〔生物工学会誌

第 97 巻第2号

66–74．2019〕2018 年度 生物工学技術賞 受賞

微生物による生分解性ポリマー PHBH 製造法の開発
佐藤俊輔 1*・有川尚志 1・小林

新吾 1・藤木哲也 2・松本圭司 3

Process development of biodegradable polymer PHBH
Shunsuke Sato1, Hisashi Arikawa1, Shingo Kobayashi1,
Tetsuya Fujiki2, Keiji Matsumoto3 (1Biotechnology ResearchLaboratories, KANEKA CORPORATION, 1-8, Miyamaecho, Takasago-cho, Takasago, Hyogo, 676-8688, 2Corporate
R&D Planning Department, KANEKA CORPORATION,
2-3-18, Nakanoshima, Kita-ku, Osaka, 530-8288, 3Graduate
School of Engineering, Osaka University, 2-1, Yamadaoka,
Suita, Osaka, 565-0871) Seibutsu-kogaku 97: 66–74, 2019.

はじめに

イクロプラスチック）
による有害物質の吸着，濃縮といった問題も近年注目されている 2–4)．2050 年には，海洋に1900 年代にプラスチックが商業化されたことにより，漂うプラスチックの量が重量ベースで魚の重量を上回る

人々の生活は飛躍的に便利になった．
たとえば，
スーパー

ことが報告され，漁獲量の急減など，食料，経済問題にのレジ袋，車の部品，PET ボトルや食品トレーなどのまで発展することが国際的に大きな議論になっている．

食品容器，飲料用ストロー，電子機器の筐体など，軽くて丈夫なプラスチック製品は身の回りに当たり前に存在

UNEP（国際環境プロジェクト）のレポートによると，一般的な生分解性プラスチックは，50°C を超える工業

し，利用する我々はその恩恵を受けている．1950 年にコンポスト条件では加水分解が促進されることで分解さ

約 200 万 ト ン で あ っ た プ ラ ス チ ッ ク 樹 脂 の 生 産 量 は2015 年には約 4 億トンにまで増加し，さらに年率約 8.4％

れるものの，実海洋環境での生分解性は十分ではないともの勢いでその生産量を増加させている 1)．

は，使い捨てプラスチック製品の生産制限に関する EU報告されている 5)．このような状況の中，欧州において

1970 年代以降，廃棄物埋め立て処分場の不足などが指令の準備が進むなど，プラスチック製品のあり方が問問題となったことから，生分解性プラスチックの研究開

われる時代が到来しつつある．最近では，マクドナルド

発が活発に行われた．1997 年の京都議定書採択以降は，やスターバックスがプラスチック製ストローを廃止する

地球温暖化対策として，再生可能資源である植物由来原ことを発表し，大きな注目を集めている．このような社料から製造されるバイオマスプラスチックの開発が加速会問題への解決方法を提供すべく，株式会社カネカでは，されている．しかしながら，正しく処分されずに廃棄さ自然環境で分解するバイオマス由来生分解性プラスチッ

れたプラスチックや，風雨などの自然現象により環境中クの実用化を進めている．

に放出されたプラスチックが最終的に河川を通過し，または直接，大量に海洋に流出・蓄積しているのが現状でポリヒドロキシアルカノエート（PHA）

ある．これら流出プラスチックを海生生物や鳥などが誤ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）は，1926 年

飲・誤食したことによる悲惨な被害に加え，紫外線や波にフランス人研究者 Lemoigne によって発見されたバク力によって 5 mm 以下に断片化したプラスチック片（マテリアによって産生されるポリエステルである（図 1）6)．

* 著者紹介 （株）カネカ E-mail: Shunsuke.Sato@kaneka.co.jp

66

生物工学

第97巻

第2号（2019）

PHB は 3HB の連鎖部分に形成されたラメラ構造が水素結合によって結ばれることで結晶化する，結晶性のプ
ラスチックである．PHBH では 3HHx モノマーは，その側鎖のプロピル基が障害となり，3HB 連鎖部分が形成する結晶構造に入ることができない．このため，3HHx
比率が高まるほど結晶性が低下し，結果として軟質性が向上する．たとえば，3HHx 比率 5 mol% の PHBH では，
引張り伸びは数％，融点 151°C であるが，3HHx 比率
図 1．共重合ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）の構造

