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ヌクレオフォスミンの新規ターゲットの探索と解明

Author(s)鈴木, 仁Citation

科学研究費助成事業研究成果報告書: 1‑5

Issue Date

2015‑06‑05

TypeResearch Paper

Text version

publisher

URL

http://hdl.handle.net/10119/12827

RightsDescription

研究種目：若手研究(B), 研究期間：2012〜2014, 課題
番号：24700974, 研究者番号：00447690, 研究分野
：分子生物学Japan Advanced Institute of Science and Technology

２版

様式

Ｃ−１９、Ｆ−１９、Ｚ−１９ （共通）

科学研究費助成事業

研究成果報告書
平成 ２７ 年

６ 月

５ 日現在

機関番号： １３３０２
研究種目： 若手研究(B)
研究期間： 2012 〜 2014
課題番号： ２４７００９７４
研究課題名（和文）ヌクレオフォスミンの新規ターゲットの探索と解明研究課題名（英文）Investigation into novel splicing targets of Nucleophosmin

研究代表者
鈴木仁（Suzuki, Hitoshi）

北陸先端科学技術大学院大学・マテリアルサイエンス研究科・特任助教
研究者番号：００４４７６９０
交付決定額（研究期間全体）：（直接経費）

3,200,000 円

研究成果の概要（和文）：NPM(ヌクレオフォスミン)は、中心体複製等の制御に関与する多機能性蛋白質である。本研
究では、中心体から離脱したT199リン酸化NPMがスプライシングを抑制する事に注目し、選択的スプライシングへの関与を検証した。まず、NPMの標的となる選択的エキソン群が不明であった為、エキソンアレイ解析を行なった。解析には、リン酸化NPMを模倣する変異型を細胞に過剰発現させ、そのtotal RNAを使用した。アレイ解析とRT‑PCR法による検証で確認できた標的エキソンは予想以上に少なかったが、細胞周期に関与するG蛋白質や白血病に関連する転写因子等の選択的エキソンがNPMにより制御される事が示唆された。

研究成果の概要（英文）：NPM (Nucleophosmin) is a multifunctional protein, such as a regulator of thecentrosome duplication. It was reported that the phospho‑Thr(199) NPM departed the centrosome andlocalized into the nuclear speckle. Also, this protein had a repressive activity of the pre‑mRNA splicingin vitro. However, the regulation of alternative splicing by NPM was unclear. Using total RNAs of thecells over‑expressing T199D‑NPM (that imitates functionalities of phospho‑Thr(199) NPM), we carried out
the Exon Array analysis to identify splicing targets of NPM. Unfortunately, the validation by the RT‑PCR
suggested that most extracted exons were not actual target exons of NPM. Nevertheless, several
alternative exons including the splicing events of a cell cycle‑related G‑protein and a leukemia‑relatedtranscription factor were obtained as potential targets of NPM. These may play critical roles in thealternative splicing by NPM.

研究分野： 分子生物学
キーワード： 選択的スプライシング

ヌクレオフォスミン

細胞周期

様	  式	  Ｃ－１９、Ｆ－１９、Ｚ－１９（共通）	 
１．研究開始当初の背景
ヌクレオフォスミン（NPM）は多機能性を有すタンパク質であり、リボソームの生合成、細胞周期制御、中心体複製、ゲノム安定化やアポトーシスなどに関与する事が知られている。細胞内の NPM は核小体、核質および中心体などに検出される。NPM の異常はガン細胞で顕著であり、NPM の高発現、異常な細胞質局在や転座による融合タンパク質の生成などが報告されている。とりわけ NPM の中心体複製制御は重要であり、その異常は細胞周期制御の乱れと、細胞のガン化に繋がる。	  G1 期の中心体に局在する NPM は、中心体複製を抑制的に制御している。細胞周期進行の準備が整うと、CDK2/cyclin	 E により 199 番目のスレオニン（T199）がリン酸化される。T199
リン酸化 NPM は中心体から離脱し、中心体複製が開始する。非常に興味深いことに、中心体を離脱した T199 リン酸化 NPM は、核内に移行し、スプライシングが行われる核スペックルに局在化した。これまでに私は、スプライシング制御因子としての NPM の機能を検証する共同研究に参加して、T199 リン酸化 NPM がin	 vitro の反応系でスプライシングを抑制的に制御することを報告した(図 1)。この活性は、選択的スプライシング制御に大きな影響を与えるものと考えられる。実際、NPM がhnRNP	 H1 と協調して、ribosomal	 protein	 L3	 (rpL3)の第 4 エキソンの制御に関与するという報告もあるが、その他の選択的スプライシングについては全く分かっていなかった。

