相同組換えで色々できちゃう DNA クローニング
永野

幸生 1*・飯笹英一 2

ここでは特定の DNA 領域を，プラスミドベクターにDNA 二本鎖切断修復時の相同組換えは，通常，姉妹組み込むことを DNA クローニングと定義する．厳密な染色分体間で起こる．母系由来染色体と父系由来染色体

定義ではないけれども，研究や開発の現場では，この意の間で起こる反応と誤解されることもあるが，これでは味で使われていることが多いであろう．本手法は生命科

DNA が修復できるとは限らず，むしろヘテロ接合性が学研究の基盤技術であるので，読者の中には，日常的に喪失する原因，つまり片方のアリルだけになる原因になDNA クローニングを行っている人が多いはずである．さて，DNA クローニングにはさまざまな手法がある．制る．このヘテロ接合性喪失はがん抑制遺伝子の機能喪失

限酵素とリガーゼを使う手法は，古典的であるけれども，伝的分化における役割は，生物工学系の研究者が大好きもっとも利用者が多いはずである．それ以外にも，さまな産業生物でも注目されており，清酒酵母では育種上のざまな試験管内 DNA 連結反応系があり，それらを使っ重要性が指摘されている 5)．また，筆者の一人の永野らている読者も多いことであろう．特に，部位特異的組換は，無性生殖することが多いカンキツの遺伝的分化機構

え酵素を使う *DWHZD\ 法は，モデル生物に関する cDNAとして，このヘテロ接合性喪失を提唱している 6)．さて，のリソースが整備されている点で，一日の長がある．

姉妹染色分体の DNA 配列の代わりに，相同配列を持つとも深く関係している 4)．近年，ヘテロ接合性喪失の遺さて，ここでは，相同組換えによる DNA クローニン

外来の DNA を細胞に導入すれば，DNA 二本鎖切断修グ技術についてのよもやま話を繰り広げる．本技術は，復時の相同組換え反応が起こり，外来 DNA が染色体に細 胞 内 で DNA 連 結 す る 点 が， さ ま ざ ま な 試 験 管 内組み込まれることが容易に想像できるであろう．外来DNA 連結反応系と異なる．試験管内 DNA 連結反応系には複数の種類があるが，どれにおいても DNA 連結のDNA の相同組換えによる染色体への導入は，遺伝子ための実験戦略の立て方はきわめて類似している．一方は，ゲノム編集技術と組み合わせて使用されている．同で，相同組換えによる DNA クローニング技術では，そ様に，外来 DNA にプラスミドと相同な配列を持たせるの戦略さえ違うところに注目して読んで頂きたい．とこことで，相同組換えは，外来 DNA をクローニングする

1)

ろで，操作手順に関しては，ウェブ上の英文記事 ，あ2)

るいは，岡山大学の守屋らの和文記事 がある．前者は，ノックアウト技術としても活用されており，特に近年で技術として活用できるわけである．ただし，遺伝子ノックアウトが可能な宿主であっても，より難度が高い技術

特殊な実験手順を写真入りで紹介しており，後者は，実である「相同組換えによる DNA クローニング」が可能

験原理の説明が詳しい．とは限らない．

相同組換えとは相同組換えによる DNA クローニング技術

相同組換えとは，相同な DNA 配列同士が組換わって相同組換えによる DNA クローニングにもっとも適し連結する反応である．メカニズムの詳細は定番の教科書 3)

た宿主は，パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）である．などを参照してほしい．相同組換えは，減数分裂時の交「非相同末端結合を防ぎつつ，相同組換えを活用すれば，叉や，DNA 二本鎖切断修復に関わっている．相同組換目的とする相同な DNA 配列同士の連結が行える」と上えを活用した DNA クローニングでは，後者の DNA 二述したが，パン酵母は，非相同末端結合の活性が低く，本 鎖 切 断 の 修 復 反 応 を 利 用 し て い る． さ て， 本来の相同組換えの活性が高い．さらに，パン酵母には，細胞DNA 二本鎖切断修復では，相同組換えと非相同末端結合（DNA 切断端を連結するのみの反応）の二つのメカ内に導入する直鎖状 DNA を分解してしまうエキソヌク
レアーゼ活性が低く，かつ，形質転換効率が高いなどのニズムが作動する．クローニングに応用する際には非相利点もある．DNA クローニングのためには，まず，直同末端結合を防ぎつつ，相同組換えを活用すれば，目的鎖状のプラスミド DNA を用意する（図 1A）．このプラとする相同な DNA 配列同士の連結が行える．

