未培養微生物（微生物ダークマター）の培養，解析，利用に関する研究開発の最前線と展望

分離培養手法の革新：
難培養性微生物の正体と資源としての可能性
青井
はじめに議輝いがために，その前進に大きな制限がかけられている状況である．難培養性微生物とはどのようなものなのか

微生物学は「感染症の原因を究明する」という人類の（正体），なぜ培養困難なのか（理由），そして，どうし生存欲求に基づく課題から派生した学問である．そしてたら培養できるのか（培養手法の革新），さらに，資源感染症の原因が微生物であると完全に証明されたのは実としての可能性はあるのであろうか（有用性）．本稿ではわずか 140 年ほど前にすぎない．すなわち，さまざまは上記にあげた課題について以下に解説する．

な紆余曲折を経て最終的に Koch のグループが微生物をなぜ培養できないのか分離培養する手法を開発し，コッホの 4 原則を確立したことで，感染症の原因は微生物であるということが初め植菌細胞数に比較して寒天平板上でのコロニーの出現て真に受け入れられた．そして，それからの微生物学の数はきわめて低いことは常識であり，それを Great発展，人類への貢献は言うまでもなく，医学分野に限らている．このように特定の微生物の機能（病原性や有用Plate Count Anomaly と呼称することもある 2)．前述した
Microbial Dark Matter とは別に，当初はこの単純な現象だけに基づいて「99％以上の微生物は培養できない」と機能）を知るためには，単一の微生物を分離して純粋培表現されていた．しかし，これだけで多くの微生物は培養するというプロセスが必要不可欠であり，プロセスそ養できないと断定することはできない．なぜなら「培養のものが現代まで続く微生物学に関わる学問体系の基盤できない多くの微生物はその時に与えられた特定の培養になっている．ところが，今日では微生物のほとんどは条件に適合しなかっただけ」と説明可能だからである．

培養困難であることが広く知られている．また，いまだ本来，培地組成，濃度，pH，温度，ゲル化剤，そして培養された菌株がいっさい存在しない「門」が半数近くそれらの組合せなど，あげればきりがないほど検討すべ存在することが正確に明らかになったことで，それらをき培養条件が考えられるため，植菌した細胞のほんの一宇宙の暗黒物質になぞらえて Microbial Dark Matter（微部しかコロニーを形成しなかったとしても，実はなんら生物ダークマター）と魅力的なキーワードで呼称される不思議ではない．そして実際に，寒天培地を作製する際ず，さまざまな学問分野，産業分野に多大な影響を与え

1)ようにもなっている ．に生成する活性酸素が多くの環境微生物の増殖を阻害

近年の培養非依存的な網羅的解析手法の著しい進展に（死滅）させることが報告され，それを回避する方法もより，未培養微生物が占める広大な未知領域が残されて提案されている 3–4)．したがって，培養条件の適合性がいることが明らかになっている．そして培養非依存的な微生物の分離培養の効率にもっとも影響を及ぼす因子で解析（メタゲノム解析や 16S rRNA 遺伝子を基盤としたあることに疑う余地はなく，微生物の難培養性に関する各種解析法）によって，未培養微生物の多様性や新規な議論はそこをベースに始めるべきである．

機能に関する重要な発見が相次いでいるが，生理学的性

しかし一方で，培養できない理由について難培養性微質や活性など本質的に重要な情報は分離株を取得して解生物自身の性質に起因した普遍的な要因（メカニズム）析する以外に有効な方法がない．また，機能（菌株）のは存在するのであろうか．多くの微生物において培養困利用と言う観点においても，分離株を直接取得して利用難な普遍的な理由やメカニズムを解明できれば，現状でする方がはるかに効率的である．さらに，環境科学的には有効技術のない難培養性の未培養微生物を培養化するきわめて重要な役割を果たしているものの，いまだ純粋ための画期的な新戦略を導き出せると考えられる．しか菌株が得られていない微生物は少なくない．環境微生物

