今日の話題

高輝度化学発光タンパク質 Nano-lantern の開発
化学発光イメージングへの誘い

蛍光タンパク質を利用した蛍光ライブイメージング技ど）の量子収率の 1/10 以下である．われわれは手始め術の発展により，動植物個体の生理機能を生きたまま可に RLuc にランダムなアミノ酸変異導入を行い，明るさ視化することが可能になった．また，多光子顕微鏡や超を改善する変異を探索したが，それだけでは RLuc の量解像顕微鏡技術などの顕微鏡技術の発展も近年著しい．

子収率を飛躍的に上げることは困難であることに気がつ

蛍光観察技術が進歩する一方で，生体試料への光毒性やいた．そこでわれわれは化学発光タンパク質と蛍光タン

自家蛍光といった問題は未解決のまま残されている．こ

パク質間の共鳴エネルギー移動（Förester resonanceのような状況のなかで，ホタルルシフェラーゼに代表さenergy transfer; FRET）を化学発光の明るさの改善にれる化学発光を用いたライブイメージングにも注目が集利用することを着想した．FRET はドナー分子からアクまりつつある．化学発光は蛍光と違い，外部からの励起セプター分子へと励起エネルギーが移動する現象であ光照射を必要としないため自家蛍光や生物個体に対するり，分子間相互作用を検出する方法としてライフサイエ

光毒性・光応答を回避することができる．化学発光の蛍ンス分野で応用されている．実は FRET は実験室だけ

光に対するこのような優位性は以前から認識されていたでなく自然界でも広く起こっている．たとえば，前述しが，放出するフォトン数が少なく数秒から数十分もの長たウミシイタケの生体内では発光タンパク質（RLuc）時間露光が必要なため，これまで時間分解能の高いライと蛍光タンパク質（ウミシイタケ GFP: Φ＝0.3）が強くブイメージングには使用されてこなかった．しかしなが相互作用し，両者の間でほぼ 100% の高率で FRET が起ら近年，われわれの開発した高輝度化学発光タンパク質きる結果，0.3/0.05＝6 倍まで発光強度が上昇し，発光色Nano-lantern を利用することで化学発光ライブイメージも青色から緑色にシフトすることが知られている．言いングが可能となった．本稿では Nano-lantern の開発と換えればウミシイタケは暗い RLuc からでなく，明るいそれを利用した化学発光ライブイメージングについて紹ウ ミ シ イ タ ケ GFP か ら 効 率 良 く 発 光 さ せ る た め に介する．

FRET を利用しているのである．この方法を人為的に模自然界には発光バクテリア，発光キノコ，夜光虫，発倣して高輝度化学発光タンパク質をデザインするにあた

光クラゲ，ホタルなど，実にさまざまな発光生物が存在

り RLuc のアクセプターとなる蛍光タンパク質の選定かする．これらの生物はそれぞれに固有のルシフェラーゼら始めた．ウミシイタケ GFP は強固な 2 量体構造をとると呼ばれる酵素（化学発光タンパク質）をもち，このルため，単量体である RLuc との融合タンパク質には適さシフェラーゼがルシフェリンと呼ばれる発光基質の酸化ない．ほかの蛍光タンパク質では何が適しているだろうを触媒することで化学発光が起こる．代表的なルシフェか？

ラーゼの一つであるレニラルシフェラーゼ（lu-をもつ．ドナーに対して適切なアクセプターを選択するciferase; RLuc）は刺胞動物に属するウミシイタケからには，重なり積分 を求めることで行える（1）．そこから同定されたルシフェラーゼであり，セレンテラジンをそアクセプターは 500 nm 近辺に吸収ピークをもつ蛍光タの 発 光 基 質 と す る． 分 子 サ イ ズ が 比 較 的 小 さ い

ンパク質が望ましいことになる．われわれはモル吸光係（35 kDa）こと，ホタルルシフェラーゼと異なり ATP,数，フォールディング効率，量子収率の高さを検討し，2+

