第 75 回

日本生物工学会大会
講演要旨集
令和 5 年 9 月 3・4・5 日
一般講演・シンポジウム・受賞講演・展示会
名古屋大学東山キャンパス（名古屋市千種区不老町）

授賞式典
名古屋大学 IB 電子情報館

IB 大講義室（A 会場）

創立100周年記念祝賀会
名古屋東急ホテル（名古屋市中区栄 4-6-8）

令和 5 年度（2023）
公益社団法人 日本生物工学会

2307_生物工学_広告_ep_eb.indd

12023/06/30

13:26:10

– 前付1 –– 前付2 –– 前付3 –– 前付4 –– 前付5 –第 75 回
日本生物工学会大会（2023）
一般講演・シンポジウム
日

時

会 場

2023 年 9 月 3 日（日）〜 5 日（火）名古屋大学東山キャンパス（名古屋市千種区不老町）

授賞式典・受賞講演
日

時

会

場

2023 年 9 月 3 日（日）9：00 〜 11：35
名古屋大学東山キャンパス IB 電子情報館（IB 大講義室）（生物工学奨励賞・生物工学若手賞・生物工学アジア若手賞の講演日程については大会日程表をご覧下さい）創立 100 周年記念祝賀会
日

時

会

場

2023 年 9 月 3 日（日）18：30 〜 20：30
名古屋東急ホテル（名古屋市中区栄 4-6-8）

生物工学若手研究者の集い（若手会）総会・交流会
日時2023 年 9 月 4 日（月）19：00 〜 21：00

会場

名古屋大学東山キャンパス 南部食堂

展示会
日

時

会 場

2023 年 9 月 3 日（日）〜 5 日（火）名古屋大学東山キャンパス IB 電子情報館，ES 総合館

ランチョンセミナー
日

時

会 場

2023 年 9 月 3 日（日）〜 5 日（火）名古屋大学東山キャンパス IB 電子情報館，ES 総合館

学生のための企業研究セミナー
日

時

会

場

2023 年 9 月 3 日（日）17：30 〜 18：30，4 日（月）18：00 〜 19：00
名古屋大学東山キャンパス ES 総合館

公益社団法人日 本 生 物 工 学 会

TEL. 06-6876-2731 FAX. 06-6879-2034
E-mail: info@sbj.or.jp
https://www.sbj.or.jp

目

次

大会日程表 ………………………………………………………………………………………………………… （3）一般講演座長一覧 ………………………………………………………………………………………………… （6）実行委員会担当者表 ……………………………………………………………………………………………… （7）
会場案内図 ………………………………………………………………………………………………………… （8）受賞者一覧 …………………………………………………………………………………………………………（12）
各種講演番号の見方 ………………………………………………………………………………………………（14）プログラム
第 1 日目

授賞式，受賞講演，シンポジウム，一般講演，ランチョンセミナー，
学生のための企業研究セミナー ………………………………………………………………（15）

第 2 日目

受賞講演，シンポジウム，一般講演，ランチョンセミナー，
学生のための企業研究セミナー ………………………………………………………………（34）

第 3 日目

シンポジウム，一般講演，ランチョンセミナー ……………………………………………（54）

第 1 日目

受賞講演 …………………………………………………………………………………………（75）

要旨

シンポジウム ……………………………………………………………………………………（78）一般講演 …………………………………………………………………………………………（81）
第 2 日目

受賞講演 ………………………………………………………………………………………（139）
シンポジウム …………………………………………………………………………………（141）
一般講演 ………………………………………………………………………………………（178）

第 3 日目

シンポジウム …………………………………………………………………………………（215）
一般講演 ………………………………………………………………………………………（235）

人名索引 …………………………………………………………………………………………………………（287）
ランチョンセミナープログラム ………………………………………………………………………………（301）
ランチョンセミナー要旨 ………………………………………………………………………………………（302）

3

大会日程表
9 月 3 日（日）
会場

午

前

9:00-11:35

昼

授賞式・受賞講演

13:00-17:06
受賞講演
（江田賞）
（13:00-13:20）

A 会場（功労賞，生物工学賞，
IB 大講義室功績賞）

B 会場
IB015 教室

午後

11:45-12:45[L] オンチップ・

酵素学，酵素工学（13:30-17:06）

C 会場
IB014 教室

[L] 東ソー株式会社

生体情報工学，バイオインフォマティクス / 酵素学，
酵素工学 / タンパク質工学（13:30-17:06）

D 会場
IB013 教室

[L] 日本ウォー
ターズ株式会社

セル＆ティッシュエンジニアリング / 生体医用工学（13:30-17:06）[CS] 生命科学研究の革新に向けたバイオ DXの挑戦【JST・CREST「データ駆動・AI 駆動を中心としたデジタルトランスフォーメー
ションによる生命科学研究の革新（バイオDX）」研究領域 共催】（13:30-15:30）

F 会場
ES021

醸造学，醸造工学（13:30-17:06）

G 会場
ES022

核酸工学 / ペプチド工学 / 脂質工学 / 糖鎖工学 / 分類，系統，遺伝学（13:30-16:54）

H 会場
ES024

発酵生理学，発酵工学 / 代謝工学 / オミクス解析（13:30-17:06）

I 会場
ES025

代謝工学 / 発酵生理学，発酵工学（13:30-17:06）

J 会場
オークマ
ホール

受賞講演
（斎藤賞）
（13:00-13:20）[C] コニカミノ
ルタ株式会社[C] サラヤ株式
会社[C] 株式会社フ
レンドマイクローブ[C] 株式会社バッ
カス・バイオイ
ノベーション[C] 大阪有機化

学工業株式会社

遺伝子工学（13:30-17:06）

K 会場
オークマ
講義室

バイオセンシング，分析化学 / センサー，
計測工学 / 遺伝子工学（13:30-17:06）

L 会場
工 1 号館
121 教室

受賞講演
生物化学工学 / バイオプロセス / 培養工学
（照井賞）
（13:30-17:06）（13:00-13:20）

M 会場
工 1 号館
131 教室システムバイオロジー / 生物化学工学 / 培養工学 /バイオプロセス（13:30-17:06）

N 会場
工 1 号館
132 教室環境工学，廃水処理技術 / 環境浄化，修復，保全技術 /バイオマス，資源，エネルギー工学（13:30-17:06）

O 会場
工 1 号館
142 教室環境浄化，修復，保全技術 / バイオマス，資源，エネルギー工学 / 環境工学，廃水処理技術（13:30-17:06）

展示会場
IB プレゼンスペース

展示会（10:00-17:30）

展示会場
ES 会議室／エントランス

展示会（10:00-17:30）

名古屋東急
ホテル

18:30-20:30

酵素学，酵素工学（13:30-17:06）

バイオテクノロ
ジーズ株式会社

E 会場
ES ホール

17:30-18:30

創立 100
周年記念
祝賀会

4

9 月 4 日（月）
会場

午

前

9:00-11:00

昼
11:30-12:30[S] プロテインクライシス

ポジウム 生物工学の未来（2050 年）第 4 回―メディカル・バイオエンジニア
リングの将来展望―【本部企画】（13:00-15:00）に挑む未来タンパク資源と新たな食システムの創成を目指して置の創出[S] 未知の生命情報を獲得[L] 株式会社 するためのバイオ分子ツー
島津製作所

ルの設計と機能創出（13:00-15:00）

C 会場
IB014 教室
[L] 株式会社

酵素学，酵素工学 / タンパク質工学（15:30-17:42）

セル＆ティッシュエンジニアリン
グ / 生体医用工学（15:30-17:42）

テクノスル
ガ・ラボ

[S] 微生物炭素固定代謝の[S] 下面発酵酵母のすべて
E 会場
ES ホール を理解するために多様性に基づく合成生物学（13:00-15:00）[S] サーキュラーバイオエ[S] データサイエンスと環コノミーにむけたバイオ
ものづくりの発展

境バイオテクノロジーの接点（13:00-15:00）

ジャパン株
式会社

[S] 博士人材のためのキャ[S] 醸造・発酵の新たなブレークスルーに向けて【本部企画】（13:00-15:00）

リアパスシンポジウム【生物工学若手研究者の集い】

I 会場
ES025

K 会場
[S] 森も木も見る微生物研
オークマ
究：連携による集積知
講義室[C] 東洋紡

醸造学，醸造工学（15:30-17:30）[C] 花王株

発酵生理学，発酵工学 /代謝工学（15:30-17:30）
受賞講演（若手賞） 発酵生理学，発酵工学 /代謝工学（15:30-17:30）（15:1015:25）[L] 辻製油株
式会社[IS]KSBB-BEST-SBJ ジョイ
J 会場
ントシンポジウム 第一部：
オークマ
酵素・微生物工学の新潮流【本ホール部企画】（9:00-11:44）

植物細胞工学，組織培養，育種工学（15:30-17:06）

受賞講演（若手賞） 食品科学，食品工学（15:10- （15:30-17:30）
15:25）[L] ブルカー

G 会場
ES022
H 会場
ES024

酵素学，酵素工学 / タンパク質工学（15:30-17:42）

タンパク質工学（15:30-17:42）

D 会場
IB013 教室

F 会場
ES021

18:00-19:00 19:00-21:00

13:00-18:00[S] 創立 100 周年記念シン

A 会場の製造・加工技術の開発
IB 大講義室[IS] 多様な生体分子を基B 会場盤とした分子ピタゴラ装
IB015 教室

午後

受賞講演 受賞講演
ジョイントシンポジウム （アジア （アジア若手賞） 若手賞）
第二部：動物細胞工学の最先端研究【本部企画】 （15:10- （15:3015:30） 15:50）（13:00-15:00）[IS]KSBB-BEST-SBJ[S] 合成生物学が切り拓く

次世代型天然物創薬（13:00-15:00）

M 会場
工 1 号館
131 教室生物化学工学 / 培養工学
（15:30-17:42）

N 会場
工 1 号館
132 教室環境浄化，修復，保全技術 /バイオマス，資源，エネルギー
工学（15:30-17:42）

O 会場
工 1 号館
142 教室バイオマス，資源，エネルギー
工学 / 環境浄化，修復，保全技術（15:30-17:42）

展示会場
ES 会議室／エントランス

展示会（9:00-17:30）

Mei-dining
南部食堂 1F[C] 共立製薬株式会社[C] 三菱ケミカル株式会社[C] 三和澱

粉工業株式会社

遺伝子工学 / 分類，系統，遺伝学（15:30-17:42）
生物化学工学 / 培養工学 /バイオプロセス（15:30-17:42）

展示会（9:00-17:30)

式会社[IS] 東南アジア国際シンポジウム – 東南アジ
アにおけるバイオテク
ノロジーとバイオものづくりの今 –【関西支部】（16:00-18:00）

L 会場
工 1 号館
121 教室

展示会場
IB プレゼンスペース株式会社

若手会総会・交流会

5

9 月 5 日（火）
午

会場

前

昼

9:00-11:00

11:30-12:30[S] 高分子医薬品モダリティーの創薬とA 会場
製剤を加速する未踏分析技術へのグ
IB 大講義室

細胞製造を目指して〜

後

13:00-17:00
酵素学，酵素工学 / タンパク質工学（13:00-16:36）

ローバルな挑戦[S] セルインダストリー発展に向けた細B 会場
胞製造工学の進化 〜世界をリードする
IB015 教室午

[L] 株式会社バッカ
ス・バイオイノベーション

C 会場
IB014 教室

酵素学，酵素工学 / タンパク質工学（13:00-16:36）

タンパク質工学 / 抗体工学（13:00-16:36）[L] 株式会社エー
ビー・サイエックス

D 会場
IB013 教室

セル＆ティッシュエンジニアリング / 生体医用工学（13:00-16:36）[S] データ駆動型研究が導く未培養微E 会場
生物（微生物ダークマター）の開拓と
ES ホール
展望

F 会場
ES021

[S] リグニンの利用に向けたホワイト[L] レフェイン・
ジャパン株式会社

G 会場
ES022
H 会場
ES024

[S] 酵母という生き物〜生態学的ふる

食品科学 , 食品工学（13:00-16:36）

発酵生理学，発酵工学 / オミクス解析 / 代謝工学（13:00-16:36）

まいとその多様性の理解に向けて[L] 株式会社豊田
中央研究所

I 会場
ES025
J 会場
オークマ
ホール

醸造学，醸造工学 / 食品科学 , 食品工学（13:00-16:36）

バイオテクノロジーの潮流[IS]INTPART-MISC 国際ジョイント
シンポジウム【INTPART-MISC 共催】

有機化学，高分子化学 / 生合成，天然物化学（13:00-16:00）[IS]INTPART-MISC 国際ジョイント
シンポジウム【INTPART-MISC 共催】（13:00-15:00）

K 会場[S] 無細胞タンパク質合成系の新展開：
オークマ講
ラボからインダストリーへ
義室

遺伝子工学（13:00-16:12）

L 会場
工 1 号館
121 教室生物化学工学 / 培養工学 / バイオプロセス（13:00-16:36）

M 会場
工 1 号館
131 教室生物化学工学 / 培養工学 / バイオプロセス（13:00-16:36）

N 会場
工 1 号館
132 教室環境浄化，修復，保全技術 / 環境工学，廃水処理技術 / バイオマス，
資源，エネルギー工学（13:00-16:36）

O 会場
工 1 号館
142 教室バイオマス，資源，エネルギー工学（13:00-16:36）

展示会場
IB プレゼンスペース

展示会（9:00-13:00）

展示会場
ES 会議室／
エントラン
ス

展示会（9:00-13:00）

S：シンポジウム
IS：国際シンポジウム
CS：共催シンポジウム
L：ランチョンセミナー
C：学生のための企業研究セミナー

6

座長一覧
一般講演
9 月 3 日（日）会場 講演番号
A
B
C
D
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O
＊

1Jp04

1Ap01–05
1Ap06–10
1Ap11–16
1Bp01–05
1Bp06–10
1Bp11–16
1Cp01–05
1Cp06–10
1Cp11–16
1Dp01–05
1Dp06–10
1Dp11–16
1Fp01–05
1Fp06–10
1Fp11–16
1Gp01–05
1Gp06–10
1Gp11–15
1Hp01–05
1Hp06–10
1Hp11–16
1Ip01–05
1Ip06–10
1Ip11–16
1Jp01–05＊
1Jp06–10
1Jp11–16
1Kp01–05
1Kp06–10
1Kp11–16
1Lp01–05
1Lp06–10
1Lp11–16
1Mp01–05
1Mp06–10
1Mp11–16
1Np01–05
1Np06–10
1Np11–16
1Op01–05
1Op06–10
1Op11–16

9 月 4 日（月）時間

13:30–14:30
14:42–15:42
15:54–17:06
13:30–14:30
14:42–15:42
15:54–17:06
13:30–14:30
14:42–15:42
15:54–17:06
13:30–14:30
14:42–15:42
15:54–17:06
13:30–14:30
14:42–15:42
15:54–17:06
13:30–14:30
14:42–15:42
15:54–16:54
13:30–14:30
14:42–15:42
15:54–17:06
13:30–14:30
14:42–15:42
15:54–17:06
13:30–14:30
14:42–15:42
15:54–17:06
13:30–14:30
14:42–15:42
15:54–17:06
13:30–14:30
14:42–15:42
15:54–17:06
13:30–14:30
14:42–15:42
15:54–17:06
13:30–14:30
14:42–15:42
15:54–17:06
13:30–14:30
14:42–15:42
15:54–17:06

座長

高田 悟郎
西矢 芳昭
林
秀謙
髙木 博史
竹中 慎治
長森 英二
政井 英司
尾高 雅文
阿野 嘉孝
福田 淳二
小島 伸彦
原
正之
渡辺 大輔
赤田 倫治
石川 森夫
金尾 忠芳
藤山 和仁
阿座上弘行
松田 史生
柘植 陽太
野尻 秀昭
仲山 英樹
丸山 潤一
横田 健治
松崎 浩明
伊藤洋一郎
秋
庸裕
福田 隆史
永谷 尚紀
金山 直樹
金政
真
片岡 正和
片倉 啓雄
仁宮 一章
養王田正文
大政 健史
若井
暁
滝口
昇
廣田 隆一
小西 正朗
井上 大介
西原 宏史

青木
航
伊藤 創平
木野 邦器
魚住 信之
橋本 義輝
小川
順
八幡
穣
鈴木 宏和
黒田 章夫
杉浦 慎治
佐藤 康史
岩井 良輔
酒井香奈江
三木 健夫
清家 泰介
大河内美奈
池野 慎也
吉田ナオト
和地 正明
磯貝 章太
榊原 康文
福居 俊昭
片岡 尚也
中島田 豊
雜賀あずさ
田中 瑞己
赤澤 真一
菊地
淳
朴
龍洙
和田 直樹
竹原 宗範
河邉 佳典
後藤 早希
寺田
聡
倉田 淳志
小林和香子
大槻 隆司
羽部
浩
藤井 達也
簡
梅芳
堀
知行
田中
剛

会場 講演番号
A
B
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
O

2Ap01–05
2Ap06–10
2Bp01–05
2Bp06–10
2Cp01–05
2Cp06–10
2Dp01–05
2Dp06–10
2Ep01–05
2Ep06–07
2Fp01–05
2Fp06–09
2Gp01–05＊
2Gp06–09
2Hp02–05＊
2Hp06–09
2Ip01–05
2Ip06–09
2Kp01–05
2Kp06–10
2Lp01–05
2Lp06–10
2Mp01–05
2Mp06–10
2Np01–05
2Np06–10
2Op01–05
2Op06–10

時間

15:30–16:30
16:42–17:42
15:30–16:30
16:42–17:42
15:30–16:30
16:42–17:42
15:30–16:30
16:42–17:42
15:30–16:30
16:42–17:06
15:30–16:30
16:42–17:30
15:30–16:30
16:42–17:30
15:42–16:30
16:42–17:30
15:30–16:30
16:42–17:30
15:30–16:30
16:42–17:42
15:30–16:30
16:42–17:42
15:30–16:30
16:42–17:42
15:30–16:30
16:42–17:42
15:30–16:30
16:42–17:42

2Gp04, 2Gp05, 2Hp01

＊

座長

有馬 二朗
片岡 道彦
二神 泰基
福﨑英一郎
河合（野間）繁子
安田 貴信
蟹江
慧
田島 健次
三﨑
亮
岡澤 敦司
中山 俊一
渡部
潤
善藤 威史
小林 和也
亀谷 将史
荘司 長三
岡橋 伸幸
中川 智行
土居 克実
細川 正人
青柳 秀紀
堀内 淳一
鈴木 研志
田代 幸寛
田中 賢二
北本 宏子
笹野
佑
本田 裕樹

中野 祥吾
橋本 義輝
根本 理子
杉森 大助
朱
博
大橋 正孝
上平 正道
鬼塚 正義
村中 俊哉
富田 因則
田中 拓未
福田 展雄
依田
毅
加藤 雅士
矢野 嵩典
生田宗一郎
佐藤里佳子
小林 洋介
諸星 知広
石川 聖人
岡野 憲司
多賀 直彦
山口 哲志
青井 議輝
戸所 健彦
門屋 亨介
岡崎 文美
佐藤
伸

講演取り消し

9 月 5 日（火）会場 講演番号A
B
C

講演取り消し

D
F
G
H
I
K
L
M
N
O

3Ap01–05
3Ap06–10
3Ap11–16
3Bp01–05
3Bp06–10
3Bp11–16
3Cp01–05
3Cp06–10
3Cp11–16
3Dp01–05
3Dp06–10
3Dp11–16
3Fp01–05
3Fp06–10
3Fp11–16
3Gp01–05
3Gp06–10
3Gp11–16
3Hp01–05
3Hp06–10
3Hp11–16
3Ip01–05
3Ip06–10
3Ip11–13
3Kp01–05
3Kp06–10
3Kp11–14
3Lp01–05＊
3Lp06–10
3Lp11–16
3Mp01–05
3Mp06–10
3Mp11–16
3Np01–05
3Np06–10
3Np11–16
3Op01–05
3Op06–10
3Op11–16

3Lp02

＊

時間

13:00–14:00
14:12–15:12
15:24–16:36
13:00–14:00
14:12–15:12
15:24–16:36
13:00–14:00
14:12–15:12
15:24–16:36
13:00–14:00
14:12–15:12
15:24–16:36
13:00–14:00
14:12–15:12
15:24–16:36
13:00–14:00
14:12–15:12
15:24–16:36
13:00–14:00
14:12–15:12
15:24–16:36
13:00–14:00
14:12–15:12
15:24–16:00
13:00–14:00
14:12–15:12
15:24–16:12
13:00–14:00
14:12–15:12
15:24–16:36
13:00–14:00
14:12–15:12
15:24–16:36
13:00–14:00
14:12–15:12
15:24–16:36
13:00–14:00
14:12–15:12
15:24–16:36

講演取り消し

座長

三浦 夏子
松井 大亮
新井 亮一
古賀 雄一
二見淳一郎
里村 武範
仙波 弘雅
岩崎 雄吾
梅津 光央
荻野 千秋
河本 正次
森
英樹
浅井 良樹
数岡 孝幸
野村 一樹
山崎 思乃
渡辺 昌規
福谷 洋介
戸谷 吉博
児玉 浩明
石井 正治
松本謙一郎
加藤 康夫
梶山慎一郎
佐藤
悠
折田 和泉
田口 精一
吉川
潤
宮地 輝光
山田 美和
林
修平
片岡
健
阿部 敬悦
原
清敬
緋田安希子
加藤 純一
中西 昭仁
園木 和典
東
雅之

跡見 晴幸
神谷 典穂
倉掛 昌裕
松田 祐介
今中 洋行
門之園哲哉
磯﨑 勇志
迫野 昌文
花井 泰三
吉野 知子
堀之内貴明
村松 和明
根来 宏明
徳岡 昌文
藤原 伸介
森脇 真希
黒木 勝久
甲元 一也
武尾 正弘
中山 二郎
今井
優
藤田 憲一
竹山 春子
柘植 丈治
岡村 好子
本田 孝祐
金井
保
尾島 由紘
石川
周
佐藤 康治
紀ノ岡正博
坂元
仁
田島 誉久
松村 吉信
久保
幹
佐々木千鶴
高久 洋暁
蓮沼 誠久
富澤
哲

7

第 75 回日本生物工学会大会（2023）
実行委員会・業務分担（○：責任者）
実行委員長

堀

克敏

副実行委員長二又裕之

総務○清水一憲・岡﨑文美・金岡英徳・金子真大・吉本将悟

会計

中谷

会場

○金岡英徳・秋山裕和・吉本将悟

受付

吉本将悟

広報

加藤竜司

プログラム

○二又裕之・井藤 彰・岩橋 均・加藤竜也・加藤竜司・金子真大・河原崎泰昌・
兒島孝明・清水一憲・志水元亨・新谷政己・田代陽介・田丸 浩・湊元幹太・
戸田 弘・中川智行・中谷 肇・中野秀雄・中村浩平・西島謙一・堀 克敏・
本多裕之・吉田信行・吉本将悟

シンポジウム井藤

学生優秀発表賞

本多裕之

ランチョンセミナー

田丸

展示

中野秀雄

学生のための企業研究
セミナー

邊見

授賞式

西島謙一

クローク

鈴木敦巨

若手交流会

○戸田

託児

○丸山千登勢・森脇真希

肇

彰

浩

久

弘・田中健二郎

創立 100 周年記念祝賀会 ○中島田豊・東
顧問

雅之・中谷

本多裕之・髙木昌宏

肇・馬場健史・堀克敏・本田孝祐・本多裕之

8

会場への交通案内＜大会会場（名古屋大学 東山キャンパス）へのアクセス＞【名古屋駅からのアクセス】●地下鉄　　地下鉄「名古屋」駅から東山線「藤が丘」行きに乗車（約 17 分），「本山」駅で名城線「右回り」に乗り換え（約 2 分），「名古屋大学駅」で下車し出口すぐ．
●タクシー　名古屋駅太閤通口または桜通口タクシー乗り場から約 30 分．
【中部国際空港（セントレア）からのアクセス】●鉄道　　　名古屋鉄道（名鉄）「中部国際空港駅」から「名鉄名古屋」行きに乗車（特急またはミュースカイで約 25 分），「金山」駅で地下鉄名城線「左回り」に乗り換え（約 25 分），「名古屋大学駅」で下車し出口すぐ．
【県営名古屋空港からのアクセス】●バス & 地下鉄 県営名古屋空港直行バス（名古屋駅前 - 空港線）
「名古屋空港」バス停から「名古屋駅前」行きに乗車（約25 分），「栄」バス停で下車後地下鉄「栄」駅から東山線「藤が丘」行きに乗車（約 10 分），「本山」駅で名城線「右回り」に乗り換え（約 2 分），「名古屋大学駅」で下車し出口すぐ．
＜祝賀会会場（名古屋東急ホテル）へのアクセス＞【名古屋大学 東山キャンパスからのアクセス】●地下鉄　　地下鉄「名古屋大学」駅から名城線「左回り」に乗車（約 4 分），「本山」駅で東山線「高畑」行きに乗り換え（約 10 分），「栄駅」で下車し 12 番出口から徒歩 5 分．
【名古屋駅からのアクセス】●地下鉄　　地下鉄「名古屋」駅から東山線「藤が丘」行きに乗車（約 5 分），「栄駅」で下車し 12 番出口から徒歩 5 分．
●タクシー　名古屋駅太閤通口または桜通口タクシー乗り場から約 15 分．
【中部国際空港（セントレア）からのアクセス】●鉄道　　　名古屋鉄道（名鉄）「中部国際空港駅」から「名鉄名古屋」行きに乗車（特急またはミュースカイで約 25 分），「金山」駅で地下鉄名城線「右回り」に乗り換え（約 7 分），「栄駅」で下車し 12 番出口から徒歩 5 分．
※直行バス「セントレアリムジン」は現在運休中です．
【県営名古屋空港からのアクセス】●バス　　　県営名古屋空港直行バス（名古屋駅前 – 空港線）「名古屋空港」バス停から「名古屋駅前」行きに乗車（約25 分），「栄」バス停で下車し徒歩 10 分．

9

会場案内
＜東山キャンパス会場配置図＞

10＜講演会場配置図＞

11

12

日本生物工学会 2023 年度受賞者

本年度の受賞者が決定しましたのでお知らせ申し上げます（敬称略）．
■第 42 回 生物工学賞
・髙木 博史（奈良先端科学技術大学院大学研究推進機構・特任教授）「微生物の代謝調節・細胞機能に関する基盤的研究と発酵・醸造への応用」■第 17 回 生物工学功績賞
・青柳 秀紀（筑波大学生命環境系・教授）「微生物機能・資源の開拓に資する培養技術の開発と利用に関する基礎的研究」
・堀克敏（名古屋大学大学院工学研究科・教授）「細菌の接着機構と界面微生物工学プロセスの創出に関する研究」■第 17 回 生物工学功労賞
・川瀬 雅也 1・中山
亨2
1
（ 長浜バイオ大学バイオサイエンス学部・教授，2 東北大学大学院工学研究科・教授）「学会における生物工学教育事業への貢献」■第 56 回 生物工学奨励賞（江田賞）
・徳岡 昌文（東京農業大学応用生物科学部・教授）「清酒中の未知オリゴ糖に関する研究」■第 59 回 生物工学奨励賞（斎藤賞）
・吉野 知子（東京農工大学工学研究院・教授）「希少細胞を対象とした単一細胞解析技術の開発と応用」■第 46 回 生物工学奨励賞（照井賞）
・井上 謙吾（宮崎大学農学部・准教授）「微生物燃料電池の発電機構の解明と有機性廃棄物処理への応用に関する生物工学研究」■第 32 回 生物工学技術賞
該当者なし■第 2 回 生物工学若手賞
・景山 達斗（神奈川県立産業技術総合研究所・常勤研究員，横浜国立大学大学院工学研究院・助教）「工学的手法を利用した毛髪再生技術の開発」
・片岡 尚也（山口大学大学研究推進機構・准教授）「有用物質生産菌における細胞内外の代謝に関する生物工学研究」■第 20 回 生物工学アジア若手賞（Young Asian Biotechnologist Prize）
・Pau-Loke Show（Professor; University of Nottingham Malaysia, Malaysia）「Recovery of valuable bioactive compounds from renewable resources towards a sustainable circular bioeconomy:
A solution to global issues」
・Chun-Yen Chen（Research Fellow; National Cheng Kung University, Taiwan）「Engineering strategies for enhancing microalgae lipid production using eﬄuents of coke-making wastewater」■第 12 回 生物工学アジア若手研究奨励賞（DaSilva Award）
・Kit Wayne Chew（Assistant Professor; Nanyang Technological University, Singapore）「Bioseparation of multiple products using nanobubbling-assisted liquid triphasic ﬂotation for microalgae
bioreﬁnery」

334

生物工学会誌

第101巻第7号（2023）

13■第 31 回 生物工学論文賞
・相馬 悠希・山路 大樹・花井 泰三（九州大学）「Dynamic metabolic engineering of Escherichia coli improves fermentation for the production of pyruvate and its
derivatives」
・増田 兼治 1,2・渡辺 和彦 1・上野 智規 3・中澤 祐人 1,4・田邊裕美子 1・加来 祐子 3・後藤希代子 3,5
江原 幸和 6*・佐伯 尚史 6・奥村
武 1・野中 浩一 1・上平 正道 2
12
3
（ 第一三共株式会社， 九州大学， 株式会社ニッピ，4 奈良先端科学技術大学院大学，5 日本皮革研究所，
6
富士フイルム和光純薬株式会社，* 現 J リーフ株式会社）「Novel cell line development strategy for monoclonal antibody manufacturing using translational enhancing
technology」
・片山 琢也・丸山 潤一（東京大学）「CRISPR/Cpf1-mediated mutagenesis and gene deletion in industrial ﬁlamentous fungi Aspergillus oryzae andAspergillus sojae」
・戸谷 吉博・清水浩（大阪大学）「Metabolic pathway engineering for the non-growth-associated succinate production in Escherichia coli based on
ﬂux solution space」
・山根萌奈実 1・Jieun Seo1・Yinghui Zhou1*・浅場 智貴 1・Shan Tu1・南茂 彩華 1・景山 達斗 1,2・福田 淳二 1,2（1 横浜国立大学，2 神奈川県立産業技術総合研究所，* 現 Fudan University）「Eﬀects of the PI3K/Akt signaling pathway on the hair inductivity of human dermal papilla cells in hair beads」
・Danshi Qian, Huimin Liu, Fan Hu, Song Song, Yuancai Chen
（South China University of Technology, China）「Extracellular electron transfer-dependent Cr(VI)/sulfate reduction mediated by iron sulﬁde nanoparticles」
・有馬 二朗・坂手 勇斗・門田 啓吾・小林 大起・西 美智佳・清水 克彦（鳥取大学）「Silica adsorption tag derived from the silica polycondensation protein glassin for the immobilization of soluble
proteins」■第 12 回 生物工学学生優秀賞（飛翔賞）
・宇田川喜信（東北大学大学院環境科学研究科）「血管の構築と評価に向けたバイオファブリケーションと電気化学デバイス」
・木伏 真子（早稲田大学大学院先進理工学研究科）「有用微生物群集の選抜に向けたダイズ根圏微生物叢の機能解析」
・加藤 大志（名城大学大学院農学研究科）「リグニンを原料とした環境低負荷なバイオエタノール生産プロセスの開発」
・角田悠（大阪大学大学院工学研究科）「CHO 細胞における Sar1A 過剰発現の抗体生産および分泌プロセスへ与える影響」
・大成 冬真（高知大学 大学院総合人間自然科学研究科）「ポリγグルタミン酸イオンコンプレックスの衛生強化目的部材としての技術応用」
・内田 和希（九州大学大学院工学府）「人工パルミトイル化タンパク質の脂質膜ドメイン選択的局在化と細胞内取り込みに関する研究」

生物工学会誌

第101巻第7号（2023）

335

14

各種講演番号の見方
受賞講演

シンポジウム

1A - A a 01

2S – A a 01

講演順

講演順

a：午前，p：午後

a：午前，p：午後

会場名（A，G, I, J，L）

会場名（A, B, E, F, H, J, K）

1：1 日目，2：2 日目（A：受賞講演）

一般講演

1：1 日目，2：2 日目，3：3 日目（S：シンポジウム）

ランチョンセミナー

3L – B 01

2 D p 01
講演順

講演順
会場名（B, C, D, G, I）

a：午前，p：午後

1：1 日目，2：2 日目，3：3 日目（L：ランチョンセミナー）

会場名（A～O）
1：1 日目，2：2 日目，3：3 日目

学生のための企業研究セミナー

1C – E 01
講演順
会場名（E, F, G, H, I）
1：1 日目，2：2 日目（C：学生のための企業研究セミナー）

研究アウトプット項目の見方想定されるアウトプットとして下の 6 つから著者が選択したものが表示されています．

・ 食品

→

食

・ 化成品

→

化

・ 医療

→

医

・ 環境

→

環

・ 農業

→

農

・ 基礎

→

基

15

第 1 日（9 月 3 日）
太字の一般講演は今年度の生物工学学生優秀賞（飛翔賞）受賞者の発表です．
学 が表示されている一般講演は学生優秀発表賞の審査対象となる発表です．

開始時間

講演番号
研究アウトプット項目

演

題

発表者氏名（所属）○印は講演者を示す

授賞式・受賞講演（生物工学功労賞，生物工学賞，生物工学功績賞）

A 会場 IB 大講義室（9:00～11:35）
9:00

会長挨拶

9:05

韓国生物工学会（KSBB）会長挨拶

9:10

功労会員推戴

9:20

各賞授賞

10:05

1A-Aa01〈生物工学功労賞〉
第 17 回生物工学功労賞の受賞にあたって...................................................... 川瀬 雅也 1, ○中山 亨 2（1 長浜バイオ大・バイオ, 2 東北大院・工）10:15

1A-Aa02

座長：福﨑 英一郎

〈生物工学賞〉

微生物の代謝調節・細胞機能に関する基盤的研究と発酵・醸造への応用...................................................................................................... ○髙木 博史（奈良先端大・研推機構）
10:45

1A-Aa03〈生物工学功績賞〉

座長：本多 裕之

微生物機能・資源の開拓に資する培養技術の開発と利用に関する基礎的研究.............................................................................................................. ○青柳 秀紀（筑波大・生命環境）
11:10

1A-Aa04〈生物工学功績賞〉
細菌の接着機構と界面微生物工学プロセスの創出に関する研究.............................................................................................................................. ○堀 克敏（名大院・工）受賞講演（生物工学奨励賞（江田賞・斎藤賞・照井賞））
A 会場 IB 大講義室（13:00～13:20）
13:00

1A-Ap01〈生物工学奨励賞（江田賞）〉

座長：児島 宏之

清酒中の未知オリゴ糖に関する研究.................................................................................................................. ○徳岡 昌文（東農大・応生科）

J 会場 オークマホール（13:00～13:20）
13:00

1A-Jp01〈生物工学奨励賞（斎藤賞）〉

座長：芦内 誠希少細胞を対象とした単一細胞解析技術の開発と応用...................................................................................................................... ○吉野 知子（農工大院・工）16

L 会場 工 1 号館 121 教室（13:00～13:20）
13:00

1A-Lp01

座長：上平 正道〈生物工学奨励賞（照井賞）〉

微生物燃料電池の発電機構の解明と有機性廃棄物処理への応用に関する生物工学研究.......................................................................................................................... ○井上 謙吾（宮崎大・農）シンポジウムE 会場 ES ホール（13:30～15:30）
生命科学研究の革新に向けたバイオ DX の挑戦 【JST・CREST「データ駆動・AI 駆動を中心としたデジタル
トランスフォーメーションによる生命科学研究の革新（バイオ DX）」研究領域 共催】
はじめに........................................................................................................................................................ 岡田 康志

13:30

座長：高橋 恒一
13:35

1S-Ep01

CREST・バイオ DX 研究領域の紹介............................................................ ○岡田 康志 1,2,3（1 理研・生命機能, 2 東大院・医, 3 東大院・理）

13:50

1S-Ep02

微生物代謝の理解と最適化に向けたバイオ DX 基盤の構築................................................. ○石井 純 1,2（1 神戸大・先端バイオ工研セ, 2 神戸大院・科技イノベ）
座長：石井 純

14:15

1S-Ep03

データ駆動進化医学で解く季節性うつと冬眠の代謝基盤............................................ ○柚木 克之 1,2,3（1 理研・生命医科学, 2 慶大・先端生命研, 3 東大院・理）

14:40

1S-Ep04

言語モデルを用いた数式フリーの細胞シミュレーション法と応用.................................................................................................................. ○岡田 眞里子（阪大・蛋白研）

15:05

1S-Ep05

バイオ DX の目指すものとその先の展望................................ ○高橋 恒一 1,2,3（1 理研・生命機能, 2 慶大・政策メディア, 3 阪大院・生命機能）
おわりに........................................................................................................................................................ 高橋 恒一

15:25

一般講演

A 会場 IB 大講義室（13:30～17:06）【酵素学，酵素工学】
13:30

1Ap01 学基

金属イオンが耐熱性 DNA (cytosine-5)-methyltransferase M.ApeKI の活性および結合能に及ぼす影響......................................................................................... ○林 真央 1, 和田 善成 2, 山村 晃 1,2, 飯田 泰広 1,2（1 神奈川工大・院工, 2 神奈川工大・応用バイオ）

13:42

1Ap02 学
化,医,基

13:54

1Ap03 学基

14:06

1Ap04 学
食,化,農,基Fatty acyl-AMP ligase を用いた N-アシルエタノールアミンの化学酵素的合成.................................... ○神谷 愛香 1, 鈴木 伸 2, 木野 邦器 1,2（1 早大院・先進理工, 2 早大・理工総研）
非リボソーム型ペプチド合成酵素由来エピメリ化ドメインの単独発現と活性評価............................ ○永田 理彩子 1, 鈴木 伸 2, 木野 邦器 1,2（1 早大院・先進・応化, 2 早大・理工総研）
Rhizobium sp. 由来 3 ケトグルコースレダクターゼの精製と特性化.................................................................................... ○宮本 菜柚, 中西 利樹, 高田 悟郎（香川大・農）

17

14:18

1Ap05 学
食,医,基Identification of transglutaminase1 substrate preferences using cDNA display and bioinformatics analysis............................. ○T.I.K. Munaweera 1, Jasmina Damnjanović 1, Maurizio Camagna 1, Kiyotaka Hitomi 2,
Naoto Nemoto 3, Hideo Nakano 1（1 Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2 Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ.,
3

休憩

14:30
14:42

Grad. Sch. Sci. Eng., Saitama Univ.）

1Ap06 学
食,化,医,基

リボソーム生合成の試験管内における再構成................. ○小坂 唯心 1,2, 宮脇 佑実 1, 森 めぐみ 1, 油屋 駿介 3, 福山 真央 4,5, 植田 充美 1,6, 青木 航 5,6,7（1 京大院・農, 2 日本学術振興会, 3 九大・生医研, 4 東北大・多元研, 5 JST 創発的研究支援事業,
6

14:54

1Ap07
環,農

京都バイオ計測センター, 7 阪大院・工）藍藻のバイオフィルム形成に関与する二成分制御系の同定........ ○小林 歩夢 1, 中村 正宗 1, 辻井 雅 1, 牧野 恒平 1, 永山 達也 1, 中村 謙介 1, 七谷 圭 1, 解良 康太 1,
古内 有希 1, 茅森 俊介 1, 古田 忠臣 2, 鈴木 石根 3, 早川 芳弘 4, Tanudjaja Ellen 1, 石丸 泰寛 1, 魚住 信之 1
（1 東北大院・工, 2 東工大・生命理工, 3 筑波大院・生命環境, 4 愛工大・工）

15:06

1Ap08 学基

芳香族カルボン酸エステラーゼ EstAC のエナンチオ選択性の評価と基質結合部位の解析...................................... ○丸山 稜介, 中井 雄也, 岸 裕亮, 山田 芳香, 杉山 勝紀, 熊谷 吉峻, 竹原 宗範（滋県大院）

15:18

1Ap09
食,化,環

Pyrococcus furiosus 由来超耐熱性エンドグルカナーゼの異種発現と糖鎖付加による耐熱化.................................................................................. ○仙波 弘雅 1, 石川 一彦 2,3, 坪井 宏和 1, 幸田 明生 1
（1 大関総研, 2 産総研・バイオメディカル, 3 松谷化学工業）

15:30

1Ap10
医,基

有機溶剤暴露量測定法および測定用酵素の開発........................................................................................ ○奥迫 拓也 1, 巽 謙太 2, 矢倉 一樹 2, 西矢 芳昭 1
（1 摂南大院・理工, 2 ニプロ）
休憩

15:42
15:54

1Ap11 学医,基応用利用を指向した高機能ペプチド転移酵素の開発........................................................................................ ○宮田 梓 1, 竹田 浩之 2, 中野 祥吾 1, 伊藤 創平 1
（1 静県大院・薬食生命, 2 愛媛大学・プロテオサイエンスセンター）

16:06

1Ap12
化

Identification and Characterization of A Novel Trans-Anethole Oxygenase....................................................................................................... ○Ni Nyoman Purwani, Marco W Fraaije（Department of Biochemsitry, Faculty of Science and Engineering, University of Groningen）

16:18

1Ap13 学基

サルコシンオキシダーゼの L-チオプロリン反応性向上変異体の結晶構造.................. ○張 宇琪 1,2, 中嶋 義隆 1, 武田 悠杜 1,2, 佐々本 康平 1, 氷見山 幹基 2, 中村 努 2, 西矢 芳昭 1
（1 摂南大院・理工, 2 産総研・バイオメディカル）

16:30

1Ap14 学基

Ni-NTA アフィニティーカラムクロマトグラフィーが金属酵素の EDTA 感受性に影響を与える一例..................................................... ○武田 悠杜 1,2, 佐々本 康平 1,2, 氷見山 幹基 2, 張 宇琪 1,2, 森芳 邦彦 3,
大本 貴士 3, 上垣 浩一 4, 中村 努 2, 西矢 芳昭 1
（ 摂南大院・理工, 産総研・バイオメディカル, 3 大阪技術研, 4 近大・農）
1

16:42

1Ap15 学基

16:54

1Ap16 学環,基2Phocaeicola plebeius および Segatella copri 由来の CBM 分断型キシラナーゼの機能解析............................................. ○田中 蒼磨 1, 髙畑 美優 1, 林 秀謙 2（1 前橋工大院・工, 2 前橋工大・工）
ヒト腸内細菌 Phocaeicola plebeius 由来キシラナーゼ 10B の触媒ドメイン分断型 CBM の特性解析..................................................... ○力石 佑紀 1, 辻 省吾 1, 林 秀謙 2（1 前橋工大院・工, 2 前工大・工）18

B 会場 IB015 教室（13:30～17:06）【酵素学，酵素工学】
13:30

1Bp01

オルニチン高生産清酒酵母に見出したフィードバック阻害非感受性変異型 N-acetyl glutamate kinase

食

の機能解析
.................................. ○大橋 正孝 1, 磯貝 章太 2, 髙木 博史 2（1 奈良産振セ・バイオ・食品グループ,
2

13:42

1Bp02 学環,基13:54

1Bp03 学食奈良先端大・バイオ）Phanerochaete chrysosporium 由来新規ジオキシゲナーゼの機能解析.......................................... ○中村 光希, 加藤 大志, 釣上 竜河, 加藤 雅士, 志水 元亨（名城大院・農）フラクトオリゴ糖生産菌 Zalaria sp. Him3 における β-フラクトフラノシダーゼの探索................................................................................ ○齋藤 佑衣 1, 眞榮田 麻友美 2, 前橋 健二 2, 吉川 潤 2（1 東農大院・応生科, 2 東農大・応生科）

14:06

1Bp04 学

Xanthomonas campestris WU-9701 由 来 グ ル コ ー ス 転 移 酵 素 XgtA を 利 用 し た ethyl alpha-D-

食,化glucopyranoside 高含有糖シロップの生産...................................................................... ○曹 偉 1, 中原 遥 1, 田村 佳都 1, 石井 義孝 2, 桐村 光太郎 1,2（1 早大院・先進理工, 2 早大・理工研）

14:18

1Bp05
化,医,基

好熱菌由来酵素を用いた ATP 生産カスケードの構築................................... ○鈴木 琢磨 1, Suryatin Alim Gladwin 1, 宮崎 健太郎 1, 冨田 宏矢 1,2, 本田 孝祐 1,2（1 阪大・生工国際セ, 2 阪大・先導的学際研機構）
休憩

14:30
14:42

1Bp06
環

海洋細菌由来新規ポリアミド 4 加水分解酵素の諸性質解析....................................... ○齋藤 祐介 1, 本田 正義 3, 古野 洋子 4, 加藤 太一郎 4, 阿部 英喜 5, 山田 美和 2
（1 岩手大院・農, 2 岩手大・農, 3 東理大・工, 4 鹿児島大院・理, 5 理研・環境資源）

14:54

1Bp07
環,基

白色腐朽担子菌 Phanerochaete chrysosporium 由来新規 flavoprotein monooxygenase の機能解析........................................... ○濵嶋 梨紅 1, 早坂 実夏 2, 加藤 大志 2, 釣上 竜河 2, 加藤 雅士 2, 志水 元亨 2
（1 名城大・農, 2 名城大院・農）

15:06

1Bp08
食,化,医

Aspergillus syodwii による鰹節だしがらの発酵と可溶性画分の特性解析...................... ○竹中 慎治 1, 加藤 将城 1, 織部 恭宏 1, 木村 行宏 1, 田中 伸一 2, 松本 淳一 2, 土居 幹治 2
（1 神戸大院・農, 2 マルトモ）

15:18

1Bp09
化,医

中等度好熱放線菌 S. thermolineatus によるキチン分解系タンパク質の分泌と同定..................................................................................................... ○枝並 研一郎 1, 有馬 二朗 2, 仁木 大輔 3
（1 鳥取大院・持社創生, 2 鳥取大・農, 3 鳥取大院・連農）

15:30

1Bp10 学化

Cellvibrio sp. WU-0601 細胞内に検出されるネオアガロビオース生成型 β-アガラーゼ AgaX の諸性質.......................................................................... ○田村 佳都 1, 海蔵寺 早希 1, 石井 義孝 2, 桐村 光太郎 1,2（1 早大院・先進理工, 2 早大・理工総研）
休憩

15:42
15:54

1Bp11 学基

茶カテキン代謝微生物の探索と初発酵素の精製............................................................................... ○姫野 南実 1, 橋本 義輝 1,2, 熊野 匠人 1,2, 小林 達彦 1,2（1 筑波大院・生命環境, 2 筑波大学・微生物サステイナビリティ研究センター）

16:06

1Bp12
基

新規クルクミン代謝微生物の単離と代謝産物の同定............................................................................... ○橋本 義輝 1,2, 佐藤 伽音 1, 熊野 匠人 1,2, 小林 達彦 1,2（1 筑波大院・生命環境, 2 筑波大学・微生物サステイナビリティ研究センター）

16:18

1Bp13

A salt and an organic solvent-tolerant phosphite dehydrogenase for the nicotinamide cofactor regeneration

食,化,農

under non-standard reaction condition................................. ○Gamal Nasser Abdel-Hady 1,2, Takahisa Tajima 1, Takeshi Ikeda 1, Takenori Ishida 1,
Hisakage Funabashi 1, Akio Kuroda 1, Ryuichi Hirota 1（1 Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 2 Fac. Agric., Minia Univ., Egypt）

19

16:30

1Bp14
化

Construction of an enzyme cascade for semi-de novo synthesis of NAD+.................... ○Christina Aryanti Pada Soa 1, Takuma Suzuki 1, Gladwin Suryatin Alim 1, Hiroya Tomita 1,2,
Kentaro Miyazaki 1, Kohsuke Honda 1,2（1 ICBiotech, Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ.）

16:42

1Bp15
化,医

16:54

1Bp16 学基

酵素の有用変異体を予測する機械学習モデルの構築........................................................................ ○礒崎 達大, 渡来 直生, 中村 祐哉, 田村 康一（digzyme）
データベースより単離した新奇 L-メチオニン酸化酵素の構造機能解析............................................. ○川村 ゆい, 中野 祥吾, 杉浦 紗也加, 伊藤 創平（静県大院・薬食生命）

C 会場 IB014 教室（13:30～17:06）【生体情報工学，バイオインフォマティクス／酵素学，酵素工学／タンパク質工学】
13:30

1Cp01
化,医,基

ヒト毛髪付着細菌群集構造の分布.................................................................................... ○渡邉 康太 1, 中山 俊一 1, 門倉 利守 1, 田代 幸寛 2
（1 東農大・応生科, 2 九大院・農）

13:42

1Cp02 学化,環13:54

1Cp03 学
食,医,環,基窒素感受性脂質合成細菌 Nitratireductor sp. OM-1 における比較 RNA-seq 解析......................................... ○前田 大翔, 平田 悠人, 高橋 宏和, 岡村 好子（広島大院・統合生命科学）
一細胞自家蛍光による非破壊的な油脂生産性の予測............................................................................... ○八幡 志央美 1, 平山 智弘 2, 芹田 達郎 4, 風間 春香 5,
森 浩二 4, 高久 洋暁 5, 野村 暢彦 3,6, 八幡 穣 3,6（1 筑波大院・生命地球科学, 2 筑波大院・生命環境科学, 3 筑波大・生命環境系,
4

製品評価技術基盤機構・バイオテクノロジーセ, 5 新潟薬大・応生命,
6

14:06

1Cp04
基

14:18

1Cp05
基

アミノ酸物性値を用いた SARS-CoV-2 スパイク配列の高速特徴抽出法の開発............................................................................................ ○岡 大椰, 吉本 将悟, 堀 克敏（名大院・工）機械学習を用いた代謝酵素の基質特異性決定残基の推定と変換................................................................. ○森 聖也, 二井手 哲平, 戸谷 吉博, 清水 浩（阪大院・情報）
休憩

14:30
14:42

筑波大・微生物サステイナビリティ研セ）

1Cp06 学
環

金属微粒子の選択的凝集を目的とした多機能タンパク質のデザインと機能評価......................................................... ○今村 沙弥香, 中島 一紀, 菅原 駿平, 石渡 悠介, 高野 力, 川崎 了
（北大院・工）

14:54

1Cp07
環

不凍タンパク質を分子骨格としたアスベスト結合タンパク質の開発......................................................... ○市川 京香, 石田 丈典, 池田 丈, 舟橋 久景, 廣田 隆一, 黒田 章夫（広島大院・統合生命科学）

15:06

1Cp08
食

産業廃棄オカラを培地基材としたタンパク質の高生産..................................................................................... ○山口 颯太 1, 小山 幸祐 1, 大城 隆 2,3, 鈴木 宏和 2,3（1 鳥大院・持続創生, 2 鳥取大・工, 3 鳥大・GSC センター）

15:18

1Cp09
環

機械学習を用いた酵素機能予測モデルによる新規 PETase の発見..................................... ○水島 良太 1,2, 鈴木 直也 2, 逸見 明央 2, 島田 幸輝 1, 神谷 幸太郎 1, 藤島 皓介 2
（1 SyntheticGestalt, 2 東工大）

15:30

1Cp10 学基

タンパク質超分子カルボキシソームの外殻タンパク質 CcmO の生化学的特性解析.................................................. ○大久保 詠一郎 1, 杉山 由花 1, 大畠 昌也 1, 中村 隆太郎 1, 松村 洋寿 1,
野口 恵一 2, 養王田 正文 2, 堂前 直 3, 尾高 雅文 1
（ 秋田大院・理工, 2 農工大院・工, 3 理研・環境資源）
1

15:42

休憩

20

15:54

1Cp11 学化,基麹菌由来界面活性タンパク質 hydrophobin RolA 自己組織化における N 末端正電荷残基の寄与................................ ○阿部 菜月 1, 高橋 尚央 1, 寺内 裕貴 2, 田中 拓未 3, 吉見 啓 4, 藪 浩 5,6, 阿部 敬悦 1
（1 東北大院・農, 2 山口大・中高温研, 3 阪大院・工, 4 京大院・地球環学, 5 東北大・WPI-AIMR,
6

16:06

1Cp12
化,医,基

東北大・多元研）

麹菌由来ハイドロフォビン RolA の自己組織化分子メカニズム解析..................................................... ○髙橋 尚央 1, 寺内 裕貴 2, 田中 拓未 3, 吉見 啓 4, 藪 浩 5,6, 阿部 敬悦 1
（1 東北大院・農, 2 山口大・中高温研, 3 阪大院・工, 4 京大院・農, 5 東北大・WPI-AIMR,
6

16:18

1Cp13
基

16:30

1Cp14
医,基

東北大・多元研）

原子間力顕微鏡を用いた三量体接着タンパク質 AtaA の 1 分子強靭性発現メカニズム解明............................................................................. ○加藤 周, 笹原 純, 吉本 将悟, 堀 克敏（名大院・工）
アルキル鎖長が異なる脂質修飾タンパク質の脂質二分子膜上での動態....................................... ○内田 和希 1, 若林 里衣 1, 後藤 雅宏 1,2, 下川 直史 3, 髙木 昌宏 3, 神谷 典穂 1,2（1 九大院・工, 2 九大・未来化セ, 3 北陸先端大・マテリアル）

16:42

1Cp15
基

好熱好酸性アーキア由来の分子シャペロニン構成サブユニットの安定性の検証............................................................................. ○田口 航暉 1, 魚住 奎太 1, 生田 宗一郎 1,2, 藤原 伸介 1,2（1 関西学院大院・理工, 2 関西学院大学・生命環境）

16:54

1Cp16
環

繊維状タンパク質の両末端連結反応を基盤とした人工繊維の形成............................................. ○長谷 彩沙 1, 南畑 孝介 1, 石川 聖人 3, 吉本 将悟 4, 堀 克敏 4, 神谷 典穂 1,2（1 九大院・工, 2 九大・未来化セ, 3 長浜バイオ大・バイオ, 4 名大院・工）D 会場 IB013 教室（13:30～17:06）【セル＆ティッシュエンジニアリング／生体医用工学】
13:30

1Dp01
医,基

13:42

1Dp02 学医

毛包オルガノイドの脱毛症治療薬スクリーニングへの応用............................................................... ○景山 達斗 1,2, 福田 淳二 1,2（1 神奈川産総研, 2 横国大院・工）細胞自己凝集化技術を用いたファイバー状毛細血管モデルの作製.................................................................................... ○橋本 真悟 1, 杉山 晶彦 2, 木股 敬裕 1, 岩井 良輔 3
（1 岡山大院・医歯薬, 2 岡山理大・獣医, 3 岡山理大・フロンティア理工学研）

13:54

1Dp03
医

14:06

1Dp04
医

圧力駆動型生体模倣システムによる微小血管組織の構築............................................................................................... ○杉浦 慎治, 進 和美（産総研・細胞分子）
毛髪再生医療のためのヒト毛乳頭細胞の低酸素刺激培養.......................................................................... ○松元 琴音 1, 景山 達斗 1,2,3, SEO JIEUN 1,2, 福田 淳二 1,2（1 横国大院・工, 2 神奈川県産業技術総合研, 3 JST・さきがけ）

14:18

1Dp05
医

三次元細胞培養における非破壊かつ迅速な逸脱検知技術の開発................................................................................... ○田中 健二郎 1, 河崎 美哉 1, 中野 慧悟 1, 林 咲希 1,
永井 美希 1, 五十嵐 陽子 2, 菅沼 寛 2, 加藤 竜司 1,3（1 名大院・創薬, 2 住友電気工業, 3 名大・ナノライフシステム研究所）
休憩

14:30
14:42

1Dp06 学医

14:54

1Dp07 学
医

15:06

1Dp08
医

液体肝臓の酵素活性改善に向けた検討....................................................................... ○岸谷 有倭, 小島 伸彦（横市大院・生命ナノシステム）
バイオ人工膵臓のためのリン脂質ポリマー修飾アルギン酸ゲルの開発........................................................................................ ○二ツ橋 龍, 金子 真大, 井藤 彰（名大院・工）
体内組織工学プロセスによる新しい自己組織人工心臓弁の開発..................................... ○佐藤 康史, 寺澤 武, 井上 雄介, 武輪 能明（旭川医大・先進医工学研究セ）

21

15:18

1Dp09 学医

細胞自己凝集化技術を用いた造影剤担持型-細胞凝集ファイバーの開発.............. ○滕 魯鵬 1,2, 福島 宗一郎 3,4, 小泉 誠 5, 長谷川 実奈美 4, 岡野 ジェイムス洋尚 4, 大木 隆生 3,
岩井 良輔 2
（1 岡山理大院・理工, 2 岡山理大・フロンティア理工学研, 3 慈恵医大・外科学講座・血管外科,
4

15:30

1Dp10 学医,基慈恵医大・総合医科学研セン・再生医学研, 5 慈恵医大・実験動物研）

Biofabrication of human liver microtissues using genetically modified hepatoma cells............................................ ○Silas Habimana, Hiroyuki Kitano, Yoshinori Kawabe, Masamichi Kamihira（Dept. Chem. Eng., Grad. Sch. Eng., Kyushu Univ.）
休憩

15:42
15:54

1Dp11
医

16:06

1Dp12 学
化,医

16:18

1Dp13
医

金ナノ粒子を固定化した羊毛由来ケラチン薄膜の作製.................................................................................... 森 英樹, 山田 健人, ○原 正之（大阪公大院・理）
放射線架橋ポリビニルアルコールゲル上におけるヒトグリオーマ細胞の増殖特性の解析.................................................................................... ○野間 陽太, 森 英樹, 原 正之（大阪公大院・理）細胞選別能を有する機能性微小ハイドロゲルの創製......................................... ○井元 乃絵 1, 冨永 将大 3, 伊藤 洋一郎 3, 石井 純 3, 近藤 昭彦 3, 神谷 典穂 1,2（1 九大院・工, 2 九大・未来化セ, 3 神戸大・先端バイオ工研セ）

16:30

1Dp14 学
医

16:42

1Dp15
医

糖鎖発現プロファイルの差が及ぼす細胞接着ペプチドへの応答..... ○藤本 瑛代 1, 田中 健二郎 1, 加藤 竜司 1,2（1 名大院・創薬, 2 名大・ナノライフシステム研究所）
修飾されたペプチドの物理化学的性質が骨芽細胞に与える影響......................................................... ○杉山 亜矢斗 1, 横井 智広 1, 蟹江 慧 1,2, 宇都 甲一郎 3, 荏原 充宏 3,
緒方 藍歌 4, 成田 裕司 4, 田中 健二郎 1, 加藤 竜司 1,5（1 名大院・創薬, 2 近大・工, 3 物質材料研究機構, 4 名大院・医, 5 名大・ナノライフシステム研究所）

16:54

1Dp16 学化,医ヘパリン混合ケラチンフィルムの作製と細胞接着性の評価.................................................................................... ○中川 凜久, 森 英樹, 原 正之（大阪公大院・理）F 会場 ES021（13:30～17:06）【醸造学，醸造工学】
13:30

1Fp01
食

醤油発酵・熟成工程における微生物叢の解析................................................................................. ○水野 裕一 1,2, 吉村 臣史 3, 澤田 和敬 3, 柘植 圭介 3,
永野 幸生 4, 吉﨑 由美子 5, 後藤 正利 6, 小林 元太 6（ 鹿児島大院・連農, 宮島醤油, 佐賀県工技セ, 4 佐賀大・分析セ, 5 鹿児島大・農, 6 佐賀大・農）
1

13:42

1Fp02
食

2

3

優良きょうかい清酒酵母の系統間の判別を可能とする SNP マーカーの開発................................................................................................. 周 延 1, 櫻井 省吾 1,2, 鄭 暁紅 1, 五島 徹也 1,
金井 宗良 1, 下飯 仁 3, 岡崎 直人 3, ○赤尾 健 1,2（ 酒総研, 2 広島大院・統合生命科学, 3 醸造協会）
1

13:54

1Fp03
食,環,農

Transcriptomic profiles of Aspergillus oryzae RIB40 and RIB143 responding to humic acid.
................................................................... ○Liyun Liu, Kanae Sakai, Takumi Tanaka, Ken-Ichi Kusumoto（Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.）

14:06

1Fp04
食,基

14:18

1Fp05
食,基

酵母のアルコール発酵を指標とした植物-微生物間相互作用因子の探索............................................. ○中瀬 由起子, 両角 佑一, 杉本 幸子, 渡辺 大輔（奈良先端大・バイオ）
核酸系うまみ成分分解に関与する麹菌酸性ホスファターゼの解析........................................................... ○酒井 香奈江 1, 鈴木 忠宏 2, 堀井 悠一郎 3, 和久 豊 4, 楠本 憲一 1
（1 阪大院・工, 2 農研機構, 3 新潟食品研究セ, 4 ビオック）

14:30

休憩

22

14:42

1Fp06
食

14:54

1Fp07 学食

酢酸イソブチル高生産酵母の育種と窒素源の影響解析......................................................................... ○圍 彰吾, 浅井 拓也, 窪寺 隆文, 明石 貴裕（白鶴酒造）
モデル化焼酎醸造系における発酵促進成分の探索................................................................... ○江部 聡 1, 丸岡 生行 2, 髙下 秀春 2, 星田 尚司 3, 赤田 倫治 3
（1 山口大院・創成科学, 2 三和酒類, 3 山口大・工）

15:06

1Fp08
食

15:18

1Fp09
食

15:30

1Fp10
基

1Fp11
食,環,基

16:06

生もと系酒母造りの清酒醪における抗酸化成分の消長......................................................................... ○野口 友嗣, 河原 航, 石川 卓, 飛田 啓輔（茨城産技セ）
酵母 DBY746 株の熱ストレスによる活性酸素量増大とミトコンドリアとの関連性........................................................................................... ○三木 健夫, 佐野 絢子（山梨大院・医工農）
休憩

15:42
15:54

高発酵性酵母 Bafilomycin A1 耐性株の V-ATPase 機能解析......................................................................... ○中瀬 舞, 浅井 拓也, 窪寺 隆文, 明石 貴裕（白鶴酒造）

エタノールによる酵母プロテアソームの活性阻害に対する低温処理の改善効果................................... Nguyet Vo Thi Anh, 安東 稜子, 古谷 昇, ○井沢 真吾（京工繊大院・工芸科学）

1Fp12 学

食酢醸造用酢酸菌 Acetobacter pasteurianus の酢酸発酵時におけるエタノール資化に関する代謝調節

食

機構の解明
........................................... ○里 実優 1, 松尾 弥俊 1, 丸山 彩乃 2, 海野 良輔 1, 鈴木 敏弘 1,2, 石川 森夫 1,2（1 東農大院・応生, 2 東農大・応生科）

16:18

1Fp13
食

吟醸仕込みにおける α-EG とプリン体の研究.................................................................................... ○石橋 勇作 1, 高山 宗幸 2, 多田 周作 2, 尾関 健二 1
（1 金工大・ゲノム研, 2 天野エンザイム）

16:30

1Fp14
食

イオンビーム照射による群馬 G101 酵母からのカプロン酸エチル高生産性酵母の育種............................................................................................ ○渡部 貴志 1, 佐藤 勝也 2, 大野 豊 2, 田島 創 1（1 群馬産技セ, 2 量研高崎研）

16:42

1Fp15
食,基

協会系酵母とは異なる系統に属する清酒酵母の高発酵性メカニズムの解明.................................................................. ○森 光太郎 1,2, 清家 泰介 1, 山田 翼 2, 田中 伸哉 2, 松田 史生 1
（1 阪大院・情報, 2 菊正宗酒造）

16:54

1Fp16
食,化,基

白麹菌 Aspergillus luchuensis mut. kawachii におけるクエン酸排出輸送体ホモログの機能解析.................................................................. 西谷 篤 1, 平松 健太郎 2, 門岡 千尋 3, 澤田 和敬 4, 奥津 果優 2,
吉﨑 由美子 1,2, 髙峯 和則 1,2, 後藤 正利 5, 玉置 尚徳 1,2, ○二神 泰基 1,2（ 鹿児島大院・連農, 2 鹿児島大・農, 3 崇城大・生物生命, 4 佐賀工技セ, 5 佐賀大・農）1

G 会場 ES022（13:30～16:54）【核酸工学／ペプチド工学／脂質工学／糖鎖工学／分類，系統，遺伝学】
13:30

1Gp01
基

全遺伝子ライブラリをハイスループットに構築するための新規 multiplex PCR 法の開発............................................................................................................. ○内山 航 1, 菅瀬 謙治 1, 青木 航 2,3,4（1 京大院・農, 2 京都バイオ計測センター, 3 JST・さきがけ, 4 阪大院・工）13:42

1Gp02 学
医,基

13:54

1Gp03
基

疎水性 de novo ペプチドナノポアの無細胞合成に向けたアプローチ................................................. ○藤田 祥子 1, 川村 出 2, 川野 竜司 1（1 農工大院・工, 2 横国大院・工）3D structure construction of cyclic peptide using Deep learning......................................................................... ○Kowit Hengphasatporn, Ryuhei Harada, Yasuteru Shigeta（CCC, Univ. Tsukuba）

14:06

1Gp04
食,農,基

塩基性 LEA ペプチドの発現による大腸菌の非生物的ストレス耐性の向上................................................................ ○池野 慎也 1, 中村 颯斗 1, 岸川 颯真 1, メトワリー キャレド 2（1 九工大院・生体工, 2 Fac. Agric., AinShams Univ.）

23

14:18

1Gp05
化,医,基

休憩

14:30
14:42

ペプチド界面を用いた細胞外小胞ミグラソームの炎症誘導評価.................................................................... ○齊藤 彰吾, 田中 祐圭, 大河内 美奈（東工大・物質理工）

1Gp06
基

乳酸菌が産生する細胞外膜小胞の高生産条件の検討.................................................................................... ○前田 朝海 1, 倉田 淳志 2, 河野 健一 3, 上垣 浩一 2
（1 近大院・農, 2 近大・農, 3 京大院・薬）14:54

1Gp07 学医CHL 細胞を用いたフコース構造類似糖鎖の添加による新規糖鎖合成系の開発................................................................... ○三石 秋澄 1, 三﨑 亮 2, 武智 大樹 2, 梶浦 裕之 2, 藤山 和仁 2
（1 阪大院・工, 2 阪大・生工国際セ）

15:06

1Gp08 学医

脱シアル化したヒト肝細胞への HBV 感染効率の評価................................................................... ○原山 魁 1, 三﨑 亮 2, 長野 太志朗 2, 梶浦 裕之 2, 藤山 和仁 2
（1 阪大院・工, 2 阪大・生工国際セ）

15:18

1Gp09 学
食,化,医

15:30

1Gp10
環

1Gp11
環,基

16:06

16:18

脱皮に関連した陸ガニ由来キチナーゼの解析............................................................................................... ○永倉 佑真, 三宅 克英（名城大院・理工）
休憩

15:42
15:54

大腸菌を用いたハーブ植物由来アピゲニン二糖配糖体の生産................................. ○小林 美稀 1, 石水 毅 2, 大橋 貴生 1（1 摂南大院・理工, 2 立命館大・生命科学）

比較ゲノム解析が明らかにする Pseudomonas fluorescens 及び Pseudomonas putida の「真」の分類..................................... ○諸星 知広 1, 谷口 尚哉 1, 染谷 信孝 2（1 宇都宮大院・地域創生, 2 農研機構）

1Gp12

アンモニアガス耐性細菌 Paenibacillus lentus NH33 の化学合成独立栄養性およびアンモニアガス耐

環,農

性機構
....................................................................................................... 清 啓自, ○吉田 ナオト（宮崎大・農）

1Gp13

中等度酸性条件下での鉱水処理に関わる微生物相の解析...................... ○金尾 忠芳 1, 八塚 優衣 1, 上村 一雄 1, 赤堀 文雄 2, 稲谷 博征 2, 公文 翔一 3, 佐藤 王高 3

環

（1 岡山大院・環境生命, 2 卯根倉鉱業, 3 DOWA ホールディングス）16:30

1Gp14 学環

耐塩性好酸性鉄酸化細菌の分離培養................................................................... ○八塚 優衣 1, 新田 優香 2, 根本 理子 1, 田村 隆 1, 金尾 忠芳 1
（1 岡山大院・環境生命, 2 岡山大・農）

16:42

1Gp15
医

ヤマブシタケが齲蝕病原性細菌 Streptococcus mutans のバイオフィルム形成に及ぼす影響............................................ ○阿座上 弘行 1,2,3, Siddiqa Ayesha 2, 濱治 百々子 3, 森川 眞有 4, 石丸 隆行 5
（1 山口大・中高温微セ, 2 鳥取大院・連農, 3 山口大院・創成科学, 4 山口大・農,5

宇部フロンティア大・食物栄養）

H 会場 ES024（13:30～17:06）【発酵生理学，発酵工学／代謝工学／オミクス解析】
13:30

1Hp01 学食,医13:42

1Hp02 学環,基大腸菌におけるジペプチド Ala-Gln によるグルタミン代謝の制御........................................................................ ○秋元 美月, 岩井 伯隆, 和地 正明（東工大・生命理工）
PET 分解経路遺伝子群の枯草菌への導入と分解活性の評価.............................................. 藤猪 志歩 1, ○田代 元彦 1, 山本 純子 2, 猪又 俊輔 2, 平谷 航 1, 上原 美夏 1,
長谷 純崇 1, 秋山 真那斗 1, 板谷 光泰 2, 宮本 憲二 1, 片岡 正和 2, 榊原 康文 1
（1 慶大, 2 信州大・工）13:54

1Hp03 学
食,化,医

リボソーム結合配列の改変による幅広い解糖系のフラックス比を持つ大腸菌ライブラリの構築........................................................................................ ○下谷 朋輝 1, 澤田 将吾 2, 戸谷 吉博 1, 清水 浩 1（1 阪大院・工, 2 AGC）

24

14:06

1Hp04 学

放線菌 Streptomyces lividans において糖消費と二次代謝物生産を向上させる中央代謝経路の遺伝子化,医破壊................................................................................................... ○中澤 堅太朗 1, 山本 省吾 2, 柘植 陽太 1,3（1 金沢大院・自科, 2 長瀬産業, 3 金沢大・新学術）

14:18

1Hp05 学基

プラスミド保持による負荷を回避するための代謝制御様式の解明..................................... ○日高 聖覚 1, 水口 千穂 1,2, 鈴木 研志 1,2, 岡田 憲典 1, 岡橋 伸幸 3, 野尻 秀昭 1,2（1 東大院・農生科, 2 東大・微生物連携機構, 3 阪大院・情報）
休憩

14:30
14:42

1Hp06
環,基

14:54

1Hp07
基

シアノバクテリアにおけるグリコールアルデヒドによる生理状態への影響.................................................................................... ○今田 辰海, 戸谷 吉博, 清水 浩（阪大院・情報）
基質としてのグリセリンが大腸菌の組換えタンパク質生産に与える影響の評価................................................... ○齋藤 肇 1, 尾島 由紘 1, 幸 慎太郎 2, 福永 浩一 2, 坪井 輝道 2, 東 雅之 1
（1 大阪公大院・工, 2 阪本薬品工業(株)）15:06

1Hp08 学
化,医,基

ピキア酵母による芳香族化合物の大量生産および代謝メカニズムの解明............................................................................. ○雲北 涼太 1, 番場 崇弘 2, 近藤 昭彦 1,2,3, 蓮沼 誠久 1,2,3（1 神戸大院・科技イノベ, 2 神戸大・先端バイオ工研セ, 3 理研・環境資源）

15:18

1Hp09 学基

15:30

1Hp10 学基

小スケール培養系に基づくハイスループット 13C 代謝フラックス解析法の構築............................................................. ○仲矢 颯太, 清家 泰介, 岡橋 伸幸, 松田 史生（阪大院・情報）
炭素源多様化に向けた酵母のメタボローム比較解析.................................................................................................... ○神山 歩夢 1, 清家 泰介 1,2, 松田 史生 1,2,3（1 阪大院・情報, 2 阪大・先導的学際研機構, 3 阪大・島津協働研）
休憩

15:42
15:54

1Hp11
医,基

16:06

1Hp12
医,基

動物細胞の分化・機能制御に資する中心炭素代謝流束の定量解析法の構築................................................................................ ○谷口 赳夫, 岡橋 伸幸, 松田 史生（阪大院・情報）
培養上清中の有機／無機成分分析による新規抗体生産宿主 CHL-YN 細胞の代謝解析........................ ○黒田 博隆 1,2,3, 空田 和也 1, 野間 あかり 1, 山野-足立 範子 1, 飯田 順子 2,3, 大政 健史 1
（1 阪大院・工, 2 島津製作所, 3 大阪大学・島津分析イノベーション協働研究所）

16:18

1Hp13
医,基

新規抗体生産宿主 CHL-YN 細胞の重要培地成分同定に向けた検討...............................................○空田 和也 1, 黒田 博隆 1,2,3, 野間 あかり 1, 山野-足立 範子 1, 大政 健史 1
（1 阪大院・工, 2 島津製作所, 3 大阪大学・島津分析イノベーション協働研究所）

16:30

1Hp14 学食サワービールの成分プロファイリングと特徴的な香味属性との相関解析................................................................................................. ○大西 喬也 1, 福崎 英一郎 1,2,3, 古野 正浩 1
（1 阪大院・工, 2 大阪大学島津分析イノベーション協働研究所, 3 阪大・先導的学際研機構）

16:42

1Hp15
食

メタボロミクスに基づく伝統的な醤油と近代的な醤油の差異の探索............................................................................. ○前川 佳花 1, 福崎 英一郎 1,3,4, 今村 美穂 2, 中村 美月 2
（1 阪大院・工, 2 キッコーマン, 3 大阪大学先導的学際研究機構,
4

16:54

大阪大学島津分析イノベーション協働研究所）

1Hp16

アセトヒドロキシ酸シンターゼ制御サブユニットの Ala31Thr 置換による清酒酵母のバリンおよび食,化,基

イソブタノール生産性の向上....................................................................................... ○磯貝 章太 1, 西村 明 1, 村上 直之 2, 堀田 夏紀 2,
小高 敦史 2, 豊川 洋一 1, 石田 博樹 2, 髙木 博史 1
（1 奈良先端大・バイオ, 2 月桂冠・総研）

25

I 会場 ES025（13:30～17:06）【代謝工学／発酵生理学，発酵工学】
13:30

1Ip01
化,医,農,基麹菌におけるゲノム編集を利用した大規模代謝改変による汎用的な異種天然物高生産宿主の開発................................................................ ○齋藤 直也 1, 片山 琢也 1,2, 南 篤志 3, 及川 英秋 4, 丸山 潤一 1,2（1 東大院・農生科, 2 東大・微生物連携機構, 3 北大院・理, 4 Sch. Biotechnol.Wuyi Univ.）

13:42

1Ip02 学食

食品関連微生物（黒麹菌）による α-トマチンからトマチジンへの生産について................................................................................ ○Hui Chun Wai 1, 中谷 友樹 1,2, 小川 順 1, 岸野 重信 1
（1 京大院・農, 2 カゴメ）

13:54

1Ip03
食,化,医

14:06

1Ip04
化,医

有機溶媒耐性菌 Kocuria rhizophila DC2201 の代謝改変によるアスタキサンチン生産........................................................................................................... ○戸田 弘, 金井 保（富山県大・工）
大腸菌におけるポリケタイド生産に向けた遺伝子工学技術の開発............................................................................... ○富田 一輝 1, 番場 崇弘 2, 近藤 昭彦 1,2,3, 蓮沼 誠久 1,2（1 神戸大院・科技イノベ, 2 神戸大・先端バイオ工研セ, 3 理研・環境資源）

14:18

1Ip05
化

大腸菌を宿主とした cis,cis-ムコン酸高生産株の開発............................................................................... ○森島 菜月 1, 番場 崇弘 2, 蓮沼 誠久 1,2, 近藤 昭彦 1,2,3（1 神戸大院・科技イノベ, 2 神戸大・先端バイオ工研セ, 3 理研・環境資源）
休憩

14:30
14:42

1Ip06
化

14:54

1Ip07
食,化,医,農

15:06

1Ip08
化,環,基

非酸化的解糖経路を導入した大腸菌によるブチロラクタム生産のための代謝経路改変.......................................... ○三吉 健太, 一色 衣香, 二井手 哲平, 戸谷 吉博, 清水 浩（阪大院・情報）
セルフクローニングによる 5-ALA 高生産光合成細菌の構築........................................ ○小島 拓真 1,2, 増田 真二 2（1 ネオファーマジャパン, 2 東工大・生命理工）
大腸菌のエネルギー代謝工学による 1,3-ブタンジオール生産の強化............................................. ○片岡 尚也 1,2, 前田 智也 3, 和田 大 4, 横田 篤 3, 松下 一信 2,5, 藥師 寿治 1,2（1 山口大・研究推進機構, 2 山口大・中高温微セ, 3 北大院・農, 4 摂南大・農, 5 山口大・農）15:18

1Ip09 学化,環ガスを原料にしたイソプロパノール生産に向けた Moorella thermoacetica 代謝改変株の開発......................... ○松尾 赳志 1, 加藤 淳也 2, 加藤 節 1, 竹村 海生 1, 藤井 達也 2, 和田 圭介 2, 渡邊 真宏 2,
中道 優介 2, 青井 議輝 1, 松鹿 昭則 2, 森田 友岳 2, 村上 克治 2, 中島田 豊 1（1 広島大院・統合生命科学, 2 産総研）

15:30

1Ip10 学基

嫌気性 CO2 資化性細菌 Moorella thermoacetica の酸素耐性向上に向けた分子育種.............................................. ○石田 隼斗 1, 加藤 淳也 2, 加藤 節 1, 藤井 達也 2, 和田 圭介 2, 渡邊 真宏 2,
中道 優介 2, 青井 議輝 1, 松鹿 昭則 2, 森田 友岳 2, 村上 克治 2, 中島田 豊 1（1 広島大院・統合生命科学, 2 産総研）
休憩

15:42
15:54

1Ip11 学化,環Cupriavidus necator H16 による CO2 を炭素源としたポリヒドロキシ酪酸 高生産株の樹立...................................................... ○安部川 直紀 1, 望月 智弘 2, 秀瀬 涼太 2, 近藤 昭彦 1,2,3, 蓮沼 誠久 1,2（1 神戸大院・科技イノベ, 2 神戸大・先端バイオ工研セ, 3 理研・環境資源）

16:06

1Ip12
化,医,環

Construction of new synthetic pathway for C4-based (4-hydroxybutyrate) biopolymers from sugar............................................................................................. ○Kai-Hee Huong, Orita Izumi, Fukui Toshiaki（Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech）

16:18

1Ip13 学

Ralstonia eutropha 改変株における 2-ヒドロキシブタン酸 (2HB) 代謝の解析と 2HB 含有配列制御型

環,基ポリヒドロキシアルカン酸 (PHAs)の生合成................................................................................ ○石原 静流 1, 折田 和泉 1, 松本 謙一郎 2, 福居 俊昭 1
（1 東工大・生命理工, 2 北大院・工）16:30

1Ip14 学

好塩性細菌ハロモナスのエクトイン非生産株におけるアスパラギン酸系アミノ酸代謝経路の改変に

食,環,農よる耐塩性の向上...................... ○JOO YUNHEUI 1, 仲山 英樹 1,2,3（1 長崎大院・水産環境, 2 長崎大・総合生産科学域,
3

長崎大・海洋未来イノベ）

26

16:42

16:54

1Ip15 学

High-salinity induced overproduction of L-proline improves salt-stress tolerance of engineered ectoine-

食,農deficient Halomonas elongata............ ○Khanh Huynh Cong, Hideki Nakayama（Grad. Sch. Fish. Sci. Environ. Stud., Nagasaki Univ.）

1Ip16 学

Improved production of GABA by engineered Halomonas elongata GOP-Gad strain cell factory from waste

食,環,農biomass............................. ○Ziyan Zou 1, Hideki Nakayama 1,2,3（1 Grad. Sch. Fish. Environ. Sci., Nagasaki Univ.,
2Inst. Sci. Technol., Nagasaki Univ., 3 Org. Marine Sci. Technol., Nagasaki Univ.）

J 会場 オークマホール（13:30～17:06）【遺伝子工学】
13:30

1Jp01
基

ピキア酵母におけるターミネーター置換での遺伝子発現量制御.................................... ○伊藤 洋一郎 1,4, 寺井 悟朗 2, 石上 美佐 3, 橋場 倫子 3, 中村 泰之 1, 番場 崇弘 1,
雲北 涼太 4, 蓮沼 誠久 1,4, 浅井 潔 2, 石井 純 1,4, 近藤 昭彦 1,4（1 神戸大・先端バイオ工研セ, 2 東大院・新領域, 3 高機能遺伝子デザイン技術研究組合,
4

13:42

1Jp02 学医,基神戸大院・科技イノベ）

バクテリオファージ由来 RNA ポリメラーゼを利用した酵母遺伝子スイッチの開発.................................................................. ○堀 智彦 1, 冨永 将大 1,2, 梶 亘佑 1, 近藤 昭彦 1,2,3,4, 石井 純 1,2（1 神戸大院・科技イノベ, 2 神戸大・先端バイオ工研セ, 3 神戸大院・工, 4 理研・環境資源）

13:54

1Jp03
化,医,基

酵母の高発現性人工誘導プロモータの開発......................................................................... ○冨永 将大 1,2, 伊藤 洋一郎 1,2, 近藤 昭彦 1,2,3,4, 石井 純 1,2（1 神戸大・先端バイオ工研セ, 2 神戸大院・科技イノベ, 3 神戸大院・工, 4 理研・環境資源）

14:06

1Jp04 学
環

酵母を用いたグルコースからポリエステルのワンステップ合成経路の開発.............. ○遠藤 涼太 1, Radityo Pangestu 1, Dianti Rahmasari 1, Prihardi Kahar 1, 近藤 昭彦 2, 荻野 千秋 3
（1 神戸大院・工, 2 神戸大院・科技イノベ, 3 神戸大・工）

14:18

1Jp05

担子菌酵母 Pseudozyma antarctica におけるグルコキナーゼ遺伝子破壊による炭素カタボライト抑制

環,農,基

の解除
................................................................................... ○田中 瑞己 1, 田中 拓未 2, 三浦 敦宏 2, 菅沼 佑奈 3,
鍋田 友美 3, 河原崎 泰昌 3, 山形 洋平 1, 北本 宏子 2
（ 農工大院・農, 2 農研機構・農環研, 3 静県大・食栄）
1

休憩

14:30
14:42

1Jp06
基

14:54

1Jp07 学食,環出芽酵母における染色体からのセントロメア DNA の切り出し誘導時に出現する生存細胞の解析............................................................................ ○松崎 浩明, 中村 祐茉, 秦野 琢之（福山大・生命工）
出芽酵母における新規 RAS1 遺伝子変異の同定と実用酵母における有用性の検討................................... ○山岸 まなみ 1, 小林 日花梨 1, 小久保 晋 2, 早川 正幸 3, 山村 英樹 2, 中川 洋史 2
（1 山梨大院・医工農, 2 山梨大院・総研部, 3 山梨県立大学）

15:06

1Jp08 学
食,環,基出芽酵母にマルチストレス耐性を付与する新規遺伝子変異の同定および有用性の検討........................................... ○荻根 千博 1, 田中 桃未 1, 小久保 晋 2, 早川 正幸 3, 山村 英樹 2, 中川 洋史 2
（1 山梨大院・医工農, 2 山梨大院・総研部, 3 山梨県立大学）

15:18

1Jp09

酵母 Pseudozyma tsukubaensis 由来糖脂質マンノシルエリスリトールリピッドの推定トランスポー

化,環,農ター（PtMMF1p）の機能解析....................................... ○雜賀 あずさ 1, 森田 友岳 1, 福岡 徳馬 1, 山本 周平 2, 菅原 知宏 2, 曽我部 敦 3（1 産総研・機能化学, 2 東洋紡・バイオテクノロジー研, 3 東洋紡・バイオ事業総括部）

15:30

1Jp10 学

麴菌の固体培養特異的発現を示すグルコアミラーゼ遺伝子 glaB プロモーターに存在する AmyR の基

シスエレメントの同定.................................................. ○青西 洋平, 大沼 司, 渡部 昭, 新谷 尚弘, 五味 勝也（東北大院・農）

27

休憩

15:42
15:54

1Jp11

マイタケ（Grifola frondosa）子実体で発現するプロテアーゼ遺伝子群の同定と異種発現系による性

食,化,医

質決定
.............................................................................. 長嶋 優芽 1, 栗田 涼子 2, 田中 瑞己 3, ○河原崎 泰昌 1,2（1 静県大・食栄, 2 静県大院・薬食生命, 3 農工大院・農）

16:06

1Jp12 学基

ヒザラガイ RTMP1 ホモログの遺伝子ノックダウンが磁鉄鉱歯形成に及ぼす影響の評価................... ○赤嶺 晴香 1, 金尾 忠芳 1, 田村 隆 1, 鈴木 道生 2, David Kisailus 3, 大越 健嗣 4, 根本 理子 1（1 岡山大院・環境生命, 2 東大院・農生科,
3

Department of Materials Science and Engineering, University of California Irvine, CA, USA,
4

16:18

1Jp13
基

16:30

1Jp14 学医,基16:42

1Jp15 学食,農

東邦大・理）

糸状菌 Trichoderma reesei における新規誘導プロモーターの探索................................................................................. ○一瀬 桜子, 柴田 望, 高橋 史員, 小山 伸吾（花王）
ミミズを用いた異種タンパク質高発現系構築に向けたプロモーター領域の解析と活性評価...................................................... ○多田 慎之輔, 小島 凌, 本間 真樹, 森山 桐, 赤澤 真一（長岡高専）
Identification of an isomaltose sensor involved in amylolytic enzyme production in Aspergillus........................................................... ○Da Min Jeong, Jikian Tokashiki, Takahiro Shintani, Katsuya Gomi
（Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.）

16:54

1Jp16 学食,化Multiple genome modification of Aurantiochytrium sp. by selection marker recycling system................................... ○Heqian Zhu, Mutsumi Nishiura, Kako Niimoto, Kenshi Watanabe, Tsunehiro Aki（Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.）

K 会場 オークマ講義室（13:30～17:06）【バイオセンシング，分析化学／センサー，計測工学／遺伝子工学】
13:30

1Kp01
環

13:42

1Kp02
医,基

尾の周波数に注目したメダカの遊泳評価について............................................................................................................... ○甲斐 穂高, 岡 芳樹（鈴鹿高専）
酵母ツーハイブリッド法を用いた Survivin と HBXIP の複合体形成部位の解析.......................................................................................... ○飯田 泰広 1,2, 伴 直輝 1, 秋山 佳穂 2, 林 真央 2
（1 神奈川工大・応用バイオ, 2 神奈川工大院・工）

13:54

1Kp03
食,医,環,農,基ゲル・カプセル・デジタル・ポリメラーゼ連鎖反応 (gc-dPCR) の開発............................................................................ ○陳 政霖, 福田 隆史, 安浦 雅人, 堀口 諭吉, 芦葉 裕樹（産総研・センシングシステム研究センター）

14:06

1Kp04
食,医,基

グラム陰性腸内細菌の Lipid A の構造解析................................................................................. ○岡橋 伸幸 1,2,3, 上田 政宏 4, 松田 史生 1, 有田 誠 2,3,5（1 阪大院・情報, 2 理研・生命医科学, 3 慶大院・薬, 4 JSR, 5 横市大院・生命医）

14:18

1Kp05 学
環

休憩

14:30
14:42

1Kp06 学
基

14:54

1Kp07
食,化,農

15:06

各種分析記述子に基づく親水性ポリマーの表面改質データサイエンス.............................................................................................................. ○岡田 真幸（名大院・生命農学）

1Kp08
化

de novo 設計ペプチドナノポアを用いたペプチドーム解析法の構築................................................................................................... ○山地 未紗, 川野 竜司（農工大院・工）紙ベース酵素センサを用いたチロシナーゼ活性阻害検出................................. ○永谷 尚紀 1, 後藤 香秋 1, 肥塚 梨菜 2（1 岡山理大・工, 2 奈良先端大・バイオ）Electrochemical sensing of interleukin 6 in human serum with epitope-imprinted polymer-coated electrodes.............................. Hung-Yin Lin 1, ○Jing-Chen Ciou 1, Kai-Hsi Liu 1,2, Chuen-Yau Chen 1, Mei-Hwa Lee 3（1 National University of Kaohsiung, 2 Zuoying Branch Kaohsiung Armed Forces General Hosp,
3

I-Shou Univ）

28

15:18

1Kp09 学
食,医,基

電界配向を用いた市販ヨーグルト中の乳酸菌の簡易生存率測定........................................................................................ ○奥原 太生 1, 近藤 涼太 2, 須加 実 1, 篠原 寛明 1
（1 富山大院・理工, 2 富山大・工）

15:30

1Kp10 学医

表面増強ラマン散乱を利用したノロウイルスの簡易検出法の開発............................................................○前畑 秀叡 1, 朴 龍洙 1,2, Khoris memdi Indra 2, Achadu Ojodomo 2（1 静大院・総合科技, 2 静大・グリーン科技研）
休憩

15:42
15:54

1Kp11
医

16:06

1Kp12
食,医,農,基水晶振動子マイクロバランス法と画像解析による細胞老化のモニタリング.............................................................................................. ○山口 響（東京工科大院・バイオニクス）
新規 Type I-D CRISPR-Cas (TiD-X)を用いた高効率なヒトゲノム編集........................................................... ○和田 直樹 1, 村上 愛美 1, 丸井 和也 1, 刑部 祐里子 2, 刑部 敬史 1
（1 徳島大院・社会産理工, 2 東工大・生命理工）

16:18

1Kp13

Activation of tumor suppressor genes in glioblastoma with CRISPR/dCas9a immobilized magnetic peptide-

化

imprinted chitosan nanoparticles.............................................................. ○Yu-Ling Lin 1, Ya-Chun Chang 1, Mei-Hwa Lee 2, Hung-Yin Lin 1（1 National University of Kaohsiung, 2 I-Shou Univ）

16:30

1Kp14
医,基

ゲノム改変技術によるハンチントン病モデル iPS 細胞の作製............................... ○倉澤 光 1,2, 相澤 康則 1,2（1 地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所,
2

16:42

1Kp15 学医,基16:54

東工大・生命理工）

抗原刺激強度依存的な遺伝子発現における BCR シグナル経路の役割..................................................... ○小野 和奏, 安福 希, 伊藤 雄大, 金山 直樹（岡山大院・統合科学）

1Kp16 学

抗原レセプターシグナル依存的に発現するオーファンレセプター NR4A1 の B 細胞における発現制医,基御機構の解明............................................. ○長門 直希, 伊藤 雄大, 野田 凌太郎, 金山 直樹（岡山大院・統合科学）

L 会場 工 1 号館 121 教室（13:30～17:06）【生物化学工学／バイオプロセス／培養工学】
13:30

1Lp01
環

13:42

1Lp02
基

13:54

1Lp03
環,基

14:06

1Lp04
医

14:18

1Lp05 学
食,環

臭気性ハロゲン化フェノールの生物学的手法を用いた高感度定量法の開発..................................................... ○後藤 早希, 中倉 快斗, 大沼 浩輝, 浦瀬 太郎（東京工科大・応生）
トルエン資化細菌 Acinetobacter sp. Tol 5 の外膜タンパク質におけるメチル化修飾......................................................................... ○井上 翔理, 岡 大椰, 吉本 将悟, 堀 克敏（名大院・工）トルエン資化細菌 Acinetobacter sp. Tol 5 の外膜トランスポーター機能解析......................................................................... ○森 さくら, 吉本 将悟, 岡 大椰, 堀 克敏（名大院・工）Escherichia coli K-１２株でのバイオフィルム形成における遺伝子発現変動.......................................................................................................................... ○小川 亜希子（鈴鹿高専）
乳製品加工残渣を栄養源とし緑藻を培養した際の細胞応答についての解析と評価................................................................................................... ○蓬田 美紗樹 1, 堀本 智仁 2, 中西 昭仁 1,3（1 東京工科大院・バイオニクス, 2 明治, 3 東京工科大・応生）
休憩

14:30
14:42

1Lp06
環,農

有用微生物の選抜を目指したダイズ根圏微生物群集の機能評価............................ ○木伏 真子 1,2, 西川 洋平 2,3, 細川 正人 1,2,3,4, 中岡 慎治 5, 穴井 豊昭 6, 竹山 春子 1,2,3,4（1 早大院・先進理工, 2 産総研・早大 CBBD-OIL, 3 早大・ナノライフ創新研, 4 早大・生命動態研,
5

14:54

1Lp07
農

北大院・生命科学, 6 九大院・農）

強酸性温泉由来微細藻類の簡易開放大量培養を目指した培養特性調査..................................................... ○岡澤 空汰 1, 邱 泰瑛 2, 小西 正朗 2（1 北見工大院・工, 2 北見工大）

29

15:06

1Lp08 学

原生生物の捕食圧下における藍藻の細胞形態変化の解析(1)：淡水性藍藻 Synechococcus elongatus

食,化,医,環,基PCC 7942 の場合....................................................................................... ○戸田 成美 1, 吉田 亮介 1, 渡辺 智 2, 石田 丈典 1,
池田 丈 1, 舟橋 久景 1, 黒田 章夫 1, 廣田 隆一 1
（1 広島大院・統合生命科学, 2 東農大院・農）

15:18

1Lp09 学

原生生物の捕食圧下における藍藻の細胞形態変化の解析(2)：海洋性藍藻 Synechococcus sp. PCC 7002

食,化,医,環,農,基の場合.............................. ○吉田 亮介 1, 渡辺 智 2, 石田 丈典 1, 池田 丈 1, 舟橋 久景 1, 黒田 章夫 1, 廣田 隆一 1
（1 広島大院・統合生命科学, 2 東農大院・農）

15:30

1Lp10
農

光合成細菌の細胞成分による植物成長促進効果........................................................................................... ○林 修平 1, 岩本 康成 1, 平川 夕貴 1, 森 康一 1,
山田 直樹 2, 牧 孝昭 2, 山本 進二郎 1, 宮坂 均 1（ 崇城大・生物生命, 2 （株）松本微生物研究所）
1

休憩

15:42
15:54

1Lp11
化

16:06

1Lp12 学基

16:18

1Lp13 学
化,環,農,基16:30

1Lp14 学
環,農

16:42

16:54

出芽酵母における培地成分としてのふすま残渣の利用価値に関する評価............................ ○森 美乃莉 1, 中西 昭仁 1,2（1 東京工科大・応生, 2 東京工科大院・バイオニクス）
鎖長の異なるポリ(ε-L-リシン) の出芽酵母に対する抗菌作用............................................. ○谷村 雨音, 吉田 修, 松井 旺大, 竹原 宗範（滋県大院・工・材料科学）
変形菌の糖質分解酵素に関する研究................................................................................ ○川合 哲也, 鈴木 孝征, 金政 真（中部大院・応生）
サツマイモ基腐病菌に対する Pseudomonas KS-4 株の抗菌作用の解明............................................................................................... ○栗原 優花, 児玉 浩明（千葉大院・園芸）

1Lp15

Deciphering characteristics of herbal medication for antiviral treatment through Ancient Oriental

医Philosophy................................................................................................ ○Boryann Chen（Dept. Chem. Mater. Eng.）

1Lp16

グラム陰性菌の培養に伴ない生成するエンドトキシンの諸特性解析..... ○今村 百花 1, 德永 成美 1, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大院・生物資源科学学位 P, 2 筑波大・生命環境系）

食,医M 会場 工 1 号館 131 教室（13:30～17:06）【システムバイオロジー／生物化学工学／培養工学／バイオプロセス】
13:30

1Mp01 学基

大腸菌細胞内の pH 調節に関与する遺伝子の網羅的な探索........................................................................................ ○福田 紘子 1, 中嶋 幹男 2, 森 浩禎 3, 片岡 正和 1
（1 信州大院・総理工研, 2 MSL, 3 広東省農業科学院）

13:42

1Mp02 学

Investigation of the expression difficulties of shark-derived immunoglobulin new antigen receptor in

医Chinese hamster ovary cells......................................... ○Yunchi Zhang 1, Xiaofang Lyu 1, Noriko Yamano-Adachi 1,2, Takeshi Omasa 1,2（1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ.）

13:54

1Mp03
医

Hspx の発現は抗体生産 CHO 細胞に高浸透圧を与えることで誘導される.................................................................................... ○中野 美貴子 1, 三﨑 亮 2, 梶浦 裕之 2, 藤山 和仁 2
（1 阪大院・工, 2 阪大・生工国際セ）

14:06

1Mp04
基

14:18

1Mp05 学化,医CHO 細胞の抗体生産性に対する長期培養による影響...................................................................................................................... ○永嶋 悠人（農工大院・工）
高浸透圧下でセリシンを利用した、ハイブリドーマ細胞の抗体生産の増強.................................. ○竹尾 将俊 1, 藤田 雅也 1, 中尾 匡志 1, 寺田 聡 1, 真杉 遼 2, 梅田 尚希 2, 高橋 潤 2（1 福井大院・工, 2 セーレン）

30

休憩

14:30
14:42

1Mp06 学医

Effect of temperature downshift on IgG production using fast growing CHL-YN cells.............................................................................○Stephanie Lie, Noriko Yamano-Adachi, Takeshi Omasa（Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.）

14:54

1Mp07

CHO 細胞を用いた抗体生産培養における Cystine と Tyrosine 添加による酸化ストレスと ER ストレ

医スの低減メカニズムの解明................................................................................................... ○柴藤 祐介 1,2, 長尾 信義 3, 養王田 正文 2
（1 AGC Biologics, 2 農工大院・工, 3 AGC）

15:06

1Mp08
基

15:18

1Mp09
食

哺乳類培養細胞における遺伝子改変細胞間接着分子 カドヘリンの局在及び機能について.......................................................................................................................... ○小林 和香子（宇部高専）
細胞凝集塊の融合を利用した三次元ウシ筋組織の作製法の開発............................................................... ○新井 世望 1, 仲上 侑友 1, 曽福 重光 2, 中田 二郎 2, 仁宮 一章 3
（1 金沢大院・自科, 2 天狗中田本店, 3 金沢大・新学術）

15:30

1Mp10
食

可食性マイクロキャリアを用いたウシ筋芽細胞の懸濁培養................................................................... ○坂本 竜朗 1, 今 拓海 1, 曽福 重光 2, 中田 二郎 2, 仁宮 一章 3
（1 金沢大院・自科, 2 天狗中田本店, 3 金沢大・新学術）
休憩

15:42
15:54

1Mp11
食

無血清培養した肝細胞の培養上清を用いたウシ筋芽細胞の無血清培養............................................................... ○高木 京馬 1, 中野 一成 1, 曽福 重光 2, 中田 二郎 2, 仁宮 一章 3
（1 金沢大院・自科, 2 天狗中田本店, 3 金沢大・新学術）

16:06

1Mp12
食

食品を用いた培地によるウシ筋芽細胞の無血清培養............................................................... ○若林 壮吾 1, 井上 皓太 1, 曽福 重光 3, 中田 二郎 3, 仁宮 一章 2
（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術, 3 天狗中田本店）

16:18

1Mp13 学化,医増殖因子セリシンが工業用動物細胞培養に与える影響....................................................... ○清水 尚樹 1, 村上 悠也 1, 寺田 聡 1, 真杉 遼 2, 梅田 尚希 2, 高橋 潤 2（1 福井大院・工, 2 セーレン）

16:30

1Mp14 学
医

16:42

1Mp15
食,化,医,環,基実験計画法を用いた iPS 細胞由来心臓前駆細胞誘導プロセスの最適化................................................................. ○片山 陽介, 秋山 裕和, 清水 一憲, 本多 裕之（名大院・工）Bifidobacterium dentium の MVs が示す Jurkat 細胞の増殖抑制効果.................................................................. ○前田 瑞歩 1, 入江 健太 2, 岡田 美玖 2, 福田 隆志 2, 川本 純 3,
今井 友也 4, 栗原 達夫 3, 倉田 淳志 2, 上垣 浩一 2
（1 近大院・農, 2 近大・農, 3 京大・化研, 4 京大・生存研）

16:54

1Mp16 学食,環藻類と動物細胞を用いた循環型培養食肉生産システムの速度論的解析............................................................ ○加藤 多貴 1, 山本 陸 1,3, 原口 裕次 2, 清水 達也 2, 紀ノ岡 正博 1,3（1 阪大・院工・生物工学, 2 東女医大・先端生命医, 3 阪大・院工・細胞製造コトづくり拠点）

N 会場 工 1 号館 132 教室（13:30～17:06）【環境工学，廃水処理技術／環境浄化，修復，保全技術／バイオマス，資源，エネルギー工学】
13:30

13:42

1Np01 学

Advanced Photocatalytic Inactivation Process of Toxigenic M.aeruginosa: Insights on Time-dependent

環

Physiological Regulation Mechanism................................................................ ○Guangqi An, Hongjian Zhang, Yingnan Yang（Univ. Tsukuba）

1Np02

耐酸性細菌を用いた強酸性条件下での金属吸着とカチオン挙動............................................................................................ ○高野 力 1, 中島 一紀 1, 青柳 秀紀 2, 川﨑 了 1

環（1 北大院・工, 2 筑波大・生命環境）

31

13:54

1Np03 学
環

14:06

1Np04
環

新規耐塩性好気的セレン酸塩還元菌 Citrobacter koseri Y2 の Se(VI)還元特性の評価..................................................................... ○岡畑 俊輔, 上田 優弥, 井上 大介, 池 道彦（阪大院・工）パイロット試験機を用いたマンガン含有坑廃水の砂ろ過処理.................................. 稲葉 知大 1, 愛澤 秀信 1, 青柳 智 1, 佐藤 由也 1, 堀 知行 1, 西村 拓朗 2, ○羽部 浩 1（1 産総研・環境創生, 2 ナガオカ）

14:18

1Np05
環,農

休憩

14:30
14:42

1Np06
環

14:54

コンポストを用いた食品廃棄物からのリン回収の検討....................................................................................................... ○滝口 昇, 渡邊 暉己（金沢大・理工）

1Np07 学環

超低濃度亜鉛除去能を有する微生物の亜鉛除去機序の解析........................................................................................... ○栁原 隆志, 大槻 隆司（山梨大院・医工農）
異化的亜リン酸酸化により増殖する化学独立栄養細菌の解析....................................................................... ○山中 享史, 加藤 淳也, 田島 誉久, 中島田 豊, 石田 丈典,
池田 丈, 舟橋 久景, 黒田 章夫, 廣田 隆一（広島大院・統合生命科学）

15:06

1Np08 学
環

15:18

1Np09
環,基

15:30

タヌキ糞便より単離されたアンモニアガス耐性細菌 Klebsiella sp.のアンモニアガス利用特性................................................................................ ○飯田 健太, 清 啓自, 吉田 ナオト（宮崎大院・農）

1Np10

好冷性アンモニアガス耐性細菌 Raoultella terrigena PB6 のアンモニア耐性機構および独立栄養性解環

明に関する研究................................................................................ ○近藤 和馬, 清 啓自, 吉田 ナオト（宮崎大院・農）
休憩

15:42
15:54

下水処理場の臭気に関与する微生物の臭気生成抑制手段の探索.............................................................................................................. ○本門 慧史（山梨大院・医工農）

1Np11
環

アンモニア酸化細菌における環状ジグアニル酸合成・分解酵素の同定と解析............................................................. ○西村 聡子, 水崎 圭, 水津 暁生, 高橋 佑, 金岡 英徳, 飯島 信司（愛工大・工）16:06

1Np12 学環

バイオフィルムを活用した排水処理向け硝化・脱窒ツールの検討............................................................... ○蒲生 智郷 1, 尾島 由紘 1, 松原 さやか 2, 福本 吉洋 2, 東 雅之 1
（1 大阪公大院・工, 2 関西化工）

16:18

1Np13 学環

The environmental effect of plants in smoking area.................. ○Jeong Wook Jo, Sung Woo Yang, Gyu Won Lee, Jae Hun Kim, Ye Jin Kim, Hyung Joo Kim（Dept. of Biological Engineering, Konkuk Univ.）

16:30

1Np14 学環

Adsorption of H1N1 influenza virus from water-immersed leaf suspensions of live indoor plants.................. ○Sung Woo Yang, Jeong Wook Jo, Gyu Won Lee, Jae Hun Kim, Ye Jin Kim, Hyung Joo Kim（Dept. of Biological Engineering, Konkuk Univ.）

16:42

1Np15
環

16:54

1Np16
環,農

水圏環境における植物と底質の関係解析.......................................................... ○五十嵐 郁, Tran Quoc Thinh, 久保 幹（立命館大院・生命科学）
Effects of 1,3 Di-Chloropropene agrochemical on earthworm and bacterial biomass....................................................................○Muhammad Akram Kharral, Quoc Thinh Tran, Motoki Kubo
（Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.）

32

O 会場 工 1 号館 142 教室（13:30～17:06）【環境浄化，修復，保全技術／バイオマス，資源，エネルギー工学／環境工学，廃水処理技術】
13:30

1Op01
環,基

フェノール分解条件下における Comamonas thiooxydans R2 株の形質不均一性と機能維持................................ ○鈴木 研志 1,2, 上原 悠太郎 3, 水口 千穂 1,2, 栗栖 太 2,4, 二又 裕之 5,6,7, 野尻 秀昭 1,2（1 東大院・農生科, 2 東大・CRIIM, 3 東大院・工, 4 東大院・工・水環セ, 5 静大・創科技院,
6

13:42

1Op02 学
食,医,環,農,基静大院・総合科技, 7 静大・グリーン科技研）

複合微生物系の機能的恒常性を可能にする微生物群集の構造的特徴....................................................................................... ○池田 麗 1, 本荘 雅宏 2, 高橋 宣博 1, 三本 麗華 3,
斎藤 保久 4, 岡田 崇 5, 木村 元彦 1, 二又 裕之 6
（1 静大院・総合科技, 2 静大・創科技院, 3 静大・工, 4 島大・学研理工, 5 京大・医生研,
6

13:54

1Op03 学環

静大・グリーン科技研）

日本海溝に生息する深海微生物の多様性及び機能の解明..................................................... ○實野 佳奈 1,2, 西川 洋平 2,3, 星野 辰彦 4, 稲垣 史生 4,5, 竹山 春子 1,2,3,6（1 早大院・先進理工, 2 産総研・早大 CBBD-OIL, 3 早大・ナノライフ創新研, 4 海洋研究開発機構,
5

14:06

1Op04
環

14:18

1Op05
環

1Op06
環

14:54

1Op07 学環

15:06

Sphingomonas bisphenolicum AO1 株の 4-hydroxyacetophenone 分解特性解析........................................................................ ○リュウ ロ, 佐々木 美穂, 松村 吉信（関西大院・理工）
キノコによる加硫ゴムの分解は炭酸カルシウム充填剤の脱離を伴う...................................................................... ○佐藤 伸 1, 米山 史紀 2（1 公立鳥取環境大学, 2 住友理工）
休憩

14:30
14:42

東北大院・理, 6 早大・生命動態研）

1Op08 学環

スルファニル酸微生物分解への亜硫酸化学平衡の影響................................................................. ○釣本 真弘, 大西 真代, 喜多 晃久, 早瀬 伸樹（新居浜高専）
Pseudonocardia sp. D17 による塩素化エチレン類の好気分解酵素及び経路に関する研究..................................................................... ○西峯 隆悟, 南薗 洸佑, 井上 大介, 池 道彦（阪大院・工）
耐酸性ヒ素吸着細菌の酸性鉱山廃水処理への活用....................................................................... ○岩間 蒼平 1, 高野 力 1, 中島 一紀 1, 青柳 秀紀 2, 川﨑 了 1（1 北大院・工, 2 筑波大・生命環境）

15:18

1Op09
環

15:30

1Op10
環

草食性陸ガニのリグニン分解活性................................................................................................... ○三宅 克英, 永倉 佑真（名城大・理工）
休憩

15:42
15:54

驚異的な油脂分解能力をもつ微生物による超効率的な食用油含有排水処理法の確立と社会実装.................................... ○小原 優季 1, 蟹江 純一 1, 堀 克敏 1,2（1 フレンドマイクローブ, 2 名大院・工）1Op11 学

Enzymatic Characterization of Unused Biomass Degradation Using the Clostridium cellulovorans

環,基Cellulosome........................... ○Mohamed Yahai Eljonaid 1, Hisao Tomita 1, Fumiyoshi Okazaki 1,2,3, Yutaka Tamaru 1,2,3（1 Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ.,
2

Department of Bioinfomatics, Mie University Advanced Science Research Center, Mie University,,
3

16:06

1Op12
環

Smart Cell Innovation Research Center, Mie University）

海洋性水素酸化細菌 Hydrogenovibrio marinus MH-110 株の培養法の検討............................................... ○岡部 航也 1, 松内 愛美 2, 花田 晶子 3, 春日 友明 3, 明戸 剛 3, 西原 宏史 1
（1 茨城大院農・実践農食, 2 茨城大農・食生科, 3 太平洋セメント・中央研）

16:18

16:30

1Op13

海洋性水素酸化細菌 Hydrogenovibrio marinus MH-110 株の増殖におけるガス基質消費量の解析と新環

たな海洋性株の探索................. ○野田 蒼士 1, 飯生 紗矢 2, 西原 宏史 1（1 茨城大院・農・実践農食, 2 茨城大農・食生科）

1Op14 学

新規藍藻増殖促進細菌 Rhodococcus cerastii AF2108 の増殖促進メカニズムの調査.............................................. ○Tan Pei Yu 1, 石田 奨 2, 加藤 勇太 3, 邱 泰瑛 2, 八久保 晶弘 2, 小西 正朗 2

環（1 北見工大院・工, 2 北見工大, 3 環境大善）

33

16:42

1Op15 学環

ケイ酸カルシウム水和物を利用した微細藻類の増殖促進技術の開発............................................................................... ○横井 佑果 1, 和賀 健太郎 1, 花田 晶子 2, 春日 友明 2,
明戸 剛 2, 吉野 知子 1, 新垣 篤史 1, 田中 剛 1（1 農工大院・工, 2 太平洋セメント）

16:54

1Op16 学基

群体性藻類 Botoryococcus braunii 単細胞培養条件の応答局面法による最適化........................................................................................... ○村山 拳午, 大槻 隆司（山梨大院・医工農）

ランチョンセミナー（11:45～12:45）
B 会場 IB015 教室
1L-B01

株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ

C 会場 IB014 教室
1L-C01

東ソー株式会社

D 会場 IB013 教室
1L-D01

日本ウォーターズ株式会社

学生のための企業研究セミナー（17:30～18:30）
E 会場 ES ホール
1C-E01

コニカミノルタ株式会社

F 会場 ES021
1C-F01

サラヤ株式会社

G 会場 ES022
1C-G01 株式会社フレンドマイクローブ

H 会場 ES024
1C-H01 株式会社バッカス・バイオイノベーション

I 会場 ES025
1C-I01

大阪有機化学工業株式会社

34

第 2 日（9 月 4 日）
学 が表示されている一般講演は学生優秀発表賞の審査対象となる発表です．

開始時間

講演番号
研究アウトプット項目

演

発表者氏名（所属）題○印は講演者を示す

受賞講演（生物工学若手賞）
G 会場 ES022（15:10～15:25）
15:10

2A-Gp01

座長：芦内 誠〈生物工学若手賞〉

工学的手法を利用した毛髪再生技術の開発..................................................................................... ○景山 達斗 1,2（1 神奈川産総研, 2 横国大院・工）I 会場 ES025（15:10～15:25）
15:10

2A-Ip01

座長：田中 剛〈生物工学若手賞〉

有用物質生産菌における細胞内外の代謝に関する生物工学研究...................................................................................................... ○片岡 尚也（山口大・研究推進機構）

受賞講演（生物工学アジア若手賞）
J 会場 オークマホール（15:10～15:50）
15:10

2A-Jp01

座長：藤山 和仁〈生物工学会アジア若手賞〉

Recovery of valuable bioactive compounds from renewable resources towards a sustainable circularbioeconomy: A solution to global issues........................................................................................................................................ ○Pau-Loke Show 1,2（1 Dept. Chem. Eng., Khalifa Univ., UAE, 2 Dept. Chem. Environ. Eng., Univ. of Nottingham Malaysia）
15:30

2A-Jp02〈生物工学会アジア若手賞〉
Engineering strategies for enhancing microalgae lipid production using effluents of coke-making wastewater................................................... ○Chun-Yen Chen 1, Yu-Han Chang 1,2, Jo-Shu Chang 1,2, Jhuan-Ling Hsu 1（1 Natl. Cheng Kung Univ., Taiwan, 2 Tunghai Univ., Taiwan）

シンポジウムA 会場 IB 大講義室（9:00～11:00）
プロテインクライシスに挑む未来タンパク資源の製造・加工技術の開発と新たな食システムの創成を目指して
9:00

はじめに
............................................................................................................................................................ 小川 順

35

座長：小川 順9:02

2S-Aa01

麹菌が拓く新しい食産業.............................................................................................................. ○萩原 大祐（筑波大・生命環境）

9:25

2S-Aa02

細胞性食品（培養肉）の研究開発動向と課題.............................................................................................................. ○長谷川 隆則（日本ハム・中研）

9:48

2S-Aa03

未来タンパク資源の大量培養、スケールアップには何が必要か...................................................................................................................... ○長森 英二（大阪工大・院）

10:11

2S-Aa04

3D フードプリンターによる食品加工のブレイクスルー................................................. ○古川 英光 1,2, 小川 純 1,2, シブリ ナヒン 1,2, 渡邉 洋輔 1,2, 貝沼 友紀 1,2,

座長：長森 英二

臼井 昭子 1,2, 鳥羽 慶 1,2, 勢井 洋史 1,2, コースラ アジット 2（1 山形大院・理工, 2 山形大学ソフト＆ウェットマター工学研究室）
10:34

2S-Aa05

新規開発食品の社会受容について考える...................................................................................................................... ○石川 伸一（宮城大・食産）
おわりに........................................................................................................................................................ 長森 英二

10:57

A 会場 IB 大講義室（13:00～15:00）
創立 100 周年記念シンポジウム 生物工学の未来（2050 年）
第 4 回—メディカル・バイオエンジニアリングの将来展望—【本部企画】
はじめに........................................................................................................................................................ 青柳 秀紀

13:00

座長：上平 正道
13:02

2S-Ap01

注射不要の次世代経皮ワクチン創生に向けて.......................................................................................................................... ○後藤 雅宏（九大院・工）13:27

2S-Ap02

動物細胞を用いたバイオ医薬生産：次の 100 年にむけて............................................ ○大政 健史 1,2,3（1 阪大院・工, 2 次世代バイオ医薬品製造技術研究組合,
3

阪大・先導的学際研機構）
座長：本多 裕之

13:52

2S-Ap03

ビボ応答を完全に再現可能なインビトロ臓器は 2050 年に出来るか？
.......................................................................................................................... ○酒井 康行（東大院・工）14:17

2S-Ap04

未来(2050 年)を見据えた培養装置開発の現状.......................................................................................................................... ○石川 周太郎（エイブル）
座長：本多 裕之, 上平 正道

14:42

パネルディスカッション

B 会場 IB015 教室（9:00～11:00）
多様な生体分子を基盤とした分子ピタゴラ装置の創出【国際シンポジウム】
Development of Biomolecular-based Pythagorean Devices
9:00

Opening Remarks................................................................................................................................................Kohsuke Honda

36

座長：Kohsuke Honda
9:02

2S-Ba01

Engineering of halogenase and dehalogenase for sustainable technology............................... ○Pimchai Chaiyen（Vidyasirimedhi Institute of Science and Technology (VISTEC)）

9:27

2S-Ba02

Engineering RNA-based switches for gene expression control.................................................................................................... ○Keisuke Fukunaga（ELSI, Tokyo Tech）

9:47

2S-Ba03

Efficient design and construction of genetic parts and circuits.................................................................................... ○Jeong Wook Lee（Dept. Chem. Eng., POSTECH）

10:12

2S-Ba04

Development of energy harvesting devices by architect of bio- and macromolecules......................................................................................... ○Madoka Takai（Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo）

座長：Daisuke Kiga

座長：Tomoaki Matsuura
10:32

2S-Ba05

Engineering a Cell-free Platform for robust expression and functioning of membrane proteins in Artificial
Cell................................................................................. ○Kwanwoo Shin（Sogang University, Seoul , Korea）

10:57

Closing Remarks........................................................................................................................................... Tomoaki Matsuura

B 会場 IB015 教室（13:00～15:00）
未知の生命情報を獲得するためのバイオ分子ツールの設計と機能創出
座長：神谷 典穂
13:00

2S-Bp01

はじめに〜未知の情報を得るバイオ分子ツールについて〜.......................................................................................................................... ○山口 哲志（東大院・工）13:10

2S-Bp02

光るタンパク質と抗体の融合が拓く生細胞イメージングの世界.......................................................................................................... ○北口 哲也（東工大・化学生命研）

13:35

2S-Bp03

細胞運命を操作する人工受容体の設計.......................................................................................... ○河原 正浩（医薬基盤・健康・栄養研究所）

13:55

2S-Bp04

生命活動と連動して機能する人工バイオ分子の創出..................................................................................... ○神谷 典穂 1,2（1 九大院・工, 2 九大・未来化セ）

14:15

2S-Bp05

機能性タンパク質を創出する分子設計......................................................................... ○新井 亮一 1,2（1 信州大・繊維, 2 バイオメディカル研）

14:35

2S-Bp06嗅覚受容体の機能的発現と匂いセンサーへの利用..................................................... ○養王田 正文, 高山 郁美, 福谷 洋介, 吉井 智哉, 生田 昂, 前橋 兼三

座長：座古 保（農工大院・工）E 会場 ES ホール（9:00～11:00）
下面発酵酵母のすべてを理解するためにはじめに........................................................................................................................................................ 野田 陽一

9:00

座長：善本 裕之
9:02

2S-Ea01

薬剤に対する感受性を指標としたビール酵母の性質の解析.................................................................................................................. ○野田 陽一（東大院・農生科）

37

9:15

2S-Ea02

醸造特性に寄与する下面発酵酵母のゲノム構造変化.............................................................. ○高橋 朋子（アサヒクオリティーアンドイノベーションズ）
座長：野田 陽一

9:40

2S-Ea03

網羅的解析技術の活用による下面発酵酵母の醸造特性の解析.................................................................................................. ○善本 裕之（キリンホールディングス）10:05

2S-Ea04

下面ビール酵母の凝集性遺伝子の不安定性に関する研究..................................................... ○佐藤 雅英 1,2（1 サッポロビール, 2 価値創造フロンティア研究所）

10:30

2S-Ea05

下面ビール酵母が獲得したマルトース、マルトトリオースを資化する能力.......................................................................................... ○畠中 治代（サントリーホールディングス）座長：堀内 裕之

おわりに........................................................................................................................................................ 堀内 裕之

10:55

E 会場 ES ホール（13:00～15:00）
微生物炭素固定代謝の多様性に基づく合成生物学
はじめに........................................................................................................................................................ 阪井 康能

13:00

座長：阪井 康能
13:03

2S-Ep01

超好熱性アーキアの C1 代謝関連酵素.......................................................................................................................... ○跡見 晴幸（京大院・工）13:21

2S-Ep02

高濃度 CO2 と（超）好熱菌の中央代謝.............................................................................................................. ○布浦 拓郎（海洋研究開発機構）

13:46

2S-Ep03

Biohydrogen production from one carbon substrates using a hyperthermophilic archaeon, Thermococcus

座長：跡見 晴幸
onnurineus NA1....................................................................................................... Hyun Sook Lee 1,2, ○Sung Gyun Kang 1,2（1 Korea Institute of Ocean Science and Technology, 2 University of Science and Technology）
14:11

2S-Ep04

微生物電気化学を活用した CO2 資源化技術.................................... ○加藤 創一郎 1,2,3（1 産総研・生物プロセス, 2 北大院・農, 3 阪大院・基礎工）14:36

2S-Ep05

C1 微生物炭素固定反応による炭素資源利用とバイオ生産への応用................................................................................................... ○阪井 康能, 由里本 博也（京大院・農）おわりに........................................................................................................................................................ 跡見 晴幸

14:58

F 会場 ES021（9:00～11:00）
サーキュラーバイオエコノミーにむけたバイオものづくりの発展はじめに........................................................................................................................................................ 細川 正人

9:00

座長：細川 正人
9:02

2S-Fa01

バイオ・デジタルプラットフォームを活用した日本型バイオファウンドリ
...................................................................................................... ○近藤 昭彦（神戸大院・科技イノベ）

38

9:29

2S-Fa02

バイオものづくりを取り巻く動向と我が国の取組について.......................................................................................................................... ○石塚 大輔（経済産業省）
休憩

9:56

座長：近藤 昭彦
10:01

2S-Fa03

Industrial biotechnology as enabler for Circular Bio-economy................................................................................................. ○Carsten Mailand Hjort（Novozymes A/S）

10:28

2S-Fa04

未培養微生物ゲノムデータベースからの有用酵素探索............................................................................................................................○津田 宗一郎（bitBiome）
おわりに........................................................................................................................................................ 近藤 昭彦

10:55

F 会場 ES021（13:00～15:00）
データサイエンスと環境バイオテクノロジーの接点
はじめに............................................................................................................................................................ 簡 梅芳

13:00

座長：堀 知行
13:02

2S-Fp01

環境 DNA 観測とデータ駆動型アプローチで迫る生態系の複雑性.......................................................................................................... ○近藤 倫生（東北大院・生命科学）

13:27

2S-Fp02

生物叢の時空間動態と生物間相互作用ネットワーク...................................................................................................................... ○東樹 宏和（京大・生態研）

13:52

2S-Fp03

バイオプロセスインフォマティクスによる環境 DX................................................................................................................................................. ○菊地 淳 1,2,3,4

座長：簡 梅芳（1 理研・環境資源, 2 名大院・生命農, 3 横市院・生命医, 4 千葉大院・医）14:17

2S-Fp04

微生物コミュニティの統合的理解が拓く新しい産業廃水処理技術.................................................................................................................. ○堀 知行（産総研・環境創生）

14:37

2S-Fp05

データサイエンスが紐解く複合生物系による環境修復機構とその課題................................................................................................... ○簡 梅芳, 工藤 宏史（東北大院・環境）

座長：堀 知行おわりに........................................................................................................................................................ 金原 和秀

14:57

H 会場 ES024（9:00～11:00）
博士人材のためのキャリアパスシンポジウム【生物工学若手研究者の集い】
はじめに............................................................................................................................................................ 青木 航

9:00

座長：蟹江 慧9:05

2S-Ha01

私のキャリアパス 〜サイエンスと産業をつなぐ架け橋を目指して〜.................................................................................................................. ○渋田 真結（アステラス製薬）

9:20

2S-Ha02

琵琶湖を望む大学で小さな研究室を立ち上げた................................................................... ○石川 聖人 1,2（1 長浜バイオ大・バイオ, 2 JST・さきがけ）

39

座長：青木 航9:35

2S-Ha03

僕のキャリアーアカデミア.......................................................................................................................... ○菊川 寛史（北大院・工）9:50

2S-Ha04

代謝工学の研究者からデータサイエンティストの道へ.............................................................................................................................. ○徳山 健斗（中外製薬）

10:05

2S-Ha05

アカデミアパスを進むー医学系への転身、単身赴任留学に育児、そしてこれから...................................................................................................................... ○西田 奈央（早大・高等研）

座長：三浦 夏子

座長：青木 航10:20

2S-Ha06

工学系研究者が進む医療の道〜医工連携とその先へ〜.......................................................................................... ○佐藤 康史（旭川医大・先進医工学研究セ）

10:35

これからの「活躍の場」を語ろう（会場参加者からの質問を含めた総合討論）......................................................................................................................................................... 全講演者

10:55

おわりに
............................................................................................................................................................ 蟹江 慧

H 会場 ES024（13:00～15:00）
醸造・発酵の新たなブレークスルーに向けて【本部企画】
はじめに............................................................................................................................................................ 山田 翼

13:00

座長：秦 洋二
13:05

2S-Hp01

サントリーウイスキー次の 100 年に向けて.......................................................................................................................... ○栗原 勝範（サントリー）
座長：山田 翼13:35

2S-Hp02

クラフトビールを起点とした地域・企業との共創によるサステナビリティ事業の展開.................................................................................................................. ○茂田 一郎（アサヒユウアス）

14:00

2S-Hp03

未利用バイオマスのアップサイクルにおける醸造・発酵技術の活用.................................................................................................. ○杉本 利和（ファーメンステーション）

座長：章 超座長：安原 貴臣
14:25
14:50

2S-Hp04

データ駆動型のバイオ生産マネジメントシステム...................................................................................................................... ○河合 哲志（ちとせ研究所）
おわりに................................................................................................................................................................ 章 超

J 会場 オークマホール（9:00～11:44）
KSBB-BEST-SBJ ジョイントシンポジウム
第一部：酵素・微生物工学の新潮流【本部企画・国際シンポジウム】
Session 1: New Trends in Enzyme and Microbial Technology
9:00

Opening Remarks.................................................................................................................................................. Hideo Nakano

40

座長：Taizo Hanai
9:02

2S-Ja01

Enzyme studies and engineering by single molecule display system coupled with NGS and bioinformatics................................... ○Jasmina Damnjanović, Hideo Nakano（Grad. Sch. Bioagric. Sci., Nagoya Univ.）

9:22

2S-Ja02

Exploring a new biocatalyst for polyethylene biodegradation and its future directions............................. ○Soo-Jin Yeom（Sch. Biol. Sci. Techol., Chonnam National University, South Korea）

座長：Jasmina Damnjanović

座長：Soo-Jin Yeom
9:42

2S-Ja03

Utilization of genome information in enzyme industry................................................................. ○Hirotaka Matsubara（Amano Enzyme Inc. Innovation center.）

10:02

2S-Ja04

Enzyme-based biocatalysts for CO2 capture................................................................................................... ○Chang Sup Kim（Yeungnam University）

座長：Jasmina Damnjanović

10:22

Break
座長：Chang Sup Kim

10:42

2S-Ja05

Synthetic biology for microbial production........................................................................................ ○Taizo Hanai（Grad. Sch. Agric., Kyushu Univ.）
座長：Taizo Hanai

11:02

2S-Ja06

Towards carbon net zero using microalgae for high-value compounds............................................................................................ ○I-Son Ng（National Cheng Kung University）

11:22

2S-Ja07

Synthetic gene expression control systems in microorganisms......................................................... ○SangWoo Seo（Sch. Chem. Biol. Eng., Seoul National University）

座長：I-Son Ng

11:42

Closing Remarks................................................................................................................................................... SangWoo Seo

J 会場 オークマホール（13:00～15:00）
KSBB-BEST-SBJ ジョイントシンポジウム
第二部：動物細胞工学の最先端研究【本部企画・国際シンポジウム】
Session 2: Current Advances in Animal Cell Technology
13:00

Opening Remarks........................................................................................................................................... Kazuhito Fujiyama
座長：Kazuhito Fujiyama

13:02

2S-Jp01

Chimeric immune cells: Engineered to expand their therapeutic potentials........................................ ○Hee Ho Park（Dept. Bioeng., Coll. Eng., Hanyang Univ., Republic of Korea）

13:22

2S-Jp02

Expansion and differentiation of human hematopoietic stem cells for immunotherapy..................................................... ○Chao-Ling Yao（Dept. Chem. Eng., Natl. Cheng Kung Univ., R.O.C）

座長：Hee Ho Park

13:42

Break
座長：Chao-Ling Yao

13:52

2S-Jp03

Morphology-based quality control and intelligent process management for cell-based product manufacturing............................................................................. ○Ryuji Kato 1,2（1 Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ.,
2Inst. Nano-life Sys., Inst. Inov. Fut. Soc., Nagoya Univ.）
座長：Ryuji Kato

14:12

2S-Jp04

New medical solutions created by Cyfuse's innovative Bio-3D printing technology................................................................................................ ○Toshihiko Maekawa（Cyfuse Biomedical）

41

14:32

2S-Jp05

14:52

Improving CHO cells' energy metabolism using process engineering approaches............................................................................................................. ○Jong Youn Baik（Inha University）
Closing Remarks................................................................................................................................................ Jong Youn Baik

J 会場 オークマホール（16:00～18:00）
東南アジア国際シンポジウム–東南アジアにおけるバイオテクノロジーとバイオものづくりの今–【関西支部・国際シンポジウム】
International Symposium on Southeast Asia
–Current Status of Biotechnology and Biomanufacturing in Southeast Asia–
16:00

Opening Remarks................................................................................................................................................... Takao Ohashi
座長：Takao Ohashi

16:10

2S-Jp06

Engineering of Escherichia coli chromosome to generate plasmid-free strains which are capable ofproducing valuable compounds............................................................................................................................ ○Daisuke Koma（ORIST）

16:35

2S-Jp07

Biohydrogen and methane production process from biomass and hydrolysate of Chlorella sp. and Chlorella
sp. TISTR 8411....................................................................... ○Alissara Reungsang, Prawan Phanduang, Apilak Salakkam（Dept. Biotechnol., Khon Kaen Univ., Khon Kaen, Thailand）
座長：Yoshihiro Ojima

17:00

2S-Jp08

Engineering Saccharomyces cerevisiae as whole-cell biocatalysts for biochemical production...... ○Surisa Suwannarangsee, Kan Tulsook, Piyada Bussadee, Ngoentra Samnaknit, Verawat Champreda（BIOTEC, Thailand）
座長：Jun Ishii

17:25

2S-Jp09

Building a sustainable bioeconomy in Singapore through synthetic biology............................................................................................................................................ ○Matthew Chang（NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation, National University of Singapore）

17:50

Closing Remarks............................................................................................................................................... Yoshihiro Ojima

K 会場 オークマ講義室（9:00～11:00）
森も木も見る微生物研究：連携による集積知
開会の挨拶........................................................................................................................................................ 野村 暢彦

9:00

座長：阿座上 弘行
9:02

2S-Ka01

基礎から応用、サイエンスとテクノロジー、個と集団の微生物研究センター...................................................... ○野村 暢彦（筑波大・微生物サステイナビリティ研究センター）

9:25

2S-Ka02

バイオとデジタルの技術融合による先端バイオ工学研究プラットフォーム確立に向けた挑戦............ ○蓮沼 誠久 1,2,3（1 神戸大・先端バイオ工研セ, 2 神戸大院・科技イノベ, 3 理研・環境資源）

9:48

2S-Ka03

低温と嫌気―微生物の培養が切り拓くタンパク質研究の新展開....................................................................................................... ○渡邉 友浩, 福井 学（北大・低温研）

42

10:11

2S-Ka04

多様な智を繋ぐネットワーク形成：集積知で生きる個性.......................................................................................................... ○片岡 正和（信州大院・生命医工）

10:34

2S-Ka05耐熱性微生物の特性とそれを生かしたグリーンエネルギー技術開発............................................................................. ○山田 守 1,2（1 山口大院・創科, 2 山口大・中高温セ）
閉会の挨拶.................................................................................................................................................... 阿座上 弘行

10:57

K 会場 オークマ講義室（13:00～15:00）
合成生物学が切り拓く次世代型天然物創薬
座長：恒松 雄太
13:00

2S-Kp01

ケムバイオハイブリッド合成を利用した天然物創薬.............................................................................................................. ○恒松 雄太（名大院・生命農学）

13:20

2S-Kp02

I 型ポリケタイド合成酵素の精密改変による次世代天然物化学................................................................................................................... ○工藤 慧, 新家 一男（産総研）

13:40

2S-Kp03

創薬研究を指向した天然物の合成生物学研究...................................................................................................................... ○浅井 禎吾（東北大院・薬）14:00

2S-Kp04

未培養微生物の遺伝子獲得に向けたシングルセルゲノミクスの活用........................................................................................................................................... ○細川 正人 1,2,3,4,5（1 早大院・先進理工, 2 早大・ナノライフ創新研, 3 早大・生命動態研, 4 産総研・早大 CBBD-OIL,
5

14:30

2S-Kp05

bitBiome）

血栓溶解促進物質 SMTP の発見と脳梗塞治療薬開発............................................................................................. ○蓮見 惠司 1,2（1 ティムス, 2 農工大院・農）

一般講演

A 会場 IB 大講義室（15:30～17:42）【酵素学，酵素工学／タンパク質工学】
15:30

2Ap01
食,医

微生物由来トランスグルタミナーゼの有向進化のための一分子ディスプレイシステムの開発................................................ ○杉山 あい 1, ダムナニョヴィッチ ヤスミナ 1, 根本 直人 2, 中野 秀雄 1
（1 名大院・生命農学, 2 埼玉大学大学院・理工学研究科）

15:42

2Ap02
化,基

一分子ディスプレイ技術による D-アミノ酸オキシダーゼの有向進化プラットフォームの開発............................... ○池田 翔 1, 大嶽 七菜 1, ダムナニョヴィッチ ヤスミナ 1, 根本 直人 1, 中野 秀雄 2
（1 名大院・生命農学, 2 埼玉大学大学院 理工学研究科）

15:54

2Ap03
医,基

16:06

2Ap04 学環,農コレステロールオキシダーゼのダブルカイネティクアッセイ用酵素への機能改変.................................... ○山本 紗生 1, 外山 二卯佳 2, 西矢 芳昭 1,2（1 摂南大・理工, 2 摂南大院・理工）
放線菌 Cellulosimicrobium 属由来 GH family 19 Chitinase のキチン結合ドメインの機能解析.................................................................................... ○仁木 大輔 1, 美藤 友博 2, 清水 克彦 3, 有馬 二朗 2
（1 鳥取大院・連農, 2 鳥取大・農, 3 鳥取大・CoRE）

16:18

2Ap05
基

Geobacillus stearothermophilus 由来乳酸デヒドロゲナーゼの基質選択性に関わる残基の同定................................................................................ ○中村 百花 1, 山口 翔太郎 2, 下澤 勇弥 3, 西矢 芳昭 1
（1 摂南大院・理工, 2 摂南大・理工, 3 甲南化工）

16:30

休憩

43

16:42

16:54

2Ap06

Geobacillus kaustophilus 由来グリシンオキシダーゼのモバイルループおよびフラビン周辺残基が反基応性に与える影響......................................................... ○種田 瞳, 東浦 優希, 外山 二卯佳, 西矢 芳昭（摂南大院・理工）

2Ap07 学

ポリスチレン基板上でのバイオシリカ生成.......................................................... ○黒滝 智子, 中島 一紀, 直田 亮, 高野 力, 川崎 了（北大院・工）

環

17:06

2Ap08 学
化,医,環

17:18

2Ap09
食,化,医

17:30

2Ap10
医,環,農,基タンパク質安定性に依存しない高機能化酵素デザイン法の開発と応用.............................. ○小澤 洋樹, 海野 伊吹, 関根 遼平, 伊藤 創平, 中野 祥吾（静県大院・薬食生命）
柑橘植物由来フェニルアラニンアンモニアリアーゼの酵素特性解析............................................................................................... ○西川 優里, 大橋 貴生（摂南大院・理工）
大腸菌由来新規生体膜曲率認識タンパク質の探索と機能解析.................................................................... ○田中 祐圭, 三宅 貴大, 大河内 美奈（東工大・物質理工）

B 会場 IB015 教室（15:30～17:42）【酵素学，酵素工学／タンパク質工学】
15:30

2Bp01
医

質量顕微鏡を用いたマウスの脳におけるチロシン水酸化反応の可視化.............................................................................................. ○篠原 菜穂 1, 福崎 英一郎 1,2,3, 新間 秀一 1,2,3（1 阪大院・工, 2 大阪大学先導的学際研究機構, 3 大阪大学島津分析イノベーション協働研究所）

15:42

2Bp02 学化,医アンブレイン合成酵素の部位特異的変異による構造安定化・耐熱化..................................... ○山澤 友葉 1, 亀谷 太一 1, 久保田 智巳 2, 石川 一彦 2,3, 上田 大次郎 1, 佐藤 努 1（1 新潟大・自然研, 2 産総研, 3 松谷化学工業）

15:54

2Bp03
化

アンブレイン高生産に向けた進化工学系の構築........................................... ○上田 大次郎 1, 佐藤 諒 1, 藤井 明日香 1, 大谷 悠介 2, 梅野 太輔 3, 佐藤 努 1（1 新潟大・自然研, 2 千葉大院・工, 3 早大院・先進理工）

16:06

2Bp04
化

Finding new compounds via a predicted data mining approach..................................................... Jiumn-Yih Wu 1, Hsiou-Yuf Ding 2, Tzi-Yuan Wang 3, ○TeSheng Chang 4（1 Dept. Food Sci., National Quemoy University,2

Dept. Cosmet. Sci., Chia Nan University of Pharmacy and Science, 3 Biodiv. Res. Cen., Academia Sinica,
4

16:18

2Bp05 学
農

2Bp06
食,環,基

16:54

昆虫由来新規テルペン合成酵素の諸性質の解析と結晶化に向けた条件検討..................................................... ○平井 知愛, 上田 大次郎, 冨士川 成美, 佐藤 努（新潟大・自然研）
休憩

16:30
16:42

Dep. Biol. Sci. Tech., National University of Tainan）

2Bp07 学食

放線菌 Amycolatopsis sp. NT-119 株由来ホスファチジン酸ホスファターゼの機能解析...................................... ○杉森 大助 1, 岩崎 雄吾 2（1 福島大・共生システム理工, 2 中部大院・応生）
酢酸菌が保有するレバンスクラーゼのシグナルペプチド非依存的な分泌............................................................................. ○山下 璃貢 1, 片岡 尚也 1,2, 石川 森夫 3, 松谷 峰之介 4,Tippayasak Uraiwan 5, Theeragool Gunjana 5, 松下 一信 1,2, 藥師 寿治 1,2（ 山口大学・院創成科学, 2 山口大学・中高温微セ, 3 東京農大・応生, 4 東京農大・ゲノム,
1

5

17:06

2Bp08 学
食,化,医,基カセサート大学・理）

コドン単位の欠失、置換、挿入が可能な新規分子進化法の開発.......................................................... ○鶴 廣太郎 1, 岡野 憲司 2, 冨田 宏矢 3, 宮崎 健太郎 3, 本田 孝祐 3,4（1 阪大院・工, 2 関西大・化生工, 3 阪大・生工国際セ, 4 阪大・先導的学際研機構）

17:18

2Bp09 学
食,化,医,基17:30

2Bp10 学
食,医,環

大腸菌翻訳アレストを用いたペプチドタグの翻訳促進機構に関する研究..................................................... ○西河 佑馬, 藤川 璃子, 中野 秀雄, 加藤 晃代（名大院・生命農学）
シャペロン共発現によるマグネトソーム膜上の受容体活性の向上........................................................................................ ○巴 瞭斗, 田中 剛, 吉野 知子（農工大院・工）44

C 会場 IB014 教室（15:30～17:42）【タンパク質工学】
15:30

2Cp01
医,基

15:42

2Cp02 学基

Modular displaying of dengue envelope protein domain III (EDIII) on SpyTagged-Norovirus-like particles.............................. ○Jirayu Boonyakida, Enoch Y. Park（Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.）
全原子分子動力学計算による三量体接着タンパク質 AtaA の機械的安定性メカニズムの解析............................................................................................ ○笹原 純 1, 吉本 将悟 1, 藤本 和士 2, 堀 克敏 1
（1 名大院・工, 2 関西大・化生工）

15:54

2Cp03 学医

三量体型オートトランスポーターアドへシンの膜貫通ドメインを用いたナノポアの構築........................................................................... ○黄 泰賢 1, 吉本 将悟 1, 笹原 純 1, 川野 竜司 2, 堀 克敏 1
（1 名大院・工, 2 農工大院・工）

16:06

2Cp04
食,医,環

タンパク質の検出を指向した生体ナノポアのタンパク質工学的改変........................................................................................ ○藤田 友紀 1, 前田 泰一 1, 一柳 敦 1, 川野 竜司 2
（1 キッコーマン, 2 農工大院・工）

16:18

2Cp05

Rapid development of single fluorescent protein-based immunosensor Flashbody through ultra-high-医,基throughput screening and cell-free protein synthesis........... ○Bo Zhu 1, Zhirou Qiu 2, Keisuke Mizutani 3, Ken Kobayashi 3, Hiroshi Ueda 1, Tetsuya Kitaguchi 1（1 CLS, Tokyo Tech, 2 Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech, 3 Sch. Eng., Tokyo Tech）
休憩

16:30
16:42

2Cp06 学食,医

抗原抗体反応が抗体結合タンパク質によって阻害されることを利用した免疫センサーの開発............................................................... ○二宮 歩武 1, 銭 成 1, 安田 貴信 2, 朱 博 2, 上田 宏 2, 北口 哲也 2
（1 東工大・生命理工, 2 東工大・化生研）

16:54

2Cp07 学
環

17:06

2Cp08
食,化,医,環,農,基

ランタノイドセンサ開発を指向したペリプラズム Dispaly............................................................................ ○田中 琴葉, 関 貴洋, 梅野 太輔（早大院・先進理工）ペリプラズム Display システムを利用した環境依存性酵素の実験室進化...................................................................................... ○関 貴洋 1, 田中 琴葉 2, 木村 友紀 2, 梅野 太輔 1,2（1 早大・理工総研, 2 早大・先進理工）

17:18

2Cp09
食,環,基

哺乳類嗅覚受容体とグラフェンセンサーを使用したニオイ検出システムの構築..................................................... ○高山 郁美, 福谷 洋介, 吉井 智哉, 生田 昴, 前橋 兼三, 養王田 正文（農工大院・工）

17:30

2Cp10
環,基

コリン応答タンパク質への ヒ素応答性の付与................................................... 山口 諒 1, 山本 哲晃 2, 梅野 太輔 3, 神谷 克政 4, ○河合（野間） 繁子 5
（1 千葉大院・融合理工, 2 千葉大・工, 3 早大・先進理工, 4 神奈川工大・工, 5 千葉大院・工）D 会場 IB013 教室（15:30～17:42）【セル＆ティッシュエンジニアリング／生体医用工学】
15:30

2Dp01
医

間葉系幹細胞における細胞形態情報を用いた品質予測モデルのためのデータ拡張技術.................................................................................. ○木村 和恵 1, 田中 健二郎 1, 蟹江 慧 2, 加藤 竜司 1,3（1 名大院・創薬, 2 近大・工, 3 名大・ナノライフシステム研究所）

15:42

2Dp02
医

浮遊系細胞の細胞形態情報解析に向けたパイプラインの検証.................................................................................. ○久田 拓海 1, 蟹江 慧 2, 田中 健二郎 1, 加藤 竜司 1,3（1 名大院・創薬, 2 近大・工, 3 名大ナノライフシステム研）

15:54

2Dp03 学医

細胞培養におけるアンビエントインテリジェンスの可能性実証............................................. ○百瀬 賢吾 1, 椎名 健 1, 田中 健二郎 1, 竹本 悠人 1, 蟹江 慧 2, 加藤 竜司 1,3（1 名大院・創薬, 2 近大・工, 3 名大・ナノライフシステム研究所）

45

16:06

2Dp04
医,基

人工知能が識別したがん幹細胞を深層学習した人工知能の開発............................................... ○杉山 友康 1, 張 再軍 1, 石畑 宏明 3, 丸山 竜人 1, 笠井 智成 2, 亀田 弘之 3
（1 東京工科大・応生, 2 岡山大学・NTRC, 3 東京工科大・コンピューター）16:18

2Dp05 学
基

休憩

16:30
16:42

深層学習の動画像認識技術を用いた細胞機能評価システムの開発...................................................... ○増原 誠, 片岡 笙, 園井 理惠, 河邉 佳典, 上平 正道（九大院・工）2Dp06 学

ナノフィブリル化バクテリアセルロースを用いた CHO 細胞の浮遊培養における細胞死の抑制と抗医体生産性への影響...................... ○金子 瑛一郎 1, 辻崎 晴人 1, 藤原 政司 2, 安藤 英紀 3, 石田 竜弘 3, 谷 博文 2, 田島 健次 2
（1 北大院・総合化学, 2 北大院・工, 3 徳島大院・薬）

16:54

2Dp07
医

灌流培養法を利用した抗体生産バイオプロセスの高度化.................................................................................... ○岡本 棟悦 1, 加藤 宏明 2, 渋谷 啓介 3, 鬼塚 正義 4
（1 徳島大院・創成科学研究, 2 日立プラントサービス・イノベーション推進本部,
3

17:06

2Dp08
医

日立製作所・研究開発, 4 徳島大院・社会産理工）CHO 細胞における二重特異性 scFv 抗体の発現と分子特性評価........................................................................... ○福間 奈々子 1, 沖田 大和 1, 天羽 宏枝 2, 伊藤 洋一郎 3,
石井 純 3, 近藤 昭彦 4, 梅津 光央 5, 鬼塚 正義 2
（1 徳島大院・創成科学研究, 2 徳島大院・社会産理工, 3 神戸大・先端バイオ工研セ,
4

17:18

2Dp09
医

17:30

神戸大院・科技イノベ, 5 東北大院・工）次世代抗体生産トランスジェニックニワトリ作製へ向けた始原生殖細胞の開発.................................................................... 辻井 竜太郎, 奥嵜 雄也, ○西島 謙一（名大院・生命農学）

2Dp10

浮遊系 Human Embryonic Kidney cells 293 (HEK293)を用いたアデノ随伴ウイルス (AAV)ベクターの医生産..................................................... ○砂 和樹 1, 前田 将治 2, 金井 貴蓉 1,2, 山野-足立 範子 1,2, 大政 健史 1,2（1 阪大院・工, 2 MAB 組合）

E 会場 ES ホール（15:30～17:06）【植物細胞工学，組織培養，育種工学】
15:30

15:42

2Ep01

構の解明
.................................................................................................................. ○石原 慎也（岐阜大院・連農）

2Ep02 学

土壌細菌による根内細菌への影響....................................................................○佐々木 匠, Tran Thinh, 久保 幹（立命館大院・生命科学）

農

15:54

超高ホルムアルデヒド耐性細菌 Methylobacterium sp. FD1 株における C1 毒性および C1 代謝制御機

環

2Ep03
環,農,基

ダイズ根毛を対象とした一細胞レベルの根粒菌感染特異的遺伝子発現解析..............○蘇 千雅 1, 松永 浩子 2, Samuel Ashok Z. 2, 奥平 美里 2, 濱崎 英史 5, 松井 南 6, 竹山 春子 1,2,3,4（1 早大院・先進理工, 2 早大・ナノライフ創新研, 3 産総研・早大 CBBD-OIL, 4 早大・生命動態研,
5

16:06

2Ep04
医,基

16:18

2Ep05
食,環,農,基培地成分の改変による植物培養細胞における組換えタンパク質生産とその影響の評価......................................................... ○梶浦 裕之, 関野 七海, 三﨑 亮, 藤山 和仁（阪大・生工国際セ）
k-mer 法によるゲノム編集ジャガイモ中の外来核酸の検出............................................... ○安本 周平 1,2, 村中 俊哉 1,2（1 阪大院・工, 2 阪大・先導的学際研機構）
休憩

16:30
16:42

理研・環境資源, 6 横市大・木原生研）

2Ep06 学環,農側根形成を誘導する植物共生菌由来の低分子エフェクターの探索..................................................... ○松浦 大空, 小川 拓水, 岡澤 敦司, 太田 大策（大阪公立大・院農）

46

16:54

2Ep07
食,環,農

バイオマス増大・多蘖・大粒遺伝子を組合わせた超多収コシヒカリの種苗法による品種登録...................................................................................................... ○富田 因則（静大・グリーン科技研）

F 会場 ES021（15:30～17:30）【醸造学，醸造工学】
15:30

2Fp01
食

15:42

2Fp02
食

15:54

2Fp03
食

16:06

2Fp04
食,基

福島県オリジナル清酒酵母を用いたビール醸造方法の最適化............................................................................... ○中島 奈津子, 齋藤 嵩典（福島県ハイテクプラザ）
清酒酵母における EHL 遺伝子破壊株の諸性質..................................................... ○友永 佳津子, 渡邉 康太, 門倉 利守, 中山 俊一（東農大・応生科）
超高圧ホモジナイザーの清酒殺菌工程への応用........................................................................................... ○荒川 弦矢, 横井 健二（富山県食品研究所）
黄麹菌 Aspergillus oryzae の生育にリグニンが及ぼす影響.......... ○田中 拓未 1, 劉 利雲 1, 酒井 香奈江 1, 山下 秀行 2, Garrido Sharon Marie Bahena 3, 岩下 和裕 3,
楠本 憲一 1
（ 阪大院・工, 樋口松之助商店, 3 酒総研）
1

16:18

2

2Fp05

協会系酵母と系統の異なる清酒酵母に見られる 「老香」を発生させにくい特長への SAM 低蓄積の

食関与.................................................................. ○柴田 裕介 1, 山田 翼 1, 池田 優理子 2, 金井 宗良 2, 藤井 力 3,
赤尾 健 2, 五島 徹也 2, 磯谷 敦子 2, 高橋 俊成 1
（1 菊正宗酒造, 2 酒総研, 3 福島大）
休憩

16:30
16:42

2Fp06
食,化,環,基16:54

2Fp07 学
食細胞径および光学密度を用いた細胞密度の推定.............................................................................................. ○福田 展雄（産総研・バイオメディカル）
Tetragenococcus halophilus において自己凝集に必要なオペロンとその調節因子の同定.............................................................. 遠藤 隆平 1, ○堀田 詩織 2, 脇中 琢良 3, 茂木 喜信 3, 渡部 潤 1,2,3,4（1 福島大院・食農, 2 福島大・食農, 3 ヤマサ醤油, 4 福島大・食農・発酵研）

17:06

2Fp08
食

17:18

2Fp09
食

カナバニンを用いたアルギニンデイミナーゼ破壊株の育種.................................................... ○脇中 琢良 1, 渡部 潤 1,2, 茂木 喜信 1（1 ヤマサ醤油, 2 福島大・食農）
酢酸低生産性醤油乳酸菌の醸造特性解析.................................................................. ○樋口 敬太 1, 額川 裕矢 2, 脇中 琢良 1, 渡部 潤 1,2, 茂木 喜信 1
（1 ヤマサ醤油, 2 福島大・食農）

G 会場 ES022（15:30～17:30）【食品科学，食品工学】
15:30

2Gp01
食

Lactiplantibacillus plantarum PUK6 が生産する多成分バクテリオシンの生合成機構.......................................................... ○松田 明香里 1, 本田 絢郁 2, 河原 あい 2, 善藤 威史 3, 松崎 弘美 1,2（1 熊本県大院・環境共生, 2 熊本県大・環境共生, 3 九大院・農）

15:42

2Gp02 学食

たくあん漬から分離した乳酸菌 Lactococcus lactis PJR24 が生産するバクテリオシンの精製と特性................................................................................................... ○永田 妃奈子 1, 善藤 威史 2, 松崎 弘美 1,3（1 熊本県大院・環境共生, 2 九大院・農, 3 熊本県大・環境共生）

15:54

2Gp03 学
食,化,医新奇乳酸菌バクテリオシンの探索および構造・特性の解析...................................... ○田中 里緒菜, 庄野 陸太, 野見山 泰成, 中山 二郎, 善藤 威史（九大院・農）

47

16:06

2Gp04
食,医

ヒト大腸内細菌叢培養モデルの培地組成が菌叢構造の再現性に与える影響の検討........................................................... 佐々木 大介 1, 松木 泰 2, ○猪熊 健太郎 1, 新谷 知也 1, 近藤 昭彦 1（1 神戸大院・科技イノベ, 2 神戸大・戦略企画室）

16:18

2Gp05
食,医

ヒト腸内細菌叢培養モデルのハイスループット化と培養精度の検証........................................................... 佐々木 大介 1, 松木 泰 2, ○新谷 知也 1, 猪熊 健太郎 1, 近藤 昭彦 1（1 神戸大院・科技イノベ, 2 神戸大・戦略企画室）
休憩

16:30
16:42

2Gp06
食

Comprehensive metabolomics-based evaluation to improve tempe functional quality............................ ○Sastia Prama Putri 1,2, Marvin Nathanael Iman 1, Rafidha Irdiani 1, Della Rahmawati 1,4,
Made Astawan 5, Eiichiro Fukusaki 1,2,3（ Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ.,
1

3
4

16:54

Shimadzu Omics Innov. Res. Lab, Osaka Univ, Japan,

Dept. Food. Sci. Tech., Swiss German Univ. Indonesia, 5 Dept. Food. Sci. Tech., IPB Univ, Indonesia）

2Gp07 学

Sensory Evaluation and Metabolomics Approach to Reveal the Characteristics of Kopyor, Indonesian

食,農Unique Coconut............ ○Yunindanova Mercy Bientri 1, Sastia Prama Putri 1,2, Hengky Novarianto 4, Eiichiro Fukusaki 1,2,3（1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ., 3 Shimadzu Omics Innov. Res. Lab., Osaka Univ,
4

17:06

2Gp08
食

BRIN, Indonesia）

米発酵食品の乳化性の比較と米素材でつくる新たな乳化食品「米マヨネーズ」の開発.................................................................................... ○小林 和也 1, 奥原 宏明 1, 羽田 知由 2, 田中 美優 2
（1 新潟県農総研食研セ, 2 山崎醸造）

17:18

2Gp09
食

甘酒の摂取が腸内環境に及ぼす影響.............................................. ○岩井 空都, 野村 亮, 兒島 孝明, 志水 元亨, 加藤 雅士（名城大院・農）H 会場 ES024（15:30～17:30）【発酵生理学，発酵工学／代謝工学】
15:30

2Hp01 学

講演中止

15:42

2Hp02 学

コリネ型細菌のミコール酸生合成欠損変異株の性状解析........................................................................ ○須之内 愛, 岩井 伯隆, 和地 正明（東工大・生命理工）

食,医

15:54

2Hp03 学化,医キチン分解菌 Cellulosimicrobium sp. NTK2 の Mg 添加による分泌タンパク質の挙動.................................................................................... ○溝尻 怜史 1, 益江 広稀 1, 仁木 大輔 2, 有馬 二朗 3
（1 鳥取大院・持社創生, 2 鳥取大院・連農, 3 鳥取大・農）

16:06

2Hp04 学食,化

16:18

2Hp05 学食,医乳酸菌 Lactococcus lactis における環状ジアデニル酸の機能.............................................. ○甲斐 達己, 松原 未佳, 西村 聡子, 金岡 英徳, 飯島 信司（愛工大・工）
黄麹菌におけるアルギニン脱炭酸酵素遺伝子１（adc1）のアグマチン合成への関与.................................................. ○村上 優衣 1,2, 生田 宗一郎 1,2, 福田 青郎 1,2, 丸山 潤一 3,4, 藤原 伸介 1,2（1 関西学院大院・理工, 2 関西学院大・生命環境, 3 東大院・農生科, 4 東大 微生物連携機構）
休憩

16:30
16:42

2Hp06 学

細胞表層タンパク質は乳酸菌 Companilactobacillus alimentarius KH4 株におけるキシラン特異的な凝食,基集に関与する....................................................................................................... ○山本 万結 1, 矢野 嵩典 2, 三井 亮司 2,3（1 岡山理大院・理, 2 岡山理大・理, 3 岡山理大・生命）

16:54

2Hp07
環,基

好熱性水素細菌 Hydrogenobacter thermophilus の有する 2 つのスレオニン合成酵素ホモログ........................ ○亀谷 将史 1,2, 新井 博之 1,2, 石井 正治 1,2（1 東大院・農生科, 2 東大微生物連携機構）

48

17:06

2Hp08 学

Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213 が誘導生産する新規酵素エラグ酸ラクトナーゼの同定と機

食能解析.......................... ○片所 杏野 1, 渡邊 寛子 1, 工藤 眞丈 2, 中島 賢則 2, 山本 浩明 2, 小川 順 1, 岸野 重信 1
（1 京大院・農, 2 ダイセル・コーポレート研）

17:18

2Hp09 学食

Halomonas sp. KM-1 株の培養液中に蓄積する赤色タンパク質に関する研究................................................... ○月俣 太飛 1, 安藤 晃規 1, 小島 幹生 1, 勝矢 祥平 2, 坪田 潤 2, 小川 順 1（1 京大院・農, 2 大阪ガス）

I 会場 ES025（15:30～17:30）【発酵生理学，発酵工学／代謝工学】
15:30

2Ip01
化

酵母 Starmerella bombicola が生産する新規ソホロリピッド誘導体の構造解析................................................... ○小林 洋介 1, 李 秋実 1, 牛丸 和乗 2, 廣田 真 1, 森田 友岳 2, 福岡 徳馬 2
（1 アライドカーボンソリューションズ, 2 産総研・機能化学）

15:42

2Ip02 学基

メチロトローフ酵母 Komagataella phaffii GS115 における奇数鎖脂肪酸生産の最適化............................. ○Zhu Junzhang 1, 疋田 慶史 2, Cai Haoliang 1, 島田 昌也 1,2, 菊川 寛史 3, 中川 智行 1,2（1 岐阜大院・連農, 2 岐阜大・応生科, 3 静大・工）

15:54

2Ip03
基

油脂酵母 Lipomyces starkeyi の油脂生産開始前後での代謝状態変化の解析............................................................... ○岩倉 崇文 1, 清家 泰介 1, 岡橋 伸幸 1, 高久 洋暁 2, 松田 史生 1
（1 阪大院・情報, 2 新潟薬大・応生命）

16:06

2Ip04
食,化

油脂酵母 Lipomyces starkeyi 油脂生産関連因子 Snf1p の同定と油脂合成経路へ及ぼす効果.............................................................. ○佐藤 里佳子 1, 渡部 凌 1, 藤井 佑弥 1, 志田 洋介 2, 小笠原 渉 2,
石谷 孔司 3, 油谷 幸代 3, 荒 学志 1, 山崎 晴丈 1, 高久 洋暁 1
（ 新潟薬大・応生命, 2 長岡技科大, 3 産総研・生物プロセス）
1

16:18

2Ip05 学
食,化

油脂酵母 Lipomyces starkeyi におけるマロニル CoA 合成経路の強化による油脂生産性の改善................... ○河野 翔吾 1, 佐藤 里佳子 1, 荒 学志 1,2, 白井 智量 3, 相馬 悠希 4, 高橋 政友 5, 和泉 自泰 5,
馬場 健史 5, 石谷 孔司 6, 油谷 幸代 6, 荒木 秀雄 2, 山崎 晴丈 1, 高久 洋暁 1
（ 新潟薬大・応生命, 2 不二製油, 3 理研・環境資源, 4 九大院・農, 5 九大・生医研,
1

6

休憩

16:30
16:42

産総研・生物プロセス）

2Ip06
食,化

油脂酵母 Lipomyces starkeyi における油脂合成制御因子 LsSpt23p の C 末端領域の油脂蓄積への関与...................... ○樋口 裕太 1, 佐藤 里佳子 1, 荒 学志 1, 石谷 孔司 2, 油谷 幸代 2, 山崎 晴丈 1, 高久 洋暁 1
（1 新潟薬大・応生命, 2 産総研・生物プロセス）

16:54

2Ip07
食,化

油脂酵母 Lipomyces starkeyi における β 酸化経路の油脂蓄積への関与......................................... ○知野 颯稀 1, 佐藤 里佳子 1, 荒 学志 1,2, 荒木 秀雄 2, 山崎 晴丈 1, 高久 洋暁 1
（1 新潟薬大・応生命, 2 不二製油）

17:06

2Ip08 学
食,化

油脂酵母 Lipomyces starkeyi における脂肪酸合成酵素遺伝子の改変によるカカオバター様油脂の生産............................................. ○渡部 凌 1, 佐藤 里佳子 1, 荒 学志 1,2, 荒木 秀雄 2, 山崎 晴丈 1, 高久 洋暁 1
（1 新潟薬大・応生命, 2 不二製油）

17:18

2Ip09 学
食,化

油脂酵母 Lipomyces starkeyi における CRISPR/Cas9 による相同組換えの高効率化................................................................................. ○丸山 魁斗 1, 佐藤 里佳子 1, 荒 学志 1,2, 荒木 秀雄 2,
石谷 孔司 3, 油谷 幸代 3, 山崎 晴丈 1, 高久 洋暁 1
（1 新潟薬大・応生命, 2 不二製油, 3 産総研・生物プロセス）

49

K 会場 オークマ講義室（15:30～17:42）【遺伝子工学／分類，系統，遺伝学】
15:30

2Kp01
基

15:42

2Kp02
基

大腸菌の外膜小胞生産促進方法の検討................................................................................ ○尾島 由紘, 熊添 優希, 東 雅之（大阪公大院・工）大腸菌の外膜小胞高生産株 ΔrodZ の細胞表層構造解析................................................................... ○戸田 佳歩 1, 尾島 由紘 1, 田原 悠平 2, 宮田 真人 2, 東 雅之 1
（1 大阪公大院・工, 2 大阪公大院・理）

15:54

2Kp03 学基

16:06

2Kp04 学環,基16:18

2Kp05 学
農

好熱性繊維状ファージの複製及び水平伝播に関わる遺伝子の機能解析...................................... ○𠮷田 智美, 長岡 未久, 副島 春香, 藤野 泰寛, 土居 克実（九大院・生資環）
非病原性 Rhizobium vitis によるアシル化ホモセリンラクトン分解機構の解析と病原性阻害への応用..................................................... ○廣瀬 航希 1, 諸星 知広 1, 染谷 信孝 2（1 宇都宮大・工, 2 農研機構）
休憩

16:30
16:42

緑膿菌バイオフィルムのライフサイクルと膜小胞産生との連関解明.................................................... ○菅野 美月 1, 田代 陽介 1,2（1 静大・創科技院, 2 静大院・総合科技）

2Kp06 学環,基細菌集団の不均一な遺伝子発現状態を識別するための高感度な細菌 1 細胞 RNA-seq 手法の開発.............................................................................................. ○西村 美郁 1, 竹山 春子 1,2,3,4, 細川 正人 1,2,3,4（1 早大院・先進理工, 2 早大・ナノライフ創新研, 3 産総研・早大 CBBD-OIL, 4 早大・生命動態研）

16:54

2Kp07 学医,環未培養口腔細菌ゲノムから獲得したファージ由来分子を用いた特異的細菌標識ツールの開発.............................................................................................. ○岩井 直哉 1, 竹山 春子 1,2,3,4, 細川 正人 1,2,3,4（1 早大院・先進理工, 2 早大・ナノライフ創新研, 3 産総研・早大 CBBD-OIL, 4 早大・生命動態研）

17:06

2Kp08 学
食,基腸内細菌叢からのビフィズス菌の選択的回収系の確立............................................................. ○宮下 聖也, 吉田 佳鼓, 嶋田 みな, 前田 智也, 横田 篤, 吹谷 智
（北大院・農）

17:18

2Kp09
医,基

17:30

2Kp10
食,化,医,環,農,基

枯草菌を用いた長鎖 DNA 構築法........................ ○金子 真也 1, 相澤 康則 1,2（1 東工大・生命理工, 2 神奈川県立産業技術総合研究所）
合成生物学利用に向けた形質転換効率の低い細菌の遺伝子工学的改変.......................... ○石川 聖人 1,2, 堀 克敏 3（1 長浜バイオ大・バイオ, 2 JST・さきがけ, 3 名大院・工）L 会場 工 1 号館 121 教室（15:30～17:42）【生物化学工学／培養工学／バイオプロセス】
15:30

2Lp01
化,基

15:42

2Lp02 学環,農15:54

2Lp03 学
基

16:06

2Lp04
食,基

16:18

2Lp05
食,化,基

皮膚常在菌の採取方法の検討および分離微生物の培養特性....................................................................................................... ○多賀 直彦, 福田 裕斗（東海大・農）
カブトムシ幼虫の成長促進に関与する腸内細菌の探索と特性評価............................................................................ ○八代 祐典, 浅野 風斗, 児玉 浩明（千葉大院・園芸）
ウグイス糞の諸特性と皮膚常在菌に及ぼす影響の解析..................... ○齋藤 愛弥 1, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大院・生物資源科学学位 P, 2 筑波大・生命環境系）
木桶を用いた醤油醸造環境中の細菌群集構造の解析と培養化..... 松﨑 大典 1, ○三木 夏凛 1, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大院・生物資源科学学位 P, 2 筑波大・生命環境系）
食品添加物が腸内細菌やモデル複合系に及ぼす影響の解析（第 3 報）................................................................................. 芦沢 紬希 1, ○鈴木 大斗 2, 桃井 玲香 2, 青柳 秀紀 1,2,3（1 筑波大院・生物資源科学学位 P, 2 筑波大・生物資源, 3 筑波大・生命環境系）
休憩

16:30
16:42

2Lp06
医,農,基

バクテリオファージを用いた微生物菌叢の減算的改変............................................................................ ○岡野 憲司, 田中 友樹, 岩木 宏明（関西大・化生工）

50

16:54

2Lp07 学
食,化,医,環,基17:06

CRISPR 転写活性化システムによる微細藻類クラミドモナスでの遺伝子発現増強................................................................................ ○宮副 こころ, 河邉 佳典, 上平 正道（九大院・工）2Lp08

ヒト消化管ストレスに耐性を有するプロバイオティクスの新規な評価・選抜・取得法の開発 （第 2

食,医,基

報）
..................................... ○小澤 拓真 1, 髙津 あゆみ 1, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大院・生物資源科学学位 P,
2

17:18

2Lp09
化,医

筑波大・生命環境系）

低分子抗体生産に向けた枯草菌技術の開発................................................................... ○東條 卓人, 西口 大貴, 井上 英俊, 和田 真由美, 大浦 智之,
壺井 雄一, 川原 彰人, 小山 伸吾, 影山 泰, 瀧村 靖
（花王）

17:30

2Lp10 学医

組換え大腸菌の高密度培養による単鎖抗体の効率的生産................................................................ ○山口 大介, 熊田 陽一, 堀内 淳一（京工繊大院・工芸科学）

M 会場 工 1 号館 131 教室（15:30～17:42）【生物化学工学／培養工学】
15:30

2Mp01 学

複合微生物工学アプローチによるバイオプロセス制御：メタ連続発酵における pH が細菌叢と有機化,環酸生産性に及ぼす影響の解明............................................................ ○古閑 友紀 1, 宮本 浩邦 2,3,4, 酒井 謙二 1, 大城 麦人 1, 田代 幸寛 1
（1 九大院・生資環, 2 千葉大・園芸, 3 理研・生命医科学, 4 サーマス）

15:42

2Mp02 学
食,医,基

15:54

2Mp03
化,医,環,農,基新規共培養システムを用いた酪酸産生菌とモデル腸上皮細胞との相互作用の解析............................. ○梅原 嘉宏 1, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大院・生命農学学位 P, 2 筑波大・生命環境系）
ゲル微粒子（GMD）の凝集培養法を使用した未培養・難培養性細菌の可培養化と分離方法の構築......................................................... ○下村 有美, 山本 明菜, 鈴木 陸太, 加藤 節, 中島田 豊, 青井 議輝（広島大院・統合生命科学）

16:06

2Mp04
環

16:18

2Mp05
食,化,医

2Mp06 学
食,化,医

16:54

2Mp07
食,化

17:06

2Mp08
食,化,医,環,農,基

17:18

17:30

新規解析方法を適用した深層学習による培地スクリーニング手法の開発..................................................... ○渡辺 一樹 1, 邱 泰瑛 2, 小西 正朗 2（1 北見工大院・工, 2 北見工大）
休憩

16:30
16:42

培地非照射型の新規な光照射培養法の開発..... ○塚田 銀志 1, 石井 湧大 1, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大院・生物資源科学学位 P, 2 筑波大・生命環境系）

酵母エキスとトリプトンの網羅的な定量分析を活用した新たな合成培地設計戦略..................................................... ○中島 拓都 1, 邱 泰瑛 2, 小西 正朗 2（1 北見工大院・工, 2 北見工大）
機械学習と機器分析を用いた微生物培地の分析と改良.............................................................................................................................. ○小西 正朗（北見工大）
動物細胞培養に用いる薄膜型レシオメトリック蛍光 pH センサ.................................................. ○小山 純弘, 神谷 美欧, 菊地 駿斗, 青木 崇, 石川 周太郎（エイブル）

2Mp09 学

Photoresponsive cell-trapping and photodegradable hydrogel layers for image-based single-cell sorting and医analysis............................○Xueyang Li, Satoshi Yamaguchi, Akimitsu Okamoto（Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo）

2Mp10

接種工程機械化のための細胞接着挙動に対する操作温度の影響評価....................... ○幡多 徳彦 1,3,4, 高野 温 1,3,4, 張本 乾一 2,3,4, Ang Kai Torng 3, 宮本 風俊 3, 紀ノ岡 正博 3,4

医（1 ローツェライフサイエンス, 2 ローツェ, 3 阪大院・工, 4 阪大院・工・細胞製造コトづくり拠点）

51

N 会場 工 1 号館 132 教室（15:30～17:42）【環境浄化，修復，保全技術／環境工学，廃水処理技術／バイオマス，資源，エネルギー工学】
15:30

2Np01
環

15:42

2Np02
化,環,農

15:54

2Np03
環

接着性のコントロールが可能なイガイ由来タンパク質によるマイクロプラスチックの回収........................................○中島 一紀, Pilakka Veedu Anju, 佐藤 岳大, 高野 力, 川崎 了（北大院・工）Development of a new surface display system on Chlamydomonas reinhardtii for PET degradation............................................. ○Shen-Long Tsai（National Taiwan University of Science and Technology）
深海模擬環境でのバイオナイロン分解実験における圧力依存的微生物群集構造.................................. ○若井 暁 1, 塚谷 京 1, 磯部 紀之 1, 野牧 秀隆 1, Asif Ali Mohammad 2, 金子 達雄 2
（1 海洋研究開発機構, 2 北陸先端大・マテリアル）

16:06

2Np04
環

生分解性バイオプラスチック LAHB 分解に伴う河川水細菌叢への影響................................................................... ○門屋 亨介 1, 曽我 瞳 1, 松田 美樹 1, 佐藤 道夫 2, 田口 精一 3
（1 椙山女学園大・生活科学, 2 明治大・農, 3 神戸大院・科技イノベ）

16:18

2Np05
化,環

休憩

16:30
16:42

2Np06 学環

16:54

ハイスループットスクリーニング法を用いたポリマー分解微生物の探索と評価......................................................................... ○高屋 朋彰, 島田 健太, 田谷 明香, 西井 圭（小山高専）
Ralstonia sp. C16 株による低温環境における土壌中 PHB フィルムの分解に関する研究....................................................................................... ○寺山 拓臣, 張 傛喆（室工大院、環境創生工）

2Np07

酵母 Pseudozyma antarctica のエステラーゼ PaE による、畑に展張したポリブチレンアジペートテレ

化,環,農

フタレート PBAT 配合生分解性プラスチック製農業用マルチフィルムの分解加速.......................................................... ○北本 宏子 1, 小板橋 基夫 1, 山下 結香 1, 植田 浩一 1, 竹内 明彦 1,
渡部 貴志 1, 佐藤 俊 2, 雑賀 あずさ 2, 福岡 徳馬 2
（1 農研機構・農環研, 2 産総研・機能化学）

17:06

2Np08
化,環,基

麹菌 Aspergillus oryzae による耐熱型 PET 分解酵素の発現................................. ○戸所 健彦 1, 伊出 健太郎 1, 佐貫 理佳子 2,3, 河野 恵美 2, 吉田 昭介 2, 石田 博樹 1
（1 月桂冠・総研, 2 奈良先端大・バイオ, 3 京工繊大・工芸科学）

17:18

2Np09
環

17:30

2Np10
化

組換え水素細菌の pH-stat ジャー培養による CO2 からの P(3HB-co-3HHx)生産..................................... ○田中 賢二 1, 折田 和泉 2, 福居 俊昭 2（1 近大・産理工, 2 東工大・生命理工）
下水とチーズホエーを使用した PHB の製造.......................................................................................................... ○張 傛喆（室工大院、環境創生工）

O 会場 工 1 号館 142 教室（15:30～17:42）【バイオマス，資源，エネルギー工学／環境浄化，修復，保全技術】
15:30

2Op01 学環

アルコール生産を目的とした Clostridium 属細菌のスクリーニング........................................................................... ○大土 光経, 鶴貝 龍聖, 中島 美咲, 三好 怜, 園部 裕也,
城代 隆貴, 志村 英則, 有谷 博文, 秦田 勇二（埼玉工大・工）

15:42

2Op02
化,環

熊本から分離した高温耐性出芽酵母のゲノム解析.................................................................................... 浜口 愛勇生 2, 大寺 史織 1, 田口 久貴 1, ○笹野 佑 1（1 崇城大・生物生命, 2 崇城大院・工）15:54

2Op03 学
食,化

16:06

2Op04
食,化,医

新奇 Spathaspora 属酵母によるペントース発酵................................................................................ ○浜口 愛勇生, 田口 久貴, 笹野 佑（崇城大院・工）凝集性酵母との共培養によるキシリトール発酵の効率化............................................. ○山脇 大輝, 東野 恭明, 熊田 陽一, 堀内 淳一（京工繊大院・工芸科学）

52

16:18

2Op05 学
化,環,基耐熱性酵素による海藻多糖 β-1,3-キシランの酵素糖化.............................. ○梶 蒼依 1, 田中 咲衣 2, 石黒 早紀 2, 西山 千遥 1, 仲山 英樹 3, 原 清敬 4, 岡﨑 文美 1
（1 三重大院・生資, 2 三重大・生資, 3 長崎大院・水産環境, 4 静県大・食栄）
休憩

16:30
16:42

2Op06 学化

代謝改変 L. plantarum を用いた未利用バイオマスの同時糖化発酵による低コスト D-乳酸生産........................................... ○久保 早友理 1, 熊田 陽一 1, 堀内 淳一 1, 岡野 憲司 2, 近藤 昭彦 3, 田中 勉 3（1 京工繊大院・工芸科学, 2 阪大院・工, 3 神戸大院・工）

16:54

17:06

2Op07

糖化酵素生産菌 Talaromyces cellulolyticus における転写因子 Hap complex の遺伝子発現制御に関す化る解析.............................................................................................. ○藤井 達也, 森田 友岳（産総研 機能化学）

2Op08

メディエーターの色の変化を指標にした大腸菌燃料電池の高出力化に適した変異株のスクリーニ

環,基ング........................................................................... ○藤平 萌 1, 尾島 由紘 1, 駒 大輔 2, 大本 貴士 2, 東 雅之 1
（1 大阪公大院・工, 2 大阪技術研）

17:18

2Op09

硫酸還元細菌 Cupidesulfovibrio sp. HK-II 株における新規 PilA と cytochromes を介した細胞外電子伝環達機構................................................................................. ○川島 京介 1, 窪野 一郎 1, 池内 元太 2, 二又 裕之 1,3,4（1 静大院・総合科技, 2 静大・工, 3 静大・創科技院, 4 静大・グリーン科技研）

17:30

2Op10 学環,基大腸菌における金属硫化物半導体形成能の強化と光駆動水素生産への応用............................................. ○山本 真帆 1, 篠原 優佳 1, 本田 裕樹 1, 渡邊 源規 2, 石原 達己 2,3, 藤井 浩 1（1 奈良女大・理, 2 九大・I2CNER, 3 九大院・工）53

ランチョンセミナー（11:30～12:30）
B 会場 IB015 教室
株式会社島津製作所

2L-B01

D 会場 IB013 教室
株式会社テクノスルガ・ラボ

2L-D01

G 会場 ES022
ブルカージャパン株式会社

2L-G01

I 会場 ES025
2L-I01

辻󠄁製油株式会社

学生のための企業研究セミナー（18:00～19:00）
E 会場 ES ホール
2C-E01

東洋紡株式会社

F 会場 ES021
2C-F01

花王株式会社

G 会場 ES022
2C-G01 共立製薬株式会社

H 会場 ES024
2C-H01 三菱ケミカル株式会社

I 会場 ES025
2C-I01

三和澱粉工業株式会社

54

第 3 日（9 月 5 日）
学 が表示されている一般講演は学生優秀発表賞の審査対象となる発表です．

開始時間

講演番号
研究アウトプット項目

演

発表者氏名（所属）題○印は講演者を示す

シンポジウムA 会場 IB 大講義室（9:00～11:00）
高分子医薬品モダリティーの創薬と製剤を加速する未踏分析技術へのグローバルな挑戦
座長：馬場 健史
9:00

3S-Aa01

バイオテクノロジーを駆使して製造されるバイオ医薬品やウイルスベクターの分析における現状と展望.............................................................................................................................. ○内山 進（阪大院・工）9:20

3S-Aa02

CD を中心とした分光分析技術によるタンパク質分析......................................................................... ○大山 泰史, 鈴木 仁子, 山根 愛, 赤尾 賢一（日本分光）

9:35

3S-Aa03

組換え抗体生産アップストリームプロセスの課題と今後...................................................................................................... ○鬼塚 正義（徳島大院・社会産理工）
座長：松田 史生

9:55

3S-Aa04

分光技術を用いた生体分子の分析とプロセスモニタリング.............................................................................................................................. ○若林 慧（堀場製作所）

10:10

3S-Aa05

MAXS 法で観察する抗体のコンフォメーションから考えられる構造と機能の関係.................................................................. ○松本 崇 1, 佐藤 瑛美 2, 亀山 良貴 2, 小薗 拓馬 2, 殿塚 隆史 2,
佐藤 孝 1, 長谷川 智一 1, 神田 浩幸 1, 西河 淳 2（1 リガク, 2 農工大）座長：松田 史生，馬場 健史
総合討議

10:25

B 会場 IB015 教室（9:00～11:00）
セルインダストリー発展に向けた細胞製造工学の進化 ～世界をリードする細胞製造を目指して～
座長：堀江 正信
9:00

3S-Ba01

細胞製造工学の産業化から学問体系の構築に向けて.............................................................................................. ○宮本 義孝（国立成育医療研究センター）

9:04

3S-Ba02

再生医療に資する細胞製造性を基盤とした製造システムの構築..................... ○紀ノ岡 正博 1,2（1 阪大院・工・生物工学, 2 阪大院・工・細胞製造コトづくり拠点）

9:32

3S-Ba03

臨床用自家 iPS 細胞の製造 〜閉鎖型自動培養装置を用いたチャレンジ〜....................................................................................................................... ○塚原 正義（京大 iPS 財団）

55

座長：宮本 義孝
10:00

3S-Ba04

細胞製品製造とクオリティ・バイ・デザイン（QbD）.......................................................................................................... ○川崎 ナナ（横市大院・生命医科）

10:28

3S-Ba05

培養肉などの動物細胞培養を民主化する技術：ウェットウェアプラットフォームの開発と可能性...................................................................................................... ○川島 一公（インテグリカルチャー）

10:56

3S-Ba06

細胞製造工学の多様性と将来展望の考察.......................................................................................................................... ○堀江 正信（京大・環安）

E 会場 ES ホール（9:00～11:00）
データ駆動型研究が導く未培養微生物（微生物ダークマター）の開拓と展望
はじめに.................................................................................................................................................... 堀之内 貴明

9:00

座長：堀之内 貴明
9:03

3S-Ea01

データ駆動型アプローチによるダークマター微生物解析............................................................................................................................................... ○岩崎 渉 1,2,3,4,5（1 東大院・新領域, 2 東大院・理, 3 東大・大海研, 4 東大・定量研, 5 東大・微生物イノベ連携研）

9:28

3S-Ea02

マイクロバイオーム研究を先導するハブとなる統合データベース Microbiome Datahub の開発...................................................................................................................................... ○森 宙史（遺伝研）

9:53

3S-Ea03

廃水処理微生物群の生態と機能をメタゲノム情報から解き明かす.......................................................................................................... ○成廣 隆（産総研・生物プロセス）

10:18

3S-Ea04

バイオレメディエーションにおける未培養微生物の活用.................................................................................................................................. ○高畑 陽（大成建設）

座長：青柳秀紀

座長：堀之内 貴明，青柳 秀紀
パネルディスカッション

10:43

F 会場 ES021（9:00～11:00）
リグニンの利用に向けたホワイトバイオテクノロジーの潮流
はじめに........................................................................................................................................................ 園木 和典

9:00

座長：園木 和典
9:02

3S-Fa01

リグニンとその化学構造の紹介.................................................................................................................. ○秋山 拓也（東大院・農生科）

9:18

3S-Fa02

生合成経路の制御がリグニンの化学構造と木材の加工性にもたらす効果................................................................................................................ ○梶田 真也（農工大院・BASE）

9:34

3S-Fa03

リグニン由来の多様な芳香族化合物の変換に関わる細菌の代謝システム.......................................................................................................................... ○政井 英司（長岡技科大）9:50

3S-Fa04

リグニンの微生物変換によるバイオプラスチック原料 2-ピロン 4,6-ジカルボン酸（PDC）の生産と高分子材料開発....................................... ○中村 雅哉 1, 大塚 祐一郎 1, 荒木 拓馬 1, 鈴木 悠造 1, 上村 直史 2, 政井 英司 2
（1 森林総研, 2 長岡技科大）

10:06

休憩

56

座長：上村 直史
10:10

3S-Fa05

リグノセルロースの三成分分離と単環芳香族化合物の製造プロセス.............................................................................................................. ○吉川 琢也（帯畜大・環境農学）

10:26

3S-Fa06

リグニンからの芳香族ポリマー原料の選択的生産...................................................................................................................... ○園木 和典（弘前大・農生）

10:42

3S-Fa07

バガスアルカリ抽出液中のリグニン成分とその産業利用............. ○栗原 宏征 1, 舩田 茂行 1, 南野 淳 2（1 東レ, 2 セルロシック・バイオマス・テクノロジー）
おわりに........................................................................................................................................................ 政井 英司

10:58

H 会場 ES024（9:00～11:00）
酵母という生き物～生態学的ふるまいとその多様性の理解に向けてはじめに........................................................................................................................................................ 渡辺 大輔

9:00

座長：渡辺 大輔
9:03

3S-Ha01

ショウジョウバエ体内における酵母の多様性と生態................................ ○清家 泰介 1,2,3（1 阪大院・情報, 2 阪大・先導的学際研機構, 3 理研・生命機能）
座長：清家 泰介

9:22

3S-Ha02

分裂酵母を使った性分化制御機構の解析................................................................................................................... ○大坪 瑶子, 山下 朗（基生研）

9:41

3S-Ha03

海に生息する黒色酵母が示す表現型可塑性.................................................................................................................. ○五島 剛太（名大・菅島臨海）

座長：渡辺 大輔

座長：清家 泰介
10:00

3S-Ha04

森林に潜む酵母...................................................................................................... ○遠藤 力也（理研・バイオリソース）

10:19

3S-Ha05

南極と北極に住む酵母の極限環境への驚くべき適応能............................................................................. ○辻 雅晴 1,2（1 旭川工業高等専門学校, 2 国立極地研）

座長：渡辺 大輔

座長：清家 泰介
10:38
10:57

3S-Ha06

発酵環境における酵母たちの相互作用.......................................................................................................... ○渡辺 大輔（奈良先端大・バイオ）
おわりに........................................................................................................................................................ 清家 泰介

J 会場 オークマホール（9:00～11:00）
INTPART-MISC 国際ジョイントシンポジウム【INTPART-MISC 共催・国際シンポジウム】
INTPART-MISC International Joint Symposium
座長：Shogo Yoshimoto
9:00

Opening Remarks................................................................................................................................................ Katsutoshi Hori

57

9:05

3S-Ja01

Trimeric autotransporter adhesins: structure, function, evolution................................................................................................. ○Dirk Linke（Dept. Biosci., Univ. of Oslo）

9:45

3S-Ja02

Methods and assays to study protein transport in vitro................................................... ○Enguo Fan（Peking Union Med. Coll./Chinese Academy of Med. Sci.）

10:25

3S-Ja03

Analysis of fish epidermal bacteriota for the development of novel disease control methods in aquaculture....... ○Hajime Nakatani 1, Fumiyoshi Okazaki 2, Tomoko Arakawa 1, Dien Anggorowati 4, Khairul Anam 3,
Dwi Susilaningsih 3, Yutaka Tamaru 2, Katsutoshi Hori 1（1 Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2 Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ., 3 RC-AM, BRIN, 4 RC-MLB, BRIN）

10:55

Closing Remarks............................................................................................................................................. Shogo Yoshimoto

J 会場 オークマホール（13:00～15:00）
INTPART-MISC 国際ジョイントシンポジウム【INTPART-MISC 共催・国際シンポジウム】
INTPART-MISC International Joint Symposium
13:00

Opening Remarks.............................................................................................................................................. Hajime Nakatani
座長：Hajime Nakatani

13:02

3S-Jp01

Loading cargo and messaging by bacterial extracellular vesicles............................................................ ○Hanne C Winther-Larsen 1, Petter Langlete 1, Anders Krabberoed 2（1 Dept. Pharm., Univ. of Oslo, 2 Dept. Biosci., Univ. of Oslo）

13:42

3S-Jp02

Using Escherichia coli as a model to test Helicobacter pylori urease inhibitors.............................. ○Marta Sanz Gaitero 1, Eva Mariana de Sousa Cunha 1, Dirk Linke 2, Hartmut Luecke 3（1 Structural Biology and Drug Discovery group, Centre for Molecular Medicine Norway, Univ. of Oslo,2

Dept. Biosci., Section for Genetics and Evolutionary Biology, Univ. of Oslo, 3 Dept. Physiol., Biophys.,Univ. of California, Irvine）

14:02

3S-Jp03

Chemical decontamination strategies for treating peri-implant diseases - using an in vitro dental pellicle-,
and a multispecies biofilm model........................................................................... ○Badra Hussain 1, Havard Jostein Haugen 1, Roger Simm 2（1 Dept. Biomater., Inst. Clin. Dent., Univ. of Oslo, 2 Inst. Oral Biol., Fac. Dent., Univ. of Oslo）

14:22

3S-Jp04

Experimental and computational approaches to the molecular characterization of a bacterial adhesin protein................................................................ ○Katsutoshi Hori, Jun Sasahara, Amane Kato, Shogo Yoshimoto（Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.）

14:52

Closing Remarks................................................................................................................................................ Katsutoshi Hori

K 会場 オークマ講義室（9:00～11:00）
無細胞タンパク質合成系の新展開：ラボからインダストリーへ
はじめに........................................................................................................................................................ 加藤 晃代

9:00

座長：中野 秀雄
9:02

3S-Ka01

再構成型無細胞タンパク質合成系（PUREfrex）で何ができるか？
.............................................................................................................. ○金森 崇（ジーンフロンティア）

58

9:27

3S-Ka02

翻訳促進ペプチドの開発とバイオモノづくりへの応用........................................................................................... ○加藤 晃代, 中野 秀雄（名大院・生命農学）
座長：ダムナニョヴィッチ ヤスミナ

9:42

3S-Ka03

進化工学のための再構成型無細胞翻訳系開発とその産業応用....................................................................... ○根本 直人 1,2（1 埼玉大, 2 Epsilon Molecular Engineering）
休憩

10:07

座長：加藤 晃代
10:15

3S-Ka04

In vitro molecular display for enzyme evolution.......................................................................... ○Jasmina Damnjanović 1, Naoto Nemoto 2, Hideo Nakano 1（1 Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2 Grad. Sch. Sci. Eng., Saitama Univ.）
座長：ダムナニョヴィッチ ヤスミナ

10:30

3S-Ka05

TRAP 提示法による人工抗体・環状ペプチドの創製......................................................................... ○村上 裕 1,2（1 名大院・工, 2 名大・未来社会創造機構）
おわりに.................................................................................................................... ダムナニョヴィッチ ヤスミナ

10:55

一般講演

A 会場 IB 大講義室（13:00～16:36）【酵素学，酵素工学／タンパク質工学】
13:00

3Ap01
化

13:12

13:24

3Ap02 学

海洋生分解性プラスチックを分解する酵素 PhaZ の異種発現系構築 および分解活性測定方法の検討

環について............................................................................ ○柿沼 亜望, 三浦 夏子, 片岡 道彦（大阪公大院・農）3Ap03 学

祖先型トリプトファン合成酵素を用いた L-Trp 誘導体合成系の確立.................................. ○大畑 実咲, 宮田 梓, 伊藤 創平, 千菅 太一, 中野 祥吾（静県大院・薬食生命）

化

13:36

酵素集合体形成による Violacein 生合成経路におけるフラックス調節........................................................................ ○伊藤 里緒子, 三浦 夏子, 片岡 道彦（大阪公大院・農）3Ap04 学環

ハイドロゲルビーズと無細胞タンパク質合成を用いた迅速酵素選抜系の構築.............................................................. ○折田 兼成 1, 大川 優生 1, 徳王 亮太 1, 南畑 孝介 1, 神谷 典穂 1,2（1 九大院・工, 2 九大・未来化セ）

13:48

3Ap05
基

新規人工酵素 Syn-F4 エンテロバクチンエステラーゼの X 線結晶構造解析............................................... 栗原 航大 1, 梅澤 公二 2,3, Donnelly Ann 4, Hecht Michael 4, ○新井 亮一 1,3（1 信州大・繊維, 2 信州大・農, 3 信州大・バイオメディカル研, 4 プリンストン大・化）
休憩

14:00
14:12

3Ap06
化,環,基

14:24

3Ap07 学
化,医,基

14:36

3Ap08 学基酵素の基質特異性決定残基の同定におけるロジスティック回帰モデルの有用性.................................................. ○二井手 哲平, 杉木 創, 森 聖也, 戸谷 吉博, 清水 浩（阪大院・情報）
進化と構造の情報を組み込んだ酵素の耐熱化デザイン............................................................. ○宮脇 佳汰, 二井手 哲平, 戸谷 吉博, 清水 浩（阪大院・情報）
形式概念分析と機械学習を用いた異種発現タンパク質の可溶性メカニズムの解明........................................... ○北條 佑斗 1, 鈴木 皓大 1, 榊原 一紀 3, 中村 正樹 3, 松井 大亮 2, 浅野 泰久 3
（1 富山県大院・工, 2 立命館大・生命科学, 3 富山県大・工）14:48

3Ap09 学基

統計解析を用いた L-アミノ酸酸化酵素の異種可溶性発現量の向上....................................................................... ○中原 歩汰 1, 河野 愛 2, 豊竹 洋祐 2, 若山 守 2, 松井 大亮 2
（1 立命館大院・生命科学, 2 立命館大・生命科学）

59

15:00

3Ap10 学基

酵素による D-アミノ酸誘導体の One-pot 合成............................................................... ○城間 一輝 1, 浅沼 和佳奈 2, 豊竹 洋佑 2, 若山 守 2, 松井 大亮 2
（1 立命館大院・生命科学, 2 立命館大・生命科学）
休憩

15:12
15:24

3Ap11 学

Agrobacterium sp. No.201 株による第一級アルコールの β 型配糖化反応の探索とフェネチルアルコー

食,化

ルの配糖化検討............................ ○石川 大空 1, 竹内 悠貴 1, 竹内 道樹 2, 原 良太郎 2, 高橋 優輔 3, 小川 順 4, 上田 誠 1,2（1 小山高専 物質工学科, 2 京大院農・産業微生物, 3 トクヤマ つくば研, 4 京大院農・応用生命）

15:36

3Ap12
基

好塩性アーキアにおける新規ヌクレオシド代謝系の同定..................... ○佐藤 喬章 1,2, 歌島(法土) 咲菜恵 1, 吉井 祐太 1, 平田 晃右 1, 神田 脩一郎 1, 斧田 優志 1,
Jin Jian-qiang 1, Xiao Suyi 1, 南 瞭子 1, 福島 ひかる 1, 野口 綾子 3, 真鍋 良幸 3,4, 深瀬 浩一 3,4, 跡見 晴幸 1,2（1 京大院・工, 2 京大・エネ研, 3 阪大院・理, 4 阪大院・理 フォアフロント研）

15:48

3Ap13
環,農

16:00

3Ap14
食

16:12

3Ap15 学
食,化,基Acidomonas 属酢酸菌のメタノール脱水素酵素群の酵素学的特徴と生理機能.......................................... 星野 遥輝, 稗田 莉奈, 堀田 靖人, 宇都宮 大貴, ○阿野 嘉孝（愛媛大・農）
λ-カラギナーゼの探索およびその酵素の性質...................................... ○倉掛 昌裕, 倉田 佳祐, 前田 幸嗣, 河毛 響平, 山下 雅揮（福山大・生命工）
Potential production of rare-disaccharide isoprimeverose by enzyme produced in Aspergillus oryzae..................... ○Fahmi Baihaqqi 1, Tomohiro Suzuki 1, Satoshi Wakai 3, Prihardi Kahar 1, Akihiko Kondo 1,2,
Chiaki Ogino 1（1 Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 3 JAMSTEC）

16:24

3Ap16 学
食,化酢酸菌グリセロール脱水素酵素の機能安定化と物質生産性への影響.................................................................................... ○金田 梨沙, 平野 成菜, 阿野 嘉孝（愛媛大・農）

B 会場 IB015 教室（13:00～16:36）【酵素学，酵素工学／タンパク質工学】
13:00

3Bp01 学食,医微生物由来 Fe(II)/α-ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼを用いた希少な alliin の立体選択的合成.......................................................................... ○勘澤 良介 1, 水谷 拓 1, 原 良太郎 1, 上田 誠 1,2, 小川 順 1（1 京大院・農, 2 小山高専・物質工学科）

13:12

3Bp02 学食,医

S-置換システイン誘導体の合成に有用な微生物酵素の探索と応用......................................................... ○水谷 拓 1, 原 良太郎 1, 竹内 道樹 1, 日比 慎 2, 上田 誠 1,3, 小川 順 1（1 京大院・農, 2 富山県大・工, 3 小山高専・物質工学科）

13:24

3Bp03

超好熱古細菌 Thermococcus kodakarensis KOD1 由来グリセロール-3-リン酸シチジリルトランスフェ

基

ラーゼの特性解析......................................................................... ○岩永 直樹 1, 古賀 雄一 1,2, 山野-足立 範子 1, 大政 健史 1
（1 阪大院・工, 2 岡山理大・工）

13:36

3Bp04 学

中性子結晶構造に基づく小分子阻害剤によるマクロファージ遊走阻止因子のサイトカイン活性の阻

基害機構の解明....................................................................................... ○江澤 理徳 1, 刈屋 佑美 2, 平野 優 3, 日下 勝弘 4,
玉田 太郎 3, 涌井 秀樹 1, 尾高 雅文 1, 松村 洋寿 1
（1 秋田大院・理工, 2 秋田大・産連, 3 量研機構・量子生命,
4

13:48

3Bp05 学医茨城大・フロンティア応用原子科学研セ）

新規架橋酵素融合タンパク質を用いた抗体薬物複合体作製法............................................. ○西岡 莉子 1, 飯田 龍哉 1, 南畑 孝介 1, 佐藤 崚 1, 木村 道夫 1, 神谷 典穂 1,2（1 九大院・工, 2 九大・未来化セ）

14:00

休憩

60

14:12

3Bp06
食,化,医

超好熱性アーキアを宿主とするウイルス メインキャプシドタンパク質の自己組織化機構の解析.................................................................. ○里村 武範 1,2, 三品 登生 1, 林 怜生 1, 杉原 伸治 1, 末 信一朗 1（1 福井大院・工, 2 福井大ライフセ）

14:24

3Bp07
食,化,医

14:36

3Bp08 学化

海洋性珪藻 Thalassiosira pseudonana の被殻へのポリペプチド提示発現.................................................................... 松田 祐介, 嶋川 銀河, ○佐藤 秀祐（関西学院大院・理工）
Split intein を用いた再構成 Tk-SP の評価.......................................................○白須 尊大 1, 巽 祐介 1, 山野-足立 範子 1,3, 古賀 雄一 2, 大政 健史 1,3（1 阪大院・工, 2 岡山理大・工, 3 次世代バイオ医薬品製造技術研究組合）

14:48

3Bp09
基

大腸菌 K トランスポーターの Na 活性化部位の同定............................................................................... ○Tanudjaja Ellen 1, 星 直美 1, 山本 兼由 2, 井原 邦夫 3,
古田 忠臣 4, 辻井 雅 1, 石丸 泰寛 1, 魚住 信之 1
（1 東北大院・工, 2 法政大・生命科, 3 名大・遺伝子実験施設, 4 東工大・生命理工）

15:00

3Bp10 学医

変性状態の細胞内総タンパク質が示す溶解性を利用した新規プロテオミクス.................. ○伊達 実鈴 1, 塩川 つぐみ 2, 多田 宏子 2, 本莊 知子 1, 宮本 愛 1, 岡田 宣宏 3, 二見 淳一郎 1（1 岡山大院・統合科学, 2 岡山大・自然生命支援セ, 3 京府医大院・医学研究）
休憩

15:12
15:24

3Bp11 学
医

15:36

3Bp12
医

親和性最適化による標的細胞特異的な直列三量体ナノボディの創出................................................................... ○オンゴノ スワンディ, 門之園 哲哉（東工大・生命理工）
微生物発現と構造安定性を考慮した機械学習支援による抗体断片の親和性成熟................................................................ ○伊藤 智之 1, 河田 早矢 1, 中澤 光 1, 村上 明一 2,3, 梅津 光央 1,4（1 東北大院・工, 2 徳島大院・医歯薬, 3 RePHAGEN, 4 理研・革新知能）

15:48

3Bp13 学医新規 binding scaffold 開発への超好熱菌由来タンパク質を基にしたプラットフォーム構築...................................................○月元 漱介 1, 長尾 征秀 1, 山野-足立 範子 1,3, 古賀 雄一 2, 大政 健史 1,3（1 阪大院・工, 2 岡山理大・工, 3 次世代バイオ医薬品製造技術研究組合）

16:00

3Bp14 学
医

16:12

3Bp15
医,基

16:24

3Bp16 学基

タンパク質性分子認識素子の大腸菌表層提示系構築の検討............................................................ ○河合 頼央, 今村 維克, 今中 洋行（岡山大院・環境生命自科）
アーキア由来キチン結合ドメインを骨格とした IL-11 結合変異体の創出.................................. ○牧野 祥嗣 1,2, 林 咲楽 1, 金井 保 1,2（1 富山県大・工, 2 富山県大・生医工研セ）
Development of a Novel NADP Transporter........................................ ○Matthew Imanaka 1,2, Kohsuke Honda 1,2, Hiroya Tomita 1,2, Kentaro Miyazaki 1（1 ICBiotech, Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ.）

C 会場 IB014 教室（13:00～16:36）【タンパク質工学／抗体工学】
13:00

3Cp01 学医

嵩高いケージングを用いた細胞内でのタンパク質の光活性化................................................................................ ○山本 涼太郎 1, 山口 哲志 1, 守山 千晴 2, 岡本 晃充 1
（1 東大院・工, 2 東大・工）

13:12

3Cp02
医

13:24

3Cp03 学医,基13:36

3Cp04 学医13:48

3Cp05 学
医

CAR-T 細胞の活性化および疲弊レベル解析による抗原親和性最適化技術の開発....................................................................................... ○坂本 祐基, 門之園 哲哉（東工大・生命理工）
アミロイドベータの線維伸長抑制に関与する Protein disulfide isomerase ドメインの同定............................................................................................... ○市田 春音, 迫野 昌文（富山大院・理工）
cDNA ディスプレイ法を駆使した翻訳促進新生ペプチド配列探索技術の開発..... ○高井 陸杜, 加藤 晃代, ダムナニョビッチ ヤスミナ, 大嶽 七菜, 中野 秀雄（名大院・生命農学）
抗体誘導スクリーニング法による抗体代替ナノボディの同定...................................................................... ○小川原 巧, 門之園 哲哉（東京工業大学 生命理工学院）

61

休憩

14:00
14:12

3Cp06
食,基

14:24

3Cp07
医,基

14:36

3Cp08
医

酵母細胞壁由来乳化糖タンパク質の構造と乳化能の関係............................................................. ○野口 紘志, 二塚 美紀, 尾島 由紘, 東 雅之（大阪公大院・工）ヒトナイーブライブラリからの新型コロナウイルス親和性一本鎖抗体の開発........................................................................ ○齋藤 虹帆, 牧野 祥嗣, 金井 保（富山県大院・生医工）
マウス型モノクローナル抗体の抗体酵素への直接変換〜抗体の酵素化とその生化学的性質〜.................................................................................. ○伊東 優依 1, 辻田 萌 1, 宇田 泰三 2, 一二三 恵美 3,4（1 大分大院 工, 2 九州先端研, 3 大分大研マネ, 4 大分大グローカル感染症研）

14:48

15:00

3Cp09 学

Development of evaluation system for antibody epitopes by Co-display of antibodies and Antigen on

医Mammalian Cells..................................................... ○Ning Lin, Tetsuya Kadonosono（Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech）

3Cp10

天然のタンパク質相互作用を模倣したエピトープターゲティング抗体工学....................................................................... ○中澤 光 1, 勝木 泰司 1, 松井 崇 2, 田中 良和 3, 梅津 光央 1

医（1 東北大院・工, 2 北里大・理, 3 東北大院・農）
休憩

15:12
15:24

3Cp11 学医

SARS-CoV-2 に対する新規モノクローナルの抗体獲得および性質決定........................................... ○木原 もなみ 1, 石井 誠 3, 長谷 哲成 3, 兒島 孝明 2, 加藤 晃代 1, 中野 秀雄 1
（1 名大院・生命農学, 2 名城大院・農, 3 名大院・医）15:36

3Cp12 学医,環15:48

3Cp13 学基

16:00

3Cp14 学
食,医,環モニタリング用イムノセンサーへの利用を目指した VHH 抗体の改変.......................... ○田端 芽依, 沼田 龍範, 三原 明大, 堀内 淳一, 熊田 陽一（京工繊大院・工芸科学）
CDR4 のアミノ酸点変異に基づく VHH 抗体の親和力制御.......................... ○三原 明大, 沼田 龍範, 田端 芽依, 堀内 淳一, 熊田 陽一（京工繊大院・工芸科学）
Fabrication of nanobody-based ratiometric bioluminescent quenchbody for simple and rapid detection......... ○Yinghui Yang 1, Akihito Inoue 1, Takanobu Yasuda 2, Bo Zhu 2, Hiroshi Ueda 2, Tetsuya Kitaguchi 2（1 Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech, 2 CLS, Tokyo Tech）

16:12

3Cp15
医,基

IgG タイプの立体構造特異的モノクローナル抗体の選択的作製法の開発............................................................... ○磯﨑 勇志 1, 湊元 幹太 2, 鈴木 雅登 1, 安川 智之 1, 冨田 昌弘 2
（1 兵庫県大院・理, 2 三重大院・工）16:24

3Cp16 学医

PURE-RD と NGS を用いて迅速なエピトープマッピング法の開発....................................................................................... ○Jia Beixi 1, 加藤 晃代 1, 兒島 孝明 2, 中野 秀雄 1
（1 名大院・生命農学, 2 名城大院・農）D 会場 IB013 教室（13:00～16:36）【セル＆ティッシュエンジニアリング／生体医用工学】
13:00

3Dp01 学

Investigation of the inhibitor for cancer cell invasion via chloride ion efflux in human breast cancer cell医,基lines.
................................................................. ○Samrat Mukherjee 1,2, Chikashi Nakamura 2, Ayana Yamagishi 2（1 Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2 AIST）

13:12

3Dp02 学
医ゲノム編集細胞を用いた過酸化水素の放射線増感効果の作用機序の解明........................................................................... ○鷲尾 周 1, ターシャ ウィンダ 1, 山手 康輝 1, 松澤 翼 2,
森 裕太郎 1, カハル プリハルディ 1, 近藤 昭彦 3, 荻野 千秋 1
（1 神戸大院・工, 2 神戸大・工, 3 神戸大院・科技イノベ）

13:24

3Dp03 学医

単一細胞解析に基づくがん患者由来血中循環ハイブリッド細胞のゲノム変異検出.............................. ○石井 彩夏 1, 中澤 胡桃 1, 桶川 隆嗣 2, 出来 真弓 2, 中村 雄 2, 田中 剛 1, 吉野 知子 1
（1 農工大院・工, 2 杏林大医学部付属病院泌尿器科）

62

13:36

3Dp04 学
医

13:48

3Dp05
医,基

3Dp06 学医

14:24

テトラスパニン制御分子 EWI-２模倣ペプチドの設計によるがん細胞の浸潤抑制...................... ○大河内 美奈, 黒羽 ことみ, Suwatthanarak Thanawat, 田中 祐圭（東工大・物質理工）
休憩

14:00
14:12

血中投与によるがんの診断と治療を指向したリン脂質ポリマー被覆磁性ナノ粒子の開発........................................................................................ ○大野 孝紘, 井藤 彰, 金子 真大（名大院・工）3Dp07 学食,医

がん治療を指向したデュアルレドックスポリマーの分子設計........................................................................................ ○小河 優玖, 井藤 彰, 金子 真大（名大院・工）ペプチドキャリアによるポリフェノールの新規水溶化技術の開発とアナフィラキシー抑制剤への応用........................ ○児玉 智基 1,2, 河村 昇吾 3, 河崎 陸 3, 前田 陽 1,2, 山名 啓太 3, 池田 篤志 3, 河本 正次 1,2（1 広島大院・統合生命科学, 2 広島大・健康長寿研究拠点, 3 広島大院・先進理工）

14:36

3Dp08 学
化

14:48

3Dp09
医,基

15:00

3Dp10 学医

β-1,3-1,6-グルカンナノ粒子に包接した機能物質のクリーム中における放出特性........................................................... ○三和 正弥, 甲元 一也（甲南大院・フロンティアサイエンス）
自動分注ロボットによる細胞懸濁パラメータの定量評価................................................. ○堀之内 貴明, 下野 晴子, 秦 喜久美, 光山 統泰（産総研・人工知能）
治療用細胞製品の製造における塑性流体を用いた分注工程の設計...............................................................................○成瀬 陸 1, Adithya Nair 1, 福守 一浩 1, 紀ノ岡 正博 1,2（1 阪大・院工・生物工学, 2 阪大・院工・細胞製造コトづくり拠点）
休憩

15:12
15:24

3Dp11
医,基

15:36

3Dp12
医

15:48

3Dp13
医

16:00

3Dp14 学
食,医,基

16:12

3Dp15 学医16:24

放射線架橋 PVA ゲル上におけるマウス神経幹/前駆細胞の移動と集塊形成挙動の解析................................................................. ○森 英樹, 李 ユウナ, 前田 結衣, 原 正之（大阪公大院・理）ボツリヌス菌由来ヘマグルチニンを用いたヒト iPS 細胞集塊の継代法における分割技術の開発..... ○山本 陸 1, 山田 康矢 1, 紀ノ岡 正博 1,2（1 阪大院・工, 2 阪大院・工・細胞製造コトづくり拠点）
ヒト iPS 細胞から高効率で安定的な肝細胞分化誘導技術の開発..... ○金 美海 1, 紀ノ岡 正博 1,2（1 阪大院・工・生物工学, 2 阪大院・工・細胞製造コトづくり拠点）
血管含有骨格筋モデル構築を目指したヒト iPSC 共分化誘導法の開発.............................................. ○松島 歩夢, 山本 一貴, 秋山 裕和, 本多 裕之, 清水 一憲（名大院・工）遺伝子操作を介さずに免疫調節機能が亢進された間葉系幹細胞の調製.................................................... ○濱﨑 奈津香, 小高 雄也, 穐山 太一, 村松 和明（電機大院 ・理工）3Dp16 学

ヒト間葉系幹細胞の細胞外マトリックスのリモデリングポテンシャルを 評価するためのプラット

医フォームの開発..... ○Tan Shao Ying 1, 金 美海 1, 紀ノ岡 正博 1,2（1 阪大院・工, 2 阪大院・工・細胞製造コトづくり拠点）

F 会場 ES021（13:00～16:36）【醸造学，醸造工学／食品科学，食品工学】
13:00

13:12

3Fp01

野生酵母 Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus のビール醸造特性解析及び酢酸イソアミル高生産

食株の育種.......................................................................................................................... ○桒原 智也（奈良産振セ）

3Fp02 学花酵母 MC87-46 のイソマルトース資化性に影響する転写因子の解析.............................. ○沼波 凜 1, 酒井 真弥 1, 榊原 誠也 1, 兒嶋 孝明 1, 赤尾 健 2, 志水 元亨 1, 加藤 雅士 1

食（1 名城大院・農, 2 酒総研）
13:24

3Fp03
食

13:36

3Fp04
食

清酒中に含まれるプリン代謝産物の定量................................................................................ ○浅井 良樹, 根来 宏明, 石田 博樹（月桂冠・総研）
清酒中に含まれるプリン代謝産物の由来と生成経路の解明................................................................................ ○根来 宏明, 浅井 良樹, 石田 博樹（月桂冠・総研）

63

13:48

3Fp05 学
食

休憩

14:00
14:12

3Fp06 学食14:24

清酒中に含まれる γ-アミノ酪酸含有量の測定...................................................................................... ○横山 元蔵 1, 数岡 孝幸 2（1 東農大院, 2 東農大）

3Fp07 学食

自然界からの新規清酒製造用酵母の分離と分離株の性質.......................................................................................... ○坂本 心 1, 数岡 孝幸 2（1 東農大院, 2 東農大）
壺造り純米黒酢醸造に関わる壺内壁の電子顕微鏡観察......................................... ○星田 栄紀 1, 亀谷 将史 1,3, 藤井 暁 2, 濱田 健作 2, 新井 博之 1,3, 石井 正治 1,3（1 東大院・農生科, 2 坂元醸造, 3 東大微生物科学イノベーション連携研究機構）

14:36

3Fp08 学食清酒に含まれる糖アルコール配糖体の探索....................................................................................... ○吉澤 耕 1, 山田 明日香 1, 勝田 亮 2, 小林 泉美 1,
本田 千尋 3, 進藤 斉 1, 穂坂 賢 1, 徳岡 昌文 1
（1 東農大院・応生科, 2 東農大院・生命, 3 静県大・食栄）

14:48

3Fp09
食

広島６号酵母を活用した、交配育種による輸出用清酒の品質向上に寄与する清酒酵母の開発...................... ○山﨑 梨沙 1, 荒瀬 雄也 1, 大場 健司 2, 五島 徹也 3, 金井 宗良 3, 赤尾 健 3, 大土井 律之 1
（1 広島総合技術研・食品工業技術セ, 2 広島総合技術研・農業技術セ, 3 酒総研）

15:00

3Fp10
食,農,基

休憩

15:12
15:24

3Fp11
食

15:36

酒米の米粒空間によりタンパク質組成は異なる......................................................................... ○高橋 圭, 河野 弘美, 上用 みどり, 奥田 将生（酒総研）

3Fp12
食

高圧技術による木片からの成分抽出の効率化............................................................................................................... ○野村 一樹, 高野 翔（金沢工大）
黄麹菌および黒麹菌の菌糸伸長時における音波照射に対する応答の比較................................................... ○松本 拓 1, 楠元 拓真 2, 増田 翔 2, 小島 幸治 1, 三枝 敬明 1, 寺本 祐司 1
（1 崇城大院・工, 2 崇城大・生物生命）

15:48

3Fp13
食

黄麹菌の回転培養が製麹に与える影響................................... ○吉村 瑞花 1, 吉岡 美紗 2, 山下 秀行 3, 中川 拓郎 3, 生田 宗一郎 1,2, 藤原 伸介 1,2（1 関西学院大・理工, 2 関西学院大院・理工, 3 樋口松之助商店）

16:00

3Fp14 学

Visualization of phospholipid distribution in Yamada and Hakutsuru brown rice for sake production using食mass microscope..................................................................... ○Eliza Farestiani 1, Eiichiro Fukusaki 1,2,3, Shuichi Shimma 1,2,3（1 Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., 2 Industrial Biotechnology Initiative Division, Institute for Open andTransdisciplinary Research Initiatives, Osaka Univ, 3 Osaka University Shimadzu Omics Innovation
Research Laboratories）

16:12

3Fp15
食

16:24

3Fp16
食

市販の酵素製剤を用いた高可溶性トマトパウダーの製造における振とうの影響............................................................. ○平田 竜一, 小島 幸治, 三枝 敬明, 寺本 祐司（崇城大院・工）
原料別米麹甘酒のレジスタントプロテイン (RP)の研究............................................................................ ○進藤 菖, 松田 理奈, 尾関 健二（金工大・ゲノム研）

G 会場 ES022（13:00～16:36）【食品科学，食品工学】
13:00

3Gp01 学
食

13:12

3Gp02
食

乳酸菌と酵母の共培養系における細胞外小胞の産生......................................................... 西村 泰風, ○川上 歩夏, 片倉 啓雄, 山崎 思乃（関西大・化生工）
リゾプス属で調製したモリンガ種子発酵物（モリンガテンペ）の機能性成分の 分析....................................................................... 青木 秀之 1, 鍋島 優夏 2, 森 朋子 1, 上野 義栄 3, ○尾山 廣 2（1 池田食研, 2 摂南大院・理工, 3 京都女子大）

64

13:24

3Gp03
食

13:36

3Gp04
食

13:48

3Gp05
食,農

NAD+増量効果のある微細藻類の探索..................................................... ○石田 快, 小乾 彰紘, 中谷 正義, 篠原 結子（ニデック・研究開発）
海藻由来多糖アスコフィランのプレバイオティクスによる腸管免疫の活性化............................................................................................... ○成田 有輝, 森脇 真希（富山大院・理工）
静電処理による無洗米の低濁度化技術の開発........................................... ○増子 祐介 1, 秋葉 憲二 2, 小座間 梓 2, 増子 貴彦 2, 荒井 広志 2, 渡辺 昌規 1
（1 山形大院・農, 2 山本製作所）
休憩

14:00
14:12

3Gp06
食,農

14:24

3Gp07
食

Development of environmental harmonized okra polysaccharides extraction process........................ ○Mikhael-Christ Dossou-Yovo, Masanori Watanabe（Grad. Sch. Agric. Yamagata Univ.）
大麦タンパク質由来アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドの探索........................................... ○遠藤 快斗 1, 辛島 健文 2, 高下 秀春 2, 秋山 裕和 1, 清水 一憲 1, 本多 裕之 1
（1 名大院・工, 2 三和酒類）

14:36

3Gp08 学食

大豆タンパク質由来二次胆汁酸ミセル崩壊ペプチドの同定............................................... ○清水 翔太 1, 平野 啓太 2, 齋藤 努 2, 秋山 裕和 1, 清水 一憲 1, 本多 裕之 1
（1 名大院・工, 2 不二製油グループ本社・未来創造研究所）

14:48

3Gp09

A green process using enzyme, ultrasound, and ultrafiltration for extraction and purification of chondroitin

食,医sulfate from jumbo squid cartilage.................................. Wen Rui Tang, Jun Rong Zhang, Kai Ruei Yang, Ming Fong Tsai, ○Chia Hung Kuo

3Gp10

L-アンセリンは初代ヒト骨格筋細胞の筋分化および筋収縮力を向上させる......................................... ○永井 研迅 1,2, 井田 正幸 1, 出雲 貴幸 1, 中井 正晃 1, 本多 裕之 2, 清水 一憲 2

（Department of Seafood Science, National Kaohsiung University of Science and Technology）
15:00

食

（1 サントリーウエルネス, 2 名大院・工）
休憩

15:12
15:24

3Gp11 学
食

15:36

3Gp12
食,農

ターゲットプロテオミクスとニューラルネットワークによる農産物の機能性予測................................................................. ○岩切 裕哉, 黒木 勝久, 永濱 清子, 榊原 陽一（宮崎大・農）NMR メタボロミクスによるサトウキビ蔗汁の構成成分評価............................................................... ○伊達 康博 1, 石川 千秋 2, 佐藤 光徳 3, 井上 健一 3, 小野 裕嗣 1
（1 農研機構・分析研, 2 農研機構・食品研, 3 鹿児島・農総セ）

15:48

3Gp13
食

16:00

3Gp14
食,化,医,環,基16:12

3Gp15 学
食

16:24

3Gp16
食,農

質量分析イメージング法を用いたカビチーズにおけるポリアミン類局在の可視化............................... ○生田 宗一郎 1,2, 藤原 伸介 1,2（1 関西学院大院・理工, 2 関西学院大・生命環境）
悪臭応答性嗅覚受容体の動物種間の機能比較.......................................... ○福谷 洋介, 金枚 玲奈, 斉藤 遥, 齋藤 芽生, 養王田 正文（農工大院・工）β-1,3-1,6-グルカンナノ粒子への包接に伴う抗酸化物質の抗酸化力の上昇.................................... ○河南 翔馬, 土居 菜々子, 甲元 一也（甲南大院・フロンティアサイエンス）
リン脂質からなる細胞サイズリポソームの顕微鏡観察を利用した飲料評価.................................................................................................................. ○依田 毅（青森産技・工総研）

H 会場 ES024（13:00～16:36）【発酵生理学，発酵工学／オミクス解析／代謝工学】
13:00

3Hp01 学食

糠床における複合微生物系代謝コミュニティーのメタゲノム解析............................................................... ○古賀 優梨 1, 篠田 あかり 1, 杉浦 俊作 2, 木村 洋 3, 中山 二郎 1
（1 九大院・生資環, 2 東海漬物・漬物機能研究所, 3 北九州小倉・糠床糠炊き研究会）

13:12

3Hp02 学医,基Spatial transcriptome technology to detect single nucleotide variants.............................................................. ○Soichiro Asami, Reza Kalhor（Dept. Biomed. Eng., Sch. Med.）

65

13:24

3Hp03 学環,農13:36

3Hp04 学
食,化,環

13:48

3Hp05
化

好熱菌発酵産物の給与によるカブトムシ幼虫肥大化におけるトランスクリプトーム解析.................................................................................... ○浅野 風斗, 宮原 平, 児玉 浩明（千葉大・園芸）
酵母液胞膜への Delta-rhodopsin 発現によるエネルギー利用の効率化と物質生産への応用.................................. ○大長 薫, 弘埜 陽子, 菊川 寛史, 田村 謙太郎, 原 清敬（静県大院・薬食生命）
光駆動プロトンポンプを利用した大腸菌の酸耐性の強化と有用物質生産への応用............................................................................... ○小林 祐摩 1, 佐野 海瑚人 1, 弘埜 陽子 2, 松田 史生 1,
石井 純 3, 原 清敬 2, 清水 浩 1, 戸谷 吉博 1
（1 阪大院・情報, 2 静県大・食栄, 3 神戸大・先端バイオ工研セ）
休憩

14:00
14:12

3Hp06
化,基

蛍光タンパク質センサを利用した大腸菌の新規 NADPH 再生反応の同定..................................................... 上野 航一郎, 澤田 将吾, 石橋 真衣, 神田 義貴, ○戸谷 吉博, 清水 浩
（阪大院・情報）

14:24

3Hp07
食,化,医

14:36

3Hp08 学化

14:48

3Hp09 学化

15:00

3Hp10 学基

光遺伝学による複数酵素を対象とした代謝フラックス抑制技術の開発.................................................................................... ○櫻井 翔太, 戸谷 吉博, 清水 浩（阪大院・情報）
マルチカラー光による大腸菌の代謝フラックス分布の光遺伝学的制御.................................................................................... ○赤木 駿斗, 清水 浩, 戸谷 吉博（阪大院・情報）
光遺伝学代謝フラックス制御を利用した大腸菌の 1,3-プロパンジオール生産.............................................. ○川西 寿和, 櫻井 翔太, 塚本 雅士, 清水 浩, 戸谷 吉博（阪大院・情報）
好熱性水素細菌 Hydrogenobacter thermophilus の硫酸同化経路遺伝子群の発現制御機構の解析............................................................................... ○浅野 泰英 1, 亀谷 将史 1,2, 新井 博之 1,2, 石井 正治 1,2（1 東大院・農生科, 2 東大微生物連携機構）
休憩

15:12
15:24

3Hp11
化,環

15:36

15:48

Citrobacter 属細菌のバイオ凝集剤生産を促進する遺伝子とプロモーターの探索......................................................... ○栗林 怜汰, 森茂 真菜, 石澤 秀紘, 武尾 正弘（兵庫県大院・工）3Hp12

Saccharomyces cerevisiae のピルビン酸デカルボキシラーゼ欠損株が示す 2-デオキシグルコース感受基性を抑圧する多コピーサプレッサーの探索................................................................. ○野村 亘, 久保田 麻友, 宇田 竜成, 井上 善晴（京大院・農）3Hp13

自律的セントラルドグマ関連タンパク質を網羅的に解析する手法の開発.............................................................. ○西澤 知里 1, 油屋 駿介 2, 小坂 唯心 1,3, 菅瀬 謙治 1, 青木 航 4,5,6

基（1 京大院・農, 2 九大・生医研, 3 日本学術振興会, 4 阪大院・工, 5 JST 創発的研究支援事業,
6

16:00

3Hp14
基

京都バイオ計測センター）異なる電位環境下でのシステインレドックスプロテオミクス解析.............................................................................................. ○田中 謙也 1,2, 近藤 昭彦 1,2,3,4, 蓮沼 誠久 1,2,3（1 神戸大・先端バイオ工研セ, 2 神戸大院・科技イノベ, 3 理研・環境資源, 4 神戸大院・工）

16:12

3Hp15
食

乳酸菌の生育に対する酵母エキスの影響.............................. ○齊藤 悠希, 冨髙 美佐, 勝又 忠与次, 二田 昴志郎, 多和田 悠貴, 深野 和紘, 周 哲（三菱商事ライフサイエンス）

16:24

3Hp16
医

線虫共生細菌 Photorhabdus khanii から発見された緑膿菌に選択的な活性を示す抗生物質 ADC58.................................................... ○今井 優 1,2, Son Sangkeun 2, Liang Libang 2, Gates Michael 2, 森 美穂 2,
Ghiglieri Meghan 2, Honrao Chandrashekhar 3, Ma Xiaoyu 3, Guo Jason 3, Lewis Kim 2（ 信州大・先鋭領域融合研究群バイオメディカル研, 2 Antimicrobial Discov. Cent., Northeastern Univ.,
1

3Cent. for Drug Discov., Northeastern Univ.）

66

I 会場 ES025（13:00～16:00）【有機化学，高分子化学／生合成，天然物化学】
13:00

3Ip01 学化

リアルタイム NMR 法によるグリコール酸ベースブロック共重合体の酵素合成機構の解析............................... ○柳川 謙吾 1, 梶川 彩香 1, 榊原 早也果 1, 久米田 博之 3, 冨田 宏矢 4, 松本 謙一郎 2（1 北大院・総合化学, 2 北大院・工, 3 北大院・先端生命科学, 4 阪大・生工国際セ）

13:12

3Ip02

Electrochemical determination variants of SARS-CoV-2 receptor binding domain with molecularly

化

imprinted polymer-coated electrodes........................... ○Zhuo-Jun An 1, Cheng-Chih Lin 1,2, Mei-Hwa Lee 3, Chuen-Yau Chen 1, Hung-Yin Lin 1（1 National University of Kaohsiung, 2 Zuoying Branch Kaohsiung Armed Forces General Hosp.,
3

13:24

3Ip03 学食

IShou Univ.）

ショウガ辛味成分 6-shogaol とエタノールの併用による抗真菌効果とその作用機序...................................................................................... ○田村 桃子 1, 山口 良弘 1, 荻田 亮 1,2, 藤田 憲一 1
（1 大阪公大院・理, 2 大阪公大・健康研セ）

13:36

3Ip04 学環

Persimmon tannin promotes the growth of Saccharomyces cerevisiae under ethanol stress......................................................... ○ Ilhamzah 1, Yoshihiro Yamaguchi 1, Akira Ogita 1,2, Ken-ichi Fujita 1（1 Grad. Sch. Sci., Osaka Metro. Univ., 2 Res. Center. Urban Health Sports, Osaka Metro. Univ.）

13:48

3Ip05
医

出芽酵母における微小管重合阻害剤添加細胞のミトコンドリアの融合・分裂異常............................................................ ○村田 和加惠 1,2, 山瀨 優日 1, 山口 良弘 2, 荻田 亮 2,3, 藤田 憲一 2（1 米子高専, 2 大阪公大院・理, 3 大阪公大健康研セ）
休憩

14:00
14:12

3Ip06 学基

機械学習を用いたフラビン依存性酸化酵素の機能改変..................................................................................... ○松下 拓磨 1, 齋藤 裕 2,3,4, 岸本 真治 1, 渡辺 賢二 1
（1 静岡県大薬, 2 産総研, 3 東大, 4 北里大）

14:24

3Ip07 学医,農Bacillomycin L 生合成遺伝子の同定.............................................................. ○伊藤 光次朗 1, 富田 駿 2, 藤巻 貴宏 3, 松谷 峰之介 4, 郡司 萌 3,
三輪 真由 3, 五十君 靜信 3, 梶川 揚申 3, 横田 健治 3
（ 東農大院・応生科, 産総研・生物プロセス, 3 東農大・応生科, 4 東農大・ゲノム解析セ）
1

14:36

3Ip08 学
医,環,農

2

ラマン分光法による微生物コロニーからの二次代謝産物のスクリーニング手法の開発......... ○諏訪 駿之介 1,3, 安藤 正浩 2, 中島 琢自 2, 堀井 俊平 1,3, 松本 厚子 2, 穴井 豊昭 4, 竹山 春子 1,2,3,5（1 早大院・先進理工, 2 早大・ナノライフ創新研, 3 産総研・早大 CBBD-OIL, 4 九大院・農,
5

14:48

3Ip09 学医,農早大・生命動態研）

Streptomyces sp. TSP2-12 株の生産する抗菌活性物質の精製とその解析.......................................................................................... ○鶴貝 龍聖, 大土 光経, 城内 孝俊, 塚越 勇斗,
中島 美咲, 石川 正英, 岩崎 政和, 秦田 勇二（埼玉工大・工）

15:00

3Ip10
化,医,農,基

休憩

15:12
15:24

タケ懸濁培養細胞におけるエピジェネティック修飾剤誘導性二次代謝産物の単離、構造解析................................................................................... 野村 泰治, ○加藤 康夫（富山県大・生医工研セ）

3Ip11 学
食,医,基テリハボク(Calophyllum inophyllum) 葉抽出物中の終末糖化産物（AGEs）生成抑制物質....................................................... ○加々美 龍大 1, 松井 杏美 1, 宇佐美 徹 2, 松川 哲也 1, 梶山 慎一郎 1（1 近大院・生物理工, 2 すまエコ）

15:36

3Ip12 学

Autotrophic biosynthesis of biodegradable polyhydroxyalkanoate from continuously supplying non-化,環combustible gas mixture by hydrogen-oxidizing bacteria............................................ ○Chih Ting Wang, Yuki Miyahara, Manami Ishii-Hyakutake, Takeharu Tsuge

3Ip13

人工代謝系構築による α 位にメチル基側鎖を有するポリヒドロキシアルカン酸の生合成.................................................................... ○宮原 佑宜, 石野 真里衣, 柘植 丈治（東工大・物質理工）（Tokyo Tech）
15:48

化,環

67

K 会場 オークマ講義室（13:00～16:12）【遺伝子工学】
13:00

3Kp01
基

高温で増殖可能なバクテリア由来のヒートショックタンパク質による大腸菌のストレス耐性強化........................................................................................................... ○佐藤 悠 1, 岡野 憲司 2, 本田 孝祐 3,4（1 山口大・大学研究推進機構, 2 関西大・化生工, 3 阪大・生工国際セ, 4 阪大・先導的学際研機構）

13:12

3Kp02 学基大腸菌-Thermus thermophilus 新規シャトルベクターの開発............................................................................. ○村山 大空 1, 宮崎 健太郎 1, 冨田 宏矢 1,2, 本田 孝祐 1,2（1 阪大・生工国際セ, 2 阪大・先導的学際研機構）

13:24

3Kp03
化,環

13:36

3Kp04
化,医

13:48

3Kp05 学
食,医,基大腸菌におけるギ酸資化経路を稼働させるための培養条件の探索................................................................. ○巽 慶太郎, 小林 祐摩, 戸谷 吉博, 清水 浩（阪大院・情報）
Modular design of Escherichia coli for ferulic acid biosynthesis from spent coffee ground (SCG)................ ○Sefli Sri Wahyu Effendi, I-Son Ng（Dept. Chem. Eng., Coll. Eng., Natl. Cheng Kung Univ.）
プラスマローゲン合成酵素の組換え発現が大腸菌の生育に及ぼす効果....................................................... ○大瀧 結衣 1, 長谷川 芽女 1, 柏木 明子 2, 西向 めぐみ 1, 山田 美和 1
（1 岩手大院・農, 2 弘前大・農生）
休憩

14:00
14:12

3Kp06 学
化,医,基

14:24

3Kp07
基

コドン最適化がタンパク質発現に及ぼす影響............................................................ ○鎌田 修平, 高橋 宏和, 岡村 好子（広島大院・統合生命科学）
酢酸菌を宿主とした異種タンパク質高発現系の構築............................................... ○棚倉 有哉 1, 生田 宗一郎 1,2, 呉 恒寧 3, 保川 清 4, 柳原 格 3, 藤原 伸介 1,2（1 関西学院大院・理工, 2 関西学院大・生命環境, 3 大阪母子医療センター, 4 京大院・農）

14:36

14:48

3Kp08

海洋細菌 Cobetia sp. IU 180733JP01 (5-11-6-3) 由来ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子のク

環

ローニングとキャラクタリゼーション................................................................................ ○石田 拓真, 梅林 勇気, 山田 美和（岩手大院・農）3Kp09

培地添加物によって変異を促進できる高変異好熱菌の構築......................................................................................................... ○鈴木 宏和 1,2, 服部 大河 3, 大城 隆 1,2

基（1 鳥取大・工, 2 鳥大・GSC センター, 3 鳥大院・持続創生）
15:00

3Kp10
基

超好熱性アーキアにおける TrpY ホモログの機能解析............................................ 堀川 拓 1, 山本 康之 1, Lee Sung-Jae 2, 竹俣 直道 1, ○金井 保 1,3, 跡見 晴幸 1
（1 京大院・工, 2 慶熙大・理, 3 富山県大・工）
休憩

15:12
15:24

15:36

3Kp11

メタノール資化性細菌の中央代謝経路改変による 3 元共重合ポリヒドロキシアルカン酸モノマー組

環,基

成の調節
............................................................................ 鶴田 爽, ○折田 和泉, 福居 俊昭（東工大・生命理工）

3Kp12 学

実験室進化による高濃度メタノール耐性メチロトローフの取得と解析........................................................................ ○千葉 恒慶, 折田 和泉, 福居 俊昭（東工大・生命理工）

環,基

15:48

3Kp13
基

Biosynthesis of PHA with unsaturated side-chain monomer using genetically-engineered Ralstonia eutropha.......................................................................................... ○Allan Devanadera, Izumi Orita, Toshiaki Fukui（Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech）

16:00

3Kp14

Biosynthesis of SCL-MCL polyhydroxyalkanoate copolymers from soybean oil using engineered Ralstonia

基eutropha expressing mutant PHA synthase from Pseudomonas sp. 61-3........................................................................... ○Ares Arrad, Satoshi Akechi, Izumi Orita, Toshiaki Fukui（Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech）

68

L 会場 工 1 号館 121 教室（13:00～16:36）【生物化学工学／培養工学／バイオプロセス】
13:00

3Lp01
化

Corynebacterium glutamicum を用いたグルコースからの 2,5-ピリジンジカルボン酸の生産......................................................................... ○野中 鏡士朗, 長村 達也, 高橋 史員, 小山 伸吾（花王）

13:12

3Lp02

講演中止

13:24

3Lp03

海洋性細菌 Shewanella woodyi による EPA 生産の検討..........................................................................................○祖父江 史明, 光増 遼太郎, 山崎 広顕（DIC）

食

13:36

3Lp04 学
食,化

味噌から単離したアラビトール高生産酵母 Zygosaccharomyces sp. Gz-5 のアラビトール生産........................................... 鹿子沢 陸央 1, ○岩田 寛 1, 岩田 葵 1, 眞榮田 麻友美 2, 前橋 健二 1, 𠮷川 潤 1（1 東農大院・農, 2 東農大・応生科）

13:48

3Lp05
食

バイオプロセスによるカルノシン生産法の開発................................................................................. ○倉本 歩 1,3, 木野 邦器 1,2, 佐藤 謙一郎 3, 岡田 行夫 3
（1 早大・理工総研, 2 早大院・先進理工・応化, 3 東海物産）
休憩

14:00
14:12

3Lp06 学食,化Engineering Escherichia coli for high production of tyrosol from phenylalanine.................................○Ning Shen 1, Yasuharu Satoh 2, Daisuke Koma 3, Yasushi Ogasawara 2, Tohru Dairi 2（1 Grad. Sch. Chem. Sci. Eng., Hokkaido Univ., 2 Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ., 3 ORIST）

14:24

3Lp07
化,環

液体酵素を用いたバイオディーゼル燃料製造における小動力散液デバイスの撹拌効果.................................................................. ○濵 真司 1, 松浦 健介 1, 荻野 千秋 3, 向田 忠弘 2, 野田 秀夫 1,2（1 Bio-energy, 2 関西化学機械製作, 3 神戸大院・工）14:36

3Lp08 学環

透明な生分解性プラスチックを合成する Cupriavidus necator の分子育種.......................................................... ○板倉 真優 1, 宮原 しろ沙 2, 田中 賢二 3, 田口 精一 4, 松崎 弘美 1,2（1 熊本県大院・環境共生, 2 熊本県大・環境共生, 3 近畿大・産理工, 4 神戸大院・科技イノベ）

14:48

3Lp09
化,環

乳酸ポリエステルの高効率生産に向けたモノマー供給経路の開拓および水素細菌への実装............................................................................................ ○高 相昊 1, 古舘 祥 2, 佐藤 俊輔 2, 田口 精一 1
（1 神戸大院・科技イノベ, 2 カネカ）

15:00

3Lp10

担子菌酵母 Pseudozyma antarctica のプロテアーゼ B 遺伝子破壊による分泌型生分解性プラスチック

環,農,基分解酵素の分解抑制効果.................................................................... ○山下（鮫島） 結香 1, 大前 奈月 2, 森田 友岳 2, 北本 宏子 1
（1 農研機構・農環研, 2 産総研・機能化学）
休憩

15:12
15:24

3Lp11 学
化,基

15:36

15:48

3Lp12 学

エチレングリコールを原料として微生物合成されるグリコール酸 (GL) ポリマーの培養条件検討に環よる GL 分率の増強...................................................................... ○太田 陽介 1, 山田 美和 2（1 岩手大院・農, 2 岩手大・農）3Lp13

好気流加培養による乳酸菌の高密度培養......................................... 一瀬 涼 2, 山崎 思乃 1, ○片倉 啓雄 1（1 関西大・化生工, 2 関西大院・理工）

食,医

16:00

3Lp14 学食

16:12

3Lp15 学
食,環,農

16:24

枯草菌による γ-ポリ-L-グルタミン酸（γ-L-PGA）合成機構の解明.............................. ○野上 莉菜, 山本 純也, 宇田 佳乃, 吉田 健一, 石川 周（神戸大院・科技イノベ）

3Lp16
化

酵母培養用天然培地 YPD のコスト削減を目指した半合成培地の開発......................................... ○平川 遥 1, 星田 尚司 2, 赤田 倫治 2（1 山口大院・創成科学, 2 山口大・工）
油性酵母の油脂生成、脂肪酸組成に与える脱脂米糠糖化液及びその構成糖の影響................................................................................................... ○彦坂 大幹, 渡辺 昌規（山形大院・農）
酵素高密度発現メタン変換生体触媒を用いたメタンからのメタノール合成.............................................................................................................. ○宮地 輝光（東工大・物質理工）

69

M 会場 工 1 号館 131 教室（13:00～16:36）【生物化学工学／培養工学／バイオプロセス】
13:00

3Mp01 学化,医13:12

3Mp02 学
医

13:24

3Mp03
食

13:36

3Mp04
環

遺伝子組換え微生物を用いた硫酸化ペプチド合成法の検討.................................................................................... ○池田 有輝, 黒木 勝久, 榊原 陽一（宮崎大・農）
ラクトフェリン融合単鎖抗体のニトロセルロースに対する吸着特性の解析と抗原結合活性評価.......................................... ○二田 諒 1, 笹岡 颯太 2（1 京工繊大院・工芸科学, 2 京工繊大・工芸科学）
焼成多孔性シリカゲルを用いたコレステロール吸収抑制ペプチドの選択的濃縮.................................................. ○入山 桃羽, 羽川 瞳, 秋山 裕和, 清水 一憲, 本多 裕之（名大院・工）カーボンマテリアルの生物学的な新規利用法の開発.................................................................................. ○山本 尚毅 1, 的場 直樹 2, 沖野 智也 2, 中西 昭仁 1,3（1 東京工科大院・バイオニクス, 2 関西熱化学, 3 東京工科大・応生）

13:48

3Mp05
医,基

休憩

14:00
14:12

3Mp06
基

14:24

3Mp07
基

14:36

抗ウイルス性能を有する多孔性粒子..................................................................... ○平尾 理恵, 重藤 啓輔, 稲垣 伸二, 石田 亘広（豊田中研）

3Mp08 学
食,化,基低温菌シンプル酵素触媒における熱処理の細胞構造と酵素保持への影響..................................... ○穴田 康太, 田島 誉久, 緋田 安希子, 加藤 純一（広島大院・統合生命科学）
微生物の振盪培養に用いる培養器の換気能に着目したガス制御システムの開発....................................................................................... ○高橋 将人, 青柳 秀紀（筑波大・生命環境系）
麹菌菌糸分散株の通気攪拌培養における混合時間の測定.............................. ○薄田 隼弥 1, 武藤 清明 1, 市川 暉 1, 宮澤 拳 1, 吉見 啓 2,3, 加藤 好一 4, 阿部 敬悦 1,3（1 東北大院・農, 2 京大院・農, 3 東北大・未来研, 4 佐竹マルチミクス・攪拌研）

14:48

3Mp09
化

MAXBLEND®リアクターを用いたサッカロミセス酵母の培養特性解析........................................ ○池谷 佳朗 1, 堀口 洋郎 1, 田中 彩 1, Kahar Prihardi 2, 荻野 千秋 2, 竹中 克英 1
（1 住友重機械プロセス機器, 2 神戸大院・工）

15:00

3Mp10

A novel inverse membrane bioreactor for methane/methanol gas-to-liquid bioconversion using a microbial

環

gas-phase reaction............................. ○Yan-Yu Chen, Ishikawa Masahito, Katsutoshi Hori（Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.）
休憩

15:12
15:24

3Mp11
医,基

培養作業の２視点撮影画像による細胞培養初心者の技術評価........................................................................... ○片岡 健 1, 川嶋 心 1, 呉屋 七海 1, 富恵 悠 1, 荘子 万能 2
（1 岡山理大・理, 2 BonBon Inc.）

15:36

3Mp12
基

15:48

3Mp13
食,医,環,基画像解析技術を用いた Saccharomyces cerevisiae の培養フェーズ予測..................................................... ○中倉 稜也 1, 邱 泰瑛 2, 小西 正朗 2（1 北見工大院・工, 2 北見工大）
大腸菌 oxyR 欠損株を用いた寒天中のコロニー形成阻害成分の特定................................................................................... ○坂元 仁 1,2, 朝田 良子 1,3, 古田 雅一 1,3, 土戸 哲明 1
（1 大阪公大・微制研セ, 2 関西大・化生工, 3 大阪公大院・工）

16:00

3Mp14
基

膜内外に異種タンパク質を連結した、バクテリアサイズユニラメラリポソームの簡便な作製法............................................... ○野場 考策 1, 吉本 将悟 1, 田中 良和 2, 横山 武志 2, 松浦 友亮 3, 堀 克敏 1
（1 名大院・工, 2 東北大院・生命科学, 3 東工大）

16:12

3Mp15
化,基

三量体接着タンパク質 AtaA の小型化とそれを用いた大腸菌の固定化................................................................................... ○吉本 将悟 1, 青木 壮太 1, 小原 優季 1, 石川 聖人 2,鈴木 淳巨 1, Linke Dirk 3, Lupas Andrei 4, 堀 克敏 1
（ 名大院・工, 長浜バイオ大・バイオ, 3 オスロ大, 4 マックスプランク研）
1

16:24

3Mp16
食,医,環

2

UVC-LED を用いた医薬品の製造工程に導入可能なウイルス不活化技術の検討......................................................... ○瀬川 和也, 井上 隆昌, 西口 優吾, 浦山 健（日本血液製剤機構）

70

N 会場 工 1 号館 132 教室（13:00～16:36）【環境浄化，修復，保全技術／環境工学，廃水処理技術／バイオマス，資源，エネルギー工学】
13:00

3Np01 学
基

13:12

3Np02
基

13:24

3Np03
農

タバコ野火病菌におけるホウ酸を介した感染機構の解明................................. ○藤川 晃太朗, 緋田 安希子, 田島 誉久, 加藤 純一（広島大院・統合生命科学）
グラム陽性土壌細菌 Leifsonia sp.の走化性に関する研究..................................... ○中川 直美, 緋田 安希子, 田島 誉久, 加藤 純一（広島大院・統合生命科学）
植物発酵物（FBP）による青枯病抑制機構の解明.............. ○田所 千佳 1, 緋田 安希子 1, 鳥居 英人 2, 竹中 航平 2, 藤岡 耕太郎 2, 岸田 晋輔 2, 加藤 純一 1
（1 広島大院・統合生命科学, 2 万田発酵）

13:36

3Np04
農

13:48

3Np05
農

有機資材施肥による根こぶ病菌の抑制.......................................................... ○平野 嵩典, Tran Quoc Thinh, 久保 幹（立命館大院・生命科学）
Isolation of plant growth-promoting rhizobacteria mutant with high resistance to hostile environment................................ ○Fathiah Rizky Kosasih 1,2, Kentaro Miyazaki 1, Hiroya Tomita 1,3, Kohsuke Honda 1,3（1 ICBiotech, Osaka Univ., 2 PT Pupuk Sriwidjaja Palembang-Indonesia, 3 OTRI, Osaka Univ.）
休憩

14:00
14:12

3Np06
環,農

14:24

3Np07
農

14:36

3Np08
農

木質バイオマスを用いた新規有機土壌の開発.......................................................... ○玉田 佑貴, Tran Quoc Thinh, 久保 幹（立命館大院・生命科学）
堆肥のミネラル成分解析による高度化.......................................................... ○神谷 康平, Tran Quoc Thinh, 久保 幹（立命館大院・生命科学）
Study on properties of organic fertilizer in Japan........................................................................................... ○Yihao Huang, Quoc Thinh Tran, Motoki Kubo
（Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.）

14:48

3Np09
環,農

15:00

3Np10 学環,農

有機物による土壌肥沃度向上に関する研究.......................................................... ○大西 智也, Tran Quoc Thinh, 久保 幹（立命館大院・生命科学）
コーヒーかす抽出液を利用した出芽酵母によるバイオスティミュラントの生産................................................................... ○河智 夏希 1, 高木 啓詞 2, 弘埜 陽子 1, 菊川 寛史 1, 原 清敬 1
（1 静県大院・薬食生命, 2 静岡県工業技術研究所 沼津工業技術支援センター）
休憩

15:12
15:24

3Np11
化

15:36

3Np12
農

15:48

3Np13
環,農

16:00

3Np14 学化

Photothermal Applications of Spent Coffee Grounds...................................... ○Chien Hsiu-Wen（National Kaohsiung University of Science and Technology）
クロレラ残渣が植物成長に対する生物刺激剤としての効果.......................................................... ○岡崎 飛鳥, 久保 幹, Tran Quoc Thinh（立命館大院・生命科学）
植物生長に対する藻類培養液のバイオスティミュラント効果...................................................... ○沖本 和香奈, Tran Quoc Thinh, 久保 幹（立命館大院・生命科学）
竹を固体培地として用いた有用酵素生産に関する研究................................................................................ ○角南 茉耶 1, 佐々木 千鶴 2, 松浦 一雄 3, 大政 健史 4
（1 徳島大院・創成科学, 2 徳島大院・社会産理工, 3 ナノミストテクノロジーズ(株), 4 阪大院・工）16:12

3Np15 学
環

16:24

3Np16
食,環,農

緑膿菌バイオフィルム形成を抑制する Bacillus sp. A13 株代謝物の特性解析...................... ○八又 翔風 1, 松村 吉信 2,3（1 関西大院・理工, 2 関西大・化生工, 3 関西大・ORDIST）
Toward Net-Zero agrifood industrial cycle through insect-based biorefinery......................................................................................................................................... ○Yu-Shen Cheng 1,2（1 Dept. Chem. & Mater. Eng., Coll. Eng., Nat'l Yunlin U. Sci. Tech.,
2

Coll. Future., Nat'l Yunlin U. Sci. Tech.）

71

O 会場 工 1 号館 142 教室（13:00～16:36）【バイオマス，資源，エネルギー工学】
13:00

3Op01 学

リグニンからの芳香族ポリマー原料の選択的生産 (第 2 報)： Pseudomonas sp. MHK4 株由来アセト化

バニロン変換酵素系 のバニリン酸生産への適用.............................................................. ○入山 就 1, 鎌田 真未 2, 増井 ゆい 1, 樋口 雄大 2, 大関 さおり 2,
坂本 千穂 2, 上村 直史 3, 政井 英司 3, 園木 和典 2（ 弘前大院・農生, 2 弘前大・農生, 3 長岡技科大・物質生物）
1

13:12

3Op02 学

リグニンからの芳香族ポリマー原料の選択的生産 (第 3 報): バガスオルガノソルブリグニン由来の化

多様な芳香族化合物からバニリン酸を選択的に生産する微生物株の作出............. ○村木 香渚美 1, 鎌田 真未 1, 大関 さおり 1, 池田 和磨 1, 児玉 直弥 2, 石丸 裕也 3, 樋口 雄大 1,
吉川 琢也 4, 吉田 曉弘 5, 上村 直史 6, 政井 英司 6, 中坂 佑太 3, 増田 隆夫 3, 園木 和典 1
（1 弘前大・農生, 2 弘前大院・農生, 3 北大院・工, 4 帯広畜産大・環境農学, 5 弘前大・地域戦略研,
6

13:24

長岡技科大・物質生物）

3Op03 学

リグニンからの芳香族ポリマー原料の選択的生産 (第 4 報) : バガスオルガノソルブリグニン由来の化

多様な芳香族化合物からバニリン酸の生産を可能にする有効変異の同定................................................................................... ○池田 和磨 1, 児玉 直弥 2, 村木 香渚美 1, 大川 全 3,
樋口 雄大 1, 上村 直史 3, 政井 英司 3, 園木 和典 1
（1 弘前大・農生, 2 弘前大院・農生, 3 長岡技科大）

13:36

3Op04

Enrichment of halotolerant hydrogen-oxidizing bacteria and production of high-value-added hydroxyectoine

化,環using a hybrid biological inorganic system.............○Xiang Feng 1, Daichi Kazama 1, Sijia He 1, Hideki Nakayama 2, Kozo Sato 1, Hajime Kobayashi 1（1 Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo, 2 Grad. Sch. Fish. Sci. Environ. Stud., Nagasaki Univ.）

13:48

3Op05 学
化

休憩

14:00
14:12

14:24

3Op06

Utilization of nipa sap as inexpensive nutrient source for Moorella thermoacetica (f. Clostridium

食,化,医,農,基thermoaceticum).......................... Nguyen Dung Van, ○Harifara Rabemanolontsoa（Grad. Sch. Energy Sci., Kyoto Univ.）

3Op07 学

硫酸化修飾による酵母の水溶液中からの重金属イオン回収能力の改善............................................................................ ○山田 こころ, 尾島 由紘, 東 雅之（大阪公大院・工）

環

14:36

Rhizopus 属糸状菌によるペーパースラッジからのコハク酸生産............................................................................................... ○海谷 美佳, 森脇 真希（富山大院・理工）

3Op08 学環

細胞プラスチックス形成における細胞内容物の多角的な特性評価................................................................................................... ○根本 進太郎 1, 入谷 康平 2, 中西 昭仁 1,3（1 東京工科大院・バイオニクス, 2 東京工科大・工, 3 東京工科大・応生）

14:48

3Op09
食,化,環,農15:00

持続可能な光触媒メッシュ微細藻類バイオリファイナリーシステムの開発.................................................................................... ○楊 英男, 張 程, 安 広キ（筑波大院・生命環境）

3Op10 学閉鎖型レースウェイ水槽における微細藻類沈殿機構に関する研究（水車パドルの回転によって形成環,基される流路方向縦渦の影響）................................................................................ ○森野 魁人 1, 植田 芳昭 2, 酒井 祐介 3, 逢坂 竜之介 3（1 摂南大院・理工, 2 摂南大・理工, 3 熊谷組）
休憩

15:12
15:24

3Op11

Lipid production by Lipomyces starkeyi using a two-stage continuous feeding strategy with a synthetic

食,農medium.................................................................................... ○Chih Chan Wu 1, Kenji Okano 2, Kohsuke Honda 1,3（1 ICBiotech, Osaka Univ., 2 Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ., 3 OTRI, Osaka Univ.）

72

15:36

3Op12
化,環

外部循環型フォトバイオリアクターを用いた遺伝子組換えシアノバクテリアによるグリセロール生産.................................................................. ○叶 静遠 1, 堀内 淳一 1, 熊田 陽一 1, 広川 安孝 2, 花井 泰三 2,
村上 明男 3, 小倉 慎也 1, 端 暸太 1, 武田 真由子 1（1 京工繊大院・工芸科学, 2 九大院・農, 3 神戸大院・工）

15:48

3Op13
食

油脂酵母 Lipomyces starkeyi における油脂超高蓄積株 N5-15 株の育種............ ○三根 健太郎 1,2, 高城 博也 1, 松尾 伸二 1, 吹井 真緒 2, 山吉 陵平 2, 佐藤 里佳子 2, 高久 洋暁 2
（1 日清食品ホールディングス, 2 新潟薬大・応生命）

16:00

3Op14 学環

海洋珪藻 Fistulifera solaris のオープンポンド型屋外培養におけるオイル蓄積機構の解析............................................... ○福田 晴 1, 熊久保 涼太 1, 村田 智志 1, 西村 恭彦 2, 吉野 知子 1, 田中 剛 1（1 農工大院・工, 2 電源開発）

16:12

3Op15
環,基

16:24

3Op16
基

Aurantiochytrium sp.産不飽和脂肪酸を原料とした 1,4-シクロヘキサジエンの合成............................................................................................ ○富澤 哲, 河本 青空, 大島 賢治（熊本高専）
微細藻類 Chlamydomonas reinhardtii におけるグリセリド蓄積誘導欠損株の変異育種と解析....................... ○加藤 悠一 1,2, 蓮沼 誠久 1,2（1 神戸大・先端バイオ工研セ, 2 神戸大院・科技イノベ）

ランチョンセミナー（11:30～12:30）
B 会場 IB015 教室
3L-B01

株式会社バッカス・バイオイノベーション

D 会場 IB013 教室
3L-D01

株式会社エービー・サイエックス

G 会場 ES022
3L-G01 レフェイン・ジャパン株式会社

I 会場 ES025
3L-I01

株式会社豊田中央研究所

9 月 3 日（日）授賞式典（9:00 〜 10:00）
会長挨拶，KSBB 会長挨拶，功労会員推戴，各賞授賞式

受賞講演（10:05 〜 11:35）〈生物工学功労賞〉

受賞者 川瀬 雅也 1，○中山 亨 2（1 長浜バイオ大・バイオ，2 東北大院・工）第 17 回生物工学功労賞の受賞にあたって
1A-Aa01

p. 75〈生物工学賞〉

受賞者 髙木 博史（奈良先端大・研推機構）
微生物の代謝調節・細胞機能に関する基盤的研究と発酵・醸造への応用
1A-Aa02

p. 75〈生物工学功績賞〉

受賞者 青柳 秀紀（筑波大・生命環境）
微生物機能・資源の開拓に資する培養技術の開発と利用に関する基礎的研究
1A-Aa03

p. 76〈生物工学功績賞〉

受賞者 堀 克敏（名大院・工）細菌の接着機構と界面微生物工学プロセスの創出に関する研究

1A-Aa04

p. 76

1A-Ap01

p. 77

1A-Jp01

p. 77

受賞講演（13:00 〜 13:20）〈生物工学奨励賞（江田賞）〉

受賞者 徳岡 昌文（東農大・応生科）
清酒中の未知オリゴ糖に関する研究〈生物工学奨励賞（斎藤賞）〉

受賞者 吉野 知子（農工大院・工）
希少細胞を対象とした単一細胞解析技術の開発と応用〈生物工学奨励賞（照井賞）〉

受賞者 井上 謙吾（宮崎大・農）
微生物燃料電池の発電機構の解明と有機性廃棄物処理への応用に関する生物工学研究
1A-Lp01
p. 78

1

シンポジウム（13:30 〜 15:30）
生命科学研究の革新に向けたバイオ DX の挑戦【JST ・ CREST 「データ駆動 ・ AI 駆動を中心としたデジタルトランスフォーメーション
による生命科学研究の革新 （バイオ DX）」 研究領域 共催】
1S-Ep01〜05
p. 78

一般講演（13:30 〜 17:06）
酵素学，酵素工学

1Ap01〜16, 1Bp01〜16

p. 81

生体情報工学，バイオインフォマティクス／酵素学，酵素工学／タンパク質工学
1Cp01〜16

p. 89

セル＆ティッシュエンジニアリング／生体医用工学

1Dp01〜16

p. 93

醸造学，醸造工学

1Fp01〜16

p. 97

1Gp01〜15

p. 101

発酵生理学，発酵工学／代謝工学／オミクス解析

1Hp01〜16

p. 104

代謝工学／発酵生理学，発酵工学

1Ip01〜16

p. 108

遺伝子工学

1Jp01〜16

p. 112

バイオセンシング，分析化学／センサー，計測工学／遺伝子工学

1Kp01〜16

p. 116

生物化学工学／バイオプロセス／培養工学

1Lp01〜16

p. 120

システムバイオロジー／生物化学工学／培養工学／バイオプロセス

1Mp01〜16

p. 124

核酸工学／ペプチド工学／脂質工学／糖鎖工学／分類，系統，遺伝学

環境工学，廃水処理技術／環境浄化，修復，保全技術／バイオマス，資源，エネルギー工学
1Np01〜16
p. 128
環境浄化，修復，保全技術／バイオマス，資源，エネルギー工学／環境工学，廃水処理技術
1Op01〜16
p. 132

75

1A-Aa01 〈受賞講演（生物工学功労賞）〉

1A-Aa02 〈受賞講演（生物工学賞）〉
微生物の代謝調節・細胞機能に関する基盤的研究と発酵・醸造への応用

第 17 回生物工学功労賞の受賞にあたって
川瀬 雅也 1, ○中山 亨 2（1 長浜バイオ大・バイオ, 2 東北大院・工）toru.nakayama.e5@tohoku.ac.jp○髙木 博史（奈良先端大・研推機構）
hiro@bs.naist.jp

この度，「学会の生物工学教育事業への貢献」という事由にて，第 17 回生物工学功労賞をいただくことになりました．以下にその主な内容を記載いたします
が，それらには，当時の生物工学教育委員会や JABEE 特別部会の委員の皆様のお力添えとご貢献なしでは実現しなかったものが多く含まれます．この度の受賞の喜びを，当時の委員の皆様と分かち合いたいと思います．また出版に関しまして事務局の皆様にご尽力いただきましたこと，改めて感謝いたしたく存じます．人材育成の中核となる「教育」は，今後も学会の考えるべき重要な課題となると考えており，引き続き微力ながら努力していきたいと考えております．
【「基礎教育奨励項目」に関するアンケートの実施と結果の公表】 現在もなお拡張・発展を続ける生物工学が体系的な学問分野であるためには，その土台を支える共通の基礎（基礎教育奨励項目）が存在するはずである．そうした考えのもと，両受賞者は今後の生物工学教育の指針となりうる「基礎教育奨励項目」
に関するアンケートを立案・企画し，生物工学教育委員会の協力を得て本学会員を対象に実施し，その結果を報告した [1]．これは，生物工学領域の特色を社会に向けて示し，多方面に対応できる生物工学学徒の潜在的能力を示しその質を保証する役割の一端を担うものとなった.
【統計解析の実践的な解説記事の連載】 生物工学領域において統計解析法の正しい理解と活用が必要とされるなかで，生物工学の研究現場に即したその実践的な解説が強く望まれていた．川瀬はそうしたニーズに答える解説記事「間違いから学ぶ実践統計解析」を生物工学会誌に約 2 年間にわたり隔月連載で掲載した．同企画は好評を得，「続・間違いから学ぶ実践統計解析」も約 2 年間にわたり隔月連載で掲載した．同連載は成書出版にも至った．
【生物工学の入門書の出版】 中山は『ひらく，ひらく「バイオの世界」１４歳からの生物工学入門』 の編集委員長として，同書の立案・企画・編集を主導
し，学会創立 90 周年記念出版物として出版に導いた（2012 年）．同書は，親子で読める平易なバイオテクノロジー入門書として好評を博しながら版を重ね，一般市民への生物工学の普及に大きく貢献している．
[1] 生物工学教育委員会ワーキンググループ 生物工学会誌 94, 806-812 (2016).

