「環境」と生物工学

キリングループの環境への取組み
吉田

聡 *・足海 洋史・西田 武央・大澤藤井 敏雄・生嶋 茂仁・玉川

文・米田 俊浩
英幸・小林統キリングループは，キリンホールディングスを中心として，キリンビール，キリンビバレッジ，メルシャン，キリン協和フーズ，小岩井乳業，協和発酵キリンなどの事業会社からなる．キリングループは環境に対する基本方針として，『全ての事業の低炭素化に努め，環境保全の取組みを実施すると共に，お客様への環境価値提案を通して，自然と共生した豊な社会の実現に貢献します』と謳っている．特に，技術面では『地球環境とお客様に価値ある自然と共生する技術開発』に取り組んでいる．
本稿では，キリンビバレッジ，キリンビール，キリンホー
ルディングスでの環境工学的な取り組みについて，実例を挙げてそれぞれ紹介したい．
軽量化ペットボトルの開発
ペットボトルは主に飲料容器に用いられるが，ペット

図 1．軽量化ペットボトルの開発

樹脂事業の国内総売り上げは約 1000 億円に上り，世界では 4 兆円という非常に大きな市場である．いわゆる容器包装ごみの多くが飲料包装によるものであり，その発ペットボトルの PET（ポリエチレンテレフタレート）生をいかにして減らすかが環境保全への大きな課題であは，エチレングリコールとテレフタル酸が脱水重合してる．そのためには，3R（Reduce, Reuse, Recycle）が必作られるが，原料に植物由来の樹脂を利用したペットボ要であり，特に Reduce が最も効果がある試みとされてトルの導入も行っている．このように限りある資源であいる．そこで，キリンビバレッジでは容器包装ごみをる原油の使用量を削減することにも取り組んでおり，よReduce するため，キリンビール・パッケージング技術

り環境負荷の低い容器の開発に努めている．

開発センターと共同で，容器そのものの軽量化に取り組んだ．初めに，2 l のペットボトルの軽量化について，バイオエタノール実証プロジェクト

ボ トルの胴部形状を 工 夫 し， 強 度 は 従 来 以 上で，約

キリンビールは，ビール，発泡酒などを製造，販売し30％軽量化（63 g → 42 g）したボトルを開発した（ペコており，酵母を用いたエタノール発酵生産の長年の技術

1)

ロジーボトル）．このボトルは，使用後容易に潰すこと蓄積がある．そこで，このような発酵技術の活用として，ができ，ペットボトルの回収効率の向上にも貢献した．

近年，石油代替エネルギーとして注目されているバイオ

なお，本発明で社団法人日本包装技術協会より第 29 回

エタノールの生産に取り組んだ．具体的には，国産バイ木下賞を受賞することができた．引き続き，ユニバーサ

オ燃料実現に向けて，北海道十勝地区で，地域の特性をルデザインを実現し，より軽量化した新 2 l ボトルの開発活かしたバイオエタノール生産プロジェクトに参画しを行った．設計にあたっては，キャップの開けやすさ，た．すなわち，バイオエタノールの原料調達から燃料の持ちやすさ，注ぎやすさ，ボトル強度，軽量化を追求した．

供給までを一体として，国産技術による事業を確立する

その結果，最大で 35 g に軽量化することに成功した（図ための農林水産省国家プロジェクト（「燃料用バイオエ1）．本技術が認められ，APF（アジア包装容器連盟）よりアジアスター賞，WPO（世界包装容器機構）よりワー

タノール製造プロジェクト」）に参画した 2)．そして，ホクレンの清水製糖工場構内に年間 1.5 万 kl 規模のバイルドスター賞，サステナビリティ賞金賞を受賞した．

オエタノール製造設備を建設し，酵母による発酵技術を* 著者紹介 キリンホールディングス・フロンティア技術研究所（主任研究員） E-mail: satoshiy@kirin.co.jp

2012年 第4号

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提供した．そして，原料として規格外小麦（でんぷん），甜菜（蔗糖）を利用し，品質としては純度 99.5％以上のエタノールを作ることに成功した．さらに，排水処理で出てくるメタンについてはバイオガスとして利用することで，より環境に配慮した生産システムを構築した．
以上のように，本取組みは，全世界的な課題である温室効果ガスの排出抑制による地球温暖化防止策として，バイオマスを用いたバイオエタノール混合ガソリン事業に貢献するものである．ビール工場における廃棄物の削減は勿論のこと，このように保有技術を新たな分野に展開することで，より環境に配慮した取組みを行っている．
ビール仕込み粕からのバイオエタノール生産
バイオエタノール生産に関して，アメリカのトウモロ図 3．各種酵母株を用いたビール仕込み粕糖化液のエタノール発酵．Ps は Pichia stipitis を，Cs は Candida shehatae を示す．
図はエタノール生産量，キシロース消費量，グルコース消費量の経時変化を示す．

