプチド交換及びペプチド特異的 CTL の活性化が確認された。しかし同様の操作を 2Kb, hA2 に行った場合の refolding 効率は最適化が必要な状況で、α 鎖のタイプ別に refolding 条件が異なる様である。今後はヒト α 鎖 hA2 をモデルとした refolding・精製の高収率プロトコル確立を目指すとともに、様々な型の α 鎖を網羅するハイスループットながん抗原ペプチドのス
クリーニング系を開発し、個別化医療の発展に繋げたい。

Study on companion diagnostics for combined cancer immunotherapy using
epigenetic drug

Development of neoantigen screening method by site-specific biotinylation
and refolding assay○Yuki Katsukawa, Hannaneh Ahmadi, Tomoko Honjyo, Jyunichiro Futami(Grad. Sch. ISEHS., Okayama Univ.)

Key words

protein engineering, antibody, immunotherapy, epigenetic○Chiharu Minetoma1, Kazuhiro Kakimi2, Junichiro Futami1(1Grad. Sch. ISEHS., Okayama Univ., 2Dept.Immunother. Tokyo Univ. Hosp.)

Key words
biotinylation

protein engineering, antigen, major hitocompatibility complex,

231

2Jp13

触媒活性を有する新規タンパク質繊維の開発○八木 創太 1, 赤沼 哲史 2, 山岸 明彦 3
（1理研・生命機能, 2早大・人間, 3東薬大・生科）
sota.yagi@riken.jp

2Jp15

自動化微量ハイスループットスクリーニングシステムによるシソ栽培品種のアミロイド β 凝集阻害活性の詳細分析○島森 圭弥, 倉賀野 正弘, 佐々木 里奈, 上井 幸司, 徳樂 清孝（室工大院・工）tokuraku@mmm.muroran-it.ac.jp

タンパク質は無機材料を上回る圧倒的な機能性を持つことから、新規機能性材料への利用が期待されている。特にタンパク質繊維は繊維業界に留まらず、ナノテクノロジー分野、医薬業界でも応用が注目されている。また、さらなるタ
ンパク質繊維の用途拡大のために、本来繊維化しないタンパク質を用いた自然界にはない全く新しい繊維開発技術の確立も求められている。これまで、本来ダイマーであるスレリスリンとモノマーである LARFH というタンパク質の α
ヘリックス上にそれぞれ相補的な結合面を設計することで両者が共重合した繊維を作ることに成功してきた（Yagi et al., BBA, 2016）。本研究では、この手法を用いて他の繊維化しないタンパク質も繊維とすることができるかを検証した。
始めに、ダイマータンパク質 3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素（以下IPMDH）の α ヘリックス上に LARFH と同様の結合面を作成した。この IPMDH
改変体は結合面を持つスレリスリンと相互作用が確認できたが、その結合力は弱く繊維形成は認められなかった。そこで、分子間でジスルフィド結合を形成させることで分子間結合の強化を図った。結合面中に１つずつシステイン残基を導入したスレリスリン改変体と IPMDH 改変体は混合すると、分子間でジス
ルフィド結合を形成し、巨大な複合体形成が生じていることが分かった。このIPMDH とスレリスリンの混合物を電子顕微鏡で観察したところ太さ約 9nm 最
大長約 1um 程の繊維構造が認められた。さらに、この混合物における IPMDHの酵素活性を測定したところ、IPMDH 活性も維持されていることがわかった。
つまり、IPMDH はスレリスリンと共に繊維化してもその酵素活性は失わず、触媒機能を有するタンパク質繊維が開発できた。

【背景・目的】 アルツハイマー病（AD）は脳内におけるアミロイド β（Aβ）の凝集・蓄積が発症の引き金となることから、Aβ の凝集・蓄積を阻害する物質は病気の予防や治療に有用である。我々は量子ドットによるイメージング技術を応用した Aβ 凝集阻害物質の微量ハイスループットスクリーニング法（MSHTS法）を開発し、シソの EtOH 抽出物が高い活性をもつことを明らかにした。本
研究では、自動化および粗抽出物の評価に最適化した新たな MSHTS システム
（Sasaki et al., Sci. Rep., 2019）を用い、3 か所の圃場で栽培した 15 種の栽培品種について、収穫部位、収穫時期別の Aβ 凝集阻害活性を評価した。
【方法】 シソ 15 品種を北海道内の 3 か所の圃場で栽培し、7 月下旬、8 月下旬、10 月上旬に収穫した。収穫した植物は洗浄し、各部位（葉、茎、根、芽）に分けた後に、重量の 5 倍量の EtOH に 1 週間浸漬・抽出した。その後、抽出液を減圧下溶媒留去し、粗抽出物サンプルとした。得られたサンプルを自動化 MSHTS
システムにより評価し、Aβ 凝集阻害活性を 50％効果濃度（EC50）として評価した。
【結果と考察】 評価した全てのサンプルにおいて葉が高い活性を示し、芽、茎、根は活性を示さない、もしくは低活性であった。以前、報告した 52 種類の香辛料を用いた EtOH 抽出物の中で、最も活性の高いスペアミント（EC50=0.018 mg/
ml）（Ishigaki et al., PLOS ONE, 2013）より、約 10 倍高い Aβ 凝集阻害活性を有するシソ葉サンプルも確認できた。また、7 月下旬より 8 月下旬および 10 月上旬に収穫したサンプルの方が高活性である傾向がみられた。さらに、10 月上旬に 3 か所で収穫されたシソ葉サンプルの EC50 の平均は異なる結果を示した。
我々は、3 か所に設置した気象観測装置より得られたデータから、気候や土壌
水分量がシソの Aβ 凝集阻害活性に関わっている可能性を見出した。

Development of artificial protein fiber holding catalytic activity

Detailed analyses of amyloid β aggregation inhibitory activity of Perillafrutescens cultivars by automated microliter-scale high-throughput
screening system○Sota Yagi1, Satoshi Akanuma2, Akihiko Yamagishi3(1BDR, RIKEN, 2Fac. Hum. Sci., Waseda Univ., 3Sch.Life Sci., Tokyo Univ. Pharm.
Life Sci.)○Keiya Shimamori, Masahiro Kuragano, Rina Sasaki, Koji Uwai,
Kiyotaka Tokuraku(Grad. Sch. Eng., Muroran Inst. Technol.)Key words

protein interaction, fiber, enzyme activity

Key words

Alzhheimer's disease, amyloid-beta, Qdot, Perilla

2Jp14

量子ドットナノプローブを用いたアミロイド β オリゴ
マー形成阻害活性の評価法の開発

2Jp16

ヘパリンによるアミロイド凝集促進効果に対するポリア
ミン由来８員環化合物の影響評価○髙木 翔梧, 倉賀野 正弘, 徳樂 清孝（室工大院・工）tokuraku@mmm.muroran-it.ac.jp○國富 理紗子 1, Pradipta Ambara R. 2, 田中 克典 2, 座古 保 1（1愛媛大院・理工, 2理研）
zako.tamotsu.us@ehime-u.ac.jp【背景・目的】アルツハイマー病（AD）の原因の一つに、アミロイド β（Aβ）タンパクが脳内で凝集・蓄積して形成した、老人斑が神経細胞死を引き起こす、アミロイドカ
スケード仮説がある。しかし、近年、老人斑の量と疾患の進行との間には相関性が低いこと、凝集により形成される繊維より中間体である Aβ オリゴマー（Aβ-o）の神経毒性が高いことが明らかとなり、凝集体中でもオリゴマーが AD
における神経細胞死の主原因であると考えられるようになってきた。そこで、本研究では量子ドット（QD）標識 Aβ（QDAβ）を用いた新たなオリゴマー形
成阻害活性評価法の開発に取り組んだ。また、開発した手法を用い、数種類のポリフェノールの Aβ-o 形成阻害活性の評価を行った。
【方法】
QDAβ と凝集阻害物質を混合した溶液を 37 °C、24 時間インキュベートした後、蛍光顕微鏡で観察後し、ImageJ ソフトウェアによって解析した。未標識 QD の各スポットの平均蛍光強度を、基準値とし、オリゴマー形成後の各スポットの蛍光強度を基準値で割った値を相対蛍光（RF）と定義した。それぞれの値をクラス分けし全体の相対蛍光値で割ることで、オリゴマー形成レベルを算出した。
【結果と考察】QDAβ を PBS 中で 24 時間インキュベートすることで蛍光強度の大きいスポッ
ト数が増加した。定量化により、モノマーを表す RF1 のスポットの割合は 79％
から 23％に減少したことから、モノマーが減少しオリゴマーが形成されたことを数値化できた。
Aβ 凝集阻害活性が期待されるポリフェノール類（ロスマリン酸、ケルセチン、
クルクミン）のオリゴマー形成阻害活性（50％阻害濃度；IC50）を添加濃度 RF1
値の減少曲線から算出したところ、化合物の中で最も高いオリゴマー形成阻害効果を示したのはロスマリン酸であった。

【背景と目的】タンパク質は凝集することにより、オリゴマーや β シート構造に富む線維状の凝集体を形成する。これらのアミロイド凝集は細胞毒性を有し、細胞に沈着して細胞死を誘導するため、多くの疾病を引き起こすと考えられている。細胞表面に存在するグリコサミノグリカンなどはタンパク質のアミロイド化に関与しているとされるが、特に負電荷を帯びたヘパリンはさまざまな蛋
白質のアミロイド線維形成を促進することが知られている。近年我々のグルー
プでは、酸化ストレス条件下で細胞から放出される高毒性分子アクロレインが、ポリアミンと速やかに８員環化合物を形成し、アミロイド β（Aβ）などのタン
パク質のアミロイド凝集形成を抑制することを見出した。一方、８員環化合物
はヘパリンと静電相互作用すると考えられる。そこで、本研究では８員環化合物がヘパリンによるタンパク質の凝集促進を阻害し得るかどうかを検討した。
タンパク質はアルツハイマー病、２型糖尿病の原因タンパク質である Aβ、アミリンを用いた。

Development of evaluation method for inhibitory activity of amyloid β
oligomer formation using quantum dot nanoprobe

Effect of polyamine-induced cyclic compound on the promotion of amyloid
formation by heparin○Shogo Takagi, Masahiro Kuragano, Kiyotaka Tokuraku(Grad. Sch. Eng., Muroran Inst. Technol.)Key words

alzheimer's disease, amyloid-beta, Qdot, oligomer【実験方法】5 μM の Aβ、アミリンをヘパリンおよび cSPM 存在下・非存在下において 37℃、pH 7 で 24 時間インキュベートした。その後、アミロイド線維に特異的に結合する蛍光プローブであるチオフラビン T を用いて線維形成の評価を行った。
【結果】Aβ、アミリンどちらにおいてもヘパリン存在下では非存在下の時に比べて高い ThT 蛍光強度を示した。このことから、既報同様にヘパリン存在下ではアミロイド線維形成が促進されることが示された。それに対して、cSPM が共存する場合で、ヘパリン存在下の場合に観察された ThT 蛍光強度の増加は観察されなかった。このことから、cSPM とヘパリンの相互作用はヘパリンによるタンパク質の線維化促進効果を打ち消すことが示唆された。

○Risako Kunitomi1, Ambara R. Pradipta2, Katsunori Tanaka2, Tamotsu Zako1(1Grad. Sch. Sci. Eng., Ehime Univ., 2RIKEN)

Key words

amyloid, polyamine, acrolein, glycosaminoglycan

232

2Jp17

MIF スーパーファミリータンパク質に対する抗リウマチ薬メトトレキサートの構造・機能解析○中垣 尊 1, 出茂 鮎美 2, 杉島 小雪 1, 面川 歩 3, 松村 洋寿 1,
尾高 雅文 1, 涌井 秀樹 1
（1秋田大院・理工, 2秋田大・理工, 3秋田大院・医）modaka@gipc.akita-u.ac.jp【概要と目的】メトトレキサート(MTX)はジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)の特異的阻害剤として古くから知られており、急性白血病のような悪性腫瘍の治療薬として古くから用いられてきた。その後、低用量の MTX 投与が関節リウマチを含む炎症性疾患の治療に有効であることが明らかとなり、現在では、関節リウマチの第一選択薬として広く用いられている。MTX の白血病治療に対する薬理作用は、DHFR に対する葉酸拮抗作用によることが既に知られているが、免疫系に対する薬効の作用機序は未だ明らかになっていない。そこで我々は MTX
新規標的タンパク質として、炎症関連タンパク質マクロファージ遊走阻害因子(MIF)を同定し、MTX との相互作用解析を進めてきた。本研究では、MTX の免
疫系に対する作用機序を解明するために、MIF と同じ炎症性シグナル経路に関与し、MIF と高い構造的な相同性を有する D-Dopachrome tautomerase (DDT)に着目した。本発表では MTX による DDT の構造及び活性に対する影響について報告する。
【結果及び考察】 ヒト末梢血単核球の cDNA から、DDT 遺伝子のクローニングを行った。大腸菌発現系によって DDT を大量発現させた後、疎水性相互作用
カラム、弱陰イオン交換カラムを用いて単一精製した。1 L あたり約 32 mg のタンパク質を精製することができた。10 mg/mL DDT と母液として 0.2 M Zinc
acetate、0.1 M MES (pH 6.0)、10% PEG 8000 を用いて、ハンギングドロップ法
により、10℃で DDT の単結晶を作製した。DDT 単結晶の X 線結晶構造解析の結果、1.37 Å の分解能の構造解析に成功した。DDT は MIF と同様にホモ 3 量体構造をとることが確認された。4-ヒドロキシフェニルピルビン酸を基質として用いて、MTX による DDT のトートメラーゼ活性の阻害効果を検討したところ、活性阻害がわずかにみられた。現在、MTX-DDT 複合体の結晶化による X
線結晶構造解析を進めている。

Structural and functional analysis of anti-rheumatic drug methtrexate on
MIF superfamily proteins.

○Takashi Nakagaki1, Ayumi Izumo2, Koyuki Sugishima1, Ayumi Omokawa3,
Hirotoshi Matsumura1, Masafumi Odaka1, Hideki Wakui1(1Grad. Sch. Eng., Sci., Akita Univ., 2Faculty of. Sci. and Eng., Akita Univ., 3Gra.
Sch. of Med., Akita Univ)

Key words

Methotrexate, anti-rheumatic drug, D-Dopachrome tautomerase

235

3S-S1a01〈特別招待講演〉

3S-S1a02 無細胞タンパク質合成系 -SDGs 実現の生産財として○南 賢尚（NUProtein株式会社）
masataka.minami@nuprotein.jp

Next generation bioprocess development○Jochen Buechs(AVT-Chair of Biochem. Eng., RWTH Aachen Univ., Germany)jochen.buechs@avt.rwth-aachen.de

The development of bioprocesses traditionally starts in shake flasks. In the last years,
also shaken micro titer plates were introduced, to benefit from a higher throughput.
These two types of bioreactors are used for primary and secondary screening and for
medium (ingredients) optimization. Final strain selection and evaluation and processoptimization require more elaborated experiments, for which small numbers of benchscale stirred tank bioreactors are usually applied. This traditional bioprocessdevelopment procedure has several crucial disadvantages. 1) No information about the
kinetic properties of the cultured microorganisms is collected during work in microtiter plates and shake flasks, as measuring options for online monitoring are scarce.
Very frequently, only endpoint determinations of product concentration are performed.
Based on this scant information strains are selected and transferred to the next steps ofbioprocess development. 2) Micro titre plates and shake flasks are operated in batch
mode, whereas production processes are most often conducted in fed-batch mode. This
results in completely different physiological conditions for the cultured microbes.
Strains selected in batch screening programs might not be the most suited for largescale fed-batch production. 3) In micro titre plates and shake flasks the pH has to becontrolled by pH buffers. This results in elevated levels of osmotic stress. In stirredtank bioreactors it is possible to control pH by titration.
In this talk a new concept for improved bioprocess development will be presented,
which minimize the disadvantages of the traditional methodology. The new concept isbased on different dedicated small-scale culture technologies with e.g. 48, 96 or 384
parallel bioreactors. These offer a lot of online monitoring options, including
measurement of the oxygen and carbon dioxide transfer rates (OTR, CTR) and therespiratory quotient (RQ), optical density (OD), dissolved oxygen tension (DOT), pH
value and biogenic fluorescence signals. To a large extent, the necessity of time course
sampling and offline analysis is avoided. If these small-scale culture devices are
combined with a liquid handling robot, whole process work flows, which are usuallyassociated with a lot of manual labor work, can completely be automated. Media
preparation, inoculation of main cultures at identical biomass concentration from precultures, addition of inducers to initiate recombinant protein production, taking
samples and separating the cell pellets from supernatant, disrupting cells to extract
target proteins, freezing samples and finally analyzing of product (e.g. enzyme
activity), can be performed by such an automated platform. Process development isaccelerated, as a maximum of stoichiometric and kinetic information about the cultured
microbial systems is already collected in early steps of process development at muchhigher throughput compared to the traditional procedure. In addition, also in micro titerplates and shake flasks, fed-batch operating mode as well as pH control bysupplementation of pH controlling agents is enabled. As a result, screening is
conducted at conditions very close to production scale. It has been proven thatbioprocesses can readily be transferred from these new small-scale culture devices tobench-scale and larger stirred tank reactors. As a prerequisite, it has to be ensured thatthe fundamental engineering parameters like e.g. maximum oxygen transfer capacity,
specific power input or level of ventilation are kept constant during scale-up fromshaken micro titer plates and shake flasks to stirred tank bioreactors.

無細胞タンパク質合成系は、当初は翻訳メカニズム解析のために開発された。
1950 年代にはラット肝臓を用いた無細胞タンパク質合成系により、tRNA の存
在が明らかにされ、さらに、1961 年には Nirenberg らが、大腸菌由来の無細胞抽出液を用い、遺伝コードの解明を行い、ノーベル賞を受賞するなど分子生物学にとって重要な研究ツールであり、その歴史は古い。
無細胞タンパク質合成系は高スループットでタンパク質が合成できるものの、
1982 年には大腸菌を宿主としてヒト型インスリンが開発されて以来、コスト面等から工業的なタンパク質生産には、大腸菌あるいは CHO 細胞を宿主とする
遺伝子組換えタンパク質産生が利用されている。
NUProtein 社では無細胞タンパク質合成系の特徴を維持・発展させつつ、工業的なタンパク質合成にも利用できるよう低コスト化を念頭にコムギ胚芽由来無細胞タンパク質合成系を開発した。
本講演では、NUProtein 社が開発したコムギ胚芽由来無細胞タンパク質合成系の低コスト化を実現した製造方法、スケールアップの必要のないリニアな収量と高回転率等の特徴を示す。
また、2015 年に国連サミットで採択された「持続可能な開発目標（SDGs）」の
17 のグローバル目標の内、低環境負荷の面から「クリーンな社会」、原材料の面から「持続可能な生産と消費」、廉価なタンパク質が合成可能な面から「健康格差是正」、幹細胞応用の面から「食料確保」の各視点で、コムギ胚芽由来無細胞タンパク質合成系の特徴を示し、研究用ツール即ち研究用消費財にとどまらず、最終製品であるタンパク質を生産するための生産財としてこれら目標への貢献可能性について述べる。

Next generation bioprocess development

Cell free protein synthesis system as producer goods to achieve SDGs

Key words
bioprocess development, small scale culture systems, online
monitoring, nutrient feeding

Key words○Jochen Buechs(AVT-Chair of Biochem. Eng., RWTH Aachen Univ., Germany)○Masataka Minami(NUProtein Co., Ltd.)

eukaryotic cell free protein expression, cytokine, emission free process

236

3S-S1a03 High-resolution plant data for greenhouse agricultural
production

3S-S1a04 Development of culture system using co-culture with foodgrade medium○Kotaro Takayama1,2, Hiroto Kitagawa3(1EIIRIS, Toyohashi Univ. Technol., 2Fac. Agric., Ehime Univ.,
3
PLANT DATA Ltd.)aa17091@gmail.com○Ikko Kawashima(IntegriCulture Inc.)
ikko@integriculture.jp

To achieve stable and maximized greenhouse crop production, more advanced control
schemes are required to control the complex crop production process. The crop centric
concept for highly-sophisticated strategy for environmental control in greenhouses isexpressed by the term speaking plant approach (SPA) and the most essential
technology in SPA concept is the accurate monitoring of plant’s growth andphysiological status. This lecture will high-light the high-resolution plant growth/
physiological information named “Plant data” obtained by using the chlorophyll
fluorescence (CF) imaging robot and the photosynthesis/transpiration real-timemonitoring chamber. The CF is red light emitted from plant leaf. Plant leaf absorbs
light energy for photosynthesis but a part of the excessive/residual light energy that is
not used for photosynthetic reaction is dissipated as CF. By illuminating a dark-adaptedleaf with a stable intensity excitation light, dynamic changes in CF emission, which iscalled “CF induction phenomenon/curve”, are observed. The shape of the CF induction
curve varies depending on the status of photosynthetic function. A numerical index
representing the shape of the CF induction curve, which was defined in our previous
study, is useful to evaluate the changes in invisible photosynthetic function of tomato
canopy in greenhouse. The photosynthesis/transpiration real-time monitoring chamber
is an open-bottom chamber, 50 × 100 × 210 cm (W × D × H) in size, that encloses two
two-meter high tomato plants with transparent film and the three fans at the top of thechamber exhaust interior air. By comparing the CO2 and H2O concentrations in inflow
and outflow air, the photosynthetic rate and transpiration rate at an interval of 5 min ismonitored. PLANT DATA Ltd., which is an Ehime University oriented start-up
company, is preparing to provide services on CF imaging robot and photosynthesis/
transpiration real-time monitoring chamber for commercial greenhouse crop
production.

The sustainability of producing meat and other animal-sourced agricultural products
are coming under question due to their large environmental footprint. Possibility ofsuch products made by mammalian cell culture has been sought since 1930’s, but any
scaling effort has been hampered by prohibitively high cost of adding growth factors
and endocrine factors in cell culture. Furthermore, little progress has been made instudies on the use of cultured cells as food. For example, basal media containing
nutrients such as amino acids and vitamins contain several substances that are notapproved as food or food additives, and the development of basal media composed
only of food or food additives are needed.
In in vivo systems, minor compounds are produced in organs and transported to otherorgans and tissues through blood vessels. In this study, a scalable flow-based systemwith food grade basal medium that allows inter-organ material transfer was constructed
and tested for animal cell culture to reduce the cost of cell culture.
In this study, a scalable flow-based system that allows inter-organ material transfer wasconstructed and tested for animal cell culture to reduce the cost of cell culture. And we
found intercellular interactions that proliferate cells that constitute organs such as fromliver and muscle tissue. Also, these results show that this method was able to remove
the need for addition of endocrine factors usually required for cell growth to reduce thecost of cell culture. In addition, a newly developed basal medium consisting only offood and food additives solved one of the production processes for using cultured cells
in food.

High-resolution plant data for greenhouse agricultural production

Development of culture system using co-culture with food grade medium○Kotaro Takayama1,2, Hiroto Kitagawa3(1EIIRIS, Toyohashi Univ. Technol., 2Fac. Agric., Ehime Univ., 3PLANT DATALtd.)

Key words

photosystem II, chlorophyll, photosynthesis, robot○Ikko Kawashima(IntegriCulture Inc.)

Key words

co-culture

237

3S-S2a01 T4SS および放線菌接合伝達システムを如何に使うか

3S-S2a02 放線菌の特異な接合伝達と染色体移動

次世代シーケンサの登場、計算機の進化、ゲノム編集技術の開発など、技術面での飛躍的革新は、我々に“ひょっとしたら人工生命体をゲノムレベルから再設計して作れるかも！我々は天照大御神になれるかも！”という妄想を抱かせる。
実際 J. Crag Venter 率いるグループでは 10 年前に化学合成したゲノムを移植することで科学者の夢の一つである人工設計された微生物の合成に人類史上初めて成功している。この一歩は大きな進歩だったが、動植物細胞などはおろか、多くの工業等に有益な微生物での人工細胞の設計、誕生への道は多くの技術障壁が存在しており、遠き道である。大きな技術障壁の一つに 50 kb を超える大きな DNA の操作と細胞間移動がある。
生物の、特に性を持たない細菌の進化を考えると、遺伝子水平移動が進化に果たした役割は大きい。古典的な F. Griffith の発見に端を発する遺伝子水平移動
機構は、自然形質転換、形質導入、接合伝達の 3 経路が知られている。接合伝
達は F 因子による大腸菌遺伝学への貢献や R 因子による薬剤耐性の拡散で知られる。我々を含む本シンポの講演者のグループでは、DNA 伝播機構として細胞外に DNA 露出せず水による剪断を受けないこと、F 因子の Hfr の例のように大きさの制限がほぼないと見なせること、接合伝達による DNA の細胞間移送は混合培養するだけで樹立できることから接合伝達機構の基礎から応用までを研究対象としている。
Type IV Secretase (T4SS)の利用：T4SS は F 因子や Ti プラスミドで知られ、応用例も多い。F 因子は接合伝達のスループット性の高さから奈良先端の森グループによるシステム生物学で重要な大腸菌の網羅的遺伝子二重欠損株の作製に使われている。F 因子は伝達宿主域が狭いため、応用性の面から Pseudomonas
aeruginosa 由来の IncP に分類される R 因子、RK2 のシステムを利用している。
RK2 をゲノムに持つ大腸菌株 S17-1 や RK2 由来のプラスミド由来の T4SS を利用して様々な菌へ DNA を異種間輸送することを検討した。枯草菌を用いた例
では、プラスミド状態での導入では、形質転換能を失った Bacillus subtilis 株に対しても標準株である B. subtilis168 株と同程度の効率で導入が可能だった。枯草菌の自然形質転換では com 遺伝子産物群の働きによって ssDNA として外部
DNA が取り込まれ、RecA 依存的に相同組換えが起きるが、接合法の場合には相同組換えの効率が極端に低かった。この不利点は一点交差の組換え株を追加培養し、相同組換え株を取得することで解決した。また、T4SS が認識する接合
開始点、oriT の最適長を調べ、二カ所の TraI の認識部位が効率的な異種間接合に必要なことが判明した。この領域を一部削ることで大腸菌間の移動効率は大きく影響されなかったが、大腸菌から枯草菌あるいは放線菌への移送効率は大きく損なわれた。
T4SS と放線菌システムの組み合わせによる遺伝子輸送システム：放線菌は T4SSとは異なる、二重鎖 DNA モーターを利用した接合伝達機構を持つ。また多くの実用放線菌菌種では形質転換法の開発がなされていない。T4SS と放線菌線状
プラスミドの接合システムを利用し、異なる遺伝背景を持つ様々な放線菌へ効
率的に二次代謝産物の生合成経路を導入する二段階接合手法を北里研究所の池田らと共に開発した。大腸菌で操作した BAC や Cosmid 上の二次代謝生合成経路を T4SS で Streptomyces avermitilis 由来でアクチノファージ φC31 の att 部位を挿入した線状プラスミド SAP1 を保持する制限修飾系の緩い中間宿主 S. lividansへ導入した。接合で移送された生合成遺伝子クラスターを含むベクターは att 部
位を介して SAP1 に組み込まれ、SAP1 の接合伝達機構を利用して様々な放線菌へ移送可能であった。このシステムでは BAC に搭載可能な大きさの DNA を制限修飾系を気にせず、形質転換系の開発をすることなく混ぜるだけで様々な遺伝背景の放線菌へ移送可能であった。
放線菌の接合システム：放線菌の接合システムは、染色体をプラスミドの移送に伴って可動化できるなど T4SS とは大きく異なるが、詳細にはわかっていな
い。また小型環状プラスミドのシステムと超巨大な線状プラスミドの接合シス
テムも異なる可能性がある。小型環状プラスミドの接合システムでは我々が解析してきた pSN22 の TraB システムについては分子生物学的解析の結果を、線状プラスミドのシステムについては必要遺伝子の異所発現によって得られているシステムの特徴を紹介する。

Streptomyces 属の細菌は 1944 年に Waksman が S. griseus の培養液から抗結核薬のストレプトマイシンを発見して以来、抗生物質の探索源として広く利用されてきた産業微生物である。Streptomyces 属は真正細菌(グラム陽性高 GC 含量細菌)にもかかわらず、染色体は環状構造ではなく、真核細胞生物と同様に線状構造を有している。また、これらの菌株が保有する plasmid も環状構造のみならず線状構造を有しており、接合伝達能を有するものも存在する。Streptomyces
属の伝達性の plasmid の特徴は、クラム陰性桿菌などの腸内細菌の plasmid の伝達とは異なり、接合は 2 本鎖 DNA で伝達されていくこと、さらに接合伝達に伴い宿主染色体の移動(染色体の組み換えを生じる)が観察されることである。
また、Streptomyces 属の環状 plasmid の接合にはグラム陰性菌の plasmid の tra
オペロンのような多数の遺伝子が関与しているのではなく、FtsK/SpoIIIE family
DNA translocase とそれが結合する cis-acting locus of transfer (clt)配列のみで達成される。さらに線状 plasmid では DNA translocase 様タンパク質(TraA/TraB)そして DNA helicase(TtrA)によって接合が達成される。２次代謝産物の生合成遺伝子群のような非常に複雑な遺伝子配置をしている遺伝子群を発現させる場合、染色体と同様に線状構造のレプリコンのほうが安定に発現する。また 100 kbp を越える２次代謝産物遺伝子群を導入した線状 plasmid も接合伝達によって同種ならびに異種 Streptomyces 属株に導入することが可能であり、物質生産も確認できた。一方、接合 plasmid による染色体の移動は plasmid 種によって効率が異なるが環状多コピー plasmid pIJ101 を用いた場合、10-3 の頻度で染色体の組み換えを確認することができた。S. avermitilis の染色体の右末端には traA/traB ならび ttrA が配置しており、さらなる詳細な解析によって、S. avermitilis の染色体自身が接合能を有している”trasnsmissible replicon”であることが示唆された。

Application of T4SS and Streptomyces conjugative transfer systems

Unique conjugation system and chromosome mobilization in Streptomycestransmissible plasmid○片岡 正和（信州大院・生命医工）mars@shinshu-u.ac.jp○Masakazu Kataoka(Dept. Biomedical Eng. Grad. Sch. Shinshu Univ.)

Key words
conjugation, Type IV secretion, Horizontal Gene Transfer,
Streptomyces○池田 治生（北里大・生命研）
ikeda@ls.kitasato-u.ac.jp○Haruo Ikeda(Kitasato Institute for Life Sicences, Kitasato University)

Key words

Streptomyces, plasmid, conjugton, antibiotics

238

3S-S2a03 大規模網羅解析への接合伝達システムの活用

3S-S2a04 接合伝達の分子機構の応用

私たちのグループは、大腸菌ゲノムプロジェクト終了後、US グループによる
MG1655 株と日本プロジェクトグループの W3110 株の詳細な比較、配列確認作
用、正確なアノテーションを目指した国際コミュニティーの構築とアノテーショ
ン作業を続けてきた。それと並行して、アノテーション情報を基にした全遺伝
子プラスミドクローンライブラリーと一遺伝子欠失株ライブラリーの構築を進めた。現在では、目的に応じた５種のクローンライブラリーと２種の欠失株ラ
イブラリーを完成し、コミュニティーの内外を問わず広く公開し、オープンリソースとして広く活用されている。
2007 年に中心代謝経路欠失株における細胞内生理状態の定量解析を行なった(Ishii et al., 2007, PubMed: 17379776)。その結果が示したことは、中心代謝経路のように非常に重要な経路にも関わらず、細胞はその欠失を受け入れるだけでなく、欠失の細胞内生理状態に及ぼす影響は、それほど大きなものではなく、細胞自体は非常に安定に保たれていたことであった。まさに細胞のロバスト性であるが、それ以降ロバスト性の分子機構解明を目的として、大腸菌全遺伝子の網羅的二重欠失株による遺伝的相互作用解析を目的とした技術開発を進めた。
大腸菌といえども、タンパク質をコードする遺伝子数は 4000 を超え、システマ
ティックな二重欠失株ライブラリー構築はそれまでの技術では到底達成できるものではなかった。そこで、開発を進めたのが、２種類の一遺伝子欠失株ライブラリーを構築し、一方を Hfr 化し接合により高効率で組合わせ、二重欠失株を作製する手法である。そのために、一方の欠失株を Hfr 化する CIP と名付けたツールの開発を進めた。F plasmid による Hfr 化は、F の持つ IS や Tn の配列を利用して宿主ゲノムに相同組換えで挿入される。一方、我々は挿入部位と挿入方向を決め、特定の場所から特定の向きで受容菌側に宿主ゲノム DNA を送り出すための設計を行なった。幸い、接合と DNA 移動に必須の tra 領域と oriT
領域には IS と Tn が存在しない。またオペロンを構成しており、接合に機能す
る断片とそれ以外の機能断片を簡単に分離できる。接合に必須の断片のみを切り離し、以下の設計デザインを行い、Hfr 化プラスミドツールを作製した。1)
大腸菌染色体上 10 箇所への CIP の挿入、2) 挿入部位より両方向にゲノム DNAを受容菌に移動、3) 受容菌側に移動後、プラスミドの複製起点は機能できない、4) 欠失株の持つ Km および Cm 以外の薬剤耐性、5) 接合後の供与菌の選別、のデザインを行なった。そこで、1) は染色体上欠失しても表現型に影響が出ない遺伝子領域の非コード領域 10 カ所を選択し、その領域約 300bp の断片を組込み相同領域とした。2)は、300bp の組込み領域を両方向にクローン化を行
い、時計回りおよび反時計回りに大腸菌ゲノム DNA を CIP の挿入領域より接合移動できる設計を行なった。3)は F の ori2 の代わりに、oriRg を複製起点としてもたせ、pir を持つ宿主にのみで複製可能になるようにデザインした。4)はaadA による Sm 耐性を持たせ選択可能にし、5)に関しては、宿主に持たせた pir
遺伝子断片を dapA 遺伝子領域に挿入し、dapA を破壊し、DAPA(Diaminpimelicacid)存在下でのみ生育可能な宿主にすることにより、3)を同時に解決できる手法を取った。現在は、染色体上 10 カ所、両方向で、20 種類の Hfr 化を制御できるようにしている。
開発した CIP を接合により Cm 耐性を持つ欠失株に移動し Hfr 化を行う。1 時
間程度の接合後、DAPA を含まない、欠失株の持つ Cm と CIP の持つ Sm を含む培地で選択を行う。受容菌側ではプラスミドとしては複製できないので、ゲノム DNA に相同領域を利用して挿入されたものが Sm 耐性を獲得することが期待される。耐性能の確認と PCR による挿入部位の構造確認を行なったのち、
Hfr 株として分離する。これを供与菌として、Keio collection 約 4000 の遺伝子欠失株と寒天培地上で接合を行い、供与菌側の Cm 耐性断片で置換された遺伝子欠失と、Keio collection の Km 耐性断片による欠失とを高効率で組合せ、二重欠失株の作製を行う。その二重欠失株の生育を、寒天培地上で、スキャナーによる画像取得と画像解析による生育の定量化を行い、合成致死など遺伝的相互作用解析を行なっている。
我々の欠失株ライブラリーには、欠失により LB 培地で生育できない遺伝子の欠失株は存在しない。そこで、このような必須遺伝子の遺伝的相互作用解析を、同じく接合を用いて、必須遺伝子の発現抑制株と Keio collection の欠失株を組合わせ、解析を可能にする手法の開発を行なった。発現抑制には CRISPRi を用い、gRNA を構成的発現、dCas9 をテトラサイクリン発現誘導プラスミドの構築を行い、F 由来の oriT を持たせることで、接合移動を可能にし、上記と同様に接合による網羅的必須―非必須遺伝子間相互作用解析を可能にした。
これまでの開発と解析を進めてきた、接合を活用した高効率遺伝子欠失多重化
手法の紹介と、問題点を共有する。また、新たに開発した欠失株には 20 塩基の分子バーコードを導入しているが、その新たな活用方法も紹介し、リソースとしての共有も図りたい。

次世代シーケンサーの登場やゲノム編集技術の進歩によって、生物の設計図であるゲノム自体の関心が非常に高まっている。これに伴いゲノム解読や部分的な編集にとどまらず、ゲノム自体の DNA を設計し、合成し、活用しようとする研究が世界各国で開始された（1）。しかしゲノムを構成している DNA は長
大なポリマーであるため、長くなればそれだけ物理的ダメージを受けやすくな
り扱いが難しくなる。すなわちゲノムのような大きなサイズの DNA（経験上200kb 以上のサイズの DNA）を無傷で扱うには、ピペッティングを伴う in vitro
操作などは適さない。そこで大腸菌、酵母、枯草菌を宿主とした in vivo でのゲノム合成法が報告されているものの、合成されたゲノムを活用する手段についての報告は極めて少ない(2)。我々は自然界での水平伝播に習って、サイズの大きな DNA の取り扱いツールとしての接合伝達の活用法に着目した。
自然界では DNA による遺伝情報のやり取り(水平伝播)が微生物間で頻繁に生じていることが報告されている。水平伝播の様式として、ファージによる「形質導入(transduction)」、細胞外の DNA を取り込む「形質転換(transformation)」、そして TypeIV secretion system による「接合伝達(conjugation)」が知られている。
これらの中で「接合伝達(conjugation)」は、細胞間に TypeIV のチャネルと呼ばれるタンパク質の管が形成され、その中を DNA が運ばれる仕組みなため、ゲノムサイズの非常に大きな DNA でも安定して移動させることが可能であり、今後合成された大きなサイズの DNA を安定に扱うための強力なツールになると期待される。我々は、これまで枯草菌のゲノム自体をベクターとして用いる
枯草菌ゲノムゲノムベクター(Bacillus subtilis Genome Manipulation; BGM)システ
ムの開発を行ってきた(3, 4)。シアノバクテリアの 3.6Mb(3,600kb)のサイズのゲ
ノ ム DNA も 合 成 す る こ と が 可 能 で あ り (5) 、 大 腸 菌 の Bacterial Artificial
Chromosome(BAC)や酵母の Yeast Artificial Chromosome(YAC)のシステムを凌駕する柔軟な合成ツールであると考えている。しかしながら合成後の大きなサイズの DNA を如何に無傷で他の宿主に移すかがこれまでの課題であった。
枯草菌の接合伝達に関わるプラスミドとしては、これまでに納豆菌由来の pLS20が単離されている(6)。65kb のサイズを持つ pLS20 プラスミドはタイプ IV の接合伝達能を有し、自身の接合伝達だけでなく、mob 遺伝子と oriT 配列を有する
他の小型プラスミド(Staphylococcus 由来の pUB110 や納豆菌由来の pLS30)の接合伝達にも関与することが明らかとなっている。この pLS20 に抗生物質マーカーを組み込んだ pLS20cat を用いて、枯草菌の標準株である 168trpC2 株由来の宿主間における接合伝達能の詳細を解析した。レシピエントとなる枯草菌株
はゲノム中に別の抗生物質マーカーが組み込まれており、複数の抗生物質耐性で選択することで接合伝達効率をモニターすることができ、その結果 pLS20cat
依存性の接合伝達効率はドナー株とレシピエント株双方の growth 状況に大きく依存していること、また制限修飾酵素による影響を受けていることなどが明らかになってきた。pLS20cat 存在下における pLS30 や pUB110 などの接合伝達効率も同様で、ドナー株とレシピエント株の growth が対数増殖初期において最も効率が良いことが示されている。本講演では、こうしたステージ特異的な枯草菌の接合伝達様式について海外の知見も交えて紹介するとともに、接合伝達を含めた菌株間の DNA の移行システムをツールとして活用し(7)、ゲノム合成技術に向けた展望を議論したい。
(1) Jef D. et al., Science.2016, Vol.353, p.126.
(2) Hutchison CA 3rd et al., Science. 2016, Vol.351, p.1414.
(3) Iwata T. et al., BMC Genomics 2013, Vol.14, 300(4) Kaneko S. et al., J. Biochem 2018, Vol.163, p.305.
(5) Itaya M. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2005, Vol.102, p.15971.
(6) Itaya M.et al., Biosci Biotechnol Biochem.2006, Vol.70, p.740-742.
(7) Kuroki A. et al., Gene 2007, Vol.399, p.72-80.

Application of conjugal DNA transfer to HT genetic network analysis

Application of molecular mechanism of Conjugation○森 浩禎 1,2, 藤田 愛 1,2, 片岡 正和 3, 牧 泰史 4, 田村 武幸 5,
松野 浩嗣 6, 高坂 智之 6, 山田 守 6（1奈良先端大・データサイエンス, 2奈良先端大・バイオ, 3信州
大・工, 4大阪医大, 5京大・化研, 6山口大・創成科学）
hmori@gtc.naist.jp○Hirotada Mori1,2, Ai Fujita1,2, Masakazu Kataoka3, Yasushi Maki4,
Takeyuki Tamura5, Hiroshi Matsuno6, Tomoyuki Kosaka6, Mamoru Yamada6(1Data Science Center, NAIST, 2Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST, 3Eng. Fac. Eng.,
Shinshu Univ., 4Osaka Med Col, 5Inst. Chem. Res., Kyoto Univ., 6Grad. Sch. Sci &Tech. for Innovation)

Key words
network

Escherichia coli, gene knockout, conjugal DNA transfer, genetic○金子 真也 1, 板谷 光泰 2
（1東工大・生命理工, 2慶大・先端生命研）
skaneko@bio.titech.ac.jp○Shinya Kaneko1, Mitsuhiro Itaya2(1Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech, 2IAB, Keio Univ.)

Key words

Bacillus subtilis, conjugation, genomic DNA

239

3S-S2a05 ゲノム合成に必須な接合伝達系

3S-S3a01 蛍光バイオセンサーで解き明かす細胞内代謝

ゲノム合成は世界の大きな潮流である。ゲノムサイズは、生物種により大きく変動するが、最小ゲノムサイズはバクテリアの 500kbp で、それを下回る DNA
は長鎖 DNA の範疇になる。しかしながらその 500kbp でも、ゲノムは巨大すぎて損傷を受けやすく、無傷で純粋に大量に試験管で作り出すことは 20 世紀には不可能であった。
不可能を可能にしたのは我々が独自に開発した枯草菌（こそうきん）と呼ばれるバクテリアである。枯草菌は、大腸菌、酵母と並んでモデル生物の一種であるが、ゲノム編集、ゲノム操作が柔軟に適用できる数少ない生物材料で、ゲノ
ム構造を思うがまま変化させられる。30 年前、誰も見向きもしなかった枯草菌のこの能力にとりつかれ、独自のアイデアと膨大な試行錯誤の繰り返しと 7 年の歳月をかけて、世界で初めてゲノムの完全合成に成功し報告した（2005 年）。
合成対象としたゲノムは光合成で生育するラン藻（シアノバクテリア）ゲノム
で、サイズ 3,500 kbp と巨大であり、枯草菌ゲノムとキメラ状態の株をシアノバ
チルス 1.0 と呼称して、世界にインパクトを与えた。枯草菌でのゲノム合成は、ドミノと呼ばれる長鎖 DNA（通常は 50kbp）を切れ目なく連続して連結して得られる。枯草菌の効率良いゲノム編集操作のおかげで、確実なゲノム連結が行
えたが、ゲノムは合成するだけでも大事業である。
本講演では、ドミノを連結するステップに接合伝達の系を適用する長年にわたる開発と実際に適用できるレベルになったことを紹介する。この新世代の枯草菌ゲノム合成システムでは、今後迅速化と簡便化が期待される。さらに、ゲノムは合成するだけでは片手落ちであり、合成ゲノムを再起動させるためのシャーシ株に移動させるためにやはり接合伝達システムが重要であり、その開発にも触れたい。枯草菌でのゲノム合成手法の独自性は高く、現在でも独走状態が続いている。枯草菌での接合伝達システムは、大腸菌のそれと比較して種類が限定され、開発に時間はかかった。枯草菌という認知度の高くない生物を用いたことで、理解され認められるまでの道のりは平坦ではない。前例は自ら作り出さねばならず、まとまった成果には時間がかかることがなかなか認識されないのがもどかしい。世界がゲノム合成に舵をきった今、合成対象は現存のゲノムだけでなく、完全に設計されたゲノムにもおよび、合成ゲノムを機能させるまでの一気通貫システムの構築が必須である。枯草菌という日本発のゲノム合成システムが接合伝達の適用で、時間とコストでも有利なシステムとして世界標準化を目指したい。

細胞は自身の生存・増殖のため、外部環境の変化に応じて細胞内代謝を精密に制御している。また、様々な疾病において、細胞内代謝の様式が大きく変化していることも知られている。そのため、細胞内代謝を正確に測定することは、細胞の恒常性維持のしくみや疾病の原因の理解のために非常に重要である。また、生物の代謝を利用した物質生産を制御する上でも、細胞内代謝の測定技術は極めて有用であると考えられる。ところが、細胞内代謝物の測定は、従来、多数の細胞を破壊して得られた抽出液をクロマトグラフィーや質量分析で分析することでおこなわれてきたため、個々の細胞における代謝物濃度のばらつき
や時間変動を知ることは原理的に不可能であった。他方、近年になり様々な蛍光タンパク質の開発が進んで遺伝子工学的な利用が可能になったことにより、
蛍光タンパク質と他の機能的タンパク質を組み合わせることによって、イオン
濃度やシグナル伝達系酵素の活性等を光のシグナルへと変換する蛍光バイオセンサーを開発できるようになった。我々は、生細胞内における代謝物の時空間的な動態を明らかにするためには、こうした可視化技術が強力な技術となると考え、代謝物濃度を測定するための蛍光バイオセンサーの開発を進めた。
まず、我々は、ATP の生細胞内動態を明らかにするため、枯草菌由来の ATP 合
成酵素 ε サブユニットと蛍光タンパク質を組み合わせた一連の蛍光 ATP バイオ
センサーの開発を進めた。アデノシン三リン酸（ATP）は細胞内のエネルギーのキャリアとして働く、極めて重要な代謝物である。フェルスター共鳴エネル
ギー移動（FRET）型バイオセンサーである「ATeam」は ε サブユニットを介してシアン色蛍光タンパク質（CFP）と黄色蛍光タンパク質（YFP）を融合したかたちをとっている。ATP 濃度が高くなると ε サブユニットに ATP が結合し、それに伴う構造変化によって CFP-YFP 間の距離と角度が変化することで、蛍光タンパク質間の FRET 効率が変化する。すなわち ATP 濃度によって蛍光の発光スペクトルが変化する。ATeam を用いることで、細胞分裂において一過的に細胞内 ATP 濃度が減少することや、細胞の局所において ATP 濃度が異なることなどが見出され、細胞内の ATP 濃度が動的に変化していることが明らかになってきた。一方、単一蛍光タンパク質型バイオセンサーである「QUEEN」は、緑
色蛍光タンパク質（GFP）の蛍光団近傍のループ部分に ε サブユニットを融合させたかたちをとっている。ATP の結合に伴う ε サブユニットの構造変化によって GFP の蛍光団周囲の環境が変化するために、ATP 濃度によって蛍光の励起ス
ペクトルが変化する。QUEEN の蛍光シグナルは蛍光タンパク質の成熟の影響を受けにくいため、特に増殖の早い細菌における ATP イメージングに有用である。QUEEN を用いることによって、全く同じ環境で培養した場合であっても、個々の大腸菌細胞の ATP 濃度には大きなばらつきがあることが見出された。
次に我々は、ロイシン、イソロイシン、バリンに特異的な蛍光バイオセンサーの開発を進めた。これらのアミノ酸は側鎖に分岐構造をもつため分岐鎖アミノ酸（Branched-Chine Amino Acids, BCAA）と総称される。生細胞内の BCAA 濃
度は mTOR 経路などを通じて細胞の代謝に大きく影響を及ぼすと考えられているものの、細胞や生体内の BCAA 濃度を測定する方法は確立されておらず、その動態は必ずしも明確ではない。分岐鎖アミノ酸バイオセンサーは、大腸菌に由来する分岐鎖アミノ酸結合タンパク質（LIVBP）内のループ部分に CFP とYFP を挿入させることで作成した。既に決定されている LIVBP の立体構造から期待されたとおり、この蛍光バイオセンサーは分岐鎖アミノ酸の結合に伴う立体構造変化により大きな FRET 効率の変化を示した。バイオセンサーを発現させたがん細胞のイメージングにより、細胞外から細胞内への分岐鎖アミノ酸の取り込みには１種類の輸送体が主要な役割を果たしていること、そして細胞質からミトコンドリア内へのバリンの輸送はロイシンやイソロイシンとは異なる輸送体が担っていることが示唆された。従来、蛍光バイオセンサーにおいて使用する機能的タンパク質はほぼ例外なく天然由来のものであり、人工的に設計したタンパク質の利用はほとんど検討されてこなかった。我々は、大腸菌由来
LIVBP を、人工設計された非天然型 LIVBP に置き換えた蛍光分岐鎖アミノ酸
バイオセンサーも作成し、良好なデータを得ている。本シンポジウムでは、その成果についても報告する予定である。

○板谷 光泰（慶應大学先端生命研）
mita2001@sfc.keio.ac.jp【参考文献】
１）板谷、金子：「ゲノム合成の潮流」実験医学、vol.37, (No.3) 452-457 (2019)２）金子、板谷:「細胞外核酸を利用した簡便で迅速な形質転換系の確立」化学
と生物,54:p.668-673 (2016)３）柘植、板谷：「ゲノム再編集のための遺伝子クラスター単位の構築」化学と生物 54, p.740-746. （2016）
３ ） 板 谷 ：「 生 命 シ ス テ ム に お け る ゲ ノ ム 科 学 と ゲ ノ ム 工 学 」、 第 7 章 、
pp131-146、’生命システム工学―進化分子工学から進化生命工学へ’,田口精一編、【化学同人】(2012)４）板谷‘合成生物学’ 浅島誠・他編、シリーズ現代生物科学入門 9、第 2 章「ゲノム構造の再編成」、pp35-65 岩波書店 (2010)

Conjugation systems essential tool for genome synthesis by a Bacillus
subtilis genome vector○Mitsuhiro Itaya(Inst. Adv. Biosci. Keio Univ)

Key words

Bacillus subtilis, competent, genome engineering, conjugation transfer○今村 博臣（京大院・生命）imamura@lif.kyoto-u.ac.jp

Visualization of intracelular metabolism with protein-baesd fluorescentbiosensors○Hiromi Imamura(Grad. Sch. Biostud., Kyoto Univ.)

Key words

biosensor, ATP, branched-chain amino acids, imaging

240

3S-S3a02 人工タンパク質設計技術を用いたサメシングルドメイン
抗体の高機能化○竹田 浩之（愛媛大・PROS）
takeda.hiroyuki.mk@ehime-u.ac.jp

抗原分子を特異的に認識し強く結合する抗体は、標的の固定、検出、攻撃などの目的で研究、検査、診断、治療などの幅広い領域で使われている。特に近年、シングルドメイン抗体や Fab、scFv などの低分子抗体が、安定化シャペロンや多重特異性抗体創出に適した機能性分子として注目されている。
サメなどの軟骨魚綱板鰓類が持つ重鎖抗体 IgNAR の可変領域を切り出すことにより、VNAR というシングルドメイン抗体を創出することができる。VNAR は
約 15 kDa と非常に小さい、最小の抗体分子の１つである。煮沸しても巻き戻り結合活性を維持できる高い可塑性、大腸菌で発現でき低コスト生産が可能など、
ラクダ由来のシングルドメイン抗体 VHH と似た特性を持つ。VHH との相違点
として、VNAR は 20〜35 残基と長く多様性に富んだ CDR3 を持つ。また抗体を持つ生物種の中で進化的に最も古い生物であるサメを用いた抗体作製は、抗体作製で利点をもたらす。つまり、ヒトやマウスと遺伝子やタンパク質の配列が大きく異なるサメを免疫に用いれば、創薬標的タンパク質のような哺乳動物
間で高度に保存された抗原タンパク質であっても、免疫系が標的抗原を異物として認識し、抗体が誘導される可能性が高い。同様に、新規なエピトープに結合する抗体の創出にも最適である。難点は、サメがモデル生物ではないため遺伝子配列や二次抗体などの研究リソースが非常に限られていることである。またサメは人工繁殖できないため、生きたサメ個体を天然から捕獲・飼育する必要があることも、サメ VNAR の開発を難しくしている。
私たちは愛媛県・伊予灘に豊富に生息するエイラクブカ (Hemitriakis japanica)を用いた VNAR 作製技術を開発した。エイラクブカは鋭い歯を持たずおとなしい性状の小型サメであり、安全に飼育する事ができる。私たちは愛媛県の協力のもと、エイラクブカの安定入手経路、陸上飼育技術、個体識別技術、エイラ
クブカ IgNAR に対する二次抗体などを開発し、エイラクブカへの免疫を安全かつ安定に行える体制を整えた。免疫によって抗原特異的な抗体価の上昇が見られたエイラクブカ個体の脾臓から RNA を抽出し、IgNAR 可変領域を増幅、VNAR 提示ファージライブラリを構築した。バイオパニングによる抗原特異的
ファージ濃縮と NGS による網羅的配列解析により抗原特異的 VNAR を取得できる体制を整えた。すでに球状可溶性タンパク質、転写因子、タンパク質複合体などの免疫と抗体作製に成功しており、膜タンパク質などの高難度な抗原への抗体作製に挑戦している。また、高圧巻き戻し技術により、大腸菌で発現させた封入体から活性のある VNAR を低コスト大量生産する技術も確立した。

3S-S3a03 In silico タンパク質設計を実現する分子シミュレーショ
ン手法の構築○原田 隆平
（筑波大・計算セ）
ryuhei@ccs.tsukuba.ac.jp

計算機の演算性能と分子動力学(MD)シミュレーションの信頼性向上に伴い, 生
体分子の機能解明や構造予測に関する理論研究が進んでいる. しかし, 現在の高性能な計算機を用いても解明困難な生体反応が数多く存在している. 何故ならば, 現状の MD シミュレーションが到達可能な時間スケールが, 機能発現の時間スケールと比較して非常に短いからである. 発表者らは, 現状における MD シ
ミュレーションの時間スケールの問題点を解決するため, 長時間 MD シミュレー
ションに代えて複数の異なる初期構造から短時間 MD シミュレーションを独立・並列に繰り返し実行する「データ駆動型分子動力学シミュレーション」の概念を提案し, タンパク質の大規模構造変化やフォールディング経路探索などに適用してきた.
開発手法の一例として, “Parallel Cascade Selection MD (PaCS-MD)“ の概念を紹介する. PaCS-MD は, 構造遷移における始・終構造が与えられた条件下で, 始構造
から終構造へ至る遷移経路を探索する. 具体的には, 反応座標として平均自乗距
離(Root-Mean Square Deviation: RMSD)の値を参照して探索構造をランキングし,終構造に類似した(RMSD が小さい)分子構造を遷移確率が高い初期構造として選択し, 短時間 MD シミュレーションをリスタートさせるサイクルを繰り返し,
終構造へ遷移する「稀にしか起こらない構造揺らぎ」の出現確率を上昇させる.
遷移確率の高い構造から逐次的に短時間 MD シミュレーションをリスタートすることで, 選択した分子構造が終構造へ近づき, 遷移経路を探索できる. PaCS-MD
は適用にあたり, 構造変化の始・終構造が既知であることが条件となるが, 終構造が未知の場合にも適用可能な形式に拡張した構造サンプリング法も提案している. 講演では, PaCS-MD の拡張版や, 具体的な適用例を紹介すると共に, 今後の研究展望として, 開発手法の in silico タンパク質設計への展望を議論したい.

私たちは従来の抗体よりも可塑性と発展性に優れる VNAR を、研究用途だけではなく医療、診断、バイオセンサーなどへの様々な目的に応用しようと考えている。VNAR は従来の抗体よりも圧倒的に生産コストを低減できるため、食品、農業など従来とは異なった分野へ展開できる可能性もある。そのためには、取得した抗体を使用目的に応じて改良・高機能化できる技術が必要である。例
えば医療分野への応用には、ヒト化技術により抗原性を抑制することが必須である。また、診断薬として使用するためには可能な限り親和性と生産性を向上することが望まれる。目的に応じて様々な高機能化を柔軟に実施するための手法を模索していたところ、ある学会でたまたま中野先生の人工タンパク質設計法に関する講演を拝聴し、衝撃を受け、その場で共同研究を申し込んだ。配列
情報のみから in silico で全く新規なタンパク質配列を創製する同技術を VNAR
改変に用いれば、天然サメ個体から取得した VNAR のヒト化、高親和性化、安定化などの多様な高機能化を迅速かつ効果的に実施できる可能性が高いと期待し、開発を進めている。

Engineering of shark single domain antibody by using in silico artificial
protein design

Enhanced molecular dynamics simulation methods for in silico protein
designin silico artificial protein design, single domain antibody, VNAR

Key words
molecular dynamics simulation, rare events of proteins, enhanced
sampling methods○Hiroyuki Takeda(PROS, Ehime Univ.)

Key words○Ryuhei Harada(CCS, Univ. of Tsukuba)

241

3S-S3a04 Structure and engineering of CRISPR-Cas9○Hiroshi Nishimasu(Grad. Sch. Sci., Univ. Tokyo)
nisimasu@bs.s.u-tokyo.ac.jp

The RNA-guided endonuclease Cas9 cleaves its target DNA and is a powerfulgenome-editing tool. However, the widely used Streptococcus pyogenes Cas9 enzyme(SpCas9) requires an NGG protospacer adjacent motif (PAM) for target recognition,
thereby restricting the genomic loci that can be targeted. Here, we report a rationallyengineered SpCas9 variant (SpCas9-NG) that can recognize relaxed NG PAMs. We
solved the crystal structure of SpCas9-NG in complex with the guide RNA and its
target DNA, demonstrating that the loss of the base-specific interaction with the third
G is compensated by newly introduced non-base-specific interactions to achieve the
NG PAM recognition. We showed that SpCas9-NG induces indels at endogenous target
sites bearing NG PAMs in human cells, and that the off-target cleavage is reduced bypreviously reported high-fidelity mutations. In addition, we found that a SpCas9-NG
D10A nickase fused with cytidine deaminase can induce C-to-T base editing at target
sites with NG PAMs in human cells. Thus, SpCas9-NG expands the targetable space inCas9-mediated genome engineering. Furthermore, we would like to present the data
showing a comparison of the cleavage activity of SpCas9-NG with that of the recently
reported xCas9 variant.

3S-S3a05 演繹的学習と帰納的学習の融合:第四次革新的データマ
イニング法による蛋白質の人工設計○伊藤 創平, 中野 祥吾（静県大院・薬食生命）
itosohei@u-shizuoka-ken.ac.jp

同じ反応を触媒し似た立体構造を持つ酵素であっても、由来する生物種によって生産性や安定性は大きく異なる。アミノ酸という同じ部品で作られ、1 次配列という単純な文字列にその秘密が隠されているはずなのに、この秘密を解き明かすことができない。わずか 10 個のアミノ酸がつながった分子でも可能な組
み合わせは 2010 = 10 兆通り。100 個以上のアミノ酸が繋がっているタンパク質・酵素では、ほぼ無限の組み合わせ可能。生命が利用しているタンパク質の配列は、あまりに多様で並べて比較しても違いに対する規則性が見出だせない。だから合理的な説明ができない。
配列の保存性からタンパク質の高次構造や機能を見ると、20~30%のわずかな相同性であってもほぼ同じ形状や機能に収束する。酵素であれば反応特異性や基質特異性が保存され、似た EC 番号が付与される。この”相同な領域に保存された機能”に研究者は注目、演繹的に解析する手法の開発を長年行ない、医療・健康・食品・環境・農業・エネルギー等の広い分野でバイオの力を活用してきた。
しかし、このような演繹的手法は、配列の違いに重きを置かない解析であるため、本質的にタンパク質がもつ多様な機能を活用しきれない。
そんな中、構造生物学が大好きだった大学院生 N 君は、タンパク質の配列と立体構造を詳細に比較、変異体多数をデザインし実験してみたところ、すべて失敗に終わり研究が嫌いになりそうになった。研究棟の屋上で西に沈む夕日に涙をにじませていたところ、ふと、配列数がいくら増えても正確に配列を比較し、コンピューターで解析しやすい出力に加工できる画期的な方法を思いついた。
次世代シーケンサー等の解析技術の進歩により、配列データベースが拡大の一途をたどる今日、より多くの配列を扱う自分のアイデアに夢を感じた。
さて、私達の研究チームは、静岡に職を得た N 先生を中心に、配列データベー
スを帰納的に解析、タンパク質分子全体を再設計する技術の開発と検証をここ
数年鋭意進めてきました。具体的には、10000 を超える相同な配列をアンサン
ブル機械学習法により解析、情報を抽出できる状態にします。そして、研究の目的とデータの特徴と研究の目的に合わせて、データの加工、分類、選抜、タ
ンパク質分子全体の設計をするパラメーターを調整(パレート最適化)します。
タンパク質は人と同じで多様であり、関係するデータベース(配列、立体構造)も異なります。よって、演繹的な手法で見出された、有用な個性を持つタンパ
ク質の情報に合わせて、データを加工するところが秘訣となります。そんなわけで、”演繹的学習と帰納的学習の融合:第四次革新的データマイニング法による高機能タンパク質の人工設計”という、大変きな臭いタイトルになったわけです。本技術の特徴は、パソコンに学習させるデータを揃えるのに苦労したり、パソコンに依存し人間の出番がなくなってしまうような技術ではないところです。研究者が苦労して発見・探求してきた課題無くして成立しない技術ですので、互いの聡明さ (Artificial and Human Intelligence) を褒め合いながらお酒が飲める楽しい共同研究に発展します。反応性や生産性の向上、基質選択性の拡張、相互作用の共進化の解析と求められる課題は様々ですが、課題を達成できる確率は 50%以上になってきた感触があります。技術と言えども生みの親に似るものなのでしょうか、研究とお酒が大好きな N 先生の遺伝子を受け継いだ研究者
フレンドリーな技術です。
相同性が低い領域に潜む規則性を抽出することで、機能未知なタンパク質であっても機能的な分類、進化速度が早いウィルスタンパク質の分類も可能となりました。また、私達の研究チームによって設計、高機能化した人工タンパク質は、かなりの数の大学・企業との共同研究において暗躍しており、近うちにいくつかの大きな成果を報告できそうです。本シンポジウムにおいても、いくつか発表が間に合うことを期待しています。本学会において、４名の修士学生が成果を発表しますので、ぜひご覧になってください。本シンポジウムにおきましては、そんな技術と人工設計した蛋白質の紹介をさせていただきます。

Structure and engineering of CRISPR-Cas9○Hiroshi Nishimasu(Grad. Sch. Sci., Univ. Tokyo)

Key words

crystallographic study, protein engineering

Synergy of artificial intelligence and human intelligence: a sequence-based
inductive and deductive learning approach applied to artificial protein
design.
○Sohei Ito, Shogo Nakano(Grad. Sch. Integr. Pharm. Nutr. Sci., Univ. Shizuoka)

Key words
protein engineering, in silico classification and screening, data mining,
artificial protein design

242

3S-S5a01 体と対話するナノ界面科学： バイオとナノデバイスの共生、サイバー空間と生体のシームレスな会話に向けて

3S-S5a02 デバイスが理解できる言語を非天然アミノ酸として含む
アプタマーの創製○山下 一郎（阪大院・工）yamashita@pmdp.arl.eng.osaka-u.ac.jp○鵜澤 尊規 1,2（1理研・開拓研究本部, 2理研・創発物性科学研究センター）
tuzawa@riken.jp

現在クラウド・デジタル世界の圧倒的コンピューティングパワーや高速データ通信、膨大なデータハンドリング技術が、人工知能 AI の発展やビッグデータ
技術と相まって世界を大きく変え始めている。実空間は IoT で検出され、サイバー空間と一体となり、さらこれらの情報はビックデータとして処理され、AIが判断し、アクチエータが実空間にフィードバックする世界（Society5.0）が始
まりつつある。その先にはマイクロ・ナノサイズで、細胞や生体とデバイスとが相互に検出・観測・刺激し、対話する世界がある。そこでは、生体・細胞とデバイスが共生し高度に連携しこれまでとは全く違う新しい世界となる。
しかし、細胞とデバイスの共生を実現するには大きな困難がある。それは両者が物理的に出会う固体表面と生体の表面が、構造と機能両面において根本的に異なることに起因する。生体・細胞の表面は「数ナノメータ単位で非周期的に配置されたペプチド、糖鎖、タンパク質などの要素が時々刻々ダイナミックに動く世界」であり、揺れ動く微細構造、時々刻々変化する化学分子の分泌/吸収や相互作用、それらの経時的変化、多層構造、異なる時定数動作などが機能を担う。一方デバイス固体表面は「原子間力・ファンデルワールス力など近距離力が支配する世界」であり、その構造は硬く結晶構造が基本で、その機能は 1〜3 次元の原子結合構造から生まれる自由電子、ホール、電圧、フォノン、プ
ラズモン、フォトンなど直接触れない機能担体にゆだねられている。
生体・細胞とデバイスが共生には、この「強い原子結合から生まれる自由電子、
フォノン、プラズモン」で機能するデバイスと「揺れ動く微細表面構造や分子の吸脱着」を信号として機能する生体・細胞とが対話できるナノ界面が必要となる。その界面は、まずナノ領域で両者に親和性が有り、生体・細胞の表面構造に応じて変化する自己組織能をもち、状況により自己修復することが求められる。これを実現するためには最新の無機・有機アプタマー技術や DNA・プロ
テインオリガミ技術、タンパク質の超分子自己集合設計技術、シミュレーショ
ン技術を動員する必要がある。さらに生体・異質の信号をつなぐためにこの界面の物理化学的性質をダイナミックに制御することも重要となる。例えば界面での誘電率を制御することで生物とデバイスの電気的結合制御を可能とする技術も必要となる。
これらの課題解決には新しい「対話型ナノ界面科学」が必要となる。この界面
科学は大変挑戦的であるが、現在のナノテクノロジーをフルに用いれば回答を出せる段階に来たと思われる。
このようなナノレベルで生体・細胞とデバイスの共生が実現すれば生体・細胞
関連工学・科学、さらには医療が一変する。ナノデバイスにより生体の多点同時測定長時間記録が可能となり、多量の細胞情報がビッグデータとしてサイバー空間に取り込まれ、AI で解析されることにより、細胞の理解が飛躍的に進む。
さらにその知見を基に細胞の人工的改変が可能になり、サイバー空間から対話型ナノ界面を持つデバイスによって、生体への刺激・反応検出・フィードバッ
クが行え、細胞からナノデバイスへの支援を求めるなど、サイバー空間と生体のシームレスな対話も可能になる。このような生体とデジタル空間が混然一体となる近未来では、我々は体を実時間でモニターし・補助するデバイスが生活の一部となっているかもしれない。
「対話型ナノ界面科学」が未来にどのように発展していくのかはまだ予測できないが、これまでの工学・科学を超えた、生体とデバイス共生の新しい挑戦が求められている。

あらゆるものがインターネットに繋がる IoT 技術は進化し続けており、様々な家電だけではなく、ウェアラブル末端を介して生体もインターネットに繋がっている。IoT 技術は今後更に進化することは確実であり、今後は細胞さらには生体分子がインターネットと繋がる新しい世界になると予想される。このような世界の実現のためには、無機材料からなるデバイスと細胞・生体分子とのナノスケール界面における高度な信号交換、いわばデバイスと生体との対話を可能とする材料が必要となると我々は考えている。

Nano-interface science that interacts with living organisms: Symbiosis of
biology and nanodevices towards seamless communication between cyber
space and living organisms

Generation of aptamers containing unnatural amino acids as signaltransduction elements○Ichiro Yamashita(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

interactive interface, aptamer, selforganization, cyber space

デバイスと生体との対話における重要な役割を果たす材料の１つとして、分子進化工学的手法によって創出されるペプチドアプタマーの利用が想定されている。2018 年にノーベル化学賞が与えられた進化分子工学的手法は、天然のスープから分子や生物が進化したとするダーウィン的進化を模倣したものである。
天然アミノ酸からなるペプチドのスープ、つまり多様な配列を含むライブラリー
ペプチド集団に対して、任意のターゲット分子に結合するという人工的な選択
圧を掛けることで、ターゲットに結合するペプチドを回収し、それらの数を増幅し、再度ライブラリーとして選択圧を掛けるサイクルを続けることで、特定のターゲット分子に結合するペプチドが得らえる。最終的に得られるペプチドは特にペプチドアプタマーと呼ばれている。
我々は上述の進化分子工学的手法を拡張し、機能性の非天然アミノ酸を含むペプチドライブラリーからペプチドアプタマーを得ることで、無機材料からなるデバイスに何らかのシグナルを送ることができる種々のペプチドアプタマーの創出を進めている。特に、感度の高い蛍光分光法を用いたセンサーとしての利用を目指して、環境応答性の蛍光色素を非天然アミノ酸として組み込んだアプ
タマーの選出を精力的に進めている。まず、我々は環境応答性の蛍光色素としてニトロベンゾオキサジアゾール(NBD)を主に用いている。この蛍光色素は、水溶液中では水によって消光されるものの、疎水性雰囲気下では蛍光を発生することが知られている。NBD を含むペプチドアプタマーがターゲットに結合す
ると、NBD 周囲の溶媒環境の変化に伴って NBD の蛍光強度が変化することが期待される。我々はこのコンセプトを実証するために、NBD を含むペプチドラ
イブラリーから、カルシウム結合型のカルモジュリンに結合するペプチドアプ
タマーを選出した。得られたペプチドアプタマーはカルモジュリンに結合すると、NBD 由来の蛍光強度が 10 倍に増えることが分かった。MD シミュレーショ
ンの結果からも、このペプチドアプタマーの NBD がターゲット結合時に疎水性環境下に置かれることが示唆された。夾雑物として 50％血清が存在する条件下においても、夾雑物のないバッファー中でみられる場合と同様の結合能を示すことから、ターゲット特異性も高いことが示された。ターゲットの結合に伴って蛍光強度が増加するというコンセプトの実証に成功したことから、次に我々はこのペプチドアプタマーの高感度化を試みた。具体的には、ペプチドアプタ
マーの NBD をナフタルイミド系蛍光色素(4-DMN)に変えることで、バックグラ
ウンドの蛍光強度をほぼゼロにまで弱められた結果、ターゲットの有無で蛍光強度を 100 倍に増加させることに成功している。我々の拡張型進化分子工学的手法はカルモジュリン以外のターゲットにも利用できることが分かっており、これまでにウイルス由来のタンパク質、藻類の貯蔵多糖に結合すると蛍光を発するペプチドアプタマーの選出にも成功している。このことは我々の拡張型進化分子工学的手法の一般性を示している。今後は拡張型進化分子工学的手法によって得られるペプチドアプタマーをデバイスと組み合わせることにより、発展が期待される生体分子がインターネットと繋がる新しい世界の構築に貢献できると期待できる。

○Takanori Uzawa1,2(1CPR RIKEN, 2CEMS RIKEN)

Key words

aptamer, unnatural amino acid, in vitro selection

243

3S-S5a03 細胞と対話をする足場材料による細胞機能のアクティブ制御

3S-S5a04 Plasmonic endoscopy for single cell interrogation○Hiroshi Uji-i1,2(1RIES, Hokkaido University, 2Department of Chemistry, KU
Leuven)hiroshi.ujii@es.hokudai.ac.jp○松崎 典弥（阪大院・工）m-matsus@chem.eng.osaka-u.ac.jp

これまで様々な生体材料が研究開発され、既に幅広い医療現場で活躍している。
生体分子と材料の接点はその界面で起こるため、生体分子に認識されないバイ
オイナートな表面設計や、生体分子と相互作用するバイオアクティブな表面設計が主に研究されてきた。しかし、これらの材料設計だけで全てが解決できる
わけではない。疾患部位の環境は、刻一刻と動的に変化する。例えば、動脈硬化、心筋梗塞、線維化、腫瘍形成は、病気の進行に従いその微小環境の細胞、
液性因子、細胞外マトリックス（ECM）成分が劇的に変化し、それに伴い臓器の弾性率や細胞・コラーゲン線維の配向性も変わる。そこで、疾患の環境変化に柔軟に対応してその構造や性質を動的に変える生体材料の分子設計が、今後重要になると考えられる。例えば、メカノバイオロジーでは、組織・臓器に対応した材料の弾性率の最適化だけでなく、疾患ステージに対応した最適な弾性率の動的制御や、必要に応じて幹細胞の分化誘導を促進する弾性率の動的制御も重要になると考えられる。さらに、細胞の配向が乱れた組織では、細胞の再配向を誘導する高分子繊維の動的配向制御が必要になる。これらを実現するた
めには、微小環境変化に応答して高分子材料の機能を動的に制御する分子設計が必要である。そのためには、生体との「対話」が求められる。
従来の生体材料では、材料から細胞・生体分子への「一方向の情報伝達」に基づく分子設計が行われてきた。細胞接着性・非接着性表面や血液適合性表面、抗菌性表面などは、材料表面から生体分子への働きかけによりその機能を発現している。一方、生体機能の基本は「対話」である。生体分子と「双方向」の情報伝達を可能とする動的な生体材料の分子設計が今後重要になると考えられる。
このようなコンセプトに基づき、我々はこれまで、ECM のように細胞と対話をする高分子材料の開発と組織工学への応用を研究してきた。具体的には、細胞間の接着を誘起する ECM ナノ薄膜で細胞表面をコートすることで、様々な三次元組織体が構築できることを報告してきた。また、最近では、マイクロメー
トルサイズの足場材料が、細胞の組織化を動的に誘導し、生体類似の ECM 密
度の高い組織体が構築できることを見出している。本シンポジウムでは、これらの内容について報告する。

Metal nanowires can be used as wave-guides for propagating surface plasmon
polaritons (SPPs), allowing the spatial confinement and transfer light energy overmicrometer distance through the structures below sub-diffraction limited diameter.
SPPs confined at the surface of single crystalline metal nanowires, such as wetchemically synthesized silver nanowires, can propagate over tens of microns before
energy is lost by Ohmic damping. Alternatively, the use of surface plasmoncs allows us
to concentrate light energy in nanometer regions, such as a nanogap between metal
nanoparticles, leading to a massive enhancement of electromagnetic filed that can beused for surface enhanced Raman scattering (SERS) or fluorescence (SEF)
spectroscopy/microscopy.
In this contribution, we introduce a noble nanoscopic techniques using a combinationof these two concept, that of SERS/SEF detection of (bio)molecules and that of subdiffraction limit SPPs wave-guiding. Specifically, we demonstrate that SPPs launchedalong a silver nanowire (50 ~ 100 nm diameter) can remotely excite SERS [1,2] andSEF [3] in the vicinity of the nanowire surface due to the SPPs wave-guiding effect.
The ability to transfer SERS/SEF excitation over several microns, through subdiffraction limited structures, will be discussed with respect to potential application
toward super-resolution endoscopy [1] and tip-enhanced Raman microscopy [4]Active control of cell functions by cell-interactive scaffolds

Plasmonic endoscopy for single cell interrogation○Michiya Matsusaki(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

biomaterials, tissue engineering, molecular recognition, scaffold

1) G. Lu, H. De Keersmaecker, L. Su, B. Kenens, S. Rocha, E. Fron, C. Chen, P. Van
Dorpe, H. Mizuno, J. Hofkens, J. A. Hutchison, H. Uji-i. Advanced Materials, 2014.
26, 5124-5128.
2) J. A. Hutchison, S. P. Centeno, H. Odaka, H. Fukumura, J. Hofkens, H. Uji-i, Nano
Lett., 2009, 9, 995 - 1001.
3) L. Su, G. Lu, B. Kenens, S. Rocha, E. Fron, H. Yuan, C. Chen, P. Van Dorpe, M. B.
J. Roeffaers, H. Mizuno, J. Hofkens, J. A. Hutchison, H. Uji-i, Nature Commun. 2015,
DOI: 10.1038/ncomms7287.
4) Y. Fujita, R. Chiba, G. Lu, N. Horimoto, S. Kajimoto, H. Fukumura, H. Uji-i, Chem.
Commun. 2014. 50, 9839-9841.

○Hiroshi Uji-i1,2(1RIES, Hokkaido University, 2Department of Chemistry, KU Leuven)

Key words

Plasmonics, single cell spectroscopy, endoscopy

244

3S-S2p01 抗生物質の生合成研究から見出した新規 tRNA 依存型
アミド合成酵素の基質認識機構

3S-S2p02 試験管内人工生合成系で擬天然物を創る○後藤 佑樹（東大院・理）y-goto@chem.s.u-tokyo.ac.jp○丸山 千登勢, 濱野 吉十（福井県大・生物資源）
c-maruyama@fpu.ac.jp

1943 年に初めて単離され、以来、数多くの放線菌から見つかっている抗生物質
streptothricin（ST)は、強力な抗菌活性を示すにも関わらず、ヒトなどの真核生物への毒性が強く医薬品や農薬として利用されていない。ST 及び ST 類縁化合物は共通して、アミノ糖とアミノ酸誘導体からなる streptothrisamine 骨格を有し、アミノ酸側鎖として、1〜7 残基の beta-Lys oligopeptide [oligo(beta-Lys)]、あるいは glycine 誘導体が結合することで数多くの類縁化合物が存在する。興味深
いことに、これまでに天然より単離された ST 類縁化合物の側鎖構造は、betaLys タイプまたは glycine タイプの 2 種類しか見つかっておらず、これら以外のアミノ酸を側鎖に持つ化合物は見つかっていない。従ってこれら 2 つのアミノ酸側鎖の生合成経路の解明は、beta-Lys、glycine に次ぐ、第 2、第 3 のアミノ酸側鎖を有する新規 ST 類縁化合物の創製につながると期待された。そこで我々はこれまでに ST 生産菌 Streptomyces rochei NBRC12908 のゲノムライブラリー
より ST 生合成遺伝子を取得し、oligo(beta-Lys)が新奇反応メカニズムを有する
非リボソーム型ペプチド合成酵素（NRPS）Orf5、18、19 によって生合成されることを明らかにした。本講演では、glycine 誘導体側鎖を有する ST 類縁化合物 BD-12 の生合成研究から見出した新奇アミド合成酵素と、最近新たに見出したそのホモログ酵素を利用した新規 ST 類縁化合物創製について紹介する。
1. BD-12 生合成遺伝子群の同定
glycine 誘導体側鎖の生合成を明らかにするために、まず、BD-12 生産菌 S.
luteocolor NBRC13826 の BAC ライブラリーより、BD-12 生合成に関わる全ての遺伝子セットを有する BAC クローンを取得し、本遺伝子群から、glycine 誘導
体側鎖の生合成酵素遺伝子の探索を試みた。当初、我々は、glycine 側鎖も STの beta-Lys 側鎖と同じく、NRPS によって生合成されると予想し、BD-12 生合成遺伝子群から Orf5、18、19 のホモログ酵素遺伝子を探索したが、予想に反し、本遺伝子群には NRPS をコードする遺伝子が存在していなかった。そこで、各遺伝子産物の構造予測を基にアミド合成に関わる酵素遺伝子を探索した
結果、 Orf11 が FemAX family に相同性を示すことが判明した。FemAX は、微生物のペプチドグリカン生合成過程におけるペプチド架橋反応を触媒する tRNA
依存型ペプチド合成酵素として知られている。従って BD-12 の glycine 側鎖は、NRPS ではなく、tRNA 依存的なメカニズムで生合成される可能性が示唆された。
2. tRNA 依存型アミド合成酵素 Orf11 の in vitro 解析
次に我々は、Orf11 の機能解析を行うために、Orf11 組換え酵素を用いた in vitro
反応を試みた。Orf11 の基質となる aminoacyl-tRNA の供給には、大腸菌由来 invitro タンパク質合成システムを利用し、streptothrisamine と glycine を基質に酵
素反応を行ったところ、BD-12 生合成中間体 glycylthricin の生成が確認された。
さらにタンパク性アミノ酸 20 種類を基質として添加し、Orf11 の基質特性を調べたところ、興味深いことに、alanine をわずかに基質認識し、alanine 側鎖を有する新規 ST 類縁化合物 alanylthricin を与えた。前述したように、ST 及び ST 類
縁化合物のアミノ酸側鎖には、beta-Lys タイプまたは glycine タイプの 2 種類しか見つかっていない。しかし、本酵素を用いた反応において、第 3 のアミノ酸側鎖を持つ新規 ST 類縁化合物の創製に成功した。すなわち、Orf11 ホモログ酵素の探索とその応用利用は、さらなる新規 ST 類縁化合物の創出への可能性が期待された。
3. Orf11 ホモログ酵素遺伝子の探索と応用利用に関する研究
放線菌ゲノムデータベースより、Orf11 に相同性を示すホモログ酵素遺伝子の探索を行ったところ、最近、Orf11 と高い相同性を示すホモログ酵素 Sba18 を見出した。そこで、Orf11 と同様に機能解析を行ったところ、Sba18 は、GlytRNAGly 以外にも Ala-tRNAAla、Ser-tRNASer を基質として認識し、glycylthricin だ
けでなく、新規 ST 類縁化合物 alanylthricin、serylthricin を生成することを明らかにした。従って Orf11 と Sba18 は 75%の相同性を示しながら、その基質特異性は大きく異なり、Sba18 は aa-tRNAaa 分子における tRNAaa 構造、アミノアシ
ル基構造の両者に対して、広い基質特異性を有するアミド合成酵素であることが判明した。さらに最近、本酵素を利用して、様々なアミノ酸側鎖を有する新規 ST 類縁化合物の酵素合成に成功した。本講演ではこれらの研究成果について紹介する。

強い生物活性を示すペプチド性天然物は、タンパク質には見られない特殊な主鎖骨格や側鎖構造を持つものが多い。天然物に広く見られるこれらの骨格を、
de novo の人工生物活性ペプチドの構成モチーフとして活用できないだろうか？
天然物の重要な局所骨格モチーフを持ちつつ、全体構造は全く新規な生物活性
分子は、単なる天然物の類縁体の範疇を超え、天然物を模した人工生物活性分子『擬天然物』と呼べるはずである。望みの活性を有した擬天然物ペプチドを創製するため、我々は擬天然物ペプチドの大規模ライブラリーを構築可能な試
験管内人工生合成系を開発している。本講演では、この人工生合成系を用いた
生物活性擬天然物の開発を紹介する。

Insight into a flexible substrate selectivity of novel aminoacyl-tRNAdependent amide synthetase

Elaboration of pseudo-natural peptides by artificial in vitro biosynthesis
systems○Chitose Maruyama, Yoshimitsu Hamano(Fac. Biotechnol., Fukui Pref. Univ.)

Key words
synthetase

Streptomyces, antibiotics, biosynthesis, tRNA-dependent amide○Yuki Goto
(Grad. Sch. Sci., Univ. Tokyo)

Key words

in vitro reconstitution, artificial biosynthesis, pseudo-natural products

245

3S-S2p03 機能未知及び潜在的二次代謝遺伝子資源からの生理活性分子生産を実現する TAR Cloning

3S-S2p04 精密解析に基づく多価不飽和脂肪酸生合成酵素の機能改変○山中 一也 1, 老川 典夫 1, 濱野 吉十 2
（1関西大・化生工, 2福井県大・生物資源）
kazuyay@kansai-u.ac.jp○林 祥平 1, 佐藤 康治 2, 小笠原 泰志 2, 大利 徹 2（1北大院・総合化学, 2北大院・工）shohei884@eis.hokudai.ac.jp

抗がん剤や抗生物質などの医薬品として利用される化合物の多くは放線菌の二次代謝産物として生産される。古くから主に陸上土壌から単離された放線菌が創薬リード化合物の生産に利用されてきたが、近年ではこうした古典的手法による新規化合物の取得頻度は大幅に下がり、かつて医薬品産業において重要な役割を果たしてきた天然物創薬研究もその役割を終えようとしている。
一方、次世代シーケンサーが普及したことに伴い多くの放線菌ゲノムには 20〜
30 に上る潜在的な二次代謝遺伝子群がコードされていることが明らかになったことで、放線菌の創薬資源としての重要性が近年再び注目されつつある。すな
わち、放線菌ゲノム上に見いだされる通常の培養条件下では機能発現していな
い“休眠状態”の二次代謝関連遺伝子群にコードされる各種酵素のアミノ酸配列からその機能や、生産される化合物の構造及び生理活性を推定し、その情報に基づいて合理的に実際の化合物を探索するゲノムマイニングと呼ばれる手法が次世代の天然物創薬研究を支えるものと期待されている。しかしながら、ゲノム解析技術の急速な進歩に相反して、数十〜百 kb に及ぶ長大な領域にコードされる二次代謝産物の生合成に関与する遺伝子群を過不足なく正確にクローン化し利用する技術の欠如のため、生理活性天然物の探索及び生合成研究においては、依然として研究対象とする二次代謝遺伝子群毎にコスミドや Bacterial
Artificial Chromosome (BAC)を利用して構築したゲノムライブラリーから研究対象とする遺伝子群を不足なく含むクローンを探し当て、異種発現により生産物の有無を確認するという非常に古典的で手間のかかる手法に頼らざるを得ないのが現状である。すなわち、急速な DNA 解析技術の進歩に対してその利用技術の発展が追い付いていないと言える。
そこで我々は、酵母の in vivo 相同組換え能を利用した Transformation-AssociatedRecombination (TAR) 法を用いて任意の二次代謝産物生合成遺伝子群をゲノムラ
イブラリーの構築を経ることなく微生物ゲノムから直接且つ過不足なくベクター
へクローン化し、異種発現宿主において化合物生産に結び付けることを目指して研究を進めてきた。我々が“TAR による休眠遺伝子資源の掘り起こし”手法の有効性を検証すべく最初の研究対象として選んだ未同定遺伝子群は、海洋放線菌 Saccharomonospora sp. CNQ490 ゲノムに見出した推定リポペプチド生合成遺伝子群であった。その理由は、当該遺伝子群のバイオインフォマティックな解析結果が、(1)チオテンプレート型の非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)によって生合成されるペプチド骨格が、既に皮膚感染症治療薬として実用化されているダプトマイシンと類似していると予想されたこと、(2)当該遺伝子クラス
ターにはハロゲン化酵素遺伝子がコードされていたことから、生産物は既知のリポペプチドとは異なるユニークな生理活性を発現する可能性があることを示していたからである。そこで、73-kb（全ゲノムの 1.5%に相当）に及ぶ長大な領域にコードされるこの推定ハロリポペプチド生合成遺伝子群を、CNQ490 株
ゲノムから直接クローン化し、更に制御遺伝子の改変、モデル放線菌での異種発現を通して、新規リポペプチドの探索を試みた。その結果、制御遺伝子欠失
変異を施した異種発現株からは、期待した通りペプチド骨格の 2 つの芳香族アミノ酸残基が共に塩素化された新規リポペプチド抗生物質及びその誘導体の生産が確認された。この化合物が TAR 手法による休眠遺伝子群の覚醒により演者らが手にした最初の天然物となった。従って、このハロリポペプチドには TAR
により生み出された長男坊 太郎(Taro)であるという特別な思いがあり、主生産
物を Taromycin A と命名した。
このように、TAR を用いる新規二次代謝産物探索及び生合成研究の手法は、合理的に遺伝子資源を化合物生産に結び付ける画期的な技術と言えるが、このプロトタイプ TAR 法においても、安定にクローン化できる遺伝子サイズに上限があること、酵母内での相同組換え過程でクローン化遺伝子を保持しない疑陽性
クローンが一定頻度で出現することから、依然として小規模ではあるが陽性ク
ローン(〜数%)の選抜過程が必要であった。これまでに、我々は本手法をハイス
ループット化し、網羅的天然生理活性物質の探索研究手法として応用することを目指し、より長大な領域にコードされる二次代謝産物生合成遺伝子群をも安定に、且つ煩雑な追加の選抜過程を経ることなくゲノム DNA からワンステップで効率的に直接クローニング出来るように改良研究を進めてきた。本講演ではその進捗や新規二次代謝産物生合成研究に於ける TAR 法の応用例についても紹介したい。

ドコサヘキサエン酸 (DHA: C22:6 ω3) やエイコサペンタエン酸 (EPA: C20:5 ω3)などの多価不飽和脂肪酸 (PUFA) は膜脂質の構成成分であり、また、プロスタ
グランジン類などのシグナル分子の前駆体である。これら PUFA は機能性脂質と呼ばれ、動脈硬化や高脂血症改善などの生理活性を示すことが知られており、医薬品やサプリメントとして需要が増加している。現在の供給源は魚油等の海洋資源であるが、海洋資源の保護の観点から海洋資源に依存しない供給源が求められており、新規供給源として微生物発酵が注目されている。
微生物には 2 つの PUFA 生合成経路が知られている。１つは酸素依存型不飽和化酵素と炭素鎖長伸長酵素によって cis 二重結合の形成及び伸長反応が触媒され、オレイン酸から段階的に PUFA を合成する経路である。もう１つはポリケチド合成酵素 (PKS) に似た酵素複合体 PUFA 合成酵素によって de novo で PUFAを合成する経路である。PUFA 合成酵素は 3 つまたは 4 つのサブユニットから構成され、ドメインが連続的に反応を触媒し、最終生産物を特異的に合成するが、その詳細な生合成機構は明らかとなっていない。
これまでに DHA、EPA とアラキドン酸 (ARA C20:4 ω6) の生合成に関与するPUFA 合成酵素遺伝子が報告されている。興味深いことに、これら 3 つの PUFA
合成酵素は cis 二重結合の導入位置 (ω3 or ω6) や炭素鎖長 (C20 or C22) の異なる
PUFA を特異的に合成するにも関わらず、そのドメイン構造が類似している。
そこで、我々はこれら PUFA 合成酵素を用いて精密な生合成解析を行い、生産物の cis 二重結合の導入位置と炭素鎖長制御機構の解明に取り組んだ。
上述のように 3 つの PUFA 合成酵素は似たドメイン構造を持つ。そこで、大腸菌を用いた異種宿主発現系を構築し、各々のサブユニット酵素遺伝子やドメインを相互に交換することで生産物の制御に関与する遺伝子とドメインを解析した。その結果、EPA と ARA 合成酵素の 2 つの dehydratase (DH) ドメインおよびサブユニット C にある β-ketoacyl synthase (KSC) /chain length factor (CLF) ドメイ
ンが cis 二重結合導入の位置の制御に関与すること、DHA と EPA 合成酵素のサブユニット C にある KSC/CLF ドメインが炭素鎖長 (C20 or C22) 制御に関与することが明らかとなった。
2 つの DH ドメインはそれぞれ、モジュラー型 PKS 中の DH (DHPKS)と cis 型不飽和脂肪酸の生合成に関わる FabA 型 DH (DHFabA) と相同性を示すことから、これらが cis 二重結合の導入位置を制御すると予想された。そこで、EPA と ARA
合成酵素由来の両 DH ドメインの組換え酵素とアシル化 acyl carrier protein(ACP) または N-アセチルシステアミン (SNAC) 基質を用いて in vitro 機能解析を試みた。その結果、3-hydroxyhexanoyl-ACP 基質に対して、ARA 合成酵素では
DHPKS が DHFabA と比較して高い触媒活性を示し、逆に EPA 合成酵素では DHFabA
が DHPKS よりも高い活性を示した。また、DHFabA は脱水反応に続く二重結合の異性化も触媒し、cis 二重結合を形成することがわかった。以上から経路中間体である 3-hydroxyhexanoyl-ACP に対する 2 つの DH ドメインの基質特異性の違いが生産物の cis 二重結合の導入位置を制御していることを明らかとした 1)。
次に、DHA と EPA 合成酵素由来 KSC/CLF ドメインの in vitro 機能解析を行った。PUFA 合成酵素にはサブユニット A にも KS ドメイン (KSA) が存在するため、両 KS ドメインの組換え酵素を調製し、炭素鎖長の異なる ACP 基質を用いてその基質特異性を比較した。その結果、KSA は何れも炭素鎖長が短い基質を認識する一方、KSC は何れも中鎖の基質を認識することが分かった。次に、炭素鎖長が 18 の基質を用いて同様に反応を行ったところ、何れも KSA のみが炭素鎖長 18 から 20 への縮合反応を触媒することがわかった。すなわち、EPA 生
合成の最後の縮合反応は KSA が関与することが示された。DHA 生合成の最後の縮合反応についても解析した結果、DHA 合成酵素由来の KSC が炭素鎖長 20から 22 への縮合反応を触媒することが示唆された。以上の結果から PUFA 合成
酵素は鎖長伸長に 2 つの KS ドメインを使い分け、KSC の僅かな基質特異性の違いが最終生産物の炭素鎖長を制御していることが明らかとなった 2)。
これまでに得られた知見に基づき、DHA 発酵生産に利用されている微細藻類由来 DHA 合成酵素に変異導入し、DHA から EPA 合成酵素へと変換させることに成功した。本シンポジウムでは明らかとなった PUFA 生合成マシナリーとその機能改変の詳細について紹介したい。

TAR cloning that allows the efficient production of natural productmolecules from uncharacterized gene collections

Dissecting and engineering of polyusaturated fatty acid synthases for
product control○Kazuya Yamanaka1, Tadao Oikawa1, Yoshimitsu Hamano2(1Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ., 2Fac. Biotechnol., Fukui Pref. Univ.)

