2002年度

修士論文

室戸海洋深層水中の細菌相の分析並びに
青紫色素violaceinを産生する新規細菌群の発見

Analysis of Bacteria in “Muroto Deep Seawater” andthe New Marine Bacteria Producing Violacein, a Violet Pigment.

高知工科大学大学院
工学研究科 基盤工学専攻
物質・環境システムコース
1055013
矢田 修一

1

目次
緒言

4

材料と方法

6

1.

2.

3.

室戸海洋深層水由来細菌の単離と保存
61-1 室戸海洋深層水の採取
6
1-2 深層水由来細菌の分離
1-3 細菌の保存6
海洋深層水由来細菌の同定
62-1 単離株の培養
62-2 ゲノムDNAの回収及び精製
6
2-3 16S rRNA遺伝子の増幅
62-4 配列の決定
7
2-5 データベース検索と属の同定
7
青紫色素産生菌の16S rRNA遺伝子全長の塩基配列の決定
73-1 青紫色素産生菌V-1グループの520P1株とV-2グループの710P1株 7

結果
1.

2.

8
室戸海洋深層水中の細菌相
1-1 単離した細菌の特徴
1-1-1 Vibrio属
Pseudoalteromonas
属
1-1-2
Shewanella
1-1-3 属1-1-4 Marinobacter属
1-1-5 Erythrobacter属
1-1-6 Tenacibaculum属
1-1-7 Bacillus属
1-1-8 Dietzia属
1-1-9 Halomonas属
1-1-10 Hyphomicrobium属
1-1-11 Idiomarina属
1-1-12 属の決定ができなかった株

10
10
10
11
11

violacein産生新規細菌群の発見

11

考察

8
8
8
9
9
10
10

13

謝辞

15

参考文献

16

実験マニュアル

20

2

図表
表1
表2
図1
図2
表3
図3
図4
図5
図6
図7

21
深層水由来細菌の単離及び培養に用いた培地（PPES）の組成
冷凍保存液の組成
16S rRNA遺伝子上におけるプライマーの位置
材料と方法（細菌の保存と同定法）
室戸海洋深層水中の細菌相
violacein産生株8株の比較
Pseudoalteromonas luteoviolacea（X82144）との比較
Pseudoalteromonas denitrificans（X82138）との比較
violacein非産生株（402W15, 520P1’B）とVグループの比較
属間での相同性

3

21
21
22
23
24
26
28
31
34

緒言
海洋深層水は、我国では1976年に海洋科学技術センター（JAMSTEC）によってその研究が始められた。「海洋深層水」とは、海洋学で言う深層水（水深1000m以深）とは異なり、産業への利用を目的とした、太陽光が届かない補償
深度以深の海水（無光層）を指す。海洋深層水中では、植物プランクトンによる有機物の生産が行われず、細菌による有機物を無機物に分解する営みが行われているため、無機栄養塩類が豊富である。また、表層水より水温が低く、溶存有機物が少ないうえ、鉛直混合や人為的影響が少ないことから清浄であることが特徴である。このように海洋深層水は、低温、豊富な無機栄養塩類、清浄性を特徴とする、資源性の高い海水と注目されている（中島敏光, 2002; 豊田
孝義 他, 1998）。
高知県室戸岬の紀伊水道側の沖合は、水深が深く、水深500-1000mを流れる
北太平洋中層流が大陸棚にぶつかるため、補償深度以深（室戸岬沖では約130m以深）の海水が局地的に湧昇している（深澤理郎,1998）。この湧昇海水の中に含まれる無機塩類を利用してプランクトンが増殖するため、それを餌とする魚が集まる好漁場となっている。このような条件を備える場所は、同時に海洋
深層水の取水にとっても適地であるため、1989年、高知県とJAMSTECは、高知
県室戸市三津に国内初の海洋深層水利用実験施設（KAUL）を完成させた。この施設は、後に高知県海洋深層水研究所に発展し、深層水の解明並びにその利用法の研究が進められている（中島俊光, 2002; 豊田孝義 他, 1998; 中島俊光
他, 1998）。
海洋深層水の特徴を活かした多くの利用法が考えられており、例えば、表層
水と深層水の水温差を利用した海洋温度差発電（OTEC）の研究や、冷水域の水産資源の培養と飼育などの調査が行われた。また、深層水やそれから逆浸透法
によって得た脱塩水が飲料水、食品原料、化粧品原料、製塩原料として活用されるようになった。海洋深層水の一つの資源としては、そこに棲息すると予想される有用細菌がある。しかし、その探索は十分に行われていないのが現状である。そこで、本論文では、海洋深層水中の有用細菌の探索を目指し、まず始めに海洋深層水中の細菌相全体を把握するため、1999-2002年にかけて室戸海
洋深層水から単離した67株の細菌について、その分類学的位置を明らかにしようとした。その結果、67株のうち58株は11属に分類されたが、残りの9株については属レベルの分類も困難な希少または未報告と考えられる細菌であった。
また、室戸海洋深層水中には、色素を産生する細菌が存在する。細菌が産生する色素はしばしば抗菌性などの生理活性を持つため、色素産生細菌のうち先に報告した青紫色素産生細菌（矢田修一, 2001）について研究を行った。この
青紫色素は、violaceinまたはそれに極めて近い物質であることが見いだされている（長崎恵子, 2001）。
violaceinを産生する細菌としては、19世紀末より土壌及び水圏から単離されるChromobacterium violaceumが知られている（Margalith, P. Z., 1992;
Chromobacterium属として分Duran, N., & Menck, C. F., 2001）。また、当初類されていたが、その後、新たに Janthinobacterium属に再分類されたJanthinobacterium lividumが知られている（John, G. H., et al., 1994）。
violaceinを産生する海洋細菌ではPseudoalteromonas luteoviolaceaがあり、McCarthy, S. H.らによって鹿児島錦江湾よりその分離が報告されている

4

（McCarthy, S. H.,et al., 1985）。Laatsch.HらによるとP.luteoviolacea
は、violaceinとdeoxyviolaceinを産生する（Laatsch, H., & Thomson, R.
H., 1984）。violaceinは、グラム陽性細菌に対する抗菌作用や抗トリパノ
ソーマ作用を示すことが知られている（Margalith, P. Z., 1992; Leon, L.
L., et al., 2001; Melo, P. S., et al., 2000）。
今回、室戸海洋深層水中から8株の青紫色素産生菌を得、その16S rRNA遺伝
子塩基配列の解析を行ったところ、P. luteoviolaceaとは異なり、しかも単一種ではなく、それぞれ同一の塩基配列を持つ二群の細菌からなることが明らか
となった。