コシのようにデンプン質を原料に用いた場合，時として食糧価格高騰などの問題を引き起こす．そのため，セルロース系原料からのエタノール生産への期待が高まって法を検討した．さまざまな条件で酸処理を行ったところ，おり，近年，全世界的に盛んに研究されている．そこで，最終的に 10％（w/v）の仕込み粕を 3％（w/v）硫酸中で，本取組みにおいては，ビール仕込み粕からの糖化，およ80qC，3 時間の処理を行うことで，全糖の約 90％を液化

びエタノール生産を検討した．

することができた．一方，高いエクソ型グルコシダーゼ

ビール仕込み粕はビールの仕込みの過程で原料である活性を示す市販酵素剤を選抜し，反応条件を精査した結麦汁を濾過するときに出てくる粕であり，飼料，土壌改

果，約 90％の収率で単糖を生産させることができた．

良材などに使われてきたものである．まず初めに，ビーそこで，両者を組み合わせて糖化を行ったところ，48 時

ル仕込み粕の構成糖を調査したところ，もっとも多く含間で約 80％の糖化効率を得ることができ，その糖組成はまれる糖はセルロースとアラビノキシランであり，それグルコースとキシロースが主であった（図 2B）．この糖らは全仕込み粕重量の半分近くを占めていることが明ら化液をキシロース資化性酵母である Pichia stipitis 野生かとなった（図 2A）．そこで，ビール仕込み粕の水分含株により発酵させたところ，30qC，48 時間で 1.26％（w/v）

量が高い事を考慮し，酸加水分解と酵素処理による糖化のエタノールを生産させることに成功した 3)．さらに，キシロースの資化性を向上させるために，キシロースからキシロース5リン酸までの代謝に関する遺伝子群（XYL1, XYL2, XYL3）を P. stipitis において過剰発現させたところ，キシロース培地での発酵速度が最大で27％向上した．そして，ビール仕込み粕糖化液を用いた発酵においても，遺伝子群を導入していないコント
ロール株と比べて最終的にエタノール収率が 20％向上
した（図 3）4)．
以上のようにビール仕込み粕は，バイオエタノールを生産するためのバイオマス資源としても活用できることが明らかになった．しかしながら，実用化には生産性の向上，糖化プロセスの低コスト化などの課題が残されており，この分野における更なる基礎的，応用的な技術開発が期待される．

Candida 属酵母を用いた L- 乳酸生産
図 2．ビール仕込み粕の構成成分（A）と糖化液の糖組成（B）

180

地球温暖化現象が急速に深刻化している近年，世界規
生物工学

第90巻

「環境」と生物工学
模での二酸化炭素削減が必要であり，効率的な炭素循環システムの構築が望まれている．植物などのバイオマスから微生物発酵によって作られるバイオプラスチック
は，焼却や分解で生じた二酸化炭素が元々は植物由来であり，追加的な二酸化炭素放出にならないという意味で，カーボンニュートラルとされている．また，生分解性プラスチックは環境に対する負荷が少ないという特徴も有している．このような状況で，生分解性プラスチックとして，バイオマスを発酵して得られる L- 乳酸の重合体であるポリ乳酸の研究が世界で活発に行われている．現在，宿主として注目されている Saccharomyces cerevisiae
は乳酸菌に比べてストレスに強いなどの特長がある一方で，Crabtree 効果陽性であることから副産物としてエタノールを生成することが問題視されている．そこで，本取組みでは Crabtree 効果陰性の酵母である Candida 属酵

図 5．Cbpdc1 破壊株におけるピルビン酸，エタノール生産能，エタノーと増殖能．図は YPD 培地における増殖（A）,（D）
ル生産量（B），ピルビン酸生産量（C）を示す．

母を宿主とする効率的な L- 乳酸生産システムの構築を試みた．具体的には，Candida 属酵母として，C. boidiniiと C. utilis の 2 つの酵母について乳酸生産技術の開発をポテンシャルを探るために，まず初めに C. boidinii と S.