Key words

natural product, homologous recombination, heterologous production

1) S. Hayashi et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2019, 58, 2326-2330.
2) S. Hayashi et al., Angew. Chem. Int. Ed., doi: 10.1002/anie.201900771.

○Shohei Hayashi1, Yasuharu Satoh2, Yasushi Ogasawara2, Tohru Dairi2(1Grad. Sch. Chem. Sci. Eng., Hokkaido Univ., 2Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.)

Key words

polyunsaturated fatty acid, polyketide synthase, fatty acid biosynthesis

246

3S-S2p05 制御因子・低分子シグナル分子による放線菌二次代謝の合理的人為制御

3S-S3p01 バイオジェット燃料の普及への取り組み○中島 陸博（日本航空）
nakashima.mtxm@jal.com○荒川 賢治（広島大院・統合生命科学）
karakawa@hiroshima-u.ac.jp

放線菌は微生物由来二次代謝産物の７割近くを生産する有用土壌微生物である。放線菌二次代謝産物に関して、近年では生合成遺伝子の改変による非天然型抗生物質の創製も盛んに行われており、創薬の研究シーズとして期待される。
近年の次世代シークエンサー解析によると、一菌株あたり 30 種類以上の二次代
謝産物生合成遺伝子クラスターがコードされているが、通常生産されるのは約
1-2 割であり、残りの 8-9 割は遺伝子発現されていないことが多く、多くの二次代謝生合成遺伝子クラスターは休眠状態である。すなわち、これら休眠二次代
謝クラスターの合理的活性化技法（ゲノムマイニング）の確立が、生物資源の有効利用とともに近年停滞気味の新規生理活性天然物の取得に繋がるといっても過言ではない。
ゲノムマイニング技法として、二次代謝遺伝子の異種発現、転写リプレッサーの遺伝子破壊、主要二次代謝の生合成遮断による代謝改変、などが挙げられ、世界中で有用生理活性物質の獲得を目指し、様々な研究が展開されている。我々
は、２つのポリケチド抗生物質ランカサイジン・ランカマイシンを生産する放線菌 Streptomyces rochei 7434AN4 株を研究材料とし、特異な二次代謝生合成機
構の解明と生産制御システムの合理的理解を展開している。本発表では、我々のゲノムマイニング技法の最近の成果について詳述するとともに、制御因子や二次代謝生産誘導シグナル分子による物質生産誘導についての可能性について議論する。

Rational control of secondary metabolism in Streptomyces species throughthe regulatory pathways and low-molecular signaling molecules○Kenji Arakawa(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)

Key words

biosynthesis, Streptomyces, regulation, antibiotics「航空機持続可能な社会のために JAL グループができること」
JAL グループでは、「SDGs をはじめとする社会の課題解決へ貢献」を目指し、
環境負荷軽減に向けてさまざまな取り組みを行っています。なかでも、航空会社として重要な課題として捉えているのは、CO2 の排出量削減についてです。
2010 年、JAL グループは、「2020 年度までに 2005 年度対比で CO2 排出量を輸
送量当たり 23%削減する」ことを宣言。使用燃料の削減に注力し、従来機よりも CO2 排出量を削減できるボーイング 787 型機や、エアバス A350 型機といった省燃費機材を導入するなど、あらゆる取り組みを行ってまいりました。
今後は、環境に優しい社会の実現に向けてさらにもう一歩踏み込むために、調達する燃料の質にも着目。CO2 排出量そのものの削減を目指し、バイオジェッ
ト燃料の利用促進を加速させていきたいと考えています。バイオジェット燃料とは、欧米を中心に開発や実用化が進んでいる燃料の一種です。その原料や製造技術はさまざまですが、都市ごみや廃木材などを原料にすることで、CO2 排
出量を大幅に削減することができます。
JAL グループでは、国際民間航空機関（ICAO）が定める国際航空分野の CO2
排出量削減の方針に合わせ、バイオジェット燃料の実用化を促進。2018 年には、一般廃棄物（都市ごみ）を原料としてバイオジェット燃料を開発する、フルクラム社への出資を行いました。今後、フルクラム社で量産体制が確立した
後は、北米発便を中心に、本格的にバイオジェット燃料の搭載を進めていきた
いと考えています。
「衣料品で空を飛ぶ！チャーターフライト実現に向けて」
バイオジェット燃料の実用生産に向けた活動は、欧米を中心に、先行して取り組まれています。一方で、JAL グループが使用する燃料の約 7 割は日本で給油しているため、「国産」のバイオジェット燃料の安定的な供給も不可欠だと考えています。こうした背景を受けて、JAL グループでは、日本の航空会社として国産のバイオジェット燃料の製造も目指し、アジアにおいても機運を高めていくべく、研究開発を始めています。
開発促進に向けた取り組みの一つとして、現在、「10 万着で飛ばそう！JAL バ
イオジェット燃料フライト」を実施しています。これは、バイオジェット燃料が皆さまにとって身近な素材である、衣料品からも製造できることに着目した
プロジェクトです。日本環境設計株式会社の協力のもと、全国の皆さまから衣料品を回収し、Green Earth Institute 株式会社と共に、公益財団法人地球環境産業技術研究機構の技術を使い、国内の既存施設にて国産バイオジェット燃料の製造を行います。
2018 年 10 月 15 日〜12 月 10 日の期間、全国の衣料品店や百貨店をはじめとする 50 社約 1000 店舗にご参加いただき、店頭に回収ボックスを設置して不要となった衣料品の提供を募集いたしました。その結果、おかげさまで 10 万着を大幅に超える約 25 万着の古着を回収することができました。現在、工場にて古着の選別作業と溶解作業が行われています。
このバイオジェット燃料を使ったチャーター便の運航は、2020 年を予定しています。本取り組みを契機として、日本国内において、今後、安定的な供給を叶えるべく、量産化への取り組みが加速化することを期待しています。
JAL グループは今後も、環境の課題解決に積極的に取り組み、社会の進歩発展に貢献してまいります。

Effort for widespread use of bio-jet fuel○Takahiro Nakashima(JAL)

Key words

Bio-jet fuel, alcohol to jet, CO2 reduction

247

3S-S3p02 微細藻類ユーグレナを活用したバイオ燃料事業化○鈴木 健吾 1,2（1ユーグレナ, 2理研・環境資源）
suzuki@euglena.jp

3S-S3p03 微細藻類を用いたバイオジェット燃料生産プロセスの
構築

○武藤 潤
（ＩＨＩ ソリューション・新事業統括本部 藻類バイオ燃料グ
ループ）
jun_mutou@ihi.co.jp

微細藻類の一種であるユーグレナは低酸素条件下におかれるとワックスエステ
ルという長鎖脂肪酸と脂肪族アルコールがエステル結合した脂質を作り出す。
このワックスエステルは炭素鎖 14 の脂肪酸（ミリスチン酸）と脂肪族アルコール（ミリスチルアルコール）から構成されるものが主成分であり、その分解により生成するバイオ燃料は、ジェット燃料等に適した性質であることが明らかとなっている。また、他の微細藻類が作り出す脂質も同様に、バイオ燃料として優れた性質を示すことがわかり、再生可能エネルギー創出の担い手として微細藻類に対する期待が高まっている。
化石燃料と競合できる価格でのバイオ燃料の生産のためには、原料となる油脂の効率的生産が必須となる。用いる株の育種は、生産性の向上に大きく貢献できる可能性があり、ユーグレナについても重イオンビーム照射による変異導入がユーグレナの変異体作出に効果的であることが示唆され、実証例として高温に耐性がある変異体株が作出された。これを遺伝子導入に依らない手法として利用し、ユーグレナ育種が実施されている。重イオンビーム照射はゲノムに大きな欠失をランダムに導入する。このため、これを用いた育種は、様々な変異が導入された個体集団の中から、目的の形質を示す個体を選抜することが必要となる。生物学的に多様な形質を有する細胞の集団から、個々の細胞を高速選抜する技術としては FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting)が有効であり、これを利用して油脂を高含有する育種を実施した。BODIPY505/515 を用いてユー
グレナ生細胞内の油脂を染色し、FACS により選抜する方法を確立することにより、重イオンビームによる変異導入と組み合わせ、実証例において野生型よりもさらに 40%程度高い油脂含量を有する株の作出に成功した。近年は、油脂生産における代謝関連のメカニズムもメタボローム解析や遺伝子の発現制御に
より明らかになってきており、これらの知見を活用することにより様々な形質を付与し、燃料生産に特化したユーグレナ育種株として発展していくことが期待される。
さらに、ユーグレナを活用したバイオ燃料の生産においては、培養装置の低コ
スト化、培養から油脂抽出におけるエネルギー投入量の削減、培養に供する栄養源の低コスト化も大きな課題である。この課題に取り組むため、多気クリス
タルタウン（所在地：三重県多気郡多気町）の中部プラントサービスが保有する木質バイオマス発電所の隣接地に、バイオ燃料向けの研究開発に特化した研
究、培養を行う設備を建設し、実証試験を行った。実証を行う上で以下のシス
テムを組み合わせることにより、ユーグレナの培養から油脂抽出までの一貫生
産システムを構築することを目指している。
・火力発電所から排出される排ガス中の CO2 を効率的に利用するシステム
・火力発電所内で未利用な排熱・排水を培養や油脂抽出工程に有効利用するシ
ステム・培地コスト低減のために下水中に含まれる栄養源を利用するシステム（本事業は、経済産業省資源エネルギー庁「平成 28 年度 微細藻類燃料生産実証
事業費補助金」を活用）
藻類バイオ燃料事業が採算合うようにするためには、材料となる油脂を安く生産できるようにするなど、解決すべき課題は多い。一方で、それらの課題と並行して、実際にユーグレナのワックスエステルを利用してバイオ燃料の生産ができることを実証するために、バイオジェット・ディーゼル燃料製造実証プラ
ントを神奈川県横浜市に建設した。当該プラントでは、ユーグレナ・ワックスエステル以外の植物油脂からも併せて燃料を試験生産する計画であるが、年間で 125 kL 生産を目指して運転を実施している。さらに、バイオ燃料を生産して供給する事業を成立させるために、さらに燃料生産以外の面でも低コスト化と安定供給を目指して様々な検討が必要である。例えば、経済性を担保するにあたっては、油脂を抽出した後の脱脂藻体等の副産物を有効利用することも全体としての経済性を考慮する上で重要である。各種課題を解決するには、広域の技術領域における開発と協力関係が必要で、生物工学を中心とした異分野融合のプロジェクトとして推進している。

世界的に CO2 排出量が増加しており、パリ協定を始め排出量削減に向けて国際的な取り組みが行われている。航空機の利用増加に伴う CO2 排出量の増加か
ら、CO2 排出量削減の一環でバイオジェット燃料の使用へ向けた取り組みが行われている。世界の航空会社からなる業界団体 IATA（International Air Transport
Association）は、航空機に関わる CO2 排出量を 2050 年までに 50%削減（2005
年比）することを掲げており、目標達成のためには航空機の技術革新や運用方法の改善に加え、バイオ燃料の導入が不可欠であるとしている。
このような世界環境の変化から、当社では 2011 年より微細藻類を用いたバイオジェット燃料生産プロセスの開発に取り組んでいる。2013 年には 100m2 規模の開放型培養槽を屋外に設置し、数か月の培養試験を行いながら基礎データを取得し、屋外における安定培養のノウハウを蓄積した。2015 年には 1500m2 規模の培養槽を設置し、運転方法の確立と曝気・収穫・乾燥などの要素技術の検証を行った。2018 年には日本より日射量が高くより生産性の向上が見込まれるタ
イ王国のサラブリ県に 1ha 規模のパイロットプラントを整備し、商用に向けた一貫生産プロセスの実証試験を進めている。
微細藻類によるバイオ燃料生産は、非農耕作地でも実施可能なため、持続可能な燃料生産手段として注目されている。当社では Botoryococcus braunii （以下、Bb）を品種改良し、高速増殖能と高オイル含量を併せ持つ株「高速増殖型ボツリオコッカス（Hyper-Growth Botryococcus braunii 、以下、HGBb)」を用いている。HGBb は炭素源として CO2 を利用し光合成により主に炭素と水素のみからなる炭化水素油を生産する。HGBb から分泌された油は液中に漏出することな
くコロニー内部に蓄積し、HGBb の乾燥物重量のうち油含量は 50wt%にのぼる。
微細藻類を大量に培養し、有価物を獲得する技術は例えば機能性食品などで実用化されている。本プロセスから生産する最終目的物が燃料であることから低コスト・低エネルギーにて大量に培養する必要がある。
当社が取り組むバイオジェット燃料生産プロセスは、微細藻類を生産する培養
工程、培養液から微細藻類を濃縮する収穫工程、濃縮した液体から水分を除く
乾燥工程、乾燥物から油を抽出する抽出工程、抽出した油からジェット燃料を精製する改質工程、からなる。当社では比較的規模が大きく、生物に合わせて設計を行う必要がある培養工程〜乾燥工程を開発対象としている。
培養工程では光合成を促進させるために十分に撹拌し、均等に HGBb へ CO2 を供給する必要がある。一般的に開放型培養槽を均一に撹拌するためには撹拌翼を液中に設置し、液中に CO2 を供給するためには曝気装置を培養槽全面に配置する方法が存在するが、コストおよびエネルギーがかかる。そのため当社では曝気管を培養槽全域に走査する機構の曝気装置を採用している。この方式により少ない曝気量で効率的に CO2 を培養槽全体に供給することが可能となる。また培養槽全体を曝気しつつ走査するため、培養液撹拌の効果も得られる。
収穫工程では HGBb の粒径が大きい性質を利用し、ろ過による固液分離方式を利用している。このとき発生した脱水液（藻体濃縮液）を乾燥工程に排出する。
ろ液は再生処理を行った後に再度培養工程にて利用する。ろ過方式では藻体を含む培養液を輸送するためのポンプ動力が発生するため、より低エネルギーな回収方法として HGBb の浮上性を利用した回収方法を検討している。HGBb を含む培養液を静置すると油を含んだ比重の軽い HGBb が自然に浮上し濃縮され浮上層が発生する。回収した浮上層のみを一旦静置することで再度浮上層させると、更に濃縮することが可能である。
乾燥工程では化石燃料由来の熱エネルギーを用いない風乾による自然乾燥方法を採用している。水分を除く工業的手法として、一般的には加熱乾燥や凍結乾燥法が知られているものの、いずれもエネルギーがかかる。当社では、太陽由来の熱エネルギーや自然風を用い乾燥し、人力で乾燥物の回収を行うことで、プロセスの低エネルギー化の検討を進めている。
微細藻類由来の純バイオジェット燃料をジェット燃料として用いるためには、
石油由来のジェット燃料との混合バイオジェット燃料の要求仕様である ASTM
D7566 を満たす必要がある。弊社の純バイオジェット燃料は ASTM D7566
Annex2 で定義されている水素化処理プロセスを利用し、改質を予定している。
現在までに国内の培養設備で HGBb を生産・抽出油の作製を行い、改質プロセ
ス最適条件を探索するための改質試験を実施した。得られた改質条件で ASTM
D4054 における Tier1、Tier2 試験用サンプルを生産し、現在 ASTM 認証取得を目指している。
本開発は、 国立研究開発法人 新エネルギー・産業技術総合開発機構（NEDO）の委託事業（プロジェクトコード P17005）で実施したことを記し、謝意を表す。

Commercialization of biofuel using a microalga Euglena

Development of production process of algae-based bio-jet fuel○Kengo Suzuki1,2(1euglena Co., Ltd., 2CSRS, RIKENS)

Key words

biomass, euglena, algae, metabolic engineering○Jun Muto(Algae-based Biofuel Group, Solution Headquarters, IHI Corp.)

Key words

Bio-jet fuel, microalgae, production

248

3S-S3p04 高性能噴流床ガス化と FT 合成による純バイオジェット
製造パイロットプラントの研究開発

3S-S3p05 100%グリーンジェット燃料の生産技術開発への挑戦○乾 将行 1,2
（1RITE・バイオ, 2奈良先端大・バイオ）inui@rite.or.jp○山内 康弘 1, 篠田 克彦 1, 菱田 正志 1, 坂井 清彦 2, 小嶋 保彦 3,
水野 拓哉 4
（1三菱日立パワーシステムズ, 2ＪＥＲＡ, 3東洋エンジニアリン
グ, 4JAXA）
yasuhiro_yamauchi@mhps.com【背景と目的】 航空業界では、今後拡大が予想される航空需要を背景に、二酸化炭素排出量削減による地球温暖化抑止対策が喫緊の課題となっており、2016
年 10 月、国際民間航空機関（ＩＣＡＯ）が、長期的な二酸化炭素排出抑制目標（2020 年以降の排出量増加ゼロ）を策定し、その達成のためにバイオジェット
燃料の普及促進は不可欠としている。
バイオジェット燃料の市場形成および導入拡大に対する期待が世界的に高まる
中、バイオジェット燃料市場形成へ向けて、ライフサイクルアセスメント（製造に係る化石エネルギー収支）や二酸化炭素排出量削減率等の評価基準をクリアし、かつ低コスト製造技術の開発が必須となっている。
このような状況を背景として、2030 年頃のバイオジェット燃料の商用化に向けて、その生産技術について、より高効率な工業化を実現するための課題抽出およびその対策を盛り込んだ一貫製造プロセスのパイロットスケール試験を行い、安定的な長期連続運転および製造コストの低減などの実現可能性を検証する計画である。本実証試験では、スケールアップに適した部分酸化式噴流床ガス化
技術と、反応器容積を大幅にコンパクト化できるマイクロチャンネル FT 合成技術を組み合わせたパイロットスケール一貫製造設備（原料処理 0.7t/D、純バ
イオジェット燃料製造 20l/D 程度）を JERA 新名古屋火力発電所構内に建設し、検証運転により技術の検証を行うと共に、得られた燃料を実エンジン燃焼試験に供し燃料性能を評価する計画である。
この実証研究は、国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構（ＮＥＤＯ）の委託業務で行うものです。

航空機からの CO2 排出量は世界の CO2 全排出量の約 2%を占め、2017 年時点で約 8 億 6 千万トンに達し、今後何の対策も講じなければ 2050 年には現在の 2〜
5 倍の排出量になると予測されている。航空機は電動化などが難しいため、航空機からの CO2 排出削減に向けて再生可能資源であるバイオマスを原料にしたバイオジェット燃料に大きな期待が寄せられている。このような背景の下、我々はバイオマス由来のブタノール（バイオブタノール）を化学的に変換したアルコール系ジェット燃料（Alcohol to Jet：ATJ）と、石油系ジェット燃料と任意の割合で混合可能で、単独でもジェット燃料の規格を満たす新規な 100%グリー
ンジェット燃料の 2 つのバイオジェット燃料の製造技術開発を行っている。
バイオブタノールを原料としたジェット燃料は、2016 年に米国材料試験協会（ASTM）の規格をクリアして、商業フライトへの利用が可能となった。バイオ
ブタノールについては、RITE が独自に開発した RITE バイオプロセスを利用して、高効率バイオブタノール生産プロセスの開発を進めている。本生産技術の特徴は、原料としてセルロース系バイオマスを利用可能で、且つ高速・高収率生産が可能な点にある。開発にあたっての課題は、ブタノールによる生産細胞への高い毒性であった。そこで我々は、生産菌に対するブタノール耐性付与な
どの育種技術や増殖非依存型バイオプロセス（RITE バイオプロセス）の特性によりこの問題を解決した。現在、米国立再生可能エネルギー研究所（NREL）との共同研究により、非可食バイオマス由来の混合糖を原料としたバイオブタ
ノール生産技術を、米パシフィック・ノースウエスト国立研究所（PNNL）との共同研究により、ブタノールを化学的にオリゴマー化による drop-in 燃料に変換する技術開発を進めている。ブタノールのバイオ生産では、世界最高レベルの生産性を達成しており、生産菌のブタノール耐性の向上、生産菌の代謝経路の最適化、および省エネルギー型ブタノール回収技術の開発などの個別要素技
術開発を進め、これらを組み合わせることによってバイオブタノールの更なる
高速・高収率な生産を目指している。一方、国内におけるバイオジェットプロ
ジェクトへの技術協力にも取り組んでいる。2018 年 10 月から始まった日本航
空株式会社（JAL）が主催する「10 万着で飛ばそう！JAL バイオジェット燃料フライト」プロジェクトである。本プロジェクトは、JAL と日本環境設計株式
会社が協力して回収した古着を原料として、RITE 発のベンチャー企業である
Green Earth Institute 株式会社がイソブタノールを生産し、ASTM に適合したバ
イオジェット燃料を製造するものであり、JAL は、2020 年中に、このバイオジェット燃料を使用した日本初のチャーターフライトの運航を目指している。
次に 100%グリーンジェット燃料の開発目的や背景について説明する。ジェッ
ト燃料は炭素数 C9〜C15 のノルマルパラフィン、イソパラフィン、シクロパラ
フィン、芳香族化合物を主成分とする炭化水素化合物の混合物であり、ASTMが定める規格によって析出点や密度などの様々な物性が規定されている。この中で、芳香族化合物は燃焼性が悪いために含量に上限が設けられているが、ニトリル系 O リングを膨潤させる性質から燃料系機器の気密性の維持に必須な成分である。ATJ も含めてこれまでに ASTM によって認証を受けているバイオ
ジェット燃料はいずれもバイオマスから製造される成分はイソパラフィンのみであり、イソパラフィンの密度はシクロパラフィンや芳香族化合物の密度よりも軽いため、イソパラフィンのみからなるバイオジェット燃料の密度はジェッ
ト燃料の規格よりもかなり軽くなる。そのため既存のバイオジェット燃料に必須な成分である芳香族成分をほとんど含まないため 100%では使用できず、いずれも石油系ジェット燃料と混合して使用され、その混合比率の上限は最大で50%までとなっている。そこで我々は、イソパラフィンだけでなくシクロパラ
フィンや芳香族化合物も含み、石油系ジェット燃料と任意の割合で混合可能な
新規な 100%グリーンジェット燃料の製造技術開発を開始した。製造法の概要を講演で解説する予定である。
航空部門からの CO2 排出量削減対策として、国際民間航空機関（ICAO）は航空機からの CO2 排出量を 2020 年以降増やさないという目標を立てており、国際航空運送協会（IATA）は 2050 年時の CO2 排出量を 2005 年時の 50%まで削減するという目標を立てている。従って、これらの目標を達成するには 2050 年時において、ジェット燃料消費量の 60%以上をバイオジェット燃料で代替させる必要がある。本講演では、我々が開発中の 2 つのバイオジェット燃料技術に関する開発状況と今後の展望について紹介する。

Development of once-through process of biomass gasification and FT
synthesis

Challenge to develop 100% green jet fuel production technology○Yasuhiro Yamauchi1, Katsuhiko Shinoda1, Masashi Hishida1, Kiyohiko Sakai2,
Yasuhiko Kojima3, Takuya Mizuno4(1Mitsubishi Hitachi Power Systemes, Ltd., 2JERA Co., 3TOYO Engineering Co.,
4
JAXA)

Key words

biojetfuel, gasification, waste wood chip, Fischer-Tropsch process○Masayuki Inui1,2(1Bio, RITE, 2Div. Biol. Sci., NAIST)

Key words
glutamicum

bio jet fuel, alcohol to jet, CO2 reduction, Corynebacterium

249

3S-S4p01 シンポジウム「ペアで紹介します，Wet と Dry の融合研究」開催趣旨3S-S4p02 植物病原糸状菌を制御する菌類ウイルスの探索とゲノム解析の迅速化○堀之内 貴明（理研・生命機能）takaaki_horinouchi@riken.jp

分析技術の発展に伴うデータ量の増大により、バイオインフォマティクスを始めとする計算科学的解析（Dry 解析）の生物工学分野における重要性が高まっている。しかしそれには高度な専門知識を要し、さらにターゲットや目的によって手法が多種多様である等のハードルが存在する。分析技術等の技術革新はデー
タ解析の質および量の変化をもたらし続けており、各研究者が Wet 実験ならびに Dry 解析の全てを独力で課題解決することはますます困難になると予想される。そのため、Wet 系ならびに Dry 系研究者の連携の重要性が高まっている。
本シンポジウムでは、Wet と Dry の融合研究について、それぞれを担当する 2名の研究者を招聘し、「1 演題につき 2 名が登壇するペアプレゼンテーション形
式」により紹介していただく。通常のシンポジウム講演とは異なり、講演要旨
集の各演題に対し登壇者が 2 名ずつアサインされていることに注意されたい。
様々な分野からの幅広い研究事例を題材とし、共同研究の成立の経緯や連携の取り方などの具体的な内容についてそれぞれの視点から紹介していただくことにより、Wet 系ならびに Dry 系研究者の連携の秘訣を議論できれば幸いである。

Introduction of symposium "Paired Presentation by Wet and Dry
Researchers: How to Integrate Wet and Dry Study? "○Takaaki Horinouchi(BDR, RIKEN)

Key words

bioinformatics

水谷 行善 1, カラッサンチオ マッテオ 2, 太田 綺弥 1, 藤森 文啓 3,○上坂 一馬 4, ○千葉 壮太郎 1（1名大院・生命農学, 2ボローニャ大・農環食科技, 3名大・遺伝子, 4東京家政大・家政）
uesaka@gene.nagoya-u.ac.jp, chiba@agr.nagoya-u.ac.jp
植物病害を引き起こす病原微生物の約 8 割は、糸状菌（いわゆるカビ）である。
これらの防除には基本的に化学農薬が用いられており、消費者の環境・健康に対する意識の高まりを受けて微生物を用いて病原菌を制御する生物的防除法に大きな期待が持たれるようになってきている。生物防除では、Trichoderma 属等の糸状菌や Bacillus 属等の細菌が主たる生物農薬として利用されるが、現在では菌類ウイルス（マイコウイルス）が第 3 のプレーヤーとして考えられるようになった。主立った植物病原糸状菌を対象にウイルスハンティングが広く実施され、新規ウイルスが次々に報告された結果、菌類ウイルスの豊かな多様性が理解されてきている。例えば、コムギの重要病害である赤かび病菌（Fusarium
boothii）BL13 株には 2 種類の RNA ウイルス、Fusarium boothii large flexivirus 1(FbLFV1)とその defective RNA（FbLFV1 の内部配列欠損 RNA 種；D-RNA）、および Fusarium boothii mitovirus 1（FbMV1）が共感染しており、宿主菌の生育やコムギ穂に対する病原性を顕著に抑制する。これらウイルスのゲノム解析の結果、FbMV1 は最も広く感染が確認されている Narunavirus 科 Mitovirus 属の 1 種で、FbLFV1 は新たなウイルス科を形成すると思われる新奇ウイルスであることが明らかにされた。旧来の cDNA ライブラリ構築に基づくウイルスゲノム解析は多大な労力と時間を要したが、昨今の NGS による塩基配列解析技術の革新
により、新規ウイルスのゲノム解析は飛躍的に簡略化されていることは言及す
るまでもない。しかし、本菌株およびウイルス同定のために、Illumina Hi-seqを利用したウイルス由来 RNA 配列の網羅的取得を試みた結果、種々の問題に直面することになった。
まず、１）菌類ウイルスでは全く新規のウイルス群が発見されることは珍しくなく、リファレンス配列情報が利用できない場合がある。また、２）末端配列情報が得られたか不明であり、RACE による追加解析が必要である。場合によっては、３）互いに近似なゲノム配列をもつ quasi species や D-RNA が混在することがある。最後に、４）コスト削減のために、ウイルス由来核酸を混合して配列解析に供することが一般的であり、同一種異系統ウイルスが含まれる場合も少なくなく、また取得コンティグの帰属（どの菌株に感染するウイルスか）も
RT-PCR で決定する必要がある。以上の理由から、de novo アッセンブリで完全長ゲノム配列が取得できないことも多く、配列取得後の追加実験も数多くあるなど、NGS の技術革新を活かしきれていない。事実、FbLFV1 および FbMV1の解析では、これらのウイルスゲノム解析に際し、上記の事由により想定外の労力と時間を必要とした。
そこで、演者らの研究グループでは、Oxford Nanopore Technologies の MinIONを用いた RNA direct sequencing をプラットフォームとして、RNA ウイルスゲノ
ム決定法の開発を試みている。MinION の利点は、1 分子 RNA の完全長配列が取得でき、D-RNA の混在が問題にならない点、また工夫次第で末端配列の決定ができる点にある。問題点としては、RNA 配列の解析精度は未だ高くなく、およそ 20％のエラーが含まれることで近似配列の差別化が困難な点、加えてリ
ファレンス配列の無い新規ウイルスの配列決定が比較的難しい点が挙げられる。
本研究では、上記の利点を最大限活かし、難点となる de novo アッセンブリの精度をバイオインフォマティクスによるワーキングフローの構築により可能な限り向上させた。また、配列の帰属決定についても簡便な方法を模索している。
以上で構築したプロトコルを用いて、実際に Fusarium 属菌に感染している RNA
ウイルス群のゲノムを網羅的に決定した例を紹介したい。

Accelerated procedures in screening for and genome characterization of
fungal viruses that attenuate virulence of plant pathogenic fungi

Yukiyoshi Mizutani1, Matteo Calassanzio2, Ayane Ota1, Fumihiro Fujimori3,○Kazuma Uesaka4, ○Sotaro Chiba1(1Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2Dept. AEFST, Bologna Univ., 3Cent.
Gene Res., Nagoya Univ., 4Dept. Domestic Sci., Tokyo Kasei Univ.)

Key words

virus, pathogen, genome, direct RNA sequencing

250

3S-S4p03 プロトン共役型オリゴペプチド輸送体の基質多選択性

3S-S4p04 麹菌摂取による宿主腸内細菌叢の改善および大腸炎の○伊藤 圭祐 1, ○河合 駿 2（1静県大院・薬食生命, 2住友化学）
sukeito@u-shizuoka-ken.ac.jp, kawais3@sc.sumitomo-chem.co.jp○兒島 孝明 1, ○志水 元亨 2, 馬場 保徳 3, 中野 秀雄 1, 加藤 雅士 2（1名大院・生命農学, 2名城大院・農, 3石川県大・生物資源研）
kojimat@agr.nagoya-u.ac.jp, moshimi@meijo-u.ac.jp

解析

プロトン共役型オリゴペプチド輸送体(POT)を介したペプチド輸送システムは微生物から高等動・植物まで広く保存されており、生体内への栄養源アミノ酸の高効率な取り込みを担っている。POT は 8,400 種類のジ・トリペプチドを輸送する“基質多選択性”を有し、その幅広い基質認識の結果、ヒト小腸・腎臓においては β ラクタム系抗生物質、抗ウィルス薬、降圧薬、抗ガン剤などの薬物輸送体としても機能する。しかしこれまで、膨大な基質数に比較して取得された POT 親和性データが少なすぎること、また解析方法が実験ごとに異なるため
データの直接比較が難しいことなどが課題となり、POT の基質多選択性の全体像、およびその分子基盤となる多基質認識メカニズムは明らかとされていなかった。
本講演では Wet/Dry 融合研究の成功事例として、我々の研究グループが取り組んだ POT の基質多選択性解析を紹介する[1]。
【ジペプチドライブラリーを用いた網羅的親和性測定】
ペプチドの生体吸収性解析には多くの場合、動物にペプチドを投与し血中アミノ酸の濃度変化を解析する方法等が用いられてきた。しかし膨大な数の基質について POT への親和性を解析するためには、ハイスループットな解析システム
が 不 可 欠 で あ る 。 そ こ で 我 々 は 、 迅 速 ・ 簡 便 な 新 規 POT 解 析 シ ス テ ム（Fluorescence-based Competitive Uptake assay）を開発し、ジペプチドライブラ
リーを用いて各種 POT（出芽酵母 scPtr2p、ヒト hPEPT2、線虫 cePEPT1、シロイヌナズナ NPF8.2、カンジダ酵母 caPTR2、納豆菌 YclF）の基質親和性を網羅的に測定した。
一連の測定データから、各 POT に対するジペプチドの親和性は最大で 3,000 倍以上異なることが明らかとなった。真核生物 POT の基質多選択性は大枠で保存されており、“ヒト必須・準必須アミノ酸”である芳香族・分岐鎖アミノ酸を含むペプチドを高効率に吸収することが示された。本講演では、現在まで知られる中で最も基質親和性が高い“超”高親和性型 POT（caPTR2）について、有用物
質生産への応用例も紹介する。
【インフォマティクスを活用した分析と予測】
近年、測定技術の飛躍的な発展に伴い、生物学では膨大な実験データが得られることが標準的になりつつある。その中で、インフォマティクス技術を活用することで、膨大かつ多様なデータから新しい知見や法則を効率的に見出すことが重要となっている。さらに、知見や法則を見出すだけでなく、それらを基にした新たな研究の展開も期待されている。
インフォマティクスの活用が重要となる中で、我々はこれまで、多様な生理活性を持ち、膨大な組み合わせを持つ“ペプチド”に着目し、その生理活性とペプ
チド配列の関係性を効率的に評価する「ペプチドインフォマティクス」を開発してきた。ペプチドインフォマティクスは、物理化学的指標（分子量、疎水度、溶解度など）とインフォマティクス（統計解析・機械学習）を組み合わせることで、生理活性の持つ物理化学的性質を分析し、得られた法則を用いることで現象の予測〜新規機能性ペプチドのデザインへ繋げる技術である。また、ペプ
チドは数十〜数百に及ぶ様々な指標に置換することが可能であり、複雑な生物学的な現象を精密に表現することを可能としている。本技術を用いることで、ペプチド‐細胞間、タンパク質間接着や高分子ポリマーとの相性などの法則の導出や新規ペプチドのデザインに成功してきた[2, 3]。
本講演では、ペプチドインフォマティクスを POT の網羅的親和性測定データに適用した事例について紹介する。具体的には、前パートで用いたジペプチドラ
イブラリーを物理化学的指標に置換し、POT の基質多選択性を分析し、加えて機械学習を利用することで in silico での予測を試みた。さらに、物理化学的指標がペプチドだけでなく低分子化合物も同様に定量できることに着目し、ジペ
プチドライブラリーから構築した予測モデルから POT から吸収可能な医薬品を推定した試みについても報告する。ここでは、解析結果を紹介するとともに、Wet データを解析する上での工夫も含めて、紹介する。

緩和

日本では古くから、多彩な味噌、醤油、清酒などを醸造し豊かな食文化を形成してきた。味噌、醤油、清酒などの醸造には麹菌および酵母の働きが不可欠であり、それらの働きによって、米、麦、大豆などの原料に含まれるデンプンやタンパク質などが分解・代謝され、糖、アミノ酸、ペプチドだけでなく、それぞれの食品に特徴的な香味が生成される。これまで、発酵食品に含まれる様々な成分が免疫力の向上など我々の健康増進・維持に寄与していることが多数報告されている。また、発酵食品の中には、熟成後に加熱処理やろ過を行い麹菌や酵母の働きを停止させることで、醸造後の品質を均一化して販売されているものも少なくない。しかしながら、加熱やろ過の工程を省いた生タイプの味噌、醤油、清酒、甘酒、塩麹、かぶら寿司の中には、麹菌が生きたまま存在しており、我々は麹菌を生きたまま摂取している場合がある。また、加熱やろ過の工程によっては、麹菌は完全に死滅していない可能性もある。近年、腸内フローラおよびそれらの活動の違いが我々の健康および疾患と深く関連していることが明らかになってきた。しかし、真核微生物である麹菌が腸内まで生きたまま届くのか、酸素濃度が低い腸内で活動しているのか、活動しているのであれば麹菌が生産した代謝物や酵素が宿主や腸内フローラにどのような影響を及ぼしているのかについては、全くと言っていいほど分かっていない。
酵母 Saccharomyces cerevisiae は、生育環境中の酸素濃度が低くなるとアルコー
ル発酵を行い生育することが知られている。一方、糸状菌については従来、絶対好気性であると妄信されていたために、嫌気条件下での生育の研究は殆どされてこなかった。ところが近年、研究代表者らによる研究などから、麹菌および類縁の糸状菌が腸内のような低酸素条件下（O2 濃度が 0.1%以下）において、硝酸の還元を伴う脱窒やアンモニア発酵、および分岐鎖アミノ酸発酵などを行うことで、酸素呼吸ができない低酸素条件下で細胞内に蓄積する NADH を NAD+ に酸化（細胞内レドックスの調節）すること、生成した NAD+ を用いて解糖系などで ATP を生産することで、低酸素条件下において麹菌がゆっくりと生育できることが明らかになっている。
近年、腸内細菌の研究が発展し、我々の食生活の違いによって腸内フローラが変化すること、腸内細菌の活動の違いが我々の健康および疾患と深く関連していることが明らかになってきている。一方、真核微生物である麹菌 Aspergillus
oryzae は、1,000 年以上前から我が国の発酵食品製造に用いられており、日本人は少なからず麹菌を生きたまま食する機会があったと考えられる。しかし、摂取した麹菌が腸内で活動しているのか、腸内フローラにどのような影響を及ぼすのかなどについては未知である。
本発表では、マウスに生きた麹菌および滅菌した麹菌を摂取させることによって、麹菌の摂取によって腸内フローラにどのような影響を及ぼすのか、宿主の腸内環境改善（大腸炎の緩和など）効果があるのか、について紹介する。なお、
この研究アプローチの過程で、16S rRNA 遺伝子によるマウス腸内フローラの網
羅的解析の必要性に直面し、Wet と Dry の融合研究へと舵を切った。
麹菌を摂取することで我々の腸内フローラを改善し健康増進・維持に寄与することが明らかになれば、麹菌を用いて製造した（発酵）食品の新しい魅力になる可能性がある。Wet 系研究者と Dry 系研究者の連携の具体例を示しつつ、本
融合研究の今後の方向性についても紹介したい。

[1] Nature Commun. 2013 4(2502).
[2] Bioengineering (Basel). 2016 Nov 19;3(4).
[3] Anal Sci. 2016;32(11):1195-1202.

Analysing the substrate multispecificity of a proton-coupled oligopeptide
transporter using a dipeptide library○Keisuke Ito1, ○Shun Kawai2(1Grad. Sch. Integr. Pharm. Nutr. Sci., Univ. Shizuoka, 2Sumitomo Chemical Co.,Ltd.)

Key words

peptide, transporter, informatics, physicochemical property

Aspergillus oryzae administration to mice increases the population of
Bifidobacterium spp. in intestinal microflora and represses DSS-induced
colitis.

○Takaaki Kojima1, ○Motoyuki Shimizu2, Yasunori Baba3, Hideo Nakano1,
Masashi Kato2(1Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2Grad. Sch. Agric., Meijo Univ., 3Res.
Inst. Bioresour. Biotechnol., Ishikawa Pref. Univ.)
Key words
Aspergillus oryzae, 16S rRNA gene sequencing analysis, Intestinal
microflora251

3S-S4p05 集まると変わること：酵母のストレス応答，あるいは生物と物理の共同研究について

3Aa01○小田 有沙, ○畠山 哲央（東大院・総合文化）
odar@g.ecc.u-tokyo.ac.jp, hatakeyama@complex.c.u-tokyo.ac.jp

More is different というのは物理学者の P. W. Anderson（1977 年ノーベル物理学賞受賞）による有名な言葉である。これは、大雑把に言えば、ミクロなスケー
ルの構成要素を多数集めることによって、マクロなスケールでは構成要素の単なる足し算とは異なる、新たな構造が生まれるという意味だ。この言葉は、1972
年に、当時の要素還元主義的な科学の風潮に対する一種の反論として Science
誌に掲載された。実際、我々は多くの自然現象において More is different の実例を見いだすことができるし、物理学（特に統計物理学）の分野では古くからこの More is different を学問として体系化してきた。
この More is different を、非常に乱暴なアナロジーではあるが、共同研究の体制にも当てはめることができるのではないだろうか。たくさんの人が集まったからといって、質的に新しい研究が生まれるとは限らない（実際に、それぞれの持つ技術の単なる足し算か、あるいは「船頭多くして船山に上る」のような状態になっているように見える共同研究も多い）が、全く異なるバックグラウン
ドを持つ研究者が集まり密に相互作用することによって、単なる足し算ではな
い質的に新しい研究コンセプトが生まれることもあるだろう。
そこで、本発表では、酵母の細胞生物学をバックグラウンドに持つ研究者と、生物の理論物理学をバックグラウンドに持つ研究者が共同研究することにより、新しい研究を生み出そうとする取り組みの一端を紹介したい。最近の我々の共同研究により、酵母の多細胞レベルでのストレス応答は、その性質が一細胞レ
ベルのストレス応答と大きく異なることが見出された。まさに More is differentである。当日は、我々がどのようにその発見に至ったのかを、対談（あるいは漫才）形式で発表したい。

酸素ラジカル処理による植物バイオマスからのバイオエ
タノール生産量の改善○伊藤 奨 1, 酒井 杏匠 1, 伊藤 昌文 2, 堀 勝 3, 志水 元亨 1,
加藤 雅士 1
（1名城大院・農, 2名城大院・理工, 3名古屋大・低温プラズマ研
究セ）
mkato@meijo-u.ac.jp【目的】 バイオエタノール生産では、酸やアルカリを用いた前処理により植物細胞壁に含まれるリグニンなどの高次構造を破壊する必要がある。その過程でリグニンからバニリンなどの低分子芳香族アルデヒドが生成する。生成したバ
ニリンはエタノールの生産に利用される酵母の生育を阻害することから、効率的にバイオエタノールを生産する上で問題になっている。
本研究では、水溶液中のバニリンに対して、低温大気圧プラズマから発生する
酸素ラジカルを照射することで、バニリンを毒性の低い化合物に変換しうるか検討した。さらに、リグニンを含む未利用植物バイオマスとして稲ワラを用いて酸素ラジカル処理の有効性を調べた。
【方法・結論】 酸素ラジカル発生装置を用いて、水溶液中のバニリン対して酸
素ラジカルを照射後、HPLC および GC-MS 分析した。酸素ラジカル処理により、バニリンは大きく減少し、それに伴いバニリン酸、プロトカテクアルデヒ
ド、5-ヒドロキシバニリン、およびシュウ酸が検出された。生成した化合物はすべて、バニリンに比べて細胞毒性の低いものとして報告されている。そこで、バニリンに酸素ラジカルを照射した生成物を添加した液体培地で酵母を生育させたところ、バニリンを添加したコントロール（酸素ラジカル非照射）と比較して、酵母の生育が大きく改善し、エタノールの生産量も向上した。さらに、
アルカリ処理した稲ワラに酸素ラジカルを照射した実験でも同様の結果が得られた。
以上のことから、稲ワラをアルカリ前処理することで生成するバニリンは、酸素ラジカル処理によって細胞毒性の低い化合物に変換され、酵母の生育およびバイオエタノールの生産量が改善されることが明らかになった。従って、アルカリ前処理した植物バイオマスの酸素ラジカル処理は、酵母の生育およびエタ
ノール生産を向上に有効であることが示された。

Oxygen radical treatment improves bioethanol production from plantbiomass○Shou Ito1, Kiyota Sakai1, Masafumi Itou2, Masaru Hori3, Motoyuki Simizu1,
Masashi Katou1(1Grad. Sch. Agric., Meijo Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol, Meijo Univ., 3Cent. Lowtemp. Plasma Sci., Nagoya Univ.)

Key words

oxygen radical treatment, bioethanol, vanillin

3Aa02

セルロース系エタノール生産のための発酵阻害物質耐性
馴養変異体における責任遺伝子変異の同定○藤森 一浩 1, 小林 洋介 1,2, 佐原 健彦 1, 扇谷 悟 1, 鎌形 洋一 1（1産総研・生物プロセス, 2Biomaterial in Tokyo）
k-fujimori@aist.go.jp【背景】
同時糖化併行複発酵（SSCF）プロセスによるセルロース系エタノール生産の実用化には、Xylose 代謝性能の付与に加えて、バイオマスに含まれる有機酸やフラン類などのエタノール発酵阻害に耐性のある株の開発が不可欠である。しかし、Glucose/Xylose 培地では高い発酵性能を示すにもかかわらず、多様な阻害物質を高濃度に含むバイオマスを原料とした場合には、期待した発酵性能を発揮できない場合が多い。実際に、我々がこれまでの研究で開発したグルコース・
キシロースを含むモデル培地でエタノール変換効率 95%という非常に高い発酵性能を示した IR-2 B12 株は、サトウキビバガスを用いた SSCF プロセスでは全く発酵できないこと、B12 株を親株として独自の馴養法により変異体 IR-2 C 株を取得したことを報告している（日本生物工学会第 69 回大会、藤森他）。
【方法・結果】
コントロール（親株、B16）及び取得した独立した４馴養実験に由来する 9 変
異体からゲノム DNA を取得し、IonPGM を用いて全ゲノムシーケンスを行った。得られたリードを、IR-2 ゲノムをリファレンスとして、variations を取得した。遺伝的背景を利用した論理アルゴリズム法により、得られた Variation の中から阻害物質耐性をもたらす責任遺伝子変異を示す Binary code を作成し、論理的に真となる variation を抽出したところ、候補遺伝子変異の中に、阻害物質耐性の表現型を示す株のすべてにおいて同一の遺伝子の、しかも異なる場所にス
トップとなるアミノ酸置換が認められた。この結果から、この遺伝子変異（おそらく機能欠損）が発酵阻害物質耐性を獲得することに重要な役割を果たしていることが示唆された。
※本研究は、バイオマスエネルギー技術研究開発/バイオ燃料製造の有用要素技術開発事業/有用微生物を用いた発酵生産技術の研究開発/C5C6 糖同時発酵微生物の開発 (NEDO)において行った。

More is different: Stress response of yeast cells and collaboration between
biology and physics○Arisa Oda, ○Tetsuhiro S. Hatakeyama(Grad. Sch. Arts Sci., Univ. Tokyo)

Key words

yeast, stress response

Identification of responsible gene mutations in the inhibitors-resistantmutants for efficient production of cellulosic ethanol.

○Kazuhiro E. Fujimori1, Yosuke Kobayashi1,2, Takahiko Sahara1, Satoru Ohgiya1,
Yoichi Kamagata1(1BPRI, AIST, 2Biomaterial in Tokyo)

Key words

ethanol, biomass, genome, acclimation

252

3Aa03

好熱性ホモ酢酸菌 Moorella thermoacetica 代謝改変株によるリグノセルロース系バイオマスを基質とした高温エ
タノール発酵3Aa05

酵母カルチャーコレクションからのバイオエタノール生産のための優良酵母の選抜と評価○荻野 千秋 1, Kahar Prihardi 1, 近藤 昭彦 2
（1神戸大・工, 2神戸大院・科技イノベ）
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp○竹村 海生 1, Rahayu Farida 1, 岩崎 祐樹 2, 加藤 節 1, 田島 誉久 1,
青井 議輝 1, 加藤 純一 1, 中島田 豊 1（1広島大院・統合生命科学, 2産総研）
nyutaka@hiroshima-u.ac.jp[緒言]化石資源の枯渇から代替資源として再生可能なバイオマス、特にリグノ
セルロース系バイオマスが注目されており、その有用物質への効率的な微生物
変換技術の開発が世界中で盛んに行われている。本研究室においても好熱性ホ
モ酢酸菌 Moorella thermoacetica ATCC39073 を用いたリグノセルロース系バイオ
マスのエタノール変換に関する研究を進めており、これまでに酢酸合成関連遺伝子 (pduL1、pduL2) を両方破壊し、エタノール生産関連遺伝子 (aldh) 導入した
株 aldhΔpduL1ΔpduL2 を作成し、グルコース等の純粋な単糖から主生産物としてエタノールの生産を確認した。本研究では aldhΔpduL1ΔpduL2 を用いてリグ
ノセルロース系バイオマスを基質とした際のエタノール収率、及び糖の有用性に関して検討した。
[方法]リグノセルロース系バイオマスとして杉 (Cryptomeria japonica) と稲わら
(Oryza sativa) を選択した。それぞれを粉砕後 1.5 % H2SO4 と混合し、オートク
レーブ (121 ℃、90 min) で処理した。その後、セルラーゼ酵素 (55 ℃、48 h) により糖化処理したものを培養基質として用いた。全糖濃度の測定にはフェノー
ル・硫酸法を用い、各糖濃度の測定、及び生産物濃度の測定には HPLC を用いた。
[結果]杉、稲わらの糖加水分解物のエタノール収率は双方とも 0.40 g/g-total sugarであった。これはグルコースやキシロースを単一基質とした際のエタノール収率 (0.5 および 0.4 g/g-sugar) と同程度であった。一方、糖化液中のグルコース、
キシロース資化速度は、単一基質と比較して低下した。これは、酸加水分解によって副生するフラン誘導体やフェノール化合物が酵母や細菌の発酵を阻害するという報告があることから、本実験においても同様の原因によって資化速度が低下したと考えられた。

【背景】 実際のバイオエタノールに適した酵母株をライブラリーから選抜し、エタノール生産を実バイオマス（バガスおよび OPEFB）から効率的に行う生産システムの確立を目指した。
【実験手法】 本研究では、エタノール生産に適した酵母株を高速かつ適切に選抜するために、NBRC 及びインドネシアカルチャーコレクションを酵母株をモデルライブラリーとして用いてスクリーニング手法を確立することを目指した。
方法としては、実バイオマスの糖化液を想定して、グルコース及びキシロース、
さらには高濃度の複数の副生成物(酢酸、ギ酸等)から構成されるモデル発酵培
地を作製し、この培地中の高温度（35℃）で増殖し発酵する酵母株の選抜及び発酵特性の解析を確立した。また、多検体スクリーニング（一度 96 検体）を可能にするために、スクリーニングはディープウェルで行い、分析は多検体分析に適している高速 HPLC を用いて行った。
【結果】 その結果、エタノール生産用宿主株として 2 株、また乳酸生産用の候補宿主として 8 株、酵母株の選抜に成功した。何れの株も、これまでに上記の目的で使用された経験の無い株であり、非常に新しい知見を有している。立候
補株の中から増殖能および発酵性の高さを比較して最終的にエタノール生産用
宿主株として 1 株（Saccharomyces cerevisiae スクリーニング番号 F118）を選択した。また、インドネシア側では同じ手法でエタノール生産用宿主株として 1
株(Saccharomyces cerevisiae BTCC3)の選抜に成功した。これらの酵母株に対して発酵能の評価を行い、さらに微生物生産プラットフォームとして使えるように
これらの酵母株の遺伝子組換え技術も開発を行った。

Thermophilic ethanol fermentation from lignocellulose hydrolysate by
genetically engineered Moorella thermoacetica

Selection of candidate yeast strain for ethanol production from culturecollection○Takemura Kaisei1, Rahayu Farida1, Iwasaki Yuki2, Kato Setu1, Tajima Takahisa1,
Aoi Yoshiteru1, Kato junichi1, Nakashimada Yutaka1(1Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 2AIST)○Chiaki Ogino1, Prihardi Kahar1, Akihiko Kondo2(1Fac. Eng., Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

ethanol fermentation, biomass

Key words

yeast, ethanol production, biomass

3Aa04

バイオマス糖化液の成分分析データからのバイオエタ
ノール生産予測3Aa06

細胞表層提示システムに適した宿主酵母の開発○小西 正朗, 渡辺 一樹, 立花 成我（北見工大）
konishim@mail.kitami-it.ac.jp○猪熊 健太郎, 北田 雄基, 蓮沼 誠久, 近藤 昭彦（神戸大院・科技イノベ）
akondo@kobe-u.ac.jp

木質バイオマス等を原料とした微生物反応によるバイオ燃料生産やバイオリファ
イナリーによる物質生産は，石油由来のオイルリファイナリーの代替技術として、注目されている。しかしながら，天然原料は，その産地や栽培環境，品種などの違いにより，組成が異なることが知られている。また，糖化処理などの前処理条件により得られる発酵原料としての糖化液の組成が変動する。変動の大きいバイオマスを原料として安定的に微生物生産する場合，原料の違いや前処理条件により変動する糖化液組成が後段のエタノール発酵に与える影響を正確に把握する必要がある。農産廃棄物であるトウモロコシの芯(corncob)および非可食部(corn stover)を原料とした酵母によるバイオエタノール発酵をモデルとして，糖化前処理工程における硫酸処理の条件と原料の違いによる発酵特性に与える影響を糖化液組成から予測するモデルの構築を試みた。産地の異なる 3
種類の concob ならびに自家栽培したトウモロコシ由来の corn stover を硫酸-酵
素処理法[硫酸濃度は 1-3％(w/v)]により糖化し，糖化液を調製した。調整した糖化液は塩化メチレンで抽出後、ガスクロマトグラフィー質量分析法により揮発性成分分析に供した。206 成分のピークが得られた。糖化液を培地として，
Saccharomyces cerevisiae S288c 株を用いて，フラスコ培養によるエタノールを生産した。原料や前処理条件により，菌体増殖やエタノール生産量に変動が認められた。成分データを独立変数，72 時間目の菌体増殖量やエタノール生産量を従属変数として，部分最小二乗法を用いて回帰分析したところ，成分データと培養結果に高い相関が得られた。相関関係に基づく重要度解析を実施したとこ
ろ，furfural や 5-hydroxymethyl furfural の他，methoxyacetophenone, apocynin など
が阻害成分として見出された。

【背景】近年、炭素循環型社会実現の観点から、再生可能なセルロースなどのバ
イオマス資源から微生物を用いて燃料や化学品を製造する技術の導入が望まれている。そのための微生物育種に有効なのが、GPI アンカーと呼ばれる構造を介して酵母の細胞表層にセルラーゼなどの酵素を集積・固定する細胞表層工学技術である。我々はこの技術を利用して酵母 Saccharomyces cerevisiae の細胞表層にセルラーゼを提示し、セルロース分解能力を付与する技術の開発・改良に取り組んでいる。これまでは、主にセルラーゼ表層提示用の遺伝子カセットを改良することで細胞表層に提示されるセルラーゼの量を増やし、酵母のセルロー
ス分解能力を向上させてきたが、一方で、酵母の細胞壁に提示できる酵素の総量には構造上の限界があることから、その限界を超える量の酵素を提示するためには、遺伝子カセットだけでなく、それを導入する宿主酵母の細胞壁も表層提示に適したものに改変する必要があると考えられた。そこで本研究では、宿主酵母の改変による細胞表層セルラーゼ活性の向上を試みた。
【方法・結果】S. cerevisiae の細胞壁の形成に関与する 5 つの遺伝子(CCW12,
CCW14, DAN1, TIP1 および CWP1)を同時にノックアウトした株を作成し、それらの株を宿主としてセルラーゼの一種である β-グルコシダーゼ（BGL）およびエンドグルカナーゼ(EG)を表層提示した株をそれぞれ構築した。そして、その菌体重量当たりの酵素活性を測定した結果、5 遺伝子をノックアウトした株を宿主とした株では、従来の株に比べて表層の BGL 活性と EG 活性がそれぞれ約66%向上した。さらに、ノックアウトする遺伝子の組み合わせについて検討したところ、少なくとも BGL 活性については、CCW12 および CCW14 の 2 遺伝子をノックアウトするだけで、上記の 5 遺伝子ノックアウト株とほぼ同等の活性向上が見られた。

Estimating ethanol production from composition profiling of lignocellulosic
biomass hydrolysates

Development of recombinant yeast strains suitable for enzyme display
system○Masaaki Konishi, Kazuki Watanabe, Tachibana Seiga(Kitami Inst. Technol.)Key words
cerevisiae

lignocellulosic materials, ethanol production, Saccharomyces○Kentaro Inokuma, Yuki Kitada, Tomohisa Hasunuma, Akihiko Kondo(Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

yeast, cell surface display, cell wall, cellulase

253

3Aa07

酵母 Saccharomyces cerevisiae へのセルラーゼ生産能の
付与

3Aa09

○松崎 浩明, 渡邉 翔介, 秦野 琢之（福山大・生命工）matsuzaki@fukuyama-u.ac.jp

スルファニル酸分解微生物への亜硫酸イオンの影響○東山 明広, 喜多 晃久, 中川 克彦, 早瀬 伸樹（新居浜高専）hayase@chem.niihama-nct.ac.jp

近年、エネルギー消費量の増大により化石燃料の枯渇が危惧されている。そこで、バイオマス資源を利用したエネルギー生産が注目されている。しかし、サトウキビやトウモロコシなどの糖・デンプン系バイオマスの利用は、食糧不足
や食糧の価格高騰を招く。本研究では、アルコール発酵酵母 Saccharomyces
cerevisiae への遺伝子導入によるセルラーゼ生産能の付与により、セルロース系
バイオマスからのバイオエタノールの生産を目指している。当研究室の過去の研究で Cryptococcus flavus 由来のカルボキシメチル(CM)-セルラーゼ（CMC1）
や Saccharomycopsis fibuligera 由来の β-グルコシダーゼ（BGL1）の生産能を付与したが、セルロースからのエタノール生産量は十分ではなかった。エンド型とエキソ型など種々のセルラーゼの生産によりセルロース分解効率を高めることが重要であると考えた。そこで、BGL1 および細菌 Cellulomonas fimi 由来のエンド型セルラーゼ（cenA）とエキソ型セルラーゼ（cex）の 3 種のセルラーゼ
生産能の付与を検討した。まず、cenA 遺伝子と cex 遺伝子を GAP1 プロモー
ター、MEL1 分泌シグナル配列と GAP1 ターミネーターとの間に連結した分泌発現型の cenA と cex を持つ YEp 型プラスミド pHM1061 を構築した。また、
BGL1 遺伝子を GAP1 プロモーターに連結した分泌発現プラスミド pHM1062 を構築した。pHM1061 と pHM1062 を導入した二重形質転換体は、コンゴレッド
染色、MUC 発色法、及び p-NPG 活性からエンド型とエキソ型のセルラーゼ及び β-グルコシダーゼを分泌生産していることが確認できた。しかし、セルラー
ゼ活性は低いと考えられた。さらに、CMC1 遺伝子を GAP1 プロモーターに連結した分泌発現プラスミド pSC7 を導入した三重形質転換体はコンゴレッド染
色で二重形質転換体よりもセルラーゼ活性が高かった。この形質転換体は紙片を形が崩れるぐらいまで分解した。

【背景・目的】合成染料の一種であるアゾ染料は、現在最も利用されている染料である。これまでの研究により、水溶性アゾ染料は、微生物により比較的容易に分解しスルホン化芳香族アミン化合物を生成することが明らかになっている。
当研究室では、アゾ染料の一種である OrangeII を分解することによって生成す
るスルホン化芳香族アミン化合物であるスルファニル酸分解に関与する微生物を分離し、その分解機構について検討を行ってきた。本研究では、複数の微生物の共生による分解促進機構について検討を行った結果について報告する。
【方法・結果】当研究室ではスルファニル酸を唯一の炭素源として長期間継代培養している集積培養液より、スルファニル酸分解微生物である Bradyrhizobium
sp.の 624S 株及び Aminobacter sp.の 11A 株を分離している。スルファニル酸を
単一炭素源とした無機塩液体培地に 624S 株及び 11A を植菌し、振とう培養を行いスルファニル酸の分解試験を行ったところ、両株ともに 4.3mM のスルファニル酸を完全に分解した。この培養上清の亜硫酸イオン濃度を測定したところ、両株ともスルファニル酸の分解に伴い亜硫酸イオンが生成していることが明らかになった。集積培養液からは 624S 株及び 11A 株以外に、スルファニル酸を資化することはできない Diaphorobacter sp.の 624L 株も分離されている。この
624L 株と 624S 株及び 11A 株の共培養を行うとスルファニル酸の分解速度が上昇し、亜硫酸イオンの蓄積が観察されなかった。本結果から 624L 株には亜硫酸イオンを酸化する能力があることが示唆され、現在、624L 株の亜硫酸イオン
酸化機構について検討を行っている。

Breeding of cellulase-producing Saccharomyces cerevisiae

Effect of sulfite ion on sulufanilic acid degrading microorganism○Hiroaki Matsuzaki, Shosuke Watanabe, Takushi Hatano(Fac. Life Sci. Biotechnol., Fukuyama Univ.)○Akihiro Higashiyama, Akihisa Kita, Katsuhiko Nakagawa, Nobuki Hayase(Niihama Natl. Coll. Technol.)Key words

cellulase, Saccharomyces cerevisiae, ethanol fermentation

Key words

sulfanilic acid, sufite ion, microorganisms, bacteria

3Aa08

デルタロドプシンによる ATP 再生を伴う物質生産性の
向上

3Aa10

Rhodococcus erythropolis N9T-4 株の aldA による低栄養性の付与○塩澤 優稀 1, 弘埜 陽子 2, 原 清敬 1（1静県大院・薬食生命, 2静県大・食栄）k-hara@u-shizuoka-ken.ac.jp○加藤 弘将, 池ヶ谷 凌士, 新谷 政己, 吉田 信行（静大院・総合科技）yoshida.nobuyuki@shizuoka.ac.jp【目的】現在盛んに行われている、微生物を利用した有用物質生産や、遺伝子組換え技術を用いてそれらの生産性を向上させる研究では、細胞内エネルギー物質である ATP の不足による、生産性の頭打ちや、微生物の増殖の低下が問題となることがある。そこで、本研究では有用物質生産によく用いられる出芽酵母の ATP 再生を活性化させるために、高度好塩菌 Haloterrigena.turkmenica がもつ
光駆動型プロトンポンプの一種であるデルタロドプシンを出芽酵母のミトコン
ドリア膜に発現させた。これにより、呼吸鎖電子伝達系に加え、デルタロドプ
シンにもプロトンの濃度勾配を形成させることで、ATP 再生を活性化させることを目的とした。本研究では、グルタチオンなどの、生産される際に ATP を消費する物質を生産物の指標として用いた。
【方法】出芽酵母 BY4741 株に ATP 消費を伴うグルタチオン排出トランスポー
ター（Gxa1）を発現させた株に、デルタロドプシンを発現させた。この株およびその親株を光受容分子（all-trans-retinal）および要求性アミノ酸を含む最小培地にて、光を照射しながら培養し、任意の時間にサンプリングを行った。
【結果および考察】BY4741 株にデルタロドプシンを発現させると、24 時間目の細胞内グルタチオン濃度が約 1.5〜2 倍に上昇した。また、Gxa １とデルタロド
プシンを共発現させた場合、細胞内グルタチオン濃度の上昇だけでなく、細胞外グルタチオン濃度の上昇もみられた。グルタチオンの合成と排出には ATP の消費を伴うため、これらの活性化は、デルタロドプシン発現により ATP 再生が活性化されたことに起因すると考えられる。

【背景と目的】Rhodococcus erythropolis N9T-4 株は炭素・窒素・硫黄源無添加の無機塩培地に良好に生育し、CO2 を要求するという超低栄養性を示す。これまでに N9T-4 株の短鎖脂肪族アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする aldA を破壊すると、この低栄養性が失われること、低栄養環境で aldA が高発現することが判明している。本研究では、N9T-4 株の持つ低栄養性を他の細菌に付与することを目的として、低栄養性の低い様々な Rhodococcus 属細菌に N9T-4 株のaldA を導入し、低栄養条件下での生育および物質生産性の比較を試みた。
【 方 法 お よ び 結 果 】 ま ず 、 供 試 菌 株 と し て N9T-4 株 を 初 め と し た 様 々 な
Rhodococcus 属細菌の低栄養性を比較した。低栄養条件下での培養は炭素源を含まない BM 培地、富栄養条件下での培養は LB 培地を用いたスポットテストの結果から、15 種のロドコッカス属細菌の多くは、強弱はあるものの低栄養性を示したが、R. erythropolis IFM 155 株と R. erythropolis NBRC 15567 株が低栄養条件で生育を示さなかった。また、細胞内に多量のトリアシルグリセロール（TAG）を蓄積し、バイオ燃料生産菌として有望視されている R. wratislaviensis
DSM 44193 株は、N9T-4 株と比較して弱いながらも低栄養性を示した。ナイル
レッド染色後に蛍光顕微鏡観察することによって TAG の蓄積を確認したところ、富栄養条件で培養した際には TAG の蓄積を示す強い蛍光が観察できたが、低栄養条件では TAG の蓄積が認められなかった。大腸菌-Rhodococcus シャトル
ベクターである pNit-RC2 に、N9T-4 株の aldA とその上流領域を挿入した pNitNN を用いて、DSM 44193 株を形質転換した。その結果、形質転換体の低栄養条件での生育は向上しなかったが、蛍光顕微鏡観察の結果、低栄養条件でのTAG の蓄積が確認できた。

Improvement of bioproduction with ATP recycling by delta-rhodopsin

Conferring of oligotrophy to other bacteria by introduction of aldA of
Rhodococcus erythropolis N9T-4○Yuuki Shiozawa1, Yoko Hirono2, Hara Kiyotaka1(1Grad. Sch. Integr. Pharm. Nutr. Sci., Univ. Shizuoka, 2Sch. Food Nutr. Sci., Univ.
Shizuoka.)

Key words

ATP, glutathione, light, rhodopsin○Hiromasa Kato, Ryoji Ikegaya, Masaki Shintani, Nobuyuki Yoshida(Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ.)

Key words

oligotroph, Rhodococcus, triacylglycerol, aldehyde dehydrogenase

254

3Aa11

Talaromyces cellulolyticus におけるセルラーゼの発現誘導機構の解析と、その育種開発と培養手法への応用

3Ba02○矢萩 大貴 1, 吉田 エリカ 1, 深田 寛朗 1, 十倉 充範 2, 臼田 佳弘 1
（1味の素バイオ・ファイン研, 2味の素研究開発企画部）
yoshihiro_usuda@ajinomoto.com

デルタロドプシン発現が出芽酵母の代謝に及ぼす影響○大塚 健介 1, 弘埜 陽子 2, 石井 寛子 3, 石井 純 3, 岡橋 伸幸 1,
戸谷 吉博 1, 原 清敬 2, 松田 史生 1
（1阪大院・情報, 2静県大・食栄, 3神戸大院・科技イノベ）
fmatsuda@ist.osaka-u.ac.jp【背景と目的】非可食バイオマスからバイオマス糖化酵素であるセルラーゼによって分解・生成される糖類は、発酵生産において、食資源と競合しない主原料として期待されている。しかし、現在のセルラーゼの製造コストが高いことが実用化に向けた課題となっており、より効率的なセルラーゼの生産技術が求められている。そこで、我々は有望なセルラーゼ生産糸状菌である Talaromyces
cellulolyticus のセルラーゼ遺伝子の発現誘導の機構を解析し、その知見を菌株育種および培養手法の構築に応用することとした。
【結果と考察】T. cellurolyticus の細胞内に局在する β-glucosidase をコードする
bgl1A 遺伝子を破壊した結果、セルロース炭素源培養におけるセルラーゼ発現がほぼ失われた。また、野生株のセルラーゼ分泌生産量を約 7 倍に向上させる
bgl1A 内のアミノ酸置換変異も見出され、T. cellurolyticus のセルラーゼ発現に重要な役割を担うことが示された。この BGL1A をセルロースの分解生成物であるセロビオースに作用させると、糖転移反応によって数種のセロオリゴ糖を生成した。その中でも、グルコース 2 分子が β-1,6 結合した二糖であるゲンチオ
ビオースの T. cellurolyticus のセルラーゼ発現に対する高い誘導能が明らかとなった。ゲンチオビオースは BGL1A によるセロビオースからの糖転移反応以外にも、BGL1A や細胞外分泌型の BGL3A を介した高濃度グルコースからの縮合反応によっても簡便に生成・蓄積することができた。このようにして調製された
ゲンチオビオースを含む糖液を用いた、高効率かつ安定的なセルラーゼの生産
培養プロセスを報告する。

【背景と目的】 出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae は炭素源から中心代謝機能を通じて、細胞増殖に必要なエネルギー（ATP）を得ている。われわれは高度好塩菌 Haloterrigena turkmenica 由来の光駆動プロトンポンプであるデルタロドプシン(dR)に着目し、光エネルギーでプロトン勾配を生成し ATP 再生能を向上することを試みている（原ら、第 70 回日本生物工学会大会）。本研究では dR を
発現が S. cerevisiae の発酵プロファイルおよび細胞内代謝物組成に及ぼす影響を検討した。
【方法】 S. cerevisiae BY4742 株を宿主として用いた。形質転換は酢酸リチウム法で行った。レチナール(10 microM を添加した SD 培地中 30℃、光照射条件下
で 120 rpm で培養した。培地中のエタノール濃度は液体クロマトグラフィーで測定した。細胞内代謝物はメタノール・クロロホルム・水法で抽出後、GC-MS
で分析を行った。
【結果と考察】S. cerevisiae BY4742 株に dR 遺伝子を発現した BY4742 pGK426::dR 株を構築した。dR の活性発現に必要な補因子であるレチナール添加培地で培養したところ、特徴的な淡いピンク色を示した。そこで BY4742 pGK426::dR 株とコント
ロール株(BY4742 pGK426）を光照射条件下で培養し、細胞内代謝物を抽出してGC-MS を用いたメタボローム分析法で細胞内代謝物の組成を比較した。その結果、デルタロドプシンの発現により濃度が変化した代謝産物があった。さらに、光照射条件下 SD 培地中でフラスコスケールでの回分培養を行った。その結果、
BY4742 pGK426::dR 株はコントロール株と比較して比増殖速度に明確な差は無かった。

Elucidation of cellulase induction mechanism in Talaromyces cellulolyticus
and its application to cellulase production

Effect of deltarhodopsin expression on the yeast metabolism○Daiki Yahagi1, Erika Yoshida1, Hiroaki Fukada1, Mitsunori Tokura2,
Yoshihiro Usuda1(1Res. Inst. Biosci. Prod. Fine Chem., Ajinomoto Co., Inc., 2R&D Planning Dept.,
Ajinomoto Co., Inc)

○Kensuke Otsuka1, Yoko Hirono2, Hiroko Ishii3, Jun Ishii3, Nobuyuki Okahashi1,
Yoshihiro Toya1, Kiyotaka Hara2, Fumio Matsuda1(1Grad. Sch. IST, Osaka Univ., 2Sch. Food Nutr. Sci., Univ. Shizuoka., 3Grad. Sch.
Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

cellulase, Talaromyces cellulolyticus, beta glucosidase, gentiobiose

Key words

Saccharomyces cerevisiae, deltarhodopsin

3Ba01

メタノール資化性酵母 Ogataea minuta におけるアル
コールオキシダーゼ遺伝子 AOX1 の発現解析

3Ba03

RNA-seq による発酵阻害物質耐性酵母 KS47-1 株の耐性機構の解明

○横尾 岳彦 1, 吉原 瑛梨奈 1,2, 小松崎 亜紀子 1, 梅村 真理子 2,
千葉 靖典 1
（1産総研・創薬基盤, 2東薬大・生科）
t.yoko-o@aist.go.jp○竹内 健人 1, 加藤 勇太 1, 荒川 知子 1, 堀内 淳一 2, 小西 正朗 3
（1北見工大院・バイオ環境, 2京都工繊院・分子化学, 3北見工大・
地域未来デザイン）
konishim@mail.kitami-it.ac.jp【背景と目的】酵母 Ogataea minuta は、メタノールを唯一の炭素源として増殖可能なメタノール資化性酵母の一種である。アルコールオキシダーゼをコードする遺伝子 AOX1 は、メタノール存在下で強力な発現誘導が引き起こされるが、本酵母種における AOX1 の発現調節メカニズムは不明のままであった。AOX1がどのような条件で発現誘導あるいは抑制がなされるか、また、発現調節にはどのような因子が関与しているかについて検討を行った。
【方法、結果と考察】AOX1 の発現レベルを調べるために、出芽酵母 Saccharomyces
cerevisiae の酸性ホスファターゼ（APase）遺伝子 ScPHO5 を AOX1 プロモータの下流に接続したレポータ遺伝子を構築した。本レポータ遺伝子を O. minuta
NBRC 10746 株に導入し、APase 活性を測定することにより、AOX1 プロモータの発現の強さを調べた。メタノールを炭素源として培養した場合は高い APase
活性を示した一方、グルコースやグリセロールを炭素源とした場合は、活性は顕著に抑制され、この系が期待通りに動作することが確認された。グルコースやグリセロールに、さらにメタノールを加えても活性は抑制されたままであり、これらの炭素源は強力なカタボライト抑制を示すことが見出された。近縁のメ
タノール酵母種からの類推により、AOX1 の転写調節因子の候補となる遺伝子
TRM1、TRM2 および MPP1 を取得した。これらの破壊株を作製し、前述のレポータ系により AOX1 プロモータの活性を測定したところ、メタノール培養時の APase 活性は野生型株の 0.2 から 0.4 倍の値を示し、これらはいずれも AOX1
プロモータの発現誘導に関与していることが明らかになった。

【背景と目的】我々が分離した酵母 Pichia membranifaciens KS47-1 は，一般的な酵母の増殖・発酵を妨げる発酵阻害物質が含まれるリグノセルロース系バイオ
マス由来糖化液でも増殖できる．しかしながら，耐性機構については未知であった．本研究では，糖化液に対する KS47-1 株の遺伝子応答を調査するため，トウモロコシの芯（コーンコブ）から作製した糖化液(HL)と活性炭処理による阻害物質除去をした同様の糖化液(AC)の間で，本菌株の遺伝子発現を比較し分析した．
【方法】コーンコブ(1:10=コーンコブ:水）を 3.0 %硫酸により糖化処理した(HL)．さらに 3 % (w/v)の活性炭を添加し，阻害物質を 3 時間に吸着除去した(AC) ． 糖 化 液 を 培 地 と し て KS47-1 株 を 培 養 し ， 対 数 増 殖 細 胞(OD600=11.4~13.7， (n = 2))において Illummina HiSeq による RNA-seq 解析した
(Q30:>94%）．TopHat2 を用いて KS47-1 株のドラフトゲノムにマッピングした．
発現量解析には Cufflinks，Cuffdiff を用いた．変動遺伝子予測には GO term finderを用いた．BLAST 解析により Saccharomyces cerevisiae データを用いて遺伝子機能予測した．
【結果と考察】両者の糖化液において増殖が観察されたが，HL では増殖に遅延が見られた．約 5Gb のリードをマッピングした結果，2919 遺伝子が検出された．カバー率は 103%前後であった．HL で培養した場合，膜輸送タンパク質に多くの変動が認められたため，多剤薬剤ポンプ等膜輸送が関与していることが示唆された．また，発酵阻害物質であるフルフラール(FL)や 5-HMF の分解に関係する ADH6, ALD4 の発現量が，発酵阻害物質存在下で上昇したことから，細胞内で FL や 5-HMF を分解し，酢酸としていることが考えられる．

Characterization of gene expression of AOX1, which encodes alcoholoxidase, in methylotrophic yeast Ogataea minuta

Explore the tolerant mechanism of Pichia membranifaciens K S47-1 ofinhibitor tolerant yeast by RNA-seq○Takehiko Yoko-o1, Erina Yoshihara1,2, Akiko Komatsuzaki1, Mariko Umemura2,
Yasunori Chiba1(1BRD, AIST, 2Sch.Life Sci., Tokyo Univ. Pharm. Life Sci.)

Key words
minutamethylotrophic yeast, gene expression, alcohol oxidase, Ogataea○Kento Takeuchi1, Yuta Kato1, Tomoko Arakawa1, Jun-ichi Horiuchi2,
Masaaki Konishi3(1Grad. Sch. Bio. Environ., Kitami Inst Tech, 2Dept. Biomole. Eng. Kyoto Inst.
Tech., 3Sch. Reg. Innov. Soc. Design Eng. Kitami Inst. Tech.)

Key words

RNA-seq, inhibitor, Pichia membranifaciens, yeast

255

3Ba04

Pichia pastoris において分泌シグナル配列の１アミノ酸
置換はタンパク質分泌生産量を劇的に増大させる

3Ba06○伊藤 洋一郎 1, 石上 美佐 2, 橋場 倫子 2, 中村 泰之 1, 蓮沼 誠久 1,
石井 純 1, 近藤 昭彦 1
（1神戸大院・科技イノベ, 2高機能遺伝子デザイン技術研究組合）
yito@dragon.kobe-u.ac.jp

出芽酵母の実験室進化により導入された遺伝子変異のグ
リセロール資化能への影響○曽根 政人 1, 高橋 駿輔 1, 河合 一輝 1, 古澤 力 2,3, 平沢 敬 1（1東工大・生命理工, 2理研・生命機能, 3東大・生物普遍性）
thirasawa@bio.titech.ac.jp

メタノール資化性酵母 Pichia pastoris（Komagataella phaffii）は、高密度培養が可能であり、タンパク質の分泌生産能に優れていることから、組換えタンパク
質生産のための宿主として利用されている。P. pastoris でのタンパク質分泌生産には、分泌シグナル配列として Saccharomyces cerevisiae 由来の MFα 配列がよく利用されている。先行研究にて、我々はタンパク質分泌生産を劇的に増加させる MFα 配列の V50A 変異を偶然見つけていた。そこで本研究では、P. pastoris
でのタンパク質分泌生産の更なる向上を目指して、MFα シグナル配列の最適化を検討した。S. cerevisiae での MFα シグナル配列の進化分子工学の先行研究結果を参考に、V50A 変異を含む 1 アミノ酸置換体を作製し分泌生産量を評価したところ、複数の 1 アミノ酸置換体において、目的とするタンパク質の分泌生
産性が 5 倍程度増加することが分かった。しかしそれらの変異を組み合わせても、分泌生産性の増加は見られなかった。GFP を分泌生産させた酵母細胞を顕微鏡観察した結果、野生型シグナル株では液胞内に緑色蛍光が観察された。一方、1 アミノ酸置換体では緑色蛍光は確認されなかったことから、1 アミノ酸置
換体では液胞への目的タンパク質のミスソートが減少したため、高分泌生産されることが示された。

【緒言】バイオディーゼルを油脂から製造する過程で副生産物として得られるグ
リセロールは供給過剰になっており、現在その有効的な利用方法が求められている。当研究 室では、 グリセロー ルを基質 として出芽酵 母 Saccharomyces
cerevisiae による有用物質生産を行うことを目指し、グリセロールを主要な炭素源とした合成培地での植え継ぎを繰り返す実験室進化により、グリセロール資化能が向上した進化株を得ることに成功した (Kawai et al. 2019 JBB)。また進化株の RNA-Seq 解析を行い、その結果に基づきグリセロール資化能が向上した組換え株の再構築を行った。さらなる出芽酵母のグリセロール資化能の向上を目
指し、本研究では実験室進化株のゲノムリシーケンス解析を行い、進化の過程で導入された変異のグリセロール資化能への影響を評価した。
【方法および結果】上記実験室進化により取得した実験室進化株からゲノム DNAを抽出し、次世代シーケンサーによるゲノムリシーケンス解析を行ったところ、グリセロール資化能が顕著に向上した 85 世代後の細胞には HOG1、SIR3、
KGD2、SSB2 の 4 つの遺伝子の ORF 内に変異が導入されていることが明らかとなった。そこで、それぞれ同定されたこれらの変異を元株に導入した組換え株を構築し、グリセロールを炭素源とする合成培地で培養することで、同定された変異のグリセロール資化能への影響を調べた。その結果、元株は培養開始か
ら 200 時間以上経過しても増殖を開始しないのに対して、HOG1 遺伝子の変異
導入株は培養開始 24 時間後には増殖が開始した。また、この HOG1 遺伝子の変異は、上記実験室進化の初期の段階で導入されていた。これらの結果から、
HOG1 遺伝子に導入された変異が、出芽酵母のグリセロール資化能の向上に寄与していることが明らかとなった。

Single amino acid substitutions of secretory signal MFα make large
improvement for secretion of recombinant proteins in Pichia pastoris

Effects of mutations introduced through adaptive laboratory evolution on
glycerol assimilation ability in Saccharomyces cerevisiae

Key words
Pichia pastoris, secretory production, secretion signal, recombinant
protein production

Key words
Saccharomyces cerevisiae, glycerol, genome engineering, adaptive
laboratory evolution○Yoichiro Ito1, Misa Ishigami2, Noriko Hashiba2, Yasuyuki Nakamura1,
Tomohisa Hasunuma1, Jun Ishii1, Akihiko Kondo1(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2TRAHED)

3Ba05

イントロンによる発現増強を受けるルシフェラーゼコー
ディング領域内配列の解析○Masato Sone1, Shunsuke Takahashi1, Kazuki Kawai1, Chikara Furusawa2,3,
Takashi Hirasawa1(1Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech, 2BDR, RIKEN, 3UBI, Univ. Tokyo)

3Ba07○菊田 浩希 1, 星田 尚司 1,2,3, 赤田 倫治 1,2,3（1山口大院・創成科学・化学系, 2山口大・中高温セ, 3山口大・
生命医工セ）
hoshida@amaguchi-u.c.jp

酵母とヒト培養細胞で扱えるプラスミドでのヒトヒストン遺伝子の解析○小野 嵩弘 1, 星田 尚司 1,2,3, 赤田 倫治 1,2,3（1山口大院・創成科学・化学, 2山口大・中高温セ, 3山口大・生
命医工セ）
b014vf@yamaguchi-u.ac.jp［背景と目的］現在、タンパク質大量発現技術が必要とされている。一般にタン
パク質の発現量には塩基配列やプロモーター強度、プラスミドコピー数、使用
コドンなどが影響する。これまでに私たちは、分泌性ルシフェラーゼ遺伝子をコードする yCLuc をイントロンを含むプロモーターで発現させると、イントロンを持たない場合に比べ 40 倍程度発現量を増加することを明らかにした。このイントロンによる発現増強メカニズムの解明を目指した。
［方法、結果］yCLuc と同じアミノ酸配列のルシフェラーゼをコードするが使用コドンが異なる hCLuc を同様に発現させたところ、イントロンを与えなくても
hCLuc は yCLuc に比べて 40 倍程発現量が高く、さらにイントロン配列を与えてもその活性は増加しなかった。発現量の差と、イントロンによる発現増強のメカニズムを解明するために、yCLuc と hCLuc のキメラ遺伝子を構築し、イントロンの有無によるルシフェラーゼ活性を比較した。その結果 yCLuc の 100
bp~200 bp の配列が発現抑制とイントロンによる発現増強に関与することが分かった。さらにこの範囲で hCLuc と yCLuc で異なる塩基を、hCLuc で一つずつ
yCLuc の塩基に変異させたところ、一つの変異での影響は比較的小さかった。
そこで変異させる塩基の数を多くしていくと発現抑制とイントロンによる発現増強が強くなり、101 bp~140 bp 中の 9 塩基の変異で yCLuc と同じ程度の抑制と増強を示した。この結果からコーディング配列内の特定領域の配列が発現を低下させ、イントロンによる発現増強にも関与していることが分かった。

［背景と目的］遺伝子を酵母やヒト培養細胞などのそれぞれの宿主で発現させるには、宿主特有のプロモーター、複製起点、選択マーカーなどを組み込んだプ
ラスミドを別々に用意する必要があった。一方、複数種の生物間で扱えるシャ
トルプラスミドも知られているが、プロモーターは目的遺伝子上流に配置する必要があるため、遺伝子発現できる宿主は 1 種類に限られていた。そこで、本研究では酵母、大腸菌、ヒト培養細胞において遺伝子発現を効率的に行えるプ
ラスミドを開発した。
［方法、結果］酵母、大腸菌、およびヒト培養細胞で効率的に遺伝子発現できるプラスミドを作製した。このプラスミドは目的遺伝子を酵母発現用 TDH3 プロ
モーター下流にクローニングすることで、酵母で発現させることができる。大腸菌と培養細胞では、PCR により、目的遺伝子とそれぞれの宿主のプロモー
ターが末端となるように増幅し、これらを各細胞に導入する。大腸菌では相同組み換え、ヒト培養細胞では非相同末端結合によってプロモーター下流に目的遺伝子がつながることで遺伝子発現が可能になる。
このプラスミドが、複数の生物において効率的に遺伝子発現できることを証明するために、進化的保存性の高いヒストン遺伝子(hH3F3A)を利用した。赤色蛍
光タンパクと融合させ、その発現を観察したところ、酵母とヒト培養細胞において核での発現が見られた。また、N 末端側からの削除解析も効率的に行える
ため、hH3F3A の核移行シグナルの同定を行ったところ、ヒストン N 末端領域を削ることで徐々に核から細胞質へ移行した。そこで、ヒストンアセチル化で知られる N 末端領域の Lysine にアミノ酸変異を与えることで、細胞内局在の変化を調べている。

A specific region of a lucferae coding sequence interferes with its expression
and is involved in intron-mediated enhancement

Histone gene analysis with a plasmid that can be used for gene expression inyeast and human cluture cells○Hiroki Kikuta1, Hisashi Hosida1,2,3, Rinji Akada1,2,3(1Dept. Appli. Chem., Grad. Sch. Sci. Tech. Innov., YamaguchiUniv., 2YURC-TMR.,
3
YUBEC)

Key words
cerevisiae

intron, intron-mediated enhancement, luciferase, Saccharomyces○Takahiro Ono1, Hisashi Hoshida1,2,3, Rinji Akada1,2,3(1Dept. Appli. Chem., Grad. Sch. Sci. Tech. Innov., YamaguchiUniv., 2YURC-TMR.,
3
YUBEC)

Key words

yeast, mammalian cell, histone, plasmid

256

3Ba08

Saccharomyces cerevisiae SPY3 の高温ストレス適応機構

磯崎 日奈子 1, 山崎 真澄 1, 澤田 俊 1, 工藤 大喜 1,
Devanadera Allad 2, Grace Pait Ivy 2, Pajares Irene 2,
Nayve Jr. Fidel Rey P. 2, ○杉山 峰崇 1
（1阪大院・工, 2フィリピン大ロスバニョス校・国立分子生物学
バイオテクノロジー研究所）
sugi2@bio.eng.osaka-u.ac.jp

3Ba10

Cloning and expressing recombinant glutamate
decarboxylase (GAD) for boost of GABA production inbeer-producing yeast○Pik Kuan Low, John Chi-Wei Lan(Biorefin. Bioprocess Eng. Lab., Dept. Chem. Eng. Mater. Sci., Coll.
Eng., Yuan Ze Univ., Taiwan 32003, R.O.C.)
lpka6752@gmail.com

出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae はバイオエタノールの発酵生産宿主として利用されている。主にバイオマスが豊富な熱帯地域でバイオエタノール生産が行われているが、ブラジルやタイなどでは発酵熱も加わり発酵温度が酵母の至適温度である 30℃を容易に超え、増殖や発酵が著しく低下する 40℃以上になることもある。そのため、冷却設備や冷却コストが必要となるが、優れた高温ス
トレス耐性を示す出芽酵母が開発できれば生産コストの効率化が進む。そこで、本研究では、自然界から単離された S. cerevisiae の中で 42℃という最も高い高温ストレス耐性を示す酵母 SPY3 の高温ストレス適応機構を解析し、高温ストレス耐性向上に重要となる知見を得ることにした。SPY3 は、高温の 41.5℃条
件下において、95%の収率でエタノールを生産した。マイクロアレイ解析を行い、研究室株と SPY3 の遺伝子発現を比較した結果、419 遺伝子が発現上昇していた。その中には ROS の除去関連遺伝子が多数含まれており、SPY3 で強く発現している ROS の除去関与遺伝子群が高温ストレス条件下で増大する ROSの蓄積を抑えていることを見出した。SPY3 で発現上昇した遺伝子の多くを制御しうる転写活性化因子として Ace2、Sfp1 および Gcn4 を見出した。これらの遺伝子は高温ストレス条件下で高発現しており、破壊すると SPY3 の高温ストレス耐性は顕著に低下した。さらに、SFP1 の過剰発現によって SPY3 の高温ス
トレス耐性がさらに向上したことから、SPY3 の優れた高温ストレス適応機構には SFP1 の機能が重要であることが明らかとなった。

Glutamate decarboxylase (GAD: EC 4.1.1.15) catalyses the decarboxylation of Lglutamate to gamma-aminobutyric acid (GABA). GABA is an importantneurotransmitter that affects the transmission of signals between brain cells and thenervous system in the human body. The present study attempted to insert a full length
GAD gene sequence into beer yeast strain to enhance synthesis of GAD which ispredicted to cause the increase of GABA production during beer fermentation. The
complete gene sequence was cloned, followed by insertion of the DNA gene template
into the pIYC08 vector. The gene was then cloned into PGASO-nkit-7-Sc-TEF1
vector, followed by the expression in wild type yeast strain cells to improve GABA
production. The expression of GAD gene was confirmed by SDS-PAGE analysis andenzymatic activity studies. To our best knowledge, this is the first finding on successful
cloning of the GAD gene in wild type yeast strain cells.

Mechanism of adaptation to high temperature stress in Saccharomyces
cerevisiae SPY3

Cloning and expressing recombinant glutamate decarboxylase (GAD) for
boost of GABA production in beer-producing yeast

Key words
Saccharomyces cerevisiae, high temperature resistance, reactive
oxygen species

Key words

GABA, glutamate decarboxylase (GAD), yeast, gene expression

3Ba11

陽性/陰性選択マーカーと蛍光タンパク質から成る 3 機
能性新規融合タンパク質を用いた酵母遺伝子スイッチの開発

Hinako Isozaki1, Masumi Yamasaki1, Shun Sawada1, Daiki Kudo1,
Allad Devanadera2, Ivy Grace Pait2, Irene Pajares2, Fidel Rey P. Nayve Jr.2,○Minetaka Sugiyama1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2BIOTECH, UPLB)

3Ba09

出芽酵母における任意領域の染色体外環状 DNA 化技術の開発○生田 宗一郎, 久富 歩, 笹野 佑, 田口 久貴（崇城大院・工）sasano@bio.sojo-u.ac.jp○Pik Kuan Low, John Chi-Wei Lan(Biorefin. Bioprocess Eng. Lab., Dept. Chem. Eng. Mater. Sci., Coll. Eng., Yuan Ze
Univ., Taiwan 32003, R.O.C.)○能崎 健太 1, 冨永 将大 1, 梅野 太輔 2, 近藤 昭彦 1,3, 石井 純 1,3（1神戸大院・科技イノベ, 2千葉大院・工, 3神戸大・先端バイオ工）
junjun@port.kobe-u.ac.jp【目的】バイオエタノール等の生産に用いられる酵母菌株には様々なストレス耐性やキシロース資化能などの能力が求められるが、現在の遺伝子工学技術では
せいぜい数個の遺伝子を改変させることしかできない。そのため大幅な遺伝子領域を自在に扱う技術の開発が不可欠である。出芽酵母の栄養増殖中ではゲノ
ム全域に渡り多くの遺伝子領域が染色体から抜け出し環状化し、染色体外環状DNA（EccDNA）として存在することが明らかになってきている。この EccDNAは染色体から独立して複製する DNA であり、この DNA が酵母の性質の変化や環境適応に関与していることも分かってきた。本研究では将来的に菌株育種に応用することを目指し、出芽酵母において狙った遺伝子領域を自在に EccDNA化する技術の開発を目的とした。
【方法・結果】本研究では EccDNA 作製のために我々が以前に開発した CRISPRPCS 法を応用した手法を用いた。9 番染色体の約 20 kb の内部領域を標的として、この領域の両末端で CRISPR/Cas9 法により DNA 二重鎖切断を引き起こした後、PCR により調製した両端と相補的な配列（50 bp）とマーカー遺伝子を持
つ DNA 断片を連結することで標的領域の EccDNA 化を行った。コロニー PCR
により、得られた形質転換体では標的領域が EccDNA 化したことが示唆された。また 15 番染色体の約 200~400 kb の内部領域を標的とした場合でも同様の結果が得られ、さらにサザン解析によっても EccDNA 化されたことを支持する
結果が得られた。本技術は新奇なゲノム工学技術として微生物育種への応用が期待される。現在、人工的に作製した EccDNA の細胞内でのふるまいを解析するため、細胞内コピー数の測定や EccDNA の胞子分離パターンの解析を行っている。

【目的】 遺伝子発現を自在に制御し新規生物機能を構築するために、よく特徴付けられた内/外来の転写因子を利用して、主に原核生物において機能最適化された人工の転写制御系（遺伝子スイッチ）が多数開発されてきた。一方、真核生物である酵母では、低いスイッチ性能と機能最適化の困難さから、実用に供するスイッチが不足している。本研究では、新規融合タンパク質を用いて、目的のスイッチを迅速かつ簡便に創り出す新規な進化工学法の確立を目的とした。
【実験と結果】 Pseudomonas fluorescens 由来の転写因子 PhlF と Simian virus 40
由来の転写活性化ドメイン、核移行シグナルを融合し、人工転写活性化因子
PhlTA を作製した。PhlTA はオペレーター配列 phlO に結合して下流遺伝子の転写を活性化し、誘導物質 2,4-diacetylphloroglucinol（DAPG）が結合することでphlO から解離して転写を抑制する。ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ HSVTK とブレオマイシン耐性タンパク質 Ble、緑色蛍光タンパク質 GFP から成る
新規融合タンパク質 TBG を構築して phlO 下流に配置し、ランダム変異 PCR に
よって PhlTA 変異体ライブラリと共に酵母 Saccharomyces cerevisiae に導入した。変異体ライブラリをまず抗生物質 Zeocin（Ble により無毒化される）を加えて培養し、TBG を発現した細胞のみを選抜した（ON 選抜）。次に DAPG とプロドラッグである 5FdU（HSV-TK により活性化される）の存在下で培養することで、TBG をリーク発現する細胞を選択的に死滅させた（OFF 選抜）。得た培養液から、GFP 蛍光により S/N 比が向上した変異体をスクリーニングした結果、最高で 7 倍の向上がみられた。また、選抜時の誘導状態を入れ替えること
で、逆転型変異体（DAPG 結合時に phlO に結合）の取得に成功し、S/N 比は14 倍に達した。このように、本手法が酵母遺伝子スイッチの改良・改質に有効であることを実証した。

Extrachromosomal circularization of targeted DNA region in the budding
yeast

Development of yeast genetic switches using a novel tri-functional fusion
protein consisting of positive/negative selection markers and fluorescentprotein○souichiro Ikuta, Hisatomi Ayumu, Yu Sasano, Hisataka Taguchi(Grad. Sch. Eng., Sojo Univ.)