演者は、微生物の新しい代謝調節機構や細胞機能を見出し、解析を行ってきた。
また、得られた基盤的知見を微生物の高機能開発に資することで、実用株の育種や発酵・醸造への応用を試み、多くの社会実装に成功した。以下に研究の概要を述べる。
アミノ酸の代謝は多岐に渡り、その調節機構は微生物の種類や生存環境、代謝様式で異なる。演者はアミノ酸の新たな代謝調節機構を解析するとともに、細胞内含量を高めた微生物を育種し、発酵・醸造食品への応用を試みた。
１）システイン（Cys）：医薬品・食品添加物などの原料として重要な Cys の代
謝調節機構と生理機能を解析し、得られた成果の一部が共同研究先による Cys
発酵生産の工業化に貢献した。
２）ロイシン（Leu）：沖縄の蒸留酒「泡盛」の高付加価値化を目的に、Leu 合成の中間体から生成され、清酒やパンの香気成分である酢酸イソアミル（IAA）の含量が増加した泡盛酵母の変異株を取得し、α-イソプロピルリンゴ酸シンター
ゼ Leu4 の遺伝子変異が Leu/IAA 高生産の原因であることを見出した。また、
沖縄に自生するハイビスカス花より分離した酵母からも Leu/IAA 含量が増加した変異株を分離し、高生産機構を明らかにした。これらの育種株で醸造した泡盛は、香味性が向上しており、商品化された。
３）オルニチン（Orn）：肝機能改善効果のある Orn を高生産する清酒酵母の変異株を分離し、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ Arg6 のアミノ酸置換によりフィードバック阻害感受性が低下し、Orn が高生産されることを見出した。育種株で醸造した清酒は Orn を高含有しており、商品化された。
４）プロリン（Pro）：ワイン・ビールの高付加価値化を目的に、酵母がブドウ中や麦中汁の Pro を資化できない未知の機構を解析し、細胞への取込み抑制に
Arg などの塩基性アミノ酸が関与することを見出した。
５）必須アミノ酸（バリン・イソロイシン・フェニルアラニン・リジン）：酵母エキス、サプリメント、飼料への利用、また代謝産物のフーゼルアルコールが酒類の香気成分やバイオ燃料として期待されるため、各アミノ酸を高生産する
産業酵母の変異株を取得し、高生産機構を明らかにした。また、フェニルアラ
ニン合成の中間体から生成するフェネチルアルコール（バラ香）を高生産する
ビール酵母については、醸造したクラフトビールが商品化された。
以上の知見をもとに、機能性アミノ酸の含量を人為的に制御した微生物の育種技術を「アミノ酸機能工学」と命名した。アミノ酸は生物に共通する分子であるため、基礎・応用の両面で波及効果は大きい。
酵母は発酵生産過程において様々な環境ストレスに曝され、有用機能が制限されている。演者は実験室酵母に見出した環境ストレスに対する細胞の耐性機構を解析するとともに、ストレス耐性の向上した産業酵母を育種し、発酵・醸造
食品の高付加価値化を試みた。
１）プロリン（Pro）
・アルギニン（Arg）代謝：Pro を蓄積する実験室酵母の変異株を分離し、Pro が種々の環境ストレスから細胞を保護すること、γ-グルタミルキナーゼ Pro1 のアミノ酸置換によりフィードバック阻害感受性が低下し、Pro が高生産されることを明らかにした。Pro の生理機能についても、活性酸素
種・細胞寿命の制御などを見出した。また、Pro を高生産する産業酵母を育種し、パン酵母では冷凍・高糖生地における発酵力の向上、清酒酵母では醸造時間の短縮やエタノール生産量の増加、ビール酵母では醸造期間の短縮と商品化に成功した。一方、Pro の研究過程で N-アセチルトランスフェラーゼ Mpr1 を
実験室酵母に発見し、酸化ストレスから細胞を保護することを明らかにした。
その後、Mpr1 は Arg 合成を亢進し、ストレス耐性に寄与することが示唆された。また、Mpr1 の構造を決定し、ユニークな反応機構を提唱するとともに、熱安定性の向上した変異体を創製し、パン酵母や清酒酵母で発現させると発酵力の向上が見られた。さらに、実験室酵母において Tah18 タンパク質依存的に一酸化窒素（NO）が合成され、細胞の高温ストレス耐性に寄与することを見出した。パン酵母では NO 合成系の強化により、製パン過程のストレスに対する耐性や発酵力が向上した。また、NO の機能二面性を提唱するとともに、NO に対する耐性機構（リボフラビン合成酵素 Rib1 の反応生成物による NO 消去、NOを介した解糖系酵素の翻訳後修飾による NADPH 合成亢進）を見出した。
２）ユビキチンシステム：様々なストレスに感受性を示す実験室酵母の変異株を分離し、ユビキチンリガーゼ Rsp5 が変性タンパク質の修復・分解に関与することを見出した。また、リン酸化を介した Rsp5 の活性制御、Rsp5 による多様なストレス応答を明らかにした。さらに、ビール酵母では Rsp5 の過剰発現により高濃度醸造が可能になり、バイオエタノール酵母では Rsp5 変異体により酢酸ナトリウム存在下での発酵力が向上した。パン酵母ではユビキチンシス
テムが冷凍で生じる変性タンパク質の分解や発酵力の維持に寄与することが判明した。
以上の成果は、他の微生物や高等生物のストレス耐性研究にも寄与している。
特に、NO やユビキチンリガーゼは疾病との関連から創薬の標的として注目されており、基礎・応用の両面で波及効果は大きい。

Receiving the 17th SBJ Meritorious Service Award

Fundamental research on metabolic regulations and cellular functions of
microorganisms and their application to fermentation and brewing

Masaya Kawase1, ○Toru Nakayama2(1 Dept. Biosci., Nagahama Inst. Bio-Sci. Technol., 2 Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ.)

Key words

education, JABEE○Hiroshi Takagi(Inst. Res. Initiatives, NAIST)

Key words

microorganisms, amino acid metabolism, stress tolerance, fermentation

76

1A-Aa03 〈受賞講演（生物工学功績賞）〉

1A-Aa04 〈受賞講演（生物工学功績賞）〉

微生物機能・資源の開拓に資する培養技術の開発と利用に関する基礎的研究

細菌の接着機構と界面微生物工学プロセスの創出に関する研究○青柳 秀紀（筑波大・生命環境）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp○堀 克敏（名大院・工）khori@chembio.nagoya-u.ac.jp

演者は培養工学や生物化学工学などを専門として、微生物や植物の細胞、プロ
トプラストや組織、動物細胞、それらの共生系を対象に、有用物質生産、環境や食品の分野などへの利用を目指し、一貫して培養・関連技術の開発研究を進めてきた。本講演ではその中の一部である、従来の微生物培養法の特性解析と新規培養法の開発・利用について中心に紹介する。
19 世紀後半に Louis Pasteur や Robert Koch により確立された微生物純粋培養法
により、多くの有用微生物が自然界から探索・単離・培養され、微生物関連産業は発展してきた。近年、遺伝子情報の解析などにより、“従来の微生物培養法
では自然界に存在する全微生物の 1%程度しか培養できない”ことが明らかとなり、その限界が指摘されている。残された 99%の未培養微生物は“微生物ダー
クマター（Microbial dark matter）”と呼ばれ、国内外でその利活用が期待され、網羅的な環境ゲノム解析などが活発に行われているが、微生物機能の解明や実用的利用を行う場合、その培養化が必須になる。“1%程度しか培養化できない”
未培養微生物の課題や学術的問いは、生物工学、農学、環境、食品、医歯薬学、など幅広い微生物関連分野に共通・普遍的な課題であり、新たな培養法の開発が求められている。これまで微生物学を支えてきた基本的・基盤的な培養法である振盪フラスコ培養法や寒天平板培養法は、それぞれ約 90 年、140 年前に開発され、世界中で使用されているが、今日までほとんど進歩しておらず諸特性も不明瞭な部分が多い。この現状を踏まえ、演者は各培養法の特性解析と新たな培養法の開発研究を進めている。
【振盪フラスコ培養法の特性解析と新たな培養法】 三角フラスコを用いて土壌試料を振盪培養し、微生物を探索する過程で、サンプリングの有無により異なる培養微生物群集構造が形成していることを見出した。サンプリング操作を行う際の培養栓の開封に着目し、培養中に意図的に培養栓を短時間、開封する実験を実施した結果、培養栓の開封の有無や開封条件により異なる培養微生物群
集構造が形成した。培養栓の開封操作の再現性の向上と煩雑さを解消するために、間歇的な通気が可能な Automatic Aeration Flask System（AAFS）を開発した。また、フラスコ振盪培養中の気相部と液相部（培養液）の二酸化炭素と酸素の濃度をモニタリングできる Circulation Direct Monitoring and Sampling System（CDMSS）を開発した。CDMSS により種々のフラスコの特性や微生物の振盪
フラスコ培養中の二酸化炭素と酸素の経時的な濃度変化を初めて明らかにすることができた。AAFS と CDMMS を用いて種々検討した結果、短時間の間歇的な培養栓の開封やフラスコ気相部への通気等による、フラスコ気相環境の変化は集積される培養微生物群集構造に影響を及ぼす事が示された（振盪フラスコの気相環境は重要な培養因子である）。また、微生物を無菌的に接種する際に行われるフラスコの口の火炎殺菌操作で、フラスコ内に燃焼ガスが巻き込まれ，二酸化炭素が蓄積する事で培養挙動が変化する微生物が存在することが示された。明らかにした振盪フラスコ培養の諸特性を基に、種々の新たな振盪フラス
コ培養法などを提案、開発している。
【寒天平板培養法の特性解析と新たな培養法】 自然界から微生物を単離培養する際、一般的に寒天平板培養法が用いられるが、自然界に存在する全微生物の1%程度しか培養ができず、限界が指摘されている。この現状を打破するために、培養素材としてオートクレーブ滅菌が可能な Specialized Cellulose Film（SCF）
を開発し、“寒天平板培養法の問題点を解消した新たな微生物単離培養基材”を開発した。本培養基材を活用する事で、寒天平板培養法では得られなかった多様な未培養微生物が様々な環境試料から培養化することができた。また、本培
養基材は寒天平板培養法が使用できない条件（強酸性，強アルカリ性）での培養（使用）が可能であり、寒天平板培養法には無い特長もある（培養中の培養液の採取や成分の測定，培養中の培地の交換や変更が可能）。一例として、中性条件で細菌を SCF で培養後、SCF を強酸性培地に移動させる事で酸ストレスを与え、耐酸性菌をスクリーニングする pH 変動培養法を開発し、中性条件下で生育し強酸性条件下で生存可能な新規な耐酸性菌の単離培養に成功した。
【微生物の利用について】 研究を遂行する過程で選抜培養や単離培養した微生物の利用例として、リン蓄積能に優れた食用可能な乳酸菌やビフィズス菌を使用する、“慢性腎臓病（CKD: Chronic Kidney Disease）の予防用のリン除去シン
バイオティクス食品素材”を開発した。また、単離培養したカビが菌体外に大量に分泌生産した色素を活用した銀ナノ粒子などの効率的な生成システムを開発した。
末筆ではございますが、ご指導いただきました恩師の田中 秀夫 先生（筑波大学名誉教授）をはじめとする先生方、研究を支えてくれた研究室の学生・スタッ
フの皆様、共同研究者の皆様、すべての関係者、家族に心より感謝申し上げます。また、大学生の時より研究発表や学会活動の場、多くのご縁を与えていただきました本会ならびにご関係の皆様に厚く御礼申し上げます。

受賞者は揮発性汚染物質を処理するバイオリアクターから、有機溶媒分解能を有する新規細菌 Acinetobacter sp. Tol 5 株を分離し、その特性や分解能力を詳細に解析、高い付着性も見出した。その後、Tol 5 に非特異的で高い付着性をもたらす細胞表層ナノファイバータンパク質 AtaA を発見し、関連の研究を精力的に進めてきた。生物工学会においては、関連研究テーマを含む学問領域の創出を目指し、『バイオインターフェース研究部会（2015-2021 年）』を設立、毎年の研究会の開催や和文誌への特集の編著、英文誌へのレビュー論文の投稿などを主導し、活発な活動を通じて学会を牽引してきた。
基礎研究では、新規接着タンパク質 AtaA の構造と接着特性、バイオフィルム形成における役割等を明らかにしてきた。AtaA は、グラム陰性病原性細菌が有する三量体型オートトランスポータアドヘシン(TAA)ファミリーに属するタンパク質である。TAA は宿主のもつタンパク質に特異的に接着して感染を引き起こすことが知られているが、あらゆる非生物材料に強力に接着することができる TAA は AtaA のみである。そもそもこの接着性は、タンパク質としてもユニークな性質である。この発見に、TAA を研究対象としてきた欧米の研究者達も大きな関心をもち、以来、受賞者が本テーマで国際共同研究を主導してきた。
その成果として、AtaA の結晶構造の決定に至った。AtaA は 3 本のポリペプチ
ド鎖からなるホモ三量体を形成し、細胞上に長さ 250nm、太さ 5nm のナノファイバーとして提示される。AtaA ナノファイバーでは 10 種類以上のドメイン構造が反復し、コイルドコイルが各ドメインを連結する。受賞者は、Tol 5 細胞がAtaA を使って固体表面に付着しバイオフィルムを形成する機構を、コロイド粒子の凝集機構を発展させた独自の理論で記述した。
応用研究では、ataA 遺伝子を非付着性細菌に導入発現させることで付着性を付与できることを見出し、新規の微生物固定化法の発明に至った（2014 年本会英文誌で論文賞受賞）。新規固定化技術は、従来の包括固定法や共有結合法が抱える物質移動律速や活性低下の問題を完全に克服した。その上、純水で洗浄する
だけで、またはある種のペプチドを加えるだけで、固定化された細胞を剥離できることも見出し、反復着脱法の発明に至った。世界で唯一、担体も微生物も再使用可能な微生物固定化技術であり、微生物工学プロセスに革新をもたらした。その後、3630 アミノ酸から成る巨大な AtaA の機能を損なわずに縮小する
方法論を国際共同研究により確立、この方法を用いて AtaA ファイバーの先端のみが非特異的接着に働く機能部位であることを明らかにし、短縮 AtaA の構築に成功した。これを利用して、大きすぎて発現が困難であった大腸菌でのataA の異種発現に成功、大腸菌の革新的固定化技術の確立に至った。さらに受賞者は、簡潔で強固な AtaA による微生物固定化技術の利点を最も活かせる生物工学プロセスとして、固定化微生物を気相中で化学反応触媒として利用する
気相微生物反応も発明した。これは、微生物を培養液中ではなく担体表面に固定化し、気相中で化学反応に供するというゲームチェンジングな技術である。
革新的な温暖化対策が求められる現在、気相微生物反応による温暖化ガス変換法は高い注目を集め、JST の先端的低炭素化技術開発（ALCA）、NEDO のムー
ンショット型研究開発事業にも連続的に採択され開発を進めた。さらに気相微生物リアクターとして、新規の気液界面リアクターを創出した。固定化技術だ
けでなく、AtaA ファイバー上に機能性分子を連結する、オン・ファイバーディ
スプレイと名付けた新規細胞表層提示技術も発明した。さらに AtaA を利用した研究は、細菌様人工粒子、接着タグ、タンパク質性超繊維の創製等へと益々発展している。様々な分野において、高い波及効果が期待される。
受賞者は、2017 年には自ら起業してベンチャー企業を立ち上げ、これら技術の社会実装を本気で目指している。受賞者の『細菌の接着機構と界面微生物工学
プロセスの創出に関する研究』は、基礎から応用研究に至るまで新規性・独創性に富んでおり、イノベーション創出・社会実装・ベンチャー起業など社会・経済への波及効果も大きく、SDGs に寄与する生物工学の発展に大きく貢献するものである。

Basic research on development and utilization of new culture technology forthe exploitation of microbial functions and resources

Study on the bacterial adhesion mechanism and the creation of interfacial
microbial engineering processes

Key words
biochemical engineering, cell culture technology, microbial dark
matter, probiotics

Key words○Hideki Aoyagi(Inst. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)○Katsutoshi Hori
(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)bacteria, adhesion, biointerface, immobilized cell

77

1A-Ap01 〈受賞講演（生物工学奨励賞（江田賞））〉

1A-Jp01 〈受賞講演（生物工学奨励賞（斎藤賞））〉

清酒中の未知オリゴ糖に関する研究

希少細胞を対象とした単一細胞解析技術の開発と応用○徳岡 昌文（東農大・応生科）
m3tokuok@nodai.ac.jp○吉野 知子（農工大院・工）y-tomoko@cc.tuat.ac.jp

糖は清酒の主要な不揮発性成分であり，通常はグルコースが最も多く，その他にオリゴ糖やデキストリンが含まれる．これらの糖は，甘味に加え，味の調和や粘稠性などへの寄与が指摘されており，清酒の味の骨格を作る要素と考えられている．1950 年代に，醸造物からコージビオースとサケビオースが世界に先駆けて発見され，その後，清酒には複数の非発酵性オリゴ糖が含まれることが示されたものの，重合度 2，3 の一部オリゴ糖を除き，研究報告は少なく，清酒中のオリゴ糖の知見は限られていた．本講演では，清酒中のオリゴ糖について演者らが取り組んだ，分析法構築から構造と生成メカニズムの解析についての研究成果を紹介する．
1. 質量分析計による清酒中オリゴ糖の分析
清酒のように，多様な化合物を含む試料の網羅的な成分解析には液体クロマト
グラフィーと質量分析計を連結した LC/MS が優れることを見出していた．そこで清酒中のオリゴ糖についても，親水性相互作用液体クロマトグラフィー（HILIC）-飛行時間型質量分析計（TOF/MS）を用いた方法を検討し，リチウムイオン付加体として特異性高くオリゴ糖を検出する方法を構築した．本方法によるオリゴ糖の分析から，清酒には少なくとも重合度 18 までのオリゴ糖が含まれ，その含有量は製品により大きく異なること，それらオリゴ糖は β-アミラー
ゼでは分解されないこと，一部のオリゴ糖にはグルコアミラーゼでは分解されない部分構造が存在することが明らかとなった．
2. 清酒中オリゴ糖の構造解析
清酒中のオリゴ糖は，醪期間を経て残存していることから，麹菌酵素では容易に分解されない特徴があると予想されるものの，原料となる米の澱粉には，麹菌酵素で分解できる結合様式しか含まれない．この矛盾にも注目し，清酒中のオリゴ糖の構造解明に取り組んだ．HILIC-TOF/MS を用いることで，清酒中の重合度 6 のオリゴ糖が明瞭な 2 本のピークとして検出できたことから，初めにこのオリゴ糖の精製を行った．精製は容易でなかったが，糖質ゼロとして販売されている清酒が，重合度 6 の目的のオリゴ糖を相対的に多く含むことを偶然見出したことで，十分な精製品の取得を達成できた．NMR 解析の結果，本オリゴ糖は，マルトテトラオースを主鎖として，非還元末端側に α-1,6 結合の隣接した分岐（以下，隣接型分岐）を持つグルコオリゴ糖であった．このオリゴ糖は α-1,4 及び α-1,6 結合のみから構成される単純な構造でありながら，天然物を含めてこれまで報告の無い新規オリゴ糖であった．さらにその後，重合度 7と重合度 8 のオリゴ糖の精製と構造決定にも成功し，隣接型分岐を含む，新規構造の重合度 6，7，8 のオリゴ糖が清酒中に存在することを明らかにした．また，重合度 8 のオリゴ糖の 1 つは，α-1,6 結合でイソマルトースの分岐(以下，
イソマルトース型分岐)を非還元末端に持つオリゴ糖であった．さらに，隣接型
分岐を非還元末端に持つオリゴ糖は，グルコアミラーゼで分解されにくかったことから，この分岐構造が，これらオリゴ糖が残存する構造的な要因と考えられた．
3. 清酒中オリゴ糖の生成メカニズムの解析
澱粉構造の研究から，澱粉の部分構造には隣接型分岐やイソマルトース型分岐は存在しないと考えられていた．また，コージビオースやサケビオースは α-グ
ルコシダーゼの糖転移作用で生成することが知られている．そのため，新たに見つかった清酒中のオリゴ糖は単なる澱粉の分解物ではなく，清酒製造工程において糖転移により生成したと予想し，糖転移活性を持つ麹菌の α-グルコシ
ダーゼから，主要なものである AgdA の遺伝子破壊株を作製し，この株を用いて製造した清酒中のオリゴ糖を調べた．その結果，イソマルトース型分岐のオリゴ糖が AgdA 遺伝子破壊で減少し，この分岐構造のオリゴ糖生成に糖転移が関与することが示された．一方で，隣接型分岐のオリゴ糖の生成には AgdA の有無は影響しなかったことから，次に澱粉の部分構造中に隣接型分岐が存在する可能性について検討した．米澱粉を糖転移が生じない条件で酵素消化し，消化残渣のオリゴ糖を調べた結果，清酒に存在する隣接型分岐オリゴ糖と同一のオリゴ糖が検出された．同様の結果が，米以外の穀類でも得られたことから，
澱粉の部分構造として隣接型分岐が存在することが初めて明らかとなった．隣接型分岐は，米澱粉中の分岐の少なくとも 1/100 程度の割合で存在すると推定され，現在の澱粉構造モデルには考慮されていないため，新たな構造モデルの検討が必要かもしれない．
以上より，清酒成分として未解明であった，重合度 4 以上のオリゴ糖に関して，その一部の構造を明らかにすることができた．明らかになったユニークな分岐
構造は，清酒で残存する特性を説明するものであった．今後のさらなる研究が必要ではあるが，おそらく他の未同定のオリゴ糖についても，同様のパターンの構造であると推定され，本研究で得られた知見から，清酒中のオリゴ糖に関する多くの情報が得られたと考えている．一方で，清酒品質とオリゴ糖の関連は未解明であり今後の研究課題である．

我々の身体は、たった 1 つの受精卵から分裂を繰り返してできた約 60 兆個の細胞集合体からなる。生命の最小単位である個々の細胞は分裂や様々な分化を繰り返して、臓器を形成する他、がんや老化の原因となる、病気を引き起こす原因細胞にもなる。一方で、僅かに存在する幹細胞や免疫細胞は再生医療や細胞医療等への利用が期待できる。この様な本来同一のゲノムを保有する細胞集合体の中にも不均一性が生じており、絶対数が少ない“希少細胞”の性質・機能の理解や利用の上でも単一細胞レベルでの遺伝子情報の取得は極めて重要である。
近年、次世代シーケンサーの技術革新をはじめ、マイクロ流体デバイスを活用した単一細胞解析技術の飛躍的な進展により、細胞集団の不均一性の解明や希少細胞集団の解析が現実のものとなっている。演者は、希少細胞の中でも、特に絶対数が極めて少ない血中循環腫瘍細胞(Circulating Tumor Cell: CTC)を対象とし、診断・治療や転移機構解明に貢献する研究を展開している。本発表では演者が注力してきた CTC を対象とした単一細胞解析技術の開発とその応用について紹介する。本技術は、末梢血からの CTC 回収に留まらず、その他の生体内
希少細胞をはじめ、微生物の分子育種における希少細胞の回収・解析に利用することが可能であり、今後の生物工学分野の進歩に寄与することが期待される。
以下にその概要を示す。
【CTC の単一細胞解析技術の開発】
CTC は、転移に関与する細胞であると考えられており、治療効果の判断指標としても注目されているが、血液 1 ml 中に含まれる約 50 億の血球細胞に対し、僅か数個から数十個程度しか存在しない非常に希少な細胞であるため、既存の単一細胞解析技術による解析が困難である。演者が開発を進めてきた単一細胞解析技術は、CTC と血球細胞との細胞サイズ・変形能の差を利用した高効率な
CTC 濃縮を実現する Microcavity array system (MCA)法、及び MCA 上に捕捉した CTC を光硬化性ハイドロゲルで包埋し、単一細胞を確実に分離可能な Gelbased cell manipulation (GCM)法から構成される。MCA は基板に直径数マイクロメートルの貫通孔を高密度にアレイ化したマイクロフィルターであり、全血を前処理なくフィルトレーションすることで CTC を効率良く MCA 上に濃縮することが可能である。さらに、小細胞肺がんなどの比較的小径のがん細胞の回収に向けた孔構造の改良や、MCA 全面の一括撮像による高速 CTC 検出システム、
MCA を内蔵した使い捨てカートリッジと送液システムを組み合わせた自動 CTC
濃縮システムなどの開発を進めて、医療機関での実証試験を進めてきた。また、
MCA 上から簡便に単一細胞を分離する技術として、GCM 法の開発に着想した。本技術は、光硬化性のハイドロゲルを利用し、標的の細胞のみに光を照射することで単一細胞を目視可能なハイドロゲルで包埋することができる。同時多並列な光照射により単一 CTC をハイドロゲルで包埋することで、希少な CTC
をロスなく確実にゲノム・トランスクリプトーム解析を行う手段として利用で
き、CTC 研究への新たな技術提供を実現している[1, 2]。
【CTC の特性解析】
上述の技術を利用したがん患者血液からの CTC 計測に加え、CTC のゲノム解析により患者間で共通する遺伝子変異の探索やトランスクリプトーム解析による遺伝子発現のモニタリング等、CTC の特性解析に関する研究を推進している。その例として、転移性胃がん患者血液から分離した CTC を対象に、シング
ルセルトランスクリプトーム解析を実施した。解析の結果から、CTC は上皮系の性質だけで無く間葉系の性質を保持している、細胞周期が停止している、幹細胞様の性質を保持している、などの不均一性が確認されている[3]。また、MCA 上に捕捉した CTC の 3D イメージング解析からは、血小板との結合や白血球との融合など血球との相互作用が複数観察され、がん患者血液中に流れるがん細胞が一様で無いことを確認している。特に尿路上皮がん患者の多くに、白血球と融合した可能性の高いがん細胞(Circulating hybrid cell：CHC)の存在が確認され、CHC を保持する患者は予後不良も示されている。ここ 10 年ほどの技術革新により CTC 研究の状況は一変し、単一細胞レベルでの網羅的な遺伝子解析が可能となり、ようやく CTC の特性解析に関する研究が始まったと言える。演者も長年に渡り CTC に特化した単一細胞解析技術の開発を進め、CTCの濃縮から単一細胞分離を一貫して行うことが可能な技術開発に至っている。
これらの技術を通じ、がんの性質の理解や新しいがん治療、診断方法の確立など、がんゲノム医療に寄与するとともに、生物工学分野で扱うあらゆる希少細胞解析への応用を展開し、当該分野の発展に貢献できるよう精進したいと思う。
最後に、本研究はご指導いただいた先生方をはじめ、多くの諸先輩方、学生の皆様に支えていただき続けられた研究であり、心より感謝したい。
【参考文献】
1. Yoshino, T. et al., Anal Chem., 88, 7230-7237 (2016)
2. Negishi, R. et al. Anal Chem., 90, 9734-9741 (2018)
3. Negishi, R. et al. Commun. Biol., 5 (20) (2022)

Studies on unidentified oligosaccharides in sake

Development of single cell technology for rare cells and their applications○Masafumi Tokuoka(Fac. Appl. Biosci., Tokyo Univ. Agric.)

Key words

sake, oligosaccharide, saccharification○Tomoko Yoshino(Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words

single-cell analysis, microfluidic device

78

1A-Lp01 〈受賞講演（生物工学奨励賞（照井賞））〉

1S-Ep01

微生物燃料電池の発電機構の解明と有機性廃棄物処理への応用に関する生物工学研究○井上 謙吾（宮崎大・農）kinoue@cc.miyazaki-u.ac.jp

CREST・バイオ DX 研究領域の紹介○岡田 康志 1,2,3（1 理研・生命機能, 2 東大院・医, 3 東大院・理）okada@phys.s.u-tokyo.ac.jp

微生物燃料電池は微生物を用いて有機化合物の化学エネルギーを電気エネル
ギーに直接変換する技術である。下水や畜産廃水などの処理と同時に発電もできることから、省エネ型の水処理技術として研究・開発が進められている。微生物燃料電池内で電極へ電子を伝える微生物は「発電菌」と呼ばれ、中性付近の廃水処理に微生物燃料電池を用いると、アノード電極表面に Geobacter 属細菌、特に G. sulfurreducens に近縁の微生物が優占種となる例が多数報告されている。つまり、G. sulfurreducens は「発電菌」の代表的な微生物種であるといえる。Geobacter 属細菌は偏性嫌気性の鉄還元菌として古くから研究がされており、細胞外の不溶性酸化鉄（III）や電極などの導体への電子伝達メカニズムについて多くの知見が蓄積している。本講演では、G. sulfurreducens の発電メカニ
ズムについて、細胞外に局在する c 型シトクロムに関する研究、および、実際の有機性廃水を用いた微生物燃料電池の実用化に向けた研究について紹介する。
【発電メカニズム研究】G. sulfurreducens のゲノム中には 100 以上の c 型シトク
ロムが存在するが、それらのうち、omcZ は高効率な電極へ電子伝達に必須である。OmcZ は、約 50 kDa（OmcZL）と約 30 kDa（OmcZS）の二つの異なる大きさで存在する。OmcZS の精製と生化学的特徴付けを行ったところ、OmcZS は極
めて高い疎水性を示し、変性温度は 94℃と非常に安定性の高いタンパク質で、酸化還元滴定により広い酸化還元領域（-420 〜-60 mV）を持つことが明らかになった。また、抗 OmcZ 抗体を用いた免疫金コロイド標識により、OmcZ は電極表面に高密度で局在することが明らかになった。電流生成時と非電流生成時との比較のためのトランスクリプトーム解析の結果、omcZ 遺伝子の直下流のSubtilisin 様プロテアーゼも発電時に高発現していた。このプロテアーゼを ozpAと命名し、ozpA 破壊株の発電能力を調べたところ、野生株と比較して著しく低下していた。また、生産される OmcZ を調べたところ、OmcZS は生産されず、
OmcZL のみ生産されていたことから、OzpA が OmcZL の開裂を行うことで
OmcZS が生産されることが示唆された。
【微生物燃料電池を用いた実廃水の処理技術開発】畜産廃棄物は水分を多く含み、有機物の含有率も高いため、そのエネルギー密度は高く、バイオマスエネ
ルギーとしての利用価値は高い。我々のグループは、微生物燃料電池を用いた
牛糞尿、および、養豚廃水の処理と発電を試みた。牛糞尿を水に懸濁（固液比=1:50）したものを用いて運転したところ、最大出力 16.3 W/m3 の出力を記録した。運転前の牛糞尿、および、アノードに形成されたバイオフィルムについて
微生物群集構造を調べたところ、運転前では Bacteroides 属細菌（26.5%）やClostridium 属細菌（18.4%）が多くを占めていたのに対し、運転後のアノード
バイオフィルムには、Clorofexi 門（29.1%）や Geobacter 属細菌が有意に優占種（18.1%）となっていたことから、これらの微生物が牛糞尿中の有機化合物の分解や発電に寄与していたことが示唆された。また、養豚廃水処理については、
一般的な曝気処理のみよりもより高い処理技術の確立を目指し、曝気と同時に微生物燃料電池を運転し、処理効率を評価した。養豚廃水処理施設内に 1 m3 容量の処理槽を作製し、曝気装置と円柱型微生物燃料電池（25〜45 本）を設置した。外部抵抗や曝気時間の条件を変更しながら 2 年以上運転を行い、最適な処
理条件を検討したところ、曝気時間 12 時間、外部抵抗は 2.7 Ω、曝気時間 4 時
間/日の条件での処理効率が最も高く、曝気のみの条件よりも 5 倍以上の効率で処理が可能であった。
食料品製造で発生する有機性廃棄物も微生物燃料電池で処理と発電が可能であることが知られている。芋焼酎粕は酸性（pH 4）で、製造される焼酎の約 2.5
倍量発生し、その含水率は 90〜95％と高く有機物濃度も高い。芋焼酎粕を用いた微生物燃料電池では、COD 10 g/L の濃度で 1.2 W/m3 程度の出力が得られ、有機物除去効率についても 9 日間で 67.4%の COD が除去されていた。焼酎粕原液（COD 73 g/L）を用いた微生物燃料電池では、Clostridium 属細菌が 75.4%と高い割合を占めていた。大豆食品廃水は多くのタンパク質や糖質を含む有機物が豊富な廃水である。大豆食品廃水を用いた微生物燃料電池においては、最大
13.0 W/m3 を記録し、65%の COD 除去効率を示した。微生物群集構造解析の結果では、Streptohyta 目（28%）や Lactobacillales 目（22%）の微生物が多くを占めていた。
上記のように、用いる有機性廃棄物の種類が違えば、そこで活躍する微生物種も大きく異なるため、それぞれの有機性廃棄物に適した微生物燃料電池の構造や運転方法のみならず、発電菌の種類も工夫することで発電量と処理効率を向上させることができると考えられる。

AI をはじめとする情報技術の進歩は著しく、これを積極的に取り入れることで組織や分野のありかたや文化にまで踏み込んだ包括的かつ革新的な飛躍を目指すデジタルトランスフォーメーション(DX)が人口に膾炙して久しい。ディープ
ラーニングの登場以降、バイオ分野と AI 研究の融合は目覚ましく、生命科学研究分野における DX が期待される。このような認識を背景に、文部科学省により戦略目標「『バイオ DX』による科学的発見の追究」が選定され、CREST「バイオ DX」領域が 2021 年度に発足した。
本領域では、情報科学・工学・生命科学が三位一体となって生命科学研究における DX を推進する、いわば「データ駆動型・AI 駆動型」の研究を推進し、多様、大量のデータセットから AI などデジタル情報処理技術を活用することでデータ取得・解析の質的・量的限界を超えて、新しい生命現象とそのモデル化を可能とするための研究開発を行い、次世代型生命科学研究のモデルケースを示すことを目指している。
本シンポジウムでは、生命科学研究におけるパラダイムシフトの潮流を作ると共に、複雑な生命システムの解明が可能な社会、研究者が真に創造的な活動に取り組むことが出来る社会の実現を目指す本研究領域の取組を紹介し、生命科学研究分野における DX の現状と展望を議論したい。

Bioengineering study of electricity generation mechanisms in microbial fuelcells and their applications in organic waste treatment

Introductionto JST CREST project, "Bio-DX"○Kengo Inoue(Fac. Agric., Miyazaki Univ.)

Key words
generation

microbial fuel cell, Geobacter, wastewater treatment, electricity○Yasushi Okada1,2,3(1 BDR, RIKEN, 2 Grad. Sch. Med., Univ. Tokyo, 3 Grad. Sch. Sci., Univ. Tokyo)

Key words

DX, AI, machine learning, robotics

79

1S-Ep02

微生物代謝の理解と最適化に向けたバイオ DX 基盤の構築

1S-Ep03○石井 純 1,2
（1 神戸大・先端バイオ工研セ, 2 神戸大院・科技イノベ）
junjun@port.kobe-u.ac.jp

データ駆動進化医学で解く季節性うつと冬眠の代謝基盤○柚木 克之 1,2,3（1 理研・生命医科学, 2 慶大・先端生命研, 3 東大院・理）katsuyuki.yugi@riken.jp

経済協力開発機構（OECD）によると，2030 年のバイオ市場は GDP の 2.7%（約180 兆円）に達すると予測されており飛躍的な市場拡大が想定される。この背景には，ゲノム解析を劇的に効率化した次世代シーケンサー（NGS）の登場
や，ゲノム編集技術・DNA 合成技術の確立，IT（情報解析）やオートメーショ
ン（自動化）のバイオ分野への適用があり，合成生物学分野として体系化が進んでいる。従来の第四次産業革命では IoT（Internet of Things）や AI（人工知能），ビックデータの活用が産業構造を変化させているとされてきたが，この合成生物学分野の急速な進歩とともに，バイオテクノロジーとデジタルテクノロ
ジーを融合した世界的な競争領域が形成されつつあり，生命現象の解明や生物機能の理解を産業応用に繋げようとする第五次産業革命が隆起しようとしている。
こうした世界規模の潮流に呼応して，AI やバイオテクノロジーは政府の策定した統合イノベーション戦略の戦略的基盤技術分野に指定されており，イノベー
ション創出への展開が強く期待されている。また，我が国のバイオ戦略においても，2030 年に向けて世界最先端のバイオエコノミー社会の実現や，バイオとデジタルの融合に関する目標が掲げられており，実験や計測の自動化や計算科学の進展により，バイオに関しても大量のデータセットをハイスループットに取得可能となりつつある今，バイオ分野におけるデジタルトランスフォーメーション（バイオ DX）を強力に推進することが求められている。
我々のミニ型 CREST の課題では，独自に開発してきた酵母および大腸菌の自動形質転換システムやハイスループット分析評価系を駆使してバイアスのない
網羅的な実験データを取得することができる。また，大阪大学の松田史生氏と共同で，取得する網羅的実験データを教師データとした代謝シミュレーションのモデル高精度化を推進し，実験室と計算機を連動させて代謝最適化問題に挑むことで，微生物によるバイオものづくり分野におけるバイオ DX のモデルケー
スとなることを目指す。本講演では，現在までに我々が取り組んできたバイオ
DX の基盤となる自動化システムなどの合成生物学基盤を含めて紹介する。

うつ病の一種である季節性うつは日照時間の減少や気温の低下がきっかけとなって発症し、活動量の低下や過食、過眠を伴うことが知られている。興味深
いことに、季節性うつのこれらの特徴は哺乳類の冬眠様行動との類似が指摘されている。これらの類似点に鑑みて、我々は季節性うつは進化的に保存された冬眠様行動の名残ではないだろうかと考え、両者に共通する代謝制御メカニズ
ムの解明を目指す。
本研究を実施する上で第一のボトルネックは、実験動物の行動に関する表現型解析である。現在、マウスにおけるうつ状態や冬眠様行動などの表現型の判定は 1 個体ずつ人間が目で見て行う試験に依っており、評価に日数を要することも相まってスループットが低い。そこでマウスの行動動画を大量撮影し、動画
解析 AI を用いて表現型を自動同定することでこのボトルネックを解消する。
第二のボトルネックは、表現型の背後にある分子メカニズムの解明である。個別分子をチェリーピックして「当たり」を探すのは僥倖に依存するだけでなく、別の重要因子を見逃すリスクが付きまとう。そこでマウス検体やヒト患者由来
検体を自動化絶対定量オミクス計測とトランスオミクス解析に供し、メカニズ
ムの実体たる多階層代謝制御ネットワークをデータ駆動的に同定する。
上記 2 つのボトルネックを解消することにより「動物行動動画→表現型の自動同定→サンプル取得→自動化絶対定量オミクス計測→ネットワーク同定→原因
因子推定・介入→動物行動動画」という一連の研究サイクルを実現する。当該研究サイクルを回すことで季節性うつと冬眠様行動の代謝制御メカニズムを解明し、両者に共通の進化的起源があるかを明らかにする。

Development of Bio-DX platform for understanding and optimizing
microbial metabolisms

Data-driven Darwinian medicine approach for exploring shared metabolic
regulatory networks between seasonal affective disorder and hibernation○Jun Ishii1,2(1 EGBRC, Kobe Univ.,, 2 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

Bio-DX, Microbial metabolism, synthetic biology○Katsuyuki Yugi1,2,3(1 IMS,RIKEN, 2 IAB, Keio Univ., 3 Grad. Sch. Sci., Univ. Tokyo)

Key words

systems biology, metabolism, depression, hibernation

80

1S-Ep04

言語モデルを用いた数式フリーの細胞シミュレーション
法と応用

1S-Ep05○岡田 眞里子（阪大・蛋白研）
mokada@protein.osaka-u.ac.jp

バイオ DX の目指すものとその先の展望○高橋 恒一 1,2,3（1 理研・生命機能, 2 慶大・政策メディア, 3 阪大院・生命機能）
ktakahashi@riken.jp

細胞は構成要素である蛋白質や遺伝子の相互作用により、様々な分子ダイナミ
クスを伴う細胞フェノタイプを示す。よって、細胞の活性やフェノタイプの人工的制御のためには、これらのダイナミクスを操作することがひとつの考え方となっている。このようなダイナミクスの表現や解析には数理モデルが用いられる。しかし、細胞や遺伝子の相互作用ネットワークを数理的に解析するためには、数学やプログラミングの知識が必要となる。また、これらの相互作用を数式として記述するには、その制御関係を事前に知っておく必要がある。発表者らは、このような生物学研究者にとって、労力を伴う問題を解決するために、数学やプログラミングの知識なしに、数理モデルを構築し、シミュレーションが行えるような、テキストベースの細胞シミュレーションの手法を開発している。本発表では、このような細胞シミュレーション手法を用いて、がんの臨床
オミクスデータから、患者ひとりひとりのイン・シリコモデル（デジタルツイン）を構築し、患者の予後分類と薬剤応答予測を行った例を紹介する。また、
公共知識ベースからの数理モデル生成したり、１報の原著論文を GPT3（大規模言語モデル）に与え、数理モデル生成とシミュレーションまでを自動的に行うといった、テキストベースのシミュレーションの様々な可能性を紹介する。

DX という言葉はなかなか厄介だ。我々が目指す DX がどんなものなのか、どうして研究の DX の起点として生命科学が適しているのかなど、我々のこれまでの思索と実践の経緯を共有したい。また、この先には研究 DX で生命科学がデータ駆動されれば AI 駆動という次の大波が控えている。これまでの AI for
Science が今後どのように Science by AI に発展してゆくかのビジョンを模索したい。

Mathematical knowledge-free cell simulation methods using language
models

Bio-DX and beyond○Mariko Okada(Inst. Protein Res., Osaka Univ.)

Key words

signal transduction, network identification○Koichi Takahashi1,2,3(1 BDR, RIKEN, 2 Grad. Sch. Media and Governance, Keio Univ., 3 Grad. Sch.
Frontier Biosci., Osaka Univ.)

Key words

Bio DX, Science by AI

81

1Ap01
学

金属イオンが耐熱性 DNA (cytosine-5)-methyltransferase
M.ApeKI の活性および結合能に及ぼす影響○林 真央 1, 和田 善成 2, 山村 晃 1,2, 飯田 泰広 1,2（1 神奈川工大・院工, 2 神奈川工大・応用バイオ）iida@bio.kanagawa-it.ac.jp

1Ap03
学

非リボソーム型ペプチド合成酵素由来エピメリ化ドメインの単独発現と活性評価○永田 理彩子 1, 鈴木 伸 2, 木野 邦器 1,2（1 早大院・先進・応化, 2 早大・理工総研）
kkino@waseda.jp

我々は、超好熱性古細菌 Aeropyurm pernix K1 由来の DNA メチル基転移酵素
M.ApeKI に着目し、研究を行っている。M.ApeKI は、A. pernix K1 内において、Restriction-Modification system (R-M system)という細菌の免疫システムとして機能していることが推測される。当該システムは、切断機構を有する制限酵素(Restriction)と修飾機構を有する DNA メチル化酵素 (Modification)で構成される。
制限酵素の多くは、補因子としてマグネシウムを必要とする。一方で、M.ApeKIと同じタイプの DNA メチル化酵素は、金属イオンによって活性が抑制される
ことが報告されている。しかしながら、金属による DNA メチル化酵素の活性抑制において、当該酵素のどの機能の阻害に起因するのかについては、詳細な報告がない。本研究では、M.ApeKI は 1. 金属イオンによって活性が阻害されるのか、2. どの機能（DNA 結合/触媒能）が関連しているのか、に関して調査することを目的とした。
本研究では、His-tag 精製した M.ApeKI から His-tag を切断し、EDTA によってキレート処理したサンプルを使用した。また、使用した緩衝液に金属イオンが含まれていないことを ICP 発光分光分析法で確認した。キレート処理した
M.ApeKI に、Ca(II), Cu(II), Fe(II), Mg(II), Mn(II), および Zn(II)を添加し、メチル化活性および DNA 結合能を評価した。その結果、Cu(II), Mg(II), Mn(II), およびZn(II)を添加した際に活性が減少した。その内の Cu(II)および Zn(II)については、DNA との結合が阻害されていることが確認された。よって、1. M.ApeKI は金属イオンによってメチル化活性が阻害されることが明らかとなった。また、金属イオンの種類によって、2. 触媒能のみの阻害、または触媒および DNA 結合能が阻害されていることが示唆された。

非リボソーム型ペプチド合成酵素(NRPS)は、触媒活性を有するドメインを含む
いくつかのモジュールで構成されており、微生物のペプチド系抗生物質の合成を担っている。基質アミノ酸の活性化を行うアデニル化(A)ドメインは、モジュー
ルから切り出して単独発現させると、生理基質だけでなくキラリティの異なる
異種アミノ酸もアデニル化することを明らかにしている。我々が見出した本知見を踏まえ、NRPS の他の機能ドメインも A ドメインと同様に単独発現させると、本来の生合成制御下では観察されない新たな機能を見出せると予想した。
本研究では、モジュール内でアミノ酸やペプチド鎖のキラリティ変換を行って生成物に d-アミノ酸を導入するエピメリ化(E)ドメインを対象として検証を行った。l-Phe のエピメリ化を担う NRPS 由来の 3 種類の E ドメインを単独発現させて、当該精製タンパク質画分の機能評価を行った。エピメリ化活性は確認できなかったが、特定のジペプチドに対する加水分解活性を新たに見出すことができた。これは、アミド結合の炭素原子に対する求核攻撃によって加水分解活性が観察されたと考えており、エピメリ化反応の触媒残基として報告されている His 残基や Glu 残基の関与の可能性を検討した。NRPS を構成する機能ドメ
インを単独発現させる本手法とその成果は、生物の厳密な制御システムや進化の多様性の理解に加えて、物質生産への利用においても意義のあることと考える。

Influence of the metal ions on thermostable DNA (cytosine-5)methyltransferase M.ApeKI activity and DNA binding

Independent expression and activity evaluation of epimerization domains
from non-ribosomal peptide synthetases○Mao Hayashi1, Yashinari Wada2, Akira Yamamura1,2, Yasuhiro Iida1,2(1 Grad. Sch. Eng., Kanagawa Inst. Technol., 2 Appl.Biosic., Kanagawa Inst.
Technol.)○Risako Nagata1, Shin Suzuki2, Kuniki Kino1,2(1 Grad. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ, 2 Res. Inst. Sci. Emg., Waseda Univ.)

Key words

DNA methyltransferase, archaea, Aeropyrum pernix K1

Key words

epimerization, non-ribosomal peptide synthetases, substrate specificity

1Ap02

Fatty acyl-AMP ligase を用いた N-アシルエタノールアミンの化学酵素的合成

1Ap04

Rhizobium sp. 由来 3 ケトグルコースレダクターゼの精
製と特性化

学

○神谷 愛香 1, 鈴木 伸 2, 木野 邦器 1,2（1 早大院・先進理工, 2 早大・理工総研）
kkino@waseda.jp

学○宮本 菜柚, 中西 利樹, 高田 悟郎（香川大・農）takata.goro@kagawa-u.ac.jp

N-アシルエタノールアミンは、長鎖脂肪酸とエタノールアミンがアミド結合を介して縮合した脂質分子である。動植物内に普遍的に存在し、抗炎症作用や神経形成など多様な生物活性を有する重要な化合物であるが、その生合成機構は複雑で効率的な合成法が開発されていない。そこで、我々が開発したアデニル化酵素を用いたアミド合成法に着目した。この合成法では、基質のカルボキシ基がアデニル化酵素により活性化した後、求核活性を有するアミンを作用させることでアミド結合が形成される。この化学酵素的アミド結合形成反応の最大の特長は、求核置換反応が非酵素的であることから、酵素の基質特異性の影響を受けず求核活性を有する任意のアミンを連結させることが可能なことである。
本研究では、長鎖脂肪酸であるドコサヘキサエン酸、アラキドン酸、オレイン酸のカルボキシ基に対して fatty acyl-AMP ligase である Mycobacterium smegmatis
MC2 155 由来の FadD26 でアデニル化を試み、さらにエタノールアミンを求核剤として作用させて N-アシルエタノールアミンの合成試験を行った。LC/MS
分析の結果、いずれの場合においても酵素添加条件において予想される生成物の分子量と一致したピークを検出し、目的とする N-アシルエタノールアミンの合成を確認することができた。医薬・医療分野において重要な化合物である Nアシルエタノールアミンの汎用的な酵素合成法となり得ることを明らかにした。

希少糖 D-アロースは癌細胞増殖抑制作用、抗酸化作用、臓器虚血保護作用といった生理機能を有する糖である。また、Rhizobium 属などの微生物は二糖の非還元側炭素第 3 位のヒドロキシ基をケト基に酸化し、加水分解、還元反応を経て代謝する。従来の D-アロース生産法である異性化酵素反応に代わり、本経路を利用し、D-グルコースを出発源に、酸化還元酵素反応によって高収率かつ低エネルギーでの D-アロース生産を目指した研究を進めている。しかし、本経路における還元酵素である 3-ケトグルコースレダクターゼ（以下 3KGR）の性
質は未だ明らかとなっていなかった。そこで本研究では、Rhizobium sp. S10 株
から 3KGR を精製し、諸性質を明らかにすることにした。
Rhizobium sp. S10 株から粗酵素を抽出し 3KGR の精製を行った。SDS-PAGE に
よって 41 kDa に単一のバンドが得られた。N 末端アミノ酸配列を調べ、データ
ベースと照合を行った結果、Agrobacterium 属の Gfo/Idh/MocA ファミリー酸化
還元酵素と一致したことから、精製タンパク質が 3KGR であることが示唆された。本酵素の反応の最適 pH はナトリウム-リン酸緩衝液の pH6.0、反応の最適温度は 50℃であり、pH6.0-7.5、40℃までの範囲で安定であった。次に、スク
ロースを酸化して得た 3-ケトスクロースを基質として、嫌気条件下で菌体反応させたところ、D-アロースとみられるピークが現れた。つづいて、本酵素遺伝
子のクローニングと大腸菌での組換え酵素生産を試みた。クローニングの結果、
本酵素遺伝子は 1,167bp からなり、389 アミノ酸をコードし計算分子量は 41,297であった。データベースと照合した結果、本酵素のアミノ酸配列は、Agrobacterium
sp. D14 の酸化還元酵素と 99%の相同性を示した。現在、さらなる 3KGR の性
質検討を行い、酸化酵素と組み合わせることで、より高収率な D-アロース生産
経路確立を試みている。

Chemoenzymatic Synthesis of N-acylethanolamine using fatty acyl-AMP
ligasePurification and characterization of 3-ketoglucose reductase from
Rhizobium sp.

○Aika Kamiya , Shin Suzuki , Kuniki Kino
(1 Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2 Res. Inst. Sci. Emg., Waseda Univ.)
1

Key words

2

1,2

N-acylethanolamine, fatty acyl-AMP ligase, amide bond formation○Nayu Miyamoto, Riki Nakanishi, Goro Takata(Fac. Agric., Kagawa Univ.)

Key words

reductase, rare sugar, enzyme activity, gene cloning

82

1Ap05
学

Identification of transglutaminase1 substrate preferencesusing cDNA display and bioinformatics analysis

1Ap07

藍藻のバイオフィルム形成に関与する二成分制御系の同定○T.I.K. Munaweera1, Jasmina Damnjanović1, Maurizio Camagna1,
Kiyotaka Hitomi2, Naoto Nemoto3, Hideo Nakano1(1 Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2 Grad. Sch. Pharm. Sci.,
Nagoya Univ., 3 Grad. Sch. Sci. Eng., Saitama Univ.)
jasmina@nuagr1.agr.nagoya-u.ac.jp○小林 歩夢 1, 中村 正宗 1, 辻井 雅 1, 牧野 恒平 1, 永山 達也 1,
中村 謙介 1, 七谷 圭 1, 解良 康太 1, 古内 有希 1, 茅森 俊介 1,
古田 忠臣 2, 鈴木 石根 3, 早川 芳弘 4, Tanudjaja Ellen 1, 石丸 泰寛 1,
魚住 信之 1
（1 東北大院・工, 2 東工大・生命理工, 3 筑波大院・生命環境, 4 愛
工大・工）uozumi@tohoku.ac.jp

Transglutaminase 1 (TG1) is one of the Ca2+-dependent transglutaminase (TG)isozymes that catalyze the cross-linking among glutamine and lysine residues ofproteins. Characterization of the preferable substrate sequences are helpful ininvestigating the physiological role of TGs. Lamellar ichthyosis and Alzheimer’s
disease are conditions identified to be linked with mutations in the TG1 gene and its
specific substrate sequence can be effectively used for prior molecular diagnosis of
those conditions. The current study uses an in vitro molecular display, the cDNA
display, technique to gain insight into the preferred substrate amino acid sequence byhuman TG1. Based on the previously identified 12-mer sequence (K5 sequence;
Sugimura et al., FEBS J, 2008) YEQHKLPSSWPF, three peptide libraries were createdby randomizing different sets of multiple positions in the K5 gene with respect to thereactive glutamine residue. The libraries were subjected to multiple selection rounds
using the cDNA display system, and selected DNA pools of all libraries were analyzed
by NGS and bioinformatics. The top enriched peptides were tested in an in vitro
enzymatic assay and proved to have higher reactivity than the K5 backbone. In-housebioinformatics analysis performed on NGS data revealed detailed TG1 substrateprofiles indicating preferred and non-preferred sequences in the peptide libraries. The
substrate profile data set is currently used to predict natural TG1 targets from thehuman proteome.

【背景・目的】
光合成細菌は CO2 固定反応を行う必要性から多様な環境変化に適応した生活環を持つ．藍藻の Synechocystis sp. PCC6803 は非光合成細菌と同様に高塩環境でバイオフィルムを形成する．しかし，バイオフィルム形成に至る環境変化の認識に関わる分子機構は未解明である．本研究では，Synechocystis がもつ数十種類の二成分制御系 (TCS) の中から，ジグアニル酸シクラーゼ (DGC) 領域をもつ
レスポンスレギュレーター Rre2 と Rre8 の酵素活性を測定し，Hik12-Rre2 とHik14-Rre8 の TCS のバイオフィルム形成への関与を調べた．
【方法・結果】
単一欠損株を作製し，塩ストレス条件におけるバイオフィルム形成を調べた結果， Rre2 と Rre8 がバイオフィルム形成に関与することが明らかになった．バ
クテリアツーハイブリッドアッセイより，Rre2 と Rre8 はそれぞれ特定のヒスチジンキナーゼの Hik12 と Hik14 と TCS を形成することが示された．大腸菌から精製した Rre2 と Rre8 の酵素活性の測定から両タンパク質ともに DGC 活性をもつことを確認した．Rre2 は脱リン酸化の有無に関わらず DGC 活性を示したが，Rre8 の DGC 活性はリン酸化依存的であった．多重変異株のバイオフィル
ム形成量を調べたところ，Hik12-Rre2 と Hik14-Rre8 のペアが高塩ストレスで誘導されるバイオフィルム形成に重要であった．以上から，Hik12-Rre2 と Hik14Rre8 は塩環境を感知して，DGC 活性をもつ Rre2 と Rre8 が c-di-GMP を産生して，Synechocystis のバイオフィルム形成の制御に関与することが明らかになった．
【参考文献】
Kobayashi et al., Mol. Microbiol. (2023)

Identification of transglutaminase1 substrate preferences using cDNA
display and bioinformatics analysis

Two cyanobacterial response regulators participate in biofilm formation

Key words

cDNA display, protein engineering, transglutaminase1, bioinformatics○Ayumu Kobayashi1, Masamune Nakamura1, Masaru Tsujii1, Kohei Makino1,
Tatsuya Nagayama1, Kensuke Nakamura1, Kei Nanatani1, Kota Kera1,
Yuki Furuuchi1, Shunsuke Kayamori1, Tadaomi Furuta2, Iwane Suzuki3,
Yoshihiro Hayakawa4, Ellen Tanudjaja1, Yasuhiro Ishimaru1, Nobuyuki Uozumi1(1 Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 2 Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech, 3 Grad. Sch.
Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 4 Fac. Eng., Aichi Inst. Technol.)Key words
biofilm, cyanobacteria, response regulator, salt

1Ap06

リボソーム生合成の試験管内における再構成

1Ap08○T.I.K. Munaweera1, Jasmina Damnjanović1, Maurizio Camagna1,
Kiyotaka Hitomi2, Naoto Nemoto3, Hideo Nakano1(1 Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2 Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ.,
3
Grad. Sch. Sci. Eng., Saitama Univ.)

学○小坂 唯心 1,2, 宮脇 佑実 1, 森 めぐみ 1, 油屋 駿介 3, 福山 真央 4,5,
植田 充美 1,6, 青木 航 5,6,7（1 京大院・農, 2 日本学術振興会, 3 九大・生医研, 4 東北大・多元研, 5 JST創発的研究支援事業, 6 京都バイオ計測センター, 7 阪
大院・工）aoki.wataru@bio.eng.osaka-u.ac.jp

学

芳香族カルボン酸エステラーゼ EstAC のエナンチオ選
択性の評価と基質結合部位の解析○丸山 稜介, 中井 雄也, 岸 裕亮, 山田 芳香, 杉山 勝紀,
熊谷 吉峻, 竹原 宗範（滋県大院）
takehara@mat.usp.ac.jp【背景】
リボソーム生合成の試験管内再構成は、新規機能を持つ人工リボソームの創出に繋がる。しかし、リボソーム生合成は 200 種近くの因子が関与する複雑な過程であり、試験管内再構成は達成されていなかった。本研究では大腸菌リボソー
ム生合成の試験管内再構成を試みた。
【方法】
リボソーム生合成とは、既に存在するリボソームが新たなリボソームを合成する過程である。そのため、試験管内でのリボソーム生合成を証明するために、
天然リボソームと区別しつつ、新生リボソームだけを検出する必要がある。まず、新生リボソームを特異的に検出可能とした。具体的には、大腸菌内で野生型 Shine–Dalgarno (SD)/anti-SD (ASD)配列と相互作用しないと知られている直交
SD/ASD 配列[1]から、試験管内で同様の性質を示すものを探索した。さらに、反応液を微小液滴に封入して高感度検出を試みた。構築した検出系を活用して、大腸菌無細胞転写翻訳系を用いて、57 種のリボソーム遺伝子を一斉に発現させ、リボソーム生合成を可能とする反応条件を探索した。
【結果】
特異的検出は、or1 と名付けられた直交 SD/ASD 配列を用いることで可能となった。また、反応溶液を微小液滴に封入したところ、1 分子リボソームの検出が可能となった。次に、構築した検出系を用いてリボソーム生合成の再構成を試みた。出発物質である、天然リボソーム・リボソーマルタンパク質（r-protein）
遺伝子群・リボソーマル RNA（rRNA）オペロン遺伝子の各濃度を検討してリボソーム生合成の再構成に成功した[2]。また、リボソーム遺伝子への変異導入
によりリボソームの機能改変にも成功した。本研究は、自在なリボソーム改変を可能とし、新規機能を持つ人工リボソームの創出を加速させると期待される。
[1] L. Chubiz et al. Nucleic Acids Res., 36 (12) [2] Y. Kosaka, et al. bioRxiv, 505692【緒言】 細菌由来エステラーゼ EstAC は、種々の芳香族カルボン酸エステルに加え、短鎖脂肪酸エステルに対しても加水分解能を示す基質特異性の広い酵素である（Biosci. Biotechnol. Biochem., (2012) 76, 1721）。相同タンパク質とのマル
チプルアライメント解析より、EstAC は活性中心に SxxK モチーフを有するファミリー VIII エステラーゼに分類できた。さらに、本酵素の活性セリン残基の求核性を高めるのに寄与している四つのアミノ酸残基を同定した。本研究ではEstAC の基質結合の様相について理解するために、アキラルなエステル基質の酸およびアルコール部分の配向を調査した。また、キラル基質に対する選択性を評価するとともに、基質結合部位を構成するアミノ酸残基を調査した。
【方法】EstAC の精製酵素について、pH スタットを用いた酸塩基滴定法で加水分解活性を評価した。任意のコンバージョンに達した反応溶液のジクロロメタ
ン抽出画分について、キラルカラムを用いた HPLC 分析により鏡像体過剰率 ee
値を算出した。AlphaFold2、またはエステラーゼ EstB (PDB: 1cI9) を鋳型とした
SWISS-MODEL により、EstAC の三次元構造を構築した。
【結果・考察】EstAC は、アキラルなエステル基質に関して、アルコール部位がかさ高い基質より、酸部位がかさ高い基質に対し高い活性を示す傾向にあった。
アルコール部位がかさ高いキラルエステルである 1-Phenylethyl acetate に対し、
87% eep を示した。一方で、1-Phenyl-1-propyl acetate に対し、1.6 % eep と著しく選択性が低下し、他の基質と異なりわずかに S 体優先となった。また、酸部位がかさ高い Ethyl ibuprofen および Ethyl 3-phenylbutyrate に対しては、それぞれ
12% eep および 31 % eep となった。これら活性測定の結果および EstAC の推定
三次元構造から、L350 が基質選択性に関与していることが示唆された。

Reconstruction of ribosome biogenesis in vitro

Evaluation of enantioselectivity of an aryl-carboxylesterase EstAC andidentification of the substrate binding site

○Yuishin Kosaka1,2, Yumi Miyawaki1, Megumi Mori1, Shunsuke Aburaya3,
Mao Fukuyama4,5, Mitsuyoshi Ueda1,6, Wataru Aoki5,6,7(1 Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 2 Research Fellow of JSPS, Tokyo, Japan, 3 Med.
Inst. Bioreg., Kyushu Univ., 4 IMRAM, Tohoku Univ., 5 JST FOREST, Tokyo, Japan,
6
Kyoto Integrated Science & Technology Bio-Analysis Center, Kyoto, Japan, 7 Grad.
Sch. Eng., Osaka Univ.)
Key words
ribosome, Escherichia coli

○Ryosuke Maruyama, Yuya Nakai, Yusuke Kishi, Yoshika Yamada,Katsunori Sugiyama, Yoshitaka Kumagai, Munenori Takehara(Dept. Mater. Sci., Grad. Sch. Eng., The Univ. Shiga Pref.)Key words
carboxylesterase, enantioselectivity, substrate binding site,
computational chemistry

83

1Ap09

Pyrococcus furiosus 由来超耐熱性エンドグルカナーゼの異種発現と糖鎖付加による耐熱化○仙波 弘雅 1, 石川 一彦 2,3, 坪井 宏和 1, 幸田 明生 1
（1 大関総研, 2 産総研・バイオメディカル, 3 松谷化学工業）
hironori.senba@ozeki.co.jp

1Ap11
学

応用利用を指向した高機能ペプチド転移酵素の開発○宮田 梓 1, 竹田 浩之 2, 中野 祥吾 1, 伊藤 創平 1
（1 静県大院・薬食生命, 2 愛媛大学・プロテオサイエンスセン
ター）itosohei@u-shizuoka-ken.ac.jp【背景及び目的】
耐熱性の高いセルラーゼはバイオマスの高温糖化やイオン液体存在下での糖化反応など過酷な条件での使用が可能であり、産業的に幅広い応用が期待される。
そこで我々は超好熱古細菌 Pyrococcus furiosus 由来エンドグルカナーゼ（EGPf）に着目し、Aspergillus niger を宿主とした異種発現を行った。その結果、組換え
EGPf は約 15 kDa 相当の糖鎖が付加された状態で分泌生産され、糖鎖付加によって EGPf の熱安定性がさらに向上している可能性が示唆された。そこで本研究
では、糖鎖付加 EGPf の特性解析を行い、その有用性を評価した。
【方法及び結果】
A. niger で発現させた糖鎖付加 EGPf および大腸菌で発現させた糖鎖未付加
EGPf をそれぞれ単一に精製し、その性能を評価した。まず酵素活性に関して、EGPf は糖鎖付加による触媒効率の向上が見られ、比活性が約 2 倍に向上することが明らかとなった。さらに糖鎖付加による熱安定性の向上も見られた。熱安
定性の評価として 100℃での半減期を算出したところ、糖鎖未付加 EGPf の半減
期は約 10 分であったのに対し、糖鎖付加 EGPf は 100℃で 5 時間加熱後も 80％以上の活性を保持していた。一方で至適 pH や耐塩性は糖鎖付加による影響が見られなかった。
一部の耐熱性酵素はイオン液体に対する高い耐性を持つことが知られているため、EGPf のイオン液体耐性についても評価を行った。その結果、EGPf は 10％[Bmim]Cl 存在下で活性が 2 倍以上に向上し、40％ [Bmim]Cl 存在下でもイオン液体非存在下と同等の活性を示した。
本研究では超耐熱性酵素に糖鎖付加を行うことで、比活性の向上と更なる耐熱化に成功した。これにより極めて高い熱安定性とイオン液体耐性を有するエン
ドグルカナーゼの作出に成功した。現在は EGPf の糖鎖付加位置について解析を行っている。

背景:創薬標的となるタンパク質の修飾は、細胞膜透過性および安定性の向上などを可能とし、選択性や反応効率の高さから酵素法によるタンパク質修飾が注目されている。その中で、ペプチド転移酵素 Sortase は、脂質修飾や蛍光標識、固定化といった生体機能に関わる多くの連結反応を触媒する。本研究では、当研究室独自のアミノ酸配列選抜法と祖先型設計法 (ASR 法) を融合させること
で、高機能化 Sortase を取得することを目的とした。取得した Sortase について、
酵素学的諸性質の解明と、固定化への応用に関する成果を報告する。
方法:放線菌由来の金属イオン非依存性酵素 SortaseE (SavSE) を起点とし ASR法を用いて、祖先型 SortaseE を 6 つ、デザインした。最も活性が強かった 1 つの祖先型 SortaseE (AcSE) について酵素学的諸性質の検討を行った。LA/PETGAペプチド (Sortag 配列) に GGGKY ペプチド (求核剤) あるいは直鎖アミン類を求核剤として反応を実施、合成された連結ペプチドを HPLC で定量することで活性を測定した。ついで AcSE を用いて、Sortag を付与した L-アミノ酸酸化酵素
HTAncLAAO2 をアミノ化ビーズへと固定化させる実験を行った。固定化酵素を用いて D-アミノ酸の合成を行った。
結果:取得した AcSE の LA/PETGA と GGGKY の連結効率は最大 60%に到達し、SavSE の 40%の連結効率を大きく上回った。祖先型設計された酵素は、基質特異性が広くなる事がある。そこで、LAETGA と各種アミン類の連結活性を評価したところ、4 種の第 1 級直鎖アミン化合物が基質となる事が判明した。AcSEの高い活性を利用し、アミノ化ビーズへの産業応用酵素の固定化への適用を検討した。モデル酵素として C 末端に Sortag 配列を付加した L-アミノ酸酸化酵素
HTAncLAAO2 を用いて実験を行い、HTAncLAAO2 をビーズに固定化することに成功し、かつ固定化酵素を用いて D -アミノ酸誘導体の合成を達成できた。

Heterologous expression of hyperthermostable endoglucanase from
Pyrococcus furiosus and improvement of thermostability by glycosylation

Development of high-performance peptidyltransferases for application use○Hironori Semba1, Kazuhiko Ishikawa2,3, Hirokazu Tsuboi1, Akio Koda1(1 Gen. Res. Lab., Ozeki Corp., 2 Biomed. Res. Inst., AIST, 3 Matsutani Chemical
Industry Co., Ltd.)○Azusa Miyata1, Hiroyuki Takeda2, Shogo Nakano1, Sohei Ito1
(1 Grad. Sch. Integr. Pharm. Nutr. Sci., Univ. Shizuoka, 2 Proteo Science Center,
Ehime University)

Key words

cellulase, endoglucanase, thermostable enzyme, Aspergillus niger

Key words

protein engineering, immobilized enzyme

1Ap10

有機溶剤暴露量測定法および測定用酵素の開発

1Ap12

Identification and Characterization of A Novel TransAnethole Oxygenase○奥迫 拓也 1, 巽 謙太 2, 矢倉 一樹 2, 西矢 芳昭 1
（1 摂南大院・理工, 2 ニプロ）
nishiya@lif.setsunan.ac.jp○Ni Nyoman Purwani, Marco W Fraaije(Department of Biochemsitry, Faculty of Science and Engineering,
University of Groningen)m.w.fraaije@rug.nl【背景・目的】塗装業を筆頭に多くの産業分野において多用されている有機溶剤
は、体内に蓄積することで生体機能障害等の健康被害を引き起こすことが知られている。健康被害の防止を目的として、労働安全衛生法等に定められる特殊
健康診断が実施されている。その主要な検査項目として、トルエン・キシレン・スチレンの尿中代謝産物である、馬尿酸（HA）・メチル馬尿酸（MHA）・マンデル酸（MA）の測定がそれぞれ行われている。現在これらは HPLC 法によって測定されているが、コストが高く、スループットが低いことに課題がある。
そこで、我々は課題解消のため、HPLC 法よりも低コスト・高スループットな
酵素的測定法を考案した。現在、酵素的測定法に用いる酵素の開発・改良等に取り組んでおり、昨年の本学会では、3 種の馬尿酸加水分解酵素（Hhase）の構
造解析及び変異体解析の結果について報告した。今回は MA の酵素的測定を含め、有機溶剤暴露量測定法および測定用酵素について総括的に報告する。
【結果・考察】HA・MHA 総量の酵素的測定法に用いる酵素として、Staphylococcus
aureus 由来の Hhase（HhaseSa）を見出した。特性評価の結果、本酵素は従来酵
素の約 105 倍の比活性を持っていることがわかった。本酵素にグリシンオキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼを追随させることで、発色定量が可能となった。また、我々は MA に対し微弱な活性を有する Enterococcus sp.由来 L-乳酸オキシ
ダーゼを見出し、タンパク質工学的改変を試みた。結果として、MA に対して野生型の約 300 倍の活性を示し、かつ L-乳酸に対する触媒効率が検出限界以下の MA 特異的な変異体を創出することに成功した。本変異体を L-マンデル酸オキシダーゼとして用い、ペルオキシダーゼ系での発色定量を組み合わせること
で、MA の測定が可能となった。

Oxygenases are a group of enzymes that catalyze the incorporation of molecularoxygen into a substrate molecule. Selective oxygenations are appealing reactions forsynthetic chemistry. As a result, there is a demand for effective oxygenases that can beused as biocatalysts. Bacterial trans-anethole oxygenases (TAOs) have been describedin literature that are able to oxidize trans-anethole, a compound found in star anise, top-anisaldehyde. A predicted structural model of a representative enzyme suggests that
TAOs are heme-dependent enzymes. The predicted heme-dependency of TAO formed
the starting point of our biochemical study of TAO. A bacterial TAO homolog wascloned and expressed in Escherichia coli, resulting in 80-90 mg purified SUMO-tagged
enzyme from one liter of culture. The purified enzyme was characterized for its
thermostability at varying pH values and temperatures. The enzyme was also tested for
its ability to catalyze industrially relevant oxidation reactions. The TAO homolog was
found to accept a broad range of substrates that show some similarity with the best
substrate, trans anethole. Therefore, this newly discovered TAO represents aninteresting enzyme with promising features for industrial applications as a biocatalyst.

Development of the assay methods for organic solvent exposure and theanalytical enzymes

Identification and Characterization of A Novel Trans-Anethole Oxygenase○Takuya Okusako , Kenta Tastumi , Kazuki Yagura , Yoshiaki Nishiya(1 Grad. Sch. Sci. Eng., Setsunan Univ., 2 Nipro Corp.)
1

Key words

22

hippuric acid, mandelic acid, health examination, enzyme

1○Ni Nyoman Purwani, Marco W Fraaije(Department of Biochemsitry, Faculty of Science and Engineering, University ofGroningen)

Key words

enzyme, expression, characterization, kinetics

84

1Ap13
学

サルコシンオキシダーゼの L-チオプロリン反応性向上
変異体の結晶構造○張 宇琪 1,2, 中嶋 義隆 1, 武田 悠杜 1,2, 佐々本 康平 1,
氷見山 幹基 2, 中村 努 2, 西矢 芳昭 1
（1 摂南大院・理工, 2 産総研・バイオメディカル）
nishiya@lif.setsunan.ac.jp

1Ap15
学

Phocaeicola plebeius および Segatella copri 由来の CBM
分断型キシラナーゼの機能解析○田中 蒼磨 1, 髙畑 美優 1, 林 秀謙 2
（1 前橋工大院・工, 2 前橋工大・工）h-hayashi@maebashi-it.ac.jp【背景及び目的】サルコシンオキシダーゼ（Sox; EC:1.5.3.1）はフラビンアデニ
ンジヌクレオチド(FAD)を補酵素として持つフラビン酵素の一種であり、コリン、クレアチン、クレアチニンなどの代謝に関わっている。Sox の触媒反応は二段階で進み、第一反応では基質の酸化と FAD の還元が、第二反応では FADの酸化と生成物の自発的な加水分解が起こる。計算科学研究により、第一反応の機構として 1 つの水素原子と 1 つの電子が同時に FAD に移動する HydrogenAtom-Coupled Electron Transfer mechanism が提案されている。
以前の研究により、サルコシンと構造的に類似する 5 員環イミノ酸 L-チオプロリン（TP）が Sox の基質となると共に、高い基質阻害作用も有することが見出された。我々は、Bacillus 属由来 Sox の X 線結晶構造解析により Sox－TP 複合体構造を決定し、活性中心近傍にある Y254 側鎖による空間的干渉が基質阻害の要因と考察した。本研究では、Y254 の役割を理解するため、変異体の調製と構造解析を行ったので報告する。
【結果及び考察】Y254A および Y254G 変異体は、TP に対する反応性向上と基質阻害の消失、サルコシンに対する反応性低下を示した。変異体酵素の X 線結晶構造解析を行った結果、変異アミノ酸残基以外の残基は、野生型と比べ構造的に変化が見られなかった。変異体では Y254 側鎖による TP への干渉が解消され、基質阻害が消失したと考えられる。一方、変異体は活性中心が広がり、反応位置でのサルコシンとの結合が難しくなったため、反応性が低下したと予想される。
野生型 Sox では、Y254 側鎖の水酸基は水 7 分子からなるネットワークとの相互作用により固定されていた。一方、変異体では水酸基の位置に新たな水分子が存在した。水分子ネットワークの酵素機能に対する役割について、現在、周辺残基の変異解析を進めている。

<目的>ヒト腸内細菌 Phocaeicola plebeius (Bacteroides plebeius)と Segatella copri(Prevotella copri)には、GH ファミリー 10 に属するキシラナーゼの触媒ドメイン
が CBM で分断された構造を持つ PpXyn10B と ScXyn10B(PcXyn10B)が存在する。それぞれのキシラナーゼの N 末端部分と C 末端部分を同一のプラスミド上に連結して共発現を行うと、二量体を形成してキシラナーゼ活性を示すことが判明している。本研究では異種由来のキシラナーゼの組み合わせ、PpXyn10Bの N 末 端 (Pp01) と ScXyn10B の C 末 端 (Sc02) で 発 現 さ せ た PpXyn10B-01ScXyn10B-02（Pp01-Sc02）の二量体の形成とキシラナーゼ活性の有無および諸性質について報告する。
<方法>PCR により Pp01 と Sc02 のそれぞれの遺伝子断片の増幅を行い、共発現ベクターに連結して、大腸菌 BL21(DE3)を形質転換した。大腸菌内で 2 つのキシラナーゼ断片を共発現させ、His タグ金属アフィニティークロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製を行い、Pp01-Sc02 の諸性質の検討を行った。
<結果および考察>ゲル濾過後の SDS-PAGE では、2 本の Pp01 と Sc02 に対応するバンドを確認した。また、Native-PAGE では単一のバンドを確認した。ゲル濾過より推定した分子量は約 65.76 kDa であり、アミノ酸配列より推定される
分子量とほぼ一致した。以上より、Pp01 と Sc02 が二量体を形成してキシラナー
ゼ活性を持つことが判明した。諸性質の解析では、至適温度は 30℃、至適 pH
は pH5.5 であった。熱安定性は 20~30℃の範囲で、pH 安定性は pH5.0~9.0 の範囲でほぼ 100%の活性を保持していた。さらに、Pp01-Sc02 に 1.0 M 塩化ナトリ
ウムを添加したところ、無添加と比較して約 340 %の活性が向上した。また、
Pp01-Sc02 に 0.5 M 塩化ナトリウムを添加して、80℃で 10 分加熱した後に 4℃
で 24 時間の冷却を行うと活性が約 70%復帰した。

Crystal structures of highly active mutant sarcosine oxidases toward Lthioproline

Functional analysis of xylanases with catalytic domains separated by CBMfrom Phocaeicola plebeius and Segatella copri○Yuqi Zhang1,2, Yoshitaka Nakajima1, Yuto Takeda1,2, Kohei Sasamoto1,
Tomoki Himiyama2, Tsutomu Nakamura2, Yoshiaki Nishiya1(1 Grad. Sch. Sci. Eng., Setsunan Univ., 2 Biomed. Res. Inst., AIST)○Soma Tanaka1, Miyu Takahata1, Hidenori Hayashi2(1 Grad. Sch. Eng., Maebashi Inst. Technol., 2 Fac. Eng., Maebashi Inst. Technol.)Key words

crystallization, flavoprotein

Key words

xylanase, glycoside hydrolase, Phocaeicola plebeius, Segatella copri

1Ap14

Ni-NTA アフィニティーカラムクロマトグラフィーが金属酵素の EDTA 感受性に影響を与える一例

1Ap16

ヒト腸内細菌 Phocaeicola plebeius 由来キシラナーゼ
10B の触媒ドメイン分断型 CBM の特性解析

学○武田 悠杜 1,2, 佐々本 康平 1,2, 氷見山 幹基 2, 張 宇琪 1,2,
森芳 邦彦 3, 大本 貴士 3, 上垣 浩一 4, 中村 努 2, 西矢 芳昭 1
（1 摂南大院・理工, 2 産総研・バイオメディカル, 3 大阪技術研,
4
近大・農）nishiya@lif.setsunan.ac.jp

学○力石 佑紀 1, 辻 省吾 1, 林 秀謙 2
（1 前橋工大院・工, 2 前工大・工）h-hayashi@maebashi-it.ac.jp【背景】ニッケルニトリロ三酢酸（Ni-NTA）アフィニティーカラムクロマトグ
ラフィーは、その利便性から組換えタンパク質の精製法として広く利用されている。しかし、金属酵素においては、Ni-NTA カラムと酵素の金属結合部位との相互作用が考えられるため、酵素活性や立体構造への影響について考慮する必要がある。金属依存性糖脱アセチル化酵素 TTE0866 は、人工透析膜などに利用される難生分解性プラスチックである酢酸セルロースを脱アセチル化可能な生分解促進酵素である。本研究では、TTE0866 を Ni-NTA あるいは陰イオン交換(AE)カラムで精製し、それらの酵素活性と結晶構造比較により、Ni-NTA カ
ラムが TTE0866 に与える影響について調査した。
【結果および考察】Ni-NTA カラムで精製した TTE0866（NN-TTE）は、活性型のホロ体として調製され、EDTA 処理で Ni2+イオンが活性中心から解離せず、
EDTA 耐性を示した。一方、AE カラムで精製した TTE0866（AE-TTE）はアポ体であり、Ni2+イオンの添加により活性化したが、続く EDTA 処理により Ni2+イオンが解離し、酵素活性が低下した。
両者で EDTA 感受性が異なる要因を解明するため、NN-TTE と AE-TTE の結晶構造解析を行った。結果として、金属結合残基のひとつである H199 および隣接する F200 の配向変化が観察された。F200 の A 置換変異体を作成し、Ni-NTA
カラムで精製したところ、ホロ体として調製されたが EDTA 耐性は示さなかった。従って、F200 の配向変化が TTE0866 の EDTA 感受性に影響することが示唆された。
これらの結果から Ni-NTA カラムが精製の過程で金属酵素の構造と反応性を変化させうることが示された。

＜目的＞ Phocaeicola plebeius の Xyn10B は GH10 の触媒ドメインを分断する様に 2 つの CBM が挿入される特徴的な構造を持ち、これらの CBM がキシランとの結合に関与していると考えられる。Xyn10B、CBM1、CBM2、CBM1-CBM2を大腸菌で発現させ、キシランやセルロースとの吸着特性解析を行った。
＜方法＞ コドン最適化した Xyn10B、CBM1、CBM2、CBM1-CBM2 の遺伝子を発現ベクターに連結して、大腸菌を形質転換した。それぞれの形質転換体より発現したタンパク質を抽出し、精製を行った。Xyn10B の CBM の基質との吸着特性を明らかとするために、Native-affinity-PAGE により Xyn10B と 3 つの CBMの移動度を測定した。また、2 つの CBM と Xyn10B を各基質と混合し、遠心分離後、その上清と沈殿（基質）を SDS-PAGE により定性的に吸着量の解析を行った。さらに CBM1、CBM2、Xyn10B を各基質と混合し、遠心分離後、その上清のタンパク質量を定量し、吸着等温式を用いて最大結合量 [PX] max と吸着
平衡定数 Ka を求めた。
＜結果および考察＞ Native-affinity-PAGE では CBM1、CBM2、CBM1-CBM2、
Xyn10B はキシランとの親和性を確認したが、CMC との親和性は非常に弱い
か、または確認できなった。SDS-PAGE による定性的な結合解析より CBM1、
CBM2、Xyn10B はキシランとセルロースとの吸着が確認できた。定量的に吸着量を測定したところ、CBM2 のオート麦キシラン対する[PX]max は 1.25 µmol/g、Ka は 0.43 µM-1 であった。小麦アラビノキシラン対する[PX]max は 3.60 µmol/g、Ka は 0.076 µM-1 であった。CBM1 と Xyn10B は定量不可能であった。以上より
Xyn10B の 2 つの CBM はキシランとの結合に関与していることが明らかとなった。さらに CBM1-CBM2 について解析していく予定である。

Purification of metalloenzyme: an example of the influence of Ni-NTA
affinity column chromatography on EDTA-sensitive activity.

Characterization of CBM that divides the catalytic domain of xylanase 10B
from the human gut bacterium Phocaeicola plebeius○Yuto Takeda , Kohei Sasamoto , Tomoki Himiyama , Yuqi Zhang ,Kunihiko Moriyoshi3, Takashi Ohmoto3, Koichi Uegaki4, Tsutomu Nakamura2,
Ypshiaki Nishiya1(1 Grad. Sch. Sci. Eng., Setsunan Univ., 2 Biomed. Res. Inst., AIST, 3 ORIST, 4 Fac.
Agric., Kindai Univ.)
Key words
carbohydrate esterase, metalloenzyme, EDTA-sensitive
1,2

1,2

2

1,2

○Yuki Chikaraishi1, Shogo Tsuji1, Hidenori Hayashi2(1 Grad. Sch. Eng., Maebashi Inst. Technol., 2 Fac. Eng., Maebashi Ins. Technol.)Key words
enzyme, glycoside hydrolase, carbohydrate binding module,
Phocaeicola plebeius

85

1Bp01

オルニチン高生産清酒酵母に見出したフィードバック阻
害非感受性変異型 N-acetyl glutamate kinase の機能解析○大橋 正孝 1, 磯貝 章太 2, 髙木 博史 2
（1 奈良産振セ・バイオ・食品グループ, 2 奈良先端大・バイオ）
m-oha-niid@von.jp

1Bp03
学

フラクトオリゴ糖生産菌 Zalaria sp. Him3 における β-フラクトフラノシダーゼの探索○齋藤 佑衣 1, 眞榮田 麻友美 2, 前橋 健二 2, 吉川 潤 2（1 東農大院・応生科, 2 東農大・応生科）
jy207183@nodai.ac.jp

酵母 Saccharomyces cerevisiae の N-acetyl glutamate kinase（NAGK）は、ARG6 遺伝子でコードされ、N-acetyl glutamate をリン酸化する酵素であり、オルニチン
及びアルギニン生合成経路の律速酵素の一つである。その NAGK 活性は、最終生成物であるアルギニンによるフィードバック阻害を受けるため、酵母は細胞内にオルニチンを高生産しない。以前、細胞内にオルニチンを高生産する清酒
酵母の変異株を取得し、解析した結果、ARG6 遺伝子にアミノ酸置換（Thr340Ile）を伴う変異を見出した。また、Thr340Ile が NAGK のアルギニンによるフィー
ドバック阻害感受性を低下させ、Lys336 と Thr340 との相互作用がアルギニンの認識に関与する可能性を報告した。今回、NAGK の Thr340 を Ala, Leu, Arg,
Glu, Ile, Asn に置換すると、アルギニンによるフィードバック阻害感受性が低下する一方で、Thr と同様に側鎖に水酸基を有する Ser への置換では、フィードバック阻害感受性の程度に変化はなかった。これらの結果から、Lys336 の主鎖のカルボニル基と Thr340 の側鎖の水酸基との相互作用によるアルギニン結合ポケットの形成が NAGK のアルギニン認識に重要であることが示唆された。また、細胞内にオルニチンを高生産する変異株を新たに 2 株取得し、各 ARG6 遺伝子に NAGK のアミノ酸置換（Cys119Tyr、Val268Ala）を伴う変異を見出すとともに、そのアミノ酸置換によって NAGK のアルギニンによるフィードバック
阻害感受性が低下することを明らかにした。Cys119 及び Val268 は、いずれもアルギニン結合領域から離れた位置にあることから、アルギニン認識に直接関わっていないと考えられる。アミノ酸置換（Cys119Tyr、Val268Ala）によって、近傍の構造が変化し、その結果、アルギニン結合領域の構造が変化することで、アルギニンによるフィードバック阻害感受性が低下することが推測された。

【緒言・目的】
フラクトオリゴ糖は、ショ糖にフルクトース単位が結合したケストース、ニス
トース、フラクトフラノシルニストースから主に構成される。フラクトオリゴ
糖の生産には、微生物の生産する β-フラクトフラノシダーゼ（FFase）によるフ
ルクトース転移反応が効果的である。現在、フラクトオリゴ糖の生産に効果的な FFase として、Aspergillus や Aureobasidium 由来の酵素が利用されており、これらは糖転移能の異なる複数の FFase を生産することが知られている。本研究では、新たにフラクトオリゴ糖を生産することが確認された黒色酵母 Zalaria sp.
Him3 株を用い、FFase の生産や性質について検討することを目的とした。
【結果】
本酵母は液体培養時の菌体懸濁液を FFase 試料として用いることができ（菌体酵素）、培養上清にも FFase 活性を確認できた（上清酵素）。スクロース培養時における菌体酵素は、72 時間での酵素活性が 48 時間のときより低下したが、転移活性（Ut）と分解活性（Uh）の合計活性（Ut+Uh）中に占める Ut の割合（Ut/(Uh+Ut)）には、ほとんど変化がなかった。一方、上清酵素では、培養時間の経過とともに FFase 活性は高くなったが、Ut/(Uh+Ut)は 48 時間でやや低く、
72 時間で高くなった。したがって、菌体酵素と上清酵素で培養時における Ut
割合の挙動に違いが見られたことから、それぞれの FFase 組成は異なっており、複数の FFase を生産して利用していることが考えられた。また、本菌株のゲノム配列を解析し、推定された 7496 遺伝子から既知の FFase と相同性の高い配列を探索したところ、g3543、g3609、g3700 と 3 つの遺伝子が FFase と推測された。基質結合部位近傍のモチーフ構造から g3543、g3700 は加水分解型であると推定された。さらに、これら候補遺伝子の経時的な発現について調べた。

Functional analysis of feedback inhibition-insensitive variants of N-acetyl
glutamate kinase found in Sake yeast mutants with ornithine
overproduction

Screening of beta-fructofuranosidase from Zalaria sp. Him3,
fructooligosaccharides producing yeast○Masataka Ohashi1, Shota Isogai2, Hiroshi Takagi2(1 Nara Pref. Inst. Ind. Dev., 2 Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)○Yui Saito1, Mayumi Maeda2, Kenji Maehashi2, Jun Yoshikawa2(1 Grad. Sch. Appl. Biosci., Tokyo Univ. Agric., 2 Fac. Appl. Biosci., Tokyo Univ.
Agric.)

Key words
kinaseSaccharomyces cerevisiae, sake yeast, Ornithine, N-acetyl glutamate

Key words

beta-fructofuranosidase, yeast

1Bp02

Phanerochaete chrysosporium 由来新規ジオキシゲナー
ゼの機能解析

1Bp04

Xanthomonas campestris WU-9701 由来グルコース転移酵素 XgtA を利用した ethyl alpha-D-glucopyranoside 高
含有糖シロップの生産学○中村 光希, 加藤 大志, 釣上 竜河, 加藤 雅士, 志水 元亨（名城大院・農）moshimi@ccalumni.meijo-u.ac.jp

学○曹 偉 1, 中原 遥 1, 田村 佳都 1, 石井 義孝 2, 桐村 光太郎 1,2（1 早大院・先進理工, 2 早大・理工研）
kkohtaro@waseda.jp

白色腐朽菌が生産するリグニンペルオキシダーゼ等のリグニン分解酵素による
リグニンポリマーの断片化については研究が進んでいる一方で、断片化後のリ
グニン断片の代謝経路はあまり明らかになっていない。
植物、一部の細菌や真菌から見出されている L-DOPA ジオキシゲナーゼ (DODA)
は L-DOPA の環開裂を引き起こすことで、植物色素ベタレインの基本共通骨格であるベタラミン酸を生成する。しかしながら、白色腐朽菌の DODA の機能については報告されていない。DODA はリグニン断片に特徴的である隣接した水酸基を有する芳香族環を開裂できることから、白色腐朽菌の DODA の機能を詳細に解析した。
白色腐朽菌 Phanerochaete chrysosporium 由来の DODA (PcDODA) を大腸菌に異種発現させ、リコンビナントタンパク質を調製した。PcDODA と L-DOPA や種々のリグニン断片を反応させたところ、カフェ酸、プロトカテク酸、カテコー
ル、クロロゲン酸、チコリ酸を基質にした際に反応液の色および紫外可視吸収
スペクトルが変化した。HPLC により、これらの開裂産物が検出できたことから、PcDODA は上記の基質の芳香環開裂を触媒することが示された。PcDODAの酵素学的パラメーターを算出すると、これまで基質として知られている LDOPA と比べてカフェ酸を基質にした際に 20 倍高い kcat/Km 値が示された。以上のことから、PcDODA は新規カフェ酸ジオキシゲナーゼ(PcCADA)であることが明らかとなった。PcCADA に関する知見は、リグニン断片の効率的分解に役立ち、木質バイオマスをはじめとする植物資源の有効活用に貢献できる。

【背景・目的】ethyl α-D-glucopyranoside (以下 α-EG) は保湿作用や整肌作用などの生理機能を示し、甘味や苦味、コク味を示すため、食品への応用が期待されている。演者
らが保有する Xanthomonas campestris WU-9701 由来の α-glucosidase (XgtA) は、
グルコース転移反応により α-arbutin などの配糖体の選択的生産に利用可能である [1-3]。さらに、XgtA による α-EG の選択的高生産にも成功している[4]。本研究では、食品への利用を目的として、XgtA を利用した α-EG 高含有糖シロップの生産について検討した。さらに、イオン交換樹脂による反応後溶液中から糖シロップの分離についても検討した。
【方法・結果】
XgtA を使用した α-EG 高含有糖シロップの生産試験では、標準条件として、1.2
M maltose、0.80 M ethanol および 100 mM KCl を含む 30 mM K2HPO4-KH2PO4 緩衝液 (pH 8.0) 1 mL に 1.25 U の XgtA および 900 GIU のグルコースイソメラーゼ(GI) を添加し、45 ℃で攪拌しながら反応させることで実施した。標準条件下 96
h の 1-batch 反応において、263 mM α-EG、765 mM グルコース、511 mM フルク
トースおよび 401 mM マルトースを含む糖シロップの生産に成功した。これまでの研究で使用した、30 mM KCl を含む 30 mM HEPES-NaOH 緩衝液 (pH 8.0)中の反応で生産された α-EG 濃度 (257 mM) と比較して、本研究で生産された
α-EG 濃度は同程度であることも確認した。また、反応後の溶液について、イオ
ン交換樹脂で緩衝液成分を除去し、α-EG 高含有糖シロップの分離を達成した。
[1] Nakagawa, H. et al., J. Biosci. Bioeng., 89, 138-144 (2000).
[2] Sato, T. et al., J. Mol. Catal. B: Enzym., 80, 20-27 (2012).
[3] Watanabe, R. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 526, 580-585 (2020).
[4] Kirimura, K. et al., J. Biosci. Bioeng., 134, 220-225 (2022).

Functional analysis of novel dioxygenases from Phanerochaetechrysosporium

Production of sugar syrups containing a high concentration of ethyl alphaD-glucopyranoside by XgtA, a glucosyl transfer enzyme derived from
Xanthomonas campestris WU-9701○Koki Nakamura, Hiroyuki Kato, Ryoga Tsurigami, Masashi Kato,
Motoyuki Shimizu(Grad. Sch. Agric., Meijo Univ.)

Key words
white-rot fungus, Phanerochaete chrysosporium, L-dopa dioxygenases,
lignin fragments○Wei Cao1, Haruka Nakahara1, Kaito Tamura1, Yoshitaka Ishii2,
Kohtaro Kirimura1,2(1 Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2 Waseda Res. Inst. Sci. Eng.)

Key words
ethyl alpha-D-glucopyranoside, alpha-glucosidase, glucosyl transfer
enzyme, Xanthomonas campestris

86

1Bp05

好熱菌由来酵素を用いた ATP 生産カスケードの構築○鈴木 琢磨 1, Suryatin Alim Gladwin 1, 宮崎 健太郎 1, 冨田 宏矢 1,2,
本田 孝祐 1,2
（1 阪大・生工国際セ, 2 阪大・先導的学際研機構）
honda.kohsuke.icb@osaka-u.ac.jp

1Bp07

白色腐朽担子菌 Phanerochaete chrysosporium 由来新規
flavoprotein monooxygenase の機能解析○濵嶋 梨紅 1, 早坂 実夏 2, 加藤 大志 2, 釣上 竜河 2, 加藤 雅士 2,
志水 元亨 2
（1 名城大・農, 2 名城大院・農）moshimi@meijo-u.ac.jp[背景]
化学品生産や医療用診断剤などに利用される酵素の多くは、アデノシン 3 リン酸 (ATP)のような補因子を必要とする。現在、商業的に利用される ATP は、主として酵母菌体などから抽出されているが、分離精製プロセスの困難さなどか
ら新規生産法の開発が望まれている。本研究では、組換え耐熱性酵素を in vitro
で組み合わせて構築した非酸化的解糖系を ATP 再生モジュール (ArNOG)として利用し、アデニンからの ATP 生産酵素カスケードを構築したので報告する。
[方法]
Thermotoga maritima 由来ホスホペントムターゼ (PPM)、Aeropyrum pernix 由来プ
リンヌクレオシドホスホリラーゼ (NsPP)、Carbonactinospora thermoautotrophica
由来アデノシンキナーゼ (AdoK)をクローニングした。これらの発現プラスミド、12 種類の ArNOG 酵素群をコードする共発現プラスミド (Suryatin Alim ら、
ChemBioChem、2022 年)、および Thermus thermophilus HB8 由来アデニル酸キ
ナーゼ (AdK)をコードするプラスミドを、それぞれ E. coli Roesetta2 (DE3) adkP87S 株 (Suryatin Alim ら、Appl Environ Microbiol、2021 年)に導入した。菌体懸濁液に超音波破砕と 70°C で 30 分間の熱処理を施し、上記の組換え酵素群の粗精製標品からなる酵素カクテルを調製した。酵素カップリング法を用いた比色定量法および HPLC 分析にて各酵素反応による生産物を定量した。
[結果]
アデニン、リボース 5 リン酸、ATP を基質とした PPM、NsPP、AdoK、AdK の
4 酵素カップリング反応を実施し、アデニンから AMP を生産することに成功した。上記 4 酵素と ArNOG を組み合わせ、でんぷん、リン酸、ADP、アデニンを基質として、でんぷんをリボース供与の前駆体とした ATP 生産のための酵素カスケード反応を構築した。この結果、対アデニン収率 4％で ATP の生産を確認した。現在、収率の向上に向けて律速段階となる酵素の同定を進めている。

白色腐朽菌担子菌 Phanerochaete chrysosporium は、難分解性芳香族高分子であるリグニン、リグニン分解酵素によって低分子化されたリグニンフラグメント、および環境汚染物質である多環芳香族化合物 (PAH) の分解能を有している。しかしながら、それらの変換に関与する P. chrysosporium の酵素についてはほとん
ど明らかとなっていない。芳香族化合物の変換に関与する酵素の一つにflavoprotein monooxygenase (FPMO) が 知 ら れ て い る 。 当 研 究 室 に て 、 P.
chrysosporium 由来の FPMO (PcFPMO) はリグニンフラグメントの変換に関与することが明らかになっており 1、H-Unit、G-Unit、S-Unit に属するリグニンフラ
グメントである 4-ヒドロキシ安息香酸 (4-HBA)、VA、シリンガ酸 (SA) 全てを脱炭酸する PcFPMO8 も見出した。本研究では、 P. chrysosporium のゲノム中にコードされている 59 種の PcFPMO の中で、 PAH を基質にする可能性のある
PcFPMO を 22 種選抜し、それらの機能を解析した。
P. chrysosporium に種々の PAH を与えて培養し、その代謝産物を HPLC および
GC-MS にて分析した。また、PAH と選抜した PcFPMO を反応させ、その反応生成物を GC-MS にて同定した。その結果、22 種の PcFPMO のうち、PcFPMO11は芳香族環境汚染物質として知られる水酸化ナフタレン酸の脱炭酸反応を触媒した。水酸化ナフタレン酸の脱炭酸を触媒する酵素は、真菌では初めての報告例となる。現在その他の PcFPMO の機能についても解析している。
1 Suzuki, et al. (2023) J. Biosci. Bioeng. 135, 17-24,

Development of ATP production cascade using thermophilic enzymes

Characterization of novel flavoprotein monooxygenases from white-rot
basidiomycete Phanerochaete chrysosporium○Takuma Suzuki1, Gladwin Suryatin Alim1, Kentaro Miyazaki1, Hiroya Tomita1,2,
Kohsuke Honda1,2(1 ICBiotech, Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ.)○Rinku Hamajima1, Mika Hayasaka2, Hiroyuki Kato2, Ryoga Tsurigami2,
Masashi Kato2, Motoyuki Shimizu2(1 Sch. Agric., Meijo Univ., 2 Grad. Sch. Agric., Meijo Univ.)

Key words

ATP, thermophilic enzyme, in vitro metabolic engineering

Key words
vanillic acid

Phanerochaete chrysosporium, flavoprotein monooxygenase, lignin,

1Bp06

海洋細菌由来新規ポリアミド 4 加水分解酵素の諸性質
解析

1Bp08

Aspergillus syodwii による鰹節だしがらの発酵と可溶性
画分の特性解析○齋藤 祐介 1, 本田 正義 3, 古野 洋子 4, 加藤 太一郎 4, 阿部 英喜 5,
山田 美和 2
（1 岩手大院・農, 2 岩手大・農, 3 東理大・工, 4 鹿児島大院・理,5
理研・環境資源）
myamada@iwate-u.ac.jp○竹中 慎治 1, 加藤 将城 1, 織部 恭宏 1, 木村 行宏 1, 田中 伸一 2,
松本 淳一 2, 土居 幹治 2
（1 神戸大院・農, 2 マルトモ）
stakenaka@people.kobe-u.ac.jp

これまでに我々は、海洋プラスチックごみ問題の解決に向けて、海洋生分解性を持つポリアミド 4(PA4)に着目し、海洋環境での分解メカニズム解明を目的として研究を行ってきた。そして、我々は海洋細菌 Pseudoalteromonas sp. Y-5 から新規の PA4 分解酵素を特定した(Y. Saito et al., Polym. Degrad. Stab., in press)。さらに、酵素の遺伝子も特定し、アミノ酸配列と立体構造情報から、本酵素は βラクタマーゼ活性や難分解性のポリアミド 6(PA6)の分解活性も有すると期待された。本研究では、本酵素のさらなる諸性質解明に向けて、PA4 分解反応生成物の分析や様々な基質に対する分解活性を調べた。
PA4 分解反応生成物の分析では、PA4 分解酵素と PA4 エマルションを 15℃で反応させ、凍結乾燥後にアセトニトリルで反応生成物を抽出した。反応生成物をLC-MS 分析に供し、C18M2D カラムを用いて、40℃、流速 0.2 mL/分で分析した。その結果、本酵素は PA4 のアミド結合を加水分解して γ アミノ酪酸オリゴ
マー(2-3mer)へと変換するエンド型の分解酵素であると示唆された。
次に、様々な基質に対する分解活性を試験した。β ラクタマーゼ活性測定では、Nitrocefin を基質として、486nm における吸光度変化を測定した。また、本酵素
はアミド結合を加水分解するため、様々なタンパク質基質を用いて、分解後に遊離したチロシン量を測定してプロテアーゼ活性を確認した。しかし、どちらの活性も確認できなかった。最後に PA6 と、その低分子量体である 6 アミノヘキサン酸の線状ダイマーの分解試験を行った。各基質と酵素を 30℃で反応させ、反応生成物を TLC で分画し、ニンヒドリン反応で検出したが、分解は確認できなかった。以上のことから本酵素は、β ラクタマーゼ活性やプロテアーゼ
活性を示さず、現状高分子の PA4 を特異的に分解するユニークな基質特異性を有することが示唆された。

【目的】伝統的な和食文化が世界的に認知され、これを支える“だし”への関心も高まっている。鰹節調整品の生産量増加に伴い、製造工程で生じる食品残渣“だしがら”の有効活用法の開発も求められている。我々は、鰹節の発酵熟成に関わる鰹節カビ由来加水分解酵素群の特性を明らかにしてきた 1)。同食品残渣は、タンパク質が主体であることから、本研究ではプロテアーゼ高生産な鰹節カビを用いた微生物発酵による加水分解処理を検討した。この報告では、Aspergillus
sydowii MA0196 を用いた“だしがら”の固体培養、鰹節タンパク質の分解に関わる酵素群および培養物の可溶性画分の特性について述べる。
【方法】MA0196 株を固体培養し 1)、培養物に含まれる MA0196 株由来タンパク質分解酵素を精製し、タンパク質同定を行った。また、同培養物について、かつおだし抽出法（90℃、3 分間）にて可溶性画分を調製し、成分や種々の生理活性を調べた。
【結果】MA0196 株を接種しなかった対照と比較すると、遊離アミノ酸量およびペプチド量はそれぞれ約 900 倍および 30 倍となった。MA0196 株の培養物にはタンパク質分解酵素活性が見られ、各種クロマトグラフィーによる精製を経て、
aminopeptidase ApsA (5Pep1)、trypsin-like serine protease (5Pep2=7Pep1)およびserine protease Oryzin (7Pep2)を見出した。鰹節から抽出したタンパク質に対する分解性は、5Pep2 (7Pep1)が優れていた。可溶性画分には、Glu>Leu>Lys>Val>Alaといったアミノ酸が多く含まれ、呈味性の向上が見られた。また、ペプチドの分子質量分布は、0.2〜17 kDa であった。同画分は、フリーラジカル消去活性、抗酸化活性、アンジオテンシン変換酵素阻害活性だけでなく、乳酸菌 3 種において増殖促進効果も示した。1) Takenaka et al. Int. J. Food Microbiol. 353:109299(2021).

Elucidating the enzymatic properties of a novel polyamide4 hydrolase frommarine bacterium

Fermentation of food residue, dashigara by Aspergillus sydowii andcharacterization of the hydrolysate○Yusuke Saito , Masayoshi Honda , Yoko Furuno , Dai-ichiro Kato , Hideki Abe ,Miwa Yamada2(1 Grad. Sch. Agric., Iwate Univ., 2 Fac. Agric., Iwate Univ., 3 Fac. Eng., Tokyo Univ.
Sci., 4 Grad. Sch. Sci., kagoshima Univ., 5 CSRS, RIKENS)
1

Key words

3

4

4

Polyamido4, nylon oligomer, biodegradation, hydrolase

5○Shinji Takenaka1, Masaki Kato1, Yasuhiro Oribe1, Yukihiro Kimura1,
Shinichi Tanaka2, Jyunichi Matsumoto2, Mikiharu Doi2
(1 Grad. Sch. Agric., Kobe Univ., 2 Marutomo Co., Ltd.)Key words

fungus, biomass, peptide, biodegradation

87

1Bp09

中等度好熱放線菌 S. thermolineatus によるキチン分解
系タンパク質の分泌と同定○枝並 研一郎 1, 有馬 二朗 2, 仁木 大輔 3
（1 鳥取大院・持社創生, 2 鳥取大・農, 3 鳥取大院・連農）
arima@tottori-u.ac.jp

1Bp11
学

茶カテキン代謝微生物の探索と初発酵素の精製○姫野 南実 1, 橋本 義輝 1,2, 熊野 匠人 1,2, 小林 達彦 1,2（1 筑波大院・生命環境, 2 筑波大学・微生物サステイナビリティ
研究センター）kobayashi.m.fe@u.tsukuba.ac.jp【目的】キチンは自然界ではセルロースに次いで多く生産され、その分解物から様々な生理活性が認められているため、次世代バイオマス資源として注目されている。一方で、分解には繁雑な工程や環境負荷等が問題とされている。 これらの問題解決のため、酵素による直接的な分解方法の開発が求められているが、未だ実現していない。我々はこれまでに、中等度好熱放線菌 Streptomyces
thermolineatus JCM6307（6307 株）から高度な α-キチン分解能を見出した。本
研究では、α-キチンの酵素による直接分解を目指し、6307 株培養上清におけるキチン基質に対する諸性質の検討、及び本菌が生産するキチン分解に関わる菌
体外タンパク質を解析した。
【方法及び結果 】6307 株をキチン入り培地で培養し、その培養上清のキチンパウダー(CP)に対する分解能を還元糖の増加量で評価した結果、還元末端遊離の反応速度は 0.04 µmol/h/mL であった。 一方で、キチンナノファイバーでの還元
末端遊離活性は CP の 1.09 倍、エチレングリコールキチンでは CP の 38.0 倍、キトサンでは CP の 54.3 倍であることが明らかとなった。また、6307 株の培養
上清からは、キトオリゴ糖に対する分解活性も確認されたため、複数のキチン分解酵素が分泌されていると考えられた。そこで、培養上清をキチンレジンカ
ラムに通し、吸着画分と非吸着画分を SDS-PAGE で比較した結果、キチンと結合できるタンパク質が複数確認された。N 末端アミノ酸配列解析によりこれらのうち 45 kDa と 20 kDa の 2 つのタンパク質を同定することができ、１つはGlycoside Hydrolase family 18 に属する Chitinase（45 kDa）、もう１つは auxiliary
activities family 10 に属する Lytic polysaccharide mono-oxygenases（20 kDa）であった。現在、本菌のゲノム解析を行っており、他のタンパク質の同定も試みている。

カテキンはお茶に含まれている植物由来のフラボノイドの一種で、抗酸化などの多様な生理活性を有し、食品・健康分野で広く利用されている。これまでのカテキン分解・代謝研究は、中間代謝産物の同定が主であり詳細な解明は限られている。さらに、これまでに行われてきたカテキン研究は全て（＋）-カテキ
ンが出発物質であるが、実際の茶葉中のカテキン類での（＋）-カテキンの割合はわずか 1%程度で、（－）-エピガロカテキンガレート ［以下、（－）EGCg］
が約 60%を占める。自然界での本来のカテキン代謝を解明するために、本研究では（－）EGCg を出発物質とするカテキン代謝微生物を探索し、その代謝経路およびそれに関わる酵素の解析を目的とした。
（＋）-カテキン資化微生物として報告のある微生物および当研究室で単離した複数の（＋）-カテキン代謝微生物を候補とし、それぞれ栄養培地で生育後、無細胞抽出液を調製した。（－）EGCg を基質として反応後、HPLC で残存（－）
EGCg を定量し、当研究室で単離した A 株が（－）EGCg 分解能をもつことを明らかにした。
まず、酵素精製に先立ち各種培地および誘導剤の検討を行い、（－）EGCg 分解
酵素活性が最も高くなる最適培地・培養条件を確立した。次に、決定した培地で大量培養した菌体から無細胞抽出液を調製し、硫酸アンモニウムによる分画
および各種クロマトグラフィーを経て目的酵素を SDS-PAGE 上で単一になるまで精製した。さらに、精製酵素標品を用いて酵素反応産物を決定後にストイキ
オメトリー解析を行い、本酵素の触媒する反応を同定し、（－）EGCg を出発物質とするカテキン代謝の初発経路の解明に成功した。

Secretion and identification of chitin-degrading proteins by the moderately
thermophilic actinomycete S. thermolineatus.

Microbial metabolism of tea catechin○Kenichiro Enami1, Jiro Arima2, Daisuke Niki3(1 Grad. Sch. Sustainability Sci., Tottori Univ., 2 Fac. Agric., Tottori Univ., 3 United
Grad. Sch. Agric. Sci., Tottori Univ.)○Minami Himeno1, Yoshiteru Hashimoto1,2, Takuto Kumano1,2,Michihiko Kobayashi1,2(1 Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2 MiCS, Univ. Tsukuba)

Key words

actinomycetes, chitin, chitinase

Key words

microorganisms, metabolism, enzyme, purification

1Bp10

Cellvibrio sp. WU-0601 細胞内に検出されるネオアガロ
ビオース生成型 β-アガラーゼ AgaX の諸性質

1Bp12

新規クルクミン代謝微生物の単離と代謝産物の同定

学○田村 佳都 , 海蔵寺 早希 , 石井 義孝 , 桐村 光太郎（1 早大院・先進理工, 2 早大・理工総研）
kkohtaro@waseda.jp
1

1

2

1,2

○橋本 義輝 1,2, 佐藤 伽音 1, 熊野 匠人 1,2, 小林 達彦 1,2（1 筑波大院・生命環境, 2 筑波大学・微生物サステイナビリティ
研究センター）kobayashi.m.fe@u.tsukuba.ac.jp【背景・目的】
アガロースの選択的加水分解により生成するネオアガロビオース（NA2）は、保湿作用や美白作用を示すため化粧品などへの応用が期待されている[1]。NA2の酵素的生産法の開発が期待されているが、NA2 生成型 β-アガラーゼは極めて少ない。当研究室では、寒天分解細菌として単離した Cellvibrio sp. WU-0601 を取得している[2]。本研究では、細胞内に NA2 生成型 β-アガラーゼ（以下、AgaX）を発見し、当該酵素（β-agarase, EC 3.2.1.81）を精製し、その酵素的特性を明らかにした。
【方法・結果】
アガロースを唯一の炭素源として培養した Cellvibrio sp. WU-0601 の無細胞抽出液から、4 段階のクロマトグラフィーにより、AgaX を SDS-PAGE で単一のバンドになるまで精製した。収率は 0.770 ％、精製倍率は 90.4 倍であった。SDSPAGE とゲルろ過クロマトグラフィーから算出した AgaX の分子量はそれぞれ
87 kDa、90 kDa であり、AgaX は単量体酵素と考えられる。また、精製した
AgaX の N 末端および内部アミノ酸配列情報を基に、AgaX をコードする遺伝子をクローニングした。AgaX 遺伝子は、798 個 のアミノ酸残基をコードしており、31 個のアミノ酸残基から成るシグナル配列と想定される領域を含んでいた。大腸菌を宿主として組換え AgaX を生産、精製し、その諸性質を検討した。
最適温度は 45˚C、最適 pH は 8.0 で、native AgaX のものと同一であった。さらに、組換え AgaX を 4 g/L アガロース溶液に作用させた場合、最終的な生成物
は NA2 のみとなった。したがって、AgaX はアガロースからの選択的な NA2生産に有用な酵素であることを明らかにした。
[1] Kobayashi, R., et al., Biosci. Biotech. Biochem., 61, 162-163 (1997).
[2] Watanabe, T., et al., J. Mol. Catal. B: Enzym., 133, S328-S336 (2016).

クルクミンはウコンに含まれる多環構造の黄色色素であり、様々な薬理学的活性を有するポリフェノールの一種である。クルクミンからジヒドロクルクミン
を経由してテトラヒドロクルクミンに変換される経路は報告されているものの、その変換反応に関わる酵素は（微生物からヒトに至るすべての生物において）同定されていなかった状況の中、我々は、微生物によるクルクミン代謝を解明するために研究を行い、腸内微生物である大腸菌がクルクミンをジヒドロクル
クミンやテトラヒドロクルクミンに変換することを見いだし、この変換に関わる酵素を発見・同定した(1)。本研究では、微生物による多様な代謝経路を解明することを目的とする。
未知のクルクミン代謝経路をもつ微生物を探索するために、様々なサンプルからスクリーニングを行った。その結果、クルクミンと反応させるとジヒドロク
ルクミンやテトラヒドロクルクミンとは異なる代謝産物を生成する微生物（以下、本菌とする）を土壌より単離することに成功した。クルクミン含有固体培
地上に生育した本菌の周囲を囲むように透明なハローが形成されていたため、本菌のクルクミン代謝に関わる酵素は菌体外に分泌されていると示唆された。
本代謝産物の HPLC の保持時間および吸収スペクトル、LC-MS を用いて決定した分子量はジヒドロクルクミンおよびテトラヒドロクルクミンとは異なっており、新たなクルクミン代謝産物の存在が示唆された。高分解能質量分析装置やLC-MS/MS を用いた実験により本代謝産物の構造を決定した。
(1) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108, 6615-6620 (2011)

Characterization of an intracellular neoagarobiose－producing beta-agarase
AgaX derived from Cellvibrio sp. WU－0601.

Screening of microorganism with novel curcumin metabolism○Kaito Tamura , Saki Kaizoji , Yoshitaka Ishii , Koutaro Kirimura(1 Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2 Waseda Univ.Res. Inst. Sci. Eng.)
1

Key words

1

2

1,2

beta-agarase, agarose, Cellbibrio sp. WU-0601, neoagarobiose○Yoshiteru Hashimoto1,2, Kanon Sato1, Takuto Kumano1,2, Michihiko Kobayashi1,2(1 Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2 MiCS, Univ. Tsukuba)

Key words

microorganisms, metabolism

88

1Bp13

A salt and an organic solvent-tolerant phosphite
dehydrogenase for the nicotinamide cofactor
regeneration under non-standard reaction condition

1Bp15○Gamal Nasser Abdel-Hady1,2, Takahisa Tajima1, Takeshi Ikeda1,
Takenori Ishida1, Hisakage Funabashi1, Akio Kuroda1,
Ryuichi Hirota1(1 Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 2 Fac. Agric., Minia
Univ., Egypt)
hirota@hiroshima-u.ac.jp

酵素の有用変異体を予測する機械学習モデルの構築○礒崎 達大, 渡来 直生, 中村 祐哉, 田村 康一（digzyme）
isozaki.tatsuhiro@digzyme.com

Phosphite dehydrogenase (PtxD) has been proposed as a promising candidate for
NAD(P)H regeneration. To expand the usability of PtxD under non-standard reaction
conditions, we cloned salt-and organic solvent-tolerant PtxD from Cyanothece sp.
ATCC51142 (Ct-PtxD). Ct-PtxD exhibited maximum activity at pH 9.0, 50 °C, andhigh stability over a wide pH range (6.0-10.0). Compared to previously reported
PtxDs, Ct-PtxD showed increased resistance to salt ions, such as Na+, K+, and NH4+.
Ct-PtxD exhibited a high tolerance to 30% ethanol, 40% DMF, and 40% methanol
when bound to its preferred cofactor, NAD. Interestingly, these organic solvents
enhanced the Ct-PtxD activity while inhibiting the PtxD activity of Ralstonia sp. 4506
(Rs-PtxD) at concentrations ranging from 10 to 30%. Molecular electrostatic potential
analysis showed that the binding site of Ct-PtxD is rich in positively charged residues,
which might attract the negatively charged pyrophosphate of NAD under high-saltconditions. Amino acid composition analysis revealed that Ct-PtxD had fewerhydrophobic amino acids than the other PtxD enzymes, which reduced hydrophobicity
and increased hydration of the protein surface under low water activity. We also
demonstrated that the NADH regeneration system using Ct-PtxD is useful in the
coupled chiral conversion of trimethylpyruvic acid to L-tert-leucine by leucine
dehydrogenase under high ammonium conditions, which is less supported by the RsPtxD enzyme.

酵素や微生物を用いて有用物質生産を行うバイオプロセスは化学法と比べて必要なエネルギーが低く環境負荷が小さいため注目を集めている。しかし、工業
スケールで大量の物質を生産するためには高い活性の酵素、または、その酵素をもった微生物を設計する必要がある。酵素のアミノ酸配列に変異を加えることで高活性な変異体を設計できた例はこれまでにも報告されている。しかし、従来はコストの大きいランダムスクリーニングや個々の酵素の構造などを人が目で見て経験則的に変異を入れて設計している例が多い。これらの方法ではコストがかかりすぎてプロセス構築までたどり着けない、または、前例の少ない
酵素ファミリーでは活性の高い酵素を設計できないという問題を抱えていた。
そこで、本研究では酵素の活性を予測する機械学習モデル Spotlight を構築した。Spotlight では酵素の変異体の実験結果が登録されているデータベースの 1つである BRENDA を教師データとして、kcat/Km の回帰を行った。EC 番号によらず Pearson 相関係数 0.66 を示したことから、酵素ファミリーに偏りなく高い精度で変異体の活性を予測できるモデルであると示唆された。さらに、Spotlight
では酵素の耐熱性の指標である Tm 値も回帰により予測するモデルも構築した。
この回帰モデルでは Pearson 相関係数は 0.69 を示したことから、耐熱性の向上
した変異体の予測もできることが示唆された。また、Spotlight を現在バイオプ
ロセス中でつかわれている酵素に適用することでバイオプロセスにおいて律速となりうる酵素活性が不十分であるという問題の解決が期待できる。

A salt and an organic solvent-tolerant phosphite dehydrogenase for the
nicotinamide cofactor regeneration under non-standard reaction condition

The construction of a machine learning model to predict capable enzyme
mutants

Key words
phosphite dehydrogenase, NAD(P)H regeneration, salt resistance,
organic solvent tolerance.

Key words

enzyme, bioinformatics

1Bp14

1Bp16

データベースより単離した新奇 L-メチオニン酸化酵素の構造機能解析○Gamal Nasser Abdel-Hady1,2, Takahisa Tajima1, Takeshi Ikeda1, Takenori Ishida1,
Hisakage Funabashi1, Akio Kuroda1, Ryuichi Hirota1(1 Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 2 Fac. Agric., Minia Univ., Egypt)

Construction of an enzyme cascade for semi-de novo
synthesis of NAD+
○Christina Aryanti Pada Soa1, Takuma Suzuki1,
Gladwin Suryatin Alim1, Hiroya Tomita1,2, Kentaro Miyazaki1,
Kohsuke Honda1,2(1 ICBiotech, Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ.)
honda.kohsuke.icb@osaka-u.ac.jp○Tatsuhiro Isozaki, Naoki Watarai, Yuuya Nakamura, Koichi Tamura(digzyme)

学○川村 ゆい, 中野 祥吾, 杉浦 紗也加, 伊藤 創平（静県大院・薬食生命）snakano@u-shizuoka-ken.ac.jp

Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) is an important cofactor in biological redox
reactions and commercially used for enzymatic diagnosis purposes. NAD+ is athermolabile compound and rapidly decomposed at high temperatures and basic pH.
Previously, we built an in vitro enzymatic module using thermophilic enzymes for
NAD+ salvage synthesis that can re-synthesis NAD+ from its thermal degradation
products. We also built an ATP regeneration module consisting of 12 thermophilic
enzymes involved in a non-oxidative glycolysis (ArNOG). In this study, we combined
these two modules to build a semi-de novo biosynthetic pathway for in vitro productionof NAD+. Seven plasmids encoding NAD+ biosynthetic enzymes from thermophilicsources were constructed. Escherichia coli Rosetta2 (DE3) adk-P87S (Suryatin Alim etal., Appl Environ Microbiol, 2021) was transformed by these 7 plasmids and a plasmid
encoding 12 enzymes involved in ArNOG (Suryatin Alim et al., ChemBioChem,
2022). Recombinant thermophilic enzymes were purified by the heat-treatment of theE. coli cell lysate at 70°C for 30 min, and then confirmed to exert their catalytic
activity. The enzyme mixture was incubated with starch, phosphate, adenine, andnicotinic acid, yielding NAD+ at a yield of 12% against adenine. Currently, further
optimization of reaction conditions is in progress to improve the production yield.

【はじめに】
先天性遺伝子疾患である「高メチオニン血症」は、血中 L-メチオニン (Met) の高濃度状態の持続により中枢神経障害や肝機能障害を引き起こす。これを未然に防ぐため、血中 L-Met 濃度の定量技術が求められる。そこで本研究では、LMet に特異的に作用する酸化酵素を見出し、本酵素の構造機能解析、および LMet 定量酵素としての応用に向けた検討に取り組んだ。
【実験・結果】
当研究室ではこれまで、独自のアミノ酸一次配列分類プログラムを用いて新規
L-アミノ酸酸化酵素 (LAAO) の探索・人工設計を進めてきた。そこで今回、いくつかに分類されたグループのうち、とある機能解析未着手のグループに属する酵素の機能解析に取り組むこととした。このグループに属する 2 つの酵素
(LAAO N1, N2) の機能解析に着手し、20 種のタンパク質性アミノ酸それぞれに対する基質選択性を検討した。酸化活性の検出は Trinder 試薬による 555 nm の
吸光度変化を測定することで行い、分析の結果、LAAON1,N2 ともに L-Met への強い活性を示した。特に、N2 は L-Met 以外のアミノ酸にも弱い活性を示した一方で、N1 は L-Met のみに酸化活性を示した。また、N1 は L-Met 濃度変化に対する線形的な吸光度変化を示したことから、L-Met 定量用酵素として利用可能である事が示唆された。
そこで LAAO N1 の基質認識機構、および反応機構についての知見を得るため、
X 線結晶構造解析を試みた。その結果、LAAO N1 の結晶構造を分解能 2.7 Å で決定することに成功した。他の LAAO の結晶構造との比較により LAAO N1 のR60 が L-Met のカルボキシ基の認識、K305 が触媒反応に関与することが推測され、確かにこれらアミノ酸の Ala 置換はそれぞれ著しい活性低下を与えた。以上本研究では新規 L-Met 酸化酵素を見出し、その機能構造解析を行い、これがL-Met 定量酵素として応用可能であることを示した。

Construction of an enzyme cascade for semi-de novo synthesis of NAD+

Structual and function analysis of novel L-methionine oxidase isolated fromdetabase○Christina Aryanti Pada Soa1, Takuma Suzuki1, Gladwin Suryatin Alim1,
Hiroya Tomita1,2, Kentaro Miyazaki1, Kohsuke Honda1,2(1 ICBiotech, Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ.)

Key words
reaction

NAD+, thermophilic enzyme, in vitro metabolic engineering, cascade○Yui Kawamura, Shogo Nakano, Sayaka Sugiura, Sohei Ito(Grad. Sch. Integr. Pharm. Nutr. Sci., Univ. Shizuoka)

Key words

amino acid, enzyme sensor, methionine

89

1Cp01

ヒト毛髪付着細菌群集構造の分布○渡邉 康太 1, 中山 俊一 1, 門倉 利守 1, 田代 幸寛 2
（1 東農大・応生科, 2 九大院・農）kw207917@nodai.ac.jp

1Cp03
学

一細胞自家蛍光による非破壊的な油脂生産性の予測○八幡 志央美 1, 平山 智弘 2, 芹田 達郎 4, 風間 春香 5, 森 浩二 4,
高久 洋暁 5, 野村 暢彦 3,6, 八幡 穣 3,6（1 筑波大院・生命地球科学, 2 筑波大院・生命環境科学, 3 筑波大・生命環境系, 4 製品評価技術基盤機構・バイオテクノロジー
セ, 5 新潟薬大・応生命, 6 筑波大・微生物サステイナビリティ
研セ）
yawata.yutaka.ga@u.tsukuba.ac.jp【背景】
人体には部位特異的に多様な細菌群集構造が存在することが知られている。我々
は先行研究により、ヒト毛髪にも一定数の細菌と安定した群集構造が存在する
ことを報告した。しかしながら、これまでの研究は主に頭頂部から採取した毛髪に限定されており、採取部位の違いが細菌群集構造の形成に及ぼす影響は明らかになっていない。そこで本研究では、5 部位から採取した毛髪試料を対象に 16S アンプリコン法による解析を行い、部位間での細菌群集構造の分布を比
較した。
【方法】
12 名の被験者を対象に、頭頂部、前頭部、後頭部、右および左側頭部の 5 部位の毛髪を採取し細菌 DNA を抽出した。16S rRNA 遺伝子の V4 領域を増幅後、次世代シーケンサーによる 16S アンプリコン解析にて細菌群集構造を解析した。
【結果】
門レベルでの細菌群集構造解析では、全サンプルで主要細菌門は Pseudomonadota
門、Actinomycetota 門、Bacillota 門であった。属レベルでは Cutibacterium 属、Pseudomonas 属、Staphylococcus 属、Lawsonella 属の 4 属がいずれのサンプルにも主要に存在した。また、主要細菌 4 属の占有率を被験者間および採取部位間で比較したところ、被験者間では有意差があった一方で、採取部位間では有意差がなかった。shannon 指数による α 多様性解析では、被験者間で多様度が有意に異なった一方で、採取部位間では有意差がなかった。Unifrac distance 値による主成分分析では、同一被験者内のプロット間の距離は近い傾向を示したのに対し、同一採取部位内のプロットは距離がばらつく傾向があった。また、プロット間の分散に寄与する因子を解析したところ、被験者の違いのみが統計的に有意なカテゴリーであり、採取部位の違いは有意な影響はなかった。以上から、同一被験者内のヒト毛髪細菌群集構造の分布は採取部位の違いによらず類似することが示唆された。

細胞自家蛍光は、細胞内の生体分子や代謝産物に由来する微弱な蛍光であり、微生物の天然の性質である。これまでに、細胞自家蛍光は、微生物の様々な生理状態を反映することが示され、非破壊で細胞の状態を評価するための有効な手掛かりとなることが示唆されている。しかしながら、細胞自家蛍光と細胞の物質生産性との関連については、未解明のままである。本研究は、食品、医学、環境を含む幅広い分野における産業利用上、有用な油脂を生産する油脂酵母をモデル微生物とし、油脂酵母の自家蛍光と油脂生産性との関連を、種・属横断的に解析した。我々は、一細胞ごとに細胞自家蛍光と油脂生産量を計測する新たな顕微鏡法を開発し、画像処理および機械学習モデルを使用し解析した。その結果、Lipomyces starkeyi 野生株の同一集団内における一細胞自家蛍光および油脂生産量には、高い不均一性が存在し、油脂生産の進行とともに細胞自家蛍光は連続的に変化することを確認した。細胞自家蛍光を使用し構築した分類モデルおよび回帰モデルにより、細胞の油脂生産量を予測できることが明らかとなった。さらに、油脂生産性の異なる株、種・属間においても、細胞自家蛍光
は集団ごとに特徴的であり、細胞自家蛍光を使用して、油脂生産能を予測することができた。このように、機械学習モデルを用いて、細胞自家蛍光と油脂生
産性を紐づけることができたことから、細胞自家蛍光は細胞の油脂生産性を反映することが示唆された。以上の結果より、一細胞自家蛍光は、細胞の油脂生産性を非破壊で解析・予測するための有効な手段であることが考えられる。細
胞自家蛍光は、微生物、動物、植物を含むすべての細胞が持つ普遍的な性質である。そのため、幅広い分野の多様な細胞の物質生産性評価に、本技術を応用できる可能性が期待される。

Distribution of bacterial community structure on human scalp hairSingle-cell innate fluorescence signature predicts cellular lipid productivityof oleaginous yeasts○Kota Watanabe1, Shunichi Nakayama1, Toshimori Kadokura1, Yukihiro Tashiro2(1 Fac. Appl. Biosci., Tokyo Univ. Agric., 2 Grad. Sch. Agric., Kyushu Univ.)

Key words

microbial community, hair, scalp

1Cp02

窒素感受性脂質合成細菌 Nitratireductor sp. OM-1 における比較 RNA-seq 解析

学○Shiomi Yawata1, Tomohiro Hirayama2, Tatsuro Serita4, Haruka Kazama5,
Koji Mori4, Hiroaki Takaku5, Nobuhiko Nomura3,6, Yutaka Yawata3,6(1 Grad. Sch. Life Earth Sci., 2 Grad. Sch. Life Environ. Sci., 3 Univ. Tsukuba Life
Environ., 4 NBRC, 5 Fac. Appl. Life Sci., Niigata Univ. Pharm. Appl. Life Sci.,
6
Univ. Tsukuba MiCS)
Key words
autofluorescence, machine learning, oleaginous yeast, confocal
microscopy

1Cp04○前田 大翔, 平田 悠人, 高橋 宏和, 岡村 好子（広島大院・統合生命科学）
okamuray@hiroshima-u.ac.jp

アミノ酸物性値を用いた SARS-CoV-2 スパイク配列の高速特徴抽出法の開発○岡 大椰, 吉本 将悟, 堀 克敏
（名大院・工）oka.hiroya.n1@f.mail.nagoya-u.ac.jp【目的】Nitratireductor sp. OM-1 株は、酢酸を炭素源とする培養時にブテン酸やそのエステル重合体を合成する。これらの脂質代謝は窒素源の存在により制御される。細菌によるブテン酸直接合成は、これまでに遺伝子組換え体を除いて他に報告がない。この新規脂質合成経路の解明に向けて、ブテン酸合成遺伝子
te を同定した。一方、吉草酸を炭素源とする培養ではペンテン酸やそのエステ
ルを合成する。ペンテン酸合成は窒素源による制御を受けないため、ブテン酸とは異なる合成経路が予想されている。また同属異種で全ゲノム配列が報告されている Nitratireductor sp. CAU1489 T 株については、te 遺伝子を保有しブテン酸を合成する一方でエステルは合成できないことを確認している。そこで本研
究では、新規エステル合成遺伝子同定を目的とした比較発現解析を行った。
【方法及び結果】酢酸または吉草酸を炭素源とし、窒素源有または無条件で OM-1株を培養し、total RNA を抽出・精製し、rRNA を除去後、RNA-seq ライブラ
リーを作製した。このライブラリーは NextSeq 500 (Illumina)でペアエンドリードを用いて配列決定した。OM-1 株ゲノム配列にマッピングし、マップされた
リードを総リード数および総発現量で正規化した。酢酸及び吉草酸条件において窒素有無条件間で発現量が 2 倍以上変動した遺伝子を、エステル合成遺伝子の候補として選抜した。さらにエステル合成能を有さない CAU1489T 株との相同性解析により、候補遺伝子のさらなる選抜を行った。比較発現解析の結果、24 個の遺伝子がヒットした。この中に機能未知遺伝子が 6 個含まれていた。さらに、CAU1489T 株との相同性検索の結果、6 個すべてが CAU1489T 株と非相同性の遺伝子であった。今後は CAU1489T 株を宿主としてエステル合成候補遺伝子を導入し、エステル合成の有無によって、その機能解明を進めていく。

【背景・目的】 SARS-CoV-2 は武漢に端を発し、世界各地で大規模な感染爆発を引き起こした。この感染拡大の理由として、スパイクタンパク質の変異による免疫回避や感染性の向上を獲得した変異体 SARS-CoV-2 の存在が挙げられる。
そのため、報告された変異体の情報を適切に収集・調査し、次なる変異を予測し対策を講じる必要がある。しかし、現在 SARS-CoV-2 変異株の配列を寄託するデータベースは過去に例を見ないサイズに到達し、従来のゲノムサーベイラ
ンスで用いた手法が計算コスト、正確性の観点から実行困難となっている。一方で、スパイクタンパク質の機能とアミノ酸の物性の関係性が示されており、それらの情報を組み込むことでより正確な予測が期待される。そこで本研究は、アミノ酸の物性値を用いることで従来法と比較し配列の次元数を最大で約 10 分の 1 に減少させ、かつスパイクタンパク質の機能を反映させた新規分類手法を提案する。
【方法・結果】アミノ酸物性値でベクトル化した配列に対して t-SNE (t-distributed
Stochastic Neighbor Embedding)による次元圧縮と DBSCAN (Density-Based Spatial
Clustering of Applications with Noise)によるクラスタリングを行った。その結果、同じ WHO 名を持つ系統同士が正しく凝集することが示された。加えて、解析
時点でデータ数の少ない Omicron 株は新規クラスターとして検出された。これ
らの結果は、アミノ酸の物性値を用いることで、情報の正確さを保持したまま計算コストを低減させたことを示す。さらには、ランダムフォレストを用いて、各クラスターに特徴的なアミノ酸残基を同定することで、これまでの配列表現では得られない生物学的な情報を抽出することに成功した。この一連の手法は、今後出現する可能性のある新しい SARS-CoV2 の系統や亜系統の迅速な解析・予測に大きく寄与すると考えられる。

Comparative RNA-seq analysis on nitrogen-sensitive lipid synthetic
bacterium Nitratireductor sp. OM-1

Development of a fast feature extraction method for SARS-CoV-2 spikesequences using amino acid physical properties○Hiroto Maeda, Yuto Hirata, Hirokazu Takahashi, Yoshiko Okamura(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)

Key words

bioinformatics, lipid, transcriptome○Hiroya Oka, Shogo Yoshimoto, Katsutoshi Hori
(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

Key words

SARS-CoV-2, machine leaning, amino acid, bioinformatics

90

1Cp05

機械学習を用いた代謝酵素の基質特異性決定残基の推
定と変換

1Cp07

不凍タンパク質を分子骨格としたアスベスト結合タンパ
ク質の開発○市川 京香, 石田 丈典, 池田 丈, 舟橋 久景, 廣田 隆一, 黒田 章夫（広島大院・統合生命科学）
akuroda@hiroshima-u.ac.jp○森 聖也, 二井手 哲平, 戸谷 吉博, 清水 浩
（阪大院・情報）shimizu@ist.osaka-u.ac.jp

代謝酵素の基質特異性改変は有用物質の生産性向上における有効な戦略の一つであるが、酵素の膨大な探索空間の中から目的機能を持つ変異体酵素を取得することは多くの時間と労力が必要である。そこで本研究では、機械学習による
アミノ酸配列保存度に基づく酵素設計法を援用し、基質特異性決定残基を同定し、基質特異性を変更する酵素設計法の開発に取り組んだ。ここでは、同じタンパク質ファミリーに属する乳酸脱水素酵素 (LDH) とリンゴ酸脱水素酵素(MDH) に着目し、両酵素の基質特異性を司るアミノ酸残基を同定してアミノ酸配列から２つの酵素が判別できるモデルを作成した。まず Swiss-Prot データベー
スから LDH と MDH のアミノ酸配列データを取得し、多重配列アラインメントを実施して配列長を統一した。これにロジスティック回帰を適用し、分類モデ
ルを作成して正解率 0.997 で２つの酵素を判別することに成功した。次に得られたモデルを分析することで基質特異性に関連するアミノ酸残基を抽出し、偏回帰係数のスコアに基づきランキング化した。ランキングの上位から、鋳型配列 と し た ３ 種 の LDH に 対 し て 変 異 導 入 を 行 っ た 。 中 で も Bacillus
stearothermophilus 由来 LDH は、先行研究において、ある残基をグルタミンからアルギニンに変換すると活性の変換が起きると報告されているが、これは本手法におけるランキング１位の残基変換と一致しており、基質特異性に関わる残基を抽出できていることが示唆された。
次に、この判別モデルを用いることで基質選択性の変換が変わり得るかを評価した。ここでは、ランキング上位から相加的に LDH に変異を蓄積させた変異体を大腸菌発現系で変異体を調製し、MDH に変化し得るかを評価した。本手法は、結晶構造の観察のみからでは分からない分子認識に関わる残基の存在など、酵素についての新たな知見を得られる可能性がある。

【目的】アスベストは、肺ガンや悪性中皮腫などを引き起こす。現在、アスベス
トの使用は禁止されているが、過去に使用された建物の解体現場ではアスベス
トの飛散のリスクが高く、迅速なアスベストの検出方法が求められている。大気中のアスベストの飛散は大気をフィルター上に吸引し、フィルター上に捕集された繊維を電子顕微鏡で検査する方法が用いられている。当研究室では、アスベスト結合タンパク質を用いたアスベストの迅速検出法を開発している。この検出法では蛍光標識したアスベスト結合タンパク質をアスベストに結合させ、簡便にアスベストを検出できる。さらにはその技術を自動化した装置などを開発している。本研究では、自動化した際に求められる十分な蛍光強度を示すア
スベスト結合タンパク質の創製を目指した。
【方法】昆虫 Tenebrio molitor 由来の不凍タンパク質(TmAFP)は、氷の結晶表面に結合するタンパク質で、氷結合面にスレオニンが規則的に繰り返された平面性の高い構造を持つ。アスベストは無機結晶であり、氷と同様、その表面は単位格子の繰り返しからなる平面である。AFP の高い平面性と繰り返し構造は、アスベスト結合タンパク質の分子骨格として利用できると考えた。これまでにAFP の繰り返しユニットの変異ライブラリーからアスベストに結合する配列(アスベスト結合ユニット)を取得している。本研究では、アスベスト結合ユニット
を繰り返したタンパク質を作製した。
【結果】TmAFP を分子骨格としてアスベスト結合ユニットを複数提示した変異体を作製し、そのタンパク質を蛍光標識した。その蛍光プローブは、アスベス
トと非アスベスト繊維の区別ができ、さらに従来のものよりもアスベストが強く光ることがわかった。

Estimation and transformation of substrate specificity determining residuesof metabolic enzymes using machine learning

Development of asbestos-binding protein using antifreeze protein as
molecular scaffold○Seiya Mori, Teppei Niide, Yoshihiro Toya, Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)○Kyoka Ichikawa, Takenori Ishida, Takeshi Ikeda, Hisakage Funabashi,
Ryuichi Hirota, Akio Kuroda(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)

Key words

enzyme activity, lactate dehydrogenase, Escherichia coli

Key words

antifreeze protein, asbestos, phage display

1Cp06

金属微粒子の選択的凝集を目的とした多機能タンパク質のデザインと機能評価

1Cp08

産業廃棄オカラを培地基材としたタンパク質の高生産学○今村 沙弥香, 中島 一紀, 菅原 駿平, 石渡 悠介, 高野 力, 川崎 了
（北大院・工）k.naka@eng.hokudai.ac.jp○山口 颯太 1, 小山 幸祐 1, 大城 隆 2,3, 鈴木 宏和 2,3（1 鳥大院・持続創生, 2 鳥取大・工, 3 鳥大・GSCセンター）
hirokazusuzuki@tottori-u.ac.jp【背景・目的】 鉱物が気泡に付着する性質を利用した浮遊選鉱法は主要な選鉱方法の一つである。銅の主要鉱物である黄銅鉱(CuFeS2)の浮選では，数 10〜
100µm サイズの鉱物は回収可能だが数 µm の微粒子は動力学的に気泡に付着せず回収が難しいという問題がある。近年，金や銅などの金属や鉱物に結合するペプチドが数多く報告されており，特定の物質に高い選択性をもつことから金属資源回収への応用が期待される。そこで本研究では，黄銅鉱結合ペプチドを含む融合タンパク質をデザインし，その融合タンパク質を用いた黄銅鉱微粒子の凝集を検討した。
【方法】 黄銅鉱結合ペプチド，疎水性タンパク質，およびプロテアーゼによって切断可能な親水性タンパク質からなる融合タンパク質を大腸菌により作製した。この融合タンパク質は黄銅鉱に結合し，プロテアーゼにより親水部位を切り離すことで疎水性部位が露出し，疎水性相互作用により黄銅鉱微粒子の凝集体を形成することが可能である。融合タンパク質を用いて黄銅鉱とシリカの微粒子の凝集実験を行い，明視野顕微鏡観察によりそれぞれの凝集体を観察した。
【結果】 融合タンパク質を入れないコントロール系では，黄銅鉱微粒子が水溶
液中で安定に分散していたのに対し，融合タンパク質添加系では速やかに微粒子が沈降する様子が観察された。沈降したサンプルの顕微鏡観察により，10〜
50µm の黄銅鉱凝集体の形成が確認された。また実際の選鉱ではシリカが多く混在しているが，シリカ微粒子は融合タンパク質によって凝集せず，黄銅鉱とシリカを混在した系でも黄銅鉱のみ凝集が確認され，選択的凝集が可能である
ことが示された。

【目的】ポリエチレンテレフタラート（PET）は，ポリエステル系プラスチックの 1 種で，ペットボトルや玉子パックなどに広く利用されている。しかし分解が難しいことから環境に流出しやすく，海洋汚染の大きな原因にもなっている。
これを背景に PET 分解法が多角的に研究されており，高活性な PET 分解酵素
（Cut190）も報告されている。その実用化を目指し，我々は好熱菌（Geobacillus
thermodenitrificans K1041）を宿主とした Cut190 の大量生産に取り組んでいる。
予備実験の結果から，本株はオカラを培地基材として生育できることが分かった。そこで本研究では，オカラ培養の最適化とオカラ培地を用いた Cut190 生産を検討した。
【実験と結果】まず蛍光タンパク質をモデルとして，その生産に適したオカラ培地を検討したところ，オカラ懸濁液に終濃度 10 mM のリン酸ナトリウム（pH7.5）と 0.4 g/L の硫酸マグネシウムを添加するだけで，蛍光タンパク質が良好に生産された。オカラ濃度を増やすに従い蛍光強度は増加したが，粘度の増加によって振盪が難しくなったため，10%を基本的なオカラ濃度とした。その生産量は，LB 培地で培養した場合と，ほぼ同等だった。続いてオカラ培地を用いた Cut190 生産を試みた。Cut190 は N-末端に推定分泌シグナルを含むが，従来はシグナルを含まない Cut190 が研究対象にされてきた。そこで分泌シグナルを含めた状態で産生させると， K1041 株から分泌生産された。発現産物は，ア
クリルアミドゲル電気泳動では検出できたが，培養液中の Cut190 活性は全く検出できなかった。培地の夾雑物が原因と考え，IMAC 法で Cut190 を精製した。
精製用のヒスチジンタグは C-末端側に融合させた。精製された場合は，明瞭なCut190 活性が検出された。現在，Cut190 活性への影響の少ない培地成分を検討している。本研究は，（公財）前川報恩会の助成を受けて行った。

Design and functional evaluation of multifunctional proteins for selective
aggregation of metal microparticles

Production of recombinant proteins using soy pulps as medium substrates○Sayaka Imamura, Kazunori Nakashima, Shunpei Sugahara, Yusuke Ishiwata,
Chikara Takano, Satoru Kawasaki(Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.)

Key words

mineral processing, aggregation, binding, metal○Sota Yamaguchi1, Kosuke Koyama1, Takashi Ohshiro2,3, Hirokazu Suzuki2,3(1 Dept. Eng., Grad. Sch. Sust. Sci., Tottori Univ., 2 Fac. Eng., Tottori Univ., 3 GSC,
Tottori Univ.)

Key words

soy pulp, Geobacillus, thermophile, cutinase

91

1Cp09

機械学習を用いた酵素機能予測モデルによる新規
PETase の発見○水島 良太 1,2, 鈴木 直也 2, 逸見 明央 2, 島田 幸輝 1,
神谷 幸太郎 1, 藤島 皓介 2
（1 SyntheticGestalt, 2 東工大）
r.mizushima@syntheticgestalt.com, fuji@elsi.jp

1Cp11
学

麹菌由来界面活性タンパク質 hydrophobin RolA 自己組
織化における N 末端正電荷残基の寄与○阿部 菜月 1, 高橋 尚央 1, 寺内 裕貴 2, 田中 拓未 3, 吉見 啓 4,
藪 浩 5,6, 阿部 敬悦 1
（1 東北大院・農, 2 山口大・中高温研, 3 阪大院・工, 4 京大院・地球環学, 5 東北大・WPI-AIMR, 6 東北大・多元研）
keietsu.abe.b5@tohoku.ac.jp

The development of high-activity, cost-effective and durable PETase (Polyethylene
Terephthalate (PET) hydrolase) for PET recycling has attracted much attention inrecent years as potential enablers for a more sustainable society. To discover anddesign such PETase, we have utilized machine learning (ML) to predict enzyme
functions from only the amino acid sequence information.
We trained the ML model by the embeddings converted from amino acid sequences ofthe enzymes with class labels of the enzyme functions. Training dataset included 42
positive PETase sequence curated from research articles on PETase. The model outputs
a vector, of which components represent the predicted probabilities of enzyme function
classes.
By using this model, We inferred the enzyme functions of the whole TrEMBL database(~0.23 billion records). The candidate PETase was determined by the class indicating
max probability score. The final candidates were selected based on the sequence
identity to known PETases. We carried out catalytic activity assays by quantifying
catalyzed products ( MHET + TPA ) with UPLC on multiple substrates (BHET,
amorphous PET film and crystalline PET powder) under various pH and temperature
conditions to explore substrate specificities of the predicted candidates. As aconsequence, we have discovered novel PETases with less than 75% identities to any
known PETases with reduced experimental burden compared to traditional methods.

【背景】麹菌 Aspergillus oryzae が産生する界面活性タンパク質 hydrophobin RolA
は、ポリエステル等の高分子基質に吸着し、静電的相互作用によりエステラー
ゼ CutL1 をリクルートすることで基質分解を促進する(1)。また、RolA は界面で自己組織化して棒状多量体構造 rodlet を形成するが、高分子分解促進機構とRolA が界面で形成する構造の関係は不明である。先行研究において、荷電性残基の集中する RolA N 末端側の正電荷残基を一部置換した三重変異体(H32S/
K34S/K46S)を用いて rodlet 伸長観察を行ったところ、rodlet の伸長速度が増大したことから、RolA の自己組織化にも静電的相互作用が影響する可能性が示唆された(2)。本研究では、自己組織化に関与する正電荷残基の詳細を明らかにするため、単変異体(H32S, K34S)を用いて自己組織化への影響を解析した。
【方法・結果】RolA 溶液の液滴を作成し、湿潤環境で任意の時間静置して液滴表面(気液界面)での RolA の自己組織化を促した。自己組織化膜を SiO2 基板に転写し、原子間力顕微鏡で観察した。各経過時間での rodlet 長を WT と変異体で比較し、変異導入が rodlet 形成に及ぼす影響を解析した。rodlet の伸長は、界面の空間に余裕があり伸長速度が速い 1st phase、界面が飽和し伸長速度が緩や
かな 2nd phase に分けられた。WT と K34S は 45 min 付近で 2nd phase に至ったのに対し、H32S は 120 min 付近で 2nd phase に至り、界面の飽和までにより長い時間を要した。また、1st phase において H32S, K34S 共に観察視野内の rodlet
が WT と比較して疎に分布していた。単変異体の場合 rodlet 形成が抑制されたことから、N 末端側領域の正電荷量が単純に rodlet 形成に影響するのではない
ことが示唆された。
(1) Toru Takahashi et al. (2015) Molecular Microbiology, 96, 14-27(2) Nao Takahashi et al. (2023) Abstract from ECFG16, 521-522

Machine learning-based enzyme function classifier enables discovery ofnovel PETases

Contribution of N-terminal positively charged residues to the self-assemblyof hydrophobin RolA from Aspergillus oryzae○Ryota Mizushima1,2, Naoya Suzuki2, Akihiro Hemmi2, Kouki Shimada1,
Kotaro Kamiya1, Kosuke Fujishima2(1 SyntheticGestalt KK, 2 Tokyo Tech)

Key words

PET, protein engineering

1Cp10

タンパク質超分子カルボキシソームの外殻タンパク質
CcmO の生化学的特性解析

学○大久保 詠一郎 1, 杉山 由花 1, 大畠 昌也 1, 中村 隆太郎 1,
松村 洋寿 1, 野口 恵一 2, 養王田 正文 2, 堂前 直 3, 尾高 雅文 1
（1 秋田大院・理工, 2 農工大院・工, 3 理研・環境資源）
modaka@gipc.akita-u.ac.jp○Natsuki Abe1, Nao Takahashi1, Yuki Terauchi2, Takumi Tanaka3, Akira Yoshimi4,
Hiroshi Yabu5,6, Keietsu Abe1
(1 Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ., 2 RCTMR, Yamaguchi Univ., 3 Grad. Sch.
Eng., Osaka Univ., 4 Grad. Sch. Glob. Environ. Stud., Kyoto Univ., 5 WPI-AIMR,
Tohoku Univ., 6 IMRAM, Tohoku Univ.)
Key words
Aspergillus oryzae, protein aggregation, protein interaction,hydrophobin

1Cp12

麹菌由来ハイドロフォビン RolA の自己組織化分子メカ
ニズム解析○髙橋 尚央 1, 寺内 裕貴 2, 田中 拓未 3, 吉見 啓 4, 藪 浩 5,6,
阿部 敬悦 1
（1 東北大院・農, 2 山口大・中高温研, 3 阪大院・工, 4 京大院・農, 5 東北大・WPI-AIMR, 6 東北大・多元研）
keietsu.abe.b5@tohoku.ac.jp

カルボキシソームはシアノバクテリアが持つ直径 150 nm の構造体であり、1000
分子もの RuBisCO を内包することで炭素固定効率を高めている。外殻は、最大7 種類の 5 または 6 角形の外殻タンパク質サブユニットが自己集合して形成されると考えられている。上記の特性から、より多くのゲストタンパク質を集積可能な新規ナノ材料開発に有用である。しかし、組換え体として発現させた外殻タンパク質間に明確な相互作用が確認できないため、超分子構造の構築原理は不明であり、本分子の応用には至っていない。我々はこれまでに、外殻タン
パク質 CcmO が外殻成分の中で唯一、単位構造以上の集合体を形成することを明らかにした。本研究では、外殻形成に重要であると考えられる外殻成分 CcmOの機能解明を目的とした。
CcmO の集合能に関与する因子として、PRPX motif および C 末端テールを同定した。前者の変異体として、Arg85 及び Arg190 を Ala に置換した二重変異体
CcmODM を、後者の変異体として、テールを削除した CcmO∆C およびテール上流にトロンビン認識配列を導入した CcmOTH、CcmODM/TH を作製した。CcmO∆Cを除く全変異体が可溶性に発現したことから、テールが CcmO のフォールディ
ングに重要であると考えられる。以後は、CcmOTH および CcmODM/TH を用い、全長の CcmO からテールを切断することによりテールの影響を評価した。SECHPLC 解析の結果、CcmODM の保持時間が分子質量 65 kDa の六量体を形成す
る外殻主成分 CcmK2 と同程度であったことから、CcmO は CcmK2 と同等の分子サイズである 6 角形の三量体構造をとる可能性が示唆された。本発表では、
テール変異体も含めた最新の研究成果について報告する。

【背景】糸状菌は陸圏で高い固体高分子分解能を発揮し、自然界の物質循環に寄与する。糸状菌が陸圏に適応するため、糸状菌の気中菌糸等の細胞壁表面はハ
イドロフォビン(HP)と呼ばれる両親媒性タンパク質で覆われて疎水化されている。HP の中には細胞壁表面などの親水-疎水界面で自己組織化して、アミロイ
ド様多量体構造(rodlet)を形成するものが存在する。HP はモノマー状態よりも
rodlet 状態で、固体表面をより疎水化させるため、HP の自己組織化は生物学的に重要であると考えられる。しかし、HP の界面特異的な自己組織化の制御機
構はほとんど不明であるため、自己組織化の生物学的意義を解明するには、まずその分子機構を明らかにする必要がある。そこで我々は、麹菌由来の HP である RolA の自己組織化について、速度論的解析を通じてその分子機構を検討した。
【方法・結果】精製 RolA を用いて Thioflavin T(ThT) assay を行った。ThT は rodletに結合すると強い蛍光を発するため、ThT の蛍光を測定することで rodlet 形成を確認できる。96 穴プレート内で RolA と ThT を混合、攪拌して RolA の自己組織化を促したときの蛍光強度を経時測定することで、経時的に自己組織化進
行度合いを評価した。得られた反応曲線をアミロイドタンパク質研究で開発された速度論モデルを用いて解析を行ったところ、RolA は核形成が生じた後にrodlet 伸長が起こると予測された。また、RolA の核形成は気液界面(親水-疎水界面)がない液中では生じなかったのに対し、rodlet 伸長は液中でも生じた。自
己組織化の始まりである核形成段階が進行するには、親水-疎水界面が必須であることが示唆された。この核形成段階の制御により、RolA は細胞内等の親水環
境では自己組織化せず、気中菌糸表面などの親水-疎水界面でのみ自己組織化するという、界面特異的な自己組織化を実現していると考えられる。

Elucidation of the biochemical properties of the carboxysome shell protein
CcmO

Molecular mechanism of the self-assembly of hydrophobin RolA from○Okubo Eiichiro , Sugiyama Yuka , Ohata Masaya , Nakamura Ryutaro ,Matsumura Hirotoshi1, Noguchi Keiichi2, Yohda Masafaumi2, Dohmae Naoshi3,
Odaka Masafumi1(1 Grad. Sch. Eng., Sci., Akita Univ., 2 Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.,
3
CSRS, RIKENS)
Key words
aggregation, bioreactor, drug delivery system
1

1

1

1

Aspergillus oryzae○Nao Takahashi1, Yuki Terauchi2, Takumi Tanaka3, Akira Yoshimi4,
Hiroshi Yabu5,6, Keietsu Abe1
(1 Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ., 2 RCTMR, Yamaguchi Univ., 3 Grad. Sch.
Eng., Osaka Univ., 4 Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 5 WPI-AIMR, Tohoku Univ.,
6
IMRAM, Tohoku Univ.)
Key words
Aspergillus oryzae, protein interaction, protein aggregation, selfassembly

92

1Cp13

原子間力顕微鏡を用いた三量体接着タンパク質 AtaA の1 分子強靭性発現メカニズム解明

1Cp15

好熱好酸性アーキア由来の分子シャペロニン構成サブユ
ニットの安定性の検証○田口 航暉 1, 魚住 奎太 1, 生田 宗一郎 1,2, 藤原 伸介 1,2（1 関西学院大院・理工, 2 関西学院大学・生命環境）
fujiwara-s@kwansei.ac.jp○加藤 周, 笹原 純, 吉本 将悟, 堀 克敏
（名大院・工）khori@chembio.nagoya-u.ac.jp【背景・目的】Acinetobacter sp. Tol 5 は細胞表層の三量体接着タンパク質 AtaAを介して様々な物質表面に対して接着する。AtaA はポリペプチド鎖がホモ三量体を形成した長さ 250 nm のファイバー状タンパク質で、数十のドメインが反復・混在した構造を持つ。その中でも、Chead と Cstalk から構成されている Cterminal passenger domain （CPSD） はポリペプチド鎖が互いに絡み合った複雑な構造を形成することが結晶構造から明らかになっており、AtaA ファイバーの強靭性に関わることが示唆されている。しかしながら、CPSD に力が加わった際に実際にどのような力学応答を示すかは不明である。そこで本研究では、原子間力顕微鏡 （AFM） を用いることで CPSD の強靭性を 1 分子解析することを目指した。
【方法・結果】AFM 測定のために N 末端にシステイン、C 末端に SpyTag を融合した測定タンパク質を大腸菌で発現・精製した。この測定タンパク質を AuS 結合を介して金基板に固定、SpyTag-SpyCatcher 結合を介して AFM カンチレ
バーに架橋した後、カンチレバーを引き上げることでタンパク質をアンフォー
ルドさせるのに必要な力を測定した。この 1 分子力学特性解析により、Cheadに非常に強靭性の高い部位が存在することが明らかになった。続いて、Chead
内で複数の水素結合を形成し Chead の強靭性に関与することが示唆されている
headCap のアミノ酸残基をアラニンに点変異した変異体を構築し、同様の方法
で 1 分子力学特性解析を行った。変異体は力学強度が大幅に低下したことから、
headCap が Chead の強靭性に関与することが明らかになった。

分子シャペロニンは細胞内のタンパク質が凝集するのを防ぎ、正常なフォール
ディングを促す。好熱好酸性アーキア Sulfolobus acidocaldarius は 3 つの分子シャ
ペロニンサブユニットを有している(α、β、γ サブユニット)。これら 3 つのサブユニット構成比は温度依存性があり、α、β サブユニットは高温で、γ サブユニットは低温で発現量が増加する。一方でそれぞれのサブユニット分子の高温、低温環境での安定性は不明である。本研究では β、γ サブユニットを精製し、タンパク質としての安定性の比較検証を行い、好熱菌の分子シャペロニンの安定化機構を解明することを目的とした。
二次構造における安定性の検証を行うため、両サブユニットを塩酸グアニジン
存在下で変性させた。円偏光二色性（CD）スペクトル測定を行い、222 nm におけるモル楕円率を比較することでタンパク質の変性を追跡した。この滴定デー
タを元に両サブユニットの熱力学パラメーターを、ギブスホルムヘルツの式に従ってフィッティングにより求めた。比較すると β サブユニットの低温側 Tm
が氷点よりも高いところで存在し、氷温でも不安定なことが示唆された。一方で γ サブユニットの熱安定性は β サブユニットよりも低いが、低温では安定であることが示された。
両サブユニットの四次構造形成における温度の影響を検討するため、それぞれを完全に変性させた。変性分子を希釈法により 30 ℃ 及び 70 ℃ でリフォール
ディングさせ、ゲルろ過クロマトグラフィーで四次構造を分析し温度の構造形成に与える影響を比較した。β サブユニットは 70 ℃ではオリゴマーを形成したが、30 ℃でその割合は減少した。また γ サブユニットは 70 ℃よりも 30 ℃の方がオリゴマーの形成率が高かった。それぞれのサブユニットが構造形成における温度依存性で異なる挙動を示した点は興味深い。

Single-molecule toughness analysis of the trimeric adhesive protein AtaA
using atomic force microscopy

Verification of stability of multiple chaperonin subunits fromthermoachidophilic archaeon○Amane Kato, Jun Sasahara, Shogo Yoshimoto, Katsutoshi Hori
(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)○Kohki Taguchi1, Keita Uozumi1, Soichiro Ikuta1,2, Shinsuke Fujiwara1,2(1 Grad. Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ., 2 Sch. Biological. Environmental.
Sci., Kwansei Gakuin Univ.)

Key words

Acinetobacter , AFM, Single-molecule, stability

Key words

chaperonin, hyperthermophilic archaeon

1Cp14

アルキル鎖長が異なる脂質修飾タンパク質の脂質二分子
膜上での動態

1Cp16

繊維状タンパク質の両末端連結反応を基盤とした人工繊維の形成○内田 和希 1, 若林 里衣 1, 後藤 雅宏 1,2, 下川 直史 3, 髙木 昌宏 3,
神谷 典穂 1,2
（1 九大院・工, 2 九大・未来化セ, 3 北陸先端大・マテリアル）
kamiya.noriho.367@m.kyushu-u.ac.jp○長谷 彩沙 1, 南畑 孝介 1, 石川 聖人 3, 吉本 将悟 4, 堀 克敏 4,
神谷 典穂 1,2
（1 九大院・工, 2 九大・未来化セ, 3 長浜バイオ大・バイオ, 4 名大院・工）kamiya.noriho.367@m.kyushu-u.ac.jp【目的】
タンパク質の脂質修飾はタンパク質の細胞膜親和性を向上させるだけでなく、様々なシグナル伝達に関与する生理機構である。特にパルミチン酸 (C16) が修飾されたタンパク質は、細胞膜上の相分離ドメイン (ラフト) への局在や細胞質-細胞膜間の小胞輸送を通して、細胞内外の信号伝達を調節する。本研究では、タンパク質へ修飾する脂質のアルキル鎖長が脂質膜上での動態に与える影響の解明を試みた。
【方法】
酵素触媒架橋反応を用いて、鎖長の異なる飽和脂肪酸により修飾された EGFPlipid (C16, C18, C20, C22) を調製した。各 EGFP-lipid を、相分離構造を有する蛍光標識人工脂質二分子膜 (GUV) ([DOPC]：[DPPC]：[Cholesterol] = 4:4:2) と、固体支持膜 (SLB) ([DPPC]:[Cholesterol] = 6:4) にアンカリングし、共焦点レーザー
顕微鏡を用いてドメイン局在の確認と蛍光退色回復法による拡散評価をそれぞれ行った。また、Concanavalin A による Jurkat 細胞の活性化に伴うラフトの内在化を利用して、EGFP-lipid の細胞内移行を観察した。
【結果と考察】GUV を用いた検討において、全ての EGFP-lipid は脂質間相互作用により脂質膜上のラフトモデル相に局在化した。SLB を用いた検討からは、脂質膜上にアンカリングした EGFP-lipid は二次元拡散しており、アルキル鎖の長鎖化に伴い
EGFP-lipid の拡散速度が低下することが確認された。一方、細胞を用いた検討
では、EGFP-lipid の細胞内への内在化の割合が C18 と C20 を境に大きく低下した。以上のことから、アルキル鎖が長い分子ほど脂質膜中で分子間の疎水性相互作用が増し、細胞内移行に伴う膜小胞の形成過程においても、脂質膜中での分子間相互作用が大きく寄与することが示唆された。
【謝辞】本研究は、JSPS 科研費 23KJ1739, JP19H00841, JP23H00247 の助成を受けたものです。

【目的】
近年、枯渇資源に依存しないタンパク質繊維が、循環型社会の実現に貢献する
次世代材料として注目されている。本研究では、繊維状タンパク質を部位特異的に連結させることで、新規タンパク質繊維を得ることを目的とした。繊維状
タンパク質としては、柔軟性と強靭性を兼ね備えた、三量体オートトランスポー
ター接着タンパク質 (TAA) の一種である AtaA の C 末端に存在する Cstalk に注目した。これとタンパク質間の特異的連結に利用される SpyTag (ST)-SpyCatcher(SC) システムを組み合わせることで、Cstalk を主要な構成因子とする繊維形成を試みた結果について報告する。
【方法】
SC が両末端に導入された SC-Cstalk-SC と、ST が両末端に導入された連結リン
カー (ST-linker-ST) を調製し、これらが繊維形成する条件について検討した。
Cstalk の連結反応は、SC-Cstalk-SC (10 µM) に対して ST-linker-ST (10, 20 or 30µM) を 25℃で混合し、一定時間後にサンプルを採取し、SDS-PAGE にて連結反応の進行を確認した。
【結果と考察】連結反応の経時変化を追跡した結果、反応 3 時間後から Cstalk の連結が確認された。次に SC-Cstalk-SC と ST-linker-ST の濃度比が連結反応に与える影響について検討した。三量体タンパク質である Cstalk に対し、単量体の ST-linker-STの濃度を上げて連結反応を行ったが、SDS-PAGE による分析では違いを見ることができなかった。一方、反応時の濃縮操作により繊維形成が促進する可能性を示唆する結果が得られたことから、球状タンパク質とは異なる連結条件の設定が必要なことが示唆された。
【謝辞】
本研究は JSPS 科研費 JP21H01727, JP23H00247 の助成を受けたものです。

Alkyl chain length affects the dynamics of lipid-modified proteins on lipid
bilayers

Artificial protein fiber formation based on site-specific terminal crosslinkage○Kazuki Uchida , Rie Wakabayashi , Masahiro Goto , Naofumi Shimokawa ,Masahiro Takagi3, Noriho Kamiya1,2(1 Grad. Sch. Eng., Kyushu Univ., 2 CFC, Kyushu Univ., 3 Sch. Mater. Sci., JAIST)1

Key words

1

1,2

protein, lipid, enzymatic conjugation, lipid domain

3○Ayasa Nagatani1, Kosuke Minamihata1, Masahito Ishikawa3, Shogo Yoshimoto4,
Katsutoshi Hori4, Noriho Kamiya1,2(1 Grad. Sch. Eng., Kyushu Univ., 2 CFC, Kyushu Univ., 3 Dept. Biosci., NagahamaInst. Bio-Sci. Technol., 4 Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

Key words

protein, protein engineering, fiber, protein conjugate

93

1Dp01

毛包オルガノイドの脱毛症治療薬スクリーニングへの
応用

1Dp03

○景山 達斗 1,2, 福田 淳二 1,2（1 神奈川産総研, 2 横国大院・工）fukuda@ynu.ac.jp

圧力駆動型生体模倣システムによる微小血管組織の構築○杉浦 慎治, 進 和美
（産総研・細胞分子）
shinji.sugiura@aist.go.jp

ヘアスタイルは人の印象を大きく左右する。そのため、薄毛治療に対する需要は老若男女すべての世代において大きい。化粧品・製薬業界では薄毛の治療薬の開発が進められているが、進行した脱毛症において高い有効性が認められた
薬剤は極めて少ない。一因として、有効な薬剤候補を見出すための in vitro 培養
モデルが確立されていないことが挙げられる。我々は近年、生体外でほぼ 100％の高効率で成熟した毛包を再生できる毛包オルガノイドの作製技術を開発した（T. Kageyama et al. Science Advances, 8, eadd4603, 2022）。再生した毛包を切断してマウス皮膚に移植すると生着し、毛の生え代わりを繰り返すことから、毛髪再生医療への応用も期待できる。本研究では、この毛包オルガノイドが薄毛治
療薬の薬効を簡便かつ正確に評価できる in vitro 培養モデルとして利用できるか検証した。ヒト毛乳頭細胞およびヒト外根鞘細胞を 1：1 で混合した細胞懸濁液をスフェロイド培養プレートに播種し、マトリゲルをゲル化しない程の低濃度（2％程度）で添加した培地で培養することにより、ヒト毛包オルガノイドを作製した。2 種類の細胞は最初に単一の凝集体を形成した後、培養 4 日目には凝集体から毛幹様構造が形成し、培養 10 日目にはその長さは約 1 mm まで伸長した。マトリゲルなしの培養系では毛幹様構造が形成しないことから、低濃度のマトリゲルが毛包への形態形成に重要な役割を果たすことが示唆された。この毛包オルガノイドに脱毛症治療薬の 1 つであるミノキシジルを添加すると、毛幹様構造の伸長速度が有意に増加した。毛幹伸長を観察するのみで薬効を評価できる簡便性は、網羅的なスクリーニングを行う上で圧倒的メリットであり、この要素を兼ね備えた毛包オルガノイドは薄毛治療薬の開発を加速させる invitro 培養モデルとして期待できる。

1. 緒言
微小血管組織を生体外で構築するためにはマイクロ流路の中に形成されたハイ
ドロゲルの中や近傍に血管内皮細胞を培養することで自発的に微小血管組織を構築できることが知られている。一方、形成した微小血管組織にシリンジポン
プやペリスタポンプを用いて培養液を灌流する場合、送液のための強い力で形成途中の血管組織やハイドロゲル自体を破壊してしまう恐れがある。
本研究では、これまでの研究で開発してきた圧力駆動型の生体模倣システム（PD-MPS）を用いて空圧によってハイドロゲルに培養液を浸透させながら培養することで、ハイドロゲル中での血管組織の形成を促進でき、培養液を灌流して培養した結果について報告する。
2. 実験
PD-MPS にハイドロゲルチャンバー（灌流方向の長さ 5.6 mm）を設け、ヒト臍
帯血由来血管内皮細胞（HUVEC）と間葉系幹細胞（MSC）を包埋したフィブ
リンゲルを導入した。フィブリンゲルに対して、2kPa の加圧で培養液を灌流した。血管組織の形成の様子を蛍光デキストラン溶液や蛍光微粒子の懸濁液を送液して確認した。対照として同様の実験を培養液の灌流を行わずに行った。
3. 結果・考察
培養液の加圧灌流を数日間行ったところ、フィブリンゲル内に内包された
HUVEC が自発的に血管組織を構築する様子が確認された。また、血管組織の形成に伴い、培養液の流量の増加が確認された。一方、同様の構成で培養液を灌流せず、静置培養した場合は血管組織の形成は確認されなかった。
フィブリンゲルに培養液を加圧灌流することで、培地成分をフィブリンゲルに浸透させることが可能となり、血管組織の形成が促進されたと考えられる。また、本研究で採用したハイドロゲルチャンバーは、従来の報告より大きく、加圧灌流によって、より大きな血管組織の形成が可能となることが示唆された。

Application of hair follicle organoids in drug screening

Construction of microvascular tissue by pressure-driven microphysiologicalsystem○Tatsuto Kageyama1,2, Junji Fukuda1,2(1 Kanagawa Inst. Ind. Sci. Technol. (KISTEC), 2 Grad. Sch. Eng., Yokohama Natl.
Univ.)○Shinji Sugiura, Kazumi Shin(CMBRI, AIST)

Key words

tissue engineering, hair follicle organoid, drug screening

Key words
microphysiological systems, microfluidic device, tissue engineering,organ-on-a-chip

1Dp02

細胞自己凝集化技術を用いたファイバー状毛細血管モデ
ルの作製

1Dp04

学

毛髪再生医療のためのヒト毛乳頭細胞の低酸素刺激培養○橋本 真悟 1, 杉山 晶彦 2, 木股 敬裕 1, 岩井 良輔 3
（1 岡山大院・医歯薬, 2 岡山理大・獣医, 3 岡山理大・フロンティ
ア理工学研）
iwai.ous@gmail.com○松元 琴音 1, 景山 達斗 1,2,3, SEO JIEUN 1,2, 福田 淳二 1,2（1 横国大院・工, 2 神奈川県産業技術総合研, 3 JST・さきがけ）
fukuda@ynu.ac.jp【背景と目的】毛細血管の恒常性維持に関わる様々な役割を相補的に担う内皮細胞と周皮細胞の両方を含む毛細血管モデルは、基礎研究や医薬品評価などへの応用が期待されるが、これまでには、新生と消失を数時間で繰り返す直径数十μm 程度の細く脆弱な構造体しか作製されていない。本研究では、形状とサイズ制御が可能な我々独自の細胞の自己凝集化技術（CAT）を用いることで、内皮細胞層が周皮細胞で裏打ちされた構造が 1 週間以上維持される直径数百 μmの太いファイバー状毛細血管モデルを作製したので報告する。
【材料と方法】ダンベル形状（長辺幅 16 mm）に切り抜いたシリコーン板を培
養皿底面に貼付して作製した溝空間を培養部屋とし、その長辺両端から 2 mm
内側の短辺中央部に直径 2 mm のシリコーン円板を細胞凝集制御のための支持材として貼付した。CAT 用のポリマー水溶液を培養部屋の底面に塗布した後、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）に周皮細胞のモデルとしてヒト間葉系幹細胞（MSC）を 20%混合した細胞懸濁液を播種し培養した。
【結果】細胞は培養部屋内に隙間のない単層を形成した後、培養部屋辺縁から中心に向かって剥離すると同時に凝集化を生じ、2 点の支持材の間に直径約 0.5mm のファイバー状細胞凝集塊を播種 1 日後に形成した。興味深いことに、凝集塊は少なくとも 1 週間の培養の間に外表面が HUVEC の単層で被覆化され、その直下には MSC が裏打ちするように接着して存在する毛細血管様の内皮-周
皮裏打ち構造へと自己組織化した。ここで、このような構造は、凝集塊当たりの細胞数によって一定数より少ないと部分的に、多いと全体に形成することが分かった。一方、内皮-周皮裏打ち構造は数週間の間維持され、血管毒性試薬を添加すると、HUVEC 層のみが脱落するという内皮細胞と周皮細胞の薬剤反応性の違いを観察することも可能であった。

毛乳頭細胞は、毛包成長を制御している指令細胞であり、様々なシグナルを送り上皮系細胞の毛幹への分化を調節している。そのため、脱毛症の治療を目的として、毛乳頭細胞を脱毛部に移植する臨床試験が実施されている。しかしながら、毛乳頭細胞の発毛関連機能は生体外培養系において急速に消失することが知られており、臨床試験の成績が期待したほど高くない要因の１つである可能性がある。一方、毛乳頭細胞の発毛関連遺伝子が低酸素誘導因子（HIF-1a）の下流にあること、脱毛症患者では正常なヒトと比較して毛乳頭における HIF-1aの発現が低下していることが知られている。そこで本研究では、HIF-1a の活性化により、毛乳頭細胞の機能維持培養法が確立できるとの仮説を立て、検証した。
HIF-1a の発現向上に本研究では脂肪酸を用いた。脂肪酸は、エネルギー代謝基質であるが、例えばオレイン酸は HIF-1a/脂肪酸結合タンパク質 5（FABP5）経路を活性化するため、HIF-1a 活性化剤として利用されている。研究用の低分子化合物を用いた HIF-1a の発現向上も過去の研究において実施してきたが、本研究では生体内に存在する脂肪酸を利用することした。具体的には、毛乳頭細胞の培養培地に脂肪酸混合物（lipid mixture）を添加し、qPCR による毛髪再生関連遺伝子（LEF1、VCAN、ALP）を評価した。その結果、評価したすべての毛髪関連遺伝子の発現レベルが有意に増加した（添加濃度 2％、暴露時間 6 時間）。
今後、いくつかの遺伝子だけではなく、動物実験により毛乳頭細胞の発毛活性を評価する必要があるが、HIF-1a の発現を脂肪酸添加により調節するアプロー
チは、安全かつ簡便に毛髪再生医療のための毛乳頭細胞を調製する方法となりうるものと考えられる。

Preparation of fiber-shaped capillary vessel model by using cell selfaggregation techniqueHypoxia stimulated culture of human dermal papilla cells for hair
regenerative medicine○Shingo Hashimoto , Akihiko Sugiyama , Yoshihiro Kimata , Ryosuke Iwai
(1 Grad. Sch. Med. Dent. Pharm, Sci., Okayama Univ., 2 Dept. Veterinary Med.,Okayama Univ. Sci., 3 Inst. Front. Sci. Tech., Okayama Univ. Sci.)
1

Key words
model

2

1

3

tissue engineering, 3D culture, cell self-aggregation, capillary vessel○Kotone Matsumoto1, Tatsuto Kageyama1,2,3, Jieun Seo1,2, Junji Fukuda1,2(1 Grad. Sch. Eng., Yokohama Natl. Univ., 2 Kanagawa Institute of Industrial Scienceand Technology, 3 PRESTO, JST)Key words

hair regeneration, dermal papilla cell

94

1Dp05

三次元細胞培養における非破壊かつ迅速な逸脱検知技術の開発○田中 健二郎 1, 河崎 美哉 1, 中野 慧悟 1, 林 咲希 1, 永井 美希 1,
五十嵐 陽子 2, 菅沼 寛 2, 加藤 竜司 1,3（1 名大院・創薬, 2 住友電気工業, 3 名大・ナノライフシステム研
究所）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp

1Dp07
学

バイオ人工膵臓のためのリン脂質ポリマー修飾アルギン酸ゲルの開発○二ツ橋 龍, 金子 真大, 井藤 彰
（名大院・工）ito.akira@material.nagoya-u.ac.jp【背景・目的】 3 次元培養された細胞は、平面培養された細胞よりも高い生体模
倣活性を有することが知られる。細胞凝集塊として培養した細胞が、細胞懸濁液の投与よりも生着率の高いことや、薬剤応答・代謝活性などの高さから創薬
開発の in vitro モデルとして有効なことが、数多くの研究で報告されつつある。
このため 3 次元的に培養される細胞や組織の需要は飛躍的に高まっている。しかし一方で、平面培養よりも 3 次元培養は細胞への栄養・酸素の供給が難しい
ことから、目的の機能性を達成する細胞・組織の製造を安定に行うことが難し
い側面がある。
我々の研究グループは、このような 3 次元細胞・組織の非破壊的な品質評価技術として、生体透過性に優れた近赤外光を利用したイメージングと情報解析を組み合わせた品質評価技術の構築を行ってきた。本研究ではこの近赤外光イメー
ジングのインプロセスモニタリング技術としての有効性について検証した結果を報告する。
【方法】3 次元培養中の細胞凝集塊に対して灌流培養を行い、培養中の変化を近赤外光イメージングによって経時的に撮影し、得られた画像の特徴量解析を行った。近赤外光画像の解析では、多波長・複数の形態特徴量を抽出し、機械学習を用いて最適な特徴量の組合せを用いて実験的に得られた凝集塊品質の予測性能を検証した。
【結果】灌流培養環境下で生じるわずかな環境変化が、細胞凝集塊の増殖や生存率に大きく影響を与えることが確認され、その変化は近赤外光イメージングから得られる画像特徴量によって高感度に検出できることが確認された。即ち、
近赤外光イメージングは、3 次元培養組織などの観察の難しい立体的な細胞集塊の安定培養プロセス開発のためのインプロセスモニタリング技術として有効性が高いと言える。

【緒言】
糖尿病の根治療法として膵島移植があるが、ドナー不足や免疫抑制剤が必要であることが問題となっている。こうした状況の中、移植治療の形態としてバイオ人工膵臓の開発が行われている。バイオ人工膵臓の材料には、移植細胞の生存に必要なものは透過させ、異物反応を引き起こすものは透過させない半透膜やハイドロゲルが利用される。従来利用されてきた材料としてアルギン酸ゲルが挙げられるが、崩壊しやすく、移植後に炎症が起きることが課題である。本
研究では、光架橋と高い生体親和性を有する 2-メタクリロイルオキシエチルホ
スホリルコリン（MPC）ポリマーを利用することで、崩壊しにくく炎症を誘起しにくいアルギン酸ゲルの開発を試みた。
【実験方法と結果】
アルギン酸ナトリウムとメタクリル酸 2-アミノエチル塩酸塩を混合し、アルギン酸のカルボキシ基にメタクリル基が修飾されたアルギン酸（MA Alg）を合成した。MA Alg 水溶液を、塩化カルシウムと MPC および光開始剤である
Irgacure1173 を含有した水溶液に滴下し pMPC Alg ビーズを作製した。その後、
365 nm の UV を 15 分間照射することで光架橋を行った。作製したビーズを凍結乾燥し FT-IR 測定により表面構造を分析したところ、MPC 由来のピークが認められたことから、ビーズ表面に MP Ｃポリマー層が構築されたことを示している。次いで、膵島 β 細胞株である MIN6 細胞で作製したスフェロイドをビーズに包埋することでバイオ人工膵臓を作製した。ストレプトゾシンで糖尿病を誘導したマウスの腹腔内へビーズを移植し、血糖値推移を測定した。pMPC Alg
を用いて作製したビーズを移植したマウスでは 1 カ月正常血糖値を維持することができた個体が確認された。

Development of non-destructive and rapid deviation detection techniques inthree-dimensional cell culture

Development of phospholipid polymer-modified alginate gels for bioartificial
pancreas○Kenjiro Tanaka1, Miya Kawasaki1, Keigo Nakano1, Saki Hayashi1, Miki Nagai1,
Yoko Igarashi2, Hiroshi Suganuma2, Ryuji Kato1,3(1 Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2 Sumitomo Electric Industries, Ltd.,
3
Institue of Nano-Life-Systems, Nagoya Univ.)

Key words

1Dp06
学○Ryo Futatsubashi, Masahiro Kaneko, Akira Ito(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

spheroid, inprocess-monitoring, near infrared light, image analysis

Key words

insulin secretion, bioartificial pancreas, alginate

液体肝臓の酵素活性改善に向けた検討

1Dp08

体内組織工学プロセスによる新しい自己組織人工心臓弁の開発○岸谷 有倭, 小島 伸彦（横市大院・生命ナノシステム）
nobuhiko@yokohama-cu.ac.jp○佐藤 康史, 寺澤 武, 井上 雄介, 武輪 能明（旭川医大・先進医工学研究セ）
y-sato@asahikawa-med.ac.jp

フェニルケトン尿症(PKU)は、主に肝臓に発現するフェニルアラニン水酸化酵
素(PAH)の機能欠損によって生じる先天性代謝異常症である。PKU 患者はフェニルアラニン（Phe）血中濃度を低く抑える必要があるため、肉や乳製品をほとんど摂取できない。肝臓・肝細胞移植は理論上有効だが、免疫抑制剤を生涯使用するリスクと食事制限とを天秤にかけると実施されない。我々は免疫抑制剤を必要としない肝細胞移植治療として、赤血球の内部に肝代謝酵素を封入した「液体肝臓」を考案してきた。液体肝臓は免疫抑制剤を用いなくとも血液型を合わせるだけで投与でき、血液中の基質代謝が期待できる。これまでに in vitro で組み替え PAH が Phe を代謝できることを報告したが、健康なレベルよりも高濃度で定常状態となり、その活性は十分とはいえなかった。そこで本研究では、
予期せぬ定常状態の原因解明することを目的とした。
PAH の失活、生成物によるフィードバック阻害、反応に必要な物質の枯渇、基質濃度低下による PAH のアロステリック制御の 4 点について検証を行った。
酵素を 37℃でプレインキュベーションしてから補酵素等を加えても Phe は代謝されたため、熱による失活が原因ではなかった。また、生成物であるチロシンを除去するチロシナーゼを反応液に添加したが大きな影響はなく、フィードバッ
ク阻害でもなかった。
次に、補酵素の濃度を変化させたところ、標準組成よりも高濃度でより多くのPhe を代謝できたが、その影響は限定的だった。カタラーゼや還元剤などの添
加物の濃度を変えても差はみられなかった。PAH の濃度を約 20 倍高めた条件
では、Phe が正常な血中濃度レベルまで低下した。高濃度の PAH では基質濃度が低くなっても高活性な分子構造を維持できているのかもしれない。
今後、新しい組成で赤血球への封入を行い、PKU モデルマウスを用いた実証試
験に取りかかりたい。

心臓弁膜症などで心臓弁が機能不全に陥った場合、機械弁や異種生体弁などの人工心臓弁への置換術が行われるが、抗血栓性や耐久性、成長性などに課題がある。近年、組織工学的手法を用いて、組織再生が起こる人工弁の研究が行われているが、製造コストや耐久性、遠隔期における石灰化などの課題が存在する。
我々は皮下に人工物を留置した際に起こる生体防御反応の「カプセル化反応」
を医療に応用した「生体内組織形成術」を用いて、自己組織由来の人工弁（バイオバルブ）の開発を行っている。バイオバルブは体外での細胞培養操作を必要とせず、皮下に組織作製用の鋳型を埋め込むだけで作製可能であり、患者自身の体内で組織工学のプロセスを完了させることができる。本研究では、バイオバルブの人工弁としての性能評価を行うため、大動物へ移植し、弁機能および組織構造変化の評価を行った。
３ D プリンターを用いて作製したアクリル製のバイオバルブ作製鋳型を成ヤギの皮下に埋入し、２〜３か月後に摘出した。鋳型は結合組織で覆われ、鋳型を抜去することで自己組織のみからなるバイオバルブを得た。バイオバルブは主に線維芽細胞とコラーゲンで構成されていた。生体内における弁機能を評価するため、ヤギの心臓弁位に移植したところ、心拍に応じた弁の開閉が起こり、顕著な逆流や血栓形成、組織の破壊は見られず、3 年以上の観察期間に渡り良好に経過した。組織学的評価において、石灰化は認められず、移植後 1 か月以内に血管内皮細胞が血液接触面を覆っていた。バイオバルブの内部にも徐々に細胞浸潤が起こり、数か月後には弁葉の心室側にエラスチンが産生され、正常の心臓弁と同様の組織構造へ変化することが明らかとなった。
以上より、バイオバルブは移植後に組織再生が起こり、血行動態や耐久性に優れる、有望な人工弁となることが期待される。

A study for improvement of enzyme activity in the liquid liver

Development of Novel Autologous Tissue Engineered Artificial Heart Valves
by in vivo Tissue Engineering Process○Yui Kishitani, Nobuhiko Kojima(Grad. Sch. Nanobiosci., Yokohama City Univ.)

Key words

phenylalanine, phenylketonuria, phenylalanine hydroxylase○Yasushi Sato, Takeshi Terazawa, Yusuke Inoue, Yoshiaki Takewa(Adv. Med. Eng. Center Asahikawa Medical Univ.)

Key words
medicine

artificial heart valve, tissue engineering, artificial organ, regenerative

95

1Dp09
学

細胞自己凝集化技術を用いた造影剤担持型-細胞凝集
ファイバーの開発

1Dp11○滕 魯鵬 1,2, 福島 宗一郎 3,4, 小泉 誠 5, 長谷川 実奈美 4,
岡野 ジェイムス洋尚 4, 大木 隆生 3, 岩井 良輔 2
（1 岡山理大院・理工, 2 岡山理大・フロンティア理工学研, 3 慈恵
医大・外科学講座・血管外科, 4 慈恵医大・総合医科学研セン・
再生医学研, 5 慈恵医大・実験動物研）
iwai@ous.ac.jp

金ナノ粒子を固定化した羊毛由来ケラチン薄膜の作製
森 英樹, 山田 健人, ○原 正之（大阪公大院・理）
hara@omu.ac.jp【背景と目的】再生医療として体内に移植した細胞凝集塊や組織体の位置を、術後に非侵襲的に確認する方法はほとんど開発されていない。我々は、独自に開発した細胞の自己凝集化技術（CAT）において、培養皿上に接着した細胞が自己凝集する前に X 線造影粒子を添加するだけで、造影粒子を担持した細胞凝集塊を得ることに成功し、昨年度の本学会にて報告した。ここで、細胞凝集塊の形をカテーテルへ格納と患部留置に適した、ファイバー状へと制御することができれば、脈管や尿管などの管組織を介した低侵襲な細胞凝集塊の移植と術後の位置確認が可能になると考えた。本研究では、CAT による細胞凝集塊作製において、造影剤を担持したファイバー状の細胞凝集塊を開発することを目的とした。
【材料と方法】シリコーン円板（直径：60 mm）を培養皿の中央部に貼付することで、シリコーン円板と培養皿外壁の間にリング形の培養溝（幅:20 mm）を設けた。CAT 用のポリマー（日産化学（株）との共同開発品）を溝内にコートした後、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を播種し培養皿底面に細胞単層を形成させた
後、タングステンカーバイドやチタンなどの造影粒子を添加して培養した。
【結果と展望】細胞単層に添加した造影粒子は数秒で沈降して細胞単層表面に付着した。続いて約 10 時間培養すると、細胞単層は造影粒子を付着したまま溝の外周部から内側に向かって自己凝集を生じ、リング形の細胞凝集塊がシリコー
ン円板の周囲に巻き付いた。細胞凝集塊は 1 点で切断することで、1 本のファイバーとして形状を維持したままカテーテルの先端から内部に吸引、任意の場
所に突出して留置できるとともに、Ｘ線透視下にて視認できることも確認した。
今後は、このような造影剤担持型-細胞凝集ファイバーの実験動物体内でのＸ線
下視認性と組織再生効果についても検証していきたい。

【目的】羊毛ケラチン蛋白質に導電性を付与できれば、新しい機能性材料となり得る。羊毛ケラチン薄膜（KF）の表面に金ナノ粒子（AuNP）を固定化した複合膜（AuNP-KF）を作製して性質を調べた。
【実験方法】16M guanidine、13M 2-mercaptoethanol を用いて還元的条件で羊毛繊維から抽出したケラチン粗抽出液の透析、圧縮、乾燥処理を経て、直径約1.4cm、厚さ約 60µm のケラチン薄膜（KF ）を作製した。0.03M クエン酸ナト
リウムと、1%(w/v) 塩化金酸の水溶液を用いて還元反応により、金ナノ粒子（AuNP）の懸濁液を調製した。原料の羊毛繊維、ならびに KF を AuNP 懸濁液に浸漬して表面に吸着固定化し、金ナノ粒子固定化ケラチン薄膜（AuNP-KF）を作製した。様々な観察と測定方法により、上記複合膜の性質を詳しく調べた。
【結果】金ナノ粒子懸濁液は明るい赤紫色に呈色するが、羊毛繊維やケラチン薄膜の表面に吸着すると色調が暗くなる。試料を乾燥後は金属光沢を示したが、再度純水に入れると元の色調に戻った。KF への AuNP 吸着量は浸漬時間に依存し、3 時間以上の浸漬で金属光沢を示した。この AuNP-KF を走査型電子顕微鏡（SEM）の観察では膜表面に粒径約 30-40nm の粒子が大量に存在し、粒子は金（Au）を含む事をエネルギー分散型蛍光 X 線分析（EDX）で確認した。全反射フーリエ変換赤外分光（ATR-FTIR）スペクトル測定では、AuNP の吸着前後
で殆ど変化が見られず、蛋白質の 2 次構造は不変と考えた。X 線回析（XRD）の測定結果も、粒子が Au の金属結晶である事を示した。また低抵抗率計による AuNP-KF の電気抵抗率測定の結果、2 週間浸漬させた AuNP-KF で平均 7.84
×10 ４ (Ω・cm)であった。

Development of contrast agent-loaded cell aggregated fibers by using cell
self-aggregation techniquePreparation of the gold nanoparticles-immobilized wool keratin film

○Lupeng Teng , Soichiro Fukushima , Makoto Koizumi ,Minami Hasegawa-Ogawa4, James Hirotaka Okano4, Takao Ohki3, Ryosuke Iwai2(1 Grad. Sci. Tech., Okayama Univ. Sci., 2 Inst. Front. Sci. Tech., Okayama Univ.
Sci., 3 Div. Vasc. Surg., Dept. Surg., The Jikei Univ. Med., 4 Div. Regen. Med., Res.
Ctr. Med. Sci., The Jikei Univ. Med., 5 Lab. Anim. Fac., Res. Ctr. Med. Sci., The
Jikei Univ. Med.)Key words
tissue engineering, mesenchymal stem cell, cell self-aggregation,
contrast agent
1,2

1Dp10
学

3,4

5

Biofabrication of human liver microtissues using
genetically modified hepatoma cells○Silas Habimana, Hiroyuki Kitano, Yoshinori Kawabe,
Masamichi Kamihira(Dept. Chem. Eng., Grad. Sch. Eng., Kyushu Univ.)
kamihira@chem-eng.kyushu-u.ac.jp

Hideki Mori, Kento Yamada, ○Masayuki Hara
(Grad. Sch. Sci., Osaka Metro. Univ.)

Key words

scaffold, cell, protein

1Dp12

放射線架橋ポリビニルアルコールゲル上におけるヒトグ
リオーマ細胞の増殖特性の解析

学○野間 陽太, 森 英樹, 原 正之
（大阪公大院・理）
hara@omu.ac.jp

Current in vitro models of the liver have limitations in accurately replicating humanliver function, emphasizing the need for novel approaches. Here, we established heatinducible hepatocytes (hiHep) from HepG2 cells by introducing BRCA1-associatedprotein-1 (BAP1) in addition to eight liver-enriched transcription factors (LETFs):
HNF-1α, HNF1β, HNF-3β, HNF-4α, HNF-6, C/EBP-α, C/EBP-β, and C/EBP-γ. The
hiHep exhibited active proliferation under standard culture conditions, which may
enable easy and scalable production in large quantities. Heat treatment at 43°C for 30
min induced growth arrest, size increase, and the appearance of double nuclei, featuresoften observed in cultured primary hepatocytes. In both monolayer and spheroid
cultures, hiHep showed enhanced ammonia removal, urea synthesis, albumin secretion,
and CYP3A4 activity. Additionally, we established a 3D spheroid culture method togenerate liver microtissues. The hiHep spheroids were formed using a 24-well ultralow attachment plate, and then cultured within a collagen-based extracellular matrix(ECM). The collagen-cultured spheroids exhibited further improvements in liverfunction and differentiation compared to bare spheroids. By generating inducible
hepatic cells and developing a 3D culture system, this study advances liver modelingtechniques and presents a viable source of functional cells, which can be utilized forcell-based target discovery, drug screening, and potentially as a source of liver function
in bioartificial livers (BALs).

【緒言】
多くの細胞は力学的刺激に応答し、特に基質の弾性率(硬さ)を感知し、メカノ
トランスダクションと称する情報伝達系を通じて、細胞の形状や増殖、硬さを調節している。合成高分子ポリビニルアルコール(PVA)は、高線量の γ 線で照射、架橋させることで生体適合性のある PVA ハイドロゲルを形成することが出来る。PVA 濃度や γ 線の照射線量を変えることでその硬さを調節出来る。本研究では、PVA ゲル上で培養したヒトグリオーマ細胞の接着及び増殖特性を調べる目的で、硬さの異なる PVA ゲル上で T98G 細胞を培養した。
【実験方法】粘弾性の異なる 3 種類の PVA（3.3 ％ /10kGy、5.5％/20kGy、9.0％/
40kGy）ゲルを調製し、レオメーターで動的粘弾性を測定した。また、各々のゲル上にヒト神経膠芽腫由来の T98G を 2.0×105cells/ml の濃度で播種し、7 日間培養した。7 日目には細胞をゲルから剥離させ、血球計算盤を用いて細胞数を測定した。さらに、回収した細胞から総 RNA を抽出し、定量的 RT-PCR 法を用
いて遺伝子発現解析を行った。
【結果】培養中の細胞の様子からはどの条件においても、細胞の形態や大きさに変化が見られなかった。細胞数は、対照の培養皿上に比べて PVA ゲル上では著しく減少したが、各々の PVA ゲル条件間では細胞数に大きな変化は見られなかった。遺伝子発現解析では、対照の培養皿上に比べて PVA ゲル上では、細胞増殖マーカーである MKI67 や TPX2 の発現レベルは半分程度となり、その一方
G1 アレストに関連する CDKN1A の発現量は、著しく上昇していた。培養皿上に比べて軟らかい PVA ゲル上では T98G の増殖率は低下したが、今回作製したゲルの粘弾性の範囲ではその増殖特性は変化しなかった。本来高い増殖性をもつ神経膠芽腫細胞の増殖が PVA ゲル上で著しく低下したことと、ゲルの粘弾性との因果関係に関してはさらに検討する必要がある。

Biofabrication of human liver microtissues using genetically modified
hepatoma cells

Analysis of growth characteristics of human glioma cells on radiationcrosslinked poly (vinyl alcohol) gels

○Silas Habimana, Hiroyuki Kitano, Yoshinori Kawabe, Masamichi Kamihira(Dept. Chem. Eng., Grad. Sch. Eng., Kyushu Univ.)

Key words

hepatocyte, transcriptional regulation, heat shock, biofabrication○Yota Noma, Hideki Mori, Masayuki Hara
(Grad. Sch. Sci., Osaka Metro. Univ.)

Key words

hydrogel, growth, glioma cells

96

1Dp13

細胞選別能を有する機能性微小ハイドロゲルの創製○井元 乃絵 1, 冨永 将大 3, 伊藤 洋一郎 3, 石井 純 3, 近藤 昭彦 3,
神谷 典穂 1,2
（1 九大院・工, 2 九大・未来化セ, 3 神戸大・先端バイオ工研セ）
kamiya.noriho.367@m.kyushu-u.ac.jp

1Dp15

修飾されたペプチドの物理化学的性質が骨芽細胞に与える影響○杉山 亜矢斗 1, 横井 智広 1, 蟹江 慧 1,2, 宇都 甲一郎 3,
荏原 充宏 3, 緒方 藍歌 4, 成田 裕司 4, 田中 健二郎 1, 加藤 竜司 1,5（1 名大院・創薬, 2 近大・工, 3 物質材料研究機構, 4 名大院・医,5
名大・ナノライフシステム研究所）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp【目的】
抗体医薬品は、抗原に対する高い特異性を持つため分子標的薬として広く利用されている。近年新たなモダリティとして、ラクダ科動物が有する重鎖のみからなる抗体の可変領域 (VHH)が次世代抗体として注目されている。VHH は IgG抗体と比較して、分子サイズや生産性の面で優れた特徴を示すことが報告されている。本研究は VHH 分泌発現宿主の選別と回収が可能な微小ハイドロゲル(ハイドロゲルビーズ、HB) の創製を目的とする。即ち、HB に封入された VHH
発現宿主の迅速・高感度分析の実現に向け、酵素反応を利用して調製した抗原
固定化 HB に宿主細胞を封入し、VHH の捕捉及び蛍光修飾抗体による蛍光標識
を行う。
【方法】
HB への宿主細胞封入のための基礎検討として、VHH そのものを用いた HB の
蛍光染色実験を行った。まず、マイクロ流路デバイスによりゲル化成分と抗原を内水相に含む W/O エマルジョンを作製し、37℃で数時間の静置により内水相をゲル化させることで、抗原固定化 HB を作製した。次に外水相から VHH を添加し HB に固定化された抗原に VHH を捕捉させ、VHH に特異的に結合する
蛍光修飾抗体を添加することで、HB の選択的な染色を観察した。
【結果と考察】抗原固定化 HB に VHH を添加したところ、VHH に結合した蛍光修飾抗体由来の蛍光が確認された。また、VHH を標識するための蛍光修飾抗体濃度を調整することで、目的の蛍光を示す陽性集団とコントロール集団を明確に分離可能であることを確認した。これは HB 内固定化抗原の捕捉された VHH に対して十分に蛍光修飾抗体が結合し、明確なシグナルを発したためだと考えられる。さらに、VHH 濃度に依存して HB の蛍光強度が変化したことから、発現量の異なる宿主細胞のスクリーニングが可能であることが示唆された。
【謝辞】本研究は AMED 課題番号 JP21ae0121004 の支援を受けたものです。

【背景・目的】組織工学・再生医療において、細胞が接触する材料の表面機能化は重要な技術である。特に生分解性を持つ体内留置型医療機器では、移植部位における再生促進などの表面機能化は重要である。従来、医療材料の表面機能化は、プラズ
マ処理などの物理化学的な親水化処理や、タンパク質などの動物由来高分子のコーティングなどによって行われてきた。しかし、プラズマ処理は細胞腫に合わせた制御といったカスタマイズ性に限界があり、巨大分子であるタンパク質の利用は製造安定性に課題がある。そこで、我々は、化学合成可能な短鎖ペプ
チドのカスタマイズ性に着目し、表面機能化分子としての有効性を検証してきた。
【方法】
DOPA をリンカー分子に用いて短鎖ペプチドをマルチウェルに固定化するハイ
スループットスクリーニングプラットホームにおいて、配列の違いや組合せに対する骨芽細胞の応答性をハイコンテント画像情報解析によってプロファイリ
ングした。多数の配列解析から見いだされた特徴的なペプチド配列については、
ペプチド表面上での増殖能など細胞応答を詳細に分析した。また、ペプチド被覆表面の物理化学的特性の理解のため、ペプチドのアミノ酸物性指標を用いた多変量解析を行った。
【結果】確立したマルチウェルのペプチドスクリーニングの結果、骨芽細胞の接着・増殖を制御できるペプチド配列とその組合せを複数発見するに至った。また、物理化学的特性解析からは、骨芽細胞が応答するペプチドに共通する物理化学的状態のルールが確認され、ペプチドを用いた材料表面物理化学的特性のチュー
ニングにより、細胞親和性の高い材料表面をデザインできる可能性が示された。

Development of functional micro hydrogel with cell selective ability

Physicochemical properties of immobilized peptide ambience (iPAM) affectosteoblast adhesion○Noe Inomoto1, Masahiro Tominaga3, Yoichiro Ito3, Jun Ishii3, Akihiko Kondo3,
Noriho Kamiya1,2(1 Grad. Sch. Eng., Kyushu Univ., 2 CFC, Kyushu Univ., 3 EGBRC, Kobe Univ.,)○Ayato Sugiyama1, Tomohiro Yokoi1, Kei Kanie1,2, Koichiro Uto3,
Mitsuhiro Ebara3, Aika Oagata4, Yuji Narita4, Kenjiro Tanaka1, Ryuji Kato1,5(1 Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2 Kindai Univ. Fac. Eng., 3 Nat. Inst. Mater.
Sci., 4 Grad. Sch. Med., Nagoya Univ., 5 Inst. Nano-Life-Sys., Nagoya Univ.)

Key words

enzyme reaction, antibody, screening, hydrogel

Key words

peptide, cell morphology, extracellular matrix, laboratory automation

1Dp14

糖鎖発現プロファイルの差が及ぼす細胞接着ペプチドへ
の応答

1Dp16

ヘパリン混合ケラチンフィルムの作製と細胞接着性の評価

学○藤本 瑛代 1, 田中 健二郎 1, 加藤 竜司 1,2（1 名大院・創薬, 2 名大・ナノライフシステム研究所）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp

学○中川 凜久, 森 英樹, 原 正之
（大阪公大院・理）
hara@omu.ac.jp【 背 景 ・ 目 的 】 生 体 内 に お い て 細 胞 は 、 細 胞 外 マ ト リ ク ス （ Extracellularmatrix：ECM）などの細胞外環境と相互作用することで、その活性や挙動が制御される。この相互作用に学び、ECM を構成するタンパク質やペプチド分子などを用いた生体材料表面機能化研究が行われている。
我々の研究グループは、材料表面に機能性を与える方法の一つとしてペプチド
コーティングによって表面の物理化学的特性を制御することで、特定の細胞が好んで接着する材料表面を設計できることを見出し、医療材料への応用を試みてきた。物理化学的特性を用いた材料表面設計は、医療材料のように安全性の観点から利用できる高分子の種類が限定される場合において、製造安定性を高く維持しながらも材料表面の生体親和性をチューニングできる利点がある。しかし、物理化学的な表面に対する細胞接着選択性が、どんな分子に起因するかは不明であった。この理解に向け、本研究ではペプチドが材料表面に作り出す環境に対して、糖鎖発現プロファイルの差が与える影響を検証した。
【方法】 モデル細胞を過剰に継代し、細胞膜糖鎖プロファイルが異なる状態の細胞株を作出した。糖鎖プロファイルの変化はレクチンアレイによって定量化
し、株間で異なる糖鎖の種類を特定した。その後、複数の ECM 分子配列から抽出した 3 残基ペプチドをコーテイングしたプレート上で接着アッセイを行い、発現糖鎖プロファイルの異なる細胞間での接着応答性について定量化を行った。
【結果】 糖鎖プロファイルが異なるモデル細胞のペプチド接着応答性を比較した結果、ペプチド被覆界面の物性パラメータの違いに応じて接着率が異なることが見出され、糖鎖の違いを選別するような細胞培養界面設計の可能性が示唆された。

【緒言】近年、羊毛や羽毛から抽出・加工成型したケラチン蛋白質を用いた組織
工学足場材料や細胞培養基材への利用が検討されている。羊毛ケラチンフィルム（KF）に細胞外基質の構成成分である多糖類を添加もしくは修飾し、生体適合性や細胞接着性をより向上させ、増殖や分化を制御できればより優れた新規の培養基材になりうる。ヘパリンは脳組織の基底膜成分であるへパラン硫酸と同様の二糖単位構造をもつ多糖類である。本研究では細胞接着性を向上させることを目的として、KF 作製時にヘパリンを混合したヘパリン混合 KF 作製し、その KF に対する細胞接着性を評価した。また、ヘパリン以外の多糖類である
ヒアルロン酸やキトサンを混合した KF についても細胞接着性を評価した。
【実験方法】羊毛から還元的条件で抽出した可溶化ケラチン粗抽出液に、ヘパリン、またはヒアルロン酸やキトサン等を混合し、透析、圧縮、乾燥プロセスを経てヘパリン混合 KF、ヒアルロン酸混合 KF、キトサン混合 KF を作製した。
これらの KF に対するヒトグリオブラストーマ細胞 T98G の細胞接着性と細胞増殖能を検討した。
【結果・考察】T98G は、培養 2 日目では、多糖類を混ぜていない KF であるコ
ントロール、キトサン混合 KF への接着は見られなかったが、ヘパリン混合 KFの表面には全体的に接着していた。ヒアルロン酸混合 KF にも細胞の接着は見られたが、部分的であった。培養 5 日目には、いずれの KF 上でも細胞が接着し、増殖した様子が見られた。
何も混合していない KF に対しても T98G は接着できたが、KF にヘパリンを混合することによって T98G の細胞接着性、増殖性を向上させることができたと考えられる。

Response to cell adhesion peptide by glycan profire

Preparation of heparin/keratin composite films and characterization of celladhesion to them

○Akiyo Fujimoto1, Kenjiro Tanaka1, Ryuji Kato1,2(1 Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2 Institute of Nano-Life-Systems, Nagoya
Univ.)

Key words

adhesion, immobilization, peptide○Rinku Nakagawa, Hideki Mori, Masayuki Hara
(Grad. Sch. Sci., Osaka Metro. Univ.)

Key words

keratin film, Glioma cells, heparin

97

1Fp01

醤油発酵・熟成工程における微生物叢の解析○水野 裕一 1,2, 吉村 臣史 3, 澤田 和敬 3, 柘植 圭介 3, 永野 幸生 4,
吉﨑 由美子 5, 後藤 正利 6, 小林 元太 6
（1 鹿児島大院・連農, 2 宮島醤油, 3 佐賀県工技セ, 4 佐賀大・分析セ, 5 鹿児島大・農, 6 佐賀大・農）mizuno-yuichi@miyajima-soy.co.jp

1Fp03

Transcriptomic profiles of Aspergillus oryzae RIB40 and
RIB143 responding to humic acid.
○Liyun Liu, Kanae Sakai, Takumi Tanaka, Ken-Ichi Kusumoto(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)
kenichi_kusumoto@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景・目的】醤油は日本を代表する発酵調味料の一つであり，麹菌，乳酸菌，
酵母の働きによって醤油の特徴的な香味が形成される．一般的に開放系で行われる実製造では，これらの主要な微生物の他に，環境由来の微生物の混入や外気温などの影響によって製品の風味にばらつきが生じることがある．品質の安定化や高品質化において，微生物全体の制御が重要であると考えられるが，醤
油諸味中の菌叢構造については未だ不明な点が多い．そこで，適切な発酵管理技術の構築を目的として，次世代シーケンサーを用いた細菌群および真菌群の網羅的分析を実施し，発酵・熟成工程中の微生物叢変遷について解析を行った．
【方法・結果】屋外発酵タンク内の醤油諸味を，仕込日から発酵・熟成工程終了までの約 5 ヶ月間にわたり経時的にサンプリングした．フードプロセッサーを用いて諸味を均一化し，凍結乾燥，破砕処理を行った後，DNA を抽出した．
16S および ITS 領域のアンプリコンシーケンスを実施し，得られたデータを用
いて菌種組成や多様性の評価を行った．細菌叢解析の結果，仕込から約 1 ヶ月までの発酵初期に Weissella 属，Kruthia 属，Staphylococcus 属など，麹やその他の環境由来と推定される微生物群が多く検出された．その後，耐塩性乳酸菌
Tetragenococcus halophilus の増殖によって pH が低下し，続いて主発酵酵母
Zygosaccharomyces rouxii によるエタノール濃度の上昇などの諸味環境の変動が生じると，菌種組成や多様性も変化することが観察された．一方，真菌叢はAspergillus oryzae と Z. rouxii が支配的な構成であったが，野生酵母と思われる菌種の存在も確認された．主要微生物以外の比較的存在量の多い準優占種は醤油の品質に何らかの影響を及ぼしている可能性が考えられるため，より詳細な解析が必要である．

Aspergillus oryzae can be classified into three groups depending on PCR analysis ofaflatoxin biosynthesis gene homolog cluster in 39 strains (Kusumoto et al. Curr.
Genet., 2000). Group 1 strains hold most of aflatoxin biosynthesis gene homologs andgroup 3 strains hold few aflatoxin biosynthesis gene homologs. A. oryzae can beisolated from plants and food, and from soils, while humic acid (HA) is amacromolecule that commonly exists in soil. HA stimulated the sporulation and giantcolony diameter of RIB40 (belongs to group 1 strains) on Czapek Dox (CD) agar
plates and stimulated the mycelial dry weight of this strain in CD liquid medium,
however, inhibited those of RIB143 (in group 3). To understand the distinctive
responses of RIB40 and RIB143 to HA in molecular level, differential transcriptomic
profiles of two strains responding to HA were compared through RNA-seq analysis.
The gene ontology enrichment analysis using different expressed genes (up-regulated
genes, HA/control>2; down-regulated genes, HA/control<0.5) showed that genes
associated with the ATPase-coupled transmembrane transporter activity were the mostupregulated, while those in the monooxygenase activity were the most downregulated
in RIB40 by HA; the genes associated with the copper ion transmembrane transporter
activity were the most upregulated, while genes associated with the heme binding werethe most downregulated in RIB143 by HA. Besides, several candidates of transcripts
regulators responding to HA were also identified in two strains.

Analysis of microbiome in soy sauce fermentation and aging process

Transcriptomic profiles of Aspergillus oryzae RIB40 and RIB143
responding to humic acid.

○Mizuno Yuichi1,2, Yoshimura Takashi3, Sawada Kazutaka3, Tsuge Keisuke3,
Nagano Yukio4, Yoshizaki Yumiko5, Goto Masatoshi6, Kobayashi Genta6(1 United Grad. Sch. Agric. Sci., Kagoshima Univ., 2 Miyajima Shoyu Co.,Ltd., 3 Ind.
Technol. Ctr. Saga, 4 Anal. Res. Ctr. Exp. Sci., Saga Univ., 5 Fac. Agric., Kagoshima
Univ., 6 Fac. Agric., Saga Univ.)○Liyun Liu, Kanae Sakai, Takumi Tanaka, Ken-Ichi Kusumoto(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

soy sauce, microbiome, fermentation

Key words

Aspergillus oryzae, soil, transcriptome

1Fp02

優良きょうかい清酒酵母の系統間の判別を可能とする
SNP マーカーの開発

1Fp04

酵母のアルコール発酵を指標とした植物-微生物間相互作用因子の探索周 延 1, 櫻井 省吾 1,2, 鄭 暁紅 1, 五島 徹也 1, 金井 宗良 1, 下飯 仁 3,
岡崎 直人 3, ○赤尾 健 1,2（1 酒総研, 2 広島大院・統合生命科学, 3 醸造協会）
akao_t@nrib.go.jp○中瀬 由起子, 両角 佑一, 杉本 幸子, 渡辺 大輔（奈良先端大・バイオ）nakase.yukiko@bs.naist.jp【目的】協会系清酒酵母（K6、K7、K9、K10 及びこれらの派生株）は今日の清酒酵母の主流だが、系統ごとに特徴的な醸造特性を有する。しかし、遺伝的には互いに極めて近縁であり、系統判別には、従来は全ゲノム情報を利用する必要があった。近年、系統ごとにゲノム情報の蓄積が進んだことから、今回、系
統判別が可能な SNP マーカーの開発を目的とした。
【方法】我々の有するゲノム DB より K6、K7、K9、K10 の各系統を判別可能な
SNP マーカー候補を体系的にスクリーニングし、別の系統既知の菌株で実効性を検証した。SNP タイピングには、迅速で多検体に対応可能な HRM 法を用いた。
【結果】K6 系統 9 株、K7 系統 16 株、K9 系統 18 株、K10 系統 5 株のゲノム情報から、系統間で明確に分布が異なる SNP として、(1)K6 系統対 K7/K9/K10 系
統 81 ヶ所、(2)K9 系統対 K6/K7/K10 系統 237 ヶ所、(3)K10 系統対 K6/K7/K9 系
統 23 ヶ所、(4)K6/K9 系統対 K7/K10 系統 94 ヶ所が選抜された。K7 系統には直接判別可能な SNP はなく、「K6、K9、K10 系統ではない」という判別基準となった。次に、ヘテロ接合位置での LOH による誤判別防止のため、(1)〜(4)それぞれに 3 個以上のマーカーを異なる染色体上に設定することとし、(1)4 ヶ所、(2)5 ヶ所、(3)5 ヶ所、(4)3 ヶ所を選抜した。これらについて HRM 法の条件を決定後、スクリーニングに用いた菌株のタイピングを行い、全てゲノム情報と一致する結果を得た。そこで、系統は既知だがゲノム情報のない K6 系統 10
株、K7 系統 25 株、K9 系統 29 株、K10 系統 10 株に適用したところ、予想どおり LOH 等による遺伝型の不一致が数例みられたが、結果的に全ての株の系統を正しく判別でき、この判別系が広く有効なことを確認した。次に、いくつかの交配株に適用したところ、複数の系統に該当して判別不能なケース、多重交配株において交配回数の多い株の系統と判別されるケースなどがみられた。

発酵食品の製造において、原材料植物由来成分は微生物の栄養源となるだけでなく生育と代謝に多様な影響を与える。このような相互作用は、自然界における植物-微生物の生態系構築の原理を解明するための有益なモデルとなる。本研
究では、植物由来成分の中でも香味、辛味、機能性などの多彩な生理活性を持
つ香辛料成分に焦点を当て、代表的な醸造微生物である酵母 S. cerevisiae によるアルコール発酵への影響を調べた。酵母のエネルギー代謝であるアルコール
発酵を指標とすることにより、生育を指標とした場合とは異なる情報が得られる可能性が考えられる。香辛料成分を添加した発酵試験を実施した結果、多くの香辛料成分がアルコール発酵を抑制したのに対し、クルクミン、ピペリン、
グリチルリチン酸、アリシンはアルコール発酵を促進することを見出した。伝
統的に香辛料の多くが防腐・抗菌の目的で用いられてきたことを考えると、想定外の結果となった。発酵促進効果が見られた 4 種類の香辛料成分の構造上の類似性は乏しく、それぞれが独立した作用を持つと予想された。特に顕著な発酵促進効果を示したクルクミンはウコン（ターメリック）の根茎の主要な色素成分であり、市販のカレー粉にも多く含まれる。カレー粉を添加した発酵試験でも、クルクミンと同様に顕著なアルコール発酵促進効果が認められたことか
ら、発酵食品製造への適用も可能であると考えられる。以上の結果から、酵母のアルコール発酵を促進する新たな植物由来シグナル因子を同定することに成功した。自然界では植物由来成分がアルコール発酵を促進することにより、酵
母はエネルギー獲得効率を高め、植物は酵母が生み出すエタノールの抗菌作用によるメリットを受けるのかもしれない。本研究を通して、アルコール発酵の調節を介した新規な植物-微生物間相互作用を提唱することができた。

Development of SNP markers to identify lineage of superior Kyokai sakeyeast and the related strains

Search for plant-microbe interaction factors using yeast alcohol
fermentation as an indicator

Yan Zhou , Shogo Sakurai , Xiaohong Zheng , Tetsuya Goshima ,Muneyoshi Kanai1, Hitoshi Shimoi3, Naoto Okazaki3, ○Takeshi Akao1,2(1 NRIB, 2 Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 3 Society of Brewing, Japan)
1

Key words

1,2

1

1

Kyokai sake yeast, SNP marker, genotyping, lineage identification○Yukiko Nakase, Yuichi Morozumi, Yukiko Sugimoto, Daisuke Watanabe(Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, alcohol, fermentation, spices

98

1Fp05

核酸系うまみ成分分解に関与する麹菌酸性ホスファター
ゼの解析○酒井 香奈江 1, 鈴木 忠宏 2, 堀井 悠一郎 3, 和久 豊 4, 楠本 憲一 1
（1 阪大院・工, 2 農研機構, 3 新潟食品研究セ, 4 ビオック）
kenichi_kusumoto@bio.eng.osaka-u.ac.jp

1Fp07
学

モデル化焼酎醸造系における発酵促進成分の探索○江部 聡 1, 丸岡 生行 2, 髙下 秀春 2, 星田 尚司 3, 赤田 倫治 3
（1 山口大院・創成科学, 2 三和酒類, 3 山口大・工）rinji@yamaguchi-u.ac.jp

麹菌の生産する酸性ホスファターゼが核酸系のうまみ成分を分解してしまうことから、だし入り味噌の製造時には、麹菌酵素を失活させるための加熱処理が必要となっている。しかし、熱処理を行うことによる味噌の風味や色調変化といった品質低下が免れない上に、粘性のある味噌を加熱するためのエネルギーや特殊な装置が必要という問題がある。そこで酸性ホスファターゼ活性が極めて低い株で味噌が醸造できれば、熱処理の工程が不要なだし入り味噌の生産につながると期待される。
これまでの研究で，麹菌 Aspergillus oryzae には 13 種類の酸性ホスファターゼ遺伝子(aphA~M)が存在し、それぞれがリン酸濃度依存的な発現制御を受けていることが明らかとなった。また、Bio’c が保有する A. oryzae 503 株のスクリーニン
グから、プロテアーゼやアミラーゼ活性は味噌作りに十分な活性を保ちつつ、
酸性ホスファターゼ活性が大きく低下した株を見出している。この株では、リン酸が十分に存在しているとき特に他の味噌用麹菌と比較して酸性ホスファ
ターゼ活性が低下しており、13 個の候補遺伝子のうち、リン酸濃度依存的な発現制御パターンやゲノム配列解析から 2 つの aph 遺伝子が本菌株における酸性
ホスファターゼ活性低下の主な原因であると考えられた。そこで、酸性ホスファ
ターゼ活性低下の原因と考えられる酵素を中心にその発現や酵素活性についての解析をさらに進めているところである。
本菌株における酸性ホスファターゼ活性低下の原因を明らかにすることで、だし入り味噌醸造用の菌株が効率的に育種できると考えている。

焼酎は、麹菌を用いて原料を糖化し、酵母による発酵を利用し製造される。糖化には麹菌が必要だが、糖化過程で生じた単糖以外の成分の発酵への重要性は知られていない。そこで、培地をモデル化し、酵母の増殖には寄与せず、発酵にのみ必要な培地成分の同定を試みた。蓋が閉められるねじ口の容器に酵母エ
キス、ペプトンおよび 10%グルコースからなる培地を入れ、OD600=2 になるよう植菌し、発酵中の CO2 量を測定すると良好に発酵した。この条件では最終酵
母濃度も上昇していた。しかし、発酵と増殖を切り離した条件設定は困難であることから、発酵を指標としてモデル化を進めた。まず、天然成分を除いた影響を調べた。すると、ペプトンを除いても同等の発酵量を示した。このペプトンを含まない培地から、さらに酵母エキス量を減少させると、濃度とともに発酵量が減少した。そこで、酵母エキス量を減少させ発酵量を抑えた培地に、ビタミンやアミノ酸などをそれぞれ加え、発酵量を高める成分を探した。その結果、MgSO4、グルタミン酸およびフェニルアラニンにより発酵量が回復した。
ところが、この培地から酵母エキスを完全になくすと発酵量が半分に低下したため、酵母エキスに含まれる別の成分が必要であることが分かった。そこで、3 成分を含む培地に他のビタミンやアミノ酸などを添加し、さらに発酵量を高める成分を探した。すると、メチオニン、イノシトールおよびチアミンにより発酵量が回復した。これまでの全ての実験条件では、酵母の増殖も進行していたが、グルコース濃度 40%かつ植菌量が OD600=16 の時、発酵のみ進行した。この結果から発酵と増殖を分けて考えられるようになった。最終的に、アスパラ
ギン酸またはグルタミン酸だけで発酵量が増加し、酸性アミノ酸が発酵に必要な成分であることが分かった。

Analysis of Aspergillus oryzae acid phosphatases involved in nucleic acidbased umami component degradation

Exploring fermentation-promoting compounds using a shochu brewing
model.

○Kanae Sakai1, Tadahiro Suzuki2, Yuichiro Horii3, Yutaka Wagu4,
Ken-Ichi Kusumoto1(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 NARO, 3 Niigata Food Res. Center, 4 Bio'c Co.,Ltd.)

Key words

1Fp06○Satoshi Ebe1, Naruyuki Maruoka2, Hideharu Takashita2, Hisashi Hoshida3,
Rinji Akada3(1 Grad. Sch. Sci. Tech. Innov., Yamaguchi Univ., 2 Sanwa Shurui Co., Ltd, 3 Fac.
Eng., Yamaguchi Univ.)

Aspergillus oryzae, acid phosphatase

Key words

fermentation, Aspergillus oryzae, yeast, shochu

酢酸イソブチル高生産酵母の育種と窒素源の影響解析

1Fp08

高発酵性酵母 Bafilomycin A1 耐性株の V-ATPase 機能解析○圍 彰吾, 浅井 拓也, 窪寺 隆文, 明石 貴裕（白鶴酒造）
shogo-kakoi@hakutsuru.co.jp○中瀬 舞, 浅井 拓也, 窪寺 隆文, 明石 貴裕（白鶴酒造）
mai-nakase@hakutsuru.co.jp

酢酸イソブチルは、酵母のバリン生合成経路を介して生成されたイソブタノー
ルと、アセチル-CoA より生じる果実香を呈するエステルである。バリン生合成
経路は、アセトヒドロキシ酸合成酵素（AHAS）にバリンが結合することでフィードバック阻害を受けるが、一部のバリンアナログ耐性変異株では、その阻害が解除される 1)。
そこで酢酸イソブチル高生産性の清酒酵母を取得するために、酢酸エステル合
成酵素 Atf1 高活性かつ、酢酸エステル分解エステラーゼ Iah1 低活性である自社酵母に、バリンアナログ耐性を付与した。
その結果、イソブタノールおよび酢酸イソブチル生産性がそれぞれ親株の 3.5
倍、2.8 倍に向上した HL430 を取得した。また Iah1 と AHAS のサブユニットに、それぞれ新規変異点を見出した。
次に、70%精米あるいは 50%精米の原料米を用いて HL430 の小仕込み試験を行ったところ、50%精米で発酵が遅延した。そこで HL430 の生育に必須な成分を同定するために、SD 培地から単一栄養成分を欠乏させた種々の培地を用いて一般的な清酒酵母と増殖速度を比較したところ、硫酸アンモニウムを除いた
場合に HL430 の増殖が遅延した。実際に、50%精米の小仕込み試験で硫酸アン
モニウムを添加したところ、発酵性は改善された。
イソブタノールは窒素源飢餓シグナルである可能性が高いこと、窒素源カタボ
ライト抑制を活性化する Gln3 を欠損した場合にイソブタノール耐性および生産性が向上することが報告されている 2)。そこで現在、HL430 の発酵遅延と窒素
源カタボライト抑制の関連性を解析するために、HL430δgln3 の作出を試みている。
1) T. Natthaporn et al., Metabolic engineering 46 (2018): 60-67.
2) K. Kuroda et al., Cell Systems 9.6 (2019): 534-547.

