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特別寄稿

阿波学会紀要2012.7第58号(pp.187-196)

吉野川流域の鉱山跡周辺における重金属耐性微生物の探索
吉野川市高越鉱山・東山鉱山など――――――――――――――― 極限環境微生物班（徳島生物学会）―――――――――――――――
佐藤

＊１

高則

遠藤

＊２

陽介

柴垣

＊３

明佳

西山

＊１

賢一

石田

＊１

啓祐

山城

＊１

考

要旨：吉野川流域にある白滝鉱山跡（高知県大川村），高越鉱山跡本坑口，久宗坑口，川田山坑口（徳島県吉野川市山川町），東山鉱山跡（徳島県吉野川市美郷）の採掘滓から，硫酸銅または硫酸鉄存在下でも生育可能な細菌の探索を行った。その結果，白滝鉱山跡では３種のStreptomyces属細菌，東山鉱山跡からはPseudomonas属細菌，高越鉱山跡からはStaphylococcus属細菌およびBacillus属細菌と推定される重金属耐性細菌をそれぞれ単離した。非火山帯の四国においても，鉱山跡採掘滓に重金属耐性細菌が存在し，白滝鉱山跡由来細菌の重金属耐性には，酸化酵素活性が寄与している可能性が示唆された。

キーワード：銅鉱山跡，重金属耐性細菌，16SrRNA遺伝子，スクリーニング，酸化酵素活性酸鉄存在下でも生育可能な細菌の探索を行った。試１．はじめに料を採取した各鉱山跡の位置を図１に示す。

四国には過去に別子，白滝など日本有数の黄銅鉱，
硫化鉄鉱の鉱山が存在した。採掘の際に出た採掘滓

２．白滝鉱山跡における重金属耐性細菌の探索は周辺に埋め立てられ，微生物の作用による金属漏出が原因となる周辺水質や土壌の酸性化が問題とな

１）鉱山跡採掘滓からの土壌試料採取と重金属耐性細菌のスクリーニングっている。硫黄濃度が高い火山帯における銅鉱山跡
では鉱山排水の強酸性化が生じ，この強酸性化に関吉野川上流に存在する白滝鉱山跡は高知県大川村

与する細菌として，好酸性好熱性の鉄酸化細菌等が朝谷に位置し（図２（A）），含銅硫化鉄鉱などを採単離されており，その適応機構や酸性化機構が提唱掘していた。この時に生じた採掘滓により整地したされている（塩田ら，1989）。しかしながら，四国

土地に，鉱山で働く住民が居住していた。白滝鉱山などの非火山帯の銅鉱山跡における重金属耐性細菌

は1972年に閉山し，鉱山跡地は治山治水資料館や自の存在の有無に関してはほとんど報告がない。

然王国白滝の里（野外活動センター）として現在利これらの観点から，非火山帯の吉野川流域の銅鉱用されている。これら採掘滓で整地された土地では，山跡における重金属（銅・鉄）耐性細菌の特性につ

風化や雨水などの影響により漏出した銅などの金属

いて知見を得ることを目的として，吉野川水系河川や酸性水が河川に流れ込み，周辺環境に影響を与え流域にある白滝鉱山跡（高知県大川村），東山鉱山

る可能性がある。前述したように，四国の鉱山跡採跡および高越鉱山跡本坑口，久宗坑口，川田山坑口

掘滓に生育する細菌に関する知見はほとんどない。

（徳島県吉野川市）の採掘滓から，硫酸銅および硫そこで本研究では，白滝鉱山跡採掘滓から銅や鉄な＊１

徳島大学大学院SAS研究部＊２

徳島大学大学院総合科学教育部＊３

徳島大学大学院人間・自然環境研究科

187

16-01̲阿波学会̲187-196̲特地質4 12.7.12 4:49 PM ページ188

吉野川流域の鉱山跡周辺における重金属耐性微生物の探索

吉野川市高越鉱山・東山鉱山など／極限環境微生物班

A
白滝鉱山跡（高知県大川村）

吉野川

徳島市

吉野川市

B

吉野川

久宗坑口跡

高越鉱山
本坑口跡
東山鉱山跡
（吉野川市美郷）

川田山坑口跡図１

試料を採取した各鉱山跡の位置（A）概略図（B）吉野川市周辺拡大図（Aの枠内を拡大）

A

B
白滝鉱山跡

採取地点B

採取地点C
N

大川村役場

図２

採取地点A

高知県白滝鉱山跡の位置（A）と試料採取地点（B）

どに耐性を示す細菌の単離・同定を行った。

C地点は採掘滓により形成された斜面下部で，B地採掘滓からの土壌試料は，図２（B）に示したA

点より粒径の大きな砕石が多く地盤が固いため，こ〜Cの三地点の地表10〜30cmの土壌を８〜21g採取

こでは地表より10cmの土壌のみ採取した。これらした。A地点は採掘滓により整地された土壌で，地の試料４gを滅菌水２mlに懸濁し，静置後，その上表から10cm，20cm，30cmの土壌を採取した。B地