Key words
DNA

Saccharomyces cerevisiae, CRISPR/Cas9, Extrachromosomal circular○Kenta Nozaki1, Masahiro Tominaga1, Daisuke Umeno2, Akihiko Kondo1,3,
Jun Ishii1,3(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2Grad. Sch. Eng., Chiba Univ., 3Eng.
Biol. Res. Ctr., Kobe Univ.)
Key words
yeast, genetic switches, screening, directed evolution

257

3Da01

芝生土壌における細菌および Bacillus subtilis の挙動
解析

3Da03

○柴田 徹 1, 平野 皓巳 1, 鈴木 宏佳 2, 服部 新吾 3, 岩田 卓也 2,
早川 敏広 3, 荒木 希和子 1, 久保 幹 1（1立命館大院・生命科学, 2理研グリーン, 3ケイアイ化成株式会社）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp

ブタ糞から単離された優占乳酸菌 Lactobacillus
amylovorus 由来の S-Layer Protein の 探索と機能性評価○浅野 風斗 1, 吉川 翔太 1, 宮原 平 1, 大野 博司 3, 宮本 浩邦 1,2,3,
児玉 浩明 1
（1千葉大・園芸, 2サーマス, 3理研・生命医科学）
kodama@faculty.chiba-u.jp【背景および目的】ゴルフ場での芝生管理では、競技に支障がでないよう、年間を通して高品質な芝生の管理が求められている。このため、芝生土壌は、砂土を客土としており、化学肥料中心の施肥が行われ、1 年中芝草が生育している
特殊な環境である。そのような環境下で、芝生管理では、芝生を刈り、生育し、再度刈るというプロセスを繰り返す。そのため、芝生の刈りカスであるサッチの残渣が土壌に蓄積することが問題となっており、微生物資材を用いた有機物の除去が試みられている。先行研究において、Bacillus subtilis を投与すること
で、芝生に残存するサッチを分解することが認められた。本研究では、B. subtilis
を芝葉面に散布し、芝生土壌の深度における Bacillus 属細菌および微生物の挙動を解明した。
【方法および結果】2018 年 4 月から 2019 年 3 月において、静岡県のゴルフ場試
験地より、ベント芝および高麗芝の芝生土壌を採取し、土壌の Bacillus 属細菌
数および細菌数を毎月定量した後、経時変化を解析した。その結果、土壌中の総細菌数は、N. D. (6.6×106 cells/g 以下) ~1.5×108 cells/g の範囲であった。また、夏季に増加して、冬季に減少する傾向を示し、土壌表層ほど豊富であった。一方、Bacillus 属細菌数は、N. D. (8.1×104 cells/g 以下) ~3.7×106 cells/g の範囲であり、土壌表層部から深部にかけて徐々に減少していた。Bacillus 属細菌は、芝葉面に最も豊富に存在し、最大で 1.2×107 cells/g を示した。これらの結果から、散布した B. subtilis は芝葉面に付着し、サッチとして土壌表面から深部に浸透することが推定された。

当研究室では未利用海産資源を高温下で発酵させた好熱菌発酵産物の機能性に関する評価研究を進めている。当該産物を家畜ブタに給与すると、死産率の低下、飼料要求率の増加、成長促進といった有用な効果をもたらす事が確認されている。また好熱菌発酵産物を給与した豚ではブタ腸内固有の優占乳酸菌である Lactobacillus amylovorus が糞中にて増加することが明らかとなっている。L.
amylovorus は細胞壁の最外層に S 層とよばれる規則的構造を持つことが知られている。S 層の構成タンパク質である S-layer protein (SLP) は、バクテリア-宿主間の相互作用に関与することが知られている。そこで本研究では、当該産物の給与後に増加する L. amylovorus 由来の SLP の探索とその機能性の評価を進めた。好熱菌発酵産物を給与した豚から単離された L. amylovorus 4-4 株、及び 4８株を対象とし、グアニジン塩酸塩処理を行い細胞壁表面物質含有画分を獲得
し、エドマン分解法、並びに質量分析法を用いて解析した。その結果、L.
amylovorus 由来の画分から SLP 断片を同定することに成功した。粗抽出した
SLP 画分と lipopolysaccharide（LPS）を混合した後、SDS-PAGE により泳動した
結果、ゲルシフトする傾向が確認され、SLP が LPS と吸着する可能性があることが推察された。さらに、フローサイトメトリーを用いて SLP と LPS の吸着能を検証した結果、L. amylovorus 菌液区とグアニジン塩酸塩処理菌液区との間ではわずかながら吸着能の差を確認することができた。以上の結果、並びに最新のデータを踏まえて、腸内の LPS に対する L. amylovorus の役割について議論する。

Analysis of behavior of soil bacteria and Bacillus subtilis in lawn soil

Identification of S-layer protein (SLP) of Lactobacillus amylovorus isolated
from pig feces and its functional evaluation○Toru Shibata1, Hiromi Hirano1, Hiroyoshi Suzuki2, Shingo Hattori3,
Takuya Iwata2, Toshihiro Hayakawa3, Kiwako S. Araki1, Motoki Kubo1(1Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2RIKENGREEN CO.,LTD., 3K-I
CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD.)○Futo Asano1, Shota Yoshikawa1, Taira Miyahara1, Hiroshi Ohno3,
Hirokuni Miyamoto1,2,3, Hiroaki Kodama1(1Fac. Horticul., Chiba Univ., 2Sermas, 3IMS,RIKEN)

Key words

Bacillus subtilis, soil bacteria, lawn field, soil environment

Key words

compost, Lactobacillus, surface layer protein(SLP)

3Da02

芝生土壌における土壌成分及び細菌の解析

3Da04

ウグイス糞の諸特性と細菌叢の解析とその利用○平野 皓巳 1, 柴田 徹 1, 鈴木 宏佳 2, 岩田 卓也 2, 早川 敏広 2,
服部 新吾 3, 荒木 希和子 1, 久保 幹 1（1立命館大院・生命科学, 2株式会社理研グリーン, 3ケイアイ化
成株式会社）
kubo@sk.ritsumeikan.ac.jp

藤茂登 遥香 1, ○石本 弥子 2, 青柳 秀紀 1,2（1筑波大院・生命環境, 2筑波大・生物資源）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp【背景及び目的】芝草は環境緑化また、優れた踏圧耐性などから、ゴルフ場やサッカーグラウンドなど様々な場所で使用さている。芝は主に砂土中で化学肥料によって養分を維持し管理されている。芝生土壌の有機物は主に芝の刈カス（サッチ）であり、何年にも渡る芝生の維持から通常の耕作地とは大きく土壌環
境が異なると推察される。本研究では芝生土壌のデータベース構築を目指し、土壌における土壌成分及び細菌の解析を行う事を目的とした。
【方法及び結果】2018 年 4 月から 2019 年 3 月において、微生物資材の散布頻度を変えた計 6 条件で芝を管理している静岡県のゴルフ場試験地より高麗芝とベント芝の土壌を毎月採取した。サンプリングは表層から 5cm、10cm、15cm の深度で行った。土壌中の全炭素量、全窒素量等の成分及び総細菌数の分析を行った。
芝生土壌の総細菌数は N. D. (6.6×106 cells/g 以下)〜1.5×108 cells/g の範囲にあり、季節変動が見られ、畑土壌と比較すると低かった。これは有機物の蓄積がサッチによるものであり、それが少ないため微生物数も少ないと考えられる。
全炭素量は上部で 9,000 mg/kg、下部で 3,000 mg/kg 程度でいずれの条件でも経時変化はみられなかった。また微生物資材の散布頻度が高いほど全炭素量は低かった。これらの結果から微生物資材散布によりサッチが分解されたことが示唆された。一方、全窒素量は 900 mg/kg〜180 mg/kg の間で変動が見られた。これは化学肥料の施肥による影響だと考えられた。芝生の生育している土壌環境
は有機物の蓄積が低いが一定数の微生物が生育しており、サッチによる有機物の供給が微生物により循環している環境であった。

【目的】
ウグイス（Horornis diphone）の糞は洗顔料やシミ抜きとして江戸時代から近年まで利用されてきた。しかし現在は、鳥獣保護管理法の施行により糞の入手が困難となり、製品の製造ができない。ウグイス糞が化粧品的効能を示す機構は、
これまで学術的検討が十分になされておらず、糞の主な要素である細菌叢（腸内由来）についても未解明な部分が多い。本研究ではウグイス糞が化粧品的効能を示す機構の解明とその利用を最終目的とし、今回は、ウグイス糞の諸特性を解析すると共に細菌叢の解析と培養化を試みた。
【方法と結果】
ウグイス糞を元素分析した結果、餌よりも糞の方が窒素の含有比が高かった。
また、ウグイス糞にはプロテアーゼ活性、トリプシン活性、抗酸化活性が検出された。次世代シーケンサー（MiSeq）を用いて、ウグイス糞の細菌群集構造を解析した結果、門レベルではすべての試料において Firmicutes が最も多く（80%以上）含まれていた。属レベルでの解析では Lactococcus （22.43%）、
Macrococcus （14.73%）、 Weissella （14.39%）などが多く検出されたが、糞試料によりその存在比は異なっていた（現在、比較のため他の鳥類の細菌群集構造解析を実施中）。ウグイス糞試料からプロテアーゼ産生細菌の単離培養を試みたところ、次世代シーケンサーを用いた細菌群集構造解析において存在比が低い細菌のみが複数、培養化された。現在、他の機能を有する細菌の単離培養について検討中である。

Analysis of soil composition and bacteria in lawn soil

Analysis of characteristics and bacterial flora of Horornis diphone fecal
matter and its utilization○Hiromi Hirano1, Toru Shibata1, Hiroyoshi Suzuki2, Takuya Iwata2,
Toshihiro Hyakawa2, Shingo Hattori3, Kiwako S. Araki1, Motoki Kubo1(1Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2RIKENGREEN CO.,LTD., 3K-I
CHEMICAL INDUSTRY CO.,LTD.)

Key words

lawn, soil environment, soil nutrient

Haruka Fujimoto1, ○Yako Ishimoto2, Hideki Aoyagi1,2(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Col. Agrobio. Resource. Sci., Univ.
Tsukuba)

Key words

bacterial community, cosmetics, fecal sample, Horornis diphone

258

3Da05

抗菌性物質が皮膚常在菌の生理活性に及ぼす影響の解析（第 2 報）3Da07

○菊田 実花, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp

Strategic formulation of spray dried synbiotic andkinetics study to prevent hyperphosphatemia○Ajeeta Anand, Hideki Aoyagi(Faculty Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp[目的]
化粧品や石鹸などに添加されている抗菌性物質（防腐剤、抗菌剤、抗生物質等）
は、雑菌や病原菌の抗菌や殺菌を目的としている。しかしながら、抗菌や殺菌の対象ではない皮膚常在菌も抗菌性物質に曝されているにも関わらず、常在菌の生理活性に及ぼす影響については知見が少ない。肌のバリア機能を担う皮膚常在菌に及ぼす影響を解析することは、抗菌性物質の適切な評価と使用、皮膚の健康の保持に重要である。この背景を踏まえ演者らは、抗菌剤のトリクロサン（TCS）が皮膚常在菌の生理活性に及ぼす影響の解析をおこない、皮膚常在菌が TCS 耐性を獲得することを報告した 1)。本研究では皮膚常在菌が獲得した
TCS 耐性の持続性評価と共培養系における諸挙動の解析を試みた。
【方法と結果】
TCS 耐性を獲得した皮膚常在菌 2 菌株（Staphylococcus epidermidis [Se], S. aureus[Sa]）を TCS 無添加の培地 [Control-M] を用いて繰り返し継代培養し評価したと
ころ、一度獲得した TCS 耐性は安定に維持されることが示された。TCS 耐性の有無が皮膚常在菌叢に及ぼす影響を解析するために、TCS 耐性を持たない Seと Sa、TCS 耐性を有する Se-TCS と Sa-TSC、を Control-M や TSC 添加培地 [TCSM] を用いて種々の組み合わせや培養条件で共培養をおこない、定常期の生菌数（CFU）と培地の pH を測定した。その結果、Control の条件（Control-M で Seと Sa を培養）と比較して、TCS 耐性の獲得によって定常期における Se またはSe-TCS と Sa または Sa-TCS の CFU の割合と培地の pH に変化が認められた。
この結果から、TCS 耐性の獲得により皮膚常在細菌叢のバランスが崩れ、常在菌の担うバリア機能が弱まってしまう可能性が示唆された。現在、変化した菌のバランス（割合）を改善する方法について検討中である。
1)H30 生物工学会要旨 p. 265.

Probiotics can be administrated as phosphate-accumulating organisms to prevent
hyperphosphatemia at early stages of chronic kidney disease in future. Reported
phosphate binders for the treatment of hyperphosphatemia have high pill burden, costand associated disadvantages like deposition in bones and adverse health effects. In
this study, a spray dried synbiotic preparation (SD) was formulated using Lactobacillus
casei JCM 1134 and Aloe vera as follows: Lysine derivatization (DAVK) of
deacetylated A. vera (DAV) formed the first layer around L. casei and the second layerof SD was composed by the supernatant obtained from DAV preparation. SD wascharacterized and evaluated for phosphate accumulation under in vitro trials. Results
showed that the outer layer served as the sacrificial layer for the survival of L. caseiduring harsh conditions of gastric juice and DAVK enhanced the phosphate
accumulation by 2.5-fold by lowering the zeta potential. Kinetics study of phosphate
accumulation by SD revealed the polynomial trend (R2=0.955) with maximum
phosphate accumulation capability approx. 0.62 [mg-phosphate/mg-SD]. The obtained
exponential trend and maximum phosphate accumulation capability of SD made agood stand to compete with commercial phosphate binders. The strategic formulationof SD has safe status and high potential to prevent hyperphosphatemia with additional
probiotic benefits.

Influence of antibacterial substances on the physiological activities ofindigenous skin bacteria (part 2)

Strategic formulation of spray dried synbiotic and kinetics study to prevent
hyperphosphatemia○Mika Kikuta, Hideki Aoyagi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)○Ajeeta Anand, Hideki Aoyagi(Faculty Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

coculture, indigenous skin bacteria, triclosan

Key words
Aloe vera, hyperphosphatemia, Lactobacillus casei, phosphate
accumulation

3Da06

マイクロ波（非熱効果）が微生物の生理活性に及ぼす影響の解析（第 2 報）

3Da08

○松田 将典 1, 堀越 智 2, 青柳 秀紀 1
（1筑波大院・生命環境, 2上智大・理工）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp

模擬微小重力環境が腸内有用細菌の諸特性に及ぼす影響の解析と利用○増田 亜理沙, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp【目的】 過去 50 年、マイクロ波が微生物、酵素、タンパク質、遺伝子などに及ぼす様々な影響が報告されてきたが、試料の温度管理が適切になされていなかったため、 (1) 試料の加熱による効果、(2) マイクロ波の特異的（非加熱）効果、
あるいは、(3) 両者の相乗効果、が複合的に作用する可能性が否定できず、前述の現象が生じる要因は未解明であった。先に演者らは、マイクロ波（非熱効果）
により、(A) モデル微生物である大腸菌（Escherichia coli K12）の増殖能が向上する、(B) サイズの大きな微生物を除去した土壌試料では、培養化される微生物叢が変化する、ことをはじめて報告した 1)。本研究では、これらの現象の普遍性の検証やマイクロ波（非熱効果）に対して感受性の高い微生物の探索を試みた。
【方法と結果】 マイクロ波照射中の試料の温度は、光ファイバー温度計でモニターし、温度の上下に応じてマイクロ波の出力を調整し、一定に維持した。マイクロ波（非熱効果）がグラム陽性菌である Lactobacillus acidophilus に及ぼす影響を種々検討した結果、適切な条件でマイクロ波（周波数：2.45 GHz、出力：
約 35 から 45 W で 37℃を維持）を照射しながら液体培養をおこなった場合、グ
ラム陰性菌である E. coli K12 同様、コントロールと比較し、最終菌体濃度が増加（1.2 倍）した。また、L. acidophilus では E.coli とは異なり菌体サイズの増大が認められた（1.33 倍）。マイクロ波（非熱効果）に対し感受性を持つ微生物を探索するため、土壌、池の水などの様々な環境試料の培養をおこない、培養化された微生物叢を PCR-変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）法で解析した。
その結果、マイクロ波（非熱効果）により培養化が、(a) 促進される微生物、(b)抑制される微生物、(c) 影響を受けない微生物、の存在が示唆された。
1） H30 生物工学会要旨集 p.180[緒言] 従来法で培養可能な微生物は、自然界に存在する微生物の 1％前後であることが示唆され、新たな培養法が求められている。先に演者らは、新たな培養法として、模擬微小重力（LSMMG）培養に着目し、LSMMG 環境が種々の
腸内有用細菌の生理活性に及ぼす影響を解析し、(A) LSMMG 培養によりLactobacillus acidophilus JCM1028 の耐酸性が向上する、(B) LSMMG 条件で L.
acidophilus の耐酸性試験をおこなうと、NG 条件よりも高い生存率を示す、新規な現象を見出した 1)。本研究では、様々な乳酸菌やビフィズス菌を対象に、この現象の普遍性の有無を解析するとともに、この現象を活用した耐酸性プロ
バイオティクスの取得を試みた。
[方法と結果] HARV bioreactor を用い、LSMMG 培養や LSMMG 条件下での耐酸性試験が、種々の乳酸菌やビフィズス菌の諸特性 (増殖、培養液の pH、胃酸耐性) に及ぼす影響を解析した。その結果、今回検討した乳酸菌やビフィズス菌の 中 に は 、 LSMMG 培 養 や LSMMG 条 件 下 で の 耐 酸 性 試 験 に お い て 、 L.
acidophilus と同様な挙動を示す菌株が複数存在した。特に、Bfidobacterium breve
JCM1192 は、LSMMG 培養することで NG 培養した場合と比べて顕著な耐酸性の向上が見られた (耐酸性試験の生存率は、NG 培養 = 0％、LSMMG 培養 =1.5％) 。LSMMG 培養した B. breve を酸耐性試験後、寒天平板培地に播種し、生成したコロニーを取得、培養、評価した結果、耐酸性の高い B. breve を取得できた (耐酸性試験の生存率 = 42％、耐酸性の維持も認められた) 。以上の結果
より、LSMMG 培養や LSMMG 条件下での耐酸性試験は耐酸性プロバイオティ
クスの取得に利用できることが示唆された。現在、他の菌株や耐酸性以外の特性について検討中である。

Influence of microwave (non-thermal effect) on the physiological activities of
microbes (part 2)

Effect of low shear and modeled-microgravity condition on the physiologicalactivities of enteric useful bacteria and its application○Masanori Matsuda1, Satoshi Horikoshi2, Hideki Aoyagi1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Fac. Sch. Technol. Sophia Univ.)

Key words

microbial dark matter, microwave, non-thermal effect, PCR-DGGE

1) H30 日本生物工学会要旨集 p. 267○Arisa Masuda, Hideki Aoyagi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words
acid tolerance, bifidobacterium, lactic acid bacteria, low shear andmodeled-microgravity

259

3Da09

コレラトキシン B サブユニットを利用した、機能性ペプチドの細胞小器官への送達

3Da11

吉井 優也, 是石 真友子, ○佐藤 あやの（岡山大・工）ayano113@cc.okayama-u.ac.jp

微細藻の細胞分裂に及ぼす培養温度・光強度の周期的制
御の影響○勝田 知尚, 森本 高章, 桑井 仁葵, 山地 秀樹（神戸大院・工）katsuda@kobe-u.ac.jp

病巣への薬剤送達は、主に細胞表面タンパク質を標的とすることにより実現し、
特定の疾患の治療に利用されている。しかし、このような方法では細胞小器官
特異的に薬剤を送達できない。
コレラトキシンは、致死性のある A サブユニットと、A サブユニットを細胞内へ送り届ける役割を果たし毒性のない B サブユニットからなる。本研究では、
この B サブユニット (以下、CTxB) を改変することにより、機能性ペプチドを細胞小器官であるゴルジ体や小胞体へ送達可能なシステムを構築し、現在の薬物送達法では治療が困難な疾患の治療に役立つ新しい細胞内薬剤送達法の開発を目指した。
機能性ペプチドには、11 アミノ酸残基からなる HiBiT を利用した。HiBiT は、
LgBiT と結合することによりルシフェラーゼ活性を発現する。LgBiT をゴルジ体や小胞体内腔に安定発現させた細胞に、HiBiT を融合した CTxB (以下、改変
CTxB) を取り込ませ、細胞内の改変 CTxB の局在および量の経時的変化をルシ
フェラーゼ活性により追跡した。
改変 CTxB は、細胞と接触およそ 15 分後にゴルジ体に到達し、その 45 分後に小胞体に到達した。さらに、小胞体への送達には、小胞体保留シグナルである
KDEL 配列の改変 CTxB の C 末端への付加が有効であった。今後、本法の改変
CTxB をさらに改変することにより、本法は、ゴルジ体内腔に局在し翻訳後修飾に関わる酵素の欠損によって起こる疾患、例えば I-cell 病などの治療へ新たなアプローチとなる可能性がある。

【背景と目的】緑藻の一種 Haematococcus pluvialis を用いたアスタキサンチンの工業的生産では，予め多数の細胞を得た上でそれらを誘導し，アスタキサンチン生合成を促す手法がとられる．我々は細胞増殖段階の効率化を目指し，培養温度と照射光強度の制御方法について検討したところ，これまで最適温度とされてきた 20.0°C で一定に保持して培養するよりも，20.0°C と細胞分裂が抑制される 30.5°C との間で 12 h 毎に温度を変化させつつ培養するほうが，増殖速度，
ならびに最高細胞密度が約 30%向上することを見出した．そこで本研究は，こうした培養温度・光強度の周期的制御が微細藻の細胞分裂に及ぼす影響を検討した．
【方法】微細藻株には H. pluvialis NIES-144 を使用した．炭素源を CO2 に依存する無機培地に再懸濁したのち，仕込み体積 200 mL のバブルカラム式光培養器を用い，CO2 を 5 v/v%で添加した空気を 0.5 vvm で通気しつつ培養を行った．
このとき，光培養器はガラス壁の恒温水槽中に設置し，外部から白色蛍光灯光
を照射光強度 140 μmol・m-2・s-1 で一定，ないし 70 と 210 μmol・m-2・s-1 で所
定時間ごとに変化させつつ照射した．また，異なる温度を設定した 2 台のチラーをタイマーリレーで所定時間ごとに切替え運転し，恒温水槽中の水温を変化させて培養温度を制御した．
【結果と考察】H. Pluvialis は，培養温度を一定に保持したときには細胞数密度が連続的に増加したが，12 h ごとに変化させたときには，培養温度を高めたときに細胞数密度が急に増加することが観察された．照射光強度の周期的変化によって微細藻の細胞分裂が同調することは知られているが，H. Pluvialis においては培養温度を変化させたときにも同調することが見出された．

Delivery of the functional peptide to organelles using cholera toxin B
subunit

Effects of circadian control of cultivation temperature and light intensity on
the cell division of microalgae

Yuya Yoshii, Mayuko Koreishi, ○Ayano Satoh(Fac. Eng., Okayama Univ.)○Tomohisa Katsuda, Takaaki Morimoto, Hitoki Kuwai, Hideki Yamaji(Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)

Key words

Golgi apparatus, Endocytosis, drug delivery system

Key words

microalgae, Haematococcus pluvialis, cell cycle, circadian cycle

3Da10

昆虫細胞を用いた MERS コロナウイルス様ナノ粒子の
調製

3Ea01

含窒素生理活性化合物 maniwamycin の生合成経路の解析

高見 佳宏 1, 町田 佑樹 1, デオ ヴィピン クマル 2, ○加藤 竜也 1,3,
朴 龍洙 1,3（1静大院・総合科技, 2静大・国際連携, 3静大・グリーン科技研）
park.enoch@shizuoka.ac.jp○藤田 昂大 1, 達川 綾香 2, 岸本 拓也 2, 福本 敦 3, 安齊 洋次郎 3,
荒川 賢治 1,2
（1広島大院・統合生命科学, 2広島大院・先端物質科学, 3東邦大・薬）
karakawa@hiroshima-u.ac.jp【目的】中東呼吸器症候群（MERS）は、2012 年以降中東地域で広く発生しているウイルス性の重症呼吸器感染症であり、MERS コロナウイルス（MERS-CoV）によって引き起こされる。現在のところ日本では症例はないが、2015 年には韓国で感染およびその拡大の報告があり、感染率は低いが致死率が高いことから、ワクチンや特異的治療法の開およびや早期検出法の確立が必須である。本研究では、それらの開発のため MERS-CoV 様ナノ粒子の調製を目的とした。
【方法および結果】MERS-CoV の構造タンパク質である S タンパク質、E タン
パク質および M タンパク質をコードする遺伝子を購入し、それぞれの遺伝子を
pFastBac1 ベクターのポリヘドリンプロモーター下流に挿入して、それぞれの遺伝子発現カセットを構築した。また、それら 3 つの遺伝子発現カセットを有す
る pFastBac1 ベクターを Gibson assembly 法で構築した。それらベクターから
Bac-to-Bac 法で組換え BmNPV (BmNPV/S および BmNPVS/E/M)バクミドを構築
し、Bm5 細胞にトランスフェクションすることでそれぞれの組換え BmNPV を得た。それぞれの組換え BmNPV を Bm5 細胞に M.O.I. 1 で感染させたところ、それぞれの組換えタンパク質の発現が確認されたが、S, E, M タンパク質の共発
現では、S タンパク質を有する MERS-CoV 様粒子の調製ができなかった。そのためそれぞれのタンパク質を発現する Bm5 細胞 1×106 個を 5 μm 孔のメンブラ
ンフィルターに押し出すことで、S タンパク質、E タンパク質および M タンパ
ク質を有するナノ粒子を作製した。ショ糖密度勾配遠心分離で粒子を部分精製し、免疫電子顕微鏡で粒子表面の S タンパク質を検出した。この方法により、昆虫細胞から MERS コロナウイルス様ナノ粒子を調製することができた。

【目的】放線菌は抗生物質などの多種多様な二次代謝産物を生産し、ゲノム上に30 種もの二次代謝生合成クラスターが存在するが、通常培養では約 2 割の代謝産物しか確認されず、残り 8 割はゲノム上に「埋もれている」といえる。放線菌 Streptomyces rochei 7434AN4 株は、通常培養において 2 つの抗生物質ランカ
サイジン（LC）、ランカマイシン（LM）を生産する。LC、LM 生合成遺伝子およびリプレッサー遺伝子 srrB に変異を加えた三重破壊株（KA57 株）において、通常培養非生産のアゾキシアルケン型化合物 KA57-A が蓄積した。本化合物のようなアゾキシ結合は非常に珍しく、クロモバクテリウム・ビオラセウムのquorum sensing を阻害することも明らかになっている。本研究では、KA57-A の構造類似体 maniwamycin に注目し、アゾキシ結合形成を含めた生合成経路の解
明および構造多様化を目指した。
【方法および結果】TOHO-M025 株（maniwamycin 生産菌）を培養し、代謝産物
を酢酸エチルで抽出した。その後 LH20 ゲル濾過およびシリカゲルクロマトグ
ラフィーによって分画、精製を行ったところ、分子式 C12H22N2O4 の maniwamycin
G が得られた。TOHO-M025 株について PacBio RS-II シークエンサーによりゲノム解析を行った。KA57-A および maniwamycin などのアゾキシアルケン化合物生合成遺伝子クラスターとの比較解析を行ったところ、酸化還元酵素や縮合酵素、キナーゼ酵素などの共通の遺伝子群を見出すことができた。また、標識
基質の取り込み実験により、maniwamycin の N 原子はセリンおよびグルタミン
酸由来であることが分かった。現在、脂肪族アミンの炭化水素鎖と生理活性の相関性を解明するために、炭化水素鎖の異なるアミンの添加培養等も進めている。

Preparation of MERS coronavirus-like nanoparticles from insect cells

Analysis of the biosynthetic pathway of nitrogen-containing bioactive
compound maniwamycin

Yoshihiro Takami1, Yuki Machida1, Vipin Kumar Deo2, ○Tatsuya Kato1,3,Enoch Y. Park1,3(1Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Org. Int. Collab., Shizuoka
Univ., 3Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)

Key words

MERS, Bm5 cells, BmNPV, Nanoparticles○Kota Fujita1, Ayaka Tatsukawa2, Takuya Kishimoto2, Atsushi Fukumoto3,
Yojiro Anzai3, Kenji Arakawa1,2(1Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 2Grad. Sch. Adv. Sci. Mat.,
Hiroshima Univ., 3Sch. Pharm., Toho Univ.)

Key words

Streptomyces, biosynthesis, azoxyalkene, enzyme reaction

260

3Ea02

放線菌 Streptomyces rochei のポリケチド抗生物質 LMの生合成に関与する P450 水酸化酵素の機能解析

3Ea04○手島 愛子 1, 近藤 寿志 1, 殿川 亜未 1, 小中 勇二 1, 板倉 康浩 1,
荒川 賢治 1,2
（1広島大院・先端物質, 2広島大院・統合生命科学）
karakawa@hiroshima-u.ac.jp

Streptomyces 属放線菌における二次代謝制御因子改変による 物質生産性プロファイルの解析○見崎 裕也, 岩國 美由季, 高橋 譲, 鈴木 敏弘, 木梨 陽康,
荒川 賢治（広島大院・統合生命科学）
karakawa@hiroshima-u.ac.jp

放線菌 Streptomyces rochei 7434AN4 株の生産する 14 員環マクロライド化合物ランカマイシン（LM）は、グラム陽性細菌に対して抗菌活性を持ち、構造はマクロライド系抗生物質エリスロマイシンと極めて類似している。当研究室では、LM 生合成遺伝子クラスターが線状プラスミド pSLA2-L にコードされていることを明らかにしており、そのうち P450 水酸化酵素遺伝子 lkmK, lkmF および糖転移酵素遺伝子 lkmL, lkmI の機能に着目した。遺伝子破壊株の代謝産物解析により、LM の生合成経路ではアグリコン 8,15-dideoxy lankanolide に対して、
LkmK(15 位水酸化)→LkmL(3 位水酸基への L-arcanose 付加)→LkmF(8 位水酸化)→LkmI(5 位水酸基への D-chalcose 付加)の順に酵素反応が進行することがわかった。そこで、本研究では lkmK および lkmF のタンパク発現系を確立し、これらの水酸化酵素の基質認識解析を行った。
まず、予想基質を得るために、ΔlkmK-lkmL 株、ΔlkmF-lkmI 株を培養・抽出し、それぞれの株から 8,15-dideoxylankanolide、3-O-L-arcanosyl-8-deoxylankanolide を単離し、構造を決定した。
タンパクは、LkmK は大腸菌発現系を用い、LkmF は大腸菌系では反応が進行しなかったため、放線菌発現系を用いて調整を行った。lkmF 遺伝子を放線菌大量発現ベクター pHSA81 に連結してプラスミド pYK01 を得て、S. lividans TK64/
pYK01 株を構築した。二重破壊株から得られた基質と酵素を用いて in vivo 反応を行なったところ、どちらも LkmK, LkmF によって水酸化された。また、
ΔlkmK, ΔlkmF, ΔlkmL, ΔlkmI 株から得られた LM 誘導体についても酵素による基質変換反応を行い、lkmF, lkmK の基質特異性の解析を行った。
本発表では、各 LM 誘導体のバイオアッセイ試験の結果も合わせて、詳細を報告する。

[背景] 放線菌 Streptomyces rochei 7434AN4 株の有する線状プラスミド pSLA2-L
上にはポリケチド抗生物質 Lankacidin(LC)・Lankamycin(LM)の生合成遺伝子クラスターがコードされている。両抗生物質の生産はシグナル分子
SRB(Streptomyces rochei butenolide)合成酵素 SrrX→シグナル分子レセプター
SrrA→SARP 型活性化因子 SrrY（→LC 生産）→SARP 型活性化因子 SrrZ（→
LM 生産）といったカスケードにより制御されている。制御カスケード解明の一環として構築した srrB 欠失株の代謝産物解析を行ったところ、LC, LM 生産
が 5 倍以上向上しており、制御カスケードにおける srrB の関与が示唆された。
S. rochei 染色体上には 35 種の生合成クラスターが存在しており、対応する化合物としてアゾキシアルケン化合物 KA57-A、ポリケチド化合物ペンタマイシン
およびシトレオジオールの 3 種類が取得されている。残りの 32 種の生合成クラスターの代謝産物は未同定であり、生合成クラスターが休眠している可能性がある。染色体上の制御遺伝子を探索したところ、レセプターホモログが５個存在した。本発表では、[1]制御カスケードにおける srrB の機能解析、および[2]染色体上レセプター遺伝子の改変による二次代謝産物生産量の増大および休眠
二次代謝の活性化の試みについて報告する。
[1]親株、制御遺伝子欠失株を対象として、(1)抗生物質生産量、(2)転写産物(srrA,
srrB, srrY)の発現解析、および(3)菌体量、について経時変化解析を行った。その結果、srrB は培養後期に srrY の発現を抑制することで、抗生物質生産における負の制御因子として機能していることが示唆された。
[2]SrrB と相同性を有するレセプターホモログ遺伝子 SRO_1739 に着目し、遺伝子破壊を行った。代謝産物を HPLC および ESI-MS 解析に共したところ、親株にはみられない化合物を検出した(分子式 C9H9O2N)。

Functional analysis of P450 hydroxylase involved in biosynthesis ofpolyketide antibiotic Lankamycin in Streptomyces rochei.

Analysis of metabolic profile changes by modification of regulatory genes in
Streptomyces○Aiko Teshima1, Hisashi Kondo1, Tsugumi Tonogawa1, Yuji Konaka1,
Yasuhiro Itakura1, Kenji Arakawa1,2(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima-Univ., 2Grad. Sch. Integr. Sci. Life,
Hiroshima Univ.)○Yuya Misaki, Miyuki Iwakuni, Yuzuru Takahashi, Toshihiro Suzuki,
Haruyasu Kinashi, Kenji Arakawa(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)

Key words

P450, biosynthesis, enzyme, antibiotics

Key words

regulation, antibiotics

3Ea03

ブテノライド型シグナル分子の構造多様性およびゲノム
マイニングへの応用

3Ea05

抗腫瘍抗生物質マイトマイシンの生合成解析○江口 雄聡 1, 住吉 美保 2, 手島 愛子 2, 荒川 賢治 1,2（1広島大院・統合生命科学, 2広島大院・先端物質科学）
karakawa@hiroshima-u.ac.jp○中川 陽 1, 小笠原 泰志 2, 大利 徹 2（1北大院・総合化学, 2北大院・工）dairi@eng.hokudai.ac.jp【目的】放線菌 Streptomyces rochei 7434AN4 株は抗生物質ランカサイジン(LC)およびランカマイシン(LM)を生産し、それらの生合成はシグナル分子 SRB により厳密に制御されている。SRB は SRB 生合成因子 SrrX によって生合成され、2,3-二置換ブテノライド構造を有している。また放線菌のシグナル分子全体のうち、６割は γ-ブチロラクトン構造と推測されているが、残り４割は[1]SRB などのブテノライド型、[2]新規骨格、[3]シグナル分子非生産、に大別できる。そこで本研究では、放線菌シグナル分子におけるブテノライド型分子の多様性の検証、さらにシグナル分子の誘導生産システムを利用した休眠二次代謝の活性化を目指した。
【方法・結果】まず、SRB の多様性検証のために供試菌として本学の保存菌株からランダムに選択した 86 株を培養し、代謝産物を酢酸エチルで抽出した。その後、抽出物を ΔsrrX 株へ添加培養し LC・LM 生産の回復を調べたが、いずれの供試菌抽出物においても回復は認められず、SRB は独特なシグナル分子構造であることが示唆された。
次に、SRB を供試菌株に対し網羅的に添加培養し、非添加と比較することで、SRB による代謝誘導が引き起こされるかを検証した。供試菌に化学合成した
SRB を１ μM 添加培養し、酢酸エチルで抽出後、TLC 解析を行い SRB 添加の有無による代謝プロファイルの変化を比較したところ、69 菌株中 8 株において代謝産物の変化が見られた。
また最近、Streptomyces ansochromogenes において、SRB よりも側鎖の短いブテ
ノライド型分子 SAB の存在が報告された。化学合成した SAB を ΔsrrX 株へ添加培養したところ、通常培養では見られない緑色スポットが検出できたため、
現在その化合物の単離・解析を行っている。

【緒言】
Mitomycin は、放線菌 Streptomyces ardus が生産する抗腫瘍抗生物質であり、ベンゾキノン、ピロリジジン、アジリジンが縮環した四環性のミトサン骨格を構
造上の特徴とする。その生合成について、標識体の投与実験から、3-amino-5hydroxybenzoic acid (AHBA) と D-glucosamine を前駆体とすることが明らかにされている。また、生合成遺伝子クラスターの解析から AHBA がアミノシキミ酸経路で生合成されることも示されている。しかし、AHBA 形成以降の経路については報告がない。そこで、本研究では組換え酵素を用いた in vitro 実験でその解明を試みた。
【方法、結果、考察】
クラスターの各遺伝子について相同性解析したところ、AHBA の生成後、アシル CoA リガーゼ (MitE) によるアシルキャリアタンパク質 (MmcB) へのロード、
または、グリコシル基転移酵素 (MitB) による糖転移反応の何れかが起きると予想された。そこで、これらの組換え酵素を発現、精製後、in vitro で反応を解析した。その結果、 MitE が ATP 存在下で AHBA を MmcB へロードし、AHBAMmcB を生成することを LC-MS 分析により確認した。また、MitB が AHBAMmcB と UDP-N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc) 間のグリコシル化反応を触媒することも確認した。他方、AHBA と UDP-GlcNAc を用いた MitB の反応は進行しなかった。以上より AHBA が、先ず MitE によって MmcB へロードされ、続いて MitB によってグリコシル化される経路が明らかとなった。

Structural diversity of butenolide-type signaling molecules and its
application toward genome mining

Biosynthesis of the antitumor antibiotics mitomycins○Yuto Eguchi1, Miho Sumiyoshi2, Aiko Teshima2, Kenji Arakawa1,2(1Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 2Grad. Sch. Adv. Sci. Mat.,
Hiroshima Univ)

Key words
metabolism

Streptomyces rochei, Signaling molecule, Genome mining, Secondary○Yo Nakagawa1, Yasushi Ogasawara2, Tohru Dairi2(1Grad. Sch. Chem. Sci. Eng., Hokkaido Univ., 2Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.)

Key words

antibiotics, acyl carrier protein, biosynthesis, in vitro analysis

261

3Ea06

ポリグルタミン酸生合成における新規エピメリ化反応○佐藤 将太 1, 重松 真由子 1, 加藤 陽菜多 1, 小笠原 泰志 2,
大利 徹 2（1北大院・総合化学, 2北大院・工）dairi@eng.hokudai.ac.jp【研究背景】
ポリグルタミン酸 (PGA) は Bacillus 属細菌が生産する D,L-グルタミン酸 (Glu)の混合ポリマーである。これまでに 3 つの酵素 PgsBCA の生合成への関与が示されているが、いずれも膜酵素であり in vitro での反応解析がほとんどなされておらず、詳細は未解明である。納豆菌はグルタミン酸ラセマーゼを有し、D-Gluを生合成できることから、これまで D,L-Glu の両者の重合反応により混合ポリマーが生合成されると考えられてきた。しかし、最近当研究室でペプチド系天然物 MS-271 の生合成における D-トリプトファン残基の導入に関わる新規ペプ
チドエピメラーゼ (MslH) を見出した。PgsA が MslH と高い相同性を有することから、PGA の生合成においても L-Glu 残基のエピメリ化反応によって D-Glu
残基が導入される可能性が示唆された。この場合、PGA の残基はすべて L-Glu
を基質に生合成される。そこで本研究では安定同位体標識した D-、L-Glu の投与実験によりその検証を行った。
【方法・結果および考察】
生産菌はグルタミン酸ラセマーゼを持ち D-、L-Glu を相互変換するため、生産菌を用いた投与実験では Glu の由来の判別は難しい。そこでグルタミン酸ラセ
マーゼ欠損大腸菌 (WM335 株) で PGA を異種宿主生産し、重水素標識した D-、
L-Glu の投与実験を行った。標識 PGA を精製、酵素的加水分解後、LC-MS で分析した結果、標識 L-Glu 投与時のみ PGA の D-Glu 残基への重水素の取り込みが確認された。この結果から PGA の D-Glu 残基の由来は L-Glu であり、その形成にエピメリ化反応が関与することが明らかになった。

Involvement of peptide epimerization in poly-γ-glutamic acid synthesis○Shota Sato1, Mayuko Shigematsu1, Hinata Kato1, Yasushi Ogasawara2,
Tohru Dairi2(1Grad. Sch. Chem. Sci. Eng., Hokkaido Univ., 2Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.)

3Ea08

放線菌 Streptoalloteichus hindustanus に見出した新規
PLP 非依存型 Diaminobutyric acid ラセマーゼの機能解析○尾崎 僚 1, 福本 響 1, 濱野 吉十 2, 老川 典夫 1, 山中 一也 1
（1関西大院・理工, 2福井県大・生物資源）
kazuyay@kansai-u.ac.jp【緒言】D-アミノ酸はさまざまな生物に分布し、L-アミノ酸には無い重要な生理機能を示すことが知られている。一般に、D-アミノ酸は生体内で異性化酵素によって対応する L-アミノ酸から生合成される。これまでに Ala や Glu 等の標準アミノ酸については、それぞれ異性化酵素が同定されているが、非標準アミノ酸の異性化酵素に関する知見は未だ乏しい。このような背景下、我々は、天然物としては稀な D 体の 2,4-Diaminobutyric acid (D-Dab)のみから構成されるホモ
ポリアミノ酸 Poly-D-Dab を生産する放線菌 Streptoalloteichus hindustanus から、先例のない PLP 非依存型の Dab 特異的ラセマーゼを見出した。本酵素の構造機能相関に関する研究は、不分明な部分が多く残される D 型非標準アミノ酸生合
成に関する知見の拡充を導くものと期待できる。従って、本研究は S. hindustanusに見出した新規 PLP 非依存型 Dab ラセマーゼ(Sh-DabR)の詳細な酵素学的性質の解明を目的とする。
【方法】Sh-dabR 遺伝子を pET21b ベクターにクローニングし、E. coli Rosetta 2(DE3)株を宿主として発現させることで組換え Sh-DabR を得た。この組換え ShDabR を L-Dab を基質として各種条件下で反応させ、生じた D-Dab を改変
Marfey 法により定量評価することで各種酵素学的性質を解析した。また、ゲル
濾過クロマトグラフィーを用いて本酵素の四次構造についても解析した。
【結果及び考察】これまでの解析の結果、Sh-DabR は単量体として機能しており 、 弱 塩 基 性 pH 領 域 で 最 大 活 性 を 示 す な ど 、 そ の 酵 素 学 的 特 性 がDiamonopimelate epimerase (DapF)と類似していることが分かった。Sh-DabR の一次構造は近縁放線菌由来の DapF と 20%程度の相同性しか示さないが、触媒残基と推定される 2 つのシステイン残基が保存されていることから、PLP 非依
存型の DapF と類似した機構により Dab の異性化を触媒するものと推定される。

Characterization of an unprecedented PLP-independent diaminobutyricacid racemase from Streptoalloteichus hindustanus○Ryo Ozaki1, Hibiki Fukumoto1, Yoshimitsu Hamano2, Tadao Oikawa1,
Kazuya Yamanaka1(1Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ., 2Fac. Biotechnol., Fukui Pref. Univ.)

Key words

poly-gamma-glutamate, biosynthesis, epimerization, tracer experiments

Key words

racemase, enzymatic characterization, D-amino acid, genome mining

3Ea07

放線菌 Streptoalloteichus hindustanus が生産する新規カ
チオン性ホモポリアミノ酸の構造決定及びその抗菌活性
評価

3Ea09

ポリ-D-ジアミノブタン酸生産放線菌 Streptoalloteichus
hindustanus に見出した新規 D-ペプチド分解酵素の同定○宮脇 大輝 1, 福本 響 1, 濱野 吉十 2, 老川 典夫 1, 山中 一也 1
（1関西大院・理工, 2福井県大・生物資源）
kazuyay@kansai-u.ac.jp○福本 響 1, 戸口 梨那 2, 荒川 賢治 3, 濱野 吉十 4, 老川 典夫 1,2,
山中 一也 1,2
（1関西大院・理工, 2関西大・化生工, 3広島大院・統合生命科学,
4福井県大・生物資源）
kazuyay@kansai-u.ac.jp【緒言】 数種の Streptomyces 属放線菌が二次代謝産物として生産する epsilonpoly-L-lysine (e-PL)は、極めて強い抗菌活性や細胞膜透過性を示すことから、抗菌剤やドラッグデリバリーキャリアとしての応用が期待されている。類縁のカ
チオン性ポリアミノ酸にも同様の生理活性が期待できることから、我々は、ゲ
ノムマイニングによる新規ポリマー探索を進めており、その過程で放線菌
Streptoalloteichus hindustanus が Poly-D-diaminobutanoic acid に加えての Lysine の異性体を構成残基とする新規カチオン性ホモポリアミノ酸を併産することを見出した。本研究は、この新規ホモポリアミノ酸の構造決定ならびにその抗菌特性を明らかにすることを目的とする。
【方法】 S. hindustanus 培養液上清から陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて当該ポリアミノ酸を分離精製した。構成アミノ酸残基及びその立体化学は、精製標品を加水分解した後、Marfey 法を用いて決定した。また、その結合様式
及び鎖長は、それぞれ NMR 及び LC-MS により決定した。抗菌活性については
各種指標菌株に対する最小生育阻止濃度 (MIC)に基づいて評価した。
【結果及び考察】 各種解析の結果、推定生合成酵素の in vitro 基質特異性解析の結果に基づいて予想した通り、当該ポリアミノ酸は L-beta-lysine のみが直鎖状につながったイソペプチド構造の epsilon-poly-L-beta-lysine (b-PL)であることが判明した。このことから、b-PL が天然物としては 5 例目のカチオン性ホモポリアミノ酸であることが確認された。また MIC 評価において、b-PL は e-PL と同様に幅広い抗菌スペクトルを示したが、特に糸状菌類に対しては e-PL と比較して顕著に強い抗菌活性を示すことも分かった。

【緒言】一般に、生体内で生合成されるタンパク質は L-アミノ酸から構成される。生体にはタンパク質合成系のみならず、多様なタンパク質分解系も存在す
るが、これらの分解酵素も一部の例外を除き L-アミノ酸残基を特異的に認識して分解する。いくつかの β-ラクタマーゼ様の酵素が、例外的に D-アミノ酸含有ペプチドに作用することが報告されているが、これらは何れも短鎖 D-アミノ酸含有ペプチドの N-末端付近の D-アミノ酸残基を遊離するのみである。したがって D-アミノ酸のみから構成される長鎖 D-ペプチドに作用する天然のペプチダー
ゼは報告がない。このような背景下、我々は長鎖 D-ペプチド(poly-D-Dab)生産
放線菌 Stereptoalloteichus hindustanus が、細胞表層に強い D-ペプチド分解酵素を有していることを明らかにした。本研究は、当該新規酵素の同定とその酵素
化学的諸性質を明らかにすることを目的とする。
【方法】S. hindustanus ゲノム配列の in silico 解析により見出した推定 poly-D-Dab
生合成遺伝子(pdb)クラスター全長を BAC ベクターにクローニングした。このベクターを導入した異種放線菌 Streptomyces lividans TK23 株の poly-D-Dab 分解
活性を休止菌体反応にて確認した。次に pdb クラスターにコードされる D-ペプ
チド分解酵素候補遺伝子を大腸菌を宿主として発現させ、得られた組換え酵素の poly-D-Dab 分解活性を評価した。
【結果及び考察】pdb クラスター全長を導入した S. lividans は、休止菌体反応において非導入株には見られない顕著な poly-D-Dab 分解活性を示したことから、
D-ペプチド分解酵素が当該遺伝子クラスターにコードされることを確認した。
更に、組換え酵素として調製した pdb クラスターにコードされる β-ラクタマー
ゼ様の酵素が、同様の強い poly-D-Dab 分解活性を示したことから、当該酵素がD-ペプチド分解酵素の実体であることを確認した。

Structure and bioactivity of a novel cationic homo poly-amino acidproduced by Streptoalloteichus hindustanus

Identification of an unprecedented D-peptide degrading enzyme from
Streptoalloteichus hindustanus○Hibiki Fukumoto1, Rina Tiguchi2, Kenji Arakawa3, Yoshimitsu Hamano4,
Tadao Oikawa1,2, Kazuya Yamanaka1,2(1Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ., 2Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ.,
3
Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 4Fac. Biotechnol., Fukui Pref. Univ.)

Key words
bioactivity

secondary metabolism, homo poly-amino acid, genome mining,○Hiroki Miyawaki1, Hibiki Fukumoto1, Yoshimitsu Hamano2, Tadao Oikawa1,
Kazuya Yamanaka1(1Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ., 2Fac. Biotechnol., Fukui Pref. Univ.)

Key words

secondary metabolism, peptidase, beta-lactamase, D-peptide

262

3Ea10

藍藻のバイオフィルム形成に関与するプトレシン合成酵
素の機能解析

3Fa01○木花 将 1, 解良 康太 1, 植村 武史 2, 五十嵐 一衛 2, 魚住 信之 1
（1東北大院・工, 2アミンファーマ研）
uozumi@biophy.che.tohoku.ac.jp

清涼飲料水中に添加した殺菌乳酸菌体の菌株判別 RNAMLSA 法の開発
○青山 冬樹（アサヒ飲料・技術研）
fuyuki.aoyama@asahiinryo.co.jp【背景・目的】酸素発生型光合成細菌であるシアノバクテリア（Synechosystis sp.
PCC6803）は塩ストレスなどの環境ストレスを感知してバイオフィルムを形成する。我々は，ポリアミン生合成経路の最初の反応を担うアルギニン脱炭酸酵
素（Adc）遺伝子を不活化すると，ポリアミン濃度は低下し，バイオフィルム形成は促進されることを報告した（K. Kera et al., 2018）。今回、バイオフィルム形成に関与するポリアミンの種類とその合成酵素を明らかにする目的で、Adcの次の反応を触媒するプトレシン合成酵素（Auh）の遺伝子の同定とその遺伝子産物の機能を解析した。
【方法・結果】シアノバクテリアのゲノム上には、2 つの auh 相同遺伝子（auh1、auh2）が存在する。これらの酵素機能を明らかにするために、Auh1、Auh2 を大腸菌で異種発現させ、Ni アフィニティークロマトグラフィーにより精製酵素
標品を取得した。アグマチンを基質として反応後、高速液体クロマトグラフィー
にてプトレシン量を測定した。その結果、Auh は両方とも活性を有し、更にAuh1 は Auh2 の約 3 倍の比活性を示すことが明らかになった。Auh のシアノバ
クテリアにおける機能を明らかにするために、Auh1、Auh2 の各単一欠損株（Δauh1, Δauh2）と二重欠損株（Δauh1/2）を作製し、生育試験をおこなった。
その結果、通常培地（BG11）において Δauh1 と Δauh1/2 株で細胞増殖速度の低下が観察された。比活性の高い Auh1 の欠損株でより遅延が観察されたことか
ら、ポリアミンは細胞増殖を促進することが示唆された。次に、バイオフィル
ム形成量を測定したところ、野生株と欠損株でバイオフィルム量に差は観察されなかった。このことから、ポリアミンに加えてアグマチンもバイオフィルム
形成制御に関与することが示唆された。

【目的】
現在機能性表示食品制度を利用した食品において、特定の菌株を利用した場合、当該の菌株の定性、定量試験方法を開発し、また第 3 者機関で実施可能な必要がある。乳酸菌を用いた発酵乳、ヨーグルト等の場合、生きた乳酸菌の特異的検出培地と菌種や菌株特異的 PCR などにより比較的容易に定量定性が可能であることが多いが、乳酸菌が添加されて殺菌された清涼飲料水の場合は、生菌を得ることができず菌株判別を行うことは極めて難しい。そこで清涼飲料水中に添加した死菌体の菌株判別手法の開発を行った。
【方法】
L. amylovorus, L. gasseri の培養菌体および清涼飲料水中の死菌体の核酸を抽出し、主にタイピング用に使用されている 6 遺伝子の解析を行った。また清涼飲料水中に添加した乳酸菌体の核酸を抽出し分解・保存状況を確認した。菌株特異的な一塩基を解析できるように 100-400nt 程度を増幅する複数の MLST(A)法用のプライマーを開発しタイピングを実施した。
【結果】
製造直後の製品中から回収した乳酸菌体では 400nt 程度の長さを増幅するプラ
イマーを用いて解析可能であったが、常温 1 年間保存を行うと増幅・解析ができなかった。しかし 2-4 個の遺伝子の 100-200nt の配列を増幅・解析するプライマーを開発し、解析配列の系統樹解析を行った結果、既存の L. amylovorus, L.
gasseri の菌株を判別することが可能であった。本方法により清涼飲料水中に添加した乳酸菌体の MLST(A)法を実施し、菌株を判別することが可能となった。

Characterization of agmatine ureohydrolases, Auh1 and Auh2, in
cyanobacteria

Developmet of RNA MLSA method for typing of Lactobacillus in
pasteurized acid bevarage○Masashi Kihana1, Kota Kera1, Takeshi Uemura2, Kazuei Igarashi2,
Nobuyuki Uozumi1(1Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 2Amine Pharma Res. Inst.)○Fuyuki Aoyama(Asahi Soft Drinks Co., Ltd., Technol. Res. Develop. Lab.)

Key words

cyanobacteria, biofilm, polyamine, stress response

Key words

Lactobacillus, mRNA, MLST, typing

3Ea11

卵菌 Saprolegnia による生理活性多価不飽和脂肪酸
Arachidonic acid 生産

3Fa02

深海底泥由来食肉加工用プロテアーゼ生産菌の探索○高野 真希 1, 吉村 英莉 2, 星野 一宏 1
（1富山大院・理工, 2富山大・工・生命）
khoshino@sus.u-toyama.ac.jp○寺内 美結, 藤井 大樹, 衛藤 晋一, 飯田 章博（三菱商事ライフサイエンス）
miyu.terauchi@mcls-ltd.com

多価不飽和脂肪酸(PUFA)は生活習慣病や脳機能の活性化など様々な調節効果および生理活性を有するため注目されている。特に、Arachidonic acid (ARA)はエ
イコサノイドの前駆体として知られており、神経伝達などに関わる生理活性物
質として重要な役割をもつ。近年では安定な生産を目指した接合菌 Mortierellaによる ARA 生産が行われている。しかし本菌種は豊富な栄養を必要とし、さらに増殖を高めるには土壌抽出液など複雑な成分を要する。このため、液体培養に適した低栄養下で ARA 生産を可能とする新規な菌種が求められる。本研
究では淡水の低栄養培地下で増殖する卵菌 Saprolegnia に着目し、本菌種による
ARA 生産について検討した。
ARA 生産株選択のため、NBRC 保存の Saprolegnia 属糸状菌 8 株を 28℃、pH
5.5、好気条件下で 7 days 振とう培養を行った。得られた菌体は乾燥し、脂質成分を抽出およびメチル化した後、GC を用いて菌体内の脂肪酸成分を分析した。
その結果、8 株すべてにおいて ARA 生産が確認できた。特に、S.semihypogyna
NBRC 33252 の ARA 生産量が最も高かったため、本菌株を選択した。ARA 生
産量を向上させるため、初期 pH を検討した結果、pH4.0 ではほぼ増殖しなかったが、pH4.5 以上で中性に近いほど菌体重量が増加し、pH 7.5 では 15.4 g/L に達した。このとき培養液当たりの総脂肪酸量は約 1.0 g/L であり、ARA 生産量
は 0.3 g/L、菌体あたりの含量は 20.8 mg/g-DCW であった。このとき、Linoleic
acid が 5.9 mg/g-tFA、γ-Linolenic acid が 0.7、および ARA が 30.1 であり、ARA
生合成がスムーズに進んでいることがわかった。また、20℃で培養したところ
ARA 生産量および含量は 0.35 g/L および 34.4 mg/g-DCW に向上できた。さらに、培地中に Soy oil を添加した場合、ARA 生産量および含量を 0.92 g/L および 57.7 mg/g-DCW へと増加させることができた。

本講演では、深海底泥微生物由来の酵素のはたらきによる食肉加工産業利用への可能性について紹介する。
【背景】海洋は地球の大部分を占めるが、そこに生存する生物については未知なことが多く取り残されている。深海は一般的に水深 200-2000m を指し、低温及び塩分を含む特異的な環境であるため、深海に存在する微生物の特性が、食品利用への新たな可能性として期待されている。一方、食肉加工現場においては、
食品衛生の観点上、低温で処理することが多く、また、調味液などの塩分の高い状況下に置かれることが多い。そこで、本研究では耐塩・低温活性プロテアー
ゼ生産菌のスクリーニングを深海底泥サンプルより行った。
【方法】深海底泥サンプルは、JAMSTEC 供与サンプル(日本近海で採取場所の異なる 5 サンプル)を使用した。各種培地及び培養温度(4,15,30℃)で生育した菌をピックアップし、食肉の構成タンパク質の一種であるエラスチンを窒素源とした寒天培地を用いて、1 次スクリーニングを行った。さらに、2 次スクリーニ
ングとして試験管及びフラスコ培養へスケールアップを行い、有用菌株の選抜を実施した。選抜菌株においては現場製造性を考慮し、培地の窒素源の変更、
Jar スケールでのプロテアーゼ生産性検討、市販酵素との酵素特性の比較試験及び選抜菌株の 16S rRNA 配列解析を実施した。
【結果】1 次スクリーニングより、エラスチン分解性を示した 63 菌株を取得した。さらに、2 次スクリーニングにおいて特に低温での活性に優位性の見られた No.1-1 株と、特に高力価を示した No.4-15 株の計 2 株を選抜した。市販酵素と比較したところ、No.1-1 株が最も低温、高塩濃度下で高い活性を示していた。

Production of physiological active PUFA Arachidonic acid by Oomycota
Saprolegnia

Screening of protease production bacteria from deep-sea sediments for meat
processing○Maki Takano1, Eri Yoshimura2, Kazuhiro Hoshino1(1Grad. Sch. Sci. Eng., Univ. Toyama, 2Dept. Life Sci. Bioeng., Univ. Toyama)

Key words

Saprolegnia , polyunsaturated fatty acid, arachidonic acid

○Miyu Terauchi, Taiki Fujii, Shinichi Eto, Akihiro Iida
(Mitsubishi Corporation Life Sciences Limited)

Key words

food processing, deep-sea, protease, screening

263

3Fa03

家畜の腸内機能の in vivo 評価モデルとしての家畜フローラマウスの開発

3Fa05○宮本 浩邦 1,2,3, 須田 亙 3, 朝倉 三貴 3, 加藤 完 3, 児玉 浩明 1,2,
服部 正平 3, 大野 博司 3
（1千葉大・園芸, 2(株)サーマス, 3理研・生命医科学）
hirokuni.miyamoto@riken.jp

Untargeted GC/MS-based metabolomic approach ofcoffee beans obtained from different altitude and various
post-harvest processing○Sastia Putri1, Fitri Amalia1,2, Yusianto3, Pingkan Aditiawati2,
Eiichiro Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Sch. Life. Sci. Tech., ITB, 3ICCRI)
sastia_putri@bio.eng.osaka-u.ac.jp

薬剤耐性菌の蔓延防止は世界的に取り組むべき喫緊の課題であり、国内外の畜産業界では、抗生物質の使用規制の準備を進めている。そのため、抗生物質の代替製剤の開発は急務であるが、産業動物を対象とした試験は、コスト、労力、安全性などの観点から障壁が高く、新規の投機的な製剤の開発は非常に難しい。
一方、実験用動物として汎用されるマウスは、衛生的に管理された SPF (specificpathogen free) 環境下で飼育されており、その腸内フローラは産業動物のそれとは大きく異なっているため、必ずしも適切な評価モデル系とは言えない。そこ
で、本研究では、家畜の腸内フローラを移植したマウス(以下、家畜フローラマ
ウス)を育成することによって、家畜の腸内機能の評価のための in vivo モデル
系の構築を目的とした。アイソレーター内で、豚糞の希釈溶液をゾンデを用いて経口投与によって、無菌マウス腸内に移植し、普通食下で飼育した場合、豚固有の優占乳酸菌のうち、Streptococcus sp.が糞中の菌叢構成として 8%前後、Bifidobacterium sp.が 3%前後確認されたが、高脂肪食条件下で飼育した場合、それぞれ 1%以下になった。Enterococcus sp.については、普通食条件下で 2%前後の菌であるのに対して、高脂肪食条件下では、15%になった。また、優占芽胞菌である Clostridium sp.は、普通食条件下で 15%前後であったが、高脂肪食条
件下では、30%を超えた。これらのデータを踏まえて、家畜の成長に貢献しう
る生菌剤候補の Bacillus hisashiiN11T の機能性を評価したところ、成長促進を伴う脂肪蓄積軽減効果を検証することができた。これらの結果から、少なくとも豚糞由来の菌叢を移植した家畜フローラマウスは、食餌条件によって異なる腸内菌叢の挙動を示し、家畜用の飼料添加物などの効果を検証することが可能な
モデル評価系であることが示唆された。

Metabolomics, the study of comprehensive profiling of metabolites, is a useful tool toelucidate factors affecting coffee beans quality, such as altitude and postharvest
processing. In this study, GC/MS-based untargeted metabolite profiling was employed
to coffee samples grown in different altitude: high (1200-1500 m), low (760-900 m)
and very low (below 760 m) and from various post-harvest processing: dry/naturalprocessing, honey processing, semi-washed processing and full-washed processing.
Principal component analysis (PCA) showed that coffee samples were clustered basedon their post-harvest processing described by first principal component (PC1) with40.1% variance and separation based on altitude was shown in PC2 with 20.1%
variance. The sample processed by dry/natural process were excluded to give moreinsights on sample clustering based on altitude. The loading plot of PCA suggested thatseveral amino acids were accumulated in lower altitude, while sugar compounds wereaccumulated in high altitude samples. This is the first study to elucidate the effect ofaltitude and post-harvest processing to coffee beans using metabolomic approach andvisualization of metabolite changes of coffee grown in different altitude might bebeneficial for development of Arabica coffee beans quality.

Establishment of livestock animal microflora harboring-mouse as a in vivo
model to estimate physiological effects of feed additives on gut function of
livestock animals

Untargeted GC/MS-based metabolomic approach of coffee beans obtained
from different altitude and various post-harvest processing○Hirokuni Miyamoto1,2,3, Wataru Suda3, Miki Asakura3, Tamotsu Kato3,
Hiroaki Kodama1,2, Masahira Hattori3, Hiroshi Ohno3(1Fac. Horticul., Chiba Univ., 2Sermas co.ltd., 3IMS,RIKEN)○Sastia Putri1, Fitri Amalia1,2, Yusianto3, Pingkan Aditiawati2, Eiichiro Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Sch. Life. Sci. Tech., ITB, 3ICCRI)

Key words

Livestock animal, in vivo model, gut function, microbial flora

Key words

coffee grounds, GC/MS, altitude, post harvest processing

3Fa04

Metabolic profiling of cocoa cake from Forastero cacao
beans by GC/MS analysis

3Fa06

Untargeted metabolomics approach to monitor
metabolite changes during pineapple ripening process○Abu Hanifah1, Hendy Firmanto2, Sastia Prama Putri1,
Eiichiro Fukusaki1(1Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Indonesian
Coffee and Cocoa Res. Inst.)
sastia_putri@bio.eng.osaka-u.ac.jp○Muhammad Maulana Malikul Ikram1, Sobir Ridwani2,
Sastia Prama Putri1, Eiichiro Fukusaki1(1Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Dept. Agronom.
Hort. Bogor Agricultural Univ.)
sastia_putri@bio.eng.osaka-u.ac.jp

The emergence of consumer awareness about cocoa beans origin and genotype used inchocolate leads to the growing market of premium chocolate with unique flavor.
Furthermore, the complex flavor of chocolate also affected by the process offermentation, drying, and roasting. Previous studies to discriminate the flavor
characteristics of cocoa beans from different genotypes, origins, and processing step
have been reported. However, there are still limited studies focusing on one genotype
from one origin country of cocoa beans in the form of cocoa cake (cocoa liquor after
separated from cocoa butter). In this study, pools of unfermented cacao beans ofForastero cultivar from 8 provinces of Indonesia was sun-dried and pressed to separate
the fat content and yield a cocoa cake. Cacao beans were collected from 5 farms fromeach city and samples were obtained from 2 to 3 cities from each province. GC/MS
analysis followed by principal component analysis (PCA) was employed to observe thedifference between Indonesian cacao beans metabolic profile. Clustering of samples
based on geographical origins was observed, in which samples from the sameprovinces are grouped together. In addition, there was a tendency that samples from thesame islands but different provinces were also closely clustered together. The results
highlight some amino acids and polyphenols that contributed to the clustering of cocoa
cake based on geographical origins.

Pineapple is one of the most cultivated tropical fruit in the world. In 2016, its market
value reach 233 billion JPY. At present, the major problem in pineapple industry is theshort shelf life of pineapple fruit that causes crop loss during distribution. This is due
to lack of detailed knowledge on the pineapple ripening stages due to its nonclimacteric characteristic. Therefore, the objective of this research is to investigate
metabolite changes in pineapple ripening process by using untargeted metabolomics
approach. The strategy is to analyze crown, peel, and flesh part of pineapple from all
ripening stages of pineapple by using color and GC/MS analysis. These data were
subsequently analyzed by multivariate analysis to perform Principal Component
Analysis (PCA) and Projection to Latent Square (PLS). Pineapple variety used in thisexperiment was Queen var. from Indonesia. Colorimetric analysis based on CIE-LCH
color spectrum indicated that color changes in Hue spectrum were increased relative tothe ripening stages. PCA also showed clustering of samples based on ripening stages
from C0 into C4 stages (Codex Stan 182-1993) for all parts of pineapple. Metabolites
that were associated with the ripening stages are threonic acid, threitol, and trehalose incrown part, threonine, isoleucine, and GABA in flesh part, and β-alanine, mannose,and tyrosine in peel part. Using untargeted metabolomics approach, a deeper
understanding regarding the changes during ripening in pineapple, a non-climactericfruit can be obtained

Metabolic profiling of cocoa cake from Forastero cacao beans by GC/MS
analysis

Untargeted metabolomics approach to monitor metabolite changes during
pineapple ripening process○Abu Hanifah1, Hendy Firmanto2, Sastia Prama Putri1, Eiichiro Fukusaki1(1Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Indonesian Coffee and Cocoa
Res. Inst.)

Key words

cocoa bean, origin, cocoa cake, metabolic profiling○Muhammad Maulana Malikul Ikram1, Sobir Ridwani2, Sastia Prama Putri1,
Eiichiro Fukusaki1(1Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Dept. Agronom. Hort. Bogor
Agricultural Univ.)

Key words

Ananas comosus, metabolomics, ripening, non-climacteric

264

3Fa07

GC/MS に基づくメタボロミクスを用いた品種と生息環境による食用エビの分類

3Fa09○大戸 優妃奈, Putri Safira Latifa Erlangga, Putri Sastia Prama,
福﨑 英一郎（阪大院・工）fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp

Metabolomics-based research for the evaluation of postharvest quality of white leg shrimp (Litopenaeus
vannamei) cultured in different salinity○Sri Hayati1, Sastia Prama Putri1, Julie Ekasari2, Eiichiro Fukusaki1(1Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Faculty ofFisheries and Marine Sci., Bogor Agricultural Univ)
sastia_putri@bio.eng.osaka-u.ac.jp

エビは世界で年間 650 万ｔ消費されている水産食品である．日本はエビの消費大国といわれ，年間約 26 万ｔ消費している．日本で消費されているエビは輸入されたものと国産のものに分けられ，輸入されるエビは主に東南アジアで集約的に養殖されているものである．
エビはその品種，また養殖と天然といった生息環境の違いによってその価格が大きく影響される．近年，エビの産業で問題になっているのが偽装表記の事例である．経済的利益を得るためにエビの品種を偽装する，または養殖エビを天然と偽って売る，といった事件が起こっている．これは消費者たちの安全性への懸念が大きな問題となり得る．安心してエビを食べるためには検出方法が必要であるが，その検出方法は確立されていない．
そこで検出方法の確立の第一歩として，メタボロミクスの運用を考案した．メ
タボロミクスは代謝物全体の網羅的解析であり，遺伝子差異や環境要因による表現型の違いを観察することのできる強力な方法論である．エビの代謝物プロファイリングの解析を行うことで，品種や生育環境によってエビを分類することを試みた．
産地や養殖池の異なる 7 品種，13 種類のサンプルを GC-MS で分析し，得られた代謝物プロファイルを PCA に供することにより，品種ごとに分類された．次に 3 品種の天然・養殖を含む 13 種類のサンプルを用いた実験においては，天然・養殖間で代謝物プロファイルに差があることが明らかになった．

Salinity plays an essential role in shrimp aquaculture, possibly affecting post-harvest
quality (physical attributes) and metabolome profiles. Currently, there are no studies
reporting salinity effect on post-harvest quality. This study aims to investigate theeffect of different salinity on metabolome profile and physical attributes of white leg
shrimp (Litopenaeus vannamei). Shrimp samples obtained from different salinity werecollected from Indonesia. Non-targeted metabolomics workflow was applied using
GC/MS and its physical attributes (texture and color) were analyzed. In controlled
system, Principal Component Analysis (PCA) of samples from different salinity levels(10, 20, and 30 ppt) showed that samples were clustered together based on different
salinity. Physical attributes were also found to be affected by salinity. Color spectrum(ΔL* and Δb*) and texture parameter (springiness and cohesiveness) showed a positive
trend as the salinity increase. In addition, in uncontrolled system, PCA of shrimp
samples from different salinity (2, 7, 10, 12, and 30 ppt) showed that PC1 separated
samples of low and high salinity with amino acids and trehalose contributing the mostto the separation. The resultant heatmap revealed that the metabolites intensities wereincreased proportionally with salinity. The result from this study will provide newknowledge on the importance of specific metabolites affected by different salinity,
which could be useful to improve post-harvest quality of shrimp.

Classification of shrimps by species and habitat using GC/MS-based
metabolomics

Metabolomics-based research for the evaluation of post-harvest quality ofwhite leg shrimp (Litopenaeus vannamei) cultured in different salinity○Yukina Ohto, Safira Latifa Erlangga Putri, Sastia Prama Putri, Eiichiro Fukusaki(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)○Sri Hayati1, Sastia Prama Putri1, Julie Ekasari2, Eiichiro Fukusaki1(1Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Faculty of Fisheries and Marine
Sci., Bogor Agricultural Univ)

Key words

metabolic analysis, shrimp, food analysis

Key words

Litopenaeus vannamei, salinity, metabolomics, post-harvest quality

3Fa08

Non-targeted metabolomics approach for size-based
prediction of Litopenaeus vannamei (white leg shrimp)

3Ga01

ビタミンナノエマルションの角膜細胞浸透性を利用した
新規点眼薬の開発○Safira Latifa Erlangga Putri1, Felicia Irene Saputra2,
Magdalena Lenny Situmorang2, Gede Suantika2, Sastia Prama Putri1,
Eiichiro Fukusaki1(1Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Sch. Life Sci.
and Tech., Institute Teknologi Bandung)
sastia_putri@bio.eng.osaka-u.ac.jp○高木 昌宏 1, 三宅 深雪 2, 栗岡 昌利 3, 辻野 義雄 1,4, 下川 直史 1
（1北陸先端大・マテリアル, 2ライオン・先進解析科学研, 3ライオン・薬品研, 4岡山理大・経営）
takagi@jaist.ac.jp

Shrimp has been known for its taste delicacy and unique flavor as its worldwide
demand is expected to grow continuously. The information regarding the taste qualityof different-sized shrimp might be useful as the consumer will acknowledge whatcomes into their plate in a particular price. This study aims to show the utilization of
non-targeted metabolomics in elucidating the correlation between shrimp size and its
metabolites profiles, focusing on non-volatile taste active compounds. In total, 15
samples (2-23 gr) were collected from Indonesia. Metabolomics workflow wereapplied using GC/MS as the analytical platform. Among 90 detected metabolites, someof them are reported to exhibit taste properties, such as sweetness, saltiness, sourness,
bitterness, and umami. These includes water-soluble components which consist of freeamino acids, fatty acids, nucleotides, as well as non-nitrogenous substances such asorganic acids and sugars. The relative intensity of these metabolites was varied in eachshrimp size, reflecting the change that occurred during the metabolism. The changes inmetabolite concentration may also reflect taste quality of shrimp. The Projection toLatent Structure (PLS) showed that 5 highest VIP score metabolites (malic acid,alanine, proline, fumaric acid) were taste-related compounds. This study provides theinsight on how taste active metabolites are varied according to the size of shrimp. The
results from this study may suggest the best shrimp size having optimum taste quality.

【背景・目的】
ビタミンＡ（VA:レチノールパルミチン酸エステル）は、疲れ目やドライアイの症状に対して、ムチン産生による涙液固定化やヒアルロン酸産生による角膜修復を促進することで有効性を発揮する。しかし、VA は脂溶性のため、点眼
薬中に澄明に分散させる技術が必要である。本研究では、界面活性剤を用いて均一に分散させた VA ナノエマルションを調製し、ドライアイ症状に効果のある点眼薬の開発を試みた。
【方法】
乳化剤として POE(60)硬化ひまし油(HCO)とトリブロック型高分子界面活性剤
F127(EOPO)を用いて VA ナノエマルションを調製した。細胞模倣膜（GUV）
は、ラフトの相分離構造を模したモデル膜等を、静置水和法にて調製し、エマルションと接触後、形態変化を観察した。角膜上皮細胞は、１晩培養してエマ
ルション溶液と接触させた後、細胞透過性をレーザー共焦点顕微鏡で観察した。
【結果・考察】HCO 系ナノエマルションでは、GUV の収縮を観測したが、乳化滴の吸着で収縮傾向は加速された。一方、EOPO 系ナノエマルションでは、GUV の内側に向う膜の引き込みや小胞を形成するエンドサイテイックな形態変化が観測され、さらに、ラフト模倣構造を有する GUV では、EOPO 系のエンドサイテイック
な形態変化がラフトを起点に加速された。付着状態の角膜細胞にナノエマルショ
ンを作用させると、HCO 系より EOPO 系の方が経時的に細胞中心部の VA 蛍光
強度が高まることから、VA が効果的に透過し、輸送されたことが示唆された。
また、角膜細胞では、実際の細胞膜からエンドサイテイックに小胞形成する様子や、細胞内部構造の同定から VA ナノエマルションが核周辺に輸送されたことがわかり、EOPO 系ナノエマルションの一連の細胞透過挙動が VA の有効性発現に関与していると考察した。

Non-targeted metabolomics approach for size-based prediction of
Litopenaeus vannamei (white leg shrimp)

Development of a new eye drops using corneal cell permeability of vitamin
nanoemulsion○Safira Latifa Erlangga Putri1, Felicia Irene Saputra2,
Magdalena Lenny Situmorang2, Gede Suantika2, Sastia Prama Putri1,
Eiichiro Fukusaki1(1Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Sch. Life Sci. and Tech.,Institute Teknologi Bandung)
Key words
Litopenaeus vannamei, metabolomics, size, taste-active compound○Masahiro Takagi1, Miyujki Miyake2, Masatoshi Kurioka3, Yoshio Tsujino1,4,
Naofumi Shimokawa1(1Sch. Mater. Sci., JAIST, 2Adv. Analytic Sci. Lab., Lion, 3Pharma. Res. Lab., Lion,
4
Dept.Man., Okayama Univ. Sci.)

Key words

cell membrane, drug delivery system, liposome, Crneal cell

265

3Ga02

Gel-in-Oil ナノエマルション開発による機能性分子の安
定送達

3Ga04

○井嶋 博之, 山本 惠美子, 重栖 佑次, 堺 裕輔
（九大院・工）ijima@chem-eng.kyushu-u.ac.jp

インジェクタブル金属イオン架橋コハク酸修飾キトサン
ハイドロゲルによる術後腹膜癒着防止効果の検討○三橋 健斗 2, 戚 蟠 2, 高橋 彬 1, 太田 誠一 2, 伊藤 大知 2（1東大院・工, 2東大院・医）taichi@m.u-tokyo.ac.jp

増殖因子をはじめとする機能性分子の使用は細胞培養から再生医療にいたるさ
まざまな分野において重要かつ不可欠なものとなっている。しかしながら、それら機能性分子は一般的に極めて高価であり、また安定性に乏しい。また、増殖因子による組織再生促進などの有効性発現には数日以上の持続的作用が不可欠である。そこで本講演では、増殖因子などの機能性分子を固定化および徐放可能な Gel-in-Oil ナノゲルエマルション（G/O エマルション）の開発ならびにその有効性について報告する。
増殖因子との高い親和性を有するヘパリン固定化ゼラチンを IPM 中に分散させた W/O エマルションを作製し、冷却もしくは化学架橋により G/O エマルションを作製した。また、この仕込み時に増殖因子を加えることにより、増殖因子
固定化 G/O エマルションを作製した。本 G/O エマルションは良好な保存安定性や経皮吸収性を示した。さらにこれらは動物細胞培養における増殖促進効果や経皮吸収による血管新生促進効果などを示した。つまり、機能性を保持したま
ま増殖因子を固定化保持しつつ、使用時にはその徐放性により有効性を発現できる G/O エマルションが開発できた。

依然として臨床現場では外科手術後の癒着形成が問題となっている。術後癒着とは、健常な状態では離れて存在する組織同士が術中に傷害された結果、組織間でのフィブリンブリッジの形成を介して組織同士が半永久的に癒合してしまう疾患である。癒着組織の形成は腸閉塞や不妊を引きおこす原因となるため、術後癒着をいかに防止するかが外科的に重要である。そのため、投与が簡便で、腹腔鏡手術時も使用可能な癒着防止材としてより良い in situ 架橋ハイドロゲルの開発が望まれている。
イオン架橋はゲル化時間の観点などから in situ 架橋ハイドロゲルを作製する上で有望な手段であるが、その架橋構造の制御が長年の課題となっている。本研
究では、多価金属イオンとの配位形成が可能なコハク酸キトサン(CH-Su)に着目した。キトサンはアミノ基を持つ多糖類であり、金属イオンキレート部位であるコハク酸の修飾が容易である。さらに、CH-Su は両性電解質であるため高い生体適合性を実現可能である。本研究では、多価金属イオン(Fe3+ , Al3+, Ca2+)でCH-Su ハイドロゲルを作製し、イオン種によるゲルの物性変化について検討を行うことで、新規癒着防止 in situ 架橋ハイドロゲルの開発を目指した。CH-Su
を Fe3+で架橋した CH-Su/Fe3+ゲルの場合、ゲルから遊離した Fe3+が高い細胞毒
性を引き起こした。Ca2+は CH-Su との錯形成定数が低く、溶解速度が非常に速くなった。その一方で、CH-Su を Al3+で架橋した CH-Su/Al3+ゲルは安定したキレート錯体を形成し、かつ細胞毒性が低いことが分かった。さらに CH-Su/Al3+ゲ
ルはラット盲腸擦過癒着モデルにおいて最も高い癒着防止効果を示し、そのうちの多くの個体において HE 染色像中に術後癒着の痕跡は認められなかった。
これらの結果から、CH-Su/Al3+ゲルは術後癒着防止用 in situ 架橋ハイドロゲルとして有用である可能性が示唆された。

Stable delivery of functional molecules by development of Gel-in-Oilnanoemulsion

Prevention of postoperative peritoneal adhesions using metal ion crosslinked N-succinyl chitosan hydrogels○Hiroyuki Ijima, Emiko Yamamoto, Yuji Omoso, Yusuke Sakai(Fac. Eng., Kyushu Univ.)○Kento Mitsuhashi2, Pan Qi2, Akira Takahasi1, Seiichi Ohta2, Taichi Ito2
(1Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo, 2Grad. Sch. Med., Univ. Tokyo)

Key words
factornanogel emulsion, drug delivery system, tissue engineering, growth

Key words

N-succinyl chitosan, ionic crosslinking, hydrogel, peritoneal adhesion

3Ga03

共培養マイクロデバイスを搭載した微小電極アレイチップによる iPS 由来運動神経・骨格筋細胞評価プロセスの
開発

3Ga05

過酸化チタンナノ粒子 (PAA -TiOx )の 細胞内傷害○古谷 太樹 1, 清水 一憲 1, 伊藤 卓治 2, 岡田 洋平 2, 本多 裕之 1,3（1名大院・工, 2愛知医大・神経内科, 3名大・予防早期医療創成セ）
honda@chembio.nagoya-u.ac.jp○小寺澤 翔太 1, 荻野 千秋 1, 西村 勇哉 2, 近藤 昭彦 2
（1神戸大院・工, 2神戸大院・科技イノベ）
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp【背景と目的】運動神経は活動電位の伝播に伴う神経伝達物質の分泌によって神経筋接合部を介して骨格筋にシグナルを伝え、シグナルを受け取った骨格筋もまた活動電位を発生し収縮する。多くの神経筋疾患ではこの機構に異常が生じる。微小電極アレイ（MEA）チップは培養細胞の活動電位を評価する有用なツールであるが、従来の共培養法では運動神経細胞と骨格筋細胞由来の活動電
位を分けて評価できなかった。そこで本研究では、MEA チップ上に搭載する神経軸索だけが通過できるマイクロ流路をもつ共培養デバイスを開発し、ヒト iPS
由来運動神経細胞と骨格筋細胞の活動電位をそれぞれ測定する共培養プロセスを構築した。
【方法と結果】開発したマイクロデバイスを MEA チップ上に搭載し、ヒト iPS
由来運動神経細胞・骨格筋細胞をそれぞれ培養区画に播種した。これらの区画
は軸索だけが通過可能なマイクロ流路で繋がっているため、細胞体を分離した状態での共培養が可能であり、区画底面の微小電極により、それぞれの細胞の活動電位測定が可能である。MEA チップ表面の処理条件や細胞播種濃度を種々検討し、長期の共培養が可能になった。実際に共培養を行い、神経特異的に刺激するグルタミン酸を加えたところ、添加量の増加に伴い両方の区画で高頻度に活動電位が発生した。次に、筋細胞特異的な活動電位阻害剤を加えると、筋区画の細胞のみ活動電位がほぼなくなった。これらの結果から、MEA チップを用いて、神経筋接合部を介して繋がった iPS 由来運動神経細胞と骨格筋細胞の活動電位をそれぞれ測定することに成功した。

本研究では shRNA を用いた RNA サイレンシグでは得られなかった SOD 1, SOD
2, GPx1 の欠損 株、及び新たな CAT 欠損株を作製するため、 CRISPR/Cas9 を用いたゲノム編集すい臓 がん細胞 BxPC-3 で行った。まず、欠損させる遺伝子中の PAM 配列 (NGG) 直前の標的部位 に対して、ワトソン -クリック塩基対形成をベースに guideR NA をデザインした。この guideRNA を、 Cas9 発現遺伝子を持つプラスミドに導入し、 BxPC-3 に形質転換させた。 細胞内に導入された
Cas9 ヌクレアーゼは guideRNA と複合体を形成する。この複合体が 標的配列へ
guideRNA によって導かれ、 Cas9 ヌクレアーゼがゲノム DNA に対して二重鎖切断 (DSBs )を引き起こす。ゲノム DNA は非相同末端連結もしくは相同組換え
修復によっ て修復される が、このとき過剰発現されている CRISPR/Cas9 によって繰り返し二重鎖切断 が導入されるこ とで修復エラーを引き起し、欠失や挿入などの変異を導入することができ る。本研究では、このとき CRISPR/Cas9 で引き起こされるフレームシトによって標的遺伝 子 SOD1, SOD2, GPx1, CAT のいず
れかをノックアウトした BxPC-3 株を作製した。

Development of coculture process of human iPSC-derived motor neurons
and myotubes on multielectrode array chips

Cell injuries investigation by PAA-TiOx○Taiki Furutani1, Kazunori Shimizu1, Takuji Ito2, Yohei Okada2, Hiroyuki Honda1,3(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2Dept. Neurol., Aichi Med. Univ., 3PME, Nagoya
Univ.)

Key words

microdevice, iPS cell, MEA chip, neuromuscular junction○Shota Koterasawa1, Chiaki Ogino1, Yuya Nishimura2, Akihiko Kondo2(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

radical, hydrogen peroxide, nano particle

266

3Ga06

超音波応答性とがん細胞標的性を有するナノ液滴を用いた超音波力学的がん細胞殺傷法

3Ga08○加藤 慎也 1, 仁宮 一章 2（1金沢大院・自科, 2金沢大・新学術）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp

UV 架橋コラーゲンゲル上で共培養したマウス神経幹細胞/前駆細胞と血管内皮細胞の観察○白岩 侑馬, 森 英樹, 原 正之
（阪府大院・理）hara@b.s.osakafu-u.ac.jp【目的】がん治療システムの１つに光増感剤（光照射により O2 を 1O2 に励起させる化合物）を用いた“光力学的がん細胞殺傷法”がある。しかし光の到達しない部位の治療に問題が残る。そこで、超音波の体内への進達性に着目し、本研究では、超音波応答性とがん細胞標的性を有するナノ液滴を用いた“超音波力学
的がん細胞殺傷法”の開発を行った。ナノ液滴としては、脂溶性の光増感剤を混合したリン脂質からなる一重膜のミセル構造で、その内部がパーフルオロカー
ボン（高濃度の O2 を溶存できる低沸点溶媒）であり、さらに、ミセル表面にがん細胞に結合するがん細胞標的ペプチドを修飾した約 100 nm サイズの液滴を作成した。本研究では、まず、本ナノ液滴の超音波応答性を評価し、次に、本ナノ液滴のがん細胞標的性を評価し、最後に、本ナノ液滴を用いた超音波力
学的がん細胞殺傷を実証した。
【方法および結果】作成したナノ液滴の超音波応答性を評価するため、ナノ液滴に暗所で超音波照射を行い、1O2 検出試薬を用いて 1O2 の発生量を評価した。その結果、ナノ液滴に超音波照射をした場合のみ高い 1O2 発生が見られた。次に、
本ナノ液滴のがん細胞標的性を評価するため、ヒト乳腺がん由来細胞株 (MCF-7)
もしくは正常ヒト皮膚線維芽細胞 (NHDF)に対して、脂溶性蛍光色素 DiO でラベルしたナノ液滴を添加・インキュベートし、蛍光顕微鏡およびフローサイト
メトリーで評価した。その結果、がん細胞 MCF-7 に対してのみナノ液滴の顕著な結合が見られた。最後に、本ナノ液滴を用いた超音波力学的がん細胞殺傷を評価するため、MCF-7 細胞に対してナノ液滴を結合させたうえで超音波を照射
し、細胞生存率を計測した。その結果、ナノ液滴と超音波照射を併用した条件
では、細胞生存率が大きく低下した。

【緒言】神経細胞やグリア細胞への多分化能と自己複製能をもつ神経幹細胞/前駆細胞(neural stem/progenitor cells：NSPC)は，無血清培地下で培養が可能であり，薬効・毒性試験などのための中枢神経モデルに応用されている。これに血管形成細胞を組み合わせて培養し，適切な形状に加工できれば更に有用なモデ
ルになると考えられる。これまでに我々はコラーゲンゲル表面の粘弾性の違い
が，NSPC の分化や細胞伸展を変化させることを報告した。本研究では，紫外線(UV)架橋によって粘弾性を変化させた I 型コラーゲンゲルを細胞の足場材料として用い，脳毛細血管内皮細胞株(bEnd.3)とマウス胎仔脳由来 NSPC(mNSPC)の共培養を試み，各々の細胞の接着や形態について調べた。
【方法】0.5％I 型コラーゲン溶液より作製した線維化コラーゲンゲルの表面にスリットが入ったフォトマスクを置き，UV 照射(254 nm)を施し，UV 架橋パター
ンコラーゲンゲルを作製した。ゲル上に bEnd.3 を播種，1 週間培養した後，
mNSPC を小さな細胞集塊の状態で播種し，更に 2 週間の共培養を行った。PI/
calcein-AM 染 色 で 共 培 養 1 ， 2 週 間 目 の 細 胞 の 生 死 判 別 を 行 っ た 。 ま た ，
GFAP，Nestin 等の抗体を用いた蛍光免疫染色によって共培養系中の各細胞の分布を確かめた。
【結果と考察】bEnd.3 はコラーゲンゲル上 UV 照射領域に多数接着したが，未照射領域に接着した細胞は少なかった。一方，mNSPC は未照射領域や bEnd.3が接着している UV 照射領域のいずれにも接着した。共培養 2 週間でも両細胞の生存が確認できた。Nestin や GFAP 陽性の細胞は UV 照射領域に接着した
bEnd.3 上や，UV 未照射のコラーゲンゲル上に小さな細胞集塊の状態で疎らに接着している様子が見られた。また，bEnd.3 上とコラーゲンゲル上との間でmNSPC の細胞集塊の形態に違いが見られた。このことは，今後の中枢神経モデルの設計に有用な情報になる。

Targeted sonodynamic cancer therapy using nanodroplets consisting ofphotosensitizer and perfluorocarbon

Observation of mouse neural stem/progenitor cells cultured with brain
capillary endothelial cells on UV-crosslinked collagen hydrogels○Shinya Kato1, Kazuaki Ninomiya2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Ints. Frontier Sci. Initiative,
Kanazawa Univ.)○Yuma Shiraiwa, Hideki Mori, Masayuki Hara
(Grad. Sch. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Key words

drug delivery system, nanodroplet, ultrasound

Key words

collagen, neural stem cell, endothelial cell, coculture

3Ga07

アルギン酸カルシウムとゼラチンの混合ハイドロゲルの
性質

3Ga09

中皮細胞選択的接着ペプチドを利用した癒着防止シートの開発

森 英樹, ○原 正之（阪大院・理）hara@b.s.osakafu-u.ac.jp○杉山 亜矢斗 1, 蟹江 慧 1, 宇都 甲一郎 2, 荏原 充宏 2, 緒方 藍歌 3,
成田 裕司 3, 加藤 竜司 1,4（1名大院・創薬, 2物材機構, 3名大院・医, 4名大・ナノライフシ
ステム研究所）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp【緒言】 ゼラチンはコラーゲン蛋白質サブユニットの変性物で、疎水性相互作
用や水素結合で互いに分子会合するので、低温で固まる熱可塑性のハイドロゲ
ルを作る。酸性多糖類のアルギン酸は粘稠な水溶液を作るが、カルシウムイオンの添加でイオン架橋してハイドロゲルを作る。どちらも安全性と生体適合性が高く、医療用具や食品素材として使われている。架橋原理の異なる 2 種の生体高分子の混合ゲルの物理的性質を調べた。
【実験方法】 先ず加熱により溶解した Type A ゼラチン水溶液を調製し、これにアルギン酸ナトリウム水溶液を加えて１％(w/v)アルギン酸と共に、2、4、8％(w/v)ゼラチン含む混合液を調製した。この液を冷却して円板状のゲルを作り、0.5MCaCl2 水溶液に浸漬してカルシウムイオンを 1 日間含侵させ、ゼラチンとアルギン酸カルシウムの混合ゲルを調製した（以下、2％ゲル、4％ゲル、8％ゲル）。
【結果と考察】 2％ゲル、4％ゲル、8％ゲルの 120℃15 分の加熱処理の前後で圧縮試験を行い、ゲルのヤング率（Young’s modulus）を求めた。加熱の前後どちらでも、ゼラチン濃度が高くなる程ヤング率の値も大きくなった。また 4％ゲ
ル、8％ゲルでは加熱処理で数値が低下し、ばらつきが増えた。ゼラチン濃度が高めのゲルでは、ゼラチン分子自身の会合で力学的な硬さが増すが、加熱処理
より溶解・溶出すると考えた。加熱処理により溶出するゼラチン蛋白質の定量を行うと 2％ゲル、4％ゲルでは差がないが、8％ゲルでは加熱によるゼラチンの溶出が見られた。上記の結果から得た結論としては、ゼラチン、アルギン酸のどちらの分子の会合も混合ゲルのヤング率などの物性に寄与するが、加熱によっては前者、カルシウムイオンの除去によっては後者の影響が減る事を確かめた。
【備考】 本研究の一部は公益財団法人日本食品化学研究振興財団の支援を受けて行われた。

心臓外科手術後の損傷治癒過程では、周囲組織における癒着が高い頻度で生じてしまうことが知られている。臓器周囲組織の癒着は、再手術の際には手術時間延長や臓器損傷の危険性を招き、臓器の機能不全を引き起こすリスクを有する。このような癒着現象は損傷部位の修復メカニズムの一端でもあるため、その回避には根本的な解決法が無い。現在、心臓外科における癒着防止には、
ePTFE 性の心膜シートなどが利用されているが、より良い術後組織の再生と癒着防止に向けての新しいバイオマテリアル開発が望まれている。
心臓は心膜と呼ばれる薄い膜で包まれており、中皮細胞がその表面を覆っている。中皮細胞は、臓器の動きを容易にするために滑りやすい面を作っているほか、炎症・免疫応答を調節し、フィブリンの分解や細胞の遊走も制御している。
このため、中皮細胞の再生や補填により癒着を軽減させる再生医療的コンセプ
トの癒着防止の研究事例が報告されつつある。
これまで我々の研究グループは、治療を促進させる細胞の接着や増殖を促進し、その他の細胞を相対的に退けるような機能性を有する細胞選択性ペプチドを複数単離しており、これを用いた体内留置型医療機器表面の機能化を試みて来ている。これら細胞選択性ペプチドは、数残基と短い配列でありながら相対的な細胞の「棲み分け」を促進する効果を有し、純度の高い分子の化学合成や定量的な表面修飾に有利だと考えている。本研究ではこのような細胞選択性ペプチ
ドで機能化した生体親和性フィルムによって生体内における癒着部位の現象を軽減できるのではないかと考え、このための中皮細胞選択的ペプチドの単離とバイオマテリアル表面への機能化法について検証を行ったのでこれを報告する。

Properties of hydrogel consisting of gelatin and calcium alginate

Development of adhesion barrier sheet functionalized with mesothelial cellselective adhesion peptides

Hideki Mori, ○Masayuki Hara
(Grad. Sch. Sci., Osaka Univ.)