酵素である。ガン細胞や胎性細胞においてそのスプライシングが変化し、過活性化型になることが報告された。血管新生の不十分な状況において、解糖系からのエネルギー供給が細胞分裂に必須であると考えられている。このようなスプライシング制御が、ガンにおける治療のターゲットとなる可能性がある。	 	  選択的スプライシング自体は、90%以上のヒト遺伝子で起こる一般的な現象である。しかし、ガンと密接に関係する NPM が標的とする選択的スプライシングには、治療などに有意義なものが存在すると期待される。NPM の選択的スプライシング制御に関しては、その標的エキソン群を含めて、よく分かっていなかった。

２．研究の目的
本研究はガン化と密接な関係にある NPM のスプライシング制御因子としての役割を明らかにするものである。	 	  G1/S 期にリン酸化された T199 リン酸化 NPM
は、中心体複製だけではなく、核スペックルに移行しスプライシング制御を担うと予想される。細胞周期などと関連した NPM の標的エキソン群や、その分子機構を検証することは、疾患メカニズムの解明や治療戦略の確立などに貢献すると期待できる。NPM の標的エキソン群を網羅的解析により同定することは、NPM を中心としたスプライシング制御機構の全容を解明する糸口となる。	 

３．研究の方法
T199 リン酸化 NPM は、核スペックルへの局在化とスプライシングの抑制的制御という 2 つの特徴を有する。この性質を模倣する NPM 変異体として、199 番目のスレオニンをアスパラギン酸へと置換した T199D-NPM が知られている。また、スレオニンをアラニンへと置換した T199A-NPM は、核スペックルへ移行せず、スプライシングにも影響しないことが明らかとなっている。本研究では、これらの NPM

図 1.	 NPM によるスプライシング制御の模式図
リン酸化した NPM は中心体から核スペックルへと移動する。この時、NPM はスプライシングを抑制する活性を持つが、標的となる選択的エキソンはほとんど知られていない。	 	  選択的スプライシングも、ガンと密接に関係する。例えば、ガン細胞におけるエネルギー供給に関して、ピルビン酸キナーゼの選択的スプライシングが注目された。ピルビン酸キナーゼは、解糖系において ATP 産生を担う

図 2.	 NPM 発現ベクター	 
野生型及び変異型 NPM(NPM1)の蛋白質コード領域を、pCS2+	 FLAG ベクターに挿入した。下部の配列は、導入した変異の場所を示す。	 

変異体を用いて、NPM の標的エキソンを同定することとした。	 	  野生型の NPM(wt)、変異型の T199D-NPM、及び T199A-NPM の発現ベクターをそれぞれ調製し、HEK293 細胞に導入した（図 2）。これ
らの野生型及び変異型 NPM の過剰発現により、細胞内における選択的スプライシングの変化を促し、それぞれ total	 RNA を精製した。
NPM の選択的スプライシングにおける新規標的エキソン群を同定する為、網羅的解析が必要となる。私は、エキソンアレイ解析を行なうこととした。アレイは生物学的デュプリケートを準備して、アフィメトリクス社のGeneChip	 human	 Exon	 1.0	 ST	 Array を用いて行なった（図 3）。スキャンデータの解析は、生物情報解析サービス会社に依頼して、Expression	 console 等を用いて解析した。	 

これらのベクターは、それぞれ HEK293 細胞に導入して、transient	 transfection を行なった。48 時間培養の後、細胞を回収して total	 
RNA の精製や細胞抽出液の調製を行なった。
導入した NPM の発現は、ウェスタンブロット法を行なって確認した（図 4）。導入した NPMは、抗 FLAG 抗体や抗 NPM 抗体で検出できており、内在性の NPM と同等の発現レベルが確認された。これと同じ操作を施して回収した細胞から、total	 RNA を精製した。	 

図 4.	 NPM の発現解析	 
ウェエスタンブロット法により NPM の発現を確認した。抗 FLAG 抗体により、導入した NPMの発現が確認される。一方、抗 NPM 抗体では内在性の NPM と導入した NPM の両者の発現を確認することができる。	 

図 3.	 エキソンアレイ解析のフローチャート	 
上記の実験部分は独立して操作を繰返して、生物学的デュプリケートを取得した。それらのスキャンデータから NPM の標的エキソン候補群を抽出した。	 	  少なくとも遺伝子が発現しているものを選別した後、スプライシングインデックス（SI 値）に注目した。SI 値は、エキソンの発現を遺伝子の発現でノーマライズした後、2 つのサンプル間の変化を示す値である。本
研究では、T199D-NPM の過剰発現細胞由来
total	 RNA と T199A-NPM のものを比較した。
SI 値などの指標を用いた抽出の後、選択的エキソンを個別に検証した。検証には、RT-PCR法を行って、T199D-NPM 依存的な選択的スプライシングの変化を解析した。	 
４．研究成果	 	 (1) 発現ベクターと total RNA の調製
図 2 に示すように、pCS2+	 FLAG ベクターに野生型 NPM の蛋白質コード領域を挿入した。これを鋳型として点変異を導入し、NPM-T199D及び NPM-T199A の発現ベクターを調製した。

