第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023
第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023

油脂酵母 Lipomyces starkeyi における脂肪酸合成酵素遺伝子の改変によるカカオバター様油脂の生産
渡部

凌 1・佐藤1

里佳子 1・荒学志 1,2・荒木秀雄 2・山崎晴丈 1・高久洋暁 1＊

新潟薬科大学大学院応用生命科学研究科，2 不二製油グループ本社〒956-8603

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Tel: 0250-25-5119

新潟薬科大学大学院応用生命科学研究科
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E-mail: htakaku@nupals.ac.jp

LsELO20%パルミチン酸(16:0)

50%

C16/18 elongase

ステアリン酸(18:0)

改変前 改変後

100%

50%

LsFAD20%∆9desaturase

オレイン酸(18:1n9c)

改変前 改変後

50%∆12desaturase

0%

リノール酸(18:2n6c)

改変前の遺伝⼦発現量

脂肪酸 (%)

パルミトレイン酸(16:1n9c)

OLE10%

改変前 改変後

100%

OLE1100%

脂肪酸 (%)

50%

改変前 改変後脂肪酸 (%)脂肪酸 (%)

100%

脂肪酸 (%)

100%

改変前 改変後50%

改変後の遺伝⼦発現量

0%

100%

100%

OthersOthers50%10µm

Lipomyces starkeyi

脂肪酸(%)脂肪酸 (%)

C18:2n6c
C18:1n9c
C18:0
C16:1
C16:00%

iey
ター
rk
オバ
staL.
カカ

カカオバター様油脂

C18:2n6c50%

C18:1n9c
C18:0
C16:1
C16:00%様ターター
オバ
オバ 脂 カカ
カ油カコロナウイルス感染症、ウクライナ危機の影響による油脂市場の混乱は、油脂自給率が僅か 14%しかない日本に大きな影響を与え、油脂の自給率向上対策は急務課題であることを我々に再認識させた。本研究対象の油脂酵
母 Lipomyces starkeyi は、地域バイオマスから高効率で油脂を生産可能なユニークな酵母である。これまで我々のグループでは、油脂酵母 L. starkeyi によるパーム油代替油脂の発酵生産の研究で、菌株育種により油脂の高生産に成功している。この先行技術を基盤とし、日本で生育が困難な植物の代換油脂の生産が可能になれば、油脂自給率向上に大きく貢献できると考えた。そこで本研究では、L. starkeyi の脂肪酸合成経路を改変することにより、高温多湿の気候で生育するカカオのカカオバター類似油脂の L. starkeyi 発酵生産系を構築した。

1. はじめに
高温多湿の熱帯で生育するカカオに含まれるカカオバターは主にチョコレートの原料として利用されている。しかし、カカオ生産地において、気候変動、害虫や病気、地球温暖化による土地の乾燥化がカカオの生30２産量に影響を与えると予測されており、将来的に不足する可能性がある 1)。また、油脂自給率の低い日本は、世界情勢の変化に応答する油脂市場に左右されることから、油脂自給率に対する危機感は高い。日本を含めた油脂低自給率の国々は、自給率向上のための新たな油脂生産技術を必要としている。

この結果を利用し、OLE1 発現強度を低下させるように内在性のプロモーターを改変した。その結果、野生株
ではステアリン酸含量は約 5％、オレイン酸含量が約50％であるのに対し、改変 OLE1 プロモーター株ではステアリン酸含量は約 12％、オレイン酸含量が約 35％に変化した（図 2）。さらに改変 OLE1 プロモーター株
に対し、LsELO2 を高発現させた場合、ステアリン酸含量は約 24％まで向上した（図 2）。この脂肪酸組成はカ
カオバターと比較して非常に類似しており、カカオバターの代替油としての可能性を期待させるものである。
100%

Others
C18:2n6c
C18:1n9c
C18:0
C16:1
C16:0

脂肪酸(%)