Key words

gelatin, alginate, hydrogel, Young's modulus○Ayato Sugiyama1, Kei Kanie1, Koichiro Uto2, Mitsuhiro Ebara2, Aika Ogata3,
Yuji Narita3, Ryuji Kato1,4(1Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2Natl. Inst. Mat. Sci., 3Grad. Sch. Med.
Nagoya Univ., 4Inst. Nano-Life-Sci., Nagoya Univ.)

Key words

cell-selective peptides, Anti-adhesion, Mesothelial cell, Fibroblast

267

3Ga10

高濃度スペルミンによる体細胞から多能性幹細胞への脱
分化

3Ha01

○塩見 尚史（神戸女学院大・人間科学）
n-shiomi@mail.kobe-c.ac.jp

Aspergillus luchuensis におけるフェノール酸脱炭酸酵素
遺伝子破壊による 4-VG 生成への影響○眞榮田 麻友美 1,2, 本底 麻綸 2, 渡嘉敷 建孝 3, 後藤 正利 1,4,
水谷 治 1,2, 上地 敬子 2, 平良 東紀 1,2（1鹿児島大院・連農, 2琉球大・農, 3石川種麹店, 4佐賀大・農）tokey@agr.u-ryukyu.ac.jp【目的】 がん幹細胞（CSC ｓ）はがん再発の要因になっているが、がん組織がCSCs を生み出すメカニズムについてはほとんどわかっていない。そこで、本研究では、がん細胞がポリアミンを高濃度に産生することに着目し、高濃度のポリアミンがこの脱分化を誘導するのではないかと考えて研究を行った。
【方法及び結果】 高濃度ポリアミンの影響を明確にするために、がん細胞ではなく、ヒト肺由来の正常線維芽細胞 TIG-1-20 を用いた。TIG-1-20 細胞を 40μMのスペルミンを含有する MEM 培地で培養した後、Cellatis DEF-CSTM500 培地に変えることにより、スペルミン誘導幹細胞（PIS 細胞）の spe-1 株を得た。その細胞では、SOX2 や OCT3/4 遺伝子が誘導され、多能性幹細胞のマーカーを発現したが、それと同時に、高濃度のスペルミンによりアポトーシスが誘導され、Rho-Rock 経路が活性化された。一般にがん細胞はアポトーシス阻害能を有する。そこで、スペルミン、アポトーシス阻害剤、Rock 阻害剤を添加した培地
で TIG-1-20 細胞を培養した。その結果、得られた PIS 細胞（PIS 細胞 spe-2 株）
は、アポトーシスは起こっておらず、多能性幹細胞のマーカーを発現し、外肺葉、中胚葉、内胚葉への分化が可能であり、心筋細胞、褐色脂肪細胞、前期神経細胞に分化可能であった。以上の結果から、高濃度スペルミンは体細胞を多能性幹細胞に脱分化する効果があり、がん細胞はこの効果を利用すると同時にアポトーシス作用を回避することで、CSCs や脱分化細胞を生みだしていると考えられる。また、体細胞を多能性幹細胞にする PIS 細胞(spe-2 株)作製法は、簡便且つ高効率であり、今後再生医療への利用が可能かもしれない。

泡盛古酒の特徴香バニリンは，醸造中に原料米中のフェルラ酸（FA）の脱炭酸反応により生成された 4-ビニルグアヤコール（4-VG）から，貯蔵中に非酵素的酸化によって生成される。醸造中の FA の脱炭酸反応は酵母や乳酸菌等の代謝もしくは，蒸留時の酸と熱によるものと考えられてきた。Saccharomyces cerevisiae
では phenylacrylic acid decarboxylase（PAD1）と ferulic acid decarboxylase（FDC1）の 2 つの酵素が共同して FA から 4-VG を生成することが報告されている。
Aspergillus luchuensis のゲノム上には，S. cerevisiae の pad1 および fdc1 と相同性を有する遺伝子と，これとは全く相同性の無い細菌類および Candida 属のphenolic acid decarboxylase（PAD）と相同性を有する pad 遺伝子が存在する。
これまでに，我々は A. luchuensis mut. kawachii の pad1 破壊株が親株と同様のFA から 4-VG への変換能（FAD 活性）を有する事，A. luchuensis var. awamori
ISH1 株（以下，ISH1 株）の pad 遺伝子（alpad）を大腸菌で発現させた AlPADが十分な FAD 活性を示す事，ウエスタンブロッティングにより定量した麹中のAlPAD 量とモロミおよび蒸留液中の 4-VG 量に高い相関がある事を示した。本
研究では，AlPAD の 4-VG 生成への寄与を明確にするために alpad 破壊株を作成し，静止菌体反応による FAD 活性および醸造中の 4-VG 生成量を野生株と比較した。
alpad 破壊株の作製は ISH1 株を親株として，アグロバクテリウム法で行った。
得られた alpad 破壊株を用いて終濃度 0.5 mM FA または 1%米ぬかを添加した最少培地で培養した菌体を用いて静止菌体反応を行った。その結果， alpad 破壊
株では FAD 活性は検出されなかった。このことから，A. luchuensis における
FAD 活性の本体は AlPAD であることが分かった。今後，alpad 破壊株を用いて醸造を行い，モロミおよび蒸留液中の 4-VG 量を親株と比較する予定である。

High Concentration of spermine induces the dedifferentiation of somatic
cells into pluripotent stem cells

Effect of gene disruption of phenolic acid decarboxylase on 4-VG productionin Aspergillus luchuensis○Naofumi Shiomi(Dept. Hum. Sci., Kobe Coll.)○Mayumi Maeda1,2, Marin Motosoko2, Tatsunori Tokashiki3, Masatoshi Goto1,4,
Osamu Mizutani1,2, Keiko Uechi2, Toki Taira1,2(1United Grad. Sch. Agric. Sci., Kagoshima Univ., 2Fac. Agric., Univ. Ryukyus,
3
Ishikawatanekojiten, 4Fac. Agric., Saga Univ.)

Key words

polyamine, stem cell

Key words
Aspergillus luchuensis, phenolic acid decarboxylase, awamori, 4vinylguaiacol

3Ga11

新規イミダゾリウム系カチオン性ラジカル重合開始剤による抗菌性樹脂の応用可能性

3Ha02○辻 俊一 1, 前田 知貴 2,3, 實廣 亜希子 1, 此枝 優希 1, 小泉 英樹 1,
堀田 篤 2（1キリンHD・基盤研, 2慶大・理工・機械工, 3茨大・F応用原子科研セ）Toshikazu_2_Tsuji@kirin.co.jp

麹菌 Aspergillus oryzae における新規ピリチアミン耐性
マーカー遺伝子 thiI の同定とゲノム編集への応用○戸所 健彦, 坂東 弘樹, 小高 敦史, 堤 浩子, 秦 洋二, 石田 博樹（月桂冠・総研）
todokoro@gekkeikan.co.jp【緒言】これまでにカチオン性ナノ粒子・ゲルの創成を目的に、4 級アンモニウ
ム構造を有する新規重合開始剤 ADIP（イミダゾリウム系カチオン性アゾ化合物）を合成した(Uchiyama et al. , Angew. Chem. Int. Ed. , 2018, 57, 5413)。ADIP に備わる生物学的機能を新たに探索した結果、ADIP で合成したひも状ポリスチ
レン（PS）から成る樹脂の抗菌機能が分かってきたので、ここに報告する。
【方法】(1) PS フィルムの作製
ADIP を用いた懸濁重合により、粉状のカチオン性 PS を合成した。合成したカ
チオン性 PS 粉体、もしくは市販の PS (Sigma Aldrich, #430102)とカチオン性 PS
粉体とを等重量混合した粉体を用意し、熱プレス成形（180℃、4 MPa）し、2種類の厚さ約 0.1mm のカチオン性 PS フィルムを得た。
(2)PS フィルムの抗菌性試験
抗菌試験は JIS Z 2801:2000 抗菌加工製品―抗菌性試験方法に準じた。菌種は黄色ぶどう球菌(Staphylococcus aureus, NBRC 12732)を用いた。
【結果・考察】市販 PS と混合して作製したカチオン性 PS フィルムの平板ゼータ電位は 7.0 mV
で、市販の PS のみから成るフィルムのゼータ電位 -23.3 mV と比較して有意に表面が正に帯電していた。重合開始剤を ADIP にすることで材料物性に変化が出ることを見出した。いずれのカチオン性 PS フィルムも、黄色ぶどう球菌に対する強い抗菌活性を示し、特にカチオン性 PS のみから成るフィルムは、黄色ぶどう球菌を 0.01%以下の数に低減させる効果を示した。比較試験として、特定の条件でカチオン性を示す市販の 1〜3 級アミン系アゾ重合開始剤で PS を合成し、熱プレス成形によりフィルムを作製した。これらフィルムは全く抗菌性を示さず、ADIP で合成した PS から成るフィルムでのみ抗菌性が発現することも明らかとなった。今後は、抗菌性 PS 材料としての活用を目指して、安全性や細胞培養への影響も精査していく予定である。

【背景・目的】麹菌 Aspergillus oryzae は伝統的発酵産業や工業的酵素生産に用いられる糸状菌であり、その産業上の重要性から広く研究・利用されている。遺伝子の機能解析や有用形質の獲得には変異導入がしばしば用いられるが、その方法は自然変異や遺伝子組み換え、近年はゲノム編集と多岐にわたる。いずれの方法も目的変異株は一般的に薬剤耐性を指標に選抜されるが、A. oryzae が多種の薬剤に耐性を示すことから、使用できる薬剤は限られている。その中でピリチアミン（PT）耐性選抜は A. oryzae において 0.1 mg/L と低濃度で機能する
ため安全面・環境面で優れているが、既知のマーカー遺伝子（thiA）による PT
耐性獲得はプロモーター領域の限られた範囲への変異導入が必要なため、ゲノム編集への利用は困難であった。そこで本研究では、麹菌 A. oryzae においてPT 耐性に寄与する新規マーカー遺伝子の同定とゲノム編集への応用を試みた。
【方法・結果】A. oryzae RIB40 の UV 変異株から、thiA に変異を持たない PT 耐性株を得た。全ゲノム解析の結果、アミノ酸トランスポーターをコードすると推定される遺伝子にアミノ酸置換を伴う変異が確認され、機能推定のため BlastP
検索を行ったところ Schizosaccharomyces pombe のチアミントランスポーター（Thi9）と約 50%の相同性を示した。この遺伝子（thiI とする）の変異が PT 耐性に寄与するのかを確認するため、thiI をターゲットとしたゲノム編集により
thiI の機能欠損株（ΔthiI）を取得した。ΔthiI は PT 耐性を示すことが確認された一方で、最小培地（Czapek-dox）において栄養要求性を示さなかった。これ
らの形質から、thiI は麹菌においてゲノム編集に利用できる有望な新規マーカー
遺伝子であることが示唆された。

Antimicrobial polymers synthesized using a novel cationic radical initiator
containing imidazolium group.

Identification of a novel pyrithiamine resistance marker gene thiI in
Aspergillus oryzae and its application for genome editing○Toshikazu Tsuji1, Tomoki Maeda2,3, Akiko Jitsuhiro1, Yuki Konoeda1,
Hideki Koizumi1, Atsushi Hotta2(1Cent. Lab. Key Tech., KIRIN HD Co. Ltd., 2Dept. Mech. Eng., Keio Univ.,, 3Front.
Res. Cent. Appl. Atomic. Sci., Ibaraki Univ.)

Key words
aureusantibacterial, polystyrene, cationic radical initiator, Staphylococcus○Takehiko Todokoro, Hiroki Bando, Atsushi Kotaka, Hiroko Tsutsumi, Yoji Hata,
Hiroki Ishida(Res. Inst., Gekkeikan Sake Co., Ltd.)Key words
marker gene

Aspergillus oryzae, genome editing, pyrithiamine resistance, selection

268

3Ha03

Mapping hazekomi on rice koji grains using βglucuronidase expressing Aspergillus oryzae and mass
spectrometry imaging

3Ha05

白麹菌 Aspergillus kawachii における laeA ホモログ遺伝
子の機能解析

○門岡 千尋 1, 池田 萌 2, 森 一樹 3, 奥津 果優 2, 吉﨑 由美子 1,2,
髙峯 和則 1,2, 後藤 正利 1,4, 玉置 尚徳 1,2, 二神 泰基 1,2（1鹿児島大院・連農, 2鹿児島大・農, 3鹿児島高専・専攻科, 4佐賀大・農）futagami@chem.agri.kagoshima-u.ac.jp○Adinda Putri Wisman1, Yoshihiro Tamada2, Shuji Hirohata2,
Katsuya Gomi3, Eiichiro Fukusaki1, Shuichi Shimma1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Hakutsuru Sake Brewing Co., Ltd.,
3
Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)
sshimma@bio.eng.osaka-u.ac.jp
Rice koji, which is made by inoculating Aspergillus oryzae on steamed rice, is one of
the most important materials for Japanese sake brewing. In sake brewing process, thequality of rice koji is mainly evaluated by experienced sake brewers based on visualinspection of the haze, which is defined by the extent of the spread of the fungal
hyphae on/into the rice grains. There is rising interest in gaining insight of the factorsthat affect the quality of rice koji to develop a more sophisticated brewing control
without skilled veteran intelligence. Several studies have focused on haze formationand enzymatic production during rice koji production. However, there are limited
analytical methods available to monitor hyphal growth on a solid surface.
Here we show that a β-glucuronidase (GUS) expressing strain of Aspergillus oryzae isutilized to visualize and map fungal growth on rice koji grains. A new GUS staining
method by spraying was developed in order to obtain best representation of themycelial distribution. Our developed method was able to produce clear indigo color ona thin section of rice koji. Furthermore, indigo color observations revealed that A.
oryzae hyphae penetrated the steamed rice grain and reached the center of rice in thelast stage (43h) of rice koji making process. Additionally, mass spectrometry imaging(MSI) of glucose demonstrates that the area of mycelial penetration is directly
correlated with the distribution of glucose.

【目的】焼酎製造に用いられる白麹菌 Aspergillus kawachii は、糖化酵素に加えてクエン酸を高生産する能力をもつ。Aspergillus 属糸状菌においてメチルトラン
スフェラーゼ LaeA は、二次代謝生産や分化の制御因子として研究されてきた。
本研究は、白麹菌において laeA のホモログ遺伝子とクエン酸生産との関連を解明することを目的とした。
【方法・結果】モデル糸状菌 Aspergillus nidulans の laeA をクエリとして、白麹菌のゲノムに laeA、laeA2、および laeA3 遺伝子を見出した。まず、白麹菌において各遺伝子の破壊株を構築し、CAP 液体培地におけるクエン酸生産を測定した。その結果、laeA 破壊株のクエン酸生産量はコントロール株の約 0.04 倍に低下した。また、laeA 破壊株に laeA を相補した結果、クエン酸生産能が回復した。一方、laeA2 破壊株と laeA3 破壊株のクエン酸生産量は、コントロール株と有意な差は見られなかった。これらの結果から、白麹菌において laeA がクエン酸生産に関与することが示唆された。LaeA はヒストンのメチル化レベルを制御することでグローバルに遺伝子発現を制御すると考えられている。そこで、laeA
破壊による遺伝子発現変動を調べるために、CAP 液体培地で培養したコント
ロール株と laeA 破壊株から RNA を抽出し、cap analysis gene expression (CAGE)-seq 解析を行った。その結果、laeA 破壊株は、コントロール株と比較して、590
遺伝子の発現が上昇、658 遺伝子の発現が減少したことが示唆された。発現減
少遺伝子の中には、クエン酸合成酵素遺伝子や推定クエン酸輸送体遺伝子が含まれており、クエン酸低生産の原因であると考えられた。

Mapping hazekomi on rice koji grains using β-glucuronidase expressing
Aspergillus oryzae and mass spectrometry imaging

Functinal analysis of laeA homologus genes in the white koji fungus,
Aspergillus kawachii○Adinda Putri Wisman1, Yoshihiro Tamada2, Shuji Hirohata2, Katsuya Gomi3,
Eiichiro Fukusaki1, Shuichi Shimma1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Hakutsuru Sake Brewing Co., Ltd., 3Grad. Sch.
Agric. Sci., Tohoku Univ.)

Key words

rice koji, hazekomi, GUS, mass spectrometry imaging

3Ha04

黄麹菌が生産する難消化性澱粉分分解酵素の探索およ
びその応用○Chihiro Kadooka1, Moe Ikeda2, Kazuki Mori3, Kayu Okutsu2,
Yumiko Yoshizaki1,2, Kazunori Takamine1,2, Masatoshi Goto1,4, Hisanori Tamaki1,2,
Taiki Futagami1,2(1United Grad. Sch. Agric. Sci., Kagoshima Univ., 2Fac. Agric., Kagoshima Univ.,
3Nat. Inst. Tech. Kagoshima Col., 4Fac. Agric., Saga Univ.)
Key words
Aspergillus kawachii, methyltransferase, citric acid, transcriptome

3Ha06○伊藤 俊彦, 臼井 俊晴, 藤田 直子, 橋爪 克己（秋田県立大・生資科）
toito@akita-pu.ac.jp

白麹菌 Aspergillus kawachii における α-アミラーゼ
AmyB の機能解析○山口 正晃 1, 門岡 千尋 2, 奥津 果優 1, 吉﨑 由美子 1,2,
髙峯 和則 1,2, 後藤 正利 1,3, 玉置 尚徳 1,2, 二神 泰基 1,2（1鹿児島大・農, 2鹿児島大院・連農, 3佐賀大・農）futagami@chem.agri.kagoshima-u.ac.jp[目的]澱粉合成酵素及び澱粉分枝酵素のアイソザイム SSIIIa、BEIIb の二重欠損変異体
米（以下#4019 と表記）は、アミロース含量 46%の超高アミロース米であり、難消化性を示す。演者らはこれまでに＃4019 を基質とした難消化性澱粉分解酵
素活性測定法を構築した。また、#4019 を麹米とし、清酒麹菌 (Aspergillus
oryzae) で作成した麹に含まれる α-グルコシダーゼが難消化性澱粉分解酵素活性に関与していることを推察した。本研究では#4019 の後継品種である A6BC2 及び酒造好適米 5 品種を麹米に用いて各種酵素活性と難消化性澱粉分解活性を比較し、α-グルコシダーゼの関与を確認した。また、A6BC2 麹の優れた消化能による酒粕の加工法を模索するために山田錦麹を対照とした酒粕消化試験を行った。
[方法]
50%精米した吟の精, 日本晴, A6BC2, 山田錦, 美山錦および秋田酒こまちを原料米とし、清酒用麹菌 (No.5 : 秋田今野商店) を用いて製麴した。得られた麹から0.5% NaCl を含む酢酸緩衝液で酵素を抽出透析し、澱粉分解に関与する各種酵
素活性を測定した。また、60%精米した原料米 A6BC2 および山田錦と清酒用麹菌で作成した麹を用いて 15%塩水中にて 30Co, 96 hr の条件で酒粕消化試験を行い、得られた上澄みの oBx 糖度を測定した。
[結果]
6 品種の澱粉分解関連酵素活性と難消化性澱粉分解酵素活性を比較したとこ
ろ、全ての品種において α-グルコシダーゼ活性と当該酵素活性の間に高い相関が認められた。また、A6BC2 麹および山田錦麹を用いた酒粕消化試験では、
A6BC2 麹には、山田錦麹と比較して明らかな oBx の上昇が認められた。

【目的】焼酎製造に用いられる白麹菌は、α-アミラーゼやグルコアミラーゼ等を大量に分泌生産する性質をもち、原料である米や大麦、サツマイモに含まれるデンプンを単糖レベルに分解する役割がある。白麹菌の分泌型 α-アミラーゼとして、中性 α-アミラーゼ（AmyA）と耐酸性 α-アミラーゼ（AsaA）の 2 つが報告されているが、白麹菌のゲノムにはもう 1 つ分泌型 α-アミラーゼをコードする amyB 遺伝子が存在する。しかし、amyB の発現量は低いため、これまでにその α-アミラーゼ活性は評価されていない。本研究は、AmyB の酵素学的諸性質と生理機能を解析することを目的として行った。
【方法・結果】まず、白麹菌において amyA と asaA の二重破壊株と amyA、asaA、
amyB の三重破壊株を構築した。デンプンを炭素源とした培地において、ΔamyA
ΔasaA 株と ΔamyA ΔasaA ΔamyB 株の生育に顕著な違いは見られなかった。しかし、各株の培養上清の α-アミラーゼ活性を測定した結果、ΔamyA ΔasaA 株と比較して ΔamyA ΔasaA ΔamyB 株は α-アミラーゼ活性が低下したことから、AmyB
は白麹菌の総アミラーゼ活性に寄与していることが示唆された。次に、ΔamyA
ΔasaA 株において、amyA プロモターの制御下で amyB を発現する株を構築した。リアルタイム RT-PCR によって ΔamyA ΔasaA PamyA-amyB 株においてコン
トロール株と比べて amyB が約 20 倍高発現したことを確認した。また、培養上
清を Native-PAGE に供し、ヨウ素-デンプン反応によるデンプン分解酵素の活性染色を行った。その結果、ΔamyA ΔasaA PamyA-amyB 株において、AmyB 由来と推定されるバンドが出現した。本菌株を用いて AmyB を精製し、酵素学的諸性質の解析に取り組む予定である。

Investigation resistant starch digestive enzyme from Aspergillus oryzae anddevelopment of its application.

Functional characterization of α-amylase AmyB in the white koji fungus
Aspergillus kawachii.

○Toshihiko Ito, Usui Toshiharu, Naoko Fujita, Katsumi Hashizume(Faculty of Bioresouce sci., Akita Pref. Univ.)

Key words

enzyme, resistant starch○Masaaki Yamaguchi1, Chihiro Kadooka2, Kayu Okutsu1, Yumiko Yoshizaki1,2,
Kazunori Takamine1,2, Masatoshi Goto1,3, Hisanori Tamaki1,2, Taiki Futagami1,2(1Fac. Agric., Kagoshima Univ., 2United Grad. Sch. Agric. Sci., Kagoshima Univ.,
3Fac. Agric., Saga Univ.)

Key words

Aspergillus kawachii, shochu, alpha-amylase, amyB

269

3Ha07

醤油乳酸菌 Tetragenococcus halophilus の凝集機構の
解析

3Ha09

○白川 大地, 脇中 琢良, 渡部 潤
（ヤマサ醤油・製造本部）
j_watanabe@yamasa.com

ビール類醸造時に亜鉛濃度が酵母発酵に及ぼす影響の解析○沓掛 登志子, 高橋 沙織, 伊藤 一恵, 稲留 弘乃（キリンホールディングス・酒類研）
Hironori_Inadome@kirin.co.jp【背景】醤油乳酸菌は諸味中で乳酸を生成し，醤油の香味形成に重要な役割を果たしている．醤油乳酸菌には凝集性を有する株（凝集性株）と有しない株（非凝集性株）が存在することが古くから知られている．非凝集性株は醤油諸味の
圧搾時に生揚げ醤油に移行し濁質の原因となる．この濁質は，濾過工程の負荷を大きくすることから，醤油の発酵スターターとしては，圧搾時に生揚げ醤油に移行しない凝集性株が望ましい．しかし，醤油乳酸菌の凝集機構は明らかになっておらず，凝集性株の効率的な取得や育種の障害となっていた．
【方法】凝集性の YA197 株から，自然変異により非凝集性となった変異株を単離した．イルミナ社の Nova Seq を用い YA197 株と変異株から各約 1 Gb のデータを取得した．リードを Platanus でアセンブルし，得られたスキャホールドにリードをマッピングすることで変異点を同定した．
【結果】YA197 株から得られたリードをアセンブルした結果，227 本のスキャ
ホールドが取得された．スキャホールドの N50 は 45.5 Kb，総延長は 2.38 Mb
であり，分断されてはいるものの醤油乳酸菌ゲノムのほぼ全長をカバーする配列が得られたと考えられた．
「YA197 株のスキャホールドに変異株のリードをマッピングしてコールされた変異」から「YA197 株のスキャホールドに YA197
株のリードをマッピングしてコールされた変異」を差し引いた結果，42 ヶ所の変異候補が抽出された．これらについてマッピングの状況を目視で確認したところ，変異が確認できたのは 1 ヶ所のみであった．この変異は ORF 上の 168 bpの欠損であり，56 アミノ酸残基の欠損を引き起こしていると考えられた．現在，この変異と凝集性との関連について更なる解析を行っている．

【背景と目的】
ビール類の醸造において、発酵助剤である硫酸亜鉛の添加は発酵を促進させる
一方で pH の低下や香味の変化など好ましくない影響を及ぼすこともある。このため、亜鉛が発酵中の酵母にもたらす現象の解明を目的として、網羅的な遺伝子発現解析を行った。

Analysis of aggregation mechanism in Tetragenococcus halophilus

Analysis of the effect of zinc concentration on yeast fermentation duringbeer brewing.

○Daichi Shirakawa, Takura Wakinaka, Jun Watanabe(Yamasa Corp.)【方法】
酵母発酵における亜鉛の影響を詳細に調べる目的で、亜鉛濃度が異なる合成培地を用いた発酵試験を行った。発酵過程で経時的に酵母を回収し、RNA seq による網羅的な遺伝子発現解析を行った。続いて、亜鉛濃度が異なる麦汁を発酵させた発酵タンク（試験醸造レベル）から回収した酵母についても遺伝子発現解析を行い、合成培地での結果と比較を行った。
【結果と考察】麦汁中の亜鉛濃度の違いによって亜鉛トランスポーター、ADH、ジンクフィン
ガー、抗酸化酵素など亜鉛関連タンパクの遺伝子に発現変動が起こることが示された。また、鉄トランスポーターなど鉄関連タンパクについても遺伝子の発現変動がみられ、細胞内代謝に影響を与えている可能性が示唆された。

○Toshiko Kutsukake, Saori Takahashi, Kazue Ito, Hironori Inadome(Kirin Holdings. Res. Laboratories for Alcoholic Beverage Technol.)Key words

soy sauce, Tetragenococcus halophilus, aggregation

Key words

gene expression analysis, RNA seq, zinc, beer brewing

3Ha08

醤油酵母 Zygosaccharomyces rouxii の産膜制御機構の
解析

3Ha10

キシロースを資化する Saccharomyces cerevisiae の非組換え育種の試み○茂木 亮介, 渡部 潤
（ヤマサ醤油・製造本部）
j_watanabe@yamasa.com○平松 孝太郎 1, 頓名 洋 1, 今野 紗希 2, 東原 成美 2, 山崎 思乃 2,
片倉 啓雄 2
（1関西大院・理工, 2関西大・化生工）
katakura@kansai-u.ac.jp【背景】醤油酵母 Zygosaccharomyces rouxii の特定の株は醤油諸味表面に白い皮膜を形成することが知られており，この現象を産膜と呼ぶ．皮膜状に生育した
酵母は，不快臭成分であるイソ酪酸やイソ吉草酸を生産し，醤油の品質を低下させるため，産膜の防止は醤油醸造において重要である．Z. rouxii NBRC 110957
株による産膜には FLO11D 遺伝子が必須であることが明らかになっている．
Flo11D は Flo11 ドメインを有しており，Saccharomyces cerevisiae において，Flo11
ドメインは invasive growth やバイオフィルム形成などに寄与していることが知られている．NBRC 110957 株による産膜は，グルコース欠乏下での高浸透圧ス
トレスによって FLO11D 発現が誘導されることで引き起こされる．しかし，
FLO11D の発現制御機構の詳細は明らかになっていない．
【結果と考察】S. cerevisiae における FLO11 発現制御は詳しく調べられており，
MAP キナーゼ経路や cAMP-PKA 経路などが関与していることが明らかになっている．NBRC 110957 株の FLO11D 発現制御においても類似の機構が存在している可能性が考えられたため，NBRC 110957 株において，それらの経路に関与する遺伝子の破壊株を作製した．遺伝子破壊株を食塩存在下で生育させたとこ
ろ，cAMP-PKA 経路に関与する転写因子をコードする SFL1 遺伝子が，産膜に重要であることが明らかになった．SFL1 遺伝子の欠損は食塩存在下での FLO11D
転写量を有意に低下させたことから，Sfl1 が FLO11D 発現を介した産膜に重要な役割を果たしていることが考えられた．現在は，SFL1 遺伝子と FLO11D 発現制御機構の関係について，詳細な解析を進めている．

【背景と目的】
化石燃料に代わるバイオエタノールは、食糧と競合しないリグノセルロース系
バイオマスを原料とすることが求められている。リグノセルロースには五炭糖が 2〜4 割含まれ、特にキシロースの発酵の可否はエタノール収率に大きく影響する。酵母のキシロース発酵にはトランスポーター、および xylose reductase(XR)、xylitol dehydrogenase (XDH)、xylulokinase (XK)が必要である。エタノール
発酵に用いられる S. cerevisiae は、XR、XDH 活性をもつ株は稀で、多くは XK
活性が十分ではなく、キシローストランスポーター活性には不明なところが多い。一方、キシロース発酵性微生物の遺伝子を導入した組換え酵母は、実用化の際に拡散防止措置が容易ではない。そこで、キシロース資化性 S. cerevisiaeの非組換え育種を試みた。
【方法】
ガラクトース 2%を含む YP 培地で培養した菌体にキシロースを添加し、30℃で30 分インキュベートして取込ませた。菌体を洗浄後、水に懸濁し 37℃で 1 時間振盪して取込まれたキシロースを抽出して定量し、取込みの初速度を細胞数で除して取込み活性を求めた。菌体を破砕して粗酵素を調製し、xylose、
xylitol、xylulose を基質として NADPH(NADH)の酸化還元による吸光度変化を測定し、酵素活性を算出した。
【結果と考察】研究室保有の 150 株をスクリーニングした結果、キシロース発酵性酵母 Pichia
stipitis NBRC 10007 株の約 2 分の 1 の XDH 比活性、3 分の 1 の XK 比活性をもつ株を得た。また、良好にエタノール発酵するパン酵母のグルコース取込み活性の、約 1 割のキシロース取込み活性をもつ株を数株得た。XR 比活性は何れの株も NBRC 10007 株の 1/100 以下であった。今後、交雑によって XR 以外の活性が高い 1 倍体を育種し、変異処理してキシロースを単一炭素源とする培地
で XR 比活性が向上した株を得る。

An analysis of flor formation by Zygosaccharomyces rouxii

Non-recombinant breeding of xylose-assimilating Saccharomyces cerevisiae○Ryosuke Mogi, Jun Watanabe(Yamasa Corp.)

Key words

soy sauce, Zygosaccharomyces rouxii, flor

○Kotaro Hiramatsu1, Hiroshi Tonna1, Saki Konno2, Narumi Higashihara2,
Shino Yamasaki-Yashiki2, Yoshio Katakura2(1Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ., 2Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ.)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, xylose transporter, bioethanol

270

3Ha11

レアメーティングにより造成した酵母の耐熱性とエタ
ノール耐性の評価

3Ia02○高橋 葵 1, 海道 直生 1, 山崎 思乃 2, 片倉 啓雄 2
（1関西大院・理工, 2関西大・化生工）
katakura@kansai-u.ac.jp

データ・マイニングを駆使した糸状菌由来転写因子の結合配列環境と発現応答の関連性の解析○岡 大椰 1, 兒島 孝明 1, 井原 邦夫 2, 小林 哲夫 1, 中野 秀雄 1
（1名大院・生命農学, 2名大・遺伝子解析施設）
kojimat@nuagr1.agr.nagoya-u.ac.jp【緒言】バイオエタノール生産に用いる微生物には様々な性質が求められるが、それらの性質を全て持つ微生物はまだ造成・発見されていない。遺伝子組換え生物には拡散防止措置が必要なため、本研究室では組換えによらない
Saccharomyces cerevisiae の育種を目指している。昨年度までに、RIM15 遺伝子をホモで欠失しエタノール耐性をもつ 2 倍体の協会 6 号酵母（K6）に、耐熱性の PS28 から得た 1 倍体を 2 回レアメーティングして 4 倍体を造成した。減数分裂を伴う胞子形成により 2 倍体を得ることで、RIM15 遺伝子をホモで欠失し、かつ耐熱性を持つ株が含まれていることを示した。また、4 倍体から得られた胞子発芽株について、RIM15 遺伝子をホモで欠失した株が速やかに増殖する条件で培養し、エタノール耐性株の濃縮をした。本研究では、胞子発芽株のエタノール耐性と耐熱性を評価する方法を確立するとともに、2 つの耐性を併せ持つ株を選抜する方法について検討した。
【方法と結果】20% glucose を含む YPD20 培地に植菌し、30℃で静置培養した。
Glucose が枯渇する前に 50%グルコース溶液を 1/4 容追加投入し、濁度とエタ
ノール濃度から比生産速度を求めた。その結果、エタノール濃度が 50 g/L 以上の区間において、エタノール耐性を持つ K6 は耐性を持たない PS28 に比べて高い比生産速度を示し、この条件でエタノール耐性を評価できると分かった。また、10% glucose を含む YPD10 培地に初期菌体濃度を統一して植菌し、42℃で静置培養した。22 時間ごとに遠心処理により菌体を回収し、新しい同培地に懸濁して発酵を繰り返した。3 回目の繰り返し発酵において、耐熱性株と非耐熱性株の比生産速度に顕著な差が見られた。これをふまえ、エタノール耐性株を濃縮した培養液に対して 42℃での繰り返し発酵を 5 回行い、耐熱性株を濃縮し、単離した株の評価をしている。

【目的】 当研究グループではこれまで Genomic SELEX-Seq (gSELEX-Seq)と発現変動解析によって得られる情報を統合することで、転写因子によって直接的に発現制御される遺伝子をゲノムワイドで同定してきた。この過程で、上流領域に結合 DNA モチーフを保有するにも関わらず、標的転写因子の高発現に応答しない遺伝子が多数検出された。このことから、転写因子-DNA 間相互作用には、DNA 配列に加え、未知の要因が関与していることが示唆された。そこで本研究では、先行研究によって得られた Aspergillus oryzae におけるキシラン・セ
ルロースやペントース代謝などに関与する転写因子 AoXlnR の転写制御情報を基に、データ・マイニングを用いて各遺伝子のモチーフ付近の配列を比較し、これらの配列環境が転写制御に与える影響を網羅的に解析することを目的とした。
【方法・結果】 gSELEX-Seq とマイクロアレイ解析によって得られた AoXlnR 転写制御に関わる遺伝子に対して、データ・マイニングを行なった。具体的には、
マイクロアレイ解析によって得られた発現変動遺伝子のプロモーターにおけるAoXlnR 結合モチーフと発現変動レベルとの相関解析を行い、プロモーター中に 5’-GGCTAA-3’、5’-GGCTGA-3’が共在することで、下流遺伝子の発現がAoXlnR 高発現依存的に促進されること、またこの影響は２つのモチーフ間の距離と関連があることを数理的に示した。さらに、DNA 構造に関連するパラメーターを用いて遺伝子プロモーター中の AoXlnR 結合 DNA モチーフ近傍の配列構造の解析を行ったところ、AoXlnR による実際の発現制御の有無によってその DNA 構造が大きく異なることが明らかとなった。

Screening and evaluation of yeast tolerant for heat and ethanol breeded byrare-mating

Analysis of the relationship between a filamentous fungal transcription
factor binding site environment and the expression responses of regulated
genes by using data mining.

○Aoi Takahashi1, Naoki Kaido1, Shino Yamasaki-Yashiki2, Yoshio Katakura2(1Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ., 2Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ.)○Hiroya Oka1, Takaaki Kojima1, Kunio Ihara2, Tetsuo Kobayashi1, Hideo Nakano1(1Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2Center for Gene Res, Nagoya Univ)

Key words
tolerance

Saccharomyces cerevisiae, rare-mating, heat tolerance, ethanol

Key words

Aspergillus oryzae, bioinformatics, transcriptional regulation, promoter

3Ia01

基質酵素反応予測のための 機械学習に基づく予測モデ
ルの構築方法の探索と評価

3Ia03

転写制御ネットワーク網羅的解析技術を用いたイネ側根
メリステムサイズの 調節機構の解明○渡邉 直暉 1, 村田 昌浩 2, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 3, 荒木 通啓 2,3（1神戸大院・工, 2京大院・医, 3神戸大院・科技イノベ）
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp○安福 航希 1, 兒島 孝明 1, 犬飼 義明 2, 中野 秀雄 1
（1名大院・生命農学, 2名大・農学国際セ）
hnakano@agr.nagoya-u.ac.jp【背景と目的】近年分子生物学データベースには、ゲノムシーケンス技術の発展によりアノテーションが付与されていない遺伝子やタンパク質配列が爆発的に増加しているため、アノテーションを計算的手法により早急に決定する必要がある。それらの配列の中には代謝工学において重要な酵素配列が含まれていることが推測され、特定の基質と反応する新たな酵素・新たな基質と反応可能な特定の酵素が存在する可能性がある。それらを新たに発見することは代謝工学において非常に重
要である。
【方法】
本研究では、このような酵素の発見や代謝経路の拡張のため酵素配列の反応予測を近年注目されている複数の機械学習を用いて 2 通りの方法で行った。まず
酵素のアミノ酸配列を用いて Enzyme Commission (EC) number の予測モデル(Emodel)を構築した。次に酵素配列に基質・生成物の化学構造情報を加えて EC
予測と同時に酵素の反応予測が可能なモデルを構築した。こちらは基質-酵素(SE-model)・基質-酵素-生成物(SEP-model)の 2 種類作成した。
【結果と考察】モデルの予測精度を評価したところ、前者の E-model において予測精度は低い結果となったが後者の 2 つのモデルにおいては用いた機械学習の種類に限らず予測精度が大幅に向上し高い精度となった。さらにこの方法によって構築されたモデルを用いることで 1 つの酵素に対する複数の反応予測への可能性も見出された。これらの結果より、酵素配列情報にさらに基質・生成物の化学構造情報を加えて予測モデルを作る方法は、酵素配列の反応予測に非常に有効的な方法である。また将来的な酵素反応予測のため機械学習の種類ごとに予測に重要な因子や予測結果の傾向の違いを議論した。

【背景と目的】 イネの根系改良による耐乾性育種は、世界的な干ばつが頻発する現状における米の増産のための有効手段の一つである。この耐乾性を高める
ためには、側根の発達を促進することが重要であり、これはイネの側根分裂組織(メリステム)サイズを増大させることによって可能となる。このメリステム
サイズ制御機構には、標的遺伝子の発現を制御する転写因子が大きく関わっている。その一つである OsbZIP1 は、細胞壁形成に関与する転写因子であるものの、その詳しい機能は未知である。
そこで本研究では、OsbZIP1 によって発現制御される遺伝子を網羅的に同定し、OsbZIP1 を介した側根メリステムサイズの制御機構を解明することを目的とした。
【方法・結果】 本研究グループは、高速 DNA シークエンス技術を駆使したトランスクリプトーム解析システムを確立している。このシステムは、in vitro の転写因子結合情報をゲノムワイドで出力する gSELEX-Seq と細胞内での転写因子依存的発現変動する遺伝子（DEG）の情報を出力する RNA-Seq を相補完的に用いることにより、従来の手法に比べてより高精度かつ網羅的な標的転写因子制
御下の遺伝子の同定を可能とする。
そこでまず、イネ野生株および OsbZIP1 変異株のそれぞれから RNA を抽出し、高速 DNA シークエンサー MiSeq に供した。これによって取得した配列データに対し、バイオインフォマティクスを用いて OsbZIP1 依存的に発現変動する数
百種類の DEG を同定した。この DEG には根の伸長や、転写因子に関係する遺伝子が含まれていた。
現在、OsbZIP1 によって直接的に発現制御される遺伝子の網羅的同定を行うた
め、gSELEX-Seq を用いた OsbZIP1 のゲノム上の結合部位の網羅的同定を行っている。

Exploration and evaluation of machine learning based models for predicting
enzymatic reactions

Elucidation of regulation mechanism of rice lateral root meristem size usingtranscriptional regulatory network comprehensive analysis○Naoki Watanabe1, Masahiro Murata2, Chiaki Ogino1, Akihiko Kondo3,
Michihiro Araki2,3(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Med., Kyoto Univ., 3Grad. Sch. Sci.
Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

bioinformatics, enzyme reaction, Machine learning○Kohki Yasufuku1, Takaaki Kojima1, Yoshiaki Inukai2, Hideo Nakano1(1Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2ICCAE, Nagoya Univ.)

Key words

Oryza sativa, gSELEX-seq, RNA-Seq, Transcript factor

271

3Ia04

大腸菌アンモニア輸送-同化ネットワークの定量的動力学モデルの構築

3Ia06○前田 和勲 1, Westerhoff Hans V. 2,3,4, 倉田 博之 1,
Boogerd Fred C. 2
（1九工大, 2VU Univ. Amsterdam, 3Univ. Manchester, 4Univ.
Amsterdam）
kmaeda@bio.kyutech.ac.jp

ボトムアップジェネティクスによる生命現象のハイス
ループット再構成○中原 航, 青木 航, 植田 充美（京大院・農）miueda@kais.kyoto-u.ac.jp

大腸菌アンモニア輸送-同化ネットワークの動力学モデルはグルタミン酸などの有用代謝物の生産性の向上に貢献できる。また、我々の動力学パラメータ推定
手法は、アンモニア輸送-同化ネットワークに限らず様々な動力学モデルに適用可能であり、シミュレーション駆動の有用細胞設計を加速することができる。

【背景】転写・翻訳・代謝などの生命現象を理解するためには、生命現象の invitro 再構成により必要十分条件となる遺伝子セットを決定することが重要である。従来の生命科学では還元的手法と構成的手法を交互に適用することで生命現象の必要十分条件を決定してきた。しかし、このアプローチでは生命現象の全体像が把握しにくく、必要十分条件の決定には多大な労力と時間を要する。
【目的】in vitro 再構成を高速に達成するための新規方法論ボトムアップジェネ
ティクスの開発を目指した。ボトムアップジェネティクスでは、遺伝子群をリポソームに封入し、生命現象の再構成を試みる。再構成が行われるとリポソー
ム内のレポーターが 蛍光を発する。蛍光リポソームを FACS (Fluorescence
Activated Cell Sorter)で選別し、NGS (Next Generation Sequencer)を使って蛍光リ
ポソームに共通する遺伝子を特定する。以上の手順により、一度の試行で必要十分条件となる遺伝子セットを特定できるため、生命現象理解の高速化が期待される。
【結果】当研究室では、ボトムアップジェネティクスを用いた β-ガラクシド加
水分解システムの in vitro 再構成に成功している[1]。そこで、いまだ再構成が成功していない大腸菌相同組み換えの in vitro 再構成を目指した。相同組み換えに必要なエキソヌクレアーゼは遺伝子を分解するため、NGS 解析ができなかった。そこで、網羅的に T7 プロモーター変異体を構築・評価し、遺伝子発現強度を自由に制御できるシステムを構築した[2]。また、遺伝子を環状化し、ヌク
レアーゼ耐性を付与した。本発表では、これらの技術を用いたボトムアップジェ
ネティクスによる相同組み換えの再構成についてまとめて報告する[3]。
[1] Aoki et al, Sci Rep, 4:4722 (2014)[2] Komura et al, PLOS ONE, 13: e0196905 (2018)[3] Nakahara et al, submitted

Developing a quantitative kinetic model of E. coli ammonium transportassimilation network

High-throughput reconstruction of biological systems by using bottom-up
genetics

Key words

kinetics, transporter, Escherichia coli, L-glutamate

Key words
Bottom-up genetics, Homologous recombination, Escherichia coli,
PURE system

3Ia05

FBA シミュレーションによる単波長光照射下におけるシ
アノバクテリアの光合成電子伝達経路のフラックス状態
の解析

3Ia07

大腸菌の主な窒素源はアンモニアである。大腸菌は TCA 回路の中間代謝物である 2-オキソグルタル酸（α-ケトグルタル酸）にアンモニアを付加することでグ
ルタミン酸とグルタミンを合成する。細胞に含まれる窒素の約 90%はグルタミン酸に由来し、残りはグルタミンに由来する。従って、大腸菌がどのようにアンモニアを環境から獲得しているのか、また、どのようにグルタミン酸とグルタミンの合成を制御しているのか明らかにすることは重要である。これを達成するには、実験データを定量的に再現できる精密な動力学モデルが不可欠だが、そのような動力学モデルを構築することは非常に難しい。
この問題を解決するために、我々は制約付き最適化に基づく新しい動力学パラ
メータ推定手法を開発した。この手法によって、様々な実験で得られた不均一な実験データや生物学的知見を同時に満たす動力学モデルを構築できる。さらに、我々はこの手法をアンモニア輸送-同化ネットワークに適用することで、定量的な動力学モデルを構築した (Maeda et al., npj Syst Biol Appl, 2019)。この動力学モデルは、３つの異なる研究グループ(JD Rabinowitz, T Hwa, and M Merrick)から得られた実験データを定量的に説明できる。次に、我々は、この動力学モデ
ルを使って、これまで一般に受動輸送体と考えられてきたアンモニアトランス
ポーター AmtB が能動輸送体である可能性が高いことを示した。

○Kazuhiro Maeda1, Hans V. Westerhoff2,3,4, Hiroyuki Kurata1, Fred C. Boogerd2(1Kyushu Inst. Technol., 2VU Univ. Amsterdam, 3Univ. Manchester, 4Univ.
Amsterdam)○Wataru Nakahara, Wataru Aoki, Mitsuyoshi Ueda
(Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)

ディープラーニングによるヒト・ミトコンドリア DNAの分類と解析
○三宅 淳 1, 馬場 俊輔 1, 中村 隼雄 1, 新岡 宏彦 2
（1大阪大学・国際医工情報センター, 2大阪大学・データビリ
ティーフロンティア機構）
jun_miyake@bpe.es.osaka-u.ac.jp○豊島 正和, 山本 千晶, 戸谷 吉博, 清水 浩
（阪大院・情報）shimizu@ist.osaka-u.ac.jp【背景と目的】シアノバクテリアは光エネルギーと二酸化炭素を使い、様々な物質を生産している。その生産性向上のためには、強い光の照射や光エネルギーの利用効率を上げる必要がある。シアノバクテリアは様々な波長の光を有効利用するために複数の光合成色素を持ち、生育光環境に合わせて光合成電子伝達や代謝状態を変化させてきた。特に光化学系 I と II の励起比（PSI/PSII 励起比）が変わると ATP や NADPH の合成量が変わると考えられる。本研究では、シアノバクテリア Arthrospira platensis と Synechocystis sp. PCC 6803 を用いて、光合成機構を精緻化したゲノムスケール代謝モデルを構築し、フラックスバランス
解析シミュレーションにより様々な波長の光照射下における光合成と代謝の状態を予測することで、光化学系の励起比と光合成電子伝達ならびに代謝状態の関係を明らかにする。
【方法と結果】我々の研究室で構築された Synechocystis のゲノムスケール代謝
モデルを異なる波長の光照射下での生育を予測できるように光合成反応の精緻化を行った。モデルの正確性を検証するために、過去に報告されている白色
LED とピーク波長が 460nm、530nm、590nm、640nm、680nm の LED 光照射下における Arthrospira の増殖速度や吸収スペクトルなどの生理学的解析データと我々が行った同様の光条件下における Synechocystis の生理学解析データを用いた。検証の結果、Arthrospira において細胞の吸収スペクトルとアンテナタンパ
ク質であるフィコビリソームから PSI と PSII へのエネルギー分配比を考慮する
ことで実験結果を正確に予測することができた。Synechocystis においても実験結果を正確に予測することができた。このモデルを用いて PSI/PSII 励起比とATP・NADPH 合成の関係を明らかにし、単波長光照射における ATP・NADPH
合成状態を利用した物質生産などで検証を行う。

【緒言・要約】 DNA を用いたハプログループの分類には SNP を用いることが通常であった。我々は遺伝子の全長を用いた新しい方法を見出したので報告する。ｍｔ DNA 全長にわたる塩基配列を用いるとハプログループの分類が可能である。当該分類においては、部分的な遺伝子配列（例えば SNP）の変動がハ
プログループの変移につながらないことを見出した。
【方法】 ヒトミトコンドリア(mt)DNA（350 本）のシークエンスを人工知能である Stacked Autoencoder(SAE)を用いて圧縮し、2 次元もしくは 3 次元空間にプロットした。SNP 情報は MitMap より得た。ハプログループとしては、L0（アフリカ系）、L3（アフリカ系）、M（アジア系）、N（中東系）、R（ヨーロッパ系）、U（ヨーロッパ系）を例として用いた。
【結果】 SAE によって圧縮された mtDNA は、それぞれのハプログループ毎に明瞭にまとまったクラスターとしてプロットされた。SNP を用いることなく
DNA の全長のシークエンスからハプログループを同定できることが示された。
さらに、特定のハプログループに属する遺伝子を用い、その SNP の配列を他のハプログループのものに置換したシークエンスを作り出し、解析を行った。しかし、SNP の置換は、その遺伝子の属するクラスターから他のクラスターへの移動をもたらすことがなかった。
【議論】 SAE による分類では、遺伝子の部分(SNP)の変化はハプログループの変更に結び付かない。遺伝子の全長にわたる配列の変化があった場合は別種のハ
プログループに属するものとして認識する場合がある。人工知能(SAE)を用いるこの分類方法は、人工知能の DNA シークエンスに関する「認識」に基づくものである。これまで、SNP という「部分」がハプログループという「全体」を示すとされてきたことについて、改めて分類の概念の検討が必要である。
。

Study on flux of photosynthetic elecrtron transport in cyanobacteria under
different spectral light based on flux balance analysis

Classification of human mitochondrial DNA by deep learning

Key words
cyanobacteria, flux balance analysis, different spectral light,
photosynthetic bacteria

Key words○Masakazu Toyoshima, Chiaki Yamamoto, Yoshihiro Toya, Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)○Jun Miyake1, Shunsuke Baba1, Hayao Nakamura1, Hirohiko Niioka2(1Global Center for Medical Engineering and Informatics, Osaka University, 2Osaka
University Institute for Datability Science)

artificial intelligence, mitochondria, DNA, haploid

272

3Ia08

ホログラフィック顕微鏡から得られる画像情報を活用し
た細胞解析

3Ia10

○岡田 光加 1, 山川 倫誉 1, 澤田 隆二 1,4, 今井 祐太 2, 岡田 真衣 2,
江連 徹 1, 加藤 竜司 2,3（1島津製作所, 2名大院・創薬, 3名大・ナノライフシステム研究所, 4パーソル パナソニック HRパートナーズ株式会社）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp

動物の表現型材料として捉える体毛の物性特徴抽出○塚本 楓 1, 坂田 研二 2, 菊地 淳 1,2,3（1横市大院・生命医, 2理研・環境資源, 3名大院・生命農学）
jun.kikuchi@riken.jp

我々は IHM（In-line Hologlaphic Microscopy）方式を用いた、細胞培養解析装置
CultureScanner CS-1 を開発してきた。本方式は、培養器上部より照射したレー
ザーを、培養器後方に設置したセンサーで受光するシンプルな光学系である。
センサーには、細胞を透過した光と細胞周辺を透過した光の干渉縞が記録され、干渉縞から光の伝播計算をすることで、細胞の光学厚みを表現する位相情報と、透過光の強さを表現する強度情報の 2 つの情報を用いて細胞を記述できる。IHM
方式を用いた細胞画像撮影は、レンズを用いない光学系なために焦点を合わせる必要がなく、手技等による画像のばらつきが生じにくい他、IHM 方式から得られる位相情報の画像には、細胞辺縁部にハロが生じないという画像解析上の利点もある。また、IHM 方式の大きな特徴として、細胞の光学厚み情報という細胞内の乾燥タンパク質濃度を表現する[Baber R. et.al, Nature(1952)]高次元情報が得られることは、本装置で細胞を解析する際の大きな新規性である。
これまで我々は、IHM 画像から細胞形態やテクスチャ情報を抽出する基本的な技術を開発し、細胞数の計測や、iPS 細胞の未分化・未分化逸脱を分類するア
ルゴリズムを確立しており、本研究ではこれらの技術をベースに、IHM 画像の特性や、画像から得られる独自の特徴量を活用した細胞画像解析手法を検討したのでこれを報告する。

【背景・目的】動物は永い進化史において海から陸へと生存圏を移すことに伴い、乾燥、日射や氷点下といった過酷な環境要因から、体毛を蓄え環境適応してきた。また羽毛・体毛の独特な表現型は、子孫を遺すために重要な材料形質でもある。ヒトにおいても直立歩行してから最も日射を受け、かつ重要器官である脳を保護する頭髪に関しては、現代人に至るまで退化することなく表現型
材料として保持し続けている。ここでは体毛を材料科学の視点から捉え直すことで、動物に特徴的な物性情報抽出を試みることとした。
【方法】鳥類、哺乳類、ヒトの羽毛・体毛サンプルについて、Intact で固体
NMR・TD-NMR・FT-IR・Autograph を用いて計測した。サンプルを微粉化処理
後 TG-DTA、洗浄・二層抽出後溶液 NMR を用いて計測を行った。
【結果】CPMAS・1H 異方性スペクトルをピーク分離し、前者からタンパク質の2 次構造情報、後者から水の運動性の異なる 3 成分を抽出した。また、Solid
Echo と CPMG から得られる緩和曲線からも運動性の異なる 3 成分が得られ、緩和の最も速い成分の割合は動物種に特有な場合もあることを見出した。
Autograph による引張試験では、伸び率・切断強度ともに種による違いが見られ、特に切断強度に大きな特徴が現れた。FT-IR ではケラチンスペクトルを用いて PKSP ツール[1-3]を基にピーク分離し、ヒト間で比較すると、男女で傾向は無く個人の経時変化の影響が大きいことが分かった。本発表では、マテリアル
ズ・インフォマティクスと類似の計測記述子を統合解析した例も議論したい。
【参考文献】[1] Ito et al. (2014) Anal. Chem. 86, 1098-1105.
[2] Wei et al. (2015) Anal. Chem. 87, 2819-2826.
[3] Yamada et al. (2019) ACS Omega 4, 3361-3369.

Cell analysis using image information obtained from the In-Line
Hologlaphic microscope

Feature extraction of hair physical properties as phenotypical materials inanimals○Mika Okada1, Momoya Yamakawa1, Ryuji Sawada1,4, Yuta Imai2, Mai Okada2,
Toru Ezure1, Ryuji Kato2,3(1Shimadzu Corp., 2Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 3Inst. Nano-Life. Syst.,
Nagoya Univ., 4Persol Panasonic HR Partners)○Kaede Tsukamoto1, Kenji Sakata2, Jun Kikuchi1,2,3(1Grad. Sch. Med. Life Sci., Yokohama City Univ, 2CSRS, RIKENS, 3Grad. Sch.
Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)

Key words

cell morphology

Key words

Hair, Physical property, Solid-state NMR, Descriptor

3Ia09

微生物による物質生産のための文献検索支援ツールの
開発

3Ia11

自家蛍光シグネチャーに基づく新規スクリーニング技術の開発: 酵母の油脂生産性を一細胞レベルで評価する○山田 洋平 1, 宮澤 せいは 2, 細山 哲 2, 梶原 茂樹 1, 飯田 順子 1,
川﨑 浩子 2, 白井 智量 3
（1島津製作所, 2NITE・NBRC, 3理研・CSRS）
yoyamada@shimadzu.co.jp○平山 智弘 1, 八幡 志央美 2, 高部 響介 2, 風間 春香 3, 高久 洋暁 3,
野村 暢彦 2,4, 八幡 穣 2,4（1筑波大院・生命環境, 2筑波大・生命環境系, 3新潟薬大・応生科, 4微生物サステイナビリティ研究センター）
yawata.yutaka.ga@u.tsukuba.ac.jp【背景と目的】微生物が本来持たない新たな機能を付加して，高効率に付加価値物質を生産する「スマートセル」に向けた研究・開発が進められている．NITE
では生物遺伝資源のバイオテクノロジーへの利活用を目的に 9 万株にのぼる微生物資源を保有，分譲，情報公開している．この多様な微生物資源の中から，目的とする付加価値物質の生産につながる有用遺伝子やそれらを有する微生物を選定するためには，目的物質の代謝情報，それに関与する酵素情報，酵素を有する微生物情報，遺伝子情報，ゲノム情報，さらに特許情報などについて，
文献や各種データベース(DB)の網羅的な検索が必要である．十分な情報を得るには，多大な時間を要し，時には情報検索漏れが生じる場合がある．情報検索
漏れの原因としては，同一酵素の名称あるいは遺伝子名の表記が異なることと，分類学的再編による学名変更もその要因である．そこで，本研究では，微生物による物質生産を目的として，酵素名を入力するだけで，それに関連する文献
情報を，短時間かつ網羅的に抽出するための検索支援ツールを開発した．
【方法】開発したツールは，単一酵素名を元に各種酵素 DB から自動的に酵素名の別称と関連遺伝子名を抽出し，検索語として自動的に PubMed 検索すること
で網羅的な文献リストを得られるようにした．次に，微生物，遺伝子，酵素，
代謝物等の名称を含む 11.5 万語の関連語を各種 DB から収集，辞書を作成し，検索で得た全文献からこれら関連語を抽出し可視化することで，一見して目的酵素に関連がある文献であるかを確認できるようにした．
【評価】モデルとして 4 酵素について，本検索支援ツールによる検索とマニュア
ル検索を比較したところ，ツール検索では有用文献の 90%を抽出でき，作業時
間は 40%短縮することができた．

有用微生物のスクリーニングにおいては、細胞の性質評価に多くの時間と手間を要することがボトルネックとなっている。これまでは LC/MS による生体分子の同定や、大量培養を介した候補株からの目的の表現型の選抜などの操作が必要であった。そこで我々は、自家蛍光に基づいて一細胞ごとの表現型を予見的に評価する技術を開発し、迅速かつ非破壊的なスクリーニングを可能にすることを目的とした。
自家蛍光とは細胞内の多様な生体分子が発する微弱な蛍光であり、様々な生理状態を反映することが明らかになっている。この自家蛍光を用いることで、GFPなどの侵襲的なタグを必要としない表現型評価が可能となる。これまでに我々は、共焦点イメージングと画像解析により、一細胞ごとの「自家蛍光シグネ
チャー」を解析する技術 (CRIF) を開発している (特許第 6422616 号)。さらに機械学習などを用いて、自家蛍光シグネチャーに基づいて細胞の増殖状態や生育条件を高感度に判別できることが明らかになっている。
今回我々は、油脂酵母 Lipomyces starkeyi の油脂生産性をモデルとして、CRIF
がスクリーニングにおける細胞評価技術として応用可能であるか検証した。まず、油脂生産性の異なる３株 (野生株、油脂高蓄積株、油脂低蓄積株) の自家蛍
光シグネチャーを比較すると、株ごとに異なる特徴が見られ、さらに、油脂生産の進行に伴い経時的に蛍光パターンが変化していた。この結果は、自家蛍光
シグネチャーが一細胞ごとの油脂生産性を反映することを示す。また、油脂生
産初期の細胞の自家蛍光シグネチャーに基づいて細胞の油脂生産性を予測する
機械学習モデルを構築することが可能であった。
今回の結果は CRIF を利用して候補株を見つける新たな迅速スクリーニング法の展望を示すものである。
(本研究の一部は NEDO スマートセルプロジェクトの支援を受けて行われた。)

Development of literature search support tools for bioproductions withmicroorganisms

Single-cell innate fluorescence analysis for high-throughput screening: A
proof-of-concept study○Yohei Yamada1, Seiha Miyazawa2, Akira Hosoyama2, Shigeki Kajihara1,
Junko Iida1, Hiroko Kawasaki2, Tomokazu Shirai3(1Shimadzu Corp., 2NBRC, NITE, 3CSRS, RIKEN)

Key words
tools

screening of microorganisms, enzyme activity, literature search support○Tomohiro Hirayama1, Shiomi Yawata2, Kyosuke Takabe2, Haruka Kazama3,
Hiroaki Takaku3, Nobuhiko Nomura2,4, Yutaka Yawata2,4(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Fac. Life Environ. Sci., Univ.
Tsukuba, 3Dept. Appl. Life Sci., Niigata Univ. Pharm. Appl. Life Sci, 4MiCS., Univ.
Tsukuba)
Key words
screening, lipid, microscopy, oil

273

3Ja01

Self-Growth Inhibiting Mechanism of Comamonas
testosteroni R2 grown on phenol

3Ja03

モデル微生物生態系における時空間的不均一性と生態系
機能維持機構○JABIR Mohd1,2, Tomoka Nishimura1, Ayaka Minoura1,
Kenshi Suzuki1, Masahiro Honjo1, Kensei Masuda1,
Yosuke Tashiro1,3, Hiroyuki Futamata1,3,4(1Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 2Innov. Cent. Agric. Adv.
Bioprocess, Univ. Technol. Malaysia, 3Grad. Sch. Integr. Sci.
Technol., Shizuoka Univ., 4Res. Inst. Green Sci. Technol.,Shizuoka Univ.)jabir.mohd.din18@shizuoka.ac.jp○鈴木 研志 1, 本荘 雅宏 1, ファティマ アズワニ 2, 増田 健誠 3,
ジャビエル モハマド 1, 天野 光喜 4, 田代 陽介 3, 二又 裕之 1,3,5（1静大・創科技院, 2Universiti Putra Malaysia, Inst. Tropical Agric.,3
静大院・総合科技, 4静大・工, 5静大・グリーン科技研）
futamata.hiroyuki@shizuoka.ac.jp

Understanding interspecies interaction is the key in manipulation of complex microbial
ecosystem. Although the growth of phenol-degrading Comamonas testosteroni strain
R2 collapsed under chemostat conditions supplied with phenol as a sole carbon andenergy source, strain R2 could maintain the phenol-utilizing activity under thepresence of non-phenol degrader Stenotrophomonas sp. strain Y. The growth of strain
R2 was more repressed under batch conditions by the supernatant from the longer
incubation culture of strain R2-chemostat culture. Strain R2 was able to degrade
phenol in the supernatant treated by strain Y. Real-time qPCR analysis showed that
population densities of strains R2 and Y were maintained under chemostat conditions.
These results suggested that strain R2 produced self-inhibiting metabolites and strain Y
utilized them as resources, resulted in coexistence on phenol. The strain R2 supernatant
was fractionated with hexane, ethyl acetate, and H2O. The growth inhibition was only
observed in H2O-fraction. The effect of the H2O-fraction on kinetic parameters forphenol and catechol of strain R2 were investigated. Phenol-and catechol-oxygenating
maximum rate were not affected but their affinities were lower than control conditions,indicating that the self-growth inhibition of strain R2 was based on competitive
inhibition. These results suggested that the relationship between strains R2 and Y wascooperative interaction and served as a model in understanding the metabolic networkof microbial ecosystems.

微生物生態系は工業や農業といった様々な分野で活用されている。一方で明確な制御法が確立されておらず、それには微生物生態系の理解が必要不可欠である。微生物生態系は多様な微生物が共存することで形成されたシステムであることから、まず、微生物共存機構および生態系機能維持機構の解明を目的とした。システムを単純化するため、phenol 資化細菌である Cupriavidus sp. P-10 株
および Comamoans testosteroni R2 株を用いた二菌株混合培連続集積養系をモデ
ル微生物生態系と位置づけ解析を行なった。唯一の炭素源を phenol とすること
で生態系機能を phenol 分解とした。一般に単一基質が供給される連続集積培養
系では、増殖速度が速く基質に対する親和性が高い微生物のみが生存し他は排除される。上記二菌株では R2 株のみが生存すると推定されたにも関わらず、二種は共存し P-10 株が高い菌密度を示した。そこで phenol に対する動力学的解析を行ったところ、P-10 株は R2 株と比較して、より高濃度で最大分解速度を示すことが明らかとなった。即ち、phenol 濃度による基質の分配が可能であることを示した。培養系内の phenol 濃度分布を解析した結果、P-10 株を優占化可能とする時空間的不均一性が存在することが示された。しかし phenol の分配率が一定であれば競争排除が起きてしまう。つまり、phenol 分配率は優占種が入れ替わる境界を跨いで揺らいでいると考えられた。そこで、各菌株の phenolhydroxylase 遺伝子の転写量を解析した結果、その値は変動した。従って、P-10株および R2 株は僅かなフェノール濃度の変化に、遺伝子転写レベルで揺らぐことで長期共存が可能であり、生態系機能は集団としての代謝状態が変化する
ことで維持されていると推察された。

Self-Growth Inhibiting Mechanism of Comamonas testosteroni R2 grown on
phenolMetabolic fluctuation corresponding to substrate-spatiotemporal
heterogeneity generate functional stability in a synthetic microbial
ecosystem○JABIR Mohd1,2, Tomoka Nishimura1, Ayaka Minoura1, Kenshi Suzuki1,
Masahiro Honjo1, Kensei Masuda1, Yosuke Tashiro1,3, Hiroyuki Futamata1,3,4(1Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 2Innov. Cent. Agric. Adv. Bioprocess,Univ. Technol. Malaysia, 3Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 4Res.
Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)
Key words
Stenotrophomonas sp., , Comamonas testosteroni R2, coexistence,
interspecific interaction

3Ja02

Resource-competitive microbes can stably coexist byflexible metabolic network in a synthetic microbial
ecosystem○Fatma Azwani1,2, Kenshi Suzuki2, Masahiro Honjo2,Kensei Masuda3, Yasuhisa Saito4, Yosuke Tashiro3,
Hiroyuki Futamata2,3,5(1Inst. Tropical Agric. Food Security., Univ. Putra Malaysia., 2Grad.
Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 3Dept. Appl. Chem. Biochem.
Eng. Grad. Sch. Sci. and Technol., Shizuoka Univ., 4Dept. Mat.,
Shimane Univ., 5Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)
fatma.hjaziz@yahoo.com
Our study investigated how microbial ecosystems maintain its functional stability withcoexistence. The synthetic microbial ecosystem (SME) under chemostat and resouce
limiting conditions with 3 kinds of bacteria (Pseudomonas sp. LAB-08, Comamonas
testosteroni R2 and Cupriavidus sp. P-10) were studied in a steady states long termreconstructed experiments. We then analysed a mathematical model of the population
dynamics to build connections between practical approaches. Based on parameters ofcompetition and growth activity, the population dynamics showed difference outcomes.
The reproducibility and stability of bacterial community structure was observed before
and after starvation, whereas the kinetic parameters for phenol and catechol of the
SME shifted in different dynamic equilibrium. It was revealed that forming mechanismof microbial community structure changed even in the similar community structure astranscriptional levels of genes encoding phenol hydroxylase and catechol dioxygenase
differed before and after starvation. Transcriptional levels indicated phenol was
degraded by strains R2 and P-10 whereas strain LAB-08 became a dominant. Catechol
was degraded mainly by strain P-10, suggested that strain P-10 would incur the cost forphenol and catechol degradation, despite other strains contributed partially to degrade
resources. These results experimentally indicated that the flexibly metabolic
networking systems allow microbial ecosystem to exhibit the homeostasis withcoexistence.

Resource-competitive microbes can stably coexist by flexible metabolic
network in a synthetic microbial ecosystem○Fatma Azwani , Kenshi Suzuki , Masahiro Honjo , Kensei Masuda ,Yasuhisa Saito4, Yosuke Tashiro3, Hiroyuki Futamata2,3,5(1Inst. Tropical Agric. Food Security., Univ. Putra Malaysia., 2Grad. Sch. Sci.
Technol. Shizuoka Univ., 3Dept. Appl. Chem. Biochem. Eng. Grad. Sch. Sci. andTechnol., Shizuoka Univ., 4Dept. Mat., Shimane Univ., 5Res. Inst. Green Sci.
Technol., Shizuoka Univ.)
Key words
fuctional stability, metabolic network, synthetic microbial ecosystem
1,2

2

2

3

○Kenshi Suzuki1, Masahiro Honjo1, Azwani Fatma2, Kensei Masuda3, Mohd Jabir1,
Koki Amano4, Yosuke Tashiro3, Hiroyuki Futamata1,3,5(1Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 2Inst. Tropical Agric., Universiti Putra
Malaysia, 3Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 4Fac. Eng. Shizuoka
Univ., 5Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)
Key words
synthetic microbial ecosystem, functional stability, coexistence,
heterogeneity

3Ja04

特異な自家熱型高温好気消化プロセスにおける劇的な細菌群集構造の変遷機構の解明○田代 幸寛, Cheng Huijun, 河野 祥尚, 朝倉 侑弥, 神田 晃佑,
福井 諒, 奥川 友紀, 酒井 謙二（九大院・農）tashiro@agr.kyushu-u.ac.jp

自家熱型高温好気消化（ATAD）プロセスは、複合微生物系を用いた排水処理であるが、常温で進行する活性汚泥法と比較すると、学術的知見は圧倒的に少ない。演者らは、福岡県築上町でヒトし尿および浄化槽汚泥を原料とする ATAD
プロセスが世界で類をみない特異な理化学特性・微生物特性を示し、3 フェーズ（初期、中期、終期）で進行することを報告した（AEM,84,e02537-17,2018）。
特に、優占門は初期から中期にはグラム陰性細菌である Proteobacteria 門からBacteroidetes 門に変遷し、終期にはグラム陽性細菌である Firmicutes 門へと劇的に変化するが、この変遷機構は明らかとなっていない。そこで本研究では、特異な ATAD プロセスにおける細菌群集変遷機構の解明を目的とした。
実機における各フェーズの ATAD 試料を実験に用いた。まず、加水分解酵素活性（β-glucanase、Protease、Lipase）および溶菌活性（Micrococcus lysodeikticus、Escherichia coli）を、各フェーズの温度（30°C、45°C、54°C）および pH（7.5、8.4、9.0）条件で測定した。一部のフェーズにのみ、β-1,3-Glucanase や Proteaseが検出されたが、細菌群集構造変遷との関連は不明であった。一方、終期からは、グラム陽性細菌である M. Lysodeikticus には活性がなく、グラム陰性細菌である E. coli にのみ溶菌活性を示したことから、変遷機構の一つであることが示唆された。また、メタゲノム解析を行ったが、溶菌に関与する遺伝子が検出されず、溶菌因子を特定できなかった。さらに、実機の ATAD 試料（初期、中期、終期）を高振とう条件で、それぞれ 30°C、45°C、54°C で培養した結果、実機 ATAD プロセスにおける一部の主要細菌の変遷を再現することができた。
よって、温度に加えて、高振とうによるせん断応力が細菌群集構造の変遷に寄与していることが示唆された (Cheng ら,JBB,126,196-204,2018)。

Elucidation of mechanisms for dynamic bacterial community changes in
autothermal thermophilic aerobic digestion process○Yukihiro Tashiro, Huijun Cheng, Yoshihisa Kawano, Yuya Asakura,
Kosuke Kanda, Ryo Fukui, Yuki Okugawa, Kenji Sakai(Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words
autothermal thermophilic aerobic digestion (ATAD), bacterial
community changes, cell lysis activity, shering force

274

3Ja05

微細藻類 Acutodesmus acminatus におけるユウロピウム
吸着に及ぼす代謝機能の影響

3Ja07○古橋 康弘 1, 本多 了 2, 原-山村 宏江 2, 長谷川 浩 2（1金沢大院・自科, 2金沢大・理工）
rhonda@se.kanazawa-u.ac.jp

Methylobacterium sp. FD1 株のホルムアルデヒド代謝系
酵素遺伝子とホルムアルデヒド培地での発現○島本 真奈, 米光 裕, 楠部 真崇（和歌山高専）yonemitsu@wakayama-nct.ac.jp

廃棄物からの希少金属の回収は、金属資源が乏しい我が国の産業において重要な課題であり、バイオソープションは従来の化学的手法に変わる低コスト・低環境負荷型の金属回収技術として研究されてきた。廃棄物からの金属回収について、多金属成分系において回収対象の金属を高品位で回収することが課題である。しかしながら金属イオンの化学性質が支配する細胞表面や細胞外分泌物
による化学吸着では化学性質が酷似しているランタノイドなどの選択的吸着は困難である。この課題を解決するためには、生物代謝による特定の金属を選択的吸着が重要である。そこで本研究ではユウロピウムに対して高い吸着能を持
つ微細藻類 Acutodesmus aucminatus における生物代謝のユウロピウム吸着に対する関与について調べた。
微生物の滅菌処理として主要な方法である紫外線及びオートクレーブによって不活化させた藻体をそれぞれ作成し、ユウロピウムの吸着に用いた。その結果、生細胞と比較して吸着量は大幅に減少した。また生細胞と不活性藻体の両方において約 30 分でユウロピウムを迅速に吸着した。さらに生細胞な場合のみ、約
9 時間までユウロピウムの吸着量は増加した。よって生細胞および不活性藻体に見られた迅速なユウロピウム吸着は細胞表面における化学吸着であり、生細胞のみに見られるその後のユウロピウム吸着には、A. acuminatus の生物代謝機能が関与していると考えられる。

【背景と目的】FA 分解菌 Methylobacterium sp. FD1 株は、FA 最小発育阻止濃度（FA-MIC）が 33 mM で、よく知られている Methylobacterium sp. AM1 株の FAMIC（1 mM）に比べて著しく高い。FD1 株の FA 耐性機構を解明することは、より高い FA 耐性能を持つ FA 分解菌の育種に応用できると考えられる。本研究では、まず FD1 株の FA 代謝系酵素遺伝子の調査とそれら遺伝子の発現に対す
る FA の影響を調べた。
【方法】FD1 株の全ゲノムシーケンスは、菌体より精製した全 DNA を鋳型にMiSeq（Illumina 社）を用いて行った。得られたシーケンスデータは DDBJ の
Pipeline および SPAdes を使ってアッセンブルした。ゲノムアノテーションはLocal Blast にて行った。FD1 株の FA 代謝系酵素遺伝子の発現解析は、まず FA
含有 Soybroth 培地にて培養した菌体より mRNA を精製後、cDNA 化し、次いでリアルタイム PCR により各種遺伝子の転写量の相対定量を行った。
【結果と考察】FD1 株は、全ゲノムシーケンス解析の結果、ゲノムサイズが 7.0
Mbp で、約 8 千個のタンパク質をコードしていると示唆された。次に既知の FA
代謝系酵素遺伝子を用いてアノテーションした結果、AM1 株で明らかになっている fae, glyA, mtdA, fdh, mxaF 等以外に fdm1, fdm2, gd-faldh 等が存在した。これ
ら遺伝子の転写量を調べた結果、fdm1 および fae は FA によりそれぞれ平均 9.6倍および 2.5 倍高くなり、FA 誘導型発現であると示唆された。その他の遺伝子は FA にほとんど影響されず、構成的発現と示唆された。これより FD1 株の高い FA 耐性は fdm1 などの FD1 株特異的遺伝子による可能性がある。

Effect of metabolic mechanism of europium absorption by microalgae
Acutodesmus acuminatus

Expression of the formaldehyde metabolic enzyme genes ofMethylobacterium sp. FD1 in formaldehyde medium○Yasuhiro Furuhashi1, Ryo Honda2, Hiroe Hara-Yamamura2, Hiroshi Hasegawa2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Inst. Sci. Eng., Kanazawa Univ.)○Mana Shimamoto, Hiroshi Yonemitsu, Masataka Kusube(Natl. Inst. Technol., Wakayama Coll.)

Key words

microalgae, biosorption, europium, metal recovery

Key words

formaldehyde, metabolism, gene expression analysis, real time PCR

3Ja06

Nutrients removal and auto-aggregation capabilities of
two microalgal strains isolated from algal-bacterial
aerobic granular sludge

3Ja08

Methylobacterium sp. FD1 株由来ホルムアルデヒドジス
ムターゼ (Fdm1) の特性解析○井元 誠志, 米光 裕, 岸本 昇
（和歌山高専）yonemitsu@wakayama-nct.ac.jp○Marjangul Nuramkhaan, Zhongfang Lei, Kazuya Shimizu,
Zhenya Zhang(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)lei.zhongfang.gu@u.tsukuba.ac.jp
Nutrients removal and auto-aggregation capabilities were examined on two microalgal
strains (A1 and A2) isolated from algal-bacterial aerobic granular sludge treating
synthetic domestic wastewater. All the performances under light/dark cycle condition
were higher than only dark cultivation. When initial NH4-N and PO4-P concentrations
were 50 mg/L and 5 mg/L, respectively, A1 removed PO4-P about 96% in comparison
to 87% by A2 within 5 days under light/dark cycle condition, which sharply decreased
to 52% (A1) and 35% (A2) under only dark condition. In terms of NH4-N removal, A1
achieved 93% and 49% respectively under light/dark cycle and only dark conditions,while A2 obtained 84% and 36% on day 5. In the first two days’ light/dark cultivation,
the auto-aggregation index of A1 was around 59%, which gradually increased to 62%,71% and 82% on days 3, 4 and 5, respectively. During only dark cultivation this index
ranged between 50-54%. In contrast, less increase was detected on the autoaggregation index of A2, about 29% on day 1, which increased to the highest (50%) on
day 5 during light/dark cultivation. While under only dark condition this index of A2
slightly increased from 26% to 32% during the first two days, which decreased fromday 3 onwards and reached 11% on day 5. In summary, compared to A2, A1 grows
faster with better nutrients removal and an higher auto-aggregation index, which may
contribute more to algae granulation and highly efficient nutrients removal in theestablished algal-bacterial granule system.

【背景と目的】ホルムアルデヒド (FA) は工業原料として幅広く用いられており、化学工業において重要な化学物質である。しかし、FA は強い毒性を持つことから、工業廃水などの液相中の FA や気相中の FA は分解処理が必要となる。当研究室では、微生物あるいは酵素を用いた FA 分解処理技術の開発を目指し、既に FA 分解菌 Methylobacterium sp. FD1 株を分離し、その FA 分解が主にホルム
アルデヒドジスムターゼ (Fdm) であることを明らかにした。そこで、この Fdmの構造や機能を明らかにすることを目的に、既に、Fdm 遺伝子 (fdm1) をクローニングし、His タグ付き Fdm1 (Fdm1-6His) の精製を試みた。本研究では、
Fdm1-6His の特性として至適 pH・温度およびミカエリス定数 (Km) を調べた。
【方法】Fdm1-6His は、遺伝子組換え大腸菌の細胞破砕液の可溶性画分より、金属 (Co2+) アフィニティクロマトグラフィで精製した。Fdm1-6His の FA 分解活性は、FA を含む緩衝液に Fdm1-6His を含む酵素溶液を添加し、所定の時間イン
キュベートした。反応の停止は、2 M HCl の添加により、行った。Fdm1-6Hisの Fdm 活性は、FA 分解によって生成したギ酸を HPLC で定量することで測定した。なお、Fdm 活性は、1 mg の Fdm1-6His が 1 分間に分解する FA の物質量とした。
【結果と考察】Fdm1-6His の至適 pH および至適温度は、それぞれ 6.0 付近および 30 ℃付近と分かった。Fdm1-6His の Km および最大反応速度 (Vmax) は、それ
ぞれ 0.21 M および 3.8 mmol/(min・mg) であった。Pseudomonas putida F61 株由来 Fdm では Km が 0.35 M であることが報告されており、Fdm1-6His の方が FAに対してより高い親和性を持つと考えられた。今後は、Fdm1-6His の高次構造、結合金属および補酵素の調査、並びに FA 分解処理システムへの応用を検討する予定である。

Nutrients removal and auto-aggregation capabilities of two microalgal
strains isolated from algal-bacterial aerobic granular sludge

Characterization of formaldehyde dismutase (Fdm1) of Methylobacterium
sp. FD1○Marjangul Nuramkhaan, Zhongfang Lei, Kazuya Shimizu, Zhenya Zhang(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

aerobic granular sludge, microbial community, microalgae, isolation○Seiji Imoto, Hiroshi Yonemitsu, Noboru Kishimoto(Natl. Inst. Technol., Wakayama Coll.)

Key words
degradation

formaldehyde dismutase, Methylobacterium sp. FD1, formaldehyde

275

3Ja09

対流型水処理装置における窒素浄化能の向上○早坂 洋輝, 荒木 希和子, 久保 幹
（立命館大院・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp

3Ja11

Rhodotorula mucilaginosa が形成するバイオフィルムを用いた水溶液中からの金属回収○菅 道哉, 尾島 由紘, 東 雅之
（阪市大院・工）azuma@osaka-cu.ac.jp【背景・目的】止水環境において、有機物流入量が微生物による分解量を上回ると、有機物が底泥に蓄積し水質悪化が生じる。これまでに水域の対流と微生物分解による自浄作用に着目し、ポンプ及び微生物カラムによって自浄作用の促し水質を改善する対流型水処理装置の開発を行ってきた。微生物カラムではポンプの流速を変え酸素供給量を調節することで、好気的もしくは嫌気的環境を作り出している。本装置は脱炭酸と脱窒が行われることが確認されたが、窒素除去の向上が課題であった。本研究では脱窒菌の生育に適したカラム条件を検討し、対流型水処理装置の脱窒を促進させることを目的とした。
【方法と結果】微生物カラムの吸着担体としてポリエステル培土とポリビニルア
ルコール（PVA）を用いた。脱窒を促す最適密度条件の検討を行うため、低・中・高の密度条件でカラムに担体を充填した。担体には自然池底泥中の微生物を吸着させた。その後、カラムに高濃度の硝酸態窒素濃度を含む富栄養水を通過させ、窒素減少量から両担体の脱窒に適したカラム内密度条件を評価した。
また装置による持続的な窒素除去効果を確認するため、硝酸態窒素濃度が一定値を下回った時点で新しい富栄養水に交換し、窒素減少量と総細菌数および脱窒菌数を 56 日間観察した。いずれの担体においても低密度条件で最も高い硝酸態窒素の減少が観測された。担体密度の違いによるカラム内溶存酸素量の差は小さく、流速が速いことで基質と脱窒菌との接触頻度の高くなる低密度条件で脱窒が最も活発に行われたと考えられた。56 日間の連続窒素除去実験の結果、硝酸態窒素は継続的に減少し、その減少率はポリエステル培土カラムで 0.25 mg/
day、PVA カラムで 0.22 mg/day であった。繊維質なポリエステル培土と多孔質な PVA はいずれも長期間、脱窒菌の生育に適した環境を維持できることが確認された。

重金属の多くは人体に悪影響を及ぼすため、環境中からの適切な除去が望まれている。また、循環型社会の実現に向けて都市鉱山などからの効率的な金属の回収も求められている。これまでに凝集沈殿法などによる金属回収が提案されているが、近年、環境への負荷が小さく低コストであることから微生物吸着剤が注目されている。しかし、連続的な金属吸着には微生物の固定が必要となる。
我々は、微生物が形成するバイオフィルムの活用を検討するため、バイオフィ
ルムを形成する酵母 Rhodotorula mucilaginosa を用い金属吸着について評価した。
最初に、R. mucilaginosa NBRC0889 株を用い浮遊細胞での吸着能を評価した結
果、微生物吸着試験によく用いられる Saccharomyces cerevisiae より高い吸着能を確認した。次に、バイオフィルム形成に適した材料検討を行った。各プラス
チック板を浸漬させた培地中で 48 時間培養し、クリスタルバイオレット染色による評価の結果、ポリプロピレン板が適していることが分かった。バイオフィ
ルム量をさらに高めるために、表面に凹凸があり表面積が大きい円筒状のポリ
プロピレン製担体 (内径 3.5 mm, 外径 5.5 mm, 高さ 11 mm)にバイオフィルムを形成させた結果、ポリプロピレン板よりもバイオフィルム量が顕著に増加した。
そこで、バイオフィルムによる金属吸着を評価した。金属溶液には 10 ppm, 10
mL の Cu2+溶液を用い、10 分の接触により吸着を行い溶液中に残った Cu2+濃度
を ICP-OES で測定した。バイオフィルムを形成した担体 1 つには約 1×108 cellsが含まれ、20 μg 程度の Cu2+を吸着することを確認した。細胞当たりの吸着量は浮遊細胞と比べて約 3 倍以上高く、バイオフィルムに含まれる多糖などへの吸着が考えられた。現在は、バイオフィルムを形成した担体を用い、連続的な金属回収について検討している。

Improvement of denitrification efficiency in our new water treatment
system.

Metal recovery from aqueous solution using biofilm formed by Rhodotorulamucilaginosa○Hiroki Hayasaka, Kiwako S. Araki, Motoki Kubo
(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)○Michiya Suga, Yoshihiro Ojima, Masayuki Azuma(Grad. Sch. Eng., Osaka City Univ.)

Key words

denitrification, bacterial column, water purification, water circulation

Key words

Rhodotorula mucilaginosa, heavy metal, biosorption, biofilm

3Ja10

リン酸基修飾酵母による鉱物化誘導の解析

3Ap01

Comparative enzymological characterization of lasparaginases from lactic acid bacteria○吉田 真実 1, 木原 摩耶 1, 尾島 由紘 1, 五十嵐 幸一 1, 吉田 朋子 2,
東 雅之 1（1阪市大院・工, 2阪市大・複合先端研究機構）
azuma@osaka-cu.ac.jp○Kodchakorn Phetsri, Makoto Furukawa, Risa Yamashiro,
Yuka Kawamura, Yosuke Toyotake, Mamoru Wakayama(Coll. Life Sci.,Dept. Biotechnol.,Ritsumeikan Univ.)
wakayama@sk.ritsumei.ac.jp【諸言】 本研究室では、微生物吸着材として、酵母にリン酸基を修飾したリン酸基修飾酵母の開発を行ってきた。特徴として、重金属や希土類元素に対して
イオン交換樹脂と同程度の吸着が可能であり、さらに酸性溶液で脱離できることが明らかになっている。また 2018 年の本大会では、希土類元素に対する選択的な回収も可能であることも報告している。このリン酸基修飾酵母を金属イオン溶液中で長時間反応させると、吸着に続いて鉱物化が起こることが観察された。酵母による鉱物化はこれまで報告されているが、多くは生体反応を利用したバイオミネラリゼーションであり、死菌であるリン酸基修飾酵母による鉱物化はこれまでに報告がない現象である。本発表ではこの鉱物化の詳細な解析を行った。
【実験方法】 リン酸基修飾酵母は、市販の製パン用ドライイーストをアルカリ条件下で Na3P3O10 と 20 時間反応することにより作製した。乾燥させたリン酸基修飾酵母を金属イオン溶液に懸濁した後、数日間振とうさせ、酵母表面での鉱物化を誘導した。鉱物化は SEM 観察によって確認し、EDS、XAFS を用いて鉱物の分析を行った。
【結果と考察】 リン酸基修飾酵母と銅イオンの反応によって、酵母表面での鉱物化が引き起こされることが SEM で観察された。鉱物化は反応 3 日後から確認され、7 日後程度で完了することが分かった。同様の結果が、希土類元素であるジスプロシウムでも確認された。銅イオンとリン酸基修飾酵母で形成した鉱物は、EDS 解析により Cu, P, O で構成されていることが予測された。XAFS
解析の結果より、形成した鉱物は、標準試料のりん酸銅(II)と比較して、局所構
造は極めて類似しているが結晶性が低い鉱物であるということが示された。

L-asparaginase (ASNase; EC 3.5.1.1.) is the critical enzyme that catalyzes hydrolysisof L-asparagine to L-aspartic acid and ammonium. Generally, ASNase from E. coli and
Erwinia chrysanthemi have been mainly applied for leukemia treatment but a few
studies of ASNase from lactic acid bacteria (LAB) have been reported, especially inthe food application. Thus, the aim of this study is to characterize ASNase production
by cloning and expression of ASNase gene from five LAB strains in E. coli. Among
LABs examined, these strains were selected based on phylogeny analysis from thegenomic LAB original strains. ASNase activity was screened by GlDH assay. ASNases
genes were closely 1 kbp and inserted into NdeI and XhoI sites of pET-28a (+) andtransform into E. coli BL21(DE3). The recombinant ASNases were purified to behomogeneity using Ni Sepharose 6 Fast Flow column. They showed the highspecificity for L-Asn significantly. Optimum and stability of pH and temperature werein the range of 5 - 9 and 30 - 50oC respectively. The activities of the enzymes weresignificantly inhibited by Ni2+ ion. Among five strains, the recombinant ASNase from
Streptococcus thermophilus NBRC 13957 showed the highest specific activity at 113.0
U mg-1and Km, Vmax, and kcat values were 2.91 mM, 174.82 U mg-1, and 1.53×102 s-1,
respectively. Results of this study indicated that the recombinant ASNases from LABs
were active at the wide range of pH and temperature, possibly reflect the potential of
L-ASNase as catalyst in food processing industry.

Analysis of mineralization induced by phosphorylated yeast

Comparative enzymological characterization of l-asparaginases from lactic
acid bacteria○Mami Yoshida1, Maya Kihara1, Yoshihiro Ojima1, Koichi Igarashi1,
Tomoko Yoshida2, Masayuki Azuma1(1Grad. Sch. Eng., Osaka City Univ., 2OCARINA, Osaka City Univ.)

