排出ガス、ばいじん及び燃え殻のダイオキシン類簡易測定法マニュアル（生物検定法）平成２２年３月

環境省水・大気環境局総務課ダイオキシン対策室

マニュアルの改訂にあたって
排出ガスやばいじん及び燃え殻に含まれるダイオキシン類の測定については、極微量の測定となるため、これまで高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計を用いた測定方法により行われてきたが、この方法では多大な時間と費用が必要となり、特定施設設置者などにとって大きな負担となってきた。
このような負担を軽減し、ダイオキシン類の長期的管理の基盤となる測定やモニタリングが効果的かつ効率的に行われるようにするため、環境省では迅速で低廉な、いわゆる簡易測定法の導入を検討し、平成 16
年 12 月にダイオキシン類対策特別措置法施行規則（平成 11 年総理府令第 67 号）の一部を改正して、廃棄物焼却炉からの排出ガス（焼却能力 2,000kg/h 未満）やばいじん及び燃え殻に含まれるダイオキシン類の測定の一部に簡易測定法を追加するとともに、平成 17 年 9 月にダイオキシン類対策特別措置法施行規則第二条
第一項第四号の規定に基づき環境大臣が定める方法（平成 17 年環境省告示第 92 号。以下「方法告示」という。
）を定め、４種類の生物検定法を指定した。
その後の科学的な知見の蓄積などを踏まえ、平成 22 年 3 月に方法告示の一部を改正し、新たに６種類の生物検定法を追加した。今般、この改正を受けて、本マニュアルを改訂し、当該測定方法を追加するとともに、マニュアルに記載されている事項の見直しを行った。
本マニュアルが、ダイオキシン類の測定やモニタリングのより効果的かつ効率的な実施に寄与し、ダイオキシン類の削減に役立つことを期待する。

平成 22 年 3 月 31 日

環境省水・大気環境局総務課ダイオキシン対策室（マニュアル制定・改正履歴）
平成 17 年 9 月 14 日制定
平成 18 年 3 月 23 日改訂
平成 20 年 3 月 17 日改訂
平成 22 年 3 月 31 日改訂

ダイオキシン類生物検定法等簡易測定法検討会委員名簿（～平成 17 年度）(敬称略、五十音順)
伊藤 裕康

独立行政法人国立環境研究所 化学環境研究領域 計測管理研究室

小森 行也

独立行政法人土木研究所 水循環研究グループ

酒井 伸一

京都大学 環境保全センター

滝上 英孝

独立行政法人国立環境研究所 循環型社会形成推進・廃棄物研究センター
有害廃棄物管理研究室

半野 勝正

千葉県 環境研究センター 廃棄物・化学物質部 化学物質研究室

細見 正明

東京農工大学大学院 共生科学技術研究部

宮田 秀明

摂南大学 薬学部○森田 昌敏渡邉肇

独立行政法人国立環境研究所
自然科学研究機構 岡崎統合バイオサイエンスセンター

ダイオキシン類生物検定法等簡易測定法検討会委員名簿（平成 19 年度～平成 21 年度）(敬称略、五十音順)
伊藤 裕康

独立行政法人国立環境研究所 化学環境研究領域 有機環境計測研究室

太田 壮一

摂南大学 薬学部 衛生薬学科

鈴木 規之

独立行政法人国立環境研究所 環境リスク研究センター 曝露評価研究室

滝上 英孝

独立行政法人国立環境研究所 循環型社会・廃棄物研究センター 物質管理研究室

鑪迫 典久

独立行政法人国立環境研究所 環境リスク研究センター 環境曝露計測研究室（平成 20 年度～）

半野 勝正
○森田 昌敏千葉県 環境研究センター 廃棄物・化学物質部 化学物質研究室
国立大学法人愛媛大学 農学部生物資源学科、独立行政法人国立環境研究所（生物検定法検討作業部会／分科会）○鈴木 規之独立行政法人国立環境研究所 環境リスク研究センター 曝露評価研究室

鑪迫 典久

独立行政法人国立環境研究所 環境リスク研究センター 環境曝露計測研究室

滝上 英孝

独立行政法人国立環境研究所 循環型社会・廃棄物研究センター 物質管理研究室

半野 勝正

千葉県 環境研究センター 廃棄物・化学物質部 化学物質研究室

中村 朊之

宮城県 保健環境センター 環境化学部（平成 19 年度）

○：座長

目

次

第１章

概論 ........................................................................... 1

第１節
第２節
第３節
第４節

対象物質........................................................................ 1
引用規格........................................................................ 1
用語の定義...................................................................... 1
測定方法の概要.................................................................. 3

第２章

各論(生物検定法に共通する事項) .................................................. 6

第１節 試料採取方法 ....................................................................6
第２節 測定結果の報告 .................................................................10
第３節 測定データの精度管理 ...........................................................14
第３章 各論(ダイオキシン類がアリール炭化水素受容体に結合することを利用した方法)......... 29
その１ 前処理に、硫酸シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性
組換え細胞 H1L6.1c2 を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 1 の 1)............................................ 29
第１節 測定方法の概要 ..................................................................29
第２節 用語の定義 ......................................................................29
第３節 試料採取方法に関する特記事項 ....................................................30
第４節 試料の前処理 ....................................................................32
第５節 測定 ............................................................................39
第６節 参考資料 ........................................................................56
その２ 前処理に、硫酸シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性
組換え細胞 101L を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する
方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 1 の 2) ............................................... 57
第１節 測定方法の概要 ..................................................................57
第２節 用語の定義 ......................................................................57
第３節 試料採取方法に関する特記事項 ....................................................58
第４節 試料の前処理 ....................................................................59
第５節 測定 ............................................................................65
第６節 参考資料 ........................................................................75
その３ 前処理に、多層カラムを使用し、測定にダイオキシン類応答性組換え細胞 HeB5 を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第92 号第 1 の 3) ......................................................................... 76
第１節 測定方法の概要 ..................................................................76
第２節 用語の定義 ......................................................................76
第３節 試料採取方法に関する特記事項 ....................................................76
第４節 試料の前処理 ....................................................................78
第５節 測定 ............................................................................85
第６節 参考資料 ........................................................................95
その４ 前処理に、硫酸シリカゲル加熱還流法を利用し、測定に、ダイオキシン類応答性組換え細胞
H4ⅡE-luc を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 1 の 4) ................................................... 96i

第１節 測定方法の概要 ..................................................................96
第２節 用語の定義 ......................................................................96
第３節 試料採取方法に関する特記事項 ....................................................97
第４節 試料の前処理 ....................................................................99
第５節 測定 ...........................................................................104
第６節 参考資料 .......................................................................113
その５ 前処理に、多層シリカゲルカラム及びアルミナカラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答
性組換え細胞 DR-EcoScreen を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等
量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 1 の 5) ................................... 114
第１節 測定方法の概要 .................................................................114
第２節 用語の定義 .....................................................................114
第３節 試料採取方法に関する特記事項 ...................................................115
第４節 試料の前処理 ...................................................................117
第５節 測定 ...........................................................................124
第６節 参考資料 .......................................................................135
その６ 前処理に、硫酸及び多層シリカゲルカラムを使用し、測定に、ダイオキシン類、アリール炭化
水素受容体及びアリール炭化水素受容体核運搬タンパク質の複合体形成反応を利用してダイオキシン
類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 1 の 6) ......................... 137
第１節 測定方法の概要 .................................................................137
第２節 用語の定義 .....................................................................137
第３節 試料採取方法に関する特記事項 ...................................................138
第４節 試料の前処理 ...................................................................140
第５節 測定 ...........................................................................148
第６節 参考資料 .......................................................................159
第４章 各論(ダイオキシン類を抗原とする抗原抗体反応を利用した方法) ..................... 160
その１ 前処理に、多層シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、抗ダイオキシン類モノ
クローナル抗体及びプレート固相抗原を用いた間接競合酵素免疫測定法を利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 2 の 1) ............................. 160
第１節 測定方法の概要 .................................................................160
第２節 用語の定義 .....................................................................160
第３節 試料採取方法に関する特記事項 ...................................................161
第４節 試料の前処理 ...................................................................162
第５節 測定 ...........................................................................168
第６節 参考資料 .......................................................................180
その２ 前処理に、多層シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、磁性ビーズ固定化抗ダイオキシン類モノクローナル抗体及び酵素標識抗原を用いた直接競合酵素免疫測定法を利用してダイ
オキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 2 の 2) ................. 181
第１節 測定方法の概要 .................................................................181
第２節 用語の定義 .....................................................................181
第３節 試料採取方法に関する特記事項 ...................................................182
第４節 試料の前処理 ...................................................................184
第５節 測定 ...........................................................................190
第６節 参考資料 .......................................................................202
その３ 前処理に、多層シリカゲルカラム及びアルミナカラムを使用し、測定に、抗ダイオキシン類モ
ノクローナル抗体及びプレート固相抗原を用いた間接競合酵素免疫測定法を利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 2 の 3) ........................... 203
ii

第１節 測定方法の概要 .................................................................203
第２節 用語の定義 .....................................................................203
第３節 試料採取方法に関する特記事項 ...................................................204
第４節 試料の前処理 ...................................................................206
第５節 測定 ...........................................................................213
第６節 参考資料 .......................................................................225
その４ 前処理に、多層シリカゲルカラム及びアルミナカラムを使用し、測定に、抗ダイオキシン類モ
ノクローナル抗体及び抗原固相化ビーズを用いた結合平衡除外法を利用してダイオキシン類の毒性等
量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 2 の 4) ................................... 227
第１節 測定方法の概要 .................................................................227
第２節 用語の定義 .....................................................................227
第３節 試料採取方法に関する特記事項 ...................................................228
第４節 試料の前処理 ...................................................................231
第５節 測定 ...........................................................................238
第６節 参考資料 .......................................................................252

iii

iv

第１章

概論

本マニュアルに記載する各測定方法は、廃棄物焼却炉のうち焼却能力が 1 時間当たり 2,000 キログラム未満の施設において当該施設設置者が排出ガスに含まれるダイオキシン類の量を測定する場合並びに廃棄物焼却炉において当該施設設置者がばいじん及び焼却灰その他の燃え殻（以下「ばいじん及び燃え殻」という。）に含まれるダイオキシン類の量を測定する場合に用いることができるものであり、罰則の適用に係る測定に用いることはできないものである。なお、今後、測定技術の進歩や科学的知見の集積等により、必要に応じ
本マニュアルの改訂があり得るものである。

第１節

対象物質

本マニュアルに記載する各測定方法では、毒性等価係数を有するダイオキシン類(ポリ塩化ジベンゾフラン、
ポリ塩化ジベンゾ－パラ－ジオキシン及びコプラナーポリ塩化ビフェニル)を測定対象とし、各測定法による実測濃度に所定の係数を乗じて測定量(毒性等量)を算出する。

第２節

引用規格

次に掲げる規格は、本マニュアルに引用されることによって、各測定方法の一部を構成する。これらの引用規格は、その最新版(追補を含む)を適用する。
JIS K0095

排ガス試料採取方法

JIS K0211

化学分析用語(基礎部門)

JIS K0215

化学分析用語(分析機器部門)

JIS K0301

排ガス中の酸素分析方法

JIS K0311

排ガス中のダイオキシン類の測定方法

JIS K0901

気体中のダスト試料捕集用ろ過材の形状、寸法並びに性能試験法

JIS R3503

化学分析用ガラス器具

JIS R3505

ガラス製体積計

JIS Z8808

排ガス中のダスト濃度の測定方法

JIS Z9020

管理図－一般指針

JIS Z9021

シューハート管理図

なお、精度管理については、環境省において公表している「ダイオキシン類の環境測定に係る精度管理の手引き（生物検定法）」及び「ダイオキシン類の環境測定を外部に委託する場合の信頼性の確保に関する指針」
を参照するとともに、高分離能ガスクロマトグラフ質量分析計を用いる場合にあっては、「ダイオキシン類の環境測定に係る精度管理指針」を参照する。

第３節

用語の定義

本マニュアルで用いられる用語の定義を以下に説明する。なお、各測定方法に固有の単語については、第3 章及び第 4 章各論において、説明する。
1

1)

TEF

毒性等価係数 (2,3,7,8-TeCDD Toxicity Equivalency Factor)。ダイオキシン類の各異性体の毒性の強さを、ダイオキシン類の中で最強の毒性を有する異性体である 2,3,7,8-四塩化ジベンゾ-パラジオキシンの毒性を 1 としたときの相対的な値として表したもの。
2)

TEQ

毒性等量(2,3,7,8-TeCDD Toxicity Equivalency Quantity)。ダイオキシン類の量（ダイオキシン類全体の毒性の強さ）を表すものであり、ダイオキシン類の各異性体の量を 2,3,7,8-四塩化ジベン
ゾ-パラ-ジオキシンの毒性に換算し、合計したもの。
WHO/IPCS(2006)の TEF

3)

WHO-TEF

4)

HRGC/HRMS

高分離能ガスクロマトグラフ質量分析計。ガスクロマトグラフのカラムとしてキャピ

ラリーカラムを用い、分解能が 10,000 以上の二重収束形質量分析計を組み合わせたもの。
5)

2,3,7,8-TeCDD

2,3,7,8-四塩化ジベンゾ-パラ-ジオキシン(2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-パラ-ジオ

キシン)
6)

PCDD

ポリ塩化ジベンゾ-パラ-ジオキシン(ポリクロロジベンゾ-パラ-ジオキシン)

7)

PCDF

ポリ塩化ジベンゾフラン(ポリクロロジベンゾフラン)

8)

生物検定法

物質の量や構成成分、効力を、その物質を与えられた生物の反応から推定する方法。バ

イオアッセイ(生物学的定量法)ともいう。
9)

コプラナーPCBs ポリ塩化ビフェニルのうち、オルト位(2, 2’, 6 及び 6’)に置換塩素をもたない化合物(ノンオルト体)及び 1 個ある化合物(モノオルト体)の中で、PCDD や PCDF と似た毒性を有するものとして規定されている 12 種の化合物。ダイオキシン様 PCBs、DL-PCBs ともいう。

10) 抗原

抗原抗体反応又は免疫応答を誘発しうる物質の総称。免疫原性をもつ完全抗原に対して、比較的小さな分子で免疫原性をもたない抗原をハプテンという。ダイオキシン類はハプテンであり、適当な担体と結合させることで抗原性がでてくる。
11) 抗体免疫反応において、抗原の刺激によって生体内に作られ、その抗原と特異的に結合するタンパ

ク質の総称。
12) プロモーター

mRNA 合成（DNA から RNA を合成する段階；転写）の開始に関与する DNA 上の

特定領域の短い塩基配列のこと。
13) 融合細胞

モノクローナル抗体を産生させるために複数の細胞を融合させてできた細胞のこと。ハイブリドーマともいう。
14) ダイオキシン類応答性組換え細胞

ヒト、マウス、ラット、モルモットなどのほ乳類由来の培養細胞に、同種のほ乳類由来のダイオキシン類応答配列を含むプロモーター等にルシフェラーゼレポーター
遺伝子を融合したプラスミドを導入したもの。
15) レポータージーンアッセイ

遺伝子発現を調節する転写プロモーターの特性や活性、又はそのプロモーターに結合する転写因子の活性を生物学的に測定する手法。目的遺伝子の転写プロモーターをβ－ガラクトシダーゼやルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子上流に挿入した人工遺伝子を作成し、細胞内に導入して、レポーター遺伝子の発現を酵素の活性や生物化学発光を測定することによって定量化する。
16) 抗原抗体反応17) 免疫測定法

抗原とそれに対応する抗体との特異的な結合によって起こる反応。
免疫反応を利用して，微量物質の検出・定量を行う生化学的手法。抗体が抗原認識部位(ダイオキシン類)と特異的に結合する反応を利用し、試料中のダイオキシン類濃度を測定する方法である。
218) 実測濃度

各生物検定法において定められた標準物質を用いて検量線を作成し、それに基づいて得られた、試料中ダイオキシン類の標準物質に相当する濃度。
19) 測定量(毒性等量)

生物検定法においては、実測濃度について対象測定媒体別に定められる方式により換算を行って得られた値。
20) RLU（相対）発光量（Relative Light Unit）。本マニュアルでは、レポータージーンアッセイにおいてルシフェラーゼが基質と作用する際に生じる発光の強さを指す。
21) 吸光度

物質が光を吸収する度合いを透過率の逆数の常用対数で表した数値。

22) HRGC/HRMS 法

高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計を用いた方法。本マニュアルでは以下の方法を指す。
・排出ガス：JIS K0311 に定める方法
・ばいじん及び燃え殻：平成 16 年環境省告示第 80 号（ダイオキシン類対策特別措置法施行規則第二条第二項第一号の規定に基づき環境大臣が定める方法）に定める方法
23)

3
mN

0℃ 、101.3kPa(760mmHg)における気体の体積(立方メートル)24) gマイクログラム(Microgram：100 万分の1g：10－6g)25) ng

ナノグラム(Nanogram：10 億分の1g：10－9g)

26) pg

ピコグラム(Picogram：1 兆分の1g：10－12g)

27) 試料における検出下限

検出できる試料中の最小濃度。本マニュアルでは、標準物質における検出下限から理論的に算出する。
28) 試料における定量下限

定量が可能な試料中の最小濃度。本マニュアルでは、標準物質における定量

下限から理論的に算出する。
29) 標準物質における検出下限

分析方法（生物検定法）において検量線作成用標準物質から求めた、検出が可能な標準物質の最小濃度。
30) 標準物質における定量下限

分析方法（生物検定法）において検量線作成用標準物質から求めた、定量が可能な標準物質の最小濃度。

第４節

測定方法の概要

対象媒体ごとに試料を採取し、ダイオキシン類を抽出後、クリーンアップを行い、以下に列挙する 10 種類の生物検定法のいずれかにより定量する。生物検定法を用いた測定のフローを図 1-1 に示す。
1) ダイオキシン類がアリール炭化水素受容体に結合することを利用した方法(1) 前処理に、硫酸シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性組換
え細胞 H1L6.1c2 を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 1 の 1)
(2) 前処理に、硫酸シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性組換
え細胞 101L を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する
方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 1 の 2)
(3) 前処理に、多層カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性組換え細胞 HeB5 を用いたレポー
タージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第92 号第 1 の 3)
3

(4) 前処理に、硫酸シリカゲル加熱還流 法を利用し、測定に、ダイオキシン類応答性組換え細胞
H4ⅡE-luc を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する
方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 1 の 4)
(5) 前処理に、多層シリカゲルカラム及びアルミナカラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性組換え細胞 DR-EcoScreen を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 1 の 5)
(6) 前処理に、硫酸及び多層シリカゲルカラムを使用し、測定に、ダイオキシン類、アリール炭化水素
受容体及びアリール炭化水素受容体核運搬タンパク質の複合体形成反応を利用してダイオキシン
類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 1 の 6)
2) ダイオキシン類を抗原とする抗原抗体反応を利用した方法(1) 前処理に、多層シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、抗ダイオキシン類モノクローナル抗体及びプレート固相抗原を用いた間接競合酵素免疫測定法を利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 2 の 1)
(2) 前処理に、多層シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、磁性ビーズ固定化抗ダイオ
キシン類モノクローナル抗体及び酵素標識抗原を用いた直接競合酵素免疫測定法を利用して、ダイ
オキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 2 の 2)
(3) 前処理に、多層シリカゲルカラム及びアルミナカラムを使用し、測定に、抗ダイオキシン類モノク
ローナル抗体及びプレート固相化抗原を用いた間接競合酵素免疫測定法を利用してダイオキシン
類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 2 の 3)
(4) 前処理に、多層シリカゲルカラム及びアルミナカラムを使用し、測定に、抗ダイオキシン類モノク
ローナル抗体及び抗原固相化ビーズを用いた結合平衡除外法を利用してダイオキシン類の毒性等
量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 2 の 4)(注意) ダイオキシン類を取り扱う場合は、吸入、誤飲、直接皮膚への接触等を避け、前処理室及び分析室の換気並びに廃液や廃棄物の管理は十分に行うこと。また、その他の薬品、溶媒等でも吸入や誤飲によって測定者の健康を損なうものがあるので、取り扱いはできるだけ慎重に行い、実験室の十分な換気に注意する。

4

目的の明確化，計画の立案

代表試料の採取

試料採取

第 2 章第 1 節

試料採取の準備，採取器具類の洗浄

試料からの抽出抽出液

試料前処理
ダイオキシン類の回収率の事前確認

クリーンアップ

生物検定法による測定

標準液の測定第 3 章及び第 4 章第 4 節

試料保存･運搬使用細胞あるいはキットの品質管理

検出下限及び定量下限の確認
ブランク試験値確認

実試料の測定既知濃度試料を用いた正確度確認
妨害成分，ばらつき確認

ダイオキシン類(実測濃度)の定量

換算係数による測定量(毒性等量)への換算
適切な換算係数の使用
HRGC/HRMS 測定値との比較

測定値確定
図 1-1 生物検定法によるダイオキシン類測定のフロー

5

第 3 章及び第 4 章第 5 節

検量線の回帰性第２章

各論(生物検定法に共通する事項)

本章では、第 3 章及び第 4 章で掲げる各生物検定法に共通する事項として、試料採取方法、測定結果の報
告及び測定データの精度管理について説明する。

第１節

試料採取方法

１．排出ガス
試料ガス採取の一般的事項は JIS K0095 による。また、ダイオキシン類測定のための試料ガス採取方法は
JIS K0311「5. 試料ガスの採取」及びダイオキシン類対策特別措置法施行規則(平成 11 年総理府令第 67 号、
以下「規則」という。) 第 2 条第 1 項第 1 号に規定するものとする。
1.1

試料採取の概要

排出ガス試料の採取手順の概略を図 2-1 に示す。

排出ガスの性状
吸着剤の精製･充てん

事 前 調 査測定孔の状況
設備稼働状況

採取器具類の洗浄

試料ガス採取装置の組
ろ紙準備

立

吸収液準備

試料ガスの採取等速吸引条件の設定
温度，ガス組成，水分，
全圧・静圧(流速)採取装置の漏れ試験
その他 CO，O2 連続測定等等速吸引条件の設定
流速･流量の確認採取装置の漏れ試験

吸引ノズル･導管の洗浄
吸収液の集約
ろ紙の保管

試料輸送･保存

前処理及び測定
図 2-1 試料ガスの採取の作業手順

6

1.2

試薬

JIS K0311「5.3 試薬」に準拠したもの。
1.3

試料採取装置JIS K0311「5.2 試料ガス採取装置」に準拠したもの。本マニュアルでは、原則として、JIS K0311 の附
属書 1 の JIS I 形又は II 形の試料採取装置を用いることとし、III 形装置を用いる場合は、JIS K0311 の 5.2
に従い採取装置の妥当性を確認し、記録を作成する。
1.4

試料ガスの採取の準備

JIS K0311「5.4 試料ガスの採取の準備」に準拠した方法。ただし、5.4.3 の内標準物質の添加は行わない。
1.5

試料ガスの採取量

試料ガスの採取量は、次のような手順によって決定する。排出ガスの採取に当たっては、通常の操業状態において(燃焼状態が安定した時点から約一時間以上経過した後を目途とする)、原則 4 時間以上採取する。
なお、採取時間については、その目的に応じて試料ガスの発生状況等を十分考慮して代表試料が採取できるようにしなければならない。各方法の具体的な算出方法については、第 3 章及び第 4 章に記載する。

𝑉=

𝑄𝐷𝐿 × 𝑣 × 𝑘 𝑉𝐸
1
×
×
1000
𝑉′𝐸 𝐶𝐷𝐿

ここに、

V： 測定に必要な最小の試料ガスの量(m3N)

QDL ： 標準物質における検出下限(pg-TEQ/mL)v： 測定用試料の液量(mL)k： 測定量(毒性等量)への換算係数(各方法固有の排出ガスの換算係数)

VE： 抽出液量(mL)

V’E： 抽出液分取量(mL)

CDL ： 必要となる試料ガスにおける検出下限(ng-TEQ/m3N)
また、本数式については代表的な例であり、各方法により数式が異なることから、詳しくは第３章及び第４章に記載する各方法に記載する数式により算出することとする。なお、標準物質における検出下限は、各方法により反応溶液(培地あるいは緩衝液と標準物質を含む DMSO 溶液の混合液)の標準物質の濃度か、添加した標準物質(DMSO 溶液中)の濃度かが異なることに留意する必要がある。
1.6

採取操作

JIS K0311「5.6 採取操作」に準拠した方法。
1.7

試料の回収及び保存

JIS K0311「5.7 試料の回収及び保存」に準拠した方法。
1.8

試料採取量の算出

JIS K0311「5.8 試料ガスの採取量の算出」に準拠した方法。
1.9

試料ガスの採取の記録

JIS K0311「5.9 試料ガスの採取の記録」に準拠した方法。

7

２．ばいじん及び燃え殻

2.1

試料採取の概要

ばいじん及び燃え殻、それらの処理物の採取方法は、平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(1)に規定するものとする。
2.2

試薬及び器具平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(1)に準拠したもの。
2.3

採取の準備

平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(1)に準拠した方法。
2.4

ばいじん及び燃え殻試料の採取量

ばいじん及び燃え殻試料の採取量は、次のような手順によって決定する。各方法の具体的な算出方法については、第３章及び第４章に記載する。

𝑊=

𝑄𝐷𝐿 × 𝑣 × 𝑘 𝑉𝐸
1
×
×
1000
𝑉′𝐸 𝐶𝐷𝐿

ここに、

W： 測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量(g)QDL ： 標準物質における検出下限(pg-TEQ/mL)v： 測定用試料の液量(mL)k： 測定量(毒性等量)への換算係数(各方法固有のばいじん及び燃え殻の換算係数)

VE： 抽出液量(mL)

V’E： 抽出液量分取量(mL)

CDL ： 必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限(ng-TEQ/g)
また、本数式については代表的な例であり、各方法により数式が異なることから、詳しくは第３章及び第４章に記載する各方法に記載する数式により算出することとする。なお、標準物質における検出下限は、各方法により反応溶液(培地あるいは緩衝液と標準物質を含む DMSO 溶液の混合液)の標準物質の濃度か、添加した標準物質(DMSO 溶液中)の濃度かが異なることに留意する必要がある。
2.5

採取操作

平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(1)に準拠した方法。
2.6

試料の回収及び保存

平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(1)に準拠した方法。
2.7

分析試料の調製

平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(2)に準拠した方法。ただし、同表ウ(イ)の内標準物質の添加の操作は行わない。
2.8

含水率

平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(2)に準拠した方法。

8

平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)

参考(1) 試料採取
焼却施設から排出される試料として代表的な試料を採取する。ばいじん及び燃え殻が分離して排出される焼却施設においては、ばいじん及び燃え殻をそれぞれ採取する。この場合において、焼却施設内でばいじん又は燃え殻を処理するときは、ばいじん又は燃え殻を処理したものを採取する。
ア

排出ピット等から、シャベル、スコップ等の採取具を用いて数箇所から採取し、容器(アルミ製バット等のダイオキシン類の吸着のない材質製のものに限る。)に移し入れ、不燃物等の異物を取り除き、十分に均一化する。
イ

均一化した試料を保存容器(ガラス製等のダイオキシン類の吸着のない材質製のものであって、密封できるものに限る。)に入れる。採取量は、試料の調製後に 150g 程度の試料を確保できる量とする。

ウ

保存容器を密封し、遮光された容器に収納する。

(2) 試料の前処理
ア

試薬
日本工業規格 K0311 の 6.2 に規定するものを用いる。

イ

器具及び装置日本工業規格 K0311 の 6.3 に規定するものを用いる。

ウ

試料の調製等(ア) 試料の調製①

灰試料の場合は、5mm の目のふるいを用いてふるい分けし、風乾後、乳鉢中で均一にすりつぶして混合する。

②

固化物試料の場合は、試料を粒径 2mm 程度以下まで粉砕する。

③

汚泥の場合は、試料を湿状のまま秤量する。この場合において、汚泥に含まれる固形分の重量比は、
当該汚泥 20g 以上 100g 以下(Ag)を平型量り瓶(容量 50mL 以上のもので、あらかじめ乾燥したものに限る。)又は蒸発皿(容量 100mL 以上のもので、あらかじめ乾燥したものに限る。)に正確に計り取り、沸騰しないように注意して水分を蒸発させ、105℃以上 110℃以下で 2 時間程度乾燥させ、デシケーター中で30 分間程度放冷させた後、当該平型量り瓶又は蒸発皿に残留した物質の重量(Bg)を正確に求め、これを固型分の重量とし、次に掲げる式により求める。
固型分の重量比(%)＝B／A×100(イ) 内標準物質の添加(ア)の操作により調製した試料 20g 以上 100g 以下をビーカーに秤取し、日本工業規格 K0311 の 6.4.1 に規定する方法により、ダイオキシン類内標準物質を加える。
エ抽出(ア) ウの操作で得られた試料について、日本工業規格 K0311 の 6.4.2a)に規定する方法により塩酸処理及び洗浄を行い、ソックスレー抽出を行う。
(イ)(ア)の操作で得られた塩酸溶液及びメタノール又はアセトン洗浄液を分液漏斗に入れ、溶液 1l 当たり

ジクロロメタン 50mL で 3 回、液―液振とう抽出を行い、硫酸ナトリウムを用いて脱水する。
(ウ)(ア)及び(イ)の操作で得られた抽出液を合わせて溶媒を加え、一定量とし、抽出液とする。

(以下、省略)9第２節

測定結果の報告

本マニュアルに定める方法により測定を行った結果は、規則様式第 6(図 2-2)の表 1 又は 3 の該当する事項
及び別紙 2(図 2-4)に記載する。その場合、規則様式第 6 の表 1 又は 3 の備考欄に簡易測定法による測定であることが分かるように「簡易測定法」と明記すること。
別紙 2 の測定方法の欄には、測定に用いた方法を記載するが、平成 17 年環境省告示第 92 号中の当該測定方法の番号(例：第 1 の 4）を記載しても差し支えない。
実測濃度の欄には、毒性等量に補正する前の濃度(つまり、各測定方法で規定される検量線より求められる測定値であり、媒体ごとに換算されていない値)を記載し、測定量の欄には、毒性等量に換算後の値を記載す
ることとする。なお、排出ガスの実測濃度及び測定量は、従来の HRGC/HRMS 法と同様に、標準酸素補正
後の値を記載すること。標準酸素補正の方法は本マニュアルの第 3 章又は第 4 章に記載している。
また、試料における定量下限及び検出下限の欄には、原則として実測濃度を記載するが、誤解のないよう単位も併せて記載することとする。
このほか、別紙 2 の備考欄には、基準値近傍の値である場合はその旨を、及び再測定を行った場合は別紙
1(図 2-3)に記載された当該再測定結果との対応等を明記することとする。

10

様式第６（第８条関係）
ダイオキシン類測定結果報告書
年月日

都道府県知事 殿
市長
氏名又は名称及び住所並び報告者 に法人にあってはその代表 印者の氏
名ダイオキシン類による汚染の状況について測定したので、ダイオキシン類対策特別措置法第２８条第３項の規定により、次のとおり報告します。
表１ 排出ガス
採取年月
日及び時
刻(開始時
刻～終了
時刻)

表2

排 出
ガス量(m 3
N／日)

測名

特定施設の名称及び使用状況

分析年月
日

測定結果
(ng―TEQ
／m3N)

試料採
取者

分析者

備考

定
称

場

特定施設の名称及び使用状況

分析年月
日

測定結果
(pg―TEQ
／L)

採水者

分析者

備考

測 定 結 果 ( ng

試料採

分析者

備考

―TEQ/g)

取者

所
排 水 量
(m3／日)

ばいじん等

採 取 年月 日

試料の種

及び時刻

別

備考

測定箇
所

排出水

採取年月日
及び時刻

表３

排出ガス
中の酸素
濃度(％)

採取箇所

特定施設の名称

分析年月日

及び使用状況

１ 報告書及び別紙の大きさは、日本工業規格Ａ４とすること。
２ ダイオキシン類対策特別措置法施行規則（以下「規則」という。）第３条第１項に基づき換算した測定結果については、別紙１を添付するものとする。
３ 規則第３条第２項に基づき換算した測定結果については、別紙２を添付するものとする。
４ ２以上の測定結果がある場合は、添付する別紙１又は２のそれぞれとの対応関係がわかるように備考欄に記載すること。
５ 排出ガスにあっては表１、排出水にあっては表２、ばいじん及び焼却灰その他の燃え殻（以下「ばいじん等」という。）にあっては表３に記載すること。なお、同一届出者が大気基準適用施設及び水質基準対象施設をともに設置している場合には、併せて１葉の様式に記載すること。
６ 排出ガス量については、温度が零度であって圧力が１気圧の状態(以下「標準状態」という。)における量に、測定結果については、標準状態における排出ガス１立方メートル中の量に、それぞれ換算したものとする。
７ ２以上の水質基準対象施設を設置し、異なる排水系統を有する水質基準適用事業場にあっては、それぞれの排水系統の排水口ごとに測定を行い、結果を記載すること。
８ 表３の試料の種別として、ばいじん、焼却灰、混合灰又はこれらの処理物（処理方法）の別を記載すること。
９ 氏名(法人にあってはその代表者の氏名)を記載し、押印することに代えて、本人(法人にあってはその代表者)が署名することができる。

図 2-2 規則様式第 6

11

様式第６（第８条関係）
別紙１
整

理

規則第３条第１項に基づき換算したダイオキシン類の構成
番

号

実測濃度

試料におけ
る定量下限

試料における
検出下限

毒性等価係数ポ

2，3，7，8―TeCDF

0.1

リ

1，2，3，7，8―PeCDF

0.03

塩

2，3，4，7，8―PeCDF

0.3

化

1，2，3，4，7，8―HxCDF

0.1

ジ

1，2，3，6，7，8―HxCDF

0.1

ベ

1，2，3，7，8，9―HxCDF

0.1

ン

2，3，4，6，7，8―HxCDF

0.1

ゾ

1，2，3，4，6，7，8―HpCDF

0.01

フ

1，2，3，4，7，8，9―HpCDF

0.01

ラ

OCDF

0.0003ン

Total PCDFs

ポ
リ
塩
化
ジ
ベ
ン
ゾ
ー
パ
ラ
ー
ジ
オ
キ
シ
ン

―

―

―

2，3，7，8―TeCDD

1

1，2，3，7，8―PeCDD

1

1，2，3，4，7，8―HxCDD

0.1

1，2，3，6，7，8―HxCDD

0.1

1，2，3，7，8，9―HxCDD

0.1

1，2，3，4，6，7，8―HpCDD

0.01

OCDD

0.0003

Total PCDDs
Total(PCDFs＋PCDDs)

コ
プ
ラ
ナ
ー
ポ
リ
塩
化
ビ
フ
ェ
ニ
ル

―

毒性等量

―

―

―

―

―

―

―

―

3，4，4’，5―TeCB(＃81)

0.00033，3’，4，4’―TeCB(＃77)

0.00013，3’，4，4’，5―PeCB(＃126)

0.1

3，3’
，4，4’
，5，5’―HxCB(＃169)

0.03

2’
，3，4，4’，5―PeCB(＃123)

0.00032，3’，4，4’，5―PeCB(＃118)

0.0003

2，3，3’，4，4’―PeCB(＃105)

0.0003

2，3，4，4’，5―PeCB(＃114)

0.00032，3’，4，4’，5，5’―HxCB(＃167)

0.0003

2，3，3’，4，4’，5―HxCB(＃156)

0.0003

2，3，3’，4，4’，5’―HxCB(＃157)

0.0003

2，3，3’，4，4’，5，5’―HpCB(＃189)

0.0003

Total コプラナーPCB

―

―

―

―

Total ダイオキシン類

―

―

―

―

備考
排出ガスの測定結果を記入する場合にあっては、単位をng／m3N（毒性等量にあっては、ng―TEQ／m3N。）、排出水の測定結果を記入する場合にあっては、単位をpg／L(毒性等量にあっては、pg―TEQ／L。)とし、ばいじん等の測定結果を記入する
場合にあっては、単位をng／g（毒性等量にあっては、ng―TEQ/g。
）とする。
２ 実測濃度の項において、検出下限以上定量下限未満の濃度は括弧付きの数字で記載すること。
３ 実測濃度の項において、検出下限未満のものは“ＮＤ”と記載すること。
４ 毒性等量は、定量下限未満の実測濃度を零として算出すること。
５ 規則第2条第1項第4号の規定に基づき環境大臣が定める方法により測定を行った場合は、備考欄に測定に用いた方法を記載すること。
６ 用語の定義は、日本工業規格Ｋ0311、Ｋ0312又は規則第2条第1項第4号の規定に基づき環境大臣が定める方法によること。
７ 整理番号は、測定結果が複数の場合に記入すること。

備考 １

図 2-3 規則様式第 6 別紙 1
12

別紙２

整理番号

規則第３条第２項に基づき換算したダイオキシン類の測定方法
測定量
測定方法 実測濃度 試料における 試料における
備 考
定量下限

検出下限

（毒性等量）

備考 １ 排出ガスの測定結果を記入する場合にあっては、単位をng／m3N（毒性等量にあっては、ng―TEQ／m3N。）とし、ばいじん等の測定結果を記入する場合にあっては、ng／g（毒性等量にあっては、ng―TEQ／g。）とする。
２ 測定方法の項においては、規則第２条第１項第４号の規定に基づき環境大臣が定める方法のうち、測定に用いた方法を記載すること。
３ 実測濃度の項においては、２の測定方法により測定された標準溶液相当濃度を記載すること。
４ 実測濃度の項において、検出下限以上定量下限未満の濃度は括弧付きの数字を記載すること。
５ 実測濃度の項において、検出下限未満のものは“ＮＤ”と記載すること。
６ 定量下限未満の実測濃度の測定量（毒性等量）は、零とすること。
７ 用語の定義は、規則第２条第１項第４号の規定に基づき環境大臣が定める方法によること。
８ 整理番号は、測定結果が複数の場合に記入すること。

図 2-4 規則様式第 6 別紙 2

13

第３節

測定データの精度管理

ダイオキシン類の測定は、極めて低濃度の測定であるため、測定精度の管理を十分に行う必要がある。このため、分析操作の際には次のような作業を行う。これらの頻度等の詳細については、本節 1～5 にて説明する。
1) 検出下限及び定量範囲の確認(標準物質における検出下限及び定量範囲の確認並びに試料における検出下限及び定量下限)
2) ブランク試験(試料採取、前処理時に使用する試薬等の汚染のレベルを確認するブランク試験(以下「操作ブランク試験」という。)並びに試料採取及び試料運搬における汚染を確認するためのブランク試験(以下「トラベルブランク試験」という。))
3) 二重測定
4) 濃度既知試料の測定
5) 回収率の確認
6) 換算係数の確認
7) 検量線の確認及び感度変動の管理図による確認
また、各操作工程において、本節 1～5 に掲げる事項について適切に行うことが望ましい。なお、精度管理については、本マニュアルに加え、ダイオキシン類の環境測定に係る精度管理の手引き(生物検定法)も参照されたい。

１. 試薬等、器具、装置及び施設の管理

以下の事項について記録等を作成・保存する。
1.1 試薬等使用する試薬について、使用目的に応じて整理した上で、測定方法に定められたものであることを確認し、メーカー、製品名、ロット番号、購入日、購入量、開封日、有効期限及び保存方法等を記録する。
なお、有効期限の定められていないものについては、開封又は調製後の使用有効な期間を定め、それを記録する。
キット化されている試薬等については、そのキットに同梱されている試薬等をキット間で流用せず、使い切ること。
購入した試薬から精製・洗浄、その他の調製を行った二次的な調製試薬については、調製作業を行った者、作業日及び作業の内容、使用期限、保存方法及び調製に使用した試薬等についてトレーサビリティを確実にする情報を記録する。
また、細胞又はキットを入手した場合、入手の情報(納入業者、担当者名、納入温度、時間及び梱包の破損の有無等)及び細胞については品質保証書について整理、保存する。細胞又はキットを保存する場合は、必要に応じ、保存場所、保存方法、汚染の配慮、温度及び湿度等の情報を記録、保存する。なお、細胞又はキットについては、停電や細胞保存容器からの液体窒素漏れといった万が一の事態に備えて、分散保管する等の対策を講じることが望ましい。
1.2

標準物質（溶液）

標準物質（溶液）については、1.1 の使用する試薬における記録に加え、使用日及び使用量を記録する。な14

お、標準溶液を購入した場合には、購入時の濃度（複数の標準物質を含むものにあっては各々の濃度）を記
録する。
1.3

器具

使用する器具について、使用目的に応じて整理した上で、測定方法に定められたものであることを確認し、メーカー、製品名及び洗浄等の処理（作業を行った者、作業日及びその内容）、保管方法を記録する。また、
マイクロピペットの吸い込みによるピペット本体内部汚染防止等、器具の汚染防止に関する記録を作成する。
なお、必要に応じて高濃度試料測定用器具と低濃度試料測定用器具とを区別し、両者が明確に識別できるよ
うに措置し、その内容を記録する。点検及び校正が必要な器具については、定期的にそれらの実施に関する記録を作成する。
1.4

装置

使用する装置について、使用目的に応じて整理した上で、測定方法に定められたものであることを確認し、メーカー、製品名、点検及び校正の実施状況並びに日常の測定における管理状況を記録する。装置の修理等を行った場合には、修理伝票の保存とともに修理等の状況を記録する。
細胞を使用する場合は、雑菌汚染やインキュベーターの故障等のトラブルに備えて、予備のインキュベー
ターを保有する等の対策を講じ、また、定期的にインキュベーターを清掃する等、適切な細胞培養環境の維持管理を行う。
1.5

施設

試料搬入後の一連の業務がどのような作業環境で実施されているかを判断できる文書を作成する。
特に試料の前処理及び生物検定法による測定の作業環境については、精度管理の観点からどのような配慮がなされているかを記述する。例えば、定期的に温度、湿度及び差圧等の条件について記録を取っておく。
同一施設で HRGC/HRMS 法によるダイオキシン類分析を行っている場合は、内標準物質による汚染が生じないような対策を講じる。
なお、作業環境については、以下の要件を満たす施設を有することとし、精度管理の観点からどのような配慮がなされているかを記述する。
1) 遺伝子組換え培養細胞を用いたレポータージーンアッセイによる試験実施施設(1) 試験施設は、培養細胞の培養細胞の保存、保存処理、継代培養、前処理及び測定等を行うための専用区域を有し、試験実施中に使用される試薬の調製並びに保管、また、器具及び機器の滅菌、維持管理並びに保管等が可能であること。
(2) 当該施設は、雑菌汚染等により培養細胞に与える影響が最小限に抑制されていること。
(3) 遺伝子組み換え培養細胞の使用に当たって、自治体等による運用規則等が定められている場合には該当する規則を遵守すること。
2) 抗原抗体反応を利用したキットによる試験実施施設
試料搬入後の一連の業務がどのような作業環境で実施されているかを判断できる文書を作成する。特に試料の前処理及びキットに対するピペッティング操作やプレートリーダー等による測定の作業環境については、精度管理の観点からどのような配慮がなされているかを記述する。
1.6

環境汚染の防止及び作業者暴露の防止
分析環境については、環境へ漏洩防止及び廃棄物処理等の環境汚染の防止並びに作業者暴露の防止についても関連法規等を遵守の上、十分な対策を講じる。

15

1.6.1

廃棄物処理

実験施設で発生した廃液及び廃棄物は汚染区分を設け、区分ごとに処理方法を明確にし、処分する。このうち、廃棄するものは、廃棄物処理業者に委託する等適正に処理されることとなるまで密閉容器に保管し、廃棄物保管室に保管することとする。
1.6.2

安全性確保

生物検定法によるダイオキシン類分析施設は、試料採取や分析を行う作業従事者の安全及び健康を確保するとともに、施設周辺環境への汚染を防止することを第一とし、これを達成するための施設の構造、設備等を備えることとする。
1) 分析室
前処理室、生物検定法による測定室、標準試料室及び廃棄物保管室といった各ダイオキシン類の分析関連室への出入りは関係者に限定し、分析室のドア等に「関係者以外立入禁止」の表示を掲げる等して管理を行うこと。
また、各分析室は、機密性を確保するとともに負圧にし、ダイオキシン類の流出を防止すること。また、排気及び排水設備の出口には、活性炭フィルターや活性炭槽を設置する等して、環境へのダイオキシン類
放出を防止すること。
2) 試料採取現場での安全管理試料採取現場内での作業中は、安全用保護具を着用すること。特に飛灰の採取時は、防じんマスク・防じんメガネ等を使用すること。
作業終了後、手洗い、うがいを行い空気中浮遊粉じんを摂取しないよう注意すること。
また、試料採取に使用した機器類を測定場所から持ち帰る時は、測定作業中に堆積した粉じんの払い落としを行う等、ダイオキシン類汚染粉じん等による環境汚染に留意すること。
3) 前処理工程での安全管理
標準試料の取り扱いに際しては、危険性の程度に応じて、ドラフト(安全キャビネット)、グローブボッ
クス等を適宜用いる。前処理工程時は、排気ファンを運転した状態で作業を行うこと。
また、飛散する可能性の高い試料を取り扱う場合は、飛散しないよう注意して取り扱うと共に、防じん
メガネ、防じんマスク及び使い捨てゴム手袋等を着用し、試料の吸引及び皮膚への直接接触を避けること。
4) 生物検定法による測定時の安全管理
培養細胞を用いるレポータージーンアッセイを行う場合、標準試料及び測定試料を曝露する際には、無菌状態の確保、ダイオキシン類による汚染防止の観点から安全キャビネット(例えば、JIS K3800 に規定するバイオハザード対策用クラス II キャビネット等）を使用することが望ましい。
また、抗原抗体反応を利用した方法では、無菌状態を確保する必要はないが、ドラフト等ダイオキシン
類による実験室の汚染を防止できる設備を使用することが望ましい。
5) 緊急時の対応
ダイオキシン類による汚染、被曝、漏洩、標準物質の紛失等、あるいはそれらのおそれがある場合、速やかに関係者に連絡、対処をしなければならない。このため、事故発生時等の緊急時の警報等の連絡シス
テム、緊急処置設備等を整備しておくこと。
6) 健康管理作業従事者には労働安全衛生法による健康診断を実施するとともに、必要に応じ検査項目を追加することができるものとする。健康診断の結果、異常が認められた場合には速やかに措置を講ずるものとする。
16

7) 安全教育
安全管理指針(規定)を作成するとともに、作業従事者に対して分析施設、設備の周知を図り、ダイオキ
シン類の取り扱い、廃棄物の取り扱い等の教育訓練を実施する。

２. 試料採取
排出ガスについては、定期的に JIS K0311 に基づく測定を行い、サンプリングスパイクの回収率が 70～130%の範囲内であることを確認することが望ましい。操作に当たっては、本マニュアル及び JIS K0311「附属書 1(規定)試料ガス採取装置」に記載の「操作上の注意」に従って試料採取を行う。
ばいじん及び燃え殻の操作に当たっては、本マニュアル及び平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)に従って試料採取を行う。
この他、下記について留意して試料採取を行う。
2.1

試料採取計画

1) 事前調査
事前調査の必要性について検討し、必要と認める時は事前調査を行う。また、事前調査結果を 2)の試料採取計画に反映させる。
2) 試料採取計画
試料の採取に際して、試料採取計画を作成する。
2.2

試料採取の実行に係る判断前日及び当日の天候（項目によっては数日前の天候についても考慮する。）その他の状況を踏まえ、試料採取担当者は、試料採取の実行の可否について判断し、可とした場合には試料採取を実施し、不可とした場合には、その経過を記録する。
2.3

試料採取の記録

試料採取計画に基づき、試料採取を実施し、以下の記録を作成・保存する。なお、特殊事情により本マニュアルに記載していない方法を講じた場合には、その理由、内容及び妥当性（比較検討結果及び引用文献等）
を試料採取計画に記録する。
1) 共通的事項(1) 試料の名称(2) 試料採取者(3) 試料採取日時(4) 試料採取地点名(5) 採取地点及び場所に係る地図及びその状況に関する記述（必要に応じて、全地球測位システム（GPS）

等により求めた試料採取地点の緯度及び経度）(6) 試料採取の実行に係る判断等(7) 採取期間内の天候(8) 試料採取時の写真（周辺の状況がわかる遠景写真及び試料採取状況がわかる近景写真の 2 種類。
ただし、写真撮影が不可の場合には、必要としない。
）(9) 試料に影響を与えている可能性のある事項(10) 試料採取量17(11) 試料採取後の輸送方法
2) 測定項目別の個別事項(1) 排出ガスa) 試料採取器具、装置及び使用した試薬等
 メーカー、形式及び模式図
 採取管部（材質、ノズルの内径及び冷却装置の有無）
 フィルターの材質
 液体捕集部（吸収瓶本数、容量及び吸収液の種類並びに量等）
 吸着捕集部（吸着剤カラムの形状及び吸着剤の材質、商品名並びに量） 吸引ポンプ（形式及びメーカー名）
 流量計（種類、形式、メーカー名及び校正結果）b) 試料採取操作
 事前調査（採取場所の地上からの高さ、測定孔の状況及び送排風機の位置等並びにダクトの形状等）
 設定した試料ガスの採取量、採取時間及び等速吸引流量
 漏れ試験の実施状況及び結果
 ガスメータの温度及び圧力 フィルター捕集部及び液体捕集部の温度
 等速吸引流量、吸引時間及び吸引ガス量
 試料ガス採取量
 排出ガスの温度、流速、組成、圧力及び水分量等c) 試料容器 試料回収の方法
 試料保存の方法（試料容器の材質及び容量等）
d) その他の追加事項
 採取試料に係る発生源の規模及び稼働状況
 酸素濃度による補正(2) ばいじん及び燃え殻a) 試料採取器具、装置及び使用した試薬等
 採取器具の種類及び材質b) 試料採取操作
 試料の採取場所
 試料採取操作の概要
 試料採取量c) 試料容器
 試料保存の方法（試料容器の種別及び材質）
d) その他の追加事項
 試料の状況
 採取試料に係る発生源（焼却施設）の規模及び稼働状況

18

2.4

トラベルブランク試験及び二重測定

試料採取に当たって、トラベルブランク試験のための操作及び二重測定のための試料採取を行い、その実施状況を記録する。なお、トラベルブランク試験を実施する対象は、排出ガス試料採取とする。
トラベルブランク試験は、移送中に汚染が考えられる場合(ばいじん等による汚染)には必ず測定し、十分に低値であることを確認しなければならないが、それ以外の場合には、その管理を十分しておけば毎回測定しなくてもよい。二重測定についても、二重測定の実施が困難である場合を除き、測定試料数の 10%程度の頻度で行い、同一の生物検定法における定量下限以上の測定量（毒性等量）について、その平均値を求め、個々の測定量（毒性等量）が平均値の±30%以内であることを確認する。なお、二重測定用の試料採取を行わない場合には、試料採取の操作について十分な管理を行うことが必要である。
トラベルブランク試験又は二重測定を行わない場合には、試料採取における信頼性について十分検討しておき、必要があればそのデータが提示できるようにしておく。

３. 試料の前処理

3.1

試料前処理計画

試料の前処理に際して、試料前処理計画を作成する。
3.2

試料の前処理に係る共通的事項

試料前処理計画に基づき次の作業を実施し、記録を作成・保存する。
1) 試料の受入検査採取された試料が測定機関に搬入された段階で試料の状態等に関する受入検査を実施し、以下の事項について記録を作成する。
(1) 試料が搬入された日時及び受入検査を実施した日時(2) 受入検査の実施者(3) 試料搬入の手段及び状態(4) 試料容器の種類及び大きさ(5) 試料の性状(6) その他特記事項
2) 抽出操作を行うまでの試料の保存及び管理
受入検査を行った試料について、3)の抽出操作を行うまでの間、以下の記録を作成した上で適切な保存及び管理を行う。
(1) 試料の管理番号(2) 試料の保存及び管理の場所、方法並びに期間
3) 試料からの抽出
試料からの抽出操作を行い、以下の記録を作成し、その内容が測定方法に定められた方法及び条件により行われたことを確認する。なお、特殊事情により本マニュアルに記載していない方法を講じた場合には、
その理由、内容及び妥当性（比較検討結果及び引用文献等）を記録する。
また、抽出操作時の他試料による汚染を判断するための参考資料として、同時期に処理を行った試料のリストを作成する。
(1) 操作を行った者
19

(2) 操作を行った日時(3) 抽出に供した試料の性状及び量(4) 抽出のために使用した器具並びにその洗浄の実施状況及び使用するまでの保管の状況(5) 抽出操作の方法及び条件（溶媒の種類、量及び抽出時間等）
4) 試料抽出液のクリーンアップ
試料抽出液のクリーンアップ操作を行い、以下の記録を作成し、その内容が測定方法に定められた方法
及び条件により行われたことを確認する。なお、特殊事情により本マニュアルに記載していない方法を講じた場合には、その理由、内容及び妥当性（比較検討結果及び引用文献等）を記録する。
また、クリーンアップ操作時の他試料による汚染を判断するための参考資料として、同時期に処理を行った試料のリストを作成する。
(1) 操作を行った者(2) 操作を行った日時(3) 操作のために使用した試料抽出液の量(4) 操作の方法及び条件(5) 使用試薬の種類a) 前処理に、硫酸シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性
組換え細胞 H1L6.1c2 を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 1 の 1)
① 硫酸シリカゲル/活性炭カラムクロマトグラフ操作
・シリカゲルの材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・活性炭の材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量b) 前処理に、硫酸シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性組換
え細胞 101L を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する
方法 (平成 17 年環境省告示第 92 号第 1 の 2)
① 硫酸シリカゲル/活性炭カラムクロマトグラフ操作
・シリカゲルの材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・活性炭の材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量c) 前処理に、多層カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性組換え細胞 HeB5 を用いたレポー
タージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第92 号第 1 の 3)
① 多層シリカゲルカラムクロマトグラフ操作
・シリカゲルの材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量② アルミナカラムクロマトグラフ操作の場合
・アルミナの材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量d) 前処理に、硫酸シリカゲル加熱還流 法を利用し、測定に、ダイオキシン類応答性組換え細胞
20

H4ⅡE-luc を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する
方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 1 の 4)
① 硫酸シリカゲル加熱還流処理
・シリカゲルの材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量e) 前処理に、多層シリカゲルカラム及びアルミナカラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性組換え細胞 DR-EcoScreen を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 1 の 5)
① 多層シリカゲルカラムクロマトグラフ操作
・シリカゲルの材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量② アルミナカラムクロマトグラフ操作
・アルミナの材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量
f) 前処理に、硫酸及び多層シリカゲルカラムを使用し、測定に、ダイオキシン類、アリール炭化水素
受容体及びアリール炭化水素受容体核運搬タンパク質の複合体形成反応を利用してダイオキシン
類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 1 の 6)
① 硫酸処理操作・ヘキサンの使用量
・硫酸の添加量及び添加回数② 多層シリカゲルカラムクロマトグラフ操作
・シリカゲルの材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量g) 前処理に、多層シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、抗ダイオキシン類モノクローナル抗体及びプレート固相抗原を用いた間接競合酵素免疫測定法を利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 2 の 1)
① 硫酸処理・ヘキサンの使用量
・硫酸の添加量及び添加回数② 多層シリカゲルカラム/活性炭カラムクロマトグラフ操作
・シリカゲルの材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・活性炭の材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量h) 前処理に、多層シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、磁性ビーズ固定化抗ダイオ
キシン類抗体及び酵素標識抗原を用いた直接競合酵素免疫測定法を利用して、ダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 2 の 2)
① 多層シリカゲルカラムクロマトグラフ操作
・シリカゲルの材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量21② 活性炭カラムクロマトグラフ操作
・活性炭の特質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量i)

前処理に、多層シリカゲルカラム及びアルミナカラムを使用し、測定に、抗ダイオキシン類モノク
ローナル抗体及びプレート固相抗原を用いた間接競合酵素免疫測定法を利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 2 の 3)
① 多層シリカゲルカラムクロマトグラフ操作
・シリカゲルの材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量② アルミナカラムクロマトグラフ操作
・アルミナの材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量

j)

前処理に、多層シリカゲルカラム及びアルミナカラムを使用し、測定に、抗ダイオキシンモノクローナル抗体及び抗原固相化ビーズを用いた結合平衡除外法を利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 2 の 4)
① 多層シリカゲルカラムクロマトグラフ操作
・シリカゲルの材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量② アルミナカラムクロマトグラフ操作
・アルミナの材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量

3.3

試料の前処理に係る測定項目別の個別事項

試料の前処理に係る測定項目別の個別事項については、以下の通り。
(1) 排出ガス
 捕集ダストの塩酸処理(2) ばいじん及び燃え殻
 試料の調製方法（粉砕情報及び粒径等）3.4

測定用試料に併せて測定を行う試料の調製

ダイオキシン類の測定に係る品質が確保されていることの確認等を行うため、以下の試料について必要な前処理等を行い、4.5 において測定を行う試料として調製するとともに、調製を行った測定担当者の氏名、調製の日時及び調製操作の概要を記録する。
1) 操作ブランク試験のための試料
一連の測定業務において用意する試料である。操作時の汚染に対して十分な管理がなされており、その値が十分低値であれば毎回行わなくてもよいが、前処理操作に大きな変更があった場合、試料間汚染が予想されるような高濃度試料を測定した場合にも試料を調製する。
なお、操作ブランク試験は、測定用試料の調整等に起因する汚染を確認し、試料の測定に支障のない測定環境を設定するために行うものである。試料の採取及び前処理に用いるのと同じ試薬等を用いて試料と同様に行う。ブランク値が高い場合等は、試料測定値の補正に操作ブランク測定値を用いる必要があるが、ブランク試験の値が大きいと測定感度が悪くなるばかりでなく、測定値の信頼性が低下するため、ブラン
22

ク試験値は極力低減を図らなければならない。そのためには、クリーンドラフト内で前処理操作等を行うこと。
2) トラベルブランク試験のための試料
2.4 に基づきトラベル試験のための操作を行った試料について、前処理操作を行い調製した試料である。
なお、トラベルブランク試験は、試料について、試料採取準備時から試料分析時までの汚染の有無を確認するためのものである。試料採取操作以外は試料と全く同様に扱い持ち運んだものについて、試料と同様の前処理操作を行う。なお、ブランク試験の値が大きいと測定感度が悪くなるばかりでなく、測定値の信頼性が低下するため、ブランク試験値は極力低減を図らなければならない。
3) 二重測定のための試料
2.4 に基づき試料採取を行った二重測定用の試料について、前処理操作を行い調製した試料である。
なお、二重測定用試料は、試料採取、前処理操作及び測定操作における総合的な信頼性を確保するために、同一試料から 2 点以上採取し、測定に供する。
排出ガスについては、同一の試料を同時に 2 台以上の装置で採取する。ばいじん及び燃え殻については、
試料採取、前処理操作及び測定操作における総合的な信頼性を確保するために、同一試料から 2 つ以上の測定試料について採取する。
4) 濃度既知試料
標準的な濃度既知試料であり、適切な頻度（例えば、一連の分析操作ごと）において、前処理から測定までの工程に精度管理上の問題が発生していないことを定期的に確認するために使用する試料である。問題が発生していると認められる場合は、さらに前処理及び測定操作等工程ごとに濃度既知試料を用いて確認し、原因の究明を行う。なお、前処理から測定までの確認は、適切な頻度で行われていれば、下記 5) 換
算係数の確認のための試料の分析をもって代えることができる。
5) 換算係数の確認のための試料
換算係数の確認のために調製する試料であり、片方は HRGC/HRMS 法に定められた方法により前処理を行い、残りは生物検定法に定められた方法により前処理を行って試料を調製する。
6) 回収率の確認のための試料
生物検定法においては、標準物質の添加などによる回収率の確認は困難であるため、尐なくとも 6 ヶ月に 1 回又は使用する試薬等の製造ロットが変わったときなどに、HRGC/HRMS 法に定められた方法により回収率を求める。

４. 生物検定法による測定

4.1

生物検定法による試料の測定計画

測定に際し、生物検定法による試料の測定計画を作成する。
4.2

計測機器の点検

計測機器の点検に関する実施基準を作成し、この基準に基づき点検等を行い以下の記録を作成する。また、停電や故障等の問題が発生した場合には、どのような処置を講じたかを記録する。
1) 日常点検(1) 点検を行った者及び点検を行った日時(2) 各種消耗品に関する基本的な事項
232) 定期点検(1) 点検を行った者及び点検を行った日時(2) 点検の実施状況
3) メンテナンス(1) 光源等の点検及び交換(2) インキュベーター等の温度制御機能の点検及び修理(3) その他
4) 問題が発生した時の処置(1) 問題の内容及び講じた処置
4.3

測定系の準備

以下の 4.4～4.7 の操作を行うに当たり、培養細胞又はキットの準備を行い、これらの測定系が使用可能であることを確認した上で以下の記録を作成する。
また、遺伝子組み換え培養細胞ならびに抗ダイオキシン類抗体の活性がダイオキシン類の測定に必要とされる状態にあることについても確認する。
1) 凍結保存されているもの(1) 解凍作業を行った者及び日時(2) 凍結保存されている培養細胞又はキットの解凍操作(3) 操作が測定に使用する上で問題がないことの確認記録（測定使用前の活性確認を含む）
2) 冷蔵保存されているもの(1) 開封等作業を行った者及び日時(2) 開封等の操作(3) 測定に使用する上で問題がないことの確認記録
3) 常温保存されているもの(1) 開封等作業を行った者及び日時(2) 開封等の操作(3) 測定に使用する上で問題がないことの確認記録
4) 細胞の管理状況
遺伝子組換え培養細胞を用いたレポータージーンアッセイにおいては、下記に示す細胞の管理状況についても確認及び記録を作成する。なお、細胞についてはその継代回数が精度管理上問題ない範囲内で試験に使用すること。
(1) 継代等の操作記録(2) 培養条件の確認及び雑菌汚染等の有無の確認(3) 細胞活性が維持されていることの確認
4.4

検量線の作成検量線作成用標準液について、測定時の同一ロット内において測定を行い、必要なデータを求める。得られたデータが測定方法に定められた条件に合致していることを確認し、以下の記録を作成する。
(1) 検量線の作成者(2) 検量線の作成日(3) 測定条件
24

(4) 計測値（発光、吸光又は蛍光等の強度）(5) 測定方法で定められている近似式及びその算出過程
4.5

試料の測定

生物検定法による試料の測定計画に基づき、検量線作成用標準液、測定用試料及び 3.4 で調製した試料について測定操作を実施し、必要なデータを集め、以下の記録を作成する。
(1) 測定操作を行った者(2) 測定を行った日(3) 測定条件(4) 測定の順番(5) 測定に供した試料量(6) 計測値（発光、吸光又は蛍光等の強度）
4.6

検量線の確認及び感度変動の管理図による確認

定量操作が適切に行われているかどうかを確認するため、測定担当者は、本マニュアルに従い、検量線作成用標準液及び濃度既知試料のそれぞれに対しての測定操作により得られたデータから、測定量（毒性等量）を求め、管理図に記録し保存する。管理図による処置基準は、管理限界（μ±2σ）からの逸脱状況及び図の傾向等に応じて下記の通りとする。（μ:工程平均、σ:測定量（毒性等量）の標準偏差）
なお、管理限界は十分なサンプル数から σ を導出することとし、変動係数（CV%）で 20%以内に収まることが望ましい。
1 点でも管理限界を超えた場合は、原因の究明と改善を行うとともに、再測定する。改善のために講じた措置及び再測定の結果について、記録をする。また、管理限界内であっても基準値に対して、一定の傾向で外れていくような状態又は偏った測定量が続くような状態においては、原因の究明を行い、必要に応じ、改善を行うとともに、再測定する。
また、原因究明を行い、再測定した結果が管理限界内とならない場合は、過去のデータを含めてその傾向を解析し、新たに管理限界を求める対象データの見直しを考慮する。
管理図より明らかとなる原因についての考察を例示する。
1) 良好な結果(1) 管理限界内
2) 注意を要する結果(管理限界内)(1) 中心線より下又は上に偏在傾向
a)

発色基質の劣化や酵素活性の低下等の発色感度低下b)

プラスミドの欠落等の細胞劣化

c)

試薬の汚染

(2) 一定の増加又は減尐傾向a)

発色基質の劣化や酵素活性の低下等の発色感度低下b)

プラスミドの欠落等の細胞劣化

c)

試薬の汚染

3) 改善を要する結果(1)

1 点以上が管理限界超過a)ピペッティング操作の不備（不良なチップ使用又はチップ取り付け不備によるリーク等）
25

b)