清を6,000rpm，５分間遠心分離を行った。得られ点は採掘滓を投棄して形成された斜面で，粒径数た上清300μlを，Konstantinidisほか（2003）の文

cmの砕石が表層に見られ，ここでは地表から10cm，

献 を 参 考 に ， LB寒 天 培 地 （ 0.5% Bacto Yeast

20cm，30cmの粒径の細かくなった土壌を採取した。

Extract，１% Bacto Tryptone，１% NaCl，いず

188

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阿波学会紀要

A

B

C

D

E

F

G

H

図３

第58号(pp.187-196)

2012.7

白滝鉱山跡採掘滓より単離した各細菌の培養後の硫酸銅・硫酸鉄培地（A）−（D）はLB/4mM CuSO4 培地を,（E）−（H）はLB/2mM FeSO4 培地を使用した。
（A），（E）：培地のみ,（B）（F）：C2を培養後の培地,（C），（G）：F47を培養後の培地，，（D），（H）：F56を培養後の培地

表１

白滝鉱山跡採掘滓から単離した細菌の性状れもナカライテスク，pH7.2），0.7mM CuSO4 を含ずれも光沢のある球状（LB/FeSO4 培地）または平

む L B 寒 天 培 地 （ L B / C u S O 4 ， p H 7 . 2 ）， 0 . 8 m M

板状（LB/CuSO4 培地）であった。また，この三種FeSO4 を含むLB寒天培地（LB/FeSO4 ，pH7.2）にの細菌（C2，F47，F56）をグラム染色したところ，それぞれ塗布し，コロニーが出現するまで37℃で１

いずれもグラム陽性で菌糸を形成していた（表１）。

〜７日間培養を行った。その結果，LB培地では225２）単離された重金属耐性細菌の生化学的試験

個，LB/CuSO4 培地では103個，LB/FeSO4 培地ではおよび16SrRNA遺伝子解析

370個のコロニーが得られた。得られたコロニーを上記で単離された重金属耐性細菌の特徴を検討す

２〜10mM LB/CuSO 4 寒天培地または２〜10mMるために，Nordほか（1974）の方法を利用した一

LB/FeSO4 寒天培地に継代培養し，生育の見られる般細菌検出キットAPI20E（日本ビオメリュー社）

細菌のスクリーニングを行った。その結果，最終的を用いて生化学的試験を行った。三種の細菌のコロに三種の重金属耐性細菌（C2，F47，F56）を単離

ニーを滅菌水に懸濁し，菌体浮遊液をAPI20Eの乾し た 。 C2は 終 濃 度 ４ mM CuSO 4 ま た は ５ mM

燥基質に添加，懸濁後，37℃，24時間保温した。こFeSO4 を含むLB培地で，F47，F56は６mM CuSO4

れを３回行い，乾燥基質の色の変化を観察し，標準または２mM FeSO4 を含むLB培地でそれぞれ生育の比色表と対比させることで判定した（表２）。そ

可能で，培養後にLB/CuSO4 培地またはLB/FeSO4の結果，３種の細菌は，クエン酸利用（CIT），ト

培地を，それぞれ茶変または黒変させた（図３）。

リプトファンデアミニダーゼ活性（TDA），ゼラチ

C2，F47，F56の三種の細菌のコロニー性状は，いナーゼ活性（タンパク質分解酵素活性，GEL）に陽189

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吉野川流域の鉱山跡周辺における重金属耐性微生物の探索

表２

吉野川市高越鉱山・東山鉱山など／極限環境微生物班

白滝鉱山跡採掘滓から単離した細菌の生化学試験

OPNG：β-ガラクトシダーゼ，ADH：アルギニンジヒドロラーゼ，
LDC：リジンデカルボキシラーゼ，ODC：オルニチンデカルボキシラーゼ，CIT：クエン酸利用，H 2 S：H 2 S産生，URE：ウレアーゼ，
TDA：トリプトファンデアミニダーゼ，VP：アセトイン産生，
GEL：ゼラチナーゼ，GLU：グルコース利用，MAN：D-マンニトール
利用，INO：イノシット利用，SOR：D-ソルビトール利用，RHA：Lラムノース利用，SAC：サッカロース利用，MEL：D-メリビオース利
用，AMY：D-アミグダリン利用，ARA：L-アラビノース利用+；陽性，−；陰性