Key words

yeast, phosphorylation, metal adsorption, mineralization○Kodchakorn Phetsri, Makoto Furukawa, Risa Yamashiro, Yuka Kawamura,
Yosuke Toyotake, Mamoru Wakayama(Coll. Life Sci.,Dept. Biotechnol.,Ritsumeikan Univ.)

Key words

l-asparaginase, lactic acid bacteria, characterization, cloning

276

3Ap02

アラレマイシン合成酵素から 5-アミノレブリン酸合成酵
素 ALAS への機能改変

3Ap04○川口 潤, 森 ひかる, 岩井 伯隆, 和地 正明（東工大・生命理工）
mwachi@bio.titech.ac.jp

Sulfolobus tokodii 由来色素依存性 L-乳酸脱水素酵素の大腸菌を宿主とした発現系の構築○宇野 紘平 1, 里村 武範 1,2, 黒沢 則夫 3, 櫻庭 春彦 4, 末 信一朗 1,2（1福井大院・工, 2福井大ライフ, 3創価大, 4香川大・農）satomura@u-fukui.ac.jp【背景と目的】Streptomyces sp. A012304 株から発見された抗生物質アラレマイシンの合成酵素である AlmA は、ポルフィリン前駆体である 5-アミノレブリン酸（ALA）の合成酵素 ALAS のホモログである。ALAS はグリシンとスクシニル
CoA を基質として ALA を合成するのに対し、AlmA はアラニンとスクシニル
CoA を基質としてアラレマイシン中間体を合成していると考えられた。ALASは動物、真菌、α-プロテオバクテリアに属する一部の細菌において保存されているのに対し、多くの細菌と植物は ALAS と全く関連のない HemA を介した経路により ALA を合成する。ALAS がどのように出現し進化してきたのか興味深い。本実験では AlmA と ALAS の進化上の関係性を探るために、AlmA の反応
生成物をアラレマイシン中間体から ALA へと変化させる機能改変を試みた。
【方法】AlmA と ALAS のアミノ酸配列比較や ALAS の結晶構造を基に、両者の基質特異性の違いをうむアミノ酸残基を推定した。塩基置換したプライマーを用いた PCR 法により変異 AlmA をコードするプラスミドを構築した。変異 AlmAの ALA 合成活性を調べるため、ALA 要求性を示す大腸菌 MG1655ΔhemA 株で
変異 AlmA を発現させ、その生育を調べた。
【結果】ALAS の活性部位において基質のグリシンと隣接するアミノ酸残基に注
目して、82 番目のセリン残基をトレオニン残基に置換した AlmA-S82T を作製した。AlmA-S82T は ΔhemA 株の生育をわずかに回復した。そこでさらに、活性部位ループにある 86 番目のグリシン残基をセリン残基に置換した AlmAS82T/G86S を作製した。その結果、ΔhemA 株の生育が顕著に回復した。この結果から AlmA-S82T/G86S は ALA 合成活性を持つようになったと考えられた。
本実験より、AlmA と ALAS の進化的関連性が強く示唆された。

[背景と目的]
色素依存性 L-乳酸脱水素酵素（Dye-LLDH）はフラビン類を補酵素とし人工酸
化還元色素存在下で L-乳酸からピルビン酸への酸化反応を触媒する酵素である。我々は、好熱性アーキア S. tokodaii のゲノム情報から Dye-LLDH をコードしていると予測される遺伝子クラスターを見出した。そこで、好熱性アーキア
S. acidocaldarius を宿主としたタンパク質発現系を作成し、本遺伝子クラスターの発現を行った。その結果、この遺伝子クラスターの発現産物から Dye-LLDH
活性を検出することができ、SDS-PAGE の結果から本酵素は 2 つの異なるタンパク質からなるヘテロ複合体構造をとっていることが判明した。また、本酵素の詳細な酵素化学的性質を測定した結果、本酵素は、これまでに見出されている Dye-LLDH に比べ非常に高い安定性を示したことから応用のための有用性が確認できた。しかし、現在用いているアーキアを宿主としたタンパク質発現系
では発現量が少ないため酵素の応用利用の律速となっている。そこで、本研究では大腸菌を宿主として好熱性アーキア由来 Dye-LLDH を発現させる発現系の構築を目的とした。
[方法]
Dye-LLDH を構成するタンパク質をコードする遺伝子を導入した大腸菌用タン
パク質発現用プラスミドを作成した。この発現プラスミドを E. coli BL21CodonPlus(DE3)-RIL に導入し形質転換した。その後、得られた形質転換株を培養、組換えタンパク質誘導後、本酵素の精製を行った。
[結果と考察]大腸菌を宿主として用いることにより S. acidocaldarius を宿主とした場合に比べて組換えタンパク質発現の効率化に成功した。また、発現した組換え DyeLLDH は S. acidocaldarius を宿主として発現させた酵素と同様の安定性が確認できた。

Functional transformation of alaremycin synthesizing enzyme to 5aminolevulinic acid synthase ALAS

Construction of expression system of dye-linked L-lactate dehydrogenasefrom Sulfolobus tokodii using E. coli as host○Jun Kawaguchi, Hikaru Mori, Noritaka Iwai, Masaaki Wachi(Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)○Kohei Uno1, Takenori Satomura1,2, Norio Kurosawa3, Haruhiko Sakuraba4,
Shin-ichiro Suye1,2(1Grad. Sch. Eng. Fukui Univ., 2Life Sci. Univ. Fukui., 3Soka Univ., 4Fac. Agric.,
Kagawa Univ.)

Key words

evolutionary engeneering, 5-aminolevulinic acid, ALAS, alaremycin

Key words
flavoprotein, thermostable enzyme, L-lactic acid, dye-linked
dehydrogenase

3Ap03

ビフィズス菌の含硫アミノ酸代謝に関与する C-S リアー
ゼの解析

3Ap05

○黒瀧 空, 松本 菜々恵, 吹谷 智, 横田 篤, 和田 大
（北大院・農）wada@chem.agr.hokudai.ac.jp

分岐鎖ポリアミンが超好熱菌の RNA ポリメラーゼ複合体に及ぼす影響○福田 萌子 1, 家森 優佳 1, 濱川 匡史 1, 秀瀬 涼太 2, 福田 青郎 1,
藤原 伸介 1
（1関西学院大・理工, 2神戸大院・科技イノベ）
fujiwara-s@kwansei.ac.jp【背景・目的】ビフィズス菌は宿主に対して整腸作用や免疫賦活化作用などの健康増進効果を示し，プロバイオティクスとして発酵乳製品などに用いられている．ビフィズ
ス菌の有用効果を充分に活用するためにはビフィズス菌自身の栄養生理に関する理解が必要である．しかし，ビフィズス菌の栄養代謝については不明な点が多いのが現状である．アミノ酸代謝については特に生物に必須な含硫アミノ酸であるシステイン（Cys）／メチオニン（Met）の代謝系は研究が進んでいな
い．我々はビフィズス菌の含硫アミノ酸代謝系に着目し，全容を解明することを目指して研究を行なっている．本研究では，含硫アミノ酸代謝系の中でも未だ同定されていない L-シスタチオニンの C-S 結合を切断し，Cys とホモシステ
インを与える C-S リアーゼの詳細な評価を行い，同定を試みた．
【方法・結果】
ヒト由来の Bifidobacterium longum 105-A のゲノムから RNA-Seq により Met を
単一硫黄源とした場合に誘導される遺伝子，あるいは他の細菌の C-S リアーゼのアミノ酸配列との比較により，４つの C-S リアーゼ候補遺伝子（BL105A_0013，BL105-A_0509，BL105-A_0510，BL105-A_1451）を選抜した．それらの遺伝子を pET ベクターに導入して発現ベクターを構築した．それらを大腸菌に導入して，発現誘導剤（IPTG）を添加し，C-S リアーゼを発現させ，得られた酵素について DTNB 法を用いて活性測定を行った．
その結果，BL105-A_1451 遺伝子から生産されるタンパク質にのみ活性が認められ，シスタチオニン β-リアーゼ（CBL）活性があると考えられた．現在 BL105A_1451 産物が実際にどのような反応を触媒するのかについて詳細に検証中である．

【目的】ポリアミンとは分子内に 2 個以上のアミノ基をもつ脂肪族炭化水素の総称であり、細胞分裂から転写・翻訳など様々な生命現象に寄与する。超好熱菌
Thermococcus kodakarensis は至適温度を 85℃にもつアーキアであり、スペルミ
ジン[34]のような直鎖ポリアミンに加え、分岐型構造をもつポリアミンである
N4-ビス（アミノプロピル）スペルミジン[3(3)(3)4]を有している。分岐鎖ポリア
ミン合成酵素遺伝子（BpsA）を破壊した T. kodakarensis では、90 〓 C 以上では野生株に比べ比増殖速度が著しく低下する。本研究では高温環境で重要な分岐鎖ポリアミンについて、超好熱菌細胞内における転写、特に RNA ポリメラーゼ（RNAP）複合体への寄与について研究を行った。
【方法と結果】トランスクリプトーム解析より、BpsA 破壊株では転写産物量が減少する遺伝子が存在することがわかった。このため RNAP が分岐鎖ポリアミンの影響を受けると推察された。そこで His タグ融合 RNAP を生産する T.
kodakarensis（KUWL 株）及びさらにこの BpsA 破壊株（DBP4 株）を作製し、それぞれの株から RNAP を抽出した。DBP4 株由来 RNAP は KUWL 株 RNAPに比べて高温での転写活性が低く、熱安定性が低いという結果が得られた。また各 RNA ポリメラーゼを SDS-PAGE により分画し LC-MS 解析を行った。その
結果、KUWL 株で検出されたリボソームタンパク質の多くが、DBP4 株では検出されなかった 1)。このことから野生株 T. kodakarensis 細胞内で RNAP とリボ
ソームは共役しており、この共役には分岐鎖ポリアミンが必要であることが示唆された。
１) Yamori Y. et al., Amino Acids (2019) in press

Analysis of C-S lyase involved in sulfur amino acid metabolism in
Bifidobacterium longum 105-A

Effect of branched-chain polyamine on RNA polymerase complex in thehyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakarensis.

○Sora Kurotaki, Nanae Matsumoto, Satoru Fukiya, Atsushi Yokota, Masaru Wada
(Grad. Sch. Agric., Hokkaido Univ.)

Key words
beta-lyase

Bifidobacterium longum, sulfur amino acid metabolism, cystathionine○Moeko Fukuda1, Yuka Yamori1, Masahumi Hamakawa1, Ryota Hidese2,
Wakao Fukuda1, Shinsuke Fujiwara1(1Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe
Univ.)

Key words
Thermococcus kodakarensis, branched-chain polyamine, transcription,
RNA polymerase

277

3Ap06

好塩性アーキアにおけるグリコールアルデヒド代謝酵素の同定と解析

3Ap08○佐藤 喬章 1, 平田 晃右 1, 南 瞭子 2, 跡見 晴幸 1
（1京大院・工, 2京大・工）takaakisato@sbchem.kyoto-u.ac.jp

生細胞内分子クラウディング環境の再構成への試み○田中 遼治, 青木 航, 植田 充美（京大院・農）miueda@kais.kyoto-u.ac.jp【背景】
当研究室におけるこれまでの研究により、高塩濃度環境下に生育している好塩性アーキアの一部が有する新規ヌクレオシド分解経路の存在が示唆されている。
本経路ではヌクレオシドのリボース部位がジヒドロキシアセトンリン酸とグリ
コールアルデヒドに代謝される。ジヒドロキシアセトンリン酸はさらに中央糖代謝経路により代謝され得るが、グリコールアルデヒドがどのように代謝されるかは不明であった。そこで、本研究では好塩性アーキアにおけるグリコール
アルデヒド代謝酵素の同定を進めた。
【方法・結果】
好塩性アーキアのゲノム情報を基にグリコールアルデヒド代謝酵素をコードする遺伝子の候補を探索し、上記のヌクレオシド代謝経路を構成する遺伝子とオペロンを形成している遺伝子を見出した。この遺伝子を発現させた大腸菌の無細胞抽出液中の活性を解析したところ、その発現産物はグリコールアルデヒド
を補酵素存在下で還元する活性を示すことが示唆された。しかし、大腸菌での発現量が低く、精製も困難であったため、好塩性アーキアの無細胞抽出液から各種カラムクロマトグラフィーにより目的タンパク質を精製することにした。
その結果、グリコールアルデヒド還元活性を示すタンパク質をほぼ単一となるまで精製することができた。そこで精製酵素の生化学的解析を進めた。数種の基質に対する活性を検討したが、その中ではグリコールアルデヒドに対してのみ有意な活性を示し、高い基質特異性が示唆された。速度論的解析により各速度論的パラメーターも算出した。また、培地への各種ヌクレオシドの添加により、本酵素の細胞内における活性が上昇することも明らかにした。さらに、LCMS 解析により精製酵素の同定を行った。予測とは異なり、元々候補として推定していたものとは異なる酵素であった。

【方法と結果】我々は、代謝に関連する要素の中でも特に ATP 合成酵素に注目した。その回転運動による物理的な攪拌が高濃度溶液の粘度上昇を抑制し、酵素反応を活性化するのではないかと仮説を立て、その検証を行った。初めに、凍結乾燥によって大腸菌破砕液を 2 時間濃縮して、タンパク質濃度の変化を測定した。また、濃縮に伴う粘度の増加を FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching)で評価し、GFP 分子の拡散係数の低下を確認した。さらに ATP 合成
酵素を反転膜小胞として調製し、その粘度に与える影響を評価した。これらの結果をまとめて報告する[3]。
[1] Fujiwara et al, PLOS ONE 2013; 8(1):e54155, [2] Parry et al, Cell 2014; 156(1-2):
183-194, [3] Tanaka et al, submitted

Identification and functional analysis of an enzyme metabolizing
glycolaldehyde in halophilic archaea

Chanllenge of reconstruction of intracellular macromolecular crowding
conditions○Takaaki Sato1, Kosuke Hirata1, Ryoko Minami2, Haruyuki Atomi1(1Grad. Sch. Eng., Kyoto Univ., 2Fac. Eng., Kyoto Univ.)【背景と目的】in vitro での酵素反応解析は、希薄溶液で行われてきた。しかし、細胞内は核酸・タンパク質などの高分子が高密度に夾雑したクラウディング環境である。細胞内で起きるクラウディング現象は酵素反応に様々な影響を及ぼすと考えられるので、生化学反応のさらなる理解のためには細胞内環境を模倣した in vitro 反応系での実験が必要である。しかし、このような反応系は作製できていない。そこで、細胞破砕液が反応系として利用されてきたが、細胞破砕
液の高分子濃度・粘度は低く、細胞環境を正確に再現できていない。例えば、溶媒の除去によって細胞破砕液を濃縮する方法で高分子濃度を細胞に近づけた
ところ、粘度が細胞内より大幅に高くなるという課題があった[1]。正常な細胞内では、高分子濃度が 300-400 mg/mL と極めて高いが、代謝関連の機構が粘度上昇を抑制していることが示唆されている[2]。そこで本研究では、細胞破砕液の濃縮と代謝関連機構の再構成によって、細胞と同等の高分子濃度・粘度の invitro 反応系を作製することを目指した。

○Ryoji Tanaka, Wataru Aoki, Mitsuyoshi Ueda
(Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)

Key words

halophile, archaea, nucleoside, metabolism

Key words

molecular crowding, bottom-up reconstruction, FRAP, molecular motor

3Ap07

PL14 ファミリーに属する新規ウルバンリアーゼ

3Ap09

ラン藻 Synechocystis sp. PCC 6803 の酵素フマラーゼ(FumC)の生化学解析

佐藤 嶺, 小林 慎太郎, 籾山 健太, ○大西 浩平（高知大・農）kouheio@kochi-u.ac.jp○片山 徳賢, 小山内 崇（明治大院・農）tosanai@meiji.ac.jp

緑藻は硫酸化多糖ウルバンを細胞壁構成成分として持つ。我々は 2 種類の緑藻、ミナミアオサとミナミアオノリから熱水抽出したウルバンを唯一の炭素源として生育する資化細菌を多数単離している。資化細菌は菌体外に多糖分解酵素であるウルバンリアーゼを分泌し、ウルバンをオリゴ糖化したのち、菌体内に取り込む。ゲノム配列解析の結果、いずれの資化細菌も polysaccharide lyase (PL)24
ならびに PL25 ファミリーに属するウルバンリアーゼを複数種保有していることが明らかとなっている。さらに、PL24 ファミリー酵素は C 末端側にウルバン結合領域を持つロング型と持たないショート型の 2 種類があることも判っている。一方、資化細菌が分泌する菌体外タンパク質を網羅的に解析した結果、菌体外にはロング型の PL24 ファミリー酵素が主要なウルバン分解酵素として存在していた。ところが、ミナミアオノリ由来ウルバンを基質としたときにのみ、ウルバン分解活性を示す分子質量 25 kDa の菌体外酵素が新たに検出された。しかも、本酵素はミナミアオノリ由来ウルバン資化細菌の培養上清にだけ存在していた。そこで、本酵素をコードする遺伝子の同定を試みたところ、PL14 ファミリーに属する新規のウルバンリアーゼであることが明らかとなった。本酵素遺伝子は、すべてのミナミアオノリ由来ウルバン資化細菌に存在しており、酵素活性の結果とよく一致していた。本酵素はこれまでに知られているいずれのウルバンリアーゼとも相同性を示さない。本酵素遺伝子をクローニングし大腸菌で発現、精製を行い、酵素の性質を調べた。新規ウルバンリアー
ゼはミナミアオサ由来ウルバンに対して反応性を全く示さなかった。一方、ミナミアオノリ由来ウルバンに対しては活性を有していたが、ロング型 PL24 ファミリー酵素とは異なるウルバン分解パターンを示した。

【背景と目的】米国エネルギー省の定めるバイオリファイナリーでの重要な 12品目にはコハク酸やフマル酸、リンゴ酸という C4 化合物が含まれる。フマラー
ゼは、TCA 回路内のリンゴ酸とフマル酸の相互変換反応を触媒する酵素である。しかし、モデルラン藻である Synechocystis sp. PCC 6803 のフマラーゼ（以後 SyFumC と表記）の生化学的特徴については報告がないため、本研究ではSyFumC の生化学解析とアミノ酸残基の改変による機能改変を試みた。
【方法】GST タグを付加した SyFumC を Escherichia coli を用いて発現させ、回収した E. coli の細胞破砕液からアフィニティークロマトグラフィーによって
SyFumC の精製を行った。分光光度計(UV-1850, 島津製作所)を用いて、フマル酸の波長 250 nm における吸収の減少及び増加を測定することで、フマル酸または L-リンゴ酸に対する酵素活性を測定した。他のシアノバクテリアとの FumCのアミノ酸配列の比較から、活性部位周辺において特徴的なアミノ酸残基を決定し、この 314 番目の Ala を変換したタンパク質である SyFumC_A314E を作製し、同様に酵素活性を測定した。
【結果と考察】SyFumC の生化学解析から至適温度及び至適 pH は 30℃、pH 7.5
であるとわかった。また、フマル酸及び L-リンゴ酸に対する Km はそれぞれ
0.244 mM、0.478 mM となり、L-リンゴ酸に対する基質親和性が低いということ が 分 か っ た 。 ま た 、 kcat/Km は そ れ ぞ れ 415.1 、 90.3 s-1 mM-1 と な っ た 。
SyFumC_A314E では至適温度及び pH は違いがほとんど見られなかったが、フマル酸を基質としたときの kcat が 101.2 s-1 から 37.8 s-1 へと低下した。このこと
は L-リンゴ酸を基質にした場合でも確認された。
以上より、今回改変した活性部位近傍のアミノ酸残基は触媒活性に重要な残基であると考察される。今後は他種シアノバクテリアのフマラーゼについても解析を行いたいと考えている。

A novel ulvan lyase belonging to PL14 family

Biochemical characterization of Fumarase C properties from a unicellularcyanobacterium demonstrates enzymatic activity altered by an amino acidsubstitution.

Ryo Satoh, Shintaro Kobayashi, Kenta Momiyama, ○Kouhei Ohnishi(Fac. Agric. Agric. Sci. Prog., Kochi Univ.)

Key words
polysaccharide-degrading enzyme, glycoside hydrolase, ulvan,
substrate specificity○Noriaki Katayama, Takashi Osanai(Grad. Sch. Agric., Meiji Univ.)

Key words

biochemistry, cyanobacteria, enzyme activity, TCA cycle

278

3Bp01

Domain structure and function of α-1,3-Glucanase from
Streptomyces thermodiastaticus HF3-3

3Bp03○Niphawan Panti1, Vipavee Cherdvorapong1, Wassana Suyotha2,
Kazuyoshi Takagi3, Shigekazu Yano4, Yosuke Toyotake1,
Mamoru Wakayama1(1Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Dept. Indust Biotechnol.,Fac. Agro Indust., Prince of Songkla Univ., 3Dept. Applied Chem.,
Fac. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 4Dept. Biochem. Engineer.,Grad. Sci Engineer., Yamagata Univ.)
wakayama@sk.ritsumei.ac.jp

Spirochaeta thermophila 由来 β-1,3 オリゴグルカンホス
ホリラーゼの諸性質○藤野 早瑛, 谷 修治, 炭谷 順一, 川口 剛司（阪府大院・生環科）
monger@biochem.osakafu-u.ac.jp

α-1,3-glucanase is an enzyme that hydrolyzes α-1,3-glucan, the main component of
extracellular polysaccharides synthesized from sucrose by Streptococcus mutan via
glycosyltransferases, component of dental plaque in human, also has been found in thecell wall of fungi. In previous study were determine the amino acid sequence of GH 87
α-1,3-glucanase from Streptomyces thermodiastaticus HF3-3 (Agl-ST2) which wascategorized as new group of α-1,3-glucanase, multi-domains enzyme including Nterminal binding domain, carbohydrate binding module family 35, C-terminal catalytic
domain and discoidin domain (DS), respectively. The comparison of Agl-ST2 with therelated enzymes revealed high similarity to mycodextranase (85%), whereas had low
homology with α-1,3-glucanase. But the properties indicated that Agl-ST2 belongs to
α-1,3-glucanase. Since Agl-ST1 is generated from Agl-ST2 by truncation of DS
region, the multi-domains of Agl-ST1 showed same as Agl-ST2 but without DS. In
this study to understand domain structure and function of Agl-ST(1&2) in α-1,3-glucanhydrolysis, we are interested in determining each domain structure and function of the
Agl-ST in the α-1,3-glucan binding and hydrolysis by constructing several domain
deletions and site-directed mutation. The preliminary results of Agl-ST with sitedirected mutation indicated low activities of hydrolysis α-1,3-glucan, while preparationof several domain deletions and the evaluation of their function are in the process ofcollecting data and analyzing.

【背景・目的】グルコース（Glc）が β-1,3 結合したラミナリオリゴ糖（LO）は機能性食品などへの応用が期待されており、安価な合成法が望まれている。本
研究では LO を合成する方法として、ホスホリラーゼに着目した。LO に作用するホスホリラーゼは通常、ラミナリビオースの加リン酸分解反応とその逆反応を触媒するラミナリビオースホスホリラーゼとラミナリトリオース以上の LOの加リン酸分解反応とその逆反応を触媒する β-1,3-オリゴグルカンホスホリラー
ゼ（LOP）に大別される。GH149 に属する Euglena gracilis 由来の LOP（EgLOP）
は LO のみならず、安価な Glc も糖受容体として認識する非常に有用な酵素であ る が 、 安 定 性 に 問 題 が あ っ た 。 そ こ で 本 研 究 で は 、 好 熱 菌 Spirochaeta
thermophila 由来 EgLOP ホモログについて大腸菌を用いて異種発現を行い、発現産物の機能解析を行うことを目的とした。
【方法・結果】S. thermophila から PCR により目的遺伝子を取得した。C 末端に
His-tag が付加されるよう発現プラスミドを構築し、宿主を大腸菌 JM109（DE3）とすることで目的遺伝子が可溶性タンパク質として発現した。この発現産物を
StLOP と命名し、アフィニティクロマトグラフィーおよび疎水クロマトグラ
フィーによって電気泳動的に単一になるまで精製した。本酵素はゲル濾過による分子量測定の結果、単量体であることが示された。また 55℃、30 分の処理で約 80％以上の残存活性を示し、ホスホリラーゼとしては比較的熱安定性が高いことが判明した。脱リン酸合成反応のカイネティックパラメータを測定した
結果、触媒効率が他の EgLOP ホモログよりも高く、LO 合成酵素として有用であることが示された。また、基質の重合度が高くなるにつれて触媒効率が低下
し、短いオリゴ糖合成に適していることが示唆された。

Domain structure and function of α-1,3-Glucanase from Streptomyces
thermodiastaticus HF3-3

Characterization of β-1,3-oligoglucan phosphorylase from Spirochaeta
thermophila○Niphawan Panti1, Vipavee Cherdvorapong1, Wassana Suyotha2,
Kazuyoshi Takagi3, Shigekazu Yano4, Yosuke Toyotake1, Mamoru Wakayama1(1Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Dept. Indust Biotechnol., Fac. Agro
Indust., Prince of Songkla Univ., 3Dept. Applied Chem., Fac. Life Sci., Ritsumeikan
Univ., 4Dept. Biochem. Engineer., Grad. Sci Engineer., Yamagata Univ.)
Key words
alpha-1, 3-glucanase, alpha-1, 3-glucan, alpha-1, 3-glucan-binding
activity

3Bp02

Characterization of catalytic α-1,3-glucanase isozymes
from Paenibacillus glycanilyticus FH11 by using
Brevibacillus system; Essential for suppression anddegradation of Streptococcus mutans biofilms○Rattanaporn Intuy1, Takao Hibi2, Takafumi Itoh2,
Wassana Suyotha3, Shigekazu Yano4, Mamoru Wakayama1(1Coll. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Dept. Biosci. Fukui Prefectural
Univ., 3Dept. Indus. Biotech. Fac. Agro-indus. Prince of Songkla
Univ., 4Grad. Sch. Sci. Eng., Yamagata Univ.)
wakayama@sk.ritsumei.ac.jp
α-1,3-Glucan has been recognized as a virulence factor in dental caries. Two novel
catalytic domains of α-1,3-glucanase isozyme genes were cloned from P. glycanilyticus
strain FH11 and expressed in Brevibacillus system. The recombinant enzymes, intermed CatAgl-FH1 and CatAgl-FH2, were purified to homogeneity with specificactivity 0.70 U/mg and 0.77 U/mg respectively. The molecular mass of enzyme wasestimated 62 kDa by SDS-PAGE. Both recombinant enzymes exhibited the different
properties. The optimal pH of CatAgl-FH1 and CatAgl-FH2 were 5.5 and 6.0,
respectively. The pH stability of CatAgl-FH1 and CatAgl-FH2 were in a range of pH
4.0-11.0 and 4.5-9.0, respectively. The optimal temperature of CatAgl-FH1 andCatAgl-FH2 were 60°C and 55°C, respectively and they were stable until 60°C. Thin
Layer chromatography revealed their mode of hydrolysis towards α-1,3-glucan was
endo-cleavage pattern. The major products of CatAgl-FH1 were di- and trisaccharide
but mainly trisaccharide was for CatAgl-FH2. Both enzymes showed high tolerance
against high concentration of sodium fluoride. For S. mutans biofilms studies, both ofrecombinant enzymes inhibited biofilm formation via hydrolyzing α-1,3-glucan morethan 80% compared to untreated biofilm at 16 h reaction time without affecting
bacterial growth. Morover, CatAgl-FH1 was able to degrade formed biofilm
approximately 70% while CatAgl-FH2 showed less than 40% at 16 h of reaction time.
Therefore, these enzymes could be applied in oral hygiene products such as toothpaste.

Characterization of catalytic α-1,3-glucanase isozymes from Paenibacillus
glycanilyticus FH11 by using Brevibacillus system; Essential for suppression
and degradation of Streptococcus mutans biofilms○Rattanaporn Intuy , Takao Hibi , Takafumi Itoh , Wassana Suyotha ,Shigekazu Yano4, Mamoru Wakayama1(1Coll. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Dept. Biosci. Fukui Prefectural Univ., 3Dept.
Indus. Biotech. Fac. Agro-indus. Prince of Songkla Univ., 4Grad. Sch. Sci. Eng.,
Yamagata Univ.)
Key words
Streptococcus mutans, alpha-1, 3-glucanase, catalytic domains,
Brevibacillus
1

2

2

3

○Sae Fujino, Shuji Tani, Jun-ichi Sumitani, Takashi Kawaguchi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Key words

Spirochaeta, phosphorylase, laminarioligosaccharide, kinetics

3Bp04

麹菌 Aspergillus oryzae が生産するヘミセルラーゼの協調的作用○松沢 智彦, 矢追 克郎（産総研・生物プロセス）
matsuzawa-tomohiko@aist.go.jp[背景と目的] 糸状菌は植物等が生産する多糖類を分解・資化するために様々な酵素を分泌している。植物が生産する多糖類は構造が多種多様であり、複雑な枝分かれ構造を有している。例えば、ヘミセルロースの一種であるキシログル
カンは beta-1,4-グルカン主鎖にキシロースが規則的に枝分かれした構造を基本とし、さらにキシロース側鎖にはガラクトースなどの糖が付加されている。このような複雑な多糖類は単一の酵素のみでは分解できず、様々な酵素の協調的作用が必要不可欠 である。我々はキシログルカンの分解に関与する麹菌
Aspergillus oryzae 由来イソプリメベロース生成酵素（IpeA）をコードする遺伝子を同定した。本酵素はキシログルカンオリゴ糖の非還元末端のイソプリメベ
ロース（alpha-D-xylopyranosyl-(1→6)-D-glucopyranose）ユニットを認識して遊離するユニークな加水分解酵素であり、キシログルカンの分解に重要な役割を担っている。我々は IpeA と協調的に働く酵素の探索を行い、麹菌におけるキシログ
ルカン分解機構の解明を目指した。
[方法と結果] IpeA をコードする遺伝子はキシログルカンオリゴ糖存在下において劇的に発現が誘導される。本遺伝子と同調的に発現している遺伝子を探索したところ、beta-ガラクトシダーゼ（LacA）をコードする遺伝子がキシログルカ
ンオリゴ糖存在下において発現が誘導されることを見出した。LacA の基質特異性を調べた結果、本酵素はキシログルカンオリゴ糖のガラクトース側鎖を効率的に遊離させることが明らかになった。また、LacA と IpeA が相互依存的にキシログルカンオリゴ糖を分解する機構を見出したので報告する。

Synergetic effects of two hemicellulases in Aspergillus oryzae○Tomohiko Matsuzawa, Katsuro Yaoi
(BPRI, AIST)

Key words

Aspergillus oryzae, hemicellulose, beta-galactosidase, enzyme

279

3Bp05

Talaromyces cellulolyticus 由来グルクロノキシラナーゼ
の機能解析

3Bp07

○中道 優介, Fouquet Thierry, 伊藤 祥太郎, 渡邊 真宏, 松鹿 昭則,
井上 宏之（産総研・機能化学）
nakamichi-y@aist.go.jp

κ-カラギナーゼ生産菌の分離およびその酵素の性質○倉掛 昌裕, 石本 圭亮, 山岡 美桜, 筒井 莊周, 長岡 洋大（福山大・生命工）kurakake@fukuyama-u.ac.jp

メチルグルクロン酸側鎖 (MeGlcA) 依存的にキシラン主鎖を分解するグルクロ
ノキシラナーゼは、糖質加水分解酵素ファミリー 30 (GH30) のサブファミリー
7 並びに 8 に分類される。細菌由来の GH30-8 キシラナーゼと比較して、主として真菌類に由来する GH30-7 キシラナーゼの機能についての知見は乏しく、立体構造に関する情報は全く無い。本研究では、リグノセルロース糖化酵素を高生産する糸状菌 Talaromyces cellulolyticus (旧 Acremonium cellulolyticus) に由来
する GH30-7 キシラナーゼ Xyn30B の機能と立体構造を明らかにした。
Xyn30B は、グルクロノキシランを基質として、キシロース主鎖の還元末端から 2 糖目に MeGlcA を保持する様々な長さの酸性キシロオリゴ糖 (MeGlcA2Xyln,n > 2) を生成した。一方、Xyn30B によるグルクロノキシランの分解が進行すると、反応液中にキシロビオース (Xyl2) が蓄積し、続いてキシロテトラオース(Xyl4) 並びにキシロヘキサオース (Xyl6) が生成した。従って、Xyn30B は、グル
クロノキシラナーゼ活性に加えて、キシロオリゴ糖の非還元末端からキシロビ
オースを遊離または転移させるキシロビオヒドロラーゼ活性を示す新規なキシラナーゼであることが分かった。Xyn30B の作用機構を明らかにするため、結晶構造を決定した。Xyn30B において、Arg-46 がグルクロノキシラナーゼ活性に重要であり、本アミノ酸残基が他の GH30-7 グルクロノキシラナーゼにも保存されていることを見出した。また、基質結合部位に配置した Xyn30B 特有のループ構造が、キシロビオヒドロラーゼ活性の発現に必要であることが示唆された。

【背景と目的】紅藻類から得られる κ-カラギーナンはゲル化剤として広く食品の添加物として利用されている。非消化性の食物繊維であり、コレステロールの排出作用、整腸作用等の機能性も有している。 この κ-カラギーナンを酵素法により分解することで液状の食物繊維へ、さらに分解することでオリゴ糖となり、その用途はさらに広がることが期待できる。本研究では土壌から κ-カラ
ギーナン分解菌を分離することで、κ-カラギナーゼの探索を行い、その酵素の性質について調べた。
【方法】1％κ-カラギーナン、1.5％寒天の平板培地にて土壌から κ-カラギーナン
分解菌の分離を行った。分離菌を ф18 mm×180 mm 試験管の 0.5％κ-カラギーナ
ン、0.25％酵母エキスの液体培地 3 ml に植菌し、レシプロ振とう 150 回/分、30 ℃で 3 日間培養した。遠心分離 (3000rpm、10 分間)した上清 0.2ml を 1％κ-カ
ラギーナン 1ml に加え混ぜ、pH6 、40℃で 60 分間反応させた。氷水中に 30 分間保持することでゲル化させた。遠心分離 (3000rpm、2 分間) し、上澄みの糖濃度を DNS（3,5-ジニトロサリチル酸）法により求め酵素活性を算出した。また上清を取り除き、残存ゲルの重量を測定した。
【結果と考察】土壌からの κ-カラギーナン分解菌の分離の結果、生育の良いものとして菌株 33 株が得られ、液体培養において細菌 Y35 株に κ-カラギナーゼ
生産性が認められた。酵素生産条件を調べるため培養液の炭素源を κ-カラギー
ナンの他に λ-カラギーナン、ラクトース、ガラクトース、グルコース等として培養したところ、λ-カラギ―ナンによる酵素生産性が高いことがわかった。さらに培養条件について検討し、生産酵素の性質について調べた。

Functional analysis of glucuronoxylanase from Talaromyces cellulolyticus

Isolation of κ-carrageenase-producing strain from soil and the enzymatic
properties.

○Yusuke Nakamichi, Thierry Fouquet, Shotaro Ito, Masahiro Watanabe,
Akinori Matsushika, Hiroyuki Inoue(Inst. Sustain. Chem., AIST)

Key words
Talaromyces cellulolyticus, glucuronoxylanase, xylooligosaccharide,
X-ray crystallography

3Bp06

好冷性海洋細菌 Psychroflexus torquis 由来 β-1,3-キシラ
ナーゼの酵素化学的諸性質○Masahiro Kurakake, Keisuke Ishimoto, Mio Yamaoka, Sousyu Tsutsui,
Youdai Nagaoka(Fac. Life Sci. Biotechnol., Fukuyama Univ.)

Key words

carrageenan, carrageenase, enzymatic hydrolysis, fiber

3Bp08

糸状菌 Aspergillus nidulans がペクチン応答的に生産する細胞外酵素の解析○谷口 瑞季 1, 工藤 基徳 2, 荻野 千秋 3, 近藤 昭彦 2,3, 田丸 浩 1,
青木 恭彦 4, 岡﨑 文美 1
（1三重大院・生資, 2神戸大院・科技イノベ, 3神戸大院・工, 4三重大院・地域イノベ）
okazaki@bio.mie-u.ac.jp○木島 尚輝 1, 山口 愛彩 1, 大堀 沙貴子 1, 鈴木 裕満 1,
高須賀 太一 2, 堀 千明 3, 志水 元亨 1, 加藤 雅士 1
（1名城大院・農, 2北大院・農, 3北大院・工）mkato@meijo-u.ac.jp【目的】β-1,3-キシラナーゼ（EC 3.2.1.32）は、海藻特有の多糖である β-1,3-キシランを加水分解するエンド型の酵素であり、海藻バイオマスの糖化およびガン細胞へのアポトーシス誘導効果を有する β-1,3-キシロオリゴ糖の生産などに有用である。本研究では、産業利用上有用な好冷性 β-1,3-キシラナーゼの開発を目的とし、南極域の海氷から分離された好冷性海洋細菌 Psychroflexus torquis 由
来 β-1,3-キシラナーゼの酵素化学的諸性質の解明を試みた。
【方法】Psychroflexus torquis ATCC 700755 のゲノム DNA から β-1,3-キシラナー
ゼ遺伝子（P.t. xyn26A）を PCR により増幅し、pCold-ProS2 ベクターに連結した。構築したプラスミドベクターを大腸菌 BL21(DE3)に導入し、ProS2 タグとの融合タンパク質として発現させ、固定化金属アフィニティークロマトグラ
フィー（IMAC）担体により精製した。β-1,3-キシランを基質として遊離した還元糖量を定量し、酵素活性を測定した。
【結果】発現誘導した組換え大腸菌内に目的タンパク質の生産が確認された。菌体を超音波破砕したところ、目的タンパク質が凝集性を示した。そこで、終濃
度 500 mM のアルギニン塩酸塩および塩化ナトリウムの共存下において凝集を抑制し、IMAC 担体により精製した。次いで、ProS2 タグを切断し、精製組換
え酵素（P.t. Xyn26A）を得た。本酵素は β-1,3-キシランに特異的に作用し、至適 pH は 6.0 付近、至適温度は 35 度付近であった。また、本酵素は反応の初期から β-1,3-キシロビオースを主に生成したことから、エンドプロセッシブ型の作用機構を有することが示唆された。

【目的】 植物バイオマスの主成分である多糖類の分解の速度および効率が高まれば、バイオ燃料生産やバイオリファイナリーなどの産業分野に大きく貢献することができる。糸状菌 Aspergillus nidulans はデンプン、セルロース、ヘミセ
ルロース、ペクチンの分解能を有していることから、それら多糖類の分解に関わる細胞外酵素およびそれらの転写制御について研究が盛んに行われている。
本研究では、ペクチンを唯一の炭素源にして生育させた際に A. nidulans が細胞外に分泌するタンパク質を網羅的に解析した。また、同定されたタンパク質の中で機能が明らかになっていないタンパク質 (Hypothetical Protein ; HP) や、既知の CAZyme (Carbohydrate-Active enZymes；糖質関連酵素) に分類されているがその機能が証明されていないタンパク質を選抜し、それらの機能を解析した。
【方法および結果】 ペクチンを唯一の炭素源にした培地で A. nidulans を所定時間培養後、菌体をろ別した。得られた培養ろ液から TCA/アセトン沈殿によりタンパク質を回収した。トリプシン処理後、LC-MS/MS にてセクレトーム解析したところ、総数で 304 種のタンパク質が同定され、その内の 55 種が HP であった。また、ペクチンの分解に関わる酵素である Glycoside Hydrolase family
78 (GH78) や GH105、 Polysaccharide Lyase family 1 (PL1) 、PL3 、PL4 、PL9 に属するタンパク質が発現していた。いくつかの HP をメタノール資化酵母 Pichia
pastoris を用いて異種発現させ、機能解析をした。その結果、新規ラムノガラク
ツロナン分解酵素などを見出すことに成功した。

Biochemical characterization of a psychrophilic β-1,3-xylanase from
Antarctic sea-ice bacterium, Psychroflexus torquis

Secretome analysis of Aspergillus nidulans grown on pectin○Mizuki Taniguchi1, Motonori Kudou2, Chiaki Ogino3, Akihiko Kondo2,3,
Yutaka Tamaru1, Takahiko Aoki4, Fumiyoshi Okazaki1(1Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.,
3
Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 4Grad. Sch. Region. Innov. Stud., Mie Univ.)

Key words

beta-1, 3-xylanase, beta-1, 3-xylan, Psychroflexus torquis, psychrophile○Naoki Kijima1, Aya Yamaguchi1, Sakiko Ohori1, Hiromitsu Suzuki1,
Taichi Takasuka2, Chiaki Hori3, Motoyuki Shimizu1, Masashi Kato1(1Grad. Sch. Agric., Meijo Univ., 2Grad. Sch. Agric., Hokkaido Univ., 3Grad. Sch.
Eng., Hokkaido Univ.)

Key words

Aspergillus nidulans, hypothetical proteins, secretome

280

3Bp09

微生物由来耐熱性 β-アミラーゼの性質と X 線結晶構造
解析

3Cp02

○田中 真奈, 西村 重徳, 谷 修治, 炭谷 順一, 川口 剛司（阪府大院・生環科）
monger@biochem.osakafu-u.ac.jp

抗体断片の熱安定性向上を目的としたバイオ情報を活用したライブラリーデザインサイクルの提案○服部 修平, 本田 亜由美, 二井手 哲平, 中澤 光, 梅津 光央（東北大院・工）mitsuo@tohoku.ac.jp【背景と目的】 β-アミラーゼはデンプンを非還元末端からマルトース単位に加水分解する酵素であり、食品産業にて利用される。近年、酵素の主な獲得源である穀物の価格が高騰傾向にあることやマルトース製造段階で熱処理が行われることから、安定供給が可能でかつ耐熱性を有する β-アミラーゼの獲得が望まれる。
当研究室において土壌を分離源として熱安定性を示す β-アミラーゼ生産菌のス
クリーニングが行われ Bacillus 属に属する一菌株が単離された。そこで、本研
究では本菌株由来 β-アミラーゼの諸性質を検討するとともに、X 線結晶構造解
析によって熱安定性を決定する構造的要因について知見を得ることで、産業応用に資する β-アミラーゼを創製することを目的とした。
【結果】 高効率分泌発現を特徴とする Brevibacillus を宿主とし、本酵素遺伝子を発現させたところ、高い生産性が確認できた。得られた培養上清を用いて酵素を精製し、諸性質を検討した。その結果、本酵素の至適温度は 50℃で、60℃、60 分間の処理後も安定であり、市販品酵素で最も熱安定性が高いとされるダイズ由来酵素よりも安定性に優れていた。また産業利用を考慮して高温条件で生デンプン分解を調べた結果、植物由来酵素と比較して高い生デンプン分解活性を有することが判明した。本酵素の高い熱安定性に関与する構造的要因を明らかにするため、精製酵素の結晶化及び X 線結晶構造解析を行った。その結果、1.8Å の解像度で立体構造の決定に成功した。本酵素は(β/α)8 バレル構造からなる触媒ドメインと CBM20 に分類されるスターチ結合ドメインを有し、熱安定性の低い Bacillus cereus var. mycoides 由来 β-アミラーゼ(identity : 52%)と非常に類似した立体構造であることが判明した。両者の構造の類似性より、本酵素が有する耐熱性は微小な構造の違いに起因するものであると推察された。

抗体の熱安定性向上を試みる際に、抗体の可変領域断片(Fv)の相補性決定領域(CDR)以外のフレームワーク領域(FR)ではアミノ酸配列の相同性が高いことに着目し、FR のレアなアミノ酸残基を出現頻度の高いアミノ酸に置換する手法が報告されている。しかし、標的認識に寄与しない FR に変異導入を行うことで予期しない結合活性の低下が起こりうる。そこで、設計したライブラリーをス
クリーニングすることにより目的機能を有するタンパク質を取得する進化分子
工学的な手法を用いることで、変異体の特性をモニタリングしながら抗体改変が可能となる。本研究では、バイオ情報から変異導入部位の決定と候補のアミノ酸の選抜を行い、設計した小規模ライブラリーのスクリーニングを行うサイ
クルを繰り返すことで抗体断片の熱安定性向上を試みた。
我々は、野生型抗体の配列を抗体データベースである abYsis により配列相同性を算出し、フレームワーク領域の配列相同性を 5 段階の変異体を作製した。その結果、FR 中の 30%までに至る 50 個のアミノ酸を相同性の高いアミノ酸へ置換することによって変性中点(Tm)が向上した一方、結合親和性が 10 倍低下していた。この結果から、安定性が向上することで結合力が低下してしまうことが示された。そこで、結合活性を維持した状態で安定性が向上した変異体の取得を試みた。出現頻度をしきい値に設定し、段階的に野生型か出現頻度の高い
アミノ酸かを選択する小規模ライブラリーのスクリーニングを行うサイクルを繰り返し行うことで、新規変異体の取得を行った。その結果、結合活性を維持した状態で Tm 値が 15 度以上向上した変異体の取得に成功した。

Characterization and X-ray crystallography of thermostable beta-amylasefrom microbe.

Bioinformatics library design cycle: improvement of thermostability ofantibody fragment○Mana Tanaka, Shigenori Nishimura, Shuji Tani, Jun-ichi Sumitani,
Takashi Kawaguchi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)○Shuhei Hattori, Ayumi Honda, Teppei Niide, Hikaru Nakazawa, Mitsuo Umetsu(Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ.)

Key words

beta-amylase, thermostable enzyme, Bacillus, X-ray crystallography

Key words

antibody, bioinformatics, thermostability, mutagenesis

3Cp01

天然構造特異的認識モノクローナル抗体の作製とその
評価

3Cp03

DlagArt 法を用いた T-cell recruiting 抗体取得のための迅速確実スクリーニング○磯﨑 勇志, 湊元 幹太, 冨田 昌弘（三重大院・工）tomita@chem.mie-u.ac.jp

杉山 在生人, ○中澤 光, 伊藤 智之, 梅津 光央（東北大院・工）mitsuo@tohoku.ac.jp

幅広い分野で利用されているモノクローナル抗体は、近年、分子標的治療薬 (抗体医薬) として注目される。しかし、現在のモノクローナル抗体の多くは、目的抗原の一次配列を認識しており、その天然構造 (立体構造) を認識することは極めて困難である。目的抗原の天然構造を認識することができれば、今までにない革新的な分子標的治療薬として期待できる。
そこで、私達の研究室では、ハイブリドーマ技術を応用した 『立体構造特異的
ターゲティング (SST) 法』 を開発した。本技術の最大のポイントは、DNA 免
疫によって感作された立体構造認識 B 細胞を目的抗原発現ミエローマ細胞によって、抗原抗体反応に基づき選択するところにある。その後、B 細胞-ミエ
ローマ細胞複合体を電気パルスによって選択融合し、抗体産生ハイブリドーマを作製する。その結果、新規法によって得られるモノクローナル抗体は目的抗原の立体構造を認識している可能性が極めて高いと考えられる。
本研究では、創薬のターゲットとして注目されている GPCR の一つである
huCRHR1 (ヒト Corticotropin-releasing hormone receptor 1) をモデルタンパク質として研究を進めた。SST 法に基づき目的の抗体産生ハイブリドーマを作製した
後、限界希釈法を利用してクローン化を行い、プロテイン A を用いて精製を行った。
精製モノクローナル抗体は、Cell-ELISA 法、免疫蛍光染色法、ウェスタンブ
ロッティング法によって評価を行った。その結果、huCRHR1 発現 CHO-K1 細胞への特異的結合が確認された。一方、ウェスタンブロッティング法においては、通常のモノクローナル抗体では変性抗原への結合が確認されたが、精製モノクローナル抗体では確認できなかった。これらの結果から、本研究で作製されたモノクローナル抗体は huCRHR1 の立体構造を特異的に認識している可能性が示された。

抗体医薬開発は進化の一途を辿っており、種々の治療に適した新規抗体構造体の開発が進められている。中でも T-cell recruiting 抗体の開発は、がん治療薬開発に直結する構造体の１つとして注力されている。T-cell recruiting 抗体を開発するために、これまでは、大規模 Fv 変異体提示ファージを作製し、結合活性スクリーニングしたのち、性能の良い数クローンについて、１つ１つ遺伝子組換えによって T-cell recruiting 抗体化し、がん傷害機能を評価していた。手間がかかる上に結合力でのみスクリーニングを行うため偽クローンを取得する例もしばしば見られた。このことから、多検体の T-cell recruiting 抗体について、がん傷害性を指標に評価できるスクリーニング手法の開発が急務であった。
本研究では、以前に作製した培地上清中でも目的の抗体量を正確に測定できる
Tag-sandwitchELISA を用いて、培地上清での細胞傷害活性試験と組み合わせることでハイスループットな T-cell recruiting 抗体スクリーニング法（Domain library
approach for generating Antibody recruiting T-cell 法：DlagArt 法）を完成させた。
この手法を用いて二重二価な T-cell recruiting 抗体（BiBian）をモデルとして細胞傷害活性試験にてスクリーニングを行い。迅速に 88 種から 5 種の Her2 結合性変異体を取得した。

Selective production of native structure-specific monoclonal antibodies andtheir evaluation

Rapid and sure screening process of T-cell recruiting antibody using
DlagArt method

Key words
DNA immunization, GPCR, hybridoma technology, stereospecificmonoclonal antibody

Key words○Yushi Isozaki, Kanta Tsumoto, Masahiro Tomita(Grad. Sch. Eng., Mie Univ.)

Aruto Sugiyama, ○Hikaru Nakazawa, Tomoyuki Ito, Mitsuo Umetsu(Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ.)

antibody, screening, phage display, protein engineering

281

3Cp04

機能的ナノボディ探索に向けた酵母表層提示システムの
最適化

3Cp06

○梶原 果穂 1,2, 青木 航 1,2, 植田 充美 1,2（1京大院・農, 2JST・CREST）
kajiwara.kaho.32a@st.kyoto-u.ac.jp

アルカリフォスファターゼ融合 scFv を用いたモノクロー
ナル抗体樹立○加藤 三恵子 1, 羽生 義郎 2
（1バイオピーク, 2産総研・バイオメディカル）
mieko.kato@bio-peak.com

酵母表層提示システムは、新しいタンパク質工学のために広く使用されてはじめているスクリーニングプラットフォームである。この方法では、提示タンパ
ク質の発現量はプロモーターによって調節され、分泌効率は分泌シグナルに影響を受ける。また、提示タンパク質の基質へのアクセサビリティおよび酵素活
性はアンカータンパク質の長さに影響を受ける。すなわち、目的に応じてシステムを最適化することが必要である。本研究では、ラクダ科動物が持つ単鎖抗体の可変部位であるナノボディの変異体ライブラリーを評価するために、酵母
表層提示システムの最適化を行った。
我々はモデルとして抗ニワトリ卵白リゾチームナノボディ（HEN Nb）を用いた[1]。HEN Nb の表層提示を最適化するために、プロモーター・分泌シグナル・
足場タンパク質の組み合わせを検討した。プロモーターとして、恒常発現プロ
モーターまたはガラクトース誘導性プロモーターを比較した。また、アンカー
タンパク質の長さとして 320 または 649 アミノ酸を、分泌シグナルとしてグルコアミラーゼまたはアルファプレタンパク質由来の配列を比較した。それぞれの酵母株に対して、HA-tag に対する免疫染色により総提示量を、蛍光標識リゾ
チームを用いた染色によりアクセサビリティと活性を評価したので、その結果をまとめて報告する。本研究で得られた結果は、ナノボディの活用に最適な酵
母表層提示システムの開発につながると期待される[2]。
[1] Lauwereys et al. The EMBO Journal. 1998. 17: 3512-3520.
[2] Kajiwara et al. submitted.

【背景】我々は、組換え技術を利用し、効率的にモノクローナル抗体を樹立できる抗体ダイレクトクローニング法 TM を開発した。本法は、大腸菌に一本鎖抗体(scFv）の発現ベクターを導入し、抗原を固定したメンブレン上にコロニーを形成させるとともに発現誘導し、陽性クローンの同定とクローニングを同時に行なうことにより、簡便に目的抗体を取得できる。
【目的】抗体ダイレクトクローニング法 TM は、陽性クローンが産生した抗原特異的 scFv の検出に、scFv に付加したタグを認識する酵素標識 2 次抗体を用いる。この検出ステップには長時間を要し、2 次抗体に由来するバックグラウン
ドや偽陽性がスクリーニングの効率を低下させている。そこで、scFv の N 端にアルカリフォスファターゼ(AP)を融合させ直接検出することで、目的 scFv の検出に 2 次抗体を必要としないシステムを開発することとした。
【方法】初めに、抗マウス IgG scFv の N 端に AP を融合した発現ベクターを作製し、大腸菌に導入後、融合させた AP を直接検出することにより、コロニーの同定が可能かどうかの検討を行った。次いで、ウサギにマウス IgG を免疫した脾臓より調整した抗体遺伝子に、AP を融合した抗マウス IgG scFv 発現ベク
ターライブラリーを作製し、大腸菌に導入後、2 次抗体を使用せず抗体ダイレ
クトクローニング法 TM 実施し、抗マウスモノクローナル抗体の樹立を試みた。
【結果】2 次抗体由来のバックグラウンドや偽陽性が低減したことにより、短時間かつ正確に新規モノクローナル抗体を樹立することが可能となった。さらに、scFv に融合させた AP を直接検出することから、2 次抗体を用いることによる反応の増幅の影響を受けないため、目的抗体の親和性や産生量等の性質も、ス
クリーニングと同時に評価できるようになった。

Optimization of the yeast surface display system for screening of functional
nanobodies

Establishing the monoclonal antibody by screening AlkalinephosphatasescFv library○Kaho Kajiwara1,2, Wataru Aoki1,2, Mitsuyoshi Ueda1,2(1Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 2CREST, JST)

○Mieko Kato1, Yoshiro Hanyu2(1Bio-peak Co., Ltd., 2Biomed. Res. Inst., AIST)

Key words

yeast surface display, protein engineering, nanobody, library

Key words

monoclonal antibody, screening, scFv, alkaline phosphatase

3Cp05

ペプチドバーコードを付加した抗体の結合能の定量評価

3Dp01

超音波処理を用いて低分子化した Schizophyllan の抗ア
レルギー活性○松崎 友星 1,2, 青木 航 1,2, 植田 充美 1,2（1京大院・農・応用生命, 2JST・CREST）
miueda@kais.kyoto-u.ac.jp○湯浅 凌我, 高野 真希, 星野 一宏（富山大院・理工・生命工）khoshino@sus.u-toyama.ac.jp【背景】 ファージや酵母を用いた抗体ディスプレイ系は、ハイスループットに抗体を取得するための優れた方法論であるが、弱点もある。例えば、提示された抗体は安定化されることが多く、遊離状態の抗体と異なる性質を示すことがある。そこで、遊離状態の抗体の結合能をハイスループットに評価するための新規方法論「ペプチドバーコーディング法」を開発してきた[1]。本手法では、
DNA バーコードを付加した抗体遺伝子ライブラリーを発現させ、DNA バーコードに対応するペプチドバーコードとの融合抗体ライブラリーを取得する。次に、結合能の高い抗体からペプチドバーコードを切り出し、質量分析機で同定する。
本手法は、遊離状態の抗体の結合能を評価できるため、より優れた抗体スクリー
ニング法になる可能性がある。本研究では、ペプチドバーコーディングの拡張を目的として、ペプチドバーコードを付加した抗 GFP ナノボディの定量アラニ
ンスキャニングを試みた。
【方法と結果】 6 つの異なるペプチドバーコードをそれぞれ付加した抗 GFP ナ
ノボディをメタノール資化性酵母で分泌発現させ、解離定数を測定した。これ
らの抗 GFP ナノボディの解離定数は同程度であり、ペプチドバーコードの付加
は抗体の結合能に影響を与えないと考えられた。また、抗 GFP ナノボディの 5
つのアラニン置換変異体を作製し、解離定数を測定した。その結果、結合能が変化した抗 GFP ナノボディ変異体が得られた。これらの抗 GFP ナノボディの
アラニン置換変異体にそれぞれペプチドバーコードを付加し、GFP との一斉結合アッセイを行った。結合したナノボディからペプチドバーコードを切り出し、質量分析機で定量分析することで、抗体の結合能の定量評価が可能となった。
これらの結果をまとめて報告する[2]。
[1]Miyamoto et al., PLOS ONE, 2019, 14(4): e0215993.
[2]Matsuzaki et al., submitted【緒言】Schizophyllan (SPG)は担子菌 Schizophyllum commune が生産する β1-3, 1-6
glucan であり、従来、抗がん剤や免疫増強剤として使用されてきた。しかし、
SPG は 106-107 の分子量を有することから難溶性であり、かつ汎用性が低く、活用が難しいことが指摘されてきた。近年では、生理活性を有する低分子化多糖類が注目されている。そこで、新規生理活性の探索を目的として低分子化
SPG (LSPG)に着目した。本研究では、超音波処理を行うことにより LSPG を生成することを検討するとともに、LSPG の抗アレルギー活性を評価した。
【方法】S. commune を 8 日間好気振とう培養し、培養液中の生成 SPG をメタノー
ル沈殿で回収した。SPG の低分子化は 0.4％ (w/v)の SPG 水溶液に対して超音波処理することで行った。LSPG はさらに GFC を用いて分子量の異なる Fraction
A-E に 分 画 し た 。 LSPG の 抗 ア レ ル ギ ー 活 性 は RBL-2H3 細 胞 を 用 い た βHexosaminidase (β-Hex)放出率の比較より評価した。
【結果】SPG に対して超音波処理を行った結果、平均分子量は処理時間 30 min
で 8.9×105 まで低下した。次に、この LSPG および SPG の添加による、RBL-2H3細胞を用いた β-Hex 放出試験を行った結果、SPG の β-Hex 放出率が無添加と比較して増加した。一方、LSPG は 12％放出率が減少した。さらに、この LSPG
を GFC によって Fraction A-E に分画した。これら分画の β-Hex 放出試験を行った結果、平均分子量 2.1×104 を有する Fraction C は 67%放出率を減少させることができた。また、脱顆粒におけるサイトカインの発現について、IL-4, IL-13 お
よび TNF-α の遺伝子発現を RT-qPCR により解析した結果、Fraction C 添加時にIL-4 は増加し、IL-13 は減少した。現在、脱顆粒におけるサイトカインの発現および細胞内 Ca2 ＋について詳細に検討中である。

Quantitative evaluation of affinities of antibodies fused with peptide
barcodesAnti-allergy effect of low-molecule Schizophyllan cleaved by ultrasonictreatment○Yusei Matsuzaki1,2, Wataru Aoki1,2, Mitsuyoshi Ueda1,2(1App. Life Sci., Grad. Sch. Agr., Kyoto Univ., 2CREST, JST)Key words

peptide barcoding, nanobody, yeast, alanine scanning○Ryoga Yuasa, Maki Takano, Kazuhiro Hoshino(Grad. Sch. Sci. Eng., Univ. Toyama)

Key words

anti-allergy, ultrasonic treatment, Schizophyllan

282

3Dp02

カチオン性ペプチド Poly(ε-L-lysine) のカルボジイミド
架橋反応による修飾： 構造解析および抗菌性分散剤としての特性評価

3Dp04○武内 正輝, 竹原 宗範（滋県大院・工・材料科学）
takehara@mat.usp.ac.jp【背景と目的】Streptomyces 属放線菌が生産する Poly(ε-L-lysine)（ε-PL）は生体適合性、抗菌活性、凝集活性等を示す生分解性のポリカチオンである。当研究室では ε-PL が静電反発力に基づく分散能を示すことを見出し、種々の産業分野で利用されている分散剤に対して、ε-PL が生分解性の代替材料となる可能性を報告した。本研究では、より広範な条件での利用、分散能の向上を目指し、εPL 分子間の架橋重合体を調製した。架橋化により、ε-PL の静電反発力に加え、ポリマー鎖間の斥力の増大による分散安定化を期待した。
【方法】水中、架橋補助剤（N-Hydroxysulfosuccinimide, Sulfo-NHS）存在下で εPL （ n ＝ 22-36, Mw/Mn ＝ 1.01, JNC( 株 ) ） を 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3ethylcarbodiimide（EDC）と反応させることで、架橋重合化 ε-PL を合成した。
得られた架橋体の分子量を SDS-PAGE より見積った。カオリン（結晶質の含水
ケイ酸アルミニウムを主成分とする天然粘土鉱物）懸濁液に所定の濃度の架橋
化 ε-PL を加え、遠心分離（75 × g, 4 min）後の上層の残留濁度（550 nm）を測定し、分散能を評価した。
【結果と考察】Sulfo-NHS との反応を pH 4.8-5.5、また EDC ・ HCl 添加時に pH
7.6-8.0 に制御し得られた架橋体について、SDS-PAGE 解析でラダー状に数量体まで高分子量化したバンドが確認できた。また、原料 ε-PL よりも見かけ上、低分子量側にバンドの広がりを示す反応条件も見出せ、分子内架橋反応が優先したことが示唆された。架橋二-四量体 ε-PL のカオリン懸濁液に対する分散能は原料の ε-PL と同程度であった。また、架橋体化した ε-PL の抗菌性についても検討した。

Modification of a cationic peptide poly(ε-L-lysine) by carbodiimide crosslinking reaction: characterization of the structure and antimicrobial
dispersant properties○Masateru Takeuchi, Munenori Takehara(Dept. Mater. Sci., Grad. Sch. Eng., Univ. Shiga Pref.)Enterococcus sp.の生産するバクテリオシン○竹内 諒, 西野 智彦（東京工科大院・バイオニクス）
nishino@stf.teu.ac.jp【背景と目的】バクテリオシンは細菌が生産する抗菌性ペプチドである。多くのバクテリオシンはヒトの消化管内で分解されることから安全性が高いと考えられている。当研究室で保有するバクテリオシン生産能力の高い乳酸菌
Enterococcus sp.は培養中に活性が低下するという問題が存在する。本実験ではこの活性低下の原因を明らかにすることを目的とする。
【方法】500 mL の坂口フラスコに、pH 低下対策のため炭酸カルシウムを 1％添加した 200 mL のバクテリオシン生産用培地（グルコース 2％、酵母エキス（BD）
0.5％）を入れて、Enterococcus sp.を 37℃で振とう培養した。生菌数はコロニー計数法で測定し、培養液中のバクテリオシン活性は、遠心分離上清を Leuconostoc
mesenteroides subsp. dextranicum NBRC100495 を指標菌に用いた寒天拡散法で測定した。細胞外に存在するタンパク質分解酵素によって、バクテリオシンが分解されている可能性を考え、培養液中のタンパク質分解活性をアゾカゼインを用いて測定した。また、定常期の培養液を加熱、冷蔵し、バクテリオシン活性の低下に与える影響を確認した。さらに、メンブレンフィルターで菌体を取り除いた定常期の培養液のバクテリオシン活性を測定した。
【結果と考察】培養液の遠心分離上清のバクテリオシン活性の低下は定常期である培養約 40 時間目からはじまった。一方、アゾカゼイン分解活性は対数増殖期後期である培養 12 時間目でピークに達し、その後低下したことから、活性低下とずれが見られた。加熱、冷蔵、メンブレンフィルター等の処理後もバクテリ
オシン活性は低下しなかったことから、バクテリオシン活性低下は、細胞外に放出されるタンパク質分解酵素によるものではなく、細胞内もしくは表面に存在するタンパク質分解酵素による可能性が示唆された。

Production of bacteriocin by Enterococcus sp.
○Ryo Takeuchi, Tomohiko Nishino(Grad. Sch. Bionics., Tokyo Univ. Technol.)Key words
linkingpoly(epsilon-L-lysine), biodegradable dispersant, antimicrobial, cross-

Key words

Enterococcus, bacteriocin, lactic acid bacteria, biopreservation

3Dp03

N-アシル化ポリ(ε-L-リシン)誘導体の合成と抗菌活性の
評価

3Dp05

低濃度オゾン水の生成と殺菌効果の評価○吉田 修 1, 松井 旺大 1, 永田 智 1, 竹原 宗範 1, 野村 亘 2,
井上 善晴 2
（1滋県大院・工・材料科学, 2京大院・農・応用生命）
takehara@mat.usp.ac.jp

松郷 誠一 1, ○滝口 昇 2, 平野 一哉 2, 靜 良治 3
（1金沢大・VBL, 2金沢大・理工, 3レネロファーマ（株））
tackey@se.kanazawa-u.ac.jp【背景と目的】 Streptomyces 属放線菌が生合成する Poly(ε-L-lysine) （ε-PL）は、
L-lysine 残基のみで構成されるカチオン性ホモポリマーである。ε-PL は幅広い
抗菌スペクトルを有する生体適合性のペプチドであり、安全性の高い新規の抗菌剤として注目されている。抗菌活性の発現において、ε-PL のカチオン性は重要な役割を担っていると考えられるが、その作用機構の詳細は不明である。本
研究では、N-アシル化 ε-PL を合成し、それらの抗菌活性試験を行い、抗菌活性におけるカチオン性の寄与、また置換基の効果について調査することを目的とした。
【方法】 中重合度体 ε-PL（n = 22-36, JNC(株)）を無水酢酸、γ-ブチロラクトン
または無水コハク酸と加熱還流し（50-80 ℃, 1-6 h）、N-アシル化 ε-PL 誘導体を合成した。被検菌として E. coli NBRC 3301、B. subtilis NBRC 3335、S. cerevisiae
BY4741 を用いた。種々の濃度の ε-PL 誘導体を含む栄養培地にて各菌株を 24 h
旋回培養を行ない、OD660 を測定することで、各菌株に対する ε-PL 誘導体の
IC50 を評価した。
【結果と考察】三種の異なる N-アシル化 ε-PL 誘導体をそれぞれ修飾率 10-90％の範囲で得た。いずれの ε-PL 誘導体においても抗菌活性が顕著に低下したことから、抗菌活性の発現にはポリマーのカチオン性が寄与していることが強く示唆された。このとき、導入した置換基の違いにより活性低下の程度は異なった
ものの、E. coli、B. subtilis、S. cerevisiae の順に、抗菌活性の低下の程度が大きい傾向が得られた。E. coli に対しては中重合度体の ε-PL が、また S. cerevisiaeに対しては低重合度体（n = 5-20）が、有意に高い抗菌活性示すことが報告されていることから、菌株間の感受性の差は N-アシル化修飾による ε-PL の見かけの低重合度化に起因することが考えられた。

【背景と目的】オゾン水の酸化作用に起因した殺菌能力が様々な分野で利用されている。医療分野では末梢血管循環障害の改善や糖尿病性皮膚潰瘍における創傷治癒の促進に用いられている。本研究では、生成時における負担の少ない低濃度オゾン水（0.1 ppm 以下）に注目し、その殺菌能力について評価を行った。
【実験方法】（１）低濃度オゾン水の作製：レネロファーマ株式会社製の気体オゾン発生器を用い、滅菌水 1 L に低濃度のオゾンガスを 20 分間曝気することに
よって低濃度オゾン水を作製した。
（２）殺菌実験：殺菌実験には E. coli DH5αを用いた。培養液の OD600 が 0.5（液量：100 mL）となるよう遠心ボトル（200mL 容）に調整後、遠心分離により集菌・洗浄したものを殺菌実験サンプルとした。サンプルを低濃度オゾン水またはコントロールである LB 培地 100 mL に
懸濁後、37℃, 160 rpm で 20 分間接触させた。再度集菌・洗浄後、滅菌した 500
mL 三角フラスコに移し、37℃, 160 rpm で培養して経時的に OD600 を測定した。12 h および 24 h においては生菌数の計測も行った。
【結果と考察】低濃度オゾン水処理サンプルの生菌数はコントロールに比べて 4割程度低く、増殖曲線による評価と比較すると明らかに低い結果であった。これは、低濃度オゾン水処理により、液体培養においては増殖活性を有するが、固体培養においては増殖できない細胞が多く存在することを示唆している。過酸化水素水を用いた実験との比較についても併せて報告する。

Synthesis of N-acylated derivatives of poly(ε-L-lysine) and evaluation of theantimicrobial activity

Evaluation of cytotoxicity of low-concentrated ozone water○Osamu Yoshida1, Akihiro Matsui1, Satoshi Nagata1, Munenori Takehara1,
Wataru Nomura2, Yoshiharu Inoue2(1Dept. Mater. Sci., Grad. Sch. Eng., Univ. Shiga Pref., 2Div. Appl. Life Sci., Grad.
Sch. Agric., Kyoto Univ.)

Key words

poly(epsilon-L-lysine), antimicrobial, cationic peptides, cell membrane

Seiichi Matsugo1, ○Noboru Takiguchi2, Kazuya Hirano2, Ryoji Shizuka3(1VBL, Kanazawa Univ., 2Coll. Sci. Eng., Kanazawa Univ., 3Renelopharma Inc.)

Key words

Escherichia coli, cytotoxicity, growth, ozone

283

3Dp06

天然物由来成分による皮膚常在菌の増殖への影響○多賀 直彦, 本脇 那々子, 石黒 悠生（東海大・農）ntaga@agri.u-tokai.ac.jp

3Ep01

糸状菌シトクロム P450 の潜在機能を活用した トリテル
ペノイド生合成○大園 昂貴 1, 北岡 卓也 2, 一瀬 博文 2（1九大院・生資環, 2九大院・農）ichinose@agr.kyushu-u.ac.jp【目的】ヒトの皮膚には、皮膚腺や汗腺などに一定の細菌群が定着しており、これらの皮膚常在菌は、皮脂，pH，および温度などの影響を受けつつ常に皮膚上に存在している。皮膚常在菌は、宿主と共生状態にあり、外来性の微生物の侵入や定着を防御し感染を防ぐ役割をしている。しかしながら、これらの皮膚常在菌は、増殖することにより不快な臭いを発する。本研究は、皮膚常在菌の増殖を抑えるとともに、ヒトに対して安全な天然物由来成分について検討した。
【 方 法 】 使 用 菌 株 は 、 皮 膚 常 在 菌 と し て Staphylococcus epidermidis NBRC
100911、および Staphylococcus aureus NBRC 102135 を用いた。使用培地は，702
液体培地および 802 平板寒天培地を用いた。皮膚常在菌の培養は、試験管を用いた振盪培養で行った。抗菌活性は、spot on lawn 法で検出した。抗菌活性検出のポジティブコントロールとして、テトラサイクリン塩酸塩を用いた。培養分
析は、検鏡、培養液 pH、培養液濁度、および CFU を分析した．
【結果】抗菌物質を溶解させる溶媒の皮膚常在菌に対する抗菌活性について検出した結果、水、メタノール、エタノール、および DMSO に皮膚常在菌に対する抗菌活性は検出されなかった。皮膚常在菌に対して強い抗菌活性を示すテトラ
サイクリン塩酸塩の抗菌活性を示す最小濃度を検討した結果、4 種類の使用溶
媒全てにおいてテトラサイクリン塩酸塩の濃度が数 μ ｇ/ｍ L で抗菌活性が得られた。天然物由来成分の抗菌活性を検出した結果、ウイキョウ油層抽出物が皮膚常在菌に対して抗菌活性を示した。皮膚常在菌の液体培養における松脂添加の影響を添加した結果、濃度依存的に増殖が始まる時間を遅らせた。松脂添加
濃度を低くして増殖に影響を与えない濃度を明らかにするとともに、松脂添加
濃度を高くすることによる増殖開始遅延に与える影響について検討している。

【背景と目的】トリテルペノイドは各種生物が産生する代謝産物であり、創薬資源のリード化合物として期待されている。しかしながら、自然界におけるトリ
テルペノイド供給量には限りがあることや化学合成が困難であることから、トリテルペノイドの産業利用には戦略的合成技術が求められる。本研究では、トリテルペノイド合成酵素（TTS）およびシトクロム P450（P450）の組み合わせ
によってトリテルペノイドの構造多様性が生まれることに着目し、植物由来
TTS と糸状菌由来 P450 を非合目的に組み合わせることで多種多様なトリテル
ペノイドの生合成を試みた。
【方法】ルペオール合成酵素（LUS）または β-アミリン合成酵素（bAS）の発現
プラスミドを保持する酵母に糸状菌 P450 発現プラスミドを組み込み、人工液体培地 25 mL に植菌し、培養した（3 日間、28°C、160 rpm）。培養後、遠心分離により回収した菌体を 20%水酸化カリウム水溶液（水：エタノール = 1:1）に懸濁し、煮沸により得られた溶菌液から酢酸エチル及びヘキサンを用いて細胞内代謝産物を抽出した。減圧乾固した代謝産物に TMSI-C を用いて TMS 誘導体
化サンプルを調製し、GC-MS 分析に供してルペオールまたは β-アミリンに対して変換活性を有する P450 分子種を特定した。
【結果と考察】本研究で用いた P450 計 425 種のうち、ルペオールに対しては 4種、β-アミリンに対しては 3 種の P450 が変換活性を示した。また、それぞれの基質に対して共通する 2 種の P450 が変換活性を示したことから、それらの P450
がルペオールや β-アミリンのみならず多くのトリテルペノイドに広く活性を示
すことが示唆された。本研究の結果は、生物種の壁を超えた酵素協同作用が様々なトリテルペノイドの合成ツールになり得ることを示唆しており、有用天然物・疑似天然物の獲得を促進すると期待される。

Effects of natural components on the growth of skin-borne bacteria

Applications of fungal cytochrome P450 monooxygenase for production ofvarious triterpenoids○Naohiko Taga, Nanako Motowaki, Yui Ishiguro(Sch. Agric., Tokai Univ.)○Koki Ozono1, Takuya Kitaoka2, Hirofumi Ichinose2(1Grad. Sch. Bioresour. Bioenviron. Sci., Kyushu Univ., 2Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words

antibacterial, Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus aureus

Key words

terpenoid, cytochrome P450, filamentous fungi

3Dp07

粉末消石灰の「待ち受け消毒」条件下における消毒効果
の評価

3Ep02

担子菌が有するセスキテルペン合成酵素の機能解明と利用○松崎 慎史, 上井 幸司, 山中 真也, 徳樂 清孝（室工大院・工）tokuraku@mmm.muroran-it.ac.jp○増永 夏輝 1, 筌場 将太 1, 北岡 卓也 2, 一瀬 博文 2（1九大院・生資環, 2九大院・農）ichinose@agr.kyuahu-u.ac.jp[背景・目的]
全国の畜産農家等では豚コレラや口蹄疫などの家畜伝染病による甚大な被害が発生している。家畜伝染病予防のため、畜産農家の出入り口に粉末消石灰を散布する「待ち受け消毒」が実施されているが、実際の使用条件と同等の適切な消毒効果評価法は知られておらず、その効果に疑問が持たれていた。そこで、本研究では現場により近い条件下における評価法の開発に取り組んだ。また、開発した手法により、実験の際の湿度や気温、粉末消石灰の含水量など、様々な条件下における粉末消石灰の消毒効果や、新たに開発したゼオライト配合粒状消石灰の消毒効果を評価した。
[方法]
本研究では病原性細菌のモデルとして大腸菌（E. coli XL-1 blue）を使用した。
大腸菌を対数増殖期まで培養し、遠心分離、リン酸生理食塩水による洗浄で完全に培地を除去した。インキュベーター中で菌体を乾燥させ、消石灰との接触面積の増加を図るため乾燥菌体を微細化した。その後、粉末消石灰を添加し、経時的に接触反応させた。接触反応後、消石灰を中和することが可能な十分量のリン酸バッファーを添加することで瞬時に中和した。中和溶液の生菌数は希釈平板法によって測定した。
[結果・考察]開発した手法により粉末消石灰の消毒効果を評価したところ、粉末消石灰のみ
では消毒効果は検出されず、水を添加することで有意な消毒効果がみられた。
さらに湿度コントロール下における消毒効果への影響を調査したところ、湿度20~80％の範囲では消毒効果はみられなかったが、90%以上で有意な消毒効果が確認された。これらの結果より、「待ち受け消毒」を目的として粉末消石灰を散布する際、湿度 90％以上の条件でなければ、水と共に散布する必要があることが明らかになった。また、ゼオライト配合粒状消石灰についても粉末消石灰と同等の消毒効果が見られた。

[背景と目的] テルペノイドはイソプレンユニットを構成単位とする天然物であり、医薬品・香料などの高付加価値化合物としても利用が期待されている。その中でも、3 つのイソプレンユニットからなるセスキテルペノイドは著しく高い構造多様性を有すことから、これらの選択的・効率的合成を可能にするセス
キテルペン合成酵素 (STS) の機能理解に興味が持たれる。
担子菌はセスキテルペノイド産生能に秀でた生物であることが知られ、多彩なSTS の探索源として期待が持たれる。本研究ではセスキテルペノイドを標的とする天然物合成新戦略の創発に向け、種々の担子菌 STS の獲得および機能解明を試みた。
[方法] ゲノム配列が公開されている Trametes versicolor、Pleurotus ostreatus、Agaricus bisporus、Phanerochaete chrysosporium、Postia placenta を供試菌に利用した。種々の培養条件で生育させた担子菌からトータル RNA を抽出し、RTPCR によって標的 STS の cDNA を増幅した。得られた PCR 産物を酵母発現ベ
クターに連結し、Saccharomyces cerevisiae に形質転換して STS を異種発現させた。形質転換酵母を人工液体培地（20 mL）に植菌して 3 日間培養し（28°C）、
フラスコ内の気相および培養液に生じた代謝物を GC-MS で分析した。
[結果と考察] 形質転換酵母が与える代謝物を GC-MS によって分析したところ、
STS 依存的に生じる多くのセスキテルペノイドが同定された。各種 STS が与えた生成物を比較したところ、各種担子菌が特徴的に与える化合物も多く見出された。本結果より、多くの担子菌が種に特徴的な STS 機能を備えると推察さ
れ、担子菌 STS の機能ライブラリを拡大することで、多種多様なセスキテルペ
ノイドの戦略的合成が可能になると期待された。

Evaluation of the disinfecting effect of slaked lime powder under thesituation of "standby disinfection"

Functional characterization of sesquiterpene synthases from wood-rotting
basidiomycetes○Shinji Matsuzaki, Koji Uwai, Shinya Yamanaka, Kiyotaka Tokuraku(Grad. sch.Eng., Muroran Inst. Technol.,)

Key words

domestic animal infectious, standby disinfecton, slaked lime powder○Natsuki Masunaga1, Shota Ukeba1, Takuya Kitaoka2, Hirofumi Ichinose2(1Grad. Sch. Bioresour. Bioenviron. Sci., Kyushu Univ., 2Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words
expression

Sesquiterpene synthase, white-rot basidiomycetes, Heterologous

284

3Ep03

褐色腐朽担子菌 Postia placenta のシトクロム P450 を利用したプロトイルデン誘導体の合成

3Ep05○木村 紘也 1, 北岡 卓也 2, 一瀬 博文 2（1九大院・生資環, 2九大院・農）ichinose@agr.kyushu-u.ac.jp

梨幼果の水およびエタノール抽出成分が出芽酵母の寿命延長およびその関連遺伝子の発現に及ぼす影響○村田 和加惠 1,2, 長谷川 真梨菜 1, 藤井 雄三 1, 藤田 憲一 2,
山口 良弘 2, 田中 俊雄 2, 荻田 亮 2,3（1米子高専, 2阪市大院・理, 3阪市大・健康研セ）
murata@yonago-k.ac.jp【緒言】セスキテルペノイド（STP）は構造多様性に富み、ユニークな生物活性を示す化合物も多く存在することから、創薬シード化合物の探索資源として期待される。本研究では STP の中でも多様な薬理活性が知られる Δ6-protoilludeneに焦点をあて、褐色腐朽担子菌 Postia placenta が有する Δ6-protoilludene 合成酵素（PpSTS-08）とシトクロム P450（P450）を利用して多種多様なプロトイルデ
ン誘導体の合成を試みた。
【実験方法】PpSTS-08 を機能発現する Saccharomyces cerevisiae に P. placenta に由来する 184 種類の P450 を共発現させた形質転換酵母を作出し、人工培地中
で 3 日間培養した（20 mL, 28℃, 160 rpm）。所定時間後、培養液画分に蓄積した生成物を固相抽出カラムで回収し、GC-MS 分析に供してプロトイルデン水酸化体をスクリーニングした。
【 結 果 お よ び 考 察 】 PpSTS-08 と CYP-5344B1 の 共 発 現 に よ っ て Δ6protoilludene-8-ol が、PpSTS-08 と CYP-5348E1 または-5348J3 を共発現によってΔ6-protoilludene-5-ol が得られた。CYP-5348J3 は未同定のプロトイルデン水酸化体を与えることも示された。さらに、複数の P450 を PpSTS-08 と共発現させてプ ロ ト イ ル デ ン 多 重 水 酸 化 体 の 合 成 を 試 み た 。 CYP-5344B1 に 加 え て
CYP-5150D15V1、-5150D15V2、-5027B4v1 または-5150D11v1 を共発現させることで Δ6-protoilludene のジオール体と考えられる生成物が生じた。現在、NMR等を用いて生成物の構造同定を進めている。
本研究により、P. placenta に由来するプロトイルデン水酸化酵素を同定し、少なくとも 5 種類のプロトイルデン誘導体を得ることに成功した。プロトイルデ
ン類は抗腫瘍活性などの有用活性を持つことが報告されており、本研究で得られた代謝物の生物活性にも興味が持たれる。

近年、日本社会の高齢化や健康ブームなどと相まって健康寿命の延伸に向けた関心が高まっている。人の健康を阻害する一つの要因として、細胞老化による免疫機能の低下や活性酸素種の影響による DNA の損傷など、細胞機能の低下に起因する加齢関連疾患が挙げられる。細胞寿命の延伸についての研究は多岐にわたり進められており、その一つとして寿命延長効果を付与する成分の探索とその応用が期待されている。本研究では、ヒトの寿命決定機構と共通性を有することから寿命・老化研究に適したモデル細胞であるとされている出芽酵母を用いて、梨幼果の水およびエタノール抽出成分による細胞寿命の延長効果を検討した。
梨の幼果を破砕し、蒸留水あるいは 70％ エタノールに懸濁し遠心後、上清をサンプルとした。細胞寿命の評価は経時寿命をコロニーカウントによって測定することにより行った。また RT-PCR 試験によって出芽酵母の mRNA の発現量を分析し、梨抽出成分による遺伝子レベルでの影響を評価した。
実験の結果、梨幼果の水抽出成分およびエタノール抽出成分のいずれを付与した場合においても、コントロールと比べて著しく経時寿命を延長させる効果が認められた。さらに、RT-PCR によって mRNA の転写量について調べたところ、
梨幼果の水抽出成分を付与したものでは、ヒト長寿遺伝子（SIRT1）の相同遺伝子とされている SIR2、および SIR4 の発現量に増加傾向が認められたが、エタノール抽出成分を加えたものでは、それら遺伝子の発現量に差は認められなかった。以上の結果から、梨の幼果における、水抽出成分およびエタノール抽
出成分では、異なる成分がそれぞれに異なる機序によって出芽酵母の寿命延伸に関与している可能性が示唆された。

Biosynthesis of protoilludene derivatives using cytochromes P450 from thebrown-rot basidiomycete Postia placenta

Effects of water and ethanol soluble components from unripe pear fruit on
lifespan extension and gene expression of budding yeast.

○Hiroya Kimura1, Takuya Kitaoka2, Hirofumi Ichinose2(1Grad. Sch. Bioresour. Bioenviron. Sci., Kyushu Univ., 2Fac. Agric., Kyushu Univ.)○Wakae Murata1,2, Marina Hasegawa1, Yuzou Fujii1, Ken-ichi Fujita2,
Yoshihiro Yamaguchi2, Toshio Tanaka2, Aikira Ogita2,3(1Yonago Natl. Coll. Technol., 2Grad. Sch. Sci., Osaka City Univ., 3Res. Center
Urban Health & Sports, Osaka City Univ.)

Key words

Postia placenta, cytochrome P450, terpenoid, Protoilludene

Key words

Saccharomyces cerevisiae, Chronological lifespan, pear, sirtuin gene

3Ep04

ナギラクトン E とアネトールの併用によって生じる相乗的抗真菌メカニズム

3Ep06

線虫を用いた Candida glabrata 感染症のハイスループッ
トな解析系の開発○上田 裕貴 1, 山口 良弘 1, 荻田 亮 1,2, 田中 俊雄 1, 藤田 憲一 1（1阪市大院・理, 2阪市大・健康研セ）
kfujita@sci.osaka-cu.ac.jp○竹葉 惇貴 1, 箕田 康一 1, 前田 淳史 2, 水野 貴之 1, 文谷 政憲 1
（1徳島文理大院・工, 2徳島文理大・理工）bunya@fst.bunri-u.ac.jp【背景および目的】 ナギ由来のナギラクトン E は出芽酵母に対して細胞壁生合成を阻害することで微弱な抗真菌作用を発揮する。一方でアニスオイルの主成分であるアネトールも微弱な抗真菌作用を示すが、本物質は他の薬剤と併用した場合、薬剤排出の阻害を介してその作用を増幅する場合がある。本研究では、両物質を併用した際に見られる相乗的抗真菌作用の仕組みを探ることを目的とした。
【方法および結果】 Saccharomyces cerevisiae BY4741 株を用いて、まず液体培地
希釈法により、各薬剤の最小生育阻害濃度 (MIC) および両薬剤を併用した場合の相乗効果を調べた。その結果、各薬剤を単独で使用した場合、薬剤処理 48 時
間後、ナギラクトン E とアネトールの MIC はそれぞれ 500 μM と 2500 μM となった。また両薬剤を併用した場合、最も効果的な組み合わせは 31.25 μM ナギ
ラクトン E と 625 μM アネトールとなり、併用処理は相乗効果を示すことがわかった。次いで薬剤排出ポンプ関連遺伝子欠損株 14 株を用いて菌体の濁度により増殖を観察したところ、脂溶性分子の排出に関わる多剤耐性薬剤排出ポンプ
Pdr5p の遺伝子欠損株においてのみ、ナギラクトン E の感受性が上昇した。さらに、リアルタイム PCR を用いて PDR5 の遺伝子発現量を測定した。両物質を併用すると薬剤処理時間の経過に伴って PDR5 の発現量が低下し、培養 72 時間
後にはコントロールレベルまで減少した。また、PDR5-GFP 株を用いて、併用処理した細胞における Pdr5p の発現量を間接的に確認した。その結果、GFP 由
来の蛍光が消失したので、PDR5p の発現量も減少したと判断した。
以上の結果より、両物質の併用によっておこる相乗的抗真菌作用にはアネトールによる PDR5 の発現抑制が関わっている可能性が示唆された。

【背景・目的】Candida glabrata は真菌感染症を引き起こす原因真菌の１つであり、感染症患者
数は真菌感染症患者の中で 2 番目に多い。また、天然に広く存在しており C.
glabrata は既存の抗真菌薬に対し低感受性であり、治療・予防が困難であるため、感染・発症機構解明や新たな治療薬の開発が必要とされている。そこで我々は、線虫(Caenorhabditis elegans)を感染宿主として用いた C. glabrata 感染症に効
果のある化合物のスクリーニングを目的に、簡便かつ迅速な解析系の開発を行った。
【方法】
今回の研究では、線虫の生残率測定と線虫体内の C. glabrata の蛍光による観察、線虫内生菌数の測定を行った。生残率測定では、C. glabrata と接触した線虫と大腸菌のみを餌として与えた線虫、C. glabrata に接触し抗真菌薬を与えた
線虫の 3 種を 20℃と 25℃で培養し測定した。線虫体内の C. glabrata の観察は、生きている細胞のみが蛍光を発する蛍光試薬を用いて顕微鏡観察した。また、
線虫体内の生菌数を求めるため、線虫をホモジナイズし、寒天培地に塗布してコロニーを計数した。
【結果】
生残率の測定では、C. glabrata に感染した線虫の生残率は、大きく低下した。
線虫内生菌数も経日的に増加し、蛍光観察すると、蛍光強度が日ごとに強くなることが確認できた。20℃と「25℃+抗真菌薬」の場合は生残率に大きな低下
はなく、生菌数は減少し、蛍光強度は弱くなった。C. glabrata と接触した線虫を 25℃で培養した時、生残率が低下し、生菌数が増加したことから、線虫でヒト C. glabrata 感染症を再現できたと考えられる。また、線虫内生菌数の増減と蛍光観察での蛍光強度が比例していることから、線虫内生菌数を蛍光観察によって評価が可能になった。これにより、抗真菌薬のハイスループットスクリーニ
ングや C. glabrata の感染機構解明に応用できることが示唆された。

Synergistic antifungal mechanism induced by nagilactone E in combination
with anethole

Development of analysis system for Candida glabrata infection using
nematode○Yuki Ueda1, Yoshihiro Yamaguchi1, Akira Ogita1,2, Toshio Tanaka1,
Ken-ichi Fujita1(1Grad. Sch. Sci., Osaka City Univ., 2Res. Center Urban Health and Sports, Osaka
City Univ.)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, anethole, nagilactone E, drug resistance○Junki Takeba1, Koichi Mita1, Atsushi Maeda2, Takayuki Mizuno1,
Masanori Bun-ya1(1Grad. Sch. Eng., Tokushima Bunri Univ., 2Fac. Sci. Eng., Tokushima Bunri Univ.)

Key words

Candida glabrata, Caenorhabditis elegans, fungal disease

285

3Ep07

Aspergillus sp. S17-5 の産生するヒドロキシヘキシルイ
タコン酸の構造解析と生理活性評価

3Ep09○野村 友佑 1, 佐野 芽生 1, 小原 仁実 1, 和田 一仁 2, 松本 圭司 2,
麻生 祐司 1
（1京都工繊大院・工芸科学, 2(株)カネカ・R&B企画部）
aso@kit.ac.jp

ベタイン型添加剤による酵素活性化と水和分子間相互作
用の相関○青木 拓真, 甲元 一也（甲南大院・フロンティアサイエンス）
koumoto@konan-u.ac.jp【目的】イタコン酸(IA)などの微生物産生ビニル化合物は、抗炎症性や抗菌性な
どの生理活性を有しており新たな創薬シード化合物として注目されている。しかし、これら微生物産生ビニル化合物の報告数は限定されている。一方、発表者らはアルケンとハロゲン化アルキルの付加反応である Mizoroki-Heck 反応を用いたビニル化合物産生菌の選択的分離法を新たに開発した。そこで本研究では、本分離法を用いて土壌よりビニル化合物産生糸状菌を分離するとともに、産生するビニル化合物の構造解析と生理活性を評価した。
【方法・結果】各地より採取した 86 種の土壌をクロラムフェニコール添加ポテ
トデキストロース培地に塗布・培養し 430 株の糸状菌を分離した。各株の培養
液上清を Mizoroki-Heck 反応に供した後、反応液を HPLC 解析することでビニ
ル化合物産生菌を探索した。その結果、IA とは異なる 2 つのビニル化合物を同時に産生する S17-5 株を得た。分取 HPLC を用いて両ビニル化合物を培養液から精製後、LC-MS および NMR を用いて構造解析した。その結果、両ビニル化
合物はそれぞれ IA の類縁体である 8-ヒドロキシヘキシルイタコン酸(8-HIA)、
9-ヒドロキシヘキシルイタコン酸(9-HIA)と同定された。また、26S rRNA 遺伝
子配列解析の結果、S17-5 株は Aspergillus sp.と同定された。次に、それぞれIA、8-HIA、9-HIA を HeLa、MRC-5 細胞の各培養液に添加し、24 h 培養後の生細胞数を測定することで細胞毒性を調べた。その結果、8-HIA を添加した場合では HeLa、MRC-5 ともに生細胞数が減少したが、9-HIA を添加した場合では
MRC-5 のみ生細胞数が減少した。一方、IA ではこの傾向は見られなかった。
よって 8-HIA、9-HIA には IA と異なり細胞毒性があることが明らかとなった。

【背景と目的】
我々の研究室で開発したベタイン型添加剤は、特異な水和挙動を示し、水溶液中で酵素の活性化や安定化をした。また、その水和挙動と分子間相互作用の関係を調べるために、Record Jr らが報告している蒸気圧測定法から、ベタイン型
添加剤と種々のイオン及び中性分子との間に特異的な水和分子間相互作用が働くことも明らかにし、日本農芸化学会 2019 年度大会において報告した。本研究では、水和パラメーターと酵素反応との相関を調べるために、各実験で得られた水和に関するパラメーターと酵素活性化パラメーターを比較した。
【結果と考察】酵素反応としては、α-グルコシダーゼによるマルトースの加水分解反応を用い、その速度論パラメーターを、ベタイン型添加剤の溶液物性に与えるパラメーター
として密度及び粘度測定による水和パラメーターを算出し、水和分子間相互作
用では分子間に働く化学ポテンシャルを蒸気圧測定法から見積もった。まず、炭素鎖長の異なる５つのベタイン型添加剤を用い、酵素反応における速度論パラメーターを算出したところ、グリシンベタインのアルキル鎖が長くなるにつれて、酵素と基質の相互作用を示す Km 値が低下していった。ベタイン型添加剤と基質であるマルトースの間にも強い排他的な相互作用が働いており、ベタ
インの水和に伴う溶媒の物性が酵素の活性化に関与していることが明らかとなった。発表では、得られた一連の解析結果について詳細に報告する予定である。

Structural analysis and bioactivity characterization of hydroxyhexylitaconic
acids produced by Aspergillus sp. S17-5

Relationship between enzyme activation and intermolecular hydration layerinteraction by addition of betaine derivatives○Yusuke Nomura1, Mei Sano1, Hitomi Ohara1, Kazuhito Wada2, Keiji Matsumoto2,
Yuji Aso1(1Kyoto Inst. Tech, 2Kaneka Corp. R&B Planning)○Takuma Aoki, Kazuya Koumoto(FIRST, Konan Univ.)