10 mol% になると，引張り伸び 400％，融点 127°C とな
る．このように，PHBH は 3HHx 比率を調節することで，ポリプロピレン（PP）や高密度ポリエチレン（HDPE）

PHA はバクテリアが炭素ならびにエネルギーの貯蔵物質を含む広範な物性をカバーすることのできる樹脂であるとして生産，蓄積する物質であり，もっとも一般的なも．また，上述したように 3HHx モノマーを導入す（図 3）

Lemoigne が発見した (R)-3-hydroxybutyrate（3HB）のは，ることで，PHB（融点 177°C）に比べて融点が低下すのホモポリマー，poly(3-hydroxybutyrate)（以下，PHB）

るため，熱分解温度（約 185°C）よりも十分低い温度でである．PHB は融点や引張強度がポリプロピレンに近成型加工が可能となり，プロセスウィンドウが広がるメ

く，環境調和型素材としての利用が期待されたものの，リットもある．

融点（約 177°C）が熱分解温度（185°C）に近く，プロ以上のように，PHBH の物性を左右する 3HHx 比率のセスウィンドウ（10°C）が狭いことから熱可塑性樹脂と制御は非常に重要である．また，PHBH のポリマーとして実用化するうえで致命的な弱点を有している．
また，しての機械的，物理的特性にはその分子量が重要要素でPHB は結晶化度が高く，硬くて脆い物性であるため，ある．次章以降は，筆者らが取り組んだ PHBH 生産微適用範囲が制限されることから普及には至らなかった．

生物の分子育種技術，特に 3HHx 比率制御，ならびに分

このため，PHB をより広範な用途に適した物性に改良

子量制御技術を紹介する．

するために，各社は 3HB に第 2 モノマー成分を導入した 共 重 合 ポ リ エ ス テ ル を 開 発 し て い る． た と え ば，Tianjin GreenBio Material 社（中国）は 4-hydroxyburyrate
を共重合モノマーとする poly(3-hydroxyburyrate-co-4hydroxybutyrate)，P（3HB4HB）を，TianAn Biologic
Material 社（中国）は 3-hydroxyvalerate を共重合モノマーとする poly(3-hydroxyburytate-co-3-hydroxyvalerate)（PHBV）を商業化している．一方で，先行していた
Metabolix 社（米国）は P（3HB4HB）の商業化を目指していたものの商業化には至らず，現在は CJ 社（韓国）に事業譲渡している．株式会社カネカ（当社）は第 2
成 分 と し て 3-hydroxyhexanoate を 導 入 し た poly(3hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)（PHBH）の商業化を目指している 7)．
一般的なプラスチック材料の熱特性を表 1 にまとめた．

PHBH 生産菌の分子育種研究開発の初期段階においては，弊社にて取得した A.

caviae FA440 株を用いた生産を試みた 8)．しかしながら，，実生産
その PHBH 生産性は非常に低く（10 g/L/60 h）への応用は断念せざるを得なかった．そこで筆者らは，PHB高生産株として知られているCupriavidus necator（旧名：Ralstonia eutropha）H16 株を宿主に選定し，PHBH
生産株の分子育種を開始した．

1997 年に福居俊昭氏（現：東京工業大学教授，当時：理化学研究所）らが A. caviae より PHBH 重合酵素遺伝
子（phaCAc）のクローニングに成功されたことから，本遺伝子を C. necator に導入することから生産菌株の分子育種を始めた 9)．筆者が入社した当時，宿主 C. necatorにて使用可能なベクターは pBBR 系や pJRD 系しか知ら

PHBH

れていなかった．筆者もそれらプラスミドベクターを利PHBH は 上 述 し た よ う に，3HB な ら び に (R)-3hydroxyhexanoate（3HHx）からなる共重合ポリエステ
ルである（図 2）．PHBH 実用化の歴史は，遡ること 28

宿主細菌が PHA を高蓄積させた際に非常に不安定にな

年前，カネカ高砂工業所内の土壌より新規ポリマー生産

で 4 回植え継いだ時に約 80％の細胞がプラスミドを保持菌として Aeromonas caviae FA440 株が発見されたことしているにも関わらず，PHB 蓄積条件では，同 4 回植から始まった．