5

材料と方法1 室戸海洋深層水由来細菌の単離と保存
1-1 室戸海洋深層水の採取
室戸海洋深層水は、高知県室戸市三津にある高知県海洋深層水研究所の取水設備を用い1999年から2002年まで採水した。海洋深層水研究所では、室戸岬沖
約2km、水深320mより鉄線鎧装硬質ポリエチレン管（外径：176.2mm，内径：125mm 管長約2,650ｍ）を用いポンプで一日920ｔの深層水を組み上げている。
採取したサンプルは、温度上昇を防ぐため保冷した状態で輸送し、同日中に細菌分離操作を行った。
1-2 深層水由来細菌の分離
深層水を、平板培地（PPES-Ⅱ 表1参照）に100μl塗布し、20℃で培養した。または、メンブレンフィルター（ミリポアSC1J419H6）で深層水1mlを濾過した後、メンブレンを平板培地に密着させ20℃で培養した。2日後からコロニーを目視で確認することができ、約6日後にコロニー数は定常となった。なお、コロニー数は150個/ml程度であった。平板培地に増殖したコロニーを白金
耳で新たな平板培地に広げ3-4日間20℃で培養した。そこで得られた単一のコロニーを研究に用いた。
1-3 細菌の保存確立した細菌株は、液体培地（PPES-Ⅱ）5mlを用い20℃で3-4日間旋回培養した。この培養液を4000rpmで5分間遠沈し、上清を捨て、沈殿した細菌に冷凍保存液（表2参照）2.5mlを加え懸濁し、0.5mlずつCryotube（Nunc）に分注
し、-80℃にて冷凍保存した。
2

海洋深層水由来細菌の同定
海洋深層水由来細菌の同定は、得られた株のうち67株について行った。
2-1 単離株の培養
単離株からゲノムDNAを回収し精製するため、単離株を1-3で述べた方法で培養した。
2-2 ゲノムDNAの回収及び精製培養液1mlを8000rpmで10分間遠心分離し培地を取り除いた。QIAamp DNA
Mini Kit（QIAGEN）を用い、残った菌体のペレットからゲノムDNAの抽出及び精製を行った。DNAは、50μlのAE緩衝液（10mM Tris･Cl, 0.5mM EDTA, pH
9.0）に溶解し、-30℃で保存した。
2-3 16S rRNA遺伝子の増幅
ゲノムDNAを鋳型とする16S rRNA遺伝子の増幅は、16S rRNA遺伝子の両端付
近の塩基配列に相当するユニバーサルプライマー（鈴木健一郎 他, 2001）を用いてPCR法によって行った。使用したプライマーは下記の通りである。
フォワードプライマー FW07 ’-agagtttgatcctggctcag-3’（Tm値60℃）
5
リバースプライマー
RV03’-aaggaggtgatccagccgca-3’（Tm値64℃）
5PCR増幅には、Taq polymerase（TaKaRa）を用い、反応はTaKaRaの方法にしたがった。プライマー濃度は各0.5μMとし、鋳型DNAは、2-2で回収したものを1μl用いた。反応サイクルは、変性を94℃15秒、アニーリングを57℃15秒、ポリメラーゼ反応を72℃30秒とし、30サイクル行った。

6

反応後、PCR産物は、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）を用い精製し50μlのEB緩衝液（10mM Tris･Cl, 1mM EDTA, pH 8.0）に溶解し、-30℃で保存した。
2-4 配列の決定
67株のシーケンス反応は、r2Lプライマー（5’-catcgttacggcgtggac-3’）を用いて行った。反応は、Cy5.5 dye Terminator kit（Amersham Biosciences）を用いAmersham Biosciencesの方法に従った。プライマー濃度は、2μMとし、鋳型DNAは、2-3でPCR反応後精製したものを0.5μl用いた。反応サイクルは、変性を94℃30秒、アニーリングを57℃30秒、ポリメラーゼ反応を72℃90秒とし、30サイクル行った。反応後、エタノール沈殿によって反応産物を精製し、DNA
シーケンサーGene Rapid（Amersham Biosciences）を用いて塩基配列を決定した。
2-5 データベース検索と属の同定得られた16S rRNA遺伝子の塩基配列は、GenBankに登録されている塩基配列から検索した。検索は、塩基配列が局所的に高い類似性を持ったものを検索す
るBLAST法で行った。
3 青紫色素産生菌の16S rRNA遺伝子全長の塩基配列決定
3-1 青紫色素産生菌V-1グループの520P1株とV-2グループの710P1株
520P1株と710P1株の16S rRNA遺伝子の全長の塩基配列の決定には以下のプライマーを用いた（鈴木健一郎 他, 2001）。
rE1L’-gtaggagtctggaccgtgt-3’
5
Tm値60℃
r1L’-gtattaccgcggctgctgg-3’
5
Tm値62℃
fE2L’-cggcaggcctaacacatgca-3’5
Tm値64℃
f2L’-ccagcagccgcggtaatag-3’
5
Tm値62℃
r2L’-catcgttacggcgtggac-3’5
Tm値60℃
fE3L’-gcaacgcgaagaaccttacctac-3’5
Tm値56℃r3L’-ttgcgctcgttgcgggact-3’
5
Tm値62℃
f3L’-gtcccgcaacgagcgcaac-3’5
Tm値64℃
929f’-aaactcaaaggaattgacgg-3’
5
Tm値56℃
r4L’-acgggcggtgtgtacaag-3’
5
Tm値58℃
ここで使用したプライマーの位置は図1に示す。
反応は、Cy5 Dye Terminator kit（Amersham Biosciences）を用いAmersham
Biosciencesの方法に従った。プライマー濃度は、6μMとし、鋳型DNAは、2-3でPCR反応後精製したものを3μl用いた。反応サイクルは、変性を94℃30秒、アニーリングをprimerのTm値より3℃低い温度で30秒、ポリメラーゼ反応を
72℃90秒とし、40サイクル行った。反応後、エタノール沈殿によって反応産物を精製し、6μlの添着用緩衝液を加えシーケンスサンプルとした。DNAシーケ
ンサーは、Long-Read Tower（Amersham Biosciences）を用いて塩基配列を決
定した。