行った．

素をコードする遺伝子（L-LDH）を導入することにより，cerevisiae のストレス耐性，特に低 pH に対する耐性を比較した．その結果，C. boidinii は S. cerevisiae よりも低 pH に対して耐性であることが明らかとなった 6)．そこで，次にピルビン酸脱炭酸酵素をコードする S. cerevisiae の ScPDC1 遺伝子の活性領域の配列をもとに設計したプライマーで増幅した DNA 断片をプローブとして，C. boidinii ゲノムより CbPDC1 遺伝子を新規にクローピルビン酸を基質として乳酸を生産させる．その際，エン化した．本遺伝子を破壊したところ，野生株に比べてタノールは副産物となるので，PDC 遺伝子を破壊する

若干の増殖遅延は示すものの，S. cerevisiae の場合のよことにより，エタノールへの経路をシャットアウトする，うに致死となることはなかった．また，CbPDC1 遺伝という戦略である（図 4）．

子破壊株はエタノールをほとんど生産しないことが確認

酵母による乳酸生成の育種は以下の戦略で行った．酵母はエネルギー源として取り込んだグルコースをピルビン酸に変換し，ピルビン酸脱炭酸酵素（PDC）の働きによりアセトアルデヒドを経てエタノールを生成する．
本来酵母は乳酸を生産しないので，外来の乳酸脱水素酵

初めに紹介する C. boidinii は，メタノール資化性の酵母であり，メタノール培地を用いたタンパク質生産誘導
5)システムが開発されている ．C. boidinii の乳酸生産のされた（図 5）．
次に，C. boidinii のコドン使用頻度にあわせて全合成したウシ L-LDH 遺伝子を Cbpdc1 遺伝子破壊株に導入し た． そ の 際，CbURA3 遺 伝 子 座 に 入 っ た 場 合 と，CbPDC1 遺伝子座に入った場合で，乳酸生産量に差があることが明らかとなった．その原因は，L-LDH 遺伝
子発現のために用いた CbPDC1 プロモーターの長さであることが示唆された．そこで，もっとも生産効率の高かった CbPDC1 遺伝子座に入った株を用いてフラスコ，およびジャーファーメーターによる詳細な発酵条件の検討を行い，乳酸生産の最適条件を調査した．まずは，フラスコを用いて通気量，初発菌体量，発酵温度についてそれぞれ調査した．通気量については 100 ml のフラス
コに入れる培地の量を変化させ，また振とう培養のスピードを調整することにより実施した．その結果，初発
図 4．酵母における乳酸生産戦略

2012年 第4号の菌体量に関わらず，20 ml，80 〜 100 rpm で培養した181

とき，もっとも乳酸生産効率が高かった．この時，乳酸生成量と最終 OD は通気量が下がるにつれ同じように低下しており，C. boidinii においては増殖と発酵は連動していることが示唆された．そこで，それを示すために，グルコース単独の培地と 10％のグルコースを含む富栄養培地（YPD）での発酵実験を行った．その結果，グルコース培地ではほとんど乳酸を作っておらず，またグルコースの消費も低いことが明らかとなり，増殖と発酵が連動していることが示された．
次に，培養条件の検討として，発酵に供する前培養の菌体について対数増殖期の菌体，定常期の菌体，それぞれを用いて比較した．その結果，定常期の菌体を用いた場合，乳酸生産量が高いことが明らかとなった．さらに，発酵に供する菌体量について OD660 で 2 〜 15 の間で検討

図 6．ジャーファーメンターを用いた C. boidinii による L- 乳酸発酵したところ，発酵 72 時間後の結果として OD660=15 のときがもっとも乳酸生産量が高かった．発酵温度について
は，25qC 〜 35qC の間で検討を行ったところ，温度が低いとグルコース消費は多いが乳酸生産量が下がること，温度が高いと糖換算での乳酸生産効率は高いものの乳酸生産量が低下することが明らかとなった．この理由としては，前者では発酵よりも呼吸にグルコースが使用されていること，後者については高温にすることで菌体にストレスを与えていることが考えられた．最終的な結果として発酵最適温度は 30 〜 32qC が良いことが明らかとなった．
さらに，この株を用いて pH の影響を調査した．pHを 4 〜 7 で変化させたところ，中性付近で乳酸生産量が

図 7．野生株と Cupdc1 破壊株の PDC 活性．Cupdc1'1, Cupdc1'2,Cupdc1'3, Cupdc1'4 は，それぞれ 1, 2, 3, 4 コピーの CuPDC1遺伝子が破壊された株を示す．

最も高いことが明らかとなり，効率的な生産には発酵過程での中和が必要であることが示唆された．そして，炭酸カルシウムで中和させた条件で発酵させたところ，L-酵母とも呼ばれ，S. cerevisiae と同じくアメリカ食品医乳酸の生産量が飛躍的に伸び，また非中和条件で生産さ薬局（FDA）が食品添加物としての安全性を認可した

れていた D- 乳酸の生産量も大幅に低下し，結果として食用酵母の 1 つである．また，無機窒素の同化能が高く，光学純度が 72.7％から 98.4％にまで上昇した．なお，キシロースも資化できることから，広葉樹の糖化液や製中和剤として，炭酸カルシウム以外に，水酸化ナトリウ