し，「培養できない理由」はほとんど解明されていない．の正しい理解に基づく「制御」やプラネットスケールでなぜなら，従来法で容易に分離される微生物を解析しての環境変動の予測などは幅広い分野における重要課題も答えにはたどり着かないというジレンマが存在するかであるにも関わらず，「鍵」となる微生物が培養できならである．

著者紹介

広島大学大学院統合生命科学研究科生物工学ユニット（准教授） E-mail: yoshiteruaoi@hiroshima-u.ac.jp

生物工学

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特集

休眠と覚醒
多くの微生物が従来法では簡単に分離培養できない理易に非増殖状態（休眠状態）に移行する．

2）環境状況が好転しても，それだけでは休眠状態からは容易に脱却しない．

由の一つとして，「生きているが増殖しない，Variable

3）休眠状態から覚醒するためには，シグナル（覚醒因

but nonculturable（VBNC）」という状態が培養困難な現象子）が必要である．そしてそれは増殖状態の特定のと直接的に関わっている可能性がある．近年では多様な種類の微生物（異種・同種）から分泌される．

微生物が非増殖状態に移行し得るということが判明してそして上記の仮説に基づいて in situ 培養において未培いる．それぞれの違いについては十分には明らかになっ養微生物が獲得されるメカニズム解明を試みた．まず，ていない．しかし，多くの環境中で観察されるその現象

海洋性カイメン由来の微生物を用いて in situ 培養を行っ（非増殖状態）は環境中において普遍的な現象であり，たところ，新規性の高い分離株の獲得効率は従来法のそさらに微生物の生存戦略の一環であり，結果として多様れに対して著しく高いことが判明した．次に，得られた性を維持することに貢献しているという可能性が示唆さ分離株を用いて，飢餓状態からの回復に対するカイメンれている5–6)．

抽出液の添加の効果を測定したところ，多くの分離株で一方で，Buerger らはマイクロプレートの培地の入っ抽出液を添加した場合に回復率（コロニー形成率）の著た各ウェルに 1 細胞ずつ環境微生物を植菌して，増殖をしい向上が見られた．一方で，従来法を通じて得られた示したウェルを定期的に記録し続けたところ，① 1 年以微生物に対してはその効果はまったく見られなかった．

上経過しても新たな増殖が確認されること，②増殖に長さらに，カイメン抽出液の添加は，比増殖速度および最期間を要した菌株だからといって新規性の高い微生物と高到達菌体密度（Saturated Cell Density）にはまったくは限らないこと（増殖の検出時期と新規性には相関性が影響を及ぼさないことを別に確認した．これらのことかない），③短期間で（たとえば 1 週間など）増殖した菌株

ら，カイメン抽出液には，in situ 培養から得られた分離と長期間（たとえば 1 年後）の培養後に増殖が確認され株のコロニー形成率を向上させる効果のある物質が含また菌株を比較すると，増殖に要する時間がまったく異なれていることが判明した．しかし，それらは栄養供給なるにも関わらず同じ種類が獲得されることなどを明らか

どによる増殖の活性化のような「増殖促進」とは完全に7)にした ．この観察結果は，つまり，各々の微生物種にことなり，「増殖開始の誘導」であることが示唆された．

対する培養条件の適合性だけではなく，「植菌された細すなわち in situ 培養の効果とは，環境中に存在する未知胞が増殖を開始するか否か」が最終的に培養の効率に重なる増殖開始因子により，休眠状態の微生物が覚醒し増要な影響を与えることを示唆している．さらに，多くの投稿中）．
殖することによるものだと判明した（Jung et al.，

環境微生物は休眠状態に陥っていること，そしてそれらはランダムに覚醒するということを示唆している．またEpstein は上記の事象と合わせて，「休眠状態の微生物はക཈οϡϱώʖ಼෨