7

結果
1

室戸海洋深層水中の細菌相
室戸海洋深層水中の細菌数を2000年1月から12月まで、材料と方法1-2で述べた平板培地の培養、及び細菌をアクリジンオレンジで染色した後、蛍光顕微鏡で観察する方法によって計数した。その結果、コロニー計数による細菌数は平均65個/ml海水であり、直接計数法による菌体数は平均5.0×104個/ml海水であった。コロニー計数による細菌数は、直接計数法により得られた細菌数の約0.1％であった。コロニー数が、直接計数法で得られる細菌数に比べて極めて少ないことは、海水のみでなく、淡水中、土壌など多くの自然界の細菌に見られる現象であるが、海洋では、嫌気性細菌、偏性高圧細菌（1atmでは増殖できない細菌）、低温細菌、低栄養条件のみで増殖する細菌、培養条件が不明な細菌などが多いためであると考えられている。
本研究では室戸海洋深層水から分離した67株それぞれについて16S rRNA遺伝
子の約350塩基の配列を決定し、GenBankに登録されている16S rRNA遺伝子の塩基配列と比較した。考察で詳しく述べるが、350塩基の配列の相同性が95%以上の株については互いに同属と考えて良いと判断した。本研究で決定した株の塩基配列とGenBankに登録されている株の塩基配列との相同性が100%を示したものは、暫定的に同属同種であると判断し、文献よりその細菌の性質を紹介する。また、この相同性が97から99%の株は、同属の近縁な細菌であると判断した。これらの細菌種については、同様に文献よりその細菌の性質を紹介する。
この結果、室戸海洋深層水より分離した67株のうち58株は、Vibrio属24株、Pseudoalteromonas属11株、 Shewanella属9株、Marinobacter属4株、Erythrobacter属3株、Tenacibaculum属 2株、Bacillus属 1株、Dietzia属 1株、Halomonas属1株、Hyphomicrobium属1株、Idiomarina属 1株の11属に分類することができた。残り9株については属を決定することはできなかった。その詳細は、「1-1-12 属の同定ができなかった株」で詳しく述べる（表3）。
1-1 単離した細菌の特徴
1-1-1 Vibrio属
室戸海洋深層水中より得られたVibrio属は、24株であり最も多かった。暫定的に同属同種と判断した株は、V. anguillarum2株（402W1, 402W4）、V.
V.
lentus 1株（315W4）、V. splendidus3株（315W13, 315W2, 315W3）、
tapetis 2株（315O4, 402W14）の4種である。同属で近縁な細菌であると判断したものは、V. anguillarum近縁種2株（315W6, 417W1）、V. fisheri近縁種1株（402W9）、V. logei近縁種1株（402W5）、V. splendidus近縁種1株（315W1）である。また、次のものは、今回決定した塩基配列の領域では、同属の2種以上の近縁な細菌が存在する株である。315O6, 402W11の2株は、V.
anguillarumとV. lentusに100%の相同性を持っていた。また、608W1Xは、V.
V.
anguillarumとVibrio sp. PMV19の両方に99%の相同性を持ち、516W3株は、
splendidusとunidentified bacterium 4cに それぞれ98%の相同性と99%の相同性を持っていた。
V. anguillarumは、ノルウェー沖より単離されたことが報告されている
V. lentusは、地中海のカキから単離され、16S（Wiik, R., et al.,1989）。
rRNA遺伝子塩基配列はV. splendidusに高い相同性を示すが、Vibrio属に対し静菌作用を持つO129（2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridin）に耐性を持つ

8

ことや炭水化物を分解して産生する酸の違いから新種であることが報告されて
V. fisheriは、黄色色素を産生し蛍いる（Macian, M. C., et al., 2001）。
V. logei
光を発することが報告されている（John, G. H., et al., 1994）。
は、東カナダの大西洋のサケより単離された冷水由来の細菌であることが報告
V. splendidus
されている（Griffiths, S. G., & Salonius, K., 1995）。
は、色素産生は行わないが蛍光を発すること、硝酸塩を還元することが報告さ
V. tapetisは、ブラウンリング病
れている（John, G. H., et al., 1994）。
のマニラハマグリから単離されその病原菌であるかどうか研究が進められている（Castro. D., et al., 2002）。
1-1-2 Pseudoalteromonas属
室戸海洋深層水中より得られたPseudoalteromonas属は、11株であった。P.
denitrificansを最も近縁とする株は9株存在し、そのうち402W15, 402P1,
520P1, 417P1の4株はP. denitrificansに99%の相同性を示し、315P1, 315P4,
P. rubra, P. piscicida
315P5, 516P1, 710P1の5株は97%の相同性を示した。
に99%の相同性を示す1020R株も得られた。
P. denitrificansは、ノルウェー西岸のフィヨルドより単離された冷水性の細菌である。また、赤色素prodigiosinを産生し、その学名の由来となった脱窒反応（denitrification）を行うことが報告されている（Enger, φ., etal., 1987）。しかしながら、室戸海洋深層水中より単離したP.
denitrificansと99%の相同性を示す株は、脱窒作用を示さず、prodigiosinではなく青紫色素violaceinを産生する（長崎恵子, 2001; 矢田修一, 2001）。
このことからP.denitrificansとは明らかに異なる細菌であった。
1-1-3 Shewanella属
室戸海洋深層水中より得られたShewanella属は、9株であった。暫定的に同属同種と判断した株は、S. fidelia 1株（516O1）、S. pealeana2株（315O2,
516O4）、S. woodyi 3株（315O3, 612W1, 612W2）の4種であった。同属で近縁な細菌であると判断したものには、S. fidelia近縁種2株（516O2, 710O）、S.
violacea 1株（315B1）であった。
S. fideliaは、2001年に北海道大学より16S rRNA遺伝子の配列がGenBankに登録されたが、その詳細は、まだ報告されていない。S. pealeanaは、ヤリイ
カLoligo pealeiの卵包腺より単離され、耐冷性の細菌であることが報告され
S. violaceaは、琉球海溝5110mのている（Michael, R. L., et al., 1999）。
海底堆積物より単離され、紫色色素を産生することが報告されている（Yuichi, N., et al., 1998）。今回単離した近縁種315B1株も黒紫色の色素を産生した。また、S. violaceaは好圧菌としても研究が進められている
S. woodyiは、地中海西部のアルボラン海（Kato, C., & Nogi, Y., 2001）。
の水深198, 220, 370, 384, 370mの海水と水深435mに棲息していたヤリイカの墨から単離され、蛍光を発することが報告されている（John, C. M., et al.,1997）。以上、報告されているものに関しては、冷水を好む傾向がある。
1-1-4 Marinobacter属
室戸海洋深層水中より得られたMarinobacter属は、4株であった。M.
の2種に100%の相同性を示した株が2株
hydrocarbonoclasticusと M. aquaeolei（315W14, 315W16）、99%の相同性を示す315W5株が存在していた。残りの1株
はMarinobacter sp. NCE312株と100%の相同性を示した。
M. hydrocarbonoclasticusは、製油所の近くの地中海の海水から単離され9た。また、0.08から3.5MのNaCl濃度で成育し、炭素とエネルギー源として様々な炭化水素を用いる石油分解菌であることが報告されている（Gauthier, M.
M. aquaeoleiは、ベトナム沖の海底油田を採掘するプ
J., et al., 1992）。
ラットホームより単離された。また、0から3.5Mの間のNaCl濃度で生育し、最適塩濃度は0.85Mであった。n-hexadecane、pristane及び、いくつかの原油成分を分解すること、M. hydrocarbonoclasticusと16S rRNA遺伝子の塩基配列が99.4%一致していることが報告されている（Nguyen, B. H., et al., 1999）。
この2種は、いずれも油田の近くで採取されている石油分解菌であり幅広い塩
濃度で棲息できる細菌であることが分かった。
1-1-5 Erythrobacter属
室戸海洋深層水中より得られたErythrobacter属は、3株であった。E.
citoreusとErythrobacter sp. JP13.1の両方に100%の相同性を示す608Y1株と99%相同性があった608Y3, 608Y2の2株があった。
E. citoreusは、地中海（カルビ、コルシカ湾）からの水深35mの海水から単離された。黄色素を産生し黄色コロニーを形成することが報告されている（Dietmar, V., et al., 1999）。608Y1, 608Y2, 608Y3の3株も黄色のコロニーを形成した。また、高知医科大学の研究により608Y2株に免疫細胞を活性化する作用がることが報告されている（渡部嘉哉 他, 2000）。
1-1-6 Tenacibaculum属
室戸海洋深層水中より得られたTenacibaculum属は、2株であった。612G2,
710Y2の2株はT. mesophilumが同属で近縁な細菌であった。
T. mesophilumは、日本とパラオの海岸に上がった海綿および緑藻から分離された。黄色素を産生し黄色いコロニーを形成することが報告されている（Makoto, S., et al., 2001）。単離した710Y2株は、黄色のコロニーを形成したが、612G2株は緑色のコロニーを形成した。
1-1-7 Bacillus属
室戸海洋深層水より得られたBacillus属は、B. horikoshiiとBacillus sp.
KX6の両方に100%の相同性を示す402Y1の１株であった。B. horikoshiiは、
2000年に海洋技術センターより16S rRNA遺伝子の配列がGenBankに登録され、深海由来であり好アルカリであることが配列と共に報告されている。
1-1-8 Dietzia属
室戸海洋深層水中より得られたDietzia属には、D. marisに近縁な608R3株が存在した。D. marisは、放線菌であり鉱物油やパラフィン（C-14からC-18）を分解する油分解菌であり、分解には、塩濃度が影響していることが報告されている（Zviagintseva, I. S., et al., 2001）。
1-1-9 Halomonas属
室戸海洋深層水中より得られたHalomonas属には、H. vonusta, H.
に100%の相同性を示す710W2株が存在した。これら
meridiana, H. aquamarina
は、16S rRNA遺伝子277塩基配列での違いは見られず、単離株がどの種であるかは同定できなかった。
H. vonusta, H. aquamarina
は、ハワイの海水より単離され、H. meridiana
は、南極大陸の塩湖より単離された。単離株に相同な3種の細菌は、3種の16S
rRNA遺伝子の塩基配列はよく似ておりそれらの相同性は、97.6%であることが報告されている（David, R. A., et al., 2002）。
1-1-10 Hyphomicrobium属