図４

16SrRNA遺伝子のPCR増幅産物のアガロースゲル
電気泳動
白滝鉱山跡採掘滓より単離した細菌のゲノムDNAを鋳型とし，E.coli 16SrRNA遺伝子に相補的なprimerおよびTakara ExTaq
DNA polymeraseを用いてPCRを行った。反応液10μlを電気泳動に用いた。PCR産物（太矢印）を切り出し後，TAベクターに挿入し，DNA塩基配列決定を行った。E.coliおよびBst（Geobacillus stearothermophilus）のゲノムDNAより増幅したものを，対照として用いた。

性を示した。またC2は，アルギニンジヒドロラー
ゼ活性（ADH）に陽性を示し，グルコース（GLU）
やサッカロース（SAC）を利用可能であった。F47
は，β-ガラクトシダーゼ（OPNG），ADH，リジン

表３

白滝鉱山跡採掘滓からの単離した細菌の16SrRNA
遺伝子塩基配列のデータベース検索結果

デカルボキシラーゼ（LDC），オルニチンデカルボ
キシラーゼ（ODC）の酵素活性を有していた。F56
は，OPNGに陽性を示した。また，F47およびF56の糖利用については，単糖であるラムノース（RHA）やアラビノース（ARA），二糖類であるア
ミグダリン（AMY）で陽性を示した場合もあったが，再現性が得られなかったため，判定不能であった。これより三種の細菌では，タンパク質やアミノ酸を炭素源または窒素源として，グルコース，ガラ
クトース，サッカロースの単糖類または二糖類を炭素源として利用可能であることが示唆された。
さらに，これら３種の重金属耐性細菌の同定を行うために，16SrRNA遺伝子を指標とした遺伝子解析を行った。まず，C2，F47，F56をLB培地で37℃，
20時間振とう培養し，集菌後，各細菌のゲノム

60秒→72℃，90秒のサイクルを30サイクル繰り返し，

DNAを調製した。Beffaほか（1996）の方法を参考

最後に72℃，90秒伸長反応を行った。この結果，予に，E.coli 16SrRNA遺伝子の11-26位に相当する

想される約1.5kbpの位置にPCR産物が確認されたUpper primer：5′-ATTCTAGAGTTTGATC（図４）。さらに，得られたPCR産物をpTA2ベクタ

ATGGCTCA-3′（24mer，Tm=53℃）およびE.coliー（Toyobo）に挿入し，ABI 310 Genetic analyzer

16SrRNA遺伝子の1393-1411位に相当するLower

でDNA塩基配列決定を行った。解析可能であった

p r i m e r ： 5 ′- A T G G T A C C G T G T G A C G G G

約1300bpについて結果をNCBI BLAST（http://

CGGTGTGTA-3′（27mer，Tm=67℃）を用いて，

blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）のblastnプログラ得られたゲノムDNAを鋳型にして，ASTEC PC707

ムでDNAの塩基配列データベースと照合したとこ

サーマルサイクラーによりPCRを行った。PCRプロろ（表３），C2ではStreptomyces viridobrunneusのグラムは，98℃，10秒で変性後，98℃，10秒→58℃，

16SrRNA遺伝子の塩基配列と99.5%一致し，他には190

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阿波学会紀要第58号(pp.187-196)

2012.7

Streptomyces showdoensis（99.4%），Streptomyces

リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）中に，各細菌のlipmanii（99.2%）などと高い相同性を示した。

粗抽出液50μlを混合し，265nmにおける吸光度を

F47は ， Streptomyces ginsengisoli（ 97.0%），

室温で２分間測定し，L-アスコルビン酸の減少量か

Streptomyces sp. R25（97.0%），Streptomyces

ら酵素反応速度を算出した。

recifensis（95.5%）の16SrRNA遺伝子と相同性が見られ，F56は，Streptomyces sp. g2b（98.5%），
相同性が見られたが，C2と比べ，既知の細菌の16SrRNA遺伝子との相同性は若干低かった。これ
らの遺伝子解析の結果より，今回単離された３種のV（nmol/min/mg）

Streptomyces sp. A7（98.4%）の16SrRNA遺伝子と

250
200
C2
F47
F56

150
100
50

重金属耐性細菌はStreptomyces属細菌であると推0定した。
３）単離された重金属耐性細菌の酸化酵素活性

図５

上記で単離した三種の重金属耐性細菌（C2，F47，

Ascorbate oxidase Ascorbate peroxidase

各細菌粗抽出液の酸化酵素活性
試料50μl，基質濃度：0.1mM，測定温度：室温
図中のバーはSDを示す。

F56）が，培養後にLB/CuSO 4 培地やLB/FeSO 4 培
地を変色させたことから，次にこれら三種の細菌中
Ascorbate peroxidase）を検討した。まず各細菌を，２mM硫酸銅を含むLB液体培地300mlで37℃，２日間培養し，遠心分離（6,000rpm，20分，４℃）により集菌後，20mM Tris-HCl緩衝液（pH7.0）で懸濁し，Yeastbuster（Novagen）で30℃，20分間反応させ，細菌を溶菌させた。8,000rpm，20分間，４℃で遠心分離後の上清を回収・透析し，粗抽出液を調製した。得られた粗抽出液について，各酵素活140
V（nmol/min/mg）の酸化酵素活性（Ferroxidase，Ascorbate oxidase，