添加忘れ等の操作ミス(2) 全ての点が管理限界超過a)ピペッティング操作の不備（不良なチップ使用又はチップ取り付け不備によるリーク等）

b)

試薬や試料の混合不良c)

反応温度不適・反応時間間違い

なお、JIS Z9021

シューハート管理図には、μ±2σ を警戒限界、μ±3σ を管理限界とする考え方も掲載されているが、本マニュアルでは、μ±2σ を管理限界とする。
4.7

検出下限等算出用検量線の作成

測定担当者は、尐なくとも 6 ヶ月に 1 回、検出下限及び定量範囲を求めるために、標準液について検量線を作成する。得られたデータが測定方法に定められた条件に合致していることを確認し、以下の記録を作成する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認を行い、記録を作成する。
(1) 検出下限等算出用検量線の作成者(2) 検出下限等算出用検量線の作成日(3) 測定条件(4) 計測値（発光、吸光又は蛍光等の強度）(5) 測定方法で定められている近似式及びその算出過程

５. 生物検定法における定量結果の確定と結果の報告
以下の 5.1～5.4 の作業を行い、作成した記録及び 4.4～4.7 の記録を整理し、以下の 5.3 で算出した測定量(毒性等量)の精度に問題がないことを確認する。当該精度に問題がない場合は、以下の 5.5～5.11 の作業を行い、それらに精度管理上問題がないと認められる場合は、測定用試料の定量結果を確定する。5.3 で算出した測定量(毒性等量)及び 5.5～5.11 の作業において、精度管理上の問題を認めた場合には、適切な措置を講ずる。
5.1

検出下限及び定量範囲

1) 標準物質における検出下限及び定量範囲の算出
原則として、検出下限等算出用検量線の測定操作により得られた測定量（毒性等量）の定量値の変動係数(CV%)が 30%以下となる点を検出下限、20%以下となる点を定量下限とし、この定量下限と本マニュアル第３章又は第４章に記載されている方法により算出された定量上限の間を定量範囲とする方法で算出し、結果を記録しておく。
この標準物質における検出下限及び定量範囲は、尐なくとも 6 ヶ月に 1 回十分な性能が得られていることを確認する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認する。
2) 試料における検出下限及び定量下限
基本的には試料量と前処理を経た最終検液量の数値と、標準物質における検出下限及び定量下限から理論的に算出する。試料における検出下限及び定量下限は、試料採取量や最終検液量等により異なってくる
ため、本マニュアルに従い試料ごとに求める。
5.2

実測濃度

1) 試料測定時の希釈倍率の設定
26

希釈倍率の公比は、希釈直線性の確認ができるように、定量範囲内に複数点のデータが入るように設定されることが望ましい。
実試料の測定において、検量線の直線性が得られる範囲内で複数点のデータが得られなかった場合は、希釈倍率の設定を見直し、再度測定することを考慮する。
2) 実測濃度の算出
本マニュアルに定められた方法により、実測濃度を算出し、その結果を記録する。また、実測濃度の算出に至った計算過程を説明できる資料を作成する。
5.3

測定量（毒性等量）の算出

本マニュアルに定められた方法により、測定量（毒性等量）を算出し、その結果を記録する。また、使用した換算係数等も含め、測定量（毒性等量）の算出に至った計算過程を説明できる資料を作成する。
5.4

再測定

記録の不備、操作ミス及び定量範囲の逸脱等、再測定の必要が生じた場合、その理由を記して再測定を行うとともに、その原因を追究して理由を明確にする。
5.5

操作ブランク試験

操作ブランク値を求め、結果が十分に低値であることを確認し、記録する。なお、操作ブランク試験の値が高い場合は、その原因を追及して理由を明確にする。
5.6

トラベルブランク試験

トラベルブランク値を求め、結果が十分に低値であることを確認し、記録する。なお、トラベルブランク
試験の値が高い場合は、その原因を追及して理由を明確にする。
5.7

二重測定

二重測定用試料の測定量（毒性等量）を求め、結果を比較検討し、記録する。なお、二重測定の値の差が大きい場合は、その原因を追及して理由を明確にする。
5.8

濃度既知試料の測定

濃度既知試料の測定量（毒性等量）を求め、これまでに同一試料について測定した結果と比較検討し、記録する。なお、濃度既知試料を測定した結果が一定の範囲（例えば、当該濃度の±30%以内、又は標準偏差の 2 倍以内）を逸脱していた場合は、濃度既知試料を用いて、前処理及び測定操作等工程ごとに確認し、原因の究明を行う。
5.9

換算係数の確認尐なくとも 6 ヶ月に 1 回又は使用する試薬等の製造ロットが変わったときなどに、HRGC/HRMS 法によって測定された試料について、本測定法による測定を行い、HRGC/HRMS 法により得られた測定量（毒性等量）と本測定法で得られた実測濃度より換算係数を算出し、本マニュアル記載の換算係数と比較し記録する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認を行い、比較結果を記録する。
本マニュアル記載の換算係数と大きく換算係数が乖離する場合又は相関が悪い場合には、原因の究明を行い、その結果及び講じた措置を記録する。
なお、HRGC/HRMS 法を用いる場合は、「ダイオキシン類の環境測定に係る精度管理指針」に留意するこ
ととする。
5.10

回収率の確認

生物検定法においては、試料の採取から前処理操作に至るまでの回収率を、標準物質の添加などによって27

確認することは困難である。また、生物検定法によって得られた実測値を毒性等量に換算する際に用いる換算係数には、既に抽出及び前処理操作における回収率が考慮されている。そのため、尐なくとも 6 ヶ月に 1
回又は使用する試薬等の製造ロットが変わったときなどに、HRGC/HRMS 法に定められた方法によって回収率の測定を行う。
このときの回収率が、50%～120%の範囲を逸脱していた場合は、抽出、前処理等の工程ごとに回収率を確認し、原因の究明を行い、その結果及び講じた措置を記録する。
5.11

異常値及び欠測値の発生原因等

5.1～5.10 でデータの確定ができなかった異常値及び欠測値については、その原因等を検討し、その結果を記録する。また、異常値及び欠測値について、精度管理上問題がある場合については、再測定などの必要な措置を講じる。
5.12

試料等の保存再測定に備えた試料等の保存及び管理を行い、その管理番号、保存及び管理の方法並びに期間を記録する。

28

第３章

各論(ダイオキシン類がアリール炭化水素受容体に結合することを利用した方法)

その１

前処理に、硫酸シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性組換

え細胞 H1L6.1c2 を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 1 の 1)

第１節 測定方法の概要

対象媒体ごとに試料を採取し、ダイオキシン類を抽出後、クリーンアップを行い、ダイオキシン類応答性
組換え細胞 H1L6.1c2 を用いたレポータージーンアッセイによる測定により定量する。測定方法のフローを
図 3-1-1 に示す。

試料採取
抽出
クリーンアップ
ダイオキシン類応答性組換え細胞 H1L6.1c2 を用いたレポータージーンアッセイによる測定
ダイオキシン類(実測濃度)の定量
換算係数による測定量(毒性等量)への換算
測定値確定
図 3-1-1 測定方法のフロー

第２節 用語の定義
Cell Line、培養により増殖できる植物や動物起源の細胞集団

1) 細胞株2) 遺伝子組み換え細胞3) 組換え DNA 技術
4) 外来遺伝子組換え DNA 技術を用いて作製された細胞

組換え DNA を作製し、それを生細胞(宿主)に移入し、増殖させる技術

Exogenous Gene、遺伝子工学的手法等により外部から細胞内に導入された遺伝子

5) ルシフェラーゼ遺伝子

Luciferase Gene。生物発光反応を触媒する酵素を発現するホタル由来の遺伝

子6) DRE

Dioxin Responsive Element。ダイオキシン応答配列、ダイオキシン類が特異的に結合する遺伝

子の塩基配列部分。
7) ベクター

Vector、組換え DNA 技術において、目的とする遺伝子を宿主細胞に運ぶ自己複製 DNA 分子298) リガンド

Ligand。タンパク質又は他の分子の特異的部位に結合する分子の総称。受容体が鍵穴でリガンドが鍵の関係。両者が結合すると、両者の関係に特異的な信号が発生し生理反応が引き起こされる。
Arylhydrocarbon Receptor。アリール炭化水素受容体、特異的な細胞外シグナル伝達分子

9) Ah 受容体

(リガンド)に結合し、細胞の応答するきっかけとなるタンパク質。ダイオキシン類の生体影響の多くは、この受容体と結合することにより引き起こされる。
Gene Transcription、ポリメラーゼという酵素により、DNA の一方の鎖から相補的な

10) 遺伝子転写配列を持つ RNA をコピーすること
Cytochrome P450、薬物代謝酵素シトクロム P450 類に属する薬物代謝酵素。CYP1A1 は、

11) CYP1A1

ダイオキシン類により誘導されることが知られている。
Subculture。保存培養から微生物あるいは培養細胞の一部を分けて別の新鮮な培地に植え

12) 継代培養

継ぎ、再び培養したもの。
Confluent。培養細胞の密集生育状態。

13) コンフルエント

Plasmid。小型の環状 DNA 分子のこと。

14) プラスミド
15) 発光基質

生物発光反応の基質。

16) 精度プロファイル

精度確認用の標準溶液濃度と変動係数(CV%)との関連図。

第３節 試料採取方法に関する特記事項

１．試料ガスの採取量

試料ガスの採取量は、次のような手順によって決定する。採取時間については、その目的に応じて試料ガスの発生状況等を十分考慮して代表試料が採取できるようにしなければならない。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小の試料ガスの量を算出する。

𝑉=

𝑄𝐷𝐿 × 0.4 × 𝑘 × 𝜈 𝑉𝐸
1
×
×
1000
𝑉′𝐸 𝐶𝐷𝐿

ここに、V： 測定に必要な最小の試料ガスの量(m3N)

QDL ： 標準物質における検出下限(pg/mL, 反応溶液中)6.1 の 2)検出下限及び定量範囲の算出例の通りに精度プロファイルより求められた検出下限の標準物質濃度k： 測定量(毒性等量)への換算係数6.1 の 2)検出下限及び定量範囲の算出例の通りに

精度プロファイルより求められた検出下限の標準物質濃度v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)

V’E： 抽出液分取量(mL)

CDL ： 必要となる試料ガスにおける検出下限(ng-TEQ/m3N)4) 算出された最小の試料ガスの量以上を試料ガスの採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
30

(例) 5ng-TEQ/m3N レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となる試料ガスにおける検出下限は0.17ng-TEQ/m3N)
抽出液を 50mL に定容し、その抽出液から 10mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に 4mLの測定用試料溶液に調製する場合の試料ガスの採取量を以下に示す。なお、標準物質による検出下限
値は 0.977pg/ml、排出ガスの測定量への換算係数は 0.221 を用いた。

𝑉=

0.977 × 0.4 × 0.221 × 4 50
1××
= 0.0101000
10 0.17

２．ばいじん及び燃え殻試料の採取量

ばいじん及び燃え殻試料の採取量は、次のような手順によって決定する。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量を算出する。

𝑊=

𝑄𝐷𝐿 × 0.4 × 𝑘 × 𝜈 𝑉𝐸
1
×
×
1000
𝑉′𝐸 𝐶𝐷𝐿

ここに、W： 測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量(g)QDL ： 標準物質における検出下限(pg/mL, 反応溶液中) 6.1 の 2)検出下限及び定量範囲の算出例の通りに精度プロファイルより求められた検出下限の標準物質濃度k： 測定量(毒性等量)への換算係数

： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)

V’E： 抽出液分取量(mL)

CDL ： 必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限(ng-TEQ/g)4) 算出された最小のばいじん及び燃え殻試料の量以上をばいじん及び燃え殻試料の採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例)3ng-TEQ/g レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限は 0.1ng-TEQ/g)
抽出液を 50mL に定容し、その抽出液から 25mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に 4mLの測定用試料溶液に調製する場合のばいじん及び燃え殻試料の採取量を以下に示す。なお、標準物質における検出下限値は 0.977pg/ml、ばいじん及び燃え殻の測定量への換算係数は 0.318 を用いた。

𝑊=

0.977 × 0.4 × 0.318 × 4 50
1××
= 0.00991000
25 0.1031

第４節 試料の前処理

１．試料の前処理の概要
採取した試料は、抽出を行う。抽出液は必要に応じて分取を行い、クリーンアップに移る。図 3-1-2 に試料の前処理から測定までのフローの例を示す。

試料
抽出
抽出液
一部分取

（省略可能）

硫酸シリカゲル／活性炭カラムクロマトグラフ操作
測定用試料
図 3-1-2 試料の前処理から測定までのフローの例

２．試薬

試料の前処理に用いる試薬は、次による。これらの試薬は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
1) 水

JIS K0557 に規定する A4(又は A3)の水、又は同等の品質のもの
JIS K8891 に規定するもの、又は同等の品質のもの

2) メタノール
3) アセトンJIS K8040 に規定するもの、又は同等の品質のもの

4) トルエンJIS K 8680 に規定するもの、又は同等の品質のもの

5) ジクロロメタン
6) ヘキサンJIS K8825 に規定するもの、又は同等の品質のもの

7) 酢酸エチル8) ノナンJIS K8117 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8361 に規定するもの、又は同等の品質のもの

測定に支障のない品質のもの

9) 硫酸ナトリウム

JIS K8987 に規定するもの

10) セライト 545 測定に支障のない品質のもの
11) 塩酸JIS K8180 に規定する特級、又は同等の品質のもの

12) 硫酸JIS K8951 に規定するもの、又は同等の品質のもの

13) ヘキサン洗浄水
14) シリカゲル

1)の水を 6)のヘキサンで十分洗浄したもの

カラムクロマト用シリカゲル(粒径 70～230μm)をビーカーに入れて 180℃で約 48 時間
32加熱した後、デシケーター中で約 30 分間放冷する。調製後、密栓できる試薬瓶に入れ、デシケータ
ー中で保存する
15) 硫酸(33.3%質量分率)シリカゲル

14)のシリカゲル 100g に対して 12)の硫酸 50.0g を添加後、十分振とうし、粉末状にする。調製後、密栓できる試薬瓶に入れデシケーター中に保存する
16) XCARB

活性炭を分散させたセライト(XCARB/セライト(1%質量分率)、又は同等の品質のもの)

17) ガラス繊維ろ紙

孔径 0.5μm 程度のもの、ブフナー漏斗に用いる

３．器具及び装置

試料の前処理に用いる器具及び装置は、次による。これらの器具及び装置は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
3.1

ガラス器具

JIS R3503 及び JIS R3505 に規定するもの。コックの部分がふっ素樹脂製のものを用いてもよい
3.2

ソックスレー抽出器

JIS R3503 に規定するもの、又はこれと同等の品質のもの。接続部にグリースを使用してはならない
3.3

濃縮器

クデルナ-ダニッシュ(KD)濃縮器、ロータリーエバポレータ又は遠心エバポレータ。接続部にグリースを使用してはならない3.4

硫酸シリカゲルカラムクロマトグラフ管(小)内径 7mm、長さ 300mm のガラス製カラムクロマトグラフ管
3.5

硫酸シリカゲルカラムクロマトグラフ管(大)内径 13mm、長さ 300mm のガラス製カラムクロマトグラフ管
3.6

活性炭カラムクロマトグラフ管

内径 6mm、長さ 300mm のガラス製カラムクロマトグラフ管
3.7

漏斗

ブフナー漏斗又はこれと同等の品質のもの

４．前処理操作

4.1

試料量の記録

採取した試料は、試料量を記録する。
4.2

抽出1) 排出ガスJIS K0311 6.4 により、抽出を行う。ただし、内標準物質の添加は行わない。図 3-1-3 に排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

33

樹脂

円筒ろ紙

吸収プローブ洗液

吸収液、洗液ろ過

残さ
HCl(2mol/L)処理

ろ液

試料 1g に対して 20mmol 以
上の塩酸

ろ過

残さ

ろ液

風乾

ソックスレー抽出液－液振とう抽出(トルエン、16 時間以上)

ジクロロメタン(3 回)

ジクロロメタン層

水層

脱水

濃縮

：検体又は試料：作業

抽出液：物又は試料

図 3-1-3 排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例

2) ばいじん及び燃え殻
平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(2)により抽出を行う。ただし、内標準物質の添加の操作は行わない。
試料の適量を用いて、ダイオキシン類分析及び水分測定を行う。図 3-1-4 にばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

34

試料

含水率測定

HCl(2mol/Ｌ)処理

ろ過

残さ

ろ液

風乾
ソックスレー抽出液－液振とう抽出(トルエン、16 時間以上)

ジクロロメタン(3 回)

ジクロロメタン層

水層

脱水

濃縮

：検体又は試料：作業：物又は試料抽出液

図 3-1-4 ばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例

4.3

クリーンアップ

図 3-1-5 にクリーンアップのフローの例を示す(注 1)。
(注 1) 本クリーンアップの手法は、下記の特許によるもの
引 用 文 献 ： M.Chu,et al.,Methods and apparatus for separating and detecting specific polyhalogenated diaromatichydrocarbons,US Patent #6,720,431(2004)

35

抽出液

：検体又は試料：作業

一部分取：省略できる作業：物又は試料

濃縮
夾雑物の少ない場合

夾雑物の多い場合

硫酸シリカゲル(小)／活性炭

硫酸シリカゲル(大)／活性炭

カラムクロマトグラフ操作

カラムクロマトグラフ操作

クロトグラフ操作
酢酸エチル：トルエン：ヘキサン(１：１：８)

クロトグラフ操作
酢酸エチル：トルエン：ヘキサン(１：１：８)トルエン
第 1 画分

トルエン

第 2 画分

第 1 画分

第 2 画分

濃縮

濃縮

測定用試料

測定用試料

図 3-1-5 クリーンアップのフローの例

1) 抽出液の分取(1) 抽出液を分取して一部を測定に使用する場合には、定容した抽出液から目的に合わせて一部を分取する。
(2) あらかじめ、ノナン 20L を入れた受器に適量の抽出液を入れ、遠心エバポレータで乾固寸前まで濃縮し、この濃縮液を室温中でトルエンを除去する。その後、次に示す硫酸シリカゲル-活性炭カラム
クロマトグラフ操作によってクリーンアップを行う。
2) 精製カラムの作製(1) 硫酸シリカゲルカラム(小)a) 3.4 のカラムクロマトグラフ管の底部にガラスウールを詰め、硫酸ナトリウム 1.7g、硫酸(33.3%質量分率)シリカゲル 3.0g、及び硫酸ナトリウム 1.7g を順次充てんする。このカラムを図 3-1-6 に示す。
b) ヘキサン 30mL を流下させる。

36

硫酸ナトリウム 1.7g

硫酸(33.3%質量分率）

シリカゲル（大） 7.1g
シリカゲル（小） 3.0g

ガラスウール

図 3-1-6 硫酸シリカゲルカラムの例(2) 硫酸シリカゲルカラム(大)a) 3.5 のカラムクロマトグラフ管の底部にガラスウールを詰め、硫酸ナトリウム 1.7g、硫酸(33.3%質量分率)シリカゲル 7.1g、及び硫酸ナトリウム 1.7g を順次充てんする。このカラムを図 3-1-6 に示す。
b) ヘキサン 50mL を流下させる。
(3) 活性炭カラム(注 2)a) 3.6 のカラムクロマトグラフ管の底部にガラスウールを詰め、硫酸ナトリウム 0.5g、1%XCARB/セライト 0.3g(注 3)、及び硫酸ナトリウム 1.0g を順次充てんする。このカラムを図 3-1-7 に示す。
b) アセトン 5mL、トルエン 20mL、ヘキサン 10mL を流下させる。
(注 2) 活性炭は製造ロットによって、品質変動が考えられるため、内標準物質(クリーンアップスパイク)を用いて、ロットが変わるたび、
添加回収を HRGC/HRMS 法により確認しておくことが望ましい。
(注 3) 定規を使用し 1%XCARB/セライト層が 3cm の厚みになっていることを確認する。厚みが 3cm に満たない場合、3cm になるよう調整する。

硫酸ナトリウム 0.5g
XCARB/セライト(1%質量分率）0.3g(3cm)
硫酸ナトリウム 1.0g

ガラスウール
図 3-1-7 活性炭カラムの例

3) 硫酸シリカゲル(小)-活性炭カラムクロマトグラフ操作(夾雑物の尐ない場合)(1) 上部に硫酸シリカゲルカラム(小)と下部に活性炭カラムを連結させる。

37

(2) 濃縮液に、ヘキサン 2mL を加え、超音波照尃後、カラムに静かに注ぎ入れる。
(3) ヘキサン 2mL で超音波照尃を行いながら、抽出液の容器を洗浄し、洗液はカラム内壁を洗いながら入れる。
(4) ヘキサン 1mL で同様の操作を行う。
(5) ヘキサン 10mL を流下させる。
(6) 硫酸シリカゲルカラムを外す。
(7) 活性炭カラムにヘキサン 10mL を流下させ、活性炭カラムを洗浄する。
(8) PCBs 溶出液(酢酸エチル/トルエン/ヘキサン(10%/10%/80%体積分率)15mL を流下させる(コプラナーPCBs 画分)。
(9) トルエン 20mL を流下させる(PCDDs 及び PCDFs 画分)。
(10) (8)および(9)画分（コプラナーPCBs 画分＋PCDDs 及び PCDFs 画分）を混合液として測定に供する。
4) 硫酸シリカゲル(大)-活性炭カラムクロマトグラフ操作(夾雑物の多い場合)(注 4)(1) 濃縮液に、ヘキサン 5mL を加え、超音波照尃後、硫酸シリカゲルカラム(大)に静かに注ぎ入れる。
(2) ヘキサン 3mL で超音波照尃を行いながら、抽出液の容器を洗浄し、洗液はカラム内壁を洗いながら入れる。
(3) ヘキサン 2mL で同様の操作を行う。ヘキサン 25mL を流下させる。
(4) 遠心エバポレータでヘキサン 2mL まで濃縮する。
(5) 濃縮液を、活性炭カラムに静かに注ぎ入れる。
(6) ヘキサン 2mL で超音波照尃を行いながら、抽出液の容器を洗浄し、洗液はカラム内壁を洗いながら入れる。
(7) ヘキサン 1mL で同様の操作を行う。
(8) ヘキサン 10mL を流下させ、活性炭カラムを洗浄する。
(9) PCBs 溶出液(酢酸エチル/トルエン/ヘキサン(10%/10%/80%体積分率)15mL を流下させる(コプラナーPCBs 画分)。
(10) トルエン 20mL を流下させる(PCDDs 及び PCDFs 画分)。
(11) (9)および(10)画分（コプラナーPCBs 画分＋PCDDs 及び PCDFs 画分）を混合液として測定に供する。
(注４) シリカゲル(大)-活性炭カラムクロマトグラフ操作を行なう目安としては、硫酸シリカゲル(小)で処理した場合に黄色もしくは、黒色のバンドが下部の硫酸ナトリウム層まで達した場合とする。この場合は、抽出液の分取からやり直し、硫酸シリカゲル(大)での処理を行う。

5) 測定用試料の保存(1) 3)又は 4)の操作によって得られた溶液(PCDDs 及び PCDFs＋コプラナーPCBs 混合液)は遠心エバポ
レータで溶媒が完全になくなるまで濃縮する。
(2) 濃縮液を乾固させた遠沈管にヘキサン 4mL を加える。
(3) 遠沈管を 10 分間超音波照尃する。
(4) 遠沈管の内壁を 2、3 回洗いながら、ヘキサンを 4mL 容のバイアル瓶へ移す。
(5) バイアル保管用の容器に入れ、冷蔵庫(5℃)で保存する。

38

第５節 測定

１．測定の概要
本方法は、ダイオキシン類応答性組換え細胞 H1L6.1c2 を用いて、試料中に含まれるダイオキシン類が細胞内の Ah 受容体と結合することに由来して発現するルシフェラーゼの活性に基づく発光量を発光光度計で測定することによりダイオキシン類の毒性等量を測定する方法である。
2,3,7,8-TeCDD を用いて検量線を作成し、試料の発光量から算出した実測濃度に排出ガス、ばいじん及び
燃え殻について定められた換算係数を乗じることにより、測定量（毒性等量）を算出する。

２．試薬、器具及び装置

2.1

使用細胞

ダイオキシン類応答性組換え細胞 H1L6.1c2：レポーター遺伝子としてホタルのルシフェラーゼ遺伝子を用い、その上流域にダイオキシン応答配列 DRE を 4 個持つマウスのシトクロム P450(CYP1A1)プロモーターを配置したプラスミド pGudLuc6.1 を、マウス肝がん由来細胞 Hepa-1c1c7 に導入したもの(注５)。
(注５) 引用文献 1：M.S.Denison,et al.,Bioassay for detecting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-para-dioxin and TCDD-like compounds
and novel recombinant cell line useful therefor,US Patent#5,854,010(1998),引用文献 2：Dalhp Han,Scott R.Nagy
and Michael S Denison,Comparison of recombinant cell bioassays for the detection of Ah receptor
agonists,BioFactors 20(2004)11-22

2.2

試薬

測定に用いる試薬は、次による。
1)培地(RPMI1640 培地、FBS(+8%体積分率)、ペニシリン/ストレプトマイシン混合溶液(+1%体積分率))2)を 500mL に 3)を 5mL、4)を 44mL 混合したもの

2)

RPMI1640 with L-Glutamine

3)

ペニシリン/ストレプトマイシン混合溶液

5000units/mL ペニシリン・5mg/mL ストレプトマイシン、ろ過滅菌及びエンドトキシンテスト済、0℃以下凍結保存
4)Fetal Bovine Serum(FBS)

56℃、30 分間非働化処理済、-20℃凍結保存5)

トリプシン溶液

6)

リン酸緩衝生理食塩液(PBS(-))

マグネシウム及びカルシウム不含

7)ジメチルスルホキシド(DMSO)JIS K9702 に規定するもの、又は同等の品質のもの(注 7)8)

細胞凍結用保存液

0.25%、0℃以下凍結保存

培地 34mL に DMSO 6mL 加え、シリンジフィルタ(孔径 0.2μm)を用い、ろ過滅菌を行ったもの
9)

標準物質(1)

2,3,7,8-TeCDD(50g/mL Toluene)10) 保管用標準液(1-1)(Conc. TeCDD 5g/mL DMSO)

9)の標準物質を DMSO で 10 倍希釈する

11) 保管用標準液(1-2)(internal TeCDD 250ng/mL DMSO)

10)の保管用標準液(1-1)を DMSO で 20 倍希

釈する
12) 検量線作成用標準液(2,3,7,8-TeCDD DMSO 溶液)
する(表 3-1-1)

3911)の保管用標準液(1-2)を DMSO で希釈して調製

13) 標準物質(2)PCDDs/PCDFs 混合溶液(4111ng-TEQ/mL nonane)14) 保管用標準液(2-1) PCDDs/PCDFs 混合溶液(180ng-TEQ/mL DMSO)

13)の標準液を DMSO に転溶

し、 DMSO で 22.8 倍する
15) Quality Control PCDDs 及び PCDFs 混合溶液(QC 溶液)(0.250ng-TEQ/mL DMSO)

14)の保管用標

準液(2-1)を DMSO で 720 倍希釈する(表 3-1-2)16) ルシフェラーゼ定量キット
17) 細胞溶解液(Cell culture lysis reagent(×5 solution))

Cell culture lysis reagent(×5 solution)2mL に、

水 8mL を加え調製する
18) 水

JIS K0557 に規定する A4(又は A3)の水又は同等な品質のもの

19) ヘキサン

JIS K8825 に規定するもの、又は同等の品質のもの

20) 炭酸ガス

CO2 99.99%

21) 液体窒素(注 7) ジメチルスルホキシド(DMSO)の品質変動は、測定結果に影響を及ぼすことがあるためロットの変更時等には十分注意する。

表 3-1-1 検量線作成用標準液の調製例
濃度(ng/mL)

標準物質(1)

2,3,7,8-TeCDD

STD0

STD1

STD2

STD3

STD4

STD5

STD6

STD7

STD8

STD9

25.0

12.5

6.25

3.13

1.56

0.781

0.391

0.195

0.09970.0488

表 3-1-2

QC 溶液の調製例

標準物質
2,3,7,8-TeCDD
1,2,3,7,8-PeCDD
1,2,3,4,7,8-HxCDD
1,2,3,6,7,8-HxCDD
1,2,3,7,8,9-HxCDD
1,2,3,4,6,7,8-HpCDD
OCDD
2,3,7,8-TeCDF
1,2,3,7,8-PeCDF
2,3,4,7,8-PeCDF
1,2,3,4,7,8-HxCDF
1,2,3,6,7,8-HxCDF
1,2,3,7,8,9-HxCDF
2,3,4,6,7,8-HxCDF
1,2,3,4,6,7,8-HpCDF
1,2,3,4,7,8,9-HpCDF
OCDF
Total PCDD/Fs(ng-TEQ/mL)

2.3(有効数字 3 桁表記)

標準物質(2)濃度(ng/mL)
保管用標準液
(2-1)

QC 溶液

1000

44

0.061

2000

88

0.12

5000

219

0.30

1000

44

0.061

2000

88

0.12

5000
3893

219
171

0.30
0.237

器具及び装置測定に用いる器具及び装置は、次による。

40

1)

ルミノメーター2)

インキュベーター

3)

遠心分離機

4)

安全キャビネット

5)

液体窒素容器6)システム顕微鏡

7)

培養顕微鏡

8)

恒温槽

9)

高圧蒸気滅菌器

室温＋5℃～50℃、飽和湿度、5% CO2 濃度

回転数 3000～4000 min-1 が得られるもの
クラスⅡタイプ A

JIS T7322 又は JIS T7324 に規定するもので 121℃以上に加熱でき、196kPa の器

内圧力で使用できるもの
10) 乾熱滅菌器

160～200℃に調節できるもの

11) バキュームポンプ
12) ミキサー13) 遠心エバポレータ
14) パスツールピペット

ガラス製、ピペット滅菌箱に入れ、乾熱滅菌をしておく

15) 10mL プラスチックピペット

10mL、50mL、ポリプロピレン製、使い捨てできるもの

16) プラスチックチューブ
17) 培養フラスコ18) チップ

ポリスチレン製、使い捨てできるもの

25cm2、75cm2、150cm2、ポリプロピレン製

20L 用、200L 用、1000L 用、オートクレーブ可能なもの、ポリプロピレン製、高圧蒸

気滅菌を行う19) 連続分注ピペットチップ

10mL20) 96 ウェルクリアボトムプレートル (マイクロプレート)

96well Flat Bottom、ポリスチレン製、白色プレート、細胞培養表面処理、滅菌済み
21) バッキングテープ
22) 凍結保存用バイアル23) 25mm シリンジフィルタ24) 13mm ガラス試験管
25) マイクロピペット

孔径 0.2m、滅菌済み

13×100mm 直口フリントガラスチューブ

20L、200L、1000L26) 8 連ピペット27) 連続分注ピペット28) 血球計算盤(改良型ノイバウェル血球計算盤、ブライトライン)
29) プレートシェーカー
2.4

器具等の滅菌操作

器具等の滅菌操作は、次の通り行う。
1) 乾熱滅菌

ガラス製及び金属製器具類の滅菌に用いる。約 170℃で約 1 時間滅菌する。

2) 高圧蒸気滅菌

2.5

使用済み培地等の滅菌に用いる。121℃で約 30 分間滅菌する。

消毒操作

消毒操作は、次の通り行う。
41

1) 試験操作の前後には、手指及び実験台、キャビネットを消毒する。消毒用エタノール(エタノール(70%体積分率))を用いる。
2) 使用済みのパスツール、吸引瓶、培地は、次亜塩素酸(10%)で消毒する。
2.6

吸引操作

吸引操作は、次の通り行う。
1) 安全キャビネット内で、バキュームポンプに接続しているチューブに滅菌済のパスツールピペットをつなぎ、バキュームポンプのスイッチを入れる。
2) 作業終了後は、2.5 の 2)の消毒操作を行う。

３．細胞の取り扱い

3.1

培養細胞の起眠1) 液体窒素保存容器(凍結保存用バイアル)から取り出し融解後、培養フラスコ(25cm2)にて培養(1) 液体窒素保存容器から凍結保存用バイアルを取り出す。
(2) 培地 1mL をマイクロピペットで凍結保存用バイアルに移し、ピペッティングにより凍結保存用バイ
アル内の氷を溶かす。溶けたものはプラスチックチューブ(15mL)に移す。これらの動作を数回繰り返す。(注 8)(3) 凍結保存用バイアル内の培地を全部移したプラスチックチューブ(15mL)を 500rpm、10min 遠心分
離する。
(4) パスツールピペットを使用して、プラスチックチューブより培地を吸引除去する。(注 8)(5) 細胞のペレットが入ったプラスチックチューブに 10mL プラスチックチューブを用いて培地 5mL を加え、ピペッティングにより細胞のペレットを懸濁する。(注 8)(6) 培養フラスコ(25cm2)に細胞懸濁液を全量移し、培養フラスコを数回傾けてなじませる。(注 8)(7) インキュベーターにフラスコを入れ、CO2 5%、37℃の環境下で培養する。
2) 培養フラスコ(25cm2)から播種し、培養フラスコ(75cm2 又は 150cm2)へ継代培養を行う。
翌日より毎日細胞の増殖状況を観察し、コンフルエントになったのが確認できたら、培養フラスコ(25cm2)をインキュベーターから取り出し、中の培地が濁っていないか目視で確認し、培養顕微鏡で細胞状態を確認する。
空の培養フラスコ(75cm2 又は 150cm2)を用意し、3.2 及び 3.3 の操作を行う (注 8)(注 9)。
(注 8) 安全キャビネット内で無菌操作を行う。
(注 9) 中の培地が濁っていたり、細胞が接着面より剥がれている場合、雑菌汚染を起こしているため、同じ培養系列の細胞を破棄して新しく冷凍細胞を起こして培養したものを使用する。

3) 特記事項(1) 液体窒素保存容器(凍結保存用バイアル)から立ち上げて、150cm2 でコンフルエントになった状態（約1 週間）から試験に使用可能な細胞とする。
(2) 試験に使用できる期限としては、40～50 代までを目安とし、期限前であっても、測定をする際に問題があった場合は、原因を追及し、細胞の使用期限であると考えられた場合は、直ちに破棄する。
(3) 停電時には、細胞をインキュベーター内で保管し、温度及び CO2 の低下を極力抑えるため、解放しない。使用する際には、細胞の状況確認し、問題なければ、測定し、問題があれば、直ちに破棄する。
42

3.2

細胞の回収

1) 培養フラスコ(150cm2)(注 10)をインキュベーターから取り出し、中の培地が濁っていないか目視で確認
し、培養顕微鏡で細胞状態を確認する。培養フラスコの容量と試薬の分注量の一覧を表 3-1-3 に示した。
2) パスツールピペットを用いて培養フラスコから培地を完全に吸引除去する。(注 8)3) プラスチックピペット(10mL)で PBS(-)を 5mL 加え、培養フラスコ壁面の洗浄を行い、パスツールピペ
ットで PBS を吸引除去する。(注 8)4) プラスチックピペットで、トリプシン溶液を 2mL 加え、細胞接着面になじませる。(注 8)5) 1 分程度培養フラスコを寝かせて静置し、細胞が浮き上がってきたら、手のひらの付け根で培養フラス
コの側面をたたいて細胞を剥がす。(注 8)6) プラスチックピペットで培地を 10mL 加え、フラスコの壁面を洗いながら注ぎ込む。(注 8)7) プラスチックピペットで、培養フラスコ中の培地を吸い取り、プラスチックチューブに移し、500rpm、10 分間遠心分離する。
8) 細胞を吸い取った培養フラスコは、プラスチックピペットで PBS(-)を 10mL 加え、壁面の洗浄を行い、パスツールピペットで PBS(-)を吸引除去する。(注 8)9) 培養フラスコをすぐに使用しない場合は、冷蔵庫で保管する。
(注 10) 培養フラスコの種類は、この限りではない。面積により試薬の注入量を変更すればよい。

表 3-1-3 培養フラスコの容量と試薬の分注量の一覧(回収時)
培養フラスコ(cm2)

PBS(-) (mL)

トリプシン溶液 (mL)

培地(mL)

PBS(-) (mL)

150

5

2

10

10

75

2

1

5

5

25

1

0.5

2

2

3.3

細胞の継代

1) インキュベーターから培養フラスコ(150cm2)(注 11)を取り出し、3.2 の回収操作を行う(注 8)。
2) 空の培養フラスコ(150cm2)にあらかじめ培地 19mL を入れておく(注 8)。
3) 細胞のペレットが入ったプラスチックチューブ(50mL)に細胞懸濁液を加える。加える培地の量は、希釈倍率に応じて変わるため、回収した培養フラスコ 1 枚分の細胞につき表 3-1-3 のようになる(注 8) (注 12)。
4) プラスチックピペットで 10 回程度ピペッティングし再懸濁し、細胞懸濁液 1mL を接種用に用意した培養フラスコに接種する(注 8)。
5) 培養フラスコを穏やかに数回傾け、培地中の細胞が均一になるようになじませる(注 8)。
6) インキュベーターにフラスコを入れ、5%CO2、37℃の環境下で培養する。
(注 11) 培養フラスコの面積は、この限りではない。面積により試薬の注入量を変更すればよい(表 3-1-4 参照)(注 12) 細胞の希釈率の決定：試験使用細胞株は、24 時間でほぼ 2 倍に増殖する。したがって、細胞を回収、使用したい日にコンフル
エントなフラスコ(フラスコ底面を細胞が 80%以上覆っている状態のもの)を手に入れるためには、以下の希釈倍率を用いればよい。コンフルエントなフラスコ 1 個から細胞を回収し、n 日後にコンフルエントな同等のフラスコ１個が欲しいとき、希釈率は、1:2n(n=1～3)で表すことができる。また、コンフルエントなフラスコ A 個から接種用のフラスコに 1：B の希釈率で接種するとき、回収した細胞を新しい培地(A×B)mL で再懸濁し播種用のフラスコに 1mL 播種する。

43

表 3-1-4 フラスコ容量と試薬の分注量の一覧(継代時)
培養フラスコ(cm2)培地 (mL)

150

19

75

9

1:2

細胞懸濁液
(mL) (注 13)
2

1:4
1:8
1:2
1:4
1:8

4
8
2
4
8

希釈倍率

(注 13) 細胞懸濁液は、細胞のペレットを再懸濁させる時に使用する培地の液量(mL)のことで、所定の培地で懸濁後、細胞懸濁液 1mLを接種し、培養フラスコ播種する場合を想定した分注量となる。

3.4

細胞の保存

1) インキュベーターから培養フラスコ(150cm2)を取り出し、3.2 の回収操作を行なう(注 8)。
2) パスツールピペットを使用し、プラスチックチューブ(50mL)より培地を吸引除去する(注 8)。
3) 細胞のペレットが入ったプラスチックチューブにプラスチックピペット(10mL)を用いて、(20mL×播種したフラスコ数)の培地を加え、ピペッティングにより細胞のペレットで懸濁液を作成する(注 8)。
4) 4.1 の細胞数の計測に従い、細胞濃度を 0.4×106cells/mL～1.2×106cells/mL となるように、培地を加え、プラスチックチューブを上下にしてよく混合する(注 8)。
5) 細胞懸濁液と細胞凍結用保存液を 1：1 の割合で混合する(注 8)。
6) マイクロピペット(1000L)を用いて、1.5mL ずつ凍結保存用バイアルに分注する(注 8)。
7) 発泡スチロールの容器に入れ、－20℃で 4 時間保存する。
8) －80℃で一晩保存する。
9) 液体窒素保存容器へ移し保管する。

４．測定操作4.1

細胞のマイクロプレートへの播種

1) インキュベーターから培養フラスコ(150cm2)を取り出し、3.2 の操作を行なう(注 8)。目安として、およそ培養フラスコ 1 枚からプレート 1 枚作成が可能である。
2) パスツールピペットを使用し、プラスチックチューブ(50mL)より培地を吸引除去する(注 8)。
3) 細胞のペレットが入ったプラスチックチューブにプラスチックピペット(10mL)を用いて培地 20mL を加え、ピペッティングにより細胞のペレットの懸濁液を作成する(注 8)。
4) マイクロピペット(20L)を用いて細胞懸濁液 15L を血球計算盤に乗せ、システム顕微鏡(×100)で細胞数(1mL 当りの細胞数)を求める。
5) 下記の計算を行い(注 13）、最終濃度 7.5×105 cells/mL となるよう最終容量を求め、最小容量になるよ
うに培地で適宜、希釈調製を行う(注 8)。
6) 8 連ピペットを用いてマイクロプレートの各ウェルに細胞懸濁液を 200L ずつ加えていく(注 8)。
7) インキュベーターにマイクロプレートを入れ CO2 5%、37℃の環境下で 14～24 時間培養する。

44

(注 13）細胞数の計測の仕方：計算時の細胞濃度(cells/mL)＝血球計算盤の 4×4 グリッドの細胞数の平均×104

最終容量 (mL) 

現在の容量 (mL)  計算時の細胞濃度 (cells / mL)
7.5  10 5 (cells / mL)

4.2 曝露4.2.1

希釈率決定曝露操作

1) 溶液の適量配分(1) 測定用試料の分取
a)13mm ガラス試験管に DMSO を 2L 分注する。

b)

測定用試料を 4mL バイアルより一部適量を分取する(注 14)。

(注 14) 希釈率決定曝露操作で適量とは、表 3-1-5 に示す分注量を指す。
希釈率は、4mL 精製液に対して、2 ウェルに必要な試料割合のことで、1:40 であれば、4mL の 1/40 量(100L)が測定用試料の分注量である。今回、希釈倍率決定の際には、3 段階の希釈倍率を各 1 ウェルを用いて測定を行うため、希釈倍率 1:40 では、その半分(50L)が適量となる。

表 3-1-5 希釈率と測定用試料の分注量の一覧
希釈率
1:40
1:400
1:4000測定用試料の分注量(1 ウェル当たり)
50L
5L
0.5L

(2) 検量線作成用標準液及び QC 溶液の分取a)13mm ガラス試験管に DMSO を 4L 分注する。

b)

9 段階に希釈された検量線作成用標準液及び QC 溶液を適所に 4L ずつ加える。

(3) ネガティブコントロール(NC)の分取
a)13mm ガラス試験管に DMSO を 4L 分注する。

2) DMSO 置換及び培地混合操作(1) ヘキサンを加え、測定用試料の試験管内液量を 0.5mL、検量線作成用標準液、QC 溶液及び NC の試
験管内液量を 1mL になるようメスアップする。
(2) 遠心エバポレータに試験管を入れ 12 分間濃縮する。
(3) その後、2 分ごとに、ガラス試験管内のヘキサンの残量確認を行う。
(4) 濃縮が確認されれば、最後に 2 分間濃縮を行い、完全に揮発させる。
(5) 連続分注ピペットを使用し、測定用試料の 13mm ガラス試験管に培地を 200 L、検量線作成用標準
液、QC 溶液及び NC の試験管に培地を 400L 加え、10 秒程ミキサーにかけ攪拌する。
3) 細胞への曝露(1) 14～24 時間培養したマイクロプレートをインキュベーターから取り出す。
(2) マイクロプレートのデカンテーションを行い、培地を完全に取り除く。
(3) 培養顕微鏡で全てのウェルの細胞の状態を確認する。尐しでも異常が見られたらプレートシートにチェックをしておく。
(4) 2)で得られた DMSO 置換溶液(測定用試料＋検量線作成用標準液及び QC 溶液＋NC をマイクロピペ
45

ットで、測定用試料 190L を 1 ウェル、検量線作成用標準液及び QC 溶液＋NC を 190L ずつ 2 つのウェルに分注する。プレートレイアウト例は、図 3-1-8 の通り。
(5) 37℃、CO2 5%の環境下で、20～24 時間培養する。
1

2

B

NC

3
希釈
1.1
→〃

C

NC

→〃

STD4 →〃

D

STD9

→〃

STD3 →〃

E

STD8

→〃

STD2 →〃

F

STD7

→〃

STD1 →〃

G

STD6

→〃

QC
溶液

→〃

希釈 希 釈16.1 16.2

希釈
16.3

A

H

4
希 釈
1.2
STD5

5
希釈
1.3
→〃

6
希釈
2.1
希釈
4.1
希釈
6.1
希釈
8.1
希釈
10.1
希釈
12.1
希釈
14.1
希釈
17.1

7
希釈
2.2
希釈
4.2
希釈
6.2
希釈
8.2
希釈
10.2
希釈
12.2
希釈
14.2
希釈
17.2

8
希釈
2.3
希釈
4.3
希釈
6.3
希釈
8.3
希釈
10.3
希釈
12.3
希釈
14.3
希釈
17.3

9
希釈
3.1
希釈
5.1
希釈
7.1
希釈
9.1
希釈
11.1
希釈
13.1
希釈
15.1
希釈
18.1

10
希釈
3.2
希釈
5.2
希釈
7.2
希釈
9.2
希釈
11.2
希釈
13.2
希釈
15.2
希釈
18.2

11
12
希釈
3.3
希釈
5.3
希釈
7.3
希釈
9.3
希釈
11.3
希釈
13.3
希釈
15.3
希釈
18.3

図 3-1-8 レイアウト例(希釈率決定)(注 15)① 太枠：B2～G2、B3～G3、B4～G4 及び B5～G5 は、検量線作成用標準液、QC 溶液並びに NC に 2 ウェルごとに使用する② それ以外のウェル：1 試料当り希釈率 3 段階の調製液を 1 ウェルずつ曝露する。
(注 15) 定量操作における希釈率の決定：定量範囲として、STD8：0.977～STD：31.2 pg/mL を設定する(詳細は 6.1 を参照)。定量範囲に入る希釈倍率を希釈倍率決定用の曝露試験にて、試料ごとに決定する。定量範囲より低い RLU を示した場合、希釈倍率を下げる。定量範囲より高い RLU を示した場合、希釈倍率を上げる。希釈倍率としては、1：4 が最高濃度となることに注意する。

4.2.2

定量曝露操作1) 溶液の適量配分(1) 測定用試料の分取
a)13mm ガラス試験管に DMSO を 4L 分注する。

b)

測定用試料を 4mL バイアルより一部適量を分取する(注 16)。

(注 16) 適量とは、希釈率決定曝露操作で得た情報を元に分取率を決定する。

(2) 検量線作成用標準液及び QC 溶液の分取
a)9 段階に希釈された検量線作成用標準液及び QC 溶液を適所に 4L ずつ加える。

(3) NC の分取
a)13mm ガラス試験管に DMSO を 4L 分注する。

2) DMSO 置換及び培地混合操作(1) ヘキサンを加え、全ての 13mm ガラス試験管中の液量を 1mL とする。
(2) 遠心エバポレータに 13mm ガラス試験管を入れ 12 分間濃縮する。

46

(3) その後、2 分ごとに、ガラス試験管内のヘキサンの残量確認を行う。
(4) 濃縮が確認されれば、最後に 2 分濃縮を行い、完全に揮発させる。
(5) 連続分注ピペットを使用し、各試験管に培地を 400L 加え、10 秒程ミキサーにかけ攪拌する。
3) 細胞への曝露(1) 14～24 時間培養したマイクロプレートをインキュベーターから取り出す。
(2) マイクロプレートのデカンテーションを行い、培地を完全に取り除く(注 8)。
(3) 培養顕微鏡で全ウェルの細胞の状態を確認する。尐しでも異常が見られたら記録用紙にチェックをしておく。
(4) 2)で得られた DMSO 置換溶液(測定用試料＋検量線作成用標準液及び QC 溶液＋NC をマイクロピペ
ットで、190L ずつ 2 つのウェルに分注する(注 8)。プレートレイアウト例は、図 3-1-9 の通り。
(5) CO2 5%、37℃の環境下で、20～24 時間培養する。
2

3

4

A
B

1

5

NC

→〃

STD5 →〃CNC→〃

STD4 →〃

D

STD9

→〃

STD3 →〃

E

STD8

→〃

STD2 →〃

F

STD7

→〃

STD1 →〃

G

STD6

→〃

QC
溶液

→〃

6

7

8

9

10

11

試料
1.1
試料
1.2
試料
2.1
試料
2.2
試料
3.1
試料
3.2

→〃

試料
4.1
試料
4.2
試料
5.1
試料
5.2
試料
6.1
試料
6.2

→〃

試料
7.1
試料
7.2
試料
8.1
試料
8.2
試料
9.1
試料
9.2

→〃

→〃
→〃
→〃
→〃
→〃

→〃
→〃
→〃
→〃
→〃

12

→〃
→〃
→〃
→〃
→〃

H
図 3-1-9 レイアウト例(定量)①

中太枠：B2～G2、B3～G3、B4～G4、B5～G5 は、検量線作成用標準液、QC 溶液、NC に 2 ウェルごとに使用する。

②

太枠：1 試料当り 2 つの同じ希釈調製液をそれぞれ横方向の 2 ウェルごとに曝露する。

4.3

ルシフェラーゼ活性の測定

1) 細胞の溶解(1) 20～24 時間培養したマイクロプレートをインキュベーターより取り出す。
(2) マイクロプレート内の培地をデカンテーションにより完全に取り除く。
(3) 8 連ピペットを用いて PBS を各ウェルに 50L ずつ加え、洗浄する。
(4) マイクロプレート内の PBS をデカンテーションにより完全に取り除く。
(5) 顕微鏡で全てのウェルの細胞の状態を確認する。尐しでも異常がみられたら、プレートシートにチェックをしておく。
(6) マイクロプレートの底にバッキングテープを貼る。
(7) 連続分注ピペットを用いて細胞溶解液を各ウェルに 30L ずつ加える。
(8) プレートシェーカーにてマイクロプレートを 2 分間穏やかに振動させ混合する。
(9) 10 分間静置する。

47

2) ルシフェラーゼ活性の測定(注 17)(1) インジェクターに発光基質溶液を充填する。
(2) フタをはずした 96 穴プレートをセットし、ルシフェラーゼ活性を測定する。
(注 17) ルミノメーターの機器管理の一環として、毎日のセットアップ時にテストプレートを用いて、機器の発光の精度を確認すること
を薦める。

５．定量

5.1

検量線の作成1) 本法のダイオキシン類の検出原理を記述する最も単純化した反応式は酵素反応式と同様の反応と考えて、下の通りに記述できる。
𝒌𝟏 𝒌𝟐
𝑬+𝑺 ⇔ 𝑪 → 𝑬+𝑷
𝒌−𝟏
ここに、E

: 酵素反応式における酵素(本法では Ah 受容体に該当)S: 酵素反応式における基質(本法ではダイオキシン類に該当)C: 酵素反応式における酵素－基質複合体(本法では Ah 受容体-ダイオキシン類結 合体に該当)P: 酵素反応式における反応生成物(本法ではルシフェラーゼに該当)k: 反応速度定数

本生物検定法ではダイオキシン類(S)と Ah 受容体(E)との結合、そしてその結果、活性化されるルシ
フェラーゼ遺伝子により生成するルシフェラーゼ(P)を、上記の酵素反応式に適用している。
2) 酵素反応のモデル式には Hill の式を用いている。
Hill の式は最も単純な式である Michaelis-Menten の式

𝑉=𝑉𝑚𝑎𝑥 × 𝑆+𝑏
𝐾𝑚 + 𝑆

ここに、 V： 反応速度Vmax ： 最大反応速度[S］ ： 基質濃度Km

： V=1/2Vmax の時の基質濃度b： Intercept parameter（切片変数）の[S ]の代わりに[S ]n を適用したもので、薬理学で薬物濃度とそれによる臓器や組織の反応を表現するのによく使われている式である。
3) 検量線のモデル式には Hill の式を用いる。

𝑉=

𝑉𝑚𝑎𝑥 × 𝑆 𝑛+𝑏
𝐾𝑚 𝑛 + 𝑆 𝑛

ここに、 V： 薬理反応(ルシフェラーゼの生成濃度＝RLU)

Vmax ： 最大薬理反応(ルシフェラーゼ最大生成量)[S ]： 基質濃度(ダイオキシン類濃度)の自然対数値

Km： V=1/2Vmax の時の基質濃度の自然対数値
48

n： Hill’s coefficient（Hill の係数）
、Slope parameter（勾配変数）b： Intercept parameter（切片変数）

4) 検量線の係数を求める
2,3,7,8‐TeCDD 標準物質の添加により生じる細胞の RLU を測定し、モデル式でカーブフィットさせ、パラメーターを決定する。
10 段階のダイオキシン類濃度希釈列に対する RLU を測定し、理論式に代入し、表計算ソフト等を用いて、4 つのパラメーター、Vmax、Km、n、b の最適化(測定した RLU と理論式における RLU との偏差の2 乗が最小になるようにする)を行う。検量線作成およびパラメータの例は、図 3-1-10 の通り。

A
23.75
11.9
5.94
2.97
1.48
0.742
0.371
0.186
0.0928標準物質濃度(pg/ml )B=
A/190*1000
125
62.5
31.3
15.6
7.81
3.91
1.95
0.977
0.488

Vmax =
Km =

標準物質
対数
変換値
C=
LN(B*100)
9.43
8.74
8.05
7.35
6.66
5.97
5.27
4.58
3.89

パラメーター
28631
7.75

RLU
22880
19448
16471
12357
7517
4754
2114
1233
434

25000
20000
15000
10000
5000
0
3.0

5.0

7.0

9.0

11.0

[TeCDD]C=LN(B*100)n =b =図 3-1-10

5.2

CALUX TeCDD 濃度-応答曲線

標準物質
計測値

Rusiferase Light Unit

標準
物質量(pg/well)

6.59
192

検量線作成及びパラメーターの例

検量線の確認及び感度変動の管理図による確認

定量操作が適切に行われているかどうかを確認するため、検量線の確認及び感度変動の確認について、管理限界（μ±2σ）を用いて行う（μ:工程平均、σ:測定量（毒性等量）の標準偏差）。
STD5(TeCDD：0.78ppt)及び QC 溶液の測定値から、測定量（毒性等量）を求め、管理図に記録し保存する。管理図による処置基準は、管理限界（μ±2σ）からの逸脱状況に応じて下記の通りとする。
1点でも管理限界を超えた場合は、原因の究明と改善を行うとともに、再測定する。改善のために講じた措
置及び再測定の結果について、記録をする。また、管理限界内であっても基準値に対して、一定の傾向で外れていくような状態又は偏った測定量が続くような状態においては、原因の究明を行い、必要に応じ、改善を行うとともに、再測定する。
感度変動の管理図作成の例を次に説明する。STD5(TeCDD：0.78ppt)及び QC 溶液管理図例は、図 3-1-11
及び図 3-1-12 の通り。
1) ４．測定操作に従って、定量を行う。
2) STD5(TeCDD ： 0.78ppt) に つ い て は 、 5.3 測 定 試 料 の 定 量 に 従 っ て 毒 性 等 量 を 算 出 す る 。
STD5(TeCDD：0.78ppt)の算出例は、表 3-1-6 の通り。

49

3) QC 溶液については、5.3 測定試料の定量に従って実測濃度を算出する。
4) QC 溶液の実測濃度に対して、PCDDs/PCDFs 混合標準液の換算係数(0.607)を乗じて、毒性等量を算出する。
測定値(毒性等量)（ng-TEQ/mL）＝実測濃度(ng/mL)×換算係数
QC 溶液(ng-TEQ/mL)＝0.53(pg/L)×0.642＝0.35
QC 溶液の算出例 は、表 3-1-6 の通り。
表 3-1-6

STD5(TeCDD：0.78ppt)及び QC 溶液の算出例

QC 溶液 (ng-TEQ/mL)＝0.53(pg/L)×0.642＝0.35
STD5
TeCDD
0.78ppt

QC 溶液

発光量
(RLU)

対数
換算値

7815

6.64

発光量
(RLU)

対数
換算値

5923

6.28

標準物質
相当量
(pg/mL)
7.68
標準物質
相当量
(pg/mL)
5.34

標準物質
相当量
(pg/400L)
3.07
標準物質
相当量
(pg/400L)
2.14

希釈
倍率
1
希釈
倍率
1

100

4

分取率
(%)

供試量
(L)

100

4

測定量
（毒性等量）(pg-TEQ/L)
0.77
測定量（毒性等量）(pg-TEQ/L)
0.53

1.00

測定値 (ngTEQ/ml(pgTEQ/mL))

0.50

測定値
測定値(pgTEQ/mL)(ngTEQ/ml ）

供試量
(L)

TeCDD(0.78ppt)

QC溶液;PCDDs/PCDFs混合溶液

0.30
測定値
μ；工程平均±2σ；管理限界0.75
測定値μ；工程平均±2σ；管理限界

0.10

0.50

0

10

20

30

40

50

0

プレート（#)

10

20

30

40

50

プレート（#)

図 3-1-11 管理図例（QC 溶液）

5.3

分取率
(%)

図 3-1-12 管理図例(TeCDD:0.78ppt)

測定試料の定量

実測濃度の算出方法の手順を以下に示す(注 19)。実測濃度の算出例は、表 3-1-7 の通り。
1) 定量範囲にある RLU から対数換算値の算出－Hill の式に検量線から求めた係数を当てはめる。なお、定量範囲については 6.1 の 2)で定義する。
1𝑘=

𝑅𝐿𝑈 − 𝑏 × 𝐾𝑚 𝑛 𝑛
𝑉𝑚𝑎𝑥 − 𝑅𝐿𝑈 + 𝑏

ここに、k：対数換算値
2) 実測濃度(pg/mL)の算出－対数換算値を乗数に換算する。

𝑋=

𝑒𝑘
100

ここに、X

：測定試料中の実測濃度(pg/mL)3) 試験管あたりの実測濃度(pg：試験管あたり 400L 培地)
50𝐶𝑇 = 𝑋 × 0.4
ここに、CT ：試験管あたりの実測濃度(pg：400L 培地)

X：測定試料中の実測濃度(pg/mL)4) 精製液中の実測濃度(pg：4mL 精製液)

𝐶𝐶 = 𝐶𝑇 × 𝑛
ここに、CCn：精製液中の実測濃度(pg：4mL 精製液)
：希釈倍率5) 抽出液中の実測濃度(pg：抽出液)

𝐶𝐸 = 𝐶𝐶 ×
ここに、CE

𝑉𝐸
𝑉′𝐸：抽出液中の実測濃度(pg：抽出液)

CC ：精製液中の実測濃度(pg：4mL 精製液)
VE ：抽出液量(mL)
V’E : 抽出液分取量(mL)6) 試料中の実測濃度(ng/m3N 又は ng/g)

𝐶𝑆 =

𝐶𝐸
1
×
𝑉 1000

ここに、CS ：実測濃度(ng/m3N 又は ng/g)

V：試料採取量(m3N 又は g)(注 19) 解析例：1 試料につき、n=2 の試験管を用いて、DMSO 転溶し、培地に溶解後、1 試験管当たり 2 ウェルに分注する。1 試料当たり、2 ウェルの RLU の平均を n=2 で算出する。
(備考) 排出ガスの酸素濃度による補正は、次式によって行う。

𝐶=

9
× 𝐶𝑆
21 − 𝑂𝑆

ここに、C

Os
Cs

： 酸素の濃度 On における実測濃度(ng/m3N)： 排出ガス中の酸素の濃度(注 20)(%)： 排出ガス中の実測濃度(ng/m3N）(注 20) 排出ガス中の酸素の濃度が 20%を超える場合は、Os=20 とする。

表 3-1-7 実測濃度の算出例
発光量
(RLU)

対数
換算値

6570
5890

6.41
6.27

標準物質
相当量
(pg/mL)
6.08
5.30

標準物質
相当量
(pg/400L)
2.43
2.12

希釈
倍率
100
100

51

分取率
(%)
20
20

試料
採取量
(m3N, g)66

実測濃度(ng/m3N,ng/g)
0.405
0.353

６．検出下限及び定量範囲6.1

標準物質における検出下限及び定量範囲の確認

検出下限等算出用検量線の測定操作により得られた測定量（毒性等量）の定量値の変動係数(CV%)が30%以下となる点を検出下限、20%以下となる上下2点間を定量範囲として算出し、結果を記録しておく。
1) 検出下限等算出用標準溶液の調製例
表 3-1-8 に示す濃度の検出下限等算出用標準溶液を調製する。
表 3-1-8 検出下限等算出用標準溶液の調製例
標準物質(1)

STD0
25.0

2,3,7,8-TeCDD

STD1
12.5

STD2
6.25

STD3
3.13

濃度(ng/mL)
STD4 STD5 STD6
1.56 0.781 0.391

STD7
0.195

STD8
0.0997

STD9 STD10
0.0488 0.0244

2) 検出下限及び定量範囲の算出例
調製した検出下限等算出用標準溶液を n=5 で測定した検量線より定量し、測定量（毒性等量）の平均、標準偏差及び変動係数(CV%)を算出し、精度プロファイルを作図し、検出下限及び定量範囲を図より読み取る。検出下限及び定量範囲の確認のレイアウト例は、図 3-1-13 の通り。
1
A
B
C
D
E
F
G

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

NC
STD10
STD9
STD8
STD7
STD6

→〃
→〃
→〃
→〃
→〃
→〃

→〃
→〃
→〃
→〃
→〃
→〃

→〃
→〃
→〃
→〃
→〃
→〃

→〃
→〃
→〃
→〃
→〃
→〃

STD5
STD4
STD3
STD2
STD1
STD0

→〃
→〃
→〃
→〃
→〃
→〃

→〃
→〃
→〃
→〃
→〃
→〃

→〃
→〃
→〃
→〃
→〃
→〃

→〃
→〃
→〃
→〃
→〃
→〃

12

H
図 3-1-13

レイアウト例(検出下限及び定量範囲の確認)

検出下限及び定量範囲の算出例を表 3-1-9、図 3-1-14 に示す。
標準物質濃度(pg/ml)の定量値から得られた変動係数(n=5)から 30～20％の地点を検出下限値（ここでは、
0.977pg/ml）、20%以下の定量範囲で最小濃度を定量下限値（ここでは、1.95pg/ml）とした

52

表 3-1-9 測定結果例(n=5 測定)
検出下限：0.977(pg/mL)
標準
物質量(pg/well)
A
47.5
23.8
11.9
5.94
2.97
1.48
0.742
0.371
0.186
0.09280.0464

標準物質
標準物質
濃度
対数
変換値
(pg/ml )B=
C=
A/190*1000 LN(B*100)
250
10.13
125
9.43
62.5
8.74
31.3
8.05
15.6
7.35
7.81
6.66
3.91
5.97
1.95
5.27
0.977
4.58
0.488
3.89
0.244
3.20

定量範囲：1.95～62.5(pg/mL)
標準物質濃度 (n=5)(pgTEQ/ml )

標準物質
計測値
(RLU)

平均

標準偏差(σ）

24560
23926
19727
15002
9696
5195
2597
1328
637
364
271

257
189
62.2
31.0
15.5
7.82
4.17
2.30
0.97
ND
ND

173
106
11.6
5.54
1.00
0.338
0.267
0.303
0.260
－
－

変動係数
（C.V.(%)）

乖離度

67.5
56.0
18.6
17.9
6.43
4.33
6.39
13.1
26.8
－
－

1.03
1.51
1.00
0.99
0.99
1.00
1.07
1.18
0.99
－
－

定
量
範
囲
定量下限
検出下限

TeCDD標準液の変動係数(n=5)
7060

C.V.(%)

50
40
30
20
10
0
4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0 10.0 11.0

[TeCDD]C=LN(B*100)

図 3-1-14

精度プロファイルの例

標準物質における検出下限及び定量範囲は、尐なくとも 6 ヶ月に 1 回十分な性能が得られていることを確認する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認する。
6.2

試料における検出下限及び定量下限

試料における検出下限及び定量下限は、試料量と前処理を経た最終検液量の数値と、反応液中の標準物質における検出下限及び定量下限から理論的に算出する。試料における検出下限及び定量下限は、試料採取量
や最終検液量等により異なってくるため、試料ごとに求める。
1) 試料ガス
試料ガスにおける検出下限及び定量下限は、下記の式により算出する。

𝐶𝐷𝐿 =

𝑄𝐷𝐿 × 0.4 × 𝑘 × 𝑣 𝑉𝐸 1
×
×
1000
𝑉′𝐸 𝑉

𝐶𝑄𝐿 =

𝑄𝑄𝐿 × 0.4 × 𝑘 × 𝑣 𝑉𝐸 1
×
×
1000
𝑉′𝐸 𝑉

ここに、CDL： 試料ガスにおける検出下限(0℃、101.32kPa)(ng/m3)

CQL： 試料ガスにおける定量下限(0℃、101.32kPa)(ng/m3)

QDL： 標準物質における検出下限(pg/mL, 反応溶液中)(例 0.977pg/mL)