スミドは酵母用の複製起点と選択マーカーを持つ必要が*1 佐賀大学 総合分析実験センター（准教授） (PDLOQDJDQR#FFVDJDXDFMS
2鹿児島大学大学院医歯学総合研究科（助教） (PDLOHLL]DVD#PNXIPNDJRVKLPDXDFMS
2015年 第10号
著者紹介623

ある．それらを必要としない方法については，後で記す．

組換えが起こり，母系由来染色体と父系由来染色体に由

直鎖状プラスミドは，制限酵素で切断したものでも良い

来する DNA 配列が混ざり合った産物が生まれる場合がし，PCR で調製したものでも良い．直鎖状のプラスミあることである．また，大腸菌と違って，プラスミドのドは細胞内では複製できないが，DNA クローニングの不和合性がないため，大腸菌に導入し直さない限り，細過程で，相同な配列同士が連結して環状になったものの胞内に複数種類の産物が存在する可能性が否定できなみが複製できる．次に，プラスミドにクローニングしたい．つまり，単一のクローンが得られるとは限らないの

い DNA を用意する．通常は，PCR 反応によって，これである．この文章の冒頭で，DNA クローニングというにプラスミドと相同な 30 bp 前後の DNA 配列を付加す言葉を定義したのは，この理由による．とにかく連結しる．PCR 産物の精製は必要ない．この付加する配列は，たい DNA を用意したら，後はそれらを酵母に形質転換

プラスミドの末端と相同な配列でなくても良い．組換えするだけでよい．酵母内で相同組換えが起こり，狙った反応の結果，プラスミドの複製起点や選択マーカーが失環状プラスミドを得ることができる．

われない位置であれば，プラスミド上のどこでも良い．

相同組換えによる DNA クローニング技術を有名にしまた，多断片連結が容易にできるので，多数の互いに相たのは，クレイグ・ヴェンター研究所による偉大な研究

同な DNA 断片を用意しても良い（図 1B）．また，連結「マイコプラズマの全ゲノム再構築」によるところが大したい DNA およびプラスミド DNA の両者と相同性がきい 9)．各々 NE の DNA 断片を連結し NE の DNA 断

あ る オ リ ゴ DNA を 用 意 し て も 良 い（ 図 1C）． オ リ ゴ片を作り，その各々 NE の DNA 断片を連結し NE

DNA は一本鎖でも二本鎖でも良いし，一本鎖の場合，向きはどちらでも良い．図 1C の挿入する二本鎖 DNAがゲノム DNA でも構わないので，ゲノム DNA から特の DNA 断片を作り，さらにその各々 NE の DNA 断片を連結し約 1 Mb のゲノムを作るのに，パン酵母を宿主とした DNA 多断片連結が用いられた．

定領域を取り出すことも可能である 7)．また，多断片連

パン酵母がもっとも適した宿主であるとしたが，他の結法の応用となるが互いに相同な多数のオリゴ DNA で宿主はどうであろうか．分裂酵母（Schizosaccharomyces8)も良い（図 1D） ．注意しなければならないのは，ヘテpombe）に関しては，相同組換えによる DNA クローニ

ロ接合性の検体から PCR を行った場合，PCR 産物間でングが可能なことを，前述の守屋のグループ 10) や，島根大学の松尾ら 11) が示している．この松尾は，筆者の一人である飯笹の佐賀大学農学部・農学研究科の同級生でもある．飯笹の影響を受けた研究であることはおそらく間違いないであろう．周りの同級生の研究に興味を持たない学生は見習ってほしい．また，ピキア酵母（メタノール資化性酵母）に関しては，京都大学の水谷らが報告している 12)．水谷は，相同組換えによる DNA クローニング技術に関する優れた英文総説を書いている 13)．膜タンパク質研究への本技術の応用が，水谷の総説では詳しい．
では，組換え DNA 操作の際のもっとも代表的な宿主である大腸菌はどうであろうか．守屋らの和文記事では，報告があるが再現性が悪いと記しているが，私たちは再現さえできていない．大腸菌で効率的に DNA クローニングができるとする最新の報告 14) があるが，これについては，まだ私たちは検証していない．後述する，パン酵母を宿主とした場合の特長をこの大腸菌の系が有するのかが興味の持たれるところである．
本技術の特長図 1．相同組換えによる DNA 連結の概要．二本鎖 DNA を二本の実線，一本鎖 DNA を一本の実線，組換え反応が起こり結合する部分，つまり互いに相同な部分を交叉する点線で示した．