え継いだ時に 30％しかプラスミドを保持していない結

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第2号（2019）

用して，育種を開始したものの，これらのプラスミドは，るということが明らかとなった．たとえば，PHB 非蓄積条件での pJRD215 系のベクターは，抗生物質非存在下67

表 1．PHA と一般的なプラスチックの熱特性

Tg (°C)

Tensil strength
(Mpa)

97

4

43

5

64

–20

27

634

119

–16

–15

31

14

53

ND

–45

104

1000

Tm (°C)ǻHm (J/g)

PHB

177

poly(3HP)

77

poly(3HV)
poly(4HB)

constituent

Elongation tp
break (%)

References

homopolymr

26

copolymer
3HHx = 5 mol%

151

69

0

―

―

3HHx = 10 mol%

127

77

–1

21

400

3HHx = 15 mol%

115

54

0

23

760

3HHx = 17 mol%

120

34

–2

20

850

3HV = 10 mol%

150

―

―

25

20

3HV = 20 mol%

135

―

―

20

100

4HB = 3 mol%

―

―

―

28

45

4HB = 10 mol%

―

―

―

24

242

4HB = 16 mol%

―

―

―

26

444

4HB = 18 mol%

150

―

―

―

―

3HP = 7 mol%

160

71

3

―

―

3HP = 11 mol%

152

36

1

―

―

3HP = 20 mol%

143

18

–1

―

―

3HP = 67 mol%

44

5

–10

―

―

PLA

164

57

62

55

5

PP

174

148

–13

34

400

PS

110

ND

100

54

4

HDPE

130

293

–36

10

620

PET

262

―

―

56

7300

PHBH

PHBV

3HB4HB

PHBP

27

28

29

30

others26

28

PLA: polylactide, PP: polypropylene, PS: polystyrene, HDPE: high density polyethylene, PET: polyethylene terephtalate

図 2．PHBH の構造

図 4．pJRD215 プラスミドベクターの保持率．
A：PHB 高蓄積条件，B：PHB 低蓄積条件．

果となった（図 4）10)．また，pBBR 系のベクターも同様に不安定であった．したがって，導入遺伝子の機能解析
図 3．各種ポリマーの伸びと弾性率68や培養条件などの評価において，プラスミドを保持させ
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第2号（2019）

るために抗生物質を添加せざるを得なかった．しかしながら，ジャー培養による高密度培養系においては，抗生物質を添加してもプラスミドの安定保持は困難であり，培養ロットごとに導入遺伝子の安定性（保持率）が変化する結果となった．このような状況により，遺伝子導入
効果が正しく評価できず，研究開発に支障をきたすこととなった．一方で，当時すでに確立していた C. necator

H16 染色体への挿入技術を利用すればプラスミド不安定性の回避は可能であったが，同技術の適用には時間を要することから，網羅的に多くの菌を作製・評価するには

図 5．pCUP3 プラスミドベクター

安定プラスミドの開発が必須であると判断した．
さらに，工業生産における抗生物質の使用は，コスト，ならびに排水処理の観点から困難であることを付け加えたい．
安定

宿主―ベクター系の開発

工業生産を目指して育種を進める際，導入遺伝子安定性が一定であり，実験ごとの評価結果が信頼できること，
また，育種した菌株がそのまま工業的に使用可能である
ことが必須である．筆者らは，PHBH 生産菌を育種するにあたり，C. necator H16 にて使用可能な安定プラス
ミドベクターの開発を進めた．プラスミドを安定に保持させるシステムとしては，抗生物質により選択圧をかけ

図 6．PHB 高蓄積条件でのプラスミド保持率

る方法の他に，par システムが知られている 11,12)．Par シ
ステムが働くと，複製したプラスミドが娘細胞に確実に分配されるため，抗生物質による選択圧を掛けなくてもプラスミドを安定に保持させることが可能となる．これまでに大腸菌にて使用可能な RP4 プラスミドの par シス
テムを組み込んだプラスミドベクター 13) や R1 プラスミ