10室戸海洋深層水中より得られたHyphomicrobium属は1株（520W1）であった。
この株は、16S rRNA遺伝子371塩基での相同性よりHyphomicrobium属に分類され、98%の相同性を示す最も近縁な種は、伊豆・小笠原海溝水深7242mの海水から単離されたHyphomicrobium sp. Ddeep-1株である（Ocky, K. R., et al.,2001）。
1-1-11 Idiomarina属
室戸海洋深層水中より得られたIdiomarina属には、I. Abyssalis1株（402W3）が存在していた。これは、北西太平洋の水深4000から5000mの海水中から単離され、耐冷性であり2.6MのNaClで生育が可能であることが報告されている（Elena, P. L., et al., 2000）。
1-1-12 属の同定ができなかった株
属の同定ができなかった株には、次の2通りがあった。まず、GenBankに登録されている16S rRNA遺伝子と高い相同性があるが、属種名が命名されていない株である。315Y12株は、アメリカのSCRIPPS海洋研究所に保存されている
SCRIPPS413株と100%の相同性をもつ同属同種であった。315Y11株はSCRIPPS413
株と相同性が99%の近縁種であった。16S rRNA遺伝子の相同性より402W6株は、
marine eubacterial sp.（Delong, E, F., et al., 1993） 北極海由来のASW7W3, ASW-4B2と同属であると考えられる。402W12は、北極海由来のASW-7W3,
ASW-4B2と南極海由来の2CM93と同属であると考えられる。402W8株は、グリー
ンランド由来の34H、日本海溝由来のNBTe（Yanagibayashi, M., et al.,1999）と同属であると考えられる。これらの単離株は、同種または近縁種と考えられる細菌が、GenBankに見出されるが、GenBank登録株の属種名が命名されていないため、現在属名は決定できていない。315Y1株と 402W10株は、線虫（Eubostrichus dianae）より分離されたEubostrichus dianae epibacterium（Polz, M. F., et al., 1999）と95%の相同性を示すため同属であると推定されるが、近縁種が特殊な細菌であるため生理学的性質及び16S rRNA遺伝子の塩基配列全長を決定して分類する必要があると考える。
次に、GenBankに登録されている16S rRNA遺伝子のどれとも相同性が低い株である612R1株と315W19株の属の同定は行えなかった。315W19株が90%の相同性を示した熱水噴出口のチューブワーム（Riftia pachyptila）に共生している細菌（Li, L., et al., 1999）の様に特殊な環境に棲息している未報告の新種である可能性が高い。
2violacein産生新規細菌群の発見
室戸海洋深層水から単離された細菌株のうちPseudoalteromonas属に同定されたものは、11株あった。その中で、色素を産生するものは9株であり、赤色
素prodigiosin産生株が1株、青紫色素violaceinを産生したものは、402P1、
417P1、520P1、315P1、315P4、315P5、516P1、710P1の8株（Vグループ）であった。また、Vグループは、16S rRNA遺伝子287塩基配列の比較で、それぞれ同じ塩基配列を持つ3株（V-1グループ）と5株（V-2グループ）の2グループに分けることができた（図2）。このことから、violacein産生細菌群は少なくとも2種類存在していることが分かった。
violaceinを産生するPseudoalteromonas属の海洋細菌として既にP.
luteoviolaceaが報告されている（Laatsch, H., & Thomson, R. H., 1984;
McCarthy, S. H., et al., 1985）。そこで、V-1グループ520P1株とV-2グルー