我々はこれまでに、清酒酵母(S. cerevisiae)の液胞膜 V-ATPase 阻害剤 Bafilomycin
A1(Baf)耐性株から高確率でアルコール高発酵性株を取得できることを見出した。Baf 耐性株は親株と比較して液胞内 pH が酸性にシフトしており、細胞内ATP 量も減少していた。これらの結果から、Baf 耐性株ではおそらく V-ATPaseの活性化により細胞質中のプロトンが液胞内に取り込まれて液胞が酸性化し、またそれに伴い細胞内 ATP が消費されることで解糖系が亢進して発酵性が向上
していることが推測された。
酵母の V-ATPase は少なくとも 14 種類のサブユニットからなる超分子複合体
で、ATP の加水分解触媒機能を担う細胞質側コンプレックス V1 と、プロトン
チャネルを形成する膜貫通コンプレックス V0 に大別される。V-ATPase の V1 とV0 はグルコース非存在下では解離し活性が低下するが、グルコース存在下では
V1 と V0 は会合し活性を持つことが知られている。Baf 耐性株の V-ATPase の会
合力を調べるため、グルコース存在/非存在下で液胞内 pH を測定した結果、Baf
耐性株ではグルコース非存在下でも液胞内 pH が酸性にシフトしていることが明らかとなった。このことから、Baf 耐性株の V-ATPase の V1V0 コンプレック
スの会合力は親株と比較して高いことが示唆された。
また、Baf 耐性株は特に醪後半の発酵性が高く、死滅率も親株と比較して低い特徴があることをこれまでに報告している。清酒酵母は清酒醪環境中で様々なストレスに晒されながら発酵している。液胞の酸性化はそのようなストレス環境下にも適応できる重要な機能を担っているのではないかと推測し、液胞の酸性化がもたらす清酒酵母への影響について現在さらなる解析を進めている。

Breeding of a Sake Yeast with Improved Isobutyl Acetate Productivity andAnalysis of the Effects of Nitrogen Source

Functional analysis of V-ATPase in highly fermentative yeast, Bafilomycin
A1 resistant strain○Shogo Kakoi, Takuya Asai, Takafumi Kubodera, Takahiro Akashi(HAKUTSURU SAKE BREWING)

Key words

butanol, alcohol acetyltransferase, esterase, branched chain amino acids○Mai Nakase, Takuya Asai, Takafumi Kubodera, Takahiro Akashi(Hakutsuru Sake Brewing Co., Ltd.)Key words

sake yeast, sake, vacuole

99

1Fp09

生もと系酒母造りの清酒醪における抗酸化成分の消長○野口 友嗣, 河原 航, 石川 卓, 飛田 啓輔（茨城産技セ）tobita@itic.pref.ibaraki.jp

1Fp11

エタノールによる酵母プロテアソームの活性阻害に対す
る低温処理の改善効果
Nguyet Vo Thi Anh, 安東 稜子, 古谷 昇, ○井沢 真吾（京工繊大院・工芸科学）
thioredoxin@kit.ac.jp【背景と目的】清酒製造における抗酸化作用は、麹、酒母、醪製造の各工程で段階的に上昇することが明らかにされている。我々は、高温糖化乳酸菌添加酒母（生もと系酒母）造りで得られた清酒は抗酸化作用が高くなることを報告し、生もと系酒母造りによって酸化による酒質変化を抑制できることを提案した*。本研究では、
生もと系酒母造りを用いた清酒醪における抗酸化成分の消長を明らかにしたので報告する。
【方法】
生もと系酒母による総米 10 kg の醸造試験を行った。酵母は明利小川酵母を、乳酸菌は生もとから分離した Leuconostoc mesenteroides 1 株を用いた。醪製造か
ら上槽まで経日的に濾液を回収して、H-ORAC 法により醪濾液および製成酒の抗酸化能を測定した。また、既知の抗酸化成分であるフェルラ酸、p-クマル酸、および抗酸化アミノ酸（システイン、チロシン、ヒスチジン、フェニルアラニン）は高速液体クロマトグラフにより定量した。さらに、醪経過 3 日目、12 日目、19 日目の濾液は CE-TOFMS によるメタボローム解析を行った。
【結果と考察】醪濾液の H-ORAC 値は経日的に増加し、製成酒の H-ORAC 値は醪経過 1 日目の 24.3 倍に増加した。醪濾液中のフェルラ酸と p-クマル酸は醪経過 16 日目まで増加し、その後はほぼ一定となった。製成酒のフェルラ酸含量は 4.9 mg/L、
p-クマル酸含量は 0.1 mg/L であった。また、抗酸化アミノ酸は醪経過 7 日目までは減少または横ばいの傾向を示したが、7 日目以降は経日的に増加した。メタボローム解析では 3-ヒドロキシアントラニル酸、ヒポタウリン、および 6,8チオクト酸などが検出され、これらは異なる消長を示した。
このように、生もと系酒母造りによる清酒醪の抗酸化成分は醪経過により異なる消長を示したことから、抗酸化作用の高さに複合的に関与していることが示唆された。
*野口ら．第 74 回日本生物工学会大会、2022 年．

高濃度のエタノールは自身でエタノールを産生する酵母にとってもストレスとなり、翻訳抑制や変性タンパク質の蓄積などのさまざまな悪影響を及ぼすことが知られている。ユビキチン－プロテアソームシステム (UPS) によるタンパク
質分解は、細胞内タンパク質のターンオーバーや変性タンパク質の処理を通じてプロテオスタシスやタンパク質品質管理において重要な役割を担っている。
昨年我々は、10%エタノールストレス下で酵母のプロテアソーム活性が強く阻害されること、6%エタノールでの前処理によって高濃度エタノールストレス下でもプロテアソーム活性が維持されるようになることを報告した(Nguyet et al.,BBA Gen. Subj., 2022)。これまでの解析は 28˚C の実験室条件下で行ってきたが、酵母を用いた酒類醸造はしばしば 28˚C よりも低温で行われる。そのため、低温域でエタノールストレス処理を行った際のプロテアソーム活性について我々は興味を抱き、今回解析を行った。15˚C、22˚C、28˚C で培養およびストレス処理を行い、シクロヘキシミドチェイスアッセイによる標的タンパク質の分解効率を指標にしてプロテアソームの活性評価を行った。解析の結果、培養した温度にかかわらず、15˚C では 10％エタノールストレス存在下でもプロテアソーム活性は阻害されず、標的タンパク質の速やかな分解が確認された。プロテアソー
ム構成因子の局在や発現レベルに大きな違いが認められないことから、15˚C と
28˚C でのプロテアソームの翻訳後修飾や構成因子に何らかの違いがあるのではないかと推測された。本研究の解析結果は、酵母のタンパク質品質管理能力が醸造温度によって大きく異なると可能性を示唆していた。

Changes in antioxidant during mash making process of sake with kimotostyle seed mash

Improved effect of low temperature treatment on inhibition of yeast
proteasome activity under severe ethanol stress○Tomotsugu Noguchi, Wataru Kawahara, Taku Ishikawa, Keisuke Tobita(Ind. Technol. Innov. Cent. Ibaraki)

Vo Thi Anh Nguyet, Ryoko Ando, Noboru Furutani, ○Shingo Izawa(Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)Key words

sake, antioxidant, mash

Key words

proteolysis, ethanol stress, yeast, proteasome

1Fp10

酵母 DBY746 株の熱ストレスによる活性酸素量増大とミトコンドリアとの関連性

1Fp12

食酢醸造用酢酸菌 Acetobacter pasteurianus の酢酸発酵
時におけるエタノール資化に関する代謝調節機構の解明○三木 健夫, 佐野 絢子（山梨大院・医工農）
takemiki@yamanashi.ac.jp

学○里 実優 1, 松尾 弥俊 1, 丸山 彩乃 2, 海野 良輔 1, 鈴木 敏弘 1,2,
石川 森夫 1,2
（1 東農大院・応生, 2 東農大・応生科）
m1ishika@nodai.ac.jp

酵母 S. cerevisiae DBY746 株は、熱ストレス（２８→４２℃）のを与えると、他の酵母株と比較して細胞内活性酸素種の著しい量的増大が観察されることを報告した（佐野ら 2022 年度生物工学会大会）。この現象はミトコンドリア電子伝達系で発生する活性酸素種に由来している可能性が考えられた。そこで本研究では、先述の活性酸素の量的増大原因について調査を行う為、本株の呼吸欠損株（Rho－株）の構築を試みた。エチジウムブロマイドを含む YPD 液体培地でDBY746 株を複数回継代培養した後、寒天培地上でコロニーを形成させた。小
さめのコロニーを優先的に選択し、グリセロール培地を用いてスクリーニングを行った結果、２株の Rho－株を得た（取得率：0.004%）。MitoBright LT Greenを用いたミトコンドリア蛍光染色の結果、Rho－株は親株と比較し、蛍光強度が低下した細胞が多く見られた。また、ミトコンドリアゲノム上に位置する
COX1〜3 および SOD2 遺伝子を PCR 増幅した結果、Rho－株は親株よりも増幅
遺伝子断片の量が少なく、エチジウムブロマイド処理により、ミトコンドリア
ゲノムに何らかの変異が生じていると考えられた。これらの結果から S. cerevisiae
DBY746 株の Rho－株は得られたものの、完全なミトコンドリア欠損株を得ることは困難であることがわかった。一方、熱ストレスを与えた Rho－株では細胞内活性酸素の量的増加が見られるものの、親株と比較してその増加率は 1/2〜
1/3 程度まで低下することがわかった。以上の結果から、熱ストレスを与えた
酵母 S. cerevisiae DBY746 株で見られる細胞内活性酸素の量的増大は、ミトコン
ドリアに関連した現象であると推定された。

【背景・目的】食酢醸造用酢酸菌 Acetobacter pasteurianus は細胞膜上に局在する
アルコールデヒドロゲナーゼ (ADH) とアルデヒドデヒドロゲナーゼ (ALDH) に
よってエタノールを酢酸に不完全酸化する酢酸発酵を行う。本菌の酢酸発酵時における菌体内生理については数多くの検討がなされているが、同時期の代謝調節機構の詳細については不明な点が残されている。そこで本研究では、酢酸
発酵時に顕著に高発現する因子を探索し、その機能解析を行うことを目的とした。
【方法及び結果】A. pasteurianus NBRC 3283 株をグルコース存在下およびグル
コース・エタノール存在下で培養し、RNA-seq による網羅的転写挙動解析を行った。その結果、酢酸発酵時 (エタノール存在下) において、転写調節因子(TetR)、アルコールデヒドロゲナーゼ (YqhD)、スクシネートセミアルデヒドデ
ヒドロゲナーゼ (Saldh) からなる TetR オペロンが顕著に高発現することが示された。TetR オペロンは NBRC 3283 株のプラスミド上にコードされている。そこで、同プラスミドを保持しない A. pasteurianus SKU 1108 株に TetR オペロンを導入し、同オペロン発現株と親株を用いて 3%エタノール存在下における生育挙動の比較解析を行った。その結果、両株の増殖曲線およびエタノールの消費量は同等であったが、同オペロン発現株はより多くの酢酸を生成した。さらに、培養中の生菌数を比較したところ、親株は定常期のより早い時期に死滅することを観察した。そこで、酢酸発酵の中間代謝物質であるアセトアルデヒドの培養液中の蓄積量について検討した結果、親株ではより多くのアセトアルデ
ヒドの蓄積が見られ、これが本菌の酢酸発酵能に影響していると考えられた。
以上より、本菌 TetR オペロンは酢酸発酵時のアルデヒドの処理に関与することが示唆された。

The increased levels of reactive oxygen species resulting from heat stress inthe yeast strain DBY746 are related to mitochondria.

Metabolic regulation of ethanol utilization during acetic acid fermentationin Acetobacter pasteurianus, an acetic acid bacteria used for vinegar
brewing○Takeo Miki, Ayako Sano
(Integr. Grad. Sch. Med. Eng. Agric. Sci, Univ. Yamanashi)

Key words

heat shock, yeast, reactive oxygen species, mitochondria○Miyu Sato1, Hisatoshi Matuo1, Ayano Maruyama2, Ryosuke Unno1,
Toshihiro Suzuki1,2, Morio Ishikawa1,2(1 Grad. Sch. Appl. Biosci., Tokyo Univ. Agric., 2 Fac. Appl. Biosci., Tokyo Univ.
Agric.)
Key words
Acetobacter pasteurianus, acetic acid fermentation, TetR, vinegar

100

1Fp13

吟醸仕込みにおける α-EG とプリン体の研究○石橋 勇作 1, 高山 宗幸 2, 多田 周作 2, 尾関 健二 1
（1 金工大・ゲノム研, 2 天野エンザイム）
ozeki@neptune.kanazawa-it.ac.jp

1Fp15

協会系酵母とは異なる系統に属する清酒酵母の高発酵性
メカニズムの解明○森 光太郎 1,2, 清家 泰介 1, 山田 翼 2, 田中 伸哉 2, 松田 史生 1
（1 阪大院・情報, 2 菊正宗酒造）
fmatsuda@ist.osaka-u.ac.jp【背景・目的】α-EG は純米酒中に 0.6-0.8%、吟醸酒に 0.3%含まれており、美肌効果が報告されている 1)。また、蒸留酒を除いたアルコール類にはプリン体が含まれており、痛風の原因物質となり、日本酒にも微量ながらプリン体が検出される。先行研究では、吟醸仕込みで TG-B を入れて α-EG が増えることが報告されている 1)。そこで本研究では、吟醸仕込みで TG-B を入れて α-EG が増える条件で、プリン体量はどうなるかの検討を行った。
【方法】
掛米は山田錦(精米歩合 50%)、麹は山田錦(精米歩合 50%)、酵母(協会 901 号)、
酵素剤は 2 種類の酵素剤(TG-B, 比較として α-Glucosidase SD; 天野エンザイム(株))を使用した。吟醸仕込みは一段仕込みで行い、麹歩合は 20%, 25%、温度は10℃、30 日間である。酵素剤添加パターンは、酵素剤無し、1/5000、1/2000 に振り分けた。α-EG 量、プリン体量は高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を用
いて、定量を行った。
【結果・考察】
吟醸仕込みの結果、麹歩合 20%と麹歩合 25%では麹歩合 20%の方が α-EG が高生産され、プリン体量が抑えられた。TG-B と α-Glucosidase SD では TG-B の方が α-EG が高生産され、プリン体量が抑えられたことを確認した。プリン体量に関しては、0.40〜0.50 mg/100 mL に抑えられ、プリン体オフの表記ができることを確認した。α-EG が高生産された原因として、酵素添加により仕込みの初期の発酵が促進されたことが考えられる。プリン体が抑えられた原因として、アルコール発酵が旺盛であったことが考えられる。今後再現性があるのかを見るために N 数を増やした仕込みを行い、経日変化による α-EG、プリン体量の推移を検討したい。
参考文献
1) 尾関健二, バイオプロセスを用いた有用性物質生産技術, 技術情報協会, p223p234 (2022)【背景・目的】清酒醸造に使用される清酒酵母は、系統樹上で協会系酵母グループとそれ以外のグループに分けられる。菊正宗酒造株式会社で長年使用される Km67 株は後者に分類される。
協会系酵母である K7 株の高い発酵能は RIM15 遺伝子の機能欠失変異に起因することが報告されている。一方、Km67 株は RIM15 の機能欠失変異を有さないにもかかわらず、K7 株と同程度の高い発酵能を有している。本研究では Km67
株の高発酵性に寄与する因子の特定を目的とした。
【方法】
X2180 株（実験室株）、K701 株（K7 株）、Km67 株を小仕込み試験に供し、留4,8,12 日目の酵母の細胞内貯蔵糖量・細胞壁強度・出芽率 を測定し、各酵母の細胞周期を調べた。細胞内貯蔵糖はグリコーゲンとトレハロースの量を測定し、細胞壁強度は Zymolyase 耐性を測定することで評価した。次に TORC1 活性を抑制する Rapamycin 存在下での発酵試験を行った。最後に留 4,8,12 日目の醪から分離した菌体を用いて RNAseq 解析を行った。
【結果・考察】Km67 株は K701 株と同様に細胞内貯蔵糖量と細胞壁強度が X2180 株よりも低く、出芽率も K701 株と同様に発酵期間を通して高い状態で維持されていた。
このことから Km67 株は G0 期へと入りにくいという K7 株と同じ表現型を有することが分かった。
Rapamycin の有無で行った発酵試験の結果、X2180 株では Rapamaycin 添加により発酵が弱まったが、Km67 株では K701 株と同様に発酵が弱まらなかった。このことから、Km67 株では TORC1 から下流へシグナルが正常に伝達されていないことが分かり、RIM15 が正常に機能していない可能性が示唆された。
RNAseq 解析により、醪から分離した上記 3 株の遺伝子発現を比較したところ
Km67 株は X2180 株と比べて RIM15 の発現量が約 4 倍低下していた。このことから RIM15 の発現量低下が細胞周期の異常をもたらし、Km67 株の高発酵性に寄与している可能性が示唆された。

Study on Alpha-EG and Purines in Ginjo Brewing

Elucidation of the higher fermentation ability of a non-kyokai sake yeast○Yusaku Ishibashi1, Hiroyuki Takayama2, Shusaku Tada2, Kenji Ozeki1(1 Genome Biotechnol. Lab., Kanazawa Inst. Technol., 2 Amano Enzyme Inc.)○Kotaro Mori1,2, Taisuke Seike1, Tasuku Yamada2, Nobuchika Tanaka2,
Fumio Matsuda1(1 Grad. Sch. IST, Osaka Univ., 2 Kiku-Masamune Sake Brewing Co., Ltd.)Key words

alpha-eg, purines, diastatic enzyme, amylases, sake brewing

Key words

fermentation, sake yeast, transcriptome, metabolism

1Fp14

イオンビーム照射による群馬 G101 酵母からのカプロン
酸エチル高生産性酵母の育種

1Fp16

白麹菌 Aspergillus luchuensis mut. kawachii におけるクエン酸排出輸送体ホモログの機能解析○渡部 貴志 1, 佐藤 勝也 2, 大野 豊 2, 田島 創 1（1 群馬産技セ, 2 量研高崎研）
watanabe-t@pref.gunma.lg.jp

西谷 篤 1, 平松 健太郎 2, 門岡 千尋 3, 澤田 和敬 4, 奥津 果優 2,
吉﨑 由美子 1,2, 髙峯 和則 1,2, 後藤 正利 5, 玉置 尚徳 1,2,
○二神 泰基 1,2（1 鹿児島大院・連農, 2 鹿児島大・農, 3 崇城大・生物生命, 4 佐賀
工技セ, 5 佐賀大・農）futagami@agri.kagoshima-u.ac.jp【背景と目的】イオンビーム育種技術は、高 LET（Linear energy transfer）のイオ
ンビーム照射により、ゲノム中の塩基配列を変異させることで、新たな形質を生み出す突然変異育種方法である。我々は、世界で初めてイオンビーム育種技術による清酒酵母 No. 227 株の実用化に成功している。しかしながら、No. 227
株は、K1801 株以上のカプロン酸エチル生産性を示す反面、酸度が高くて全国
新酒鑑評会の出品酒造りには適さなかった。また、No. 227 株の親株は K901 株であるため、100%群馬県独自株ではないという課題もあった。群馬 G1 酵母（G1 株）は、発酵力が高い本醸造酒向けの群馬県独自酵母であるが、泡あり株であったため、30 年以上前に頒布を中止した株である。そこで本研究では、イオンビーム育種技術を用いて G1 株からカプロン酸エチル高生産性酵母を育種することを目的とした。
【方法と結果】Froth floatation 法により G1 株を泡無し化し、群馬 G101 酵母（G101 株）を実用化した。続いて、量子科学技術研究開発機構高崎量子応用研
究所 TIARA にて、炭素イオンビーム（ 12C5+ 、220MeV）を G101 株に照射
（200~300Gy）した。グリセロールを炭素源としたセルレニン含有 YPGy 培地で生育してきた候補株 552 株を取得した。濃縮麹エキスを用いた液体培養により、カプロン酸エチル生産量を指標に 32 株を選抜した。次に総米 200g の小仕込み試験を実施し、5 株のカプロン酸エチル高生産性候補株を選抜した。さらに、
総米 1kg の小仕込み試験により、K1801 株と同等のカプロン酸エチル高生産性、酸度生産性を有する QCI3 株を最終候補として選抜した。
【謝辞】本研究の一部は、科研費基盤 C 21K12538 により実施した。

【背景・目的】焼酎造りに使用される白麹菌 Aspergillus luchuensis mut. kawachii
は多量のクエン酸を分泌生産する。先行研究において、白麹菌においてクエン酸の細胞外への分泌を担うクエン酸排出輸送体 CexA が同定された。本研究は、白麹菌のゲノムにコードされる CexA ホモログの機能を解明することを目的とした。
【方法】白麹菌のゲノムには CexA のホモログが 11 遺伝子にコードされていた。
また、トランスクリプトームの情報からこれらの遺伝子の発現レベルが低いことが示唆された。そこで、白麹菌の cexA 遺伝子破壊株を宿主として各ホモログ
を過剰発現する株を構築し、培養上清に分泌されるようになる有機酸を HPLC
により分析した。なお cexA 遺伝子破壊株は、クエン酸の分泌生産を防ぐために使用した。
【結果・考察】まず、白麹菌において各 cexA ホモログ遺伝子が過剰発現したことをリアルタイム RT-PCR により確認した。次に、各過剰発現株を液体培地で培養し、その培養上清を HPLC により分析した。また、菌体を凍結乾燥して重量を測定し、菌体重量あたりの有機酸生産量を評価した。その結果、いずれもクエン酸生産量は変化しなかったため、CexA ホモログはクエン酸排出輸送体
ではないことが示唆された。また、過剰発現株のうち培養上清に α-ケトグルタ
ル酸とフマル酸をコントロール株よりも高濃度に蓄積したものがあった。これらの CexA ホモログは α-ケトグルタル酸とフマル酸の細胞外への排出輸送体である可能性が示唆された。

Breeding of high-ethyl caproate producing yeast from Gunma G101 yeast by
ion-beam irradiation

Functional analysis of citrate exporter homologs in the white koji fungus,
Aspergillus luchuensis mut. kawachii○Takashi Watanabe1, Katsuya Satoh2, Yutaka Oono2, Tajima So1(1 Gunma Ind. Technol. Center, 2 QST Takasaki)

Key words

yeast, ethyl caproate, ion-beam, fermentation

Atsushi Nishitani1, Kentaro Hiramatsu2, Chihiro Kadooka3, Kazutaka Sawada4,
Kayu Okutsu2, Yumiko Yoshizaki1,2, Kazunori Takamine1,2, Masatoshi Goto5,
Hisanori Tamaki1,2, ○Taiki Futagami1,2(1 United Grad. Sch. Agric. Sci., Kagoshima Univ., 2 Fac. Agric., Kagoshima Univ.,
3Fac. Biotechnol. Life Sci., Sojo Univ., 4 Ind. Tech. Cent. Saga, 5 Fac. Agric., Saga
Univ.)
Key words
Aspergillus kawachii, transporter, organic acid

101

1Gp01

全遺伝子ライブラリをハイスループットに構築するための新規 multiplex PCR 法の開発

1Gp03

3D structure construction of cyclic peptide using Deeplearning○Kowit Hengphasatporn, Ryuhei Harada, Yasuteru Shigeta(CCC, Univ. Tsukuba)
kowith@ccs.tsukuba.ac.jp○内山 航 1, 菅瀬 謙治 1, 青木 航 2,3,4（1 京大院・農, 2 京都バイオ計測センター, 3 JST・さきがけ, 4 阪
大院・工）aoki.wataru@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景と目的】
非モデル生物が持つ多様な生命現象を理解することは生命の複雑さを理解する上で重要である。
生命現象を理解する上で、研究対象となる生物の全遺伝子ライブラリは重要なリソースとなる。しかし、遺伝子を個別にクローニングする従来の全遺伝子ラ
イブラリ構築法では、膨大な時間とコストが必要とされるため、非モデル生物の全遺伝子ライブラリはほとんど構築されていない。そこで本研究では、multiplex
PCR 法を改良し、全遺伝子を迅速かつ簡便に増幅できるような PCR 条件の探索・手法の開発に取組んだ。
【方法と結果】
我々は、大腸菌の全遺伝子を同時並列的に増幅出来る multiplex PCR 法を検討した。ず、プライマー設計と PCR 条件を再検討することで、ランダムに選択された数十種類の遺伝子を高効率で増幅出来る条件を探索した。次に、全遺伝子の増幅に必要となる PCR プライマーを簡便に取得する方法を構築し、multiplex
PCR で得られる増幅産物量を増やせるように最適化した。さらに、増幅した遺伝子断片をプラスミドベクターに一斉に導入する方法をデザインした。
今回開発したメソッドは、全遺伝子ライブラリをハイスループットに構築する
試みに大きく貢献すると期待される。

Cyclic peptides currently play a significant role in drug design and development owing
to potentially better specificity to a given target than small-molecule drugs and higher
membrane permeability than antibodies. However, a major challenge for researchers
working on cyclic peptide development is finding suitable cyclic peptides for theprotein target predicted by in silico techniques for in vitro or in vivo studies. Herein,
we developed software based on deep learning (DL) algorithms to address thesechallenges. The software offers 2 working modes for cyclic peptide construction; (i)the first mode starts with the user inputting cyclic peptide sequence, then processed by
the DL algorithm to find similar cyclic peptide information, match potential ligands,
scores them, and generates the one-dimensional (1D) cyclic peptide database. (ii) The
second mode begins with the user inputting a protein target information. After that, theprogram will search for the cyclic peptide/protein target-related information by the DL
algorithm and subsequentially generates a cyclic peptide database similar to mode (i).
Based on these two modes, the generated 1D cyclic peptide database was converted toa 3D structure and performed molecular dynamics optimization. We employed Mean
Absolute Error (MAE) as a metric to validate the accuracy and performance of ourmachine learning model. This program will contribute to developing cyclic peptidebased drugs by streamlining the process and improving efficiency for the docking
study.

Development of a multiplex PCR method for the high-throughput
construction of comprehensive gene libraries

3D structure construction of cyclic peptide using Deep learning

Key words
PCR, comprehensive gene library for non-model organisms, in vitro
reconstitution of biological phenomenon

Key words

virus, drug screening, computer-aided drug design, bioinformatics

1Gp02

1Gp04

塩基性 LEA ペプチドの発現による大腸菌の非生物的ス
トレス耐性の向上○Wataru Uchiyama1, Kenji Sugase1, Wataru Aoki2,3,4(1 Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 2 Kyoto Integrated Science & Technology BioAnalysis Center, 3 PRESTO, JST, 4 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

学

疎水性 de novo ペプチドナノポアの無細胞合成に向けたアプローチ○藤田 祥子 1, 川村 出 2, 川野 竜司 1
（1 農工大院・工, 2 横国大院・工）rjkawano@cc.tuat.ac.jp○Kowit Hengphasatporn, Ryuhei Harada, Yasuteru Shigeta(CCC, Univ. Tsukuba)○池野 慎也 1, 中村 颯斗 1, 岸川 颯真 1, メトワリー キャレド 2（1 九工大院・生体工, 2 Fac. Agric., AinShams Univ.）
ikeno@life.kyutech.ac.jp【背景と目的】ナノメートルサイズの穴であるナノポアを用いるナノポア計測技
術は、迅速、簡便かつラベルフリー検出が可能な電気的 1 分子計測法である。
我々は以前、より広範な分子の検出及び識別を目指し、脂質二分子膜中で会合して β バレルナノポアを形成する β ヘアピンペプチド SVG28 の新規設計を報告した。しかし、更なる SVG28 配列の最適化を行う上で、SVG28 は疎水性が高く化学合成が困難であることが課題であった。そこで本研究では、大腸菌の転写翻訳系を利用し簡便にペプチドを合成できる無細胞合成系を用いて SVG28の合成を試みた。
【方法・結果】高疎水性のため直接無細胞合成不可能な SVG28 の合成に向け、（1）配列内部の親水性変異導入（2）親水化アルギニンタグ付加（3）脂質成分添加を試みた。ペプチドの合成には再構成型無細胞合成系を用いた。（1）内部親水性変異の導入では SVG28 親水性改変体の無細胞合成に成功し、これらはナノポア形成能と単分子検出能を保持していた[1]。一方で会合モノマー数の減少とポアノイズの増大が見られ、これは親水性変異によりペプチドの膜中安定性が低下したためと考えられる[1]。
（2）親水化アルギニンタグの付加は配列内部に親水性変異を持たないためポア性能への影響が少ないと予想される。しかし、タグ付加 SVG28 は（1）と比較して合成効率が大きく低下し、疎水性ペプチドの無細胞合成には配列内部の親水性が重要であることが示された。（3）脂質成分の添加は膜タンパク質の無細胞合成に用いられており、リポソームなどを添加して疎水成分の凝集を抑制する。無細胞合成系に添加したリポソームを電気計測すると、ナノポア形成が見られたもののその傾向が変化した。そのため、今後は合成条件の最適化と全長合成の確認が必要である。
[1] S. Fujita, I. Kawamura, R. Kawano, ACS Nano, 17, 4, 3358-3367, 2023.

【背景と目的】LEA タンパク質は、植物の種子が乾燥耐性を得るために大量に発現する天然変性タンパク質である。近年、クマムシやネムリユスリカの幼虫などの極限環境で生存できる動物からも見出されている。LEA-I ペプチドはネムリユスリカ由来の LEA タンパク質の繰り返し配列を基に設計された 13 個のアミノ酸からなる機能性ペプチドであり、これを発現した大腸菌は様々なストレス耐性が向上することを報告している。本研究では、LEA ペプチドの変異体を設計し、それらを発現させた大腸菌に紫外線、乾燥、低温のストレス処理を行い、各耐性の評価を行った。対照として線虫由来の LEA ペプチドを発現させた大腸菌の評価も行うことで、ネムリユスリカ由来の LEA ペプチドとの比較検討を行った。
【方法および結果】
各 LEA ペプチド遺伝子を導入したプラスミドを用いて大腸菌 BL21(DE3)を形質転換した。得られた形質転換体を培養後、IPTG を添加し 4 時間ペプチドの発現誘導を行った。各組換え体に対して、紫外線、乾燥、低温のストレス処理を行い、ストレス処理前と処理後の大腸菌が LB 寒天培地に形成したコロニー数を指標として生存率を算出することで、ペプチドによるストレス耐性向上を比較評価した。
LEA-E、LEA-K、LEA-C.ele ペプチドを発現した大腸菌はその乾燥耐性の優位性を確認した。特に、LEA-K ペプチドは他の LEA ペプチドよりも高い細胞保護機能を示した。LEA-K ペプチドは他の LEA ペプチドよりも等電点が極めて高いことから、塩基性アミノ酸の導入が LEA ペプチド機能の向上に重要である可能性が考えられる。また、低温ストレス処理した際、すべての LEA ペプチドが大腸菌の低温ストレス耐性を向上させることを確認した。各 LEA ペプチド間で大きな優位性はみられず、他のストレス耐性向上メカニズムと違う作用機序でペプチドが細胞保護に寄与している可能性がある。

An approach for the cell-free synthesis of hydrophobic de novo peptide
nanopores

Enhanced abiotic stress tolerance in Escherichia coli by expression of basic
LEA peptide○Shoko Fujita , Izuru Kawamura , Ryuji Kawano(1 Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2 Grad. Sch. Eng., Yokohama Natl.
Univ.)
1

Key words

2

1

nanopore, cell-free synthesis, de novo design○Shinya Ikeno1, Hayato Nakamura1, Soma Kishikawa1, Khaled Metwally2(1 Grad. Sch. Life Sci. Syst. Eng., Kyushu Inst. Technol., 2 Fac. Agric., AinShams
Univ.)

Key words
Escherichia coli, abiotic stress tolerance, peptide, Late embryogenesis
abundant protein

102

1Gp05

ペプチド界面を用いた細胞外小胞ミグラソームの炎症誘導評価○齊藤 彰吾, 田中 祐圭, 大河内 美奈（東工大・物質理工）
okochi.m.aa@m.titech.ac.jp

1Gp07
学

CHL 細胞を用いたフコース構造類似糖鎖の添加による新規糖鎖合成系の開発○三石 秋澄 1, 三﨑 亮 2, 武智 大樹 2, 梶浦 裕之 2, 藤山 和仁 2
（1 阪大院・工, 2 阪大・生工国際セ）
fujiyama@icb.osaka-u.ac.jp

背景
非免疫細胞が局所的に過剰量の炎症性サイトカイン IL-6 を発現することにより誘導される IL-6 アンプは、自己免疫疾患に関与する。また、細胞外小胞ミグラ
ソームは、細胞が遊走後、足跡を残すように細胞接着面に形成される。本研究では、ミグラソームがもつ情報伝達機能の解明に向け、IL-6 アンプに着目し、ミグラソームの分画が可能なペプチド界面を用いたその炎症誘導について評価
を行った。
結果・方法
ミグラソームの分画に用いる基板は、インテグリンリガンドの RGDS ペプチドと細胞膜結合ペプチドを混合したペプチド溶液を作製して作製した。この基板上で細胞を培養後、インテグリンの結合作用を阻害する EDTA 10 mM を含む
PBS に 30 分浸漬することで細胞の剥離を行い、ミグラソームを基板上に分画した。
混合ペプチド修飾基板上に、ヒト脳神経膠芽腫細胞（H4）を播種し、一晩培養した。この細胞に対し、IL-6、可溶性 IL-6 受容体、腫瘍壊死因子 TNF-α をそれ
ぞれ 20 ng/mL となるように添加することで IL-6 アンプを誘導した。その後、IL-6 アンプを誘導した細胞由来のミグラソームをペプチド基板上に分画した。
この基板上で新たに細胞を播種し培養後、IL-6 の発現量を評価した。その結果、IL-6 アンプ誘導条件下で形成したミグラソームを取り込んだ IL-6 アンプ非誘導細胞において IL-6 発現量の上昇が確認され、ミグラソームを介した炎症誘導が確認された。
結言本研究で、ペプチド界面を用いることでミグラソームを分画し、炎症誘導機能について評価した結果、ミグラソームが IL-6 アンプに関与することを示した。
これは、ミグラソームが局所的な情報伝達に寄与することを示唆しており、ミグラソームの機能について新たな知見を得た。

〈背景と目的〉近年、抗体医薬品は標的物質への特異性が高く副作用が少ないため、次世代の主要バイオ医薬品として注目されている。また、抗体が持つ糖鎖の構成糖のひ
とつ「フコース」は抗体の重要な機能である抗体依存性細胞障害（ADCC）活性を抑制し、糖鎖へのフコース転移（フコシル化）を阻害すると ADCC 活性が上昇する。フコシル化は抗体重鎖定常領域の立体構造に影響するため、フコー
スの代替糖を付加した新規糖鎖を合成出来れば抗体機能をさらに向上できる可能性がある。本研究では、フコースの構造類似体であるアラビノースをフコー
ス代替糖候補として用いた。アラビノースを細胞培養液中に添加し、細胞が持つフコース転移酵素の基質特異性を利用した糖転移を試みた。さらに、フコシ
ル化糖鎖合成経路を抑制することで、効率よくアラビノースを付加出来る細胞構築に取り組んだ。
〈方法と結果〉
フコシル化糖鎖 de novo 合成経路に関わる酵素遺伝子を CRISPER/Cas9 によりノックアウトした変異チャイニーズハムスター肺（CHL）細胞を樹立した。LCMS/MS を用いて野生株の糖鎖型と比較した結果、変異 CHL 細胞では質量分析器レベルでフコシル化糖鎖が検出限界以下または 1％程度にまで減少していることを確認した。変異 CHL 細胞の培養液に対し、フコースの構造類似体である
アラビノースを、終濃度が 10 mM となるように添加した。アラビノース存在下
で 1 ヶ月培養した後、LC-MS/MS で細胞内に存在する糖鎖を解析したところ、
アラビノシル化糖鎖と推測される糖鎖を 2 種類検出した。変異 CHL 細胞と比較して、アラビノース添加 CHL 細胞ではフコシル化糖鎖の割合が 0.2％程度減少
し、糖鎖型全体に占める割合で比較して、アラビノシル化糖鎖をフコシル化糖
鎖の約 2 倍量に増加することに成功した。

Evaluation of inflammatory response regarding extracellular vesicles"migrasome" using a peptide interface.

Application to novel glycosylation for antibody production by addition of
Fucose like sugars to CHL cells○Shogo Saito, Masayoshi Tanaka, Mina Okochi(Sch. Mater. Chem. Technol., Tokyo Tech)

Key words

1Gp06○Azumi Mitsuishi1, Ryo Misaki2, Hiroki Takechi2, Hiroyuki Kajiura2,
Kazuhito Fujiyama2(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 ICBiotech, Osaka Univ.)

peptide, extracellular vesicles

Key words

glycosylation, fucosylation, CHL cell

乳酸菌が産生する細胞外膜小胞の高生産条件の検討

1Gp08

脱シアル化したヒト肝細胞への HBV 感染効率の評価○前田 朝海 1, 倉田 淳志 2, 河野 健一 3, 上垣 浩一 2
（1 近大院・農, 2 近大・農, 3 京大院・薬）095605@nara.kindai.ac.jp

学○原山 魁 1, 三﨑 亮 2, 長野 太志朗 2, 梶浦 裕之 2, 藤山 和仁 2
（1 阪大院・工, 2 阪大・生工国際セ）
fujiyama@icb.osaka-u.ac.jp【目的】乳酸菌は、細胞膜から構成される膜小胞（membrane vesicles、MVs）を培養液中に生産し、その MVs が免疫賦活作用を示すことが明らかになりつつある。そこで乳酸菌の MVs 高生産条件を検討した。MVs 生産乳酸菌に変異処理を行い、MVs 高生産株を探索した。さらに MVs 高生産培地を検討した。
【方法・結果】UV 照射により乳酸菌 RD055328 株から得た変異株 88 株に対して、曲率認識ペプチドを用いて MVs 生産量を評価した結果、野生株と比較してMVs 量が変化した変異株 2 株（MT3、MT13）を得た。続いて細胞膜特異的な蛍光色素 FM4-64 を用いて、変異株と野生株の培養液中の MVs 量を比較した結果、変異株 MT3 と MT13 の MV 画分の蛍光強度は、野生株の MV 画分の蛍光強度のそれぞれ 11 倍、1.7 倍であった。蛍光ナノ粒子トラッキング解析で野生株と変異株 MT3 の MV 画分の粒子濃度を比較した結果、培養液の OD600 あた
り MT3 株は野生株の 24 倍の MVs を生産した。さらに、野生株と MT3 株のMV 画分のゼータ電位を測定した結果、それぞれ-1.1 mV、-33.8 mV であった。
一般的に乳酸菌の培養には、0.1% Tween80 添加培地が用いられる。0.1% Tween80
添加および無添加培地を用いて、Lactiplantibacillus plantarum JCM 8341 の培養
液中の MVs 濃度を蛍光ナノ粒子トラッキング解析で比較した。その結果、0.1%
Tween80 添加および無添加条件では、OD600 あたり本菌株は培養液中にそれぞれ 6.9×105 particles/ml 、 1.8×107 particles/ml の MVs を 生 産 し た 。 さ ら に
Tween20、Tween40、Tween60、Tween80 をそれぞれ 0.1%添加した培地を用いて本菌株を培養して、FM4-64 を用いて OD600 あたりの各培養液中の MVs 量を比較した。その結果、Tween80 を添加した培養液から得た MV 画分の蛍光強度に比べて、Tween 無添加および Tween40 を添加した培養液から得た MV 画分の蛍
光強度は、それぞれ 1.9 倍、2.7 倍に増加した。

背景と目的
B 型肝炎ウイルス（HBV）感染は世界的な公衆衛生問題であり、約 2 億 9600
万人が慢性的に感染していると推定されている。深刻な感染症であるにもかかわらず、現在の臨床治療では感染した細胞から HBV を完全に除去することは困難とされており、新しい抗 HBV 剤が必要とされている。糖鎖は、細胞の識別や情報交換のためのマーカーとして生理的な役割を担っている。また、いく
つかの病原ウイルスの細胞への感染に大きく関与することも分かってきた。先行研究で、我々は HBV 生産細胞で糖鎖のシアリル化を抑制すると、細胞からの HBV 分泌を阻害できることを報告した(Priyambada et al., 2018)。一方で、シアリル化糖鎖が HBV の感染過程にどのような影響を与えるかはまだ明らかではない。本研究では、HBV 感染モデル細胞であるヒト肝癌細胞を用い、感染標
的細胞のシアリル化糖鎖合成の抑制が HBV 感染効率にどのような影響を及ぼすのかを調査した。
方法と結果
シアリル化糖鎖合成にかかわる酵素をゲノム編集技術を用いてノックアウトし、糖鎖が脱シアリル化したヒト肝癌細胞を構築した。蛍光標識したレクチンを用い、細胞表面のシアリル化糖鎖を染色したところ、ノックアウト株では蛍光がほとんど検出できなかった。また、本細胞から糖タンパク質を抽出し、シアリ
ル化糖鎖量を逆相液体クロマトグラフィーで分離・精製し、質量分析器で解析を行った。その結果、野生株と比較してノックアウト株ではシアリル化糖鎖量が 96%減少した。次に、野生株とノックアウト株を標的として HBV を感染した。感染後の細胞より核酸を抽出し、含まれるウイルスの核酸量をリアルタイ
ム定量 PCR で解析した。その結果、ノックアウト株に対する HBV 感染効率が野生型と比較して約３倍上昇した。以上のことから、宿主細胞におけるシアリ
ル化糖鎖の存在が HBV 感染の防御機構に寄与していると考えた。

Breeding of a strain of lactic acid bacterium with high productivity ofmembrane vesicles and culture conditions for the membrane vesiclesproducing lactic acid bacterium

Evaluation of HBV infection efficiency to desialylated human hepatocytes○Asami Maeda1, Atsushi Kurata2, Kenichi Kawano3, Koichi Uegaki2(1 Grad. Sch. Agric., Kindai Univ., 2 Fac. Agric., Kindai Univ., 3 Grad. Sch. Pharm.
Sci., Kyoto Univ.)

Key words

lactic acid bacteria, membrane vesicles, breeding, culture condition○Kai Harayama1, Ryo Misaki2, Daijiro Nagano2, Hiroyuki Kajiura2,
Kazuhito Fujiyama2(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 ICBiotech, Osaka Univ.)

Key words

hepatitis B virus, sialylation, hepatocyte

103

1Gp09
学

大腸菌を用いたハーブ植物由来アピゲニン二糖配糖体の
生産

1Gp11

比較ゲノム解析が明らかにする Pseudomonas
fluorescens 及び Pseudomonas putida の「真」の分類○諸星 知広 1, 谷口 尚哉 1, 染谷 信孝 2
（1 宇都宮大院・地域創生, 2 農研機構）
morohosi@cc.utsunomiya-u.ac.jp○小林 美稀 1, 石水 毅 2, 大橋 貴生 1
（1 摂南大院・理工, 2 立命館大・生命科学）
takao.ohashi@lif.setsunan.ac.jp【背景・目的】植物特化代謝産物の一種であるフラボノイドは、糖鎖が付加することで配糖体化し多様な構造と機能を有する。セロリやパセリ、カモミール等のハーブ植物は、抗不安や頭痛緩和等の機能を持つ食材として利用されてきた。
ユニークな単糖アピオースを含むアピゲニン二糖配糖体（アピイン）は、これらのハーブ植物内の主要なフラボノイド配糖体である。アピインの糖鎖部分が抗不安等の機能に重要な役割を果たしていると考えられるが、詳細な分子メカ
ニズムは未解明である。その分子メカニズム解明のためには大量のアピインが必要であるため、本研究では大腸菌を用いたアピインの生産を目的とした。
【結果・考察】アピイン生合成に関わる 3 種類の酵素遺伝子（UDP-アピオース
合成酵素、グルコース転移酵素、アピオース転移酵素）を導入した組換え大腸菌を作製した。この組換え大腸菌からタンパク質を抽出し、SDS-PAGE とウエ
スタンブロットによりタンパク質の発現を確認した。次に、形質転換体を生体触媒とし、受容体基質であるアピゲニンに作用させ、アピイン生産を行った。
発酵生産物の逆相 HPLC 解析を行ったところ、アピインの生産が確認された。
微生物を用いたアピインの発酵生産は本研究が初めての報告である。今後は、糖転移酵素の基質となる UDP 糖の合成量増加を狙い、UDP-グルコース合成経路を増強させることで、更なるアピイン生産量向上を目指す。

Pseudomonas fluorescens 及び Pseudomonas putida は、バイオコントロール剤や環境浄化細菌として広い分野で用いられてきたが、従来は蛍光発現や運動性といった特徴を指標に分類が行われてきたため、定義が曖昧で誤同定が多いのが現状である。本研究では、微生物保存機関 JCM 及び NBRC から入手した菌株について、各基準株に対し明確に同種として分類できる「真」の P. fluorescens 及び
P. putida を特定することを目的とした。
JCM 及び NBRC から入手した 33 株の P. fluorescens と 46 株の P. putida について、16S rRNA 及び rpoD の連結配列を基に系統樹を作成し、98%の同一性を指標に OTU 分類を行ったところ、P. putida は 9 つの OTU に分類され、P. putida
JCM 13063T を含む OTU には 6 株しか分類されなかった。また、P. fluorescens
JCM 5963T と同じ OTU に分類される菌株は存在せず、真の P. fluorescens に分類できる菌株は基準株の JCM 5963 のみであるという結論に至った。
ゲノムレベルで真の P. putida を特定するため、JCM 13063 に近縁な 13 株のドラ
フトゲノムを取得し、JCM 13063 に対する ANI 値と dDDH 値を計算したとこ
ろ、JCM 20005、JCM 21368、JCM 13061 の 3 株のみが同種の基準である
ANI≧95%、dDDH≧70%をクリアしたため、本研究で用いた 46 株の中で、基準株を含む 4 株のみが真の P. putida であるとの結論に至った。
NCBI データベースから入手した P. putida のゲノム配列の中から、真の P. putida
だけに共通するオルソログを探索したところ、hypothetical protein をコードする
特異的な遺伝子の存在が明らかになった。この遺伝子をターゲットとしたプライマーを作成し、P. putida 46 株についてコロニーダイレクト PCR を行ったとこ
ろ、真の P. putida に分類される 4 株のみで PCR 増幅が見られた。よって、このプライマーは真の P. putida を検出するための有効なツールとなる可能性が示唆された。

Production of the herbal plant-derived apigenin diglycoside in Escherichia
coli

Comparative genomic analysis reveals the classification of the "true"
Pseudomonas fluorescens and Pseudomonas putida○Miki Kobayashi1, Takeshi Ishimizu2, Takao Ohashi1(1 Grad. Sch. Sci. Eng., Setsunan Univ., 2 Coll. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)○Tomohiro Morohoshi1, Naoya Yaguchi1, Nobutaka Someya2(1 Grad. Sch. Reg. Dev. Creat., Utsunomiya Univ., 2 NARO)

Key words

Escherichia coli, Flavonoid, glycosyltransferase

Key words
Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, genome, comparative
genomic analysis

1Gp10

脱皮に関連した陸ガニ由来キチナーゼの解析

1Gp12○永倉 佑真, 三宅 克英（名城大院・理工）
miyake@meijo-u.ac.jp

アンモニアガス耐性細菌 Paenibacillus lentus NH33 の化
学合成独立栄養性およびアンモニアガス耐性機構
清 啓自, ○吉田 ナオト（宮崎大・農）a04109u@cc.miyazaki-u.ac.jp

カニやエビなどの外骨格はキチンが主要成分である。キチンは N-アセチルグル
コサミンが b-1,4 結合で直鎖状に数百から数千も繋がった難分解性，不溶性の多糖であり、これらの動物ではカルシウムなどと結合し、強度成分として機能している。地球上で年間、約 1,000 億トン合成されており、セルロースに次ぐ資源量であるが、毎年大量に廃棄されている。このキチンからは、構成糖である N-アセチルグルコサミンには変形性膝関節症の改善効果や美肌効果、分解オ
リゴ糖には動植物の自然免疫系を活性化して生体防御反応を惹起するエリシター活性が報告されている。本研究では，分解産物を得るための酵素としてカニ本体のキチナーゼに着目した。日本の海岸林に多く生息するアカテガニのRNA-seq を行い、キチナーゼを単離し，解析した。
アカテガニの臓器及び、体液の活性測定を行ったところ、中腸線、胃、体液で強い活性を示した。また脱皮中の方が強い活性を示した。そこで肝臓と膵臓の機能を持ち、多くの酵素の生産を担っているアカテガニの中腸腺から全 RNAを精製し、RNA-seq に供した。この際、通常と脱皮直後のカニの２つのサンプ
ルを用意した。この RNA-seq の解析から、キチナーゼ遺伝子を複数見出した。
ほとんどのキチナーゼは脱皮直後のカニで発現が昂進していた。そのうち最も発現量の多い酵素（29294）は、GH18 ファミリーに属するエキソ型のキチナーゼであり、全キチナーゼ発現量の大半（通常カニ 87％、脱皮カニ 98%）を占めていた。29294 キチナーゼを大腸菌に生産させて活性を解析したが、強い活性は得られなかった。そこで酵母で新たに生産を行ったところ、強い活性を得られた。その中でも非結晶性であるキチンで強い活性を示した。今後は結晶性のキチンを分解できるキチナーゼの探索も行う予定である。キチン結合ドメインを複数もつ酵素に着目している。

アンモニアガス(AmG)耐性細菌を 1350ppm AmG 存在下、グルコースを含む最少培地（MMG）にて単離した。16SrRNA の塩基配列の比較から単離菌をPaenibacillus lentus NH33 とした。NH33 の生育において AmG の最少阻止濃度は4500ppm であり、NH33 は E. coli や同属の P. illinoiensis と比較して強い AmG 耐性があった。NH33 は最少培地（MM）でも生育できるので、化学合成独立栄養が可能である。解離アンモニア（NH4 ＋）との代替では生育不可であるので、
NH33 は絶対 AmG 要求性といえる。MMG、MM における生育最適 AmG 濃度はそれぞれ 1350ppm、170ppm であった。独立栄養条件で 15NH3 の元で培養すると、細胞の窒素の全てが 15N で構成されていた。
全ゲノムシーケンスによると、NH33 のゲノムサイズは約 580 万塩基対であった。アンモニア酸化に必要なアンモニアモノオキシゲナーゼ遺伝子は確認されなかった。したがって既知アンモニア酸化細菌とは異なる機構でエネルギーを得ていると思われる。炭素固定については還元的 TCA サイクルによるのではな
いかと推測される。
独立栄養条件で発現する RNA を調べると、tmRNA、lantibiotic subtilin、cold
shock protein D2 の順に高かった。これらの遺伝子を大腸菌に導入発現させ、AmG 耐性を比較すると、耐性度の増大が確認された。これらの遺伝子は AmG
耐性付与に関与していると思われる。NH33 では特に tmRNA は高発現しており、アンモニアから受ける mRNA の障害を除去しているのではないかと思われる。

Analysis of Chitinase from A Land Crab

Chemolithoautotrophy and ammonia gas tolerant mechanism of ammonia
gas tolerant bacterium, Paenibacillus lentus NH33

○Yuma Nagakura, Katuhide Miyake(Fac. Sci. Tech, Meijo Univ.)

Key words

chitinase, land crab, molting

Keiji Kiyoshi, ○Naoto Yoshida(Fac. Agric., Univ. Miyazaki)

Key words

ammonia-tolerant, ammonia metabolism, Paenibacillus sp., tmRNA

104

1Gp13

中等度酸性条件下での鉱水処理に関わる微生物相の
解析

1Gp15

ヤマブシタケが齲蝕病原性細菌 Streptococcus mutans のバイオフィルム形成に及ぼす影響○阿座上 弘行 1,2,3, Siddiqa Ayesha 2, 濱治 百々子 3, 森川 眞有 4,石丸 隆行 5
（1 山口大・中高温微セ, 2 鳥取大院・連農, 3 山口大院・創成科
学, 4 山口大・農, 5 宇部フロンティア大・食物栄養）
azakami@yamaguchi-u.ac.jp○金尾 忠芳 1, 八塚 優衣 1, 上村 一雄 1, 赤堀 文雄 2, 稲谷 博征 2,
公文 翔一 3, 佐藤 王高 3
（1 岡山大院・環境生命, 2 卯根倉鉱業, 3 DOWAホールディングス）tkanao@okayama-u.ac.jp【背景と目的】酸性鉱山排水（AMD, Acid Mine Drainage）は、人間の活動によって空気（酸素）を含む地下水が鉱床と反応することによって発生する。多くの場合、強酸性で大量の二価鉄イオン（Fe2+）を含むため、そのまま流出すると甚大な環境と生態系に甚大な被害を及ぼす。従って、AMD は中和と除鉄という２つの処理を施さなければならない。岡山県美咲町柵原鉱山から流出する
AMD は、酸性条件下で鉄酸化細菌を利用し、中和処理の前に溶存する Fe2+ を予め酸化することで、中和コストの削減に成功している。今回、生物的鉄酸化処理を現行の pH 2.5 から pH 3.5~4.0 で行うことで、Fe3+ の中和処理への混入を防ぎ、生物的鉄酸化物として回収することを目的とした。またそれらの微生物相を解析した。
【方法と結果】柵原鉱山鉱水処理施設内に pH 調整が可能なミニプラントを設置
し、実験を行なった。発生する AMD を NaOH で pH 3.5 または 4.0 に調整して鉄酸化槽へと送液し、曝気すると 2~5 日で二価鉄の酸化が確認できた。それぞれの pH における鉄酸化処理液から DNA を回収し、16S rRNA 塩基配列に基づ
く次世代シーケンスによる菌相解析を行なった。その結果、pH 4.0 では
Ferritrophicum, Acidimicrobium 属細菌が鉄酸化細菌として計６割を占めていたのに対し、pH 3.5 では Ferritrophicum 属細菌が全体の約９割を占めていた。現行
施設の鉄酸化処理槽（pH 2.5）では Ferrovum 属細菌が主な鉄酸化細菌として検出されるほか好酸性の Acidiphilium 属が優先種となり、異なる菌相を示した。
この Ferritrophicum 属の鉄酸化細菌は、登録されている Ferritrophicum radicicola
CCJ 株と 99.3%の相同性を示したが、pH 7.0~4.5 で生育する好中性の鉄酸化細菌であっため、pH 3.5 で優先種となる Ferritorophicum 属細菌は新規な鉄酸化細菌であることが期待できた。

Streptococcus mutans は、う蝕病原性微生物の 1 つと考えられており、口腔内のS. mutans のバイオフィルム形成を除去および制御することは、虫歯の予防に重要であると考えらる。 Hericium erinaceum (ヤマブシタケ) は、神経保護、抗炎症、抗酸化特性など、さまざまな薬理作用を示すことが報告されている食用キノコである。 以前、ヤマブシタケ抽出物が歯周病関連細菌 Eikenella corrodensのバイオフィルム形成を阻害することを報告した。
本研究では、 S. mutans UA159 を使用して、そのバイオフィルム阻害能力を観察した。 ヤマブシタケ抽出物はショ糖存在下で UA159 を阻害した。 抽出物は
S. mutans の増殖を阻害しなかったため、バイオフィルムの阻害は S. mutans に対する殺菌活性によるものではないと仮定した。 また、S. mutans のう蝕の病因に関与するグルカン形成を阻害する能力も示した。 S. mutans は、他の多くの口腔細菌と同様に、AI-2 をクオラムセンシングのシグナル (オートインデュー
サー) として使用する。 ヤマブシタケ抽出物の添加は、S. mutans の AI-2 産生にも影響を与えることが示された。 S. mutans は、AI-2 以外にもクオラムセンシ
ングに CSP および XIP のシグナルも使利用する。 ヤマブシタケによるバイオ
フィルム阻害に対する AI-2 の効果を明らかにするために、それぞれ CSP と XIPを合成できない comC と comX 欠失株を使用した。 その結果、ヤマブシタケ抽出物による S. mutans バイオフィルム形成は、comC を介した CSP を介して AI-2
産生を減少させ、QS に影響を与えることによって抑制される可能性があることが示唆された。

Microbial community analysis of the biological iron-oxidation system foracid mine drainage treatment under moderate acidic conditions.

Effects of yamabushitake extract on the biofilm formation of Streptococcus
mutans○Tadayoshi Kanao1, Yui Yatsuka1, Kazuo Kamimura1, Fumio Akahori2,
Hiromasa Inaya2, Shoichi Kumon3, Kimitaka Sato3(1 Grad. Sch. Environ. Life Sci., Okayama Univ., 2 Unekura mining Ltd., 3 DOWA
HDs.)

Key words
metagenome

1Gp14
学

acid mine drainage, moderate acidophilic bacteria, iron oxidation,○Hiroyuki Azakami1,2,3, Ayesha Siddiqa2, Momoko Hamaji3, Mayu Morikawa4,
Takayuki Ishimaru5(1 Res. Center Thermotolerant Micorob. Resour., Yamaguchi Univ., 2 United Grad.
Sch. Agric. Sci., Tottori Univ., 3 Grad. Sch. Sci. Tech. Innov., Yamaguchi Univ.,
4Fac. Agric., Yamaguchi Univ., 5 Dept. Food Nutr., Ube Frontier Univ.)
Key words
Streptococcus mutans, biofilm, mushroom extract, quorum sensing

耐塩性好酸性鉄酸化細菌の分離培養

1Hp01○八塚 優衣 1, 新田 優香 2, 根本 理子 1, 田村 隆 1, 金尾 忠芳 1
（1 岡山大院・環境生命, 2 岡山大・農）tkanao@okayama-u.ac.jp

学

大腸菌におけるジペプチド Ala-Gln によるグルタミン代
謝の制御○秋元 美月, 岩井 伯隆, 和地 正明（東工大・生命理工）
mwachi@bio.titech.ac.jp【背景と目的】バイオリーチングは、微生物を利用して酸性環境下で硫化鉱石から銅などの有用金属を回収する湿式製錬方法である。これは生物的な精錬のため、低品位鉱石からも回収が可能であることが利点であり、鉄酸化細菌が利用されている。鉄酸化細菌は二価鉄イオン（Fe2+）を三価鉄イオン（Fe3+）に酸化してエネルギーを得る独立栄養細菌であり、特にバイオリーチングには強酸性環境を至適 pH とする好酸性鉄酸化細菌の働きが重要である。好酸性鉄酸化細菌は、強酸性環境に耐えるため、膜が正電荷を帯びており静電的反発によってプロトンの生体膜内への侵入を防いでいる。この性質から、好酸性鉄酸化細菌には陰イオン耐性が低く、特に塩化物イオン存在下では鉄酸化活性が低下する
ことが報告されている。乾燥地帯や半乾燥地帯などの淡水利用が制限される地域には鉱山が多く存在し、製錬に用いられる工業用水と人が利用する生活用水の対立が問題となっている。このことから、バイオリーチングに海水の利用が検討され、これに必要となる耐塩性鉄酸化細菌の探索が行われてきた。しかしながらその報告はほとんどないため、本研究において耐塩性好酸性鉄酸化細菌の獲得を目的とした。
【方法と結果】酸性鉱山排水処理場など自然界から試料を採取し、エネルギー源として 20mM FeSO4 を添加し好酸性鉄酸化細菌の集積培養を行った。これらか
ら固体培地でコロニーを形成させ単離菌株を得た。単離菌株に対し 2% NaCl 添
加培地で培養し、耐塩性鉄酸化細菌のスクリーニングを行った。2% NaCl 添加培地で唯一鉄酸化活性が確認された菌株を YU-1 とし、16S rRNA の部分配列を決定した結果、Acidithiobacullus ferrooxidans と最も高い相同性を示した。YU-1
を培養液の塩濃度を段階的に引上げて培養した結果、3.3% NaCl 添加培地でも鉄酸化活性が確認できた。

Bacillus 属細菌から見出された遊離アミノ酸同士を α 位で結合させる酵素 Lamino acid α-ligase（LAL）を大腸菌で発現させることによって、グルコースとアンモニアを原料とした安価で高効率なジペプチド Ala-Gln の発酵生産法が開発された。しかし、生産されたジペプチドの分解を防ぐためにペプチダーゼをコードする pepA、pepB、pepD、pepN の 4 重欠損株（Δpeps 株）を構築したところ、Ala-Gln によってその増殖が阻害されるという現象が報告された。これ
までの研究により、Ala-Gln による生育阻害は GcvB small RNA 依存的にグルタ
ミン酸や分岐鎖アミノ酸などの複数のアミノ酸の生合成が抑制されるためであることが明らかとなった（Miyakoshi et al., Mol. Microbiol., 2022）。しかしながら、大腸菌が Ala-Gln を感知するメカニズムや、Ala-Gln とは一見関係のないアミノ酸の生合成が抑制される生理的意義は分かっていない。本研究では、大腸菌におけるジペプチド Ala-Gln によるアミノ酸代謝の制御機構の生理的意義の解明を目的とした。
大腸菌のグルタミン要求性変異株 ΔglnA 株にグルタミン源として Ala-Gln または Gln を添加した場合の細胞増殖やジペプチド及びアミノ酸の消費速度を測定した。Ala-Gln と Gln をそれぞれ単独で加えた場合、Ala-Gln のほうが増殖速
度、消費速度ともに速かった。また、Gln に少量の Ala-Gln を添加すると、AlaGln を単独で添加したときと同じレベルにまで増殖と消費が速まった。このことから、Ala-Gln は Gln の代謝を促進する効果があることが示唆された。Gln 代謝系の遺伝子の発現量を qRT-PCR により定量したところ、Gln に少量の Ala-Glnを添加すると Gln 単独の時に比べて Gln 取り込み担体をコードする glnHPQ オ
ペロンの転写量が顕著に増大することが明らかとなった。このことから Ala-Gln
は Gln の取り込みを促進することが示唆された。

Isolation and cultivation of salt-tolerant acidophilic iron-oxidizing bacteria

Regulation of glutamine metabolism by dipeptide Ala-Gln in Escherichia
coli○Yui Yatsuka1, Yuka Nitta2, Michiko Nemoto1, Takashi Tamura1, Tadayoshi Kanao1(1 Grad. Sch. Environ. Life Sci., Okayama Univ., 2 Fac. Agric., Okayama Univ.)

Key words

isolation, salt tolerance, Acidithiobacillus ferrooxidans○Mizuki Akimoto, Noritaka Iwai, Masaaki Wachi(Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)

Key words

amino acid, peptide, gene expression, metabolism

105

1Hp02
学

PET 分解経路遺伝子群の枯草菌への導入と分解活性の評価
藤猪 志歩 1, ○田代 元彦 1, 山本 純子 2, 猪又 俊輔 2, 平谷 航 1,
上原 美夏 1, 長谷 純崇 1, 秋山 真那斗 1, 板谷 光泰 2, 宮本 憲二 1,
片岡 正和 2, 榊原 康文 1
（1 慶大, 2 信州大・工）yasu@bio.keio.ac.jp

1Hp04
学

放線菌 Streptomyces lividans において糖消費と二次代謝物生産を向上させる中央代謝経路の遺伝子破壊○中澤 堅太朗 1, 山本 省吾 2, 柘植 陽太 1,3（1 金沢大院・自科, 2 長瀬産業, 3 金沢大・新学術）
ytsuge@staff.kanazawa-u.ac.jp

合成生物学の手法を適用して外来の代謝経路を微生物に導入し，生産性の高い
新たな生命システムを創り出す研究が活発に行われるようになった．本研究では PET(ポリエチレンテレフタラート)を分解する Ideonella sakaiensis 201-F6 株が保有する PETase(PET 分解酵素) を含む代謝経路中の全遺伝子を枯草菌 Bacillus
subtilis RM125 株に導入し，PET 分解活性の評価および RNASeq によるトラン
スクリプトーム解析を行った．PETase は大腸菌などの様々な生物種に導入されているものの，PET 代謝経路に関係する全遺伝子を導入した例はない．
PET から TCA 回路までの経路を設計し，その 14 遺伝子の DNA 配列を取得，コドン最適化を行い，Bacillus subtilis RM125 に導入した株を作製した．PETase
単体を導入した株 p21-032 と PETase プラスミドに加え下流の 13 遺伝子群をオ
ペロン構造として設計し導入した株 p22-121 で，逆転写 PCR により導入したすべての遺伝子の発現を確認した．次に，p22-121 について BHET 培地で培養を行い，RNASeq による遺伝子発現差異解析を行なったところ BHET 培地では野生株と比較して導入経路より下流の遺伝子の発現上昇が確認された．
PET 分解活性の評価では，BHET 添加培地において BHET，MHET，TPA を
HPLC により定量した．BHET に関し，p21-032 及び p22-121 で野生株と比較し有意に分解されていることが確認された．また MHET の生成量に関し，p22-121
では p21-032 と比較し有意に低いことが確認されたことから，PETase だけではなく導入した下流遺伝子による代謝経路が動作していることが示唆された．

【背景と目的】放線菌 Streptomyces 属は様々な抗生物質や生物活性物質などの二次代謝物の生産菌として知られている。そのため二次代謝に関する研究は多く行われているが、一次代謝に関しての研究は進んでいない。二次代謝物は増殖期に中央代謝経路を利用して合成した一次代謝物を前駆体として合成される。
従って、中央代謝経路の改変は一次代謝物及びそれらを前駆体として合成される二次代謝物の生産に大きな影響を与える可能性がある。そこで本研究ではStreptomyces lividans における中央代謝経路の改変に伴う代謝変動を明らかにすることを目的とし、中央代謝の 1 遺伝子の欠損が一次代謝及び二次代謝に与える影響を検証した。
【結果と考察】S. lividans 1326 株と中央代謝遺伝子欠損株を、合成培地を用いてフラスコ培養した結果、遺伝子欠損株では野生株と比較してグルコース消費量
が 44%増加した。また、遺伝子欠損株では S. lividans が生産する二次代謝物の一つである undecylprodigiosin の生産量が野生株の最大 4.8 倍に増加した。次に二つの株をジャーファーメンターで培養した結果、遺伝子欠損株ではグルコー
ス消費量が野生株の 2.5 倍に増加した。大腸菌やコリネ型細菌では本遺伝子の欠損により増殖速度やグルコース消費が減少すると報告されており、S. lividans
では異なる表現型を示した。以上のように、S. lividans では本遺伝子の欠損により、二次代謝物の生産量に加えてグルコース消費量が増加することを明らかにした。この結果は S. lividans の一次代謝物の生産宿主としての可能性を開拓す
るものと期待できる。

Introduction of PET degradation pathway into Bacillus subtilis andevaluation of its degradation activity

Gene disruption of the central metabolic pathway that enhances sugar
consumption and secondary metabolite production in Streptomyces lividans

Shiho Fujii1, ○Motohiko Tashiro1, Junko Yamamoto2, Shunsuke Inomata2,
Wataru Hiratani1, Mika Uehara1, Sumitaka Hase1, Manato Akiyama1,
Mitsuhiro Itaya2, Kenji Miyamoto1, Masakazu Kataoka2, Yasubumi Sakakibara1(1 Keio Univ., 2 Eng. Fac. Eng., Shinshu Univ.)○Kentaro Nakazawa1, Syogo Yamamoto2, Yota Tsuge1,3(1 Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2 NAGASE & CO., LTD,
3
InFiniti, Kanazawa Univ)

Key words

Bacillus subtilis, genome engineering, PET, metabolic engineering

Key words
Streptomyces, central metabolic pathway, suger consumption,
secondary metabolites

1Hp03

リボソーム結合配列の改変による幅広い解糖系のフラックス比を持つ大腸菌ライブラリの構築

1Hp05

学

○下谷 朋輝 1, 澤田 将吾 2, 戸谷 吉博 1, 清水 浩 1（1 阪大院・工, 2 AGC）
shimizu@ist.osaka-u.ac.jp

学

プラスミド保持による負荷を回避するための代謝制御様式の解明○日高 聖覚 1, 水口 千穂 1,2, 鈴木 研志 1,2, 岡田 憲典 1, 岡橋 伸幸 3,
野尻 秀昭 1,2
（1 東大院・農生科, 2 東大・微生物連携機構, 3 阪大院・情報）
anojiri@g.ecc.u-tokyo.ac.jp【背景・目的】
微生物を用いた物質生産において、フラックスを制御して最適化する技術が求められているが、RNAi や CRISPRi などの制御技術は代謝に負荷がかかる場合があり、自在に代謝フラックスを変えることは困難であった。一方、染色体上のリボソーム結合部位（RBS）の塩基配列を改変する手法では、外来遺伝子を導入する必要がなく、フラックス分布を自在に制御できるという利点がある。
本研究では、大腸菌の 3 つの解糖経路(EMP,PP,ED)の分岐に関わる酵素遺伝子のRBS を改変し、フラックス比が異なるライブラリの構築を目指した。EMP と
PP 経路の分岐に関わる pgi の発現抑制株は先行研究で取得されたため、PP とED 経路の分岐に関わる gnd の RBS への変異導入を行い、gnd の段階的な発現抑制株の取得を試みた。
【方法・結果】
gnd の RBS を改変するため、多重自動ゲノム工学法(MAGE）を用いて変異導入を行った。用いたオリゴ DNA は MODEST を用いて段階的に gnd の発現量が低下するように設計した。比増殖速度が低下した変異株について、13C 標識実験を行い PP と ED 経路のフラックス比を決定した。その結果、PP 経路のフラックスが 50 %抑制された株を取得することができた。同様の方法で、pgi 抑制と
gnd 抑制を組み合せた 2 遺伝子抑制株の取得を試みた。組合せ抑制株についても解糖系のフラックス比を測定し、pgi の抑制に伴って EMP 経路が減少し、gndの抑制に伴って PP 経路が減少することを確認した。この結果より、複数遺伝子の場合においても RBS 改変によるフラックスの調節が可能であることが示された。また、構築した pgi と gnd の組み合せ抑制株のライブラリでは、3 つの解糖経路のフラックス比が段階的に変化し、フラックス比の実現可能な範囲を網羅していた。本株に有用物質生産に必要なプラスミドを導入することで、フラックス比が生産性に及ぼす影響の解析が可能になる。

プラスミドは宿主に抗生物質耐性等の新規形質を付与する一方で、プラスミド
由来の形質が宿主にとって有利でない非選択条件下では、その保持は宿主に負荷を及ぼす。この負荷により、プラスミドの細胞内での安定性の低下や宿主の集団中での生残性の低下等が引き起こされる。
当研究室の過去の研究で、Pseudomonas resinovorans CA10dm4 株において、様々な不和合性群のプラスミドを保持させても生育負荷を感じない「プラスミド非感受性」が見出された。当該形質に関与する遺伝子の探索のため、CA10dm4 株のトランスポゾン (Tn5) 変異株ライブラリを用いたスクリーニングが行われ、プラスミド感受性株が 2 株取得された。両株を用いた解析の結果、硫黄代謝系の 主 要 転 写 制 御 因 子 で あ る CysB と 、 そ の 制 御 下 の 3 つ の 転 写 制 御 因 子(SpiR1〜3) からなるネットワークが当該形質の発揮に必須であると同定された。
しかし、上記以外にプラスミド非感受性に寄与する分子機構は未解明である。
また CysB の活性化には co-factor が必要であり、co-factor は硫黄代謝経路の中間代謝産物である可能性が示唆されているが、その正体は未解明である。
本研究では、CysB の co-factor を含め、プラスミド非感受性の発揮に重要な因子の探索を目指し、CA10dm4R(pCAR1PK) 株と、当該株のプラスミド感受的な変異株 (2 つの Tn5 変異株、spiR3 破壊株) を用いてメタボローム解析を行った。
各株をコハク酸を唯一の炭素源とする培地で対数増殖期まで培養し、細胞内の代謝産物をメタノールで抽出後、CE-TOFMS で解析し、216 種の化合物が検出された。主成分分析の結果、変異株は野生型株と比べ異なる代謝プロファイルを示した。更に、その違いはシステイン代謝やグルタミン酸代謝、及びペントー
スリン酸経路上の化合物の増加に起因し、これらがプラスミド非感受性の発揮に重要である可能性が示唆された。

Constructing a strain library that takes a variety of glycolytic flux ratio by
ribosome-binding sequences engineering in Escherichia coli

Host metabolism reducing fitness cost imposed by plasmid carriage○Tomoki Shimotani , Shogo Sawada , Yoshihiro Toya , Hiroshi Shimizu(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 AGC Inc.)
1

Key words

2

1

metabolic engineering, metabolic flux, flux analysis

1○Masaaki Hidaka1, Chiho Suzuki-Minakuchi1,2, Kenshi Suzuki1,2, Kazunori Okada1,
Nobuyuki Okahashi3, Hideaki Nojiri1,2(1 Grad. Sch. Agric. Life Sci., Univ. Tokyo, 2 CRIIM, Univ. Tokyo, 3 Grad. Sch. IST,
Osaka Univ.)

Key words

plasmid, Pseudomonas resinovorans, metabolism

106

1Hp06

シアノバクテリアにおけるグリコールアルデヒドによる生理状態への影響○今田 辰海, 戸谷 吉博, 清水 浩
（阪大院・情報）shimizu@ist.osaka-u.ac.jp

1Hp08
学

ピキア酵母による芳香族化合物の大量生産および代謝メ
カニズムの解明○雲北 涼太 1, 番場 崇弘 2, 近藤 昭彦 1,2,3, 蓮沼 誠久 1,2,3（1 神戸大院・科技イノベ, 2 神戸大・先端バイオ工研セ, 3 理研・
環境資源）
hasunuma@port.kobe-u.ac.jp

シアノバクテリアは光条件変化に対して，代謝の恒常性を保つための様々な代
謝制御機構を持つことが知られており，このような制御機構は，Calvin–Benson–
Bassham 経路（CBB 回路）に代表される炭素代謝で働いている．CBB 回路の再活性化に代表される，代謝で起こる光防御機構を解明するためには，対象以外の反応を阻害する薬剤を用いた研究が一般的であり，研究目的に応じた適切な実験条件の設定には，その阻害機構に対する理解が不可欠である．しかしながら，多くの先行研究が報告されている電子伝達系の阻害剤と比較して，CBB 回路の反応を停止させる阻害剤の数は豊富とは言えない．
グリコールアルデヒド（GA）は CBB 回路阻害剤として知られており，ホスホ
リブロキナーゼ（PRK）反応を阻害することで，RuBP 再生産を阻害する．しかし，GA が存在することによって実際に代謝フラックスがどのように変化す
るかを明らかにしている研究は報告されていない．本研究では，GA を含む
BG11 培地でシアノバクテリアを培養し，GA が CBB 回路やほかの経路に対してどのように影響を与えるかを実験的に検証した．様々な GA 濃度について光混合栄養条件で培養を行ったところ，GA 濃度が高くなるにつれて増殖速度の低下が確認され，GA の IC50 濃度はおよそ 240 μM であった．決定された IC50
濃度で，13C 代謝フラックス解析によるフラックス推定を行ったところ，予想とは異なり CBB 回路の代謝フラックスには GA による影響を受けていなかった．また，PRK の酵素活性計測を行ったところ，IC50 濃度付近では，GA による PRK の阻害は確認されなかった．これらの結果から，低濃度における GA による増殖の阻害は，CBB 回路阻害によるものではないことが確認された．

芳香族アミノ酸「チロシン」から生産できる芳香族化合物群は、主に医薬品原料、栄養機能食品などに使用されており、化粧品業界や食品業界、製薬業界な
どの多方面で応用されている。現行の製造法では植物からの直接抽出に依存しているが、植物中に含まれる量が少なく、また、天候・気温により植物の収穫量は大きく変動するため、安定的な供給が困難である。付加価値の高い芳香族化合物群を安価かつ安定的に供給するためには、生育が早く高密度培養が可能な微生物を用いて高収率で発酵生産させるプロセスの開発が急務である。
本研究では、ピキア酵母を宿主に芳香族化合物群の大量生産を目指している。
ピキア酵母は増殖が速く、発酵産物（エタノール）を生産しないため、芳香族化合物群を短時間で大量生産できる可能性がある。私たちはこれまでの研究で、（１）芳香族化合物群生産における中間前駆体「チロシン」を高生産できるチロ
シンシャーシ株の作出、（２）植物由来酵素群の多重導入を行うことで、ピキア酵母を宿主とした芳香族化合物群の発酵生産に初めて成功している（Kumokita
et al., 2022, ACS synthetic biology）。
また、培養条件の検討を重ねることで、ピキア酵母ではグルコースを炭素源とした場合と比較して、グリセロールを炭素源にすることで芳香族化合物群生産
量が２〜３倍に向上することを見出した。現在は、ピキア酵母での芳香族化合物群高生産に寄与する因子の探索を行っている。具体的には、グルコースおよびグリセロールのそれぞれを炭素源とした際の細胞内および培養上清に含まれる代謝物を網羅的に調べ、ピキア酵母の代謝メカニズムの解明に取り組んでいる。その結果、グリセロールを炭素源に用い、特定のアミノ酸（Asp、Glu、Trp）を添加することで、ピキア酵母が芳香族化合物を高生産できることが明らかとなった。

Effect of glycolaldehyde on physiological states of cyanobacteria

Engineering the yeast Pichia pastoris for high-level production of aromaticcompounds and understanding the metabolic mechanism○Tatsumi Imada, Yoshihiro Toya, Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)○Ryota Kumokita1, Takahiro Bamba2, Akihiko Kondo1,2,3, Tomohisa Hasunuma1,2,3(1 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2 EGBRC, Kobe Univ., 3 CSRS,RIKENS)

Key words
metabolic flux analysis, metabolic response, cyanobacteria,
photosynthetic bacteria

Key words
Pichia pastoris, metabolic engineering, aromatic compounds,
metabolic analysis

1Hp07

1Hp09

基質としてのグリセリンが大腸菌の組換えタンパク質生産に与える影響の評価○齋藤 肇 1, 尾島 由紘 1, 幸 慎太郎 2, 福永 浩一 2, 坪井 輝道 2,
東 雅之 1（1 大阪公大院・工, 2 阪本薬品工業(株)）ojima@omu.ac.jp

学

小スケール培養系に基づくハイスループット 13C 代謝
フラックス解析法の構築○仲矢 颯太, 清家 泰介, 岡橋 伸幸, 松田 史生（阪大院・情報）
fmatsuda@ist.osaka-u.ac.jp

大腸菌は広く組換えタンパク質生産の宿主として用いられており、その基質にはグルコースを用いることが多い。しかし、グルコースを基質とした際には、増殖は良いものの、カタボライトリプレッションや中枢代謝のアミノ酸合成効率の低下によって生産量が低下する。一方で、グリセリンを基質とすると増殖は低下するが、前述の 2 つの問題点を解決できることが知られている。また、グルコースとグリセリンの併用によって生産量を向上する培養法が提案されている。そこで本研究では基質としてグリセリンを用いた際に、どちらの問題点の解決による寄与が大きいのかを評価するため、酵母由来の有用タンパク質
Gas1 を発現するプラスミドを形質転換した大腸菌 SHuffleT7 を基質組成の異なる 3 種の最小培地で 24 h 培養した。基質にはそれぞれ、グルコース 0.8%（以下 Glu 培地）、グルコース 0.4%+グリセリン 0.4%（以下 GluGly 培地）、グリセ
リン 0.8%（以下 Gly 培地）を用いた。増殖および菌体あたりの Gas1 生産量はGluGly 培地で最も高く、培養液あたりの Gas1 生産量も高かった。続いて、培養液の基質濃度を HPLC で測定したところ、GluGly 培地では 10 h でグルコースが完全に消費され、10 h 以降はグリセリンのみが基質となっていた。Gas1 生
産量が高かった GluGly 培地について、使用する基質が移行していた 10 h 後の細胞の中枢代謝遺伝子 glpK、zwf、gapA、pta と目的遺伝子 gas1 の発現量を qRTPCR で調べた。その結果、グリセリンの取り込みに関する遺伝子である glpKを除く中枢代謝遺伝子は Glu 培地と同程度の発現だったが、gas1 遺伝子の発現量は 1.8 倍に増加していた。このことから、グリセリンを基質とした際の組換えタンパク質生産においては、カタボライトリプレッションの解除の寄与が大きいことが示唆された。

【背景】
13
C 代謝フラックス解析法 (13C-MFA) は物質生産微生物の中心炭素代謝流束の推定に利用されている。本法のハイスループット化にはより小スケール培養系での解析が求められる。そこで本研究では、96well プレートで培養した出芽酵母
Saccharomyces cerevisiae への 13C-MFA の適用を試みた。
【方法】
出芽酵母 S. cerevisiae BY4947 株を[1-13C]グルコース含有 SD 培地中 30℃で回分培養した フラスコ及び 96well プレートスケールでは、それぞれ 50 mL、120 rpm(GBR-200) と 200 μL、180 rpm (SYNERGY HTX multi-mode reader、Bio Tek)の条件を用いた。細胞数・培地成分の経時観測とタンパク質由来アミノ酸の 13C 標
識割合を測定し 13C-MFA を行った。
【結果】
まず、フラスコスケールで培養した S.cerevisiae の 13C-MFA を行った。その結果
解糖系の鍵反応であるホスホフルクトキナーゼ (PFK) 反応の代謝フラックスは12.1 mmol/g DCW/h となるなど先行研究と同様のフラックス分布が得られることを確認した。次いで 96 well プレートを用いフラスコと比較して 1/25 の培地
液量中で培養したところ、フラスコスケールに比べて、比増殖速度が 8%、グルコース消費およびエタノール生産比速度は 41%と 43%減少するなど異なる培養挙動がみられた。またフラスコスケールの 20%しか菌体が回収できないことから、菌体回収法や誘導体化法などを最適化することで、少ない菌体からタンパク質由来アミノ酸の 13C 標識割合の測定を可能とした。比速度と 13C 標識割
合データを用いて 96well プレートで培養した出芽酵母 S. cerevisiae への 13C-MFAの適応に成功した。PFK 反応の代謝フラックスは 5.9 mmol/g DCW/h とフラス
コスケールの 48.7％であり、フラスコスケールとは異なる代謝状態にあることが推測された。以上のようにして小スケール培養系への 13C-MFA の適用を行った。

Effect of glycerol on recombinant protein production in Escherichia coli

Development of a high-throughput 13C metabolic flux analysis method
based on a small-scale culture system○Hajime Saito1, Yoshihiro Ojima1, Shintaro Miyuki2, Koichi Fukunaga2,
Terumichi Tsuboi2, Masayuki Azuma1(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Metro. Univ., 2 Sakamoto Yakuhin Kogyo Co., Ltd.)Key words

Escherichia coli, protein production, glycerol○Sota Nakaya, Taisuke Seike, Nobuyuki Okahashi, Fumio Matsuda(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words

metabolic flux analysis, yeast

107

1Hp10
学

炭素源多様化に向けた酵母のメタボローム比較解析○神山 歩夢 1, 清家 泰介 1,2, 松田 史生 1,2,3（1 阪大院・情報, 2 阪大・先導的学際研機構, 3 阪大・島津協働研）
fmatsuda@ist.osaka-u.ac.jp

1Hp12

培養上清中の有機／無機成分分析による新規抗体生産
宿主 CHL-YN 細胞の代謝解析○黒田 博隆 1,2,3, 空田 和也 1, 野間 あかり 1, 山野-足立 範子 1,
飯田 順子 2,3, 大政 健史 1
（1 阪大院・工, 2 島津製作所, 3 大阪大学・島津分析イノベーショ
ン協働研究所）omasa@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景・目的】
酵母を用いたバイオエタノール生産では、通常、穀物由来のグルコースが主な炭素源として使用されている。しかし、これらの原料は食料としても利用されるため、他の炭素源の探求が求められている。本研究では、異なる炭素源条件下で培養した酵母の細胞内外の代謝物含量を定量し、炭素源と代謝状態の関係性を調べた。
【方法】
Saccharomyces cerevisiae BY4947 および Kluyveromyces marxianus NBRC1777 の 2
種類の酵母株を実験に用いた。グルコース（Glc）、フルクトース（Fru）、スクロース（Suc）、ラフィノース（Raf）、キシロース（Xyl）の 5 種類の炭素源を単一の炭素源とする合成培地で好気的に回分培養し（50 mL、30℃）、培地中の細胞外代謝物を HPLC で分析した。各炭素源で培養した酵母を対数増殖期と定常期に回収・抽出し、LC-MS/MS (SHIMADZU) を用いて細胞内代謝物の含量を測
定した。
【結果】
S. cerevisiae と K. marxianus を 5 種類の糖を炭素源とする合成培地で培養し、培地成分を HPLC で調べた。BY4947 のクラブツリーポジティブ株では、Glc、
Fru、Suc 培地で対数増殖期からエタノールの生産が見られた。一方、NBRC1777のクラブツリーネガティブ株では、Glc、Fru、Suc 培地で定常期以降から大量のエタノール生産が観察された。また両株とも、Suc 培地で最も高いエタノー
ル収率を示し、Glc と比較して 1.3-1.4 倍になった。次に、酵母から細胞内代謝物を抽出し、LC-MS/MS を用いてメタボローム分析を行い、80 種類の代謝物を測定した。各培地条件下での代謝物含量を比較した結果、Suc 培地では他の条件に比べてアミノ酸の含量が相対的に低下する傾向が見られた。また、Raf お
よび Xyl 培地で培養した NBRC1777 では、好気的反応が活性化され、酵母がア
ルコール発酵または細胞内呼吸のどちらを優先するかは炭素源に大きく依存する可能性が示唆された。

CHO 細胞は抗体医薬品生産宿主として広く使用されているが、微生物に比較し増殖が遅いという課題がある。そこで当研究室では、CHO-K1 細胞に比較し約２倍の比増殖速度を有するチャイニーズハムスター肺由来(CHL-YN)細胞を樹立している 1)。本細胞を抗体生産宿主として活用するうえでは代謝的特徴を理解し、代謝に基づく適切な培養条件を開発する必要がある。これまでに、CHLYN 細胞では Glutamine Synthetase (GS)発現量が CHO-K1 細胞に比較して 6 倍以
上高く、Glntamine (Gln) 合成能を有することが明らかにされたが 1)、その他の代謝的特徴は明らかではない。そこで、本研究では CHL-YN／CHO-K1 細胞の細胞外成分を比較解析することで CHL-YN 細胞の代謝的特徴 を明らかにした。
CHL-YN／CHO-K1 細胞を同一の無血清培地で振とう回分培養し、生存率が 70%を下回るまで 12 時間おきに培養上清を回収した。培養上清を前処理後、LC/MS/MS Method Package Cell Culture Profiling Ver.3（Shimadzu）を用いて 144
成分を測定した。検出された 84 成分のうち CHL-YN 細胞でのみ消費・分泌された成分に着目すると、尿素回路の成分が多く含まれ、尿素回路の活性が細胞種間で異なることが示唆された。そこで RNA-seq 解析により尿素回路関連酵素の mRNA 発現量を測定した結果、尿素回路の反応を触媒する Arginase-2 の発現が CHL-YN 細胞でのみ認められた。以上より、CHL-YN 細胞では Gln 合成に加え尿素回路の代謝活性が CHO-K1 細胞に比べて高いことが明らかになった。こ
こで、GS と Arginase-2 はいずれも Mn 酵素であるため、Mn 要求性が CHO-K1細胞に比較して高いと考えられた。そこで培養上清中 Mn 濃度を ICPMS-2030（Shimadzu）を用い測定した結果、Mn の比消費速度が CHL-YN 細胞において有意に高い（p < 0.05）ことが示された。
1) Yamano-Adachi N., et al., Scientific Reports 10:17612 (2020).

Comparative metabolomic analysis of yeast for carbon source diversification

The metabolic analysis of CHL-YN cell through the analysis of organic /inorganic components in culture supernatant○Ayumu Kamiyama1, Taisuke Seike1,2, Fumio Matsuda1,2,3(1 Grad. Sch. IST, Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ., 3 Omics. Innov. Res. Lab,
Osaka Univ. Shimadzu Corp)○Hirotaka Kuroda1,2,3, Kazuya Sorada1, Akari Noma1, Noriko Yamano-Adachi1,
Junko Iida2,3, Takeshi Omasa1(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Shimadzu Corp., 3 Osaka Univ. Shimadzu Omics
Innovation Research Laboratories, Osaka Univ.)

Key words

metabolic analysis, yeast, sucrose, amino acidKey words

Chinese hamster ovary cell, metabolic analysis

1Hp11

動物細胞の分化・機能制御に資する中心炭素代謝流束の定量解析法の構築

1Hp13

新規抗体生産宿主 CHL-YN 細胞の重要培地成分同定に向けた検討○谷口 赳夫, 岡橋 伸幸, 松田 史生（阪大院・情報）
fmatsuda@ist.osaka-u.ac.jp○空田 和也 1, 黒田 博隆 1,2,3, 野間 あかり 1, 山野-足立 範子 1,
大政 健史 1
（1 阪大院・工, 2 島津製作所, 3 大阪大学・島津分析イノベーショ
ン協働研究所）omasa@bio.eng.osaka-u.ac.jp[背景]
動物細胞は分化や機能発揮に伴い代謝を再配線させる。その代謝シフトを定量的に測定することで、分化や機能の制御に資する情報が得られると期待される。
そこで本研究では、動物細胞であり免疫細胞の一種である好中球の分化、機能発揮による代謝シフトを定量可能な 13C 代謝フラックス解析法の開発に取り組んだ。
[方法]
骨髄系前駆細胞株 HL-60 を[1, 2-13C]グルコース、[U-13C]グルコース、[U-13C]非
必須アミノ酸のいずれかを含む培地で培養した。レチノイン酸で好中球様に分化させ、大腸菌由来リポ多糖で免疫応答させた。細胞数・培地成分の経時変化と細胞内代謝物の 13C 標識割合を計測し、13C 代謝フラックス解析を行った。
[結果]
13
C 代謝フラックス解析法の実施に必要な代謝モデルを構築するために、中心炭素代謝に流入する炭素源を探索した。 [U-13C]非必須アミノ酸 1 種ずつを含む培地で細胞を培養し、細胞内代謝物の 13C 標識割合を測定した結果、グルタミ
ン、グルタミン酸、アスパラギン酸が中心炭素代謝に流入することがわかった。
続いて細胞構成成分の分解で生じる炭素の流入経路を探索するために、13C 標
識細胞を非標識培地で培養し、細胞内代謝物の 13C 標識割合を測定した。その結果、M+3 ピルビン酸は三態の細胞で 7％以下であったのに対し、M+2 クエン酸は 18％以上計測されたことから、脂肪酸の流入が示唆された。これらのことを考慮することで、13C 代謝フラックス解析を好中球に適用することに成功した。好中球様に分化することで解糖系が 0.40 倍に減少し、ペントースリン酸経路が不活性化した一方で、クエン酸回路の代謝フラックスに変化はなかった。
免疫応答させるとグルコースの取り込み量が 1.4 倍に増加し、ペントースリン酸経路フラックスが活性化した。

チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（CHO 細胞）は、糖鎖修飾などの翻訳後修飾が可能、無血清培地への馴化培養が可能といった理由から、抗体医薬品生
産の宿主細胞として広く使用されているが、大腸菌や酵母などの微生物に比較して増殖が遅いという課題がある。そこで当研究室では、CHO-K1 細胞に比較して約２倍の比増殖速度を有し、抗体を短期間で生産可能なチャイニーズハム
スター肺由来細胞（CHL-YN 細胞）を樹立している 1) 。一方、CHL-YN 細胞の代謝に関する情報は不足しており、代謝プロファイルの解析とそれに基づく培地開発により、さらなる細胞増殖能や抗体生産能の向上が期待できる。本研究では、異なる組成の培地で培養した CHL-YN 細胞について培養上清を分析し、細胞増殖能や抗体生産能の向上に関連する培地成分の同定を試みた。
IgG 生産 CHL-YN 細胞のヘテロセルプールを 5 つの異なる組成の ChemicallyDefined Media（培地 A〜E）に馴化させ、振とう回分培養を行った 。12 時間おきに培養液を回収し、生細胞濃度および生存率を Vi-CELL XR（Beckman
Coulter）を用いて測定し、培養上清は前処理後、LCMS-8060NX（島津製作所）
を用いて代謝物 144 成分を測定した。
その結果、培地条件間で比増殖速度には差は認められず、概ね 0.06 h-1 から 0.07
h-1 であった。一方、最大生細胞濃度には差が認められ、培地 D, E は培地 A, B,
C と比較して約 1.5 倍であった。条件間の生細胞濃度の差異に寄与する代謝物を同定するため、対数増殖期における代謝物の比速度から PLS-DA モデルを構築し、VIP スコアが 1 以上の成分として複数の必須アミノ酸を同定した。これ
らの成分は培地 D, E に多く含まれており培養の経過とともにその他の培地より多く消費される傾向が観察されたため、高細胞濃度との関連が示唆された。
1) Yamano-Adachi N., et al., Scientific Reports 10:17612 (2020).

Development of a quantitative analysis of central carbon metabolic flux for
regulation of differentiation and function in mammalian cells

Investigation for identification of key medium components of CHL-YN cells○Takeo Taniguchi, Nobuyuki Okahashi, Fumio Matsuda(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words

metabolic flux analysis, metabolic shift, mammalian cell

○Kazuya Sorada1, Hirotaka Kuroda1,2,3, Akari Noma1, Noriko Yamano-Adachi1,
Takeshi Omasa1(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Shimadzu Corp., 3 Osaka Univ. Shimadzu Omics
Innovation Research Laboratories, Osaka Univ.)

Key words

Chinese hamster ovary cell, metabolic analysis

108

1Hp14
学

サワービールの成分プロファイリングと特徴的な香味属性との相関解析

1Hp16○大西 喬也 1, 福崎 英一郎 1,2,3, 古野 正浩 1
（1 阪大院・工, 2 大阪大学島津分析イノベーション協働研究所,
3
阪大・先導的学際研機構）
fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp

アセトヒドロキシ酸シンターゼ制御サブユニットのAla31Thr 置換による清酒酵母のバリンおよびイソブタ
ノール生産性の向上○磯貝 章太 1, 西村 明 1, 村上 直之 2, 堀田 夏紀 2, 小高 敦史 2,
豊川 洋一 1, 石田 博樹 2, 髙木 博史 1
（1 奈良先端大・バイオ, 2 月桂冠・総研）
s-isogai@bs.naist.jp

一般的なビールは、麦芽、ホップ、水を主原料とし、酵母を用いて発酵させた
アルコール飲料であり、麦のうまみやホップの苦味を主体とした香味を特徴とする。しかし近年、消費者の嗜好が多様化する中において、様々な香味を持つ
ビールの需要は増加している。本研究では、一般的なビールの香味とは大きく異なり、酸味を特徴とした香味を持つサワービールに着目した。サワービール
は Lactobacillus 属 や Pediococcus 属 の 乳 酸 菌 や Acetobactor 属 の 酢 酸 菌 、Brettanomyces 属の酵母など、通常のビール醸造では危害菌となる酸を産生する
微生物を用いて、長期間に及ぶ発酵や樽熟成を経て造られる。このような醸造工程により、サワービールは酸味だけでなくコクや甘味、フルーティーな香りなど独特の香味を有する。サワービールに関する先行研究では、菌種と香味の関係に焦点を当てた研究は報告されているが、香味特徴とそれに関与する成分を調査した研究は報告されていない。本研究ではサワービールの特徴的な官能
属性とそれを説明する成分プロファイルを把握することを目的とした。
製法や産地が異なるレッドエールおよびランビックを中心とした市販の 14 種類のサワービールを対象に、液液抽出法を用いたアンターゲットのガスクロマト
グラフィー質量分析法と、アミンとアニオン性化合物をターゲットとした液体クロマトグラフィー質量分析法による成分分析を行った。また、熟練者によるQDA（Quantitative Descriptive Analysis）法を用いた官能評価から特徴的な香味
属性と各属性に対する官能スコアを得た。得られた成分情報を説明変数、各属
性の官能スコアを応答変数として OPLS（Orthogonal Partial Least Square）回帰分析を行うことにより、回帰モデルを作成した。この結果、各モデルから特徴的な香味を説明する成分を推定でき、香味に関する新たな成分情報を得た。

分岐鎖アミノ酸の一種バリンは、疲労軽減、肝機能改善、筋肉強化など様々な生理機能を有する必須アミノ酸である。また、バリンの代謝によって生成する
イソブタノールは、酒類や食品の香気性に寄与する。そのため、産業用酵母のバリン生産性を強化することで、発酵・醸造食品の呈味性や香気性が変化し、高付加価値化につながることが期待できる。本研究では、バリン由来の香気成分が増加し付加価値が向上した清酒を醸造するために、バリンを高生産する清酒酵母を育種するとともに、その高生産機構を明らかにすることを目的とした。
月桂冠株式会社保有の実用清酒酵母株に突然変異処理を施し、細胞内バリン含量が親株の 1.7 倍に増加した K7-V7 株を取得した。
本株の変異点を解析したところ、バリン生合成の律速酵素であるアセトヒドロ
キシ酸シンターゼ（AHAS）の制御サブユニットをコードする ILV6 遺伝子にAla31Thr のアミノ酸置換を伴う変異を同定した。Ala31Thr 変異体の酵素学的解
析の結果、アミノ酸置換の導入によって、AHAS に対するバリンによるフィー
ドバック阻害が部分的に解除され、バリンおよびバリンに由来する香気成分の生産性が向上したことが明らかとなった。本研究により、真菌類の AHAS に保存された N 末端領域がバリンによる活性制御に寄与することを初めて見出した。得られた知見は酵母によるバリンやその代謝産物の高生産に向けた AHASの改変に応用できると考えられる。
さらに、K7-V7 株を用いて清酒の小仕込み試験を行った結果、親株と比較して、清酒中のイソブタノールや酢酸イソブチル含量が 1.5 倍に増加し、本株を用いることで特徴的な香気性を示す清酒が醸造できる可能性が示された（本研
究は、農研機構生研支援センター「イノベーション創出強化研究推進事業」の支援を受けて実施した）。
S. Isogai et al., FEMS Yeast Res., 23, foad012 (2023).

Profiling of components in sour beer and analysis of correlation with theirflavor characteristics

Improvement of valine and isobutanol production in sake yeast by Ala31Thr
substitution in the regulatory subunit of acetohydroxy acid synthase○Kyoya Onishi1, Eiichiro Fukusaki1,2,3, Masahiro Furuno1(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Osaka University Shimadzu Omics Innovation
Research Laboratories, 3 OTRI, Osaka Univ.)○Shota Isogai1, Akira Nishimura1, Naoyuki Murakami2, Natsuki Hotta2,
Atsushi Kotaka2, Yoichi Toyokawa1, Hiroki Ishida2, Hiroshi Takagi1(1 Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST, 2 Res. Inst., Gekkeikan Sake Co., Ltd.)Key words

sour beer, flavor, comprehensive component analysis, metabolomics

Key words
cerevisiae

acetohydroxy acid synthase, valine, sake brewing, Saccharomyces

1Hp15

メタボロミクスに基づく伝統的な醤油と近代的な醤油の
差異の探索

1Ip01

麹菌におけるゲノム編集を利用した大規模代謝改変による汎用的な異種天然物高生産宿主の開発○前川 佳花 1, 福崎 英一郎 1,3,4, 今村 美穂 2, 中村 美月 2
（1 阪大院・工, 2 キッコーマン, 3 大阪大学先導的学際研究機構,
4
大阪大学島津分析イノベーション協働研究所）
fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp○齋藤 直也 1, 片山 琢也 1,2, 南 篤志 3, 及川 英秋 4, 丸山 潤一 1,2（1 東大院・農生科, 2 東大・微生物連携機構, 3 北大院・理, 4 Sch.
Biotechnol.Wuyi Univ.）
amarujun@g.ecc.u-tokyo.ac.jp

日本の醤油は製造方法に基づき本醸造醤油とアミノ酸分解醤油に分類され、日本の醤油生産量の約８割を本醸造醤油が占めている。本研究では本醸造醤油を伝統的な醤油、アミノ酸分解醤油を近代的な醤油と定義する。伝統的な醤油は、長期間の微生物（麹菌、乳酸菌、酵母）の醗酵を経て製造される。一方、近代的な醤油は、酸を加えてアミノ酸と糖に分解したアミノ酸液を添加し、ほとん
ど微生物の醗酵なしに製造される。このように製造方法が異なると醤油に含まれる成分の種類や量も異なり、醤油の品質に大きな影響を与えると考えられる。
品質に大きく関与する官能特性や成分の違いを明らかにすることで新たな製造方法の提案や更なる品質向上、消費者の嗜好に合わせた醤油の提案に向けた重要な情報を提供することが可能となる可能性がある。先行研究により醤油の製造方法による官能特性の違いは明らかとなっているが、製造方法による網羅的な成分プロファイルの差異やその成分と官能特性の関係については明らかになっていない。そこで、本研究では伝統的な醤油と近代的な醤油の成分の差異を
GC/MS 分析基盤のメタボローム解析によって明らかにし、香味の差異と相関のある可能性がある成分を調査することを目的とした。
不揮発性及び、揮発性成分プロファイリングの結果、不揮発性成分について、伝統的な醤油はメチオニン、ロイシンなどのアミノ酸が特徴的であり、近代的な醤油はレブリン酸が特徴的であるという結果が得られた。揮発性成分について、伝統的な醤油はエステル類やアルコール類が特徴的であり、近代的な醤油はピラジン類、酸類、硫黄含有化合物が特徴的であるという結果が得られた。
今後、官能評価を実施し、これらの結果を合わせ、多変量解析を行うことで香味の差異に寄与する可能性のある重要な化合物の探索が期待される。

麹菌 Aspergillus oryzae は、近年異種天然物生産の宿主として生合成研究に利用されている。産業利用のためには、異種経路へつながる代謝を増強させる多重の遺伝子改変により高い生産性を実現することが不可欠である。また、天然物
ごとに多重遺伝子改変を行って生産性を向上させる方法は非効率であり、一度取得した高生産株を他の天然物の生産に汎用的に利用できるようにすることが重要である。我々は麹菌におけるゲノム編集 CRISPR/Cas9 を利用した高効率の多重遺伝子改変技術を確立したことで 1)、大規模な代謝改変を行ったのち不必要になった生合成遺伝子群を除去することが技術的に可能になった。そこで本研究では、異種天然物としてテルペンを対象とし、ゲノム編集を利用して麹菌における汎用的な異種天然物高生産宿主を開発することを目的とした。
異種テルペンのモデルとして用いた担子菌由来の抗生物質 pleuromutilin の生産株において、エタノール発酵・TCA サイクル・メバロン酸経路それぞれから代謝関連遺伝子 13 個を組み合わせて改変を行った。その結果、生産量は野生型株と比較して 8.5 倍(収量 161.6 mg/L)まで増加した。続いて、導入していた 7 個のpleuromutilin 生合成遺伝子を除去することで、他の天然物の生産宿主として使用可能な 13 重代謝関連遺伝子改変株を取得した。この株に子嚢菌由来の抗腫瘍性ジテルペン aphidicolin の生合成遺伝子を導入したところ、野生型株と比較して 65.6 倍(収量 7.34 mg/L)の生産能力の大幅な向上が確認された。以上の結果か
ら、取得した 13 重代謝関連遺伝子改変株が、異種天然物を高生産する宿主として汎用的に利用可能であることを示した。
1) Katayama et al. (2019) Appl. Environ. Microbiol. 85:e01896-18.

Metabolomics based investigation of the differences between traditional soy
sauce and modern soy sauce

Development of a versatile host hyper-producing heterologous natural
products in Aspergillus oryzae by large-scale metabolic engineering basedon genome editing○Yoshika Maekawa , Eiichiro Fukusaki , Miho Imamura , Miki Nakamura(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Kikkoman Corp., 3 Industrial Biotechnology
Initiative Division, Institute for Open and Transdisciplinary Research Initiatives,
Osaka Univ., 4 Osaka University Shimadzu Omics Innovation ResearchLaboratories)
Key words
soy sauce, metabolomics, GC/MS
1

1,3,4

2

2

○Naoya Saito1, Takuya Katayama1,2, Atsushi Minami3, Hideaki Oikawa4,
Jun-ichi Maruyama1,2(1 Grad. Sch. Agric. Life Sci., Univ. Tokyo, 2 CRIIM, UTokyo, 3 Grad. Sch. Sci.,
Hokkaido Univ., 4 Sch. Biotechnol.Wuyi Univ.)
Key words
Aspergillus oryzae, genome editing, heterologous production,
metabolic engineering

109

1Ip02
学

食品関連微生物（黒麹菌）による α-トマチンからトマチジンへの生産について

1Ip04

大腸菌におけるポリケタイド生産に向けた遺伝子工学技術の開発○富田 一輝 1, 番場 崇弘 2, 近藤 昭彦 1,2,3, 蓮沼 誠久 1,2（1 神戸大院・科技イノベ, 2 神戸大・先端バイオ工研セ, 3 理研・
環境資源）
hasunuma@port.kobe-u.ac.jp○Hui Chun Wai 1, 中谷 友樹 1,2, 小川 順 1, 岸野 重信 1
（1 京大院・農, 2 カゴメ）
kishino.shigenobu.3e@kyoto-u.ac.jp【背景・目的】α-トマチンは、アグリコンであるトマチジンに４つの糖から成る糖鎖が結合した構造を持つ糖アルカロイドの一種である。α-トマチンはトマトの茎・葉・未成熟果実などの部位に存在し、植物病原菌の侵入を阻害する役割を持っている。
しかし、一部の植物病原菌は α-トマチンを加水分解的に脱糖鎖することでトマトに感染できる。また、加水分解反応産物であるトマチジンには、筋肉細胞の成長を促進する効果が報告されている。さらに、抗がん作用や抗ウィルス作用などの生理活性も報告されていることから、トマチジンの高齢化社会におけるサプリメントもしくは医薬としての応用が期待されている。しかし、現時点ではトマチジンの大量生産法は確立されていない。トマトからトマチジンを得るには、α-トマチンの糖鎖を除去する必要がある。そこで本研究では、微生物変換に焦点を当て、食品関連微生物を対象に α-トマチンをトマチジンへと変換しうる微生物を探索した。
【方法・結果】
乳酸菌、麹菌、酵母など計 1,035 株について、休止菌体を用いた α-トマチン変
換反応を行い、質量分析法および高速液体クロマトグラフ法を用いた定性・定量分析に供した。その結果、Aspergillus 属から 11 株のトマチジン生産菌を取得した。その中で黒麹菌である Aspergillus luchuensis JCM 22302 が高い活性を示したため、本菌を選抜し、反応条件の検討を行った。その結果、A. luchuensis JCM
22302 の胞子を反応触媒とする 37 ℃、pH 5.5 の反応において、効率的変換が達成された。これまでに報告されているトマチジン生産菌はトマト病原菌であったことから、食品関連微生物がトマチジン生産活性を有するとする本知見は新規である。今後は、黒麹菌を用いたトマト葉搾汁液を原料とするトマチジン生産の反応条件の確立と、関与する反応を触媒する酵素の精製・機能解析を行う。

ポリケタイドは、薬理作用や生理活性を持つことが多く、医薬品などに利用される有用化合物である。多くは一部の放線菌や糸状菌、植物の二次代謝物として天然に生産されているが、生産収量が少ないことが課題である。こうした生産菌や植物は生合成に関する情報が乏しいことに加え、遺伝子操作がしにくい
ため、改変育種が進んでいないのが現状である。
一方、近年の合成生物学の進展に伴い、polyketide synthase（PKS）を大腸菌や酵母等の汎用宿主に導入するアプローチが広く用いられている。
本研究ではポリケタイドの一種であるオルセリン酸（以下 OSA）に着目し、大腸菌での高生産を目指した。OSA は薬理効果がある他有用なメロテルペノイドの共通前駆体であり、将来的なメロテルペノイドの高生産に繋がるハブ化合物である。具体的には、放線菌、糸状菌、植物由来の OSA 生合成酵素 AviM, OrsA,
ORS を大腸菌に導入した。37℃で培養を行ったところ、ORS を導入した株では、わずかながら発現が確認されたが、OSA の生産は確認できなかった。ORSの由来生物である Rhododendron dauricum が寒冷地域に生息する植物であることに注目し、25℃にて培養を行ったところ、OSA の生産が確認された。タンパク
質発現量を調べたところ、25℃でより多くの ORS が発現していることも明らかとなった。

alpha-Tomatine degradation to tomatidine by food-related Aspergillus
species belonging to the section Nigri

Development of genetic engineering technology for polyketide production in
Escherichia coli.

○Chun Wai Hui1, Yuki Nakatani1,2, Jun Ogawa1, Shigenobu Kishino1(1 Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 2 Kagome Co., Ltd.)○Itsuki Tomita1, Takahiro Bamba2, Akihiko Kondou1,2,3, Tomohisa Hasunuma1,2(1 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2 EGBRC, Kobe Univ.,, 3 CSRS,RIKENS)

Key words

tomatidine, alpha-tomatine, Aspergillus, conidia

Key words

1Ip03

有機溶媒耐性菌 Kocuria rhizophila DC2201 の代謝改変によるアスタキサンチン生産

1Ip05○戸田 弘, 金井 保
（富山県大・工）htoda@pu-toyama.ac.jp

plasmid, malonyl-CoA, protein expression

大腸菌を宿主とした cis,cis-ムコン酸高生産株の開発○森島 菜月 1, 番場 崇弘 2, 蓮沼 誠久 1,2, 近藤 昭彦 1,2,3（1 神戸大院・科技イノベ, 2 神戸大・先端バイオ工研セ, 3 理研・
環境資源）
hasunuma@port.kobe-u.ac.jp【背景】アスタキサンチンに代表されるカロテノイド化合物は微生物、藻類、植物、動物などが有する天然色素であり、高い抗酸化作用を持つことから、近年
サプリメントや化粧品等に利用されている。また抗腫瘍活性や免疫賦活作用な
どの生理活性が報告されているものもあり、医薬品としての利用も研究されている。これらカロテノイド化合物の効率的な生産を目的として、我々はグラム陽性菌である K. rhizophila を宿主とした生産を目指している。Kocuria 属細菌はカロテノイド生合成経路を有することから、代謝経路を改変することで各種カ
ロテノイド化合物の生産を試みた。
【実験方法・結果】K. rhizophila DC2201 のゲノム配列中に存在する一連のカロテノイド合成遺伝子オペロン(CrtEBIYeYfEb)のうち、CrtEb がリコペンからデカ
プレノキサンチンなどへの C50 カロテノイド生成に関与していることが推測された。そこで CrtEb 遺伝子を破壊し、菌体中のカロテノイドを HPLC により確認した結果、リコペンの蓄積および C50 カロテノイドの消失を確認した。
本破壊株によるアスタキサンチン合成を目的として、各種微生物由来 CrtWZY
遺伝子を導入した結果、Paracoccus haeunndensis 由来 CrtY、Brevundimonas
aurantiaca 由来 CrtW および Pantoea ananatis 由来 CrtZ が K. rhizophila 菌体内で有意に発現・機能することが明らかとなった。また、CrtY+CrtZ 導入株におけるゼアキサンチンの生成、および CrtY+CrtW 導入株におけるカンタキサンチンの生成をそれぞれ確認した。しかし、3 遺伝子導入株におけるアスタキサンチンの生成が確認されず、それぞれの酵素活性を確認した結果、CrtW の発現が抑制されていることが明らかとなった。そこで様々な強度のプロモーターを用いて各遺伝子の発現を検討した結果、CrtW および CrtZ の発現強度を低下させることでアスタキサンチンの生成を確認した。

cis,cis-ムコン酸（MA）はナイロンなどのポリマー原料を生産する際の共通前駆体である。現在、それらの繊維原料の生産は化石資源を用いた化学合成で行われている。しかしながら、化石資源を用いた物質生産は、化石資源枯渇の恐れや世界情勢に伴う価格の変動、温室効果ガスの排出などが問題視されている。
環境保護等の観点から再生可能な生物資源であるバイオマスを原料として、微生物の発酵により化学原料をつくりだし、多様な化学製品の生産を展開していくというバイオリファイナリーに期待が高まっている。本研究では、大腸菌を宿主に MA の微生物生産に取り組んでいる。大腸菌は元来 MA を生産しないため、様々な MA 生合成経路の検討・強化等が行われてきた。しかしながら、先行研究の MA 生産には様々な大腸菌株が用いられており、MA 生産に適した株のスクリーニングが不十分であることや、毒性のある代謝中間体であるカテコー
ルの蓄積が MA 生産の妨げになっている可能性が示唆されている。そのため本研究では、（１）MA 生産能力の高い宿主株の選定及び生産経路の強化によりMA 生産量の向上を目指し、（２）MA 生合成関連遺伝子の発現バランスの最適化を行い MA 高生産株の作出を行っている。（１）生産経路の強化として、シキミ酸経路までを強化する遺伝子をプラスミドで導入したところ、強化前と比較して 40 倍程度の生産量の向上がみられた。現在は競合経路の破壊やシキミ酸経路内の強化を行っているところである。
（２）については、シキミ酸経路からMA を生産するのに必要な 3 遺伝子に対して発現強度の異なるプロモーター 4
種を掛け合わせた 64 種のプラスミドライブラリーの作成及び導入を行い MA
高生産株の開発につなげる。本研究は、従来法より環境に配慮した繊維原料の生産に貢献する可能性がある。

Metabolic engineering of the organic solvent tolerant microorganism,
Kocuria rhizophila DC2201 for producing astaxanthin

Development of cis,cis-muconic acid high-producing strains using
Escherichia coli as a host○Hiroshi Toda, Tamotsu Kanai(Fac. Eng., Toyama Pref. Univ.)

Key words

metabolic engineering, carotenoid, astaxanthin, Kocuria rhizophila○Natsuki Morishima1, Takahiro Bamba2, Tomohisa Hasunuma1,2,
Akihiko Kondo1,2,3(1 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2 EGBRC, Kobe Univ., 3 CSRS,RIKENS)

Key words

Escherichia coli

110

1Ip06

非酸化的解糖経路を導入した大腸菌によるブチロラクタ
ム生産のための代謝経路改変

1Ip08

大腸菌のエネルギー代謝工学による 1,3-ブタンジオール
生産の強化○片岡 尚也 1,2, 前田 智也 3, 和田 大 4, 横田 篤 3, 松下 一信 2,5,
藥師 寿治 1,2
（1 山口大・研究推進機構, 2 山口大・中高温微セ, 3 北大院・農,4
摂南大・農, 5 山口大・農）nkataoka@yamaguchi-u.ac.jp○三吉 健太, 一色 衣香, 二井手 哲平, 戸谷 吉博, 清水 浩
（阪大院・情報）shimizu@ist.osaka-u.ac.jp

非酸化的解糖（NOG）経路は、解糖系での炭素ロスを回避することで、物質生産の重要な代謝中間体の一つであるアセチル CoA の収率を向上させることができる。しかし、NOG 経路では菌体合成や物質生産等に必要な ATP や NADH といった補酵素が生成されないため、NOG 経路により高生産可能な目的物質は限られる。そこで本研究では、物質収支に着目した代謝シミュレーションにより、NOG 経路導入によって理論炭素収率が向上する新規有望目的物質を探索する。
また、基質を細胞合成に使用しない増殖停止期における物質生産に適した代謝デザインを行うことで、目的物質の収率向上を目指す。
代謝物の物質収支に基づいて理論炭素収率を計算するフラックスバランス解析（FBA）により、NOG 経路の有無による目的物質の理論炭素収率を比較した。
NOG 経路導入により理論炭素収率が向上する目的物質として、ラクタム類やイ
ソアミルアルコールが新規に予測された。以後の研究では、有機溶媒や化成品
原料として利用されるブチロラクタムを目的物質に選定した。これまでにブチロラクタム生産大腸菌を構築し、増殖停止期でのブチロラクタム生合成を確認した。増殖停止期での物質生産に適した代謝デザインを行うため、物質収支を満たす最小の構成要素に代謝経路を分解するエレメンタリーモード解析を行った。菌体合成や目的物質生産に寄与しないエレメンタリーモードを削除する多重遺伝子破壊候補を予測することで、増殖期では菌体合成に優れ、増殖停止期
では目的物質生産が必須となる代謝デザインを行った。結果として、pntAB,
pykAF, sfcA, ptsG などの多重遺伝子破壊により、増殖停止期にブチロラクタム生産が強いられることが予測された。実際に多重遺伝子破壊株を構築し、ブチロ
ラクタムや中間代謝物の生産性を評価する。

【背景・目的】微生物による物質生産において, 異化代謝の強化は, 発酵原料の速やかな消費と前駆体や還元力の供給増強を可能にする点で重要な課題である。
我々はこれまでに, 大腸菌の好気呼吸においてエネルギー生成の大部分を占める
酸化的リン酸化を司る呼吸鎖酵素の中でも, プロトン駆動力形成能に強く関わる
I 型 NADH 脱水素酵素 (NDH-I) とシトクロム bo3 オキシダーゼ (Cytbo3) の単独
および二重変異株で, 糖代謝 (異化代謝) が亢進することを報告した (1)。本研究では, これら変異株が物質生産において有用性を持つかを, 1,3-ブタンジオール
を対象に検証した。
【方法・結果】親株として大腸菌 MG1655 F’を用いた。NDH-I, Cytbo3 の単独(ΔNDH-I, ΔCytbo3) および二重変異株 (ΔΔ) は P1 トランスダクションにより構築した。1,3-ブタンジオール生産は, Ralstonia eutropha 由来 phaAB と Clostridium
saccharoperbutylacetonicum 由来 bld を高発現させることで誘導した。各株を 2 L
容ジャーファメンターを用いて 222 mM のグルコースを含む発酵培地で培養し,その発酵特性を解析した。その結果, 生育は, 親株 > 単独変異株 (ΔNDH-I ≥ΔCytbo3) > 二重変異株 (ΔΔ) の順で減少した一方で, グルコース消費に差は見られなかった。1,3-ブタンジオール生産は, 生育とは逆の順で収量が増加し, ΔNDHI, ΔCytbo3, ΔΔ でそれぞれ親株の 1.80, 1.92, 2.06 倍の 1,3-ブタンジオールを生産した。顕著な差が見られた他の代謝産物として酢酸が挙げられ, 特に ΔΔ で著量の蓄積が確認された。酢酸生成が ATP 生成を伴うことを考慮すると, これも, エネルギー充足度の低下に伴う応答であると考えられた。最も良好な生産性を示した ΔΔ で流加培養を行ったところ, 44 時間の培養で 180 mM の 1,3-ブタンジ
オールを生成した。
1. Kihira et al., J. Biotechnol., 158: 215-223. (2012).

Metabolic pathway engineering for butyrolactam production in Escherichia
coli harboring the non-oxidative glycolysis

Energy metabolic engineering of Escherichia coli for the enhancement of
1,3-butanediol production○Kenta Miyoshi, Kinuka Isshiki, Teppei Niide, Yoshihiro Toya, Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words
glycolysis

metabolic engineering, metabolic flux analysis, non-oxidative

1Ip07

セルフクローニングによる 5-ALA 高生産光合成細菌の構築○小島 拓真 1,2, 増田 真二 2
（1 ネオファーマジャパン, 2 東工大・生命理工）
shmasuda@bio.titech.ac.jp○Naoya Kataoka1,2, Tomoya Maeda3, Masaru Wada4, Atsushi Yokota3,
Kazunobu Matsushita2,5, Toshiharu Yakushi1,2(1 Org. Res. Initiatives, Yamaguchi Univ., 2 RCTMR, Yamaguchi Univ., 3 Grad. Sch.
Agric., Hokkaido Univ., 4 Fac. Agric., Setsunan Univ., 5 Fac. Agric., Yamaguchi
Univ.)
Key words
Escherichia coli, energy metabolism, 1, 3-butanediol, respiratory chain

1Ip09
学

ガスを原料にしたイソプロパノール生産に向けたMoorella thermoacetica 代謝改変株の開発○松尾 赳志 1, 加藤 淳也 2, 加藤 節 1, 竹村 海生 1, 藤井 達也 2,
和田 圭介 2, 渡邊 真宏 2, 中道 優介 2, 青井 議輝 1, 松鹿 昭則 2,
森田 友岳 2, 村上 克治 2, 中島田 豊 1（1 広島大院・統合生命科学, 2 産総研）
nyutaka@hiroshima-u.ac.jp

5-アミノレブリン酸（5-ALA）はヘム合成経路の初発基質であり，代謝されると光合成に必要なクロロフィルや呼吸鎖に必要なヘムとなってエネルギー生産に重要な役割を果たす．ヘム合成経路において 5-ALA 合成が律速段階であることが知られている．製品としての 5-ALA は癌の診断薬や光治療薬，化粧品，サプリメント，飼料や肥料として幅広い分野で利用されている．現在 5-ALA は人工的突然変異誘発により育種された光合成細菌で工業的に発酵生産されている．
本研究では更なる 5-ALA 生産性の向上に向け，光合成細菌のゲノム上の 2 つの5-ALA 合成酵素遺伝子（hemA，hemT）の上流に恒常的に活性なプロモーター
として同種由来の rrnB 遺伝子及び rsp_7571 遺伝子のプロモーターを挿入し，得られた株が遺伝子組換え体とは見做されないセルフクローニング株に相当す
る 5-ALA 高生産菌の構築を試みた．構築した株の hemA 及び hemT 遺伝子の発現量を定量したところ， rrnB 遺伝子のプロモーターを挿入した株では，通常微好気条件下のみで活性化する hemA 遺伝子の発現量が，好気条件下で野生型の2.4 倍以上，微好気条件下で 1.3 倍以上に向上し，通常サイレントである hemT
遺伝子の発現量は好気条件下で野生型の 24 倍以上，微好気条件下で 37 倍以上に向上していた．これらの株の試験管での簡易的な 5-ALA 発酵試験の結果，野生株が最大で 0.78 mM の 5-ALA を培養液中に蓄積したのに対し，rrnB 遺伝子のプロモーターを hemT 遺伝子上流に挿入した株では 9.2 mM と約 12 倍もの 5ALA を培養液中に蓄積した．以上，本研究により恒常的に活性型のプロモーターとして同種由来の rrnB 遺伝子のプロモーターを hemT 遺伝子上流に挿入することで遺伝子組換え体とは見做されない ALA 高生産菌の構築に成功した．

【背景および目的】我々は低炭素社会の実現に向けてガス発酵技術の開発を行っている。ガス発酵とは、工場や大気中から回収される CO2、再生可能エネルギーを活用して製造した H2、さらに廃ガスや有機物ごみのガス化で得られる合成ガス（H2、CO）を原料として基礎化学品を生産する技術である。好熱性酢酸生成菌 M. thermoacetica は、これらのガスを利用し酢酸を合成する特徴を持つ。本
研究では、本菌を代謝改変し、酢酸の代わりにプラスチック原料等として利用可能なイソプロパノール（以下 IPA）を合成する株を開発することを目的とした。
【実験方法および結果】本菌は、糖やガスからアセチル CoA を経て酢酸を合成
するが、アセチル CoA から酢酸へ変換する酵素遺伝子を２つ有している（pduL1/2）。まず初めに、耐熱性チオラーゼ、CoA トランスフェラーゼ、デカル
ボキシラーゼ、２級アルコールデヒドロゲナーゼの４つの酵素をコードする遺伝子群（IPA 合成オペロン）を、pduL2 領域を分断するように導入した株を作製した。次に、得られた株を糖（フルクトース）もしくはガスを基質として回分培養（バイアルスケール）で培養試験を行い、IPA と酢酸の生成比を指標として IPA 生産能を評価した。糖を基質として培養したところ、IPA/酢酸生成比
は 3.0 であった。CO/H2 混合ガス（1：2）を基質とした場合、IPA/酢酸生成比は0.38 に低下した。さらに CO2/H2 混合ガス（2：8）を基質とした場合では、IPA/
酢酸生成比が 0.29 であり、菌体の増殖も観察されなかった。これらの結果か
ら、糖を用いた培養では IPA を酢酸よりも優先して合成するが、ガス培養ではそれが逆転することが明らかになった。現在、ガスを基質とした IPA 生産量を向上させる培養工学的な検討を実施すると共に、基質の供給速度などの培養条件の制御が可能なリアクター装置を用いた IPA 生産試験を進めている。

Genetic strategy for construction of Rhodobacter sphaeroides
overproducing 5-aminolevulinic acid without exogenous-DNA insertion

Development of a metabolically engineered strain of isopropanol-producing
Moorella thermoacetica for gas fermentation○Takuma Kojima , Shinji Masuda(1 Neopharma Japan Co., Ltd., 2 Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)
1,2

Key words

25-aminolevulinic acid, Rhodobacter sphaeroides, self-cloning○Takeshi Matsuo1, Junya Kato2, Setsu Kato1, Kaisei Takemura1, Tatsuya Fujii2,
Keisuke Wada2, Masahiro Watanabe2, Yusuke Nakamichi2, Yoshiteru Aoi1,
Akinori Matsushika2, Tomotake Morita2, Katsuji Murakami2, Yutaka Nakashimada1(1 Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 2 AIST)

Key words
production

gas fermentation, metabolic engineering, acetogen, isopropanol

111

1Ip10
学

嫌気性 CO2 資化性細菌 Moorella thermoacetica の酸素耐性向上に向けた分子育種

1Ip12

Construction of new synthetic pathway for C4-based (4hydroxybutyrate) biopolymers from sugar○Kai-Hee Huong, Orita Izumi, Fukui Toshiaki(Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)
tfukui@bio.titech.ac.jp○石田 隼斗 1, 加藤 淳也 2, 加藤 節 1, 藤井 達也 2, 和田 圭介 2,
渡邊 真宏 2, 中道 優介 2, 青井 議輝 1, 松鹿 昭則 2, 森田 友岳 2,
村上 克治 2, 中島田 豊 1（1 広島大院・統合生命科学, 2 産総研）
nyutaka@hiroshima-u.ac.jp【背景と目的】
好熱性酢酸生成菌 M. thermoacetica は、糖に加えてガス（H2、CO、CO2）を基質として利用し、酢酸を生産する。代謝改変により酢酸以外の基礎化学品を生産する発酵技術を構築できれば、低炭素社会実現への貢献ができる。しかし本菌は偏性嫌気性細菌であり、酸素への暴露で死滅するため、酸素に対する耐性能の向上が課題である。本研究では、遺伝子操作技術を用い、水素の還元力を利用した酸素耐性能の向上について検討した。
【方法】
M. thermoacetica はスーパーオキシドアニオン（O2-）を水へと還元するスーパー
オキシドジスムターゼ（SOD）およびカタラーゼを有する。従って、還元型フェレドキシン（Fd）により酸素を O2-へ変換すれば、本菌の酸素耐性能が向上すると予想した。そこで、Fd をコードする遺伝子および H2 を用いて Fd を還元するヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した株（HMC48）を作製した。培養試験では、糖と H2 を加えた培地で野生株（WT）および HMC48 を対数増殖初期まで培養し、1.5%または 5.0%の酸素を加え、各株の酸素耐性能を評価した。また、ヒドロゲナーゼ遺伝子のみを導入した株も作製し、同様の検討を行った。
【結果と考察】酸素を 1.5％添加した場合、WT は添加後約 40 時間増殖を停止し、その後増殖を再開したが、HMC48 では酸素添加の影響はなかった。また、酸素を 5.0％添加した場合、WT では添加後 550 時間経過しても増殖が停止したままであったのに対し、HMC48 は約 200 時間の増殖停止を経て増殖を再開した。これらの結果から、HMC48 は、野生株と比較して酸素耐性能が向上していることが明らかとなった。また、ヒドロゲナーゼ遺伝子、Fd 遺伝子のそれぞれを単独導入
した改変株を作製し、酸素添加条件にて培養した結果、ヒドロゲナーゼ単独導入株でも酸素耐性が向上したことから、内在性 Fd もこの酸素耐性機構に関与することが示唆された。

Polyhydroxyalkanoate containing 4-hydroxybutyrate (4HB) has prominent applications
as a high-value biomaterial in healthcare industries. Here, we designed and constructed
an alternative synthetic pathway for this kind of PHA copolymers by expressing an
oxygen-tolerant 4-hydroxybutyrl-CoA dehydratase (4HcD) from Archaea in Ralstonia
eutropha, which permits a direct conversion of sugar-derived feedstock to 4HB. A
glucose-utilizable strain of R. eutropha NSDG-GGΔB1 was used as a host for thecodon-optimized 4HcDgene from Nitrosophumilus maritimus. The resulting strain had
the ability to incorporate 4HB monomer (~3.6 mol%) into PHA on glucose,demonstrating one-step complementation of the missing conversion of crotonyl-CoA
to 4HB-CoA in R. eutropha. However, the incorporation has only occurred under low
shaking speed of 60 strokes/min; suggesting that the archaeal 4HBD is still oxygen
sensitive to certain extent, and requires microaerobic cultivating condition. Further
metabolic engineering of the strain has resulted in an increase in the 4HB monomer
composition up to 10 mol%. Besides, we also identified that intracellular crotonyl-CoA
is one of the bottlenecks for further monomer increment. As R. eutropha is ametabolically versatile hydrogen-oxidizing bacterium with a significant impact incurrent and future industrial biomanufacturing, this work provides a practical example
that the bacterium can be used as a chassis to accommodate exogenous gene for novel
metabolic pathway that functions under unusual conditions.

Molecular breeding of the anaerobic bacterium Moorella thermoacetica toenhance the oxygen tolerance

Construction of new synthetic pathway for C4-based (4-hydroxybutyrate)
biopolymers from sugar○Hayato Ishida1, Junya Kato2, Setsu Kato1, Tatsuya Fujii2, Keisuke Wada2,Masahiro Watanabe2, Yusuke Nakamichi2, Yoshiteru Aoi1, Akinori Matsushika2,
Tomotake Morita2, Katsuji Murakami2, Yutaka Nakashimada1(1 Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 2 AIST)○Kai-Hee Huong, Orita Izumi, Fukui Toshiaki(Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)

Key words

acetogen, hydrogen, oxygen tolerance, metabolic engineering

Key words
polyhydroxyalkanoate, 4-hydroxybutyrate (4HB), Ralstonia eutropha,
metabolic engineering

1Ip11

Cupriavidus necator H16 による CO2 を炭素源としたポリヒドロキシ酪酸 高生産株の樹立

1Ip13

学

○安部川 直紀 1, 望月 智弘 2, 秀瀬 涼太 2, 近藤 昭彦 1,2,3,
蓮沼 誠久 1,2
（1 神戸大院・科技イノベ, 2 神戸大・先端バイオ工研セ, 3 理研・
環境資源）
hasunuma@port.kobe-u.ac.jp

学

Ralstonia eutropha 改変株における 2-ヒドロキシブタン
酸 (2HB) 代謝の解析と 2HB 含有配列制御型ポリヒドロ
キシアルカン酸 (PHAs)の生合成○石原 静流 1, 折田 和泉 1, 松本 謙一郎 2, 福居 俊昭 1
（1 東工大・生命理工, 2 北大院・工）tfukui@bio.titech.ac.jp

化石燃料を原料とする化学品生産では、大気中への CO2 排出量増大が問題となっている。そこで、化石燃料に変わる新たなエネルギー源として H 2 を利用し、炭素源として CO2 を利用するバイオ生産技術の開発が期待されている。
Cupriavidus necator H16（以下、H16）は H2 を還元力とし、CO2 を同化することができる化学合成独立栄養細菌である。また、生分解性プラスチック原料であるポリヒドロキシ酪酸（PHB）を合成する能力を持つ。
本研究では、 H2 と CO2 を用いたガス発酵で PHB 生産性を向上する H16 組換え
株の創出に取り組んだ。PHB は CO2 からアセチル CoA を介して生産される。
シアノバクテリアではアセチル CoA 供給量の強化が PHB 生産性向上につながったとの報告があるが、H16 ではそうした関係性は知られていない。そこで本研
究では、人工アセチル CoA 生合成経路である非酸化的解糖系（NOG）経路の導入を試みた。NOG 経路はカルビン回路内のフルクトース-6-リン酸、および、
キシロース-5-リン酸を出発物質とし、既存経路とは異なるルートでアセチル
CoA を生合成することができる。NOG 経路導入株を用いてガス発酵を行った
ところ、PHB 生産性を 2.2 倍向上させることに成功した。本研究の成果は、H2と CO2 を原料とする新規の PHB 生産プロセスの開発に寄与することが期待される。

【目的】生分解性高分子である微生物産生ポリヒドロキシアルカン酸 (PHA) の社会実装には，多様な素材種の開発が必要である．近年，キメラ PHA 重合酵素
PhaCAR が配列制御重合能を有することが報告された．本研究では PHA 生産能が高い Ralstonia eutropha の PhaCAR 導入株による PHA ブロック共重合体の生合成を検討した．
【方法・結果】L-イソロイシンの生合成前駆体である 2-ケトブタン酸 (2KB) から(R)-2HB-CoA を生成し，(R)-3HB-CoA と共重合させる生合成経路の確立のため，R. eutropha PhaCAR ＋株染色体上の高発現領域に Clostridioides difficile 由来 2ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素 LdhACd, 2-ヒドロキシイソカプロン酸 CoA転移酵素 HadACd の遺伝子を導入した．この改変株はグルコース単一炭素源培
地で 2HB ユニットを微量含む PHA を生合成した．PhaCAR の機能確認のため(R/S)-2HB 添加培養を行ったところ，R. eutropha が(R)-2HB および(S)-2HB の両方で強い生育阻害を受けることを見出し，その機構と 2HB 代謝酵素を新たに同定した．L-バリン添加で生育阻害を抑制した 2HB 添加培養において，本改変株は8~35 mol%の 2HB を含有した PHA 共重合体を生合成した．NMR 解析・溶媒分
別の結果から，この共重合体は 2HB のホモセグメントを有するブロック共重合体であることが強く示唆された．

Engineering Cupriavidus necator H16 to increase Polyhydroxybutyrate
production from CO2

Metabolisms of 2-hydroxybutyrate (2HB) and biosynthesis of 2HBcontaining sequence-regulated polyhydroxyalkanoates (PHAs) byengineered Ralstonia eutropha○Naoki Abekawa , Tomohiro Mochizukki , Ryota Hidese , Akihiko Kondo ,Tomohiro Hasunuma1,2(1 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2 EGBRC, Kobe Univ.,, 3 CSRS,RIKENS)
1

2

2

Key words
CO2 fixation, hydrogen-oxidizing bacteria, hydrogen,polyhydroxyalkanoate

1,2,3○Shizuru Ishihara1, Izumi Orita1, Ken'ichiro Matsumoto2, Toshiaki Fukui1(1 Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech, 2 Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.)

Key words
polyhydroxyalkanoate, PHA synthase, Ralstonia eutropha,
biodegradable plastic

112

1Ip14
学

好塩性細菌ハロモナスのエクトイン非生産株におけるア
スパラギン酸系アミノ酸代謝経路の改変による耐塩性の
向上

1Ip16
学

Improved production of GABA by engineered
Halomonas elongata GOP-Gad strain cell factory fromwaste biomass○Ziyan Zou1, Hideki Nakayama1,2,3(1 Grad. Sch. Fish. Environ. Sci., Nagasaki Univ., 2 Inst. Sci.
Technol., Nagasaki Univ., 3 Org. Marine Sci. Technol., Nagasaki
Univ.)
nakayamah@nagasaki-u.ac.jp○JOO YUNHEUI 1, 仲山 英樹 1,2,3（1 長崎大院・水産環境, 2 長崎大・総合生産科学域, 3 長崎大・海洋未来イノベ）nakayamah@nagasaki-u.ac.jp
本研究室では、バイオマス由来の多様な炭素・窒素源の資化性に優れた好塩性細菌 Halomonas elongata（ハロモナス）を細胞工場とすることにより、廃棄バ
イオマスを有用化学品に再資源化することを最終目標としている。ハロモナス
は高塩環境に適応するためにエクトイン（Ect）を浸透圧調節物質として高効率に生合成できるが、Ect 生合成オペロン（ectABC）を欠失したハロモナス KA1 株（ΔectABC）では塩ストレス感受性が高まっている。そこで本研究では、KA1 株のアスパラギン酸（Asp）系アミノ酸代謝経路を改変することにより、耐塩性が向上した組換えハロモナス株が Ect の代わりに浸透圧調節物質として蓄積しているアミノ酸類の解析を行うことを目的とした。
特に本研究では、レポーターの mCherry 遺伝子と共に Asp 脱炭酸酵素（asD）
による Asp の脱炭酸により L-Ala を生合成する人工 mCherry-asD オペロン、さらにアラニンラセマーゼ（alr）により L-Ala から D-Ala を生合成する人工
mCherry-asD-alr オペロンを構築し、ハロモナスゲノム上の Ect 生合成オペロンの ectABC 遺伝子部位と置換して導入する戦略により、Asp から Ect の代わりに
L-Ala または DL-Ala を生産する組換えハロモナス JN1 株（ΔectABC::mCherryasD）及び JN2 株（ΔectABC::mCherry-asD-alr）を創製した。そして HPLC 分析
により、得られた組換えハロモナスにおいて、高塩濃度条件下で主要な浸透圧調節物質として蓄積しているアミノ酸類の解析を行った。特に、3〜11％の塩化ナトリウム(NaCl)及び 4％グリセリンを炭素源として含む M63 無機塩培地に alrの補酵素である PLP を添加して培養した結果、11％ NaCl を含む高塩濃度条件
下で KA1 株の増殖が抑制されたのに対し、DL-Ala の蓄積量が高い JN2 株の増殖は抑制されなかった。この結果から、JN2 株の細胞内で DL-Ala が浸透圧調節物質として機能していることが示唆された。

Previously, we have generated the recombinant H. elongata GOP-Gad strain, which
can produce GABA as a major compatible osmolyte under high-salinity condition.
Here, we acquired metabolic engineering approach to further improve GABA
accumulation in the GOP-Gad strain. We found that the wild-type H. elongata
OUT30018 strain, which can assimilate GABA as sole carbon and nitrogen sources,
has an orthologue of the GabTD operon containing gabT-like and gabD-like genes
encoding a putative GABA aminotransferase and a succinate semialdehyde
dehydrogenase involved in GABA utilization. To increase productivity of GABA, wehave generated GOP-GadΔGabT strain by deleting a GabT-like gene from the GOPGad strain’s genome. Under high-salinity growth conditions in the synthetic M63
minimal media with glycerol as carbon source, the GOP-GadΔGabT strain showedenhanced growth and higher GABA production than the original GOP-Gad strain,
possibly due to reduced GABA decomposition. Here, to evaluate the ability of the
GOP-GadΔGabT strain to produce GABA from high-salinity and nutrient-rich organic
waste medium, we cultured the strain in the complex LB medium containing 12%
NaCl mimicking the medium. Again, the GOP-GadΔGabT strain could produce higher
level of GABA than the original GOP-Gad strain in the medium. Therefore, we
conclude that the H. elongata GOP-GadΔGabT strain is a good candidate to be used asa cell factory to produce GABA from waste biomass feedstocks.

Metabolic engineering of aspartate-derived amino acid biosynthetic
pathway improves salt-stress tolerance in the ectoine-deficient Halomonas

Improved production of GABA by engineered Halomonas elongata GOPGad strain cell factory from waste biomass

elongata○Yunheui Joo1, Hideki Nakayama1,2,3(1 Grad. Sch. Fish. Sci. Environ. Stud., Nagasaki Univ., 2 Inst. Sic. Technol.,Nagasaki Univ., 3 Org. Marine Sci. Techonol., Nagasaki Univ.)○Ziyan Zou1, Hideki Nakayama1,2,3(1 Grad. Sch. Fish. Environ. Sci., Nagasaki Univ., 2 Inst. Sci. Technol., Nagasaki
Univ., 3 Org. Marine Sci. Technol., Nagasaki Univ.)

Key words

Halomonas elongata, Alanine, salt tolerance

Key words

Halomonas elongata, GABA, salt tolerance, eutrophication

1Ip15

High-salinity induced overproduction of L-proline
improves salt-stress tolerance of engineered ectoinedeficient Halomonas elongata

1Jp01

ピキア酵母におけるターミネーター置換での遺伝子発現量制御学○Khanh Huynh Cong, Hideki Nakayama(Grad. Sch. Fish. Sci. Environ. Stud., Nagasaki Univ.)
nakayamah@nagasaki-u.ac.jp○伊藤 洋一郎 1,4, 寺井 悟朗 2, 石上 美佐 3, 橋場 倫子 3,
中村 泰之 1, 番場 崇弘 1, 雲北 涼太 4, 蓮沼 誠久 1,4, 浅井 潔 2,
石井 純 1,4, 近藤 昭彦 1,4（1 神戸大・先端バイオ工研セ, 2 東大院・新領域, 3 高機能遺伝子
デザイン技術研究組合, 4 神戸大院・科技イノベ）
junjun@port.kobe-u.ac.jp

L-Proline (Pro) is one of the major osmolytes for adaptation to salt stress in plants andmicroorganisms. However, Halomonas elongata produces ectoine (Ect) as a major
osmolyte during salt stress. Here, we aim to engineer H. elongata that produces andaccumulates Pro instead of Ect. Using self-cloning strategy, we amplified Pro
biosynthetic pathway genes, proB, proA, and proC, which encode the enzymes γglutamyl kinase (GK), γ-glutamyl phosphate reductase, and pyrroline-5-carboxylate
reductase, from genome of H. elongata OUT30018 strain. These 3 genes and an
mCherry reporter gene were used to replace three ect genes of the salt-inducible Ectbiosynthetic ectABC operon in the OUT30018 strain to create H. elongata HN1 strain(∆ectABC::mCherry-proBAC), which expressed an artificial salt-inducible Probiosynthetic mCherry-proBAC operon. We also created H. elongata HN2 strain(∆ectABC::mCherry-proBmAC), in which a mutant proBm gene encoding a feedbackinsensitive GK mutant was expressed in place of proB. We found that the HN2 strain,
but not the HN1 strain, could produce Pro as a major osmolyte during salt stress. To
minimize Pro catabolism, a putA gene encoding a major Pro catalytic enzyme wasdeleted from HN2 strain to create H. elongata HN3 strain (∆ectABC::mCherryproBmAC, ∆putA), which exhibits increase Pro accumulation and higher salt tolerance
than HN2 strain. We conclude that the H. elongata HN3 strain can be used to develop
cell factories for production of Pro and Pro-derived chemicals

近年、石油化学に頼らないバイオ化学品の発酵生産が世界的に盛んであり、ピキア酵母は、外来タンパク質生産だけでなく、様々な化合物生産の宿主としても期待されている。有用化合物の生産性向上のためには、反応にかかわる酵素
遺伝子の発現量を最適に調節することが重要である。サッカロ酵母で報告があるターミネーター置換による遺伝子発現量の調節手法をピキア酵母へ応用する
ため、様々なターミネーター配列をピキア酵母内に導入してその特性を評価した。具体的には、GAPDH プロモーター制御での GFP 遺伝子のターミネーター
配列を置換した構築物を有するピキア酵母細胞の GFP 蛍光強度をフローサイト
リーにて測定し、ターミネーター強度とした。サッカロ酵母由来及びピキア酵
母由来、合成ターミネーターを含む 72 種類のターミネーター配列を評価した結果、ターミネーター置換による GFP 遺伝子発現量調節のダイナミックレンジは17 倍であり、またサッカロ酵母で作成されたターミネーターカタログはピキア
酵母でも有効であることが分かった。さらに mRNA 安定性評価及び in silico による解析より、ｍ RNA 3’-UTR の二次構造の細胞内での安定性がターミネー
ター強度に影響していることを見出した。代謝工学研究への応用例として、黄色素であるベタキサンチン合成（L-チロシンから 3 段階の合成反応）をモデルと し て 実 証 実 験 を 行 っ た と こ ろ 、 第 1 段 階 の 酵 素 遺 伝 子 （ L-Tyrosinehydroxylase）に使用した複数のターミネーターの強度とベタキサンチン合成量が相関しており、ターミネーター置換による pathway flux 調節に成功した。このようにターミネーター置換による遺伝子発現量調節は、プロモーター置換と共に、ピキア酵母での代謝工学や合成生物学分野で重要なツールとなりうる。

High-salinity induced overproduction of L-proline improves salt-stress
tolerance of engineered ectoine-deficient Halomonas elongata

Exchange of endogenous and heterogeneous yeast terminators in Pichia
pastoris to tune mRNA stability and gene expression○Khanh Huynh Cong, Hideki Nakayama(Grad. Sch. Fish. Sci. Environ. Stud., Nagasaki Univ.)

Key words

halophile, proline○Yoichiro Ito1,4, Goro Terai2, Misa Ishigami3, Noriko Hashiba3,
Yasuyuki Nakamura1, Takahiro Bamba1, Ryota Kumokita4, Tomohisa Hasunuma1,4,
Kiyoshi Asai2, Jun Ishii1,4, Akihiko Kondo1,4(1 EGBRC, Kobe Univ.,, 2 Grad. Sch. Front. Sci., Univ. of Tokyo, 3 TRAHED, 4 Grad.
Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)
Key words
Pichia pastoris, terminator, gene expression, mRNA stability

113

1Jp02
学

バクテリオファージ由来 RNA ポリメラーゼを利用した
酵母遺伝子スイッチの開発○堀 智彦 1, 冨永 将大 1,2, 梶 亘佑 1, 近藤 昭彦 1,2,3,4, 石井 純 1,2（1 神戸大院・科技イノベ, 2 神戸大・先端バイオ工研セ, 3 神戸大院・工, 4 理研・環境資源）
junjun@port.kobe-u.ac.jp

1Jp04

講演中止

学

【目的】新規な微生物機能の創出を目指す合成生物学では，化学物質の濃度に応答して遺伝子発現をコントロールする人工の転写制御系（遺伝子スイッチ）を用いて，遺伝子発現を自在に制御することが重要である。シンプルな遺伝子発現系を持つ原核生物では優れた遺伝子スイッチが多数開発されているが，真核微生物の酵母では遺伝子スイッチの開発が遅れている。これは，多数の転写因子，RNA ポリメラーゼ，制御配列などの多数の因子が複雑に絡みあう酵母の遺伝子発現について，個々の要素が機能に与える影響を正確に予測できないためである。本研究では，酵母内在の因子と相互作用しないバクテリア由来の RNA
ポリメラーゼとそのプロモータからなるシンプルな転写系を利用した，新たな酵母遺伝子スイッチの簡便な作出法の確立を目指した。
【方法・結果】Bacteriophage T7 由来の RNA ポリメラーゼ（T7 RNAP）とそのプロモータ（PT7 ）を導入したバクテリア型の酵母遺伝子発現系を利用する。
Pseudomonas fluorescens 由来の転写因子（PhlF）は，そのオペレータ配列である（ phlO ） に 結 合 し 下 流 遺 伝 子 の 転 写 を 阻 害 す る が ， 誘 導 物 質 2,4diacetylphloroglucinol（DAPG）が結合すると phlO から解離して転写を誘導する。ここで，plhO を PT7 と緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子との間に挿入したプラスミドを構築した。このプラスミドを T7 RNAP を発現する酵母株に導入したところ，PT7 による GFP 遺伝子の発現は，DAPG 非添加時には PhlF により抑制され，DAPG を添加すると GFP 発現が最大で 16 倍亢進された。このよ
うに，バクテリア型の転写系を利用して，酵母遺伝子スイッチが容易に作出可能であることを実証できた。本発表では，同様の手法を用いた，さまざまな分子に応答する酵母遺伝子スイッチのシリーズ開発の試みについても紹介する。

Development of yeast transcriptional switches using bacteriophage RNA
polymerase○Tomohiko Hori1, Masahiro Tominaga1,2, Kousuke Kaji1, Akihiko Kondo1,2,3,4,
Jun Ishii1,2(1 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2 EGBRC, Kobe Univ.,, 3 Grad. Sch.
Eng, Kobe Univ., 4 CSRS, RIKENS)

Key words

yeast, genetic switches, expression system, biosensor

1Jp03

酵母の高発現性人工誘導プロモータの開発○冨永 将大 1,2, 伊藤 洋一郎 1,2, 近藤 昭彦 1,2,3,4, 石井 純 1,2（1 神戸大・先端バイオ工研セ, 2 神戸大院・科技イノベ, 3 神戸大院・工, 4 理研・環境資源）
junjun@port.kobe-u.ac.jp

1Jp05

担子菌酵母 Pseudozyma antarctica におけるグルコキ
ナーゼ遺伝子破壊による炭素カタボライト抑制の解除○田中 瑞己 1, 田中 拓未 2, 三浦 敦宏 2, 菅沼 佑奈 3, 鍋田 友美 3,
河原崎 泰昌 3, 山形 洋平 1, 北本 宏子 2
（1 農工大院・農, 2 農研機構・農環研, 3 静県大・食栄）mizuki-tanaka@go.tuat.ac.jp【背景】遺伝子の転写を担うプロモータは，合成生物工学における最も基本的な遺伝子パーツの一つである。遺伝子発現を自在に制御するための人工誘導プロ
モータが盛んに開発されているが，狙った通りに振る舞う人工誘導プロモータの設計は依然として困難である。特に真核微生物の酵母では原核微生物に比べて開発例が少なく，天然の糖誘導性プロモータなどの限られたプロモータ系が多用されている。そこで本研究では，高発現性の酵母人工誘導プロモータの開発を試みた。【方法・結果】バクテリアの転写因子 PhlF の結合配列(phlO)をTATA box の上流に融合して構築した人工プロモータと，ウイルス由来の転写活性化モチーフと PhlF とを融合した人工の転写活性化因子 PhlTA を利用した。
PhlTA は，2,4-Diacetylphloroglucinol (DAPG)に応答して phlO へ結合・解離するため，構築した人工プロモータ下流の転写は DAPG に応答して活性化される。
まず，phlO 融合型の人工プロモータを下流の緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝
子とともに酵母に導入した。しかし，この酵母に PhlTA を導入しても GFP 発現の活性化はみられなかった。そこで，PhlTA の発現カセットにランダム変異を導入した酵母ライブラリを構築し，独自に開発した 3 機能性セレクションマー
カー（Tominaga M., et al., Nat. Commun., 18, 1846 (2021)）を用いて，DAPG 添加
時にのみ遺伝子発現が活性化される PhlTA 変異体を単離した。得られた変異体
PhlTA を導入した酵母に DAPG を添加すると，非誘導時の 500 倍以上の GFP 発
現が誘導された。また，同様の方法を他の転写因子にも適用することで，高発現性の人工誘導プロモータを並列に構築できた。講演では，タンパク質生産性の高いメタノール資化性酵母の Komagataella phaffii で使用できる高発現性の人
工プロモータの構築や，タンパク質の分泌生産への応用についても紹介する。

担子菌酵母 Pseudozyma antarctica が生産する PaE は強力な生分解性プラスチッ
ク分解活性を持ち、生分解性マルチフィルム分解への応用が期待されている。
これまでに、キシロース誘導性の強力な転写活性を持つキシラナーゼプロモー
ターを用いることで PaE の高生産が達成されている。しかし、キシロースは高価であり、より安価なグルコースと併用することによる培養コストの削減が望まれる。キシラナーゼプロモーターからの発現は、グルコースが存在すると炭素カタボライト抑制（CCR）によって抑制される。本研究では、P. antarctica に
おいて CCR に関与する因子を同定し、CCR を解除することを目指した。
子嚢菌酵母では、CCR が解除されることでグルコースアナログである 2-デオキ
シグルコース（2DG）に耐性を示すことが知られている。そこで、P. antarcticaの野生株に紫外線を照射し、2DG 耐性を示す変異株を取得した。出芽酵母では、グルコースキナーゼの１つであるヘキソキナーゼの機能欠損によって 2DG耐性を示すことが知られていることから、選抜した 2DG 耐性株の中で、CCRが解除されていることが予想された 3 株のグルコースキナーゼ遺伝子の DNA
配列を調べた。その結果、いずれの株でもヘキソキナーゼ遺伝子には変異が存在せず、グルコキナーゼ遺伝子（Paglk1）にフレームシフト変異が存在した。
次に、キシラナーゼプロモーターを用いた PaE 高生産株において Paglk1 を破壊した。キシロースとグルコースの混合培地において、コントロール株では PaE
生産性が著しく減少したのに対し、破壊株ではキシロース培地と同等の PaE 生
産性を示した。以上の結果から、P. antarctica ではグルコキナーゼが CCR に関与しており、その機能欠損によって CCR を解除できることが示された。
本研究は生研支援センター「イノベーション創出強化研究推進事業」（JPJ007097）の支援を受けて行った。

Designing strongly inducible yeast synthetic promoters

Release of carbon catabolite repression by deletion of the glucokinase genein Pseudozyma antarctica.

○Masahiro Tominaga1,2, Yoichiro Ito1,2, Akihiko Kondo1,2,3,4, Jun Ishii1,2(1 EGBRC, Kobe Univ.,, 2 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 3 Grad. Sch.
Eng, Kobe Univ., 4 CSRS, RIKENS)

Key words

yeast, synthetic promoter, secretory production, protein overproduction○Mizuki Tanaka1, Takumi Tanaka2, Atsuhiro Miura2, Yuna Suganuma3,
Tomomi Nabeta3, Yasuaki Kawarasaki3, Yohei Yamagata1, Hiroko Kitamoto2(1 Grad. Sch. Agric., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2 NIAES, 3 Sch. Food Nutr. Sci.,
Univ. Shizuoka.)

Key words

basidiomycetes, gene disruption, enzyme production

114

1Jp06

出芽酵母における染色体からのセントロメア DNA の切り出し誘導時に出現する生存細胞の解析○松崎 浩明, 中村 祐茉, 秦野 琢之（福山大・生命工）matsuzaki@fukuyama-u.ac.jp

1Jp08
学

出芽酵母にマルチストレス耐性を付与する新規遺伝子変異の同定および有用性の検討○荻根 千博 1, 田中 桃未 1, 小久保 晋 2, 早川 正幸 3, 山村 英樹 2,
中川 洋史 2
（1 山梨大院・医工農, 2 山梨大院・総研部, 3 山梨県立大学）
youji@yamanashi.ac.jp

我々は、酵母 Saccharomyces cerevisiae において R-RS 部位特異的組換え系を利用して染色体からセントロメア DNA を切り出すことで細胞死を誘導するシステムを構築した。セントロメア DNA の切り出しは、一倍体細胞の第 IV 番染色体の CEN4 の両側に組換え標的部位 (RS) を同じ方向に挿入し、ガラクトースにより R レコンビナーゼの発現を誘導して行う。レコンビナーゼの発現で生存率が大きく低下し、細胞死を誘導できた (生存率：1.4×10-5) 。しかし、僅かな数の生存細胞が出現したので原因を解析した。生存細胞 51 クローンの解析から主な原因は、2 個の RS のうち一方の RS が染色体から欠失し、切り出しが起こらなかったことであった。また、生存細胞の中には CEN4 が切り出された細胞が 3クローン存在した (No. 5、No. 14、No. 15) 。そこで、細胞死の効率改善と核型進化に関する知見を得るためにそれらの 3 クローンの出現メカニズムを解明することにした。パルスフィールドゲル電気泳動による染色体パターンの解析か
ら全クローンで第 IV 番染色体のサイズが変化していた。さらに、No. 14 と No.
15 では第 III 番染色体が消失し、新しい染色体が形成されていた。サザン解析
で染色体の構造を解析した結果、No. 14 と No. 15 では第 IV 番染色体に CEN3
および第 III 番染色体の左腕テロメア付近の VAC17 と右腕テロメア付近の GIT1が存在した。全クローンで第 IV 番染色体には第 IV 番染色体の左腕テロメア近傍の PHO13 と右腕テロメア近傍の HSP31 が存在した。したがって、No. 14 とNo. 15 では第 IV 番染色体は、CEN4 が切り出された後に第 III 番染色体と融合した可能性が示唆される。現在、No. 5 で第 IV 番染色体にハイブリダイズする
セントロメア DNA を探索している。今後、セントロメアの機能に基づく解析からも出現メカニズムを検討しようとしている。

【背景・目的】出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae は幅広い産業に利用されているが、利用過程における高糖濃度や冷凍などの様々なストレス、すなわちマルチ
ストレスによる発酵力や生存率の低下が問題となっている。本研究室では酵母からマルチストレス耐性変異株を効率よく分離できる致死的濃度過酸化水素法（LCH 法）を開発している。本研究室において変異処理を行わずに実験室酵母
株から LCH 法で得られたマルチストレス耐性変異株 S-80-1 に関して、遺伝学的解析と次世代シーケンス解析の結果より、原因変異として新規遺伝子変異が推定された。そこで本研究では、本変異がマルチストレス耐性の原因変異であるか否かを明らかにし、本変異の酵母育種における有用性を検討することを目的とした。
【方法・結果】一倍体実験室酵母野生型株の当該変異による置換株を構築しストレス耐性試験を行った結果、置換株は過酸化水素、高糖濃度、高エタノール濃度、凍結融解、乾燥、高温、老化など多数のストレスに耐性を示した。従って、本変異は新規のマルチストレス耐性変異であることが証明された。本変異はコー
ドするタンパク質の末端 3 つのアミノ酸がフレームシフトにより変化する変異であることから、当該遺伝子の破壊株を構築しストレス耐性試験を行った結果、破壊株も過酸化水素、乾燥、冷凍、高糖濃度ストレス等に耐性を示した。従って、本変異によるマルチストレス耐性の表現型は当該遺伝子の機能欠損によることが示唆された。興味深いことに、グリセロールを炭素源とした平板培地において置換株は野生型株と同程度の生育を示したのに対し、破壊株は弱い生育を示した。従って当該遺伝子の破壊とは異なり、本変異は呼吸能に大きな影響を与えることなくマルチストレス耐性を付与できる変異である可能性が示された。

Analysis for surviving cells appeared with induction of excision ofcentromeric DNA from a chromosome in Saccharomyces cerevisiae

Identification and evaluation of the usefulness of a novel mutation that
confers multistress tolerance on Saccharomyces cerevisiae○Hiroaki Matsuzaki, Yuma Nakamura, Takushi Hatano(Fac. Life Sci. Biotechnol., Fukuyama Univ.)○Chihiro Ogine1, Momomi Tanaka1, Susumu Kokubo2, Masayuki Hayakawa3,
Hideki Yamamura2, Youji Nakagawa2(1 Integr. Grad. Sch. Med. Eng. Agric. Sci, Univ. Yamanashi, 2 Grad. Fac. Interdisc.
Res., Univ. Yamanashi, 3 Yamanashi Prefectur. Univ.)

Key words

cell death, centromere, Saccharomyces cerevisiae, karyotype evolution

Key words
peroxide

Saccharomyces cerevisiae, multistress tolerance, mutation, hydrogen

1Jp07

出芽酵母における新規 RAS1 遺伝子変異の同定と実用
酵母における有用性の検討

1Jp09

酵母 Pseudozyma tsukubaensis 由来糖脂質マンノシルエ
リスリトールリピッドの推定トランスポーター（PtMMF1p）の機能解析学○山岸 まなみ 1, 小林 日花梨 1, 小久保 晋 2, 早川 正幸 3,
山村 英樹 2, 中川 洋史 2
（1 山梨大院・医工農, 2 山梨大院・総研部, 3 山梨県立大学）
youji@yamanashi.ac.jp○雜賀 あずさ 1, 森田 友岳 1, 福岡 徳馬 1, 山本 周平 2, 菅原 知宏 2,
曽我部 敦 3
（1 産総研・機能化学, 2 東洋紡・バイオテクノロジー研, 3 東洋
紡・バイオ事業総括部）
azusa-saika@aist.go.jp【背景・目的】出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae は様々な産業で用いられているが、産業利用の過程で冷凍や高糖濃度などの多様なストレスすなわちマルチス
トレスにさらされることで生存率や発酵能が低下することが問題となっている。
そのため、実用酵母にマルチストレス耐性を付与できる変異が求められている。
当研究室において一倍体実験室酵母株から変異処理を行わずに致死的濃度過酸
化水素法によって分離されたマルチストレス耐性優性変異株について遺伝学的解析と次世代シーケンス解析を行った結果、原因変異として RAS1 遺伝子の新規なミスセンス変異が推定された。そこで本研究では、本変異がマルチストレ
ス耐性の原因変異であるか否かを明らかにし、本変異の実用酵母育種における有用性を検討することを目的とした【方法・結果】実験室酵母一倍体野生型株の RAS1 を本変異で置換した株を構築
し、ストレス耐性をスポット試験により調べた結果、置換株は過酸化水素、高糖濃度、乾燥、熱ショック、冷凍に対してストレス耐性を示した。従って、本変異がマルチストレス耐性変異であることが証明された。さらに置換株と野生型株との二倍体を構築しストレス耐性を調べた結果、ヘテロ接合性の二倍体株は上記のストレスについて一倍体置換株と同程度もしくはより強いストレス耐性を示したことから本変異は優性の表現型を示すことが判明した。そこで実用
酵母育種における本変異の有用性を検定するため、本変異を保持する単コピー
型プラスミドを構築し実用パン酵母株に導入した結果、対象株と比べて導入株
は過酸化水素、乾燥および冷凍ストレスに対する耐性が高かった。従って、本変異は実用パン酵母株にマルチストレス耐性を付与できることが判明した。

マンノシルエリスリトールリピッド（MEL）は酵母が生産する糖脂質型のバイ
オ界面活性剤である。MEL は推定トランスポーター（Mmf1p）により菌体外に分泌されると考えられているが、その機能は不明である。本研究では、酵母
Pseudozyma tsukubaensis の Mmf1（PtMMF1p）を対象に、遺伝子破壊株を利用した PtMMT1p の機能解析を行った。
P. tsukubaensis の PtMMF1 破壊株（ΔPtMMF1）を作製し、MEL が菌体外に分泌されるかを評価した。ΔPtMMF1 および親株を培養し、薄層クロマトグラフィー
で分析した結果、予想に反して MEL は ΔPtMMF1 の菌体内ではなく培養上清から検出された。このことから P. tsukubaensis には PtMMF1p 以外のトランスポー
ターが存在する可能性が示唆された。また、親株はアシル基が 2 つ結合したジアシル型 MEL を単一生産するのに対し、ΔPtMMF1 はジアシル型 MEL の生産量が減少し、代わりにアシル基が 1 つ結合したモノアシル型 MEL および構造未知の糖脂質を生産した。この構造未知の糖脂質を液体クロマトグラフィー/質量分析計および核磁気共鳴分光法で分析した結果、新たなモノアシル型 MEL（モノアシル型 MEL-B）であった。これらの結果から、PtMMF1p の機能について、2 つの仮説：1. ジアシル型 MEL の分泌に関わる主要なトランスポーターであり、欠損によりジアシル型 MEL が菌体内に滞留した結果、脱アシル化によりモノアシル型 MEL の比率が高くなる、2. アシル CoA あるいはモノアシル型
MEL の運搬に関わるオルガネラ間のトランスポーターであり、欠損によりアシル化反応が進行しにくくなった結果、モノアシル型 MEL の比率が高くなる、を立てた。

Identification of a novel RAS1 mutation and evaluation of the usefulness in
an industrial strain of Saccharomyces cerevisiae

Functional analysis of PtMMF1p from Pseudozyma tsukubaensis, a putativetransporter of mannosylerythritol lipids○Manami Yamagishi , Hikari Kobayashi , Susumu Kokubo , Masayuki Hayakawa ,Hideki Yamamura2, Youji Nakagawa2(1 Integr. Grad. Sch. Med. Eng. Agric. Sci, Univ. Yamanashi, 2 Grad. Fac. Interdisc.
Res., Univ. Yamanashi, 3 Yamanashi Prefectur. Univ.)
1

Key words
yeast

1

2

Saccharomyces cerevisiae, multistress tolerance, mutation, baker's

3○Azusa Saika1, Tomotake Morita1, Tokuma Fukuoka1, Shuhei Yamamoto2,
Tomohiro Sugahara2, Atsushi Sogabe3(1 AIST, RISC, 2 Toyobo Co., Ltd., BRL, 3 Toyobo Co., Ltd., BOD)

Key words

biosurfactant, glycolipid, mannosylerythritol lipids, transporter

115

1Jp10
学

麴菌の固体培養特異的発現を示すグルコアミラーゼ遺伝子 glaB プロモーターに存在する AmyR のシスエレメ
ントの同定

1Jp12
学

○青西 洋平, 大沼 司, 渡部 昭, 新谷 尚弘, 五味 勝也（東北大院・農）katsuya.gomi.a6@tohoku.ac.jp

ヒザラガイ RTMP1 ホモログの遺伝子ノックダウンが磁
鉄鉱歯形成に及ぼす影響の評価○赤嶺 晴香 1, 金尾 忠芳 1, 田村 隆 1, 鈴木 道生 2, David Kisailus 3,
大越 健嗣 4, 根本 理子 1（1 岡山大院・環境生命, 2 東大院・農生科, 3 Department ofMaterials Science and Engineering, University of California Irvine,
CA, USA, 4 東邦大・理）mnemoto@okayama-u.ac.jp

麹菌は古くから日本の醸造産業に利用されており、その安全性と高い酵素生産
量から酵素生産の宿主として利用されている。酵素生産量は米や小麦ふすまといった固体を基質として培養する（固体培養）することで格段に高くなることに加え、固体培養特異的に生産される酵素が存在する。固体培養特異的に発現することが知られているグルコアミラーゼ遺伝子 glaB では AmyR と FlbC の 2
種類の転写因子が発現を制御しており、FlbC が glaB プロモーターの(G/C)(G/C)NGATC 配列に結合することが実験的に示されている。また、先行研究では－253 bp から－236 bp(Region R)の領域に AmyR が結合すると予測されている一方、－332 bp から－313 bp(Region S)も重要な未同定転写因子のシスエレメントと考えられている。本研究では、配列の特徴（CGGN8CGG）から Region S にAmyR が結合し発現を制御しているのではないかとの仮説を立て、Region S、
Region R の glaB 発現制御への関与および AmyR との結合性を調べることを目的として実験を行った。まず Region S、Region R を欠損した glaB プロモーターを用いた GUS レポーターアッセイ、および Region S、Region R 欠損株を用いたグルコアミラーゼ活性測定を行った。その結果、Region R を欠損させても活性はわずかにしか下がらなかった一方で、Region S を欠損させると GUS 活性、
グルコアミラーゼ活性ともに大幅に減少した。次に麴菌由来 AmyR の Zinc finger
motif を含む N 末端 131 アミノ酸残基を GST 融合タンパク質として大腸菌で発現させ精製を行い、Region S、Region R の配列を含む DNA 断片を用いてゲルシ
フトアッセイを行った。その結果、Region S は Region R よりも AmyR と強く結合することが示された。これらの結果から、glaB プロモーターにおいて Region
S が AmyR のシスエレメントとして中心的に働き glaB 発現を制御していることが示唆された。

【目的】多板綱 (ヒザラガイ類) は、大側歯の歯冠部に酸化鉄の一種である磁鉄鉱 (Fe3O4) が沈着した、歯舌と呼ばれる摂餌器官を有する。磁鉄鉱が沈着した多板綱の歯は生物が形成する鉱物の中で最大の硬度をもつため、歯の形成機構を解明できれば新規高強度材料の開発への貢献が期待される。当研究室はこれま
でに、オオバンヒザラガイ Cryptochiton stelleri の磁鉄鉱歯特異的タンパク質として新奇タンパク質 radular teeth matrix protein 1 (RTMP1) を同定した。本研究では、ヒザラガイ Acanthopleura japonica を対象として、RTMP1 ホモログ遺伝子である AjRTMP1 遺伝子を RNA 干渉法によりノックダウンし、その機能を明らかにすることを目的とした。
【方法】まず、AjRTMP1 遺伝子を対象として RNA 干渉法を用いた遺伝子ノッ
クダウンを行った。遺伝子ノックダウンを行った個体の歯舌組織切片を作製した後、プルシアンブルーによる鉄染色を行い、顕微鏡の明視野で撮影した画像を解析した。
【結果及び考察】RNA 干渉法による遺伝子ノックダウンを行った結果、AjRTMP1の二本鎖 RNA (dsRNA) を注入した個体は EGFP の dsRNA を注入したネガティ
ブコントロールと比較して AjRTMP1 遺伝子の発現量が有意に低下した。また、
歯舌組織切片をプルシアンブルー染色し、光学顕微鏡による解析を行った結果、
AjRTMP1 遺伝子の発現量が低下した個体では、大側歯の歯冠部において鉄沈着の減少が観察された。以上の結果から AjRTMP1 遺伝子のヒザラガイの歯における酸化鉄沈着への関与が示唆された。

Identification of a cis-element of AmyR in the promoter of the solid-state
culture-specific gene glaB in Aspergillus oryzae

Effects of gene knockdown of the chiton RTMP1 homolog on magnetite
teeth formation○Yohei Aonishi, Tsukasa Onuma, Akira Watanabe, Takahiro Shintani,
Katsuya Gomi
(Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)○Haruka Akamine1, Tadayoshi Kanao1, Takashi Tamura1, Michio Suzuki2,
David Kisailus3, Kenji Okoshi4, Michiko Nemoto1(1 Grad. Sch. Environ. Life Sci., Okayama Univ., 2 Grad. Sch. Agric. Life Sci., Univ.
Tokyo, 3 Dept. Materials Sci. Eng., 4 Fac. Sci., Toho Univ.)

Key words
element

Aspergillus oryzae, solid state fermentation, glucoamylase gene, cis-

Key words

biomineralization, RNA interference, chiton

1Jp11

マイタケ（Grifola frondosa）子実体で発現するプロテアーゼ遺伝子群の同定と異種発現系による性質決定

1Jp13

糸状菌 Trichoderma reesei における新規誘導プロモーターの探索

長嶋 優芽 1, 栗田 涼子 2, 田中 瑞己 3, ○河原崎 泰昌 1,2（1 静県大・食栄, 2 静県大院・薬食生命, 3 農工大院・農）kawarsky@u-shizuoka-ken.ac.jp○一瀬 桜子, 柴田 望, 高橋 史員, 小山 伸吾（花王）
koyama.shingo@kao.com【背景と目的】マイタケ子実体（可食部）は強いプロテアーゼ活性をもつことで知られるが、同酵素活性は複数の未同定酵素群で構成され、詳細は不明である。
そこで本研究は可食部で発現する個々のプロテアーゼを同定し、個別に性質決定を行うことを目的とした。
【方法】ゲノム上の 66 種のプロテアーゼ遺伝子から分泌シグナルを持つものを選抜し、各々の特異的プライマーを設計した。子実体で発現する遺伝子は、子実体 cDNA ライブラリーを鋳型とする PCR により同定した。酵素機能の評価
は、増幅したプロテアーゼ cDNA を発現する組換え出芽酵母を作製し、BSA な
どの蛋白質を基質として用いて行った。
【結果と考察】日本産マイタケ（YM 株）の子実体では、13 種のアスパラギン
酸プロテアーゼ遺伝子のうち 3 種（YMPr1_0、YMPr1_3、YMPr1_8）、ズブチ
リシン様プロテアーゼ遺伝子 2 種（YMSubLa、YMSubLb）、ペプシン様プロテアーゼ遺伝子 YMPep1 が発現していた。これら 6 種のプロテアーゼ cDNA の塩基配列より、スプライシング部位の解析・先行研究（大規模解析）との比較、蛋白質の局在予測や予測構造の解析を行った。組換え酵母を用いた発現を試みたところ、YMPr1_3 と YMPr1_8 プロテアーゼは活性型酵素として分泌された。
この培地上清を「モノクローンの酵素溶液」として両者の性質決定を行い、以下の結果を得た。i) 至適反応 pH3.0-3.5、ii)最適反応温度 50℃、iii) 厳密な配列
特異性がない、iv) 基質非存在下では自己消化して不安定、v) pH7 で安定保存可能、vi) pH により優先的に分解される蛋白質が異なる。また卵白アルブミンの分解抵抗性は、予め加熱処理を施すと減少した。これらより両酵素は、基質の配列よりも部分的な構造を認識して分解反応を始めると予想された。

糸状菌 Trichoderma reesei は糖化酵素を菌体外に多量に分泌生産することから、糖化酵素の生産宿主として広く研究されてきた。さらに近年では、その高いタ
ンパク質生産能力を活かして、異種タンパク質の生産宿主としての利用も期待されている。異種遺伝子などの目的遺伝子を高発現させるプロモーターとして、
これまでに高い発現誘導能を示すセルラーゼ遺伝子 cbh1 のプロモーターが用いられてきた。しかし、cbh1 プロモーターはセルラーゼ生産条件下において活性化するため、cbh1 プロモーターを用いて目的遺伝子を発現させた場合、目的タ
ンパク質以外にも内在性のセルラーゼなどが同時に生産されるという課題があった。そこで、目的タンパク質のみを高生産するために、セルラーゼ生産に関与しない新規の誘導プロモーターを探索することとした。
T. reesei PC-3-7 株をセルロースを含む液体培地で 72 時間培養し、そこにセルラーゼ生産に関与しない炭素源や窒素源などを添加した。添加後 8 時間目の菌体を回収し、菌体から抽出した RNA を用いて RNAseq 解析を行った。その結果、エリスリトールを添加した条件において特異的に発現する遺伝子としてTr68466, Tr68585, Tr122079 及び Tr68606 の 4 遺伝子が見出された。これら 4 つの遺伝子のプロモーター領域を用いてキシラナーゼ XYN3 を誘導発現させてみると、Tr68466 及び Tr68585 プロモーターにおいてエリスリトール添加に応答
して XYN3 が誘導発現することが確認された。以上の結果から、T. reesei における新規の誘導プロモーターとして、エリスリトール誘導性プロモーターを獲得することができた。

Cloning and identification of Grifola frondosa protease genes that express

Screening of novel inducible promoter in Trichoderma reesei

Yume Nagashima1, Ryoko Kurita2, Mizuki Tanaka3, ○Yasuaki Kawarasaki1,2(1 Sch. Food Nutr. Sci., Univ. Shizuoka., 2 Grad. Sch. Integr. Pharm. Nutr. Sci., Univ.
Shizuoka, 3 Grad. Sch. Agric., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words

enzyme, protease, Grifola frondosa (Maitake), expression system○Sakurako Ichinose, Nozomu Shibata, Fumikazu Takahashi, Shingo Koyama(Kao)

Key words

Trichoderma sp., inducible promoter, erythritol

116

1Jp14
学

ミミズを用いた異種タンパク質高発現系構築に向けたプ
ロモーター領域の解析と活性評価○多田 慎之輔, 小島 凌, 本間 真樹, 森山 桐, 赤澤 真一（長岡高専）
s-akazawa@nagaoka-ct.ac.jp

1Jp16
学

Multiple genome modification of Aurantiochytrium sp.
by selection marker recycling system○Heqian Zhu, Mutsumi Nishiura, Kako Niimoto, Kenshi Watanabe,
Tsunehiro Aki(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)
aki@hiroshima-u.ac.jp【目的】近年，遺伝子組換え生物を用いて治療薬を生産するバイオ医薬が注目されており，特に動植物個体を用いた生産法は高額な生産設備を必要としないため次世代型生産法として注目されている．そこで我々は，新規宿主としてミミ
ズ Eisenia fetida 及び Eisenia andrei に注目し，異種遺伝子発現系の構築を目指してきた．これまでに遺伝子データベースの構築，宿主開発の根幹技術となる世界初のミミズ個体・細胞への遺伝子導入法の構築，個体での腎性貧血治療薬ヒ
トエリスロポエチン（hEPO）遺伝子の発現に成功してきたが[1,2]，ウイルス由来 CMV プロモーターを用いているためかタンパク質生産性が低いという課題があった．そこで，本研究ではミミズ由来高発現プロモーターの取得を目指した．
【方法】独自に構築した Eisenia fetida/andrei ゲノム・RNA データベースより 4つの発現量の高い遺伝子を見出し，その上流域のクローニングを行った．次に推定転写因子結合部位を解析し，様々な長さのプロモーターコンストラクトを作成し，NIH3T3 p-7 cl-3 に作成したコンストラクトをトランスフェクション
し，デュアルルシフェラーゼアッセイによるプロモーターアッセイを行い，どの領域のプロモーター活性が最も高いか検証した．
【結果】ミミズが有する 3 つのプロモーター領域を取得し，EFC000009_35（Actin上流）領域が最も高いプロモーター活性を有することを明らかにした．本知見
はミミズ宿主開発や強力な動物プロモーター開発に貢献する．
[1] Akazawa, S. et al. Sci. Rep. 11: 8190 (2021). [2] 赤澤真一．特願 2019-700 号（2019）．

Marine microorganism of the genus Aurantiochytrium produces value-added lipids
such as polyunsaturated fatty acids and carotenoids useful in various industrial fields.
To establish technique for gene modification at multiple genome site is desirable toelucidate their complicated production mechanism and improve productivity bymetabolic engineering. However, the number of selection marker used to screentransformants is limited. In this study, we aimed to establish a selection marker
recycling system in which marker genes once used are functionally deleted and thenreused.
Selection marker genes, URA3, LYS2, TRP1, and GAP1, used in Saccharomyces
cerevisiae, have been reported to allow positive selection in the case of both
introduction and deletion of those markers using auxotrophic complementation andsuicide substrate tolerance, respectively. As a result of culturing in medium containing
each of the suicide substrates, Aurantiochytrium limacinum SR21 showed significant
sensitivity to 3 g/L of 5-fluoroorotic acid (5-FOA) and 1 g/L of 5-fluoroanthranilic
acid (5-FAA) which could be converted into cytotoxic compounds by URA3 and TRP1,
respectively. We are then attempting to disrupt genes similar to URA3 and TRP1 foundin the genome of the strain SR21 by CRISPR-Cas9 system and investigate theauxotrophy and the resistance against the suicide substrates of disruptants.

Investigation of various earthworm promoter activities for the constructionof heterologous-gene expression systems using earthworm

Multiple genome modification of Aurantiochytrium sp. by selection marker
recycling system○Shinnosuke Tada, Ryo Kojima, Maki Homma, Kiri Moriyama, Shin-ichi Akazawa(Nagaoka Natl. Coll. Technol.)○Heqian Zhu, Mutsumi Nishiura, Kako Niimoto, Kenshi Watanabe, Tsunehiro Aki(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)

Key words

promoter, earthworm, lumbrokinase, Eisenia sp.

Key words

1Jp15

Identification of an isomaltose sensor involved inamylolytic enzyme production in Aspergillus

1Kp01

学

○Da Min Jeong, Jikian Tokashiki, Takahiro Shintani, Katsuya Gomi
(Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)
katsuya.gomi.a6@tohoku.ac.jp

Aurantiochytrium sp., genome breeding, metabolic engineering

尾の周波数に注目したメダカの遊泳評価について○甲斐 穂高, 岡 芳樹
（鈴鹿高専）
kai@chem.suzuka-ct.ac.jp

Aspergillus oryzae or koji mold, is known for its ability to produce high levels ofhydrolytic enzymes including amylolytic and proteolytic enzymes, which are used invarious industrial applications In A. oryzae, the regulation of amylolytic enzyme gene
expression is controlled by the fungal-specific transcription factor AmyR. The
induction of AmyR activity is triggered by isomaltose most effectively compared toglucose or maltose. However, isomaltose was found to be barely incorporated into thefungal cells both in A. oryzae and Aspergillus nidulans, suggesting the existence of anunidentified isomaltose sensor on the plasma membrane. In this study, to identify theisomaltose sensor, A. nidulans mutant strains showing good growth on isomaltose agar
were isolated from the strain that showed a defective growth due to overexpression ofbrlA, a transcription factor required for conidiation, with the strong α-amylase genepromoter. Genomic DNA of the most promising candidates were used for wholegenome sequencing to compare genetic polymorphisms. SNP analysis revealed that
mutation in the putative coding sequences (CDS) was included in the major facilitator
superfamily (MFS) transport proteins. Interestingly, different kinds of polymorphisms
were identified in this CDS in common. This MFS transporter is considered to be an
isomaltose sensor of interest in this study, because deletion of the gene restored growthof the A. nidulans strain harboring the brlA overexpression cassette on isomaltose agar
medium.

化学物質に曝露された生物は、何らかの作用やダメージを受けて行動に変化が生じる。化学物質に曝露されたメダカの場合、メダカの泳ぎ方に異常が生じる。
メダカの泳ぎ方の異常は定性的に評価されることが多いが、遊泳速度や遊泳距離などから泳ぎ方の異常を定量的に評価することもできる。本研究では、化学物質に曝露されたメダカの生態影響評価を行うことを目的として、メダカの尾の周波数に注目して、メダカの泳ぎ方の定量的な評価を行っている。実験では、次の方法によりメダカの尾の周波数測定を試みた。いくつかの体長のメダカを円形水槽（例えば直径 6 cm－水深 1.5 cm）に泳がせ、水槽真下から作画トレー
ス台の光を当て、水槽真上からビデオカメラ（Nikon D5300）で約 3 分間撮影した。撮影は、600×600×600 mm の撮影ボックス（外側は黒色、内側は銀幕貼り、照度は 1334 lux、円形水槽の底からビデオカメラレンズまでの距離は 335 mm）
内で行った。撮影したメダカ映像から、シルエット抽出後に細線化して、水槽の枠とメダカの骨格を抽出した。抽出した水槽枠のピクセル数から、ピクセル・
実寸値のスケール変換係数を算出し、抽出した骨格情報からメダカ部位座標を解析して、尾の振動を数値化し、これをフーリエ変換して周波数領域での振幅スペクトルを算出した。既往の研究では、体長約 1.5cm のメダカの尾の周波数は 6－8 Hz に最も強い強度が認められた。本研究ではこの体長よりも小さいメ
ダカの尾の周波数を測定しており、1－30 Hz で一様に振幅スペクトルが分散し、特定の周波数に強度が認められなかった。よって、尾の周波数測定は、体長が重要な測定条件の一つであること、体長に応じて解析条件を細かく設定する必要があることが示唆された。

Identification of an isomaltose sensor involved in amylolytic enzyme
production in Aspergillus

Evaluation of medaka swimming focusing on tail frequency○Da Min Jeong, Jikian Tokashiki, Takahiro Shintani, Katsuya Gomi
(Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)

Key words
disruption

amylase gene, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, gene

○Hotaka Kai, Yoshiki Oka(Suzuka Natl. Coll. Technol.)Key words

tail frequency, medaka, fourier transform

117

1Kp02

酵母ツーハイブリッド法を用いた Survivin と HBXIP の複合体形成部位の解析

1Kp04○飯田 泰広 1,2, 伴 直輝 1, 秋山 佳穂 2, 林 真央 2
（1 神奈川工大・応用バイオ, 2 神奈川工大院・工）iida@bio.kanagawa-it.ac.jp

グラム陰性腸内細菌の Lipid A の構造解析○岡橋 伸幸 1,2,3, 上田 政宏 4, 松田 史生 1, 有田 誠 2,3,5（1 阪大院・情報, 2 理研・生命医科学, 3 慶大院・薬, 4 JSR, 5 横市大院・生命医）n-okahashi@ist.osaka-u.ac.jp

多くのがん細胞ではアポトーシスの機能が抑制されており、増殖や転移等の悪影響を及ぼすことが知られている。Survivin はがん細胞で高く発現しているタンパク質で、アポトーシスの制御に関わる BIR ドメインを有している。このSurvivin は、同様に多くのがん細胞で発現量の多い HBXIP と複合体を形成する
ことによりカスパーゼを阻害することでアポトーシスを抑制することが知られている。この複合体形成を阻害することでアポトーシス誘導型の抗腫瘍活性が得られることを見出してきているが、HBXIP はドメイン構造等未知の部分が多く、複合体を形成する部位は分かっていない。本研究では Survivin-HBXIP 複合体において、HBXIP の複合体形成部位を酵母ツーハイブリッド法を用いて解析した。
HBXIP の Survivin への結合領域を調べるために、HBXIP の部分欠損体をデザイ
ンし、AlphaFold2 を用いてその構造を検証した。Wild type と同様の構造が担保されると予測された HBXIP の部分欠損体 4 種類をサブクローニング後、当該配列を含む発現ベクターを構築した。構築した部分欠損 HBXIP 発現ベクターをSurvivin 発現ベクターを持つ酵母にそれぞれ形質転換し、ツーハイブリッド酵
母を作製、β-galactosidase 活性を指標にその結合に関して評価した。

[背景・目的] 腸内に共生するグラム陰性細菌は細胞膜に存在するリポ多糖の構
成成分 Lipid A を介して、宿主免疫系の活性化や抑制に関与する。これまでに、
Lipid A は菌種ごとに構造の多様性があり、構造に応じて宿主受容体との親和性が異なることが示唆されているが、ヒト腸内細菌の Lipid A の構造や量は不明である。そこで、本研究では、LC-QTOF/MS を用いて Lipid A の分析法を構築
し、バクテロイデス門細菌の解析に適用した。
[方法]嫌気培養したバクテロイデス門細菌 9 株の菌体ペレットを回収し、TriReagent を用いてリポ多糖を抽出したあと、弱酸で糖鎖部分を加水分解して Lipid
A の粗精製物を得た。分析には、LC-QTOF/MS を用いた。
[結果・考察] クロマトグラフィーで Lipid A を保持、分離するために、大腸菌
由来 Lipid A 標準品を用いてカラムおよび移動層条件を検討した。メタルフリー
カラムを利用し、アンモニアを添加した塩基性溶媒を用いることで、リン酸基の金属配管への吸着を低減し、シャープな Lipid A のピークが得られることが分かった。さらに、大腸菌の既知 Lipid A の MS/MS スペクトルから、6 本のア
シル基の結合位置を推定できることを確かめた。続いて、代表的なバクテロイ
デス門細菌 B. fragilis の Lipid A 粗抽出物を分析した結果、その構造はリン酸基
1 つ、アシル鎖 5 本から成り、主鎖には炭素数 15〜17 の多様なヒドロキシ脂肪酸の組み合わせが存在することが明らかとなった。一方、側鎖は C15:0 のみであり、2’位のヒドロキシ脂肪酸にエステル結合していることが分かった。菌株間でこれらの Lipid A の量比を比較したところ、B. fragilis と近縁種では総鎖長81 の Lipid A が 30~50％を占めていたのに対し、遠縁種では総鎖長数が 79 や 80の Lipid A の割合が増加することが明らかとなった。このことから、Lipid A の構造や量比が菌株の分類と対応することが示唆された。

Analysis of the site of Survivin-HBXIP complexation formation by using theyeast two-hybrid method

Stuructre analysis of lipid A in gram-negative intestinal bacteria○Yasuhiro Iida1,2, Naoki Ban1, Yoshiho Akiyama2, Mao Hayashi2(1 Dept. Biosci., Kanagawa Inst. Technol., 2 Grad. Sch. Eng., Kanagawa Inst.
Technol.)○Nobuyuki Okahashi1,2,3, Masahiro Ueda4, Fumio Matsuda1, Makoto Arita2,3,5(1 Grad. Sch. IST, Osaka Univ., 2 IMS,RIKEN, 3 Grad. Sch. Pharm., Keio Univ., 4 JSR
Co., 5 Grad. Sch. MLS, Yokohama City Univ.)

Key words

Two-Hybrid System, antitumor, screening, Survivin

Key words

lipid A, intestinal bacteria, untargeted mass spectrometry

1Kp03

ゲル・カプセル・デジタル・ポリメラーゼ連鎖反応 (gcdPCR) の開発

1Kp05

各種分析記述子に基づく親水性ポリマーの表面改質デー
タサイエンス○陳 政霖, 福田 隆史, 安浦 雅人, 堀口 諭吉, 芦葉 裕樹（産総研・センシングシステム研究センター）
t-fukuda@aist.go.jp

学○岡田 真幸（名大院・生命農学）
jun.kikuchi@riken.jp

液滴デジタル PCR (ddPCR) 法は核酸の絶対定量が可能だが、反応中に起こる液滴の融合等に由来する精度低減の課題が残る。これまでに、フッ素油の導入や界面活性剤の添加により、液滴の安定性を向上させてきたが、フッ素油の供給減や生産停止が続き、コストが高騰している。その為、フッ素油や界面活性剤の使用に代わる方法が必要である。そこで、私達はコア・シェル構造を持つヒ
ドロゲルカプセルに PCR 反応液を封入することにより、安定性と高反応効率を合わせ持つゲル・カプセル・デジタル PCR (gc-dPCR) 法を考案した。アルギン酸ヒドロゲルを用いて、ゲルカプセルを生成した時、10%ひずみになる応力を加えても、ゲルカプセルが破裂しないことを確認した。Cq 値とエンドポイント
蛍光強度を指標に定量 PCR (qPCR) 法、ddPCR 法、gc-dPCR 法の PCR 効率を比較したところ、qPCR より gc-dPCR と ddPCR の Cq 値が有意的に下がり、gcdPCR を ddPCR と比較した際に、実用レベルでの差が認められなかった。エンドポイント評価時の蛍光強度により、gc-dPCR の反応効率が ddPCR より高いことが確認された。この結果は固化しないゾルは PCR 効率に影響がないことを示している。そして、分散媒をフッ素油から大豆油にした時、液滴が分散媒によりよく分散でき、エンドポイント評価時の蛍光強度が有意に上がったことが確認された。又、増幅された核酸が容易に精製できる為、増幅後のシーケンシン
グ等にも対応できる。大豆油を分散媒とした gc-dPCR 法のランニングコストはフッ素油を分散媒とした ddPCR 法の 1/4000 に抑えることができる。gc-dPCR
法は温度サイクルに依存する PCR のみならず、LAMP 法等の定温増幅法にも適用でき、資源が限られている状態下での絶対定量が可能である。

医療や環境分野などで課題となっているファウリングを制御する手法として、
親水性ポリマーによる材料界面のコーティングが活用されている。その材料開発や評価では熟練研究者の勘コツに頼る場面が多く、非効率なプロセスが残っている。今後は材料科学と情報科学の融合による材料開発や評価の効率化が期待されているが、ポリマーは構造の複雑さから情報科学との融合に必須となるポリマーらしさを表す記述子も多様であることから、予測モデルの開発は発展途上にある。そこで、本研究ではコーティング材の表面改質で重要な剥離防止
や水中での安定性に関与すると考えられる柔剛性とファウリングに関与する親水性を予測できるモデルを構築するために、NMR などの分析機器から得られるデータの記述子化とそこからの物性予測に取り組む。
親水性モノマー、架橋剤と光開始重合剤を種々の濃度で配合したコート液をPET 表面に塗布して乾燥後、UV 硬化処理を経て親水性ポリマーを作製した。
各サンプルの緩和曲線を TD-NMR のパルスシークエンス（CPMG、MSE、DQ、
MAPE、SE）により取得した。それらデータをビン化、解析する緩和時間の幅
スムージング条件、及び正規化条件などを検討した。表面組成は FT-IR（または顕微 IR）で測定し、多変量スペクトル分離によって次元を圧縮した。親水性は接触角により評価した。これら前処理した分析機器のデータと PubChem および RDKit から得た各化合物の物理化学的情報のうち剥離や親水性に関与する重要因子の抽出および物性の予測をランダムフォレストなどの機械学習を用いて試みた。その取り組みを報告する。

Development of gel capsule digital polymerase chain reaction (gc-dPCR)

Data science for improving surface properties on hydrophilic polymers
based on various analytical descriptors○Zheng Lin Tan, Takashi Fukuda, Masato Yasuura, Yukichi Horiguchi,
Hiroki Ashiba(Sensing Syst. Res. Center, AIST)

Key words

digital PCR, droplet digital PCR, gel capsule, nucleic acid quantitation○Masayuki Okada(Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)

Key words

NMR data science, machine learning, polymer

118

1Kp06
学

de novo 設計ペプチドナノポアを用いたペプチドーム解
析法の構築

1Kp08

Electrochemical sensing of interleukin 6 in human serumwith epitope-imprinted polymer-coated electrodes
Hung-Yin Lin1, ○Jing-Chen Ciou1, Kai-Hsi Liu1,2, Chuen-Yau Chen1,
Mei-Hwa Lee3
(1 National University of Kaohsiung, 2 Zuoying Branch Kaohsiung
Armed Forces General Hosp, 3 I-Shou Univ)linhy@nuk.edu.tw○山地 未紗, 川野 竜司（農工大院・工）rjkawano@cc.tuat.ac.jp【緒言】
ナノポア計測とはナノスケールの細孔（以下ナノポア）を通過する分子を電気的に 1 分子レベルで検出する手法である。短鎖ペプチドの検出が可能なことから、ペプチド解析への応用が期待される。ナノポア計測において分子は電気泳
動力と電気浸透流(EOF)によりナノポアに挿入される。そのため不均一な電荷分布により電気泳動力の効果が小さいペプチドは低い検出頻度が課題であった。
本研究では検出頻度の改善のためにナノポアと電解質で制御可能な EOF に注目し、強力な EOF が期待される de novo 設計ペプチドナノポア SVG28[1]と分子の泳動の数理モデル[2]を組み合わせによりペプチドの検出頻度の向上を試みた。
【実験・結果】
高い電解質濃度はナノポア計測の分子同定能を向上させるが、EOF の効果を低下させる。そのため電解質濃度の最適化が必要である。電解質は KCl を用いた。数理モデルから SVG28 において EOF が電気泳動力より優位に働く可能性が示唆された 1 M KCl 条件下で荷電状態の異なるペプチドを検出した。その結果、ペプチドの検出頻度は 10〜102 倍になった。これは EOF が強化されただけ
でなく、ナノポアの挿入口におけるペプチドとの静電相互作用によるものと考えられる。
さらに検出シグナルからペプチドの同定を試みた。ナノポア計測で検出された分子はその体積を反映する阻害電流量により同定される。しかし、検出されたペプチドはその体積差に対して阻害電流量の分布が近く、これまでの阻害電流量だけではペプチドの同定は困難であった。本研究では新たなパラメータとして、ナノポアと分子の相互作用の変化を反映するペプチド特異的な電流値変化を検出シグナルから抽出した。これらの解析によりペプチドの同定精度の向上が期待される。
【参考文献】[1] K.Shimizu et.al., Nature Nano., 2022., [2] M.Chinappi and M.Yamaji
et.al., ACS Nano, 2020.

Cardiovascular disease (CVD) includes various types of heart diseases such as
coronary artery disease, heart failure, and abnormal heart rhythms, as well as otherconditions such as stroke, hypertensive heart disease, rheumatic heart disease,cardiomyopathy, valvular heart disease, aortic aneurysms, and peripheral artery disease
Interleukin 6 (IL-6) is a multifunctional cytokine that plays a crucial role in the
immune and inflammatory systems It has been associated with a variety of healthconditions, including cardiovascular disease (CVD). Epitope-imprinted polymers(EIPs) have been synthesized and applied in various fields, such as electrochemicalsensors, separations, assays, sensors, imaging, and protein recognition. In this work,
several peptides of IL-6 were synthesized and then imprinted onto poly(aniline-co-3aminobenzenesulfonic acid), poly(AN-co-MSAN), by electropolymerization. These
conductive polymer films were then examined by both scanning electron microscopy(SEM) and atomic force microscopy (AFM). The sensing range of this IL-6 EIP
biosensor was from 1.0 to 1000 fg/mL. Finally, commercially available serum wasdiluted and then measured using the epitope-imprinted polymer-coated electrodes toestimate the accuracy compared with ELISA results.

Peptidome analysis method with de novo designed peptide nanopore

Electrochemical sensing of interleukin 6 in human serum with epitopeimprinted polymer-coated electrodes○Misa Yamaji, Ryuji Kawano(Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words

1Kp07

Hung-Yin Lin1, ○Jing-Chen Ciou1, Kai-Hsi Liu1,2, Chuen-Yau Chen1,
Mei-Hwa Lee3
(1 National University of Kaohsiung, 2 Zuoying Branch Kaohsiung Armed Forces
General Hosp, 3 I-Shou Univ)

nanopore, peptide, proteome

Key words
sensing

interleukin 6, human serum, epitope imprinting, electrochemical

紙ベース酵素センサを用いたチロシナーゼ活性阻害検出

1Kp09

電界配向を用いた市販ヨーグルト中の乳酸菌の簡易生存率測定○永谷 尚紀 1, 後藤 香秋 1, 肥塚 梨菜 2
（1 岡山理大・工, 2 奈良先端大・バイオ）nagatani@ous.ac.jp

学○奥原 太生 1, 近藤 涼太 2, 須加 実 1, 篠原 寛明 1
（1 富山大院・理工, 2 富山大・工）
suga@eng.u-toyama.ac.jp【緒言】
安価で製作が可能であり廃棄性の良さから, 紙をベースとしたセンサが研究されている。紙の吸水性を利用することでポンプレスの送液を行うマイクロ流体ペー
パー分析デバイス (Microfluidic paper-based analytical devices, μPADs)として, 日米の研究者を中心として多数報告されている。本研究では，プリンタで流路をワックス(インク)で印刷した紙ベースのセンサを用いてチロシナーゼの酵素活性阻害の検出を行ったので報告する。印刷したセンサではチロシナーゼ活性阻害試
料液を滴下するのみで検出が可能であった。
【実験】
印刷した紙ベースのセンサへの最適な試料の滴下量を調べるために水性インクを用いた。チロシナーゼ活性の検出には基質としてチロシン, ドーパを用いた。
チロシナーゼはチロシンからドーパへドーパからメラニンへの２つの段階の反応を触媒する。チロシナーゼによってメラニンまでに分解されると茶色に発色する。この茶色の発色を酵素活性の目安とした。酵素活性の阻害剤としてはア
ルブチン, コウジ酸を用いた。
【結果】
水性インクを用いた紙ベースのセンサへの試料の滴下量の最適化実験では, 25
μL でセンサの末端に到達することがわかった。アルブチンを用いて酵素活性の阻害を検出したところ 5 mM でチロシンからメラニンへの酵素活性が阻害されているのが確認できドーパでは活性が阻害されていないことが確認できた。これはアルブチンがチロシンからドーパへの触媒活性のみを阻害することと一致する。コウジ酸では 3 mM までコントロール (水)に比べてチロシン, ドーパ共に発色が弱くなっている。これはコウジ酸がチロシンからドーパ, ドーパからメラ
ニンの両方の触媒活性を阻害することと一致した結果である。コウジ酸を含んだ美白化粧品では 100 倍希釈までセンサを用いて酵素活性阻害が確認できた。

発酵食品の品質管理において微生物の生存率測定法は重要である。従来の測定法であるコロニー計数法は培養時間が長く、またフローサイトメトリー法は装置が高価であり、一般に蛍光染色が必要であるという課題がある。こうした課題に対し当研究室では、非球形微生物細胞の交流電界中での誘電分極に基づく
電界配向現象を利用する迅速で簡便な生死判別法を開発している。本研究では、
この電界配向法を用いて、市販ヨーグルト中の乳酸菌の生存率を迅速、簡便に測定できたので報告する。
市販ヨーグルトからの乳酸菌サンプルの調製は、物質・材料研究機構の中尾らが開発したボルテックスミキサーでカゼインミセルを取り除く簡易迅速法を用いた。通常の電界配向法では蛍光染色する必要はないが、本研究では個々の細胞の生死を可視化するため蛍光染色した。生菌を染色する SYTO9 および細胞膜損傷菌を染色する Propidium iodide（PI）で二重染色し、遠心分離機を用いて染色液を取り除いてから蒸留水 (0.2 mS/m)で再懸濁した。透明な Indium tin oxide（ITO）電極２枚でこのサンプル 0.5 µL を挟み込み、蛍光顕微鏡ステージに設置
し、電極間に発振器で 10 MHz、2 V の交流電圧を 10 秒印加した。
市販ヨーグルトから単離した乳酸菌サンプルでも、菌種によらず電界配向により直立した真円形の細胞と、転倒した楕円形の細胞が観察された。また、SYTO9で染色された生細胞は直立し、PI で染色された死細胞は転倒している様子が観察され、蛍光染色の違いと配向方向の違いは一致していた。これは、電界配向法による生死判別が、細胞膜損傷により細胞内の導電率が低下することを指標とするためである。以上の結果から、電界配向法で市販ヨーグルト中の乳酸菌の生存率を迅速で簡便に測定できることが明らかとなった。

Detection of inhibition of tyrosinase activity using a paper-based enzyme
sensor

Simple viability assay for lactic acid bacteria in commercial yogurt using
electro-orientation○Naoki Nagatani , Kaaki Goto , Rina Koezuka(1 Fac. Eng., Okayama Univ. Sci., 2 Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)1

Key words

1

2

biosensor, enzyme sensor, microfluidic device○Taiki Okuhara1, Ryota Kondo2, Minoru Suga1, Hiroaki Shinohara1(1 Grad. Sch. Sci. Eng., Univ. Toyama, 2 Fac. Eng., Univ. Toyama)

Key words

viability, lactic acid bacteria, electro-orientation, yogurt

119

1Kp10
学

表面増強ラマン散乱を利用したノロウイルスの簡易検出
法の開発

1Kp12

新規 Type I-D CRISPR-Cas (TiD-X)を用いた高効率なヒトゲノム編集○和田 直樹 1, 村上 愛美 1, 丸井 和也 1, 刑部 祐里子 2, 刑部 敬史 1
（1 徳島大院・社会産理工, 2 東工大・生命理工）kosakabe@tokushima-u.ac.jp○前畑 秀叡 1, 朴 龍洙 1,2, Khoris memdi Indra 2, Achadu Ojodomo 2（1 静大院・総合科技, 2 静大・グリーン科技研）
park.enoch@shizuoka.ac.jp

ノロウイルス（NoV）は直径約 35 nm の粒子で一本鎖プラス RNA を遺伝子として持つ、非常に感染力の強いウイルスである。食中毒の主な原因であり感染すると、感染性胃腸炎を発症し、下痢や嘔吐、腹痛を引き起こすなど食品の安全性に深く関わっている。感染拡大を防ぐには、感染者の早期検出が重要である。そこで、ナノ材料による表面増強ラマン散乱（SERS）を利用した簡易ウイ
ルス検出法を開発し報告する。
銀ナノ粒子を金ナノ粒子の表面にコーティングした Au@Ag コアシェルナノ粒子を作製した。そこにラマンタグである 4 メルカプト安息香酸（4-MBA）を修飾し、さらに Au@Ag の表面に金ナノ粒子を修飾することで、サテライト型
Au@Ag-MBA-Au NPs を作製し、ナノタグとした。ナノタグと磁気ナノ粒子（MNP）に抗 NoV 抗体を修飾させ、抗体修飾ナノタグ、抗体修飾 MNP を作製した。ノロウイルス様粒子（NoV-LP）存在下で、これらと混合するとナノタグ－NoV-LP－MNP のサンドイッチ構造が形成する。サンドイッチ構造を磁気分離した後、金基板に滴下し小型ラマン分光光度計（PR-1w, Jasco）でラマン散乱を測定する NoV 検出方法を開発し、評価を行った。
本法で作製したナノタグは、Au@Ag-MBA の約 4 倍、4-MBA の約 30 倍と優れた SERS を示した。このナノタグを用いて NoV-LP 検出を行った結果、ウイル
ス濃度 1 pg/mL ~ 1 ng/mL の範囲で濃度依存的なラマン散乱強度が確認できた。
また 30 分以内の検出時間で検出限界は 0.68 pg/mL の優れた感度を有していることが示された。今後、夾雑物中での検出を行い、この検出システムの有用性を示していく予定である。

我々はこれまで、藍藻 Microcystis aeruginosa が有する CRISPR-Cas type I-D シス
テムに着目し、新規国産ゲノム編集ツール TiD を開発、動植物のゲノム編集への利用を報告してきた。TiD の大きな特徴の一つは、高い特異性である。TiD
は、最も汎用的に利用されている CRISPR-Cas9 よりも長い配列を認識するため(Cas9: 20 塩基, TiD: 35-36 塩基)、高精度な国産ゲノム編集ツールとしての利用が期待できる。また、標的配列周辺に長鎖欠失を誘導するなど、CRISPR-Cas9とは異なるユニークな特徴を持っている。
本研究では、これまでとは異なる菌株由来の CRISPR-Cas type I-D に注目し、さらに高い変異導入効率を示すゲノム編集ツール TiD-X の開発を行った。ヒト細胞において TiD-X を用いたゲノム編集を行うことで、外来遺伝子、ヒト内在遺伝子ともに高効率な変異導入が可能であることを明らかにした。また、適切な標的配列を用いることで、CRISPR-Cas9 と同等の変異導入効率が得られることがわかった。半数体モデル細胞株である HAP1 細胞を用いて行った HPRT 遺伝
子へのノックアウト実験では、薬剤選抜を行うことなしに、HPRT 遺伝子ノッ
クアウト細胞株を効率的に単離することができた。さらに、Split-GFP を用いた
TriFC システムを利用し、全ての TiD cas 遺伝子や crRNA が共導入された細胞を濃縮することで、ノックアウト細胞株の樹立効率を高めることに成功した。
今後、さらなる改良や解析を進め、様々な分野で利用可能な高精度かつ高効率な国産ゲノム編集ツールとして確立したい。

Development of a simple detection method for norovirus using surface
enhanced Raman scattering

Highly efficient genome editing using Type I-D CRISPR-Cas (TiD-X)○Shuei Maehata1, Enoch Y. Park1,2, Indra Khoris memdi2, Ojodomo Achadu2(1 Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2 Res. Inst. Green Sci. Technol.,Shizuoka Univ.)○Naoki Wada1, Emi Murakami1, Kazuya Marui1, Yuriko Osakabe2, Keishi Osakabe1(1 Grad. Sch. Biosci. Bioind, Tokushima Univ., 2 Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)

Key words

surface-raman scattering(sers), gold nanoparticles, sensor

Key words

genome engineering, CRISPR-Cas, Human Cell

1Kp11

水晶振動子マイクロバランス法と画像解析による細胞老化のモニタリング

1Kp13

Activation of tumor suppressor genes in glioblastoma
with CRISPR/dCas9a immobilized magnetic peptideimprinted chitosan nanoparticles○山口 響（東京工科大院・バイオニクス）
tsugiyama@stf.teu.ac.jp○Yu-Ling Lin1, Ya-Chun Chang1, Mei-Hwa Lee2, Hung-Yin Lin1
(1 National University of Kaohsiung, 2 I-Shou Univ)linhy@nuk.edu.tw【はじめに】細胞老化は、がん増殖と止める役割がある。その一方で老化関連性
分泌タンパク質を発現して周辺細胞のがん化を促進する。そして、個体老化との関連などから医薬品の標的として注目されている。老化細胞を検出する技術は重要で、細胞老化に特徴的な肥大、扁平化や、特定のタンパク質や遺伝子発現などが調べられている。水晶振動子マイクロバランス法(QCM 法)は、水晶振動子表面の質量、粘性変化をナノグラムレベルで検出できるため、接着細胞の動態変化を調べることができる。そこで、本研究では、QCM 法により老化細胞を特異的に検出できるか検証することを目的とした。
【方法】本研究では、酸化インジウムスズを成膜した AT カット水晶振動子を用いた。QCM 法による細胞動態の測定は、QCM 測定器と顕微鏡撮影機構、CO2
インキュベーターが一体となった装置を用いた。ヒト大腸がん細胞 HCT116 を
抗がん剤ドキソルビシンで老化誘導を行い、老化誘導を行っていない細胞と比較した。細胞老化に伴う肥大化の評価は画像処理ソフトである ImageJ を使用し、細胞の平面積を比べた。老化関連酸性 β-ガラクトシダーゼ活性は固定化した細胞を X-gal で染色して比色した。
【結果と考察】培養ディッシュ上で老化誘導した細胞を水晶振動子上に播種した
ところ、共振周波数の低下が比較的に早いことを観察した。次に水晶振動子上で老化誘導を行ったところ、老化誘導を行っていない細胞に比べて細胞数が少ないにもかかわらず、共振周波数低下量はほぼ変わらない、あるいは大きかった。老化誘導による応答が得られたため、細胞老化を QCM 法でモニタリング
できる可能性が示唆された。しかし、播種量の誤差、接着力や局所的な細胞密度の違い、老化から免れた細胞の増殖など個々の要因の寄与度は不明である。
今後は増殖速度や老化細胞の割合の確認などの基礎実験を行う予定である。

Glioblastoma is the most aggressive and malignant form of glioma, and is the mostcommon type of primary brain tumor in adults. Tumor suppressor genes are a type ofgene that normally help to prevent the development of cancer by regulating cell growthand division, repairing damaged DNA, and triggering cell death (apoptosis). The
CRISPRCas9 system works by using an RNA molecule to guide an enzyme called
Cas9 to a specific location in the DNA sequence. In this work, several guide RNA(gRNA) of tumor suppressor genes were synthesized to form
ribonucleoprotein (RNPs) with dCas9-VPR, and then immobilized on magnetic
peptide-imprinted chitosan nanoparticles (MMIPs). These RNPs/MMIPs weredelivered to the glioblastoma U87MG cells for the activation of various tumor
suppressor genes. Interestingly, the staining results indicated that these tumor
suppressor genes were activated in both normal and cancers. The viabilities of the
U87MG cells were decreased to as low as 60% compared with normal HS68 cells.

Monitoring of cellular senescence by Quartz Crystal Microbalance andimage analysis

Activation of tumor suppressor genes in glioblastoma with CRISPR/dCas9a
immobilized magnetic peptide-imprinted chitosan nanoparticles○Hibiki Yamaguchi(Grad. Sch. Bionics Comput. Media Sci., Tokyo Univ. Technol.)Key words

quartz crystal microbalance, senescence○Yu-Ling Lin1, Ya-Chun Chang1, Mei-Hwa Lee2, Hung-Yin Lin1
(1 National University of Kaohsiung, 2 I-Shou Univ)

Key words
clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPRassociated protein 9 (Cas9) system, gene activation, tumor suppressor genes,
magnetic peptideimprinted chitosan nanoparticles (MMIPs)

120

1Kp14

ゲノム改変技術によるハンチントン病モデル iPS 細胞の作製○倉澤 光 1,2, 相澤 康則 1,2（1 地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所, 2 東工大・生命理工）yaizawa@bio.titech.ac.jp

1Kp16
学

抗原レセプターシグナル依存的に発現するオーファンレ
セプター NR4A1 の B 細胞における発現制御機構の解明○長門 直希, 伊藤 雄大, 野田 凌太郎, 金山 直樹（岡山大院・統合科学）
nkanayam@okayama-u.ac.jp

ゲノム編集技術の発達により、健常者由来 iPS 細胞のゲノム上の配列を改変し、疾患を模倣した細胞を作製するという「疾患モデリング」が注目されている。
作製した疾患モデル細胞と、その親株である健常者由来細胞は遺伝的背景が同一であるため、両者を比較することで、どのような遺伝子ネットワークの変化が生じたのかを明確に比較することができるという利点がある。
近年、我々は、CRISPR/Cas9 システムを利用したゲノム改変手法「Universal
Knock-in System (UKiS)」を開発した。本手法は、対象としているゲノム領域の両アリルを任意に改変できる技術である。この手法の応用として、トリプレッ
トリピート病であるハンチントン病の疾患モデル細胞の作製を試みた。ハンチントン病は、責任遺伝子であるハンチンチン遺伝子上の CAG リピート数が増大することで、グルタミン（Q）配列が異常に伸長したハンチンチンタンパク質が細胞に対して毒性を示すという発症機序が知られている。我々は UKiS 法を用いて、健常者由来 iPS 細胞のハンチンチン遺伝子上の CAG リピート数を改変し、10Q/10Q を有する「非疾患型」、55Q/10Q を有する「成人発症型」、
99Q/10Q を有する「若年発症型」のモデル細胞を作製した。さらにこれらに加えて、両方のアリルに異常伸長した CAG リピートが導入された、55Q/55Q を有する「成人発症型のホモ接合体」、99Q/99Q を有する「若年発症型のホモ接合体」を作製することに成功した。異常伸長した CAG リピートをホモ接合で有する細胞株は、より強い表現型を示すと期待される。本発表では、これら 5 株の細胞セットに対する表現型解析の最新のデータを報告する。

我々は、自発的に抗体可変部遺伝子に変異を導入するニワトリ B 細胞株 DT40を利用した抗体の親和性成熟技術の開発に取り組んでいる。本研究では、免疫系の親和性成熟システムで抗体ライブラリーから親和性の高い抗体産生細胞を選択する過程を in vitro で再現し、in vitro 抗体スクリーニング系への応用を目指している。抗原と BCR(B 細胞抗原受容体)が結合した際に細胞内に伝わる
BCR シグナルによって、シグナル強度依存的に発現する転写因子 NR4A1 に着目し、その発現制御機構の解明を試みた。BCR シグナルを抗 IgM 抗体による
BCR 架橋刺激によって惹起し、NR4A1 転写量を測定した。BCR シグナルの上流シグナル伝達因子のうち、Syk あるいは PLCγ2 をノックアウトした DT40 細胞でのみ、BCR 刺激による NR4A1 転写が起こらなかった。Ca2+キレーターやCa2+受容体 Calmodulin(CaM)阻害剤の添加によっても NR4A1 転写が顕著に抑制されたことから、Syk や PLCγ2 の関与する Ca2+シグナル伝達が主要なシグナルであることが示された。また、その下流の Calcineurin や PKC の関与も特異的阻害剤を用いて示された。続いて、NR4A1 プロモーター下流に蛍光タンパク質
遺伝子を組み込んだベクターを DT40 細胞に導入し、BCR 刺激による NR4A1 転写活性化を蛍光強度で観察するレポーター系を構築した。NR4A1 プロモーター
領域に見られた２ヶ所の転写因子 MEF2 の結合モチーフに変異を導入すると、BCR 刺激なしでも蛍光発現が起こり、逆に BCR 刺激による発現誘導が減弱した。すなわち、BCR 無刺激時には NR4A1 転写が MEF2 を介して抑制され、刺激時には促進されていることが示唆された。現在、NR4A1 転写に関与する MEF2
以外の因子を探索している。これらの知見は、B 細胞における親和性認識機構を利用した高親和性抗体産生クローンの選択技術の開発に利用可能であると考えられる。

Generation of Huntington's disease model iPS cells by genome engineering
technology

Mechanisms of the orphan receptor NR4A1 expression regulated by B cell
antigen receptor signals○Kurasawa Hikaru1,2, Aizawa Yasunori1,2(1 Kanagawa Institute of Industrial Science and Technology, 2 Sch. Life Sci. Technol,Tokyo Tech)○Naoki Nagato, Yuta Ito, Ryotaro Noda, Naoki Kanayama(Grad. Sch. ISEHS., Okayama Univ.)

Key words

genome engineering

Key words

nr4a1, DT40 cells, affinity maturation, signal transduction

1Kp15

抗原刺激強度依存的な遺伝子発現における BCR シグナ
ル経路の役割

1Lp01

臭気性ハロゲン化フェノールの生物学的手法を用いた高感度定量法の開発

学○小野 和奏, 安福 希, 伊藤 雄大, 金山 直樹（岡山大院・統合科学）
nkanayam@okayama-u.ac.jp○後藤 早希, 中倉 快斗, 大沼 浩輝, 浦瀬 太郎（東京工科大・応生）
urase@stf.teu.ac.jp

抗体の親和性成熟では、活性化 B 細胞の抗体可変部に変異が導入され、生じた変異抗体産生細胞から高親和性クローンが選択される。高親和性クローンのその後の分化過程でも抗原との親和性が重要な役割を果たす。これらの選択には
BCR（B 細胞抗原受容体）と抗原との親和性が重要だが、親和性と BCR シグナルの関係性は十分に説明されていない。抗原親和性に依存した B 細胞応答を解明するため、ニワトリ B 細胞株 DT40 において BCR シグナル強度依存的に発現が誘導される遺伝子に着目し、そのシグナル伝達経路を解明することを試みる。
遺伝子発現情報データベース NCBI GEO に登録されている BCR 刺激 DT40 細
胞の DNA アレイ解析データを分析し、BCR シグナル強度依存的に発現する遺伝子を探索した。これらの遺伝子について、anti-chicken IgM mAb (M4) で BCR
を架橋刺激後、抽出したｍ RNA を RT-PCR によって転写量解析した。また、発現に至るシグナル伝達経路を解明するため、BCR シグナル伝達因子を阻害した条件下で M4 刺激を行い、各遺伝子の転写量を解析した。さらに、M4 抗体濃度を変えることで抗原刺激強度の違いを模倣し、各遺伝子発現における抗原親和性と使用するシグナル経路との関係について評価した。
抽出された 10 遺伝子中、9 遺伝子において BCR 刺激強度依存的な転写量の増加が認められた。各因子に対する阻害剤を添加後、刺激強度を変えて発現誘導に関与するシグナル伝達経路を解析した結果、高刺激強度時は MEK 経路、低刺激強度時は CAMK 経路に依存しやすいことが明らかになった。一方で、JNKや IKK、Calcineurin 経路はどちらの刺激強度にも依存しており、p38 の経路は
初期一時間の刺激ではあまり使われないことが明らかになった。抗原刺激強度に依存した遺伝子発現調節機構は、高親和性抗体を発現する細胞のスクリーニ
ング系の構築に有用であると考えられる。

【背景・目的】ハロゲン化フェノールは、飲料水の異臭味の原因物質であり低濃度までの定量が求められる。しかしながら、従来の測定方法では、操作が煩雑であり定量に必要な試料水の液量も多い。そこで、本研究では、細菌を利用してハロゲン化フェノールをメチル化し、ハロゲン化アニソールを GC/MS により定量することで少量の試料水でも測定可能な高感度定量法を開発した。
【方法・結果】ハロゲン化フェノールの 1 種である 2,4,6-トリクロロフェノール（2,4,6-TCP）を 2,4,6-トリクロロアニソール（2,4,6-TCA）に変換する微生物を探索するため、さまざまな水環境中からスクリーニングを行った。その結果、消毒用塩素に常に曝される環境から 2,4,6-TCA 生成能が高い株の単離に成功した。さらに、単離した細菌は、2,4,6-TCP 以外のハロゲン化フェノールもメチル化することが確認された。単離した細菌を用いて 2,4,6-TCP の定量法を開発するため、0.1〜10 μg/L の 2,4,6-TCP を含む R2A 液体培地に細菌を接種し、24 時間培養した。培養後、培地中の 2,4,6-TCA を GC/MS により定量した結果、添加した 2,4,6-TCP 量と生産された 2,4,6-TCA 量は比例していた（R2>0.99）。また、細菌の 2,4,6-TCP からの 2,4,6-TCA の変換率を求めたところ、85.9±5.3%と高かった。この変換率の数値を使用し、2,4,6-TCP を添加しなかった試料の 3σ および
10σ から 2,4,6-TCP の検出下限値と定量下限値を求めたところ、それぞれ 5.2
ng/L および 17.3 ng/L であった。今後は、2,4,6-TCP 定量法のさらなる高感度化
や、2,4,6-TCP 以外のハロゲン化フェノールの高感度定量法の開発を行う予定である。

Role of BCR signaling pathways in antigen stimulation intensity-dependent
gene expression

Development of a biological method for the determination of odorous
halogenated phenols with a high sensitivity○Wakana Ono, Nozomi Yasufuku, Yuta Ito, Naoki Kanayama(Grad. Sch. ISEHS., Okayama Univ.)

Key words

antibody, affinity maturation, DT40 cells, signal transduction○Saki Goto, Kaito Nakakura, Hiroki Ohnuma, Taro Urase(Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Univ. Technol.)Key words

halogenated phenol, odorous substance, biological quantification

121

1Lp02

トルエン資化細菌 Acinetobacter sp. Tol 5 の外膜タンパ
ク質におけるメチル化修飾

1Lp04

Escherichia coli K-１２株でのバイオフィルム形成における遺伝子発現変動○小川 亜希子（鈴鹿高専）
ogawa@chem.suzuka-ct.ac.jp○井上 翔理, 岡 大椰, 吉本 将悟, 堀 克敏
（名大院・工）khori@chembio.nagoya-u.ac.jp【背景】
トルエン資化細菌 Acinetobacter sp. Tol 5 は菌体表層に有するファイバー状のタ
ンパク質 AtaA を介して、様々な材料表面に強固に接着する。ごく最近、AtaA
は細菌では珍しい翻訳後修飾であるメチル化修飾を受けることが明らかになってきた。AtaA が属する三量体型オートトランスポーターアドヘシン (TAA) ファ
ミリータンパク質においてメチル化修飾に関する先行研究はなく、AtaA のメチ
ル化修飾が Tol 5 の接着性に及ぼす影響は不明であった。そこで本研究では、
菌体表層タンパク質 AtaA のメチル化修飾が Tol 5 の接着性に及ぼす影響を明らかにした。
【方法】AtaA のメチル化に関与すると予想される Tol 5 由来外膜タンパク質リシ
ン残基メチル化酵素 (PKMT) の遺伝子欠損株 (Δpkmt 株) を作製した。その後、LC-MS/MS 解析により野生株と Δpkmt 株のメチル化修飾を解析・比較した。さらに、SDS-PAGE と免疫染色により pkmt 欠損による AtaA の発現量と菌体表層への提示量の変化を調べた。その後、Δpkmt 株を用いてプレート付着試験を行うことで、pkmt 欠損が Tol 5 の接着性に及ぼす影響を評価した。
【結果および考察】Tol 5 野生株で発現した AtaA 分子全体のリシン残基がメチル化されていた一方、Δpkmt 株で発現した AtaA はメチル化されなかった。また、
PKMT は他のタンパク質をメチル化せず、AtaA のみを特異的にメチル化していた。このメチル化修飾は、Tol 5 の AtaA を介した高い接着性に寄与している可能性が考えられたが、想定に反して AtaA がメチル化されない Δpkmt 株で AtaAの発現量および菌体表層への提示量が増加し、野生株より高い接着性を示した。
この結果は、AtaA のメチル化修飾が Tol 5 の接着には寄与していないことを示しており、他の役割を果たしている可能性が示唆された。

バイオフィルムは、微生物とそれらが産生した細胞外高分子基質からなる複合体であり、生存戦略である。生体内でのバイオフィルム形成はバイオフィルム
感染症を引き起こす要因であり、そのリスクは挿入型医療器具の利用で引き上げられる。そのため、生体材料に抗バイオフィルム特性を付与し、感染症発生
リスクを減らさねばならない。ここで、生体材料の抗バイオフィルム特性の評
価（バイオフィルム定量）が重要となる。現在、バイオフィルム定量法としてクリスタルバイオレット染色法が知られているが、本研究では、バイオフィル
ム形成に伴う細菌の遺伝子発現変動の利用を提案している。
我々は、バイオフィルムのモデル生物として E. coli K-12 sp.を選択し、攪拌型バイオフィルム形成装置内でバイオフィルムを形成させた。続いて、バイオフィ
ルムから RNA を抽出して DNase 処理し RNA 試料とした。対照として、振とう培養した E. coli K-12（これを浮遊状態と呼ぶ）から抽出した RNA 試料を使用した。これら RNA 試料（n = 1）をマイクロアレイ解析（Takara Bio）し、得られたシグナル強度を元にして浮遊状態とバイオフィルム状態での遺伝子発現を比較した。結果、浮遊状態とバイオフィルム状態との間で（1）共通してシグナ
ル検出された遺伝子数は 7124、（2）バイオフィルム状態でのみシグナル検出された遺伝子数は 135、（3）浮遊状態でのみシグナル検出された遺伝子数は 751であった。また、6 種類のハウスキーピング遺伝子について、浮遊状態とバイ
オフィルム状態間でシグナル強度を比較したところ、遺伝子種によって両者間で遺伝子発現量に差が見られた。KEGG pathway には E. coli の biofilm-formationがある。今回の結果から、バイオフィルム形成に伴う遺伝子発現変動は、この
biofilm-formation 経路だけでなく他の代謝系も関連していると示唆される。

Methylation of an outer membrane protein in the toluene degrading
bacterium Acinetobacter sp. Tol 5

Change of gene expressions in biofilm formation of Escherichia coli K-12
strain○Shori Inoue, Hiroya Oka, Shogo Yoshimoto, Katsutoshi Hori
(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)○Akiko Ogawa(KOSEN, Suzuka Coll.)

Key words
degradation

Acinetobacter , post translational modification, adhesion, toluene

Key words

biofilm, Escherichia coli, microarray

1Lp03

トルエン資化細菌 Acinetobacter sp. Tol 5 の外膜トラン
スポーター機能解析

1Lp05

乳製品加工残渣を栄養源とし緑藻を培養した際の細胞応答についての解析と評価○森 さくら, 吉本 将悟, 岡 大椰, 堀 克敏
（名大院・工）khori@chembio.nagoya-u.ac.jp

学○蓬田 美紗樹 1, 堀本 智仁 2, 中西 昭仁 1,3（1 東京工科大院・バイオニクス, 2 明治, 3 東京工科大・応生）
nakanishiah@stf.teu.ac.jp【背景・目的】 気相微生物反応は、担体に微生物を直接固定することにより気相中で微生物反応を行う革新的なバイオプロセスである。グラム陰性菌
Acinetobacter sp. Tol 5 は細胞表面にある接着性タンパク質 AtaA を介して担体へ容易に固定でき、気相微生物反応でトルエンやモノテルペンの物質変換に成功している。一般に、グラム陰性菌における疎水性分子の取り込みは外膜トラン
スポーターを介するが、Tol 5 においてどの外膜トランスポーターがどの疎水性分子の輸送に関わるのか、またそれらが液相/気相で異なるのかはわかっていない。本研究では、Tol 5 の主な基質であるトルエンの取り込みに関わるトランス
ポーターの探索を目的とした。
【方法・結果】 まず、トルエンの取り込みに関わることが報告されている
Pseudomonas putida todX と配列相同性が高い Tol 5 外膜トランスポーター fadL-2
をシチジン塩基編集によりノックアウトした株を作製した。GC-MS によりトル
エン分解量を測定した結果、fadL-2 ノックアウト株は非ノックアウト株に比べトルエン分解量が少なかった。これより、fadL-2 はトルエン取り込みに関わることが明らかとなった。しかし、fadL-2 ノックアウト株はトルエンを唯一の炭素源とする培地で増殖したため、トルエン取り込みトランスポーターは他にも存在すると考えられた。そこで、BLAST を用いて fadL-2 以外の疎水性分子を取り込むと推定されるトランスポーターの探索を行った。探索の結果、Tol 5 には疎水性芳香族の取り込みに関わるとされる Pseudomonas aeruginosa oprG に類似したトランスポーター遺伝子が少なくとも 6 つ存在することが明らかになった。現在、これらの遺伝子について機能評価を進めている。

【目的】ホエイは乳製品の製造工程で残渣として得られる。ホエイはタンパク質を豊富に含んでおり栄養源として好ましいため、廃棄せずに効率よく利用でき
れば産業上価値が高いと考えた。そこで一般的な陸生植物に比べ炭酸固定能が10 ~ 50 倍高く物質生産性に優れた Chlamydomonas reinhardtii を用いた有用物質
生産系の構築を目指した。本研究では、細胞応答を細胞の生育性と網羅的な遺伝子転写量を解析することで評価し、ホエイを高付加価値化合物の生産に活用できるかを示す。
【方法】乳製品加工残渣として、ホエイを限外濾過に供した際の濾物である「WPC34」と、ホエイを乾燥させた「ホエイパウダー」を用いた。従属栄養系の合成培地である TAP 培地の単一窒素源である NH4Cl を WPC34 とホエイパウ
ダーに置換して C. reinhardtii を培養し、比増殖速度と最大細胞密度を導出して細胞増殖を評価した。また乳製品加工残渣と NH4Cl を窒素源として生育した細胞の網羅的な遺伝子転写量を定量 PCR によって解析し細胞応答を推察した。
【結果・考察】細胞増殖について、細胞密度が培地中 WPC34 濃度に依存したことから、WPC34 が窒素源として C. reinhardtii の生育に利用されたことが示唆された。また、等量の乳製品加工残渣を培地に添加した際、WPC34 を使用した時の方がホエイパウダーを使用した時よりも C. reinhardtii の比増殖速度が低かったため、WPC34 はホエイパウダーと比較して、C. reinhardtii の増殖に有利なア
ミノ酸や微量元素等が不足している可能性が示唆された。不足していると考えられる成分を WPC34 およびホエイパウダーの組成からピックアップし、WPC34を含む TAP 培地に 1 つずつ添加した培地で細胞の生育性を評価した。また、現在解析中の遺伝子転写量評価の結果を報告する。これらの結果からホエイを高付加価値化合物の生産に活用できることを示す。

Functional analysis of outer membrane transporters of the toluenedegrading bacterium Acinetobacter sp. Tol 5

Analysis and evaluation of cellular responses of green algae cultured in a
medium with dairy-processing residues as a nutrient○Sakura Mori, Shogo Yoshimoto, Hiroya Oka, Katsutoshi Hori
(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

Key words

transporter, toluene-degrading bacteria, Acinetobacter○Misaki Yomogita1, Tomohito Horimoto2, Akihito Nakanishi1,3(1 Grad. Sch. Bionics Comput. Media Sci., Tokyo Univ. Technol., 2 Meiji Co., Ltd.,
3
Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Univ. Technol.)Key words

Chlamydomonas reinhardtii, whey, transcription level

122

1Lp06

有用微生物の選抜を目指したダイズ根圏微生物群集の機
能評価○木伏 真子 1,2, 西川 洋平 2,3, 細川 正人 1,2,3,4, 中岡 慎治 5,
穴井 豊昭 6, 竹山 春子 1,2,3,4（1 早大院・先進理工, 2 産総研・早大 CBBD-OIL, 3 早大・ナノラ
イフ創新研, 4 早大・生命動態研, 5 北大院・生命科学, 6 九大院・農）
haruko-takeyama@waseda.jp

1Lp08
学

原生生物の捕食圧下における藍藻の細胞形態変化の解
析(1)：淡水性藍藻 Synechococcus elongatus PCC 7942 の場合○戸田 成美 1, 吉田 亮介 1, 渡辺 智 2, 石田 丈典 1, 池田 丈 1,
舟橋 久景 1, 黒田 章夫 1, 廣田 隆一 1
（1 広島大院・統合生命科学, 2 東農大院・農）hirota@hiroshima-u.ac.jp【背景と目的】 近年、有用微生物を土壌に播種することで植物の生育を制御する試みが行われており、複数微生物による協調効果も期待されている。従来は、単独の微生物の機能に着目する研究が主であったが、微生物叢が多様な土壌環
境では、群集としての機能を捉えた上で個々の役割を解析する必要があると考えられる。そこで本研究では、微生物叢解析と 1 細胞ゲノム解析を組み合わせることで、群集レベルで微生物の機能を評価する手法を構築した。
【方法】 佐賀大学の圃場にて 3 成長段階（根粒形成期・開花期・登熟期）でダイズを採取し、根の周辺を細分化(根から離れた土壌・根圏・根表面・根粒・根)して微生物画分を調製した。これらの計 791 サンプルから、微生物叢および1 細胞ゲノム情報を取得した。
【結果と考察】 異なる前作履歴を持つ圃場での 2 年間のサンプリングにより、根の周辺の微生物叢は、画分>成長段階>前作・年度、の順に影響を受けることが確認された。そこで、有用微生物が多く存在すると考えられる根表面に着目
し、存在量の増減から微生物共起ネットワークを構築した。続いて、1 細胞ゲノム解析により、504 属 16,883 個の微生物ゲノムから 5 種類の主要な植物生育促進機能に関わる遺伝子を検出した。個々の有用機能情報と微生物間の共起関係を獲得したため、両者を複合して考察を行った。その結果、多くの共起関係を持ちネットワークの中心となるハブ微生物は必ずしも有用機能を保有しておらず、単独の機能によって植物に強い影響を及ぼすわけではないことが示唆された。そこで、共起する微生物をまとめて群集レベルで機能評価を行い、高機能な微生物群を選抜した。現在、これらの微生物群について植物への播種実験を進めることで、有用機能の検証を行っている。
【謝辞】 本研究は内閣府ムーンショット型農林水産研究開発事業によって実施された。

【目的】微細藻類は光合成により CO2 を固定し有用物質を生産できるため、持続可能な物質生産システムとして期待されている。しかし実用規模培養では、原生生物のコンタミネーションとその捕食による藻類の生産性低下が大きな課題となっている。我々はこれまでに藍藻の培養系で頻出する捕食性原生生物
Poterioochromonas malhamensis が極めて深刻な捕食被害をもたらすことを明らかにした。しかしながら P. malhamensis 存在下で藍藻 Synechococcus elongatus
PCC 7942 を培養すると、一定の頻度で捕食から逃れる PCC 7942 細胞が出現し、それらの多くは細胞長が劇的に伸長していることから、細胞サイズが大きくなることで捕食から逃れていることが示唆された。本研究ではこの細胞形態変化を藍藻培養における捕食抵抗性の付与に活用することを最終的な目標とし、形態異常が生じる原因とメカニズムの解明を試みた。
【方法・結果】PCC 7942 と P. malhamensis を共培養したところ、多くの PCC 7942
は数日で捕食されたが、約 7 日後から細胞長が著しく伸長した細胞が出現し培養系を優占した。この伸長株を単離し継代培養すると、P. malhamensis 非存在下においても伸長形質を維持した。そこで複数の伸長株のゲノムを NGS 解析により調べると、細胞分裂や細胞壁形成に関する遺伝子に複数の変異が見出された。
遺伝子変異と伸長形質との関連を調べるため、当該遺伝子のノックアウト株を作製したところ同様の伸長形質が確認されたことから、検出された遺伝子変異
が伸長形質の原因であることが明らかになった。また、単離された伸長株に改めて P. malhamensis を添加し培養すると、野生株と比較して細胞数の減少量が低下したことから、伸長株は伸長した形態により捕食耐性を向上させていることが示された。

Functional assessment of microbial consortium in soybean rhizosphere
aimed for the selection of beneficial microbes

Analysis of the morphological changes of cyanobacteria under grazingpressure (1): The case of freshwater cyanobacterium Synechococcus
elongatus PCC 7942

○Masako Kifushi , Yohei Nishikawa , Masahito Hosokawa, Shinji Nakaoka ,Toyoaki Anai6, Haruko Takeyama1,2,3,4(1 Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2 CBBD-OIL, AIST-Waseda Univ., 3 Res.
Org. Nano Life Innov., Waseda Univ., 4 Inst. Adv. Res. Biosyst. Dyn., Waseda Res.
Inst. Sci. Eng., Waseda Univ., 5 Grad. Sch. Life Sci., Hokkaido Univ., 6 Grad. Sch.
Agric., Kyushu Univ.)
Key words
single-cell analysis, soybean, metagenomic libraries, rhizoplane○Narumi Toda1, Ryosuke Yoshida1, Satoru Watanabe2, Takenori Ishida1,
Takeshi Ikeda1, Hisakage Funabashi1, Akio Kuroda1, Ryuichi Hirota1(1 Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 2 Grad. Sch. Agric., Tokyo Univ.
Agric.)
Key words
cyanobacteria, cell morphology, coculture, microalgae

1Lp07

1Lp09

1,2

2,3

1,2,3,45

強酸性温泉由来微細藻類の簡易開放大量培養を目指した培養特性調査○岡澤 空汰 1, 邱 泰瑛 2, 小西 正朗 2
（1 北見工大院・工, 2 北見工大）
konishim@mail.kitami-it.ac.jp

学

原生生物の捕食圧下における藍藻の細胞形態変化の解析(2)：海洋性藍藻 Synechococcus sp. PCC 7002 の場合○吉田 亮介 1, 渡辺 智 2, 石田 丈典 1, 池田 丈 1, 舟橋 久景 1,
黒田 章夫 1, 廣田 隆一 1
（1 広島大院・統合生命科学, 2 東農大院・農）hirota@hiroshima-u.ac.jp

微細藻類は光合成により二酸化炭素を同化する微生物である。その培養手法の一種である開放型培養では培養対象の微生物以外による汚染(コンタミネーション)が課題として挙げられ、これに対し他の生物が生育できない強酸性、強アル
カリ性など極限環境下での培養が多く検討されている。本研究では強酸性温泉
より微生物を単離および同定し、強酸性温泉水を用いた培地で培養することで安価な開放型培養の可能性を探索した。微生物は北海道の川湯温泉周辺より採取、分離し DNA シーケンスで取得した 18S rDNA の塩基配列から系統解析し同定した。取得した 12 菌株すべてが緑藻 Chlamydomonas eustigma と同定された。
温泉水は川湯温泉より取得し、イオンクロマトグラフィー(IC)で含有イオン濃度を定量した。IC の結果、温泉水は微生物の増殖に必要な窒素源、リン源が極めて低濃度であることが示唆された。この結果より温泉水に窒素または窒素とリンを添加した培地で C. eustigma を培養したとろ、合成培地で培養した場合と同程度の濁度が得られた。さらに、有機炭素源を含まない合成培地および試薬を添加した温泉水に 5 g/L の glucose を追加し混合栄養条件の培養とすること
で、最終濁度が 8 倍ほどになり、合成培地で 3.5 g/L ほどの乾燥菌体重量が得られた。また、同菌株は振とう条件よりも静置条件で良好に増殖することがわかった。開放条件下での混合栄養培養でも微生物汚染を防止し、優占的に生育可能なことが示唆されている。以上から本研究で分離された C. eustigma は温泉水を用いて攪拌のない開放条件という非常に簡便な条件下で培養可能であることが示唆された。本発表では微細藻類の温泉水を用いた培養とその培養特性について紹介する。

【目的】藍藻は光合成によって CO₂を固定し、様々な有用物質を生産できること
から持続可能な物質生産システムのホストとして期待されている。実用レベルの藍藻培養は大型の培養槽で行われる場合が主であるが、規模が大きくなると完全な滅菌は困難である。そのため、捕食性原生生物のコンタミネーションによる藍藻の増殖低下が大きな課題となっている。先行研究において、捕食性原生生物の存在下で淡水性藍藻が伸長・分枝するなどの形態変化を起こし、捕食から免れるという現象を見出している。この現象を応用することで、原生生物
による捕食被害を軽減できる可能性がある。そこで本研究では、高密度培養が可能であるなどの実用的な利点を有する海洋性藍藻 Synechococcus sp. PCC 7002
においても捕食圧下で同様の形態変化が起きるのかを調べ、そのメカニズムの解明を試みた。
【方法・結果】広島県内で採取した海水から 2 種類の捕食性繊毛虫を単離、同定した。これらを PCC 7002 と共培養したところ、約 6 日後から PCC 7002 の細胞形態に変化が現れた。その細胞形態は、分裂した細胞が連続的に並んで糸状化したものや、単一な細胞が分裂せずに伸長したもの、形がいびつなものであった。これらの株を単離しゲノムを NGS 解析により調べたところ、複数の変異が見出された。それらの遺伝子変異と形態変化の関係を調べるために、見出された変異遺伝子のうち、細胞分裂や細胞壁溶解に関わると思われる遺伝子の破壊株を作製した。その遺伝子破壊株の細胞形態を観察した結果、単離した形態異常株と同様の表現型を示した。この結果から、単離された形態異常株の形質は、当該遺伝子の変異が原因であることが明らかになった。また、単離や遺伝子破壊によって得られた形態異常株を捕食者と共培養したところ、野生株と比較して高い捕食耐性を持つことが分かった。

Characterization of microalgae isolated from acidic hot spring: in aiming
open pond culture utilization.

Analysis of the morphological changes of cyanobacteria under grazingpressure (2): The case of marine cyanobacterium Synechococcus sp. PCC
7002○Sorata Okazawa , Tai-Yang Chiou , Masaaki Konishi(1 Grad. Sch. Eng., Kitami Inst. Technol., 2 Kitami Inst. Technol.)1

Key words

microalgae, open pond2

2

○Ryosuke Yoshida1, Satoru Watanabe2, Takenori Ishida1, Takeshi Ikeda1,
Hisakage Funabashi1, Akio Kuroda1, Ryuichi Hirota1(1 Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 2 Grad. Sch. Agric., Tokyo Univ.
Agric.)
Key words
cyanobacteria, marine microalgae, symbiosis, cell morphology

123

1Lp10

光合成細菌の細胞成分による植物成長促進効果○林 修平 1, 岩本 康成 1, 平川 夕貴 1, 森 康一 1, 山田 直樹 2,
牧 孝昭 2, 山本 進二郎 1, 宮坂 均 1（1 崇城大・生物生命, 2 （株）松本微生物研究所）
shayashi@bio.sojo-u.ac.jp

1Lp12
学

鎖長の異なるポリ(ε-L-リシン) の出芽酵母に対する抗菌作用○谷村 雨音, 吉田 修, 松井 旺大, 竹原 宗範（滋県大院・工・材料科学）
takehara@mat.usp.ac.jp

植物の成長を促進させる紅色非硫黄細菌（光合成細菌）は、植物の成長に有益な化合物を生産する能力により、植物生産において注目を集めている光合成微生物である。植物に使用する場合、光合成細菌は生細胞、死細胞、細胞由来製品の 3 つに区別される。これまでの研究は主に生細胞の使用に焦点を当てており、死細胞の使用にはあまり焦点を当てていなかった。本研究では、生細胞を超音波処理することによって死細胞を調製し、死細胞と生細胞による植物の成長促進効果を比較した。さらに、死細胞成分に含まれる植物の成長促進に関わる物質について検討した。
生細胞あるいは死細胞を投与した植物は、それぞれ無投与の対照群に比べて新鮮重量が有意に増加し、死細胞は生細胞よりも高い成長促進効果を示した。さらに、死細胞を遠心分離し、上清（可溶成分）とペレット（不溶成分）に分け、それぞれを植物に投与した。上清では、比較的高濃度で投与した場合に植物の成長が促進されたが、ペレットでは、比較的低濃度では植物の成長が促進されることがわかった。
紅色非硫黄細菌はグラム陰性菌であり、不溶成分であるペレットには、細胞壁成分であるペプチドグリカンやリポ多糖（LPS）が含まれていることが考えられる。その中でも生理活性が報告されている LPS が植物の成長を促進するのではないかと仮説を立て、光合成細菌由来の LPS と大腸菌由来の LPS を植物に投与して比較した。10〜100 pg/mL の濃度で光合成細菌由来 LPS を投与した植物は、無投与の対照群に比べて新鮮重量が有意に増加した。一方、100 pg/mL の濃度で大腸菌由来 LPS を投与した植物は、無投与の対照群とほぼ同等であった。光合成細菌由来 LPS と大腸菌由来 LPS では、構成するリピド A の構造が異なり、そのことが植物成長促進効果の差を生じさせていると考えられる。

【背景と目的】Streptomyces 属放線菌により生産されるポリ(ε-L-リシン) (ε-PL)は、幅広い抗菌スペクトルを示す一方で、生体適合性に優れたカチオン性ポリペプチドである。食品保存料として利用されている ε-PL は中重合度体 (M-ε-PL,n = 22-36) であるが、我々は低重合度体 (S-ε-PL, n = 5-20) を見出し、天然培地中
では S-ε-PL の方が M-ε-PL よりも出芽酵母に対して高い抗菌性を示すことを報告した (Biotechnol. Lett., (2010) 32, 1299)。本研究では、これら鎖長の異なる εPL について、出芽酵母の細胞表層への蓄積や膜破壊の有無、細胞膜透過を検討した。
【方法】被検菌として Saccharomyces cerevisiae BY4741 を用いた。S-ε-PL、M-εPL を SD 培地またはリン酸緩衝液 (pH 6.8) 中で S. cerevisiae に作用させたときの抗菌性を評価した。また、蛍光色素 FAM を内包させたリポソームの漏出試
験や Propidium iodide (PI) 染色により、ε-PL の細胞膜に対する細孔形成能を調査した。さらに Dansyl hydrazine により蛍光ラベル化した ε-PL を S. cerevisiae に作用させ、抗菌能や細胞膜透過能のエネルギー依存性を検討した。
【結果と考察】SD 培地中では S-ε-PL が、リン酸緩衝液中では M-ε-PL の方がそれぞれ高い抗菌性を示した。ε-PL の添加で、リポソームからの FAM の漏出や、PI 染色による菌体の蛍光強度増大は見られず、ε-PL は細胞膜に細孔を形成したり膜破壊を引き起こしたりしないことが示された。低温条件下では、M-ε-PL のS. cerevisiae に対する細胞内取り込みが大幅に減少したが、抗菌能は十分に抑制されなかった。ε-PL はエネルギー依存的に細胞膜を透過し抗菌性を発現するだけでなく、細胞膜外でも作用していることが示唆された。

Plant growth promoting effect by cell components of photosynthetic bacteria

Antifungal action of poly(epsilon-L-lysine)s with different chain lengths
against Saccharomyces cerevisiae○Shuhei Hayashi1, Yasunari Iwamoto1, Yuki Hirakawa1, Koichi Mori1,
Naoki Yamada2, Takaaki Maki2, Shinjiro Yamamoto1, Hitoshi Miyasaka1(1 Fac. Biotechnol. Life Sci., Sojo Univ., 2 Matsumoto Institute of Microorganisms
Co., Ltd.)○Amane Tanimura, Osamu Yoshida, Akihiro Matsui, Munenori Takehara(Dept. Mater. Sci., Grad. Sch. Eng., Univ. Shiga Pref.)Key words
photosynthetic bacteria, plant growth promoting effec,
lipopolysaccharide

Key words
membrane

1Lp11

1Lp13

出芽酵母における培地成分としてのふすま残渣の利用価値に関する評価○森 美乃莉 1, 中西 昭仁 1,2（1 東京工科大・応生, 2 東京工科大院・バイオニクス）
nakanishiah@stf.teu.ac.jp

学

poly(epsilon-L-lysine), antifungal, Saccharomyces cerevisiae, cell

変形菌の糖質分解酵素に関する研究○川合 哲也, 鈴木 孝征, 金政 真
（中部大院・応生）
kanamasa@isc.chubu.ac.jp【背景と目的】
小麦を製粉する過程で副産物として得られるふすまは、アミノ酸などの潤沢な栄養成分を含むことから食品等に利用されている。ただ、限定的な小麦ふすまの利用方法が課題となっており、新規利用方法の開拓が求められている。そこ
で小麦ふすまを栄養源とした培地で出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae BY4741
株を培養させ、一般的に高価な培地成分の代替や選択培地としての利用の開拓を試みた。更に、小麦ふすまを用いて培養された当該株の代謝経路を SD 培地
での代謝経路と比較し、網羅的な細胞応答の変化を予測することで、培地成分として小麦ふすまの利用可能性の提示を目的とした。
【方法】
本研究では、BY4741 株は一般的な酵母培養に用いられる SD 培地の YNB を小麦ふすまで代替した培地 (SDY 培地)で培養され、細胞生育性は OD600、エタノー
ル発酵試験で評価された。また、ロイシン要求性当該株は、ロイシンマーカー
遺伝子が組み込まれた pATP425 で形質転換の後、ロイシン抜きの選択培地で増殖が評価された。更に小麦ふすま含有培地で培養された酵母細胞の応答は、遺伝子転写量を網羅的に解析し、評価された。
【結果、考察】BY4741 株は SDY 培地で増殖した。従って当該株の培養において、小麦ふすま
による YNB の代替つまり少なくとも窒素源としての利用が示された。また YNBを小麦ふすまで代替しかつロイシンを除いた培地では、BY4741 株の増殖が確認されず、pATP425 で形質転換させた当該株の増殖が確認された。この結果から、小麦ふすまは当該株のロイシン選択培地としての利用が示された。さらに、
小麦ふすま含有培地ではＳＤ培地で培養された BY4741 株の細胞応答とは異なるエタノール発酵性や、代謝経路が予測され、副産物である小麦ふすまから出
芽酵母を介した物質生産の可能性が示された。

【目的】
バイオマスは地球上に最も多く存在する再生可能な資源であり、その利用過程で生じる二酸化炭素は植物に吸収されて炭素循環を形成することから、持続可能社会の実現に向けたひとつの有力な解決策になると期待されている。食糧と競合しない木質バイオマスの利用のためには糖質加水分解酵素による分解（糖化）が必要である。しかし木質バイオマスはセルロースとヘミセルロース、リグニンからなる複雑で強固な構造のため、より効率的な分解方法の開発が課題である。変形菌（真性粘菌）の一種である Physarum polycephalum（モジホコリ）は、糖質加水分解酵素を生産するが、詳細は未解明である。そこで、本菌を用いた木質バイオマス利用を最終目標として、本研究では、粘菌の糖質分解
酵素の分析や、酵素遺伝子の探索に取り組んだ。
【材料と方法】
本菌を、アビセル（結晶性セルロース）、ガラクトマンナン、キシランからそれぞれ合成された基質を含む平板培地にて培養し、それぞれの分解活性をプレー
トアッセイにより調べた。また、本菌の酵素や生産物を定量的に測定しやすくするために、液体培地での培養法構築を目指し、液体培養法を検討した。
【結果】
プレートアッセイでは、キシランを盛んに分解し、ガラクトマンナンも分解することが分かった。アビセルに対する分解活性は認められなかった。
【考察】
プレートアッセイで用いた基質は天然物を修飾して合成された基質であるため、基質特異性を厳密には判断できないものの、本菌におけるマンナン分解については初めての報告である。

Evaluation of utilizing wheat bran residue as a medium components of S.
cerevisiae

Study on carbohydrate hydrolase of myxomycete○Minori Mori , Akihito Nakanishi(1 Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Univ. Technol., 2 Grad. Sch. Bionics Comput.
Media Sci., Tokyo Univ. Technol.)1

Key words

1,2

Saccharomyces cerevisiae, transcription, wheat bran residue○Tetsuya Kawai, Takamasa Suzuki, Shin Kanamasa(Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Chubu Univ.)