紙工場から出る亜硫酸パルプを糖源として菌体の工業生ム，水酸化カリウムを検討したが，炭酸カルシウムでもっ産が行われた経緯がある 7)．さらに，電気パルス法によるとも高い効率が得られた．

形質転換法を含む遺伝子組み換えツールが整備され，モ以上のフラスコ培養で得られた条件を基に，ジャーネリンなどの異種タンパク質の高生産にも利用されてきファーメンターを用いて 2.5 l の YPD 培地で 48 時間発酵た酵母である 8)．まず，この C. utilis において，CuPDC1させたところ，32qC，3％（w/v）炭酸カルシウム添加遺伝子を単離，同定し，破壊することとした．C. utilis

により，100 g のグルコースからまったくエタノールをは高次倍数体であることが示唆されていたが，CuPDC1生産せずに，光学純度で 99.6％の L- 乳酸を 80 〜 90.4 g（生遺伝子を破壊する過程で，親株として用いた C. utilis 株は産効率 0.77 〜 0.96 g/g D-glucose）生産させることに成4 倍体であることが示唆された（図 7）．また，C. boidinii
同様，Cupdc1 完全破壊株は S. cerevisiae の PDC 破壊株

功した（図 6）6)．
同様のストラテジーで，Crabtree 効果陰性である C.

utilis において L- 乳酸生産を行った．C. utilis は，トルラ
182のような重篤な生育遅延を示さなかった 9)．
次に，この Cupdc1 完全破壊株にウシ由来の L-LDH
生物工学

第90巻

「環境」と生物工学
表 1．各種酵母による L- 乳酸生産性の比較課題でもあり，技術のブレークスルーにより，より一層

ScKlPsCbCu

生産量（g/l）82.3
生産効率（g/g Glc） 0.82
発酵時間（h）
216
生産速度（g/l/h）
0.38

109
1.19
137
0.80

410.44450.91

94.4
0.90
41
2.27

103
0.94
33
3.12

Sc, Saccharomyce cerevisiae; Kl, Kluyveromyces lactis; Ps, Pichia
stipitis; Cb, Candida boidinii; Cu, Candida utilis.

環境に配慮した生産が期待される．
以上のようにキリングループでは，「地球環境とお客様に価値ある自然と共生する技術開発に取り組む」行動
方針の下，今後も新たな技術開発を行っていきます．
本報告にあたり，北海道バイオエタノール，トヨタ自動車，キリンビバレッジ，キリンビールの関係者の方々にご協力いただきました．この場を借りて感謝申し上げます．

文
遺伝子を染色体に組み込んで発現させた．そのとき，コピー数の異なる株を取得し，2 コピー組み込んだ形質転換体を用いて発酵試験を行い，温度などの最適条件をフラスコ培養で検討した．そして，最終的にジャーファー
メンターにおいて，中和剤として 4.5％（w/v）炭酸カルシウムを添加した 35qC での発酵条件で，109 g/l のグルコースから，33 時間で 99.9％を越す光学純度の L- 乳酸を 103 g/l 生産させることに成功した（表 1）9)．
さらに，蔗糖からの D- 乳酸の生産 10)，キシロースから の L- 乳 酸 生 産 11) に つ い て の 検 討 も 行 い， そ れ ぞ れ90％を超える収率で生産することに成功している．今後は，中和剤を使わずに生産することによる低コスト化，バイオマスからの生産などの課題が挙げられる．このような課題は，微生物を用いたさまざまな物質の生産での2012年 第4号

献1) http://www.beverage.co.jp/fun/kids/eco/pecology/point.
html2) http://www.kirin.co.jp/company/news/08/070619_1.
html
3) 足 海 洋 史 ら： 日 本 農 芸 化 学 会 大 会 講 演 要 旨 集，p.99(2009).
4) 玉 川 英 幸 ら： 日 本 農 芸 化 学 会 大 会 講 演 要 旨 集，p.99(2009).
5) Komeda, T. et al.: Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 628(2002).
6) Osawa, F. et al.: Yeast, 95, 215 (2009).
7) Boze, H. et al.: Crit. Rev. Biotechnol., 12, 65 (1992).
8) Kondo, K. et al.: Nat. Biotechnol., 15, 453 (1997).
9) Ikushima, S. et al.: Biosci. Biotechnol. Biochem., 73,1818 (2009).
10) 堀江 暁，生嶋茂仁：バイオインダストリー，6, 11 (2011).
11) Tamakawa, H. et al.: J. Biosci. Bioeng., 113, 73 (2012).

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