RLuc の発光スペクトルは，480 nm にそのピーク

Mg の補因子を必要としないことから化学発光を利用

ド ナ ー と し て Venus（2） を 用 い る こ と に し た． 次 に，したスクリーニングなどで使用される機会が多い．しかRLuc と Venus のさまざまな融合タンパク質を作成し最しながら前述したとおり，蛍光に比べて暗いためこれまも FRET 効率の高いものをプローブとして選び出すこでライブイメージングには使われてこなかった．RLucとを行った．融合タンパク質の遺伝子構築には Venusが暗い理由の一つとして，発光量子収率（Φ）が約 0.05だけでなくその円順列変異体 5 種類も利用し，RLuc とと非常に低いことが挙げられる．これは蛍光イメージン

Venus の間のアミノ酸リンカーはさまざまな長さを試しグで用いられる代表的な蛍光色素（GFP や Alexa488 なた．また，RLuc を C 末端，Venus を N 末端側に替えた

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化学と生物 Vol. 52, No. 10, 2014

今日の話題
600(A)

530 nmFRET

480 nm

分割した改変RLuc(N)
発光基質(酸化されない)

発光強度

発光基質

400

Venus

RLuc

RLuc

Venus

改変RLucCaM

Nano-lantern

530 nm500
波長 (nm)

FRET
発光基質

600

図 1 ■ 高輝度化学発光タンパク質 Nano-lantern の開発
RLuc と Nano-lantern の模式図および発光スペクトル．

分割した
改変RLuc(C)-Ca2++Ca2+2000400

M13(B)

発光強度

1.0-Ca2++Ca2+0.50400500

波長 (nm)600

図 3 ■ Nano-lantern を応用した Ca2+プローブの開発（A）Nano-lantern（Ca2+）の模式図と（B）Ca2+ありなしでの発光スペクトル．

融合タンパク質も作成した．精製した各融合タンパク質の発光スペクトルから，Venus 由来の発光値（530 nm）と RLuc 由来の発光値の比（530/480 nm 比）を求めることで，最大の FRET 効率をもつ融合タンパク質を選び出した．さらに，RLuc 自体の発光量を改善するために，エラー誘発 PCR 法により RLuc に対してランダムなアミ
図 2 ■ Nano-lantern の細胞レベルと個体レベルへの応用（A）HeLa 細胞の細胞小器官に局在させた Nano-lantern の化学発光画像（上段）と蛍光画像（下段）．蛍光画像は Nano-lantern 内のVenus に対する励起波長を照射して撮影した．スケールバーは20 µm．（B）小動物の化学発光ライブイメージングシステム．（C）
自由に動き回るマウス中で緑色（疑似カラー表示）に光る腫瘍．
（（C）は Web 版でのカラー図，または参考文献 3 の Fig. 2 を参照のこと）．

ノ酸変異を導入し，発光量を指標にマイクロプレートリーダでスクリーニングすることで，発光量を改善するアミノ酸変異を見いだした．これを先述の最大の FRET効率をもつ融合タンパク質に導入することで，その明るさは RLuc の 10 倍以上にも達した（図 1）．われわれはこの融合タンパク質を，ナノスケールの光源という意味を込 め て「Nano-lantern（ナ ノ・ ラ ン タ ン）」と名づけた（3）．

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今日の話題ヒスタミン添加図 4 ■ Nano-lantern（Ca2+） に よ る 細 胞
内 Ca2+のビデオレート可視化（A）Nano-lantern（Ca2+） を 発 現 さ せ た
HeLa 細胞 Ca2+のビデオレートでの可視化．
スケールバーは 10 µm．（B）ROI（四角で囲んだ領域）中の Ca2＋の経時変化．

まずわれわれは Nano-lantern を細胞内のさまざまなCa2+ありなしでのシグナル変化量が 300%*1 と非常に大場所に局在させてイメージングができるかどうかを試しきかった（図 3）．これを Nano-lantern（Ca2+）と名づけた．化学発光観察のために市販の専用装置を用いずに，た．Nano-lantern（Ca2+）はこれまでの化学発光タンパ

手持ちの顕微鏡で細胞レベルでの発光観察をする際のコク質に比べても非常に明るいため，それを発現させたツについては以前のわれわれの総説を参照されたい（1）．

HeLa 細胞の Ca2+イメージングを驚くべきことにビデオNano-lantern は Venus の蛍光でイメージングした場合レートで行うことができた（図 4）．また，細胞を操作と遜色ないクオリティで細胞小器官を可視化することがす る 光 遺 伝 学 的 手 法 と 今 回 開 発 し た Nano-lantern