(2) エキソンアレイ解析	 
NPM-T199D の発現は、NPM 依存的な選択的スプライシングを促進して、細胞内の遺伝子発現を変化させたと予想される。また、NPM は多機能性蛋白質であるため、コントロールとして NPM-T199A を用いた。これら 2 種類のtotal	 RNA を用いて、エキソンアレイ解析を行なった（図 3）。さらに、独立に同じ実験を行なって、生物学的デュプリケートを取得している。これらのスキャンデータから、CELファイルを取得し、数値化を行なった。	 	  標的エキソンの抽出には、まず、エキソンアレイ解析で遺伝子発現シグナルが極めて低い遺伝子を除外した。そして、デュプリレート間で SI 値の正負が異なるものも除外した。SI 値の平均が 1.4 未満のエキソンも除外
すると、約 350 エキソンが抽出される。このうち、約 35％のエキソンが、ゲノムブラウザー上で選択的エキソンと判定された。それらの選択的エキソン群からランダムにエキソンを選択し、エキソンアレイ解析とエキソンの抽出手法の正当性を RT-PCR 法により評価した。残念ながら、大多数のエキソンにおいて顕著な変化が認められなかったため、抽出したものの多くは NPM の標的エキソンではないと示唆された。	 
(3)	 RT-PCR 法による標的エキソンの同定	 
抽出した選択的エキソン群から細胞周期やがんに関わる遺伝子・エキソンを選別する予定であったが、個々のエキソンを RT-PCR 法により注意深く検証し、数少ない標的エキソンを同定することとした。エキソン抽出に関しても、SI 値の平均値が 1.6 以上で、デュプリケートでいずれも大きな SI 値を示したエキソンに変更して、プライマー設計の容易な20 個のエキソンを選択して検証した。いずれも顕著な変化とはいえないが、数個のエキソンで NPM-T199D 依存的な変化が示唆された。
典型的なスプライシング制御因子のtransient	 transfection の場合でも、導入効率などの影響によりスプライシングの変化が微弱となる。また、内在性の NPM も発現して、スプライシングの変化が検出しにくい状況となったと考えられる。	 

当初の計画通りがん関連の標的候補を抽出することに成功した。これらの遺伝子を含めて、T199 リン酸化 NPM の選択的スプライシングにおける新規の標的エキソン候補を同定することができており、NPM とそのスプライシング制御を中心とする細胞にガン化において重要な知見となると考えている。	 	 

図 6.	 RT-PCR 法	 
左図に G 蛋白質、右図に Zn フィンガー型転写因子の結果を示す。いずれも全長型蛋白質をコードする PCR 断片が相対的に減少した。	 	 
５．主な発表論文等	 
（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）	 