11

プ710P1株の16S rRNA遺伝子のほぼ全域である1486塩基の配列を決定し、そのうち1353塩基について、P. luteoviolacea（GenBank登録番号X82144）の塩基配列と比較を行ったところ、V-1グループとV-2グループは共に94%のP.
luteoviolaceaとの相同性を示した（図3）。この結果からはVグループとP.
luteoviolaceaは同属であるが全く別種の細菌であることが判明した。
BLAST法で最も相同性の高い塩基配列を持つ細菌をGenBankより検索したところ、P. denitrificans（GenBank登録番号X82138）がVグループ8株の 287塩基
配列との相同性が高く近縁であると判明した。P. denitrificansは、北欧フィヨルドより単離された細菌で赤色素prodigiosinを産生することが報告されてP.
いる（Enger,Φ., et al., 1987）。BLAST法を用いた比較によりdenitrificansは、 V-1グループ（402P1、417P1、520P1）と 99%の相同性を示し、V-2グループ（315P1、315P4、315P5、516P1、710P1）とは97%の相同性を示した。さらにVグループの1424塩基配列について、GenBankに登録されている
P. denitrificans（X82138）の16S rRNA遺伝子塩基配列との比較を行った（図4）。その結果、V-1グループ520P1株とV-2グループ710P1株は、それぞれ1425
塩基配列中16塩基、44塩基が異なっており、相同性は99%、97%であった。
GenBankに登録されたP. denitrificansの配列中の5個の塩基の種類が未同定であるため相同性はこれより高くなる可能性がある。よって、V-1グループ520P1
株は、P. denitrificansと近縁であるが、産生色素が異なること、P.
denitrificansの特徴である脱窒（denitrification）活性を示さない（矢田修
一, 2001）ことから異なる種の細菌であると考えられる。V-2グループ710P1株
は、GenBankに登録されている細菌ではP. denitrificansとの相同性（97%）が最も高いものであったので、これも未報告の新しい種と考えられる。
V-1グループ520P1株を継代していくとviolaceinを産生しない白色コロニーを生じた。色素産生コロニーと混在するまま継代を続けるとviolacein産生コ
ロニーよりも白色コロニーが優勢となっていった。白色コロニーより単離した
株は、継代してもviolaceinを合成することはなかった。そこで、violaceinを産生していない2株（520P1B’、520P1C’）についてその16S rRNA遺伝子を元株である520P1株と比較した。比較の結果、16S rRNA遺伝子138塩基配列について
520P1, 520P1B’, 520P1C’の配列は完全に一致した（図5）。この結果から白色
コロニーは、培養時の他の細菌の混入によるものではなく、violacein産生を行わなくなった520P1株の変異株であると分かった。また、海洋深層水からもV-1グループと同じ配列を持つにもかかわらずviolaceinを産生しない白色コロニーを形成する402W15株が単離された（図5）。このことから、実験室内の環境だけでなく、自然界でもviolaceinを産生しない株が存在することが分かっ
た。

12

考察
本研究ではGenBankに登録されたデータベースとの相同性検索をBLAST法を用いて行った。約300塩基の16S rRNA遺伝子塩基配列に基づく属の同定が妥当なものであるかどうかを検討するため、属分類に際し最も株数の多いVibrio属とそれに続き株数の多かったPseudoalteromonas属、Shewanella属の16S rRNA遺伝子のほぼ全長に近い1366塩基配列を比較し、同属であるための塩基配列の相同性を割り出した。さらに16SrRNA遺伝子の塩基配列を決定するため用いたリ
バースプライマー（r2L）から5’末端側の360塩基配列の相同性をVibrio属、Pseudoalteromonas属、Shewanella属を用いて比較することで、このプライマーを用いた塩基配列に基づく属の分類の可否について検討した。 Vibrio属
は、V.anguillarum, V.lentus, V.fiseri, V.logei, V.splendidus,
V.tapetisの塩基配列をデータベースより得て用いた。また、同様に
Pseudoalteromonas属は、P.denitrificans, P.luteoviolacea, P.rubraを、
Shewanella属は、S.fidelia, S.pealeana, S.woodyi, S.violaceaの配列を得て比較に用いた。
1366塩基配列の相同性は、Vibrio属間で93-97%であり比較的高い相同がみられた。また、Pseudoalteromonas属間で93-98%、Shewanella属間で94-97%あった。同様にVibrio属6種とPseudoalteromonas属3種の相同性をそれぞれ比較したところ相同性は86-88%、Vibrio属6種とShewanella属4種のそれぞれの相同性は87-90%、Pseudoalteromonas属3種とShewanella属4種の相同性は88-90%であった（図6）。
360塩基配列の相同性は、Vibrio属間で96-98%であり1366塩基の相同性よりやや高い相同性が見られた。また、Pseudoalteromonas属間で95-99%、
Shewanella属間で97-98%あった。同様にVibrio属6種とPseudoalteromonas属3種の相同性をそれぞれ比較したところ相同性は86-91%、Vibrio属6種とShewanella属4種のそれぞれの相同性は89-90%、Pseudoalteromonas属3種とShewanella属4種の相同性は92-94%であった。
その結果、360塩基配列で比較したものは1366塩基配列で比較したものより
相同性の数値がやや高く出るものの、同属間の相同性と異属間の相同性でその値に明確な差が見られた。約300塩基の相同性比較で95%以上の相同性があれば同属と見なして良いと考えられる結果が得られた。このことからリバースプラ
イマー（r2L）を用いた配列を比較することで属同定を行った本研究は、16S
rRNA遺伝子全長の配列を用いた場合とほぼ同一の結果を与えるものと考えられる。
本研究により室戸海洋深層水から単離し、分類した株のうちその有用性が報告されているものには、次のものがあり、その利用が検討されている。
Marinobacter属の石油分解菌は、タンカー座礁により流出した石油の分解に利用できると考えられる。Bacillus属の好アルカリ性細菌は、産生する酵素（リパーゼ、プロテナーゼ）をアルカリ環境下である洗剤に配合することができることが期待できる。Dietzia属の油分解細菌は、鉱物油やパラフィンを分解することから工業排水の浄化処理に用いることが期待できる。
Erythrobacter属に分類できた 1株は、高知医科大学の報告により免疫細胞を活性化する働きがあることから医学分野での利用が考えられる。
Pseudoalteromonas属に分類できた1株は、prodigiosinを産生し、この色素は13