できた（図 2A）．次にわれわれは個体レベルでの化学発（Ca2+）の併用を行った．代表的な光遺伝学ツールであ光イメージングを試みた．個体レベルでの発光観察装置（6）
る ChR2（チャネルロドプシン 2）
は青色光を照射するとして，Xenogen 社IVIS, Biospace Lab 社Photon IMAGER

ことで神経細胞を興奮させることができるが，came-が発売されており，これらのシリーズには静止画だけでleon や G-CaMP，ﬂuo-4 など，頻用される蛍光指示薬をなく動画が撮影できるものもある．こういった装置を励起する青色光を照射すると ChR2 も光を吸収し作動しもっていれば容易に個体レベルの化学発光ライブイメーてしまうため，これまで両者の併用は難しかった．Na-ジングが行えるであろう．しかしながらこれらの機材はno-lantern（Ca2＋） は 励 起 光 を 必 要 と し な い た め，高価（数千万円）であり一研究室でもつことは困難であ

ChR2 を作用させることなく併用することが容易にできる．そこでわれわれは割と安価に個体レベルの化学発光た．ChR2 や LOV ドメインを利用した光遺伝学以外にも（4）

ラ イ ブ イ メ ー ジ ン グ 環 境 を セ ッ ト ア ッ プ し た （図CALI やケージド化合物といった細胞を光操作するツー2B）．Nano-lantern を安定発現させたマウス大腸がん細ルとの併用も容易に行うことができると考えている．

胞株 colon26 細胞を BALB/c マウスの皮下に移植し数ミ

次に cAMP を検出する機能性プローブの作成を行っリの腫瘍に成長させた．毛をそらず無麻酔で自由に動きた．FRET を利用した cAMP の検出方法がすでにいく

回るこのマウスの背中で光る腫瘍部位をビデオレートでつか報告されているが，シグナル変化量が非常に小さく可視化することに成功した（図 2C）．マウス個体を非侵（1〜15%）検出が容易でないことが問題となっていた．

襲的に観察できることから，経日的な薬剤投与試験へのEPAC1 タンパク質の cAMP 結合に必要な断片を Nano-応用が期待される．

lantern（Ca2+）の CaM-M13 に替えて挿入したところ，次にわれわれは Nano-lantern を改変し，細胞内で重cAMP ありなしでシグナルが 130% 変化するプローブを要な働きをもつ生理分子を検出するための機能性プロー作成することができた．これを Nano-lantern（cAMP）

2＋ブを作成することにした．まずその手始めに Ca プと 名 づ け た．Nano-lantern（cAMP） を 発 現 さ せ た ア

ローブの作成を行った．FRET や蛍光タンパク質をベーメーバ細胞の集団を飢餓状態に置いたところ，細胞が集2+スとした Ca プローブ作成に倣い，Nano-lantern の発光合していく過程で cAMP が細胞間を伝播していく様子タンパク質（RLuc）内部に Ca2+に結合し構造を変化すを撮影することに成功した（図 5）．

る カ ル モ ジ ュ リ ン（CaM） と そ の タ ー ゲ ッ ト で あ る
M13 ペプチドを挿入した（5）．挿入部位を検討した結果，
RLuc の 228 番と 229 番のアミノ酸残基間に挿入した際に648*1 シグナル変化量（%）=（変化後のシグナル/変化前のシグナル−1）×100

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今日の話題い，Nano-lantern（ATP）を葉緑体に発現させる株を作成した．蛍光プローブでは励起光が植物に光応答を引き起こすために光照射による ATP 合成の様子を観察することはこれまでできなかった．われわれは Nano-lantern（ATP）を葉緑体に発現するシロイヌナズナ葉を用いることで，光照射に伴う ATP 産生の様子を可視化することに世界で初めて成功した（図 6）．
図 5 ■ Nano-lantern（cAMP）による細胞間シグナル伝播の可視化（A）Nano-lantern（cAMP）を発現させた約 10 万のアメーバ細胞の cAMP 可視化．スケールバーは 1 mm．（B）2 カ所の ROI（青の点線とマゼンタの実線）中の cAMP の経時変化．

