静電気学会誌，38, 2（2014）108-112

J. Inst. Electrostat. Jpn.

論文

高電界パルス印加による大腸菌の伸長
村本 裕二 ，岡 洋佑 ，村上 祐一 ，清水 教之 ，市原 茂幸
＊, 1

＊

＊

＊＊＊

（2013年9月6日受付；2014年2月14日受理）

Elongation of E. coli after High Electric Field Pulse Application＊, 1＊＊Yuji MURAMOTO , Yosuke OKA , Yuichi MURAKAMI ,＊＊＊Noriyuki SHIMIZU and Shigeyuki ICHIHARA(Received September 6, 2013; Accepted February 14, 2014)
We report sterilization of liquid using high electric field pulse. Sample was liquid including Escherichia coli (E. coli). The⊖4survival rate of E. coli reduced to 10 after the application of 50 pulses in a coaxial cylindrical tank. Most cells of E. coli
elongate after the pulse application. The elongation of E. coli means that the bacteria can not divide. Therefore the pulse
application retards the E. coli from cell division.

1．はじめに

本研究では，高電界パルスによる大腸菌殺菌における食品の殺菌 には，加熱殺菌と非加熱殺菌がある．加熱

パルス印加回数－生菌率特性に与える殺菌槽形状の影響

殺菌は最も簡単な殺菌方法であり，強い殺菌効果が証明さを示し，さらに高電界パルス印加により大腸菌の長さがれている．しかし，熱によって食品の品質が変化すること無印加のものより増大し，増殖を阻害する効果を示したやエネルギー効率が悪いことが問題である．非加熱殺菌法ことについて報告する．

1）には，パルス殺菌，紫外線殺菌，放射線化学的殺菌などが挙げられ，加熱殺菌の問題を解消できる殺菌法として期

2．高電界パルスによる殺菌モデル待されている．パルス殺菌法のなかでも，高電界パルス殺図 1 に高電界パルスによる殺菌のモデルを示す．細

8-15）

菌法は，熱や放電による殺菌ではなく，パルス電界により胞の表面は細胞膜で覆われ，細胞の内部は，主に細胞質細胞膜に発生する Maxwell 応力を利用している．そのため，で構成されている．電気的にみると，細胞膜の脂質二重他の方法に比して食品の品質に与える変化が少ない．

層は絶縁体で，細胞質はイオンを含んでおり導電性流体

これまで多くの研究者達によって高電界パルス殺菌のである．高電界パルスを細胞に印加すると，細胞質内外研究が進められ，大腸菌，枯草菌，酵母などに対して高のイオンの移動によって細胞膜の両側に電位差が発生す電界パルスを印加し，殺菌されることが示されている．

る．この電位差によって Maxwell 応力が発生し，細胞膜これらの研究により電界強度と殺菌力の関係が示されてを圧縮する．その圧縮により細胞膜が薄くなることで電おり，電界が高いほど殺菌力が上昇することが報告され気絶縁破壊が生じ，孔があく．電位差が小さい時は孔がている．殺菌機構については，パルス電界により細小さいため，細胞は自己修復をして孔をふさぐことがで胞膜に発生する電気的圧縮による電気穿孔によりこれをきる（可逆的破壊）．電位差が大きい時は孔が大きいため，破壊すること，臨界電圧以上で可逆的破壊または，不可細胞は自己修復ができなくなり，細胞死に至ると考えら

2-15）

逆的破壊が進行することが知られている

．

8-15）

キーワード：高電界パルス，液体食品，大腸菌，細胞分裂＊
名城大学理工学部電気電子工学科（〒468-8502 名古屋市天白区塩釜口 1-501）
Department of Electrical and Electronic Engineering,
Faculty of Science and Technology, Meijo University,
Shiogamaguchi 1-501, Tempaku-ku, Nagoya 468-8502, Japan．
＊＊（元）
名城大学農学部（〒468-8502 名古屋市天白区塩釜口 1-501）(Retirement) Faculty of Agriculture, Meijo University,
Shiogamaguchi 1-501, Tempaku-ku, Nagoya 468-8502, Japan．
1
muramoto@meijo-u.ac.jp

図 1 高電界パルスによる殺菌
Fig.1 High electric field pulse sterilization.