QQL： 標準物質における定量下限(pg/mL, 反応溶液中)(例 0.195pg/mL)v： 希釈倍率(測定用試料中からの分注量)(例 4、d=1mL)
4mL 容測定用試料の一部を分注する率＝4/d(d：測定用試料の液量(mL))

VE： 抽出液量(mL)(例 50mL)

53

V’E

： 抽出液分取量(mL)(例 10mL)V： 試料ガスの採取量(0℃、101.32 kPa)(例 4m3)k

： 補正係数＝0.221(排出ガス)

2) ばいじん及び燃え殻
ばいじん及び燃え殻試料における検出下限及び定量下限は、下記の式により算出する。

𝐶𝐷𝐿 =

𝑄𝐷𝐿 × 0.4 × 𝑘 × 𝑣 𝑉𝐸
1
×
×
1000
𝑉′𝐸 𝑊

𝐶𝑄𝐿 =

𝑄𝑄𝐿 × 0.4 × 𝑘 × 𝑣 𝑉𝐸
1
×
×
1000
𝑉′𝐸 𝑊

ここに、CDL： ばいじん及び燃え殻試料における検出下限(ng/g)

CQL： ばいじん及び燃え殻試料における定量下限(ng/g)

QDL： 標準物質における検出下限(pg/mL, 反応溶液中)(例 0.977pg/mL)

QQL： 標準物質における定量下限(pg/mL, 反応溶液中)(例 1.95pg/mL)v： 希釈倍率(測定用試料中からの分注量)(例 4、d=1mL)
4mL 容測定用試料の一部を分注する率＝4/d(d：測定用試料の液量(mL))

VE： 抽出液量(mL)(例 50mL)

V’E： 抽出液分取量(mL)(例 25mL)W： ばいじん及び燃え殻試料の採取量(g)(例 7g)k： 補正係数＝0.318(ばいじん及び燃え殻)

７．測定量(毒性等量)への換算

測定量(毒性等量)の算出方法を以下に示す。
本生物検定法における実測濃度は、2,3,7,8-TeCDD 検量線より求めた生物検定法独自の毒性評価値となる。
従って HRGC/HRMS 法にて測定した毒性等量と比較するためには、換算が必要となる。
あらかじめ、多検体の HRGC/HRMS 法によって測定された試料について本生物検定法による測定を行い、両法における相関関係を求め、その回帰式の傾きを換算係数として、実測濃度から測定量(毒性等量)を算出する。
測定量(毒性等量)(ng-TEQ/g、ng-TEQ/m3N)＝実測濃度(ng/g、ng/m3N)×換算係数
なお、測定結果の報告様式については、第２章第２節「測定結果の報告」を参照すること。

８．換算係数の確認
尐なくとも 6 ヶ月に 1 回、HRGC/HRMS 法によって測定された試料について、本測定法による測定を行い、HRGC/HRMS 法により得られた測定量（毒性等量）と本測定法で得られた実測濃度より換算係数を算出し、換算係数と比較する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認を行う。得られた換算係数が、第６節記載の換算係数と大きく乖離する場
合又は相関が悪い場合には、原因の究明を行い、その結果及び講じた措置を記録する。
試料は、片方について HRGC/HRMS 法に定められた方法により前処理を行い、残りについては生物検定法に定められた方法により前処理を行って試料を調製する。
排出ガス試料については、JIS K0311 に従い抽出までを行った抽出試料（ただし、アッセイに影響を及ぼ54

すサンプリングスパイク及び抽出工程でのクリーンアップスパイクの添加は行わない）を分割し、片方は JIS
K0311 に定められた方法により測定量（毒性等量）を求め、残りは、本法 4.1～4.3 及び 5.3 に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を算出する。
ばいじん及び燃え殻試料については、平成4年厚生省告示第192号別表第一(第一号関係)(2)に準拠した方法（ただし、同表ウ(イ)の内標準物質の添加の操作は行わない）により測定量（毒性等量）を求め、残りは、本法4.1～4.3及び5.3に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を算出する。

55

第６節 参考資料「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(排出ガス試料)」
多数の排出ガス試料(この例では n=46。n=20 以上が望ましい)について本測定方法と HRGC/HRMS 法でそれぞれ実測濃度、毒性等量を求め、HRGC/HRMS 法による毒性等量を本測定方法による実測濃度で除したものの平均値を換算係数とする。
(例)排出ガス試料の換算係数導出の方法
1) 本測定方法による実測濃度を X、HRGC/HRMS 法による毒性等量を Y とし、Y/X を求める。
2) 全試料について Y/X の値を求め、全試料の平均値を計算し、これを換算係数とする(図 3-1-15 では Y/Xの平均値である 0.221 を換算係数とした)。

「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(ばいじん及び燃え殻試料)」
多 数の ばいじ ん及 び燃え殻 試料 (こ の例 では n=94、 n=20 以 上が 望ま しい )に つい て本測 定方 法とHRGC/HRMS 法でそれぞれ実測濃度、毒性等量を求める。HRGC/HRMS 法による毒性等量を本測定方法による実測濃度で除したものの平均値を換算係数とする。
(例)ばいじん及び燃え殻試料の換算係数導出の方法
1) 本測定方法による実測濃度を X、HRGC/HRMS 法による毒性等量を Y とし、Y/X を求める。
2) 全試料について Y/X の値を求め、全試料の平均値を計算し、これを換算係数とする(図 3-1-16 では Y/Xの平均値である 0.318 を換算係数とした)。
80

排出ガス
y = 0.221x
R2 = 0.993(n=46)

15

毒性等量(ng-TEQ/g)

毒性等量(ng-TEQ/m 3N)

20

10
5

0

ばいじん及び燃え殻
y = 0.318x
R2 = 0.899(n=94)

60
40
20

0
0

20
40
60
実測濃度(ng/m 3N)

図 3-1-1580

換算係数算出(例)（排出ガス）

050100
実測濃度(ng/g)

図 3-1-16

換算係数算出(例)（ばいじん及び燃え殻）

56

150

その２

前処理に、硫酸シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性組換

え細胞 101L を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成17 年環境省告示第 92 号第 1 の 2)

第１節 測定方法の概要

対象媒体ごとに試料を採取し、ダイオキシン類を抽出後、クリーンアップを行い、ダイオキシン類応答性
組換え細胞 101L を用いたレポータージーンアッセイによる測定により定量する。測定方法のフローを図
3-2-1 に示す。

試料採取
抽出
クリーンアップ
ダイオキシン類応答性組換え細胞 101L を用いたレポータージーンアッセイによる測定
ダイオキシン類(実測濃度)の定量
換算係数による測定量(毒性等量)への換算
測定値確定
図 3-2-1 測定方法のフロー

第２節 用語の定義

1)

Ah Receptor、Arylhydrocarbon Receptor。アリール炭化水素受容体。特異的な細胞外

Ah 受容体シグナル伝達分子(リガンド)に結合し、細胞の応答するきっかけとなるタンパク質。ダイオキシン類の生体影響の多くは、この受容体と結合することにより引き起こされる。
2)

Ligand。タンパク質又は他の分子の特異的部位に結合する分子の総称。受容体が鍵穴でリガンド

リガンドが鍵の関係。両者が結合すると、両者の関係に特異的な信号が発生し生理反応が引き起こされる。
3)

ルシフェラーゼ遺伝子

Luciferase Gene。生物発光反応を触媒する酵素を発現するホタル由来の遺伝子。
4)

CYP1A1

Cytochrome P450。薬物代謝酵素シトクロム P450 類に属する薬物代謝酵素。CYP1A1は、ダイオキシン類により誘導されることが知られている。
Xenobiotics Responsive Element、生体異物応答配列。

5)

XRE

6)

プラスミド

Plasmid、小型の環状 DNA 分子のこと。
57

7)

Subculture。保存培養から微生物あるいは培養細胞の一部を分けて別の新鮮な培地に植え

継代培養

継ぎ、再び培養したもの。
8)

発光基質

生物発光反応の基質。

第３節 試料採取方法に関する特記事項

１．試料ガスの採取量

試料ガスの採取量は、次のような手順によって決定する。採取時間については、その目的に応じて試料ガスの発生状況等を十分考慮して代表試料が採取できるようにしなければならない。
1)

評価しなければならない最小の濃度を決定する。

2)

特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
(例)5 ng-TEQ/m3N レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合（必要となる試料ガスにおける検出
下限は 0.17 ng-TEQ/m3N3)

以下の式によって測定に必要な最小の試料ガスの量を算出する。

𝑉=

𝑄𝐷𝐿 × 𝑘 × 𝑣 𝑉𝐸
1
×
×
1000
𝑉′𝐸 𝐶𝐷𝐿

ここに、V

4)： 測定に必要な最小の試料ガスの量(m3N)

QDL： 標準物質における検出下限(pg/mL, DMSO 溶液中)k

： 測定量(毒性等量)への換算係数v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)

V’E： 抽出液分取量(mL)

CDL： 必要となる試料ガスにおける検出下限 (ng-TEQ/m3N)算出された最小の試料ガスの量以上を試料ガスの採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。

(例) 抽出液を 20 mL に定容し、その抽出液から 10 mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に 0.08
mL の測定用試料溶液に調製する場合の試料ガスの採取量を以下に示す。なお、標準物質における検出下限値は 300pg/mL、排出ガスの測定量への換算係数は 0.185 を用いた。

𝑉=

300 × 0.185 × 0.08 20
1
××= 0.0521000
10 0.17

２．ばいじん及び燃え殻試料の採取量

ばいじん及び燃え殻試料の採取量は、次のような手順によって決定する。
1)

評価しなければならない最小の濃度を決定する。

2)

特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下にばいじん及び燃え殻試料における検出下限を
設定する。

3)

以下の式によって測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量を算出する。
58

𝑊=

𝑄𝐷𝐿 × 𝑘 × 𝑣 𝑉𝐸
1
×
×
1000
𝑉′𝐸 𝐶𝐷𝐿

ここに、W

4)： 測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量(g)QDL： 標準物質における検出下限(pg/mL, DMSO 溶液中)k

： 測定量(毒性等量)への換算係数v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)

V’E： 抽出液分取量(mL)

CDL： 必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限(ng-TEQ/g)算出された最小のばいじん及び燃え殻試料の量以上をばいじん及び燃え殻試料の採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。

(例) 3 ng-TEQ/g レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合（必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限は 0.1 ng-TEQ/g）
抽出液を 10 mL に定容し、その抽出液全量を用いてクリーンアップを行い、最終的に 0.2 mL の測定用試料溶液に調製する場合のばいじん及び燃え殻試料の採取量を以下に示す。なお、標準物質における検出下限値は 300pg/mL、ばいじん及び燃え殻の測定量への換算係数は 0.192 を用いた。
𝑊=

300 × 0.192 × 0.2 10
1
××= 0.121000
10 0.1

第４節 試料の前処理

１．試料の前処理の概要
採取した試料は、抽出を行う。抽出液は必要に応じて分取を行い、クリーンアップに移る。図 3-2-2 に試料の前処理から測定までのフローの例を示す。

試料
抽出
抽出液
一部分取

（省略可能）

硫酸シリカゲル／活性炭カラムクロマトグラフ操作
測定用試料
図 3-2-2 試料の前処理から測定までのフローの例

59

２．試薬
試料の前処理に用いる試薬は、JIS K0311 若しくは平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(1)に記載の試薬(ただし、内標準物質は使用しない) 又は同等の品質のもの、及び次による。これらの試薬は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
1) ジメチルスルホキシド(DMSO)
2) ケイソウ土

JIS K9702 に規定するもの、又は同等の品質のもの(注 1)

バリアン社製ハイドロマトリックス、又は同等の品質のもの。

(注 1) ジメチルスルホキシド(DMSO)の品質変動は、測定結果に影響を及ぼすことがあるためロットの変更時等には十分注意する。

３．器具及び装置

試料の前処理に用いる器具及び装置は、次による。これらの器具及び装置は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
3.1

ガラス器具

JIS R3503 及び JIS R3505 に規定するもの。コックの部分がふっ素樹脂製のものを用いてもよい
3.2.1

ソックスレー抽出器

JIS R3503 に規定するもの、又はこれと同等の品質のもの。接続部にグリースを使用してはならない
3.2.2

高速溶媒抽出装置(ASE 抽出装置)

ダイオネクス製 ASE-300 又は同等品。ASE 用の器具一式(セルボディー、
セルエンドキャップアセンブリ、
溶媒ボトル、捕集ボトルアセンブリー、コンプレッサー等)
3.3

濃縮器

クデルナ-ダニッシュ(KD)濃縮器又はロータリーエバポレータ。接続部にグリースを使用してはならない
3.4

その他

JIS K0311 又は平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(1)に記載のもの及び下記の器具、又はこれらと同等の品質のもの。
1) pH 試験紙

ばいじん等の pH 測定に使用

2) アルミロート

ハイドロマトリックスの充填に使用

3) セルロースフィルター

33 mm、ASE 抽出に使用

4) 固相抽出用チューブ

60 mL 用、フリット付、クリーンアップに使用

5) 固相抽出用チューブ

10 mL 用、クリーンアップに使用

6) フリット9 mm、クリーンアップに使用

7) ユニストッパー

4)と 5)の連結に使用、中央に4 mm 程度の穴を開けたもの

8) カラムアタッチメント
9) KD 管50 mL プラスチックボトルのフタ中央に4 mm 穴を開けたもの

12 mm×L 92mm、クリーンアップ済み試料の DMSO 置換に使用

60

４．前処理操作

4.1

試料量の記録

採取した試料は、試料量を記録する。
4.2

抽出1) 排出ガスJIS K0311 6.4 により、抽出を行う。ただし、内標準物質の添加は行わない。図 3-2-3 に排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

樹脂

円筒ろ紙

吸収プローブ洗液

吸収液、洗液ろ過

残さ
HCl(2mol/l)処理ろ液

ダスト 1 g に対して 20 mmol
以上の塩酸

ろ過

残さ

ろ液

風乾

ソックスレー抽出液－液振とう抽出(ﾄﾙｴﾝ、16 時間以上)

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ(3 回)

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ層

水層

脱水

濃縮

：検体又は試料：作業

抽出液：物又は試料

図 3-2-3 排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例

612) ばいじん及び燃え殻
平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(2)又は下記の方法により抽出を行う。ただし、内標
準物質の添加の操作は行わない。適量の試料を用いてダイオキシン類の測定及び含水率の測定を行う。
図 3-2-4 にばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

試料

含水率測定

HCl 処理試料の pH が 7 を超える場合

ろ過

残さ

ろ液

風乾
ASE 抽出(ｱｾﾄﾝ、ﾄﾙｴﾝ)
脱水
濃縮：検体又は試料：作業

抽出液：物又は試料

図 3-2-4 ばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例

以下に、ASE 抽出装置を用いた方法を示す。
(1) 試料を適量の精製水中に入れて混和し、pH 試験紙で水層の pH を測定する。pH が 7 を超える場合
は、塩酸処理を行う。pH が 7 以下の場合には塩酸処理を省略し、抽出操作に進む。
(2) 抽出操作を行う場合には損失のないように注意し、容器に残った試料を完全に拭き取りセル中に合わせる。
(3) ASE の抽出は下記の条件で行う。
サイクル数： 2(1 サイクル目：アセトン、2 サイクル目：トルエン)

HEATING： 9分

STATIC： 10 分

FLUSHING ： 50 %62

PURGING： 300 秒温度

： 200 ℃

圧力

： 1500 psi(4) アセトン抽出液を濃縮したもの及びトルエン抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水し、合わせる。
(5) ナスフラスコをエバポレータ等の濃縮器にセットし抽出液を濃縮する。
(6) 濃縮液をヘキサンで 10 mL にメスアップする。
4.3

クリーンアップ

平成 4 年厚生省告示第 192 号に記載の方法、又は下記の方法によりクリーンアップを行う。図 3-2-5 にクリーンアップのフローの例を示す。

抽出液：検体又は試料：作業

一部分取：省略できる作業：物又は試料

濃縮

硫酸シリカゲル／活性炭
カラムクロマトグラフ操作
クロトグラフ操作
ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ：ﾍｷｻﾝ (1：3)
第 1 画分

ﾄﾙｴﾝ
第 2 画分夾雑物の多い場合

硫酸シリカゲルカラム
クロマトグラフ操作
クロトグラフ操作
夾雑物の多い場合

濃縮

測定用試料
図 3-2-5 クリーンアップのフローの例

631) 抽出液の分取
抽出液を分取して一部を測定に使用する場合には、定容した抽出液から目的に合わせて一部を分取する。
（通常、抽出液の 1/1～1/10 程度を用いる。高濃度であることが予想される場合には、より尐量を分取してもよい。
）
2) 精製カラムの作製(図 3-2-6)(1) 硫酸シリカゲルカラム
60 mL 用固相抽出用チューブに下から乾式充填法で、脱脂綿適量、44 %硫酸シリカゲル 10±0.1 g、シリカゲル 1.8±0.1 g、無水硫酸ナトリウム 5～5.5 g、フリットの順に積層する。
(2) 活性炭カラム
12 mL 用固相抽出用チューブに下から乾式充填法で、フリット、活性炭埋蔵シリカゲル 0.5±0.02 g、
無水硫酸ナトリウム 0.3±0.02 g、フリットの順に積層する。

60 ml 固相抽出チューブ

フリット
無水硫酸ﾅﾄﾘｳﾑ：5～5.5 g
シリカゲル：1.8±0.1 g
44 %硫酸シリカゲル：10±0.1 g
脱脂綿：適量ユニストッパー
12 ml 固相抽出チューブ
フリット
無水硫酸ナトリウム：0.3±0.02 g
活性炭埋蔵ｼﾘｶｹﾞﾙ：0.5±0.02 g
フリット
図 3-2-6 精製カラムの例

3) クリーンアップ操作(1) 硫酸シリカゲルカラム及び活性炭カラムにヘキサンを 20 mL 流す。
(2) 活性炭カラムの上に硫酸カラムをセットし、ヘキサンを 10 mL 流す。
(3) ヘキサンが流れ終わってから、試料をカラムに添加する。ヘキサンで抽出液の入っていた容器を洗浄し、洗液をカラムに注入する。
(4) カラムにヘキサン 70 mL を流す。
(5) 硫酸シリカゲルカラムの層を観察し、破過した場合には(8)まで操作を行った後(10)へ。
(6) 硫酸シリカゲルカラムを外し、活性炭カラムの上に空の 60 mL 用固相抽出用チューブを接続し、ジクロロメタン：ヘキサン＝1：3 を 50 mL 流す。
(7) 活性炭カラムの下にナスフラスコをセットし、トルエン 70 mL で溶出する。
(8) ナスフラスコをロータリーエバポレータ等の濃縮器にセットし、トルエン層を 0.5 mL 程度まで濃縮64する。
(9) 濃縮液を KD 管に移す。ナスフラスコをヘキサンで洗い込みながら KD 管に移し約 3 mL にし 4)の溶
媒置換の工程へ。
(10) 新しい硫酸シリカゲルを用意し、ヘキサン 30 mL を流す。
(11) 硫酸シリカゲルカラムの下に空のナスフラスコをセットする。
(12) 濃縮液をカラムに注入する。濃縮液の入っていたナスフラスコをヘキサンで洗い洗液をカラムに注入する。
(13) カラムにヘキサン 70 mL を流す。
(14) ナスフラスコをロータリーエバポレータ等の濃縮器にセットし、ヘキサン層を 0.5 mL 程度まで濃縮する。
(15) 硫酸シリカゲルカラムが破過していない場合は(9)、破過している場合は(10)の工程へ。
4) 溶媒置換及び測定用試料の保存(1) 3)で得られた試料(ヘキサン層)の入った KD 管を吹き付け装置にセットして 20L まで濃縮し、着色や沈殿等の異常がないことを確認する。次に DMSO 20L を添加し、20L まで濃縮することにより
DMSO に溶媒置換する。
(2) KD 管に DMSO を適量加え(排出ガス試料の場合 60L、ばいじん等試料の場合 180L。試料の濃度等により増減する場合もあり)、試験管ミキサー等でよく撹拌する。
(3) 試料をバイアルに移し、試料識別用のラベルを貼り、最終検液として室温で暗所に保存する。

第５節 測定１．測定の概要
本方法は、ダイオキシン類応答性組換え細胞 101L を用いて、試料中に含まれるダイオキシン類が細胞内の Ah 受容体と結合することに由来して発現するルシフェラーゼの活性に基づく発光量を発光光度計で測定することによりダイオキシン類の毒性等量を測定する方法である。
2,3,7,8-TeCDD を用いて検量線を作成し、試料の発光量から算出した実測濃度に排出ガス、ばいじん及び
燃え殻について定められた換算係数を乗じることにより、測定量（毒性等量）を算出する。

２．試薬、器具及び装置

2.1

使用細胞

ダイオキシン類応答性組換え細胞 101L：レポーター遺伝子としてホタルのルシフェラーゼ遺伝子を用い、その上流域に生体異物応答配列 XRE を３個持つヒトのシトクロム P450（CYP1A1）プロモーターを配置したプラスミド pL1A1N を、ヒト肝がん細胞由来 HepG2 に導入したもの。
2.2

試薬

測定に用いる試薬は、次による。
1) 培地

イーグル MEM

炭酸水素ナトリウム含有、L-グルタミン不含、ろ過滅菌及びエンドトキシン

テスト済、冷蔵保存
65

2) FETAL BOVINE SERUM(FBS)
3) L-グルタミン

56 ℃、30 分間非働化処理済、-20 ℃凍結保存

200 mM、ろ過滅菌及びエンドトキシンテスト済、0 ℃以下凍結保存

4) ピルビン酸ナトリウム100 mM、ろ過滅菌及びエンドトキシンテスト済、冷蔵保存

5) 培養液1)の 500 mL、2)の 25 mL、3)の 10 mL、4)の 5 mL を混合したもの、冷蔵保存

6) 滅菌水滅菌済みの JIS K0557 に規定する A4(又は A3)の水又は同等な品質のもの

7) G418

GENETICIN(G418)(γ 線滅菌済)

1 g に 25 mL の滅菌水を加えて 40 mg/mL に調製し、0 ℃以下で凍結保存したもの
8) ペニシリン・ストレプトマイシン

10000 units ペニシリン・10 mg/mL ストレプトマイシン、ろ過滅菌及びエンドトキシンテスト済、0 ℃以下凍結保存
9) トリプシン溶液

1×solution、0 ℃以下凍結保存

10) ハンクス緩衝液

炭酸水素ナトリウム含有、ろ過滅菌及びエンドトキシンテスト済

11) リン酸緩衝生理食塩液(PBS(-))

マグネシウム及びカルシウム不含12) 発光基質

東洋インキ製

ピッカジーン発光キット

13) 標準物質

2,3,7,8-TeCDD(50 μg/mL DMSO)

14) 炭酸ガス

CO2 99.5 %15) 液体窒素16) 細胞凍結用保存液

1)、2)、DMSO 及び 7)を 40：50：9：1 の割合で混合したもの、使用時に毎回調

製する
2.3

器具及び装置測定に用いる器具及び装置は、次による。
1)

培養シャーレ(ペトリ皿)

100 mm、滅菌済のもの

2)培養マイクロプレート

96 ウェル、滅菌済のもの

3)

メスピペット

4)

遠心管

5)

三角フラスコ

6)

ビーカー

7)

マイクロピペット用滅菌チップ

8)

マイクロピペット用チップ

9)マイクロピペット

50 mL 及び 10 mL、滅菌済のもの

50 mL 及び 10 mL、滅菌済のもの
滅菌済のもの滅菌済のもの200L、1000L

5～20L 、20～200L、200～1000L10) 12 チャンネルマイクロピペット
11) ピペットエイド

200L、1000L 、滅菌済のもの

5～50L 、50～300L

メスピペットに取り付けて液の出し入れに使用できるもの

12) 安全キャビネット

クラスⅡのもの

13) インキュベーター

37 ℃恒温、飽和湿度、5 % CO2 濃度

14) ウォーターバス
15) 遠心分離機

1000 rpm で遠心分離できるもの

16) 試験管ミキサー17) 血球計算盤
18) 光学顕微鏡
19) カウンター
6620) 微量遠心管
21) 試験管

12×75 mm22) マイクロプレートミキサー
23) ルミノメーター
24) オートクレーブ
25) 凍結保存用バイアル
26) 凍結処理容器

2 mL、滅菌済のもの

BICELL 又はそれと同等の性能を有するもの、又はプログラムフリーザー

27) ドライアイス又はディープフリーザー-80 ℃28) 液体窒素保管容器
29) 吸引装置(アスピレーター)30) リザーバー

３．細胞の取り扱い

3.1

培養細胞の起眠1) 液体窒素保管容器から 101L 細胞の入った凍結保存用バイアルを取り出し、37 ℃のウォーターバス中で解凍する。
2) バイアルの内容物を培養シャーレに移した後、培養液 12 mL を加えて混和する(注 2)。
3) 培養シャーレをインキュベーターに入れ、5 時間程度培養する。
4) 培養シャーレをインキュベーターから取り出し、培養液を取除き、新しい培養液を 12 mL 加えた後、G418 及びペニシリン・ストレプトマイシンを 120L ずつ加えて混和する（終濃度で G418：0.4 mg/mL、ペニシリン 100 units、ストレプトマイシン 0.1 mg/mL になるように調製する）(注 2)。
5) 培養シャーレをインキュベーターに入れ、3～4 日間培養する。
6) 継代操作を繰り返し、細胞が安定して増殖するようになったことにより、細胞に異常がないことを確認し測定に使用する。
3.2

細胞の継代

1) 培養シャーレをインキュベーターから取り出し培養液を取り除く。トリプシン溶液を 2 mL 分注し混和する（細胞の成育状況に応じてトリプシンの分注量を増減してもよい。）(注 2)。
2) 培養シャーレをインキュベーターに 8 分間入れる。
3) 培養シャーレをインキュベーターから取り出し、1)で使用したトリプシン溶液と等量の培養液を分注し混和する。
シャーレの底面に張り付いている細胞はメスピペットを用いてピペッティングで剥がして遠心管に移す(注 2)。
4) 遠心管を遠心分離機に入れ、1000 rpm で 5 分間遠心分離操作を行う。
5) 上澄み液を廃棄し、残ったペレット状の細胞に培養液を適量加えてピペッティングし、懸濁液を作製する(注 2)。
6) 懸濁液の一部を微量遠心管に移し、ハンクス緩衝液等の緩衝液又は培養液をマイクロピペットで適量加えて希釈する(注 2)。
7) よく混和した懸濁液を血球計算盤に適量分注し、顕微鏡で細胞数をカウントして懸濁液の濃度
67

(cells/mL)を計算する。
8) 作製する培養シャーレ 1 枚当り 12 mL、培養マイクロプレート 1 枚当り 24 mL を目安として、調製に必要な液量を計算する。
9) 125,000 cells/mL の濃度調製に必要な懸濁液量と培養液量を計算し、両者の合計量の 1/100 量に相当する G418 及びペニシリン・ストレプトマイシン量を計算する（終濃度で G418：0.4 mg/mL、ペニ

シリン 100 units、ストレプトマイシン 0.1 mg/mL になるように調製する）(注 2)。
10)

G418 及びペニシリン・ストレプトマイシンと培養液を混合した後、懸濁液を加えて混和し、培養
シャーレ 1 枚当たり 12 mL ずつ、培養マイクロプレートの 1 ウェル当たり 200 L ずつ分注する。培養マイクロプレートに分注する際は、懸濁液をリザーバーに移し、12 チャンネルマイクロピペット等で分注する(注 2)。

11)

インキュベーターに入れ、3～4 日間培養する。

12)

試験に使用する細胞株は 3～4 日間で 3～5 倍程度に増殖するのでそれを目安として作製する培養シ
ャー13)細胞の継代操作は起眠後 25 回までを目安とし、期限前であっても測定に支障が生じる等細胞に問題があると考えられる場合にはそれ以後の継代には使用せず廃棄する。

14)

インキュベーター内で細胞を培養中に停電した際には、温度及び CO2 濃度の低下を極力抑えるため、扉の開閉を控える。復旧後細胞の状況を確認し、問題があると考えられた場合には使用せず廃棄する。

3.3

細胞の保存

下記に細胞保存の例を記載する。
1) 3.2 の 1)～7）の方法で細胞懸濁液を調製する。
2) 細胞懸濁液を遠心管に移し(注 2)、遠心分離機に入れ、1000 rpm で 5 分間遠心分離操作を行う。
3) 上澄み液を廃棄し、残ったペレット状の細胞に細胞凍結用保存液を加えてピペッティングし、細胞懸
濁液の濃度が 2.0×106～4.0×106 cells/mL 程度になるよう調製する(注 2)。
4) 凍結保存用バイアルに 1 mL ずつ分注(注 2)して凍結処理容器の中に入れ、ドライアイス入りの箱又はディープフリーザー（－80 ℃）に 3 時間程度入れる。
5) 凍結保存用バイアルを取り出し、液体窒素保管容器の中に入れて保存する。
(注 2) 安全キャビネット内で無菌操作を行う。

４．測定操作4.1

細胞の培養マイクロプレートへの播種

1) 3.2 の 9)で調製した懸濁液を培養マイクロプレートの各ウェルに 200L ずつ分注する(注 2)。
2) 培養マイクロプレートをインキュベーターに入れ、3～4 日間培養する。
4.2

曝露1) 測定値が定量範囲内に入るよう必要に応じて、第 4 節 4.3 の 4)で調製した測定用試料に DMSO を加えて希釈系列試料を作製する。試料希釈の例を表 3-2-1 に示す。
2) ブランク溶媒、検量線作成用標準液(STD：濃度調製例 0.5、1、2、5、10 ng/mL))、及び 1)で作製した希釈系列試料を試験管内で培養液で 100 倍希釈し、測定用試料液を調製する(注 2)。

683) 3～4 日間培養した培養マイクロプレートをインキュベーターから取り出し、ウェル中の培養液をアス
ピレーター等で吸引除去する(注 2)。
4) 2）で調製したブランク溶媒、STD、希釈系列試料の測定用試料液を培養マイクロプレートの各ウェルに 50 L ずつ、2 つ以上のウェルに分注する。同一操作で扱う培養マイクロプレートが複数枚ある場
合には、それらを 1 つのバッチとして扱い、バッチごとに STD を入れる(注 2)。
5) ウェルプレートでの試料の配置例を図 3-2-7 に示す。
6) 培養マイクロプレートをインキュベーターに入れ、16±0.5 時間曝露する。
表 3-2-1 試料希釈の例
1 倍試料、5 倍希釈試料、25 倍希釈試料、125 倍希釈試料、625 倍希釈試料を作製する際の調製例
試料
1 倍試料
5 倍希釈試料
25 倍希釈試料
125 倍希釈試料
625 倍希釈試料

DMSO

DMSO

STD5

STD5

試料
1-4
試料
2-4
試料
3-4
試料
4-4

試料
1-4
試料
2-4
試料
3-4
試料
4-4

希釈元
1 倍試料
1 倍試料
5 倍希釈試料
25 倍希釈試料
125 倍希釈試料

STD1
QC
試料
試料
1-5
試料
2-5
試料
3-5
試料
4-5
図 3-2-7

STD1
QC
試料
試料
1-5
試料
2-5
試料
3-5
試料
4-5

分取量（L）
-20
20
20
20

STD2
試料
1-1
試料
2-1
試料
3-1
試料
4-1
試料
5-1

STD2
試料
1-1
試料
2-1
試料
3-1
試料
4-1
試料
5-1

STD3
試料
1-2
試料
2-2
試料
3-2
試料
4-2
試料
5-2

DMSO 分注量（L）
0
80
80
80
80

STD3
試料
1-2
試料
2-2
試料
3-2
試料
4-2
試料
5-2

STD4
試料
1-3
試料
2-3
試料
3-3
試料
4-3
QC
試料

STD4
試料
1-3
試料
2-3
試料
3-3
試料
4-3
QC
試料

96 ウェルプレート上での試料の配置例(注 3)(注 3）プレートの外周部分のウェルは、培養中に培養液の蒸発等の影響を受けやすいため、原則として定量には使用しない。

4.3

ルシフェラーゼ活性の測定

1) 曝露が終わった培養マイクロプレートをインキュベーターから取り出し、ウェル中の測定用試料液をアスピレーター等で吸引除去する。
2) 培養マイクロプレートの各ウェルに PBS(-)を 100 L 加え、アスピレーター等で吸引除去する。
3) 各ウェルに細胞溶解液を 50 L 加え、室温で 10 分間放置する。
4) 培養マイクロプレートをマイクロプレートミキサーにセットし、5 分間撹拌する。
5) ルミノメーターに発光基質及び緩衝液をセットし、ルミノメーターに接続されたコンピュータ等に設定条件を入力する。
6) 培養マイクロプレートをルミノメーターにセットし、緩衝液及び発光基質を適量自動分注させ、発光
基質分注 1 秒後から 2 秒後までの 1 秒間の RLU を測定する。

69

５．定量

5.1

検量線の作成1) ルミノメーターで測定した STD の発光量（RLU)をブランク溶媒の発光量（ RLU)で除し、foldinduction(発光量比)を求める。
2) STD の濃度(X)及び fold induction (Y)について、一次回帰式による検量線を作成する。一例を図 3-2-8
に示す。

140

Fold Induction

120
100
80
60
40
20
0

0

2

4
6
TeCDD(ng/ml)

810

図 3-2-8 検量線例

5.2

検量線の確認及び感度変動の管理図による確認

定量操作が適切に行われているかどうかを確認するため、測定担当者は、検量線作成用標準液の測定操作により得られたデータから、測定量（毒性等量）を求め、管理図に記録し保存する。管理図による処置基準
は、管理限界（μ±２σ）からの逸脱状況及び図の傾向等に応じて下記の通りとする（μ：工程平均、σ：測定
量（毒性等量）の標準偏差）。
データが 1 点でも管理限界を超えた場合は、原因の究明と改善を行うとともに、再測定する。改善のために講じた措置及び再測定の結果について記録をする。また、管理限界内であっても基準値に対して、一定の傾向で外れていくような状態又は偏った測定量が続くような状態においては、原因の究明を行い、必要に応じ、改善を行うとともに、再測定する。
5.1 により作成した検量線の 10 ng /mL の点の検量線による換算値（ng-TEQ/mL）を算出し、管理図にプロットする。一例を図 3-2-9 に示す。

70

12

TeCDD(ng-TEQ/ml)

11
μ +2σ
μ +2 σ
μ

10

μ -2σ
μ -2σ

9
8
7
6
0

5

10

15

20

25

30

測定回数(回)

図 3-2-9 管理図例

5.3

測定試料の定量

1) ルミノメーターで測定した試料の発光量をブランク溶媒の発光量で除し、fold induction を求める。
2) 測定試料の fold induction を検量線の回帰式に代入し、測定値を求める。
3) 検量線の定量範囲内にある fold induction のうち、試料の希釈倍率と測定値の間に良好な直線関係(希釈直線性)が得られる希釈段階について、測定値に希釈倍率を乗じて実測濃度(測定用試料当たり）を求める。
4) で求めた実測濃度(測定用試料当たり）について、抽出に供した実試料及びクリーンアップ、測定に供した試料の分取割合等から単位測定試料量当たりの実測濃度を算出する。
5) 試料希釈列の全ての fold induction が検量線の定量範囲から外れた場合、試料の希釈倍率を再度調製した上で測定を行う。
(備考) 排出ガスの酸素濃度による補正は、次式による。

𝐶=

9
× 𝐶𝑆
21 − 𝑂𝑆

ここに、C ： 酸素の濃度 On における実測濃度(ng/m3N)
Os ： 排出ガス中の酸素の濃度(注 4)(%)
Cs ： 排出ガス中の実測濃度(ng/m3N）(注 4) 排出ガス中の酸素の濃度が 20%を超える場合は、Os=20 とする。

６．検出下限及び定量範囲6.1

標準物質における検出下限及び定量範囲

第２章各論（生物検定法に共通する事項）第３節では、非線形検量線を対象とした「原則として、検出下限等算出用検量線の測定操作により得られた測定量（毒性等量）の定量値の変動係数(CV%)が30 %以下となる点を検出下限、20 %以下となる点を定量下限とする」としているが、本方法では、線形検量線を使用する
ため、本マニュアル第２章第３節に記載の通り、上記算出方法を誘導する際の元となった方法「測定値の標準偏差を検量線の傾きで割った数値を求め、その3.3倍に相当する標準物質濃度を検出下限、10倍に相当する

71

標準物質濃度を定量下限とする」により検出下限及び定量下限を求め、検量線が直線となる最大濃度（通常10 ng/mL）迄を定量範囲とする。
この標準物質における検出下限及び定量範囲は、尐なくとも6ヶ月に1回十分な性能が得られていることを確認する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認する。
1) 検出下限等算出用標準溶液の調製例
2,3,7,8-TeCDD 標準溶液を DMSO で希釈し、検出下限等算出用標準溶液を調製する。
調製濃度の例：ブランク（DMSO）、0.1、0.3、0.5 ng/mL2) 検出下限及び定量範囲の算出例(1) 1)で調製した検出下限等算出用標準溶液を n=5 以上で測定し、ブランク RLU を差し引いた RLU から、直線回帰検量線を作成する。検出下限等算出用検量線の例を、図 3-2-10 に示す。
(2) ブランクの各測定値（RLU）の平均値と標準偏差を算出する。
(3) (2)で求めた標準偏差を、(1)で求めた検量線の傾きで割る。
(4) (3)で得られた数値の 3.3 倍に相当する標準物質濃度を検出下限、10 倍に相当する標準物質濃度を定量下限とし、検量線に直線性の認められる範囲(通常約 10 ng/mL)迄を定量範囲とする。
算出例を表 3-2-2 に示す。
表 3-2-2 検出下限及び定量下限の算出例

195

ブランク（DMSO）の RLU
標準偏差
244
202
224
196
21.3
検量線回帰式：RLU=932×TeCDD (R2=0.990)
検出下限＝21.3÷932×3.3＝0.075 ng/mL
定量下限＝21.3÷932×10 ＝0.23 ng/mL

傾き
932

500

400

RLU

300

200

100

0

0

0.1

0.2
0.3
TeCDD(ng/ml)

0.4

0.5

図 3-2-10 検出下限等算出用検量線例

3) 実運用上における検出下限及び定量下限
上記の計算を用いた検出下限及び定量下限の値は測定機器の安定性が高い場合にはかなり低い数値とし72

て計算される場合がある。しかし現実の運用上は測定機器の分解能等から考え、標準物質の測定値がブランクの測定値に対し 1.5 倍～2 倍以上の RLU（Fold Induction として 1.5～2.0 以上）を与える濃度以上で定量することが望ましい。現状の測定系で実際に使用している検出下限及び定量下限を表 3-2-3 に示す。
表 3-2-3 標準物質における検出下限及び定量下限の実運用例
検出下限
0.15 pg/well
6.2

定量下限
0.3 ng/mL

0.25 pg/well

0.5 ng/mL

試料における検出下限及び定量下限

試料における検出下限及び定量下限は、試料量と前処理を経た最終検液量の数値と、実運用上の検出下限
及び定量下限から理論的に算出する。試料における検出下限及び定量下限は、試料採取量や最終検液量等により異なってくるため、試料ごとに求める。
表 3-2-4 試料における検出下限算出例（排出ガス）
測定媒体
排出ガス

バイオアッセイ1well 中検出下限
試料量pg/wellL/well
0.15
0.5

採取量
m3N
4

試料調製
分取液量/
酸素濃度
抽出液量
%
mL/mL
12
10/20

媒体中濃度
最終
定容量
mL
0.08

希釈
倍率

実測濃度
ng/m3N１

0.01

表 3-2-5 試料における検出下限算出例（ばいじん及び燃え殻）
測定媒体
ばいじん
及び
燃え殻

バイオアッセイ1well 中検出下限
試料量pg/wellL/well
0.15

0.5

採取量
g

固形分
%

5

100

試料調製
分取液量/抽
出液量
mL/mL

最終
定容量
mL

媒体中濃度
希釈
倍率

実測濃度
ng/g

10/10

0.2

1

0.01

表 3-2-6 試料における定量下限算出例（排出ガス）
測定媒体
排出ガス

バイオアッセイ1well 中定量下限
試料量pg/wellL/well
0.25
0.5

採取量
m3N
4

試料調製
分取液量/抽
酸素濃度
出液量
%
mL/mL
12
10/20

73

媒体中濃度
最終
定容量
mL
0.08

希釈
倍率

実測濃度
ng/m3N1

0.02

表 3-2-7 試料における定量下限算出例（ばいじん及び燃え殻）
測定媒体
ばいじん
及び
燃え殻

バイオアッセイ1well 中定量下限
試料量pg/wellL/well
0.25

0.5

採取量
g

固形分
%

5

100

試料調製
分取液量/抽
出液量
mL/mL

媒体中濃度
最終
定容量
mL

希釈
倍率

実測濃度
ng/g

10/10

0.2

1

0.02

７．測定量(毒性等量)への換算5.3 で求めた実測濃度に排出ガス、ばいじん及び燃え殻ともに換算係数を乗じることで測定量(毒性等量)に換算する。なお、測定結果の報告様式については、第２章第２節「測定結果の報告」を参照すること。

８．換算係数の確認
尐なくとも 6 ヶ月に 1 回、HRGC/HRMS 法によって測定された試料について、本測定法による測定を行い、HRGC/HRMS 法により得られた測定量（毒性等量）と本測定法で得られた実測濃度より換算係数を算出し、換算係数と比較する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認を行う。得られた換算係数が、第６節記載の換算係数と大きく換算係数が乖離する場合又は相関が悪い場合には、原因の究明を行い、その結果及び講じた措置を記録する。
試料は、片方について HRGC/HRMS 法に定められた方法により前処理を行い、残りについては生物検定法に定められた方法により前処理を行って試料を調製する。
排出ガス試料については、JIS K0311 に従い抽出までを行った抽出試料（ただし、アッセイに影響を及ぼすサンプリングスパイク及び抽出工程でのクリーンアップスパイクの添加は行わない）を分割し、片方は JIS
K0311 に定められた方法により測定量（毒性等量）を求め、残りは、本法 4.1～4.3 及び 5.3 に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を算出する。
ばいじん及び燃え殻試料については、平成4年厚生省告示第192号別表第一(第一号関係)(2)に準拠した方法（ただし、同表ウ(イ)の内標準物質の添加の操作は行わない）により測定量（毒性等量）を求め、残りは、本法4.1～4.3及び5.3に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を算出する。

74

第６節 参考資料「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(排出ガス試料)」
多数の排出ガス試料(この例では n=32、n=20 以上が望ましい)について本測定方法と HRGC/HRMS 法でそれぞれ実測濃度、毒性等量を求める。HRGC/HRMS 法による毒性等量を本測定方法による実測濃度で除したものの平均値を換算係数とする。
(例)排出ガス試料の換算係数導出の方法
1) 本測定方法による実測濃度を X、HRGC/HRMS 法による毒性等量を Y とし、Y/X を求める。
2) 全試料について Y/X の値を求め、全試料の平均値を計算し、これを換算係数とする(図 3-2-11 では Y/Xの平均値である 1/5.4 を換算係数とした)。

「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(ばいじん及び燃え殻試料)」
多 数の ばいじ ん及 び燃え殻 試料 (こ の例 では n=41、 n=20 以 上が 望ま しい )に つい て本測 定方 法とHRGC/HRMS 法でそれぞれ実測濃度、毒性等量を求める。HRGC/HRMS 法による毒性等量を本測定方法による実測濃度で除したものの平均値を換算係数とする。
(例)ばいじん及び燃え殻試料の換算係数導出の方法
1) 本測定方法による実測濃度を X、HRGC/HRMS 法による毒性等量を Y とし、Y/X を求める。
2) 全試料について Y/X の値を求め、全試料の平均値を計算し、これを換算係数とする(図 3-2-12 では Y/Xの平均値である 1/5.2 を換算係数とした)。

ばいじん及び燃え殻(n=41)

y = 0.1896x 0.9989
R² = 0.9775100

毒性等量(ng-TEQ/g)

毒性等量(ng-TEQ/m 3N)

排ガス試料(n=32)

10

1

0.1

y = 0.2256x 0.9705
R² = 0.9664

10
1
0.1
0.01

0.01

0.001

0.1

1

10

100

1000

実測濃度(ng/m 3N)

図 3-2-11

0.01

0.1

1

10

100

1000 10000

実測濃度(ng/g)

図 3-2-12 換算係数算出(例)

換算係数算出(例)(排出ガス)(ばいじん及び燃え殻)

75

その３

前処理に、多層カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性組換え細胞 HeB5 を用いたレポー

タージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 1の 3)

第１節 測定方法の概要

対象媒体ごとに試料を採取し、ダイオキシン類を抽出後、クリーンアップを行い、ダイオキシン類応答性
組換え細胞 HeB5 を用いたレポータージーンアッセイによる測定により定量する。測定方法のフローを図
3-3-1 に示す。

試料採取
抽出
クリーンアップ
ダイオキシン類応答性組換え細胞 HeB5 を用いたレポータージーンアッセイによる測定
ダイオキシン類(実測濃度)の定量
換算係数による測定量(毒性等量)への換算
測定値確定
図 3-3-1 測定方法のフロー
第２節 用語の定義

1) Ah 受容体

Arylhydrocarbon Receptor。アリール炭化水素受容体。特異的な細胞外シグナル伝達分子(リガンド)に結合し、細胞の応答するきっかけとなるタンパク質。ダイオキシン類の生体影響の多くは、この受容体と結合することにより引き起こされる。
2) ルシフェラーゼ遺伝子
3) XRE

Luciferase Gene。生物発光反応を触媒する酵素を発現するホタル由来の遺伝子。

Xenobiotics Responsive Element。生体異物応答配列

4) 継代培養

Subculture。保存培養から微生物あるいは培養細胞の一部を分けて別の新鮮な培地に植え継ぎ、再び培養したもの。
5) 発光基質

生物発光反応の基質。

6) 精度プロファイル

精度確認用の標準溶液濃度と変動係数(CV%)との関連図。

第３節 試料採取方法に関する特記事項

76１． 試料ガスの採取量

試料ガスの採取量は、次のような手順によって決定する。採取時間については、その目的に応じて試料ガスの発生状況等を十分考慮して代表試料が採取できるようにしなければならない。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小の試料ガスの量を算出する。

𝑉=

𝑄𝐷𝐿 × 𝑘 × 𝑣 𝑉𝐸
1
×
×
1000
𝑉′𝐸 𝐶𝐷𝐿

ここに、V： 測定に必要な最小の試料ガスの量(m3N)

QDL ： 標準物質における検出下限(pg/mL, DMSO 溶液中)k

： 測定量(毒性等量)への換算係数v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)

V’E： 抽出液分取量(mL)

CDL ： 必要となる試料ガスにおける検出下限(ng-TEQ/m3N)4) 算出された最小の試料ガスの量以上を試料ガスの採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例) 5ng-TEQ/m3N レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となる試料ガスにおける検出下限は0.17ng-TEQ/m3N)
抽出液を 50mL に定容し、その抽出液から 25mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に 0.07mLの測定用試料溶液に調製する場合の試料ガスの採取量を以下に示す。なお、標準物質における検出下限
値は 100pg/mL、排出ガスの測定量への換算係数は 0.319 を用いた。

𝑉=

100 × 0.319 × 0.07 50
1××= 0.0261000
25 0.17

２． ばいじん及び燃え殻試料の採取量

ばいじん及び燃え殻試料の採取量は、次のような手順によって決定する。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量を算出する。

𝑊=

𝑄𝐷𝐿 × 𝑘 × 𝑣 𝑉𝐸
1
×
×
1000
𝑉′𝐸 𝐶𝐷𝐿

ここに、W： 測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量(g)QDL ： 標準物質における検出下限(pg/mL, DMSO 溶液中)k

： 測定量(毒性等量)への換算係数v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)
77

V’E

： 抽出液分取量(mL)

CDL ： 必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限(ng-TEQ/g)4) 算出された最小のばいじん及び燃え殻試料の量以上をばいじん及び燃え殻試料の採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例) 3ng-TEQ/g レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限は 0.1ng-TEQ/g)
抽出液を 50mL に定容し、その抽出液全量を用いてクリーンアップを行い、最終的に 0.07mL の測定用試料溶液に調製する場合のばいじん及び燃え殻試料の採取量を以下に示す。なお、標準物質における検出下限値は 100pg/mL、ばいじん及び燃え殻の測定量への換算係数は 0.390 を用いた。

𝑊=

100 × 0.390 × 0.07 50
1××= 0.0271000
50 0.1

第４節 試料の前処理

１．試料の前処理の概要
採取した試料は、抽出を行う。抽出液は必要に応じて分取を行い、クリーンアップに移る。図 3-3-2 に試料の前処理から測定までのフローの例を示す。

試料
抽出
抽出液
一部分取

（省略可能）

多層シリカゲルカラムクロマトグラフ操作
測定用試料
図 3-3-2 試料の前処理から測定までのフローの例

２．試薬

試料の前処理に用いる試薬は、次による。これらの試薬は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
JIS K0557 に規定する A4(又は A3)の水、又は同等の品質のもの

1)

水

2)

メタノール

JIS K8891 に規定するもの、又は同等の品質のもの
78

3)

アセトン

JIS K8040 に規定するもの、又は同等の品質のもの

4)

トルエン

JIS K8680 に規定するもの、又は同等の品質のもの

5)ジクロロメタン

6)

ヘキサン

7)

ジメチルスルホキシド(DMSO)

8)硫酸ナトリウム

9)

塩酸

JIS K8180 に規定するもの、又は同等の品質のもの

10) 硫酸JIS K8951 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8117 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8825 に規定するもの、又は同等の品質のもの

11) ヘキサン洗浄水

JIS K9702 に規定するもの、又は同等の品質のもの(注 1)

JIS K8987 に規定するもの、又は同等の品質のもの

1)の水を 6)のヘキサンで十分洗浄したもの

JIS K0311 6.2 に規定するもの、又は同等の品質のもの

12) シリカゲル

13) 水酸化カリウム(2%質量分率)シリカゲル
14) 硫酸(44%質量分率)シリカゲル
15) 硝酸銀(10%質量分率)シリカゲル
16) アルミナ

JIS K0311 6.2 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K0311 6.2 に規定するもの、又は同等の品質のもの
JIS K0311 6.2 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K0311 6.2 に規定するもの、又は同等の品質のもの

17) ガラス繊維ろ紙

JIS K0311 6.2 に規定するもの、又は同等の品質のもの

18) 窒素JIS K01107 に規定するもの、又は同等の品質のもの

19) 酢酸JIS K8355 に規定する特級、又は同等の品質のもの

20) 無水酢酸

JIS K8886 に規定する特級、又は同等の品質のもの

21) テフロンフィルタ

孔径 0.5μm 以下のもので、ダイオキシン類の吸着や妨害成分の溶出がないもの(注 1) ジメチルスルホキシド(DMSO)の品質変動は、測定結果に影響を及ぼすことがあるためロットの変更時等には十分注意する。

３．器具及び装置

試料の前処理に用いる器具及び装置は、次による。これらの器具及び装置は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
3.1

ガラス器具

JIS R3503 及び JIS R3505 に規定するもの。コックの部分がふっ素樹脂製のものを用いてもよい
3.2

ソックスレー抽出器

JIS R3503 に規定するもの、又はこれと同等の品質のもの。接続部にグリースを使用してはならない
3.3

濃縮器

クデルナ-ダニッシュ(KD)濃縮器又はロータリーエバポレータ。接続部にグリースを使用してはならない
3.4

還流抽出器

3.2 のソックスレー抽出器(JIS R3503 付図 71)の抽出塔を外して、代わりに共通すり合わせ直管形連結管(JIS R3503 付図 76)により、共通すり合わせ球管冷却器と共通すり合わせ短首平底フラスコを連結したもの、又は同等のもの
3.5

超音波洗浄器水槽を約 50℃に加温でき、38kHz 前後の超音波を発振できるもの
3.6

マントルヒーター

793.2 のソックスレー抽出器及び 3.4 の還流抽出器を加熱し、還流させることが出来るもの

４．前処理操作

4.1

試料量の記録

採取した試料は、試料量を記録する。
4.2

抽出1) 排出ガスJIS K0311 6.4 により、抽出を行う。ただし、内標準物質の添加は行わない。図 3-3-3 に排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

80

樹脂

円筒ろ紙

吸収プローブ洗液

吸収液、洗液ろ過

残さ
HCl(2mol/l)処理ろ液

ダスト 1g に対して 20mmol
以上の塩酸

ろ過

残さ

ろ液

風乾

ソックスレー抽出液－液振とう抽出(ﾄﾙｴﾝ、16 時間以上)

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ(3 回)

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ層

水層

脱水

濃縮

：検体又は試料：作業

抽出液：物又は試料

図 3-3-3 排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例

2) ばいじん及び燃え殻
試料を酢酸に浸して酸処理を行った後、還流抽出器にかけて抽出を行い、硫酸ナトリウムによる脱水後に、濃縮器等で濃縮する。分取して用いる場合はこれを一定量とする。
図 3-3-4 にばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

81

試料

含水率測定

酢酸処理

還流抽出

超音波抽出
脱水
濃縮
：検体又は試料：作業

抽出液
図 3-3-4

ばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例

1) 分析試料採取
試料約 2g を共通すり合わせ短首平底フラスコ等に採取する。水分の多い試料の場合は風乾を行った後に採取することが望ましい。
2) 酢酸処理酢酸を 10mL 加える。湿りのある、発泡や発熱が著しいサンプルについては、さらに無水酢酸を 10mL添加する。その後、超音波洗浄器に 10 分以上かける。
3) 還流抽出
酢酸処理を行った平底フラスコにトルエン 50mL を加え、直管形連結管により、球管冷却器と平底フラスコを連結し、2 時間以上還流抽出を行う。(酢酸処理の酢酸は、還流抽出前に取り出す必要は無く、トルエンを追加してそのまま還流を行うことができる。酢酸又は無水酢酸を追加している場合には還流抽出前に酢酸を取り出し、抽出後のトルエンと合わせる方が良い。)
4) 超音波抽出
還流抽出後、超音波洗浄器に約 20 分かける。
5) 脱水ろ過
ガラスロートに石英ウールをいれ、その上に無水硫酸ナトリウムを約 50g 敷き詰め、あらかじめヘキサン 100mL で洗浄した脱水用ロートをセットした 300mL ナスフラスコに試料液を移して脱水ろ過する。トルエンで 3 回、ヘキサンで 3 回洗浄する。1 回では脱水が不充分な場合は、濃縮後に再度、無水硫酸ナト
リウムによる脱水操作を繰り返す。

82

4.3

クリーンアップ

図 3-3-5 にクリーンアップのフローを示す。

抽出液：検体又は試料：作業

一部分取：省略できる作業

濃縮

多層シリカゲルカラム
クロマトグラフ操作
クロトグラフ操作
白濁の少ない場合白濁の多い場合
白濁の無い場合

アルミナカラム
クロマトグラフ操作
クロトグラフ操作
白濁の少ない場合白濁の多い場合

ろ過

ﾃﾌﾛﾝﾌｨﾙﾀｰ

ろ過

ﾃﾌﾛﾝﾌｨﾙﾀｰ
白濁の無い場合

濃縮

測定用試料
図 3-3-5 クリーンアップのフローの例

1) 抽出液の分取
抽出液を分取して一部を測定に使用する場合には、定容した抽出液から目的に合わせて一部を分取する。(通常、抽出液の 1/1～1/10 程度を用いる。高濃度であることが予想される場合には、より尐量を分取してもよい。)
2) 精製カラムの作製(1) 多層シリカゲルカラムa) 石英ウールを詰めたガラスクロマト管(内径 15mm)に、図 3-3-6 に示すように、下から、シリカゲ
ル、硝酸銀シリカゲル、シリカゲル、水酸化ナトリウムシリカゲル、シリカゲルをトルエンでクロ83

マト管に湿式充填により積層する。
b) ヘキサン 30mL を通液し、カラム内の溶媒をヘキサンに置換する。
c) 硫酸(44%質量分率)シリカゲル、シリカゲル、硫酸ナトリウムをヘキサンで湿式充填により積層する。
d) ヘキサン 100mL を通液し、充填カラム全体の洗浄を行う。ヘキサンの液面が無水硫酸ナトリウムの上面まで下がったところで通液を止める。

硫酸ナトリウム：2g程度
シリカゲル：2g程度
硫酸(44%質量分率)シリカゲル：8～10g程度

シリカゲル：1g程度
水酸化カリウム(2%質量分率)シリカゲル：3g程度
シリカゲル：1g程度
硝酸銀(10%質量分率)シリカゲル：7～5g程度
シリカゲル：1g程度
石英ウール：適量
化学修飾シリカゲル等の充填量・充填割合は、試料性状に応じて、適宜変更してもかまわない。
ただし、ダイオキシン類の回収が得られることを確認しておくこと。

図 3-3-6 多層シリカゲルカラムの例(2) アルミナカラム
石英ウールを詰めたガラスクロマト管(内径 10mm)に、アルミナ 10g を湿式充填により充填する。ただし、アルミナカラムは試料の性状によって必要な場合のみ使用するため、必要の都度、作製する。
3) クリーンアップ操作
クリーンアップは、2)の(1)多層シリカゲルカラム、(2)アルミナカラム、及び孔径 0.5μm 以下のテフロ
ンフィルタ等を用いて、図 3-3-5 のフローに従って行う。
4) 溶媒置換及び測定用試料の保存
溶媒置換は、トルエン、ヘキサン等の極性の低い溶媒から、DMSO への転溶を行う。溶媒置換はロータ
リーエバポレータ等の濃縮器を用いて、可能な限り無極性溶媒の量を減じる。
約 50mL のアセトンを加えて再度、濃縮器で濃縮を行う。この操作を 3 回繰り返す。その後、アセトンに、測定用試料として必要な量の DMSO を添加して濃縮する。
濃縮液は、測定用試料の保存容器にアセトンを用いて洗い込む。アセトンによる洗い込み及び、窒素吹付け等による濃縮を繰り返し、最終的に DMSO のみの溶液に調製する。
測定用試料は、測定するまでの間、室温で暗所に保存する。
84

第５節 測定

１．測定の概要
本方法は、ダイオキシン類応答性組換え細胞 HeB5 を用いて、試料中に含まれるダイオキシン類が細胞内の Ah 受容体と結合することに由来して発現するルシフェラーゼの活性に基づく発光量を発光光度計で測定することによりダイオキシン類の毒性等量を測定する方法である。
2,3,7,8-TeCDD を用いて検量線を作成し、試料の発光量から算出した実測濃度に排出ガス、ばいじん及び
燃え殻について定められた換算係数を乗じることにより、測定量（毒性等量）を算出する。

２．試薬、器具及び装置

使用細胞

2.1

ダイオキシン類応答性組換え細胞 HeB5：レポーター遺伝子としてホタルのルシフェラーゼ遺伝子を用い、その上流域に生体異物応答配列ＸＲＥを５個配置したプラスミド pGL3－chTATA－YaXREx5－bsd を、マウス肝がん細胞由来 Hepa－1clc7 に導入したもの試薬

2.2

測定に用いる試薬は、次による。
1) 培地

αMEM、NaHCO3(特級)56℃、30 分間非働化処理済、-20℃凍結保存

2) Fetal Bovine Serum(FBS)3) リン酸緩衝生理食塩液(PBS(-))

マグネシウム及びカルシウム不含4) トリプシン溶液

0.25%、0℃以下凍結保存5) 細胞分散用試薬

0.25%トリプシン溶液／1mM EDTA 溶液

6) ブラストサイジン S(Bsd)

塩酸塩 1%含有

7) 細胞凍結用保存液
8) 発光基質

ルシフェリン及び組成物

9) 細胞溶解液10) 標準溶液

ホタルルシフェラーゼによる発光が測定可能なもの
2,3,7,8-TeCDD (50μg/mL DMSO)

11) ジメチルスルホキシド(DMSO)
12) 水JIS K9702 に規定するもの、又は同等の品質のもの(注 1)

JIS K0557 に規定する A4(又は A3)の水又は同等な品質のもの

13) 炭酸ガス

CO2 99.99%

14) 液体窒素
器具及び装置

2.3

測定に用いる器具及び装置は、次による。
100mm 培養シャーレ(ペトリ皿)

1)

細胞培養用プレート

2)

培養／アッセイ用プレート

3)

ピペット

4)

滅菌用フィルター

5)

マイクロピペット及びマルチチャンネルピペット用チップ類

96 ウェルプレート

滅菌ピペット 10mL、25mL 等
0.22μm85

200L、1000L、1200L 等

6)細胞凍結保存用チューブ

7)

血球計算盤

8)

96 ウェルディープウェルプレート

9)

リザーバー

ポリプロピレン製、試料を培地に添加・混合するのに用いる細胞懸濁液の調製、分注に用いる

10) マルチチャンネル(8ch 又は 12ch)ピペッター

電動又はマニュアル

11) マイクロピペット
12) インキュベーター

37℃恒温、飽和湿度、5% CO2 濃度

13) 安全キャビネット

クラスⅡB14) オートクレーブ
15) 培養用倒立位相差顕微鏡
16) ルミノメーター

マルチウェル発光プレートリーダー

17) ディープフリーザー－80℃18) 液体窒素保存容器(細胞保存用)
19) 培地吸引装置(吸引ポンプ、トラップ及びチューブ等一式)
20) 吸引装置(アスピレーター)

３．細胞の取り扱い

3.1

培養細胞の起眠1)培地の調製
粉末 αＭＥＭ培地(1L 分)を超純水に溶解した後、NaHCO3 を 2.2g 添加・溶解し(黄色透明→赤色透明)、

超純水で 1L 容とする。これを滅菌用フィルターで減圧濾過し、この無血清培地 500mL に対し、50mL の
FBS を混合し、10%血清入り培地とする。培地の容器を開放する(フィルターを取り外す、又は蓋を開ける)
等の無菌操作が必要な場合は安全キャビネット内で行う。安全キャビネット内に物品及び手を入れる際、約 80%エタノールのスプレーでそれらを消毒する。
ブラストサイジン S(Bsd)含有培地は以下のように調製する。Bsd が粉末の場合はまず PBS(-)に溶解し、0.22μm のフィルターでろ過滅菌する。滅菌済み Bsd 溶液は適当量(目安として 2mg/mL の濃度で 4mL ずつ)小分けし凍結保存しておくと良い。この Bsd 溶液を上記 10%血清入り培地の Bsd の終濃度が 16μg/mLとなるように添加・混合する。
2)細胞の立ち上げ
冷蔵庫に保管している Bsd 含有/10%血清入り培地を、37℃恒温水槽であらかじめ温めておく。前記培地を100mm の培養シャーレに 10mL 注ぐ。液体窒素又はディープフリーザーで保存した細胞入り細胞凍結
保存用チューブを取り出し、直ちに 37℃恒温水槽で細胞凍結保存用チューブを振りながら融解する(1～2分程度)。細胞凍結保存用チューブの外側を 80%エタノール噴霧により消毒し、融解した細胞懸濁液を培地
入り100mm 培養シャーレに注ぐ。凍結塊が残っている状態で培地を尐量添加し、融解・懸濁させて培養
シャーレに注いでも良い。培養シャーレを縦及び横方向に数回ゆすって細胞を拡散させた後、この培養シ
ャーレをインキュベーターに入れて培養する。培養条件は、CO2 5%、37℃、飽和湿度に設定する。起眠後、継代 3 回目から試験に用いる。

86

3.2

細胞の継代

通常、細胞が培養シャーレの底面一杯を覆うまで増殖する前に細胞を継代する。使用する培地及び PBS(-)
をあらかじめ 37℃恒温槽で温めておく。培養シャーレをインキュベーターから取り出し、80%エタノールを噴霧して消毒後、安全キャビネット内に入れる。培養シャーレに付着しているエタノール液をふき取っておく。片手で培養シャーレを持ち、蓋を開け(全開にはしない)、先にチップ(200L)を装着したアスピレーター
等で培地を吸引除去する。次に PBS(-)をピペットで 5mL 程度、培養シャーレの側面に液を当てながら注入する。培養シャーレを傾ける等により PBS(-)が培養シャーレの底面全体に行き渡るようにする。洗浄済みのPBS(-)を吸引除去する。細胞分散用試薬(トリプシン/EDTA 溶液)を培養シャーレの側面から 1～2mL 程度注
ぎ、培養シャーレを傾けて底面全体に液が行き渡るようにする。細胞分散用試薬(トリプシン/EDTA 溶液)を吸引除去し、培養シャーレを室温で 5～10 分程度静置する。培養用倒立位相差顕微鏡で細胞が底面から剥がれそうになっていること、及び細胞が互いに分離していることを確認したら、培養シャーレの底を手で軽く叩き(タッピング)、細胞を底面から剥離させる。安全キャビネット内で、剥がれた細胞に培地(通常 Bsd 不含/10%血清培地)を 10mL 程度加え、ピペットによる吸引・吐出を繰り返し細胞を分離させる。あらかじめ 10mLの Bsd 含有／10%血清培地を注いだ培養シャーレに、細胞懸濁液の一部(通常 0.3～0.5mL 程度、目的に応じて増減させる)を注ぎ、培養シャーレを縦及び横方向に数回ゆすって細胞を拡散させる。培養シャーレをイン
キュベーターに入れて培養する。通常、細胞懸濁液の 1/20 を継代培養に用い、2～3 日間培養後、同様に継代を行う。顕微鏡観察で、2 日間の培養で培養シャーレ底面の 70%以上に細胞が安定して増殖するようになったことにより細胞に異常がないことを確認する。継代は 20 代程度までを使用の目安とする。継代中の細胞は可能な限り培養環境を一定に保つように留意する。
3.3