高輝度化学発光タンパク質 Nano-lantern およびそれを利用した機能性プローブにより，これまで蛍光ライブイメージングではできなかったことが可能になった．しかし，Nano-lantern の FRET 効率はその発光スペクトルから 20% 程度と見積もられており，使途の多様化だけでなくこの点においてもまだ伸び代がある．さらに化学発光タンパク質の性能は量子収率だけで決まるわけではない．発光基質の代謝回転速度の向上によっても明るさの改善が見込まれる．また発光基質のほうを改良していくことも可能だろう．しかしながら，昨今ブームとなっているオプトジェネティクスとの併用という点においてNano-lantern は蛍光分子に勝っているため，今後より多くの研究者が化学発光をイメージング手段として取り入れていくのではないかとおおいに期待している．

図 6 ■ Nano-lantern（ATP）による光合成経由の ATP 産生の可視化（A）Nano-lantern（ATP）を葉緑体内に発現させたシロイヌナズ
ナ葉の画像．スケールバーは 20 µm．（B）光照射による葉緑体内の ATP の変化．

1) 齊藤健太，永井健治：化学と生物，49, 555 (2011).
2) T. Nagai:, 20, 87 (2002).
3) K. Saito, Y. F. Chang, K. Horikawa, N. Hatsugai, Y. Higuchi, M. Hashida, Y. Yoshida, T. Matsuda, Y. Arai & T.
Nagai:, 3, 1262 (2012).
4) K. Saito, Y. Higuchi, Y. Arai & T. Nagai:(2013), doi:10.1038/protex.2013.024
5) K. Horikawa, Y. Yamada, T. Matsuda, K. Kobayashi, M.
Hashimoto, T. Matsu-ura, A. Miyawaki, T. Michikawa, K.
Mikoshiba & T. Nagai:, 7, 729 (2010).
6) F. Zhang:, 446, 633 (2007).
7) H. Imamura, K. P. H. Nhat, H. Togawa, K. Saito, R. Iino,
Y. Kato-Yamada, T. Nagai & H. Noji:, 106, 15651 (2009).

（齊藤健太 *1，永井健治 *2，*1 東京医科歯科大学脳統合機能研究センター，*2 大阪大学産業科学研究所）

さ ら に ATP を 検 出 す る プ ロ ー ブ の 作 成 を 試 み た．
（7）
FRET を利用した ATP プローブ（ATeam）に利用されているFoF1-ATP 合成酵素の ε サブユニット（mBSUε）
を Nano-lantern（Ca2＋）の CaM-M13 に替えて挿入した
ところ，ATP ありなしでのシグナル変化量が 200% にも達 す る プ ロ ー ブ が 作 成 で き た． こ れ を Nano-lantern（ATP）と名づけた．シロイヌナズナに遺伝子改変を行化学と生物 Vol. 52, No. 10, 2014649

今日の話題プロフィル
齊藤 健太（Kenta SAITO）＜略歴＞1998 年北海道大学理学部生物科学科卒業／2005 年同大学理学研究科化学専攻博士後期課程修了／同年同大学電子科学研究所特任助教／2012 年大阪大学産業科学研究所特任准教授を経て同年より東京医科歯科大学助教＜研究テーマと抱負＞神経変性疾患解明のための新規測光法・イメージング手法の開発＜趣味＞コーヒー，パン屋巡り

永井 健治（Takeharu NAGAI）＜略歴＞1992 年筑波大学第二学群生物学類卒業／1998 年東京大学大学院医学系研
究科脳神経医学専攻博士後期課程修了／同
年理化学研究所基礎科学特別研究員／2001
年 JST さきがけ研究員／2005 年北海道大学電子科学研究所教授を経て 2012 年より大阪大学産業科学研究所教授＜研究テーマと抱負＞バイオイメージング全般，少数性
生物学，グリーンバイオロジー＜趣味＞登山，スキー，ドライブ，飲酒しながらの科
学談義
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