高電界パルス印加による大腸菌の伸長（村本 裕二ら）れている（不可逆的破壊）．Zimmermann 氏らによると

10）

109（39）図 4 に本実験で使用した回路図を示す．パルス電圧印加

細胞膜穿孔は，電位差が約 1 V を超えると生じると報告には，インパルス電圧発生器（東京変圧器（株） 898101）されている．

を使用した．平行平板電極槽では，一方を接地し，他方に高電圧を印加した．同軸円筒電極槽では，外部電極を接地

3．実験方法し，内部電極をインパルス電圧発生器の出力に接続した．

使用した大腸菌は無害なもの（ JM103）を用い，実験コンデンサに 88 kV（22 kV × 4）充電し，直列放電ギャッ

試料は菌を培養した液体培地を純水で 10 倍に薄めたもプを放電により短絡させることで，パルス電圧を殺菌槽にのとした．液体培地（ Luria Broth ）は tryptone（1 wt％），印加した．印加電圧は負極性，殺菌槽内外で放電が起こら酵母エキス（0.5 wt％），NaCl（0.5 wt％），純水（98 wt％）ない波高値とした．
殺菌槽にかかる電圧は，分圧器（ IWATSUの混合液である．試料の導電率は，約 130 ｍ S/m であった．

ELECTRIC CO.LTD, HV-P30）を通してディジタルオシロス

実験試料を殺菌槽に入れパルス電圧を印加することで殺コープで測定した．図 5 は，実験試料の入った殺菌槽に印菌した．殺菌槽は，平行平板電極槽（電極寸法 60 mm ×加したパルス電圧波形を示す．波形は，両電極槽に対して50 mm，電極間距離 4 mm ）と同軸円筒電極槽（内部電同じであり，波高値 5.6 kV，波頭長 2.8 μs，波尾長 16.1 μs

極の直径 5 mm，電極間距離 5 mm，深さ 45 mm ）を用いとした．またパルス印加間隔は，約 60 秒であった．

た．図 2 に平行平板電極槽，
図 3 に同軸円筒電極槽を示す．

図 4 高電界パルス印加回路
Fig.4 High electric field pulse application circuits.
図 2 平行平板電極槽
Fig.2 The parallel plane electrodes tank.

図 5 パルス印加波形
Fig.5 The shape of the voltage pulse.

殺菌槽内の電界は，図 2 に示す平行平板電極槽では，平等電界で 14 kV/cm となり，図 3 に示す同軸円筒電極槽
では，内部電極に近い程大きく，最大で 20 kV/cm，最小で 6.7 kV/cm となる．パルス電圧を両殺菌槽に 50 回印加
図 3 同軸円筒電極槽
Fig.3 The coaxial cylindrical electrodes tank.

した．印加 1 回ごとに殺菌槽を振って攪拌し，さらに印加 10 回ごとにコロニー計数法で生菌数を測定した．ま静電気学会誌 第38巻 第 2 号（2014）

110（40）たパルス電圧を印加した大腸菌と印加していない大腸菌無い場合には，殺菌はされていないことが確認できる．
生菌率は，パルス電圧の印加回数の増加に従い，減少をグラム染色し，光学顕微鏡で観察も実施した．
コロニー計数法とは，試料の生菌数を測定する方法でする．しかし，生菌率の減少は，ある印加回数を超えるある．充分に希釈した試料を寒天状の平面培地に広げてと小さく，緩やかになる．これは，大腸菌の大きさの相1 日間培養するとコロニーがその培地上に形成される．

違や菌の溶液中の分布によりパルス電界が細胞膜に印加

ひとつのコロニーが 1 つの菌から分裂によって生ずるたされにくくなり，菌が生き残るためであると考えられる．

め，形成されたコロニー数を数えれば試料の生菌数が測

平行平板電極槽での生菌率は，パルス電圧印加 20 回後から減少していない．これは平行平板電極槽にかかる定できる．

電界が平等電界であり，小さな菌を殺すことができず，

4．実験結果及び考察生き残ったためと考えられる．

4.1 生菌率と印加回数との関係

同軸円筒電極槽では，パルス電圧印加回数の増加に対生菌率 rx を rx ＝ nx／no にて求めた．ここで，n0 はパルして，生菌率は減少し続けている．攪拌により高電界領ス電圧を印加する前の生菌数，nx は x 回のパルス電圧印域に移動した菌は，小さくても殺菌されやすくなる．し加後の生菌数，x は印加回数である．表 1 と図 6 に両電極たがって生菌率は減少したと考えられる．