624

本技術の優れた点は，なんと言っても，多断片を容易にクローニングできる点であろう．多数箇所の変異導入
生物工学

第93巻

に多断片 DNA 連結法は活用できるが，これについてもも守屋による和文記事に良い実験例が紹介されている 2)．

守屋による和文記事 2) を参照されたい．NE を越える

一般的なクローニングではマルチクローニングサイトにDNA 断片をクローニングしたい場合，NE を越える一つの PCR 断片をクローニングするよりも，数 NE のPCR 断片を多断片連結した方が，クローニング効率が高いことを経験している．これは PCR 反応中の副産物DNA 断片を連結するのが通常であるが，本技術においの影響を受けるからであろう．ヴェンター研究所の合成ニングサイト以外が切断されると困ってしまう．このよゲ ノ ム 研 究 に お い て は，2008 年 の 論 文 15) で は 後 にうな場合，本技術では，切断する部位をブリッジするオGibson アセンブリー16)と呼ばれる試験管内多断片 DNAては，直鎖状のプラスミドを調製するのにマルチクローニングサイトが有用であるという認識だけで良い．
また，試験管内 DNA 連結反応系では，マルチクローリゴ DNA，PCR 産物，あるいは，他の制限酵素で切断連結法を併用しているけれども，最終的に全ゲノム再構したプラスミド DNA の切断物を一緒に混ぜるだけで，築を実証した 2010 年の論文では，上述のように酵母に切断部位を連結することができる（図 )）．

よる多断片 DNA 連結法を用いている．しかし，試験管このように，試験管内 DNA 連結反応系とは，実験戦内の多断片 DNA 連結を可能にした点で Gibson アセン

略の立て方が違うということを頭に入れて，実験を行う

ブリーは意義深く，方法が公開されているので試薬を比必要がある．また，本技術は高価な酵素をあまり使わな較的安価に自作できる点が良い．また，これもすでに触いため，安価である．

れたが，相同組換えは，PCR 産物などの DNA 断片だけでなく，多数のオリゴ DNA の連結に活用することもで本技術の一般的なプラスミドベクターへの応用

きる 8)．Gibson アセンブリーの開発者による単著論文に本技術には大きな問題がある．パン酵母内でプラスミ詳細は記載されているが，この方法は Gibson アセンブドを増幅，選抜するためには，酵母の複製起点と選択マーリーとは言わないので，注意されたい．近年，人工合成

カーのカセットが必要である．しかし，一般的なプラス遺伝子の受託価格が著しく低下しているため，本技術にミドベクターにはそれがないため，本技術は，日常的による多数のオリゴ DNA の連結法の出番は少ないと思う．

行う DNA クローニングには使用できない．しかし，筆また，人工合成遺伝子の作製技術として，本技術が用い者の一人である飯笹が佐賀大学農学部四年生の時に，本られているわけではない．しかし，構築済みのプラスミ技術を一般的なベクターの DNA クローニングに容易にドベクターに 100 bp 程度またはそれ以上の DNA 配列を適用する方法を発案した．当時，飯笹は，植物の受容体付加したいときに，多数のオリゴ DNA の導入法は重宝タンパク質を網羅的に発現させる実験を行っていた．最する．

初は，酵母をその発現宿主に用いていたため，発現ベクまた，DNA 連結効率が DNA の大きさに影響を受けター構築に，簡便な本技術を用いていた．そのおかげで，ないことも本技術の優れた点の一つである．本技術で大研究室に入りたてで，実験技術がおぼつかなかった彼できな DNA が扱えることは，ヴェンター研究所による研も，難なく 10 個程度の受容体遺伝子を発現ベクターに究からも自明であろう．植物形質転換用ベクターに関しクローニングすることができた．色々とコツを要する制ては，プラスミドサイズが巨大なために，クローニング

限酵素とリガーゼの方法と違い，誰にでも比較的容易にに苦労することが多々あるが，本技術を使えば苦労するできることも本技術の特長である．しかし，肝心のタンことはない

17)．

パク質の発現の方が芳しくなかったため，続いて，大腸さらに忘れてはならない本技術の大きな利点は，組換菌での発現を検討することにした．ところが，今度は，え部位の自由度の高さである．本技術は，実験戦略の立制限酵素とリガーゼで発現ベクターの構築を試みたとこて方が，試験管内 DNA 連結反応系とは異なると前述しろ，なかなか上手く行かず，彼は筆者のもう一人であるた．試験管内 DNA 連結反応系では，連結反応が起こる

永野からプレッシャー（叱咤激励？）をかけられながら，場所は，多くの場合，DNA の末端である．*DWHZD\ 法毎日試行錯誤していた．しかし，彼がある時，昔の実験などは例外であるが，DNA 上の特定の場所であることノートにあった酵母発現ベクターとその時に使っていたに変わりはない．一方，本技術では，連結反応が起こる大腸菌発現ベクターのマップを見て，それらにファージ場所は DNA 末端などの特定の場所ではない．図 1E で示の f1 複製起点と大腸菌の pUC/pBR 複製起点の二つの共した置換反応がわかりやすい例であろう．特定の DNA通配列があり，その配列で相同組換えが起これば，酵母領域を，その領域を試験管内の操作で除くことなく，他複製起点と酵母選択マーカーのカセットが大腸菌ベクの領域に置換することができるのである．これについてターに組み込まれることに気付いた．さらに，その二つ