Key words

Aspergillus, bioactivity, hydroxyhexylitaconic acids, structural analysis

Key words

betaine, hydration, repulsive interaction, kinetic parameter

3Ep08

Concentration of chitosan-like polysaccharide from thecultures of Citrobacter spp. and its crystalline nano/microfiber formation.

3Fp01

改変型ストレプトリジン O を用いた ASO 試薬の調製方法に関する開発○角田 洋輔, 北澤 宏明, 川井 淳, 岸本 高英（東洋紡）
Takahide_Kishimoto@toyobo.jp○Priyanka Baranwal, Seiji Negoro, Masahiro Takeo(Dept. Appl. Chem., Grad. Sch. Eng., Univ. Hyogo)
takeo@eng.u-hyogo.ac.jp

Chitin/chitosan is a polysaccharide composed of N-acetyl-D-glucosamine/Dglucosamine linked with beta 1,4-glycosidic bonds. Our previous studies have shownthat several bacterial strains belonging to the Citrobacter genus can produce a chitosanlike polysaccharide into the cultures as a soluble form, which showed flocculation
activity against kaoline (fine cray powder) solutions. Thus, it can be used as a
microbial flocculant. In this study, we report the recovery and concentration method
and the crystalline nano/microfiber formation of the polysacchride.
The polysaccharide could be recovered and concentrated from the cultures by hollow
fiber membrane modules with >100kDa-cutoff hydrophilic membranes without
significant loss of the flocculation activity. When the 50 to 100-fold concentrated
samples were preserved in a refrigerator, crystalline nano/microfibers appeared in thesample solutions. The width of each primary fiber was at nano meter levels and thelength was various. Larger crystalline fibers grew probably from dozens of thenanofibers, forming a unique sheaf-like structure with the size of approximately 1 mm
by 0.5 mm, in which the nanofibers seem to be tightly packed in the middle andunpacked at both ends. After washing the fibers with water repeatedly and dissolving
them with acids, the solution still showed strong flocculation activity.

【背景・目的】A 群レンサ球菌は上気道感染症や猩紅熱など多くの化膿性疾患の原因となることが知られている。その診断方法としては A 群レンサ球菌が産生するストレプ
トリジン O(SLO)に対する抗体(ASO)価の測定が行われている。ASO 試薬の原料に用いられる SLO は、これまで主にレンサ球菌そのものを培養することで製造されてきたが、生産性が低いため、低コストかつ高純度な SLO を製造することは困難であった。また、SLO は溶血活性を有するため、工業スケールでの製造及び使用時の安全性の観点から溶血活性を欠損させることが望まれていた。そこで、我々は溶血活性が無く、安全面に配慮した高純度な改変型 SLO を工業ス
ケールで高生産するための技術を開発し、すでに販売を開始している。今回更に我々は、この改変型 SLO を広く普及させるため、ASO 試薬調製に適したラ
テックス粒子の探索及び固定化条件の検討を行った。
【方法・結果】
溶血活性を欠損させた改変型 SLO を生産する組換え大腸菌の培養、各種クロマ
トグラフィーによる精製を行い、SDS-PAGE にて単一バンドとなった改変型
SLO を調製した。続いて、公知のラテックス粒子への固定化法をベースにラテックス粒子の種類や改変型 SLO の感作条件を検討した。ラテックス粒子に関しては、数種のカルボキシル基導入ラテックス粒子の中から改変型 SLO の感作に適している粒子を見出し、感作条件に関しては、pH、感作量などが試薬性能に与える影響を調べ、固定化条件の最適化を図った。さらに、共有結合によるラテックス試薬の調製においてはラテックス粒子のロット間差が試薬性能に影響しやすいことが知られているため、各ロットの性状と試薬性能との相関についても詳細に検討を行った。発表当日はロット間差の影響も含めて、検討結果の詳細を報告予定である。

Concentration of chitosan-like polysaccharide from the cultures of
Citrobacter spp. and its crystalline nano/microfiber formation.

Development of manufacturing of ASO reagent with mutant Streptolysin O○Priyanka Baranwal, Seiji Negoro, Masahiro Takeo(Dept. Appl. Chem., Grad. Sch. Eng., Univ. Hyogo)

Key words

Citrobacter, bioflocculant, microfiber, chitosan○Yosuke Sumida, Hiroaki Kitazawa, Atsushi Kawai, Takahide Kishimoto(Toyobo Co., Ltd.)Key words

Streptococcus pyogenes, Streptolysin O, antigen, ASO IVD reagent

286

3Fp02

Quantification of intracellular crowding level in Bacillus
subtilis

3Fp04○Yuki Kitahara, Enno Oldewurtel, Sven van Teeffelen(Dept. Microbiology, Pasteur Inst.)
yuki.kitahara@pasteur.fr

Monitoring of an enzymatic reaction using broadband
coherent anti-stokes Raman spectroscopy.
○Jeffrey Harmon, Ryo Imai, Naoko Senda, Tomoyuki Sakai(Hitachi Ltd., Res. and Dev. Group - Bio. Syst. Res. dept.)
Jeffrey.harmon.zv@hitachi.com

Bacterial cytoplasm is densely packed with macromolecules. This crowded
environment is biologically important for various processes such as protein diffusion,
protein-protein interaction, enzymatic reaction, etc. To maintain the crowding levelbacteria must coordinate dry-mass production and cell-volume expansion, but thecoordination mechanism is still unclear. Here we investigated how bacteria balance
dry-mass growth and volume growth at the single-cell level by using rod-likebacterium Bacillus subtilis.
To quantify dry mass of the cell we applied quantitative phase microscopy named
SLIM. To measure the cell volume we carried out two dimensional segmentation ofphase-contrast images. We also calculated dry-mass density (dry mass/volume) as aproxy of crowding.
Our measurements revealed that during exponential growth and even upon sudden
nutritional downshifts volume growth was well synchronized with dry-mass growth,and therefore dry-mass density was constantly maintained. In contrast, when wetreated cells with drugs targeting cell-wall synthesis, volume growth was severelyarrested while dry-mass growth still continued, which caused an increase of dry-mass
density. However, after washing out the drugs, cells interestingly accelerated volumeexpansion rate by increasing cell diameter and decreased dry-mass density to theoriginal level. This implies that B. subtilis regulates its intracellular crowding level bychanging cellular morphology.

Designing enzymatic reactions is very important for biochemical industries. For testing
the design of an enzyme, a cell-free synthesis system is useful. However, to evaluate
performance of the enzymatic reaction, destructive measurements such as HPLC or
MS are necessary, which is typically a time-consuming process. On the other hand,
optical measurement methods perform a non-invasive and rapid check of theperformance through measuring the concentration of substrates.
Here, we demonstrate the measurement of an enzymatic reaction with broadband
coherent anti-stokes Raman spectroscopy (CARS). CARS is an adaptation of Raman
spectroscopy which boasts signal levels that are several orders of magnitude greaterthan spontaneous Raman systems, and allows for rapid analysis of the reactions.
We present a feasibility study about using a broadband (500-3500 cm-1) CARS system
for monitoring biomolecules produced via an enzymatic reaction. We firstly checked
the system sensitivity using glucose. Glucose concentration levels were estimated andquantified having a system sensitivity of more than 10 mM for 10 seconds per sample.
As a demonstration of monitoring enzymatic reactions, an imperative step in theglycolysis process was monitored using the CARS system. The decomposition offructose 1-6 bisphosphate into GADP and DHAP was observed from the change infructose concentration.

Quantification of intracellular crowding level in Bacillus subtilis

Monitoring of an enzymatic reaction using broadband coherent anti-stokes
Raman spectroscopy.

○Yuki Kitahara, Enno Oldewurtel, Sven van Teeffelen(Dept. Microbiology, Pasteur Inst.)○Jeffrey Harmon, Ryo Imai, Naoko Senda, Tomoyuki Sakai(Hitachi Ltd., Res. and Dev. Group - Bio. Syst. Res. dept.)

Key words

Bacillus subtilis, growth, cell morphology

Key words
coherent anti-stokes Raman spectroscopy, biomolecule monitoring,
glucose concentration

3Fp03

A plant microbial fuel cell based biosensor for the indoor
greenA plant microbial fuel cell based sensor for theindoor green plants monitoring plants monitoring

3Fp05○Ji Eun Kim1, Tae Hang Yoon1, Hak Jin Song1, Wu-Young Jeong1,
Yunjeong Yang1, Eun Bin Lee1, Kwang Jin Kim2, Ho Hyun Kim3,
Hyung Joo Kim1
(1Dept. Biological Eng., Konkuk Univ., 2Urban Agric. Res. Div.,NIHHS, Rural Development Administration, 3Dept. Integr.
Environ. Syst., Pyeongtaek Univ.)
hyungkim@konkuk.ac.kr
A plant microbial fuel cell (PMFC) technique based biosensor for the indoor green
plants monitoring was investigated. The consumption of plant exudates byelectrochemically active bacteria (EAB) in the rhizosphere was the basis of thismethod. The result shows that the OCP (open circuit potential) from the PMFC was
highly depended on the plant health in the system. Cultivation conditions such as
watering, fertilizing, temperature variation, and lighting also affected the OCP
development from the PMFC system. With the live plant, OCP was about 0.4V. The
addition of fertilizer increased the OCP to 0.7V. However, the heat induced dead plantshowed the remarkable potential decrease (0.0V). In the dark condition, a gradualdecrease in potential development was observed (0.38V to 0.25V). In the multiple
examination conditions such as combination of watering, lighting and temperature
variation, the OCP development was also affected. Without water and light, thepotential was decreased. Among the combination of environmental conditions, thetemperature variation showed the highest effect on the OCP developments from thePMFCs. These results suggested that the application of PMFC technique provides a
cost effective, rapid plant health monitoring method.

A plant microbial fuel cell based biosensor for the indoor greenA plantmicrobial fuel cell based sensor for the indoor green plants monitoring
plants monitoring○Ji Eun Kim1, Tae Hang Yoon1, Hak Jin Song1, Wu-Young Jeong1,
Yunjeong Yang1, Eun Bin Lee1, Kwang Jin Kim2, Ho Hyun Kim3, Hyung Joo Kim1
(1Dept. Biological Eng., Konkuk Univ., 2Urban Agric. Res. Div., NIHHS, Rural
Development Administration, 3Dept. Integr. Environ. Syst., Pyeongtaek Univ.)
Key words
plant health monitoring, plant microbial fuel cell, rhizobacteria,
electrochemically active bacteria

A biosensor for Influenza virus detection, controlling
distance dependent LSPR between AuNPs and CdZnSeS
quantum dots
○Fahmida Nasrin1, Ankan Dutta Chowdhury2, Kenshin Takemura1,
Enoch Y. Park1,2(1Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci.
Technol., Shizuoka Univ.)park.enoch@shizuoka.ac.jp

Development of label free sensing has been emerging in recent science to fulfil thegrowing demand in the field of biosensor. In this report, a localized surface plasmon
resonance (LSPR) regulated approach has presented for the detection of Influenza
virus, controlling the distance between gold nanoparticles (AuNPs) and fluorescent
CdZnSeS quantum dots. Here, we present a new combination of AuNPs and CdZnSeS
QDs linked with a peptide chain of 18 amino acids after functionalization in its bothends. The synthesized peptide has been used here as a linker between these duos andprovide the anchoring sides for the antibody conjugation. In the optimized condition,
the fluorescent properties of the QDs has been enhanced due to the surface plasmon
effect of the adjacent AuNPs. On the basis of the physical significance on LSPR
sensing, we have attempted to detect different concentration of Influenza virus andstudied their detection sensitivity by analyzing the quenched spectra of the QDs
fluorescence due to the induced steric effect of the virus molecule on the LSPR
behavior. A linear range of 10-15 to 10-9 g mL-1 Influenza virus has been obtained with adetection limit of 0.8 fg mL-1. On the basis of the obtained results and the detection
mechanism, we hope, the method of this proposed biosensor can be a good alternative
for the general biomolecule detection by changing the entrapped antibody and its
corresponding analytes, in the wide variety of other sensing application in future.

A biosensor for Influenza virus detection, controlling distance dependent
LSPR between AuNPs and CdZnSeS quantum dots

○Fahmida Nasrin1, Ankan Dutta Chowdhury2, Kenshin Takemura1, Enoch Y. Park1,2(1Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka
Univ.)

Key words

AuNPs, QDs, LSPR, Influenza Virus detection

287

3Fp06

Controlling Size, Concentration and Distance of Surface
Plasmon Resonance, Application of Virus Detection by
LSPR Regulated Biosensor

3Gp01

Cre 組換え酵素を用いたミニサークル DNA ベクター調製法の開発○久野 晶生 1, 河邉 佳典 1, 羽田 毅 1, 井藤 彰 1,2, 上平 正道 1
（1九大院・工, 2名大院・工）kamihira@chem-eng.kyushu-u.ac.jp○Ankan Dutta Chowdhury1, Fahmida Nasrin2, Kenshin Takemura2,
Enoch Y. Park1,2(1Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Grad. Sch. Sci.
Technol. Shizuoka Univ.)park.enoch@shizuoka.ac.jp
Localized surface plasmon resonance (LSPR) has been emerging recently as a mostapplicable system among label-free biosensing techniques due to its nanoscale
phenomenon which offers sensitive, robust, and facile detection technique. There areseveral biomolecule sensors are reported so far tuning the LSPR mechanism of afluorescent molecule and its counterpart of noble metal nanoparticle in term of theirsizes, concentration, alignment, and distance. Though the technologies are now widely
studied and used to measure biomolecular interactions, several challenges remain to
optimize their parameters for a most suitable state of biosensing. Here, in this report,
we offer a complete analysis of sensing strategy optimizing all the probable parameters
to get the best results in detection. On the basis of the physical significance on LSPR
sensing, we have attempted to detect different virus concentration as the analyte andstudied their detection pathway by altering the LSPR behavior between CdSeTeS QDs
and AuNP. Depending on their size, shape, concentration, pH and most importantly
distance, we have framed different sensing platform for the virus detection byenhancing or quenching the fluorescence of CdSeTeS QDs. Applying this system, we
have found the LOD of 32.6 fg mL-1 for the detection of Norovirus like particle (NoVLP) taken as a reference for CdSeTeS QDs-AuNP based sensor.

＜目的＞我々は、これまでに Cre-loxP システムをベースとして、ゲノム上の特定部位に目的遺伝子を複数導入することが可能な逐次遺伝子組込みシステム（AGIS）を開発しており、AGIS を用いることで高生産 CHO 細胞株の構築に成功している。この際、ドナーベクターとして、バクテリア由来の配列（バックボーン）が取り除かれたミニサークル DNA ベクター（MC）が効率的な遺伝子組み込みに有効であることがわかった。本研究では、簡便で高収率な MC 調製法の開発と細胞への組み込み評価を行った。
＜方法と結果＞ loxP 配列を有するプラスミド（R2）へ Cre タンパク質を添加し、Cre-loxP 反応を利用することで in vitro で MC を作製した。MC 精製後、制限酵素処理して電気泳動を行い、回収率を評価したところモル換算で 10.5%のR2 が MC 化し回収できた。MC 回収率向上のために Cre-loxP 反応効率の改善を行った。Cre 反応の方向を MC 化の方向に制御するために、R2 のもつ 2 つのloxP 配列に変異を加えた R2-mlox を作製した。R2-mlox として、loxP 配列のス
ペーサー領域の異なる 3 つのプラスミド (R2-mlox-SpWT, R2-mlox-Sp8, R2-mloxSp12) を作製し、これらのプラスミドを利用して Cre 反応および MC 精製を行い、MC 化効率が上昇する loxP 配列の検討を行った。その結果、R2-mloxSpWT、R2-mlox-Sp8 を用いたときに MC 化効率が高くなった。さらに、最適なCre 量や反応時間を検討したところ、初期量からモル換算で 50.7%の MC が回収できた。次に、精製した MC が細胞で正常に機能するか評価した。Cre-loxP
組換え反応により目的遺伝子がゲノムへ組み込まれると、赤色蛍光が消光する
CHO/hprt-DsRed 細胞に対して、MC を Cre 発現ベクターとともに一過性導入したところ、蛍光のシフトを観察できたことから、精製した MC は細胞で正常に機能することが示された。

Controlling Size, Concentration and Distance of Surface Plasmon
Resonance, Application of Virus Detection by LSPR Regulated Biosensor

Preparation of minicircle DNA vector using Cre recombinase○Ankan Dutta Chowdhury1, Fahmida Nasrin2, Kenshin Takemura2, Enoch Y. Park1,2(1Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka
Univ.)○Akio Kuno1, Yoshinori Kawabe1, Takeshi Hada1, Akira Ito1,2,Masamichi Kamihira1(1Fac. Eng., Kyushu Univ., 2Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

Key words

fluorescence spectra, localizasion analysis, sensor, virus

Key words

minicircle DNA vector, Cre/LoxP system, CHO cells

3Fp07

Fluorescent-labeled liposomal amplified biosensor for theultrasensitive detection of virus

3Gp02

温熱誘導型遺伝子発現システムの遺伝子発現挙動解析○Sabrina Sharmin, Ankan Dutta Chowdhury, Enoch Y. Park
(Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)park.enoch@shizuoka.ac.jp○波多江 有輝 1, 井藤 彰 1,2, 増本 新也 1, 小野 章彦 3, 河邉 佳典 1,
上平 正道 1,3
（1九大院・工, 2名大院・工, 3九大院・シス生科）
kamihira@chem-eng.kyushu-u.ac.jp

Amplification of sensing signal is one of the most promising mechanism for thedetection of low amount of analytes. In this report, we have presented a fluorometricmethod to detect influenza virus by a newly developed fluorophore-labeled liposome
and magnetic combined system. Homogeneously distributed amine-functionalized
dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) liposome has been constructed and filled withstrong fluorophore of Rhodamine 6G. In addition, APTES-functionalized Fe3O4
nanoparticles are also synthesized by standard silanization process. These two
nanocomposites are conjugated with monoclonal antibodies for Influenza virus.
Addition of different concentration of viruses in the biosensing system, Rh6Gliposome and magnetic particles can bind with the viruses and make a sandwich likestructure. The Fe3O4-conjugated Rh6G-liposome system has magnetically separated
from its analyte medium and then externally heated at the melting point of liposome toburst out the fluorophores from the core of the liposome. Hence, large number offluorophores can come out from few numbers of viruses and amplify the detection
signal significantly. The detection limit has been found in the range of femto molar
concentration of influenza virus. Minimal cross-reactivity with similar viruses andproteins confirms the stable and non-leaky MB-liposome platform with low
background signal. In summary, the rapid response and high sensitivity of this present
method can offer a huge potential in point-of-care diagnostics for virus detection.

【目的】本研究では、組織工学的に作製した三次元組織において、任意の場所とタイミングで血管新生を促すシステムの構築を目指し、熱ストレスに応答して一過的に血管内皮細胞増殖因子（VEGF）および緑色蛍光タンパク質（EGFP）
を共発現する一過的温熱誘導型遺伝子発現システムと、持続的に遺伝子共発現を行う持続的温熱誘導型遺伝子発現システムを開発した。
【方法と結果】一過的温熱誘導型では、テトラサイクリン応答配列（TRE）と熱
ショックプロモーター（HSP）からなる人工合成プロモーターを作製し、人工合成プロモーターで、IRES を介して VEGF と EGFP が共発現する発現ユニット
をレンチウイルスベクターに組み込んだ。このベクターを、人工転写活性化因子（tTA）を恒常的に発現するレンチウイルスベクターとともに C2C12 細胞へ感染させた。感染させた細胞集団に対して、GFP を指標に限界希釈法で細胞クローンを樹立し、熱応答性を評価した。細胞播種 24 時間後に、ウォーターバス
を用いて 43℃で 1 時間加温した。24 時間後に FACS で解析したところ、GFP
発現がみられた。48 時間後に再度 FCAS で解析したところ、蛍光割合の減少を確認できたことから、一過的温熱誘導ができたと考えられる。
一方、持続的温熱誘導型では、HSP プロモーターをスイッチとして tTA を発現させた後、TRE-PCMVmin プロモーターで応答させることで、ポジティブフィー
ドバックループを形成し、持続的発現系が構築できるように設計した。tTA 発
現ユニットならびに、目的遺伝子（TRE-PCMVmin /VEGF/IRES/EGFP）を有した各レンチウイルスベクターを C2C12 細胞に感染させた。細胞集団に対して、
43℃で１時間加温し、蛍光発現がみられた細胞を FACS でソートしたところ、１ヶ月以上持続的に発現する細胞が得られた。

Fluorescent-labeled liposomal amplified biosensor for the ultrasensitive
detection of virus

Gene expression behavior analysis of heat induction type gene expression
system○Sabrina Sharmin, Ankan Dutta Chowdhury, Enoch Y. Park
(Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)

Key words

immunoliposome, liposome immunoassay○Yuki Hatae1, Akira Ito1,2, sinya Masumoto1, Akihiko Ono3, Yosinori Kawabe1,
Masamiti Kamihira1,3(1Fac. Eng., Kyushu Univ., 2Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 3Grad. Sch. Syst. Life
Sci., Kyushu Univ.)

Key words
heat shock protein, angiogenesis, regenerative medicine, vascularendothelial growth factor

288

3Gp03

ニワトリシアル酸転移酵素の解析とインフルエンザワク
チン生産効率化への応用

3Gp05○金岡 英徳 1, 加藤 万貴 1, 牧田 芳隆 1, 佐野 観月 1, 飯島 信司 2,
西島 謙一 1
（1名大院・工, 2愛工大・工）kaneoka@chembio.nagoya-u.ac.jp

細胞死受容体を利用した結合部位特異的抗体選択系の構築○河原 正浩, 江口 晃弘（東大院・工）kawahara@chembio.t.u-tokyo.ac.jp【背景と目的】
新型インフルエンザ発生とパンデミックの懸念からインフルエンザワクチン生産の効率化が急がれている。しかしながら、現在行われている発生途中のニワ
トリ胚（発育鶏卵）を用いるワクチン生産は時間がかかり、急な流行に対応できない。ヒトインフルエンザウイルスは感染時に細胞表面を覆う糖鎖構造末端の α-2,6 結合型シアル酸を認識するが、発育鶏卵では α-2,3 結合型シアル酸が大部分を占め、ワクチン生産に必要なウイルス培養に長時間を有する原因になっている。そこでこの問題を解決するため、糖鎖制御工学の概念に基づき α-2,6結合シアル酸転移酵素を導入したトランスジェニックニワトリを作製し、このニワトリ由来の発育鶏卵（ヒト型糖鎖含有鶏卵）を用いてインフルエンザワク
チン生産効率化を目指している。
【方法・結果】
我々はこれまでのニワトリシアル酸転移酵素の研究により、インフルエンザウ
イルスを培養する漿尿膜において、α-2,6 結合型シアル酸の形成に必要なシアル酸転移酵素 ST6Gal1 の発現量が低い一方で、ニワトリが多く持つ α-2,3 結合型
シアル酸を形成する ST3Gal6 の発現量が高いことを明らかにしてきた。これらの結果に基づき、２種類のニワトリ糖鎖改変法を検討した。ひとつ目は CRISPR/
Cas9 を用いたゲノム編集により、ST3Gal6 遺伝子座に α-2,6 結合シアル酸を形成する ST6Gal1 遺伝子を組込むことで、α-2,3 結合シアル酸を減少させると同時に、α-2,6 結合シアル酸形成を促進させる方法である。もうひとつは Cre/loxP 作
動性遺伝子発現変換を利用した糖鎖改変システムを piggyBac トランスポゾンにより導入する方法を検討した。まずは今回のシステムを培養細胞において導入確認を行い、その結果として起こる糖転移酵素の発現量変化を解析した。

【背景・目的】 膜蛋白質は医療における重要なターゲットであり、膜蛋白質抗原に対する高特異性・高親和性抗体を迅速、簡便かつ確実に取得する系の開発が必要とされている。そこで本研究では、動物細胞膜上に提示させた膜蛋白質
抗原の特定のエピトープに対してより高い親和性で結合する抗体を簡便に得るための技術を開発した。
【実験方法・結果】 本研究では、細胞死シグナルを伝達する受容体 Fas に着目した。本研究で考案した系では、抗原‐Fas 融合蛋白質と、抗原特異的抗体ク
ローンを用いた合成小分子依存的二量体化抗体を細胞に遺伝子導入して共発現させる。得られた細胞に、使った抗体クローンの抗原親和性に影響する部分の配列をランダム化した抗体ライブラリーを遊離の状態でさらに共発現させる。
この細胞に合成小分子を添加して培養すると、抗原‐Fas 融合蛋白質が活性化されて細胞は死滅するが、抗体ライブラリーの中に、元の抗体クローンより親和性の高い抗体があれば、その抗体は二量体化抗体よりも優先的に抗原に結合するので、抗原‐Fas 融合蛋白質の二量体化を阻害し、細胞死を阻害して生存する。生存した細胞から抗原への親和性が上昇した抗体遺伝子を得ることができる。実際に、抗原として ErbB2 を用いてライブラリースクリーニング実験を行った。その結果、元の抗 ErbB2 クローンよりも解離が起きにくく高い親和性で結合する scFv クローンが複数得られ、いずれも元クローンと同一のエピトープに結合することが分かった。以上より、本系では特定のエピトープに結合する抗体の親和性成熟が可能であることが示された。

Analyses of chicken sialyltransferases for optimization of influenza vaccine
production

Designing an epitope-specific antibody selection system utilizing a cell death
receptor○Hidenori Kaneoka1, Maki Kato1, Yoshitaka Makita1, Mizuki Sano1, Shinji Iijima2,
Ken-ichi Nishijima1(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2Fac. Eng., Aichi Inst. Technol.)○Masahiro Kawahara, Akihiro Eguchi(Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)

Key words

influenza vaccine, CRISPR/Cas9, transgenic chicken

Key words

antibody, receptor, screening, mammalian cell

3Gp04

ニワトリ始原生殖細胞の分化・培養に関わるサイトカイ
ンの解析

3Gp06

バイオ医薬品生産のためのチャイニーズハムスター腎臓
組織由来細胞株の構築

奥嵜 雄也 1, 萩原 遥太 1, 中山 裕貴 1, 村上 晴太郎 1, 飯島 信司 1,2,
金岡 英徳 1, ○西島 謙一 1（1名大院・工, 2愛工大・工）nishijima@chembio.nagoya-u.ac.jp○河邉 佳典 1,2, 巖 流征 1, 山中 寛子 1, 上平 正道 1,2（1九大院・工, 2次世代バイオ医薬品製造技術研究組合（MAB組合））kamihira@chem-eng.kyushu-u.ac.jp[背景と目的] ニワトリは発生分野などで古くからモデル生物として用いられてきただけでなく、ニワトリ卵白で生産された最初の組換え医薬品が我が国においても臨床に供されるなど実用面でもその有用性が示されている。将来精子・卵子となる始原生殖細胞を長期培養して操作した後、ニワトリ個体まで効率よく発生させることができれば、ニワトリの遺伝子改変を自由に進めることができる。ニワトリ胚から採取した始原生殖細胞は BMP や Activin などのサイトカ
インの添加で長期培養が可能となったが、その分化に関する知見はまだ限られたものである。これまでの解析から、マウス始原生殖細胞の誘導分化に重要な
転写調節因子がニワトリ始原生殖細胞の正常な発達にも関与していることが明らかとなっている。また、BMP や Activin はマウス ES 細胞から始原生殖細胞を in vitro で誘導する際に添加されるサイトカインである。そこで、未分化なES 細胞様の細胞が存在する産卵直後の胚盤葉期胚に着目し、これらサイトカインの影響を検討した。
[方法および結果] 白色レグホン胚盤葉期の細胞を回収し、BMP 及び Activin を含む始原生殖細胞培養用の培地で培養し、3 日後に遺伝子発現を検討した。その結果、CVH や DAZL など生殖細胞特有遺伝子の発現レベル上昇は認められなかった。一方、ある程度の分化を誘導するとされるサイトカインなしの DMEM
培地においてもやはり生殖細胞関連遺伝子の発現は低いものであった。また、
ニワトリ始原生殖細胞の分化に重要との報告がある CVH 遺伝子の過剰発現によっても DAZL などの発現は始原生殖細胞に比べて低いものであり、他の因子の重要性が推測された。

【背景と目的】我々はこれまでにチャイニーズハムスター腎臓組織の初代細胞から不死化させた純国産のオリジナル細胞株、CHK 細胞の樹立に成功している。
CHK 細胞の遺伝子転写産物を RT-PCR 法で解析したところ、腎幹細胞マーカーの発現が認められた。このことから、CHK 細胞は腎幹細胞が形質転換したもの
で、培養条件を制御することにより、増殖性と機能分化を任意のタイミングで切り換えることが可能な細胞株であると考えた。本研究では、CHK 細胞を用いて、セルエンジニアリングにより増殖と機能性を任意のタイミングで制御可能なバイオ医薬品生産宿主細胞の創製を目指した。
【方法と結果】はじめに、低分子薬剤等を用いて細胞内シグナルを調節すること
で、機能分化誘導に適した培養環境条件を調査した。低分子薬剤や液性タンパ
ク質因子等複数の候補物質を様々な濃度で細胞培養液に添加した。その結果、セミコンフルエントの細胞密度から、毒性なく細胞形態の変化とともに増殖性を低下させる物質として、レチノイン酸（all-trans RA）、エストラジオール（E2）、および PD0325901 を見いだした。これらの物質は、血清条件で不死化した CHK 細胞ならびに無血清・浮遊馴化した CHK 細胞どちらにおいても同濃度の添加で有効であった。各低分子薬剤添加時に発現している遺伝子の転写産物
をマイクロアレイにより解析したところ、各低分子薬剤添加条件で異なる遺伝子において有意な発現変動が観察された。現在、見出された低分子薬剤や変動
遺伝子をベースとした人工の遺伝子発現系を構築しており、合わせて報告する。
（本研究は、日本医療研究開発機構（18ae0101063h0001）により助成を受けて実施した。
）

Analysis of chicken primordial germ cells

Establishment of immortalized cell line derived from kidney of Chinese
hamster for production of biopharmaceuticals

Yuya Okuzaki1, Yota Hagihara1, Yuki Nakayama1, Seitaro Murakami1,
Shinji Iijima1,2, Hidenori Kaneoka1, ○Ken-ichi Nishijima1(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2Fac. Eng., Aichi Inst. Technol.)Key words

chicken, germline○Yoshinori Kawabe1,2, Ryusei Iwao1, Hiroko Yamanaka1, Masamichi Kamihira1,2(1Fac. Eng., Kyushu Univ., 2MAB)

Key words

CHK cells, Biopharmaceuticals, Kidney

289

3Gp07

医療タンパク質の高生産化に向けたチャイニーズハムス
ター卵巣細胞の改変

3Gp09○嶋田 順太 1, 三﨑 亮 1, 大橋 貴生 1,2, 藤山 和仁 1
（1阪大・生工国際セ, 2摂南大院・理工）Fujiyama@icb.ecs.osaka-u.ac.jp

抗体医薬品生産細胞の高度化を目指した高機能化因子
迅速同定システムの開発○鬼塚 正義 1,2, 嶋津 敦子 2, 天羽 宏枝 2
（1徳島大院・社会産理工, 2次世代バイオ医薬品製造技術研究組
合）onitsuka@tokushima-u.ac.jp【背景と目的】医療タンパク質の多くは合成後に輸送小胞によって細胞外へ分泌されるが、適切に分泌されず細胞内に蓄積し、生産性が制限されることが課題である。小胞による輸送は、多数のタンパク質及びそれらの複合体によって仲介されており、それらの発現量を変化させることで目的タンパク質の分泌量を向上できる可能性がある。本研究では特に SNARE タンパク質に注目した。
SNARE は様々な細胞小器官や輸送小胞に存在し、それらが互いに結合し複合体を形成することで、輸送小胞と標的膜との膜融合を引き起こす。今回は、リサイクリングエンドソーム、後期エンドソーム、ゴルジ体において働く６種類の SNARE を選択した。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞におけるこれらの SNARE の過剰発現効果を検証し、分泌経路を補強することによって、医療タンパク質の生産性の向上を目指す。
【方法】哺乳類発現用ベクターにヒト由来の SNARE 遺伝子をそれぞれ挿入し、6 種類のベクターを作成した。ヒト抗デングウイルス抗体を安定発現する
CHO‐K1 細胞に、構築したベクターをそれぞれリポフェクション法により導入し、SNARE を一過性に発現させた。24 時間後に、細胞培養液中に分泌された IgG を回収し、サンドイッチ ELISA 法を用いて IgG 生産量を定量した。
【結果と考察】一過性発現した SNARE のうち、４種は生産性にほとんど影響を与えず、１種は負の影響を与えたが、ある種の SNARE の一過性発現は、組換え IgG の分泌生産性に正の影響を与えた。この SNARE はトランスゴルジネッ
トワーク（TGN）において発現され、初期エンドソームから TGN への逆行性輸送に関与する。この逆行性輸送では TGN から細胞膜への輸送に必要なタン
パク質のリサイクルが行われていると言われており、当該 SNARE の一過性発現によりこのリサイクルが活性化し、抗体の分泌輸送が促進されたと示唆される。

抗体医薬品は主に動物細胞を用いた組換えタンパク質として製造されている。
現在、生産対象の抗体分子や製造プロセスの特性に応じて、生産細胞の高度化や改変を目的としたセルエンジニアリング手法の開発が求められている。しかしながら高度化や改変に有用な遺伝子、即ち高機能化因子（Production enhancer
gene: PEG）を発掘、同定するには 6 ヶ月程度の時間と多大な実験量が必要である。そこで我々は抗体医薬品の製造で汎用されている CHO 細胞を対象として、
PEG の迅速同定システムを開発した。本システムでは IgG1 抗体生産 CHO 細胞にエピソーマル発現システムを導入している。即ち EBNA1 発現遺伝子を CHO
細胞染色体に組み込み、評価対象となる遺伝子発現用のプラスミドには oriP 配
列を組み込むことで、導入プラスミドが細胞内で複製しながら細胞が増殖する。
開発したシステムを用いて発表論文として抗体生産能力の向上が報告されている遺伝子を評価した結果、必ずしも PEG として作用しないことが示され、従来手法の問題点が推察された。また各種の遺伝子を評価した結果、複数の PEG を同定することに成功した。さらに PEG の 1 つを CHO 細胞の染色体に導入した安定発現細胞を構築したところ、小フラスコを用いた培養試験で IgG1 生産量
が 0.5g/L（親細胞）から 1.9g/L（改変細胞）に劇的に向上した。本システムは遺伝子導入から 10 日程度の短期間と少ない労力で高機能化因子を同定できるため、従来の評価・同定手法と比較して労力と期間の点で圧倒的に優位な手法であり、生産細胞の合理的な高度化に貢献するであろう。

Modification of Chinese hamster ovary cells for high productivity of
biohparmaceuticals.

Rapid identification of production enhencer gene (PEG) in CHO antibody
production○Junta Shimada1, Ryo Misaki1, Takao Ohashi1,2, Kazuhito Fujiyama1(1ICBiotech, Osaka Univ., 2Grad. Sch. Sci. Eng., Setsunan Univ.)○Masayoshi Onitsuka1,2, Atsuko Shimadzu2, Hiroe Amou2(1Grad. Sch. Biosci. Bioind, Tokushima Univ., 2MAB)

Key words

Chinese hamster ovary, IgG, Productivity, SNARE protein

Key words
recombinant protein production, CHO cells, cell engineering,production enhancer gene

3Gp08

HCP 混入リスクの低減を目的とした Anxa2、Ctsd ノッ
クアウト CHO 細胞株の樹立

3Hp01○福田 展雄, 千賀 由佳子, 本田 真也（産総研・バイオメディカル）
nob-fukuda@aist.go.jp

ITO 電極システムと試料の前処理を活用した新規微生物培養化法の開発○名取 暁 1, 小山 純弘 2, 青柳 秀紀 1
（1筑波大院・生命環境, 2エイブル）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp

チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞は、モノクローナル抗体等の組換え治療用タンパク質の生産における宿主細胞として広く利用されてきた。宿主由来タンパク質（HCP）の大部分は精製過程において除去されているが、最終製品中に含まれる 100ppm 以下の HCP が治療用タンパク質の品質低下や免疫応答を誘発することが報告されている。これらの HCP を精製過程において完全に除去することは現実的には困難であるため、理想的には不要タンパク質を発現しないノックアウト細胞株を樹立して宿主とすることが望ましい。しかしながら、細胞自身の増殖や治療用タンパク質の生産能力に対して、遺伝子ノックアウト
が及ぼす影響については未だ評価されていない。
そこで本研究では、CRISPR/Cas9 システムを用いて、Anxa2 または Ctsd ノック
アウト CHO 細胞株を樹立することで、治療用タンパク質に対する HCP 混入リ
スクの低減を目的とした遺伝子ノックアウトの実現可能性を評価することとした。樹立した細胞株のライセート中に標的 HCP が存在しないことを確認したの
ち、各細胞の増殖能および生存率を評価したところ野生型と同等の数値を示す
ことが確認された（Biotechnol Prog. 2019 Apr 11:e2820.）。これらの細胞株を宿主として治療用タンパク質を生産することで、治療用タンパク質の品質低下や免疫応答のリスク低減が可能となることが期待される。今後は候補遺伝子のノッ
クアウトの影響を比較していく必要があり、治療用タンパク質の生産能力や安定性の定量的評価についても、分析手法の整備における課題として検討を進め
ていく。

【目的】
未開拓な遺伝子資源や有用代謝産物の獲得、機能解明を目指し、未培養微生物の培養化が国内外で期待され、新たな方法論が求められている。この現状を踏
まえ、本研究では未培養微生物の培養化を目指し、酸化インジウムスズ（ITO）
電極システムに着目し、本システムの各プロセスにおける特性（微生物の選抜や回収の特徴や仕組み）を把握すると共に、環境試料の適切な前処理と組み合わせることで、未培養微生物の培養化を試みた。
【方法と結果】
筑波大学構内で採取した土壌や池の水などの環境試料を 0.8 μm の孔径を有するフィルターで濾過する等の前処理により適宜調製し実験に使用した。ITO 電極（作用電極）、白金電極（対電極）および銀／塩化銀電極（参照電極）を装備したチャンバーに、調製した試料を投入し、−0.4 V の定電位を印加し、電極上に微生物を集めた（プロセス１）。続いて±20 mV、9 MHz の正弦波電位を印加し（プロセス２）、微生物を取得した（電極上に残存した菌はスクレーパーを用いて取得）。それぞれのプロセスで得られた微生物を R2A 寒天培地等で培養し、PCR-DGGE 法などで培養微生物叢を解析した結果、高周波電位の印加により特異的に培養化する細菌の存在が示唆された（電位の印加で培養化が抑制［または死滅］する細菌も存在）。このことから、高周波電位刺激によって培養化が、(a) 促進される、(b) 阻害される、(c) 影響を受けない、3 つのタイプの細菌が存在することが示唆された。また、PCR-DGGE 解析で高周波電位刺激を加えた場
合にのみ特異的に見られたバンドのシークエンスを解析したところ、相同性が95%未満の細菌が複数存在した（現在、単離培養について検討中）。

Anxa2- and Ctsd-knockout CHO cell lines to diminish the risk ofcontamination with HCP

Development of culture method for uncultured microbes using ITO
electrode system and sample pretreatment○Nobuo Fukuda, Yukako Senga, Shinya Honda(Biomed. Res. Inst., AIST)

Key words

gene knockout, CHO, host cell proteins○Akira Natori1, Sumihiro Koyama2, Hideki Aoyagi1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2ABLE. Co.)

Key words

ITO electrode, pretreatment, microbial dark matter, PCR-DGGE

290

3Hp02

腸上皮細胞と腸内細菌の共培養法の開発○遠藤 輪, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp

3Hp04

生体物質付着抑制材 prevelex®は細胞増殖因子の非特異的付着を抑制し効率的な細胞培養を可能とする○中嶋 宏之, 安部 菜月, 鈴木 康平, 広井 佳臣, 西野 泰斗（日産化学）
nishino@nissanchem.co.jp【目的】
近年、腸内細菌叢が宿主の健康や疾患に関係していることが示されているが、腸内環境で生じる諸現象のメカニズムの多くは未だ解明されていない。特に腸管内の物質動態の把握は腸内細菌の機能を理解するために重要であり、その解析には腸内環境を模倣した in vitro 実験モデルの開発が望まれる。しかし現状では、腸上皮細胞と腸内細菌の共培養は技術的に困難であり、両者が関与する現象の解析に in vitro 実験系は十分に活用できていない。本研究では、腸上皮細胞と腸内細菌の共培養を実現するために、共培養時に制御すべき培養因子を把握するとともに、その因子を制御した共培養系の構築を試みた。
【方法と結果】
共培養時に制御すべき培養因子を明らかにするために、想定される物理化学的な環境の変化（栄養源の枯渇、微生物代謝物の添加、培養液の pH の低下）を
Caco-2 細胞（腸上皮細胞）に与え、その影響を評価した。種々検討した結果、特に培養液の pH の低下が腸上皮細胞の生存率やバリア機能を大きく低下させることが明らかになった。次に、上述の培養因子を制御し、共培養を実現する
ために微生物と腸上皮細胞の生育空間を隔てた培養系を構築した。本培養系を用いて共培養を試みたところ、適切な条件を設定することで、24 h の共培養後にも良好な腸上皮細胞の生育が認められた。以上の結果から、培養因子をコン
トロールすることによって、それぞれの細胞を個別に培養する場合よりも生体内環境を高度に模した in vitro 腸管モデルが構築できる可能性が示唆された。

タンパク質等の生体物質は保存や調製時に疎水性相互作用により容器表面に非特異的に付着してしまう。そこで我々は非特異的付着を防止する新規材料としてリン酸ユニットとアミンユニットから構成される双極性イオンポリマー
prevelex®を開発した。本研究では prevelex®を各種基材に塗布した際のタンパク
質付着抑制効果を確認するとともに、細胞培養への応用を検討した。
ポリプロピレン(PP)やポリスチレン(PS)、ガラス製の器具に prevelex®を塗布して HRP 標識 IgG 蛋白質の付着を評価したところ、prevelex®を塗布した器具は付
着量が 9 割以上減少した。また、この付着抑制効果はタンパク質の分子量や等電点に依存せず、gamma 線滅菌後も効果が保たれた。
細胞培養を行うとき Basic fibroblast growth factor(bFGF)等の細胞増殖因子を培養培地に添加することがある。しかし、これら細胞増殖因子は培養容器に付着するため培地中での濃度が細胞培養時に低下することが懸念されている。そこで、
細胞培養用プレートに prevelex®を塗布し、スフェロイド状態のヒト子宮由来平滑筋肉腫細胞(SKN 細胞)と bFGF 0.01-100 ng/ml を加えて 4 日間培養したところ
prevelex®を塗布したプレートは細胞増殖が 1.5 倍早かった。また bFGF の EC50を算出したところ prevelex®塗布により EC50 が 1/6 以下に減少した。更に ELISA
試験により prevelex®が細胞培養プレートへの bFGF の付着を抑制することも確認できた。
以上のように prevelex®は PP や PS、ガラス製の培養容器に塗布可能であり、本材料を塗布した培養容器はより低い細胞増殖因子の濃度にて効率的に細胞を培養できることが明らかとなった。現在 prevelex®を用いた幹細胞の培養システムを検討している。

Development of co-culture method of intestinal epithelial cells and intestinalbacteria

Biological material adhesion inhibitor prevelex® suppresses nonspecificadhesion of cell growth factors and enables efficient cell culture○Rin Endo, Hideki Aoyagi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)○Hiroyuki Nakajima, Natsuki Abe, Kohei Suzuki, Yoshiomi Hiroi, Taito Nishino(Nissan chemical Corp.)

Key words

Caco-2 cells, coculture, microbial flora, viability

Key words

protein adsorption, cell growth factor, cell culture

3Hp03

Silver nanoparticles biosynthesis from extracellularpigment of Talaromyces purpurogenus and theirbiomedical applications

3Hp05

吸着剤を用いた培地再生方法の試み○Sharad Bhatnagar1, Toshiro Kobori1,2, Hideki Aoyagi1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Food Res. Inst.,
Natl. Agric. Food Res. Org., Tsukuba)
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp○北川 文彦 1, 菊池 晴菜子 2, 近藤 昌幸 1, 神保 陽一 1, 亀田 知人 2,
吉岡 敏明 2
（1日機装・技術開発研, 2東北大院・環境）
f.kitagawa@nikkiso.co.jp

Bio-fabrication of nanoparticles is attaining increasing attention due to environmental
costs associated with conventional techniques. Moreover, functionalized nanoparticles
generated from biological reduction process have demonstrated interesting biomedical
applications. In this view, extracellular pigment produced by Talaromyces
purpurogenus was used as an economical and environmentally friendly reducing agent
for synthesis of silver nanoparticles (AgNPs). In order to synthesize silver
nanoparticles, silver nitrate was mixed with pigment and incubated with light for 48 h.
Produced AgNPs were found to have a surface plasmon resonance around 410 nm andrate of synthesis was influenced by pigment pH. The biosynthesized AgNPs werecharacterized by Transmission electron microscopy (TEM), Dynamic light scattering(DLS), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), Electron probe micro analyzer(EPMA) and Zeta potential. TEM analysis indicated the presence of spherical AgNPs
with size distribution from 5-40 nm. The AgNPs exhibited a significant antimicrobialactivity against E. coli and S. epidermidis. The cytotoxic potential of AgNPs wasinvestigated against human cervical cancer (HeLa), human liver cancer (HepG2) andhuman embryonic kidney (HEK-293) cell lines with 5-fluorouracil acting as a positive
control. A significant activity was recorded against HepG2 cell lines with an inhibitory
concentration (IC50) value of 11.1 μg/ mL.

【背景と目的】スピナーフラスコ等を用いておこなわれる高密度攪拌培養では、細胞の高密度化に伴い、様々な問題が生じる。特に、iPS 細胞の維持や分化誘導を高密度攪拌培養で行う場合、乳酸やアンモニア等の老廃物の蓄積やグルコース等の栄養源が枯渇することにより、高頻度で高価な培地を交換する必要があり、培養コストが増加する。我々は、培養コストを低下させるために、細胞培養中の培地から細胞老廃物である乳酸とアンモニアを吸着剤により除去することで、培地再生しながら高密度攪拌培養するシステムの開発を目指している。
本研究では、培養上清から細胞老廃物を吸着除去可能な吸着剤の探索と、吸着剤による培地再生方法の有効性を検証することを目的とした。
【方法】継代培養直前の乳酸とアンモニアを含んだ培養上清に、様々な吸着剤を浸漬して乳酸、アンモニア除去性能を確認し、最適な吸着剤を探索した。また、選定した乳酸吸着剤とアンモニア吸着剤を細胞培養用培地に浸漬させた後、LSMS/MS を用いた培地成分網羅的解析を実施し、培地成分吸着の有無を調べた。
さらに、細胞培養により増殖や性質を確認した。
【結果と考察】乳酸吸着剤として層状複水酸化物、アンモニア吸着剤として L型ゼオライトを用いることで、培養上清中から乳酸とアンモニアを除去可能であることを確認した。また、培地成分網羅的解析の結果、吸着剤による培地有用成分吸着は数種類であった。さらに、層状複水酸化物と L 型ゼオライトを浸漬した培地にて細胞培養したところ、細胞の増殖性や性質に影響を与えないことを確認した。以上の結果から、培養上清から乳酸・アンモニアを選択的に吸着する吸着剤を選択でき、これらの吸着剤を用いた培地再生手法は、有用であると考えられる。

Silver nanoparticles biosynthesis from extracellular pigment of Talaromyces
purpurogenus and their biomedical applications

Medium regeneration method utilizing adsorbents for large scale cell culture

Key words
Anti-cancer activity, Green nanotechnology, Silver nanoparticles,
Talaromyces purpurogenus

Key words○Sharad Bhatnagar1, Toshiro Kobori1,2, Hideki Aoyagi1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Food Res. Inst., Natl. Agric. Food
Res. Org., Tsukuba)○Fumihiko Kitagawa1, Hanako Kikuchi2, Masayuki Kondo1, Yoichi Jimbo1,
Tomohito Kameda2, Toshiaki Yoshioka2(1Nikkiso Co., Ltd., 2Grad. Sch. Environ. Stud. Tohoku Univ.)

regeneration, cell

291

3Hp06

複雑な流体環境は単球の生理的機能を亢進する○小田 彰恭 1, 池田 光悦 1, 高橋 美裕 1, 野辺 善仁 2, 村松 和明 1
（1電機大院 ・理工, 2大洋技研）
k-muramatsu@mail.dendai.ac.jp

3Hp08

ヒト人工多能性幹細胞の無菌閉鎖系における塑性流体を用いた 1 L 規模の培養工程の構築○長谷 洸輝, 山本 陸, 紀ノ岡 正博（阪大院・工）kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景・目的】
血液中の好中球や単球が血管外遊走（ホーミング）をする際、ホーミングレセ
プターである L-セレクチンとその認識リガンドである細胞表面糖鎖との蛋白質-糖鎖分子の相互作用により、細胞の流速を減速することが知られているが、血管内の流体環境が L-セレクチンの発現に与える影響については不明な点が多い。そこで本研究では、血管内のような複雑な流体環境を想定した in vitro 系において、ヒト単球性白血病細胞株 THP-1 を用いることで、複雑な流体環境が単球の生理的機能に及ぼす影響について評価した。
【実験方法】
複雑な流体環境は自転公転式攪拌装置を用いて創出した。自公転式撹拌装置による動的環境下、あるいは静置培養下で THP-1 を培養し、RT-PCR 法にて L-セレクチンの経時的な発現挙動の評価を行った。また、それぞれの環境下で培養した THP-1 にホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート（PMA）による刺激
後、マクロファージ様細胞の出現数及びその生理的機能について比較・評価した。
【結果・考察】複雑な流体環境（動的環境）下で培養した THP-1 は、静置培養下の細胞と比較し、L-セレクチンの発現が促進され、PMA 依存的な接着性の亢進を認めた。さらに、動的環境下で培養した THP-1 を PMA で刺激したところ、静置培養と比べてマクロファージ様細胞の接着性と遊走活性が向上した。一方、接着後の細胞における接着因子遺伝子の発現比較では、両群間で顕著な差は確認されなかった。これら結果により、血液循環がもたらす流体環境は、白血球の刺激感受性を高め、細胞間接着の向上に寄与する内在的要因となる可能性を示唆した。

【背景と目的】ヒト人工多能性幹細胞 (hiPSCs) を再生医療や創薬研究など種々の分野に活用する試みがなされている．そのため多量の細胞の用意する増幅工程の構築が急務となるが，hiPSCs のせん断応力への脆弱性から大規模 ( > ca. 1
L) での培養例は少なく，hiPSCs に適した培養系の検討は十分ではない．また製造を鑑みて，異物混入や交差汚染の危険性を排除した工程設計が求められるた
め，無菌閉鎖系の培養工程構築が望まれる．そこで iPSCs を無菌的に培養可能な大量培養工程構築を目指し研究を行った．
【方法】交差汚染のリスク低減並びに，装置の滅菌，洗浄処理とそのバリデー
ションを必要としないという有用性から本研究ではシングルユース培養装置を利用した．また，無撹拌で細胞の浮遊維持が可能となる塑性流体を培地として採用した．低頻度の振とう操作により，液界面での酸素供給と培養環境の均質化を行いながら 120 h 培養を行った．また塑性流体は中空糸膜内を流動させる
ことで膜分離での液交換が可能である．そこで培養装置と膜分離装置を無菌的に接続し培養 48，96 h において培地交換を行った．培養 24 h 毎に細胞密度の計測を行い，対数増殖期の比増殖速度を算出し細胞の増殖能を評価した．
【結果と考察】膜分離装置を用いた培地交換操作と、装置間の無菌接続により，培養期間において閉鎖系を維持した培養が可能であった．また本培養工程において塑性流体を用いることで、1 L 規模の培養装置での hiPSCs 増殖が確認され、とくに対数増殖期における細胞の比増殖速度は，既存の小規模撹拌型培養
装置での培養と同等の値を示した．これらの結果から本研究で提案した培養系
は、塑性流体を用いたことで hiPSCs の増殖能維持が可能になり、また無菌閉鎖
系の維持が可能となる培養工程の構築が行われた．

Complicated dynamic fluid environment upregulated the expression ofphysiological function of monocyte

Development of 1 L scale closed expansion process with plastic fluid forhuman induced pluripotent stem cell

○Akinori Oda1, Koetsu Ikeda1, Miyu Takahashi1, Yoshihito Nobe2,
Kazuaki Muramatsu1(1Grad. Sch. Sci. Eng. Tokyo Denki Univ., 2Taiyo Giken Co.Ltd)○Hiroki Nagatani, Riku Yamamoto, Masahiro Kinooka(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

dynamic fluid environment, rotation/revolution, monocyte, culture

Key words
culture bag

closed culture process, plastic fluid, hiPSCs expansion, single-use

3Hp07

回転浮遊培養におけるヒト iPS 細胞集塊挙動の速度論的
解釈

3Hp09

ヒト iPS 細胞培養における播種密度が分化ポテンシャルに与える影響○橋田 礼博 1, 植村 壽公 2, 紀ノ岡 正博 1
（1阪大院・工・生命先端, 2阪大院・工・精科応物）
kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp○金 美海, 秋山 真一, 紀ノ岡 正博（阪大院・工）kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp

近年，再生医療，創薬・疾患研究におけるヒト iPS 細胞の利用拡大に伴い，細胞の大量培養技術の確立が強く求められている．ヒト iPS 細胞の大量培養には，省スペース化・高密度培養を可能とする浮遊培養が適しているが，同じ工程で培養を行ったとしても細胞株の種類に依存して細胞収率が変動してしまう．現在，この変動に対応した制御手法が確立されていないことが，大量培養技術を構築していく上での問題点の 1 つとなっている．この原因として，培養過程で形成される細胞集塊の挙動が細胞増殖に与える影響について十分に理解されていないことが挙げられる．本研究では，細胞集塊の挙動（細胞増幅，集塊合一，
集塊崩壊）に着目し，これらの挙動が細胞増殖に与える影響を，反応速度論的解釈を通じて明らかにすることを目的とした．
我々は，静置培養系（細胞増幅のみが発生）と回転浮遊培養系（細胞増幅，集
塊合一，集塊崩壊が発生）を用い，ヒト iPS 細胞集塊（253G1 株，201B7 株）の培養を 72 h 行った．2 つの培養系間で，細胞増幅の評価指標である比増殖速度・比死滅速度，集塊合一・集塊崩壊の評価指標である比集塊数増幅速度・比
集塊サイズ増幅速度を比較した．253G1 株では初期の 24 h で集塊合一が高頻度で発生しており，その後の比増殖速度が静置培養系と比較して著しく低下していた．一方で 201B7 株では，培養開始から 24 h 以降，細胞集塊がシングルセル
へと崩壊する頻度が高く，こちらも静置培養系と比較して比増殖速度が著しく低下していた．さらに我々は，細胞集塊凍結切片の免疫蛍光染色の結果から，集塊合一に寄与している E-cadherin や集塊形成の安定性に寄与している ECMの発現が細胞株間で顕著に異なることを見出した．以上から，これらのタンパ
ク質発現の違いが集塊合一・集塊崩壊の発生頻度を変化させ，細胞増殖に影響を与えていることが示唆された．

【方法および結果】ヒト iPS 細胞を 2 つの播種密度 2.5×103 cells/cm2 と 2.5×104 cells/cm2 で iMatrix 面上に播種し，StemFit AK02N 培地を用いて継代培養を行った．
継代 1 と 50 回目の細胞を用い， 216 h の培養を行い，培養中のヒストン H3 の4 番目と 27 番のリジンのメチル化(H3K4me3，H3K27me3) の変化をウェスタン
ブロット法で解析した．その結果，H3K4me3 と H3K27me3 はいずれも培養中にする増加する傾向がみられ，培養 216 h で播種密度の違いを比較すると高密度条件でメチル化のレベルがより高いことが確認された．さらに，高密度条件の 50 回継代培養を行った細胞と比べると，1 回継代培養を行った細胞よりはる
かに高いことが分かった．これらの細胞を用い三胚葉への分化誘導へと誘導したところ，異なる播種密度で継代した細胞での各胚葉系の分化ポテンシャルが変化していることが確認された．以上の結果から，細胞の周囲の状況によってヒストンのメチル化に変化が生じ，繰り返された培養操作によってメチル化の異常がおきている可能性が示され，それが分化ポテンシャルに変化をもたらす
ことが分かった．

Elucidation of kinetics on aggregate behaviors of human induced
pluripotent stem cells in rotating flow culture

Impact of seeding density on differentiation potential in culture of human
iPS cells

Key words
human induced pluripotent stem cells, kinetics on aggregate behaviors,coalescence, collapse

Key words
Human induced pluripotent stem cells, Expansion culture, Histone
methylation, Differentiation potential○Akihiro Hashida1, Toshimasa Uemura2, Masahiro Kino-oka1(1Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Dept. Prec. Sci. Technol., Grad.
Sch. Eng., Osaka Univ)【目的】ヒト iPS 細胞の産業利用・医療応用する上で細胞の品質管理や規格化の需要が高まり，様々な研究が行われている．近年では iPS 細胞株の品質評価や規格化技術の確立へ向けてエピジェネティック修飾解析が有用になってきた．
しかし，ヒストン修飾によるクロマチン構造変化は，遺伝子の転写制御に重要な役割を果たす報告はあるが，細胞増幅培養での育て方の違いが未分化性と分化ポテンシャルに与えている影響は明らかではない．本研究では，iPS 細胞培養における播種密度の違いがエピジェネティックスの変化と分化ポテンシャルに及ぼす影響について検討する．

○Mee-Hae Kim, Shinichi Akiyama, Masahiro Kino-oka(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

292

3Ip01

ソルビトールストレスが酵母 OC-2 株の脂肪酸構成に与
える影響

3Ip03

○三木 健夫（山梨大院・医工総）takemiki@yamanashi.ac.jp【目的】酵母に含まれる脂肪酸の構成比は、培養温度によって変化することが知られている。これは酵母のストレス応答の一例とされている。一方、温度変化
以外のストレスに対する酵母の脂肪酸構成比変化について調査したものは少ない。本研究では、3M ソルビトール溶液を用いて浸透圧ストレスを与えた酵母
Saccharomyces cerevisiae OC-2 株の脂肪酸構成比を解析した。また、浸透圧ストレス耐性と関係する GPD1 あるいは GPD2 遺伝子を欠損した株についても同様に調査を行った。
【方法】S. cerevisiae OC-2 株および本株の GPD1、GPD2 遺伝子破壊株を SD 合成培地にて定常期まで培養した。酵母細胞を集菌し洗浄した後、3M ソルビトー
ル溶液(50ml)に対して 2.5×107 clls/ml になるよう細胞を接種し、28℃で 2 時間、浸透圧ストレスを与えた。ストレス処理後、細胞を洗浄し凍結乾燥させ、脂肪酸抽出メチル化キットおよびメチル化脂肪酸精製キット(Cat. No.06482-04,
06482-94；ナカライテスク)用いて、酵母細胞より脂肪酸を抽出・精製した。脂肪酸抽出をガスクロマトグラフィーに供し、脂肪酸構成比を測定した。
【結果】非ストレス条件下にある OC-2 株および GPD1、GPD2 遺伝子破壊株の脂肪酸構成を調査した結果、脂肪酸（C14, C14:1, C16, C16:1, C18, C18:1）の比率は 3 株とも同様であった。一方、浸透圧ストレスを与えた場合、各株とも
C16:0 に対する C16:1 割合は大きく変化しなかったものの、C18:0 に対する C18:1の割合が 20％程度増加しており、この傾向は GPD1 遺伝子破壊株で強く見られることがわかった。この様な現象が観察される原因について、現在調査中である。

Effect of Sorbitol stress on fatty acid component in yeast S. cerevisiae OC-2
○Takeo Miki
(Grad. Sch. Med. Eng., Univ. Yamanashi)

出芽酵母における自然発生型の新規マルチストレス耐性
変異株の分離と解析○田中 桃未 1, 中川 洋史 2, 小林 日花梨 1, 小久保 晋 2, 山村 英樹 2,
早川 正幸 2
（1山梨大院・医工総, 2山梨大院・総研部）
youji@yamanashi.ac.jp【背景・目的】出芽酵母において，食品製造過程における冷凍や高糖濃度などの様々なストレス，すなわちマルチストレスにより発酵力や生存率に影響を受けることが問題となっている．本研究室では，マルチストレス耐性変異株を効率的に取得できる致死的濃度過酸化水素法（LCH 法）を用いて，これまでにエチ
ルメタンスルホン酸により変異処理を行った実験室酵母からマルチストレス耐性変異株を取得し，原因変異遺伝子として CDC25 遺伝子のミスセンス変異である CDC25-P1306L を同定している．しかし，変異処理を行わずに LCH 法で取得されるマルチストレス耐性変異株については知見が少ない．そこで本研究では，LCH 法で取得される自然発生型のマルチストレス耐性変異株における原因変異遺伝子の同定を目的として実験を行った．
【方法・結果】野生型の実験室酵母株を，変異処理を行うことなく 10 mM の過酸化水素含有 YPDA 平板培地にプレーティングして培養し，生育コロニーの分
離およびスポット試験により，17 株の過酸化水素耐性変異株を取得した．取得
した株の高ショ糖濃度耐性および高エタノール濃度耐性を調査したところ，高エタノール濃度に耐性を示さなかった 1 株以外の変異株は両ストレスに耐性を示した．また，取得した変異株のうち 7 株について優性劣性試験を行った結果，過酸化水素に対し優性もしくは半優性のストレス耐性変異を持っていることが明らかになった．さらに，これらの株について CDC25 の塩基配列を解読した
結果，7 株中 5 株は CDC25 に様々な種類の CDC25-P1306L とは異なる変異を持つことが判明した．従って，LCH 法を用いることで，CDC25 に変異を持つ自然発生型のマルチストレス耐性変異株が多く取得できることが示唆された．現在，CDC25 変異とマルチストレス耐性の関係を解析するとともに，残りの変異株についても原因変異遺伝子の同定を進めている．

Isolation and analysis of new multistress-tolerant spontaneous mutants of
Saccharomyces cerevisiae○Momomi Tanaka1, Youji Nakagawa2, Hikari Kobayashi1, Susumu Kokubo2,
Hideki Yamamura2, Masayuki Hayakawa2(1Grad. Sch. Med. Eng., Univ. Yamanashi, 2Grad. Fac. Interdisc. Res., Univ.
Yamanashi)

Key words

lipid, yeast, osmotic response, stress

Key words
Saccharomyces cerevisiae, spontaneous mutant, muiltistress tolerance,hydrogen peroxide

3Ip02

有機溶媒に対する酵母の応答：キシレンによる酸化的ス
トレスと翻訳抑制の惹起

3Ip04

河合 孝朗 1, 芳本 奈々 1, 吉田 雅偲 2, ○井沢 真吾 1,2（1京工繊大院・工芸科学, 2京工繊大・工芸科学）
thioredoxin@kit.ac.jp

Komagataeibacter medellinensis NBRC3288 の高温育種
株の耐熱性メカニズム○水町 優希 2, 小田 みすず 2, 伊藤 光平 2, 松本 奈実 2,
松谷 峰之介 2, 片岡 尚也 1,2,3, 藥師 寿治 1,2,3, 松下 一信 1,2,3（1山口大・農, 2山口大院・医系, 3中高温微セ）
kazunobu@yamaguchi-u.ac.jp

発酵による疎水性物質の生産には水・有機溶媒二相系がしばしば用いられるため、微生物の有機溶媒耐性の向上が強く求められている。バクテリアでは有機溶媒に対する応答機構や耐性改善について多数の研究報告があるのに対し、真菌類についての報告は非常に少ないのが現状である。そこで我々は、出芽酵母
Saccharomyces cerevisiae の有機溶媒に対するストレス応答機構を解析し、得られた知見を基に有機溶媒耐性の改善に取り組んでいる。本研究では、シックハ
ウスシンドロームの原因物質の一つでもあり、代表的な有機溶媒であるキシレンに対する酵母の細胞応答について解析を行った。
0.02%以上のキシレンによってミトコンドリアの断片化と細胞内活性酸素種(ROS)レベルの有意な上昇が速やかに引き起こされた。また、ROS レベルの上昇に伴って、酸化的ストレス応答性の転写因子 Yap1 の核局在と、Yap1 標的遺伝子である GPX2 などの転写活性化が確認された。0.02% キシレンストレス下では Gpx2 タンパク質レベルも顕著に増加したのに対し、0.03% キシレンスト
レス下では GPX2 mRNA レベルが顕著に増加したにもかかわらず、Gpx2 タン
パク質レベルの上昇が認められなかった。そこで、タンパク質合成に対する影
響をポリソーム解析などで検討したところ、0.03% 以上のキシレンストレスによって酵母の翻訳活性が持続的に強く抑制されることを新たに見出した。以上の結果から、0.03% 以上のキシレン存在下ではタンパク質の新規合成を介したストレス耐性の獲得は困難だと考えられた。また、酵母のキシレン耐性を改善する上では、キシレンの細胞内への侵入を防ぎ、細胞外への排出能を前もって高めることが有効だと考えられた。

【背景と目的】酢酸菌は偏性好気性菌であり、果実やその酸敗した果実酒などの中で高濃度の糖やアルコールを様々な糖酸、有機酸に酸化的に変換して高濃度で蓄積する能力を有している。中でも Acetobacter や Komagataeibacter は産業的な食酢の生産に用いられているが、酢酸発酵を行う際に発酵熱が生じることで培地の温度が上昇し生育や酢酸発酵が阻害される。そのため細かい温度制御が必要となるが、もし酢酸菌自身が耐熱性を獲得し高温で発酵可能な耐熱化株を得ることができれば冷却のコスト削減などの効果が期待できる。本研究ではKomagataeibacter medellinensis NBRC 3288 を発酵条件下で高温適応育種し得られた株である ITO−1 株に生じた spoT 遺伝子の変異（C 末制御ドメイン一部の欠失）に注目して研究を行なった。
【結果】これまでに ITO−1 株は発酵条件下では耐熱性を示すが非発酵条件下では耐熱性を示さないことが分かっており、spoT の C 末制御ドメイン全域を欠失した ΔspoT 株を作製し調べたところ、発酵条件下で ITO-1 株と同じように耐熱性を示すことが明らかになっている。しかしながら今回、ΔspoT 株は非発酵条
件でも ITO-1 株と異なり耐熱性を示すことを明らかにした。また spoT は、
pp(p)Gpp の合成分解を介して細胞伸長に関与すると報告されているため、細胞長を測定したところ ΔspoT 株と ITO−1 株で同じ条件でも細胞長に違いが見られた。これらの違いは spoT における C 末制御ドメインに２つの領域があるためと考え、ITO-1 株と同じ欠損を持つ株の作製を進めているので併せて発表する。
（本研究は JST-ALCA の支援を受けて行われた。
）

Xylene causes oxidative stress and pronounced translation repression in
Saccharomyces cerevisiae

Analysis of thermotolerance mechanism in thermally adapted strains ofKomagataeibacter medellinensis NBRC 3288

Takao Kawai1, Nana Yoshimoto1, Masasi Yoshida2, ○Shingo Izawa1,2(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst.
Technol.)

Key words
cerevisiae

xylene, translation repression, oxidative stress, Saccharomyces○Yuki Mizumachi2, Misuzu Oda2, Kouhei Ito2, Nami Matsumoto2,
Minenosuke Matsutani2, Naoya Kataoka1,2,3, Toshiharu Yakushi1,2,3,
Kazunobu Matsushita1,2,3(1Fac. Agric., Yamaguchi Univ., 2Grad. Sch. Med., Yamaguchi Univ., 3ResearchCenter for Thermotolerant Microbial Resources, Yamaguchi Univ.)
Key words
thermotolerance, acetic acid, spoT

293

3Ip05

酢酸菌 Acetobacter pasteurianus NBRC3283 株における酸化ストレス応答因子 Dps の機能解析

3Ip07○小林 聖弥 1, 鈴木 敏弘 1, 宮平 響子 1, 勝木 浩平 1, 岸 幹也 2,
石川 森夫 1
（1東京農大応生科・醸造, 2Mizkan Holdings・中研）
m1ishika@nodai.ac.jp

1-ブタノールの添加が大腸菌細胞に与える影響○川畑 龍司 1, 荒木 勇登 2, 青井 議輝 1, 中島田 豊 1, 加藤 節 1（1広島大院・統合生命科学, 2広島大・工）setsukato@hiroshima-u.ac.jp【目的】食酢醸造に用いられる酢酸菌 Acetobacter pasteurianus はエタノールを細胞膜上の脱水素酵素によって酢酸に不完全酸化し（酢酸発酵）、生成した酢酸を細胞内で完全酸化する（酢酸過酸化）絶対好気性菌である。本菌の電子伝達系の駆動時には、電子の授受に付随した活性酸素種（ROS）の発生が予測される。
そこで本研究では本菌の ROS 応答機構の解析を行った。
【方法及び結果】A. pasteurianus NBRC 3283 株を、エタノール存在下で培養を行ったところ、酢酸過酸化時に著量の ROS の蓄積が見られた。一方、同時期におけるカタラーゼの活性は低かった為、本菌は ROS 耐性機構を有する可能性が示唆された。そこで、大腸菌において ROS 耐性への関与の報告がある Dps に着目し、本菌 Dps の機能について検証を行った。プラスミド DNA と Dps の共存下で H2O2 と Fe2+に暴露した結果、プラスミド DNA の断片化が抑制された。
また、Dps は H2O2 と Fe2+存在下で濃度依存的にヒドロキシラジカルの発生を抑制し、Fe2+の添加により Fe3+の Dps 分子内での保持を示す 305nm の吸光度の上昇が見られた。これらの結果から本因子はヒドロキシラジカルによる酸化障害に対して防御的な作用を示すことが強く示唆された。さらに dps 遺伝子の破壊による影響について検討した結果、dps 破壊株は親株と比較して顕著な H2O2 感受性を示すとともに、細胞内に Fe2+が蓄積した。以上のことから、本菌 Dps は
細胞内 Fe2+を捕捉し、Fenton 反応を阻害することで酢酸過酸化期における菌体に ROS 耐性を付与している可能性が示唆された。

【背景・目的】 低炭素社会の実現に向けて、バイオ燃料は石油に代わる環境に
やさしい燃料として注目されている。特にバイオブタノール生産はエネルギー
密度の高い、優れた燃料生産技術として研究が進められている。しかし、ブタ
ノールはほかのアルコールと比べて高い細胞毒性があり、ブタノール生産菌の増殖を妨げ、その結果最大ブタノール濃度が低いことが課題となっている。そこで本研究では、1-ブタノールが微生物に対してどのように毒性をもたらすのかを、大腸菌細胞をモデルとして１細胞解析により検討した。
【方法・結果】 LB 培地で対数増殖期まで培養した大腸菌 BW25113 株に 0〜2%の 1-ブタノールを添加し、さらに 2 時間培養後に顕微鏡で細胞観察を行った。
同時に、死細胞染色試薬の Propidium iodide を加えて生死判定も行った。その結果、2%のブタノール濃度において死菌率が大きく上昇し、70%以上が死細胞と判定された。また、1-ブタノール濃度が 2%のとき細胞の変形が観察された。その形態は細胞質のタンパク質が凝集した細胞とよく似た表現型であり、1-ブタ
ノールの毒性は細胞内タンパク質の凝集を介して細胞死を引き起こす作用があることが示唆された。そこで、凝集タンパク質と共局在することが知られている IbpA をマーカーとして、タンパク質の凝集体形成がブタノール添加後どういったタイミングで起こるのか、また凝集体の形成がどのようにして最終的に細胞死を引き起こすのか、その様子をタイムラプス観察により解析する予定である。

Functional analysis of Dps against oxidative stress in Acetobacter
pasteurianus NBRC 3283

Effect of 1-butanol addition on Escherichia coli cells○Seiya Kobayashi1, Toshihiro Suzuki1, Kyoko Miyahira1, Kohei Katsuki1,
Mikiya Kishi2, Morio Ishikawa1(1Dept. Ferment. Sci., Tokyo Univ. Agric., 2Mizkan Holdings Co., Ltd.)○Ryuji Kawabata1, Yuto Araki2, Yoshiteru Aoi1, Yutaka Nakashimada1, Setsu Kato1(1Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 2Hiroshima Univ.)

Key words

Acetobacter pasteurianus, Dps, ROS tolerance, Fenton reaction

Key words

Escherichia coli, butanol, aggregation

3Ip06

Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 におけるspo0A 遺伝子が胞子形成とブタノール生産に及ぼす影響

3Ip08

ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素活性部位における変異導入の影響○古屋 一彦 1, 清 啓自 2, Panjuy Chaophaya 2, 門倉 利守 1,
鈴木 健一朗 1, 中山 俊一 1（1東農大院・農, 2宮崎大・農）
s3nakaya@nodai.ac.jp○南部 友香, 柘植 丈治（東工大・物質理工）
tsuge.t.aa@m.titech.ac.jp【背景・目的】
ブタノール生産能と胞子形成能を有する嫌気性グラム陽性細菌 Clostridium
saccharoperbutylacetonicum N1-4（以下 N1-4）は熱感受性があり、30℃で旺盛にブタノールを生産するのに対して 37℃ではブタノール生産能が顕著に低下する。顕微鏡観察をしたところ、37℃では栄養増殖を停止し胞子形成している可能性が示唆された。そこで胞子形成開始を担う転写因子 spo0A を破壊し、胞子形成を阻害することでブタノール生産能が回復するかどうかを検討した。
【結果】
spo0A 遺伝子破壊には clostron システムを用いた。エリスロマイシン（以下Em）耐性遺伝子が spo0A 遺伝子に挿入されることで、PCR にて増幅される DNA
断片のサイズの差異に基づいて遺伝子破壊を確認した。Em 耐性遺伝子を有するプラスミドを含むコントロール株と比較した結果、spo0A 破壊株は 30℃と37℃培養では共に生育能が低下し、ブタノール生成能を失い酢酸と酪酸のみを生成するようになった。一方、顕微鏡観察では胞子の形成を確認した。このことから、spo0A 遺伝子はブタノール生成を正に制御する重要な因子であり、Spo0A が活性化し胞子形成が引き起こされることが熱感受性の直接的な原因ではない可能性が示唆された。

[背景]ある種の微生物は、ポリヒドロキシアルカン酸(PHA)と呼ばれるポリエス
テルを PHA 重合酵素の触媒反応を介して重合を行う。PHA 重合酵素(PhaC)には、活性中心であるシステインを含む共通したアミノ酸配列 G-X-C-X-G-G が存在する。この配列は保存性が高く、我々は、PhaC ボックスと呼ぶことを提唱している。本研究では、この PhaC ボックス内に存在するアミノ酸に点変異を導入し、重合活性への影響について調査した。
[実験] Ralstonia eutropha 由来の PHA 重合酵素である PhaCRe の PhaC ボックスに対して、活性中心である 319 位のシステイン及びその周辺である 317、321、322 位のグリシンに対して Overlap-PCR により点変異を導入した。この変異遺伝子をモノマー供給酵素遺伝子保持したプラスミドに挿入し、Escherichia coli
XL1-Blue に形質転換した。LB 培地に炭素源としてグルコース 20g/L 添加し、30℃で振とう培養を行った。また LB 培地にグルコース 20g/L と PHA の染色色素である Nile Red を含む寒天培地を作製し、これに変異株を塗布し、30℃で静置培養を行った。ポリマー蓄積の確認は、ガスクロマトグラフィーと Nile Red
プレートによる目視で行った。
[結果・考察]まず、タンパク質構造に影響の少ないアラニンを PhaC ボックスに導入した結果、活性中心である C319 を置換した変異体（C319A）のみがポリマーの合成を行わなかった。次に、Halomonas 属では S-X-C-X-G-G という PhaC
ボックス様の配列を有することから、PhaCRe の 317 位グリシンをセリンに置換した変異体（G317S）を作成して調べたところ、PHA の合成が観察された。
さらに PhaC ボックス内を種々のアミノ酸に置換して重合能を調べたところ、
G322 はアミノ酸置換に対して許容性が低く、G317 及び G321 は許容性が高い
ことが示唆された。

Characterization of spo0A disruptant in spore-forming butanol-producing
Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4

Polymerization activity of polyhydroxyalkanoate synthase having point
mutation at its active site

Key words
Clostridium saccharoperbutylacetonicum, butanol production,
sporulation, spo0A

Key words○Kazuhiko Furuya1, Keiji Kiyoshi2, Chaophaya Panjuy2, Toshimori Kadokura1,
Kenichiro Suzuki1, Syunichi Nakayama1(1Grad. Sch. Agric., Tokyo Univ. Agric., 2Fac. Agric., Univ. Miyazaki)○Yuka Nambu, Takeharu Tsuge(Sch. Mater. Chem. Technol., Tokyo Tech)

polyhydroxyalkanoate, PHA synthase, Ralstonia eutropha, PhaC Box

294

3Ip09

P(3H2MB)生合成量増強のためのモノマー供給酵素の
探索

3Jp02

○木原 崇博, 古舘 祥, 柘植 丈治（東工大・物質理工）
tsuge.t.aa@m.titech.ac.jp

微生物燃料電池：アノード電極上のバイオマス量および細胞内グルタミン酸濃度と電流生成の相関○佐々木 大介 1, 佐々木 建吾 1, 柘植 陽太 2, 近藤 昭彦 1
（1神戸大院・科技イノベ, 2金沢大・新学術）
daisuke@port.kobe-u.ac.jp＜緒言＞ 微生物が炭素貯蔵物質として蓄積するポリヒドロキシアルカン酸(PHA)は、生分解性、熱可塑性、生体適合性を有するバイオポリエステルとして利用できる。その中でも α 位にメチル基が付いた 3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸(3H2MB)を構成ユニットとする P(3H2MB)は、既存の PHA と比較して結晶化速度が速いため、緩慢な結晶化挙動を示すバイオポリエステルの欠点を解消することが期待されている。しかし、現在、P(3H2MB)を含むポリマーの大量生
産にはチグリン酸を原料として合成可能であるが、合成量は乾燥菌体重量の 20
wt%程度である。そのため、P(3H2MB)の生産量増強のためにはモノマー供給酵
素や重合酵素の機能を増強する必要がある。本研究では、チグリン酸からP(3H2MB)を生合成する際のモノマー供給酵素である R-特異的エノイル CoA ヒ
ドラターゼ（R-ヒドラターゼ、PhaJ）に着目し、他細菌由来の R-ヒドラターゼに置き換えることで P(3H2MB)生産量が増強されるのかを調べた。
＜実験＞ Aeromonas caviae 由来の PHA 生合成オペロンを組み込んだ大腸菌に、種々の細菌由来の phaJ 遺伝子を共発現させ、チグリン酸を炭素源としてP(3H2MB)を生合成した。PHA 含有量は細胞から回収した PHA の重量を用いて算出し、PHA モノマー組成は GCMS により確認した。
＜結果・考察＞これまで P(3H2MB)の合成を行っていた A. caviae 由来の PhaJ に加えて本研究室で用いている Pseudomonas 属および Bacillus 属の PhaJ を比較した結果、P. aeruginosa 由来の PhaJ1 を共発現した組換え大腸菌が最も合成量が多く、中鎖 PHA 特異的な PhaJ は P(3H2MB)モノマーを供給できないことが明らかになった。しかし、A. caviae の PHA 生合成オペロンをそのまま導入した時と比較して生産量が減少したことから、P(3H2MB)の生合成にはオペロンごと
PHA 合成遺伝子を導入することが適切であることが示唆された。

【背景・目的】我々は微生物燃料電池(MFC)の微生物ないしは微生物群集を対象とした網羅的細胞内代謝解析を実施し、代謝状態と機能を結びつけて評価する
ことに成功している。すなわち MFC の電流生成量と TCA 回路の代謝物濃度および ATP/ADP 比には正の相関が存在し、逆に解糖系の代謝物濃度には負の相関があることを報告してきた。本報告では、全く同じ装置構成および運転条件
でいくつかの MFC を運転し、電流生成量が異なった MFC の微生物群集に対して詳細な解析を行うことで、電流生成に寄与する因子を明らかにすることを目的とした。
【方法】模擬排水を基質としてエアカソード型 MFC(250 mL 容量)を水理学的滞留時間：24 h で運転し、電流生成量に差が出た MFC のパフォーマンスを解析した。またアノード電極上および発酵液から DNA を抽出し、16S rRNA 遺伝子を標的とした網羅的な微生物群集構造解析を実施した。さらに代謝状態を比較するため、それぞれのアノード電極上から回収した微生物群集の細胞内代謝物を抽出し、LC-MS/MS・GC-MS を用いて網羅的に解析した。
【結果・考察】電流生成量の違いで化学的酸素要求量の除去率や有機酸濃度に有意差は検出されなかったが、アノード電極上のバイオマス量は電流生成量に負の相関を示した。また電流生成が大きい場合は Geobacter sp.の割合が高かったが、小さい場合は他の発酵性細菌やメタン生成菌が優占化していた。代謝解析
では、過去の知見と同様に TCA 回路関連の代謝物濃度・ATP/ADP 比の上昇が電流生成量と正の相関することが示されただけでなく、菌体増殖の指標である
グルタミン酸の濃度と電流生成量に負の相関があることが明らかになった。つ
まり本報告から、アノード電極上のバイオマス量および細胞内グルタミン酸濃度の増加が電流生成を減少させる因子の一つであることが示唆された。

Verification of PHA monomer supplier for enhancing P(3H2MB) production

Less biomass and intracellular glutamate in anodic biofilms lead to efficientelectricity generation by microbial fuel cells○Takahiro Kihara, Sho Furutate, Takeharu Tsuge(Sch. Mater. Chem. Technol., Tokyo Tech)○Daisuke Sasaki1, Kengo Sasaki1, Yota Tsuge2, Akihiko Kondo1(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2InFinti., Kanazawa Univ.)

Key words

polyhydroxyalkanoate, monomer supplier, R-hydratase

Key words
glutamatemicrobial fuel cell, microbial community, anodic biofilm, intracellular

3Jp01

微生物由来蓄電性 Mackinawite による嫌気バイオコンバージョン活性の向上

3Jp03

バイオ電気化学的システムによる複合微生物系の制御○安池 一貴 2, 片桐 美紀 1, 工藤 優輝 2, 田代 陽介 2,3, 二又 裕之 2,3,4（1静大・工, 2静大院・総合科技, 3静大・創科技院, 4静大・グリー
ン科技研）
futamata.hiroyuki@shizuoka.ac.jp○佐々木 建吾 1, 佐々木 大介 1, 森田 仁彦 2, 柘植 陽太 3,
近藤 昭彦 1
（1神戸大院・科技イノベ, 2電中研, 3金沢大・新学術）
sikengo@people.kobe-u.ac.jp

嫌気微生物群集による物質変換能力は、環境浄化、メタン発酵あるいは発酵食品生産等に利用されている。その一方で、嫌気条件下における諸々の微生物反
応は段階的に進行し一般的に遅いため、物質変換能力の向上が求められる。そこで本研究では、硫酸還元細菌 Desulfovibrio sp. HK-II 株が生産する蓄電性バイ
オ ミ ネ ラ ル （ Rechargeable bio-mineral : RBM ） で あ る Mackinawite （ FeX+1S,X=0~0.11）が嫌気バイオコンバージョンに及ぼす影響について解析した。
汽水湖底泥を摂取源とし、4 mM 乳酸および RBM を添加した系（RBM 系）および RBM 無添加系（Control 系）を構築し、時系列的に有機酸、水素およびメタンを測定した。乳酸消費後、乳酸追加を 2 回実施した後に培地上清を新鮮な培地と 95%交換する継代回分培養を数百日間実施した。その結果、両培養系において乳酸の分解に伴い、酢酸およびプロピオン酸が蓄積した。Control 系と比較し RBM 系の変換速度が速い傾向を示した。具体的には RBM 系および Control
系のプロピオン酸の蓄積量は約 7.1 mM および 7.6 mM であり RBM 系の方が若干低く、酢酸消費およびメタン生成速度は RBM 系の方が速かった。PCR-DGGEに基づく MDS 解析では微生物群集構造が RBM 系および Control 系のみならず
上清および沈殿物においてもそれぞれ異なった。SYBR Green I による蛍光顕微鏡観察では RBM 系において微生物凝集体が RBM 上に確認され、電気化学的測定である DPV 測定では RBM 系において Control 系で見られないピークが存在した。また、両培養系のギブズ自由エネルギーを計算した結果、Control 系では
約-73 kJ reaction-1 であったのに対し RBM 系では約-190 kJ reaction-1 と約 2.6 倍大
きいことが示された。以上の結果から、RBM を電子授受の場として利用する特異的な微生物群集が形成され、結果的に嫌気バイオプロセスの向上に寄与していることが示唆された。

【背景・目的】バイオ電気化学的システムは、電極上での酸化還元反応を利用して微生物の代謝を改変できることが知られている。一方、メタン発酵のような嫌気性消化においては複合微生物系が関わっており、酸化還元バランスを保って反応を進行させている。嫌気性消化を利用して廃棄物より水素・メタンを得
る水素・メタン二段発酵は処理速度が速いプロセスとして知られている。本報
告では、バイオ電気化学的システムを水素発酵に適用して、水素・メタン二段
発酵に与える効果を明らかにする事を目的とした。
【方法】グルコース 10 g/L を含む合成液体培地を基質として使用し、初期 pH を
6.5 に調整した。液体培地を水素発酵槽に投入して、55℃で連続運転した。水
素発酵については、1) 電気化学的制御を行ったもの、2) 電気化学的制御を行っていないもの、を準備した。バイオ電気化学的システムについて、電極として炭素板を使用し 3 電極方式を用いた。作用極上の電位を−1.0 V（銀／塩化銀電極基準）に制御した。なお、この制御法では水電解による水素生成は起こらない。水理学的滞留時間 2 日で定常状態になるまで運転して、水素発酵の廃液は後段のメタン発酵槽に投入した。後段の水理学的滞留時間は 4 日とした。
【結果】電気化学的制御を行った、ないしは行っていない水素発酵槽間におけるガス組成はほぼ等しく、水素ガス含量は約 52%であった。しかし、両者の水素発酵槽間において、有機酸プロファイルに変化が認められた。電気化学的制御を行った水素発酵槽の廃液を投入したメタン発酵槽では、制御を行っていない
ものの廃液を投入したメタン発酵叢に比べて、メタン生成量が増加していた。
本発表では詳細な微生物叢解析結果についても報告し、バイオ電気化学的システムの可能性について論じる。

Improve of anaerobically bio-conversion activity by biogenic rechargeable
mackinawite

Control of microbial community in the bioelectrochemical system○Kazuki Yasuike2, Miki Katagiri1, Yuki Kudo2, Yosuke Tashiro2,3,
Hiroyuki Futamata2,3,4(1Fac. Eng. Shizuoka Univ., 2Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 3Grad.
Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 4Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)

Key words
mineralinterspecies electron transfer, electrosymbiosis, rechargeable bio-

○Kengo Sasaki1, Daisuke Sasaki1, Masahiko Morita2, Youta Tsuge3,
Akihiko Kondo1(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2CRIEPI, 3InFinti, Kanazawa Univ.)