槽での生菌率とパルス電圧印加回数依存性を示す．この

4.2 パルス印加後の大腸菌観察

結果は，同一の実験を 5 回行い，平均をとったものである．

図 7 に高電界パルス印加直後の大腸菌を，図 8 に高電大腸菌の初期菌数は，10 CFU/ml である．なお図 6 には界パルス無印加の大腸菌の写真を示す．ここで高電界パパルスを印加しない場合の生菌率の変化も示す．この場

ルスは，同軸円筒電極槽（図 3）にて 50 回印加した．こ合，印加回数ではなく，0～50 回の印加に要する時間 0～

れらの写真は，多くの菌が存在する領域で撮られたもの

850 分に対して生菌率の変化を示してある．パルス印加が
表 1 生菌率
Table.1 The survival rate.

Number ofpulses

Survival rate
The coaxial
cylindrical tank

The parallel planeelectrodes tank01102.64 × 10－22.46 × 10

1206.4 × 10－44.3 × 1030

1.6 × 10

5.7 × 10407.6 × 10

3.1 × 1050

3.5 × 10

3.2 × 10－4－5－5－2－3－3－3－3

図 6 生菌率のパルス印加回数依存性
Fig.6 The survival rate as a function of the number of pulses.

図 7 パルス電圧印加直後の大腸菌
Fig.7 E. coli just after the pulse application.

図 8 パルス電圧無印加の大腸菌
Fig.8 E. coli without the pulse application.

高電界パルス印加による大腸菌の伸長（村本 裕二ら）
で，写真に写っている菌の数は生菌率と関係はない．こ111（41）

図 11 は，図 10 と同じ時間が経過した後，撮影したもの

れらの写真から 100 個の大腸菌の長さを測定して得た長である．図 10，11 に写っている菌の数は，図 7，8 と同さ分布を図 9 に示す．図 9 の分布は，高電界パルスの印様に生菌率とは関係はない．これらの写真においても加直後には，大腸菌の長さに差がないことを示している．

100 個の大腸菌の長さを測定して得た長さ分布を図 12に示す．この分布では，高電界パルスを印加した大腸菌が無印加の菌に比べ長くなっていることが示された．さらにｔ検定にてパルス印加の有無による大腸菌の長さの有意差を評価したところ 99.9999％以上の棄却率にて評価でき，パルス印加有の大腸菌は，パルス印加無しのものに比べて長くなることが確認された．

図 9 パルス電圧印加直後と無印加の長さ分布
Fig.9 Distribution of cell length just after the pulse application.

図 10 に高電界パルス印加 2.5 時間後の大腸菌の写真を，図 11 に高電界パルス無印加の大腸菌の写真を示す．
図 12 パルス電圧印加から 2.5 時間後の長さ分布
Fig.12 Distribution of cell length after 2.5 hours from the pulseapplication.

高電界パルス印加が，印加から 2.5 時間後の大腸菌の長さ分布に変化を与え，さらにコロニー計数法で求めた生菌率が大きく低下している．図 13 に著者らの推測した細胞分裂の過程に及ぼす高電界パルス印加の影響を示
す．大腸菌は一般に時間とともに DNA が複製（ DNA 複製期）され，伸長し約 2 倍の長さになると 2 つに分裂（細図 10 パルス電圧印加から 2.5 時間後の大腸菌
Fig.10 E. coli with the pulse application after 2.5 hours.

図 11 パルス電圧印加から 2.5 時間後の無印加の大腸菌
Fig.11 E. coli without the pulse application after 2.5 hours.

図 13 細胞分裂の過程に及ぼす高電界パルス印加の影響
Fig.13 Effect of high electric field pulse on cell division.