2015年 第10号

625

のベクターとともに，相同な配列を付加した目的の遺伝も開発した 20)．トランスポゾンの挿入や，宿主の変異が子配列を酵母に導入すれば，本技術を用いて，大腸菌ベ効率低下に寄与するような，きわめて効率が高いシステクターを大腸菌 – 酵母シャトルベクターに変換すると同ムである．効率を 99％から 99.8％にあげるために，大時に，そこに目的遺伝子をワンステップでクローニング

学院生の後藤に一年くらい苦労させた．

できると直感した．早速この方法を試してみたところ，あっという間に，今まで苦労していた受容体遺伝子の大おわりに腸菌発現用のベクターが作製できた．さらに，永野が，本技術は，いくつかある DNA クローニング法の一つ

f1 複製起点ではなく，多くの pUC 系プラスミドが有する pUC/pBR 複製起点と Ampr の配列で組換えを起こす
図 2 のようなヘルパープラスミドを開発すれば，汎用性である．前述のように，数ある方法の中で，部位特異的cDNA のリソースが整備されている点で，一日の長があが高いことを発案し，本方法が完成した次第である 18)．

る．しかし，次世代シーケンサーやゲノム編集技術の登本方法の原理は，これまで文章を読んでいただいた方に場で，モデル生物以外でも研究がしやすくなったと思っは，図を見ればわかるであろう．植物形質転換用ベクターている方々は多いのではなかろうか．そのような方々に，はアンピシリン抵抗性遺伝子を持たないので，植物用のゲノム編集の際のターゲティングベクターなど複雑なベシステムも開発している 17)．なお，通常のプラスミドベクターを作製する際に，柔軟性に富む本技術に興味を®

クターを酵母ベクターに変換するためのDNA GeneArt

High-Order Vector Conversion Cassette が市販されているが，本方法と同様のシステムであるにもかかわらず，酵母ベクターへの変換に本技術を用いていないのは驚くべきことである．なお，飯笹の当初の目的であった植物受容体研究は，結局，パン酵母発現系により実を結び，すでに Google Scholar ベースで 100 件以上の引用がある論文となった 19)．
後に，非相同末端結合などによるさまざまな副産物を排除することで，さらに DNA 連結効率をほぼ 100％にまで高めた XOWUDORZ EDFNJURXQG '1$ FORQLQJ V\VWHP

図 2．酵母用ではない一般的プラスミドに本技術を適用する
方法

626

組換え酵素を使う *DWHZD\ 法は，モデル生物に関する持っていただけたら幸いである．
文献

  KWWSZZZELRSURWRFRORUJZHQ]KDQJDVS["LG 2) 守屋央朗，蒔苗浩司：実験医学，32, 2145 (2014).
3) ワトソンら：ワトソン遺伝子の分子生物学，p. 283, 東京電機大学出版局 (2010).
  :HLQEHUJ 5 $ 7KH %LRORJ\ RI &DQFHU S 
Garland Science (2013).
5) 赤尾 健：化学と生物，52, 223 (2014).
  7VKHULQJ3HQMRUet al.Sci. Rep., 4, 4853 (2014).
  .RXSULQD 1 DQG /DULRQRY 9 Nat. Protoc., 3, 371(2008).
  *LEVRQ'*Nucleic Acids Res., 37, 6984 (2009).
9) Gibson, D. G. et al.Science, 329, 52 (2010).
10) Chino, A. et al.PLoS One, 5, e79652 (2010).
  0DWVXR< et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., 74, 685(2010).
  0L]XWDQL.et al.Protein Expr. Purif., 77, 1 (2011).
  0L]XWDQL . Biosci. Biotechnol. Biochem., 79, 1(2015).
  )X-et al.Nat. Biotechnol., 30, 440 (2012).
15) Gibson, D. G. et al.Science, 319, 1215 (2008).
16) Gibson, D. G. et al.Nat. Methods, 6, 343 (2009).
17) Nagano, Y. et al.Plant Cell Rep., 26, 2111 (2007).
  ,L]DVD(DQG1DJDQR<Biotechniques, 40, 79 (2006).
19) Iizasa, E. et al.J. Biol. Chem., 285, 2996 (2010).
  *RWR.DQG1DJDQR<PLoS One, 8, e56530 (2013).

生物工学

第93巻