免疫抑制作用、アポトーシス誘導作用があることが報告されているため医学分野での利用が考えられる（Kawauchi, K., et al., 1997）。
また、本研究での有用細菌の探索は、コロニーの色で識別できる色素産生細菌に注目した。色素は、複雑な構造をとることが多く、生理活性や抗生作用を有していることが多い。ここで、重点的に種の同定を行ったもの以外にも、
赤、黄、オレンジ、濃紫などの色素を産生するものが採取されたため、これらの色素の解析と種の同定を進めていくことも今後の課題である。
V-1グループ520P1株の継代培養時に現れたviolaceinを産生しない株とviolaceinを産生する株の違いはどこにあるのか解明することも求められる。
violaceinを合成する酵素の遺伝子解析は、Chromobacterium violaceumのviolacein合成酵素群の遺伝子について行われており、少なくとも4種の酵素あ
るいはタンパク質の遺伝子が含まれていることが報告されている（GenBank登
録番号AB032799）。しかし、C.violaceumのviolacein合成酵素遺伝子の配列をもとに作成したプライマーでは、violacein合成酵素遺伝子の1つであるvio Aと相同性を示す配列を520P1株のゲノムから増幅することはできたものの、残りの3つの遺伝子については増幅できなかったことが報告されている（工藤彰
C.violaceumのviolacein合成酵
人, 2002; 中嶋敦志, 2002）。このことから、素遺伝子と520P1株のviolacein合成酵素遺伝子の塩基配列もしくは、4つの遺伝子のゲノム上の配置が違うことが考えられる。violacein産生株とviolacein
非産生株の違いを明らかにするためには、520P1株におけるviolacein合成酵素
遺伝子の所在とその構成の解明が必要と考えられる。violaceinのような色素は無光層に棲息する細菌には一見無用のように思える。実際520P1株から生じた白色コロニーを形成する変異株の増殖が色素を産生する元株より速いのは、色素合成と言う負担が無くなるためであろうと推測される。ところが、自然界では色素を産生しない株は比較的まれであると考えられる。今回は1株のみ色素非産生株であった。これはviolaceinがグラム陽性菌に対して抗菌作用を示し（Margalith, P, Z., et al., 1992）、そのため自然界でも他の細菌の繁殖を抑えることによって自らのコロニーを形成していくためではないかと推測される。
室戸海洋深層水中の細菌相は、Vibrio属35.8%、Pseudoalteromonas属
16.4%、Shewanella属13.4%、Marinobacter属6.0%、Erythrobacter属4.5%、
Tenacibaculum属3%、Bacillus属1.5%、Dietzia属1.5%、Halomonas属1.5%、
Hyphomicrobaculum属1.5%、Idiomarina属1.5%、属同定ができなかった株13.4%であった。Ocky, et al.の報告によると北西太平洋水深1000-8000mの深海から採取した試料中の細菌相はVibrio属44.2%、Pseudoalteromonas属29.3%、
Photobacterium属26.5%であり（Ocky, K. R., et al., 2001）、本研究での結果とよく似ているが、Photobacterium属は今回の研究では確認できなかった。
また、同じくOcky, et al.の報告では、北西太平洋水深0-200mの表層から採取した試料中の細菌相は、Vibrio属19.7%、Pseudoalteromonas属31.8%、
Halomonas属25.1%、Pseudomonas属2.9%、Photobacterium属20.5%である。しかし、今回の研究では、Pseudomonas属、Photobacterium属は確認できず、
Halomonas属は1株を確認したのみであった。この結果から、室戸海洋深層水の細菌相は、表層海水の細菌相と異なり、むしろ1000m以深の細菌相に近いこと
より、未報告の細菌や有用細菌の発見が今後も期待できる。

14

謝辞
本研究をまとめるにあたり、御指導と御助力を賜りました高知工科大学工学部榎本恵一教授を始め、大濱武教授、佐塚正樹講師に深く感謝いたします。また、研究を遂行するうえ多くの御尽力をいただいた高知工科大学工学部の教員の皆さまに深く感謝いたします。
また、本研究を行ううえでさまざまな面から支えて下さいました皆さまに深く感謝いたします。

15

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20表１
深層水由来細菌の単離及び培養に用いた培地（PPES-Ⅱ）の組成

PPES-Ⅱ
Polypeptone
Proteose peptone
SoytoneYeast extract
H
6 FeC
5O7・nH2O
seawater

2.0
No.3 1.0
1.0
1.0
0.1
1000

g
g
g
g
g
ml

1M NaOHを用いpHを7.8に調整する。
（門田元, 多賀信夫 編, 1985）

表2
冷凍保存液の組成
glycero（鈴木健一郎、平石明、横田明

21

2.5 gpepton
50 ml
450 mlseawater
編,

2001）

図1
16S

rRNA遺伝子上における使用プライマーの位置

プライマーFW07, RV03は、16SrRNA遺伝子のPCR増幅に用いた。
他のプライマーは、塩基配列を決定するのに用いた。

22

図2

材料と方法（細菌の保存と同定法）
海洋深層水をPPES-Ⅱ（表1）平板培地に25, 50, 100μl塗布（1-2）
3-4日間20℃で培養↓コロニーを単離↓
PPES-Ⅱ液体培地に植菌
3-4日間20℃で旋回培養

海洋深層水由来細菌の同定
QIAamp

DNA Mini

細菌の保存（1-3）

Kit(QIAGEN)を用いた遠心分離

細菌からゲノム DNA の回収および精製

↓

（2-2）

保存液（表 2）で再懸濁↓
PCR による 16S rRNA 遺伝子の増幅（2-3）↓
シーケンス反応（2-4,

3）

↓
シーケンス
↓
データベース検索と属の同定（2-5）

23

表3-1
室戸海洋深層水中の細菌相

表3-2
室戸海洋深層水中の細菌相

24

表3-3
室戸海洋深層水中の細菌相

25

図3
violacein産生株8株の比較
V1

V2

V1

V2

V1

V2

V1

V2

V1

V2

¦
¦
¦
¦
-

402P1
417P1
520P1
315P1
315P4
315P5
516P1
710P1

402P1
417P1
- 520P1- 315P1¦ 315P4¦ 315P5¦ 516P1- 710P1-

TAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTA
AAGCGTACGCAGGCGGTTTAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTA
AAGCGTACGCAGGCGGTTTAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTA
AAGCGTACGCAGGCGGTTTAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTA
AAGCGTACGCAGGCGGTTTAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTA
AAGCGTACGCAGGCGGTTTAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTA
AAGCGTACGCAGGCGGTTTAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTA
AAGCGTACGCAGGCGGTTTAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTA
AAGCGTACGCAGGCGGTT************************************************************-TGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAGATGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAGATGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAGATGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAGATGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAGATGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAGATGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAGATGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAGA************************************************************-CTAGAGTATGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTG
CTAGAGTATGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTG
CTAGAGTATGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTG
CTAGAGTATGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTG
CTAGAGTATGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTG
CTAGAGTATGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTG
CTAGAGTATGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTG
CTAGAGTATGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTG************************************************************-AAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAATACTG
ACGCT
AAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAATACTG
ACGCT
AAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAATACTG
ACGCT
AAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAATACTG
ACGCT
AAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAATACTG
ACGCT
AAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAATACTG
ACGCT
AAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAATACTG
ACGCT
AAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAATACTG
ACGCT******************************************
*****