静電気学会誌 第38巻 第 2 号（2014）

112（42）胞分裂期）する．そして，DNA の複製および伸長，分裂を繰り返して増殖をする ．一方，高電界パルスを印加
16）も同軸円筒電極槽での生菌率は，パルス電圧印加回数の増加に対して大きく減少した．

された大腸菌は伸長できる．しかし，コロニー計数法に（2）パルス電圧印加後の大腸菌を観測したところ，菌のよって測定された生菌率が減少していることから，大腸長さが長くなっていることがわかった．高電界パル菌は分裂できないこと，即ち増殖できないことが示され

ス印加が大腸菌の DNA の複製および細胞分裂の一た．本実験の結果からは，高電界パルスが DNA の複製方又は両方を阻害することが示唆された．

を阻害したのか，細胞分裂を阻害したかは不明である．
今後，DNA が複製されているかを検討する必要がある．
図 14 に一般的な長さの約 10 倍長い大腸菌を示す．これは図 10 と同様の条件によって得られた．図 14 に示すような極めて長い大腸菌が存在することからも，高電界パルスが大腸菌の DNA の複製および細胞分裂の一方又は両方を阻害することが支持される．

参考文献
1） 高 野 光 輝： 食 品 の 殺 菌 － そ の 科 学 と 技 術 － , pp.12,19,20,327,328，（株）
幸書房（1998）
2） Grahame W, Gould：New Methods of Food Preservation,
Springer, pp.244-245（1995）
3） 佐藤正之：水中パルス電界による微生物の殺菌．化学工学論文集，14（1988）566
4） 清水光浩：高電圧パルスによるイースト菌の破壊．静電気学会誌，13（1989）322
5） 佐藤正之：高電圧パルスによる微生物制御．日本食品工学会誌，8（2007）191
6） Takayuki Ohshima, Kaneko Okuyama and Masayuki Sato:
Effect of culture temperature on high-voltage pulse sterilizationof Escherihia coli. Journal of Electrostatics, 55（2002）227
7） D. Garcia, N. Gomez, S. Condon, J. Raso and R. Pagan: Pulsed
electric fields cause sublethal injury in Escherichia coli.
Letters in Applied Microbiology, 36（2003）140

図 14 通常の長さの約 10 倍の大腸菌
Fig.14 10 times length of E.coli.

8） Humberto Vega-Mercado et al: Non-thermal food preservation:
Pulsed electric fields. Trends in Food Science & Technology, 8（1997）151

図 6 から高電界パルス殺菌後の生菌率が，大きく減少しているにもかかわらず，印加後に撮影した写真（図 7，9） 王斗艶，秋山秀典：パルスパワーによる液中の殺菌・バ
イオ応用．静電気学会誌，37（2013）132

10）に大腸菌は写っている．つまり，高電界パルス殺菌10）U. Zimmermann, G. Pilwat and F. Riemann： DIELECTRIC

後の大腸菌の多くは，分裂することができないが，原形BREAKDOWN OF CELL MEMBRANES. Biophysicalを保っている．原形を保つことができなかった菌数は，Journal, 14（1974）881

直接，顕微鏡観察による計数法を用いることで測定することができる．これらの分裂できない大腸菌は，少なく

11） 葛西道生，稲葉浩子：高電圧パルスによる細胞穿孔のメ
カニズム．蛋白質核酸酵素，31（1986）1591とも染色の時点までは生きており，その後の生死は明確

12）杉村厚，清水伸：電気穿孔法．化学と生物，29（1991）54

ではない．しかし，増殖して多数となった菌が害毒を及13）佐藤正之：パルス殺菌技術．食品と技術，2008 年 7 月

ぼすので，増殖の能力を奪えば無毒化したことになり，殺菌の目的は達していると考えられる．

号（2008）1
14）大島孝之，谷野考徳：水中における高電圧パルス電界・放電の発生と利用．静電気学会誌，35（2011）114

5．まとめ
大腸菌を含んだ液体に高電界パルスを印加し，殺菌し

15）T. Kotnik, P. Kramar, G. Pucilhar, D. Miklavcic and M.
Tarek：Cell Membrane Electroporation – Part 1: The

た結果，以下の結論を得た．

Phenomenon. IEEE Electrical Insulation Magazine, 28（2012）（1）大腸菌の生菌率は，パルス電圧の印加回数の増加に14従って減少した．平行平板電極槽と同軸円筒電極槽との生菌率を比較したところ，平行平板電極槽より

16）太田行人，岡田節人，岡田善雄

編：岩波講座現代生物

化学 3 細胞の構造と機能Ⅱ，p.171，岩波書店（1975）