図 7．KNK-005 株の遺伝型

ドの par 領域を組み込んだプラスミドベクター 14) が知られていたが，筆者らの使用宿主である C. necator H16が著しく向上しており，以後，この pCUP3 ベクターを株にて使用可能な安定プラスミドベクターは報告されて利用することで，分子育種の速度が飛躍的に向上するこいなかった．そこで，筆者らは C. necator H16 と同属ととなった．さらに，pCUP3 は接合伝達に関わる遺伝である Cupriavidus metallidurans CH34 が保有するメガ子群を保有しないことから，工業的に利用可能なプラス

プラスミド（pMOL28）の par システム（parABS）とミドベクターである 10)．

複製開始点（oriV）を利用することで，C. necator H16
において安定なプラスミドベクターを開発することを着PHBH 生産経路想した．同 parABS，oriV を大腸菌プラスミドベクター

筆者らは，C. necator H16 株の PHB 重合酵素遺伝子と連結し，新規プラスミドベクター（pCUP3）を作製（phaC1Cn）を A. caviae FA440 株由来の PHBH 重合酵素

した（図 5）．pCUP3 はポリエステル（PHA）を多量に遺伝子（phaCAcNSDG）に置換した PHBH 生産菌（KNK-

蓄積する条件においても，抗生物質非添加条件にて，非常に高い安定性を示した．一方で，oriV のみを導入し005 株）を育種した（図 7）．図 8 に植物油を原料とした
PHBH 生産経路を示す．植物油はリパーゼによって脂たベクター（pCUP2）は C. necator に形質転換可能で

肪酸とグリセリンに分解され，それぞれの代謝経路に入．この結果あるものの，安定性は顕著に低かった（図 6）

る．ここではグリセリンは割愛させていただき，主成分より，C. metallidurans の par システムおよび，oriV が C.

である脂肪酸から PHBH までの代謝を説明する．

necator にて機能することが証明された．また，pCUP3細胞に取り込まれた脂肪酸は，ȕ 酸化経路にて代謝さは既存のプラスミドベクターと比較して，形質転換効率

れ，炭素数 2 のアセチル -CoA が生産される．アセチル

生物工学

第97巻

第2号（2019）69

図 10．ȕ ガラクトシダーゼ活性

図 8．PHBH 生産経路

図 9．遺伝子発現カセットの配列-CoA2 分子は ȕ- ケトチオラーゼ（PhaA）が触媒する重縮合反応によって炭素数 4 のアセトアセチル -CoA に変換され，さらに (R)- 特異的還元酵素（PhaB）によってPHBH のモノマーの一つである (R)-3- ヒドロキシブチリ
ル -CoA へと変換される．もう一つのモノマーである(R)-3- ヒドロキシヘキサノイル -CoA は ȕ 酸化中間体である 2- ヘキセノイル -CoA が (R)- 特異的エノイル CoA
ヒドラターゼ（PhaJ）によって水和されることで生産される 15,16)．生合成された 2 種類のモノマーは PHBH 重合酵素（PhaCAcNSDG）によって重合される．
3HHx 比率制御技術開発

配列（RBS）もしくはその破壊体（dRBS：図 9 中二重下線）を連結した複数の新規遺伝子発現カセットを作製し（図 9），それらカセットのプロモーター活性をレポー
ター遺伝子（lacZ）の発現による ȕ- ガラクトシダーゼ
活性を指標に評価した（図 10）．次に，それらプロモーター配列を phaJ4a，ならびに phaJ4b 遺伝子に連結し，3HHx 比率を評価したところ，プロモーター活性に応じて，3HHx 比率を変化させることに成功した．筆者らが育種した C. necator は，さまざまな異なる 3HHx 比率のPHBH を再現良く生産可能であったことから，使用した発現カセットの強度によって代謝フラックスの微調整が可能であることを実証した（表 2）．生産された PHBH

初期に育種した KNK-005 株はパーム油を原料として培の熱特性解析を実施した結果，3HHx 比率の増加に伴う養した場合に 3HHx 比率が 3 〜 7 mol% 程度の PHBH を