細胞の保存

3.2 の記載方法に従って細胞懸濁液を調製後、細胞懸濁液を遠心チューブに移して低速(～1000rpm)で 2～
5 分間遠心する。培地を除去した後、細胞ペレットに細胞凍結用保存液を加え、ピペッティングによって穏
やかに懸濁させる。懸濁液の濃度は目安として 2×106～1×107 cells/mL とする。細胞凍結保存用チューブに0.5～1mL/チューブの割合で細胞懸濁液を分注し、-80℃のディープフリーザーにて凍結させる(-20～-30℃のフリーザーで凍結後、ディープフリーザーに移しても良い)。ディープフリーザーにて凍結後、適宜、細胞凍結保存用チューブを液体窒素保存容器に移して保管する。

４．測定操作4.1

細胞の 96 ウェルプレートへの播種

3.2 の記載方法に従って細胞を剥離し、10%血清培地(Bsd 不含)により細胞懸濁液を調製する。細胞懸濁液の一部を血球計算盤に採取し、位相差顕微鏡で細胞数を計測する。細胞の数え方は血球計算盤の使用方法に従う。
細胞懸濁液を 10%血清培地(Bsd 不含)で適宜希釈し、10,000～20,000(通常 15,000)cells/100L 濃度に調製する。希釈細胞懸濁液をリザーバーに注ぎ、マルチチャンネルピペッター等で 96 ウェルプレートに100L/well の割合で分注する。この間、細胞懸濁液がなるべく均一になるよう、混合・攪拌に努める。細胞を播種した 96 ウェルプレートをインキュベーターに入れ、培養する。
4.2

曝露

前処理の後、DMSO 溶液とした試料は、適宜、DMSO により希釈する。TEQ 濃度が全く未知の試料の場
87

合、1 例として、原液、10 倍希釈液、100 倍希釈液、及び 1000 倍希釈液の 4 水準濃度の測定を行う(表 3-3-1)。
必要に応じて更に希釈を行う。希釈にはガラス容器等(ダイオキシン類の吸着のない材質製のもの)を用いる。
表 3-3-1 試料の希釈例

1倍

希釈元(L)DMSO(L)

原液

0

10 倍

原液

10

100 倍

10 倍希釈液

10901000 倍

100 倍希釈液

10

90

90

試料のほかに、必ず検量線作成のための標準溶液を用意する。1 例として、0(DMSO)、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10、20、50 及び 100pg/L 濃度の 2,3,7,8-TeCDD の DMSO 溶液を調製する。
希釈元には市販の 2,3,7,8-TeCDD に付属の DMSO 溶液が利用できる。
上述各調製 DMSO 溶液を 10%血清培地(Bsd 不含)に添加する。例として、あらかじめ 37℃の恒温槽で温めた 10%血清培地(Bsd 不含)をリザーバーに注ぎ、96 ウェルディープウェルプレートにマルチチャンネルピ
ペッターを用いて 990L/well 分注する。これに上で調製した試料の DMSO 溶液を 10L/well 添加する。一連(例えば、96 ウェルプレートの 1 枚分)の試料添加が終了したら、マルチチャンネルピペッターで試料添加済み培地を、吸引、吐出の繰り返しにより混合した後、4.1 で播種し 1 日(約 24 時間)培養した 96 ウェルプレ
ートに 100L/well の割合で添加する(DMSO 溶液ベースでは 1L/well：DMSO の終濃度は 0.5%体積分率)。
96 ウェルプレート上での試料の配置例を図 3-3-7 示す。通常 4 ウェルの平均値をとることとし、4 ウェルず
つに試料を添加する。試料の添加後、96 ウェルプレートをインキュベーターに戻し、培養を続ける。
4.3

ルシフェラーゼ活性の測定

以下に、培地を除去後、細胞を溶解してから発光基質を添加する方法(ノン・ホモジニアスアッセイ)について記す。試料添加の 20～24 時間後に、96 ウェルプレートから培地を吸引除去する。続いて、PBS(-)(非滅菌)をマルチチャンネルピペッターで 80～100L/well 添加し、96 ウェルプレートを緩やかに傾け(回して)ウェ
ル内を洗浄する(細胞が剥がれないように注意)。PBS(-)を吸引除去し、再び PBS(-)を 80～100L/well の割合で添加する。同様にウェル内を洗浄後、PBS(-)を吸引除去する。別途作製した細胞溶解液(通常 5 倍濃度のものを超純水で 5 倍希釈する)を 15L/well 添加する。96 ウェルプレートを傾けてウェル底面全体に溶解剤が行き渡るようにする。時々、96 ウェルプレートを傾けながら、室温で 30 分間細胞を溶解する。細胞が溶解していることを確認後(細胞の溶解後の組織片の目視、あるいは顕微鏡観察)、96 ウェルプレートをラップで包み、冷凍庫に保管する。96 ウェルプレートが複数の場合は前の 96 ウェルプレートの細胞溶解中に培地の除去・洗浄等の作業を行ってよい。
凍結保存した 96 ウェルプレートを取り出し、室温で融解する。融解後は 96 ウェルプレートを傾けて底面全体に液を行き渡らせ、また、ミキサーで攪拌する。室温においてから約 15 分後に 96 ウェルフォーマット
のルミノメーターに 96 ウェルプレートをセットする。ルミノメーターのパラメーターは機器付属マニュアルを参照して設定する。表計算ソフト等により、測定結果のデータ処理を行う。

88

1

2

A

DMSO

B

DMSO

C

DMSO

D

DMSO

E
F
G
H
1

A

DMSO

B

DMSO

C

DMSO

D

DMSO

E
F
G
H

3

4

5

6

7

8

9

0.1

0.2

0.4

0.6

0.8

1

2

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

0.1

0.2

0.4

0.6

0.8

1

2

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

0.1

0.2

0.4

0.6

0.8

1

2

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

0.1

0.2

0.4

0.5

0.8

1

2

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

3

4

5

10

20

50

100

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

3

4

5

10

20

50

100

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

3

4

5

10

20

50

100

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

3

4

5

10

20

50

100

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

2
操作BL
（n1）
x1000
操作BL
（n2）
x1000
操作BL
（n3）
x1000
操作BL
（n4）
x1000
操作BL
（n1）
x10
操作BL
（n2）
x10
操作BL
（n3）
x10
操作BL
（n4）
x10

3
試料a
（n1）
x1000
試料a
（n2）
x1000
試料a
（n3）
x1000
試料a
（n4）
x1000
試料a
（n1）
x10
試料a
（n2）
x10
試料a
（n3）
x10
試料a
（n4）
x10

4
試料b
（n1）
x1000
試料b
（n2）
x1000
試料b
（n3）
x1000
試料b
（n4）
x1000
試料b
（n1）
x10
試料b
（n2）
x10
試料b
（n3）
x10
試料b
（n4）
x10

5
試料c
（n1）
x1000
試料c
（n2）
x1000
試料c
（n3）
x1000
試料c
（n4）
x1000
試料c
（n1）
x10
試料c
（n2）
x10
試料c
（n3）
x10
試料c
（n4）
x10

6
試料d
（n1）
x1000
試料d
（n2）
x1000
試料d
（n3）
x1000
試料d
（n4）
x1000
試料d
（n1）
x10
試料d
（n2）
x10
試料d
（n3）
x10
試料d
（n4）
x10

7
操作BL
（n1）
x100
操作BL
（n2）
x100
操作BL
（n3）
x100
操作BL
（n4）
x100
操作BL
（n1）
x1
操作BL
（n2）
x1
操作BL
（n3）
x1
操作BL
（n4）
x1

8
試料a
（n1）
x100
試料a
（n2）
x100
試料a
（n3）
x100
試料a
（n4）
x100
試料a
（n1）
x1
試料a
（n2）
x1
試料a
（n3）
x1
試料a
（n4）
x1

図 3-3-7

9
試料b
（n1）
x100
試料b
（n2）
x100
試料b
（n3）
x100
試料b
（n4）
x100
試料b
（n1）
x1
試料b
（n2）
x1
試料b
（n3）
x1
試料b
（n4）
x1

10

11

12

10
試料c
（n1）
x100
試料c
（n2）
x100
試料c
（n3）
x100
試料c
（n4）
x100
試料c
（n1）
x1
試料c
（n2）
x1
試料c
（n3）
x1
試料c
（n4）
x1

11
試料d
（n1）
x100
試料d
（n2）
x100
試料d
（n3）
x100
試料d
（n4）
x100
試料d
（n1）
x1
試料d
（n2）
x1
試料d
（n3）
x1
試料d
（n4）
x1

12

100
pg/μl
100
pg/μl
100
pg/μl
100
pg/μl

96 ウェルプレート上での試料の配置例(上段：検量線プレートの例、下段：試料測定プレートの例)

５．定量

5.1

検量線の作成濃度既知の標準溶液を 5 濃度水準以上測定し、最小二乗法により回帰させた式を使用する。以下に
2,3,7,8-TeCDD 標準溶液を用い 14 濃度水準で測定して検量線を求める例を記載する。
測定した RLU に関し、4 ウェルの平均値及び標準偏差(si)を求める。
2,3,7,8-TeCDD の各濃度に対応する平均 RLU から、DMSO コントロール(0)の平均 RLU を差し引いて、

89

総 RLU を求める。0 濃度を除き、各 s i

2を求め、その総和

s2iを算出する。

i

次に各 RLU の重み wi  si

2

 (s

2
i

n)

を求める。

i

ロジスティック曲線の一般式yαδ ・・・(式Ⅰ) を基にし、
1 β* e -γx

表計算ソフトで変数 α、β、γ 及び δ パラメーターのセルを設定する(図 3-3-8)。
図 3-3-7 の y の予測値の欄に式Ⅰを入力する。ただし、濃度 X は常用対数 log(x)を用いる。次に試料の RLUy と y の予測値の差の平方(残差平方)を求める(式を入力)。次いで、各残差平方に対応する重み wi を乗じた
重み付き残差平方を求める(式を入力)。この重み付き残差平方和が最小となるように変数 α、β、γ 及び δ を算出する。

ｙ = α /(1+β *EXP（-γ *LOG(x)))+δ
α
β
γ
δ
ｘ
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1
2
3
4
5
10
20
50
100

946789.21
15.662918
3.1685912-801.9887

重み付きxのｙの予測値 残差平方 残差平方*重み 予測値
18531733.8
1.43E+04
1.43E+05
0.10
7848
5752.1
4.39E+06
1.88E+05
0.25
14501
16024.3
2.32E+06
6.40E+06
0.37
31478
28210.0
1.07E+07
9.39E+06
0.65
42904
41668.8
1.53E+06
1.99E+05
0.82
61160
56018.1
2.64E+07
3.85E+05
1.1134792 133794.7
9.95E+05
1.39E+04
2.0
201875 211775.0
9.80E+07
2.73E+06
2.9257310 283967.8
7.11E+08
3.22E+06
3.6350956 348555.2
5.76E+06
4.27E+05
5.0579009 569956.5
8.19E+07
1.92E+05
10724430 754322.7
8.94E+08
3.59E+05
17889940 882453.6
5.60E+07
3.49E+04
55
918315 920457.2
4.59E+06
1.31E+04
94
ｙ

残差平方和

1.89E+09

2.37E+07 ←最小二乗法計算ｾﾙ

図 3-3-8 表計算ソフトを用いたロジスティック曲線近似式による予測の例

5.2

検量線の確認及び感度変動の管理図による確認

検量線の作成例を図 3-3-9 に示す。
定量操作が適切に行われているかどうかを確認するため、測定担当者は、検量線作成用標準液の測定操作により得られたデータから、測定量（毒性等量）を求め、管理図に記録し保存する。作成した検量線の 50%RLU
を求め、検量線からその強度における EC50 値（pg-TEQ/μL）を読み取り管理図にプロットする。一例を図3-3-10 に示す。管理図による処置基準は、管理限界（μ±2σ）からの逸脱状況に応じて下記の通りとする。

90

1.0E+06

8.0E+05

RLU

6.0E+05

4.0E+05

2.0E+05

0.0E+00
0.1

1

10

100

2,3,7,8-TeCDD(pg/μ L)

図 3-3-9 検量線の例
1 点でも管理限界を超えた場合は、原因の究明と改善を行うとともに、再測定する。改善のために講じた措置及び再測定の結果について、記録をする。また、管理限界内であっても基準値に対して、一定の傾向で外れていくような状態又は偏った測定量が続くような状態においては、原因の究明を行い、必要に応じ、改善を行うとともに、再測定する。

15
12
μ +2σ

EC50

9

μ

6

μ －2σ

3
0
0

5

10

15

20

25

30

35

40

測定回数（回）図 3-3-10 管理図例

5.3

測定試料の定量

通常、試料の RLU から、並行処理している操作ブランクの RLU を差し引いた総 RLU を求める。この総RLU を 5.1 で求めた近似式に代入し、実測濃度を算出する。また、希釈試料の複数の水準が定量範囲に収まった場合、それぞれの希釈水準から求められた濃度を平均して実測濃度とする。
求めた濃度 X（ng/mL）から以下の式によって試料量あたりの実測濃度を求める。
91

1

− 𝑙𝑛

濃度 X の求め方：

𝑋 = 10 𝛾

𝛼
−1
𝑦 −𝛽

𝛽

1) 排出ガス

𝐶𝑆 = 𝑋 × 𝑛 × 𝑣 ×
ここに、Cs

𝑉𝐸 1
×
𝑉′𝐸 𝑉

： 排出ガス中の実測濃度(ng/m3N)

X： 希釈試料中実測濃度(ng/mL）n： 希釈倍率v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)

V’E： 抽出液分取量(mL)V： 試料ガスの採取量(m3N)(備考) 排出ガスの酸素濃度による補正は、次式による。

𝐶=

9
× 𝐶𝑆
21 − 𝑂𝑆

ここに、C： 酸素の濃度 On における実測濃度(ng/m3N)

Os ： 排出ガス中の酸素の濃度(注 2)(%)
Cs ： 排出ガス中の実測濃度(ng/m3N）(注 2) 排出ガス中の酸素の濃度が 20%を超える場合は、Os=20 とする。

2) ばいじん及び燃え殻

𝐶𝑊 = 𝑋 × 𝑛 × 𝑣 ×
ここに、Cw

𝑉𝐸
1
×
𝑉′𝐸 𝑊

： ばいじん及び燃え殻中の実測濃度(ng/g)

X： 希釈試料中実測濃度(ng/mL)n： 希釈倍率v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)

V’E： 抽出液分取量(mL)W： ばいじん及び燃え殻試料の採取量(g)６．検出下限及び定量範囲6.1

標準物質における検出下限及び定量範囲の確認

検出下限等算出用検量線の測定操作により得られた測定値の定量値の変動係数(CV%)が 30%以下となる点を検出下限、20%以下となる上下 2 点間を定量範囲とする。
この標準物質における検出下限及び定量範囲は、尐なくとも 6 ヶ月に 1 回確認する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認する。

92

1) 検出下限等算出用標準溶液の調製例
2,3,7,8-TeCDD の DMSO 標準溶液を用い、0(DMSO)、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10、20、30、50 及び 100pg/L の DMSO 溶液を調製する。
2) 検出下限及び定量範囲の算出例
4.1～5.1 に準じて測定を行い、17 濃度水準の検量線を作成する。ただし、各濃度水準におけるウェル数
は 5 以上とする。個々の RLU について、検量線から毒性等量（pg-TEQ/L）を求め、濃度水準ごとに測定量の変動係数を算出し、精度プロファイルを作成する。
変動係数(CV%)が 30%となる点を検出下限、20%となる上下 2 点間を定量範囲とする。濃度水準ごとに6 ウェルで測定した例を図 3-3-11 に示す。
40
CV=30%

CV(%)

30

CV=20%

20

10

0
0.01

0.1

1

10

100

毒性等量（pg-TEQ/μ L)

図 3-3-11

6.2

精度プロファイルの例

試料における検出下限及び定量下限

試料における検出下限及び定量下限は、試料量と前処理を経た最終検液量の数値と、標準物質における検出下限並びに定量下限から理論的に算出する。試料における検出下限及び定量下限は、試料採取量や最終検液量等により異なってくるため、試料ごとに求める。

７．測定量(毒性等量)への換算
図 3-3-12 に、生物検定法によって測定された濃度の HRGC/HRMS 法によって求めた濃度に対する相関図を示す。現時点で相関図より近似式を求めた結果、排出ガスの場合 y=0.319x、ばいじん及び燃え殻の場合
y=0.390x となっている。従って、生物検定法で求めた実測濃度(ng/m3N あるいは ng/g)を、排出ガスの場合、換算係数 0.319、ばいじん及び燃え殻の場合、換算係数 0.390 を乗じて測定量(毒性等量)を求める。なお、測定結果の報告様式については、第２章第２節「測定結果の報告」を参照すること。

93

８．換算係数の確認
尐なくとも 6 ヶ月に 1 回、HRGC/HRMS 法によって測定された試料について、本測定法による測定を行い、HRGC/HRMS 法により得られた測定量（毒性等量）と本測定法で得られた実測濃度より換算係数を算出し、換算係数と比較する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認を行う。
試料は、片方について HRGC/HRMS 法に定められた方法により前処理を行い、残りについては生物検定法に定められた方法により前処理を行って試料を調製する。
得られた換算係数が、第６節の換算係数と大きく換算係数が乖離する場合又は相関が悪い場合には、原因の究明を行い、その結果及び講じた措置を記録する。
排出ガス試料については、JIS K0311 に従い抽出までを行った抽出試料（ただし、アッセイに影響を及ぼすサンプリングスパイク及び抽出工程でのクリーンアップスパイクの添加は行わない）を分割し、片方は JIS
K0311 に定められた方法により測定量（毒性等量）を求める。残りは、本法 4.1～4.3 及び 5.3 に従って操作し、生物検定法における測定量（毒性等量）を求める。
ばいじん及び燃え殻試料については、平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(2)に準拠した方法（ただし、同表ウ(イ)の内標準物質の添加の操作は行わない）ならびに本法 4.1～4.3 及び 5.3 に従って操作し、それぞれの方法について測定量（毒性等量）を求める。
HRGC/HRMS 法により求めた毒性等量と生物検定法により求めた実測濃度の相関図を作成し、回帰直線の係数を換算係数とする。相関図の例を次節に示す。

94

第６節 参考資料「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(排出ガス試料)」
多数の排出ガス試料(この例では n=25。n=20 以上が望ましい)について本測定方法と HRGC/HRMS 法でそれぞれ実測濃度、毒性等量を求め、HRGC/HRMS 法による毒性等量を本測定方法による実測濃度で除したものの平均値を換算係数とする。
(例)排出ガス試料の換算係数導出の方法
1) 本測定方法による実測濃度を X、HRGC/HRMS 法による毒性等量を Y とし、Y/X を求める。
2) 全試料について Y/X の値を求め、全試料の平均値を計算し、これを換算係数とする(図 3-3-12 では Y/Xの平均値である 0.319 を換算係数とした)。

「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(ばいじん及び燃え殻試料)」
複 数 の ば い じ ん 及 び 燃 え 殻 試 料 ( こ の 例 で は n=44 。 n=20 以 上 が 望 ま し い ) に つ い て 本 測 定 方 法 と
HRGC/HRMS 法でそれぞれ実測濃度、毒性等量を求める。HRGC/HRMS 法による毒性等量を本測定方法による実測濃度で除したものの平均値を換算係数とする。
(例)ばいじん及び燃え殻試料の換算係数導出の方法
1) 本測定方法による実測濃度を X、HRGC/HRMS 法による毒性等量を Y とし、Y/X を求める。
2) 全試料について Y/X の値を求め、全試料の平均値を計算し、これを換算係数とする(図 3-3-12 では Y/Xの平均値である 0.390 を換算係数とした)。

排ガス(n=25)[WHO-TEF(2006)]

100

1000

y = 0.3188x
2
R = 0.9611100

毒性等量(ng-TEQ/g)

毒性等量(ng-TEQ/m3N)

1000

10
1
0.1
0.01
0.01

ばいじん及び燃え殻(n=44)[WHO-TEF(2006)]
y = 0.3897x
R2 = 0.9953

10

1

0.1

0.1

1
10
100
実測濃度(ng/m3N)

0.01
0.01

1000

図 3-3-12

0.1

1

10

実測濃度(ng/g)

換算係数算出(例)(排出ガス、ばいじん及び燃え殻)

95

100

1000

その４

前処理に、硫酸シリカゲル加熱還流 法を利用し、測定に、ダイオキシン類応答性組換え細胞

H4ⅡE-luc を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成17 年環境省告示第 92 号第 1 の 4)

第１節 測定方法の概要

対象媒体ごとに試料を採取し、ダイオキシン類を抽出後、クリーンアップを行い、ダイオキシン類応答性
組み換え細胞 H4ⅡE-luc を用いたレポータージーンアッセイによる測定により定量する。測定方法のフローを図 3-4-1 に示す。

試料採取

抽出
水層
クリーンアップ

ダイオキシン類応答性組換え細胞 H4ⅡE-luc を用いたレポータージーンアッセイによる測定

ダイオキシン類(実測濃度)の定量

換算係数による測定量(毒性等量)への換算

測定値確定
図 3-4-1 測定方法のフロー

第２節 用語の定義

1) ルシフェラーゼ遺伝子

Luciferase Gene。生物発光反応を触媒する酵素を発現するホタル由来の遺伝子。
2) Ah 受容体

Arylhydrocarbon Receptor。アリール炭化水素受容体、特異的な細胞外シグナル伝達分子(リガンド)に結合し、細胞の応答するきっかけとなるタンパク質。ダイオキシン類の生体影響の多くは、この受容体と結合することにより引き起こされる。
3) リガンド

Ligand。タンパク質又は他の分子の特異的部位に結合する分子の総称。受容体が鍵穴でリガンドが鍵の関係。両者が結合すると、両者の関係に特異的な信号が発生し生理反応が引き起こされる。
4) DRE

Dioxin Responsive Element。ダイオキシン応答配列。ダイオキシン類が特異的に結合する遺伝

子の塩基配列部分。
5) CYP1A1

Cytochrome P450。薬物代謝酵素シトクロム P450 類に属する薬物代謝酵素。CYP1A1 は、
96ダイオキシン類により誘導されることが知られている。
Subculture。保存細胞から微生物あるいは培養細胞の一部を分けて別の新鮮な培地に植え

6) 継代培養継ぎ、再び培養したもの。
Confluent。細胞の密集生育状態。

7) コンフルエント
8)

プラスミド

9)

発光基質

Plasmid。小型の環状 DNA 分子のこと。
生物発光反応の基質。

10) 精度プロファイル

精度確認用の標準溶液濃度と変動係数(CV%)との関連図。

第３節 試料採取方法に関する特記事項

１．試料ガスの採取量

試料ガスの採取量は、次のような手順によって決定する。採取時間については、その目的に応じて試料ガスの発生状況等を十分考慮して代表試料が採取できるようにしなければならない。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小の試料ガスの量を算出する。

𝑉=

𝑄𝐷𝐿 × 𝑘 × 𝑣 𝑉𝐸
1
×
×
1000
𝑉′𝐸 𝐶𝐷𝐿

ここに、V： 測定に必要な最小の試料ガスの量(m3N)

QDL ： 標準物質における検出下限(pg/mL, DMSO 溶液中)k

： 測定量(毒性等量)への換算係数v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)

V’E： 抽出液分取量(mL)

CDL ： 必要となる試料ガスにおける検出下限(ng-TEQ/m3N)4) 算出された最小の試料ガスの量以上を試料ガスの採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例) 5ng-TEQ/m3N レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となる試料ガスにおける検出下限
は 0.17ng-TEQ/m3N)
抽出液を 40mL に定容し、その抽出液から 10mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に0.05mL の測定用試料溶液に調製する場合の試料ガスの採取量を以下に示す。なお、標準物質における検出下限は 12.1pg/ml、排出ガスの測定量への換算係数は 0.308 を用いた。

𝑉=

12.1 × 0.308 × 0.05 40
1××= 0.0044
1000
10 0.1797

２．ばいじん及び燃え殻試料の採取量

ばいじん及び燃え殻試料の採取量は、次のような手順によって決定する。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下にばいじん及び燃え殻試料における検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量を算出する。

𝑊=

𝑄𝐷𝐿 × 𝑘 × 𝑣 𝑉𝐸
1
×
×
1000
𝑉′𝐸 𝐶𝐷𝐿

ここに、W： 測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量(g)QDL ： 標準物質における検出下限(pg/mL, DMSO 溶液中)k

： 測定量(毒性等量)への換算係数v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)

V’E： 抽出液分取量(mL)

CDL ： 必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限(ng-TEQ/g)4) 算出された最小のばいじん及び燃え殻試料の量以上をばいじん及び燃え殻試料の採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例)3ng-TEQ/g レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限は 0.1ng-TEQ/g)
抽出液を 90mL に定容し、その抽出液から 30mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に0.05mL の測定用試料溶液に調製する場合のばいじん及び燃え殻試料の採取量を以下に示す。なお、標準物質における検出下限は 12.1pg/ml、ばいじん及び燃え殻の測定量への換算係数は 0.356 を用いた。

𝑊=

12.1 × 0.356 × 0.05 90
1
××= 0.0065
1000
30 0.198

第４節 試料の前処理

１．試料の前処理の概要
採取した試料は、抽出を行う。抽出液は必要に応じて分取を行い、クリーンアップに移る。図 3-4-2 に試料の前処理から測定までのフローの例を示す。

試料
抽出
抽出液
一部分取
硫酸シリカゲル加熱還流操作
測定用試料
図 3-4-2 試料の前処理から測定までのフローの例

２．試薬

試料の前処理に用いる試薬は、次による。これらの試薬は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
1) 水

JIS K0557 に規定する A4(又は A3)の水、又は同等の品質のもの

2) アセトンJIS K8040 に規定するもの、又は同等の品質のもの

3) トルエンJIS K8680 に規定するもの、又は同等の品質のもの

4) ジクロロメタン
5) ヘキサンJIS K8117 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8825 に規定するもの、又は同等の品質のもの

6) ジメチルスルホキシド(DMSO)
7) 硫酸ナトリウム

JIS K9702 に規定するもの、又は同等の品質のもの(注 1)

JIS K8987 に規定するもの、又は同等の品質のもの

8) 塩酸

JIS K8180 に規定するもの、又は同等の品質のもの

9) 硫酸

JIS K8951 に規定するもの、又は同等の品質のもの

10) ヘキサン洗浄水
11) シリカゲル

1)の水を 6)のヘキサンで十分洗浄したもの

JIS K0311 6.2 に規定するもの、又は同等の品質のもの

12) 硫酸(44%質量分率)シリカゲル
13) ガラス繊維ろ紙
14) 窒素JIS K0311 6.2 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K0311 6.2 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K01107 に規定するもの、又は同等の品質のもの(注 1)ジメチルスルホキシド(DMSO)の品質変動は、測定結果に影響を及ぼすことがあるため、ロットの変更時等には十分注意する。

99

３．器具及び装置

試料の前処理に用いる器具及び装置は、次による。これらの器具及び装置は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
3.1 ガラス器具
JIS R3503 及び JIS R3505 に規定するもの。コックの部分がフッ素樹脂製のものを用いてもよい
3.2 ソックスレー抽出器
JIS R3503 に規定するもの、又はこれと同等の品質のもの。接続部にグリースを使用してはならない
3.3 濃縮器
クデルナ-ダニッシュ(KD)濃縮器、ロータリーエバポレーター、窒素気流濃縮装置等。接続部にグリースを使用してはならない
3.4 還流装置
80℃に温度調節可能な恒温水槽に還流用冷却管(球管)をセットしたもの。

４．前処理操作

4.1 試料量の記録採取した試料は、試料量を記録する。

100

4.2 抽出1) 排出ガスJIS K0311 6.4 により、抽出を行う。ただし、内標準物質の添加は行わない。図 3-4-3 に排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

樹脂

円筒ろ紙

吸収プローブ洗液

吸収液、洗液ろ過

残さ
HCl(2mol/l)処理

ろ液

試料 1g に対して 20mmol 以
上の塩酸

ろ過

残さ

ろ液

風乾

ソックスレー抽出液－液振とう抽出(ﾄﾙｴﾝ、16 時間以上)

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ(3 回)

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ層

水層

脱水

濃縮

：検体又は試料：作業

抽出液：物又は試料

図 3-4-3 排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例

2) ばいじん及び燃え殻
平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(2)により抽出を行う。ただし、内標準物質の添加の操作は行わない。
試料の適量を用いて、ダイオキシン類分析及び水分測定を行う。図 3-4-4 にばいじん及び燃え殻試料の101

抽出液調製までのフローの例を示す。

試料

含水率測定
HCl(2mol/l)処理

ろ過

残さ

ろ液

風乾
ソックスレー抽出(ﾄﾙｴﾝ、16 時間以上)

液－液振とう抽出
ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ(3 回)

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ層

水層

脱水：検体又は試料

濃縮：作業：物又は試料抽出液
図 3-4-4

ばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例

102

4.3 クリーンアップ
図 3-4-5 にクリーンアップのフローの例を示す。

：検体又は試料

抽出液

：作業
一部分取

：省略できる作業

濃縮
夾雑物の多い場合

硫酸シリカゲル加熱還流操作

濃縮

測定用試料
図 3-4-5 クリーンアップのフローの例

1) 抽出液の分取
抽出液を分取して一部を測定に使用する場合には、定容した抽出液から必要量を分取する。
2) 硫酸シリカゲル加熱還流の準備
夾雑物の尐ない場合は三角フラスコに硫酸(44%質量分率)シリカゲル 20g を量り取り、ヘキサン 45mL及び沸石を添加する。夾雑物が多い場合は硫酸(44%質量分率)シリカゲルとヘキサンを倍加する。
3) 硫酸シリカゲル加熱還流処理(1) 抽出液を約 1mL まで濃縮して 2)に加え、ヘキサン 2mL で抽出液の容器を 2 回洗い込む。
(2) 冷却管にセットし、水温 80℃に維持したウォーターバスに三角フラスコを浸け、60 分間加熱還流を行う。
(3) 放冷後、濃縮容器にロートとろ紙をセットし、無水硫酸ナトリウム 5ｇをろ紙底に添加し、試料をろ過する。
(4) ヘキサン 30mL を三角フラスコに注ぎ振り洗い、ろ過する。これを 2～3 回繰り返す。
4) 測定用試料の保存(1) 3)の試料を、ロータリーエバポレーターで約 1mL まで濃縮し、試料識別ラベルを貼ったバイアルに移す。
(2) 濃縮液に固化、着色が認められた場合は尐量のヘキサンで溶解後、3)の硫酸シリカゲル加熱還流処理を繰り返す。
(3) ヘキサンで濃縮容器を 2 回洗い込みながら、窒素気流濃縮装置により乾固させる。
103

(4) 乾固後、直ちに DMSO 50L を添加し、試験管ミキサー等で撹拌する。
(5) 最終検液として冷蔵庫で保存する。

第５節 測定１．測定の概要
本方法は、ダイオキシン類応答性組換え細胞 H4ⅡE－luc を用いて、試料中に含まれるダイオキシン類が細胞内の Ah 受容体と結合することに由来して発現するルシフェラーゼの活性に基づく発光量を発光光度計
で測定することによりダイオキシン類の毒性等量を測定する方法である。
2,3,7,8-TeCDD を用いて検量線を作成し、試料の発光量から算出した実測濃度に排出ガス、ばいじん及び
燃え殻について定められた換算係数を乗じることにより、測定量（毒性等量）を算出する。

２．試薬、器具及び装置

2.1 使用細胞
ダイオキシン類応答性組換え細胞 H4ⅡE－luc：レポーター遺伝子としてホタルのルシフェラーゼ遺伝子を用い、その上流域にダイオキシン類応答配列ＤＲＥを４個持つラットのシトクロムＰ450（ＣＹＰ１Ａ１）
プロモーターを配置したプラスミド pGudLuc1.1 を、ラット肝がん細胞由来 H4ⅡE に導入したもの(注 2)。
(注 2) 引用文献：P.M.Garrison et al., Species-Specific Recombinant Cell Line as Bioassay Systems for the Detectionof 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin like Chemicals,Fundam Appl Toxicol.1996 Apr;30(2):194-203

2.2 試薬測定に用いる試薬は、次による。
α-MEM、FBS(+10%体積分率)

1)

培地

2)

Fetal Bovine Serum

3)

ハンクス平衡塩溶液(HBSS)

4)

トリプシン溶液

5)

リン酸緩衝生理食塩液(PBS(-))

マグネシウム及びカルシウム不含

6)ジメチルスルホキシド(DMSO)JIS K9702 に規定するもの、又は同等の品質のもの(注 1)

7)細胞凍結用 DMSO

8)

CaCl2・2H2O

0.13g を 13)の水 100mL に溶かしたもの

9)

MgCl2・6H2O

0.1g を 13)の水 100mL に溶かしたもの

室温保存

0.05％、-20℃凍結保存10) 細胞凍結用保存液
11) 標準物質-20℃凍結保存

エンドトキシン、ハイブリドーマ試験済み、滅菌済みのもの

1)の培地と凍結保存用 DMSO を 4:1 で混合したもの

2,3,7,8-TeCDD(50μg/mL)12) ルシフェラーゼ定量キット
13) 水

JIS K0557 に規定する A4(又は A3)の水又は同等の品質のもの

14) 炭酸ガス
15) 液体窒素1042.3 器具及び装置
測定に用いる器具及び装置は、次による。
75cm2、滅菌済み

1) 培養フラスコ

2) プラスチックピペット

1mL、5mL、10mL、滅菌済み、使い捨てできるもの

3) プラスチックチューブ

15mL、50mL、滅菌済み、使い捨てできるもの

4) 凍結保存用バイアル

滅菌済み5) 96 ウェルマイクロプレート

平底、細胞培養表面処理、滅菌済み

6) 48 ウェルマイクロプレート

平底、滅菌済み

7) 連続分注ピペット

5mL、25mL、滅菌済み

8) マイクロピペット

10L、40L、200L、1000L9) チップ
10)50L、250L、1000L、高圧蒸気滅菌可能なもの

8 連ピペット11) マルチプレートシール
12) リザーバー

高圧蒸気滅菌可能なもの

13) 50mL シリンジ
14) スパイナル針

ポリプロピレン製、滅菌済み
1.20×90mm、滅菌済み

15) 33mm シリンジフィルター16) 安全キャビネット

孔径 0.22m、滅菌済み

クラスⅡタイプ A17) インキュベーター
18) 培養用倒立位相差顕微鏡
19) 恒温水槽
20) プレートシェーカー
21) ルミノメーター
22) 超低温冷凍庫(-80／-150℃）
23) 液体窒素容器
24) 高圧蒸気滅菌器
25) ミキサー

３．細胞の取り扱い

3.1 培養細胞の起眠
1) 培養フラスコ(75cm2)2 個に培地を 10mL ずつ移し、CO2 5%、37℃の環境下のインキュベーターで 4
時間放置する。
2) 液体窒素保存容器から凍結保存用バイアルを取り出し、37℃の恒温水槽で、わずかに氷塊が残る程度まで融解する。
3) 1)のフラスコ内の培地 0.5mL を 1mL ピペットで 2)に添加し、穏やかに混合後、各フラスコの細胞濃度が異なるように細胞懸濁液を移す(通常は 1mL と 0.5mL)。
4) フラスコを数回傾けてなじませ、インキュベーターに移して CO2 5%、37℃の環境下で培養する。
5) 培養フラスコ内に雑菌汚染がないことを確認できれば、継代を 3 代行った後、試験に使用しても良い。
105

6) 1),3)の操作は安全キャビネット内で無菌的に行う。
(注 3) 安全キャビネット内で無菌操作を行う

3.2 細胞の継代
1) 培地、HBSS、トリプシン溶液を恒温水槽で 37℃に温める。
2) 培養フラスコをインキュベーターから取り出し、細胞観察を行う。
3) ピペットで培地を除去後、新しいピペットで HBSS を 5mL 添加して細胞接着面を洗浄し、HBSS を除去する。
4) ピペットでトリプシン溶液を 3mL 添加し、細胞接着面になじませた後、トリプシン溶液を除去する。
5) インキュベーター内でフラスコを 3 分間静置後、手のひらでフラスコの底面を軽くたたく。
6) 顕微鏡でフラスコ内の細胞が浮遊し、丸くなっていることを確認する。
7) ピペットで培地を 10mL 添加して混合・単細胞化し、細胞懸濁液を作製する。
8) 新しいフラスコに、細胞懸濁液と培地を併せて 10mL になるよう、培地と 7)の細胞懸濁液を適量(培養の日数により、細胞懸濁液の量を調節する)移す。
9) インキュベーターに 8)のフラスコを移し、CO2 5%、37℃の環境下で２～４日培養する。
10) 細胞の継代操作は 80 代まで目安とし、期限前であっても測定に支障が生じる等、細胞に問題があると考えられる場合にはそれ以後の継代には使用せず廃棄する(注 4)。
11) 3),4),7),8）の操作は安全キャビネット内で無菌的に行う。
(注 4) 測定に支障が生じる場合とは、細胞の活性低下(検量線作成時の DEMS のみと 300pM/well の発光量の比が 8 以下となった時)、
コンタミネーション等を指す

3.3

細胞の保存

1) 90％コンフルエントに達したフラスコ 5 個について、3.2 の 1)～6)の操作を行う。
2) 1 番目のフラスコに 5mL の培地を添加して細胞を剥がして懸濁し、その細胞懸濁液全量を 2 番目のフラスコに移す。
3) 同様に 2 から 3、3 から 4、4 から 5 番目のフラスコへと細胞懸濁液を移し、5 番目のフラスコにフラ
スコ 5 個分の細胞を集め、混合・単細胞化する。
4) 10 本の凍結保存用バイアルにプラスチックピペットで 3)の細胞懸濁液を分注し、10 分間静置する。
5) 凍結保存用培地(細胞保存用 DMSO：培地＝１：４)を調製し、穏やかに滴下して 4)に添加する。
6) の凍結保存用バイアルを数回反転させて内容物を混合し、-80℃の冷凍庫で１日凍結させる。
7) １日-80℃で凍結した凍結保存用バイアルを液体窒素保存容器または超低温冷凍庫(-150℃)に移し、保管する。細胞を短期間保管するのであれば、-80℃の冷凍庫でも良い。
8) 2)、3)の 5 個のフラスコについて、再度 2)、3)と同様の操作を行う。
9) コンタミネーションの有無の確認を行うため、8)の培地、凍結保存用培地及び１日以上液体窒素中で保存した細胞を解凍し、インキュベーターに移して CO2 5%、37℃の環境下で培養する。
10) 1),2),3),4),5),8）の操作は安全キャビネット内で無菌的に行う。

４．測定操作

4.1 細胞のマイクロプレートへの播種
1) インキュベーターからコンフルエントに達した培養フラスコを取り出し、3.2 の 1)～7)の操作を行う。

106

2) 細胞懸濁液を 50mL プラスチックチューブに移し、同量（10 mL）の培地をピペットで添加し、混合・単細胞化する (注 5)。
3) PBS(-)、HBSS、滅菌水等をリザーバーに移し、ずつマイクロプレートの外側１周(36 ウェル)に添加する (注 6)。
4) 連続分注ピペットで 2)の細胞懸濁液 100L を 3)の残りの内側 60 ウェルに添加する。
5) マイクロプレートをインキュベーターに移し、CO2 5%、37℃の環境下で 16～24 時間培養する。
6) 1),2),3),4）の操作は安全キャビネット内で無菌的に行う。
(注 5) 細胞の量によっては添加する培地の量を増減しても良い。
(注 6) プレートの外周部分のウェルは、培養中に培地の蒸発等の影響を受けやすいため、原則として定量には使用しない。

4.2 曝露1) 測定用試料(DMSO 溶液)を、測定値が定量範囲内に入るよう適宜 DMSO で希釈し、3～12 水準の希釈
系列試料を調製する。試料の希釈例を 表 3-4-1 に示す。
2) 48 ウェルプレートに培地 500l を入れ、DMSO(ブランク)、検量線作成用標準液及び 1)で調製した試料を 8l を加えてよく混合する。検量線作成用標準液の濃度調製例を 表 3-4-2 に示す。
3) 16～24 時間培養したマイクロプレートの内側 60 ウェルに、100L、3 ウェルずつ 2)を添加する(注 7)。
4) 再度マイクロプレートをインキュベーターに戻し、CO2 5%、37℃の環境下で約 24 時間培養する。
5) 1),2),3）の操作は安全キャビネット内で無菌的に行う。
(注 7) 検量線作成用標準液はプレート毎に曝露・測定する。レイアウト例を 図 3-4-6 に示す。

表 3-4-1 試料の希釈例
試料
原液
2 倍希釈
6 倍希釈
20 倍希釈60 倍希釈

希釈元
原液
原液
2 倍希釈
2 倍希釈
6 倍希釈

分取量(L)
(50)
25
15
10
10

DMSO 分注量(L)
0
25
30
90
90

表 3-4-2 検量線作成用標準液の濃度調製例
終濃度(pM/well)
0.3
1
3
10
30
100
300

希釈前(nM)
0.0375
0.125
0.375
1.25
3.75
12.5
37.5

107

希釈前(pg/mL)
12.07540.25
120.75402.51207.5
4025
12075

DMSO

STD-1

STD-2

STD-3

STD-4

STD-5

STD-6

STD-7

試料
2-6

試料
2-5

試料
1-1

試料
1-2

試料
1-3

試料
1-4

試料
1-5

試料
1-6

試料
2-1

試料
2-2

試料
2-3

試料
2-4

図 3-4-6

96 ウェルプレート上でのレイアウト例(注 6)

4.3 ルシフェラーゼ活性の測定
1) PBS(+)の調製
CaCl2 溶液及び MgCl2 溶液を、PBS(-)：CaCl2 溶液：MgCl2 溶液＝8：1：1 の割合で混合する(注 8)。
(注 8) PBS(+)は沈殿が生成しやすいため、使用直前に調製する

2) ルシフェラーゼ活性の測定(1) 約 24 時間曝露を行ったマイクロプレートをインキュベーターから取り出し、プレートを裏返して、マイクロプレート内の培地を除去する。
(2) マイクロプレートの内側 60 ウェルに、8 連ピペットで PBS(+)を 50L ずつ添加し、デカンテーショ
ンで除去する。
(3) 再度マイクロプレートの内側 60 ウェルに、8 連ピペットで PBS(+)を 50L ずつ添加する。
(4) ルシフェラーゼ定量キットの発光基質を緩衝液で溶解し、(3)のマイクロプレートの内側 60 ウェルに、
8 連ピペットで 50L ずつ添加する（図 3-4-6 参照）。
(5) のマイクロプレートにマルチプレートシールを貼る。
(6) 遮光して室温で 30 分静置後、ルミノメーターで発光量の測定を行う。

５．定量

5.1 検量線の作成
検量線はプレート毎に作成する。
1) ルミノメーターで測定した各 3 ウェルの検量線作成用標準液の発光量平均値を DMSO ブランクの発光量平均値で差し引いて校正する。
2) 検量線作成用標準液の濃度(pM/well)と校正済み発光量平均値について以下の式にカーブフィットさ
せ、a0、a1、a2 の各パラメーターを得る。

𝑦=

𝑎0
𝑥 𝑎2
1+ 𝑎
1

ここに、 y ： 測定値(RLU)
x ： 検量線作成用標準液濃度(pM/well)a0 ： 最大 RLU
a1 ： 曲線の EC50
a2 ： 曲線のスロープ

1083) 得られたパラメーターから検量線を作成する。
200000160000RLU

120000

80000

40000

0
0.1

1

10

100

1000

2,3,7,8-TeCDD(pM/well)

図 3-4-7 検量線例

5.2 検量線の確認及び感度変動の管理図による確認
定量操作が適切に行われているかどうかを確認するため、測定担当者は、検量線作成用標準液の測定操作により得られたデータから測定量(毒性等量)を求め、管理図に記録し保存する。
3pM/well 及び 1pM/well 検量線作成用標準液の検量線へのフィッティング値(pM/well)を求め、管理図にプロットする。管理図による処置基準は管理限界(μ±2σ)からの逸脱状況に応じて以下の通りとする。
1 点でも管理限界を超えた場合は、原因の究明と改善を行うとともに、必要に応じ再測定を行う。改善のために講じた措置及び再測定の結果について、記録をする。また、管理限界内であっても基準値に対して、一定の傾向で外れていくような状態又は偏った測定量が続くような状態においては、原因の究明を行い、必要に応じ、改善を行うとともに、再測定する。3pM/well の管理図例を 図 3-4-8 に示す。
3pM/well の実測値
3pM-TeCDD

測定値(pM/well)

3.5

μ+2σ

3

μ
μ-2σ

2.5
0

10

20
プレート№
測定回数

図 3-4-8

3pM/well の管理図例

109

30

5.3 測定試料の定量
1) 5.1 の式に、検量線作成用標準液測定値から計算して得られたパラメーターを代入してプレート毎の検量線近似式を求める。
2) DMSO 校正後の各濃度試料(各試料の希釈列)の発光量平均値を代入してウェル中の 2,3,7,8-TeCDD 換
算濃度を算出する(pM/well)。
3) で得られた濃度に次式から、各濃度試料の実測値を算出する(pg/g、pg/m3N)。
実測値(pg/g、pg/m3N)＝(ウェル中の濃度(pM/well)×125 倍＊×検液の希釈倍率×最終検液量(μl)×322(2,3,7,8-TeCDD 分子量)×10-6)-操作ブランク(pg/最終検液))/試料処理量(pg/g、pg/m3N)＊125 倍：アッセイに添加した試料濃度からウェルに添加するまでに 125 倍の希釈を行っている。

4) 試料の定量値の確定は曝露した各濃度試料のうち、3pM の場合のデータを用いて行う(注 9)。3)で得られた数値のうち、濃度が 3pM/well 前後に相当する 2 点を以下の式に代入し、算出する(注 10)。

𝑦=𝐵−𝐴× 3−𝑏 +𝐵𝑏−𝑎ここで、y：試料の実測値(pg/g、pg/m3N)
a：3pM/well より低濃度側の濃度(pM/well)
A：3pM/well より低濃度側の実測値(pg/g、pg/m3N)
b：3pM/well より高濃度側の濃度(pM/well)
B：3pM/well より高濃度側の実測値(pg/g、pg/m3N)(注 9) 3pM/well 前後に相当する 2 点の希釈濃度試料がない場合は、再度希釈しアッセイを行う。
(注 10) 得られた値の単位は pg/m3N 又は pg/g であるため、ng/m3N 又は ng/g に換算する(備考) 排出ガスの酸素濃度による補正は、次式による。

C=

9
× CS
21 − OS

ここに、C ： 酸素の濃度 On における実測濃度(ng/m3N)
Os： 排出ガス中の酸素の濃度(注 11)(%)
Cs： 排出ガス中の実測濃度(ng/m3N）(注 11) 排出ガス中の酸素の濃度が 20%を超える場合は、Os=20 とする。

６．検出下限及び定量範囲

6.1 標準物質における検出下限及び定量範囲の確認
検出下限等算出用検量線の測定操作により得られた測定量の定量値の変動係数(CV%)が 30％以下となる点を検出下限、20％以下となる上下 2 点間を定量範囲とする。
この標準物質における検出下限及び定量範囲は、尐なくとも 6 ヶ月に 1 回確認する。また、測定条件が大幅に変わった場合(機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等)にも、確認する。
1) 検出下限算出用標準溶液の調製例
2,3,7,8-TeCDD の標準液(DMSO 溶液)を用い、0(DMSO ブランク)、0.1、0.3、0.5、1、3、5、10、30、50、100、150、300pM/well となるように DMSO で希釈を行う。
110

2) 検出下限及び定量範囲の算出例
4.1～5.1 に準じて測定を行い、12 濃度水準の検量線を作成する。ただし、各濃度水準におけるウェル数
は 5 以上とする。ここの RLU について、検量線から濃度(pM/well)を求め、濃度水準ごとに測定量の変動係数を算出し、精度プロファイルを作成する。
変動係数(CV%)が 30％となる点を検出下限、20％となる上下 2 点間を定量範囲とする。濃度水準ごとに5 ウェルで測定した例を図 3-4-9 に示す。
60

検出下限：0.3pM/well(12.1pg/ml)

CV%

40

定量範囲：0.3～50pM/well(12.1～2010pg/ml)

20

各条件を満たす標準液濃度を採用した。
(

0
0.1

1
10
100
STD濃度（pM/well）)内は、標準液(DMSO 溶液)中の濃度

1000

図 3-4-9 精度プロファイルの例

6.2 試料における検出下限及び定量下限
試料における検出下限及び定量下限は、試料と前処理を経た最終検液量の数値と、標準物質における検出下限並びに定量下限から理論的に算出する。試料における検出下限及び定量下限は、試料採取量や最終検液量等により異なってくるため、試料ごとに求める。

７．測定量(毒性等量)への換算
図 3-4-10 に、生物検定法によって測定された濃度の HRGC/HRMS 法によって求めた濃度に対する相関図を示す。現時点で相関図より近似式を求めた結果、排出ガスの場合、ｙ＝0.308x、ばいじん及び燃え殻の場
合、ｙ＝0.356x となっている。したがって、生物検定法で求めた実測濃度(ng/g、ng/m3N)を、排出ガスの場
合、換算係数、ばいじん及び燃え殻の場合、換算係数を乗じて測定量(毒性等量)を求める。なお、測定結果の報告様式については、第２章第２節「測定結果の報告」を参照すること。

８．換算係数の確認
尐なくとも 6 ヶ月に 1 回、HRGC/HRMS 法によって測定された試料について、本測定法による測定を行い、HRGC/HRMS 法により得られた測定量(毒性等量)と本測定法で得られた実測濃度より換算係数を算出し、換算係数と比較する。また、測定条件が大幅に変わった場合(機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等)にも、確認を行う。
試料は、片方について HRGC/HRMS 法に定められた方法により前処理を行い、残りについては生物検定法に定められた方法により前処理を行って試料を調製する。
111

得られた換算係数が第６節の換算係数と大きく換算係数が乖離する場合又は相関が悪い場合には、原因の究明を行い。その結果及び講じた措置を記録する。
排出ガス試料については、JIS K0311 に従い、抽出までを行った抽出試料(ただし、アッセイに影響を及ぼすサンプリングスパイク及び抽出工程でのクリーンアップスパイクの添加は行わない)を分割し、片方は JIS
K0311 に定められた方法により測定量(毒性等量)を求める。残りは本法第 5 節 4.1～4.3 及び 5.3 に従って操作し、それぞれの方法について測定量(毒性等量)を求める。
HRGC/HRMS 法により求めた毒性等量と生物検定法により求めた実測濃度の相関図を作製し、回帰直線の係数を換算係数とする。相関図の例を次節に示す。

112

第６節 参考資料「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(排出ガス試料)」
多数の排出ガス試料(この例では n=54、n=20 以上が望ましい)について本測定方法と HRGC/HRMS 法でそれぞれの実測濃度、毒性等量を求め、HRGC/HRMS 法による毒性等量を本測定方法による実測濃度で除したものの平均値を換算係数とする。
(例)排出ガス試料の換算係数導出の方法
1)

本測定方法による実測濃度を X、HRGC/HRMS 法による毒性等量を Y とし、Y/X を求める。

2)

全試料について Y/X の値を求め、全試料の平均値を計算し、これを換算係数とする(図 3-4-10 では Y/Xの平均値である 0.308 を換算係数とした)「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(ばいじん及び燃え殻試料)」
多 数のばいじ ん及び燃え殻 試料 ( この例では n=41、 n=20 以 上が望ま しい )につい て本測定方 法とHRGC/HRMS 法でそれぞれ実測濃度、毒性等量を求める。HRGC/HRMS 法による毒性等量を本測定方法による実測濃度で除したものの平均値を換算係数とする。
(例)ばいじん及び燃え殻試料の換算係数導出の方法
1)

本測定方法による実測濃度を X、HRGC/HRMS 法による毒性等量を Y とし、Y/X を求める。

2)

全試料について Y/X の値を求め、全試料の平均値を計算し、これを換算係数とする(図 3-4-11 では Y/Xの平均値である 0.356 を換算係数とした)。

ばいじん及び燃え殻試料(n=41)

排ガス試料(n=54)
100

10

y = 0.308 x
2
R = 0.995

毒性等量(ng-TEQ/g)

毒性等量(ng-TEQ/m3 N)

100

1
0.1
0.01
0.001
0.001

0.01

0.1

1

10

100

10
1
0.1
0.01
0.001
0.001

1000

y = 0.356 x
2
R = 0.981

0.01

実測濃度(ng/m3 N）

図 3-4-10

図 3-4-11

換算係数算出(例)(排出ガス)0.1
1
実測濃度(ng/g）

換算係数算出(例)(ばいじん及び燃え殻)

113

10

100

その５

前処理に、多層シリカゲルカラム及びアルミナカラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性組換え細胞 DR-EcoScreen を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 1 の 5)

第１節 測定方法の概要

対象媒体ごとに試料を採取し、ダイオキシン類を抽出後、クリーンアップを行い、ダイオキシン類応答性
組換え細胞 DR-EcoScreen を用いたレポータージーンアッセイによる測定により定量する。測定方法のフローを図 3-5-1 に示す。

試料採取
抽出
クリーンアップ
ダイオキシン類応答性組換え細胞 DR-EcoScreen を用いたレポータージーンアッセイによる測定
ダイオキシン類(実測濃度)の定量
換算係数による測定量(毒性等量)への換算
測定値確定
図 3-5-1 測定方法のフロー

第２節 用語の定義

1)

Ah 受容体Ah Receptor、Arylhydrocarbon Recepto。アリール炭化水素受容体。特異的な細胞外シグナル伝達分子（リガンド）に結合し、細胞の応答するきっかけとなるタンパク質。ダイオキシン類の生体影響の多くは、この受容体と結合することにより引き起こされる。
2)

リガンド

Ligand。タンパク質または他の分子の特異的部位に結合する分子の総称。受容体が鍵穴でリガンドが鍵の関係。両者が結合すると、両者の関係に特異的な信号が発生し生理反応が引き起こされる。
3)

ルシフェラーゼ遺伝子

Luciferase Gene。生物発光反応を触媒する酵素を発現するホタル由来の遺伝子。
4)

CYP1A1

Cytochrome P450。薬物代謝酵素シトクロム P450 類に属する薬物代謝酵素。CYP1A1 は、

ダイオキシン類により誘導されることが知られている。
5)

DRE

Dioxin Responsive Element。ダイオキシン応答配列。ダイオキシン類が特異的に結合する遺伝

子の塩基配列部分。
114

6)

プラスミド

7)

継代培養

Plasmid。小型の環状 DNA 分子のこと。
Subculture。保存培養から微生物あるいは培養細胞の一部を分けて別の新鮮な培地に植え継ぎ、再び培養したもの。
8)

発光基質

生物発光反応の基質。

第３節 試料採取方法に関する特記事項

１．試料ガスの採取量

試料ガスの採取量は、次のような手順によって決定する。採取時間については、その目的に応じて試料ガスの発生状況等を十分考慮して代表試料が採取できるように設定しなければならない。
1)

評価しなければならない最小の濃度を決定する。

2)

特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。

3)

以下の式によって測定に必要な最小の試料ガスの量を算出する。

𝑉=

𝑄𝐷𝐿 × 𝑘 × 𝑣 𝑉𝐸
1
×
×
1000
𝑉′𝐸 𝐶𝐷𝐿

ここに、V：

測定に必要な最小の試料ガスの量（m3N）

QDL ： 標準物質における検出下限（pg/mL, DMSO 溶液中）k：

測定量（毒性等量）への換算係数v：

測定用試料の液量（mL）

VE：

抽出液量（mL）

VE’ ： 抽出液分取量（mL）
CDL ： 必要となる試料ガスにおける検出下限（ng-TEQ/m3N）4)算出された最小の試料ガスの量以上を試料ガスの採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。

（例）5ng-TEQ/m3N レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合（必要となる試料ガスにおける検出下限
は 0.17ng-TEQ/m3N）
抽出液を 10mL に定容し、その抽出液から 5mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に 1mL の測定用試料溶液に調製する場合の試料ガスの採取量を以下に示す。なお、標準物質における検出下限は10pg/mL、排出ガスの測定量への換算係数は 0.2057 を用いた。

𝑉=

10 × 0.2057 × 1 10
1××
= 0.0241000
5 0.17

２．ばいじん及び燃え殻試料の採取量

ばいじん及び燃え殻試料の採取量は、次のような手順によって決定する。
1)

評価しなければならない最小の濃度を決定する。

2)

特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。

3)

以下の式によって測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量を算出する。
115

𝑊=

𝑄𝐷𝐿 × 𝑘 × 𝑣 𝑉𝐸
1
×
×
1000
𝑉′𝐸 𝐶𝐷𝐿

ここに、W：

測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量（g）

QDL ： 標準物質における検出下限（pg/mL, DMSO 溶液中）k：

測定量（毒性等量）への換算係数v：

測定用試料の液量（mL）

VE：

抽出液量（mL）

VE’ ： 抽出液分取量（mL）
CDL ：必要となるばいじん及び燃え殻における検出下限（ng-TEQ/g）4)算出された最小のばいじん及び燃え殻試料の量以上をばいじん及び燃え殻試料の採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。

（例）3 ng-TEQ/g レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合（必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限は 0.1 ng-TEQ/g）
抽出液を 10mL に定容し、その抽出液全量を用いてクリーンアップを行い、最終的に 1mL の測定用試料溶液に調製する場合のばいじん及び燃え殻試料の採取量を以下に示す。なお、標準物質における検出
下限は 10pg/mL、ばいじん及び燃え殻の測定量への換算係数はそれぞれ 0.2759 及び 0.2069 を用いた。

(1) ばいじん𝑊=

10 × 0.2759 × 1 10
1××
= 0.0281000
10 0.1(2) 燃え殻𝑊=

10 × 0.2069 × 1 10
1××
= 0.0201000
10 0.1116

第４節 試料の前処理

１．試料の前処理の概要
採取した試料は、抽出を行う。抽出液は必要に応じて分取を行い、クリーンアップに移る。図 3-5-2 に試料の前処理から測定までのフローの例を示す。

試料
抽出
抽出液
一部分取

（省略可能）

多層シリカゲル／アルミナカラムクロマトグラフ操作
測定用試料
図 3-5-2 試料の前処理から測定までのフローの例

２．試薬

試料の前処理に用いる試薬は、次による。これらの試薬は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
JIS K0557 に規定する A4 (又は A3) の水

1)

水

2)

メタノール

3)

アセトン

JIS K8040 に規定するもの、又は同等の品質のもの

4)

トルエン

JIS K8680 に規定するもの、又は同等の品質のもの

5)ジクロロメタン

6)

ヘキサン

7)

デカン

8)

ジメチルスルホキシド (DMSO)

9)

塩酸JIS K8180 に規定するもの、又は同等の品質のもの

10) 硫酸JIS K8951 に規定するもの、又は同等の品質のもの

11) 硝酸銀

JIS K8891 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8117 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8825 に規定するもの、又は同等の品質のもの

測定に支障のない品質のもの
JIS K9702 に規定するもの、又は同等の品質のもの（注１）

JIS K8550 に規定するもの、又は同等の品質のもの

12) 硫酸ナトリウム

JIS K8987 に規定するもの、又は同等の品質のもの

13) ヘキサン洗浄水

1) の水を 6) のヘキサンで十分洗浄したもの

14) シリカゲル

JIS K0311 6.2 に規定するもの、又は同等の品質のもの
11715) 硫酸（44%質量分率）シリカゲル JIS K0311 6.2 に規定するもの、又は同等の品質のもの
16) 硝酸銀 (20%質量分率) シリカゲル

14) のシリカゲル 100 g に対して 11)の硝酸銀で調製した硝酸銀溶液 (625 g/L) 40 mL を加えた後、ロータリーエバポレータで水分を完全に除去する。硝酸銀シリカゲルは、調製後、密閉できる着色容器に入れ、デシケーター中に保存する。
17) アルミナ

JIS K0311 6.2 に規定するもの、又は同等の品質のもので、本法に適用して良好な結果が得られることが確認されているもの
18) 窒素JIS K1107 に規定する高純度窒素１級19) ガラスウール

JIS K8251 に規定するもの、又は同等の品質のもの

20) ガラス繊維ろ紙

JIS K0311 6.2 に規定するもの、又は同等の品質のもの（注１）ジメチルスルホキシド（DMSO）の品質変動は、測定結果に影響を及ぼすことがあるためロットの変更時等には十分注意する。

３．器具及び装置

試料の前処理に用いる器具及び装置は、次による。これらの器具及び装置は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
3.1

ガラス器具

JIS R3503 及び JIS R3505 に規定するもの。コックの部分がフッ素樹脂製のものを用いてもよい
3.2

高速溶媒抽出装置

ダイオネクス製 ASE-200 又はこれと同等品。ASE 用の器具一式 (セルボディー、セルエンドキャップア
センブリ、溶媒ボトル、捕集ボトルアセンブリ、コンプレッサー等)
3.3

ソックスレー抽出器

JIS R3505 に規定するもの、又はこれと同等の品質のもの。接続部にグリースを使用してはならない
3.4

濃縮器

クデルナ－ダニッシュ(KD)濃縮器又はロータリーエバポレータ。接続部にグリースを使用してはならない。
3.5

多層シリカゲルカラムクロマトグラフ管

内径 14mm、長さ 300mm のガラス製カラムクロマトグラフ管
3.6

アルミナカラムクロマト管

内径 6mm、長さ 50mm のガラス製カラムクロマトグラフ管
3.7

ヒーター

カラムクロマト管を包み込み 100℃程度まで加熱することができるもの
3.8

送液ポンプ

流速の調節が毎分 0.1 ～ 10 mL の範囲内で可能であって、流速の変動が±2%以内のもの

４．前処理操作

4.1

試料量の記録

採取した試料は、試料量を記録する。

118

4.2

抽出

1) 排出ガスJIS K0311 6.4 に準拠し、抽出を行う。ただし、内標準物質の添加は行わない。図 3-5-3 に JISⅡ形装置を用いて採取した排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

吸引プローブ洗液

円筒ろ紙

ダイオアナフィルタろ過
20mmol/g-ダスト以上
発泡がないことを確認

HCL(2mol/L)処理
ろ液

残渣
ろ過・水洗

ろ液・洗液

残渣

乾燥

液-液振とう抽出
ジクロロメタン、3回

高速溶媒抽出*トルエン、2回：検体又は試料
濃縮：作業

定容：物又は試料

粗抽出液＊：高速溶媒抽出をソックスレー抽出（トルエン、16時間以上）に代えることも可能

図 3-5-3 排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例
高速溶媒抽出は下記条件で 2 回行う
溶媒

：

トルエン

加熱

：

7分

静置時間

：

2分

フラッシュ ：

70%

パージ

：

60 秒

サイクル

：

5回

温度

：

150℃

圧力

：

2000psi1192) ばいじん及び燃え殻
平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(2) 又は下記の方法により抽出を行う。ただし、内標
準物質の添加の操作は行わない。図 3-5-4 にばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例を示す。
試料