Key words

enzyme production, myxomycete, Physarum polycephalum

124

1Lp14
学

サツマイモ基腐病菌に対する Pseudomonas KS-4 株の抗菌作用の解明1Lp16

グラム陰性菌の培養に伴ない生成するエンドトキシンの諸特性解析○今村 百花 1, 德永 成美 1, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大院・生物資源科学学位P, 2 筑波大・生命環境系）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp○栗原 優花, 児玉 浩明（千葉大院・園芸）
kodama@faculty.chiba-u.jp

サツマイモ主要産地である九州地方で 2018 年秋から、国内で初めてサツマイモ
基腐病が確認され、収量の減少が問題となっている。本病の原因菌は糸状菌である Diaporte destruens と考えられ、感染すると苗が立ち枯れを起こし塊根が腐敗する症状が発生する。2021 年には全国的な感染拡大が確認されており、現状
では病害の発生生態、防除対策についての知見がなく強力な有効策は見つかっていない。
Pseudomonas KS-4 株は生育良好なピーマンの茎から植物内生菌として単離された。KS-4 株は園芸作物の病害糸状菌を抑制する Pseudomonas fluorescens と近縁で、オーキシン産生、リンの可溶化能をもつ植物成長促進細菌(plant growthpromoting bacteria PGPB)である。また KS-4 株はサツマイモ基腐菌をはじめ、果樹 類 の 根 を 腐 敗 さ せ る Rosellinia necatrix 、 キ ク 立 ち 枯 れ 病 を 引 き 起 こ す
Rhizoctonia solani の成長を強く阻害する。この抗糸状菌活性は揮発性の物質によるものと推定されたので報告する。

【目的】 演者らは、Endotoxin（ET）の高感度・迅速測定法（LAL 固定化ビーズ法）を開発し、グラム陰性菌の培養に伴う ET の挙動を解析した結果、”菌体の増殖に伴い ET が菌体外に顕著に遊離する”タイプと、”ほとんど遊離しない”タ
イプのグラム陰性菌が存在することを見出した(1)。しかしながら、菌体外に遊離する Extracellular ET（E-ET）と、菌体に留まる Intracellular ET（I-ET）の諸
特性については未知な部分が多い。本研究では、E-ET と I-ET の諸特性の比較解析を行った。
【方法・結果】 Escherichia coli UKT-B 株由来の Control Standard Endotoxin（CSE）と、Klebsiella pneumoniae（菌体の増殖に伴い ET を菌体外に顕著に遊離）および E. coli K12（ET をほとんど遊離しない）の E-ET、I-ET を対象に、注射用水を使用して実験を行った。界面活性剤 Triton X-114 を用いた二層分離で ET の水和性の解析を行った結果、CSE は親水層に多く分布したのに対し、両菌株の EET、I-ET は疎水層に多く分布した。また、両菌株の E-ET、I-ET は、対数増殖期の中期と後期で親水性、疎水性の割合が変化することが明らかとなり、ET の菌体外への遊離との関連性が示唆された。超音波処理が各種の ET の活性に及ぼす影響を解析した結果、CSE は活性が 7 倍上昇し、K. pneumoniae の E-ET は
約 1.7 倍、I-ET は約 3.5 倍上昇した。一方、E. coli の E-ET は約 1.2 倍、I-ET は
約 1.3 倍活性が上昇し、K. pneumoniae の ET と比べて活性の上昇は少なかった。
TEM 観察により、各種の ET の集合体が崩れると ET 活性が上昇する可能性が示された（ET を菌体外に遊離しやすい菌株の ET は構造が脆弱である可能性が示唆された）。現在、腸内における ET の挙動の解析を目指し、注射用水の代わりに人工腸液を用いた系について検討中である。

Elucidation of antibacterial effect of Pseudomonas KS-4 on Diaporthe
destruens

Analysis of the characteristics of endotoxins produced by gram-negative
bacteria

R1 日本生物工学会大会要旨, p. 173.

○Yuka Kurihara, Hiroaki Kodama(Grad.Fac. Horticul., Chiba Univ.)○Momoka Imamura1, Narumi Tokunaga1, Hideki Aoyagi1,2(1 Grad. Sch. Deg. P. Agro-Bioresour. Sci. Technol., Univ. Tsukuba, 2 Inst. Life
Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

Pseudomonas sp., antibacterial

Key words
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, extracellular endotoxin,
intracellular endotoxin

1Lp15

Deciphering characteristics of herbal medication for
antiviral treatment through Ancient Oriental Philosophy

1Mp01○Boryann Chen
(Dept. Chem. Mater. Eng.)
boryannchen@yahoo.com.tw

学

大腸菌細胞内の pH 調節に関与する遺伝子の網羅的な探索○福田 紘子 1, 中嶋 幹男 2, 森 浩禎 3, 片岡 正和 1
（1 信州大院・総理工研, 2 MSL, 3 広東省農業科学院）
mars@shinshu-u.ac.jp

Many Traditional Chinese medicine (TCM) components in formulae can act upon
multiple targets and pathways for antiviral treatment. According to Ancient Oriental
Philosophy, “Jun Chen Zuo Shi” is the principle of TCM compounding formulasprescription. Combined interactions of compounding formulae are important totreatment efficacy, but still not deciphered. ES-polyphenolics are found to increase
power-stimulating capabilities for energy utilization and catalyze disease-treating
efficacy. Chemicals with ortho- and para-dihydroxyl substituents-bearing aromatics
exhibited convertible characteristics of antioxidants and catalytic ESs. Studies
disclosed that medicines with ortho-dihydroxyl substituents on benzene ring as ES
backbone (e.g., dopamine, L-DOPA, epinephrine) could even treat brain disorderassociated disease (e.g., Parkinson’s disease (PD)). Moreover, the efficacy of PD
medicines and antiviral flavonoid herbs was strongly governed by their bioenergystimulating proficiency. Most of TCM antiviral herbal extracts (11/18) for SARS andH1N1 influenza were ES-rich, indicating that ES herbal extracts were not only
abundant in phytonutrient contents, but also plentiful in anti-oxidant and antiinflammatory activities. Forsythia suspensa extract expressed the highest inhibition
against nitric oxide production for anti-inflammation. Top ranking efficacious herbs foranti-COVID-19 were both bioenergy-steered and electron transfer-mediated,
supporting curative significance behind “Jun Chen Zuo Shi”.

好中性細菌の大腸菌は、外部 pH 変動に対し、細胞内の pH を約 7.2〜7.8 に維持している。細胞内 pH を狭い範囲に維持することで、タンパク質や核酸等の安定性が保たれ ATP 合成などの酵素反応を含む様々な生化学反応が正常に進行する。すなわち、細胞内 pH 調節機構は生体内で非常に重要な役割を果たすシステムである。
細胞内 pH 調節機構には、酸性環境下で酸耐性機構、アルカリ環境下で cation /H ＋ antiporter（NhaA、NhaB、ChaA）の関与が報告されている。しかし、全遺伝子を対象とした研究は少なく、細胞内 pH 調節機構の全貌は未解明である。
また、異なる条件下の NhaA、NhaB、ChaA の変異体の細胞内 pH を観測する当研究室の先行研究より、未知の調節機構の存在が示唆された。そのため、本研究の目的を大腸菌細胞内 pH 調節機構に関わる遺伝子の網羅的な探索とした。
本研究では、研究者の意見や恣意的な解析が入り込む余地をできる限り無くす
ために、大腸菌全遺伝子単一欠失株(Keio collection)の増殖特性を統計学や AI を用いて解析することにより、大腸菌細胞内 pH 調節に関わる遺伝子の探索を試みた。実験では、Na+又は K+条件と pH 条件の異なる固体培地で Keio collectionを生育させ、高精度菌体生育測定システム(Colony-live system)によって増殖動態を定量化した。算出した全測定値を用いて、高次元の入力データーから少数のパラメーターに集約させる AutoEncoder を用いた教師無し学習による自動クラスタリングを実施した。その結果、「失敗した実験」や「良好な増殖」、「増殖が低下」などを示すクラスターを確認できた。加えて、これまで人間が見逃していた「遅れて増殖が立ち上がる」クラスターを提示することが可能であった。
50 万もの時系列の中で数百しか存在しない事例を見つけることは人力では困難であるが、AI を用いることで効率的に発見することが可能であった。

Deciphering characteristics of herbal medication for antiviral treatment
through Ancient Oriental Philosophy

Exhaustive investigation of genes for intracellular pH regulation in E. coli

○Boryann Chen
(Dept. Chem. Mater. Eng.)

Key words

mediator○Hiroko Fukuda1, Mikio Nakajima2, Hirotada Mori3, Masakazu Kataoka1(1 Grad. Sch. Sci. Technol., Shinshu Univ., 2 MSL Corp., 3 Guangdong. Acad. Agri.
Sci.)

Key words

intracellular pH, homeostasis, growth phenotype, gene knockout

125

1Mp02
学

Investigation of the expression difficulties of sharkderived immunoglobulin new antigen receptor in Chinese
hamster ovary cells

1Mp04○Yunchi Zhang1, Xiaofang Lyu1, Noriko Yamano-Adachi1,2,
Takeshi Omasa1,2(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ.)
omasa@bio.eng.osaka-u.ac.jp

CHO 細胞の抗体生産性に対する長期培養による影響○永嶋 悠人
（農工大院・工）yohda@cc.tuat.ac.jp

Immunoglobulin new antigen receptor – IgNAR, has the known smallest variabledomain (~12 kDa), and high stability against denaturation. Thus, it is a candidate fornext-generation therapeutic antibody. We successfully expressed monoclonal
recombinant IgNAR fused with human IgG Fc region (IgNAR-Fc) in Chinese Hamster
Ovary (CHO) cells, with complex N-glycosylation1). However, the specific production
rate of constructed CHO cells was very low, thus, increasing the specific production
rate is crucial to enable further analysis and biopharmaceutical application. Based on
previous results2), investigations were performed at 2 levels to deduce where theexpression difficulty is present – 1. Translational level for protein synthesis, 2.
Posttranslational level for protein folding and ER-to-Golgi transportation. One result
showed that the Xbp1s-mRNA-level ratio between CHO TU1 and CHO IgNAR
increased by 1.7 times under the influence of ER inducer Brefeldin A. The Xbp1smRNA level indicates the ER stress level due to protein accumulation, this suggested
that less IgNAR-Fc was accumulating in the ER. Consequently, one of the expressiondifficulties may be that IgNAR-Fc has a lower translational rate, comparing to human
IgG in CHO cells. To confirm that, more investigations will be performed at thetranslational level.
1) Enatsu H.et al., J.Biosci. Bioeng., 132:302-309 (2021).
2) Lyu X. et al.,YABEC2022 (2022).

【背景・目的】
抗体医薬品の市場は拡大しており、2013 年の医薬品世界売り上げトップ 10 のうち 5 品目を抗体医薬品が占め、今後も更なる成長が予想されている。抗体医
薬品は高次構造を有するため、微生物での生産は難しく、主に CHO(Chinese
Hamster Ovary)細胞などの哺乳動物細胞を宿主として生産されている。その製造過程において、セルバンクから工業用のリアクターまでのスケールアップには
約 60 日かかるとされている。そのため長期培養した細胞でも、抗体の品質を維持しつつ安定した生産が求められているが、CHO 細胞固有のゲノム可塑性により実際には難しい。本研究では CHO 細胞の安定性を向上させるため、細胞の長期培養による抗体生産への影響を確認した。
【実験方法】
抗体を生産する CHO 細胞から高生産株と低生産株を選択し、droplet digital PCR
で抗体遺伝子の導入コピー数、qRT-PCR で mRNA 量を測定した。また高生産株
1 クローンを用いて、培養初期および約 2 ヵ月間培養後の細胞でも抗体生産量、抗体遺伝子の導入コピー数、抗体の mRNA 量を確認した。
【結果・考察】各生産株の抗体生産量、導入コピー数、mRNA 量に正の相関が認められたものの、高生産でありながらコピー数が少ない株も確認できた。これは抗体発現効率の高い転写ホットスポットが存在する可能性が予想された。
長期培養を評価した細胞株では生細胞密度、培養液量あたりの抗体生産量ともに減少した。また導入した抗体遺伝子の数も半減していたが mRNA 発現量と細胞当たりの抗体生産量は維持されていた。本結果から発現効率の高い転写ホットスポットに導入された遺伝子は、長期培養後も安定に維持されている可能性があると考察した。今後は遺伝子の導入位置及び長期培養の影響を確認するため、様々な生産性の細胞株を用いて評価する予定。

Investigation of the expression difficulties of shark-derived immunoglobulin
new antigen receptor in Chinese hamster ovary cells

Effect of long-term culture on antibody productivity of CHO cells○Yunchi Zhang1, Xiaofang Lyu1, Noriko Yamano-Adachi1,2, Takeshi Omasa1,2(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ.)○Yuto Nagashima(Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words

Chinese hamster ovary cell, antibody, translation, folding mechanism

Key words

antibody, CHO cell, long-time culture

1Mp03

Hspx の発現は抗体生産 CHO 細胞に高浸透圧を与えることで誘導される

1Mp05

高浸透圧下でセリシンを利用した、ハイブリドーマ細胞の抗体生産の増強○中野 美貴子 1, 三﨑 亮 2, 梶浦 裕之 2, 藤山 和仁 2
（1 阪大院・工, 2 阪大・生工国際セ）
fujiyama@icb.osaka-u.ac.jp

学○竹尾 将俊 1, 藤田 雅也 1, 中尾 匡志 1, 寺田 聡 1, 真杉 遼 2,
梅田 尚希 2, 高橋 潤 2（1 福井大院・工, 2 セーレン）
terada@u-fukui.ac.jp＜背景と目的＞
組換えタンパク質医薬は主に CHO 細胞を用いて生産されるが、本細胞の培養に多大なコストを要するため、細胞のタンパク質生産能の向上および分泌タン
パク質の品質の改善が望まれる。近年、CHO 細胞培養培地へ高濃度のトレハ
ロースを添加することで分泌された抗体の凝集が抑制され、効能が向上することが明らかになった (Onitsuka et al., 2014)。一方で、細胞培養液への物質添加は浸透圧の増加させるため、細胞増殖阻害と生産タンパク質の収量低下を招く。
そこで、浸透圧下で発現量の変化する内在性タンパク質の情報を集積し、浸透圧耐性をもつ宿主 CHO 細胞を構築したい。本研究では、高濃度のトレハロー
ス含有培地でも生育可能な高濃度トレハロース馴化 CHO 細胞を構築し、本細胞株と馴化前の細胞株の遺伝子発現量を網羅的に比較することで、浸透圧耐性に関与する可能性がある因子を調査した。
＜方法と結果＞
100 mM のトレハロースを含む培地に馴化したヒト IgG 抗体安定発現 CHO 細胞を、培地中のトレハロース濃度を段階的に増加することで樹立した。本細胞の遺伝子発現量を RNA シーケンス解析で網羅的に調査し、トレハロース非存在下で培養した非馴化細胞と比較して発現量が変化している遺伝子を複数見出した。中でもある種の熱ショックタンパク質 Hspx の発現量が劇的に上昇していた。しかし、当該 Hspx は、細胞質局在タンパク質 (緑色蛍光タンパク質: GFP)を生産する CHO 細胞ではトレハロース由来の浸透圧負荷による発現量の増加は見られなかった。また、トレハロース非存在下で培養した抗体生産株の Hspxの発現量と野生型 CHO 細胞の Hspx の発現量にも有意差が見られなかったことから、抗体生産が Hspx の過剰発現を誘導したのではなく、抗体生産と浸透圧のどちらもが Hspx の発現に関与していると考えられた。

細胞培養による有用物生産増加には、1 細胞当たりの生産量「比有用物生産速度 (μ) 」と、培養当たりの細胞数の総和「細胞数の時間積分値 (IVC) 」の向上が有効である。μ を加速する方法として、高浸透圧での培養がよく知られている。この方法は、培地に塩を添加するだけの簡便さ、育種や馴化が不要で汎用的に多様な細胞株に適用できるという長所がある。しかし増殖や生存が損なわれて IVC が減少し、生産量そのものはほとんど改善されない。そこで本研究では、高浸透圧での IVC 減少を何らかの因子で回復し、高浸透圧での μ 加速を生産量向上に結びつけることを目指した。
IVC を増加・回復する因子として、本研究では絹由来タンパク質セリシンの加水分解物（以下、セリシン）に着目した。我々はこれまで、セリシンは多様な細胞に対して増殖を促進することを報告しており、「高浸透圧培養へのセリシンの適用」も、多様な細胞に有効なことが期待される。
ハイブリドーマ細胞によるモノクローナル抗体生産系を対象に検討した。浸透圧については、標準的な培地は、生理的食塩水と等張とみなした。そして NaClを追加してそのモル濃度から浸透圧を推定した。
浸透圧を生理的環境の 1.3 倍に高めると、μ は 1.5 倍以上に向上するが、IVC は
0.7 倍弱にまで低下した。ここにセリシンを添加することで、IVC は対照の 1.3倍にまで改善、高浸透圧による μ 加速は保たれたため、結果的に抗体生産量を２倍に高めることに成功した。期待通り、セリシンによる IVC 増加は、高浸透圧による μ 加速と相乗的に作用した。
しかしながら、より高い浸透圧（生理的環境の 1.5 倍以上）では、一層の μ 加
速が期待される一方で、セリシンによる IVC 回復効果が消失してしまう。これを改善すべく、現在、さらなる改善を試みている。

Expression of Hspx was induced in antibody-producing CHO cells byhyperosmolality

Enhancement of antibody production in Hybridoma cells using sericin
under hyperosmolarity○Mikiko Nakano , Ryo Misaki , Kajiura Hiroyuki , Kazuhito Fujiyama(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 ICBiotech, Osaka Univ.)
1

Key words

2

2

Chinese hamster ovary cell, osmotic response, antibody

2○Masatoshi Takeo1, Masaya Fujita1, Masashi Nakao1, Satoshi Terada1,
Ryo Masugi2, Naoki Umeda2, Jun Takahashi2(1 Grad. Sch. Eng. Fukui Univ., 2 SEIREN Co. Ltd.)Key words

hyperosmolarity, sericin, hybridoma, betaine

126

1Mp06
学

Effect of temperature downshift on IgG production using
fast growing CHL-YN cells

1Mp08

哺乳類培養細胞における遺伝子改変細胞間接着分子 カ
ドヘリンの局在及び機能について○小林 和香子（宇部高専）
wkoba@ube-k.ac.jp○Stephanie Lie, Noriko Yamano-Adachi, Takeshi Omasa(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)
omasa@bio.eng.osaka-u.ac.jp

Chinese Hamster Lung (CHL)-YN is a newly developed cell line for recombinant
protein production with a remarkable high growth rate compared to Chinese Hamster
Ovary (CHO) cells1). However, the rapid growth is followed by a sharp decline of
viable cell concentration and viability, resulting in a relatively short culture time.
Temperature downshift strategy has been widely known to increase productivity by
reducing growth rate and extending culture time. In this study, temperature downshift
strategy was applied to the IgG1-producing CHL-YN cells, and its effect on growthand productivity was investigated.
Three different temperatures (35, 33, and 31˚C) and shift time (Day 2, 3, and 4) wereused in the screening step to find combination that give positive impact to specificproduction rate (Qp) and IgG concentration. Temperature shift to 33˚C on Day 2
resulted in longest culture time, highest IgG concentration, and good correlation
between Qp and IgG concentration.
To confirm this result, this combination culture was performed again. Overall,
reduction in specific growth after temperature shift was observed again. Qp after
temperature shift was lower than control, however final IgG concentration still
increased 1.4-fold than that of control culture.
1) Yamano-Adachi N., et al, Scientific Reports 10:17612 (2020).

上皮細胞は、細胞同士が E-カドヘリン という細胞間接着分子を介して結合する
ことで、互いに結合し構造を維持している。 スネイル遺伝子は E-カドヘリンの転写を抑制し、上皮-間葉転換（Epithelial-mesenchymal transition; EMT）を誘導することが報告されている。既報では、スネイル発現細胞に外来性 E-カドヘリンを発現させると、本来局在する細胞膜でのタンパク質蓄積が認められなかった。このことは、E-カドヘリンの細胞内輸送経路がスネイルの発現によって阻害されている可能性が考えられた。 そこで、 E-カドヘリンの細胞内輸送経路を調べるため正常上皮細胞である MDCK 細胞にスネイルと E-カドヘリン-GFP を導入した細胞を用いて E-カドヘリンの細胞内蓄積部位の同定を行った。 E-カド
ヘリンはトランスフェリン及び初期エンドソームである EEA-1 との一部共局在を認めた。また、E-カドヘリンの細胞膜輸送に関わるシグナル（ジロイシンモチーフ）に変異を入れた E-LA 変異体をスネイル発現細胞に導入した場合、ELA 変異体が細胞膜に局在するかを検討した。その結果、E-LA 変異体発現細胞は細胞膜での染色が確認された。 E-LA 変異体発現細胞の運動性はスネイル発
現細胞と同様の結果を示した。この結果から、E-LA 変異体は細胞膜に局在はしているが、細胞の運動性を抑制する機能は有していないことが示唆された。

Effect of temperature downshift on IgG production using fast growing
CHL-YN cells

Localisation and function of the genetically engineered intercellularadhesion molecule cadherin in cultured mammalian cells○Stephanie Lie, Noriko Yamano-Adachi, Takeshi Omasa(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)○Wakako Kobayashi(Ube Natl. Coll. Technol.)Key words
production

CHL-YN cells, temperature downshift, animal cell culture, antibody

Key words

adhesion molecules, transcriptional regulator gene, mutants

1Mp07

CHO 細胞を用いた抗体生産培養における Cystine とTyrosine 添加による酸化ストレスと ER ストレスの低減
メカニズムの解明

1Mp09

細胞凝集塊の融合を利用した三次元ウシ筋組織の作製法の開発○新井 世望 1, 仲上 侑友 1, 曽福 重光 2, 中田 二郎 2, 仁宮 一章 3
（1 金沢大院・自科, 2 天狗中田本店, 3 金沢大・新学術）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp○柴藤 祐介 1,2, 長尾 信義 3, 養王田 正文 2
（1 AGC Biologics, 2 農工大院・工, 3 AGC）
yusuke.shibafuji@agc.com

CHO 細胞による抗体医薬品の生産プロセスにとって、Cysteine (Cys) や Tyrosine(Tyr) のような濃度を上げると細胞毒性を示すアミノ酸や溶解度の低いアミノ酸の濃度コントロールは大きな課題となっている。本研究では、Cys よりも細胞毒性が低く、添加剤としてより一般的に用いられる Cystine の添加条件と Tyr の添加条件を比較し、マルチオミクス解析を実施した。先行研究とは異なり、Cystine 単独の添加では、Endoplasmic reticulum (ER) ストレスが生じ、Endoplasmic
reticulum-associated degradation (ERAD)やグルタミノリシス、アポトーシスが促進されることにより、生存率と生産性の低下が生じた。一方、Tyr 単独の添加
では、ER ストレスやアポトーシスを抑制する効果があることがわかり、Tyr から生合成されるユビキノン（コエンザイム Q10）が影響していることが示唆された。Cys の細胞要求を満たしつつ、Cystine 添加による還元力低下から生じる
アポトーシスを抑制するため、Cystine と同時に Tyr を添加したところ、増殖能の向上・生存率の維持・生産性が改善した。これは、Glutathione (GSH) 代謝の活性化、ER ストレスや酸化ストレスの抑制、ERAD の減少及び Tricarboxylic
acid (TCA) サイクルの活性化が影響していることがわかった。また、Ingenuity
Pathway Analysis (IPA) 解析の結果から、DeoxyriboNucleic Acid (DNA) の修復や複製の安定化に関連するパスウェイ、細胞分裂の促進、酸化的リン酸化の活性化が Monoclonal antibody (ｍ Ab) 生産にとって重要であることが示唆された。本
研究で示したマルチオミクスアプローチは、Fed-Batch 培養だけでなく、パーフュージョン培養等の様々な培養モードにも適用できると考えられ、バイオプ
ロセス条件の変動に対する細胞の反応を理解することが、バイオプロセスの生産性と堅牢な制御の向上につながると考えられた。

【目的】現在、ウシ食肉生産による環境問題が課題となっており、ウシ細胞を三次元的に培養したウシ培養肉が注目されている。ウシ培養肉（三次元ウシ筋組織）の作製では、通常、コラーゲンやフィブリンといった動物由来の三次元ゲ
ルを培養足場とするが、動物肉の代替物を製造するためにこれら動物由来の足場タンパク質を使用することは問題がある。そこで、本研究では、ウシ筋芽細胞の凝集塊であるスフェロイド同士の融合を利用して、培養足場となる動物由来の細胞外基質タンパク質を使用せず、三次元ウシ筋組織を作製する方法を開発することを目的とした。
【方法および結果】本研究では、と畜後のウシ尾肉から分離したウシ衛星細胞を培養して得たウシ筋芽細胞を用いた。まず、増殖培地（10%FBS および 5 ng/mL
bFGF を含む DMEM 培地）で培養することにより得たウシ筋芽細胞 1200×10⁴
cells を、10% FBS を含む DMEM 培地が 60 mL 入ったスピナーフラスコへ播種し、24 時間懸濁培養した。これにより、直径約 80 μm 程度のウシ筋芽細胞ス
フェロイドを作製した。次に、ウシ筋芽細胞スフェロイドを、1%寒天溶液でコートした 24 well プレートへ播種し、24 時間静置培養してさらに凝集させ、直径約 3 mm 程度のウシ筋原基を作製した。最後に、ウシ筋原基を、2 個、自作デバイスに重ねて搭載し、6 well プレート内で振とう培養を行った。振とう培養開始から 2-4 日後に、筋原基どうしの融合、筋原基とデバイスの接着を確認した後、組織の両端が接着しているデバイスの間隔を 2 mm 程広げた。さらに 2 日後に再び組織の両端が接着しているデバイスの間隔をさらに 2 mm 程広げた。結果として、足場タンパク質を使用せずに、高さ 4 mm 程度の一方向に張力のかかった三次元ウシ筋組織を作製できた。

Cystine and Tyrosine feed reduces oxidative and ER stress in CHO cell

Fabrication of scaffold-free 3D bovine muscle tissue based on fusions ofmulticellular spheroids○Yusuke Shibafuji1,2, Nobuyoshi Nagao3, Masafumi Yohda2(1 AGC Biologics, 2 Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 3 AGC Inc.)

Key words

Chinese hamster ovary cell, cysteine, tyrosine, monoclonal antibody○Tsugumi Arai1, Yukito Nakagami1, Shigemitsu Sobuku2, Jiro Nakata2,
Kazuaki Ninomiya3(1 Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2 Teng Nakata Honten Co., Ltd.,
3
Ints. Frontier Sci. Initiative, Kanazawa Univ.)

Key words

bovine myoblast, scaffold-free, 3D issue culture

127

1Mp10

可食性マイクロキャリアを用いたウシ筋芽細胞の懸濁
培養

1Mp12

○坂本 竜朗 1, 今 拓海 1, 曽福 重光 2, 中田 二郎 2, 仁宮 一章 3
（1 金沢大院・自科, 2 天狗中田本店, 3 金沢大・新学術）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp

食品を用いた培地によるウシ筋芽細胞の無血清培養○若林 壮吾 1, 井上 皓太 1, 曽福 重光 3, 中田 二郎 3, 仁宮 一章 2
（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術, 3 天狗中田本店）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp【目的】ウシ畜産は環境問題につながるため、近年、三次元ウシ筋組織（ウシ培養肉）の生産が注目されている。三次元ウシ筋組織の生産には、大量のウシ筋芽細胞が必要である。ここで、足場依存性の動物細胞の大量培養には、マイクロキャリアが用いられる。そこで、本研究では、最終のウシ筋組織にマイクロキャリアが残存することも想定し、可食性のマイクロキャリアを作成してウシ
筋芽細胞の懸濁培養を行った。
【方法および結果】シリンジに取り付けたノズルから 1%アルギン酸ナトリウム溶液を吐出し、1 g/L Tween 20 を含む 100 mM CaCl2 溶液に対し入水させること
で、アルギン酸ゲルビーズを作成した。作成したビーズは、1%魚鱗由来ゼラチ
ン溶液でコーティングし、終濃度 0.5%の微生物由来トランスグルタミナーゼ溶
液中で架橋させることで、マイクロキャリアを作成した。マイクロキャリアの直径は約 200 μm であった。懸濁培養では、30 mL 容スピナーフラスコに 10 mLの増殖培地（10%FBS および 5 ng/mL bFGF を含む DMEM 培地）とマイクロキャ
リアを添加し、ウシ筋芽細胞を 10×104 cells/mL となるよう播種した。播種後 24
h までは、静置 28 min と撹拌（40 rpm）2 min を繰り返し、マイクロキャリアに細胞を接着させた。播種後 24 h からは、増殖培地をさらに 10 mL 加え、50 rpm
で培養を行った。マイクロキャリア終濃度 10％(v/v)での懸濁培養の結果、培養
24 h においてすべての細胞がマイクロキャリア上に接着していた。また、培養
12 d においてウシ筋芽細胞濃度は 110×104 cells/mL まで増大した。これは、単層培養でのコンフルエント時の細胞濃度と比較し、大きかった。

【目的】ウシ肉生産にまつわる環境問題を解決するため、ウシ三次元筋組織（ウシ培養肉）が注目されている。ウシ培養肉の作製の際にウシ筋芽細胞を培養するためには、基礎培地（無機塩、糖、アミノ酸、ビタミンからなる）に対して、ウシ胎児血清（微量金属、脂質、血清タンパク質（アルブミン、トランスフェ
リン、インスリン、フィブロネクチンなど）を含む）や増殖因子タンパク質（bFGF）を添加する必要がある。しかしながら、動物肉の代替物を製造するためにウシ血清を使用することは問題がある。そこで、本研究では、「ウシ由来成分不含で安価なウシ筋芽細胞のための培地」として、細胞接着因子として魚鱗
ゼラチン、細胞増殖因子として鶏卵を使用した無血清培地の作製を試みた。
【方法および結果】本研究では、と畜後のウシ尾肉から単離した衛星細胞を bFGF
で活性化させて得たウシ筋芽細胞を用いた。まず、0.1%魚鱗ゼラチン溶液を
コーティングしたプレート上で無血清の DMEM 培地中におけるウシ筋芽細胞の細胞接着評価を行った。その結果、既存のウシ筋芽細胞の増殖培地（10%FBS
および 5 ng/mL bFGF を含む DMEM 培地）と同等の細胞接着が見られた。そこ
で、無血清の DMEM 培地中に種々の濃度の卵黄上清を添加した培地を作製し、魚鱗ゼラチンコートしたプレート上でウシ筋芽細胞の細胞増殖評価を行った。
その結果、細胞の増殖は見られなかった。そこで、卵黄に足りていないと推測される増殖因子（Insulin, Transferrin, bFGF）を組換えタンパク質として添加した培地を作製し、ウシ筋芽細胞を培養した。その結果、無血清の DMEM 培地
中に 10％卵黄上清を添加し、Insulin と bFGF を補填した培地中では、既存のウシ筋芽細胞の増殖培地に対して、約 70%の増殖を確認できた。

Suspension culture of bovine myoblast cells using edible microcarriers

Serum-free culture of bovine myoblast cells using food-based media○Tatasuro Sakamoto1, Takumi Ima1, Shigemitsu Sobuku2, Jiro Nakata2,
Kazuaki Ninomiya3(1 Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2 Tengu Nakata Honten Co., Ltd.,
3
Ints. Frontier Sci. Initiative, Kanazawa Univ.)○Sogo Wakabayashi1, Kota Inoue1, Shigemitsu Sobuku3, Jiro Nakata3,
Kazuaki Ninomiya2(1 Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2 Ints. Frontier Sci. Initiative,
Kanazawa Univ., 3 Tengu Nakata Honten Co., Ltd.)Key words

bovine myoblast, alginate microcarrier, gelatin coating

Key words

1Mp11

無血清培養した肝細胞の培養上清を用いたウシ筋芽細胞の無血清培養1Mp13○高木 京馬 1, 中野 一成 1, 曽福 重光 2, 中田 二郎 2, 仁宮 一章 3
（1 金沢大院・自科, 2 天狗中田本店, 3 金沢大・新学術）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp

学bovine myoblast, serum-free culture, food based medium

増殖因子セリシンが工業用動物細胞培養に与える影響○清水 尚樹 1, 村上 悠也 1, 寺田 聡 1, 真杉 遼 2, 梅田 尚希 2,
高橋 潤 2（1 福井大院・工, 2 セーレン）
terada@u-fukui.ac.jp【目的】近年、ウシ筋芽細胞からなる三次元組織（ウシ培養肉）が注目されている。ウシ筋芽細胞の培養に用いる培地は、基礎培地（無機塩・糖・アミノ酸・
ビタミンからなる）にウシ胎児血清（FBS）や組換えタンパク質（増殖因子bFGF）を添加したものである。しかし、血清の調達はウシ飼育が前提であり、組換えタンパク質は高価である。そこで本研究では、安価な無血清培養法として、血清タンパク質や増殖因子タンパク質を分泌生産すると考えられる細胞株を無血清で培養し、その培養上清を無血清培地として利用する。
【方法および結果】血清タンパク質（アルブミン、トランスフェリン、フィブロ
ネクチンなど）を分泌生産することが報告されているヒト肝臓由来がん細胞株
HuH-7 を用いた。HuH-7 株は、微量金属成分や脂質などを補充した RPMI 培地
を用いて無血清培養した。無血清で十分に増殖した HuH-7 株の培養ディッシュから培地を除去し、新たに培地を添加し一定時間、HuH-7 株で培地を馴化させた。このように無血清で調製された培養上清を用いて、ウシ筋芽細胞の増殖評価を行った。ウシ筋芽細胞としては、と畜後のウシ尾肉から単離した衛星細胞
を bFGF で活性化させて得た細胞を用いた。増殖評価は、6 well plate で、播種濃度 3×10⁴ cells/mL で行った。Positive control では、DMEM 培地に 10% FBS と5 ng/mL bFGF を添加した増殖培地を用いた。Negative control では、FBS と bFGF
無添加の DMEM 培地を用いた。ウシ筋芽細胞播種後、毎日培地交換を行いながら 4 日間培養した。その結果、FBS と bFGF 無添加の Negative control ではウ
シ筋芽細胞の増殖は見られなかったが、培養上清を用いた無血清培地では増殖が確認できた。

【緒言】抗体医薬品など多くの有用タンパク質は、動物細胞培養で生産されている。重要な因子の一つが「グルコース濃度」で、これは「グルコース消費速度」
や「乳酸（老廃物）生成速度」に影響し、結果的に「細胞数の時間積分値(IVC)」や「比有用物生産速度(μ)」、最終的には「有用物生産量(P)」を左右する。また、増殖因子も重要である。増殖因子は細胞増殖・生存・活性化のために添加されるが、グルコース消費や乳酸生成にも影響する。我々は増殖因子として、絹タンパク質セリシンの加水分解物（セリシン）の有用性を示してきた。
セリシンは EGF 受容体などを経るシグナリングで細胞に作用する。本研究では、工業的に広く用いられているハイブリドーマ細胞と CHO 細胞を対象とし、「グルコース濃度」が「グルコース消費速度・IVC・μ・P」に及ぼす効果に対して、セリシンがどのような影響を及ぼし、培養を改善しているのかを探索した。
【方法】無血清の RPMI 培地（富士フイルム和光純薬）に馴化した細胞を対象に、増殖因子としてセリシン（同上）または BSA（同上）を添加し、グルコー
ス濃度を増減して培養した。細胞増殖はトリパンブルー染色後に血球算定盤で計数、抗体濃度は ELISA 法、グルコース濃度はラボアッセイグルコース（同上）で定量した。
【結果】セリシン不在下では、グルコース濃度が増大すると細胞のグルコース消費速度が上昇する。増殖因子として BSA を用いても同様だが、セリシンはグル
コース消費を顕著に抑制した。このグルコース消費の抑制により培養期間が延長し、増殖促進効果と合わせ、IVC の顕著な増大をもたらした。一方、セリシ
ンは μ には影響せず、この IVC 増加の直接の帰結として、有用物の生産量増大が達成されていたと考えられる。

Serum-free culture of bovine myoblast cells using conditioned medium

Effect of the growth factor sericin on industrial mammalian cells.

○Kyoma Takagi1, Itsei Nakano1, Shigemitsu Sobuku2, Jiro Nakata2,
Kazuaki Ninomiya3(1 Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2 Tengu Nakata Honten Co., Ltd.,
3
Ints. Frontier Sci. Initiative, Kanazawa Univ.)

Key words

bovine myoblast, serum-free culture, conditioned medium○Naoki Shimizu1, Yuya Murakami1, Satoshi Terada1, Ryo Masugi2, Naoki Umeda2,
Jun Takahashi2(1 Grad. Sch. Eng. Fukui Univ., 2 SEIREN Co. Ltd.)Key words

CHO cells, hybridoma, sericin, IVC

128

1Mp14
学

実験計画法を用いた iPS 細胞由来心臓前駆細胞誘導プ
ロセスの最適化○片山 陽介, 秋山 裕和, 清水 一憲, 本多 裕之（名大院・工）honda@chembio.nagoya-u.ac.jp

1Mp16
学

藻類と動物細胞を用いた循環型培養食肉生産システムの速度論的解析
○加藤 多貴 1, 山本 陸 1,3, 原口 裕次 2, 清水 達也 2, 紀ノ岡 正博 1,3（1 阪大・院工・生物工学, 2 東女医大・先端生命医, 3 阪大・院
工・細胞製造コトづくり拠点）
kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp[目的] 重度心疾患治療の切り札として、iPS 細胞を用いた心臓再生医療が期待されている。iPS 細胞由来心臓前駆細胞は再生医療の有用な細胞源であるが、その実用化には iPS 細胞から心臓前駆細胞を効率的かつ安定的に誘導するプロセス確立が必須である。本研究では、Quality by Design の 1 手法である実験計
画法と、培地調製と細胞解析を自動化したセミオートメーション実験システム
を組み合わせて、プロセスの最適化を試みた。
[方法] 心臓前駆細胞への分化に有効と報告されている 3 因子（BMP-4, Chir99021,
Activin A）について、2 水準完全実施要因計画に基づく実験を行い、実際に効果的な因子をスクリーニングした。続けて、スクリーニングした因子を用いて中心複合計画に基づく実験を行うことで、応答曲面モデルを構築し最適条件を推定した。培地への因子添加には自動分注機を活用し、培養後は心臓前駆細胞マーカー（KDR/PDGFRα）の免疫蛍光染色を行い、ハイスループットサンプ
ラー付きのフローサイトメーターで自動分析を行なった。さらに、得られた心臓前駆細胞を Wnt 阻害剤（IWP-2）添加下で培養することで、心筋細胞への分化誘導も行なった。
[結果] 完全実施要因計画に基づく実験より、BMP-4 には誘導効果がなく、Chir99021 と Activin A に強い効果が認められた。効果を認めた 2 因子を変数とする応答曲面モデルを構築し、90%超の誘導効率が見込まれる最適条件を推定した。この条件で 3 バッチの繰り返し培養実験を行なったとき、いずれも 90%超の誘導効率が得られ、その安定性が確認できた。さらに、心臓前駆細胞に
IWP-2 を添加し培養を継続したところ、90%超の心筋細胞を誘導できることが確認できた。以上より、実験計画法とセミオートメーション実験システムを組み合わせることで、効率・安定性の両面で心臓前駆細胞の誘導プロセスの最適化に成功した。

食肉生産において，穀物を飼料とした家畜飼育では広大な土地や水などの資源が必要となり，また屠畜による倫理問題や生じる温室効果ガスなど様々な問題が挙げられている．これに対する代替法として，培養した細胞を利用する食肉生産が注目されている．しかし，細胞培養に必要な培地成分の多くは穀物由来であるため，同様に土地などの資源が必要となり，さらに培養廃液が新たな環
境負荷となる．またそれらの扱いにコストがかかる．そこで，これらを考慮した培養システムとして，動物細胞と藻類の培養において生じる廃液を相互の栄養源として再利用することで，培養液を効率的に利用する循環型の培養食肉生産システムが提案され，構築に向けた検討を行っている．この循環型システムを構築する主たる工程は，動物細胞培養工程，藻類培養工程，藻類酸加水分解
による栄養素抽出工程であり，このシステムを効率的に循環させるには，各工程の反応と重要成分を理解し，それらを制御することが求められる．
本研究では，動物細胞と藻類の増殖および代謝反応を速度論的に解析し，反応における重要因子を仮定して，循環型システムの培養モデルを設計した．このモデルにおける培養体積比を変数としてシミュレーションを行い，長期間の循環型の培養が達成されるための最適な条件やその条件に寄与する要素を検討した．
これにより動物細胞培養体積に対する藻類培養体積の最適な比が１ ： ４であり，等体積の条件と比較して循環培養時間が１．７倍に増加することが判明した．このとき，動物細胞培養におけるグルタミン濃度および藻類培養における乳酸濃度が培養体積比の決定に寄与することが確認された．このように循環型システムをモデル化し，シミュレーションを行うことで，システムが効率化され，持続可能な培養食肉生産の実現が可能となると期待される．

Optimization of cardiac progenitor cell induction process from iPSCs using
design of experiments

Kinetic analysis of circular cell culture system for the production of cultured
meat using algae and animal cells○Yosuke Katayama, Hirokazu Akiyama, Kazunori Shimizu, Hiroyuki Honda(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

Key words

cytokine, cell

1Mp15

Bifidobacterium dentium の MVs が示す Jurkat 細胞の増殖抑制効果○前田 瑞歩 1, 入江 健太 2, 岡田 美玖 2, 福田 隆志 2, 川本 純 3,
今井 友也 4, 栗原 達夫 3, 倉田 淳志 2, 上垣 浩一 2
（1 近大院・農, 2 近大・農, 3 京大・化研, 4 京大・生存研）
095605@nara.kindai.ac.jp○Taki Kato1, Riku Yamamoto1,3, Yuji Haraguchi2, Tatsuya Shimizu2,
Masahiro Kino-oka1,3(1 Dept. Biotechnology, Grad. Sch. Eng., Osaka University, 2 Inst. Adv. Biomed.
Eng. Sci., Tokyo Women Med. Univ., 3 Research Base for Cell Manufacturability,
Grad. Sch. Eng., Osaka University)
Key words
algae, animal cells, cultured meat, simulation

1Np01
学

Advanced Photocatalytic Inactivation Process of
Toxigenic M.aeruginosa: Insights on Time-dependent
Physiological Regulation Mechanism○Guangqi An, Hongjian Zhang, Yingnan Yang
(Univ. Tsukuba)yo.innan.fu@u.tsukuba.ac.jp【目的】多様な細菌は、脂質二重膜から成るナノサイズの小胞（Membrane
vesicles；MVs）を生産する。本研究では、Bifidobacterium dentium の MVs に注
目して、その特性や、ヒト白血病 T 細胞およびヒト結腸がん由来細胞に対する影響を検討した。
【方法・結果】分画遠心法により B. dentium の培養液から MV 画分を調製した。
細胞膜特異的な蛍光色素 FM4-64 による発色と透過型電子顕微鏡での観察によって、本画分に MVs を検出できた。ナノ粒子トラッキング解析により、本菌株の培養液上清中に 6.9×10⁸個/mL の MV（平均 113.2±3.6 nm）を検出できた。
GC-MS で MV 画分中の脂肪酸を分析した結果、菌体を構成する脂肪酸と同様に、14-メチルペンタデカン酸、パルミチン酸、10-オクタデセン酸、エライジ
ン酸、ステアリン酸を検出できた。WST-1 アッセイでは、本 MV 画分は濃度依
存的なヒト白血病 T 細胞の増殖抑制作用を示し、本 MV 画分（タンパク質濃度
69 μg/mL）は 62%の増殖抑制率を示した。ヒト結腸がん由来細胞に対して、本MV 画分（タンパク質濃度 50 μg/mL）は 28%の増殖抑制率を示した。これらの細胞では、本 MV 画分によってミトコンドリアの膜電位の低下、カスパーゼ-3/7
およびカスパーゼ-8 の活性化、核の形態変化を確認できた。ヒト白血病 T 細胞
では、ホスファチジルセリンの細胞表層への提示を確認できたので、本 MV 画
分によってヒト白血病 T 細胞ではアポトーシスが誘導された。共焦点レーザー
走査型顕微鏡でヒト白血病 T 細胞への MVs の作用機序を検討した結果、本 MVs
はヒト白血病 T 細胞の表面に局在していた。

The widespread occurrence of Microcystis-dominated cyanobacterial blooms (MCBs)
has posed serious threats to aquatic ecosystems and human health. In this work, a novel
solar-light-driven g-C3N4-Ag/Ag2O/BiPO4/Bi2WO6 photocatalytic mesh was
successfully developed for Microcystis aeruginosa (M. aeruginosa) inactivation and its
released toxic microcystins (MCs) degradation. To elucidate the inactivation
mechanism of M. aeruginosa, the physiological characteristics during thephotocatalytic process were systematically investigated. The results showed that thephotocatalytic mesh exhibited 96.6% of M. aeruginosa inactivation within 6 hours andremained stable after 5 cycles. During the initial 3 hours of the inactivation process, thedefense system actioned along with an increase in photosynthetic activity, followed by
the stimulated activity of antioxidant systems. Meanwhile, an increase in theintracellular contents of MCs was observed. After 4 hours of treatment, theintracellular activity decreased rapidly. As a result, the cell membrane ruptured andMCs were released, which were subsequently completely degraded. During thephotocatalytic inactivation process, the physiology of M. aeruginosa was regulated tomitigate the oxidant response induced by active species ⋅O2-, ⋅OH and h+ from thesolar-light-driven g-C3N4-Ag/Ag2O/BiPO4/Bi2WO6 photocatalytic mesh system. This
study indicated that the advanced photocatalytic mesh has promising potential toachieve MCBs mitigation and MCs risk control.

Antiproliferative effect of membrane vesicles produced by Bifidobacterium
dentium on Jurkat cells

Advanced Photocatalytic Inactivation Process of Toxigenic M.aeruginosa:
Insights on Time-dependent Physiological Regulation Mechanism○Mizuho Maeda , Kenta Irie , Miku Okada , Takashi Fukuda , Jun Kawamoto ,Tomoya Imai4, Tatsuo Kurihara3, Atsushi Kurata2, Koichi Uegaki2(1 Grad. Sch. Agric., Kindai Univ., 2 Fac. Agric., Kindai Univ., 3 Inst. Chem. Res.,
Kyoto Univ., 4 RISH, Kyoto Univ.)
1

Key words

2

2

2

bifidobacterium, membrane vesicles, apoptosis, cell morphology

3○Guangqi An, Hongjian Zhang, Yingnan Yang
(Univ. Tsukuba)

Key words

eutrophication, mechanism, stress response, catalytic efficiency

129

1Np02

耐酸性細菌を用いた強酸性条件下での金属吸着とカチオ
ン挙動

1Np04

パイロット試験機を用いたマンガン含有坑廃水の砂ろ過
処理
稲葉 知大 1, 愛澤 秀信 1, 青柳 智 1, 佐藤 由也 1, 堀 知行 1,
西村 拓朗 2, ○羽部 浩 1（1 産総研・環境創生, 2 ナガオカ）
hiroshi.habe@aist.go.jp○高野 力 1, 中島 一紀 1, 青柳 秀紀 2, 川﨑 了 1（1 北大院・工, 2 筑波大・生命環境）
takano.chikara@eng.hokudai.ac.jp【背景と目的】金属資源の需要の増大に伴い、鉱山から採掘される一次資源について、鉱床の偏在による地政学的リスク、採掘に伴うエネルギー消費や環境汚染等の課題点に注目が集まっている。また、将来的な電子機器の大量廃棄も懸念される。このため、環境親和的な金属のリサイクルや、金属汚染環境の浄化技術として、生物による金属吸着の研究が進められてきた。しかし、その多くは、中性条件下で行われており、強酸性の実環境とは pH の隔たりが大きく、中和処理が必要となる。この現状を踏まえ、我々は、耐酸性細菌を用いた酸性条件下での金属吸着に取り組んできた。本研究では、強酸性条件下での金属吸着効率に影響する因子の解明を目的として、細胞内外の金属イオンの挙動を測定した。
【方法と結果】
金属のリサイクルの湿式処理を模倣し、pH 1.5 の模擬金属浸出液（Co, Cu, Li,
Mn, Ni 各 1 g/L）を用いて、中性環境から単離した Priestia sp. Mn7 株を用いて金属吸着処理を行い、各金属の吸着能力を評価した。１回あたり 1.5 g/L の菌体を用いて、30 min, 5 回の吸着処理を行った結果、最大で 20% (Cu) 、5 金属合計
で 10%の吸着効率が得られた。
また、吸着による他の金属の濃度変化を測定した結果、Ca, K, Mg, Na の各カチ
オン濃度が有意に増加し、その中で最も増加率が大きかったのは K（5.12 倍）であった。この結果から、Mn7 株が、金属を吸着する際、代替としてカチオンを放出していることが示唆された。金属吸着前後の菌体表面の状態を電子顕微鏡で観察した結果、吸着後も菌体の形状が保たれていたことから、溶菌により菌体内のカチオンが溶出した可能性は低いと考えられた。現在、1) 菌体内のカチオンの能動的放出、2) 菌体表面の官能基のカチオンの置換、の可能性を考慮し、金属吸着とカチオン放出の関係性の解明について検討中である。

【背景・目的】
砂ろ過法は、浄水処理場等において原水（地下水等）からの鉄・マンガン（Mn）
除去に広く利用されているが、原水中 Mn 濃度の多くは 0.5 mg/L 以下である。
一方、休廃止鉱山から排出される約 22 mg/L の Mn イオンを含む中性坑廃水の処理は、大量のアルカリを添加し続ける中和処理により行われている。従来の中和処理よりも環境調和型かつ薬剤コスト低減を指向した新たな Mn 除去方法
を探索するため、砂ろ過法の高濃度 Mn 除去への適用可能性および Mn 酸化への微生物関与の可能性を検証した。
【方法・結果】
休廃止鉱山の既設廃水処理場内にパイロットスケールの砂ろ過試験装置を設置し、約 pH 7 の坑廃水原水に関して pH 調整を行わずに Mn 除去を試みた。未使
用の砂を用いた試験機に通水を開始してから約 1 ヶ月のラグ（2018 年 8 月－9月）を経て Mn 除去率が上昇しはじめ、約 3 ヶ月後（2018 年 10 月－11 月）には砂が黒変するとともに Mn 除去率は約 40%に達した。その時点で SEM-EDS
にて砂の元素分析を行ったところ、Mn 酸化物の形成が確認された。また Mn
除去率上昇開始時と除去率約 40%の 2 時点で Illumina 社の MiSeq を用いた砂菌叢の比較解析を行ったところ、優占上位 10 種において既知の Mn 酸化細菌は検出されなかったものの、スウェーデン Ytterby 鉱山に存在する Mn 酸化物の菌叢解析で優占種であった Immundisolibacter 属細菌と近縁の operational taxonomic
unit (OUT)の存在が確認された。一方、既知の Mn 酸化細菌の OTU についても
相 対 存 在 量 の 変 化 を 確 認 し た と こ ろ 、 特 に Pedomicrobium 属 細 菌 やHyphomicrobium 属細菌など Alphaproteobacteria に属する Mn 酸化細菌の相対存在量が増加していることが示された。

Metal biosorption and cation dynamics under strongly acidic environment
using acid tolerant bacteria

Treatment of manganese-containing mine water using a pilot-scale rapid
sand filter○Chikara Takano1, Kazunori Nakashima1, Hideki Aoyagi2, Satoru Kawasaki1(1 Fac. Eng., Hokkaido Univ., 2 Inst. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Tomohiro Inaba1, Hidenobu Aizawa1, Tomo Aoyagi1, Yuya Sato1, Tomoyuki Hori1,
Takuro Nishimura2, ○Hiroshi Habe1(1 Environ. Manage. Res. Inst., AIST, 2 Nagaoka International Corp.)

Key words

acid tolerance, biosorption, E-waste, metal recycling

Key words

microbial community, wastewater treatment, bioremediation, bioreactor

1Np03

新規耐塩性好気的セレン酸塩還元菌 Citrobacter koseri
Y2 の Se(VI)還元特性の評価

1Np05

コンポストを用いた食品廃棄物からのリン回収の検討

学○岡畑 俊輔, 上田 優弥, 井上 大介, 池 道彦
（阪大院・工）ike@see.eng.osaka-u.ac.jp○滝口 昇, 渡邊 暉己（金沢大・理工）tackey@se.kanazawa-u.ac.jp【背景と目的】セレン（Se）は半導体材料などとして工業的に広く利用されている一方、水溶性 Se（セレン酸塩（Se(VI)）、亜セレン酸塩（Se(IV)））は毒性が高く、Se 含有排水の適切な処理が求められる。微生物の Se 代謝機能を用いて水溶性 Se を不溶性の元素態 Se（Se(0)）に還元し排水から除去する生物学的処
理手法は、従来の物理化学的手法と比較して低コスト・低環境負荷であるため実用化が期待されている。しかし、Se 含有排水は高濃度の塩分を含むことが多く、微生物作用の阻害が課題とされる。そこで本研究では、新たに分離された
耐塩性 Se(VI)還元菌 Citrobacter koseri Y2 の高塩分濃度 Se 含有排水処理への適用に向けて、Se(VI)還元特性を明らかにすることを目的とした。
【方法と結果・考察】様々な塩分濃度下で Se(VI)及び Se(IV)の還元試験を行った
ところ、C. koseri Y2 は塩分濃度 5％まで顕著な阻害を受けずに、Se(VI)及びSe(IV)を Se(0)まで還元可能であることが明らかとなった。また、塩分濃度 3％では、好気及び嫌気の両条件下において 4 日間で約 1 mM の Se(VI)及び Se(IV)を Se(0)まで還元できたが、好気条件と嫌気条件で差異が見られた。すなわち、嫌気条件下では、Se(VI)還元が好気条件下より速やかに進行したが、一時的にSe(IV)が蓄積した。また、Se(IV)還元試験でも、嫌気条件下では還元開始までにラグが観察された。以上の結果から、C. koseri Y2 は酸素条件により Se(VI)及びSe(IV)の還元速度が異なる複数の Se 還元メカニズムを有する興味深い Se(VI)還元菌であると示唆された。また、この特徴から、C. koseri Y2 を用いた排水処理においては、好気条件と嫌気条件での処理を適切に組み合わせることで、排水からの効率的な Se 除去が可能であると示唆された。

自然界のリン資源が乏しい日本では，下水汚泥や家畜し尿，工業排水，食品廃棄物等に含まれるリン資源の再利用が試みられている。我々も食品廃棄物からのリン回収を検討しているが，リン含有率の低さや，分散しての排出が課題である。本研究では，コンポストを用いた食品廃棄物からのリン回収方法の確立を目指し，コンポスト化による食品廃棄物中のリン濃度，コンポスト組成がリンの溶出に及ぼす影響と溶出能力の評価，HAP 法によるリン回収率の評価について検討した。
コンポストに使用した食品廃棄物を含む原料および完成したコンポストサンプ
ル中の全リン測定の結果，コンポストサンプル中のリンの約 87%が食品に由来することがわかった。また，コンポスト化により廃棄物量が 90%以上減少し，食品廃棄物中のリンを濃縮できることが確認された。
コンポスト中には卵の殻や骨由来のカルシウムが含まれることが想定される。
カルシウムはリン酸と結合してリン酸塩を形成することで，リンの溶出を抑制することが考えられる。そこで，コンポスト中のカルシウムがリン溶出にどのような影響を与えるかを調べた。その結果，硫酸，塩酸，純水による溶出ではリンの溶出率に大きな差が見られたが，クエン酸では同程度の溶出率となった。
これは，生成したリン酸カルシウムがクエン酸可溶性のリン酸一水素カルシウ
ムであったことに起因すると考えられた。また食品廃棄物から直接クエン酸でリンを溶出させた場合よりも溶出効率が向上した。クエン酸によるリン溶出後に，HAP 法で回収したところ，約 90%の回収率が確認された。以上のことか
ら，本研究により食品に含まれる比較的低濃度のリンを濃縮し回収できることが示され，有効性が示された。

Characterization of a novel halotolerant aerobic selenate-reducing
bacterium, Citrobacter koseri Y2

Phosphorus recovery from food waste using compost○Shunsuke Okahata, Yuya Ueda, Daisuke Inoue, Michihiko Ike(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
bacterium

selenate reduction, selenite reduction, halotolerant selenate-reducing○Noboru Takiguchi, Koki Watanabe(Coll. Sci. Eng., Kanazawa Univ.)

Key words

phosphorus recovery, compost

130

1Np06

超低濃度亜鉛除去能を有する微生物の亜鉛除去機序の解析○栁原 隆志, 大槻 隆司（山梨大院・医工農）
tohtsuki@yamanashi.ac.jp

1Np08
学

下水処理場の臭気に関与する微生物の臭気生成抑制手段の探索○本門 慧史（山梨大院・医工農）
tohtsuki@yamanashi.ac.jp【背景及び目的】工業排水中に含まれる重金属の許容濃度基準は世界で厳格さを増している。高濃度重金属を含有する排水は、アルカリ塩として沈降剤と共に除去が行われることが多い。特に多種の重金属イオンが混在する排水の場合、基準の厳しい重金属の除去に重点を置いて処理を行うと、亜鉛は極低濃度ながら残存する。国内の亜鉛許容濃度は 1 mg/L であり現状はそれを下回るので問題視されていないが今後、規制強化により問題となる可能性が高い。本研究では、
そのような極低濃度亜鉛の除去を、微生物を活用して行うことをめざした。
【方法及び結果】本研究室では、メッキ工場排水処理汚泥を微生物源として亜鉛除去能を有する微生物の単離ならびに超低濃度亜鉛の除去を行う培養条件の検討を行い、1 mg/L 濃度の亜鉛水溶液から亜鉛を 0.1 mg/L 以下まで除去可能な条件を見出した。亜鉛除去能を見出した単離株 ZR-１，ZR-２は、亜鉛水溶液と混合すると１０分間で上清中の亜鉛を速やかに除去することから吸着による除去が考えられた。亜鉛除去時における亜鉛の所在を調べるために、ZR-１，ZR-２株の細胞をビーズミル粉砕した後に遠心分離により細胞壁と細胞外高分子物質（EPS）を分画することで、各分画の亜鉛吸着能の評価を試みている。同時にZR-１，ZR-２株の簡易同定も試みており、既知の細菌属種であった場合には標準株でも同様の試験を行うことで亜鉛除去能を比較する。標準株に亜鉛除去能
力が乏しく、ZR-１，ZR-２株の細胞壁あるいは EPS 画分に亜鉛吸着が見られた
場合には ZR-１，ZR-２株特異的な亜鉛吸着構造についての知見を報告したいと考えている。

【背景および目的】峡東浄化センター（山梨県笛吹市）では、活性汚泥法による汚水処理において、余剰汚泥処理工程で生ずる悪臭が問題となっている。工程調査では、余剰汚泥を濃縮・脱水した脱水ケーキの常温放置により、硫化水素
やメチルメルカプタンの顕著な発生が確認された。同工程では濃縮汚泥に亜鉛系制菌剤を混合し臭気抑制を図っているが、コスト高に加え脱水ケーキの堆肥用途があり、投入亜鉛量にも制限がある。本研究では、脱水ケーキ中微生物叢
で特定の属種が臭気生成の主因となるならば抑制手段をとりうると考え、16S
rDNA アンプリコン解析を行ったが、流入下水組成の変動もあり、微生物相 推
移の規則性や共通性は見いだせていない。そこで、原因属種にかかわらず普遍
的に臭気生成を抑制し、曝気槽への返送水や河川放流水に溶出したとしても環境影響の少ない物質の供給源として、身近な植物やハーブ・スパイス類から臭気抑制物質を探索した。
【方法および結果】収集した植物およびハーブ・スパイスを乾燥粉末とし、メタノール抽出物および熱水抽出物を得た。脱水ケーキより鑑別培地を用いて単離した硫化水素産生菌を臭気抑制のモデル微生物として培養し、各抽出液を添加した。３日間の培養を行い経時的に生育をモニタリングし、培養終了後に総気体発生量と含まれる硫化水素およびメチルメルカプタン濃度を測定したところ、
サツキ葉、カレーリーフ、タイム、リコリス、ローズマリーのメタノール抽出物、マジョラムの熱水抽出物に臭気抑制効果が見られた。特にカレーリーフのメタノール抽出物は、菌体生育を阻害せずに臭気生成を著しく抑制したことか
ら、現在、HPLC による活性画分の精製を行うとともに、単離株だけでなく脱水ケーキ中微生物叢に対し普遍的に臭気抑制効果を示すのかどうかを検討している。

Analysis of ultra-low-concentration-zinc removal mechanism of bacteria
from plating plant wastewater treatment sludge

Search for methods to control odor production by microorganisms involved
in odors at sewage treatment plants○Ryuji Yanagihara, Takashi Ohtsuki(Integr. Grad. Sch. Med. Eng. Agric. Sci, Univ. Yamanashi)○Satoshi Motokado(Integr. Grad. Sch. Med. Eng. Agric. Sci, Univ. Yamanashi)

Key words

zinc removal, bioremediation, zinc localization

Key words

sewage sludge waste, odor control, herbal extract

1Np07

異化的亜リン酸酸化により増殖する化学独立栄養細菌の
解析

1Np09

タヌキ糞便より単離されたアンモニアガス耐性細菌
Klebsiella sp.のアンモニアガス利用特性学○山中 享史, 加藤 淳也, 田島 誉久, 中島田 豊, 石田 丈典,
池田 丈, 舟橋 久景, 黒田 章夫, 廣田 隆一（広島大院・統合生命科学）
hirota@hiroshima-u.ac.jp○飯田 健太, 清 啓自, 吉田 ナオト（宮崎大院・農）a04109u@student.miyazaki-u.ac.jp【目的】異化的亜リン酸酸化(Dissimilatory Phosphite Oxidation, DPO)とは、亜リン酸(HPO32－)の酸化によって ATP 及び還元力を得るエネルギー獲得様式であり、同化的な亜リン酸酸化と区別される。DPO を行う微生物(DPOM)は数種類報告されているが、環境中での分布や存在量、生態についてはまだ不明な点が多い細菌である。これまでに、浜名湖底泥由来の嫌気消化汚泥を、亜リン酸を電子供与体とした培地で集積培養した結果、既知の DPOM である Candidatus
Phosphitivorax anaerolimi Phox-21 株の DPO 関連遺伝子と相同性が高い配列を見出したことから、DPOM の存在が示唆された。そこで今回は、集積培養系内に存在する DPOM について、その増殖における電子受容体や炭素源を明らかにするため、硫酸イオンおよび CO2 の影響を調べるとともに、メタゲノム解析による DPOM の同定・特性解析を試みた。
【方法・結果】DPOM を検出した集積培養系を植種源として、硫酸イオンまた
は CO2 の有無で培養を行った結果、硫酸イオンと CO2 いずれも DPOM の増殖に必要であったため、硫酸イオンを電子受容体、CO2 を炭素源として用いる
DPOM の存在が示唆された。次に、集積培養系に存在する DPOM の同定および特性解析のため、集積培養系を亜リン酸またはリン酸をリン源とする培地で培養し、抽出した DNA の PacBio によるロングリードおよび DNBSEQ によるショートリードの次世代シークエンサーによるメタゲノム解析を行った。得られた DNA 配列と Phox-21 株の亜リン酸酸化系遺伝子クラスターとの相同性を調べたところ、部分的に一致する配列が複数見られ、この遺伝子クラスターは少なくとも 62 kb にわたって保存されていることが明らかになった。しかし、Phox-21 株は硫酸塩を電子受容体として利用できないとされており、今回の集積培養系には Phox-21 株とは異なる DPOM が存在する可能性が示唆された。

【目的】本研究ではタヌキ糞便中よりアンモニアガス濃度 350 ppm で単離したアンモニアガス要求性細菌である Klebsiella sp.のアンモニアガス利用特性の調査を行った。
【材料及び方法】Klebsiella sp.を対象に、炭素源や窒素源を含まず生育因子のみを含む MM 培地、MM 培地にグルコースを添加した MMG 培地を用いて、アンモニアガス下で培養しコロニーサイズの経時変化を見ることで生育特性の調査を行った。NO2-の検出はナフチルエチレンジアミン吸光光度法に従った。
【結果及び考察】MM 及び MMG における培養結果から本株はアンモニアガス
をエネルギー源及び窒素源として利用可能であることがわかった。MMG 培地
においてはコロニーサイズの増大、至適アンモニアガス濃度の上昇が見られた。
また同条件で培養を行った大腸菌と比較しても高いアンモニアガス濃度における生育が確認された。これらの培養後菌体から NO2-が検出されたことから本株はアンモニア酸化能を有していると考えられる。窒素源としてアンモニウムイ
オンを添加することでも生育が見られたがコロニーサイズを比較するとガス態の方がコロニーサイズが大きく、利用性が高いと考えられる。
アンモニアガス非存在下で培養を行ったところ MM、MMG いずれにおいても生育が確認されたことから本株が窒素固定能を有すること、アンモニアガス濃度の経時変化の測定結果から窒素を固定しアンモニアガスとして放出することがわかった。
嫌気条件下でアンモニアガス培養を行った際にも生育が確認されたことから嫌気的アンモニア酸化(Anammox 反応)を行うことが示唆された。Fe3+添加によってコロニーサイズの増大が見られたことから Fe3+ を最終電子受容体とする
Feammox 反応を行う可能性が考えられる。

Characterization of chemoautotrophic bacteria that grow by dissimilatory
phosphite oxidation

Characteristics of ammonia gas utilization by ammonia gas tolerant bacteria
Klebsiella sp. isolated from raccoon-dog feces.

○Takafumi Yamanaka, Junya Kato, Takahisa Tajima, Yutaka Nakashimada,
Takenori Ishida, Takeshi Ikeda, Hisakage Funabashi, Akio Kuroda, Ryuichi Hirota(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)

Key words

phosphite oxidation, metagenomics, chemoautotroph, sulfate reduction○Kenta Iida, Keiji Kiyoshi, Naoto Yoshida(Grad. Sch. Agric., Univ. Miyazaki.)

Key words
anaerobic ammonium oxidation, nitrogen fixation, ammonia-tolerant,
ammonia gas

131

1Np10

好冷性アンモニアガス耐性細菌 Raoultella terrigena PB6のアンモニア耐性機構および独立栄養性解明に関する
研究

1Np12
学

○近藤 和馬, 清 啓自, 吉田 ナオト（宮崎大院・農）a04109u@cc.miyazaki-u.ac.jp

バイオフィルムを活用した排水処理向け硝化・脱窒ツー
ルの検討○蒲生 智郷 1, 尾島 由紘 1, 松原 さやか 2, 福本 吉洋 2, 東 雅之 1
（1 大阪公大院・工, 2 関西化工）
azuma@omu.ac.jp

ウマ糞便から 350ppm アンモニアガス(AmG)中で耐性細菌を単離した。培地はグルコースを含む最少培地(MMG)とし、培養温度は 15℃とした。16SrRNA 遺伝子の解析から、単離菌は Raoultella 属細菌であり、R. terrigena PB6 とした。
PB6 には AmG 要求性があり、104ppm AmG 中で生育可能であった。グルコースを含まない最少培地(MM)でも生育可で、化学合成独立栄養性があるといえる。
MMG、MM における最適生育アンモニアガス濃度はそれぞれ 200ppm、400ppmであった。NH4+を含む MM でも生育可能であるので偏性アンモニアガス要求性である。また窒素源のない MM で生育が見られるので、窒素固定能力があることも示唆された。
ゲノム解析によると、560 万塩基対の環状 DNA と 13 万塩基対の線状 DNA を有していた。アンモニアモノオキシゲナーゼ遺伝子は不保持であったので、新規なアンモニア酸化細菌であると予想される。
PB6 はファージに感染しており、phage tail sheath protein などをコードするファージ関連 RNA が高発現していた。ゲノム中にもプロファージ遺伝子の存在が確認された。PB6 のファージ由来 RNA の発現を RT-qPCR にて調べた。アンモニ
アガスが存在すると、ファージ由来 RNA の発現は抑制された。ファージ由来
RNA はアンモニアから受ける反応を軽減している可能性がある。PB6 はファー
ジを共存させてアンモニアガスの毒性を除去し、耐性を獲得していると考えられる。

生活排水及び工業排水に含まれるアンモニアは、富栄養化等の環境問題の要因となる。その処理にはコストや環境負荷等を考慮し、硝化・脱窒細菌を含む活性汚泥が利用されている。しかし、活性汚泥には多くの微生物が含まれ、その除去に関わる有用微生物の割合は少なく処理性能は低い。そのため、硝化反応に関わる微生物を固定化した担体の利用等が検討されている。我々はプラスチッ
ク表面に付着したバイオフィルムによるアンモニア除去・水質浄化の可能性を評価するため、排水処理工程の流動床等に使用されている中空円筒状の発泡ポ
リプロピレン製担体（内径 6 mm、外径 10 mm、高さ 10 mm）を用い硝化・脱窒反応について検討した。担体を硝化槽の活性汚泥あるいは脱窒細菌 Paracoccus
pantotrophus NBRC16712 の培養液に長時間浸漬した後に洗浄した。クリスタル
バイオレット染色及び SEM 観察から、担体表面へ微生物が付着しバイオフィ
ルムを形成していることを確認した。次に、硝化槽の活性汚泥由来のバイオフィ
ルムを形成した担体をアンモニア溶液（アンモニア性窒素濃度:10 ppm）に投入
し、アンモニア濃度の経時変化を調べた。結果、時間の経過とともにアンモニアが減少し、亜硝酸が発生してその後減少し、硝酸が発生することが分かり、バイオフィルム内の細菌によってアンモニアを亜硝酸経由で硝酸に変換したと考えられた。また、脱窒細菌バイオフィルムを形成した担体を亜硝酸溶液（亜硝酸イオン濃度:10 ppm）あるいは硝酸溶液（硝酸イオン濃度:10 ppm）に投入
し、亜硝酸及び硝酸濃度の経時変化を調べた。結果、時間の経過とともに亜硝酸及び硝酸の顕著な減少が見られ、脱窒反応により亜硝酸や硝酸が速やかに消費されたと考えられた。現在は 2 種類のバイオフィルムを用い、硝化・脱窒反
応により溶液中からのアンモニア、亜硝酸、硝酸の除去に取り組んでいる。

Ammonia gas tolerant mechanism and chemolithoautotrophic property ofpsychrophilic ammonia gas tolerant bacterium, Raoultella terrigena PB6Study on nitrification and denitrification tools using biofilms for wastewater
treatment○Kazuma Kondo, Keizi Kiyoshi, Naoto Yoshida(Grad. Sch. Agric., Univ. Miyazaki.)○Tomoki Gamo1, Yoshihiro Ojima1, Sayaka Matsubara2, Yoshihiro Fukumoto2,
Masayuki Azuma1(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Metro. Univ., 2 Kansaikako Corp.)

Key words

psychrophile, phage, ammonia gas, Raoultella sp.

Key words

1Np11

アンモニア酸化細菌における環状ジグアニル酸合成・分解酵素の同定と解析

1Np13○西村 聡子, 水崎 圭, 水津 暁生, 高橋 佑, 金岡 英徳, 飯島 信司（愛工大・工）iijimarecdna@aitech.ac.jp

学

biofilm, nitrification, denitrification, ammonia wastewater treatment

The environmental effect of plants in smoking area
○Jeong Wook Jo, Sung Woo Yang, Gyu Won Lee, Jae Hun Kim,
Ye Jin Kim, Hyung Joo Kim(Dept. of Biological Engineering, Konkuk Univ.)
hyungkim@konkuk.ac.kr

生活・工業廃水中の窒素化合物を除去する方法として、生物学的硝化・脱窒法が広く利用されている。このうち硝化過程にはたらくアンモニア酸化細菌
Nitrosomonas europaea は、アンモニアの酸化によってエネルギーを得る化学合成独立栄養細菌であり、増殖に有機物を必要としない。この菌は、廃水処理プ
ラントなどでは通常バイオフィルムを形成しているが、極めて増殖が悪く生物学的窒素処理の律速となっており、この点を克服できれば廃水処理の効率化が期待できる。
環状ジグアニル酸は、グラム陰性細菌を中心に広く分布するセカンドメッセン
ジャーであり、細菌の運動やバイオフィルム形成の調節に重要な役割を果たすことが知られている。本研究は、アンモニア酸化細菌における環状ジグアニル酸の生理作用を明らかにすることで、細菌増殖・バイオフィルム形成の制御および廃水処理の高効率化を目的とする。
細菌内の環状ジグアニル酸濃度は、環状ジグアニル酸合成酵素（DAC）および分解酵素（PDE）によって制御されている。NCBI データベースおよび SMARTを用いた解析から、アンモニア酸化細菌 N. europaea NBRC14298 において、DACに特徴的な GGDEF モチーフを含む酵素３種、PDE に特徴的な EAL モチーフを含む酵素７種、およびその両方を含むタンパク質 5 種が存在すると推定された。
定量 PCR により、GGDEF タンパク質 3 種、EAL タンパク質 7 種のいずれもmRNA レベルで発現していることが確認された。またこれらの酵素遺伝子の一部を発現ベクターにクローン化し、His タグ融合タンパク質として発現させた。
精製した His タグ融合タンパク質を用いて酵素反応を行い、ELISA で定量する
ことにより酵素活性の確認を進めており、その結果を報告する。

In this study, the effect of live plants on the soil environment of smoking areas wasinvestigated. During the study, the number of smokers, and cadmium (Cd)concentrations of the smoking area environments (plant leaves, topsoil, andrhizosphere) were analyzed in the selected smoking areas. ICP-MS method was used
for the Cd analysis. Soil microorganisms and rhizospheres were analyzed using DGGE
and metagenomic analysis. Results showed that the smoking area with the live plants
had higher visiting number of the smokers (176.67 ± 7.85) compared to the smoking
area without live plants (153.67 ± 5.44). The highest Cd concentration (347.117 ±24.542 μg/kg) was observed at the plant leaves of smoking areas. However, in the caseof the top-soil samples, the smoking area without plants showed significant Cd
concentration (295.77 ± 16.64 μg/kg) compared to the top-soil from the smoking areawith plants (87.53 ± 5.68 μg/kg). This result indicates that the presence of live plant
reduced the Cd accumulation in the soil of smoking areas. The DGGE andmetagenomic analysis of soil samples also showed that the smoking affected themicrobial system in smoking areas. The preliminary microbial analysis showed that thepresence of plants in the smoking area stimulated the Cd removal activity of the
microorganisms in the soil.

Identification and analysis of enzymes involved in c-di-GMP synthesis anddegradation in an ammonia oxidizing bacterium

The environmental effect of plants in smoking area

○Akiko Nishimura, Kei Mizusaki, Akio Suizu, Tasuku Takahashi,
Hidenori Kanika, Shinji Iijima(Fac. Eng., Aichi Inst. Technol.)Key words

nitrogen removal, wastewater treatment, biofilm○Jeong Wook Jo, Sung Woo Yang, Gyu Won Lee, Jae Hun Kim, Ye Jin Kim,
Hyung Joo Kim(Dept. of Biological Engineering, Konkuk Univ.)

Key words

smoking area, plant environment, cadmium, metagenomics

132

1Np14
学

Adsorption of H1N1 influenza virus from waterimmersed leaf suspensions of live indoor plants

1Np16

Effects of 1,3 Di-Chloropropene agrochemical onearthworm and bacterial biomass○Muhammad Akram Kharral, Quoc Thinh Tran, Motoki Kubo
(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)
kubo@sk.ritsumei.ac.jp○Sung Woo Yang, Jeong Wook Jo, Gyu Won Lee, Jae Hun Kim,
Ye Jin Kim, Hyung Joo Kim(Dept. of Biological Engineering, Konkuk Univ.)
hyungkim@konkuk.ac.kr

Using plants to control indoor particles has gained interest due to global air pollution
and the spread of pandemic-causing viruses. However, the interaction between humanpathogenic viruses (HPVs) and live plants remains unexplored due to difficulties indetecting small amounts of infectious viruses in carriers like aerosols and a lack ofsuitable examination methods. This study introduced a novel evaluation method bysubmerging live plant leaves in water to examine their effect on HPVs using the H1N1
influenza virus as a model. Selected plant foliage was immersed in a bag with HPVwater suspension, and a rapid virus detection kit evaluated the activities of 20 plant
species on the virus suspension. Within 72 hours, ten plant species demonstrated theability to reduce virus concentrations in the water suspension. Epipremnum aureum
showed the highest virus-decreasing characteristics. Immersed E. aureum leaves
enhanced their capacity to decrease viral content (approximately 70％ reduction inconcentration) when the pot was electrically grounded (i.e. electrochemical fertilizer).
Analysis of foliage samples indicated that virus adsorption to the plant surface played amajor reason for the decrease in the suspension. These findings propose the applicationof this method to select plants for further investigation into plant-HPV interactions.

1,3-Dichloropropene (named DD) is an agrochemical used as a soil fumigant to control
soil borne pests such as nematodes, fungi, and insects. The use of DD has been linked
to adverse effects on the environment, particularly on the survival rate of earthworms
and microorganisms in soil. This study aims to identify the effects of DD on
earthworm survival and bacterial biomass in organic and chemical amended soils. The
soil was incubated for 28 days and samples were collected on day 0, day 3, day 7, day
14, and day 28. In the experiment, control, 121 μL/kg, 242 μL/kg, and 363 μL/kg
concentrations of DD were fumigated in soils where organic and chemical fertilizer
were applied.
The results showed higher earthworm survival rate in organic fertilizer treatmentcompared to chemical fertilizer treatment. Earthworm survival rates in organic soil
were 100%, 80%, 40%, and 10 %, while those in chemical soil were 80 %, 60%, 10%,and 0 % at control, 121 μL/kg, 242 μL/kg, and 363 μL/kg respectively. Bacterial
biomass in organic soil was higher than those in chemical soils. Moreover, biologicalproperties such as nitrogen and phosphorus circulation activities were also examined,
and they showed higher values in organic soils compared to chemical soils. The study
confirmed that DD has adverse effects on earthworm survival and microorganism,however, organic fertilizer application environment can increase the earthworm
survival, bacterial biomass, and biological properties like nitrogen and phosphorus
circulation activities.

Adsorption of H1N1 influenza virus from water-immersed leaf suspensionsof live indoor plants

Effects of 1,3 Di-Chloropropene agrochemical on earthworm and bacterial
biomass○Sung Woo Yang, Jeong Wook Jo, Gyu Won Lee, Jae Hun Kim, Ye Jin Kim,
Hyung Joo Kim(Dept. of Biological Engineering, Konkuk Univ.)○Muhammad Akram Kharral, Quoc Thinh Tran, Motoki Kubo
(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words
forming unit

influenza virus, plant-virus interaction, electrical grounding, plaqueKey words

biodegradation, phytoremediation

1Np15

水圏環境における植物と底質の関係解析

1Op01

フェノール分解条件下における Comamonas thiooxydans
R2 株の形質不均一性と機能維持○五十嵐 郁, Tran Quoc Thinh, 久保 幹
（立命館大院・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp○鈴木 研志 1,2, 上原 悠太郎 3, 水口 千穂 1,2, 栗栖 太 2,4,
二又 裕之 5,6,7, 野尻 秀昭 1,2（1 東大院・農生科, 2 東大・CRIIM, 3 東大院・工, 4 東大院・工・水環セ, 5 静大・創科技院, 6 静大院・総合科技, 7 静大・グリー
ン科技研）
anojiri@g.ecc.u-tokyo.ac.jp[背景・目的]近年、水圏環境では系外からの過剰な有機物や栄養塩類の流入量が、生物の浄化能を上回りことにより、湖沼のヘドロ化や富栄養化などの問題が引き起こされている。微生物や植物の分解能力を用いた土壌や水圏環境汚染の浄化方法の一つに、バイオレメディエーションが挙げられる。本研究では水生植物の中でも、底質に張った根と水中の植物体の両方から栄養を吸収する特性を持つ、沈水植物を用いた水質浄化システムの構築を目的とした。
[方法・結果]
水中に溶出せず、植物体が安定して栄養吸収出来る底質の確立のため、有機資材の中から沈水植物の生育に最も適している底質とその濃度を探索した。一般
的に植物の生育に適している有機資材では成分溶出による水質汚濁が考えられたため、デカンテーションを行った。デカンテーション後の有機資材を水質への影響の観点からスクリーニングしたところ、色度・濁度において最も水質への影響が少なかったのが骨粉であった。ガラス資材に骨粉を配合した底質条件
におけるセキショウモの栽培を行い、3 日ごとに色度、濁度の計測を行った。
その結果、13 日目までは水質に影響を及ぼすこと無く、植物体は平均 7.6 cm の成長が確認出来た。また同条件で、植物のない実験系と色度、濁度の比較をおこなった結果、植物のある条件下での方がどちらも低い値を示した。これらの結果から、水中の栄養分を植物体が吸収したことによって色度、濁度の上昇が押さえられたと考えられた。13 日目以降の沈水植物の安定した生育及び水質の維持、骨粉ではまかないきれない栄養分の供給方法の構築を発表する予定である。

微生物個体群はクローナルな集団である一方で、細胞性状は不均質であることが知られている。Comamomas thiooxydans R2 株はフェノールを唯一の炭素源とする連続培養系で、その分解は一部の細胞に依存することが示唆されていた。
しかも R2 株はフェノール分解力という機能維持において不安定であり、細胞不均質性と機能維持に密接な関係があることが考えられた。そこで本研究では、
R2 株における機能維持機構を細胞レベルの代謝から解明することを目的とした。連続培養系を構築し選択培地を用いた CFU 測定の結果、フェノール分解に直接関与する細胞は全体の 10%以下まで減少し増減することが示された。また、細胞生存率は約 93%であり、大半の細胞がフェノール以外の代謝物に依存して生残していることが示唆された。フェノール分解細胞の減少が突然変異によるのかどうかを検討するため、選択培地上のコロニーを用いて連続培養系を構築したところ、同様にフェノール分解細胞と非分解細胞が確認された。従って、フェノール非分解細胞の出現は遺伝的な変異には依らず、培養系内には発現系の異なる様々な細胞が混在しその割合が変化していると考えられた。培養系内で利用される代謝物を特定するため、連続培養系の培養上清を用いて R2株を培養し、培養前後で増減する代謝物を分析した結果、R2 株の顕著な増殖は確認できないものの、少なくとも 81 種の代謝物が増減することが明らかとなった。特に分子量 278.18809 で分子式が C17H26O3 と予測された代謝物の減少が顕著であった。以上の結果から、連続培養系におけるフェノール分解という機能は一部の細胞により発揮され、様々な代謝物を利用することで生残した細胞が僅かな環境変化に応答しつつ発揮する能力を切り替えることで、系全体としての機能を維持していることが示唆された。

Study on relationship between plant and sediment in aquatic environment

Phenotypic heterogeneity of Comamonas thiooxydans R2 under phenol-fed
chemostat○Kaoru Igarashi, Quoc Thinh Tran, Motoki Kubo
(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words
phytoremediation, organic matter decomposition, aquatic plant,
environmental effect of waste water○Kenshi Suzuki1,2, Yutaro Uehara3, Chiho Minakuchi1,2, Futoshi Kurisu2,4,Hiroyuki Futamata5,6,7, Hideaki Nojiri1,2(1 Grad. Sch. Agric. Life Sci., Univ. Tokyo, 2 CRIIM, Univ. Tokyo, 3 Grad. Sch. Eng.,
Univ. Tokyo, 4 Grad. Sch. Eng. Res. Ctr. WET., Univ. Tokyo, 5 Grad. Sch. Sci.
Technol. Shizuoka Univ., 6 Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 7 Res.
Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)
Key words
phenotypic heterogeneity, metabolism, chemostat, phenol

133

1Op02
学

複合微生物系の機能的恒常性を可能にする微生物群集の構造的特徴1Op04

Sphingomonas bisphenolicum AO1 株の 4hydroxyacetophenone 分解特性解析○リュウ ロ, 佐々木 美穂, 松村 吉信（関西大院・理工）
ymatsu@kansai-u.ac.jp○池田 麗 1, 本荘 雅宏 2, 高橋 宣博 1, 三本 麗華 3, 斎藤 保久 4,
岡田 崇 5, 木村 元彦 1, 二又 裕之 6
（1 静大院・総合科技, 2 静大・創科技院, 3 静大・工, 4 島大・学研
理工, 5 京大・医生研, 6 静大・グリーン科技研）
futamata.hiroyuki@shizuoka.ac.jp

微生物群集は人の腸内、畑作土壌など様々な場の機能の一部として重要な役割を担っている。しかし、これらの制御は経験則に依存している面があり、如何にして安定に機能を発揮し続けているのか理論的理解が不足している。その為、複合微生物系の機能安定化機構の解明が希求されている。これまで、数菌株系
では微生物間不完全代謝補完による共存および機能安定化が示唆されている。
しかし、得られた知見がより複雑な系に適応できるかは不明である。そこで本研究では、複合微生物系を構築し、複合微生物系においても不完全代謝補完が機能安定化に寄与するのか解析を行った。
Phenol を唯一の炭素源、土壌を接種源、滞留時間を 10 日とした連続集積培養系（R-1 と R-2）を構築し、phenol 蓄積を機能の不安定化と定義した。R-1 は安定から不安定へ、R-2 は不安定から安定へ変化した。R-1 は phenol に対する親和定数が幅広く、不安定期で低親和傾向を示した。一方、R-2 は一様に高親和であった。Amplicon Sequence により科レベルでの群集構造を解析した結果、R-1 では安定状態を示した一方、R-2 では優占種の変遷後に寡占的安定を示した。異なる機能的安定性を示す培養 253 日および 321 日目から分離した代謝産
物資化性細菌の phenol 分解能を解析した結果、機能的安定状態において非資化性細菌数がより多かった。さらに、安定化および不安定化要因を解析するため、R-2 で優占的であった科に属する 3 菌株を用いて各々 2 菌株混合培養系を構築した。その結果、1 つの共培養系でのみ phenol 蓄積が確認され、システムの機
能安定性における微生物群集の機能的構造の重要性が示唆された。
以上の結果から、R-1 および R-2 では phenol 分解と代謝産物分解の役割分担による機能安定化が推察され、システムの機能的安定性発揮には不完全代謝を補完する代謝ネットワーク構築の重要性が示唆された。

【背景および目的】ビスフェノール A（BPA）は、乳児などにおいて神経機能や免疫システムの発達障害、内分泌撹乱作用や発がん作用を示すことが報告されて い る 。 当 研 究 室 で は こ れ ま で に 、高 い BPA 分 解 能 を示 す Sphingomonas
bisphenolicum AO1 株を単離し、BPA 分解特性について検討してきた。AO1 株の BPA 分 解 は 弱 い 女 性 ホ ル モ ン 活 性 を 有 す る 中 間 代 謝 産 物 4hydroxyacetophenone（4-HAP）の分解が律速段階となるため、AO1 株の BPA 分
解能の向上には、4-HAP 分解速度の向上が重要である。しかしながら、これまでに 4-HAP 分解酵素や遺伝子の特定には至っていない。そこで本研究では、4HAP 分解酵素活性に影響を与える要因の検討および 4-HAP の分解産物の特定を進めることを目的とした。
【方法および結果】反応温度の違いによる AO1 株の休止細胞の 4-HAP 分解活性を評価した結果、4-HAP 分解の最適温度は 25〜30℃であった。AO1 株の 4-HAP
分解特性を検討するために、様々な培地で培養した AO1 株から調製した休止細胞の 4-HAP 分解能を調査した。その結果、L、L-4HAP、L-BPA 培地で培養した休止細胞では全く 4-HAP の分解が確認されなかった。一方、BPA または 4-HAPを添加した無機塩培地で培養した休止細胞では、50 µg/ml の 4-HAP をそれぞれ
6 時間と 24 時間で完全に分解した。現在、4-HAP の分解が確認できた休止細胞から細胞内画分と細胞膜画分を調製し、4-HAP 分解酵素の局在性を明らかにするとともに、4-HAP 分解産物の特定を進めている。

Feature of microbial community structure enable to functional homeostasisof complex microbial systems

Characterization of 4-hydroxyacetophenone degradation in Sphingomonas
bisphenolicum strain AO1○Lu Liu, Miho Sasaki, Yoshinobu Matsumura(Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ.)○Rei Ikeda1, Masahiro Honjo2, Nobuhiro Takahashi1, Reika Mimoto3,
Yasuhisa Saito4, Takashi Okada5, Motohiko Kimura1, Hiroyuki Futamata6(1 Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2 Grad. Sch. Sci. Technol.
Shizuoka Univ., 3 Fac. Eng. Shizuoka Univ., 4 Grad. Sch. Sci. Eng. Shimane Univ.,
5Inst. Med. Biol. Kyoto Univ., 6 Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)
Key words
microbial community, metabolic network

Key words

4-Hydroxyacetophenone, Sphingomonas, biodegradation

1Op03

1Op05

キノコによる加硫ゴムの分解は炭酸カルシウム充填剤の
脱離を伴う

学

日本海溝に生息する深海微生物の多様性及び機能の解明○實野 佳奈 1,2, 西川 洋平 2,3, 星野 辰彦 4, 稲垣 史生 4,5,
竹山 春子 1,2,3,6（1 早大院・先進理工, 2 産総研・早大 CBBD-OIL, 3 早大・ナノラ
イフ創新研, 4 海洋研究開発機構, 5 東北大院・理, 6 早大・生命動態研）
haruko-takeyama@waseda.jp○佐藤 伸 1, 米山 史紀 2（1 公立鳥取環境大学, 2 住友理工）
s-sato@kankyo-u.ac.jp

プレートの沈み込み帯に位置する海溝は、水深 6,000m を超える地球上で最も深い海洋環境を形成している。海溝には表層から沈降集積する有機物の分解者として従属栄養の微生物生態系が元素循環に寄与しているが、環境中に優占する個々の微生物系統が有する代謝機能及び元素循環における生態学的な役割については不明な点が多い。本研究では、国際深海科学掘削計画（IODP）第 386
次研究航海において日本海溝（水深 7,445〜8,023m）から採取した堆積物試料を用いて網羅的なゲノム解析を行い、超深海底微生物群集の系統的多様性や代謝機能に関わるゲノム特性を調査した。まず、日本海溝軸に沿った計 6 地点、海底面下 1 m から微生物分析用の堆積物試料を採取し、早稲田大学で開発されたシングルセルゲノム解析技術（SAG-gel 法）を用いて Single Amplified Genome（SAG）を獲得した。さらに、環境中の微生物ゲノムを網羅的に獲得しショット
ガンメタゲノム解析を実施した。その結果、堆積物環境において最も優占していた Phylum の一つである Atribacterota（JS1 class）の SAG が 279 個得られ、種レベルで異なる 9 つの JS1 系統が存在することを明らかとした。さらに、特定の JS1 系統の検出頻度が堆積物中のメタン濃度と正の相関があり、それらの系
統が部分的にメタン生成に関与する遺伝子を有していることを見出した。以上の結果から、日本海溝の表層堆積物では、特異なゲノム特性を有する複数の JS1
系統が海溝軸にそって広域分布し、生物地球化学的な炭素循環に重要な役割を担っていることが示唆された。現在、さらに深い堆積層から取得された試料を対象として、シングルセルゲノムシーケンスによる SAG の獲得を試みている。
本発表では、これらのゲノムデータを含めた JS1 系統細菌の多様性と代謝機能について報告する。

演者はこれまでに、鳥取県内で分離された木材腐朽菌 Trichaptum abietinum（シハイタケ）および Trichaptum biforme（ハカワラタケ）が加硫天然ゴムシートを分解することを見出している。これらの菌によるゴムの分解では、培養が進むにつれてゴム材料内部の構造が大きく変化していくことを走査型電子顕微鏡（SEM）や X 線マイクロ CT による観察から明らかとなってきているが、ゴム全体において分解に伴う化学組成や化学結合の変化、物性的な強度変化との関係は十分把握できていなかった。本研究は、T. abietinum および T. biforme が加硫天然ゴムシートの分解過程で引き起こす形態変化に伴うゴム材料成分の変化、引張強度や破断強度といった物性との相関関係を明らかにすることを目的に行ってきた。
実験では、市販の加硫天然ゴムシート KGR-1300（itec.co, 65mm × 15mm ×1mm）２枚を、ブナ木粉・フスマ培地（含水率 65%）を含む 300 mL 三角フラスコに加え、滅菌後にそれぞれの Trichaptum 属菌を植菌し、1〜9 か月間 25℃
で培養を行なった。培養開始から 1 か月ごとにゴムシートを回収し、SEM-EDS
による表面と側面の観察、熱重量分析による成分分析、引張強度測定などを行なったところ、培養 3 か月を過ぎた頃から、重量とゴム組成に菌処理による変化が見られ、３か月以降はその違いが顕著となった。この研究からゴムの重量減少の大部分はゴムの製造過程で補強材の役目として添加さに含まれる炭酸カ
ルシウムフィラーが菌によって取り除かれることがきっかけで起きることが推察された。また、最も微生物処理の影響を受けないか、生育阻害剤となるカー
ボンブラックの量も菌処理後に変化しており、菌の処理がカーボンブラックを含む一般的な加硫ゴム製品のリサイクルに役立つ可能性が示された。

Genetic characterization of deep-sea microorganisms in the Japan Trench
sediments

Biodegradation of vulcanized rubber is associated with removal of calcium
carbonate filler by wood decay fungi○Kana Jitsuno , Yohei Nishikawa , Tatsuhiko Hoshino , Fumio Inagaki ,Takeyama Haruko1,2,3,6(1 Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2 CBBD-OIL, AIST-Waseda Univ., 3 Res.
Org. Nano Life Innov., Waseda Univ., 4 JAMSTEC, 5 Grad. Sch. Sci., Tohoku Univ.,
6Inst. Adv. Res. Biosyst. Dynam., Waseda Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ.)
Key words
single-cell analysis, metagenomic libraries, subseafloor sediments,
hadal zone
1,2

2,3

4

4,5

○Shin Sato1, Fuminori Yoneyama2(1 Tottori University of Environmental Studies, 2 Sumitomo Riko Company Ldt)

Key words

wood decay fungi, vulcanized rubber, biodegradation

134

1Op06

スルファニル酸微生物分解への亜硫酸化学平衡の影響○釣本 真弘, 大西 真代, 喜多 晃久, 早瀬 伸樹（新居浜高専）n.hayase@niihama-nct.ac.jp

1Op08
学

耐酸性ヒ素吸着細菌の酸性鉱山廃水処理への活用○岩間 蒼平 1, 高野 力 1, 中島 一紀 1, 青柳 秀紀 2, 川﨑 了 1（1 北大院・工, 2 筑波大・生命環境）
takano.chikara@eng.hokudai.ac.jp[背景・目的]スルホン化芳香族アミン化合物であるスルファニル酸を単一炭素源とした長期の集積培養より Afipia sp. 624S と Diaphorobacter sp. 624L が分離された。624S
株はスルファニル酸を単一炭素源として増殖し、624L 株は 624S 株のスルファ
ニル酸分解に伴い生成する亜硫酸を酸化することにより 624S 株の亜硫酸による増殖阻害を低減していると考えられている。この亜硫酸は pH によってイオンの化学平衡が変化し、酸性では微生物増殖抑制効果の高い重亜硫酸イオンが増加する。そこで、本研究では、pH の変化による 624S 株のスルファニル酸分
解への亜硫酸イオン種の影響について検討を行った。
[方法及び結果]
pH を 6.0〜8.0 に調整した栄養塩培地に亜硫酸を添加して 624S 株を培養し、亜硫酸存在下で 624S 株の増殖への pH の影響を調べた。次に、pH を 6.5〜8.0 に調整したスルファニル酸を単一炭素源とした無機塩培地で 624S 株を培養した。
また、同様に pH を調製したスルファニル酸培地で 624S 株と 624L 株の共培養を行った。
亜硫酸を添加していない栄養塩培地では、624S 株は pH6.0〜8.0 で良好な増殖を示した。
亜硫酸を添加した時には pH7.5〜8.0 の弱アルカリ性の培地でのみ菌体増殖が見られ、亜硫酸イオン種による増殖への影響が考えられた。624S 株を、スルファ
ニル酸を炭素源とした培地で培養したところ、pH8.0 で最も良好な増殖を示し、pH が低下するにつれて増殖も低下し、pH6.5 ではほとんど増殖が見られなかった。624S 株と 624L 株の共培養では、624S 株のみの培養とは異なり、pH6.5〜
8.0 で増殖が見られ、スルファニル酸も分解された。624S 株のみでの培養では亜硫酸イオンによる影響を強く受け、624S 株と 624L 株との共培養では 624L
株による亜硫酸イオンの酸化により亜硫酸イオンの影響が軽減されている可能性が示唆された。

【背景・目的】 鉱山開発により、地中の硫化鉱物が大気に曝され酸化し、地下水と反応することで、高濃度の重金属を含む酸性鉱山廃水 (AMD) が発生する。
AMD は閉山後、数十年以上にわたり発生し続け、河川に流出するとその水を利用する人々や生態系に悪影響を及ぼすため、現在、一般的に中和処理が行われている。中和処理法では、As 等の重金属を含む中和殿物が生成し、産業廃棄物またはそれに類する扱いで処分されている。そのため、中和殿物を低減する
AMD 処理法の開発が望まれている。演者らは、耐酸性細菌を用いて中和前に金属を回収するプロセスを考案した。本研究では AMD から As を回収する耐酸性細菌を単離し、その回収能力を評価すると共に、菌体表面を解析することでAs の回収原理の解明を試みた。
【方法・結果】Specialized Cellulose Film 法 1) によって単離培養した耐酸性細菌
を幌別硫黄鉱山から採水した AMD (pH 2, As 6 mg/L 程度) に懸濁し、一定時間、金属の回収処理を行った後、遠心分離によって菌体を除去した。回収処理前後の AMD 中の As 濃度を誘導結合発光分光法により定量し、細菌の As 回収量を算出した。その結果、43.6％の回収に成功した。また、走査型電子顕微鏡による観察の結果、菌体の表面に As の局在が見られ、As が菌体表面に吸着されたことが示された。これらの結果から、耐酸性細菌による AMD 中の As の回収が可能であることが示唆された。これまで、実試料を用いた酸性条件下のバイオ
ソープションの研究例は少なく、本研究は実際の AMD への適用への一助となる。本法は中和処理前に有害金属を回収するため、有害な殿物の発生を低減でき、持続可能な AMD 処理法として期待できる。
1) Aoyagi et al. JMM., 195, 106450, 2022.

Effect of chemical equilibrium of sulfite ion on microbial degradation of
sulfanilic acid

Utilization of acid tolerant arsenic absorbing bacteria for acid minedrainage treatment○Mahiro Tsurimoto, Mayo Oonishi, Akihisa Kita, Nobuki Hayase(National Institute of Technology, Niihama College)○Sohei Iwama1, Chikara Takano1, Kazunori Nakashima1, Hideki Aoyagi2,
Satoru Kawasaki1(1 Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ., 2 Inst. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

biodegradation, sulfanilic acid, sulfite

Key words

acid tolerance, arsenic, bioremediation, biosorption

1Op07

Pseudonocardia sp. D17 による塩素化エチレン類の好気分解酵素及び経路に関する研究

1Op09

驚異的な油脂分解能力をもつ微生物による超効率的な食用油含有排水処理法の確立と社会実装

学○西峯 隆悟, 南薗 洸佑, 井上 大介, 池 道彦
（阪大院・工）ike@see.eng.osaka-u.ac.jp○小原 優季 1, 蟹江 純一 1, 堀 克敏 1,2（1 フレンドマイクローブ, 2 名大院・工）khori@chembio.nagoya-u.ac.jp【研究背景・目的】Pseudonocardia sp. D17 は塩素数 1~3 の塩素化エチレン類（CEs）を共代謝に依らず好気分解可能な細菌株であり、バイオレメディエー
ションにおける活用が期待される。本研究では、D17 株による CEs 好気分解機
構を解明する一環として、同株が生成する酸素添加酵素の CEs に対する基質特異性を調査すると共に、CEs 分解経路及び経路内で主流となる反応の推定を行った。
【実験方法及び結果・考察】D17 株が保有するテトラヒドロフランモノオキシゲ
ナーゼ（THFMO）とシトクロム P450（CYP450）に関して、THFMO に関連する遺伝子群を導入した形質転換体と、CYP450 阻害剤であるフェニルヒドラジンを用いた分解試験を行い、CEs 分解における THFMO 及び CYP450 の関与を調査した。その結果、THFMO は cis-ジクロロエチレン（c-DCE）、1,1-ジクロロ
エチレン、クロロエチレンの分解、CYP450 は trans-ジクロロエチレンの分解に関与すると示唆された。他方、どちらの酵素もトリクロロエチレン（TCE）の分解を触媒しなかった。以上の結果から、D17 株は基質特異性の異なる複数の酵素を利用することで、5 種類の CEs を分解可能であることが判明した。また、TCE と c-DCE を対象として、分解過程で生成する塩化物イオン（Cl-）、及び中間代謝物を分析した。その結果、D17 株は c-DCE の分解量に対して 2 倍量のCl-を生成した。また、その分解過程で微量のシュウ酸の生成が検出された。以上の結果から、c-DCE は完全に脱塩素化され、その代謝物の一部はシュウ酸となり蓄積することが判明した。他方、TCE では、その分解量とほぼ同量の Clが生成し、分解過程でシュウ酸とトリクロロ酢酸が検出された。これらの結果
から、TCE の分解経路には、塩素原子が脱離せずトリクロロ酢酸が蓄積する主たる経路と、脱塩素化と微量のシュウ酸の蓄積を伴う経路の少なくとも 2 つが存在すると考えられた。

名古屋大学の堀研究室で単離された Burkholderia arboris と Yarrowia lipolytica は油脂に対して非常に高い分解活性を示し、難分解性のトランス脂肪酸にも適応可能である。本研究では、これら油脂分解微生物を利用した油性排水処理法の確立と社会実装について述べる。上記 2 種の混合微生物製剤の油脂分解能を評価したところ、3000 mg/L 以上の油性排水を１日で処理する分解性能を示した。
これは一般的な微生物製剤の分解速度の 10 倍以上に相当する。従来の微生物製剤の性能では、従来食品工場で油対策に使われてきた加圧浮上分離装置を代替することは難しく、本微生物製剤は、標準的な滞留時間内で油脂を分解可能な
ほぼ唯一の製剤であるといえる。油脂はリパーゼによる加水分解を介し、遊離脂肪酸となり、脂肪酸は微生物に取り込まれ、二酸化炭素と水に分解される。
このため、本微生物の高い油脂分解活性は、リパーゼの能力と微生物の脂肪酸分解能力に由来すると考えられた。そこで、B. arboris の有する新規リパーゼに着目し機能解析を行ったところ、従来のリパーゼでは認められなかったトラン
ス脂肪酸含有油脂の加水分解能力が、初めて認められた。さらに本リパーゼは、油脂に対するメチルエステル化を触媒することも確認された。将来、リパーゼを用いた新たなバイオディーゼル生産技術の確立に寄与するだろう。本微生物製剤は既に食品工場において実装されており、今後も市場が拡大することが見込まれる。これにより、加圧浮上分離装置の問題であった悪臭、廃棄物、メン
テナンスといった課題から解放される夢の技術が市場に広がる。本研究は廃棄物削減から将来のバイオエネルギー生産まで、SDGs 推進に大きく貢献する。
現在、複数の排水処理会社、エンジニアリング会社、食品会社、化学会社、商社との連携が進んでおり、産業界からの熱い視線が向けられている。

Enzymes and Pathways Involved in the Aerobic Chloroethenes Degradation
by Pseudonocardia sp. D17

Establishment and Social Implementation of an Ultra-Efficient Edible Oilcontaining Wastewater Treatment Method Using Microorganisms with
Remarkable Oil Degradation Capabilities○Ryugo Nishimine, Kousuke Minamizono, Daisuke Inoue, Michihiko Ike(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
pathway

Pseudonocardia sp., monooxygenase, chloroethenes, degradation○Yuki Ohara1, Junichi Kanie1, Katsutoshi Hori1,2(1 Friendmicrobe, 2 Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

Key words

oil treatment, wastewater treatment, bacteria, lipase

135

1Op10

1Op12

草食性陸ガニのリグニン分解活性○三宅 克英, 永倉 佑真（名城大・理工）miyake@meijo-u.ac.jp

海洋性水素酸化細菌 Hydrogenovibrio marinus MH-110
株の培養法の検討○岡部 航也 1, 松内 愛美 2, 花田 晶子 3, 春日 友明 3, 明戸 剛 3,
西原 宏史 1
（1 茨城大院農・実践農食, 2 茨城大農・食生科, 3 太平洋セメン
ト・中央研）
hirofumi.nishihara.agr@vc.ibaraki.ac.jp【背景及び目的】天然の原生林と海が接した海岸林に生息するアカテガニやクロ
ベンケイガニなどの陸ガニ類は、海岸森林バイオマスの分解者として、海と森の間の物質循環に大きな役割を果たしている。これらの陸ガニ類は落ち葉や木片を食料として利用することが報告されている。本研究の目標は、これまで有用生物資源として省みられることのなかった陸ガニ類のバイオマス分解能力を解析、同定、抽出し、生物工学的な応用を可能にすることである。今回はカニのリグニン分解活性の特徴とリグニン分解酵素の候補として RNA-seq 解析で検出したラッカーゼの機能解析を試みた。
【結果及び考察】カニのリグニン分解活性として、ラッカーゼ活性及びグアヤ
コールパーオキシダーゼ活性を指標として用いている。活性は主に中腸腺から検出され、植食性との相関があった。両活性ともに植物性の餌を与えると顕著に誘導された。RNA-seq によりラッカーゼ遺伝子を見出し、大腸菌で生産させた。活性は十分ではなかったが、植食性の強いクロベンケイガニ由来のラッカー
ゼの方が強い活性を示した。グアヤコールパーオキシダーゼ遺伝子は特定できなかった。またカニ消化管から細菌群を単離し、Mn パーオキシダーゼ活性とその候補遺伝子を特定できた。これらの酵素群はカニの植食性に寄与しているものと思われる。ラッカーゼの活性改善のために、酵母や昆虫細胞での発現を試みている。グアヤコールパーオキシダーゼに関しては、カニからの精製、他の候補遺伝子の検討を予定している。
(1) Miyake and Baba, J. Comp. Physiol. B, 192, pp. 247-261 (2022)(2) Miyake et al., J. Biosci. Bioeng., 128, pp. 316-322 (2019)

海水から分離された絶対独立栄養性の水素酸化細菌 Hydrogenovibrio marinus
MH-110 株は高い炭酸固定能と酸素耐性を有する等、炭酸ガスの有機資源化への利用において優れた特徴をもっている。実用化に向け、ガス基質供給の効率化と培地の低コスト化が重要な課題となる。今回、水素酸化細菌の培養に必要な基質ガスの培地への供給におけるマイクロバブルの有効性の評価、および無機塩類と水資源の確保の観点から、海水を利用した培養の検討を進めた。フラスコによる培養では気相に H2/O2/CO2 からなる混合ガスを充填し、30℃にて振とう培養を行った。マイクロバブルの有効性を検証するため、セラミック型マ
イクロバブル発生器を使用して 10L 容量のジャーファーメンターを用いた培養を行い、通常通気での培養との比較を行った。使用したマイクロバブル発生器
は通気量が 1 本当たり 100mL/min に限られたため、ガス供給口から分岐してマイクロバブル発生器を 2 本装着して培養を行った。少ない通気量の条件での比較実験であるが、通常通気の場合と比較して、マイクロバブルを利用して基質ガスを供給した場合は溶存酸素律速となるまでの時間が明確に長くなり、その時点での菌体濁度も増加するといった効果が得られた。また、海水を利用した培養では、250mL 容量のジャーファーメンターによる通気撹拌培養を行った。
海水をベースとして菌体の生育に不足すると考えられる無機成分を加え、培養の経過とともに逐次添加しながら培養を試みており、その結果について報告する。

Lignin degradation activities of herbivorous land crabs

Study of a cultivation method of marine hydrogen-oxidizing bacterium
Hydrogenovibrio marinus MH-110○Katsuhide Miyake, Yuma Nagakura(Fac. Sci. Tech., Meijo Univ.)○Koya Okabe1, Manami Matsuuchi2, Akiko Hanada3, Tomoaki Kasuga3,
Tsuyoshi Aketo3, Hirofumi Nishihara1(1 Grad. Sch. Agric., Practical Agric. Food Sci., Ibaraki Univ., 2 Dept. Food and Life
Sci., Coll. Agric., Ibaraki Univ., 3 Central Res. Lab., Taiheiyo Cement Corp.)

Key words

laccase, lignin degradation, land crab, biomass

Key words
cultivationhydrogen-oxidizing bacteria, Hydrogenovibrio marinus, CO2 fixation,

1Op11

Enzymatic Characterization of Unused Biomass
Degradation Using the Clostridium cellulovorans
Cellulosome

1Op13

海洋性水素酸化細菌 Hydrogenovibrio marinus MH-110株の増殖におけるガス基質消費量の解析と新たな海洋性
株の探索

学○Mohamed Yahai Eljonaid1, Hisao Tomita1, Fumiyoshi Okazaki1,2,3,
Yutaka Tamaru1,2,3(1 Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ., 2 Department of Bioinfomatics,
Mie University Advanced Science Research Center, Mie
University,, 3 Smart Cell Innovation Research Center, Mie
University)
ytamaru@bio.mie-u.ac.jp○野田 蒼士 1, 飯生 紗矢 2, 西原 宏史 1
（1 茨城大院・農・実践農食, 2 茨城大農・食生科）
hirofumi.nishihara.agr@vc.ibaraki.ac.jp

The cellulolytic system of Clostridium cellulovorans mainly consisting of acellulosome that synergistically collaborates with non-complexed enzymes wasinvestigated using cellulosic biomass. C. cellulovorans was able to completely degrade
shredded paper for 9 days and to be continuously cultivated by the addition of new
culture medium containing shredded paper, indicating, through TLC analysis, that its
degradative products were glucose and cellobiose. Regarding the rice straw andsugarcane bagasse, while the degradative activity of rice straw was most active using
the cellulosome in the culture supernatant of rice straw medium, that of sugarcane
bagasse was most active using the cellulosome from the supernatant of cellobiose
medium. Based on these results, no alcohols were found when C. acetobutylicum wascultivated in the absence of C. cellulovorans as it cannot degrade the cellulose. While
1.5 mM of ethanol was produced with C. cellulovorans cultivation, both n-butanol(1.67 mM) and ethanol (1.89 mM) were detected with the cocultivation of C.
cellulovorans and C. acetobutylicum. Regarding the enzymatic activity evaluation
against rice straw and sugarcane bagasse, the rice straw cellulosome fraction was themost active when compared against rice straw. we found that the degradation activity
was almost twice as high with 10 mM L-cysteine compared with without it. These
results will provide new insights for biomass utilization.

海水から分離された絶対独立栄養性の水素酸化細菌 Hydrogenovibrio marinus
MH-110 株は高い炭酸固定能と酸素耐性を有する等、炭酸ガスの有機資源化への利用において優れた特徴をもっている。本研究では、菌体の増殖に対するガ
ス基質消費量を調べるために、ガス閉鎖循環培養による解析を行った。フラス
コでの前培養は、H2：O2：CO2 ＝ 7：2：1 の混合ガスを充填し、30℃にて振とう培養を行った。本培養では 250ml 容量のジャーファーメンターを使用して、当初は混合ガスを供給して 34℃で連続通気培養を行い、溶存酸素濃度を測定しながらガス組成と撹拌数を変化させた。菌体濃度を高めた後、培養槽をガスリ
ザーバーに接続してガス閉鎖循環培養に切り替えた。この間、溶存酸素律速にならないようにして対数増殖を維持し、菌体濁度（OD）、ガス消費量およびガ
ス組成を測定した。ガス組成はガス分析計にて O2 および CO2 濃度をリアルタイムで測定し、その他を H2 とした。ガス濃度は GC/TCD による分析も行った。
また、新たに海洋サンプル由来の水素酸化細菌株の分離を試みた。県内で採取した試料を水素・酸素・炭酸ガス気相下で集積培養に供した後、ジャーファー
メンターでの増殖を確認して純化を進めた。集積培養系から IU-95Y2C 株とIU-101 株を分離することができ、これらは 16S rDNA による系統解析の結果から Hydrogenovibrio 属細菌に位置付けられた。H. marinus MH-110 株は、窒素律速条件下でグリコーゲンを蓄積することが知られているため、新規分離株の解析を行ったところ、いずれも窒素律速培地での培養において時間の経過に伴って培養液 OD 当りの糖量が増加した。
なお、本研究の一部は養殖業成長産業化技術開発事業（水産庁）の研究課題「水素細菌を活用した養殖飼料開発」の一環として実施された。

Enzymatic Characterization of Unused Biomass Degradation Using the
Clostridium cellulovorans Cellulosome

Analysis of gas substrate consumption of a marine hydrogen-oxidizing
bacterium Hydrogenovibrio marinus MH-110 and screening of new marine
isolates○Mohamed Yahai Eljonaid , Hisao Tomita , Fumiyoshi Okazaki ,Yutaka Tamaru1,2,3(1 Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ., 2 Department of Bioinfomatics, Mie University
Advanced Science Research Center, Mie University,, 3 Smart Cell Innovation
Research Center, Mie University)
Key words
cellulosic biomass, enzymatic degradation, cellulosome; C.
cellulovorans
1

1

1,2,3

○Aoshi Noda1, Saya Iino2, Hirofumi Nishihara1(1 Grad. Sch. Agric., Practical Agric. Food Sci., Ibaraki Univ., 2 Dept. Food and Life
Sci., Coll. Agric., Ibaraki Univ.)

Key words
isolationhydrogen-oxidizing bacteria, Hydrogenovibrio marinus, CO2 fixation,

136

1Op14
学

新規藍藻増殖促進細菌 Rhodococcus cerastii AF2108 の増殖促進メカニズムの調査○Tan Pei Yu 1, 石田 奨 2, 加藤 勇太 3, 邱 泰瑛 2, 八久保 晶弘 2,
小西 正朗 2
（1 北見工大院・工, 2 北見工大, 3 環境大善）
konishim@mail.kitami-it.ac.jp

1Op16
学

群体性藻類 Botoryococcus braunii 単細胞培養条件の応答局面法による最適化○村山 拳午, 大槻 隆司（山梨大院・医工農）
G20dia02@yamanashi.ac.jp

光合成細菌である藍藻は、大気中の二酸化炭素を固定し、有機物に変換する能力を持つため、生理活性化合物や次世代バイオ燃料の生産など、幅広い用途での利用が期待されている。しかし、藍藻は従属栄養生物より増殖が遅いため、生産コストが高いことが課題である。そこで、藻類バイオマスの収量と代謝産物の生産を改善するため、他の微生物との共培養が着目されている。そして、我々は藍藻 Synechococcus elongatus PCC7942 に対し、16 倍増殖促進効果のある
細菌 Rhodococcus cerastii AF2108 を見出した。しかし、生理学的に共生機構が完全に解明されていないことにより、安定かつ効率のある共培養システムの構築が困難である。したがって、本研究は、PCC7942 と AF2108 との相互共生メ
カニズムを調査した。
精密ろ過膜で 2 槽に分割した別府フラスコを用いて、PCC7942 と AF2108 の非接触的共培養と通常の共培養を実施したところ、同程度の増殖促進効果を示した。この結果は、共培養および別府フラスコ培養において、AF2108 からの代謝物による PCC7942 の増殖促進が起こっていることを示唆している。更に、安定同位体分析では、単独培養と比較し、共培養した PCC7942 と AF2108 の両方で炭素 (δ13C) と窒素(δ15N) 同位体比 がそれぞれ、約 5.4-5.8 ‰と 9.3–12.8 ‰の増加を示した。安定同位体分別効果により、共培養中にクエン酸回路とアンモニ
ア同化の関与が起こっている可能性が高いと考えられる。また、生態学分野では、炭素(δ13C) と窒素(δ15N) の安定同位体比が食物連鎖の解析に用いられており、食物連鎖においてより高位な生物ほど安定同位体比が高くなることが知られている。従って、共培養において、PCC7942 と AF2108 がお互いの代謝物を利用していることが示唆された。

微細藻類 Botryococcus braunii (以下ボトリオコッカス)は 30 から 40 の炭素が結合したテルペン骨格を持つ、重油に相当する炭化水素(ボトリオコッセン)を生産することから化石資源の代替原料供給源として期待されている。しかし、ボトリオコッカスは他の藻類種と比較して増殖速度が著しく遅いため、遺伝子組換えやゲノム編集技術が問題解決をはかる上で非常に重要なツールと考えられている。形質転換による遺伝子組換えはすでに報告があるが、群体状態のヘテロな(遺伝子改変内容が異なる可能性がある細胞が混在する)形質転換体となる
ことから機能解析や産業への利用には不適切だった。また、ボトリオコッカス
は強固な細胞外マトリックスに覆われており、細胞との間隙に炭化水素が満たされているため、遺伝子導入が非常に困難という課題も存在した。我々はこの細胞外マトリックスから単細胞を高い生存率で分離する方法を見出し、得られた単細胞からコロニーを再生させることに成功した。この単細胞に遺伝子導入を行い、形質転換された単細胞から単一コロニーを得ることができれば、炭化水素生産性の向上に対する特定遺伝子の改変効果の解析に著しく貢献する。一方で、現状では単細胞からコロニーを再生し、解析に十分な細胞量を得るのに、最低でも 3 ヶ月を要する。そこで本研究では、ボトリオコッカス単細胞を迅速に再生、生育させるための最適な条件を決定するために、窒素源濃度やリン源
濃度、グルコース、クエン酸鉄、微量金属、植物ホルモンなどを１因子実験で選抜した。この結果からボトリオコッカスの生育を向上させた 5 つの因子を中心複合計画(CCD)を用いて培地成分の最適化を行い、単細胞の再生・生育時間の大幅な短縮を目指した。

Investigation of the growth promotion mechanism of a novel
cyanobacterium growth promoting bacteria Rhodococcus cerastii AF2108

Optimization of culture condition of the colonial microalga Botoryococcus
braunii single-cells using response surface methodology○Pei Yu Tan1, Masashi Ishida2, Yuta Kato3, Tai-Ying Chiou2, Akihiro Hachikubo2,
Masaaki Konishi2(1 Grad. Sch. Eng., Kitami Inst. Technol., 2 Kitami Inst. Technol., 3 Kankyo Daizen
Company, Ltd)Key words

cyanobacteria, Rhodococcus, coculture

1Op15

ケイ酸カルシウム水和物を利用した微細藻類の増殖促進
技術の開発

学

○横井 佑果 1, 和賀 健太郎 1, 花田 晶子 2, 春日 友明 2, 明戸 剛 2,
吉野 知子 1, 新垣 篤史 1, 田中 剛 1（1 農工大院・工, 2 太平洋セメント）
tsuyo@cc.tuat.ac.jp【目的】微細藻類は高い CO2 固定能を示すことから、炭素貯留のための生物ホストとしての利用が注目されている。しかし、微細藻類の CO2 固定は、水へのCO2 溶解が律速となっており、CO2 溶解促進技術が求められている。当研究室
では、これまでにケイ酸カルシウム水和物 (calcium silicate hydrate: CSH)が、水への CO2 溶解を促進する資材として利用できることを明らかにしている。そこで本研究では、種々の微細藻類における CSH の増殖促進効果の検証を行い、微細藻類の CO2 固定量の向上が可能であるか評価した。
【方法】微細藻類として、円石藻 Emiliania huxleyi、珪藻 Fistulifera solaris 及び緑藻 Pseudoneochloris sp. NKY372003 株の 3 種類を用いた。それぞれの藻類に適した培地に 1 g/l の CSH を添加したものを用い、通気条件下 (air または 6% CO2)で各藻類の培養を行った。温度及び光量子束密度は、各藻類に至適な条件で行った。CSH 添加に伴う溶液中の炭酸濃度を藻類存在下と非存在下で測定した。
【結果と考察】CSH を添加した各培地の炭酸濃度をモニタリングしたところ、
air 通気下で 4~6 日目に飽和に達し、非添加条件と比較して平均約 1.5 倍に増加した。この条件下で藻類培養したところ、円石藻と珪藻の最終藻体到達濃度は、非添加条件と比較してそれぞれ 1.7 倍、約 1.8 倍に向上した。このことから、
CSH の炭酸濃縮によって微細藻類の増殖促進が可能であることが示された。一方で、緑藻において、air 通気下では CSH 添加による増殖促進効果は確認できなかったが、6%CO2 通気下では約 2 倍の増殖促進効果が認められた。このことから、CSH による増殖促進効果は藻類の炭酸要求性の違いにより異なることが示唆され、CO2 供給量の最適化が必要であると考えられた。本研究により、CSH
添加による炭酸濃縮効果が示され、微細藻類の増殖促進技術として応用可能であることが示された。

Development of growth -promoting technology for microalgae by using
calcium silicate hydrate○Yuka Yokoi1, Kentaro Waga1, Akiko Hanada2, Tomoaki Kasuga2,
Tsuyoshi Aketo2, Tomoko Yoshino1, Atsushi Arakaki1, Tsuyoshi Tanaka1(1 Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2 Taiheiyo Cement Corp.)

Key words

biomass, carbon dioxide, microalgae, growth stimulation○Kengo Murayama, Takashi Ohtsuki(Integr. Grad. Sch. Med. Eng. Agric. Sci, Univ. Yamanashi)

Key words

microalgae, Botryococcus braunii, single cell, response surface method

9 月 4 日（月）受賞講演（生物工学若手賞）（15:10 〜 15:25）〈生物工学若手賞〉

受賞者 景山 達斗 1,2（1 神奈川産総研，2 横国大院・工）工学的手法を利用した毛髪再生技術の開発

2A-Gp01

p. 1392A-Ip01

p. 139〈生物工学若手賞〉

受賞者 片岡 尚也（山口大・研究推進機構）
有用物質生産菌における細胞内外の代謝に関する生物工学研究受賞講演（生物工学アジア若手賞）（15:10 〜 15:50）〈生物工学アジア若手賞〉

受賞者 ○ Pau-Loke Show 1,2（1 Dept. Chem. Eng., Khalifa Univ., UAE,
2 Dept. Chem. Environ. Eng., Univ. of Nottingham Malaysia）

2A-Jp01

p. 140Recovery of valuable bioactive compounds from renewable resources towards a sustainable circularbioeconomy: A solution to global issues〈生物工学アジア若手賞〉

2A-Jp02

受賞者 ○ Chun-Yen Chen 1, Yu-Han Chang 1,2, Jo-Shu Chang 1,2, Jhuan-Ling Hsu 1（1 Natl. Cheng Kung Univ., Taiwan, 2 Tunghai Univ., Taiwan）

p. 140Engineering strategies for enhancing microalgae lipid production using effluents of coke-making
wastewater

シンポジウム (9:00 〜 11:00/13:00 〜 15:00)
プロテインクライシスに挑む未来タンパク資源の製造 ・ 加工技術の開発と新たな食システムの創成を目指して
2S-Aa01〜05
p. 141
創立 100 周年記念シンポジウム 生物工学の未来 （2050 年）
第 4 回―メディカル ・ バイオエンジニアリングの将来展望― 【本部企画】
多様な生体分子を基盤とした分子ピタゴラ装置の創出【国際シンポジウム】

2S-Ap01〜04

p. 1432S-Ba01〜05

p. 1452

シンポジウム［9:00 〜 11:00（11:44）/13:00 〜 15:00/16:00 〜 18:00］
未知の生命情報を獲得するためのバイオ分子ツールの設計と機能創出

2S-Bp01〜06

p. 148

下面発酵酵母のすべてを理解するために

2S-Ea01〜05

p. 151

微生物炭素固定代謝の多様性に基づく合成生物学

2S-Ep01〜05

p. 153

サーキュラーバイオエコノミーにむけたバイオものづくりの発展

2S-Fa01〜04

p. 156

データサイエンスと環境バイオテクノロジーの接点

2S-Fp01〜05

p. 158

博士人材のためのキャリアパスシンポジウム【生物工学若手研究者の集い】

2S-Ha01〜06

p. 160

醸造 ・ 発酵の新たなブレークスルーに向けて 【本部企画】

2S-Hp01〜04

p. 163

KSBB-BEST-SBJ ジョイントシンポジウム 【本部企画 ・ 国際シンポジウム】
第一部：酵素 ・ 微生物工学の新潮流 （〜 11:44）
2S-Ja01〜07
第二部：動物細胞工学の最先端研究
2S-Jp01〜05〈招待講演 （韓国生物工学会）〉
2S-Ja02, 2S-Ja04, 2S-Ja07, 2S-Jp01, 2S-Jp05〈招待講演 （台湾生物工学会）〉
2S-Ja06, 2S-Jp02

p. 165
p. 169東南アジア国際シンポジウム―東南アジアにおけるバイオテクノロジーとバイオものづくりの今―
2S-Jp06〜09
p. 171【関西支部 ・ 国際シンポジウム】（16:00 〜 18:00）
森も木も見る微生物研究：連携による集積知

2S-Ka01〜05

p. 173

合成生物学が切り拓く次世代型天然物創薬

2S-Kp01〜05

p. 1762Ap01〜10, 2Bp01〜10

p. 178

2Dp01〜10

p. 186

一般講演（15:30 〜 17:42）
酵素学，酵素工学／タンパク質工学
タンパク質工学

2Cp01〜10

セル＆ティッシュエンジニアリング／生体医用工学
植物細胞工学，組織培養，育種工学

2Ep01〜07

醸造学，醸造工学

2Fp01〜09

食品科学，食品工学
発酵生理学，発酵工学／代謝工学
遺伝子工学／分類，系統，遺伝学

2Gp01〜09

2Hp02〜09, 2Ip01〜09

生物化学工学／培養工学／バイオプロセス
生物化学工学／培養工学

2Kp01〜10
2Lp01〜10

2Mp01〜10

p. 183
p. 188
p. 190p. 192
p. 194
p. 199p. 201
p. 204

環境浄化，修復，保全技術／環境工学，廃水処理技術／バイオマス，資源，エネルギー工学
p. 2062Np01〜10

バイオマス，資源，エネルギー工学／環境浄化，修復，保全技術

2Op01〜10

p. 209139

2A-Gp01 〈受賞講演（生物工学若手賞）〉

2A-Ip01 〈受賞講演（生物工学若手賞）〉
有用物質生産菌における細胞内外の代謝に関する生物工
学研究

工学的手法を利用した毛髪再生技術の開発○景山 達斗 1,2（1 神奈川産総研, 2 横国大院・工）kageyama-tatsuto-tp@ynu.ac.jp○片岡 尚也（山口大・研究推進機構）
nkataoka@yamaguchi-u.ac.jp

受賞者は、工学的アプローチを利用した再生医療技術の研究開発を進めている。
本講演では、特に顕著な業績として、毛髪の再生医療に関する研究について紹介する。現在、毛髪の再生医療をめぐっては、主に三つの手法が提案されている。1.「毛乳頭細胞」の移植、2.「毛包原基」の移植、3.「生体外で再生した毛包」の移植である。受賞者は、これら三つのアプローチそれぞれにおいて、実用化を想定した研究開発を進めてきた。以下に受賞者の研究成果を抜粋して紹介する。
1．毛乳頭細胞の移植による毛包の活性化
脱毛症の治療に対するニーズは高く、男性型脱毛症には有効な薬剤も開発されている。この薬剤は、頭皮に残る毛包を活性化することで、脱毛の進行をおさえ、毛幹を太くよみがえらせる効果がある。しかし、薬剤治療の効果を維持す
るには、毎日継続して服用する必要があり、副作用も懸念される。また、女性や子供に対して有効性の高い薬剤は確立されていない。「毛乳頭細胞」の移植は、男女問わず一回の移植で長期間の有効性が期待できる画期的な技術として期待できる。毛乳頭細胞は、毛髪を成長させるシグナルを産生する細胞であり、脱毛症患者はこの細胞の機能が低下する。正常な毛乳頭細胞を患者の弱った毛包周囲に補完することで、毛包を活性化するというコンセプトで臨床試験が国内外で進められている。しかし現状では、細胞の増殖プロセスに課題があり、細胞移植治療の有効性はいまだ薬剤治療を超えていない。受賞者は、毛乳頭細胞の増殖方法として、電気刺激を印加しながら培養する方法やコラーゲンゲル
ビーズに包埋し培養する方法、PI3k/Akt パスウェイの活性剤を用いる方法を開発した。これらの方法で増殖させた細胞は、従来の培養ディッシュで増殖させた細胞よりも高い機能を有しており、我々の技術を利用することで細胞移植の治療効果が向上すると期待できる。現在、実用化に向けた研究開発を進めている。
2．毛包原基の移植による毛髪再生“毛髪の総本数の増加”を可能とする毛髪再生医療の開発も進めている。毛包は、上皮と間葉の相互作用によって毛包原基が形成されるプロセスを経て発生する。
近年、この発生過程で生じる毛包原基を生体外で人工的に再現し、これを移植する毛髪再生医療が注目を集めている。しかし、これまでに毛包原基を大量調製する手法は確立されておらず、ヒトの治療に必要な数千個の均一な毛包原基を大量に調製する技術の開発が、毛髪再生医療の実現に不可欠であった。受賞者は、マウス毛包の幹細胞（上皮系細胞と間葉系細胞）の懸濁液を混ぜて 1 つの凝集体を形成させると、培養 3 日間のうちにそれぞれの細胞が自発的に分離して毛包原基を形成する現象を発見し、微細加工技術を用いて一定間隔でマイクロウェル構造を備えた培養器を開発することにより、毛包原基の大量調製を実現した（T. Kageyama, et al. Biomaterials, 154, 291-300, 2018）。作製したマイクロウェルアレイチップは、培地表面からの酸素供給に加えて、PDMS 膜を介した底面からも酸素を供給できる。これにより、大量細胞培養で課題となる細胞の低酸素障害が抑えられ、毛包原基の大量培養を実現することができた。このように大量調製した毛包原基をヌードマウス皮下に移植すると、毛周期を繰り返す毛髪が再生した。さらに、生体の毛包周囲に含まれる多血小板血漿や血管内幹細胞、コラーゲンを毛包原基の作製時に混合すると、毛髪再生機能が向上することを見出している。最近では脱毛症患者の細胞を用いて毛包原基を作製し、マウスに移植すると毛髪再生できることも確認しているが、その再生効率は実用化するにはかなり低い。今後は培養条件の最適化検討を進め、再生効率の高い毛包原基の作製技術を確立することで、毛髪再生医療の社会実装を目指したい。
3．生体外で再生した毛包の移植による毛髪再生
毛包原基は“毛の種”のようなものであり、皮膚という畑に移植することで毛包が再生するが、毛の再生方向（毛並み）まで制御することは難しく、ましてや移植した種から確実に毛包が再生するかは保証できない。生体外で毛包組織を再生できれば、畑に苗を移植するように、毛並みを揃えた毛髪をほぼ確実に再生することが可能となる。このようなコンセプトから、我々は生体外で毛包を再生する培養技術を開発した（T. Kageyama, et al. Science Advances, 8, 42,
eadd4603, 2022）。マウス毛包に存在する上皮系細胞と間葉系細胞の自己組織化
プロセスに着目し、培養初期に形成する凝集体の空間配置パターンを制御することで高効率（＞ 99％）に成熟した毛包を再生することに成功した。再生した
毛髪は 30 日間の培養で約 5 mm の長さまで達し、この毛包を移植すると移植部
で生着し、毛周期を繰り返す様子が観察された。現在、脱毛症患者の細胞を用いた検討にも取り組んでおり、組織構造としては未熟ではあるものの、高効率で毛幹様構造が形成することを確認している。
最後に、本研究に関わっていただいた関係者の皆さまに心より感謝を申し上げます。この受賞を励みに三つのアプローチの研究開発を進め、私の理想とする“毛髪の悩みのない世の中”を実現できるよう尽力して参ります。

近年の地球温暖化に代表される環境・エネルギー問題の深刻化から, 持続可能な社会の実現に向けた技術の開発が急務の課題となっている。これに応えるべく
我々は, 微生物の持つ機能の中でも, 特に代謝に着目し, 有用物質生産菌である大腸菌・酢酸菌・コリネ型細菌を材料に, その高度産業利用を目指した生物工学研究を展開してきた。本講演では, これまでの研究成果の中でも, 大腸菌の細胞内代謝を介した非天然化合物生産と酢酸菌の膜結合型脱水素酵素によるペリプラ
ズムでの物質変換に関するものを中心に紹介する。
1. 大腸菌の細胞内代謝に関する研究
微生物による物質生産は, 代謝制御発酵, 代謝工学, 合成生物学, と科学技術の発展を経ることで段階的に成長し, これまでに様々な化合物を効率的に生産可能な技術の開発が実現されてきた。しかしながら, 微生物により生産される化合物種
を石油化学工業で生成される化合物種と比較すると, 未だ大きな差が存在する。
微生物による物質生産の実用可能性の拡大には, このギャップを埋める新たな技術の開発が望まれる。こういった背景から我々は, 合成代謝経路の構築を基盤とした大腸菌での非天然化合物の生産を報告してきた。この基盤となったのは, ポリヒドロキシアルカン酸生産水素細菌 Ralstonia eutropha 由来 phaAB とブタノー
ル発酵細菌 Clostridium saccharoperbutylacetonicum 由来 bld で構成された合成代
謝経路の機能的発現による 1,3-ブタンジオール生産大腸菌の構築である。その後, 有機酸の CoA 体への活性化を触媒するルーメン細菌 Megasphaera elsdenii
由来 pct および活性化された CoA 体とアセチル CoA の縮合に優れた R. eutropha
由来 bktB を活用した, 出発基質に用いる有機酸依存的に異なる化学骨格を持つ
1,3-ジオール類を生産可能なプラットフォーム経路の構築による 1,3-ペンタンジ
オール, 4-メチル-1,3-ペンタンジオール, 1,2,4-ブタントリオールの生産を報告した。現在は, エネルギー代謝の改変による生産強化に関する研究に取り組んでいる。
2. 酢酸菌のペリプラズムでの代謝に関する研究
酢酸菌は, 細胞質膜のペリプラズム側に多種多様な膜結合型脱水素酵素を保有しており, その働きにより, 基質を不完全に酸化する酸化発酵と呼ばれる代謝を営む。本発酵系は, 原料に用いる基質や生産物の取り込みや排出を必要としないため, 省エネルギー型の発酵形態であり, 高濃度の代謝産物を高収率で培地中に蓄積可能であることから産業的に利用価値が高い。我々は酸化発酵の中でも糖質の酸化能が多様な Gluconobacter 属酢酸菌に保存されたジヒドロキシアセトン(DHA) 発酵を解析してきた。本発酵系では, 出発基質であるグリセロールは, 膜結合型グリセロール脱水素酵素 GLDH の働きにより DHA に変換された後, 細胞内で資化される。我々は, 3 つの ATP 依存的リン酸化酵素 (GlpK, DhaK, DerK)が DHA 資化の初発酵素であることを酵素精製およびゲノム情報を用いて明らかにした。さらに, この知見を活用することで, 定量的に DHA を生産しうるシステムを報告した。また, 逆遺伝学および遺伝子工学的なアプローチにより DHA
発酵の鍵酵素である GLDH が, L-リボースを L-リボン酸に変換することを見出した。GLDH の基質特異性に関する研究は古くから行われており, 様々な基質に作用することが明らかにされていたが, その反応は Bertrand-Hudson 則と呼ばれるルールに限定され, 2 位と 3 位の水酸基が D-エリスロ入りを持つポリオー
ルの 2 位をケトンに酸化する。しかし, 見出した変換系はそのルールに従っておらず, 1 位の水酸基をも酸化することを示していた点で興味深く, 酢酸菌由来膜
結合型脱水素酵素による未開拓の新規酸化系の存在を予感させた。現在は, 遺伝
子工学による未だ機能が明らかにされていない酢酸菌由来膜結合型酵素の解析に取り組んでいる。
今後は, 上記研究の更なる発展とともに, 酢酸菌由来の基質特異性の広い膜結合型脱水素酵素の活用を鍵とした, 非天然化合物生産大腸菌との共培養による, 微生物で生成可能な化合物種の拡充といった研究にも取り組んでいきたいと考えている。

Bioengineering approaches for hair follicle regeneration

Biotechnological research on the cytoplasmic and periplasmic metabolisms
in bacteria producing useful compounds○Tatsuto Kageyama1,2(1 KISTEC, 2 Grad. Sch. Eng., Yokohama Natl. Univ.)

Key words

tissue engineering, regeneration○Naoya Kataoka(Org. Res. Initiatives, Yamaguchi Univ.)

Key words
metabolism

Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Gluconobacter spp.,

140

2A-Jp01 〈受賞講演（生物工学アジア若手賞）〉

2A-Jp02 〈受賞講演（生物工学アジア若手賞）〉
Engineering strategies for enhancing microalgae lipid
production using effluents of coke-making wastewater

Recovery of valuable bioactive compounds fromrenewable resources towards a sustainable circularbioeconomy: A solution to global issues○Chun-Yen Chen1, Yu-Han Chang1,2, Jo-Shu Chang1,2,
Jhuan-Ling Hsu1
(1 Natl. Cheng Kung Univ., Taiwan, 2 Tunghai Univ., Taiwan)
ccy.ncku@gmail.com○Pau-Loke Show1,2(1 Dept. Chem. Eng., Khalifa Univ., UAE, 2 Dept. Chem. Environ.
Eng., Univ. of Nottingham Malaysia)
showpauloke@gmail.com
One of the key challenges that we face in the 21st century is the need to feed an everincreasing human population with increasingly limited natural resources. Even today it
is estimated that roughly 1 out of 9 people in the world are undernourished, of which
the most important factor is protein-energy malnutrition. By establishing microalgae as
a new food and feed platform, we have the opportunity to increase the supply of theseessential products to address global demands in a more efficient and environmentally
sustainable way. Many types of algae are nutritionally complete foods, their yields
outperform most plant crops, and there is a growing set of tools to develop improved
strains of algae. Similar improvements were achieved in traditional crops throughthousands of years of breeding and strain selection, whereas with the newest genetic
engineering tools and advanced strain selection techniques, similar changes can be
implemented in microalgae in just a few years. Here we describe different strategies
that could be used to enhance the nutritional content, productivity, and organoleptic
traits of algae to help drive development of this new crop. Clearly developing more
efficient, sustainable, and nutritious foods and feed would be an enormous benefit forthe planet, and algae represents an opportunity to develop a new crop that would
complement traditional agriculture, and one that could potential result in a more
efficient means to meet the world's food and feed supply. In recent year, Liquid
Biphasic System (LBS) has become a proven tool used in separation and purification
technology for circular bioeconomy in microalgae biorefinery. The application ofInternet of Things (IoT) in LBSs in clarification, partitioning and partial purification of
biomolecules and bioproducts had showed the rapid development. This method is able
to give high recovery yield and high purity in a single step. The LBS shows
characteristics of high selectivity and is easily to scale up. Therefore, LBS offers an
attractive alternative that meets the requirements of the high demand in industry
processes and it is also beneficial in terms of economic and environmental protection.
This presentation aims to share on the recent literature works in the development ofdifferent type of LBSs and their applications in novel separations and purifications ofbiomaterials. Hopefully this presentation will able to build solid researchcollaborations among industry players and researchers.

The finite nature of fossil fuel resources such as coal, gas and crude oil threatens global
development and environmental sustainability. It is expected that blue carbon has thepotential to replace fossil fuel as a sustainable resource for food, fuels, andbiochemicals. One of the major marine resources is microalgae, which is endowed witha higher carbon fixation potential compared to that of terrestrial plants. The carbonrich microalgal biomass has potential applications in animal feed, health food,
pharmaceuticals, and other high-value products. Therefore, using microalgae tomitigate CO2 emissions is a promising strategy and feasible option for carbon capture
and climate change mitigation. This study uses industrial flue gas and coke-making
wastewater for the cultivation of microalgae with highly efficient CO2-fixation
efficiency. The obtained microalgal biomass will be converted to high-value chemicals(e.g., succinic acid, butanol), biochar and other biofuels (e.g., lipid, ethanol). This
study will also use clean CO2 (from fermentation or CCS process) to cultivate
microalgae with the potential for developing health food, aquatic/animal functional
feed additives and supplementary feed. To realize the cost-effective commercializationof microalgae industry, some key technologies required for microalgae-based CO2
emission mitigation and biochemical production will be introduced.

Recovery of valuable bioactive compounds from renewable resources
towards a sustainable circular bioeconomy: A solution to global issues

Engineering strategies for enhancing microalgae lipid production using
effluents of coke-making wastewater○Pau-Loke Show1,2(1 Dept. Chem. Eng., Khalifa Univ., UAE, 2 Dept. Chem. Environ. Eng., Univ. of
Nottingham Malaysia)

Key words

algal, biorefinery, circular bioeconomy, microalgae○Chun-Yen Chen1, Yu-Han Chang1,2, Jo-Shu Chang1,2, Jhuan-Ling Hsu1
(1 Natl. Cheng Kung Univ., Taiwan, 2 Tunghai Univ., Taiwan)

Key words

microalgae, wastewater, biorefinery, mitigation of CO2 emissions

141

2S-Aa01

麹菌が拓く新しい食産業○萩原 大祐（筑波大・生命環境）
hagiwara.daisuke.gb@u.tsukuba.ac.jp

2S-Aa02

細胞性食品（培養肉）の研究開発動向と課題○長谷川 隆則（日本ハム・中研）
t.hasegawa@nipponham.co.jp

世界の人口増加に伴い食料需要が伸び続けるが、農資源は限られており、現行のフードシステムでは供給が追いつかないと予想される。また気候危機などを背景に、環境負荷の低い持続可能な食料生産の導入が強く求められている。これらの課題解決に向けて、代替肉・プロテインの開発が世界中で精力的に進められ、プラントベースフードを中心とした製品がすでに多く販売されている。
しかし、食感や風味の最適化など加工性の点で課題も残されており、代替食品のさらなる普及に向けて、新たな魅力ある選択肢を用意することが必要である。
その一つとして近年注目されている技術が、菌類を利用したバイオマス発酵でありマイコプロテインである。
菌類を液体培養等により大量培養した菌体バイオマスそのものをマイコプロテ
インと呼称し、これを原料として様々な肉様食品に加工することで、代替食品として利用される。海外では、すでに様々なマイコプロテイン食品が販売されており、次世代食として大きな期待が寄せられている。その利点として、１）製造プロセスにおける環境負荷が、食肉生産に比べ低く抑えられる、２）菌類
は糸状性の成長を示すため、菌体塊が繊維構造を有しており、肉用の食感を再現しやすい、３）培養タンクによる工場生産が基本となり、培養期間も短いことから、安定した効率的な生産が見込める、ことが挙げられる。
私たちのグループでは、このマイコプロテイン生産において、日本の伝統的発酵微生物である麹菌を利用することで、既存の製品に比べ優位性を持つ食品が作れると発想し、研究開発を進めている。その根拠には、１）使用されている
他の菌類に比べ、麹菌は長年の食経験があることから、消費者の安心感を得や
すい、２）実際に現存する麹菌株は、長年の産業利用の中で安全な株が選抜、育種されており、安全性が担保されている、３）培養技術や遺伝子、代謝、細胞に関する知見の蓄積や研究リソースの充実、などが挙げられる。
培養した麹菌の菌体を食品成分分析すると、タンパク質含量は 30-50%と測定され、大豆や畜肉に匹敵する値を示し、タンパク質食品として優れたポテンシャ
ルが示された。また、遊離アミノ酸分析からグルタミン酸を豊富に含むことがわかり、うま味成分を高含有する食材としての利用も期待できる。さらに、麹菌の細胞壁が β-1,3-グルカンなどの食物繊維で構成されており、健康機能に関して検証を進める価値があると考えられる。このように麹菌マイコプロテイン
は、単なる“代替”ではなく、付加価値を持つ新たな食材として様々な利用法も期待することができる。
以上のように、麹菌をはじめとする菌類を用いたマイコプロテイン食品は、その有用性は明らかであり、新たな食産業としての期待が大きく膨らむ。その一方で、菌体バイオマスを得るために使用する培地原料や培養方法の議論も重要になる。つまり、他の食産業と同様に、何を原料にどのように培養（栽培、飼育）するかは、生産コストだけでなく、味や栄養、機能性といった食品機能、製品コンセプトなどに大きく影響を与える。そのため、環境と社会に調和した
サステナブルな食産業を確立する上で、原料から製品加工まで、どのようなサ
プライチェーンを設定するかが一つの鍵となる。この点で、微生物学や生物工学はその可能性を広げ、礎を築くために重要な学問であり、次世代の発酵学として果たすべき役割は大きいと考える。

細胞性食品（培養肉）は、家畜や魚などに由来する「細胞」を培養して増やし、原料とした食品である。その一般的な製造方法は、（１）家畜、魚などから細胞を採取する→（２）細胞を培養装置で大量に増やす→（３）増やした細胞を回収する→（４）集めた細胞を成型する という工程を取る。将来のたんぱく質不足が懸念される中、動物性たんぱく質を工業的に生産でき、国内で製造すれば自給率の向上や食糧安全保障上のメリットもある。また、アニマルウェルフェアの問題も、従来の動物性たんぱく質の生産よりも小さく、生産時の環境負荷（GHG の排出や水・土地の使用など）も、少なくなると見積もられている。
このような背景から、将来、細胞性食品の市場は大きく伸びると予測されており、アメリカの A.T. Kearney のレポート 1)では、2040 年には、代替肉を含む食
肉市場の中で、約 35％が細胞性食品に置き換わると試算されている。細胞性食品の研究開発は、海外スタートアップ企業における進展が著しく、特に、アメリカやイスラエルなどのいくつかのスタートアップが開発をリードしている。
これらのスタートアップは、世界中から多額の出資を受け、研究開発に投資するとともに、大型培養槽など製造設備の建設も進めている。
海外スタートアップでは、現状の技術を活用した細胞性食品の試作品を公表し、その進捗と将来性をアピールしている。2020 年には、シンガポールにおいて、
米 Eat Just 社が細胞性食品の販売承認を得たほか、ここ半年ほどの間に、米Upside foods 社や Eat Just 社が米国食品医薬品局（FDA）の審査において、No
Questions Letter（安全性に疑義なし）との裁定を受けており、米国農務省（USDA）の認可が今後必要であるものの、米国での細胞性食品の販売に一歩近づいた。
日本においては、細胞性食品の販売承認はまだ先になると推察するが、業界をまとめる組織として、細胞農業研究機構（前身＝細胞農業研究会）が発足し、国内におけるルール形成などの取りまとめを行い、関係省庁等と議論を開始している。
細胞性食品の技術開発は、2013 年にオランダ・マーストリヒト大学のマーク・ポスト教授が、細胞から成型した「ハンバーガーパティ」を公表して以来、急速に進展してきた。主に、「細胞」、「培養液」、「培養装置」、「筋繊維化・成型」の 4 つの領域で、基礎研究、応用研究が行われている。
「細胞」については、家畜・魚から採取した初代細胞に加え、株化細胞、iPS 細胞などの応用研究を進めるスタートアップもある。
「培養液」については、基礎培地成分の低コスト化に加え、動物血清や成長因子の代替・フリー化に関する研究が行われ、また、抗生物質フリーの検討も並行している。
「培養装置」では、食べられる足場材料の開発、培養槽のデザインや培養条件の最適化による生産性向上の検討が進んでいる。また、「筋繊維化・成型」の部分は、日本の企業、研究機関でも精力的に研究が進んでおり、筋組織の積層による成型や 3D プリンターの活用など、斬新な手段が検討されている。
一方で、細胞性食品の実現までには、まだ課題を残す。１つ目は、細胞コストの課題である。使用する種細胞の増殖能を上げ、培養液コストを低減し、細胞を従来のたんぱく質源に近い価格で生産する技術革新が求められている。２つ目は、食べられる材料で培養液を組成する課題であり、動物血清および成長因
子の食品代替が必要である。３つ目は、成型の課題である。細胞を集めても流動物体であり、食肉や魚肉のような形ある食品に加工するには、何らかの成型技術が必要である。４つ目は、ルール形成の課題である。安全性を担保しながら、どのような技術応用が許容されるか、今後、議論が進んでいくと考えるが、世界各国でルール形成が進む中、法令のグローバルハーモナイゼーションも重要になる。５つ目は、消費者受容の課題である。これまでに前例がない食品であるため、安全性や社会的な価値を丁寧に情報提供することが重要であろう。
このように、細胞性食品は、一般の食卓に並ぶまでには、まだいくつかの課題が残るが、将来の食や環境の問題解決に有効な供給手段の一つとして、今後も注目を浴びていくと考えられる。技術開発や安全性評価、ルール形成など多岐にわたり、産学官の連携が、引き続き重要になると考える。
1) A.T. Kearney (2019), How Will Cultured Meat and Meat Alternatives Disrupt theAgricultural and Food Industry ?

Koji mold opens up a new food industry

Trends and issues in research and development of cell cultivated food○Daisuke Hagiwara(Fac. Life and Env. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

alternative meat, Mycoprotein, Aspergillus oryzae○Takanori Hasegawa(R&D Center, NH Foods Ltd.)Key words

cell culture, food, cultured meat

142

2S-Aa03

未来タンパク資源の大量培養、スケールアップには何が必要か

2S-Aa04○長森 英二（大阪工大・院）
eiji.nagamori@oit.ac.jp

3D フードプリンターによる食品加工のブレイクスルー○古川 英光 1,2, 小川 純 1,2, シブリ ナヒン 1,2, 渡邉 洋輔 1,2,
貝沼 友紀 1,2, 臼井 昭子 1,2, 鳥羽 慶 1,2, 勢井 洋史 1,2,
コースラ アジット 2（1 山形大院・理工, 2 山形大学ソフト＆ウェットマター工学研究室）
furukawa@yz.yamagata-u.ac.jp

バイオものづくりに寄せられる社会的期待は膨らんでいる。中でも SDGs やプ
ロテインクライシスの観点から、精密発酵によるタンパク質資源の製造・加工が注目を集めるようになった。バイオ生産技術の開発は、非常に複雑な事象を扱うが故の困難が多く、現場の経験則（匠の技）に頼ってきた面も手伝って、
特に新規参入者にとっては長い期間を要しがちである。既存バイオ企業の製造現場においても、団塊世代のリタイヤに伴う人材難が声高に叫ばれる状況となっており、若手技術者が魅力を感じる開発現場や製造現場へと更新する必要がある。“産業のバイオ化”の加速に向け、これら産業界の共通課題を解決するために必要と考えられる事柄（最適化期間を短縮する仕組みとしての設備、試作支
援、人材育成、自動化、省力化）について、“大阪工業大学バイオものづくりラボ”の取り組みを交えて紹介したい。
製造プロセス開発に潜む課題（共通のお困りごと）
有用菌株の育種・生産プロセスの開発を新規に行う際の最大のボトルネックは、
スケールアップや分離精製、廃水処理、コスト試算、環境影響評価など、実用化に向けて欠かせない各要素について、網羅的に俯瞰視された育種を行うことに困難性が高い点である。育種開発に何度も手戻りが生じ、その開発期間が長期間化すると、経営層や投資家の理解を得ることが困難になってくる。スケー
ルアップや培養操作の最適化・効率化検証には、複数の培養槽（実験室サイズ
から中規模まで）を備えた施設が、まず必要となり、この時点で億を超える先行投資が必要になる。生物化学工学の実務に通じた培養技術者（バイオだけでなく培養生産に関わる化学工学や機械工学など複数領域を理解した専門家）を確保することが重要だが、このような人材を新規に見つけることは困難な状況である。製品の市場性を把握するには、サンプルを作ってユーザーに評価してもらう必要がある（モノ＝実物がないと話が進まない）。試作品製造を請負う培養受託メーカーに委託する際には、数十リットルスケールでの試験実績を求められる場合が多く、これが無いと受託期間・業務量に目処が立たず見積書すら得られない。実生産プラント開発にも障壁が想定される。バイオプロセスは複雑な生物反応が織りなす複雑系であり、特に、大規模培養に伴う不均一性の課
題は完全に解決したとは言えず、そのオペレーションは熟練労働者の経験と試
行錯誤に頼る複雑な暗黙知になりがちである。生物を対象とするが故に運転の安定性を高められず、訓練された生産技術者が付きっきりで監視・操作することとなる。２４時間３交代で操作をおこなうと、人件費だけでなく、生産技術者の人材確保、育成も問題となる。また培養技術者が各々に属人的なデータ管理をしていることで、その経験知や培養データの継承が熟練技術者の退職時に問題となる。
バイオプロセス開発を高スループット化する取組み
大阪工業大学バイオものづくりラボでは、“開発期間の短縮”を謳い文句とした様々な技術基盤開発、情報基盤整備を推進し、新規参入を目指す企業の開発支援に実活用している。0.25 L 小型多連培養槽から 30 L 蒸煮滅菌型培養槽までを取り揃え、バッチ培養による培養条件把握から、流加培養や実生産にまつわる
課題把握を目的とした検証を行うための設備と熟練スタッフを備える。各培養槽の性能は酸素供給能やシェアストレスの指標で紐付けられ、スケールアップの手間と時間を廃する。多連の培養槽ではサンプリング・分析の手間は増大するため、煩雑な作業の自動化は欠かせない。取得される培養データ（機器デー
タ、測定データ）は膨大となる。培養動態の把握に欠かせない各種比速度や収率の解析や可視化、さらには多変量からの主因推定などの作業を省力化するバ
イオＤＸアプリを開発し、作業者の負担低減を図っている。作業者は雛形に沿ったデータ入力するため、整った培養データが効率的に格納・保管される。蓄積されたビックデータを活用した最適化・運転制御など、より省力化された未来の開発現場や製造現場が見通せるようになると期待する。
バイオ産業人材の育成事業
わが国の発酵産業を支えてきた団塊世代の大量退職と少子化の影響、学においても実践的な培養工学を指導できるアカデミア人材が不足したことで、産業バ
イオ人材の輩出が困難になっている。このような背景を受け、大阪工業大学バ
イオものづくりラボでは、NEDO 特別講座 1)として、産業バイオ人材育成セミ
ナーを、実技教育を備えた形で開講した 2)。培養操作の理論と実践を学ぶ基礎
セミナーの受講者は 2023 年 5 月末までに 54 社、12 機関、5 大学から計 142 名に達した。流加培養や蒸煮滅菌培養槽の操作を扱う応用編も 2023 年度より開講し、既に申込は 35 名を超えた。外部企業の開発支援の利用希望数は増えており、実務を伴ったトレーニング（OJT）による高度産業バイオ人材育成の場として機能している。
参考資料
1) https://www.nedo.go.jp/news/press/AA5_101556.html (2023/6/6)
2) http://www.oit.ac.jp/bio/labo/~nagamori/seminar.html (2023/6/6)

山形大学では、2009 年から高強度ゲルの 3D プリンティングの研究を開始しました。2012 年に始まった 3D プリンターブームにより、私たちの 3D ゲルプリ
ンターが注目を浴びるようになりました。その時に、食品もゲルであることから、『3D フードプリンター』の開発を始め、研究を展開してきました。工学部の研究は、3D プリンティングの技術開発と性能向上が主体ですが、食品としての価値を高めるためには、物理的なリアリティの再現性だけでなく、心理的なリアリティについても追求する必要があることに気づきました。『3D フードプ
リンター』で新しい食品を創成するために、工学の枠を超え、デザインのプロ
や食品の専門家との共創による食品の価値創造研究に取り組んでいます。この講演では、『3D フードプリンターによる食品加工のブレイクスルー』について、初期の開発経緯から最新の取り組みまでを紹介します。

What is needed for mass culture and scale-up of future protein resources?

Breakthroughs in food processing with 3D food printers○Eiji Nagamori(Grad. Sch. Eng., Osaka Inst. Technol.)Key words

bioreactor, scale-up, mass culture, protein○Hidemtisu Furukawa1,2, Jun Ogawa1,2, Nahin Shlblee1,2, Yosuke Watanabe1,2,
Yuki Kainuma1,2, Shoko Usui1,2, Kei Toba1,2, Hirofumi Sei1,2, Ajit Khosla2(1 Grad. Sch. Sci. Eng., Yamagata Univ., 2 Soft & Wet mat. Eng. Lab. (SWEL))

Key words

gelation, 3D Printer143

2S-Aa05

新規開発食品の社会受容について考える○石川 伸一（宮城大・食産）
ishikawa@myu.ac.jp

2S-Ap01

注射不要の次世代経皮ワクチン創生に向けて○後藤 雅宏（九大院・工）m-goto@mail.cstm.kyushu-u.ac.jp

１．はじめに
昔の SF の物語の世界で見たような未来の食が、実現化しつつある。具体的には、食料不足や環境問題、ウェルビーイングなど、人間が抱える課題を解決するためのさまざまな「新しい食」の開発などである。第４次産業革命とよばれるサイバーフィジカルシステムを基にした製造業の革命が食産業の分野でも起こり、リアル空間とデジタル空間が融合したスマート化やロボット化などが急速に進展している。
２．フードテックによる食産業全体の革命
新規開発食品の技術は、「フードテック（Food Tech）」と総称され、最先端のさ
まざまなテクノロジーを食の分野に活用することとされる。具体的には、培養
肉、植物性代替肉、3D フードプリンタ、全自動で料理を作るロボット、AI（人工知能）・IoT（もののインターネット）を活用した調理機器、個人に最適化したテーラーメイド食、ウェアラブル端末による健康データの取得と AI による
健康アドバイスなどがあり、さまざまなテクノロジーが食の分野に登場、応用されている。フードテックが担う領域は、食材の生産（この分野は特にアグリ
テックとよばれる）から消費までの広いフードシステム、さらにその後の私たちの身体の中の代謝に関わるヘルステックまでの幅広い分野に及んでいる。
３．フードテック勃興の背景
フードテックが注目される背景のひとつとして、年々増え続ける世界の人口にある。人口増加にともなって食料需要が増し、なかでも問題と考えられているのがタンパク質の需要量が供給量を上回る「プロテインクライシス（タンパク質危機）」とよばれる課題である。現在の重要なタンパク質の供給源である畜産
は持続可能な生産が難しい課題があり、しかも拡大すれば温室効果ガスの排出を増やしてしまう可能性がある。また、もうひとつの大きなタンパク質供給源である水産物については、多くの魚種で資源の枯渇が懸念されている。こうした状況のなかでも、食料生産の持続可能性を実現し、世界の人々の需要は満たしていかなければならならず、その解決策として期待されているのがフードテッ
クである。
フードテック勃興の背景にはプロテインクライシス以外にも多くの理由がある。
たとえば、気候変動、異常気象といった不安定な食料供給体制への対応、ヴィー
ガンやベジタリアン、あるいは宗教上の戒律によって食べるものが制限されている人への対応、動物愛護（アニマルウェルフェア）への対応、食の生産現場における課題や飲食店の人手不足などの解決などにも貢献できると考えられている。
４．新規開発食品の社会受容性
フードテックの社会実装するにあたり、その科学・技術の発展が前提にあるが、新規開発食品が消費者に受け入れられるかという受容性の課題が大きく立ちはだかっている。新規開発食品の歴史を振り返ればテクノロジーの歴史であり、長い年月の間に多くのものが生まれは、消えていったともいえる。たとえば、包丁は、機械に取って代わられることなく、さまざまな「自然淘汰」を経て現在の形に少しずつ進化してきたといえる。実際に登場してきた新しい食の何が消え、何が残るのか、新規開発食品は何が重要で何が重要でないかという点を考える必要がある。車や携帯電話など他分野のテクノロジーは、新しいものが比較的受け入れられやすい傾向にあるが、食のテクノロジーの受容は、食べる
人の心理、思想、文化、価値観などの影響がかなり大きく、フードテックが生み出す新規開発食品の社会的受容の予測は極めて難しいといえる。
５．新規開発食品と食文化
フードテックによる新規開発食品は消費者に受容されるのか、さらに新しい食文化として定着するのかなどについて、今幅広い視点で考えて行く必要に迫られている。たとえば、私たちが普段食しているものは、調理という操作を施した料理を食べている。食材によって適切とされる調理法や料理があるように、
新規開発食品においても受容されやすい適切な料理が存在すると考えられる。
丸ごとの姿の昆虫食に嫌悪感を示す日本人は少なくないが、昆虫を粉末化した
せんべいにすることでその受容性が高まることは一般的に知られている。また、新規食品には既存の料理ではなく、新しい料理の方が相性が良い可能性も考えられる。そのため、フードテックによる新規開発食品がどのような料理とマッチングが良いかという知見などは、その普及にとって非常に重要であり、また、人が求める食の本質を理解する上でも重要な示唆となるであろう。
６．おわりに人の求める料理は、食材や調理法などが限られている場合、選べるものは限定されるが、フードテックの発展は、その制約を解消し、選択肢の幅を広げ、それによって、自分の価値観により合った多様性のある食を選ぶ機会が増えていくであろう。近年、消費者それぞれが SDGs などの社会的課題の解決を考慮し、課題に取り組む事業者を応援しながら消費活動を行う「倫理的消費（エシカル消費）」が取り上げられることが多くなっているが、その背景には、フードテッ
クによって食の生産、加工、流通、消費の幅が広がり、各自が選ぶことができる食品の種類が増えていることがその要因のひとつであると考えられる。

概要：
痛みを伴わない非侵襲性の経皮デリバリーシステムが、従来の注射に変わる薬
物投与法として注目されている。本研究では、簡便で高効率な経皮吸収を可能にする新たな経皮デリバリー技術、Solid-in-oil(S/O)ナノ分散化技術を開発した。
この S/O 技術を用いると、これまで経皮吸収が困難であったペプチドやタンパ
ク質が、皮膚から吸収されることが明らかになった。この浸透技術を利用する
ことで、がん、花粉症、インフルエンザさらにはマラリアの経皮ワクチンが創製可能となり、注射と同程度のワクチン効果（抗体産生）が得られることが、動物試験によって確認された。
研究背景：
経皮デリバリーは、薬物を皮膚から持続的に吸収させて、治療効果をもたらす
有用な薬物の投与法である。しかし皮膚は、バリア機能が非常に高く、一般的に分子量 500 以上の薬物は皮膚へ浸透できないとされている。その最大の要因
は、表皮最外層の角層の存在である。角層は死細胞からなる疎水性の高い多層膜で、外因性物質の皮膚浸透において最も高いバリア能を示す。したがって親
水性薬物の経皮デリバリーは、一般的に非常に困難であり、特に親水性高分子であるタンパク質に至ってはイオントフォレシスやマイクロニードルなどの物
理的吸収促進を行わずに、有効領域まで経皮デリバリーできる技術はほとんど無いのが現状である。
研究内容：
近年では注射に代わる新たな投与法として経皮ワクチンが注目されている。経皮ワクチンとは、塗り薬や貼り薬のように皮膚からワクチン抗原を吸収させて免疫化を行う手法であるため、簡便性・安全性・非侵襲性に優れた手法として期待されている。中でも深さ約 200μm 付近に存在するランゲルハンス細胞（LC）の重要性が指摘されている。経皮ワクチンにおいて高い抗原特異的な免疫応答を誘導するためには、LC へ効率的に抗原を送達することが重要である。しかしながら、先にも述べたように、LC の常在する表皮の最外層には疎水性で非常に高いバリア能を有する角層が存在する。そこで我々は S/O®技術によって、油状基剤を用いたタンパク性医薬品の経皮デリバリーが可能となることから、本手法を経皮免疫へ応用することを試みた。
1. 経皮がん免疫療法
皮膚がんの一種であるメラノーマ（B16F10 細胞）を用い、抗原にはメラノーマ
特異的に発現する tyrosinase related protein-2（TRP-2）のペプチド抗原（配列：SVYDFFVWL）を選択した。CpG ODN や R-848 等のアジュバント等を添加した TRP-2 封入 S/O 製剤を、メラノーマ移植前（予防）あるいは移植後（治療）のマウス耳介に塗布することで免疫化を行い、腫瘍成長の抑制や延命効果を評価した。また B16F10 細胞は転移性であることから、本免疫システムが、がんの転移抑制にも効果があることを確認した。
2. 経皮アレルギー減感作ワクチン療法
日本国民の 4 人に 1 人が罹患しているとの報告があるスギ花粉症を対象として、
経皮ワクチンによる治療効果を評価した。抗原タンパク質の一部分を使用する「T 細胞エピトープペプチド」を用いた免疫療法は、重篤な副作用を引き起こさず、治療期間の短縮を見込める治療法として期待される。本研究では、スギ抗原由来のヒト T 細胞エピトープペプチド（7crp）を用い、ペプチドサイズと徐放性や皮膚浸透性との関連を調べ、スギ花粉症モデルマウスを作製し、シール型の経皮ワクチンが花粉症に対して注射と匹敵する程度効果があることを検証した。
3. 実抗原への展開（インフルエンザとマラリアワクチン）
臨床試験への橋渡しについては、上記のがんや花粉症ペプチド療法では、経皮ワクチンについて研究期間内に早期の臨床試験実施の見通しを立てることは困難であったが、九州大学臨床センター(ARO)の協力で、ヒト用に実用化されているインフルエンザワクチンを提供いただいた。そこで本研究では、インフル
エンザに対する S/O 製剤の可能性を検討し、ワクチン効果を小動物（マウス）を用いて確認した。さらに、本研究で得られた知見を利用し、マラリアワクチ
ンの経皮製剤化を、鹿児島大学との共同研究によって実施し、そのワクチン効
果も確認した。
また、本次世代経皮吸収技術は、新規モダリティとしての核酸医薬への応用も可能となっているので、本講演では、それらの結果も合わせて紹介したい。

Consumer acceptance of novel foods

Toward the creation of next-generation transdermal vaccines as alternatives
to injection○Ishikawa Shin-ichi(Sch. Food Ind. Sci., Miyagi Univ.)

Key words

foodtech, consumer acceptance, novel food technologies○Masahiro Goto
(Grad. Sch. Eng., Kyushu Univ.)

Key words

drug delivery system, vaccine, drug carrier, DNA vaccine

144

2S-Ap02

動物細胞を用いたバイオ医薬生産：次の 100 年にむけて○大政 健史 1,2,3（1 阪大院・工, 2 次世代バイオ医薬品製造技術研究組合, 3 阪大・
先導的学際研機構）
omasa@bio.eng.osaka-u.ac.jp

2S-Ap03

ビボ応答を完全に再現可能なインビトロ臓器は 2050 年に出来るか？
○酒井 康行（東大院・工）sakaiyasu@chemsys.t.u-tokyo.ac.jp

1. はじめに
今でこそ当たり前に用いられている動物細胞培養技術であるが、細胞培養の黎明期においては、生体外において細胞を培養するということ自体が、特別な技術として取り扱われていた。動物細胞の生体外培養は、今から 100 年以上前にHarrison によって開始されて以降、生体外培養の技術は、一部のワクチン生産を除いて、主に科学的研究の手段として用いられていた。この状況が一変したのは、1980 年の後半から遺伝子工学の発展である。組換え細胞株を用いたタン
パク質医薬品生産が実用化されるに伴って、従来の微生物培養における様々な
生物化学工学の研究が動物細胞に導入されるようになってきた。本講演では、
動物細胞を用いたバイオ医薬品生産を対象にして、生物工学分野におけるこれまでの研究開発の歴史を振り返り、さらに今後の 100 年を見据えた将来の研究開発について考察してみたい。
2. 抗体医薬とともに発展した動物細胞工学分野
動物細胞の産業応用は、細胞を生産の媒介として利用する手段と、細胞そのものが生産物として利用する手段に大別できる 1)。バイオ医薬品（バイオロジックス）には、現在では抗体医薬、ワクチン、から細胞そのものを医薬品とした利用まで含まれるが、ここでは、主に、タンパク質医薬品や抗体医薬品を生産するプロセスを主として取り上げる。バイオ医薬品の特徴は、その高機能性と薬効の高さもさることながら、化合物医薬品と比べたその生産の困難さにも特徴がある。特にバイオ医薬品としての抗体医薬品は、糖鎖修飾を始めとする翻訳後修飾が生理活性に必要である場合が多く、高等真核生物由来の細胞である、
株化動物細胞を生産プロセスの宿主として利用する手段が用いられている。動物細胞を用いたバイオ医薬品製造プロセスにおいては、大きく、アップストリー
ム工程、ダウンストリーム工程、原薬から製品に至る製剤プロセスに分けられ、動物細胞を用いたバイオプロセスの特徴がでるのは、アップストリーム工程になる。このアップストリーム工程は、生産細胞を構築する Cell line developmentと細胞培養系を構築する Cell culture process development の大きく２つに分けられ、前者の細胞構築は、プロセスを構築する際に一度だけ行われるものであり、後者の細胞培養工程は、構築した後、繰り返し実施されるという特徴がある 2,3)。
Cell line development においては、生物そのものの不確定性や、生産物が持つ本
質的な不均一性などを解決し、Rational なデザインを実現していくことが真に求められている。特に近年著しい抗体医薬等は、6 割以上の製品がチャイニー
ズハムスター卵巣（CHO）によって生産されている。抗体医薬の発展によって
CHO 細胞は、バイオ医薬品生産において最も用いられている宿主細胞となっている。一方、Cell culture process development において、最も用いられている培養方法は無血清流加培養である。特に高濃度の流加培地を間欠的に流加する手法によって、近年では抗体濃度 10g/L を超える培養が実現されている 2,3)。さらには、連続灌流培養を用いた高濃度抗体の連続生産も様々な抗体において実用化が広がっている。タンパク質医薬品以外への展開として、遺伝子治療用のベクター製造においても HEK293 に代表される動物細胞が生産手段として汎用されるようになってきており、今後の発展も期待されている 4)。
3. さいごにーこれからの 100 年を見据えて100 年前には、動物細胞培養は実験室レベルでの限られた研究者の研究ツールとして始まった。現在、動物細胞は様々なバイオ医薬生産に欠かせない存在となっており、実験室レベルだけでなく、2 万 L 規模での生産培養も稼働している。さらに最も汎用されている CHO 細胞においてはゲノムも解析され、細胞構築、細胞培養において、ゲノム情報も含めた様々な情報も活用されている。
さらに従来の CHO 細胞の欠点を克服する新規のチャイニーズハムスター由来細胞の構築やその産業応用も進んできている。今後の 100 年の展望を示すことは難しいが、株化細胞という人工的に作り出した無限増殖能を持つ細胞を自在に設計し、設計指針通りに、この細胞を用いた生物工場として、小スケールから産業応用まで様々なバイオ医薬品生産が可能となるシステムが構築される、
そのような未来が訪れることを期待している。
参考文献
1. 大政健史 “生物化学工学分野における動物細胞工学に関する研究” 生物工学
99(1):15-22 (2021).
2. 大政健史（監修、著）”抗体医薬品製造～基礎から基盤技術開発まで” シーエ
ムシー・リサーチ (2022) .
3. 大政健史（監修、著）・「抗体医薬のための細胞構築・培養・ダウンストリー
ムのすべて・シーエムシー出版(2015,2021) .
4. 大政健史 “遺伝子治療用製品の製造技術開発” 医薬品医療機器レギュラト
リーサイエンス, PMDRS, 53(2):91-97 (2022).

約 20 年前にヒト遺伝子の塩基配列が解明されて以来．生体を構成する多様な分子の網羅的計測手段が格段の進歩を遂げ，今や１細胞単位での発現解析も可能となっている．このような計測データを，日々更新されるデータを参照しつつ，計算機科学に代表される先進的な数理手法にて解析することで，メカニズムに迫ることもできる．この延長線上には，個別人体のダイナミックな応答を全て数理的に表現・予測できる“バーチャル生理学的人体”や“バイオデジタルツイン”の構築といった将来像が描ける．
このような解析・メカニズム解明・再構成を展望する上で，相当長期に渡って生物的な実験系は欠かせない．ヒト臨床や動物実験でのインビボ組織への適用というトップダウン的なアプローチだけでなく，様々な仮説・シナリオの検証が可能なヒトの生理学的培養組織に基づくボトムアップ的アプローチを並行して進めることで，より効率的なメカニズム解明と再構成とが達成されよう．この後者の実験系の代表が生理学性の高いヒト細胞培養臓器モデルである．近年の幹細胞技術の発達によりヒトの正常臓器細胞の取得が可能になりつつあることに加え，各種三次元培養技術や共培養技術の発達や，従来は不可能であった
培養環境を実現する organ on-a-chip，マイクロフィジオロジカルシステム(MPS)の発達が大きく寄与している．．
さて，そもそもインビボの同様な細胞群を得て，同様な環境下で培養することができれば，原理的にはインビボと同様の機能や応答を発現＝真の生理学性の達成が成し遂げられるはずである．不完全ながらも実現に必要な知見と技術とを現代の我々は手にしつつある．しかし現状は，新規技術が成し遂げる改善が個別の必要条件に過ぎず，それらをどのように組み合わせれば必要十分条件になるのか，さらに足りない要因は何かなどが依然として明らかでない．今後は，インビボ現象との多面的な比較を含む極めて地道で系統的な研究を進める必要がある．特に筆者は，このような organ on-a-chip や MPS を嚆矢とした真の生理学性の追求は，現代の一見完成度の高い細胞培養手法－ヒト初代培養細胞を始めとする細胞とそれぞれに最適化された高価な専用培養液－に隠れた“非生理学性”を自ずと明らかにすることになると考えている．これは例えば，培養系での酸素供給とエネルギー生産，培養液の非生理学性といった点である．
生理学性に富んだ個別臓器の完成と並行して，人体の持つシステムとしての特性―ロバストネス（例えばホメオスタシス維持が成功裏に行われている状態，
疾患が進行はしているが可逆段階に留まっている状態に）やフラジャリティー
（疾患の不可逆的な進行や死の直前に見られるような多臓器・全身に渡る急速な機能低下など）―の再現・理解への真剣なトライも必須である．動物個体や人体とは異なり，培養臓器モデルを基礎とするボトムアップ的な方法では，相互作用の解明を行う臓器モデルのみの連結も可能となる．つまり，動物実験や臨床データではしばしば不明瞭となる多様な要因間の因果関係を，明確化できる．
これを多様な組み合わせとシナリオ下で活用すれば，メカニズムにより良く依拠した“バーチャル生理学的人体”や“バイオデジタルツイン”への構築へと繋がると期待している．
2023 年の時点で，残念ながら生物科学者の中には多かれ少なかれ「所詮はビトロ」という認識が厳然として存在する．2050 年に向けてインビトロ系の抜本的な革新を目指す研究者は，「所詮はビトロ」という認識の背後にある現象を科学的に解明し，ビトロとビボの乖離の克服に正面から取り組むべきである．Organ
on-a-chip や MPS に関する世界的な盛り上がりは強力な追い風であり，例え一時のブームは数年で過ぎたとしても，インビトロ臓器・人体モデルの研究開発と社会への利用はますます強まるであろう．この裏付けとなる学術的・系統的な取り組みがより強く求められる．

Next-generation biologics production using mammalian cell

Can we organize in vitro organs in 2050 that can completely reproduce thevivo responses?

○Takeshi Omasa1,2,3(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 MAB, 3 OTRI, Osaka Univ.)

Key words

Chinese hamster ovary cell, antibody, biologics, mammalian cell

○Yasuyuki Sakai(Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)

Key words

cell, microfluidic device, tissue engineering, systemic response

145

2S-Ap04

未来(2050 年)を見据えた培養装置開発の現状○石川 周太郎（エイブル）
shutaro@biott.co.jp

2S-Ba01

Engineering of halogenase and dehalogenase forsustainable technology○Pimchai Chaiyen(Vidyasirimedhi Institute of Science and Technology (VISTEC))
pimchai.chaiyen@vistec.ac.th

培養装置の役割の多くは、微生物や細胞を増殖させ、有用物質を生産させることにある。効率的な生産を行うために、溶存酸素濃度(DO)や PH の制御、また基質等の供給により、微生物や細胞にとって、最適な培養環境を作り出す必要がある。そのため、培養装置は、雑菌汚染を防ぐための滅菌工程に耐えうる、容器と DO/PH センサー、それらを制御するための制御システムで構成されている。培養装置の黎明期から培養装置の製造・開発に携わってきた当社には、培養装置発展の歴史が刻まれている。本稿では、培養装置発展の歴史を紹介しな
がら、未来(2050)を見据えた培養装置開発の現状を説明する。
約 40 年前に、当社で開発した、培養用の滅菌可能な DO センサーは、培養装置に搭載され、培養環境を改善することに、大きな役割を果たした。一方で、その時代は、滅菌出来るセンサーや容器が少なく、また、培養装置を小型化するための電子基板技術も未熟であったため、培養条件の検討に、30L 規模の培養装置を使用せざるを得なかった。その後のセンサーの普及や、電子部品の発達により、約 20 年前から、培養装置が小型化され、1～3L 程度が主流となった。
さらに、パソコンの進化により、複数の培養装置を、1 台のパソコンで集中管理することが可能になり、培養条件の検討を行いやすくなった。パソコンに限らず、培養装置が進化してきた背景には、日進月歩で進む、様々な分野における技術革新がある。その背景を踏まえ、(1)培養容器のシングルユース化、(2)分析技術の開発、について説明する。
(1)培養容器のシングルユース化
現在の培養容器は、ガラスやステンレスで構成されており、ユーザーは、使用毎に培養容器を組立、センサーを校正し、滅菌工程を経て、培養を行う。さらに、培養容器やセンサーの保管、メンテナンス等の煩雑な作業が必要なため、培養装置を使用出来るユーザーが限定されている。培養容器やセンサーを、シングルユース化することにより、煩雑な作業を低減出来ることから、従来の培養装置に比べ、簡便に、多くの培養条件の検討が可能となる。そこで、当社では、培養装置の小型(培養液量 30mL)化と共に、培養容器のシングルユース化に取り組んでおり、その実現のため、多くの要素技術を確立してきた。その代表的な要素技術である、培養制御用 DO/PH シングルユースセンサーについて説明する。
現在使用されている、培養を制御するための、DO/PH センサーは、直径 1.2cm
で、長さは 20cm 程度の筒状の形が一般的であり、ガルバニ電池式など、電気化学を応用したものが主流となっている。このような電気化学センサーは、筒状のセンサー内部に、液体(電解液)が封入されているため、日々のメンテナン
スや、雑菌汚染のリスク、また、取り扱いの煩雑さに加え、高コスト化が課題である。そこで、当社では、培養容器のシングルユース化に向けた光学式センサーの開発に取り組んできた。光学センサーは、蛍光物質に、光を照射することで励起される、蛍光量の変化を、読み取る手法を用いている。蛍光物質は、培養容器内壁に固定され、培養容器内の DO/PH を計測するが、その体積は、直径 0.6cm で厚さは 0.1cm 以下と、現在のセンサーの約 1/800 以下である。さらに、電解液を用いないため、雑菌汚染のリスクがなく、コストダウンが可能で、取り扱いが容易である。光学式センサーは、光を照射する LED 素子や、蛍光量を測定する Photodiode など、半導体技術の発展の恩恵を大きく受けている。
(2)分析技術の開発
現在の培養装置では、特定の成分の濃度(微生物や細胞の増殖状況や、栄養源と代謝物等)を把握するため、ユーザーは、培養中の培養液を雑菌汚染せずに、採取(サンプリング)する必要がある。約 30 年前は、現在のように、分析技術が発展していないため、大量の培養液を、サンプリングする必要があった。例えば、菌濃度や、基質源のグルコース濃度を計測するために、約 100 ｍ L の培養液をサンプリングしていた。当時、培養条件の検討に、30L 規模の培養装置が運用されていたもう一つの要因が、この分析技術にあった。しかしながら、現在は、
数 mL のサンプリング量で、多くの成分を分析出来るようになった。さらに、未来(2050)を見据えたとき、労働人口の減少や、働き方の改善などで、日々のサンプリングや分析業務に懸念が生じる。そのため、当社では、サンプリング
不要な分析技術の開発に取り組んできたが、その手法は、光透過によるスペクトル解析である。培養液中に、特定の波長の光を透過することで得られる、膨大な量のスペクトルデータを、多変量解析により、特定の成分の濃度を算出する手法で、情報技術の発展の恩恵である。
半導体技術、また、情報技術の革新的な発展が、培養装置を進化させてきたが、本稿にて、その一端を紹介した。現在、様々な分野の革新的な技術を培養装置に取り込んでいるが、これは、40 年前に当社で DO センサーを開発し、また、
20 年前に、パソコンによる集中管理システムが普及した時代に類似する。未来(2050 年)、現在の革新的な技術が成熟し、培養装置の一般的な機能になったと
き、新たな革新的な技術が生まれ、そして、培養装置は、さらに進化するものと考える。

Our research interests are in the broad areas of enzyme catalysis, enzyme engineering,systems biocatalysis, metabolic engineering and synthetic biology. In this talk, I will
highlight our recent work which leads to applications in biocatalysis, detection
detection and circular economy. The first system is mechanistic investigation andrational-engineering of a flavin-dependent halogenase which is valuable for catalyzing
halogenation under green conditions. The second system is development of an
enzymatic cascade and engineering of a flavin-dependent monooxygenase, HadA,
which catalyzes the dehalogenation and denitration of the toxicants, nitro- andhalogenated phenols, to benzoquinone. The HadA reaction was applied in one-pot
reactions towards the de novo synthesis of D-luciferin. Currently, this technology
allows us to develop a new method for synthesizing various D-luciferin analogues. As
nitro- and halogenated phenols are key indicators of human overexposure to pesticides
commonly used worldwide and indicators of pesticide contamination, the technology
provides a sensitive and convenient tool for improved biomedical and environmental
detection at ppb sensitivity in biological samples without the requirement for any pretreatment. The last system is a showcase of our work in metabolic engineering where
we have developed cofactor and energy boosting systems to support whole cellbiocatalysts to convert low value organic feedstocks into valuable compounds.

Design of the future (2050) fermentation system

Engineering of halogenase and dehalogenase for sustainable technology○Shutaro Ishikawa(ABLE)

Key words

fermentor, sensor, scale-up○Pimchai Chaiyen(Vidyasirimedhi Institute of Science and Technology (VISTEC))

Key words

enzyme, biodegradation, metabolic engineering, enzymatic conversion

146

2S-Ba02

Engineering RNA-based switches for gene expression
control

2S-Ba03

Efficient design and construction of genetic parts andcircuits○Jeong Wook Lee(Dept. Chem. Eng., POSTECH)
jeongwook@postech.ac.kr○Keisuke Fukunaga(ELSI, Tokyo Tech)keisuke.fukunaga@elsi.jp

Synthetic riboswitches that can regulate gene expression by a small molecule
recognized by an RNA aptamer in mammalian cells have various potential applications
in biotechnology and medicine. However, the variety of small molecules and theircognate aptamers that have been demonstrated to function in mammalian cells is
limited. The currently available aptamer-ligand pairs also require high small molecule
concentrations to enable gene regulation, making them less desirable for industrial andbiomedical applications. We conducted in vitro selection of RNA aptamers against asmall molecule ASP7967 whose structure is closely related to ASP2905, a known
inhibitor of potassium voltage-gated channel sub-family H member 3 (KCNH3). Oneof the aptamers selected (AC17–4) was found to be functional in HEK293 cells, and it
was used to design aptazyme-based riboswitches that can activate gene expression(>10-fold) in the presence of ASP2905 or ASP7967 at as low as 5 μM in the culture
medium. An aptazyme-based riboswitch was successfully used to regulate humanerythropoietin expression in mice injected with an adeno-associated virus (AAV8)
vector using orally administered ASP7967. Furthermore, by combining aptazymebased and exon-skipping riboswitch mechanisms, an ON/OFF ratio approaching 300
was achieved with a low basal expression level in cultured cells.

Synthetic gene circuits possess a wide range of applications spanning industries,
environmental settings, and clinical scenarios. The diverse utility of these circuits
necessitates the development of an efficient approach for designing and constructing
genetic parts, modules, and circuits that are potentially applicable even to non-modelorganisms. This talk presents efficient ways of designing and building genetic partsand circuits. To design genetic circuits, we initially created various genetic logic gate
modules based on transcription factors (TFs) and dCas9. Through evaluation of thesemodules, we developed mathematical models for each genetic module that elucidate
and predict the behavior of TF/dCas9-based logic modules. Our ongoing work involves
the development of a circuit design automation tool capable of automaticallygenerating nucleotide sequences encoding genetic circuits to perform user-designed
logic operations in various microbial hosts. In the second part, the focus shifts to
expanding the applicability of genetic circuits to non-model organisms. We havedeveloped a systematic framework for acquiring genetic parts, specifically promoters,in cyanobacteria. Leveraging the cell-free transcription system with CRISPR/Cas12a,
we successfully characterized cyanobacterial promoters and evaluated their strengths
in a high-throughput manner. To generate synthetic promoters, we incorporated
machine learning technologies. Utilizing dRNA-seq data of cyanobacteria, we createda Variational Autoencoder (VAE) model to generate synthetic promoters that embody
features of native cyanobacterial promoters. Additionally, we developed a
Convolutional Neural Network (CNN) model to estimate promoter strength. Finally,
we validated the utility of our VAE and CNN models for generating and estimating
synthetic promoters using the cell-free-based methodology. By presenting theseadvancements, this talk aims to discuss efficient ways to design and construct genetic
parts and circuits for their future practical implications across diverse fields.

Engineering RNA-based switches for gene expression control

Efficient design and construction of genetic parts and circuits○Keisuke Fukunaga(ELSI, Tokyo Tech)

Key words

aptamer, riboswitch, mammalian cell

○Jeong Wook Lee(Dept. Chem. Eng., POSTECH)

Key words

genetic circuit, genetic part, genetic module, circuit design

147

2S-Ba04

Development of energy harvesting devices by architect ofbio- and macromolecules

2S-Ba05

Engineering a Cell-free Platform for robust expression
and functioning of membrane proteins in Artificial Cell
○Kwanwoo Shin(Sogang University, Seoul , Korea)
kwshin@sogang.ac.kr○Madoka Takai(Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)
takai@bis.t.u-tokyo.ac.jp

Enzymatic biofuel cells (EBFCs) are generators that use enzymes to catalyze
electrochemical reactions, and fuels are glucose and oxygen in case therefore it calls
energy harvesting device.
The EBFCs consist of a biocathode and biocathode which enzymes catalyze theoxidation of fuel such as glucose, and the reduction of oxidizer such as oxygen.
Therefore, the EBFCs can generate power in the water with presence of fuel andoxygen. Considering in vivo environment, biological fluid, such as blood, and sweat
contains glucose and oxygen, the EBFCs can be worked in our body, and it would be a
powerful tool as implantable battery to operate implantable electronics devices, infuture.
The power of EBFCs depends on catalytic efficiency of enzyme, and biofouling, so inthis study we have been developed EBFCs with the functions to reduce the biofoulingand to keep the enzymatic activity by use of biocompatible polymer hydrogel.
As for the biocompatible polymer, we developed polymer with two functional units inthe side chain, one is phosphorylcholine group and the other is active ester group. The
phosphorylcholine group is same chemical structure of cell membrane, which shows
the function to reduce protein adsorption and cell adhesion. Moreover, protein in
nearby the phosphorylcholine group keeps its activity for long term. The developed
polymer can spontaneously form hydrogel, and we can modify enzyme and electron
mediator to the active ester group in the polymer hydrogel.
The glucose oxidase(GOD) loaded hydrogels with the amino-ferrocene(Fc) on carbon
electrode showed good enzymatic oxidation reaction by measurement of cyclic
voltammetry. The GOD/Fc/hydrogel acted as bioanode of fuel cell and generated thepower. The operating stability obtained around 10 days, furthermore the bioanode kept
the good performance under the protein rich condition in vitro. Therefore, ourdeveloped biocompatible polymer hydrogel shows the possibility for applying an
implantable battery in vivo.

The bottom-up assembly of synthetic cell systems is a promising approach tounderstanding living organisms. One important objective in synthetic biology is thecreation of artificial cells capable of replicating biological functions. These cells are
typically generated under non-equilibrium conditions, posing a challenge for theirmaintenance. The development of controllable, self-regenerating artificial cells
represents a crucial advancement in this field.
In our research, we focused on generating giant unilamellar vesicles (GUVs) as
artificial cell membranes. These GUVs served as containers for various essential
biomolecules required for the synthesis of target proteins, including green fluorescence
protein (GFP) and membrane proteins with energy harvesting and signal transduction
functions. Our self-regenerating cells initiate the replication of DNA, which is thentransferred to a location where protein synthesis takes place. Subsequently, functionaland essential proteins are synthesized to sustain energy generation and ensure survival,
functioning within the same liposomal space.
We have identified a series of experimental steps that enable the autonomous
maintenance of protein expression and the transportation of synthesized proteins tofunction in the plasma membrane. Although the journey towards creating reproductive
artificial cells is still long and the current state is characterized by fragmented
biochemical mimics, our research demonstrates promising results from a technicalperspective.

Development of energy harvesting devices by architect of bio- andmacromolecules

Engineering a Cell-free Platform for robust expression and functioning of
membrane proteins in Artificial Cell

○Madoka Takai(Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)

Key words

enzyme, biofuel cell, macromolecules, catalytic efficiency○Kwanwoo Shin(Sogang University, Seoul , Korea)

Key words

membrane lipids, lipid vesicle, protein expression

148

2S-Bp01

はじめに～未知の情報を得るバイオ分子ツールについて～

2S-Bp02

光るタンパク質と抗体の融合が拓く生細胞イメージングの世界○北口 哲也（東工大・化学生命研）
kitaguct-gfp@umin.ac.jp○山口 哲志（東大院・工）yamaguchi@chembio.t.u-tokyo.ac.jp

データサイエンスの発展に伴い、生命システムに関わる膨大な情報が、医療や産業に利活用され始めている。このような潮流において、重要な生命現象や疾病に関わるこれまでに獲得できなかった情報を得る新しい技術がますます重要となっている。そこで、本シンポジウムでは、未知の生命情報を獲得するためのバイオ分子ツールを設計・創出して、分子や細胞を時間的・空間的に制御し、選択的に可視化する技術について、最新の研究成果と今後の展望について議論する。
本発表では、例をあげて、本シンポジウムの主旨説明を行う。具体的には、我々が開発してきた光応答性の細胞付着剤を用いて、細胞を基板上に 1 細胞レベルの精度で光配置し、これまで観察できなかった表現型を可視化した研究について紹介する。我々はこれまでにポリエチレングリコール（PEG）脂質を基本骨格とした光分解性細胞付着剤[1]や光活性化型細胞付着剤[2]を開発し、浮遊性の免疫細胞を光配置して、その形状変化[3]や受容体の局在変化[4]、免疫細胞とがん細胞との相互作用を定量解析してきた[2,5]。特に、細胞間相互作用に関しては、網羅的な 1 細胞観察データから、機械学習を用いて異なるメカニズムの相互作用を自動分類することにも成功している[2]。このように、細胞を操作する
分子ツールは、未踏未知の表現型を可視化でき、データサイエンスと上手に協働することで新しい生命工学を開拓することが期待される。
Reference: [1] Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 128-131; [2] J. Am. Chem. Soc. 2022,
144, 13154-13162; [3] Macromol. Biosci. 2014, 14, 1670-1676; [4] Lab on a Chip
2017, 31, 1933-1938; [5] J. Am. Chem. Soc. 2022, 144, 17980-17988.

「細胞の中のいろんなものを見てみたい」を実現する蛍光タンパク質を基盤としたセンサーは、光学顕微鏡を用いた生細胞イメージングに広く利用されている。
細胞内における、タンパク質の時空間情報の獲得にとどまらず、シグナル分子の濃度変化やタンパク質の活性化状態などのダイナミックな生理機能が可視化できるようになっている。したがって、今や蛍光タンパク質センサーは、細胞生理機能を担う分子間の協調性や階層性を解析するための必要不可欠なツールとなっている。
我々は、標的分子をリガンドとする結合タンパク質と蛍光タンパク質とをつなげる位置関係を半合理的にデザインし、分子進化の手法を組み合わせることで、
蛍光タンパク質センサーを開発してきた。これまで、cAMP、cGMP、ATP をはじめとするさまざまなセンサー開発に成功してきたが、標的分子に対する結合タンパク質が未知であるときや、そもそも存在しないときは、センサーを作ることができないとうデメリットがあった。そこで、高い特異性と結合能を持つようなセンサーを自分で設計し、自由自在に開発できないだろうかと考えて思いついたのが抗体の抗原認識反応を応用することであった。本発表では、これらの目的に応じて自由自在に蛍光タンパク質センサーを構築するユニークな手法について紹介したい。

Introduction: biomolecular tools for obtaining unclarified biologicalinformation

Florescent proteins and antibodies open the door to live cell imaging○Satoshi Yamaguchi(Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)

Key words

cell immobilization, chemical modification, cell-cell interactions○Tetsuya Kitaguchi(CLS, Tokyo Tech)

Key words

GFP, antibody, biosensor, protein engineering

149

2S-Bp03

細胞運命を操作する人工受容体の設計○河原 正浩（医薬基盤・健康・栄養研究所）
m-kawahara@nibiohn.go.jp

2S-Bp04

生命活動と連動して機能する人工バイオ分子の創出○神谷 典穂 1,2（1 九大院・工, 2 九大・未来化セ）kamiya.noriho.367@m.kyushu-u.ac.jp

細胞内の様々な事象に対する理解が進み、目的に適う細胞プロセスを実現するための合成生物学が進展してきている。その究極のゴールは機能性細胞（デザ
イナー細胞）の創製と制御であり、その実現を目指した研究開発が盛んに行われている。実際に、がん治療効果の高い CAR-T 細胞が臨床応用される時代とな
り、デザイナー細胞を自在に創り込んで治療に供する、という新たな遺伝子細胞治療モダリティーが躍進してきている。その治療効果を高めるためには、シグナル伝達制御を基盤として、デザイナー細胞の運命を自由自在に制御する系の構築が重要である。
演者らは、シグナル伝達系の指揮者に相当する受容体蛋白質に注目し、そのリガンド受容能やシグナル伝達特性を改変した人工受容体を設計してきた。リガ
ンド受容能の改変に関しては、細胞の基本運命ともいえる増殖・分化・遊走・死を制御するサイトカイン受容体を選び、細胞外リガンド認識部位を抗体可変領域に置換した人工受容体を設計した。この人工受容体を発現させた細胞では、用いたサイトカイン受容体のシグナル伝達特性に応じて、特異的抗原の添加により増殖・分化・遊走・死を制御できた。また、複数の抗原・人工受容体ペアを用いて、増殖→死[1]、増殖→分化[2]といった運命変換を経時的に制御できた。シグナル伝達特性の改変に関しては、特定のシグナル伝達分子をリクルー
ト可能なモチーフ配列を細胞内ドメインに連結した人工受容体を設計した。この人工受容体を発現させた細胞では、人工リガンドや光刺激によって単独あるいは複数の標的シグナル伝達分子をアラカルトに活性化できた[3]。そこで、造血幹細胞の増殖に関わる複数のシグナル伝達分子を活性化する人工受容体を作製したところ、天然型受容体をも凌ぐレベルで造血幹細胞の増殖を誘導できた[4]。このように、人工受容体は細胞運命を操作可能なバイオ分子ツールとして有用であり、幅広い疾患に対する効果的な細胞治療への応用が期待される。
参考文献[1] Biotechnol. J. 17, 2100463 (2022).
[2] PLOS ONE 17, e0279409 (2022).
[3] Commun. Biol. 4, 752 (2021).
[4] ACS Synth. Biol. 7, 1709-1714 (2018).

生体系を構成する分子群のなかでも、タンパク質は生命活動のあらゆる面に寄与する究極の生体分子でありながら、遺伝子工学的手法により一義的にそのアミノ酸配列を規定可能なことから、人為的にその機能改変が可能な稀有な分子とも捉えられる。生化学（科学）と工学を繋ぐ鍵技術の１つとして生まれたタ
ンパク質工学は、現在、機械学習を基盤とする計算科学的手法の革新により、さらなる進展の只中にある。遺伝子組換え技術は、単量体タンパク質そのものの機能改変・向上に役立つだけではなく、複数のタンパク質ユニット（ドメイン）からなる人工タンパク質の設計にも有効である[1]。即ち、タンパク質 A(PA) とタンパク質 B (PB) を組み合わせ、単純な足し合わせ以上の機能が生まれることを期待するものである。一方、タンパク質とは異なる生体由来分子の連結により、新たな機能を有するハイブリッド型タンパク質 (Bioconjugate) も得られる。生体系においては、脂質や糖鎖修飾といったタンパク質の翻訳後修飾が、その最たるところであろう。
当 研 究 グ ル ー プ で は 、 微 生 物 由 来 ト ラ ン ス グ ル タ ミ ナ ー ゼ (Microbial
transglutaminase, MTG) が触媒するタンパク質（ペプチド基質）間架橋反応を活用したハイブリッド型人工タンパク質の創製に長らく取り組んできた [2]。例えば、PA として single-chain Fv (scFv)を、PB として大腸菌由来アルカリホスファ
ターゼ (BAP) を選択し、それぞれの末端に導入した MTG 架橋用ペプチドタグ
を介して、scFv-BAP 融合タンパク質を得ることができる[3]。同様の発想で、核酸 (DNA, RNA) と酵素からなるハイブリッド分子の調製も可能である[4,5]。
これらのハイブリッド型タンパク質は、固相免疫測定法における抗原検出用分子ツール、in situ ハイブリダイゼーションにおける核酸プローブ分子としてそれぞれ利用することができるが、生命システムの動的な性質に働きかけるものではなかった。そこで、タンパク質の翻訳後修飾の一つである脂質修飾に注目し、これを模した人工脂質修飾タンパク質を設計した [6]。人工パルミトイル化
タンパク質と人工二分子膜・生細胞を用いた検討からは、パルミトイル基の付加が、脂質膜上の相分離ドメイン（ラフト）への局在を通した内在化に寄与することが明らかとなった [7]。また、抗真菌活性を示すキチナーゼを用いた検討
では、キチン結合ドメインへの脂質修飾が抗真菌活性を顕著に増強することが確認され、真菌の生育に摂動を与える分子設計の可能性が示された [8]。最近、MTG 前駆体と抗体結合ドメイン（protein G）からなる融合タンパク質が、protein
G 部位を介した近接効果により、IgG 抗体表面の特定の Lys 残基のみをラベル可能なことを見出した。今後、薬物を含む様々な人工基質が部位特異的に修飾された IgG 抗体の設計が容易になり、バイオ分子ツールの選択の幅の拡大に繋がることが期待される。
最後に、筆者は九州大学で学位を取得後、東京大学化学生命工学専攻長棟研究室にて研鑽を積ませて頂いた [9]。当時、故上田宏先生はご自身が開発された新規免疫測定法であるオープンサンドイッチ法 [10] を精力的に研究されており、異分子融合タンパク質を用いたバイオ分析の進展を肌で感じる機会に恵まれた。
幾つかの共著論文とラボでの研究活動を通して、タンパク質工学の面白さをご教示頂いた上田先生に心より感謝致します。
【参考文献】[1] Yu K, et al., Biotechnol. Adv., 33, 155-164 (2015)[2] Kamiya N, et al., Bioconj. Chem., 14, 351-357 (2003)[3] Takazawa T, et al., Biotechnol. Bioeng., 86, 399-404 (2004)[4] Tominaga J. et al., Chem. Commun., 401-403 (2007)[5] Kitaoka M, et al., Anal. Chem., 84, 5885-5891 (2012)[6] Takahara M, et al., Chem. Eur. J., 25: 7315-7321 (2020)[7] Uchida K, et al., Langmuir, 38: 9640-9648 (2022)[8] Santoso P, et al., ACS Infec. Dis., 8, 1051-1061 (2022)[9] 神谷典穂, 生物工学, 78, 108 (2000)[10] Ueda H, et al., Nature Biotechnol., 14, 1714-1718 (1996)【謝辞】
本研究は、JSPS 科研費 JP19H00841, JP23H00247 ならびに AMED 課題番号
JP21ae0121004 の支援を受けたものです。共同研究者の皆様に、深く感謝申し上げます。

Designing artificial receptors to manipulate cell fates

Creation of artificial biomolecules that function in biological systems○Masahiro Kawahara(NIBIOHN)

Key words

receptor, signal transduction, chimeric protein, cell fate control○Noriho Kamiya1,2(1 Grad. Sch. Eng., Kyushu Univ., 2 CFC, Kyushu Univ.)

Key words

enzyme reaction, antibody, antifungal, lipid

150

2S-Bp05

機能性タンパク質を創出する分子設計○新井 亮一 1,2（1 信州大・繊維, 2 バイオメディカル研）
rarai@shinshu-u.ac.jp

2S-Bp06嗅覚受容体の機能的発現と匂いセンサーへの利用○養王田 正文, 高山 郁美, 福谷 洋介, 吉井 智哉, 生田 昂,
前橋 兼三（農工大院・工）yohda@cc.tuat.ac.jp

近年、未知の生命情報を獲得するためのバイオ分子ツールを設計・創出し、応用を目指す研究が発展し、人工タンパク質や複合体の設計開発も、ますます重要になってきている。私達は、融合タンパク質の設計構築によるバイオ分子ツールの開発に長年に渡って取り組んできた。例えば、古くは、抗体可変領域 VHと蛍光タンパク質変異体 BFP および抗体可変領域 VL と蛍光タンパク質 GFP との融合タンパク質をそれぞれ構築し，抗原濃度依存的な複合体形成を蛍光共鳴
エネルギー移動(FRET)により検出することにより，洗浄操作不要で簡便迅速なオープンサンドイッチ免疫測定法を開発した。また近年は、新規人工タンパク質 WA20 の特徴的 2 量体構造を活かしたタンパク質ナノブロックを設計開発
し、多様な超分子ナノ構造複合体を創出してきた。例えば、WA20 と T4 ファージの 3 量体 foldon ドメインとを融合した WA20-foldon を構築し、樽型 6 量体、
正四面体型 12 量体等の 6 の倍数量体のナノ構造超分子複合体を創製した。また、WA20 を 2 個タンデム(直列)に融合したタンパク質ナノブロックも開発し、環鎖状構造や直鎖状構造の形成にも成功した。さらに最近、糖鎖結合タンパク
質レクチンを用いたナノブロックの開発に取り組み、野生型よりも多価のレクチン複合体を創出することで結合力の向上を目指した。2 量体人工タンパク質
WA20 とヤナギマツタケ由来 2 量体レクチン ACG を融合したレクチンナノブ
ロック WA20-ACG を開発した。大腸菌で発現した WA20-ACG を精製し、会合状態を解析した結果、2 の倍数量体の様々な複合体の形成を確認し、会合数の大きい複合体ほど結合力が向上することが示された。また、タグ結合システム
を用いて、タンパク質ナノブロック複合体形成後に機能ドメインを付加する試みなども紹介したい。

Olfaction is mediated via olfactory receptors (ORs) that are situated on the cilia
membrane of olfactory sensory neurons (OSNs) in the olfactory epithelium. ORs are atype of G-protein-coupled receptor (GPCR) and constitute the largest family of thesereceptors. Each mature OSN expresses only one OR in accordance with the “one cell–
one receptor” rule. Different from ordinary GPCRs, one OR responds to multiple odor
molecules, and one odor molecule activates multiple ORs, allowing for thediscrimination of an unlimited number of odorants. Many ORs are structurally unstableand fail to be transported into the plasma membrane and instead remain in theendoplasmic reticulum when expressed in non-olfactory cells. Receptor-transporting
proteins (RTPs), such as RTP1S and RTP2, act as chaperones and mediate the transportof ORs to the plasma membrane of OSNs. The structural instability and divergencefrom conserved residues of individual ORs underlie intracellular retention. ORs thatare designed based on consensus amino acids for each site (consensus ORs) were
found to be efficiently trafficked to the cell surface. We have succeeded in thefunctional expression of a consensus OR using cell-free protein expression system. By
immobilizing the in vitro expressed OR on the graphene field effect transistor, we
could observe the ligand response of OR. In this presentation, I will talk about the
recent results of our studies on the function of ORs and the development of odorantsensors.

Molecular design and construction of functional proteins and complexes

Functional expression of olfactory receptors and their application for thedevelopment of odorant sensors○Ryoichi Arai1,2(1 Fac. Textile Sci. Technol., Shinshu Univ., 2 Inst. Biomed. Sci., Shinshu Univ.)

Key words

artificial protein, fusion protein, quenchbody, lectin○Masafumi Yohda, Ikumi Takayama, Yosuke Fukutani, Tomoya Yoshii,
Takashi Ikuta, Kenzo Maehashi(Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words

sensor, odorant response, cell free expression, receptor

151

2S-Ea01

薬剤に対する感受性を指標としたビール酵母の性質の解析

2S-Ea02○野田 陽一（東大院・農生科）
anoday@g.ecc.u-tokyo.ac.jp

醸造特性に寄与する下面発酵酵母のゲノム構造変化○高橋 朋子（アサヒクオリティーアンドイノベーションズ）
tomoko.takahashi@asahi-qi.co.jp

酵母を含む真菌類は日本の伝統的産業の一つである発酵産業に欠かせない真核微生物である．特にアルコールを含む飲料の消費の歴史は古く，紀元前数千年前にまで遡ることができる．アルコール発酵における酵母の役割が明確に認識されたのはかなり後，すなわち Luis Pasteur による一連の素晴らしい実験によりアルコール発酵が酵母によることが示された 1860 年代である．現在ラガータイ
プのビールの発酵に用いられる出芽酵母である Saccharomyces pastorianus は，
Saccharomyces cerevisiae と Saccharomyces eubayanus から形成されたハイブリッ
ドをその起源とすると考えられており，染色体は 4n を基本とした allopolyploid（異質倍数体）であり，そこから染色体の構造変化を経て派生した aneuploid（異数体）である．異種の交雑から生まれた S. pastorianus のプロトタイプは，さらにその後の醸造環境からの影響，進化，選抜の過程を経て，現在の S. pastorianusに至ったと考えられている．
S. pastorianus を よ り 良 く 理 解 す る た め に は ハ イ ブ リ ッ ド の 起 源 と な る S.
cerevisiae と S. eubayanus のそれぞれの性質を知ることが重要である．S. cerevisiaeに関してはその研究の歴史が長くすでに多くの知見が蓄積されているが，S.
eubayanus は近年発見された株であり低温での高い増殖能以外にはその性質について未知な点が多い．我々はこれら三種の酵母の様々な化合物への感受性の差異を指標として，S. eubayanus の未知の性質を見出しその基盤を解明すること，またそれらが S. pastorianus の持つ性質に，どのような理由でどのように反映されているかを明らかにすることを目的とした研究を開始した．
S. cerevisiae，S. eubayanus，S. pastorianus の性質の違いを探索するにあたり，倍数性の違いによる影響も考慮に入れて解析するために以下の株を作製した．S.
cerevisiae と S. eubayanus の各々について auto の三倍体と四倍体を作製した．
また S. pastorianus の進化的に初期の状態に近いと考えられるモデル株として S.
cerevisiae と S. eubayanus の三倍体と四倍体のハイブリッド株作製した． allo のハイブリッド株の三倍体は S. cerevisiae の 二倍体と S. eubayanus の一倍体から作製した株と S. cerevisiae の一倍体と S. eubayanus の二倍体から作製した株の二種類を用意した．これら七種の菌株と S. cerevisiae の二倍体株である BY4743，
S. eubayanus の二倍体株である CBS12357，S. pastorianus の W34/70 に由来する
二株，計 11 種類の株の化合物への感受性を，濃度の異なる各化合物存在下での生育速度を指標として調べた．化合物としては，蛋白質合成阻害，脂質合成性阻害作用など既知の作用機序，標的を持つ様々な化合物を選択した．
実験の結果，調べた株の間で異なった感受性を示すいくつかの化合物が見出された．一部の化合物に対する感受性の差異の原因の解析結果に関しても発表する．

下面発酵酵母である Saccharomyces pastorianus は、発酵後期に酵母がタンク底へ沈むという特徴を有する酵母で、世界のビール生産の大部分を占めるラガー
ビールの製造に使用されている。S. pastorianus は Saccharomyces cerevisiae とSaccharomyces eubayanus の両方の染色体を有する異質倍数性酵母であることが明らかとなっており、S. cerevisiae と S. eubayanus の自然交配がその起源と考えられている。自然交配後、ビール醸造環境での馴化や選択を経てその染色体は様々に変化し、現在の S. pastorianus は異数性であることが知られている。
ビール製造において、発酵は重要な工程である。発酵中、酵母は麦汁からエタ
ノールや香気成分、その他多くの化合物を生成する。こうした生成物はビールの味を決める重要な要素であるが、これらの生成物の量や組成は酵母の種類や酵母の状態に影響を受けるため、酵母はビールの品質を特徴づける重要な役割を担っている。一方で、下面発酵ビールの製造においては、S. pastorianus の酵
母がタンク底へ沈む性質を活用し、沈降した酵母をタンク底から回収し、次の発酵へ繰り返し使用することで効率的な製造を実現している。こうした下面発
酵酵母特有のハンドリングに加え、上述した S. pastorianus の異質倍数性や異数性といった複雑な染色体構造であることが要因となり、下面発酵酵母の醸造特性に変化が生じることがある。安定して高品質なビールを製造するためには、
醸造特性変化の発生を抑える酵母のハンドリング技術や醸造特性の変化した酵
母の早期検出が重要である。
これまで、アサヒグループでは安定的な発酵管理を目指して、酵母ハンドリン
グ技術や醸造特性の変化した酵母の早期検出技術の開発に取り組んできた。本
シンポジウムでは、ビール製造に使用した下面発酵酵母の解析から、ゲノム構
造変化と醸造特性との関連性を見出し、検出方法を構築した取り組みについて報告する。
また、現在、東京大学の社会連携研究部門と S. pastorianus のゲノム不安定性や
S. pastorianus の起源である S. eubayanus の未知の特性を明らかにする研究に取り組んでいる。その中から、S. pastorianus の持つ異質倍数性に由来するゲノム
不安定性を明らかにすることを目的に、S. cerevisiae に S. eubayanus の 16 本の各染色体を移行した interspecific disomy 株を用いた研究について、一部のinterspecific disomy 株において移行した S. eubayanus の染色体の安定性、および移行した S. eubayanus 染色体上のセントロメア領域が S. cerevisiae で機能するかを検討した内容を紹介する。

Analysis of the beer fermenting yeasts using low molecular weightcompounds

Chromosomal changes of bottom-fermenting yeast contribution to brewing
characteristics○Yoichi Noda
(Grad. Sch. Agric. Life Sci., Univ. Tokyo)

Key words

genome, Saccharomyces cerevisiae, stress response○Tomoko Takahashi(Asahi Quality & Innovations, Ltd.)Key words
aneuploidy

Saccharomyces pastorianus, chromosomal change, allopolyploidy,

152

2S-Ea03

網羅的解析技術の活用による下面発酵酵母の醸造特性の解析

2S-Ea04○善本 裕之（キリンホールディングス）hyoshimoto@kirin.co.jp

下面ビール酵母の凝集性遺伝子の不安定性に関する研究○佐藤 雅英 1,2（1 サッポロビール, 2 価値創造フロンティア研究所）
masahide.sato@sapporobeer.co.jp

ビールは、麦芽とホップを主な原料として酵母の働きにより造られる。自然の力を最大限引き出すことで美味しい(必要な予定期間内にビール類を製造し、香味上の品質を安定化し、消費者への高品質かつ多様で、継続的に美味しいビー
ルは生まれるが、その美味しさは発酵工程で主役となる酵母の活躍で決まる。
酵母は、仕込工程で製造された麦汁を栄養源として発酵工程で糖を分解してアルコールと二酸化炭素を造ると共に、ビールにとって大切な香味成分も造り出す。しかしながら、発酵中の酵母の挙動は大部分がブラックボックスである。
ビール類(ビール、発泡酒、新ジャンル)を消費者へ安定供給するためには、酵母の生理状態を良い状態へ保ち、発酵が健全に行われるために発酵遅延やオフ
フレーバー等の課題が発生しないことが重要である。原料となる麦芽やホップは農作物であり、気候変動等の影響を受けるために、それらより造られる麦汁
中の必要な栄養源が必ずしも一定になるわけではない。一方、様々な特徴や機能性を持つ発泡酒や新ジャンルの商品が開発され、麦芽の低使用比率、或いは麦芽以外の原材料を用いられるようになってきた。その結果、発酵遅延やオフ
フレーバー等の課題が発生し、予定期間内にビール類を製造できず、香味上の品質が低下し、消費者へ高品質なビール類を安定供給できなくなるリスクが発生する場合がある。一方、ビール酵母の一つである下面発酵酵母(Saccharomyces
pastorianus)は、S. cerevisiae と S. eubayanus との異質倍数体であり、複雑な染色体構成を持つ。その品質管理は、従来の方法だけでは不十分であったため、新しい品質管理・発酵制御技術の開発のためには、下面発酵酵母の解析技術の開発が強く望まれていた。大学との連携により、下面発酵酵母の解析技術の開発を推し進め、研究進捗の加速を図ることができた。
（１）下面発酵酵母の解析技術の開発
上面発酵酵母に関する解析においては S. cerevisiae の解析技術が応用できたものの、より複雑なゲノム構造を持つ下面発酵酵母に関しては従来の解析技術だ
けでは不十分であった。科学技術の進展に伴い、上面発酵酵母については遺伝
子、遺伝子発現、蛋白質、代謝物、及び表現型のレベルで網羅的に解析できるようになってきたものの、下面発酵酵母は雑種であり、これらの既存解析技術
だけでは、課題における真の原因を導き出すことが困難であった。そこで、下面発酵酵母は上面発酵酵母と 80％程度の相同性を持つ 2 種類の遺伝子を持っていることを踏まえ、遺伝子レベルの解析を行い、S. cerevisiae 由来と S. eubayanus
由来の 2 種類遺伝子を識別できる解析手法を開発した。遺伝子レベルの解析に続き、遺伝子発現・蛋白質・代謝物・表現型のレベルで網羅的に解析を行う下面発酵酵母への技術を開発・改良した。これによりビール類の発酵中に発生する各種課題の仮説を立てて、解決へ向けての原因を推定することに役立てることができるようになり、酵母由来の各種課題に対する原因究明、酵母配布業務、酵母の生理状態把握等を行い、品質管理技術として確立した。
（２）発酵制御法への展開
開発した下面発酵酵母の解析技術を用いて、発酵遅延やオフフレーバー等の課
題の原因を探り、その課題の原理原則を明らかにしつつ、課題解決のための発酵制御技術の開発を行った。課題の発生した酵母を、遺伝子・遺伝子発現・蛋
白質・代謝物・表現型レベルそれぞれの網羅的解析技術で解析し、酵母の生理状態を定量的、かつ総合的に表すことで、課題発生の原因を成分とその定量値で表すことができるようになった。そのデータを用いて検討し、発酵制御法の開発に繋げることができた。従来の技術で明らかにしてきたエステル制御に加えて、硫化水素・亜硫酸制御、糖類と糖類以外の栄養源バランス制御、ビタミ
ン・ミネラル添加法、流加培養における馴化法(呼吸から発酵への制御)等の原理原則を明らかにしつつ、発酵制御技術を開発した。
これらの取り組みにより、酵母の品質管理技術として活用すると共に、発酵中に発生する酵母の課題に関連する原理原則を解明した。発酵制御法を開発しつ
つ、下面発酵酵母の醸造特性を明らかにしてきた。その結果、必要な予定期間
内にビール類を製造し、香味上の品質を安定化し、消費者への高品質かつ多様で、継続的に美味しいビール類の安定供給へ繋げることができた。

【序論】微生物の凝集現象は 100 年以上も前から知られており、酵母においては1876 年にパスツールによりビール酵母で最初に報告されている。現在、世界的に主流のビール醸造（下面発酵）では、この酵母の凝集形質が上手く工程に利用されている。ビール醸造は、主発酵と後発酵からなり、大半の酵母は主発酵終了後に発酵タンクの底部から効率的に回収され、次の発酵に使用するという工程が数回繰り返される。この際、酵母の凝集性が弱過ぎると、効率のよい酵
母の回収ができず、次の発酵に十分な量の酵母が集まらないことになる。また、
後発酵への過剰な酵母の持ち込みは、酵母の自己消化に伴うビールの香味や泡持ち等ビール品質へ悪影響を与える場合もある。従って、理想的な発酵を行なうためには、ビール酵母に主発酵後期の適度な凝集性が要求される。このように、凝集性はビール酵母の基本的でかつ重要な性質であるにもかかわらず、実際の醸造現場において、昔から凝集性は変異し易い性質の一つであることが経験的に知られており、完全に制御されていない面もあった。Saccharomyces
cerevisiae における凝集性遺伝子の存在は、1970 年代末に漸くわかり、その後発展した分子生物学的手法によって凝集性遺伝子 FLO1 が 1980 年代末に
Watari ら 1)によってクローン化された。この遺伝子は、第 I 染色体上に存在し、ORF が 4611 bp であり、その塩基配列から 1537 個のアミノ酸からなる蛋白質をコードしていると推測された。一方、下面ビール酵母 S. pastorianus は、その高次倍数性、異数性、元々遺伝的には S. cerevisiae と S. eubayanus とのハイブリットである、胞子形成は困難でまたほとんど発芽しない等、従来の遺伝学的解析はほとんど不可能であった。しかし、先に解析が行われた FLO1 遺伝子の研究成果が契機になり、その塩基配列を利用して Kobayashi ら 2)によって下面ビー
ル酵母から凝集性遺伝子がクローン化された。中間の繰り返し領域は、FLO1と同様に大腸菌に形質転換した際に不安定であったため完全に塩基配列を決定することは難しかったようである。繰り返し領域を除いた N 末端領域と C 末端領域の塩基配列の決定が行われている。下面ビール酵母は、別名 Lager 酵母とも呼ばれることから、下面ビール酵母の凝集性遺伝子は、Lg-FLO1 遺伝子と命名された。その塩基配列は、FLO1 の配列と部分的に異なり、特に、マンノー
ス結合部位に関与していると推定される N 末端部位が異なるため、両レクチン様蛋白質の認識する糖は異なる。このように長年の疑問であった下面ビール酵
母の凝集性について分子遺伝学的な解析が可能になり、凝集性の実体にかなり迫ることができた。ところが、ビール醸造現場において比較的頻度高く起こる
凝集性弱化現象については、まだ解決すべき課題として残されていた。
【方法、結果】96 穴のマイクロプレートを用いて、酵母集団中の凝集性株と非凝集性株を目視で判定した結果と Helm’s 法による凝集性評価、実際の発酵における酵母の沈降性などを比較・調査した。その結果、下面ビール酵母の凝集性の弱化現象が、酵母細胞集団中における、凝集性株に対する非凝集性株の比率が増加することによって起こることを突き止め、下面ビール酵母の凝集性弱化
モデルを提案した。さらに、FLO1 遺伝子の配列を基にして、サザン及びノーザン解析を行った結果、非凝集性株においては、染色体上で下面ビール酵母の凝集性遺伝子 Lg-FLO1 の C 末端部位が検出されなかった。その後の下面ビール
酵母の凝集性遺伝子の調査の過程において、Lg-FLO1 遺伝子の N 末端部分と同様の塩基配列を有するが C 末端部分が異なる新たな遺伝子を見出した。本遺伝
子の凝集性への関与を調べるために、既に報告されている Lg-FLO1 遺伝子のプ
ロモーター領域の塩基配列を利用した inverse-PCR によって本遺伝子を取得し、部分的な塩基配列の決定を実施した。さらに、数種類の DNA プローブを用いたサザン解析を行い、以下に示した結果を得た 3)。
（１）本遺伝子は、Lg-FLO1 遺伝子の N 末端部位と S. cerevisiae の第 IX 染色体に存在する YIL169c の融合遺伝子であると推定された。
（２）S. cerevisiae の第 IX 染色体上に位置するの複数の DNA プローブを用いた
PFGE サザン解析の結果は、YIL169c から左腕テロメアまでの約 20kb の染色体領域が Lg-FLO1 遺伝子を含む下面ビール酵母の第 VIII 染色体に相当する染色体に転座した可能性を示唆した。
（３）本遺伝子は、非凝集性の下面ビール酵母において検出されたので、凝集性の表現型には直接関与していないと推察された。以上の結果を踏まえて、本遺伝子を ILF1 (Inactivated Lg-FLO1)遺伝子と命名した。染色体間の組換えによって生成したと考えられる ILF1 遺伝子の発見は、下面ビール酵母の凝集性株から
非凝集性株への変化が、凝集性遺伝子 Lg-FLO1 の構造変化によることを支持し、下面ビール酵母の凝集性遺伝子の遺伝的変異メカニズム解明に繋がった。
【参考文献】
１） J. Watari et al. (1994) Yeast ,10, 211
２） O. Kobayashi et al. (1998) J. Bacteriol., 180(24), 6503
３） M. Sato et al. (2002) J. Biosci. and Bioeng. 93, 395

Analysis of brewing characteristics of the bottom-fermenting yeast using
comprehensive analytical techniques

Genetic instability in flocculation of bottom-fermenting yeast

Key words
Saccharomyces pastorianus, bottom-fermenting yeast, comprehensive
analysis, fermentation

Key words○Hiroyuki Yoshimoto(Kirin Holdings Co., Ltd.)○Masahide Sato1,2(1 Sapporo Breweries Ltd., 2 Value Creation Frontier Laboratories)

flocculation, bottom-fermenting yeast, chromosome, translocation

153

2S-Ea05

下面ビール酵母が獲得したマルトース、マルトトリオー
スを資化する能力

2S-Ep01○畠中 治代（サントリーホールディングス）Haruyo_Hatanaka@suntory.co.jp

超好熱性アーキアの C1 代謝関連酵素○跡見 晴幸（京大院・工）atomi@sbchem.kyoto-u.ac.jp

麦汁はグルコース(G1)10-15％、マルトース(G2)60-70％、マルトトリオース(G3)10-20％を主な糖として含んでいる。そのためビール酵母にとって G2、G3を資化する能力が高いことは大変重要である。糖資化の律速段階は取り込みだと言われており、G2 あるいは G3 を取り込むトランスポーター(MT)は、サブテ
ロメアに位置する MAL loci に発現活性化因子と分解酵素であるマルターゼと並んでコードされている。その遺伝子発現はグルコース抑制を受け、G2 により誘導される。また、MT は膜に局在後にも G1 が存在すると速やかに分解されることが知られている。G1 を取り込むヘキソーストランスポーターは促進拡散であるのに対し MT はプロトンシンポーターなので、細胞内酸性化を防ぐために細胞は ATP を消費してプロトンを排出する必要がある。従ってエネルギー効率の違いを考えると、このような制御機構を持つことは合理的と考えられる。実験
室酵母の MT としては、Malx1（x=1, 2, 3, 4, 6）が知られているが、このうちMal11 は Agt1 とも表記され基質特異性が広く、G2、G3 の他、G1、フラクトー
ス、シュークロースなども取り込むことができる。これに対してその他の Malx1
は、麦汁の糖の中では G2 しか取り込めない。上面ビール酵母は主に多倍性のS.cerevisiae であるのに対し、下面ビール酵母である S.pastrianus は S.cerevisiaeと S.eubayanus からなるハイブリッド酵母（約四倍体）である。染色体には多くの乗り換えがあること、倍数性が高いこと、MT がサブテロメアにあることなどから、ビール酵母の MT の種類、数、SNP を明らかにすることは難しい。
*本要旨中、Sc あるいは Se から始まる遺伝子・タンパク質は、下面ビール酵母の持つ 2 種類のゲノム由来（由来が不明な場合は Sp と記載）であることを示す。これらがついていない場合は、上面ビール酵母あるいは実験室株由来である。
１）ビール酵母の持つ G2 あるいは G3 を取り込むトランスポーター(MT)下面ビール酵母(WS34/70)は、互いに 100％近い同一性を持つ数種の ScMalx1と、ScMalx1 と 90％の同一性を持つ G3 資化型トランスポーター SpMtt1 を持っている。ScAgt1 はトランケイトされていて活性がなく、SeMalx1 も ScAgt1 同様トランケイトされている。SeAgt1 はインタクトだが G3 取り込み能は SpMtt1
よりも低く、発現量も ScMalx1 や SpMtt1 に比べると非常に低い。WS34/70 のSeAGT1 を破壊してもほとんど発酵速度が変わらないことから、WS34/70 は
ScMalx1 と ScMtt1 によって、G2 と G3 を取り込んでいると考えられる。一方、
エール酵母では株によって様々な比率で Agt1 がトランケイトされている。また、Malx1 と 90％以上の同一性を持つ MT を複数持つ株があり、G2 と G3 に対する基質特異性も様々であった。我々は今までに実験室株から取得した Agt1,
Mal21, Mal31, Mal61 の性質を調べており、Agt1 は最もグルコース誘導性分解速度が早く、Mal21 は例外的にグルコース誘導性分解速度が非常に遅いことを明らかにしている。麦汁発酵では G1 と G2 が同時に存在することから、Mal21 のような分解されにくい MT を持つことは麦汁発酵に有利ではないかと思われた。
しかし、調べた 22 株の上面・下面酵母の中に、Mal21 の分解耐性を決定づける
2 つのアミノ酸残基を持つ MT は存在しなかった。
２）分解されにくいトランスポーターを持つことのリスク
ビール酵母は Mal21 型の MalX1 を持っていなかったことから、分解耐性を持つ
トランスポーターを持つことは、不利な一面があると考えた。MAL6 locus のMAL61 のみを破壊した実験室株を宿主として、MAL21 を高発現させたところ、その株は G1 と G2 両糖を炭素源とする培地で増殖阻害が起きた。この増殖阻害
は、マルターゼも同時に高発現した株では生じなかった。G1 と G2 両糖の存在下で培養した MAL21 高発現株は、マルターゼ遺伝子を十分発現しているにも拘らず、マルターゼ活性が非常に低く、細胞内に G2 を大量に蓄積していた。糖の種類や糖濃度が急に変化した場合、分解しにくい MT を持っていることは、増殖にとってリスクを伴うものと思われた。
３）マルトースとマルトトリオースの基質特異性を決めるもの
下面酵母の SpMtt1 は G3 資化型であるが、逆に ScMalx1 は G2 しか取り込めない。一方、上面酵母からは G2 資化型、Ｇ 3 資化型、G2+G3 資化型の MT が見つかった。基質特異性に関与するアミノ酸残基について検討したところ、G3 資化型から G2 資化型へ、G2+G3 資化型から G2 資化型あるいは G3 資化型へ変換させることはできたが、G2 資化型に G3 資化能を付与することはできなかった。醸造用酵母の糖資化性の獲得について考察する。

アーキアは第３の生物ドメインを構成し、真核生物やバクテリアとは異なる酵
素や代謝経路を利用する場合は少なくない。Thermococcus kodakarensis は鹿児
島県小宝島の硫気孔から分離された超好熱性アーキアの１種であり、アミノ酸、
ペプチド、ピルビン酸、多糖類などを炭素源として従属栄養生育を示す。興味深いことに T. kodakarensis はそれまで Calvin-Benson-Bassham 回路（CBB 回路）の 鍵 酵 素 と し て 知 ら れ て い た ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase（Rubisco）を保有し、その代謝機能が注目された。結果的に T. kodakarensis 由来
Rubisco（Tk-Rubisco）は炭酸固定を行う CBB 回路で機能せず、本菌のヌクレオシド分解に関与する pentose bisphosphate pathway で機能することがわかった。
一方で、Tk-Rubisco は carboxylase 活性のみならず、ribulose 1,5-bisphosphate（RuBP）に対する oxygenase 活性も示し、その τ 値は 10-20 程度であった。T.
kodakarensis は絶対嫌気性菌であり酸素を利用することはできないが、微好気条件においても生育を示す。したがって同条件においては T. kodakarensis 菌体内に Tk-Rubisco の oxygenase 活性の産物 2-phosphoglycolate の生成が想定される。
2-Phosphoglycolate は多様な代謝酵素を阻害することが知られ、植物・藻類・藍藻などは glycolate pathway を利用して 2-phosphoglycolate を分解・除去し、その炭素を回収して RuBP carboxylase 活性の生成物 3-phosphoglycerate にまで変換しCBB 回路に導入させる。T. kodakarensis は CBB 回路をもたないが、細胞内に 2phosphoglycolate が生成する可能性があるため、それを除去する代謝機構について検討を加えた。結果として、T. kodakarensis にも 2-phosphoglycolate の脱リン酸化、酸化、アミノ基転移を触媒する酵素が同定され、2-phosphoglycolate から
グリシンまでの変換経路が明らかとなった。また glycine cleavage system（GCS）の機能を確認することができ、serine hydroxymethyltransferase とともにグリシンからセリンへの変換が示唆された。さらに既にその存在が明らかとなっていた
ADP 依存的な serine kinase などを含め、セリンから 3-phosphoglycerate までの代謝がつながっていることが示され、植物の glycolate pathway と類似した代謝経路が CBB 回路をもたない超好熱性アーキアにも存在することが示唆された。
ここでは上記の代謝を中心に、本菌の C1 代謝に関連する酵素について紹介する。

The ability of the bottom-fermenting yeast to assimilate maltose andmaltotriose

Enzymes from hyperthermophilic archaea related to C1 metabolism○Haruyo Hatanaka(Suntory Holdings Ltd.)Key words

beer yeast, maltose, maltotriose, transporter○Haruyuki Atomi(Grad. Sch. Eng., Kyoto Univ.)

Key words

archaea, metabolism, carbon dioxide

154

2S-Ep02

高濃度 CO2 と（超）好熱菌の中央代謝○布浦 拓郎（海洋研究開発機構）
takuron@jamstec.go.jp

2S-Ep03

Biohydrogen production from one carbon substrates
using a hyperthermophilic archaeon, Thermococcus
onnurineus NA1
Hyun Sook Lee1,2, ○Sung Gyun Kang1,2(1 Korea Institute of Ocean Science and Technology, 2 University of
Science and Technology)
sgkang@kiost.ac.kr（超）好熱菌は、深海底熱水孔や温泉等の高濃度 CO2 環境に生息するが、高CO2 環境の（超）好熱菌の代謝に与える影響はほぼ見過ごされてきた。しかし、近年、高濃度 CO2 が（超）好熱菌の中央代謝の機能に大きく影響する事例が複数報告されている。例えば、有機物も炭素源として利用することが可能な通性
化学合成独立バクテリアから発見された可逆的 TCA 回路では、化学合成独立栄
養条件で増殖する際にはクエン酸合成酵素の逆反応を含む還元的な回路が機能するが、その還元方向の回転には、高濃度 CO2 が不可欠であることが示されている(Nunoura et al. 2018; Mall et al. 2018; Steffens et al. 2021)。また、偏性従属栄
養バクテリアである Thermotoga 属においては、通常の条件下では、基質となる
有機物は酢酸まで酸化され、排出されるが、高濃度 CO2 存在下においては、酢
酸を取りこんで CO2 を固定して乳酸を生産することがバイオテクノロジーの観
点 か ら 注 目 さ れ て い る (d'Ippolito et al. 2014) 。 我 々 の 研 究 グ ル ー プ で は 、
Thermosulfidibacter より可逆的 TCA 回路を発見した後、代謝解析手法のアップ
デートを図ると共に、Thermotoga や超好熱性従属栄養アーキア Thermococcus をモデルとして高濃度 CO2 環境下における中央代謝経路、そしてゲノム情報からは不完全と推測される TCA 回路の機能・振る舞いについて研究を進めている。
本発表においては、新たな 13C トレーサーを用いた新たな代謝解析手法と共に、これらに関する最新の知見を紹介したい。

Hydrogen is attracting widespread attention as a promising energy carrier, which isprimarily produced from fossil fuels. Biological hydrogen (biohydrogen) production isa promising alternative since it has potential to considerably reduce cost andenvironmental impact by harnessing renewable resources. We have been studying
about hydrogenase and biohydrogen production in Thermococcus onnurineus NA1
isolated from a deep-sea hydrothermal vent as a biohydrogen producer. The genome of
T. onnurineus NA1 encodes seven different [NiFe]-hydrogenases such as cytoplasmichydrogenases (SulfI SulfII and FrhAGB-encoded hydrogenase) and membrane-boundhydrogenases (Mbh, Mch, Mfh1 and Mfh2). Particularly, Mch and Mfh2 wereidentified to play key roles in hydrogen production and energy conservation from CO
and formate utilization in T. onnurineus NA1, respectively. Multi-omics analysis underculture medium containing one-carbon substrates allowed us to understand how thehydrogenases of the strain were differentially expressed and the metabolic pathway
was modulated upon the presence of one-carbon substrates. It has also been attempted
to identify eessential regulators to play a critical role on the expression of thehydrogenases. Enhancement of biohydrogen productivity was also attained by rationaland evolutionary engineering of T. onnurineus NA1. To make biohydrogen production
cost-effective, we attempted to utilize industrial waste gas as a cheap feedstock. The
advances on biohydrogen production of Thermococcus onnurineus NA1 and future
prospect will be discussed.