120
100

C2
F47
F56

80
60
40
20
0

0

50

100
150
Sample（μl）

200

250

図６ 各細菌粗抽出液のFerroxidase活性
基質濃度：0.2mM，測定温度：室温.
図中のバーはSDを示す。

性を測定した。
Ferroxidase活性の測定はBonomiほかの方法

各細菌の粗抽出液におけるAscorbate oxidase活（1996）に従って行った。終濃度0.2mMのFe（SO4 ）2性およびAscorbate peroxidaseの結果を図５に，（NH4 ）2 を含む20mM Tris-HCl緩衝液（pH7.0）中に，

Ferroxidase活性の測定結果活性を図６に示す。こ各細菌の粗抽出液50〜200μlを混合し，315nmにおれらの結果から，C2では酸化酵素活性は見られな

3+

ける吸光度を室温で１分間測定し，Fe の生成量かかったが，F47およびF56の粗抽出液ではL-

ら酵素反応速度を算出した。L-ascorbate oxidase活

ascorbate oxidaseおよびL-ascorbate peroxidaseの性の測定は，Pitariほかの方法（1998）に従って行

酸化酵素活性が検出され，またこれらのFerroxidase

った。終濃度0.1mMのL-アスコルビン酸ナトリウム

活性は酵素量依存的に増加した。特にF56は，検討を含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）中に，した３種の細菌抽出液の中で，最も高い酸化酵素活

各細菌の粗抽出液50μlを混合し，265nmにおける性が観察された。さらに他の酸化酵素活性として，吸光度を室温で２分間測定し，L-アスコルビン酸のPeroxidase活性およびPeroxiredoxin活性（Cheng

減少量から酵素反応速度を算出した。L-ascorbate

ほか，2004）についても検討を行ったところ，

peroxidase活性の測定は，Shigeokaほかの方法

Peroxidase活性はC2，F47，F56で，Peroxiredoxin（1980）に従って行った。終濃度0.1mMのL-アスコ

活性はF47およびF56で検出された（データ未掲載）。

ルビン酸ナトリウムおよび0.1mMH2 O2 を含む0.1M

前述の硫酸銅および硫酸鉄培地の色の変化は，これ191

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吉野川流域の鉱山跡周辺における重金属耐性微生物の探索

吉野川市高越鉱山・東山鉱山など／極限環境微生物班

らの酸化酵素の作用により生成したCu 2 OやFe 2るTrypsinおよびSubtilisinに対する培養液遠心後上（SO4 ）3 などが要因であり，単離したStreptomyces

清の阻害活性についても検討したところ，F47およ属細菌はこの酸化物を利用して生育可能であると推びF56では阻害能が見られた（データ未掲載）。以定されるが，酸化物の利用形態や硫酸銅・硫酸鉄耐上の形態観察，生化学的特性，遺伝子解析および酵性との相関については今後詳細な検討が必要であ

素科学的特徴を踏まえ，今回単離した三種の細菌は，る。

放線菌の一種であるStreptomyces属細菌であるとさらに，Streptomyces属細菌は細胞外にProtease

推定され，非火山帯の四国においても，鉱山跡採掘

inhibitor（SSI）を分泌することが知られているた滓に重金属耐性細菌が存在し，白滝鉱山跡由来細菌

め（Taguchiほか，1994），代表的なProteaseであの重金属耐性には，Streptomyces属細菌の酸化酵

A
N

久宗坑口跡
東山鉱山跡
高越鉱山
本坑口跡
川田山坑口跡

1000m

図７

0

1000

2000

3000

B

C

D

E

高越鉱山（本坑口，川田山坑口，久宗坑口）および東山鉱山跡の位置（A）と試料採取地点（B）高越鉱山本坑口坑道入口，（C）高越鉱山川田山坑口（ふいご橋精錬所跡），（D）高越鉱山久宗第三坑口湧水，（E）東山鉱山鉱泉湧水

192

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阿波学会紀要

素活性が寄与している可能性が考えられる。

第58号(pp.187-196)