HCl(2mol/l)処理

20 mmol/g-試料以上発泡がないことを確認

ろ過・水洗

残渣

ろ液・洗液

乾燥

液－液振とう抽出
ジクロロメタン，3 回

高速溶媒抽出＊
トルエン，2 回：検体又は試料

濃縮

：作業

定容
：物又は試料

粗抽出液＊：高速溶媒抽出をソックスレー抽出（トルエン、16時間以上）に代えることも可能

図 3-5-4

ばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例

高速溶媒抽出は下記条件で 2 回行う
溶媒

：

トルエン

加熱

：

7分

静置時間

：

2分

フラッシュ ：

70%

パージ

：

60 秒

サイクル

：

5回

温度

：

150℃

圧力

：

2000psi120

4.3

クリーンアップ

図 3-5-5 にクリーンアップのフローの例を示す。

粗抽出液

一部分取

転溶

ヘキサン

多層シリカゲルカラムに添加
多層シリカゲルカラムを 60 °C 加熱

多層シリカゲルカラムとアルミナカラムを連結

アルミナカラムを乾燥

ヘキサン溶出窒素

DMSO を逆方向に送液し、回収

90 °C 加熱下 DMSO 溶出

測定溶液

図 3-5-5 クリーンアップのフローの例

1) 抽出液の分取(1) 抽出液を分取して一部を測定に使用する場合には、定容した抽出液から目的に合わせて一部を分取する。排出ガスについては 1.0m3N 相当量、ばいじん及び燃え殻については 1.0g 相当量の抽出液を 1回のクリーンアップの目安とする。
(2) あらかじめ、デカン 0.4 mL を入れた受器に適量の抽出液を入れ、ロータリーエバポレータで乾固寸前まで濃縮する。この濃縮液に適当量のヘキサンを加え、ロータリーエバポレータで乾固寸前まで濃縮する。この操作を 3 回程度繰り返し、トルエンを除去する。その後、次に示す多層シリカゲルカラ
ム－アルミナカラム操作によってクリーンアップを行う。
2) 精製カラムの作製(1) 多層シリカゲルカラム
3.4 のカラムクロマトグラフ管の底部にガラスウールを詰め、シリカゲル 2.3g、硫酸（44%質量分率）
シリカゲル 10.4g、シリカゲル 0.2g、硝酸銀（20%質量分率）シリカゲル 3.6g、シリカゲル 1.5g を順次充填する。このカラムを図 3-5-6 に示す。

121

シリカゲル ： 1.5g

硝酸銀 (20%質量分率) シリカゲル ： 3.6g
シリカゲル ： 0.2g

硫酸 (44%質量分率) シリカゲル ： 10.4g

シリカゲル ： 2.3g
ガラスウール ： 適量

図 3-5-6 多層シリカゲルカラムの例(2) アルミナカラム
3.5 のカラムクロマトグラフ管の底部にガラスウールを詰め、アルミナ 1.0g 程度充填し、その上からガラスウールを詰める。このカラムを図 3-5-7 に示す。

ガラスウール ： 適量
アルミナ ： 1.0g
ガラスウール ： 適量

図 3-5-7 アルミナカラムの例

3) クリーンアップ操作(1) 図 3-5-8 に示す様に、2) の(1)多層シリカゲルカラム、(2)アルミナカラムを連結し、多層シリカゲ
ルカラムを構成する上端のシリカゲル、硝酸銀シリカゲル及び硫酸シリカゲルの上半分の部分を覆うようにヒーターをセットする。
(2) 濃縮した試料にヘキサンを加え、多層シリカゲルカラムに添加する。添加する試料の液量は容器の洗液を合わせて最大 5mL までとする。
(3) ヒーターにより 60℃で 10 分間カラムを加熱する。
122

(4) 60℃加熱下、ヘキサン 85 mL を送液 (2.5 mL/min) する。

ヒーター

ヘキサン送液(60℃加熱)多層シリカゲルカラム

接続アダプター

図 3-5-8 多層シリカゲルカラムとアルミナカラムの組み立て例

4) 溶媒置換及び測定用試料の保存(1) 3) の(4)の操作後、アルミナカラムに窒素を通じ、ヘキサンを除去する。
(2) アルミナカラムを包み込むようにヒーターをセットし、90℃で 10 分間加熱する。
(3) 90℃加熱下、3) の(4)のヘキサンの送液方向とは逆方向に、即ちアルミナカラム下端側から DMSO
2.5mL を送液 (2.5mL/min) し、上端側から溶出する DMSO 溶液約 1mL を予め秤量済みのバイア
ル瓶に回収する。図 3-5-9 にアルミナカラムを反転させない場合の操作例を示した。
(4) 回収後、バイアル瓶を秤量し、密栓後、室温で暗所に保存する。秤量の差分を DMSO 定容量とする。

123

アダプター

ヒーター (90℃加熱)

バイアル瓶

アルミナカラムDMSO 送液

図 3-5-9 アルミナカラムを反転させない場合の DMSO への置換操作の例

第５節 測定１．測定の概要
本方法は、ダイオキシン類応答性組換え細胞 DR－EcoScreen を用いて、試料中に含まれるダイオキシン類が細胞内の Ah 受容体と結合することに由来して発現するルシフェラーゼの活性に基づく発光量を発光光度計で測定することによりダイオキシン類の毒性等量を測定する方法である。
2,3,7,8-TeCDD を用いて検量線を作成し、試料の発光量から算出した実測濃度に排出ガス、ばいじん及び
燃え殻について定められた換算係数を乗じることにより、測定量（毒性等量）を算出する。

２. 試薬、器具及び装置

2.1 使用細胞
ダイオキシン類応答性組換え細胞 DR－EcoScreen：レポーター遺伝子としてホタルのルシフェラーゼ遺伝子を用い、その上流域に生体異物応答配列ＸＲＥを７個持つマウスのシトクロム P450（CYP1A1）プロモー
ターを配置したプラスミド pIND－GCDR7 を、マウス肝がん細胞由来 Hepa－1c1c7 に導入したもの(注 1)。
（注 1）引用文献：S. Takeuchi, et al., In vitro screening for aryl hydrocarbon receptor agonistic activity in 200 pesticides
using a highly sensitive reporter cell line, DR-EcoScreen cells, and in vivo mouse liver cytochrome P450-1A
induction by propanil, diuron and linuron. Chemosphere, 74:155-165 (2008)

2.2 試薬測定に用いる試薬は、次による。
1)培地（MEM）

炭酸水素ナトリウム含有、L-グルタミン不含、滅菌及びエンドトキシンテスト済、

冷蔵保存
56℃、30 分間非働化処理済、-20℃凍結保存

2)

Fetal Bovine Serum（FBS）

3)

L-グルタミン

4)

ペニシリン・ストレプトマイシン

200mM、滅菌及びエンドトキシンテスト済、0℃以下保存
10000units ペニシリン・10mg/mL ストレプトマイシン、滅菌及びエンドトキシンテスト済、0℃以下保存

124

5)

Hygromycin B

6)継代用培養液滅菌済、原液濃度 50mg/mL、冷蔵保存
1)の 500mL、2)の 25mL、3)の 10mL、4)の 5mL、5)の 1.5mL を混合したもの、冷蔵保存
1)の 500mL、2)の 25mL、3)の 10mL、4)の 5mL を混合したもの、冷蔵保存

7)

アッセイ用培養液

8)

ルシフェラーゼアッセイキット

9)

標準物質

10) 炭酸ガス

ホモジニアス長時間発光タイプ

2,3,7,8-TeCDD（50g/mL DMSO）
CO2 99.5%
JIS K9702 に規定するもの、又は同等の品質のもの（注 2）11) ジメチルスルホキシド（DMSO）

0.25% トリプシン／1mM EDTA 溶液

12) トリプシン/EDTA 溶液
13) トリパンブルー液

0.4% 溶液14) 細胞凍結用保存液

培地 34mL に DMSO 6mL 加え、シリンジフィルタ（孔径 0.2m）を用い、ろ過滅菌を行ったもの（注 2） ジメチルスルホキシド（DMSO）の品質変動は、測定結果に影響を及ぼすことがあるためロットの変更時には十分注意する。

2.3 器具及び装置
測定に用いる器具及び装置は、次による。
96 ウェル平底、白色プレート、滅菌済のもの

1)

培養マイクロプレート

2)

2

培養フラスコ（25 cm ）

3)

ピペット

4)

遠心管（コニカルチューブ）5)

マイクロピペット用滅菌チップ

6)

マイクロピペット用チップ

7)

マイクロピペット8)12 あるいは８チャンネルマイクロピペット

9)

ピペットエイド

滅菌済のもの10mL 及び 5mL、滅菌済のもの
ポリプロピレン製、50mL 及び 15mL、滅菌済のもの
200L、1000L、滅菌済のもの

200L20L、200l、1000L10) 安全キャビネット

クラスⅡA タイプ

11) インキュベーター

37℃恒温、飽和湿度、5%CO212) ヒートブロック
13) 遠心分離機

100×g で遠心分離できるもの

14) 試験管ミキサー
15) 血球計算盤
16) 光学顕微鏡
17) カウンター
12×75mm、ポリスチレン製、滅菌済みのもの

18) ラウンドチューブ

19) マイクロプレートミキサー
20) ルミノメーター

マルチウェル発光プレートリーダー

21) 細胞凍結保存用バイアル22) ディープフリーザー

滅菌済みのもの–80℃

23) リザーバー

125３．細胞の取り扱い

3.1 培養細胞の起眠
1)

凍結保管箱からダイオキシン類応答性組換え細胞 Hepa1c1c7 の入った凍結保存用バイアルを取り出し、37℃で解凍する。

2)

15mL 遠心管にバイアルの内容物と継代用培養液 5mL を混和し（注 3）、遠心分離機を用いて 100xgで遠心する。

3)

上清を捨て、沈降した細胞に培養液 10mL を加えて混和し、培養フラスコに移す（注 3）。

4)培養フラスコをインキュベーターに入れ、5 時間程度培養する。

5)

培養フラスコをインキュベーターから取り出し、培養液を取り除き、新しい継代用培養液を５mL 加
えた（注 3）後、インキュベーターに入れ、２～３日間培養する。

6)

継代操作を繰り返し、細胞が安定して増殖するようになりに、細胞に異常がないことを確認した上で測定に使用する。

（注 3） 安全キャビネット又はクリーンベンチ内で無菌的に操作する。

3.2 細胞の継代
1)

培養フラスコをインキュベーターから取り出し継代用培養液を取り除く。トリプシン/EDTA 溶液を
2mL 分注し混和する（注 4）。培養フラスコをインキュベーターに５分間入れる。

2)

培養フラスコをインキュベーターから取り出し、継代用培養液を 10mL 加え混和する。シャーレの底面に張り付いている細胞をピペッティングで剥がして 15mL 遠心管に移す（注 4）。

3)遠心管を遠心分離機に入れ、４℃、100×g で５分間遠心分離操作を行う。

4)

上澄み液を廃棄し、残ったペレット状の細胞に継代用培養液を適量加えてピペッティングし、懸濁液を作製する（注 4）。

5)

懸濁液の一部を試験管に移し、等量のトリパンブルー液を加えて混和する。

6)

懸濁液を血球計算盤に適量分注し、顕微鏡で細胞数をカウントして懸濁液の濃度（cells/mL）を計算する。

7)

懸濁液を継代用培養液で希釈して 100,000 cells/mL になるようにする。なお、培養マイクロプレー
トに播種する場合には、懸濁液をアッセイ用培養液で希釈する（注 4）。

8)

継代用培養液で希釈後の懸濁液 5mL を培養フラスコに入れ、インキュベーター内で３～４日間培養する。

9)細胞の継代操作は起眠後 25 回までを目安として使用する。

10) 細胞の継代中および培養中に、停電などにより測定結果に影響を与える可能性があると試験責任者が判断した場合には、その細胞を破棄する。
（注 4） 安全キャビネット又はクリーンベンチ内で無菌的に操作する。

3.3 細胞の保存下記に細胞保存の例を記載する。
1)

3.2 の 1)～6)の方法で細胞懸濁液を調製する。

2)

細胞懸濁液を遠心管に移し（注 5）、遠心分離機に入れ、1000 rpm で５分間遠心分離操作を行う。

3)

上澄み液を廃棄し、残ったペレット状の細胞に細胞凍結用保存液を加えてピペッティングし、細胞懸
濁液の濃度が 2.0×106 cells/mL 程度になるように調製する（注 5）。
126

4)

凍結保存用バイアルに 1mL ずつ分注（注 5）して、ディープフリーザー（-80℃）に入れて保存する。

（注 5） 安全キャビネット又はクリーンベンチ内で無菌的に操作する

４．測定操作

4.1 細胞のマイクロプレートへの播種
1)3.2 の 7)で調製した懸濁液を培養マイクロプレートの各ウェルに 90L ずつ分注する。目安として、およそ培養フラスコ１個からプレート５枚作成が可能である。

2)

培養マイクロプレートをインキュベーターに入れ、24 時間培養する。

4.2 曝露1)

測定値が定量範囲内に入るよう必要に応じて、第 4 節 4.3 の 4)で調製した測定用試料に DMSO を加えて希釈系列試料を作製する（表 3-5-1）（注 6）。

2)

ブランク溶媒、検量線作成用 2,3,7,8-TeCDD 標準液（STD：濃度調製例 10、20、30、50、100、200、300、500、1000 pg/mL）、及び 1)で作製した希釈系列試料を試験管内でアッセイ用培養液を用いて10 倍希釈し、測定用試料液を調製する（注 6）。

3)

24 時間培養した培養マイクロプレートをインキュベーターから取り出し、2)で調製したブランク溶
媒、STD、希釈系列試料の測定用試料を培養マイクロプレートの各ウェルに 10L ずつ、３つのウェルに分注する（図 3-5-10）。同一操作で扱う培養マイクロプレートが複数枚ある場合には、それらを１つのバッチとして扱い、バッチごとに STD 希釈列試料を入れる（注 6）。

4)培養マイクロプレートをインキュベーターに入れ、24 時間曝露する。

（注 6） 安全キャビネット内で無菌的に操作する

表 3-5-1 試料希釈の例
１倍試料、５倍希釈試料、25 倍希釈試料、125 倍希釈試料、625 倍希釈試料を作製する際の調製例
試料

希釈元

分取量（L）

DMSO 分注量（L）

１倍試料

１倍試料

－

0

５倍希釈試料

１倍試料

20

80

25 倍希釈試料

５倍希釈試料2080125 倍希釈試料

25 倍希釈試料

2080625 倍希釈試料

125 倍希釈試料

20

80

127

BlankSTD 10STD 20

STD 30STD 50

STD 100

STD 200

STD 300

STD 500

STD1000

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

A (×625)

A (×125)

A (×25)A (×5)

A (×1)

B (×625)

B (×125)

B (×25)

B (×5)

B (×1)

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

〃

図 3-5-10

96 ウェルプレート上での試料の配置例（注 7）（注 7）プレートの外周部分のウェルウェルは、培養中に培養液の蒸発等の影響を受けやすいため、PBS(-) 0.1mL を添加し原則として定量には使用しない。

4.3 ルシフェラーゼ活性の測定
1) 曝露が終わった培養マイクロプレートをインキュベーターから取り出し、各ウェルに細胞溶解液と酵
素基質を含むホモジニアス長時間発光タイプのルシフェラーゼアッセイ試薬を一定量添加する。
2) 培養マイクロプレートをマイクロプレートミキサーにセットし、一定時間撹拌する。
3) 培養マイクロプレートをルミノメーターにセットし、１秒間の RLU を測定する。

５．定量

5.1 検量線の作成
1) STD である 2,3,7,8-TeCDD 濃度（X）及びルミノメーターで測定した RLU（Y）をプロットし、用量反応曲線を作成し、細胞の反応性を確認する。一例を図 3-5-11 に示す。
2) 直線性を示す STD 20～100 pg/mL の範囲の点（20, 30, 50, 100 pg/mL）を用いて一次回帰式による検量線を作成する。定量はこの濃度範囲内で行う。一例を図 3-5-12 に示す。

128

160000
140000

ルシフェラーゼ活性（発光量）

120000100000
80000
60000
40000
20000
0
0

100

200

300

400

500

600

700

800

900 1000

TCDD濃度（pg/ml）

図 3-5-11

2,3,7,8-TeCDD（STD）の用量反応曲線の一例

80000
70000
y = 656.8x + 8814
R 2 = 0.9974

ルシフェラーゼ活性（発光量）

60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
0

20

40

60

80

100

120

TCDD濃度（pg/ml）

図 3-5-12

2,3,7,8-TeCDD（STD）による検量線の一例

5.2 検量線の確認及び感度変動の管理図による確認
定量操作が適切に行われているかどうかを確認するため、測定担当者は、検量線作成用標準液の測定操作により得られたデータから、測定量（毒性等量）を求め、管理図に記録し保存する。管理図による処置基準
は、管理限界（２σ）からの逸脱状況及び図の傾向等に応じて下記の通りとする（：工程平均、σ：測定
量（毒性等量）の標準偏差）。
データが１点でも管理限界を超えた場合は、原因の究明と改善を行うとともに、再測定する。改善のために講じた措置及び再測定の結果について記録をする。また、管理限界内であっても基準値に対して、一定の129

傾向で外れていくような状態又は偏った測定値が続くような状態においては、原因の究明を行い、必要に応じ、改善を行うとともに、再測定する。
5.1 により作成した検量線の 50 pg/mL の点の検量線による換算値（pg/mL）を算出し、管理図にプロットする。一例を図 3-5-13 に示す。
65

2,3,7,8-TeCDD （pg/ml）

6055
μ ＋２ σμ50

μ －２ σ

45

40

35
0

5

10

15

20

25

30

測定回数 （回）図 3-5-13

管理図の例

5.3 測定試料の定量
1) ルミノメーターで測定した試料の発光量（RLU）を検量線の回帰式に代入し、測定試料の定量を行う。
2) 検量線の定量範囲内にある発光量（RLU）のうち、試料の希釈倍率と定量データの間に良好な直線関係が得られる希釈段階（最低 3 点で判断）について、定量データに希釈倍率を乗じて実測濃度（測定用試料あたり）を求める。
3) 2)で求めた実測濃度（測定用試料あたり）について、抽出に供した実試料及びクリーンアップ、測定に供した試料試料の分取割合等から単位測定試料量あたりの実測濃度を算出する。
4) 試料希釈列の全ての発光量（RLU）が検量線の定量範囲から外れた場合、試料の希釈倍率を再度調製した上で測定を行う。

（備考）排出ガスの酸素濃度による補正は、次式による。

𝐶=

9
× 𝐶𝑆
21 − 𝑂𝑆

ここに、

C ：酸素の濃度 On における実測濃度（ng/m3N）
Os ：排出ガス中の酸素の濃度（注４）（％）
Cs：排出ガス中の実測濃度（ng/m3N）（注４）排出ガス中の酸素の濃度が 20％を超える場合には、Os=20 とする。

130

６．検出下限及び定量範囲

6.1 標準物質における検出下限及び定量範囲
第２章各論（生物検定法に共通する事項）第 3 節では、非線形検量線を対象とした「原則として、検出下限等算出用検量線の測定操作により得られた測定値（毒性等量）の定量値の変動係数（CV%）が 30%以下となる点を検出下限、20%以下となる点を定量下限とする」としているが、本方法では、線形検量線を使用するため、本マニュアル第２章第３節に記載の通り、上記算出方法を誘導する際の元となった方法「測定値の標準偏差を検量線の傾きで割った数値を求め、その 3.3 倍に相当する標準物質濃度を検出下限、10 倍に相当
する標準物質濃度を定量下限とする」により検出下限及び定量下限を求め、検量線が直線となる最大濃度（通常 100 pg/mL）迄を定量範囲とする。
この標準物質における検出下限及び定量範囲は、尐なくとも 6 ヶ月に１回十分な性能が得られていることを確認する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認する。
1) 検出下限等算出用標準溶液の調製例,3,7,8-TeCDD 標準溶液を DMSO で希釈し、検出下限等算出用標準溶液を調製する。
調製濃度の例：ブランク（DMSO）、10、20、30 pg/mL2) 検出下限及び定量範囲の算出例(1) 1)で調製した検出下限等算出用標準溶液を n=5 以上で測定し、濃度とブランク RLU を差し引いた RLU
から、直線回帰検量線を作成する。検出下限等算出用検量線の例を図 3-5-14 に示す。
(2) ブランクの各測定値（RLU）の平均値と標準偏差を算出する。
(3) （2）で求めた標準偏差を、（1）で求めた検量線の傾きで割る。
(4) （3）で得られた数値の 3.3 倍に相当する標準物質濃度を検出下限、10 倍に相当する標準物質濃度を定量下限とし、検量線に直線性の認められる範囲（通常約 100pg/mL）までを定量範囲とする。算出例を表 3-5-2 に示す。

表 3-5-2 検出下限及び定量下限の算出例
11503

ブランク（DMSO）の RLU
標準偏差
11115
11615
11985
12228
432
検量線回帰式：RLU=599×2,3,7,8,-TeCDD （R2=0.966）
検出下限＝432÷599×3.3 = 2.4 pg/mL
定量下限＝432÷599×10 = 7.2 pg/mL

131

傾き
599

2500020000
y = 599.01x
R² = 0.9659

RLU

15000

10000

5000

0
0

10
20
30
2,3,7,8-TeCDD （pg/ml）
図 3-5-1440

検出下限等算出用検量線の一例

3) 実運用上における検出下限及び定量下限
上記の計算を用いた検出下限及び定量下限の値は測定機器の安定性が高い場合にはかなり低い数値として計算される場合がある。しかし現実の運用上は測定機器の分解能等から考え、標準物質の測定値がブ
ランクの測定値に対し 1.5 倍以上の RLU を与える濃度以上で定量することが望ましい。現状の測定系で実際に使用している検出下限及び定量下限を表 3-5-3 に示す。
表 3-5-3 標準物質における検出下限及び定量下限の実運用例
検出下限
0.01 pg/well

定量下限
10 pg/mL

0.02 pg/well

20 pg/mL

6.2 試料における検出下限及び定量下限
試料における検出下限及び定量下限は、試料量と前処理を経た最終検液量の数値と、標準物質における運用上の検出下限及び定量下限から理論的に算出する。試料における検出下限及び定量下限は、試料採取量や最終検液量等により異なってくるため、試料ごとに求める。
表 3-5-4 試料における検出下限算出例（排出ガス）
バイオアッセイ

試料調製

測定媒体

検出下限
pg/well

1 well 中
試料量
L/well

採取量
m3N

酸素濃度
％

排出ガス

0.01

1

4

12

132

分取液量
／
抽出液量
mL/mL
5/10

媒体中濃度
最終
定容量
mL

希釈
倍率

実測濃度
ng/m3N

1

1

0.005

表 3-5-5 試料における検出下限算出例（ばいじん）
バイオアッセイ

試料調製

測定媒体

検出下限
pg/well

1 well 中
試料量
L/well

採取量
g

固形分
％

排出ガス

0.01

1

5

100

分取液量
／
抽出液量
mL/mL
10/10

媒体中濃度
最終
定容量
mL

希釈
倍率

実測濃度
ng/g

1

1

0.002

最終
定容量
mL

希釈
倍率

実測濃度
ng/g

1

1

0.002

表 3-5-6 試料における検出下限算出例（燃え殻）バイオアッセイ

試料調製

測定媒体

検出下限
pg/well

1 well 中
試料量
L/well

採取量
g

固形分
％

排出ガス

0.01

1

5

100

分取液量
／
抽出液量
mL/mL
10/10

媒体中濃度

表 3-5-7 試料における定量下限算出例（排出ガス）
バイオアッセイ

試料調製

測定媒体

検出下限
pg/well

1 well 中
試料量
L/well

採取量
m3N

酸素濃度
％

排出ガス

0.02

1

4

12

分取液量
／
抽出液量
mL/mL
5/10

媒体中濃度
最終
定容量
mL

希釈
倍率

実測濃度
ng/m3N1

1

0.01

表 3-5-8 試料における定量下限算出例（ばいじん）
バイオアッセイ

試料調製

測定媒体

検出下限
pg/well

1 well 中
試料量
L/well

採取量
g

固形分
％

排出ガス

0.02

1

5

100

分取液量
／
抽出液量
mL/mL
10/10

媒体中濃度
最終
定容量
mL

希釈
倍率

実測濃度
ng/g

1

1

0.004

表 3-5-9 試料における定量下限算出例（燃え殻）バイオアッセイ

試料調製

測定媒体

検出下限
pg/well

1 well 中
試料量
L/well

採取量
g

固形分
％

排出ガス

0.02

1

5

100

分取液量
／
抽出液量
mL/mL
10/10

媒体中濃度
最終
定容量
mL

希釈
倍率

実測濃度
ng/g

1

1

0.004

７．測定量（毒性等量）への換算5.3 で求めた実測濃度に排出ガス、ばいじん及び燃え殻ともに換算係数を乗じることで測定量（毒性等量）に換算する。なお、測定結果の報告様式については、第２章第２節「測定結果の報告」を参照すること。

133

８．換算係数の確認

尐なくとも６ケ月に１回、HRGC/HRMS 法によって測定された試料について、本測定法による測定を行い、HRGC/HRMS 法により得られた測定値（毒性等量）と本測定法で得られた実測濃度より換算係数を算出し、換算係数と比較する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬または施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認を行う。得られた換算係数が、第６節記載の換算係数と大きく換算係数が乖離する場合または相関が悪い場合には、原因の究明を行い、その結果及び講じた措置を記録する。
試料は、片方について HRGC/HRMS 法に定められた方法により前処理を行い、残りについては生物検定法に定められた方法により前処理を行って試料を調製する。
排出ガス試料については、JIS K0311 に従い抽出までを行った抽出試料（ただし、アッセイに影響を及ぼすサンプリングスパイク及び抽出工程でのクリーンアップスパイクの添加は行わない）を分割し、片方は JIS
K0311 に定められた方法により測定量（毒性等量）を求め、残りは、本法 4.1～4.3 及び 5.3 に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を算出する。
ばいじん及び燃え殻については、平成４年厚生省告示第 192 号別表第一（第一号関係）（２）に準拠した方法（ただし、同表ウ（イ）の内標準物質の添加の操作は行わない）により測定値（毒性等量）を求め、残りは、本法 4.1～4.3 及び 5.3 に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を算出する。

134

第６節 参考資料「実測濃度から測定量（毒性等量）を求める際の換算係数の導出について（排出ガス試料）」
多数の排出ガス試料（この例では n=31。n=20 以上が望ましい）について本測定方法と HRGC/HRMS 法でそれぞれ実測濃度、毒性等量を求める。HRGC/HRMS 法による毒性等量を本測定方法による実測濃度で除したものの平均値を換算係数とする。
（例）排出ガス試料の換算係数導出の方法
1) 本測定方法による実測濃度を X、HRGC/HRMS 法による毒性等量を Y とし、Y/X を求める。
2) 全試料について Y/X の値を求め、全試料の平均値を計算し、これを換算係数とする（図 3-5-15 では Y/Xの平均値である 0.2057 を換算係数とした）。

HRGC/HRMS測定値（ng-TEQ/m3N）14
y = 0.2057x
R2 = 0.8864

12
10
8
6
4

n = 31
2
0
0

10

20

30

40

50

60

70

実測濃度（ng/m3N）

図 3-5-15

換算係数算出例（排出ガス）「実測濃度から測定量（毒性等量）を求める際の換算係数の導出について（ばいじん試料）」
多数のばいじん試料（この例では n=20。n=20 以上が望ましい）について本測定方法と HRGC/HRMS 法でそれぞれ実測濃度、毒性等量を求める。HRGC/HRMS 法による毒性等量を本測定方法による実測濃度で除したものの平均値を換算係数とする。
（例）ばいじん試料の換算係数導出の方法
1) 本測定方法による実測濃度を X、HRGC/HRMS 法による毒性等量を Y とし、Y/X を求める。
2) 全試料について Y/X の値を求め、全試料の平均値を計算し、これを換算係数とする（図 3-5-16 では Y/Xの平均値である 0.2759 を換算係数とした）。

「実測濃度から測定量（毒性等量）を求める際の換算係数の導出について（燃え殻試料）」
多数の燃え殻試料（この例では n=24。n=20 以上が望ましい）について本測定方法と HRGC/HRMS 法でそれぞれ実測濃度、毒性等量を求める。HRGC/HRMS 法による毒性等量を本測定方法による実測濃度で除したものの平均値を換算係数とする。

135

（例）燃え殻試料の換算係数導出の方法
1) 本測定方法による実測濃度を X、HRGC/HRMS 法による毒性等量を Y とし、Y/X を求める。
2) 全試料について Y/X の値を求め、全試料の平均値を計算し、これを換算係数とする（図 3-5-16 では Y/Xの平均値である 0.2069 を換算係数とした）
。

ばいじん

燃え殻
9

10
y = 0.2759x
R2 = 0.9219

8HRGC/HRMS測定値（ng-TEQ/g）

HRGC/HRMS測定値（ng-TEQ/g）

9
8
7
6
5
4
3

n = 202

y = 0.2069x
R2 = 0.919

7
6
5
4
3

n = 24

2
1

1

0

0
0

5

10

15
20
25
実測濃度（ng/g）

図 3-5-16

30

0

35

5

10

15
20
25
30
実測濃度（ng/g）

換算係数算出例（ばいじん及び燃え殻）

136

35

40

45

その６

前処理に、硫酸及び多層シリカゲルカラムを使用し、測定に、ダイオキシン類、アリール炭化水素

受容体及びアリール炭化水素受容体核運搬タンパク質の複合体形成反応を利用してダイオキシン類の毒性等
量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 1 の 6)

第１節 測定方法の概要

対象媒体ごとに試料を採取し、ダイオキシン類を抽出後、クリーンアップを行い、抗アリール炭化水素受容体（Ah 受容体）複合体ポリクローナル抗体を用いた間接競合酵素免疫測定法による測定を行い、定量化する。測定方法のフローを図 3-6-1 に示す。

試料採取
抽出
クリーンアップ
抗 Ah 受容体複合体ポリクローナル抗体を用いた間接競合酵素免疫測定法による測定
ダイオキシン類(実測濃度)の定量
換算係数による測定量(毒性等量)への換算
測定値確定
図 3-6-1 測定方法のフロー

第２節 用語の定義

1) サイトソル

ここではモルモット（guinea pig）等の肝細胞抽出精製液を指す。

2) Ah 受容体

Arylhydrocarbon Receptor。アリール炭化水素受容体、特異的な細胞外シグナル伝達分子(リガンド)に結合し、細胞の応答するきっかけとなるタンパク質。ダイオキシン類の生体影響の多くは、この受容体と結合することにより引き起こされる。
3) ARNT

Arylhydrocarbon Receptor Nuclear Translocator,

Ah 受容体がリガンドと結合する際、複合体を形成する役割を担うタンパク質。
4) DRE Dioxin Responsive Element。ダイオキシン応答配列。ダイオキシン類が特異的に結合する遺伝
子の塩基配列部分。
5) AB1 抗体

ダイオキシン類との Ah 受容体複合体を認識する抗体。

6) AB2 抗体

AB1 を認識する抗体。

7) DEQ

Dioxion Equivalent Quantity。本測定法で標準物質(2,3,7,8-TeCDD)を用いて定量した実測値。

137

第３節 試料採取方法に関する特記事項

１．試料ガスの採取量

試料ガスの採取量は、次のような手順によって決定する。採取時間については、その目的に応じて試料ガスの発生状況等を十分考慮して代表試料が採取できるようにしなければならない。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小の試料ガスの量を算出する。

𝑉=

𝑄𝐷𝐿 × 𝑘
1
𝑉𝐶
𝑉𝐸
×
×
×
1000
𝐶𝐷𝐿 𝑉′𝐶 𝑉′𝐸

ここに、

V

: 測定に必要な最小の試料ガスの量(m3N)

QDL： 標準物質における検出下限(pgDEQ/ウエル)k： 測定量(毒性等量)への換算係数

CDL： 必要となる試料ガスにおける検出下限(ng-TEQ/m3N)

Ｖc： 作成した最終試料 DMSO 量(μL)

V 'C： １ウエルに添加する最終試料 DMSO 量(μL)

VE： 抽出液量(mL)

V 'E： 抽出液分取量(mL)4) 算出された最小の試料ガスの量以上を試料ガスの採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例)

0.1 ng-TEQ/m3N レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となる試料ガスにおける検出下限は、0.0033ng-TEQ/m3N)
抽出液を 50 mL に定容し、その抽出液から 25 mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に
40 μL の測定用試料 DMSO 溶液に調製する場合の排出ガスの試料採取量を以下に示す。
なお、標準物質における検出下限は 1 pgDEQ/ウエル、１ウエルに添加する測定用試料 DMSO 量
は 2μL、排出ガスの測定量への換算係数は 0.0494 (TEQ/DEQ)を用いた。ここで、通常、1 回の測定で必要とする最小測定用試料 DMSO 量は 2 ウエル分の 4 μL(2 μL/ウエル×2 ウエル)であるが、精度および操作性の観点から、余裕を見てその 10 倍量である 40 μL 程度を作成しておくものとした。

QDL：標準物質における検出下限

1 pgDEQ/ウエル

CDL：必要となる試料ガスにおける検出下限

0.0033 ng-TEQ/m3N(= 0.1/30)k：測定量(毒性等量)への換算係数

0.0494 (TEQ/DEQ)

VC：作成した測定用試料 DMSO 量

40μL

V’C

：１ウエルに添加する測定用試料ＤＭＳＯ量

2μL

VE

： 抽出液量50 mL

V’E： 抽出液分取量

25 mL

𝑉=

1 × 0.0494
1
40 50
×
×
×
= 0.59 m3 N
1000
0.0033 2 25
138

２．ばいじん及び燃え殻試料の採取量

ばいじん及び燃え殻試料の採取量は、次のような手順によって決定する。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量を算出する。

𝑊=

𝑄𝐷𝐿 × 𝑘
1
𝑉𝐶
𝑉𝐸
×
×
×
1000
𝐶𝐷𝐿 𝑉′𝐶 𝑉′𝐸

ここに、

Ｗ

： 測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量(g)QDL： 標準物質における検出下限(pgDEQ/ウエル)k： 測定量(毒性等量)への換算係数

CDL：必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限(ng-TEQ/g)

VC： 作成した最終試料 DMSO 量(μL )V’C： １ウエルに添加する最終試料 DMSO 量(μL )VE： 抽出液量(mL)

V’E： 抽出液分取量(mL)4) 算出された最小のばいじん及び燃え殻試料の量以上をばいじん及び燃え殻試料の採取量とする。
ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例)

1 ng-TEQ/g レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限は、0.033ng-TEQ/g)
抽出液を 50 mL に定容し、その抽出液から 25 mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に
40 μL の測定用試料 DMSO 溶液に調製する場合のばいじん及び燃え殻試料の採取量を以下に示す。
なお、標準物質における検出下限は、1 pgDEQ/ウエル、１ウエルに添加する測定用試料 DMSO 量
は、2μL、ばいじん及び燃え殻の測定量への換算係数は、0.0523(TEQ/DEQ)を用いた。ここで、通常、1 回の測定で必要とする最小測定用試料 DMSO 量は 2 ウエル分の 4 μL(2 μL/ウエル×2 ウエル)であるが、精度および操作性の観点から、余裕を見て、その 10 倍量である 40 μL 程度を作成しておくもの
とした。

W

QDL

：標準物質における検出下限

1 pgDEQ/ウエル

CDL：必要となる試料ガスにおける検出下限

0.033 ng-TEQ/g(=1/30)k：測定量(毒性等量)への換算係数

0.0523 (TEQ/DEQ)

VC：作成した測定用試料 DMSO 量

40μL

V’C

：１ウエルに添加する測定用試料 DMSO 量

2 μL

VE

： 抽出液量50 mL

V’E： 抽出液分取量25 mL

1 0.0523
1
40 50

 
 0.063 g
1000
0.033 2 25

139

第４節 試料の前処理

１． 試料の前処理の概要
採取した試料は、抽出を行う。抽出液は必要に応じて分取を行い、クリーンアップに移る。図 3-6-2 に試料の抽出から測定用試料作成までの前処理のフローの例を示す。

試料
抽出

抽出液
一部分取

（省略可能）

硫酸処理
多層シリカゲルカラムクロマトグラフ操作
測定用試料
図 3-6-2 試料の抽出から測定用試料作成までのフロー

２． 試薬

試料の前処理に用いる試薬は、次による。これらの試薬は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
JIS K0557 に規定する A4(又は A3)の水、又は同等の品質のもの

1)

水

2)

メタノール

3)

アセトン

JIS K8040 に規定するもの、又は同等の品質のもの

4)

トルエン

JIS K 8680 に規定するもの、又は同等の品質のもの

5)ジクロロメタン

6)

ヘキサン

7)

ジメチルスルホキシド(DMSO) JIS K9702 に規定するもの、又は同等の品質のもの

8)

硫酸ナトリウム

9)

硫酸

JIS K8891 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8117 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8825 に規定するもの、又は同等の品質のもの
JIS K8987 に規定するもの

JIS K8951 に規定するもの、又は同等の品質のもの

10) 多層シリカゲルカラム
下記のシリカゲルを充填した多層シリカゲルカラム、又は同等の品質のもの

140

表 3-6-1 多層シリカゲルカラムの構成例(カラム上段から)種類
無水硫酸ナトリウム
10％ 硝酸銀シリカゲル
シリカゲル
44％ 硫酸シリカゲル
シリカゲル11) ろ紙グレード
残留農薬・ＰＣＢ試験用
ダイオキシン類測定用
ＰＣＢ分析用ダイオキシン類測定用
ＰＣＢ分析用

充填量
3g
1g
0.2 g
6g
0.2 g

抽出に用いる。ガラス製又は石英製で、必要量の風乾した試料が入るサイズのもの。使用に先立ってアセトン洗浄し、さらにトルエン等でソックスレー抽出を行うか、又は 450℃以上で 4 時間以上加熱処理して用いるとよい。
12) 窒素 JIS K1107 に規定する高純度窒素 2 級

３． 器具及び装置

試料の前処理に用いる器具及び装置は、次による。これらの器具及び装置は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
3.1

ガラス器具
JIS R3503 及び JIS R3505 に規定するもの。コックの部分がふっ素樹脂製のものを用いてもよい。

3.2

高速溶媒抽出装置(ASE 抽出装置)
ダイオネクス製 ASE-300 又は同等品。ASE 用の器具一式(セルボディー、セルエンドキャップアセンブ
リー、溶媒ボトル、捕集ボトルアセンブリー、コンプレッサー等)

3.3 濃縮器
クデルナ-ダニッシュ(KD)濃縮器、ロータリーエバポレータ又は遠心エバポレータ。接続部にグリースを使用してはならない。
3.4 ターボバップ
窒素気流による濃縮装置
3.5 試験管濃縮装置
窒素気流下により試験管内の有機溶媒を気化させる装置
3.6 その他
吸引ポンプ、最高使用圧力が 0.25MPa の真空ポンプ、又は同等の性能を有するもの

141

４． 前処理操作

試料量の記録4.1

採取した試料は、試料量を記録する。
抽出

4.2
1)

排出ガス
JIS K0311 6.4 により、抽出を行う。ただし、内標準物質の添加は行わない。

2)

ばいじん及び燃え殻
平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(2)又は下記の方法により抽出を行う。ただし、内標

準物質の添加の操作は行わない。図 3-6-3 にばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例を示す。以下に、ASE 抽出装置を用いた方法を示す。

（トルエン）

図 3-6-3 燃え殻・ばいじん試料の抽出液調製フローの例(1) 試料を適量の精製水中に入れて混和し、pH 試験紙で水層の pH を測定する。pH が 7 を超える場合
は、塩酸(HCl)処理を行う。pH が 7 以下の場合には塩酸処理を省略し、抽出操作に進む。
(2) 抽出操作を行う場合には損失のないように注意し、容器に残った試料を完全に拭き取りセル中に合わせる。
(3) ASE 抽出装置での抽出は下記の条件で行う。
溶媒：トルエン 100 %,サイクル数： 2 サイクル

加熱

： 7 分,

静置： 10 分パージ： 60 秒圧力： 2000 psi

フラッシング： 60 %vol,
温度： 150 ℃,

142

セル

： 33 mL(4) 操作手順a)

ASE 抽出用セルの一方にエンドキャップを取り付け、ろ紙を入れ、約 5mm ハイドロマトリックスを敷きつめる。

b)

風乾試料をセルに入れ、空隙をガラスビーズで上部まで満たし、上部もろ紙で塞ぎエンドキャップを取り付ける。

c)

セルと捕集用バイアルを ASE 本体にセットし、抽出条件及びスケジュールを確認し、スタートボ
タンを押し、抽出を行う。

d)

トルエン抽出液は無水硫酸ナトリウムで脱水後、ナスフラスコに合わせる。その際、捕集ボトルも使用溶媒でよくリンスし、抽出液に加える。

e)

ナスフラスコをエバポレータ等の濃縮器にセットし、0.5mL 程度まで減圧濃縮する。
（濃縮条件：水浴 60℃、減圧度 50mmHg 程度）。

4.3 クリーンアップ
図 3-6-4 にクリーンアップのフローの例を示す。

抽出液

一部分取
硫酸処理
濃縮
多層シリカゲルカラムクロマトグラフ操作
DMSO 転溶
測定溶液
図 3-6-4 クリーンアップのフローの例
1)

硫酸処理

(1) 分液ロートに硫酸約 10mL を入れ、濃縮された試料を移す。
(2) ナス型フラスコ内をヘキサンで洗いながら内容物を完全に分液ロートに移し、最終ヘキサン量を約
40 mL とする。
(3) 分液ロートを振とう機に取り付け、5 分程度振とうし、静置分離後、硫酸層を棄てる。
(4) 硫酸層が呈色しなくなるまで、(3)の操作を繰り返す。
(5) ヘキサン層をヘキサン洗浄水により 3 回洗浄し、ヘキサン層をビーカーに移し、無水硫酸ナトリウ
ムにより脱水する。
2)

濃縮
143

硫酸処理液をターボバップ専用濃縮容器に移し、40℃加温下で窒素パージにより 0.5mL 程度まで濃縮を行う。
3)

多層シリカゲルカラムの作製(1) ガラス製クロマト管に石英ウールをつめ、下部を適当量のヘキサンで満たす。
(2) 下から順に、シリカゲル 0.2 g、44%硫酸シリカゲル 6 g、シリカゲル 0.2 g、10%硝酸銀シリカゲル
1 g、無水硫酸ナトリウム 3 g を充填する。このカラムを図 3-6-5 に示す。

無水硫酸ナトリウム：3g
10%硝酸銀シリカゲル：
シリカゲル：0.2g

1g
44%硫酸シリカゲル：6g

シリカゲル：0.2g
石英ウール：適量

図 3-6-5 多層シリカゲルカラムの例

4)

クリーンアップ操作(1) 多層シリカゲルカラムをヘキサン 70 mL で予備洗浄（流下速度は１滴／秒程度）を行う。
(2) 濃縮液を予備洗浄したカラムに添加する。容器をヘキサンで洗いながら、内容物を全て添加する。
(3) ヘキサン 100 mL で溶出（流下速度は１滴／秒程度）する。
5)

溶媒置換及び測定用試料の保存(1) 多層シリカゲルカラムの流下液を、ロータリーエバポレーターにより 1 mL 程度に濃縮する（濃縮
条件：水浴 40 ℃、減圧度 200 mmHg 程度）。
(2) 濃縮液を先細試験管に移し、さらに濃縮容器をヘキサンで洗いながら内容物を全て試験管に移す。
(3) 試験管濃縮装置を 35 ℃に設定し、温度が安定したら試験管を設置する。
(4) 窒素をノズルの先端に手をかざしてかすかに感じるくらいの強さで吹きつけ、試料を濃縮する。
(5) 液量が 0.4 mL 以下になったら、パスツールピペットで試験管の上部からヘキサンを流して内壁を洗い落とす。この時ヘキサンの量は 1 mL の目盛を超えないようにする。
(6) さらに窒素パージを続け、ヘキサンを完全に留去する。
(7) 試験管に DMSO 40 L を加え、ボルテックスミキサーで攪拌後、40～50 ℃程度の温水中で超音波により再溶解し、さらにボルテックスミキサーで攪拌し、これを測定用試料とする。
(8) ここでは、DMSO 40 L としているが、ピペット操作の容易性・操作誤差・操作ミスを考慮して、最小でも 20L 以上が望ましい。
144

(9) 試料をバイアルに移し、試料識別用のラベルを貼り、最終検液として、室温で暗所に保存する。
4.4 自動化クリーンアップ
自動化クリーンアップを 4.3 クリーンアップに代えて利用しても良い。図 3-6-6 に自動化クリーンアップのフロー例を示す。
粗抽出液

一部分取

転溶

ヘキサン

多層シリカゲルカラムに添加
多層シリカゲルカラムを 60℃加熱

多層シリカゲルカラムとアルミナカラムを連結

アルミナカラムを乾燥

ヘキサン溶出窒素

DMSO を逆方向に送液し、回収

90℃加熱下 DMSO 溶出

測定溶液
図 3-6-6 自動化クリーンアップのフローの例

1)

抽出液の分取(1) 抽出液を分取して一部を測定に使用する場合には、定容した抽出液から目的に合わせて一部を分取する。
(2) あらかじめ、デカン 0.4 mL を入れた受器に適量の抽出液を入れ、ロータリーエバポレータで乾固寸前まで濃縮する。この濃縮液に適当量のヘキサンを加え、ロータリーエバポレータで乾固寸前まで濃縮する。この操作を 3 回程度繰り返しトルエンを除去する。その後、次に示す多層シリカゲルカラ
ム－アルミナカラム操作によってクリーンアップを行う。
2)

精製カラムの作製(1) 多層シリカゲルカラム
カラムクロマトグラフ管の底部にガラスウールを詰め、シリカゲル 2.3 g、硫酸（44%質量分率）シリカゲル 10.4 g、シリカゲル 0.2 g、硝酸銀（20%質量分率）シリカゲル 3.6 g、シリカゲル 1.5 g を順次充填する。このカラムを図 3-6-7 に示す。

145

シリカゲル：1.5 g
20% 硝酸銀シリカゲル：3.6 g
シリカゲル：0.2 g

44% 硫酸シリカゲル：10.4 g

シリカゲル：2.3 g
石英ウール：適量

図 3-6-7 自動化クリーンアップの場合の多層シリカゲルカラムの例(2) アルミナカラム
カラムクロマトグラフ管の底部にガラスウールを詰め、アルミナ 1.0 g 程度充填し、その上からガ
ラスウールを詰める。このカラムを図 3-6-8 に示す。

ガラスウール ： 適量
アルミナ ： 1.0 g
ガラスウール ： 適量

図 3-6-8 自動化クリーンアップの場合のアルミナカラムの例

3)

クリーンアップ操作(1) 図 3-6-9 に示す様に、多層シリカゲルカラムの上端のシリカゲル、硝酸銀シリカゲル及び硫酸シリカ
ゲルの上半分の部分を覆うようにヒーターをセットする。
(2) 濃縮した試料にヘキサンを加え、多層シリカゲルカラムに添加する。添加する試料の液量は容器の洗液を合わせて最大 5 mL までとする。
(3) ヒーターにより 60 ℃で 10 分間カラムを加熱する。
(4) 60 ℃加熱下、ヘキサン 85 mL を送液（2.5 mL/min）する。

146

ヒーター

ヘキサン送液(60 ℃加熱)

多層シリカゲルカラム

接続アダプター

アルミナカラム

図 3-6-94)多層シリカゲルカラムとアルミナカラムの組み立て例

溶媒置換及び測定用試料の保存(1) 3）の（4）の操作後、アルミナカラムに窒素を通じ、ヘキサンを除去する。
(2) アルミナカラムを包み込むようにヒーターをセットし、90 ℃で 10 分間加熱する。
(3) 90 ℃加熱下、3）の（4）のヘキサンの送液方向とは逆方向に、即ちアルミナカラム下端側から DMSO
2.5 mL を送液（2.5 mL/min）し、上端側から溶出する DMSO 溶液約 0.9 mL を予め秤量済みのバイ
アル瓶に回収する。図 3-6-10 にアルミナカラムを反転させない場合の操作例を示した。
(4) 回収後、バイアル瓶を秤量し、密栓後、室温で暗所に保存する。秤量の差分を DMSO 定容量とする。
アダプター

ヒーター

バイアル瓶

(90 ℃加熱)

アルミナカラムDMSO 送液

図 3-6-10

アルミナカラムを反転させない場合の DMSO への置換操

作の例
147

第５節 測定

１． 測定の概要
本方法は、ダイオキシン類、Ah 受容体及び ARNT の複合体に対して特異的に反応する抗 Ah 受容体複合体ポリクローナル抗体を用いた間接競合酵素免疫測定法によりダイオキシン類の毒性等量を測定する方法である。
2,3,7,8-TeCDD を用いて検量線を作成し、試料の吸光度から算出した実測濃度に排出ガス、ばいじん及び
燃え殻について定められた換算係数を乗じることにより、測定量(毒性等量)を算出する。

２． 使用キット、試薬、器具及び装置

使用キット

2.1

使用キット（アリール炭化水素受容体には、モルモット由来の細胞質液（サイトソル）に含有されるもの
を、アリール炭化水素受容体核運搬タンパク質（ＡＲＮＴ）には、バキュロウィルスの発現系を用いて生産したヒト由来のものを、ダイオキシン類応答配列ＤＲＥには、化学合成したものを、抗アリール炭化水素受容体複合体ポリクローナル抗体には、ヤギ由来の融合細胞（ハイブリドーマ）から収得したＡＲＮＴを特異的に認識する抗体を使用する。
）は、以下の試薬等から構成されるものである(注 1)。
7.5 mL×4 本*

1)

サイトソル(Cytosol) Ｆ

2)

ARNT 抽出液（ARNT Extract） Ｆ*

250L×2 本
60L×2 本

*Ｆ

3)

DRE

4)

アクチベータ(Activator) *Ｆ

0.75 mL×2 本
120 L*Ｃ

5)

AB1 抗体6)

AB 希釈液*Ｃ

7)

洗浄液 （ELISA プレートの洗浄用溶液） 25 mL

8)検出溶液*Ｃ（検出タブレットの溶解用溶液）

9)25 mL×2 本*Ｃ*Ｃ

検出タブレット （発色のための錠剤）

10) ELISA プレート*Ｃ11) α ナフトフラボン(αNAP)

33.3 mL
4 個
１ 個(蓋つき)*Ｃ

標準物質

200 L(濃度 0.5 mg/mL DMSO)

12) AB2 抗体*Ｃ

120 L13) リザーバー,チューブ

5 個14) チューブ

1本

15) 取扱い説明書

1冊（注１） 保管種類には冷蔵（＊Ｆ）と冷凍(＊Ｃ)の２種類があるので、受け取り後、それぞれ、冷凍庫（-80℃）と冷蔵庫（+4℃）に保管すること。

2.2 試薬測定に用いる使用キット以外の試薬は、次による。
1) 標準物質

2,3,7,8-TeCDD(濃度 32 ng/ｍL DMSO) （注 2）

148

（注 2）本キット用に販売されている調整済標準試薬を使用するのが望ましい。

2.3 器具及び装置
測定に用いる器具及び装置は、次による。
1)

吸光マイクロプレートリーダー

分光光度計、測定波長 405 nm

2)

冷凍庫

-80 ℃

3)

冷蔵庫

4 ℃

4)

恒温器

30 ℃

5)

プレートオウオッシャー

96 穴マイクロプレート同時洗浄用

6)

ボルテックスミキサー

7)

マルチピペット

200～400 L 12 チャンネル用が望ましい。

8)

ピペッター

2～10 L

9)

ストップウオッチ

10) アスピレーター
11) メスシリンダー1000 mL12) ビーカー

1000 mL×3 個13) 廃液用タンク

5 L 有機溶剤系用

14) 廃液用タンク

5 L 水系用

15) マイクロチップ

2 L(1 ﾌﾟﾚｰﾄ当り 20 個使用)

16) チップ

200 L(1 ﾌﾟﾚｰﾄ当り 15 個使用)

17) チューブ

1 mL（必要数）

18) 紙タオル

2 箱19) 手袋2 箱20) キムワイプ

2 箱21) アルミホイル

1 箱

３． キットの取り扱い

以下の取り扱い上の注意点を遵守すること。
1) キットの有効期間は、発送日から 3 ヶ月。キットを分割使用する場合は、未使用の試薬類及びプレー
トを適切な保存条件で保管すること。 だたし、冷凍保存の指示がある試薬の分割の残りは、解凍せずに、冷凍保管すること。凍解した場合には再使用できないので注意のこと。冷蔵保管の指示がある試
薬の分割の残りは、速やかに、冷蔵保存すること。
2) 本キットを構成する試薬の「ARNT extract」は遺伝子組み換え生物等の第二種使用等に該当するため、その保管・取り扱い・廃棄は関連規則に準拠すること。

４．測定操作測定操作の手順を図 3-6-11 に示す。
149

事前準備

試薬溶液の調製

マイクロプレート上への調製

活性化サイトソルとの反応

インキュベート、試薬除去と洗浄

30℃、2 時間

AB1 抗体添加

AB1 抗体との反応

インキュベート、試薬除去と洗浄

30℃、1 時間

AB2 抗体添加

AB2 抗体との反応

インキュベート、試薬除去と洗浄

30℃、1 時間

検出試薬添加発色反応

インキュベート

30℃、30-60 分

吸光度測定

図 3-6-11

本生物検定法による測定のフロー
測定のフロー

4.1

事前準備
1) ELISA プレートの配置の決定(1) 試料
試料は通常 4 段階の 2 倍希釈系列とする。1 列 8 段階の 2 倍希釈でも良い。
(2) 標準液
標準液は 7 段階あるいは 6 段階の 2 倍希釈系列を用い、各 3 重測定を行う。
標準液の濃度はウェル内反応溶液 200L あたり 64pg, 32pg, 16pg, 8pg, 4pg, 2pg,1 pg, 0 pg の 7 段階
あるいは、64pg, 32pg, 16pg, 8pg, 4pg, 2pg, 0pg の 6 段階希釈系列でも良い。
(3) 操作ブランク
定期的に操作ブランクを行うこと。操作ブランクは 3 重測定とする。
(4) 配置ELISA プレートでの配置例を図 3-6-12,に示す。図 3-6-12 は、①測定対象試料は 18 種類で 4 段階の2 倍希釈、②標準液は 7 段階 2 倍希釈の 3 重測定、及び③溶媒ブランク（DMSO のみ）の 3 重測定の場合のレイアウトを示している。図 3-6-13 は、①測定対象試料は同じく 18 種類で 4 段階の 2 倍希釈、②標準液は 6 段階 2 倍希釈の 3 重測定、③溶媒ブランク（DMSO のみ）の 3 重測定および④操作ブランクの 3 重測定の場合のレイアウトを示している。図 3-6-12 のレイアウトでは、標準液の最150

小濃度が 1 pg/ウエル、図 3-6-13 のレイアウトでは、検量線の最小濃度が 2 pg/ウエルとなる。

Ａ
Ｂ
Ｃ
Ｄ
Ｅ
Ｆ
Ｇ
Ｈ

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

試料1
原液

試料2
原液

試料3
原液

試料4
原液

試料5
原液

試料6
原液

試料7
原液

試料8
原液

試料9
原液

標準液
64pg

標準液
64pg

標準液
64pg

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

32pg

32pg

32pg

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

16pg

16pg

16pg

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8pg

8pg

8pg

試料10
原液

試料11
原液

試料12
原液

試料13
原液

試料14
原液

試料15
原液

試料16
原液

試料17
原液

試料18
原液

4pg

4pg

4pg

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2pg

2pg

2pg

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

1pg

1pg

1pg

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

溶媒
ブランク

溶媒
ブランク

溶媒
ブランク

図 3-6-12 ELISA プレートの配置の例-操作ブランクのない場合-

Ａ
Ｂ
Ｃ
Ｄ
Ｅ
Ｆ
Ｇ
Ｈ

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

試料1
原液

試料2
原液

試料3
原液

試料4
原液

試料5
原液

試料6
原液

試料7
原液

試料8
原液

試料9
原液

標準液
64pg

標準液
64pg

標準液
64pg

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

32pg

32pg

32pg

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

16pg

16pg

16pg

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8pg

8pg

8pg

試料10
原液

試料11
原液

試料12
原液

試料13
原液

試料14
原液

試料15
原液

試料16
原液

試料17
原液

試料18
原液

4pg

4pg

4pg

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2倍希釈

2pg

2pg

2pg

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

4倍希釈

溶媒ブラ
ンク

溶媒
ブランク

溶媒
ブランク

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

8倍希釈

操作
ブランク

操作
ブランク

操作
ブランク

図 3-6-13 ELISA プレートの配置の例-操作ブランクのある場合2) インキュベート用温浴槽の準備
恒温器内においても ELISA プレートの保温温度を一定に保持するため、インキュベート内に置ける
水浴槽を準備し水温を 30 ℃に保持しておくこと。
4.2

試薬溶液の調製

1) 試薬溶液の調製(1) 標準溶液の調製
標準物質として 2,3,7,8-TeCDD を DMSO 溶媒を用いて 32 ng/mL-DMSO に調製してもよいが、このキット用に販売されている調製済標準試薬を利用することを推薦する。
1 キットでの消費量は 3 重測定であるので、12 L である(2 L/ウエル×2 倍×3 重測定=12L)。
151

(2) 洗浄稀釈液の調製
1000 mL のメスシリンダー内にて、洗浄液を蒸留水 500 mL で希釈し調製しておく。
(3) AB1 抗体溶液の調製
AB1 抗体の入ったバイアルの中身を AB 希釈液のビン１本に移し、バイアルを共洗い後静かに混合しておく。この調製は最初のインキュベートの最中に行うのが良い。AB 希釈液は２本あり、どちらを使っても構わない。
(4) AB2 抗体溶液の調製
AB2 抗体の入ったバイアルの中身を AB 希釈液のビン１本に移し、バイアルを共洗い後静かに混合しておく。この調製は AB1 抗体添加後のインキュベートの最中に行うのが良い。AB 希釈液は２本あり、どちらを使っても構わない。
(5) 検出試薬の調製
検出タブレット 4 個を検出溶液の入ったビンに入れる。アルミホイルでビンの周囲を覆い、必ず遮光して、静かに溶解させる。タブレットが完全に溶解するまで最短で 15 分程度かかるので、準備時間を見込んでおくこと。この調製は AB2 抗体添加後のインキュベートの最中に行うのが良い。
2) 活性化サイトソルの調製(1) 解凍サイトソル、ARNT 抽出液、DRE、アクチベータを解凍する。サイトソルは冷凍庫から取り出した後、室温の蒸留水を入れたビーカーに入れて解凍すること。
(2) サイトソル-DRE 混合液の調製解凍したサイトソルを 50 mL チューブ１本に移し、DRE のバイアルの中身を加えて混合し、サイト
ソル-DRE 混合液を作成する。
(3) サイトソル-DRE-ARNT 混合液の調製
ARNT 抽出液をサイトソル-DRE 混合液に加えてサイトソル-DRE-ARNT 混合液を作成する。
(4) 活性化サイトソル溶液の調製
最後に、アクチベータをサイトソル-DRE-ARNT 混合液に加え、静かに混合させる。これを「活性化
サイ トソル溶液」と呼ぶ。作成後、必ず氷温に保管する。
(5) 上記の(2)～(4)の調製において、混合操作は泡立てないように静かにかつ迅速に行うこと。
3) 標準液・試料・ブランクの活性サイトソル溶液との調製の例
図 4-1-12 に示す配置の例に従って説明する。
活性化サイトソル溶液 200 μL に対して、①調製した試料（DMSO 溶液）、②標準液（DMSO 溶液）、③
溶媒ブランク(DMSO 溶液)がそれぞれ 2 μL の割合になるように、活性サイトソル溶液との調製を行う。こ
こでは調整方法の例を示す。
(1) 測定試料の調整
1 試料あたりの測定に必要な測定試料量は 2 μL/ウエル×2 ウエル分=4 μL であるので、余裕を見て、5 μL
を前処理用チューブ内で活性サイトソル溶液 500 μL と混合・反応させ、調製し準備する。ここでは 18
種類あるので、おのおの調整する。
(2) 標準液の調製
標準液は 3 重測定を行うために必要な標準液量は 2 μL/ウエル×3 重測定×2 ウエル分=12 μL である
ので、余裕を見て 15 μL を活性サイトソル溶液 1,500 μL と混合・反応させ、調製し準備する。
152

(3) 稀釈系列で必要な調整
測定試料と標準液の調整原液が入るウエル以外での必要な活性サイトソル溶液量は、(98-(18+3))×200
μL=15,000 μL である。余裕を見て 18,000 μL とし、180 μL の DMSO と混合・反応させ、調製し準備する。上記で使用する活性サイトソル溶液の全量は、500μL×18 種類+1,500μL+18,000μL=28,500 μL になる。ちなみに、キットのサイトソル量は 7.5mL×4 ヶ=30,000 μL である。
ELISA プレート上への調製

4.3

1) 最初の試料及び標準液の注入
上記 4.1 3)で作成した調製済試料（試料 1～9）は A 行 1 列から 9 列まで、及び調製済試料（試料 10～18）
は E 行 1 列から 9 列、活性化サイトソル溶液による調製済標準液は A 行 10 列から 12 列にマルチピペットを使って、各々200 μL を注入する。
2) 残りのウェルへの活性化サイトソル注入
その他のウエルに、調製済ブランク溶液をマルチピペットを使って、各々200 L 注入する。
3) 希釈系列の調製試料については各々4 濃度の希釈系列（稀釈無、2 倍希釈、4 倍希釈、8 倍希釈）
、標準液については、6
濃度の 3 反復希釈系列（64 pg、32 pg、8 pg、4 pg、2 pg、1 pg）を下記の手順で作ってゆく。
(1) 試料 1～9 では、B 行の 1 列から 9 列までのウエルにマルチピペットにより、調製済試料 200 μL をおのおの各 200 μL を注入し、既に注入してある溶液と繰り返し十分に混合させる。続いて、各 200μLを吸引し、次の C 行の各ウェルに注入し、既に注入してある溶液と繰り返し十分に混合させる。このピペッティング操作を希釈系列ごとに繰り返し、希釈系列を作成する。系列の最後のウェルから各200 μL を抜き取り、廃棄物容器などに廃棄する。
(2) 試料 10～18 では、F 行の 1 列から 9 列までのウエルにマルチピペットにより、調製済試料 200μL
をおのおの注入し、既に注入してある溶液と繰り返し十分に混合させる。続いて、各 200μL を吸引し、次の G 行の各ウェルに注入し、既に注入してある溶液と繰り返し十分に混合させる。このピペッティング操作を希釈系列ごとに繰り返し、希釈系列を作成する。系列の最後のウェルから各 200μLを抜き取り、廃棄物容器などに廃棄する。
(3) 標準液では、B 行の 10 列から 12 列までのウエルにマルチピペットにより、調製済標準液 200 μL をおのおの注入し、既に注入してある溶液と繰り返し十分に混合させる。続いて、各 200 μL を吸引し、次の C 行の各ウェルに注入し、既に注入してある溶液と繰り返し十分に混合させる。このピペッテ
ィング操作を希釈系列ごとに繰り返し、希釈系列を作成する。系列の最後のウェルから各 200 μL を抜き取り、廃棄物容器などに廃棄する。系列の最後の G 行のウェルから各 200μL を抜き取り、廃棄物容器などに廃棄する。
(4) マイクロプレート上への調製が完了した後、カバーをかけ、インキュベートを行う。
(5) ピペッティング操作の際、ウェルから溢れることが無い様に、慎重に行うこと。
4.3

インキュベート、試薬除去と洗浄

1) インキュベート
インキュベートは下記の各操作段階での条件で行う（表 3-6-2 参照）。ELISA レートにカバーをかけ、温水の入った温浴槽でインキュベートを行う。

153

表 3-6-2 各操作段階でのインキュベートの条件
操作段階
活性化サイトソルとの反応
AB1 抗体との反応
AB2 抗体との反応
発色反応

インキュベート条件
30℃、2 時間
30℃、1 時間
30℃、1 時間
30℃、30-60 分2) 試薬除去
インキュベート終了後、試薬を除去する。除去した廃液は、適切な処分を行うため、廃棄物容器に保管すること。活性化サイトソルとの反応液はダイオキシン類を含むので、明示された廃棄物容器に保管す ること。処分は規制に準拠し適切に行うこと。
3) 洗浄(1) リザーバーに洗浄液を入れ、マルチピペットを使ってすべてのウェルに 330μL ずづ分注する。
(2) 2 分間放置後、アスピレーターで除去する。プレートウオッシャーを利用して洗浄してもよい。
(3) 上記(1)、(2)の操作を計 3 回行う。
4.4

発色反応と吸光度測定

1) AB2 抗体反応が終了し、ウェルを洗浄した後、リザーバーに調製した検出試薬を入れ、マルチピペットを使ってすべてのウェルに 200μL 分注する。
2) 吸光度の測定は、30℃のインキュベートで 60 分後、吸光マイクロプレートリーダーにて 405nm の吸光度で行う。30 分後にも測定しておくことが望ましい。
4.5