Key words
microbial community, hydrogen, methane fermentation,
electrochemical cultivation

295

3Jp04

好気的硫黄代謝細菌を活用した重金属除去○黒田 真史 1, 小林 慎 1, 高山 一也 2, 池 道彦 1
（1阪大院・工, 2日東電工(株)）kuroda@see.eng.osaka-u.ac.jp

3Jp06

1,4-ジオキサン分解菌による多様な環状エーテル類の分解能の評価○中澤 昌俊, 井上 大介, 黒田 真史, 池 道彦
（阪大院・工）ike@wb.see.eng.osaka-u.ac.jp【背景・目的】重金属類は、様々な産業に利用される一方で、そのほとんどが高い毒性を有するため、世界各地で重金属による深刻な水環境汚染が発生している。硫化物法は硫化ナトリウム等の硫化剤を添加することで排水から重金属を除去する技術であり、除去効率が高い反面、運転中に毒性・腐食性の高い硫化水素が発生するため、実処理への適用例は少ない。本研究では、細菌の好気的硫黄代謝を用いることで、硫化水素を発生させることなく重金属を硫化物として沈殿・除去できる新規プロセスの創成を目指し、重金属除去活性の高い新規
硫黄代謝細菌の集積と単離を試みた。
【結果・考察】兵庫県生野鉱山付近から採取した土壌から、チオ硫酸ナトリウ
ム、塩化銅(II)、塩化亜鉛(II)、塩化カドミウム(II)、およびキレート剤としてニトリロ三酢酸を含む TSB 培地（以下、重金属含有 TSB 培地）を用いて、各重金属を安定して 70〜100%の除去率で除去する微生物集積系を構築した。メタ
16S rRNA 解析の結果、得られた集積系は主に Lysinibacillus sp.、Stenotrophomonas
sp.、Ochrobactrum sp.、Paenibacillus sp.の 4 種から成ることが明らかとなった。
集積系からこれら 4 種の細菌を単離し、それぞれ HM1、HM2、HM3、HM4 株と命名した。各菌株の重金属除去能力を評価したところ、いずれの菌株も 94%
以上の Cu 除去率を示したが、HM2、HM3、HM4 の 3 株は Cd 除去率が 15.7〜
48.9%、Zn 除去率が 13.5〜41.3%に留まった。一方、HM1 株は Cu、Cd、Zn をそれぞれ 100%、99.9%、86.4%除去し、最も高い重金属除去能力を示したこと
から、Lysinibacillus sp. HM1 は重金属除去プロセスを担う細菌として有望であるものと考えられた。

【背景・目的】環状エーテル類は、化学的に非常に安定なエーテル結合を有する
ことから、一般的に生物難分解性であることが知られているが、発がん性が疑われる 1,4-ジオキサン（DX）のように人体に有害なものも含まれ、環境汚染に伴う悪影響が懸念されている。一方、近年では、DX をはじめとする環状エー
テル類を分解する細菌が複数発見されてきている。また、これまでの知見から、DX の生分解では、可溶性鉄（II）モノオキシゲナーゼ（SDIMO）を触媒とす
るエーテル結合の開裂が重要な役割を果たすと推測されている。DX 以外の環状エーテルにおいても、同様の機構により生分解が進行する可能性が考えられることから、本研究では、DX に対して異なる分解特性を示す 3 種の DX 分解菌（構成型資化菌、誘導型資化菌、共代謝菌）をモデル DX 分解菌として選定
し、多様な環状エーテル類の分解能を明らかにすることを目的とした。
【方法・結果】本研究では、誘導型 DX 分解菌 Mycobacterium sp. D6、構成型 DX
分解菌 Pseudonocardia sp. D17 及び共代謝型 DX 分解菌 Rhodococcus sp. T1 を供試菌株として用い、エーテル結合の数や炭素数、環構造への修飾の有無の異なる 14 種の環状エーテルを対象物質として選定した。各物質を単一炭素源として添加した無機塩培地に各試験菌株を植種し、各物質の分解と試験菌株の増殖をモニタリングした。その結果、3 種の DX 分解菌による環状エーテル類の分解能は、エーテル結合の数や環構造に修飾する官能基の種類及び修飾部位によって大きく異なることが観察され、化学構造が分解性を決定する重要な因子である可能性が明らかとなった。また、ゲノム解析の結果から、各菌株が保有する
SDIMO 遺伝子が異なっていることが明らかとなり、SDIMO の多様性も各分解菌による環状エーテル類の分解特性に影響を及ぼしている可能性が考えられた。

Heavy metal removal by using bacterial sulfur metabolism under aerobic
condition

Abilities of 1,4-dioxane degrading bacteria to degrade various cyclic ethers○Masashi Kuroda1, Makoto Kobayashi1, Kazuya Takayama2, Michihiko Ike1
(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Nitto Denko Corp.)○Masatoshi Nakazawa, Daisuke Inoue, Masashi Kuroda, Michihiko Ike(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

heavy metal, wastewater treatment, thiosulfate, sulfur metabolism

Key words
1, 4-dioxane, cyclic ethers, biodegradation, soluble di-ironmonooxygenase gene

3Jp05

Pseudomonas stutzeri NT-I によるセレン化物半導体ナノ
粒子の合成

3Jp07

○佐藤 守, 黒田 真史, 井上 大介, 池 道彦
（阪大院・工）ike@wb.see.eng.osaka-u.ac.jp

Leptothrix 属細菌の分泌ナノ繊維は連鎖状菌体に環境適応性を付与する○久能 樹 1,2, 森永 花菜 2,3,4, 杉本 真也 2,5, 豊福 雅典 1,2,6,
野村 暢彦 1,2,6, Utada Andrew 1,2,6（1筑波大・生命環境, 2JST・ERATO, 3筑波大院・生命環境, 4産総研, 5慈恵医大, 6筑波大・微生物サスティナブル セ）
kuno.tatsuki.gb@u.tsukuba.ac.jp【背景及び目的】近年、従来の半導体にない優れた特性を示す半導体ナノ粒子が注目されており、これらを利用した高機能製品の創出が期待されている。他方、現在の半導体ナノ粒子合成プロセスは高環境負荷であるという課題を抱えており、微生物を用いた低環境負荷な合成方法への関心が高まっている 。我々はこれまでに好気条件下で亜セレン酸（Se(IV)）還元能を示す 細菌 Pseudomonas
stutzeri NT-I を用いて Bi2Se3 ナノ粒子の合成に成功しているが、このような生物反応が Bi 以外の金属から成る化合物半導体ナノ粒子の合成に適用可能かは明らかにされていない。そこで本研究では、半導体ナノ粒子の生物合成の知識基盤の構築を目指して、種々の金属イオンに対する NT-I 株のセレン化物半導体合成
特性を検討した。
【方法】P. stutzeri NT-I を TSB 培地中で 24 時間回転振盪培養後、Se(IV)と各種金属（Sc(III)、V(III)、Cr(III)、Mn(II)、Fe(III)、Co(II)、Ni(II)、Cu(II)、Zn(II)、Ga(III)、Cd(II)、In(III)、Sb(III)、Bi(III)）の塩化物をそれぞれ 1.0 mM となるよ
うに添加し、72 時間回転振盪培養を行った。経時的に試料を採取し、液相と固相の各金属濃度を誘導結合プラズマ発光分光分析により測定した。また、固相に含まれる粒子を透過型電子顕微鏡（TEM）により観察した。
【結果と考察】試験した金属イオンのうち、Cd(II) および Bi(III)を添加した培養系においてのみ、液相の金属濃度の減少と固相の金属量の増加が確認された。
また、24 時間以降には金属濃度がほぼ一定となったことから、NT-I 株による粒子合成反応は 24 時間以内に生じたと考えられた。得られた粒子を TEM で観察したところ、細胞の周囲に直径 20~80 nm の粒子が確認された。以上のことから、NT-I 株は Bi2Se3、CdSe ナノ粒子の合成能を有することが明らかになった。

湧出地下水が流れ込む小川、側溝等の水圏に広く生息する鉄酸化細菌 Leptothrix
属は、酸化鉄粒子で被覆されたマイクロチューブから成るバイオマットを構築する。フィラメント状に分裂した Leptothrix 属細菌は、菌体表面から無数の有機物ナノ繊維を分泌する。これら繊維が絡まったチューブ原基の外側に酸化鉄粒子が沈着することで、マイクロチューブを形成する。然しながら、細菌の増殖過程におけるリアルタイムの分泌ナノ繊維のダイナミクスは明らかになっていない。本研究では、高さを 1.3 um に制限したチャンバーを有するマイクロ流路デバイスを用い、二次元空間における鉄酸化細菌の増殖をリアルタイムで観察した。野生型株は、デバイス表面に接着後にフィラメント形成を開始するが、ナノ繊維非分泌株は、接着出来ず、ほとんど増殖しなかった。即ち、フィラメ
ントの伸長にはナノ繊維を介した接着が必須であった。ナノ繊維の骨格である
糖鎖のアミノ基を蛍光染色した結果、接着直後の菌体周囲の蛍光シグナルに偏りがあり、増殖方向にはシグナルが検出されなかった。金ナノ粒子でラベルしたナノ繊維を大気圧走査電顕で観察しても同様の偏りがみられた。従って、ナノ繊維による伸長方向の決定が示唆された。一方、伸長したフィラメントの周囲には強い蛍光シグナルが観察された。時折先端部分の菌体が分離するので、分裂につれてマイクロチューブ原基が順次形成されると予想される。狭いチャンバー空間では伸長するフィラメントは、壁に衝突しても“折れ曲り”または“反転”して伸長を継続した。分泌ナノ繊維による接着力と衝突による反発力によるシミュレーション結果と一致し、低角度の衝突では“折れ曲り”、逆に高角度の衝突では、“反転”する頻度が高かった。以上の結果、分泌ナノ繊維は環境適応性を付与すると考えられる。

Biosymthesis of selenide semiconductor nanoparticles by Pseudomonas
stutzeri NT-I

Leptothrix nanofibril appendages impart adaptability to whole filaments○Mamoru Sato, Masashi Kuroda, Daisuke Inoue, Michihiko Ike(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

Pseudomonas stutzeri, nanoparticle, biosynthesis, selenium○Tatsuki Kunoh1,2, Kana Morinaga2,3,4, Shinya Sugimoto2,5, Masanori Toyofuku1,2,6,
Nobuhiko Nomura1,2,6, Andrew Utada1,2,6(1Fac. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2ERATO, JST, 3Grad. Sch. Life Environ.
Sci., Univ. Tsukuba, 4AIST, 5Sch. Med., Jikei Univ., 6MiCS, Univ. Tsukuba)

Key words

biofilm, growth control, surface attachment, nanofibril

296

3Jp08

Investigation of solar-driven Linear Fresnel
Photocatalytic Reactor (LFP) for wastewater treatment○Cheng Zhang, Na Liu, Qiansu Ma, Akiho Yagi, Yingnan Yang
(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)yo.innan.fu@u.tsukuba.ac.jp

Wastewater has become a serious problem. Photocatalysis has shown degradation
capacity of organic pollutant under illumination. As solar light was considered to be
the low-cost light source for photocatalysis, many photoreactors have been developed,
among which Inclined Plate Collector (IPC) was the most mature photoreactor.
However, due to solar motion, these photoreactors were unable to provide stable andefficient solar energy for photocatalyst by passively accepting solar light. In recent
years, the linear Fresnel concentrators with multi-column mirrors were designed to
track solar light and showed the potential to provide stable and efficient solar energy.
Therefore, in this study, a photocatalytic reactor based on the linear Fresnel
concentrator for wastewater treatment was firstly developed and named LFP. The main
components of LFP include multi-row mirrors, quartz glass tubes and control system.
The mirrors can be controlled to track solar motion and reflect solar light onto quartz
glass tubes individually. Therefore, wastewater involved with photocatalyst in quartz
glass tubes could be illuminated by stable and efficient solar light. For the comparative
experiments between LFP with IPC, TiO2 and Rhodamine B solution were used as
photocatalyst and model of wastewater, respectively. For LFP, the light intensity wasstable and efficient, and the temperature increased rapidly and then remained stable.
Therefore, LFP showed much higher degradation efficiency of Rhodamine B than IPC.

Investigation of solar-driven Linear Fresnel Photocatalytic Reactor (LFP)
for wastewater treatment○Cheng Zhang, Na Liu, Qiansu Ma, Akiho Yagi, Yingnan Yang
(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

wastewater treatment, photocatalytic reactor, solar energy

3Jp09

Mass spectrometry imaging reveals the correlation
between the production of quorum sensing metabolites
and the biofilm development in Pseudomonas putida
biofilms○Pitchapa Rattanaburi, Eiichiro Fukusaki, Shuichi Shimma(Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)
sshimma@bio.eng.osaka-u.ac.jp

Quorum sensing (QS) is generally used to describe the phenomenon that bacteria
release and perceive signal molecules to coordinate cooperative behavior in responseto their population size and biofilm development. QS-based communication has
therefore been considered a social trait. Understanding the heterogeneity of QS
metabolites exist in biofilms related to the stages of biofilm development is important
to know the mechanism driving the biofilm formation. Mass spectrometry imaging(MSI) is a technique to directly visualize the production of metabolites from microbial
biofilms. In this study, the method for matrix-assisted laser desorption/ionization(MALDI)-MSI visualization of the QS metabolites distribution in Pseudomonas putida
biofilms was developed and applied to examine the correlation between metabolites
production and cultivation times. Here we show that N-acyl-homoserine lactones arehomogeneously produced in the early stage of P. putida biofilms and act mainly as
regulatory signals for biofilm formation. In addition, the spatially distribution ofquinolones and siderophore which are the key metabolites involved in the process of
extracellular polymeric substance production and iron chelation were visualized
correlated to the swarming motility of P. putida in the mature biofilms. Our findings
broaden the perspective on QS by showing that the heterogeneity in QS has arelationship with the stages of biofilms and provide more information to understand themechanism of biofilm formation.

Mass spectrometry imaging reveals the correlation between the productionof quorum sensing metabolites and the biofilm development in Pseudomonas
putida biofilms○Pitchapa Rattanaburi, Eiichiro Fukusaki, Shuichi Shimma(Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
biofilm

mass spectrometry imaging, quorum sensing, Pseudomonas putida,

297

人名索引

A
Adinda Putri Wisman
3Ha03
Aditiawati Pingkan
3Fa05
Ahmadi Hannaneh
2Jp10
Almasl Alﬁ
2Gp04
Amalia Fitri
3Fa05
Amza Rezky Lastinov
1Ip06
Anand Ajeeta
3Da07
Aneksampant Apichaya
1Cp08
Angelidaki Irini
1Bp03
Ao Zhalaga
1Cp14
Aoyagi Hideki
3Da07, 3Hp03
Arita Mayuno
2Gp02
Ashutosh Kumar
1Cp15
Aslam Mehwish
2Dp01, 2Dp02
Astuti Dea Indriani
2Cp08
Asun Arlene Cherilyn
2Ja03

B
Baranwal Priyanka
Bhatnagar Sharad
Boogerd Fred C.
Boonyakida Jirayu
Buechs Jochen

3Ep08
3Hp03
3Ia04
2Jp03
3S-S1a01

C
Campanaro Stefano
Chaiyaso Thanongsak
Cheng Huijun
Cherdvorapong Vipavee
Choi Yong-Keun
Chowdhury Ankan Dutta
Critchley Kevin

1Bp03
2Ba05
3Ja04
3Bp01
1Cp04
3Fp06
2Ip11

Fouquet Thierry
3Bp05
Fujiyama Kazuhito
1Ep13
Fukusaki Eiichiro
2Cp08, 2Ea03,
3Fa04, 3Fa05, 3Fa06, 3Fa08,
3Fa09, 3Ha03, 3Jp09
Furukawa Makoto
3Ap01
Futamata Hiroyuki
3Ja01, 3Ja02

G
Ganganboina Akhilesh Babu 2S-S3p01
Golding Bernard T.
1Ap15
Gomi Katsuya
3Ha03
Grace Pait Ivy
3Ba08

H
Hadiwidjaja Stacy
Han Sung Ok
Hanifah Abu
Harmon Jeﬀrey
Hayashi Junji
Hayati Sri
Hibi Takao
Hirohata Shuji
Hong Jong Wook
Honjo Masahiro
Horiuchi Jun-ichi
Huynh Hung Hiep
Hyeon Jeong Eun

I
Imai Ryo
Intuy Rattanaporn
Irene Davidova
Itoh Takafumi

D
2Bp03
2Ea03
2Aa06,
2Ea10
Devanadera Allad
3Ba08
Dlamini Nombuso Temalangeni 1Hp13
Doong Ruey-an
2S-S3p01
Dutta Chowdhury Ankan
2Fp15,
3Fp05, 3Fp07

E
3Fa09
1Jp06
1Hp02
2Ip11

F
Fatma Azwani
Firmanto Hendy

3Fp04
3Bp02
1Cp09
2Ap12, 3Bp02

J

Da XiaDahlan Hadi Akbar
Danshiitsoodol Narandalai

Ekasari Julie
Elmeligy Enas
Eun Young
Evans Stephen

2Ga06
2S-S2p02
3Fa04
3Fp04
2Ap12
3Fa09
2Ap12, 3Bp02
3Ha03
2S-S3p05
3Ja01, 3Ja02
1Dp14, 2Da07
2Gp03
2S-S2p02

3Ja02
3Fa04

Jeon Tae-Joon
Jeong Ki-jae
Jeong Wu-Young
Jiang Dong
Jin Yong-Su
Joo Young-Chul
Joseph Suﬂita
Jung Dawoon

1S-S3p01
2S-S3p03
3Fp03
1Ap15
2S-S2p01
2S-S2p02
1Cp09
1Hp01

K
Kahar Prihardi
Kam Y. J. Zhang
Katayama Takuya
Kato Junichi
Kato Tatsuya
Kawamura Yuka
Kawashima Ikko
Kim Dae Hoon
Kim Ho Hyun

3Aa05
1Cp15
2Gp03
1Hp12
1Fp16
3Ap01
3S-S1a04
2S-S3a06
3Fp03

Kim Hyung Joo
Kim Ji Eun
Kim Ju Young
Kim Kwang Jin
Kim Kwang Jin
Kim Kwang Sik
Kisailus David
Kishimoto Michimasa
Kitagawa Hiroto
Kitahara Yuki
Ko Young Jin
Kobori Toshiro
Komatsu Kei
Kumada Yoichi
Kumon Kento
Kuriyama Naohiro
Kuroda Noritaka

1Cp04, 3Fp03
1Cp04, 3Fp03
2S-S3p05
1Cp04
3Fp03
2S-S3p05
1Fp14
1Dp14
3S-S1a03
3Fp02
2S-S2p02
3Hp03
2Gp02
1Dp14, 2Da07
2Gp02
2Da07
2Da07

L
Lai Yuen Hing
Lan John Chi-Wei

2Ja04
1Hp13, 2Ja02,
2Ja03, 2Ja04, 3Ba10
Lee Chang Hyun
2S-S3p05
Lee Eun Bin
1Cp04, 3Fp03
Lee Hei Chan
2S-S3a06
Lee Jaebeom
2S-S3p03
Lee Sang Hyun
1Cp04
Lei Zhongfang
2Cp03, 3Ja06
Liu Na
1Cp12, 3Jp08
Loh Wai Leng Carmen
2Ja02
Low Pik Kuan
3Ba10
Luo Gonglinfeng
1Hp12

M
Ma Qiansu
3Jp08
Maduka Subodinee
2Cp10
Mainland Joel D
2Fp07
Malikul Ikram Muhammad Maulana
3Fa06
Marie Ting Perez Charose
1Ip03
Maruyama Jun-ichi
2Gp03
Masuda Kensei
3Ja01, 3Ja02
Minkner Robert
1Fp16
Minoura Ayaka
3Ja01
Misaki Ryo
1Ep13
Mohd JABIR
3Ja01
Motakatla Venkateswar Reddy 1Bp16
Muhammad Muddassar
1Cp15

N
Nasrin Fahmida
Nayve Jr. Fidel Rey P.
Negishi Nobuaki
Negoro Seiji
Ng Hui Suan

3Fp05, 3Fp06
3Ba08
1Cp12
3Ep08
2Ja02

298

Ng Hui-Suan
Nguyen Hieu Nghia
Nishimasu Hiroshi
Nishimura Tomoka
Nuramkhaan Marjangul

2Ja03
1Dp14
3S-S3a04
3Ja01
3Ja06

Song Hak Jin
Suantika Gede
Sultana Nasrin
Suyotha Wassana
Suzuki Kenshi

O
Ohashi Takao
Oldewurtel Enno
Oltmann-Norden Imke
Omasa Takeshi
Onitsuka Masayoshi
Oyunsuren Tsendsuren

T
1Ep13
3Fp02
1Fp16
2Gp02
2Gp02
2Ea04

P
Pajares Irene
Panjuy Chaophaya
Panti Niphawan
Park Enoch Y.

3Ba08
3Ip06
3Bp01
1Fp16, 3Fp05,
3Fp06, 3Fp07
Phetsri Kodchakorn
3Ap01
Phumsombat Putthapong
2Ap12
Porchetta Alessandro
2Ip01
Pradipta Ambara R.
2Jp16
Prihardi Kahar
1Ip06
Puti Wanguyun Aken
1Fp03
Putri Saﬁra Latifa Erlangga
3Fa07,
3Fa08
Putri Sastia
3Fa05
Putri Sastia Prama
2Cp08, 2Ea02,
2Ea03, 3Fa04, 3Fa06,
3Fa07, 3Fa08, 3Fa09

R
Rahayu Farida
Rakotondravao Michelle
Rattanaburi Pitchapa
Razi Muhamad Alif
Ricci Francesco
Ridwani Sobir
Rivera Jesus

1Cp04, 3Fp03
3Fa08
2Aa06
3Bp01, 3Bp02
3Ja01, 3Ja02

3Aa03
2Da07
3Jp09
1Fp02
2Ip01
3Fa06
1Fp14

U
2S-S3p02
3S-S5a04
3Jp07
1Ep13

W
Wakayama Mamoru
Wang Caifeng
Wang Lun
Wang Xuezhi
Westerhoﬀ Hans V.
Wätzig Hermann

2Ap12, 3Ap01,
3Bp01, 3Bp02
2S-S3p03
2Ep07
2Cp03
3Ia04
1Fp16

X
Xu Jian

1Fp16, 2Jp03

S

Y

Saito Masato
2S-S3p04
Saito Yasuhisa
3Ja02
Sakai Tomoyuki
3Fp04
Sakamoto Toshihiro
2Gp03
Sakoda Yumiko
2Da07
Sano Chiharu
2Ap12
Saputra Felicia Irene
3Fa08
Sato Arisa
2Cp08
Sekitani Tsuyoshi
2S-S3p02
Senda Naoko
3Fp04
Sharmin Sabrina
3Fp07
Shimizu Kazuya
2Cp03, 3Ja06
Shimma Shuichi
3Ha03, 3Jp09
Shin Kyusoon
2S-S3p05
Shinkura Reiko
2Gp03
Situmorang Magdalena Lenny 3Fa08

Yagi Akiho
3Jp08
Yamashiro Risa
3Ap01
Yang Yingnan 1Cp12, 2Cp04, 3Jp08
Yang Yung-Hun
1Cp04
Yang Yunjeong
1Cp04, 3Fp03
Yano Shigekazu
3Bp01, 3Bp02
Yohda Masafumi
2Gp02
Yoon Tae Hang
3Fp03
Yuan Tian
2Cp03
Yusianto
3Fa05

Z
Zagst Holger
Zhang Cheng
Zhang Kuan
Zhang Mengxiao

2Cp04
2Cp03, 3Ja06
2Cp04
2Cp04

V
van Teeﬀelen SvenTajima Takahisa
1Hp12
Takagi Kazuyoshi
3Bp01
Takahashi Ryosuke
2Da07
Takayama Kotaro
3S-S1a03
Takemura Kenshin
3Fp05, 3Fp06
Takeo Masahiro
3Ep08
Tamada Yoshihiro
3Ha03
Tamang Abiral
2Ip11
Tan Li
1A-Gp01
Tashiro Yosuke
3Ja01, 3Ja02
Techawaree Ueatrongchit
2Ap04
Toyotake Yosuke
2Ap12, 3Ap01,
3Bp01
Treu Laura
1Bp03
Tsend-Ayush Chuluunbat
2Ea04
Tu Thi Tram Anh
2Ip02

Uemura Takafumi
Uji-i Hiroshi
Utada Andrew
Uthailak Naphatsamon

Zhang Nan
Zhang Zhenya
Zheng Hanying
Zhu Yunxin

1Fp16
1Cp12, 3Jp08
2Cp07
1Bp15

3Fp02

あ
相沢
相田
會見
青井
青井

智康
紗織
忠則
真人
議輝

2Fa07
2Gp13
2Ep04
1Gp18
1Hp01, 1Hp02, 1S-S2p01,
2Ca07, 3Aa03, 3Ip07
青木 恭彦
3Bp06
青木 拓真
3Ep09
青木 航
2S-S4p08, 3Ap08, 3Cp04,
3Cp05, 3Ia06
青野 陸
2Bp12
青柳 秀紀
1Dp15, 1Dp16, 1Dp17,
1Dp18, 2Da01, 2Da02, 2Ep01,
3Da04, 3Da05, 3Da06, 3Da08,
3Hp01, 3Hp02
青山 冬樹
3Fa01
赤尾 健
2Hp10, 2Hp13
赤坂 直紀
1Gp10, 2Da04
赤澤 真一
1Gp12
赤澤 陽子
2Bp06
赤田 倫治
3Ba05, 3Ba07
赤沼 哲史
1Fp12, 2Jp13
赤間 剛
2Ga08
秋 庸裕 1Bp03, 1Gp18, 1Ip03, 2Dp17
秋光 和也
1Ap10
秋山 真一
3Hp09
阿久津 澪
2Jp09
阿久津 美歩
2Ca10
阿座上 弘行
2Ep04
朝倉 三貴
3Fa03
朝倉 侑弥
3Ja04
浅田 元子
1Dp02, 2Ba06
浅内 由佳
2Hp14
浅沼 成人
1S-S4p08
浅野 風斗
3Da03
浅野 泰久
2Ap04, 2Ap13
朝山 宗彦
1Bp12
芦内 誠
2Da03
芦崎 瑞稀
2Hp14
芦田 均
1Ap13
アショク サムエル
2Fp08
東 豊浩
2S-S2a04
東 雅之
1Cp13, 2Ip08, 3Ja10, 3Ja11
畔上 純也
1Ep07
麻生 祐司
3Ep07
安達 優華
2Gp07
新 裕太
2Da08
跡見 晴幸
2Dp01, 2Dp02, 3Ap06
阿野 貴司
2Ba01, 2Ba02
阿野 嘉孝
1Gp06

299

アハマドシャヒー アハマドノール
油井
阿部
阿部
阿部
阿部
阿部
安部
阿部
天野
天羽
綾部
新井
新井
新井
荒岡
新垣
荒川

信弘
郁朗
勝正
敬悦
淳
峻之
菜月
文明
光喜
宏枝
時芳
博之
宗仁
亮一
亮祐
篤史
賢治

新川
荒川
荒木

翔也
知子
希和子

荒木
荒木
荒木
有川
有澤
有馬
有馬
有馬
有吉
有吉
淡川
安齊
安蔵
安藤
安藤

通啓
康子
勇登
浩司
美枝子
一成
秀幸
勇夫
由佳
龍太郎
孝義
洋次郎
光弘
晃規
正浩

2S-S3a03
1Bp07, 1Bp08
1Gp07
1Cp02
1Fp04, 1Fp05, 1Hp08
1Gp11
2Hp18
2Ga03, 3Hp04
2Fp16
3Ja03
3Gp09
2Fa07
2Bp13, 2Ha11
1Fp11, 2S-S5a05
2Ap03
2Cp13
1Fp14, 2Dp18
3Ea01, 3Ea02, 3Ea03,
3Ea04, 3Ea07, 3S-S2p05
2Fa04
3Ba03
2Ba09, 2Ba10, 3Da01,
3Da02, 3Ja09
3Ia01
1Gp07
3Ip07
2Aa09, 2Aa10, 2Ep03
1Ep15
1Fp10, 2Bp06
2Hp09
2Ea04
1Ap14
1Fp01
1Gp07
3Ea01
1S-S1p01
1S-S2p02, 2S-S2a01
2Fp08, 2Fp10

いイ ジュンホ
2Da12
今泉 裕
1Jp09
飯尾 魁
2Dp16
飯島 信司
2S-S4p01, 3Gp03, 3Gp04
飯嶋 益巳
2Gp15
飯田 章博
3Fa02
飯田 順子
3Ia09
飯田 円
2Gp12
飯田 亮平
2Ep04
五十嵐 一衛3Ea10
五十嵐 幸一3Ja10
五十嵐 陽子
2Ga11
生田 宗一郎2Fp13, 3Ba09
池 道彦
1Bp13, 2Ca12, 3Jp04,
池ヶ谷 凌士
池川 繁男
池添 浩輝

3Jp05, 3Jp06
3Aa10
2Fp02
2Ap11

池田
池田
池田
池田
池田
池田
池田
池田
池田
池野
池袋
井坂
井沢
石井
石井
石井
石井
石井
石井
石井
石上
石川
石川
石川
石川
石川
石黒
石澤
石田
石田
石田
石原
石原
石原
井嶋
井嶋
石丸
石本
石本
泉田
和泉
出茂
何森
磯谷
磯貝
磯崎
磯﨑
板倉
井谷
板谷
板谷
市川
一木
一瀬

明夏里
2Fa06
光悦
3Hp06
丈
2Bp05, 2Ca06
治生
2Dp11, 3S-S2a02
美紗希
2Ca12
萌
3Ha05
湧
1Fp15
優理子
2Hp11, 2Hp12
陽子
2S-S3a04
慎也
2Ip09
一典
2Ip01, 2Ip02
修久
1Ep15
真吾
3Ip02
啓介
1Cp11
慧
1Fp13
純 2Ca02, 3Ba02, 3Ba04, 3Ba11
智樹
2Bp09
寛子
3Ba02
正治
2Bp13, 2Ha11
恵
1Ap18
美佐
3Ba04
一彦
1Fp07
元
1Ep16, 2Ga02
聖人
2Dp16
森夫
2Fa08, 3Ip05
陽一
1Ep16, 2Ga02
悠生
3Dp06
秀紘
1Bp13
丈典
2Ca06
尚之
1Fp15
博樹
2Hp02, 2Hp03, 3Ha02
沙季
2Jp04
潤一
2Ep08
真奈
2Bp02
浩一朗
1Dp13
博之
3Ga02
泰寛
1Ep15
圭亮
3Bp07
弥子
3Da04
智史
2S-S3a02
自泰
2Fa05, 2Fa06, 2S-S4p07
鮎美
2Jp17
健
1Ap10
敦子
2Hp11, 2Hp12
章太
2Ca03
日奈子
3Ba08
勇志
3Cp01
康浩
3Ea02
彩乃
2Ea12
かえで
2Cp13
光泰
3S-S2a04, 3S-S2a05
暉
1Hp08
啓志
2Fp03
博文
1Cp03, 3Ep01,

一瀬
一刀
井手
井出

涼
かおり
圭吾
曜子

3Ep02, 3Ep03
1Ip10, 1Ip11
1Ep15
2Ep03, 2Fp09
1Gp11

イディリス アリムジャン
1Hp14
井藤 彰
1Jp07, 3Gp01, 3Gp02
伊藤 あやの
1Ip04
伊藤 一恵
3Ha09
伊藤 一成
1A-Ip01伊藤 圭祐
3S-S4p03
伊藤 研悟
2Fp04
伊藤 光佑
1Ep12
伊藤 考太郎
1Gp07
伊藤 光平
3Ip04
井藤 純
2S-S3a04
伊藤 奨
3Aa01
伊藤 祥太郎
3Bp05
伊藤 創平
1Ap07, 1Fp08, 1Fp09,

2Ap13, 3S-S3a05

伊藤 大知
2S-S4p03, 3Ga04
伊藤 卓治
1Jp09, 3Ga03
伊藤 俊彦
3Ha04
伊藤 智之
3Cp03
伊藤 菜奈子
2Ap02
伊藤 伸哉
1A-Ka02, 2Bp07, 2Ip04
伊藤 文恵
2Gp16
伊藤 昌文
3Aa01
伊藤 麻里
2Fp02
伊東 祐二
1Fp10, 2Bp06
伊藤 洋一郎
3Ba04
伊藤 玲奈
2Gp04
稲岡 健ダニエル
1Gp07
稲垣 慶一
2Ga09
稲垣 賢二
1Ep08, 2Ap01, 2Ap02
稲留 弘乃
2Hp07, 2Hp08, 3Ha09
稲場 克弘
1Cp14
乾 博
1Bp11
乾 将行
1Ep03, 2Ja05, 2Ja07,

3S-S3p05

犬飼 義明
3Ia03
井上 暁人
1S-S3p06
井上 謙吾
2Aa03
井上 小槙
2S-S3a04
井上 大介 1Bp13, 2Ca12, 3Jp05, 3Jp06
井上 豊久
2Hp11, 2Hp12
井上 宏之
3Bp05
井上 裕介
2Aa06
井之上 ゆき乃
2Bp09
井上 善晴
3Dp03
猪熊 健太郎
3Aa06
猪瀬 陽加
2Da02
井原 邦夫
3Ia02
今井 健夫
2Hp07, 2Hp08
今井 友也
2Ip07
今井 泰彦
1A-Ka01
今井 祐太
2Gp10, 2Gp12, 3Ia08
今田 勝巳
2Ap02
今中 洋行
1Fp15
今藤 嵩大
1Ap13
今村 維克
1Fp15
今村 博臣
3S-S3a01
今村 梨子
2Fp02
猪村 剛史
1S-S5p01

300

井村 誠
2Fa02
井元 誠志
3Ja08
岩井 謙一
2Ea05, 2Ha09
岩井 伯隆
3Ap02
岩井 良輔
1S-S5p06, 2Ga03, 2Ga04
巖 流征
3Gp06
岩城 沙弥子
1Ep08
岩切 亮
2Fa02
岩國 美由季3Ea04
岩崎 建史朗
1Hp11
岩崎 卓巳
1Cp05
岩崎 将士
2Ip03
岩崎 祐樹
2Ca07, 3Aa03
岩下 和裕
2Hp09
岩田 卓也
3Da01, 3Da02
岩田 至叡
1Cp07, 1Cp08
岩橋 佑真
2Hp09
岩本 悟志
2Ep05
岩本 康成
1Dp01

う
上垣
植川
上坂
上田
上田
上田
上田
上田
植田

浩一
泰好
一馬
愛巳
太郎
宏
誠
光宏
充美

2Ip07
2Da04
3S-S4p02
1Dp03, 1Dp04, 1Dp06
2Gp14
1S-S3p06, 2Jp08
1S-S2p02
1Bp11
1Fp06, 1Hp07, 2S-S4p05,
3Ap08, 3Cp04, 3Cp05, 3Ia06
上田 裕貴
3Ep04
上地 敬子
2Bp04, 3Ha01
上野 絹子
2Ip01
上野 大心
1Ep09, 1Ep10,
1Ep11, 1Ep12
上野 慶行
1S-S3p06
上原 由紀子
2S-S3a04
植村 武史
3Ea10
植村 壽公
3Hp07
上村 真理子
2Ep10
魚住 和輝
1Ap06
魚住 信之
1Ep15, 3Ea10
筌場 将太
3Ep02
鵜澤 尊規
3S-S5a02
牛丸 和乗
2Ip12
臼井 俊晴
3Ha04
臼田 佳弘
2Ja11, 3Aa11
内川 瞳
2Ha07
内倉 寛斗
2Ca05, 2Ja06, 2Ja07
内堀 孝博
2Dp03
内村 浩美
1S-S3p02
宇都宮 大貴1Gp06
宇都宮 仁
1S-S1p03
内海 亮太郎1Fp06, 1Hp07
宇都 甲一郎2Ga12, 3Ga09
鵜頭 理恵
1Jp10, 2Ga07
宇野 紘平
3Ap04
梅崎 太造
2S-S3a04

梅澤
梅津

覚
光央

梅野
梅村
梅山
宇山

太輔
真理子
幸子
裕貴

浦野
上井
海野

泰臣
幸司
良輔

2Ap17, 2Bp11
2Jp09, 2S-S5a03,
3Cp02, 3Cp03
2Dp13, 3Ba11
3Ba01
1Gp08
1Bp14, 1Dp03, 1Dp04,
1Dp05, 1Dp06
2Ip05
2Jp15, 3Dp07
2Fa08

え
江口
江口
江連
衛藤
江夏
榎本
荏原
江邉
遠藤
遠藤
遠藤

晃弘
雄聡
徹
晋一
朔
紗希子
充宏
正平
銀朗
晃輔
輪

3Gp05
3Ea03
3Ia08
3Fa02
2Gp01
2Ga07
2Ga12, 3Ga09
2Ba01, 2Ba02
1Cp11
1Ep15
3Hp02

お
老川

典夫

及川 未早来王 悦
扇谷 悟
大井 太士郎大井 俊彦
大池 達矢
大石 悠起子
大内 将司
大浦 智之
大浦 友紀
大潟 祥梧
大川 敦司
大木 尭之
大熊 盛也
大河内 美奈
大越 佳乃
大作 理文
大迫 香穂
大島 敏久
大城
大隅
大園
太田
太田
太田
太田
太田
大田
大瀧
大谷

隆
早紀
昂貴
綺弥
誠一
惣介
拓
風輝
悠里
賀也
優太

3Ea07, 3Ea08,
3Ea09, 3S-S2p03
2S-S5a03
2Ga12
3Aa02
1Cp16
1Hp10
2Ba01, 2Ba02
2Ep02
1S-S3p05
2Ca09
2Ha08
1Hp10
2Ap01
2Hp06
2Aa02, 2Aa03
2Fp16, 2Ip10, 2Ip11
1Gp15
2Hp09
1Gp11
2Bp15, 2Bp16,
2Bp17, 2Bp18
2Aa04, 2Aa05
2Ga06
3Ep01
3S-S4p02
3Ga04
2Hp07
2Hp07, 2Hp08
1S-S5p06
1Hp04, 1Hp05
2Da01
1Fp06, 1Hp07

大塚 健介
大塚 貴志
大槻 隆司
大戸 駿弥
大戸 優妃奈
大土井 律之
大西 敦也
大西 浩平
大貫 喜嗣
大野 遥
大野 博司
大野 豊
大場 健司
大橋 晶良
大橋 沙季
大橋 貴生
大橋 千紘
大橋 正孝
大原 彩香
大原 直也
大堀 沙貴子
大前 俊昭
大政 健史

3Ba02
1S-S5p01
1Bp10, 2Cp05
2Ep12
3Fa07
2Hp13
2Ap07
3Ap07
2Ip16
1Cp03
3Da03, 3Fa03
1Bp01, 1Bp02
2Hp13
1Hp02
2Dp11
2Ip03, 3Gp07
1Gp04
2Hp17
1Hp18
2Jp01
3Bp08
1Hp14
1Ap11, 1Hp15, 2Ap05,
2Ap06, 2Da12, 2Gp01
大村 智
1S-S2p03
大室 有紀
1S-S3p06
大室（松山） 有紀
2Jp08
大谷 早紀
1Bp18
大矢 裕之
1Dp17
岡 拓二
2Jp04
岡 知里
2Gp08, 2Gp09
岡 大椰
3Ia02
岡﨑 文美
2Cp01, 2Cp02,
2Gp07, 3Bp06
岡澤 敦司
2S-S3a02
小笠原 真也
2Da09
小笠原 泰志 3Ea05, 3Ea06, 3S-S2p04
岡田 丈
1Cp06
岡田 真衣
3Ia08
岡田 光加
3Ia08
岡田 洋平
1Jp09, 3Ga03
緒方 藍歌
2Ga12, 3Ga09
岡南 政宏
2Ba01, 2Ba02
岡西 崚輔
2Da09
岡野 憲司
1Dp11, 2Cp14, 2Cp15
岡橋 伸幸 1Ip07, 1Ip08, 1Ip09, 3Ba02
岡村 洋
2Ga01
岡村 匡浩
2Dp03
岡村 好子
1Bp03, 1Gp18, 2Dp17
岡本 淳之介
1Ap17
小川 健二郎2Ea04, 2Ea05
小川 広大
2Ip14
小川 順
1S-S2p02, 2S-S2a01
小川 祥二郎
2Fp02
小川 貴弘
2Ap18
小川 拓哉
1Fp03
小川 千晶
2Ep10
小川 信明
1Ap16
荻田 亮
3Ep04, 3Ep05

301

沖野
荻野

祥平
千秋

1Dp08
1Gp17, 1Ip06, 2Ba03,
2Ba11, 2Ja01, 3Aa05,
3Bp06, 3Ga05, 3Ia01
奥川 友紀
3Ja04
奥嵜 雄也
3Gp04
奥田 伸哉
2Ha08
奥田 裕暁
2Ep13
奥田 将生
2Hp09
奥津 果優
3Ha05, 3Ha06
奥原 拓也
2Ap14
奥村 直也
1Ap06
奥村 真衣
2Hp15
小黒 芳史
2Ha04
桶田 凜
1Cp10
尾崎 守
1Ep04
尾崎 信紘
2Ha04
尾崎 僚
3Ea08
長田 穣
2S-S2a04
小山内 崇
2S-S2p04, 3Ap09
尾島 由紘 1Cp13, 2Ip08, 3Ja10, 3Ja11
尾関 健二
2Ha07
小田 彰恭
3Hp06
小田 有沙
3S-S4p05
織田 健
2Hp09
小田 忍
1Gp03
小田 達也
2Ea09
小田 みすず
3Ip04
小田 祐之亮
2Ca08
小田 龍佑
2Ap03
尾高 雅文
1Ap08, 1Ap16,
2Ap18, 2Jp17
越智 健太郎
2Aa02
越智 浩
2Fp16
落合 秋人
2Ip14, 2Ip15
鬼塚 正義
3Gp09
小野 章彦
3Gp02
小野 嵩弘
3Ba07
小野 真由子
1Ap07
小野 陽介
2Bp06
小野寺 正幸1Hp03
小野寺 瑠依1Bp16
小原 聡
1A-Ka04
小原 仁実
3Ep07
小布施 祈織
1Ep08
面川 歩
2Jp17
重栖 佑次
3Ga02
小山 貴之
1Ap12
小山 智己
1Bp01, 1Bp02
折田 和泉
1Bp15, 2Cp16,
2Dp13, 2Dp14
恩田 岳英
1Bp08

か
海道 直生
加賀谷 夏海
柿内 俊文
垣見 和宏
角谷 朝香

3Ha11
2Ap18
2Fp04
2Jp12
1Gp14

景山
景山
笠井
笠井
笠井
笠原
風間
梶原
梶村
梶山
柏木
柏木
梶原
數岡
片岡
片岡
片岡
片桐
片倉
片山
片山
勝河
勝木
葛西
勝田
勝野
勝又
勝目
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤

達斗
裕也
大輔
智成
由紀
真二郎
春香
茂樹
恒
博司

2Ga05
2Ba07
1Cp05
2Gp13
1Gp11
1Hp17
3Ia11
3Ia09
2Bp01
1Bp14, 1Dp03, 1Dp04,
1Dp05, 1Dp06
立己
1Ap09
紀賢
1Gp17, 2Ba03
果穂
3Cp04
孝幸
2Hp16
尚也
2Ja09, 2S-S5p01, 3Ip04
正和 2Dp11, 3S-S2a01, 3S-S2a03
道彦
1Fp06, 1Hp07
美紀
3Jp01
啓雄
1Ip10, 1Ip11, 2Ea11,
2Ea12, 3Ha10, 3Ha11
徳賢
3Ap09
航
2Fp01
祐希
2Jp10
浩平
3Ip05
晴郎
1Jp08
知尚
3Da11
雅央
2Gp12
政和
2S-S3a01
智也
2Ap15
愛理
2Ba04
且也
1Hp17
晃 1Ep09, 1Ep10, 1Ep11, 1Ep12
紗也
1Gp10
純一
3Aa03
淳也
2Ca07
慎也
3Ga06
節
1Bp03, 1Hp01, 1Hp02,
2Ca07, 2Dp17, 3Aa03, 3Ip07
太一郎
1Fp10, 2Bp06
竜也
1Ep07, 2Jp03, 3Da10
完
3Fa03
晃代
1S-S3p05, 2Gp04, 2Gp05
陽菜多
3Ea06
寛隆
2Ea05
弘将
3Aa10
広海
2S-S2a04
万貴
3Gp03
雅士
2Bp01, 3Aa01,
3Bp08, 3S-S4p04
優
2Hp07, 2Hp08
三恵子
3Cp06
康夫
2Ip12, 2Ip13
泰彦
2Aa11
悠一
1Bp01, 1Bp02, 2S-S3a02
勇太
3Ba03
好一
1Hp08
竜司
2Ga11, 2Ga12, 2Gp10,
2Gp11, 2Gp12, 3Ga09, 3Ia08

門岡
門倉

千尋
利守

3Ha05, 3Ha06
2Ep06, 2Hp05,
2Hp06, 3Ip06
門之園 哲哉
2S-S5a02
金井 保
2Dp01, 2Dp02
斉藤 加奈子
1Hp04
金指 真菜
2Bp10
金本 拓也
1Ip05
金森 拓
2Dp03
金山 直樹
2Gp08, 2Gp09
蟹江 慧
2Ga11, 2Ga12, 2Gp10,
2Gp11, 2Gp12, 3Ga09
金岡 英徳
3Gp03, 3Gp04
金子 喬士郎
2Ga12
金子 真也
3S-S2a04
金子 俊郎
2S-S3a03
兼崎 友
2Hp05
兼田 康平
2Ip13
金丸 愛望
1Fp10
狩野 光伸
2S-S1p04
鎌形 洋一
3Aa02
鎌田 健太郎
2Ca02, 2S-S2p05
上岡 惇也
2Da11
上垣内 宏司
2Hp09
神鳥 成弘
1Ap10
上平 正道
1Jp07, 3Gp01,
3Gp02, 3Gp06
上村 直史
2Ca10
上村 哉生樹2Dp04
神谷 典穂
1Fp01, 1Fp02, 1S-S3p04
亀川 亜希子
1Ap09
亀田 倫史
2Aa12, 2Jp09, 2S-S5a03
亀田 知人
3Hp05
亀田 弘之
2Gp13
亀谷 将史
2Bp13, 2Ha11
カラッサンチオ マッテオ
3S-S4p02
軽部 征夫
2Cp07
川井 淳
3Fp01
河合 一輝
3Ba06
河合 駿
3S-S4p03
河合 総一郎
1Fp03
河合 孝朗
3Ip02
川井 隆太郎
2Ca11
川上 隆史
2Ip16
川上 了史
2Ep02, 2Jp01, 2Jp02
河岸 洋和
1Bp17, 1Cp03
川口 潤
3Ap02
川口 剛司
1Gp14, 3Bp03, 3Bp09
川口 秀夫
2Ca04, 2Cp09
川﨑 了
1Ap17, 1Cp07, 1Cp08
川崎 大志
2Ap03
川崎 健
2Ep12
川﨑 浩子
3Ia09
川﨑 芳美
2Da02
川島 成貴
1Bp07
川島 万凜
1Hp06
川津 一隆
2S-S2a04
川西 琢也
1Cp17, 2Ba12
河野 邦晃
2Ea05, 2Ha09

302

河野
川畑
河原
河原
河原
河邉

祥尚
龍司
あい
正浩
裕美
佳典

3Ja04
3Ip07
2Ea07, 2Ea08
3Gp05
1S-S5p01
1Jp07, 3Gp01,
3Gp02, 3Gp06
2Ha10
1Dp13
2S-S5p05
1Hp03
1Fp03
2Gp06
1Hp06
1Gp13
1Ap07
1Ip04
3Ja04
1Gp12
2Hp11, 2Hp12

河股 優輔
川見 菜実香
川向 誠
川村 奈々
川本 純
河本 正次
川本 智也
河原崎 泰昌
河原林 裕
菅 英一郎
神田 晃佑
神田 直輝
神田 涼子

き
木内 敏之
菊川 寛史
菊田 浩希
菊田 実花
菊地 淳
菊池 成真
菊池 晴菜子菊池 康紀
岸 幹也
岸川 凜太郎
岸田 正夫
岸野 重信
貴嶋 紗久
木島 尚輝
岸本 高英
岸本 拓也
岸本 昇
喜多 晃久
北 潔
木田 仁
北岡 卓也
北垣 浩志
北川
北川
北口
北澤
北島
北田
北畑
北堀
北松
北村
北村
北村
北山
城戸

文彦
航
哲也
宏明
悠花
雄基
信隆
智希
瑞生
憲司
さや香
昌大
雄己哉
康年

1S-S1p02
2Ba04
3Ba05
3Da05
2Fp04, 2Fp05, 3Ia10
1Ep06
3Hp05
1A-Ka04
3Ip05
1Bp17
1Gp09
1S-S2p02
2Gp14
3Bp08
3Fp01
3Ea01
3Ja08
2Cp06, 3Aa09
1Gp07
2Fp07
3Ep01, 3Ep02, 3Ep03
2Ha01, 2Ha02, 2Ha03,
2Hp01, 2S-S5p04
3Hp05
2Aa12
1S-S3p06, 2Jp08
3Fp01
2Ha02
3Aa06
2Ba08
1Gp18
1Ep14
1S-S4p02
2Fa01
1Hp17
2Fp01
1Gp07

木梨
木野

陽康
邦器

3Ea04
2Ap14, 2Ap15, 2Ap16,
2Ap17, 2Bp11, 2Bp12, 2S-S1p01
紀ノ岡 正博 1A-Ka03, 1Jp03, 2Da11,
3Hp07, 3Hp08, 3Hp09
木下 幹朗
1S-S4p07
木下 理恵
2Jp11
木花 将
3Ea10
木原 明彦
2Ha06
木原 崇博
3Ip09
木原 摩耶
3Ja10
儀武 菜美子
1Cp05
金 相完
1Hp06
金 賢徹
2Gp16
金 美海
1Jp03, 3Hp09
金 允卿
1Fp04
金 英寿
2Ha03
木村 圭
2Hp04
木村 啓太郎
2Dp05
木村 信忠
2Dp06
木村 宏
2Jp08
木村 紘也
3Ep03
木村 浩之
2Cp15
木村 麻美子
1Ep14
木村 祐太
1Bp14, 1Dp03, 1Dp04,
1Dp05, 1Dp06
木村 行宏
1Ap13, 2Ep09, 2Ep10
清 啓自
3Ip06
清野 珠美
2Hp09
清野 宏
2Fp10
切岩 祥和
2S-S3a01
桐村 光太郎1Gp15, 1Gp16, 2Bp02,
2Ca08, 2Ca09
金田一 智規
1Hp02
金原 和秀
1Cp06, 2Aa01,
2Aa02, 2Aa03

く
久下 裕司
日下 勝弘
草加 直幸
日下部 宜宏
日下部 均
草場 裕貴
串山 夏望
楠田 みのり
楠部 真崇
楠本 憲一
朽津 和幸
沓掛 登志子
工藤 大喜
工藤 基徳
工藤 優輝
工藤 悠希
久渡瀬 太一國澤 純
國富 理紗子
久野 晶生
久野 斉

1Jp06
1Ap08
2Ga03
1S-S3p04
2Ap02
2Hp01
1Bp05
1Hp09
3Ja07
2Ha12
2Ba08
3Ha09
3Ba08
3Bp06
3Jp01
1Hp10
1Cp01
2Ea11, 2Ea12, 2Fp10
2Jp16
3Gp01
2Bp10

久能
久原
久保
久保
久保
久保

樹
哲
いづみ
智里
稔
幹

久保田 恵理窪田 健太
久保田 進
久保田 浩美久保庭 雅恵熊谷 孝則
熊崎 努
熊田 佳菜子
熊田 陽一

倉掛 昌裕
倉賀野 正弘
倉敷 凌太
倉田 淳志
倉田 博之
倉橋 敦
栗岡 昌利
栗田 俊輔
栗原 新
栗原 達夫
栗本 昌樹
栗山 克
栗山 尚浩
栗山 風貴子
黒川 摩利
黒沢 則夫
黒澤 尋
黒田 章夫
黒田 昂輝
黒田 俊一
黒田 照夫
黒田 典孝
黒田 真史
黒瀧
黒谷
黒部
桑井
桑原
桑山

空
篤之
督惠
仁葵
美空
翔一

3Jp07
1Hp06
2Fp17
2Fp16
1Ap08
2Ba09, 2Ba10, 3Da01,
3Da02, 3Ja09
2Hp05
2Ba05
1Hp14
2Fp11
1Ep05
2Dp07
2Hp09
1Ep15
1Dp10, 1Dp11, 1Dp12,
1Dp13, 1Hp18, 2Da08,
2Da09, 2Da10
3Bp07
2Jp14, 2Jp15
2Aa04
2Ip07
3Ia04
2Ha04
3Ga01
1Bp15
2S-S5p10
1Fp03, 2Ip07
2Fp16
2Aa05
1Hp18
2Gp07
2Ba08
3Ap04
2Ip16
2Bp05, 2Ca06
1Hp15
2Gp15
2Dp07
1Hp18
1Bp13, 2Ca12, 3Jp04,
3Jp05, 3Jp06
3Ap03
2Fp04
1Ap01
3Da11
1Gp04
2Hp06

け
解良
解良

康太
芳夫

3Ea10
1Cp02

こ
胡 玥
小池 あゆみ
小泉 英樹
小泉 史明
郭 朕

2S-S3a03
2Jp05
3Ga11
1Jp05
2Ja10

303

纐纈
香西
高坂
幸田
甲元
古賀
古賀

健人
雄介
智之
明生
一也
信康
雄一

2Ap14
1Ep14, 2S-S3a04
3S-S2a03
1Fp07
2Fp06, 3Ep09
2S-S5a04
1Ap11, 1Hp15, 2Ap05,
2Ap06, 2Da12, 2Gp01
古賀 凌
2Ja09
小川 雅人
2Fp09
小久保 晋
3Ip03
小境 敏揮
2Ea05
小酒井 智也
2Dp08
小崎 一功
2Ip17, 2Ip18
幸治 幸治
2Bp09
兒島 孝明
1S-S3p05, 2Gp04, 3Ia02,
3Ia03, 3S-S4p04
小島 千明
1Hp14
小島 伸彦
2Ga08
小島 基
1Ip05
小嶋 保彦
3S-S3p04
五島 徹也
2Hp10, 2Hp13
小高 敦史
1S-S4p04, 2Hp02, 3Ha02
小谷 哲也
1Hp14
児玉 詩織
2Hp09
児玉 浩明
1Gp08, 2Cp12, 2Cp13,
3Da03, 3Fa03
小玉 誠
1Bp04
小玉 優哉
2Ap04
小寺澤 翔太
3Ga05
後藤 綺花
2Fp02
後藤 博
2Ha04
後藤 麻衣子
2Fa06
後藤 正利
2Dp06, 2Hp04, 3Ha01,
3Ha05, 3Ha06
後藤 雅宏
1Fp01, 1Fp02
後藤 佑樹
3S-S2p02
小中 勇二
3Ea02
児波 克哉
2Ip08
小西 研吾
2Ga09
小西 正朗
1Dp07, 1Ep06,
3Aa04, 3Ba03
此枝 優希
3Ga11
小濵 可奈絵
2Ha03
小林 和輝
2Ep01
小林 元太
2Hp04
小林 準次
2Ga02
小林 俊介
2Ca04, 2Ja08
小林 慎太郎
3Ap07
小林 聖弥
3Ip05
小林 拓嗣
2Hp09
小林 巧
2Da08
小林 哲夫
3Ia02
小林 日花梨
3Ip03
小林 慎
3Jp04
小林 由衣乃
1Hp03
小林 洋介
3Aa02
小堀 俊郎
2Dp17
駒田 拓也
1Fp02

小松 大祐
2Ap18
小松 夕子
2Hp09
小松 陽介
2Fa07
小松崎 亜紀子
3Ba01
五味 勝也
1Gp10, 1Gp13, 2Bp14
児美川 拓実2Ip11
古明地 敬介
1Hp08
小山 純弘
1Ep16, 2Ga02, 3Hp01
小山 泰二
1Ip04
是石 真友子
3Da09
権平 文夫
2Da09
近藤 昭彦
1Bp01, 1Bp02, 1Dp11,

近藤
近藤
近藤
今野

1Gp17, 1Ip06, 2Ba03, 2Ca04,
2Ca05, 2Cp09, 2Ja01, 3Aa05,
3Aa06, 3Ba04, 3Ba11, 3Bp06,
3Ga05, 3Ia01, 3Jp02, 3Jp03
寿志
3Ea02
昌幸
3Hp05
倫生
2S-S2a04
紗希
3Ha10

さ
雑賀 あずさ
最相 大輔
齊藤 朱音
齋藤 一樹
斉藤 加奈子齋藤 樹理
齋藤 慎太郎齋藤 寛
齊藤 三希子
齋藤 裕
齊藤 亮太
佐伯 琴音
酒井 杏匠
坂井 清彦
酒井 謙二
堺 裕輔
榊原 康文
阪口 由佳
酒瀬川 信一
坂田 研二
坂中 哲人
坂元 仁
阪本 龍司
坂元 博昭
阪本 真由子
坂本 祐一朗
鷺 陽香
佐久間 健輔
櫻井 恵太
櫻井 徹生
櫻庭 春彦
提箸
座古
迫田
笹川

祥幸
保
裕美子
和彦

2Ea11, 2Ea12
2S-S3a04
2Ba03
2Jp07
1Hp05
1Hp10
2Ca09
2Ep03
2S-S3a05
2Aa12, 2S-S5a03
2Hp09
2Ga07
2Bp01, 3Aa01
3S-S3p04
3Ja04
3Ga02
2Dp05
2Ep07
1Ap12
2Fp05, 3Ia10
1Ep05
2Dp15
1Bp11
2Bp15, 2Bp16, 2Bp17,
2Bp18, 2Fp03
2Ha02, 2Ha03
1Dp13
2Cp12
2Ba05
2Fa05
1Gp05
2Bp15, 2Bp16, 2Bp17,
2Bp18, 3Ap04
2Ip14, 2Ip15
2Jp16
1Hp18
1S-S5p06

佐々木
佐々木

啓
建吾

佐々木 大作佐々木 大介佐々木 千鶴佐々木 晴菜佐々木 春弥佐々木 美月佐々木 由佳佐々木 陽介佐々木 里奈笹野 佑
佐々野 僚一佐々本 康平佐塚 隆志
佐藤 淳
佐藤 あやの
佐藤 勝也
佐藤 純
佐藤 俊輔
佐藤 将太
佐藤 喬章
佐藤 成樹
佐藤 将
佐藤 守
佐藤 実穂
佐藤 康治
佐藤 悠
佐藤 嶺
佐藤 崚
里中 健太
里村 武範
佐野
佐野
佐野
佐原
澤井
澤田
澤田
澤田
澤邊

七海
観月
芽生
健彦
美伯
和敬
俊
隆二
朋美

2Da11
1A-Ep01, 2Ca05,
3Jp02, 3Jp03
1Bp12
2Ca05, 3Jp02, 3Jp03
1Dp02
2Ea11
2Ap18
1Bp12
2Cp15
2Da06
2Jp15
2Hp02, 3Ba09
2Fa04
1Ap02
2Cp09
2Gp13
3Da09
1Bp01, 1Bp02
2Jp03
1Cp16
3Ea06
3Ap06
2Cp12
2Ip16
3Jp05
2Fa08
3S-S2p04
2Cp14, 2Cp15
3Ap07
1Fp01
2Ea06
2Bp15, 2Bp16, 2Bp17,
2Bp18, 2Fp03, 3Ap04
2Ip04
3Gp03
3Ep07
3Aa02
2Hp15
2Hp04
3Ba08
3Ia08
2Ip08

し
椎名 一樹
塩澤 優稀
塩見 尚史
志賀 敏英
繁 宥樹
茂野 俊也
繁原 安美
重松 真由子
靜 良治
設樂 弘之
實野 佳奈
實廣 亜希子
篠崎 一雄
篠田 克彦

1Gp03
3Aa08
3Ga10
1Cp07
2Da04
1Hp03
2Ep07
3Ea06
3Dp05
2Ha06
2Ep03
3Ga11
2S-S3a01
3S-S3p04

304

篠原 輝
篠原 靖智
志波 智生
柴田 徹
柴田 納央子柴田 幹哉
柴田 裕介
柴田 友香莉
柴野 麻由
渋田 真結
島 知輝
嶋田 順太
島田 友輝
島田 昌也
嶋津 敦子
島本 真奈
島森 圭弥
清水 亮啓
清水 一憲

1Cp02
1Gp07
2Ap01
3Da01, 3Da02
2Fp10
1Ap04
2Hp10
2Hp14
2Ep06
2Ga11
1Ip09
3Gp07
1Ep15
2Ep05, 2Ep07, 2Hp15
3Gp09
3Ja07
2Jp15
2Ga05
1Jp08, 1Jp09, 2Ga06,
2Ip17, 2Ip18, 3Ga03
清水 拓
2Fp01
清水 浩
1Hp09, 1Ip07, 2Ca02,
2Ca11, 2Fa01, 2Fa02,
2Hp03, 2S-S2p05, 3Ia05
清水 浩美
2Hp17
清水 みなみ2S-S3a04
志水 元亨
2Bp01, 3Aa01,
3Bp08, 3S-S4p04
清水 由宇
2Fa07
下飯 仁
2Bp14
下川 直史 2Da06, 2Ip05, 2Ip06, 3Ga01
下澤 勇弥
1Ap02
下野 雅仁
1Cp13
下平 武彦
2Fa06
下総 葉子
2Dp08
下山 達
1Jp05
ジャビエル モハマド
3Ja03
周 伯揚
2Jp06
章 超
2Ea05, 2Ha09
白井 智量
2Ca04, 2Ca05, 3Ia09
白岩 侑馬
3Ga08
白川 大地
3Ha07
城 宜嗣
1Ap08
白木澤 佳子2S-S1p03
志波 優
2Dp05, 2Fa08
新谷 智子
2Bp14
新谷 政己
1Cp06, 2Aa01, 2Aa02,
2Aa03, 2S-S2a02, 3Aa10
神内 奈々子
1Dp03
神保 陽一
3Hp05
新間 秀一
2Ea01, 2Fp13, 2Fp14
新森 彰信
2Ja10

す
末

信一朗

末永 光
菅 道哉
菅沼 寛

2Bp15, 2Bp16, 2Bp17,
2Bp18, 2Fp03, 3Ap04
2Dp06
3Ja11
2Ga11

菅原
杉浦
杉島
杉本
杉本
杉本
杉本
杉森
杉山
杉山
杉山
杉山
杉山
杉山
杉山
杉山
須崎
鈴木
鈴木

達也
慎治
小雪
明
真也
岳人
礼子
大助
亜矢斗
在生人
周
巧
友康
政則
峰崇
友亮
萌
喬太
健一朗

鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
須田
砂山
鷲見
角田
角田
炭谷
住吉
陶山

健吾
研志
康平
伸
健弘
哲朗
徹
敏弘
尚幸
治人
宏和
裕満
宏佳
宗典
啓仁
陸太
亙
博文
典克
祐介
洋輔
順一
美保
明子

1S-S4p06
1A-Jp01
2Jp17
1A-Ka04
3Jp07
2Ep11
2Ga12
1Ap12
3Ga09
3Cp03
1Hp02
2Hp07, 2Hp08
1Cp10, 2Gp13
2Aa06, 2Ea10
2Hp02, 3Ba08
2Da10
2Gp14, 2Gp15
1Ep15
2Ep06, 2Hp05,
2Hp06, 3Ip06
1Bp09, 3S-S3p02
2Ca01, 3Ja03
2Ga03, 3Hp04
2Ap15, 2Ap16
2Ip17
2Fp15
2Dp08
2Fa08, 3Ea04, 3Ip05
2Cp16
2Bp16
2Aa04, 2Aa05
3Bp08
3Da01, 3Da02
1Ip05
2Bp01
1Hp02
3Fa03
2Fp01
2S-S3a04
1Ip03
3Fp01
1Gp14, 3Bp03, 3Bp09
3Ea03
2Dp06

せ
瀬川 直矢
戚 蟠
關 光
関 未央
関 実
関川 貴寛
関口 勇地
関田 美沙
関藤 孝之
妹尾 幸枝
妹尾 政都
千賀 由佳子
善藤 威史

2Da11
3Ga04
1Ip05
2Bp03
1Jp10, 2Ga07
2Ba04
1Hp04
2Ep02
1S-S4p03
2S-S2p05
2Ba06
3Gp08
1Gp04, 2Ea07

仙波

弘雅

1Fp07

そ
周 法宇
早田 邦康
早出 広司
相馬 悠希
曽川 沙希
曽田 匡洋
曽根 政人
園木 和典
園元 謙二
染谷 信孝

1Cp01
2S-S5p08
2Ip02
1Hp11, 2Fa06
2Ja09
1Gp17, 2Ba03
3Ba06
2Ca10
1Gp04
2Dp04

た
平良
大利
田尾
多賀
高木
高木
高木
高木
髙木
髙木
高木

東紀
徹
文哉
直彦
明香莉
誠仁
一好
さつき
翔梧
妙子
博史

2Bp04, 3Ha01
3Ea05, 3Ea06, 3S-S2p04
2Ga08
3Dp06
1Bp12
2Cp12
2Ap09, 2Ap10
1Gp11
2Jp14
1Hp05
1S-S4p05, 2Ca03,
2Hp17, 2Hp18
高木 昌宏
2Da06, 2Ip05,
2Ip06, 3Ga01
高木 睦
2Ga01
高久 洋暁
3Ia11
高島 圭介
2S-S3a03
髙嶋 大輝
2Bp14
高須 耀子
2Hp05
高須賀 太一
3Bp08
髙瀨 良和
2Ea05
高塚 由美子
2Bp03
高辻 義行
1Dp09
高寺 美砂都1Ip10, 1Ip11
高野 恵里
2Fp01
高野 力
1Dp18
高野 真希
3Dp01, 3Ea11
高萩 航太郎2S-S3a04
高橋 葵
3Ha11
高橋 彬
3Ga04
高橋 一敏
2Ap04
高橋 克嘉
1Bp04
髙橋 清文
2Aa09, 2Aa10
高橋 慶太郎
2Hp14
髙橋 憲司
2Ba11, 2Ca04, 2Ca05,
2Ga09, 2Ga10, 2Ja05, 2Ja06, 2Ja08
高橋 浩一
2Da09
高橋 孝太郎
2Ea08
高橋 沙織
3Ha09
高橋 駿輔
3Ba06
高橋 祥司
1Cp02
高橋 征司
2Bp09
高橋 俊成
2Hp10
高橋 治子
1S-S5p03

305

高橋
高橋
髙橋
高橋
高橋
高橋
髙橋
高橋
高橋
高橋
高橋
高橋
高橋
高原
高部
高見
田上
髙峯
高村

宏和
弘喜
昌樹
将人
政友
雅弥
正之
美裕
森里
雄太
譲
洋子
良輔
茉莉
響介
佳宏
宇乃
和則
映一郎

高山 一也
多喜 俊介
滝口 有沙
滝口 昇
滝澤 昇
多久島 朗
田口 精一
田口 久貴
竹内 綾
竹内 健人
竹内 俊文
竹内 誠亮
武内 正輝
竹内 道樹
武内 大和
竹内 諒
竹尾 映美
竹下 正彦
竹園 恵
竹田 浩之
武田 真樹
武田
武智
竹中

真由子
大樹
慎治

竹中
竹葉
竹原
竹原
竹村
竹村
竹本
竹山

武藏
惇貴
直輝
宗範
海生
謙信
悠人
春子

田島
田島
田代
田代

誉久
直幸
康介
幸寛

1Bp03, 1Gp18, 2Dp17
2Ep08
1S-S3p06
1Dp16
2Fa05, 2Fa06
2Ha07
2Hp09
3Hp06
1Cp11
2Ip10
3Ea04
1S-S2p03, 2Fp08
1Hp18
1Fp02
3Ia11
3Da10
2Ap04
3Ha05, 3Ha06
2Bp15, 2Bp16, 2Bp17,
2Bp18, 2Fp03
3Jp04
2Bp15, 2Bp18
2Ca08
1Cp17, 2Ba12, 3Dp05
2Ga04
1Cp13
1Gp05, 1Hp10
3Ba09
1Gp12
3Ba03
2Fp01
1S-S5p02
3Dp02
1S-S2p02
2Ip12, 2Ip13
3Dp04
2Fp14
2Ea04
1Hp03
3S-S3a02
1Bp14, 1Dp03, 1Dp04,
1Dp05, 1Dp06
1Dp12
2Ip03
1Ap13, 2Ba05,
2Ep09, 2Ep10
1Gp17, 2Ba03
3Ep06
1Ap16
3Dp02, 3Dp03
2Ca07, 3Aa03
2Fp15
2Gp10
2Aa09, 2Aa10, 2Ep03,
2Fp08, 2Fp09, 2Fp10
3Aa03
2Aa12
1Hp06
3Ja04

田代 陽介
2Ca01, 3Ja03, 3Jp01
立花 成我
1Dp07, 3Aa04
達川 綾香
3Ea01
立田 祐琳亜
2Jp04
巽 萌美
2Ap04
巽 祐介
2Ap06
田中 克典
2Jp16
田中 賢二
2Cp16
田中 純平
2Hp05, 2Hp06
田中 淳也
2Hp09
田中 孝明
2Ip14, 2Ip15
田中 貴大
2Ap07
田中 拓未
1Fp04, 1Fp05
田中 勉
1Dp11
田中 剛 1Bp05, 1Bp06, 1Jp05, 2Da05
田中 俊雄
3Ep04, 3Ep05
田中 信男
2Fa03
田中 伸哉
2Hp10
田中 祐圭
2Fp16, 2Ip10, 2Ip11
田中 優
2Ha01
田中 真奈
3Bp09
田中 瑞己
1Gp13
田中 桃未
3Ip03
田中 靖浩
1Bp09
田中 涼
2Ca02
田中 遼治
3Ap08
谷 明生
2Ep07
谷 一寿
1Ap09
谷 修治
1Gp14, 3Bp03, 3Bp09
谷井 沙織
1Ep15
谷内 達彦
2Ga10
谷川 浩司
1Dp03, 1Dp04,

塚本 楓
津川 若子
佃 怜奈
柘植 圭介
柘植 謙爾
柘植 丈治
柘植 陽太

辻 周真
辻 俊一
辻 寛之
辻 雅晴
辻井 啓夢
辻野 義雄
津田 宏治
土戸 哲明
土屋 高伸
土屋 友理
筒井 莊周
都築 翔
都築 正男
堤 星太郎
堤 浩子
常田 聡
津波古 遥奈
坪井 宏和
湊元 幹太
鶴 雄基
鶴田 篤弘
鶴野 圭悟
鶴本 智大

1Dp05, 1Dp06

谷口 正之
2Ip14, 2Ip15
谷口 瑞季
3Bp06
種田 大介
1Dp08
玉置 尚徳
2Hp04, 3Ha05, 3Ha06
玉田 太郎
1Ap08
玉野 孝一
1Ip04, 2Aa12
田丸 浩 2Cp01, 2Cp02, 2Gp07, 3Bp06
田村 隆
1Ep08, 2Ap01, 2Ap02
田村 武幸
3S-S2a03
田村 具博
1Ip04, 2Aa12
田村 泰之
1Ep16, 2Ga02
田山 爽也華
2Da05
タンダル セバスチャン トミ 2S-S2p05

ち千葉 壮太郎
千葉 靖典
張 嘉修
張 傛喆
莊 漢聲
趙 理海

3S-S4p02
3Ba01
1Bp02
1Bp16
2Fp03
1Gp07

つ
塚越
塚原
塚本

かおり
正俊
郁子

2Ip01, 2Ip02
2Hp18
1Ap10

3Ia10
2Ip02
2Ep11
2Ha03
2Ca02
1Gp05, 3Ip08, 3Ip09
2Ba11, 2Ca04, 2Ca05,
2Ja05, 2Ja06, 2Ja07,
2Ja08, 3Jp02, 3Jp03
1Ip08
3Ga11
2S-S3a04
2Ep08
1Ap08
2Da06, 3Ga01
2S-S5a03
2Dp15
2Bp14
2Hp07, 2Hp08
3Bp07
2Bp01
2Hp17
2Bp01
2Ja01, 3Ha02
1Hp04, 1Hp05
2Bp04
1Fp07
3Cp01
1Bp06
1Fp10, 2Bp06
1Hp11
2S-S3a02

て
デオ
手島
出村
寺内
寺内
寺内
寺門
寺島
寺本

ヴィピン クマル
3Da10
愛子
3Ea02, 3Ea03
拓 1Ep09, 1Ep10, 1Ep11, 1Ep12
勉
2Fa06
美結
3Fa02
裕貴
1Fp04, 1Fp05
和奏
2Ea06
義文
1A-Ka04
潤
2Cp09と土井 晃一郎
土居 幹治
董 金華
當舎 武彦
東樹 宏和
道羅 英夫
遠矢 将太郎
遠山 忠
渡嘉敷 建孝
常盤 広明
徳井 教孝
徳田 宏晴
德田 真穂
戸口 梨那

1Cp10
2Ep09, 2Ep10
1S-S3p06
1Ap08
2S-S2a03
1Ep07
1Dp09
1Bp09
3Ha01
2Ap13
1S-S4p10
2Hp16
2Aa03
3Ea07

306

徳永 成美
徳光 浩
十倉 充範
徳樂 清孝
戸澤 譲
戸田 弘
戸所 健彦
利根川 聡史殿川 亜未
冨岡 敏一
冨ケ原 祥隆
富田 寿男
冨田 昌弘
富田 因則
富永 信一
冨永 将大
友広 いずみ戸谷 吉博

2Da01
2Gp08, 2Gp09
2Ja11, 3Aa11
2Jp14, 2Jp15, 3Dp07
2Bp09
2Bp07
3Ha02
1Bp18
3Ea02
2Ep13
2S-S1p02
2Cp01, 2Cp02
3Cp01
2Ep14
2Ba09
3Ba11
2Ja09
1Hp09, 2Ca02, 2Ca11,
2Fa01, 2S-S2p05, 3Ba02, 3Ia05
外山 博英
2Cp10
豊川 洋一
2Hp18
豊島 正和
2Fa01, 3Ia05
豊田 敦
2Hp01
豊田 晃一
1Ep03, 2Ja05, 2Ja07
豊竹 洋佑
2Ap07, 2Ap08, 2Ap09,
2Ap10, 2Ap11, 2Ha10
豊福 雅典
3Jp07
虎谷 哲夫
1Ap15
童 俞靜
2Fp03
頓名 洋
3Ha10

な
内藤
永井
永井
中江
中尾
永尾
長尾
長岡
長岡
長岡
中垣
中川
中川
中川
中川
中川
中川
長崎
中沢
中澤

秋花
智
美希
貴司
貴一
晃治
征秀
綾
亨
洋大
尊
克彦
拓郎
智行
博之
陽
洋史
晃
伸重
光

中澤
中澤
中島
中島
中島
中嶋

昌俊
昌美
一紀
陸博
琢自
桃香

1Dp11
2Fp11
2Ga11
2Hp11, 2Hp12
2Da09
2Ha01
2Ap05
2Cp11
1Cp09
3Bp07
2Jp17
3Aa09
2Ha05
2Ep05, 2Ep07, 2Hp15
1Gp15
3Ea05
3Ip03
2Gp14
2Hp14
2Jp09, 2S-S5a03,
3Cp02, 3Cp03
3Jp06
1Bp11, 2S-S5p03
1Ap17, 1Cp07, 1Cp08
3S-S3p01
1S-S2p03, 2Fp08
1Dp01

中島 鈴佳
中島 敏明
中嶋 宏之
中嶋 義隆
中島 芳浩
中嶋 陸満
長島 拓則
永島 直翔
中島田 豊

2Dp03
1Hp03, 2Dp03
3Hp04
1Ap01
2Bp06
2Ga05
1Jp08, 1Jp09, 2Ga06
1S-S4p02
1Bp03, 1Hp01, 1Hp02,
2Ca07, 2Cp06, 2Dp17, 3Aa03, 3Ip07
中田 國夫
1Ap09
中田 菜月
2Dp02
仲田 真穂
2Ea11
永田 暁洋
1Hp10
永田 智
3Dp03
永田 夫久江1Hp17
永田 裕二
2S-S2a04
永田 佳嗣
2Ip06
長竹 貴広
2Ea12
中谷 有沙
2Jp07
中谷 航太
2Fa05
中谷 祐将
2Ip05
長谷 洸輝
3Hp08
永留 真優
2Ha02
中西 昭仁
2Cp07
中西 崇文
2Jp03
仲野 育惠
2Dp10
中野 浩平
2Ep07
中野 祥吾
1Ap07, 1Fp08, 1Fp09,
2Ap13, 3S-S3a05
中野 智貴
2Jp06
中野 秀雄 1S-S3p05, 2Gp04, 2Gp05,
3Ia02, 3Ia03, 3S-S4p04
中野 正貴
2Ba08
永野 真吾
2Aa05
長野 正信
2Ha11
永野 幸生
2Hp04
中林 麗奈
2Ep09, 2Ep10
中原 航
3Ia06
中東 良太
1Ap18
中道 優介
3Bp05
永宗 喜三郎
1Gp07
中村 彩奈
2Ha04
中村 克哉
1Ip05
中村 公則
2Fa07
中村 健人
1Jp09
中村 浩平
2Ep11
中村 聡
1Bp15, 2Dp13, 2Dp14
中村 卓登
2Bp15
中村 史
2Gp14, 2Gp15, 2Gp16
中村 努
1Ap02
中村 強
2Ha01, 2Ha02
中村 隼雄
3Ia07
中村 真由
1Dp17
中村 泰之
3Ba04
中村 友綺
1Bp16
中村 嘉利
1Dp02, 2Ba06
長森 英二
2S-S4p04
中山 俊一
2Ep06, 2Hp05,

2Hp06, 3Ip06

中山 二郎
1S-S4p09, 2Ha01, 2Ha02
中山 宗一郎
2Bp13
中山 亨
2Bp09
中山 裕貴
3Gp04
那須 英里圭
2Jp02
名取 暁
3Hp01
成田 裕司
2Ga12, 3Ga09
成瀬 つきひ
1Ep11
ナンタポン ナワラート
2Ja09
南部 友香
3Ip08
南部 洋輔
2Ea02

に
新岡 宏彦
二井手 哲平
西 達也
西内 巧
西江 百加
西川 健幸
西川 洋平
西迫 栄
西島 謙一
西田 敬二
西野 駿佑
西野 泰斗
西野 智彦
西宮 佳志
西向 めぐみ
西村 重徳
西村 勇哉
西本 歩紗
西本 友之
西矢 芳昭
西山 和夫
新田 克章
仁宮 一章

二瓶
如田

健司
奈津美

1S-S5p05, 3Ia07
2Jp09, 3Cp02
1Cp05
2Cp12
1Gp06
2Ap14
2Fp09
2Gp13
3Gp03, 3Gp04
2Cp09
1Ip07
2Ga03, 3Hp04
3Dp04
2Aa12
2Ha01
3Bp09
3Ga05
1Bp11
1Ap03
1Ap01, 1Ap02, 2Ap03
2Ea04, 2Ea05
2Dp14, 2Fa02
2Ba11, 2Ca04, 2Ca05,
2Ga09, 2Ga10, 2Ja05,
2Ja06, 2Ja08, 3Ga06
2S-S3a03
2Ea08

ぬ
沼田

圭司

2Dp09

ね
根木 麻耶加
根岸 諒
根来 宏明
根本 理子
根路銘 伸介

2Jp05
1Jp05
2Hp03
1Ep08, 2Ap01, 2Ap02
2Ha08

の
能崎 健太
能年 義輝
盧 鎮栄
野口 範子
野口 英樹
野澤 大樹

3Ba11
1Ep14
1Hp11
2Ip05
2Ep08, 2Hp01
2Bp08

307

野島 大佑
野田 彩乃
野田 尚宏
野田 浩史
野田 正文
野田 凌太郎
野地 秀和
野中 衛
野々村 祐輝野々山 智美野辺 善仁
登木 耕陽
野見山 泰成
野村 泉
野村 隆臣
野村 高志
野村 暢彦
野村 勇揮
野村 友佑
野村 亘
野矢 洋一

1Bp05
2Aa11
1Hp04, 1Hp05
2Ep13
2Aa06, 2Ea10
2Gp08, 2Gp09
2Hp16
1Ap16
2Ap10
1Bp06
3Hp06
2Cp14, 2Cp15
1Gp04
2Dp08
2Ap03
1Ap08
3Ia11, 3Jp07
2Ba12
3Ep07
3Dp03
1Jp06

は
萩原 万貴
1Ap14
萩原 遥太
3Gp04
朴 龍洙 1Ep07, 2Fp15, 2Jp03, 3Da10
白米 優一
2Da03
端 瞭太
1Dp12
橋口 和典
2Ha11
橋田 礼博
3Hp07
橋爪 克己
3Ha04
橋場 倫子
3Ba04
橋本 真悟
2Ga04
橋本 貴史
2Bp08
羽城 周平
2Aa07, 2Aa08
蓮沼 誠久
1Bp01, 1Bp02, 2S-S3a02,

3Aa06, 3Ba04

長谷 純嵩
2Dp05
長谷川 倫男
1Hp16
長谷川 浩
3Ja05
長谷川 真輝1Ip03
長谷川 真梨菜
3Ep05
畑 浩介
1Gp18
秦 洋二 2Hp02, 2Hp03, 2Ja01, 3Ha02
羽田 毅
3Gp01
波多江 有輝3Gp02
畠山 哲央
3S-S4p05
畑中 唯史
1Ap18
秦野 琢之
3Aa07
八谷 剛史
2Dp05
八田 誠二
2Ap10
八田 貴
1Cp01
服部 公央亮2S-S3a04
服部 修平
3Cp02
服部 新吾
3Da01, 3Da02
服部 正
2S-S1p06
服部 正平
3Fa03
花井 泰三
1Dp12, 1Hp11
花岡 翼
1Bp09

羽生
羽場
馬場
馬場
馬場
馬場
羽部
濱川
浜島
濱田
濱野

義郎
清人
嵩一朗
俊輔
啓彰
保徳
浩
匡史
弘史
浩幸
吉十

3Cp06
2Hp08
2Hp04
3Ia07
1Hp01
3S-S4p04
1Bp18, 2Ca09
1Ep04, 3Ap05
2Ha01
1Hp11
2Ip12, 2Ip13, 3Ea07,
3Ea08, 3Ea09, 3S-S2p01, 3S-S2p03
浜本 晋
1Ep15
早川 享志
2Ep05, 2Ep07, 2Hp15
早川 敏広
3Da01, 3Da02
早川 正幸
3Ip03
早坂 洋輝
3Ja09
林 修平
1Dp01
林 順司
2Ap07, 2Ap08, 2Ap09,
2Ap10, 2Ap11, 2Ha10
林 祥平
3S-S2p04
林 英輝
1Ap08
林 雅弘
1Bp04, 2Cp11
林 将也
2Ap01
林 美伶
2Ip10
林 勇樹
1Fp11
早瀬 伸樹
2Cp06, 3Aa09
早田 優理
2Ap16
原 清敬 2Ba04, 2Ba07, 2Ca02, 2Fp12,
2S-S2p03, 3Aa08, 3Ba02
原 富次郎
2Bp03
原 太志
1Hp14
原 正之
1Jp04, 3Ga07, 3Ga08
原 良太郎
1S-S2p02, 2Ap14, 2Bp12
原島 俊
2Hp02
原田 繁春
2Ap01
原田 春佳
2Ha08
原田 雄斗
2Ep05
原田 隆平
3S-S3a03
原田 玲奈
1Dp15
原山 重明
1Gp11
原 - 山村 宏江
3Ja05
坂東 弘樹
3Ha02
馬場 健史
2Fa05, 2Fa06, 2S-S4p07

ひ
稗田 莉奈
比嘉 悠貴
東 恭平
東 達也
東 恒仁
東浦 優希
東川 史子
東原 成美
東本 繰未
東山 明広
引地 啓太
樋口 美栄子
久田 拓海

1Gp06
2Ea01
2S-S5p07
2Fp02
1Jp06
2Ap03
2Aa06, 2Ea10
3Ha10
2Ba10
3Aa09
2Ip06
2Dp09
2Gp11

久富 歩
菱田 正志
秀瀬 涼太
日野 智也
氷見山 幹基
平 大輔
平井 英明
平井 浩文
平川 夕貴
平沢 敬
平田 晃右
平塚 功尚
平野 一哉
平野 伸一
平野 皓巳
平林 翼
平松 孝太郎
平松 希望
平山 歩夢
平山 隆志
平山 智弘
平山 匡男
平山 伶奈
広井 佳臣
廣江 綾香
広岡 和丈
廣岡 青央
広川 安孝
廣瀬 遵
広瀬 佑紀
廣田 隆一
弘埜 陽子
廣部 綾乃
廣森 美樹

3Ba09
3S-S3p04
2Ip06, 3Ap05
2Aa05
1Ap02
2Jp04
1Cp14
1Bp17, 1Cp03
1Dp01
3Ba06
3Ap06
2Ep06
3Dp05
1Cp09
3Da01, 3Da02
2Dp14
3Ha10
1Fp09
2Dp13
2S-S3a04
3Ia11
2Ha04
1Hp07
2Ga03, 3Hp04
1Gp05
2Dp12
2Hp09
1Dp12
2Dp06
1Cp10
2Bp05, 2Ca06
2Ca02, 3Aa08, 3Ba02
2Ba11
2Bp09

ふ
ファティマ アズワニ
3Ja03
ファン チィー キム ユン
2Aa01
深沢 知加子
2S-S3a01
深瀬 葵
2Ap09
深田 寛朗
2Ja11, 3Aa11
深田 悠太
2Dp11
深見 裕之
2Ha03
府川 祐太
1Ap05
吹谷 智
3Ap03
福居 俊昭
1Bp15, 2Cp16,
福井
福井
福﨑

福島
福島
福田
福田
福田
福田
福田

2Dp13, 2Dp14
2Ip07
3Ja04
1Ep05, 2Dp14, 2Ea01,
2Ea02, 2Fa02, 2Fa03, 2Fa04,
2Fp13, 2Fp14, 3Fa07
昭二
2S-S4p02
康裕
1A-Ka04
淳二
2Ga05
展雄
3Gp08
雅夫
1Cp05
まみ
2Hp14
萌子
1Ep04, 3Ap05
瑞季
諒
英一郎

308

福田

青郎

福谷 洋介
福本 敦
福本 響
福本 悠地
藤井 暁
藤井 克彦
藤井 大樹
藤井 力
藤井 雄三
藤川 康夫
藤崎 和弘
藤島 義之
藤田 愛
藤田 憲一
藤田 昂大
藤田 直子
藤谷 将也
藤根 志帆
藤野 早瑛
伏原 和久
藤原 秀彦
藤村 孝志
藤本 一嗣
藤茂登 遥香
藤森 一浩
藤森 文啓
藤山 和仁
藤吉 好則
藤原 伸介
藤原
藤原
藤原
二神
二又
二見

政司
優人
由梨
泰基
裕之
淳一郎

二見
佛願
舟橋
古川
古川
古澤
古田
古田
古舘
古谷
古野
古橋
古屋
古屋
文谷

翠
道男
久景
謙介
裕貴
力
雅一
未有
祥
太樹
正浩
康弘
一彦
俊樹
政憲

1Ep04, 1Gp10,
2Da04, 3Ap05
2Fp07
3Ea01
3Ea07, 3Ea08, 3Ea09
2Ba01
2Ha11
1Bp07, 1Bp08
3Fa02
2Hp10, 2Hp11, 2Hp12
3Ep05
2S-S3a02
1S-S5p06
2S-S1p05
3S-S2a03
3Ep04, 3Ep05
3Ea01
3Ha04
2Gp11
2Da06
3Bp03
2Bp09
2Dp06
2Gp06
2Da05
3Da04
3Aa02
3S-S4p02
2Ip03, 3Gp07
1Ap09
1Ep04, 1Gp10, 2Da04,
2Ip06, 2S-S5p06, 3Ap05
2Ga01
1Dp17
2Fa06
2Dp06, 3Ha05, 3Ha06
2Ca01, 3Ja03, 3Jp01
2Jp06, 2Jp10,
2Jp11, 2Jp12
2Jp06
2Fa05
2Bp05, 2Ca06
2Dp06
2Gp05
3Ba06
2Dp15
1Ep15
3Ip09
1Jp08, 1Jp09, 3Ga03
2Fa03, 2Fa04
3Ja05
3Ip06
1Bp18, 2Ba08, 2Bp08
3Ep06

ほ
包 紅彬
坊垣 隆之
星 和明

2Hp09
1Fp07, 2Ha08
2Ip02

星 南穂子
星田 尚司
星野 一宏
星野 翔太郎
星野 力
星野 亘
細川 正人
細見 晃司
細山 哲
堀田 篤
堀田 夏紀
堀 采音
堀 有音
堀 克敏
堀 千明
堀 勝
堀井 俊平
堀内 淳一

堀内 祐貴
堀江 裕紀子
堀尾 京平
堀越 智
堀田 靖人
堀永 晃作
堀之内 貴明
本莊 知子
本庄 宏
本荘 雅宏
本田 亜由美
本田 孝祐
本田 真也
本田 直樹
本多 裕之
本多
本間

了
裕人

2Ha11
3Ba05, 3Ba07
3Dp01, 3Ea11
1Gp07
2Bp10
2Ap04
2Aa09, 2Aa10,
2Fp09, 2Fp10
2Fp10
3Ia09
3Ga11
2Hp02
2Gp06
1Jp10
1Fp13, 2Dp16
1Hp10, 3Bp08
3Aa01
2Fp08, 2Fp10
1Dp10, 1Dp11, 1Dp12,
1Dp13, 1Hp18, 2Da08,
2Da09, 2Da10, 3Ba03
2Ep02
2Fp02
2Dp17
3Da06
1Gp06
2Bp17
3S-S4p01
2Jp10, 2Jp11
1Hp11
2Ca01, 3Ja03
3Cp02
2Cp14, 2Cp15
3Gp08
2S-S4p09
1Jp08, 1Jp09, 2Ga06,
2Ip17, 2Ip18, 3Ga03
3Ja05
2Hp16

ま
眞井
前川
前川
前田

洋輔
忠義
大樹
淳史

1Jp06
1Jp08
2Ap05
1Dp03, 1Dp04, 1Dp05,
1Dp06, 3Ep06
前田 勇
1Cp14
前田 和勲
3Ia04
前田 新一
2Ea11
前田 憲成
1Dp09
前田 知貴
3Ga11
眞榮田 麻友美
3Ha01
前田 義昌
1Bp06, 2Da05
前田 航
2Bp14
曲 正樹
2Gp08, 2Gp09
曲山 幸生
2Ha12
牧 泰史
3S-S2a03
牧田 晟洋
1Bp13
牧田 芳隆
3Gp03

牧野
槇本
政井
正木
正木
真崎
升井
増井
増子
増田
増田
増永
増本
町田
町田
町田
松井
松井
松井
松浦
松浦
松尾
松尾
松尾
松岡
松倉
松郷
松崎
松崎
松崎
松崎
松崎
松崎
松沢
松沢
松鹿
松下
松島
松田
松田
松田

祥嗣
2Ip04
純
2Hp11
英司
2Ca10
和夫
2Hp15
佑弥
1Ap14
雄一
1Jp06
伸治
2Ip16
良治
1Ap10
穂
2Ep06
亜理沙
3Da08
健誠
3Ja03
夏輝
3Ep02
新也
3Gp02
雅之
2Ha07
悠
1Gp12
佑樹
3Da10
旺大
3Dp03
翼
1S-S5p04
徹
1Cp10
和則
1S-S3p03
友亮
2Aa11
慎作
2Ap02
直紀
1Ap03
洋孝
1S-S2p03
真生
1Cp15
智子
1Hp04, 1Hp05
誠一
3Dp05
弘美
2Ea07, 2Ea08
典弥
3S-S5a03
慎史
3Dp07
浩明
3Aa07
素道
1Gp07
友星
3Cp05
智彦
3Bp04
弘貴
2Ja05
昭則
2Ca07, 3Bp05
一信
2Ja09, 2S-S5p01, 3Ip04
雛子
2Fp03
綾子
2Cp11
修平
2Cp05
史生 1Ip07, 1Ip08, 1Ip09, 2Ca02,

松田
松田
松谷
松永
松永
松永
松波
松野
松原
松村
松村

将典
侑大
峰之介
安由
是
浩子
宏明
浩嗣
健生
憲吾
洋寿

松村
松村
松本
松本
松本

2Fa02, 2Hp03, 2S-S4p06, 3Ba02
3Da06
1Gp07
2Ja09, 3Ip04
2Ea12
1Jp05, 2Dp18
2Aa09, 2Aa10, 2Ep03
2Fp07
3S-S2a03
1Gp09
2Hp02, 2Hp03
1Ap08, 1Ap16,
2Ap18, 2Jp17
幸彦
1Bp03
吉信
2Dp10, 2Ep13
厚子
2Fp08
圭司
3Ep07
謙一郎
1Hp10

309

松本 崇揮
松本 奈々
松本 菜々恵
松本 奈実
松本 伯夫
松本 光晴
松本 光史
松本 美徳
松山 彰収
松山 晃久
松山 恵介
真山 茂樹
黛 新造
丸山 千登勢
丸山 直也
丸山 正晴
丸山 実菜
丸山 竜人

1Jp03
1Bp06
3Ap03
3Ip04
1Cp09
2S-S5p09
1Bp05
1Ap01
2Bp08
1Cp15
1Gp18
1Ep08
1Gp18, 1Ip03
2Ip12, 2Ip13, 3S-S2p01
2Dp11
1Ip07, 1Ip08, 1Ip09
2Dp18
1Cp10

み
三井田 篤志
三浦 愛
三浦 夏子
三木 健夫
見崎 裕也
三﨑 亮
三島 俊介
水越 利巳
水澤 愛衣
水谷 治
水谷 行善
水谷 友梨香
水沼 正樹
水野 洸介
水野 匠詞
水野 貴之
水野 拓哉
水野 光
水町 優希
箕田 康一
三谷 恵一
三井 亮司
三ツ石 方也
満倉 浩一
光武 進
三橋 健斗
三橋 麻由
水上 留以
南 博道
南 牧歩
南 賢尚
南 瞭子
南野 優季
南畑 孝介
源 和晃
三成 由美
峯崎 美歌子
峯苫 智晴
蓑田 義将

2Ip15
1Ip04
1Fp06, 1Hp07
3Ip01
3Ea04
2Ip03, 3Gp07
2S-S3a02
1Ap09, 2Ap04
2Gp14, 2Gp15
2Cp10, 3Ha01
3S-S4p02
2Ba04
1S-S4p01
2Ep05
1Gp05
3Ep06
3S-S3p04
2Ja05
3Ip04
1Bp14, 3Ep06
2Ha08
2Hp15
1Fp05
1Ap04, 1Ap05, 1Ap06
2Ha01
3Ga04
2Aa07, 2Aa08
2Hp09
2Cp09
2Ea01
3S-S1a02
3Ap06
1Fp08
1Fp01, 1S-S3p04
2Fp01
1S-S4p11
2Ea04
2Jp12
1Jp10

三原
宮内
宮川
三宅
三宅
三宅
宮坂
宮崎
宮崎
宮崎
宮澤
宮澤
宮澤
宮田
宮田
宮野
宮原
宮原
宮平
宮本
宮本
宮本
宮本
宮本
宮本

笑
啓介
幸
淳
子龍
深雪
均
翔子
均
穂乃香
拳
沙哉佳
せいは
健
大暉
博
平
佳子
響子
和英
憲二
樹里
哲也
捺央
浩邦

宮本
宮本
宮脇
河田
明賀
三好
三好
三好
三輪

上聖
侑子
大輝
美幸
史純
克樹
佑奈
柚紀
聡一

1Gp17, 2Ba03
1Cp11
2Ha01, 2Ha02
3Ia07
2Fp06
3Ga01
1Dp01
2Cp09
2Ea06
2Ep06
1Hp08
2Ap17
3Ia09
2Jp09
1Ap11
2Ap04
1Gp08, 3Da03
2Fp11
3Ip05
2Jp07
2Ep02, 2Jp01, 2Jp02
2Cp16
2Ha05, 2Ha06
1Ip06
1Gp08, 2Cp12, 2Cp13,
3Da03, 3Fa03
1Dp02
2Ea04
3Ea09
1S-S4p03
2S-S3a01
2Ca06
1Cp06
2Ea12, 2Ip07
1Jp06