融点（Tm）の低下が確認された（表 3）．PHB の融点は生産した．幅広い用途展開のためには，その 3HHx 比率

その熱分解温度に近く，成形加工を著しく難しくさせてを自在に調節し，要求物性（異なる共重合比率）に応じいる．一方で，3HHx 成分を共重合している PHBH はた PHBH を作り分ける必要がある．特に，軟質 PHBH の3HHx 成分による結晶化阻害により融点が低下し，成形生産が難しく，さらに 3HHx 比率を高める技術が必要で加工のプロセスウィンドウが広がっており，成形加工性

あった．そこで筆者らは，3HHx モノマー供給経路の鍵が向上している．また，結晶化度が低下することで，柔酵素である phaJ の精密発現制御を試みた．これまでの研軟な性質も付与されている 22)．

究において，C. necator では，さまざまな物質生産研究

本技術開発により，所望の物性の PHBH を生産するがなされており，そのためにさまざまな遺伝子発現系の生産菌株の育種に成功した．育種した生産株は，実生産検討がなされてきた．たとえば，プロモーターについてと同様の高密度流加培養条件下においても生産性に影響

は，E. coli で一般的に使用される Plac，PlacUV5，Ptac，を与えることなく，さまざまな 3HHx 比率の PHBH を

T7，PBAD や，C. necator 自身が持つ PphaC1，PphaP，
PacoE，PacoD，PpdhE などが利用されている 17–21)．筆
coli に由来するプロモーター，PlacUV5，
者らは，E.
Ptrc，Ptrp，ならびに C. necator の PHB 重合酵素遺伝子
phaC1Cn のプロモーター PphaC1 とそのリボソーム結合

生産することが可能であり，工業的な生産株として使用

70可能であることを確認している．今後の工業生産規模拡大に対して，
異なる培養槽や原料の使用が想定されるが，本技術により，生産株の変更のみで変化に対応可能となったことは大きなメリットであると考える．
生物工学

第97巻

第2号（2019）

表 2．phaJ 発現調節株による PHBH 培養生産結果

Dry cell weight(mg/ml)

PHA content(% dry cell weight)

PHA(mg/ml)Real cell massa(mg/ml)3HHx composition(mol%)

19.1 ± 0.1

84.2 ± 0.2

16.1 ± 0.1

3.0 ± 0.1

2.8 ± 0.1

005dZ126C1A

19.3 ± 0.2

84.7 ± 2.0

16.4 ± 0.2

2.9 ± 0.4

5.3 ± 0.1

005dZ126TRPDA

19.1 ± 0.6

84.2 ± 2.7

16.1 ± 0.0

3.0 ± 0.6

7.8 ± 0.0005dZ126TRPA

19.1 ± 0.3

82.3 ± 1.5

15.8 ± 0.0

3.4 ± 0.3

8.6 ± 0.1

005dZ126UV5DA

19.2 ± 0.5

83.4 ± 0.9

16.0 ± 0.3

3.2 ± 0.3

9.1 ± 0.0005dZ126UV5A

18.7 ± 0.8

84.0 ± 1.1

15.7 ± 0.4

3.0 ± 0.3

9.9 ± 0.2005dZ126TRCDA

19.1 ± 0.5

82.1 ± 0.2

15.7 ± 0.3

3.4 ± 0.1

9.6 ± 0.0005dZ126C1DB

18.8 ± 0.2

85.0 ± 0.6

16.0 ± 0.1

2.8 ± 0.2

5.8 ± 0.2005dZ126C1B

19.3 ± 0.5

84.2 ± 0.7

16.3 ± 0.3

3.0 ± 0.2

6.7 ± 0.6005dZ126TRPB

18.8 ± 0.1

84.7 ± 1.3

15.9 ± 0.3

2.9 ± 0.2

10.0 ± 0.1005dZ126UV5B

19.0 ± 0.0

84.1 ± 1.9

16.0 ± 0.3

3.0 ± 0.4

10.6 ± 0.0005dZ126TRCB

18.2 ± 0.4

84.0 ± 3.3

15.3 ± 1.0

2.9 ± 0.5

10.7 ± 0.1

Strain005dZ126

Data represent mean ± SD from three experiments performed in triplicateaReal cell mass = dry cell minus polyhydroxyalkanoates (PHAs)
表 3．PHBH の熱特性