測定操作時の留意事項

1) 活性サイトソルとの反応、AB1 抗体反応、AB2 抗体反応、発色反応の反応時間及び反応温度は所定の条件で必ず行うこと。
2) ウェル内の洗浄後、確実に反応物を取り除くため、ELISA プレートをペーパータオルに包み、裏返し、机に叩きつけるように上下に動かすのがよい。

５．定量

5.1

検量線の作成キットごとに検量線を作成する。下記にその例を示す。
1) 標準溶液濃度と吸光度測定値からブランク吸光度測定値を引いた差とで、最小二乗法により 3 次回帰式
による検量線を作成する。標準液は 3 反復で、7 段階あるいは 6 段階の２倍希釈系列で行う。
2) 標準液の量は、ウェル 200 μL あたり、7 段階希釈においては、64 pg, 32 pg, 16 pg, 8 pg, 4 pg, 2 pg,1
pg,0 pg(DMSO のみ)、6 段階希釈においては、64 pg, 32 pg, 16 pg, 8 pg, 4 pg, 2 pg, 0pg(DMSO のみ)としてよい。
3) 標準液の各濃度において検量線に CV 値（％）を算出し、20％以下の濃度範囲を定量範囲とする。定量
下限は定量範囲の下限値、検出下限は定量下限の 1/3 とする。通常、定量下限は 1～4pg、検出下限は0.3～1pg になる。図 3-6-14 に検量線の作成の例、表 4-1-3 に回帰式の各濃度における CV(％)の例を示す。

154

4.5866E-09-1.0961E-05
2.4150E-02-5.4671E-01
0.999778069
0.48325395

標準液濃度

Y=m X +m X +m X+b
Y：ｐｇＤＥＱ Ｘ：mOD
係数 m1
係数 m2
係数 m3
係数 ｂ
R2
Yの標準誤差:pg

pgDEQ/ウェル

標準液濃度
pgDEQ/ウエル
70
60
50
40
30
20
10
0
0

500

1,000

1,500

2,000

2,500

OD値x1000(405nm)

図4-1-14 図
検量線の作成の例
3-6-14 検量線の作成の例
式の各濃度でのCV(％)値
式の各濃度での CV(%)値

表 3-6-3 回帰式の各濃度での CV(％)値の例
検量線の評価注入量
標準誤差 CV
pg
pg
％
64.0
0.88
1.4
32.0
1.17
3.7
16.0
0.35
2.2
8.0
0.38
4.7
4.0
0.21
5.3
2.0
0.11
5.5
1.0
0.25
24.5

定量範囲
20%以下
〇
〇
〇
〇
〇
〇

検量線の確認及び感度変動の管理図による確認

5.2
1)

検量線の確認定量操作が適切に行われているかどうかを確認するため、発色操作でのインキュベート時間が 60 分での吸光度が下記の項目について満足していることを確認し、記録する。この条件を満たさない場合は、キッ
トの劣化による原因が考えられるので、製造メーカーに問い合わせること。
(1) ブランクでの吸収度：0.5 以下(2) 64 pg/ウエルと溶媒ブランクでの吸収度の差：1.0 以上
2)

感度変動の管理図
定量操作が適切に行われているかどうかを確認するため、測定担当者は、検量線作成用標準液の測定操作により得られたデータから、測定量（毒性等量）を求め、管理図に記録し保存する。管理図による処
置基準は、管理限界（2）からの逸脱状況及び図の傾向等に応じて下記の通りとする（：工程平均、
：測定量（毒性等量）の標準偏差）。
データが１点でも管理限界を超えた場合は、原因の究明と改善を行うとともに、再測定する。改善のために講じた措置及び再測定の結果について記録をする。また、管理限界内であっても基準値に対して、一定の傾向で外れていくような状態又は偏った測定値が続くような状態においては、原因の究明を行い、必要に応じ、改善を行うとともに、再測定する。
155

5.1 により作成した検量線の 8 pg/L の点の検量線による換算値（pg/L）を算出し、管理図にプロットする。一例を図 3-6-15 に示す。

測定値(pg/L）

9

8
測定値
平均値
±2σ

7
0

5.3

10

20
30
プレート(＃)

図 3-6-15

感度変動の管理図例

4050

測定試料の定量

下記の手順で測定試料の定量を行う。
1) ウェル当たりの計測値 Y の算出
各試料の吸光度測定値からブランク吸光度平均値を引いた吸光度測定値の差を X として、検量線の 3 次
回帰式に代入し、標準液としてのウェル当たりの計測値 Y を算出する。
Y（pgDEQ/well）=m1×X3+ m2×X2+ m3×X+b
ここに、
m1、m2、m3、b： 最小２乗法で求められる係数

X： 各試料の吸光度測定値-ブランク吸光度平均値

2) 実測濃度の決定
下記の式に従い、サンプルの採取量あたりの実測濃度を決定する。
(1) 排出ガス

𝐶𝑆 = 𝑌 ×

𝑉𝐶
𝑉𝐸 1
1
×𝑛×
× ×
𝑉′𝐶
𝑉′𝐸 𝑉 1000

ここに、

Cs

： 排出ガス中の実測濃度(ngDEQ/m3N)Y： 1 ウェル当たりの計測値(pgDEQ/well)

VC： 作成した試料 DMSO 量(mL)：0.04 ｍL( 40L)

V’C ： 1 ウェルに添加した試料 DMSO 量(mL)：0.002 ｍL(2L)n： 希釈倍率(-)
VE： 抽出液量(mL)

V’E ： 抽出液分取量(mL)V： 試料ガスの採取量(m3N)

156

(2) ばいじん及び燃え殻

𝐶𝑆 = 𝑌 ×

𝑉𝐶
𝑉𝐸
1
1
×𝑛×
× ×
𝑉′𝐶
𝑉′𝐸 𝑊 1000

ここに、

CS

： ばいじん及び燃え殻中の実測濃度(ngDEQ/g)

Y： 1 ウエル当たりの決定計測値(pgDEQ/well)

VC ： 作成した試料 DMSO(mL)：0.04 ｍL( 40L)
V’C ： １ウエルに添加した試料 DMSO 量(mL)：0.002 ｍL( 2L)n： 希釈倍率(-)
VE ： 抽出液量(mL)
V’E ： 抽出液分取量(mL)W： ばいじん及び燃え殻の採取量(ｇ)3) 実測値の決定
4 希釈系列での実測濃度を前後のウェル間で比を計算し、その比が 0.8-1.2 の範囲にある実測濃度の平均値を、実測値とする。その比が 0.8-1.2 の範囲にない場合で、定量下限以上であれば、試料濃度が大きすぎるので、希釈し再度測定を行う。また、定量下限以下になった場合で、定量下限が測定したい基準値より大きい場合には、試料量が尐ないと考えられるので、量を増やして、抽出あるいはクリーンアップから再試験を行う。実測値の決定の判断方法の例を下記図 3-6-15 に示す。

１．ウエルあたりの実測濃度（pg/DEQ/g）
1
2
3
A 54,690
67,8863,650
B 52,139
86,606
7,520
C 51,121
84,332
13,701
D 41,723
84,811
22,34475,99488,60288,309104,158

60,04071,26782,894

２．前後の実測濃度の比
1
2
B/A
0.95
1.28
C/B
0.98
0.97
D/C
0.82
1.01

3
2.06
1.82
1.63

E
F
G
H

F/E
G/F
H/G

40,074
46,77739,95344,798

1.17
0.85
1.12

1.17
1.00
1.18

前後比が 0.8-1.2 に対応する実測濃度（斜字）の平均値を実測値とする。

39,335

ウエルの前後比が 0.8-1.2 になる範囲の値を採用する。

1.53

1.19
1.16
図 3-6-15

実測値の決定の例

157

６．検出下限及び定量範囲

6.1 標準物質における定量範囲および検出下限の確認
標準物質における検量線の測定操作により得られた測定値変動係数(CV%)が 20%以下となる点を定量下限、その 1/3 を検出下限とする。この標準物質における定量下限の検定は、キットごとに行うこととする。
「５．
定量 5.1 検量線の作成」を参照のこと。
6.2 試料における検出下限及び定量下限
試料における検出下限及び定量下限は、試料量と前処理を経た最終検液量の数値と、標準物質における検出下限並びに定量下限から理論的に算出する。試料における検出下限及び定量下限は、試料採取量や最終検液量等により異なってくるため、試料ごとに求める。

７．測定量(毒性等量)への換算

排出ガス、ばいじん及び燃え殻の場合の換算の仕方は、おのおの下記の計算による。なお、測定結果の報告様式については、第 2 章第 2 節「測定結果の報告」を参照すること。
1) 排出ガスの場合
本測定法では、実測値 X から測定値（毒性等量）Y への換算は下記の式で行う。

Y= kg×X
ここで、Y（ngTEQ/ m3N）

：測定値（毒性等量）kg（ngTEQ/ngDEQ）：換算係数: kg=0.0494

X（ngDEQ/ m3N）

：実測値2) ばいじん及び燃え殻の場合
本測定法では、実測値 X から測定値（毒性等量）Y への換算は下記の式で行う。

Y= ka×X
ここで、Y（ngTEQ/g）：測定値（毒性等量）

ka（ngTEQ/ngDEQ）：換算係数: ka=0.0523

X（ngDEQ/ g）：実測値

８．換算係数の確認
尐なくとも 6 ヶ月に 1 回、HRGC/HRMS 法によって測定された試料について、本測定法による測定を行い、HRGC/HRMS 法により得られた測定量（毒性等量）と本測定法で得られた実測濃度より換算係数を算出し、換算係数と比較する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認を行う。試料は、片方について HRGC/HRMS 法に定められた方法により前処理を行い、残りについては生物検定法に定められた方法により前処理を行って試料を調製する。得られた換算係数が、第 6 節の換算係数と大きく換算係数が乖離する場合又は相関が悪い場合には、原因の究明を行い、その結果及び講じた措置を記録する。
158

第６節 参考資料

１．本生物検定法における換算係数の考え方
本測定法では、N=20 以上のサンプルに対して生物検定法によって測定された実測濃度（ DEQ）と
HRGC/HRMS 法によって求めた毒性等量（TEQ）の倍率（Y/X）の平均値を換算係数とする。

２．排出ガス試料の場合の換算係数
図 3-6-16 には、排出ガス試料の場合(n=42)における本生物検定法によって測定された濃度（X）とHRGC/HRMS 法によって求めた毒性等量（Y）に対する相関図の例を示す。相関図において、平均倍率は0.0494 であり、この値が換算係数である。

３．ばいじん及び燃え殻試料の場合の換算係数
図 3-6-17 には、ばいじん及び燃え殻試料の場合(n=41)における本生物検定法によって測定された濃度（X）と HRGC/HRMS 法によって求めた毒性等量（Y）に対する相関図の例を示す。相関図において、平均倍率
は 0.0523 であり、この値が換算係数である。

ばいじん及び燃え殻(n=41)
1000

1000
y = 0.0447x
R = 0.9941
換算係数=0.0494(各データの倍率平均から）

10

2

R = 0.9683
換算係数＝0.0523（各データの倍率平均から）100
毒性等量（ngTEQ/g）

毒性等量（ngTEQ/m3N）2100

y = 0.0406x））

排ガス( n=42)

1
0.1

10
1

0.1
0.01

0.01
0.1

1

10

100

1000

0.1

10000

10

100

1000

10000

実測濃度（ngDEQ/g）

実測濃度（ngＤEQ/m3Ｎ)

図 3-6-161

図 3-6-17

排出ガス試料の換算係数算出(例)

ばいじん及び燃え殻試料の換算係数算出(例)（排ガス、ばいじん及び燃え殻）

159

第４章

各論(ダイオキシン類を抗原とする抗原抗体反応を利用した方法)

その１

前処理に、多層シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、抗ダイオキシン類モノクローナル抗体及びプレート固相抗原を用いた間接競合酵素免疫測定法を利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 2 の 1)

第１節 測定方法の概要

対象媒体ごとに試料を採取し、ダイオキシン類を抽出後、クリーンアップを行い、抗ダイオキシン類モノ
クローナル抗体を用いた間接競合酵素免疫測定法による測定により定量する。測定方法のフローを図 4-1-1
に示す。

試料採取
抽出
クリーンアップ
抗ダイオキシン類モノクローナル抗体を用いた間接競合酵素免疫測定法による測定
標準物質(実測濃度)の定量
換算係数による測定量(毒性等量)への換算
測定値確定
図 4-1-1 測定方法のフロー

第２節 用語の定義

1) 抗ダイオキシン類抗体

免疫反応によって脊椎動物に産生される抗体(タンパク質)を、マウス由来の融合細胞(ハイブリドーマ)を用いて収得したもので、ダイオキシン類と特異的に反応する性質を有する。
2) 一次抗体溶液

抗ダイオキシン類抗体を緩衝液中に溶解させたもの。

3) 二次抗体溶液

マウス由来の抗ダイオキシン類抗体と特異的に反応するヤギ由来の酵素標識されたポリ

クローナル抗体を緩衝液に溶解したもの。
4) 一次免疫反応

抗ダイオキシン類抗体と抗原(ダイオキシン類)との反応。

5) 二次免疫反応

固相プレート上の擬似抗原に結合した抗ダイオキシン類抗体と二次抗体との反応。

6) B/B0%
7) IC50

測定対象の吸光度をブランク(濃度 0)の吸光度で除し 100 倍した数値。

50%の阻害がかかる濃度(50% Inhibition Concentration) 。

8) 精度プロファイル

精度確認用の標準溶液濃度と変動係数(CV%)との関連図。
160

第３節 試料採取方法に関する特記事項

１．試料ガスの採取量

試料ガスの採取量は、次のような手順によって決定する。採取時間については、その目的に応じて試料ガスの発生状況等を十分考慮して代表試料が採取できるようにしなければならない。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小の試料ガスの量を算出する。

𝑉 = 𝑄𝐷𝐿 × 𝑣 ×
ここに、V

𝑉𝐸
1
×
𝑉′𝐸 𝐶𝐷𝐿：測定に必要な最小の試料ガスの量(m3N)

QDL ：標準物質の検出下限(ng-TEQ/mL、DMSO 溶液中)v

：測定用試料の液量(mL)

VE ：抽出液量(mL)
V’E ：抽出液分取量(mL)
CDL ：必要となる試料ガスにおける検出下限 (ng-TEQ/m3N)4) 算出された最小の試料ガスの量以上を試料ガスの採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例) 5ng-TEQ/m3N レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となる試料ガスにおける検出下限は0.17ng-TEQ/m3N)
抽出液を 20mL に定容し、その抽出液から 10mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に 1mLの DMSO 溶液に調製する場合の試料ガスの採取量を以下に示す。なお、標準物質における検出下限は0.011ng-TEQ/mL を用いた。

𝑉 = 0.011 × 1 ×

20
1
×= 0.13
10 0.17(原則として、4 時間、3m3N の試料ガス採取を標準とする。)

２．ばいじん及び燃え殻試料の採取量

ばいじん及び燃え殻試料の採取量は、次のような手順によって決定する。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下にばいじん及び燃え殻における検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量を算出する。

𝑊 = 𝑄𝐷𝐿 × 𝑣 ×

𝑉𝐸
1
×
′
𝑉 𝐸 𝐶𝐷𝐿

ここに、W ： 測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量(g)QDL ： 標準物質の検出下限(ng-TEQ/mL、DMSO 溶液中)
161

v

： 測定用試料の液量(mL)

VE ： 抽出液量(mL)
V’E ： 抽出液分取量(mL)
CDL ： 必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限(ng-TEQ/g)4) 算出された最小のばいじん及び燃え殻試料の量以上をばいじん及び燃え殻試料の採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例) 3ng-TEQ/g レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限は 0.1ng-TEQ/g)
抽出液を 20mL に定容し、その抽出液から 10mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に 1mLの DMSO 溶液に調製する場合のばいじん及び燃え殻試料の採取量を以下に示す。なお、標準物質における検出下限は 0.009ng-TEQ/mL を用いた。

𝑊 = 0.009 × 1 ×

20
1
×= 0.18
10 0.1

第４節 試料の前処理

１．試料の前処理の概要

採取した試料は、抽出を行う。抽出液は必要に応じて分取を行い、クリーンアップに移る。図 4-1-2 に試料の前処理から測定までのフローの例を示す。

試料
抽出
抽出液
一部分取

（省略可能）

硫酸処理
多層シリカゲル／活性炭カラムクロマトグラフ操作
測定用試料
図 4-1-2 試料の前処理から測定までのフローの例

162

２．試薬

試料の前処理に用いる試薬は、次による。これらの試薬は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
JIS K0557 に規定する A4(又は A3)の水、又は同等の品質のもの

1)

水

2)

アセトン

JIS K8040 に規定するもの、又は同等の品質のもの

3)

トルエン

JIS K8680 に規定するもの、又は同等の品質のもの

4)ジクロロメタン

5)

ヘキサン

6)

ジメチルスルホキシド(DMSO)

7)硫酸ナトリウム

8)

硫酸

9)

多層シリカゲルカラム

JIS K8117 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8825 に規定するもの、又は同等の品質のもの
JIS K9702 に規定するもの、又は同等の品質のもの(注 1)

JIS K8987 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8951 に規定するもの、又は同等の品質のもの
ダイオキシン類のクリーンアップ用として市販されているものの中で、活性炭カラムと連結して使用が可能なもの。JIS K0311 に規定されたシリカゲル類と同等の分離性能を有するもの。
10) 活性炭カラム

ダイオキシン類のクリーンアップ用として市販されているものの中で、本法に適用して良好な結果が得られることが確認されているもの。逆方向の溶出が可能なもの (リバーシブルカーボ
ンカラム)。
11) 円筒ろ紙

ソックスレー抽出に用いる。ガラス製又は石英製で、必要量の風乾した試料が入るサイズのもの。使用に先立ってアセトン洗浄し、さらにトルエン等でソックスレー抽出を行うか、又は 450℃
以上で 4 時間以上加熱して用いるとよい
12) 窒素JIS K1107 に規定する高純度窒素 2 級(注 1) ジメチルスルホキシド(DMSO)の品質変動は、測定結果に影響を及ぼすことがあるためロットの変更時等には十分注意する。

３．器具及び装置

試料の前処理に用いる器具及び装置は、次による。これらの器具及び装置は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
3.1

ガラス器具

JIS R3503 及び JIS R3505 に規定するもの。コックの部分がふっ素樹脂製のものを用いてもよい
3.2

ソックスレー抽出器

JIS R 3503 に規定するもの、又はこれと同等の品質のもの。接続部にグリースを使用してはならない
3.3

濃縮器

クデルナ-ダニッシュ(KD)濃縮器又はロータリーエバポレータ。接続部にグリースを使用してはならない
3.4

その他

吸引ポンプ、最高使用圧力が 0.25MPa の真空ポンプ、又は同等の性能を有するもの

163

４．前処理操作

4.1

試料量の記録

採取した試料は、試料量を記録する。
4.2

抽出1) 排出ガスJIS K0311 6.4 により、抽出を行う。ただし、内標準物質の添加は行わない。図 4-1-3 に排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

樹脂

円筒ろ紙

吸収プローブ洗液

吸収液、洗液ろ過

残さ
HCl(2mol/L)処理

ろ液

試料 1g に対してHCl(2mol/L)を 10mL 以上加

ろ過

残さ

える

ろ液

風乾

ソックスレー抽出液－液振とう抽出(ﾄﾙｴﾝ、16 時間以上)

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ(3 回)

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ層

水層

脱水

濃縮

：検体または試料：作業

抽出液
図 4-1-3 排出ガス試料の抽出液調製フローの例
164：物または試料

2) ばいじん及び燃え殻
平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(2)により抽出を行う。ただし、内標準物質の添加の操作は行わない。図 4-1-4 にばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

試料

含水率測定

HCl(2mol/L)処理

試料 1g に対してHCl(2mol/L)を 10mL 以上加
える

ろ過

残さ

ろ液

風乾
ソックスレー抽出液－液振とう抽出(ﾄﾙｴﾝ、16 時間以上)

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ(3 回)

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ層

水層

脱水

濃縮

：検体または試料：作業：物または試料抽出液

図 4-1-4 燃え殻・ばいじん試料の抽出液調製フローの例

4.3

クリーンアップ

1) 抽出液の分取
抽出液を濃縮し、溶媒を加えて通常 20mL に定容する。採取した試料の量及び試料中の予想されるダイ
オキシン類濃度から下式を用いて分取量を算出する。最終的に DMSO 溶液中のダイオキシン類濃度が 20～1000pg-TEQ/mL の範囲内となるように分取量を決定する。

𝑉′𝐸 = 𝐶1 × 𝑣 × 𝑉𝐸 ×
ここに、V’E

1
𝐶2 × 𝑋 × 1000

： 抽出液分取量(mL)
165

C1

： キット測定用試料(DMSO 溶液)中のダイオキシン類濃度(20～1000pg-TEQ/mL の範囲内が望ましい)v： キット測定用試料(DMSO 溶液)の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)

C2： 試料中の予想ダイオキシン類濃度(ng-TEQ/g 又は ng-TEQ/m3N)

X： 試料採取量(g 又は m3 N)(例)ダイオキシン類濃度が 1ng-TEQ/g と予想されるばいじん試料 5g を抽出し、20mL の抽出液を得て、約 250pg-TEQ/mL のキット測定用試料を 1mL 調製する場合の抽出液分取量は、以下の通りとなる。

𝑉′𝐸 = 250 × 1 × 20 ×1
=1
1 × 5 × 1000

2) 精製カラムの作製
市販品を用いる。もしくは JIS K0311 に規定された方法に準拠して、多層シリカゲルカラム及び活性炭
カラムを作成する。
3) クリーンアップ
図 4-1-5 にクリーンアップのフローの例を示す。

抽出液：検体または試料：作業一部分取：省略できる作業

濃縮

硫酸処理
夾雑物の多い場合

多層シリカゲル／活性炭カラム
クロマトグラフ操作

濃縮

測定用試料
図 4-1-5 クリーンアップのフローの例

166

(1) 硫酸処理
JIS K 0311「6.4.4 硫酸処理/シリカゲルカラムクロマトグラフ操作又は多層シリカゲルカラムクロマト
グラフ操作」に準拠した方法。
(2) 多層シリカゲルカラムクロマトグラフ／活性炭カラムクロマトグラフ操作(注 2)a) 多層シリカゲルカラムをヘキサン 10mL で洗浄し、ヘキサン流下中に吸引ポンプを使用して空気抜きを行う。
b) 活性炭カラムを逆方向にセットし、最初にトルエン 100mL で洗浄し、トルエン流下中に吸引ポンプを使用して空気抜きを行う。続いてヘキサン 100mL で洗浄する。
c) 多層シリカゲルカラムと活性炭カラムを図 4-1-6 に示す通りに連結する。
d) 溶媒リザーバーをはずし、コックを閉じてヘキサンを多層シリカゲルカラムの上面まで充填する。
e) 多層シリカゲルカラムの上面に試料を充填し、溶媒リザーバーにヘキサン 60mL を入れ、多層シリカゲルに再度セットする。
f)

ヘキサンを滴下(2mL/min)する。

g) 多層シリカゲルカラムを取り外し、活性炭カラムを逆向きにして上端に溶媒リザーバーをセットする。
h) 溶媒リザーバーにトルエン 60mL を入れ、コックを開いてトルエンを自然滴下させ、得られた溶出液を 2mL 程度まで濃縮する。
(注 2) 活性炭カラムのプレ洗浄の際に、トルエンがカラム内に残存していると試料中のダイオキシン類が流出し、回収率が著しく低下するため、ヘキサンで十分置換すること。

溶媒リザーバー
コネクター
多層シリカゲルカラム
コネクター

活性炭カラムコック
吸引ポンプへ錘

フラスコ

図 4-1-6 多層シリカゲルカラムと活性炭カラムの組み立て例

なお、ここで挙げた精製操作以外の操作であっても、次の条件を満たすことが確認されれば、用いてもよい。この確認には、適用する試料媒体について、5 以上の採取地点の異なる試料を用いて167

5 回以上の繰返し、計 25 点以上のデータが必要である。
a) ダイオキシン類の回収率が HRGC/HRMS 法による測定で 90%以上である。
b) 適用しようとする新規の操作方法によって得られた試料液について本測定方法によりえられた結果が、従来の操作方法により得られた試料液で本測定方法により得られた結果の±30%である。
4) 溶媒置換及び測定用試料の保存(1) 3)の操作により得られた濃縮液を窒素気流下で試験管壁をヘキサンで洗い込みながら乾固寸前まで濃縮する。
(2) 濃縮後、試験管にすばやく DMSO 溶液 0.5mL を加え、攪拌する。
(3)(2)の DMSO 溶液を窒素気流下で 10 分間程度静置する。ヘキサン等の疎水性有機溶媒が残っていると、測定操作の段階で検体溶液が白濁することがあるので注意すること。

(4) DMSO 溶液をパスツールピペットでメスフラスコに移す。
(5) 尐量の DMSO 溶液で試験管内を洗浄し、その洗液も先のメスフラスコに移す。最終的に DMSO 溶
液で一定量に定容する。(通常 1mL に定容する。試料中の予想ダイオキシン類濃度により定容量を変更しても良い。)(6) 定容した DMSO 溶液を所定の褐色バイアル瓶に移し、密栓後、室温で暗所に保存する。

第５節 測定１．測定の概要

本方法は、ダイオキシン類の毒性等量との相関性が高い、五塩化ジベンゾフラン類と特異的に反応する抗ダイオキシン類モノクローナル抗体及びプレート固相抗原を用いた間接競合酵素免疫測定法によりダイオキ
シン類の毒性等量を測定する方法である。
2,4,5-トリクロロフェノールグリシルグリシン(TCP)を用いて検量線を作成し、試料の吸光度から算出した
実測濃度に排出ガス、ばいじん及び燃え殻について定められた換算係数を乗じることにより測定量(毒性等量)を算出する。

２．使用キット、試薬、器具及び装置

2.1

使用キット

使用キット（抗ダイオキシン類モノクローナル抗体には、マウス由来の融合細胞（ハイブリドーマ）から収得した五塩化ジベンゾフラン類を特異的に認識する抗体を、プレート固相抗原には、２，４，５－トリク
ロロフェノール及び牛血清アルブミン（ＢＳＡ）から合成した化合物を、検量線作成用標準品には、２，４，
５－トリクロロフェノール及びグリシルグリシンから合成した化合物を使用する。）は、以下の試薬等から構成されるものである。なお、1)～4)までの試薬は発送時に室温保存用箱に収納されており、5)～12)までの試
薬及びパーツは冷蔵保存用箱に収納されている。
1)

2,4,5-トリクロロフェノール-グリシルグリシン(TCP)濃縮標準溶液2)

試料希釈用 DMSO

3)

反応停止液

10mL

15mL
168

1mL

50mL

4)

10 倍濃縮洗浄液

5)

抗原固相マイクロプレート

6)

一次免疫反応用緩衝液

7)

一次抗体溶液8)

二次抗体濃縮溶液

9)二次抗体希釈用緩衝液

10) 発色基質液

1枚

10mL

15mL
0.15mL
15mL

15mL11) プレート密閉用シール

1枚12) 取り扱い説明書
試薬

2.2

測定に用いる使用キット以外の試薬は、次による。
1)
2.3

水

JIS K 0557 に規定する A4(又は A3)の水又は同等の品質のもの

器具及び装置測定に用いる器具及び装置は、次による。
分光光度計、測定波長 450 nm、温度制御機能は不要

1)

吸光マイクロプレートリーダー

2)

プレートウォッシャー

3)

試験管ミキサー

4)

冷蔵庫

5)

マイクロピペット10～100L

6)

マイクロピペット100～1000L

7)マイクロピペット

1～10mL

8)

マルチチャンネルピペット

8 チャンネル30～300L

9)

マルチチャンネルピペット

12 チャンネル

30～300L (8 チャンネルで代用可)

10) 分注用電子ピペット

マイクロピペットで代用可

11) ピペットチップ
12) ピペッティングリザーバー
13) マイクロチューブ

1.5mL14) マイクロチューブ用ラック
15) キャップ付マイクロチューブ
16) 遠沈管

マルチチャンネルピペットに対応したもの
1.5mL 程度の容量

15mL 容量より大きいもの

17) ストップウォッチ
18) 金属トレー

氷でも代用可、一次免疫反応時のプレート分注操作で使用

19) ペーパータオル

３．キットの取り扱い

以下の取り扱い上の注意点を遵守すること。
1) 冷蔵保存用箱に収納されている試薬及びプレートは、冷蔵庫(2～8℃)にて保管すること。
2) 室温保存用箱にて送付する TCP 濃縮標準溶液は必ず常温(15～25℃)で保管すること。
1693) キットの有効期間は、未開封の状態で製造より 1 年間である。キットを分割使用する場合は、未使用の試薬類及びプレートを適切な保存条件で保管し、開封後 1 ヶ月以内に使い切ること。なお、プレートの残りは専用の収納袋に戻し、袋内の空気を極力抜いた状態でしっかりとチャックを閉じておくこと（ここでの「開封」とは、各試薬容器の開栓や、マイクロプレートの真空パック開封を指す）。
4) キットの内容物である「試料希釈用 DMSO」が凍っている場合があるが、品質に影響しない。ただし、使用前に常温で解凍すること。
5) キットを保管する場合は、保存場所、保存方法、汚染の配慮、温度及び湿度の情報を記録し、保存すること。

４．測定操作4.1

抗体溶液の調製

1) 一次抗体溶液の調製調製不要。
2) 二次抗体溶液の調製
二次抗体濃縮液を二次抗体希釈用緩衝液で 150 倍に希釈して使用する。二次抗体溶液は、二次抗体の安定性確保の観点から、二次免疫反応を行うまでの 2 時間以内に調製し、使用するまで冷蔵保管する。
分割使用の場合は、二次抗体濃縮液を必要に応じて量り取り調製すること（ただし開封後 1 ヶ月以内に使い切ること）。
4.2標準溶液の調製

以下の操作はキャップ付マイクロチューブを用いて行う。
試料希釈用 DMSO を用いて「TCP 標準溶液(1mg/mL)」を 5 倍に希釈し、200g/mL 標準溶液を調製する(例：TCP 標準液 0.2mL に希釈用 DMSO を 0.8mL 加え混和する)。
その後、希釈調製した TCP 溶液(200g/mL)を試料希釈用 DMSO で 4 倍ずつ希釈し、50、12.5、3.13、0.78、0.20、0.05濃度になるようにそれぞれ調製する(例：TCP 標準溶液 0.2mL に希釈用 DMSO 0.6mL を加え混和する)。最終的に、200g/mL か
ら 7 段の希釈系列を調製する。
マイクロチューブを 8 本用意し、希釈調製した各 TCP 標準溶液を、濃度系列に従って 80L ずつマイクロチューブに移す。TCP 濃度が 0.05g/mL の次のマイクロチューブには試料希釈用 DMSO 80L を入れる。
4.3

試料希釈系列の調製

DMSO に転溶した試料から、希釈用 DMSO を用いて 4～8 水準の 2 倍希釈系列を調製する。
(例：8 水準の希釈系列で n=2 で測定する場合)
1) マイクロチューブ 8 本を用意し、1 本目のチューブに原液 80L を加え、残り 7 本の各チューブに希釈
用 DMSO 80L を加える。
2) 更に 2 本目のチューブに原液 80L を加え、攪拌後にその混合液 80L を分取して 3 本目のチューブに加えて攪拌する。同様の操作を 8 本目のチューブまで行う。
3) 8 本目のチューブ(残量 160L)から 80L を抜き取り、廃棄する。
4.4

混合溶液の調製

マイクロチューブに調製した(a)TCP 標準溶液及び試料に、(b)一次免疫反応用緩衝液及び(c)一次抗体溶液を
1：1：2 の割合で添加する(表 4-1-1)。試薬を添加する順番は(a)→(b)→(c)とする。試薬を添加後、すばやく
170マイクロチューブを試験管ミキサー等で攪拌混合する。混合後、4℃で 10 分間静置する。
表 4-1-1 混合溶液の調製
(a)
(b)
(c)

4.5

試薬
標準溶液及び試料
一次免疫反応用緩衝液
一次抗体溶液

添加量
80L
80L
160L

添加順
↓

一次免疫反応4℃で 10 分間静置後、抗原固相マイクロプレートに混合溶液を 100L/well ずつ分注する。分注操作は冷却した金属プレート上(又は氷上)で行うこと。分注後、軽く抗原固相マイクロプレートを振とうし、密閉シー
ルで抗原固相マイクロプレートを密閉して 4℃(注 4)で 60 分間静置する。
n＝2 で測定する場合の、各混合溶液のマイクロプレートへの分注(配置)例を図 4-1-7 に示す。

標準物質
1

2

A

DMSO

DMSO

B

STD7

STD7

C

STD6

STD6

D

STD5

STD5

E

STD4

STD4

F

STD3

STD3

G

STD2

STD2

H

STD1

STD1

試料１
3
試料
1-1
試料
1-2
試料
1-3
試料
1-4
試料
1-5
試料
1-6
試料
1-7
試料
1-8

図 4-1-7

4
試料
1-1
試料
1-2
試料
1-3
試料
1-4
試料
1-5
試料
1-6
試料
1-7
試料
1-8

試料２
5
試料
2-1
試料
2-2
試料
2-3
試料
2-4
試料
2-5
試料
2-6
試料
2-7
試料
2-8

6
試料
2-1
試料
2-2
試料
2-3
試料
2-4
試料
2-5
試料
2-6
試料
2-7
試料
2-8

試料３
7
試料
3-1
試料
3-2
試料
3-3
試料
3-4
試料
3-5
試料
3-6
試料
3-7
試料
3-8

8
試料
3-1
試料
3-2
試料
3-3
試料
3-4
試料
3-5
試料
3-6
試料
3-7
試料
3-8

試料４
9
試料
4-1
試料
4-2
試料
4-3
試料
4-4
試料
4-5
試料
4-6
試料
4-7
試料
4-8

10
試料
4-1
試料
4-2
試料
4-3
試料
4-4
試料
4-5
試料
4-6
試料
4-7
試料
4-8

試料５
11
試料
5-1
試料
5-2
試料
5-3
試料
5-4
試料
5-5
試料
5-6
試料
5-7
試料
5-8

12
試料
5-1
試料
5-2
試料
5-3
試料
5-4
試料
5-5
試料
5-6
試料
5-7
試料
5-8

96 ウェルマイクロプレート上での試料の配置例

一次反応終了後、プレートウォッシャーで反応液を除去し、各ウェルを洗浄液 300L で 4 回洗浄する。洗
浄後、ペーパータオル上で抗原固相マイクロプレートをタッピング(強く十分に叩く)し、洗浄液を完全に除去する。
(注 4) 反応温度が高くなる(8℃以上)と感度が低下する場合がある。

4.6

二次免疫反応

洗浄した抗原固相マイクロプレートに希釈調製した二次抗体溶液を 100L/well ずつ分注する。分注後、プレート密閉シールで抗原固相マイクロプレートを密閉し、室温(25℃前後)で 60 分間反応させる。
二次免疫反応終了後、各ウェルを洗浄液 300L で 6 回洗浄する。洗浄後、タッピング(強く十分に叩く)で洗浄液を完全に除去する。なお、マイクロプレートの洗浄には、プレートウォッシャーを使用すること。

171

4.7

発色反応

洗浄した抗原固相マイクロプレートに発色基質液を 100L 添加し、室温(25℃前後)で 30 分間反応させる(要遮光)。試料数が多いときは、各試料の発色反応時間が一定になるようにすばやく分注操作を行うことが望ましい。発色反応後、反応停止液を各ウェルに 100L 添加し、反応を停止させる。
4.8

吸光度測定

抗原固相マイクロプレート外側の底面に付着した汚れや水分を、柔らかなペーパータオル等できれいに拭き取った後、波長 450nm における吸光度を吸光マイクロプレートリーダーで測定する(注 5)。
(注 5) 吸光度測定は反応停止後、速やかに行うこと(5 分以内が望ましい)。

4.9

測定操作時の留意事項

1) 一次免疫反応、二次免疫反応、発色反応の反応時間及び反応温度は所定の条件で必ず行うこと。
2) 一次抗体溶液をマイクロチューブに分注した後は、速やかに混合攪拌すること。
3) マイクロチューブから抗原固相マイクロプレートへの分注操作は素早く行い、室温で長時間(5 分以上)放置することがないように注意すること。
4) 抗原固相マイクロプレートの洗浄後は、次の試薬を分注する前に、残液が極力尐なくなるようにタッピ
ング(強く十分に叩く)を行い、残液を除去すること。
5) 発色反応の際に異常発色が認められる場合は、二次抗体による非特異反応が考えられる。抗原固相マイ
クロプレートの洗浄条件を再検討し、ウェル内の二次抗体が十分除去できる洗浄条件に設定すること。
6) 反応停止液を分注した後は、5 分以内に吸光度を測定することが望ましい。

５．定量

5.1

検量線の作成標準物質(TCP)の濃度に対して吸光度をプロットし、検量線を作成する。
1) 標準物質
2,4,5-トリクロロフェノール-グリシルグリシン(略称 TCP 標準物質)2) 標準溶液の調製
表 4-1-2 に検量線作成用標準液の調製例を示す。まず、TCP 濃縮標準溶液を試料希釈用 DMSO で 5 倍に希釈して STD1 を調製する。次に、STD1 から一定量を分取して試料希釈用 DMSO で 4 倍に希釈してSTD2 を調製する。同様の操作で順次 4 倍希釈操作を行えば、表 4-1-2 に示す濃度の STD1～STD7 を調製することができる。なお、TCP 標準物質を含まない試料希釈用 DMSO のみをブランクとする。
表 4-1-2 検量線作成用標準溶液の調製例
単位ng/well
ng/mL

STD1
5000
200000

STD2
1250
50000

STD3
313
12500

STD4
78.1
3125

STD5
19.5
781

STD6
4.88
195

STD7
1.22
48.8

ブランク
0
0

3) 検量線の作成
各濃度に調製した TCP 標準溶液のキット測定を行い、吸光マイクロプレートリーダーにより波長450nm における吸光度を測定する。TCP 標準溶液の吸光度測定は、必ず試料測定と同一の抗原固相マイ

172クロプレートで同時に行うこと。TCP 標準物質設定濃度及び吸光度から、下記に示す 4-パラメーターの式の各係数(A～D)を算出(吸光マイクロプレートリーダーコントロールソフトを用いても良い)する。検量線作成の例を図 4-1-8 に示す。

𝐴−𝐷
+𝐷
𝑥 𝐵
1+
𝐶
ここに、x ： 実測濃度(ng/mL)𝑦=y ： 吸光度A ： 0 濃度の吸光度
B ： 曲線部分の傾き
C ： IC50 (50％阻害濃度)(ng/mL)
D ： 最小吸光度各係数

吸光度

B/B0
(％)

100
80

ブランク

0

1.987

100

STD7

48.8

1.825

95.3

STD6

195

1.694

87.4

STD5

781

1.212

64.3

STD4

3125

0.613

30.6

STD3

12500

0.164

8.9

STD2

50000

0.045

2.1

STD1

2000000.017

0.8

B/B0 (%)

TCP 標準物質濃度(ng/mL)

60
40
20
0
10

100

1000

10000

100000 1000000

TCP標準品濃度(ng/ml )図 4-1-8 検量線作成の例

5.2

検量線の確認及び感度変動の管理図による確認

検量線作成用標準溶液の測定操作により得られたデータから測定量(毒性等量)を求め、管理図に記録し保存する。以下に、排出ガスの例を示す。
1) 検量線における IC50(B/B0 で 50%)付近の吸光度から、4-パラメーターの式を用いて標準物質濃度を算出する。表 4-1-3 の例では、STD5 における測定値の B/B0 がおよそ 60%(59～63%)に相当する。
2) 標準物質濃度に希釈倍率(例では 256)を乗じた数値を換算式に代入し、測定量(毒性等量)(ng-TEQ/mL)を算出する。（表 4-1-3 参照）
3) 得られた測定量(毒性等量)(ng-TEQ/mL)を平均(例：(5.4+5.4)/2=5.4)し、管理図に記録し保存する。
4) IC50 付近における測定量(毒性等量)の工程平均(μ)と標準偏差(σ)を算出し、±2σ を管理限界とする。変動係数(CV%)は 20%以内に収まることが望ましい。測定媒体ごとの管理限界等の数値例を表 4-1-4 に示す。
5) １点でも管理限界を超えた場合は、原因の究明と改善を行うと共に、再測定する。改善のために講じた措置及び再測定の結果について、記録をする。

173

表 4-1-3 管理図用データ導出例(排出ガス)
TCP 標 準
物質濃度

n＝2

n=1
測定値
(吸光度)
1.929
1.787
1.587
1.138
0.507
0.147
0.032
0.018

ブランク
STD7
STD6
STD5
STD4
STD3
STD2
STD1

B/B0
(％)
100
92.6
82.3
59.0
26.3
7.6
1.7
0.9

TEQ
測定値
(ng-TEQ/mL) (吸光度)
1.810
1.796
1.584
5.4
1.136
0.551
0.147
0.033
0.014

標準物質濃度(ng/mL)→ 196227

B/B0
(％)
100
99.2
87.5
62.8
30.4
8.1
1.8
0.8

標準物質濃度(ng/mL)TEQ(ng-TEQ/mL)→ 197126

5.4

表 4-1-4 管理図用データ算出例
測定媒体
工程平均(ng-TEQ/mL)
測定値の標準偏差(ng-TEQ/mL)
測定値の変動係数(%)
管理限界(ng-TEQ/mL)

μ
σ
C.V.
μ±２σ

排出ガス
5.49
0.32195.86
4.85～6.13

ばいじん及び燃え殻
9.72
0.48374.98
8.75～10.7

IC50近傍毒性等量（ng-TEQ/ml）

0.80
0.75

μ+2σ

0.70
0.65

μ

0.60
0.55

μ-2σ

0.50
0.45
0

5

10

15
20
測定回数（回）

25

30

35

図 4-1-9 管理図の例(排出ガス)

5.3

測定試料の定量

各試料の吸光度を検量線に内挿し、阻害率(B/B0) 20～80%の範囲でかつ試料の希釈倍率の逆数と吸光度から求めた標準物質換算濃度(実測濃度)との間に良好な直線関係(希釈直線性)が得られる希釈段階について、標
準物質換算濃度(実測濃度)に各希釈倍率を掛けた値の平均値（濃度の平均値）を算出する。最後に次式により実測濃度(排出ガスにおいては ng/m3N、ばいじん及び燃え殻においては ng/g)を算出する。

𝐶𝑆 = 𝑋 ×

𝑉𝐸 𝑣
×
𝑉′𝐸 𝑉

ここに、CS ： 実測濃度（ng/m3N 又は ng/g）

X： 濃度の平均値(ng/mL)

VE ： 抽出液量 (mL)174

V’E ： 抽出液分取量(mL)v： 測定用試料の液量(mL)V： 試料採取量（m3N 又は g)(備考) 排出ガスの酸素濃度による補正は、次式による。

𝐶=

9
× 𝐶𝑆
21 − 𝑂𝑆

ここに、C

Os
Cs

： 酸素の濃度 On における実測濃度(ng/m3N)： 排出ガス中の酸素の濃度(注 6)(%)： 排出ガス中の実測濃度(ng/m3N）(注 6) 排出ガス中の酸素の濃度が 20%を超える場合は、Os=20 とする。

６．検出下限及び定量範囲

6.1

検出下限及び定量範囲の確認

検出下限及び定量範囲の確認は、定量値の変動係数(CV%)が 30%以下となる点を検出下限とし、20%以下となる上下 2 点間を定量範囲とする方法で行う。下記に、排出ガスにおいて n=5 で測定した例を示す。
1) 検出下限等算出用標準溶液の調製例(1) TCP 濃縮標準溶液を試料希釈用 DMSO で 8 倍に希釈し、STD1 を調製する。
(2) STD1 から一定量を分取し、試料希釈用 DMSO で 4 倍に希釈して STD2 を調製する。
(3) 以下、同様の手順で順次 4 倍希釈液(STD3～STD6)を調製し、検出下限等算出用標準溶液として TCP
標準物質の 6 段希釈系列を調製する。
(4) さらに、TCP 標準物質を含まない試料希釈用 DMSO のみをブランクとする。(表 4-1-5 参照)
表 4-1-5 検出下限等算出用標準溶液
STD1125000

単位
ng/mL

STD2
31250

STD3
7813

STD4
1953

STD5
488

STD6
122

ブランク
0

2) 検出下限及び定量範囲の算出例(1) 調製した検出下限等算出用標準溶液を４．測定操作に従って測定する。n=5 の 7 段希釈系列で測定する場合のマイクロプレートへの分注操作の一例を図 4-1-11 に示す。
(2) 吸光度（測定値）を測定して、4-パラメーターの式の各係数(A～D)を算出(吸光マイクロプレートリ
ーダーコントロールソフトを用いても良い)し、吸光度から検出下限等算出用標準溶液相当量(定量値)を算出する。
(3) 検出下限等算出用標準溶液相当量(定量値：ng/mL)を下式に代入し、測定量(毒性等量)に変換する。

定量値
測定量 毒性等量 (ng − TEQ/mL) = 0.0669 ×1000

0.8301(4) 各希釈濃度域における測定量(毒性等量)の平均値、標準偏差(σ)及び変動係数(CV%)を算出する。(表4-1-6 参照)
(5) 横軸に測定量(毒性等量)、縦軸に変動係数をプロットした精度プロファイルを作成する。(図 4-1-11
参照)

175

(6) 作成した精度プロファイルより、定量値の変動係数(CV%)が 30％以下となる点を読み取り検出下限とする。また、定量値の変動係数（CV%)が 20%以下となる上下 2 点を読み取り定量範囲とする。

A
B
C
D
E
F
G

1
ﾌﾞﾗﾝｸ
DMSO
STD
6.1
STD
5.1
STD
4.1
STD
3.1
STD
2.1
STD
1.1

2
ﾌﾞﾗﾝｸ
DMSO
STD
6.2
STD
5.2
STD
4.2
STD
3.2
STD
2.2
STD
1.2

3
ﾌﾞﾗﾝｸ
DMSO
STD
6.3
STD
5.3
STD
4.3
STD
3.3
STD
2.3
STD
1.3

4
ﾌﾞﾗﾝｸ
DMSO
STD
6.4
STD
5.4
STD
4.4
STD
3.4
STD
2.4
STD
1.4

5
ﾌﾞﾗﾝｸ
DMSO
STD
6.5
STD
5.5
STD
4.5
STD
3.5
STD
2.5
STD
1.5

6

7

8

9

10

11

図 4-1-10

96 ウェルマイクロプレート上での検出下限等算出用標準溶液の配置例

H

表 4-1-6 変動係数の算出例（排出ガス）

Std.6
Std.5
Std.4
Std.3
Std.2
Std.1

標準液濃度
(ng-TEQ/mL)
0.012
0.037
0.12
0.37
1.2
3.7

測定結果（ng-TEQ/mL）
1
2
3
4
5
0.013
0.0071
0.011
0.014
0.016
0.037
0.034
0.035
0.037
0.036
0.12
0.12
0.12
0.12
0.13
0.35
0.34
0.37
0.35
0.34
1.1
1.1
1.1
1.2
1.1
8.8
15
15
11
6.5

平均
0.012
0.036
0.12
0.35
1.1
11

50
45
40
35

ＣＶ=30%

30

ＣＶ(%)

Std

25

ＣＶ=20%

20
15
10
5
0

0.01

0.1

1

毒性等量(ng-TEQ/m l )図 4-1-11

精度プロファイルの例(排出ガス)

176

10

σ
0.00340.00150.0034
0.014
0.064
3.8

CV
(%)
28.3
4.2
2.8
4.0
5.7
33.8

12

上記方法により算出した排出ガス、ばいじん並びに燃え殻における検出下限及び定量範囲を表 4-1-7 及び表
4-1-8 に示す。なお、本法により算出した検出下限及び定量範囲は、イムノアッセイに供する DMSO 溶液 1mL
中の毒性等量(ng-TEQ/mL)である。
最終的に 1mL に定容した試料(DMSO 溶液)から 80L を分取し、これに一次免疫反応用緩衝液 80L 及び一次抗体溶液 160L を加えて攪拌混合した溶液 100L をウェルに分注するため、１ウェル当たりの試料分
注量は 25L となる。本操作は測定媒体に関わらず同じである。
表 4-1-7 検出下限
検出下限
(ng-TEQ/well)(ng-TEQ/mL)

測定媒体

0.000280.00023

排出ガス
ばいじん及び燃え殻

0.011
0.009

表 4-1-8 定量範囲
定量範囲
(ng-TEQ/well)(ng-TEQ/mL)

測定媒体

0.00043～0.055
0.00035～0.075

排出ガス
ばいじん及び燃え殻

6.2

0.017～2.2
0.014～3.0

試料における検出下限及び定量下限の確認

前処理に供した試料量と前処理を経た最終検液量等から、6.1 の操作により得られた検出下限及び定量下限を用いて理論的に算出する。試料における検出下限及び定量下限は、試料採取量や最終検液量等により異なるため、表 4-1-9 及び表 4-1-10 に例を示す。

表 4-1-9 試料における検出下限
キット
測定媒体

排出ガス
測定媒体
ばいじん

検出下限

サンプル調製媒体中濃度

最終酸素濃度 分取量/総抽出液量
検液量

希釈
倍数

実測濃度

分注量

ガス量

(ng-TEQ/well) (L/well)

(m3N)

(％)

(mL/mL)(mL)－(ng-TEQ/m3N)

4.0

12.0

10/20

1.0

1.0

0.00550.00028

25

キット
検出下限
分注量 試料量(ng-TEQ/well) (L/well)(g)
0.00023

25

10.0

キット
測定媒体
検出下限
分注量 試料量(ng-TEQ/well) (L/well)(g)
燃え殻0.0002325
50.0

サンプル調製
分取量/総抽出液量
最終検液量(mL/mL)(mL)
10/20
サンプル調製
分取量/総抽出液量(mL/mL)
10/20

177

1.0
最終検液量
(mL)
1.0

媒体中濃度
希釈倍数 実測濃度－(ng-TEQ/g)
1.00.0018

媒体中濃度
希釈倍数 実測濃度－(ng-TEQ/g)
1.00.00036

表 4-1-10試料における定量範囲（注.7）
キット

測定媒体

排出ガス

測定媒体

定量範囲値

サンプル調製分注量

ガス量(ng-TEQ/well) (L/well)

(m3N)

(％)

4.0

12.0

0.00043～
25
0.055
キット
定量範囲値
分注量

燃え殻

最終
検液量

希釈
倍数

実測濃度

(mL/mL)(mL)－(ng-TEQ/m3N)

10/20

1.0

酸素濃度 分取量/総抽出液量

試料量(ng-TEQ/well) (L/well)(g)
0.00035～
ばいじん
25
10.0
0.075
キット
測定媒体 定量範囲値
分注量 試料量(ng-TEQ/well) (L/well)
0.00035～
25
0.075

媒体中濃度

サンプル調製
分取量/総抽出液量
最終検液量(mL/mL)

(mL)

10/20

1.0

サンプル調製
分取量/総抽出液量
最終検液量

(g)

(mL/mL)

(mL)

50.0

10/20

1.0

0.0085～1.1
媒体中濃度
希釈倍数 実測濃度－(ng-TEQ/g)
0.0028～
1.0
0.60
媒体中濃度
希釈倍数 実測濃度－(ng-TEQ/g)
0.00056～
1.0
0.12
1.0

(注 7) 本例では、定量下限及び定量上限の両方を求めた。

７．測定量(毒性等量)への換算

測定量(毒性等量)は下記の換算式を用いて実測濃度から算出し、結果を記録する。また、使用した換算式も含め、測定量の算出に至った計算過程を説明できる資料を作成する。
1) 排出ガス
希釈系列 1mL 当たりの実測濃度(ng/mL)×希釈系列希釈倍数(以下「Q」と表記)から換算式を用いて測定量(毒性等量、排出ガス総抽出液当たり)への換算を行う。

測定量 毒性等量 (ng − TEQ/m3 N ) = 0.0669 ×
ここに、Q

𝑄 0.8301
𝑣
𝑉𝐸
×
×
1000
𝑉′𝐸 𝑉

： 希釈系列希釈倍数に実測濃度を乗じたもの (ng/mL)

VE ： 抽出液量 (mL)V’E ： 抽出液分取量(mL)v： 測定用試料の液量(mL)V： 試料採取量（m3N)2) ばいじん及び燃え殻
希釈系列 1mL 当たりの実測濃度(ng/mL)×希釈系列希釈倍数(以下「Q」と表記)から換算式を用いて測定量(毒性等量、ばいじん総抽出液当たり)への換算を行う。

測定量(毒性等量)(ng − TEQ/g) = 0.0601 ×
ここに、Q

𝑄 0.9605
𝑣
𝑉𝐸
×
×
1000
𝑉′𝐸 𝑉

：希釈系列希釈倍数に実測濃度を乗じたもの (ng/mL)

VE ：抽出液量 (mL)V’E ：抽出液分取量(mL)v：測定用試料の液量(mL)

178

V

：試料採取量（g)なお、測定結果の報告様式については、第２章第２節「測定結果の報告」を参照すること。

８．換算係数の確認
尐なくとも 6 ヶ月に 1 回、HRGC/HRMS 法によって測定された試料について、本測定法による測定を行い、HRGC/HRMS 法により得られた測定量（毒性等量）と本測定法で得られた実測濃度より換算係数を算出し、換算係数と比較する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認を行う。得られた換算係数が、第６節記載の換算係数と大きく換算係数が乖離する場合又は相関が悪い場合には、原因の究明を行い、その結果及び講じた措置を記録する。
試料は、片方について HRGC/HRMS 法に定められた方法により前処理を行い、残りについては生物検定法に定められた方法により前処理を行って試料を調製する。
排出ガス試料については、JIS K 0311 に従い抽出までを行った抽出試料（ただし、アッセイに影響を及ぼすサンプリングスパイク及び抽出工程でのクリーンアップスパイクの添加は行わない）を分割し、片方は JIS
K 0311 に定められた方法により測定量（毒性等量）を求め、残りは、本法 4.1～4.3 及び 5.3 に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を算出する。
ばいじん及び燃え殻試料については、平成4年厚生省告示第192号別表第一(第一号関係)(2)に準拠した方法（ただし、同表ウ(イ)の内標準物質の添加の操作は行わない）により測定量（毒性等量）を求め、残りは、本法4.1～4.3及び5.3に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を算出する。

179

第６節 参考資料「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(排出ガス試料)」
濃度既知の試料（この例では n=29、n=20 以上が望ましい）を本測定方法により測定し得られた実測濃度(ng/mL)と、HRGC/HRMS 法により測定し得られた試料中の毒性等量(ng-TEQ/mL)の関係から測定量(毒性等量)への換算式を算出した（図 4-1-12 参照）。
排出ガス n=29
100

y = 0.0669(x/1000) 0.8301
r 2 = 0.9783

毒性等量（ng-TEQ/ml ）

10

1

0.1

0.01

0.001

0.0001
1

10

100

1000

10000

1000001000000

実測濃度（ng/ml ）図 4-1-12

換算係数算出(例)(排出ガス)「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(ばいじん及び燃え殻試料)」
濃度既知の試料（この例では n=27、n=20 以上が望ましい）を本測定方法により測定し得られた実測濃度(ng/mL)と、HRGC/HRMS 法により測定し得られた試料中の毒性等量(ng-TEQ/mL)の関係から測定量(毒性等量)への換算式を算出した（図 4-1-13 参照）。
ばいじん・燃え殻

n=27

100

毒性等量（ng-TEQ/m l ）y = 0.0601(x/1000) 0.9605
r 2 = 0.9415
10

1

0.1

0.01
100

1000

10000

1000001000000

実測濃度（ng/ml ）図 4-1-13

換算係数算出(例)(ばいじん及び燃え殻)
180

その２

前処理に、多層シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、磁性ビーズ固定化抗ダイオ

キシン類モノクローナル抗体及び酵素標識抗原を用いた直接競合酵素免疫測定法を利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 2 の 2)

第１節 測定方法の概要

対象媒体ごとに試料を採取し、ダイオキシン類を抽出後、クリーンアップを行い、抗ダイオキシン類モノ
クローナル抗体を用いた直接競合酵素免疫測定法による測定により定量する。試料採取から測定値確定までのフローの例を図4-2-1に示す。
採取試料
抽出
クリーンアップ
抗ダイオキシン類モノクローナル抗体を用いた直接競合酵素免疫測定法による測定
標準物質（実測濃度）の定量
換算係数による測定量（毒性等量）への換算
測定値確定
図4-2-1

試料採取から測定値確定までのフローの例

第２節 用語の定義

1) 抗ダイオキシン類抗体

抗ダイオキシン類抗体産生マウス細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させることで自律増殖能を持ったハイブリドーマを作製し、単一の抗体産生細胞を選択する。ここではこの抗体産生細胞により得られる、ダイオキシン類に特異的に反応する性質を有するマウスモノクローナル抗体を指す。
2) 免疫反応試薬

磁性ビーズに固定化された抗ダイオキシン類抗体とアルカリ性ホスファターゼ標識抗原とが、凍結乾燥体として試薬カップに封入されている。
3) 直接競合酵素免疫測定法

サンプル中に含まれる微量の目的物質を、酵素標識した抗原と固体化した抗体を用い、直接抗原抗体反応を行って目的物質を測定する方法。
4) 蛍光物質の生成速度

酵素基質として4-メチルウンベリフェリルりん酸を一定量添加し、酵素反応により生成した蛍光物質（4-メチルウンベリフェロン）の蛍光強度を落尃型蛍光光度計を用いて、励起波長363 nm、蛍光波長447 nmで測定し、蛍光物質の生成速度（nmol/(L・s)、或いはRate値）を磁気撹拌下に37℃で5分間測定して、実測濃度（標準物質濃度に換算された濃度）を算出する。
181

5) B/B0

測定対象について得られた蛍光物質の生成速度の平均値（B）を標準物質濃度ゼロの蛍光物質の生成速度の平均値（B0）で割った%値。
6) 精度プロファイル
7) TCAP

精度確認用コントロール濃度と変動係数（CV%）との関係図。

抗ダイオキシン類抗体に反応する化合物。5-オキソ-5-[(2,4,5-トリクロロフェニル)アミノ]ペンタン酸であり、検量線を作成するための標準品として使用される。

第３節 試料採取方法に関する特記事項

１．試料ガスの採取量
試料ガスの採取量は、次のような手順によって決定する。採取時間については、その目的に応じて試料ガスの発生状況等を十分考慮して代表試料が採取できるようにしなければならない。

1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1) で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小の試料ガスの量を算出する。

𝑉=

𝑄𝐷𝐿 × 𝑣 𝑉𝐸
1
× ′ ×
𝑘
𝑉 𝐸 𝐶𝐷𝐿

ここに、 V：

測定に必要な最小の試料ガスの量（m3N）

QDL ： 標準物質における検出下限（ng-TCAP/mL, DMSO 溶液中）k：

測定量（毒性等量）への換算係数v：

測定用試料の液量（mL）

VE：

抽出液量（mL）

V’E：

抽出液分取量（mL）

CDL ： 必要となる試料ガスにおける検出下限（ng-TEQ/m3N）4) 算出された最小の試料ガスの量以上を試料ガスの採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
（例）5 ng-TEQ/m3N レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合（必要となる試料ガスにおける検出下
限は 0.17 ng-TEQ/m3N）
抽出液を 20 mL に定容し、その抽出液から 10 mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に 0.5mL の測定用試料溶液に調製する場合の試料ガスの採取量を以下に示す。
なお、標準物質における検出下限は 26.3×103 ng-TCAP/mL、排出ガスの測定量への換算係数は、200.6×103 を用いた。換算係数は以下により求めた。
(1)

本測定方法による実測濃度を Y、HRGC/HRMS 法による毒性等量を X とし、Y/X を求める。

(2)

全試料について Y/X を求め、全試料の幾何平均値を換算係数とする。

𝑉=

26.3 × 103 × 0.5 20
1××= 0.77𝑚3 𝑁
3200.6 × 10
10 0.17

２．ばいじん及び燃え殻試料の採取量
ばいじん及び燃え殻試料の採取量は、次のような手順によって決定する。

1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
182

2) 特に指定がない限り、1) で決定した濃度の 1/30 以下にばいじん及び燃え殻試料における検出下限を設定する。

3) 以下の式によって測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量を算出する。

𝑊=

𝑄𝐷𝐿 × 𝑣 𝑉𝐸
1
× ′ ×
𝑘
𝑉 𝐸 𝐶𝐷𝐿

ここに、 W：

測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量（g）

QDL ： 標準物質における検出下限（ng-TCAP/mL, DMSO 溶液中）k：

測定量（毒性等量）への換算係数v：

測定用試料の液量（mL）

VE：

抽出液量（mL）

V’E：

抽出液分取量（mL）

CDL ： 必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限（ng-TEQ/g）4) 算出された最小のばいじん及び燃え殻試料の量以上をばいじん及び燃え殻試料の採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
（例）3 ng-TEQ/g レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合（必要となる試料における検出下限は 0.1
ng-TEQ/g）
抽出液を 10 mL に定容し、その抽出液から 10 mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に 0.5mL の測定用試料溶液に調製する場合のばいじん及び燃え殻試料の採取量を以下に示す。
なお、標準物質における検出下限は 26.3×103 ng-TCAP/mL、排出ガスの測定量への換算係数は、175.5×103 を用いた。換算係数は以下により求めた。
(1)

本測定方法による実測濃度を Y、HRGC/HRMS 法による毒性等量を X とし、Y/X を求める。

(2)

全試料について Y/X を求め、全試料の幾何平均値を換算係数とする。

※ばいじん及び燃え殻の換算係数に差は認められないため、両試料を合わせた換算係数を採用する。

𝑊=

26.3 × 103 × 0.5 10
1××= 0.749𝑔
3
175.5 × 10
10 0.1183

第４節 試料の前処理

１．試料の前処理の概要

採取した試料は、抽出を行う。抽出液は必要に応じて分取を行い、クリーンアップに移る。図4-2-2に採取
試料の抽出から前処理までのフローの例を示す。

採取試料
抽出
抽出液
一部分取

（省略可能）

硫酸処理（省略可能）

多層シリカゲル／活性炭カラムクロマトグラフ操作
測定用試料
図4-2-2

採取試料の抽出から前処理までのフローの例

２．試薬

試料の前処理に用いる試薬は、次による。これらの試薬は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
JIS K0557 に規定する A4（又は A3）の水、又は同等の品質のもの

1)

水

2)

アセトン

JIS K8040 に規定するもの、又は同等の品質のもの

3)

トルエン

JIS K8680 に規定するもの、又は同等の品質のもの

4)ジクロロメタン

5)

ヘキサン

6)

ジメチルスルホキシド（DMSO）

7)

硫酸ナトリウム

8)

デカン

9)

硫酸

JIS K8117 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8825 に規定するもの、又は同等の品質のもの
JIS K9702 に規定するもの、又は同等の品質のもの（注１）

JIS K8987 に規定するもの、又は同等の品質のもの

測定に支障の無い品質のもの
JIS K8951 に規定するもの、又は同等の品質のもの

10) 多層シリカゲルカラム JIS K0311 に規定されたシリカゲル類と同等の分離性能を有するもの
11) 活性炭カラム

活性炭を分散させたシリカゲル、又はこれと同等の分離性能を持つもの

12) 円筒ろ紙 ソックスレー抽出に用いる。ガラス製又は石英製で、必要量の風乾した試料が入るサイズのもの。使用に先立ってアセトン洗浄し、さらにトルエン等でソックスレー抽出を行うか、又は 450℃
以上で 4 時間以上加熱処理する
18413) ガラス繊維ろ紙 孔径 0.5 m 程度のもの、ブフナー漏斗に用いる
14) 窒素 JIS K1107 に規定する高純度窒素 2 級（注１） ジメチルスルホキシド（DMSO）の品質変動は、測定結果に影響を及ぼすことがあるためロットの変更時等には注意する。
３．器具及び装置

試料の前処理に用いる器具及び装置は、次による。これらの器具及び装置は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
3.1 ガラス器具
JIS R3503 及びJIS R3505 に規定するもの。コックの部分がふっ素樹脂製のものを用いてもよい
3.2 ソックスレー抽出器
JIS R3503 に規定するもの、又はこれと同等の品質のもの。接続部にグリースを使用してはならない
3.3 濃縮器
クデルナ－ダニッシュ濃縮器(KD)、ロータリーエバポレータ又は遠心エバポレータ。接続部にグリースを使用してはならない
3.4 その他
吸引ポンプ、最高使用圧力が0.25 MPaの真空ポンプ、又は同等の性能を有するもの