む
向井
向田
向田
武藤
村井
村井
村上
村上
村上
村上
村上
村田
村田
村田
村中
村松
村山
村山
村山
村山
室田

克之
潤
尭史
潤
克輝
雄大
明男
克治
周一郎
晴太郎
将和
智志
昌浩
和加惠
俊哉
和明
和隆
拳午
晃一
周平
昌輝

2Bp08
2Hp15
1Ep10
3S-S3p03
2Ca04, 2Ca05
1Hp06
1Dp12
2Ca07
1Ap14
3Gp04
2Dp10
1Fp14
3Ia01
3Ep05
1Ip05
3Hp06
1Ap12
1Bp10
1Dp18
1Hp04
2Ap01

め
メトワリー

キャレド

2Ip09

も
茂木 亮介
持田 恵一
茂木 太極
本底 麻綸
本橋 令子
本山 智晴
本脇 那々子
籾山 健太
森 一樹
森 一博
森 貴翔
森 光一
森 康一
森 哲也
森 智夫
森 ひかる
森 英樹
森 弘樹
森 浩禎
森 光矢
森川 正章
森田 大地
森田 仁彦
森田 雅宗
森谷 亜希
森永 花菜
森本 一輝
森本 高章
守屋 綾子
森脇 健司
諸星 知広

3Ha08
2S-S3a04
2Ep06
3Ha01
2S-S3a01
1Fp09, 2Ap13
3Dp06
3Ap07
3Ha05
1Bp09
2Fp01
1Ap15
1Dp01
1Ap03
1Bp17, 1Cp03
3Ap02
1Jp04, 3Ga07, 3Ga08
2Bp12
3S-S2a03
2Aa01
1Bp09, 1Bp13
2Dp07
3Jp03
1Hp04, 1Hp05
1Bp04
3Jp07
1Ep06
3Da11
1Ep14
1S-S5p06
1Cp16, 2Dp04

や
矢追 克郎
矢尾井 健人
八木 周和
八木 創太
藥師 寿治
矢澤 彌
矢嶋 祐也
安井 典久
安池 一貴
安枝 寿
安田 貴信
安武 義晃
安中 優太
安福 航希
柳田 晃良
柳戸 彩奈
柳谷 洸輔
栁瀬 裕介
矢野 成和
矢野 剛久
矢野 佳果

3Bp04
2Dp07
2Fp12
2Jp13
2Ja09, 2S-S5p01, 3Ip04
2Hp09
2Ga07
2S-S5a01
3Jp01
2Aa07, 2Aa08
1S-S3p06
2Aa12
1Ip04
3Ia03
2Ha01
2Ea09
2Aa02, 2Aa03
1Gp08
2Bp04
2Fp11
2Ap02

310

矢萩 大貴
藪 浩
屋部 佑介
山内 七海
山内 康弘
山岡 奈央
山岡 美桜
山川 ひとみ
山川 倫誉
山岸 明彦
山岸 彩奈
山口 陽
山口 愛彩
山口 健一
山口 利男
山口 晴彦
山口 浩輝
山口 紘武
山口 真琴
山口 正晃
山口 良弘
山崎 一輝
山崎 思乃

山野 めぐみ山野 - 足立 範子

吉田
吉野

稔
知子

山村
山本
山本
山本
山元
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山谷
家森
八幡
八幡

吉原
吉原
吉見
吉村
吉村
吉村
吉本
芳本
依田
依田
米光
米村

明秀
瑛梨奈
啓
明浩
英莉
柚紀
将悟
奈々
卓東
ひろみ
裕
彩乃

山崎

湯浅 一貴
湯浅 凌我
雪 真弘
弓削 類

山崎
山﨑
山崎
山﨑
山﨑
山崎
山崎
山崎
山地
山下
山下
山下
山下
山下
山城
山田
山田
山田
山田
山田
山田
山田
山田
山田
山田
山中
山中
山中
山中
山中
山中
山中

3Aa11
1Fp05
1Bp05
2Da03
3S-S3p04
1Jp08, 1Jp09
3Bp07
1Jp05
3Ia08
2Jp13
2Gp14, 2Gp15, 2Gp16
2Ja07
2Bp01, 3Bp08
2Ea09
1Ep15
2Bp09
1Ap09, 2Ap04
2Ep02
2Bp09
3Ha06
3Ep04, 3Ep05
1Ip07
1Ip10, 1Ip11, 2Ea11,
2Ea12, 2Ip07, 3Ha10, 3Ha11
将太朗
1Ep09, 1Ep10,
1Ep11, 1Ep12
直人
1Bp14
正夫
2Ea04, 2Ea05
真澄
3Ba08
梨沙
2Hp13
竜次
2Aa05
翔子
1Hp14
智彦
2Ip02
美輝
2Aa09, 2Aa10
秀樹
3Da11
一郎
3S-S5a01
哲
2Bp09
瀬菜
1Bp03
秀行
2Ha05
陽子
1Ap13
圭輔
1Gp04
康嗣
1Bp09
泰蔵
2Ap08
隆
2Ep12
翼
2Hp10
浩之
1Fp07
将大
2Dp01, 2Dp02
真澄
1Jp10, 2Ga07
守
3S-S2a03
美和
2Bp14
洋平
3Ia09
章裕
1Ap03
一也
3Ea07, 3Ea08,
3Ea09, 3S-S2p03
真也
3Dp07
寛子
3Gp06
優志
2Ep13
祐実
1Hp14
由利恵
1Ep14

2Fa07
1Ap11, 1Hp15,
2Ap05, 2Ap06, 2Da12, 2Gp01
英樹
3Ip03
惠美子
3Ga02
克哉
1Cp13
光士郎
2Bp05
翔太
2Hp05
進二郎
1Dp01
千晶
2Fa01, 3Ia05
博文
1Bp14
雅一
1Gp07
真由香
1Ap01
裕貴
2Hp01
雄大
2Ap13
陸
3Hp08
涼平
2Ga11
麗奈
1Dp10
竜大
1Gp12
優佳
3Ap05
志央美
3Ia11
穣
3Ia11

ゆ

よ
楊 俐聡
養王田 正文
横尾 岳彦
横尾 俊憲
横田 篤
横田 仁子
横森 愛美
横山 萌
吉井 優也
吉岡 育哲
吉岡
吉岡
吉岡
吉川
吉川
吉川
吉﨑
吉田
吉田
吉田
吉田
吉田
吉田
吉田
吉田
吉田
吉田
吉田

貫太郎
敏明
実咲
航平
翔太
博文
由美子
エリカ
修
啓
滋樹
昭介
朋子
豊和
信行
裕美
雅偲
真実

り
李
李
劉
劉

怡然
天成
昊
利雲

2Bp02
2Ap18, 2Fp07
3Ba01
1Hp10
2Ja10, 2S-S5p02, 3Ap03
2Ep09, 2Ep10
1Ep07
1Ap13
3Da09
1Gp15, 1Gp16, 2Bp02,
2Ca08, 2Ca09
1Jp07
3Hp05
2Jp11
2Fa03
3Da03
2Dp05
3Ha05, 3Ha06
3Aa11
3Dp03
2Gp10, 2Gp12
2Ea06
1S-S2p04
3Ja10
1Ap04, 1Ap05, 1Ap06
3Aa10
1Ap10
3Ip02
3Ja10

2Ea04
2Fp15
1Cp01
2Hp09

る
ル ティ トゥ

1Cp17
3Dp01
2Aa02, 2Aa03
1S-S5p01

1Cp15
1Bp05, 1Bp06,
1Jp05, 2Da05
1Ap10
3Ba01
1Fp04, 1Fp05, 1Hp08
2Hp15
3Ea11
1Fp06, 1Hp07
1Fp13
3Ip02
2Dp18
2Jp05
3Ja07, 3Ja08
1Dp05, 1Dp06

ホン

2Dp05

わ
若井
若林
若林
若山

暁
敬二
里衣
守

脇 滉
和氣 駿之
脇田 克也
脇中 琢良
脇本 紗梨
涌井 秀樹
和田 一仁
和田 圭介
和田 昌憲
和田 大
綿井 大輔
渡辺 一樹
渡辺 賢一
渡邉 研志
渡部 潤
渡邉 翔介
渡辺 大輔
渡邉 大輔
渡邊 崇人
渡部 貴大
渡邉 直暉
渡邉 肇
渡辺 昌規
渡邊 真宏
渡邉 実
渡邉 恵
和地 正明

2Ja01
2Ba07
1Fp02
2Ap07, 2Ap08, 2Ap09,
2Ap10, 2Ap11, 2Ha10
2Cp06
2Bp09
2Ep13
3Ha07
1Gp16
2Jp17
3Ep07
2Ca07
2Ga02
2Ja10, 3Ap03
1Ep05
3Aa04
2Ha04
1Bp03, 1Gp18, 1Ip03
3Ha07, 3Ha08
3Aa07
2Hp17, 2Hp18
2Dp01
2Dp06
1Hp14
3Ia01
2Aa11
2Ba05
3Bp05
1Dp08
1Ep14
3Ap02

311

キーワード索引A
Abditibacteriota
2Ep01
abiotech stress
2Ip09
acclimation
3Aa02
Acer palmatum
2Ep01
acetic acid3Ip04
acetic acid bacteria
1Gp06, 2Da04
Acetobacter pasteurianus
3Ip05
acetylcholine
2Fp14
acetylcholine receptor
1Jp08
Achromobacter sp.
1Ap04
acid tolerance
1Dp18, 2Ip09, 3Da08
Acinetobacter
2Dp16
aconitate isomerase
2Ca08
acrolein
2Jp16
actin
2Gp14
1Gp03, 1S-S2p03
actinomycetes
active site residue
2Ap02acyl carrier protein
3Ea05
acyl homoserine lactone
2Dp04
Acyl-(ACP) reductase
1Fp11
adalimumab
2Gp03
adaptive laboratory evolution
3Ba06
adenylation
2Ap15
adenylation enzyme
2Ap16
adhesion
1Fp13, 1S-S5p06
adjuvant
2Ip02
aerial microalgae
1Bp07, 1Bp08
aerobic culture
1Dp16
aerobic granular sludge
3Ja06
Aﬃnity Ligand
2Da07
aﬃnity separation
2Da08
AFM
2Gp15
African trypanosomiasis
1Gp07
agar plate
1Dp15
aggregate suspension culture
1Jp03
aggregation
3Ha07, 3Ip07
aging
2Ha06
agmatine
1Gp10, 2S-S5p06
2Cp01, 2Cp02
agricultural waste
2S-S3a05
agriculture
air plasma
2S-S3a03
Air-lift bioreactor
1Dp10
airlift bioreactor
1Dp12
alanine scanning
3Cp05
alaremycin
3Ap02
ALAS
3Ap02
albumin
2Ja11
alcohol oxidase
3Ba01
alcohol to jet
3S-S3p01, 3S-S3p05
aldehyde dehydrogenase
3Aa10
algae
3S-S3p02
alginate
3Ga07alignment
1Jp08

alkaline phosphatase
3Cp06
alkane 1-monooxygenase
1Cp06
Alkane biosynthesis
1Fp11
allergen
2Fp16
Aloe vera
3Da07
alpaca VHH antibody
2Bp06
alpha-1,3-glucan
3Bp01
alpha-1,3-glucan-binding activity 3Bp01
alpha-1,3-glucanase
2Bp02, 2Bp04,
3Bp01, 3Bp02
alpha-amylase
3Ha06
alpha-EG
2Ha08
alpha-keto acid
2Ap17
alpha-tocopherol
2Ip05
alpha-tocotrienol
2Ip05
Alternating electric ﬁeld 1Ep16, 2Ga02
altitude
3Fa05
alzheimerʼs disease
2Jp14
Alzhheimerʼs disease
2Jp15
amazake
2Ha04
ambrosia beetle
2Bp01
amidation
2Ap08
2Ap16
amide bond formationamino acid
1S-S4p01, 1S-S4p04,
1S-S4p05, 2Ca03, 2Ea03
amino acid analogue
1S-S4p04
amino acid analysis
2Ap04amino acid oxidase
2Bp14amino acid transporter
1S-S4p03
5-aminolevulinic acid
3Ap02
aminopeptidase
1Ap18
ammonia
2Ap17
ammonium transporter gene
1Gp11
ammonium-rich waste
2Cp04
amyB
3Ha06
amyloid
2Jp16
2Jp14, 2Jp15
amyloid-beta
anaerobic
1Hp04
2Aa02
anaerobic condition
anaerobic degradation
2Cp03
anaerobic digestion
2Cp04
2S-S5p03
anaerobic respiration
Ananas comosus
3Fa06
Ancestral reconstruction
1Fp08
Anchorage-dependent cells
2Ga02
anethole
3Ep04
aneuploid2Hp02
aneuploidy
2Hp01
angiogenesis
3Gp02
anion exchange
2Fa05
anodic bioﬁlm
3Jp02
Antarctic yeast
2Ep08
Anti-adhesion
3Ga09
anti-allergy
3Dp01
Anti-cancer activity
3Hp03

anti-inﬂammatory
2Ha03
anti-rheumatic drug
2Jp17
antibacterial
3Dp06, 3Ga11
antibacterial peptide
1Gp04
antibiotics
1Gp03, 2Ba01, 3Ea02,
3Ea04, 3Ea05, 3S-S2a02,
3S-S2p01, 3S-S2p05
antibody
1Hp17, 1S-S3p06, 2Gp02,
2Gp04, 2Gp08, 2Gp09, 2Ja11,
2Jp08, 2Jp09, 2Jp10, 2Jp11,
3Cp02, 3Cp03, 3Gp05
antibody mimetics
2S-S5a02
antifungal
2Bp04
antifungal activity
2Ip15
antigen
2Jp12, 3Fp01
3Dp02, 3Dp03
antimicrobial
antioxidant
1Jp06, 2Ha10
apoptosis
2Ip14
aptamer
2Ip01, 3S-S5a01, 3S-S5a02
aquaculture
1Bp14
Arabidopsis thaliana
1Ep09, 1Ep11,
1Ep12, 1Ep14, 1Ep15, 2S-S3a01
arachidonic acid
3Ea11
archaea
1Ap07, 2Dp01, 2Dp02,
2S-S5p06, 3Ap06
aromatic acid decarboxylase
2Bp12
aromatic ring compound 1Cp01, 1Cp05
arsenic removal
1Cp11
artiﬁcial biosynthesis
3S-S2p02
artiﬁcial intelligence 2Gp13, 2S-S5a03,
3Ia07
artiﬁcial protein design
3S-S3a05
artiﬁcial viral capsid
1S-S3p03
ascochlorin
1Gp07
ascofuranone
1Gp07
Ashbya gossypii
1Ep07
Asia
1S-S4p09
ASO IVD reagent
3Fp01
asparagine synthetase
2Ap08
Aspergillus
3Ep07
Aspergillus kawachii
3Ha05, 3Ha06
Aspergillus luchuensis
2Ea05, 3Ha01
Aspergillus nidulans
3Bp08
Aspergillus niger 1Gp16, 2Bp02, 2Ca08
Aspergillus oryzae
1A-Ip01, 1Fp04,
1Fp05, 1Gp10, 1Gp13, 1Hp08,
1Ip04, 2Bp14, 2Ea10, 2Fp02,
2Gp03, 2Ha05, 2Ha06, 2Ha10, 2Ja01,
3Bp04, 3Ha02, 3Ia02, 3S-S4p04
Aspergillus tubingensis 1Gp15, 1Gp16,
2Bp02
assay
1S-S5p04
astaxanthin
1Dp10, 1Hp13,
2Ba07, 2Fp12
atomic force microscopy 1Fp05, 1Fp13

312

ATP
2S-S2p03, 3Aa08, 3S-S3a01
ATP regeneration
2Ca02
atrophy
2Ga06
AuNP
1Fp15
AuNPs
3Fp05
Auranchytrium
2Cp11
Aurantiochytrium
1Bp04, 1Ip03
Aurantiochytrium sp.
1Gp18
autoﬂuorescence
1Hp16
autophagy
1S-S4p03
autothermal thermophilic aerobic diges3Ja04
tion (ATAD)
autotransporter
1Fp13
Awamori
2Hp18, 3Ha01
azoxyalkene
3Ea01

B
Bacillus
3Bp09
Bacillus cereus
2Bp05
Bacillus sp.
2Ba01, 2Ba02
Bacillus subtilis 2Ba10, 2Dp05, 2Dp12,
2Dp15, 2Ja03, 3Da01, 3Fp02,
3S-S2a04, 3S-S2a05
Bacillus subtilis 51-CS
2Ip07
bacteria
1Hp05, 2Ca07, 2Dp18,
2Ep03, 2S-S2a02, 3Aa09
bacterial adhesion
1Fp13
bacterial column
3Ja09
bacterial community
3Da04
bacterial community changes
3Ja04
bacterial conjugation
2Aa02
bacterial consortium
2Cp06
bacterial cultivation
1Hp04
bacterial diversity
2Fa08
bacterial oxidation
1Cp11
bacteriocin
1Gp04, 2Ea07,
2Ea08, 3Dp04
bacteriolysin
1Gp04
baculovirus
1S-S3p04
Barley2S-S3a04
base composition
2Aa03
batch culture
2Fa02
beer brewing
2Hp08, 3Ha09
beetle1Fp14
behavioral analysis
2S-S4p09
beni-koji
2Ea01
1Ap05
benzyloxycarbonyl groupbeta glucosidase
3Aa11
beta-1,3-glucanase
2Bp04
beta-1,3-xylan
3Bp06
beta-1,3-xylanase
3Bp06
beta-amylase
3Bp09
beta-aspartyl compound
2Ap08
beta-galactosidase
3Bp04
beta-lactamase
3Ea09
betaine
2Fp06, 3Ep09
bFGF
2Ip16
Bifidobacterium
2Dp08, 2S-S5p09,
3Da08

Bifidobacterium longum
3Ap03
bile acid
2Da02, 2Ea04, 2Ha02
biliverdin
2S-S2p02
bio jet fuel3S-S3p05
2Ga09, 2Ga10
bio-3D printerBio-based monomer
2Ca10
bio-corrosion
1Cp09
bio-imaging
1S-S5p05
3S-S3p01, 3S-S3p03
Bio-jet fuelbio-production
2Da04
Bioactive compounds
2Fp08
bioactive peptide
1Ap13
bioactivity
3Ea07, 3Ep07
biocatalysis
1A-Ka02, 2Bp08
biochemical engineering
1A-Ka03biochemistry
3Ap09
biocontainment
2Dp16
biocontrol
2Bp03
biocontrol agent
2Ba08
3Dp02
biodegradable dispersantbiodegradable plastic
1Bp15, 1Cp16
biodegradable polymer
1Bp16
biodegradation 1Bp18, 1Cp01, 1Cp02,
2Ap18, 2Dp16, 3Jp06
biodiesel fuel1Bp01, 1Bp02, 1Bp03,
1Cp17, 2Bp10, 2Cp11
bioeconomy
2S-S1p01, 2S-S1p05,
2S-S1p06, 2S-S3a05
bioenergy
1A-Gp01
bioethanol
3Aa01, 3Ha10
bioﬁlm 1Bp07, 1Cp13, 2Ep04, 2Ep13,
3Ea10, 3Ja11, 3Jp07, 3Jp09
bioﬁlm formation
1Ep05
bioﬂocculant
3Ep08
BioFoundry
2S-S1p05
biofuel cell
2Bp15, 2Bp16,
2Bp17, 2Bp18
bioimazing
2Bp06
bioinformatics
1Ep09, 3Cp02, 3Ia01,
3Ia02, 3S-S4p01
biojetfuel3S-S3p04
Biological medicine
1Gp12
2Aa09, 2Aa10
Biological tissue
Bioluminescence
1Fp11
biomass 1Bp03, 1Bp09, 1Bp13, 1Dp11,
1Fp07, 1Gp14, 2Ba11, 2Ca07, 2Cp09,
3Aa02, 3Aa03, 3Aa05, 3S-S3p02
biomaterial
2Ga12biomaterials
3S-S5a03
biomimetic membrane
1S-S3p01
biomineralization 1Ap17, 1Ep08, 2Bp05
biomolecule monitoring
3Fp04
Biopanning
2Da09
biopharmaceutical
2Gp03, 2Ja11
Biopharmaceuticals
3Gp06
biopreservation
3Dp04
1Hp16, 1S-S2p02
bioprocess
bioprocess development
3S-S1a01
bioproduction
1Hp11

bioreactor
1Hp09, 2S-S4p01
bioreﬁnery
2Ba11bioremediation 1Cp03, 2Ap18, 2Dp10
bioresources
1Bp16
1S-S3p06, 2Aa11, 2Ap02,
biosensor
2Fp03, 2S-S3p02, 3S-S3a01
biosorption
3Ja05, 3Ja11
biosynthesis
1Hp10, 2Dp18, 2Ip10,
3Ea01, 3Ea02, 3Ea05, 3Ea06,
3Jp05, 3S-S2p01, 3S-S2p05
biosynthetic gene cluster
1Gp15
biotinylation
2Jp12
biphenyl/PCB
2Dp06
black vinegar
2Ha11
blood glucose
2Ha04
Bm5 cells
3Da10
3Da10
BmNPV
Botoryococcus braunii
1Bp10
Bottom-up genetics
3Ia06
bottom-up reconstruction
3Ap08
Brachypodium distachyon
1Ep14
brain function improvement
2Ha09
branched-chain amino acids 3S-S3a01
branched-chain polyamine
3Ap05
breeding
2Hp04
BRET
1Fp10
Brevibacillus
3Bp02
brewing
2Hp07
brownian motion
2Fp03
butanol
3Ip07
butanol production
3Ip06

C
13C-metabolic ﬂux analysis
1Ip09
C-terminal
2Ap10
C1 assimilation pathway
2Dp14
Caco-2 cells
2Ea10, 3Hp02
Caenorhabditis elegans
2S-S4p08,
2S-S4p09, 3Ep06
caﬀeic acid2Cp09
cancer biomarker
2Jp11
cancer cell
2Gp16, 2S-S3p01
cancer cells
2Ga10
cancer diagnosis
2Fp01
cancer stem cell
2Gp13
Candida albicans
2Ip15
Candida glabrata
3Ep06
capillary vessels
2Ga04
carbon dioxide
1Dp16
carbon source
2Ja03
carboxylation
2Bp12
carotenoid
1Gp18
carotenoids
2Ja02
carrageenan
3Bp07
carrageenase
3Bp07
carrier
2S-S4p02
caspase2Ip14
catalisis
1Ap08
catalytic domains
3Bp02

313

cationic peptides
3Dp03
cationic radical initiator
3Ga11
CDR
2Jp09
cell
1Jp10, 3Hp05
cell culture
2Ga07, 3Hp04
cell cycle
3Da11cell detachment
2Ga02
cell diﬀerentiation
1S-S5p01
cell engineering
3Gp09
cell factory
2S-S2p03
cell growth factor
3Hp04
cell lysis activity
3Ja04
cell manufacturability
1A-Ka03cell membrane
2Da06, 2S-S5p01,
3Dp03, 3Ga01
cell morphology 2Da11, 2Gp10, 2Gp13,
3Fp02, 3Ia08
cell penetrating peptide
2Ip18
cell self-aggregation technology (CAT)
2Ga03, 2Ga04
cell surface display
3Aa06
cell wall
3Aa06
cell-cell connection
2Da11cell-selective peptide
2Ga12cell-selective peptides
3Ga09
cell-substrate connection
2Da11cellomics
2S-S4p08
1Fp07, 1Gp14, 3Aa06,
cellulase
3Aa07, 3Aa11
cellulose
1Ap14, 2Ba06, 2Cp03
cellulose membrane
1Dp17
central carbon metabolism
1Ip09
central metabolism
1Ip07
centrifugal-assisted thermal convection
PCR
2S-S3p04
ceramide
1S-S4p08
cerebroside
1S-S4p07
CFD simulation
1Hp08
chaperonin
2Jp05
characterization
2Ap09, 3Ap01
cheese2Fa08
2Jp02
chemical modiﬁcation
chemoenzymatic synthesis
2Ap15
chicken
3Gp04
Chinese hamster lung cells
2Da12Chinese hamster ovary
2Ip03, 3Gp07
Chinese hamster ovary cells
1Hp15,
2Da12
chiral alcohols
1A-Ka02chiral epoxides
1A-Ka02chiral separation
2Fa03
chitin1Fp14, 2Cp06
chitinase
2Bp04, 2Dp01, 2Dp02
chitosan
3Ep08
CHK cells
3Gp06
Chlamydomonas
1Bp01
chlorophyll
3S-S1a03
chloroplast
2S-S3a01
CHO
3Gp08

CHO cell
1Hp16, 2Gp01
CHO cells
3Gp01, 3Gp09
cholesterol
2Ea04, 2Ea05
Chomatogrphy
1Fp16
2S-S5p07
Chondroitin sulfate
chrolide channel
2Gp16
chrolide ion
2Gp16
chromosomal translocation
2Da12
Chronological lifespan3Ep05
circadian cycle
3Da11
circular economy
2S-S1p06
Circulating tumor cell
1Jp05
citrate carrier protein CitT
2Ca08
citric acid
1Gp16, 3Ha05
Citrobacter3Ep08
citrus peel
2Ba07
cleavage sites
1Ep09
click chemistry
2Ip12
cloning
2Aa05, 2Ap09, 3Ap01
closed culture process
3Hp08
closed system
1S-S5p02
Clostridium beijerinckii
2Cp01
Clostridium cellulovorans
2Cp01, 2Cp02
Clostridium saccharoperbutylacetonicum
3Ip06
co-culture
2Ca11, 3S-S1a04
2Cp16
CO2 ﬁxation
CO2 reduction
3S-S3p01, 3S-S3p05
coalescence
3Hp07
cobalamin
1Ap15
Coccomyxa
1Gp11
cocoa bean
3Fa04
cocoa cake
3Fa04
coculture
1Hp09, 1Hp11, 1Jp07,
2S-S2a03, 3Da05, 3Ga08, 3Hp02
codon usage
2Aa12
coenzyme Q
2S-S5p05
coexistence
3Ja01, 3Ja03
coﬀee grounds
2Ba04, 3Fa05
coherent anti-stokes Raman spectroscopy
3Fp04
cold-adapted microorganism
1Fp03
collagen
1Jp10, 2Ha08, 3Ga08
collagen tube
2Ga07
collapse
3Hp07
Comamonas testosteroni R2
3Ja01
Commensal bacterium
1Bp10
competent
3S-S2a05
1Gp08, 2Cp13, 3Da03
compostcomposting
2Ba06
comprehensive analysis
1Ep10
computational ﬂuid dynamics
1Dp08
conjugal DNA transfer
3S-S2a03
conjugation
2Dp11, 3S-S2a01,
3S-S2a04
conjugation transfer
3S-S2a05
conjugton
3S-S2a02
1Fp09
consensus protein design

contraction
1S-S5p04
controlled fermentation
2Cp08
correlation analysis
2Fa08
Corynebacterium glutamicum
1Ep03,
2Aa07, 2Aa08, 2Ca04, 2Ja08,
2Ja09, 2Ja10, 2S-S2p02, 3S-S3p05
corynephage
2Aa07, 2Aa08
cosmetics
3Da04
Crabtree eﬀect
2Fa02
craft beer
1S-S1p02
Cre/LoxP system
3Gp01
CRISPR/Cas9
1Bp05, 3Ba09, 3Gp03
CRISPR/Cas9 system
1Gp16
Crneal cell
3Ga01
Crohnʼs disease
2Fa07
cross-linking
1Fp01, 3Dp02
cryo-electron microscopy
1Ap09
Cryptococcus diffluens
1Gp09
crystal structure
2Ap01, 2Ap03
crystallographic study
3S-S3a04
cultivation
1Dp06, 2Da01
culture3Hp06
culture system
1Hp07
culture-plug
1Dp16
cuticular proteins
1Fp14
cutinase
1Fp04
cyanide ion
2Ap18
cyanobacteria 1Dp12, 2Fa01, 2S-S4p06,
3Ap09, 3Ea10, 3Ia05
cyber space
3S-S5a01
cyclic ethers
3Jp06
cyclic peptide
2Ip17
cycloheximide
2Hp02
cystathionine beta-lyase
3Ap03
cysteine
1Jp06
cysteine biosynthesis
2Bp13
cytochrome P450 1Cp03, 3Ep01, 3Ep03
cytokine
3S-S1a02
cytotoxicity
3Dp05

D
3D culture
2Ga04, 2Ga06
3D image analysis
2Ga09
3D tissue
2Ga10
2Fa03, 2Ha11, 3Ea08
D-amino acidD-amino acid-containing dipeptide
2Ap15
D-cycloserine
2Dp07
D-Dopachrome tautomerase
2Jp17
D-lactic acid1Dp11
D-peptide
3Ea09
Daphnia magna
2Aa11
data mining
3S-S3a05
data science
2S-S3a04
database
2Ha12
1Ap06, 1Cp05, 1Gp10
decarboxylase
deep learning
1S-S5p05
deep-sea
3Fa02
deep-sea sediment
2Ip07

314

defatted-rice bran
2Ba05
defensin
2Ip14, 2Ip15
deﬂuorination
1Ap15
degradation
1Ap03, 1Cp16
dehalogenation
1Ap15
delivery system
2Jp05
deltarhodopsin
3Ba02
dendritic cells
2Fp10
denitriﬁcation
1Cp15, 3Ja09
Descriptor
3Ia10
detection
2Dp17, 2Fp15
DHA
1Bp04
diagnostic
1S-S3p02
diatom
1Bp05, 1Ep08
diet
1S-S4p09
dietary ﬁber
1S-S4p10
dietary habits
1S-S4p11
diﬀerent spectral light
3Ia05
diﬀerentiation
1Jp04
Diﬀerentiation potential
3Hp09
3,4-dihydroxybenzoic acid
1Ap04
dimethy trisulﬁde2Hp11
dimethyl trisulﬁde
2Hp12
diol end group
1Gp05
1,4-dioxane
3Jp06
dioxygenase
1Cp05
dipeptide
1S-S4p02, 2Ap07
direct electron transfer
2Bp15
direct RNA sequencing
3S-S4p02
directed evolution
1Fp11, 2S-S5a01,
3Ba11
disinfection
1Cp12
disparity mutagenesis
1Ep07
dispersed motif-like sequence
1Fp09
dissolved oxygen
1Ip10
disulﬁde bond2Ip18
disulﬁde isomerase
2Gp02
DltA
2Ap15
DNA
3Ia07
DNA immunization
3Cp01
DO-stat
1Dp13, 1Dp14
Doburoku
2Ha07
domestic animal infectious
3Dp07
double emulsion
2Ip04
Dps
3Ip05
droplet microﬂuidics
1Hp05
droplet microﬂuidics,
1Hp04
drug delivery system
1Fp02, 2Ip04,
2Ip12, 2Ip13, 3Da09,
3Ga01, 3Ga02, 3Ga06
drug resistance
3Ep04
Drug screening
2Gp11, 2Gp12
drug screening model
2Ga06
DsbC
2Gp04
DT40 cells
2Gp08, 2Gp09
duckweed
1Bp13
dye-decolorizing peroxidase
2Dp06
dye-linked dehydrogenase
3Ap04
dynamic ﬂuid environment
3Hp06

dynamic kinetic resolution
dynamic metabolic model

1Fp08
2S-S4p06

E
Early growth
1Ep16
Earthworm
1Gp12
ectoine hydroxylase
2Ap14
ectosymbiotic fungi
2Bp01
eﬃcient recovery
2Da03
egg
2Ha05, 2Ha06
Eggshell membrane
1Ap13
Eikenella corrodens
2Ep04
Eisenia sp.
1Gp12
elastase
1Ap13
elderly
1S-S4p11
electro-fermentation
2Ja04
electrochemical
2Fp15, 2S-S3p01
electrochemical cultivation
1A-Ep01,
1Dp09, 3Jp03
electrochemically active bacteria 3Fp03
electron donor
1Cp09
electron transfer system
1Bp11electrosymbiosis
3Jp01
ELISA
2Fp06
emission free process
3S-S1a02
Emticicia sp.
1Bp09
emulsion
1Hp06
emulson
2S-S4p02
encapsulation
2Jp04
Encapsulin
1Ap16
Endocytosis
3Da09
endophyte
2Ba08
endoscopy
3S-S5a04
endothelial cell
3Ga08
endothlial cell
2Ea06
endotoxin
2Da01, 2Da02
energy metabolism
2S-S2p03
enhanced sampling methods 3S-S3a03
Enterococcus
3Dp04
environmental bacteria 1Cp14, 1Dp09,
1Hp06, 2Fp09
enzymatic characterization
3Ea08
enzymatic cross-linking
1Fp02
enzymatic deprotection
1Ap05
enzymatic hydrolysis
3Bp07
enzyme 1Cp10, 2Bp03, 2Fp14, 2Hp07,
2S-S5a05, 2S-S5p10, 3Bp04,
3Ea02, 3Ha04
enzyme activity
2Ja05, 2Jp13,
3Ap09, 3Ia09
enzyme assay
2Ap04
enzyme maturation
2Ap05
enzyme production
1Gp14, 1Hp08,
2Ip13
enzyme puriﬁcation
1Ap03, 2Ap01
enzyme reaction 1Ap07, 3Ea01, 3Ia01
enzyme turnover
2Ja06
epidemiology
1S-S4p10
epigenetic
2Jp10, 2S-S5p08

epimerization
3Ea06
equol
2Bp08
ergothioneine
2Fp02
Escherichia coli
1Dp07, 1Dp13,
1Hp09, 2Aa05, 2Ca02, 2Ca03,
2Ca11, 2Cp09, 2Ep02, 2Fa06,
2Fp12, 2Ip08, 2Ip09, 2S-S2p05,
2S-S5p02, 3Dp05, 3Ia04, 3Ia06,
3Ip07, 3S-S2a03
esterase
1S-S2p04
esteriﬁcation
1Bp08
ethanol
1A-Ka04, 2Cp14, 3Aa02
ethanol fermentation 1A-Gp01, 2Cp07,
2Ep08, 3Aa03, 3Aa07
ethanol production
2Ca07,
3Aa04, 3Aa05
ethanol tolerance
3Ha11
ether bond
1Bp18
ethyl alpha-D-glucoside
2Ha07
ethyl caproate
2Hp12
Ethyl caproate production
2Hp17
Euglea graclis
1Bp09
euglena
1Bp11, 3S-S3p02
Euglena gracilis
2S-S5p03
Eukaryote
1Ip03
eukaryotic cell free protein expression
3S-S1a02
europium
3Ja05
evolution
1S-S2p04
evolutionary engeneering
3Ap02
exosome
2Da08, 2S-S3p05
exosomes
2Fp01
Expansion culture
3Hp09
explosive detection
2Ip11
expression
2Ap09, 2Ep14
expression system
2Da04, 2Jp04
extracellular matrix
1Jp03
Extrachromosomal circular DNA 3Ba09

F
far infrared
fatty acidfatty acid biosynthesis
Fe2+-chelate
fecal sample
fed-batch culture

2S-S3a06
1Ip04, 2Ep06
3S-S2p04
2Bp11
3Da04
1Dp13, 1Dp14,
1Hp14, 1Ip11
Fenton reaction
3Ip05
fermentation 1A-Ep01, 2Ba04, 2Cp10,
2Dp05, 2Ea01, 2Ea02,
2Ha01, 2Ha12, 2Ja02
fermented foods
2Ha12
ferric-chelate reductase
2Bp11
Ferritin like protein
1Ap16
fertilizer
2Ba09
ferulic acid
2Ap16, 2Hp15
FGFR agonist
2Ip16
ﬁber
2Jp13, 3Bp07
Fibroblast
3Ga09

315

ﬁlamentous fungi
1Hp08, 3Ep01
ﬁlm sensor
1S-S5p06
ﬁreﬂy luciferase
1Fp10, 2Bp06
Fischer-Tropsch process
3S-S3p04
FISH
2Da12
ﬁssion yeast
2S-S5p05
Fistulifera solaris
1Bp05
ﬁtness cost
2Aa01
ﬂavonol
2Bp07
ﬂavoprotein
3Ap04
Flexivirga alba ST13
1Cp10
ﬂor
3Ha08
ﬂow cytometry
1S-S3p06
ﬂuctuation
2Bp16
Fluorescence aptamer
2Ip01
ﬂuorescence spectra
1Hp16, 3Fp06
ﬂuorescent ﬁlm
1Ip10
ﬂuorescent protein 1Fp10, 1Hp09, 2Jp08
ﬂux balance analysis
3Ia05
folate2Hp10
food analysis
2Ea02, 3Fa07
food and agriculture industries 2S-S3a02
food culture
2Ha12
food function
1S-S4p06
food processing
3Fa02
force monitoring
1S-S5p06
formaldehyde
3Ja07
3Ja08
formaldehyde degradation
formaldehyde dismutase
3Ja08
FPS
2Ea05
FRAP
3Ap08
freeze tolerant
1Ep06
freeze-thaw
2Hp14
freshwater
1Cp16
FRET
1Hp05
fruit bearing
1Dp04
Fucose2Ip03
fuctional stability
3Ja02
2S-S4p08
functional cellomics
functional food
2S-S5p09
functional property
1S-S4p05
functional stability
3Ja03
fungal community
2Ep09
fungal disease
3Ep06
fungi
2Ba04
fungicide
1Cp01, 2Fp13
fungus
2Ha01
Fusarium oxysporum strain EI
2Bp01
fusion protein
2Gp04
future medicine
2S-S3p05

GG-body1Fp06, 1Hp07
G-quadruplex
2Ip01, 2Ip02
GABA
2Ja03, 3Ba10
gamma-aminobutyric acid
2S-S5p02
gamma-glutamyl compounds
2Ap11
gamma-glutamyltranspeptidase 2Ap10,
2Ap11, 2Ap12

gas fermentation
2Ca07
gasiﬁcation
3S-S3p04
GC/MS
2Ea02, 2Fa04, 3Fa05
gelatin
3Ga07
gene
1Cp10, 2Ep14, 2Fp17
2Dp02, 2Dp10
gene disruption
gene expression
1Gp13, 2Aa04,
2Aa10, 2Dp05, 2Dp08, 2Ja05,
2Ja07, 3Ba01, 3Ba10
gene expression analysis 1Gp14, 2Aa11,
3Ha09, 3Ja07
gene knockout
3Gp08, 3S-S2a03
gene transfer
2Dp09, 2S-S2a02
genetic diversity
2Ep03
genetic engineering
1Bp06
genetic network
3S-S2a03
genetic switches
3Ba11
genome2Aa09, 2Ep14, 2Hp18,
3Aa02, 3S-S4p02
genome editing 1Gp18, 2Cp09, 3Ha02
genome engineering
2Dp18, 3Ba06,
3S-S2a05
genome integration
2Dp18
Genome mining
2Dp07, 3Ea03,
3Ea07, 3Ea08
genome stability
2Dp10
genomic analysis
1Ep07
genomic DNA
3S-S2a04
gentiobiose
3Aa11
Geobacillus
2Aa04
Geobacillus stearothermophilus 1Ap09
germination
2Dp15
germline
3Gp04
GFP
1Cp07
GID complex
2Hp03
Glucose
1Dp02, 2Dp12
3Fp04
glucose concentration
glucose consumption
2Ja05, 2Ja07,
2Ja08
glucosylceramide
1S-S4p08
glucuronoxylanase
3Bp05
glutamate decarboxylase (GAD) 3Ba10
glutamate fermentation
2Ja09
glutamic acid
2S-S5p02
glutathione
2Ca02, 3Aa08
Glycan2Ip03
glycerol
1Cp17, 2Cp07, 3Ba06
glycine2Ap03
glycolysis
2Ca01, 2Ca05,
2Ja07, 2S-S2p05
glycosaminoglycan
2Jp16
glycoside hydrolase
3Ap07
glycosylceramide
2Ha02
gold colloid
2Ip10
goldﬁsh
2Gp07
1Hp15, 3Da09
Golgi apparatus
Gordonia terrae
2Ja02
GPCR
3Cp01
Gram-negative
1Cp12

gram-negative bacteria
2Da01
Gram-positive
1Cp12
Green nanotechnology
3Hp03
GroEL/GroES
2Jp05
ground water
1Cp11
growth
1Gp08, 2Ca01, 3Dp05, 3Fp02
growth control
3Jp07
growth factor
3Ga02
growth inhibition
1S-S4p02
growth promotion
1Bp09, 1Bp10
growth stimulation
1Dp01, 1Dp09
gSELEX-seq
3Ia03
GUS
3Ha03
GUS reporter gene
1Gp11
gut
1A-Ep01, 1S-S4p09
gut function
3Fa03
gut microbes
1Hp04
gut microbiota
1S-S2p02, 1S-S4p11,
2Cp13, 2S-S5p10

H
1Dp10,
1Hp13, 3Da11
haemolymph
1Fp16
Hair
3Ia10
hair follicle germ
2Ga05
hair regeneration
2Ga05
halophile
3Ap06
haploid3Ia07
harvest2Ga01
hazekomi
3Ha03
heat shock protein
3Gp02
heat tolerance
3Ha11
heat treatment
1Hp12
Heavy chain antibody
2Gp01
heavy metal
3Ja11, 3Jp04
hemicellulose
3Bp04
hemoglobin
2S-S4p03
Heparan sulfate
2S-S5p07
hepatocyte
2Ga08
heterogeneity
3Ja03
Heterologous expression
3Ep02
heterologous production 2Bp14, 2Dp07,
3S-S2p03
heterotrophic
1Hp13
Hevea brasiliensis
2Bp09
hexadecylpyridinium
2Da03
hexavalent chromium
1Cp10high copy number plasmid
2Aa08
High sensitivity
2Fp06
high temperature
2Ja05, 2Ja06, 2Ja08
high temperature resistance
3Ba08
high-throughput screening
1S-S3p05,
2Gp11, 2Gp12
high-throuput
2Fa03
higher education
2S-S1p04
HILIC
2Fa05
hineka2Hp11, 2Hp12
hiPSCs expansion
3Hp08
Haematococcus pluvialis

316

histone
3Ba07
Histone methylation
3Hp09
homo poly-amino acid3Ea07
homologous recombination
2Dp03,
3Ia06, 3S-S2p03
hop
2Hp07, 2Hp08
Horizontal Gene Transfer
2Aa02,
3S-S2a01
Horornis diphone
3Da04
host cell proteins
3Gp08
host range
2Aa02, 2Aa03
house laundry
2Ep13
Hsp104
2Hp14
Human glucocerebrosidase
1Ep13
human IgG
2Da07
human induced pluripotent stem cell
1Jp03
Human induced pluripotent stem cells
3Hp07, 3Hp09
human iPS cell
2Ga08
human iPS cells
2Ip16
hybrid enzyme
1Ap03
hybridoma technology
3Cp01
hydration
3Ep09hydrogel
3Ga04, 3Ga07
hydrogen
3Jp03
hydrogen bond network
1Ap08
hydrogen peroxide
3Ga05, 3Ip03
hydrogen-oxidizing bacteria
2Cp16hydrolysis reaction
2Bp03
hydrophobin
1Fp04, 1Fp05
hydroxyapatite
2Da10
4-hydroxybenzoate
2Ca10hydroxyhexylitaconic acids
3Ep07hydroxylation
2Bp08
hyperphosphatemia
3Da07
hyperthermophile
2Dp01, 2Dp02
hyperthermophilic archaeon
1Ep04,
2Bp16
hypothetical proteins
3Bp08
hypoxia
1Fp06, 1Hp07

I
IBE fermentation
2Cp01
IgA
2Ea11
IgA-enhancing eﬀect
2Ip07
IgG
1Hp17, 3Gp07
IgNAR
2Gp01
IL-8
2Ea10
illumination condition
2Cp04
Image analysis
2Gp10
image processing
2Fp03
imaging
3S-S3a01
immobilization 1Cp07, 2Ap12, 2Da08
immobilized bacteria
1Cp08
Immunochromatography
2Da09
immunoglobulin A
2Ea12
immunoliposome
3Fp07
immunostimulation
2Ea11

immunosuppression
2Gp06
immunotherapy
2Jp10
impedance
2S-S3p01
in silico artiﬁcial protein design
3S-S3a02
in silico classiﬁcation and screening
3S-S3a05
in silico classiﬁcation/screening 1Fp09
in silico protein sequence analysis
1Fp09
in vitro analysis
3Ea05
in vitro reconstitution
3S-S2p02
in vitro selection
3S-S5a02
in vivo model
3Fa03
indigenous skin bacteria
3Da05
indigo
2Aa05
Indonesian shrimp paste
2Cp08
industry-academia collaboration
1A-Ka01
infectious disease
2S-S4p05
inﬂammation
1S-S4p07, 2Ea09
inﬂuenza vaccine
3Gp03
Inﬂuenza virus
2Da09
Inﬂuenza Virus detection
3Fp05
informatics
3S-S4p03
inhibitor
1Cp15, 1Ep15, 3Ba03
injured microbes
2Dp15
insulin
2Ha04
interactive interface
3S-S5a01
interfacial culture
1Gp03
intermediate ﬁlament
2Gp14, 2Gp15
interspecies electron transfer
3Jp01
interspeciﬁc interaction
3Ja01
intestinal absorption
1S-S4p06
intestinal bacteria
1S-S4p08, 2Ha02
intestinal microbiome
2S-S5p09
Intestinal microﬂora
3S-S4p04
intrabody
2Jp08
intracellular glutamate
3Jp02
intravenous immunoglobulin
2Gp06
intron3Ba05
intron-mediated enhancement
3Ba05
invasion
2Gp16
ion channel
1S-S3p01
ionic crosslinking
3Ga04
ionic liquid pretreatment
2Ba11
iPS cell
1Jp07, 1Jp09, 3Ga03
iron
1Cp09
isolation
1S-S2p01, 3Ja06
isoprenol
2Ca11
itaconic acid
1Hp12
ITO electrode
3Hp01

J
Japanese sake yeast
Juvenile Hormone

2Hp17
2Aa11

K
Katsuo bonito

2Ep10

katsuobushi bonito
2Ep09
Kidney3Gp06
kinetic parameter
3Ep09
kinetics
1Fp12, 3Bp03, 3Ia04
kinetics on aggregate behaviors 3Hp07
Koji
2Ha04, 2Ha06
Koji making
1A-Ip01, 2Ha01, 2Ha05
Komagataeibacter europaeus
2Da04
Kynureninase
2Da10

L
L-amino acid deaminase
2Ap17
L-amino acid esterase
2Ap07
L-amino acids oxidase
1Fp08
l-asparaginase
3Ap01
L-galactonic acid1Gp09
L-glutamate
3Ia04
L-glutamate oxidase
2Ap02
L-lactic acid
3Ap04
L-methionine decarboxylase
2Ap01
L-threonine 3-dehydrogenase
2Ap13
lactate-utilizing bacterium
2Cp13
lactic acid
2Ja06, 2S-S2p04
lactic acid bacteria
1Dp11, 1Gp04,
2Aa06, 2Ea04, 2Ea07, 2Ea08, 2Ea11,
2Ea12, 2Ha11, 3Ap01, 3Da08, 3Dp04
lactic acid bacterial diversity
2Ep06
Lactobacillus
3Da03, 3Fa01
Lactobacillus casei
3Da07
Lactobacillus plantarum
2Ea07
Lactococcus lactis
1Ip11, 2Ea08
lactonase
2Dp04
lactose2S-S2p01
Lactuca sativa
1Dp05, 1Dp06
laminarioligosaccharide
3Bp03
Langmuir monolayer
1Fp05
lanthanide
2Ep05
lanthanides
1Gp06
lawn
3Da02
lawn ﬁeld
3Da01
LC-MS analysis
1Gp15
LC/ESI-MS/MS
2Fp02
LC/MS
2Fa03
LEA peptide
2Ip09
leaf cross section
2Fp13
LED
2S-S3a02
lettuce
1Dp06
leucine dehydrogenase
1Ap09
Leuconostoc mesemteroides
1Ip10
levulinic acid
2Ca09
library
3Cp04
life-course multi-omics data 2S-S3a04
lifespan
1S-S4p01, 2S-S5p08
light
3Aa08
lignin1Bp18, 2Ca10, 2Dp06
lignin degradation
1Bp17
lignocellulosic materials
3Aa04
Limulus amebocyte lysate
2Da01,
2Da02

317

linear plasmid
2Dp11
linoleic acid
2Ba05
lipase2Ep10
lipid
1Bp12, 2Ip06, 3Ia11, 3Ip01
lipid accumulation
1Bp07
lipid binding
2Ip14
Lipid production
1Ip03
lipid vesicle
2Ip04, 2Ip06
lipid-protein conjugate
1Fp02
Lipomyces starkeyi
1Ip05, 1Ip06
lipopolysaccaride
1Dp01
liposime-inclusion antigen
2Gp07
liposome
1Fp02, 3Ga01
liposome immunoassay
3Fp07
liquid medium
1Hp01
liquid repellant
1Cp13
Liquid-ordered domain
2Ip05
literature search support tools
3Ia09
Litopenaeus vannamei
3Fa08, 3Fa09
liver
2Ha01
liver cell
2Ga07
Livestock animal
3Fa03
living cell
2S-S4p07
localizasion analysis
3Fp06
long term evolution experiment 2Ep02
long-chain fatty acids
1Ip06
long-chain polyamine
2Bp05
low residual pesticide
2S-S3a03
low shear and modeled-microgravity
3Da08
low temperature
1Cp06
low-carbon society
2Bp12
LP-PLA2
1Ap12
LSPR
3Fp05
luciferase
3Ba05
lymphedema
2S-S3a06
lysine production
2Ja10
Lyso PAF
1Ap12
lysoplasmalogen
1Ap12

M
machine learning
2Fp05, 2Hp09,
2S-S4p09, 2S-S5a03, 3Ia01
macroalga
2Ea09, 2Ep03
magnesium
2S-S3p03
magnetotactic bacteria
2Da05
major hitocompatibility complex 2Jp12
malate dehydrogenase
1Ap02
MALDI-imaging mass spectrometry
2Ea01
malic acid2Hp03, 2Hp04
malodor
2Ep13
maltose promoter
2Aa04
mammalian cell 2Jp06, 3Ba07, 3Gp05
marine environment
2Ea09, 2Ep03
marine microorganisms
1Ip03
mass microscope
2Fp13
mass spectrometry imaging
2Fp14,
3Ha03, 3Jp09

material cycle
2Ba09
Materials informatics
2Fp05
MCF-7
1Ip08
MCR-ALS
2Fp08
MEA chip
3Ga03
mechanism
2Ea09
mechanobiology
1S-S5p04
Megasphaera elsdnii
2Cp13
membrane emulsiﬁcation
2S-S4p03
membrane lipids
2Da06
membrane localization
2Dp01
membrane modiﬁcation
2Da05
membrane permeability
1Hp12
membrane potential
2Ip06
membrane protein
1Cp08
membrane vesicle
2Ea11
membrane vesicles
2Ea12, 2Ip07
MERS
3Da10
mesenchymal stem cell 1Jp04, 2Ga01,
2Gp10
Mesothelial cell
3Ga09
metabolic adaptation
1Ip08
metabolic analysis 1Bp02, 1Ip11, 2Cp11,
2Fa04, 2Fa06, 3Fa07
metabolic engineering
1Bp15, 1Ip04,
2Ca04, 2Ca05, 2S-S4p06, 3S-S3p02
metabolic ﬂux
2Ca05, 2Ja07
metabolic ﬂux analysis 2Fa01, 2S-S4p06
metabolic network
3Ja02
metabolic pathway modiﬁcation
1S-S4p05
metabolic proﬁling
3Fa04
metabolic response
2Ja08
metabolic switch
2Ca04
metabolism
2Ca01, 2Ga08,
3Ap06, 3Ja07
metabolite
2Fp14
metabolite production
1Dp05
metabolite proﬁling
1Ep05
metabolome
2Hp09
metabolomics
1Ep06, 2Ea02, 2Ea03,
2Fa02, 2Fa05, 2S-S4p07,
3Fa06, 3Fa08, 3Fa09
metagenome
1A-Ka02, 2Fa08
Metagenome analysis
2Ep11
metal adsorption
3Ja10
Metal ions
2Ep02
metal recovery
3Ja05
metal-binding peptide
1Cp08
methane fermentation 1A-Gp01, 2Cp02,
2Cp03, 2Cp05, 2Cp15, 3Jp03
methanogen
2Cp02
methanol2Dp14
methionine
2Ca12
methionine cycle
2Hp10
Methotrexate
2Jp17
methoxysalicylic acid
2Bp12
Methylobacterium
2Ep07
Methylobacterium sp. FD1
3Ja08

Methylorubrum extorquens
2Dp14
methylotroph
2Dp13, 2Dp14, 2Ep05
methylotrophic yeast
3Ba01
methyltransferase
2Bp07, 3Ha05
mevalonate
2Ca11
Meyerozyma guilliermondii TY-89
1Hp03
micobiome design
2S-S2a03
micro device
1Jp08
micro vascular structure
2Ga09
microalgae
1Bp02, 1Bp06, 1Bp12,
2Bp10, 2S-S3a02, 3Da11,
3Ja05, 3Ja06, 3S-S3p03
microbe2Fa07
microbial awakening
1S-S2p01
microbial community
2Cp03, 2Cp05,
2S-S2a02, 2S-S2a03,
2S-S2a04, 3Ja06, 3Jp02, 3Jp03
microbial consortia 1A-Ep01, 2S-S2a01,
2S-S2a03
microbial consortium 1S-S2p04, 2Dp17
microbial cultivation
1Hp01
microbial dark matter
1Dp15, 3Da06,
3Hp01
microbial diversity
2S-S2a04
microbial dormancy
1S-S2p01
microbial ﬂora
1S-S4p09, 1S-S4p10,
3Fa03, 3Hp02
microbial fuel cell
2Ba01, 3Jp02
microbial inoculant
2Ba02
microbial interaction
1Hp02
microbiota
1S-S2p02
microcarrier
2Ga01
microdevice
1Jp09, 3Ga03
microﬁber
3Ep08
microﬂuidic device
1A-Jp01, 2Fp09,
2Ip04
microﬂuidics
2S-S3p04
microgravity
1S-S5p01
microorganisms
3Aa09
Microphysiological systems
1A-Jp01
microscopy
3Ia11
microsystem
2S-S3p05
microtubules
1S-S3p03
Microwave
1Dp02, 3Da06
milk
2Fp16
mineralization
3Ja10
minicircle DNA vector
3Gp01
miPS-LLCcm cells
2Gp13
mitochondria
1Bp11, 2Hp05,
2S-S5p04, 3Ia07
mix-mode chromatography
2Da10
mixed proteomics
2S-S4p05
mixotrophic
1Hp13
MLST
3Fa01
Model robustness
2Gp10
modeling
1Dp08
molecular crowding
3Ap08
molecular dynamics simulation

318

3S-S3a03
molecular imprinting
2Fp01
molecular motor
3Ap08
molecular recognition 1Fp15, 3S-S5a03
Monascus spp.
2Ha03
monoclonal antibody 1S-S3p05, 2Gp03,
3Cp06
monocyte
3Hp06
monomer supplier
3Ip09
monooxygenase
2Bp08
monosaccharide
1Ap10
Monostroma latissimum
1Bp14
Morphological proﬁling 2Gp11, 2Gp12
mRNA
1Ep12, 2Dp17, 3Fa01
mRNA degradation
1Ep09, 1Ep10,
1Ep11mRNA secondary structure
2Aa12
MRSA
2Fp03
muiltistress tolerance
3Ip03
multicopper oxidase
2Bp15, 2Bp18
multimodal chromatography
1Hp18
municipal solid waste
1A-Gp01
muscle protein
2Cp12
mushroom
2Ep04
mussel adhesive proteins
1Cp07
mutagenesis
1Fp12, 2Jp01, 3Cp02
mutant2Hp11
mycotoxin
1Gp15

NN-succinyl chitosan
3Ga04
N2O
1Cp15
NAD(P)H
2S-S2p05, 2S-S5p01
NAD+/NADH
2Fa02
nagilactone E
3Ep04
nano particle
3Ga05
nano-bio sensor
2Fp15
nanobody
3Cp04, 3Cp05
nanocapsule
2Jp02
nanocarrier
2Jp05
nanodroplet
3Ga06
nanoﬁbril
3Jp07
nanogel emulsion
3Ga02
nanoluc
1S-S3p06
nanoneedle
2Gp15
nanoparticle
3Jp05
Nanoparticles
3Da10
nanopore
1S-S3p01
natural product
3S-S2p03
near-infrared light imager
2Ga11
neonicotinoid
1Cp03
nestin2Gp14, 2Gp15
neural stem cell
3Ga08
neuromuscular junction 1Jp07, 1Jp09,
3Ga03
neutron crystallography
1Ap08
new compounds
1S-S2p03
next generation sake rice
2Hp09
next-generation metabolome analysis

2Fa05
NGR peptide
2Ip17
NGS analysis
2Hp04
Nicotiana benthamiana
1Ep13
nit-4
1Bp17
nitriﬁcation
2S-S2a01
nitrifying bacteria
2S-S2a01
nitrilase
2Ap18
nitrile hydratase
1Ap08
nitrogen ﬁxation
1Cp14
Nitrogen-replete
1Bp01
nlpI
2Ip08
NMR
2Fp04
NMR metabolome
2Fa07
nocodazole
2Hp01
noise reduction
1S-S5p05
non-airﬂow box
1A-Ip01
non-antibody molecular scaﬀold
2S-S5a01
non-climacteric
3Fa06
non-epithelial cancer
1Ip09
non-thermal eﬀect
3Da06
nucleoside
3Ap06
nutrient feeding
3S-S1a01
nutrient source
1Bp07

O
object recognition
1S-S5p05
Ochrobactrum sp
2Ca09
Odorant receptors
2Fp07
Ogataea minuta
3Ba01
oil
3Ia11
oil degrading bacteria
1Cp06
oleaginous yeast
1Ip05, 2Ba05
oleaginous yeasts
1Ip06
oleic acid
2Ba05
Olfactory mucosa
2Fp07
oligodeoxynucleotides
2Ip02
oligoester
1Gp05
oligomer
2Jp14
oligosaccharide
2Ja01, 2S-S2p01
oligotroph
2Ep05, 3Aa10
Olyset Net
2S-S1p02
online monitoring
3S-S1a01
optogenetics
2S-S2p05, 2S-S4p08
Organ-on-a-chip
1A-Jp01
organic acid2Hp06
organic circuits
2S-S3p02
organic compounds
1Bp13
organic solvent
1Ap11
organophosphorus compounds
1Cp02
orientated immobilization
2Bp16
orientation
2Bp15
origin3Fa04
Oryza sativa
3Ia03
osmotic response
3Ip01
osteogenic diﬀerentiation
2S-S3p03
outer membrane vesicles
2Ip08
Overexpression
1Ap16

oxaloacetate
2Ja10oxidase
2Ap03
oxidation
2S-S5p01
oxidative stress
2Ea06, 3Ip02
oxidoreductase
2Bp172-oxoglutarate
2Ap142-oxoglutaric acid
2Ca09
oxygen2Ca04, 2S-S4p02
oxygen radical treatment
3Aa01
oxygen sensing
2S-S4p01
Oxygenation
2Bp11, 2S-S4p03
ozone
3Dp05

P
P/Ag/Ag2O/Ag3PO4/TiO2 photocatalyst
1Cp12
P450
3Ea02
paper devices
1S-S3p02
Parachlorella
1Bp12
Paris Agreement
2S-S1p05
pathogen
2Fp17, 3S-S4p02
PCR
2Fp17
PCR-DGGE
2Ba10, 2Ep09,
3Da06, 3Hp01
PDI
2Gp04
pear
3Ep05
Penicillium citrinum
2Bp14
pentose phosphate pathway
2Ca05
peptidase
1Fp10, 2Ep10, 3Ea09
peptide 1S-S3p03, 2Dp09, 2Ip10, 2Ip11,
2Ip13, 2Ip16, 2Jp07, 3S-S4p03
peptide array
2Fp16, 2Ip17, 2Ip18
peptide barcoding
3Cp05
peptide screening
2Ip17, 2Ip18
peptide tag
2Gp05
perﬂuorocarbon
2S-S4p02
perﬂuorocarbon emulsion
2S-S4p04
Perilla2Jp15
periodontopathogenic bacteria
2Ep04
peritoneal adhesion
3Ga04
PET
1S-S2p04
peyers patches
2Fp10
PFC
2S-S4p03
pH
1Dp15
PHA
1Bp16
PHA synthase
3Ip08
PhaC Box
3Ip08
phage
2Ep12
phage display
2Bp06, 2Gp07,
2S-S5a01, 3Cp03
Phanerochaete chrysosporium
1Ap14
PHB
1Bp16
PHBH
2Cp16
phenolic acid decarboxylase
3Ha01
phenome2S-S3a04
Phenotypic assay
2Gp12
phosphate
2Ba12, 2Ca06
phosphate accumulation
3Da07
phosphatidylcholine
2Da05

319

phospholipase D
1Ap12
phosphorylase
3Bp03
phosphorylation
3Ja10
photocatalytic reactor
3Jp08
photosensitizer
1Jp04
photosynthesis
2S-S3a01, 3S-S1a03
photosynthetic bacteria 1Dp01, 2Dp09,
3Ia05
photosystem II
3S-S1a03
phthalate derivatives
1Ap06
phylloepiphytic bacteria
2Ep07phylogenetic tree
2Hp13
Physical property
3Ia10
physicochemical property
2Fp05,
3S-S4p03
physicochemical screening
1S-S2p03
physiologically active substance 1Bp06
phytochemicals
2S-S3a06
Pichia membranifaciens
3Ba03
Pichia pastoris
3Ba04
pig
2Cp12
pigment
1Bp02
plant
1Dp01, 2Fp13
Plant activator
1Ep14
plant growth
2Ba09
plant growth promoting activity 1Dp17
plant growth promoting bacteria 1Dp17
plant health monitoring
3Fp03
plant immunity
2Ba08
plant microbial fuel cell
3Fp03
plant mRNA
1Ep10, 1Ep11
plant pathogen control
2S-S3a03
plant rhizosphere
1Cp04
Plant-made pharmaceuticals
1Ep13
plasma2Fa04
plasmid 2Aa01, 2Aa03, 2Aa04, 2Aa05,
2S-S2a02, 3Ba07, 3S-S2a02
Plasmonics
3S-S5a04
plastic ﬂuid
3Hp08
plastic surface
1Cp13
poly(amino acid)2Dp05
poly(epsilon-L-lysine)
3Dp02, 3Dp03
poly-gamma-glutamate 2Da03, 3Ea06
polyamine
1Ep04, 1Ep05, 2Jp16,
2S-S5p06, 2S-S5p08, 3Ea10, 3Ga10
Polyamines
2S-S5p07, 2S-S5p10
polycation
2Ip12
polyhydroxyalkanoate 1Bp15, 1Gp05,
1Hp10, 2Dp13, 2Ja04, 3Ip08, 3Ip09
polyion complex
2Da03
polyisoprene
2Bp09
3S-S2p04
polyketide synthase
Polymer
2Fp04
polymyxin B
2Da02
polyphenol
2S-S3a02
polysaccharide
2Ga12polysaccharide-degrading enzyme
3Ap07
polystyrene
3Ga11

polyunsaturated fatty acid

3Ea11,
3S-S2p04
polyvinyl alcohol
1Ap03
Porphyromonas gingivalis
1Ep05
post harvest processing
3Fa05
post-harvest quality
3Fa09
post-translation
2Jp08
Postia placenta
3Ep03
poultry manure
2Ba12
PPFMs
2Ep07
Prediction
2Fp04
predictive modeling
1Dp07
prenyl transferase
2Bp09
preservative
2Fp11
pressed sake cake
2Hp10
pretreatment
2Fa04, 3Hp01
probiotics
1S-S4p08, 2Cp12
processing
2Ea03
production
1Ip04, 3S-S3p03
production enhancer gene
3Gp09
Productivity
3Gp07
Prolamine
2Ha07
proline
1Ap01
promoter
1Ep03, 1Gp11, 2Aa07,
2Dp08, 3Ia02
1,3-propanediol
1Dp12
propeptide
1Fp01
prostaglandin
1Bp06
protease
3Fa02
1Hp17
protein A
protein adsorption
3Hp04
protein engineering
1Fp07, 2Ap03,
2Ap04, 2Bp07, 2Jp06, 2Jp09, 2Jp10,
2Jp11, 2Jp12, 2S-S5a01, 2S-S5a02,
2S-S5a03, 2S-S5a04, 2S-S5a05,
3Cp03, 3Cp04, 3S-S3a04, 3S-S3a05
protein expression
1Fp03, 1S-S3p04,
2Dp12, 2Gp05, 2Jp04
protein folding
2Gp02, 2Jp06
protein interaction
2Gp14, 2Jp13,
2S-S5a05
protein nanoparticle
2Jp02
protein supramolecule
2Jp01
proteome
1Ep08, 2Hp03
proteomics
1Ep04, 1Fp14, 2S-S4p07
Proteus vulgaris
2Ap17
protocatechuic acid
2Dp03
Protoilludene
3Ep03
protoplast
2Bp02
3S-S2p02
pseudo-natural products
Pseudomonas
2Aa01, 2Ca10, 2Dp03
Pseudomonas aeruginosa
2Ap10
Pseudomonas indica
1Ap13
Pseudomonas nitroreducens
2Ap11,
2Ap12
Pseudomonas putida
1Cp04, 3Jp09
Pseudomonas sp.
1Ap06
Pseudomonas stutzeri
2Ca12, 3Jp05
Psychroflexus torquis
3Bp06

psychrophilepulsed lighting

1Hp12, 3Bp06
1Bp14, 1Dp03,
1Dp05, 1Dp06
pulsed ligting
1Dp04
PURE system
3Ia06
puriﬁcation
1Fp16, 1Hp17, 2Da10
purine2Hp08
purine body
2Hp07
putrescine
2S-S5p09
pyrazine
2Ap13
pyridoxal-5ʼ-phosphate
2Ap01
pyrithiamine resistance
3Ha02
pyruvate carboxylase
2Ja10
pyruvate transporter
2Hp05

Q
QCM
2Fp06
Qdot
2Jp14, 2Jp15
QDs
3Fp05
quality evaluation
2Ga11
quality improvement
2Cp08
quantiﬁcation
2Fa06
quantum dots
2Ip11
quorum sensing 2Aa06, 2Dp04, 3Jp09

R
R-hydrataseracemaseradicalRalstonia eutropha

3Ip09
3Ea08
3Ga05
1Bp15, 2Cp16,
2Dp13, 3Ip08
Ralstonia eutropha H16
2Ja04
Raman microspectroscopy
2Fp08
rare events of proteins
3S-S3a03
rare sugar
2Ja01
rare-mating
3Ha11
RDS2
2Hp06
reaction mechanism
2Ap13
reactive oxygen nitrogen species
2S-S3a03
reactive oxygen species 1Jp04, 2Ba08,
3Ba08
real time PCR
3Ja07
receptor
2Da05, 3Gp05
rechargeable bio-mineral
3Jp01
reclasiﬁcation
2Ep08
recombinant Escherichia coli
1Cp02
Recombinant Protein
2Jp03
recombinant protein production 3Ba04,
3Gp09
recovery
2Ba12
red yeast rice
2Ha03
redox potential
2Bp18
reduced phosphorus compound 2Ca06
reduction
2Ca12
regeneration
3Hp05
regenerative medicine
1A-Ka03,
1S-S5p01, 2Ga03, 3Gp02
regulation
3Ea04, 3S-S2p05

320

repression of lactate
1Ip11
repulsive interaction
3Ep09
resin
1Hp18
Resistant protein
2Ha07
resistant starch
3Ha04
respiratory activity
1Ip10
respiratory chain
2S-S5p02
resveratrol
2Ea06
reward2S-S4p09
rhamnose
2Dp12
rhizobacteria
3Fp03
Rhizopus sp.
1Cp17
rho-associated protein kinase inhibitor
1Jp03
Rhodococcus
2Aa12, 2Dp06, 3Aa10
rhodopsin
2Ca02, 2S-S2p03, 3Aa08
Rhodotorula mucilaginosa
3Ja11
rhyzosphere
1S-S2p02
riboﬂavin
1Ep07
ribosome proﬁling
1Ep12
rice
1S-S4p10, 2Ep14, 2Ip15
rice husk biochar
2Ba02
rice infectious ﬁlamentous fungi 2Bp03
rice koji
3Ha03
rice malt
2Fp02
rice syrup
1Gp10
ripening
3Fa06
RNA polymerase
3Ap05
RNA production
2Aa07, 2Aa08
RNA seq
3Ha09
RNA-Seq
2Aa09, 3Ba03, 3Ia03
RNase
1Hp05
robot
3S-S1a03
RolA
1Fp04
Root culture
1Ep13
root-knot nematode
1Gp08
ROS tolerance
3Ip05
rotary shaking
1Hp03
rotation/revolution
3Hp06
rotenone
1Ip08
rubber biosynthesis
2Bp09
RubisCO1Hp10

S
16S rRNA gene sequencing analysis
3S-S4p04
S-adenosylmethionine
2Bp07
Saccharomyces cerevisiae
1Ip07,
1S-S4p03, 2Cp07, 2Cp10, 2Hp01,
2Hp02, 2Hp03, 2Hp05, 2Hp06,
2Hp10, 2Hp15, 2Hp18, 2Ja01,
2S-S2p01, 3Aa04, 3Aa07, 3Ba02,
3Ba05, 3Ba06, 3Ba08, 3Ba09, 3Ep04,
3Ep05, 3Ha10, 3Ha11, 3Ip02, 3Ip03
sake
1S-S1p03, 2Ha08, 2Hp02,
2Hp15, 2Hp16
sake yeast
1S-S4p04, 2Hp04, 2Hp06,
2Hp11, 2Hp12, 2Hp13,
2Hp16, 2S-S5p04

salinity
3Fa09
Samarium
2Ep05
Saprolegnia
3Ea11
sarcosine oxidase
1Ap01
scaﬀold
1Fp15, 3S-S5a03
scale-up
1Dp08
1Dp13, 1Dp14, 2Da08,
scFv
2Da09, 2Gp07, 3Cp06
Schizophyllan
3Dp01
Schizosaccharomyces pombe 1S-S4p02
Science Technology and Innovation
2S-S1p04
Science, Technology and Innovation(STI)
2S-S1p03
screening 1Bp18, 2Fp08, 3Ba11, 3Cp03,
3Cp06, 3Fa02, 3Gp05, 3Ia11
screening of microorganisms
3Ia09
SDGs 2S-S1p01, 2S-S1p02, 2S-S1p03,
2S-S1p04, 2S-S1p05,
2S-S1p06, 2S-S4p05
Secondary metabolism 1Gp07, 3Ea03,
3Ea07, 3Ea09
secondary metabolite
1Gp03, 2Ea01
secondary metabolites 1Ip05, 1S-S2p03
secreted protein
1Fp03, 1Hp14
secretion signal
3Ba04
secretome
3Bp08
1Fp03, 1Gp05,
secretory production
3Ba04
secureeconomy
2S-S3a05
Seed germination
1Ep16
selection marker gene
3Ha02
Selective breeding
1Bp01
selective fermentation
1A-Ka04
selective hydroxylation
2Ap14
selenium
2Ca12, 3Jp05
self-assembly 1Ap17, 1S-S3p03, 2Jp01
selforganization
3S-S5a01
sensing
2S-S3p01
sensor
2Fp01, 2Fp07, 2Fp16,
2S-S4p01, 3Fp06
sensory analysis
2Hp09
separation
2Fp12, 2S-S3p05
Sequence based protein design
1Fp08
Sesquiterpene synthase
3Ep02
sesquiterpenoid
2Bp11
shake-ﬂask culture
1Dp16
Shark antibody
2Gp01
shering force
3Ja04
Shirakami kodama yeast
2Hp14
shochu3Ha06
1Bp04
shochu distillery wastewater
Shrimp2Jp03, 3Fa07
sigma factor
1Ep03
signal sequence
1Fp06
Signaling molecule
3Ea03
silica2Bp05
silica-forming protein
1Ap17
silkwom
1Fp16

silkworm
1S-S3p04, 2Jp03
Silver nanoparticles
3Hp03
simulation
1Dp08, 2Da11
Simultaneous Sacchariﬁcation and
1Dp11
Fermentation
single cell
1S-S3p05, 2Aa10
single cell spectroscopy
3S-S5a04
single domain antibody
3S-S3a02
single-cell analysis
1Jp05, 2Fp09,
2Fp11, 2S-S4p07
single-use culture bag
3Hp08
sirtuin gene
3Ep05
site-directed mutagenesis
2Bp18
size
3Fa08
skeletal muscle 1Jp08, 2Ga06, 2S-S4p04
skin
1S-S4p06
slaked lime powder
3Dp07
2S-S5a02
small biopharmaceuticals
Small cyclic peptides
1Ep14
small scale
1Hp07
small scale culture systems
3S-S1a01
smart protein design
2S-S5a02
SNARE protein
3Gp07
social cheater
1Dp09
Society 5.0
2S-S1p01
soil
1Cp01, 1Cp14
soil bacteria
2Ba09, 3Da01
soil environment
3Da01, 3Da02
soil nutrient
3Da02
Solanum lycopersicum L.
1Cp04
solar energy
3Jp08
solid-liquid-solution systems 2S-S3p03
Solid-ordered domain
2Ip05
Solid-state NMR
2Fp05, 3Ia10
Solubility
1Dp14, 2Fp04
soluble di-iron monooxygenase gene
3Jp06
somatic hypermutation 2Gp08, 2Gp09
soy sauce
3Ha07, 3Ha08
specialized cellulose ﬁlm
1Dp18
spermine
2S-S5p08
1S-S5p06, 2Ga03, 2Ga08
spheroid
spheroids
2Ga11Sphingobium
1Cp02
sphingolipid
1S-S4p07
sphingolipids
1S-S4p06
spinach
2Ep07
Spirochaeta
3Bp03
split intein
2Ap06
spo0A
3Ip06
spontaneous mutant
3Ip03
spore
2Dp15
sporulation
2Hp13, 3Ip06
3Ip04
spoT
stability
2S-S2a04
stable isotope
2Fa06
Stack plates
2Ga02
standby disinfecton
3Dp07
staphylococci
2Dp04

321

Staphylococcus
2Fp11
Staphylococcus aureus
3Ga11
Staphylococcus aureus
3Dp06
Staphylococcus epidermidis
3Dp06
statistical experimental design
2Cp04
steam treatment
2Ba06
stem cell
3Ga10
stem cell culture
1A-Ka03
Stenotrophomonas sp.
3Ja01
stereoselectivity
1Ap01
stereospeciﬁc monoclonal antibody
3Cp01
STI for SDGs
2S-S1p03
strawberry
1Dp04
Streptococcus mutans
3Bp02
Streptococcus pyogenes
3Fp01
Streptolysin O
3Fp01
Streptomyces
1Ap18, 1Gp17, 2Ba03,
2Dp11, 3Ea01, 3S-S2a01,
3S-S2a02, 3S-S2p01, 3S-S2p05
Streptomyces lavendulae
2Dp07
Streptomyces rochei
3Ea03
Streptomyces sp.
2Ip13
Streptomyces thermoviolaceus
1Gp17
stress
3Ip01
stress resistance
1Bp12
stress response 1Ep03, 3Ea10, 3S-S4p05
stress tolerance
2Ca03
structural analysis
1Ap07, 3Ep07
structural change
1Ap02
subcellular localization
1Fp06
substrate recognition
1Ap02, 2Ap11
substrate speciﬁcity
1Fp01, 2Ap02,
2Ca06, 3Ap07
Substratome
1Dp07
1Ap11, 2Ap05, 2Ap06
subtilisin
succinate
2S-S2p04
succinic acid2Ja06
suﬁte ion
3Aa09
sugar
1A-Ka04
1Dp03, 1Dp04
sugar content
sulfanilic acid3Aa09
sulfate2Bp13
sulfate reducing bacteria
1Cp09
sulfate-reducing
2Ep11
sulfonamide
1Ap04
3Ap03
sulfur amino acid metabolism
sulfur assimilation
2Bp13
sulfur metabolism
3Jp04
surface attachment
3Jp07
surface layer protein(SLP)
3Da03
surfactant
2Da06
Suspension cells
2Gp11
sustainability
1S-S3p04
Sustainable Development Goals
2S-S1p03
sweetpotato shochu
2Ha09
sweetpotato shochu oil
2Ha09
symbiosis
2Cp06

symbiotic bacteria
2Fp10
Synechocystis
2S-S2p04
syngas fermentation
2Cp14, 2Cp15
synonymous codon
2Aa12
synthetic biology
1Hp11
synthetic microbial consortium 2Cp15
synthetic microbial ecosystem
3Ja02,
3Ja03
Syntrophobacteraceae
2Ep11

T
T celltag lines
TAG lipasetagatose
Talaromyces cellulolyticus

2Gp06
2S-S3a01
1Bp05
2S-S2p01
2Ja11,
3Aa11, 3Bp05
Talaromyces purpurogenus
3Hp03
taste-active compound
3Fa08
taurine biosynthesis
2S-S2p02
taxonomy
1Ep06
2S-S2p04, 3Ap09
TCA cycle
TEF3
1Hp15
tempe
2Ea03
terasi
2Cp08
terephthalic acid
2Dp03
terminator
2Dp08
2Bp10, 3Ep01, 3Ep03
terpenoid
Tetragenococcus halophilus
3Ha07
thallusin
1Bp14
Theanine
2Ap12
1Hp15
Therapeutic antibody
thermal stability
1Ap09
Thermoanaerobacter kivui
2Cp14,
2Cp15
Thermococcus kodakarensis
1Ep04,
3Ap05
thermophile 2Ba03, 2Bp17, 2S-S5p06
Thermophilic actinomycetes
1Gp17
thermostability
1Fp12, 3Cp02
thermostable enzyme
1Ap11, 1Fp07,
1Fp12, 2Ap05, 2Ap06, 3Ap04, 3Bp09
Thermotolelance
2Ja09
thermotolerance
3Ip04
Thermus thermophilus
1Ap10
thioproline
1Ap01
thiosulfate
2Bp13, 3Jp04
three dimension
1S-S5p03
three-dimensional tissue
1Jp09
time series analysis
2S-S2a04
tissue culture
2S-S4p04
tissue engineering
1Jp07, 1Jp10,
1S-S5p03, 2Ga03, 2Ga04,
2Ga07, 3Ga02, 3S-S5a03
toll like receptor
2Ip02
toluene-degrading bacteria
1Cp04, 2Ep11
tomato1Dp03
toxicity
1Jp06

tracer experiments
3Ea06
trans-3-hydroxyproline
2Ap14trans-aconitic acid
2Ca08
Transcript factor
3Ia03
transcription
1Cp06, 3Ap05
transcription factor
1Bp17
transcriptional regulation
1Gp13,
2Dp13, 3Ia02
transcriptional regulator gene
2Jp06
transcriptome
1Ep08, 1Jp05, 2Aa09,
2Aa10, 3Ha05transfer genes
2Dp11
Transformation
1Gp12, 2Dp09
transgenic chicken
3Gp03
transketorase
1Ap10
2Gp05, 2S-S5p07
translationtranslation repression
3Ip02
transomics
1Ip07, 2S-S4p05
transporter
1Ep15, 1Gp13, 2Ca06,
2S-S5p10, 3Ia04, 3S-S4p03
tree bark
2Ep01
triacylglycerol
3Aa10
tricarboxylic acid cycle
2Ca09
trickling ﬁlter process
1Cp11
triclosan
3Da05
triplex
2Ip01
triterpenoid
1Ip05
tRNA-dependent amide synthetase
3S-S2p01
troponin I
2Cp12
trypsin
2Ga01
Tryptamine
2Da07
tryptophan
1S-S4p02
2Hp01, 2Hp05
TTC staining
tumor
1S-S5p03
tumor associated antigen
2Jp11
Type IV secretion
3S-S2a01
typing3Fa01

Uubiquinone
2S-S5p05
ubiquitin
2Jp07
ubiquitin ligase
2Jp07
ubiquitination
2Jp07
ultrasonic treatment
3Dp01
ultrasound
3Ga06
ulvan
3Ap07
uncultured bacteria
1Dp18, 1Hp01,
1Hp02, 1Hp06, 1S-S2p01, 2Ep01
Undibacterium
1Cp16
uniform culture
1A-Ip01
unnatural amino acid
3S-S5a02
unsaturated carbonyl compounds 1Jp06
urban mining
1Dp18

VvacuoleVal-Gly
vanillin

1S-S4p03
2Ap07
2Cp10, 3Aa01

322

Vapor stimulation
2Fp07
vascular endothelial growth factor
3Gp02
4-VG
2Hp15
VHH
1Fp15
3Hp02
viability
vinegar fermentation
2Ha10, 2Ha11
4-vinylguaiacol
3Ha01
2Fp15, 3Fp06, 3S-S4p02
virus
vitamin B12
1Ap15
VNAR
3S-S3a02
volatile fatty acids
1Bp03, 2Cp06

W
waste
1Hp03, 2Ja03
waste wood chip
3S-S3p04
wastewater treatment
3Jp04, 3Jp08
water
1Bp08
water circulation
3Ja09
water puriﬁcation
3Ja09
wax ester
1Bp11, 2S-S5p03
wearable
2S-S3p02
weed
2Cp05
whey
2Ha10
White spot syndrome virus
2Jp03
white-rot basidiomycetes
3Ep02
white-rot fungi
1Bp17, 1Cp03
whitlockite
2S-S3p03
WHO
2S-S1p02
whole genome analysis
2Ep08
wine
1S-S1p01
wound healing
2Ea06

X
X-ray crystallography

1Ap07, 3Bp05,
3Bp09
X-ray structure
1Ap10
xanthophyll
1Bp08
Xanthophylloyces dendrorhous 2Ba07
xenobiotic compounds
2Dp10
2Ep09, 2Ep10
xerophilic Aspergillus
xylanase
1Ap14
xylene3Ip02
xyloglucanase
2Bp01
xylooligosaccharide
3Bp05
Xylose1Dp02, 2Cp11
xylose transporter
3Ha10

Y
yeast 1A-Ka04, 1Gp09, 1Hp03, 1Hp14,
1S-S4p01, 1S-S4p05, 2Ba04,
2Bp10, 3Aa05, 3Aa06, 3Ba03,
3Ba07, 3Ba10, 3Ba11, 3Cp05,
3Ip01, 3Ja10, 3S-S4p05
yeast extract
1Dp07
yeast surface display
3Cp04
Youngʼs modulus
3Ga07

Z
zinc
Zn-porphyrin
Zygosaccharomyces rouxii
zymogen

3Ha09
2S-S2p02
3Ha08
1Fp01

323

ランチョンセミナー
本大会のランチョンセミナーは，事前登録不要・参加費無料です．開催日の朝 10:30 まで，受付にて整理券を配布いたしますので，参加ご希望の方は整理券をお受け取りください．セミナー開始時刻を過ぎると，整理券は無効となりますのでご注意ください．
整理券をお持ちでない方も聴講することは可能ですので，参加される場合は直接会場にお越しください．
ただし，お弁当を提供できない場合がありますのでご了承ください．

9/16（月）（大会１日目）12：00 ～ 12：50
LS1-1 ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社

S1 会場（A21）

エクソソーム精製用ペプチドの開発

LS1-2

東ソー株式会社

S4 会場（E11）

糖鎖改変タンパク質医薬品の生産〜ニワトリの「糖鎖制御工学」〜

LS1-3

株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ

S5 会場（E21）

微生物培養の最新技術紹介

1. Water-in-oil(w/o) ドロップレットを活用した微生物培養技術
2. ゲルマイクロドロップによるタンパク質高分泌生産株の高速スクリーニング技術の開発

9/17（火）（大会２日目）12：00 ～ 12：50
LS2-1 株式会社林原

S1 会場（A21）

栄養素の吸収と食品成分による調節〜グルコーストランスポーターを中心に〜

1. 栄養素の腸管吸収を担うトランスポーターと食品成分による制御
2. 新しい水溶性食物繊維『イソマルトデキストリン』の栄養素吸収調節作用
LS2-2

タカラバイオ株式会社

S4 会場（E11）

目的遺伝子のはたらきを調べる 3 つの異なるアプローチをあなたに− DNA、RNA、タンパク質レベルでの遺伝子機能解析システムのご紹介−

LS2-3 株式会社島津製作所
1. 代謝階層をまたいだ計測の意義とデータ可視化の役割
2. 卓上型質量分析計による簡便な培養モニタリング

9/18（水）（大会３日目）12：00 ～ 12：50
LS3-1 三洋貿易株式会社

S5 会場（E21）

S1 会場（A21）〜最新のバイオプロセス器材の紹介〜
各種バイオプロセスセンサーおよび低ストレス連続培養・細胞分離技術他

LS3-2

天野エンザイム株式会社

再生医療を酵素でサポートする―膵島移植に貢献する酵素―

S4 会場（E11）324

ランチョンセミナー

月
9

日（月）
16

325

ランチョンセミナー

月

9

日（月）

16

326

ランチョンセミナー

第71回 日本生物工学会大会
オンチップ・バイオテクノロジーズ株式会社
ランチョンセミナー「微生物培養の最新技術紹介」

9

月

日時
： 2019年9月16日(月) 12:00- 12:50
会場： S5会場
講演番号： LS1-3

日（月）

16

演題1

Water-in-oil(w/o)ドロップレットを活用した微生物培養技術

野田尚宏先生(産業技術総合研究所・バイオメディカル研究部門）
Water-in-oil (w/o)ドロップレットとは油中に分散した微小水滴（ドロップレット）のことです。直径30から150 µm（体積は数十ピコリットルから数ナ
ノリットル）程度のw/oドロップレットを数百万個のオーダーで容易に作製する技術が開発されています。このw/oドロップレットに微生物を封入し、その内部で培養を行い、微生物が増殖したw/oドロップレットを選択的に回収し、さらに回収したドロップレットから微生物を生きた状態で獲得するという一連の技術をご説明いたします。以上のような説明を通してw/oドロップレット培養技術の利点や今後の課題・展望をご紹介いたします。

演題2

ゲルマイクロドロップによるタンパク質高分泌生産株の高速スクリー
ニング技術の開発

町田雅之先生（金沢工業大学・ゲノム生物工学研究所）
ゲルマイクロドロップ（GMD）は直径50 µm程度のアガロースなどの微粒子で、フローサイトメータによるソーティングが可能である。酵素などのタンパ
ク質遺伝子を組み込んだ微生物を変異処理して、1個のGMDに1細胞以下となる
ように包埋し、培養によってGMD内に分泌・捕獲されたタンパク質を蛍光標識することにより、高速に高分泌生産株をスクリーニングすることができる。本
研究では、オンチップバイオテクノロジーズ社のマイクロ流路型装置を利用することにより、粒径の揃ったGMDの作製、分泌生産量を指標としたソーティン
グについて、極めて簡便・迅速に行えることが示された。現在行っている、酵母を用いた結果などについて紹介する。

株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ

東京都小金井市中町2-24-16 農工大・多摩小金井ベンチャーポート
042-385-0461 http://www.on-chip.co.jp
info@on-chip.co.jp

327

ランチョンセミナー

月

9

日（火）

17

328

ランチョンセミナー
月

9

日（火）

17

第７１回日本生物工学会大会

�����

目的遺伝子のはたらきを調べる�つの異なるアプローチをあなたに－���、R��、タンパク質レベルでの遺伝子機能解析システムのご紹介－
目的遺伝子機能を解析する方法は、���、R��、タンパク質のどのレベルからのアプローチが良いかは研究目的によって異なります。 重要な点は、最も効果的と思われるレベルで、解析実験法が効率よく、さらに簡単に行えるシステムを利用する点になります。
タカラバイオは遺伝子機能解析分野において、R��レベルおよびタンパク質レベルでの機能解析を可能にするシステムに加えて、近年熱い注目を集めるゲノム編集CRISPR�C�s技術を取り入れたゲノムワイドで遺伝子スクリーニングを行うシステムを新たに開発しました。これにより、���、R��、タンパク質すべての面から遺伝子機能解析が行える、以下のシステムをご提供しています。
���レベルCRISPR�C�sのノックアウトを利用した関連遺伝子特定のためのスクリーニングシステム
・Guide�it™ CRISPR Genome��ide s�R�� �ib���y System���レベル
電気のスイッチを入れるように目的遺伝子の発現������調節が可能
・�et System
タンパク質レベル
細胞内の標的タンパク質の“量”を正確、迅速かつ可逆的に直接コントロール可能
・P�oteo�une�™ S�ield System
低分子化合物を用いてタンパク質間相互作用を自在に制御・i�ime�i�e™ Inducible System
本セミナーでは、これらシステムの特長を詳しくご紹介し、遺伝子機能解析を行われている皆さまへのお役立ち情報をご提供いたします。

１７日（火）�２：�� � ��：��

日 時：９月会 場：S�会場＜���＞
演 者：大門 尚志（タカラバイオ株式会社 営業企画部
テクニカルサポート担当 博士（医学））329

ランチョンセミナー

月

9

日（火）

17

330

9

三洋貿易株式会社

月

ランチョンセミナー

第��回 日本生物工学会大会

日（水）

18

ランチョンセミナー

�月 ��日（水）�����～�����
��会場 ＜���＞
講演番号：�����

～最新のバイオプロセス器材の紹介～

バイオプロセスラマン
����������

各種バイオプロセスセンサー
および低ストレス連続培養・細胞分離技術他

弊社では、
長年バイオセンシング器材におけるリーディングカンパニーの一つ独国�������社製品、
その他様々な特長ある細胞培養装置、バイオプロセス器材を取り扱っております。

本講演では、次の特長あるバイオプロセス器材製品群を紹介いたします。
・ （蛍光式）光学式バイオプロセスセンサー（���������）・ （固定化酵素式）グルコース・乳酸（糖代謝）モニター・ （ラマン分光法式）バイオプロセスラマン（グルコース・乳酸・グルタミン・
アンモニウムイオン・生細胞・アミノ酸他）モニター
・ 音響式連続細胞培養・デブリ分離ユニット ������
・ ステムセル（動物細胞）用シングルユースバイオリアクタなど。

331

ランチョンセミナー

第 71 回 日本生物工学会大会
天野エンザイム株式会社ランチョンセミナー（LS３-2）

日時

令和元年 9 月 18 日（水）12 時 00 分～12 時 50 分

会場

岡山大学 津島キャンパス
岡山県岡山市北区津島中

座長

天野エンザイム株式会社 マーケティング本部
取締役メディカル用酵素事業部長

演者

東京農工大学 大学院農学研究院
応用生命化学部門 教授

山口 庄太郎

山形 洋平 先生

膵島移植は、健常者の膵臓組織よりインスリン産生細胞である膵島のみを分離し、糖尿病患者へと移植する治療法である。移植手術が不要であることから、患者への負担が軽いという大きな利点がある。
膵島細胞は、膵臓組織を酵素処理することにより分離されるが、相応しい膵臓のドナーの確保が容易でないため、ダメージの少ない膵島を高収率で回収することが大きな課題となっており、そのために用いられる酵素製剤を最適化することが考えられる。東北大学後藤教授、東京農工大学山形教授と当社の研究
グル ー プ で は 、 ����������� に 加え 、ŦƏƒƖƗƕƌƇƌƘƐŃ ƋƌƖƗƒƏƜƗƌƆƘƐ 由来の ����������� お よ び���������� �������� ���������を組み合わせることで、膵島へのダメージを最小限に抑えつつ、膵島
分離効率を向上させられることを明らかにした。

ZZZDPDQRHQ]\PHFRMS

ᴾ

18

日（水）

―膵島移殖に貢献する酵素―

月『再生医療を酵素でサポートする』

9

第第 71回（ 2019年）

回

71

日本生物工学会大会講演要旨集

日本生物工学会大会
講演要旨集
会

期

2019 年（XX 元年）9 月 16 日（月・祝）～ 18 日（水）会場

岡山大学津島キャンパス

二〇一九

第 71 回日本生物工学会大会講演要旨集
2019 年 8 月 9 日発行
発行所

日本生物工学会

公益社団法人 日本生物工学会〒 565-0871 大阪府吹田市山田丘 2-1
大阪大学工学部内
TEL. 06-6876-2731 FAX. 06-6879-2034
E-mail: info@sbj.or.jp
https://www.sbj.or.jp

公益社団法人 日本生物工学会