2012.7

LB寒天培地（LB/FeSO4 ，pH7.2），２mM Fe（NH4 ）2（SO4 ）2 を含むLB寒天培地（LB/Fe（NH4 ）2（SO4 ）2 ，

３．高越，名越，久宗，東山鉱山跡における重金属耐性細菌の探索
１）鉱山跡採掘滓からの土壌試料採取と重金属耐性細菌のスクリーニング

pH7.2）にそれぞれ塗布し，コロニーが出現するまで37℃で１〜７日間培養を行った。その結果，
LB/CuSO4 培地では87個，LB/FeSO4 培地では52個，LB/Fe（NH4 ）2（SO4 ）2 培地では84個のコロニーが得高越鉱山跡本坑口，久宗坑口，川田山坑口は吉野られた。また，得られたコロニーの採取場所別の内

川市山川町に位置し（図７），含銅硫化鉄鉱などを

訳は，高越本坑口41コロニー，久宗坑口５コロニー，

採掘していたが，久宗坑口は1971年に閉山した（山川田山坑口24コロニー，東山153コロニーであった。

川町史編集委員会，1987）。一方，東山鉱山は吉野得られたコロニーを２〜４mM LB/CuSO4 寒天培地

川市美郷（旧美郷村）に存在し（図７），徳島県内

または２〜８mM LB/FeSO 4 寒天培地に継代培養では最大級の含銅硫化鉄鉱脈を有していたが，終戦し，生育の見られる細菌のスクリーニングを行った。

期に閉山した。前章の白滝鉱山と同様に，これらのその結果，最終的に４種の重金属耐性細菌（HYC24，

鉱山跡でも採掘で生じた採掘滓が積み上げられておK2F10，K2F13，K2F20）を単離した。

り（東明ほか，2012），過去には風化や雨水などのHYC24は東山鉱山跡採掘滓由来の試料で，グラ影響により漏出した銅などの金属や酸性水が河川に

ム陰性の桿菌であった。残り３種（K2F10，K2F13，

流れ込み，田畑などに鉱毒被害を与えたとの記録がK2F20）は高越鉱山跡本坑口採掘滓由来の試料でいある（山川町史編集委員会，1987）。しかし，これ

ずれもグラム陽性細菌であり，LB/８mM FeSO4 でらの鉱山跡採掘滓に生育する細菌に関する知見はこ

培養後に細菌が茶色に着色していた。形状はK2F13

れまでほとんどない。そこで，高越および東山鉱山

のみ桿菌で，K2F10およびK2F20は球菌であった跡採掘滓から銅や鉄などに耐性を示す細菌の単離・（表４）。また，これらの細菌では，培養後の培地の同定を行った。

黒変または茶変などの変化は観察されなかったた採掘滓からの土壌試料は，図７に示した各鉱山跡

め，酸化酵素活性については今回検討していない。

採掘滓の地表より10〜30cmの土壌を約20g採取した。高越鉱山跡本坑口では６地点，久宗坑口および
川田山坑口ではそれぞれ２地点，東山鉱山跡では３表４高越および東山鉱山跡採掘滓から単離した細菌の性状

地点で土壌試料を採取した。高越鉱山跡本坑口はコンクリートで封鎖されているが，廃水口から内部廃水が排出されている（図７（B））。ここでは，廃水溜り底部の堆積泥（２地点），坑口横の粘土質堆積+；陽性，−；陰性土壌（４地点）を採取した。川田山坑口（図７（C））
は精錬所跡で，粒径数cmの砕石が表層に見られ傾斜地で地盤が固いため，ここでは地表から10cmの２）単離された重金属耐性細菌の生化学的試験
および16SrRNA遺伝子解析

２地点で土壌試料を採取した。久宗坑口（図７（D））

上記で単離された重金属耐性細菌の特徴を検討す

は，第３坑口湧水口に堆積したバイオフィルム状のるために，前述の白滝鉱山跡試料と同様に，試料（２地点）を採取した。最後に東山鉱山跡では，

API20E（日本ビオメリュー社）を用いて生化学的東山鉱山鉱泉湧水（図７（E））底部の赤褐色粘土質試験を行った（Nordほか，1974）（表５）。その結土壌を10〜30cm採取した。これらの各試料４gを，果，４種の細菌は，クエン酸利用（CIT），トリプ

前述の白滝鉱山跡試料と同様の処理（Konstantinidis

トファンデアミニダーゼ活性（TDA）に陽性を示

ほか，2003）を行い，２mM CuSO4 を含むLB寒天した。またHYC24は，アルギニンジヒドロラーゼ

培地（LB/CuSO 4 ，pH7.2），２mM FeSO 4 を含む（ADH），ウレアーゼ（URE），アセトイン産生
193

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吉野川流域の鉱山跡周辺における重金属耐性微生物の探索

表５吉野川市高越鉱山・東山鉱山など／極限環境微生物班

高越および東山鉱山跡採掘滓から単離した細菌の生化学試験

OPNG：β-ガラクトシダーゼ，ADH：アルギニンジヒドロラーゼ，
LDC：リジンデカルボキシラーゼ，ODC：オルニチンデカルボキシラーゼ，CIT：クエン酸利用，H 2 S：H 2 S産生，URE：ウレアーゼ，
TDA：トリプトファンデアミニダーゼ，VP：アセトイン産生，
GEL：ゼラチナーゼ，GLU：グルコース利用，MAN：D-マンニトー
ル利用，INO：イノシット利用，SOR：D-ソルビトール利用，RHA：
L-ラムノース利用，SAC：サッカロース利用，MEL：D-メリビオース
利用，AMY：D-アミグダリン利用，ARA：L-アラビノース利用+；陽性，−；陰性