OLE1

ステアリン酸(18:0)∆9desaturase

LsFAD2オレイン酸(18:1n9c)∆12desaturase

リノール酸(18:2n6c)

タカカオ
バ

C16/18 elongase

野LsELO2

パルミチン酸(16:0)

⽣株

0%ー50%プ 改変ロモ OLー E
タ 1ー株
改変Ls OL
EL E
O 1プ
2⾼ ロ
発 モー
現 タ株 ー

油脂酵母 L. starkeyi は乾燥菌体重量の 70％以上もパーム油類似脂肪酸組成の油脂を細胞内の脂肪球に蓄積できる。また、グルコース以外にもキシロース、マンノース、フルクトース、デンプンなどの様々な糖を炭素源として利用できる 2)。したがって、食品・醸造残渣などの複数の糖が混在するバイオマス由来の糖化液からの油脂生産が期待できる。
これまで我々のグループでは、L. starkeyi による
パ ー ム 油 代 替 油 脂 の 発 酵 生 産 の実 用 化 へ 向 け 、 L.
starkeyi の油脂生産制御因子の発見と改変により研究を推進してきた 3)。この技術と脂肪酸組成改変技術の活用は、日本で生育が困難な植物の代替油脂生産に繋がり、油脂自給率向上に大きく貢献できると考えた。
L. starkeyi 野生株の生産油脂とカカオバターの脂肪酸組成は、パルミチン酸(C16:0)、ステアリン酸(C18:0)、オレイン酸(C18:1)の含量に違いがある。本
研究では、L. starkeyi によるパルミチン酸からオレイン酸までの変換に関与する酵素遺伝子 LsELO2, OLE1の発現調節によるカカオバター様油脂の発酵生産系の構築を目指した（図 1）。

OLE1
パルミトレイン酸(16:1n9c)

図 1.

改変前

改変後

本研究における脂肪酸合成経路の改変戦略図

2. 材料と方法
本研究では L. starkeyi の野生株と比較して相同組換え効率が格段に向上している L. starkeyiΔlslig4株を宿主として使用した 4)。OLE1 の発現強度を調節するために、OLE1 プロモーター解析を実施した。そのため、β-ガラクトシダーゼをコードする大腸菌由来のLacZ をレポーター遺伝子として様々な長さの OLE1 プロモーターの融合遺伝子断片を作製した。作製した遺伝子断片をエレクトロポレーション法によりΔlslig4株に導入後、その菌株を培養し、β-ガラクトシダーゼ活性の測定を実施した。
OLE1 プロモーター解析結果を利用し、OLE1 の発現を弱める改変 OLE1 プロモーターを内在性の OLE1 プロモーター領域に、LsELO2 高発現カセットを LsLIG4 領域に導入した。構築した株を培養し、適宜サンプリング及び油脂抽出を行い、GC で脂肪酸組成を分析した。

3. 結果と考察

OLE1 プロモーター解析の結果、プロモーターの長さに応じてβ-ガラクトシダーゼ活性は徐々に低下した。

図 2.

野生株及び改変 OLE1 プロモーター株における脂肪酸組成解析

4. 結言
本研究では、L. starkeyi の脂肪酸合成酵素遺伝子の発現を調節した結果、カカオバターと類似した油脂を生産させる酵母の創製に成功した。今後は本研究で構築した菌株に対して、油脂生産制御因子の改変を行うことにより、カカオバター様油脂の高生産化に向けて取り組み、産業利用への応用を目指す。

謝辞
本研究は NEDO の助成事業の支援を受けて実施した。

参考文献
1) Konzock, O. et al., Microbial Cell Factories,
25, 1186 (2022).
2) Oguri, E. et al., Antonie van Leeuwenhoek, 101,359 (2012).
3) Takaku, H., Appl Microbiol Biotechnol., 107,1269 (2023).
4) Oguro, Y. et al., Current Genetics, 63, 751(2017).

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