図 5.	 エキソンアレイと RT-PCR 法により得られた標的エキソンの例	 
上図に G 蛋白質、下図に Zn フィンガー型転写因子の選択的スプライシングを示す。矢頭はプライマーを示し、その結果は図 6 に示す。
両方とも選択的エキソンを有し（赤）、その変化が検出できた。	 	  RT-PCR 法により T199D-NPM 依存的な傾向が示されたエキソンには、遺伝子名を明示しないが G 蛋白質や Zn フィンガー型転写因子の選択的エキソンが存在した（図 5）。この G 蛋
白質のエキソンは 3'スプライスサイト選択型であり、Zn フィンガー型転写因子のエキソンはカセット型であった。どちらのエキソン使用でも、全長型の相対的な発現低下が生じると推定される。T199 リン酸化 NPM の重要な標的候補となると考えている。	 	  驚いたことに、Zn フィンガー型転写因子はがん抑制遺伝子のパラログであった。さらに活性化した NPM により誘導され得る短縮型の転写因子は、ある種の白血病患者で高発現することが報告されていた。一方、この G 蛋白質は細胞周期制御に関連する。このように、〔雑誌論文〕（計 4 件）
[1]	  Alam	  S,	  Suzuki	  H,	  Tsukahara	  T.	 
Alternative	  splicing	  regulation	  of	  APP	 
exon	 7	 by	 RBFox	 proteins.	 Neurochem	 Int.	 
査読有.	 78 巻.	 7-17 頁.	 2014 年.	 	 
[2]	 Alam	 S,	 Phan	 HT,	 OkazakiM,	 Takagi	 M,	 Kawahara	  K.	  Tsukahara	  T,	  Suzuki	  H.	 
Computational	  extraction	  of	  a	  neural	 molecular	  network	  through	  alternative	 splicing.	  BMC	 Res	 Notes.	  査 読 有 .	  7 巻 .	 
2014 年.	 DOI:10.1186/1756-0500-7-934	 
[3]	  Suzuki	  H,	  Tsukahara	  T.	  A	  View	  of	 Pre-mRNA	 Splicing	 from	 RNase	 R	 Resistant	 RNAs.	  Int.	 J.	 Mol.	 Sci.	  査読有.	 15 巻.	 
9331-9342 頁.	 DOI:	  10.3390/ijms15069331.	 	 
2014 年.	 	 
[4]	 Suzuki	 H,	 Kameyama	 T,	 Ohe	 K,	 Tsukahara	 
T,	 Mayeda	 A.	 Nested	 introns	 in	 an	 intron:	 
evidence	 of	 multi-step	 splicing	 of	 a	 large	 
intron	 in	 the	 human	 dystrophin	 pre-mRNA.	 
FEBS	 Lett.	 査読有.	 587 巻.	 555-561 頁.	 
2013 年.	 	 	 〔学会発表〕（計 5 件）
[1]	 鈴木	  仁,	 亀山俊樹,	 前田	  明,	 塚原俊文.	 環状型転写産物の包括的理解に向けた DMD 遺伝子ホットスポットの解析.	 第 37回日本分子生物学会年会.	 2014 年 11 月 25 日〜27 日.	 パシフィコ横浜(神奈川県・横浜市)	 
[2]	 鈴木	  仁.	 circRNA とスプライシング.	 

第 1 回北陸エピジェネティクス研究会.	 2014年 11 月 18 日〜19 日.	 金沢大学付属医学部図書館	 十全記念スタジオ（石川県・金沢市）	 
[3]	 Suzuki	 H,	 Saito	 T,	 Kameyama	 T,	 Masuda	 
S,	 Nagata	 T,	 Takeda	 S,	 Mayeda	 A,	 Tsukahara	 
T.	 Circular	 RNA	 and	 multiexon-skipping	 in	 the	 DMD	 gene	 hotspot.	 RIKEN	 Symposium/15	 th	 Tokyo	 RNA	 club,	 ncRNA	 Regulation.	 2014年 10 月 1 日.	 理化学研究所和光キャンパス	 
鈴木梅太郎ホール（埼玉県・和光市）	 
[4]	 シャフュール	 アラム,	 鈴木	  仁，塚原俊文.	 RBFox による APP 遺伝子 exon7 のスプライシング制御.	 第 16 回日本 RNA 学会年会.	 
2014 年 7 月 22 日〜24 日.	 ウインクあいち（愛知県・名古屋市）	 
[5]	 鈴木	  仁,	 亀山俊樹,	 前田	  明,	 塚原俊文.	  DMD 遺伝子のホットスポットのスキップ産物と circRNA.	 第 15 回日本 RNA 学会年会.	 2013 年 7 月 24 日〜26 日.	 ひめぎんホール(愛媛県・松山市)	 	 
〔図書〕（計 1 件）
[1]	 Suzuki	 H,	 Tsukahara	 T.	 Comprehensive	 
analyses	  of	  alternative	  exons	  in	 neuronally	 differentiated	 P19	 cells.	 NOVA	 science	  publishers.	  New	  development	  in	 alternative	  splicing	  research.	  2013 年 .	 
pp.49-68.	 	 	 〔産業財産権〕	 
○出願状況（計 0 件）	 	 
名称：	 
発明者：	 
権利者：	 
種類：	 
番号：	 
出願年月日：	 
国内外の別：	 	 	 ○取得状況（計 0 件）	 	 
名称：	 
発明者：	 
権利者：	 
種類：	 
番号：	 
出願年月日：	 
取得年月日：	 
国内外の別：	 	 	 〔その他〕	 ホームページ等	 	 
６．研究組織	 (1)研究代表者	 
鈴木	  仁（SUZUKI	 Hitoshi）	 
北陸先端科学技術大学院大学・マテリアル
サイエンス研究科・特任助教	 	  研究者番号：00447690	 	 (2)研究分担者	 	  	  該当無し	  	  	  	  	  （	  	  	  ）	 	 	  研究者番号：	 	 
(3)連携研究者	 	  該当無し	  	  	  	  	  （	  	  	  ）	 	 	  研究者番号：	 	 
(4)協力研究者	 
塚原俊文（TSUKAHARA	 Toshifumi）	 	 
前田	  明（MAYEDA	 Akila）