図８

16SrRNA遺伝子のPCR増幅産物のアガロースゲル
電気泳動
高越および東山鉱山跡採掘滓より単離した細菌のゲノムDNAを鋳型とし， E.coli 16SrRNA遺伝子に相補的なprimerおよびTakara ExTaq DNA polymeraseを用いてPCRを行った。反応液
10μlを電気泳動に用いた。PCR産物（太矢印）を切り出し後，
TAベクターに挿入し，DNA塩基配列決定を行った。Bst（Geobacillus stearothermophilus）のゲノムDNAより増幅したものを，対照として用いた。

（VP）に陽性を示し，グルコース（GLU）やサッカロース（SAC）を利用可能であった。K2F10は，オルニチンデカルボキシラーゼ（ODC）とUREに陽性を示した。K2F13は，β-ガラクトシダーゼ

表６高越および東山鉱山跡採掘滓から単離した細菌の16SrRNA遺伝子塩基配列のデータベース検索結果（OPNG），ADH，VP，ゼラチナーゼ（GEL）に陽性を示し，糖としてGLU，SACに加え，D-マンニトール（MAN），イノシット（INO），D-ソルビトール（SOR）L-アラビノース（ARA）を利用可能であることが示唆された。K2F20では，OPNG，オルニチンデカルボキシラーゼ（ODC），UREに陽性を示し，糖としてGLU，MAN，SACを利用可能であった。
さらに，これら４種の重金属耐性細菌の同定を行うために，先に述べた白滝鉱山跡試料と同様の方法（Beffaほか，1996）にて，16SrRNA遺伝子を指標とした遺伝子解析を行った。各細菌ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った結果，予想される約1.5kbpの位置にPCR産物が確認された（図８）。さらに，得られたPCR産物をpGEM-Tベクター（Promega）に挿入した後，全領域解析のためFasmac株式会社に塩基配列決定を依頼し，16SrRNA遺伝子全長の塩基配列を決定した。

Pseudomonas属細菌（グラム陰性細菌）であると得られた結果をNCBI BLAST（http://blast.

推定される。K2F10は，Staphylococcus sp.やncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）のblastnプログラムで

Staphylococcus epidermidisの16SrRNA遺伝子のDNAの塩基配列データベースと照合したところ

塩基配列と100%一致し，Staphylococcus属細菌（表６），HYC24ではPseudomonas rhodesiaeの（グラム陽性細菌）であることが示唆された。また，

16SrRNA遺伝子の塩基配列と99.9%一致したため，

K2F13では，Bacillus licheniformis（99.6%），

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2012.7

Bacillus subtilis（99.6%）などと高い相同性を示し，Bacillus属（K2F13）と推定される重金属耐性細菌

Bacillus属である可能性が示唆された。最後にをそれぞれ見出した。これより，非火山帯の四国に

K2F20は，未同定の細菌（Uncultured bacterium）

おいても，鉱山跡採掘滓に硫酸銅／硫酸鉄（II）耐の16SrRNA遺伝子と95.8%の相同性が見られたが，性細菌が存在し，このうち白滝鉱山跡由来細菌の硫

他の細菌の検索結果と比べ相同性は若干低く，デー酸銅／硫酸鉄（II）耐性には，酸化酵素活性が寄与

タベース上で候補となる具体的な細菌名が無かった

している可能性が示唆された。本研究で硫酸銅／硫ため，具体的な細菌の推定に至らなかった。

酸鉄耐性細菌として推定したStreptomyces属細菌

以上の形態観察，生化学的特性，遺伝子解析の結は，他の事例でもCu，Feなどに耐性を示す株が報果を踏まえ，東山鉱山跡採掘滓にはPseudomonas

告されており，Superoxide dismutaseやCupric属細菌が，高越鉱山跡採掘滓にはブドウ球菌である

reductaseのような酸化還元酵素の寄与が推定されStaphylococcus属細菌とBacillus属細菌が，それぞている（Schmidtほか，2007；Albarracinほか，

れ硫酸銅／硫酸鉄（II）に耐性を示す細菌として単2008；Louisほか，2009）。またPseudomonas属細離された。今後，これらの細菌の重金属耐性に寄与