ランダムに覚醒し，覚醒した微生物は他の微生物の覚醒を促す」という Scout 仮説を提唱している 8)．
一方で，微生物が通過できない孔径の膜によって構成֐෨‫ڧ؂‬ଁ৫ְ੩

されているデバイスを用いることで，実環境中で微生物を培養する手法（in situ 培養）は，未培養微生物の獲得手法として有効であることが数多くの研究から実証されている 9–11)．人工的な培養環境には存在しない未知なる増殖促進物質の供給が環境中から供給されるため，未培養微生物の獲得が可能になるのではいかと考えられているが，そのメカニズムはまったく明らかにされていなかった．
そこで，筆者らは上記の Scout 仮説を拡張して以下のような仮説を立ててみた．

1）環境中の微生物（難培養性微生物）は好ましくない条件下（エネルギー源や栄養源の枯渇など）では容552

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図 1．In situ 培養において未培養微生物が培養可能になることについて，想定されるメカニズム

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以上の結果より，少なくとも一部の環境微生物は，非増殖状態であり，増殖を開始するためには栄養源の供給

培養手法の革新の方向性だけでなく，未知なる覚醒因子の供給が必要であること，

培養非依存的な解析手法の近年の著しい発展に比べ

そして，その性質が従来法で獲得困難（未培養）な理由て，分離培養の方法論は 150 年前からさほど進展していになり得るということを示唆している．また覚醒因子はないと言っても過言ではない．新規手法のほとんどが既同種・異種の微生物が生産している可能性が高い（図 1）．

存の手法をベースにした工夫の範囲に収まるものであそして冒頭で述べた Great plate count anomaly（植菌細り，新しいコンセプトに基づく手法開発（イノベーショ胞数とコロニー形成数のギャップ） という微生物学上ン）はきわめて少ないと言える．一方で，近年，マイクロ・の謎は，決して取るにたらない事象（個々の微生物の培ナノ成型技術に代表されるさまざまな微小スケールテク養条件の適合性の問題）ではなく，普遍性のある理由にノロジーが発達している．微生物学分野においては，そよっても引き起こされている可能性が高い．

れらの技術を応用することで，シングルセルレベルでの資源としての可能性動態解析や各種計測，極小スケールでの培養などを通じて，未知なる生理・生態学的な新規機能の発見につなが世界保健機構（WHO）による「複数の抗生物質に耐性ることが期待できる．実際に，一度に数百万スケールとを持つ多剤耐性菌の増大に対して新薬の開発が追いつかいう分離培養を 1 枚のチップで実現できるハイスルーない現状」に関するレポート（2017 年 9 月）によると，プット分離培養手法も提案されている 15)．

多剤耐性菌に対抗可能な臨床開発段階の治療薬を調査し筆者らは同技術を活用し，上記 in situ 培養をさらに拡たところ，画期的と定義できる新薬の候補は 8 種類しか張したコンセプトに基づいた画期的な分離培養手法を開ないと言う 12)．すなわち深刻な状況は当分続くというこ発している．すなわち，培養装置を環境中に設置するだとを意味している．伝統的には多くの抗菌薬は天然物けで自動的に分離・培養させるという今までにない新し（微生物）から発見されてきている．それは環境中の微いコンセプトである．環境中の微生物を動力源なしに分生物が生存戦略として，生態学的，進化的合理性を伴っ離して培養し，複数の純粋培養株を自動的に得ることがて保持している武器を人間が利用するというきわめて合できる．すでにモデル微生物を用いてコンセプトの実証理的な策であるが，天然物から抗菌薬などの生理活性物に成功している 16)．

質の候補物質を探索するというアプローチは，非効率で微小テクノロジーの一般的な効果の一つは，「小さく前時代的ではないかと感じられるかもしれない．しかし，すること」で「数を増やすこと」ができることである．