Impacts of high CO2 concentration on the central carbon metabolism of(hyper)thermophiles

Biohydrogen production from one carbon substrates using a
hyperthermophilic archaeon, Thermococcus onnurineus NA1○Takuro Nunoura(JAMSTEC)

Key words

CO2 fixation, hyperthermophile, thermophile, central metabolism

Hyun Sook Lee1,2, ○Sung Gyun Kang1,2(1 Korea Institute of Ocean Science and Technology, 2 University of Science andTechnology)

Key words

Thermococcus onnurineus NA1, One carbon substrate, Biohydrogen

155

2S-Ep04

微生物電気化学を活用した CO2 資源化技術○加藤 創一郎 1,2,3（1 産総研・生物プロセス, 2 北大院・農, 3 阪大院・基礎工）s.katou@aist.go.jp

2S-Ep05

C1 微生物炭素固定反応による炭素資源利用とバイオ生
産への応用○阪井 康能, 由里本 博也（京大院・農）sakai.yasuyoshi.8x@kyoto-u.ac.jp

地球規模の気候変動を抑制するため、二酸化炭素の排出および大気中濃度の削減が喫緊の課題とされている。とりわけ、二酸化炭素の回収や貯留にとどまらず、二酸化炭素を原料とし燃料、化成品、構造材などの有用有機物を生産する、
いわゆる二酸化炭素資源化技術の開発が大きな注目を集めている。本講演では二酸化炭素資源化バイオ技術の新しいカタチである、非光合成生物を利用した技術の取り組みを紹介する。
二酸化炭素資源化バイオ技術の急先鋒は、植物や藻類といった光合成生物の利用、いわゆるバイオマス生産（増産）およびその利用であろう。植物や藻類は
確かに二酸化炭素から多様・複雑な有機物を生産可能であるが、致命的なデメ
リットも内包する。1 つには二酸化炭素固定の反応速度、効率が極めて低い点である。一般的な栽培作物の場合、施肥等で多大なエネルギー投入をしているにもかかわらず、太陽光エネルギーから有機物の化学エネルギーへの変換効率
は最適条件下においても 0.2%程度にすぎない。加えてその栽培には広大な耕作可能地や淡水を必要とし、燃料や構造材の生産にあたっては食料生産との競合という課題も存在する。これは耕作可能地が限られている我が国においては特に大きな問題である。実際、我が国で生産されているバイオ燃料やバイオポリ
マーの大部分は、国外から輸入したスターチやパーム油を使用しているのが現状である。一方、触媒化学や電気化学といったマテリアルサイエンスの分野でも、人工光合成に代表される二酸化炭素資源化の研究が精力的に行われている。
マテリアル利用の大きなメリットはその反応速度、効率の高さにある。例えば無機半導体をベースとした太陽光発現は、栽培作物より二桁高い約 20％のエネ
ルギー変換効率を有している。しかし現状、無機触媒や電気化学反応で二酸化炭素を還元し多様・複雑な有機物を生産することはできていない。以上の通り、
マテリアルもしくはバイオのどちらかを使用した技術は、互いに相補的ともいえるメリット・デメリットを有している。
講演者らは、マテリアルが得意とするエネルギー変換反応とバイオが得意とす
る有機物生産反応のカップリングによる、新たな二酸化炭素資源化技術の構築を目指している。本技術のキモは、マテリアルとバイオの反応をどこでどのように接続するか、言い換えるとバイオに対してどのような形でエネルギーおよび炭素を供給するか、にある。手段の 1 つは太陽光発電などにより得られた電力を使用し、電解反応により水素や C1 化合物（場合によっては C2～化合物）を生成し、それらの持つ化学エネルギーを生物（例えば水素酸化細菌）に供給する手法である。もう 1 つは電力をそのまま利用可能な微生物（電気合成微生物）を使用する手法であり、ここでは生物に供給されるのは電気エネルギーの形態となる。本講演では、講演者らが取り組んでいる実際の研究例を交え、新
たな二酸化炭素資源化バイオ技術の現状や将来の可能性を紹介、議論したい。

低炭素社会の構築に向けて、CO2 の固定反応が注目を集めている。しかし CO2の生物資源への固定には必ずエネルギーが必要で、そのために光、電気、水素などの供給が必要である。一方、メタンやメタノールなどの C1 化合物を単一の炭素およびエネルギー源として利用できる C1 微生物（メチロトローフ）は、代謝中間体であるホルムアルデヒドを起点に、エネルギーを獲得する異化経路と、ホルムアルデヒドを固定する資化経路に分岐する。このホルムアルデヒド
固定（C1 炭素固定）には、細菌およびアーキアに属する C1 微生物がもつリブ
ロースモノリン酸経路（RuMP 経路）とセリン経路、メタノール資化性酵母（C1酵母）がもつキシルロースモノリン酸経路（XuMP 経路）の 3 つが知られているが、いずれもトータルの反応として、CO2 固定とは異なりエネルギーを必要としない exergonic な反応であることが特徴である。要するに C1 微生物は C1化合物を CO2 に酸化してエネルギーを得ると同時に、CO2 まで酸化されるより前によりエネルギーレベルの高いホルムアルデヒドを固定することで効率的な
C1 代謝を行い、C1 化合物での増殖が可能となっている。本講演では、以下の3 つのトピックスについての現状を紹介したい。
1） 新しい炭素循環像を基にした C1 バイオエコノミーの創生
CO2 固定のみならず、C1 炭素固定も積極的に共用することで、結果的に C1 炭
素の生物資源化が可能になると考えている。たとえば、メタノールを原料に生産した微生物製剤の農業利用は、そのバイオスティミュラント効果により大きな CO2 削減効果をもたらすことになる (1)。
2）C1 酵母を宿主とした新たな異種タンパク質高生産系
C1 酵母 Pichia pastoris（Komagataella phaffii）を対象に、我々は炭素源による遺伝子発現制御の分子機構を総合的に明らかにした (2,3)。この新しい知見を基に、メタノール培地における高遺伝子発現のみならず、産業廃棄物培地での高遺伝子発現が可能になると考えられる。本講演では代謝ならびに転写因子の改変により可能となったエタノール+メタノール共存培地での高遺伝子発現系の構築ならびに、メタノールフリー培地での高遺伝子発現に向けた戦略について紹介する。
一方、多くの分泌タンパク質生産において小胞体におけるタンパク質のフォー
ルディングが律速となっているとされている。我々は Pichia ゲノムライブラ
リーを導入した細胞から FACS により小胞体内タンパク質折りたたみ促進因子のスクリーニング系を確立し、その因子について現在解析しており、その一部についても紹介する。
3）メタン酸化と有用物質生産
メタン資化性細菌がもつメタン酸化酵素（MMO）については、大腸菌などにおける活性型酵素の異種遺伝子発現に関する報告があるものの、これまで報告されてきた MMO 活性が非酵素反応である可能性が近年指摘され、MMO の活性型異宿主発現に関する確固たる報告はない。特に膜結合型 pMMO の反応機構については、混沌とした論争の中にある。これらメタン酸化反応に関する現状と問題点について、我々の実験結果とともに紹介する。この研究過程で、我々は新たなメタン酸化菌を見いだした。これを用いたメタンを直接の原料とする
one-pot 異種タンパク質生産と、それを可能とした新たなメタン酸化菌の性質について紹介する。
文献）
1) Yurimoto, H. et al., Microb Biotechnol, 14: 1385-1396 (2021)
2) Ohsawa, S. et al., Sci Rep, 8: 18051 (2018)
3) Inoue, K. et al., Mol Microbiol, 118: 683-697 (2022)
4) 由里本博也、阪井康能, メタンと二酸化炭素～その触媒的化学変換技術の現状と展望～（上田 渉 監修）, pp.59-66, CMC リサーチ (東京) (2023).

CO2-fixing biotechnology using microbial electrochemistry

Utilization of carbon resources through microbial C1- fixation reactions tobioproduction○Souichiro Kato1,2,3(1 BPRI, AIST, 2 Grad. Sch. Agric., Hokkaido Univ., 3 Grad. Sch. Eng. Sci., Osaka
Univ.)

Key words

microorganisms, electrochemistry, CO2 fixation, biosynthesis○Yasuyoshi Sakai, Hiroya Yurimoto(Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)

Key words

methylotroph, methanol, formaldehyde-fixing enzymes

156

2S-Fa01

バイオ・デジタルプラットフォームを活用した日本型バイオファウンドリ

2S-Fa02

バイオものづくりを取り巻く動向と我が国の取組について○石塚 大輔（経済産業省）ishizuka-daisuke@meti.go.jp○近藤 昭彦（神戸大院・科技イノベ）
akondo@kobe-u.ac.jp

バイオテクノロジーを利用した経済「バイオエコノミー」が、工業、健康医療、農業等の幅広い分野で急拡大し、バイオ産業革命の様相を呈しています。このバイオ産業革命の流れを加速しているのが、ゲノム解読技術やゲノム合成・編集技術等の先端バイオ技術と IT、AI 技術やロボット技術を融合（「バイオ・デジタル」融合）して誕生した、技術分野 Engineering Biology であり、各種要素
技術を集積した革新的なプラットフォームがバイオファウンドリ技術です。バイオファウンドリは、DBTL システムとして構成されていますが、コンピューターを活用しての細胞の代謝設計技術（Design：Ｄ）、ロボティックス技術を活用した迅速かつ自動化された微生物構築技術（Build：Ｂ）、迅速・高精度代謝評価技術（Test：Ｔ）、さらなる微生物設計の高度化のための機械学習や数理モ
デリング（Learn：Ｌ）等の先端技術を統合したものです。さらに、この DBTL
サイクルで得られるデータをシステム内に集積することで、データベースや知識ベースを構築していくことで、開発時間のさらなる短縮を図るものです。
日本では、2012 年から開始した「革新的バイオマテリアル実現のための高機能化ゲノムデザイン技術開発」事業（経済産業省事業）や、2016 年からスタート
した、大規模なスマートセルプロジェクト（NEDO 事業）「植物等の生物を用いた高機能品生産技術の開発：高生産性微生物創製に資する情報解析システムの開発」により、バイオファウンドリの開発と、それを活用しての様々な有用
物質生産技術の開発が精力的に行われました。
バイオファウンドリは各国のバイオ開発における根幹的なプラットフォームであり、多くの国で、政府の支援を受けたバイオファウンドリが構築されています。最近はアジアにおいても、中国で、中国科学院（天津の Tenjin Institute ofIndustrial Biotechnology および深圳の Shenzhen Institute of Advanced Technology）
において大規模なバイオファウンドリが整備され、韓国でも、KAIST や KRIBB
を中心に K-biofoundry を大規模に整備する構想が進められています。この様に、先端的なバイオファウンドリ構築の競争は世界的に激化しています。一方で、これらのパブリックバイオファウンドリの世界的なネットワークを構築して連携することで標準化やデータ連携を図る動きがあり、2019 年 5 月に神戸大学において、Global Biofoundry Alliance（GBA）が正式にスタートしましたが、現在メンバーとなるバイオファウンドリが世界で増加しています。
一方、民間セクターにおいては、バイオファウンドリ企業が米国を中心に存在感を増しています。ボストン地区にある、Gingko Bioworks 社、Conagen 社、サンフランシスコ地区にある、Amyris 社など代表的な存在です。いずれの企業も巨額の資金調達を行い、多くのパートナー企業とプロジェクトを推進し、バイ
オ産業革命を牽引しています。中国や韓国においても、最近いくつかのバイオ
ファウンドリ企業が設立され、活発に活動しています。
日本において社会実装を加速する民間バイオファウンドリを構築するために、
私たちは、2020 年に、神戸大学における、バイオファウンドリ技術を包括的に移転し、バッカス・バイオイノベーション社を起業しました。バッカス・バイ
オイノベーション社は、神戸市のポートアイランドのクリエイティブラボ神戸（CLIK）にバイオファウンドリを大規模に整備して、日本におけるバイオエコ
ノミー拡大に貢献することを目指して、多くの企業とプロジェクトを推進しつつあります。投資資金や人材面で制約がある日本が世界の中で、存在感を出せるバイオ産業を発展させるために日本型バイオファウンドリの構築が不可欠ですが、次の三つのことが重要と考えています。一つ目は、大学等のパブリック
バイオファウンドリと民間バイオファウンドリが密接に連携することです。大学等の公的な機関は革新的な技術開発を得意とする一方、工業化のための開発には民間バイオファウンドリが不可欠であり、連携により、技術革新と工業化を効率よく行える体制を構築することは重要です。二つ目は、微生物開発から製造プロセス開発、最終的には工場建設・運転までをデータを共有しながら一貫して行える“統合型バイオファウンドリ”の仕組みを構築することが重要です。
三つ目として、多様な業種の民間企業群とバイオファウンドリ企業が綿密な連携の下に共創すること、そして可能な範囲で人材や宿主などの開発を共有することで、目的化合物に最適な微生物を選定して、迅速に開発を行える体制を構築することです。
本発表では、バイオファウンドリの技術概要、そして世界の研究開発や事業化の現状を踏まえて、日本型バイオファウンドリ構築の方向性について述べたいと思います。

近年、ゲノム編集や DNA 合成など、遺伝子配列や代謝経路をデザインするバ
イオテクノロジーの高度化に伴い、世界中でバイオものづくり革命とも言われるかつての産業革命に匹敵するような大変革が起きつつある。
米国では、バイオベンチャーへの民間投資が年々増加し、２０２１年には年間約２兆円へ拡大。令和４年９月には、バイオものづくりに関する大統領令も発令された。今後１０年で世界の製造プロセスの３分の１がバイオ技術に置き換わり、その市場規模を約４，０００兆円とした上で、バイオものづくり分野への政策の総動員と集中投資を進める方針を示している。さらに、中国でも１０兆円以上の政府投資で研究拠点の整備が進んでいると言われている。今後、世界的な技術覇権競争の激化は必至である。
我が国は、発酵技術をはじめ歴史的にバイオ分野に強みを有している。到来す
る大市場を見据えて我が国がバイオ分野で世界をリードしていくためには、今こそ成長へのチャレンジが必要である。そのために経済産業省は、中長期的に腰を据えて、大胆かつ重点的な投資を行っていく。
バイオものづくりは、ゲノム編集技術等によって物質の生産効率を高める微生物開発プラットフォーマーと、その微生物を大量培養し、最終製品を製造するメーカーとの連携が重要である。微生物開発プラットフォーマーの育成と製造メーカーの新規ビジネス投資への覚悟が鍵を握っている。
経済産業省では、グリーンイノベーション基金約１，８００億円を活用し、CO2 を原料として様々な物質を生産するバイオものづくり研究開発プロジェク
トを立ち上げた。この技術が実用化すれば、我が国の脱炭素化の切り札ともなり得る。そして、CO2 以外の我が国の未利用資源、例えば廃棄衣類や食品残渣などを原料としてプラスチックや繊維などを生み出す技術についても、新たに
約３，０００億円の基金を造成し、実用化を図る。バイオものづくり技術は我が国の資源自律や食糧安全保障等の観点からも非常に重要になってきている。
バイオ分野の研究開発予算も継続して実施し、経済産業省として約５，０００
億円の予算で我が国のバイオものづくり産業を盛り上げていく。
他方で、バイオ産業の飛躍は、政府の予算措置だけでは成し得ない。バイオ技術の恩恵を最大限引き出し、産業の発展と世界の課題解決を両立させていくた
めに、産業界、アカデミアの叡智を総動員し、皆でチャレンジし、世の中を変えていく必要がある。技術開発のみならず、標準化、原料資源の回収・再利用の仕組み作り、バイオ由来製品の品質表示ルール、消費者とのリスクコミュニ
ケーション等を通じた受容形成など、市場環境整備のための取組も欠かすことが出来ない。
加えて、将来拡大する市場を見据えたバイオ人材の育成が急務である。足下では、企業での生産段階を担う人材の高齢化が進み、また、アカデミアからの技術をもつポスドク人材が企業において十分な活躍の場が提供されていないとも言われている。バイオ人材の育成は、複数の専門知識・技能を要し、一足跳びで増やすことは難しいことから、早期に対応を進めていくことも考えなければならない。
その他、バイオ分野の参入障壁を下げるために、企業等が利用可能な実証拠点の整備やネットワーク形成を円滑化するための環境整備など、今後官民で取り組むべき項目は多岐にわたる。
「バイオものづくり革命」の実現のために、経済産業省としての今後の取組及び道筋を紹介する。

Development of Japanese biofoundry by using bio-digital platform

Trends surrounding biomanufacturing and Japan's efforts○Akihiko Kondo(Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

biofoundry, engineering biology, synthetic biology, bioproduction○Daisuke Ishizuka(METI)

Key words

biomanufacturing

157

2S-Fa03

Industrial biotechnology as enabler for Circular Bioeconomy

2S-Fa04○Carsten Mailand Hjort(Novozymes A/S)
cahj@novozymes.com

未培養微生物ゲノムデータベースからの有用酵素探索○津田 宗一郎（bitBiome）
soichiro.tsuda@bitbiome.co.jp

New solutions are needed to solve global challenges including climate changes, loss of
biodiversity and growing population. The current fossil based technologies is no
solution. Biotechnological solutions based on renewables from plants, biomass andP2X offer a truly circular carbon economy to replace current fossil based technologies.
Cellulosic ethanol has been pursued for more than 20 years and Novozymes has been akey player developing enzyme solutions and yeast solutions to enable this industry.
Several different enzyme activities are needed to degrade cellulose and hemicellulose
components of biomass to fermentable carbohydrate. It is a challenge to produce all ofthese at economically viable conditions. Fermentation of the carbohydrate iscomplicated by the diversity of C6 and C6 carbon sources resulting from the enzymatichydrolysis. Particularly the C5 carbon sources xylose and arabinose are challenging
and lack of efficient C5 yeasts delayed the development of cellulosic ethanol for years.
Currently both efficient enzyme products for degradation of biomass to fermentablesugars and efficient C5 yeasts are available for use. Low oil prices have effectively put
this industry into hibernation for about a decade, but current developments in energy
prices and geopolitical stability is reviving the industry.
Power to Anything (P2X) is a revolution that enables production of fuels like methanol
and fertilizers like ammonium using surplus electricity to reduce CO2 or nitrogen
respectively. To this day few biological applications of P2X have been matured but
several new concepts are being scoped. These concepts are focused on production offuels (e.g. Sustainable Aviation Fuel), chemical building blocks and proteins.
A combination of efficient carbon capture systems, catalytic conversion of CO2 tosimple organic molecules and subsequent fermentation of these molecules into an arrayof different products has the potential to introduce a truly circular bioeconomy. Thiscan become one of the most important tools to meet the huge challenges the world isfacing on climate, food security and biodiversity.

環境微生物には、これまでに知られていない生体触媒酵素・産業用酵素など膨大な未開拓資源が存在すると考えられている。ショットガンメタゲノム解析は、複雑な微生物相から培養を必要とせずそのような酵素を発見するための有効な手段ではあるが、多様な微生物種を含むサンプル（例えば土壌など）のゲノム
解析は一般的に難しく、多くの課題が残されている。bitBiome ではマイクロ流体デバイスを用いてゲルカプセル内で個々のバクテリアを分離し、そのゲノムを増幅する bit-MAP®法と呼ばれる微生物シングルセルシーケンス法を開発した。
この方法では、複雑な環境微生物叢のゲノム解析において従来のショットガン
メタゲノム解析と比較して 30 倍以上の効率が得ることが可能になっている。これは言い換えれば、既存の手法では解析が難しい難培養性微生物（微生物ダー
クマターとも呼ばれる）のゲノム情報を bit-MAP®を用いれば圧倒的に高効率で獲得する事が出来るとも言える。この方法を用いて、現在 12 億以上の遺伝子を含む大規模微生物遺伝子データベース「bit-GEM」を構築しており、そこから目的の酵素を効率的に探索する in silico 解析技術「bit-QED」も合わせて開発している。
講演では、我々がこれまで進めてきた、細菌を特異的に殺菌するバクテリオ
ファージ由来酵素（エンドライシン）を用いた創薬分野での研究開発や、PET
分解酵素などの産業用酵素の事例を紹介したい。
Environmental microorganisms are vast untapped resources of previously unknown
biocatalytic and industrial enzymes. Although shotgun metagenomic sequencing
enabled enzyme discoveries from complex uncultured microbiota, genome analysis ofsamples containing diverse microbial species (e.g., soil microbiomes) is still difficultand many challenges remain. bitBiome employs a microfluidic device designed toisolate individual bacteria within a gel capsule, facilitating the independent
amplification and sequencing of individual genomes. This innovative microbial singlecell sequencing approach, known as bit-MAP®, sets us apart as the sole pioneers
capable of executing this distinctive process.
This method is found to be over 30 times more efficient than conventional shotgun
metagenomic analysis in the genomic analysis of complex environmental microflora.
In other words, bit-MAP® can be used to obtain genomic information on difficult-toculture microorganisms (also called microbial dark matter), which are difficult toanalyze using existing methods, with overwhelmingly high efficiency. Using thismethod, we are currently constructing a large-scale microbial gene database "bitGEM" containing more than 1.2 billion genes, and are also developing an in silico
analysis technology "bit-QED" to efficiently search for target enzymes from thisdatabase.
In my presentation, I would like to introduce our research and development in the fieldof drug discovery using bacteriophage-derived enzymes (endolysins) that specificallykill bacteria, as well as examples of industrial enzymes such as PET-degrading
enzymes.

Industrial biotechnology as enabler for Circular Bio-economy

Development of industrial enzymes from uncultured microbial genome
database○Carsten Mailand Hjort(Novozymes A/S)

Key words

industrial biotechnolgy, biomass, power to x, circular carbon economy○Soichiro Tsuda(bitBiome Inc.)

Key words

microbe, single-cell analysis, enzyme

158

2S-Fp01

環境 DNA 観測とデータ駆動型アプローチで迫る生態系の複雑性

2S-Fp02○近藤 倫生（東北大院・生命科学）
michio.kondo.b8@tohoku.ac.jp

生物叢の時空間動態と生物間相互作用ネットワーク○東樹 宏和（京大・生態研）
toju.hirokazu.4c@kyoto-u.ac.jp

1. はじめに
生物多様性の喪失が進行している。生物多様性課題の本質は、自然という資本の管理・運用手法の改善である。自然は自己増殖・再生できる資本であり、その価値は利用法に大きく依存する。適切に利用すれば価値や持続性を高めることが可能だが、利用の最適化は容易ではない。その理由として、第一に生態系が極めて巨大かつ複雑であるために、観測による状態把握が容易ではないこと、第二に生態系動態には基礎方程式が存在しない上に、その変動は状況依存的で、予測困難な非線形動態を示すことが挙げられる。
2. データ駆動型アプローチとその可能性
生態系の状態把握や変動の理解に資する新しいアプローチが注目されている。
大量のデータをもとに自由度の高いモデリングを活用するデータ駆動型アプロー
チである。例えば、私たちが生態学分野で提案した「ミニマリストアプローチ[1]」では、多生物種の時系列データを元に、非線形因果推論等を活用すること
で個体群密度や生物多様性指標、生態系機能などの異なる生物学的レベルに属する要素間に働く因果を明らかにすることを目指す。例えば、舞鶴湾における潜水魚類相観測データを利用した研究では、魚類の種間相互作用ネットワーク
を特定した上で、その複雑性が魚類群集の力学的安定性を高める効果を持つことが示された [1]。
微生物群集は高い多様性と幅広い機能によって特徴づけられるが、そのサイズの小ささや極めて速い動態、メタゲノム解析技術の発展も手伝って、ミニマリ
ストアプローチに基づく研究を進める上での格好の材料となりうる。例えば、
このアプローチを土壌微生物群集の液体培養実験系に適用した研究では、環境ストレスが引き起こす群集ネットワークの大規模な構造変化を捉えることができた [2]。また、湖沼における植物プランクトンの長期にわたる観測データから
は、その変動を予測するモデリングが可能になる。
3. 環境 DNA 技術と ANEMONE
大型生物を対象に大規模観測データを獲得する技術として、環境 DNA が急速に発展を遂げている。環境 DNA とは、水や土壌中に含まれる生物由来の DNAを指す。環境 DNA を環境試料中より抽出、分析することで、そこに生息する生物を特定したり、分布を評価したりすることができる [3]。環境 DNA を利用した生物多様性調査は、現場での作業が少なく、多地点、あるいは高頻度での生態系情報獲得が可能になる。例えば全国多地点での環境 DNA 調査からは、
日本沿岸の魚類分布を推定することができた。また、同一地点での毎週観測か
らはさまざまな生物種が変動しながら共存する様子を見てとることができる [4]。
環境 DNA 技術を利用することで得られる生物多様性情報の活用可能性を探る
べく、東北大学、かずさ DNA 研究所、筑波大を中心に設立されたのが、「ANEMONE（All Nippon eDNA Monitoring Network）」である。ANEMONE は、
環境 DNA メタバーコーディングに基づく全国規模の生物多様性観測ネットワー
クである。採水、ろ過、DNA 抽出、MiFish プライマーによる分子解析、塩基
配列決定など、eDNA メタバーコードの手順は、環境 DNA 学会が提供する標準化プロトコルに従った共通手法で行われる。
ANEMONE の最大の特徴はオープンサイエンスアプローチにある。2015 年に京都府舞鶴湾で最初の定期観測が開始されて以来、1,000 サイト以上で 5,000 件以上の調査が行われた [5]。現在、全国の大学や国立研究機関、地方自治体に支えられた 77 の固定観測点が稼働している。2020 年からは地域コミュニティーから数百人の参加者が環境 DNA 調査に協力するようになった。獲得データは、メタバーコードデータのハイスループット解析パイプラインである Claident によって分類群が特定され、東北大学で管理されている専用データベース
ANEMONE DB において一般公開されている [5]。
4. これからの展望
生態系の科学的理解を推進し、その持続的な利用を実現するには、生物多様性
観測網の充実と大規模データを活用したモデリング技術の共発展が求められる。
2022 年 6 月には産官学民の ANEMONE コンソーシアムが設立され、ANEMONE
データを活用したネイチャーポジティブなビジネスのあり方が検討され始めた。
行政やビジネスセクターとアカデミアの連携によって生態系情報の獲得とその価値化を相互依存的に発展させていけるかどうかが、今後の生物多様性課題解
決の鍵となるだろう。
[1] Ushio et al. (2018) Fluctuating interaction network and time-varying stability of anatural fish community. Nature 554: 360-363.
[2] Yang et al. (2023) Reconstruction of a soil microbial network induced by stress
temperature. Microbiology Spectrum 10: e0274822.
[3] Yamamoto et al. (2016) Environmental DNA as a 'snapshot' of fish distribution: acase study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLOS ONE 11:
e0153291.
[4] Ushio et al. (2018) Quantitative monitoring of multispecies fish environmental
DNA using high-throughput sequencing. Metabarcoding Metagenomics 2: 1-15.
[5] https://db.anemone.bio

ヒトやその他の動物に共生する微生物叢や土壌・植物共生微生物叢を対象とした研究の発展により、種組成の時系列動態や空間変異を解明することが可能となり、多数のゲノムが相互作用することで構成されるシステムの理解が格段に深まってきた。
生命系は階層的であり、分子の集まりが細胞を、細胞の集まりが個体を形成している。その最も複雑な階層が、種の集まりである生物群集（および生態系）
であり、この生物群集の動態を駆動する原理を見出すことが、科学における大きな挑戦であるといえる。生物群集を構成する個々の種のゲノム配列を得ることができるようになった現代、多種システムの挙動を左右する決定論的過程と確率的過程を統合的に理解することが可能になっていくと予想される。
本講演では、ゲノム科学や微生物学、理論生態学、ネットワーク科学を統合することで、階層的な生命システムの構造と駆動原理をいかに解明していけるかについて議論したい。DNA シーケンシング技術の発達によって、生物群集の構造に関する大規模データをハイ・スループットに取得することができるようになってきた。ヒト腸内細菌叢や植物共生微生物叢を対象とし、種組成の時系列
動態や空間変異を解明することが可能となり、多数のゲノムが相互作用することで構成されるシステムを科学の対象とすることができるようになりつつある。
こうした背景を踏まえ、土壌微生物叢や植物共生微生物叢、養殖システムにおける魚類関連微生物叢を対象とした空間解析や時系列解析に関する事例を紹介する。その上で、「多種のシステムを設計・制御することで実装できる生物機能」が、今後の農学・工学・医学分野における技術革新をもたらす可能性について論じたい。

Unraveling the complexity of ecosystems through environmental DNA
monitoring and data-driven analysis

Spatio-temporal dynamics of microbiomes and interaction networks○Michio Kondoh(Grad. Sch. Life Sci., Tohoku Univ.)

Key words
stability

complex microbiological system, environmental DNA, interspecific,○Hirokazu Toju
(CER, Kyoto Univ.)

Key words

microbial community

159

2S-Fp03

バイオプロセスインフォマティクスによる環境 DX○菊地 淳 1,2,3,4（1 理研・環境資源, 2 名大院・生命農, 3 横市院・生命医, 4 千葉大院・医）jun.kikuchi@riken.jp

2S-Fp04

微生物コミュニティの統合的理解が拓く新しい産業廃水
処理技術
○堀 知行
（産総研・環境創生）
hori-tomo@aist.go.jp

SDGs 提言の一根拠であるプラネタリーバウンダリー（人類生存の安全な活動
領域と限界点の定義）では、特に生物多様性の減少と、生態系の生産性の起点である窒素やリンの負荷による富栄養化や貧栄養化を含む栄養塩の偏在化が警鐘されてきた。両者は共に、流域圏からの農業肥料・生活排水の放出や、河川・湖沼および沿岸の生態系変動として、深く関連している。演者はヒト社会活動の影響が集約される沿岸環境・生態系を指標化し、生態系プロセスの安定性を考慮した人間社会の活動指針となる「環境処方箋」をデータ可視化することを目指している[1,2]。こうした環境データサイエンスは、例えば赤潮予測[3,4]や、ブルーカーボン等の炭素固定化の推進[5]、水圏の微生物群集形成プロセス評価
等[6]、プラネタリーバウンダリーを意識して行動していくための社会変革に資する効果とインパクトを与えることが期待できる。
一方で 2022 年のプラネタリーバウンダリー改訂に伴い、「淡水利用」と「新興化学物質」項目が新たに限界点超過として警鐘されている。前者は農業における水利用負荷低減[7,8]、あるいは土壌環境改善が貢献し得るものの[9,10]、AIを活用した排水処理技術等々[11,12]、都市での循環的水利用も視野に入ると思われる。他方で新興化学物質の警鐘には、2050 年には世界中の全魚類総量を上回るとされる海漂プラスチック問題が含まれる。言うまでも無く、都市等のヒト流域圏を経てポリマーが海漂されてしまうのだが、包装材等の汎用ポリマー以外にも、衣服洗濯後の繊維片、タイヤ摩耗粉や化粧品および洗剤ケミカル等
も意図せず流出してしまう「新興化学物質」である。一連のポリマーや界面活性剤をマテリアルズインフォマティクスや、最適化問題を駆使することで所望の物性を有しつつ生分解性化する試みも急速展開しており[13-17]、講演では筆者らのプロセスインフォマティクス手法も紹介したい。
引用文献
1) Kikuchi, J. & Yamada, S. (2021) RSC Adv. 11, 30426-30447.
2) Miyamoto, H. & Kikuchi, J. (2023) Comput. Struct. Biotechnol J. 21, 869-878.
3) Ito, K. et al. (2021) Anal. Chem. 93, 6901-6906.
4) Oita, A. et al. (2018) Sci. Total Environ. 636, 12-19.
5) Miyamoto, H. et al. (2023) Environ. Res. 219, 115130.
6) Yokoyama, D. & Kikuchi, J. (2023) Environ. Res. 219, 116202.
7) Ogura, T. et al. (2016) Sci.Rep. 6, 28011.
8) Mega, R. et al. (2019) Nature Plants 5, 153-159.
9) Ichihashi, Y. et al. (2020) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 117, 14552-14560.
10) Miyamoto, H. et al. (2023) ISME Commun. 3, 28.
11) Yokoyama, D. et al. (2022) ACS Omega 7, 12654-12660.
12) Yokoyama, D. et al. (2022) ACS Omega 7, 30399-30404.
13) Yamada, S. et al. (2021) Int. J. Mol. Sci. 22, 1086.
14) Yamawaki, R. et al. (2021) Appl. Sci. 11, 2820.
15) Hara, K. et al. (2022) Sci. Rep. 12, 10558.
16) Yamada, S. et al. (2023) J. Magn. Reason. 351, 107438.
17) Yokoyama, D. et al. (in press) ISME Commun.

単一微生物系は反応選択性や効率性が高く主にものづくり等へ適用されるが、微生物コミュニティ（複雑微生物系）は阻害に強く柔軟性が高いという特長を有し発酵・醸造や環境浄化等で利用される。自然環境における物質変換や動態を担う微生物酸化還元反応では、熱力学の法則に従って酸化還元電位の高い電子受容体から順に還元され（酸素→硝酸→鉄(III)→硫酸→CO2）、有機物は電子供与体として一部酸化（異化）され、残りは生合成（同化）に使われる。異化と同化の割合は微生物それぞれの代謝経路や生育状況によって異なり、その分配の仕組みは分かっていない。水素や硫黄等の無機還元剤を電子供与体として用い、CO2 を炭素源とする独立栄養微生物も存在する。電子供与体が易分解性で豊富に供給される時には複数の電子受容体の還元が重複して起こるが、酸化還元電位のより高い電子受容体を利用する微生物はより低濃度かつ多様な電子供与体を利用可能で、これにより微生物間の基質競合に勝っている。CO2 はあ
らゆる自然環境に存在しており、この還元で生じるメタン生成は最終電子受容反応として地球物質循環の根幹を為す。このように自然環境で複雑に交錯して起こる微生物呼吸代謝の理解のためには、微生物コミュニティの構成種、存在量、空間分布、生理的役割を詳細に特徴づけることが不可欠である。
講演者は、次世代シーケンサーを用いた 1000 万種規模の微生物種同定技術を立ち上げ、SIP (Stable Isotope Probing)、RNA-seq、共焦点反射顕微鏡法との融合により、高解像度かつ高感度な解析法を確立・適用してきた。特に 13C 標識物質の微生物による分解・取り込みを追跡する SIP では、RNA 密度勾配を次世代シーケンサーに供することで、従来法に比べて約 500 倍の感度上昇を達成し、稀少な未知微生物の機能解析を可能にした。自然環境で連続かつ重複して起こる微生物酸化還元反応の理解は地球物質循環の評価・予測の高精度化に直結するだけでなく、これら連続反応の一部を切り出し・効率化することで水処理や土壌浄化等に利用されている。これまでに水処理槽や土壌・堆積物等の様々な
自然・工学的環境における物質変換や動態の普遍的理解・制御を目指し、微生物コミュニティの研究を展開している。特に環境微生物解析技術を駆使することにより、顕在化する水質汚染物質の分解促進や有用物質変換などの社会課題に企業や大学とともに取り組んできた。
本講演では、微生物による汚染物質分解機構とその解析手法を概説し、微生物
コミュニティを用いた新しい産業廃水処理技術の開発について発表する。さらに現在取り組んでいる微生物動態と物質動態の連結から環境状態・変化を綿密に捉える試みについても紹介する。

Environmental DX based on bioprocess informatics

Industrial wastewater treatment technologies developed by integrated
understanding of microbial communities○Jun Kikuchi1,2,3,4(1 CSRS, RIKENS, 2 Grad.Sch.Bioagri., Nagoya Univ., 3 Grad.Sch.Med.Life.,
Yokohama City Univ., 4 Grad.Sch.Med., Chiba Univ.)

Key words

machine learning, prediction, planetary boundary, NMR○Tomoyuki Hori
(EMRI, AIST)

Key words

microbial community, wastewater treatment

160

2S-Fp05

データサイエンスが紐解く複合生物系による環境修復機
構とその課題2S-Ha01

私のキャリアパス ～サイエンスと産業をつなぐ架け橋を目指して～○渋田 真結（アステラス製薬）
mayu.shibuta@astellas.com○簡 梅芳, 工藤 宏史（東北大院・環境）
meifangchien@tohoku.ac.jp

持続可能な開発を実現するための環境バイオテクノロジーの一つとして、環境汚染物質を高濃度で体内に蓄積し、土壌・水環境から除去する植物を利用したファイトエキストラクションの適用が期待されている。ヒ素を例として、演者らはその超蓄積植物モエジマシダ（Pteris vittata）を研究対象とし、そのヒ素蓄積機構および根圏微生物との生物間相互作用の解明から、この生物間作用を活用した微生物補助型ファイトエキストラクションの提案・実証試験まで行ってきた。
圃場と実施時期等によって、ヒ素除去の効果にバラツキがあったが、環境由来の影響に加え、微生物と植物の相互作用は複雑であり、実環境におけるヒ素除去の影響因子を決定することは容易ではない。この問題の解決を図り、モエジ
マシダ根圏のマイクロバイオームとメタボロームデータを含むマルチオミック
ス解析と、それらのデータの因果関係を分析するベイジアンネットワーク解析を起用し、二つの圃場におけるモエジマシダの栽培実験を行った。
ヒ素濃度の高い圃場 MK では、根圏に接種した亜ヒ酸酸化微生物の Pseudomonas
sp. m307 株（以降 m307 株）により、モエジマシダ羽片中のヒ素濃度が上昇し、最大で他の条件に比べて 1.5 倍高くなった。ベイジアンネットワークにより、
m307 株はある代謝物の相対量の増加、ひいてはモエジマシダのヒ素蓄積に寄与することが示唆された。さらに、根圏中の MND1 目に属する微生物がヒ素蓄
積に正に寄与していることが示唆された。MND1 の生理学的特徴から、根圏中低窒素条件がもたらす鉄酸化の抑制が生物利用可能なヒ酸の割合を高め、モエ
ジマシダのヒ素吸収に有利だった可能性を示唆した。データサイエンスの適用により、土壌環境における植物・微生物・土壌因子の因果関係を一部可視化でき、微生物補助型ファイトエキストラクションを実環境に適用する際に有益な知見を提供した。講演では、本研究で見えた課題についても触れたい。

本講演では「モノづくりの研究者」を目指した私が歩んだキャリアパスを若手研究者、特に修士・博士学生向けに紹介する。
最先端の科学（サイエンス）を「産業」にするためには、サイエンスを理解して社会の役に立つ「モノ」を創り出す必要がある。私にとっての「モノづくりの研究者」とは、まさにこの「だれか（もしくは社会）」の役に立つ「モノ」を創る研究者であった。生物学を中心とした広い学問領域で得られた知見を工学の知識と組み合わせ、多様な分野の問題解決に挑戦する生物工学はまさにこの「モノづくり」の研究であると思う。大学院進学を機にとびこんだ生物工学の世界での経験は、自分がなりたい研究者象をはっきりとイメージするきっかけとなった。
ここでは、生物工学と出会い「モノづくりの研究者」を目指した私が、修士・博士課程での研究や留学、異分野との共同研究を通して学んだことを振り返り、
製薬企業で創薬に携わる企業研究者にいたるまでのキャリアパスと「進路選択の決断のカギ」を紹介したい。そして、学生時代から社会人となった現在にいたるまでの経験を通して感じた「最先端のサイエンス」を活かした「モノづくり」の楽しさとやりがいを伝えたい。

Data science unfolds the mechanisms of environmental remediation bycomplex biological systems and its challenges

A career story: my approach to be a researcher bridging between a newscience and industry○Mei-Fang Chien, Hiroshi Kudo
(Grad. Sch. Environ. Stud. Tohoku Univ.)

Key words

bioremediation, Bayesian network, multi-omics, field experiment○Mayu Shibuta(Astellas Pharma. Inc.)

Key words

career story

161

2S-Ha02

琵琶湖を望む大学で小さな研究室を立ち上げた○石川 聖人 1,2（1 長浜バイオ大・バイオ, 2 JST・さきがけ）
m_ishikawa@nagahama-i-bio.ac.jp

2S-Ha03

僕のキャリアーアカデミア○菊川 寛史（北大院・工）kikukawa@eng.hokudai.ac.jp

2022 年 4 月、滋賀県長浜市田村町にある長浜バイオ大学に着任して研究室を立ち上げました。構成員は私一人だけ。広い教員室と実験室にはダンボールが沢山積まれている。いつになったら片付くのだろうか。早く実験を再開しないとプロジェクトが進まない。申請書も書かないといけない。論文執筆も止まっている。数多くの不安を抱えながら毎週の講義の準備をする。1 時間半の講義に使うスライドは 35 枚くらいだろうか、そうすると 1 枚の作成に費やすことの時間は何分？とにかく考えることが多くて大変・・・でも、楽しかった。これまでにない経験ができたとても濃密で楽しい時間でした。
研究費の潤沢な研究室で育ってきた私は、試薬や装置があることを当然のように思っていました。当たり前ですが NaCl すら買わないとありません。周りには誰もいません。試薬・装置・人をそろえてきたボスの偉大さに気付きます。
ボスも顔を見ないと寂しいものです（すぐ慣れました）。幸いなことにスタート
アップ資金があったので、少しずつ試薬と装置をそろえていき、研究補助員を募集して雇用しました。人が増えるとあっという間に部屋が片付きました。準備をしっかりして講義をしていたら、研究室に興味を持ち、配属を希望してくれる学生がいました。徐々に研究室らしくなっていくのは、仲間を増やし装備を整えていくロールプレイングゲームのようでとても楽しかったです。偉大なボス（BIGBOSS）の研究室に居続けたらもっと研究に集中することができ、もっと業績を積み上げることができていたかもしれません。しかし、研究室をゼロから立ち上げるという経験は何事にも代えがたいと思っています。
現在、研究室には私を含めて 10 名在籍しています。長浜バイオ大学と同じく琵
琶湖のほとりにある長浜城は、豊臣秀吉が最初に主となった城です。私には天下統一のような野望はありませんが、琵琶湖を臨む美しいキャンパスで自分らしく研究と教育に取り組む所存です。PI になることは研究者の大きな１つの目標であると思います。PI になる状況はケースバイケースかと思いますが、若手研究者のキャリアパスの参考になれば幸いです。

2015 年に博士号を授与して頂いてから、（ポスドク）、助教と経験して、2023 年
4 月より准教授に就けて頂いた。キャリアパスにおいて後々気づくのは、これまで通ってきた道が少しずつ絡みあい、今の自分に繋がっていること。そして、大学教員職として、やはり教育が重要であること。国公立大学のキャリアを通して、自分が見聞き・感じてきたことをご紹介します。 Plus Ultra !!

My small laboratory was set up at a university overlooking Lake Biwa.

My career, academia○Masahito Ishikawa1,2(1 Dept. Biosci., Nagahama Inst. Bio-Sci. Technol., 2 PRESTO, JST)Key words

career-path○Hiroshi Kikukawa(Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.)

Key words

academic career path, family supports, human networks

162

2S-Ha04

代謝工学の研究者からデータサイエンティストの道へ○徳山 健斗（中外製薬）
tokuyama.kento26@chugai-pharm.co.jp

2S-Ha05

アカデミアパスを進むー医学系への転身、単身赴任留学に育児、そしてこれから○西田 奈央（早大・高等研）
nnishida@aoni.waseda.jp

第 3 次 AI ブームが始まった 2000 年代ごろから現在まで、新しい AI 技術が絶え間なく登場し、様々な分野・プロセスでイノベーションが起きている。従来、インフォマティクス技術者は Wet (バイオ技術開発) と Dry (計算科学) を「つなぐ」役目として重要視されてきたが、Dry 技術のハードルは年々低くなってきた。バイオエンジニアリングの本質は対象のプロセスを実用化・最適化することであり、古い枠組みにとらわれず、利用可能なアプローチはすべて活用し目
標達成を目指すべきである。現代の博士人材には、科学技術イノベーションの創出が強く求められており、「つなぐ」のではなく「リード」する攻めの姿勢が重要であると考えている。本講演では、代謝工学の研究者からデータサイエン
スの分野に進んだ自身のキャリアパスを紹介する。今後の博士人材がキャリアパスを考える際の参考になれば幸いである。

私はこれまで、博士取得後、国内と留学先でポスドクとして働き、帰国後も大学で研究しているという、いわゆるアカデミアパスにいる。自分も博士課程や次のポジションを探す節目で悩んで、その都度キャリアセミナーを聞いたり、周りの人に相談したりしてきたので、このキャリアパスでお話する機会をいた
だいて何とか力になりたいと思う。同時にそれぞれの目指すキャリアや環境、
ワークライフバランスは十人十色なので、具体的なアドバイスはあまり役立たないように思う。従って、このキャリアセミナーでは、アカデミアパスに少しでも興味ある人に、私みたいな経歴を辿っている人もいることを知っていただ
いて、何とかなる、とそれぞれの目指したい方向に向けて進むための一押しになったらと願っている。

The data scientist career path from metabolic engineering researcher

Pursuing an Academic Career: transitioning to medical research, studying
abroad alone, raising a child, and the next steps○Kento Tokuyama(Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.)Key words
engineering

data science, artificial intelligence, machine learning, metabolic○Nao Nishida(WIAS, Waseda Univ.)

Key words

career path, career development

163

2S-Ha06

工学系研究者が進む医療の道～医工連携とその先へ～○佐藤 康史（旭川医大・先進医工学研究セ）
y-sato@asahikawa-med.ac.jp

2S-Hp01

サントリーウイスキー次の 100 年に向けて○栗原 勝範（サントリー）
Katsunori_Kurihara@suntory.co.jp

大学院生にとって修了後のキャリアは「学生」から「社会人」になるという、人生における大きなターニングポイントであり、大きな決断を迫られる時期である。大学院の進学や修了後の進路について悩みを抱えている学生は少なくないだろう。私もその一人であり、進学や就職に際し多くの悩みを抱えた。
医療に関係する研究に携わりたく、組織工学・再生医療に関わる研究室を選択し、博士課程まで進学をした。学位取得後の進路は非常に悩んだが、医療系研
究所でのポスドクを選択した。その後、大手企業およびベンチャー企業で働き、2020 年に現在の大学へ着任した。4 つの職場を経験し、それぞれ異なる立場・環境で働いたことで、様々な経験を得ることができたと考えている。一方で、一貫して医療に関わる研究開発に携わっており、特に医工連携に関する研究領域を進んでいる。工学系の大学出身であるが、医療という自らの専門とは異なる業界へ進み、様々な困難に直面しているものの、楽しさややりがいを感じている。
本講演では、演者がこれまで歩んできた道を、アカデミアおよび企業研究者としての経験を含めて紹介したい。大学院生や若手研究者が自身のキャリアパス
を考える上での一助になれば幸いである。

1923 年サントリー創業者鳥井信治郎は日本初のモルトウイスキー蒸溜所の建築をスタートさせた。1929 年には国産第一号ウイスキー白札を発売することができたが、本格スコッチウイスキーを模したこの製品はピート香が強く、全く日本人にはなじまなかった。そこで、信治郎は日々テイスティングを繰り返し、
日本人の味覚に合ったウイスキーの開発を行い、1937 年角瓶、1950 年オールドを発売。日本のウイスキー市場を大きく成長させることに成功した。1972 年にはグレーンウイスキー製造用の「知多蒸溜所」、1973 年にはサントリー第 2 のモルトウイスキー製造用の「白州蒸溜所」を相次いで設立。1983 年には国内生産量も 40 万 KL に迫る勢いで市場は拡大した。しかし、この年をピークに日本ウイスキー市場は急激に縮小。2007 年までの 24 年間市場は縮小し続け 1/5 程
度にまで落ち込んでしまった。2008 年に始まったハイボールブームをきっかけに、日本のウイスキー市場は再び成長軌道にのり、近年ではジャパニーズウイ
スキーブームも重なった結果、生産数量は 20 万 KL 程度までは復活してきたが、それでも 1983 年に比べると半分程度の市場規模にすぎない。このようにウ
イスキーの市場は非常に変動が大きい。それはウイスキーが嗜好品であることに由来しており、そうした特徴を持つ限り、将来再び日本のウイスキー市場が縮小する可能性を排除することはできない。本報告では、このような特徴をもつウイスキー産業がとるべき戦略について述べる。
ウイスキー産業がとるべき戦略は大きく分けると 2 つ。1 つ目は飲用シーンを増やすこと。従来バーやスナックなどお酒を楽しむ場で、嗜好品として消費されることが多いのがウイスキーの特徴であった。しかし、そのような場は限定的で、景気の影響も受けやすい。そこで、より日常的な飲用シーンである晩酌への進出が重要な戦略となった。サントリーでは水割りやお湯割り、ハイボー
ルといった飲み方を提案し続けてきた結果、近年ようやく晩酌のお酒として日本市場に定着することができた。
もう 1 つの戦略はグローバル化である。このグローバル化を考えるうえで酒の本質的な価値や、ウイスキーの特徴について考えなくてはならない。まず酒の本質的な価値についてだが、本来酒産業は極めてローカルな産業であった。例
えば、世界で最も愛されている酒の 1 つであるワインだが、その品質は原料となる葡萄の品質で大きく左右される。すなわち、葡萄の栽培適地がワインの醸
造適地になる特徴があり、ワインの世界ではその栽培適地ならび風土をテロワールと呼んで大切にしている。一方、ウイスキーやビールといった麦芽を原材料とする酒は少し異なる。麦芽の場合は葡萄とは違い保存が効く。そのため、栽
培適地＝醸造適地とはならず、醸造・蒸溜技術が集積的に発展したエリアに根付く。例えばビールと言えばドイツが有名であるが、ミュンヘン周辺ではヴァ
イツェンビール、デュッセルドルフ周辺ではアルトビールといった形で産業集積が行われる。また、アメリカンウイスキーであるバーボンも同じような特徴があり、ケンタッキー州、テネシー州周辺で産業集積がなされている。このよ
うに麦芽を使った酒の本質的な特徴は地場との結びつきであり、ジャパニーズ
ウイスキーの更なる発展のためには、健全な産業集積が一つのポイントになると考えている。そのために重要となるのはジャパニーズウイスキーの定義づくりである。2021 年 2 月、日本洋酒酒造組合が中心となり、ジャパニーズウイス
キーの定義を定めた。詳細は示さないが、「日本で採水された水を使うこと」、「糖化・発酵・蒸溜は日本国内の蒸溜所で行うこと」などが定められている。現
在は自主基準として運用されているが、スコットランドや米国では法律として運用されており、定義を厳格に運用することで地場産業である酒を守っている。
ジャパニーズウイスキーにおいても造り手が厳格にルールをまもることが結果
的に産業の発展につながると思われることから、早期の法制化への期待の声も大きい。
次にウイスキーの特徴について述べる。ウイスキーが他の酒類と決定的に違う
ことは、熟成により完成することにある。ウイスキーというお酒の品質を形作るために最低 3 年程度の年月が必要となる。しかも、木樽という天然の容器に入れ貯蔵することから、品質のコントロールが極めて難しい。この熟成というメカニズムが明確になっていないプロセスがあるからこそ、ウイスキーには高い価値が付与されるのだが、メカニズムが明確になっていないことで再現性の難しさが出てくる。すなわち、この熟成のコントールは多分に技能的であり、経験が人や組織に集積していく特性をもっている。このように、ウイスキーという酒づくりは土地や人・組織に集積する特性があり、その特性を把握し強化していくことが、ジャパニーズウイスキーのグローバル化にとって重要であるといえる。
これからもウイスキーを楽しんでいただける場を提供すること。そして、ウイ
スキーづくりに関わる人や土地・風土を大切にし、産業としてしっかりと育成
していくことが肝要であり、次の 100 年も変わらず続けていくことで、ウイスキーが日本の文化として根付くことに貢献したい。

The Career Path of the Engineering Researcher in the Medical Field:
Medical-Engineering Collaboration and the Future

Suntory whisky for the next 100 years○Yasushi Sato(Adv. Med. Eng. Center, Asahikawa Medical Univ.)

Key words

career path, medicine-engineering collaboration○Katsunori Kurihara(SUNTORY SPIRITS LIMITED)

Key words

whisky, global strategy

164

2S-Hp02

クラフトビールを起点とした地域・企業との共創によるサステナビリティ事業の展開

2S-Hp03

未利用バイオマスのアップサイクルにおける醸造・発酵技術の活用○杉本 利和（ファーメンステーション）
sugimoto@fermenstation.jp○茂田 一郎（アサヒユウアス）
ichiro.moda@asahi-youus.com

アサヒユウアス株式会社は地域課題解決と循環型社会形成を目的に 2022 年 1 月に設立されたアサヒグループホールディングス傘下の事業会社である。大量販
売大量消費型のモデルではなく，地域コミュニティ独自の課題解決に貢献すべ
く，従来事業とは一線を画した小回りの利くビジネスモデルでサステナビリティ
事業を幅広く手掛けている。
事業の 1 つであるクラフトビール事業においては，「フードロスの削減」，「障がいを持つ方の多様な働き方の創出」，「地域の特産物を活かした経済循環の活性化」を目的として，食品の製造や販売の過程でやむなく発生していたフードロ
スをクラフトビールに“アップサイクル”することに取り組んできた。これまで，
蔵前地区の焙煎店の廃棄されるコーヒー豆を活用した「蔵前 BLACK」，同じく蔵前地区のサンドイッチ店のパン耳を活用した「蔵前 WHITE」，埼玉県狭山市の茶産業で副産物として出てしまう「ケバ茶」を活用した「狭山 GREEN」，千葉県山武市の観光農園で取り残されたイチゴを活用した「さんむ RED」、愛知
県豊田市の手摘みだからこそ出てしまう茶葉の茎を活用した「豊田 AMBER」など，様々な地域において地元の事業者や地方自治体と連携してサステナブル
クラフトビール（酒税法上の区分は発泡酒）を展開してきた。例えば「蔵前WHITE」においては、蔵前のサンドイッチ店で発生するパンの耳を地元の福祉事業所の知的障害を持つ作業者の方に回収、ラスク状に加工してもらい、当社が原料として購入するというしくみを地元事業者のみなさんの協力を得て構築することで商品化が実現した。地元に「フードロスの削減」，「障がいを持つ方の多様な働き方の創出」といった課題を意識し、活動している方がいたことがサステナブルクラフトビールの取り組みを実現する上での大きなカギとなった。
地域課題解決の手段としてクラフトビールに着目した理由は主に 3 つある。一つ目は取り扱える食材の幅が広く、特徴を活かしやすいことである。様々な地
域の特産物を柔軟に活用することができることは幅広い課題に対応できるという点で大きなメリットとなる。二つ目は多様な味わいを表現することができる
ので、どんな味わいを目指すのか開発の過程で地域の関係者のみなさんとのコ
ミュニケーションが促進されることである。一例として「豊田 AMBER」の開発にあたっては、茶の茎を焙じる条件やお茶を抽出する際の温度や時間の条件、
ベースビールの選択等に関して、生産者や地元の関係者のみなさんと意見交換を行ってきた。三つ目は商品化後にコミュニケーションツールとして活用できることである。開発段階でのコミュニケーションも含めて、地域でのコミュニ
ケーションの活性化がサステナビリティ取り組みを広げるきっかけになると考えている。
また、当社のフラッグシップとなっているのがバイオマス素材を原料に使用したリユース容器「森のタンブラー」と「森のマイボトル」である。
「森のタンブラー」は"使い捨て"という消費行動自体を変革することを目標とし、"使い捨てしない"飲料容器としてアサヒとパナソニックが 2019 年に共同開発したリユー
スできるエコカップであり、原料の 55%にバイオマス素材を使用している。この技術を使って「地域の未利用資源の活用」にも取り組んでいる。地域の森の
間伐材、切らざるを得ない桜の老木、お茶の微粉、焙煎する際の麦の微粉、欠点のあるコーヒー豆、サトウキビの搾りかすなどそのままでは廃棄されてしまう多様な素材を有効活用し、地域での課題解決の取り組みと連動して活用してきた。
「森のマイボトル」は間伐材やバイオマスポリエチレンなど植物由来の原料を 43%使用したリユースできるエコボトルであり、軽くてかさばらず、木材
由来の自然な質感を持つ。新規プラスチックの使用量を削減するとともに、"使い捨て"という消費行動を変革し"マイボトルを持ち運ぶ"という文化の醸成を目指して開発を行った。ウォーターサーバーと一緒に森のタンブラーや森のマイボトルを導入する取り組みを進めており、実際に PET ボトルや使い捨てカップの削減につながった事例が増えている。
サステナブルクラフトビールや森のタンブラー、森のマイボトルのように、現状は未利用原料をアップサイクルする技術や商品に目が向きがちではあるが、サステナビリティの本質は「無駄をなくし余らせない」、「使い捨てしない」ことにある。新規プラスチック使用量をさらに減らすアップサイクルの技術・仕組みに挑戦すると同時に、廃棄そのものを減らす活動への取り組みも進めたい。
サステナブルな社会の実現へ向かって継続して共に取り組めるパートナーと連携することが課題解決につながる近道であると考えている。

全国各地で発生している規格外の農産物や食品・飲料製造工程で出る残渣などの製造副産物などの「未利用バイオマス」は、現状、産業廃棄物として焼却処理、もしくは飼料化、肥料化されることが多く、充分に有効活用出来ているとは言いがたい。我が国では、コーン由来液糖や廃糖蜜など、ある程度均質な糖組成物を発酵原料として用いる発酵産業においては優れた生産技術を有しているが、規格外農産品や製造副産物を発酵原料として活用する事例は少ない。その理由は、未利用バイオマスの成分プロファイル（デンプン質やセルロール/ヘ
ミセルロースなどの化学的な成分構成）が複雑であること、そのような雑多なバイオマス原料を適切に酵素分解し、更にその分解物を原料として最適に発酵制御する技術の蓄積がまだ充分でないことに起因すると考えられる。また、我々の事業領域の一つである化粧品分野においては、処方配合される原料（化粧品原料）が、石油由来成分から化学合成により生産されているものも多いため、それらをバイオ素材に代替していくことの意義も大きい。更に、それらが、未利用バイオマスの発酵技術により生産可能となれば、環境負荷低減に資する機
能性素材として、化粧品マーケットニーズにもマッチすると考えられる。
我々は、未利用バイオマスを原料に、独自の発酵技術で、高付加価値で経済性の高い発酵バイオ素材を開発し、それら発酵素材を活用した化粧品や衛生用品等の商品化を行なう研究開発型のスタートアップ企業である。このような「発酵アップサイクル技術」のプラットフォームを構築することで、未利用バイオマスの活用を加速させ、社会課題解決につなげることを目指している。
発酵アップサイクル技術領域における研究開発は、近年、着目されるようになってきたが、多種多様な未利用バイオマスの網羅的な発酵技術に関する研究開発
事例はまだ少ない。我々は、これまでに、岩手県奥州市を中心に休耕田・耕作放棄地等で新たに栽培された飼料米や、岩手県/青森県等で加工されたりんご搾
汁残渣等、首都圏で大量発生している廃棄炊飯米、パン耳などの未利用バイオマスを活用し、エタノール及び化粧品原料などを開発・製造してきた。その過程で、未利用バイオマスの発生時期や発生量だけでなく、適切な酵素分解技術
や酵素分解物の成分プロファイルに関する情報を「未利用バイオマスデータベース」として整備するとともに、その酵素分解物に最適な微生物選択や発酵制御に関するノウハウが蓄積された「発酵微生物ライブラリー」を構築してきた。
更に、目標発酵生産物の生産性最大化だけを追い求めるのでなく、その発酵残渣の付加価値化をも目論むカスケード型の発酵生産モデルである「アップサイ
クルカスケード」のコンセプト実現にも取り組んできた。
本講演では、我々の研究開発事例を紹介するともに、未利用バイオマスの発酵
アップサイクルにおける技術的な課題や今後の研究開発の動向などにも言及したい。

Development of sustainability business through co-creation with local
communities and companies, with craft beer as a springboard

Fermentation technology in the upcycling of unutilized biomass○Ichiro Moda
(Asahi YOU.US)

Key words

sustainability, craft beer, local community○Toshikazu Sugimoto(FERMENSTATION Co., Ltd.)Key words

upcycling fermentation, unutilized biomass, cosmetic ingredients

165

2S-Hp04

データ駆動型のバイオ生産マネジメントシステム○河合 哲志
（ちとせ研究所）
tetsushi.kawai@chitose-bio.com

2S-Ja01

Enzyme studies and engineering by single molecule
display system coupled with NGS and bioinformatics○Jasmina Damnjanović, Hideo Nakano(Grad. Sch. Bioagric. Sci., Nagoya Univ.)
jasmina@agr.nagoya-u.ac.jp

ちとせ研究所は、不均衡進化理論に基づく独自の変異技術を開発し、産業株育種の事業からスタートした企業である。育種には培養技術も欠かせないため、我々は培養技術の開発も行ってきた。育種や培養を核とする事業を通じて、多様な発酵企業の意見を聴取する機会を得てきたが、そこから見えてきたのは日本が直面する発酵の課題であった。現行の商用バイオリアクター（通気攪拌型培養槽）の原型は 1940 年頃に作られ、それ以来改良が続けられてきたものの、技術革新は停滞している。加えて、生産拠点の海外移転が進行し、発酵生産技
術のノウハウが海外へと流出している。これらの技術的な課題に加えて、発酵制御のためのキーファクターはまだ確認されておらず、開発や生産には長年のノウハウが必要である。しかし、日本国内の生産現場が失われつつあり、技術者の高齢化や世代交代は大きな課題となっている。これらの社会的課題に対応するため、ちとせ研究所は AI を利用し、データに基づく発酵生産を実現する
バイオ生産マネジメントシステムを開発した。
AI を活用する際、まず重視すべきは学習データの質である。データ駆動型の取り組みという性質上、AI の品質はデータの品質に依存する。そこで考えられるのは、どのようなデータが発酵の改善に有効かという問いだ。培養状態を把握するためのキーファクターが明確ではない状態であるが、AI の一種である機械
学習は、このような原理が不明な問題に対応することが得意であるため、この特性を利用することは肝要である。つまり、どのデータが重要かを事前に考えるのではなく、可能な限り多様なデータを取得し、AI による解析を通じてデー
タの重要性を判断することが重要であると考えた。ただし、発酵制御に活用するためには最低限の要件を満たす必要があり、これには連続性、リアルタイム
での取得可能性、安価な取得コストなどが含まれる。人の思考を前提とせずにAI 学習に特化したデータセットを「コンボリューショナルデータ」と名付け、新たなデバイスの開発を実施した。この新規デバイスの一例として、多次元酸
化還元電位センサーがある。従来は白金電極による酸素応答のみを ORP セン
サーでデータ取得していたが、呼吸に直接関連しない物質の情報も培養状態を把握するためには重要であると考えた。結果として、10 種類以上の金属を検討
し、白金電極だけでは捉えられない培養液中の酸化還元電位の時間経過に伴う変化を観察することができた。
機械学習の特性のもう一つ重要な点は、学習に必要なデータ量である。AI が成功を収めている囲碁や将棋のような領域では、コンピュータシミュレーションが可能で、何百万局という学習量が確保できる。また、最近注目を浴びている
ChatGPT の学習量も膨大である。しかし、培養データは一つのコストが高く、このような大量の学習データを確保することは不可能である。したがって、AI技術を発酵分野に適用するためには、限られたデータ量でも学習効果を高める
仕組みが必要となる。しかし、そのようなデータを人間が思考によって作り出すことは困難であると考えられる。その理由は、人間が一度に扱えるのは 2 次
元が限界であり、取得するデータには通常偏りが生じるためである。この偏り
は本来、経験に基づく重要なノウハウだったが、学習データにおいては多様性が求められる。そこで、ベイズ最適化による実験計画法を利用すると、人間の思考による条件設定を含む広範囲の培養データを効率良く取得できることが確認された。
収集したデータを活用し、予測モデルによって培養の状態の予測が可能となった。予測モデルの利用法としては、一つにソフトセンサ、もう一つに制御モデルの構築がある。ソフトセンサは、生産物量など直接測定が困難な項目を、他の容易に測定可能なパラメータから間接的に推測する技術である。生産物量の予測ソフトセンサを作成したところ、従来の温度や pH 等のデータのみを学習させた場合と比べ、コンボリューショナルデータを活用した場合には、予測値と実測値の誤差を示す二乗平均平方根誤差が 5 倍以上低下した。この結果、通常では生産時に得られなかった情報でも、リアルタイムの培養データを学習することで生産量や副生産物量などの情報を取得することが可能となった。次に制御モデルは、AI によって培養の状態を最適化する制御値を提案させる技術である。本技術の特徴は、通常の制御では温度や pH などは一定値であるが、培養の経時変化に応じて最適制御値も変更する点にある。培養中の微生物の状態は誘導期などフェーズにより変化するため、本来であればそれぞれに適した制御値に変更することでより高精度な制御が可能となることが期待されていたが、その設定値を人間が考え出すことは難しかった。しかし、制御モデルの導入により、これが可能となり、生産量の安定的な向上が達成できた。
発酵分野における AI の活用はまだ始まったばかりであるが、すでに AI が人間を代替したり、その能力を上回る成果が次々と見られている。発酵分野が直面する社会的課題を解決するため、人の経験に依存する状況からデータ駆動の技術への転換を目指し、これからも更なる技術開発を推進していく所存である。

Evolutionary molecular engineering plays a major role in the design of proteins withdesired properties. The principle relies on the generation of large genetic diversity
followed by the selection of desired variants under increasing selection pressure. Suchevolved proteins and peptides often have greatly improved properties as compared tothe starting wild-type or template protein.
Due to the large generated diversity (e.g. randomization of 5 amino acid positions
produces a library of 106), selection is the most critical step and has long been abottleneck in terms of time, labor, and cost. In vitro selection methods using cell-freeprotein synthesis are advantageous to in vivo methods using E.coli or othermicroorganisms where library size is limited by the efficiency of DNA transformation.
cDNA display is one of the in vitro methods utilizing a special linker to make aphysical link between genotype (cDNA) and phenotype (peptide or protein) on a single
molecule level (Nemoto et al., FEBS Lett, 1997), without the need for internalization
into the cells or any artificial compartments, with manageable library size of more than1013 in a 1mL reaction. Until recently, analysis of the selected pool of variants was only
possible on a limited scale, since the variants needed to be cloned and sequenced by
the Sanger method. However, the increasing availability of the next-generation
sequencing (NGS), enable us to analyze the entire pool of variants with high accuracy
and speed. Big data analysis provides a comprehensive profile of selected sequences
and can be used to derive the rules of enrichment and sequence evolution towards thedesired property.
To reap the benefits of high-throughput, robustness, and accuracy of display
technologies, the authors used the cDNA display technology coupled with NGS andbioinformatics to study the substrate profiles of transglutaminases (TGs), are a groupof protein crosslinking enzymes that catalyze the formation of covalent iso-peptide
bonds between Lys and Gln residues of proteins and play essential roles in humanhealth by regulating blood clotting, epidermis and hair follicle formation, woundhealing, apoptosis, extracellular matrix formation, and cell adhesion (Griffin et al.,Biochem J, 2002).
Although the TG research has advanced over the years, there are still many
unanswered questions especially related to the comprehensive analysis of their naturalprotein targets for which specific and highly reactive substrate probes are desired.
Preferred sequences of several TGs have been previously studied by the group of Prof.
Hitomi at Nagoya University using phage display technology, and some of theobtained sequences have been used as Gln probes to study TGs. Building on that
legacy, we teamed up with the Hitomi group to comprehensively explore the substrateprofiles of TGs and further evolve the TG probes for higher reactivity and specificity.
We prepared random libraries of cDNA-displayed peptides in which the selected
positions of 12-amino-acid sequences previously discovered by phage display havebeen randomly mutated. To make a library for TG2 substrate profiling, we used
(HQSYVDPWMLDH; Sugimura et al, J Biol Chem, 2006) as the template andrandomized four amino acid positions surrounding the reactive Gln. For TG1 substrateprofiling we constructed three different libraries based on the K5 sequence(YEQHKLPSSWPF; Sugimura et al., FEBS J, 2008) with randomized positions
around the reactive Gln, throughout the backbone, and a library consisting of single
mutant variants. After one to seven rounds of screening and selection, the cDNA
corresponding to the selected pool of peptides was PCR-amplified and analyzed by
NGS and bioinformatics. Bioinformatics included NGS data analysis by random forest
approach to derive the preferred amino acid at each randomized position and databasesearch using in-house Python script to identify potential natural protein targets of TG2
and TG1. As a result, we discovered improved peptide probes for both TGs, defined
their preferred substrate profiles (Damnjanovic et al., Scientific Rep, 2022), and, basedon those profiles, suggested yet undiscovered natural protein substrates of these
enzymes by searching protein databases.

Data-driven bioproduction management system

Enzyme studies and engineering by single molecule display system coupledwith NGS and bioinformatics○Tetsushi Kawai(Chitose Laboratory Corp.)

Key words

AI, bioproduction, sensing, control○Jasmina Damnjanović, Hideo Nakano(Grad. Sch. Bioagric. Sci., Nagoya Univ.)

Key words
in vitro molecular evolutionary engineering, enzyme, substratespecificity, transglutaminase, D-amino acid oxidase

166

2S-Ja02 〈招待講演（韓国生物工学会）〉

2S-Ja03

Exploring a new biocatalyst for polyethylene
biodegradation and its future directions○Soo-Jin Yeom
(Sch. Biol. Sci. Techol., Chonnam National University, South
Korea)
soojin258@jnu.ac.kr

Utilization of genome information in enzyme industry○Hirotaka Matsubara(Amano Enzyme Inc. Innovation center.)
hirotaka_matsubara@amano-enzyme.com

Plastic contamination currently threatens a wide variety of ecosystems and presents
damaging repercussions and negative consequences for many wildlife species.
Sustainable plastic waste management is an important approach to environmental
protection and a necessity in the current life cycle of plastics. In this regard, plastic
biodegradation by microorganism is most notable. This presentation includes current
plastic pollution trends, screening of plastic biodegradable new bacteria, discovery of
new a trigger biocatalyst for polyethylene (PE) biodegradation and the research
hypothesis is that our common area is already surrounded with a bunch of plastics, so it
could be possible to screen plastic-degrading bacteria, although a trash-contaminateduncommon environment might have many plastic-degrading bacteria. Furthermore, we
propose adopting P450 into plastic-eating synthetic bacteria for PE biodegradation.
This strategy can be applicable to other dense plastics, such as polypropylene andpolystyrene.

The development of next-generation sequencing technologies has revolutionizedwhole-genome analysis, offering new possibilities in the enzyme industry.
Amano Enzyme Inc. has actively incorporated these technologies and here we present
two specific cases as examples.
1. Novel Gene for Enzyme Production in Commercial Strain
Efficient enzyme production is important in the enzyme industry. The development of
production host strain is necessary to optimize productivity.
In general, traditional mutational breeding or rational modification of host throughgenetic engineering is employed.
Each approach has its strengths and limitations. Traditional mutational breeding selects
strains with desired traits.
However, the selection of desired strain takes a long time. On the other, genetic
engineering is thought to be highly effective if the relationships between phenotypes
and genes are known but cannot be applied if the relationship is unknown.
Amano Enzyme Inc. has been using Bacillus amyloliquefaciens, a strain known for αamylase production, for over 40 years.
The strain has been continuously improved in enzyme productivity through only
mutational breeding.
We conducted whole-genome sequencing of strains at different stages of mutational
breeding and investigated the mutations associated with improved enzyme productivity
by comparing the variations among strains.
Compared the gene mutation and the phylogenetic relationships, we selected candidate
genes. As the result a gene designated as No.30 is identified.
The disruption of No.30 gene exhibited a significant increase in enzyme productivity.
Furthermore, complementary restoration of the disrupted gene led to a reduction in
enzyme productivity back to the original level. As the function of No.30 still unknown,
therefore its role is under investigated.
This study shows the identification of novel genes associated with enzyme productivity
and provides a successful case to host cell development.
2. Discovery of a Novel Protein-Glutaminase Gene through Genome Mining
The rapid increasing of gene sequence in databases leads comprehensive screening
methods for novel enzymes. Traditional activity-based screenings faces somedifficulties such as limited enzyme expression and detection level.
In contrast, genome mining enables in silico-based screenings that access all genes,
regardless of expression levels or cultivability. We aimed to discover a gene encoding aprotein-glutaminase, an enzyme with valuable industrial applications. Proteinglutaminase was discovered in specific species. To explore candidate genes, including
those with low similarity and identity to known protein-glutaminase genes, weemployed PSI-BLAST searches.
As a result, we identified over 500 candidate genes and narrowed them down to 76
genes based on classification. Furthermore, we incorporated structural considerations
to refine the selection of candidate genes. The enzyme activities of the gene products
were confirmed through recombinant expression in E. coli. As a result, we successfully
discovered several genes exhibiting protein-glutaminase activity. These findings
revealed a broader distribution of protein-glutaminase expanding our understanding of
its presence beyond species reported. This study shows that the genome mining
complements traditional approaches and expand the chance of the discovery of novel
enzymes.
In conclusion, the utilization of genomic information extracts valuable insights fromgenome data base. Those valuable insights will help to sophisticated novel enzyme
development, contributing to implementation of circular economy society.

Exploring a new biocatalyst for polyethylene biodegradation and its future
directions

Utilization of genome information in enzyme industry○Soo-Jin Yeom
(Sch. Biol. Sci. Techol., Chonnam National University, South Korea)

Key words

plastic biodegradation, P450 monooxygenase○Hirotaka Matsubara(Amano Enzyme Inc. Innovation center.)

Key words

genome, enzyme production

167

2S-Ja04 〈招待講演（韓国生物工学会）〉

2S-Ja05

Enzyme-based biocatalysts for CO2 capture○Chang Sup Kim(Yeungnam University)
cskim1409@ynu.ac.kr

Synthetic biology for microbial production○Taizo Hanai(Grad. Sch. Agric., Kyushu Univ.)
taizo@brs.kyushu-u.ac.jp

Developing carbonic anhydrase (CA)-based materials for environmentally-friendly
carbon dioxide (CO2) sequestration under mild conditions would be highly valuable forcontrolling environmental emissions and producing value-added chemicals. In thisstudy, we developed micelle-templated biocatalytic silica nanoparticles as a biocatalyst
using two-phase silicification for CO2 capture. Each CA and silica-forming peptide R5
was conjugated with hydrophilic ends of F127. Biocatalytic silica nanoparticles (F127CA/R5 micelle@SiNPs) were synthesized via R5-mediated F127-CA/R5 micellesilicification in a two-phase system. F127-CA/R5 micelle@SiNPs showed ~ 17 nm of
uniform and monodisperse particles with ~ 1.5 nm thin silica layer compared to themicelle. The SiNPs exhibited almost identical KM and kcat values in CO2 hydration
activity compared to the free enzyme with enhanced thermal and storage stability.
These results implied that synthesized silica nanoparticles could protect enzymes fromexternal environments while retaining their activity with high mass transfer. Thus, ourstrategy demonstrates the successful application of CA-encapsulated silica
nanoparticles as a promising biocatalyst for CO2 sequestration by showing excellent
mass transfer and high thermal stability.

A gene expression control system designed and reconstructed by combining
biomolecular parts with known functions is called a "synthetic genetic circuit".
Synthetic genetic circuits are expected to be applied to various engineering fields, suchas metabolic control to produce target chemicals, because they can be made to executea specific purpose according to the intention of their creators. In the field of synthetic
biology, synthetic genetic circuits and artificial metabolic pathways consisting ofmultiple enzyme genes (synthetic metabolic pathways) are the main research subjects.
This presentation will focus on our previous work on engineering applications ofsynthetic biology.
Overexpression of genes in synthetic metabolic pathways for target chemical
production and permanent knockout of genes in competing pathways are often
employed to improve production titer and yield in metabolic engineering. However, thedeletion of a pathway responsible for growth and cell maintenance has not previously
been employed, even if its competition with the synthetic metabolic pathway for target
chemical production is obvious. To optimize intracellular metabolism at eachfermentation phase for bacterial growth and production, a methodology employing
conditional knockout is required. We constructed a metabolic toggle switch in
Escherichia coli as a novel conditional knockout approach and applied it toisopropanol production. The resulting redirection of excess carbon flux caused byinterruption of the TCA cycle via switching gltA OFF improved isopropanol
production titer and yield. This approach is a useful tool to redirect carbon flux
responsible for bacterial growth and/or cell maintenance toward a synthetic metabolic
pathway for target chemical production.
Chemicals production by engineered microorganisms often requires induction of target
gene expression at an appropriate cell density to reduce conflict with cell growth. The
lux system in Vibrio fischeri is a well-characterized model for cell density-dependent
regulation of gene expression termed quorum sensing (QS). However, there are
currently no reports for application of the lux system to microbial chemical production.
Here, we constructed a synthetic lux system as a tunable cell density sensor-regulator
using a synthetic lux promoter and a positive feedback loop in E. coli. In this system,
self-induction of a target gene expression is driven by QS-signal, and its threshold celldensity can be changed depending on the concentration of a chemical inducer. We
demonstrate auto-redirection of metabolic flux from central metabolic pathways
toward a synthetic isopropanol pathway at a desired cell density resulting in asignificant increase in isopropanol production.
Synthetic microbial consortia consisting of microorganisms with different synthetic
genetic circuits or divided synthetic metabolic pathway components can exert
functions that are beyond the capacities of single microorganisms. However, few
consortia of microorganisms with different synthetic genetic circuits have beendeveloped. We designed and constructed a synthetic microbial consortium composedof an enzyme-producing strain and a target chemical-producing strain using E. coli forchemical production with efficient saccharification. The enzyme-producing strain
harbored a synthetic genetic circuit to produce beta-glucosidase, which converts
cellobiose to glucose, destroys itself via the lytic genes, and release the enzyme when
the desired cell density is reached. The target chemical-producing strain was
programmed by a synthetic genetic circuit to express enzymes in the synthetic
metabolic pathway for isopropanol production when the enzyme-producing strain
grows until release of the enzyme. Our results demonstrate the benefits of synthetic
microbial consortia with distributed tasks for effective chemical production frombiomass.

Enzyme-based biocatalysts for CO2 capture

Synthetic biology for microbial production○Chang Sup Kim(Yeungnam University)

Key words

enzyme, biocatalysts, carbon dioxide capture○Taizo Hanai(Grad. Sch. Agric., Kyushu Univ.)

Key words

synthetic biology, genetic circuit, synthetic pathway

168

2S-Ja06 〈招待講演（台湾生物工学会）〉

2S-Ja07 〈招待講演（韓国生物工学会）〉

Towards carbon net zero using microalgae for high-value
compounds

Synthetic gene expression control systems in
microorganisms○I-Son Ng(National Cheng Kung University)
yswu@mail.ncku.edu.tw○SangWoo Seo(Sch. Chem. Biol. Eng., Seoul National University)
swseo@snu.ac.kr

Microalgae are the oldest photosynthetic organisms on the earth. During the natural
evolution process, microalgae have adapted to environmental changes for capture,
store and utilize atmospheric carbon dioxide through photosynthesis. Compared toother carbon capture and storage strategies, such as geologic sequestration, using
microalgae carbon fixation has advantages of high carbon dioxide uptake rates, highbiomass productivity, and potential for producing value-added products. Thus, themicroalgae are considered the superior candidate to reduce the greenhouse effect andachieve carbon neutralization.
Among most of new technologies, CRISPRi (clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats interference) is a powerful tool to manipulating gene regulation indifferent type of cells. Therefore, we use CRISPRi mediated on the endogenous
PEPC1 gene in Chlamydomonas reinhardtii for the first time. All CrPEPC1 downregulated strains have lower chlorophyll color, but higher biomass concentration andlipid accumulation rate. We reveal that CRISPRi based transcriptional silencing wasapplicable in C. reinhardtii and expanded the way to improve the yield, titer, andproductivity of microalgae-based products.
On the other hand, carbonic anhydrase, (CA) converts atmospheric CO2 to bicarbonate
which is crucial for carbon‐concentrating mechanism (CCM) in microalgae and boosts
cell density. Therefore, C. reinhardtii harboring the heterologous CA from
Mesorhizobium loti (MlCA) and Sulfurihydrogenibium yellowstonense (SyCA) were
explored to increase CO2 capture and utilization (CCU) through different culture
devices. Genetically modified C. reinhardtii was able to grow from mixotrophic toautotrophic conditions. By integrated SyCA to Chlamydomonas reinhardtii, the lutein
and lipid production are maximized to 21.32 mg/L and 672 mg/L using photobioreactor (PBR) with 5% CO2. Moreover, CO2 assimilation rate was 2.748 g-CO2/gDCW and 2.792 g-CO2/g-DCW under mixotrophic and autotrophic conditions,
respectively. Finally, a better carbon net zero technology should be considered to
produce valuable chemicals toward a sustainable society in the future.

In this talk, we introduce newly developed synthetic gene expression control systems
in bacteria. First, we demonstrate that a synthetic protein quality control (ProQC)
system which enables translation only when both ends of mRNAs are present andfollowed by circularization based on sequence-specific RNA–RNA hybridization canbe applied for various metabolic engineering applications. Second, to precisely control
the gene expression level, we introduce tunable CRISPRi systems at bothtranscriptional and translational levels by engineering sgRNA and crRNA. Finally, asynthetic translation coupling system (synTCS) that allows translation of thedownstream mRNA only when the upstream mRNA is translated with the intended
ratio in a polycistronic mRNA will be described. We believe that these tools can beapplied to improve the efficiencies of metabolic pathways.

Towards carbon net zero using microalgae for high-value compounds

Synthetic gene expression control systems in microorganisms○I-Son Ng(National Cheng Kung University)

Key words

carbon dioxide, microalgae, cyanobacteria, genome engineering○SangWoo Seo(Sch. Chem. Biol. Eng., Seoul National University)

Key words

synthetic biology, metabolic engineering

169

2S-Jp01 〈招待講演（韓国生物工学会）〉

2S-Jp02 〈招待講演（台湾生物工学会）〉

Chimeric immune cells: Engineered to expand their
therapeutic potentials

Expansion and differentiation of human hematopoietic
stem cells for immunotherapy○Hee Ho Park
(Dept. Bioeng., Coll. Eng., Hanyang Univ., Republic of Korea)
parkhh@hanyang.ac.kr○Chao-Ling Yao(Dept. Chem. Eng., Natl. Cheng Kung Univ., R.O.C)
yao8@gs.ncku.edu.tw

Severe infectious diseases, such as coronavirus disease 2019 (COVID-19), can induce
hypercytokinemia and multiple organ failure. In spite of the growing demand for
peptide therapeutics against infectious diseases, current small molecule-based
strategies still require frequent administration due to limited half-life and enzymatic
digestion in blood. To overcome this challenge, a strategy to continuously express
multi-level therapeutic peptide drugs on the surface of immune cells, is established.
Here, chimeric T cells stably expressing therapeutic peptides are presented fortreatment of severe infectious diseases. Using lentiviral system, T cells are engineered
to express multi-level therapeutic peptides with matrix metallopeptidases- (MMP-) andtumor necrosis factor alpha converting enzyme- (TACE-) responsive cleavage sites on
the surface. The enzymatic cleavage releases -carboxyglutamic acid of protein C(PC-Gla) domain and thrombin receptor agonist peptide (TRAP), which activate
endothelial protein C receptor (EPCR) and protease-activated receptor-1 (PAR-1),
respectively. These chimeric T cells prevent vascular damage in tissue-engineeredblood vessel and suppress hypercytokinemia and lung tissue damages in vivo,
demonstrating promise for use of engineered T cells against sepsis and otherinfectious-related diseases.

Dendritic cells (DCs) and neutrophils are promising cell types for cell immunotherapy
due to their unique functions. The generation of DCs and neutrophils for clinicalimmunotherapy requires the use of well-defined components and culture conditions tofollow clinical regulations. Therefore, the aim of this presentation was to propose
serum-free culture systems for the induction of DCs and neutrophils. In a previous
study, we developed a serum-free HSC expansion system (SF-HSC medium) to expand
large numbers of primitive HSCs ex vivo. Herein, DC and neutrophil induction
medium (DC medium and neutrophil medium) were proposed to further generate large
numbers of functional DCs and neutrophils, respectively from serum-free expanded
HSCs, which were developed and the biological cell functions were confirmed
including surface antigen expression, endocytosis ability, mixed lymphocyte reaction,
specific cytokine secretion, lipopolysaccharide stimulation, phagocytosis, chemotaxis,
ROS production, NET formation and bacterial challenge (pathogen-killing ability) in
NOG. Taken together, our results demonstrated that serum-free expanded HSCs
showed the excellent the ability to differentiate into DCs and neutrophils, and a
combination of induction system and HSC expansion system can efficiently induce andexpand large quantities of functional DCs and neutrophils, respectively. These induced
DCs and neutrophils can serve as an excellent cell model for basic research andprovide a promising cell source for cell immunotherapy in the near future.

Chimeric immune cells: Engineered to expand their therapeutic potentials

Expansion and differentiation of human hematopoietic stem cells for
immunotherapy○Hee Ho Park
(Dept. Bioeng., Coll. Eng., Hanyang Univ., Republic of Korea)

Key words
solid tumor, DNA/polymer nanocomplex, in vivo CAR-macrophage,
cytotoxic T lymphocyte○Chao-Ling Yao(Dept. Chem. Eng., Natl. Cheng Kung Univ., R.O.C)

Key words

hematopoietic stem cells, dendritic cells, neutrophils, immunotherapy

170

2S-Jp03

Morphology-based quality control and intelligent process
management for cell-based product manufacturing

2S-Jp04○Ryuji Kato1,2(1 Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2 Inst. Nano-life Sys., Inst.
Inov. Fut. Soc., Nagoya Univ.)
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp

Cell-based products have emerged as a promising therapeutic approach, offering
potential treatments for currently incurable diseases that cannot be effectively
addressed by traditional chemical-based drugs. Recent advancements in animal cell
culture technologies, including stem cell engineering and tissue engineering, have
paved the way for successful clinical trials worldwide. As a result, cell-based products
have gained recognition as the new frontier in drug development, holding immense
market potential.
Despite the increasing enthusiasm surrounding cell-based products, manufacturing live
and fragile cells with consistently high quality poses significant challenges.
Conventional cell quality evaluation methods, which are often invasive and expensive,
are incompatible with the cell manufacturing process. Furthermore, animal cell culture
techniques have remained relatively primitive, relying heavily on human skill andexperience. The current manual processes with a lack of quality monitoring technology
have become a bottleneck for the industrialization and global expansion of cell-based
product distribution.
In Japan, bio-chemical engineers have been leading various engineering endeavors tofacilitate the industrialization of cell manufacturing. The process development andoptimization technologies fostered in the biological manufacturing industry offer
valuable insights for cell-based product manufacturing. This presentation highlights
recent engineering challenges, with a focus on the integration of artificial intelligence(AI) and digital transformation (DX) technologies, to establish consistent
manufacturing processes for cell-based products. These examples serve as a starting
point for further discussions on overcoming the hurdles and realizing the full potentialof cell-based product industrialization.
In this presentation, we will introduce Morphology-based quality control, a cuttingedge technology that combines image processing and artificial intelligence[1, 2]. Thisapproach improves cell manufacturing processes by using images and AI models.
Through our examples, we will demonstrate how this innovative method canrevolutionize the traditional human-dependent cell culture process. Additionally, we
are working on developing more applications that use image data to better understandcell culture techniques. This comprehensive data transformation effort has great
potential for advancing cell manufacturing.
References:[1] Imai Y, et al.: Scientific Reports, 12, 9296 (2022)[2] Suyama T, et al.: Regeneration and Inflammation, 42, 30 (2022)

Morphology-based quality control and intelligent process management forcell-based product manufacturing○Ryuji Kato1,2(1 Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2 Inst. Nano-life Sys., Inst. Inov. Fut. Soc.,
Nagoya Univ.)

Key words
intelligencecell morphology, cell manufacturing, quality control, artificial

New medical solutions created by Cyfuse's innovative
Bio-3D printing technology
サイフューズの革新的なバイオ 3D プリンティング技術
が生み出す新しい医療技術○Toshihiko Maekawa(Cyfuse Biomedical)
toshihiko.maekawa@cyfusebm.com

We have been making 3D tissues from cells only, based on the corporate philosophy of"contributing to dramatic advances in medical care through the practical application of
innovative 3D cell stacking technology."
Currently, in the field of regenerative medicine, we have obtained approval from the
Ministry of Health, Labor, and Welfare for large artificial organs with functions such as
nerve regeneration, osteochondral regeneration, and blood vessel regeneration, which
are made from only patient cells as raw materials. We are proceeding with
development with the aim of putting it into practical use.
On the other hand, this 3D cell stacking technology can be extended to the field ofreproducing some functions of human organs outside the body which will change themethod for developing new products in the fields of drug discovery, foods, cosmetics,
etc.
Using our unique basic technology, we have developed a small device that extracts apart of the functions in the human body and reproduces it outside the body by a special
cell processing and culture technology called "functional cell device" (FCD), and foods
and cosmetics. We are planning a business to develop in the "healthcare" field. As thefirst step, we have developed a three-dimensional liver structure (3D mini-liver). The
in vitro human liver model has a wide range of uses, such as evaluation ofhepatotoxicity of drugs, elucidation of drug metabolism mechanism, and model of liverdisease. In this report, we will outline it together with actual examples in regenerative
medicine.
当社（株式会社サイフューズ）は、2010 年の創業以来、「革新的な三次元細胞積層技術の実用化を通じて医療の飛躍的な進歩に貢献する」という企業理念のもと、細胞のみから作製した立体的な組織・臓器を難病に苦しむ患者や先端医療の現場へ届け、未来社会の次世代「医療」に貢献することを目指すベンチャー企業である。その基盤となる技術は、独自に開発した「剣山方式」と呼ばれるものである。細胞が自己凝集してできたスフェロイドを、あらかじめデザイン
した通りにニードルアレイ上に積層・配置することで任意の三次元形状に組織を形作り、続く熟成培養を経ることでスフェロイド同士が融合した細胞だけで構成された３次元細胞組織を作製する画期的な技術である。
現在、当社では、再生医療分野において、患者の細胞だけを原材料として作製した神経再生、骨軟骨再生、血管再生等の機能を有する大型の人工臓器を、医薬品等の既存の製品や自由診療のようなサービスとは異なり、厚生労働省の承認を取得かつ保険収載された新たな製品（「再生医療等製品」）として実用化することを目指して開発を進めており、いくつかの製品はヒト臨床試験の段階に来ている。
一方で、本三次元細胞積層技術は、ヒトの臓器の一部機能を体外で再現する分
野への拡張も可能であり、創薬、食品や化粧品等の分野での新製品開発における手法を一変する新たな技術として用いられるなどヘルスケア分野における複数市場の潜在ニーズに大きく合致・貢献できる可能性が非常に高い。
具体的には、当社独自の基盤技術でしか実現できない「機能性細胞デバイス」（FCD 製品）という、特殊な細胞加工・培養技術によってヒト体内の機能の一部を取り出して体外で再現した小型のデバイスを、医薬品・食品・化粧品等の「ヘルスケア」分野において展開する事業を計画している。第一弾として三次元
肝臓構造体（ヒト 3D ミニ肝臓）を開発した。薬物の肝毒性評価、薬物代謝機
構解明、肝臓疾患のモデルなど、in vitro のヒト肝臓モデルの用途は広い。従来の評価系として使われてきた平面（2 次元）培養のヒト初代培養肝臓細胞では、短期間で代謝活性が低下するなどの課題があり、培養培地の改良や 3 次元培養系の検討などが報告されてきた。我々は、自社で開発したバイオ 3D プリンタを用いて作製したヒト肝臓細胞のみからなる大きさ 1 mm 程度の 3D ミニ肝臓は、個々のばらつきを抑えることで再現性の高い評価系を構築できる特徴も有している。本報告では、再生医療での実例、機能性細胞製品としての実例について概説する。

New medical solutions created by Cyfuse's innovative Bio-3D printing
technology○Toshihiko Maekawa(Cyfuse Biomedical)

Key words

Bio-3D printing, cell aggregation, 3D tissue, regenerative medicine

171

2S-Jp05 〈招待講演（韓国生物工学会）〉

2S-Jp06

Improving CHO cells' energy metabolism using processengineering approaches

Engineering of Escherichia coli chromosome to generate
plasmid-free strains which are capable of producing
valuable compounds○Daisuke Koma
(ORIST)koma@orist.jp○Jong Youn Baik(Inha University)
jybaik@inha.ac.kr

Chinese hamster ovary (CHO) cells are widely used to produce biopharmaceuticals
such as monoclonal antibodies. While the product titer of CHO cultures has drasticallyincreased over past three decades, most of the efforts had focused on the increase of
biomass rather than the specific productivity. The limited success on the increase in
specific productivity of CHO cells is presumably due to the inefficient energy
metabolism of CHO cells, characterized by excessive aerobic glycolysis during the
exponential growth phase. Aerobic glycolysis and its by-product lactate accumulation
are usually associated with adverse culture phenotypes such as poor cell viability andproductivity. Due to the lack of knowledge on underlying mechanisms andaccompanying biological processes, the regulation of aerobic glycolysis has been an
ongoing challenge in culture process development for therapeutic protein productivity.
NAD+, a coenzyme and co-substrate in energy metabolism, promotes the conversion of
inefficient glycolysis into an efficient oxidative phosphorylation pathway. However,
the effect of NAD+ on CHO cells for biopharmaceutical production has not beenreported yet. In this work, we aimed to elucidate the influence of NAD+ on cell culture
performance by examining metabolic shifts and mAb productivity. The
supplementation of NAD+ increased the intracellular concentration of NAD+ andpromoted SIRT3 expression. Antibody titer and the specific productivity in the growthphase were improved by up to 1.82 and 1.88-folds, respectively, with marginal
restrictions on cell growth. NAD+ significantly reduced the accumulation of ROS andthe lactate yield from glucose, determined by lactate accumulation versus glucose
consumption (YLAC/GLC). In contrast, oxidative phosphorylation capacity and aminoacid consumption rate increased substantially. Collectively, these results suggest that
NAD+ contributes to improving therapeutic protein productivity in bioprocessing via
inducing an energy metabolic shift.

Introduction
Fossil resources are considered limited resources, and use of it cause increase of
atmospheric carbon dioxide. Therefore, the production of materials from renewable
resources like biomass has been focused on developing sustainable social systems. In
such background, I have been working on the production of aromatic compounds fromcarbohydrates by genetically modified microorganisms.
Aromatic compounds are an important class of chemicals that are used in many fields.
Fortunately, phenylalanine (Phe) and tyrosine (Tyr) have been commercialized bycompanies and there are many related articles about gene modifications andproductions. Thus, we introduced the genes related to the shikimate pathway (Phe andTyr synthetic pathway) and the synthesis of various aromatic compounds into
Escherichia coli cells to generate aromatic compound producing-E. coli strains.
Chromosome integration (generation of plasmid-free strain)
E. coli is a good strain for genetic engineering because of easy handling, available formany genetic tools and information, and many successful data for synthesis of valuable
products. For the generation of a strain capable of producing valuable product,
introduction of synthetic pathway genes is one of important techniques. Most studies
are using plasmids for gene introduction. Plasmids are the good tool for genetic
modification of E. coli, in particular, multicopy plasmids are convenient and powerfulvehicles for the overexpression of heterologous genes. However, use of plasmids
frequently causes troubles including metabolic burden. To circumvent such issues, we
introduced synthetic genes into the E. coli chromosome to generate plasmid-freestrains. To integrate the pathway genes into E. coli chromosome, we used the
traditional methods consisting of red-recombination, P1 transduction, and FLP/FRT
recombination. Using the methods, several aromatic compounds could be produced
from glucose by chromosome engineered E. coli strains. However, the yields of therespective compounds were not sufficient because only three genes were integrated forthe shikimate pathway modification.
Toward high yield of Phe and Tyr (a platform strain for production of aromaticcompounds)
To improve the yields of aromatic compounds, the central metabolic pathway and theshikimate pathway were genetically engineered. In particular, overexpression of tktAgene seemed to be necessary for high yield of Phe and Tyr in the many previous
studies. However, tktA overexpression distinctly decreased yield in the chromosome
engineered E. coli. By spending many efforts and periods, high yield of Phe and Tyr
were finally achieved along with tktA overexpression. The generated strain possessed
T7 promoter controlled ten genes on the six loci of the chromosome.
Application of the platform strain to generate hydroxytyrosol-producing strain
3-Hydroxytyrosol (HT), is a natural polyphenol found mainly in olive. HT is a superantioxidant that protects human cells from active oxygen. In addition, many
physiological effects have been reported so far. HT is now used in cosmetics, dietary
foods, and pharmaceuticals. A critical issue of natural olive HT is extremely
expensive. Chemically synthesized one is also expensive and environmentally
unfriendly. As an alternative method, bioproduction is very attractive. Several
substrates have been tested for HT production to date. Glucose is one of possible
substrates; however, HT titer was less than 1 g/L until 2020. We generated HTproducing strain from the platform strain, which produced approximately 9 g/L HT by
fed-batch cultivation in 3 L jar fermenter, and applied to patent in 2021; patentdecision in 2022. We purified the HT from the fermenter, and then collaborators
demonstrated that it could be used for a component of high-performance biomimetic
glue. The study is now addressing to increase HT titer furthermore for industrial
application.
Acknowledgments
This study was partially supported by the JST Adaptable and Seamless Technology
Transfer Program through Target-driven R&D (A-STEP), Grant Numbers
JPMJTM19CC and JPMJTM20QJ, and also partially supported by JSPS KAKENHI
Grant Numbers 19780082 and 21780105.

Improving CHO cells' energy metabolism using process engineering
approaches

Engineering of Escherichia coli chromosome to generate plasmid-freestrains which are capable of producing valuable compounds

Key words
Chinese hamster ovary cell, biomanufacturing, media development,
energy metabolism

Key words○Jong Youn Baik(Inha University)○Daisuke Koma
(ORIST)

Escherichia coli, fermentation, metabolic engineering

172

2S-Jp07

Biohydrogen and methane production process frombiomass and hydrolysate of Chlorella sp. and Chlorella
sp. TISTR 8411

2S-Jp08

Engineering Saccharomyces cerevisiae as whole-cellbiocatalysts for biochemical production○Surisa Suwannarangsee, Kan Tulsook, Piyada Bussadee,
Ngoentra Samnaknit, Verawat Champreda(BIOTEC, Thailand)surisa.suw@biotec.or.th○Alissara Reungsang, Prawan Phanduang, Apilak Salakkam(Dept. Biotechnol., Khon Kaen Univ., Khon Kaen, Thailand)alissara@kku.ac.th

Microalgal biomass is regarded as the third-generation feedstock for biofuels
production. This owes to its high fermentable content, and its advantages over biomassof the first (starch and sugar) and second generations (lignocellulosic biomass),
including higher biomass productivity and lower lignin composition. However, theutilization efficiency of the biomass is still poor, warranting the need of improvement
for the process to be viable. This presentation demonstrates the feasible processes forbiohydrogen and methane production from Chlorella sp. and Chlorella sp. TISTR 8411
biomass including Process I: anaerobic solid-state fermentation (ASSF), Process II:
ASSF followed by dark fermentation (ASSF-DF), Process III: DF followed byanaerobic digestion (DF-AD), Process IV: DF followed by photo-fermentation (DFPF), and Process V: DF followed by AD (DF-AD). It was found that Chlorella sp.
biomass is the highly potential feedstock for biohydrogen and methane production, andthat Process V is the most effective energy recovery process from the biomass.
Additionally, the integrated processes, whether DF-PF or DF-AD, were more effective
than the single ones.

In recent decades, the shift from chemical processes to greener biocatalysis processes
has gained increasing attention due to substantial environmental concerns and thesustainability of the process. Whole-cell biocatalysts, which offer mild operational
conditions, high selectivity, and biodegradable properties, have been developed to
produce various specialty and commodity chemicals. As Thailand contains abundantand low-cost agricultural resources, it would be a great opportunity to enable economic
production of bio-based chemicals within the country. In this presentation, we will
highlight our recent research on the development of yeast whole-cell biocatalysts forbiochemical production. Firstly, we constructed a Saccharomyces cerevisiae strain that
expresses trehalose synthase on the cell surface using our unique anchoring protein
system. This engineered yeast strain was then utilized as a whole-cell biocatalyst forthe biotransformation of maltose into trehalose, which is a multifunctional sugar thatfinds applications in the food, cosmetic, and pharmaceutical industries. The second
research focus is on engineering Trichoderma reesei and S. cerevisiae for thebioconversion of pectin-rich biomass into D-galacturonic acid. This study
demonstrates the potential application of yeast whole-cell biocatalyst platforms in the
biocatalysis of inexpensive feedstock into valuable products.

Biohydrogen and methane production process from biomass andhydrolysate of Chlorella sp. and Chlorella sp. TISTR 8411

Engineering Saccharomyces cerevisiae as whole-cell biocatalysts forbiochemical production○Alissara Reungsang, Prawan Phanduang, Apilak Salakkam(Dept. Biotechnol., Khon Kaen Univ., Khon Kaen, Thailand)

Key words

biomass, microalgae, methane fermentation, hydrogen production○Surisa Suwannarangsee, Kan Tulsook, Piyada Bussadee, Ngoentra Samnaknit,
Verawat Champreda(BIOTEC, Thailand)

Key words
trehalose

Saccharomyces cerevisiae, whole cell biocatalyst, cell surface display,

173

2S-Jp09

Building a sustainable bioeconomy in Singapore throughsynthetic biology

2S-Ka01

基礎から応用、サイエンスとテクノロジー、個と集団の微生物研究センター○野村 暢彦
（筑波大・微生物サステイナビリティ研究センター）
nomura.nobuhiko.ge@u.tsukuba.ac.jp○Matthew Chang(NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation,
National University of Singapore)bchcmw@nus.edu.sg

This talk will touch upon Singapore’s existing initiatives to nurture research talent andbring innovative biomanufacturing technologies to market, as well as highlight the
myriad ways the Republic’s synthetic biology community is laying the foundations fora sustainable bioeconomy.

微生物は環境・食・健康に広くそして深くかかわっている生き物である。筑波大学微生物サステイナビリティ研究センターは微生物の利用・制御をとおして、
21 世紀の環境・食・健康の分野に貢献することを目指し創設されたセンターである。微生物の研究も基礎から応用まで、サイエンスからテクノロジーまで微生物分野のみならずそれらの微生物研究を推進に必要な他分野の研究者までを集めた研究者集団である。関連する学術コミュニティも、医学・理学・工学・
農学・環境まで幅広く網羅している。
具体的には、以下のように２つの部門と国際・産学連携部門で構成されている。
「次世代微生物制御部門」
地球の生態系は微生物で溢れており、動物、植物、他の微生物との関わり合いによって生態系が守られています。しかし、最先端の科学によってもこの多くが未解明のままとなっています。本部門では微生物と他者の関わりを探る新たな技術の構築と解明によって、水と土を保全し、人類の食と健康を守るイノベー
ションを目指して研究開発を進めています。具体的には、腸内細菌とヒト、病原菌と植物、微生物同士の分子・細胞レベルでの相互作用を独自に開発した顕微分光技術等によって解明しています。また生態系における微生物の役割についての研究も進めています。こうした研究により微生物と他者との「会話を聞く」ことを通して、プロバイオティクス、作物病害の防除、水処理技術の改善
等のイノベーションに貢献する多くの基礎的知見が得られています。
「次世代微生物利用部門」
微生物には人知を超えた多様な種が存在し、それぞれが多様な能力を持っています。この力を活用することで、バイオマスを原料として新たな機能性材料・化合物を作ることができます。これによって、二酸化炭素削減、省エネルギー、
健康に役立つイノベーションを目指しています。このために、本部門ではバイオマス由来の高機能性プラスチックやその原料の開発、健康を守る医薬や機能性化合物の開発などの微生物発酵による生産に取り組んでいます。また、最新の顕微鏡技術を活用した発酵生産菌の育種に関する研究も進めています。さらに、こうした取組等を通じて得られる新たな微生物と遺伝子を、生物・遺伝子資源として守る取り組みも進めます。
「国際・産学連携推進部門」
本部門では、国内外の研究機関や企業との連携を推進し、微生物の制御と利用を通した持続可能な社会の構築と新たなイノベーションの創出を担う研究を推し進めます。
本講演では、各部門の取り組みとともに、それらの最新の研究成果をまじえて紹介させていただく。

Building a sustainable bioeconomy in Singapore through synthetic biology

About Microbiology Research Center for Sustainability [MiCS]○Matthew Chang(NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation, National
University of Singapore)

Key words

synthetic biology, Singapore○Nomura Nobuhiko(MiCS, Univ Tsukuba)

Key words

microbe174

2S-Ka02

バイオとデジタルの技術融合による先端バイオ工学研究
プラットフォーム確立に向けた挑戦

2S-Ka03

低温と嫌気―微生物の培養が切り拓くタンパク質研究の新展開○渡邉 友浩, 福井 学
（北大・低温研）
watanabe1986@lowtem.hokudai.ac.jp○蓮沼 誠久 1,2,3（1 神戸大・先端バイオ工研セ, 2 神戸大院・科技イノベ, 3 理研・
環境資源）
hasunuma@port.kobe-u.ac.jp

経済協力開発機構はバイオ産業の市場規模が 2030 年に 1.6 兆ドルに成長すると予測し、分野別内訳の中で工業（モノづくり）分野が 39%を占めるとしている。生物資源とバイオテクノロジーを用いて地球規模の課題解決と経済発展の共存を目指す概念は「バイオエコノミー」と言われ、欧米諸国をはじめとする多くの国が戦略的な取り組みを進めている。わが国では統合イノベーション戦
略 2022 が閣議決定され、バイオコミュニティやバイオものづくりを核とした市場拡大戦略が打ち出された。特筆すべきはこの中で、合成生物学を活用した異分野との共同開発の加速、バイオものづくりの中核を担う微生物設計プラット
フォームの育成が記載され、産業界のニーズを踏まえた基盤技術開発、拠点形
成及び人材育成、生物資源関連ビッグデータ利活用等への積極的な取り組みが求められている。研究の方向性としては、バイオとデジタルの融合指針が明文化されている。
近年のバイオ研究の潮流として、異分野とりわけデータサイエンスやロボティ
クスとの融合が急速に進み、データ駆動型の合成生物学、バイオ実験のロボティ
クス化、さらにそれらを実装した研究開発プラットフォームの創出が世界的に行われている。バイオものづくり分野では発酵生産がその中核を成すことから、
ターゲット物質を高生産できる微生物株の育種基盤の開発が進められ、世界的な競争領域となっている。
神戸大学先端バイオ工学研究センターでは、計算科学的手法を用いた代謝設計
や酵素設計、ロボティクスによる遺伝子組換え微生物株構築や変異体酵素ライ
ブラリー構築等に取組み、スマートセル（計算科学で設計され、先端遺伝子工学で構築された物質生産細胞）創出プラットフォームを開発してきた。デジタル技術との融合により、産業展開可能な微生物株や酵素が開発されてきている。
一方で、こうした革新の源泉はデータであり、それを生み出す分析評価技術である。また、超臨界流体を用いたハイスループットな微生物スクリーニング技
術や、前処理工程の自動化により再現性を飛躍的に向上させたメタボロミクス技術等を開発してきた。本講演では、これらを組込んだ「スマートセル創出プ
ラットフォーム（バイオファウンドリ）」を紹介し、未来の生物工学を展望したい。
神戸大学では科学技術イノベーション研究科、工学研究科、農学研究科、理学研究科等の綿密な連携により、文部科学省の先端融合イノベーション創出拠点形成事業「バイオプロダクション次世代農工連携拠点」を実施したほか、経済産業省委託事業「革新的なバイオマテリアル実現のための高機能化ゲノムデザ
イン技術開発」、AMED 委託事業「次世代治療・診断実現のための創薬基盤技術開発」，NEDO 委託事業「植物等の生物を用いた高機能品生産技術の開発」などをとおして、バイオプロダクションに関する多数の研究開発や人材育成事業を行ってきた。また、多くの大学や理化学研究所，産業技術総合研究所，そして数十社の企業と協働研究開発を推進してきた。
先端バイオ工学研究センターは、こうした神戸大学の強みと特色を生かし、先端バイオ工学の開拓推進を行うとともにイノベーションの創出を目指す国内唯一の研究センターとして、2018 年 7 月 1 日に設立された。本研究センターは、
産学官連携による先端的な研究開発を推進するとともに、研究開発のプラットフォームを構築・集積してハード（研究スペース，機器）とソフト（研究者，知財）を整備したイノベーションハブとなることを目指している。先端バイオ工学における教育研究実績や関係機関との連携協力関係を基盤として、国や社会の要請に応えて多様な有用物質のバイオプロダクションの実現をはじめとするイノベーション創出を行うことでバイオエコノミーを牽引することを目指す
当研究センターの取り組みついても紹介できればと思う。

持続可能社会を目指す上で、自然現象の基礎を理解し、そこに学ぶことは重要である。低温科学研究所は、低温環境における自然現象の基礎と応用の研究を
国内外の研究機関と連携しながら推進している。微生物生態学分野では、寒冷圏の微生物生態系を中心とした研究を展開している。フィールドワークを起点に、情報生物学（メタゲノムやメタトランスクリプトームなど）によって様々な微生物生態系の遺伝子情報を解析している。通常、ゲノムは典型的なパイプ
ラインを通して解析されるが、出力結果を改めてつぶさに解析すると、奇妙な遺伝子（構成）を持つ環境微生物ゲノムが見つかる例がある。これらは遺伝子資源の原石といえる。そのポテンシャルを実験的に検証することができれば、社会実装への道筋がみえてくると考えられる。しかし、環境微生物（非モデル微生物）の培養は難しい。環境中の９割以上の微生物は実験室では培養できな
いと考えられており、仮に培養に成功したとしても培養条件を最適化しなければ社会実装を見据えた研究への発展は難しい。つまり、環境微生物ゲノムの遺伝子資源を開拓するボトルネックは、培養にあると言える。低温科学研究所微生物生態学分野では、未培養微生物の「分離培養」と培養株の「培養条件の最適化」を通じて、環境微生物の実験研究の限界に挑戦している。例えば、演者らは生化学研究に乏しかったメタン生成アーキアの大量培養を実現することで、そのヘテロジスルフィド還元酵素（Hdr）複合体が CO2 還元・固定酵素と超複合体を形成することを発見し、Hdr 複合体が活性化した電子が CO2 還元を推進することを見出した。一方で、Hdr 複合体の遺伝子配列はメタン生成アーキア
以外の多様な微生物ゲノムにも保存されており、高度に多様化している。多様化した Hdr 複合体の真の機能は未知であるが、少なくとも様々なエネルギー代
謝において中心的な役割を担うと考えられている。未知 Hdr 複合体の実験研究を実現するためには、様々な微生物を大量培養する必要がある。我々は、硫黄酸化菌の大量培養によって、新しい Hdr 複合体を精製することに成功し、その構造をクライオ電子顕微鏡で解析している。本講演では、我々が展開している
環境微生物（非モデル微生物）のゲノムとタンパク質研究の現状を紹介し、機関連携による生物工学研究の可能性を議論する。

Challenge to establish advanced bioengineering research platform byintegrating biotechnology and digital technology

Protein research from environmental microbes in cold and anoxic
environments○Tomohisa Hasunuma1,2,3(1 EGBRC, Kobe Univ.,, 2 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 3 CSRS,RIKENS)

Key words

metabolic engineering, microbe, enzyme, metabolism○Tomohiro Watanabe, Manabu Fukui(ILTS, Hokkaido Univ.)

Key words
bacteria

enzyme purification, enzyme reaction, bioinformatics, environmental

175

2S-Ka04

多様な智を繋ぐネットワーク形成：集積知で生きる個性○片岡 正和（信州大院・生命医工）mars@shinshu-u.ac.jp

2S-Ka05耐熱性微生物の特性とそれを生かしたグリーンエネル
ギー技術開発○山田 守 1,2
（1 山口大院・創科, 2 山口大・中高温セ）
m-yamada@yamaguchi-u.ac.jp

信州大学では，次世代の研究クラスターとして「応用微生物学ルネサンスセン
ター（Renaissance Center for Applied Microbiology :RCAM」を組織し，県内に散在する信州大学の微生物研究者や県内研究所の職員を繋ぐのみならず，論理的生命科学進展に必要な全国の研究者ともネットワークを形成し，知を集積，次世代に展開することを目指しています。RCAM は，微生物学の最前線を走り続ける全国の研究者たちが集い，知識を共有し，新しい領域へ挑戦する機会を提供する場をめざしています。その究極の目的は，全国の微生物研究者のコミュ
ニケーションを活発化させ，知を集積し，個々の研究を強化することです。集積知を活用し，現在の私たちの知識を超えて，多様な分野での新しい発見や研究成果を生み出し，日本の科学競争力を高めたいと考えています。
日本の科学技術の強みとして，賛否両論はあるにせよ，村社会とも呼べるネッ
トワーク形成が存在しています。これは日本独特のものではなく，ユヴァル・
ノア・ハラリがサピエンス全史で指摘したように，人類を人類たらしめた広義の「宗教」と同様の役割を果たしていると考えられます。日本の失われた 30 年はよく言われるフレーズですが，今後どのように科学技術を繋ぎ育てていくのかは，人材が唯一の強力な資源となる日本にとって重要なテーマです。 前世紀中盤以降，量子力学に続いて生命科学は驚異的な進展を遂げてきました。微生物の研究から得られた多くの知見が分子生物学の発展に貢献しました。科学を推進する力の源である情報技術や解析技術のさらなる進展により，多くの興味は分子生物学勃興期に多くの知見をもたらした微生物の研究から，より複雑な人間の病気や高度な複合機能である脳科学，奇跡的な機能調和によってもたらされる発生などにシフトしています。この流れの中で微生物学の社会的な価値はやや薄れているように感じられますが，微生物学は「発酵」などで人類の歴史に深く関わり，感染症や腸内免疫など、人間の健康に不可欠な関係性を持っています。現在，急速に進展している技術を総合的に活用すれば、伝統的なバイオ技術を含む新たな応用微生物学の展開が可能だと考えられます。ただし、進展が早く先鋭的になっている現代の先端技術を利用するためには，細分化された生命科学技術の専門家たちの協力が不可欠であり，そのためには共通の志を持つ人々のネットワーク形成が重要です。
RCAM の実質的アプローチとして，研究者間の自由な討論や情報の流通を促進するためにビジネスチャットを設置しています。このビジネスチャットでは，さまざまな情報交換が行われるだけでなく、共同研究の始まりとなる場としても機能しています。同様の情報流通の場として，次世代の研究者に様々な機会を提供するために，学生間で情報を共有するためのビジネスチャット「RenaissanceCollege」も運用しています。加えて各分野でのトップ研究者による講演会もハ
イブリッドで開催しており，登録さえすれば日本全国どこからでも参加することができます。
信州大学内では現在 8 研究室がメインに参画しており，「放線菌の分子遺伝学」「接合を用いた DNA 導入システム」「長大遺伝子集積と DNA デリバリーシステ
ムを用いた合成生物学」「細胞内 pH 測定法の開発」「ストレス誘導性二次代謝活性化」「大腸菌単一遺伝子網羅的ノックアウト株を用いたシステム生物学」「新
しい放線菌の画期的分離手法の開発」「放線菌の潜在能力活性化技術の確立と活用」「抗生物質耐性機構の解明」「抗生物質の本質の解明」「細菌バイオフィルム
形成制御に関わる分子機構の解明」「細菌酸化ストレスセンサーの研究」「光合成微生物-セルロース生産菌人工共生によるナノセルロース生産システムの構
築」「安全な薬の生産」「担子菌類の二次代謝産物の利用」「キノコの応用研究」「藻類を用いたプロセス研究」「巨大データ解析を実現するオンライン解析環境の構築」等の広範なテーマを展開しています。
本シンポジウムではこれらの中から，演者の研究室で実施している日本の宝ともいえる森浩禎博士（元 NAIST,現広東農業科学院）が構築した大腸菌単一遺伝
子欠損ライブラリー（Keio library）を用いた外環境 pH 変化に対する pH 恒常性に関する研究を題材にしたリソースや情報処理に焦点を当てた話題を紹介します。また，RCAM ネットワークをうまく利用した東邦大―慶應大―京都大の大腸菌の高温環境適応に関する研究の進捗状況についても紹介する予定です。さらに，研究の幅広い視点やリソースの共有によって，より大きな成果を生み出すために重要な大学間の研究協力体制の構築にも言及する予定です。

山口大学中高温微生物研究センターには ASEAN 諸国との国際拠点事業等によって分離・育種した耐熱性微生物のコレクションがある。その中の耐熱性酵母を用いて高温エタノール発酵の技術開発を進めてきた。高温発酵は冷却コスト削減,糖化酵素削減,設備の簡易化など有利な点があり,次世代型の発酵技術になると期待される 1）。本発表ではバイマス需要拡大に沿って澱粉系バイマスだ
けでなくセルロース系バイマス(CB)にも使える酵母の開発や食品残渣等をグリー
ンエネルギーに変換する技術開発について紹介する。
高温エタノール発酵にはいくつかの酵母が試されているが,耐熱性が強い
Kluyveromyces marxianus の報告例が多い。特に,K. marxianus DMKU 3-1042 は完全ゲノムや種々条件でのトランスクリプトーム解析が報告され,さらに遺伝子工学的技術やシミュレーション基盤が構築されており物質生産の cell factory として注目されている 2,3）。本酵母は Saccharomyces cerevisiae と比べて糖資化スペク
トルが広く,多くの糖輸送体を有し,キシロース,アラビノース,セロビオースも利用できる。このように CB の利用能力も有し,S. cerevisiae と比べてグルコース抑制が弱く混合糖からの有用物質生産にも適している 1,2）。また,高温での生存のために代謝切替えをしているようである 4)。
主に K.marxianus を用いて高温エタノール発酵の技術開発を行った。高温発酵の温度領域では比較的弱い減圧によってエタノールを蒸留回収できることから,発酵と減圧蒸留及び膜分離を連結するプロセスを開発した 5)。また,本酵母は発酵熱による温度上昇に耐えることから,非温度制御条件でのエタノール発酵も検討した。一方,種々バイオマスに適した耐熱性酵母を分離した 1）。たとえば,キッサバ澱粉を原料とする高温発酵に適した Pichia kudriavzevii 株,多糖イヌリンからのエタノール生産能力が高い K.marxianus 株,キシロースからのエタノール生産能力が高い K.marxianus 株,グルコース抑制がなくキシロースからのエタノール生産能力が高い Spathaspora passalidorum 株などである。さらに,簡便な育種法を考案し,より耐熱性やストレス耐性の強い株を開発した 1）。
高温発酵の利点を生かしてグリーンエネルギー技術開発を進めている。清酒製
造では製造工程において大量の酒造用水を使用し,また多量の酒造残渣が発生する。そこで企業との共同研究によって,高温エタノール発酵と改質エンジンを組み合わせ,酒造残渣及び排水から電力を得る技術開発を行った。一方,食品加工過程で発生する残渣を原料として発酵から発電までの分散発電システムの開発を進めた。このシステムはコンパクトであることから災害時にも活用できると期待される。

Formation of a network that connects various types of intelligence:individuality that thrives on aggregated knowledge

Characteristics of thermotolerant microbes and technology development ofgreen energy by its application○Masakazu Kataoka(Bio.Med.Eng Grad.Sch. Shinshu Univ.)

Key words
genetics

integrated intelligence, systems biology, population and individual,

1) Lertwattanasakul, N., et al., Potential of thermo-tolerant microorganisms for
production of cellulosic bioethanol. In: Handbook of Biorefinery Research andTechnology. Springer (2023)
2) Lertwattanasakul, N., et al., Kluyveromyces marxianus as a platform in synthetic
biology for the production of useful materials. In: Synthetic Biology of Yeasts.
Springer (2022)
3) Nurcholis, M., et al., Integration of comprehensive data and biotechnological tools
for industrial applications of Kluyveromyces marxianus. Appl Microbiol Biotechnol
104: 475–488 (2020)4) Kosaka, T., et al., Distinct metabolic flow in response to temperature inthermotolerant Kluyveromyces marxianus. Appl Env Microbiol 88: 1-18. (2022)
5) Kumakiri, I., et al., Process Intensification in Bio-Ethanol Production–Recent
Developments in Membrane Separation. Processes, 2021, 9, 1028 (2021)○Mamoru Yamada1,2(1 Yamaguchi Univ. Gra, Sch. Sci. Tech. Innov., 2 Yamaguchi Univ. TMR)

Key words
thermotolerant yeast, high-temperature fermentation, ethanol
fermentation, green energy

176

2S-Kp01

ケムバイオハイブリッド合成を利用した天然物創薬○恒松 雄太（名大院・生命農学）
tsune@agr.nagoya-u.ac.jp

2S-Kp02

I 型ポリケタイド合成酵素の精密改変による次世代天然物化学○工藤 慧, 新家 一男（産総研）
kudo-k@aist.go.jp【背景・目的】
赤痢アメーバ症は世界人口の約１％が感染している腸管感染性原虫症である。
現行治療薬メトロニダゾールは遺伝毒性などの副作用、薬剤耐性原虫の出現が認められるため、別の作用点をもつ新規薬剤の開発が求められている。抗赤痢
アメーバ活性を示す化合物としては天然物フマギリン(FM)が古くから知られている。メチオニンアミノペプチダーゼ 2 (MetAP2)の強力な阻害剤である本化合物は、複数の製薬企業にて長年、がんや肥満症などの疾病を対象に化学誘導体
化(半合成)による臨床開発が行われてきた。しかし、一部被験者にて神経毒性や血栓形成など重篤な副作用が認められるなどの原因により未だ新薬承認には至っていない。この問題を解決するために、従来型の半合成とは異なる、新たな化合物開発法が必要と考えた。我々は天然物生合成遺伝子を発現制御する技
術と有機合成を組み合わせた「化学・生物ハイブリッド合成」を基盤とし、さらに薬学・医学分野との多分野(寄生虫学・感染症学・薬物代謝・毒性学など)連携を通じ新薬創製に挑戦してきた。
【方法・結果】
FM 産生菌およびその構造類縁体オバリシン(OV)産生菌から得た生合成遺伝子
を適宜組み合わせ、Aspergillus nidulans を宿主とし異種発現させることで FM・OV 類縁体である非天然型新規化合物を 40 種以上得た。天然物よりも強力な抗赤痢アメーバ活性を示した非天然型化合物 1 (構造は未公表)は、その化学構造
中に構造展開の足掛かりとして利用できる部分構造を有していた。そこで、ジャーファーメンターを用いた大量培養によって 1 をグラムスケールにて獲得する系を構築し、続いて有機合成による構造展開・最適化を行った。数十種類の構造展開の結果、in vitro において強力な抗赤痢アメーバ活性(ED50 15 nM)を示すのみならず、ヒト細胞毒性との選択性、薬物代謝抵抗性などの各種評価系
において良好な性質を示す化合物 YOK24 を見出した。YOK24 はハムスターを用いた赤痢アメーバ肝膿瘍モデルに対し、経口投与にて明瞭な治療効果を示した。

これまでに上市された医薬品のうち約３分の２は天然化合物あるいは天然化合物を由来とする合成化合物である。したがって天然化合物は最も重要な創薬資源であると考えられる。一方で現在の天然物スクリーニングにおいて新規活性物質の枯渇が問題となっている中、創薬化学においては革新的な誘導体化技術が求められている。また、近年、分子量 500 から 2,000 程度の中分子領域が注目されているが、強力な生物活性を示す中分子の多くは天然化合物である。中分子天然化合物の誘導体化におけるボトルネックの一つは、多数の不斉点を含む極めて複雑な構造を有しているため、合成化学的なアプローチによる骨格改変が極めて困難なことである。そのため、生合成機構を利用した誘導体創成技術の開発が期待されている。
天然化合物の中でもポリケタイドは、ペプチドと並び最も多様な化合物ファミリーである。多くの重要なポリケタイドは、I 型ポリケタイド合成酵素 (I 型
PKS) によって生合成される。I 型 PKS の特徴は、assembly line 型と形容される
マルチドメイン構造である。1 回のポリケタイド鎖の伸長と修飾を担うドメインのセット (モジュール) が連なり、モジュール間を生合成中間体が順次受け渡されていくことで骨格が形成される。各モジュールはポリケタイド骨格の部分構造に対応することから、モジュールの入れ替えによりポリケタイド化合物の骨格を人為的に改変することが可能であると考えられてきた。様々な I 型 PKSのモジュールを部品として再構成することで、存在し得るあらゆるポリケタイ
ド骨格が取得可能になるという戦略である。I 型 PKS のモジュールが生み出す部分構造は基本的に 14 通り存在し、これらを組み合わせることで理論上は指数関数的に骨格の多様性を得ることが可能である。しかし、このようなコンセプ
トを実現するためには I 型 PKS 遺伝子を望む位置で改変 (切り貼り) する必要があるが、従来考えられてきた方法論では効率的に改変遺伝子を取得することは極めて困難であった。その主たる要因は、I 型 PKS 遺伝子がバクテリアの中でも最大級に巨大な遺伝子であり、かつモジュール同士が非常に高い相同性を有することである。一例として、免疫抑制・抗腫瘍活性薬のラパマイシンを生合成する I 型 PKS は全長 75 kbp の 3 遺伝子にコードされた 14 個のモジュールから構成され、伸長反応を担う ketosynthase (KS) ドメイン間の塩基配列相同性は
平均 83%、最大 96%に達する。先行研究において、温度感受性ベクターを用いた相同組換えによるラパマイシン PKS 遺伝子の改変が試みられたが、600 以上の組換え体をスクリーニングしたにもかかわらず、目的のクローンは 1 つも得られなかったことが報告されている。このように相同組換えは I 型 PKS 遺伝子
に対して適用できない。また、CRISPR/Cas9 を利用した in vivo ゲノム編集は、
二本鎖切断の後に相同組換えが必須であることに加えて、上述の相同性の問題と放線菌 (多くの I 型 PKS は放線菌から発見されている) のゲノムが高 GC 含量であるためオフターゲットの回避が非常に難しいことから、有効な方法論とは言えない。
以上のような背景の下、我々は、諸問題を克服した新しい方法論として、「invitro モジュール編集」と名付けた技術を開発した。本技術は、(1) 細菌人工染
色体 (BAC) にクローニングした生合成遺伝子全長に対し、(2) in vitro で CRISPR/
Cas9 を用いた二本鎖切断を行い、(3) Gibson assembly によって目的の改変遺伝
子断片をシームレスに連結した改変 BAC を、(4) 宿主放線菌に導入して異種発現生産により骨格改変化合物の生産を評価するというものである。改変 BAC
はサンガーシーケンスによって一塩基もエラーのない配列であることを確認することが可能である。我々は feasibility study としてラパマイシン PKS を鋳型としてモジュールの欠失、交換、挿入を試み、22 種の新規骨格ラパマイシン誘導体を創製することに成功した。さらに、これらの誘導体のうち、生産性が良好であったものについて活性を評価したところ、元のラパマイシンと同等以上の
FKBP-mTOR 複合体形成促進作用を示す一方で、細胞増殖抑制作用が著しく減弱している誘導体を見出した。本化合物は triene の中央の二重結合を単結合に還元した構造を有し、合成化学的には発想されにくいことから、生合成機構を利用することの利点を示すことができたと考えている。
我々の研究開始当初の予想とは異なり、多くの場合デザイン通りに骨格改変ポリケタイドを創製可能であったことから、I 型 PKS は機能改変に対して寛容であることが明らかとなった。また、近年、遺伝子単位を基本としたモジュール
観を改め、モジュール間の基質受け渡しに基づく新しいモジュール境界が提唱された。今後はこれらの技術や知見を総合することでより高生産性、高効率なI 型 PKS 改変が可能となり、巨大で複雑な分子を人為的に創製する次世代型の天然物化学へと発展していくものと期待している。

Harnessing natural products pathway toward drug discovery

Precise edit of type I polyketide synthase leading to next-generation natural
product chemistry○Yuta Tsunematsu(Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)

Key words

synthetic biology, natural products, biosynthesis, drug discovery○Kei Kudo, Kazuo Shin-ya(AIST)

Key words

natural products, genetic engineering, polyketide, Streptomyces

177

2S-Kp03

創薬研究を指向した天然物の合成生物学研究○浅井 禎吾（東北大院・薬）teigo.asai.c8@tohoku.ac.jp

2S-Kp04

未培養微生物の遺伝子獲得に向けたシングルセルゲノミ
クスの活用○細川 正人 1,2,3,4,5（1 早大院・先進理工, 2 早大・ナノライフ創新研, 3 早大・生命動
態研, 4 産総研・早大 CBBD-OIL, 5 bitBiome）
masahosokawa@aoni.waseda.jp

微生物や植物が創り出す天然物は、これまでに多種多様な医薬品の開発に貢献してきた、重要な医薬資源である。天然物は、複雑かつ多様な構造を有しており、また、生合成過程に裏付けられる医薬品として好ましい性質、例えば、膜透過性、水溶性と疎水性のバランス、生体分子との親和性など、を有しており、現在でも、医薬品開発の有望な資源として期待されている。一方で、天然から得られる量が微量かつ再現性が低いことや複雑な構造故に有機合成による供給が難しく、また、類縁構造の創製も難しい点など、天然物を創薬研究の主要なモダリティーに再興するには、クリアしなければならない課題がいくつも存在する。
近年、ゲノム解読技術の発展によるゲノム情報の蓄積と、汎用宿主や発現ツー
ルの充実化により、ゲノム情報から天然物を合成生物学により具現化することが可能になってきた。この方法では、生合成に基づくゲノムマイニングにより、新しい天然物の探索が可能になるだけでなく、標的天然物およびその構造類縁体を合理的に創製でき、かつ、ある程度の生産量が期待できる。すなわち、天然物の合成物学研究は、従来の天然物創薬における課題であった、探索、供給、構造展開にパラダイムシフトをもたらすものである。そこで、私たちのグルー
プでも、ゲノムマイニングと異種発現を基盤とする天然物の探索および構造展
開実践している。
これまでに、植物や昆虫に内生する糸状菌を 100 種以上分離している。それらを順次ドラフトゲノム解読することで、50 種程度の糸状菌の独自のゲノム情報
ライブラリーを整備している。それらの情報を利用したゲノムマイニングにより、新規天然物の合理的な探索研究、また、活性天然物の多様な類縁体の創製を行なってきた。さらに、ごく最近、糸状菌から初となるカルコン合成酵素の発見に成功し、有用天然物の一群である植物フラボノイドの初期中間体である、S-ナリンゲニンを麹菌で de novo 生合成することに成功した。
本講演では、当研究室でこれまでに取り組んできた、糸状菌ゲノム情報を材料とした、ゲノムマイニングと異種発現を基盤とする天然物の合成生物学的な取り組みについて概説する。

環境微生物のゲノム解析は、微生物の生態系や機能の理解につながるだけでな
く、産業上有用な遺伝子資源の探索にも有効である。DNA シーケンシング技
術・バイオインフォマティクス技術の目覚ましい発展に伴い、未培養微生物の
メタゲノム解析が現在広く利用されている。メタゲノム解析は「試料にどんな
遺伝子配列“断片”が存在するか？」を知ることができる簡便で強力な方法であるが、遺伝子の“全長”やその遺伝子の “由来微生物”を正確に捉えることは苦手である。土壌のように多種多様な微生物が生息する試料では、特にこの課題が顕著になる。生合成遺伝子のような長い遺伝子クラスターをメタゲノムデータから復元することは特に難しい。そのため、従来のメタゲノム解析では未培養
微生物由来の有用遺伝子を取りこぼしていることが示唆されている。
そこで、演者らは、シングルセル解析と呼ぶ技術を開発し、微生物細胞１つから全ゲノムの解読を行う技術を開発してきた。本法では、細胞１つから取得したゲノムを比較することで、同一種内の細菌株単位での機能遺伝子・パスウェ
イの保有の違いまで、詳細な比較解析が可能である。これまでに、ヒト共生微生物叢や土壌・海洋の微生物叢解析に本手法を応用しており(Chijiiwa et al.
Microbiome 2020, Ide et al. Front. Microbiol. 2022, Nishikawa et al. ISME Commun.
2022, Hosokawa et al. J. Biosci. Bioeng. 2023)、メタゲノム解析と統合解析する手法(Arikawa et al. Microbiome 2021)、試料中の生きた細菌のみからゲノム配列を獲得する手法(Hosokawa et al. Sci. Rep. 2022)や、完全長環状ゲノムを獲得する手法(Kogawa et al. Front. Microbiol. 2023)を報告している。
本発表では、演者らの技術を土壌微生物叢解析に適用した実例から、獲得できる微生物ゲノム種、遺伝子数、生合成遺伝子クラスターの豊富さに着目して、従来のメタゲノム解析から得られる情報との違いやシングルセル解析技術が広げる微生物遺伝子活用の展望について紹介する。

Synthetic Biology of Natural Products for Drug Development

Application of Single-Cell Genomics for Obtaining Genetic Informationfrom Uncultured Microbes○Teigo Asai
(Grad. Sch. Pharm., Tohoku Univ.)

Key words

biosynthesis, genome mining, fungus, natural products○Masahito Hosokawa1,2,3,4,5(1 Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2 Res. Org. Nano Life Innov., Waseda
Univ., 3 Inst. Adv. Res. Biosyst. Dyn., Waseda Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ.,
4
CBBD-OIL, AIST-Waseda Univ., 5 bitBiome)

Key words

single cell, genome, metagenome

178

2S-Kp05

血栓溶解促進物質 SMTP の発見と脳梗塞治療薬開発○蓮見 惠司 1,2（1 ティムス, 2 農工大院・農）hasumi@cc.tuat.ac.jp

血栓溶解を促進する化合物の探索においてクロカビの１株から単離した小分子
SMTP（Stachybotrys microspora triprenyl phenol）は、プラスミノゲン（血栓溶解
酵素プラスミンの前駆体）のコンホーメーション変化をもたらし、プラスミノ
ゲンのフィブリン結合を促進する。この作用により、SMTP はフィブリン上でのプラスミノゲン活性化（プラスミン生成）を促進し、生理的血栓溶解を加速すると考えられる。また、SMTP の薬効を検討する過程で、我々は予期せぬ抗炎症作用を見出し、この作用に関与する候補分子として可溶性エポキシドヒド
ロラーゼ（sEH）を同定した。SMTP の抗炎症作用は、sEH 阻害による抗炎症性脂肪酸エポキシドの蓄積によるものと説明できる。さらに、SMTP のビタミ
ン E に類似した骨格は抗酸化作用にかかわることが示唆される。このような複合的な特徴により、SMTP はいくつかの動物モデルで脳梗塞改善に著効を示すと考えられる。私たちは、株式会社ティムスにおいて SMTP 同族体の一つ
BIIB131（以前の名称 TMS-007）を脳梗塞治療薬候補として開発し、前期臨床
第 2 相試験を 2021 年に完了した。この講演の前半では SMTP の発見、作用機序、薬理活性、臨床開発について紹介する。
後半では、SMTP の生合成経路と生合成の意義について述べる。SMTP の構造
は、クロマンラクタム環、イソプレン側鎖、ラクタム環窒素原子に結合する側鎖（N 側鎖）から構成される。イソプレン側鎖からクロマン骨格の一部はイソプレノイド経路に、クロマン骨格の芳香環部分はポリケタイド経路により合成されると推測される。これまでに我々が発見した SMTP は 66 種類に上り、その大部分は N 側鎖部分が異なる分子である。このような多様性を生む機序は、生合成の最終段階での非酵素的反応である。ここでは、クロマン骨格の芳香環部分にオルトジアルデヒド構造をもつ SMTP 前駆体 pre-SMTP が任意の一級アミンと反応し、一級アミンがラクタム環から N 側鎖として SMTP の構造に取り込まれる。SMTP 生合成の主要な制御機序は、pri-SMTP（pre-SMTP の 2 つのアルデヒド基の 1 つがヒドロメチル基である、pre-SMTP の一つ手前の中間体）の酵素的酸化反応である。この反応がアミン化合物の存在により加速し pre-SMTPを生産する。SMTP 生合成のもう一つの調節機構は、pri-SMTP 生合成の制御であり、好適な窒素源により抑制され、その飢餓あるいは貧利用窒素源存在下に誘導される。以上の知見を総合すると、SMTP 生合成は生産菌の窒素獲得の手段となっていると推察される。
最後に、SMTP の発見と開発の過程で得た経験をもとに、医薬品としての天然物の魅力・可能性について多少触れてみたい。

2Ap01

微生物由来トランスグルタミナーゼの有向進化のための一分子ディスプレイシステムの開発○杉山 あい 1, ダムナニョヴィッチ ヤスミナ 1, 根本 直人 2,
中野 秀雄 1
（1 名大院・生命農学, 2 埼玉大学大学院・理工学研究科）
Jasmina@nuagr1.agr.nagoya-u.ac.jp【背景と目的】Streptomyces mobaraensis 由来の微生物性トランスグルタミナーゼ（MTG）は、
食品産業における各種食肉製品の調製や、製薬産業における抗体-薬物複合体の調製において、タンパク質架橋に広く使用されている。MTG は、Lys と Gln の側鎖を持つタンパク質間にイソペプチド結合を形成し、安定した共有結合の生成物を得ることができる。しかし、MTG の基質に対する特異性は低く、しばしば機能不全の架橋体が得られ、医薬品製造には好ましくない。そこで本研究では、IgG の特定の反応性 Gln 周辺のアミノ酸配列に特異性の高い MTG を得ることを目的としている。その手段として、mRNA 一分子とその翻訳タンパク質を物理的に結合させ、mRNA を逆転写することで得られる cDNA ディプレイ
を、MTG の変異ライブラリー作成とそのスクリーニングに用いることとし、その実験系の開発を行っている。理論的に 10 の 14 乗以上の膨大なライブラリ構
築と、迅速なスクリーニングと次世代シーケンサーを用いた解析が可能であることなど、生細胞を用いた系に比べて数多くの利点がある。
【方法と結果】
MTG の新しい一分子スクリーニングシステムを確立するために、まず無細胞タ
ンパク質合成システムを用いて、プロペプチドに変異を加えたいくつかの MTG
遺伝子コンストラクトを構築し、再構成無細胞タンパク質合成系(PURE system)
により発現実験を行なった。合成量と活性の観点から、もっとも良いと判断した候補となる遺伝子コンストラクトを選定し、それを用いて 1 分子ディスプレイ（mRNA-リンカー-MTG 複合体）を構築し、ディスプレイされた状態でのMTG の発現とその活性を測定した。その結果、提示された MTG は酵素活性を有していることがわかった。現在、野生型 MTG と不活性型 MTG を混合したモ
デルライブラリーに対する選択条件の最適化を行なっている。

Development of a single-molecule display system for the directed evolutionof microbial transglutaminase○Ai Sugiyama1, Jasmina Damnjanović1, Naoto Nemoto2, Hideo Nakano1(1 Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2 Grad. Sch. Sci., Engineering., Saitama
Univ.)

Key words

transglutaminase, evolutionary engeneering, single-molecule display

2Ap02

一分子ディスプレイ技術による D-アミノ酸オキシダー
ゼの有向進化プラットフォームの開発○池田 翔 1, 大嶽 七菜 1, ダムナニョヴィッチ ヤスミナ 1,
根本 直人 1, 中野 秀雄 2
（1 名大院・生命農学, 2 埼玉大学大学院 理工学研究科）
jasmina@nuagr1.agr.nagoya-u.ac.jp

cDNA ディスプレイ法は、一分子の mRNA から翻訳されるタンパク質とそのmRNA を逆転写した cDNA を、ピューロマイシンリンカーを介して物理的に結合させる一分子ディスプレイである。最大 10¹⁴の大規模変異 DNA ライブラリー
をタンパク質ライブラリーに変換し、その機能を指標とした迅速スクリーニン
グ可能であり、指向性進化によるタンパク質創成技術として注目されている。
この手法は、これまで主に結合活性を指標とした抗体やペプチドのスクリーニ
ングや、基質としてのペプチドのスクリーニングに応用されてきた。しかしながら、酵素スクリーニングへの適用は、わずかな例外を除いてほとんど報告されていなかった。
そこで本研究では、疾患や病態のマーカーとなる D-アミノ酸の検出や定量に重要な役割を果たす D-アミノ酸オキシダーゼ（DAAO）の、cDNA ディスプレイ
方による酵素スクリーニングシステムの確立を目指した。通常の cDNA ディス
プレイ法により DAAO タンパク質とその cDNA との複合体を形成し、そこにペルオキシダーゼを結合させた。この一分子複合体に対して、D-アミノ酸およびビオチン化チラミドを加えると、DAAO とペルオキシダーゼの連続酵素反応より、その複合体がビオチン化される。続いてストレプトアビジンでコーティン
グした磁気ビーズにより回収することで、活性を有する DAAO 酵素の遺伝情報を解析することが可能となる。
我 々 は ま ず 大 腸 菌 再 構 成 無 細 胞 タ ン パ ク 質 合 成 系 (PURE system) に よ り 、Schizosaccharomyces pombe 由来 DAAO が活性体として合成できることを確認した。つぎに活性型 DAAO 遺伝子と不活性型 DAAO 遺伝子をそれぞれ 1：10 のモル比で混合し、前述のセレクションを行ったところ、活性型 DAAO 遺伝子が顕著に濃縮されていた。今後本システムを用いた DAAO の指向性進化に用いる予定である。

Discovery of the prothrombolytic compound SMTP and its development as adrug for treatment of ischemic stroke○Keiji Hasumi1,2(1 TMS Co., 2 Grad. Sch. Agric., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words

proteolysis, inflammation, biosynthesis

Development of a platform for directed evolution of D-amino acid oxidaseusing single-molecule display technology○Kakeru Ikeda1, Nana Odake1, Jasmina Damnjanović1, Naoto Nemoto1,
Hideo Nakano2(1 Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2 Grad. Sch. Sci., engineering Saitama
Univ.)

Key words

oxidase, evolutionary engeneering, single-molecule display

179

2Ap03

コレステロールオキシダーゼのダブルカイネティクアッ
セイ用酵素への機能改変

2Ap05

Geobacillus stearothermophilus 由来乳酸デヒドロゲナー
ゼの基質選択性に関わる残基の同定○中村 百花 1, 山口 翔太郎 2, 下澤 勇弥 3, 西矢 芳昭 1
（1 摂南大院・理工, 2 摂南大・理工, 3 甲南化工）
nishiya@lif.setsunan.ac.jp○山本 紗生 1, 外山 二卯佳 2, 西矢 芳昭 1,2（1 摂南大・理工, 2 摂南大院・理工）
nishiya@lif.setsunan.ac.jp【背景および目的】ダブルカイネティックアッセイ（DKA）は、2 試薬系自動分析における測定手法である。試料と第 1 試薬添加後にカイネティックアッセイ（KA）を行い、第 2 試薬添加後にも KA を実施する。両測定データの演算により、1 回のアッセイで複数の濃度データが得られる。すでに尿素態窒素の臨床検査において DKA が実用化されており、他の検査項目への応用も理論的に可能である。例えば、第 1 試薬添加後に遊離コレステロール濃度を測定、第 2 試
薬添加後に総コレステロール濃度を測定し、両測定値の差分にてコレステロー
ルエステル濃度も算出できる。しかし現状のコレステロール検査はエンドポイ
ントアッセイで行うため、使用するコレステロールオキシダーゼ（Cho）のコ
レステロールに対する親和性が極めて高く、KA には不向きであった。われわ
れは Cho のランダム変異体の中から KA 用酵素を選択し、その応用について報告したが 1、DKA 用酵素として十分なものではなかった。本研究では結晶構造に基づき、Cho の DKA 用酵素への機能改変を目指した。
【結果および考察】Cho の基質取込の入口付近と予想される残基のシステイン置
換変異体を作成、更に SH 基修飾剤 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one（MIT）の化学修飾により側鎖を嵩高くし、基質取込能の低下を狙った。結果として、システ
イン置換および反応試薬組成の検討により、Km 値が約 12 倍に高まった変異体
使用条件が得られ、DKA 使用への目処を得た。一方、MIT 修飾の基質親和性への影響は、Km 値として約 10%高値に留まった。Cho のモデル構造に基づき、変異効果、MIT 修飾効果、および試薬組成の基質親和性に対する影響を議論したので報告する。
【文献】1. Clin. Chim. Acta, 287:111-122, 1999

【背景および目的】NAD ＋依存性乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH, EC:1.1.1.27）は、
NAD ＋または NADH を補酵素としてピルビン酸（PYR）と乳酸の酸化還元反応を触媒する。本酵素は、構造的に類似しているリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（MDH,
EC: 1.1.1.37）と同じく α-ケト酸デヒドロゲナーゼファミリーに属している。一般に MDH の基質特異性は厳密だが、LDH は MDH に比べて基質特異性が低いという特徴があり、本来の基質である PYR 以外の α-ケト酸にも反応する。わ
れわれは以前、MDH の高基質特異性を、立体構造変化、基質結合部位の電荷、触媒残基のスイッチングなどの複合的要因から説明した。その結果に基づき、本研究では Geobacillus stearothermophilus 由来 LDH を対象として、基質選択性に関わるアミノ酸残基を同定したので報告する。
【結果および考察】MDH は触媒残基のスイッチングが起こるのに対し、LDH は起こらない。両者の構造比較により、MDH と LDH でそれぞれ高度に保存されている触媒残基近傍の異なる 3 残基が、スイッチングに影響を与えると考えられた。そこで、LDH の保存残基を MDH 型に改変することにより、基質特異性
において重要な残基を特定した。また、LDH は MDH と異なり、基質選択が複合的に制御されていないため、基質結合部位のサイズ変更は基質特異性に直接影響を与えると予想された。in silico にて基質結合部位を改変した LDH 変異体をデザインし、実際に作成した変異体の活性測定を行ったところ、基質特異性が顕著に変化することを確認した。以上のことから、基質結合部位および触媒残基近傍の保存領域内における特定のアミノ酸残基が、基質選択に重要である
ことが示唆された。
【展望】これらの結果を踏まえ、LDH の基質特異性を合理的に改変し、分析分野への応用を目指したいと考えている。

Improvement of cholesterol oxidase for double kinetic assay.

Identification of the residues involved in the substrate selectivity of lactate
dehydrogenase from Geobacillus stearothermophilus○Saki Yamamoto1, Fuka Toyama2, Yoshiaki Nishiya1,2(1 Dept. Life Sci., Setsunan Univ., 2 Grad. Sch. Sci. Eng., Setsunan Univ.)○Momoka Nakamura1, Syotaro Yamaguchi2, Yuya Simozawa3, Yoshiaki Nishiya1(1 Grad. Sch. Sci. Eng., Setsunan Univ., 2 Sci. Eng., Setsunan Univ., 3 Konan
Chemical Ind. Co., Ltd.)Key words

cholesterol, kinetic assay, enzyme, chemical modification

Key words
Geobacillus stearothermophilus, substrate selectivity, lactate
dehydrogenase

2Ap04

放線菌 Cellulosimicrobium 属由来 GH family 19
Chitinase のキチン結合ドメインの機能解析

2Ap06

学

○仁木 大輔 1, 美藤 友博 2, 清水 克彦 3, 有馬 二朗 2
（1 鳥取大院・連農, 2 鳥取大・農, 3 鳥取大・CoRE）
arima@tottori-u.ac.jp

Geobacillus kaustophilus 由来グリシンオキシダーゼのモ
バイルループおよびフラビン周辺残基が反応性に与える
影響○種田 瞳, 東浦 優希, 外山 二卯佳, 西矢 芳昭（摂南大院・理工）nishiya@lif.setsunan.ac.jp【目的】キチンは一般的に廃棄物として扱われるが、近年、その分解物から様々な機能が見出されているため、次世代のバイオマス資源として注目されている。
一方、キチン分解には環境負荷などの問題が残され、酵素による分解法の確立が求められているが、未だ実現していない。我々はこれまでに，α-キチンを直接分解する放線菌 Cellulosimicrobium sp. NTK2 を単離した。本菌が分泌するキチナーゼに、Glycoside Hydrolase (GH) Family 19 ドメインのみ有する Chitinaseclass I-2 (Chi I-2)と GH Family 19 ドメイン及び Carbohydrate Binding Module
Family 5 (CBM5)ドメインを有する Chitinase class I-3 (Chi I-3)がある。先行研究
では、CBM5 を持つ Chi I-3 は Chi I-2 と比べ、約 30 倍以上の酵素活性を示すことを明らかにした。本研究では、上記 2 つの酵素の CBM5 に焦点を当て、Chi
I-3 の CBM5 を Chi I-2 に付与した Chi I-2+CBM、Chi I-3 の CBM5 を欠損させた
Chi I-3ΔCBM を新たに構築し、CBM5 の付与や欠損によるキチン分解活性への影響を調べた。
【方法及び結果】Chi I-2，Chi I-2+CBM，Chi I-3，Chi I-3ΔCBM それぞれの GST
融合タンパク質を GST カラムで部分精製し、得られた組換えタンパク質を使用して性質を検討した。キチン基質を用いて、各酵素のキチン分解最適条件について調べた。その結果、変異型と野生型を比べ、最適条件と基質特異性に大きな差は観察されなかった。一方で、エチレングリコールキチンに対し、CBM5を持つ 2 つのキチナーゼ(Chi I-2+CBM、Chi I-3)は CBM5 を持たないキチナーゼ(Chi I-2、Chi I-3ΔCBM)と比べ Km 値が 65％以下であり、CBM5 ドメインの有無が親和性に影響していることが考えられた。また、様々なキチン基質の分解能を調べた結果、CBM5 を持つキチナーゼはキチンやキトサンに対する分解活性が 1.68 倍以上の値を示した。

[背景および目的] グリシンオキシダーゼ（Gox）はフラビンアデニンジヌクレ
オチドを補酵素として、グリシンの酸化的脱アミノ化を触媒し、グリオキシル
酸とアンモニア、過酸化水素を生成する酸化還元酵素である。生体内では、中間生産物であるイミノグリシンがビタミン B1 のチアゾールの合成に使われる。
応用面では、グリシン測定や除草剤耐性遺伝子としての利用等が期待されている。なかでも、Geobacillus kaustophilus 由来 Gox（GoxGk）は熱安定性や pH 安
定性に優れており、高い実用性を有する。しかし、Gox の実用化には低比活性や基質阻害等の反応性に関する課題を解決しなければならない。そこで、本研
究では GoxGk を対象とし、構造面から反応性に影響を与えると予想されたアミノ酸残基の改変を行ったので報告する。
[結果および考察] 既に決定された GoxGk 結晶構造（PDB ID：4YSH）の解析か
ら、Closed 構造には反応性グリシン以外に非反応性グリシンが確認され、基質阻害への関与が示唆されている。また、Open-Closed 構造比較より、非反応性
グリシン結合部位近傍にモバイルループが見出されている。本モバイルループの柔軟性低下により、非反応性グリシン結合のスペースが狭まると予想された。
そこで、ループのヒンジに位置する F247 と G251 を柔軟性低下への効果が期待される P と I に置換した。F247P と G251I を精製し、それぞれのキネティック・パラメーターを算出したところ、野生型と比べて比活性向上が見られ、基質阻害消失も確認された。一方、GoxGk の C232 はフラビンのＣ 7 炭素の近傍に存在する。C232 がフラビンによる基質酸化に対して影響を与えているか確認する
ため、C232S 変異体を作製した。特性比較より、C232S は野生型に対し約 2 倍の比活向上が見られた。従って、C232 側鎖の負極性がフラビンの酸化能低下に関与している可能性があり、検討を進めている。

Functional analysis of the chitin-binding domain of GH family 19 Chitinasefrom an actinomycete Cellulosimicrobium.

Influence of the mobile loop and flavin proximal regions on the reactivity ofglycine oxidase from Geobacillus kaustophilus○Daisuke Niki , Tomohiro Bito , Katsuhiko Shimizu , Jiro Arima(1 United Grad. Sch. Agric. Sci., Tottori Univ., 2 Fac. Agric., Tottori Univ., 3 CoRE.,
Tottori Univ.)
1

Key words

2

3

2

chitin binding domain, actinomycetes, enzyme activity, chitosan○Hitomi Taneda, Yuki Higashiura, Niuka Toyama, Yoshiaki Nishiya(Grad. Sch. Sci. Eng., Setsunan Univ.)

Key words

Geobacillus kaustophilus, glycineoxidase, flavin enzymes

180

2Ap07
学

ポリスチレン基板上でのバイオシリカ生成○黒滝 智子, 中島 一紀, 直田 亮, 高野 力, 川崎 了
（北大院・工）k.naka@eng.hokudai.ac.jp

2Ap09

柑橘植物由来フェニルアラニンアンモニアリアーゼの酵
素特性解析○西川 優里, 大橋 貴生（摂南大院・理工）
takao.ohashi@lif.setsunan.ac.jp【背景・目的】 ポリスチレン（PS）などのプラスチックと多孔質シリカの複合材料は，シリカ層に酵素などの生体分子を組み込むことで，バイオセンサーや新たな生体触媒材料への応用が可能である。しかし，シリカ重合の際，酸・塩
基触媒を用いた過酷な反応条件の影響で，固定化する生体分子が失活するという問題がある。そこで，本研究では常温・中性 pH という温和な条件でシリカ形成が可能なシリカ重合酵素（silicatein）を用いたシリカ-PS 複合材料を作製した。silicatein の高い凝集性を抑制するため，高い水溶性タンパク質である
Pseudomonas syringae 由来氷核タンパク質の InaKC を silicatein に融合した。また，PS 上でシリカ形成を行うために，silicatein にポリスチレン結合ペプチド（PSBP: polystyrene-binding peptide）を融合した。これにより，PS 上に silicateinの配向性を保った状態で安定的に固定化し，その場（in situ）でシリカの重合により複合材料の作製を行うというアプローチである。
【実験方法】 InaKC と PSBP を融合した silicatein（InakC-Sil -PSBP）を E.coli を宿主として発現し，リフォールディングを行うことで可溶性の融合タンパク質を作製した。この融合タンパク質を PS ウェルプレートへ固定化した後，シリカ前駆体である TEOS（オルトケイ酸テトラエチル）を加えてシリカ重合を行うことで，シリカ-PS 複合材料を作製した。その後，モリブデンブルー法を用いて PS 上に固定化したシリカ量を定量した。
【結果】 4 種類の PSBP から発現および PS 上への固定化に最適な PSBP を選定した。融合タンパク質を用いたシリカ-PS 複合材料作製において，InakC-SilPSBP 添加系では，タンパク質非添加系の４倍以上のシリカが形成した。PSBPを付加した silicatein を用いて PS 基板上でシリカ重合を行うことで，温和な条件下でのシリカ-PS 複合材料の作製に成功した。

【背景・目的】trans-ケイ皮酸は香水や染料、医薬品、プラスチックなどの化成品原料として重要な芳香族化合物の一種である。trans-ケイ皮酸は植物からの抽出及び石油からの化学工業プロセスにより生産されてきたが、低炭素型・炭素循環型社会の実現の観点から，再生可能資源であるバイオマスを原料とし、微生物を用いたバイオプロセス生産への転換が強く望まれている。trans-ケイ皮酸
はフラボノイド生合成中間代謝産物であり、L-Phe を基質にフェニルアラニン
アンモニアリアーゼ（PAL）によって合成される。フラボノイドを多量に蓄積する柑橘系植物は高 PAL 活性が期待されるため、オレンジ（Citrus sinensis）由来の PAL 様タンパク質に着目した。微生物を用いた trans-ケイ皮酸の発酵生産を最終目的とし、本研究では CsPAL 遺伝子の同定と組換え酵素の特性解析を行った。
【方法・結果】組換え大腸菌 BL21(DE3)及び SHuffleT7 を宿主に His タグ融合タ
ンパク質として CsPAL タンパク質を生産し、SDS-PAGE、ウエスタンブロッ
ティング解析を行った。次に、組換え CsPAL タンパク質を用いて、L-Phe を基質に酵素反応を行い PAL 活性があることを確認した。活性確認後に CsPAL タ
ンパク質を Ni カラムで精製し、CsPAL の酵素特性解析を行ったので報告する。

Biosilica formation on polystyrene plate

Enzymatic characterization of phenylalanine ammonia-lyase from Citrus
sinensis.

○Tomoko Kurotaki, Kazunori Nakashima, Ryo Naota, Chikara Takano,
Satoru Kawasaki(Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.)○Yuri Nishikawa, Takao Ohashi(Grad. Sch. Sci. Eng., Setsunan Univ.)

Key words

biomineral, immobilization

Key words

Escherichia coli, Flavonoid, Phenylalanine ammonia-lyase

2Ap08

タンパク質安定性に依存しない高機能化酵素デザイン法の開発と応用2Ap10

大腸菌由来新規生体膜曲率認識タンパク質の探索と機能解析

学○小澤 洋樹, 海野 伊吹, 関根 遼平, 伊藤 創平, 中野 祥吾（静県大院・薬食生命）
itosohei@u-shizuoka-ken.ac.jp○田中 祐圭, 三宅 貴大, 大河内 美奈（東工大・物質理工）
tanaka.m.bn@m.titech.ac.jp

酵素は環境にやさしい次世代の触媒として注目を集めるが、産業応用には天然型酵素の高機能化が必要となる。これまで高機能化研究の多くは、酵素立体構
造の安定性を評価する Rosetta Score (REU) を指標として改変型酵素の設計を進めてきた。しかし各酵素に応じて高機能化を要する性質が異なるため、安定性に非依存的な指標等の機能的に多様な酵素改変が必要とされている。そこで我々は高機能化酵素デザインツール GAOptimizer を開発した。本ツールは遺伝的アルゴリズム (GA) を採用し、任意の選択圧存在下で改変対象となる酵素に機能上有利となる変異を導入、蓄積が可能であるという特徴を有する。本研究ではGAOptimizer における選択圧として、安定性に非依存的な指標を採用した酵素改変を実施した。
ここでは疎水性度の矛盾を評価する HiSol Score を採用し、キャッサバ由来ヒド
ロキシニトリルリアーゼ (MeHNL) を鋳型酵素とした酵素改変を試みた。HiSol
Score を指標に、ホモログ酵素のアミノ酸配列を参照に疎水性度の矛盾を正す
変異が蓄積された複数のアミノ酸配列 (GaHNLs) を取得した。GaHNLs と REUを指標にした従来の設計法で得られた改変酵素のアミノ酸配列を比較した結果、
GaHNLs では非電荷極性アミノ酸から電荷アミノ酸への変異が限定的であることが分かった。次に GaHNLs の酵素学的諸性質を分析した結果、熱安定性は鋳型酵素とほぼ同等、反応速度は 3～6 倍の向上、可溶性発現量は最大約 8 倍向上
していることが明らかとなった。以上の結果は、GAOptimizer で採用する選択圧の違いで異なる質の変異を導入でき、従来法とは異なる機能向上を達成可能であることを示唆する。本発表では、本新規手法の詳細を報告する。

（背景） 真核生物では、曲率認識タンパク質と呼ばれる細胞膜曲面の曲率を認識するタンパク質が細胞膜構造の制御に関わることが知られる。一方で、原核生物では曲率認識タンパク質に関する報告が非常に乏しい。これまでに我々は、粒径の異なる球形の SiO2 粒子を脂質膜で被覆した生体膜材料（SSLB: Spherical
Supported Lipid Bilayer）に対する結合試験に基づく、曲率認識タンパク質の探索法の開発を進めてきた。そこで本研究では、原核生物である大腸菌から新規曲率認識タンパク質を探索することを目的とした。
（方法） 粒径が 100 nm と 1 μm の SiO2 粒子に対して、大腸菌細胞膜から抽出した脂質を被覆することで SSLBs を作製した。大腸菌から得られる表在性膜タン
パク質画分を用いて、各サイズの SSLB に対するタンパク質結合量を LCMS/MS により評価した。
（結果及び考察）結果として、２種類の SSLB 上から合計 438 種のタンパク質を同定した。また、同定されたタンパク質を定量的に比較した結果、粒径 100 nmに有意に多く結合したタンパク質は 35 種、1 μm からは 47 種類が同定され、これらを曲率認識タンパク質候補群とした。同定された候補タンパク質には FtsZなどの膜構造制御に関与することが知られるタンパク質が含まれた。このうち
1 μm に有意に結合した SecA を His タグ融合タンパク質として大腸菌で発現、精製し、サイズの異なる SSLB と結合試験を実施した。その結果、1 μm に有意に高い結合能を示したため、このタンパク質が緩やかな曲面を認識する新規曲
率認識タンパク質であることが示された。以上より、この曲率認識タンパク質の探索技術が原核生物にも適用できることが示された。今後はこれらのタンパ
ク質の詳細な機能解析から、原核生物における新たな曲率認識タンパク質の機能解析や曲率認識能の発現メカニズムの理解が進むことが期待される。

Development and application of a method for designing highly functional
enzymes independent of protein stability

Exploration and functional analysis of membrane curvature sensing proteinfrom Escherichia coli

○Hiroki Ozawa, Ibuki Unno, Ryohei Sekine, Sohei Ito, Shogo Nakano(Grad. Sch. Integr. Pharm. Nutr. Sci., Univ. Shizuoka)

Key words

enzyme, protein engineering○Tanaka Masayoshi, Miyake Takahiro, Mina Okochi(Sch. Mater. Chem. Technol., Tokyo Tech)

Key words

proteomics, spherical supported lipid bilayer, Escherichia coli

181

2Bp01

質量顕微鏡を用いたマウスの脳におけるチロシン水酸化
反応の可視化

2Bp03○篠原 菜穂 1, 福崎 英一郎 1,2,3, 新間 秀一 1,2,3（1 阪大院・工, 2 大阪大学先導的学際研究機構, 3 大阪大学島津分
析イノベーション協働研究所）
fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp

アンブレイン高生産に向けた進化工学系の構築○上田 大次郎 1, 佐藤 諒 1, 藤井 明日香 1, 大谷 悠介 2, 梅野 太輔 3,
佐藤 努 1（1 新潟大・自然研, 2 千葉大院・工, 3 早大院・先進理工）
satot@agr.niigata-u.ac.jp

ドーパミンやノルアドレナリンはカテコールアミン類に属し，脳で合成される神経伝達物質である．カテコールアミン類は中枢神経系や心血管系の機能維持やストレスの認知機能調節に重要な役割を果たし，これらの脳内濃度の低下が鬱病といった疾患を引き起こすことが報告されている (1,2)．カテコールアミン
類はチロシン水酸化反応を律速段階とする経路によりチロシンから産生される.
このため，チロシン水酸化反応が鬱病発症に関わっている可能性が高い．近年，鬱病モデルとして社会的敗北ストレス(SDS)モデルマウスが確立された(3)．そこで，SDS モデルマウスの脳におけるカテコールアミンの局在とチロシン水酸
化反応の局在を可視化することで鬱病状態の脳におけるカテコールアミン濃度変動メカニズムの全容解明の一助になることが期待される．近年，質量分析イ
メージング(MSI)を酵素組織化学に応用した手法が報告された(4)．本研究では，
MSI を用いて SDS モデルマウスの脳における内在カテコールアミンの局在，チロシン水酸化反応の局在を可視化した．
(1) A Whitton et al., Brain 143, 701, (2020)(2) Daubert et al., Physiol., 590, 4881– 4895 (2012)(3) Golden et al., Nat Protoc., 6, 1183-1191 (2011)(4) E Takeo et al., Anal Chem, 92 (18), 12379-12386 (2020)

龍涎香はマッコウクジラの腸管内から発見される結石であり、古くから伝統薬や香料として用いられてきた。自然界から入手することは困難を極め、「幻の香り」と称されている。その主成分はアンブレインであり、希少性の高い化合物となっている。
我々は Bacillus megaterium 由来二機能性テルペン環化酵素（BmeTC）の部位特異的実験によって BmeTCY167A/D373C（YD）をアンブレイン合成酵素として創出することに成功した 1)。工業化に至る収率ではなかったため、すでに報告されていたスクアレン‐ホペン環化酵素の進化工学系 2)を応用し、さらなるアンブレ
イン高生産を目指した。
YD 遺伝子を鋳型とし、エラープローン PCR に供しライブラリーを作成した。
その後、ヒト由来スクアレン合成酵素遺伝子とブドウ球菌由来 C30 カロテノイ
ド不飽和化酵素遺伝子（crtn）と共に大腸菌で発現した。スクアレンを進化型
YD と CrtN が奪い合い、相対的に YD 活性が上回ると白色コロニーに、CrtN 活
性が上回ると黄色コロニーになる。したがって、白色のコロニーの中からスク
アレン消費活性の高いアンブレイン合成酵素を選抜した。初期の進化工学系において、YD と CrtN を共発現させた結果、色づきが薄く、活性の高い変異体を選抜することが困難であった。そこで、ベクターのプロモーターを変更し、YDの発現量を抑え、CrtN の発現量を上げることによってコロニーの色づきを調節した。この系にライブラリーを導入した結果、アンブレインを高生産する変異酵素を得ることに成功した。よって本研究により、アンブレイン合成酵素の進化工学系を構築することに成功したと考えている。今後、この系を用いて産業化に利用できるアンブレイン合成酵素を創出する予定である。
1) Y. Yamabe, et al. Sci Rep., 10, 19643 (2020). 2) 梅野ら、特開 2022-11610

Visualization of tyrosine hydroxylase reaction in mouse brain using mass
microscope

Construction of Evolutionary Engineering Systems for High Production ofAmbrein○Naho Shinohara1, Eiichiro Fukusaki1,2,3, Shuichi Shimma1,2,3(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Industrial Biotechnology Initiative Division,
Institute for Open and Transdisciplinary Research Initiatives, Osaka Univ., 3 Osaka
University Shimadzu Omics Innovation Research Laboratories)○Daijiro Ueda1, Ryo Sato1, Asuka Fujii1, Yusuke Otani2, Daisuke Umeno3,
Tsutomu Sato1(1 Grad. Sch. Sci. Technol., Niigata Univ., 2 Grad. Sch. Eng., Chiba Univ., 3 Grad.
Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words

mass microscope, enzyme activity, Tyrosine hydroxylase

Key words

terpenoid, biosynthesis, evolutionary engeneering

2Bp02

アンブレイン合成酵素の部位特異的変異による構造安定
化・耐熱化

2Bp04

Finding new compounds via a predicted data mining
approach学○山澤 友葉 1, 亀谷 太一 1, 久保田 智巳 2, 石川 一彦 2,3,
上田 大次郎 1, 佐藤 努 1（1 新潟大・自然研, 2 産総研, 3 松谷化学工業）
satot@agr.niigata-u.ac.jp

Jiumn-Yih Wu1, Hsiou-Yuf Ding2, Tzi-Yuan Wang3,○TeSheng Chang4(1 Dept. Food Sci., National Quemoy University, 2 Dept. Cosmet.
Sci., Chia Nan University of Pharmacy and Science, 3 Biodiv. Res.
Cen., Academia Sinica, 4 Dep. Biol. Sci. Tech., National Universityof Tainan)
mozyme2001@gmail.com

マッコウクジラの代謝産物である龍涎香の主成分 Ambrein が持つ様々な生理活
性は、香料や薬剤において高い有用性が期待される。我々は、Squalene-Hopene
環化酵素（SHC）と Bacillus megaterium 由来二機能性環化酵素（BmeTC）を用いることで、入手が容易な squalene を基質とした Ambrein の人工合成経路を創出した 1）。さらに、変異導入した BmeTC により一酵素での Ambrein 酵素合成に成功、Y167A と D373C の 2 アミノ酸置換体（YD）にて 21.3 %の Ambrein 収率を得た 2）。BmeTC 野生株（WT）と YD の二酵素合成経路では、現在報告されている中で最も高い 46.0 %の Ambrein 収率を達成することができた 2）。最近、
我々は WT と YD の X 線結晶構造解析にも成功し、反応機構の解析も行っている 3）。
本研究では、BmeTC の熱安定性を向上させることで Ambrein 生産量の増加を目指した。好熱菌 Alicyclobacillus acidocaldarius 由来 SHC との構造比較に基づき、7 つの領域を標的に変異導入を行った。その結果、3 つの変異体にて構造安定化・耐熱化に成功し、この 3 変異を合わることで至適温度と活性が相加的に高まった。また、YD への変異導入においても構造安定性と耐熱性の向上が示唆された。
以上の結果をふまえ、今後も WT と YD の両者でさらなる構造安定化・耐熱化の検討を進め、より Ambrein 収率が高い合成酵素の創出を目指したいと考えている。
1）Sato, T. et al., J. Am. Chem. Soc. 135, 18335–18338 (2013).
2）Sato, T. et al., Sci Rep. 10, 1-12 (2020).
3）亀谷ら、日本農芸化学会 2022, 2F02-08

The discovery of new compounds derived from natural sources plays a vital role in thedevelopment of novel drugs. In addition to the chemical synthesis and purification ofnatural products, biotransformation of these compounds can also lead to the discoveryof new bioactive substances. However, the process of biotransformation, particularly
for novel bioactive molecules, traditionally relies on trial-and-error, which is both
fundamental and time-consuming. In this regard, a predicted data mining approach(PDMA) offers a rapid method to target new compounds using known enzymes andchemicals. By selecting an enzyme, the PDMA implementation identifies
biotransformable candidates among commercially available natural compounds.
Furthermore, the novelty of the anticipated products resulting from the presumed
biotransformation can be assessed by mining existing chemical databases. Ultimately,
by evaluating the biotransformable candidates through biotransformation experiments
using the selected enzymes and identifying the resulting products, several newcompounds were discovered. Our study demonstrates that PDMA is an efficientmethod for discovering new compounds from both natural and commercial sources,
and it holds promise for future enzymatic biotransformations such as dehydrogenation,
methylation, and (de)glycosylation of commercially available natural products.

Structural stabilization and thermostability by site-directed mutation ofambrain synthase

Finding new compounds via a predicted data mining approach○Tomoha Yamazawa , Taichi Kameya , Tomomi Kubota , Kazuhiko Ishikawa ,Dijiro Ueda1, Tsutomu Sato1(1 Grad. Sch. Sci. Technol., Niigata Univ., 2 AIST, 3 Matsutani Chemical Industry
Co., Ltd.)
1

Key words

1

2

terpenoid, enzyme activity, thermostable enzyme

2,3Jiumn-Yih Wu1, Hsiou-Yuf Ding2, Tzi-Yuan Wang3, ○TeSheng Chang4(1 Dept. Food Sci., National Quemoy University, 2 Dept. Cosmet. Sci., Chia Nan
University of Pharmacy and Science, 3 Biodiv. Res. Cen., Academia Sinica, 4 Dep.
Biol. Sci. Tech., National University of Tainan)

Key words

data, mining, predicted

182

2Bp05
学

昆虫由来新規テルペン合成酵素の諸性質の解析と結晶化に向けた条件検討○平井 知愛, 上田 大次郎, 冨士川 成美, 佐藤 努
（新潟大・自然研）
satot@agr.niigata-u.ac.jp

2Bp07
学

酢酸菌が保有するレバンスクラーゼのシグナルペプチド
非依存的な分泌○山下 璃貢 1, 片岡 尚也 1,2, 石川 森夫 3, 松谷 峰之介 4,Tippayasak Uraiwan 5, Theeragool Gunjana 5, 松下 一信 1,2,
藥師 寿治 1,2
（1 山口大学・院創成科学, 2 山口大学・中高温微セ, 3 東京農大・応生, 4 東京農大・ゲノム, 5 カセサート大学・理）juji@yamaguchi-u.ac.jp

昆虫がテルペン類のフェロモンを放出することはよく知られているが、フェロモン生合成の詳細は未だ解明されていない。我々は、ゲノムマイニングを駆使し、昆虫由来新規テルペンの探索と生合成機構の解明を目指している。近年、昆虫において、既知テルペン合成酵素と配列類似性を示さず、イソプレニル二リン酸合成酵素（IDS）と配列類似性を有すテルペン合成酵素（IDS-type TPS）
が同定された。昆虫特異的な IDS-type TPS の研究を進めることは、フェロモン
生合成機構の解明、新規テルペンの発見、そして害虫駆除の新たなターゲット
発見につながる可能性を秘めている。
近年の研究において Phyllotreta striolata（ハムシ）に存在する 5 種類の IDS-type
TPS（PsTPS1-5）の機能解析が報告されている。本研究では新規テルペンの発見を目指し、PsTPS1-5 の再現性実験を実施した。その結果、PsTPS2 において、大腸菌での発現、及び精製に成功した。先行研究で同定されていない PsTPS2と（E,E）-FPP の反応生成物について、単離及び構造決定を 実施したが収量が少ないことから構造決定には至らなかった。さらに生成物の収量を上げるため酵素の活性向上を検討した。PsTPS2 の諸性質解析（金属イオン、pH、基質濃度など）及び反応時の重層溶媒の検討から、収率を 4.1 倍に向上させることに成功した。さらに、解析の報告例がない IDS-type TPS ホモログを多様な昆虫ゲ
ノムから探索し、3 種類について大腸菌組換え酵素の反応解析を行った。そのうち１種類について環状セスキテルペンと予想される生成物が確認された。今後、これらの生成物の同定を行う予定である。

外膜を持つグラム陰性バクテリアである酢酸菌は，セルロースやアセタン等のポリマーを産生する。また、レバンスクラーゼ(Lsc)を分泌することでスクロー
ス中のフルクトシル基を重合させ、レバンを産生する。Lsc には 2 つの型が存在する。1 型はシグナルペプチド非依存的に分泌され、2 型はシグナルペプチド依存的に分泌される。私たちの研究室では，このシグナルペプチド非依存的な未知分泌機構の解析を行っている。
まず、分泌された Lsc を精製しアミノ末端のアミノ酸配列を分析した。推定されるアミノ酸配列と一致し、N 末端領域の切断は確認されなかった。よって，
Lsc は Tat や Sec といったシグナル配列に依存する輸送経路を用いないことが示唆された。また、グラム陰性バクテリアである大腸菌の遺伝子欠損株コレクションを用いた異種発現系において、I, II, III 型分泌装置、Tat 経路を欠損した株ではスクロースを含む寒天培地上でレバン様物質を産生した。酢酸菌のプロトン
駆動力生産型末端酸化酵素を破壊した株（ΔCytbo3 株）では、レバン様物質の産生が著しく抑制された。また、大腸菌の末端酸化酵素を破壊した株（ΔcyoB株）でも同様にレバン様物質が産生されなかった。Western Blotting を用いてLsc 発現量を調べたところ，野生株と ΔcyoB 株では Lsc の発現量に差はなかった。培養液を遠心分離し，培養上清と細胞に分画した場合では、どちらの株でも Lsc は細胞画分に存在していた。
これらの結果から、寒天培地上でレバン様物質を産生するためにはエネルギー
または、プロトン駆動力生産型末端酸化酵素の存在が必要であることが考えられた。また、スクロースを含む寒天培地上でのレバン様物質産生は、Lsc の細胞外へ分泌とは関係が無い可能性も示唆された。

Analysis of properties and investigation of conditions for its crystallizationof a novel terpene synthase from insects

Signal peptide-independent secretion of levansucrase of acetic acid bacteria○Chinaru Hirai, Daijirou Ueda, Narumi Fujikawa, Tutomu Satou(Grad. Sch. Sci. Technol., Niigata Univ.)

Key words

terpenoid, biosynthesis

2Bp06

放線菌 Amycolatopsis sp. NT-119 株由来ホスファチジン酸ホスファターゼの機能解析○杉森 大助 1, 岩崎 雄吾 2
（1 福島大・共生システム理工, 2 中部大院・応生）
sugimori@sss.fukushima-u.ac.jp○Riku Yamashita1, Naoya Kataoka1,2, Morio Ishikawa3, Minenosuke Mathutani4,
Uraiwan Tippayasak5, Gunjana Theeragool5, Kazunobu Matsushita1,2,
Toshiharu Yakushi1,2(1 Grad. Sch. Sci. Tech. Innov., Yamaguchi Univ., 2 RCTMR, Yamaguchi Univ., 3 Fac.
Appl. Biosci., Tokyo Univ. Ag.,, 4 NODAI Genome, Tokyo Univ. Ag., 5 Fac. Sci.,
Kasetsart Univ.)
Key words
secretory production, Acetobacter xylinum, energy metabolism,
levansucrase

2Bp08
学

コドン単位の欠失、置換、挿入が可能な新規分子進化法の開発○鶴 廣太郎 1, 岡野 憲司 2, 冨田 宏矢 3, 宮崎 健太郎 3, 本田 孝祐 3,4（1 阪大院・工, 2 関西大・化生工, 3 阪大・生工国際セ, 4 阪大・先導的学際研機構）
okano.k@kansai-u.ac.jp

ホスファチジン酸ホスファターゼ（PAP）はホスファチジン酸（PA）の脱リン酸化を触媒するホスホリパーゼ C (PLC)の一種である。これまで酵母や動物由来 PAP に関する研究報告例は多数あるが、原核生物由来 PAP についてはわずかな報告例しかなく、その機能はほぼ未解明のままである。本発表では、放線菌
Amicolatopsis sp. NT119 由来菌体外 PAP（PAPNT119）の諸特性について報告する。
40%飽和硫安濃縮、4 種類のカラムクロマトグラフィーを用いて目的 PAPNT119を精製し、諸特性解析を行った。その結果、本酵素は Mg2+要求性であり、pH
7.0、55℃で最大活性を示した。PAPNT119 は PA に最も良く作用し、ホスファ
チジルコリンに対して 27％の相対活性を示した。その他のリン脂質、p-ニトロ
フェニルリン酸、グリセロール 3 リン酸には作用しなかった。さらに、sn-1,2位アシル鎖の鎖長、不飽和度およびその組み合わせ（組成）が異なるリン脂質を用いた特異性試験の結果、PAPNT119 はジラウロイルホスファチジン酸 12:0
PA に最も良く作用し、12:0 PA 以外のリン脂質に対する活性は低下した。また、
リゾホスファチジン酸（LPA）に対しては sn-1 位に 14:0 を持つ LPA に対して
約 20%の相対活性を示した以外、その他鎖長の LPA には全く作用しなかった。
以上の結果より、PAPNT119 はリン脂質の極性頭部とともに sn-1,2 位アシル鎖の炭素鎖長とその組成を認識していると結論づけた。

酵素への変異導入と選抜のサイクルを人為的に加速させる進化工学は産業用酵素の開発に重要な手法である。Error-prone PCR 法は PCR 増幅時に DNA ポリメ
ラーゼの複製エラーを誘発する手法であり、進化工学において頻繁に利用される。しかし、この方法は一塩基置換に基づくため、平均して 5、6 種類ほどのアミノ酸置換しか行えず、欠失、挿入変異も導入できない。そこで、本研究では標的部位に対してコドンの欠失、置換、挿入が可能な新規分子進化法を開発し、得られる変異体の多様性の向上を目指す。
Zeocin 耐性遺伝子と大腸菌の複製領域から形成されるプラスミド（約 1 kbp）を構築し、モデル遺伝子として chloramphenicol acetyltransferase 遺伝子（cat; 648bp）をクローニングした。その後、cat の標的コドンの周囲にアニーリングする
プライマー対によってインバース PCR を行った。この際、認識配列の外側を切断する 3 種類の TypeIIS 制限酵素の認識配列と NNS 配列（S = G or C）を含むアダプター配列をプライマーの 5’側に付加しておいた。これにより、使用する酵素の種類を変えることで、異なる位置でアダプター配列を除去できる。その後、セルフライゲーションを行うことで各変異が導入されたプラスミドを作成できる。
まず、cat 中の 6 つのコドンに対して置換、欠失、挿入変異の導入を行ったところ、欠失変異体は 11/12、置換変異体は 18/24、挿入変異体は 23/24 の割合で取得することができた。その後、本手法を cat 全 216 コドンに対して適応し、欠失変異体ライブラリーの作成を行った。現在は、作成した欠失変異体ライブラ
リーを用いて、野生型と変異体のクロラムフェニコール耐性の比較を行い、活性の向上した変異酵素のスクリーニングを行っているところである。また、置換、挿入変異体のライブラリー作成についても実施しているところである。

Characterization of phosphatidate phosphatase from Amycolatopsis sp.
NT-119Development of enzyme evolution method that enables deletion, substitution,and insertion of codons○Daisuke Sugimori , Iwasaki Yugo
(1 Fac. Symbio. Syst. Sci., Fukushima Univ., 2 Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Chubu
Univ.)
1

2

Key words
actinomycetes, Amycolatopsis sp., phospholipase C, phosphatidate
phosphatase (PAP)○Kotaro Tsuru1, Kenji Okano2, Hiroya Tomita3, Kentaro Miyazaki3,
Kohsuke Honda3,4(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ.,
3
ICBiotech, Osaka Univ., 4 OTRI, Osaka Univ.)

Key words

molecular evolution, DNA library

183

2Bp09
学

大腸菌翻訳アレストを用いたペプチドタグの翻訳促進機構に関する研究

2Cp01

Modular displaying of dengue envelope protein domain
III (EDIII) on SpyTagged-Norovirus-like particles○Jirayu Boonyakida, Enoch Y. Park
(Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)park.enoch@shizuoka.ac.jp○西河 佑馬, 藤川 璃子, 中野 秀雄, 加藤 晃代（名大院・生命農学）
nishikawa.yuma@molbiotech-nagoya.org

大腸菌などの微生物は、遺伝子組み換えタンパク質生産の宿主としてよく使用される。しかし、タンパク質によっては発現量が十分でなくその最適化に多大な時間と労力を要する場合がある。当研究室の Ojima-Kato らは、目的タンパク質をコードする遺伝子の開始コドン直後に 4 つのアミノ酸からなる SKIK タグを付加することにより、タンパク質発現量を顕著に増大できることを発見した。
さらにその後の解析で、翻訳反応が促進されている可能性と、SKIK 配列にコドンの影響はなくペプチド自体が翻訳促進に関与している可能性が示唆された。
そこで、本研究では、SKIK タグとは見かけ上逆の効果を発揮する、翻訳を一時停止するアレストペプチド(AP)に着目し、SKIK タグの翻訳促進機構の解明を目指した。
まず、大腸菌にて報告されている制御機構の異なる種々の AP の上流に SKIKを配置した sfGFP 発現プラスミドを作製し、無細胞系で sfGFP の発現量を解析した。その結果、用いた AP のうち SecM AP、CmlA leader では SKIK による発現量の増大が確認され、短い人工 AP である WPPP (FQKYGIWPPP)ではその効
果は観察されなかった。
次に、SecM の AP と SKIK とを種々の順序で配置した配列を構築し、無細胞系
でタンパク質発現を行なった。その結果、AP による翻訳阻害が確認された一方で、SKIK または MSKIK 配列の位置によって発現量の増減が確認された。この実験の結果から、翻訳で生じる(M)SKIK という新生ペプチドが AP による翻訳停止の解除に重要である可能性が示唆された。
さらに、SKIK では翻訳停止を解除できなかった WPPP を用いて、SKIK と WPPPの間が 0～13 アミノ酸残基となるようにした配列を構築し、SKIK と AP との距離が及ぼす影響について検討した。その結果、SKIK と WPPP の距離が近いと、
WPPP による翻訳停止が解除され SKIK と AP との距離が翻訳アレストの解除に重要な因子であることがわかった。

In our recent work, we successfully developed a SpyTagged-Norovirus-like particle(NoV-LP) with improved conjugation efficiency through the insertion of the ‘EAAAK’linker between the C-terminus of norovirus major nucleocapsid protein VP1 and Nterminus of SpyTag (SpT) peptide. Using N- and C-termini deletion mutant
SpyCatcher protein (SpCΔNΔC)-fused EGFP and mCherry as model proteins, weobserved a significant change in conjugation efficiency by almost 2-fold (~40% before
the linker insertion and ~70% after the insertion).
To demonstrate the versatility of the norovirus-based platform, we are attempting todisplay envelope protein domain III of dengue virus (EDIIIDENV) from the four
serotypes on the particle for a vaccine candidate. The EDIIIsDENV (serotypes 1-4) werefused to the SpCΔNΔC protein, expressed using a silkworm expression system, andwere purified via affinity purification. Subsequently, each protein was mixed with thesilkworm-derived SpyTagged-NoV-LP at different molar ratios to determine theoptimum condition required for the reaction. Based on the densitometric analysis, theconjugation efficiencies were about 50% for 1EDIII and 3EDIII, while 2EDIII and
4EDIII were about 70%. Then, the NoV-LPs with or without EDIIIDENV display werecharacterized by dynamic light scattering analysis, negative staining transmission
electron microscopy, and ELISA. The decorated NoV-LPs are being investigated fortheir immunogenicity and ability to induce neutralizing antibodies.

Research on the mechanism of translation enhancement of peptide tags byusing E. coli translation arrest.

Modular displaying of dengue envelope protein domain III (EDIII) on
SpyTagged-Norovirus-like particles○Yuma Nishikawa, Riko Fujikawa, Hideo Nakano, Teruyo Kato
(Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)○Jirayu Boonyakida, Enoch Y. Park
(Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)

Key words

protein expression, Escherichia coli, peptide

Key words

EDIII, Norovirus, SpyTag/SpyCatcher

2Bp10

シャペロン共発現によるマグネトソーム膜上の受容体活
性の向上

2Cp02

全原子分子動力学計算による三量体接着タンパク質
AtaA の機械的安定性メカニズムの解析学○巴 瞭斗, 田中 剛, 吉野 知子（農工大院・工）y-tomoko@cc.tuat.ac.jp

学○笹原 純 1, 吉本 将悟 1, 藤本 和士 2, 堀 克敏 1
（1 名大院・工, 2 関西大・化生工）
khori@chembio.nagoya-u.ac.jp【目的】磁性細菌 Magnetospirillum magneticum は細胞内に脂質二重膜で覆われた磁気微粒子 (マグネトソーム)を生合成する。当研究室ではマグネトソーム膜上にヒト由来の膜受容体を発現させ、創薬研究への応用を試みている。しかし、
マグネトソーム膜上に発現させた膜受容体は動物細胞膜上での発現と比較して、リガンド親和性が低下することが課題である。この原因の１つとして、異種発現による膜受容体のミスフォールドが考えられる。そこで本研究では、磁性細菌において膜受容体-シャペロン共発現株を構築し、マグネトソーム膜上の膜受容体発現量及びリガンド親和性向上への寄与を評価した。
【方法】甲状腺刺激ホルモン受容体 (TSHR)及び大腸菌由来のシャペロン遺伝子
群 （DnaKJE, GroESL）をコードする TSHR-DnaKJE, -GroESL, -DnaKJE-GroESL
遺伝子を含むベクターを構築し、磁性細菌に導入することで各 TSHR-シャペロ
ン共発現株を得た (KJE 株、Gro 株、KJE-Gro 株)。各株からマグネトソームを抽出し、TSHR の発現量及びリガンド親和性を評価した。
【結果と考察】シャペロン共発現株における各マグネトソーム膜上の TSHR 発
現量/リガンド親和性を評価した結果、非シャペロン共発現株と比較してそれぞれ有意な向上が示された。特に、発現量においては KJE-Gro 株が最も高い 5 倍の向上を示した。次に、TSHR 発現量/リガンド親和性向上の要因を考察するた
め、TSHR の mRNA 量及び不溶性収量比を評価した。その結果、非シャペロン
発現株と比較して、Gro 株、KJE-Gro 株における mRNA 量が向上することが示された。さらに、不溶性 TSHR は各シャペロン共発現株においてそれぞれ約30%低下していた。
以上から、シャペロン共発現により TSHR の遺伝子発現レベルの向上や不溶性画分の減少に寄与することで、マグネトソーム上の TSHR 発現量及びリガンド親和性が向上することが示唆された。

【背景・目的】
数多くの細菌はアドヘシンを介して表面に付着し、生存や増殖に適した環境を確保している。アドヘシンはせん断応力や引張力などの機械的負荷を受けるため、その固有の強度が細胞接着の維持に重要である。Acinetobacter sp. Tol 5 は、細胞表層タンパク質 AtaA を介して、生体表面だけでなく様々な材料表面に対して高い接着性を示す。AtaA は長さ 250 nm の三量体型テザー分子であり、容易に構造が崩壊しない強靭さを有している。AtaA の C 末端 head ドメイン
(Chead) は AtaA ファイバーの基部に位置し、その結晶構造から推測される複雑な構造が強靭性に寄与していると考えられてきた。しかし、AtaA が強靭性を発揮するメカニズムは未だ不明である。そこで本研究では、Chead の機械的安定性とその分子機構の解明を目的とした。
【方法・結果】
Chead の引張力に対する力学応答を解析するために、全原子分子動力学シミュ
レーションを行った。Chead の両末端を一定速度 (2 nm/ns) で伸長したところ、
headCap が強い力で崩壊した後に Ylhead が弱い力で崩壊した。これより、Cheadは機械的安定性の高い headCap が、機械的安定性の低い Ylhead ドメインを外力から保護することが明らかとなった。このメカニズムを解明するために、Cheadを伸長した際の力学伝播経路を解析した。力学伝播経路が引張軸方向だけでな
く、headCap を介して引張軸と垂直な方向に広がる様子が確認された。これにより Chead が複雑な三量体構造をとることで、鎖内・鎖間・ドメイン間相互作用により外力に対する力学的負荷を分散させる分子機構が存在することが示唆された。また、headCap 内のアミノ酸残基に変異を導入することで力学伝播経路が変化し、機械的安定性が大幅に低下することが明らかとなった。本研究か
ら力学伝播経路のコントロールが、タンパク質の機械的安定性に重要であることを見出した。

Co-expression of molecular chaperones improves receptor activities onmagnetosome membrane

Mechanical stability analysis of the trimeric adhesive protein AtaA by allatom molecular dynamics simulation○Ryoto Tomoe, Tsuyoshi Tanaka, Tomoko Yoshino(Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words

magnetotactic bacteria, magnetosome, molecular chaperone, GPCR

○Jun Sasahara1, Shogo Yoshimoto1, Kazushi Fujimoto2, Katsutoshi Hori1(1 Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2 Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ.)

Key words

Acinetobacter , mechanism, adhesion, stability

184

2Cp03
学

三量体型オートトランスポーターアドへシンの膜貫通ド
メインを用いたナノポアの構築

2Cp05○黄 泰賢 1, 吉本 将悟 1, 笹原 純 1, 川野 竜司 2, 堀 克敏 1
（1 名大院・工, 2 農工大院・工）khori@chembio.nagoya-u.ac.jp

Rapid development of single fluorescent protein-based
immunosensor Flashbody through ultra-high-throughput
screening and cell-free protein synthesis○Bo Zhu1, Zhirou Qiu2, Keisuke Mizutani3, Ken Kobayashi3,
Hiroshi Ueda1, Tetsuya Kitaguchi1(1 CLS, Tokyo Tech, 2 Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech, 3 Sch.
Eng., Tokyo Tech)kitaguc.t.aa@m.titech.ac.jp

脂質二重膜に数ナノメートルの孔を形成するタンパク質 (ナノポア) は、孔内を通過する 1 分子を高感度に検出可能なため、DNA シーケンサーに応用されている。さらなる次世代技術としてナノポアを用いた Protein シーケンサーの開発が期待されているが、タンパク質を構成する全アミノ酸の識別は達成されていない。三量体オートトランスポーターアドヘシンタンパク質の一種である AtaAは、C 末端の膜貫通ドメイン（TM）内壁に親水性残基で構成される狭窄部を持つ。狭窄部では各アミノ酸固有の電気シグナルが得られやすいため、タンパク質の検出に有用であると考えられる。そこで本研究では、AtaA の TM を用いた
ナノポアを構築しその特性を評価することを目的とした。
TM は coiled-coil が β-barrel の中心を貫いた構造をしており、ネイティブな構造
では孔が埋まっている。孔を形成させるために coiled-coil を遺伝子上で欠損させた変異体（AtaApore）を設計し、大腸菌発現及び無細胞タンパク質発現を行った。無細胞タンパク質発現ではタンパク質が生産された一方、大腸菌では細胞毒性のためか生産されなかった。続いて、蛍光分子を内包したリポソーム存在下で無細胞タンパク質発現を行ったところ、リポソームからの蛍光分子の放出が検出され、リポソームに AtaApore が挿入され孔が形成されたことが示唆された。最後に、AtaApore を含むリポソームを平面膜と融合させ、孔の特性を電気
生理学的手法により評価した。AtaApore を含む平面膜では固有の開孔電流値が測定され、その値とノイズから AtaApore の会合数やナノポアセンサとしての特性が明らかになった。

Visualization and monitoring of intracellular dynamics pose immense importance inthe elucidation of biological processes. The single fluorescent protein-based
immunosensor, Flashbody, is a valuable tool for the above tasks. It was generated byconnecting the antibody variable domains and circularly permuted fluorescent protein(cpFP) with two critical peptide linkers (VH-Linker1-cpFP-Linker2-VL). Benefittingfrom the antibody's recognition capabilities, Flashbody exhibits an extensive potential
target spectrum. However, the development period of a Flashbody is usually over a
year by using step-wise saturated mutagenesis of the critical linkers, which slowed its
application to new targets. In this study, we established an ultra-high-throughput
screening method for enriching a Flashbody critical linker library in 3 weeks. For
checking the responses of the enriched variants, the cell-free protein synthesis (CFPS)
of Flashbody was achieved to further accelerate the development. Two new functional
Flashbodies with over 2-fold responses against bone metabolic marker osteocalcin
were identified from the enriched Flashbody library using CFPS. Next, the enrichedlibrary was analyzed using long-read next-generation sequencing (NGS). The NGS
data were also used for fine-tuning a transformer-based protein language model tocreate models for the critical linker predictions. This work will make it possible toprovide Flashbodies for more fundamental research and industrial applications in acustomizable and expedient manner.

Construction of nanopores using a transmembrane domain of the trimericautotransporter adhesin

Rapid development of single fluorescent protein-based immunosensor
Flashbody through ultra-high-throughput screening and cell-free protein
synthesis○Taehyun Hwang1, Shogo Yoshimoto1, Jun Sasahara1, Ryuji Kawano2,
Katsutoshi Hori1(1 Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2 Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)○Bo Zhu1, Zhirou Qiu2, Keisuke Mizutani3, Ken Kobayashi3, Hiroshi Ueda1,
Tetsuya Kitaguchi1(1 CLS, Tokyo Tech, 2 Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech, 3 Sch. Eng., Tokyo Tech)

Key words
nanopore, transmembrane domain, electrophysiological measurements,
single-molecule detection

Key words
high-throughput screening, biosensor, in vitro coupled transcription/translation, machine learning

2Cp04

2Cp06

タンパク質の検出を指向した生体ナノポアのタンパク質工学的改変○藤田 友紀 1, 前田 泰一 1, 一柳 敦 1, 川野 竜司 2
（1 キッコーマン, 2 農工大院・工）yufujita@mail.kikkoman.co.jp

学

抗原抗体反応が抗体結合タンパク質によって阻害されることを利用した免疫センサーの開発○二宮 歩武 1, 銭 成 1, 安田 貴信 2, 朱 博 2, 上田 宏 2, 北口 哲也 2
（1 東工大・生命理工, 2 東工大・化生研）
kitaguc.t.aa@m.titech.ac.jp

生体ナノポアとは、イオンチャネルや膜孔形成細胞溶解毒素などから成る脂質二重膜中に形成されるナノメートルサイズの微細なタンパク質の孔で、近年ナノポアシーケンサが実用化されるなど工学的な応用が期待されている。これまで DNA など比較的サイズの小さな分子検出には成功しているが、より大きな分子を検出可能なナノポアタンパク質の報告は限られていた。本研究ではモノ
マー同士が会合することにより直径の大きなポアを形成する膜孔形成タンパク
質 Intermedilysin (ILY)に注目し、それにアミノ酸変異を加えることで、フォー
ルディング状態のタンパク質を直接検出可能なサイズを有するナノポアの開発を試みた。
ILY は可溶性構造から膜上でプレポア構造に変化することでオリゴマー化し、その後ポア構造に変化することで膜を貫通しポアを形成する。我々はまず、ILYのプレポア構造及びポア構造を安定化させることを目的とした変異体を計 25 種作製した。次に各変異体モノマー同士がオリゴマーを形成するかについて SDSPAGE と Western Blotting で評価したところ、野生型よりモノマー間の相互作用が促進した変異体 3 つを選抜した。最後に、これら変異体のポア安定性を電気化学的に評価した結果、野生型より安定なポアを形成する変異体を特定した。
一方で、この変異体は野生型と比べて小さい直径のポアを形成する確率が高い
ことが分かった。そこで我々は ILY の膜接触領域または膜貫通領域をかさ高くすることで大きな直径のポアが開く確率を向上できないかと考えた。新たなに作製した変異体のうち、プレポア構造の膜接触領域に存在するモチーフを 1 つ追加した変異体において、直径 10 nm 以上のポアが開く確率が野生型より向上した。現在、変異体ポアを利用しタンパク質を検出できるか検討中である。

Protein M（PM）はマイコプラズマ由来の抗体軽鎖結合タンパク質である。 抗体との結合時に PM のかさ高な C 末側が抗原結合部位に接近するため、大きな抗原の結合が阻害されることが知られている。本研究ではこの C 末端のかさ高さを利用し、大きな抗原を検出するセンサーを開発した。
まず、PM の 319 番目のリシンをアンバーコドンに置換し、アンバーサプレッ
ションシステムにより、この部位にアジドフェニルアラニンを導入した。そして C 末端に DBCO を結合させた発光タグ HiBiT をクリック反応により結合させ、PM（319HiBiT）を得た。HiBiT を結合させた部位は、抗体との結合面であり、抗体が結合すると覆い隠されるため、LgBiT を加えても発光活性を示さず、また一方で大きな抗原が抗体と結合している場合、PM は抗体に結合できない
ため、露出した HiBiT により発光活性を示すことを期待した。
まず、PM（319HiBiT）に LgBiT と基質を加えたときに発光するかを確認した
ところ、検出に十分な発光が確認でき、HiBiT が露出して LgBiT と再構成できることが示唆された。次に PM（319HiBiT）に 5 種類の抗体を結合させると、どの抗体を用いても発光が抑制されており、HiBiT が覆い隠されたことが示唆された。そして、これらの抗体と抗原の複合体に PM（319HiBiT）を加えて発光を確認すると、分子量の小さい 3 種類の抗原を用いたときは発光が抑制されたが、分子量の大きい 2 種類の抗原を加えたときは、発光が確認できた。このことから PM（319HiBiT）による検出は、抗原の分子量に依存していることが示唆され、タンパク質などの大きな抗原の迅速簡便な検出が可能であることか
ら、臨床検査や食品分析における活躍が期待される。

Engineering of protein nanopores for protein detection

Development of an immunosensor based on the inhibition of antigenantibody reactions by antibody-binding proteins.

○Yuki Fujita1, Yasukazu Maeda1, Atsushi Ichiyanagi1, Ryuji Kawano2(1 Kikkoman Corp., 2 Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words

protein engineering, nanopore, membrane protein, nanopore sensing○Ayumu Ninomiya1, Cheng Qian1, Takanobu Yasuda2, Bo Shu2, Hiroshi Ueda2,
Tetsuya Kitaguchi2(1 Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech, 2 Lab. for Chem. and Life Sci. Inst. of
Innobative Res, Tokyo Tech)

Key words

biosensor, antibody, bioluminescence

185

2Cp07
学

ランタノイドセンサ開発を指向したペリプラズム Dispaly○田中 琴葉, 関 貴洋, 梅野 太輔（早大院・先進理工）
umeno@waseda.jp

2Cp09

哺乳類嗅覚受容体とグラフェンセンサーを使用したニオ
イ検出システムの構築○高山 郁美, 福谷 洋介, 吉井 智哉, 生田 昴, 前橋 兼三,
養王田 正文
（農工大院・工）yohda@cc.tuat.ac.jp

バイオセンサーは，環境モニタリングや診断の重要なツールとして，その需要は高まり続けている。細胞を利用する金属バイオセンサーの主流は，金属応答
性転写因子によって細胞内に取り込まれた金属イオンを検出するものであった。
しかし，細胞内膜の絶縁性により，そもそも細胞外の金属イオンを細胞内へ輸送することは困難である。最近我々は，テトラサイクリン(Tc)排出機能を持つ
膜タンパク質 TetA の細胞外ループに水溶性タンパク質を挿入し，大腸菌のペリ
プラズム空間へ提示する技術を開発した。この技術では，リガンドとの結合による提示タンパク質の安定化を TetA の機能として読み出すことができる。本研
究では，この TetA-Display 技術を利用した，細胞外の金属イオンを捕獲・検出する新規バイオセンサーの開発を目的とした。
金属受容体として，近年発見されたランタノイド(Ln)特異的結合タンパク質
Lanmodulin (LanM)に着目した。まず，2 残基分のコドンをランダム化したスペー
サーを介して，LanM を，TetA に 6 ヶ所存在する細胞外ループに遺伝子レベル
で in-frame 融合した。Tc および Ln 存在下で，Tc 耐性をもたらすものを選抜した。その結果，Ln に対して用量依存的に Tc 耐性を示す TetA-LanM を取得できた。この TetA-LanM の Ln 応答は，EDTA の培地添加によって失われることから，ペリプラズム空間に存在する Ln を検出できるセンサーの構築に成功した。
本発表では，現在進めている TetA-LanM の Ln 応答性の改良の試みなどについても報告する。

嗅覚受容体（Odorant receptor, OR) は、生物のニオイセンサーとして機能する G
タンパク質共役型受容体（GPCR）である。ヒトでは約 400 種の OR があり、OR 毎の異なるニオイ分子認識能が嗅覚のニオイセンシング能に重要である。
OR のニオイ分子応答解析では、OR 発現培養細胞を用いてニオイ分子刺激に伴うシグナル伝達下流で誘導されるルシフェラーゼ活性を検出する手法が一般的である。しかし、この手法は精製した OR の機能解析には利用できず、細胞を用いずに汎用性のある OR タンパク質アッセイ手法の開発が求められている。
そこで本研究は、グラフェン電界効果トランジスタ(GFET)を用いた OR タンパ
ク質を利用したリガンド応答解析手法の確立を目的とした。モデル OR として、カルボン酸類に応答し、比較的安定性が高い chOR52 を in vitro で合成して利用した。chOR52 をコムギ胚芽無細胞タンパク質合成システムによりリポソーム上に合成した後に、界面活性剤で可溶化し、グラフェン基板へ物理吸着させる
ことで、OR-GFET センサーを作製した。この、OR-GFET センサーで chOR52のアゴニストであるノナン酸を選択的に検出することに成功した。現在、ペプチドを用いた OR 被覆率改善を目的に、OR の C 末端へグラフェン吸着性ペプ
チドを付加した改変型 OR の作製を行っている。また、他の OR に対しても同様に評価可能か試験している。その結果も含め、本発表で紹介する。

Lanthanide sensors using periplasmic display technology

Development of the odor detection system using mammalian olfactory
receptors and the graphene sensor.

○Kotoha Tanaka, Takahiro Seki, Daisuke Umeno(Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)○Ikumi Takayama, Yosuke Fukutani, Tomoya Yoshii, Takashi Ikuta,
Kenzo Maehashi, Masafumi Yohda(Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words

Escherichia coli, protein engineering, biosensor

Key words

2Cp08

ペリプラズム Display システムを利用した環境依存性酵
素の実験室進化2Cp10○関 貴洋 1, 田中 琴葉 2, 木村 友紀 2, 梅野 太輔 1,2（1 早大・理工総研, 2 早大・先進理工）
t.seki0608@aoni.waseda.jp

GPCR, odorant response, odorant receptor, graphene sensor

コリン応答タンパク質への ヒ素応答性の付与
山口 諒 1, 山本 哲晃 2, 梅野 太輔 3, 神谷 克政 4,○河合（野間） 繁子 5
（1 千葉大院・融合理工, 2 千葉大・工, 3 早大・先進理工, 4 神奈川
工大・工, 5 千葉大院・工）kawai-noma@chiba-u.jp

タンパク質の進化工学研究において，機能スクリーニングは，主に生細胞内で発現されたタンパク質に対して行われてきた．しかしながら，タンパク質のな
かには，細胞内の代謝ネットワークなどと競合してしまうものや，還元状態に保たれている細胞内ではジスルフィド(S-S)結合を形成できず機能発現できないものが多く存在する．そこで我々は，大腸菌ペリプラズム空間に着目した．ペリプラズムは，細胞としての特性を保持しつつ，遮蔽性の高い細胞膜によって細胞内代謝ネットワークから隔離されている．さらに，外膜に存在するポーリンによって小分子は自由往来できるため，その環境を自在に操作可能な空間であるうえ，酸化的環境にあるため，より S-S 結合の形成が容易である．我々は，最近開発したテトラサイクリン排出機能を持つ膜タンパク質 TetA を介したペリ
プラズムへ提示技術を用いて環境依存性の異なる変異体へと改変させることを試みた．
大腸菌アルカリフォスファターゼは S-S 結合を有する金属タンパク質であり，細胞内では機能発現できない．そこで，この PhoA の S-S 結合をリストラし，
S-S 結合非依存なタンパク質に改変することを試みた．タンパク質中に 2 つ存
在する S-S 結合を完全に除去した変異体を TetA の細胞外ループに挿入し，PhoA
活性および TetA 活性を評価した．両活性とも失活していることから，S-S 結合喪失によってペリプラズムでも PhoA は機能構造をとることが困難になることが確認できた．PhoA の構造遺伝子全域にランダム変異を導入し，TetA 活性を指標とした選抜を行ったところ， TetA 活性および PhoA 活性の両方を回復した
変異体を複数得ることができた．本発表では，得られた変異体がどのように SS 結合不在を補償したのか，そのメカニズムについて議論する．

地球上に普遍的に存在するヒ素をモニタリングするために, 「微生物」を用いた
安価で簡便なセンサーの開発が高い注目を集めている. 従来は，微生物のヒ素代謝に関わる転写因子 ArsR を用いた微生物ヒ素センサーの研究が主流であった.
最近, 我々はシステインを複数有するビブリオ菌のクオラムセンシング制御因子
LuxR が, ヒ素代謝と全く機能的に関係ないにも関わらず, ヒ素に応答しヒ素センサーとなり得ることを発見した. そして我々は, ArsR に限らず, どんなタンパ
ク質でもシステインさえあればヒ素センサーになり得ることを証明した. そこで
本研究では, ヒ素代謝とは全く関係のないコリン応答性の浸透圧調節を制御している TetR family の転写抑制因子 BetI に, ヒ素応答性を付加することを目指した. MD 計算によれば, BetI のヒンジ部分 2 箇所とリガンド結合部位近傍の計３箇所のアミノ酸をシステインに置換してヒ素を結合させると, BetI 構造を不安定にすることなく, TetR family が持つ on/off switch mechanism を介した構造変化が引き起こされ, DNA オペレーター配列からの乖離が促されることが予測された.
その予測通りに, 3 箇所のシステイン置換体は, オペレーター配列下流に配置したレポーター sfGFP の発現による蛍光強度の結果から, ヒ素に対する応答性を獲得したことが示された. さらに興味深いことに, この BetI システイン置換体はリガンド結合部位近傍に変異を入れているにも関わらず, コリンに対する結合応答性を保持していた. 本研究において, 直交する二つのリガンドを入力因子として一つのタンパク質で応答し出力する OR 型論理ゲートの構築に成功した.

Periplasm Display System for Screening of Novel Emzyme Properties

Imparting arsenic responsiveness to the Colin response protein○Takahiro Seki1, Kotoha Tanaka2, Yuki Kimura2, Daisuke Umeno1,2(1 Waseda Res. Inst. Sci. Eng., 2 Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words

Escherichia coli, periplasm display, protein engineering, biosensor

Ryo Yamaguchi1, Tetsuaki Yamamoto2, Daisuke Umeno3, Katsumasa Kamiya4,○Shigeko Kawai-Noma5(1 Grad. Sch. Sci. Eng., Chiba Univ., 2 Eng., Chiba Univ., 3 Sch. Adv. Sci. Eng.,
Waseda Univ., 4 Fac. Eng., Kanagawa Inst. Technol., 5 Grad. Sch. Eng., Chiba Univ.)

Key words
arsenic whole cell sensor, cysteine, molecular dynamics (MD)simulation, OR gate

186

2Dp01

間葉系幹細胞における細胞形態情報を用いた品質予測モ
デルのためのデータ拡張技術○木村 和恵 1, 田中 健二郎 1, 蟹江 慧 2, 加藤 竜司 1,3（1 名大院・創薬, 2 近大・工, 3 名大・ナノライフシステム研究所）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp

2Dp03
学

細胞培養におけるアンビエントインテリジェンスの可能性実証○百瀬 賢吾 1, 椎名 健 1, 田中 健二郎 1, 竹本 悠人 1, 蟹江 慧 2,
加藤 竜司 1,3
（1 名大院・創薬, 2 近大・工, 3 名大・ナノライフシステム研究所）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp【背景・目的】 近年、細胞医薬の急速な発展に伴い、ヒト細胞は細胞製品として工業的に大量生産される時代が到来しつつある。しかし、従来の低分子による医薬品に比べ、細胞は生きた材料であり、製造過程においての細胞の品質・有効性の予測が難しい。現在の細胞の品質評価法は、遺伝子発現や FACS を用いた侵襲的な評価のものが多く、非侵襲的な評価法が求められている。当研究室では、機械学習や AI といったテクノロジー技術を組み合わせることによる「非侵襲的な細胞品質評価技術」の研究開発を報告してきた。本技術は、位相差画像から算出される細胞形態データと、実験的に得られる細胞品質情報を機械学習により紐づけることで、品質を非侵襲的に予測する技術である。こうしたAI を実用化するには、質のいい学習データが必要である。しかし、他の産業や分野と比較して、細胞培養分野では、データ獲得に課題がある。細胞は、培養・加工過程において、変遷的であり、各培地条件などで形態変化を示す特性があるが、それらを包括したデータを準備することは難しい。
【方法】 本研究では、品質予測モデルの精度向上のため、限定された細胞デー
タから、データを増やす「データ拡張技術」について検証した。３つの lot の脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）の長期培養による経時的な細胞形態変化・品
質劣化データかつ、他の 21lot 分の間葉系幹細胞のデータを用いて、細胞が取りえる形態について評価を行った。また、その結果から、データ拡張法の検討・モデルの精度検証について研究を行った。
【結果】 結果、本技術でのデータ拡張法を応用することにより、単純に得られたデータだけを用いて構築するモデルに比べ、データ強化に応用できる可能性を示唆した。

【目的】近年の再生医療研究の発展により、生きた治療用細胞を用いて疾患治療を行う再生医療等製品に注目が集まっている。高品質の治療用細胞を供給するには、大規模な細胞製造の実現が必要とされるが、現在の細胞培養プロセスは
手作業に大きく依存している。この俗人的な感覚に支配された培養プロセスは、
教育・訓練するにも客観的・定量的な到達目標が立てにくく、習熟に多くのコストとエフォートを費やしてしまう大きな課題がある。
一方、医療分野では、医師や看護師の属人的な作業を統一することが難しいという課題解決の一つとして、手術視野や入院患者の部屋の動画情報を網羅的に蓄積し、先端 AI 技術を用いて徹底的に定量化・解析することで、医療ミスの低減や患者のケアを改善する取り組みが ”アンビエントインテリジェンス”技術として注目されている。
そこで本研究では本コンセプトを細胞培養作業の定量化に応用し、培養スキルを定量的に評価し、作業教育を効率化するシステムとしての有効性を検証した。
【方法】本研究では 6-well プレートを用いた細胞培養操作を評価対象とした。
被験者として培養経験歴 10 年以上の熟練作業者 1 人と、経験歴 2 年未満の作業
初心者 3 人を設定し、各作業者の作業の一部始終を動画撮影した。動画に対して骨格推定 AI を用いて作業者のクリーンベンチ内の手作業のデータ化を行い、その解析・スコア化アルゴリズムを開発した。
【結果】培養作業者のアンビエントインテリジェンス技術開発の結果、作業者間の差の分析や、目的を持った培養教育が可能であることが示され、細胞製造の効率と安全性を向上させる有効なアプローチであることが示唆された。

Data augmentation technology for morphology-based prediction model ofmesenchymal stem cells

Demonstrating the potential of ambient intelligence for cell culture○Kazue Kimura1, Kenjiro Tanaka1, Kei Kanie2, Ryuji Kato1,3(1 Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2 Fac.Eng,. Kinki Univ., 3 Institute of Nanolife-Systems., Nagoya Univ.)○Kengo Momose1, Takeru Shiina1, Kenjiro Tanaka1, Yuto Takemoto1, Kei Kanie2,
Ryuji Kato1,3(1 Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2 Kindai University Faculty of Engineering,3
Inst. of Nano-Life-Systems, Nagoya Univ.)

Key words
analysismesenchymal stem cell, machine learning, data augmentation, image

Key words

movie analysis, cell culture

2Dp02

浮遊系細胞の細胞形態情報解析に向けたパイプラインの
検証

2Dp04

人工知能が識別したがん幹細胞を深層学習した人工知能の開発○久田 拓海 1, 蟹江 慧 2, 田中 健二郎 1, 加藤 竜司 1,3（1 名大院・創薬, 2 近大・工, 3 名大ナノライフシステム研）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp○杉山 友康 1, 張 再軍 1, 石畑 宏明 3, 丸山 竜人 1, 笠井 智成 2,
亀田 弘之 3
（1 東京工科大・応生, 2 岡山大学・NTRC, 3 東京工科大・コン
ピューター）
tsugiyama@stf.teu.ac.jp

近年の細胞科学の発展により、バイオ医薬品や再生医療等製品など細胞培養技術を駆使して生産する次世代医薬品の開発が急速に加速している。これら次世
代医薬品は、従来の化成品では治療が難しかった疾患の治療効果など、画期的な有効性が多数報告されており、細胞培養の工業化・産業化に向けた新規技術開発に大きな期待が集まっている。これら「細胞培養」を工業的かつ大規模に制御する製品製造はいまだに品質管理が極めて難しく、高コストかつ効率的な技術が少ない。
我々のグループはこれまで、細胞画像から非破壊的に経時的な形態変化の情報を抽出し、機械学習によって品質管理を効率化する「細胞形態情報解析」を開発してきている。細胞製造の品質管理支援技術としての有効性が高いことが理解されつつあるが、しかし多くの細胞画像解析技術は、画像取得および形態変化のしやすい接着系細胞に対して開発されているものが多く、浮遊系細胞に対する有用な評価技術の報告は極めて少ない。浮遊系細胞は抗体医薬品生産や白血病に対する抗がん剤開発を中心的に担う細胞であり、浮遊系細胞を評価可能
な画像解析技術が期待されている。
本研究では、これまで我々のグループでは、接着系細胞の画像解析により細胞形態情報のみから品質を評価する技術を開発してきた。本研究では、この解析技術を浮遊系細胞へと応用することを目指し、モデル細胞として浮遊系がん細胞と抗体生産細胞を用い、抗がん剤への作用機序特異的な細胞応答および品質
変化化合物投与下の細胞応答を、細胞形態情報のみから比較・判別できる解析
フローの開発に取り組み、画像撮影から細胞形態の特徴量化まで浮遊系細胞へと適応させた解析パイプラインの設計を行った。

【はじめに】がん幹細胞はがん亢進や再発に関わる重要な細胞として注目されている。その細胞形態については十分に検討されていない。一方、画像を識別す
る人工知能（AI）の技術が急速に発展している。筆者らはがん幹細胞の形態を認識する AI をはじめて作成した。がん幹細胞を深層学習した AI は一定の識別精度を示すが(Biomedicines 2022, 10, 941)、本研究では AI が識別したがん幹細胞を、別の人工知能が深層学習して、がん幹細胞の識別の精度が向上すること報告する。
【方法】マウスがん幹細胞 miPS-LLCcm の位相差画像と GFP 蛍光（nanog-GFP
レポーター遺伝子の発現）画像をペアで取得した。深層学習は Conditional
Generative Adversarial Nets (CGAN)で行い、位相差画像を診てがん幹細胞の画像を出力する AI を作成した。AI が出力する画像の精度評価は再現率、適合率、
F 値を指標にした。位相差画像を分類する AI の作成は convolutional neuralnetwork（CNN）を用いた。AI の学習の可視化は gradient-weighted class activation
mapping (Grad-CAM)および Grad-CAM++を使用した。
【結果と考察】細胞核のイメージを位相差画像に追加することは、生成した AIの精度を上げなかった。AI 出力画像の精度はがん幹細胞の位相差画像によって異なり、その差は大きかった。AI は識別しやすい画像とそうでない画像がある可能性が考えられたため、位相差画像の分類を試みた。その結果、AI は分類可能な程度に位相差画像を認識したことが分かった。そこで AI が得意とする画像だけを深層学習させたところ、がん幹細胞の識別精度が有意に向上した（Int.
J. Mol. Sci. 2023, 24, 5323）。本 AI 作成方法は有用と考えられた。

Validation of a pipeline for morphology-based suspension cell evaluation

Deep learning of cancer stem cell recognized by an artificial intelligence.

○Takumi Hisada1, Kei Kanie2, Kenjiro Tanaka1, Ryuji Kato1,3(1 Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2 Kindai Univ. Faculty of Engineering,3
Inst. Nano-Life-Systems, Nagoya Univ.)

Key words
learning

Chinese hamster ovary cell, antitumor, image analysis, machine○Tomoyasu Sugiyama1, Zaijun Zhang1, Hiroaki Ishihata3, Ryuto Maruyama1,
Tomonari Kasai2, Hiroyuki Kameda3(1 Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Univ. Technol., 2 NTRC, Okayama University,
3Sch. Computer Sci., Tokyo Univ. Technol.)Key words

cell, deep learning, cancer stem cell, CGAN

187

2Dp05
学

深層学習の動画像認識技術を用いた細胞機能評価シス
テムの開発

2Dp07

○増原 誠, 片岡 笙, 園井 理惠, 河邉 佳典, 上平 正道（九大院・工）kamihira@chem-eng.kyushu-u.ac.jp

灌流培養法を利用した抗体生産バイオプロセスの高度化○岡本 棟悦 1, 加藤 宏明 2, 渋谷 啓介 3, 鬼塚 正義 4
（1 徳島大院・創成科学研究, 2 日立プラントサービス・イノベーション推進本部, 3 日立製作所・研究開発, 4 徳島大院・社会産
理工）onitsuka@tokushima-u.ac.jp

近年、深層学習を用いた画像認識の分野は急速に発展を遂げている。中でも医用画像を元にした診断や顕微鏡画像での分類・検出技術の進歩は著しく、バイオ分野での応用にも期待が寄せられている。一方で、バイオ医薬品製造で多用されている CHO 細胞などの培養動物細胞では、深層学習を応用した画像認識
はあまり試みられていない。組換えタンパク質を生産する細胞の評価に、深層学習をベースとした手法が適用できれば、高品質かつ高生産可能な細胞を迅速に識別・取得可能となるかもしれない。本研究では、深層学習を用いた識別手
法により、培養時の細胞画像から、細胞種や状態を識別する技術の開発を目的とした。初めに、人間でも識別可能な 3 種の動物細胞を判別するシステムを構築した。位相差画像を撮影し、元画像を切り取ることで個別細胞画像を計 750枚取得した。画像認識による細胞種判別を行ったところ、良好な識別精度が得られた。このことから開発したシステムは、複数種の動物細胞を高精度で判別可能であると考えられる。次に、位相差画像のみでは人間には識別できない同一種の細胞において、遺伝子組換えによって抗体を生産する細胞と、非組換えで生産しない細胞の識別を試みた。個別細胞画像を計 2200 枚取得して画像認識による識別を行ったところ、識別精度が低く、細胞密度や培養日数の条件を固定しても有意な差は見られなかった。学習経過グラフから検証損失の増加が見られ、画像の特徴量不足に伴う過学習が考えられた。学習データの特徴量を増やすために、タイムラプス画像を用いることにした。個別細胞動画を 2560 枚取得し、動画認識による識別を行ったところ、複数条件で良好な識別精度が得られた。この結果から、タイムラプス画像を用いることで、静止画像では識別できない抗体生産の有無による特徴の変化を高精度で検出可能であると考えられる。

【背景・目的】 現在、バイオ医薬品製造プロセス開発は大きな転換点を迎えており、流加培養法（Fed-batch）から次世代培養法である灌流培養（Perfusion）
への移行のための技術開発が進んでいる。灌流培養は培地交換により培養条件
や細胞数の制御が可能であり、生産抗体の品質が安定することが報告されている。本研究では灌流培養の特性を利用して、IgG1 抗体を生産する組換え CHO
細胞の培養条件を変動させ、生産される抗体の重要品質特性（N 型糖鎖構造・凝集化抗体）の変化を解析し、優れた品質を備えた抗体の生産培養条件の探索を試みた。
【実験方法】 培養温度・培養液 pH・溶存酸素濃度・攪拌速度・灌流率（培地交換量）等を変数とした条件を設定し、60 日程度の長期灌流培養を実施した。培
養液中の抗体生産濃度は BLI 法により測定した。また培養液から抗体精製を行い、サイズ排除クロマトグラフィー、Fc レセプター親和性クロマトグラフィー
により、抗体の凝集体量や抗体糖鎖構造（Fc レセプターへの結合能）等の重要品質特性を分析した。
【結果並びに考察】 抗体分子サイズの解析より、灌流開始後に凝集化抗体量は低減し、流加培養と比較して低い凝集化抗体量を維持した。また、抗体 Fc 領域の N 型糖鎖構造を解析した結果、培養条件の変化に応じて末端ガラクトシル化
量が大きく変動し、1 日あたりの累積生細胞数と N 型糖鎖末端ガラクトシル化
割合に相関性が見出された。この結果より細胞増殖性が良好な条件下では、末端ガラクトシル化糖鎖を多く備えているために細胞障害活性が高い抗体が生産されることが示唆された。現在、培養液成分を変数に加えた条件件検討を行っており、培養液内の副生成物量と CHO 細胞の特性や生産抗体品質への影響についての解析結果も合わせて報告を行う。

Development of a cell function evaluation system using deep learning video
recognition technology

Enhancing bioprocess for recombinant antibody production using perfusion
culture○Makoto Masuhara, Sho Kataoka, Rie Sonoi, Yoshinori Kawabe,
Masamichi Kamihira(Grad. Sch. Eng., Kyushu Univ.)○Muneyoshi Okamoto1, Hiroaki Kto2, Keisuke Shibuya3, Masayoshi Onitsuka4(1 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Tokushima Univ., 2 Res. Dev. Dept. Innov. Div.,
Hitachi Plant Services Co., Ltd., 3 Res. Dev., Hitachi, Ltd., 4 Grad. Sch. Biosci.
Bioind, Tokushima Univ.)

Key words

deep learning, Chinese hamster ovary cell, video recognition

Key words
quality

perfusion, Chinese hamster ovary cell, monoclonal antibody, protein

2Dp06

ナノフィブリル化バクテリアセルロースを用いた CHO
細胞の浮遊培養における細胞死の抑制と抗体生産性への
影響

2Dp08

CHO 細胞における二重特異性 scFv 抗体の発現と分子特性評価

学○金子 瑛一郎 1, 辻崎 晴人 1, 藤原 政司 2, 安藤 英紀 3, 石田 竜弘 3,
谷 博文 2, 田島 健次 2
（1 北大院・総合化学, 2 北大院・工, 3 徳島大院・薬）ktajima@eng.hokudai.ac.jp○福間 奈々子 1, 沖田 大和 1, 天羽 宏枝 2, 伊藤 洋一郎 3, 石井 純 3,
近藤 昭彦 4, 梅津 光央 5, 鬼塚 正義 2
（1 徳島大院・創成科学研究, 2 徳島大院・社会産理工, 3 神戸大・
先端バイオ工研セ, 4 神戸大院・科技イノベ, 5 東北大院・工）onitsuka@tokushima-u.ac.jp

近年需要が拡大している抗体医薬のプロトタイプであるモノクローナル抗体の生産量を増大させるために、Chinese hamster ovary (CHO) 細胞などの動物細胞のより大きなスケール、高密度での培養が求められているが、細胞に加わる機械的ストレスが課題となっている。また糖質などを原料とし、セルロース合成菌
を分散剤を含む培地中で通気撹拌培養することによって調製されるナノフィブ
リル化バクテリアセルロース (NFBC) は、生体適合性・優れた力学強度を有し、その長い繊維長 (17 μm、アスペクト比 > 1,000) に基づく絡まり合いネットワー
クによって分散状態において特異な粘弾性挙動を示すことが確認されている。
本研究では、CHO 細胞の浮遊培養において NFBC を培地に添加することにより、CHO 細胞への機械的ストレスを低減して細胞死を抑制することを目的とした。
NFBC として、ヒドロキシプロピルセルロース (HPC) を分散剤として調製された HP-NFBC を用いた。HP-NFBC を 0.01 ~ 0.20 w/v％ 添加した 10％ NBS Ham’s F-12 培地 20 mL に CHO 細胞 DP-12 clone#1934 (ATCC CRL 12445) 株を 2.0×
105 cells/mL で播種し、100 mL 容スピナーフラスコ中で浮遊培養した。生細胞濃度をトリパンブルー法で調べたところ、最大の生細胞濃度は 0.05 w/v％添加
で無添加培地より大きく、0.10 w/v％以上でさらに大きかった。レオメーターで測定した培地の粘度および粘弾性は HP-NFBC 添加量の増加に応じて上昇し、0.05 w/v％ 以上で角周波数に依らずゲル様の性質を示した。死細胞数の指標として乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH) 量を測定したところ、HP-NFBC 添加量の増加に応じて減少し、細胞死の抑制が示唆された。以上より、長い繊維長を有する HP-NFBC を培地に添加することで細胞死を抑制することに成功し、機械的ストレスの低減が示唆された。

【背景・目的】
二重特異性抗体は高い機能性を有する一方で複雑な分子構造を有することから、製造コストが高くなる傾向がある。そのため、抗体生産量や抗体品質などの製造適合性を見据え、優れた分子特性を有する抗体の選定が必要である。本研究では、CHO 細胞一過性発現システムにより 9 種類の scFv 型二重特異性抗体を発現させ、分子特性を評価した。
【方法】
本研究で用いた抗体は、scFv 抗体 A（A1、A2：各抗体につき可変ドメイン VHVL と VL-VH）、scFv 抗体 B（B1、B2：VH-VL で固定）を持つ。各抗体の塩基配列について、リピート配列・GC 含有率・最適化コドンの使用を考慮して一過性発現プラスミドを調製、一過性発現用 CHO 細胞に遺伝子導入し、10 日間程度の培養を実施した。培養終了後、Protein L 親和性クロマトグラフィーで培
養上清から抗体を精製し、SDS-PAGE とキャピラリー電気泳動により抗体発現の確認を行った。また、CD スペクトル測定と熱変性測定により抗体構造と安定性を確認した。さらに SEC-HPLC により凝集抗体量を分析した。
【結果・考察】SDS-PAGE とキャピラリー電気泳動の結果より、全ての抗体で培養上清と細胞内への発現を確認した。しかし抗体の種類に応じて発現量は大きく異なり、特に A2-B1 抗体で良好な分泌生産量を示した。つまり、培養上清への分泌抗体生
産量は抗体配列に依存して生産量が変動すると考えられる。さらに CD スペク
トル測定では β-ストランド構造特有のスペクトルを示し、熱変性測定では A1B1 抗体で 2 つの変性中点が確認され、scFv 抗体単位で段階的に変性することが示唆された。また SEC-HPLC の分析から、抗体 A 可変ドメインが VH-VL の順番で配置された場合に凝集性が低減する傾向が認められた。すなわち、抗体のオリゴマー化や凝集化は抗体の分子構造フォーマットに依存して変化が生じると考えられる。

Restraining of cell death and effects on antibody production in suspension
culture of CHO cells by nanofibrillated bacterial cellulose

Expression and molecular characterization of bispecific scFv antibodies in
CHO cells○Eiichiro Kaneko , Haruto Tsujisaki , Masashi Fujiwara , Hidenori Ando ,Tatsuhiro Ishida3, Hirohumi Tani2, Kenji Tajima2(1 Grad. Sch. Chem. Sci. Eng., Hokkaido Univ., 2 Fact. Eng., Hokkaido Univ., 3 Fact.
Pharm. Sci., Tokushima Univ.)
1

Key words
culture123Chinese hamster ovary cell, antibody, bacterial cellulose, suspension○Nanako Fukuma1, Yamato Okita1, Hiroe Amou2, Yoichiro Ito3, Jun Ishii3,
Akihiko Kondo4, Mitsuo Umetsu5, Masayoshi Onitsuka2(1 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Tokushima Univ., 2 Grad. Sch. Biosci. Bioind,
Tokushima Univ., 3 EGBRC, Kobe Univ.,, 4 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe
Univ., 5 Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ.)
Key words
scFv antibody, Chinese hamster ovary cell, aggregation

188

2Dp09

次世代抗体生産トランスジェニックニワトリ作製へ向けた始原生殖細胞の開発

2Ep01

超高ホルムアルデヒド耐性細菌 Methylobacterium sp.
FD1 株における C1 毒性および C1 代謝制御機構の解明○石原 慎也（岐阜大院・連農）
t_nakaga@gifu-u.ac.jp

辻井 竜太郎, 奥嵜 雄也, ○西島 謙一（名大院・生命農学）
nishijim@nuagr1.agr.nagoya-u.ac.jp

次世代抗体を安定高生産できるニワトリを効率よく作製する技術開発を進めている。生殖系列（精子）への分化実績のある雄由来ニワトリ始原生殖細胞（Primordial germ cell, PGC）株に遺伝子改変を施し,レシピエント胚に移植することで作製した生殖腺キメラ個体を成熟させて交配することでトランスジェニッ
クニワトリ個体を得る。scFvFc を次世代抗体のモデルとして,CHO 細胞においてランダム遺伝子導入で外来遺伝子を高発現したローカスに該当する染色体位
置に CRISPR/Cas9 を用いた相同組み換えにより scFvFc の発現ユニットを導入した。PCR により目的部位に遺伝子が導入されたこと及び片アレルのみ導入され,その他の部位への導入はないことが確認された。樹立された PGC 細胞は増殖が若干遅くなることが観察された。この PGC をレシピエント胚に移植して,生殖腺キメラを得た。性成熟後に精子を採取し導入遺伝子コピー数を検定した
ところ,約 0.05 コピーであった。このことから,移植した PGC が生殖腺キメラ雄
個体の体内で精子へ分化していることが確認された。現在,交配と次世代のスクリーニングを進めている。
本研究は AMED「次世代治療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業」の支援を受け実施された。

【目的】
Methylobacterium sp. FD1 株はシックハウス症候群の原因物質ホルムアルデヒド（FA）に対して高い耐性と消去能力をもつことが知られており、2.7 M の FA 溶液をも処理できるこれまでに報告例のない「スーパーメチロトローフ」である。
FD1 株は、FA ジスムターゼ（Fdm）により高い FA 消去活性をもつが、FD1 株がもつ 3 つの Fdm 遺伝子のうち主要 Fdm をコードする遺伝子は同定されていない。また、FA 代謝における FA 消去系がどのように機能するか、さらにはメ
タノール代謝系を含めた FA に対する細胞応答に関する知見はない。
そこで本研究では、FD1 株の FA 消去系の発現制御とメタノール代謝系の FA に対する応答を観察し、その FA 代謝制御の詳細を示すことを目的とした。
【方法・結果】
FD1 株の FA に対する細胞応答を観察するため、FD1 株の生育 4 条件（コハク
酸、コハク酸/FA、メタノール、メタノール/FA）におけるトランスクリプトー
ムを RNA Seq にて網羅的に比較解析した。その結果、FD1 株において主要に発現する Fdm 遺伝子は fdm3 であり、その発現は FA により 55.0 倍に誘導された。
また fdm3 は fldA や fghA など FA 代謝酵素群と遺伝子クラスターを形成しており、これら遺伝子群も FA により発現が大きく上昇した。一方、FD1 株は、FA活性化経路を FA の存在にかかわらずほぼ構成的に発現するのに対し、セリン経路を含めたメタノール資化経路はメタノールで誘導されるものの、その発現は FA の存在で大きく抑制された。これらのことから、FD1 株は成育環境下のFA 濃度が高くなるとメタノール代謝を抑制し、fdm3 遺伝子クラスターにコードされる FA スカベンジャー系により FA の毒性を消去していることが考えられる。

Chicken primordial germ cells producing scFv-Fc protein

Analysis of regulation mechanism for C1 toxicity and C1 metabolism in thehyper formaldehyde-tolerant bacterium Methylobacterium sp. FD1

Ryutaro Tsujii, Yuya Okuzaki, ○Ken-ichi Nishijima(Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)○Shinya Ishihara(United Grad. Sch. Agric. Sci., Gifu Univ.)

Key words

chicken, germline, antibody, egg white

Key words

2Dp10

浮遊系 Human Embryonic Kidney cells 293 (HEK293)を用いたアデノ随伴ウイルス (AAV)ベクターの生産

2Ep02○砂 和樹 1, 前田 将治 2, 金井 貴蓉 1,2, 山野-足立 範子 1,2,
大政 健史 1,2
（1 阪大院・工, 2 MAB組合）
omasa@bio.eng.osaka-u.ac.jp

学

methanol, formaldehyde

土壌細菌による根内細菌への影響○佐々木 匠, Tran Thinh, 久保 幹
（立命館大院・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp

アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターは有用な遺伝子治療用ベクターとして注目されている。しかしながら AAV ベクターは治療効果を出すためには大量の AAV
ベクターを投与することが必要となる。現在 AAV の生産に主に用いられている生産手法には接着性 HEK293T 細胞が用いられている。しかし、HEK293T には SV40T 抗原が含まれているため、安全性に懸念が残る。また接着細胞を用いた生産系では培地体積当たりの生産性の向上には限界がある。そこで本研究では、SV40T 抗原を含まない浮遊化 HEK293 を用いた AAV ベクターの高生産系の構築を目標にしている。
まず HEK293(CRL-1573、ATCC)の培地中の FBS 濃度を 135 日間かけて段階的に下げることによって無血清培地へと馴化させ、その後フラスコ振盪培養を行うことで細胞の浮遊化を行った。その後 PEIpro（polyplus 社）を用いてトラン
スフェクションを行い、AAV2 生産性についての評価を行った。PEIpro 液量とプラスミドの比率(g-plasmid/g-PEI pro)を 1.0、1.5、2.0、3.0 と変化させ、AAV2の力価を qPCR によって評価した。その結果、PEIpro プラスミドの比が 1.5 で最も高い AAV 力価が得られた。Polyethylennimine とプラスミドの複合体のサイ
ズはインキュベート時間に依存して大きくなり[1] 、細胞に導入される適切なサイズが存在している。そこで、DLS を用いて培地中での複合体直径とインキュ
ベート時間の関係を検討した結果、インキュベート時間、30 秒、2 分、4 分、7分、12 分、20 分において、200、300、400、500、600、700 nm のサイズが得られた。複合体の大きさによる影響は細胞内での DNA 分解経路が関係していると考え、構築した HEK293 細胞の外来遺伝子分解経路について検討を現在行っている。
[1]Hu Y. et al., 21(13):5697-5705 (2021).

【背景・目的】 植物の体内には多様な細菌が生息している。これらの細菌は親株から子株に継承される垂直感染と植物の生育環境から侵入する水平感染の 2通りの感染経路がある。根は土壌中に存在しているため、根内細菌叢は土壌細菌叢の影響を強く受けることが分かっているが、土壌環境の違いによる土壌細菌叢の変化が根内細菌叢にどのような影響を及ぼすかは明らかになっていない。
本研究では、有機肥料を施肥した土壌および化学肥料を施肥した土壌でコマツナを栽培し、土壌および根内の細菌叢を解析することによって、施肥による土壌細菌の変化が根内細菌叢に与える影響を明らかにすることを目的とした。
【方法・結果】 バーミキュライトおよび真砂土、黒土、ピートモスを 5：3：1：
1 (v/v)で混合し、栽培土壌とした。この土壌に有機肥料または化学肥料を施肥し、それぞれを有機条件、化学条件とした。また、栽培土壌を 20 分間焼却し、化学肥料を施肥したものを焼却条件とした。3 条件の土壌に播種後 1 週間のコ
マツナを定植し、4 週間栽培した。栽培後、土壌およびコマツナの根から細菌
DNA を抽出し、細菌数の算出と 16S rRNA 解析を行った。
土壌細菌数は有機条件で 4.2×108 cells/g-soil と最も多く、焼却条件では検出限界以下でった。また、根内細菌数はいずれの条件でも 5.1～5.4×108 cells/g-root であった。このことから、土壌細菌数は根内細菌数にあまり影響を与えないことが示唆された。土壌細菌叢の多様性は科レベルでみると有機条件と化学条件が同程度であり、焼却条件が低かった。また、根内細菌叢の多様性も同様に有機条件と化学条件が同程度であり、焼却条件で低かった。このことから、土壌細菌叢は根内細菌叢に影響を与えていることが示唆された。

Production of adeno-associated virus (AAV) vectors using suspended
HEK293The effects of soil bacteria on endophytic bacteria in roots○Kazuki Suna , Masaharu Maeda , Guirong Kanai , Noriko Yamano-adachi ,Takeshi Omasa1,2(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 MAB)
1

Key words

2

1,2

adeno associated virus, polyethylenimine, HEK293, transfection

1,2○Takumi Sasaki, Thinh Tran, Motoki Kubo
(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words

soil, root, bacteria

189

2Ep03

ダイズ根毛を対象とした一細胞レベルの根粒菌感染特異的遺伝子発現解析

2Ep05

k-mer 法によるゲノム編集ジャガイモ中の外来核酸の検出○安本 周平 1,2, 村中 俊哉 1,2（1 阪大院・工, 2 阪大・先導的学際研機構）
yasumoto_shuhei@bio.eng.osaka-u.ac.jp○蘇 千雅 1, 松永 浩子 2, Samuel Ashok Z. 2, 奥平 美里 2,
濱崎 英史 5, 松井 南 6, 竹山 春子 1,2,3,4（1 早大院・先進理工, 2 早大・ナノライフ創新研, 3 産総研・早大
CBBD-OIL, 4 早大・生命動態研, 5 理研・環境資源, 6 横市大・
木原生研）
haruko-takeyama@waseda.jp
ダイズを含むマメ科植物は、根粒菌との共生により窒素固定産物を得ている。
この共生関係により、ダイズは収量・品質を向上するため、根粒菌共生は重要な現象である。そこで本研究では、共生の初期段階である感染に注目し、ダイズ応答機構の解明を目指した。
根粒菌は、ダイズ根表面に存在する根毛を通じて感染する。根粒菌感染時、根毛の遺伝子発現動態を調べた先行研究では、多数のダイズから取得した数万本以上の根毛をまとめて解析していた。しかし、根粒菌はダイズ根毛に一様に感染するわけではない。よって先行研究では、正確な発現変動解析が困難であった。そこで本研究では、根毛１本レベルでの RNA-seq の実現、及び根粒菌感染
特異的な遺伝子の抽出と機能解析を目指した。
解析対象として、発芽前のダイズに根粒菌を接種した接種群及び、非接種群を準備した。2 日間の培養後、微小組織採取装置（Yamazaki et al. Sci.Rep. 2020）を使用し、根毛 1 本レベルの組織採取を行った。この方法の比較対象として、多数の根毛を削ぎ落としたバルク根毛サンプルを作製した。
根毛 1 本レベルの RNA-seq は、バルク根毛の RNA-seq より、根粒菌感染特異的な遺伝子を 10 倍多く検出できた。根毛 1 本を対象とすることで、遺伝子発現解析の解像度を上げることが可能となることが示された。次に、根毛 1 本レベ
ルの RNA-seq 結果をクラスタリングすると、根粒菌接種群内で複数のクラス
ターに分かれた。接種群内の一部のクラスターは、既知の根粒菌感染マーカー
遺伝子を発現していたため、感染段階であることが示唆された。擬似時間解析の結果、その他の接種群のクラスターは、非感染の根毛とは異なる感染前段階であることが示唆された。現在上記結果をもとに、詳細な根毛の感染過程の解析を進めている。
本研究は内閣府ムーンショット型農林水産研究開発事業により実施された。

ゲノム編集は作物の狙った遺伝子を改変可能な強力な育種技術である。日本国
内では外来遺伝子の残存しないゲノム編集生物はカルタヘナ法の規制の対象外となることが示されており、作物の育種現場での利用が期待されている。しかし、ゲノム編集生物中の外来遺伝子の残存を確認するコンセンサスの取れた手法は知られていない。近年、次世代シークエンス (NGS) によって全ゲノムを解読した大量の塩基配列データを使用することで、ゲノム編集に利用したベクター
配列を高精度に検出可能な k-mer 法が新たな外来遺伝子検出法として注目されている。本研究では k-mer 法がゲノム編集ジャガイモ中の外来核酸を検出可能かどうか検討を行った。まず 20 塩基の外来 DNA を挿入した四倍体ジャガイモのゲノム情報をコンピューター上で準備し、コンピューターシミュレーションによる k-mer 解析を実施した。取得する NGS データ量がゲノムサイズの 30 倍以上の場合、20-mer での解析によって外来 DNA を見落としなく検出できることが確認できた。続いて、実際にゲノム編集用のベクター DNA が導入された形質転換ゲノム編集ジャガイモからゲノム DNA を抽出し、NGS データを取得、
k-mer 解析を行ったところ、外来 DNA の検出に成功した。本研究により、k-mer
解析法がジャガイモにおける外来遺伝子検出の１つとして有効であることが示された。k-mer 法は数十塩基程度の短い外来核酸の検出が可能であり、PCR 法
等の特性の異なる複数の検出手法を用いることで、ゲノム編集生物中の外来遺伝子の残存をより確実に評価することが可能となると期待される。

Analysis of rhizobial infection-specific gene expression at the single-cell levelin soybean root hairs

Foreign DNA detection in genome-edited potatoes by k-mer method○Shuhei Yasumoto1,2, Toshiya Muranaka1,2(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ.)○Qianya Su , Hiroko Matsunaga , Ashok Z. Samuel , Misato Okudaira ,Hidefumi Hamasaki5, Minami Matsui6, Haruko Takeyama1,2,3,4(1 Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2 Res. Org. Nano Life Innov., Waseda
Univ., 3 CBBD-OIL, AIST-Waseda Univ., 4 Inst. Adv. Res. Biosyst. Dynam., Waseda
Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ., 5 CSRS, RIKENS, 6 Kihara Inst. Biol. Res.,
Yokohama City Univ.)
Key words
single-cell level transcriptome, soybean, root hairs, rhizobia

Key words

genome editing, next-generation sequencing, transgenic plant

2Ep04

2Ep06

側根形成を誘導する植物共生菌由来の低分子エフェク
ターの探索

1

2

2

2

培地成分の改変による植物培養細胞における組換えタン
パク質生産とその影響の評価○梶浦 裕之, 関野 七海, 三﨑 亮, 藤山 和仁（阪大・生工国際セ）
fujiyama@icb.osaka-u.ac.jp

学○松浦 大空, 小川 拓水, 岡澤 敦司, 太田 大策（大阪公立大・院農）okazawa.atsushi@omu.ac.jp【 背景と目的 】
近年、植物体に加え、植物培養細胞を用いた組換えタンパク質生産が注目されている。培養細胞では生産した組換えタンパク質を培地中に分泌でき、通常植物体からタンパク質を抽出・精製する際の煩雑な工程を簡略化できる利点がある。また、培地組成の改変により、その分泌・蓄積量を増加させることも期待できる。中でも、種々の添加物により分泌生産能を向上させた報告例があり、分泌生産能の向上は植物での組換えタンパク質生産のダウンストリームプロセ
ス向上に直結する結果をもたらすはずである。
本研究では、植物培養細胞による組換えタンパク質の分泌生産に着目し、添加剤による培地成分の改変により、組換えタンパク質生産性、特に分泌能の向上を目指した。
【 方法 】
使用する植物培養細胞には、糖鎖修飾経路を改変したタバコ近縁種の Nicotiana
benthamiana から誘導し、モデルタンパク質としてゴーシェ病治療薬である βGlucocerebrosidase (GCase) を 発 現 し た 培 養 細 胞 を 用 い た 。 添 加 剤 に は
Polyvinylpyrrolidone (MW=360,000)、Polyehylene glycol (MW=8,000)、ゼラチン、Bovine serum albumin (BSA)、マンニトールの 5 種類を使用し、濃度の最適化、また培養日数の最適化を行った。また、培地中に分泌された GCase の活性からそれぞれの分泌能を評価した。
【 結果 】
培地中への GCase 分泌を誘導した添加剤はを最も安定化させたのはゼラチンであった。ゼラチンは、食品にも添加されており、今回試した添加物の中ではヒトに安全性も担保されている。ゼラチンを加えることで、ヒトに対する親和性を保ちつつ、培地中に分泌した GCase を安定化させることができると考えられた。

高等植物は, 他種植物や真菌, 細菌の感染等の外来性刺激に対して, 土壌中では主に根系を介して応答している. 根圏での相互作用に関して, 真菌や細菌の中には, 高等植物と共生して宿主に有益な効果をもたらす生物種の存在が確認されている. 本研究で用いる Serendipita indica は植物に共生する担子菌であり、宿主植物の根の内部で共生して宿主にストレス耐性の向上や生育促進をもたらすことが報告されている. 本研究では生育促進の起因となる根系の発達に着目し, S.
indica 由来の側根形成を誘導する化合物の同定を試みた. S. indica を透析チュー
ブ (分画分子量 3500) に封入して液体培地中で培養し, 培養液 (S. indica culture
media, SCM) を回収した. オーキシン応答を可視化できる DR5::GUS シロイヌナ
ズナ形質転換体に SCM を処理し, 側根誘導を定量的に評価したところ，側根誘導部位が SCM の濃度依存的に増加した. 以前の研究から ＳＣＭ 中に側根形成を誘導する低分子化合物の存在が示唆された. 本研究で側根形成を誘導する化合物の精製のために SCM を HPLC に供したところ, 顕著な側根誘導活性を持つ F2と F3 の 2 画分が得られた. 特に活性が高かった F3 に対して HPLC を利用した精製をさらに 2 回行い, 活性を評価した結果, F3 から 1 ppm で有意な活性を示す
画分が得られた. また, F2 にも有意な活性を示す 2 画分が確認されたため, 側根誘導活性を持つ化合物は少なくとも 3 つ以上存在すると推測された. 今後, これらの化合物の精製条件を検討し, シロイヌナズナの側根形成を誘導する S. indica
由来の低分子化合物の単離, 同定を試みる. これらの化合物について, 環境負荷の少ない植物成長促進剤やバイオスティミュラントとしての活用, さらには, 持続可能な社会に向けた人工的な化学肥料や農薬の削減に関わる課題への貢献が期待される.