菌では，細胞内に取り込んだ銅を活性中心とするする因子（遺伝子や酵素など）の同定が課題である。

multicopper oxidaseがferroxidase活性を示すこと
でFe（II）を利用可能であるとの報告もある（Huston

４．まとめ

ほか，2002）。一方Staphylococcus属細菌やBacillus

火山帯や鉱山跡採掘滓などから単離されている鉄属でも重金属に耐性を持つ株が報告されている酸化細菌としては好酸性グラム陰性細菌の（Turgayほか，2012）。本研究で単離された細菌はAcidithiobacillus ferrooxidansやAcidithiobacillus

硫酸銅／硫酸鉄（II）耐性を示し，窒素源や炭素源

thiooxidansが報告されており（塩田ほか，1989；

として，それぞれ前述のアミノ酸や糖を利用可能でJohnsonほか，1992；Paulinoほか，2001），これらあり，また中性付近で生育が可能であったが，好気の細菌が関与する金属硫化鉱物からの金属溶出およ

的かつ中性条件下でFeSO4 を用いてスクリーニング

び酸性化機構（間接溶出説）が提唱されている。塩を行ったためFe への空気酸化の影響があり，硫酸田ほか（1989）によると，黄鉄鉱（FeS 2 ）が空気

鉄（II）耐性として単離された細菌が，実際の黄鉄

酸化を受けFeSO4 と硫酸が生成し，この酸性条件下

鉱等のFe（II）を利用可能かどうかは不明である。

（pH2.0）で鉄酸化細菌によりFe（SO24）
3 が生成する。

前述の間接溶出説では酸性条件下の場合であるが，生成したFe（SO24）
3 は再度黄鉄鉱に作用し，FeSO 4

中性，アルカリ性での黄鉄鉱などからの金属溶出にと硫酸を生じる。酸性条件下で鉄酸化細菌の存在には嫌気性の中性鉄酸化細菌や光合成細菌などの関与

より，このサイクルが繰り返されることが，周辺環が示唆されており，鉱石や採掘滓内部の嫌気的な環境の酸性化や鉄溶出の原因と考えられている。一方境にあるFe（II）を酸化する（塩田ほか，1989）。こでこれらの鉄酸化細菌は，岩手県旧松尾鉱山跡の強の点に関しては，今回単離した２種のStreptomyces

酸性鉱山廃水の処理やバイオリーチングなどにも用属細菌（F47，F56）がFerroxidase活性を有しておいられている（Wangほか，2009）。

り，Fe（II）を酸化できる可能性があることから，

3+

一方本研究では，吉野川流域に存在した黄銅鉱，

今後，嫌気的条件下または酸性条件下での鉄酸化能

硫化鉄鉱の鉱山跡採掘滓から，硫酸銅または硫酸鉄

や実際の黄鉄鉱等への作用を検討する必要があり，に耐性を示す細菌の探索を行った。その結果，白滝

その他の単離した細菌に関しても同様の検討を行う

鉱山跡（高知県大川村）では３種のStreptomyces

ことで，将来的には硫酸銅／硫酸鉄（II）耐性細菌

属細菌を（C2，F47，F56），東山鉱山跡（徳島県を用いたバイオレメディエーションに応用できる可

吉野川市美郷）からはPseudomonas属細菌を能性があると考えられる。

（HYC24），高越鉱山跡（徳島県吉野川市山川町）
からはStaphylococcus属細菌（K2F10）および195

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吉野川流域の鉱山跡周辺における重金属耐性微生物の探索

吉野川市高越鉱山・東山鉱山など／極限環境微生物班

謝辞
本研究は，平成18年〜20年度文部科学省現代的教育ニーズ取組み支援プログラム（現代GP）「豊饒な吉野川を持続可能とする共生環境教育」（実施校：
徳島大学総合科学部）の援助を受け実施された。また，平成19年度徳島大学教育研究支援経費および平成21年度徳島大学総合科学部創生プロジェクト研究
経費の援助を受けて実施された。
徳島県吉野川市山川町での高越鉱山跡での試料採取について，NPO法人元気やまかわネットワークの原井恵美様をはじめとする会員各位のご指導・ご協力を頂いた。また，白滝鉱山跡での試料採取について，徳島大学大学院金井拓氏，青木拓氏，北村真一氏のご協力を頂いた。この場を借りて，厚く御礼申し上げます。
文献
Albarracin, V.H., Avila, A.L., Amoroso, M.J., Abate, C.M.
（2008）Copper removal ability by Streptomyces strains
with dissimilar growth patterns and endowed with cupric
reductase activity. FEMS Microbiol. Lett. 288, 141−148.
Beffa, T., Blanc, M., Lyon, P.F., Vogt, G., Marchiani, M.,
Fischer, J.L., Aragno, M.（1996）Isolation of Thermus
strains from hot composts（60 to 80 degrees C）. Appl.
Environ. Microbiol. 62, 5, 1723−1727.
Bonomi, F., Kurtz Jr., D.M., Cui, X.（1996）Ferroxidase
activity of recombinant Desulfovibrio vulgaris
rubrerythrin. J Biol Inorg Chem., 1, 67−72.
Cheng, X.J., Yoshihara, E., Takeuchi, T., Tachibana, H.（2004）
Molecular characterization of peroxiredoxin from
Entamoeba moshkovskii and a comparison with
Entamoeba histolytica. Mol Biochem Parasitol. 138, 2,
195−203.
Huston, W.M., Jennings, M.P., McEwan, A.G.（2002）The
multicopper oxidase of Pseudomonas aeruginosa is aferroxidase with a central role in iron acquision. Mol.
Microbiol. 45, 6, 1741−1750.
Johnson, D.B., Ghauri, M.A., Said, M.F.（1992）Isolation andcharacterization of an acidophilic, heterotrophic bacterium
capable of oxidizing ferrous iron. Appl. Environ. Microbiol.