First heating process

Second heating process

Cooling process

3HHx composition(mol%)

Tm (°C)ǻHm (J/g)

Xc (%)

Tg (°C)Tc (°C)ǻHc (J/g)

Tcc (°C)ǻHcc (J/g)

0 (PHB)b

175.1

103

70.5

0.4

77.4

80.2

―

―

2.7

150.8

72.9

49.9

–2.3

50.2

25

50.3

21.7

5.2

142

70.8

48.5

–2.9

41

3.6

58.8

47.1

5.9

138.9

69.5

47.6

–2.4

―

―

68.2

43.3

7.1

133.5

66.3

45.4

–2.1

―

―

74.5

27.2

7.9

131.1

67.5

46.2

–2.2

―

―

76.7

20.2

9.1

116.4

65.9

45.1

–3.4

―

―

77

12.2

10

114.7

60.4

41.4

–3.6

―

―

78.9

1.9

10.8

113.5

55.8

38.2

–4.7

―

―

79.9

1.2

a

DSC analysis of PHBH with various 3HHx composition.
Tm: melting temperature; ǻHm: melting enthalpy; Xc: crystallinity; Tg: glass transition temperature; Tc: crystallization temperature;ǻHc: crystallization enthalpy; Tcc: cold-crystallization temperature; ǻHcc: cold-crystallization enthalpybPurchased from Sigma-Aldricha

PHBH 分解酵素遺伝子破壊による分子量制御と同じく，PHBH 重合酵素の発現量と基質供給速度によって変化するが，そのような代謝状態の変化により分子量はプラスチックの機械的，物理的性質を左右す

3HHx 比率や PHBH 生産速度にも影響を与えてしまう．

る重要因子の一つである．菌体内に蓄積されたPHBHは，そこで，それらに影響を与えずに分子量を向上させる手

環境影響を考慮した水系精製工程にて菌体内から取り出段として，PHBH 分解酵素に着目した．PHBH 生産宿され，続いて熱加工プロセスによってさまざまなアプリ

主である C. necator H16 株は 9 つの PHB 分解酵素遺伝子

ケーションへと成形加工され，使用される．PHBH はを保有している．これらは，7 つの PHB デポリメラー

ポリエステルであることから，熱やアルカリ条件下で比ゼ（PhaZ1 から PhaZ7）と 2 つの 3HB オリゴマーハイ

較的加水分解を受けやすく，ダウンストリームプロセス

ドロラーゼ（PhaY，PhaY2）をコードする．しかしなの間に分子量が低下することが問題である．この分子量

がら，これら分解酵素の PHBH の蓄積期における関与の低下を考慮すると，微生物発酵工程では，できるだけについては，とりわけ，分子量制御への関与に関しては，高い分子量の PHBH を生産することが要求される．

十分に分かっていなかった（表 4）．

生合成される PHBH の分子量は，一般的な触媒重合
生物工学

第97巻

第2号（2019）

一般論として，細胞内に蓄積された PHBH をエネル

71

表 4．C. necatorH16 が保有する PHB 分解酵素

6XEVWUDWHVSHFL¿FDFWLYLW\ ȝmol/min/mg)a
3HB oligomers

PHB granules

Name

Locus tag

Dimer

TrimerTetramer

Pentamern-PHBb

a-PHBcLocalization

PhaZ1

H16_A1150

0

0

1.1

1.2

0

0.71

PHB

PhaZ2

H16_A2862

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

33

PhaZ3

H16_B0339

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

34

PhaZ4

PHG178

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

35

PhaZ5

H16_B1014

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

34

PhaZ6

H16_B2073

1.2

2.6

0

ND

0.43

110

PHB and cytosoledReference(s)
31
32

PhaZ7

H16_B2401

ND

ND

ND

ND

Active

ND

?