The effect of additives on recombinant protein production in plantsuspension cultured cells

Isolation of lateral root-inducing compounds from the endophytic fungus○Hiroyuki Kajiura, Nanami Sekino, Ryo Misaki, Kazuhito Fujiyama(ICBiotech, Osaka Univ.)

Key words
additives

plant suspension cultured cells, recombinant protein production,○Hirotaka Matsuura, Takumi Ogawa, Atsushi Okazawa, Daisaku Ohta
(Grad. Sch. Agric., Osaka Met. Univ.)

Key words

symbiosis, root, basidiomycetes

190

2Ep07

バイオマス増大・多蘖・大粒遺伝子を組合わせた超多収
コシヒカリの種苗法による品種登録

2Fp02○富田 因則（静大・グリーン科技研）
tomita.motonori@shizuoka.ac.jp

清酒酵母における EHL 遺伝子破壊株の諸性質○友永 佳津子, 渡邉 康太, 門倉 利守, 中山 俊一（東農大・応生科）
s3nakaya@nodai.ac.jp

激化する気象変動のもとで多発する大型台風、大雨によって主力のコシヒカリ
をはじめ米の倒伏害が拡大しており、さらに、グローバル化による外国産コシ
ヒカリ流入で自給体制の崩壊が懸念される。本研究ではコシヒカリのゲノムにバイオマス増大遺伝子 Bms、短稈・多蘖遺伝子 d65、大粒遺伝子 GW2 を集積して新しいコシヒカリを開発した。
コシヒカリより 10 cm 背丈が高くて耐倒伏性が強い「みどり豊」とコシヒカリとの交雑で分離した頑健個体を一回親にして、コシヒカリを反復親とする戻し交雑 BC1F2～BC6F2 各世代においてコシヒカリより穂数が多くて地際で匍匐状に湾曲する頑健性が 1 遺伝子遺伝したため、これをバイオマス増大遺伝子 Bms と命名した。一方、豊コシヒカリへのコシヒカリ sd1(品種ヒカリ新世紀)の戻し交
雑では二重短稈がメンデル遺伝し、sd1 とは異なる短稈遺伝子 d65 が見出された。そこで、コシヒカリ d65×コシヒカリ Bms で分離した d65Bms ホモ型個体を一回親とするコシヒカリへの 5 回の戻し交雑で「コシヒカリ d65Bms」を育成し、コシヒカリ GW2 ×コシヒカリ d65 により「コシヒカリ d65GW2」、さらに、三系交雑を経て「コシヒカリ d65GW2Bms」を育成した。
コシヒカリ d65、d65Bms、d65GW2、d65GW2Bms は d65 によって 16.3～20.0%
短稈化し、全ゲノム解析では SNPs が 0.5～1.2 個/Mb に減少していた。穂数はコシヒカリ d65 で 34.6%、d65Bms で 18.0%、d65GW2 で 6.0%、d65GW2Bms では 75.8% 増 加 し た 。 粒 重 は コ シ ヒ カ リ d65 で 2.3% 、 d65GW2 で 26.8% 、d65GW2Bms で 30.8%増加した。以上のように、d65 には短稈に加えて多蘖・粒大効果があり、Bms、GW2 と組合せると、気候危機に対して植物体が強靭で飛躍的多収の遺伝子型に改変された。コシヒカリ d65Bms は種苗法の審査を経て農林水産省で品種登録され、宮城、大阪他 5 府県で将来の生産振興を見越して生産力検定・適応性試験が実施された。

【背景と目的】 EHL 遺伝子は、きょうかい酵母 K7 の全ゲノム解析で見出された清酒酵母特異的な遺伝子で、サブテロメア領域に 3 コピーある。ホモロジー
解析から epoxide hydrolase をコードすると推定されているが、実際に担う機能は明らかになっていない。我々は EHL 遺伝子が清酒酵母特異的であること、そしてコピー数が多いことから、清酒醸造において特別な役割を持つのではないかと推定し、EHL 遺伝子破壊株を取得しその性質を調査した。
【方法】 K7 の泡なし変異株である K701 の一倍体株を親株とし、EHL 遺伝子内にストップコドンを挿入して破壊株を作製した。遺伝子が 3 コピーあるためマーカー除去型プラスミドを用い、ストップコドンの挿入とマーカー除去を 3 回繰り返して破壊株を得た。得られた破壊株と親株を用いて、グルコース 10%を含
む YM 培地での発酵試験、ビタミン要求性試験、メタボローム解析、小仕込試
験などを行った。
【結果と考察】 YM 培地での発酵試験では、EHL 遺伝子破壊株の生育能およびアルコール発酵能は親株と同等であった。またビタミン要求性試験とメタボロー
ム解析を行った結果、EHL 遺伝子破壊株ではパントテン酸生合成量が低下していた。そこでパントテン酸生合成経路の中間代謝物をビタミンフリー培地に添加して培養したところ、中間代謝物の一つであるパントエイトの合成能が低下している可能性が示唆された。小仕込試験では、YM 培地での発酵試験と同様に EHL 遺伝子破壊株は親株と同等のアルコール発酵能を示した。しかし清酒の香気成分、特にカプロン酸エチルと酢酸イソアミルが親株に比べて大きく減少した。それぞれを合成する酵素の活性と酵素をコードする遺伝子の転写量も低下しており、EHL 遺伝子の破壊により生成酵素をコードする遺伝子の転写量が低下した結果、香気成分量が大きく減少したものと推定された。

Varietal registration of super high-yielding isogenic Koshihikari combining
genes for biomass, tillering and large grain

Characteristics of the EHL gene disruptant in sake yeast○Motonori Tomita(Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)○Kazuko Tomonaga, Kouta Watanabe, Toshimori Kadokura, Shunichi Nakayama(Fac. Appl. Biosci., Tokyo Univ. Agric.)

Key words

rice, genome, gene, genome engineering

Key words

sake yeast

2Fp01

福島県オリジナル清酒酵母を用いたビール醸造方法の最
適化

2Fp03

超高圧ホモジナイザーの清酒殺菌工程への応用○中島 奈津子, 齋藤 嵩典（福島県ハイテクプラザ）
nakajima_natuko_01@pref.fukushima.lg.jp○荒川 弦矢, 横井 健二（富山県食品研究所）
genya.arakawa01@pref.toyama.lg.jp＜背景と目的＞
クラフトビール製造が全国的に活発化し、地域特産品を用いた特徴あるフレーバーを含むビールや発泡酒など、製造場ごとに工夫を凝らした製品が精力的に上市されている。福島県でも同様に新規製造場が増え、製品の多様化および特徴づけに取り組んでいる。そこで、県産酒としての特徴づけの一助とするため、福島県オリジナル清酒酵母「うつくしま煌酵母」を用いたビール製造を目指し、吟醸香（カプロン酸エチル）を含む和風ビールの製造に活用できる最適な発酵管理方法の構築に取り組んだ。
＜方法＞
１．煌酵母を用いた麦汁発酵試験
初期比重 1.02～1.07 の麦汁に対し、煌酵母および市販ビール酵母を 1×104cell/ml
および 1×107cell/ml となるように添加した試験区を作成した。それぞれ 11℃、25℃にて一定期間発酵させ、pH、比重、アルコール、濁度等を比較した。
２．市販ビール酵母との混合発酵
初期比重 1.05 の麦汁および麦芽エキスを用い、煌酵母と市販ビール酵母について、それぞれの酵母の添加量および添加時期の異なる試験区を作成し、混合発酵を行った。発酵は一定温度で行い、比重、アルコール、香気成分、有機酸等を測定した。
＜結果と考察＞煌酵母は、一般的なビールの発酵温度帯においては増殖が不十分であり、本試験の条件では単独でのアルコールの生成は困難であった。煌酵母をビール酵母と同程度まで増殖させるためには、高温で一定期間発酵を行う必要があった。
また、煌酵母とビール酵母を混合し、煌酵母の香気特性（カプロン酸エチル）
を適度に含み、2 週間程度でアルコール 5％を達成するための発酵条件を明らかにした。混合発酵により製成したビールは、ビール酵母単独の場合とは異なる
有機酸組成となった。清酒酵母をビール製造に使用する際、適切な管理を行う
ことで新たな香味の付与等に役立てられると考える。

＜目的＞火入れは伝統的な清酒の殺菌工程であり、微生物を殺菌し酵素を失活させることで清酒の品質を安定させるが、同時に発がん性が疑われているカル
バミン酸エチル(EC)を生成する。本研究では EC が生成しない殺菌方法として超高圧ホモジナイゼーション(Ultra-High Pressure Homogenization; UHPH)による清酒の殺菌を試みた。
＜結果及び考察＞市販の生酒に火落ち菌 4 種(Lactobacillus casei, Lactobacillus
fructivorans, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus homohiochii)をそれぞれ 105/ml になるように添加し、1-3 回の UHPH 処理を行った後に生菌数を測定した。その結果 L. fructivorans と L. hilgardii は 1 回処理で殺菌されており、L. casei と L.
homohiochii は 2 回処理で殺菌された。きょうかい酵母 4 種類に対し同様の実験を行ったところ、酵母は 1 回処理で殺菌された。次に 2-4 回 UHPH 処理した清酒の α-amylase, glucoamylase, acid-carboxypeptidase の酵素活性を測定したところ全ての酵素が失活していたため、UHPH 処理は清酒中の微生物の殺菌と酵素失活に有効であることが明らかになった。
2-4 回の UHPH 処理は日本酒度や酸度、アミノ酸度にほとんど影響を与えなかったが、アルコール濃度は 16.8％から 16.4-16.6％に減少した。同様に有機酸や香気成分も減少し、最も減少率の高いカプロン酸エチルは 17％減少した。興味深
いことに、63 度で 10 分の火入れを 2 回した清酒では 9.8 ppb の EC が検出されたが、UHPH 処理した酒では明確なシグナルは検出されなかった。以上の結果
から UHPH 処理は火入れよりも EC の生成が少ない殺菌方法であることが明らかになった。

Optimization of beer brewing method with SAKE yeast developed in
FUKUSHIMA prefecture

Application of ultra-high pressure homogenization to pasteurization processof sake production○Natsuko Nakajima, Takanori Saito(Industrial Technology Institute Fukushima Prefectural Government)

Key words

beer, fermentation, sake yeast, alcohol○Gen-ya Arakawa, Ken-ji Yokoi(Toyama Pref. Food Res. Inst.)

Key words
sake, hiochi lactobacillus, ethyl carbamate, ultra-high pressure
homogenization

191

2Fp04

黄麹菌 Aspergillus oryzae の生育にリグニンが及ぼす
影響

2Fp06

○田中 拓未 1, 劉 利雲 1, 酒井 香奈江 1, 山下 秀行 2,
Garrido Sharon Marie Bahena 3, 岩下 和裕 3, 楠本 憲一 1
（1 阪大院・工, 2 樋口松之助商店, 3 酒総研）
kenichi_kusumoto@bio.eng.osaka-u.ac.jp

細胞径および光学密度を用いた細胞密度の推定○福田 展雄（産総研・バイオメディカル）
nob-fukuda@aist.go.jp

麹菌 Aspergillus oryzae の表現型は、生育時に接触する高分子に応答し変化する。
我々は以前、難分解性高分子である土壌成分フミン酸が A. oryzae の生育・表現型に影響することを報告した（劉、第 74 回生物工学会大会）。A. oryzae がフミン酸を分解するという報告はこれまでに無く、A. oryzae は自身が分解・資化しない高分子にも応答する可能性が予想された。本研究では、製麹過程において
A. oryzae が接触する植物由来高分子の内、難分解性高分子であるリグニンに着目した。A. oryzae のリグニン分解能力に関する報告はごくわずかである。また、リグニンおよびその分解産物は酵素反応や微生物の増殖を阻害することが知られている。ここから、リグニンが A. oryzae の生育を阻害すると予想し、Czapek-Dox (CD)寒天培地及び CD 寒天培地で A. oryzae RIB40 株を培養した。リ
グニン濃度 0.01～0.1% (w/v)では予想に反しコロニー径が拡大し、0.5%では変化なし、1%では縮小した。分生子や菌核、セクター等の変化も観察された。
従って、植物由来基質中の難資化性高分子も A. oryzae の増殖に影響する可能性が示唆された。次に、様々な A. oryzae 株のリグニンへの応答を解析した。A.
oryzae は 17 クレードに分類される（Watarai, 2019; Sharon、日本農芸化学会 2023
年度大会）。入手した A. oryzae 株群約 30 株を、CD 寒天培地及び 0.05%リグニ
ン添加 CD 寒天培地で培養した。コロニー径「拡大・縮小・変化なし」のいずれも観測され、同じクレードの株同士では類似の変化を示した。各 A. oryzae 株が選抜される過程で応答性が分化した可能性が推察される。一方、同じクレード内で逆の応答を示す株も存在しており、株間のゲノム DNA や遺伝子発現の比較によりリグニン応答因子の同定が可能と考えられる。
本研究は公益財団法人発酵研究所寄付講座助成(grant number K-2021-008)を受けて実施した。

波長 600 nm での光学密度 (OD600) 測定は、微生物培養における細胞密度を推定するために広く利用されています。 出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae は、産業界で最も使用されている微生物の 1 つであり、ランベルト・ベールの法則を用いることで、測定された OD600 の値から細胞密度が概算されています。 この
OD600 値は濁度測定に基づいているため、ランベルト・ベールの法則は細胞密度が低い微生物の培養にのみ適用することができます。 一般的には酵母菌株は一倍体と二倍体に分類され、 二倍体酵母の細胞サイズが一倍体酵母よりも大きいことが知られています。 さらに、三倍体や四倍体などの倍数体酵母は、パン製造やラガービール醸造などに使用されています。一方、ランベルト・ベール
則における比例定数は、細胞サイズ（粒子径）などのいくつかのパラメータに大きく依存すると考えられていますが、現実的には細胞の倍数性による上記の比例定数の差異にはほとんど注目されていません。 本研究では、同質遺伝子的背景を持つ一倍体、二倍体、三倍体、および四倍体酵母の細胞サイズを比較し、ランベルト・ベールの法則における比例定数との関係性を調査しました。 本研究において、上記の比例定数はフローサイトメトリーによって推定された見かけの細胞直径に比例することが判明しました。 各細胞の特性は遺伝的要因と環境的要因に大きく依存しますが、異なる倍数性を持つ酵母株から得られたデー
タセットは、酵母研究者や技術者が実施する細胞密度測定において有益な参考
情報源となるものと期待されます。

The effect of Lignin to the growth and morphology of Aspergillus oryzae.

Estimation of cell density using cell diameter and optical density○Takumi Tanaka1, Liyun Liu1, Kanae Sakai1, Hideyuki Yamashita2,
Sharon Marie Bahena Garrido3, Kazuhiro Iwashita3, Ken-ichi Kusumoto1(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Higuchi Matsunosuke Shoten Co., Ltd., 3 NRIB)○Nobuo Fukuda(Biomed. Res. Inst., AIST)

Key words

Aspergillus oryzae, growth phenotype, lignin, biomass

Key words

yeast, optical density

2Fp05

協会系酵母と系統の異なる清酒酵母に見られる 「老香」を発生させにくい特長への SAM 低蓄積の関与

2Fp07

Tetragenococcus halophilus において自己凝集に必要なオペロンとその調節因子の同定○柴田 裕介 1, 山田 翼 1, 池田 優理子 2, 金井 宗良 2, 藤井 力 3,
赤尾 健 2, 五島 徹也 2, 磯谷 敦子 2, 高橋 俊成 1
（1 菊正宗酒造, 2 酒総研, 3 福島大）
y-shibata@kikumasamune.co.jp

学

遠藤 隆平 1, ○堀田 詩織 2, 脇中 琢良 3, 茂木 喜信 3, 渡部 潤 1,2,3,4（1 福島大院・食農, 2 福島大・食農, 3 ヤマサ醤油, 4 福島大・食農・発酵研）
watanabe@agri.fukushima-u.ac.jp【背景】老香は清酒の貯蔵中に生成されるオフフレーバーの一種であり、その主要成分であるジメチルトリスルフィド(DMTS)の生成には酵母のメチオニン再生経路の関与が示唆されている 1)。協会系酵母と系統の異なる清酒酵母、Km67 株を用いた製成酒の貯蔵による DMTS 生成量(DMTS-pp)は協会系酵母に比べて低いことが明らかになっている 2)が、その詳細は不明である。また、Km67 株はメ
チオニン再生経路の中間代謝物である S-アデノシルメチオニン(SAM)を蓄積しないという特徴を有している。そこで、SAM 低蓄積の特徴に着目しながら、
Km67 株の清酒において、老香が発生しにくい機構の解明を目指してきた。これまでに醪に添加された SAM が酵母のメチオニン再生経路を介して、DMTS生成に関与する可能性が示されていた 3)ため、今回は酵母内に蓄積された SAMと DMTS 生成との関連について、調べた結果を報告する。
【方法、結果】ADO1 遺伝子の破壊株は SAM 蓄積量が増加すること、メチオニ
ン再生経路関連遺伝子、MDE1 の破壊株を用いた場合、清酒の DMTS-pp が著しく低下することに着目し、Km67 株を親株として、ADO1 破壊株、MDE1 破壊
株、ADO1 と MDE1 の二重破壊株を作製後、清酒醸造試験を実施した。ADO1
破壊株では、親株と比較して酒粕の SAM 含量の増加と清酒の DMTS-pp の増加が確認された一方、二重破壊株では、MDE1 破壊株と比較して、SAM 含量が増加したにも関わらず、DMTS-pp の増加は確認されなかった。以上より、酵母内に蓄積された SAM がメチオニン再生経路を介して、清酒の DMTS 生成に関与していること、Km67 株の SAM 低蓄積が Km67 株を用いた製成酒の貯蔵による
DMTS 生成量の低さに寄与していることが示唆された。
1) 磯谷敦子, 生物工学会誌, 93, 116-121 (2015)
2) Takao Y., et al., J. Biosci. Bioeng., 126, 617-623 (2018)3) 柴田ら、日本生物工学会大会講演要旨集、p169 (2022)【目的】耐塩性乳酸菌 Tetragenococcus halophilus は醤油醸造に使用される重要な微生物である。凝集性を示す T. halophilus は，醤油諸味を圧搾する際に凝集塊が濾布にトラップされ生揚げに移行しないことから，醤油の清澄化に有用であるとされているが，その凝集メカニズムは未解明であった。著者らは，さまざ
まな塩蔵食品等から凝集性を有する T. halophilus を分離し，その遺伝的メカニ
ズムを明らかにすることを目的に研究を実施した。
【結果と考察】へしこなどの塩蔵食品から，凝集性を示す T. halophilus を 5 株（AB4 株, AL1 株, IT2 株, OK1 株, および MS4 株）分離した。これらの凝集株に固有の遺伝子をドラフトゲノム情報から探索した結果，凝集に関与する可能性がある 4 つの遺伝子（aggR, A, B, C）が見出された。相同性検索により，aggR,
A, B, C は，それぞれ転写因子，コラーゲン結合タンパク質，ソルターゼ，推定
タンパク質をコードすると予測された。AggA は，分泌シグナル，コラーゲン
結合ドメイン，Can B タイプドメイン，LPXTG モチーフから構成され，他の乳酸菌の凝集因子と構造的に類似していたことから，T. halophilus においてもこのタンパク質が凝集の原因であると推定された。逆転写 PCR 解析によって aggA,
B, C がオペロン（agg オペロン）を構成することが明らかになった。AB4 株および AL1 株から表現型を指標に取得した 22 株の非凝集性変異株は，例外なくaggR または aggA にインサーションシーケンスの挿入などの変異が認められた。
また，TIMING 法により遺伝子型を指標に取得した aggR 破壊株および aggA 破壊株は凝集性を失っていたことから，この 2 遺伝子は T. halophilus の凝集に必須であると考えられた。aggR に IS が挿入された変異株は，agg オペロンの発現量が著しく低下していたことから，AggR は agg オペロンを正に制御する転写因子であると考えられた。

The effect of low SAM accumulation on low hineka odor in sake brewed
with a non-Kyokai yeast

Identification of an operon and its regulator required for autoaggregation in○Yusuke Shibata , Tasuku Yamada , Yuriko Ikeda , Muneyoshi Kanai ,Tsutomu Fujii3, Takeshi Akao2, Tetsuya Goshima2, Atsuko Isogai2,
Toshinari Takahashi1(1 Kiku-Masamune Sake Brewing Co., Ltd., 2 NRIB, 3 Fukushima Univ.)
1

Key words

12S-adenosylmethionine, sake yeast, dimethyl trisulfide

2

Tetragenococcus halophilus

Ryuhei Endo1, ○Shiori Hotta2, Takura Wakinaka3, Yoshinobu Mogi3,
Jun Watanabe1,2,3,4(1 Grad. Sch. Food and Agric. Sci. Fukushima Univ., 2 Fac. Food and Agric. Sci.
Fukushima Univ., 3 Yamasa Corp., 4 Inst. Ferment. Sci. Fac. Food and Agric. Sci.
Fukushima Univ.)
Key words
aggregation, food, Tetragenococcus halophilus, soy sauce

192

2Fp08

カナバニンを用いたアルギニンデイミナーゼ破壊株の
育種

2Gp01

Lactiplantibacillus plantarum PUK6 が生産する多成分

バクテリオシンの生合成機構○松田 明香里 1, 本田 絢郁 2, 河原 あい 2, 善藤 威史 3, 松崎 弘美 1,2（1 熊本県大院・環境共生, 2 熊本県大・環境共生, 3 九大院・農）matusaki@pu-kumamoto.ac.jp○脇中 琢良 1, 渡部 潤 1,2, 茂木 喜信 1
（1 ヤマサ醤油, 2 福島大・食農）
wakinaka@yamasa.com【目的】好塩性乳酸菌 Tetragenococcus halophilus は、醤油醸造において乳酸発酵を担う。T. halophilus はアルギニンを分解するアルギニンデイミナーゼ経路を有しており、この経路の代謝物は発がん性が指摘されるカルバミン酸エチルの前駆体となるため、醤油醸造においてアルギニンが分解される反応は好まれない。
演者らは以前に、トランスポゾンの転移を利用してアルギニンデイミナーゼ経路を不活化した変異株を育種できることを報告したが、非常に手間のかかる方法であったため、アルギニン非分解性株の効率的なスクリーニング法を検討することとした。
【結果と考察】アルギニンのアナログであるカナバニンを含む培地で培養すると、アルギニン非分解性株が優先的に生育することを見出した。このようにして取得した変異株は、従来の方法で取得した変異株と同様に、アルギニンデイ
ミナーゼオペロンにトランスポゾンが転移していることが確認された。カナバ
ニンは、アルギニン分解性株の増殖を遅延させたが、アルギニン非分解性変異株の増殖に与える影響は相対的に小さく、これによってアルギニン非分解性株が優先的に生育したと考えられた。カナバニンは一般的に、誤ってタンパク質合成に用いられることで毒性を発揮する。アルギニンデイミナーゼを有する菌株は、この経路でアルギニンを大量に消費し、菌体内でカナバニンの存在比を高めてしまうことで、カナバニンの毒性をより強く受けるのではないかと推測された。このように、アミノ酸を大量に消費する経路が破壊されることで、菌体内のアナログ存在比が低下してアナログ耐性が向上するという機構は、従来知られていなかった新奇なアナログ耐性機構である可能性がある。

【目的】乳酸菌が生産するバクテリオシンは安全性に優れた食品保存料として期待されている。Lactiplantibacillus plantarum PUK6 は熊本県の伝統的発酵食品「味噌漬け豆腐」から分離されたバクテリオシン生産乳酸菌である。本研究では、PUK6 株が生産する多成分バクテリオシンの生合成機構を明らかにすることを目的とした。
【方法および結果】PUK6 株培養液上清から 3 種類のバクテリオシン（plantaricin）
を精製し、アミノ酸配列を分析後、バクテリオシン遺伝子の PCR クローニングを行った。そして、plantaricin 生合成関連遺伝子群（pln locus）の全塩基配列（21.8 kb）を決定した。pln locus 上の各遺伝子の機能を推定したところ、機能不明遺伝子の orf1 および orf2 を見出した。これらがバクテリオシンの構造遺伝子であると予想し、orf1 および orf2 の発現を RT-PCR で確認した。そこで、それらの遺伝子産物の推定成熟ペプチドの機能解析を行った結果、これらを 2 分子ペプチドからなるクラス IIb バクテリオシン遺伝子と同定し、その活性型バクテリオシンを plantaricin PUK6 と命名した。以上より、PUK6 株は少なくとも 4
種類のバクテリオシン（plantaricins A、EF、NC8 および PUK6）を生産することが明らかとなった（Kawahara et al. J. Biosci. Bioeng. 2022）。次に、pln locus 上の各遺伝子の機能を推定したところ、推定 ABC トランスポーター遺伝子（plnG）と、そのアクセサリータンパク質遺伝子（plnH）を見出した。ウェブデータベース解析によって、PlnG/H は PUK6 株が生産するバクテリオシンのプロセッシン
グと菌体外輸送に関与すると推測した。現在、バクテリオシン生合成機構を明らかにするため、plnG/H 遺伝子破壊株や plnG/H 遺伝子と各バクテリオシン遺伝子との共発現株の作製を進めている。

Isolation of arginine deiminase mutants with arginine analogue canavanine.

Biosynthesis mechanism of multiple bacteriocins produced by
Lactiplantibacillus plantarum PUK6

○Takura Wakinaka1, Jun Watanabe1,2, Yoshinobu Mogi1(1 Yamasa Corp., 2 Fac. Food and Agric. Sci. Fukushima Univ.)

Key words

2Fp09○Akari Matsuda1, Ayaka Honda2, Ai Kawahara2, Takeshi Zendo3,
Hiromi Matsusaki1,2(1 Grad. Sch., Environ. Sym. Sci., Pref. Univ. Kumamoto, 2 Fac. Environ. Sym. Sci.,
Pref. Univ. Kumamoto, 3 Grad. Sch. Agric., Kyushu Univ.)

screening, lactic acid bacteria, soy sauce

Key words

bacteriocin, lactic acid bacteria, Lactiplantibacillus plantarum

酢酸低生産性醤油乳酸菌の醸造特性解析

2Gp02

たくあん漬から分離した乳酸菌 Lactococcus lactis
PJR24 が生産するバクテリオシンの精製と特性○樋口 敬太 1, 額川 裕矢 2, 脇中 琢良 1, 渡部 潤 1,2, 茂木 喜信 1
（1 ヤマサ醤油, 2 福島大・食農）
higuchik@yamasa.com

学○永田 妃奈子 1, 善藤 威史 2, 松崎 弘美 1,3（1 熊本県大院・環境共生, 2 九大院・農, 3 熊本県大・環境共生）
matsusaki@pu-kumamoto.ac.jp【目的】醤油乳酸菌 Tetragenococcus halophilus は初期醤油諸味において乳酸を生産し、醤油に爽やかな酸味をもたらす。この乳酸発酵に伴う諸味 pH の低下は、醤油酵母に対してアルコール発酵に好適な環境を提供する役割を担っている。
T. halophilus は諸味中で乳酸と共に酢酸を生産するが、酢酸の多くはクエン酸を代謝する際に生じることが報告されている 1)。酢酸は酵母の主要な生育阻害物
質であるため、これを低減することができればアルコール発酵が旺盛に進み、官能面で特徴のある醤油が製造できると考えられた。そこで T. halophilus のクエン酸代謝酵素をコードするシトレートオペロンに変異が生じた株を取得し、これを発酵スターターとした際の醤油醸造特性を親株と比較検討することとした。
【結果と考察】シトレートオペロン変異株は演者らのグループが以前に開発したTIMING 法により取得した。この方法はランダムに生じた変異株プールから、任意の遺伝子に内在性のインサーションシーケンス（IS）が挿入された変異株
を、遺伝子型を指標に単離する方法である。PCR による選抜の結果、クエン酸代謝に必要な citC 遺伝子に IS が挿入された変異株が得られた。本株を解析したところ、クエン酸資化能が失われ、酢酸生産量が低下していることが確認された。この citC 変異株をスターターとして醤油の試醸を行ったところ、親株を接種した対照醤油と比較して醤油中の酢酸濃度が低下し、エタノール濃度が上昇していることが確認された。また、官能評価により酸臭が対照と比較して有意に低くなっていることが明らかになった。以上の結果から、酢酸低生産性の乳酸菌株を醤油醸造に用いることで酸臭が穏やかでエタノール含量が高い特徴
的な醤油を製造できることが実証された。
1) Kanbe C, Uchida K. Appl Environ Microbiol., 53(6), pp. 1257-62 (1987).

【目的】乳酸菌が生産する抗菌性ペプチドのバクテリオシンは、その安全性の高さから天然の食品保存料として期待される。ナイシン A は、我が国で食品添加物として使用が認められている唯一のバクテリオシンであるが、酸性領域でのみ安定で、単独ではグラム陰性菌に抗菌作用を示さないことから、使用用途が制限される。そのため、多種多様な特性を持つ新規バクテリオシンの探索が重要である。Lactococcus lactis PJR24 は、熊本県阿蘇地方で製造されたたくあん
漬より分離した乳酸菌であり、新規バクテリオシンを生産すると予想している。
本研究では、PJR24 株が生産するバクテリオシンを精製し、その特性を明らかとすることを目的とした。
【方法および結果】PJR24 株を M17G 液体培地にて 37 ˚C、18 h 培養した。その培養液上清に対して 70 %飽和硫安分画を行い、透析（MWCO 3,500）後、0.2-1.0
M NaCl の直線濃度勾配による陰イオン交換クロマトグラフィーによりバクテリ
オシンを精製した。次に、得られた活性画分について限外ろ過（MWCO 2,000）
により濃縮・分画を行った。濃縮サンプルの Tricine-SDS-PAGE およびゲルバイ
オアッセイを行った結果、PJR24 株は約 10 kDa のバクテリオシンを生産していることが示唆された。また、PJR24 株の培養液上清および硫安沈殿後の透析液を用いて本バクテリオシンの抗菌スペクトルを調べた結果、近縁種だけでなく、
Listeria 属や Enterococcus 属細菌などに抗菌活性を示すことがわかった。次に、透析液の pH 安定性および熱安定性を調べた結果、本バクテリオシンは、pH 3-11の幅広い範囲で少なくとも 50 %以上の活性を保持しており、80 ˚C、30 min の
加熱後にも 12.5 %の残存活性が見られたが、100 ˚C 以上では抗菌活性がほとんど失活した。現在、PJR24 株が生産するバクテリオシンを同定するため、さらに精製を進めている。

Application of a low acetate-producing lactic acid bacterium to soy sauce
fermentation starter.

Purification and characterization of the bacteriocin produced by
Lactococcus lactis PJR24 isolated from pickled Japanese radish.

○Keita Higuchi , Yuya Nukagawa , Takura Wakinaka , Jun Watanabe ,Yoshinobu Mogi1(1 Yamasa Corp., 2 Fac. Food and Agric. Sci. Fukushima Univ.)
1

Key words

2

1

screening, lactic acid bacteria, acetic acid, soy sauce

1,2○Hinako Nagata1, Takeshi Zendo2, Hiromi Matsusaki1,3(1 Grad. Sch. Environ. Sym. Sci., Pref. Univ. Kumamoto, 2 Grad. Sch. Agric.,
Kyushu Univ., 3 Fac. Environ. Sym. Sci., Pref. Univ. Kumamoto)Key words

bacteriocin, lactic acid bacteria, Lactococcus lactis

193

2Gp03
学

新奇乳酸菌バクテリオシンの探索および構造・特性の
解析

2Gp05

講演中止

2Gp06

Comprehensive metabolomics-based evaluation to
improve tempe functional quality○田中 里緒菜, 庄野 陸太, 野見山 泰成, 中山 二郎, 善藤 威史（九大院・農）zendo@agr.kyushu-u.ac.jp

乳酸菌が生産するバクテリオシンは、主にグラム陽性菌に対して抗菌活性を示す抗菌ペプチドもしくはタンパク質であり、その多くは熱や酸に対する安定性をもつ。乳酸菌の高い安全性から、そのバクテリオシンは食品保存料や医薬品などへの応用が期待される。乳酸菌バクテリオシンの構造や抗菌スペクトルは多種多様で、目的に応じた使い分けも可能と考えられる。そこで、様々な分離
源から乳酸菌を分離し、既存のものとは異なる抗菌スペクトルを持つ新奇バク
テリオシンを見出し、構造や特性を明らかにすることを本研究の目的とした。
まず、身近な植物や発酵食品を分離源として乳酸菌を単離した。これらについて direct 法などの抗菌活性試験を行い、バクテリオシン様の抗菌活性を示した株について、16S rRNA 遺伝子解析による菌種の同定、種々のクロマトグラフィー
によるバクテリオシンの精製および分子量の測定、ドラフトゲノム解析によるバクテリオシン生合成遺伝子群の同定を行った。
結果、複数の株でバクテリオシン様の抗菌活性を確認した。そのうちの数株について、バクテリオシンの精製および特性評価を行った。花から単離した
Enterococcus faecalis FL2A は、比較的狭い抗菌スペクトルを示した。FL2A 株
は、同属では報告例の少ない 10 kDa 以上の大きさの抗菌タンパク質を生産しており、最終的にバクテリオシン様の抗菌活性をもつ 3 つの画分が精製された。
そのうちの一つは約 25 kDa の抗菌タンパク質である可能性が示唆された。一方、ぬか床から単離した Companilactobacillus insicii N12 からは、同種では初めてのバクテリオシン生産が確認された。ドラフトゲノム解析により、N12 株は複数のバクテリオシン様遺伝子を有していることを確認できた。現在、バクテ
リオシンの精製と構造決定を試みている。

Screening and characterization of novel bacteriocins from lactic acidbacteria○Riona Tanaka, Rikuta Shono, Taisei Nomiyama, Jiro Nakayama, Takeshi Zendo(Grad. Sch. Agric., Kyushu Univ.)

Key words
proteinbacteriocin, lactic acid bacteria, antibacterial peptide, antibacterial

2Gp04

講演中止

○Sastia Prama Putri1,2, Marvin Nathanael Iman1, Rafidha Irdiani1,
Della Rahmawati1,4, Made Astawan5, Eiichiro Fukusaki1,2,3(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ., 3 Shimadzu
Omics Innov. Res. Lab, Osaka Univ, Japan, 4 Dept. Food. Sci.
Tech., Swiss German Univ. Indonesia, 5 Dept. Food. Sci. Tech.,
IPB Univ, Indonesia)
sastia_putri@bio.eng.osaka-u.ac.jp

Tempe, a fermented soybean from Indonesia, has recently attracted plant basedindustry as a global superfood owing to its excellent nutritional and health benefits.
Our group has pioneered tempe metabolomics research, including the investigation ofmultiple factors contributing to tempe quality. To date, research on the metabolites
having health benefits in tempe has been heavily focused on a limited number of
specific, well-studied, bioactive metabolites, such as soy isoflavones. Metabolomics
allow a comprehensive analysis of metabolites in food and therefore will enable
identification of metabolites having health benefits that were previously overlooked. In
this study, improvement of the functional quality of tempe was conducted by screening
for potential metabolites having health benefits in tempe. Further characterization of
the bioactive components of tempe were conducted using a nutritional epidemilogicalanalysis. As a result, 16 bioactive metabolites were identified using metabolomicsbased bioactive metabolite profiling. A promising bioactive metabolite withhypolipidemic properties was highlighted and further characterized through population-based study involving a meta-analysis of two well-characterized cohorts. The findingsof this research highlights the potential of tempe for controlling LDL-C levels.

Comprehensive metabolomics-based evaluation to improve tempe functional
quality○Sastia Prama Putri1,2, Marvin Nathanael Iman1, Rafidha Irdiani1,
Della Rahmawati1,4, Made Astawan5, Eiichiro Fukusaki1,2,3(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ., 3 Shimadzu Omics Innov. Res.
Lab, Osaka Univ, Japan, 4 Dept. Food. Sci. Tech., Swiss German Univ. Indonesia,
5
Dept. Food. Sci. Tech., IPB Univ, Indonesia)
Key words
metabolic analysis, fermentation, tempe, tempeh

194

2Gp07
学

Sensory Evaluation and Metabolomics Approach to
Reveal the Characteristics of Kopyor, Indonesian Unique
Coconut

2Gp09○Yunindanova Mercy Bientri1, Sastia Prama Putri1,2,
Hengky Novarianto4, Eiichiro Fukusaki1,2,3(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ., 3 Shimadzu
Omics Innov. Res. Lab., Osaka Univ, 4 BRIN, Indonesia)
sastia_putri@bio.eng.osaka-u.ac.jp

甘酒の摂取が腸内環境に及ぼす影響○岩井 空都, 野村 亮, 兒島 孝明, 志水 元亨, 加藤 雅士（名城大院・農）mkato@meijo-u.ac.jp

Coconut is one of important commodities from tropical countries utilized in many
products. Besides normal coconuts, there are some unique coconuts in the world, oneof which is kopyor from Indonesia. Kopyor is a broken-endosperm type of coconut
generated from natural mutation. Currently, there is growing popularity of uniquecoconut in the world. However, for kopyor, the utilization is still limited due to lack of
information about kopyor property. Thus, understanding the metabolites of kopyor
coconut will increase the potential application which will contribute to thesustainability of the coconut industry. This research investigated the uniquecharacteristics of kopyor using sensory evaluation and metabolomics approach.
Kopyor endosperm with maturity of 11 months was utilized to evaluate characteristics
of kopyor and to compare with commercial coconut in general consisting of normal old
coconut (11 months) and normal young coconut (6 months). The result of sensory
analysis showed that kopyor water had milky, creamy, nutty, bitter, and astringent taste
which were different from the normal old and young coconut. Based on GC-MS
analysis, water of kopyor accumulated more metabolites than normal old and normal
young coconut water. Kopyor water was characterized by the accumulation of flavourrelated metabolites such as amino acid and organic acid. This pioneering information
will lead to the use of kopyor for the food industry in the future.
Key words: coconut, metabolomics

麴菌は清酒、醤油、味噌、甘酒などの製造に用いられており、日本の食文化において不可欠な微生物である。発酵過程で麴菌が産生する種々の酵素や代謝産物は発酵食品に独特の味や香りを付加するだけでなく、それらの摂取により様々
な健康効果がもたらされることが近年明らかになってきている。しかし、発酵
食品の健康効果に関する具体的なメカニズムについては完全に解明されていない。本研究では、甘酒に含まれるプレバイオティクス成分と考えられているイ
ソマルトースの摂取が宿主の腸内環境に及ぼす影響を解析した。市販および自作した甘酒中に含まれるイソマルトースを定量したところ、平均で 110 mM であった。そこで、イソマルトース (110 mM、100 µL) をマウスに 14 日間毎日経口投与し、腸内細菌叢に及ぼす影響を解析した。イソマルトースを投与しない
場合と比べて、投与することで、腸内細菌叢に占める Lactobacillus reuteri の割
合が 1.7 倍増加した。イソマルトースを唯一の炭素源にした最少培地でマウス
糞便中の微生物を分離したところ L. reuteri が単離されたことから、L. reuteri はイソマルトースを資化することが示された。本研究から、ヒトにおいても甘酒を継続的に摂取することで、腸内細菌叢に占める Lactobacillus 属細菌の割合を増加できることが示唆された。

Sensory Evaluation and Metabolomics Approach to Reveal theCharacteristics of Kopyor, Indonesian Unique Coconut

Effect of amazake administration on the intestinal environment○Yunindanova Mercy Bientri1, Sastia Prama Putri1,2, Hengky Novarianto4,
Eiichiro Fukusaki1,2,3(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ., 3 Shimadzu Omics Innov. Res.
Lab., Osaka Univ, 4 BRIN, Indonesia)○Sorato Iwai, Ryo Nomura, Takaaki Kojima, Motoyuki Shimizu, Masashi Kato
(Grad. Sch. Agric., Meijo Univ.)

Key words

coconut, metabolomics

Key words

isomaltose, microbial flora, prebiotics, metagenomic libraries

2Gp08

米発酵食品の乳化性の比較と米素材でつくる新たな乳化
食品「米マヨネーズ」の開発

2Hp01

講演中止

○小林 和也 1, 奥原 宏明 1, 羽田 知由 2, 田中 美優 2
（1 新潟県農総研食研セ, 2 山崎醸造）
kobayashi.kazuya@pref.niigata.lg.jp【背景と目的】乳化食品の製造には卵黄、乳タンパク質および大豆等の乳化力の高い原料が不可欠であるが、これらの原料はアレルギー特定原材料等に該当するという問題点がある。アレルギー特定原材料等に該当しない原料には米が挙げられるものの、米を乳化食品の原料に使用する場合には乳化の安定化が技術的課題になる。そこで我々は、米由来の乳化素材として米発酵食品の利用に着眼した。すなわち、本研究の目的は、米由来の新規乳化食品の製造技術を開発するため、米発酵食品から優れた乳化素材を選定し、その活用方法を確立することである。
【方法】1)乳化力の比較：各種発酵食品 20 g を水 20 g で懸濁した後、米油 60 g
を加えながら混合し、さらにホモジナイザーで乳化処理することで乳化物を得た。この乳化物について油の合一の有無を確認するとともに、粘度をＢ型粘度計で計測した。2)米マヨネーズの試作：発酵食品 20 g、食酢 10 g に対して水と植物油の配合を違えた混合物を調製した後、乳化処理した。得られた乳化物について、外観を評価するとともに、粘度を B 型粘度計で計測した。
【結果と考察】米発酵食品の乳化性を比較したところ、山崎醸造（株）が製造す
る「大豆を使わないおみそ調味料」が乳化の安定化とマヨネーズ様の物性の再現に有効であることを見出した。さらに、この米発酵食品を乳化剤に用いて調製した乳化物は、米油含量 65～70%の場合に粘度 30 Pa・s を超えた。このことから、米発酵食品、米酢および米油を使用することで、半固体状ドレッシングの日本農林規格を満たす新規米加工食品「米マヨネーズ」の製造が可能になった。

Comparison of emulsifiability among the fermented foods derived from rice
and development of a novel emulsified food "rice mayonnaise" made fromthe rice-derived materials○Kazuya Kobayashi1, Hiroaki Okuhara1, Tomoyuki Haneda2, Miyuu Tanaka2(1 Niigata Pref. Agric. Res. Inst. Food Res. Center, 2 Yamazaki-Jyouzou Co., Ltd.)Key words

emulsification, rice

学

195

2Hp02
学

コリネ型細菌のミコール酸生合成欠損変異株の性状解析○須之内 愛, 岩井 伯隆, 和地 正明（東工大・生命理工）
mwachi@bio.titech.ac.jp

2Hp04
学

乳酸菌 Lactococcus lactis における環状ジアデニル酸の機能○甲斐 達己, 松原 未佳, 西村 聡子, 金岡 英徳, 飯島 信司（愛工大・工）kaneoka-h@aitech.ac.jp

コリネ型細菌 Corynebacterium glutamicum は、胞子形成能を持たないグラム陽性桿菌で、グルタミン酸生産菌として分離された。グルタミン酸生産は、ビオチ
ン制限やペニシリン添加等の細胞表層構造に影響を与える処理により誘導されるが、細胞表層形成との関係性は未だ十分には解明されていない。また、ペプ
チドグリカン層の外側に厚い脂質の層であるミコール酸層を有しており、グラム陽性菌であるにもかかわらずリゾチームに耐性を示す。また近年ではタンパ
ク質の分泌生産宿主としての開発も進んでおり、タンパク質分泌の際にもミコー
ル酸層が透過障壁として機能することが示唆されている。これまでの研究により、リゾチーム高感受性変異株である ltsA 変異株では細胞分裂面のミコール酸層が欠損しており、これがリゾチーム感受性を示す原因であると考えられた（Kumagai et al., Microorganisms, 2021）。本研究では、C. glutamicum におけるミコール酸層の透過障壁としての機能を解析することを目的として、ミコール酸
生合成経路の遺伝子 pks13 の欠失変異株を作成し、その性状解析を行った。
pks13 欠失変異株は生存可能で、ミコール酸層の分別染色によってミコール酸層が完全に欠損していることが確認された。pks13 欠失変異株は野生株と比較して凝集性が高く、細胞はやや膨潤したオボイド状の形態を示した。また、
pks13 欠失変異株は野生株と比較して生育速度が遅く、リゾチーム添加によりさらに生育速度が低下するが、ltsA 変異株でみられるようなリゾチーム添加に伴う急激な溶菌は観測されなかった。一方、ミコール酸層の外葉の主成分であるトレハロースジミコール酸の合成酵素をコードする cop1 の欠失変異株ではリゾチーム添加により溶菌が観察された。以上の結果から、ミコール酸層の欠損だけではリゾチーム感受性を十分に説明できないことが判明した。

環状ジアデニル酸は細菌で機能するセカンドメッセンジャーとして注目されており、カリウムチャンネルを介しての浸透圧の調節、細胞壁恒常性の維持、菌体外多糖合成制御などの生理機能が報告されている。また、このヌクレオチド
は、自然免疫を活性化させ生体防御に貢献するだけでなく、間接的に抗体生産や細胞性免疫を活性化することが知られている。特に感染が起きる臓器表面の粘膜での抗体生産は、粘膜免疫としてその生体防御における有用性が期待されている。我々は腸管における粘膜免疫に着目し、ヒト免疫の活性化や、便通を改善するなど良好な腸内環境の維持に大きく貢献しているプロバイオティクス
である乳酸菌における環状ジアデニル酸の生理機能を解明することを目的に研究を進めている。
NCBI データベースを用いて乳酸菌 Lactococcus lactis subsp. cremoris の環状ジアデニル酸合成酵素を検索したところ、唯一の合成酵素である CdaA が確認された。cdaA を広宿主域ベクター pTRKH3 にクローン化し、erythromycin ribosomal
methylase promoter で発現するベクターを構築した。この cdaA 過剰発現ベクターをエレクトロポレーションにより L. lactis subsp. cremoris に導入し、乳酸菌菌体
内の環状ジアデニル酸を ELISA で定量したところ、野生株に比べ過剰発現株は高濃度の環状ジアデニル酸が検出された。cdaA 過剰発現株のアンピシリン、セファレキシン、メチシリンなどの β ラクタム系抗生物質耐性は、野生株と比較して増強された。一方で、増殖は阻害されたため、過剰の環状ジアデニル酸は菌体にとって有害であると考えられる。増殖への影響が見られたため、現在はcdaA 過剰発現株における継代ごとのプラスミド安定性の測定を行い、さらにcdaA のノックアウトにより、環状ジアデニル酸の生理機能について解析を進めている。

Characterization of Corynebacterium glutamicum mutants defective inbiosynthesis of mycolic acids

Function of Cyclic Bis(3'-5') diadenylic Acid in Lactococcus lactis○Ai Sunouchi, Noritaka Iwai, Masaaki Wachi(Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)○Tatsuki Kai, Mika Matsubara, Akiko Nishimura, Hidenori Kaneoka, Shinzi Iizima(Fac. Eng., Aichi Inst. Technol.)Key words
acids

Corynebacterium glutamicum, cell wall, secretory production, mycolic

Key words

lactic acid bacteria, signal transduction2Hp03

キチン分解菌 Cellulosimicrobium sp. NTK2 の Mg 添加による分泌タンパク質の挙動

2Hp05

黄麹菌におけるアルギニン脱炭酸酵素遺伝子１（adc1）のアグマチン合成への関与

学○溝尻 怜史 1, 益江 広稀 1, 仁木 大輔 2, 有馬 二朗 3
（1 鳥取大院・持社創生, 2 鳥取大院・連農, 3 鳥取大・農）arima@tottori-u.ac.jp

学○村上 優衣 1,2, 生田 宗一郎 1,2, 福田 青郎 1,2, 丸山 潤一 3,4,
藤原 伸介 1,2
（1 関西学院大院・理工, 2 関西学院大・生命環境, 3 東大院・農生科, 4 東大 微生物連携機構）
fujiwara-s@kwansei.ac.jp【目的】
カニ殻に含まれるキチンは年間約 10 億 t 生産され、その分解物は種々の生理活性を持つことからバイオマス資源として期待される。しかし、カニ殻やキチンのバイオマス利用は環境への負荷が大きく煩雑な処理が必要であり、これらの問題を解決するために近年では微生物や酵素を利用した穏和な環境での処理方法の確立が求められている。当研究室ではカニ殻コンポストから、迅速にカニ殻を分解する放線菌 Cellulosimicrobium sp. NTK2 (NTK2 株)を単離した。本研究では NTK2 株のキチン分解に関わる条件を明らかにし、効率よくキチンを分解する条件を調べた。
【方法・結果】
NTK2 株の培養に終濃度 1 mM の MgSO4 を添加することで、通常の培養よりも高い生育を示した。また、NTK2 株の培養に有利となるキチンを添加した培養条件でも生育の増加が確認され、これと併せて NTK2 株から分泌されるキチ
ナーゼ量が増加することが GlcNAc2-pNP やキトサン、エチレングリコールキチン等を用いた試験により確認された。試験に用いたすべての基質で活性が向上
していたことから、Mg の存在により NTK2 株のタンパク質発現と分泌に対して何らかの影響が及ぼされることが示唆された。SDS-PAGE による分泌タンパ
ク質の解析において、Mg を添加した条件で顕著に分泌されるタンパク質の存在が確認されたため、N 末端解析を行った結果、顕著に分泌されるタンパク質はエンドヌクレアーゼであった。培養上清中の核酸を調べたところ、キチン添加条件で培養した条件のみ核酸が確認され、それ以外では見られなかった。これらの結果から、細胞外に分泌された核酸の再取り込みが NTK2 株の生育増強に関連することが示唆された。Mg の存在とエンドヌクレアーゼの分泌の関連性は明らかとなっていないため、現在はエンドヌクレアーゼの活性と分泌に関わる試験を通して具体的な Mg による影響を検討している。

アグマチンは神経疾患や記憶・学習障害を緩和することが知られている。醸造に用いられる麹菌 Aspergillus oryzae はアグマチンを高生産する。このアグマチンを生産する酵素がアルギニン脱炭酸酵素 (ADC) であるが、ADC 遺伝子オル
ソログは A. oryzae において未同定である。そこで A.oryzae RIB40 株から ADC
活性を指標にタンパク質を精製したところ、45kDa の機能分子が得られた。質量分析により、このタンパク質がフォスファチジルセリン脱炭酸酵素（PSD）
としてアノテートされている遺伝子によってコードされることが明らかになった。本研究では本酵素の生化学的特性の機能解析や生体内での役割の解明を目的とした。
adc1 遺 伝 子 を 挿 入 し た 高 発 現 用 プ ラ ス ミ ド pET28a を 使 っ て 、 大 腸 菌
BL21(DE3)Codon plus-RIL で組換え体として高発現させた。結果、20℃では可溶化しピルボイル型の成熟を受け、活性のある機能分子が得られた。黄麹菌内でも同様の成熟を経て機能していると考えられる。活性が確認された画分からタンパク質の精製を行い、複数の塩基性アミノ酸を基質として反応速度論解析を行ったところ、アルギニンに対する活性が最も高かった。同定した遺伝子を黄麹菌における ADC 遺伝子と考え、adc1 と命名した。次に ADC1 の特異的抗体を取得し、異なる pH 環境で製麹した RIB40 株における発現を検討した。その結果、低 pH ストレス依存的な ADC1 の発現は認められなかった。また、
CRISPR/Cas9 法を用いて麹菌内の adc1 遺伝子のノックアウトを試みた。ヤタ
ラーゼによってプロトプラスト化した RIB40 株を、cas9 遺伝子を有するプラス
ミドを用いて形質転換した。この株の ADC 活性測定を行なったところ、Δadc1
株では親株と比べて顕著な活性の減少が確認された。これらの結果から、本酵素が実際に ADC 活性を有し、麹菌内でアグマチン合成に関与している事が示された。

Behavior of proteins by Mg in the chitin-degrading bacterium
Cellulosimicrobium sp. NTK2

Involvement of arginine decarboxylase gene 1 (adc1) in agmatine synthesis
in koji○Reiji Mizoshiri , Hiroki Masue , Daisuke Niki , Jiro Arima(1 United Grad. Sch. Sustainability Sci., Tottori Univ., 2 United Grad. Sch. Agric.
Sci., Tottori Univ., 3 Fac. Agric., Tottori Univ.)
1

Key words

1

2

actinomycetes, chitin, chitinase, magnesium

3○Yui Murakami1,2, Soichiro Ikuta1,2, Wakao Fukuda1,2, Jun-ichi Maruyama3,4,
Shinsuke Fujiwara1,2(1 Grad. Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ., 2 Sch. Biological Environmental
Sci., Kwansei Gakuin Univ., 3 Grad. Sch. Agric. Life Sci., Univ. Tokyo, 4 CRIIM,
The Univ. of Tokyo)
Key words
Aspergillus oryzae, arginine decarboxylase, polyamine, agmatine

196

2Hp06
学

細胞表層タンパク質は乳酸菌 Companilactobacillus
alimentarius KH4 株におけるキシラン特異的な凝集に関
与する

2Hp08
学

○山本 万結 1, 矢野 嵩典 2, 三井 亮司 2,3（1 岡山理大院・理, 2 岡山理大・理, 3 岡山理大・生命）
tyano@ous.ac.jp

Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213 が誘導生産する新規酵素エラグ酸ラクトナーゼの同定と機能解析○片所 杏野 1, 渡邊 寛子 1, 工藤 眞丈 2, 中島 賢則 2, 山本 浩明 2,
小川 順 1, 岸野 重信 1
（1 京大院・農, 2 ダイセル・コーポレート研）
kishino.shigenobu.3e@kyoto-u.ac.jp【背景・目的】近年植物由来乳酸菌の保健機能に注目が集まっており、その食品への積極的利用が見られる。乳酸菌が植物や植物成分と相互作用する可能性に興味を持ち、発酵食品から乳酸菌を分離して種々の解析を行った。その結果、
食 物 繊 維 キ シ ラ ン に 対 し て 高 い 凝 集 性 を 示 す 菌 株 Companilactobacillus
alimentarius KH4 を見いだした。本研究では凝集因子の一つとして細胞表層タン
パク質に着目し、キシラン特異的な凝集への関与を調べることを目的とした。
【 方 法 ・ 結 果 】 分 離 し た キ シ ラ ン に 対 し て 高 い 凝 集 性 を 示 す 乳 酸 菌 C.
alimentariusKH4 株に加えて、同種であるがわずかな凝集能を示す NBRC 106464
株、凝集能を全く持たない RD012579 株の 3 株を対象として凝集に関わる因子の解析を試みた。まず、KH4 株の細胞表層タンパク質を塩化リチウム(LiCl)処理により除去した菌体を調製し、キシランに対する凝集性を評価した。その結果、キシランに対する凝集性が失われたことから、細胞表層タンパク質がキシランに対する凝集性に関与する可能性が示唆された。そこで３菌株全てを LiCl
処理し、各菌液の上清を SDS-PAGE に供した結果、３菌株とも遊離したタンパ
ク質のバンドが観察された。しかし、３菌株に共通するタンパク質バンドは検出されなかった。そこで最も凝集性が高い KH4 株の特徴的なバンドについて
N 末端アミノ酸配列を解析した結果、細胞表層に局在するとされるグリセルア
ルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH) 、機能未知の細胞表層タンパク質に特徴的な疎水性のシグナルペプチド配列を有する２つを同定することができた。
今後は同定されたタンパク質がキシランに対する凝集に関与するかを調べる予定である。

【背景・目的】
ウロリチンとはポリフェノール化合物の一種であり、ザクロやクルミなどに含まれるエラジタンニンに由来する代謝物である。腸内細菌によりエラジタンニ
ンがエラグ酸、さらにウロリチン類へと代謝される。特に腸内細菌の代謝により得られるウロリチン A、B は抗酸化・抗炎症作用を示し、健康増進への寄与が期待されている。腸内でのウロリチン産生はエラグ酸の分子内ラクトンの加水分解を初発反応とし、それにより生じるウロリチン M5 を起点として多様な
ウロリチンが産生される。
ヒト糞便由来腸内細菌 Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213 はエラグ酸をウ
ロリチン M5 へと変換し、さらにウロリチン M5 を M6、M6 を C へと脱水酸化する。しかし、変換に関わる酵素や反応機構などの詳細な分子メカニズムは未解明である。そこで本研究では、G. urolithinfaciens DSM 27213 がもつエラグ酸のウロリチン M5 への変換反応を触媒する酵素を特定し、その機能解析を行った。
【方法・結果】
本菌を、エラグ酸添加あるいは非添加培地にて培養し、各条件で得られた菌体のエラグ酸変換活性を比較した。その結果、エラグ酸添加培地で培養した菌体のみにエラグ酸変換活性を見出した。これより、本菌のエラグ酸変換酵素はエラグ酸により誘導されることが明らかとなった。次に、プロテオーム解析により誘導菌体と非誘導菌体でのタンパク質の発現を比較したところ、誘導菌体で高発現している加水分解酵素と予想されるタンパク質 (UroH) を見出した。続いて、大腸菌を宿主とする UroH の異種タンパク発現系を構築し機能評価を行った結果、UroH がエラグ酸からウロリチン M5 への加水分解反応を触媒する新規酵素であることを見出した。続いて、形質転換株より精製した UroH の諸性質の解析を行い、本酵素が pH 7.0 ~ 9.0, 50 ℃にて高い活性を示すことを明らかにした。

Cell surface proteins are related to xylan-mediated aggregation in
Companilactobacillus alimentarius KH4

Identification and characterization of a novel inducible enzyme, ellagic acidlactonase, in Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213○Mayu Yamamoto1, Takanori Yano2, Ryoji Mitsui2,3(1 Grad. Sch. Sci., Okayama Univ. Sci., 2 Fac. Sci., Okayama Univ. Sci., 3 Fac. Life
Sci., Okayama Univ. Sci.)○Anno Katasho1, Hiroko Watanabe1, Masatake Kudoh2, Takanori Nakajima2,
Hiroaki Yamamoto2, Jun Ogawa1, Shigenobu Kishino1(1 Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 2 Daicel Corp. Corporate Research Center)

Key words

lactic acid bacteria, cell surface protein, aggregation, xylan

Key words

urolithin, gut bacteria, ellagic acid lactonase

2Hp07

好熱性水素細菌 Hydrogenobacter thermophilus の有する 2 つのスレオニン合成酵素ホモログ

2Hp09

Halomonas sp. KM-1 株の培養液中に蓄積する赤色タン
パク質に関する研究○亀谷 将史 1,2, 新井 博之 1,2, 石井 正治 1,2（1 東大院・農生科, 2 東大微生物連携機構）
akameya@g.ecc.u-tokyo.ac.jp

学○月俣 太飛 1, 安藤 晃規 1, 小島 幹生 1, 勝矢 祥平 2, 坪田 潤 2,
小川 順 1（1 京大院・農, 2 大阪ガス）
ogawa.jun.8a@kyoto-u.ac.jp

Hydrogenobacter thermophilus TK-6 はバクテリアでもっとも古くに他から分岐した Aquificota 門に属する好熱性水素細菌であり、二酸化炭素をエネルギー源に
独立栄養的に生育する。本菌では、アミノ酸生合成をはじめとする多くの代謝で既知のバクテリアとは異なる新規機構が見つかってきた。
本 菌 の Thr 生 合 成 経 路 は 未 解 明 で あ っ た た め ゲ ノ ム を 精 査 し た と こ ろ 、homoserine をリン酸化し phosphohomoserine とする homoserine kinase のホモログ
遺伝子が 1 つ、phosphohomoserine を Thr に変換する Thr synthase ホモログ遺伝
子が 2 つ見つかった。そこでこれら 3 遺伝子を異種発現・精製し、その性質を調べた。
Homoserine kinase ホモログおよび Thr synthase ホモログのうち一方はそれぞれ予想された酵素活性を示し、これら 2 遺伝子産物が Thr 生合成反応の触媒酵素であることが明らかになった。一方、Thr synthase ホモログのうちもう片方はThr synthase 活性を示さず、Thr 生合成への寄与は不明であった。しかしさらなる検討を通じて、これまで生合成経路が未知だった別のアミノ酸の生合成に寄与する活性を本酵素が有することが明らかになった。Thr synthase ホモログが同様の反応を触媒してアミノ酸生合成に寄与する報告例はなく、本菌が新規なア
ミノ酸生合成ネットワークを有していることが示唆された。

【背景と目的】 好塩・好アルカリ菌 Halomonas sp. KM-1 は、アンモニアを流加しながら好気培養を行った後、嫌気培養を行うと赤色タンパク質を生産する特徴を持つ。赤色タンパク質は一部の微生物において無機窒素代謝と関連していることが知られており、それらは特にアンモニア酸化細菌や脱窒菌において観察される。したがって、このタンパク質が KM-1 株の無機窒素代謝と関連している可能性が示唆された。本研究では、KM-1 株により生成されるこの赤色タンパク質の同定を目的とした。
【方法】 ジャーファーメンターによる培養上清から、限外ろ過と Native-PAGE
法によりタンパク質の分離・精製を行った。紫外可視吸収スペクトル分析および N 末端アミノ酸配列解析によりタンパク質の同定を行った。
【結果と考察】 紫外可視吸収スペクトル分析の結果、406 nm と 524 nm に吸収ピークを持つ赤色タンパク質が検出され、これは cytochrome c の特性と一致した。N 末端アミノ酸配列の解析結果は KM-1 のゲノム上にコードされている
cytochrome c5 family protein と一致した。また、本酵素遺伝子はヘム結合部位を保持していた。さらに cytochrome c5 をコードする遺伝子が亜酸化窒素還元酵素をコードする nos オペロンと一酸化窒素応答性レギュレーターをコードする nsrRに隣接していたことから、無機窒素代謝との関連性も示唆された。
以上の結果から、Halomonas sp. KM-1 の培養液上清に生産される赤色タンパク
質は cytochrome c であり、その遺伝子座位から無機窒素代謝との関連性を持つ可能性が示唆された。

Two homologs of threonine synthase from a thermophilic hydrogenoxidizing bacterium, Hydrogenobacter thermophilus

Study on red proteins accumulated in the culture medium of Halomonas sp.
KM-1○Masafumi Kameya , Hiroyuki Arai , Masaharu Ishii(1 Grad. Sch. Agric. Life Sci., Univ. Tokyo, 2 CRIIM, Univ. Tokyo)
1,2

Key words

1,2

1,2

amino acid, metabolism, biosynthesis, substrate specificity○Taito Tsukimata1, Akinori Ando1, Mikio Kojima1, Shohei Katsuya2, Jun Tsubota2,
Jun Ogawa1(1 Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 2 Osaka Gas Co., Ltd.)Key words

halophile, bacteria, cytochrome c

197

2Ip01

酵母 Starmerella bombicola が生産する新規ソホロリ
ピッド誘導体の構造解析

2Ip03

油脂酵母 Lipomyces starkeyi の油脂生産開始前後での代謝状態変化の解析○岩倉 崇文 1, 清家 泰介 1, 岡橋 伸幸 1, 高久 洋暁 2, 松田 史生 1
（1 阪大院・情報, 2 新潟薬大・応生命）
takafumi.iwakura@ist.osaka-u.ac.jp○小林 洋介 1, 李 秋実 1, 牛丸 和乗 2, 廣田 真 1, 森田 友岳 2,
福岡 徳馬 2
（1 アライドカーボンソリューションズ, 2 産総研・機能化学）
y.kobayashi@allied-c-s.co.jp【背景】バイオサーファクタント（BS）は、植物油脂や糖類などのバイオマスを原料として微生物によって生産される両親媒性脂質であり、SDGs の広まりや機能性バイオ素材として世界的に使用が広まっている。BS の 1 種であるソホロ リ ピ ッ ド (SL) は 二 糖 の ソ ホ ロ ー ス に 脂 肪 酸 が 結 合 し た 糖 脂 質 で 、 酵 母
Starmerella bombicola によって発酵生産され、広く研究開発が進められている。
SL には酸型（ASL）とラクトン型（LSL）の 2 種類の機能が異なる誘導体が知られており、ASL は水溶性の陰イオン系界面活性剤、LSL は疎水性の非イオン系界面活性剤である。培養液中にはこれら誘導体が共存しており、その含有率
は SLs の BS としての性能に大きな影響を与えると考えられる。本発表では SLの分析方法の最適化と、その過程で同定した新規 SL 誘導体について報告する。
【結果】メタノールを使用した HPLC 分析によって SL は ASL と LSL に分離することができた。しかし、物質収支から全 SL の量に対して ASL と LSL の総量が少なく、逆相 TLC の結果からも異なる SLs が存在している可能性が考えられた。また、LC/MS 分析で、ASL や LSL の分子量とは異なるピークが存在したことから、これらが SL の新規誘導体である可能性が推察された。これら物質を順相および逆相クロマトグラフィーを組み合わせることで単離し、NMR によって構造を同定した。得られた誘導体は、SL の脂肪酸末端にグリセリンがエ
ステル結合した化合物 (SL グリセリド)であり、発酵液中から得られた SL の組
成比は LSL:ASL:SL グリセリド = 49.2:33.5:17.3 であった。また、SL グリセリド
は LSL と同じ非イオン系界面活性剤であり、ASL と同じく高い水溶性を示した
点など、LSL と ASL の中間的性質を有することが確認された。これらの結果から、SL には今まで未知であった SL グリセリドが含まれており、SL の構造と機能のバリエーション拡大が見込まれた。

【背景・目的】
油脂酵母 Lipomyces starkeyi は窒素が不足した定常期において油脂生産を開始することで知られている。しかし、油脂生産の開始に伴う代謝状態の変化についてはまだ解明されていない。本研究では、逆転写 PCR を用いて mRNA を定量し、L. starkeyi の増殖期と定常期の代謝状態を比較することで、油脂生産の増加につながる新たな知見を得ることを目指した。
【方法】
L. starkeyi NBRC10381 株を 50 mL の窒素制限合成培地中で 30℃、120 rpm で回分培養した。培養開始から 36 時間後の増殖期と、72 時間後の定常期にあたる菌体を回収し、RNeasy (Qiagen)を用いて mRNA を抽出した。抽出した mRNA
を鋳型として PrimeScript (Takara)により逆転写反応を行い cDNA を合成し、StepOnePlus (Takara) を用いて mRNA を定量した。
【結果・考察】Saccharomyces cerevisiae の ACT1 遺伝子と最も相同性の高い遺伝子を標準物質として増殖期と定常期の間で L. starkeyi の中心炭素代謝や油脂生産に関わる酵素をコードする遺伝子の転写量を比較した。その結果、定常期では解糖系遺伝子 10 種のうち 8 種の発現量が増加していた。以前行った定量プロテオミクスでは、酵素タンパク質が定常期において減少する傾向があったことから、プロテアーゼによる分解など遺伝子転写以外の要因で中心炭素酵素の発現量が制御されている可能性が示唆された。
一方、ピルビン酸から酢酸を経てアセチル CoA を生成するアセチル CoA 生産
経路のうち、Pyruvate Dehydrogenase Bypass (PDH バイパス) と呼ばれる経路に関与する遺伝子は、定常期において著しく mRNA の発現量が増加していた。酵素タンパク質の定量結果からも同様の結果が得られており、PDH バイパスは遺伝子転写の段階から正に制御されていることが示唆された。

Characterization of novel naturally occurring sophorolipid glycerides
produced by Starmerella bombicola

Analysis of changes in the metabolic state of the oleaginous yeast Lipomyces
starkeyi before and after the start of lipid production.

○Yosuke Kobayashi1, Qiushi Li1, Kazunori Ushimaru2, Makoto Hirota1,
Tomotake Morita2, Tokuma Fukuoka2(1 Allied Carbon Solutions Co., Ltd., 2 RISC, AIST)○Takafumi Iwakura1, Taisuke Seike1, Nobuyuki Okahashi1, Hiroaki Tkakau2,
Fumio Matsuda1(1 Grad. Sch. IST, Osaka Univ., 2 Fac. Appl. Life Sci., Niigata Univ. Pharm. Appl.
Life Sci.)

Key words

yeast, biosurfactant, sophorolipids

Key words

transcriptome, metabolic shift, gene expression, yeast

2Ip02

メチロトローフ酵母 Komagataella phaffii GS115 における奇数鎖脂肪酸生産の最適化

2Ip04

油脂酵母 Lipomyces starkeyi 油脂生産関連因子 Snf1pの同定と油脂合成経路へ及ぼす効果

学○Zhu Junzhang 1, 疋田 慶史 2, Cai Haoliang 1, 島田 昌也 1,2,
菊川 寛史 3, 中川 智行 1,2（1 岐阜大院・連農, 2 岐阜大・応生科, 3 静大・工）nakagawa.tomoyuki.u0@f.gifu-u.ac.jp○佐藤 里佳子 1, 渡部 凌 1, 藤井 佑弥 1, 志田 洋介 2, 小笠原 渉 2,
石谷 孔司 3, 油谷 幸代 3, 荒 学志 1, 山崎 晴丈 1, 高久 洋暁 1
（1 新潟薬大・応生命, 2 長岡技科大, 3 産総研・生物プロセス）
htakaku@nupals.ac.jp【目的】ヘプタデセン酸（C17:1）は抗炎症効果など様々な機能性をもつ奇数鎖脂肪酸である。私たちは、メチロトローフ酵母 Komagataella phaffii がメタノール（MeOH）生育において C17:1 の細胞内脂肪酸組成比を増加させることを見出しており 1)、本酵母による C17:1 の高生産系の構築を目指している。本研究では、K. phaffii における C17:1 の生産性をより向上させるべく、C17:1 生産の最適条件の検討を行なった。
【結果】最初に K. phaffii の C17:1 生産における炭素源の影響を観察した。その結果、総脂肪酸に対する C17:1 の相対比は MeOH 生育細胞が高いものの、細胞内 C17:1 含有量は、総脂肪酸量が最も多い Glc 生育細胞が最大値を示した。一方、Glc を炭素源とした Glc/YNB 培地において 0.1% プロピオン酸を添加した
場合、細胞内 C17:1 含有量は有意に増加した。さらに、0.1% プロピオン酸と10 mM バリンを Glc/YNB 培地に添加した場合、C17:1 生産の著しい促進が観察され、K. phaffii における C17:1 細胞内含有量は 3.33 mg/L に達し、Glc/YNB 培
地生育細胞に比べて、8.89 倍に増加した。
これら結果は、遺伝子工学的な高脂肪酸生合成技術が確立されている K. phaffiiにおいて 2)、本培養条件を用いることで奇数鎖脂肪酸の生産量を飛躍的に上昇させることができることを示している。
1)
Ma et al. 2021. Yeast. 38: 541-548.
2)
Cai et al. 2022. PNAS. 119: e2201711119.

近年の世界人口増加や新興国の成長に伴い、食品・工業・エネルギー分野で油脂需要が高まりつつある。そのような中で日本の油脂自給率は 14%と低く、海外からの輸入に依存していることから、自給率向上は重要な課題である。日本に適した油脂生産方法としてバイオマス由来の炭素源から油脂生産が可能な油
脂酵母 Lipomyces starkeyi の活用が期待される。しかし、産業利用化には、改変対象遺伝子情報を活用した油脂生産性の改善が必要である。先行研究で、油脂高蓄積変異株のゲノム比較解析より見出した油脂生産制御因子の活用は、油脂
生産性の改善に効果的であった。本研究では、他油脂酵母で報告されている油脂生産関連因子ホモログに注目し、L. starkeyi の油脂生産性向上に資する因子を見出すことを目的とした。
油脂酵母 Yarrowia lipolytica で報告されている油脂生産関連因子 Snf1p ホモログ
欠失株 (Snf1p 欠失株)または Mhy1p ホモログ欠失株(Mhy1p 欠失株)を作製し、L. starkeyi の油脂生産への関与を調査した。培養 5 日目の Snf1p 欠失株の培地あたりの油脂生産量は野生株と比較して 1.8 倍に向上していた。すなわち、L.
starkeyi Snf1p は、油脂生産性向上に寄与する負の生産因子であることが明らかとなった。一方で、Mhy1p 欠失株の油脂生産量は、野生株と同程度で油脂生産との関連性はなかった。次いで、L. starkeyi Snf1p が油脂生産性向上に寄与した
要因を明らかにするために、油脂合成経路の遺伝子発現解析を実施した。Snf1p
欠失株のアシル CoA 合成経路全遺伝子とケネディ経路の一部遺伝子の持続的な高発現が油脂生産性向上に寄与したと考えられた。以上より、Snf1p の欠失は、油脂合成経路の活性化に繋がり、油脂生産性向上に効果的であることが明らかとなった。本研究の一部は、JST 共創の場形成支援プログラム JPMJPF2211 及
び JSPS 科研費(22H02250)の支援を受けた。

Optimization for production of odd-chain fatty acids in the methylotrophic
yeast Komagataella phaffii GS115

Identification and effect of lipid production-related factor Snf1p on lipid
biosynthesis pathway in oleaginous yeast Lipomyces starkeyi○Junzhang Zhu , Yoshihumi Hikida , Haoliang Cai , Masaya Shimada ,Hiroshi Kikukawa3, Tomoyuki Nakagawa1,2(1 United Grad. Sch. Agric. Sci., Gifu Univ., 2 Fac. Appl. Biol. Sci., Gifu Univ., 3 Fac.
Eng. Shizuoka Univ.)
1

Key words

2

1

Komagataella phaffii, odd-chain fatty acids

1,2○Rikako Sato1, Ryo Watabe1, Yuuya Fujii1, Yosuke Shida2, Wataru Ogasawara2,
Koji Ishiya3, Sachiyo Aburatani3, Satoshi Ara1, Harutake Yamazaki1,
Hiroaki Takaku1(1 Fac. Appl. Life Sci., Niigata Univ. Pharm. Appl. Life Sci., 2 Nagaoka Univ.
Technol., 3 BPRI, AIST)
Key words
oleaginous yeast, Lipomyces starkeyi, Snf1p, lipid

198

2Ip05
学

油脂酵母 Lipomyces starkeyi におけるマロニル CoA 合
成経路の強化による油脂生産性の改善

2Ip07

油脂酵母 Lipomyces starkeyi における β 酸化経路の油脂蓄積への関与○知野 颯稀 1, 佐藤 里佳子 1, 荒 学志 1,2, 荒木 秀雄 2, 山崎 晴丈 1,
高久 洋暁 1
（1 新潟薬大・応生命, 2 不二製油）
htakaku@nupals.ac.jp○河野 翔吾 1, 佐藤 里佳子 1, 荒 学志 1,2, 白井 智量 3, 相馬 悠希 4,
高橋 政友 5, 和泉 自泰 5, 馬場 健史 5, 石谷 孔司 6, 油谷 幸代 6,
荒木 秀雄 2, 山崎 晴丈 1, 高久 洋暁 1
（1 新潟薬大・応生命, 2 不二製油, 3 理研・環境資源, 4 九大院・農, 5 九大・生医研, 6 産総研・生物プロセス）
htakaku@nupals.ac.jp【目的】ウクライナ危機などの世界情勢の変化は、様々なサプライチェーンに大きな影響を与え、油脂も影響を受けた物質の１つである。油脂輸入国の日本は
その危機感を再認識させられ、油脂自給率向上は急務課題である。本研究室で注目している油脂酵母 Lipomyces starkeyi は、細胞内に油脂を高蓄積し、油糧植物と異なり、天候・気候に非依存的で、限られたスペースで油脂を発酵生産できる。すなわち、日本の抱える状況における油脂供給が可能である。産業利用へ向け、これまでに我々はスマートセル情報解析技術を活用し、L. starkeyi の油脂生産制御因子 LsSpt23p を見いだし、この因子の改変株（スマセル株）により油脂生産性を大きく向上させてきた。本研究では、産業活用へ向け、フラック
スバランス解析(FBA)を活用したスマセル株のさらなる油脂生産性向上を目的とした。
【方法及び結果】5L ジャーを用い、培地中の糖濃度を指標とした糖流加培養によるスマセル株の油脂発酵生産を行った。経時的な培地成分、細胞濃度、油脂量、排出 CO2 濃度の分析結果を活用した FBA により、複数の代謝強化点及び弱化点が提案された。技術的に改変可能な代謝の強化点について検討したとこ
ろ、油脂合成に必須であるアシル CoA 合成経路のアセチル CoA からマロニル
CoA への変換に関与する炭酸脱水酵素(CA)の高発現により油脂生産性が改善され た 。 具 体 的 に は 、 L. starkeyi の CA を コ ー ド す る 遺 伝 子 55185 又 は
Thermosulfurimonas dismutans 由来の CA をコードする tdCA を導入したスマセル
株の油脂生産評価培養において、細胞が肥大化し、1 細胞あたりに蓄積する油脂量の増加、さらに対糖油脂収率も向上した。以上のようにスマセル株のさらなる油脂生産性強化に成功し、FBA の有効性が実証された。本研究の一部はNEDO の支援を受け、実施した。

【目的】我々の生活において重要な役割を担っている油脂の需要は、近年のエネ
ルギー問題、急激な人口増加などにより増加している。しかし、我が国の油脂自給率はわずか 14 % であり、日本の油脂自給率向上は急務課題である。油脂
酵母 Lipomyces starkeyi は、食品・醸造残さ由来の様々な糖を油脂に変換し、細胞内に高蓄積できる。その蓄積油脂は脂肪酸組成の類似性から植物代替油脂となりうる。しかし、産業利用へ向け、油脂生産メカニズムを解明し、その知見
を油脂生産性の向上に繋げることが必要である。L. starkeyi の油脂合成に関する知見は蓄積しつつあるが、油脂分解についての知見は少ない。本研究では、L.
starkeyi の脂肪酸分解経路のペルオキシソーム β 酸化の油脂蓄積への関与を明らかにすることを目的とした。
【方法及び結果】L. starkeyi におけるペルオキシソーム β 酸化に関与する Pox1p,
Mfe1p, Pot1p, Pot2p 及びペルオキシソーム形成に関与する Pex10p の欠失株を作製し、評価培養を行った。その結果、Mfe1p 欠失株のみ生育が低下したが、油脂蓄積量が向上した。L. starkeyi のゲノムからミトコンドリア β 酸化に関与するホモログ遺伝子が見いだされたため、それらの遺伝子発現解析を実施したとこ
ろ、Mfe1p 欠失株以外の株において、野生株より高発現していた。これらのことから L. starkeyi の主要な β 酸化経路はペルキオキシソームにあるが、そこに機能的な欠陥があるときはミトコンドリアによりその機能が相補されると考えられた。また、Mfe1p については、他の酵母でペルオキシソームとミトコンド
リアに局在する報告があることから、L. starkeyi においても両オルガネラで機能していることが推察された。本研究の一部は NEDO の支援を受け、実施した。

Improvement of lipid productivity with enhancement of malonyl-CoA
biosynthesis pathway in oleaginous yeast Lipomyces starkeyi

Involvement of beta-oxidation pathway in lipid accumulation in theoleaginous yeast Lipomyces starkeyi○Shogo Kono , Rikako Sato , Satoshi Ara , Tomokazu Shirai , Yuki Soma ,Masatomo Takahashi5, Yoshihiro Izumi5, Takeshi Bamba5, Koji Ishiya6,
Sachiyo Aburatani6, Hideo Araki2, Harutake Yamazaki1, Hiroaki Takaku1(1 Fac. Appl. Life Sci., Niigata Univ. Pharm. Appl. Life Sci., 2 Fuji Oil Co., Ltd.,3
CSRS, RIKEN, 4 Grad. Sch. Agric., Kyushu Univ., 5 Med. Inst. Bioreg., Kyushu
Univ., 6 BPRI, AIST)
Key words
Lipomyces starkeyi, malonyl-CoA, lipid, oleaginous yeast

Key words

Lipomyces starkeyi, oleaginous yeast, beta oxidation, lipid

2Ip06

2Ip08

油脂酵母 Lipomyces starkeyi における脂肪酸合成酵素遺伝子の改変によるカカオバター様油脂の生産

1

1

1,2

3

4

油脂酵母 Lipomyces starkeyi における油脂合成制御因子
LsSpt23p の C 末端領域の油脂蓄積への関与○樋口 裕太 1, 佐藤 里佳子 1, 荒 学志 1, 石谷 孔司 2, 油谷 幸代 2,
山崎 晴丈 1, 高久 洋暁 1
（1 新潟薬大・応生命, 2 産総研・生物プロセス）
htakaku@nupals.ac.jp○Satsuki Chino1, Rikako Sato1, Satoshi Ara1,2, Hideo Araki2, Harutake Yamazaki1,
Hiroaki Takaku1(1 Fac. Appl. Life Sci., Niigata Univ. Pharm. Appl. Life Sci., 2 Fuji Oil Co., Ltd.)学○渡部 凌 1, 佐藤 里佳子 1, 荒 学志 1,2, 荒木 秀雄 2, 山崎 晴丈 1,
高久 洋暁 1
（1 新潟薬大・応生命, 2 不二製油）
htakaku@nupals.ac.jp【目的】現在、油脂需要は世界の人口増加、食生活の変化などに伴い増加している。油脂自給率が 14 ％と低い日本は、輸入への依存度が高く、国際情勢の影響を大きく受けるため、油脂資源確保は大きな課題である。そこで我々は、自給率向上に貢献可能な油脂酵母に注目した。油脂酵母 Lipomyces starkeyi は、地域
バイオマス由来の様々な糖を資化し、細胞内に油脂を高蓄積できる。産業利用へ向け、さらなる油脂生産性向上が必要であるが、我々はこれまでに、その油脂生産性を向上させる鍵となる油脂生産制御因子 LsSpt23p を見出している。さらに、LsSpt23p の C 末端領域への変異が、細胞における油脂の蓄積性を向上させることも明らかにしている。そこで本研究では、LsSpt23p の C 末端側の領域に着目し、油脂蓄積性との関係を明らかにすることを目的とした。
【方法及び結果】LsSpt23p のドメイン検索解析により、C 末端には TM(膜貫通領域)が存在し、これを介して小胞体膜上に局在することが推測された。このTM 及び先行研究で油脂生産性を向上させることが明らかとなった変異部位を含む C 末端側の領域と油脂蓄積性の関係を明らかにするため、内在性 LsSpt23p
を欠失させ、C 末端側から段階的に短くした LsSpt23p コンストラクトを導入した株を作製後、油脂蓄積性の評価を行った。その結果、LsSpt23p を短くし、C末端側に存在する TM、変異部位が欠失していくにつれて、油脂蓄積性は徐々に低下したが、C 末端から 1/3 程度欠失した LsSpt23p を有する株で油脂蓄積性が野生株よりも大幅に向上した。それぞれの作製株の油脂蓄積性と LsSpt23p が直接転写を制御するアシル CoA 合成遺伝子発現に相関性がみられたことから、これらの油脂蓄積性は各 LsSpt23p の細胞内における安定性又は機能の影響を受けた結果と考えられる。本研究の一部は JSPS 科研費(22H02250)の助成を受けた。

【目的】自給率の低い日本は、ウクライナ危機のような世界情勢の変化に非常に弱く、低自給率の油脂に関しての危機感は特に高い。すなわち、油脂の自給率向上対策は急務課題である。本研究対象の油脂酵母 Lipomyces starkeyi は、地域
バイオマスから高効率で油脂を生産可能なユニークな酵母である。これまで本研究室では、パーム油類似脂肪酸組成の油脂を生産するこの酵母の油脂生産性を向上させ、実用化の目処を立ててきた。この蓄積された先行技術を活用する
ことにより、日本で生育が困難な植物の代替油脂の生産が可能になれば、油脂自給率向上に大きく貢献できると考えた。そこで本研究では、高温多湿の気候で生育するカカオ由来のカカオバター様油脂の L. starkeyi 発酵生産系の構築を目的とした。
【方法及び結果】L. starkeyi とカカオバターの脂肪酸組成を比較すると、ステアリン酸(C18:0)とオレイン酸(C18:1)の含量に違いが見出され、生産油脂のステア
リン酸含量の向上とオレイン酸含量の低下が課題としてあげられた。ステアリン酸からオレイン酸への変換酵素をコードする OLE1 の発現を調節することにより、その脂肪酸組成を変えることを考案した。そこで OLE1 の発現を低下させるため、OLE1 プロモーター解析を行った。プロモーター解析の結果を利用し、内在性 OLE1 の転写量を低下させるように内在性 OLE1 プロモーターを改変したところ、生産油脂のオレイン酸含有量を低下させ、ステアリン酸含有量を向上させることに成功した。加えて、改変 OLE1 プロモーター導入株に対し、パルミチン酸からステアリン酸への変換酵素をコードする ELO2 を高発現させたところ、カカオバター様油脂の生産に成功した。本研究の一部は NEDO の支援を受け、実施した。

Involvement of C-terminal region of lipid synthesis regulatory factor
LsSpt23p in lipid accumulation in the oleaginous yeast Lipomyces starkeyi

Cocoa butter-like lipid production by genetic engineering of fatty acyl
desaturase and elongase genes in the oleaginous yeast Lipomyces starkeyi○Yuuta Higuchi , Rikako Sato , Satoshi Ara , Koji Ishiya , Sachiyo Aburatani ,Harutake Yamazaki1, Hiroaki Takaku1(1 Fac. Appl. Life Sci., Niigata Univ. Pharm. Appl. Life Sci., 2 BPRI, AIST)1

Key words

1

1

2

Lipomyces starkeyi, oleaginous yeast, LsSpt23p, lipid

2○Ryo Watabe1, Rikako Sato1, Satoshi Ara1,2, Hideo Araki2, Harutake Yamazaki1,
Hiroaki Takaku1(1 Fac. Appl. Life Sci., Niigata Univ. Pharm. Appl. Life Sci., 2 Fuji Oil Co., Ltd.)Key words

Lipomyces starkeyi, OLE1, stearic acid, lipid

199

2Ip09
学

油脂酵母 Lipomyces starkeyi における CRISPR/Cas9 による相同組換えの高効率化

2Kp02○丸山 魁斗 1, 佐藤 里佳子 1, 荒 学志 1,2, 荒木 秀雄 2, 石谷 孔司 3,
油谷 幸代 3, 山崎 晴丈 1, 高久 洋暁 1
（1 新潟薬大・応生命, 2 不二製油, 3 産総研・生物プロセス）
htakaku@nupals.ac.jp

大腸菌の外膜小胞高生産株 ΔrodZ の細胞表層構造解析○戸田 佳歩 1, 尾島 由紘 1, 田原 悠平 2, 宮田 真人 2, 東 雅之 1
（1 大阪公大院・工, 2 大阪公大院・理）ojima@omu.ac.jp【目的】近年、世界の人口増加によるエネルギー問題等に伴い油脂需要は増加しており、油脂低自給率国である日本においては、安定供給へ向けた独自の油脂生産システムの構築が必要である。そこで我々は、菌体内に油脂を高蓄積する
油脂酵母 Lipomyces starkeyi による油脂生産に着目した。本研究室では、遺伝子組換え技術を利用して油脂高蓄積株が創製されてきたが、形質転換体の選抜に
薬剤耐性遺伝子マーカーを利用しているため、遺伝子多重改変や食用油脂産業への応用に課題があった。そこで本研究では、前大会で報告した CRISPR/Cas9を用いた切断箇所への塩基の挿入・欠失技術に続き、相同組換えによる目的遺伝子導入技術の開発を目指した。
【方法及び結果】CRISPR/Cas9 の標的遺伝子として LsURA3 遺伝子を選択し、デザインした 2 種類の sgRNA による in vitro LsURA3 遺伝子切断活性を検証した
結果、目的の位置で切断が確認された。次に、L. starkeyi WT 又は相同組換え効率が向上した Δlslig4 に Cas9 遺伝子を導入した WT/Cas9、Δlslig4/Cas9 株を作製し、sgRNA 及びドナー DNA（薬剤耐性遺伝子）を導入した。WT/Cas9 株の場
合、3000 bp の相同領域を有するドナー DNA のみを導入したとき、相同組換え
効率は 10.9％だったが、sgRNA を共導入した結果、相同組換え効率は 80.0％まで向上した。Δlslig4/Cas9 株の場合、250 bp の相同領域を有するドナー DNA のみを導入したとき、相同組換え効率は 0％であったが、sgRNA を共導入した結果、相同組換え効率は 100％まで向上した。すなわち 、 L. starkeyi において、Δlslig4 株を活用しても相同組換えができなかった僅か 250 bp の相同領域でも、
CRISPR/Cas9 技術を活用することにより、組換え株を取得でき、その相同組換え効率が 100%であることから、高効率相同組換え技術の構築に成功した。本
研究の一部は NEDO の支援を受け、実施された。

外膜小胞（OMVs）はグラム陰性菌が形成する細胞外小胞であり、ワクチンや物質生産ツールへの応用研究が盛んに行われている。一方でその産生機構については解明されていない部分も多い。本研究では、大腸菌において OMVs 高生
産が報告されている膜タンパク質 RodZ 欠損株（ΔrodZ）に対して、詳細な検討を行った。RodZ は MreB などのアクチン様タンパク質やペプチドグリカン合成
酵素などと超分子複合体を形成し、桿菌の細胞形状決定において重要な役割を果たす。また、rodZ 遺伝子の欠失は大腸菌の細胞形状を桿状から球状へ変形させる［1］。塩析と超遠心分離による OMVs 回収と FM4-64 による膜脂質基準及び SDS-PAGE によるタンパク質基準での OMVs 定量を行った結果、ΔrodZ は野
生株の約 50 倍以上の OMVs 生産量を示し、以前 OMVs 高生産を報告した
ΔmlaEΔnlpI 株よりも高い値を示した［2］。続いて、ΔrodZ の細胞に関して、急速凍結レプリカ電子顕微鏡法により詳細な構造を観察した。先行研究で報告されている通り ΔrodZ 細胞は球状だったが、ΔmlaEΔnlpI 株などで報告されている
外膜と内膜のペリプラズム空間が拡張する原形質分離は観察されず、OMVs の高生産機構が異なることが示唆された。その一方で、ΔmlaEΔnlpI 株では観察されなかった異常な細胞表面構造が一部の細胞で観察された。具体的には、細胞表面が部分的に欠落したような窪みが多数存在する凹凸構造、細胞表層に複数の不規則な曲線が貼りつき周囲にえぐれたような跡が残る曲線構造などが観察された。現在、培養温度の変更や、MreB の発現量を CRISPRi により抑制する
ことで、OMVs 生産量の評価と細胞表層の観察を行っており、発表では異常な表面構造と OMVs 高生産機構の関係性について議論する。
［1］Bendezú et al., EMBO J., 28(3), 193-204 (2009).
［2］Ojima et al., Front. Microbiol., 12:706525 (2021).

Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination in theoleaginous yeast Lipomyces starkeyi

Cell surface structures in hypervesiculating Escherichia coli strain rodZ
mutant○Kaito Maruyama1, Rikako Sato1, Satoshi Ara1,2, Hideo Araki2, Koji Ishiya3,
Sachiyo Aburatani3, Harutake Yamazaki1, Hiroaki Takaku1(1 Fac. Appl. Life Sci., Niigata Univ. Pharm. Appl. Life Sci., 2 Fuji Oil Co., Ltd.,
3
BPRI, AIST)

Key words

2Kp01○Kaho Toda1, Yoshihiro Ojima1, Yuhei Tahara2, Makoto Miyata2,
Masayuki Azuma1(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Metro. Univ., 2 Grad. Sch. Sci., Osaka Metro. Univ.)

Lipomyces starkeyi, genome editing, CRISPR/Cas9, LsURA3

Key words

RodZ, Escherichia coli, outer membrane vesicle, cell surface

大腸菌の外膜小胞生産促進方法の検討

2Kp03

緑膿菌バイオフィルムのライフサイクルと膜小胞産生との連関解明○尾島 由紘, 熊添 優希, 東 雅之
（大阪公大院・工）ojima@omu.ac.jp

学○菅野 美月 1, 田代 陽介 1,2（1 静大・創科技院, 2 静大院・総合科技）
tashiro.yosuke@shizuoka.ac.jp

グラム陰性菌が生産する外膜小胞（OMVs）は，ワクチンや有用物質分泌生産
ツールへの応用が研究されているが，遺伝子欠損により細胞壁を脆弱化させる
アプローチで OMVs 生産を促進すると，細胞への負荷が大きく増殖や目的物質の生産が低下する問題がある．そこで遺伝子欠損の代わりに，発現調節技術である CRISPRi を用いて大腸菌の特定遺伝子の発現を抑制し，細胞負荷を緩和した状態での OMVs 生産の促進を試みた。
欠損による OMVs 生産の促進が報告されている 2 つの遺伝子 mlaE と nlpI について，gRNA を設計したプラスミドと dCas9 発現プラスミドをそれぞれ野生株に形質転換した．各大腸菌株を LB 培地 37℃で培養し，8 時間後の増殖期にmRNA を抽出し，qRT-PCR により発現量を測定した．24 時間後に OD660 を測定し，培養上清中の OMVs を塩析と超遠心分離により回収し，タンパク質量基準で評価した．結果として，複数設計した gRNA の内，mlaE では 3 つ，nlpI では 1 つの gRNA が有意に対象遺伝子の mRNA 発現を抑制した．一般的に，対象遺伝子の N 末端に近い領域に gRNA を設計したほうが抑制効率が高いとされるが，今回の結果からその傾向は見られなかった．mlaE では，3 つの gRNA をそれぞれ導入することで，野生株の 32, 10, 3%の発現量に抑制された．OD660 は野生株と mlaE 欠損株の間の値となり回復傾向が確認された．さらに，OMV 生
産量は遺伝子の発現抑制度合いに応じて，野生株と欠損株の間の値となった．
nlpI に関しては，gRNA の導入により 13%の発現量に抑制され，増殖は野生株と欠損株の間の値となった．興味深いことに，OMV 生産量は，欠損株よりも40%ほど増加した．CRISPRi を用いて発現抑制株を作製することで，欠損株よりも高い増殖を保ちながら，OMV 生産量を向上できた．現在は，mlaE と nlpIの発現抑制を組み合わせる，もしくは mlaE 欠損株の nlpI 発現を抑制するなどの検討を行っている．

【背景と目的】 細菌は自身の細胞膜から直径 20-400 nm の球状構造体である膜小胞（Membrane vesicle, MV）を放出する。膜小胞は細胞膜由来の成分で構成されており、病原因子運搬やシグナル伝達などの細胞間情報伝達媒体として利用される。また、膜小胞は微生物の三次元構造体であるバイオフィルムにおいて活発に産生される。細菌は感染時に宿主細胞上でバイオフィルムを形成し、多量に放出した膜小胞により免疫応答を誘導する。よって、生存戦略としてバイオフィルムにおける膜小胞産生誘発機構の存在が考えられるが、その全容は明らかとなっていない。そこで本研究では、バイオフィルム研究におけるモデル細菌である緑膿菌 Pseudomonas aeruginosa PAO1 株を用い、バイオフィルム状態における膜小胞産生誘発機構の解明を目指した。
【結果と考察】 PAO1 株ゲノムへのトランスポゾン挿入により、緑膿菌ランダム
遺伝子変異株を作製した。バイオフィルム状態における膜小胞産生量を解析したところ、産生量が著しく低下する株が特定された。解析の結果、べん毛運動（Flg, Mot）や細胞外多糖（Psl）合成が媒介する菌体の付着行為が、膜小胞多量
産生のトリガーとなることが示唆された。これらの因子は、バイオフィルム形
成促進においても重要であることが知られる。一方、バイオフィルム脱離を担う脂肪酸シグナル cis-2-デセン酸の合成酵素（DspI）も膜小胞産生を誘発することが明らかとなった。以上より、バイオフィルムライフサイクル循環因子と膜小胞産生誘発の関与が示された。バイオフィルムは強固な構造であり完全な除去が困難なため、医療や工業の現場で大きな問題となっている。本研究より、バイオフィルムのライフサイクルにおける膜小胞産生誘発の様相が明らかとなり、膜小胞産生制御によるバイオフィルム形態および細菌感染症制御への応用が期待される。

Study on facilitating methods of outer membrane vesicles production in

Relationship between membrane vesicle production and biofilm lifecycle in

Escherichia coli

Pseudomonas aeruginosa○Yoshihiro Ojima, Yuki Kumazoe, Masayuki Azuma(Grad. Sch. Eng., Osaka Metro. Univ.)

Key words

Escherichia coli, outer membrane vesicle, CRISPRi○Mizuki Kanno1, Yosuke Tashiro1,2(1 Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 2 Grad. Sch. Integr. Sci. Technol.,Shizuoka Univ.)

Key words

membrane vesicle, biofilm

200

2Kp04
学

好熱性繊維状ファージの複製及び水平伝播に関わる遺伝
子の機能解析
○𠮷田 智美, 長岡 未久, 副島 春香, 藤野 泰寛, 土居 克実（九大院・生資環）
doi@agr.kyushu-u.ac.jp

2Kp06
学

細菌集団の不均一な遺伝子発現状態を識別するための高感度な細菌 1 細胞 RNA-seq 手法の開発○西村 美郁 1, 竹山 春子 1,2,3,4, 細川 正人 1,2,3,4（1 早大院・先進理工, 2 早大・ナノライフ創新研, 3 産総研・早大
CBBD-OIL, 4 早大・生命動態研）
masahosokawa@aoni.waseda.jp

細菌に感染するウイルスであるバクテリオファージ（ファージ）のうち、Inoviridae 科に属する繊維状ファージは、感染細胞が溶菌せずファージ粒子を放出しながら増殖を続けるため、分泌型ファージとも呼ばれ、その感染及び複製機構は特徴的である。他方、ファージの中には原始地球に似た高温環境に生息する好熱性ファージも存在し、その遺伝解析は、分子進化の解明だけでなく、
常温性ファージを応用する上で障害となってきた高温条件における不活化問題の解決にも繋がると期待される。しかし、好熱性ファージの単離例は少なく、特に繊維状ファージの単離例は些少である。
我々は、小浜温泉熱水（75℃、pH 7.5）から Thermus thermophilus HB8 株を指示菌とし、好熱性繊維状ファージ ΦOH16 を単離した。本ファージゲノム上には
9 つの ORF が推定され、常温性繊維状ファージ M13 ゲノムとの比較で各 ORFの機能が推測されたが、実際の機能は不明である。
本研究では ΦOH16 の遺伝子機能を解析することを目的とし、Single-strand DNA
binding protein（SSB）、Major coat protein（MCP）及び、Transposase（Tnp）遺伝子に着目し、これらを大腸菌を用いて異種発現を試み、機能を検討した。まず、
推定 SSB はゲルシフトアッセイの結果、ΦOH16 の ssDNA に優先的に結合する
ものの、多様な dsDNA にも非特異的結合した。また、本タンパク質は Thermal
shift assay で 90℃までの耐熱性を示した。次に、推定 MCP は膜貫通タンパク質であり、大腸菌内で不溶化したため、HB27 株内での発現を試みた。推定 Tnp
は IS110 ファミリー共通の DEDD モチーフを持つことから、DNA 結合特異性を検討した。

同一株由来の細菌集団であっても不均一な遺伝子発現状態を示す。これは、突然の環境変化に適応する細菌の生存戦略であり、抗生物質耐性など多様な表現
型が集団内で確率的に形成される。不均一な細菌集団の生態理解には、集団全体の平均的な遺伝子発現解析ではなく 1 細胞単位の遺伝子発現解析が求められる。1 細胞 RNA-seq は、主に哺乳類細胞の研究で用いられてきたが、mRNA 構造の違いにより細菌への応用は制限されてきた。2020 年以降、いくつかの細菌
1 細胞 RNA-seq 手法が開発されてきたが、1 細胞から検出される遺伝子種は全遺伝子の 5%程度と少なく、遺伝子検出感度に課題が残っていた。
本研究では高い遺伝子検出感度を備えた細菌 1 細胞 RNA-seq 手法の開発を目指した。真核生物の１細胞 RNA に対して高感度な遺伝子検出能力を持つ RNA-seq
手法 (RamDA-seq) と CRISPR-Cas9 based rRNA 除去を組み合わせた手法を開発した。E. coli total RNA の希釈系列を用いて遺伝子発現量の解析性能を評価した
結果、細菌 1 細胞相当の微量 RNA からバルク RNA 測定結果と高い相関(R>0.78) が得られ、5500 bp 以上の長いオペロンに対しても一様な転写物配列の取得が可能であった。続いて、E. coli 1 細胞を用いた評価の結果、従来法の 4倍以上多い遺伝子 (全遺伝子の約 24%) を検出した。さらに、異なる増殖時間で培養した E. coli 集団、および熱ショックを加えた E. coli 集団に対して本手法で解析を行った。この結果、１細胞レベルの遺伝子発現パターンは集団間で異なるクラスターを形成し、各条件における特徴的な遺伝子発現が検出された 1)。
本研究で開発した高感度な細菌 1 細胞 RNA-seq 手法は、今後の更なる検証を経て複雑な環境細菌叢の生態解明に活用できると期待される。
1) Nishimura, M. et al., J. Biosci. Bioeng., in press (2023).

Functional analysis of genes involved in replication and horizontal genetransfer of thermophilic filamentous phage

Development of a highly sensitive bacterial single-cell RNA-seq method to
identify transcriptional heterogeneity in bacterial populations○Tomomi Yoshida, Miku Nagaoka, Haruka Soejima, Yasuhiro Fujino, Kastumi Doi(Grad. Sch. Bioresour. Bioenviron. Sci., Kyushu Univ.)○Mika Nishimura1, Haruko Takeyama1,2,3,4, Masahito Hosokawa1,2,3,4(1 Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2 Res. Org. Nano Life Innov., Waseda
Univ., 3 CBBD-OIL, AIST-Waseda Univ., 4 Inst. Adv. Res. Biosyst. Dynam., Waseda
Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words

phage, heterologous production, thermophilic, replication

Key words

bacteria, RNA-seq, single cell, transcriptome

2Kp05

非病原性 Rhizobium vitis によるアシル化ホモセリンラ
クトン分解機構の解析と病原性阻害への応用

2Kp07

未培養口腔細菌ゲノムから獲得したファージ由来分子を用いた特異的細菌標識ツールの開発

学○廣瀬 航希 1, 諸星 知広 1, 染谷 信孝 2
（1 宇都宮大・工, 2 農研機構）
morohosi@cc.utsunomiya-u.ac.jp

学○岩井 直哉 1, 竹山 春子 1,2,3,4, 細川 正人 1,2,3,4（1 早大院・先進理工, 2 早大・ナノライフ創新研, 3 産総研・早大
CBBD-OIL, 4 早大・生命動態研）
masahosokawa@aoni.waseda.jp

Rhizobium vitis は、ブドウ根頭がん腫病の原因菌であるが、非病原性 R. vitis は、
その高い定着性から、ブドウ根頭がん腫病に拮抗作用を示す微生物農薬としての応用が検討されている。多くの植物病原菌は、アシル化ホモセリンラクトン（AHL）を介したクオラムセンシングにより、自身の病原性発現を制御しているが、AHL を人為的に分解することができれば、病原性発現を大幅に抑制することが可能である。本研究では、微生物農薬の候補である非病原性 R. vitis MAFF
212306 株（=VAR 03-1 株）から新規 AHL 分解遺伝子をクローニングし、その諸性質の解析を行うことを目的とした。まず、AHL を添加した培地で MAFF
212306 株を培養したところ、培養後の上清から AHL が検出されなくなったことから、MAFF 212306 株は AHL 分解活性を有することが明らかとなった。
MAFF 212306 株は、全ゲノム配列が既に公開されており、ゲノム中には既知のAHL 分 解 遺 伝 子 と 相 同 性 を 示 す 3 つ の ORF （ RvVAR031_10180 、
RvVAR031_26070、RvVAR031_27660）が存在することが明らかとなった。これ
らの遺伝子をクローニングし、大腸菌に形質転換したところ、RvVAR031_27660
を 形 質 転 換 し た 大 腸 菌 の み が AHL 分 解 活 性 を 示 し た こ と か ら 、
RvVAR031_27660 が AHL 分解遺伝子をコードすることが明らかとなった。
RvVAR031_27660 を His タグ融合タンパク質として発現、精製し、酵素活性を測定したところ、至適反応温度が 30℃付近であり、50℃の熱処理によりほぼ失活することが明らかになった。最後に、RvVAR031_27660 を広宿主範囲ベクター
pBBR1MCS5 にクローニングし、AHL によりペクチナーゼ生産を制御するジャガイモ軟腐病菌 Pectobacterium carotovorum に形質転換したところ、ジャガイモに対する腐敗活性が大幅に抑制されたことから、RvVAR031_27660 は植物病原菌の病原性抑制に効果的であることが明らかとなった。

当研究室では、環境中に存在する多種多様な未培養細菌の理解に向けて、1 細胞ゲノム解析手法 SAG-gel 法 1)を開発してきた。本手法により取得された 1 細胞ゲノムからは、細菌に感染するウイルスであるファージの配列(プロファー
ジ)も検出でき、ファージと宿主細菌の関係を明らかにできる。本研究では、ヒト唾液より獲得した未培養の口腔内細菌由来ゲノムからファージ配列を取得し、ファージ由来溶菌酵素の宿主選択性に関わる分子である細胞壁接着ドメイン(CBD)を人工的に合成することで、細菌種特異的な標識ツールとして応用することを目指した。
SAG-gel 法を用いて、ヒト口腔内細菌の 450 個超の 1 細胞ゲノム配列情報を獲得した。そのうち、口腔内細菌であるレンサ球菌を対象とし、ゲノム配列からファージ由来の CBD を in silico で探索し、大腸菌を用いた組換え発現により蛍光タンパク質と CBD を融合させた標識ツールを複数種作製した。本標識ツー
ルを介した磁気分離とフローサイトメトリーの結果、蛍光タンパク質融合 CBDは細菌の生存性を維持したまま、ヒトの唾液からレンサ球菌を検出・濃縮できることを確認した 2)。
本研究で開発したファージ由来の細菌標識ツールは、特異的な細菌種の標識と細菌集団からの分離に有効と考えられる。未培養細菌の１細胞ゲノム情報から
ファージ分子を探索することで、様々な細菌特異的制御ツールを生み出すことができる。本手法は、多様な細菌集団からの有用菌や病原菌の in situ 検出や分離解析などへの応用が期待される。
1) Chijiiwa, R. et al., Microbiome (2020).
2) Hosokawa, M. et al., J. Biosci. Bioeng. (2023).

N-acylhomoserine lactone-degrading activity of nonpathogenic Rhizobium
vitis and its application for biocontrol agent

Development of specific bacterial labeling tools using phage-derived
molecules acquired from uncultured oral bacterial genomes○Koki Hirose , Tomohiro Morohoshi , Nobutaka Someya(1 Fac. Eng., Utsunomiya Univ., 2 NARO)
1

Key words
agent

1

2

quorum sensing, acyl homoserine lactone, Rhizobium vitis, biocontrol○Naoya Iwai1, Haruko Takeyama1,2,3,4, Masahito Hosokawa1,2,3,4(1 Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2 Res. Org. Nano Life Innov., Waseda
Univ., 3 CBBD-OIL, AIST-Waseda Univ., 4 Inst. Adv. Res. Biosyst. Dynam., Waseda
Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words

bacteria, phage, cell-wall binding domain, synthetic biology

201

2Kp08
学

腸内細菌叢からのビフィズス菌の選択的回収系の確立○宮下 聖也, 吉田 佳鼓, 嶋田 みな, 前田 智也, 横田 篤, 吹谷 智
（北大院・農）s-fukiya@agr.hokudai.ac.jp

2Kp10

合成生物学利用に向けた形質転換効率の低い細菌の遺伝子工学的改変○石川 聖人 1,2, 堀 克敏 3
（1 長浜バイオ大・バイオ, 2 JST・さきがけ, 3 名大院・工）m_ishikawa@nagahama-i-bio.ac.jp【背景・目的】ビフィズス菌の腸内における生存と定着に関する分子機構は未だ不明な点が多い。これを解明するためには、腸内での詳細な遺伝子発現プロファ
イルを明らかにすることが有効である。腸内細菌叢から特定菌種のみの RNAを調製することは困難であるが、腸内での遺伝子発現プロファイルを保ったま
ま、特定のビフィズス菌を選択的に回収することができれば、この課題を解決できる可能性がある。本研究では、通常飼育マウス腸内に定着させた
Bifidobacterium longum subsp. longum 105-A（105-A 株）を、常在腸内細菌叢から選択的に回収する系を確立することを目的とした。
【方法・結果】105-A 株を選択的に回収するために、同株を特異的に識別可能なタグを細胞表層に提示させ、タグを認識する分子を結合した磁気ビーズを用いて、タグ発現 105-A 株を回収することを着想した。ビフィズス菌の糖質 ABC
輸送体の基質結合タンパク質である GltA は、N 末端が細胞膜にアンカーされ、C 末端が細胞外へ露出している。この C 末端領域は改変可能なため、GltA の C
末端側にペプチドタグ (Strep-TagII, FLAG, HA, Myc) をそれぞれ付加した融合タ
ンパク質を恒常発現させるプラスミドを構築し、105-A 株に導入した。構築したタグ発現株について、Western blotting と免疫染色によりタグの発現を確認した。続いて、タグ発現株を単独培養し、磁気ビーズを用いて菌体を回収した。
回収前後の菌数を計測することで，回収率を評価したところ，Strep-TagII 発現
105-A 株が最も高い回収率を示した。また、7 種の腸内細菌共存下での同株の回収を行い，FISH 解析により評価したところ，同株を 90%以上の純度で回収することができた。現在、回収の再現性、回収操作に伴う RNA の品質および遺伝子発現プロファイルの維持について評価を進めている。

世界的な盛り上がりを見せる合成生物学分野において、大腸菌に代わる宿主細菌のニーズが高まっている。これは実験室で利用していた細菌を自然環境下で利用可能なものへと発展させようとする潮流からである。よって、新しい宿主
細菌には魅力的な物質生産能力だけでなく、自然環境下でも安定であることが求められている。ただし、環境細菌の多くは形質転換効率が低く、遺伝子組換えが困難である。Acinetobacter sp. Tol 5 はトルエン除去装置から分離された環境分離株である。我々はこれまで、Tol 5 株の遺伝子組換え系を独自に開発し、独創的な物質変換プロセスを構築しながら、Tol 5 株は合成生物学研究に適した宿主細菌であることを示してきた。しかし、Tol 5 株は大腸菌と比べて遥かに形
質転換効率が低く、遺伝子組換えに多くの時間が費やされることが課題であった。そこで、本研究では Tol 5 株の形質転換を妨げる要因を特定し、それを解除することで合成生物学利用に適した宿主細菌へと改変することを目指した。
Tol 5 株は大腸菌で複製されたプラスミドを用いるとエレクトロポレーションではほとんど形質転換することができないが、Tol 5 株で複製された同一のものを用いると形質転換効率が約 1 億倍も向上することが明らかとなった。これは Tol
5 細胞内で複製されたプラスミドには、Tol 5 株特有の塩基修飾が存在し、それに基づいて外来遺伝子と自己の DNA を見分けて排除することが予想された。
そこで、制限修飾系の関与を疑い、Tol 5 株の制限酵素遺伝子を全て破壊し、形質転換効率への影響を調べた。その結果、主要な働きをしていた制限酵素を特定し、それらの多重変異を行うと形質転換効率が野生株と比べて 10 万倍まで向上した。この変異株は、in vitro 及び in vivo で DNA assembly を行うことができ、
CRISPR-Cas を基盤とする塩基編集を行うことができた。

Establishment of a selective recovery system for bifidobacteria from the gut
microbiota

Genetic engineering of a non-competent bacterium toward synthetic biology
applications○Seiya Miyashita, Kako Yoshida, Mina Shimada, Tomoya Maeda, Atsushi Yokota,
Satoru Fukiya(Grad. Sch. Agric., Hokkaido Univ.)○Ishikawa Masahito1,2, Katsutoshi Hori3(1 Dept. Biosci., Nagahama Inst. Bio-Sci. Technol., 2 PRESTO, JST, 3 Grad. Sch.
Eng., Nagoya Univ.)

Key words

bifidobacterium, cell surface display, gene expression

Key words

transformation, restriction-modification system, genome editing

2Kp09

枯草菌を用いた長鎖 DNA 構築法

2Lp01

皮膚常在菌の採取方法の検討および分離微生物の培養
特性○金子 真也 1, 相澤 康則 1,2（1 東工大・生命理工, 2 神奈川県立産業技術総合研究所）
skaneko@bio.titech.ac.jp○多賀 直彦, 福田 裕斗（東海大・農）ntaga@agri.u-tokai.ac.jp

近前世紀ゲノムは「調べて学ぶ」対象であった。今世紀ゲノム編集技術を用いて「変えて活用できる」ようになり、「デザインして作り出す」時代が到来しつつある。前世紀後半から勃興した遺伝子工学は大腸菌のプラスミドベクターを用いて、数 kb (数千塩基対)のＤＮＡを対象として発展した。しかしゲノムは遥
かにサイズが大きいので取り扱いに従来の常識は通用しない。これは DNA は
長くなるほど物理的ダメージを受けやすく、サイズの大きい DNA はピペッティ
ングを伴う in vitro 操作には適さないからである。ＤＮＡの二重らせん構造は長大なポリマー(細長い鎖状高分子)を形成しており、長くなればそれだけ溶液中の水流による剪断応力の影響を受けやすいため、溶液中での無傷な長鎖ＤＮＡの扱いは難しい。経験上 200 kb を超えると 1 回のピペッティング操作でもダメージが入りエタノール沈殿もできない。こうした理由から長鎖 DNA を全て繋いだ状態で 1 bp も間違わず正確に化学合成するのは極めて難しい。そこで
DNA 断片(数 kb)を「細胞中」で繋ぎ合わせて構築する方法が世界的に行われている。これまで一般的に出芽酵母が宿主として多く用いられてきた。出芽酵母を用いた方法 Gap repair cloning(GRC)法は、出芽酵母の卓越した相同組み換え能を利用して、多断片を効率よく、簡便につなぎ合わせることができる技術である。しかしながら同手法は必ずしも万能ではないことが我々の研究でも明らかになりつつある。そこで我々は、出芽酵母の GRC 法を見直し、枯草菌を用いた方法を考案した。枯草菌を用いた場合のメリットや可能性について報告する。

【背景・目的】化粧品に皮膚常在微生物を応用する試みが増えてきた。化粧品に皮膚常在菌を応用するには使用する培地や培養条件を検討する必要がある。本
研究の目的は、皮膚常在菌を化粧品へ応用するための皮膚常在菌の採取方法の検討および培養特性などの基礎情報を集めることである。
【方法】研究者自身の皮膚常在菌の分離を行い、皮膚常在菌の採取方法を改善した。単離した 7 種の皮膚常在菌へのテトラサイクリン塩酸塩の抗菌活性試験は、Spot on lawn 法 を 用 い 、 比 較 と し て Staphylococcus aureus NBRC 102135 とStaphylococcus epidermidis NBRC 100911 を使用した。また、皮膚常在菌のマン
ニット食塩寒天培地を用いた耐塩性試験、研究室メンバー間の分離皮膚常在菌の比較、および S. aureus と S. epidermidis を LB、MRS、YPD、および 702 液体培地の４種類の培地での培養を行った。
【結果・考察】皮膚常在菌の採取方法の改良では、採取液にポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート含有滅菌生理食塩水を用いて、菌を採取した綿棒を直接プレートに塗抹する方法が最適であった。また、培養時間は最長で約3 日間だった。今回の研究では限られた種類の菌しか採取できなかった。テト
ラサイクリン塩酸塩の抗菌活性検出では、単離した皮膚常在菌すべてに抗菌活性が確認された。マンニット食塩寒天培地を用いた耐塩性試験では、4 種類の菌に耐塩性が確認された。今回単離した菌には S. aureus が存在しなかった。研
究室メンバー間の分離皮膚常在菌の比較では、分離微生物の種類および菌数とも異なった。皮膚常在菌の４種類の培地での培養では、S. aureus が MRS 液体
培地での増殖が乏しかった。MRS 液体培地を S. aureus の選択培地として使用が示唆された。以上から化粧品への皮膚常在菌の応用への基礎的な知見が得られた。

Construction of large-sized DNA using Bacillus subtilis

Examination of method for collecting skin resident bacteria and culture
characteristics of isolated microorganisms○Shinya Kaneko1, Yasunori Aizawa1,2(1 Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech, 2 KISTEC)

Key words
gap repair cloning, homologous recombination, genome synthesis,
transformation○Naohiko Taga, Yuuto Fukuda(Sch. Agric., Tokai Univ.)

Key words

skin resident bacteria, isolation, cosmetics

202

2Lp02
学

カブトムシ幼虫の成長促進に関与する腸内細菌の探索と
特性評価

2Lp04

木桶を用いた醤油醸造環境中の細菌群集構造の解析と培養化
松﨑 大典 1, ○三木 夏凛 1, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大院・生物資源科学学位P, 2 筑波大・生命環境系）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp○八代 祐典, 浅野 風斗, 児玉 浩明（千葉大院・園芸）
kodama@faculty.chiba-u.jp

循環型社会を目指す現代において、間伐材をはじめとした未利用の木質バイオマスの活用が求められている。カブトムシの幼虫はこの木質バイオマスを餌として分解する昆虫であるため未利用木質バイオマスの有効利用を期待できるとともに、同幼虫は魚の成長に必要なリジンを豊富に含み高タンパクであることから、養魚飼料としての可能性を検討している。先行研究では未利用の海産資源を高温下で発酵させて得られる好熱菌発酵産物をヘラクレスオオカブトの幼虫に給与した結果、メス幼虫において成長促進が認められ、その腸内で Mollicutes
綱細菌の増加が見られた（Asano et al. (2023) J. Appl. Microbiol. 134: lxac006）。そのため本研究では、カブトムシの成長促進に関与する腸内細菌の単離を行った。
結果として Mollicutes 綱細菌は得られなかったが、木質バイオマス分解に関わる可能性が高い菌が複数単離され、それらの菌をカブトムシの幼虫の餌となる廃菌床に散布し給与したところ、Luteimicrobium album に近縁の 6m3 株およびXylanimonas protaetiae に近縁の hf16 株は幼虫の初期成長を促進した。一方で invitro 条 件 下 で セ ル ロ ー ス お よ び キ シ ラ ン の 高 い 分 解 活 性 が 確 認 さ れ た
Xylanimonas protaetiae に近縁の hf2 株をカブトムシ幼虫に給与した場合、幼虫の成長が抑制された。以上の結果から、腸内細菌による木質バイオマス分解活性と腸内細菌の給与によるカブトムシ幼虫の成長促進との間には直接的な相関がみられないことが示唆された。

【緒言】 古くから、醤油蔵の建物や木桶、道具に棲みついた“蔵付き菌”と呼ばれる微生物集団を活用し、醤油は醸造、作成されてきた。しかしながら、醤油
醸造環境中の微生物群集構造の全容や微生物の機能については十分に明らかにされているとは言い難い。本研究では、330 年以上にわたり木桶を使用して醤油を醸造している現場の諸味と木桶の試料を対象に、細菌群集構造の比較解析と多様な細菌の培養化を試みた。
【方法・結果】 次世代シーケンサー(MiSeq)を用いて、諸味と木桶の細菌群集構造を解析した結果、醤油醸造環境では諸味と木桶は隣接しているのにも関わらず、全く異なる細菌群集構造を有することが明らかとなった。諸味では
Tetragenococcus 属、木桶では Salinisphaera 属や Lentibacillus 属が優占化していた。NaCl を添加した MRS 寒天平板培地を用いてそれぞれの試料で優占化していた細菌の単離培養を試みた結果、諸味試料からは Tetragenococcus 属の細菌
（Tetragenococcus halophilus）が単離培養できたが、木桶からは Staphylococcus
epidermidis が単離培養され、優占化している属の細菌は単離培養できなかった。
また、木桶試料を寒天平板培地で培養し、得られた細菌集団を PCR-DGGE 法を用いて解析した結果、増殖はしているが、肉眼で目視できるコロニーを形成しない Virgibacillus massiliensis や Methylobacterium adhaesivum と推定される細菌の存在が示唆された。木桶や諸味の試料から多様な細菌の培養化を目指し、醤油を含む寒天培地の使用について種々検討したが、十分な性能を有する培地の作成は困難であった。現在、醤油を含む培地でも使用可能な単離培養法の開発と培養化について検討中である。

Exploration and characterization of gut bacteria involved in growthpromotion of beetle larvae.

Cultivation and analysis of bacterial community structure present inwooden barrels used in soy sauce brewing○Yusuke Yatsushiro, Huto Asano, Hiroaki Kodama(Grad. Sch. Horticul., Chiba Univ.)

Key words

2Lp03
学

Daisuke Matsuzaki1, ○Karin Miki1, Hideki Aoyagi1,2(1 Grad. Sch. Deg. P. Agro-Bioresour. Sci. Technol., Univ. Tsukuba, 2 Inst. Life
Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

growth rate, microbial flora, insect, cellulose

Key words
bacteria

isolation culture, halophilic bacteria, soy sauce brewery, lactic acid

ウグイス糞の諸特性と皮膚常在菌に及ぼす影響の解析

2Lp05

食品添加物が腸内細菌やモデル複合系に及ぼす影響の解析（第 3 報）○齋藤 愛弥 1, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大院・生物資源科学学位P, 2 筑波大・生命環境系）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp

芦沢 紬希 1, ○鈴木 大斗 2, 桃井 玲香 2, 青柳 秀紀 1,2,3（1 筑波大院・生物資源科学学位P, 2 筑波大・生物資源, 3 筑波大・
生命環境系）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp【目的】 ウグイス（Horornis diphone）の糞は洗顔料やシミ抜きとして平安時代
から近年まで利用されてきた。しかし、鳥獣保護管理法の施行により糞の入手が困難となり、現在は製品の製造ができない。ウグイス糞が化粧品的効能を示す機構は、これまで学術的検討が十分になされておらず、糞の主な要素である
細菌叢（腸内由来）も未解明な部分が多い。この現状を踏まえ、我々はウグイ
ス糞の諸特性や細菌群集構造の一端を明らかにしてきた(1)。本研究では、ウグ
イス糞が化粧品的効能を示す機構の解明を最終目標に、ウグイス糞の諸特性と皮膚常在菌に及ぼす影響の解析を試みた。
【方法と結果】 ウグイスの糞に加え、既存のウグイス糞由来化粧品“うぐいすの粉®”を実験に使用した。“うぐいすの粉®”の製造方法を模倣してウグイスの糞を処理し、次世代シークエンサー（MiSeq）を用いて細菌群集構造を解析した結果、ウグイスの糞に含まれている Pseudomonas 属や Acinetobacter 属などの割合が減少し、Leuconostoc 属などの乳酸菌の含有率が高くなることが明らかとなった。処理したウグイスの糞と“うぐいすの粉®”の抽出液を添加した 802 培地で、皮膚常在菌である Staphylococcus epidermidis（善玉菌）と S. aureus（悪玉菌）を培養した結果、いずれも S. epidermidis の増殖が 802 培地（コントロール）と比
べて相乗的に増大したのに対し、S. aureus では増殖促進効果は認められなかった。種々検討した結果、ウグイス糞、“うぐいすの粉®”ともに、S. epidermidis の増殖を促進する因子が含まれている可能性が示唆された。
(1) R. 4. 日本生物工学会大会講演要旨 p. 178.

【緒言】 近年、腸内細菌叢と宿主の健康との関連が報告されている。食品に含まれる食品添加物は抗菌性や乳化性など多様な機能を有するが、それらが腸内細菌叢に与える影響は未解明である。本研究では、独自に構築した複数の腸内細菌で構成されるモデル複合系（細菌カクテル）を用い、各種の食品添加物が腸内細菌（叢）に与える影響を客観的に比較できる新規な評価法の開発と利用について検討を行った。
【方法・結果】 善玉菌、日和見菌、悪玉菌のモデルとしてそれぞれ Lactobacillus
gasseri、Bacteroides fragilis、Escherichia coli を用い(1)、通常状態の腸内細菌叢のモデルである細菌カクテル GRC（Good Ratio Cocktail）と、適切な腸内細菌組成が崩れた状態（Dysbiosis）のモデルである BRC（Bad Ratio Cocktail）を作成した。種々の食品添加物を適宜、添加した培地に GRC や BRC を植菌し、各細菌の増殖や細菌表面の特性を比較した結果、一部の腸内細菌は共存する細菌の比率によって、食品添加物への感受性が変化することが示唆された。モデル複合系で得られた結果を客観的に比較するために“添加物マップ”を作成し、その影響を可視化した。“添加物マップ”に基づき、腸内細菌への影響が逆の食品添
加物（Sodium nitrite と Potassium sorbate）を組み合わせた効果について検討した
結果、L. gasseri への影響が低減された（B. fragilis と E. coli への影響は低減されなかった）。本研究で作成した“添加物マップ”を適切に活用することで、影響を相殺できる食品添加物の組み合わせの見当付けや、複合効果の評価を容易におこなえる可能性が示唆された。

Analysis of the characteristics of Horornis diphone feces and their effect on
the growth of indigenous skin bacteria

Effect of food additives on the model microbiota system of intestinalbacteria (part 3)○Manami Saito , Hideki Aoyagi(1 Grad. Sch. Deg. P. Agro-Bioresour. Sci. Technol., Univ. Tsukuba, 2 Inst. Life
Environ. Sci., Univ. Tsukuba)
1

Key words

1,2

bacterial community, cosmetics, fecal sample, Horornis diphone(1) R4 日本生物工学会要旨 p. 248.

Tsumugi Ashizawa1, ○Hiroto Suzuki2, Reika Momoi2, Hideki Aoyagi1,2,3(1 Grad. Sch. Deg. P. Agro-Bioresour. Sci. Technol., Univ. Tsukuba, 2 Coll. AgroBiological Resour. Sci., Univ. Tsukuba, 3 Inst. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

intestinal bacteria, food additives, mixed culture

203

2Lp06

バクテリオファージを用いた微生物菌叢の減算的改変○岡野 憲司, 田中 友樹, 岩木 宏明（関西大・化生工）
okano.k@kansai-u.ac.jp

2Lp08

ヒト消化管ストレスに耐性を有するプロバイオティクスの新規な評価・選抜・取得法の開発 （第 2 報）
○小澤 拓真 1, 髙津 あゆみ 1, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大院・生物資源科学学位P, 2 筑波大・生命環境系）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp

微生物の集合体である菌叢の変化は宿主の健康改善や土壌の元素循環などに重要な影響を与える。菌叢の働きを自在に改変・制御できれば、健康維持や持続的耕地利用といった社会課題の解決に貢献できる。そこで、我々はバクテリオ
ファージの宿主特異的な溶菌機構を利用して菌叢から標的微生物のみを死滅させる菌叢改変技術の開発を行っている。
モ デ ル 菌 叢 と し て 、 Escherichia coli 、 Pseudomonas putida 、 Bacillus subtilis 、Lactiplantibacillus plantarum からなる 4 菌共培養系を利用し、ファージを用いて
E. coli のみを死滅させられるかを検討した。まず、E. coli に感染する T4 ファー
ジを NBRC より入手し、その特異性の確認を行った。各微生物の単培養系に対して、T4 ファージを 104 PFU/mL の力価で添加した結果、E. coli は全く増殖しなかったのに対し、他の微生物群はファージ非添加時と全く同等の増殖を示し
E. coli への感染特異性が示された。続いて、4 菌からなる人工菌叢に対して T4
ファージを添加した結果、24 h 培養後の E. coli の生菌数が、ファージ非添加時
では 2.4×108 CFU/mL であったのに対し、添加時は 1.0×101 CFU/mL と著しく減少した。一方、残りの 3 菌の生菌数は、ファージ添加の有無による差は無く、
E. coli の増殖を特異的に抑制できたといえる。
続いて入手した T4 ファージを直接利用するのではなく、T4 ファージのゲノム
DNA から無細胞翻訳系を用いて人工合成した T4 ファージを用いて同様の実験を行ったところ、やはり同様の結果が得られた。この結果は、ファージを人工合成して、微生物菌叢を改変するという菌叢改変スキームが実行可能であることを示している。
現在は P. putida や B. subtilis に感染するファージを池や土壌から単離することに成功しており、これらの微生物を標的とした菌叢改変実験を行っているところである。

【目的】 健康長寿社会の実現が謳われ、プロバイオティクス（PB）の活用が注目されている。PB が健康効果を示すためには、ヒト消化管を通過する際に胃酸や胆汁酸から受ける連続的ストレスへの耐性が重要であるが、ストレスの耐性は、各研究者により異なる条件で評価されている。また、PB を摂取する際の体内環境（空腹時）に着目した評価は乏しく、PB の探索も時間と労力を要する。
我々は、独自に開発した新規培養法（Specialized Cellulose Film［SCF］法）を改良し、簡易で高効率な PB の評価・選抜・取得法を開発した（1）。本研究では、開発した手法を用いてヒト消化管ストレスに優れた耐性を有する PB の探索と取得した PB の諸特性を解析し、その有効性評価を試みた。
【方法と結果】 SCF 法は Specialized Cellulose Film と液体培地を含浸させた不織布製の足場で構成され、両者は分離できるため、Film を移動させることにより培養細菌叢を保持した状態で培養環境を変更できる。空腹時の体内環境を模倣し、低濃度の胆汁酸やリン脂質を加えた人工胃液（pH 1.6）と人工腸液（pH6.5）を調製し、SCF 法を用いてウグイスの糞から PB の選択的取得を試みた。
その結果、胃酸や胆汁酸耐性に優れた PB（乳酸菌）が単離培養できた。単離培養した菌株の胃酸・胆汁酸耐性試験を SCF 法を用いて行った結果、ヒト消化管
ストレスに対する耐性を有することが示された（本法の有用性が示された）。また、取得した PB の自己凝集能はタイプ株と比べて僅かに高い値を示した。現
在、取得した PB のヒト消化管ストレス耐性をさらに向上させる系について検討中である。
(1) R4 日本生物工学会要旨集 p. 248

Subtractive modification of microbiota using bacteriophages

Development of evaluation, selection, and acquisition methods for probiotics
resistant to human gastrointestinal stress (Part 2)○Kenji Okano, Tomoki Tanaka, Hiroaki Iwaki(Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ.)○Takuma Kozawa1, Ayumi Kozu1, Hideki Aoyagi1,2(1 Grad. Sch. Deg. P. Agro-Bioresour. Sci. Technol., Univ. Tsukuba, 2 Inst. Life
Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

Bacteriophage, microbial flora

Key words

2Lp07

CRISPR 転写活性化システムによる微細藻類クラミドモ
ナスでの遺伝子発現増強

2Lp09

学

○宮副 こころ, 河邉 佳典, 上平 正道（九大院・工）kawabe@chem-eng.kyushu-u.ac.jp

gastrointestinal stress, probiotics, screening, specialized cellulose film

低分子抗体生産に向けた枯草菌技術の開発○東條 卓人, 西口 大貴, 井上 英俊, 和田 真由美, 大浦 智之,
壺井 雄一, 川原 彰人, 小山 伸吾, 影山 泰, 瀧村 靖
（花王）
toujou.takuto@kao.com

単細胞光合成真核生物である微細藻類クラミドモナスは、バイオ燃料生産や組換えタンパク質、バイオ色素等の生産技術開発のための優れたモデル生物である。核ゲノム改変による外来遺伝子発現システムは開発が進められているものの、さらなる導入遺伝子の発現増強が求められている。これまでにクラスミド
モナスでは、CRISPR 技術による遺伝子発現調節に関してほとんど検討されていない。本研究では CRISPR 転写活性化システムを用いたクラスミドモナスにおける遺伝子高発現増強システムの開発を行った。
クラミドモナスコドンで最適化された Cas9 をコードする遺伝子において点変異
導入 PCR を行い、DNA 切断能欠損型 Cas9 (dCas9) 発現ベクターを構築した。
続いて転写活性化ドメイン (TAD) との融合タンパク質となるように遺伝子工学的に設計し、人工転写因子として機能する dCas9-TAD 発現ベクターを作製した。このベクターを、TRE を認識するガイド RNA (sgRNA) 発現ベクターおよび TRE 応答配列を有する分泌型ルシフェラーゼ遺伝子発現ベクターとともに電気穿孔法で評価モデル細胞 Chlamy/S へ遺伝子導入した。導入 4.5 時間後培養上清中のルシフェラーゼ発現量を評価した。その結果、化膿連鎖球菌由来 dCas9
を HSP70A/RbcS2 (HR) プロモーターで発現させ、TAD として単純ヘルペスウ
イルス由来 VP16 の 3 回繰り返し (VP48) を用いた場合、ルシフェラーゼ発現量が最大化した。次に、HR プロモーターに対して種々の sgRNA 認識配列を設計し、評価したところ、最大 6.9 倍発現量の増強が認められた。さらなる発現量向上のため、SAM システムを適用したところ、HR プロモーターの転写を 9.3
倍増強できることがわかった。

近年微生物生産が可能な低分子抗体が着目されており、バイオ医薬品として盛んに研究開発が行われている。低分子抗体の発現には一般的に大腸菌が用いられるが、発現生産成功率、および菌体内発現生産であることに起因する著量の夾雑タンパク質を除く精製工程の複雑さが課題として挙げられる。我々は、枯草菌が VHH 抗体をはじめとした低分子抗体を効率よく細胞外に分泌生産できることを見出していたので今回報告する。
多数の VHH 抗体について枯草菌での発現量を検証した結果、枯草菌で製造した VHH 抗体は目的の抗原結合活性を示す構造体として取得できること、および高い発現成功率と生産性を示す特徴を確認した。また VHH 多量体や ScFv な
どの低分子抗体モダリティについても発現生産が可能であった。さらに、VHH
生産性の強化として、これまでに開発してきたタンパク質生産能を強化する技
術の適用、およびタンパク質生産に不要な遺伝子を削除したゲノム縮小株の活用により、野生株と比較して VHH 抗体生産性を大幅に向上させられることも確認した。加えて、枯草菌のタンパク質生産の特徴である分泌生産経路を活用
してこれらの低分子抗体を生産できたことから、精製工程の簡略化にも繋がることを示唆する結果も取得している。
以上の結果から、枯草菌は低分子抗体の発酵生産のみならず精製プロセスに対しても有利な形質を示すことから、VHH 抗体活用の普及を導く有望な細胞基材であると考える。本発表では、低分子抗体発現宿主としての枯草菌の活用に対するその利点や課題などを議論したい。

Enhancing gene expression in Chlamydomonas reinhardtii using CRISPRtranscriptional activation system

Development of Bacillus subtilis technology for antibody fragments
production○Kokoro Miyazoe, Yoshinori Kawabe, Masamichi Kamihira(Grad. Sch. Eng., Kyushu Univ.)

Key words

Chlamydomonas reinhardtii, CRISPR/dCas9, transcription, microalgae○Takuto Tojo, Hiroki Nishiguchi, Hidetoshi Inoue, Mayumi Wada, Tomoyuki Oura,
Yuichi Tsuboi, Akihito Kawahara, Shingo Koyama, Yasushi Kageyama,
Yasushi Takimura(Kao Corp.)

Key words

Bacillus subtilis, antibody, secretory production, protein expression

204

2Lp10
学

組換え大腸菌の高密度培養による単鎖抗体の効率的生産○山口 大介, 熊田 陽一, 堀内 淳一（京工繊大院・工芸科学）
horiuchi@kit.ac.jp

2Mp02
学

新規共培養システムを用いた酪酸産生菌とモデル腸上皮細胞との相互作用の解析○梅原 嘉宏 1, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大院・生命農学学位P, 2 筑波大・生命環境系）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp［背景及び目的］
これまでに、分泌シグナルを導入した組換え大腸菌を用いた溶存酸素濃度(DO)を制御する DO-stat 流加培養 1), 2)により、活性型単鎖抗体(scFv)の 5~6 g/L の高濃度菌体外生産を報告した。この手法が実用化されれば、生産性の向上と精製工程の簡素化により生産コストの画期的低減を実現できる。一方で、scFv 生産が培養中期で停止し、菌体外生産が行われないケースが確認された。本研究では、流加培養中の組換え大腸菌のプラスミド保持率に着目し、scFv 生産に及ぼす影響について検討した。
［実験方法］
anti-CRP scFv 遺伝子をプラスミド pET22-b(+)を用いて、Rosetta2(DE3)株に形質転換した。この生産株を用い、70~100 時間の DO-stat 流加培養による scFv 生産を行った。抗生物質含有/非含有培地を用いたコロニーカウント法により、流加培養中における組換え大腸菌のプラスミド保持率を測定した。
［結果と考察］流加培養中のプラスミド保持率を経時的に測定した結果、scFv が良好に菌体外生産された場合、プラスミド保持率は比較的高く維持されたのに対し、scFv 生
産が停止したケースでは、プラスミド保持率が 47 時間目に 11%まで減少しており、長時間の培養中にプラスミド保持率が低下し、scFv 生産が停止した。プラスミド保持率の低下は、β-ラクタマーゼの菌体外分泌によるアンピシリンの失活によると推定された。今後は培養中期から後期にかけて、プラスミド保持率を高く維持するための培養工学的手法を検討する。
[参考文献]
1)N. H. Nghia et.al J.Biosci. Bioeng.132.1:56-63 (2021)
2)N. H. Nghia et.al Biochem. Eng. J. 176:108184 (2021)【目的】 腸内には多種多様な微生物が生息し、特に短鎖脂肪酸を産生する微生
物は健康への有益性から注目されている。我々はこれまで、簡便に嫌気性微生物と動物細胞との共培養を可能にし、両者の挙動解析が可能な共培養システムを開発した(1)。本研究では開発した共培養システムの有効性を評価するために、腸管腔に生育する微生物と腸上皮細胞の共培養を試みると共に、両者の相互作用の解析を試みた。
【方法と結果】 開発した共培養システムを用いてヒト由来の酪酸産生菌
Eubacterium barkeri とモデル腸上皮細胞（MDCK, Caco-2）を共培養し、MDCK
や Caco-2 の生育状態の指標である経上皮電気抵抗と培養後の生存率、E. barkeriの増殖経過、培養液のグルコースや乳酸、短鎖脂肪酸（酢酸、酪酸）濃度、の経時変化を測定した。その結果、E. barkeri は共培養条件ではグルコース消費が抑制されながらも E. barkeri の純粋培養時と同程度まで増殖し、モデル腸上皮細胞の生育状態が向上する傾向が観察された。また、培養液中の乳酸の増加が抑えられ、短鎖脂肪酸が増加した。さらに、酪酸の増加量は E. barkeri の純粋培養時と比べて小さいという現象も観察された。以上の結果から、モデル腸上皮細胞が生産した乳酸を E. barkeri が代謝して短鎖脂肪酸が産生され、それらをモデル腸上皮細胞が栄養源として利用するという相互作用の一端が示された。
本共培養システムは、これまで困難であった嫌気性微生物－動物細胞の共培養と両者の挙動解析を簡便に実現すると共に、報告例の少ない in vitro での相互作用の解析が可能となり、その有効性の一端が示された。
本研究は JSPS 科研費 JP23KJ0274 の助成を受けた。
(1) Umehara & Aoyagi. J. Biosci. Bioeng. 135, 487-492 (2023).

Effective production of shingle chain variable fragment using recombinant
Escherichia coli by high cell density culture

Analysis of interaction between butyric acid-producing bacteria and model
intestinal epithelial cells using a novel co-culture system○Daisuke Yamaguchi, Yoichi Kumada, Jun-ichi Horiuchi(Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)○Yoshihiro Umehara1, Hideki Aoyagi1,2(1 Grad. Sch. Deg. P. Life Agric. Sci. Technol., Univ. Tsukuba, 2 Inst. Life Environ.
Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

Escherichia coli, plasmid, scFv, production

Key words

butyric acid, coculture, Eubacterium barkeri, intestinal epithelial cell

2Mp01

複合微生物工学アプローチによるバイオプロセス制御：
メタ連続発酵における pH が細菌叢と有機酸生産性に及ぼす影響の解明

2Mp03

ゲル微粒子（GMD）の凝集培養法を使用した未培養・難培養性細菌の可培養化と分離方法の構築

学○下村 有美, 山本 明菜, 鈴木 陸太, 加藤 節, 中島田 豊, 青井 議輝（広島大院・統合生命科学）
yoshiteruaoi@hiroshima-u.ac.jp○古閑 友紀 1, 宮本 浩邦 2,3,4, 酒井 謙二 1, 大城 麦人 1, 田代 幸寛 1
（1 九大院・生資環, 2 千葉大・園芸, 3 理研・生命医科学, 4 サーマス）
tashiro@agr.kyushu-u.ac.jp
背景、目的複合微生物プロセスを工業，農業，環境，医薬等への応用を目指す学問である『複合微生物工学』の創成を目指している１。特に、複合微生物を用いた有価物
生産プロセスをメタ発酵と定義提唱しており 2、複数の基質利用や雑菌汚染への耐性などのメリットが存在する一方、生産物のヘテロ化や制御理論と技術の未構築が課題である。連続発酵は高生産性・長期操作安定性に優れている一方で、多くの研究は生産性や生産濃度に焦点を当てており、細菌叢を含む統合的な知見は乏しい。細菌叢への影響を解明することでプロセスの最適化を可能とし、生産性の向上につながる。本研究は pH が細菌叢と有機酸生産に及ぼす影響の解明を目的とした。
方法
複合種菌として堆肥を用い、グルコースを炭素源とする培地で嫌気的、24 時間
回分発酵を行い、連続発酵に切り替えた。pH は 7.0、6.5、6.0、非制御 に調整した。細菌叢、糖消費量、有機酸生産を解析した。
結果
pH 7.0 において、Xylanivirga thermophila が優占種となり(47.6%)、乳酸、酢酸がそれぞれ 9.36、6.96 g/L 生産された。 pH 6.5 では 64 h で 51.8 g/L の乳酸が生産されたが、その後、164 h で 14.2 g/L まで減少し、定常状態に達しなかった。最優占種 C. hisashii に加えて多種の細菌の増殖が確認された。pH 6.0 では W.
coagulans が優占種となり(>99%)、44 h で乳酸濃度が 50.5 g/L まで達し、濃度を維持して 104 h で定常状態に達し、乳酸選択性 99.4％、2.57 g/L/h の乳酸生産性を達成した。pH 非制御では pH は 4.9 程度に低下し、W. coagulans が最優占種になったが、6.49 g/L の乳酸が低濃度で生産された。
6.5 以上の pH では細菌間競争、非制御では生産阻害を引き起し、pH6.0 が乳酸生産に最適な値であることを明らかにした。
参考文献
1
田 代 幸 寛 、 酒 井 謙 二 , 生 物 工 学 ,99,627-630, 2021; 2Tashiro et al., Bioresour.
Technol., 2016

環境細菌の大部分は未培養・難培養性であるため、それらを可培養化する新しい培養手法が求められている。本研究では、微生物間相互作用が多くの難培養性細菌の可培養化の鍵になるという仮説に基づき、微小ゲル粒子（GMD; gelmicrodroplet）凝集培養法という、高密度の複合培養系でありながら各細菌の純粋培養状態が維持でき、かつ微生物間相互作用の維持も期待できる培養方法を用いて、未培養・難培養性細菌の可培養化と分離株の取得手法の構築を試みた。
森林土壌より抽出した微生物細胞を含む GMD を作成し、それらをミネラルオ
イルに添加することで GMD の凝集体を形成させ、その凝集体を攪拌しながら培養した。対象試験としては標準寒天平板法（SDP; standard direct plating）を行った。GMD は経時的にサンプリングし、細菌の可培養化率の計測と菌叢解析を行うとともに、培養 1 ヶ月目には細胞を含む GMD を Cell Sorter で分取して培地に接種した。培地に生育した菌体は NGS 解析で菌種を推定し、未培養・難培養性細菌については単離操作を行った。細菌の可培養化率は SDP では 0.5%であったのに対して GMD 培養では 50%に達した。GMD 凝集培養中の菌叢は、初 期 は Gammaproteobacteria が 優 占 し て い た が 、 培 養 日 数 が 進 む に つ れ て
Bdellovibrionota、Myxococcota などの未培養・難培養性細菌の相対存在率の増加が見られた。培地接種後に生育した菌体は、SDP では Pseudomonadota が 96%に 対 し て GMD で は 52% と 低 く 、 40% は Actinomycetota 、 2% は 難 培 養 性 のVerrucomicrobiota であった。GMD より Verrucomicrobiota や Gemmatimonadota、
寄生性である Bdellovibrionota の共培養株など、複数の難培養性細菌の分離株が得られたことから、本手法は微生物間相互作用による難培養性細菌の増殖と単離効率促進効果を有することが示唆された。本研究の成果は、NEDO 助成事業の結果得られた。

Control of bioprocess with Complex Microbial Engineering: Elucidation ofeffect of pH on microbial community structure and their organic acidproductivity in continuous meta-fermentation.

Construction of a method for culturalization and isolation of uncultured
bacteria using gel-micro droplet (GMD) aggregate culture method.

○Tomonori Koga1, Hirokuni Miyamoto2,3,4, Kenji Sakai1, Mugihito Oshiro1,
Yukihiro Tashiro1(1 Grad. Sch. Bioresour. Bioenviron. Sci., Kyushu Univ., 2 Fac. Horticul., Chiba
Univ., 3 IMS,RIKEN, 4 Sermas co., ltd)
Key words
mixed culture, continuous culture, microbial community, lactic acid

○Yumi Shimomura, Akina Yamamoto, Rikuta Suzuki, Setsu Kato,
Yutaka Nakashimada, Yoshiteru Aoi(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)

Key words

gel-micro droplet, uncultured bacteria, isolation

205

2Mp04

培地非照射型の新規な光照射培養法の開発○塚田 銀志 1, 石井 湧大 1, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大院・生物資源科学学位P, 2 筑波大・生命環境系）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp

2Mp06
学

酵母エキスとトリプトンの網羅的な定量分析を活用した
新たな合成培地設計戦略○中島 拓都 1, 邱 泰瑛 2, 小西 正朗 2
（1 北見工大院・工, 2 北見工大）
konishim@mail.kitami-it.ac.jp【目的】 光照射が様々な微生物の増殖や物質生産に与える影響が研究され、新規な光受容体も報告されている。演者らは光照射培養の実験を行う過程で、従来の光照射培養系では、菌体への直接的な光照射による影響と、光照射の影響を受けた培地が培養中の菌体に与える間接的な影響が混在した状態で検討されており、それぞれの影響を分けて個別に解析する必要があるのではないかと考えた。本研究では、培地への光照射を制限し、菌体への直接的な光照射のみを可能とした培地非照射型の新規な光照射培養法の開発と利用について検討を行った。
【方法と結果】 モデルとして土壌試料を寒天平板培地に播種し、独自に開発した LED 照射型小型培養システムを用いて光照射培養した結果、暗所培養と比較して異なる培養菌叢が得られると共に、光照射培養した培地の色が薄くなることが観察された。培地への光照射の影響と菌体への光照射の影響を分けて解析するために、黒色のポリカーボネート板（コントロール: 透明のポリカーボネート板）をシャーレの形状に切り取り、表面に任意のサイズの 200 個の穴を格子状に穿孔した遮光プレートを独自に製作し、寒天平板培地の上に直接設置して光 照 射 培 養 す る 方 法 を 考 案 し た 。 実 際 に 本 培 養 法 を 用 い て 、 Azospirillum
brasilense を培養した結果、透明な遮光プレートを用いた場合にはコロニーの形成が著しく阻害されたのに対し、黒色の遮光プレートでは、培地の色の変化を抑え、遮光プレートの穴を通して光が照射された A. brasilense のコロニーが形成した。本法により、培地への光照射を抑え、光照射された培地からの培養菌体への間接的な影響を排除し、菌体にのみ光照射して培養することが可能となった。現在、A. brasilense のオーキシン生産挙動について検討中である。

酵母エキス(YE)やトリプトン(TRY)などのフィードストックを含む天然培地は微生物培養に広く使用されている．しかしながら，天然物の組成はメーカー，バッチ間で異なるため微生物培養へ影響を及ぼす．一方，合成培地(CDM)は全て化学薬品で構成されているため組成が明瞭であり，培養収率の再現性も高いが，その設計には多大な労力を要する．そこで，本研究では複数の分析手法を用いて YE と TRY 中の成分を網羅的に定量し，天然培地を模倣する新たな合成培地の設計手法を提案した．モデル微生物には GFP 生産組換え大腸菌を使用し，LB 培地，定量分析結果から調製した合成培地(LBq 培地)，公表されている成分量から調製した合成培地(LBp 培地)，M9 最少培地での増殖とタンパク質発
現で評価した．網羅的な定量分析より YE と TRY 中の 55 成分が検出された．
その内訳はアミノ酸 20 種，有機酸 5 種，無機酸 1 種，核酸 3 種，糖・糖アル
コール 8 種，ビタミン 5 種，カチオン 5 種，アニオン 7 種，元素 1 種であった．
なお，タンパク質を構成するアミノ酸量は加水分解して遊離アミノ酸として定量した．LBq 培地と LBp 培地の全アミノ酸は遊離アミノ酸に置き換え，ペプチ
ド・プロテインフリーな培地とした．培養 6 時間目において， LBq 培地の細胞増殖は LB 培地の 0.74 倍であったが， GFP 生産量は LB 培地の 1.2 倍であった．
一方，LBp 培地の性能は LB 培地の 0.2 倍程度であり，M9 最少培地よりもわずかに劣った．この要因として，有機酸，核酸等がないことが大腸菌の培養に影響している可能性がある．以上の結果より，YE と TRY の定量データベースにより，細胞増殖性ではやや劣るが，GFP 産生では優れる CDM を設計することが可能であるが，天然培地を公表値に基づいて CDM に変換することは困難であるが示された．本発表では天然培地の定量的解析を基に CDM を設計する戦略について，その詳細データを紹介する．

Development of novel light-irradiated culture without direct illumination ofculture medium

A new strategy for designing chemically defined media using comprehensive
quantitative analysis of yeast extract and tryptone○Ginji Tsukada1, Yuta Ishii1, Hideki Aoyagi1,2(1 Grad. Sch. Deg. P. Agro-Bioresour. Sci. Technol., Univ. Tsukuba, 2 Inst. Life
Environ. Sci., Univ. Tsukuba)○Takuto Nakajima1, Tai-Ying Chiou2, Masaaki Konishi2(1 Kitami Inst. Tech., Grad. Sch. Eng., 2 Kitami Inst. Technol.)Key words

light-irradiated culture, Azospirillum brasilense, LED

Key words

Escherichia coli, chemically defined media, quantitative analysis

2Mp05

新規解析方法を適用した深層学習による培地スクリーニ
ング手法の開発

2Mp07

機械学習と機器分析を用いた微生物培地の分析と改良○渡辺 一樹 1, 邱 泰瑛 2, 小西 正朗 2
（1 北見工大院・工, 2 北見工大）
konishim@mail.kitami-it.ac.jp○小西 正朗（北見工大）
konishim@mail.kitami-it.ac.jp[背景]微生物の発酵技術において，培地最適化は経済性向上のため重要である．
近年は機械学習を駆使した手法が考案され成果を挙げているが，機械学習には多量の学習用の培養データが必要であり，実験データ収集が律速段階となるため，迅速な培地設計のためには少ない学習データでの最適化が望ましい．本研
究では限られたデータ数で迅速に培地最適化する手法を検討するため，実験計画法の検討と，学習データの深層学習への適用方法を検討した．
[方法] Escherichia coli BL21(DE3)による緑色蛍光タンパク質(GFP)発現系を対象とした．培地成分と濃度水準を設定し，各成分を直交表及びラテン超方格法に割付けし，2 つの方法で 64 種類の培地を設計し，ディープウェルプレート中に培地調整した．これによる本培養 8 時間目の GFP 蛍光強度データを学習に用いた．培地組成を x, GFP 蛍光強度を y としてデータセットを作成し，以下のサイ
クルを 50 回実施した．(1)ランダムに 15%のデータを汎化性テストのために抜き出し，残り 85%のデータで深層学習モデルを構築．(2)MSE の算出と感度解析を実施．これにより，各データセットから 50 個ずつモデルを構築した ．次に，各モデルの感度解析結果を指標とし，k-means 法でモデルを 6 クラスに分類し，各クラス中最高精度のモデルを選択して，最適化アルゴリズムを実施した．得られた培地で培養し，最適化の効果を検証した．
[結果]本法で得られ最適化培地の組成は，使用した実験計画法やモデルの違い
により大きく異なった．検証培養の結果，ラテン超法格データセットから作成したモデルでは GFP 蛍光強度が増大する培地が多数得られ，直交表と比較して優位性が認められた．また，異なる学習結果に収束したいくつかのモデルへ最適化を実施し，多数の候補を探索して検証することで，より迅速かつ効果的に培地最適化を達成できた．

微生物を培養するためには、微生物の増殖に必要な栄養成分を培地として調合する必要がある。従属栄養微生物である場合には、炭素源、窒素源、リン源、微量金属等の栄養成分を適切に配合する必要がある。また、微生物によっては、
一部のアミノ酸やビタミンを新規合成する代謝経路を持っていないため、培地に供給する必要がある。それらの成分の適正値は取り扱う微生物および目的生産物質によって多様である。また、工業的には培地成分を安価で性能が優れている様々な天然物由来の混合物で代用しており、培地の設計や管理をより複雑にしている。演者らは、多様な微生物の培地を迅速に設計するため、ロボットによる半自動培地調合、ディープウェルを用いた小スケール培養による評価、機械学習による予測モデルおよび最適組成探索を組合せたハイスループット培
地スクリーニングシステムを提案している。本法により、大腸菌によるタンパ
ク質生産、コリネ型細菌の増殖、乳酸菌によるヒアルロン生産に適した培地を提案することができている。また、天然培地の成分変動が引き起こす生産性の低下などの原因を評価するための独自の培地プロファイリング技術および培養基材データベース(DB)を開発している。培地プロファイリング技術により、天然物成分の変動によるバイオプロセスの不安定化の原因究明に応用が期待できる。また、詳細な培養基材プロファイリングにより作成した DB を活用して、天然培地組成を参考に完全合成培地を設計する手法の提案にも至っている。本発表では、これらの技術の概要および展望について、紹介する。

Development of the novel methodology for fermentation medium screening
using deep neural network

Improving microbial media by machine learning and multiple instrumental
analysis○Kazuki Watanabe , Tai-Ying Chiou , Masaaki Konishi(1 Kitami Inst. Tech., Grad. Sch. Eng., 2 Kitami Inst. Technol.)1

Key words
production

2

2

Escherichia coli, medium optimization, recombinant protein○Masaaki Konishi(Kitami Inst. Technol.)Key words

machine learning, medium, fermentation, cultivation

206

2Mp08

動物細胞培養に用いる薄膜型レシオメトリック蛍光 pH
センサ

2Mp10

接種工程機械化のための細胞接着挙動に対する操作温度の影響評価○幡多 徳彦 1,3,4, 高野 温 1,3,4, 張本 乾一 2,3,4, Ang Kai Torng 3,
宮本 風俊 3, 紀ノ岡 正博 3,4（1 ローツェライフサイエンス, 2 ローツェ, 3 阪大院・工, 4 阪大
院・工・細胞製造コトづくり拠点）
hata.norihiko@rorze-ls.com○小山 純弘, 神谷 美欧, 菊地 駿斗, 青木 崇, 石川 周太郎（エイブル）
koyama@able-biott.co.jp【目的】本研究は、動物細胞培養に用いる薄膜型レシオメトリック蛍光 pH セン
サの開発を目的とした。
【方法】pH 感受性色素には蛍光指示薬である 8-hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonicacid (HPTS) を 用 い 、 Octadecyl dimethyl (3-trimethoxysilylpropyl) ammonium
chloride (OCT) と イ オ ン 対 を 形 成 さ せ た 。 3-glycidoxy-propyl-trimethoxy-silane(GPTMS)と ethyl-triethoxy-silane (ETEOS)、硬化促進剤には 1-methylimidazole を用いてゾルゲルマトリックスとし、イオン対形成させた HPTS を覆うことでガラス繊維上に封入した。HPTS の蛍光 (515 nm)には pH に依存しない励起波長帯(405 nm)と pH に依存する励起波長帯(460 nm)が存在する。これら 2 波長励起帯を利用することで、レシオメトリック蛍光 pH センサを構築した。
【結果】作成した薄膜型蛍光 pH センサを用い、10% FBS 含有 Dulbecco’s Modified
Eagle’s Medium (DMEM)、無血清 Free style 293 expression medium、0.1M リン酸
緩衝液での各 pH における蛍光強度比（キャリブレーションカーブ）を測定した。培地にフェノールレッドが含まれると、蛍光 pH センサからの蛍光強度が極端に低下し、蛍光強度比を利用した pH 測定ができなくなった。蛍光 pH セン
サの測定可能範囲は pH 4 から pH 8 で、pH 分解能は DMEM で 0.12 pH unit、Free style 293 expression medium で 0.04 pH unit、リン酸緩衝液で 0.05 pH unit であった。薄膜型蛍光 pH センサを取り付けた弊社小型培養装置 BWB を用い、無血清培地 HE400AZ で 5 日間、CHO-S 細胞を培養した。その結果、9 割を超える生存率で CHO-S 細胞が増殖することを確認した。CHO-S 細胞培養時は pH が7.2±0.1 付近で制御されていることを、薄膜型蛍光 pH センサにより明らかとした。

【背景と目的】再生医療分野における細胞培養の安定化には、現在手作業で実施されている培養工程の機械化が必要不可欠である。しかし手作業での操作条件の全てが最適化されている訳ではなく、そのままの条件で機械化することは、
必ずしも細胞培養の安定化には寄与しない。
そこで本研究開発では、培養開始後 24 時間の培養画像を用いた細胞接着挙動に対する客観的かつ定量的な評価方法を構築し、細胞接種における操作温度の影
響評価を目的とした。
【方法】本実験では、モデル細胞として株化された間葉系幹細胞 2 株（骨髄由来
JCRB1136、臍帯血由来 JCRB1546）を用い、10％FBS 含有 DMEM と接着細胞
培養 90mmDish による培養を行った。細胞接種の操作条件は、実験前日にアダプターに設置した Dish を、実験当日に細胞懸濁液を接種した培地入りの遠沈管を加温（37℃）、室温、冷蔵の 3 温度にて保管し、各温度にて Dish に細胞接種した。接種した Dish は搬送装置を用いてインキュベータ（37℃、5%CO2）へと搬送され培養を開始し、培養開始後 24 時間に搬送装置と接続した細胞観察装置を用いて撮影可能な Dish の培養面を全面撮影した。そして LabView を用いた画像処理により撮影した培養画像における接着細胞数を計測し、接着細胞の均一性（ばらつき）について接種操作温度の影響評価を行った。
【結果と考察】その結果、培養 24 時間の接着挙動において、加温操作で最も多くの細胞が培養面に接着した一方、室温操作 で Dish 内での接着細胞のばらつ
きが最も小さくなり、接種操作の再現性が高く、接着挙動が安定化したことが明らかとなった。本研究開発では、接着細胞の均一性（ばらつき）について培
養画像を用いた評価方法を構築し、細胞接種における操作温度の影響評価が可能となった。

Thin-film ratiometric fluorescent pH sensors for use in animal cell
cultivation

Evaluation of the effect of operating temperature on cell adhesion behavior
for mechanization of the inoculation process○Sumihiro Koyama, Mio Kamiya, Hayato Kikuchi, Takashi Aoki,
Shutaro Ishikawa(ABLE Co. Ltd.)○Norihiko Hata1,3,4, Atsushi Takano1,3,4, Kenichi Harimoto2,3,4, Kai Torng Ang3,
Fushun Miyamoto3, Masahiro Kino-oka3,4(1 RORZE Lifescience Inc., 2 RORZE CORPORATION, 3 Grad. Sch. Eng., Osaka
Univ., 4 Res. Base for Cell Manufacturability, Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

pH sensor, HPTS, fluorescence, ratiometric sensing

Key words

cell adhesion, cell inoculation, operation temperature, cell dispersion

2Mp09

Photoresponsive cell-trapping and photodegradablehydrogel layers for image-based single-cell sorting andanalysis2Np01

接着性のコントロールが可能なイガイ由来タンパク質によるマイクロプラスチックの回収学○中島 一紀, Pilakka Veedu Anju, 佐藤 岳大, 高野 力, 川崎 了
（北大院・工）k.naka@eng.hokudai.ac.jp○Xueyang Li, Satoshi Yamaguchi, Akimitsu Okamoto(Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)
yamaguchi@chembio.t.u-tokyo.ac.jp

Recent advances in single-cell analysis have revealed that cellular heterogeneity is
critical in diseases and therapy. A high-throughput workflow consisting single-cell
imaging, sorting and gene analysis can directly associate single-cell phenotypes withgenetic information, giving new insights into biological phenomena. Such workflow
using microwells and droplets recently has been actively studied but cannot allow forphenotypic analysis of adherent cells. In this study, we envision that a photoresponsive
cell attachment surface achieves both the construction of single-cell array of adherent
cells for image-based analysis and light-induced sorting in a high-throughput manner.
Therefore, we aim to develop a process that enables image-based single-cell sortingand subsequent gene analysis.
A thin photodegradable gel layer was prepared on a substrate surface by crosslinking
gelatin with a photocleavable brunched polymers. Then, photoactivatablepoly(ethylene glycol) (PEG)-lipid (PA-BAM) was modified onto the surface of the gellayer to create the single cell array by exposure to a pattern of near UV light.
Subsequently, the cells were incubated, and their adhesion was observed with amicroscope, followed by light-induced release from the surface. The released cells
could be collected, and gene expression analysis was performed to directly link thephenotype to gene expression.

【緒言】 岩場や船底などに接着にするイガイの足糸タンパク質（foot protein: fp）
は水溶液中で様々な材料表面に接着する性質をもつため，新たな環境調和型の接着剤として期待されている。しかし，fp は水溶液中で高い自己凝集性を示す
ため，ハンドリングや接着のコントロールが非常に難しいという問題があった。
我々のこれまでの研究により，fp の 1 種である fp1 に水溶性タンパク質 InaKCを融合した InaKC-fp1 は水溶液中で安定に存在し，部位特異的プロテアーゼにより InaKC を切断・除去することで本来の接着性が回復することが明らかとなっている。本研究では， fp1 が無機物から有機物まで様々な材料に結合する性質を利用してマイクロプラスチックとマグネタイトの複合体を形成させ，水溶液中のマイクロプラスチックの磁力による回収を検討した。
【実験】 InaKC と fp1 の間にプロテアーゼ認識サイトを導入した融合タンパク質
InaKC-fp1 を大腸菌で発現した後，精製・リフォールディングを行い，可溶性の InaKC-fp1 を得た。マイクロプラスチックのモデル材料としてポリスチレン
ビーズ（PS ビーズ，粒径 10 μm）を用いた。PS ビーズ，マグネタイト，InaKCfp1 を水溶液中で混合し，プロテアーゼで InaKC 部位を切断・除去することで複合体の形成を行った。反応後，分散液および得られた凝集体を光学顕微鏡および SEM で観察した。
【結果と考察】 白濁した PS ビーズの分散液にマグネタイトと InaKC-fp1 を添加（プロテアーゼ処理）し，攪拌することで凝集体が得られた。凝集体を磁石により回収し，光学顕微鏡と SEM で観察したところ， PS ビーズとマグネタイトの複合体が形成されていることが分かった。PS ビーズ分散液の濁度が凝集体除去
後には大きく減少しており，マグネタイトと fp1 により水溶液中のマイクロプ
ラスチックが効率的に除去できることが示された。

Photoresponsive cell-trapping and photodegradable hydrogel layers forimage-based single-cell sorting and analysis

Recovery of microplastics using mussel adhesive protein with controllable
adhesive property○Xueyang Li, Satoshi Yamaguchi, Akimitsu Okamoto(Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)

Key words

hydogel, cell recovery, single-cell analysis○Kazunori Nakashima, Anju Pilakka Veedu, Takahiro Sato, Chikara Takano,
Satoru Kawasaki(Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.)

Key words

protein aggregation, adhesion, bioremediation, wastewater treatment

207

2Np02

Development of a new surface display system on
Chlamydomonas reinhardtii for PET degradation

2Np04

生分解性バイオプラスチック LAHB 分解に伴う河川水細菌叢への影響○門屋 亨介 1, 曽我 瞳 1, 松田 美樹 1, 佐藤 道夫 2, 田口 精一 3
（1 椙山女学園大・生活科学, 2 明治大・農, 3 神戸大院・科技イノ
ベ）
rkadoya@sugiyama-u.ac.jp○Shen-Long Tsai(National Taiwan University of Science and Technology)
stsai@mail.ntust.edu.tw

The accumulation of plastic waste in the environment has led to significant
environmental problems, and there is a growing need for new and innovative solutions
to tackle this issue. One approach to this problem is using enzymes to break plastic into
smaller molecules. One possible way to achieve this is by displaying the enzymes on
the surface of microorganisms. In this study, we developed a surface display system on
Chlamydomonas reinhardtii, a unicellular green alga, for polyethylene terephthalate(PET) degradation. To expand the size span of displayed enzymes, we took advantageof the spy-catcher and spy-tag system, which allows for the covalent attachment oflarger proteins to the cell surface. The PETase and MHETase involved in PET
degradation could be functionally displayed on the surface of C. reinhardtii using the
spy-catcher and spy-tag system. The displayed enzymes could synergistically degrade
PET, demonstrating the potential of this system for PET biodegradation. This system
has several advantages. First, C. reinhardtii is a photosynthetic microorganism that canutilize light energy for growth and metabolism. This makes it a cost-effective andsustainable option for biodegradation. Second, C. reinhardtii has a cell wall that canprotect the displayed enzymes, increasing their stability and half-life. Third, the spycatcher and spy-tag system allows for the covalent attachment of larger enzymes,
expanding the range of enzymes displayed on the surface of C. reinhardtii.

プラスチックは手軽で耐久性に富み、安価に生産できる反面、多くは「使い捨て」されており、環境中に流出することもある。一度流出したプラスチックご
みは、やがてマイクロプラスチックとなる。本来自然界に存在しないマイクロ
プラスチックが生物の体内に取り込まれた結果、人間にも健康被害が出てくるのではないかと懸念されている。このような背景から環境中で微生物により分解され、最終的には水と二酸化炭素になる生分解性プラスチックが注目されている。
乳酸と 3HB のランダム共重合体である多元ポリ乳酸(LAHB)は、ポリ乳酸と同様に透明で柔軟化したバイオプラスチック素材である。しかしながら、水環境中での分解過程や環境細菌叢の変化、LAHB 分解細菌など、解明されていない部分は多い。生分解性プラスチックの実用化には、分解よる環境への影響や生分解機構の解明が重要である。
本研究では、水環境中における細菌叢の変化を指標に、LAHB の分解が水環境に及ぼす影響を解析した。異なる乳酸分率（19%と 69%）の LAHB を愛知県内の 2 ヶ所の河川水（河川 A、B）に浸漬し、分解過程を観察した結果、両河川
水で LAHB の分解が観察された。分解した LAHB の乳酸分率を測定し、河川水中での分解部位の予測したところ、河川 A では乳酸と 3HB の同時分解、河川
B では 3HB のみを分解している可能性が示された。両河川の細菌叢は、LAHB
分解時には河川 A と B では大きく異なっていた。河川 A では乳酸重合体と 3HB重合体の分解及び資化、河川 B では 3HB 重合体のみの分解及び資化に依存した細菌叢変化だと考えられた。Lefse 解析により LAHB 分解時に河川 A で特異的に増加した細菌が検出され、これらが乳酸重合体分解細菌であることが示唆された。本研究で得られた結果は、生分解性プラスチック利用における環境面の検討における重要な知見となる。

Development of a new surface display system on Chlamydomonas
reinhardtii for PET degradation

Effects of LAHB degradation in the water environment on bacterial
communities○Shen-Long Tsai(National Taiwan University of Science and Technology)○Ryosuke Kadoya1, Hitomi Soga1, Miki Matsuda1, Michio Sato2, Seiichi Taguchi3(1 Sch. Life Studies, Sugiyama Jogakuen Univ., 2 Sch. Agric., Meiji Univ., 3 Grad.
Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

Chlamydomonas reinhardtii, PET, biodegradation, protein interaction

Key words

biodegradable plastic, microbial community, water

2Np03

深海模擬環境でのバイオナイロン分解実験における圧力依存的微生物群集構造

2Np05

ハイスループットスクリーニング法を用いたポリマー分
解微生物の探索と評価○若井 暁 1, 塚谷 京 1, 磯部 紀之 1, 野牧 秀隆 1,
Asif Ali Mohammad 2, 金子 達雄 2
（1 海洋研究開発機構, 2 北陸先端大・マテリアル）
wakais@jamstec.go.jp○高屋 朋彰, 島田 健太, 田谷 明香, 西井 圭
（小山高専）
tkouya@oyama-ct.ac.jp

近年、深海を含む海洋環境でのプラスチックごみ問題が顕在化し、生分解可能なプラスチック材料の開発が進められている。しかしながら、物理化学的な環境が表層海水環境とは大きく異なる深海環境（低温・高静水圧）での生分解性についてはほとんど調べられていない。深海環境における分解試験法として、深海に評価部材を設置し、回収して重量減少から調べる方法があるが、膨大なコストがかかる上に、途中経過の観察が難しい。本研究では、深海模擬環境を実験室レベルで再現した加圧培養試験を実施し、微生物群集構造の変化を調べた。
海洋環境で生分解可能なことが明らかになっているポリアミド N6i と表層海水および海洋堆積物を加えて、0.1、10、20、30、40、50 MPa（深海 5000 m 相当）に加圧して、4℃で培養した。低温に対する比較として、0.1 および 50 MPa については、25℃でも培養した。試験終了後の海水および堆積物を回収し、それぞれから DNA を抽出して微生物群集構造解析を実施した。
培養開始から 6 カ月後、いずれの培養条件においてもポリアミド N6i は視認することができなくなるまで水溶化した。微生物群集構造解析の結果、圧力依存
的に微生物群集構造は異なっていた。これまでに分離しているポリアミド分解
微生物と同属の微生物（Marinobacter 属細菌、Sulfitobacter 属細菌、Shewanella属細菌）が、それぞれ 25℃・0.1 MPa、4℃・0.1 MPa、4℃・30 MPa で集積していた。これらはそれぞれの物理化学的条件を好むポリアミド分解微生物の特徴を反映していると考えられる。これまでに、深海環境でポリアミド分解微生物の報告はなく、この新しい発見は深海を含む全海洋環境でも生分解可能なポリ
アミド分子の開発に有益な知見となり得る。

【背景・目的】世界中でプラスチック製品の需要は年々高まっているが，環境に放出されたプラスチックゴミやマイクロプラスチックによる生態系への甚大な被害が問題視されている．我々は，ポリマー分解微生物を迅速に探索して分解性を評価するための手法として，多孔質ポリマー膜と完全合成寒天培地を組み合わせたハイスループットスクリーニング（HTS）法を開発した．本研究では，様々な脂肪族ポリエステルやポリオレフィンについて，ガラスろ紙を足場材料とした各種ポリマーのコーティングを検討した．さらに，HTS 法を用いた環境
中からのポリマー分解微生物の単離と同定，および分解性の評価を検討した．
【方法】ポリマーとしてポリブチレンサクシネートアジぺート（PBSA）や cis-1,
4-ポリイソプレン（PIP）等を用いた．溶媒に溶解させた各ポリマー溶液にガラスろ紙を浸漬してコーティング処理を行い，風乾による溶媒の除去を行った．
ポリマー分解性微生物の単離は，土壌，湖沼，河川，海洋から行った．微生物の同定は，16S rRNA 遺伝子配列により行った．HTS 法を用いた分解性の評価
は，殺菌・洗浄したポリマーコーティング済ガラスろ紙に菌体を播種し，完全合成寒天培地上で，好気条件で培養を行った．一定期間ごとにサンプリングを行い，乾燥操作後にクロロホルムを用いて抽出・濃縮操作を行い，GPC を用いて分子量分布を測定し、その分解能を評価した．
【結果】土壌より単離・同定した放線菌 Streptomyces sp. ONCT 10002 株を用いたHTS 法による分解性評価の結果，PBSA は培養 4 週間でほぼ分解できること，
また，PIP は培養 4～8 週間で部分的に低分子化できることが明らかとなった．
さらに湖沼や河川から，PBSA の分解性を有する候補株 5 菌株を単離することができ，特に NG6-2 株が分解性を有していることが示唆された．

Hydrostatic dependent microbial community structures in biodegradation
test under deep-sea mimic conditions

Isolation and characterization of polymer-degrading microorganisms byusing high-throughput screening method.

○Satoshi Wakai , Misato Tsukatani , Noriyuki Isobe , Hidetaka Nomaki ,Mohhammad Asif Ali2, Tatsuo Kaneko2(1 JAMSTEC, 2 Sch. Mater. Sci., JAIST)1

Key words

1

1

1

biodegradation, microbial community, deep-sea, marine environment○Tomoaki Kouya, Kenta Shimada, Haruka Taya, Kei Nishii(Oyama Natl. Coll. Technol.)Key words

biodegradation, polymer, actinomycetes

208

2Np06
学

Ralstonia sp. C16 株による低温環境における土壌中
PHB フィルムの分解に関する研究

2Np08

麹菌 Aspergillus oryzae による耐熱型 PET 分解酵素の発現○戸所 健彦 1, 伊出 健太郎 1, 佐貫 理佳子 2,3, 河野 恵美 2,
吉田 昭介 2, 石田 博樹 1
（1 月桂冠・総研, 2 奈良先端大・バイオ, 3 京工繊大・工芸科学）
todokoro@gekkeikan.co.jp○寺山 拓臣, 張 傛喆
（室工大院、環境創生工）
ychang@mmm.muroran-it.ac.jp[背景・目的] 生分解性プラスチックの一つであるポリヒドロキシ酪酸（PHB;または P(3HB)）は微生物によって生産され、石油由来プラスチックを代替できるポリマーである。活性汚泥や海洋より単離された PHB 分解菌は最適条件下において高い PHB 分解率を示すことが報告されている。一方、プラスチック汚染は
エベレストなどの高山においても報告されており、幅広い環境下における分解適用性の検討が必要となっている。しかし、実際の環境を模した土壌中における分解実験は少なく、低温環境、特に高山のような低温環境における検討例はほとんどない。そこで、本研究では低温域に属する山岳地域から単離された
Ralstonia sp. C16 株を使用し、低温条件での分解可能性および分解に必要な時間の検証を行った。
[方法] 国立公園での土壌試料採取が困難であったため、土壌試料は大学敷地内より採取したものを使用し、C16 株を添加した土壌（0.1 mL/g）を用いて土壌埋没法により PHB 分解能力を評価した。30℃及び 14℃の条件下において土壌
水分量 40～45％に保持し、暗所で培養した。培養期間は最大 40 日間として一定期間ごとに PHB フィルムを採取し、重量変化より生分解率を算出した。また、採取したフィルム表面の生菌数も同時に測定し、細菌数と真菌数の変化を記録した。
[結果] 30℃の条件下において C16 株を添加した土壌では 20 日間の培養でほぼ完全な PHB フィルムの分解が観察された。さらに 14℃の条件下では 40 日間の培養で PHB フィルムを約 50％分解し、フィルム表面では分解と連動する細菌
及び真菌の増加が確認された。以上より、高山から単離された C16 株の常温及び低温における分解能を確認することができた。よって、生活圏だけでなく、高山のような自然環境へ汚染が進んだ場合でも有用菌を利用することで PHB の分解が可能であることが明らかになった。

【背景・目的】Polyethylene terephthalate（PET）は石油を原料に製造され、ペットボトルや衣類などに汎用されている合成樹脂である。PET 廃棄物は環境汚染の原因となることから、より効率的なリサイクル方法の開発が望まれる。近年、PET を分解資化する細菌 Ideonella sakaiensis が単離され(1)、産生する菌体外 PET
分解酵素 PETase について精力的に研究がすすめられている。中でも FASTPETase は native な PETase の 5 アミノ酸置換であるが耐熱性・反応性が大きく向上すると報告されており、実用化に向けて期待が持たれる(2)。麹菌 Aspergillus
oryzae は伝統的発酵産業に古くより用いられてきた糸状菌であり、高い酵素生
産・分泌能力を有する。我々はこれまでに A. oryzae をホストに I. sakaiensis のnative な PETase について活性型酵素の発現に成功しており、本研究では FASTPETase を異種発現させ、麹菌の PET 分解への活用の可能性を検討した。
【方法・結果】我々は麹菌での異種発現のためのコドンを自動生成・採点するア
ルゴリズムをこれまでに構築しており、同手法により FAST-PETase のコドンを最適化した。さらにこの N 末端に菌体外排出シグナルを結合したものを sodM
プロモーター下で恒常発現するコンストラクトを A. oryzae OSI1013 leu-株へ導入し、FAST-PETase の菌体外分泌を確認した。また、麹菌による酵素発現では糖鎖付加が生じ酵素活性に悪影響する可能性があることから、Hypocrea jecorina
由来 endo-β-N-acetylglucosaminidase(3)も共発現することで FAST-PETase の糖鎖を減少させた。分泌された酵素は、固体 PET を分解する高い酵素活性をもつことが確認された。
1) Yoshida et al. Science 351.6278 (2016): 1196-1199.
2) Lu et al. Nature 604.7907 (2022): 662-667.
3) Li et al. Journal of bioscience and bioengineering 129.5 (2020): 573-580.

Degradation of PHB film in soil under low temperature environment by
Ralstonia sp. C16

Production of thermostalble PETase by Aspergillus oryzae○Takumi Terayama, Young Cheol Chang(Div. Sustain. Environ. Eng., Muroran Inst. Technol.)○Takehiko Todokoro1, Kentaro Ide1, Rikako Sanuki2,3, Emi Kawano2,
Shosuke Yoshida2, Hiroki Ishida1(1 Res. Inst., Gekkeikan Sake Co., Ltd., 2 Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST, 3 Sch. Sci.
Technol., Kyoto Inst. Technol.)Key words

PHB, degradation, soil, environmental bacteria

Key words

Aspergillus oryzae, PET, FAST-PETase

2Np07

酵母 Pseudozyma antarctica のエステラーゼ PaE による、畑に展張したポリブチレンアジペートテレフタレー
ト PBAT 配合生分解性プラスチック製農業用マルチフィ
ルムの分解加速2Np09

組換え水素細菌の pH-stat ジャー培養による CO2 からのP(3HB-co-3HHx)生産○北本 宏子 1, 小板橋 基夫 1, 山下 結香 1, 植田 浩一 1, 竹内 明彦 1,
渡部 貴志 1, 佐藤 俊 2, 雑賀 あずさ 2, 福岡 徳馬 2
（1 農研機構・農環研, 2 産総研・機能化学）
kitamoto@affrc.go.jp○田中 賢二 1, 折田 和泉 2, 福居 俊昭 2
（1 近大・産理工, 2 東工大・生命理工）
tanaka@fuk.kindai.ac.jp【背景と目的】野菜の生産に用いる被覆資材は、生分解性プラスチック製品（マルチ）を用いると、使用後に畑に鋤き込み分解処理ができる。耐久性が高い
PBAT を配合した製品は、使用後の分解が遅い。そこで、使用者が望むタイミ
ングで分解を促進する方法を開発する。
【方法】in-vitro で、精製 PaE 溶液を PBAT フィルム表面に滴下し、反応液中に溶出したオリゴマーを LC-MS、残存フィルムを GPC で分析した。PBAT フィル
ムと市販マルチを、PaE を含む培養ろ液（PaE 溶液）に浸漬後に秤量した。次に、畑に展張したマルチの表面に PaE 溶液を撒布処理し、翌日、フィルムの電子顕微鏡観察と引張強度測定を行い、土壌中に鋤き込んだ後に、目視でフィル
ム断片を回収し、洗浄・風乾後の総重量と電子画像を解析した。
【結果と考察】PBAT ポリマー鎖は、PaE によりランダムに分断され、ポリマーの数平均分子量が減少した。フィルムは、PaE 溶液に浸漬後に薄くなり、重量が減った。分解で生じる有機酸による反応抑制を防ぐ為には、粒径が小さい炭酸カルシウムの併用に効果があった。畑に展張したマルチは、PaE 溶液処理後翌日、用いた PaE 濃度が高いほど電顕下や目視で亀裂が観察された。引張強度が下がり、分解が確認された。鋤き込み後は、大きな断片が減り、断片内部に穴や亀裂が多く生じ、目につく断片の総重量が減った。この手法は、野外で用
いる農業用資材などのプラスチック製品や、生ごみに混入した食品包装材などを土に還す、循環型社会の形成へ資する。本研究は、農林水産省委託プロ「農食事業」25017A, 25017AB 及び生研支援センター「イノベーション創出強化研
究推進事 JPJ007097」で実施した。Kitamoto H. et al., Scientific Reports (2023)【背景・目的】 (R)-3-ヒドロキシブタン酸(3HB)と(R)-3-ヒドロキシヘキサン酸(3HHx)の共重合ポリエステル P(3HB-co-3HHx)は、柔軟性と加工性、海洋分解性に優れた微生物産生ポリエステルであり、（株）カネカによって植物油脂を原料とする商用生産も進んでいる。我々は、水素細菌 Cupuriavidus necator の遺伝
子組換え株が、従属栄養条件で安価な糖質から P(3HB-co-3HHx)を効率よく生合成し 1)、H2・O2・CO2 の混合ガスを基質とする化学合成独立栄養条件でも P(3HBco-3HHx)を蓄積することをフラスコ培養により明らかにしている 2）。今回、pHstat ジャー培養による P(3HB-co-3HHx)高濃度生産について報告する。
【方法・結果】 全容１ L 容のガラス製ジャー発酵槽と閉鎖循環式ガス発酵シス
テムを用いて、無機塩合成培地に上記混合ガスを通気し撹拌することにより組換え株４株を培養した。温度は 30℃とし、pH コントローラにより pH 7.0 付近に維持した。
いずれの組換え株も独立栄養条件下で良好に増殖し、CO2 から 3HHx モノマーに富む P(3HB-co-3HHx)をよく蓄積した。なかでも MF01/ pBPP-ccrMeJAc-emd 株が生合成した P(3HB-co-3HHx)は、ポリエステル物性上最も好ましいとされる
10mol%近い 3HHx 分率を示した。本株では、培養 205 時間で菌体濃度 61.4g/L、P(3HB-co-3HHx)濃度 51.5g/L が得られた。現在、通気撹拌効果の高い発酵槽を用いるとともに培地無機塩類の補充量と供給ガス組成を適正化することによって、培養時間の短縮と P(3HB-co-3HHx)濃度のさらなる向上を検討している。
1) Insomphun, C.,Fukui et al., Metab. Eng. 2015, 27, 38–45.
2) Tanaka, K. et al., Bioengineering 2021, 8(11), https://doi.org/10.3390/
bioengineering8110179.

Acceleration of degradation of polybutylene adipate-co-terephthalate PBAT
containing biodegradable plastic agricultural mulch film spread on field by
esterase from the yeast Pseudozyma antarctica PaE

Production of P(3HB-co-3HHx) from CO2 by pH-stat jar cultivation ofengineered hydrogen-oxidizing bacterium○Hiroko Kitamoto1, Motoo Koitabashi1, Yuka Yamashita1, Hirokazu Ueda1,
Akihiko Takeuchi1, Takashi Watanabe1, Shun Sato2, Azusa Saika2,
Tokuma Fukuoka2(1 NIAES, 2 AIST)
Key words
biodegradable plastic, esterase, Pseudozyma○Kenji Tanaka1, Izumi Orita2, Toshiaki Fukui2(1 Fac. Humanity-Oriented. Sci. Eng., Kindai Univ., 2 Sch. Life Sci. Technol, Tokyo
Tech)

Key words
Ralstonia eutropha, hydrogen-oxidizing bacteria,
polyhydroxyalkanoate, CO2 fixation

209

2Np10

下水とチーズホエーを使用した PHB の製造○張 傛喆（室工大院、環境創生工）
ychang@mmm.muroran-it.ac.jp

2Op02

熊本から分離した高温耐性出芽酵母のゲノム解析
浜口 愛勇生 2, 大寺 史織 1, 田口 久貴 1, ○笹野 佑 1（1 崇城大・生物生命, 2 崇城大院・工）sasano@bio.sojo-u.ac.jp[背景・目的] ポリヒドロキシ酪酸（PHB; P(3HB)）は、生体適合性材料として期待されている生分解性プラスチックの一種である。しかし PHB は生産コストが高いため実用に至っていない。一方処理前の下水は、衛生的な観点から、有用物質生産の資源として未だ利用されていない。 しかし衛生管理を徹底すれば、生下水を工業用水として活用することが可能になり、省エネやゼロエミッショ
ン、さらには持続可能な開発目標（SDGs）の達成に寄与できる。一方、生下水を使用した細菌（Bacillus sp. CYR1 株）による PHB 生産を試みたが、生産量が極めて少なかった。 したがって、生下水への炭素源の補充、低炭素含有生下水を用いた高濃度炭素含有チーズホエーの希釈、生下水の利用可能性を評価するための生下水の濃縮など、さまざまな戦略を適用し PHB 生産性を高めた。
[方法] 生下水のみを用いた場合、蒸留水に炭素源を添加した場合、生下水に炭素源を添加した場合の 3 パターンで培養を行い、PHB 生産性、有機物の消費量（生下水のみはタンパク質、炭素源を添加したものは糖の量）を比較した。また
培養は 96 時間行い、培養後の上澄み液を再度用いることで再利用可能性についても検討した。なお最初の 96 時間培養後の上澄み液を 1 次、次の 96 時間後を
2 次、最後の 96 時間培養後の上澄み液を 3 次とした。
[結果] 細菌の PHB 生産能力は、グルコース補給後 22 倍に強化された。炭素源を追加した条件における PHB 生産では、比較的高いグルコース消費率（83.6%）が確認でき、無機塩培地よりも下水含有培地を用いた条件の方が高かった。また、生下水で希釈したチーズホエーで培養した細菌は、蒸留水で希釈したチー
ズホエーで培養した細菌よりも高い PHB 産生能力を示した。これらの結果か
ら、CYR1 株は、低炭素および高濃度炭素含有廃水を使用した PHB の製造に有用であると考えられる。

バイオマスを原料にしたバイオエタノール生産において、前処理後の糖化と発酵の工程における至適温度に大きな差が存在することから、冷却コストの増大などの問題が生じている。また、食料と競合しないリグノセルロース系バイオマスに含まれる五炭糖も効率的に発酵する必要がある。これらの問題を解決するため、高温下においても六炭糖と五炭糖が同時に含まれる環境で効率的なエタノール発酵が行える酵母株の育種が求められている。
我々が熊本県熊本市の立田山の朽木に溜まった水から分離した酵母 AH465 株は42.5℃の高温でも旺盛に増殖し、2％グルコースから理論収率の 80％を超える
エタノールを生産することができる。AH465 株は rDNA 配列解析の結果、
Saccharomyces cerevisiae と同定された。本株のゲノム配列を決定するため、ONT
社 MinION 及び Illumina 社 MiSeq によるシーケンス解析を行い、ロングリードとショートリードを用いたハイブリッドアセンブリーにより最終的に BUSCO
値が 99.3％のドラフトゲノム配列が得られた。
本株はゲノム配列が解読されている株の中では S. cerevisiae YPS128 株と最も近縁であったが、YPS128 株は特に耐熱性であるという報告はない。AH465 株はYPS128 株と比較して 60 か所の構造変異が見られた。その内訳は欠失 30 か所,
挿入 13 か所, 重複 1 か所, 逆位 1 か所, 転移 15 か所であった。欠失および挿入の
多くは Ty エレメントに起因していたが、いくつかの機能未知の ORF を含む領域の挿入や欠失も見られた。現在、これらの領域の耐熱性への影響と、本株をバイオエタノール生産へ応用するため、嫌気条件でも効率的にキシロースを発酵可能な酵母 Spathaspora passalidarum のキシロース資化遺伝子(XYL1.1, XYL1.2,
XYL2.1, XYL2.2)を AH465 株に導入した株を育種し、高温条件下でのキシロース
からの効率的なエタノール生産が可能か検討している。

Production of PHB using sewage and cheese whey

Genome analysis of a thermotolerant budding yeast isolated in Kumamoto○Young Cheol Chang(Div. Sustain. Environ. Eng., Muroran Inst. Technol.)

Ayuki Hamaguchi2, Shiori Ohtera1, Hisataka Taguchi1, ○Yu Sasano1(1 Fac. Biotechnol. Life Sci., Sojo Univ., 2 Grad. Sch. Eng., Sojo Univ.)

Key words

PHA, biomass, Bacillus sp., PHB accumulation

Key words

yeast, Saccharomyces cerevisiae, genome, transcriptome

2Op01

アルコール生産を目的とした Clostridium 属細菌のスク
リーニング

2Op03

新奇 Spathaspora 属酵母によるペントース発酵

学○大土 光経, 鶴貝 龍聖, 中島 美咲, 三好 怜, 園部 裕也,
城代 隆貴, 志村 英則, 有谷 博文, 秦田 勇二（埼玉工大・工）hatada@sit.ac.jp

学○浜口 愛勇生, 田口 久貴, 笹野 佑
（崇城大院・工）sasano@bio.sojo-u.ac.jp【背景と目的】近年、地球温暖化への対策として SDGs・脱炭素社会への転換が求められており、その対策の一環として化石燃料に変わるバイオ燃料が注目されている。主なバイオ燃料としてバイオエタノールがよく知られているが、バイオブタノールはガソリン代替としてバイオエタノールよりもエネルギー密度が高く、蒸気圧が低く、水と混和しにくいという優れた特性を持ちあわせている。本実験では代表的なバイオブタノール生産菌として有名な Clostridium 属細菌を幅広く取得することを目的とした。従来の嫌気パウチや嫌気ジャーを使用したスクリーニングではバチルス菌などが多くとれ選択性が低いことが課題であった。そこで、新しく考案したスクリーニング方法を使用し実際に自然界から Clostridium 属細菌のスクリーニングを試み、取得された Clostridium 属細菌のアルコール生産性を評価した。
【方法と結果】今回、新しく考案した Clostridium 属細菌のスクリーニングによって 90 株の菌体を取得し、16SrRNA 遺伝子のダイレクトシークエンス解析を実施 し た 結 果 、 Clostridium 属 細 菌 近 縁 種 を 82 株 (Clostridium(66 株 ) ・
Paraclostridium(16 株))取得していることが明らかとなった。取得した Clostridium
属細菌を強化クロストリジウム培地にて培養を行いアルコールアッセイキット(CELL BIOLABS,INC.) によるアルコール生産の確認を行った。特に生産性の高かったサンプルを対象としたガスクロマトグラフィー分析を行い、アルコールの生産割合を調べた。更に、取得した Clostridium 属細菌のセルロース資化性についても確認を行っている。

食料と競合しないリグノセルロース系バイオマスには D-キシロース、L-アラビ
ノースなどのペントースが多く含まれている。バイオエタノール生産に用いられる Saccharomyces cerevisiae はペントースを発酵できないため、ペントースを効率的に発酵する酵母が求められている。Spathaspora 属酵母は、キシロースからの効率的なエタノール発酵が可能であり、主に南米で分離され約 20 種程度が記載されている。アジアでは中国から分離されているが日本国内からの報告は少ない。
今回、九州各地の木質系、昆虫サンプルから単離した酵母の中から、Spathaspora
属と思われる新種酵母 3 株（AH190, AH410, AH535)を単離した。これらの菌株
は rDNA（ITS 領域、D1/D2 領域）の相同性検索とゲノム解析により Spathaspora
属に近縁の新種であると判明した。系統解析の結果、アジア分離株とクラスターを形成していた。また、Spathaspora 属に特徴的な表現型である D-キシロース
発酵能を有し、S. passalidarum と比較してキシリトール生産能が 24 時間培養後に 6~7 倍程度高く、変換収率は約 30~37%であった。これらの 3 株はゲノム解
析 の 結 果 か ら 、 キ シ ロ ー ス 代 謝 酵 素 （ XR:Xylose Reductase 、 XDH:Xylitol
dehydrogenase）がそれぞれ１コピーずつ確認された。AH190 株は L-アラビノー
スを単一の炭素源として既知のアラビノース資化酵母 Candida arabinofermentans
よりも旺盛に生育し、著量のアラビトールを蓄積していた。現在、AH190 株の
XR が L-アラビノース代謝に関与するか検討中である。しかし、AH190 株は Lアラビトールを単一の炭素源として生育できず、ゲノム解析の結果からは既知のアラビノース資化遺伝子も確認できなかった。従って、アラビトール生産には XR が関与するが、L-アラビノースでの生育には未知の L-アラビノース資化遺伝子が関与することが示唆された。

Screening of Clostridium bacteria for Alcohol production

Pentose fermentation by novel yeast species belonging to Spathaspora clade○Hironobu Ootsuchi, Ryusei Tsurugai, Misaki Nakajima, Ren Miyoshi,
Yuya Sonobe, Ryuki Kinoshiro, Hidenori Shimura, Hirofumi Aritani, Yuji Hatada(Fac. Eng.,Saitama Inst. Technol)

Key words

butanol, Clostridium○Ayuki Hamaguchi, Hisataka Taguchi, Yu Sasano(Grad. Sch. Eng., Sojo Univ.)

Key words

yeast, xylose, Spathaspora sp., L-arabinose

210

2Op04

凝集性酵母との共培養によるキシリトール発酵の効率化○山脇 大輝, 東野 恭明, 熊田 陽一, 堀内 淳一（京工繊大院・工芸科学）
horiuchi@kit.ac.jp

2Op06
学

代謝改変 L. plantarum を用いた未利用バイオマスの同時糖化発酵による低コスト D-乳酸生産○久保 早友理 1, 熊田 陽一 1, 堀内 淳一 1, 岡野 憲司 2, 近藤 昭彦 3,
田中 勉 3（1 京工繊大院・工芸科学, 2 阪大院・工, 3 神戸大院・工）horiuchi@kit.ac.jp

背景及び目的当研究室では化学的還元法によるキシリトール生産とバイオマスを原料とした
発酵プロセスへの転換を進めている。これまで包括法により固定化したキシリ
トール生産酵母(Candida magnoliae)を用いた繰り返し回分培養による最大 120
g/L のキシリトール生産を報告しているが、菌体の固定化コスト及び固定化菌
体 の 安 定 性 に 課 題 が あ っ た 。 1) 本 研 究 で は 、 凝 集 性 酵 母 (Saccaromyces
cerevisiae)と C. magnoliae との共培養により、菌体の固定化を行わずにキシリ
トール生産酵母の再利用と高濃度化を可能とする共培養について検討を行った。
実験方法
微好気条件下でキシリトールを生産する酵母 Candida magnoliae (FERM P-16522)
及び凝集能を示す酵母 Saccaromyces cerevisiae (NBRC 1953) を使用した。2 L 容
エアリフトバイオリアクターを用いて、キシリトール生産培地 (キシロース 30
g/L、YNB1.7 g/L、尿素 2.27 g/L、カサミノ酸 1.0 g/L) を用い、温度 30 ℃、pH
7.0、通気量 0.33 vvm の条件で繰り返し回分培養を行った。
実験結果
S. cerevisiae(NBRC1953)は極めて強い凝集性を示したことから、共培養への適用が可能であると考えられた。そこで、両菌体を同時に植菌し培養を行たところ、
C. magnoliae 及び S. cerevisiae が十分に増殖せず、この方法では共培養は困難だと考えられた。そこで S. cerevisiae を十分に増殖させ、その後 C. magnoliae を植菌して、共培養を行ったところ、最大 11.0 g/L のキシリトール生産が確認され、共培養が可能であることが示唆された。キシリトール濃度を向上させるためには C. magnoliae の菌体濃度を高めることが重要であることから、C. magnoliae
を十分に増殖させた後、別途増殖させた S. cerevisiae を植菌することで共培養を行う方法を検討した。
参考文献
1) 姜林涛ら, 第 69 回日本生物工学会大会, 3P-F181 (2017)[背景・目的]未利用バイオマスを原料とした同時糖化発酵(SSF)による D -乳酸の低コスト生産を検討している。乳酸生産コストは、約 76％を MRS 培地成分、約 15％を糖化酵素が占めており、これらを削減できれば、乳酸生産の低コスト化が期待できた。そこで本研究では、コーンコブを用いた SSF による D-乳酸生
産における培地成分及び糖化酵素の添加量の検討を行い、乳酸生産の低コスト化を試みた。
[方法] 乳酸発酵には、神戸大学から提供を受けた代謝改変乳酸菌である
Lactobacillus plantarum NCIMB 8826 Δldhl1::PxylAB-xpk1::tkt-Δxpk2::PxylAB を用いた(1)。本菌株は、元株に新たにキシロース代謝経路を導入しており、グルコース及びキシロースから高濃度の D-乳酸を生産できる。バイオマスとして
コーンコブ(CC, 中国産)を使用した。コーンコブを 1.5 % H2SO4 により酸加水分
解し、コーンコブ酸加水分解物を得た。ジャーファーメンターに MRS 培地成
分を添加したコーンコブ酸加水分解物及びメイセラーゼを加えて SSF による D乳酸生産を行った。
[結果] MRS 培地成分の中でコストの約 96%を占める Peptone、Beef Extract 及びYeast Extract を削減した種々の条件で SSF を行った。その結果、Peptone 及びBeef Extract を無添加とし、Yeast Extract のみを 0.5 g/L 添加した条件でも最終的な乳酸濃度はほぼ同一となった。次に、メイセラーゼ添加量を検討したところ、従来の 0.05 g/g-CC から 0.02 g/g-CC まで削減してもほぼ同等の乳酸濃度が得られた。これらの検討により乳酸生産コストは約 78％低減でき、コーンコブを原料として用いる場合、培地成分及び糖化酵素添加量の大幅削減が可能であった。
今後は更なる低コスト化を進めるため、低コスト培地を用いた D-乳酸生産の高濃度化を検討する。
[参考文献] 1) Kenji Okano et al., Appl Microbiol Biotechnol (2017) 101:1869-1875

Efficient production of xylitol by co-cultivation of Candida magnoliae andflocculating yeast

Cost-effective production of D-lactic acid from lignocellulosic biomass by
simultaneous saccharification and fermentation using genetically engineered
lactic acid bacteria○Taiki Yamawaki, Yasuaki Higashino, Youichi Kumada, Junichi Horiuchi(Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)○Sayuri Kubo1, Yoichi Kumada1, Jun-ichi Horiuchi1, Kenji Okano2,
Akihiko Kondo3, Tsutomu Tanaka3(1 Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.,
3
Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)
Key words
D-lactic acid, corn cob, Lactobacillus plantarum, simultaneous
saccharification and fermentation

xylitol, flocculation, co-cultivation

Key words

2Op05

耐熱性酵素による海藻多糖 β-1,3-キシランの酵素糖化○梶 蒼依 1, 田中 咲衣 2, 石黒 早紀 2, 西山 千遥 1, 仲山 英樹 3,
原 清敬 4, 岡﨑 文美 1
（1 三重大院・生資, 2 三重大・生資, 3 長崎大院・水産環境, 4 静県
大・食栄）
okazaki@bio.mie-u.ac.jp

学

2Op07

糖化酵素生産菌 Talaromyces cellulolyticus における転写因子 Hap complex の遺伝子発現制御に関する解析○藤井 達也, 森田 友岳（産総研 機能化学）
tatsuya.fujii@aist.go.jp【背景・目的】β-1,3-キシランは、キシロースが β-1,3-結合した直鎖構造のホモポリマーであり、紅藻類および緑藻類の細胞壁にのみ存在する海藻特有の多糖である。β-1,3-キシラナーゼ（1,3-β-D-xylan xylanohydrolase; EC 3.2.1.32）および
β-1,3-キシロシダーゼ（1,3-β-D-xylan xylohydrolase; EC 3.2.1.72）は、β-1,3-キシランに特異的に作用し、キシロオリゴ糖およびキシロースを生ずる。我々はこれまでに超好熱性海洋細菌 Thermotoga neapolitana が耐熱性 β-1,3-キシラナー
ゼ（TnXyn26A）および β-1,3-キシロシダーゼ（TnXlo3A）を有することを明らかにした。本研究では、海藻未利用資源の有効利用を目的として、超好熱性海洋細菌由来の耐熱性酵素による海藻多糖 β-1,3-キシランの酵素糖化条件を検討した。
【方法・結果】 目的遺伝子を大腸菌により発現、精製し、組換え酵素 TnXyn26A
および TnXlo3A を得た。両酵素の反応至適温度は 85 ℃付近であり、高い耐熱性と触媒効率を示した。β-1,3-キシランに対して両酵素を種々の混合比率により同時に作用させ、遊離した還元糖を Somogyi-Nelson 法により定量した。その結
果、酵素量を 1:1 の比率で作用させた時に、生成される還元糖量が最大となった。酵素反応液を薄層クロマトグラフィーにより解析した結果、キシロースの生成が確認された。次いで、両酵素を緑藻クビレズタ（Caulerpa lentillifera）およびイチイズタ（Caulerpa taxifolia）の藻体に作用させたところ同様にキシロースが生成された。以上のことから、両酵素により海藻多糖 β-1,3-キシランの効
率的な酵素糖化が可能であると考えられた。今後、海藻未利用資源からの有用物質の発酵生産技術の開発を目指し、酵素糖化液を用いた好塩性細菌
Halomonas elongata の培養を試みる。

【背景】
バイオエコノミー社会の実現に向け原料確保は喫緊の課題であり、バイオマスを効率的に糖化する技術が求められている。我々は、バイオマスの糖化効率が高い酵素を生産可能な糸状菌 Talaromyces cellulolyticus を用い、本菌の糖化酵素
遺伝子の発現に関わる転写因子を複数同定してきた。本研究では、新たに転写因子 Hap complex の糖化酵素遺伝子の発現制御について検討した。
【結果・考察】本菌のエンドグルカナーゼ遺伝子のプロモーター領域に β-グルクロニダーゼ遺伝子を連結したレポーター解析を実施したところ、開始コドンから 612-812 bp
上流の 200 bp の領域が転写に重要なことが明らかとなった。この 200 bp の領域の遺伝子配列を解析した結果、他の糸状菌で Hap complex が認識すると報告がある配列 5’-CCAAT-3’を２箇所見出した。これらの結果から、本菌のエンドグ
ルカナーゼ遺伝子の転写に Hap complex が寄与している可能性が見出された。
Hap complex は、HapB/C/E の３つのサブユニットから構成され、１つでも欠けると機能を失うことが知られている。そこで、本菌の全ゲノム情報を参照し、他の糸状菌の HapB/C/E の各アミノ酸配列に相同性を示す遺伝子を検索したところ、有意に相同性を示す遺伝子をそれぞれ見出した。それらのうち、HapBに相同性を示した遺伝子（thaB）の遺伝子破壊株を作製し、セルロースを炭素源とした液体培地で培養した。得られた培養上清中の糖化酵素（FP アーゼ、βグルコシダーゼ、CMC アーゼ、キシラナーゼ）活性を測定したところ、すべて
コントロール株よりも低下していた。さらに、thaB 破壊株の各セルラーゼ・キ
シラナーゼ遺伝子の発現量を解析したところ、すべての遺伝子の発現量がコントロール株よりも低かった。以上の結果から、本菌の糖化酵素遺伝子の発現に、
Hap complex が寄与していることが明らかとなった。

Efficient enzymatic saccharification of the macroalgal polysaccharide
beta-1,3-xylan using thermostable enzymes

Transcriptional regulation of saccharification enzyme genes by Hap complex
in the fungus Talaromyces cellulolyticus○Aoi Kaji , Sae Tanaka , Saki Ishiguro , Chiharu Nishiyama , Hideki Nakayama ,Kiyotaka Hara4, Fumiyoshi Okazaki1(1 Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ., 2 Fac. Bioresour., Mie Univ., 3 Grad. Sch. Fish.
Sci. Environ. Stud., Nagasaki Univ., 4 Sch. Food Nutr. Sci., Univ. Shizuoka.)1

Key words

2

2

1

macroalga, beta-1, 3-xylan, thermostable enzyme, fermentation

3○Tatsuya Fujii, Tomotake Morita(RISC, AIST)

Key words
gene

cellulase, biomass, Talaromyces cellulolyticus, transcriptional regulator

211

2Op08

メディエーターの色の変化を指標にした大腸菌燃料電池の高出力化に適した変異株のスクリーニング○藤平 萌 1, 尾島 由紘 1, 駒 大輔 2, 大本 貴士 2, 東 雅之 1
（1 大阪公大院・工, 2 大阪技術研）
azuma@omu.ac.jp

2Op10
学

大腸菌における金属硫化物半導体形成能の強化と光駆
動水素生産への応用○山本 真帆 1, 篠原 優佳 1, 本田 裕樹 1, 渡邊 源規 2, 石原 達己 2,3,
藤井 浩 1（1 奈良女大・理, 2 九大・I2CNER, 3 九大院・工）honda@cc.nara-wu.ac.jp

微生物燃料電池（MFC）とは，生体触媒である微生物の代謝システムを利用し，有機物から電子を取り出し電極に伝達することで発電する装置である。再生可能なクリーンエネルギーを得る方法として注目されているが低出力が課題となっている。我々の研究室では大腸菌（E. coli BW25113）を生体触媒として用い，触媒の改変から出力の向上を目指している。これまでに電子を多量に生成させるために中央代謝関連遺伝子を 5 つ欠損させた 5 重欠損株（Δ5 株）を構築し，野生株と比較して著しい出力の増加を確認した【1】。その後,Δ5 株を基に遺伝子改変を行い更なる出力の向上を目指しているが，クーロン効率の改善は見られるものの大幅な出力の改善には至っていない。様々な変異株を対象として触媒評価を行うことが望まれるが，触媒評価において出力測定は煩雑で大規模なスクリーニングには適さない。そのため，本研究では簡便な触媒評価を可能とする評価系を確立しスクリーニングを実施した。大腸菌燃料電池にメディエーターとして用いているキノン系化合物（2-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノン）の電子授受に伴う色の変化（赤から無色へ）に着目した。菌体をメディエーター
溶液に加え色の変化を目視で経時的に観察した結果，Δ5 株と野生株では Δ5 株の変化が顕著であった。この 2 株を用いメディエーター濃度や観察時間などの条件を設定しスクリーニングを実施した。具体的には，野生株をエチルメタン
スルホン酸（EMS）で処理し突然変異誘発を誘発しコロニーを取得し，それらについて上記の色の変化を野生株と比較した。その結果，400 株の中から野生株に比べ色の変化の違いが明確だった 4 株を取得した。それら 4 株について出力測定を行ったところ WT と比較して 1.3~1.4 倍程度出力が向上していることが分かった。
【1】Ojima Y. et al., Bioproc Biosyst Eng, 43, 323 (2020).

【背景と目的】水素社会の実現に向け、化石燃料の消費に依存しない光を用いる
クリーンな水素生産法の開発に期待が寄せられている。演者らは、可視光応答性光触媒である硫化カドミウム（CdS）の光-化学エネルギー変換と、水素生成
酵素の物質生産を組み合わせた無機-生体ハイブリッド系を構築し、可視光駆動型水素生産を提案してきた[ChemBioChem, 21, 3389 – 3397 (2020).]。本講演では、大腸菌の CdS 形成能の遺伝子工学的な強化による光エネルギー変換能の向上と、その当該ハイブリッド系全体での光駆動水素生産能の向上への寄与について報告する。
【方法】Clostridium acetobutylicum NBRC 13948 由来[FeFe]-ヒドロゲナーゼ遺伝
子群を導入した組換え大腸菌を供試菌とした。これに加えてシステインデスル
フヒドラーゼ（DSH）遺伝子を大腸菌に導入し、菌体のスルフィド生成の促進により CdS 形成を強化した。菌体内外の Cd 量や CdS 形成時における菌体の吸収波長を、原子吸光と積分球を用いた紫外可視吸光測定で追跡した。CdS を形成した組換え大腸菌を回収し、ヒドロゲナーゼを生産させ、所定の条件下で光照射し水素生産量を測定した。
【結果と考察】原子吸光測定から、DSH 遺伝子を導入した菌体（DSH+）は、未導入の菌体（DSH－）と比較して、短時間で Cd が菌体へ移行することが確認された。また、菌体で CdS の形成がはじまってから可視光の吸収を示すまでの時間が短縮された。さらに、DSH+では DSH－よりも高濃度の Cd 存在下で CdSを形成した。光水素生産では、DSH+は DSH－ の 2 倍の水素生成量を示した。
DSH 遺伝子の導入により、形成した CdS の質が変化し、ハイブリッド系全体の光水素生産の向上に寄与することが明らかになった。
（本研究の一部は公益財団法人野田産業科学研究所の助成により実施した。）

Screening of mutant strains suitable for increasing the performance ofEscherichia coli fuel cell using mediator color change as an indicator

Enhancing cadmium sulfide semiconductor precipitation by Escherichia coli
and its application to the light-driven hydrogen production○Hajime Fujihira1, Yoshihiro Ojima1, Daisuke Koma2, Takashi Ohmoto2,
Masayuki Azuma1(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Metro. Univ., 2 ORIST)

Key words

microbial fuel cell, Escherichia coli, mediator

2Op09

硫酸還元細菌 Cupidesulfovibrio sp. HK-II 株における新規 PilA と cytochromes を介した細胞外電子伝達機構○川島 京介 1, 窪野 一郎 1, 池内 元太 2, 二又 裕之 1,3,4（1 静大院・総合科技, 2 静大・工, 3 静大・創科技院, 4 静大・グ
リーン科技研）futamata.hiroyuki@shizuoka.ac.jp

硫酸還元細菌（Sulfate reducing bacteria: SRB）は嫌気環境下の代表的な微生物であり、地球上の炭素・硫黄循環に寄与する一方、金属腐食の原因微生物でもある。そのため、SRB の代謝の理解・制御は工学的・生態学的に重要である。これまでに我々は、汽水湖底泥より硫酸還元細菌 Cupidesulfovibrio sp. HK-II 株を分離し、細胞外電子伝達（Extracellular electron transfer: EET）能を有することを見出した。EET 研究のモデル微生物である Geobacter や Shewanella では、外膜
シトクロムや導電性 pili による EET 機構が報告されている一方、SRB における
EET 機構の詳細はいまだ不明である。そこで本研究では、HK-II 株を SRB のモ
デル微生物と捉え、本株の EET 機構解明を目的として、EET 関連遺伝子およびタンパク質の解析を行った。
硫酸還元および EET 条件下で培養した菌体から RNA 抽出し、RNAseq 解析を行った結果、遺伝子転写が大きく異なっていた。特に、硫酸還元条件に対しEET 条件時に 3 コピー存在する pilA 全てが極高転写されていた。HK-II 株のPilA の導電性をアミノ酸配列に基づき評価した結果、導電性は予測されなかった。また、AlphaFold2 によるタンパク質構造予測では、Geobacter sulfurreducensの線毛を構成する PilA-N および PilA-C のうち PilA-C に該当するような構造はなかったが、PilA-N とは構造が類似していた。一方で、局在位置が不明の
RVX_R28140 および RVX_R03310 の両シトクロムが高転写されていた。HK-II
株を細胞質・ペリプラズム、内膜および外膜に分画し、非還元型 SDS-PAGE
後、ヘムタンパク質に特異的な TMB 染色したところ EET 条件でのみ外膜画分にヘムタンパク質発現が確認された。以上の結果から、HK-II 株は PilA による
シトクロム分泌機構により RVX_R28140 および RVX_R03310 等のシトクロムを外膜に分泌し、EET を行っている可能性が示唆された。

Extracellular electron transfer mechanism of sulfate-reducer
Cupidesulfovibrio sp. strain HK-II via novel PilA and cytochromes○Kyosuke Kawashima1, Ichio Kubono1, Genta Ikeuchi2, Hiroyuki Futamata1,3,4(1 Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2 Fac. Eng. Shizuoka Univ.,
3
Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 4 Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka
Univ.)

Key words
extracellular electron transfer, microbial fuel cell, RNAseq, sulfate
reducing bacteria○Maho Yamamoto1, Yuka Shinohara1, Yuki Honda1, Motonori Watanabe2,
Tatsumi Ishihara2,3, Hiroshi Fujii1(1 Fac. Sci., Nara Women's Univ., 2 I2CNER, Kyushu Univ., 3 Grad. Sch. Eng.,
Kyushu Univ.)

Key words

cadmium sulfide, hydrogen production, hydrogenase, photocatalyst

9 月 5 日（火）シンポジウム（9:00 〜 11:00/13:00 〜 15:00）
高分子医薬品モダリティーの創薬と製剤を加速する未踏分析技術へのグローバルな挑戦
3S-Aa01〜05
p. 215
セルインダストリー発展に向けた細胞製造工学の進化〜世界をリードする細胞製造を目指して〜

3S-Ba01〜06

p. 217

データ駆動型研究が導く未培養微生物 （微生物ダークマター） の開拓と展望
3S-Ea01〜04

p. 220

リグニンの利用に向けたホワイトバイオテクノロジーの潮流

3S-Fa01〜04

p. 222酵母という生き物〜生態学的ふるまいとその多様性の理解に向けて

3S-Ha01〜06

p. 226INTPART-MISC 国際ジョイントシンポジウム【INTPART-MISC 共催 ・ 国際シンポジウム】

3S-Ja01〜03

p. 2293S-Jp01〜04

p. 2303S-Ka01〜05

p. 2323Ap01〜16, 3Bp01〜16

p. 235タンパク質工学／抗体工学

3Cp01〜16

p. 243

セル＆ティッシュエンジニアリング／生体医用工学

3Dp01〜16

p. 247

醸造学，醸造工学／食品科学，食品工学

3Fp01〜16

p. 251

食品科学，食品工学

3Gp01〜16

p. 255

発酵生理学，発酵工学／オミクス解析／代謝工学

3Hp01〜16

p. 259有機化学，高分子化学／生合成，天然物化学

3Ip01〜13

p. 263遺伝子工学

3Kp01〜14

p. 266

3Lp01〜16, 3Mp01〜16

p. 269無細胞タンパク質合成系の新展開：ラボからインダストリーへ

一般講演（13:00 〜 16:36）
酵素学，酵素工学／タンパク質工学

生物化学工学／培養工学／バイオプロセス

環境浄化，修復，保全技術／環境工学，廃水処理技術／バイオマス，資源，エネルギー工学
3Np01〜16
p. 277
バイオマス，資源，エネルギー工学

3Op01〜11

p. 281

3

215

3S-Aa01

バイオテクノロジーを駆使して製造されるバイオ医薬品
やウイルスベクターの分析における現状と展望

3S-Aa02○内山 進（阪大院・工）suchi@bio.eng.osaka-u.ac.jp

CD を中心とした分光分析技術によるタンパク質分析○大山 泰史, 鈴木 仁子, 山根 愛, 赤尾 賢一（日本分光）
taiji.oyama@jasco.co.jp

抗体医薬品に代表されるように、バイオテクノロジーを利用して製造された組換えタンパク質やウイルスの医薬品としての利用が拡大しており、今後も増加することが見込まれている。こうしたバイオ医薬品など生体高分子製剤の実用化において鍵となるのは製造技術であり、さらに、有効性や安全性の担保のためには、品質分析と品質管理が重要であることは広く認識されつつある。20 年以上の実績がある抗体医薬品では、品質分析や品質管理の手法は装置開発を含
め成熟しつつあり、さらに、比較的早期の創薬時点から製造を見据えた研究開発を行うことで有望な医薬品の開発を実現できる状況にあり、残る課題は実利
用場面を十分に考慮した製剤化やコールドチェーンに頼らない製剤開発、などに限られつつある。一方、組換えウイルスであるウイルスベクターの医薬品としての利用は遺伝子治療の分野を中心に近年になり本格化されつつある分野で、
現在、欧米を中心に盛んに開発および臨床試験が進められ、すでに複数の製品が認可されている。通常、ウイルスベクターの製造は動物細胞を用いて行われるが、抗体などの組換えタンパク質製剤と比べ製造量が非常に限られ、アップストリームからダウンストリームに至るまで大幅な改善の必要がある研究開発
項目が数多く残されている。ただし、そういった状況でもベストプラクティス
での製造による実用化が欧米では盛んに推進されており、ウイルスベクターの品質分析や品質管理については、抗体医薬品で開発された手法の転用と最適化、
さらに、ウイルスベクター専用の手法開発が同時平行的に進められている状況
で、技術の進歩が著しい。
本講演では、まず、抗体医薬品における課題である輸送や保管中の凝集について、特に演者らが取り組んできたプレフィルドシリンジなどの保管容器を考慮した研究例を中心に現状と展望を述べる。ウイルスベクターについては、現時点で必要とされている品質分析および品質管理の紹介、規制との関係、さらに、将来展望について、2017 年頃から演者らが取り組んできた研究開発の成果を紹介しながら、述べる予定である。

抗体医薬品は、その高い治療効果と少ない副作用により、1986 年に MuromonabCD3 が初めて承認されて以来、数十年で飛躍的にその市場を拡大している。さらに、バイオ後続品の開発・上市が加速することで、大きな市場を形成することが予想されている。抗体は、複雑な非共有結合の積み重ねによって高次構造(HOS: Higher-order structure) を形成し、機能を発現する。そのため、熱などの外部刺激による HOS 変化は、薬効の低下を招くのみならず、免疫原性の原因となりうる凝集体形成を導く可能性がある。抗体医薬品の品質・安全性を保つ上でHOS は極めて重要な物理化学的特性の一つである。
X 線結晶構造解析等の手法に対して、円二色性（CD）分光法を中心とした分光法は、高解像度にタンパク質の構造を決定することはできないが、タンパク質の HOS に関する情報を迅速、非破壊かつ熱などの摂動を与えた状態で取得できる。そのため、これらの手法は抗体医薬品の研究開発から品質管理において強力なツールとなる。特に医薬品規制調和国際会議（The International Council for
Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use: ICH）
Q6B では、CD 分光法をバイオ医薬品の物理化学的特性評価法の一つとして推奨しており、CD 分光法の抗体医薬品への適用は加速している。分光法においては、スペクトルに HOS の情報が含まれるため、スペクトルからどのように
HOS の情報を取り出すかが重要となる。本シンポジウムでは、長らく取り組まれてきた以下の 4 つの課題に対する最新のソリューションを報告する。
抗体医薬品の二次構造推定精度の向上
遠紫外 CD スペクトルからタンパク質の二次構造の比率を推定する統計的手法
や機械学習を用いたアルゴリズムが開発されてきたが、抗体医薬品をはじめとする β-sheet を豊富に含むタンパク質の解析精度に課題があった。2015 年、J.
Kardos、A. Micsonai らが中心となり、β-strands 間のねじれに由来する CD スペ
クトルを見出し、β-strands 間のねじれを考慮して二次構造推定を行えるアルゴ
リズム BeStSel を開発した。1-5) BeStSel は β-sheet に富むタンパク質を含む幅広いタンパク質に対して高い推定精度を持ち、8 種類の二次構造情報を取得できる特長を持つ。ここでは、BeStSel を利用した抗体医薬品の詳細な構造解析結果を報告する。
統計検定を利用したスペクトルの同一性の評価
スペクトルの同一性の評価は、長らくスペクトルを目視することで判断が行われてきた。一方で、ICH Q5E では抗体医薬品の品質に関するガイドラインとして、製造工程変更前後での HOS の同等性／同質性を客観的に評価することが示されており、客観的な同一性評価法の確立が求められている。我々はこれらの要求に応えるために、統計検定を用いてスペクトル同一性を評価できるソフト
ウェア qHOS を開発した。6) ここでは、先行バイオ医薬品に対するバイオ後続品の同一性や、強制分解試験によるスペクトルの僅かな変化を、qHOS を用いて評価した結果を報告する。
HOS のオーソゴナルアセスメント
バイオ後続品の特性評価において物理化学的特性の評価が重要視されている。
特に一つの重要品質特性（CQA）に対して、原理が異なる二つ以上の分析手法を適用するオーソゴナルアセスメントが推奨されている。7) ここでは、先行バ
イオ医薬品に対するバイオ後続品の HOS の同一性を、遠紫外 CD 分光法、近紫外 CD 分光法、フーリエ変換赤外分光法（FT-IR）、Raman 分光法を用いて網羅的に評価した結果を報告する。
製剤化された抗体医薬品の二次構造評価
CD 分光法は、低濃度のタンパク質を測定できる利点があるが、抗体医薬品の多くは 10 mg/mL 以上の高濃度で製剤化される。高濃度条件下では、抗体分子は希釈条件下とは異なる分子間相互作用や HOS の変化を引き起こす可能性がある。8) これらの HOS 変化は、免疫原性を引き起こす凝集体の形成につながるた
め、CD 分光法を用いた高濃度の抗体の測定法の開発が望まれている。ここでは、上市されている抗体医薬品に対して CD 分光法を持いて二次構造解析を実施した結果を報告する。
1) A. Micsonai, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 112, E3095 (2015).
2) A. Micsonai, et al., Nucleic Acids Res., 46, W315 (2018).
3) A. Micsonai, et al., Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 2199, 175 (2021).
4) A. Micsonai, et al., Front. Mol. Biosci., 9 (2022).
5) A. Micsonai, et al., Nucleic Acids Res., 50, W90 (2022).
6) T. Oyama, et al., Appl Spectrosc., 76(12), 1482 (2022).
7) N. Nupur, et al., Front. Bioeng. Biotechnol.,10 (2022).
8) S. Uchiyama, YAKUGAKU ZASSHI, 136(3), 443-448 (2016).

Current status and perspectives of analytics for biopharmaceuticals andvirus vectors

Protein structure analysis by spectroscopic techniques○Uchiyama Susumu(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

antibody, virus, vector, quality control○Taiji Oyama, Satoko Suzuki, Ai Yamane, Ken-ichi Akao
(JASCO Corp.)

Key words

antibody, protein, structural analysis, stability

216

3S-Aa03

組換え抗体生産アップストリームプロセスの課題と今後○鬼塚 正義（徳島大院・社会産理工）
onitsuka@tokushima-u.ac.jp

3S-Aa04

分光技術を用いた生体分子の分析とプロセスモニタリング○若林 慧（堀場製作所）
satoru.wakabayashi@horiba.com

抗体など複雑な分子構造を有するタンパク質医薬品は、動物細胞を用いた組換
えタンパク質として生産されている。医薬品として最も重要視される品質は生産細胞株の特性にも依存するがより重要な点は、生産培養（アップストリームプロセス）のプロセス一貫性やコントロール戦略である。生産されるタンパク質医薬品の品質特性は生産培養の条件に大きく依存するため、優れた品質を備えた医薬品を生産するためにはプロセス開発ならびに制御が必要である。プロ
セスでタンパク質医薬品を創り込む目的から、Quality by Design の概念に基づいた取り組みが活発に行われているが、アップストリームプロセスの特性上、解決すべき課題も多い。プロセス開発と制御の点から「何を測定し、何を制御する必要があるのか」という点から話題提供をするために、本発表ではアカデ
ミアでの研究例として、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を用いた抗体生産のバイオプロセス研究を報告する。具体的には、下記 3 点の研究をトピッ
クス形式で報告する予定である。
１．インラインセンサを使用したリアルタイムモニタリング：BR1000 アドバ
ンストコントロールバイオリアクターシステムを使用し、高性能 CHO 細胞のFed-batch 培養を実施した。本システムは赤外分光測定ならび誘電分光測定が可能なインライン計測システムを内包しており、グルコース/乳酸濃度、生細胞密度のリアルタイム予測が可能である。オフライン計測値と良い一致を示す項目もある一方で、生産細胞の特性に基づく計測上の課題なども明らかになった。
２．バイオプロセスで発生する非天然構造抗体の検出と分子特性：凝集体などの非天然構造抗体は、抗体品質劣化を引き起こす原因となりうる。我々は化学発光測定により、CHO 細胞内部から非天然構造抗体が分泌される現象を見出し、非天然構造抗体が通常の天然型構造抗体の品質を劣化させることを確認した。また非天然構造抗体は天然構造と大きく異なるミスフォールディング構造を形成していた。
３．Perfusion 培養を利用した培養条件の探索：Perfusion 培養（灌流培養）は培
地交換により培養条件や細胞数の制御が可能であり、生産抗体の品質が安定することが報告されている。安定した培養条件を維持できるという Perfusion 培養の特性を利用して、組換え CHO 細胞の培養条件を変動させ、生産される抗体の重要品質特性（N 型糖鎖構造・凝集化抗体）の変化を解析した。

バイオ医薬品の生産には哺乳類細胞をはじめとするタンパク質発現系が用いられ、製造プロセスの変動が医薬品の最終品質に大きな影響を及ぼす。そのため、「事前の目標設定に始まり、製品および工程の理解ならびに工程管理に重点をおいた、立証された化学および品質リスクマネジメントに基づく体系的な開発手法」と定義される Quality by Design に基づく開発が主流となっている。このような背景から、研究開発段階における物性評価から、製造工程における重要品
質特性のモニター、原料や最終産物の品質管理に至るまで、非破壊、非接触を特長とする各種分光法の活用が期待されている。本発表ではバイオ医薬品や関連試料の分析に用いられる分光法として、ラマン分光法と蛍光分光法の一種である吸光-透過励起蛍光マトリクス(Absorption Transmission Excitation Emission
Matrix; A-TEEMTM)測定法について取り上げ、当社で行った分析事例を紹介する。
光が物質に入射した際、物質との相互作用により 2 次波が放出される現象を散乱と呼ぶ。2 次波のうち、入射光と異なる波長をもつものをラマン散乱光と呼ぶ。ラマン散乱光の波長は、物質が持つ分子振動のエネルギー分だけ励起波長からシフトするため、分光器を用いて検出し、得られたスペクトルを読み取ることで、物質の化学組成に関する情報を取得できる。
ラマン分光法は(1)装置構成の自由度が高く、試料や実験系にあわせた光学系を構築可能であること、(2)他の振動分光法と比べて水の干渉影響を受けにくいこと、(3)吸収分光法では測定困難な高濃度試料の In-Situ 分析が可能であること、(4)多変量解析と組み合わせることで混合試料中成分の定量分析が可能であることといった特長を有し、過去 20 年以上にわたってバイオ医薬品やバイオプロセスに関連する様々な分析に適用されてきた。本発表ではラマン分光法の強みを生かした分析事例として、グルコースをはじめとする培地成分の定量分析を行った事例と、高濃度抗体製剤の安定性評価を行った事例について紹介する。
分子が光子を吸収するとその電子励起状態が引き上げられ、基底状態に戻る際に入射光よりも長波長の光子を放出することがあり、この現象を蛍光と呼ぶ。
蛍光発光を観測できる分子は限られるものの、ラマンをはじめとする振動分光
法では検出が難しい濃度帯（ng/mL~μg/mL オーダー）の試料も検出可能であることを強みとする。
A-TEEM 分光法とは、試料の吸光度、透過率、蛍光励起発光マトリクス(EEM)を同時に取得する方法であり、複数の蛍光物質が共存する試料から全ての蛍光発光プロファイルを短時間で取得できる。蛍光発光スペクトル測定や EEM 測定において、試料濃度が高い場合、励起光もしくは蛍光発光が試料中分子によって吸収され、最終的なスペクトル形状にゆがみが生じ、定量性に影響がでることが課題となる。一方、A-TEEM 分光法では同時に測定する吸光度を用いてゆがみの補正が可能であるため、それを用いることで広い濃度範囲で正確な定量分析が可能となる。
バイオ医薬品やバイオプロセスに関連する試料はタンパク質、遊離芳香族アミノ酸、ビタミン類、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸といった蛍光物質の混合物であるものが殆どで、A-TEEM 分光法に適している。また、ラマン分光法同様、多変量解析と組み合わせることで、混合試料中蛍光成分の定量や、混合試料の状態判別が可能である。こういった特性から、液体混合試料の品質管理・品質保証への応用も期待されており、本発表では A-TEEM 分光法を使用した培地やバイオ医薬品の状態判別を行った事例を紹介する。
今回紹介するラマン分光法と A-TEEM 分光法は相互補完的な分析手法といえ、それぞれを適切に使い分ける、あるいは併用することで、バイオ医薬品のより多角的な評価の実現が期待できる。

Challenges and Future in the upstream process of recombinant antibody
production

Analytical and process solutions for biologics using spectroscopic
technologies

Key words
Chinese hamster ovary cell, recombinant protein production,bioreactor, protein folding

Key words○Onitsuka Masayoshi(Grad. Sch. Biosci. Bioind, Tokushima Univ.)○Satoru Wakabayashi(HORIBA, Ltd.)

biologics, spectroscopy, process analytical technology

217

3S-Aa05

MAXS 法で観察する抗体のコンフォメーションから考えられる構造と機能の関係

3S-Ba01○松本 崇 1, 佐藤 瑛美 2, 亀山 良貴 2, 小薗 拓馬 2, 殿塚 隆史 2,
佐藤 孝 1, 長谷川 智一 1, 神田 浩幸 1, 西河 淳 2（1 リガク, 2 農工大）
t-matumo@rigaku.co.jp

細胞製造工学の産業化から学問体系の構築に向けて○宮本 義孝（国立成育医療研究センター）
miyamoto-ys@ncchd.go.jp

高分子医薬品は、遺伝子組換え技術や細胞培養技術を用いて製造された、酵素、抗体等を有効成分とする医薬品であり、その市場は年々拡大を続けている。現在、この高分子医薬品の主流をなす抗体医薬品は、ガン、自己免疫疾患、血液疾患等の特定の作用点に対してピンポイントで結合し作用を発揮できる事から、より限られた副作用で高い治療効果を発揮する。また複数ターゲットを対象とし た 高 度 な 機 能 を 持 た せ る 事 も 可 能 で あ る た め 、 様 々 な 新 し い Mode ofaction(MOA)に基づくユニークな抗体薬が次々と開発・上市されている。このよ
うに、抗体医薬品は多くの有用性をもつ反面、動物培養細胞を用いて生産されるため、開発・生産コストがかさみ、また糖鎖が付加した複雑な高次構造を有する事から、製造した抗体医薬品の formulation や品質管理は容易ではないとい
う難しさがある。
一般に医薬品開発における薬剤の設計及び最適化にはターゲット分子、薬剤分
子双方の立体構造情報が大きな役割を果たす。これらの高次構造情報を得るための手法として、単結晶 X 線構造解析や低温電子顕微鏡を用いた単粒子解析が多く用いられているが、いずれの手法も高分解能での構造情報が得られる反面、原理的な制限が存在する。それは、観察される結果が、結晶のパッキングの影響を受けた構造であったり、凍結条件下にあるスナップショットの重合わせであったりし、観察された構造が実際に機能している溶液中の動きのある状態を反映しているとは限らないという点である。
特に、抗体分子は Fab 領域と Fc 領域が柔軟な hinge 領域で連結された構造を持つため、結晶化は極めて困難であり、また顕微鏡観察においても単粒子解析は適応できない為、分解能が限られるトモグラフィー法を利用する必要がある。
このような背景のため、Protein Data Bank (PDB) に登録されている抗体分子全長の構造は極めて限定されており、そのほぼ全てが Fab や Fc といった各領域の断片構造である。すなわち、これまでの知見において、実際に機能する全長の抗体分子としての重要な特性が見過ごされている可能性がある。
さらに重要な点は、いずれの観察手法においても観察に供するための条件が極めて限定的で、観察の為の観察条件を設定する必要があるということである。
言うまでもなく、高分子医薬品は、機能と深く関連する複雑な高次構造を有するため、製造過程の違い、環境要件、formulation や、試料溶液の取扱い方法に
よって大きく性質や安定性が変化するが、この変化の要因となる高次構造の違い・変化を直接知る事ができないという限界である。
ここで、各種溶液中の目的分子の直接観察が可能となれば、先のような様々な条件における生体分子の構造の違いやコンフォメーション変化を迅速に条件と関連づけて知ることが可能となり、抗体医薬品をはじめとした高分子医薬品の開発・製造工程にかかる時間的・経済的コストを削減できる可能性があるだけ
でなく、溶液条件における構造変化を織り込んだ MOA や ADME/PK 設計など、新たな展開が可能になると考えられる。
これまで、溶液中の高分子構造情報を解析する手法として X 線小角散乱：small
angle X-ray scattering (SAXS)が利用されており、分子サイズの変化や凝集の存在、およびおおよその分子形状といった構造情報を得ることができる。しかし、
SAXS 解析で使用する小角領域の情報は、測定データの分解能が限られていることから、分子の詳細な挙動やコンフォメーション変化といった解析を実施す
るには不十分な場合が多い。
ところで、同じ X 線溶液散乱においても、さらに高い分解能情報を含む中角領
域［q = 0.30〜0.75 Å -1］には分子内のドメイン間相関や二次構造間距離といった重要な情報が含まれる。残念なことに、この領域における散乱は、強度が極めて弱く信頼度の高い測定・解析を行う事は困難であり、これまで積極的に利用される事はほとんどなかった。
我々は、これらの情報を用いる事でより詳細な分子の挙動やコンフォメーショ
ン変化の観察が可能となるとの考えを礎として、これら中角領域までを含む散乱を、X 線中角散乱：middle angle X-ray scattering (MAXS)と呼ぶこととし、この中角領域の測定に焦点を当てた装置や解析方法の開発を行っている。
本発表では、マウスモノクロナール抗体の隔日スケールの経時変化に伴う構造変化について、現在開発中の新しい溶液散乱装置を利用した溶液中の分子動態を直接観察できる手法により得た結果に関して議論する。今回、溶液中での経時的構造特性を追う事により、発現されたマウスモノクロナール抗体は、時間を追って刻一刻と立体的特徴が変化することを見出した。この得られた新しい
知見：経時的構造変化、に合わせて、その構造変化から考えられる抗体を介したシグナル伝達ついて紹介したい。

再生医療、細胞医療と遺伝子治療の社会実装と産業化を促進する上で、基盤となる医療技術が「細胞の生産・製造」である。大量の細胞を製造する工程は非常に複雑で、その品質を管理することは難しい。近年、産学官の連携が活性化
し、産業競争力が強化されると共に、細胞製造の実践が深まり、新たに「細胞製造性（Cell Manufacturability）」という学問体系が構築された。本シンポジム
では、「細胞製造工学」の産業化から学問体系の構築に向けての先端的な取り組みを紹介する。

Structure-function relationship based on the conformation of IgG observedby MAXS method.