58, 5, 1423−1428.
Konstantinidis, K.T., Isaacs, N., Fett, J., Simpson, S., Long,
D.T., Marsh, T.L.（ 2003） Microbial Diversity andResistance to Copper in Metal-Contaminated Lake
Sediment. Microb. Ecol. 45, 191−202.
Louis, M.S., Kothe, E., Abate, C.M.（ 2009） Cadmium
biosorption by Streptomyces sp. F4 isolated from former
uranium mine. J. Basic Microbiol. 49, 1−8.
Nord, C.E., Lindberg, A.A., Dahlbäck, A.（1974）Evaluation offive test-kits-API, AuxoTab, Enterotube, PathoTec and RB-for identification of Enterobacteriaceae. Med Microbiol
Immunol. 159, 3, 211−220.
Paulino, L.C., Bergamo, R.F., Mello, M.P, Garcia Jr., O., Manfio,
G.P., Ottoboni, L.M.M.（2001）Molecular characterization of
Acidithiobacillus ferrooxidans and A. thiooxidans strains
isolated from mine wastes in Brazil. Antonie van
Leeuwenhoek, 80, 65−75.
Pitari, G., D'Andrea, G., Salucci, M.L., Rossi, A., Avigliano, L.
（ 1998） Effect of tunicamycin on the activity andimmunoreactivity of ascorbate oxidase（Cucurbita pepo
medullosa）expressed in cultured green zucchini cells.
Glycoconj J. 15, 8, 777−782.
Schmidt, A., Schmidt, A., Haferburg, G., Kothe, E.（2007）
Superoxide dismutase of heavy metal resistant
streptomycetes. J. Basic Microbiol. 47, 56−62.
Shigeoka, S., Nakano, Y., Kitaoka, S.（1980）Metabolism ofhydrogen peroxide in Euglena gracilis Z by L-ascorbic
acid peroxidase. Biochem J. 186, 1, 377−380.
塩田日出夫ほか高分子学会バイオ・高分子研究会編（1989）９．
硫黄・鉄酸化細菌の鉱床地帯における生態，特異な機能を有する微生物とその応用, 学会出版センター，pp.189−211．
Taguchi, S., Kojima, S., Terabe, M., Miura, K., Momose, H.
（1994）Comparative studies on the primary structures andinhibitory properties of subtilisin-trypsin inhibitors from
Streptomyces. Eur J Biochem. 220, 3, 911−918.
東明省三，石田啓祐，森江孝志，阿部 肇，西山賢一（2012）
吉野川市山川町に分布する段丘堆積物と鉱山跡，阿波学会紀要, 吉野川市山川町総合学術調査報告，56，in press
Turgay, O.C., Görmez, A., Bilen, S.（2012）Isolation andcharacterization of metal resistant-tolerant rhizospherebacteria from the serpentine soils in Turkey. Environ.
Monit. Assess. 184, 515−526.
Wang, J., Bai, J., Xu, J., Liang, B.（2009）Bioleaching of metals
from printed wire boards by Acidithiobacillus
ferrooxidans and Acidithiobacillus thiooxidans and their
mixture. J. Hazard. Material. 172, 1100−1105.
山川町史編集委員会編（1987）改訂山川町史，pp.275−282.

Exploration for Cu, Fe-resistant bacteria from copper mine spoils in the Yoshino River basin, Shikoku．
SATOH Takanori, ENDO Yousuke, SHIBAGAKI Haruka, NISHIYAMA Ken−ichi, ISHIDA Keisuke, YAMASHIRO Tadashi,

Proceedings of Awagakkai, No. 58（2012）, pp.187−196．

196