PhaY1

H16_A2251

58

59

54

50

0

3

Cytosol and PHB

PhaY2

H16_A1335

31

200

240

310

0

3

Cytosol

31
36
36
31
37
31
37

a

ND, not determined
native PHBcDUWL¿FLDODPRUSKRXV3+%dactive, but it could not be compared with other data because the experimental methods were differenteexamined but unclearb

表 5．PHB 分解酵素破壊株の培養評価結果

PHA production from palm kernel oil by various gene deletion mutants of Cupriavidus necator.a
StrainDry cell weight(mg/ml)

PHA content(% dry cell weight)

PHA (mg/ml)

3HHx composition(mol%)

Mw ( × 106)

KNK-005

18.1 ± 0.4

73.3 ± 2.2

13.3 ± 0.5

3.3 ± 0.12

1.4 ± 0.05

005dZ1

16.9 ± 0.1

73.8 ± 1.2

12.5 ± 0.2

3.4 ± 0.07

1.2 ± 0.05

005dZ217.0 ± 1.0

75.5 ± 6.4

12.9 ± 1.7

3.2 ± 0.14

1.3 ± 0.03

005dZ1217.4 ± 0.6

72.0 ± 5.8

12.5 ± 1.2

3.3 ± 0.13

1.2 ± 0.03

005dZ617.1 ± 1.7

74.7 ± 3.3

12.8 ± 1.7

3.5 ± 0.23

2.9 ± 0.23005dZ1618.3 ± 1.1

74.8 ± 4.2

13.7 ± 1.5

4.1 ± 0.10

2.8 ± 0.19

005dZ126

17.3 ± 1.7

73.0 ± 3.9

12.7 ± 1.9

4.1 ± 0.11

2.7 ± 0.17005dZ1246

18.4 ± 1.7

74.8 ± 1.6

13.8 ± 1.6

4.0 ± 0.28

2.9 ± 0.11005dZ1267

17.4 ± 2.3

70.6 ± 6.3

12.4 ± 2.6

4.0 ± 0.16

2.8 ± 0.55005dZ126Y1

17.7 ± 2.4

73.2 ± 5.4

13.0 ± 2.6

3.9 ± 0.24

2.8 ± 0.20

005dZ126Y2

17.1 ± 1.8

72.8 ± 3.8

12.5 ± 1.9

4.1 ± 0.11

2.7 ± 0.08a

The cells were cultured in the mineral salt medium with 0.129 w/v% (NH4)2SO4 and 1.5 w/v% palm kernel oil for 90 h.
Data represent mean ± SD from three experiments performed in triplicate

ギーや炭素供給源として利用するには，いったんモノ

有することが報告されている 22,23)．そこで筆者らは，野マーまで分解する必要がある．したがって，培地中の栄

生型の C. necator H16 に対して PHB 分解酵素の網羅的養枯渇時に速やかに分解利用されるためには，合成の段な遺伝子破壊を行い，生産される PHB の分子量に与え階からある程度，分子量を小さく（分子数を多く）制御

る影響の確認を行った．その結果，phaZ6 遺伝子破壊にしておくことが，微生物にとって好ましいと考えられる．

よって，分子量が顕著に向上することを発見した（表 5）．

すなわち，PHBH の蓄積においても，何らかの分子量

KNK-005 株の phaZ6 破壊株を作製し，パーム油を用いて PHBH を生産させた結果，その分子量は phaZ6 非破壊株に対して約 2 倍となり，重量平均分子量約 300 万制御機構が働いている可能性が推測された．PHB 分解酵素の中では，PhaZ6 と PhaZ7 が強いエンド型活性を

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図 11．PHBH 分解メカニズムにまで向上した．PhaZ6 の機能については，先行研究において解析されており，PHA 蓄積期にその転写が誘導

図 12．PHBH 成形加工例

スになったと考える．

されることが報告されていたものの，遺伝子破壊による安定的な発酵生産プロセスには，微生物も重要である

PHA 生産性，ならびに分解挙動に顕著な影響は確認さが，その培養プロセスが大きな鍵を握っている．本稿でれていなかった．本研究の結果から，PhaZ6 は PHBH

はとても紹介しきれないが，培養のスケールアップ技術

蓄積期において，PHBH 鎖を内部から切断し，分子鎖開発では非常に多くのことを学ばせてもらった．PHBH

数を増加させる役割を担っていることが推測された（図をプラスチックとして利用するためには，細胞から11）．さらに筆者らは，PhaZ6 破壊株において細胞内PHB の分解挙動を確認したが，分解速度に変化は見られなかった 24)．本技術開発により，PHBH の生産性やその 3HHx 比率とは独立に分子量を向上させることが可

