第75回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
7RSLFVRI
第of 2023&RU\QHEDFWHULXPJOXWDPLFXP を用いた
グルコースからの ピリジンジカルボン酸の生産
野中鏡士朗・長村達也・高橋史員＊・小山伸吾
花王株式会社 生物科学研究所
〒和歌山県和歌山市湊  番地
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(PDLOWDNDKDVKLIXPLND]X#NDRFRP

要旨 
リグニン原料から微生物変換法によって得られる
ピリジンジカルボン酸 3'&$ は、テレフタル酸に類似した骨格を持つ植物由来樹脂原料として期待される。しかし、プロトカテク酸を経由する既知の代謝経路には中間体が不安定である点や外部からアンモニウム塩を添加する必要がある点などの課題がある。
本研究では、アミノヒドロキシ安息香酸 $+%$ の酸化開裂反応によって自発的に 3'&$ が形成される現象に着目し、グルコースから $+%$ を経由して 3'&$ を生産する新規代謝経路を設計した。本経路を導入したコリネ型細菌 &RU\QHEDFWHULXPJOXWDPLFXP の培養を行った結果、実際に 3'&$ が生産可能であることが示された。
背景  炭素循環型社会の構築に向けて、バイオマスなどの再生可能資源から化学品を生産する技術の開発が望まれる。芳香族ジカルボン酸の１種であるテレフタル酸はポリエチレンテレフタレートなどに大量に使用される石化由来化学品原料であり、フランジカルボン酸など類似した骨格を持つ再生可能資源由来の代替原料を生産する研究が盛んに行われている。

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近年、テレフタル酸と類似したヘテロ芳香族ジカルボン酸である ピリジンジカルボン酸 3'&$
図  をバイオマスの一種であるリグニン原料から生産し、テレフタル酸代替素材として汎用樹脂材料に応用する試みが英国 :DUZLFN 大学と %LRPH %LRSODVWLFV社の研究グループによって報告された  。3'&$は農薬・医薬品の原料としても利用されるほか、ピリジン環に由来する水素結合形成能などを活かして金属錯体型ガス分離剤  、エンジニアリングプラスチック
、燃料電池用高分子電解質  などのビルディングブロックとしても研究されており、従来テレフタル酸が用いられてきた材料において 3'&$ を用いることで新たな機能を付与できる可能性も秘めている。

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図１テレフタル酸と 3'&$ の分子構造
上 記 の 3'&$ 生 産 検 討  で は 、 5KRGRFRFFXVMRVWLL5+$ 株を宿主としてプロトカテク酸ジオ
キシゲナーゼ 3UD$ を異種発現させ、リグニンの分解によって微生物細胞内で生じるプロトカテク酸 3&$をさらに酸化開裂し塩化アンモニウムと反応させることで、 時間で  PJ/ の 3'&$ が得られている。しかし、カテコール型骨格の酸化開裂物にアンモニウム塩を作用させる本手法は、変換に別途アンモニウム塩の添加を必要とする点や開裂物が不安定で夾雑物のアミン基とも反応し収率を低下させ得る点などに課題がある 図  。
図 3&$ の酸化開裂による 3'&$ の形成
一方、既報  にて アミノヒドロキシ安息香酸
$+%$ 資化性菌 %RUGHWHOOD VS G 株由来の 
アミノヒドロキシ安息香酸ジオキシゲナーゼ$KG$ が $+%$ を酸化的に開裂し、その開裂物は後続の分解酵素が存在しない条件下において非酵素的に3'&$ へと自己変換されることが報告されている。
本反応を用いれば、別途アンモニウム塩を添加する必要がなく、また開裂物が自発的に 3'&$ へと変換されるため安定性に関する課題も解消されると期待される 図  。用いてグルコース流加培養条件下で  P/ スケールのジャー培養を行い、培養上清中の成分濃度を高速液体クロマトグラフィーにて分析した結果、 時間時点で J/ の 3'&$ が検出された 図  。また、その際に検出された $+%$ の濃度はわずか  J/であった。これらのことから、$%$ の  位水酸化反応と $+%$ の酸化開裂反応を & JOXWDPLFXP の代謝経路に導入することで、グルコースから 3'&$ を生産可能であることが示された。
本研究の結果は、微生物による化学品生産のための人工代謝経路のさらなる多様化と、再生可能資源由来の炭素源を活用した高機能材料の拡大に貢献するものと期待される。
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図 ジャー培養における培養上清の各成分の濃度●：3'&$、〇：$+%$

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図 $+%$ の酸化開裂による 3'&$ の形成

謝辞 
我々はこれまでに アミノ安息香酸 $%$ の  位水酸化を触媒する独自の ヒドロキシ安息香酸  位水酸 化 酵 素 変 異 体 &Y3+%+PXW を コ リ ネ 型 細 菌&RU\QHEDFWHULXPJOXWDPLFXP の代謝経路に導入することで安価な再生可能資源であるグルコースから $+%$ がグラムスケールで得られることを見出しており  、本代謝経路に対してさらに $+%$ の酸化開裂反応を導入することで、グルコースから 3'&$ を生産する新規代謝経路が構築できると考えられる。そこで本研究では、& JOXWDPLFXP を用いてグルコースから $+%$ を経由して 3'&$ を生産することを試みた。


結果 と 考 察 & JOXWDPLFXP  1%5& $7&& 株を親株として内在性の $%$ 生合成経路を強化し、さらに &
JOXWDPLFXP にコドン最適化された &Y3+%+PXW 遺伝子と$KG$ 遺伝子を含む発現カセットを染色体上に導入することで 3'&$ 生産株を作製した。得られた株を

 本研究の一部は 1('2 プロジェクト「カーボンリサイクル実現を加速するバイオ由来製品生産技術の開発」に参画して行われました。

文献 

0\FURIW= HWDO *UHHQ&KHP －  
3HOOLV $ HW DO 1DW &RPPXQ   
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特許第  号
特許第  号;LDR/HWDO)XHO&HOOV－  

7DNHQDND6HWDO(XU-%LRFKHP－  
1RQDND . HW DO 5HV 6T >SUHSULQW@：KWWSVGRLRUJUVUVY 

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