Establishment of the Academic System for Cell Manufacturing

Key words
middle angle X-ray scattering, dynamic conformation, structurefunction relationshipKey words
technology○Matsumoto Takashi1, Sato Akimi2, Kameyama Yoshitaka2, Kozono Takuma2,
Tonozuka Takashi2, Sato Takashi1, Hasegawa Tomokazu1, Kanda Hiroyuki1,
Nishikawa Atsushi2(1 Rigaku Corporation, 2 Tokyo Univ. Agric. Technol.)○Yoshitaka Miyamoto(National Center for Child Health and Development)

cell manufacturing, industrialization, regenerative therapy, medical

218

3S-Ba02

再生医療に資する細胞製造性を基盤とした製造システムの構築

3S-Ba03

臨床用自家 iPS 細胞の製造 〜閉鎖型自動培養装置を用いたチャレンジ〜○塚原 正義（京大iPS財団）
masayoshi.tsukahara@cira-foundation.or.jp○紀ノ岡 正博 1,2（1 阪大院・工・生物工学, 2 阪大院・工・細胞製造コトづくり拠点）
kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp

再生医療や細胞治療は，製造された細胞を治療に用いるため，医学・薬学・生物学分野だけでなく，製造に資する工学分野も含めた学際的な協力により成り立つ．移植に使用する細胞の製造研究では，工程と品質の向上を目指した工程開発が必要となる．その際，従来の医薬品製造とは異なり細胞製品は，品質が不明確であり，さらに，分離精製工程の導入が困難である場合が多く，あらか
じめ示した品質指標に対してもばらつきが多い．よって，製品品質の安定を導くための工程の安定化研究も重要となる．これらの理由により，製造の機械化・
スケールアップなどの障害となっており，よって，変動要因を区別し，システ
ムの変動要因を解析する，細胞製造固有のプロセス構築法を体系化することが製造の安定性を生み，結果として，製品の品質安定につながるものと考えている．
一般的に製品の製造設計では，製造技術の基本概念として，製造における種々の変動を考慮することによる設計の容易性である「製造性」の設計が重要である．これに対し，細胞加工製品では，細胞の同定が困難であることや，生きた細胞が系内で勝手に乱れることにより，製造性の設計において細胞を製品として取り扱う，固有の製造性を加える必要がある．このような生きた細胞を製品とする製造（細胞製造）における製造性は，工程設計における製品品質の実現において不可欠な要素である．私たちは，細胞を利用する製造に対しての製造性，「細胞製造性」を提案し，「生物学的見地と工学的見地を理解し橋渡しした工程による，細胞の製造に対する可能性（種々の変動を考慮する際の製造設計の容易性）」と定義した．さらに，細胞製造性設計を，「顧客に対する安心と製品品質に対する安定を得つつ，製造所内外（原材料調達，搬送や病院での調製も含む）での簡易・安全・安価な工程にて，如何に簡単に製造するかを考える
細胞製品の製造設計」とし，生物学と工学の間の要求ギャップを理解して工程の効率と安定性を高めるシステム最適化を実践し，製品品質変動を低減することを目指してきた．
工程中の製品品質の乱れの原因は，1)外乱（無菌環境など）由来の変動，2)細胞・原材料・資材由来の変動，3)工程での内なる乱れ（培養環境変動，操作変動や細胞自身の揺らぎ）由来の変動，4)実用化に向けた変動（機械化，スケー
ルアップなどの開発時から実生産までの入力および工程の柔軟性による変動）
が挙げられる．さらに，これらの変動は，工程の長期かつ連続性により，乱れが増大・累積し，製品品質変動を助長する．つまり，「一度乱れだすともっと乱れる」発散型乱れであり，2 つの現象である「変動が生まれること」と「変動が大きくなること」と捉え，それぞれ，「工程不安定性の抑制」と「工程安定性の向上」の活動が必要となる．
工程中での品質変動の特徴としては，原料であり製品である細胞は不確定要素が多く，細胞自らが細胞イベントを引き起こす．その結果，細胞は随時状態を変化し（時間依存性），シグナル開始から表現型を提示するまでに時間がかかる（時間遅発性）などの時間に起因する変動を有する．また，目的細胞が得られた
かの判定は，細胞イベントの実時間ではなく，検出してから結果が出るまでラグタイムが存在する（時間遅延性）．そのため，day-scale で行う工程中の操作イベントと hour-scale での一連の細胞イベントとの不一致により，得られる細胞群が不均質になり，ロット間にも変動が生じると考えられる．
工程の制御については，種々の操作が hour-scale や min-scale であるとき，細胞応答が同等や小さな scale の際に操作制御が困難となり，品質の不安定化を引き起こす可能性がある．これらの困難な特性が，特に，内なる乱れの発生や増大を抑制するうえで，今後，変動要因を区別し，システムの変動要因を解析することが必要である．
内なる乱れとしては，3 つに大別できる．1）培養環境からの乱れ：培地，足場，隣接する細胞など，細胞周りの環境を起因とする細胞特性の変化に起因するもので，老廃物蓄積，足場劣化，または細胞密集などによる増殖阻害が挙げられる。2）操作による乱れ：ピペッティング時などの液ハンドリング動作や容器移動時などの容器ハンドリング動作など動作を起因とする細胞特性の変化によるもので，シェアーストレスや慣性力による細胞剥離などが挙げれられる。
3）細胞自身からの乱れ：細胞自身の挙動などに起因する細胞特性の変化によるもので，アポトーシスによる細胞死，過剰酸化による短寿命化，メカノトラン
スダクションを介した特定遺伝子のメチル化（細胞運命変化）などが挙げられる。これらの内なる乱れを理解し，いわゆる「細胞の気持ち」を測定，解析する技術が品質の安定化を実現する上で重要となる．
本講では，細胞の気持ちを理解しながら工程を開発する経緯を示しつつ，細胞製造性，内なる乱れなど，体系化を目指した研究の在り方について紹介し，将来展望を述べる．

臨床用自家ヒト iPS 細胞を低コストで安定して樹立・培養するために、閉鎖型培養装置を用いた製造プロセスおよび品質管理に関する研究開発を行っている。
これまで iPS 細胞は 2D 条件で樹立することが一般的であったが、我々は末梢血から 3D 条件で iPS 細胞を樹立することに成功し、心筋分化までの全工程を3D で行うプロセスを開発した。本発表では 3D-iPS 細胞の特性、また、閉鎖型培養装置の課題と期待について議論したい。
背景
これまでに我々は、臨床用 iPS 細胞として、HLA ホモ iPS 細胞株 27 株と、HLA
ホモ株由来のゲノム編集株 1 株を製造し、出荷してきた。これら細胞株の概要を下記に述べる。
＜ HLA ホモ iPS 細胞＞
7 人の HLA ホモドナー由来の iPS 細胞 27 株を作製し、保管・配布を行っている。これは日本人の約 40%をカバーする。2015 年に最初の臨床用 iPS 細胞を出
荷後、10 以上の臨床試験に使用されている。品質試験としては、無菌試験、マ
イコプラズマ、エンドトキシン、ウイルス否定試験、コロニー形態、確認試験、リプログラミングベクターの残存、ゲノム変異、核型、未分化マーカーなどを実施し、製造した 125 株から基準に合格した 27 株を選抜した。この中でベクター残存及びゲノム変異が不合格要因の上位であった 1)。
＜ HLA ゲノム編集 iPS 細胞＞
HLA ホモ株でカバーできない残りの 60%及び海外対応として、ゲノム編集技術を用いた HLA ゲノム編集株の製造を進めており、本年 6 月に、最初のゲノム編集株を出荷した。上記 HLA ホモドナー由来の iPS 細胞を用いて、HLA-A,
HLA-B, C2TA の 3 遺伝子に対して、CRISPR-Cas9 により HLA ゲノム編集株を製造した。3 遺伝子同時のゲノム編集は、大規模欠損や転座などのゲノム異常のリスクが懸念されるが、ここでは継代数を最小化するため、3 遺伝子同時にゲノム編集を行った。ゲノム編集と変異を効率的にスクリーニングする手法を開発した 2)が、さらなる効率化を目指して、自動化なども進めている。
my iPS プロジェクト
移植時の拒絶反応を最小化するためには自家由来 iPS 細胞から作製した分化細胞が望ましいが、製造・品質管理コストの課題がある。my iPS®プロジェクトでは、従来の手作業による製造を「閉鎖型装置化」する、また、破壊試験による品質管理を「リアルタイム・非破壊」とすることで、大幅なコストダウンにチャレンジしている。細胞製造を閉鎖型装置で完全自動化するためには、(1)閉鎖型装置の開発、(2)閉鎖型装置に適した細胞培養プロセスの構築、(3)装置と一体化した試薬・資材のパッケージ化・キット化、(4)閉鎖型装置と組合せたリアルタ
イムモニタリング手法の開発、などが必要である。閉鎖型装置での製造により、コストダウン、少量多品種の同時製造の実現に加えて、温度・ガス・圧力などの培養環境を制御可能なことから細胞の品質向上についても期待している。
閉鎖型装置での 3D-iPS 細胞の樹立と品質特性
末梢血から 3D 条件（浮遊条件）で iPS 細胞を樹立し、iPS 細胞の拡大培養・心筋分化までの全工程を 3D で実施可能なプロセスを開発した。併せて、末梢血から iPS 細胞の樹立までを市販の閉鎖型装置で実施可能なプロセスを構築した。
装置で作製した“3D-iPS 細胞”の品質特性は、従来の 2D 条件で樹立した iPS 細胞と同等の特性を示し、心筋分化率も同等であった。一方、前述した臨床用 iPS細胞株とは異なり、シングルセルクローニングを行っていないバルク培養した
iPS 細胞であること、また、継代数が少ない（培養期間が短い）ことから、ドナー間差・ロット間差などが懸念され、今後のさらなる品質検証が必要である。
今後の展望
閉鎖型装置での実施が、最も困難と思われた iPS 細胞の樹立プロセスが構築出来たことで、今後、拡大培養、分化誘導までの全工程を一気通貫で行うプロセス開発に弾みをつけていきたい。一方、細胞品質とリンクしたモニタリング指標（画像や培地成分など）については課題も多く、現状有効な手段が無い。本
発表を通して、こうした未解決の課題についても議論を深めたい。
参考文献
1) Yoshida, S. et al., A clinical-grade HLA haplobank of human induced pluripotent
stem cells matching approximately 40% of the Japanese population, MED, 4, 51-66(2023)
2) Kitano, Y. et al., Generation of hypoimmunogenic induced pluripotent stem cells by
CRISPR-Cas9 system and detailed evaluation for clinical application, Mol. Ther.
Methods Clin. Dev., 26, 15-25 (2022).
Production of autologous iPSCs for clinical applications: Challenges using a closed
culture system〇 Masayoshi Tsukahara1（1CiRA Foundation）
key word iPSCs, closed culture system, cardiomyocyte, 3D culture

Development of manufacturing system based on cell manufacturability forregenerative medicine

Production of autologous iPSCs for clinical applications: Challenges using
closed culture system○Masaihro Kino-oka1,2(1 Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Research Base for Cell
Manufacturability, Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
designhuman cells, cell manufacturability, regenerative medicine, process○Tsukahara Masayoshi(CIRA_F)

Key words

iPSCs, three dimension

219

3S-Ba04

細胞製品製造とクオリティ・バイ・デザイン（QbD）○川崎 ナナ（横市大院・生命医科）
nana@yokohama-cu.ac.jp

3S-Ba05

培養肉などの動物細胞培養を民主化する技術：ウェット
ウェアプラットフォームの開発と可能性○川島 一公（インテグリカルチャー）
ikko@integriculture.com

細胞製品の実用化には、求める品質の細胞を一貫して提供することができる製
造工程と管理戦略の構築が不可欠である。医薬品の開発と製造においては、ク
オリティ・バイ・デザイン (QbD)のアプローチが主流となっている。QbD とは、製品および工程の理解、ならびに工程管理に重点をおいた、立証された科学およびリスクマネジメントに基づく体系的な開発手法のことである。このアプローチは細胞製品の開発と製造においても参考になると思われる。
QbD における製品の理解の主な目標は、重要品質特性（CQA）を特定することである。 CQA とは、要求される製品品質を確実にするため、適切な限度内、範囲内、又は分布内にする必要がある物理的、化学的、生物学的、微生物学的な性質又は特性と定義される。工程の理解の主たる目標は、CQA に影響を及ぼす物質特性や工程パラメータなどを明らかにすることである。その結果に基づき適切な工程を設計し、管理戦略を構築することによって、CQA は適切な範囲内や限度内、分布内に入ることが保証される。管理戦略には主に工程内管理と最終製品の管理があるが、QbD では工程内管理に重点がおかれる。また、工程の理解や工程の管理にプロセス解析工学（PAT）ツールが利用されることがある。
細胞製品の開発と製造においても、CQA を特定することが肝要であろう。細胞製品の QbD では、品質特性としての細胞の分子基盤を理解することも重要なポイントの一つと思われる。すなわち、遺伝子、トランスクリプト、タンパク質、
翻訳後修飾、代謝物などの理解を深めることで関連する CQA を特定し、そのCQA を適切な限度内、範囲内、又は分布内に入れる方策を考案していく。特に、タンパク質とその翻訳後修飾は細胞機能や細胞構造の本質であり、多くのCQA が存在すると思われる。その CQA の特定には、細胞内タンパク質集団のプロファイルを明らかにし、適切な限度内、範囲内、又は分布内から逸脱した
ときに細胞の機能や構造へ特に大きな影響を及ぼすタンパク質を発見するアプローチが求められる。タンパク質量とトランスクリプト量の相関性は 45％程度ともいわれ、直接細胞内のタンパク質を解析するプロテオミクスは、細胞特性の理解に適した手法であろう。特に、LC/MS/MS を用いた定量プロテオーム解析技術は、同時に多数のタンパク質関連 CQA を解析できることから、PAT ツールとしての活用期待もされる。
そこで、我々は、iPS 細胞由来製品の開発と製造に役立てることを目指して、
LC/MS/MS による定量的プロテオーム解析技術を用いて、iPS 細胞由来製品のCQA の探索と、工程内管理手法の開発を行っている。具体的には、iPS 細胞が神経幹細胞に分化する過程で変動するタンパク質を明らかにすることで、分化と関係のあるタンパク質を抽出し、さらに RNA 干渉により遺伝子発現抑制したときの分化への影響を調べることで、CQA 候補や工程モニタリング用分子マーカーの探索を行っている(1)。本シンポジウムでは、細胞製品開発と製造における QbD について、細胞タンパク質の体系的解析を例に議論したい。
(1) T. Urasawa, et al., Quantitative Proteomics for the Development and Manufacturingof Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Stem Cells Using DataIndependent Acquisition Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 2023, 22, 1843-1854

培養肉などの動物細胞培養技術の開発は、持続可能な食品生産と環境保護の両面で重要な役割を果たす可能性がある。一方、動物細胞の共通の性質を活用したウェットウェアプラットフォームである CulNet System の開発は、動物細胞培養を民主化し、広範な利用を可能にするための革新的な手段として開発を進めている。本講演では、培養肉技術の現状とウェットウェアプラットフォームの開発における可能性について解説する。
培養肉は、動物の細胞を培養し、食品として利用する技術である。その生産方
法は、従来の畜産業に比べて環境負荷が低く、持続可能な食品生産の一環として期待されている。また、動物福祉や食品安全性の向上にも寄与する可能性がある。培養肉の需要は急速に増大すると予測されており、2050 年までにはタン
パク質市場の数十％近くまで拡大することが予測されている。
一方、ウェットウェアプラットフォームは、インテグリカルチャー株式会社の目指す、動物細胞培養を民主化し、広く利用できるようにするための技術である。従来の培養肉の生産方法では、高度な技術と専門的な設備、精製した成長因子や血清成分等が必要であり、コスト面や食品としての安全面、法律面で多くの制約がある。しかし、弊社が開発を進めるウェットウェアプラットフォー
ムである CulNet system は、個人や小規模事業者も動物細胞培養を行うことが可能となることを目指しており、培養肉の生産がより民主化し、持続可能な食品生産への参加が広がるとともに、生物工学のニーズも急拡大すると考えられる。
CulNet system の開発には、動作原理である臓器間相互作用の解明が急務である。これまでに、臓器間相互作用を網羅的に探索するスクリーニングの開発を進め、得られた結果を、数リットルスケールの CulNet system でスケーラビリ
ティを証明することが可能な実験系の構築を進め、POC を加速させている。これまでに鳥類の細胞を用いた試験において、臓器間相互作用によって細胞の生産が可能であることが明らかとなっている。
CulNet system を構成する要素に関しても、食品製造を念頭に置いた動物細胞生
産の規格はなく、それぞれの工程において規格化を進めている。一つ目は細胞培養に用いる基礎培地であり、研究用の試薬では食品として認可されていない成分が含まれていることからすべての原料を見直し、食品グレードで構成される培地を作出した。二つ目は、培養肉を生産するために必要な食品で構成された足場成分である。食品として活用する細胞、特に初代細胞は足場などの接着領域が存在することで比較的安定した細胞増殖能を誘起することが可能である。
従って培養肉生産にはこれらの要素を埋めることが重要であった。三つ目は培養プロセスである。食品として細胞を生産するためには、抗生物質を用いることができないため、コンタミネーションを抑止するためのプロセスの構築や人の練度向上などを進め、バイオエンジニアとしての育成を進めるとともに、多くの人が容易に細胞の生産が可能となるような自動化へ結び付けるノウハウの蓄積を進めている。
これらの開発を進める中で 2023 年の 2 月にアヒル肝臓由来細胞を食品原料のみで培養し生産した細胞を用いて官能評価会を実施した。官能評価会では開発に関与したメンバーでサンプルを食し、おいしさの評価を行い、うま味などの表
現は十分であるが、動物性脂肪の蓄積はまだ課題が残されていることが明確化された。
開発が進む CulNet system と培養肉であるが、以前開発にはいくつかの課題が存在している。例えば、安全性や品質管理、倫理的な観点からの取り組みが重要であると考えている。また、スケールＵＰ技術の開発や、規制の整備も課題となります。これらの課題に対して、産業界、学術界、規制当局などの関係者と協力を進め、持続可能な食品生産の実現に向けた取り組みを進める必要がある。

Quality by Design in the manufacture of cellular products

Culture Technology for Biomanufacturing with Animal Cells: Development
and Potential of Wetware Platforms○Nana Kawasaki(Grad. Sch. Med. Life Sci., Yokohama City Univ.)

Key words
stem cell

cell therapy products, quality control, manufacture, induced pluripotent○Ikko Kawashima(Integriculture Inc)

Key words

cultured meat, wetware, cellular agriculture

220

3S-Ba06

細胞製造工学の多様性と将来展望の考察○堀江 正信（京大・環安）horie.masanobu.4z@kyoto-u.ac.jp

3S-Ea01

データ駆動型アプローチによるダークマター微生物解析○岩崎 渉 1,2,3,4,5（1 東大院・新領域, 2 東大院・理, 3 東大・大海研, 4 東大・定量研, 5 東大・微生物イノベ連携研）
iwasaki@k.u-tokyo.ac.jp

ヒト細胞を含む動物細胞を大量製造するための技術や学問体系の確立は、再生医療や細胞治療といった医療分野社会実装だけではなく、近年では人口増加とSDGs に端を発する食料問題を解決するための重要な事項として認知されており、生物工学分野の研究者が中心となって活躍する分野であると考えられる。
本シンポジウムにおいては臨床用細胞を製造している塚原正義先生、再生医療
や細胞治療に資する細胞製造に関するサプライチェーンを含めたコトづくりを進められている紀ノ岡正博先生、培養食肉を社会実装されつつある川島一公先
生、品質保証と製造プロセスデザインを川崎ナナ先生にご講演いただく。本講
演では各先生方のご講演について概説するとともに、動物細胞製造工学の多様性および学問に昇華するために必要な事項や、将来に向けた展望に関して考察を行う。

ゲノム解析・メタゲノム解析は微生物ダークマターの研究を大きく進めてきたが、一方で、本質的なボトルネックも数多く残されている。その一つが、メタゲノムに含まれる遺伝子の多くが、配列類似性解析によって機能が推定できないという点である。本発表では、以下に挙げた論文などを取り上げつつ、ダー
クマター微生物の機能や役割に迫るためのデータ駆動型アプローチ研究例を紹介する。
Naoki Konno and Wataru Iwasaki.
Machine learning enables prediction of metabolic system evolution in bacteria.
Science Advances, 9, eadc9130. (2023)
Salvatore Cosentino and Wataru Iwasaki.
SonicParanoid: fast, accurate and easy orthology inference.
Bioinformatics, 35, 149–151. (2019)
Tsukasa Fukunaga and Wataru Iwasaki.
Mirage 2.0: fast and memory-efficient reconstruction of gene-content evolution
considering heterogeneous evolutionary patterns among gene families.
Bioinformatics, 38, 4039–4041. (2022)
Satoshi Hiraoka, Yusuke Okazaki, Mizue Anda, Atsushi Toyoda, Shin-ichi Nakano,and Wataru Iwasaki.
Metaepigenomic analysis reveals the unexplored diversity of DNA methylation in anenvironmental prokaryotic community.
Nature Communications, 10, 159. (2019)
山内駿，岩崎渉．
de novo 遺伝子誕生学〜「遺伝子とは何か？」を改めて問う鍵として
実験医学，40，1835-1841．(2022)
岩崎渉．
機能未知遺伝子の機能を推測するバイオインフォマティクス：AlphaFold から遺伝子誕生学へ
日本微生物生態学会誌, 37, 3-13. (2022)

Consideration for cell manufacturing diversity and future perspective.

Data-driven approaches to microbial dark matter○Horie Masanobu(Agency for Health, Safety and Environment, Kyoto Univ.)

Key words

cell manufacturing technologies, cell therapy, industrialization○Wataru Iwasaki1,2,3,4,5(1 Grad. Sch. Frontier Sci., UTokyo, 2 Grad. Sch. Sci., UTokyo, 3 AORI, UTokyo,
4
IQB, UTokyo, 5 CRIIM, UTokyo)

Key words

bioinformatics, genome, metagenome, evolution

221

3S-Ea02

マイクロバイオーム研究を先導するハブとなる統合デー
タベース Microbiome Datahub の開発

3S-Ea03

廃水処理微生物群の生態と機能をメタゲノム情報から解
き明かす
○成廣 隆
（産総研・生物プロセス）t.narihiro@aist.go.jp

○森 宙史
（遺伝研）
hmori@nig.ac.jp

微生物群集をメタゲノム解析等で培養することなく解析するマイクロバイオー
ム研究は、爆発的な勢いで研究が行われている。特に、バイオインフォマティ
クス技術の発展によってメタゲノム配列から個別菌のドラフトゲノム配列を再構築する Metagenome Assembled Genome (MAG)解析手法が洗練されここ数年で普及したため、微生物のゲノムの多様性の記述が著しく進展している。これまで我々は微生物のエンサイクロペディアを目指して微生物統合データベース
MicrobeDB.jp を開発してきた。MicrobeDB.jp は微生物の生息環境に注目してデータを整理してきたが、我々は昨年度から MicrobeDB.jp をマイクロバイオー
ム研究に特化した国際的なデータハブ Microbiome Datahub (https://mdatahub.org)
として再構築している。具体的には、マイクロバイオームデータはもちろんのこと、微生物の表現型や MAG などの新しいデータを統合化するとともに、マイクロバイオーム関連のデータ検索機能を強化している。本発表では、Microbiome Datahub の概要と、未培養微生物を含む MAG データを用いた解析例について紹介する。

水資源の再利用を支える生物学的廃水処理プロセスは、人間社会に欠かすことができない基盤技術の一つである。生物学的廃水処理技術の研究開発は 1900 年
代初頭に標準活性汚泥法や嫌気消化法が確立されてからおよそ 100 年の間、低コストに効率良く廃水を処理して河川や海洋に放流できる水質基準を満たすという視点から盛んに行われ、その成果として硝化脱窒法や嫌気性上昇流汚泥床法（up-flow anaerobic sludge blanket, UASB）などの多種多彩な処理方式が開発され、個々の現場において処理の対象となる廃水の質や量に適したプロセスが導入されてきた。こうした状況からも生物学的廃水処理はすでに完成された技術であると言えるが、処理の現場によっては突発的な処理効率の低下や汚泥性状の悪化といった課題が残されているのが現状である。我々は、生物学的廃水処理の中核を担う微生物群の多様性や代謝機能が十分に理解されないまま運用されていることがこのような課題の原因の一つであると捉え、その解決を図る
ための研究を進めてきた。1990 年代から 2000 年代にかけて報告された世界各
国の廃水処理プロセスを対象とした 16S rRNA 遺伝子クローンライブラリ解析の結果からは、汚泥を構成する廃水処理微生物群の多くがそれまでに純粋分離培養されていない微生物であることが示唆された。その後、この 10 年の間に急速に発展した高速シークエンス技術が利用されるようになると、さまざまな廃水処理プロセスの菌叢構造や機能遺伝子に関するデータが飛躍的に蓄積されることとなった。このような遺伝子情報を解析することで、純粋分離培養が困難
な未培養微生物の生態や代謝機能をある程度の確信を持って推定できるようになりつつある。本講演では、我々の研究グループが実施してきた廃水処理微生物群を対象とする菌叢解析やショットガンメタゲノム解析について、ポリエチ
レンテレフタレート(polyethylene terephthalate, PET)の原料となる化学物質の製造過程から排出される廃水を処理する嫌気性プロセス等を対象とした研究の成果を紹介する。
PET はペットボトルなどに広く利用されるプラスチック材料の一つである。PET
は石油由来の高純度テレフタル酸(purified terephthalic acid, PTA)もしくはテレフ
タル酸ジメチル(dimethyl terephthalate, DMT)を主原料として製造され、それらの原料を製造する工程でさまざまな芳香族化合物等を高濃度に含む有機性廃水が排出される。これらの廃水は、しばしば UASB 法等の嫌気性生物学的廃水処理技術を用いて処理されているが、その処理効率は不安定であることが知られていた。そこでまず、PET 原料製造廃水を処理する実規模ならびに実験室スケー
ルの嫌気性リアクターから汚泥試料を採取して菌叢解析を実施することでその特徴付けを試みた。リアクター内に優占している微生物の存在量比データに基づき相関分析を実施したところ、芳香族化合物分解または揮発性脂肪酸分解を担う嫌気性栄養共生細菌(シントロフ)が中心となる 2 つの独立した微生物ネッ
トワークが見出され、その協業により処理効率の安定化が図られることが示唆された。また、これらのリアクターから採取した嫌気汚泥を接種源としてさまざまな芳香族化合物を添加するバッチ培養試験を実施し、ショットガンメタゲ
ノム解析により再構築したドラフトゲノム情報と RNA 発現情報から、メタン
生成アーキアとの種間水素伝達により芳香族化合物を分解する複数のシントロ
フが、周辺環境の熱力学的条件、すなわち水素分圧の変化に応じて複数の代謝経路を使い分けていることが示唆された。さらに、DMT 製造廃水に一部のメタ
ン生成アーキアが利用可能なギ酸やメタノールといった成分が含まれていることに着目し、処理効率の不安定化が生じやすい PTA 製造廃水に混合することで処理の安定化を実現した。また、PET 原料製造廃水処理リアクターを接種源としてさまざまな集積培養系を構築することで、PET のモノマー分子であるテレ
フタル酸ビス(2-ヒドロキシエチル) (terephthalic acid bis[2-hydroxyethyl] ester,
BHET) や DMT を嫌気環境において分解する Spirochaeota 門細菌や、メタン生
成アーキアに寄生する可能性がある Candidatus Patescibacteria 門細菌を発見するに至った。
今後、廃水処理プロセスに関連する微生物の生態学的役割や代謝機能の解明をさらに押し進めることで、処理の効率化や安定化、各種化学物質の浄化処理へ向けた機能性の向上、廃水からのエネルギー・資源の回収に向けての新しい微生物機能が発掘されることが見込まれ、それらの微生物機能に基づく新しい廃水処理技術の創出が期待される。

Development of an integrated microbiome database Microbiome Datahub

Metagenomic information reveals the ecology and functions of wastewater
treatment microbiome○Hiroshi Mori(NIG)

Key words

microbial community, bioinformatics, database, metagenome○Takashi Narihiro(BPRI, AIST)

Key words

wastewater treatment, microbial community, metagenome

222

3S-Ea04

バイオレメディエーションにおける未培養微生物の活用○高畑 陽（大成建設）
yoh.takahata@sakura.taisei.co.jp

3S-Fa01

リグニンとその化学構造の紹介○秋山 拓也（東大院・農生科）
akiyama-takuya@g.ecc.u-tokyo.ac.jp

バイオレメディエーションとは、有用な微生物を利用して土壌や地下水中に存在する有害物質を浄化する技術であり、経済的で環境負荷の小さい浄化技術のニーズが高まる中で適用数が増えている。商業的に行われているバイオレメディ
エーションの多くが、地盤内に存在する浄化菌を活性化することで行われており、バイオスティミュレーションと呼ばれている。様々な微生物が存在する自然環境の中で浄化菌の能力を人為的に引き出す必要があり、浄化に適した菌叢が形成されるまで時間を要する場合も多い。そこで、単離された有用菌を培養し、汚染した地盤に導入するバイオオーグメンテーションと呼ばれる技術も実用化されている。
テトラクロロエチレン（PCE）やトリクロロエチレン（TCE）などの塩素化エチレン類は過去に幅広い産業分野で使用され、国内の様々な事業所で地下水汚染が生じている。汚染地下水に有機物を含む浄化材を供給し、有機物から供給される水素を電子受容体とする脱塩素反応を利用して、PCE や TCE をシス 1,2ジクロロエチレン（cis-DCE）、クロロエチレン（VC）に順次変換し、最終的に無害なエチレンまで浄化する細菌（脱塩素細菌）を用いる浄化技術が国内で急速に普及している。
この浄化技術は脱塩素細菌を速やかに活性化できれば浄化期間を短縮でき、特に cis-DCE 以降の脱塩素化を唯一行うことができる Dehalococcoides 属細菌 1）を活性化することが重要とされている。浄化材には様々な有機物が使われるが、その中でも酵母エキスは様々な細菌を短期間に培養できる原料として広く使用されている。筆者らが開発したビール酵母エキスを含む浄化材「TM-BioQuick」
2）
はビール酵母に含まれるホップ成分が地下水中の一部の細菌の増殖を抑制する一方で、Dehalococcoides 属細菌を速やかに増やす効果がある。TCE で汚染された地下水に TM-BioQuick を供給して菌数の変化を定量 PCR により解析した結果、細菌の 16S rRNA 共通遺伝子領域コピー数が浄化開始から 2 週目までに
約 2 オーダー増加し、その後、5 週目以降には Dehalococcoides 属細菌の 16S
rRNA 遺伝子数が浄化開始時より 2 オーダー以上増加して塩素化エチレン類の脱塩素化が緩やかに進行した。
Dehalococcoides 属細菌は地盤中で菌数が少ない場合が多いため、浄化効果の高い浄化材を用いてバイオスティミュレーションを行っても浄化開始時に浄化が進行しにくいことが課題となっている。そこで、筆者らは前述した浄化サイト
か ら Dehalococcoides 細 菌 （ Dehalococcoides mccartyi UCH007 株 ） と
Sulfurospirillum sp. UCH001 株を分離した。UCH001 株は塩素化エチレン類の脱塩素活性を有していないが、UCH007 株と共培養することで脱塩素速度を上げる効果がある。TCE で汚染された帯水層から採取した土壌および地下水をガラ
スバイアル瓶に密閉した模擬地盤を作成して、これらの 2 株を共培養した菌液の導入効果を確認した。その結果、浄化材のみを供給したバイオスティミュレー
ション条件では、15 週間の培養終了時までに cis -DCE 以降の脱塩素化が十分に進行しなかった一方で、浄化材と菌液を加えたバイオオーグメンテーション条
件では菌液導入から 6 週間までにほとんどの TCE がエチレンまで脱塩素化され、浄化期間が大幅に短縮された。
本試験で得られた土壌試料の門レベルでの菌叢を次世代シーケンサーにより解析した結果 3）、増加した細菌には TCE から cis-DCE の脱塩素化に寄与する
Desulfobacterota 門 に 属 す る Geobacteraceae 科 や Firmicutes 門 のDesulfitobacterium 属などの細菌が顕著に増加していることを確認した。一方、バイオスティミュレーション条件とバイオオーグメンテーション条件の菌叢構成には大差がなく，UCH007 株の出現率は全細菌数に対して 0.1％以下と低かった。この結果から、Dehalococcoides 細菌は優占種とならなくても一定の菌数が存在すれば塩素化エチレン類の浄化に寄与することが示された。また、有機酸を 代 謝 し て 水 素 を 発 生 す る Firmicutes 門 の Desulfosporosinus acididurans やSpirochaetes 門の Treponema 属など、有機酸を代謝して脱塩素細菌に必要な水素を供給する役割を果たしていると考えられる細菌が多く検出され、脱塩素細菌の活性化に寄与していると推察された。
今後も直接的に浄化に作用する浄化菌の情報だけでなく、浄化対象とする環境の中で浄化に関与する様々な微生物の役割について把握し、浄化環境における微生物を適切にコントロールして安全かつ効率的に浄化を進める技術を検討していきたいと考えている。
参考文献
1）He, J. et al, Nature, 424, pp.62-65, (2003)
2）高畑陽ほか，環境浄化技術，18(5), pp.38-41 (2019)3）伊藤雅子ほか，土木学会論文集 G，78(1), pp.1-12 (2022)

リグニンはセルロースに次ぐ地球上で最も豊富な植物資源成分であり、バイオ
マス総合利用の観点からリグニンの利用技術の進展に期待が寄せられている。
そのリグニンについては、数十年前までは、複雑な高分子、と一括りにされて、リグニン研究者以外を寄せ付けない難解なイメージがあった。しかし現在、リ
グニンに含まれる各々の部分構造についての理解は進み、フェニルプロパン骨
格単位の間の結合状態が詳細に把握されつつある。リグニンの高分子構造に規則的な配列はみつかっていない。しかしながら、その構造は決して無秩序なのではなく、芳香核型と結合様式の頻度、側鎖部分の立体化学構造などの各部分構造との間に明らかな相関関係が認められる。また、構造と化学反応性の関係についての基礎研究も 1970 年代から継続的に続けられており、リグニンの化学変換による開発手段を設計する際に役立つと思われる情報が蓄積されてきた。
本発表では、シンポジウム「リグニンの利用に向けたホワイトバイオテクノロ
ジーの潮流」の導入部として、リグニンの基本構造とその化学的特徴、およびバイオマス利用におけるリグニンの位置づけについて概要説明を試みる。リグ
ニン生合成時にモノリグノールが脱水素重合して高分子化する過程、その過程で生じる部分構造の多様性、および NMR 測定や化学分解法による実際の分析
例を示しながら、リグニンの利用を考える上で要となり得る化学構造的特徴について紹介してみたい。

Utilization of uncultured microorganisms for bioremediation

Introducing lignin and its chemical structure○Yoh Takahata(Taisei Corp.)

Key words

bioremediation, uncultured bacteria○Takuya Akiyama(Grad. Sch. Agric. Life Sci., Univ. Tokyo)

Key words

lignin, cell wall, structural analysis, biomass

223

3S-Fa02

生合成経路の制御がリグニンの化学構造と木材の加工性にもたらす効果

3S-Fa03

リグニン由来の多様な芳香族化合物の変換に関わる細菌の代謝システム○政井 英司
（長岡技科大）emasai@vos.nagaokaut.ac.jp○梶田 真也（農工大院・BASE）
kajita@cc.tuat.ac.jp

リグニンは植物細胞壁に蓄積する芳香族高分子であり、植物の堅牢性や頑健性を与えている。同じ細胞壁ポリマーであるセルロースとは異なり、その重合（伸長）過程にいかなるタンパク質も寄与しないことから、規則的な繰り返し構造を持たない特徴を持つ。そのため、加水分解酵素などによる生化学反応の基質になりにくく、微生物による生分解にも比較的高い耐性を持つ。リグニンは、
コニフェリルアルコールやシナピルアルコール等の主要なモノマー（モノリグノール）が内在性のフェノールオキシダーゼで脱水素されて生成するフェノキ
シラジカル同士、あるいは伸長中のオリゴマーとモノマーのラジカル同士が反応することで伸長する。ラジカルには幾つかの共鳴寄与体が存在することから、
ラジカル同士の反応によってできる生成物は一様とはならず、このことがリグ
ニンの分子構造を複雑にする所以である。このようなリグニンの生成機構を考慮すると、内在性のフェノキシラジカルの基質となってラジカルを生成する化合物であれば、いかなる分子もリグニンのモノマーとして振る舞うことができる可能性を持つ。事実、構造単位として天然のリグニン中には存在しない分子であっても、試験管内での人為的な重合によりリグニン様分子の一部に取り込まれるものがある。また、天然の植物細胞壁中に存在するリグニンも、その量の多寡は違えどモノリグノール以外の分子が分子中に取り込まれており、一つとして同じ分子構造のものはない。このように生成機構の特徴からリグニンには分子構造の形成過程にかなりの自由度があるため、他の天然高分子に比較して人為的な分子構造の改変が容易である。
演者らは、リグニンやそれを含むリグノセルロースの利用の一層の効率化を目的に、植物に内在するリグニン生合成関連酵素や、他の生物に由来する芳香族
代謝および異化酵素の機能を利用して、天然には存在しえないリグニンを遺伝
子組換え植物に作らせることに挑んできた。本講演では、これまでの試みの幾つかについて紹介し、リグニンの人為的な改変の可能性と意義を議論したい。

リグニンの有効利用法として、高分子リグニンの化学的低分子化で生じる雑多な芳香族化合物を細菌の代謝能を活用してポリマー原料等の有価物に変換・収束させる biological funneling が注目されている(1,2)。例えば、針葉樹由来のリグ
ニンは主にグアイアシル(G)型で構成されており、リグニンを酸化分解するとバ
ニリンとバニリン酸を中心に雑多な芳香族化合物が生成する。細菌においてバ
ニリンはバニリン酸に酸化され、脱メチル化されてプロトカテク酸(PCA)に変換された後、2,3-、3,4-、4,5-開裂経路のいずれかによって代謝される。4,5-開裂
経路と 3,4-開裂経路の中間代謝物である 2-ピロン-4,6-ジカルボン酸と β-ケトア
ジピン酸、3,4-開裂経路から誘導可能な 3-カルボキシムコノラクトン、そしてPCA の脱炭酸と環開裂で生じる cis,cis-ムコン酸はポリマー原料として期待されている。リグニンの化学分解物には先のバニリンやバニリン酸以外にもその他の単量体やオリゴマーが含まれており、これら化合物の代謝系に関する知見は、微生物を利用したリグニンからの有価物生産系構築の基盤となる。
Sphingobium sp. SYK-6 株はリグニン由来芳香族化合物分解細菌であり、G 型だ
けでなく、広葉樹・草本類に含まれるシリンギル(S)型と草本類に含まれる p-ヒ
ドロキシフェニル(H)型のリグニン由来の単量体やリグニン中の様々な分子間結合を持つ二量体芳香族化合物を炭素源として生育できる。本株においてこれら化合物の代謝に関わる 50 以上の遺伝子が解析され、細菌におけるリグニン由来
芳香族化合物の代謝が最も詳しく明らかにされている(3-5)。ここでは、SYK-6株の代謝システムについて特に特徴的な点を紹介する。
SYK-6 株では、G 型リグニン由来の芳香族化合物は PCA に変換されて 4,5-開裂
経路で代謝されるが、S 型リグニン由来の化合物はシリンガ酸に集約され、脱メチル化で生成する 3-O-メチルガリック酸が複数の経路を経由し PCA 4,5-開裂
経路に合流する。本株はリグニン由来芳香族化合物を唯一の炭素源として生育するが、グルコース等の糖類や有機酸で生育できず、またメトキシ基のない
PCA での生育時にメチオニン要求性を示す。これは Pseudomonas 属等がバニリン酸の脱メチル化にオキシゲナーゼ(VanAB)を利用するのに対し、SYK-6 株はテトラヒドロ葉酸(THF)依存性のメチル基転移酵素(LigM)を利用し、生成する5-メチル THF がメチオニン生合成のメチル基供与体に利用されるためである。
通常、5-メチル THF は 5,10-メチレン THF の還元で生成するが、SYK-6 株はこの活性を持たない。したがって本株においてリグニン由来芳香族化合物の脱メチル化が、代謝を進行させるだけでなく、メチオニン生合成にも必須のプロセスとなっている。
リグニン由来二量体化合物の中には立体異性体が存在するため、細菌がこれら異性体をどのように代謝するのかという点は特に興味が持たれる。リグニン中に最も多量に存在する β-O-4 結合を持つ二量体化合物には 4 つの立体異性体が存在するが、SYK-6 株は立体選択的な複数の dehydrogenase を用いてこれら異性体を酸化し 2 つの鏡像異性体に変換する。そして立体選択的なグルタチオン
S-トランスフェラーゼ(GST)が β-O-4 結合を開裂し、生じるグルタチオン抱合体に別の GST が作用することでアキラルな化合物に変換されて代謝される。難分解性の β-1 結合を持つ二量体化合物にも 4 つの立体異性体が存在するが、この代謝システムの詳細がごく最近明らかにされた(6,7)。
以上のように SYK-6 株はさまざまなリグニン由来芳香族化合物を完全分解する
ために多様かつ巧妙な代謝システムを有しており、本株の代謝系遺伝子群は、リグニン由来芳香族化合物からの有価物生産菌の機能強化に有用である。将来
的には、SYK-6 株自体をプラットフォームとした高効率な変換システムの開発が望まれる。
本研究の一部は、JST 未来社会創造事業 JPMJMI19E2、及び JST 共創の場形成
支援プログラム JPMJPF2104 の支援を受けて実施された。
文献
1. Curr Opin Biotechnol, 42:40-53 (2016); 2. Biotechnol Adv, 37:107360 (2019); 3.
Biosci Biotechnol Biochem, 71:1-15 (2007); 4. Environ Microbiol Rep, 9:679-705; 5.
Lignin, 3:9-14 (2022); 6. Proc Natl Acad Sci USA 120: e2212246120 (2023); 7. Appl
Environ Microbiol (in press, 2023)

Metabolic engineering of the lignin biosynthetic pathway for structuralmodification of lignin and wood characteristics

Bacterial catabolic systems for the conversion of various lignin-related
aromatic compounds○Shinya Kajita(Grad. Sch. BASE)

Key words

lignin, lignocellulosic materials○Eiji Masai(Nagaoka Univ. Technol.)Key words

lignin degradation, bacteria, Sphingobium, catabolic pathways

224

3S-Fa04

リグニンの微生物変換によるバイオプラスチック原料
2-ピロン 4,6-ジカルボン酸（PDC）の生産と高分子材料
開発

3S-Fa05

リグノセルロースの三成分分離と単環芳香族化合物の製造プロセス○吉川 琢也（帯畜大・環境農学）
yoshikawa@obihiro.ac.jp○中村 雅哉 1, 大塚 祐一郎 1, 荒木 拓馬 1, 鈴木 悠造 1, 上村 直史 2,
政井 英司 2
（1 森林総研, 2 長岡技科大）nmasaya@ffpri.affrc.go.jp
１．はじめに木材構成成分の約 30％を占めるリグニンはその複雑な構造から高度な利用技術はほとんど確立されていない。しかしながら自然界では微生物により分解•資化されている。パルプ工場排水路より単離された Sphingobium sp. SYK-6 株は様々な構造のリグニン二量体化合物を分解・資化することができ、各分解・資化過程に関与する酵素遺伝子が片山［1］・政井［2］らにより同定されている。その代謝過程を見ると様々な構造のリグニン二量体化合物は中間代謝産物として、
2-ピロン-4,6-ジカルボン酸（PDC）に収斂して資化される。そこで我々はリグ
ニン分解・代謝酵素遺伝子を再構成することにより PDC に誘導し、高付加価値を持つ新規高機能材料を生産する新しい植物バイオマス利用技術の確立を目指した。
２．PDC とは
PDC は 4,6-位のカルボキシル基を二官能性のモノマーと重縮合して対応するポリアミドやポリエステル、ポリウレタンなどの高分子へと導くことが可能な有
望なプラットフォームケミカルの一つで、石油化学にも例の無い新しい特性が期待される物質である。PDC は(1)分極性の強い３つのカルボニル基、(2)弱ア
ルカリでの分解、生分解を受け易いラクトン部、(3)共役二重結合の剛直環構造を有することから PDC 骨格を有するポリマーは、剛直環構造からなり親疎水性であると同時に容易なラクトン環の加水分解開裂、共役二重結合の酸化・水和開裂などが予想される生分解性の高分子材料としての展開が期待出来る。また、有機材料科学の視点から見ると PDC は分子内の電子的 push-pull 効果は共役二重結合の π 電子系に異方性をもたらすため、高分子材料として分子配向を制御できれば、新しい高屈折率材料や非線形光学材料への利用、新しい圧電・焦電
材料への利用が可能となる興味深い物質である。さらに高分子化後の架橋反応などを利用すれば、新しいレジスト材料や光学材料への可能性が考えられる。
３．PDC の発酵生産
組換え微生物バイオリアクターを使った低分子リグニン化合物からの PDC の発酵生産技術の確立に取り組んだ。 Sphingobium sp. SYK-6 株のバニリン脱水素酵
素遺伝子（lig V）、プロトカテク酸 4,5-ジオキシゲナーゼ酵素遺伝子（lig AB）、
4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素遺伝子（lig C）、Pseudomonas.putida KT2440 株からバニリン酸デメチラーゼ酵素
遺伝子（van AB）を得てそれらを再構成した発現プラスミドを構築した。得られたプラスミドを P.putida PpY1100 に導入してバイオリアクターを構築し、バニリン酸からの PDC 発酵生産を行なった。その結果、変換率は 99％ではある
が変換量は 15g/L と低く、実用化を目指すには改善の余地があった。そこで、細胞密度と細胞活性の最適化のための発酵制御法を検討するためメタボローム
解析を行ったところ微量金属と炭素源の欠乏が明らかとなり基質添加時にこれらの物質の添加したところ、発酵生産性が改善され、100g/L を達成した。
4. PDC 骨格を有するとするバイオベースポリマーの開発
PDC を骨格に組み込んだ各種ポリエステル（PDC-PET、PDC-PBS、PDC-PLLA
共重合体等）の合成に成功しているが、いずれも PDC に由来する低い熱分解温度（5%質量減少温度 Td5≦250℃）が問題となっていた。しかしながら、PDC とのエステルをアルキル基からフェニル基にすることで、ポリマーは芳香族の存在に起因すると考えられる高い熱分解温度を示した（ Td5≧300 ℃）。
一方、PDC は接着剤としての展開の可能性が示された。PDC にグリシドールを脱水縮合させたエポキシ化 PDC を得て、酸無水物、微量の三級アミン開始剤を加えた組成物を各種金属板の間に挟み接着を行った結果、ステンレス板の場合、市販のビスフェノール A 型接着剤 に比べ高い引っ張り接着強さ（約 90 MPa）を示し、鉄同士の接着では 115 M Pa の接着強度を示した。この高性能な接着力
は ESCA スペクトル解析により、金属表面の Metal-OH，Metal=O 基などの弱塩基に対して PDC のピロン環が開環付加していることに起因しているものと示唆された。また、この接着剤は金属の他に，極性基を有するガラス，セラミック
ス，耐熱性の難接着性プラスチック（PC 樹脂，PA66 樹脂）にも適用可能であり，接着剤以外に，塗料や電気・電子材料への用途が期待されている。
[1] Katayama Y, et al. : Mokuzai Gakkaishi，33，77-79（1987）[2] Masai E, et al. : Biosci. Biotechnol. Biochem.，71, 1 –15（2007）

木質・草本系バイオマスは、主にリグニン、ヘミセルロース、セルロースから構成されており、各成分への変性を抑制した状態で成分分離することで、その後の用途展開が広がる。強い酸・アルカリ試薬を用いずに温和な条件で成分分離が可能な手法として、有機溶媒を用いたオルガノソルブ処理が知られる。著者のグループは、これまで水と 1-ブタノールを用いた 2 相系オルガノソルブ処理を開発し、リグニン、ヘミセルロース、セルロースをそれぞれブタノール相
可溶分、水相可溶分、固形成分として回収できることを見出した。本研究では、
2 相系オルガノソルブ処理によりリグニンをブタノール相中に回収した後、可溶化リグニンのアルカリ酸化分解により、バニリン等の単環芳香族を製造する
プロセスの構築を目的とした。
まず、オルガノソルブ処理は、回分式反応器に種々のバイオマス、所定量の蒸留水と 1-ブタノールを導入して行った。200℃程度の処理温度で実施すること
で、セルロースを固体として回収しながら、リグニンをブタノール相に選択的に回収した。次に、可溶化リグニンを原料に水酸化銅触媒を用いたアルカリ酸
化分解プロセスを検討した。原料に、エバポレーションと減圧乾燥によりブタ
ノール溶媒を除くことで得られた濃縮リグニンを用いた場合、生成する単環芳香族は低い収率に留まった。濃縮リグニンの熱重量分析と粒度分布測定により、濃縮過程の熱履歴により、変性を受けていることが示唆された。そこで、可溶化リグニンの回収法を改良し、ブタノール相をアルカリ溶液に接触させること
で、熱履歴を与えずに元々の可溶化リグニンの分散状態を維持しうる液液抽出を行った。種々のバイオマスから得られた可溶化リグニンのブタノール相からアルカリ溶液への抽出率は、7〜8 割の高い値を示した。抽出リグニンを含むアルカリ溶液を用いて酸化分解を行ったところ、濃縮リグニンの場合と比較して、同反応条件下、バニリンを主成分とする単環芳香族の収率が大きく向上した。
さらに、酸化分解後の生成物に対し、シンプルな溶剤分画を適用することで、重質分を溶剤不溶分として除去し、溶剤可溶分中に選択的に単環芳香族を回収した。
以上より、2 相系オルガノソルブ処理に特有な有機相の疎水性に着目することで、可溶化リグニンの液液抽出プロセスを構築し、その後のアルカリ酸化分解と溶剤分画を経ることで、バイオプロセスに提供可能なバニリン等の単環芳香族を製造した。
本研究の一部は、JST 未来社会創造事業（JPMJMI19E2）の支援を受けて実施した。

Production of a novel platform chemical from lignin by microbial
fermentation and its pplication.

Three-component separation of lignocellulose and the process for producing
monoaromatic compounds○Masaya Nakamura1, Yuichiro Otsuka1, Takuma Araki1, Yuzo Suzuki1,
Naofumi Kamimura2, Eiji Masai2(1 FFPRI, 2 Nagaoka Univ. Technol.)Key words

lignin, lignin degradation, biomass, platform chemical○Takuya Yoshikawa(Dept. Agro-environ. Sci., Obihiro Univ. Agric. Vet. Med.)Key words

organosolv treatment, lignin, alkaline oxidation, liquid lquid extraction

225

3S-Fa06

リグニンからの芳香族ポリマー原料の選択的生産○園木 和典（弘前大・農生）
sonoki@hirosaki-u.ac.jp

3S-Fa07

バガスアルカリ抽出液中のリグニン成分とその産業利用○栗原 宏征 1, 舩田 茂行 1, 南野 淳 2（1 東レ, 2 セルロシック・バイオマス・テクノロジー）
hiroyuki.kurihara.z9@mail.toray

芳香族高分子であるリグニンは, 熱安定性や UV 吸収性, 剛直性などの機能をポリマーに与える芳香族化合物の供給源として期待されてきたものの, その構造の不均一性が障壁となっている。この不均一性に対応してリグニンから産業に有用な芳香族化合物を生産するためには, リグニンを一度低分子化して, 生成する
多様な芳香族化合物の混合物から有用な化合物を選択的に取り出す方法が挙げられる。しかし化学的性質が類似した多様な芳香族化合物の混合物から目的の化合物を効率よく取り出すことは容易ではない。これを解決する方法の 1 つに,リグニンを化学分解して生成する多様な芳香族化合物を利用して増殖できる微生物の代謝を利用して, リグニン由来の芳香族化合物の混合物を特定の有用物質へと変換する Biological funneling が注目されている。そのため近年, リグニンを化学分解して生成する芳香族化合物の混合物からポリマー合成に利用できる基
幹化合物の生産に関する報告例は増えている。しかしリグニンから特定の芳香族化合物を生産する微生物株の作出, リグニンから生産された芳香族化合物を高分子素材の合成に適用することは十分に検討されていない。そこで本研究では,リグニンからポリマー原料として利用可能な芳香族化合物の生産に関する我々のこれまでの取り組みを紹介したい。
我々は先ず, Sphingobium sp. SYK-6 株を利用して, 針葉樹由来のサルファイトリ
グニンから耐熱性ポリマーの合成原料であるバニリン酸 (VA, 4-hydrox-3methoxybenzoic acid) を生産することに取り組んだ。リグニンの化学的分解方法には酸化分解, 還元分解, 酸触媒分解などが提案されているが, 我々は酸化剤に酸素, 触媒には分子状酸素の活性化能を有するとともに反応後に回収できるCu(OH)2 を用いたアルカリ酸化分解を選択した。アルカリ酸化分解はパルプ製造に広く採用されてきたため工業化への障害が少なく, また分解産物にBiological funneling に適した芳香族アルデヒドやカルボン酸 (4-ヒドロキシベン
ズアルデヒド，4-ヒドロキシ安息香酸，バニリン，VA など) を得ることができる 。 そ こ で SYK-6 株 の vanillate/3-O-methylgallate O-demethylase 遺 伝 子 とsyringate O-demethylase 遺伝子を破壊した VA 分解能欠失株を作製し, この株を用いることで, サルファイトリグニンをアルカリ水酸化銅酸化分解して生成した芳香族化合物の混合物を VA へと変換した。そして培養液から抽出したリグニン由来の VA から, メチルエステル化, ヒドロキシエチル化, 蒸留を経てmethyl-4-(2-hydroxyethoxy)-3-methoxybenzoate を合成・単離精製し, チタン触媒を用いた溶融重合反応を行うことで, 耐熱性ポリマーの 1 つである poly(ethylene
vanillate) を得ることができることを明らかにした。すなわち, リグニンの低分子化から芳香族素材の合成が一気通貫で可能であることを実証した<sup>1)</i>。
針葉樹リグニンの芳香核は主にグアイアシル核 (G 核) から構成される。広葉樹のリグニンは G 核とシリンギル核 (S 核) , そして草本植物のリグニンは G 核, S
核に加えて, p-ヒドロキシフェニル核を含むので, 酸化分解反応に伴ってより多様な芳香族化合物が生成する。そこで次に, Pseudomonas sp. NGC7 株を宿主に用いて, サトウキビバガス由来のオルガノソルブリグニンをアルカリ水酸化銅酸
化分解して生成する芳香族化合物の混合物から VA を生産できる微生物株の作出に取り組んだ。NGC7 株は, 前記 SYK-6 株やリグニン由来の芳香族化合物からの有用物質生産に適用されている Pseudomonas 属細菌よりも, アルカリ酸化
分解で生成する芳香族アルデヒドやカルボン酸への馴応性が高い微生物株である 2)。VA 収率に関わる vanillate O-demethylase 遺伝子, vanillin reductase 遺伝子を破壊し, SYK-6 株由来のアセトフェノン類変換酵素遺伝子群を導入した形質転換体は, シリンガ酸 (SA, 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzoate) の分解に関わる酵素遺伝子群を保持しているにも関わらず, VA とともに SA も蓄積するという予想外の性質を示した。そこで DNA アルキル化剤を用いた突然変異誘発を利用した
結果, バガスアルカリ酸化分解物に含まれる多様な芳香族化合物から, SA を蓄積することなく, VA を選択的に蓄積する微生物株の作出に成功し, バガスオル
ガノソルブリグニン分解物からも VA を選択的に生産する見通しを得た 3),4)。
本研究は, JST 未来社会創造事業 (JPMJMI19E2), R4 年度 地域中核大学イノベー
ション創出環境強化事業 の支援を受けて実施したものです。この場を借りてご支援に御礼申し上げます。
1)
樋口雄大ら, 第 73 回日本生物工学会大会, 2021. 2)Akutsu M, et al., Bioresour.
Technol. 2022. 3)村木香渚美ら, 第 75 回日本生物工学会大会, 2023. 4)池田和磨ら,
第 75 回日本生物工学会大会, 2023.

東レでは、NEDO 国際実証事業において、バガス 10t/日の実証プラントをタイ国に建設し、２０１８年から２０２２年度まで実証試験を行った。実証プラン
トでは、バガスを連続的に NaOH でアルカリ処理し、得られたアルカリ処理液を中和後、固液分離を行う。固液分離後、アルカリ溶解リグニンを固体として回収する。固液分離後のろ液抽出液は、さらに樹脂精製を行うことで、精製ポリフェノールを得る。アルカリ溶解リグニンおよび精製ポリフェノールは抗酸化活性を有しており、飼料等への利用が期待される。アルカリ処理後のバガス
固体は、酵素分解を行い、その後、膜分離を行うことでオリゴ糖や各種発酵原料となりうるグルコースを得ることができる。前記アルカリ溶解リグニンの分
子量は 10,000~15,000 であり、Ｓ核/Ｇ核比率はバガス・リグニンとほぼ同じであった。バガス・アルカリ処理条件もクラフト法に比べると温和であることか
ら、変性の少ないリグニンが回収されたものと推測される。また固液分離後のろ液抽出液には、クマル酸が約１ｇ/Ｌ程度、フェルラ酸が１００ｍｇ/Ｌ程度含まれる。アルカリ処理により、エステル結合したクマル酸、フェルラ酸が加水分解され、各ナトリウム塩として抽出されたものと考えられる。４月〜１１月の間は非製糖期となり、徐々に原料バガスの劣化が進行し、クマル酸、フェルラ酸の収量は減少することを確認した。また弘前大・園木教授との共同研究において、ＰｏｂＡ酵素を欠損したシュードモナスをろ液抽出液に添加し、培養することでフェルラ酸を炭素源として消費し、p-クマル酸から p-ヒドロキシ安息香酸が高収率に得られることを確認した。

Selective production of aromatic compounds from lignin

Lignin components of sugarcane bagasse alkaline extract and its industrial
applications○Tomonori Sonoki(Fac. Agric. Life Sci., Hirosaki Univ.)

Key words

lignin, metabolic engineering, chemical engineering○Hiroyuki Kurihara1, Shigeyuki Funada1, Atsushi Minamino2(1 Toray Industries, Inc., 2 Cellulosic Biomass Technology)

Key words

biomass, lignin degradation

226

3S-Ha01

ショウジョウバエ体内における酵母の多様性と生態○清家 泰介 1,2,3（1 阪大院・情報, 2 阪大・先導的学際研機構, 3 理研・生命機能）
taisuke_seike@ist.osaka-u.ac.jp

3S-Ha02

分裂酵母を使った性分化制御機構の解析○大坪 瑶子, 山下 朗
（基生研）
otsubo@nibb.ac.jp

酵母は地球上の至る所に棲息しており、動物などにより媒介され分散される。
特に酵母を餌とするショウジョウバエとは密接な関わりがあり、酵母の多様性や分散にショウジョウバエが寄与していると考えられている。しかし、ハエと酵母の相互作用に関する研究は少なく、「昆虫の体内」での酵母の生態はよく分かっていない。そこで、私は自然界のショウジョウバエの体内に存在する野生酵母を詳細に分類し、ハエと酵母の関係性に関する知見を得ようと試みている。
この研究を通じて、酵母の多様性と新しい環境への適応について深く理解し、野生酵母の生態の実態解明を目指している。
ショウジョウバエの腸管内には酵母などの微生物を蓄える臓器「クロップ」が存在する。私は日本各地の 50 ヶ所以上でショウジョウバエを採集し、その体内に存在する酵母を調べた。まずショウジョウバエを 1.5 mL のチューブ内ですり潰し、ハエの抽出液を得た。その後、抽出液を希釈し、バクテリアの増殖を抑制するクロラムフェニコール入りの培地にまき、酵母のシングルコロニーを得た。酵母の分類では、コロニーの色や見た目の違い、顕微鏡での形態観察などを指標にし、最終的に 26S リボソーム RNA の D1/D2 領域の配列を決定することで酵母の種を同定した。その結果、現在までに 39 属 98 種以上の野生酵母を発見し、その中には新種も含まれていることがわかった。次に、東京・大阪・沖縄などで採集した一部のショウジョウバエについて、より詳細な酵母叢（集団）を把握するためにメタ 26S 解析を行った。酵母集団からゲノムを抽出し、26S リボソーム RNA 領域を PCR で増幅して、イルミナ MiSeq によりシーケン
スデータを得た。興味深いことに、バナナなどの果実に誘引されたショウジョ
ウバエからは多様な酵母が分離されたが、特定の花を住処にするハエ（カザリシ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ Drosophila elegans や ク ワ ズ イ モ シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ
Colocasiomyia alocasiae など）からは極少数の酵母しか見つからなかった。これにより、ショウジョウバエの繁殖場所や嗜好性によって、酵母の多様性やニッチに大きく影響する種としない種が存在することが示唆された。
また、ショウジョウバエからは分裂酵母の一種 Schizosaccharomyces japonicus が複数単離された。この種は、昭和 3 年に九州帝国大学時の農学部のイチゴから分離された酵母であり、光反応性や菌糸形成など、ユニークな性質を持つことから、2000 年代に入りモデル生物として注目されている。面白いことに、ショウジョウバエから分離された Schizosaccharomyces japonicus の株は、標準株とは異なる表現型を示した。特に注目すべき相違点は、富栄養条件下でも胞子形成することである（Seike et al., J Fungi, 2021）。酵母は窒素源が不足すると増殖を止め、有性生殖による胞子形成に移行する。分離された株の解析からは、胞子形成を誘導する過程で変異が生じ、胞子形成経路の中心的な役割を果たす ste11
遺伝子に変異が見られた。ショウジョウバエから分離された Schizosaccharomyces
japonicus 系統株では、窒素源による胞子形成の制御を受けなくなった変異体であった。さらに、出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae でも、ショウジョウバエから分離された株は栄養豊富な条件下で多くの胞子を形成することが観察された。
この事実から、自然界の異なる地域から正常な遺伝子に変異を持つ酵母が複数見つかったということは、その変異が特定の環境で生存に有利であるために選択された可能性を示唆している。酵母の胞子は頑丈な胞子壁を持ち、物理的なストレスや化学的なストレスに対して耐性がある。ショウジョウバエの腸管は場所によって pH が大きく変動し（pH2〜9.5）、ハエの消化酵素などにより過酷な環境であると考えられる。そのため、酵母が胞子を作ることで、ショウジョ
ウバエの消化器官内での生存率を高め、最終的に糞として排出されることで生き残りと分散が促されると考えられる。このようなプロセスによって、酵母は新たな環境に広がり、多様性を生み出すことが可能になるかもしれない。最近、
私は酵母の胞子形成能が環境の pH により変動することを見出している（Seikeet al., unpublished）。このことからも、ショウジョウバエのような昆虫の体内は、酵母の有性生殖を促進し、多様性を生み出す理想的な場所として機能している可能性がある。
さらに、将来的にはショウジョウバエのニッチな嗜好が、酵母種の特化にどのような役割を果たすのかを解明することで、酵母の多様性についてより深い理解が得られるだろう。そのためには、バナナなどの果実に引き寄せられるショ
ウジョウバエの種の他にも、特定の植物やキノコに棲息するショウジョウバエの採集し、ハエの種と酵母の関係について調査する必要がある。現在、野生酵
母の生態学的な知見は圧倒的に不足しているため、このような研究は新たな機能を持った酵母種の単離や発見にも役立つことが期待される。

我々は、細胞が周辺の栄養状態を認識して、的確に応答する仕組みに興味を持
ち、分裂酵母 Schizosaccharomyces pombe を用いた解析を行っている。分裂酵母
は、真核細胞のモデル細胞として広く使われている酵母の一つである。分裂酵
母は栄養が豊富な環境では、通常一倍体で体細胞分裂を繰り返し、無性生殖により増殖していく。栄養が枯渇すると、無性的な増殖から性分化し、有性生殖過程 へと移行する。細胞周期の G1 期で増殖を停止し、異なる接合型の一倍体の細胞間でフェロモンの授受を行って、接合して二倍体となり、減数分裂を経て、最終的に胞子を形成し、栄養状態の回復を待つ。我々は、分裂酵母の栄養応答機構の詳細を解き明かすことを目標に研究を進めている。遺伝子レベルで生命現象を理解する上で強力な武器となる酵母の変異体を用いた遺伝学的スク
リーニングを利用した解析について紹介したい。
これまでの解析から、分裂酵母の栄養源飢餓に応答した有性生殖から無性生殖への切り換えにおいてタンパク質リン酸化酵素の TOR (target of rapamycin)キ
ナーゼが中心的な役割を担っていることがわかってきている。TOR キナーゼ
は、酵母からヒトまで真核生物全般に広く保存された Ser/Thr キナーゼで、細胞が環境変化に応答して、生体分子の生合成や分解などを適切に調節し、成長、増殖を制御する過程で不可欠な働きをしていることが知られている。また、TOR
キナーゼの異常が様々な疾患の原因になることも示されており、多くの研究者の注目を集めている。TOR キナーゼは、複合体 TORC1、TORC2 を構成し、それぞれ異なる機能を発揮する。分裂酵母や出芽酵母は二つの TOR キナーゼをもっている。分裂酵母は二つの TOR キナーゼ Tor1 と Tor2 がそれぞれ TORC2と TORC1 を形成する。一方、哺乳類は一種類の TOR キナーゼしかもっておらず、単一の TOR が複合体の構成を変えることで二つの TOR 複合体を形成している。TOR キナーゼを中心とするシグナル伝達系については、多くの情報が蓄積してきているが、未だその全貌は解き明かされていない状況にある。
分裂酵母が有性生殖過程の初期に G1 期で停止するということに注目して、栄養源飢餓時の G1 期停止に欠損のある変異体の単離が行われてきた。その後の解析から、得られた変異体(G1 arrest defective から gad 変異体と名づけられた)のうちの一つの gad2 変異株の原因遺伝子が分裂酵母の TOR の一つ tor1 であることが判明した。tor1 欠損株は、栄養が枯渇しても G1 期停止できず、有性生
殖不能の表現型を示した。
一方、もう一つの TOR である Tor2 は生育に必須であった。そこで、酵母の分子遺伝学的な手法を利用して、高温でのみ Tor2 が活性を失う、いわゆる温度感
受性株を作製した。この温度感受性株で Tor2 の活性を人為的に失わせると、通常無性的に増殖する栄養が豊富な状態であっても、細胞周期を G1 期で停止して、有性生殖を開始してしまうことがわかった。これらの結果から、有性生殖開始に対して、Tor1 が形成する TORC2 は正に、Tor2 が形成する TORC1 は負に、という対照的な働きをしていることが明らかとなった。
続いて、Tor2 と同じ経路上で働く新規因子を単離するため、遺伝学的スクリー
ニングを行った。tor2 温度感受性株と同様に富栄養状態でも有性生殖過程に移行してしまうというドラスティックな表現型を示す変異体をスクリーニングを行い、Tor2 と遺伝学的に関連する因子の探索を進めた。このスクリーニングの結果、タンパク質の合成に必須な tRNA の前駆体が、栄養状態を感知して Tor2の活性を制御するという新たな TOR の調節機構を見出した。また、Tor2 が減数分裂の開始に重要な因子などを標的にしていることなどもわかってきた。
このような我々の研究も含め、分裂酵母の TOR キナーゼに関連する研究は多数報告されているが、TOR キナーゼを中心とするシグナル伝達経路は、細胞にとって根幹的な増殖に関わる調節機構に関わっているため非常に複雑であり、未だその全貌は明らかになっていない。我々が最も興味を持っている増殖から性分化への切り換えの制御機構も謎が多いままである。我々は、これまでに、
tor1、tor2 の変異体株を複数作製してきたが、これらの変異体株を使って解析を進める中で、変異体株の中に、復帰変異が出現しやすいものが存在することを見出した。そこで、TOR キナーゼ変異の復帰変異株を網羅的に単離し、全ゲ
ノムシーケンス解析を行って変異部位を同定することにより、TOR キナーゼ経路に関わる新規の因子を探索するという新たなスクリーニングにも挑戦している。本シンポジウムでは、この最近の結果も含めて、様々な遺伝学的スクリー
ニングを行いながら少しずつ明らかになってきた有性生殖開始制御機構に関わる分裂酵母の TOR キナーゼについて紹介したい。

Diversity and Ecology of Yeasts in Drosophila

Molecular mechanisms regulating sexual differentiation in fission yeast○Taisuke Seike1,2,3(1 Grad. Sch. IST, Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ., 3 BDR, RIKEN)

Key words

yeast diversity, screening, Drosophila, 26S amplicon sequencing○Yoko Otsubo, Akira Yamashita(Nat. Inst. Basic. Biol.)

Key words

yeast, mutant, signal transduction

227

3S-Ha03

海に生息する黒色酵母が示す表現型可塑性○五島 剛太（名大・菅島臨海）
goshima@bio.nagoya-u.ac.jp

3S-Ha04

森林に潜む酵母○遠藤 力也（理研・バイオリソース）
rikiyasu@riken.jp

真菌類は海洋にも生息する。2020 年から現在までに、鳥羽市の菅島臨海実験周辺の海水、泥の中、あるいは海洋生物の体表から真菌を 300 株以上単離した。
ライブイメージングにより、いくつかの黒色酵母株では、細胞密度依存的に分裂・成長様式に可塑性が見られることが判明した。細胞密度が低い時には細胞
伸長と隔壁形成により多細胞体が生まれたのに対し、細胞密度が高い時は出芽により単細胞が増殖した（Goshima, 2022）。すなわち、単細胞か多細胞かという根本的な様式でさえ環境に応じて変化させる酵母がいることが示唆された。
ドラフトゲノム配列を決定したところ、可塑性を示す黒色酵母はいずれもDothideomycetes 綱に属していた（Kurita et al. 2023）。最近、培地の栄養状態を変えることでこれらの黒色酵母の分裂・成長様式を変換させられることがわかった。現在、表現型可塑性の分子メカニズムの理解に向け、栄養状態に正しく応答しない変異体を単離し、分析している。

我が国の 3 分の 2 を占める森林は、微生物資源の宝庫である。森林には多種の
昆虫・植物をはじめとした生物が棲息しており、酵母を含む多様な微生物と何らかの関わりをもっている。酵母といえば発酵の担い手であり、細胞生物学のモデル生物であるが、森林には多種多様な「野生酵母」が人知れず棲息している。本発表では、森林に密かに棲息する「野生酵母」を紹介し、その微生物資源としての秘めた可能性を議論する。
演者が以前、ブナ科樹木萎凋病（通称、ナラ枯れ）のベクターであるカシノナ
ガキクイムシ Platypus quercivorus（以下、カシナガ）の巣から菌類を分離した
ところ、約 20 種の酵母が検出され、そのほとんどが当時は未記載種だった。特に、2 種の酵母 Ambrosiozyma kashinagicola および Candida sp.と植物病原糸状菌
Raffaelea quercivora がカシナガの巣の奥部から必ず分離され、主要な共生菌であることが強く示唆された（Endoh et al., 2011）。カシナガは共生菌を栽培して餌にする養菌性キクイムシ Ambrosia beetles の一種であり、上記の酵母がカシナガの食餌菌である可能性が高いと考えられた。日本では約 20 種のナガキクイム
シ科昆虫と、300 種余りのキクイムシ科昆虫が記録されている（後藤，2010）。
これらの一部から高頻度に酵母が分離されることが既に確認されており（梶村，2010）、キクイムシ類だけを分離源としても多くの酵母リソースが開発できると期待される。
ナラ枯れの被害林分において、樹液が滲出するコナラやクヌギは多く観察される。樹液に「樹液酵母」群集が成立することは以前から知られているが、日本で詳細に研究された事例はなかった。演者はナラ枯れに関連した野生酵母の研究経験を活かし、樹液酵母の正体解明にも取り組んでいる。野外で採集したコ
ナ ラ の 樹 液 に は Hanseniaspora 属 、 Saccharomyces 属 、 Starmerella 属 、
Zygosaccharomyces 属などの子嚢菌酵母が優占しており、その存在量は樹液 1
μL あたり 100 万細胞をはるかに超える検体もあった。樹液は森林で最も酵母の存在密度が高いホットスポットであり、酵母リソースの開発源としてのホットスポットでもある。今後、樹液酵母と樹液を訪れる昆虫との共生関係の有無を解明していく予定である。
このように、我が国の森林は多種多様な酵母の Natural habitat であり、微生物資源の宝庫である。バクテリアやアーキアに比べれば、酵母は培養しやすい種が多く、菌株の確立や保存も容易である。バクテリアやアーキアでは難培養でカルチャーが存在しない菌種が多く、 いわゆる“微生物ダークマター”である。一方、酵母では培養が容易だが分離を試みられていないために未発見のものが多いと考えられ、“微生物ブライトマター”といえるかもしれない。菌株のリソース化に手間が比較的かからないというのは酵母の大きな利点である。微生物の資源戦略という観点からも、既知種・未知種を問わず、微生物株を研究開発に
普く利活用できるようリソース化することは極めて有意義である。酵母に関しては、例えば未利用バイオマスからのバイオ燃料産生（エタノールや油脂）、バ
イオサーファクタント（生物界面活性剤）産生といった応用利用の用途が想定される。こういった利活用の可能性を広げるために、スクリーニング源として様々な菌種・菌株のラインナップを拡充することが公的菌株保存機関（カルチャーコレクション）に求められる。とりわけ、応用利用に関して権利的な制
限の少ない国産株で多種多様なリソースを取り揃えることは益々重要になるだ
ろう。我が国の森林は、こういった課題を解決するポテンシャルを多大に秘めている。
野生酵母の生態を探究することは基礎研究の範疇だが、その過程で菌株を多数リソース化できる。それら菌株の利活用は、応用研究を主眼とする研究コミュ
ニティの支援がなければ成しえない。生物工学会を通じて応用研究・基礎研究
双方の研究者が科学的興味を共有し、森林に潜む酵母を巡る研究開発で連携する機会が増えることを切に願う。

Phenotypic plasticity of marine-derived black yeast

Unattended yeasts in forests○Gohta Goshima(Sugashima MBL, Nagoya Univ.)

Key words

yeast, marine environment, cell cycle○Rikiya Endoh(BRC, RIKEN)

Key words

yeast diversity, symbiosis, screening

228

3S-Ha05

南極と北極に住む酵母の極限環境への驚くべき適応能○辻 雅晴 1,2
（1 旭川工業高等専門学校, 2 国立極地研）
spindletuber@gmail.com

3S-Ha06

発酵環境における酵母たちの相互作用○渡辺 大輔（奈良先端大・バイオ）watanabe.daisuke@bs.naist.jp

南極や北極は極度の乾燥と低温に晒された地球上で最も過酷な環境の 1 つである。
このように世界で最も過酷な環境の 1 つである南極と北極だが、これまでに南極からは 1000 種以上、北極からは 2 万種以上の菌類が報告され、そのうち約300 種は南極域の中でも特に環境が厳しい大陸性南極、約 40 種は北緯 80°以上のカナダ高緯度北極から見つかっている。
大陸性南極やカナダ高緯度北極のような極限環境に生息している菌類は氷点下でも細胞が凍る事無く、生存する事が可能なことから有機物の最終分解者として極地における物質循環に重要な役割を果たしている。
南極の昭和基地や世界最北端の有人島と知られているカナダ高緯度北極にある
エルズミア島では、1 年のうち 10 ヶ月間は平均最高気温がマイナスとなっている。
つまり、 これらの地域では 1 年の大半が 0℃以下の気温となる。 では、 南極やカナダ高緯度北極に生息している菌類は氷点下でも成長するのだろうか？
筆者は昭和基地のある東オングル島やカナダ・エルズミア島から分離した生育
上限温度が 15℃以下の好冷菌から 30℃まで成長が可能な耐冷菌までの 20 種の酵母を選抜し、-3℃で培養することで氷点下における成長能を調べてみた。-3℃という培養温度は、 インキュベータなどの温度の誤差を考慮すると、 酵母の培養実験で広く使われている YPD 液体培地やポテト・デキストロース寒天培地が凍らない下限の温度である。
その結果、 至適増殖温度や増殖上限温度に関わらず、 全ての種で-3℃での増殖を確認した。 極地に生息している菌類は、-35℃まで呼吸をしているという報告もあることから、 氷点下でも休眠せずに活動しているようだ。驚くことに南極や高緯度北極から分離した酵母は、-80℃で凍結させた寒天培地上でも成長することを確認した。
これらの極地に生息している菌類は、一体どのように極地のような極限環境に適応しているのだろうか？
これまでの極地から分離された菌類の低温ストレスへの応答に関する研究は、
不凍タンパク質という生体において、凝固点（凍る時の温度）を低下させ、凍結防止や氷結晶の再結晶化防止による生物の生命維持に寄与するタンパク質を生産するか、細胞膜などの菌体脂肪酸組成について調べられることがほとんどだった。
極地産酵母について、不凍タンパク質の分泌を調べる試験を行なったところ、
Glaciozyma 属や Rhodotorula 属など一部の酵母が不凍活性を持っている（不凍タンパク質を生産）しているが、大部分の極地産酵母は不凍タンパク質を生産していないことが分かった。
つまり極地に生息している酵母にとって、不凍タンパク質を利用した極限環境への適応は少数派ということになる。
そこで筆者は、南極や高緯度北極で培養可能な菌類の優占種である Mrakia 属菌を至適生育温度と氷点下でそれぞれ培養した場合、培養時間の経過と共にどのような代謝反応に影響が出るのかをメタボローム解析とトランスクリプトーム
解析を用いて調べた。
その結果、低温での生育に優れた M. blollopis SK-4 株はイネなどで低温ストレス適応に関与しているとされるポリアミン類の合成経路の発現量や代謝蓄積物
量が増加していることが分かった。
SK-4 株は氷点下で培養すると寿命が延長することが分かった。ポリアミン類の合成経路の一部であるメチオニン代謝経路は、寿命の制御に関与していることから、この代謝経路について調べてみると、SK-4 株では Saccharomyces cerevisiae
がストレス応答で示すのとは異なる奇妙な代謝反応が見られた。
本講演では、SK-4 株が示したこの奇妙な代謝反応についても詳細を紹介したい。 また時間があれば極地産菌類のリソース化に向けた取り組みについてもご紹介したい。

微生物学においては、微生物を単離・同定しその純粋培養を通してキャラクタ
リゼーションを行うことが常套手段であり、発酵食品の製造に関与する微生物についても例外ではない。しかしながら、微生物が発酵食品の製造においてどのような生きざまを示し、そこにはどんな因子がどのように関与しているのかが解明し尽くされたのかというと、いまだに十分とは言えない。発酵食品の製造のように様々な成分・環境要因が存在し、時間をかけてダイナミックな変化をしていく中での微生物の本来の生態は、従来の研究手法では見落とされがちであった。本シンポジウムでは、微生物共培養実験により徐々に明らかとなってきた、発酵環境における酵母の相互作用に関する研究事例を紹介する。
発酵食品の製造に欠かすことのできない酵母 Saccharomyces cerevisiae とは、生育環境中にグルコースが存在すると、グルコース以外の炭素源の利用に関連する遺伝子の発現を抑制し、グルコース利用に関する「スペシャリスト」的な性質を示す微生物である。ところが、ある種の細菌を共存させることにより酵母の代謝調節が改変され、グルコースが存在しているにもかかわらず他の炭素源を利用する「ジェネラリスト」的な性質へと変化することが明らかになった。
我々は、伝統的な清酒醸造法として知られる生酛（きもと）造りの酒母で認められる代表的な生酛乳酸菌を清酒酵母と共培養させた結果、元々グルコース利
用の「スペシャリスト」であった清酒酵母が「ジェネラリスト」へと変化することを明らかにした。伝統的な製法における乳酸菌は、単に乳酸を産生して雑菌の生育を抑制するだけでなく、清酒酵母の炭素代謝能力を改変していることが判明した 1)。驚くべきことに、この作用は酵母と乳酸菌の種類によって強弱が異なることも見出した。
「スペシャリスト」から「ジェネラリスト」への代謝
改変は、生酛造りにおける酒母の中で実際に共存する微生物の間で選択的に引き起こされる現象であり、この作用が強いほど両者が共生しやすい可能性が想定された。さらに、代謝改変を受けた「ジェネラリスト」はアルコール発酵の立ち上がりが有意に遅くなることを見出した。発酵試験終了後のエタノール収量には差が見られなかったが、酵母の死滅率が顕著に低下したことから、アルコール発酵の遅延によって高濃度のエタノールにさらされる期間が短く済み、死滅を免れているのではないかと考察した。エタノールストレスの低減は、酵母だけでなく共存する他の全ての微生物にとってのメリットとなる。酵母と共存する細菌は、酵母のアルコール発酵を遅延させることで微生物生態系の共存・共栄を図っているのかもしれない。この現象に関与する酵母側の因子として、
グローバルな転写調節に必須な Cyc8p-Tup1p 複合体を同定した 2)。
伝統的な発酵食品の製造では、原材料に由来する微生物叢との相互作用も考慮していく必要がある。近年我々は、ワインの起源を模した自発的な発酵におけるブドウ果皮常在菌の役割を新たに見出した 3)。通説では、ワインの原料であるブドウの果皮にアルコール発酵を行うことのできるワイン酵母（S. cerevisiae
およびその近縁種）が存在すると信じられてきたが、実際には、傷のない健全なブドウの果皮にはワイン酵母がほとんど生育しておらず、アルコール発酵能のないまたは低い常在性の微生物からなる生態系が形成されている。代表的なブドウ果皮常在菌の一種である Aureobasidium pullulans と S. cerevisiae との表現型を比較した結果、A. pullulans は植物表層の細胞壁やクチクラ層を分解するための酵素を細胞外に分泌し、その分解産物を単一の炭素源として利用し生育する高い能力を有することを見出した。特に、クチクラ層の分解産物である ω-ヒドロキシパルミチン酸を利用できる微生物は、本研究において初めて発見された。ブドウ果皮常在菌は、植物表層の細胞壁やクチクラ層を分解し、その分解産物を自らのエネルギーに変換する能力によってブドウ果皮に常在できると考えられる。次に、最少培地に無傷のブドウ果実を炭素源として添加した条件でのアルコール発酵を調べた結果、A. pullulans を S. cerevisiae と共培養すること
により、S. cerevisiae 単独の場合と比べて顕著に高い発酵速度を示した。以上の結果から、S. cerevisiae がブドウ果実内部の糖分にアクセスして自発的にアルコール発酵を行う上で、植物表層の細胞壁やクチクラ層が障壁となっている可能性が示唆された。A. pullulans 自身はアルコール発酵性を有さないが、植物表層を分解して消費する能力を介して S. cerevisiae の糖分へのアクセスを促進しアルコール発酵に貢献していると考えられる。
【参考文献】
1) D. Watanabe et al., J. Biosci. Bioeng., 126, 624-629 (2018)2) D. Watanabe et al., Int. J. Mol. Sci. (submitted)
3) D. Watanabe and W. Hashimoto, Sci. Rep., doi: 10.1038/s41598-023-35734-z(2023)

Remarkable adaptability to extreme environments of Antarctic and Arctic
yeastsInteraction of yeasts in fermentation environments○Masaharu Tsuji1,2(1 Natl. Inst. Technol. Asahikawa College, 2 Natl. Inst. Polar Res.)

Key words

yeast, Antarctica, Arctic, cold-adapted microorganism○Daisuke Watanabe(Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)

Key words

yeast, fermented food, microbial interaction, alcoholic fermentation

229

3S-Ja01

Trimeric autotransporter adhesins: structure, function,
evolution

3S-Ja02○Dirk Linke(Dept. Biosci., Univ. of Oslo)dirk.linke@ibv.uio.no

Methods and assays to study protein transport in vitro○Enguo Fan(Peking Union Med. Coll./Chinese Academy of Med. Sci.)
enguo.fan@ibms.pumc.edu.cn

Trimeric autotransporter adhesins (TAAs) are a subset of a larger protein family called
the type V secretion systems. They are localized on the cell surface of Gram-negative
bacteria, function as mediators of attachment to inorganic surfaces and host cells, andthus include important virulence factors. Understanding their structure and function is
key to a multitude of biotechnology applications. I will present recent work on the type
V secretion process and on how we can block the process to achieve stalled transportintermediates. I will also present data to show the complex repeat structure of these
fibrous surface proteins, and disucss the evolutionary implications of these repeats.
Finally, I will discuss the eukaryotic binding partners of these adhesins, and how
variations in the binding domains can be used by pathogens to change binding
properties, and thus potentially, the outcome of infections.

Gram-negative bacteria secret many virulence factors across the outer membrane byuse of the type-V secretion pathway, which is either a dedicated translocator protein(two-partner secretion) or is a covalently fused translocator domain (autotransporters)that both are β-barrels. It is currently known that the assembly of these β-barrels
requires the β-barrel assembly machinery (BAM). To understand the molecular detailsof the insertion of these β-barrels by the BAM as well as the type-V proteintranslocation across the outer membrane, we have developed a versatile in vitro
investigation systems that faithfully recapitulates both branches of the type-V secretion
pathway and the assembly of β-barrel outer membrane proteins. The application of thissystem to various example substrates and the new results obtained with this assay will
be presented and discussed.

Trimeric autotransporter adhesins: structure, function, evolution

Methods and assays to study protein transport in vitro○Dirk Linke(Dept. Biosci., Univ. of Oslo)

Key words

adhesion, 1NMR, transmembrane domain○Enguo Fan(Peking Union Med. Coll./Chinese Academy of Med. Sci.)

Key words

protein, in vitro assay

230

3S-Ja03

Analysis of fish epidermal bacteriota for the developmentof novel disease control methods in aquaculture

3S-Jp01

Loading cargo and messaging by bacterial extracellular
vesicles○Hanne C Winther-Larsen1, Petter Langlete1, Anders Krabberoed2(1 Dept. Pharm., Univ. of Oslo, 2 Dept. Biosci., Univ. of Oslo)hannewi@farmasi.uio.no○Hajime Nakatani1, Fumiyoshi Okazaki2, Tomoko Arakawa1,
Dien Anggorowati4, Khairul Anam3, Dwi Susilaningsih3,
Yutaka Tamaru2, Katsutoshi Hori1(1 Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2 Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ.,
3
RC-AM, BRIN, 4 RC-MLB, BRIN)
nakatanih@chembio.nagoya-u.ac.jp
One of the obstacles to improving aquaculture productivity is the problem of massmortality caused by poor growth or disease outbreaks in juvenile fish, and methods forsolving this problem are being explored. While traditional measures such as the use ofantibiotics and vaccination have been employed, these approaches have encounteredissues such as the emergence of antibiotic-resistant bacteria and the limited range ofpathogens to which vaccines can be applied.
We have conducted research focusing on the function of microbial communities(microbiomes). Specifically, we initiated a study using the skin microbiome of fish as amodel, and gained insights into the role of changes in the skin microbiome due tostress and the role of the skin microbiome in protecting against pathogen infections
through a dermal infection model using the zebrafish, an experimental fish species. We
have also analyzed the changes in the skin microbiome of rainbow trout reared on afish farm and found that the composition of the microbiome changes significantly, withbacteria species possessing antibacterial activity being identified as one of the causesof these changes.
To apply this fundamental knowledge of fish skin microbiomes to disease prevention
strategies for aquaculture, we developed a new disease control method called "fishepidermal probiotics" that uses the bacteria with antimicrobial activity derived isolated
from the skin mucus to complement existing measures such as antibiotics andvaccines, and we have been conducting the studies for its feasibility. Our findings
show that many antimicrobial bacteria derived from fish skin mucus have the ability tosuppress the growth of multiple fish pathogens. In infection prevention experiments
using zebrafish and rainbow trout, multiple doses of the bacteria in the water prevented
pathogen infection and significantly improved survival rates.
Furthermore, we are conducting studies to expand the use of fish epidermal probiotics
in many kinds of fish and evaluate the effect on reducing antibiotic usage inaquaculture. The latter is particularly important for addressing the problem ofantibiotic-resistant bacteria, and we have conducted a collaborative research projectwith a research institution in Indonesia, where the use of antibiotics in fish farming isreportedly high, to address this issue.

Extracellular vesicles secreted by Gram-negative bacteria resemble smaller versions of
the bacterial mother cell, with contents of proteins, LPS, DNA and RNA. They have
proven to be important in bacterial defense mechanisms, cellular communication andhost-pathogen interactions and it is of interest to properly characterize their cargo. We
have characterized the genetic content of the vesicles compared that to the proteomic
content. DNA analysis reveals enrichment of nucleic acid containing specific protein
binding sites, as well as a positive correlation with AT-content. Some mRNAs werehighly enriched in the vesicle fraction, and a negative correlation was found between
mRNA enrichment and transcript length, suggesting mRNA inclusion in vesicles may
be a size-dependent process. A negative correlation was found between transcript andprotein enrichment. This result opposes the hypothesis that a significant degree ofprotein translation occurs in vesicles after budding.

Analysis of fish epidermal bacteriota for the development of novel disease
control methods in aquaculture

Loading cargo and messaging by bacterial extracellular vesicles○Hajime Nakatani1, Fumiyoshi Okazaki2, Tomoko Arakawa1, Dien Anggorowati4,
Khairul Anam3, Dwi Susilaningsih3, Yutaka Tamaru2, Katsutoshi Hori1(1 Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2 Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ., 3 RC-AM,
BRIN, 4 RC-MLB, BRIN)

Key words

microbiome, probiotics○Hanne C Winther-Larsen1, Petter Langlete1, Anders Krabberoed2(1 Dept. Pharm., Univ. of Oslo, 2 Dept. Biosci., Univ. of Oslo)

Key words

pathogen, vesicular transport, FISH, bacteria

231

3S-Jp02

Using Escherichia coli as a model to test Helicobacter
pylori urease inhibitors

3S-Jp03○Marta Sanz Gaitero1, Eva Mariana de Sousa Cunha1, Dirk Linke2,
Hartmut Luecke3(1 Structural Biology and Drug Discovery group, Centre for
Molecular Medicine Norway, Univ. of Oslo, 2 Dept. Biosci.,
Section for Genetics and Evolutionary Biology, Univ. of Oslo,3
Dept. Physiol., Biophys., Univ. of California, Irvine)
martasg@uio.no

Chemical decontamination strategies for treating periimplant diseases - using an in vitro dental pellicle-, and amultispecies biofilm model○Badra Hussain1, Havard Jostein Haugen1, Roger Simm2(1 Dept. Biomater., Inst. Clin. Dent., Univ. of Oslo, 2 Inst. Oral Biol.,Fac. Dent., Univ. of Oslo)badra.hussain@odont.uio.no

Helicobacter pylori infects about 50% of the world’s population. Chronic colonizationof the stomach is associated with several gastric diseases, including gastric carcinoma.
Hence, the consequences of gastric colonization argue for its eradication. Standard H.
pylori eradication triple therapy involves at least two antibiotics and a proton pumpinhibitor. Nowadays, with the failure rates of traditional treatment exceeding 30%,
there is a critical need for an eradication strategy to complement or replace antibiotic
therapy not affecting the normal microbiome. H. pylori is able to colonize the acidic
gastric environment of the mammalian stomach via the mechanism of acid acclimation,
which allows the organism to maintain a relatively neutral periplasm even when
exposed to high medium acidity. A major component of the acid acclimation
mechanism is urease, which hydrolyzes each urea molecule into two NH3 and one CO2,
molecules, buffering both cytoplasm and periplasm against entering protons fromgastric acid. Our aim is to develop an innovative monotherapy by targeting the H.
pylori-specific 1.1 MDa cytoplasmic urease complex. To reach this goal we use E. coli
expressing the genes necessary to produce H. pylori urease as a model to test different
urease inhibitor drugs at a low pH and will analyze structure/function relationships of
the urease- inhibitor complexes using cryo-EM.

Dental implants are frequently used as a treatment option for tooth loss, with excellent
success rates in osseointegration. One of the biggest problems associated with dental
implants is peri-implantitis. Peri-implantitis is defined as a destructive inflammatory
lesion with an accelerating pattern affecting the peri-implant bone of the implants infunction, all of which are initially osseointegrated. Biofilm is widely recognized as theprimary cause of peri-implant diseases. Biofilm formation begins with the formation ofa pellicle layer on the surface, which serves as a foundation for bacterial attachment
and subsequent biofilm maturation. The adhesion of proteins to the surface facilitatesbacterial attachment and biofilm development. In this study the effectiveness of six
available chemical debridement solutions in removing the acquired pellicle andpreventing pellicle re-formation, as well as in removing a multispecies oral biofilm
growing on a titanium implant surface model is evaluated.
Six chemical decontamination solutions, EDTA (Prefgel), NaOCl (Perisolv), Hydrogen
peroxide (Sigma-Aldrich), Poloxamer gel (Pluronic), Poloxamer gel+ Hydrogen
peroxide (NuboneClean) and Chlorhexidine (GUM Paroex), were evaluated in thiscontrolled laboratory study. In the first part of this study, pooled saliva from healthy
individuals was applied to moderately rough titanium surfaces mimicking the
OsseoSpeed® implant. Two parallel sets of discs were used. The first group was
decontaminated and analyzed, while the other was decontaminated, re-contaminatedwith the pooled saliva, and analyzed again to evaluate the pellicle formation on thesurface after decontamination. The cleanness of the surfaces was assessed with contact
angle measurements and X-ray spectroscopy. In the second part of this study, threebacterial strains were used for growing a multispecies biofilm (S. oralis, F. nucleatumand A. actinomycetemcomitans) onto the surface. A mixed bacterial suspension wasplaced over the titanium discs and incubated under anaerobic conditions at 37°C for 60
hours and then submitted to cleaning. After completion of the cleaning procedure, thesurfaces were analyzed by evaluating biofilm biomass, biofilm viability, and biofilm
thickness and morphology.
Activating the detergent effect of the poloxamer using hydrogen peroxide provides asignificant synergetic effect compared to the two ingredients alone. This group showedbeneficial effects by hampering pellicle formation on the titanium surface, producing
surfaces with less carbon contamination compared to the other test groups. This groupalso showed less viable bacteria and a lower Live/Dead ratio compared to the negative
control. None of the groups showed complete biofilm removal.

Using Escherichia coli as a model to test Helicobacter pylori urease
inhibitors

Chemical decontamination strategies for treating peri-implant diseases using an in vitro dental pellicle-, and a multispecies biofilm model○Marta Sanz Gaitero1, Eva Mariana de Sousa Cunha1, Dirk Linke2,
Hartmut Luecke3(1 Structural Biology and Drug Discovery group, Centre for Molecular Medicine
Norway, Univ. of Oslo, 2 Dept. Biosci., Section for Genetics and Evolutionary
Biology, Univ. of Oslo, 3 Dept. Physiol., Biophys., Univ. of California, Irvine)
Key words
Helicobacter pylori, structural biology, drug discovery, urease○Badra Hussain1, Havard Jostein Haugen1, Roger Simm2(1 Dept. Biomater., Inst. Clin. Dent., Univ. of Oslo, 2 Inst. Oral Biol., Fac. Dent.,
Univ. of Oslo)

Key words

biofilm, pellicle, peri-implantitis

232

3S-Jp04

Experimental and computational approaches to themolecular characterization of a bacterial adhesin protein

3S-Ka01

再構成型無細胞タンパク質合成系（PUREfrex）で何が
できるか？
○金森 崇
（ジーンフロンティア）
kanamori@genefrontier.com○Katsutoshi Hori, Jun Sasahara, Amane Kato, Shogo Yoshimoto(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)
khori@chembio.nagoya-u.ac.jp

Acinetobacter sp. Tol 5, a toluene-degrading bacterium that we previously isolated
from a biofiltration system, exhibits autoagglutination and high adhesiveness to solid
surfaces. Tol 5 cells quickly adhere to various material surfaces, from hydrophobic
plastics to hydrophilic glass and metals, independent of biofilm formation. Atomic
force microscopy (AFM) revealed that the adhesion force of Tol 5 to a sharp silicon
nitride probe was near 2 nN, which was 1–2 orders of magnitude stronger than that ofother highly adhesive bacteria. This characteristic nonspecific adhesiveness of Tol 5
cells is mediated by a single protein, AtaA, a member of the trimeric autotransporter
adhesin (TAA) family.
TAAs on the cell surface of Gram-negative pathogens mediate bacterial adhesion tohost cells and extracellular matrix proteins. However, AtaA of the strain Tol 5 shows
nonspecific high adhesiveness to abiotic material surfaces as well as to biotic surfaces.
It consists of a passenger domain secreted by the C-terminal transmembrane anchor
domain (TM), and the passenger domain contains an N-terminal head, N-terminal
stalk, C-terminal head (Chead), and C-terminal stalk (Cstalk). The Chead-Cstalk-TM
fragment, which is conserved in many Acinetobacter TAAs, has by itself the headstalk-anchor architecture of a complete TAA. Previously, we detrermined the crystal
structure of the Chead-Cstalk fragment, AtaA_C-terminal passenger domain (CPSD),
providing the first view of several conserved TAA domains. The YadA-like head
(Ylhead) of the fragment is capped by a unique structure (headCap), composed of threebeta-hairpins and a connector motif; it also contains a head insert motif (HIM1) before
its last inner beta-strand. The headCap, Ylhead, and HIM1 integrally form a stable
Chead structure. Some of the major domains of the CPSD fragment are inherently
flexible and provide bending sites for the fiber between segments whose toughness is
ensured by topological chain exchange and hydrophobic core formation inside thetrimer. Thus, although adherence assays using in-frame deletion mutants revealed thatthe characteristic adhesive sites of AtaA reside in its N-terminal part, the flexibility andtoughness of the CPSD part provide the resilience that enables the adhesive propertiesof the full-length fiber across a wide range of conditions.
In this study, we elucidated the molecular mechanics and stability of Chead, using
atomic force microscopy (AFM) and steered molecular dynamics (SMD) simulations.
Chead proved to be very robust compared to other adhesins, and the Ylhead domain
was shown to unfold after the headCap domain was disrupted. Thus, the toughheadCap protects unstable Ylhead like an armor. We have identified the residue
contributing to Chead's resilience inside the headCap by introducing a point mutation.
Analysis of force propagation networks during headCap collapse visualized Chead's
mechanical pathways, suggesting that the trimeric structure of Chead effectively
prevents structural collapse by dispersing mechanical loads.

PUREfrex®は、再構成型無細胞タンパク質合成系「PURE system」（Ref.1）をもとに我々が開発した反応系である。オリジナルの PURE system と比較して、構成タンパク質にヒスチジンタグなどのタグ配列が付加されていない、反応液に混入している LPS や RNase が減少している、という違いがある。PUREfrex を発売してから 10 年以上経ち、リボソームなどの構成因子の調製方法や反応液組成の改良を進めた結果、現在では、最大で 1mg/mL の合成量を得ることも可能になっている。本発表では、PUREfrex を使用した下記のような事例を紹介しながら、PUREfrex の可能性について議論したい。
1. 配列と合成量
PUREfrex を用いたタンパク質合成では、合成するタンパク質によって合成量が大きく異なる。さまざまな報告で N 末端の塩基配列がタンパク質の合成量に影響を与えることが示されているが、PUREfrex においても、N 末端のアミノ酸のコドンは、メジャーコドンよりも AT リッチなコドンにした方が良いことを確認している。また、N 末端領域の 1 アミノ酸置換により、低温での合成量が大きく変化することも見出している。このように、分解反応などが起こらない
PUREfrex を用いることで、タンパク質合成効率と配列の関係を特定することが容易になる。
2. 翻訳後修飾
PUREfrex は精製因子から翻訳反応を再構成した系のため、そのままではポリペプチドが合成されるだけである。しかし、適切な因子を添加して反応を行うことにより、さまざまな翻訳後修飾を制御して行うことができる。例えば、ジス
ルフィド結合が必要な抗体（IgG）分子の合成では、還元剤と酸化剤で酸化還元状態を制御し、反応時間、反応温度などの合成条件を最適化することで抗原結合活性を有した IgG を合成できている（Ref.2）。また、大腸菌で発現、調製することが難しい N 末端修飾タンパク質も、PUREfrex 反応液に修飾酵素と基質を添加することにより合成できることを確認している（Ref.3）。このように、目的の翻訳後修飾に必要な因子を PUREfrex に適切に添加することで、翻訳後修飾されたタンパク質を合成することも可能である。
3. Ribosome display
無細胞タンパク質合成系を利用した分子選択技術（in vitro ディスプレイ）が利用されている。例えば、リボソームディスプレイ、mRNA ディスプレイ、cDNA
ディスプレイと呼ばれる技術である。in vitro ディスプレイでは、反応液内でRNA や提示されたタンパク質（ペプチド）が安定に存在することが重要である
ため、RNase やプロテアーゼがほとんど含まれない PUREfrex はこの技術に最適な無細胞タンパク質合成系である（Ref.4）。
4. 合成生物学での利用
近年、生物（やそのシステム）を人為的に構築，操作することで生物を理解、利用する「合成（構成的）生物学」と呼ばれる分野の研究が進展している。
PUREfrex は、100 種類以上の分子から翻訳反応を再構成した系であり、まさに合成生物学を体現するものである。様々な生命システムに関与するタンパク質を合成する PUREfrex を、リポソームや油中水滴のような微小区画内に封じた系は、人工細胞の基盤となり得る。最近では，PUREfrex に他の生命システムを組み合わせて、多様な機能を有した人工細胞の構築に向けた研究が行われている。例えば，DNA 複製系と組み合わせて DNA 複製を伴う分子進化を行う人工細胞や、ATP 合成酵素と組み合わせて光による ATP 産生能を有する人工細胞が報告されている。もともと、無細胞タンパク質合成系は、細胞が有しているタンパク質合成能力を借りて、細胞外でタンパク質を合成する技術として開発された。しかし、PUREfrex は、精製した分子から再構成した翻訳系という利点を生かし、単純にタンパク質を作る目的以外にも様々な技術のベースとして利用されてきている。特に、合成生物学の分野においては、非常に重要な基盤技術であり、今後もますます利用されていくと考えられる。
Ref.1) Shimizu et al. (2001) Nat. Biotechnol., 19, 751., Ref.2) Murakami et al. (2019)
Sci. Rep., 9, 671., Ref.3) Matsumoto et al. in revised., Ref.4) Tsuihiji et al. (2022)
Pharmaceuticals, 15, 1506.

Experimental and computational approaches to the molecularcharacterization of a bacterial adhesin protein

What can be done using PUREfrex?

○Katsutoshi Hori, Jun Sasahara, Amane Kato, Shogo Yoshimoto(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

Key words
strengthadhesion molecules, AFM, molecular dynamics simulation, mechanical○Takashi Kanamori(GeneFrontier Corp.)

Key words

cell-free protein synthesis, synthetic biology, in vitro display

233

3S-Ka02

翻訳促進ペプチドの開発とバイオモノづくりへの応用○加藤 晃代, 中野 秀雄（名大院・生命農学）
teruyo@agr.nagoya-u.ac.jp

3S-Ka03

進化工学のための再構成型無細胞翻訳系開発とその産業応用○根本 直人 1,2（1 埼玉大, 2 Epsilon Molecular Engineering）
nemoto@mail.saitama-u.ac.jp

酵素や抗体などの有用なタンパク質は、ライフサイエンス研究・産業を支える分子のひとつであり、所望の機能を有するタンパク質を見つけ最適化したり、
低環境負荷でタンパク質を大量に作り利用しやすくしたりするための技術開発
は、持続可能な産業発展のためにもますます重要になってきている。
一方で、コドンや誘導条件を検討しても、発現すらしてくれないタンパク質に遭遇したことはないだろうか。そのようなタンパク質は「難発現タンパク質（difficult-to-express protein）」と呼ばれ、研究開発を滞らせる厄介な存在である。
難発現の原因として、mRNA の構造や UTR が良くない、プロモーターとの相性が悪い、プロテアーゼに分解されやすい、そもそもの分子量が大きすぎるから仕方ない、などの様々な理由が考えられているが、実は明確には分かっていないことが多い。
そんな中、演者のグループでは、大腸菌や酵母においてほとんど生産されなかった難発現タンパク質の生産性を増大できる、Ser-Lys-Ile-Lys の 4 アミノ酸残基から成る SKIK ペプチドタグを開発してきた[1]。タンパク質のＮ末端、つまり開始コドンの直後に SKIK をコードする 12 残基を付加して発現させる、という簡単な方法である。そのメカニズムは謎であったが、生細胞のみならず無細胞タンパク質合成系で生産困難だったタンパク質の生産量も増大させることができた。
最近は、SKIK タグによるタンパク質生産増大メカニズムを解明すべく、生細胞系に加え、転写・翻訳に必要な成分以外が含まれない再構成系の大腸菌無細胞タンパク質合成系を用いた研究を進めてきた。その結果、コドンは何でも良いことや、転写ではなく翻訳が効率化されていることなどがわかってきた。そして、翻訳を停止させてしまう新生鎖として知られるアレストペプチドと SKIK
を組み合わせた実験により、ユニークな現象を見出した。それは、翻訳工程で生じる SKIK という新生ペプチドが、アレスト性ペプチドによるリボソームの翻訳停止効果を打ち消し、その結果タンパク質生産量を増大させているというものである[2]。
現在は、細胞の状態や代謝物などの影響を受けない再構成系無細胞タンパク質のメリットを活用し、そのような新生ペプチドが翻訳工程でどのように翻訳を促進しているのかについての詳細な解析を進めている。また、新規かつ強度の異なる翻訳促進ペプチドを探索しその特徴を明らかにすべく、翻訳促進ペプチ
ドを生細胞系および無細胞系で探索したり、その効果・強度を評価したりするための系を開発している。
本講演では、大腸菌の再構成系無細胞タンパク質とヒト細胞由来の無細胞タン
パク質合成系を中心に、翻訳促進ペプチドの探索・評価、そしてバイオモノづ
くりへの応用展望について紹介したい。
[1] J. Biosci. Bioeng., 123, 540 (2017)[2] J. Biol. Chem., 299, 104676 (2023)

はじめに私が「無細胞タンパク質合成系」という言葉に出会ったのは、今からちょうど
30 年ぐらい前で 1992 年頃、当時 8 年間勤めた高校教員を辞めて埼玉大の伏見譲教授と今後の研究の話をしている時であった。1990 年は進化分子工学の有効性が実証された年で、ハーバード大の Szostak 博士が RNA の in vitro selection でNature に、G.P. Smith 博士のファージディスプレイによるペプチドの in vitro
selection が Science に発表された年である。実は、Smith 博士がファージディス
プレイに用いた fd ファージは伏見先生がインスピレーションを与えている。そのような経緯もあり、当時の伏見研究室ではファージディスプレイを超える「遺伝子型―表現型対応付け分子」の開発が研究テーマに挙がっていた。博士課程のテーマとしてファージディスプレイを超える技術を考えるために伏見先生に紹介頂いた論文が 1988 年に Science に発表されたロシアの Spirin 博士の連続無細胞翻訳系に関するものであった。当時、無細胞翻訳系は合成量が少なくこれを用いたバイオツールは実用性に乏しいと考えられた。しかしこのような中で、
Spirin 博士の研究は従来の見方を覆す画期的な成果である。今になって思えば、
リボソームを含む翻訳系が生物学的な「翻訳反応」から合成生物学的な「翻訳分子システム」として捉えられる契機だったのかもしれない。いずれにしてこの頃から無細胞翻訳系は私の主要な研究ツールであり、研究テーマとなったのである。
In vitro virus (mRNA display)開発
しかしながら、教員を辞めて大学院に入学したそもそもの目的はいわゆる「生命の起源」を研究したいためであった。今でこそ生命の起源は宇宙生物学や合成生物学の興隆もあり、最先端の学際分野として受け入れられつつあるが、1990
年当時はそれを真顔で言うと物好きか変人扱いされる雰囲気であったと思う。
そんなことは一向に気にならなかったのは当時の私は「世の中で一番役に立たないことをしよう」と覚悟を決めて大学院に入ったからに他ならない。さて、生命の起源研究はどれも難問といえば難問だが、とりわけコード化された RNAから鋳型依存的にタンパク質が合成されるメカニズム、つまり翻訳系の起源がもっとも大きな謎であると思えた。M. Eigen 博士の Hypercycle 理論はまさにこの翻訳系の起源に対する理論的なアプローチであった。一見、もっともらしい
完璧な理論なのだが、１点、この系はダーウィン進化のような漸進的進化が許されない。そこで、この系にダーウィン進化を導入するためにはウイルス型遺伝子型-表現型対応付け分子が必要であることを証明した（1）。次は実際にこのｍ RNA とそれにコードされたポリペプチドを連結した分子を実験的に実現することが目標となった。私はその頃（1992 年）、まだ有名なワトソンの教科書「遺伝子の分子生物学」で分子生物学を自習していた。そんなある日、あるペー
ジで目が釘付けになった。そこにはピューロマイシンという抗生物質が伸長中のポリペプチドの C 末端にリボソーム上で連結する模式図があった。
「ｍ RNA
の 3’末端をピューロマイシンで修飾すれば、伸長中のポリペプチドにリボソー
ム上でｍ RNA は連結するのではないか」というのがその時閃いたアイデアであった。私はすぐさま指導教官であった伏見先生の教官室に行った。3 時間程
度白板を前に立ったままその可能性を議論しただろうか。紆余曲折の後、私はそのアイデアを実験的に証明するために三菱化学生命化学研究所の柳川弘志博士のもとで研究を始め、ピューロマイシンを介してリボソーム上でｍ RNA とタンパク質が共有結合することを証明したのは 1997 年であった（2）。しかし、この時の連結効率は 0.01％程度であって、実用化にはほど遠いものだった。
再構成型無細胞翻訳系とｍ RNA display
In vitro virus(mRNA display)は何とかできたもののその合成効率は実用化には程遠いものであった。課題には次のようなものがある。１）mRNA とピューロマ
イシン・リンカーの連結効率 ２）mRNA の不安定性による selection の制限 ３）
伸長中のポリペプチドとピューロマイシンの連結効率、等々であった。各プロ
セスの効率化を一つ一つ解決し、mRNA display を安定化した cDNA display まで開発したものの最終収率は 10％程度で、何とか使いこなすことができる段階であった。これ以上の収率は難しいと諦めかけた頃、埼玉大理学部の戸澤譲先生が再構成型無細胞翻訳系（PURE system）で組成を検討し、この効率を上げることを提案いただいた。最終的に現在、60％まで収率が向上し、今までライ
ブラリの大部分を無駄にしていた状況を克服できるようになった。更に無細胞
翻訳系そのものの合成効率の向上によって、ペプチドやドメインレベルのタン
パク質だけでなく酵素等の標準的なタンパク質の進化工学にも貢献するものと期待している。
（１）N. Nemoto, Y. Husimi, J. theor. Biol. (1995) 176, 67–77（２）N. Nemoto, et al., FEBS Lett., (1997) 414, 405-408

Development of translation enhancing peptide and its use in the bio-industry

A modified PURE system for evolutionary molecular engineering and its
industrial applications○Teruyo Kato, Hideo Nakano(Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)

Key words

translation, peptide, Escherichia coli

○Naoto Nemoto1,2(1 Saitama University, 2 Epsilon Molecular Engineering)

Key words
in vitro molecular evolutionary engineering, phage display, protein
engineering, translation

234

3S-Ka04 In vitro molecular display for enzyme evolution

3S-Ka05

Evolutionary molecular engineering plays a major role in protein design. Randommutagenesis is used to generate large genetic diversity which is then expressed to thecorresponding proteins and selected under directed evolutionary pressure. Selected
proteins and peptides usually acquire greatly improved properties as compared to thestarting template sequence.
Due to the large generated diversity, selection is the most critical step for the successful
and timely acquisition of evolved proteins with desired properties. Traditionally,
selection is done by screening of microbial colonies transformed with DNA library, aslow and laborious process limited by the cell transformation efficiency, and toxicity ofsome proteins to the cells. In vitro selection methods enable screening of the largest
libraries, of up to 1013 variants, because these do not use living cells but rely on cellfree protein synthesis and stable connection between genotype and phenotype, realized
through compartmentalization of DNA and corresponding protein pairs, or display
technologies where genotype and phenotype are physically linked on a single molecule
level without compartmentalization. While display technologies have been widely used
for peptide and antibody fragment evolution, there is only one published study
describing the evolution of enzymes using mRNA display technology. Reasons are
numerous and encompass challenges in the efficiency of display formation, display ofenzymes in active form as well as difficulties in the design of appropriate selection fordifferent enzyme chemistries.
Inspired by the numerous advantages of in vitro display methods, we teamed up with
the Nemoto group from Saitama University and established a cDNA display (Nemoto
et al., FEBS Lett, 1997) based system for substrate profiling of transglutaminases(Damnjanović et al., Sci Rep, 2022). In the following, the established system was used
as a base to develop similar systems that would allow us to evolve diverse enzymes.
The first target to evolve by the new system was D-amino acid oxidase (DAAO) whichplays a crucial role in the detection and quantification of D-amino acids (DAAs)
serving as markers for diseases and pathologies. Currently used methods to distinguishand quantify individual DAAs (e.g. HPLC) are slow and costly, and difficult to apply
in population-wide health monitoring or disease screening. DAAO is an enzyme
reacting on most DAAs except for D-Asp and D-Glu. However, if the substratepreference of DAAO could be evolved towards individual DAAs, the enzymatic assay
system for DAA quantification can be constructed. Thus, we aimed at establishing anefficient system for DAAO evolution towards substrate specificity change.
cDNA display of DAAO using the conventional method was prepared with a reporter
enzyme that would convert DAAO activity into biotinylation of target cDNA display
complexes. By subsequently recovering these complexes using streptavidin-coatedmagnetic beads, it is possible to analyze the genetic information of selected DAAO
enzymes. First, we confirmed that DAAO derived from Schizosaccharomyces pombe
could be synthesized in an active form using the PURE system. Next, we performedmodel library (mixtures of different molar ratios of wild-type and inactive DAAO
genes) screening as a proof of concept that the system operates as predicted. As aresult, the active DAAO gene was enriched.
Besides DAAO, we focused our efforts on developing a system for the evolution of
microbial transglutaminase (mTG), important for position-specific crosslinking during
the production of antibody-drug conjugates as pharmaceuticals.
We first established cell-free protein synthesis of active mTG in the PURE system by
optimizing its propeptide sequence according to previous studies and our own
experience with this protein. Based on the synthesis level and activity, the mostpromising mTG candidates were selected and displayed on a single-molecule level(mRNA-linker-mTG complex). The expression and activity of displayed mTG were
measured. The results revealed that the displayed mTG retained its enzymatic activity.
Currently, we are optimizing the selection conditions and testing the efficiency ofenrichment under different conditions.

人工抗体は、ファージディスプレイや mRNA ディスプレイなどの in vitro 選択
法により作製される抗体代替品である。我々は近年、高速 in vitro 選択法（TRAP
ディスプレイ）を開発し、様々な標的に対して人工抗体を創製する研究を行っている。例えば、ヒトフィブロネクチンの BC ループと FG ループに 18-22 個のランダムな残基を持つライブラリから、IC50 = 46 pM という非常に強い中和活性を持つ SARS-CoV-2 の中和抗体の選択に応用したことを報告した（Science
Advances, 2020, 6(42), eabd3916.）, Life Science Alliance, 2022, 5, 6, e202101322.）。
さらに近年では、同様のライブラリを使用して、人工リガンドである 1-(4hydroxyphenyl)-3-phenylurea (HPPU)に、KD = 8 nM）で結合するモノボディの創製にも成功している（投稿準備中）。
高速 in vitro 選択法において重要な因子の一つが、人工抗体の多様性を高める工夫である。我々は近年、多様性を決定する因子である TRAP 提示法を用いた人工抗体の提示効率について、大腸菌リボソームの P サイトと E サイトのコドンが大きな影響を及ぼしていることを突き止めた。これにより、ライブラリの多様性を最大限にする配列を取得した（論文査読中）。
高速 in vitro 選択法において重要なもうひとつの因子がライブリの質である。これは、例えば、15 残基のランダム配列の理論的多様性は 10^19 であるが、実験的に調製できる多様性が 10^13–^14 程度と、実験では理論の多様性をほとんど網羅できないためである。実際に哺乳類の抗体 IgG では Tyr の出現率が高く、また、人工抗体 monobody では Trp の出現率が高い。このことから、Tyr, Trp
は、タンパク質の結合形成に重要なアミノ酸であることが示唆される。これらの知見を基に、これらのアミノ酸の比率を 15%ずつ（加えて Pro 10%）に高め
た、WYP-rich 大環状ペプチドライブラリの構築を行った。さらに、我々の仮説
通り Trp, Tyr 残基が結合形成に重要であることを、WYP-rich ライブラリと従来の NNK コドンを用いたライブラリを混合し、共通の 4 種類の標的タンパク質に対して選択を行い実験的に検証した。
以上、本発表では TRAP 提示法を用いた人工抗体の選択例、ライブラリの多様性に影響を及ぼす因子、WYP-rich 大環状ペプチドの有用性について発表する。

In vitro molecular display for enzyme evolution

TRAP display for developing functional antibody-like proteins andmacrocyclic peptides○Jasmina Damnjanović1, Naoto Nemoto2, Hideo Nakano1(1 Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2 Grad. Sch. Sci. Eng.,
Saitama Univ.)
jasmina@agr.nagoya-u.ac.jp○Jasmina Damnjanović1, Naoto Nemoto2, Hideo Nakano1(1 Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2 Grad. Sch. Sci. Eng., Saitama Univ.)

Key words
in vitro molecular evolutionary engineering, enzyme, substratespecificity, oxidase

TRAP 提示法による人工抗体・環状ペプチドの創製○村上 裕 1,2
（1 名大院・工, 2 名大・未来社会創造機構）
murah@chembio.nagoya-u.ac.jp○Hiroshi Murakami1,2(1 Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2 InFuS, Nagoya Univ.)

Key words
translation

antibody, peptide, affinity selection, in vitro coupled transcription/

235

3Ap01

酵素集合体形成による Violacein 生合成経路におけるフラックス調節○伊藤 里緒子, 三浦 夏子, 片岡 道彦（大阪公大院・農）miuran@omu.ac.jp

3Ap03
学

祖先型トリプトファン合成酵素を用いた L-Trp 誘導体合成系の確立
○大畑 実咲, 宮田 梓, 伊藤 創平, 千菅 太一, 中野 祥吾（静県大院・薬食生命）snakano@u-shizuoka-ken.ac.jp【目的】細胞内におけるタンパク質の集合体形成は酵素連続反応の調節に寄与することが示唆されている。“Fused in Sarcoma (FUS)”の集合体形成ドメインを用いた先行研究[1]では、5 段階の連続反応からなる Violacein 生合成経路を担う一部の酵素を一過的に集合させることで、出芽酵母内で目的化合物の効率的な生産が可能であることが示された。そこで本研究では、新たなベクター系を構築し、当該現象が銅イオンプロモーターによる制御下でも同様に観察できるか検証した。
【方法】Violacein の生合成に関わる VioA から VioE までの 5 つの酵素のうち、
VioC と VioE を FUS の 集 合 体 形 成 ド メ イ ン （ FUSN ） に よ り 集 合 さ せ 、Deoxyviolacein の生合成量の増加を目指した。Violacein 生産酵母株は、FUSN を
上 流 側 に 付 加 し た Violacein 生 合 成 遺 伝 子 を 組 み 込 ん だ プ ラ ス ミ ド でSaccharomyces cerevisiae BY4741 株を形質転換することで得た。また、銅イオン
プロモーターとして CUP1 プロモーターを、集合体形成の確認のための蛍光タ
ンパク質として FusionRed と EGFP を用いた。作製した形質転換株を培養し、蛍光顕微鏡を用いて集合体形成の有無を確認したのち、HPLC による生成物分析を行うことにより、Deoxyviolacein の生合成量を評価した。
【結果】顕微鏡観察の結果より、FUSN を付加したプラスミドで形質転換した酵
母において、集合体形成を確認することができた。また、HPLC による生成物
分析の結果より、VioC と VioE の酵素集合体を形成させることで、Violacein の合成量に対して、Deoxyviolacein の合成量が増加することが示唆された。したがって、銅イオンプロモーターによる制御下でも、FUS の集合体形成能を用いることで、目的化合物の効率的な生産が可能であることが示された。
[1] Zhao et al. 2019 Nature Chemical Biology

インドールと L-Ser を基質として L-Trp の合成反応を触媒するトリプトファン
合成酵素 β サブユニット TrpB は、ペプチド医薬品の原薬としても注目される
L-Trp 誘導体を安価な基質からワンステップで合成できるなど応用が期待される。一方、応用利用のために TrpB の室温領域における活性向上、およびインドールの水溶性の低さから高い有機溶媒耐性が求められている。本研究では上記課題を解決すべく高機能化 TrpB の開発を試みた。
我々はこれまで独自の配列データベース分類法と祖先型設計（ASR）法を駆使することで、いくつかの酵素の高機能化に成功している。ASR 法とは、相同アミノ酸配列をもとにした系統樹上の祖先にあたるアミノ酸配列を数学的に復元する手法であり、祖先型酵素は熱安定性や活性に優れていることが知られている。そこで本手法を TrpB に適用し、応用利用に向けた高機能化を検討することとした。まず、4 つの祖先型 TrpB（AncTrpB-N1~N4）を設計し活性を測定した。その結果、AncTrpB-N1 が最も強い活性を示したため、本酵素の酵素学的諸性質を検討し、これを応用した L-Trp 誘導体合成系の確立を目指した。まず、AncTrpB-N1 の触媒効率が従来報告のある TrpB と同等以上であることを明らかとし、さらに有機溶媒に対して高い耐性を有することが判明した。以上から
AncTrpB-N1 は、室温条件下で十分な活性と高い耐有機溶媒性を有し応用利用に適した酵素であることが明らかとなった。そこで本酵素を用い、酵素法による L-Trp 誘導体の合成を試みた。検討の結果、種々のインドール誘導体と L-Serなどの安価な基質から、高価な L-Trp 誘導体を室温条件下、グラムスケールで合成することに成功した。そのため、本研究は L-Trp 誘導体の大量製造に大きく貢献できる成果を与えた。

Flux regulation in the violacein biosynthesis pathway using enzyme
assembly formation

Design of ancestral tryptophan synthase to produce L-Trp derivatives atgram scale○Rioko Ito, Natsuko Miura, Michihiko Kataoka(Grad. Sch. Agric., Osaka Metro. Univ.)○Misaki Ohata, Azusa Miyata, Sohei Ito, Taichi Chisuga, Shogo Nakano(Grad. Sch. Integr. Pharm. Nutr. Sci., Univ. Shizuoka)

Key words

Fused in Sarcoma, Saccharomyces cerevisiae, enzyme assembly

Key words

amino acid, protein engineering, enzyme

3Ap02

海洋生分解性プラスチックを分解する酵素 PhaZ の異種発現系構築 および分解活性測定方法の検討について

3Ap04

ハイドロゲルビーズと無細胞タンパク質合成を用いた迅
速酵素選抜系の構築

学○柿沼 亜望, 三浦 夏子, 片岡 道彦（大阪公大院・農）miuran@omu.ac.jp

学○折田 兼成 1, 大川 優生 1, 徳王 亮太 1, 南畑 孝介 1, 神谷 典穂 1,2（1 九大院・工, 2 九大・未来化セ）kamiya.noriho.367@m.kyushu-u.ac.jp

近年プラスチックによる環境汚染が深刻化しており、微生物により分解される
生 分 解 性 プ ラ ス チ ッ ク が 注 目 さ れ て い る 。 Poly(3-hydroxybutyrate-co-3hydroxyhexanoate)（PHBH）は海洋環境においても分解される数少ない生分解性
ポ リ マ ー 素 材 で あ る 。 PHBH 分 解 活 性 を 示 す 酵 素 ｐ olyhydroxyalkanoate
depolymerase（PhaZ）にはアミノ酸配列に多様性があるが、その配列と分解可能な分子鎖長やモノマー構成、分解産物などの相関は未解明の部分が多い。それらの解明によって自然環境での PHA 分解機構を明らかにし、更には PhaZ の分解特性を利用した新たな生分解性ポリマーの設計を可能とすることを目的とし、まず PhaZ の異種発現系構築および分解活性評価法の検討を行った。
大腸菌 BL21（DE3）株を宿主として Bdellovibrio bacteriovorus HD100 由来の細胞外 PhaZ と Pseudomonas fluorescens GK13 由来の細胞外 PhaZ を発現させる
His-Tag 付きプラスミドを各々作製し、異種発現を行った。発現誘導は、IPTG
誘導および Overnight Express システム（Merck KGaA, Darmstadt, Germany）による誘導を行った。IPTG 誘導法では２種の PhaZ は不溶性画分にのみ発現したが、Overnight Express システムでは２種の PhaZ の一部を可溶性画分に発現させることができた。誘導後、超音波破砕により可溶性画分と不溶性画分を得た後、可溶性画分から His-Tag 精製を行い２種の精製 PhaZ を得た。
そして、PhaZ による PHBH 分解活性評価法を検討した。PHBH 粉末の乳化溶液を用いて作製した PHBH 寒天プレートに穴を開け PhaZ を添加し、分解に伴うクリアーゾーン形成の速度や最終到達半径を測定する方法に加え、乳化溶液に直接 PhaZ を添加し濁度変化を評価する方法により PHBH 分解活性評価を行ったところ、その両者で分解活性を確認することができた。
今後は、PhaZ による PHBH 分解生成物について解析を行う予定である。

【目的】
酵素（生体触媒）は持続可能な社会の構築を担う触媒の有力な候補であるが、天然由来の酵素の多くは、高温での変性や厳密な至適 pH のため、その利用範囲に制限が生じる。そこで、望みの機能を発現する酵素の迅速選抜系として、
当研究室ではハイドロゲルビーズ(HB)と無細胞タンパク質合成(CFPS)を組み合わせた新規酵素選抜系の構築を目標としている。本発表では、微生物由来トラ
ンスグルタミナーゼ(MTG)と酸化酵素ラッカーゼ(LAC)をモデルとした選抜系の構築について報告する。
【方法】
ゲル基材 (8 分岐型 PEG-SH)、CFPS 試薬、各酵素の遺伝子を内包した HB を作製し、内水相中でゲル化と CFPS を行うことで、発現酵素を内包した HB を作製した。この際、MTG 内包 HB には蛍光ペプチド基質を、LAC 内包 HB にはフェノール性小分子基質を加えておき、それぞれの酵素の触媒活性に基づき HBを蛍光染色した。セルソーターを用いて蛍光染色された HB 集団を回収し、還元剤を添加して HB を溶解することで、内包酵素の遺伝子を回収し、分析に供した。
【結果と考察】MTG の選抜においては、酵素活性に影響を与える領域にアミノ酸置換が入った
変異体の選択的な濃縮が確認され、HB と CFPS を組み合わせた酵素選抜系が機能することが確認された。一方、LAC の選抜系においては、活性中心を構成す
る銅イオンの添加濃度が、タンパク質発現並びに酵素活性に影響を与えることが明らかとなった。また、CFPS により発現した LAC を内包した HB を蛍光強度に応じてソーティングし、回収された HB 集団より LAC 遺伝子の存在が確認されたことから、ハイスループットな酵素選抜系としての汎用性が示唆された。
【謝辞】本研究は JSPS 科研費 JP19H00841 ならびに国立研究開発法人新エネル
ギー・産業技術総合開発機構 (NEDO) の委託業務 (JPNP20011)の助成を受けたものです。

Construction of a heterologous expression system for PhaZ, enzymes that
degrade marine biodegradable plastics, and methods for measuring its
degradation activity.

Construction of a high-throughput screening system of an enzyme usinghydrogel beads and cell free protein synthesis○Ami Kakinuma, Natsuko Miura, Mitihiko Kataoka(Grad. Sch. Agric., Osaka Metro. Univ.)

Key words

biodegradable plastic, PHB depolymerase, protein expression○Kensei Orita1, Yui Okawa1, Ryota Tokuo1, Kousuke Minamihata1,
Noriho Kamiya1,2(1 Grad. Sch. Eng., Kyushu Univ., 2 CFC, Kyushu Univ.)

Key words

enzyme, evolutionary engeneering, hydrogel, cell free protein synthesis

236

3Ap05

新規人工酵素 Syn-F4 エンテロバクチンエステラーゼのX 線結晶構造解析
栗原 航大 1, 梅澤 公二 2,3, Donnelly Ann 4, Hecht Michael 4,○新井 亮一 1,3（1 信州大・繊維, 2 信州大・農, 3 信州大・バイオメディカル研,4
プリンストン大・化）
rarai@shinshu-u.ac.jp

3Ap07
学

進化と構造の情報を組み込んだ酵素の耐熱化デザイン○宮脇 佳汰, 二井手 哲平, 戸谷 吉博, 清水 浩
（阪大院・情報）shimizu@ist.osaka-u.ac.jp

触媒活性を示し、生体内で生物学的に機能する人工タンパク質を新規に創出することは、タンパク質工学や合成生物学の重要な目標である。近年、生体内で機能する新規人工酵素 Syn-F4 エンテロバクチンエステラーゼが創出された。
Syn-F4 は鉄エンテロバクチンを加水分解し、鉄制限培地で増殖できないエンテ
ロバクチンエステラーゼ欠損株(Δfes) 大腸菌が、Syn-F4 の発現により相補されて増殖できるようになった。そこで、本研究では、Syn-F4 の立体構造および反応機構を解明するために、Ｘ線結晶構造解析を行った。Syn-F4 は 2 量体の 4-ヘ
リックスバンドル構造を形成し、各単量体は 2 本の長い α-ヘリックスからなり、各ループは同じ側に向いていた。興味深いことに、Syn-F4 構造の中央付近に貫通した穴が存在した。網羅的な変異実験により、5 つの残基（Glu26, His74,
Arg77, Lys78, Arg85）が酵素活性に必須であることがわかり、これらの残基はすべて Syn-F4 構造の中央部の穴の付近に位置しており、触媒二残基（Glu26His74）をもつ活性部位であること示唆された。また、分子動力学シミュレー
ションにより推定活性部位の動的特性が示唆され、ドッキングシミュレーショ
ンにより鉄エンテロバクチンが結合した構造が予測された。Syn-F4 の構造や活性部位は、天然のエンテロバクチンエステラーゼとは全く異なるものであり、人工的に創出されたタンパク質が、天然酵素とは大きく異なる構造や機構で生命維持のための触媒作用を発揮し得ることが示された。

酵素の耐熱化は医薬品や化成品の工業生産において、収量・収率を向上させる
際の重要な因子の一つである。なかでも、多くの医薬品や農薬に重要なハロゲンを修飾可能なハロゲナーゼの耐熱化は、生成物の収量や収率向上に貢献する
重要なターゲットである。これまで、スクリーニングをベースとしたタンパク
質工学による酵素の熱安定性向上の試みが実施されてきたが、スクリーニング
規模の制限から、研究者が試行錯誤的に変異箇所を同定する必要があった。そこで本研究では、変異導入の位置・種類・数をアミノ酸配列の保存度と構造モ
デリングから効率的に探索する酵素設計プロセスの開発を目指した。ここではモデル酵素として L-lysine 4-chlorinase(besD)を対象に、耐熱化に向けた酵素設計
プロセスを提案する。
まず besD のアミノ酸配列を query として BLAST 検索を実施し、各アミノ酸残基の進化的頻度を表す行列 (位置特異的重み行列: PSSM) を作成した。次に、Rosetta ソフトウェアを用いて、アミノ酸配列の各位置に PSSM で進化的頻度が高いアミノ酸残基を besD の構造に点変異導入し、安定化した変異候補アミノ酸を PSSM から抽出した。続いて、選抜された変異候補アミノ酸を組み合わせて変異導入し、Rosetta 内で変異導入した時の構造の安定性を表すスコア (Rosettaenergy units; REU) が低い安定な構造を獲得した。設計の結果、REU の値から野生型の besD と比較して安定化したことが示唆された。最後に、設計した変異体を大腸菌発現系で調製し、実験的に熱安定性、熱処理後の酵素活性を評価した。また、今回使用した進化情報の中には、ヒドロキラーゼも含まれていたため、変異体の基質特異性についても評価を行った。

Crystal structure of a de novo enzyme, ferric enterobactin esterase Syn-F4

Thermal stability design of enzyme incorporated with evolutionary andstructural information

Kodai Kurihara1, Koji Umezawa2,3, Ann Donnelly4, Michael Hecht4,○Ryoichi Arai1,3(1 Fac. Textile Sci. Technol., Shinshu Univ., 2 Fac. Agric., Shinshu Univ., 3 Inst.
Biomed. Sci., 4 Dept. Chem., Princeton Univ.)○Keita Miyawaki, Teppei Niide, Yoshihiro Toya, Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words
bundlede novo enzyme, X-ray crystallography, enterobactin esterase, 4-helix

Key words
stability

enzyme activity, protein engineering, structural information, thermal

3Ap06

酵素の基質特異性決定残基の同定におけるロジスティッ
ク回帰モデルの有用性

3Ap08

形式概念分析と機械学習を用いた異種発現タンパク質の可溶性メカニズムの解明○二井手 哲平, 杉木 創, 森 聖也, 戸谷 吉博, 清水 浩
（阪大院・情報）shimizu@ist.osaka-u.ac.jp

学○北條 佑斗 1, 鈴木 皓大 1, 榊原 一紀 3, 中村 正樹 3, 松井 大亮 2,
浅野 泰久 3
（1 富山県大院・工, 2 立命館大・生命科学, 3 富山県大・工）sakakibara@pu-toyama.ac.jp

酵素の基質特異性を司るアミノ酸残基の空間的な位置やその種類を同定することは、酵素反応メカニズムやタンパク質の進化の軌跡を推定する重要な情報を与えるため、タンパク質科学研究における重要な課題の一つである。我々はこれまで、構造的一致度を示すが補酵素特異性が異なる酵素を題材に、それぞれのアミノ酸配列を入力データとした教師あり機械学習を実施することで 1 アミノ酸レベルの解像度で補酵素特異性に寄与するアミノ酸残基をランキング形式で推定することに成功した。そして補酵素特異性発現に関する寄与度の高いアミノ酸残基を変更することで、大掛かりなスクリーニング操作無しに、補酵素特異性を完全に切り替えることに成功した。
そこで本研究では、これまで開発してきた手法の汎用技術化を目指し、対象酵素を拡大してその適用可能性を評価した。具体的には、リンゴ酸脱水素酵素と乳酸脱水素酵素間で基質特異性を決定するアミノ酸位置の推定や、中枢代謝経路の酵素の補酵素選択性を決めるアミノ酸残基の推定を実施した。例えば、共通の祖先タンパク質から派生したと考えられているリンゴ酸脱水素酵素と乳酸脱水素酵は高い構造的一致度を示すため、両酵素の配列を比較することで基質特異性を司るアミノ酸残基が抽出できると考え、データベースよりそれぞれの酵素のアミノ酸配列データを収集し、ロジスティック回帰を適用した。その結果、学習済み分類器は各酵素の特徴を良く捉え、精度 0.997 でリンゴ酸脱水素
酵素と乳酸脱水素酵素を分類することに成功した。さらに、このモデルを解析することで、どのアミノ酸残基が基質特異性に関与しているかを推定することができた。本分類モデルが提案したアミノ酸残基は、既往の研究で基質特異性への関与が指摘されているアミノ酸残基と一致しており、AI 駆動による酵素工学の可能性示したと言える。

タンパク質の産業利用において，異種発現は重要な技術の一つである．しかし，複数のタンパク質生産において，不溶性画分に発現する問題がある．我々はこれまでに，不溶性画分に発現するタンパク質の，変異導入による可溶性発現について検討してきた．この変異導入部位の予測を可能とすれば，タンパク質の産業利用の拡張に貢献することができる．そこで，機械学習を用いてタンパク質の可溶性発現を予測する学習器の構築に挑戦した．Thermus thermophilus HB8由来のタンパク質 414 種類を各々大腸菌で発現し，SDS-PAGE で可溶性および不溶性画分の発現情報を得た．アミノ酸配列とその発現情報を用いて，ニュー
ラルネットワークで学習した結果，およそ 75%の精度で，アミノ酸配列から可溶性発現の確率と，可溶性発現量を向上する変異部位を予測する学習器を作成した．
一般的に機械学習では，得た学習の傾向，すなわち可溶性発現に関与する生化学的な特徴の傾向を把握することが困難である．そこで学習器の出力に対して，生化学的な特徴間の従属関係を網羅的に抽出することができる「形式概念分析」
を適用し，その傾向を可視化することに挑戦した．その結果，一定の立体構造を持たない Disorder 領域以外の領域において，親水性かつ芳香族アミノ酸を，
Gly，Val，Thr のいずれかに変異することで，可溶性発現しやすい傾向を得た．
非常に興味深いことに，作成した学習器には，Disorder 領域に関する情報を入力していない．つまり，この学習器がアミノ酸配列からタンパク質の異種発現に関与する，“これまで明らかになっていない“生化学的な特徴を踏まえた予測となっていると考えられる．このように学習器に形式概念分析を適用すること
で，学習器が予測するタンパク質の可溶性発現の特徴を，可視化することに成功した．

Application of Logistic Regression Models for Identification of Residues
Determining Substrate Specificity in Enzymes

Solution of Soluble Mechanism of Heterologous Proteins by Machine
Learning and Formal Concept Analysis○Teppei Niide, Sou Sugiki, Seiya Mori, Yoshihiro Toya, Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words

enzyme, machine learning○Yuto Hojo1, Kodai Suzuki1, Kazutoshi Sakakibara3, Masaki Nakamura3,
Daisuke Matsui2, Yasuhisa Asano3(1 Grad. Sch. Eng., Toyama Pref. Univ., 2 Coll. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 3 Fac.
Eng., Toyama Pref. Univ.)

Key words

bioinformatics, enzyme, neural network

237

3Ap09
学

統計解析を用いた L-アミノ酸酸化酵素の異種可溶性発
現量の向上○中原 歩汰 1, 河野 愛 2, 豊竹 洋祐 2, 若山 守 2, 松井 大亮 2
（1 立命館大院・生命科学, 2 立命館大・生命科学）
d-matsui@fc.ritsumei.ac.jp

3Ap11
学

Agrobacterium sp. No.201 株による第一級アルコールのβ 型配糖化反応の探索とフェネチルアルコールの配糖化検討○石川 大空 1, 竹内 悠貴 1, 竹内 道樹 2, 原 良太郎 2, 高橋 優輔 3,
小川 順 4, 上田 誠 1,2（1 小山高専 物質工学科, 2 京大院農・産業微生物, 3 トクヤマ つくば研, 4 京大院農・応用生命）
mueda@oyama-ct.ac.jp【目的】異種発現系で酵素遺伝子を発現させた場合、封入体の形成で活性を示さないことが多く、異種宿主による酵素の発現において問題となっている。これまでに抗生物質耐性マーカーによる可溶性発現する酵素の単離法（Matsuietal.,
Biosci.Biotechnol.Biochem. ,2015）や帰納法による可溶性発現技術を開発している（Matsuietal., Sci.Rep. ,2017）。本研究では、大腸菌で可溶性発現が困難な低基
質特異性 L-アミノ酸酸化酵素（LAO）の発現系構築を目的として、変異導入実験による発現量の向上に挑戦し、さらに統計分析で可溶性発現に関与する特徴を調べた。
【方法】発現系の構築：糸状菌由来 LAO 遺伝子を、マルトース結合タンパク質（MBP）タグを挿入した発現プラスミドに挿入した。大腸菌 BL21（DE3）を形質転換し、抗生物質を含む LB 培地で培養後、超音波破砕機で粗酵素液を調製した。活性測定：L-Phe を基質とし、酸化反応で生じる過酸化水素をペルオキ
シダーゼと TOOS、4-アミノアンチピリンによる比色法で測定した。変異導入：
無作為に選抜したアミノ酸残基 108 箇所を疎水性アミノ酸は Ser（親水性）に、
親水性アミノ酸は Ala（疎水性）に置換した。統計分析：ロジスティック回帰分析を実施した。
【結果】野生型酵素の異種発現：発現プラスミド pET11a を用いた発現では検出限界以下であった。MBP タグを用いた発現でわずかに活性を検出した。変異導入の効果：108 種類の変異型酵素の内、92 種で活性が減少し、16 種で増加が見られた。統計分析：目的変数に活性値（活性の減少を 0、活性の増加を 1 の 2値）、説明変数に変異前のアミノ酸の種類と中心からの距離（ユークリッド距離）、二次構造（ループ、ヘリックス、シート）を使用した。その結果、可溶性発現に関する予測値と実測値に相関がみられ（89.8%）、これらの特徴が可溶性発現に関与していることを明らかにした。

＜背景と目的＞
配糖体はその物性や生理機能から、界面活性剤や化粧品、食品など広く利用されている。 アルコール化合物の酵素や化学反応による配糖化の研究は多く、α型配糖体は糖転移酵素反応による工業生産例もある。β 型配糖体では糖のドナーとして、 p-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシドやラクトースなどが報告されているが、セロビオースからの糖転移反応で効率的な報告例は少ない。バイオ
ものづくり研究の進展によるセルロース類の将来的な安価化を期待し、我々はセロビオースをドナーとした β-グルコシドの合成を触媒する新規酵素の取得を目指して研究を進めてきた。本研究では、セロビオースとアルコール化合物から β-グルコシドを合成する微生物をスクリーニングによって取得し、 高活性な
Agrobacterium sp. No.201 株による配糖化反応によって生成する β-グルコシドの構造解析と定量的な活性評価を行ったので報告する。
＜実験方法＞
配糖化反応の検討は、セロビオースを主炭素源とした培養液から調整した洗浄
菌体に基質を添加することで行った。生成配糖体の定性・定量は TLC, HPLC を用いた。生成したフェネチルアルコール配糖体は、分離精製し、NMR 及び LCMS にて構造解析を行った。
＜結果＞
Agrobacterium sp. No.201 は、基質フェネチルアルコールに対し高い単糖配糖体の合成活性を示した。また、NMR による構造解析の結果、フェネチルアルコー
ル-β-D-グルコピラノシドであることを確認した。反応温度、基質濃度の検討を行ったところ、7 g/L フェネチルアルコール、100 g/L セロビオース, 40 °C での合成において、添加フェネチルアルコールに対しモル収率 15.2 %であった。

Improvement of heterologous soluble expression of L-amino acid oxidaseusing statistical analysis

Synthesis of β-glucosides of primary alcohols via glucosyl transfer reaction
catalyzed by Agrobacterium sp. No.201.

○Ayuta Nakahara1, Ai Kouno2, Yosuke Toyotake2, Mamoru Wakayama2,
Daisuke Matsui2(1 Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2 Coll. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words
amino acid oxidase, heterologous soluble expression, mutagenesis,
statistical analysis

3Ap10
学

酵素による D-アミノ酸誘導体の One-pot 合成○城間 一輝 1, 浅沼 和佳奈 2, 豊竹 洋佑 2, 若山 守 2, 松井 大亮 2
（1 立命館大院・生命科学, 2 立命館大・生命科学）
d-matsui@fc.ritsumei.ac.jp○Ozora Ishikawa1, Yutaka Takeuchi1, Michiki Takeuchi2, Ryotaro Hara2,
Yusuke Takahashi3, Jun Ogawa4, Makoto Ueda1,2(1 Dept. Materials Chem. Bioeng., Natl. Inst. Technol., Oyama Coll., 2 Ind.
Microbiol., Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 3 Tsukuba Res. Lab., Tokuyama Co.,
4
Div. Appl. Life Sci., Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)
Key words
Agrobacterium, transglycosylation, glucoside, beta-glucosidase

3Ap12

好塩性アーキアにおける新規ヌクレオシド代謝系の同定○佐藤 喬章 1,2, 歌島(法土) 咲菜恵 1, 吉井 祐太 1, 平田 晃右 1,
神田 脩一郎 1, 斧田 優志 1, Jin Jian-qiang 1, Xiao Suyi 1, 南 瞭子 1,
福島 ひかる 1, 野口 綾子 3, 真鍋 良幸 3,4, 深瀬 浩一 3,4, 跡見 晴幸 1,2（1 京大院・工, 2 京大・エネ研, 3 阪大院・理, 4 阪大院・理 フォア
フロント研）
takaakisato@sbchem.kyoto-u.ac.jp【目的】当研究室では安価なアミノ酸からケト酸を介したアミド合成について報告しており（Matsui et al., Chem. Lett., 2021）、ケト酸をハブ分子とした合成は様々な反応に展開できる。本研究では、L-アミノ酸酸化酵素で L-アミノ酸からケト酸に変換し、得られたケト酸とアルキルアミンでイミンを合成し、イミン還元酵素（IRED）により D-アミノ酸誘導体を連続的に合成する One-pot 合成法
について検討した。
【方法】IRED の調製：系統樹解析から選抜した 12 種類の IRED 遺伝子を挿入した発現プラスミド pET11a で、大腸菌 BL21 (DE3)を形質転換した。抗生物質を添加した LB 液体培地で培養し、0.5 mM IPTG を添加後、さらに 16 時間培養した。超音波破砕で無細胞抽出液を調製した。活性測定：IRED 活性は、2-メチ
ル-1-ピロリン、2-メチルイミノ-3-フェニルプロパン酸を基質として、NADPHの減少量を 340 nm の吸光度で測定した。立体選択性は、反応生成物を 2、3、4、6-テトラ-o-アセチル-β-D-グルコピラノシルイソチオシアナートで誘導体化
し、ODS カラムで分離後、254 nm で生成物量を測定した。
【結果】IRED の立体選択性：大腸菌で発現検討をした結果、6 種の IRED が可
溶性画分の発現量が多く、3 種の IRED が一部不溶性画分に発現、3 種の IRED
が不溶性画分の発現量が多い結果となった。吸光度法で 12 種類全ての IRED に2-メチル-1-ピロリンに対する活性を見出し、また HPLC 法では半数が R 選択
性、残りの半数が S 選択性 IRED であることを明らかにした。D-アミノ酸誘導体の One-pot 合成：Rhizoctonia solani 由来 LAO T204A と、2-メチルイミノ-3フェニルプロパン酸に対する酵素活性および高い R 選択性を示す Streptomyces
sp. SLBN192 と unclassified Streptomyces 由来 IRED を用いて、L-アミノ酸からメ
チル-D-フェニルアラニンの One-pot 合成を行った（最大鏡像体過剰率 75.1%、
収率 20.3%）。

真核生物や細菌はペントースリン酸経路でヌクレオシドを代謝する。一方、多くのアーキアは本経路を持たず、超好熱性アーキアの一部は炭酸固定酵素リブ
ロース-1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ（ルビスコ）を含む新規経路でヌクレオシドを分解することを明らかにしてきた。ルビスコの基質はリボース-1,5-ビスリン酸イソメラーゼ（R15Pi）によってリボース-1,5-ビスリン酸の異性化により生成する。一方、好塩性アーキアの一部はゲノム上に R15Piのホモログを有するにもかかわらず、ルビスコは持たない。そこで本研究では、ルビスコを持たない好塩性アーキアにおけるヌクレオシド代謝系の解明を目指した。
対象とした好塩性アーキアのゲノム情報を解析し、r15pi 遺伝子と共にオペロンを形成することが多い遺伝子をヌクレオシド代謝遺伝子の候補とした。これらの組換え型タンパク質を解析し、グアノシンホスホリラーゼと ATP 依存的リ
ボース-1-リン酸キナーゼであることを同定した。これらの酵素と R15Pi により、グアノシンからリブロース-1,5-ビスリン酸を生成し得る。さらに比較ゲノ
ム解析により、リブロース-1,5-ビスリン酸代謝遺伝子の候補として haloaciddehalogenase (HAD)-superfamily hydrolase および fuculose-1-phosphate aldolase と推定されていた遺伝子を選抜した。これらの組換え型タンパク質を解析し、各々
リブロース-1,5-ビスリン酸ホスファターゼおよびリブロース-1-リン酸アルドラーゼであることを同定した。前者はこれまでの代謝には出てこなかった新規酵素である。以上から、好塩性アーキアにおいてグアノシンをリブロース-1,5ビスリン酸を経てジヒドロキシアセトンリン酸およびグリコールアルデヒドに代謝する新規ヌクレオシド代謝系を同定できた。基幹的な生体分子であるヌク
レオシドの代謝ですら多様であることが示された。

Combination of enzymatic oxidation and reduction for D-amino acidderivative toward a one-pot process

Identification of a previously unrecognized nucleoside metabolic pathway inhaloarchaea○Kazuki Shiroma1, Wakana Asanuma2, Yosuke Toyotake2, Mamoru Wakayama2,
Daisuke Matsui2(1 Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2 Coll. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words

amino acid oxidase, imine reductase, D-amino acid, one-pot synthesis○Takaaki Sato1,2, Sanae Utashima (Hodo)1, Yuta Yoshii1, Kosuke Hirata1,
Shuichiro Kanda1, Yushi Onoda1, Jian-qiang Jin1, Suyi Xiao1, Ryoko Minami1,
Hikaru Fukushima1, Ayako Noguchi3, Yoshiyuki Manabe3,4, Koichi Fukase3,4,Haruyuki Atomi1,2(1 Grad. Sch. Eng., Kyoto Univ., 2 Inst. Adv. Energy, Kyoto Univ., 3 Grad. Sch. Sci.,
Osaka Univ., 4 Forefront Res. Center, Osaka Univ.)
Key words
archaea, metabolism, halophile, nucleoside

238

3Ap13

Acidomonas 属酢酸菌のメタノール脱水素酵素群の酵素学的特徴と生理機能
星野 遥輝, 稗田 莉奈, 堀田 靖人, 宇都宮 大貴, ○阿野 嘉孝（愛媛大・農）anoy@agr.ehime-u.ac.jp

3Ap15
学

Potential production of rare-disaccharide isoprimeverose
by enzyme produced in Aspergillus oryzae○Fahmi Baihaqqi1, Tomohiro Suzuki1, Satoshi Wakai3,
Prihardi Kahar1, Akihiko Kondo1,2, Chiaki Ogino1(1 Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov.,
Kobe Univ., 3 JAMSTEC)
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp【背景と目的】Acidomonas methanolica は酢酸菌でありながらメタノールを単一炭素源にして生育できるユニークな細菌である。本菌には他のメタノール資化性細菌と同様， PQQ 依存性メタノール脱水素酵素（MDH）が初発酸化に関わっていることが知られている。MDH には Ca を補因子とする MxaF に加え，La を補因子とする XoxF の２種が存在し，本菌のゲノム上にもこれらの２種の遺伝子が存在し，環境中の La に応答して XoxF を誘導することを確認している。一方，破壊株等の解析から本菌の XoxF は，他の細菌とは性質が異なることも推測されている。本研究ではこれらの MDH 群を精製して酵素学的特徴を明らかにすることで，これらの酵素群の生理機能を探ることを目指した。
【方法】Ac. methanolica MB58 を La 添加／非添加条件で培養し, MDH 活性を追跡して精製酵素標品を得た。また，Methylorubrum extorquensAM1 の XoxFI を精製し，酵素学的特徴を比較した。
【結果と考察】Ac. methanolica 由来 MB58_XoxF は，MB58_MxaF や M. extorquens
由来 AM1_XoxFI に比べ, 広い pH 領域で活性を示した。また，MB58_XoxF は
MB58_MxaF に比べメタノールに対して厳格な基質特異性を示すにも関わらず，
10,000 倍以上高い Km 値を示した。しかしながら，本菌は La 存在下でも高濃度
メタノールで良い生育を示すことはなく，酵素学的特徴と生育に相関は見られなかった。分子系統解析では MB58_XoxF は XoxF クレードのいずれにも属さなかったことも含め, MB58_XoxF の生理機能について考察する。

Isoprimeverose (α-D-xylopyranose-(1→6)-β-D-glucopyranose) is a rare disaccharide
that consists of 1 unit of xylose and glucose. Since this unique structure, this physicalfunctional properties still remain as unknown. However, it has been reported that
isoprimeverose may have a prebiotic function. Previously, we successfully developed
Aspergillus oryzae strain producing endoglucanase and IPase for isoprimeverose
production. This cultured supernatant cocktails contain a set of enzymes
endoglucanase and IPase that had been used and produced isoprimeverose fromtamarind xyloglucan. The enzyme was produced under submerged fermentation, as
filamentous fungal species like Aspergillus oryzae exhibit diverse responses to theenvironmental conditions throughout the fermentation process. Understanding
submerged fermentation is important to achieve efficiency in isoprimeverose
production and improve yield productivity. Here, we focus on profiling physiochemical fermentation parameters i.e., the concentration of carbon source, pH,agitation speed, and fed-batch process which are influential to the Aspergillus oryzae
enzyme productivity. These results might provide a better understanding of optimizing
the Aspergillus system for enzyme production.

Enzymatic property and physiological function of methanol dehydrogenases
from Acidomonas methanolica

Potential production of rare-disaccharide isoprimeverose by enzyme
produced in Aspergillus oryzae

Haruki Hoshino, Rina Hieda, Yasuhito Horita, Daiki Utsunomiya, ○Yoshitaka Ano(Fac. Agric., Ehime Univ.)○Fahmi Baihaqqi1, Tomohiro Suzuki1, Satoshi Wakai3, Prihardi Kahar1,
Akihiko Kondo1,2, Chiaki Ogino1(1 Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.,
3
JAMSTEC)

Key words

pyrroloquinoline quinone, methanol

Key words

Aspergillus oryzae, tamarind xyloglucan, isoprimeverose

3Ap14

λ-カラギナーゼの探索およびその酵素の性質

3Ap16

酢酸菌グリセロール脱水素酵素の機能安定化と物質生産性への影響○倉掛 昌裕, 倉田 佳祐, 前田 幸嗣, 河毛 響平, 山下 雅揮（福山大・生命工）kurakake@fukuyama-u.ac.jp

学○金田 梨沙, 平野 成菜, 阿野 嘉孝（愛媛大・農）anoy@agr.ehime-u.ac.jp【目的】土壌からの λ-カラギナーゼ生産菌の分離を行い、紅藻類から得られる
λ-カラギーナンを効率良く加水分解できる λ-カラギナーゼの探索を行い、得られた酵素の性質について調べた。
【方法】土壌からの菌の分離には 0.5％λ-カラギーナン、1.5％寒天の平板培地を用い 30℃で 3〜7 日間培養を行った。分離菌を 1％λ-カラギーナン、0.5％酵母エキスの液体培地 3ml に植菌し、150 回/分、30℃で 3 日間培養した。酵素活性は、0.9％λ-カラギーナン、pH5、40℃で 10〜20 分間保持後、生成還元糖量をDNS（3,5-ジニトロサリチル酸）法で測定することで求めた。スルファターゼ
活性は、基質に 1mM pNP(p-ニトロフェニル)-硫酸を用い、pH7、40℃、10〜20分間反応させることで測定した。
【結果及び考察】λ-カラギーナン平板培地により土壌から 107 株の菌を分離し、液体培養液上清の λ-カラギナーゼ活性を測定したところ、比較的高活性の酵素を生産する Y78B2 株が得られた。Y78B2 株酵素の最適 pH は 5 付近で、安定pH は 5〜8 であった。また最適温度は 40℃付近で、安定温度は 40℃以下であった。0.9％λ-カラギーナンに pH5、40℃で作用させたところ、反応 20 時間での生成糖量は λ-カラギーナン 1g 当たり 38mg で、その収率は 4％程度であった。
硫酸基による酵素阻害が考えられたので、土壌より同培地により分離した K13株由来のスルファターゼを添加して作用させたが、生成糖量はわずかにしか増加しなかった。しかし、Y78B2 株酵素により λ-カラギーナン溶液の粘度がほとんど消失することから、この酵素はエンド型酵素であり、λ-カラギーナンは比較的大きなサイズに低分子化され、水溶性食物繊維としての機能が期待できる
ことがわかった。

【背景と目的】Gluconobacter 属酢酸菌のグリセロール脱水素酵素(GLDH)は、ピ
ロロキノリンキノン(PQQ)を補欠分子族とする「ゆるい基質特異性」をもった酵素である。その酸化物は、化粧品や食品に利用されるなど、GLDH は産業的に重要な多くの酸化反応を担っている。しかし、キレート作用を持つグルコン酸などを基質とする反応では PQQ が容易に脱離してしまう性質がある。この性
質は安定な物質生産の妨げとなり、GLDH の産業利用拡大の障壁となる。本研
究では、他の酵素との比較によって、キレート作用に安定な変異体 GLDH を作
製して、得られた優良変異体の酵素機能を明らかにすることを目的とし、安定的な物質生産系の構築を目指した。
【方法】キレート剤感受性が異なる酵素と GLDH の一次構造を比較することにより、キレート耐性に関わるアミノ酸残基を推測し、部位特異的置換によって
17 の変異体 GLDH(m1-17)を作製した。得られた変異体についてその特徴を調査し、変異箇所とキレート耐性および PQQ 結合との関連を整理した。また、キレート作用をもつグルコン酸を基質としたケトグルコン酸発酵への影響を調査した。
【結果と考察】部位特異的置換によって得られた 17 の変異体について、EDTA
および PQQ 添加の活性への影響を調べたところ、野生株では、10 mM の EDTA
で完全に活性が消失していたのに対し、30 mM の EDTA を添加しても安定な活性を維持している変異体 m6 を見出した。さらに、m6 変異体は強力なキレート耐性に加えて本酵素に特徴的な「ゆるい基質特異性」にも変化が生じていたことから、物質生産性にも良い影響をもたらしていることが示唆された。現在、物質生産性への影響の詳細について調査しているところである。

Search for lambda-carrageenase from nature and its properties

Stabilization of enzyme activity and its effect of glycerol dehydrogenasefrom Gluconobacter○Masahiro Kurakake, Keisuke Kurata, Yukitsugu Maeda, Kyouhei Koumo,
Masaki Yamasita(Fac. Life Sci. Biotechnol., Fukuyama Univ.)

Key words

carrageenase, surfatase, lambda-carrageenan○Risa Kaneda, Seina Hirano, Yoshitaka Ano(Fac. Agric., Ehime Univ.)

Key words

pyrroloquinoline quinone, protein engineering

239

3Bp01
学

微生物由来 Fe(II)/α-ケトグルタル酸依存性ジオキシゲ
ナーゼを用いた希少な alliin の立体選択的合成

3Bp03○勘澤 良介 1, 水谷 拓 1, 原 良太郎 1, 上田 誠 1,2, 小川 順 1（1 京大院・農, 2 小山高専・物質工学科）
ogawa.jun.8a@kyoto-u.ac.jp

超好熱古細菌 Thermococcus kodakarensis KOD1 由来グ
リセロール-3-リン酸シチジリルトランスフェラーゼの特性解析○岩永 直樹 1, 古賀 雄一 1,2, 山野-足立 範子 1, 大政 健史 1
（1 阪大院・工, 2 岡山理大・工）omasa@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景と目的】ニンニクに含まれる alliin は、抗酸化活性や血小板凝集阻害活性を有する有用化合物である。Alliin は、分子内の硫黄原子と α-炭素原子がキラル中心となるため、理論上 4 種類の立体異性体が存在する。このうち、ニンニ
ク中ではほとんどが(+)-L-alliin として存在し、わずかに(－)-L-alliin が含まれる。その一方、(+)-D-alliin と(－)-D-alliin は天然物としては報告がない。(+)-Lalliin は、我々が見出した Bacillus thuringiensis 2e2 由来 L-イソロイシンジオキシ
ゲナーゼ (IDO)によって、S-allyl-L-cysteine を立体選択的にスルフォキシド化す
ることで合成可能である。しかし、その他の立体異性体を生成する酵素は報告がない。そこで本研究では、希少な alliin 異性体の生理活性評価を可能とすべく、(+)-L-alliin 以外を生成可能な微生物由来 Fe(II)/α-ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼを探索した。
【方法と結果】様々な Fe(II)/α-ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼの遺伝子配列を大腸菌用コドンに改変し、大腸菌で高発現させた。当該菌体を触媒とし、S-allyl-L-cysteine または S-allyl-D-cysteine と反応させ、生成物を HPLC で分析した。その結果、Pantoea ananatis 由来イソロイシン 4′-ジオキシゲナーゼ (HilA)[1] や Aspergillus oryzae 由来ピペコリン酸 4-ジオキシゲナーゼ (Pip4H) [2] など
が S-allyl-L-cysteine を基質として立体選択的に(－)-L-alliin を生成した。興味深
いことに、IDO、HilA、および Pip4H は S-allyl-D-cysteine も基質とし、天然物にはない(+)-D-alliin および (－)-D-alliin を生成した。これにより、任意の alliin
立体異性体を選択的に酵素合成する技術を確立した。
[1] Smirnov et. al. (2013) MicrobiologyOpen, 2 (3) 471－481[2] Hibi et. al. (2016) Appl. Environ. Microbiol, 82 (7) 2070－2077【目的】
Thermococcus kodakarensis KOD1 は高温下で生育する超好熱古細菌で、耐熱性をはじめとする特有の機能を持つタンパク質を産生するほか、高温環境に適応した生物である。適合溶質として知られるグリセロール-3-ホスホジエステルは高温環境下でタンパク質の安定化等の生理活性作用を示す。本物質の代謝に関わる酵素は細菌や古細菌に幅広く分布しているが、僅かなアミノ酸配列の違いによって、酵素学的特性の差異を生み出していると考えられる。T. kodakarensis
KOD1 には本酵素の遺伝子の存在が確認されているが、その酵素学的特性は明らかにされていない。そこで、T. kodakarensis KOD1 由来グリセロール-3-リン酸シチジリルトランスフェラーゼの特性解析を目的として、大量発現系の構築を行った。
【方法・結果・考察】
グリセロール-3-リン酸シチジリルトランスフェラーゼ（Tk2274）をコードする
遺伝子配列および His-tag 配列を pET28a ベクターにクローニングした。その後、E. coli BL21(DE3)を宿主として発現誘導を行い、Tk2274 の可溶性発現を確認した。また、アフィニティークロマトグラフィーにより、最適な精製条件を検討した結果、イミダゾール濃度 300 mM が最適であると決定し、夾雑タンパ
ク質が無く、高純度の Tk2274 の精製に成功した。収量としては、培養液 1L 中から 5.31 mg の Tk2274 を回収した。また、熱安定性評価を行った結果、80℃でも変性することがなく、高温条件下でも構造が安定な酵素であることが示唆された。一方、本酵素はグリセロール-3-リン酸を基質とした、シチジリルトラン
スフェラーゼ活性を示しておらず、本発表では、基質特異性について検討を行った結果を含めて発表する。

Stereoselective synthesis of rare alliin stereoisomers using microbial Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenases

Characterization of glycerol-3-phosphate cytidylyltransferase from
Thermococcus kodakarensis KOD1

○Ryosuke Kanzawa1, Taku Mizutani1, Ryotaro Hara1, Makoto Ueda1,2, Jun Ogawa1(1 Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 2 NIT, Oyama College)○Naoki Iwanaga1, Yuichi Koga1,2, Noriko Yamano-Adachi1, Takeshi Omasa1(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Fac. Eng., Okayama Univ. Sci.)

Key words

alliin, garlic, dioxygenase, sulfoxide

Key words
protein engineering, hyperthermophilic archaeon, enzyme purification,
protein expression

3Bp02

S-置換システイン誘導体の合成に有用な微生物酵素の探
索と応用

3Bp04

学

○水谷 拓 1, 原 良太郎 1, 竹内 道樹 1, 日比 慎 2, 上田 誠 1,3,
小川 順 1（1 京大院・農, 2 富山県大・工, 3 小山高専・物質工学科）
ogawa.jun.8a@kyoto-u.ac.jp

学

中性子結晶構造に基づく小分子阻害剤によるマクロ
ファージ遊走阻止因子のサイトカイン活性の阻害機構の解明○江澤 理徳 1, 刈屋 佑美 2, 平野 優 3, 日下 勝弘 4, 玉田 太郎 3,
涌井 秀樹 1, 尾高 雅文 1, 松村 洋寿 1
（1 秋田大院・理工, 2 秋田大・産連, 3 量研機構・量子生命, 4 茨城大・フロンティア応用原子科学研セ）
matsumuh@gipc.akita-u.ac.jp【背景と目的】ネギ属植物中には有用な生理活性を持つさまざまな S-置換システイン類が含まれる。中でもニンニクに含まれる S-allyl-L-cysteine (SAC)やそのスルフォキシド体である alliin は、抗疲労や抗酸化活性などの活性を持つことから注目を浴びている。しかし、当該化合物の主な供給源は植物に限られており、純度や安定性に課題がある。そこで本研究では、酵素を用いた高効率な S置換システイン類の供給法の構築を目指し、本プロセスに有用な微生物酵素の探索を行なった。
【方法】大腸菌由来 tryptophan synthase (TrpAB) がチオールと L-Ser から S-置換
システイン類を合成可能であるが、より高活性な TrpAB の取得を目指し、探索を行った。trpAB の発現制御を回避するため、L-Trp を含まない合成培地でさまざまな菌を培養し、取得した菌体を触媒として allyl mercaptan と L-Ser を基質とする反応を行い、SAC 生成量を評価した。次に、選抜した TrpAB を大腸菌に高発現させ、S-置換システインの立体選択的スルフォキシド化を触媒するジオキ
シゲナーゼと組み合わせることで alliin をはじめとした S-置換システインスル
フォキシドのワンポット合成を試みた。
【結果】Aeromonas hydrophila ssp. hydrophila NBRC 3820 において最も高い SAC
合成活性を見出した。本株由来 trpAB 遺伝子と、ジオキシゲナーゼ遺伝子を共発現させた大腸菌体を構築し、S-置換システイン合成と立体選択的スルフォキ
シド化を組み合わせることで、S-置換システインスルフォキシドをチオールとL-Ser からワンポットで合成することができた。本反応系により、植物にはわ
ずかにしか含まれない ethiin や butiin など、alliin 以外にも様々な S-置換システ
インスルフォキシドが合成可能であった。

マクロファージ遊走阻止因子(MIF)は、炎症及び免疫応答において重要な役割を担うサイトカインである。MIF による炎症反応は、MIF と受容体 CD74 の結合により、CD74/CD44 の活性化とその下流のシグナル伝達がおこることで惹起されることが知られている。炎症反応が過剰になると関節リウマチ等の自己免疫疾患を引き起こすため、MIF は潜在的な創薬標的として注目されている。これまでに幾つかの低分子 MIF 阻害剤が開発され、X 線結晶構造解析を含む相互作
用解析が行われてきた。しかし、MIF による CD74/CD44 活性化の詳細な機序が未解明であり、MIF 阻害剤の阻害機構も未だ不明である。最近、MIF の構造には、分子表面の CD74 結合部位と分子内部の N 末端 Pro1 を繋ぐ水素結合を介した構造ネットワークが存在しており、Pro1 を含む N 末端のダイナミクスがこの構造ネットワーク全体のダイナミクスを調節することで、CD74 の活性化が制御されていることが理論計算により予想された。しかし、この構造ネットワー
クの実験的な証明はなされていない。そこで我々は、MIF の構造ネットワーク
を観測するために、中性子結晶構造解析により MIF の水素原子を含む精密構造を決定した。中性子結晶構造中に、先行研究の理論計算の結果と類似した構造
ネットワークが観測された。また、Pro1 のアミノ基の水素原子は 2 つの位置の平衡状態として観測された。この Pro1 の平衡状態は、構造ネットワークのダイ
ナミクスの調節に関与し、CD74 の活性化を制御していることが示唆された。
MIF 阻害剤の多くは MIF の Pro1 に結合するため、MIF 阻害剤は、この Pro1 の平衡状態に影響を与えることで CD74 の活性化を阻害していると考えられる。

Screening and application of microbial enzymes useful for the synthesis of Ssubstituted cysteine derivatives

Inhibition mechanism of cytokine activity of macrophage migration
inhibitory factor by small molecule inhibitors based on the neutron crystal
structure○Taku Mizutani , Ryotaro Hara , Michiki Takeuchi , Makoto Hibi ,Makoto Ueda1,3, Jun Ogawa1(1 Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 2 Fac. Eng., Toyama Pref. Univ., 3 NIT, Oyama
College)
1

Key words

1

1

2

S-substituted cysteine, tryptophan synthase, garlic, oxygenase○Toshinori Ezawa1, Yumi Kariya2, Yu Hirano3, Katsuhiro Kusaka4, Taro Tamada3,
Hideki Wakui1, Masafumi Odaka1, Hirotoshi Matsumura1(1 Grad. Sch. Eng., Sci., Akita Univ., 2 Coop. Res. Cent., Akita Univ., 3 Inst. Quant.
Life Sci., QST, 4 Frontier Res. Center for Appl. Atomic Sci., Ibaraki Univ.)
Key words
Neutron crystallography, cytokine, macrophage migration inhibitory
factor, inhibitor

240

3Bp05
学

新規架橋酵素融合タンパク質を用いた抗体薬物複合体
作製法

3Bp07

海洋性珪藻 Thalassiosira pseudonana の被殻へのポリペ
プチド提示発現松田 祐介, 嶋川 銀河, ○佐藤 秀祐（関西学院大院・理工）
yusuke@kwansei.ac.jp○西岡 莉子 1, 飯田 龍哉 1, 南畑 孝介 1, 佐藤 崚 1, 木村 道夫 1,
神谷 典穂 1,2
（1 九大院・工, 2 九大・未来化セ）kamiya.noriho.367@m.kyushu-u.ac.jp【目的】
抗体薬物複合体 (ADC) は、抗体の特異性と低分子薬物の薬効を両立した次世代医薬品として注目されている。ADC の作製においては、抗体への薬物の部位特異的な修飾が必要となる。我々は、微生物由来トランスグルタミナーゼ活性型前駆体 (ProMTG) に抗体結合ドメインである protein G (pG) を融合した ProMTGpG が、IgG 抗体の特定の Lys 残基に色素が修飾された Gln 基質をラベル可能であることを最近見出した。一方、ProMTG-pG への自己ラベル反応および抗体共存下における凝集形成が課題として残った。そこで本研究では、上述の課題を解決可能な新規 ProMTG-pG 変異体の設計を試みた。
【方法】
IgG 抗体の Fc または Fab 領域に特異的に結合する pG を融合した ProMTGpG(Fc)、ProMTG-pG(Fab)を調製した。次に、IgG 抗体と各 ProMTG-pG 変異体を混合後、濁度 (OD600) 測定により抗体との凝集形成を評価した。また、Lys
及び Gln 残基を置換した ProMTG-pG 変異体を用いて、薬物モデル Gln 基質による IgG 抗体標識反応を行い、架橋触媒特性を評価した。
【結果と考察】ProMTG-pG と、ProMTG-pG(Fc)ならびに ProMTG-pG(Fab)の比較検討から、pG部位の特異性を制御することで IgG 抗体との凝集が解消されることが示された。また、pG の全ての Lys 残基を置換した ProMTG-pG(Fab) において自己ラベルの抑制が確認され、自己ラベルの反応点が pG 配列中の Lys 残基であることが示された。また、両変異体は IgG 抗体重鎖の Lys65 に薬物モデル Gln 基質を単点修飾可能であり、ProMTG の基質特異性との相関が示唆された。即ち、
Lys65 周辺領域が抗体中の他の Lys 残基の中でもより正に帯電しており、負に帯電した MTG の活性部位に認識され易かったためと考えられる。
【謝辞】 本研究は、AMED 課題番号 JP21ae0121004 の支援を受けたものです。

担持体に固定した酵素は、反応後の酵素回収・再利用が可能である。しかし、酵素を担持体へと固定する際に急激な pH 変化や高温などの条件を必要とする
ため、酵素活性や酵素固定効率の低下が問題となる。この解決策として、非変性環境で酵素を効果的に固定する方法の開発が望まれている。バイオミネラルの 1 つである珪藻被殻において、被殻形成因子である silica affinity protein（Silaffin）は、シリカ沈着小胞 (silica deposition vesicle: SDV) へ輸送された後、シリカ重合を促進し、ナノ構造被殻を形成する。被殻形成は SDV 内で常温、常圧かつ極端な pH 変化を伴わず進行するため、Silaffin が SDV へ移行する仕組みを利用することで、任意の有用酵素タンパク質を化学的処理よりも温和な条件下で被殻に提示・固定でき、新たな酵素固定化技術として期待されている。本
研究では、中心目珪藻 Thalassiosira pseudonana のシリカバイオミネラリゼー
ションを利用し、D-フルクトースの 3 位の水酸基の転移により希少糖の D-アルロースに異性化する酵素である D-allulose 3– epimerase（DAE）およびグラム陽性菌に対して抗菌活性を示す Royalisin（Roy）を珪藻被殻に提示・固定化することを目的とした。実験方法について、Silaffin をコードする Sil3 遺伝子の被殻移行シグナルと、局在の標識として FLAG タグまたは EGFP 遺伝子、目的酵素
遺伝子の融合遺伝子を作製し、野生型 T. pseudonana に導入した。発表では、提示発現の結果と提示タンパク質の応用例を報告する。

A new enzymatic method for the preparation of antibody-drug conjugatesusing a novel fusion protein

Expression of polypeptide on the frustule of the marine diatom Thalassiosira
pseudonana○Riko Nishioka1, Ryuya Iida1, Kosuke Minamihata1, Ryo Sato1, Michio Kimura1,
Noriho Kamiya1,2(1 Grad. Sch. Eng., Kyushu Univ., 2 CFC, Kyushu Univ.)

Yusuke Matsuda, Ginga Shimakawa, ○Shusuke Sato
(Grad. Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ.)

Key words

protein, antibody, enzyme reaction

Key words

3Bp06

超好熱性アーキアを宿主とするウイルス メインキャプ
シドタンパク質の自己組織化機構の解析

3Bp08○里村 武範 1,2, 三品 登生 1, 林 怜生 1, 杉原 伸治 1, 末 信一朗 1（1 福井大院・工, 2 福井大ライフセ）
satomura@u-fukui.ac.jp

学

diatom, silica, immobilization, polypeptide

Split intein を用いた再構成 Tk-SP の評価○白須 尊大 1, 巽 祐介 1, 山野-足立 範子 1,3, 古賀 雄一 2,
大政 健史 1,3
（1 阪大院・工, 2 岡山理大・工, 3 次世代バイオ医薬品製造技術研
究組合）
y-koga@ous.ac.jp

超好熱性アーキアが生産するタンパク質は高い耐熱性に加え、様々な種類の有機溶媒やタンパク質変性に対して高い耐性を有していることが報告されている。
近年、この超好熱性アーキアに感染するウイルスが発見され注目されている。
超好熱性ウイルスは宿主が超好熱性アーキアであることから、これらのウイル
ス由来タンパク質も高い安定性を有していることが考えられるためナノマテリ
アルへの応用などが期待されている。これまでに多くの超好熱性ウイルスが単離されゲノム解析が行われてきたが、超好熱性ウイルスがコードするオープン
リーディングフレーム（ORF）は既知の ORF との相同性が認められないため超好熱性ウイルスタンパク質の機能解析は進んでいない。
本研究では、ウイルス粒子を形成するキャプシドタンパク質が同定されている
好気性超好熱性アーキアに感染する桿状ウイルスである Aeropyrum pernix
bacilliform virus 1（APBV1）と紡錘状ウイルスである Sulfolobus spindle-shape virus
1 (SSV1)に焦点を当てた。APBV1 と SSV1 はウイルスの形状は異なるが粒子を形成するメインキャプシドタンパク質の構造は類似性がある。そこで、
APBV1、SSV1 のメインキャプシドタンパク質の大腸菌による組換えタンパク
質発現の構築を行い発現タンパク質の粒子形成を行い、それぞれの粒子形成におけるキャプシドタンパク質の機能を明することを目的に研究を行った。

【背景・目的】超 好 熱 古 細 菌 Thermococcus kodakarensis KOD1 由 来 の subtilisin-like serine
protease である Tk-SP は、耐熱性に優れ、90℃以上の高温、高濃度変性剤存在下といった、通常の酵素が変性・失活してしまう条件下で酵素活性を維持できる。さらに、伝播性海綿状脳症の原因として考えられている異常型プリオンタ
ンパク質 PrPSc を分解することが可能で、医療用酵素洗剤としての応用が期待されている。しかし、Tk-SP を大腸菌で発現させると、そのタンパク質分解活性のため増殖阻害が引き起こされ、大量生産が困難である。本研究では、酵素を、活性を持たない断片として発現させ、protein trans-splicing（PTS)を起こす
split intein を利用することで Tk-SP を再構築するシステムを開発した。
【方法・結果・考察】
Tk-SP を断片化し、split intein を融合させて組換え発現すると、断片の可溶性と再構築効率が問題となる。断片化後の Tk-SP の可溶性を向上させるために、シミュレーションツール（AlphaFold2、SOLart）を用いて、Tk-SP 分子上の複数の分割位置ごとのタンパク質の溶解度予測を行い、可溶性を維持できる位置の予測を行った 1) 。大腸菌 Escherichia coli BL21 (DE3)を用いた発現系を構築し、Tk-SP 断片の発現を行い、SDS-PAGE により可溶性画分のタンパク質量を解析した。さらに、断片同士を混合させることにより PTS が進行するかを確認し、さらにザイモグラフィーを用いて再構成体の酵素活性確認を行った。本発表では、可溶性シミュレーションと実験結果の比較評価、及び再構成 Tk-SP の活性について報告を行う。
1) 白須 他, 第 74 回日本生物工学会 (2022).

Self-assembly mechanism of the main capsid protein from archaeal virus

Evaluation of reconstituted Tk-SP by split intein○Takenori Satomura1,2, Toi Mishina1, Reo Hayashi1, Shinji Sugihara1,
Shin-ichiro Suye1(1 Grad. Sch. Eng. Fukui Univ., 2 Life Univ. Fukui)

Key words

nano particle, archaea, virus○So Shirasu1, Yusuke Tatsumi1, Noriko Yamano-Adachi1,3, Yuichi Koga2,
Takeshi Omasa1,3(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Fac. Eng., Okayama Univ. Sci., 3 MAB)

Key words

protein engineering, enzyme production, split intein

241

3Bp09

大腸菌 K トランスポーターの Na 活性化部位の同定○Tanudjaja Ellen 1, 星 直美 1, 山本 兼由 2, 井原 邦夫 3, 古田 忠臣 4,
辻井 雅 1, 石丸 泰寛 1, 魚住 信之 1
（1 東北大院・工, 2 法政大・生命科, 3 名大・遺伝子実験施設, 4 東工大・生命理工）
uozumi@tohoku.ac.jp

3Bp11
学

親和性最適化による標的細胞特異的な直列三量体ナノボディの創出○オンゴノ スワンディ, 門之園 哲哉（東工大・生命理工）
tetsuyak@bio.titech.ac.jp

目的 K は細胞内の主要元素であり，膜電位の形成，浸透圧や細胞体積の調節，酵素の活性化などの役割を担い，細胞増殖・分裂に必須である．微生物や植物は，動物とは異なり細胞内に K を吸収する Na-K ポンプを持っておらず，別のK 取込み輸送体をもっている．その一つの Trk/Ktr/HKT 系は大腸菌，枯草菌，藍藻，酵母，植物や原虫などで K 取込み輸送体として機能している．一方，Na透過活性をもつ HKT 輸送体もあり，植物の耐塩性に関与している．大腸菌には 2 種類の Trk/Ktr/HKT 系の TrkG と TrkH が K 取り込み系として報告されているが，両 Trk に関する輸送活性に関わる情報は限られている．本研究では，大腸菌の Trk 輸送体の性質について解析を行った．
方法と結果 TrkG と TrkH の輸送活性を検討するために P1-transduction およびDatsenko＆Wanner 法で K 輸送体遺伝子の大腸菌の多重変異株を作成した．TrkG
は Na 依存性 K 輸送活性と Na 輸送活性をもつが，TrkH は Na の影響を受けな
い K 輸送体であることを前回までに報告した．今回，さらに TrkG の Na 輸送
活性と Na 活性化について検討したところ，TrkG と TrkH のキメラ蛋白質を作製したが明瞭な結果は得られなかった．一方，TrkG のイオン選択孔周辺には，特徴的な酸性アミノ酸が存在していることを見いだした．この結果，Na を活性化に関する第 3 選択孔付近の保存されたアスパラギン酸が Na の活性化に重要であることが明らかになった．Tanudjaja et al. J. Biol. Chem. 299, 102846 (2023)

低分子抗体ナノボディ (Nb)は、従来の抗体医薬同様に抗原に特異的かつ強力に結合する。そのため、がんをはじめとする様々な疾患の分子標的治療における創薬モダリティとして期待されている。しかし、抗原親和性が強すぎる場合、抗原を過剰発現する標的細胞だけでなく、抗原をわずかに発現する正常細胞にも結合するため、重篤な副作用を引き起こす懸念がある。そのため、標的細胞への特異性を高めた Nb の創出技術の確立が求められている。
本研究では HER2 を抗原とする Nb に変異を導入して抗原親和性を弱め、さらに直列三量体化することで、抗原発現量に依存して結合するような、標的細胞特異性を高めた Nb の創出を目的とした。まず、精製した Nb の HER2 発現細胞への結合をフローサイトメトリーで解析すると、HER2 高発現細胞だけでなく、
HER2 低発現細胞へも結合が見られた。次に、Nb の抗原結合残基を異なるアミノ酸に置換した 6 種類の変異型 Nb を作製したところ、T103A 変異体およびY104A 変異体において HER2 発現細胞への結合量が大きく低下した。そこで、
直列三量体 Nb (TriNb)と Y104A 変異型 TriNb を作製して HER2 高発現細胞と低発現細胞への結合量を調べると、TriNb はどちらの細胞にも同程度の量が結合したが、Y104A 変異型 TriNb は HER2 低発現細胞よりも高発現細胞に多く結合し、標的細胞特異性を向上させることに成功した。今後、Y104A 変異型 TriNbの結合条件を詳細に解析し、新たな変異体を設計することで、より抗原発現量への依存性を高めた Nb の創出を目指す。

Identification of the Na+ activation site of K+ transporter in Escherichia coli

Development of tandem trimer nanobody for specific binding on target cells
by affinity optimization○Ellen Tanudjaja1, Naomi Hoshi1, Kaneyoshi Yamamoto2, Kunio Ihara3,
Tadaomi Furuta4, Masaru Tsujii1, Yasuhiro Ishimaru1, Nobuyuki Uozumi1(1 Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 2 Dept. Front. Biosci., Hosei Univ., 3 Center for
Gene Research., Nagoya Univ., 4 Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)○Onggono Suwandi, Tetsuya Kadonosono(Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)

Key words

potassium transport, Trk/Ktr/HKT, Escherichia coli, transporter

Key words

nanobody, side-effect, drug selectivity, binding affinity

3Bp10

変性状態の細胞内総タンパク質が示す溶解性を利用した
新規プロテオミクス

3Bp12

微生物発現と構造安定性を考慮した機械学習支援による抗体断片の親和性成熟学○伊達 実鈴 1, 塩川 つぐみ 2, 多田 宏子 2, 本莊 知子 1, 宮本 愛 1,
岡田 宣宏 3, 二見 淳一郎 1（1 岡山大院・統合科学, 2 岡山大・自然生命支援セ, 3 京府医大院・医学研究）
futamij@okayama-u.ac.jp○伊藤 智之 1, 河田 早矢 1, 中澤 光 1, 村上 明一 2,3, 梅津 光央 1,4（1 東北大院・工, 2 徳島大院・医歯薬, 3 RePHAGEN, 4 理研・革新
知能）
mitsuo@tohoku.ac.jp

従来のがんの３大治療法（化学療法・外科療法・放射線療法）に加え，現在，
がん免疫療法が新しい柱として注目されている．特に免疫チェックポイント阻
害剤は，一部の進行がんに対して従来の治療成績を大幅に上回る著効例を示す
一方で，個人差が大きく，奏効率の予測と，免疫関連副作用のリスク管理が大きな課題となっている．この課題突破のため，がん免疫応答をプロファイリン
グし，がん免疫サイクルの活性化レベルをモニタリングする技術が現場から求められている．当研究室ではがん免疫サイクルの活性化に伴って上昇する各種の「がん抗原に対する自己抗体群」をバイオマーカーとして定量評価する抗体
検査診断技術を開発中である．本研究では，このバイオマーカー網の強化を目的に，各種の臨床検体の血漿中に含まれる自己抗体バイオマーカーをプロテオ
ミクスで同定・拡張する作業を進めている．この過程で，プロテオミクスの効率化をはかるため，従来法よりも多検体に対応しやすい 2 次元分離技術を開発した．ヒト培養細胞内の総タンパク質は核酸を完全に除去すると，変性状態でも高い溶解性を示す知見 1 を活用して lysate を調製し，逆相 HPLC で分画することで疎水性度(HYD)に応じて総タンパク質を分画した後，SDS-PAGE で分子
量別(MM)に分画することで，高い再現性で HYD/MM による 2 次元分離を可能にした．この HYD/MM 技術は従来の等電点電気泳動法と比較して，逆相 HPLC
でサンプルを分画さえすれば，あとは市販のゲルを用いることで均質なレプリカを大量に調製できる点が秀逸であり，多検体の測定を「安価かつ高解像度」
で実施できる画期的な方法と考えている．本発表ではこの技術の概要と同定された自己抗原の特徴や，変性状態の細胞内総タンパク質が示す溶解性についてご紹介したい．
1) PLoS One (2014) e113295

標的特異的な結合能を持つ抗体は医薬品や研究試薬として広く用いられているが、親和性を向上させる変異導入が立体構造の不安定化をまねいてしまうなど、抗体の標的結合機能は構造安定性など他の物性と反相関の関係になることがある。そこで本研究では、SARS-Cov-2 のレセプター結合ドメイン(RBD)に対する結合能を有するラクダ由来抗体断片(VHH)を対象として、複数条件を同時に満たす機械学習手法を利用して、抗体断片の微生物発現と構造安定性を向上させつつ親和性を向上させることを試みた。
まず一部アミノ酸をランダム化した抗 RBD VHH を提示するファージライブラ
リーを 108 規模で作製し、RBD に対する生体外選択操作後を 4 回行った後、各変異体の存在率を次世代シークエンサーにて解析した。その結果、高い生存率を示した変異体は特定の 5 残基に変異を有していた。そこでこの 5 残基にラン
ダム変異を導入した 117 種変異体を大腸菌 BL21(DE3)株を用いて培養し、各変異体の発現量および結合活性を、それぞれバイオレイヤー干渉法および酵素固
定化免疫吸着法により測定した。また発現量が大きい変異体は折りたたみ効率が高く、構造安定性と正相関すると仮定し、発現量と結合活性を掛け合わせた
スコア値を新たに定義してアミノ酸配列とスコア値が紐づけされた教師データを作成し機械学習を行った。その結果予測された上位 40 変異体を作製し機能評価を行ったところ、変異導入前と比較して発現量が約 5 倍、結合活性が約 70 倍向上した変異体が得られ、さらにサーマルシフトアッセイの結果、野生型と同等以上の熱安定性を示した。このことから、発現量と結合活性データを用いた機械学習を行うことで、抗体断片の親和性を向上させつつ物性も最適化できる可能性が示唆された。

Novel proteomics based on the solubility of denatured total intracellular
proteins

Machine-learning-assisted affinity maturation of an antibody fragment
simultaneously improving the bacterial expression and structural stability○Mirei Date , Tsugumi Shiokawa , Hiroko Tada , Tomoko Honjo , Ai Miyamoto ,Nobuhiro Okada3, Junichiro Futami1(1 Grad. Sch. ISEHS., Okayama Univ., 2 Dept. Inst. Anal., Okayama Univ., 3 Grad.
Sch., Med., Kyoto Pref. Med. Univ.)
1

Key words

2

2

1

protein engineering, screening, 2D electrophoresis, proteomics

1○Tomoyuki Ito1, Sakiya Kawada1, Hikaru Nakazawa1, Akikazu Murakami2,3,
Mitsuo Umetsu1,4(1 Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 2 Grad. Sch. Biomed. Sci., Tokushima Univ.,
3
RePHAGEN Co. Ltd., 4 AIP, RIKEN)

Key words

phage display, machine learning, antibody fragment

242

3Bp13
学

新規 binding scaffold 開発への超好熱菌由来タンパク質を基にしたプラットフォーム構築

3Bp15

アーキア由来キチン結合ドメインを骨格とした IL-11 結合変異体の創出○牧野 祥嗣 1,2, 林 咲楽 1, 金井 保 1,2（1 富山県大・工, 2 富山県大・生医工研セ）
makino@pu-toyama.ac.jp○月元 漱介 1, 長尾 征秀 1, 山野-足立 範子 1,3, 古賀 雄一 2,
大政 健史 1,3
（1 阪大院・工, 2 岡山理大・工, 3 次世代バイオ医薬品製造技術研
究組合）
y-koga@ous.ac.jp【背景・目的】
治療薬や分子イメージング及びアフィニティーリガンドなどの研究ツールとして、高い親和性と特異性で標的蛋白質に結合する非抗体タンパク質（binding
scaffold）の研究が進んでいる。これまでに治療薬で課題となる免疫原性を避けるためにヒト由来のタンパク質を利用した binding scaffold が開発されているが、それらの構造安定性は Tm37〜65℃程度であった。高い構造安定性を持つ
binding scaffold は、高温や変性剤条件下などの劣悪な環境でも使用できる分子ツールとして有用であることから、高い構造安定性を有する超好熱菌
Fervidobacterium islandicum 由来サチライシン様セリンプロテアーゼ Islandisin のβ-sandwich domain1 (SD1)に着目し、超好熱菌を基にした binding scaffold 開発のプラットフォーム構築を試みた。Islandisin は極めて高い安定性を有し、そのドメインである SD1 は Tm77.5℃の安定性を示し、また抗体の可変ドメインと類似した構造であることから、標的分子に対する結合表面の構築が可能であると考えられる。先行研究において、SD1 を大腸菌で大量発現させた際の可溶性の低さが binding scaffold としての課題であることが示されたため、SD1 へのラン
ダム変異導入とコンセンサス配列解析により大腸菌で発現させた際の SD1 可溶
性向上を行った。
【方法・結果・考察】
error-prone PCR 法によりランダム変異を導入した SD1 ライブラリーに対して、
GFP 由来の蛍光強度でタンパク質の可溶性発現を検出する split-GFP システムを用いてスクリーニングを行った。Flow cytometry を用いて、野生型 SD1 より高蛍光強度の陽性クローンを分取した。またコンセンサス配列解析では、SD1 の相同配列から非保存アミノ酸を保存アミノ酸に置換することにより可溶性の向上を試みた。本発表では、これらの方法によって得られた可溶化変異 SD1 について報告する。

近年、インターロイキン 11（IL-11）のがんとの関係について、消化器系がん等の増殖や浸潤を促進し得ることや、バイオマーカーとしての活用が可能なことなどが明らかになってきた。例えば、大腸がんでは IL-11 陽性細胞の一群の遺伝子発現と再発率の相関が報告された（Nishina, T. et al. Nat Commun 12, 2281
(2021))。また、非小細胞肺がんでは、IL-11 がバイオマーカーとなり得ることも報告されている（Seki, et al. cells 11, 2257 (2022))。これらのことから、IL-11 をターゲットとするバイオ医薬品の、がん治療または診断における有効性が期待できる。そこで我々は本研究で、IL-11 に特異的に結合してその活性を阻害する
ような、非抗体型の変異タンパク質の創出を試みた。抗体でない比較的分子量の小さなタンパク質を改変することで、迅速な開発と、微生物等による低コスト、効率的な組換え生産が可能となる。
まず、骨格として利用するタンパク質として、変異導入に対する耐性を期待し、
超好熱性アーキア（Thermococcus kodakarensis KOD1）由来のキチン結合ドメインを選定した。次に、このタンパク質構造のループ領域のアミノ酸をランダマイズする遺伝子を合成し、リボソームディスプレーライブラリを構築した。これを用いて、IL-11 をリガンドとする親和性スクリーニングを 4 ラウンドまで繰
り返し、回収した遺伝子をモノクローン化した。ELISA により IL-11 との親和性を評価したところ、多くのクローンで特異的親和性を示すシグナルが得られた。さらに、高活性が期待される変異体タンパク質をいくつか精製し、詳細な活性評価を試みた。

Development of the platform for the new binding scaffolds based on proteinsfrom hyperthermophiles

Development of IL-11 binding mutants using the chitin-binding domain ofArchaea○Sosuke Tsukimoto1, Masahide Nagao1, Noriko Yamano-Adachi1,3, Yuichi Koga2,
Takeshi Omasa1,3(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Fac. Eng., Okayama Univ. Sci., 3 MAB)

○Yoshihide Makino1,2, Sakura Hayashi1, Tamotsu Kanai1,2(1 Fac. Eng., Toyama Pref. Univ., 2 Biotechnol. Res. Center, Toyama Pref. Univ.)

Key words

protein engineering, binding scaffold, screening, protein solubility

Key words

3Bp14

タンパク質性分子認識素子の大腸菌表層提示系構築の
検討

3Bp16

学

○河合 頼央, 今村 維克, 今中 洋行（岡山大院・環境生命自科）
imanaka@okayama-u.ac.jp

学

protein engineering, archaea, protein library screening, IL-11

Development of a Novel NADP Transporter○Matthew Imanaka1,2, Kohsuke Honda1,2, Hiroya Tomita1,2,
Kentaro Miyazaki1(1 ICBiotech, Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ.)
matthew_imanaka@icb.osaka-u.ac.jp【目的】
特定の標的分子を捕捉するタンパク質性分子認識素子を効率よくスクリーニン
グする手段の一つとして細胞表層提示系の利用が挙げられる. 本研究では発現の容易さや定量的な分析の可能性を考慮し，大腸菌表層提示系の適用を考えた．
そして，数種類のアンカータンパク質を用い，各種目的タンパク質の表層提示能についてそれぞれ評価を行うこととした．
【方法・結果】
大腸菌表層提示系において，比較的分子量の大きなパッセンジャータンパク質の提示が可能であると報告例のあるアンカータンパク質の適用を考え，大腸菌
リポタンパク質の Lpp と大腸菌外膜タンパク質の OmpA を融合した Lpp-OmpA
ならびにオートトランスポーターである AIDA-I の二種類を用いる事とした．
パッセンジャータンパク質にはラクダ科動物由来の低分子で構造安定性の高い
VHH 抗体（VHHgfp_enhancer）と，超好熱菌 Pyrococcus furiosus 由来で極めて高い構造安定性を有するホモ三量体タンパク質 CutA1 を１本鎖化し，単量体にした scCutA1 を用いた．VHHgfp_enhancer の表層提示については VHH-GFP 間相互作用による蛍光強度の増加を指標に特性を評価し，scCutA1 の表層提示特性は挿入した FLAG タグを Western blotting あるいはフローサイトメトリーにより評価した．さらに，タンパク質同士を繋ぐ生体分子糊の一つである SpyTag/
SpyCather をアンカータンパク質とパッセンジャータンパク質にそれぞれ融合
し，共発現後にパッセンジャータンパク質を提示するモジュール方式での大腸
菌表層提示系についても検討を進めている．

Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate (NADP) have similar structures and redox potentials. However, NAD(H) is
generally utilized in catabolic reactions, while NADP(H) is utilized in anabolic
reactions. To better understand the evolutionary relationship between NAD(H) andNADP(H), we propose the creation of an NADP-auxotrophic E. coli strain. Our
strategy includes (I) gene deletion or suppression of the NADP synthesis gene, NADkinase (NADK) (II) supplementation of NADP exogenously via an NADP transporter.
As NADK is an essential gene in E. coli, we first tried to suppress the gene using theinducible CRISPRi (dCas12F1) system. As the induction strength increased, the cell
viability decreased, suggesting that NADK was successfully suppressed. Next, wesearched for an NADP transporter, but no such protein has been reported. However,
due to the similarities between NAD and NADP, we reason an NAD transporter could
possibly also transport NADP. We selected the NAD transporter NTT4, isolated fromthe endoparasite bacterium Protochlamydia amoebophilia UWE25. We expressed thentt4 gene in E. coli and measured the intracellular NAD concentration. We found thatthe intracellular NAD concentration was higher in NTT4-expressing cells, indicating
the proper NTT4 expression. Next, we will evolve NTT4 to transport NADP.
Mutagenized NTT4 will be expressed under NADK suppression and NADP
supplemented in the media. We expect cells expressing the desired NTT4 variant tosurvive.

Investigation of surface display of proteinaceous molecular recognition
elements in Escherichia coli

Development of a Novel NADP Transporter○Raio Kawai, Koreyoshi Imamura, Hiroyuki Imanaka(Grad. Sch. of Environ., Life, Nat. Sci. & Tech., Okayama Univ.)

Key words

cell surface display, antibody, protein engineering○Matthew Imanaka1,2, Kohsuke Honda1,2, Hiroya Tomita1,2, Kentaro Miyazaki1(1 ICBiotech, Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ.)

Key words

transporter, NAD(P)H, mutagenesis, gene knockout

243

3Cp01
学

嵩高いケージングを用いた細胞内でのタンパク質の光活性化○山本 涼太郎 1, 山口 哲志 1, 守山 千晴 2, 岡本 晃充 1
（1 東大院・工, 2 東大・工）yamaguchi@chembio.t.u-tokyo.ac.jp

3Cp03
学

アミロイドベータの線維伸長抑制に関与する Protein
disulfide isomerase ドメインの同定○市田 春音, 迫野 昌文（富山大院・理工）msakono@eng.u-toyama.ac.jp

タンパク質の活性を細胞内で光制御する技術は、タンパク質の時間的、空間的な役割を明らかにできる。近年、そのような技術として、光分解性の保護基を修飾して不活性化する「ケージング」が用いられてきた。ケージングを施した
タンパク質は、細胞内に導入後、光照射によって望みのタイミングに特定の場
所でのみ活性化できる。光応答性タンパク質との融合体として制御するオプト
ジェネティクスとは異なり、保護基の光分解によって未修飾のタンパク質に戻すことができるため、タンパク質の役割を正確に調べることができる。しかし、低分子量の保護基を用いて、100 倍以上の大きさのタンパク質の活性を確実に制御するのは困難である。そこで、我々の研究グループでは、嵩高い分子であるタンパク質により標的タンパク質の表面を全体的に遮蔽する「嵩高いケージング」技術を開発し、試験管内や細胞表層でタンパク質活性の厳密なオフオン制御が実現できることを報告してきた。この技術は、タンパク質表面をランダ
ムに化学修飾するだけで煩雑な遺伝子操作は必要無い。また、機能や活性部位などが未知なタンパク質にも応用可能である。従って、幅広いタンパク質の細胞内での役割を解明する強力なツールとなる。そこで、本研究では、「嵩高いケージング」技術を用いて細胞内でタンパク質の光活性化が可能であるかを調べた。また、応用を見据えるケージングを介した細胞導入機能の追加を目指す。

約 40 のアミノ酸から構成されるアミロイドベータペプチドは、脳内で線維状の凝集体を形成することでアルツハイマー型認知症を引き起こす。我々は、酸化還元酵素である Protein Disulfide Isomerase（PDI）がアミロイドベータの線維化を効果的に抑制することを報告した[1]。そのため、PDI によるアミロイドベー
タ線維化抑制メカニズムの解明はアルツハイマー病の新たな治療法確立につながることが期待されるが、その抑制メカニズムは不明である。そこで、PDI を構成する a-b-b’-a’の 4 つのドメインに注目し、各ドメインのアミロイドベータ
線維化抑制能力について検討を行った。アミロイドベータ及び PDI の混合溶液
を 24 時間 37℃でインキュベートしたのち、アミロイド形成を Thioflavin T（ThT）
蛍光アッセイおよび電気泳動により評価した。ThT プローブによる評価にて、
a 型のドメインを含む PDI のフラグメントでは ThT 蛍光の抑制が見られたが、a 型のドメインを含まない b 型のドメインのみで構成された PDI フラグメント
では ThT 蛍光の抑制は観察されなかった。また、SDS-PAGE/western blot(アミロイドベータ抗体)による評価においても、a 型のドメインを含む PDI のフラグメ
ントではモノマー由来のバンドを観測できたが、b 型のドメインのみで構成された PDI フラグメントでは線維化によりバンドの消失が確認された。このこと
は、PDI によるアミロイドベータ線維化抑制効果は a 型ドメインが重要な役割を果たすことを示唆した。
参考文献[1] K. Kitauchi and M. Sakono, Biochem. Biophys. Res. Commun. , 481 (2016)
227-231.

Intracellular photoactivation of proteins using sterically bulky caging

Identification of domain of protein disulfide isomerase involved insuppression of amyloid-beta fibrillation.

○Ryotaro Yamamoto1, Satoshi Yamaguchi1, Chiharu Moriyama2,
Akimitsu Okamoto1(1 Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo, 2 Fac. Eng., Univ. Tokyo)○Harune Ichida, Masafumi Sakono(Grad. Sch. Sci. Eng., Univ. Toyama)

Key words

protein, cell, photoactivation

Key words

amyloid fibril, protein aggregation

3Cp02

CAR-T 細胞の活性化および疲弊レベル解析による抗原親和性最適化技術の開発

3Cp04

cDNA ディスプレイ法を駆使した翻訳促進新生ペプチド
配列探索技術の開発○坂本 祐基, 門之園 哲哉（東工大・生命理工）
tetsuyak@bio.titech.ac.jp

学○高井 陸杜, 加藤 晃代, ダムナニョビッチ ヤスミナ, 大嶽 七菜,
中野 秀雄（名大院・生命農学）
teruyo@agr.nagoya-u.ac.jp

キメラ抗原受容体 (CAR)-T 細胞は、抗体由来の抗原結合ドメインと T 細胞受容体由来のシグナル伝達ドメインで構成される CAR を発現する遺伝子改変 T 細胞であり、抗原を発現するがん細胞に対して高い細胞障害性を示す。しかし、
CAR の抗原親和性が強すぎる場合、過剰な活性化シグナルにより CAR-T 細胞は早期に疲弊状態に陥り、治療効果が低下することが課題となっている。そのため抗原親和性の最適化により、高い活性を持ちながら疲弊状態になりにくい
CAR-T 細胞の創出技術の確立が求められている。
本研究では、乳がんマーカー HER2 を抗原とする低分子抗体ナノボディ (Nb)を
抗原認識ドメインに持つ Nb-CAR-T 細胞を用いて、Nb の抗原親和性が活性化
および疲弊レベルに与える影響を明らかにすることを目的とした。まず Nb-CAR遺伝子を設計し、T 細胞株に導入して Nb-CAR-T 細胞を作製した。また、Nb の抗原結合残基を異なるアミノ酸に置換して抗原親和性を変化させた 6 種類の変異型 Nb-CAR を設計し、これらの遺伝子をＴ細胞株へ導入して Nb-CAR-T 細胞
ライブラリーを作製した。次に、これらの細胞を組み換え HER2 タンパク質で刺激後、活性化マーカー CD69 および疲弊マーカー PD-1 の発現量をフローサイ
トメトリーで測定した。その結果、Nb の抗原親和性の変化により、活性化および疲弊レベルが変化することが分かった。現在、Nb-CAR-T 細胞の抗原親和性、活性化レベル、疲弊レベルに大きな影響を与える Nb の残基を複数特定し、これらのアミノ酸をランダム配列化することでより大きな Nb-CAR-T 細胞ライブ
ラリーの構築を進めている。今後、構築したライブラリーに含まれる変異型
Nb-CAR-T 細胞を詳細に解析し、抗原親和性の最適化技術を開発したい。

【目的】
当研究室では、難発現タンパク質をコードする遺伝子の開始コドン下流に 4 つのアミノ酸からなる SKIK ペプチドタグを挿入すると、大腸菌におけるタンパ
ク質の発現量が増大することを発見した。また、その後の研究で、翻訳伸長の一時停止（翻訳アレスト）を引き起こす AP(Arrest Peptide)の直前に MSKIK タ
グを挿入すると、翻訳アレストが解除されることを見出した。そこで本研究では、大腸菌において翻訳アレストを解除し得る新たな翻訳促進新生ペプチド配列を発見するため、cDNA ディスプレイ法を用いた探索技術の開発を目指した。
【方法・結果】
まず、モデル実験として、既知の翻訳促進配列で AP のアレストを打ち消す
SKIK タグが cDNA ディスプレイ法によって選択的に濃縮され得るかを検討した。ここでは、翻訳アレストを引き起こす大腸菌タンパク質として secM 由来の AP 遺伝子を用い、その直前を SKIK タグあり・なしとした DNA 混合液をモ
デルライブラリとして cDNA ディスプレイによるセレクションを行なった。その結果、アガロースゲル電気泳動により、SKIK タグを有する遺伝子が濃縮されたことが確認できた。次に、AP の直前に NNK×4 のランダムペプチドライブ
ラリを導入し cDNA ディスプレイによるセレクションを行なった。スクリーニ
ング前・後の遺伝子プールを用い、PURE system による sfGFP の発現量を比較したところ、1 ラウンド後の蛍光強度が増大しており、翻訳促進配列が濃縮できている可能性が示唆された。加えて、濃縮された複数の新規配列のいくつかが翻訳促進能を有していることを確認した。
【まとめ】
・cDNA ディスプレイ技術を応用し、大腸菌の翻訳促進ペプチドを探索できる系を構築した。
・SKIK 以外の翻訳促進ペプチドを見出すことに成功した。

Development of Antigen Affinity Optimization Technology by Analyzing
Activation and Exhaustion Levels of CAR-T Cells.

Development of a translation-enhancing nascent peptide sequence discovery
technique using cDNA display methodology○Yuki Sakamoto, Tetsuya Kadonosono(Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)

Key words

chimeric antigen receptor, nanobody, binding affinity, exhaustion○Rikuto Takai, Teruyo Kato, Jasmina Damnjanović, Nana Odake, Hideo Nakano(Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)

Key words

Nascent polypeptide, translation

244

3Cp05
学

抗体誘導スクリーニング法による抗体代替ナノボディの
同定

3Cp07

ヒトナイーブライブラリからの新型コロナウイルス親和性一本鎖抗体の開発○齋藤 虹帆, 牧野 祥嗣, 金井 保
（富山県大院・生医工）makino@pu-toyama.ac.jp○小川原 巧, 門之園 哲哉（東京工業大学 生命理工学院）
tetsuyak@bio.titech.ac.jp

抗原に特異的かつ強力に結合する低分子抗体ナノボディ (Nb)は、安定性、組織
浸透効率、体外排出効率が高く、従来の抗体医薬とは異なる動態を持つ新たな創薬モダリティとしての開発が進められている。我々はこれまでに、抗体の構造情報から設計したペプチドライブラリーの中から、抗体（ガイド抗体, gAb）と同じエピトープに結合するペプチドを同定する、抗体誘導スクリーニング法
MAGPIE screen を開発している。さらに、細胞膜上にディスプレイした抗体の抗原親和性スコアを取得する技術も開発している。これらの技術を応用することで、Nb ライブラリーの中から特定の抗体の代替となる Nb を効率よく同定することが可能である。
本研究では、標的抗原として乳がんマーカー HER2、gAb として抗 HER2 抗体
医薬 Pertuzumab (Per)を用い、MAGPIE screen によって Per と同じエピトープに強く結合する Nb の同定を目指した。まず、抗 EGFR Nb の CDR3 領域を含む
18 アミノ酸をランダム配列化した Nb ライブラリーを HER2 発現細胞膜上にディスプレイし、MAGPIE screen により約 3.6 x 104 個の細胞を回収した。次に、回収した細胞に発現する Nb 変異体の HER2 親和性をスコア化した結果、431 種の親和性スコアを取得できた。現在、これらの Nb 変異体うちスコアが上位の 5種を選別し、HER2 への親和性および特異性を詳細に解析している。今後は、得られた変異体の結合様式も解析して本技術の有用性および汎用性を証明し、革新的な創薬技術へと繋げたい。

新型コロナウイルス感染症に対する抗体医薬品は、発症抑制等を目的として継続的に使用されている。ただし、抗体医薬品は薬価が高く、大きな経済的な負担を伴う。そこで、例えば、抗体と同等な働きをするが比較的低分子で安価に生産できる、一本鎖抗体 (scFv) による代替が検討されている。我々は本研究で、SARS-CoV-2 表面で感染に関与する S1 タンパク質ドメインに結合して感染を抑制するような、scFv のスクリーニングと評価を行った。
まず、ヒト末梢血白血球から抽出した mRNA をもとに、VL 鎖および VH 鎖ライ
ブラリを構築した後、アセンブリ PCR 法で Naive ライブラリ DNA を得た。続いて、これを我々が開発した大腸菌ディスプレイベクターにクローニングし、スクリーニング用ライブラリ (2.3×104(cfu)) を得た。一方、抗原として、Nanotag または Twin-Strep-tag を付加させた SARS-CoV-2 表面 S1 タンパク質の RBD
部分を、in vitro 転写/翻訳系により調製した。これらを用いて、親和性スクリー
ニングを 3 回または 4 回繰り返した。選択後に回収された大腸菌のコロニー形
成数について、リガンドの有無および初期ライブラリとの比較により評価した
ところ、濃縮ライブラリ中には RBD または S1 タンパク質への親和性配列が濃縮されていると予想された。そこで、選択後ライブラリから scFv 遺伝子をサブクローニングし、組換えタンパク質の可溶性発現を試みた。複数の方法で可溶化を検討したところ、pelB シグナル配列を融合したペリプラズム発現の有効性が確認されたので、現在、可溶化 scFv クローンの調製と活性評価等を進めている。

Identification of antibody mimetic nanobodies with antibody-guided
screening

Development of anti-coronavirus single-chain antibodies from the human
Naive library○Takumi Ogawara, Tetsuya Kadonosono(School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, Yokohama
226-8501, Japan.)○Nijiho Saito, Yoshihide Makino, Tamotsu Kanai(Grad. Sch. Bio. Pha. Eng., Toyama Pref. Univ.)

Key words
therapyprotein engineering, high-throughput screening, antibody, cancer

Key words

SARS-CoV-2, Escherichia coli, scFv, screening

3Cp06

酵母細胞壁由来乳化糖タンパク質の構造と乳化能の
関係

3Cp08

マウス型モノクローナル抗体の抗体酵素への直接変換〜抗体の酵素化とその生化学的性質〜○野口 紘志, 二塚 美紀, 尾島 由紘, 東 雅之
（大阪公大院・工）azuma@omu.ac.jp○伊東 優依 1, 辻田 萌 1, 宇田 泰三 2, 一二三 恵美 3,4（1 大分大院 工, 2 九州先端研, 3 大分大研マネ, 4 大分大グローカ
ル感染症研）
e-hifumi@oita-u.ac.jp

乳化現象は食品や化粧品などの製造過程において広く利用されており、エマル
ジョンを形成させるために乳化剤が用いられる。多くの場合、化学合成された乳化剤が利用されるが、食品分野では天然由来のカゼインや卵黄に含まれるレ
シチンなども用いられる。タンパク質乳化剤は高分子量で嵩高く、安定なエマルジョンを形成する特徴がある。しかし、タンパク質の構造が複雑であるため、乳化能との関係はあまり解明されていない。我々の研究室では酵母細胞壁由来の糖タンパク質をモデルタンパク質として捉え、研究を進めている。酵母
Saccharomyces cerevisiae の細胞壁抽出物から乳化能を持つタンパク質 Gas1 を同定し 1)、2021 年度日本生物工学会大会で報告した。本研究では Gas1 の変異タ
ンパク質の解析から構造と乳化能の関係を調べた。Gas1 は通常 GPI アンカーを介して細胞壁に固定化されているが、GPI アンカー固定シグナルを除去し、C末端側に His タグを付加したものを培地に分泌発現させ、アフィニティーカラ
ムにより精製したタンパク質を実験に用いた。Gas1 はタンパク質部分が約 56
kDa であり、ばらつきが大きいものの、60 kDa 程度の糖鎖修飾を受けたタンパ
ク質が生産される。Gas1 にはジスルフィド結合を 4 つ形成している領域があり、その領域に対して変異を加えると糖鎖修飾量および乳化能が増加した。また、HLB 値で表されるように乳化剤の親水性と疎水性のバランスは非常に重要な指標となる。そこで、タンパク質の一部の疎水性領域に着目して数アミノ酸の置換を行った。作製した変異 Gas1 を精製し、糖鎖修飾量や乳化能を解析した。この内、乳化活性が低下する変異タンパク質も得られており、発表ではこれらの結果からタンパク質構造や糖鎖修飾量と乳化能の関係を考察する。
1) M. Onishi, et al., Food Hydrocoll., 112,106321 (2021).

【緒言】インフルエンザウイルスは宿主細胞の受容体と結合するヘマグルチン(HA)配列に頻繁に変異が入ることが原因でパンデミックを起こし易い。これを克服するには HA の保存領域を標的にすることが肝要である。即ち、この保存領域を狙ってウイルス側の HA 構造を壊し、感染を阻止すれば良い。InfA-3, -6,-9 モノクローナル抗体は、この保存領域のペプチドをハプテンとして作製した抗体である。我々が開発した 1 残基変異導入法によって、軽鎖に抗原分解活性を持たせ、抗体を酵素化することに成功したので報告する。
【方法】抗体軽鎖遺伝子は、塩基配列を決定後、大腸菌 BL21(DE3)pLysS で発現させた。Pro95 欠失には KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO)を用いた。軽鎖タンパク質は Ni-NTA カラムクロマト及びイオン交換クロマトで精製し、免疫学的反応性は ELISA で、抗原分解活性は FRET-InfA peptide で、感染抑制能はPlaque assay で評価した。
【結果と考察】InfA-3, -6, -9 抗体、および軽鎖（野生型）は抗原分解活性を示さないのに対し、軽鎖 CDR-3 に存在する Pro95 を欠失させた変異体(P95Δ)は、抗原ペプチドに対する分解活性のみならず、インフルエンザウイルスに対して感染抑制効果を示した。分子モデリングでは、Pro95Δ 変異体の Asp1, Ser92, His93
が触媒三ツ組残基構造を構築すると推定された。また、免疫学的反応性の検討
により、Pro95Δ の変異導入によって抗原親和性が数 10 倍強くなることが分かった。以上のことから、Pro95Δ 変異導入が酵素活性サイトの構築のみならず、免疫学的反応性の向上にも寄与したことで、軽鎖の酵素化が実現出来たと考えられた。

Relationship between structure and emulsifying ability of yeast cell wallderived emulsifying glycoproteins

Direct conversion of mouse-type monoclonal antibody to the corresponding
catalytic antibody ~Enzymatization of antibody and the biochemical
features~○Koshi Noguchi, Minori Nizuka, Yoshihiro Ojima, Masayuki Azuma(Grad. Sch. Eng., Osaka Metro. Univ.)

Key words

yeast, cell wall, glycoprotein, emulsification○Yuina Ito1, Moe Tsujita1, Taizo Uda2, Emi Hifumi3,4(1 Grad. Eng., Oita Univ., 2 ISIT, 3 Oita Univ. Inst. Res. Mgmt., 4 Oita Univ. Res. Glb.
Infect. Dis.)

Key words
sequence

antibody, catalytic antibody, Influenza virus, highly conserved

245

3Cp09
学

Development of evaluation system for antibody epitopes
by Co-display of antibodies and Antigen on Mammalian
Cells

3Cp11
学

○Ning Lin, Tetsuya Kadonosono(Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)
tetsuyak@bio.titech.ac.jp

SARS-CoV-2 に対する新規モノクローナルの抗体獲得および性質決定○木原 もなみ 1, 石井 誠 3, 長谷 哲成 3, 兒島 孝明 2, 加藤 晃代 1,
中野 秀雄 1
（1 名大院・生命農学, 2 名城大院・農, 3 名大院・医）hnakano@agr.nagoya-u.ac.jp

Epitopes determine the specificity and therapeutic efficacy of monoclonal antibodies(mAbs) drugs, enabling molecular targeted therapy for diseases. However, evaluation
system of the antibody epitopes is limited and there is a need for an efficient method toevaluate the epitopes of massive candidate molecules in parallel. We have established asystem in which antigen and antibody are co-displayed on the mammalian cell surface
and the isolation of epitope-specific binders is guided by a fluorescently-labeled mAb(gAb). In this study, we aim to demonstrate the feasibility of this system in epitope
evaluation and to analyze factors affecting its performance.
Anti-HER2 mAbs, trastuzumab and pertuzumab, which bind distinct epitopes, wereused as gAbs. We displayed single-chain variable fragment (scFv) or scFv mutants
derived from the gAbs on HER2-expressing cell surfaces. Flow cytometric analysis
revealed the specific separation of scFvs with varying affinities by their correspondinggAbs. Furthermore, we found lower HER2 density and gAb concentration favored theisolation of epitope-specific scFvs. Notably, our method successfully isolated epitopespecific scFvs in the simultaneous presence of two distinct gAbs. Parallel evaluation
using single or dual gAbs and next-generation sequencing, we successfully identified
epitope-specific scFvs from a mini library comprising 14 variants. In the future, wewould like to further evaluate this system and establish an innovative drug discovery
technology.

【背景】リボソームディスプレイ(RD)とは、リボソームを介して mRNA とポリペプチドをリンクさせ、mRNA-リボソーム-ポリペプチドの三元複合体を作製する手法である。複合体をペプチドの結合活性をもとに選別し、ペプチドとリンクした mRNA を鋳型とした逆転写 PCR によって高い親和性を持つペプチドの遺伝子情報を取得できる。本研究では、当研究室で開発された Ecobody 法とリボソームディスプレイ法を組み合わせたモノクローナル抗体(mAb)取得・解析プラットフォームの開発をめざしている。
【方法・結果】SARS-CoV-2 の膜タンパク質である spike protein の RBD を抗原とした mAb の探索を行った。多くの中和抗体を有していると考えられる COVID-19
患者由来 B 細胞のうち、抗原結合ビーズを用いて抗原特異的な抗体を提示している B 細胞をセレクションした。その後、逆転写 PCR により抗体遺伝子を取得し、発現に必要な配列や Lc と Hc の会合に必要なロイシンジッパー配列を付加した。この遺伝子を鋳型に無細胞タンパク質合成系(CFPS)にて Fab を合成し
ELSA により抗原に対する結合能を評価した。また、Brevibacillus 分泌発現シス
テムを用いて Fab の生産を確認した。
次に、Lc と Hc が天然ペアであるクローン(Lc20*Hc28)と、WT・オミクロン株
2 種のどちらにも結合能を示したクローン(Lc12*Hc18)についてエピトープの予測を行った。ランダムな 6 アミノ酸をコードする mRNA ライブラリを鋳型にCFPS によって mRNA-リボソーム-ランダムペプチド三元複合体を作製した。その後 CFPS にて合成した Fab と結合する複合体をセレクションし、リボソームから mRNA を解離させ、逆転写 PCR・CFPS での発現に必要な T7P の付加を行
い親和性の高いペプチドの遺伝子を濃縮した。次世代シーケンス解析により濃縮されたペプチドの配列を解析したところ、RBD のうち特定の領域がエピトープであると示唆された。

Development of evaluation system for antibody epitopes by Co-display ofantibodies and Antigen on Mammalian Cells

Acquisition and characterization of a novel monoclonal antibody against
SARS-CoV-2○Ning Lin, Tetsuya Kadonosono(Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)○Monami Kihara1, Makoto Ishii3, Tetsunari Hase3, Takaaki Kojima2, Teruyo Kato1,
Hideo Nakano1(1 Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2 Grad. Sch. Agric., Meijo Univ., 3 Grad.
Sch. Med., Nagoya Univ.)

Key words

antibody screening, antibody engineering, epitope

Key words

antibody, ribosome display, Brevibacillus choshinensis

3Cp10

天然のタンパク質相互作用を模倣したエピトープターゲ
ティング抗体工学

3Cp12

モニタリング用イムノセンサーへの利用を目指した
VHH 抗体の改変○中澤 光 1, 勝木 泰司 1, 松井 崇 2, 田中 良和 3, 梅津 光央 1
（1 東北大院・工, 2 北里大・理, 3 東北大院・農）hikaru@tohoku.ac.jp

学○田端 芽依, 沼田 龍範, 三原 明大, 堀内 淳一, 熊田 陽一（京工繊大院・工芸科学）
kumada@kit.ac.jp

高い標的特異性と親和性を備えた抗体は、抗体医薬品としてよく用いられる。
特定の標的に対する抗体を作成するために、ファージ、酵母、またはリボソー
ムディスプレイなどの方法により大規模な変異ライブラリーから結合親和性を指標として in vitro 選択が行われているが、望んだターゲットエピトープに結合できる抗体が必ずしも得られるわけではない。本研究では、天然のタンパク質
間相互作用を利用して、エピトープを標的とする抗体を着実に作成するアプロー
チを提案する。これまでに我々は、無機材料表面に対する特異性を有する独自の抗体フラグメントを構築するために、標的結合ペプチドの相補性決定領域(CDR) への移植と、残りの CDR ループのファージディスプレイによるランダ
ム化による抗体親和性成熟法（CAnIGET 法）を提案してきた。
本研究では、CAnIGET 法を使用して、細胞分裂に関与する FtsZ の重合に対して阻害活性を有する VHH 抗体断片を作製した。標的結合に関与する天然ルー
プを構造と長さを考慮して VHH へ移植し、進化の方向性を示すことで、エピトープ特異的進化工学的改変を行った。まず、FtsZ の T7 ループ周辺領域と
VHH の CDR の結晶構造を観察し、立体構造と末端距離差を考慮して移植断片と置換領域を選定し、足場タンパク質の立体構造を損なわないように 7 種の T7
ループ移植 VHH を設計した。ペプチドを移植していない野生型と比べて VHH7
以外は全て結合性を示し、VHH4 が最大であった。最も結合性が高かった VHH4の未改変の CDR3 を NNK コドンによりランダム変異導入し、ファージライブ
ラリーを作製し、4 ラウンドのバイオパニングにより結合性がさらに向上した
4 種の VHH4 変異体 (B4、F1、F5、G1) を同定した。最も親和性の高い F5 のFtsZ に対する解離定数を測定したところ 42 nM であり、親和性を VHH4 に比較して約 100 倍向上させることができた。

1．緒言・目的ラクダ科重鎖抗体の抗原結合ドメインである VHH は、耐熱性ならびに耐久性に優れ、バイオセンサのリガンド分子として利用が期待されている。特に、モニタリング用イムノセンサーはターゲット分子に対する高い選択性はもちろんのこと、優れたレスポンス応答性と迅速な解離特性を必要とする。これまでの研究で、VHH の CDR4 におけるアミノ酸点変異によってターゲット分子に対する特異性はそのままに、結合・解離特性を精密に制御することに成功している。
本研究では、作成した変異型 VHH の吸脱着特性を解析するとともに、上記リガンド分子に最適な結合・解離パラメーターについて考察を行った。
2．実験方法
抗 RNase A VHH (cAb-RN05)をモデルとし、オリジナルクローンならびに CDR4-3にアミノ酸点変異を有する 18 種類の変異型クローンの発現ベクターを調製した。これらで大腸菌 Rosetta 2(DE3)を形質転換し、上清中に VHH を生産した。
みかけの解離速度定数 appkoff の大きく異なる 4 クローン(4-3R, 4-3H, 4-3E, 4-3F)を選択し、これらの抗原に対する吸脱着特性を SPR センサを用いて評価した。
得られた速度パラメーターならびに結合・解離データを基に、リアルタイムモ
ニタリングに必要な操作条件を探索した。
3．結果と考察オリジナルクローン(4-3R)の解離定数 KD ＝ 504 pM に対し、変異型クローンはそれぞれ 4-3H：2.29 nM、4-3E：7.98 nM、4-3F：11.1 nM と 4.5〜22 倍増加し、点変異によって抗原に対する親和力が低下していることが明らかとなった。特に変異型クローン 4-3F は解離速度が極めて大きく、180 秒以内に抗原抗体複合体をほとんど解消できることが明らかとなった。以上の結果より、VHH の CDR4
点変異によってモニタリング用イムノセンサーに利用可能なアフィニティリガ
ンドを創生可能である。

Synthesis of epitope-targeting antibody based on native Protein-Protein
interaction

Development of VHH antibody mutants for use in immunosensors formonitoring○Hikaru Nakazawa , Taiji Katsuki , Takashi Matsui , Yoshikazu Tanaka ,Mitsuo Umetsu1(1 Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 2 Grad. Sch. Sci., Kitasato Univ., 3 Grad. Sch.
Agric. Sci., Tohoku Univ.)
1

Key words
engeneering

1

2

3

affinity selection, antibody, protein interaction, evolutionary○Mei Tabata, Tatsunori Numata, Akihiro Mihara, Jun-ichi Horiuchi,
Yoichi Kumada(Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)Key words

VHH, CDR4, antigen-binding kinetics, immunosensors

246

3Cp13
学

CDR4 のアミノ酸点変異に基づく VHH 抗体の親和力
制御

3Cp15

IgG タイプの立体構造特異的モノクローナル抗体の選択的作製法の開発○磯﨑 勇志 1, 湊元 幹太 2, 鈴木 雅登 1, 安川 智之 1, 冨田 昌弘 2
（1 兵庫県大院・理, 2 三重大院・工）yisozaki@sci.u-hyogo.ac.jp○三原 明大, 沼田 龍範, 田端 芽依, 堀内 淳一, 熊田 陽一（京工繊大院・工芸科学）
kumada@kit.ac.jp[緒言]
ラクダ科重鎖抗体の可変部である VHH は抗原と直接的に相互作用する相補性決定領域(CDR)と物理化学的特性に関与するフレーム領域 (FR)から構成されている。近年、VHH の FR3 中に抗原と直接相互作用していないが、CDR の立体構造に影響を及ぼす第 4 のループ構造、すなわち CDR4 が存在することが明らかとなっている。(1)本研究では、CDR4 内アミノ酸配列が VHH の抗原親和性に及す影響を明らかにすることを目的とした。特に、CDR4 配列内でも他の CDRに近接している領域 (CDR4-3〜6)に着目し、点変異によって、VHH の抗原結合
親和力がどの程度変化するのかを評価した。
[実験方法]
本研究では anti-RNase A VHH (cAb-RN05)をモデルとした。inverse PCR により、
CDR4 の 3, 5, 6 残基目に 18 種類のアミノ酸を導入した VHH 変異体の発現ベクターを構築した。これらで、大腸菌 Rosetta2 (DE3) を形質転換し、Overnight
Express 培地を用いて、培養上清中に VHH を生産した。また、上清中の VHHの抗原に対する結合は SPR センサーによって確認するとともに、解離プロファ
イルからみかけの解離速度定数 appkoff (s-1) を算出した。
[結果と考察]抗原結合部位に近い CDR4 の 3 残基目 (CDR4-3) に点変異を加えたクローンのpH 7.4 における appkoff 値は、3 残基目が Arg であるオリジナルクローンが最も低く、点変異を加えることで 1×10-4〜4×10-3 (s-1) の範囲で変化した。したがって、本位置へのアミノ酸変異によって、VHH の抗原親和力が大きく変化することが明らかとなった。一方で、CDR4-5 に点変異を加えたクローンは pH7.4 における解離速度を大きく変化させるには至らなかった。発表では CDR4-6 の点変異の影響についても合わせて報告する。
[文献](1) Sean W. Fanning and James R. Horn, PROTEIN SCIENCE 20, 1196-1207 (2011)

モノクローナル抗体は高い特異性と親和性を有することから、分子標的治療薬(抗体医薬) として注目されている。生体内で機能するタンパク質を標的とする
場合、その立体構造を認識することが極めて重要である。そこで、立体構造特異的ターゲティング (SST) 法を開発し、標的タンパク質の立体構造を特異的に認識できるモノクローナル抗体を作製した。さらに、本研究では、免疫回数に着目することで、IgG タイプのモノクローナル抗体を選択的に作製できることを報告する。
目的遺伝子をコードしたプラスミド DNA をマウスに投与した。複数回の DNA
免疫の後、最終免疫として、目的抗原発現 CHO-K1 細胞を投与した。免疫化マ
ウスから脾臓を摘出し、感作 B 細胞を含む細胞懸濁液を調製した。目的抗原発
現ミエローマ細胞と混合し、複合体を形成した後、複合体を電気パルス融合に
よって選択的に細胞融合した。
複数のハイブリドーマ細胞を限界希釈法に基づき、単クローン化した後、アフィ
ニティーカラムを用いてモノクローナル抗体を精製した。モノクローナル抗体をウェスタンブロッティング法、免疫蛍光染色法によって評価したところ、変性目的抗原に対してモノクローナル抗体の結合を認めることができなかった。
このことから、精製モノクローナル抗体は目的抗原の立体構造を認識している可能性が示唆された。さらに、DNA 免疫の回数を 3 回から 4 回に増やすことによって、ハイブリドーマ上清中に含まれる抗体中の IgG タイプの割合が増加することを見出した。従って、SST 法は立体構造を認識する IgG タイプのモノク
ローナル抗体を選択的に作製できる画期的な方法であると期待される。今後は、
マイクロデバイス上での細胞融合に取り組み、スクリーニング工程が不要な方法を開発していきたい。

Controlling antigen-binding affinity of VHH antibody by point mutation of
CDR4

Development of effective technique for the production of IgG-typestereospecific monoclonal antibodies.

○Akihiro Mihara, Tatunori Numata, Mei Tabata, Jun-ichi Horiuchi, Yoichi Kumada(Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)○Yushi Isozaki1, Kanta Tsumoto2, Masato Suzuki1, Tomoyuki Yasukawa1,
Masahiro Tomita2(1 Grad. Sch. Sci., Univ. Hyogo., 2 Grad. Sch. Eng., Mie Univ.)

Key words

VHH, CDR4, antigen-binding affinity, point mutation

Key words

monoclonal antibody, native structure, DNA immunization, IgG

3Cp14

Fabrication of nanobody-based ratiometricbioluminescent quenchbody for simple and rapid
detection

3Cp16

PURE-RD と NGS を用いて迅速なエピトープマッピン
グ法の開発

学

学

○Yinghui Yang , Akihito Inoue , Takanobu Yasuda , Bo Zhu ,Hiroshi Ueda2, Tetsuya Kitaguchi2(1 Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech, 2 CLS, Tokyo Tech)kitaguc.t.aa@m.titech.ac.jp
1

1

2

2

○Jia Beixi 1, 加藤 晃代 1, 兒島 孝明 2, 中野 秀雄 1
（1 名大院・生命農学, 2 名城大院・農）jbeixi@molbiotech-nagoya.org[Objective] Nano Quenchbody (nano Q-body) is a fluorescent dye-labeledimmunosensor based on camelid VHH (nanobody) well known for smaller size andthermostability. However, the extra light sources required for nano Q-bodymeasurement are not portable and cost-efficient for point-of-care applications. To
address this issue, a luciferase (Nluc) was fused with nano Q-body to fabricate theratiometric bioluminescent nano Q-body whose bioluminescence color changes by thebioluminescence resonance energy transfer (BRET) responding to antigen binding,which was named as BRET nano Q-body. The nanobody utilized for this proof ofprinciple experiment recognizes methotrexate (MTX), which is a chemotherapy agent
for cancer treatment.
[Results & Discussion] Nluc and cysteine tag were fused with anti-MTX nanobody,and the fluorescent dye, 5-TAMRA was labeled through thiol-maleimide reaction. The
BRET nano Q-body showed ratiometric changes after applying MTX in a dosedependent manner, which caused by decrease and increase in emission intensity of
Nluc and TAMRA, respectively. The flexibility and lengths of linkers between Nlucand cysteine tag were adjusted to improve BRET efficiency. As a result, the BRET
nano Q-body with a flexible linker showed higher response compared to the one
without linker or with a rigid linker. Moreover, BRET nano Q-body can qualify MTX
in 50% human serum at the range of practical concentration. These results suggest that
BRET nano Q-bodies are a promising tool for therapeutic drug monitoring.

再構成無細胞タンパク質合成系 PURE システムを利用したリボソームディスプ
レイ(PURE-RD)は、標的分子に結合するペプチドまたはタンパク質をハイスルー
プットに選択する強力なツールである。また、次世代シーケンシング(NGS）を活用することで、PURE-RD の各選択ステップで濃縮された DNA 配列をモニターすることができる。ここでは、抗体エピトープの迅速・安価な解析システ
ムの構築をめざし、PURE-RD、NGS 解析、バイオインフォマティクスを組み合わせたスキームの構築を行った。
まず、SecM のリボソームアレストペプチド配列の N 末端側に、10 個の NNK
トリプレットオリゴヌクレオチドを含むランダムライブラリーを作製し、in vitro
転写して PURE システムで翻訳した。リボソームはランダムペプチドを翻訳後にリボソームアレストペプチド配列で停止するため、mRNA-リボソーム-ペプ
チド三元複合体が合成される。得られた複合体を抗 HA タグモノクローナル抗体を固定化した磁性ビーズと混合、洗浄後、EDTA を加えて mRNA を遊離させた。選択された mRNA を逆転写反応および PCR 増幅により、DNA プールを回収し、NGS 解析に供した。得られた NGS の DNA 配列情報を、連続する３アミノ酸のすべての組み合わせ配列の濃縮度計算および抗原マッチングさせるプロ
グラムを開発し、実際の解析に供した。
解析結果は、今回使用した抗 HA タグモノクローナル抗体が、"DVPDY"をエピトープとして認識している可能性が示唆された。HA タグに対してアラニンス
キャニングを行い、結合活性評価したところ、エピトープ予測プログラムの結果と一致していることがわかった。これらの結果から、構築したシステム(PURERD、NGS、バイオインフォマティクス解析)がエピトープマッピングに有効であることを示した。現在他の抗体についても同様に解析を行なっており、本システムの汎用性を検証中である。

Fabrication of nanobody-based ratiometric bioluminescent quenchbody forsimple and rapid detection

The development of epitope mapping utilizing PURE ribosome display and
NGS○Yinghui Yang , Akihito Inoue , Takanobu Yasuda , Bo Zhu , Hiroshi Ueda ,Tetsuya Kitaguchi2(1 Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech, 2 CLS, Tokyo Tech)
1

Key words

1

2

2

2

immunosensor, nanobody, bioluminecence, point-of-care testing○Beixi Jia1, Teruyo Kato1, Takaaki Kojima2, Hideo Nakano1(1 Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2 Grad. Sch. Agric., Meijo Univ.)

Key words

ribosome display, epitope mapping

247

3Dp01
学

Investigation of the inhibitor for cancer cell invasion via
chloride ion efflux in human breast cancer cell lines.
○Samrat Mukherjee1,2, Chikashi Nakamura2, Ayana Yamagishi2(1 Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2 AIST)
chikashi-nakamura@aist.go.jp

3Dp03
学

単一細胞解析に基づくがん患者由来血中循環ハイブリッ
ド細胞のゲノム変異検出○石井 彩夏 1, 中澤 胡桃 1, 桶川 隆嗣 2, 出来 真弓 2, 中村 雄 2,
田中 剛 1, 吉野 知子 1
（1 農工大院・工, 2 杏林大医学部付属病院泌尿器科）
y-tomoko@cc.tuat.ac.jp

Chloride intracellular channel 1 (Clic1), is overexpressed in the cancer cells andinvolved in the invasion process. It also plays an important role in regulatory volume
decrease (RVD), in which the efflux of Cl- and K+ ions lead to cell volume reduction
by inducing an export of water molecules during cell swelling process. Previously, we
have reported that Clic1 is also activated by the stretching of the cell membrane bysimple mechanical stress. This is supposed to cause cell membrane stretching due tocell deformation as cancer cells invade through narrow spaces, which reduces thevolume of cancer cells by RVD and promotes invasion. In this study, we investigatedwhether Clic1 inhibitors can inhibit ion efflux by the stretching of the cell membrane
thereby preventing the invasion of human breast cancer cells. The cell lines of different
invasive potential (MCF-7 and MDA-MB-231) were used for the external force
applied using a tipless cantilever and an atomic force microscope.
Key words: cancer cell, invasion, chloride ion channel, atomic force microscopy【目的】血中循環腫瘍細胞 (Circulating Tumor Cell：CTC)は血液から低侵襲に採取が可能であるため、組織の代替試料として注目されている。さらに、近年では白血球と CTC の融合細胞である血中循環ハイブリッド細胞（Circulating Hybrid
Cell：CHC)も確認されている。CHC は予後との相関が報告されており、臨床研
究への応用が期待されるが、その有用性に関する研究はほとんど行われていな
い。当研究室では、細胞捕捉デバイス Microcavity array (MCA)と単一細胞分離技術 Gel-based cell manipulation (GCM)法を用いて、固形がん患者由来の CTC の単一細胞オミクス解析を実施している。そこで、本研究では、薬剤選択に利用可能なバイオマーカーが乏しい尿路上皮がん患者を対象として、血液からのCHC の検出、及び遺伝子変異検出を行い、CHC の有用性を検証した。
【方法・結果】患者全血を MCA に導入し CTC および CHC を捕捉後、がん細胞マーカーであるサイトケラチン (CK)と白血球マーカーである CD45 の染色を行った。顕微鏡観察を行った結果、CK+CD45-細胞である CTC に加えて、
CK+CD45+細胞である CHC の検出が確認された。また、CHC は CTC に比べて患者血液中の数が多いことも確認された。さらに化学療法前後の血液におけるCTC 数と CHC 数を比較した結果、治療後の CHC 検出数が CTC と比較して高いことが確認された。次に、GCM 法によって回収した CHC に対して全ゲノム
増幅及び標的配列の PCR を行い、シークエンスにより遺伝子変異を確認した。
尿路上皮がんで変異率の高い遺伝子を対象に配列解析を行った結果、CHC においても変異が確認された。従って、CHC の解析により低侵襲なゲノム変異のモ
ニタリングが可能であり、尿路上皮がんの解析試料として CHC の有用性が示唆された。

Investigation of the inhibitor for cancer cell invasion via chloride ion efflux
in human breast cancer cell lines.

Mutation detection of circulating hybrid cells in blood from cancer patients
based on single cell genomic analysis○Samrat Mukherjee1,2, Chikashi Nakamura2, Ayana Yamagishi2(1 Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2 AIST)○Ayaka Ishii1, Kurumi Nakazawa1, Takatsugu Okekawa2, Mayu Deki2,
Yu Nakamura2, Tsuyoshi Tanaka1, Tomoko Yoshino1(1 Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2 Hosp., Kyorin Univ. Urol.)Key words

tumor, cell membrane, ion channel

Key words

cancer, liquid biopsy, circulating tumor cell, mutation analysis

3Dp02

ゲノム編集細胞を用いた過酸化水素の放射線増感効果の作用機序の解明

3Dp04

血中投与によるがんの診断と治療を指向したリン脂質ポ
リマー被覆磁性ナノ粒子の開発

学○鷲尾 周 1, ターシャ ウィンダ 1, 山手 康輝 1, 松澤 翼 2,
森 裕太郎 1, カハル プリハルディ 1, 近藤 昭彦 3, 荻野 千秋 1
（1 神戸大院・工, 2 神戸大・工, 3 神戸大院・科技イノベ）
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp

学○大野 孝紘, 井藤 彰, 金子 真大（名大院・工）ito.akira@material.nagoya-u.ac.jp【目的】 がんの主な治療法である放射線療法は、深部がんや大きく成長したがんには弊害がある。特に、腫瘍内部の低酸素領域は放射線療法の要であるラジカルの発生源となる酸素が少なく、治療効果が最大で 3 分の 1 にまで低下してしまう。先行研究から、細胞中の過酸化水素が放射線増感効果を示すことが示
唆されているが、その詳細な作用機序は解明されていない。本研究では過酸化水素が放射線増感効果を示す仕組みを解明するため、過酸化水素の分解と酸素の発生を触媒する抗酸化酵素に着目し、検証を行った。
【実験方法】 酸素濃度 1%で 24h 培養を低酸素条件と設定し、ウェスタンブロッ
ティングによる低酸素誘導因子 HIF-1α の検出、放射線抵抗性の確認を行った。
また、CRISPR/Cas9 システムを用いたカタラーゼのノックアウトにより、過酸
化水素の放射線増感効果におけるカタラーゼの寄与を調べた。
【結果と考察】 ウェスタンブロッティングでは、HIF-1α の発現が低酸素条件のサンプルにおいて確認できた。このことから、ヒト膵臓がん細胞では酸素濃度1%、24h 培養によって低酸素状態を再現できたと考えた。また、コロニーアッ
セイ法を用いて、低酸素培養細胞の放射線抵抗性の確認を行った。結果から、過酸化水素添加サンプルにおいて、低酸素条件のサンプルは細胞生存率が大きく、低酸素条件での細胞の放射線抵抗性が示された。続いて、カタラーゼの検出のためのウェスタンブロッティングでは、ヒト胎児腎細胞においてカタラー
ゼのノックアウトが確認できた。さらに、カタラーゼ欠損細胞を用いた放射線照射実験から、カタラーゼが欠損することで、過酸化水素による放射線増感効
果が低下した。このことから、過酸化水素が酸素に分解されることで放射線増感効果を示すことがわかった。

【背景】磁性ナノ粒子は、MRI や magnetic particle imaging によるイメージングや交流磁場照射によるがん温熱療法を可能にすることから、がんの診断と治療を実現するマテリアルとして注目されている。ここで、血中投与により磁性ナ
ノ粒子を腫瘍へ送達するには、生体内で安定かつ貪食細胞に捕捉され難い性質が必要とされる。本研究では、高い生体親和性をもつ 2-methacryloyloxyethyl
phosphorylcholine（MPC）ポリマーの被覆により、血中投与可能な磁性ナノ粒子の開発をおこなった。
【方法と結果】シランカップリング反応によりマグネタイトナノ粒子表面に原子移動ラジカル重合（ATRP）の開始基を固定した。この粒子に対して MPC モノ
マーとフリーの開始剤を加えて表面開始 ATRP を行い、MPC ポリマー層を有す
る磁性ナノ粒子を作製した。フリーの開始剤と MPC モノマーのモル比を変えることで、10, 50, 100 量体の MPC ポリマー層を有する磁性ナノ粒子 MNPsPMPC10, MNPs-PMPC50, MNPs-PMPC100 をそれぞれ合成した。粒子に対するウシ
血清アルブミンの吸着量を測定したところ、MNPs-PMPC10 > 未修飾の磁性ナノ粒子 > MNPs-PMPC50 > MNPs-PMPC100 の順に減少した。次にマウスマクロファー
ジ様細胞 RAW264 に磁性ナノ粒子を添加したところ、未修飾の磁性ナノ粒子 >MNPs-PMPC10 > MNPs-PMPC50 > MNPs-PMPC100 の順に取り込み量が減少した。
磁性ナノ粒子をマウス結腸がん CT26 腫瘍担持マウスに血中投与したところ、未修飾の磁性ナノ粒子 < MNPs-PMPC10 < MNPs-PMPC100 の順に腫瘍への蓄積率が向上した。これらの結果は、磁性ナノ粒子表面に 100 量体の MPC ポリマーを修飾することで、タンパク質や貪食細胞に対するステルス性、ひいては腫瘍蓄積性が向上することを示している。

Elucidation of radio sensitizing mechanism of hydrogen peroxide using
genome editing cells

Preparation of phospholipid polymer-modified magnetic nanoparticles forcancer theranostics○Amane Washio , Winda Tasia , Koki Yamate , Tsubasa Matsuzawa ,Yutaro Mori1, Prihardi Kahar1, Akihiko Kondo3, Chiaki Ogino1(1 Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2 Fac. Eng., Kobe Univ., 3 Grad. Sch. Sci. Technol.
Innov., Kobe Univ.)
1

Key words

1

1

2

radiosensitizer, hypoxia, antioxidant, reactive oxygen species○Takahiro Ono, Akira Ito, Masahiro Kaneko(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

Key words
polymers

tumor, drug delivery system, magnetic nanoparticles, phospholipid

248

3Dp05

テトラスパニン制御分子 EWI-２模倣ペプチドの設計によるがん細胞の浸潤抑制○大河内 美奈, 黒羽 ことみ, Suwatthanarak Thanawat, 田中 祐圭（東工大・物質理工）
okochi.m.aa@m.titech.ac.jp

3Dp07
学

ペプチドキャリアによるポリフェノールの新規水溶化技術の開発とアナフィラキシー抑制剤への応用○児玉 智基 1,2, 河村 昇吾 3, 河崎 陸 3, 前田 陽 1,2, 山名 啓太 3,
池田 篤志 3, 河本 正次 1,2（1 広島大院・統合生命科学, 2 広島大・健康長寿研究拠点, 3 広島
大院・先進理工）skawa@hiroshima-u.ac.jp

テトラスパニンは、進化的に保存された細胞膜 4 回貫通型の膜タンパク質ファ
ミリーであり、増殖、運動、膜融合、シグナル伝達など様々な細胞の生理作用および恒常性維持に関与する分子オーガナイザーである。本研究では、CD9 制御分子として機能する Ewing (EWI) -2 のアミノ酸配列を基にペプチドを設計し、作製した EWI-2 模倣ペプチドによる、がん細胞の遊走、浸潤活性の抑制について検討した。
CD9 結合性ペプチドは、D 体のアミノ酸を用いて合成した。乳がん細胞 MDAMB-231 およびメラノーマ細胞 B16/BL6 を用いて細胞遊走及び浸潤活性を評価した。細胞遊走解析を行ったところ、ペプチド添加 100 nM で細胞生存率には変化が見られないが、がん細胞の遊走活性の減少を確認した。また、正常細胞
では、遊走能は 80％程度に維持された。これらの結果より、本ペプチドは細胞毒性を示さず、CD9 を高発現するがん細胞において遊走阻害効果を示すことが示唆された。超高解像度顕微鏡を用いた解析により、細胞の CD9 を介した
Tetraspanin web を観察した結果、ペプチド添加による形成数およびサイズの減少が確認された。本ペプチドは CD9 を起点とする膜タンパク質の会合を抑制
し、シグナル伝達場の形成を阻害することが示唆された。次に、エクソソームの分泌および取込みへの影響について評価したところ、100 nM 以上の CD9 結合ペプチド添加において有意にエクソソーム分泌量、エクソソーム取込み量の減少が確認された。さらに、マウスを用いた動物実験において、がん細胞移植
24 日後の肺結節について計数した結果、ペプチド添加によりがん細胞の転移を有意に抑制できた。以上の結果より、CD9 結合性ペプチドは、がん細胞の浸潤・転移活性およびエクソソームの分泌・取込みを抑制する機能を有することが示唆された。

【目的】 医薬品及び食品素材に適用される難水溶性の有用化合物は生体利用性が低く、これを解決することは当該開発分野における喫緊の課題である。我々はメカノケミカルな高速振動粉砕法 (HSVM) によって、生体適合性に優れるポリペプチドをキャリアとしたナノ構造体形成による難水溶性化合物の新規水溶化技術を開発した。本法は化学修飾や有機溶剤を用いないシンプルかつクリーンな手法であり、医薬・食品分野への応用が期待できる。本研究では、難水溶性ポリフェノールであるレスベラトロール (Res) をモデル化合物として HSVMを適用し、ポリペプチドとの超分子ナノ構造体形成による本分子の可溶化を試みると共に、アナフィラキシー抑制剤への応用可能性を検討したので報告する。
【方法・結果】 ポリ-L-リジン (PLL) 、ポリグルタミン酸 (PGA) 、およびゼラチン (Gel) を可溶化剤として HSVM により Res と混合・超純水抽出することで、ポリペプチド/Res (polyP/Res) 複合体を調製した。本複合体の形成は Res に優れた水溶性と安定性を付与した。動的光散乱測定と透過型電子顕微鏡観察から、
polyP/Res 複合体は細胞透過性と保持効果を高めるのに適した約 200 nm のナノ構造体を形成していることが確認された。実際に当該 polyP/Res 複合体は良好
な細胞/組織への取り込み特性を示し、in vitro において優れた I 型アレルギー反応抑制活性を発揮した。また、最も著明な抑制活性を示した PGA/Res 複合体は
in vivo においても受動皮膚アナフィラキシー反応を抑制した。
【結論】 ポリペプチドをキャリアとした HSVM 技術によって、難水溶性ポリフェノールの水溶化に成功すると共に、同ナノ構造体の著明な生体利用性なら
びにアナフィラキシー抑制作用を立証した。本技術は、アナフィラキシー等抗アレルギー薬への新たな製剤プラットフォームを提供するものと期待される。

Inhibition of cancer cell invasion by designing tetraspanin regulatory
molecule, EWI-2 mimic peptides

Development of a novel water dispersible technology for polyphenols by
peptide carriers and its application to anaphylaxis inhibitors○Mina Okochi, Kotomi Kuroha, Thanawat Suwatthanarak, Masayoshi Tanaka(Sch. Mater. Chem. Technol., Tokyo Tech)○Tomoki Kodama1,2, Shogo Kawamura3, Riku Kawasaki3, Akira Maeda1,2,
Keita Yamana3, Atsushi Ikeda3, Seiji Kawamoto1,2(1 Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 2 HiHA, 3 Grad. Sch. Adv. Sci. Eng,
Hiroshima Univ.)