¦

402P1
417P1
- 520P1- 315P1¦ 315P4¦ 315P5¦ 516P1- 710P1
¦

402P1
417P1
- 520P1- 315P1¦ 315P4¦ 315P5¦ 516P1- 710P1
¦

402P1
417P1
- 520P1- 315P1¦ 315P4¦ 315P5¦ 516P1- 710P1¦

CTATAGCTGTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGG
CTATAGCTGTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTT
CGTGCCAGCAGCCGCGG
CTATAGCTGTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGG
TTGCAGCTGTGACGTTACTTACAGAAGAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGG
TTGCAGCTGTGACGTTACTTACAGAAGAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGG
TTGCAGCTGTGACGTTACTTACAGAAGAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGG
TTGCAGCTGTGACGTTACTTACAGAAGAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGG
TTGCAGCTGTGACGTTACTTACAGAAGAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGG*******************************************************

26

室戸海洋深層水より採取されたviolacein産生産生株の16S rRNA遺伝子287塩
基配列を比較した。図中で赤く表記した塩基は、異なっていた配列を持った部
位である。

27

図4

Pseudoalteromonas luteoviolacea（X82144）との比較
520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGT
AACAGAGATAGCTTGCTATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGG
AAACGAGAATAGCTTGCT----------------------AACACATGCAAGTCGAGCGGTAACATTTCTAGCTTG
CT*****************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

TCTGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAATATGCCTTTAGGTGGGGGAA
TTCGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAATATGCCTTTAGGTGGGGGAA
AGAAGATGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACGTGCCGTAAGGTGGGG
GA*** ************************************ * **********

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

AGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATGATGTCTACGGACCAAAGTGGGGGACCTTCAAC
AGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGTGGGGGACCTTCAACCAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGG----C
TT**************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

GCCTCACGCCTAAAGATTAGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTTGAGGTAAAGGCTCGG
GCCTCACGCCTAAAGATTAGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTTGAGGTAAAGGCT
CGG
CGG--CTCTCGCCTTATGATCGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGT-AAGGTAATGG
CT****** ***** * ********************************** ****

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

CACCAAGGCAACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACTACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAG
AC******** **************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

ACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTG
ACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTG
ACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCC
TG************************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

ATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCC
CTAGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCC
CTAGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTAAGGAATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTAAGGA******************************************* *************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

GGAAAGGTTA
TAGTTTAATAGACTATAGCTGTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTGGAAAGGTTGTAATTTAATAGATTGCAGCTGTGACGTTACTTACAGAAGAAGCACCGGCTGGAAAGGTTAGTAGTTAATACCTGCTAGCTGTGACGTTACTTACAGAAGAAGCACCGG
CT***********************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

TCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGG
AACT
TCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGG
AACT
AACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTG
GG**** *********************************************** *****

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

CGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGC
CCCGGGCTCAACCTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGC
CCCGGGCTCAACCTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTG
GG************************************************************

28

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

AACTGCATTTCGAACTGGCAGACTAGAGTATGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAG
AACTGCATTTCGAACTGGCAGACTAGAGTATGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAG
AACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGT
AG******************** ************************* *************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

CGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAATCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAATCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAAC***********************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

ACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCAC
ACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCAC
ACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC
AC***************************************** *****************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

GCCGTAAACGATGTCTACTAGGAGCTGG
AATC-TTCGGATGACTTTTCCAAACGTAACGC
GCCGTAAACGATGTCTACTAGGAGCTGGG
ATC-TTCGGATGACTTTTCCAAACGTAACGC
GCCGTAAACGATGTCTACTAGGAGCTGGGGTCCTTCGGACAACTTTTCCAAAGCTAAC
GC************************************* ** **************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

ATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGG
GG************************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

GCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACAGCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACAGCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTA
CA************************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

CTTGACATCCAGAGAAGAGACTAGAGATAGACTTGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGT
CTTGACATCCAGAGAAGTTACTAGAGATAGTTTCGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGT
CTTGACATACAGAGAACTTACTAGAGATAGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAG
GT******** *********************************** *********

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

GCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTA
AGTCCCGCAACGAGCGC
GCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTA
AGTCCCGCAACGAGCGC
GCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGC
GC************************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

AACCCCTATCCTTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAGGGAGACTGCCGGTGATAACCCCTATCCTTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAGGGAGACTGCCGGTGATAACCCCTATCCTTAGTTGCCAGC-GATTCGGTCGGGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTG
AT******************* ******************** *** ********

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

AAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTAC
AC************************************************************

29

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

ACGTGCTACAATGGCAGGTACAGAGTGCTGCGAGCTCGCGAGGGTAAGCGAATCACTTAA
ACGTGCTACAATGGCAGGTACAGAGTGCTGCGAGCTCGCGAGGGTAAGCGAATCACTTAA
ACGTGCTACAATGGCAGATACAGAGTGCTGCGAACTTGCGAGAGTAAGCGAATCACTT
AA***************** ********************************** *****

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

CCTGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGT
AG
CCTGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAGAGTCTGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTA
GT** *********************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

AATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCC---*******************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

CACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTGGCTAGTCTAACTGC
TTGCAGAGGACGGTCAC
CACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTGGCTAGTCTAACT-TTCGAGAGGACGGTCAC-----------------------------------------------------------

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.luteoviolacea

CACGGAGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGC
CCTA--CACGGAGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGC
CCTAGGG--------------------------------------------------

violaceinを産生するP. luteoviolaceaとVグループの16S rRNA遺伝子の1353
塩基配列を比較した。図中で赤く表記してある塩基は、P. luteoviolaceaと異なった塩基配列を持つ部位である。

30

図5

Pseudoalteromonas denitrificans（X82138）との比較
520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGT
AACAGAGATAGCTTGCTATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGG
AAACGAGAATAGCTTGCT-TTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGAGATAGCTTG
CT******************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

ATCTGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGC
TTGGGAATATGCCTTTAGGTGGGGGA
TCGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAATATGCCTTTAGGTGGGGGAAT
ATCTGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCNTGGGAATATGCCTTTAGGTGGGG
GA**** ****************************************** ********

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

CAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATGATGTCTACGGACCAAAGTGGGGGACCTTCAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGTGGGGGACCTTCAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGTGGGGGACC
TT***********************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