実は本質的なボトルネックは「新規な微生物を獲得できしかし一方で，数と言う意味での培養スケールの単純かない」という現状にこそあるかもしれない．つまり，従来つ大幅な増加だけでは，未培養性（有用）微生物の獲得法で容易に分離培養可能な微生物は概ね獲り尽くしたと効率が期待通りに大幅に上昇すると見込まれるわけでは言い換えることができるのではないだろうか．そこで，ない，ということに注意が必要である．その一つの理由

もし新規性の高い微生物（未培養微生物）を効率的に獲は，仮に数百万（純粋な培養容器の数という意味で）と得可能であれば，候補物質のヒット効率は格段に高くないうスケールで培養が可能であったとしても，ダウンスるはずである．実際に，その多くが難培養性で知られてトリーム操作も同じスケールでハイスループットでなけいる Verrucomicrobia 門，Acidobacteria 門に属する微生れば，結局は，その後のステップがボトルネックになる物には生理活性物質を生産する生合成遺伝子クラスターからである．ダウンストリーム操作とは，目的微生物のを放線菌に匹敵するレベルで保持することが近年判明しスクリーニング，微生物の同定，回収などの操作である．ている13)．また，耐性菌が原理的には出現しないというそもそも平板培養は，細胞分離，培養そして検出を一度画期的な抗菌薬の候補物質「Teixobactin」が数年前にに簡便に行えるという意味において，きわめて画期的で報告されたが 14)，これは新規分離培養手法（上述の inある（だからこそ 150 年以上主要な方法として使われてsitu 培養）を通じて分離した新しい微生物から発見されたものである．Teixobactin を産生する菌株 Eleftheria
terrae が従来法では分離培養困難であったのかどうかはいる）．そして，1 枚の培養プレートから 100–200 株の分離株をきわめて簡便に取得可能という点において，実定かではないが，上記の成果は新規分離培養手法の開発が，未培養微生物が従来の培養法では培養困難であるとが新たな未利用資源の再開拓につながり，産業的に有用いう点にあるからである．

な基盤技術と成り得ることを示している．
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は十分に高効率である．もう一つの理由は，問題の本質

したがって，筆者は技術革新の方向性について，「数553特集の向上」だけでなく，「質的な変化」をも目指すべきであると考える．つまり，従来法では原理的に分離培養困難な未培養微生物を効率的に培養化すること（手法開発・メカニズム解明）にこそチャレンジを続ける必要があるのではないだろうか．そのためには，難培養性微生物は何か？なぜ培養困難なのかという問いを真摯に投げかけながら，そのメカニズムの解明と手法開発を同時に行う（フィードバックをかけながら）ことが真のイノベーションにつながると考えている．
文献1) Rinke, C. et al.: Nature, 499, 431 (2013).
2) Staley, J. T. et al.: Annu. Rev. Microbiol., 39, 321 (1985).
3) Tanaka, T. et al.: Appl. Enviorn. Microbiol., 80, 7659
(2014).
4) Kato, S. et al.: Appl. Enviorn. Microbiol., 84, e00807,5547659 (2018).
5) Lennon, J. T. et al.: Nat. Rev. Microbiol., 9, 119 (2011).
6) Pinto, D. et al.: Crit. Rev. Microbiol., 41, 61 (2015).
7) Buerger, S. et al.: Appl. Environ. Microbiol., 78, 3229
(2012).
8) Epstein, S. S.: Nature, 457, 1083 (2009).
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11) Aoi, Y. et al.: Manuals of Environmental Microbiology
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12) WHO: https://www.who.int/news-room/detail/20-09-2017the-world-is-running-out-of-antibiotics-who-reportFRQ¿UPV  13) Crits-Christoph, A. et al.: Nature, 558, 440 (2018).
14) Ling, L. L. et al.: Nature, 517, 455 (2015).
15) Ingham, C. J. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104,18217 (2007).
16) Tandogan, N. et al.: Plos ONE, 9, e101429 (2014).

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