４．前処理操作

4.1 試料量の記録採取した試料は、試料量を記録する。
4.2 抽出1) 排出ガスJIS K0311 6.4 により、抽出を行う。ただし、内標準物質の添加の操作は行わない。図 4-2-3 に排出ガ
ス試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

185

樹脂

円筒ろ紙

吸収プローブ洗液

吸収液、洗液ろ過

残さ

HCl（2 mol/L）処理ろ液

ダスト 1 g に対して 20 mmol
以上の塩酸

ろ過

残さ

ろ液

ソックスレー抽出液－液振とう抽出（ﾄﾙｴﾝ、16 時間以上）

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ（3 回）

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ層

水層：検体又は試料

濃縮

：作業
抽出液
図4-2-3：物又は試料

排出ガス試料の抽出液調製フローの例

1862) ばいじん及び燃え殻
平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一（第一号関係）(2)又は下記の方法により抽出を行う。ただし、内標準物質の添加の操作は行わない。図 4-2-4 にばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例
を示す。

試料

含水率測定
HCl（2 mol/L）処理

試料 1 g に対して 20 mmol
以上の塩酸

ろ過

ろ液

残さ

ディーンスタークアダプタ付ソックスレー抽出（トルエン、16 時間以上）：検体又は試料
濃縮：作業：物又は試料抽出液
図4-2-4

ばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例

187

4.3 クリーンアップ
図4-2-5にクリーンアップフローの例を示す。

抽出液

一部分取

濃縮
夾雑物の多い場合

硫酸処理
夾雑物の多い場合

多層シリカゲル／活性炭
カラムクロマトグラフ操作

濃縮・DMSO 転溶

測定用試料
図4-2-5： 検体又は試料： 作業： 省略できる作業

クリーンアップのフローの例

1) 抽出液の分取(1) 抽出液を分取して一部を測定に使用する場合には、定容した抽出液から目的に合わせて一部を分取する。
(2) あらかじめ、デカン 0.3 mL をいれた受器に適量の抽出液を入れ、ロータリーエバポレータで乾固寸前まで濃縮する。
2)

精製カラムの作製(1) 多層シリカゲルカラム
ガラスクロマト管（内径 15 mm）に、図 4-2-6 に示すように、下から乾式充填法でフリット、硝酸銀
シリカゲル（1.5 g 程度）、シリカゲル（1.5 g 程度）、硫酸[44%（質量分率）]シリカゲル（7.5 g 程度）、
シリカゲル（2.5 g 程度）、硫酸ナトリウム（2.5 g 程度）、フリットの順に積層する。

188

フリット
硫酸ナトリウム

シリカゲル

44%硫酸シリカゲル

シリカゲル
硝酸銀シリカゲル
フリット
化学修飾シリカゲル等の充填量・充填割合は、試料性状に応じて、適宜変更してもかまわない。
ただし、ダイオキシン類の回収率が得られることを確認しておくこと。

図 4-2-6 多層シリカゲルカラムの例(2) 活性炭カラム（注 2）
ガラスクロマト管（内径 6 mm）に下から乾式充填法でフリット、硫酸ナトリウム（厚さ約 10 mm）、
活性炭分散シリカゲルを 0.3 ± 0.01 g、硫酸ナトリウム（厚さ約 10 mm）、フリットの順に積層する。
（注 2） 活性炭は製造ロットによって、品質変動が考えられるため、内部標準物質（クリーンアップスパイク）を用いて、ロットが変わるたび、添加回収を HRGC/HRMS 法により確認しておくことが望ましい。

3)

クリーンアップ(1) 硫酸処理
JIS K0311「6.4.4 硫酸処理/シリカゲルカラムクロマトグラフ操作又は多層シリカゲルカラムクロマ
トグラフ操作」に準拠した方法。
(2) 多層シリカゲルカラムクロマトグラフ／活性炭カラムクロマトグラフ操作a) 活性炭カラムの上に多層シリカゲルカラムをテフロン製ユニオンで連結し、真空ポンプで脱気した後、ヘキサンを充填する。
b) 濃縮液にヘキサン 1 mL を加え攪拌した後、多層シリカゲルカラムに試料を添加する。
c) ヘキサン 1 mL で抽出液の入っていた容器を洗浄し、洗液をカラムに注入する。
d) ヘキサン 1 mL で同様の操作を行う。
e) カラムにヘキサン 45 mL を流す。
f)

多層シリカゲルカラムを外し、活性炭カラムにトルエン：ヘキサン＝1：9 (v:v)を 40 mL 流す。

g) 活性炭カラムを逆向きにして、トルエン 30 mL を流す。

189

4)

溶媒置換及び測定用試料の保存(1) 3) で得られた溶出液をロータリーエバポレータ等の濃縮器で1 mL程度まで濃縮する。
(2) 濃縮液をガラス試験管（スピッツ形状）に移し、窒素気流下で乾固寸前まで濃縮し、DMSOを0.5 mL
加え撹拌する。
(3) 試料をバイアルに移し、密栓後、室温で暗所に保存する。

第５節 測定１．測定の概要

本方法は、ダイオキシン類の毒性等量との相関性の高い、五塩化ジベンゾフラン類及び六塩化ジベン
ゾフラン類と特異的に反応する磁性ビーズ固定化抗ダイオキシン類モノクローナル抗体及び酵素標識抗原を用いた直接競合酵素免疫測定法によりダイオキシン類の毒性等量を測定する方法である。
5-オキソ-5-[(2,4,5-トリクロロフェニル)アミノ]ペンタン酸（TCAP）を用いて検量線を作成し、試料の蛍光物質の生成速度から算出した実測濃度（標準物質濃度に換算された濃度）を排出ガス、ばいじん及び燃え殻について定められた換算係数で除することにより測定量(毒性等量)を算出する。

２．使用キット、試薬、器具及び装置

2.1 使用キット
使用キット（磁性ビーズ固定化抗ダイオキシン類モノクローナル抗体には、マウス由来の融合細胞（ハイブリドーマ）から収得した五塩化ジベンゾフラン類及び六塩化ジベンゾフラン類を特異的に認識する抗体を、酵素標識抗原には、アルカリ性ホスファターゼで標識された２，４，５－トリクロロフェノール誘導体を、検量線作成用標準品には、TCAP を使用する。
）は、以下の試薬等から構成されるものである。

1) 免疫反応試薬（100テスト分/箱）
試薬カップ20個がひとつの試薬カップトレイに並び、アルミ製の防湿袋に納められている。1回測定
分（試薬カップ1個）には凍結乾燥状態で主成分として抗ダイオキシン類抗体固定化ビーズおよびア
ルカリ性ホスファターゼ標識2,4,5-トリクロロフェノール誘導体が含まれている。

2) 標準品セット（標準品(1)～(6) 各 1 mL 入り各 2 本/箱）
ジメチルスルホキシド（DMSO）溶液であり、以下の濃度の 5-オキソ-5-[(2,4,5-トリクロロフェニル)アミノ]ペンタン酸（TCAP）を含む。
0 g/mL

ダイオキシン類標準品(1)ダイオキシン類標準品(2)約40 g/mL

ダイオキシン類標準品(3)約120 g/mL

ダイオキシン類標準品(4)約360 g/mL

ダイオキシン類標準品(5)約 1,100 g/mL

ダイオキシン類標準品(6)約 3,000 g/mL

ダイオキシン類標準品(6)の濃度は約 3,000 g/mL であるが、標準品セットのロットにより変動があるた
め、保障できる検量域の上限として 2,800 g/mL とする。
190

3) 検体希釈液（4 mL 入り 4 本/箱）
0.01% Triton X-100 を含む水溶液で、標準品及び検体の希釈に適するように調製されている。

4) コントロールセット（レベル 1、レベル 2 各 4 mL 入り各 2 本/箱）
ジメチルスルホキシド（DMSO）溶液であり、以下の濃度の 5-オキソ-5-[(2,4,5-トリクロロフェニル)アミノ]ペンタン酸（TCAP）を含む。
ダイオキシン類コントロール

レベル 1

約 180 g/mL

ダイオキシン類コントロール

レベル 2

約 360 g/mL5) 分注液（100 mL 入り 4 本/箱）
主成分として 1 びん（100 mL）あたり、プロクリン 300（保存剤）0.03 g を含む。

6) 洗浄液（100 mL 入り 4 本/箱）
主成分として 1 びん（100 mL）あたり塩化ナトリウム 0.88 g、サポニン 0.05 g を含む

7) 基質セット
基質（凍結乾燥品、100 mL 用 2 本/箱）：
主成分として 1 びんあたり 4-メチルウンベリフェリルりん酸 26 mg を含む
基質溶解液（100 mL 入り 2 本/箱）：
主成分として 100 mL あたり 2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール 4.5 g を含む
2.2 試薬測定に用いる使用キット以外の試薬は、次による。

1) 水 JIS K0557 に規定する A4（又は A3）の水、又は同等の品質のもの
2) ジメチルスルホキシド（DMSO）
JIS K9702 に規定するものまたは同等の品質のもの（注１）（注１） ジメチルスルホキシド（DMSO）の品質変動は、測定結果に影響を及ぼすことがあるためロットの変更時等には注意する。

2.3 器具及び装置
測定に用いる器具及び装置は、次による。

1)

酵素免疫測定装置

2)

ボルテックスミキサー（試験管ミキサー）

3)

冷蔵庫

4)

マイクロピペット（10～100L、100～1,000L）

5)

マイクロピペットチップ

6)

ガラス試験管（13 mm X 100 mm：スピッツ形状）

7)

試験管用ラック

8)

酵素免疫測定装置用サンプルチップ（1,000 本/箱）

9)

検体処理用カップ（200 カップ/箱）

10) 検出器検定用カップ（200 カップ/箱）
11) パスツールピペット
12) 電子天秤（計量範囲：0.001 g～約 200 g）

191

３．キットの取り扱い

以下の取り扱い上の注意点を遵守すること。

1) ダイオキシン類の各試薬類は使用するまで 2～8℃で保存し、15～25℃に戻してから使用すること。
2) ダイオキシン類の有効期間は、未開封の場合は、遮光下、2～8℃保存で、製造日より 1 年間有効である。

(1) 免疫反応試薬

ダイオキシン類免疫反応試薬の防湿袋を開封して使用する。開封後は、15～25℃

放置で1日、2～8℃保存で7日間有効である。

(2) 標準品

ダイオキシン類標準品セット（標準品(1)～(6)）及びコントロールセット（レベル1、レベル2）はジメチルスルホキシド（DMSO）溶液であり、DMSOの融点は18.5℃のため、使用の際には20～25℃に戻して融解、十分に混和してから使用する。標準品はいずれも、開封後は密封
し15～25℃保存で1日間有効である。コントロールは、開封後は密封し15～25℃保存で30日間有効である。

(3) 検体希釈液

ダイオキシン類検体希釈液は液体なので、開封後15～25℃で使用する。開封後は密封し15～25℃保存で30日間有効である。

(4) 基質液

基質セット中の基質1びんに基質溶解液1びん（100 mL）を加えて基質液を調製する。

調製後は、遮光下、15～25℃保存で3日間、2～8℃保存で7日間有効である（直尃日光、紫外線に当てないように注意する）。

(5) 洗浄液

洗浄液を装置付属の洗浄液タンクに入れる。15～25℃放置で30日間有効である。

(6) 分注液

分注液を装置付属の分注液タンクに入れる。15～25℃放置で30日間有効である。

(7) 検体処理用カップ

検体処理用カップ（STCカップ）は酵素免疫測定装置の取扱説明書に従い、試薬カップアダプタにセットする。有効期限はないが、15～25℃で保存する。

3) キットを保管する場合は、保存場所、保存方法、汚染の配慮、温度及び湿度の情報を記録し、保存すること。

４．測定操作冷蔵（2～8℃）保存されている試薬類は、15～25℃に戻してから使用する。
4.1

免疫反応試薬アルミ製の防湿袋（試薬カップ20個がひとつの試薬カップトレイに収納）を破り、試薬カップを取り出して使用する。
4.2

標準品セット
標準品セット及びコントロールセットはジメチルスルホキシド（DMSO）溶液であり、調製不要である。

各標準品及びコントロールは20～25℃に戻してから開封して使用する。
4.3

その他の試薬・サンプルチップ
分注液、洗浄液、基質液、検体希釈液及び酵素免疫測定用サンプルチップは調製不要である。酵素免疫測定装置の取扱説明書に従いセットする。
4.4

試料希釈系列の調製
前処理の後、DMSO溶液とした試料は、適宜、DMSOにより希釈する。TEQ濃度が全く未知の試料の場
192

合、1例として、原液、3倍希釈液、9倍希釈液、27倍希釈液、及び81倍希釈液の5水準濃度の測定を行う（表4-2-1）。希釈にはガラス容器を用いる。

表4-2-1

試料の希釈例

1倍
3倍
9倍
27倍
81倍
4.5

希釈元（L）
原液
原液 1003倍希釈液 1009倍希釈液 10027倍希釈液 100

DMSO（L）
0
200
200
200
200

標準品の測定標準品セット中の各標準品はジメチルスルホキシド（DMSO）溶液であり、20～25℃に戻してから開封し、酵素免疫測定装置にセットする。標準品は検体希釈液にて自動希釈され、20% DMSO標準液(1)～(6)が調製される。調製された各20% DMSO標準液50L及び分注液各50 Lは自動的に免疫反応試薬の試薬カップに分注され免疫反応が開始される。各標準液(1)～(6)を三重測定して得られる各標準液の蛍光物質の生成速度の平均を求める。得られた蛍光物質の生成速度の平均値（B）を標準液(1)の蛍光物質の生成速度の平均値（B0）で割った%値（B/B0とし、この値をyとする）と各標準液の濃度（xとする）を元にLogit-Log三次回帰式により検量線を作成する。

1) 酵素免疫測定装置の取扱説明書に従い、日常点検を実施する。
2) 酵素免疫測定装置の取扱説明書に従い、以下の登録を行う。標準品(1)～(6)の各濃度、及び標準品測定プログラムを酵素免疫測定装置に登録する。

3) 標準品(1)～(6)はジメチルスルホキシド（DMSO）溶液である。DMSO の融点は 18.5℃であるので、使用の際には 20～25℃に戻して融解し、十分に混和してからガラス試験管（13 mm X 100 mm：
スピッツ形状）に約 300L 移し変える。

4) 以下の図 4-2-7 に記載してあるように、標準品を移し変えたガラス試験管（図中の標 1～標 6）、検体処理用カップ（図中の処理）1 個及びダイオキシン類 免疫反応試薬の試薬カップ（図中の免疫）3 個の順番で酵素免疫測定装置にセットし（検体処理用カップ計 6 個、ダイオキシン類 免疫反応試
薬の試薬カップ計 18 個）、各標準品を 3 重測定する。
なお標準品は、標準品(1)から低い濃度順に並べる必要がある。

193

標1

処理

免疫

免疫

免疫

標2

処理

免疫

免疫

免疫

１1

１1

標3

処理
免疫

１1

免疫
免疫

標準品(1)～(6)

標4
１1
処理
免疫
免疫

免疫

免疫

免疫

処理

標6

免疫

免疫

免疫

１1

図 4-2-7

処理

標5

免疫

１1

検量線作成時の試験管、検体処理用カップ、免疫反応試薬カップ設置の例

5) 測定を開始すると、各標準品 DMSO 溶液 40 L および検体希釈液 160 L が検体処理用カップ(図中の処理)に分注され、サンプルチップにより吸引吐出して十分に混和する事により 5 倍希釈液が自動的に調製される。希釈された 20% DMSO 標準液(1)～(6)各 50 L 及び分注液各 50L が免疫反応試薬の試
薬カップ（図中の免疫）に分注され抗原抗体反応が開始する。磁気撹拌下に抗原抗体反応を 10 分間、
37℃で行った後、洗浄液で洗浄することにより遊離の酵素標識抗原と検体成分を除去し、その後、
磁性ビーズに結合した酵素の活性を測定するため、酵素基質を添加し、磁気撹拌下に 37℃で 5 分間
測定することにより、酵素反応の結果得られる蛍光物質の生成速度を求める。なお、測定開始から
結果出力までは装置にて自動的かつ連続的に行われる。

6) 測定開始後、約 20 分で最初の測定結果が出力され、その後 1 分ごとに 1 つずつ結果が報告される。
4.6

コントロール及び検体の測定例

1) 酵素免疫測定装置の取扱説明書に従い、コントロール測定プログラムを酵素免疫測定装置に登録する。
2) コントロール

レベル 1 およびレベル 2 はジメチルスルホキシド（DMSO）溶液である。DMSO の

融点は 18.5℃であるので、使用の際には 20～25℃に戻して融解し、十分に混和してからガラス試験
管（13 mm×100 mm：スピッツ形状）に約 300 L を移し変える。

3) 検体（原液及び希釈された系列試料）をガラス試験管（13 mm×100 mm：スピッツ形状）に約 300L
移し変える。

4) 図 4-2-8 に記載してあるように、コントロールを移し変えたガラス試験管（図中のコ 1 とコ 2）、検体処理用カップ（図中の処理）1 個及びダイオキシン類 免疫反応試薬の試薬カップ（図中の免疫）
1 個の順番で酵素免疫測定装置にセットし（検体処理用カップ計 2 個、ダイオキシン類 免疫反応試
薬の試薬カップ計 2 個）、各コントロールを 1 重測定する。（注 2）5) 検体を移し変えたガラス試験管（図中の検 1）、検体処理用カップ（図中の処理）1 個及びダイオキ
シン類 免疫反応試薬の試薬カップ（図中の免疫）1 個の順番で酵素免疫測定装置にセットし検体を 1重測定する。

6) 測定した検体の中で B/B0 が 50%に最も近い検体を更に 2 重測定する。
194

7) 得られた合計 3 回の検体測定結果の平均値を得る。
（注 2） コントロールの測定は測定日ごとに 1 回実施する。

コ1

処理

免疫

コ2

処理

免疫

検1

処理

免疫

検2

処理

免疫
処理
免疫

コントロール

検体 (1 重測定)

検体 (2 重測定)

図 4-2-8 コントロール、検体時の試験管、検体処理用カップ、免疫反応試薬カップ設置の例

５．定量

5.1

検量線の作成1) 標準品(1)～(6)の測定から得られた各標準品(2)～(6)の蛍光物質生成速度の平均値(B)を標準品(1)の蛍光物質の生成速度の平均値(B0)で割った%値（B/B0 とし、この値を y とする）と各標準品の濃度（x とする）を元に、Logit-Log 三次回帰式により検量線を作成する。Logit-Log 三次回帰式とは以下の重回帰式を示す。
Y =A X3 + B X2 + C X + D

又はLogit y =A [Log (x/5)] 3 + B [Log (x/5)] 2 + C [Log (x/5)] + D
Y：Logit y、
X：Log (x/5)、

y：B/B0、A, B, C, D：係数

x：標準物質の濃度 [g/mL]2) 検量線の有効期間は 60 日間であり、ダイオキシン類 免疫反応試薬の同一ロットのみに適用される。
検量線作成から 60 日経過した場合、コントロール値が表示濃度範囲を逸脱した場合、免疫反応試薬のロット変更をする場合、もしくは蛍光ランプの交換等の場合には、再度上記手順に従って検量線を作成する。

3) 測定操作により得られる検量線の例を図 4-2-9 に、標準品測定結果及び B/B0 の例を表 4-2-2 に示す。

195

図 4-2-9 酵素免疫測定装置から出力された検量線の例
表 4-2-2 図 4-2-9 の結果得られる再現性及び B/B0 の例
TCAP 標準物質濃度(g/mL)
0.0
1
0.0
0.0
41.9
2
41.9
41.9
125.0
3
125.0
125.0
373.0
4
373.0
373.0
1,169.0
1,169.05
1,169.0
2,885.06
2,885.0
2,885.0

Rate 値*
46.16
48.40
50.15
41.87
39.60
41.60
32.43
32.44
33.13
18.64
19.40
19.79
7.62
7.62
7.91
2.61
2.60
2.70

平均値

SD

CV

B/B0

48.24

2.00

4.1%

100%

41.02

1.24

3.0%

85%

32.67

0.40

1.2%

68%

19.27

0.58

3.0%

40%

7.72

0.17

2.2%

16%

2.64

0.06

2.2%

5%

*：蛍光物質の生成速度であり、nmol/(L・s)で表す。

5.2

検量線の確認及び感度変動の管理図による確認

精度管理の例（同時再現性）

1) 「４．測定操作」に従い検量線を作成する。次に、コントロール

レベル 1 又はレベル 2 を同時に各々10 回測定し、コントロール濃度を算出する。なお、同時再現性による精度管理には、コントロールを同時に 2 回以上測定することが望ましい。ただし、酵素免疫測定装置設置時或いは修理後の検収には、コントロールを同時に 10 回測定することが望ましい。

2) 得られたコントロール濃度（g/mL）を管理図に記録し保存する。
3) 各コントロール測定値の平均（M）と標準偏差（SD）を算出し、±2SD を管理限界とする。変動係数（CV）は 20%以内に収まることが望ましい。結果の例を表 4-2-3 および管理図の例を図 4-2-11

196

に示す。
表 4-2-3

コントロール

レベル 1 及びレベル 2 の測定結果の例
レベル 1

コントロール

63.9
183.3
7.35
4.01
168.6～198.0

B/B0（%）
M(g/mL)
SD(g/mL)
CV%
M±2SD

検量線上の結合比
平均値
測定値の標準偏差
測定値の変動係数
管理限界

250

レベル 2

コントロール

46.6
357.5
16.43
4.60
324.6～390.4

450

測定値

M+2SD
M

M-2SD

測定値

400
200

M+2SD
M

350

M-2SD

150
300

100

250
1

2

3

4

5
6
7
測定回数

図4-2-10

8

9

10

1

表4-2-3で得られたコントロール

2

3

4

5
6
7
測定回数

8

9

10

レベル1及びレベル2の管理図の例

4) 1 点でも管理限界を超えた場合は、原因の究明を行い、再測定する。原因究明に基づいて講じた措置
および再測定の結果を記録する。

5.3

測定試料の定量

B/B0 が 50%に最も近い試料の測定結果（DMSO 溶液中の実測濃度）を平均する。
求めた濃度（g-TCAP/mL）から以下の式によって試料量あたりの実測濃度を求める。

1) 排出ガス

𝐶𝑆 = 𝑋 × 𝑛 × 𝑣 ×

𝑉𝐸 1
×
𝑉′𝐸 𝑉

ここに、 Cs：

排出ガス中の実測濃度（g-TCAP/m3N）

X：

希釈試料中実測濃度（g-TCAP/mL）

n

：

希釈倍率

v

：

測定用試料の液量（mL）

VE：

抽出液量（mL）

V’E：

抽出液分取量（mL）

V：

排出ガス試料の採取量（m3N）

197

（備考）排出ガスの酸素濃度による補正は、次式による。

𝐶=

9
× 𝐶𝑆
21 − 𝑂𝑆

ここに、 C

酸素の濃度 On における実測濃度（ng/m3N）：

Os ： 排出ガス中の酸素の濃度（注 3） （%）
Cs ： 排出ガス中の実測濃度（ng/m3N）（注 3）排出ガス中の酸素の濃度が 20%を超える場合は、Os = 20 とする。

2) ばいじん及び燃え殻

𝐶𝑤 = 𝑋 × 𝑛 × 𝑣 ×
ここに、 Cw

𝑉𝐸
1
×
𝑉′𝐸 𝑊
：

ばいじん及び燃え殻中の実測濃度（g-TCAP/g）

X：

希釈試料中実測濃度（g-TCAP/mL）

n

：

希釈倍率

v

：

測定用試料の液量（mL）

VE：

抽出液量（mL）

V’E：

抽出液分取量（mL）

W：

ばいじん及び燃え殻試料の採取量（g）

６．検出下限及び定量範囲

6.1 標準物質における検出下限及び定量範囲の確認
標準物質における検出下限及び定量範囲の確認は、定量値の変動係数（CV%）が 30%以下となる濃度を検出下限とし、20%以下となる上下 2 点間の濃度を定量範囲とする方法で行う。
以下に、ダイオキシン類試薬を用いて n = 10 で測定した例を示す。

1) 検出下限及び定量範囲算出用標準物質溶液の調製(1) 標準品(1)～(6)及び標準品(1)と(2)の間の濃度を標準品(2)と標準品(1)を用いて調製する。
(2) 調製した標準物質溶液の濃度の例を以下の表 4-2-4 に記載する。
表 4-2-4 検出下限及び定量範囲算出用標準物質溶液の調製例
単位
g/mL

標準品
(1)
0.0

希釈 1

希釈 2

希釈 3

13.0

20.8

28.1

標準品
(2)
42.9

標準品
(3)
126.3

標準品
(4)
377.8

標準品
(5)
1,116.6標準品(6)3,318.62) 検出下限及び定量範囲の算出(1) 標準品(1)～(6)を用いて検量線を作成する。
(2) 標準品(2)～(6)及び標準品(1)と(2)の間の濃度の希釈液 1～3 を n = 10 で測定し、結果を得る。
(3) 各濃度域における測定値の平均値、標準偏差（SD）及び変動係数（CV%）を算出する。各濃度について、5 回以上測定することが望ましい。

(4) 検出下限及び定量範囲算出用測定結果の例を表 4-2-5 に示す。

198

表 4-2-5 検出下限及び定量範囲算出用測定結果の例
表示濃度(g/mL)

名称
希釈液 1

13.0

希釈液 2

20.8

希釈液 3

28.1

標準品
(2)
標準品
(3)
標準品
(4)
標準品
(5)
標準品
(6)

42.9
126.3
377.8
1,116.6
3,318.6

測定結果（g/mL）
1.7
ND
7.2
18.1
27.5
24.2
35.0
48.9
116.7
117.2
391.3
405.0
1,159.9
1,121.4
3,219.4
3,501.0

13.8
6.9
18.5
25.2
41.5
12.9
52.6
45.4
120.5
157.8
376.4
376.4
1,179.2
1,156.5
3,390.5
3,178.1

8.6
2.5
22.0
24.9
19.0
32.6
34.5
57.3
130.9
146.3
373.9
381.0
1,194.3
1,149.7
3,400.0
3,496.7

11.3
4.2
14.8
16.7
37.8
25.2
48.5
46.9
111.1
122.4
401.8
384.4
1,167.9
1,165.5
3,487.0
3,472.3

SD

CV
%

9.8

7.10

72.3

18.9

6.98

36.9

27.2

8.81

32.4

45.0

7.41

16.4

127.6

14.54

11.4

385.6

10.69

2.8

1,165.0

20.90

1.8

3,386.8

113.29

3.4

平均
16.1
23.4
11.2
30.5
31.0
19.8
39.2
42.0
131.7
121.7
380.7
385.5
1,166.0
1,190.0
3,359.3
3,364.1

ND:Not Detected（検量線の回帰式から濃度を計算されず）
横軸に表示濃度（g/mL）、縦軸に変動係数（CV%）をプロットした精度プロファイル図を作成する。

(5) 精度プロファイルの例を図 4-2-11 に示す。

標準品濃度に対する濃度CV(%)

50
45

y = 233.76x-0.6276

40

濃度 CV(%)

35
30
25
20
15
10
5
0
10

100

26.3 g/mL
50.3 g/mL

図 4-2-11

1000

10000

標準品濃度（μg/mL）

精度プロファイルの例（標準品及び希釈液）(6) 精度プロファイル図から、変動係数 30%の濃度を検出下限、20%となる上下 2 点間の濃度範囲を定量範囲とする。

(7) 本法により算出した検出下限及び定量範囲は、酵素免疫測定に供する DMSO 溶液 1 mL 中の標準物
質相当量（g/mL）である。

199

最終的に 1 mL に定容した DMSO 溶液試料 10 L 及び検体希釈液 40 L の混合溶液 50 L と、分注
液 50 L の計 100 L を免疫反応試薬の試薬カップに分注するため、1 カップ当たりの試料分注量は 10 L となる。上記方法から算出したダイオキシン類試薬の検出下限を表 4-2-6 に、定量範囲を表
4-2-7 に示す。
表 4-2-6 標準物質による検出下限
標準物質における検出下限
263 ng-TCAP/カップ
26.3 g-TCAP/mL
表 4-2-7 標準物質による定量範囲
標準物質における定量範囲
0.503～28.0 g-TCAP/カップ
50.3～2,800g-TCAP/mL
6.2 試料における検出下限及び定量下限の確認

1) 排出ガス(1) 「第３節 試料採取方法に関する特記事項 １．試料ガスの採取量」で記載した計算式から、試料ガスの採取量を 1.0 m3N とし、抽出液を 10 mL に定容し、その抽出液から 10 mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に 0.5 mL の測定用試料溶液に調製する場合の検出下限を求めると、0.066
ng-TEQ/m3N となる。

(2) 同様に定量範囲を求めると、表 4-2-8 のように 0.13～7.0 ng-TEQ/m3N となる。但し、実際は転溶した試料から希釈用 DMSO を用いて、5 水準の 3 倍希釈系列（最大 81 倍）を調製するため、定量範囲の上限は検量域上限の 81 倍（570ng-TEQ/m3N）まで定量可能である。
表 4-2-8 排出ガス試料における検出下限と定量範囲
試料における検出下限
0.066 ng-TEQ/m3N

2)

試料における定量範囲
0.13～7.0 ng-TEQ/m3N

ばいじん及び燃え殻(1) 「第３節 試料採取方法に関する特記事項 ２．ばいじん及び燃え殻試料の採取量」で記載した計算
式から、
ばいじん及び燃え殻の採取量を 1.5 g とし、抽出液を 10 mL に定容し、その抽出液から 10 mLを分取してクリーンアップを行い、最終的に 0.5 mL の測定用試料溶液に調製する場合の検出下限を求めると、0.050 ng-TEQ/g となる。

(2) 同様に定量範囲を求めると、表 4-2-9 のように 0.096～5.3 ng-TEQ/g となる。但し、実際は転溶した試料から希釈用 DMSO を用いて、5 水準の 3 倍希釈系列（最大 81 倍）を調製するため、定量範
囲の上限は検量域上限の 81 倍（430 ng-TEQ/g）まで定量可能である。

200

表 4-2-9．

ばいじん及び燃え殻における検出下限と定量範囲

試料における検出下限
0.050 ng-TEQ/g

試料における定量範囲
0.096～5.3 ng-TEQ/g

７．測定量(毒性等量)への換算5.3で求めた実測濃度を排出ガス、ばいじん及び燃え殻ともに換算係数で除することで測定量（毒性等量）に換算する。ここで、排出ガスの換算係数（「第３節 試料採取方法に関する特記事項

１．試料ガスの採取量」を参照）は200.6×103、ばいじん及び燃え殻の換算係数（「第３節 試料採取方法に関する特記事項

２．

ばいじん及び燃え殻試料の採取量」を参照）は175.5×103である。
測定量（毒性等量）（ng-TEQ/m 3N、ng-TEQ/g）= 実測濃度（g-TCAP/m 3N、g-TCAP/g）／換算係数
なお、測定結果の報告様式については、第２章第２節「測定結果の報告」を参照すること。

８．換算係数の確認

尐なくとも6ヶ月に1回、HRGC/HRMS法によって測定された試料について、本測定法による測定を行い、HRGC/HRMS法により得られた測定量（毒性等量）と本測定法で得られた実測濃度より換算係数を算出し、換算係数と比較する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担
当者の変更等）にも、確認を行う。得られた換算係数が、第３節記載の換算係数と大きく換算係数が乖離する場合又は相関が悪い場合には、原因の究明を行い、その結果及び講じた措置を記録する。具体的には、換算係数が100±30%を逸脱した場合、又は相関係数が0.9以下となった場合には、原因の究明を行い、その結果及び講じた措置を記録する。
試料は、片方についてHRGC/HRMS法に定められた方法により前処理を行い、残りについては生物検定法に定められた方法により前処理を行って試料を調製する。
排出ガス試料については、JIS K0311に従い抽出までを行った抽出試料（ただし、アッセイに影響を及ぼすサンプリングスパイク及び抽出工程でのクリーンアップスパイクの添加は行わない）を分割し、片方はJIS
K0311に定められた方法により測定量（毒性等量）を求め、残りは、本法４．測定操作及び５．定量に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を算出する。
ばいじん及び燃え殻試料については、平成4年厚生省告示第192号別表第一(第一号関係)(2)に準拠した方法（ただし、同表ウ(イ)の内標準物質の添加の操作は行わない）により測定量（毒性等量）を求め、残りは、本法４．測定操作及び５．定量に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を算出する。
※ 毒性等価係数（TEF）は、WHO-TEF(2006)を採用した。

201

第６節 参考資料「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について（排出ガス試料）」
多数の排出ガス試料（この例ではn = 52。6ヶ月に1度n = 6以上測定）について本測定方法とHRGC/HRMS
法でそれぞれ実測濃度、毒性等量を求める。本測定方法による実測濃度をHRGC/HRMS法による毒性等量で除したものの幾何平均値を換算係数とする。
(例)排出ガス試料の換算係数導出の方法
1) 本測定方法による実測濃度をY、HRGC/HRMS法による毒性等量をXとし、Y/Xを求める。
2) 全試料についてY/Xの値を求め、全試料の幾何平均値を計算し、これを換算係数とする（図4-2-12ではY/Xの平均値である200.6 × 103を換算係数とした）。

「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について（ばいじん及び燃え殻試料）」
多数のばいじん及び燃え殻試料（この例ではn = 57。6ヶ月に一度n = 6以上で測定）について本測定方法とHRGC/HRMS法でそれぞれ実測濃度、毒性等量を求める。本測定方法による実測濃度をHRGC/HRMS法
による毒性等量で除したものの幾何平均値を換算係数とする。
(例) ばいじん及び燃え殻試料の換算係数導出の方法
1) 本測定方法による実測濃度をY、HRGC/HRMS法による毒性等量をXとし、Y/Xを求める。
2) 全試料についてY/Xの値を求め、全試料の幾何平均値を計算し、これを換算係数とする（図4-2-13ではY/Xの平均値である175.5 × 103を換算係数とした）。

排出ガス試料 (n = 52)

ばいじん及び燃え殻試料 (n = 57)

100,000

10,00010,000

実測濃度 (g-TCAP/g)

実測濃度 (g-TCAP/m3 N)

0.964

y = 208.732 x
R2 = 0.983

1,000

100

10

y = 183.966 x0.949
R2 = 0.966
1,000

100

10
0.1

1

10

100

0.1

3

毒性等量 (ng-TEQ/m N)

110

毒性等量 (ng-TEQ/g)

図4-2-12 換算係数算出（例）

図4-2-13（排出ガス）

換算係数算出（例）（ばいじん及び燃え殻）

202

100

その３

前処理に、多層シリカゲルカラム及びアルミナカラムを使用し、測定に、抗ダイオキシン類モノク

ローナル抗体及びプレート固相抗原を用いた間接競合酵素免疫測定法を利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 2 の 3)

第１節 測定方法の概要

対象媒体ごとに試料を採取し、ダイオキシン類を抽出後、クリーンアップを行い、抗ダイオキシン類モノ
クローナル抗体を用いた間接競合酵素免疫測定法による測定により定量する。測定方法のフローを図 4-3-1
に示す。

試料採取
抽出
クリーンアップ
抗ダイオキシン類モノクローナル抗体を用いた間接競合酵素免疫測定法による測定
標準物質（実測濃度）の定量
換算係数による測定量（毒性等量）への換算
測定値確定
図 4-3-1 測定方法のフロー

第２節 用語の定義

1) 抗ダイオキシン類モノクロナール抗体 ここではダイオキシン類似化合物とキャリアタンパク質の複合体を免疫することにより得られる抗ダイオキシン類抗体産生能を有する B 細胞と、マウス骨髄腫細胞（ミエローマ）を融合することにより作成したハイブリドーマから得られ、ダイオキシン類と特異的に反応する性質を有するモノクローナル抗体を指す。
2) 一次抗体溶液 抗ダイオキシン類抗体を緩衝液中に溶解させたもの
3) 標識二次抗体溶液 抗ダイオキシン類抗体の Fc 部位（不変部位）と特異的に反応するポリクローナル
抗体（酵素標識物）を緩衝液に溶解したもの。
4) 一次抗原抗体反応 抗ダイオキシン類抗体と抗原(ダイオキシン類)との反応。
5) 二次抗原抗体反応 固相プレート上の擬似抗原に結合した抗ダイオキシン類抗体と二次抗体との反応。
6) B/B0% 測定対象の吸光度をブランク(濃度 0)の吸光度で除し 100 倍した数値。
203

7) IC50

50%の阻害がかかる濃度(50% Inhibition Concentration)。

8) 精度プロファイル 精度確認用の標準溶液濃度と変動係数(CV%)との関連図。

第３節 試料採取方法に関する特記事項

1) 試料ガスの採取量
試料ガスの採取量は、次のような手順によって決定する。採取時間については、その目的に応じて試料ガスの発生状況等を十分考慮して代表試料が採取できるようにしなければならない。
(1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
(2) 特に指定がない限り、(1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
(3) 以下の式によって測定に必要な最小の試料ガスの量を算出する。

𝑉 = 𝑄𝐷𝐿 × 𝑘 × 𝑣 ×
ここに、V

𝑉𝐸
1
×
𝑉′𝐸 𝐶𝐷𝐿： 測定に必要な最小の試料ガスの量(m3N)

QDL ： 標準物質における検出下限(ng/mL, DMSO 溶液中)k

： 測定量(毒性等量)への換算係数v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)

V'E： 抽出液分取量(mL)

CDL ： 必要となる試料ガスにおける検出下限(ng-TEQ/m3N)(4) 算出された最小の試料ガスの量以上を試料ガスの採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例) 5ng-TEQ/m3N レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となる試料ガスにおける検出下限
は 0.17ng-TEQ/m3N)
抽出液を 20mL に定容し、その抽出液から 10mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に 1mLの DMSO 溶液に調製する場合の試料ガスの採取量を以下に示す。なお、標準物質における検出下限
は 0.018ng/mL、排出ガスの測定量への換算係数は 0.422 を用いた。

𝑉 = 0.018 × 0.422 × 1 ×

20
1
×= 0.0910
0.17(原則として、4 時間 3m3N の試料ガス採取を標準とする。)

2) ばいじん試料の採取量
ばいじん試料の採取量は、次のような手順によって決定する。
(1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
(2) 特に指定がない限り、(1)で決定した濃度の 1/30 以下にばいじん試料における検出下限を設定する。
(3) 以下の式によって測定に必要な最小のばいじん試料の量を算出する。

𝑊 = 𝑄𝐷𝐿 × 𝑘 × 𝑣 ×
ここに、W

𝑉𝐸
1
×
𝑉′𝐸 𝐶𝐷𝐿： 測定に必要な最小のばいじん試料の量(g)QDL ： 標準物質における検出下限(ng/mL, DMSO 溶液中)204k

： 測定量(毒性等量)への換算係数v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)

V'E： 抽出液分取量(mL)

CDL ： 必要となるばいじん試料における検出下限(ng-TEQ/g)(4) 算出された最小のばいじん試料の量以上をばいじん試料の採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例) 3ng-TEQ/g レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となるばいじん試料における検出下
限は 0.1ng-TEQ/g)
抽出液を 20mL に定容し、その抽出液から 10mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に 1mLの DMSO 溶液に調製する場合のばいじん試料の採取量を以下に示す。なお、標準物質における検出
下限は 0.018ng/mL、ばいじん試料の測定量への換算係数は 0.595 を用いた。
20

1

𝑊 = 0.018 × 0.595 × 1 × 10 × 0.1 = 0.22
3) 燃え殻試料の採取量
燃え殻試料の採取量は、次のような手順によって決定する。
(1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
(2) 特に指定がない限り、(1)で決定した濃度の 1/30 以下に燃え殻試料における検出下限を設定する。
(3) 以下の式によって測定に必要な最小の燃え殻試料の量を算出する。

𝑋 = 𝑄𝐷𝐿 × 𝑘 × 𝑣 ×
ここに、X

𝑉𝐸
1
×
𝑉′𝐸 𝐶𝐷𝐿： 測定に必要な最小の燃え殻試料の量(g)QDL ： 標準物質における検出下限(ng/mL, DMSO 溶液中)k

： 測定量(毒性等量)への換算係数v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)

V'E： 抽出液分取量(mL)

CDL ： 必要となる燃え殻試料における検出下限(ng-TEQ/g)(4) 算出された最小の燃え殻試料の量以上を燃え殻試料の採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例) 3ng-TEQ/g レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となる燃え殻試料における検出下限は0.1ng-TEQ/g)
抽出液を 20mL に定容し、その抽出液から 10mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に 1mLの DMSO 溶液に調製する場合の燃え殻試料の採取量を以下に示す。なお、標準物質における検出下限は、0.018ng/mL、燃え殻試料の測定量への換算係数は 0.522 を用いた。
20

1

𝑊 = 0.018 × 0.522 × 1 × 10 × 0.1 = 0.19

205

第４節 試料の前処理

１．試料の前処理の概要
採取した試料は、抽出を行う。抽出液は必要に応じて分取を行い、クリーンアップに移る。図 4-3-2 に試料の前処理から測定までのフローの例を示す。

試料
抽出
抽出液
一部分取

（省略可能）

多層シリカゲル／アルミナカラムクロマトグラフ操作
測定用試料

図 4-3-2 試料の前処理から測定までのフローの例
２．試薬
試料の前処理に用いる試薬は、次による。これらの試薬は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
JIS K0557 に規定する A4 (又は A3) の水

1)

水

2)

メタノール

3)

アセトン

JIS K8040 に規定するもの、又は同等の品質のもの

4)

トルエン

JIS K8680 に規定するもの、又は同等の品質のもの

5)ジクロロメタン

6)

ヘキサン

7)

デカン

8)

ジメチルスルホキシド (DMSO)

9)

塩酸JIS K8180 に規定するもの、又は同等の品質のもの

10) 硫酸JIS K8951 に規定するもの、又は同等の品質のもの

11) 硝酸銀

JIS K8891 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8117 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8825 に規定するもの、又は同等の品質のもの
測定に支障のない品質のもの
JIS K9702 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8550 に規定するもの、又は同等の品質のもの

12) 硫酸ナトリウム

JIS K8987 に規定するもの、又は同等の品質のもの

13) ヘキサン洗浄水

1) の水を 6) のヘキサンで十分洗浄したもの

14) シリカゲル

JIS K0311 6.2 に規定するもの、又は同等の品質のもの

15) 硫酸（44%質量分率）シリカゲル JIS K0311 6.2 に規定するもの、又は同等の品質のもの
16) 硝酸銀 (20%質量分率) シリカゲル

14) のシリカゲル 100 g に対して 11)の硝酸銀で調製した硝酸銀

溶液 (625 g/L) 40 mL を加えた後、ロータリーエバポレータで水分を完全に除去する。硝酸銀シリカ
206

ゲルは、調製後、密閉できる着色容器に入れ、デシケーター中に保存する。
17) アルミナ

JIS K0311 6.2 に規定するもの、又は同等の品質のもので、本法に適用して良好な結果が得られることが確認されているもの
18) 窒素JIS K1107 に規定する高純度窒素１級19) ガラスウール

JIS K8251 に規定するもの、又は同等の品質のもの

３．器具及び装置

試料の前処理に用いる器具及び装置は、次による。これらの器具及び装置は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
3.1 ガラス器具
JIS R3503 及び JIS R3505 に規定するもの。コックの部分がフッ素樹脂製のものを用いてもよい。
3.2 高速溶媒抽出装置
ダイオネクス製 ASE-200 又はこれと同等品。ASE 用の器具一式 (セルボディー、セルエンドキャップ
アセンブリ、溶媒ボトル、補修ボトルアセンブリ、コンプレッサー等)
3.3 濃縮器
クデルナ－ダニッシュ(KD)濃縮器又はロータリーエバポレータ。接続部にグリースを使用してはならない。
3.4 多層シリカゲルカラムクロマトグラフ管
内径 14mm、長さ 300mm のガラス製カラムクロマトグラフ管
3.5 アルミナカラムクロマト管
内径 6mm、長さ 50mm のガラス製カラムクロマトグラフ管
3.6 ヒーター
カラムクロマト管を包み込み 100℃程度まで加熱することができるもの
3.7 送液ポンプ
流速の調節が毎分 0.1 ～ 10 mL の範囲内で可能であって、流速の変動が±2%以内のもの

４．前処理操作

4.1 試料量の記録採取した試料は、試料量を記録する。
4.2 抽出1) 排出ガスJIS K0311 6.4 に準拠し、抽出を行う。ただし、内標準物質の添加は行わない。図 4-3-3 に排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

207

吸収液、洗液

吸引プローブ洗液

円筒ろ紙

樹脂

ろ過
HCl (2mol/L)処理
ろ液

残渣

ろ過・水洗

ろ液・洗液

20 mmol/g-ダスト以上
発泡がないことを確認

残渣
乾燥

高速溶媒抽出トルエン、2 回

液－液振とう抽出
ジクロロメタン、3 回

濃縮：検体又は試料
定容
粗抽出液

：作業
：物又は試料

図 4-3-3 排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例
高速溶媒抽出は下記条件で 2 回行う
溶媒

：

トルエン

加熱

：

7分

静置

：

2分

フラッシュ

：

70%

パージ

：

60 秒

サイクル

：

5回

温度

：

150℃

圧力

：

2000psi2) ばいじん及び燃え殻
平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(2) 又は下記の方法により抽出を行う。ただし、内標
準物質の添加は行わない。図 4-3-4 にばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

208

試料
HCl(2mol/L)処理

ろ過・水洗

残渣

ろ液・洗液

乾燥

液－液振とう抽出

高速溶媒抽出ジクロロメタン、3トルエン、2 回

回

濃縮：検体又は試料定容：作業：物又は試料粗抽出液
図 4-3-4

ばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例

高速溶媒抽出は下記条件で 2 回行う
溶媒

：

トルエン

加熱

：

7分

静置

：

2分

フラッシュ

：

70%

パージ

：

60 秒

サイクル

：

5回

温度

：

150℃

圧力

：

2000psi

4.3 クリーンアップ
図 4-3-5 にクリーンアップのフローの例を示す。

209

粗抽出液
一部分取
転溶

ヘキサン

多層シリカゲルカラムに添加
多層シリカゲルカラムを 60℃加熱

多層シリカゲルカラムとアルミナカラムを連結

ヘキサン溶出窒素

アルミナカラムを乾燥

DMSO を逆方向に送液し、回収

90℃加熱下 DMSO 溶出

測定溶液
図 4-3-5 クリーンアップのフローの例
1) 抽出液の分取(1) 抽出液を分取して一部を測定に使用する場合には、定容した抽出液から目的に合わせて一部を分取する。排出ガスについては 1.0m3N 相当量、ばいじん及び燃え殻については 1.0g 相当量の抽出液を 1 回のクリーンアップの目安とする。
(2) あらかじめ、デカン 0.4 mL を入れた受器に適量の抽出液を入れ、ロータリーエバポレータで乾固寸前まで濃縮する。この濃縮液に適当量のヘキサンを加え、ロータリーエバポレータで乾固寸前まで濃縮する。この操作を 3 回程度繰り返し、トルエンを除去する。その後、次に示す多層シリカゲルカラム－アルミナカラム操作によってクリーンアップを行う。
2) 精製カラムの作製(1) 多層シリカゲルカラム
3.3 のカラムクロマトグラフ管の底部にガラスウールを詰め、シリカゲル 2.3g、硫酸（44%質量分率）
シリカゲル 10.4g、シリカゲル 0.2g、硝酸銀（20%質量分率）シリカゲル 3.6g、シリカゲル 1.5g を順次充填する。このカラムを図 4-3-6 に示す。

210

シリカゲル ： 1.5g

硝酸銀 (20%質量分率) シリカゲル ： 3.6g
シリカゲル ： 0.2g

硫酸 (44%質量分率) シリカゲル ： 10.4g

シリカゲル ： 2.3g
ガラスウール ： 適量

図 4-3-6 多層シリカゲルカラムの例(2) アルミナカラム
3.4 のカラムクロマトグラフ管の底部にガラスウールを詰め、アルミナ 1.0 g 程度を充填し、その上からガラスウールを詰める。このカラムを図 4-3-7 に示す。

ガラスウール ： 適量
アルミナ ： 1.0g
ガラスウール ： 適量

図 4-3-7 アルミナカラムの例
3) クリーンアップ操作(1) 図 4-3-8 に示す様に、2) の(1)多層シリカゲルカラム、(2)アルミナカラムを連結し、多層シリカゲル
カラムを構成する上端のシリカゲル、硝酸銀シリカゲル及び硫酸シリカゲルの上半分の部分を覆うよ
うにヒーターをセットする。
(2) 濃縮した試料にヘキサンを加え、多層シリカゲルカラムに添加する。添加する試料の液量は容器の洗液を合わせて最大 5mL までとする。
(3) ヒーターにより 60℃で 10 分間カラムを加熱する。
211

(4) 60℃加熱下、ヘキサン 85 mL を送液 (2.5 mL/min) する。

ヒーター

ヘキサン送液(60℃加熱)多層シリカゲルカラム

接続アダプター

アルミナカラム

図 4-3-8 多層シリカゲルカラムとアルミナカラムの組み立て例
4) 溶媒置換及び測定用試料の保存(1) 1)の(4)の操作後、アルミナカラムに窒素を通じ、ヘキサンを除去する。
(2) アルミナカラムを包み込むようにヒーターをセットし、90℃で 10 分間加熱する。
(3) 90℃加熱下、3) の(4)のヘキサンの送液方向とは逆方向に、即ちアルミナカラム下端側から DMSO
2.5mL を送液 (2.5mL/min) し、上端側から溶出する DMSO 溶液約 1mL を予め秤量済みのバイアル瓶に回収する。図 4-3-9 にアルミナカラムを反転させない場合の操作例を示す。
(4) 回収後、バイアル瓶を秤量し、密栓後、室温で暗所に保存する。秤量の差分を DMSO 定容量とする。

212

アダプター

ヒーター (90℃加熱)

バイアル瓶

アルミナカラムDMSO 送液

図 4-3-9 アルミナカラムを反転させない場合の DMSO への置換操作の例
第５節 測定１．測定の概要

本方法は、ダイオキシン類の毒性等量との相関性の高い、五塩素化ジベンゾフラン類と特異的に反応する
抗ダイオキシン類モノクローナル抗体及びプレート固相抗原を用いた間接競合酵素免疫測定法によりダイオキシン類の毒性等量を測定する方法である。
6-(3,3',4'-トリクロロビフェニル-4-イロキシ)ヘキサン酸（略称77-2標準物質）を用いて検量線を作成し、試料の吸光度から算出した実測濃度に、排出ガス、ばいじん及び燃え殻について定められた換算係数を乗じることにより、測定量(毒性等量)を算出する。

２．使用キット、試薬、器具及び装置

2.1 使用キット
使用キット（抗ダイオキシン類モノクローナル抗体には、マウス由来の融合細胞（ハイブリドーマ）から収得した五塩化ジベンゾフラン類を特異的に認識する抗体を、プレート固相抗原及び検量線作成用標準品には、6-(3,3',4'-トリクロロビフェニル-4-イロキシ)ヘキサン酸を使用する。）は、以下の試薬等から構成されるものである。
1)

ダイオキシン抗原固相化マイクロプレート 96well 1 枚

2)

希釈液(0.0375% Triton X-100，0.05% スラオフ 72N) 7mL

3)

一次抗体粉末 3.5mL 用 2 本

4)

標識二次抗体粉末 7mL 用 2 本

5)粉末抗体溶解液(0.4% ブロックエース(カゼイン系ブロッキング剤)，0.05% スラオフ 72N) 24mL

6)

6 倍濃縮洗浄液 50mL

7)

発色液(0.05%以下 テトラメチルベンジジン，0.01%以下 過酸化水素，0.5%以下 pH 緩衝剤，1%以下 安定化剤等) 15mL

8)

発色停止液(約 2%(0.2M)硫酸，その他 0.1%以下) 15mL
213

9)

プレートシール 1 枚10) 使用説明書 1 部

2.2 試薬測定に用いる使用キット以外の試薬は、次による。
1) 水 JIS K0557 に規定する A4(又は A3)の水又は同等の品質のもの
2) ジメチルスルホキシド(DMSO) JIS K9702 に規定するもの、又は同等の品質のもの(注 1)3) 標準物質(6-(3,3',4'-トリクロロビフェニル-4-イロキシ)ヘキサン酸)(77-2 標準物質)(注 1) ジメチルスルホキシド(DMSO)の品質変動は、測定結果に影響を及ぼすことがあるためロットの変更時等には十分注意する。

2.3 器具及び装置
測定に用いる器具及び装置は、次による。
測定波長 450 nm、温度制御機能は不要

1)

プレートリーダー 分光光度計

2)

ディスポーザブル培養試験管 96well タイプのガラス製希釈容器で代用可

3)試験管ミキサー

4)

冷蔵庫

5)

マイクロピペット 1～20L

6)

マイクロピペット 20～200L

7)マイクロピペット 200～1000L

8)

マルチチャンネルピペット 8 チャンネル 5～50L

9)

マルチチャンネルピペット 8 チャンネル 50～300L10) ピペットチップ
11) ピペッティングリザーバー
12) マイクロチューブ用ラック マルチチャンネルピペットに対応したもの
13) ストップウォッチ
14) ストリップイジェクター
15) ペーパータオル

３．キットの取り扱い

以下の取り扱い上の注意点を遵守すること。
1) キットは、冷蔵庫(2～8℃)にて保管すること。
2) キットは、使用前に 30 分程度放置して室温に戻してから使用すること。
3) 異なるキットの試薬を組み合わせて使用しないこと。
4) キットを分割使用する場合、粉末抗体を溶解後、冷蔵保存で 2 週間を過ぎたものは使用しないこと。
5) キットの有効期間は、未開封の状態で製造より 1 年間で、有効期間の過ぎたものは使用しないこと。
6) キットを保管する場合は、保存場所、保存方法、汚染の配慮、温度及び湿度の情報を記録し、保存す
ること。

214

４．測定操作

4.1 予備実験
本測定では、IC50 付近の吸光度となる値を定量値として採用するため、予備実験により IC50 となる希釈倍率を推定したのちに本実験を行うことが望ましい。予備実験は次のような手順によって行う。予備実験例を
図 4-3-10 に示す。
1) 試料を DMSO 溶液で 10 倍、100 倍に希釈する。
2) 4.4 以降の手順で n=1 で測定を行い、B/B0%を算出する。
3) 結果を片対数グラフにプロットし、IC50 となる希釈倍率を読み取る。読み取った希釈倍率となるように試料を DMSO 溶液で希釈し、本実験用試料とする。

予備実験

：

吸光度と B/B0%算出→

片対数プロット→

希釈・本実験

希釈倍率
ブランク
×1
×10
×100

吸光度
1.250
0.129
0.543
0.975

B/B0%
100
10.3
43.4
78

B/B0(%)

100

50

希釈倍率を
16 倍とする

0

1

10 16

100

希釈倍率

図 4-3-10

予備実験例

4.2 標準溶液の調製
DMSO 溶液を用いて標準物質を希釈し、20、5、1、0.3、0.1ng/mL 濃度になるようにそれぞれ培養試験管に調製する。
4.3 試料希釈溶液の調製
各試料に対して設定した希釈倍率の希釈溶液を培養試験管に調製する。
4.4 一次抗体液の調製
一次抗体粉末に粉末抗体溶解液（24mL）のうちの 3.5mL を加えて溶解する。
4.5 一次抗原抗体反応
ダイオキシン抗原固相化マイクロプレートの各 well に、希釈液 40L/well を添加し、次に 2)及び 3)で調製した標準溶液、試料希釈溶液及び濃度 0 ブランク（100%DMSO 溶液）を 10L/well 添加し、20%DMSO
溶液を作製する。その後、4)で調製した一次抗体液 50L/well を添加し、液面が水平になるように端を軽く叩く（注 2）。プレートシールを貼り、室温（18～25℃）で 90 分間反応させる（注 3）。
n＝3 で測定する場合の、各試料溶液のマイクロプレートへの分注（配置）例を図 4-3-11 に示す。

215

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

DMSO DMSO DMSO

試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料
3-1 3-2 3-3 11-1 11-2 11-3 19-1 19-2 19-3

B

STD
5

STD
5

STD
5

試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料
4-1 4-2 4-3 12-1 12-2 12-3 20-1 20-2 20-3

C

STD
4

STD
4

STD
4

試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料
5-1 5-2 5-3 13-1 13-2 13-3 21-1 21-2 21-3

D

STD
3

STD
3

STD
3

試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料
6-1 6-2 6-3 14-1 14-2 14-3 22-1 22-2 22-3

E

STD
2

STD
2

STD
2

試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料
7-1 7-2 7-3 15-1 15-2 15-3 23-1 23-2 23-3

F

STD
1

STD
1

STD
1

試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料
8-1 8-2 8-3 16-1 16-2 16-3 24-1 24-2 24-3G

試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料
1-1 1-2 1-3 9-1 9-2 9-3 17-1 17-2 17-3 25-1 25-2 25-3

H

試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料 試料
2-1 2-2 2-3 10-1 10-2 10-3 18-1 18-2 18-3 26-1 26-2 26-3

図 4-3-11

96well マイクロプレート上での試料の配置例(注 2)泡立ちやすいため、分注の際は気泡が入らないようゆっくりと操作すること。
(注 3)反応中はマイクロプレートを静置すること。

4.6 洗浄液の調製及び未反応物の除去
一次抗原抗体反応時間中に、6 倍濃縮洗浄液と蒸留水を 1:5 の割合で混合し、洗浄液を調製する。一次抗原抗体反応終了後、反応液を廃棄する。洗浄液 300L /well 入れて廃棄する操作を 3 回繰り返し、各ウェルを洗浄する。洗浄後、ペーパータオル上でダイオキシン抗原固相化マイクロプレートをタッピングし、洗浄液を完全に除去する。
4.7 標識二次抗体液の調製
標識二次抗体粉末に、粉末抗体溶解液（24mL）のうちの 7mL を加えて溶解する。
4.8 二次抗原抗体反応
洗浄したダイオキシン抗原固相化マイクロプレートに 7)で調製した標識二次抗体液 100L /well を添加し、液面が水平になるように端を軽く叩く。プレートシールを再び表面に貼り、室温（18～25℃）で 60 分間反応させる。
4.9 未反応物の除去
二次抗原抗体反応終了後、反応液を廃棄する。6)で調製した洗浄液 300L/well 入れて廃棄する操作を 3 回繰り返し、各ウェルを洗浄する。洗浄後、ペーパータオル上でダイオキシン抗原固相化マイクロプレートをタッピングし、洗浄液を完全に除去する。
4.10 発色反応
洗浄したダイオキシン抗原固相化マイクロプレートに発色液を 100L/well 添加し、液面が水平になるように端を軽く叩く。プレートシールを再び表面に貼り、室温（18～25℃）で 30 分間反応させた後、発色停止
液を 100L/well 添加する。
4.11 吸光度測定
ダイオキシン抗原固相マイクロプレート外側の底面に付着した汚れや水分を、柔らかなペーパータオル等
できれいに拭き取った後、波長 450nm における吸光度をプレートリーダーで測定する(注 4)。
216

(注4) 吸光度測定は反応停止後、速やかに行うこと(15分以内が望ましい)。

4.12 測定操作時の留意事項
1) 一次抗原抗体反応、二次抗原抗体反応、発色反応の反応時間及び反応温度は所定の条件で必ず行うこと。
2) ダイオキシン抗原固相化マイクロプレートへの分注操作は素早く行うこと。
3) ダイオキシン抗原固相マイクロプレートの洗浄後は、次の試薬を分注する前に、残液が極力尐なくなる
ようにタッピングを行い、残液を除去すること。
4) 発色反応の際に異常発色が認められる場合は、二次抗体による非特異反応が考えられる。ダイオキシン
抗原固相マイクロプレートの洗浄回数を再検討し、ウェル内の二次抗体が十分除去できる洗浄条件に設定すること。
5) 発色停止液を分注した後は、15 分以内に吸光度を測定することが望ましい。

５．定量

5.1 検量線の作成
標準物質の濃度に対して吸光度をプロットし、検量線を作成する。
1)

標準物質
6-(3,3',4'-トリクロロビフェニル-4-イロキシ)ヘキサン酸(77-2 標準物質)

2)標準溶液の調製
表 4-3-1 に検量線作成用標準液の調製例を示す。77-2 標準溶液を DMSO で順次希釈していき、表 4-3-1に示す濃度の STD1～STD5 を調製する。なお、77-2 標準物質を含まない 100%DMSO 溶液をブランクとする。
表 4-3-1 検量線作成用標準溶液の調製例

単位pg/well
ng/ml

3)

STD1
200
20

STD2
50
5

STD3
10
1

STD4
3
0.3

STD5
1
0.1

ブランク
0
0

検量線の作成各濃度に調製した 77-2 標準溶液のキット測定を行い、プレートリーダーにより波長 450nm における吸光度を測定する。77-2 標準物質設定濃度及び吸光度から、下記に示す 4-パラメーターの式の各係数（A～D）を算出（4-パラメーター・ソフトウェアを用いてもよい）する。表 4-3-2 及び図 4-3-12 に検量線の作成例を、表 4-3-3 にパラメーターの式の各係数例を示す。

𝑦=

𝐴−𝐷
+𝐷
𝑥 𝐵
1+ 𝐶

ここに、x ： 実測濃度(ng/mL)

y ： 吸光度A ： 濃度0でのB/B0%
B ： IC50での傾き
C ： IC50 (ng/mL)
217

D ： 過剰濃度でのB/B0%
表 4-3-2 検量線の作成例

77-2標準物質濃度
ng/ml
ブランク
0
STD5
0.1
STD4
0.3
STD3
1
STD2
5
STD1
20

B/B0
%
100
89.6
74.5
44.3
15.4
7.2

100

B/B0 （%）

80

60

40

20

0
0.1

1
10
77-2標準物質濃度（ng/ml）

図 4-3-12
表 4-3-3100

検量線の作成例

4-パラメーターの式の各係数例

4-パラメーター式の各係数
A 濃度0でのB/B0%
99.83
B IC50での傾き
1.088
IC(ng/ml)C
0.740
50
D 過剰濃度でのB/B0% 4.702

5.2 検量線の確認及び感度変動の管理図による確認
検量線作成用標準溶液の測定操作により得られたデータから測定量(毒性等量)を求め、管理図に記録し保存する。以下に、ばいじんの例を示す。
1) 検量線における IC50(B/B0 で 50%)付近の吸光度から、4-パラメーターの式を用いて標準物質濃度を算出する。表 4-3-2 の例では、STD3 における測定値の B/B0 がおよそ 50%に相当する。
2) 標準物質濃度に希釈倍率を乗じた数値を換算式に代入し、測定量(ng-TEQ/mL)を算出する（表 4-3-4 参照）。
3) 得られた測定量(ng-TEQ/mL)を平均し、管理図に記録し保存する。
218

4) IC50 付近における測定量の工程平均(μ)と標準偏差(σ)を算出し、±2σ を管理限界とする。この際の変動係数(CV%)は、20%以内に収まることが望ましい。管理限界等の数値例及び作成した管理図の例をそれ
ぞれ表 4-3-4 及び図 4-3-13 に示す。
5) １点でも管理限界を超えた場合は、原因の究明と改善を行うと共に、再測定する。改善のために講じた措置及び再測定の結果について、記録をする。
表 4-3-4 管理図用データ導出例
77-2標準
物質濃度
測定値
ng/ml
（吸光度）
ブランク
1.428
STD5
1.333
STD4
1.078
STD3
0.668
STD2
0.254
STD1
0.113

n=1
標準物質濃度
TEQ
測定値
ng/ml
ng-TEQ/ml （吸光度）
1.564
1.425
1.235
→1.02
→0.61
0.834
0.322
0.122

B/B0
%
100
93.4
75.5
46.8
17.8
7.9

B/B0
%
100
91.1
79.0
53.3
20.6
7.8

n=2
標準物質濃度TEQ
ng/ml
ng-TEQ/ml

→1.00

→0.60

表 4-3-5 管理図用データ算出例

工程平均
測定値の標準偏差
測定値の変動係数
管理限界

μ
σ
C.V.
μ±2σ

0.60
0.01933.19
0.56～0.64

IC50 近傍毒性等量(ng-TEQ/ml)