CGGGCCTCACGCCTAAAGATTAGCCCAAGTGGGATTAGCTAGT
TGGTTGAGGTAAAGGCTCGGGCCTCACGCCTAAAGATTAGCCCAAGTGGGATTAGCTAGT
TGGTTGAGGTAAAGGCTCGGGCCTCACGCCTAAAGATTAGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGT-GAGGTAAAGG
CT*********************************************** ************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

CACCAAGGCAACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGC
CACACTGGAACTGAGACCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACCACCAAGGCAACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAG
AC********* **************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

ACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTG
ACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTG
ACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCC
TG**************************************************** *******

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

ATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTAAGGAATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAG
GA**********************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

GGAAAGGTTATAGTTTAATAGACTATAGCTGTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTGGAAAGGTTGTAATTTAATAGATTGCAGCTGTGACGTTACTTACAGAAGAAGCACCGGCTGGAAAGGTTATAGTTTAATAGACTATAGCTGTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGG
CT********* ** ******************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans-TTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGG
AAC-TTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGG
AAC
AACCTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACT
GG*** ********************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

GCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGG
GCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGG
GCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGG************************************************************

31

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

GAACTGCATTTCGAACTGGCAGACTAGAGTATGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGAACTGCATTTCGAACTGGCAGACTAGAGTATGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGAACTGCATTTCGAACTGGCAGACTAGAGTATGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTG
TA************************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

GCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTC
AA************************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

TACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCATACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCATACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCNGGTAGTCCA************************************************** *********

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

CGCCGTAAACGATGTCTACTAGGAGCTGGAATC-TTCGGATGACTTTTCCAAACGTAACGCGCCGTAAACGATGTCTACTAGGAGCTGG
GATC-TTCGGATGACTTTTCCAAACGTAACGCGCCGTAAACGATGTCTACTAGGAGCTGGAATCCTTCGGATGACTTTTCCAAAGCTAACG****************************************** **************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

CATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGG
CATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGG
CATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACG
GG************************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

GGCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTAC
GGCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTAC
GGCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTAC************************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

ACTTGACATCCAGAGAAGAGACTAGAGATAGACTTGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGG
ACTTGACATCCAGAGAAG
TTACTAGAGATAGTTTCGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGG
ACTTGACATCCAGAGAAGAGACTAGAGATAGACTTGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACA
GG*********************************************** ********

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

TGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTT
AAGTCCCGCAACGAGCG
TGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTT
AAGTCCCGCAACGAGCG
TGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTNAGTCCCGCNACGAG
CG*************************************************** *******

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

CAACCCCTATCCTTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAGGGAGACTGCCGGTGACAACCCCTATCCTTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAGGGAGACTGCCGGTGACAACCCCTATCCTTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTANGGAGACTGCCGGT
GA******************************************** ***************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

TAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACA************************************************************

32

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

CACGTGCTACAATGGCAGGTACAGAGTGCTGCGAGCTCGCGAGGGTAAGCGAATCACTTA
CACGTGCTACAATGGCAGGTACAGAGTGCTGCGAGCTCGCGAGGGTAAGCGAATCACTTA
CACGTGCTACAATGGCAGGTACAGAGTGCTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCGAATCACT
TA**********************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

AAGCCT
GTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGAAGCCT
AAGCCTATCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCT
AG****** *****************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

TAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCG
TC************************************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

ACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTGGCTAGTCTAACTG
CTTGCAGAGGACGGTCA
ACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTGGCTAGTCTAACTT
TCG--AGAGGACGGTCA
ACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTGGCTAGTCTAACTGCTG------------******************************************

520P1̲V-1group̲
710P1̲V-2group̲P.denitrificans

CCACGGAGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAG
CCCTA--CCACGGAGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAG
CCCTAGGG---------------------------------------------------

BLAST法により最も近縁とされたPseudoalteromonas denitrificansとviolacein産生株の16S rRNA遺伝子の1425塩基配列を比較した。赤で示した塩
基は、P.denitrificansと塩基配列が異なっていた部位である。P.
denitrificansの ”N” で示された塩基は、その種類が決定されていないもので
ある。

33

図6
violacein非産生株（402W15,

520P1B’）とVグループの塩基配列の比較

520P1̲V-1group1̲
710P1̲V-2group̲
402W15520P1'B

CTATAGCTGTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGG
TTGCAGCTGTGACGTTACTTACAGAAGAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGG
CTATAGCTGTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGG-----------------------------------------------------------

520P1̲V-1group1̲
710P1̲V-2group̲
402W15520P1'B

TAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTA
AAGCGTACGCAGGCGGTTTAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTA
AAGCGTACGCAGGCGGTTTAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTA
AAGCGTACGCAGGCGGTT--------------------------------ACTGGGCGTA
AAGCGTACGCAGGCGGTT******************

520P1̲V-1group1̲
710P1̲V-2group̲
402W15520P1'B

TGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAGATGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAGATGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAGATGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAGA************************************************************

520P1̲V-1group1̲
710P1̲V-2group̲
402W15520P1'B

CTAGAGTATGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTG
CTAGAGTATGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTG
CTAGAGTATGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTG
CTAGAGTATGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTG************************************************************

520P1̲V-1group1̲
710P1̲V-2group̲
402W15520P1'B

AAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAATACTG
ACGCTCATGTACGAAAGCAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAATACTG
ACGCTCATGTACGAAAGCAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAATACTG
ACGCTCATGTACGAAAGCAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAATACTG
ACGCTCATGTACGAAAGC************************************************************

520P1̲V-1group1̲
710P1̲V-2group̲
402W15520P1'B------------------------------------------------GTGGGGAGCAAACGGGA

室戸海洋深層水中より分離したviolacein非産生株402W15及び、violacein産
生株520P1の継代培養中に現れたviolacein非産生株520P1’Bの16S rRNA遺伝子塩
基配列をV-1グループ、V-2グループのものと比較した。

34

図7
属間での相同性（％）

本研究で最も多く得られたVibrio属の6種と、それについで株数の多かった
Pseudoalteromonas属3種、Shewanella属4種の16S rRNA遺伝子の配列をデータ
ベースより得て、その相同性を表にまとめた。16S rRNA遺伝子ほぼ全域である
1366塩基配列の相同性は上段黒文字で記した。また、シーケンスに用いたプライマー（r2L）を含む5’末端側へ360塩基配列の相同性は下段赤文字で記した。
黄色のセルはVibrio属内の相同性、紫色のセルはPseudoalteromonas属内の相同性、オレンジ色のセルはShewanella属内の相同性を示す。水色のセルは異属間の相同性を示す。

35