PHBH を取り出し，精製するダウンストリームプロセス，
生産された PHBH を加工する樹脂加工技術が必要である．ダウンストリームプロセスは，環境に配慮した完全
水系プロセスによって細胞から高純度に PHBH を取り能となり，安定的な工業生産が可能となった．微生物に出すクリーンプロセスを開発した．樹脂加工技術，およよる PHA の重合，蓄積，分解のメカニズムは，いまだび配合技術研究も近年大きく進展し，射出成型，押出成に分かっていないことが多く，分子量の精密制御のため型，インフレーション成型などさまざまな成型加工が可には，今後のますますの研究が必要であると考える．

能となり，シート，フィルム，ボトル，さらには発泡成

まとめ型や繊維化まで可能となりつつある（図 12）．

PHA は発見から 90 年以上が経っているにも関わらず，筆者らは微生物による PHBH の製造方法の開発に関

未だに実用化途上の素材である．しかしながら，元来，して，生産微生物 C. necator の分子育種ツールである宿生物が生産，蓄積する物質であるという捉え方をすれば，

主−ベクター系の開発，それを利用した分子育種により，セルロース，天然ゴム，油脂などと同じ天然高分子であ3HHx 比率精密制御技術，ならびに分子量向上技術を確立することに成功した．これらの技術を PHBH 高生産

る．はじめにも書いたが，PHBH の大きな差別化点と株に適用することで，樹脂物性，機械特性が制御された海洋環境でも良好に分解することがあげられる．PHBH

して，天然構造に由来する高い生分解性，特に実環境，

PHBH 工業生産技術を作り上げた．さらに，工業規模

製のフィルムを海水中に浸漬すると，海水由来の微生物での培養スケールアップ技術開発，精製技術開発を行い，叢によって，その表面に多量のバイオフィルムが形成さ実用化に耐えうる PHBH 工業生産プロセスを開発した．

れ，バイオフィルム中の分解微生物によって効率的に分微生物育種初期は，生産性を高めることに重きを置い解されることが明らかとなっている 25)．PHBH はすでた研究開発を行っていたが，研究が進むにつれ，実用化に国際的な認証機関である VINÇOTTE より，「OK bio-のためにポリマーの物性を意識するようになった．
また，酵生産では共重合比率や分子量の培養バッチ間再現性がdegradable MARINE」の認証を得ている（Vincotte は2017 年 12 月 TÜV AUSTRIA Belgium NV に認証業務を引き継いだ）（図 13）．今後，土壌やコンポスト環境のみならず，海水中でも分解するという PHBH の特徴を低いことは仕方ないとは考えず，化学合成樹脂に負けな活かした用途展開を進め，地球環境の保全と，持続可能い製造技術構築を意識した微生物育種を実施したことな社会の実現に貢献していきたい．

工業規模での安定生産技術の重要性に気づかされた．通常の化学反応による重合制御と異なり，微生物による発で，生産初期と比較すると飛躍的に安定的な生産プロセ
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図 13．OK bio-degradable MARINE 認証マーク

謝辞まずは，本賞に選出いただいたことに対し，深く感謝いた
します．本技術開発は，25 年以上にわたる産学連携研究の成果であり，多くの研究者，技術者による数々のブレークスルー
によるものです．すべての方々に深く感謝申し上げます．
特に，本研究に対し，当初より多大なるご指導を頂きました，
土肥義治先生，また，生産菌の分子育種に関する基礎研究において，多くの貴重な技術指導，アドバイスを頂きました，田口精一教授（東京農業大学），福居俊昭教授（東京工業大学），
柘植丈治准教授（東京工業大学），阿部英明チームリーダー，
沼田圭司チームリーダー（理化学研究所），岩田忠久教授（東京大学）には深謝いたします．
また，本事業は当社のプロセス開発チーム，成形加工技術
研究チームの方々や開発チームの方々の顕著な成果無しでは，成り立たない事業であります．PHBH の基礎研究，工業生産
プロセス開発，樹脂加工技術開発，製品開発に携わったすべての方々に深く感謝いたします．

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