0.7

0.65

μ +2σ

μ

0.6

μ -2σ

0.55

0.5
0

5

10

15
20
測定回数（回）

図 4-3-13

25

30

35

管理図の例

5.3 測定試料の定量
各試料の吸光度を検量線に内挿し、阻害率(B/B0) 20～80%の範囲でかつ希釈直線性が認められる範囲の濃度に各希釈倍率を掛けた値の平均値（濃度の平均値）を用いて、次式により実測濃度(排出ガスにおいては
ng/m3N、ばいじん及び燃え殻においては ng/g)を算出する。

𝐶𝑆 = 𝑋 ×

𝑉𝐸 𝑣
×
𝑉′𝐸 𝑉
219

ここに、CS： 実測濃度(ng/m3N 又は ng/g)

X： 濃度の平均値(ng/mL)

VE： 抽出液量(mL)

V'E： 抽出液分取量(mL)v： 測定用試料の液量(mL)V： 試料採取量(m3N 又は g)(備考) 排出ガスの酸素濃度による補正がは、次式による。

𝐶=

9
× 𝐶𝑆
21 − 𝑂𝑆

ここに、C： 酸素の濃度 On における実測濃度(ng/m3N)
Os ： 排出ガス中の酸素の濃度(%) (注 5)
Cs ： 排出ガス中の実測濃度(ng/m3N）(注 5) 排出ガス中の酸素の濃度が 20%を超える場合は、Os=20 とする。

６．検出下限及び定量範囲

6.1 標準物質における検出下限及び定量範囲の確認(各媒体共通)標準物質における検出下限及び定量範囲の確認は、定量値の変動係数(CV%)が 30%以下となる点を検出下限とし、20%以下となる上下 2 点間を定量範囲とする方法で行う。下記に n=6 で測定した例を示す。
1) 検出下限等算出用標準溶液の調製例(1) 100ng/mL の標準溶液(STD1)を DMSO で 4 倍に希釈し、STD2 を調製する。
(2) STD2 から一定量を分取し、DMSO で 4 倍に希釈して STD3 を調製する。
(3) 以下、同様の手順で順次 4 倍希釈液(STD4～STD7)を調製し、検出下限等算出用標準溶液として標準溶液の 7 段希釈系列を調製する(表 4-3-6 参照)。
表 4-3-6 検出下限等算出用標準溶液

単位
ng/ml

STD1
100

STD2
25

STD3
6.25

STD4
1.56

STD5
STD6
STD7 ブランク
0.391 0.0977 0.024402) 検出下限及び定量範囲の算出例(1) 調製した検出下限等算出用標準溶液を 2.5 測定操作に従って測定する。n=6 の 7 段希釈系列で測定する場合のマイクロプレートへの分注操作の一例を図 4-3-14 に示す。
(2) 吸光度（測定値）を測定して、4-パラメーターの式の各係数(A～D)を算出し、吸光度から検出下限等算出用標準溶液相当量(定量値)を算出する。
(3)

各希釈濃度域における定量値の平均値、標準偏差(σ)及び変動係数(CV%)を算出する(表 4-3-7 参照)。

(4) 横軸に検出下限等算出用標準液濃度、縦軸に変動係数をプロットした精度プロファイルを作成する(表 4-3-15 参照)。
(5) 精度プロファイルより、変動係数 30%の点を検出下限、20%となる上下 2 点間を読み取り、定量範
囲とする。変動係数の検出下限、定量下限の確定方法は、第３節

220

測定データの精度管理

５. 生物

5.1 検出下限及び定量範囲に示すとおりである。

検定法における定量結果の確定と結果の報告

1

2

3

4

5

6

A

DMSO DMSO DMSO DMSO DMSO DMSO

B

STD
7-1

STD
7-2

STD
7-3

STD
7-4

STD
7-5

STD
7-6

C

STD
6-1

STD
6-2

STD
6-3

STD
6-4

STD
6-5

STD
6-6

D

STD
5-1

STD
5-2

STD
5-3

STD
5-4

STD
5-5

STD
5-6

E

STD
4-1

STD
4-2

STD
4-3

STD
4-4

STD
4-5

STD
4-6

F

STD
3-1

STD
3-2

STD
3-3

STD
3-4

STD
3-5

STD
3-6

G

STD
2-1

STD
2-2

STD
2-3

STD
2-4

STD
2-5

STD
2-6

H

STD
1-1

STD
1-2

STD
1-3

STD
1-4

STD
1-5

STD
1-6

図 4-3-14

7

8

9

10

11

12

96 ウェルマイクロプレート上での検出下限等算出用標準溶液の配置例
表 4-3-7 変動係数の算出例

測定結果(ng/ml)
標準液濃度
σ
ng/ml
1
2
3
4
5
6
平均
ブランク
0 0.026
(-)
(-)
0.011
(-)
(-)
0.018 0.011
STD7
0.0244 0.033(-)
0.036 0.049 0.051 0.058 0.045 0.011
STD6
0.0977 0.103 0.103 0.116 0.129 0.122 0.128 0.117 0.012
STD5
0.391 0.401 0.365 0.399 0.398 0.387 0.375 0.388 0.015
STD4
1.56 1.456 1.406 1.530 1.553 1.446 1.503 1.482 0.056
STD3
6.25 7.696 6.747 6.889 7.975 6.544 6.889 7.123 0.573
STD2
25 36.789 25.545 13.665 44.156 24.610 30.136 29.150 10.563
STD1
100 33.126(+)(+) 31.559(+)(+) 32.343 1.108
STD(備考)表中の(-)及び(+)は測定結果が得られなかったことを示す。
CV は測定結果が得られたものについて算出した。

221

CV
%
56.7
23.3
10.0
3.8
3.8
8.0
36.2
3.4

60
50

CV(%)

40
30
20
10
0
0.01

0.035 0.10.0181標準溶液濃度(ng/ml)

図 4-3-15

10

10.2

精度プロファイルの例

上記方法により算出したキットの検出下限及び定量範囲を表 4-3-8 に示す。なお、本法により算出した検出下限及び定量範囲は、100%DMSO 溶液中の標準物質相当量(ng/mL)である。
また、1 ウェル当たりの試料分注量は 10L であり、測定媒体に関わらず同じである。
表 4-3-8 標準物質における検出下限及び定量範囲

検出下限
pg/well
ng/ml
0.18
0.018

定量範囲
pg/wellng/ml
0.35～100 0.035～10

6.2 試料における検出下限及び定量範囲の確認
前処理に供した試料量と前処理を経た最終検液量等から、標準物質における検出下限及び定量下限を用いて理論的に算出する。試料における検出下限及び定量下限は、試料採取量や最終検液量等により異なるため、
表 4-3-9 及び表 4-3-10 に例を示す。
表 4-3-9 試料における検出下限
キット
測定媒体

検出下限
pg/well

排出ガス
ばいじん
燃え殻

0.18

サンプル調製

最終 希釈
分注量
試料量
酸素濃度 分取量/総抽出液量
検液量 倍率μl/well m3N又はg(注6)
%
ml/ml
ml
1.5
12.0
10/20
1.0
1
10
1.00
10/20
1.0
1
1.00
10/20
1.0
1

222

媒体中濃度
実測濃度
3

ng/m N又はng/g(注7)
0.024
0.036
0.036

表 4-3-10試料における定量範囲（注 8）

キット

サンプル調製

最終 希釈
測定媒体 定量範囲値 分注量
試料量
酸素濃度 分取量/総抽出液量
検液量 倍率pg/well
μl/well m3N又はg(注6)
%
ml/ml
ml
排出ガス
1.5
12.0
10/20
1.0
1
10
ばいじん 0.35～100
1.00
10/20
1.0
1
燃え殻
1.00
10/20
1.0
1

媒体中濃度
実測濃度
3

ng/m N又はng/g(注7)0.05～13.3
0.07～200.07～20(注 6) 排出ガスにおいては m3N、ばいじん及び燃え殻においては g とする。
(注 7) 排出ガスにおいては ng/m3N、ばいじん及び燃え殻においては ng/g とする。
(注 8) 本例では、定量下限及び定量上限の両方を算出した。

７．測定量(毒性等量)への換算

測定量(毒性等量)は下記の換算式を用いて実測濃度から算出し、結果を記録する。また、使用した換算式も含め、測定量の算出に至った計算過程を説明できる資料を作成する。
1) 排出ガス
希釈系列 1mL 当たりの実測濃度(ng/mL)×希釈倍率 (以下「Q」と表記)から換算式を用いて測定量(毒性等量、排出ガス総抽出液当たり)への換算を行う。
測定量(毒性等量)(ng-TEQ/m3N)  Q  0.422 
ここに、 QVE v
V 'E V： 希釈倍率に実測濃度を乗じたもの(ng/mL)

VE： 抽出液量(mL)

V'E： 抽出液分取量(mL)v： 測定用試料の液量(mL)V： 試料採取量(m3N)2) ばいじん希釈系列 1mL 当たりの実測濃度(ng/mL)×希釈倍率(以下「Q」と表記)から換算式を用いて測定量(毒性等量、ばいじん総抽出液当たり)への換算を行う。
測定量(毒性等量)(ng-TEQ/g)  Q  0.595 
ここに、 QVE v
V 'E V： 希釈倍率に実測濃度を乗じたもの(ng/mL)

VE ： 抽出液量(mL)
V'E ： 抽出液分取量(mL)v： 測定用試料の液量(mL)V： 試料採取量(g)3) 燃え殻希釈系列 1mL 当たりの実測濃度(ng/mL)×希釈倍率(以下「Q」と表記)から換算式を用いて測定量(毒性等量、燃え殻総抽出液当たり)への換算を行う。
223

測定量(毒性等量)(ng-TEQ/g)  Q  0.522 

ここに、

VE v

V 'E VQ ： 希釈倍率に実測濃度を乗じたもの(ng/mL)
VE ： 抽出液量(mL)
V'E ： 抽出液分取量(mL)v： 測定用試料の液量(mL)V ： 試料採取量(g)なお、測定結果の報告様式については、第 2 章第 2 節「測定結果の報告」を参照すること。

８．換算係数の確認
尐なくとも 6 ヶ月に 1 回、HRGC/HRMS 法によって測定された試料について、本測定法による測定を行い、HRGC/HRMS 法により得られた測定量（毒性等量）と本測定法で得られた実測濃度より換算係数を算出し、換算係数と比較する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認を行う。得られた換算係数が、第 6 節記載の換算係数と大きく換算係数が乖離する場合又は相関が悪い場合には、原因の究明を行い、その結果及び講じた措置を記録する。
試料は、片方について HRGC/HRMS 法に定められた方法により前処理を行い、残りについては生物検定法に定められた方法により前処理を行って試料を調製する。
排出ガス試料については、JIS K0311 に従い抽出までを行った抽出試料（ただし、アッセイに影響を及ぼすサンプリングスパイク及び抽出工程でのクリーンアップスパイクの添加は行わない）を分割し、片方は JIS
K0311 に定められた方法により測定量（毒性等量）を求め、残りは、本法 2.5 の 1)～11)及び 2.6 の 5)に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を算出する。
ばいじん及び燃え殻試料については、平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(2)に準拠した方法（ただし、同表ウ(イ)の内標準物質の添加の操作は行わない）により測定量（毒性等量）を求め、残りは、
2.5 の 1)～11)及び 2.6 の 5)に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を算出する。

224

第６節 参考資料「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(排出ガス試料)」
濃度既知の排出ガス試料を本測定方法により測定し得られた実測濃度(ng/mL)と、HRGC/HRMS法により測定し得られた試料中の毒性等量(ng-TEQ/mL)の関係から測定量(毒性等量)への換算式を算出した（図4-3-16参照）。

排出ガス

n=20

y = 0.4224x
R 2 = 0.9101

毒性等量 (ng-TEQ/ml)

10

8

6

4

2

0
0

5

10

15

20

実測濃度 (ng/ml)

図 4-3-16

換算係数算出例（排出ガス）「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(ばいじん試料)」
濃度既知のばいじん試料を本測定方法により測定し得られた実測濃度(ng/mL)と、HRGC/HRMS法により測定し得られた試料中の毒性等量(ng-TEQ/mL)の関係から測定量(毒性等量)への換算式を算出した（図4-3-17参照）。

225

ばいじん

n=20

y = 0.5952x
R 2 = 0.8869

毒性等量 (ng-TEQ/ml)

10

8

6

4

2

0
0

5

10

15

20

実測濃度 (ng/ml)

図 4-3-17

換算係数算出例（ばいじん）「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(燃え殻試料)」
濃度既知の燃え殻試料を本測定方法により測定し得られた実測濃度(ng/mL)と、HRGC/HRMS法により測定し得られた試料中の毒性等量(ng-TEQ/mL)の関係から測定量(毒性等量)への換算式を算出した（図4-3-18
参照）。

燃え殻

n=20

y = 0.5221x
R 2 = 0.8836

毒性等量 (ng-TEQ/ml)

10

8

6

4

2

0
0

5

10

15

実測濃度 (ng/ml)

図 4-3-18

換算係数算出例（燃え殻）

226

20

その４

前処理に、多層シリカゲルカラム及びアルミナカラムを使用し、測定に、抗ダイオキシン類モノク

ローナル抗体及び抗原固相化ビーズを用いた結合平衡除外法を利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(平成 17 年環境省告示第 92 号第 2 の 4)

第１節 測定方法の概要

対象媒体毎に試料を採取し、ダイオキシン類を抽出後、クリーンアップを行い、抗ダイオキシン類モノク
ローナル抗体を用いた結合平衡除外法による測定により定量する。測定フローを図 4-4-1 に示す。

試料採取

抽出

クリーンアップ
抗ダイオキシン類モノクローナル抗体を用いた結合平衡除外法による測定

標準物質(実測濃度)の定量

換算係数による測定量（毒性等量）への換算

測定値確定

図 4-4-1 測定方法のフロー

第２節 用語の定義

1)

抗ダイオキシンモノクローナル抗体

免疫反応によって脊椎動物に産生される抗体（タンパク質）を、マウス由来の融合細胞（ハイブリドーマ)を用いて取得したもので、ダイオキシン類と特異的に反応する性質を有する。
2)

結合平衡除外法

レセプター分子（抗ダイオキシンモノクローナル抗体）とリガンド(ダイオキシン類)との相互作用を短時間で評価するフロー式免疫測定法であり、ホモジニアス系（均一系）であるが B/F
分離を行ったと同様な状態を構成できる高感度な測定系。
3)

フロー式免疫測定法

ダイオキシン類と抗ダイオキシンモノクローナル抗体複合体形成時の平衡状態への干渉を抑え、複合体形成に消費されない未反応抗体トレーサーを、抗体との親和性を制御したリガンドを固相化した測定セルに通液し、固相上に捕捉された抗体トレーサー量よりダイオキシン類濃度を算出する方法。
4)

生体分子間相互作用

液相における生体分子間の結合力（アフィニティ）に関して、極めて強い、若しくは極めて弱い結合力、又は、極めて早い、若しくは極めて遅い結合・解離反応などの生物学的相227

互作用のこと。
5)

測定セル

未反応抗体トレーサーを捕捉する目的で、親和性を制御したリガンドを固相化した高分子

担体を充填した光透過性ユニットのこと。
6)

再生液

抗体－リガンド複合体から抗体を解離させるアルカリ性の緩衝液。

7)

キャリーオーバー洗浄液

高濃度ダイオキシン類試料を測定した際に配管へのダイオキシン類の吸着が懸念されるが、これを洗浄除去する目的で使用する 50%DMSO 水溶液のこと。
8)

校正試料補正本法は 1 つの測定セル上で抗体の結合、解離を反復して行い、結合した抗体量を蛍光量として連続して求めるという方法をとることから、反復測定によるセル表面の経時変化、及び測定
セル間誤差を補正する必要がある。そのため各試料の測定した実測値について、TCPHA 校正液の実測値と TCPHA 標準溶液検量線との値の乖離を補正することをいう。
9)

スクリーニング測定

前処理を行った環境試料中に含まれるダイオキシン類の濃度範囲を推定し、定量範囲での測定をするための希釈評価測定用最適供試量を求める測定。
10) 希釈評価測定

スクリーニング測定により得られた実測値が測定系の定量下限値以上である場合、設定された最適供試量をもとに 3 段階以上の希釈系列の試料を測定し、ダイオキシン類濃度を算出する
測定。
11) 低濃度評価測定

スクリーニング測定により得られた実測値が測定系の定量下限値未満である場合、スクリーニング測定での希釈倍率を、排出ガスは 4 倍と 8 倍、ばいじん及び燃え殻は 2 倍と 4 倍に下げて 2 段階を測定し、定量範囲内の値をもとにダイオキシン類濃度を算出する測定。
12) 定量測定

ダイオキシン類濃度を最も精度高く測定するために、TCPHA 校正液濃度と同濃度になる

ように希釈評価測定により算出した測定試料量を測定し、ダイオキシン類濃度を算出する測定 。
13) IC50

使用した抗体量の 50%反応値。50%の阻害がかかる濃度（50% Inhibition Concentration）

14) B/B0 測定対象の蛍光量をブランク（濃度０）の蛍光量で除した数値。
第３節 試料採取方法に関する特記事項

１．試料ガスの採取量

試料ガスの採取量は、次のような手順によって決定する。採取時間については、その目的に応じて試料ガスの発生状況等を十分考慮して代表試料が採取できるようにしなければならない。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の1/30以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小の試料ガスの量を算出する。

𝑉=

𝑄𝐷𝐿 × 𝑛 × 𝑣 𝑉𝐸
1××𝑘
𝑉′𝐸 𝐶𝐷𝐿

ここに、 V：測定に必要な最小の試料ガスの量 (m3N)

QDL：標準物質における検出下限 (g/mL, 測定試料溶液中)

n：希釈倍率(測定試料溶液中の測定用試料量の割合)k：測定量（毒性等量）への換算係数v：測定用試料の液量 (mL)
228

VE

：抽出液量 (mL)V’E

：抽出液分取量 (mL)

CDL

：必要となる試料ガスにおける検出下限 (ng-TEQ/m3N)4) 算出された最小の試料ガスの量以上を試料ガスの採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
（例）5ng-TEQ / m3N レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となる試料ガスにおける検出下限
は0.17ng-TEQ/m3N)
抽出液を20mL に定容し、その抽出液から10mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に0.9mLの測定用試料溶液に調製する場合の試料ガス採取量を以下に示す。なお、標準物質における検出下限は0.0022g/mL、希釈倍率は20倍、排出ガスの測定量への換算係数は1.49g/ng-TEQを用いた。

𝑉=

0.0022 × 20 × 0.9 20
1
××= 0.311.49
10 0.17

２．ばいじんの採取量

ばいじんの採取量は、次のような手順によって決定する。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の1/30 以下にばいじんにおける検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小のばいじんの量を算出する。

𝑊=

𝑄𝐷𝐿 × 𝑛 × 𝑣 𝑉𝐸
1××𝑘
𝑉′𝐸 𝐶𝐷𝐿

ここに、W：測定に必要な最小のばいじんの量 (g)QDL ：標準物質における検出下限 (g/mL, 測定試料溶液中)
n：希釈倍率(測定試料溶液中の測定用試料量)k：測定量（毒性等量）への換算係数v：測定用試料の液量 (mL)VE ：抽出液量 (mL)V’E ：抽出液分取量 (mL)
CDL ：必要となるばいじんにおける検出下限 (ng-TEQ / g)4) 算出された最小のばいじんの量以上をばいじんの採取量とする。
ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
（例）3ng-TEQ/g レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となるばいじん試料における検出下限
は0.1ng-TEQ/g)
抽出液を20mL に定容し、その抽出液から10mLを分取してクリーンアップを行い、最終的に0.9mLの測定用試料溶液に調製する場合のばいじんの採取量を以下に示す。なお、標準物質における検出下限は、0.0022g/mL、希釈倍率は20倍、ばいじん試料の測定量への換算係数は、1.22g/ng-TEQを用いた。

𝑊=

0.0022 × 20 × 0.9 20
1
××= 0.651.22
10 0.1229

３．燃え殻の採取量

燃え殻の採取量は、次のような手順によって決定する。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の1/30 以下に燃え殻における検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小の燃え殻の量を算出する。

𝑊=

𝑄𝐷𝐿 × 𝑛 × 𝑣 𝑉𝐸
1××𝑘
𝑉′𝐸 𝐶𝐷𝐿

ここに、 W：測定に必要な最小の燃え殻の量 (g)

QDL：標準物質における検出下限 (g/mL、DMSO 溶液中)

n

：希釈倍率(測定試料溶液中の測定用試料量)k：測定量（毒性等量）への換算係数v：測定用試料の液量 (mL)

VE

：抽出液量 (mL)V’E

：抽出液分取量(mL)

CDL：必要と燃え殻試料における検出下限(ng-TEQ/g)4) 算出された最小の燃え殻の量以上を燃え殻の採取量とする。
ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
（例）3ng-TEQ / g レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となる燃え殻試料における検出下限
は0.1ng-TEQ / g)
抽出液を10mL に定容し、その抽出液から10mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に1 mLの測定用試料溶液に調製する場合の燃え殻試料の採取量を以下に示す。なお、標準物質における検出
下限は0.0022g/mL、希釈倍率は20倍、燃え殻試料の測定量への換算係数は1.27g/ng-TEQを用いた。

𝑊=

0.0022 × 20 × 0.9 20
1
××= 0.621.27
10 0.1230

第４節 試料の前処理

１．試料の前処理の概要

採取した試料は、抽出を行う。抽出液は必要に応じて分取を行い、クリーンアップに移る。図 4-4-2 に試料の前処理から測定までのフローの例を示す。

試料
抽出
抽出液
一部分取

（省略可能）

多層シリカゲル／アルミナカラムクロマトグラフ操作
測定用試料
図 4-4-2 試料の前処理から測定までのフローの例

２．試薬

試料の前処理に用いる試薬は、次による。これらの試薬は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
1)

水 JIS K0557 に規定する A4 (又は A3) の水

2)

メタノール

3)

アセトン

JIS K8040 に規定するもの、又は同等の品質のもの

4)

トルエン

JIS K8680 に規定するもの、又は同等の品質のもの

5)ジクロロメタン

6)

ヘキサン

7)

デカン

8)

ジメチルスルホキシド (DMSO)

9)

塩酸JIS K8180 に規定するもの、又は同等の品質のもの

10) 硫酸JIS K8951 に規定するもの、又は同等の品質のもの

11) 硝酸銀

JIS K8891 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8117 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8825 に規定するもの、又は同等の品質のもの

測定に支障のない品質のもの
JIS K9702 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8550 に規定するもの、又は同等の品質のもの

12) 硫酸ナトリウム

JIS K8987 に規定するもの、又は同等の品質のもの

13) ヘキサン洗浄水

1) の水を 6) のヘキサンで十分洗浄したもの

14) シリカゲル

JIS K0311 6.2 に規定するもの、又は同等の品質のもの
23115) 硫酸（44%質量分率）シリカゲル JIS K0311 6.2 に規定するもの、又は同等の品質のもの
16) 硝酸銀 (20%質量分率) シリカゲル

14) のシリカゲル 100 g に対して 11)の硝酸銀で調製した硝酸銀

溶液 (625 g/L) 40 mL を加えた後、ロータリーエバポレータで水分を完全に除去する。硝酸銀シリカ
ゲルは、調製後、密閉できる着色容器に入れ、デシケーター中に保存する。
17) アルミナ

JIS K0311 6.2 に規定するもの、又は同等の品質のもので、本法に適用して良好な結果が得られることが確認されているもの
18) 窒素JIS K1107 に規定する高純度窒素１級19) ガラスウール

JIS K8251 に規定するもの、又は同等の品質のもの

３．器具及び装置

試料の前処理に用いる器具及び装置は、次による。これらの器具及び装置は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
3.1 ガラス器具
JIS R3503 及び JIS R3505 に規定するもの。コックの部分がフッ素樹脂製のものを用いてもよい
3.2 高速溶媒抽出装置
ダイオネクス製 ASE-200 又はこれと同等品。ASE 用の器具一式 (セルボディー、セルエンドキャップア
センブリ、溶媒ボトル、補修ボトルアセンブリ、コンプレッサー等)
3.3

濃縮器

クデルナ－ダニッシュ(KD)濃縮器又はロータリーエバポレータ。接続部にグリースを使用してはならない。
3.4

多層シリカゲルカラムクロマトグラフ管

内径 14mm、長さ 300mm のガラス製カラムクロマトグラフ管
3.5

アルミナカラムクロマト管

内径 6mm、長さ 50mm のガラス製カラムクロマトグラフ管
3.6

ヒーター

カラムクロマト管を包み込み 100℃程度まで加熱することができるもの
3.7

送液ポンプ

流速の調節が毎分 0.1 ～ 10 mL の範囲内で可能であって、流速の変動が±2%以内のもの

４．前処理操作

4.1

試料量の記録

採取した試料は、試料量を記録する。
4.2
1)

抽出
排出ガス
JIS K0311 6.4 に準拠し、抽出を行う。ただし、内標準物質の添加は行わない。図 4-4-3 に JISⅡ形装置

を用いて採取した排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

232

吸引プローブ洗液

円筒ろ紙

ダイオアナフィルタろ過
HCl (2mol/l) 処理
20 mmol/g-ダスト以上
ろ液

残渣

ろ過・水洗

ろ液・洗液

発泡がないことを確認

残渣

乾燥液－液振とう抽出

高速溶媒抽出ジクロロメタン，3 回

トルエン，2 回

濃縮：検体又は試料定容：作業：物又は試料粗抽出液

図 4-4-3 排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例
高速溶媒抽出は下記条件で 2 回行う

2)

溶媒

：

トルエン

加熱

：

7分

静置

：

2分

フラッシュ ：

70%

パージ

：

60 秒

サイクル

：

5回

温度

：

150℃

圧力

：

2000psi

ばいじん及び燃え殻
平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(2) 又は下記の方法により抽出を行う。ただし、内標準物質の添加の操作は行わない。図 4-4-4 にばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例を
示す。
233

試料

HCl(2mol/l)処理

20 mmol/g-試料以上発泡がないことを確認

ろ過・水洗

残渣

ろ液・洗液

乾燥

液－液振とう抽出
ジクロロメタン，3 回

高速溶媒抽出トルエン，2 回

濃縮：検体又は試料定容：作業：物又は試料粗抽出液
図 4-4-4

ばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例

高速溶媒抽出は下記条件で 2 回行う

4.3

溶媒

：

トルエン

加熱

：

7分

静置

：

2分

フラッシュ ：

70%

パージ

：

60 秒

サイクル

：

5回

温度

：

150℃

圧力

：

2000psi

クリーンアップ

図 4-4-5 にクリーンアップのフローの例を示す。

234

粗抽出液

一部分取

転溶

ヘキサン

多層シリカゲルカラムに添加

多層シリカゲルカラムとアルミナカラムを連結

アルミナカラムを乾燥

多層シリカゲルカラムを 60 °C 加熱
ヘキサン溶出窒素

DMSO を逆方向に送液し、回収

90 °C 加熱下 DMSO 溶出

測定溶液
図 4-4-5

クリーンアップのフローの例

1) 抽出液の分取(1) 抽出液を分取して一部を測定に使用する場合には、定容した抽出液から目的に合わせて一部を分取する。排出ガスについては 1.0m3N 相当量、ばいじん及び燃え殻については 1.0g 相当量の抽出液を 1回のクリーンアップの目安とする。
(2) あらかじめ、デカン 0.4mL を入れた受器に適量の抽出液を入れ、ロータリーエバポレータで乾固寸前まで濃縮する。この濃縮液に適当量のヘキサンを加え、ロータリーエバポレータで乾固寸前まで濃縮する。この操作を 3 回程度繰り返しトルエンを除去する。その後、次に示す多層シリカゲルカラム－アルミナカラム操作によってクリーンアップを行う。

2) 精製カラムの作製(1) 多層シリカゲルカラム
3.3 のカラムクロマトグラフ管の底部にガラスウールを詰め、シリカゲル 2.3g、硫酸（44%質量分率）
シリカゲル 10.4g、シリカゲル 0.2g、硝酸銀（20%質量分率）シリカゲル 3.6g、シリカゲル 1.5g を順次充填する。このカラムを図 4-4-6 に示す。

235

シリカゲル ： 1.5g

硝酸銀 (20%質量分率) シリカゲル ： 3.6g
シリカゲル ： 0.2g

硫酸 (44%質量分率) シリカゲル ： 10.4g

シリカゲル ： 2.3g
ガラスウール ： 適量

図 4-4-6 多層シリカゲルカラムの例(2) アルミナカラム
3.4 のカラムクロマトグラフ管の底部にガラスウールを詰め、アルミナ 1.0g 程度充填し、その上からガラスウールを詰める。このカラムを図 4-4-7 に示す。

ガラスウール ： 適量
アルミナ ： 1.0g
ガラスウール ： 適量

図 4-4-7 アルミナカラムの例

3) クリーンアップ操作(1) 図 4-4-8 に示す様に、2) の(1)多層シリカゲルカラム、(2)アルミナカラムを連結し、多層シリカゲル
カラムを構成する上端のシリカゲル、硝酸銀シリカゲル及び硫酸シリカゲルの上半分の部分を覆うよ
うにヒーターをセットする。
(2) 濃縮した試料にヘキサンを加え、多層シリカゲルカラムに添加する。添加する試料の液量は容器の洗液を合わせて最大 5mL までとする。
(3) ヒーターにより 60℃で 10 分間カラムを加熱する。
236

(4) 60℃加熱下、ヘキサン 85 mL を送液 (2.5 mL/min) する。

ヒーター

ヘキサン送液(60℃加熱)多層シリカゲルカラム

接続アダプター

アルミナカラム

図 4-4-8 多層シリカゲルカラムとアルミナカラムの組み立て例

4) 溶媒置換及び測定用試料の保存(1) 3)の(4)の操作後、アルミナカラムに窒素を通じ、ヘキサンを除去する。
(2) アルミナカラムを包み込むようにヒーターをセットし、90℃で 10 分間加熱する。
(3) 90℃加熱下、3) の(4)のヘキサンの送液方向とは逆方向に、即ちアルミナカラム下端側から DMSO
2.5mL を送液 (2.5mL/min) し、上端側から溶出する DMSO 溶液約 1mL を予め秤量済みのバイアル瓶に回収する。図 4-4-9 にアルミナカラムを反転させない場合の操作例を示した。
(4) 回収後、バイアル瓶を秤量し、密栓後、室温で暗所に保存する。秤量の差分を DMSO 定容量とする。

237

アダプター

ヒーター (90℃加熱)

バイアル瓶

アルミナカラムDMSO 送液

図 4-4-9

アルミナカラムを反転させない場合の DMSO への置換操作の例

第５節 測定１．測定の概要

本方法は、ダイオキシン類の毒性等量との相関性の高い、五塩化ジベンゾフラン類に特異的に反応する抗ダイオキシン類モノクローナル抗体及び抗原固相化ビーズを用いた結合平衡除外法に基づく生体分子間相互作用解析技術を利用したフロー式免疫測定法によりダイオキシン類の毒性等量を測定する方法である。
2,4,5-トリクロロフェノキシヘキサノイルアミノプロピオン酸（TCPHA）を用いて検量線を作成し、試料の蛍光量から算出した実測濃度を、排出ガス、ばいじん及び燃え殻について定められた換算係数で除することにより、測定量（毒性等量）を算出する。

２．使用キット、試薬、器具及び装置

2.1 使用キット
使用キット（抗ダイオキシン類モノクローナル抗体には、マウス由来の融合細胞（ハイブリドーマ）から収得した 2,3,4,7,8－五塩化ジベンゾフランを特異的に認識する抗体を、抗原固相化ビーズには、2,4,5－トリ
クロロフェノキシ誘導体及び高分子担体から合成したものを、検量線作成用標準品には、2,4,5-トリクロロフェノキシヘキサノイルアミノプロピオン酸を使用する。）は、以下の試薬等から構成されるものである。
5 個入り

1)

測定セル（抗原固相化ビーズ充填済）

2)

抗ダイオキシン抗体溶液（×10 濃度）5mL

3)抗体溶液希釈用バッファー液

4)2,4,5-トリクロロフェノキシヘキサノイルアミノプロピオン酸(TCPHA)校正液

5)

キャリーオーバー洗浄液

6)CD(検量線データ入り)

7)

添付書類

45mL

50mL
1枚

238

4mL

試薬

2.2

測定に用いる使用キット以外の試薬は，次による。
JIS K0557 に規定する A4(又は A3)の水、又は同等の品質のもの

1)

水

2)

リン酸水素二ナトリウム十二水和物

3)

塩化ナトリウム

4)

リン酸二水素カリウム5)

塩化カリウム6)

リン酸緩衝生理食塩液（PBS（-））7)

ウシ血清アルブミン（BSA）

JIS L1902 で使用されている生化学試験用のもの

8)

水酸化ナトリウム（NaOH）

JIS K8576 に規定するもの、又は同等の品質のもの

9)

アジ化ナトリウム（NaN3）K9501 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8001 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8001 に規定するもの、又は同等の品質のもの
JIS K8001 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8001 に規定するもの、又は同等の品質のもの
JIS K0461 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K8101 に規定するもの、又は同等の品質のもの

10) エタノール

11) 試料調製用緩衝液

1000mL の水にリン酸水素二ナトリウム十二水和物 2.79g、 塩化ナトリウム7.60g、 リン酸二水素カリウム 0.20g、 塩化カリウム 0.20g、 アジ化ナトリウム 0.20g 、 ウシ血
清アルブミン 1.0g を十分に溶解させた後、孔径 0.45μm のフィルターを用いてろ過したもの
12) 測定用緩衝液

800mL の水にリン酸水素二ナトリウム十二水和物 2.79g、塩化ナトリウム 7.60g、リン酸二水素カリウム 0.20g、 塩化カリウム 0.20g、 アジ化ナトリウム 0.20g、 ウシ血清アルブミン
1.0g を十分に溶解させた後、DMSO 50mL を加え攪拌する。水を用いて全量を 1000mL とし、再度攪拌した後、孔径 0.45μm のフィルターを用いてろ過したもの
13) ジメチルスルホキシド（DMSO）
14) 再生液

JIS K9702 に規定するもの、又は同等の品質のもの

95mL の水に水酸化ナトリウム 0.10g を溶解させた後、5mL の DMSO を加え攪拌溶解させ

たもの
2.3

器具及び装置測定に用いる器具及び機器は、次による。
1)

蛍光検出装置キットで供給される測定セルを装着し、励起波長 650nm を発光でき、得られる蛍光波

長 665nm の蛍光強度を精度良く検出できる装置
JIS K3802 に規定するもの、又は同等の品質のもの

2)

フィルター(0.45m)

3)

試料瓶(ガラス製)

4)

マイクロピペット用チップ

5)マイクロピペット

5～10mL 程度の遮光の出来る褐色瓶
JIS K 0970 に規定するもの、又は同等の品質のもの

JIS K 0970 に規定するもの、又は同等の品質のもの

200L 、1000L

10～100L、20～200L、100～1000L
6)

送液システム3 種類以上の溶液（反応液、緩衝液、再生液等）を正確かつ、精密な流量、流速で送液できるシステム7)

送液チューブダイオキシン類の吸着を抑制した内径 0.5mm のステンレス製のチューブ

３．キットの取り扱い

以下の取り扱い上の注点を遵守すること。
1) 測定セル、抗ダイオキシン抗体溶液（×10濃度）および抗体溶液希釈用バッファー液は、冷蔵庫(2～8℃)
239

にて保管すること。
2) 抗ダイオキシン抗体溶液（×10濃度）および抗体溶液希釈用バッファー液の有効期間は、納入より2ヶ月以内。ただし、抗体溶液（×1濃度）へ調製後は、1ヶ月間以内に使い切ること。
3) 測定セルの有効期間は、納入より2ヶ月以内。ただし、開封後は1日以内に使用すること。
4) TCPHA校正液は必ず常温遮光下で保存すること。納入時に凍っている場合は、常温で解凍し十分に混合すること。品質に影響しない。
5) キットを保管する場合は、保存場所、保存方法、汚染の配慮、温度及び湿度の情報を記録し、保存すること。

４．測定操作4.1

測定方法のフロー
前処理を行ったダイオキシン類試料を用いて結合平衡除外法を用いた測定により定量する。測定方法のフローを図 4-4-10 に示す。

240

測定溶液
適量分取

測定試料溶液を調製

抗ダイオキシン（DXN）抗体液添加

スクリーニング測定
結合平衡除外法による測定（蛍光検出装置）
定量下限値未満

定量下限値以上
解析
ダイオキシン類濃度を推定
最適供試量決定
希釈評価測定

低濃度評価測定

結合平衡除外法による測定

結合平衡除外法による測定（蛍光検出装置）（蛍光検出装置）

解析

解析

ダイオキシン類濃度を定量

ダイオキシン類濃度を算出

定量測定
結合平衡除外法による測定（蛍光検出装置）

必要に応じて、希釈評価測定の後、「定量測定」を行うこと
により、より精度の高い測定値を得ることが出来る

解析
ダイオキシン類濃度を定量

図 4-4-10 測定方法のフロー

241

4.2

測定試料調製

1) ブランク試料溶液（B0 値）の調製
DMSO 400L と試料調製用緩衝液 5600L を試料瓶に加え泡立てないように攪拌混合した後、抗ダイ
オキシン類抗体液 2000L を追加し、再度泡立てないよう穏やかに攪拌混合し調製する。
2) 校正試料溶液の調製
校正液 200L と試料調製用緩衝液 2800L を試料瓶に加え泡立てないように攪拌混合した後、抗ダイ
オキシン類抗体液 1000L を追加し、再度泡立てないよう穏やかに攪拌混合し調製する。
3) 測定試料溶液の調製（スクリーニング測定用）
スクリーニング測定時の試料溶液調製例を表 4-4-1 に示す。試料量と DMSO 量の合計が 200L となるように下記の表 4-4-1 に従い、試料と DMSO を試料瓶に加え軽く混合する。そこに試料調製用緩衝液
2800L を追加し、泡立てないように攪拌混合した後、さらに抗ダイオキシン類抗体液 1000L を追加
し、再度泡立てないよう穏やかに攪拌混合し試料を調製する。
表 4-4-1 スクリーニング測定時の測定試料溶液調製例(注１)
B0 溶液

校正試料溶液

測定試料溶液DMSO 量

400L

試料量

－

0L
TCPHA
200L
2800L
1000L4000L(200-X)L
前処理済み試料XL2800L
1000L4000L

5600L2000L8000L

試料調製用緩衝液量
抗ダイオキシン類抗体液量
測定時の調製試料量（注 1)

X は前処理での前処理量と調製液量の条件にあわせて設定し、その試料量において一律に行う。排出ガスの場合約0.022m3N 相当量、ばいじん及び燃え殻の場合約 44mg 相当量。(例排出ガス 1m3N/0.9mL 、ばいじん及び燃え殻

1g/0.9mL の前処理済み調製試料を用いる場合の試料量(X)は排出ガスの場合 20L、ばいじん及び燃え殻の場合 40Lとなる)

4) 測定試料溶液の調製(希釈評価測定用)
希釈評価測定時の試料溶液調製例を表 4-4-2 に示す。試料量と DMSO 量の合計が 200L となるように下記の表 4-4-2 に従い、算出した各試料量とそれぞれに対応した DMSO を試料瓶に加え軽く混合する。
そこに試料調製用緩衝液 2800L を追加し、泡立てないように攪拌混合した後、さらにそれぞれに抗ダイオキシン類抗体液 1000L を追加し、再度泡立てないよう穏やかに攪拌混合し 3 試料を調製する。
表 4-4-2 希釈評価測定時の測定試料溶液調製例（注 2）
DMSO 量
試料量
試料調製用緩衝液量
抗ダイオキシン類抗体液量
測定時の調製試料量

希釈評価試料１(200－0.5X)L
前処理済み試料
0.5XL2800L
1000L4000L

希釈評価試料２(200－X)L
前処理済み試料XL2800L
1000L4000L(注 2)スクリーニング測定結果より以下の式を用いて、希釈評価測定用最適供試量を求める。

242

希釈評価試料３(200－1.5X)L
前処理済み試料
1.5XL2800L
1000L4000L𝑋=

0.0095 × 𝑉
𝐶

ここに、

X ：

希釈評価測定用最適供試量（L）

V ：測定への試料量(L) (例 排出ガス：0.022m3N 相当量)

C：

標準物質相当量（TCPHA 換算値g/mL）5) 測定試料溶液の調製(低濃度評価測定用)
低濃度測定時の試料溶液調製例を表 4-4-3 に示す。試料量と DMSO 量の合計が 200L となるように
下記の表 4-4-3 に従い、各試料量とそれぞれに対応した DMSO を試料瓶に加え軽く混合する。そこに試料調製用緩衝液 2800L を追加し、泡立てないように攪拌混合した後、さらに抗ダイオキシン類抗体液1000L を追加し、再度泡立てないよう穏やかに攪拌混合し 2 試料を調製する。
表 4-4-3 低濃度評価測定時の測定試料溶液調製例（注 3）
DMSO 量
試料量
試料調製用緩衝液量
抗ダイオキシン類抗体液量
測定時の調製試料量

低濃度評価試料１(200-X)L
前処理済み試料XL2800L
1000L4000L

低濃度評価試料２(200-2X)L
前処理済み試料2XL2800L
1000L4000L(注 3) 排出ガスの場合約 0.089m3N 相当量、ばいじん及び燃え殻の場合約 89mg 相当量。 (例 排出ガス 1m3N/0.9mL 、ばいじん及び燃え殻 1g/0.9mL の前処理済み調製試料を用いる場合の試料量(X)は 80L)6) 測定試料溶液の調製(定量測定用)
定量測定時の試料溶液調製例を表 4-4-4 に示す。下記の表 4-4-4 に従い、算出した試料量と DMSO を試料瓶に加え軽く混合する。そこに試料調製用緩衝液 2800L を追加し、泡立てないように攪拌混合した後、さらに抗ダイオキシン類抗体液 1000L を追加し、再度泡立てないよう穏やかに攪拌混合し試料を調製する。
表 4-4-4 定量測定時の測定試料溶液調製例 (注 4)
DMSO 量
試料量
試料調製用緩衝液量
抗ダイオキシン類抗体液量
測定時の調製試料量

定量試料(200－X)L
前処理済み試料XL2800L
1000L4000L(注 4) 希釈評価測定結果より Y=aX の原点を通る直線式が得られ、この直線式より定量測定に用いる定量測定用最適供試量を求める。

𝑋=

0.0095𝑎

ここに、

X：定量測定用最適供試量（L）

a：希釈評価測定結果より得られた原点を通る直線式の傾き

243

4.3

結合平衡除外法によるダイオキシン類の測定
測定セルへの送液は、測定対象物の非特異的吸着を抑制するために送液チューブを用いて行うこと。

1)

測定操作のフロー
測定セルを用いた試料溶液測定のフローを図 4-4-11 に示す。

試料通液操作：測定セルに調製試料溶液を送液する

洗浄操作：測定セルに測定用緩衝液を送液し、残存する試料溶液を除去する

測定操作：蛍光量を測定する

再生操作：測定セルに再生液を送液し、測定セルに補足された抗体を解離させる

洗浄操作：測定セルに測定用緩衝液を送液し、測定セル内を測定用緩衝液へ置換する

図 4-4-112)

試料溶液測定のフロー

スクリーニング測定(1) 4.2-1)～3)に従って測定用試料を調製する。
(2) 測定セルに 4.2-1)ブランク試料溶液 0.4mL を流速 0.75mL/min で送液する（以下、試料通液操作と称する）。
(3) 測定用緩衝液 0.75mL を流速 0.75mL/min で送液（以下、洗浄操作と称する）し、測定セル部に残存する試料溶液を洗浄除去する。
(4) 蛍光量を測定する（以下、測定操作と称する）（B0 値）。
(5) 測定セルに再生液 0.75mL を流速 0.75mL/min で送液（以下、再生操作と称する）し、測定セルに結合した抗ダイオキシン類抗体を解離させる。
(6) 洗浄を行い、測定セルを元の状態に復帰させる。
(7) 測定セルに 4.2-2)の校正試料溶液 0.4mL を流速 0.75mL/min で送液する。次に洗浄操作を行い、蛍光量を測定する。
(8) 測定セルの再生操作後、洗浄操作を行い、測定セルを元の状態に復帰させる。
(9) 測定セルに 4.2-3)の測定試料溶液 0.4mL を流速 0.75mL/min で送液する。次に洗浄操作を行い、蛍光量を測定する（B 値）。
(10) 測定セルの再生操作後、洗浄操作を行い、測定セルを元の状態に復帰させる。
(11) 1 個の測定セルで検体数に応じ、図 4-4-11 に示す操作を繰り返し、測定を行う。
次に引き続き、定量下限未満の場合は低濃度評価測定、定量下限以上の場合は希釈評価測定を行う。
244

3)

希釈評価測定(排出ガス、ばいじん及び燃え殻)(1) 4.2-1)、4.2-2)、4.2-4)に従って測定用試料を調製する。
(2) 図 4-4-11 に示すフロー（試料通液操作、洗浄操作、測定操作、再生操作、洗浄操作）に従って測定を行う。
4)

低濃度評価測定(排出ガス、ばいじん及び燃え殻)(1) 4.2-1) 、4-2-2)、4-2-5) に従って測定用試料を調製する。
(2) 図 4-4-11 に示すフロー（試料通液操作、洗浄操作、測定操作、再生操作、洗浄操作）に従って測定
を行う。
5)

定量測定

(排出ガス、ばいじん及び燃え殻)(1) 4.2-1) 、4-2-2)、4-2-6) に従って測定用試料を調製する。
(2) 図 4-4-11 に示すフロー（試料通液操作、洗浄操作、測定操作、再生操作、洗浄操作）に従って測定
を行う。

５．定量

本法においては、その原理に基づき、同一ロットの試薬等を用いた場合、測定毎に毎回検量線を取得する必要がない。特に、図 4-4-11 に示すフローを自動で行う場合、常に校正液を用いた補正を行う事で予め作成した検量線の情報を基に定量値への換算を行う事が可能である。
ただし、本測定系は、測定時における環境温度と測定感度が連動することから、検量線を作成する場合は、環境温度について記録する。
5.1

検量線の作成濃度既知の TCPHA 標準溶液の 6 濃度水準以上に対して蛍光量をプロットし、検量線を作成する。
1) TCPHA 標準溶液
表 4-4-5 に検量線作成用 TCPHA 標準溶液の調製例を示す。TCPHA 標準溶液 (STD7；20g/mL)を段階
希釈により STD1～STD6 の濃度系列を調製する。
2) 測定試料溶液の調製
表 4-4-5 に検量線作成用測定試料溶液の調製例を示す。まず、7 つの試料瓶に濃度ごとの TCPHA 標準溶液を 200L ずつ添加する。その後、試料調製用緩衝液 2800L を追加し、泡立てないように攪拌混合した後、さらに抗ダイオキシン類抗体液 1000L を追加し、再度泡立てないよう穏やかに攪拌混合し調製する。測定試料溶液の濃度は試料調製用緩衝液と抗ダイオキシン類抗体を添加することにより TCPHA 標準溶液を 20 倍希釈したことになる。なお、TCPHA 標準溶液を含まない DMSO のみをブランクとする。
表 4-4-5 検量線作成用測定試料溶液の調製例
溶液
TCPHA標準溶液
測定試料溶液

単位
g/ml
g/ml

ブランク

STD1

STD2

STD3

STD4

STD5

STD6

STD7

0
0

0.01
0.0005

0.10
0.005

0.19
0.0095

0.40
0.02

1
0.05

4
0.2

20
1

3) 検量線の作成

セル間誤差の補正
各濃度に調製した TCPHA 標準溶液の測定を行い、蛍光検出装置により波長650nm における蛍光量を
本法は１測定セル(ELISA固相の１wellに相当)上で抗体の結合、解離を反復して行い、結合した抗体量を蛍光量として連続して求めるとい測定する。TCPHA 標準物質設定濃度及び蛍光量から、下記に示す
4-パラメーターの式の各係数（a～d）
う方法を採っており実測値δ に含まれる、反復測定によるセル表面を算出する。
の経時変化、及び測定セル間誤差は適切な補正により排除し測定精度を確保している。
本試験では経時変化による影響の無い範囲内で測定を行っているた
245
め、セル間誤差のみを補正した。
補正方法；８濃度(８セル)で測定したB0値の平均(δ '=8.255)を元に実測値を補正し、測定値Yを求めた。

検量線作成及びパラメーターの例を図 4-4-12 に示す。

𝑎−𝑑𝑦=1+ 𝑋 𝑐
ここに、 y

𝑏

+𝑑

：測定値

d

：曲線における下方漸近値 (最小検出器測定結果)(B/B0)a：曲線における上方漸近値 (最大検出器測定結果)(B/B0)

X：標準物質の質量濃度(g-TCPHA / mL)c：IC50 における標準物質の質量濃度(g-TCPHA/mL)b：曲線の傾きg/mL
0.00050.005
0.0095
0.02
0.05
0.2
1

B/B0 値
0.970
0.845
0.745
0.603
0.411
0.178
0.052

1

0.8

0.6

B/Bo

測定試料溶液濃度

0.44-パラメーター式の各係数5.2a

最大 B/B0

0.997

b

曲線の傾き

0.878

c

IC50 濃度0.0326d

最小 B/B0

0.007

0.2

0
0.0001

0.001

0.01

0.1

1

10

測定試料液濃度（g/ml）
図 4-4-12 検量線作成及びパラメーターの例

検量線の確認及び感度変動の管理図による確認
定量操作が適切に行われているかどうかを確認するため、測定担当者は、測定毎の感度校正として使用

する校正液（0.0095g/mL）の測定値を、管理図に記録し保存する。また同時に測定時の環境温度を記録する。
管理図による処置基準は、管理限界 ( ±2σ) からの逸脱状況及び図の傾向等に応じて下記のとおりとする (：工程平均、σ：測定値 の標準偏差)。
検量線作成時の環境温度±1℃の範囲内で測定された校正液の測定値が１点でも管理限界を超えた場合は、原因の究明と改善を行うとともに、再測定する。改善のために講じた措置及び再測定の結果について記録をする。また、管理限界内であっても基準値に対して、一定の傾向で外れていくような状態又は偏った測定量が続くような状態においては、原因の究明を行い、必要に応じ、改善を行うとともに、再測定する。
5.1 での校正試料溶液(0.0095g/mL) の測定を 25℃で行い、検量線による換算値 (ng-TCPHA/mL) を算
出し、管理図にプロットする。34 セルについて行った一例を表 4-4-6、表 4-4-7、図 4-4-13 に示す。

246

表 4-4-6 管理図用データ導出例
測定回数

B/B0

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

0.742
0.763
0.744
0.748
0.737
0.744
0.749
0.766
0.744
0.748

換算値
(10-3g-TCPHA/ml)
9.77
8.57
9.67
9.46
10.09
9.66
9.39
8.42
9.65
9.43

34

0.741

9.81

表 4-4-7 管理図用データ算出例

工程平均
測定値の標準偏差
測定値の変動係数
管理限界

μ
σ
CV
μ±2σ

9.31
0.50
5.34%
8.31～10.30

12.0

測定値 (ng-TCPHA/ml)

11.0



10.0


9.0


8.0
7.0

6.0
0

5

10

15

20

25

30

35

40

測定回数 (回)図 4-4-13

管理図の例

5.3 測定試料の定量
各環境試料での測定において、阻害率 (B/B0 %) 65～80% の範囲かつ希釈評価測定での直線性が認められる場合、その測定結果(B/B0)を検量線に内挿し、得られた希釈試料中実測濃度を用いて、次式により(TCPHA
標準溶液相当)、実測濃度 (排出ガスにおいては ng/m3N、ばいじん及び燃え殻においては ng/g) を算出する。

𝐶𝑆 = 𝑋 × 𝑛 ×

𝑉𝐸 𝑣
×
𝑉′𝐸 𝑉

ここに、Cs： (TCPHA 標準溶液相当) 実測濃度 (g/m3N 又は g/g)

X ： 測定試料溶液実測(TCPHA 標準溶液相当)濃度 (g/mL）(注5)
N ： 希釈倍率v： 測定用試料の液量 (mL)

VE ： 抽出液量 (mL)247

V’E ： 抽出液分取量 (mL)V

： 試料採取量 (m3N 又は g)(注5) 測定試料溶液実測濃度はセル間誤差等の影響があるため、校正試料での補正を行う。

𝑋 = 𝑋試料 ×

0.0095
𝑋校正試料

ここに、

X試料

： 環境試料溶液 (TCPHA 標準溶液相当) 実測値 (g/mL)

X校正試料： 校正試料溶液の実測値 (g/mL）(備考) 排出ガスの酸素濃度による補正は、次式による。

𝑉=

9
× 𝐶𝑆
21 − 𝑂𝑆

ここに、 C： 酸素の濃度On における実測濃度 (ng/m3N)

Os ： 排出ガス中の酸素の濃度 (注6) (%)
Cs ： 排出ガス中の実測濃度 (ng/m3N）(注6) 排出ガス中の酸素の濃度が20%を超える場合は、Os=20 とする。

６．検出下限及び定量範囲6.1

標準物質における検出下限及び定量範囲

標準物質における検出下限及び定量範囲の確認は、定量値の変動係数(CV%)が 30%以下となる点を検出下限とし、20%以下となる上下 2 点間を定量範囲とする方法で行う。ただし、検量線において CV が 30%となる点の濃度における B/B0 値が 0.9 を超える場合、この数値を適応せずに B/B0 値が 0.9 を示す濃度を検出下限値とする。また、同様に CV が 20%となる点の濃度における B/B0 値が 0.85 を超える場合、この数値を適応せずに B/B0 値が 0.85 を示す濃度を定量下限値とする。この場合、それぞれの CV はより小さくなるため、規定よりも厳しい判定となる。
1) 検出下限等算出用標準溶液の調製例
表4-4-8 に示す濃度の検出下限等算出用標準溶液を調製する(詳細は5.1-2)を参照)。

表 4-4-8 検出下限等算出用標準溶液の調製例
溶液
単位 ﾌﾞﾗﾝｸ STD100.01
TCPHA標準溶液 g/ml
00.0005
測定試料溶液 g/ml

STD2
0.1
0.005

STD3
0.19
0.0095

STD4
0.4
0.02

STD5
1
0.05

STD6
4
0.2

STD7
20
1

STD8
40
2

2) 検出下限及び定量範囲の算出
1)で調製した検出下限等算出用標準溶液を n=5 以上で測定した検量線より定量し、測定量(毒性等量)の平
均、標準偏差及び変動係数(CV)を算出し、精度プロファイルを作図し、検出下限及び定量範囲を図より読み取る。検出下限及び定量範囲の算出例を表 4-4-9、図 4-4-14、図 4-4-15 に示す。

248

表 4-4-9 測定結果例(n=6)
濃度
n=1
g/ml
0.0005 0.955
0.005 0.826
0.0095 0.716
0.02 0.574
0.05 0.371
0.2 0.163
1 0.047
2 0.031

n=2
0.964
0.829
0.720
0.581
0.382
0.168
0.051
0.034

測定値(Y)：B/B0値
n=3
n=4
n=5
0.962 0.958 0.959
0.832 0.821 0.821
0.721 0.713 0.714
0.579 0.567 0.569
0.375 0.364 0.376
0.163 0.160 0.168
0.050 0.054 0.055
0.029 0.036 0.036

n=1
g/ml
0.0005 0.001
0.005 0.005
0.0095 0.010
0.02 0.020
0.05 0.051
0.2 0.189
1 1.230
2 2.837

n=2
0.000
0.005
0.010
0.019
0.049
0.181
1.075
2.373

n=3
0.001
0.004
0.009
0.020
0.050
0.189
1.099
3.377

n=4
0.001
0.005
0.010
0.021
0.053
0.194
0.974
2.049

n=5
0.001
0.005
0.010
0.021
0.050
0.181
0.934
1.994
50

40

40
定量値のCV(%)

50

30

20

10

0
0.0001

Ave
0.961
0.826
0.717
0.574
0.372
0.164
0.052
0.034

n=6
0.000
0.005
0.010
0.020
0.053
0.188
0.962
1.933

Ave
0.001
0.005
0.010
0.020
0.051
0.187
1.046
2.427

YのCV
%
0.4%
0.5%
0.4%
1.0%
1.9%
1.9%
6.1%
9.7%

Xの
CV(rc)
%
31.2%
5.4%
3.3%
2.2%
1.6%
1.5%
6.1%
57.7%

30

20

10

0.001

0.01

0.1

1

0
0.0001100.001

濃度（μ g/mL）

図 4-4-14

YのSD
σ
0.004
0.005
0.003
0.006
0.007
0.003
0.003
0.003

定量値(X)：g/ml

濃度

定量値のCV(%)

n=6
0.964
0.825
0.719
0.574
0.364
0.163
0.054
0.037

0.01

0.1

1

10

濃度（μ g/mL）

検出下限値の求め方

図 4-4-15

定量下限値及び定量上限値の求め方

図の精度プロファイルにより求めた検出下限値は 0.0006g/mL (B/B0=0.959)であり、この濃度は検量線において B/B0 値が 0.9 を超えることから、B/B0 値が 0.9 を示す濃度を検出下限値(0.0022g/mL)とする。
また、定量下限は 0.0009g/mL (B/B0=0.945)であり、この濃度は検量線において B/B0 値が 0.85 を超えていることから、B/B0 値が 0.85 を示す濃度を定量下限値(0.0038g/mL)とする。
表 4-4-10

標準物質における検出下限並びに定量下限の実用例
検出下限試料
g/mL
0.0022定量下限
g/mL
0.0038249

TCPHA 標準溶液における検出下限及び定量範囲は、尐なくとも 6 ヶ月に 1 回十分な性能が得られていることを確認する。また、測定条件が大幅に変わった場合(機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等)にも、確認する。
6.2

試料における検出下限及び定量下限

試料における検出下限及び定量下限は、試料量と前処理を経た最終定容量の数値と、反応液中の TCPHA
標準溶液における検出下限及び定量下限から理論的に算出する。試料における検出下限及び定量下限は、試料採取量や最終定容量等によって異なってくるため、試料ごとに求める。

𝐶𝐷𝐿 = 𝑄𝐷𝐿 × 𝑛 × 𝑣 ×𝐶𝑄𝐿 = 𝑄𝑄𝐿 × 𝑛 × 𝑣 ×
ここに、

𝑉𝐸 1
×
𝑉′𝐸 𝑉

𝑉𝐸 1
×
𝑉′𝐸 𝑉

CDL

：環境試料における検出下限 (g/m3N 又は g/g)

CQL：環境試料における定量下限 (g/m3N 又は g/g)

QDL：標準物質における検出下限 (g/mL, 測定試料溶液中)

QQL：標準物質における定量下限 (g/mL, 測定試料溶液中)

n：希釈倍率(測定試料溶液中の測定用試料量の割合)(例 測定試料溶液0.40mL中に測定用試料0.02 mLの場合、n=20)v：測定用試料の液量 (mL)

VE

：抽出液量 (mL)V’E

：抽出液分取量 (mL)V

：試料採取量 (m3N 又は g)

なお、QDL、QQL には、第 5 節「6.1 標準物質における検出下限及び定量範囲」に従い算出した検出下限と定量下限を用いる。「6.1 の 2) 検出下限及び定量下限の算出例」における表 4-4-10 に示した例では、標準物質における検出下限は 0.0022g/mL、定量下限は 0.0038g/mL である。
表 4-4-11
測定媒体
排ガス
ばいじん
燃え殻

試料における検出下限算出例（排出ガス、ばいじん及び燃え殻）
試料調製
使用キット
媒体中濃度
分取液量
最終
実測濃度(注8)
採取量(注7)
検出下限
希釈
/
定容量
倍率 g/m3N or g
g/mL
m3N or g
抽出液量mL

0.0022

2

10/20

0.9

20

0.040

(注 7) 排出ガス m3N、ばいじん及び燃え殻 g(注 8) 排出ガスg/m3N、ばいじん及び燃え殻 g/g

表 4-4-12

測定媒体
排ガス
ばいじん
燃え殻

試料における定量下限算出例（排出ガス、ばいじん及び燃え殻）
試料調製
使用キット
媒体中濃度
採取量(注
分取液量
/
最終
実測濃度(注
定量下限
希釈
9)
抽出液量 定容量
10)
倍率
g/mL
mL/mL
mL
m3N or g
g/m3N or g

0.00382

10/20(注 9) 排出ガス m3N、ばいじん及び燃え殻 g(注 10)排出ガスg/m3N、ばいじん及び燃え殻 g/g

250

0.9

20

0.068

７．測定量(毒性等量)への換算

図4-4-16 に、生物検定法によって測定された濃度のHRGC/HRMS 法によって求めた濃度に対する相関図を示す。現時点で相関図より近似式を求めた結果、排出ガスの場合y=1.488x、ばいじんの場合y=1.221x 及び燃え殻の場合y=1.267x となっている。従って、生物検定法で求めた実測濃度(ng/m3N あるいはng/g)を、排出ガスの場合、換算係数1.488 (g/ng-TEQ)、ばいじんの場合、換算係数1.221 (g/ng-TEQ)、及び燃え殻の場合、換算係数1.267 (g/ng-TEQ)を除して測定量(毒性等量)を求める。次式により測定量(毒性等量)を算出する。また、測定量(毒性等量)への換算係数の例を表4-4-13に示す。
測定量 毒性等量 (ng − TEQ/m3 N 又はng − TEQ/g) =𝐶𝑆𝑘

ここに、 Cs ： (TCPHA 標準溶液相当) 実測濃度 (g/m3N 又は g/g)(注11)k ：測定量(毒性等量)への換算係数(g/ng-TEQ)(注11)(TCPHA 標準溶液相当) 実測濃度の算出方法の詳細は5.3を参照すること。

表 4-4-13 毒性等量への換算係数の例
換算係数

排出ガス
1.488

ばいじん
1.221

燃え殻
1.267

なお、測定結果の報告様式については、第2章第2節「測定結果の報告」を参照すること。

８．換算係数の確認
尐なくとも 6 ヶ月に 1 回、HRGC/HRMS 法によって測定された試料について、本測定法による測定を行い、HRGC/HRMS 法により得られた測定量（毒性等量）と本測定法で得られた実測濃度より換算係数を算出し、換算係数と比較する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認を行う。得られた換算係数が、第６節の換算係数と大きく換算係数が乖離する場合又は相関が悪い場合には、原因の究明を行い、その結果及び講じた措置を記録する。
試料は、片方について HRGC/HRMS 法に定められた方法により前処理を行い、残りについては生物検定法に定められた方法により前処理を行って試料を調製する。
排出ガス試料については、JIS K0311 に従い抽出までを行った抽出試料（ただし、アッセイに影響を及ぼすサンプリングスパイク及び抽出工程でのクリーンアップスパイクの添加は行わない）を分割し、片方は JIS
K0311 に定められた方法により測定量（毒性等量）を求める。残りは、本法 4.1～4.3 及び 5.3 に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を算出する。
ばいじん及び燃え殻試料については、平成 4 年厚生省告示第 192 号別表第一(第一号関係)(2)に準拠した方法（ただし、同表ウ(イ)の内標準物質の添加の操作は行わない）により測定量（毒性等量）を求め、残りは、
本法 4.1～4.3 及び 5.3 に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を算出する。

251

第６節 参考資料「実測濃度から測定量（毒性等量）を求める際の換算係数の導出について（排出ガス試料）」
濃度既知の試料を本測定方法により測定し得られら実測濃度（g/mL）と、HRGC/HRMS 法により測定し得られた試料中の毒性等量（ng-TEQ/mL）の関係から測定量（毒性等量）への換算式を算出した（図 4-4-16参照）。
排出ガス n=35203

実測濃度（g-TCPHA/m N)

y = 1.488x
R = 0.971
15

10

5

0
0

2

図 4-4-16468
毒性等量（ng-TEQ/m3N）1012

換算係数算出（例）（排出ガス）「実測濃度から測定量（毒性等量）を求める際の換算係数の導出について（はいじん及び燃え殻試料）」
濃度既知の試料を本測定方法により測定し得られら実測濃度（g/mL）と、HRGC/HRMS 法により測定し得られた試料中の毒性等量（ng-TEQ/mL）の関係から測定量（毒性等量）への換算式を算出した（図 4-4-17
参照）。

燃え殻 n=27

ばいじん n=23
1212
y = 1.221x
R = 0.946

y = 1.267x
R = 0.97110
実測濃度（ g-TCPHA/g)

実測濃度（ g-TCPHA/g)

10
8
6
4

8
6
4
2

2

0

0
0

2

4
6
8
毒性等量（ng-TEQ/g）

図 4-4-17

0

10

2

4
6
8
毒性等量（ng-TEQ/g）

換算係数算出（例）（ばいじん及び燃え殻）

252

10