Key words

peptide, peptide chip, tetraspanin

Key words

allergy, mast cells, peptide career, polyphenol

3Dp06

がん治療を指向したデュアルレドックスポリマーの分子
設計

3Dp08

β-1,3-1,6-グルカンナノ粒子に包接した機能物質のクリー
ム中における放出特性学○小河 優玖, 井藤 彰, 金子 真大（名大院・工）kaneko.masahiro@material.nagoya-u.ac.jp

学○三和 正弥, 甲元 一也（甲南大院・フロンティアサイエンス）
koumoto@konan-u.ac.jp【背景】がん細胞は酸化ストレスに対して脆弱であり、酸化ストレスを誘導する化合物は新規抗がん剤として注目されている。我々は、細胞膜透過性を有する
レドックスリン脂質ポリマーを用いることで、がん細胞に酸化ストレスを介した細胞死が誘導されることを示してきた。レドックスリン脂質ポリマーは生体親和性の高い 2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（MPC）ユニッ
トと酸化還元活性ユニットにより構成されるランダムコポリマーであり、酸化
還元ユニットの選定により抗がん活性を変化させることができる。本研究では酸化還元活性ユニットとしてビニルフェロセン（VFc）と 2-ビニルアントラキ
ノン（VAq）ユニットを単一ポリマー中に有するデュアルレドックスポリマー
poly[MPC-co-n-butyl methacrylate (BMA)-co-VFc-co-VAq]（pMBFcAq）を合成し、その抗がん活性を検証した。
【方法】フリーラジカル重合により、酸化還元ユニットとして VFc のみを持つ
poly(MPC-co-VFc) pMFc、VAq のみを持つ poly(MPC-co-BMA-co-VAq) (pMBAq)、
VFc および VAq を持つ pMBFcAq を合成した。マウス結腸がん CT26 細胞の培養液中に 0.1－1 mg/mL の濃度で pMFc, pMBAq, および pMBFcAq を添加して 24時間培養した後に細胞生存率を評価した。
【結果と考察】pMBFcAq と pMFc の添加後の細胞生存率を比較すると、ポリマー
濃度 0.5 mg/mL 以下において pMBFcAq は pMFc より大きく生存率を低下させる傾向が認められた。また、pMBFcAq と pMBAq の添加後の細胞生存率を比較すると、ポリマー濃度 1 mg/mL 以下で pMBFcAq は pMBAq より大きく生存率を低下させる傾向が認められた。以上の結果は、VFc と VAq の 2 種類の酸化還元ユニットを組み込むことで、抗がん活性が向上したことを示唆している。

【背景と目的】
効果的な化粧品や医薬品原料物質の多くは、水に溶けない性質を持っており、そのままでは製品に配合することができない。我々の研究室では、β-1,3-1,6-グ
ルカンから作られた高水溶性のナノ粒子を利用して、これらの物質を包接することで、水溶性を向上させる手法を開発してきた。しかし、包接された物質は水溶液中で徐々に放出されてしまい、包接状態を持続させることが難しいという課題があった。本研究では、放出速度を制御するためにクリームに化粧品や医薬品の原料物質を包接したグルカンナノ粒子を配合させ、その放出挙動を水溶液中と比較した。
【方法】
紫外線吸収剤として化粧品に配合されているオキシベンゾン-3 とアボベンゾン
を用い、定法に従ってグルカンナノ粒子に包接させた。使用したクリームは、
水中油滴型(O/W 型)のものを用いた。グルカンナノ粒子からの物質の放出は、バルク溶液中のゲスト分子に由来する吸光度を測定することで算出した。
【結果と考察】まず、オキシベンゾン-3 の包接複合体について検証を行った。水溶液中では、包接されたオキシベンゾン-3 の 71.6％が 24 時間経過後に放出されていた。一方、同じ実験を O/W 型のクリーム中で評価したところ、包接されたオキシベン
ゾン-3 の放出量は 108 時間経過してもわずか 7.8％にとどまっていた。つまり、O/W 型のクリーム中では、グルカンナノ粒子内に包接された機能成分の放出速度が著しく低下することが示された。発表では、この知見を一般化するために他の原料物質でも同様の挙動が確認されるか、放出量の定量を行い、そのメカ
ニズムについて考察する予定である。

Molecular design of dual redox-active polymers for cancer therapy

Releasing properties of functional molecule encapsulated in beta-1,3-1,6glucan nanoparticles in cream○Yuki Ogawa, Akira Ito, Masahiro Kaneko(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

Key words

antitumor, oxidative stress, glutathione, apoptosis○Masaya Miwa, Kazuya Koumoto(FIRST, Konan Univ.)

Key words

beta-1, 3-glucan, drug delivery system

249

3Dp09

自動分注ロボットによる細胞懸濁パラメータの定量評価○堀之内 貴明, 下野 晴子, 秦 喜久美, 光山 統泰（産総研・人工知能）
takaaki.horinouchi@aist.go.jp

3Dp11

放射線架橋 PVA ゲル上におけるマウス神経幹/前駆細胞の移動と集塊形成挙動の解析○森 英樹, 李 ユウナ, 前田 結衣, 原 正之
（大阪公大院・理）morihide@omu.ac.jp【背景・目的】細胞培養や細胞を用いたアッセイにおいてピペッティングによる液体ハンドリ
ングは最も基本的かつ再頻出の操作である。実験生物学における様々な実験対象の中でも培養細胞はとくに物理的摂動に対して繊細であり、意図せぬ影響を与えないために慎重な操作が求められる。その一方、実験プロトコルの記述粒
度は「ゆっくりと混和する」などの定性的なものとどまることがほとんどであり、個人間で実験手技に差が生じることは不可避である。これに対し、液体分注機をはじめとするロボットを用いることで、人間とは比較にならないほどの高い時空間繰り返し精度（mm 単位、msec 単位）での操作が可能である。そこで本研究では細胞培養実験を題材として、液体ハンドリング操作における物理パラメータが実験結果に与える影響を定量的に評価する。
【方法・結果】
本研究ではオープンソースプラットフォームである自動分注機 OT-2（Opentrons社製）を細胞懸濁液の調製や分取に用い、そのパラメータの影響を評価した。
HEK293T 細胞の懸濁液を準備し、一定条件で沈降させた細胞塊を再懸濁する際のピペッティングパラメータ（流速、混和容積、混和回数）を様々な組み合わせに設定して操作を行い、均一に懸濁できたかをセルカウントにより評価した。
本研究は人間によるマニュアル実験では制御できない物理パラメータの調査であるだけでなく、今まであいまいな表現で扱われていた実験操作を安価なロボッ
トによりデジタル化する取り組みの概念実証として、実験の再現性向上やバイ
オ DX の普及に貢献するものである。

【背景と目的】軟らかいハイドロゲル上では硬い培養皿上とは異なった細胞挙動が得られる場合がある。我々は親水性ポリマーのポリビニルアルコール（PVA）
を放射線架橋した放射線架橋 PVA ゲル上に、マウス神経幹/前駆細胞（NSPC）
が接着し、細胞集塊を形成しながら増殖することを報告している。しかし、この PVA ゲル上の NSPC 培養増殖過程については詳しく調べていなかった。本研
究では、PVA ゲル上において NSPC がどのように移動し、集塊を形成するのかについて調べることを目的とした。
【方法と結果】PVA ゲル上で培養した NSPC およびその細胞集塊の移動と集塊形成の経時変化を画像解析し、細胞と細胞集塊の移動能を評価するとともに、
細 胞 の 移 動 能 に 影 響 す る と 考 え ら れ る matrix metalloproteinase （ MMP-2 、
MMP-9）の発現変化について解析した。播種後 24〜48 時間では、培養皿上に比べて PVA ゲル上の細胞の移動速度は遅く、10 μm/h 未満の細胞が最も多かった。播種後 96 時間以降はいずれの条件も移動速度は低下した。また、NSPC によって形成された細胞集塊の大きさ（投影面積）の増加率に関しても、播種後24〜96 時間において培養皿上における細胞の方が PVA ゲル上と比較して高かった。MMP-2 及び MMP-9 とこれら NSPC の移動能の変化との関係について調べるために、MMP-2/-9 阻害剤を加え、培養皿上における細胞の挙動変化を解析したところ、阻害剤の添加により細胞の移動速度は減少した。さらに、培養皿上と PVA ゲル上で培養した其々の細胞の培養上清に含まれる MMP-2 と MMP-9の活性をセラチンザイモグラフィーで調べたところ、培養１、3 日目においてPVA ゲル上に比べて培養皿上の上清の方が MMP の活性が高く、培養 5 日目以降は低下した。これらの結果より、培養皿上と PVA ゲル上の NSPC 移動能の違
いには、MMP の活性が関与している可能性が示唆された。

Robotic validation of cell suspension

Analysis of the migration and aggregation behaviors of mouse neural stem/
progenitor cells on radiation-crosslinked PVA hydrogels○Takaaki Horinouchi, Haruko Shimono, Kikumi Hata, Mitsuyama Toutai(AIRC, AIST)○Hideki Mori, Yunan Li, Yui Maeda, Masayuki Hara
(Grad. Sch. Sci., Osaka Metro. Univ.)

Key words

laboratory automation, cell calture, OT-2, bioDX

Key words

neural stem cell, poly(vinyl alcohol), aggregation, stress response

3Dp10

治療用細胞製品の製造における塑性流体を用いた分注工
程の設計

3Dp12

ボツリヌス菌由来ヘマグルチニンを用いたヒト iPS 細胞
集塊の継代法における分割技術の開発

学○成瀬 陸 1, Adithya Nair 1, 福守 一浩 1, 紀ノ岡 正博 1,2（1 阪大・院工・生物工学, 2 阪大・院工・細胞製造コトづくり拠点）
kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp○山本 陸 1, 山田 康矢 1, 紀ノ岡 正博 1,2（1 阪大院・工, 2 阪大院・工・細胞製造コトづくり拠点）
kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp

治療用細胞製品の製造工程は，主として，細胞を増幅させる培養工程と増幅させた細胞懸濁液を分注・凍結工程からなる．分注工程は，あらかじめ凍結保護剤に懸濁された細胞懸濁液を，分注のためのリザーバー（分注前容器）に収め，細胞懸濁液を，定量，定濃度，定活性となるよう，バイアル（分注後容器）に，小分けする工程である．懸濁液リザーバーを静置すると，細胞沈降により，細胞濃度に対する空間的不均一性が生じ，分注後のバイアル間において細胞濃度のばらつきが観察される．よって，細胞の均一分散のために，リザーバー内の細胞懸濁液を適度に攪拌する必要がある．大量製造においては，長期による攪
拌が，せん断応力等の影響により，細胞活性が変化することが考えられ，振盪
せずに細胞を均一分散することが望まれている．
そこで本研究では，塑性流体の一つであるゲランガムを用いて細胞懸濁液の調製，リザーバーの無攪拌でのバイアルへの分注，バイアルからの細胞回収の方法を確立し，定量・定濃度・定活性分注の実現性性について検討を行った．
塑性流体の一つであるゲランガム（FP001, 日産化学）を用いて細胞懸濁液の調製において，ゲランガム濃度を種々変化させ，細胞濃度 3.0×106 cells/mL，所要時間 240 min での目視での判断にて，FP001 が 0.03 %以上の濃度にて，沈降抑制が可能であることが分かった．さらに，分注後の塑性流体は，遠心分離での細胞回収を困難となるため，塑性流体のニュートン流体に戻す必要がある（脱塑性流体化）．そこで，トリス塩酸緩衝液を用い，脱塑性流体化を経た，細胞凍
結前後の細胞活性についても検討を行ったところ，細胞の凍結前の生存率，凍結・解凍後の回収率，解凍播種後の接着能，その後の増殖能に影響がないことを確認した．以上より，大量分注技術への展開が可能であることを示唆した．

ヒト iPS 細胞を利用した同種移植や組織形成では多量の細胞が必要とされ，三次元タンク型の懸濁培養装置を用いた大量製造工程の構築が進められている．
接着依存性を示すヒト iPS 細胞は，懸濁培養下において凝集塊を形成し増殖する．一方で，一定以上の集塊径では増殖は阻害されるため，集塊の分散を伴う継代操作が，長期間かつスケールアップを伴う拡大培養工程に求められている．
また拡大培養された細胞集塊は下流工程において単分散され凍結保存されることが一般的であり，上流から下流工程において細胞集塊の分散技術の確立が必要とされる．
従来の酵素処理法は煩雑な工程を必要とするために，大規模な培養工程には適していない．これまで著者らの研究グループは，細胞間接着を阻害するボツリヌス菌由来ヘマグルチニンを利用することで，洗浄工程を必要とせず，ピペッ
ティング操作による物理ストレスにより細胞集塊を分割する手法を提案している．本手法は大規模培養への展開が期待され，ピペッティング操作に置き換わる閉鎖系への適用が可能な集塊分割技術の開発が急務となっている．
そこで本研究では，流動方向の制御により細胞集塊へ応力を加えるデバイスの設計し，分割技術の構築を目指した．実験条件の検討により，一定以上の流速で，デバイス内に細胞集塊を含む懸濁液を循環させることで，均一な小集塊への分散が確認された．このとき，細胞集塊に対して加わる応力の違いにより，分散状態が異なることが示唆され，目的に応じたデバイス形状の設計が必要なことが想定された．本分割手法はデバイス内に液を循環する単純な機構であり，低コストかつ，閉鎖系の維持が容易であり，スケールアップへ適用可能であると考えられる．そのため本技術は効率的なヒト iPS 細胞の大量製造工程の構築に寄与することが期待される．

Design of filling process with plastic fluid in cell manufacturing fortherapeutic use

Development of break-up method for passage of hiPSC aggregates using
botulinum hemagglutinin○Riku Naruse , Nair Adithya , Kazuhiro Fukumori , Masahiro Kino-oka(1 Dept. Biotechnology, Grad. Sch. Eng., Osaka University, 2 Research Base for Cell
Manufacturability, Grad. Sch. Eng., Osaka University)
1

Key words

1filling process, plastic fluid

1

1,2○Riku Yamamoto1, Koya Yamada1, Masahiro Kino-oka1,2(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Research Base for Cell Manufacturability, Grad.
Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
hiPSC aggregates, botulinum hemagglutinin, passage operation, cellaggregate break-up system

250

3Dp13

ヒト iPS 細胞から高効率で安定的な肝細胞分化誘導技術の開発○金 美海 1, 紀ノ岡 正博 1,2（1 阪大院・工・生物工学, 2 阪大院・工・細胞製造コトづくり拠点）
kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp

3Dp15
学

遺伝子操作を介さずに免疫調節機能が亢進された間葉系幹細胞の調製○濱﨑 奈津香, 小高 雄也, 穐山 太一, 村松 和明（電機大院 ・理工）k-muramatsu@mail.dendai.ac.jp【目的】多能性幹細胞は細胞治療・再生医療・創薬開発に活用できると期待されている．しかし，iPS 細胞のような多能性幹細胞は，培養条件によって増殖特性や分化能が大きく変わる不安定な側面があり，これらの多能性幹細胞から分化細胞を安定的に大量調製するためには，培養の正確性・確実性を担保するための安定化技術が不可欠である．そこで本研究では，細胞－細胞間接着を阻害するボツリヌス菌由来のヘマグルチニン(HA)を有効活用し，ヒト iPS 細胞から高効率で安定的に肝細胞が誘導出来る手法を開発した．
【方法および結果】ヒト iPS 細胞をラミニン 511-E8 フラグメントでコートした培養面に 2500 cells/cm2 の密度で播種し，HA を添加し未分化維持 Stemfit 培地
で 5 日間培養後，従来の肝細胞分化誘導培地を用いて 21 日間分化誘導培養を行った．培養 5 日目に HA 添加した細胞の未分化マーカー(OCT3/4/SSEA4)陽性率を調べたところ，HA を添加していない条件と比較して陽性率が有意に高く，バッチ内と間のばらつきを示す変動係数（CV 値）が 0.10 以下であることが示された．また，21 日間肝細胞分化誘導培地を用いて分化誘導したところ，HAを添加していない条件に比べ肝細胞マーカー(Albumin)陽性率が有意に高く，バッチ内と間の CV 値も 0.10 以下であることが示され，肝細胞分化の頑健性と再現性を有意に増加したことが確認できた．このように，HA を用いた分化誘導時のヒト iPS 細胞の同期化に対する本手法は，高効率で安定的な肝細胞分化に重要な役割を担っていると考えられた．

【背景と目的】近年、間葉系幹細胞(MSC)がもつ抗炎症作用や免疫調節機能に着目し、重篤な移植片対宿主病等に対する二次治療等に同種 MSC の適用が始まっている。演者等はこれまで、炎症性サイトカインの刺激により活性化される
MSC において、抗炎症性サイトカイン IL-10 の遺伝子発現には、高分子量ヒア
ルロン酸(HA)の共存が重要であることを発見した。また、その効果を最大限に引き出す HA 誘導体（PGA-g-HA）の開発にも成功した。そこで本発表では、
免疫制御を目的とした MSC の in vitro 培養プロセスにおいて、PGA-g-HA を活用することにより、最終的な細胞加工製品の高機能化が実現できるか否かを検証した。
【方法と結果】MSC の培養プロセスを構築するため、本研究ではラット骨髄由来正常 MSC をモデル細胞に活用した。in vitro 培養過程において、TNF-α とともに高分子量 HA または PGA-g-HA で細胞を活性化させることにより、それら刺激因子を培地から除去した後も IL-10 遺伝子の発現は約 6 時間持続した。また、同様のプレコンディショニング操作を行なった後、トリプシン処理で MSCの細胞懸濁液を調製したところ、IL-10 遺伝子の発現は少なくとも約３時間は持続した。また、プレコンディショニング操作を行なった細胞を凍結保存した
後、再び解凍した場合であっても MSC における IL-10 遺伝子の発現は維持されていた。
【結論】MSC のプレコンディショニング操作に高分子量 HA またはその誘導体
PGA-g-HA を活用することにより、遺伝子操作を介さずとも IL-10 高発現性 MSCを調製することが可能であり、体内に投与される直前の細胞懸濁液の状態下においても Il-10 の発現持続性は維持することが期待された。

Development of highly efficient and stable hepatocyte differentiationinduction technology from human iPS cells

Preparation of mesenchymal stem cells with enhanced immunomodulatory
function without genetic manipulation

Key words
human induced pluripotent stem cells, hepatocyte differentiation,
botulinum hemagglutinin, cell synchronization

Key words

mesenchymal stem cell, Hyaluronan, immunomodulation

3Dp14

3Dp16

ヒト間葉系幹細胞の細胞外マトリックスのリモデリング
ポテンシャルを 評価するためのプラットフォームの開発○Mee-Hae Kim1, Masahiro Kino-oka1,2(1 Dept. Biotech., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Research Base for Cell
Manufacturability, Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

学

血管含有骨格筋モデル構築を目指したヒト iPSC 共分化誘導法の開発○松島 歩夢, 山本 一貴, 秋山 裕和, 本多 裕之, 清水 一憲（名大院・工）shimizu@chembio.nagoya-u.ac.jp○Hamazaki Natsuka, Kotaka Yuya, Akiyama Taichi, Muramatsu Kazuaki(Grad. Sch. Sci. Eng. Tokyo Denki Univ.)

学○Tan Shao Ying 1, 金 美海 1, 紀ノ岡 正博 1,2（1 阪大院・工, 2 阪大院・工・細胞製造コトづくり拠点）
kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景と目的】
骨格筋組織内の血管は組織への酸素・栄養分の供給だけでなく、筋再生や恒常性維持にも関与している。そのため、糖尿病や筋ジストロフィーでは血管と骨格筋の両方に病態が見られる。こうした病態を解析するため、血管を含む骨格筋モデルの開発が求められている。近年、幹細胞を多種類の細胞に共分化誘導する技術が注目されており、例えば、ヒト iPSC から骨格筋細胞と運動神経細胞、ヒト ESC から骨格筋細胞と血管内皮細胞に共分化誘導できることが報告された。本研究では、ヒト iPSC から骨格筋細胞と血管内皮細胞を共分化誘導する培養プロセスを開発し、マイクロデバイス上で血管網を有する骨格筋モデルの構築を試みた。
【方法と結果】
ドキシサイクリン（Dox）添加によって外因性の筋分化制御因子 hMyoD1 が過剰発現されるヒト iPSC 株（409B2tet-MyoD）を用いた。Dox と血管内皮増殖因子を含む培地成分を組み合わせることで骨格筋細胞や血管内皮細胞の共分化誘導を行った。はじめに平面培養にて共分化誘導に適する基礎培地の検討を行った。
骨格筋誘導培地のみ、血管内皮誘導培地のみ、それぞれの培地を 1:1 で混合した培地（混合培地）で比較した。その結果、混合培地を用いた場合に骨格筋細胞と血管内皮細胞（CD31 陽性）の両方が比較的多く存在した。次に、血管内皮細胞をより増殖させるため、混合培地に小分子を添加し、その影響を比較した。その結果、TGF-β 阻害剤と γ-セクレターゼ阻害剤を添加した場合に血管内皮細胞の大幅な増加が確認され、同時に骨格筋細胞の増加も確認された。最後に、マイクロデバイス上に三次元組織を構築し、平面培養で見出した条件で共分化誘導を行った。その結果、誘導された筋組織は収縮能を有し、免疫蛍光染
色により血管網が形成されていることが示唆された。

【目的】ヒト間葉系幹細胞(MSC)のコラーゲン等の細胞外マトリックス(ECM)リ
モデリング能力は，MSC を用いた組織線維化が治療において重要な役割を果たす．しかしながら，培養した MSC の ECM リモデリングポテンシャルを評価するためのプラットフォーム技術は確立されていない．本研究では，高密度コラー
ゲン塗布面を用いて，長期培養した MSC の ECM リモデリングポテンシャルを評価するためのプラットフォームを開発した．
【方法および結果】従来方法で塗布したコラーゲン面(Conventional CL 面)と I 型
コラーゲンを高密度(1.05 mg/cm2)で塗布した面(CL 面)を用い，集団倍加回数(PD)の異なる羊膜由来 MSC 細胞の培養を行った．PD = 0 の細胞を Conventional CL
面と CL 面上で 3 日間培養した後，分解されたコラーゲン検出用プローブ CHPとコラーゲン分解に関与する細胞分泌型酵素 MMP-1 の蛍光染色を行ったとこ
ろ ， CL 面 上 で は 細 胞 周 辺 に CHP お よ び MMP-1 発 現 が 確 認 さ れ た が ，Conventional CL 面では観察されなかった．また，Conventional CL 面と CL 面上
での CHP 陽性細胞率(FCHP+)を確認したところ，CL 面上では 50%の陽性率であることに対し，Conventional CL 面ではほぼ 0 であり，CL 面を用いることでConventional CL 面では評価できなかった細胞の ECM リモデリン グポテンシャ
ルを評価することができた．また，PD = 0 と PD = 13.07 の MSC 細胞を CL 面上で培養した後，DNA 損傷指標である γH2AX と CHP を染色し，DNA 損傷がない細胞と DNA 損傷された細胞の ECM リモデリングポテンシャルをそれぞれ FγH2AX-/CHP+と FγH2AX+/CHP+で定量評価した．PD = 0 の FγH2AX-/CHP+は PD = 13.07 と比べ 0.7 倍高いことから，PD によって ECM リモデリングポテンシャルが低下
していることが分かった．これらより，CL 面は長期培養した細胞の ECM リモ
デリングポテンシャルを評価するにも有用であることが示唆された．

Co-differentiation of human iPSCs for developing vascularized skeletal
muscle models

Development of platform to study extracellular matrix remodeling potentialof human mesenchymal stem cells○Ayumu Matsushima, Kazuki Yamamoto, Hirokazu Akiyama, Hiroyuki Honda,
Kazunori Shimizu(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

Key words

iPS cells, differentiation, microfluidic device○Shao Ying Tan1, Mee-Hae Kim1, Masahiro Kino-oka1,2(1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Research Base for Cell Manufacturability, Grad.
Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
human mesenchymal stem cells, extracellular matrix remodeling,collagen-coated culture surface, culture platform

251

3Fp01

野生酵母 Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus のビール醸造特性解析及び酢酸イソアミル高生産株の育種

3Fp03○桒原 智也（奈良産振セ）kuwahara@pref-nara.jp

清酒中に含まれるプリン代謝産物の定量○浅井 良樹, 根来 宏明, 石田 博樹（月桂冠・総研）
yo_asai@gekkeikan.co.jp

奈良県産業振興総合センターでは、これまで清酒醸造業界で広く使用されている清酒酵母との差別化を図るため、県内の地域資源から野生酵母を分離し、それらを使用した清酒の開発を進めてきた。一方、これらの県有酵母は、清酒醸
造以外ではほとんど実用化されておらず、新たな活用方法としてビール醸造への利用可能性を検討した。
その結果、奈良公園内の奈良八重桜の花から分離したナラノヤエザクラ酵母が、
マルトース発酵能を有し、麦汁中で高いアルコール発酵能を有していたことから、ビール醸造に利用できることが示された。さらに、ナラノヤエザクラ酵母
は、分離当初 26S rRNA 遺伝子の D1/D2 領域の塩基配列から Saccharomyces
cerevisiae と推定されていたが、PCR 法により分泌性グルコアミラーゼをコードする STA1 遺伝子が検出され、本株は Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus であることが強く示唆された。S. diastaticus は、一般的にビール混濁や容器破損等を引き起こす有害酵母として認識されているものの、非常に高い麦汁発酵能を有することから一部のビアスタイルでは好んで使用されている。本株を用いたビール醸造試験の結果、外観発酵度は S. diastaticus の市販ビール酵母と比較して低く、S. cerevisiae の市販ビール酵母と同等であった。さらに、ナラノヤエ
ザクラ酵母から TFL 耐性株を取得することにより、親株の 2 倍以上の酢酸イソアミルを含むビールの醸造が可能な変異株を得た。

【背景と目的】清酒中にはプリンを部分構造として持つ様々な種類の代謝産物（以下、総称してプリン体）が含まれる。清酒醸造におけるプリン体の動態は、過去にいくつかの報告があるものの詳細は不明である。我々は清酒中のプリン体の組成とその生成機構について解析を進めている。本研究では、清酒中に含まれるプリン代謝産物の組成について詳細な解析を試み、その特徴を明らかにすることを目的とした。
【結果と考察】初めに、LCMSMS を用いたプリン体の測定条件を検討し、プリン体ヌクレオチド、ヌクレオシド、プリン塩基について、絶対検量線法により定量できることを確認した。これを用いて清酒中に含まれるプリン体を測定したところ、キサンチンやヒポキサンチンなどのプリン塩基と、アデニン骨格を含む化合物（以下、アデニン化合物）やグアニン骨格を含む化合物（以下、グアニン化合物）から主に構成されることが分かった。ビール中においてはグアノシンをはじめとするヌクレオシドが多く含まれ、清酒中における組成とは大きく異なっていた。LCMSMS では同定できなかった清酒中のアデニン化合物やグアニン化合物については、メタボローム解析による評価を試みた。その結果アデニン化合物の一部は S-アデノシルメチオニンであることが示唆されたが、ヌクレオチドやヌクレオシド以外の測定対象外の化合物も多く含まれていると推定された。最後に醪におけるプリン体組成の推移を調べたところ、発酵が進
むにつれていずれも増加する傾向にあり、酵母や麹菌の酵素による代謝の影響を受けていると考えられた。

Beer brewing characterization of a wild yeast Saccharomyces cerevisiae var.
diastaticus and isolation of isoamyl acetate high productivity mutants.

Quantification of purine metabolites in sake○Tomoya Kuwahara(Nara Pref. Inst. Ind. Dev.)○Yoshiki Asai, Hiroaki Negoro, Hiroki Ishida(Res. Inst., Gekkeikan Sake Co., Ltd.)Key words

Saccharomyces diastaticus, wild yeast, beer, isoamyl acetate

Key words

sake, purine, fermentation

3Fp02

花酵母 MC87-46 のイソマルトース資化性に影響する転写因子の解析

3Fp04

清酒中に含まれるプリン代謝産物の由来と生成経路の解明

学○沼波 凜 1, 酒井 真弥 1, 榊原 誠也 1, 兒嶋 孝明 1, 赤尾 健 2,
志水 元亨 1, 加藤 雅士 1
（1 名城大院・農, 2 酒総研）
mkato@meijo-u.ac.jp○根来 宏明, 浅井 良樹, 石田 博樹（月桂冠・総研）
negoro@gekkeikan.co.jp

日本酒は、醸造に用いる酵母 Saccharomyces cerevisiae の種類によって味と香りが変化する。本研究室で開発した清酒 「華名城 （ はなのしろ ） 」 は、カー
ネーションから単離した野生酵母 ” MC87-46 ” を用い醸造しており、ほのかな甘みを有している。この清酒と一般に酒造りに用いられている「きょうかい酵
母(R) 」 ( K701 ) にて醸造した清酒との含有成分を比較したところ、 MC87-46 を用い醸造した清酒には、整腸作用を有し、まろやかな甘みを呈することが知られているイソマルトースが多く含まれていた。我々は既に、 K701 に比べて、MC87-46 のイソマルトース資化能が低いことを明らかにしてきた 1 。
今回、 MC87-46 のイソマルトース資化能が低い原因を解明するため、 MC87-46の全ゲノム解析を行った。これまでにイソマルトース分解酵素遺伝子の転写調節因子であることが報告されている Mal63p のオルソログが、 K701 では VII 番
染色体 ( YPR196W-2ab ) と XVI 番染色体上 ( YPR196W ) の２箇所に存在していることが明らかにされている。 これに対し、 MC87-46 では XVI 番染色体
( YPR196W ) の１箇所にのみ存在することが明らかとなった。現在、K701 由来の YPR196W-2ab を MC87-46 に導入し、 YPR196W-2ab のイソマルトース資化
能への影響を詳細に解析している。
1
Tsutsumi et al. (2019) Sci. Rep., 9, 13908【背景と目的】 清酒中にはプリンを部分構造として持つ様々な種類の代謝産物（以下、総称してプリン体）が含まれる。清酒醸造におけるプリン体の動態は、過去にいくつかの報告があるものの詳細は不明である。我々は清酒中のプリン体の組成とその生成機構について解析を進めている。本研究では原料からの供給と微生物による代謝に焦点を当てて生成機構に関する検証を行った。
【結果と考察】 初めに、清酒の原料である白米と米こうじ、および清酒醪中の酵母細胞にどのようなプリン体が含まれるか検討した。白米、米こうじ、酵母
細胞のいずれもアデニン骨格を含む化合物（以下、アデニン化合物）とグアニン骨格を含む化合物（以下、グアニン化合物）を有しており、さらに米こうじ
はヒポキサンチンやキサンチンを含む化合物も有していた。米こうじからの抽出操作によりプリン体の構成が変化したことから、麹菌の酵素はプリン体変換能を持つと考えられた。そこで米こうじの粗酵素液を調整して各種プリン体標
準品との反応に供すと、いくつかのヌクレオシドやヌクレオチドが塩基に変換された。次に、発酵におけるプリン体の変遷を調べた。米こうじの量あるいは酵素活性を変化させると、米こうじの量が多い場合にグアニン化合物とキサンチンが増加し、酵素活性が高い場合にヒポキサンチンが増加した。また、エタ
ノール生成に応じて酵母の生存率が低下するとアデニン化合物が増加した。以上の結果から、清酒の醪中には米や米こうじからアデニン化合物、グアニン化合物およびキサンチンが供給され、酵母は発酵初期にこれらのプリン体を取り込んで代謝するが発酵後半では生存率の低下とともに溶出し、溶出したプリン体は麹菌の酵素によりプリン塩基へ変換される、という生成機構を推察した。

Analysis of transcription factors affecting the isomaltose assimilation abilityof Saccharomyces cerevisiae MC87-46,the wild yeast from a flower.

Elucidation of the origin and production mechanism of purine metabolites
in sake○Rin Numanami , Maya Sakai , Seiya Sakakibara , Takaaki Kojima ,Takeru Akao2, Motoyuki Shimizu1, Masashi Kato1(1 Grad. Sch. Agric., Meijo Univ., 2 NRIB)
1

Key words

11

isomaltose, Saccharomyces cerevisiae, sake, wild yeast

1○Hiroaki Negoro, Yoshiki Asai, Hiroki Ishida(Res. Inst., Gekkeikan Sake Co., Ltd.)Key words

sake, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus oryzae, purine

252

3Fp05
学

清酒中に含まれる γ-アミノ酪酸含有量の測定○横山 元蔵 1, 数岡 孝幸 2
（1 東農大院, 2 東農大）
t3kazuoka@nodai.ac.jp

3Fp07
学

壺造り純米黒酢醸造に関わる壺内壁の電子顕微鏡観察○星田 栄紀 1, 亀谷 将史 1,3, 藤井 暁 2, 濱田 健作 2, 新井 博之 1,3,
石井 正治 1,3
（1 東大院・農生科, 2 坂元醸造, 3 東大微生物科学イノベーション
連携研究機構）141masaharu@g.ecc.u-tokyo.ac.jp【背景と目的】清酒中に含まれるアミノ酸の 1 つに γ-アミノ酪酸（GABA）があり、麹菌により産生されるという報告がある。一方で、有意差は認められなかっ
たが、速醸酛清酒に比べ生酛系清酒の GABA 含有量が多い傾向にあるという報告もある。これらの報告を参考にした場合、清酒中の GABA の生成要因に、麹菌以外のものがある可能性が考えられた。そこで本研究では、改めて速醸酛清
酒と生酛系清酒の GABA 含有量を測定し、それらの間に含有量の違いがあるのかを再検証することを目的とする。
【方法】生酛系純米酒 24 点と速醸酛純米酒 22 点の合計 46 点の市販清酒をサンプルとした。GABA 含有量の測定は GABA 測定キット（株式会社 ENZYME・SENSOR 製）を用いた。
【結果と考察】GABA 含有量の平均値は、生酛系純米酒が 1406μM、速醸酛純米
酒が 435μM であり、有意差も 5%水準で認められた。しかし、銘柄ごとの GABA
含有量をみると A 社 a 銘柄と b 銘柄（GABA 含有量：7368μM、7332μM）が際立って多く、ついで A 社 c、d、e(GABA 含有量：1120~2330μM 程度)、B 社 6
銘柄（GABA 含有量：870~2200μM 程度）、そしてその他 13 銘柄（GABA 含有
量：350~650μM 程度）となった。A 社の銘柄に着目すると、銘柄 a,b は酒母仕込みの製品であり、銘柄 c、d、e は三段仕込みの製品であることから、仕込み方法の違いが含有量の違いに関係していると予想された。一方で、A 社 c,d,e と同じ三段仕込みの製品である他の銘柄との含有量の違いについては、仕込み方
法以外の要因があると考えられた。

【背景と目的】鹿児島県では伝統的手法による純米黒酢醸造が行われ、麹以外に菌の添加を行わず、壺内壁や麹中の微生物によって自然に醸造が進行する点に特徴がある。我々の過去の研究により、Acetobacter pasteurianus が酢酸発酵期に発酵液中で優占化すること、発酵の初期には Lactobacillus acetotolerans が出現
し発酵に寄与することが分かっている。先行研究により A. pasteurinaus や乳酸菌は壺内壁に定着していることが示されているが、どのような形態で内壁に存在しているかは不明であった。この研究では、走査型電子顕微鏡により壺内壁を観察し、その形態を明らかにすることを目的とした。
【方法と結果】発酵終了後、洗浄してから砕き、高さの異なる 3 箇所(上部、中部、下部)の破片を走査型電子顕微鏡により、表面を観察した。酢酸菌膜が形成される発酵液表面付近の壺上部では、短棹菌である酢酸菌が付着する様子が観察されたが、他の菌は見られなかった。壺中部では、酢酸菌と長棹菌である乳酸菌が観察された。壺下部では、それらに加え、酵母と見られる大きな細胞が観察された。全体の観察を通して、内壁のセラミックの孔の径は菌よりも小さかったことから、酢酸菌は孔の中に入っているのではなく、内壁表面にバイオフィルムを形成し、或いは釉薬のヒビの隙間に入り込むことで生き延びていると考えられた。

Determination of Gamma-aminobutyric acid content in Sake

Observation of the inner-wall of a jar involved in black vinegar
fermentation by electron microscope○Genzo Yokoyama1, Takayuki Kazuoka2(1 Grad. Sch. of Tokyo University of Agric., 2 Tokyo University of Agric.)○Haruki Hoshida1, Masafumi Kameya1,3, Akira Fujii2, Kensaku Hamada2,
Hiroyuki Arai1,3, Masaharu Ishii1,3(1 Grad. Sch. Agric. Life Sci., Univ. Tokyo, 2 Sakamoto Kurozu, Inc., 3 CRIIM, Univ.
Tokyo)

Key words

amino acid, sake

Key words
vinegarelectron microscopy, acetic acid bacteria, lactic acid bacteria, black

3Fp06

自然界からの新規清酒製造用酵母の分離と分離株の
性質

3Fp08

清酒に含まれる糖アルコール配糖体の探索

学○坂本 心 , 数岡 孝幸（1 東農大院, 2 東農大）
t3kazuok@nodai.ac.jp1

学2○吉澤 耕 1, 山田 明日香 1, 勝田 亮 2, 小林 泉美 1, 本田 千尋 3,
進藤 斉 1, 穂坂 賢 1, 徳岡 昌文 1
（1 東農大院・応生科, 2 東農大院・生命, 3 静県大・食栄）
m3tokuok@nodai.ac.jp【背景・目的】清酒醸造において、酵母はアルコール発酵だけではなく風味の形
成においても重要なはたらきを担っており、使用する酵母株によって風味が変化する。近年では清酒酵母としてきょうかい酵母とその派生株が多く使用されて高品質の清酒が安定して製造されているが、限られた種類の酵母が使用されることによって、酵母が形成する風味の多様性が少なくなっているとも言える。
そこで本研究は新規清酒製造用酵母を探索・分離し、その性質を解明する事で清酒の風味の多様性を広げることを目的としている。
【方法】当研究室で自然界から分離されたが、同定やアルコール発酵能などが調べられていない 132 株の保存株に対して小規模の発酵試験を行い、アルコール発酵能が高い可能性がある株を選抜した。その選抜株を用いて総米 500g 相当の三段仕込みを行うことで選抜株の醸造特性を検討した。対照株としてきょうか
い酵母 9 号と 901 号を使用した。
【結果】132 株に対して総米 150g 相当の小規模発酵試験を行ったところ、対照株の 9 割以上のアルコール生成、酢酸低生成、異臭非生成の条件を満たす株は9 株存在していた。それらの中で同じ分離源から同様の性質を有する株については 1 株を選んで、最終的に sk014、sk046、sk060－1、sk060－2、sk067、sk103の 6 株を選抜した。選抜株を用いて三段仕込みを行ったところ、sk014、sk046
は泡なし酵母で、対照株と同程度のアルコール発酵能が見られた。また、香気成分を分析したところ、K9, sk014, sk046 のカプロン酸エチル生成量は、それぞれ 0.74、0.64、0.64 mg/L であり、酢酸イソアミル生成量は、2.79、3.01、3.32
mg/L であった。sk060－1、sk060－2、sk067 はいずれも泡あり酵母であり、それらの製成酒からはオフフレーバーが感じ取れた。sk060－1、sk060－2 については K9 と比較して低酸性の傾向がみられた。

清酒には呈味に関わる α-エチルグルコシドや α-グリセリルグルコシドなどの配糖体が含まれ、麹菌 Aspergillus oryzae の α-グルコシダーゼの糖転移作用により生成することが示唆されている。我々は最近、糖アルコール配糖体として α-グルコシルエリスリトールを清酒から新たに発見した。グリセロールに続きエリスリトールの配糖体が見出されたことから、その他の糖アルコールの配糖体も存在することが予想されたため、本研究では清酒で未同定のアラビトール、マンニトールの配糖体を探索した。
清酒成分の質量分析からグルコースとアラビトールまたはマンニトールが脱水縮合した化合物と質量電荷比の一致する化合物が検出された。当該化合物は A.
oryzae の α-グルコシダーゼである AgdA の遺伝子破壊麹菌株の米麹で仕込んだ清酒で検出強度が特徴的に減少したことから、AgdA の糖転移で生成する配糖体と予想された。当該化合物を清酒から精製するのは困難であると考え、異種発現した AgdA を用いてマルトースをドナー、アラビトールまたはマンニトー
ルをアクセプターとした in vitro 糖転移反応を行った。生成物から、清酒で確認された当該化合物と質量電荷比、溶出時間が一致する化合物がそれぞれ確認され MS/MS 解析でフラグメントイオンが一致したことから、清酒にアラビトー
ル及びマンニトールの配糖体が含まれることが強く示唆された。

Isolation and Characterization of New Sake Brewing Yeasts

Exploration of sugar alcohol glycoside in sake

○Kokoro Sakamoto1, Takayuki Kazuoka2(1 Grad. Sch. of Tokyo University of Agric., 2 Tokyo University of Agric.)

Key words

yeast, alcohol, sake

○Kou Yoshizawa1, Asuka Yamada1, Ryo Katsuta2, Izumi Kobayashi1,
Chihiro Honda3, Hitoshi Shindou1, Masaru Hosaka1, Masafumi Tokuoka1(1 Grad. Sch. Fac. Appl. Biosci., Tokyo Univ. Agric., 2 Grad. Sch. Fac. Life. Sci.,
Tokyo Univ. Agric., 3 Sch. Food Nutr. Sci., Univ. Shizuoka.)

Key words

sake, Aspergillus oryzae, transglycosylation

253

3Fp09

広島６号酵母を活用した、交配育種による輸出用清酒の品質向上に寄与する清酒酵母の開発

3Fp11○山﨑 梨沙 1, 荒瀬 雄也 1, 大場 健司 2, 五島 徹也 3, 金井 宗良 3,
赤尾 健 3, 大土井 律之 1
（1 広島総合技術研・食品工業技術セ, 2 広島総合技術研・農業技術セ, 3 酒総研）
r-yamasaki88852@pref.hiroshima.lg.jp

高圧技術による木片からの成分抽出の効率化○野村 一樹, 高野 翔
（金沢工大）
k_nomura@neptune.kanazawa-it.ac.jp【背景・目的】大正期に広島の酒蔵から分離された広島 6 号酵母（H6）は、現在主流の協会系酵母とは遺伝的に近縁ながら、協会系酵母が持たない胞子形成能を持つ稀有な菌株である。発酵性はやや緩慢であるが、清酒醸造に十分使用可能な発酵力を有している。また、清酒の貯蔵劣化臭の主要成分であるジメチ
ルトリスルフィド(DMTS)の生成ポテンシャル(DMTS-pp)が低いという優れた特徴が見出されている 1）。H6 の胞子形成能と貯蔵劣化臭低生産性を活用し、従来の清酒酵母では困難であった交配育種を実装することにより、製成酒の貯蔵劣化臭の生成が緩やかな実用酵母の開発を目的として研究を実施した。
【方法・結果】H6 の一倍体と優れた醸造特性を持った協会系酵母の一倍体との交配株を胞子形成させ、四分子分離を行った。得られた一倍体 2）の醸造特性と貯蔵劣化臭低生産性を選抜指標とし、交配に用いる一倍体を選抜、交配株を得た。交配株を小仕込み試験で選抜した後、選抜株 2 株をパイロットスケール醸造試験に供試し、醸造特性と DMTS 生成について、実規模での実証を行った。
選抜株の製成酒の 45℃貯蔵を行ったところ、対照株と比較して、有意に DMTS
生成速度及び生成量が小さい傾向が確認された。選抜株による製成酒の DMTS
生成が緩やかである理由については考察中であるが、醪中の死滅率が低いこと
等が原因であると推察している。
本研究は、JST 研究成果展開事業研究成果最適展開支援プログラム A-STEP ト
ライアウトの支援を受けて実施されたものである。
1) R. Yamasaki, et al.: Biosci., Biotech., Biochem., 84 (4), 842-853 (2020)2) R. Yamasaki, et al.: J., Biosci., Bioeng., 129 (6), 706-714 (2020)【緒言】
ウイスキーなどの蒸留酒は、香りや色合いなどによって様々に評価されている。
それらの品質を左右する熟成は、製造工程の中で最も時間が必要な工程でもある。熟成は、樽材など木材からの成分抽出、抽出された成分の化学変化、未熟香などの除去、エタノールと水のクラスター化などの工程を経て進行するが、その全容は未だ明らかとなっていない。
高圧技術とは、1,000 気圧以上の非常に高い圧力により食品などを加工する技術の一つであり、食品素材への液体含浸、物性変化、殺菌・静菌などに応用される。
本研究では、樽材など木材からの成分抽出の工程に着目し、ウイスキーなど蒸留酒の熟成期間短縮を目指して、高圧技術による木材から成分抽出の効率化について検討した。
【方法】
アルコール度数 66%の醸造用エタノールをモデルウイスキーとし、3 cm3 に成型したミズナラおよびナラの木片を本実験に供した。モデルウイスキー 100 mL
および各木片をパウチに入れて脱気包装した。高圧 (HP) 試料は、100 MPa (約1,000 気圧)、室温 (25°C)、10 min の条件で高圧処理した。HP 試料および対照(C) 試料は、木片と共にそれぞれ小瓶へ移して室温、暗所で保存した。熟成の変化は、280 nm の波長で評価した【結果と考察】各試料の吸光度は、保存時間に依存して経時的に増加した。ミズナラの木片を入れた HP 試料は、保存期間中において C 試料よりも高い吸光度の値を示した。
特に保存 7 h 以降は有意に高い値を示し、保存 31 日目においても同様の傾向を示した。ナラの木片を入れた試料においても、ミズナラ試料と同様に、HP 試料が C 試料よりも高い値を示した。
以上の結果から、高圧処理により木材の成分を効率的に抽出できることが示された。この結果は、熟成前の短期間の高圧処理が、その後の長期間の熟成工程における効率的な成分抽出に寄与することを示唆した。

Development of Sake yeast with distinctive brewing characteristics and low
production of dimethyl trisulfide, an off-flavor, through crossbreeding
utilizing sake yeast strain Hiroshima no. 6.

Efficient extraction of components from wood chips using high hydrostaticpressure○Kazuki Nomura, Kakeru Takano(Kanazawa Inst. Technol.)○Risa Yamasaki1, Yuya Arase1, Kenji Oba2, Tetsuya Goshima3, Muneyoshi Kanai3,
Takeshi Akao3, Ritsushi Ohdoi1(1 Food Technol. Res. Center, Hiroshima Prefectural Technol. Res. Institute,2
Agricultural Technol. Res. Center, Hiroshima Prefectural Technol. Res. Institute,3
NRIB)
Key words
Saccharomyces cerevisiae, sake yeast, dimethyl trisulfide

Key words

wood extracts, high hydrostatic pressure

3Fp10

3Fp12

黄麹菌および黒麹菌の菌糸伸長時における音波照射に対する応答の比較

酒米の米粒空間によりタンパク質組成は異なる○高橋 圭, 河野 弘美, 上用 みどり, 奥田 将生（酒総研）
k.takahashi@nrib.go.jp○松本 拓 1, 楠元 拓真 2, 増田 翔 2, 小島 幸治 1, 三枝 敬明 1,
寺本 祐司 1
（1 崇城大院・工, 2 崇城大・生物生命）
g2118d02@m.sojo-u.ac.jp【背景及び目的】 清酒醸造において、米タンパク質に由来する含窒素化合物は清酒品質に大きく影響する可能性があるにも関わらず、酒米米粒のタンパク質の空間・量・質的な知見は少ない。そこで、酒米の粗タンパク質含量や組成比等の米粒胚乳内空間の分布を米品種ごとに解析することにより、米粒内のタンパク質成分の分布や構成比の違いを明らかにすることを目的とした。
【方法と結果】 ５収穫年分の酒米７品種（山田錦、日本晴、五百万石等）について家庭用精米機を用い、精米歩合 90%まで搗精した後、醸造用小型精米機を用い精米歩合 90%から 30%まで搗精し 3 つの画分に分画した他、米中心部をバ
イブレーティングミルにより粉砕し、合計 4 つの画分を得た。精米歩合別米粉
末画分からタンパク質を抽出し、低温条件下で変性後、SDS-PAGE を行い、BioRad 社 QuantityOne により、タンパク質総量、グルテリン酸性サブユニット及び塩基性サブユニット、プロラミンを定量した。
その結果、精米歩合 90%の酒米７品種の総タンパク質に占めるグルテリン（G/TP）比は平均 41%、総タンパク質に占めるプロラミン（P/TP）比は平均 21%
であることが分かった。五百万石では他の品種と比較し、いずれの精米歩合別
米粉末画分又は収穫年でも G/TP 比は高かった。精米歩合 50%-30%画分ではG/TP 比は低い傾向があり、精米歩合 30%-0%画分では米品種によって変動した。一方、P/TP 比は米品種によらず精米歩合 90%-70%画分で低く、精米歩合
50%-30%画分で高かった。グルテリン／プロラミン（G/P）比については、品種によらず、精米歩合 90%-70%画分で高く、精米歩合 50%-30%画分で低かった。G/P 比は五百万石では他の品種と比較して高く、特に精米歩合 50%-30%画分や精米歩合 30%-0%画分など米の中心部で高かった。以上から、米粒空間において、米胚乳内のタンパク質組成が異なることが示された。

黄麹菌 Aspergillus oryzae RIB40 NBRC100959 株の分生子に対する音波照射の効
果について検討した。分生子を濡れた濾紙の上に置いて 30℃で 24 時間無音下にて静置すると、発芽率は 2.5%を示し、actA や amyA といった通常の生育に必要な遺伝子発現が確認された。この条件下にて 16 kHz の音波処理を行い、この分生子を用いて製麹すると米麹のグルコアミラーゼ活性は音波処理無しの米麹と比較して 0.87 倍に低下していた(第 74 回日本生物工学会大会)。発芽準備段階の分生子に付与された音響効果は、製麹した米麹の酵素活性に影響を及ぼすことが確認された。そこで本研究では発芽から菌糸伸長段階の分生子に対する音
波処理を検討した。また黒麹菌 Aspergillus luchuensis NBRC4119 株の分生子に対しても同様に音波処理を行い、黄麹菌の結果と比較した。
蒸米に各種麹菌の分生子を加え、30℃で 24 時間無音下にて静置した。黄麹菌の発芽率は 8 時間経過後では 34.1 ± 10.1%になり、24 時間経過後には蒸米全体に菌糸伸長が観察された。この条件下で 6.3 kHz の音波処理を行った結果、8 時
間経過後の発芽率は 33.9 ± 6.63%であり、無音下の発芽率と比べても変化は見られなかったが、24 時間経過後グルコアミラーゼ活性は 1.29 倍の有意差のある
増加が確認された。発芽から菌糸伸長段階の分生子に対して音波処理すること
で、米麹のグルコアミラーゼ活性を増加させる結果を見いだした。一方、黒麹菌の場合、無音下での発芽率は 8 時間経過後では 34.1 ± 2.35%であった。音波処理を行った結果、発芽率は 32.8 ± 5.80%と無音下の米麹と比べて変化は見られなかったが、24 時間経過後グルコアミラーゼ活性は 1.57 倍の有意差のある増加が確認された。

Protein composition varies depending on spatial region of the sake rice grain

The comparison of response to sound waves during hyphal elongation ofyellow-koji and black-koji○Kei Takahashi, Hiromi Kohno, Midori Joyo, Masaki Okuda(NRIB)

Key words

sake rice, rice grain, protein composition, spatial distribution○Taku Matsumoto1, Takuma Kusumoto2, Kakeru Masuda2, Kouji Kojima1,
Noriaki Saigusa1, Yuji Teramoto1(1 Grad. Sch. Eng., Sojo Univ., 2 Fac. Biotechnol. Life Sci., Sojo Univ.)

Key words

Aspergillus oryzae, Aspergillus luchuensis, Rice-koji

254

3Fp13

黄麹菌の回転培養が製麹に与える影響○吉村 瑞花 1, 吉岡 美紗 2, 山下 秀行 3, 中川 拓郎 3,
生田 宗一郎 1,2, 藤原 伸介 1,2（1 関西学院大・理工, 2 関西学院大院・理工, 3 樋口松之助商店）
fujiwara-s@kwansei.ac.jp

3Fp15

市販の酵素製剤を用いた高可溶性トマトパウダーの製造における振とうの影響○平田 竜一, 小島 幸治, 三枝 敬明, 寺本 祐司（崇城大院・工）g2118d01@m.sojo-u.ac.jp[背景]
黄麹菌である Aspergillus oryzae はデンプンやタンパク質を含有する原料を分解する加水分解酵素を生産するため、さまざまな発酵食品の製造に用いられている。甘酒製造や日本酒醸造では、A.oryzae の胞子(種麹)を蒸米にまぶし、一定時間培養(製麹)させ菌糸成長した状態をつくる。これまで、米麹の菌糸成長と内在性化合物の局在に相関があることが分かっている[1]。しかし、製麹方法を変え、菌糸成長の状態を変化させた際の内在性代謝物への影響についての知見は少ない。本研究では、A.oryzae を静置培養あるいは回転培養することで，異なる製麹方法が菌糸成長及び内在性代謝物の蓄積にどのような影響を及ぼすのか検証することを目的とした。
[実験方法]
実験サンプルとして，製麹前の蒸米，静置培養した米麹と回転培養した米麹を用いた。菌糸の様子を実体顕微鏡で観察し，ヤタラーゼによって細胞壁を分解し N-アセチルグルコサミンを検出することで菌糸体量を計測した。さらに数種類のアミノ酸やポリアミンを標的として質量分析イメージング法を用いて内在性化合物の異なる製麹方法における局在の違いを調査した。
[実験結果]
静置培養及び回転培養した米麹中の麹菌由来の菌糸体量を比較した結果，回転培養した米麹で，米麹の外側に伸長する気菌糸が減少した。質量分析イメージ
ング法を用いて内在性化合物の局在を調査した結果，回転培養した米麹の内側の栄養菌糸においてアルギニンが特異的に局在していた。これらの結果より回転培養による気菌糸の減少が栄養菌糸及び米麹内部のアミノ酸局在に影響を与えている可能性が高い。
[1] Wisman, A. P et al., Metabolic visualization reveals the distinct distribution ofsugars and amino acids in rice koji, Mass Spectrom., 9, A0089 (2020).

演者らは、水に溶けやすいトマトパウダーを低コストで開発することを目的に、青果の繊維分解、植物の成分抽出、剥皮等の用途として食品業界で使用されている 3 種類の市販酵素製剤によるトマトの糖化を試みた。各市販酵素製剤の酵
素濃度、糖化温度、時間、振とう速度の影響は異なると考えられたため、微結晶セルロースである Avicel PH-101（Fluka）0.3 g を基質とし、各市販酵素製剤の糖化条件を確立し、同様の条件でトマトを糖化させた。コントロールは、酵
素溶液の代わりに 0.05 M 酢酸緩衝液（pH4.5）を用いた。その結果、いずれの酵素製剤も静置条件が振とう条件に比べ有意に糖化率が増加した。一方、最適糖化温度は、スクラーゼ X（三菱化学フーズ株式会社）およびアクレモセルラー
ゼ KM（協和化成株式会社）は 50℃、スクラーゼ C（三菱化学フーズ株式会社）は 45℃であった。そこで同様の条件でトマトの糖化に対する影響について検討した結果、振とうの有無によるグルコース量、還元糖量の増加に有意差はみられなかった。糖化によって最もグルコースおよび還元糖の遊離が確認できたのは、スクラーゼ X で、使用したトマトにおいてグルコースへの糖化率は86.2%、還元糖への糖化率は 96.7%であった。また、糖化処理による抗酸化活性の影響を総ポリフェノール含量と DPPH ラジカル消去能測定により評価した結果、スクラーゼ C、スクラーゼ X で糖化した場合、総ポリフェノール含量はコントロールと比較して、それぞれ 1.34 倍、1.24 倍増加した。DPPH ラジカル消去能はいずれの酵素製剤でも、0.59 倍-0.49 倍に低下した。また、総ポリフェ
ノール含量と DPPH ラジカル消去能は振とうの有無での有意差はみられなかった。これらのことから、トマトにおいては静置における糖化であっても十分に糖化でき、より低コストに高可溶性トマトパウダーを製造できる可能性があると示唆された。

Effect of rotary cultivation of Aspergillus oryzae on making koji

Effect of shaking on the production of highly soluble tomato powder using acommercial enzyme preparation.

○Mizuka Yoshimura1, Misa Yoshioka2, Hideyuki Yamashita3, Takurou Nakagawa3,
Souichirou Ikuta1,2, Shinsuke Fujiwara1,2(1 Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ., 2 Grad. Sch. Sci. Technol., Kwansei
Gakuin Univ., 3 Higuchi Matsunosuke Shoten Co., Ltd.)○Ryuichi Hirata, Kouji Kojima, Noriaki Saigusa, Yuji Teramoto(Grad. Sch. Eng., Sojo Univ.)

Key words

Aspergillus oryzae

Key words

cellulase, saccharification

3Fp14

Visualization of phospholipid distribution in Yamada and
Hakutsuru brown rice for sake production using mass
microscope

3Fp16

原料別米麹甘酒のレジスタントプロテイン (RP)の研究

学○Eliza Farestiani1, Eiichiro Fukusaki1,2,3, Shuichi Shimma1,2,3(1 Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., 2 Industrial Biotechnology
Initiative Division, Institute for Open and Transdisciplinary
Research Initiatives, Osaka Univ, 3 Osaka University Shimadzu
Omics Innovation Research Laboratories)
fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp○進藤 菖, 松田 理奈, 尾関 健二（金工大・ゲノム研）
ozeki@neptune.kanazawa-it.ac.jp

Rice is the principal constituent in the production of sake due to its provision of starch,which is concentrated in the core of the grain and can be fermented to release sugar,
subsequently converted into alcohol. Conversely, the outer of the rice comprises husk
and bran, containing a substantial quantity of lipids and proteins, which are superfluous
as they contribute to undesirable flavors and unpleasant aromas to sake. These
unnecessary compounds need to be removed through polishing process.
Hypothetically, different sake rice species might require different polishing method
leading to the necessity of understanding their distribution. Nevertheless, thedistribution and abundance of these components within rice grains remain inadequately
explored. This investigation employed mass microscopy, and advanced imaging
technique that combines mass spectrometry and microscope, to visualize
Yamadanishiki and Hakutsurunishiki brown rice samples. These variates represent
commonly used sake rice and its sibling species, respectively. The results showed that
phosphatidylcholine, fatty acylcarnitine, diacylglycerol, phosphatidylethanolamine,and phosphatidylglycerol were mainly distributed in the entire rice grains and the
distribution was not too significantly different in both sake rice species. This study
may contribute to a better understanding of the phospholipid information in sake rice
samples and provide new insights in the development of polishing strategy for
improving sake quality.

【背景・目的】難消化性タンパク質であるレジスタントプロテイン（RP）とはコレステロール低減効果等を示す食品成分であり、RP は米や酒粕等に含有している。市販の甘酒にも RP が多く含まれ、RP 量 120 mg でコレステロール低減、便通改善などの効果があり、250 mg の摂取で腸内細菌叢を大いに改善できることが報告されている 1)。市販の米麹甘酒の RP 含量を調べた時、米以外の穀物が入った甘酒は RP 含量が高く特徴的であった。本研究では、原料米に様々な穀物を加え甘酒を作製し、RP を高含有する甘酒の特徴を調査した。
【方法・結果】本研究では原料米に穀物を加え、米麹甘酒を作製し RP の分析を行った。原料 8 種類を蒸し、炊飯米 12.5 g、味噌麹 12.5 g、RO 水 25 ml で55℃、22 時間液化・糖化させ甘酒を作製した。作製した甘酒を遠心分離させ、残渣部分を難消化性タンパク質画分とし、Bradford 法、SDS-PAGE によって総タンパク質量の測定、タンパク質の検出を行った。甘酒 8 種類全てに RP が含有しており、有効量 250 mg を超えるものが多くあった。今回使用した原料米でコシヒカリより RP 量が多い原料米は春陽（低グルテリン米）、赤米、緑米であり、官能評価の高いものも確認できた。また、疑似穀物であるアマランサス
も RP 量が多い傾向であった。RP 残存率は米類で 5 割程度残存していた。
参考文献：1)甘酒中のレジスタントプロテインの機能性解析について 尾関健二
日本醸造協会誌第 117 巻第 9 号 627-634(2022)

Visualization of phospholipid distribution in Yamada and Hakutsuru brownrice for sake production using mass microscope

Study on Resistant Protein (RP) of Koji Amazake by Different Rice
Ingredients○Eliza Farestiani , Eiichiro Fukusaki , Shuichi Shimma(1 Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., 2 Industrial Biotechnology Initiative Division,
Institute for Open and Transdisciplinary Research Initiatives, Osaka Univ, 3 Osaka
University Shimadzu Omics Innovation Research Laboratories)
1

Key words

1,2,3

Mass microscope, phospholipid, rice, sake

1,2,3

○Ayame Shindo, Rina Matsuda, Kenji Ozeki(Genome Biotechnol. Lab., Kanazawa Inst. Technol.)Key words

resistant protein, Amazake

255

3Gp01
学

乳酸菌と酵母の共培養系における細胞外小胞の産生西村 泰風, ○川上 歩夏, 片倉 啓雄, 山崎 思乃（関西大・化生工）
shino.ya@kansai-u.ac.jp

3Gp03

NAD+増量効果のある微細藻類の探索○石田 快, 小乾 彰紘, 中谷 正義, 篠原 結子（ニデック・研究開発）
kai_ishida@nidek.co.jp【背景と目的】味噌やチーズなどの発酵食品中では乳酸菌と酵母が栄養素などを授受しつつ共生している。近年、原核生物である細菌が産生する細胞外小胞（EV）の機能や産生機構が注目されているが、真核生物である酵母も EV を産生することが分かってきた。しかし、従来の EV 研究の多くは純粋培養系を対象としており、共培養系における EV 産生については理解が進んでいない。そこで本研究では、乳酸菌と酵母の純粋培養系と共培養系における EV 産生について調
べるとともに、共培養系においてそれぞれの EV 産生に影響を及ぼす代謝物について検討した。
【方法】Lactiplantibacillus plantarum3 菌株および Saccharomyces cerevisiae NBRC
0216 は MRS 培地で 24 時間、嫌気的に静置培養した。フィルターろ過した培養
上清を超遠心分離（150,000 × g, 2 h, 4℃）し、EV を回収した。EV 濃度は、脂質特異的な FM4-64 で染色し、蛍光強度（励起波長 515 nm、蛍光波長 640 nm）
により定量した。
【結果・考察】L. plantarum NBRC 12006、NBRC 15891、NCIMB 8826 および酵
母はいずれも純粋培養において EV を産生した。また、乳酸菌 3 菌株と酵母とをそれぞれ共培養すると、いずれの組み合わせでも純粋培養時に比べて EV 産
生量が増加し、特に NCIMB 8826 株で顕著であった。乳酸菌と酵母の主要な代謝産物である乳酸とエタノールに着目し、NCIMB 8826 株の培地にエタノールを添加して培養したところ EV 産生量に変化はなかったが、酵母の培地に乳酸を添加して培養したところ EV 産生量は増大した。酢酸の添加によっても EV
産生量は増大したことから、酸ストレスにより酵母の EV 産生が誘導される可能性が示唆された。現在は、共培養での EV 産生量の増大に関わる他の因子についても検討中である。

NAD+（Nicotinamide adenine dinucleotide）は、酸化還元反応を触媒する補酵素としてエネルギー代謝に関わる他、DNA 損傷応答や遺伝子発現制御等の細胞内機能に関わる重要な生体分子である。近年、動物体内の NAD+量は加齢とともに減少し、これが加齢に伴う生体機能低下や疾患発症の要因の一つと考えられている。そして、NMN（Nicotinamide mononucleotide）などの NAD+の材料になる
栄養素を摂取することで、老化を一部抑制する結果が主に動物実験において示されている。我々は、食利用されており、持続可能性のある生物資源として注目されている微細藻類に着目し、NAD+を補給できる高齢化社会のヘルスケア
素材としての活用検討を行った。微細藻類として、Euglena gracilis NIES-48（ユー
グレナ）および Chlorella vulgaris NIES-2170（クロレラ）を用い、NAD+前駆体としてニコチン酸、ニコチンアミド、キノリン酸をそれぞれ培地に加えて培養した。その結果、ユーグレナではいずれの前駆体でも、クロレラではニコチンアミドで NAD 含有量が高まった。これら培養物について、由来組織の異なる
マウス線維芽細胞（NIH/3T3）およびヒト網膜色素上皮細胞（ARPE-19）を用いて、動物細胞 NAD+増量効果を評価した。微細藻類培養物の抽出物を調整し、NAD+サルベージ経路特異的な阻害剤である FK866 と共に培養液に添加して各動物細胞を培養した。その結果、NIH/3T3 での評価では、ユーグレナはニコチン酸およびニコチンアミド培養物で NAD+が増量した。また、クロレラのニコチンアミド培養物でも NAD+が増量した。ARPE-19 での評価では、NAD+前駆体
添加の有無にかかわらずユーグレナ培養物は細胞内 NAD+を増量した。一方、クロレラ培養物では増量効果はなかった。以上の結果、NAD+前駆体を添加して培養し NAD 含有量を高めた微細藻類培養物は、NAD+補給源になりうると考える。

Production of extracellular vesicles in coculture of lactic acid bacteria andyeasts.

An exploration of microalgae as a NAD+ booster

Yasukaze Nishimura, ○Honoka Kawakami, Yosio Katakura,
Shino Yamasaki-Yashiki(Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ.)○Kai Ishida, Akihiro Koinui, Masayoshi Nakatani, Yuuko Shinohara(R&D Div. NIDEK Co., Ltd)Key words

lactic acid bacteria, yeast, coculture, extracellular vesicle

Key words

microalgae, NAD

3Gp02

リゾプス属で調製したモリンガ種子発酵物（モリンガテンペ）の機能性成分の 分析

3Gp04

海藻由来多糖アスコフィランのプレバイオティクスによる腸管免疫の活性化

青木 秀之 1, 鍋島 優夏 2, 森 朋子 1, 上野 義栄 3, ○尾山 廣 2（1 池田食研, 2 摂南大院・理工, 3 京都女子大）oyama@lif.setsunan.ac.jp○成田 有輝, 森脇 真希（富山大院・理工）mtakano@eng.u-toyama.ac.jp【目的】テンペは蒸煮大豆をクモノスカビで発酵させた食品であり、イソフラボ
ンアグリコン、GABA などの機能性成分が含まれる大豆発酵食品である。モリンガは熱帯・亜熱帯の汎用性樹木であり、種子には油脂のほかタンパク質も豊富なことから、大豆の代替素材として、栽培面積の拡大が期待されるモリンガ
種 子 に 着 目 し た 。 テ ン ペ の 固 体 発 酵 法 に よ り 、 ス タ ー タ ー に は Rhizopus
oligosporus または Rhizopus stolonifer を用いて、モリンガ種子発酵物のモリンガ
テンペ（Moringa tempe Rm と Moringa tempe Rs）を調製した。これらに含まれる遊離アミノ酸含量、総ポリフェノール濃度、抗酸化活性などを分析し、モリ
ンガテンペの有用性を考察した。
【方法】脱皮したモリンガ種子を浸漬、蒸煮後、２種類のテンペ・スターターの胞子懸濁液を植菌し、32℃、45 時間または 70 時間発酵させた。90℃、30 分間の加熱殺菌後に凍結乾燥し、Moringa tempe Rm と Rs の粉末を調製した。各粉末について、HPLC 法によるアミノ酸組成の分析、フォーリン・チオカルト法による総ポリフェノールの定量、DPPH ラジカル消去活性評価法による抗酸化活性の分析およびキチン結合活性を測定した。
【結果】Moringa tempe Rm は、GABA や L-Glu などの遊離アミノ酸の含有量が未発酵種子に比べて約３倍高くなったが、Moringa tempe Rs の含有量には変化がなかった。総ポリフェノール含有量は、Moringa tempe Rm と Rs 共に、未発酵種子に比べて約４倍高くなり、さらに抗酸化活性は約９倍も高くなった。一方、抗真菌活性を有するキチン結合タンパク質は、発酵後も大部分が残留していた。以上より、モリンガテンペは、大豆テンペと同様に GABA、遊離アミノ酸、ポリフェノールが種子そのものに比べて豊富に含有する共に、抗酸化活性も高いことから、新しい機能性発酵食品としての可能性が示唆された。

近年、腸内細菌叢の調整による免疫向上や体質改善が注目されている。そこで腸内細菌叢のバランスを整える食品として食物繊維や発酵食品の研究が進められている。海藻である Ascophyllum nodosum から抽出した多糖 Ascophyllan はヒト試験において NK 細胞を活性化する機能等があることが報告されており、機能性食品としての利用が期待されている。しかし Ascophyllan に対する腸内細菌の応答は不明である。そこで本研究では Ascophyllan のプレバイオティクス
機能を評価するため、Ascophyllan 添加における腸内細菌への効果を検討した。
腸内細菌として Lactobacillus 属や Lactococcus 属、Bifidobacterium 属等を用いた。細菌類は GAM 培地で嫌気条件、37℃、静置で 24 h 培養した。また
Ascophyllan HS およびこれから精製した Ascophyllan（ともに林兼産業株式会社
製）を用い、1.0 g/L で GAM 培地に添加して細菌類の培養を行った。さらに細菌間の相互作用を調べるため、NBRC ヒト常在微生物カクテルを用いて同様に培養した。各腸内細菌を Ascophyllan および Ascophyllan HS を添加した GAM 培
地で培養したところ、Enterococcus casseliflavus NBRC12256 および Lactobacillus
rhamnosus NBRC3425 において培養 24 h の全菌数が Ascophyllan 無添加培養よりも増加した。しかし、どちらの菌においても培養液中の乳酸や酢酸の濃度は多糖による影響がみられなかった。また、NBRC ヒト常在微生物カクテルの培養においても Ascophyllan および Ascophyllan HS 添加による短鎖脂肪酸の生産に差がみられなかった。これらの結果から、Ascophyllan や Ascophyllan HS は一部の腸内細菌の菌数を増やすもしくは維持する効果があるものの、短鎖脂肪酸
生産には影響しない可能性が考えられた。現在、Ascophyllan による細菌叢の変化を調べるとともに、胃腸モデル液による消化多糖を用いた細菌叢への影響も検討中である。

Analysis of functional ingredients of tempe-like fermented Moringa oleifera
seeds (Moringa tempe) prepared with Rhizopus species

Stimulation of intestinal tract immunity by prebiotics of seaweed-derived
dietary fiber, ascophyllan

Hideyuki Aoki , Yuka Nabeshima , Tomoko Mori , Yoshie Ueno ,○Hiroshi Oyama2(1 Ikeda Food Res. Co. Ltd., 2 Grad. Sch. Sci. Eng., Setsunan Univ., 3 Dept. of Home
Econ., Kyoto Women's Univ.)
1

Key words

2

1

3

fermentation, tempe, Moringa oleifera, Rhizopus sp.

○Yuki Narita, Maki Moriwaki(Grad. Sch. Sci. Eng., Univ. Toyama)

Key words

prebiotics, lactic acid bacteria, intestinal epithelial cell

256

3Gp05

静電処理による無洗米の低濁度化技術の開発○増子 祐介 1, 秋葉 憲二 2, 小座間 梓 2, 増子 貴彦 2, 荒井 広志 2,
渡辺 昌規 1
（1 山形大院・農, 2 山本製作所）
mwata@tds1.tr.yamagata-u.ac.jp

3Gp07

大麦タンパク質由来アンジオテンシン変換酵素阻害ペプ
チドの探索○遠藤 快斗 1, 辛島 健文 2, 高下 秀春 2, 秋山 裕和 1, 清水 一憲 1,
本多 裕之 1
（1 名大院・工, 2 三和酒類）
honda@chembio.nagoya-u.ac.jp【背景・目的】無洗米は、研ぎ洗いの必要がなく、炊飯の時短が可能であることから、外食産業等を中心に需要が伸びている。無洗米浸漬時の濁度は無洗米の品質指標であり、一定となっていない現状にあるため、その低濁度化が求められている。併せて、本濁度の主要因となりうる成分の特定も為されておらず、無洗米の低濁度化への明確なアプローチが導き出せていない状況にある。本研
究では、低コストで無洗米製造が可能な摩擦方式（乾式）の無洗米製造装置の静電雰囲気の任意制御による無洗米の低濁度化技術の開発と無洗米浸漬水および分離副産物の成分分析により、濁度に関与する物質の特定を目指した。
【方法・結果】摩擦方式（乾式）の無洗米製造装置内部（摩擦部）に陰イオンモジュールと帯電列の異なる樹脂板を設置し、任意の静電的雰囲気の形成による原料米（白米）の無洗米処理試験を実施した。処理後に得られた無洗米は浸漬
水の濁度測定に供し、処理時に副生する分離物（精白かす）並びに、無洗米浸
漬水の蒸発乾固物は、それぞれ成分分析に供した。その結果、上記無洗米処理試験により得られた無洗米浸漬水の濁度は、陰イオンモジュールの設置数、樹脂板の最適化により、約 20％の浸漬水の濁度低下（原料白米比）が認められた。また、無洗米浸漬水の蒸発乾固物の成分分析の結果、各処理条件間において、全糖、タンパク質含量値に有意な差は認められなかったのに対し、有機リン化合物の一つであるフィチン酸含量値は濁度値と同様に特異的な減少が認められた。これらの結果より、精白かすに含有するフィチン酸（フィチン）が無
洗米浸漬水の濁度に関与している可能性が示された。

高血圧は最も有症率が高い生活習慣病であり、脳卒中や心臓病など循環器疾患の主要因子となっている。高血圧改善のため、種々のアンジオテンシン変換酵
素 (ACE)阻害薬や受容体拮抗薬が開発されているが、急激な降圧作用に注意が必要である。このため、近年、緩やかに作用する食品タンパク質由来の ACE 阻
害ペプチドが機能性素材として注目され、機能性表示食品も上市されている。
しかし、なぜその配列が機能するのかは明確でない。そこで我々は、ACE 阻害
ペプチドデータベースに登録されたペプチド配列を統計解析し、ACE 阻害ペプ
チドにはプロリン残基が多く含まれることを見いだした。また、大麦タンパク質(ホルデイン)はプロリン残基の割合が他のタンパク質に比べて顕著に高いこともわかった。そこで、大麦タンパク質加水分解物中の ACE 阻害ペプチドの探索を試みた。
最初に大麦タンパク質を種々のプロテアーゼ(ペプシン、トリプシン、パパイ
ン、オリエンターゼ AY)で加水分解し、それぞれの ACE 阻害活性を比較するとともに加水分解物の分子量分布を測定した。次に、タンパク質源のアミノ酸組成に起因する阻害活性への影響を調査するために、大麦タンパク質とカゼインの加水分解物の阻害活性を比較した。最後に大麦タンパク質とカゼインの加水分解物を HPLC により分取し、より高活性な画分の探索も行った。
大麦タンパク質に対してはオリエンターゼ AY を用いた場合、阻害活性が最も高くなることがわかった。一方で、大麦タンパク質加水分解物がカゼイン加水
分解物に比べて、より高い阻害活性を持つことは確認できなかった。大麦タン
パク質加水分解物を HPLC で分画すると、親水性の画分に分取前の加水分解物
よりも阻害活性が上がる画分があることがわかった。今後、プロリン残基を含むペプチドが加水分解物中にどの程度含まれるかを質量分析で明らかにする予定である。

Development of low-turbidity technology for rinse-free rice by the electrostatical approach

Angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides from proteasehydrolysate of barley protein○Yusuke Masuko1, Kenji Akiba2, Azusa Ozama2, Takahiko Masuko2, Hiroshi Arai2,
Masanori Watanabe1(1 Grad. Sch. Agric., Yamagata Univ., 2 Yamamoto co., ltd.)○Kaito Endo1, Takefumi Karashima2, Hideharu Takashita2, Hirokazu Akiyama1,
Kazunori Shimizu1, Hiroyuki Honda1(1 Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2 Sanwa Shurui Co., Ltd)Key words

rinse-free rice, anion, electrification series, phytin

Key words

antihypertensive activity, bioactive peptides, protease, barley protein

3Gp06

Development of environmental harmonized okra
polysaccharides extraction process

3Gp08

大豆タンパク質由来二次胆汁酸ミセル崩壊ペプチドの同定○Mikhael-Christ Dossou-Yovo, Masanori Watanabe(Grad. Sch. Agric. Yamagata Univ.)mwata@tds1.tr.yamagata-u.ac.jp

学○清水 翔太 1, 平野 啓太 2, 齋藤 努 2, 秋山 裕和 1, 清水 一憲 1,
本多 裕之 1
（1 名大院・工, 2 不二製油グループ本社・未来創造研究所）
honda@chembio.nagoya-u.ac.jp

Okra (Abelmoschus esculentus (L.) Moench) has provoked interest as a raw material toextract functional materials such as polysaccharides due to its wide application range.
However, conventional methods involve water, organic acids, and alkali solutions, withsignificant chemicals for the extraction. Therefore, in order to apply the optimized
conditions to electrolyzed water extraction, a low-chemical approach as environmental
harmonized process, the current study focused on optimizing polysaccharide extraction
conditions by Response Surface Method (RSM). Three factors were investigated: pHvalue (4, 7, 10), ratio of solvent to okra powder (40–50) for extraction, and ethanol
volume (2-4 volumes) to recover polysaccharides. Thus, okra polysaccharide was
extracted for 2 hours at 70 °C from okra powder. For a predicted extraction yield of
30% (w/w okra powder), the optimum conditions were: ratio of solvent to okra powderof 45.04, ethanol volume of 3.19, and pH value 7 respectively. About total
polysaccharides, the optimum conditions were: ratio of solvent of 50, 2 volumes of
ethanol, at a pH value of 4, for a predicted total polysaccharide of 31.06 (w/w
recovered polysaccharide). The ethanol volume and pH showed significant effects on
the extraction yield, at the opposite of total polysaccharides. As further research,
application of okra residue after polysaccharide extraction for biofuel production isunder investigation. Overall, this study will provide important insight for okra
polysaccharide extraction.

近年、食の欧米化によって高脂肪食を摂取する機会が増加している。高脂肪食は生体内でコレステロール、一次胆汁酸へと代謝され、腸内細菌叢によって二次胆汁酸へと変換される。その中で、二次胆汁酸の 1 種であるデオキシコール酸（DCA）は大腸がんリスクファクターと言われており、体外排泄が求められている。
胆汁酸はミセル形成して可溶化し、ミセル崩壊で不溶化し体外排泄される。このため本研究では、大豆のペプシン加水分解物が胆汁酸結合能を持つとの報告
１を参考に、大豆タンパク質由来の DCA ミセル崩壊ペプチドを探索した。まず、8 種の大豆タンパク質配列からペプチドライブラリーを設計し、固相合成
ペプチドアレイへの DCA 結合活性を評価することで候補ペプチド 42 配列を絞り込んだ。次に、それらの遊離ペプチドをすべて合成し、DCA で作製したミセルの崩壊試験を行うことで、ほとんどの配列に活性があることを検証した。また、二次胆汁酸ミセルだけでなく、一次胆汁酸や胆汁酸抱合体ミセルに対する崩壊活性を高スループットで評価できる系を構築し、それぞれのミセルに対する崩壊活性を調べた。また、クラスタリング分類を行い、配列特徴について解析した。さらに、大豆タンパク質のペプシン加水分解物を作製し、LC-MS/MS
によって 1354 種の遊離ペプチドを同定した。同定された配列のうち、DCA 結合活性評価によって得られた候補ペプチドを含む代表配列 10 種を化学合成してDCA ミセル崩壊試験を行った。10 配列すべてが崩壊活性を示したため、これらは二次胆汁酸の体外排泄を促進するペプチドと考えられ、我々の探索法は胆汁酸排泄ペプチドの探索法として優れていることがわかった。
今後は、体外排泄検証をさらに進めるとともに、当該ペプチドの分離濃縮法を検討する。
１．Pak et al., Chem. Nat. Compd., 41, 710-714 (2005)

Development of environmental harmonized okra polysaccharides extraction
process

Identification of soy-derived peptides with micelle disruption activity of
secondary bile acids○Mikhael-Christ Dossou-Yovo, Masanori Watanabe(Grad. Sch. Agric. Yamagata Univ.)

Key words(RSM)okra, polysaccharides, electrolyzed water, Response Surface Method○Shota Shimizu1, Keita Hirano2, Tsutomu Saitou2, Hirokazu Akiyama1,
Kazunori Shimizu1, Hiroyuki Honda1(1 Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2 Fuji Oil Holdings Inc. Research Institute forCreating the Future)

Key words

peptide, deoxycholic acid, micelle, soy protein

257

3Gp09

A green process using enzyme, ultrasound, andultrafiltration for extraction and purification ofchondroitin sulfate from jumbo squid cartilage

3Gp11
学

Wen Rui Tang, Jun Rong Zhang, Kai Ruei Yang, Ming Fong Tsai,○Chia Hung Kuo(Department of Seafood Science, National Kaohsiung University of
Science and Technology)
kuoch@nkust.edu.tw

ターゲットプロテオミクスとニューラルネットワークによる農産物の機能性予測○岩切 裕哉, 黒木 勝久, 永濱 清子, 榊原 陽一（宮崎大・農）katsu1982@cc.miyazaki-u.ac.jp

This research proposed to extract a natural product of chondroitin sulfate (ChS) fromjumbo squid (Dosidicus gigas) cartilage by ultrasound-assisted enzymatic extract
method. According to the previous results of mass transfer coefficients based on Fick’slaw, the ultrasounds can assist enzymatic extraction methods to extract ChS fromjumbo squid. In addition, the enzymatic extract method employed three kinds ofprotease, Alcalase, Papain, and Protin NY100. Therefore, a response surface
methodology can integrate the parameters in the extraction experiment design toevaluate the relation of extraction conditions to the ChS extraction yield. Finally, theoptimal extract results of the Alcalase can apply in the ridge max analysis to show thatthe maximum extraction yield was 11.9 mg/mL with 59.4 oC of extraction
temperature, 24.01 min of extraction time, and 8.25 of extraction pH values, and 3.6 %of Alcalase concentration. Furthermore, the chondroitin sulfate purification by a highly
efficient hollow fiber dialyzer (HFD) can obtain a 63 % ChS recovery yield and 86 %purity. The structure and physical property of ChS identified using FTIR, 1H-NMR,
13C-NMR, and gel permeation chromatography (GPC) to confirm the jumbo squid
ChS structure was belonging the E type of ChS, and molecular weight determines as
208.2 kDa.

近年注目されている健康長寿社会の実現には、日ごろから摂取している食品による健康寿命の延伸が必要不可欠である。そのため、食品の三次機能である「生体調節機能」の活用が重要となる。多様な化学構造を持った食品成分が存在し、それらは種々の生体調節機能を有することが知られる。そのため、食品機能研究において、機能性評価試験が重要となる。しかしながら、種々の機能性に応じた個別の評価試験を行う必要があることから、多くの時間と労力を要する。
そのため、多様な生体調節機能を有する食品素材を効率的に探索するため、我々は 1 度の実験で複数の機能性を予測可能な食品機能性予測システムを構築した。
本手法では、まず、HepG2(ヒト肝癌由来)細胞にポリフェノール類、脂肪酸類
等の各種食品成分や薬剤類を処理した。その後、細胞中のバイオマーカータン
パク質の発現量を、質量分析計を用いた MRM(Multiple Reaction Monitoring)法によって算出した。次に、バイオマーカー発現変動値と個別の機能性評価試験で得られた実測値(生理活性値)をニューラルネットワークに入力値として機械学習を実行した。これにより、バイオマーカーの発現変動値を入力値として複数の機能性(10 種類)を推定する革新的なスクリーニング法を開発した。本発表では、この食品機能性予測システムにより、宮崎県産のマンゴー、ゴーヤ、豚肉等の農畜産物の機能性を予測した。その結果、マンゴーのアセトン抽出物は抗酸化ストレス活性が高く、ゴーヤは水、メタノール、アセトン抽出の全てにおいて抗ウイルス活性が高い推定値を得た。実際に、マンゴーのアセトン抽出物における ARE（抗酸化剤応答配列）レポーターアッセイにおいて、予測と同様に高い抗酸化ストレス活性を確認した。このことより、本システムは効率的で効果的な農畜水産物の機能予測システムとしての応用が期待された。

A green process using enzyme, ultrasound, and ultrafiltration for extraction
and purification of chondroitin sulfate from jumbo squid cartilage

Functional Prediction of Agricultural Products by Targeted Proteomics andNeural Networks

Key words
chondroitin sulfate, jumbo squid cartilage, protease, ultrasound-assisted
enzymatic extraction

Key words

biomarker, MRM, functional food

3Gp10

3Gp12

NMR メタボロミクスによるサトウキビ蔗汁の構成成分評価

Wen Rui Tang, Jun Rong Zhang, Kai Ruei Yang, Ming Fong Tsai, ○Chia Hung Kuo(Department of Seafood Science, National Kaohsiung University of Science andTechnology)

L-アンセリンは初代ヒト骨格筋細胞の筋分化および筋収縮力を向上させる○Yuya Iwakiri, Katsuhisa Kurogi, Kiyoko Nagahama, Yoichi Sakakibara(Fac. Agric., Univ. Miyazaki)○永井 研迅 1,2, 井田 正幸 1, 出雲 貴幸 1, 中井 正晃 1, 本多 裕之 2,
清水 一憲 2
（1 サントリーウエルネス, 2 名大院・工）shimizu@chembio.nagoya-u.ac.jp○伊達 康博 1, 石川 千秋 2, 佐藤 光徳 3, 井上 健一 3, 小野 裕嗣 1
（1 農研機構・分析研, 2 農研機構・食品研, 3 鹿児島・農総セ）
datey262@affrc.go.jp【背景】
超高齢社会において、サルコペニアや廃用性筋萎縮に伴う筋力低下が問題である。こうした背景から筋力低下を予防する食品成分が求められている。L-アン
セリンは回遊魚や鳥類に多く含まれており、様々な食品から摂取されている成分である。L-アンセリンは多様な生理活性が報告されているが、筋分化や筋収縮力の作用は未解明である。本研究では、初代ヒト骨格筋細胞を用いた平面培
養系および独自のマイクロデバイスを用いた三次元培養系において L-アンセリンの筋分化および筋収縮力へ及ぼす影響を検討した。
【方法】
初代ヒト筋芽細胞を平面培養で播種後、分化誘導を行った。誘導 4 日目に L-ア
ンセリンを添加し、96 時間培養した。その後、Myosin Heavy Chain の免疫染色および筋分化マーカーの遺伝子発現を測定した。また、ヒト培養筋組織を作製し、マイクロデバイス上で三次元培養を行った。分化誘導 4 日目に L-アンセリ
ンおよびその構成アミノ酸である β-アラニンまたは 1-メチルヒスチジンを添加し、筋収縮力を測定した。さらにメカニズム検討のため、ヒスタミン H1 受容体(H1R)のアンタゴニストを用いて筋収縮力を評価した。
【結果と考察】1μM の L-アンセリン添加により筋短径が有意に増加し、Myogenin および Myosin
heavy chain の遺伝子発現が増加した。三次元培養における筋収縮力評価の結果、L-アンセリン添加により有意に筋収縮力が増加した。一方、構成アミノ酸は効果が見られなかったため、ジペプチド構造が重要であることが示唆された。
L-アンセリンの筋収縮力増加作用は、H1R アンタゴニスト共添加によって消失したため、この効果は H1R を介すことが示唆された。本検討により L-アンセ
リンは筋分化を促進し、筋収縮力を増加させる可能性が示された。また、独自のマイクロデバイスはサルコペニアを予防する食品成分評価に応用できる可能性が示された。

砂糖やバイオエタノールの原料であるサトウキビは、日本では南西諸島で商業的に生産されており、その地域の生活基盤を支える重要な作物である。これら
地域の持続可能な発展の一助として、サトウキビの生産性の向上や高品質化等が求められており、栽培管理法の改善や育種による作物の改良が進められている。しかしながら、サトウキビは高次倍数性でゲノム構造が複雑であり、また栽培期間が 1 年〜1 年半と長いことから、他作物に比べ品種改良が難しい作物である。そこで近年、この問題を解決するための一方策としてメタボローム解
析を含むオミクス解析が注目を集めており、我々もメタボロームビッグデータを用いた新規育種技術の開発や新品種の開発、栽培管理や収量予測、品質の向上や付加価値の創出等を目指して研究を推進している。その一端として本研究では、鹿児島県徳之島で栽培されたサトウキビに対して NMR を用いたメタボ
ローム解析を適用し、サトウキビ蔗汁中における構成成分の変動性や多様性を評価した。特に本会では、施肥に対する品種ごとの代謝応答性の差異や蔗汁中のアミノ酸代謝との関係性に関する知見を中心に議論したい。

L-anserine increases myodifferentiation and muscle contractility in primary
human skeletal muscle cells

Sugarcane metabolome compositional variation based on cultivation
conditions in Tokunoshima island○Akitoshi Nagai , Masayuki Ida , Takayuki Izumo , Masaaki Nakai ,Hiroyuki Honda2, Kazunori Shimizu2(1 Suntory Wellness Ltd., 2 Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)
1,2

1

1

1

Key words
L-anserine, three-dimensional skeletal muscle tissues, microdevices,
contractile force○Yasuhiro Date1, Chiaki Ishikawa2, Mitsunori Sato3, Kenichi Inoue3, Hiroshi Ono1
(1 NAAC, 2 NFRI, 3 Kagoshima Pref. Ins. Agri. Dev.)

Key words

metabolic analysis, sugarcane juice

258

3Gp13

質量分析イメージング法を用いたカビチーズにおけるポリアミン類局在の可視化○生田 宗一郎 1,2, 藤原 伸介 1,2（1 関西学院大院・理工, 2 関西学院大・生命環境）
fujiwara-s@kwansei.ac.jp

3Gp15
学

β-1,3-1,6-グルカンナノ粒子への包接に伴う抗酸化物質の
抗酸化力の上昇○河南 翔馬, 土居 菜々子, 甲元 一也（甲南大院・フロンティアサイエンス）
koumoto@konan-u.ac.jp[背景・研究目的]
カビを生育させて製造するチーズ(以下カビチーズ)は，代表的な発酵食品の 1つであり，ラクトペプチド、オレイン酸アミド、ポリアミンなど人体への健康増進効果が報告されている。特にポリアミンの含有量は青カビチーズや白カビチーズなどの種類によって異なることが報告されている[1]。この違いは，カビチーズ製造に用いるカビ種のポリアミン合成能の違いによるものだと予想される。これまでの分析技術はカビチーズに含まれるカビのみを選択的に分析することは不可能であった。本研究では，質量分析イメージング法を用いて，カビチーズに含まれるカビのみを選択的に分析しポリアミンの局在情報を分析する
方法の構築を目的とした。
[実験方法]
標準物質を用いてポリアミン類と関連する代謝物を質量分析イメージング法によって検出する手法を確立した。次に，市販されているチーズやカビチーズを用いて，分析に供する凍結切片作成法の検討をおこなった。その後，同じチーズを用いて上記で標的とした化合物の検出強度と局在分布を比較した。
[実験結果]
本研究によって，複数種のポリアミン種をカビチーズにおいて検出することに成功した。さらにチーズ種によってポリアミン分布が異なることが示された。
例えば，白カビチーズの一種であるブリーチーズや，青カビチーズの一種であるブルーチーズではアグマチンが検出されたが，白カビチーズの一種であるいくつかのカマンベールチーズではアグマチンが検出されなかった。本実験結果
より，カビチーズ試料中のポリアミン合成の違いを質量分析イメージング法によって比較することができた。
[1] Atiya Ali M. et al., Polyamines in foods: development of a food database. Food
Nutr Res. 55 (2011)【背景と目的】
栄養素の適切な摂取は健康維持・増進に不可欠である。しかし、多くの栄養成
分は経口摂取後、分解され、腸管から吸収される量は限られている。このような栄養素を効率的に摂取するために、DDS キャリアが近年注目されている。
我々の研究室では、食品由来の β-1,3-1,6-グルカンで作ったナノ粒子を、生活習慣病予防に有効であるとされるポリフェノールのデリバリーキャリアとして利用し、その抗酸化活性を評価してきた。その中で、包接によって抗酸化活性が上昇または低下する興味深い現象を発見した。しかし、ポリフェノールの活性に影響を与える具体的な因子については明確にならなかった。そこで本研究では、多様な構造を持つ抗酸化物質をグルカンナノ粒子に包接させ、その活性に影響を及ぼす因子を明らかにすることを目的とした。
【方法】
定法に従って、24 種類のポリフェノールをグルカンナノ粒子に包接させ、その包接量を定量した。抗酸化活性は、「農産物・食品抽出液等の抗酸化能測定に関する標準作業手順書 親水性酸素ラジカル吸収能(H-ORAC)測定法」に従って測定し、評価した。
【結果】使用したすべてのポリフェノールがグルカンナノ粒子に包接されることが明らかとなった。得られた包接複合体と未包接のポリフェノールの活性を比較した
結果、同じポリフェノール濃度でも活性に違いがあることが確認された。ナノ粒子を構成する β-1,3-1,6-グルカン自体もわずかに抗酸化活性が確認されたが、前述の違いはグルカンによるものとは考えにくく、包接に伴うポリフェノールの活性変化が原因である可能性が示唆された。発表では、ナノ粒子内のポリフェ
ノールの会合形態や電子状態などの影響について解析した結果についても報告する。

Investigation of polyamines distribution in moldy cheese using mass
spectrometry imaging

Increase in antioxidant ability of antioxidants upon inclusion in beta-1,3-1,6glucan nanoparticles○Soichiro Ikuta1,2, Shinsuke Fujiwara1,2(1 Grad. Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ., 2 Sch. Biological Environmental
Sci., Kwansei Gakuin Univ.)○Shoma Kannan, Nanako Doi, Kazuya Koumoto(FIRST, Konan Univ.)

Key words

mass spectrometry imaging, polyamine, cheese

Key words

beta-1, 3-glucan, antioxidant, drug delivery system

3Gp14

悪臭応答性嗅覚受容体の動物種間の機能比較

3Gp16

リン脂質からなる細胞サイズリポソームの顕微鏡観察を利用した飲料評価○福谷 洋介, 金枚 玲奈, 斉藤 遥, 齋藤 芽生, 養王田 正文（農工大院・工）fukutani@cc.tuat.ac.jp○依田 毅（青森産技・工総研）
tsuyoshi_yoda@aomori-itc.or.jp

生物は嗅覚により環境中に漂う臭気分子を検出・知覚し、危険回避や食糧探索など生存に必要な情報を得ている。嗅覚の分子認識基盤は、嗅覚受容体（Odorant
receptor, OR）と臭気分子の結合である。哺乳類の OR は G タンパク質共役型受容体（GPCR）に属し、選択的な分子結合が起きると細胞内の G タンパク質を介し、細胞応答が誘導される。動物種ごとに数百種類の OR があり、OR 毎の
分子選択性を組み合わせコードとして利用している。
他の動物と比べて嗅覚が劣っているヒトでも、臭気によっては高感度に検出できる。その代表として、特定悪臭物質にも指定されている硫黄化合物や低級のアルデヒドや脂肪酸が挙げられる。発表者はメタンチオール応答ヒト OR とその応答を阻害ずるアンタゴニストを同定し、アンタゴニストによってメタンチ
オール臭を抑制できることを見出した(Fukutani et al., Curr biol 2023)。そこで、本研究では、悪臭分子応答 OR の機能性の検証と臭気センサー応用に向け、動物種オルソログを用いた機能性の比較を行った。
ヒトの 3 種の硫黄化合物応答 OR、1 種のアルデヒド応答 OR、2 種の脂肪酸応
答 OR、1 種のアミン応答 OR を対象とし、そのマウスとイヌのオルソログのOR の cDNA を各ゲノム DNA からクローニングした。各 OR を HEK293T 細胞に発現させ、細胞膜発現と臭気分子応答性の評価を行った。臭気分子応答評価
は cAMP 依存型ルシフェラーゼである Glosensor を用いた。
ヒトの悪臭応答 OR の多くはシャペロンである RTP1S 非依存的に発現したことから、立体構造の安定性が高い受容体であることが分かり、その高発現性はマ
ウスとイヌでも同様の傾向がみられたリガンドとなる臭気分子の応答性は、主要な分子に対する応答には共通性が見られた一方で、一部のオルソログ間で分子選択性の違いがみられ、進化の過程で変化したアミノ酸による影響であると予測された。

[背景]清酒に含まれるカプロン酸エチル（EC）はやりんごジュースに含まれる
プロシアニジン(PB)は商品価値を高めるため、ガスクロマトグラフィーや高速
液体クロマトグラフィーによる濃度の精密測定が行なわれてきた。これらの装置は高価で、測定に高純度のガスや有機溶媒が必要なため、イニシャルコスト
とランニングコストが高いという欠点があった。
[目的・方法] 精密測定を行う試料を選ぶための予備分析のような形での簡易な評価法を開発する目的で研究に取り組んだ。具体的には、リン脂質である 1,2ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン/ 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3ホスホコリン/コレステロールの三成分と飲料から作製し、相分離(固体秩序相/
液体無秩序相, So/Ld 等)する細胞サイズリポソームを用いて蛍光顕微鏡観察を行った。
[結果・考察] 脂質フィルム作製時に加えていた試料を水和時に加えることで試料からの揮発・揮散を抑えた評価が可能かどうか調べた。細胞サイズリポソー
ムの作製に試料を用いる際、そのまま使用できるものと、純水による希釈が必要であるものが有ることが分かった。
作製した細胞サイズリポソームを観察した結果、EC 濃度の増加による直径サイズの減少、PB 濃度の増加による直径サイズの増加、EC 濃度の増加および PB
濃度の増加による相分離構造を持つ割合の減少が観察された。これらの観察結果を参考にした飲料品質評価法を検討した。

Comparison of malodor-responsive odorant receptors among animal species

Beverage evaluation using cell-sized liposomes made from phospholipids on
microscopic observation○Yosuke Fukutani, Reina Kanemaki, Haruka Saito, Mei Saito, Masafumi Yohda(Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words

odorant response, odorant receptor, sensory evaluation○Tsuyoshi Yoda
(AITC, Ind. Res. Inst.)

Key words

lipid, membrane lipids

259

3Hp01
学

糠床における複合微生物系代謝コミュニティーのメタゲ
ノム解析○古賀 優梨 1, 篠田 あかり 1, 杉浦 俊作 2, 木村 洋 3, 中山 二郎 1
（1 九大院・生資環, 2 東海漬物・漬物機能研究所, 3 北九州小倉・
糠床糠炊き研究会）
nakayama@agr.kyushu-u.ac.jp

3Hp03
学

好熱菌発酵産物の給与によるカブトムシ幼虫肥大化におけるトランスクリプトーム解析○浅野 風斗, 宮原 平, 児玉 浩明（千葉大・園芸）
kodama@faculty.chiba-u.jp【目的】糠床は、発酵と熟成が進むと菌叢が変化し、それに伴い漬物の風味に変化をもたらす。しかし、菌叢と風味成分との関係については、熟成の指標と言われているプロピオン酸を始め、未知な部分が多い。そこで本研究では、メタゲノム解析の手法により、糠床における複合微生物系における代謝コミュニ
ティーについて知見を得ることにした。
【方法】長期熟成糠床の上部、中部、底部から DNA を抽出し、150 bp のペアエ
ンドショットガンメタゲノムシーケンスに供し、各サンプル当たり計 6〜8 Gbのシーケンスを得た。まず、その配列を用いて菌叢解析プログラムである Kaiju
により菌組成を求めた。次に、各配列を Metaspades によりアッセンブルし、得られた contig をビニングし、Metagenome Assemble Genome (MAG)を得た。そして各 MAG 上の遺伝子について、DRAM により機能アノテーションを行った。
【結果・考察】菌叢解析の結果、乳酸桿菌と産膜酵母を主体とする菌組成である
ことが確認された。乳酸菌叢は、熟成糠床に優占的に存在することが知られている Lactobacillus acetotolerans を主体とし、加えて 30 種以上の乳酸桿菌で構成されていることが示された。各 MAG の遺伝子の機能性については、CAZY 解析により、アラビナン分解酵素遺伝子を有する乳酸菌の存在が示された。一次代謝については、ほぼすべての乳酸菌 MAG に乳酸と酢酸の代謝経路が確認された。一方、プロピオン酸生成の代謝については、乳酸から 1,3-Propanediol の代謝を司る Lentilactobacillus buchneri の一連の酵素と、1,3-Propanediol から
Propionyl-CoA を経由してプロピオン酸を生成する他の乳酸桿菌の酵素が複数の菌に分かれて見出された。以上、糠床の主要香気成分であるプロピオン酸が乳酸発酵の主要産物である乳酸を原料とした、複数の乳酸菌による代謝リレーにより生成されていることが示唆された。

当研究室では、好熱菌発酵産物という小魚などの未利用海産資源を高温下で発酵させることによって得られた堆肥（以下、発酵物）の給与が動植物に及ぼす影響について研究している。カブトムシ幼虫は腐葉土を食べて生育するため、発酵物がカブトムシ幼虫に対して良い効果が得られると考えた。実際に発酵物をカブトムシ幼虫に給与して生育差を比較すると、興味深いことにメス幼虫にのみ成長促進効果が認められた。また、糞中腸内細菌を次世代シーケンサーで解析したところ発酵物を給与したメス幼虫のみ、健康なクワガタ幼虫で優占的に存在していることが知られている特定の細菌の増加が見られたことから発酵物がプロバイオティクスとして機能していることが推測された。本研究では、腸内細菌の変動が宿主幼虫に与える影響を解明すべく幼虫の遺伝子発現解析及び腸内の代謝産物の測定をすることでカブトムシ幼虫の肥大化を誘導する原因を探った。3 齢初期のヘラクレスオオカブト幼虫の雌雄判別を行ったのち、通常の市販餌を給与したものを対照区、発酵物を市販餌に対して重量比 1％混合した餌を給与したものを試験区として各群 4 匹ずつ用意した。カブトムシ幼虫を解剖することにより脂肪体から RNA を抽出し、トランスクリプトーム解析を行い発酵物の有無による影響を調べた。また、中腸・後腸部位ごとに分け内容物の有機酸やイオン濃度を LC で測定した。その結果、対照区のメスと比較して試験区のメス幼虫は幼虫の肥大化を促す幼若ホルモンを運搬するためのタ
ンパク質関連遺伝子の発現量が上昇しており、免疫活性の指標であるディフェ
ンシンの発現量が減少していた。さらに、試験区の幼虫では腸内容物のアンモニウムイオンの濃度が有意に減少していた。以上を踏まえ、腸内細菌叢の変化が幼若ホルモンを介してメス幼虫の肥大化をもたらしていることが推定された。

Metagenomic analysis of metabolic communities in complex microbiota of"Nukadoko"

Transcriptome analysis in beetle larval enlargement by feeding on
thermophilic fermentation○Yuri Koga1, Akari Shinoda1, Shunsaku Sugiura2, Hiroshi Kimura3,
Jiro Nakayama1(1 Grad. Sch. Bioresour. Bioenviron. Sci., Kyushu Univ., 2 Pickle Funct. Lab., Tokai
Pickles Co., 3 Kitakyushu Kokura Nukadoko Nukadaki Study Group)○Futo Asano, Taira Miyahara, Hiroaki Kodama(Fac. Horticul., Chiba Univ.)

Key words
bacteria

Nukadoko, metagenomic libraries, shotgun metagenomics, lactic acidKey words

compost, beetle, gene expression

3Hp02

Spatial transcriptome technology to detect single
nucleotide variants

3Hp04

酵母液胞膜への Delta-rhodopsin 発現によるエネルギー
利用の効率化と物質生産への応用

学○Soichiro Asami, Reza Kalhor(Dept. Biomed. Eng., Sch. Med.)kalhor@jhu.edu

学○大長 薫, 弘埜 陽子, 菊川 寛史, 田村 謙太郎, 原 清敬
（静県大院・薬食生命）
k-hara@u-shizuoka-ken.ac.jp

With the advent of Next Generation Sequencing, new areas of biological research
involving single nucleotide variants (SNVs) have emerged. Advancements in singlecell technologies and spatial transcriptomics have accelerated the comprehensive
understanding of intricate biological details at an unprecedented resolution. However,
the availability of versatile and spatial SNV detection methods at single-cell resolution
remains inadequate. Here, we introduce a novel spatial transcriptomic technology todetect SNVs expressed in RNAs. We applied invader padlock (iLock) oligos withacrylamide-modified primers to PFA-fixed tissue slices. Polyacrylamide gel was
introduced to the tissue slices, which spatially maintained the iLock-RNA duplexes inthe tissue. This was followed by Proteinase K treatment, replacing the tissue matrix
with a polyacrylamide gel matrix. Enzymatic reactions were carried out to amplify
tandem repeats from the iLock oligos. in situ sequencing was applied to achieve
multiplex SNV detection from the tissue slice. We successfully detected Apoa2 SNVs
between C57BL/6J and BALB/c expressed in the liver with an accuracy exceeding
98%. Further, we applied it to a mouse brain slice, where two cell type specific genes
and four cortex layer specific genes were simultaneously detected by using in situ
sequencing. This technique does not require thermodynamical optimization and can bescaled up to thousands of genes easily, enabling further detailed high-throughput
analysis.

＜背景・目的＞ 微生物による有用物質生産において、微生物細胞内でのエネル
ギー不足は物質生産を頭打ちにする要因の一つである。出芽酵母液胞膜に局在する膜タンパク質 V-ATPase を介した ATP 駆動プロトン輸送機構は、細胞内でのエネルギー消費機構の一つである。本研究では、光照射で駆動する高度好塩菌由来のプロトンポンプ「Delta-rhodopsin(dR)」を出芽酵母液胞膜へ発現・駆動させることで、プロトン輸送への代替による ATP 消費抑制方法の開発、それに付随する有用物質生産性の向上を目的としている。
＜方法＞ Saccharomyces cerevisiae BY4741 を親株とした。液胞膜局在タンパク質である AVT6 と dR を連結、この複合タンパク質を親株の液胞膜に発現させAVT6-dR 発現株を作製した。この変異株の液胞膜を単離・再構成し、顕微鏡観察および pH メーターを用いた液胞膜局在 dR の光駆動ポンプ活性を測定した。
YPD 培地を用いて培養後、ルシフェリンルシフェラーゼアッセイで細胞内 ATP
濃度を測定した。SD 培地を用いた培養後、ATP を消費して合成される有用物質であるグルタチオンの細胞内濃度を測定した。
＜結果＞単離・再構成した液胞膜は光依存的なプロトンポンプ活性を示した。
100 µmol/m2/sec の光照射発酵試験を行った結果、親株と比較して、AVT6-dR 株
細胞内 ATP 濃度は大幅に増加した。また、AVT6-dR 発現株において細胞内グル
タチオン濃度も増加した。しかし、SD 培地による培養において AVT6-dR 発現
株で細胞増殖の遅延が確認された。現在、最適な培養条件の模索や、物質生産性の指標として他の細胞内生産物質の測定を検討している。

Spatial transcriptome technology to detect single nucleotide variants

Expression of Delta-rhodopsin on yeast vacuolar membrane for
improvement of energy utilization efficiency and application tobioproduction○Soichiro Asami, Reza Kalhor(Dept. Biomed. Eng., Sch. Med.)Key words

transcriptome○Kaoru Daicho, Yoko Hirono, Hiroshi Kikukawa, Kentaro Tamura, Kiyotaka Hara
(Grad. Sch. Integr. Pharm. Nutr. Sci., Univ. Shizuoka)

Key words

ATP, vacuole, yeast, rhodopsin

260

3Hp05

光駆動プロトンポンプを利用した大腸菌の酸耐性の強化と有用物質生産への応用

3Hp07

光遺伝学による複数酵素を対象とした代謝フラックス抑制技術の開発○櫻井 翔太, 戸谷 吉博, 清水 浩
（阪大院・情報）shimizu@ist.osaka-u.ac.jp○小林 祐摩 1, 佐野 海瑚人 1, 弘埜 陽子 2, 松田 史生 1, 石井 純 3,
原 清敬 2, 清水 浩 1, 戸谷 吉博 1
（1 阪大院・情報, 2 静県大・食栄, 3 神戸大・先端バイオ工研セ）
ytoya@ist.osaka-u.ac.jp【背景・目的】
大腸菌を利用した物質生産では、目的物質の生合成経路の駆動や副産物による
細胞内酸性化の緩和に ATP が利用される。そこで、ロドプシンを大腸菌に異種発現させることで、光エネルギーを利用して細胞内外でプロトン濃度勾配を生み出し、大腸菌の ATP 再生能を強化する取り組みが進められている。本研究では、大腸菌におけるロドプシンの用途拡大を目的とし、弱酸性環境でのロドプ
シンの働きが、細胞生存率やメバロン酸からイソプレノールへの変換効率に及ぼす影響を評価した。
【方法・結果】
大腸菌 MG1655(DE3)株を形質転換し、高度好塩菌由来のデルタロドプシン(dR)
遺伝子を導入した dR 株を得た。LB 培地で培養した菌体を PBS バッファで洗浄・懸濁した後、弱酸を添加した。サンプルを明条件 (100 µmol m-2 sec-1 の白色光) もしくは暗条件で 37℃、3.5 時間培養した。弱酸添加前と 3.5 時間培養した
後のサンプルを LB 寒天培地に播種し、形成されたコロニー数から細胞生存率を算出した。その結果、明条件における dR 株では、暗条件や dR 非発現株と比較して細胞生存率が上昇することが確認された。また、ロドプシンのプロトンポンプ能力は、非緩衝溶液に懸濁した細胞を用いて測定し、ロドプシンが低 pH下においてより強力にプロトンを排出することを明らかにした。そこで、弱酸性条件においてメバロン酸からイソプレノールへの変換を評価したところ、中性条件よりも生産性が向上することが明らかとなった。

【背景・目的】
微生物を用いた物質生産において、生産性を向上させるために代謝の流れ（フラックス）を最適化する技術が求められている。代謝フラックスを変化させるには鍵となる酵素の発現量の調節が有効であるため、酵素の遺伝子破壊や過剰発現が行われてきた。しかし、これらは静的な制御方法であるため培養途中に制御を切り換えることができず、代謝を常に最適な状態に維持することが困難であった。そこで本研究では光を誘導シグナルに用いた新たな代謝フラックス
制御システムの開発を目的とする。本システムでは代謝の可逆的な制御が可能になり、自由度の高い代謝制御を行うことができる。
【方法・結果】
緑色光条件下で特定の promoter からの転写を誘導、赤色光条件下で転写を抑制する働きを持つ Synechocystis sp. PCC 6803 由来の光感受性タンパク質 CcaS/R により、標的 mRNA の翻訳を阻害するアンチセンス RNA（asRNA）の転写を制御することで代謝フラックス光制御システムを開発した。asRNA は標的酵素の発現量を抑制するため、酵素ごとの最適発現量を考慮する必要がなく、汎用性の高い代謝フラックス制御が可能になると期待される。
大腸菌解糖系の酵素を対象に代謝フラックス光制御システムを構築し、RTqPCR、13C 代謝フラックス解析を行うことでその性能を評価した。その結果、開発したシステムにより標的の酵素の発現量を選択的に抑制できており、代謝
フラックスを制御可能であることを実証した。しかし同時に標的酵素抑制効果の不足、制御切り替え速度の遅さが示唆された。そこでこれらの欠点を補うべ
く、多くの細菌内在のタンパク分解系と直交性をもつと報告されている
Mesoplasma florum 由来の Lon protease の発現を光で制御することで標的酵素分解系を導入することを試みた。

Applications of a light-driven proton pump to enhance the weak acidtolerance and bioproduction in Escherichia coli

Development of metabolic flux repression technology targeting multiple
enzymes based on optogenetics○Yuma Kobayashi1, Mikoto Sano1, Yoko Hirono2, Fumio Matsuda1, Jun Ishii3,
Kiyotaka Hara2, Hiroshi Shimizu1, Yoshihiro Toya1(1 Grad. Sch. IST, Osaka Univ., 2 Sch. Food Nutr. Sci., Univ. Shizuoka., 3 EGBRC,
Kobe Univ.,)○Shota Sakurai, Yoshihiro Toya, Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words

acid tolerance, rhodopsin, acetate, Escherichia coli

Key words
optogenetics, metabolic flux analysis, metabolic engineering,
Escherichia coli

3Hp06

蛍光タンパク質センサを利用した大腸菌の新規 NADPH
再生反応の同定

3Hp08

上野 航一郎, 澤田 将吾, 石橋 真衣, 神田 義貴, ○戸谷 吉博,
清水 浩（阪大院・情報）shimizu@ist.osaka-u.ac.jp

学

マルチカラー光による大腸菌の代謝フラックス分布の光
遺伝学的制御○赤木 駿斗, 清水 浩, 戸谷 吉博（阪大院・情報）ytoya@ist.osaka-u.ac.jp【背景・目的】NADPH は細胞の同化や有用物質の生合成の反応を駆動する補酵素である。大腸菌の中枢代謝の幾つかの反応で NADPH が再生されることが知られているが、増殖期以外やグルコース以外の炭素源において、NADPH 再生の仕組みはよく分かっていない。本研究では、NADPH に応答して蛍光を発する mBFP を利用することで、飢餓状態の大腸菌に炭素源を供給した際に NADPH を再生する反応を調査した。
【方法・結果】
大腸菌の親株や遺伝子破壊株を炭素源を含まない溶液に懸濁し、過酸化水素を加えて 1 分間処理することで、細胞内の NADPH を枯渇させた。その後、10 mMの炭素源を細胞懸濁液に加え、蛍光強度 (Ex 345 nm, Em 450 nm) をモニタリン
グした。親株にグルコースやキシロースを加えると蛍光強度が急激に増加し、細胞内 NADPH 濃度の増加が観察された。NADPH 再生反応に関係する様々な遺伝子破壊株についても同様の実験を行ったところ、キシロースを加えた際に既知の代謝経路だけでは説明がつかない蛍光強度の増加を見出した。すなわち、ホスホグルコースイソメラーゼなどを欠失し、キシロースから酸化的ペントー
スリン酸経路への道筋を遮断した場合にも、グルコース 6 リン酸脱水素酵素(G6PDH) の働きによって蛍光強度が増加することが明らかとなった。この結果
は、G6PDH がキシロース代謝経路の中間代謝物に対して活性を持つことを示唆している。そこで精製した G6PDH を用いた in vitro の反応において、様々なペントースリン酸経路の中間体を基質として添加した際の NADPH 生産を調べた
ところ、G6PDH はエリトロース 4 リン酸を基質としても反応することを発見した。

【背景・目的】バイオプロセスを用いた物質生産性の向上のためには、代謝の流れ（フラックス分布）を目的物質の生産に対して最適化する必要がある。代謝経路上の複数の分岐について、そのフラックス比を独立に制御することができれば、より精密にフラックス分布の最適化が実現できると考えた。本研究では、青色光依存
DNA 結合タンパク質 EL222 と緑・赤色光依存 DNA 結合タンパク質 CcaS/R による遺伝子発現制御系を大腸菌の中枢代謝経路の酵素遺伝子の発現に応用した。グルコースを出発基質として、３つの解糖経路のフラックス比をマルチカ
ラー光の照射により制御することを目的とした。
【方法・結果】
まず EL222、CcaS/R の両光制御システムの直交性を蛍光タンパク質の発現によって調査した。青色光で RFP の発現、緑・赤色光で GFP の発現を制御する
株を青、緑、赤の３色の光条件で培養し、24 時間後にそれぞれの蛍光強度を測定したところ、ともに特異的な応答が見られた。３つの解糖経路のフラックス
比制御株は、大腸菌 MG1655(DE3)ΔpgiΔgntR 株を宿主に開発した。青色光照射
時に Pentose-phosphate (PP)経路を抑制、Entner-Doudoroff (ED)経路を誘導するため、それぞれの経路の反応を触媒する酵素遺伝子 gnd と edd のプロモーター配列の適切な位置に EL222 と特異的に結合する DNA 配列を挿入した。さらに解糖系の入り口の反応を触媒する酵素遺伝子 pgi を CcaS/R 制御下に置いたプラス
ミドを導入した。構築した株を緑、赤、赤＋青の光条件下で[1-13C]グルコースを炭素源とする合成培地で回分培養した。GC/MS を用いたアラニンの 13C 濃
縮度から各光条件でのフラックス比を決定したところ、EMP：PP：ED のフラックス比は（緑）80%：9%：11%、（赤）14%：35%：51%、（赤＋青）46%：8%：
46%となり、３つの解糖経路のフラックス比をマルチカラー光によって制御することに成功した。

Identification of a novel NADPH regeneration reaction using a fluorescencesensor in Escherichia coli

Optogenetic regulation of metabolic flux distribution by irradiating
multicolor lights in Escherichia coli

Koichiro Ueno, Shogo Sawada, Mai Ishibashi, Yoshiki Kanda, ○Yoshihiro Toya,
Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words

NAD(P)H, xylose, pentose phosphate pathway, central metabolism○Hayato Akagi, Hiroshi Shimizu, Yoshihiro Toya
(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words

optogenetics, metabolic flux, regulation

261

3Hp09
学

光遺伝学代謝フラックス制御を利用した大腸菌の 1,3-プ
ロパンジオール生産

3Hp11

Citrobacter 属細菌のバイオ凝集剤生産を促進する遺伝
子とプロモーターの探索○栗林 怜汰, 森茂 真菜, 石澤 秀紘, 武尾 正弘（兵庫県大院・工）takeo@eng.u-hyogo.ac.jp○川西 寿和, 櫻井 翔太, 塚本 雅士, 清水 浩, 戸谷 吉博（阪大院・情報）ytoya@ist.osaka-u.ac.jp【背景・目的】
微生物を利用した有用物質生産を高効率化するには、増殖と目的物質合成を両立する必要がある。多くの場合、増殖と目的物質合成は競合するため、増殖期と生産期にフェーズに分けて培養することで、生産性を高める取り組みがなされてきた。しかし、生産期に増殖を完全に抑制すると、代謝活性が徐々に低下
し、結果的に生産性も低下してしまう。本研究では、酵素発現量を光感受性タ
ンパク質により制御することで、培養系外部からの光刺激によって代謝の流れを切り替える仕組み（光応答代謝スイッチ）を利用し、生産フェーズにおける代謝活性を長期間維持することを目指した。この仕組みを大腸菌の 1,3-プロパンジオール (1,3-PDO) 生産株に実装し、光を利用した代謝フラックス制御が物質生産に及ぼす効果を検証した。
【方法・結果】
本研究では、微細藻類由来の光感受性タンパク質 CcaS/R を用いて解糖系のト
リオ―スリン酸イソメラーゼ (TPI) の発現量を制御する機構を用いた。緑色光を照射すると TPI の発現が誘導され、赤色光を照射すると発現が抑制される。
増殖のためには緑色光を照射することで解糖系へのフラックスを増強し、1,3PDO 生産のためには赤色光を照射することで解糖系へのフラックスを抑制し、競合する 1,3-PDO 合成経路のフラックスを増加させた。まず、増殖期には緑色、生産期には赤色光を照射して、グリセロールを単一炭素源として生産菌を培養したところ、緑色光もしくは赤色光のみを照射したときの約 1.6 倍の 1,3PDO を生産することができた。さらに、生産期に周期的に緑色光と赤色光を交互に照射することで、1,3-PDO 生産量のさらなる向上に成功した。特に、緑色
光と赤色光を 5 分毎に照射した条件では連続光条件の約 5 倍の 1,3-PDO を生産することができた。

我々は、Citrobacter 属細菌が生産するキトサン様アミノ多糖に強い凝集作用を見い出し、これをバイオ凝集剤として生産することを試みている。本研究では、
このバイオ凝集剤の生産を促進する遺伝子やプロモーターを含むと考えられる
DNA 領域のスクリーニングを行った。これまでの研究で、バイオ凝集剤の多糖化と膜分泌に関わる遺伝子として、大腸菌のバイオフィルムを構成するポリ Nアセチルグルコサミン（PNGA）の生産遺伝子群 pgaABCD と一定の相同性（各遺伝子産物のアミノ酸配列レベルで 26.2-67.3%）を有する bpfABCD を同定している。pgaABCD の転写を活性化する LysR タイプの DNA 結合タンパク NhaR をコードする nhaR 遺伝子が知られていることから、バイオ凝集剤生産菌 C. freundii
IFO13545 株の染色体へこの菌株が保有する nhaR をアラビノース誘導発現系（araC-PBAD）の下流に接続し、独自に開発した染色体埋め込みベクター pKTLOF
を用いて本菌株の染色体へ導入した。その結果、nhaR 導入株は、非導入株に比べて、アラビノース誘導条件下でのみ約 20%凝集活性が上昇し、本遺伝子の効果が実証できた。また、このように凝集活性を上昇させる有用遺伝子を高発現させる自己のプロモーターを探索するために、プロモーター検索ベクター
pKK232-8 に、1kb 程度に制限酵素分解した本菌株のゲノム DNA 断片を挿入して、本菌株に導入し、クロラムフェニコールに対する耐性を指標に強いプロモーター活性を有する DNA 断片を探索した。その結果、酢酸、グルコース、グリ
セリンを炭素源とした培地でそれぞれ強いクロラムフェニコール耐性を有する
形質転換株が得られ、そのような菌株から複数のプロモーター候補の遺伝子断片が取得できた。

Application of optogenetic metabolic flux control for 1,3-propanediol
production in Escherichia coli

Screening of genes and promoters activating bioflocculant production in
Citrobacter spp.

○Suwa Kawanishi, Shota Sakurai, Masashi Tsukamoto, Hiroshi Shimizu,
Yoshihiro Toya
(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)○Ryota Kuribayashi, Mana Morishige, Hidehiro Ishizawa, Masahiro Takeo(Grad. Sch. Eng., Univ. Hyogo)

Key words

Escherichia coli, optogenetics, metabolic engineering, production

Key words

Citrobacter, polysaccharide, production, promoter

3Hp10

好熱性水素細菌 Hydrogenobacter thermophilus の硫酸同化経路遺伝子群の発現制御機構の解析

3Hp12

Saccharomyces cerevisiae のピルビン酸デカルボキシラー
ゼ欠損株が示す 2-デオキシグルコース感受性を抑圧する
多コピーサプレッサーの探索学○浅野 泰英 1, 亀谷 将史 1,2, 新井 博之 1,2, 石井 正治 1,2（1 東大院・農生科, 2 東大微生物連携機構）
141masaharu@g.ecc.u-tokyo.ac.jp○野村 亘, 久保田 麻友, 宇田 竜成, 井上 善晴（京大院・農）nomura.wataru.4r@kyoto-u.ac.jp【背景と目的】好熱性水素細菌 Hydrogenobacter thermophilus TK-6 は、70℃で生育する好気性の独立栄養性細菌である。本菌は硫酸及びチオ硫酸を硫黄源として生育する。先行研究より硫酸同化経路の反応を触媒する酵素について同定されており、さらに本菌の硫酸同化経路の触媒酵素はチオ硫酸存在下で発現抑制されることが分かっている。一方でこの硫黄同化経路の制御機構は明らかになっていない。本研究では硫黄同化経路の制御機構の解明を目的として硫酸同化経路遺伝子群の上流に存在し、転写調節因子をコードする HTH0442 に着目し、この遺伝子破壊株を作製し発現制御への関与を検証した。
【方法と結果】HTH0442 遺伝子破壊株（Δ0442）を相同組換えにより耐熱性カナ
マイシン耐性遺伝子と置換することで作製し、野生株及び Δ0442 を硫酸イオン
及びチオ硫酸イオンを含む培地で前培養した。この前培養液中の菌体を野生株
及び Δ0442 それぞれについて異なる硫黄源条件（硫黄源無し、硫酸イオンのみ、チオ硫酸のみ、硫酸イオン及びチオ硫酸）の培地に植菌し、生育試験を行った。結果として硫酸イオンを唯一の硫黄源とする条件において野生株では生育が見られたのに対し、Δ0442 では生育が見られなかった。またチオ硫酸イオン
のみを含む条件、及び硫酸イオンとチオ硫酸イオンを含む条件では両株の間で生育に差は見られなかった。以上のことから HTH0442 の本菌における硫酸同化経路の制御への関与が示唆され、HTH0442 遺伝子産物が本菌において硫酸同化経路遺伝子群の転写調節因子として働いていることが示唆された。

出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae のピルビン酸デカルボキシラーゼ（PDC）は、ピルビン酸をアセトアルデヒドへと脱炭酸する発酵経路の初発反応を触媒する酵素であり、Pdc1、Pdc5、Pdc6 の 3 つのアイソザイムが存在する。その中で、機能的な PDC は Pdc1 と Pdc5 であると考えられており、PDC1 と PDC5 の二重欠損株はグルコースを炭素源とした培地で生育することが出来ない。グルコー
ス培地条件において、野生型株では Pdc1 が主要な PDC であり、PDC5 の遺伝
子発現は強力に抑制されているが、PDC1 が欠失した際には PDC5 の発現が著しく誘導されることで細胞の PDC 活性は補完される。そのため、PDC1 の単独欠損が示す明確な表現型についての知見は非常に乏しい。それに対して我々は、
PDC1 欠損株がグルコースアナログである 2-デオキシグルコース（2-DG）に対して高い感受性を示すことを新規に見出した。
今回我々は、PDC1 欠損と 2-DG 感受性との因果関係の詳細を明らかにすることを目的として、PDC1 欠損株の 2-DG 感受性を抑圧する多コピーサプレッサーの取得を試みた。その結果、PDC1 を含む５つの遺伝子を多コピーサプレッサーとして同定することに成功した。PDC1 以外のサプレッサー遺伝子の中には、
チアミン生合成関連酵素や PDC1 および PDC5 の発現にも関与する転写因子である PDC2 が含まれていた。多コピーによる PDC2 の過剰発現は、PDC1 欠損
株の 2-DG 感受性を抑圧したが、野生型株に対して高い 2-DG 耐性を付与することはなかった。これらのことは、Pdc1 欠損が 2-DG 感受性を示す原因となる機構に Pdc2 が関与することを示唆していると考えられた。

Analysis on the regulatory mechanism of expression of the sulfate
assimilation pathway gene clusters in the thermophilic and hydrogenoxidizing bacterium Hydrogenobacter thermophilus

Screening for multicopy suppressors of 2-deoxyglucose sensitivity of
pyruvate decarboxylase mutant in Saccharomyces cerevisiae○Yasuhide Asano1, Masafumi Kameya1,2, Hiroyuki Arai1,2, Masaharu Ishii1,2(1 Grad. Sch. Agric. Life Sci., Univ. Tokyo, 2 CRIIM, Univ. Tokyo)

Key words
biosynthesis

hydrogen-oxidizing bacteria, regulation, thermophilic, cysteine○Wataru Nomura, Mayu Kubota, Ryusei Uda, Yoshiharu Inoue(Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)

Key words
fermentation

pyruvate decarboxylase, Saccharomyces cerevisiae, 2-deoxyglucose,

262

3Hp13

自律的セントラルドグマ関連タンパク質を網羅的に解析する手法の開発

3Hp15○西澤 知里 1, 油屋 駿介 2, 小坂 唯心 1,3, 菅瀬 謙治 1, 青木 航 4,5,6（1 京大院・農, 2 九大・生医研, 3 日本学術振興会, 4 阪大院・工,5
JST創発的研究支援事業, 6 京都バイオ計測センター）aoki.wataru@bio.eng.osaka-u.ac.jp

乳酸菌の生育に対する酵母エキスの影響○齊藤 悠希, 冨髙 美佐, 勝又 忠与次, 二田 昴志郎, 多和田 悠貴,
深野 和紘, 周 哲（三菱商事ライフサイエンス）
yuki.saito@mcls-ltd.com【背景と目的】
自律的セントラルドグマの試験管内再構成は、自己複製する人工細胞の創出にとって重要である。ここで自律的セントラルドグマとは、DNA 複製・転写・翻訳のプロセスを担うタンパク質自体が、セントラルドグマによって生み出されることを意味する。
自律的セントラルドグマは多種類のタンパク質が協働する複雑な過程であり、その再構成は容易でない。こうした複雑な過程の再構成条件を探索するには、関連タンパク質の発現量を簡便に定量し、適切な発現比率へ最適化していくことが肝要である。そこで本研究では、自律的セントラルドグマ関連タンパク質を簡便かつ高感度に定量する parallel reaction monitoring（PRM）の開発に取り組んだ。
【方法と結果】
我々は、大腸菌の DNA 複製関連タンパク質とリボソームタンパク質（r–proteins）を網羅的に分析するための PRM メソッドを構築した。まず、Orbitrap
Exploris 240 で DNA 複製関連タンパク質とリボソームの標品を分析し、PRM で用いるプリカーサーイオンの候補を選定した。次に、DNA 複製関連タンパク質と r–proteins を大腸菌無細胞転写翻訳系で一斉に発現させた反応液を PRM で分析し、ターゲット以外のタンパク質を多数含む条件下でもターゲットタンパク
質を高い特異性と感度で定量できるようメソッドを最適化した。最後に、13C6・
15
N4 同位体標識アミノ酸を用いて DNA 複製関連タンパク質と r–proteins を発現させることで、試験管内転写翻訳によって新生したターゲットタンパク質の量を定量できるようにした。
今回開発したメソッドは、自律的セントラルドグマを試験管内で再構成する試
みに大きく貢献すると期待される。

乳酸菌は古くから人類にとって最も身近な微生物種のひとつである。特に近年はプロバイオティクスとしても有用性が見いだされ、菌体自体の需要も高まっており、工業化された乳酸菌発酵において菌体生育の効率化は命題である。また酵母エキスは、そのものが酵母を利用した調味料であるとともに、様々な微生物の培地栄養源として広く用いられている。私たちは培地源としての酵母エ
キスと乳酸菌の生育との関わりを探る目的で、以下調査をおこなった。
種々市販酵母エキスを培地に用いて乳酸菌（主に一般標準株を使用）をそれぞれ培養し、それらの生育を濁度で評価した。また同時に、使用した酵母エキスに含まれる化合物についてはメタボローム解析を行い、それぞれの成分特性を主成分分析にて確認した。
酵母エキスはその由来酵母種や製法によって成分特性が異なり、それぞれの成分の違いによって各乳酸菌に対する効果影響に差があることが示唆された。また、培地組成中に酵母エキスを複数種併用することによって、その効果が変化することも示された。

Development of a method to analyze the proteins associated with theautonomous central dogma

Effect of yeast extract on the growth of lactic acid bacteria○Chisato Nishizawa1, Shunsuke Aburaya2, Yuishin Kosaka1,3, Kenji Sugase1,
Wataru Aoki4,5,6(1 Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 2 Med. Inst. Bioreg., Kyushu Univ., 3 Japan
Society for the Promotion of Science, 4 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 5 JST
FOREST, 6 KIST-BIC)
Key words
in vitro reconstitution of central dogma, parallel reaction monitoring,cell-free transcription and translation

3Hp14

異なる電位環境下でのシステインレドックスプロテオミ
クス解析○Yuki Saito, Misa Tomitaka, Tadayoshi Katsumata, Koshiro Futada, Yuki Tawada,
Kazuhiro Fukano, Zhe Zhou
(Mitsubishi Corporation Life Sciences Ltd.)Key words

yeast extract, lactic acid bacteria

3Hp16

線虫共生細菌 Photorhabdus khanii から発見された緑膿菌に選択的な活性を示す抗生物質 ADC58○田中 謙也 1,2, 近藤 昭彦 1,2,3,4, 蓮沼 誠久 1,2,3（1 神戸大・先端バイオ工研セ, 2 神戸大院・科技イノベ, 3 理研・環境資源, 4 神戸大院・工）tanaka@emerald.kobe-u.ac.jp○今井 優 1,2, Son Sangkeun 2, Liang Libang 2, Gates Michael 2,
森 美穂 2, Ghiglieri Meghan 2, Honrao Chandrashekhar 3,
Ma Xiaoyu 3, Guo Jason 3, Lewis Kim 2（1 信州大・先鋭領域融合研究群バイオメディカル研,2
Antimicrobial Discov. Cent., Northeastern Univ., 3 Cent. for Drug
Discov., Northeastern Univ.）
y.imai@shinshu-u.ac.jp

タンパク質に含まれるシステインのチオール基は細胞機能調節や活性酸素種除去に重要な役割を果たす。代表的な例であるチオレドキシンは代謝酵素や抗酸化酵素のジスルフィドを還元して活性化する。他にも多くのタンパク質が細胞内で還元力の授受に関与し、複雑なレドックス制御システムが存在する。しかし、このレドックス制御システム全体を完全に理解することはできていない。
酸化還元のされやすさを表す中間電位は、レドックス制御システムを理解する上で、重要な熱力学的パラメーターの一つである。しかし、システインの中間電位を実験的に求めるには、精製タンパク質を用意する必要があり、多大な労力と時間がかかる。そこで本研究では、タンパク質のシステイン残基の中間電位を網羅的に決定する手法の開発を行っている。
まず、細胞培養液からタンパク質を抽出し、それらを異なる電位のバッファーに加え、システインの酸化還元比率を網羅的に決定することを試みた。iodoTMT を用いて還元体と酸化体を識別したサンプルを作成し、LC-MS/MS 解析を行った結果、1355 個のシステイン含有ペプチドが検出された。これらには異なる電位に対して平衡化したペプチドとしなかったペプチドが含まれており、平衡化したペプチドにはジスルフィド結合を含むタンパク質が多く存在した。
一方、タンパク質の構造からジスルフィド結合の電位を予測するため、in silico
での解析を行った。過去に実験的に求められた 60 個以上のシステインの電位と、そのタンパク質の構造的特徴量との相関を調査した。さらに現在、機械学習によるモデル化を試みている。
今後、これらの解析を発展・組み合わせることで、新たな還元力の授受経路発見によるレドックス制御システムの理解に加え、望ましい電位を持つ酵素開発などタンパク質工学にも貢献することが期待される。

線虫共生細菌 Photorhabdus 属は近年新しい抗生物質の探索源として注目されている。これまでに我々は, Photorhabdus khanii からグラム陰性細菌に特異的な活性を示す抗生物質ダロバクチンを発見している。P. khanii の全ゲノム解析から,同菌が 20 以上の二次代謝産物生合成遺伝子群 (抗生物質を含む) を有することが明らかとなった。このことから我々は, P. khanii がダロバクチン以外にもグラ
ム陰性細菌に選択的に働く抗生物質を生産している可能性があると考えた。P.
khanii から調製した液体培養物を, 高速液体クロマトグラフィー分析に供試した。溶出時間によって分画したサンプルを, 大腸菌 Escherichia coli, 緑膿菌
Pseudomonas aeruginosa ( 共 に グ ラ ム 陰 性 細 菌 ) そ し て , 黄 色 ブ ド ウ 球 菌
Staphylococcus aureus (グラム陽性細菌) を検定菌とした抗菌活性試験に供したと
ころ, P. aeruginosa にのみ活性を示す画分を見出した。活性物質を精製後, 構造解析に供したところ, この化合物が分子量 704 の新規抗生物質であることが判明
し, ADC58 と命名した。ADC58 の P. aeruginosa に対する最小生育阻止濃度(MIC) は 128 µg/ml と比較的高いものの, E. coli や S. aureus に対する MIC は1024 µg/ml 以上であり, P. aeruginosa に対して明確な選択性を有することが明らかとなった。また P. aeruginosa から分離した ADC58 耐性変異株の変異解析から, pmrB 遺伝子 (二成分制御系シグナルセンサーキナーゼをコードする) における変異が, ADC58 への耐性を付与することも突き止めた。pmrB 変異は, ポリミ
キシン (リポ多糖に結合し, グラム陰性細菌を選択的に殺す抗生物質) 耐性に関与することが知られている。このことから, ADC58 は P. aeruginosa の細胞外膜に作用することが示唆され, 現在, 作用機序の詳細を調べている。

Cysteine redox proteomic analysis under different potential environments

ADC58, an antibiotic that selectively kills Pseudomonas aeruginosa wasdiscovered from nematode symbiont Photorhabdus khanii○Kenya Tanaka1,2, Akihiko Kondo1,2,3,4, Tomohisa Hasunuma1,2,3(1 EGBRC, Kobe Univ.,, 2 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 3 CSRS,RIKENS, 4 Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)

Key words

cysteine, proteomics, cyanobacteria○Yu Imai1,2, Sangkeun Son2, Libang Liang2, Michael Gates2, Miho Mori2,
Meghan Ghiglieri2, Chandrashekhar Honrao3, Xiaoyu Ma3, Jason Guo3, Kim Lewis2(1 Inst. Biomed. Sci., Shinshu Univ., 2 Antimicrobial Discov. Cent., Northeastern
Univ., 3 Cent. for Drug Discov., Northeastern Univ.)

Key words
aeruginosa

antibacterial, nematode symbiont, Photorhabdus, Pseudomonas

263

3Ip01
学

リアルタイム NMR 法によるグリコール酸ベースブロッ
ク共重合体の酵素合成機構の解析○柳川 謙吾 1, 梶川 彩香 1, 榊原 早也果 1, 久米田 博之 3,
冨田 宏矢 4, 松本 謙一郎 2（1 北大院・総合化学, 2 北大院・工, 3 北大院・先端生命科学, 4 阪
大・生工国際セ）
mken@eng.hokudai.ac.jp

3Ip03
学

ショウガ辛味成分 6-shogaol とエタノールの併用による抗真菌効果とその作用機序○田村 桃子 1, 山口 良弘 1, 荻田 亮 1,2, 藤田 憲一 1
（1 大阪公大院・理, 2 大阪公大・健康研セ）
fujita@omu.ac.jp

ポリヒドロキシアルカン酸は、微生物が合成する生分解性のバイオプラスチッ
クである。人工改変型の PHA 重合酵素 PhaCAR は、3 ヒドロキシ酪酸(3HB)およびグリコール酸(GL)を共重合したとき、3HB のホモポリマーセグメントと 3HBと GL のランダムセグメントからなるブロック共重合体を合成することが分かっている。本研究では、このような特殊なポリマーを合成する PhaCAR のメカニズ
ムを in vitro 系で解析し、各セグメントが合成される順序を明らかにした。今
回、複数基質の同時消費反応を分析するために、リアルタイム NMR 法を PhaCのアッセイに初めて応用した。本手法は、基質と酵素を NMR チューブ内で反応させ、連続的に NMR 測定を行うことで、基質消費を速度論的に評価する。
反応終了後は、溶媒交換によりポリマーなどの不溶性生成物の解析も可能であるため、反応を網羅的に解析することができる。3HB と GL のシグナルを検出する上で、酵素由来のシグナルとのオーバーラップが問題となった。そこで基質を 13C ラベルすることで、基質のシグナルのみを相対的に強くした。さらに、
NMR の測定手法も 13C-1H 2D NMR を使用することで、混みあったシグナルの中から、基質シグナルを単独で検出することに成功した。実験の結果、3HB 基
質が GL 基質に先行して消費されていることが分かり、反応の後半でランダムセグメントが重合されていることが示唆された。そこで、酵素を失活させることで反応を途中で停止させ、反応中間生成物の構造解析を行った。その結果、反応の前半では 3HB のホモポリマーセグメントのシグナルのみが検出されたた
め、PhaCAR は 3HB をホモポリマーを合成した後、GL を含むランダムセグメン
トを合成していることが明らかになった。このことから、PhaCAR は反応中に基質特異性が変化することで、ブロック共重合体ポリマーを作り出していることが示唆された。

近年、食品流通の簡便性を確保するため、保存料や日持ち向上剤の需要が高まっている。なかでも、カビや酵母などの真菌に対する抗真菌作用を持つ保存料や日持ち向上剤は、開発が困難なことから実用されている例も少なく、その使用条件も限られたものばかりである。本研究では、天然由来成分であることから安全性が担保されており、かつ、抗菌活性を有することが知られているショウ
ガエキスに着目し、ショウガエキス由来成分による抗真菌活性、ショウガ由来
成分とエタノールの併用による効果、および、それらにより発現する抗真菌活性の作用機序について解析を行った。
出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae をモデル生物としてショウガエキスに含まれる種々成分による抗真菌活性を調べた。加熱処理したショウガエキスに含まれる 6-shogaol 単独の処理では、出芽酵母に対して微弱な抗真菌活性しか示さなかったが、エタノールとの併用によって相加的な抗真菌活性を示した。この結果から、6-shogaol とエタノールとの併用は、それぞれの単独で有効となる添加量を減少させつつ、有効となる抗真菌活性が得られることを示している。6Shogaol + エタノールの併用により処理された細胞における細胞膜障害作用、および細胞内活性酸素種の産生について調べたところ、細胞膜障害作用と活性酸
素種産生のいずれの増幅も認められなかった。一方で、酸素電極を用いて細胞レベルでの呼吸が阻害されるかどうかを検討したところ、それぞれの単独処理細胞では呼吸阻害が認められなかったが、6-shogaol + エタノールの併用処理細胞では呼吸阻害活性が認められた。以上の結果から、6-shogaol + エタノールの併用は相加的な抗真菌活性を示し、保存料や日持ち向上剤への応用が期待される。

Real-time NMR analysis of polyhydroxyalkanoate synthase reaction thatsynthesizes block copolymer comprising glycolate and 3-hydroxybutyratev

Antifungal activity of a ginger's pungent ingredient, 6-shogaol, in
combination with ethanol and its mechanism○Kengo Yanagawa1, Ayaka Kajikawa1, Sayaka Sakakibara1, Hiroyuki Kumeta3,
Hiroya Tomita4, Kenichiro Matsumoto2(1 Grad. Sch. Chem. Sci. Eng., Hokkaido Univ., 2 Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.,
3
Faculty of Advanced Life Science, 4 ICBiotech, Osaka Univ.)○Momoko Tamura1, Yoshihiro Yamaguchi1, Akira Ogita1,2, Ken-ichi Fujita1(1 Grad. Sch. Sci., Osaka Metro. Univ., 2 Res. Center. Urban Health Sports, Osaka
Metro. Univ.)

Key words

PHA, PHA synthase, Block copolymer, Glycolate based polymer

Key words

Saccharomyces cerevisiae, shelf life improver, antifungal, 6-shogaol

3Ip02

Electrochemical determination variants of SARS-CoV-2
receptor binding domain with molecularly imprinted
polymer-coated electrodes

3Ip04

Persimmon tannin promotes the growth of
Saccharomyces cerevisiae under ethanol stress

学○Zhuo-Jun An , Cheng-Chih Lin , Mei-Hwa Lee ,Chuen-Yau Chen1, Hung-Yin Lin1
(1 National University of Kaohsiung, 2 Zuoying Branch Kaohsiung
Armed Forces General Hosp., 3 IShou Univ.)
linhy@nuk.edu.tw
1

1,2

3

○Ilhamzah1, Yoshihiro Yamaguchi1, Akira Ogita1,2, Ken-ichi Fujita1(1 Grad. Sch. Sci., Osaka Metro. Univ., 2 Res. Center. Urban HealthSports, Osaka Metro. Univ.)
fujita@omu.ac.jp

The COVID-19 pandemic of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2(SARS-CoV-2) has over 750 million confirmed cases globally and more than six
million deaths. Several variants have been named and identified as variants of concern
by the World Health Organization (WHO); these include the Delta (BA.4 and BA.5)
and Omicron (XBB and XBB 1.5) variants. Molecularly imprinted polymers (MIPs)
have been used as artificial receptors for microorganisms, proteins, nucleic acids andsmall molecules. This work demonstrates the integration of epitope-imprinted
conductive polymers for the sensitive detection of the covid spike protein. Peptides
with only single mutation from these variants of the receptor-binding domain (RBD)
on the spike protein were synthesized and imprinted onto poly(aniline-co-3aminobenzenesulfonic acid), poly(AN-co-MSAN), by electropolymerization. The
sensing range of the peptide-imprinted polymers-coated sensor demonstrated herein is
about 0.01-1000 fg/mL, which is similar to that of a polyscopoletin nanofilm on gold
SPRi chips. This MIP-based sensor has potential for use in portable personal protective
equipment (PPE).

The yeast, Saccharomyces cerevisiae, is an important organism in fermentationindustry, especially in the production of bioethanol. However, during the fermentation
process, the yeast is subjected to various environmental stresses such as ethanol stress,
which inhibits its cell growth. To improve yeast tolerance to ethanol stress, naturalingredients containing antioxidants have been added to the culture. In this study, we
focused on tannins found in persimmon fruits, which are known to show highly
antioxidative effects. We investigated the effects of persimmon tannins on the growthof the yeast cells under ethanol stress. After 48 hours of incubation in YPD broth,addition of 6.25 mg/ml persimmon tannins to the culture increased the cell growth up
to 10% as compared to treatment with 12.5% ethanol. This indicates that thepersimmon tannins improved yeast growth under ethanol stress. Ethanol induced
oxidative stress, such as production of cellular reactive oxygen species (ROS) and lipid
peroxidation. Persimmon tannins reduced ethanol-induced ROS production and lipid
peroxidation. Although ethanol induced membrane damage, increasing membrane
permeability, persimmon tannins slightly restricted ethanol-induced cell membrane
damage. These indicates the potential of persimmon tannins as a protective agent forincreasing yeast tolerance to ethanol stress.

Electrochemical determination variants of SARS-CoV-2 receptor binding
domain with molecularly imprinted polymer-coated electrodes

Persimmon tannin promotes the growth of Saccharomyces cerevisiae underethanol stress○Zhuo-Jun An , Cheng-Chih Lin , Mei-Hwa Lee , Chuen-Yau Chen ,Hung-Yin Lin1
(1 National University of Kaohsiung, 2 Zuoying Branch Kaohsiung Armed Forces
General Hosp., 3 IShou Univ.)
1

1,2

3

1

Key words
severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2),
molecular imprinting, receptor-binding domain (RBD), electrochemical sensing○Ilhamzah1, Yoshihiro Yamaguchi1, Akira Ogita1,2, Ken-ichi Fujita1(1 Grad. Sch. Sci., Osaka Metro. Univ., 2 Res. Center. Urban Health Sports, Osaka
Metro. Univ.)

Key words
tanninSaccharomyces cerevisiae, growth stimulation, antioxidant, persimmon

264

3Ip05

出芽酵母における微小管重合阻害剤添加細胞のミトコン
ドリアの融合・分裂異常○村田 和加惠 1,2, 山瀨 優日 1, 山口 良弘 2, 荻田 亮 2,3, 藤田 憲一 2（1 米子高専, 2 大阪公大院・理, 3 大阪公大健康研セ）
murata@yonago-k.ac.jp

3Ip07
学

Bacillomycin L 生合成遺伝子の同定○伊藤 光次朗 1, 富田 駿 2, 藤巻 貴宏 3, 松谷 峰之介 4, 郡司 萌 3,
三輪 真由 3, 五十君 靜信 3, 梶川 揚申 3, 横田 健治 3
（1 東農大院・応生科, 2 産総研・生物プロセス, 3 東農大・応生科, 4 東農大・ゲノム解析セ）
yokota@nodai.ac.jp

真核生物の主要な細胞骨格の一つである微小管は、細胞の形態維持や細胞分裂などの多様な細胞機能において重要な役割を担っている。微小管は α-tubulin とβ-tubulin が結合した二量体を構成単位とし、微小管の両端では二量体による重合と脱重合が絶えず繰り返されている動的な構造をもつことで知られている。
一方、ミトコンドリアは細胞分裂に必要なエネルギー供給、アポトーシスの制
御や細胞老化などにおいて重要な働きを担い、融合および分裂を繰り返すこと
で自身の形態を維持している多機能な細胞小器官である。ミトコンドリアの融合および分裂に関わるタンパク質はいくつか同定されている。しかし、微小管との関係についての研究報告はほとんどなされていない。本研究では、出芽酵母である Saccharomyces cerevisiae を用いて研究を行った。微小管重合阻害剤である thiabendazol および微小管安定化剤である nordihydroguaiarentic acid を S.
cerevisiae に添加し、ミトコンドリアの融合および分裂異常がどのような割合で生じるのかを GFP を用いて細胞内での局在を観察することによって検証を行った。その結果、thiabendazol 添加細胞においては分裂したミトコンドリアが観察され、微小管の伸長阻害も確認された。一方、nordihydroguaiarentic acid 添加細胞においては、枝分かれしたミトコンドリアが観察され、微小管の伸長阻害も確認された。また、これらの微小管脱重合阻害剤添加細胞においてミトコンド
リア GFP の蛍光が強く見られたため、RT-PCR を行った結果、ミトコンドリアに関連する遺伝子において微小管脱重合阻害剤を添加した細胞において転写量の増加が観察された。

Bacillus velezensis TCG15 は、土壌から分離した環状リポペプチド(cLP)生産性菌株であり、LC-ESI-MS/MS 解析から bacillomycin L と surfactin、plipastatin の３
種類の cLP の生産性が確認されている。Bacillomycin L は 、iturin ファミリーに分類される cLP である。Iturin ファミリーは、β-アミノ脂肪酸とヘプタペプチドから構成され、非リボソーム依存型ペプチド合成（NRPS）により生合成されるペプチド部位の一次構造の相違により、bacillomycin L を含む 7 種類の類縁体が報告されている。Iturin ファミリーのうち、3 種類の cLP については NRPS 遺伝子の配列情報が明らかにされているが、bacillomycin L については報告例がない。そこで本研究では、TCG15 が保有する bacillomycin L の NRPS 遺伝子の同定と配列情報の比較を目的とした。
Miseq を用いた NGS により TCG15 のドラフトゲノム配列の取得し、in silico 解
析により解析したところ、iturin ファミリーの NRPS 遺伝子のオペロン構造と類似した 4ORF から構成される全長 37kbp の遺伝子配列を見出した。推定 NRPS
オペロンの最上流の ORF について、遺伝子破壊株と、当該 ORF を発現ベクターへクローニングし、破壊株へ導入した相補株を作出して、cLP 生産性の評価か
ら、bacillomycin L の NRPS オペロン、bmyL オペロンを同定した。そして bmyL
オペロンを構成する 4ORF を上流から bmyLD、A、B、C とした。
bmyL オペロンと既知の iturin ファミリーの NRPS オペロンについて、ORF 毎に
推定アミノ酸配列を系統解析したところ、bmyL オペロンは bacillomycin D のNRPS オペロンと最も近縁であった。
また、bmyLD 破壊株の cLP 生産性の解析から、破壊株は bacillomycin L のみな
らず、surfactin と plipastatin についても生産性が消失する奇異な現象が認められ、bmyL オペロンの発現による未知の cLP 生合成制御機構の存在が予想された。

Inhibition of mitochondrial fusion and fission by addition of microtubule
polymerization inhibitors in budding yeast

Identification and characterization of non-ribosomal peptide synthesis
operon for bacillomycin L biosynthesis in Bacillus velezensis TCG15○Wakae Murata1,2, Yuni Yamase1, Yoshihiro Tmaguchi2, Akira Ogita2,3,
Ken-ichi Fujita2(1 Yonago Natl. Coll. Technol., 2 Grad. Sch. Sci., Osaka Metro. Univ., 3 Res. Center.
Urban Health Sports, Osaka Metro. Univ.)

Key words

3Ip06
学○Kojiro Ito1, Shun Tomita2, Takahiro Fujimaki3, Minenosuke Matsutani4,
Moe Gunji3, Mayu Miwa3, Sizunobu Igimi3, Akinobu Kajikawa3, Kenji Yokota3(1 Grad. Appl. Biosci., Tokyo Univ. Agric., 2 BPRI, AIST, 3 Fac. Appl. Biosci., Tokyo
Univ. Agric., 4 NODAI Genome Res. Center., Tokyo Univ. Agric.)

Saccharomyces cerevisiae, mitochondria, tubulin

Key words

Bacillus sp., bacillomycin L, cyclic lipopeptide, antifungal

機械学習を用いたフラビン依存性酸化酵素の機能改変

3Ip08

ラマン分光法による微生物コロニーからの二次代謝産物のスクリーニング手法の開発○松下 拓磨 1, 齋藤 裕 2,3,4, 岸本 真治 1, 渡辺 賢二 1
（1 静岡県大薬, 2 産総研, 3 東大, 4 北里大）
kenji55@u-shizuoka-ken.ac.jp

学○諏訪 駿之介 1,3, 安藤 正浩 2, 中島 琢自 2, 堀井 俊平 1,3,
松本 厚子 2, 穴井 豊昭 4, 竹山 春子 1,2,3,5（1 早大院・先進理工, 2 早大・ナノライフ創新研, 3 産総研・早大
CBBD-OIL, 4 九大院・農, 5 早大・生命動態研）
haruko-takeyama@waseda.jp

天然物は古来から医薬品のシード化合物として重宝されており、現在市場されている医薬品のうち 50%以上が天然物に化学的な修飾を施した誘導体であることが知られている。このことから、天然物誘導体の効率的な取得を目指して、
天然物の生合成研究が行われてきた。また、天然物の生合成酵素の中でも、フラビン依存性酸化酵素（FMO）は多様な反応メカニズムにより、様々な二次代
謝産物の生合成に関与するため、その機能改変が創薬研究に大きく寄与することが期待される。本研究では、従来の方法とは一線を画す手法である、機械学
習による FMO の効率的な機能改変に着手した。
その方法論を確立すべく、FMO のモデル酵素である Pseudomonas aeruginosa 由
来の PHBH に着目した。活性部位のアミノ酸残基 4 残基の変異体中（約 16 万種類）の、約１ 5 ０種類の変異体を作製し、本来の基質（１）、その誘導体（２〜７）と酵素反応させ、補酵素である NADPH の消費量を定量した。実験結果
から、野生型 PHBH の NADPH 消費量は、1〜4 では 100％、６では 4 ４%であったのに対して、５では 5%、７では８%しか消費されなかった。また、約１ 5 ０
種類の変異体の中でも、野生型酵素の 10 倍以上の活性を持つものは、５に対しては 2 種類、７に対しては 3 種類であり、高活性変異体の効率的な探索を目指
して、機械学習を行った。この機械学習では、初めに活性試験を行った約 150
種類の変異体について、活性部位の４種類のアミノ酸残基の配列を数値化し、その数値と実際の酵素活性の相関関数を作成した。得られた相関係数に約 16 万種類の変異体のアミノ酸配列の数値を当てはめることで、５,７に対して、高い酵素活性を持つ変異体を予測した。その中の僅か 20 種類の活性試験をし、HPLC
にて生成物を定量すると、５,７に対して野生型酵素の 15 倍以上の活性を示す
変異体を、それぞれ確認することに成功した。

微生物由来の生理活性物質は医薬品として用いられているものが多く，創薬研究の発展のため，新規物質のスクリーニングは重要である。スクリーニングは，
環境サンプルからの菌株の単離に始まり，培養液の生物活性評価，活性画分からの標的化合物の分離，精製を経て，構造を決定する。しかし，培養と分離，精製操作に膨大な手間がかかるうえ，新規物質のヒット率は低い。本研究では分光学的手法であるラマン分光法を用いて，寒天上のコロニーから直接に二次代謝産物の産生を評価できるようなスクリーニング技術の開発を目指した。
まず、4 種類の放線菌株をそれぞれ寒天培養し，コロニーをスライドガラス上にかき取り，顕微ラマン分光計でのスキャン測定によりスペクトルを取得した。
スペクトル分解(MCR-ALS)によって，データから単一成分のスペクトルを抽出し，スペクトルライブラリを構築した。次に，菌株特異的な二次代謝産物の産生がみられた Streptomyces coelicolor A を小型シャーレ上で寒天培養した。形成
したコロニーをスライドガラスを介して顕微ラマン測定し，単一コロニーのラ
マンイメージを取得した。そして，ライブラリを利用したスペクトル解析により，二次代謝産物の産生を評価した。
ライブラリの構築では一般的な生体分子に加え，actinorhodin や prodigiosin などの二次代謝産物スペクトルが得られた。単一コロニーのラマン測定では測定条
件の検討により，コロニーから直接に生体分子スペクトルを取得できた。そしてスペクトル解析を通して，コロニーごとの二次代謝産物の産生を評価することができた。寒天上のコロニーで直接二次代謝産物の産生を，分子レベルで評価した研究はこれまで例がなく，新しい二次代謝産物スクリーニング技術としての発展が期待される。
本研究は内閣府ムーンショット型農林水産研究開発事業によって実施された。

Functional modification of flavin-containing monooxygenase throughmachine learning methodology

Development of a screening technique for microbial secondary metabolites
by using Raman spectroscopy○Takuma Matsushita , Yutaka Saito , Shinji Kishimoto , Kenji Watanabe(1 Dept. Pharm., Univ. Shizuoka, 2 AIST, 3 Univ. Tokyo, 4 Kitasato Univ.)
1

2,3,4

1

Key words
machine learning, Pseudomonas aeruginosa, flavin dependent
monooxygenase, Aspergillus fumigatus

1○Shunnosuke Suwa1,3, Masahiro Ando2, Takuji Nakashima2, Shumpei Horii1,3,
Atsuko Matsumoto2, Toyoaki Anai4, Haruko Takeyama1,2,3,5(1 Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2 Res. Org. Nano Life Innov., 3 CBBDOIL, AIST-Waseda Univ., 4 Grad. Sch. Agric., Kyushu Univ., 5 Inst. Adv. Res.
Biosyst. Dyn., Waseda Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ.)
Key words
Raman spectroscopy, secondary metabolite, screening

265

3Ip09
学

Streptomyces sp. TSP2-12 株の生産する抗菌活性物質の精製とその解析○鶴貝 龍聖, 大土 光経, 城内 孝俊, 塚越 勇斗, 中島 美咲,
石川 正英, 岩崎 政和, 秦田 勇二（埼玉工大・工）hatada@sit.ac.jp

3Ip11
学

テリハボク(Calophyllum inophyllum) 葉抽出物中の終末糖化産物（AGEs）生成抑制物質○加々美 龍大 1, 松井 杏美 1, 宇佐美 徹 2, 松川 哲也 1,
梶山 慎一郎 1（1 近大院・生物理工, 2 すまエコ）
kajiyama@waka.kindai.ac.jp［目的］抗生物質は、細菌による感染症などの治療に必要不可欠なものである。
しかし現在、既存の抗生物質に対する薬剤耐性菌の出現が問題となっている。
そこで、新しい抗生物質の探索が求められている。新しい抗生物質の発見のための有望な供給源としては、放線菌が知られている。発表者らは、抗菌活性を有する放線菌を土壌サンプルから数多く分離している。その中の一つ
Streptomyces sp. TSP2-12 株（以下、TSP2-12 株）の分泌生産する抗菌活性物質の精製を試みた。
［方法］スクリーニングの結果、土壌から、抗菌活性能を示す微生物を数多く取得し、16SrRNA 解析結果も加味して、TSP2-12 株を選抜した。本株の培養上清をクロロホルムと 1：1 で混和し、得られたクロロホルム抽出物をさらにメタ
ノール：酢酸エチル(23：27)の展開溶媒にてシリカゲルカラムを用いて精製した。
［結果と考察］クロロホルム抽出物の TLC 解析を実施した結果、365nm の UVを照射することで Rf 値 0.3 付近及び、Rf 値 0.9 付近にスポットの検出ができ、少なくとも 2 種類の抗菌活性物質を生産していることが示された。ニンヒドリ
ン及び硫酸では検出されなかった。また、Rf 値 0.3 付近にスポットが確認された抗菌活性物質を精製し、同抗菌活性物質の各被検菌に対する抗菌活性を実施したところ、Bacillus subtilis 及び Stapylococcus epidermidis などのグラム陽性菌に対して 100µg/mL で抗菌活性が見られた。同抗菌活性物質は、炭素源と窒素源を検討した最適化培地を用いて、培養液 120mL で本株を 5 日間培養した結果、培養上清から 20mg 程度取得できた。

テリハボク(Calophyllum inophyllum)はテリハボク科テリハボク属の広葉樹であり、熱帯から亜熱帯の沿岸部、日本国内では沖縄県や小笠原諸島に分布している。テリハボクは種子に豊富な油分を含んでおり，粗油には抗炎症作用、チロシナーゼ阻害作用、抗アクネ菌作用など様々な生理活性があることが認められており，新たな生理活性物質の資源作物として注目を集めつつある。一方，テ
リハボクの代謝物の研究はその商業的価値から種子に関するものに限定されており，他の組織に含まれる二次代謝物質に関する知見は極めて乏しい。そこで
我々は二次代謝物質を豊富に含む葉に着目し，新たな生理活性物質のスクリー
ニングを行ってきた。その結果，葉には種子油抽出物には認められない抗糖化活性物質が含まれることを見いだした。
生体内で糖化が起こると、タンパク質と糖質が反応し、最終的に AGEs(advanced
glycation end-products)が生成される。近年，糖化反応の進行によるタンパク質の変性や AGEs 蓄積が老化や様々な疾患の原因と考えられており，糖化を抑制・阻害する手段の開発が求められている。そこで我々はテリハボクの葉抽出物に含まれる抗糖化活性物質の単離と構造解析を目的として研究を行った。
まず抽出溶媒の検討から行った。テリハボク葉を乾燥後，粉砕したものを極性の異なる種々の溶媒で抽出し抗糖化活性を評価したところ、50％エタノール水
溶液抽出物に最も活性が見いだされた。そこで本抽出物から逆相系カートリッ
ジカラムおよび分取 HPLC により単離を行った。単離物を LCMS 分析に供したところ，[M+H] + =449 および[M-H] - =447 のシグナルが認められたことから本物質の分子量は 448 であることが示唆された。現在，NMR による構造解析を進めており，本講演では詳細を報告する。

Purification and analysis of antibacterial substance produced by
Streptomyces sp. TSP2-12 strain

Isolation and characterization of Anti-Glycation substances from
Calophyllum inophyllum leaf extracts.

○Ryusei Tsurugai, Hironobu Otsuchi, Takatoshi Jounai, Hayato Tsukagoshi,
Misaki Nakajima, Masahide Ishikawa, Masakazu Iwasaki, Yuji Hatada(Fac. Eng.,Saitama Inst. Technol)○Ryuta Kagami1, Ami Matsui1, Toru Usami2, Tetsuya Matsukawa1,
Shinichiro Kajiyama1(1 Grad. Sch. Biology-Oriented Sci. Technol., Kindai Univ., 2 Sumaeco Co.Ltd ,Okinawa, Japan)

Key words

Streptomyces sp., antibiotics, purification, 1NMR

Key words
Anti AGEs formation substances, Calophyllum inophyllum, isolation,
characterization

3Ip10

タケ懸濁培養細胞におけるエピジェネティック修飾剤誘導性二次代謝産物の単離、構造解析

3Ip12

野村 泰治, ○加藤 康夫（富山県大・生医工研セ）
ykato@pu-toyama.ac.jp

学

Autotrophic biosynthesis of biodegradable
polyhydroxyalkanoate from continuously supplying noncombustible gas mixture by hydrogen-oxidizing bacteria○Chih Ting Wang, Yuki Miyahara, Manami Ishii-Hyakutake,
Takeharu Tsuge(Tokyo Tech)tsuge.t.aa@m.titech.ac.jp「合理的代謝フロースイッチング」1)は、植物培養細胞において活発な二次代謝経路から派生する新たな生合成経路を遺伝子組換えにより導入することで、外来目的物質の効率的な生産を行う手法である。当研究室では、同手法を用い、独自に樹立したタケ・ササ類の培養細胞を物質生産宿主として確立することを目指している。このような背景に基づき、タケ・ササ類の培養細胞が潜在的にもつ二次代謝能を発掘することを目的として、エピジェネティック修飾剤の投与による新たな二次代謝誘導の有無と誘導物質の同定を進めている。
ホウライチク (Bambusa multiplex; Bm) 懸濁培養細胞に、ヒストン脱アセチル化
酵素阻害剤である suberoyl bis-hydroxamic acid (SBHA) を投与したところ、顕著に誘導生産される未知化合物を 2 種見いだした。SBHA 投与濃度、培養開始時の細胞量、および培養期間の最適化によって決定した未知化合物 2 種の高蓄積条件下で Bm 懸濁細胞を培養し、その MeOH 抽出物を各種クロマトグラフィーに供することで、当該化合物 2 種を精製した。各種分光学的手法による構造解
析から、それらの構造を 3-O-feruloylquinic acid および 3-O-p-coumaroylquinic acidと同定した 2)。このことから、Bm 細胞は、「合理的代謝フロースイッチング」
によるフェニルプロパノイド系化合物の生産宿主として有望であることが示唆された。両化合物の生合成は SBHA によって誘導されることから、Bm 細胞に「合理的代謝フロースイッチング」を適用して外来のフェニルプロパノイド化合物を生産する際には、SBHA の有無による生合成のオン/オフ調節を利用したユ
ニークな物質生産系を構築できるものと期待される。
1) Nomura T et al. (2018) Sci. Rep., 8, 13203
2) Nomura T et al. (2021) Appl. Biochem. Biotechnol., 193, 3496-3511

Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are biodegradable polyester that can be biosynthesized
by a variety of microorganisms from renewable biomass resources. PHAs haveattracted extensive attention as alternatives to petroleum-based plastics. Ralstonia
eutropha is a hydrogen-oxidizing chemoautotrophic bacterium that can accumulate
PHA from CO2 by supplying H2 and O2 as energy sources. In the traditional
autotrophic production of PHA, a large amount of H2 (75-80 vol%) containing O2 andCO2 is required. However, a high concentration of hydrogen presents a risk of
explosion, which is a major drawback in performing autotrophic cultivation. In thisstudy, we have constructed a safe and efficient autotrophic cultivation system, which iscontinuously supplied a non-combustible gas mixture (H2: O2: CO2: N2 = 3.6: 7.6:
12.3: 76.5 vol%) to a 250 mL jar fermentor. The cell growth and PHA accumulation byusing the constructed system was significantly enhanced compared to that of previous
studies using flask cultures. Furthermore, increasing gas flow rate and agitation speed
enhanced both cell growth and PHA production. Nitrogen deficiency also promoted
PHA production, resulting in PHA titer and PHA accumulation of 2.94 g/L and 89
wt.%, respectively, after 144 hours. In conclusion, the constructed autotrophic culture
system proposed in this study is beneficial for PHA production from CO2 as it fully
nullifies the risk of explosion.

Activation of cryptic secondary metabolite biosynthesis in bamboo
suspension cells by an epigenetic modifier

Autotrophic biosynthesis of biodegradable polyhydroxyalkanoate fromcontinuously supplying non-combustible gas mixture by hydrogen-oxidizing
bacteria

Taiji Nomura, ○Yasuo Kato
(Biotechnol. Res. Center, Toyama Pref. Univ.)

Key words
inhibitor

biosynthesis, epigenetic modifier, plant cell culture, histone deacetylase○Chih Ting Wang, Yuki Miyahara, Manami Ishii-Hyakutake, Takeharu Tsuge(Tokyo Tech)

Key words
bacteria

polyhydroxyalkanoate, metabolic engineering, biodegradable plastic,

266

3Ip13

人工代謝系構築による α 位にメチル基側鎖を有するポリヒドロキシアルカン酸の生合成○宮原 佑宜, 石野 真里衣, 柘植 丈治（東工大・物質理工）
tsuge.t.aa@m.titech.ac.jp

3Kp02
学

大腸菌-Thermus thermophilus 新規シャトルベクターの開発○村山 大空 1, 宮崎 健太郎 1, 冨田 宏矢 1,2, 本田 孝祐 1,2（1 阪大・生工国際セ, 2 阪大・先導的学際研機構）
honda.kohsuke.icb@osaka-u.ac.jp

ポリヒドロキシアルカン酸（PHA）は、糖や植物油などのバイオマス資源から生合成され、海水中でも生分解可能な微生物ポリエステルである。その中でも、α 位にメチル基側鎖を有する PHA は、高い柔軟性と透明性を有しており、結晶化速度が速いため、より実用的な PHA 材料といえる。しかしながら、α メチル
化 PHA を生合成するためには、高価な脂肪酸前駆体を使用する必要があり、また、脂肪酸の有する細胞毒性により菌体収量が低下するという課題がある。このため、より安価なバイオマス資源である糖類や有機酸からの α メチル化 PHAを生産する技術開発が必要と考えられる。本研究では、人工代謝経路を導入した組換え大腸菌を構築し、安価な炭素源であるグルコールとプロピオン酸からの α メチル化 PHA の生合成を目的とした。
まず初めに、α メチル化 PHA を生合成するために、Ascaris suum 由来のチオラー
ゼ遺伝子（acat3 or acat5）、Ralstonia eutropha H16 由来のアセトアセチル CoA
レダクターゼ遺伝子（phaB）および PHA 重合酵素遺伝子（phaCNSDG）を導入した組換え大腸菌を構築した。次いで、構築した組換え大腸菌を種々の培地へと接種し、炭素源としてグルコースおよびプロピオン酸を添加して、30℃で 76
時間培養を行った。培養後の菌体から PHA を抽出し、ガスクロマトグラフィー（GC）および核磁気共鳴分光法（NMR）へと供することで、PHA ポリマー鎖に
α メチル化モノマーの導入を確認した。また、使用する培地や炭素源濃度などの培養条件を最適化することで、最大 17.8 mol%の α メチル化モノマーを含む共重合体 PHA の生合成に成功した。

【背景・目的】Thermus thermophilus は至適生育温度を約 70℃に持つ高度好熱菌であり、本菌の生産する酵素は熱安定性が高く、バイオテクノロジーにおいて大きな関心を集めている。また本菌を宿主に用いることで、多くの中温菌由来のタンパク質が適応進化により耐熱化されている。そのため、T. thermophilus
を遺伝子操作することにより有用なタンパク質の作出が期待される。しかしながら、T. thermophilus の遺伝子組換えに用いられているプラスミドベクターは、
T. thermophilus HB8 株が保持する pTT8 に限定されているというのが現状である。pTT8 はコピー数が少なく、T. thermophilus を用いたタンパク質の大量発現やプラスミドの獲得が困難となっている。そのため本研究では、大腸菌-T.
thermophilus 新規シャトルベクターを開発することで、プラスミドベクターの利便性を向上させることを目的とする。まず、pTT8 をもとにした高コピー数プ
ラスミドの獲得を目指した。
【方法・結果】大腸菌-T. thermophilus シャトルベクターは pTT8 の複製に関わる
遺伝子約 1.9 kb を大腸菌ベクター pHSG298Hg に挿入することにより作成した。
作成したシャトルベクターは E. coli JM109 株、T. thermophilus HB27 株の両方で自律複製することが確認された。コピー数変異体を視覚的に選抜するため、シャトルベクターに Parageobacillus caldoxylosilyticus 由来の β-ガラクトシダーゼ遺伝子を搭載し、X-gal 存在下で活性発現を確認した。β-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現量はプラスミドのコピー数に比例すると考えられ、コピー数が高いもの
ほど強い青色を呈色すると考えられる。今後、pTT8 の複製に関わる遺伝子にError-Prone PCR を適用し、コピー数変異体の獲得を目指す。

Biosynthesis of polyhydroxyalkanoate copolymers containing alpha-carbon
methylated monomer units by constructing an artificial metabolic pathway

Development of novel Escherichia coli-Thermus thermophilus shuttle
vectors○Yuki Miyahara, Marii Ishino, Takeharu Tsuge(Sch. Mater. Chem. Technol., Tokyo Tech)○Sora Murayama1, Kentaro Miyazaki1, Hiroya Tomita1,2, Kohsuke Honda1,2(1 ICBiotech, Osaka Univ., 2 OTRI, Osaka Univ.)

Key words
bacteria

polyhydroxyalkanoate, metabolic engineering, biodegradable plastic,

Key words

thermophile, plasmid, shuttle vector

3Kp01

高温で増殖可能なバクテリア由来のヒートショックタン
パク質による大腸菌のストレス耐性強化

3Kp03

大腸菌におけるギ酸資化経路を稼働させるための培養条
件の探索○佐藤 悠 1, 岡野 憲司 2, 本田 孝祐 3,4（1 山口大・大学研究推進機構, 2 関西大・化生工, 3 阪大・生工国際セ, 4 阪大・先導的学際研機構）
yusato@yamaguchi-u.ac.jp○巽 慶太郎, 小林 祐摩, 戸谷 吉博, 清水 浩
（阪大院・情報）shimizu@ist.osaka-u.ac.jp

熱ショックタンパク質（HSP）は宿主のストレス耐性の向上に関わるタンパク質の１つである。特に、平均分子量が 20 kDa 前後の HSP20 は、ストレス条件
下において細胞内のタンパク質の変性や凝集を阻害することで、細胞内のタン
パク質の恒常性に寄与している。これまでに中温性を示す生物由来の HSP20 を発現させることでモデル生物の多様なストレス耐性の向上が認められており、中には線虫由来の HSP20 の発現により大腸菌の最高生育温度を上昇させた例[Ezemaduka et al. (2014) J. Bacteriol. ]も報告されている。
「より過酷な環境下で増殖可能な微生物由来の HSP20 であれば宿主のストレス耐性をさらに強化できる」と考え、本研究では高温で増殖可能なバクテリア由来の HSP20 の機能解析を試みた。はじめに、原核生物の生育温度データーベース(http://togodb.org/db/
tempura)を利用して、大腸菌と系統的に近縁から遠縁まで多様な 13 種を選抜した。一部のバクテリアは複数の HSP20 を有しており、計 18 種類の HSP20 を使用した。大腸菌細胞にて発現させ、SDS-PAGE により確認したところ、可溶性
画分にて 17 種類の HSP20 の発現が確認でき、いずれも熱処理(70-80℃、30 分)に耐えうる熱安定性を示した。これらの発現株を多様な条件[高温(52℃)、凍結
融解、酸性(pH3)、アルカリ性(pH11)、高浸透圧(10% NaCl)]に暴露し、暴露前後の生菌数から生存率を算出した。その結果、空ベクターを含むコントロール株と比較して、いずれの条件においても各発現株の生存率の方が１桁から３桁ほど高いことが明らかとなった。また、一部の発現株は長期の高温条件下(52℃、5 日間)でも生存可能であることが示された。本成果により、宿主のストレス耐性を向上させる際に、高温で増殖可能なバクテリア由来の HSP20 が有用であると示された。

【背景・目的】
微生物を用いた物質生産において、地球温暖化の一因である CO2 から合成できるギ酸が炭素源として有望視されている。しかし、大腸菌はギ酸を中枢代謝経路の中間体につなげる経路を持っておらず、新たな経路が必要となる。そこで本研究では、ギ酸をセリンへ同化できることが報告されているメタノール資化性菌由来のテトラヒドロ葉酸（THF）回路を大腸菌に導入し、大腸菌にギ酸取り込み能力を付与する。さらに、その働きを強化するために THF 回路のギ酸同化能向上に関わる培養条件を探索する。
【方法・結果】
大腸菌 MG1655(DE3)株を宿主として、メタノール資化性菌由来の遺伝子を導入し、THF 回路を発現する大腸菌株を得た。その株をギ酸単一炭素源や、ギ酸と他の基質との混合炭素源上で培養することで、ギ酸の同化が可能な培養条件の探索や THF 回路を介したギ酸同化に必要な基質の絞り込みを行った。結果として、ギ酸単一炭素源における培養ではギ酸の同化は確認できなかったが、ギ酸とカザミノ酸の混合炭素源において培養液中のギ酸濃度の低下が確認できた。
同条件において 13C 標識ギ酸ナトリウムを用いて培養し、ガスクロマトグラ
フィー質量分析法を用いてタンパク質由来アミノ酸の 13C 標識割合を測定し、THF 回路が発現しないコントロール株と比較した結果、THF 回路を発現した株においてのみセリンに 13C 標識が取り込まれていることが確認でき、ギ酸の一部は THF 回路により同化されていることが分かった。カザミノ酸はトリプト
ファン以外のアミノ酸の混合物であることから、THF 回路によるギ酸同化には何らかのアミノ酸が必要であり、そのアミノ酸を特定できれば、THF 回路によるギ酸同化の改善の手掛かりとなると考えられるため、今後は THF 回路に必要なアミノ酸を特定することを試みる。

Enhancement of stress tolerance in Escherichia coli by small HSP20 fromthermotolerant bacteria

Exploring culture conditions for activating an formate assimilation pathway
in Escherichia coli

○Yu Sato , Kenji Okano , Kohsuke Honda(1 ORI, Yamaguchi Univ., 2 Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ., 3 ICBiotech,
Osaka Univ., 4 OTRI, Osaka Univ.)
1

Key words

2

3,4

heat shock, Escherichia coli, thermophile, stress resistance○Keitaro Tatsumi, Yuma Kobayashi, Yoshihiro Toya, Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words

formate, Escherichia coli

267

3Kp04

Modular design of Escherichia coli for ferulic acidbiosynthesis from spent coffee ground (SCG)○Sefli Sri Wahyu Effendi, I-Son Ng(Dept. Chem. Eng., Coll. Eng., Natl. Cheng Kung Univ.)
yswu@mail.ncku.edu.tw

3Kp06
学

コドン最適化がタンパク質発現に及ぼす影響○鎌田 修平, 高橋 宏和, 岡村 好子（広島大院・統合生命科学）
okamuray@hiroshima-u.ac.jp

Engineering microbial cell factories for the production of valuable aromatics is a
resource-conserving and environmentally-friendly synthesis route. Among all, ferulic
acid (FA) is one of the high-value aromatics with various pharmacological activities
for nutraceutical and pharmaceutical applications. Nevertheless, native FA production
still faces indigent titer along with inequality productivity yield, thus introducing
economic issues. The present study reconstituted artificial FA pathways in robust
Escherichia coli-derived T7 lineages by employing modular designs. A step-by-stepengineering strategy was executed by screening the expression of E. coli hosts,
harboring aromatic transporter, modifying codon adaptation using codon simulation
tools, enriching cofactor pools via in vivo regeneration, and optimizing the culture
conditions. As a result, engineered transporter and cofactor were unveiled as criticalelements for high-level FA titer due to reducing diffusion limitation, accelerating FA
accumulation, and suppressing extravagant cofactor usage. At the utmost, the potentialof spent coffee ground (SCG) as a low-cost precursor of FA was also explored for the
first time, expecting to pave the way toward a circular economy.

【目的】外来遺伝子発現において、各コドンを宿主のコドン使用頻度に最適化させた配列への変更はタンパク質高発現に寄与すると考えられている。一方で、配列によっては合成が困難な部分もあることから部分的なコドン変更のみが行われてきた。当研究室ではライゲーションを基盤とする新規遺伝子合成法を開発し、以前まで合成困難であった配列も合成可能になりつつある。そこで本研
究では遺伝子の全配列についてコドン最適化を行った後、in vivo 及び in vitro でのタンパク質発現を行うことで極端なコドン変更が発現にどのような影響を及ぼすのかについて発現量を基準として検討することを目的とした。
【実験方法・結果】Paramecium bursaria Chlorella virus 1 (PBCV-1) DNA Ligase (919bp)のネイティブ配列と E. coli の最頻度コドンに置き換えた配列を当研究室で開発された遺伝子合成法を用いて合成した。
in vivo 発現用には合成配列を pGEX ベクターに連結し E. coli に形質転換した
後、自動誘導法によってタンパク質を発現させた。また、in vitro では T7 プロ
モーターを保持する発現用カセットに連結後、タンパク質合成キットを用いて発現を行った。その後、SDS-PAGE によって発現量を比較した。
その結果、ネイティブ配列については、in vivo 及び in vitro のどちらも発現の確認が取れた。現在、コドン最適化配列について実験中であり、発表では、配列間の発現量の比較を考察する予定である。また、精製タンパク質について比活性で評価することについても考察する予定である。

Modular design of Escherichia coli for ferulic acid biosynthesis from spentcoffee ground (SCG)

Effect of codon optimization on protein expression○Sefli Sri Wahyu Effendi, I-Son Ng(Dept. Chem. Eng., Coll. Eng., Natl. Cheng Kung Univ.)○Shuhei Kamata, Hirokazu Takahashi, Yoshiko Okamura(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)

Key words

Escherichia coli, ferulic acid, recombinant protein, spent coffee groundKey words

3Kp05

プラスマローゲン合成酵素の組換え発現が大腸菌の生育に及ぼす効果3Kp07

学○大瀧 結衣 1, 長谷川 芽女 1, 柏木 明子 2, 西向 めぐみ 1,
山田 美和 1
（1 岩手大院・農, 2 弘前大・農生）
myamada@iwate-u.ac.jp

codon optimization, DNA synthesis, protein expression

酢酸菌を宿主とした異種タンパク質高発現系の構築○棚倉 有哉 1, 生田 宗一郎 1,2, 呉 恒寧 3, 保川 清 4, 柳原 格 3,
藤原 伸介 1,2
（1 関西学院大院・理工, 2 関西学院大・生命環境, 3 大阪母子医療センター, 4 京大院・農）fujiwara-s@kwansei.ac.jp[背景と目的] プラスマローゲン (Pls) は、グリセロリン脂質の sn-1 位にビニル
エーテル結合を持つ機能性リン脂質である。Pls は、抗酸化作用などさまざまな
健康機能性を有し、アルツハイマー症や動脈硬化症などの予防や治療に有効であると注目されている。しかし、従来の合成法では Pls の大量供給が難しく、
Pls と疾病の関係性についての研究が難航している。当研究室では、Pls の安定供給を目指し、Pls 合成酵素を導入した組換え大腸菌による Pls 合成を試みてきた。その過程で、宿主である大腸菌の生育に及ぼす興味深い効果を発見したた
め、今回報告する。
[方法] pET-26b (+) によって Selenomonas ruminatium 由来 Pls 合成酵素遺伝子(plsAR) を大腸菌 BL21(DE3) に導入した。組換え大腸菌を Brain Heart Infusion 培
地で 30℃、好気条件下で培養して、OD660 が 0.5 付近となった際に終濃度 0.1
mM IPTG で PlsAR 発現を誘導し、16 時間後に集菌した。この際、培養液のOD660 を経時的に測定し、成長曲線を作成した。その後、集菌した菌体を凍結乾燥して脂質を抽出し、LC/MS-MS によって Pls の定量を行った。
[結果と考察] PlsAR 発現株は、非発現株よりも IPTG 誘導後の増殖が良好となり、集菌時の菌体密度も増加していた。PlsAR 発現株において、微量であるがPls の合成が確認されたことから、Pls の抗酸化作用により宿主である大腸菌が受ける酸化ストレスが軽減され、PlsAR 発現株の生育が良好となった可能性が示された。続いて、モデル酵素として選んだ β-ガラクトシダーゼ (LacZ) 遺伝子を plsAR 遺伝子下流に組み込み、同プロモーターによってオペロンとして LacZと PlsAR の共発現を試みた。その結果、PlsAR 発現株では、集菌時の高い菌体
密度は維持されていた。よって、Pls 合成酵素を発現した大腸菌は、生産性の高い有用物質生産の宿主として応用できる可能性を持つと期待できる。

【背景】好酸性・耐酸性微生物由来タンパク質は、発現させる宿主の細胞質内pH 環境が適切でない場合、変性することがある。食酢製造に使用される酢酸菌
Komagataeibacter europaeus は増殖につれて細胞内 pH が徐々に低下していく。
そのため、K. europaeus は耐酸性タンパク質の発現に適した宿主となりうる。
本研究では、異種タンパク質発現にストレス誘導性 groESL 遺伝子のプロモー
ターを適用した。groESL は大腸菌でエタノールストレスによる誘導が可能(1)であるが、K. europaeus は増殖にエタノールを資質と利用するため、発現誘導に適用できるか不明であった。そこで、酢酸菌由来の groES プロモーターを用いた異種タンパク質の発現手法の検討を目的とした。
【方法】レポータータンパク質 EGFP の上流に groES プロモーターを導入し異なるエタノールや酢酸の濃度、培養温度で検討し高発現の誘導系を評価した。検討条件を用いて、逆転写活性をもつ高度好熱菌 Thermus thermophilus M1 由来のDNA ポリメラーゼと流産を引き起こす耐酸性細菌 Ureaplasma parvum 由来の制限酵素 UPV230 を、それぞれ groES プロモーターの制御下で発現させた。
【結果】エタノール (30 %) と酢酸 (20 %) を添加し熱ストレスで EGFP の発現が促進されることが明らかになった。DNA ポリメラーゼは熱ストレスを加えた培地にエタノールと酢酸を添加し高発現した。また、UPV230 にも同条件で高発現し、均質に精製できた。UPV230 の酵素特性を評価したところ、pH6 と pH7の条件で認識配列が変化し、この変化は pH に依存した UPV230 の構造変化に起因していることが明らかになった。今後、今回見られた高発現が、K. europaeusの groES プロモーターの転写活性向上によるものか、GroESL が高発現したことによる安定化効果によるものかを検討する必要がある。
1) Sahu SK., et al., Biotechnol Lett., 31, 1745-52 (2009)

Effect of recombinant expression of plasmalogen synthase on the growth ofConstruction of high expression system for heterologous proteins using
acetic acid bacteria as a hostEscherichia coli

○Yui Otaki , Meme Hasegawa , Akiko Kashiwagi , Megumi Nishimukai ,Miwa Yamada1(1 Dept. Biolog. Chem. Food sci. Iwate Univ., 2 Fac. Agric. Life Sci., Hirosaki Univ.)
1

Key words

1

2

Escherichia coli, plasmalogen, growth stimulation

1○Yuya Tanakura1, Soichiro Ikuta1,2, Hengning Wu3, Kiyoshi Yasukawa4,
Itaru Yanagihara3, Shinsuke Fujiwara1,2(1 Grad. Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ., 2 Sch. Biological Environmental
Sci., Kwansei Gakuin Univ., 3 Dept. Dev. Med., Osaka Women's and Children's
Hospital., 4 Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)
Key words
acetic acid bacteria, Komagataeibacter europaeus, stress response,
GFP

268

3Kp08

海洋細菌 Cobetia sp. IU 180733JP01 (5-11-6-3) 由来ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子のクローニングとキャラクタリゼーション

3Kp10○石田 拓真, 梅林 勇気, 山田 美和（岩手大院・農）
myamada@iwate-u.ac.jp

超好熱性アーキアにおける TrpY ホモログの機能解析
堀川 拓 1, 山本 康之 1, Lee Sung-Jae 2, 竹俣 直道 1, ○金井 保 1,3,
跡見 晴幸 1
（1 京大院・工, 2 慶熙大・理, 3 富山県大・工）kanai@pu-toyama.ac.jp【背景・目的】
我々は以前に，海藻成分を原料としてバイオプラスチックである
polyhydroxyalkanoate (PHA) を合成可能な，Cobetia 属細菌を海洋環境から単離した．細胞内の PHA 合成には複数の酵素が関与するが，そのなかでも PHA 合
成酵素 (PhaC) は，合成される PHA の生産性やモノマー組成を決定する鍵酵素である．この重要性から，これまでに陸上細菌由来の PhaC はよく研究されてきたが，海洋細菌由来の PhaC に関する研究例は少ないため，本研究では，
Cobetia 属細菌の PhaC (PhaCCo) の諸性質解明を目的とした．
【方法・結果】
本菌のゲノム上で予測された PhaCCo 遺伝子の ORF を，T7 プロモーターと，
PHA 合成菌である Cupriavidus necator 由来モノマー供給遺伝子群との間に挿入
し，プラスミドを構築した．これを大腸菌 JM109 (DE3) に導入し，2% (w/v)
Glucose を含む培地にて 30 ℃で培養した．続けて，終濃度 0.1mM IPTG を添加してタンパク質発現を誘導し，48 時間培養した．PhaCCo の発現は細胞破砕液のSDS-PAGE 分析で，PHA の合成はガスクロマトグラフィー分析で確認した．その結果，PhaCCo の発現と，典型的な PHA である poly(3-hydroxybutyrate) [P(3HB)]の合成が確認された．次に，他種の PHA 合成菌が保有する PhaC アミノ酸配列との相同性に基づき PhaCCo の系統解析を行ったところ，PhaCCo は Class I に属する PhaC と近縁であった．また，アライメント結果によると，PhaCCo が C 末
端側に他の PhaC には見られない 320 アミノ酸程度の領域を有していた．この領域を有するために，PhaCCo サブユニットは約 100 kDa と推定され，他の ClassI に属する PhaC サブユニット (60 ~ 70 kDa) よりも大きい．このような PhaC の報告はこれまでにない．PhaC は基質特異性とサブユニット分子のサイズによって分類されることから，PhaCCo が新たなクラスの PhaC として加えられる可能性が示唆された．

TrpY はメタン生成アーキア Methanothermobacter thermautotrophicus の Trp 生合成オペロンの転写抑制因子である。しかし超好熱性アーキア Thermococcus
kodakarensis がもつ TrpY ホモログは、本菌の Trp 生合成には関与しないことが示されている 1)。本研究では T. kodakarensis の TrpY ホモログの機能解明を目的とした。T. kodakarensis KU216 株を用いて TrpY 遺伝子破壊株(KTY1 株)を作製し、本破壊株を用いたトランスクリプトーム解析を行った。その結果、KTY1
株で転写量が上昇した遺伝子として複数のプロテアーゼ遺伝子が検出され、中には 2 種の分泌型の subtilisin-like プロテアーゼ遺伝子も含まれていた。KTY1株の培養上清と細胞破砕液に対して、ゼラチン添加 SDS-PAGE ゲルを用いた活性染色によりプロテアーゼ発現量の増加を確認したところ、KTY1 株の培養上
清でゼラチン分解による明瞭なバンドが見られた。このことから本遺伝子は分泌型プロテアーゼの発現に関与することが示唆された。次に KTY1 株のマイク
ロアレイ解析で転写産物量が変化した遺伝子を選択し、それらのプロモーター
領域を含む DNA 断片と TrpY タンパク質との結合実験(Electrophoretic Mobility
Shift Assay)を行った。その結果、本タンパク質が subtilisin-like プロテアーゼ遺伝子を含む複数のプロモーター DNA 上に結合することを確認した。以上のことから T. kodakarensis の TrpY ホモログは、分泌型プロテアーゼの発現調節に関与することが示唆された。
1) Yamamoto, Y. et al, mBio. 2019; 10:e01213-19.

Cloning and characterization of polyhydroxyalkanoate synthase gene from
Cobetia sp. IU 180733 JP01 (5-11-6-3) isolated from marine environments

Functional analysis on a TrypY homolog in a hyperthermophilic archaeon○Takuma Ishida, Yuki Umebayashi, Miwa Yamada(Dept. Biolog. Chem. Food sci. Iwate Univ.)

Taku Horikawa1, Yasuyuki Yamamoto1, Sung-Jae Lee2, Naomichi Takemata1,○Tamotsu Kanai1,3, Haruyuki Atomi1(1 Grad. Sch. Eng., Kyoto Univ., 2 Col. Sci., Kyung Hee Univ., 3 Fac. Eng., Toyama
Pref. Univ.)

Key words

PHA, PHA synthase, gene cloning

Key words

hyperthermophile, archaea, transcriptional regulation, protease

3Kp09

培地添加物によって変異を促進できる高変異好熱菌の
構築

3Kp11

メタノール資化性細菌の中央代謝経路改変による 3 元共
重合ポリヒドロキシアルカン酸モノマー組成の調節○鈴木 宏和 1,2, 服部 大河 3, 大城 隆 1,2（1 鳥取大・工, 2 鳥大・GSCセンター, 3 鳥大院・持続創生）
hirokazusuzuki@tottori-u.ac.jp

鶴田 爽, ○折田 和泉, 福居 俊昭（東工大・生命理工）
orita.i.aa@m.titech.ac.jp【目的】任意酵素の耐熱化変異体を容易に発生さらには同定することができれば，より様々な酵素の産業実用化が促進されると期待できる。そのための手法の確立を目指し，以前の研究において細胞内の自発的変異性が向上した好熱菌株（高変異性好熱菌）を構築した。さらに，本株中で発生した変異遺伝子の発現産物が耐熱化している場合に生育が促進されることも見出し，これらを組み合わせた耐熱化変異体創出法の開発に取り組んでいる。その工程にはプラスミ
ドの再導入が必要と考えられるが，以前に構築した高変異性好熱菌は，接合伝達法によってしか形質転換できない。接合伝達は効率が低く，大腸菌を経由しなくてはならないため，プラスミドの再導入が煩雑となる。さらに構成的に変異が発生するため，遺伝的安定性も低い。そこで本研究では，電気穿孔法で形質転換ができ，なお一定の条件下で自発的変異性を向上させる好熱菌の構築を目的とした。
【実験と結果】Geobacillus thermodenitrificans K1041 は，電気穿孔法でプラスミドを導入できる。その pyrFE 破壊株は，以前の研究で構築した。pyrFE 破壊株
は，ウラシル要求性を示す。pyrFE 破壊株を宿主としたカウンター選択システ
ムを用いて，さらに ung 遺伝子を破壊した。ung は，DNA 中のウラシル除去に寄与する。得られた ung 破壊株は，ウラシル取り込み能が高く，さらにウラシル除去能が低い。よって変異原性の 5-ブロモウラシルや 5-ブロモウリジンを培地に添加することで変異率が向上すると期待し，各条件下における変異率を分析した。通常の培養では，ung 破壊株と野生株の変異率に大差なかった。ところが培地に 5-ブロモウリジンを添加すると，ung 破壊株では変異率が大きく向上した。ung 破壊株は，電気穿孔法で形質転換ができ，さらに培地によって変異性を向上させられる株として有用と期待できる。

【目的】モデルメタノール資化性細菌 Methylorubrum extorquens AM1 はメタノー
ルから生分解性ポリエステルであるポリヒドロキシアルカン酸（PHA）を生合成する。これまでに、PHA 重合酵素を広基質特異性酵素に置換した組換え株が炭素数 4，5、6 のモノマーが共重合した 3 元共重合 PHA を生合成すること、また逆 β 酸化酵素の強化により炭素数 5、6 のモノマー分率が増加することを明らかにしていた。本研究では、これまでプラスミド上で発現させていた逆 β 酸化酵素遺伝子群を本菌のメタノール資化経路上の遺伝子と置換し、メタノール
生育能と蓄積した PHA に与える影響を評価した。
【方法と結果】本菌はエチルマロニル-CoA 経路によりグリオキシル酸を再生することで、C1 化合物資化経路であるセリン回路を維持している。エチルマロニ
ル-CoA 経路の最初のステップでは β-ケトチオラーゼ（PhaA）によって２分子のアセチル-CoA を縮合することでアセトアセチル-CoA を合成し、アセトアセ
チル-CoA を NADPH 依存性アセトアセチル-CoA レダクターゼ（PhaB）によって炭素数 4 のモノマーである(R)-3-ヒドロキシブチリル-CoA（(R)-3HB-CoA）に還元する。逆 β 酸化酵素遺伝子を染色体上の phaB 遺伝子と置換した組換え株を相同組換えにより構築し、メタノールを単一炭素源とする培地で培養した。
その結果、メタノール生育に重要な PhaB を欠失したにもかかわらず、生育速度が増加した。また、(R)-3HB-CoA の減少に伴って炭素数 5、6 のモノマー分率の増加もみられた。逆 β 酸化経路は NADH に依存するため、メタノール生育
時、NADPH の供給が十分でないことが示唆された。

Construction of an error-prone thermophile that enhances mutations by
medium additives

Regulation of monomer composition of the polyhydroxyalkanoate
terpolymer by metabolic engineering of central pathway for utilization of C1
compounds in methylotrophic bacterium○Hirokazu Suzuki , Taiga Hattori , Takashi Ohshiro(1 Fac. Eng., Tottori Univ., 2 GSC, Tottori Univ., 3 Dept. Eng., Grad. Sch. Sust. Sci.,
Tottori Univ.)
1,2

Key words

3

1,2

thermophile, mutation, engineering, gene disruption

So Tsuruta, ○Izumi Orita, Toshiaki Fukui(Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)

Key words

methanol, polyhydroxyalkanoate, methylotroph, PHA

269

3Kp12
学

実験室進化による高濃度メタノール耐性メチロトローフの取得と解析

3Kp14○千葉 恒慶, 折田 和泉, 福居 俊昭（東工大・生命理工）tfukui@bio.titech.ac.jp

Biosynthesis of SCL-MCL polyhydroxyalkanoate
copolymers from soybean oil using engineered Ralstonia
eutropha expressing mutant PHA synthase from
Pseudomonas sp. 61-3
○Ares Arrad, Satoshi Akechi, Izumi Orita, Toshiaki Fukui(Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)
tfukui@bio.titech.ac.jp【目的】持続供給可能な資源であるメタノールを資化できるメチロトローフ
Methylorubrum extorquens AM1 は多くの知見があることに加えて、生分解性ポリエステルであるポリヒドロキシアルカン酸（PHA）などの有用物質をメタノー
ル原料から生産できる微生物として重要である。しかし、高濃度メタノール存在下では生育が抑制されるため、物質生産培養時には培地中のメタノール濃度
を低濃度に維持する必要がある。本研究では、M. extorquens によるメタノールを原料とした有用物質の効率的生産を目指し、高濃度メタノール存在下にて生育が良好な変異株の取得および M. extorquens の高濃度メタノール耐性獲得機構の解明を試みた。
【方法と結果】通常濃度の 10 倍となる 5%、さらに高濃度の 8%のメタノールを添加した最少培地にて継代を繰り返す実験室進化を行った。本菌はレアアースに依存するメタノール代謝が見出されており、レアアース依存型代謝への変異誘発も期待して、培地に 30 μM LaCl3 を添加した。親株は 5％メタノール添加条
件では生育できないが、6~10 回継代することで、誘導期なく OD600 の増加を認める高濃度メタノール耐性株を得た。実験室進化株を 5%メタノール培地で培養したところ、親株の 0.5%メタノール培地での培養と比較して培地当たり PHA
生産量が約 2 倍に増加していた。進化株から抽出したゲノムのリシークエンシ
ング解析の結果、K+:H+アンチポーターに変異を見出した。そこで、進化株と親株について 0.5%メタノールでの生育菌体を KCl 水溶液に懸濁し、5%メタノー
ルを添加して培地の pH 変化挙動を調べたところ、親株では変化が見られなかった一方で、進化株では pH が顕著に上昇した。このことから、進化株ではプロトンの菌体内への取り込みが高濃度メタノール耐性と関連していることが示唆された。

Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are biopolyesters produced by various microorganisms
under unbalanced growth conditions. PhaC1EDQK is a E130D/Q481K double mutant of
PHA synthase derived from Pseudomonas sp. 61-3 with uniquely broad substratespecificity to C4-C12 substrates. Ralstonia eutropha strain H16-C1EDQK carrying
phaC1EDQK can synthesize poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyalkanoate) (P(3HBco-3HA)) composed of short-chain-length (SCL) 3HB and medium-chain-length(MCL) 3HA units. The strain H16-C1EDQK accumulated P(3HB) homopolymer on
fructose with intracellular content of about 50 wt%, whereas it only accumulated lessthan 10 wt% of P(3HB-co-3HA ) when soybean oil was used as the carbon source. RTqPCR and Western blot analyses showed actual transcription of phaC1EDQK, but thedisappearance of the corresponding protein in the cells of H16-C1EDQK grown on
soybean oil indicated the degradation of the PhaC1EDQK protein specifically on soybean
oil. Although modifications of the N- or C-terminal end of PhaC1EDQK did not improve
the PHA synthesis on soybean oil, we here found that E130V, a previously reported
beneficial amino acid substitution for PHA biosynthesis, improved the intracellularstability of the PHA synthase and increased P(3HB-co-3HA) production from soybean
oil by five-fold. Further investigations for enhancement of P(3HB-co-3HA) production
on soybean oil is now in progress.

Analyses of Methylorubrum extorquens mutant strains with high methanol
tolerance obtained by adaptive laboratory evolution

Biosynthesis of SCL-MCL polyhydroxyalkanoate copolymers from soybean
oil using engineered Ralstonia eutropha expressing mutant PHA synthasefrom Pseudomonas sp. 61-3

○Tsuneyoshi Chiba, Izumi Orita, Toshiaki Fukui(Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)○Ares Arrad, Satoshi Akechi, Izumi Orita, Toshiaki Fukui(Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)

Key words

methanol, methylotroph, evolutionary engeneering, PHA

Key words
synthase

Ralstonia eutropha, polyhydroxyalkanoate, protein engineering, PHA

3Kp13

Biosynthesis of PHA with unsaturated side-chain
monomer using genetically-engineered Ralstonia

3Lp01

Corynebacterium glutamicum を用いたグルコースからの 2,5-ピリジンジカルボン酸の生産

eutropha○Allan Devanadera, Izumi Orita, Toshiaki Fukui(Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)
tfukui@bio.titech.ac.jp○野中 鏡士朗, 長村 達也, 高橋 史員, 小山 伸吾（花王）
takahashi.fumikazu@kao.com

Bacterial polyhydroxyalkanoates (PHAs) have gained attraction as usefulbiodegradable bio-based plastics. Introduction of unsaturated side chains into PHAs
can enable chemical modifications to control its physical properties andbiodegradability.
Ralstonia eutropha is a well-studied PHA producer. To incorporate unsaturated
carboxylic acid precursor into PHA, R. eutropha strain harboring PHA synthase withbroad substrate specificity was further engineered by introduction of phaJ encoding(R)-enoyl-CoA hydratase and multiple deletion of genes encoding β-ketothiolases. The
resultingrecombinantstrainproducedapoly(3-hydroxybutyrate-co-3hydroxyhexanoate-co-3-hydroxy-5-hexenoate) [P(3HB-co-3HHx-3H5He)] terpolymer
when fed with glucose and 5-hexenoic acid. The unsaturated 3H5He fraction could be
regulated within the range from 3.8% up to 30.9% depending on the precursor
concentration. The terpolymer containing 9% 3H5He showed amorphous andelastomeric properties with 1,158% elongation at break.
The recombinant strain produced poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-3hydroxy-4-pentenoate) [P(3HB-co-3HV-co-3H4Pe)] with fructose and 4-pentenoic
acid feeding. In both the cases of C5 and C6, significant fraction of saturated 3HV or
3HHx unit was detected, suggesting reduction of the terminal double bond. As there isno highly homologous gene to known 2,4-dienoyl-CoA reductase in R. eutropha
genome, purification and identification of the enigmatic enzyme responsible for theterminal reduction is now in progress.

2,5-ピリジンジカルボン酸(2,5-PDCA)は、樹脂原料として非再生可能資源から大量に製造されるテレフタル酸と類似した骨格を持つことから、再生可能資源由
来のテレフタル酸代替素材として期待されている 1。これまでにリグニンからプロトカテク酸(PCA)を経由して 2,5-PDCA を生産する方法が知られているが 2、PCA から 2,5-PDCA への変換にプロトカテク酸-2,3-ジオキシゲナーゼによる酸化的開裂反応が利用されており、開裂物が不安定である点や 2,5-PDCA への変
換にアンモニウム塩を別途必要とする点などの課題を抱えている。
一方、我々はこれまでに、コリネ型細菌 Corynebacterium glutamicum を用いてグ
ルコースから 4-アミノ-3-ヒドロキシ安息香酸(4,3-AHBA)が効率的に得られることを見出している 3。また既報にて 4,3-AHBA 資化性菌 Bordetella sp. 10d 株由来の 4-アミノ-3-ヒドロキシ安息香酸-2,3-ジオキシゲナーゼ(4A3HBA23D)が 4,3AHBA を酸化的に開裂し、開裂物は後続の分解酵素が存在しない条件下で非酵
素的に 2,5-PDCA へと自己変換されることが報告されている 4。本反応を用いれば、開裂物の分子構造に起因する従来法の課題が解消されると考えられる。
そこで本研究では、PCA の代わりに 4,3-AHBA を経由してグルコースから効率
よく 2,5-PDCA を生産する新規生合成経路の構築を試みた。実際に 4,3-AHBA
生産株を宿主として 4A3HBA23D を発現させたところ、グルコース流加培養条
件下でグラムスケールの 2,5-PDCA が得られた。本研究の結果は、微生物による化学品生産のための人工代謝経路の多様化と、再生可能資源由来の高機能材料の拡大に貢献するものと期待される。
1. A. Pellis et al., Nat. Commun. 10, 1762 (2019).
2. Z. Mycroft et al., Green Chem. 17, 4974 (2015).
3. 野中ら, 日本農芸化学会 2023 年度大会
4. S. Takenaka et al., Eur. J. Biochem. 269, 5871 (2002).

Biosynthesis of PHA with unsaturated side-chain monomer using
genetically-engineered Ralstonia eutropha

Production of 2,5-pyridinedicarboxylic acid from glucose using

Key words
polyhydroxyalkanoate, Ralstonia eutropha, metabolic engineering,
gene disruption

Key words
aromatic ring compound, Corynebacterium glutamicum, dioxygenase,metabolic pathway modification○Allan Devanadera, Izumi Orita, Toshiaki Fukui(Sch. Life Sci. Technol, Tokyo Tech)

Corynebacterium glutamicum○Kyoshiro Nonaka, Tatsuya Osamura, Fumikazu Takahashi, Shingo Koyama(Kao Corp.)

270

3Lp02

講演中止

3Lp04
学

味噌から単離したアラビトール高生産酵母
Zygosaccharomyces sp. Gz-5 のアラビトール生産
鹿子沢 陸央 1, ○岩田 寛 1, 岩田 葵 1, 眞榮田 麻友美 2, 前橋 健二 1,
𠮷川 潤 1（1 東農大院・農, 2 東農大・応生科）
jy207183@nodai.ac.jp【背景・目的】
アラビトールは炭素数 5 の糖アルコールで、天然にはキノコに多く含まれる。
糖アルコール類は総じてショ糖より低カロリーで非う蝕性という特性を有し、機能性甘味料として期待されている。一方で、アラビトールは酵母による発酵生産の事例が複数知られているものの産業利用は未だなされていない。アラビトールの大量生産を達成することは、新たな糖質甘味料ならびに化成品の開発が期待できる。一般に微生物は細胞内外の浸透圧を調節するために糖アルコー
ルを生産することが知られている。味噌はその水分濃度や塩分濃度から高浸透
圧環境であり、味噌の主発酵酵母である Zygosaccharomyces rouxii にはアラビ
トール高生産株の存在が報告されている。そこで本研究では、味噌からアラビトール高生産酵母を単離し、その生産性について検討した。
【結果・考察】全国各地の市販味噌 18 種から高濃度グルコースを炭素源として糖アルコール生産酵母を探索し、計 122 株を単離した。これらのうち、徳島県産の御膳味噌から単離した９株の培養液からアラビトールの生産が TLC で確認された。さらに選抜するため、低濃度グルコースでのアラビトール生産性を確認したところ、
Gz-5 株のみからその生産を確認することができた。Gz-5 株は、D1/D2 配列の相同性から Z. pseudorouxii と高い類似度を示したが、ITS 配列の相同性からは Z.
rouxii、Z. pseudorouxii と別クレードを形成したため、Zygosaccharomyces sp.と同定された。Gz-５株はグルコース濃度を 10~50 %まで変動させたとき、30 %の時に最も高い約 39 %の収率で、116 g/L のアラビトール生産を示した。その際の生産量は、対照とした Z. rouxii の市販実用株や実験室標準株よりも優れており、将来的な醸造調味料製造への利用が期待された。

High arabitol-producing yeast, Zygosaccharomyces sp. Gz-5 isolated frommiso and its arabitol production

Rikuo Kanokozawa1, ○Kan Iwata1, Aoi Iwata1, Mayumi Maeda2, Kenji Maehashi1,
Jun Yoshikawa1(1 Grad. Sch. Agric., Tokyo Univ. Agric., 2 Fac. Appl. Biosci., Tokyo Univ. Agric.)

3Lp03

海洋性細菌 Shewanella woodyi による EPA 生産の検討○祖父江 史明, 光増 遼太郎, 山崎 広顕（DIC）
fumiaki-sobue@ma.dic.co.jp

Key words

sugar alcohol, Zygosaccharomyces, arabitol, osmotorelant

3Lp05

バイオプロセスによるカルノシン生産法の開発○倉本 歩 1,3, 木野 邦器 1,2, 佐藤 謙一郎 3, 岡田 行夫 3
（1 早大・理工総研, 2 早大院・先進理工・応化, 3 東海物産）
okada@tokaibsn.co.jp【背景と目的】
社会の高齢化に伴い、健康寿命の延伸、メタボリックシンドローム解消に貢献
し、QOL 向上を実現するヘルスケア製品の需要は高まっている。
EPA や DHA など、ω-3 脂肪酸は機能性食品素材として知られており、魚油などに含まれる一般的なトリグリセリド結合型 ω-3 脂肪酸と、クリルオイルやイカに含まれるリン脂質が結合したリン脂質結合型 ω-3 脂肪酸がある。とくに、リン脂質の１種であるホスファチジルグリセロール（PG）が結合した EPA（PGEPA）は、複数の健康増進機能を示す結果が当社の研究によって得られている。
当社ではこれまでに PG-EPA を比較的高生産する海洋性細菌 Shewanella 属微生物を深海魚の腸管より見出した。該菌株は 16S rRNA 解析により Shewanella
woodyi として同定された。S. woodyi を用いて PG-EPA の効率的な生産を実現す
る培養条件の検討を進めた。
【方法と結果】
先行研究（１）を基に、タンパク加水分解物を主成分とする培地を用いて、菌体密度の向上を試みた。しかし、栄養源を資化する際に生じるアンモニアが蓄積し、菌体増殖が阻害され、菌体密度は 17.9 g-DCW/L で停滞した。このとき、培養液あたりの PG-EPA 濃度は 284.6 mg/L となった。S. woodyi を含む多くのShewanella 属微生物は、動物由来成分を含む培地でなければ良好な生育を示さないことで知られていた。この課題を解決するべく、培地成分の検討や継代育種を重ねた結果、安価な炭素源であるグルコ―スを主成分とする培地で旺盛に増殖する株の取得に成功した。これにより、アンモニアの蓄積を回避した培養条件を確立し、菌体密度を 36.8 g-DCW/L まで向上させることができた。結果として、培養液あたりの PG-EPA 濃度は 505.7 mg/L に達し、培養条件の変更前
より約 1.8 倍の EPA 生産性を実現することができた。
(1)鈴木信雄ら、 Nippon Suisan Gakkaishi 58(2),323-328(1992).

イミダゾールジペプチド(IDPs）は動物の筋肉や脳に高濃度で含まれているジペプチドで、抗酸化作用や抗疲労効果、認知機能改善効果などの多様な生理機能を有する化合物である。IDPs は魚肉や鶏肉からの抽出法が生産の主流であるため、食との競合や原料の安定供給、養鶏時の温室効果ガス排出などが課題となっている。一方、我々は L-アミノ酸リガーゼ(Lal)に着目し、構成アミノ酸から
IDPs を直接生産する IDPs 生産法を開発してきた 1), 2)。
本研究では、Lal を高発現させた大腸菌を用いるカルノシンの工業的生産プロ
セスを検討した。まず、生体触媒となる高活性菌体を高濃度化するために、培養培地を検討した。酵母エキスやペプトンを主成分とする LB 培地から、グルコースを主炭素源とする安価な工業生産培地に変更すると、菌体量は増加したがカルノシン生産が認められなかった。この原因は、発現用プラスミドの特性
上、グルコースによる発現抑制によるものと考えられた。そこで、炭素源をグ
リセロールとし、発現誘導剤のラクトースを予め添加した培地に変更した結果、カルノシン合成活性が改善され、二倍以上の菌体量も得ることができた。5L 容
ジャーファーメンターでの菌体反応では、カルノシンの生産量も 4.0 g/L から
7.5 g/L に向上した。その他、検討した諸条件について報告する。
本研究の一部は、NEDO の「バイオモノづくり PJ：PJ20011(JM08)」の支援を受けて行われた。
1) 倉本ら、日本農芸化学会 2019 年度大会講演要旨集，1D7p12
2) 倉本ら、日本農芸化学会 2022 年度大会講演要旨集，4B09-02

Eicosapentaenoic acid production by marine bacterium Shewanella woodyi

Development of production method of Carnosine by bioprocess○Fumiaki Sobue, Ryoutarou Mitsumasu, Hiroaki Yamasaki(DIC)

Key words

eicosapentaenoic acid, fermentation, bioreactor○Ayumu Kuramoto1,3, Kuniki Kino1,2, Kenichiro Sato3, Yukio Okada3(1 Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ., 2 Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 3 Tokai
Bussan Ltd.)Key words

imidazole dipeptide, L-amino acid α-ligase, whole cell biocatalyst

271

3Lp06
学

Engineering Escherichia coli for high production oftyrosol from phenylalanine○Ning Shen1, Yasuharu Satoh2, Daisuke Koma3,
Yasushi Ogasawara2, Tohru Dairi2(1 Grad. Sch. Chem. Sci. Eng., Hokkaido Univ., 2 Grad. Sch. Eng.,
Hokkaido Univ., 3 ORIST)
syasu@eng.hokudai.ac.jp

3Lp08
学

透明な生分解性プラスチックを合成する Cupriavidus
necator の分子育種○板倉 真優 1, 宮原 しろ沙 2, 田中 賢二 3, 田口 精一 4, 松崎 弘美 1,2（1 熊本県大院・環境共生, 2 熊本県大・環境共生, 3 近畿大・産理
工, 4 神戸大院・科技イノベ）
matusaki@pu-kumamoto.ac.jp

Tyrosol (2-(4-hydroxyphenyl)ethanol) is an attractive phenolic compound with healthbeneficial effects for humans and great industrial value as a fine chemical. In thisstudy, we engineered Escherichia coli for high tyrosol production by metabolicengineering. In this strain, tyrosine supplied by a bacterial phenylalanine hydroxylasewith O2 and tetrahydromonapterin as a cofactor from phenylalanine was converted totyrosol by three-step reactions: decarboxylation of tyrosine by tyrosine decarboxylase,
deamination of tyramine by tyramine oxidase, and reduction of 4hydroxyphenylacetaldehyde by alcohol dehydrogenase. Since gene expressions on
chromosome are usually more stable than plasmid-based gene expressions, two genes
encoding a tyrosine decarboxylase and a tyramine oxidase, both of which showed thehighest activities by screening, were integrated into the chromosome of E. coli. The
engineered strain produced tyrosol with endogenous alcohol dehydrogenase(s) during a
48-h test tube cultivation and overexpression of the alcohol dehydrogenase genesignificantly increased the titer.

【目的】化石燃料由来プラスチックの代替品として、自然界に存在する微生物により二酸化炭素と水にまで分解される生分解性プラスチックが注目されている。
生分解性プラスチックの 1 つに微生物が菌体内に合成・蓄積するポリヒドロキ
シアルカン酸（PHA）があるが、一般に不透明であり、その使用用途は制限される。一方、乳酸（LA）および 3-ヒドロキシブタン酸（3HB）ユニットからなる共重合ポリエステル P(LA-co-3HB)は LA 分率を 15〜30 mol%に高めると透明性・柔軟性に優れる。さらに、現在最も実用化されている生分解性プラスチッ
クであるポリ乳酸（PLA）と比較して生分解性にも優れることから、幅広い用
途での実用化が期待される。本研究では、PHA 生産能に優れる水素細菌
Cupriavidus necator を宿主として、高性能で実用的な LA ベースポリマー P(LAco-3HB)を生合成することを目的とした。
【方法】LA ユニットを供給する D-乳酸脱水素酵素遺伝子（ldhD）、プロピオニ
ル CoA トランスフェラーゼ遺伝子（pct）および Pseudomonas sp. 61-3 由来の改変 PHA 重合酵素遺伝子 [phaC1(STQK)] を C. necator に導入した組換え株を作製し、糖を唯一の炭素源として培養を行った。また、LA 分率向上のため、グルコース資化能をもつ C. necator NCIMB 11599 の phbCAB オペロンを相同的組換
えにより破壊した 3HB ユニット供給系弱化株（GdCAB 株）を作製して宿主に用いた。
【結果】C. necator GdCAB を宿主とした組換え株の一つは、グルコースから LA
分率が 24.6 mol%まで向上した P(LA-co-3HB)を合成した。この株について二酸
化炭素を炭素源として独立栄養培養したところ、ポリマー蓄積率は約 7 wt%と低いものの、LA 分率が 8.2 mol%の P(LA-co-3HB)を合成した。LA 分率およびポリマー蓄積率の向上のため、さらなる分子育種を現在進めている。

Engineering Escherichia coli for high production of tyrosol fromphenylalanine

Molecular breeding of Cupriavidus necator to synthesize transparent
biodegradable plastics○Ning Shen1, Yasuharu Satoh2, Daisuke Koma3, Yasushi Ogasawara2, Tohru Dairi2(1 Grad. Sch. Chem. Sci. Eng., Hokkaido Univ., 2 Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.,
3
ORIST)

Key words
oxidasetyrosol, phenylalanine hydroxylase, tyrosine decarboxylase, tyramine

3Lp07

液体酵素を用いたバイオディーゼル燃料製造における小
動力散液デバイスの撹拌効果○Mahiro Itakura1, Shirosa Miyahara2, Kenji Tanaka3, Seiichi Taguchi4,
Hiromi Matsusaki1,2(1 Grad. Sch. Environ. Sym. Sci., Pref. Univ. Kumamoto, 2 Fac. Environ. Sym. Sci.,
Pref. Univ. Kumamoto, 3 Fac. Humanity-Oriented Sci., Eng., Kindai Univ., 4 Grad.
Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)
Key words
biodegradable plastic, polyhydroxyalkanoate, lactate-based polymers,
Cupriavidus necator

3Lp09○濵 真司 1, 松浦 健介 1, 荻野 千秋 3, 向田 忠弘 2, 野田 秀夫 1,2（1 Bio-energy, 2 関西化学機械製作, 3 神戸大院・工）hama@bio-energy.jp

乳酸ポリエステルの高効率生産に向けたモノマー供給経
路の開拓および水素細菌への実装○高 相昊 1, 古舘 祥 2, 佐藤 俊輔 2, 田口 精一 1
（1 神戸大院・科技イノベ, 2 カネカ）
koh@port.kobe-u.ac.jp【背景と目的】液体リパーゼ酵素を用いる植物油のエステル交換反応では，油相と水相の二液を撹拌した後，相分離によって長鎖脂肪酸エステル（油相）とグリセリン（水相）を得る．この酵素反応では，比重の大きいグリセリンの副生など反応液の組成や性状が経時的変化する中で，少量の水を細かく分散させて油水界面での触媒作用を促進することが鍵となることから，撹拌に伴う動力負荷が大きいことが課題であった．本研究では，この反応系の混合分散を従来よりも小さい撹拌動力で実現し，そのシステムを実用規模までスケールアップすることを目的とした．
【方法】撹拌翼の遠心力によって槽底付近の液を液面より上方で吐出する特徴をもつ散液デバイスを開発した．吐出される液体は，油脂中に水，酵素，グリセリンなどを含むエマルションであり，槽壁へ衝突した後に重力と旋回流に従って槽底付近に到達し，同撹拌翼によって再び吸液される．このような上下流動を繰り返すことで，小動力でありながら目的の混合分散を実現する仕組みとなる．本研究では，1〜3L スケールのガラス製フラスコによる実験と CFD 解析で当該技術の原理を確認し，ベンチプラントを用いた 50L スケールの実証を経て，1,000L（全容 1.5m3 の反応槽 2 基）スケールの実証を行った．
【結果と考察】モデル反応液として精製パーム油およびパーム酸油を使用したと
ころ，単位体積あたりの撹拌所要動力（Pv 値）が約 0.1kW/m3 で撹拌 24h 後の残留グリセリド濃度が規格を満たすことが分かった．講演では，動力基準のス
ケールアップ事例の詳細を示すとともに，当該技術が他の混相流にも応用できる可能性を示す．
【謝辞】この成果は，国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構（NEDO）の助成事業（JPNP10020）の結果得られたものです．

次世代型ポリ乳酸 LAHB (P[(D-LA-co-3-ヒドロキシ酪酸 (3HB))]) は、従来の化
学合成ポリ乳酸 (PLA) にはない柔軟性と生分解性を兼ね備えたバイオプラス
チック素材である。これまでに我々は、乳酸重合酵素 (LPE) の創出 (S. Taguchi
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2008) を契機として、大腸菌を用いた LAHB の微生物
合成システムを確立してきた。本研究では、LAHB の本格生産を目指して、ポリヒドロキシアルカン酸 (PHA) の産業菌である水素酸化細菌 Cuprividius necatorを用いた LAHB 生産プラットフォーム構築を目的とした。
本目的遂行のため、我々は C. necator の内在経路である 3HB-CoA モノマー供給の強力な駆動力を保持しつつ、LA-CoA モノマー供給人工経路を導入し、これら２つのモノマーを LPE によって重合する戦略を立てた。まず、LAHB 中の
LA 分率 (mol%) を指標に、LAHB 合成に最適な D-乳酸脱水素酵素 (D-LDH) とプロピオニル CoA 転移酵素 (PCT) を探索したところ、Epulopiscium sp.由来のPCTEs、Leuconostoc mesenteroides 由来の LDHLm の 2 つの有益な酵素をスクリー
ニングでき、これらを水素細菌に導入することで LAHB のワンポッド合成が可能となった。しかし、この時点での LA 分率は 1 mol%と低かった。そこで、発現解析を実施したところ、想定外にも、D-LA を代謝する際にグリコール酸脱水素酵素（GLC）をコードする遺伝子クラスターが発現上昇することが判明した。この結果に基づいて、当該遺伝子を欠失させると、共重合体中の LA 分率
が 5 mol%へ増大し、GLC が D-LA エスケープ経路に関わっていることが明らかとなった。現在、さらなる LA 分率向上ならびに生産性強化を目指した分子育種を検討しているところである。本講演では、既存の大腸菌生産系との対比
から、水素酸化細菌を LAHB 生産プラットフォームとして用いるアドバンテー
ジについて発表する。

Agitation effect of liquid spreading device with small power input on
biodiesel fuel production using liquid enzymes

Metabolic design of monomer supplying pathway for effective production of
lactate-based polyester in Cupriavidus necator○Shinji Hama , Kensuke Matsuura , Chiaki Ogino , Tadahiro Mukaida ,Hideo Noda1,2(1 Bio-energy Corp., 2 Kansai Chemical Engineering Co., Ltd., 3 Grad. Sch. Eng,
Kobe Univ.)
1

Key words

1

3

lipase, biodiesel fuel, bioreactor, palm oil

2○Sangho Koh1, Sho Furutate2, Shunsuke Sato2, Seiichi Taguchi1(1 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2 Kaneka Corp.)

Key words

biodegradable plastic, biomass, poly(L-lactide)

272

3Lp10

担子菌酵母 Pseudozyma antarctica のプロテアーゼ B 遺伝子破壊による分泌型生分解性プラスチック分解酵素の分解抑制効果

3Lp12
学

エチレングリコールを原料として微生物合成されるグリコール酸 (GL) ポリマーの培養条件検討による GL 分率の増強○太田 陽介 1, 山田 美和 2
（1 岩手大院・農, 2 岩手大・農）
myamada@iwate-u.ac.jp○山下（鮫島） 結香 1, 大前 奈月 2, 森田 友岳 2, 北本 宏子 1
（1 農研機構・農環研, 2 産総研・機能化学）
yamashita@affrc.go.jp【背景・目的】担子菌酵母 Pseudozyma antarctica は、キシロースの添加で発現誘導される生分解性プラスチック分解酵素（PaE）を培養液中に分泌する。PaE を用いた生分解性プラスチック分解促進技術開発のためには、安定した PaE 生産も重要な課題のひとつである。酵素の実製造で培養が大規模化すると、培養終了後、培養液からの菌体除去と培養ろ液回収に時間を要する。現在の PaE 生産
条件では、その間に溶菌が進み PaE の分解が生じる。さらに、菌体除去後もPaE の安定性は低く、対策が必要であった。そこで、真菌の広域プロテアーゼの一つである Protease B（ProB）に着目し、その遺伝子破壊株を用いて 1）培養ろ液回収過程および 2）培養ろ液保管中の PaE 分解抑制に対する効果を検証した。
【方法・結果】 P. antarctica GB-4(0) のゲノム配列からプロテアーゼ B 遺伝子（PaPRO2）を見出し、PaE 大量生産株 XG8 を親株（WT）として破壊株（Δpro2）を作製した。次に 3L Jar 培養装置を用い、WT および Δpro2 を PaE 生産培地で3 日間培養した。得られた培養液を用い、1）菌体除去前の培養液を 25°C で 48
時間静置し、経時的に PaE 活性を測定した。その結果、WT では遠心上清中のPaE 活性が 55.1%まで減少した。一方、Δpro2 では 94.0%の活性を維持していた。また、2）菌体除去前の培養液を 25°C で 24 時間静置した後、珪藻土ろ過で菌体を除去した。この培養ろ液を 14 日間 25°C で静置し、経時的に PaE 活性を測定した結果、WT では PaE 活性が 30%程度にまで低下した。一方、Δpro2の培養ろ液では PaE 活性がほぼ 100%維持された。以上の結果から、P. antarcticaの PaPRO2 破壊が、常温でも PaE 分解抑制に効果的であることが示された。
本研究は農林水産産業・食品産業科学研究推進事業 25017AB および生研支援センター「イノベーション創出強化研究推進事業」(JPJ007097)の支援を受けて行った。

[背景・目的]
グリコール酸 (GL) ポリマー [P(GL-co-3HB)] は、これまでの微生物合成ポリマーにはない高い加水分解性と柔軟性が期待されており、ポリマー中の GL 分率はその性質を決定づける。我々は、これまでに GL 合成酵素遺伝子 (fucO、aldA)
および GL ポリマー合成酵素遺伝子 (pct、phaA、phaB、phaC1STQK) を導入した組換え大腸菌において、産業廃棄物の主成分であるエチレングリコール (EG)からの GL ポリマー合成経路を構築した。しかし、GL ポリマー中の GL 分率は0.1 mol%と著しく低かった。この原因として、単一細胞で複数の酵素遺伝子を共発現させている宿主細胞内での負荷や、細胞内で合成された GL が速やかに細胞外に排出されるために、細胞内 GL モノマー供給量が低い等の可能性を考えた。そこで、本研究では GL 合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌 (GL 合成株) と、GL ポリマー合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌 (GL ポリマー合成株) を共培養することで、GL ポリマー中の GL 分率向上を目指した。
[方法・結果]GL 合成株と GL ポリマー合成株を、EG と糖を含む LB 培地に 1:1 の比率で植菌し、30℃で 48 時間共培養した。培養後のポリマー生産量・モノマー分率、培養液中の GL 濃度はガスクロマトグラフィーと核磁気共鳴装置、および高速
液体クロマトグラフィーによりそれぞれ測定した。その結果、培養液中に 192
mM の GL が検出され、約 2 mol%の GL ユニットを含む GL ポリマーの合成 (0.38g/L) が確認された。続いて、GL 合成株のみを 48 時間培養して EG から GL を培地中に合成させた後、GL ポリマー合成株を同培地へ植菌して糖を添加し、GL ポリマーを合成させた。その結果、ポリマー生産量は 2.4 g/L、GL ポリマー
中の GL 分率は約 8 mol%へと向上した。よって、本研究で構築した培養法は、EG を原料として合成する際の GL ポリマー中の GL 分率向上に有効であることが示唆された。

Effect of protease B gene disruption on the stability of extracellularbiodegradable plastic-degrading enzyme in the basidiomycetous yeast

Investigation of cultivation conditions to enhance glycolate (GL) fraction in
GL-based polymers synthesized by recombinant Escherichia coli fromethylene glycol

Pseudozyma antarctica○Yuka Sameshima-Yamashita1, Natsuki Omae2, Tomotake Morita2,
Hiroko Kitamoto1(1 NIAES/NARO, 2 AIST)○Yosuke Ota1, Miwa Yamada2(1 Grad. Sch. Agric., Iwate Univ., 2 Fac. Agric., Iwate Univ.)

Key words
protease B

Pseudozyma antarctica, biodegradable plastic-degrading enzyme,

Key words

ethylene glycol, glycolate, PHA, polyhydroxyalkanoate

3Lp11

枯草菌による γ-ポリ-L-グルタミン酸（γ-L-PGA）合成
機構の解明

3Lp13

好気流加培養による乳酸菌の高密度培養学○野上 莉菜, 山本 純也, 宇田 佳乃, 吉田 健一, 石川 周
（神戸大院・科技イノベ）
shu@people.kobe-u.ac.jp

一瀬 涼 2, 山崎 思乃 1, ○片倉 啓雄 1
（1 関西大・化生工, 2 関西大院・理工）
katakura@kansai-u.ac.jp

ポリ-γ-L-グルタミン酸（PGA）は、バイオプラスチックとしての利用が期待されるが非常に高価であり、広く利用されるには低コスト・高効率な生産法の開発が必要となる。我々は、枯草菌においてグルコース・アンモニア塩を唯一の炭素源・窒素源とした安価培地で高効率に DL-PGA を生産する方法を開発したが、その過程で L-PGA 生産変異株の取得にも成功した。
PGA 合成は PgsBCA 複合体により行われるが、枯草菌において過剰発現させると DL-PGA 生産により粘性のあるコロニーを形成する。さらに PGA 分解酵素
PgdS を高発現させると分解により粘性は消失するが、PgdS で分解できない LPGA 生産株へと変異することで粘性を回復させる株が複数得られた。これらは全て PgsA 変異を有しており、詳細な解析の結果、L-PGA 合成には、PgsA の N
末端から近傍の膜貫通領域までが必須であり、PgsA の活性を消失させるような
Ｃ末端領域の欠損あるいは点変異が必要であることがわかった。生産性は、C末端の欠損では約 1/8〜1/40 に激減したが、点変異では生産性の低下は限定的であった。AlphaFold2 による PgsBCA の構造予測の結果、PgsA の細胞内 N 末
端領域は PgsB と、膜貫通領域は PgsC と相互作用し、細胞外のＣ末端エピメ
ラーゼドメインは広く PgsC と相互作用していた。これは、PgsA の N 末端領域
が PGA 生産に必須であり、PgsA のＣ末端欠損が生産性を著しく減少させる理由を説明できる結果となっていた。L-PGA を生産する PgsA 点変異株をスクリーニングした結果、従来の γ-DL-PGA 生産性よりも高い生産性を示す γ-L-PGA 生
産株の取得にも成功した。これらの知見から、DL-および L-PGA 合成のメカニズムを議論する。

【緒言】
乳酸菌はプロバイオティクスとして注目され、低コストで培養する技術が求められているが、従来の回分培養では乳酸による増殖阻害のため、高濃度培養ができない。解糖系で消費される NAD+の再生を乳酸脱水素酵素以外で代替でき
れば乳酸生産を抑制できる。酸素を電子受容体する NAD+再生経路は、炭素源を浪費しない代替経路であるが、他の代替経路と同様に、その能力が不十分であるうえにグルコースで抑制される。そこで本研究では、Lactococcus lactis
MG1363 を好気的な指数流加培養によってグルコース濃度を様々なレベルに保ち、乳酸生産を抑制できる条件を検討するとともに、高密度培養を試みた。
【方法】
グルコース以外の栄養素が不足しないように改変した MRS 培地を用い、約 1
vvm で通気し、比増殖速度 μ を 0.1〜0.4 h-1 に設定して指数流加した。好気培養
では、副生する過酸化水素を消去するためカタラーゼを添加した。
【結果と考察】好気回分培養、嫌気流加培養では乳酸生産はほとんど抑制できなかった。嫌気回分培養では、乳酸の比生産速度 ρL は 2.8±0.6 g·g-cell-1·h-1 であったのに対して、好気流加培養では、μ を 0.2 h-1 以下に設定すると ρ は 0.5 g·g-cell-1·h-1 以下に抑制できた。しかし、これ以上の μ では、ρL は急激に上昇し、アセトインについても同様に比生産速度が上昇した。一方、酢酸の比生産速度は 0.2 h-1 でピー
クとなり、低い μ では ATP の不足を補うために酢酸が生産されると考えられた。そこで、ATP を呼吸鎖によって生産させて酢酸生産を抑制するため、ヘム
5 mg·L-1 を添加し、μ を 0.25 h-1 に設定して好気的に流加培養した。その結果、乳酸と酢酸の生産を抑制でき、0.42±0.02 g-cell·g-glucose-1 の高い菌体収率で、菌体濃度は 15 時間後に 19 g-cell·L-1 (5.6×1010 cfu·mL-1) に達した。

Elucidation of the mechanism of poly-gamma-L-glutamic acid (gamma-LPGA) synthesis in Bacillus subtilisHigh density culture of lactic acid bacteria by aerobic fed-batch culture○Rina Nogami, Junya Yamamoto, Yoshino Uda, Ken-ichi Yoshida, Shu Ishikawa(Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

poly-γ-glutamic acid, Bacillus subtilis

Ryou Ichinose2, Shino Yamasaki-Yashiki1, ○Yoshio Katakura1(1 Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ., 2 Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ.)

Key words

lactic acid bacteria, fed-batch culture, aerobic culture, high cell density

273

3Lp14
学

酵母培養用天然培地 YPD のコスト削減を目指した半合成培地の開発3Lp16

酵素高密度発現メタン変換生体触媒を用いたメタンからのメタノール合成○宮地 輝光（東工大・物質理工）
miyaji.a.aa@m.titech.ac.jp○平川 遥 1, 星田 尚司 2, 赤田 倫治 2
（1 山口大院・創成科学, 2 山口大・工）rinji@yamaguchi-u.ac.jp

酵母はエタノール発酵や有用タンパク質生産など幅広く利用されており、酵母の増殖や発酵能を制御する培地の組成やコストは重要である。酵母の培養には、一般に酵母エキス、ペプトン、グルコースからなる YPD 培地が広く使用されているが、酵母エキスとペプトンが高価であり、また天然成分なので組成が一定
ではなく最適化や品質管理が難しい問題がある。そこで本研究では、酵母エキ
スやペプトンを減らした YPD 培地をベースに、増殖を補う代替栄養素を探索することで、コスト削減を可能にする半合成培地の開発を目指した。
酵 母 は ブ ラ ジ ル の 商 用 エ タ ノ ー ル 生 産 株 で あ る Saccharomyces cerevisiae
NCYC3233 株を用いて、液体培地、L 字管での振とう培養でバイオレコーダーを用いて経時的に増殖を測定した。さらに、48 時間後の OD600 の濁度を最終増殖濃度として増殖能を評価した。YPD 中のペプトンの濃度だけを減らすと、増殖速度に影響を与えることなく最終濃度が上昇した。したがって、このペプト
ン中には最終濃度の上昇を阻害する成分が入っていることがわかった。一方、酵母エキスの濃度だけを減らすと、濃度依存的に増殖速度、最終濃度ともに低下した。そこで、足りない栄養素を探すためにアミノ酸やビタミン類などを個々に添加した結果、特定の金属イオンやビタミンが増殖速度や最終濃度をそれぞれ向上させることがわかった。さらに、市販の 9 種のペプトンにおいて、酵母エキスを減らした培地で、同定栄養素の有無による酵母の増殖を比較した。植物性ペプトン使用培地では影響がほとんど見られなかったものの、酵母エキスの減少により増殖能が低下した動物性ペプトン使用培地では、栄養素添加により回復した。以上のことから、ペプトンの種類によって必要な栄養素が異なる
ことがわかり、また、各ペプトンに対応する栄養素補完カクテルが開発できたと考えている。

【背景と目的】メタンは、天然ガスやバイオガスとして得られるエネルギー・炭素源として重要である。しかし一方で、メタンおよびメタン利用により排出される二酸化炭素が環境変動におよぼす影響が懸念されている。そのため、省エ
ネルギー且つ高選択的なメタン変換技術が望まれる。この技術の一つとしてメタン資化細菌の利用が挙げられる。メタン資化細菌は、細胞内の銅含有メタン
酸化酵素（pMMO）により常温常圧、一段階でメタンを酸化し、工業基幹原料や燃料として利用されるメタノールを選択的に合成する。これまでメタン資化
細菌 Methylosinus trichosporium OB3b の生体触媒利用が研究され、メタノール生産性の向上が検討されてきた。本研究では、細胞内の pMMO 発現量を高めたメ
タン資化性菌の培養方法を検討し、メタンからのメタノール生産性能を明らかにすることを目的とした。
【方法】M. trichosporium OB3b の培養には 1 μM あるいは 50 μM 銅イオンを含む
硝酸無機培養液、培養器にはバッフル付き三角フラスコ（100 mL）を用いた。
培養器内の気相にメタンガスを導入した後、回転振とう培養器内で 30 ℃、225
rpm で培養した。得られた菌体内の pMMO 発現量は電気泳動法により分析した。また 25℃においてメタン酸化反応を行い、生成するメタノール量をガスク
ロマトグラフで分析した。
【結果と考察】細胞内の pMMO 発現量を測定した結果、銅イオン濃度 50 μM の培養液で培養した菌体には、銅イオン濃度 1 μM の培養液で培養した菌体と比
べて 2 倍量の pMMO が発現していた。この細菌細胞を生体触媒としてメタン変換反応を行った結果、9.6 mol /g-触媒/h のメタノール生産性能を示した。この性能は銅イオン濃度 1 μM の培養液で培養した菌体の 3 倍であった。すなわち、培養液中銅イオン濃度を高めることでメタノール生産性能が増大することがわかった。

Development of semi-synthetic medium to reduce the cost of the natural
medium YPD for yeast culture

Methanol synthesis using the biocatalyst with high enzyme expression formethane conversion○Haruka Hirakawa1, Hisashi Hoshida2, Rinji Akada2(1 Grad. Sch. Sci. Tech. Innov., Yamaguchi Univ., 2 Fac. Eng., Yamaguchi Univ.)○Akimitsu Miyaji(Sch. Mater. Chem. Technol., Tokyo Tech)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, growth, amino acidKey words

biocatalyst, bioconversion, methanol, methane monooxygenase

3Lp15

油性酵母の油脂生成、脂肪酸組成に与える脱脂米糠糖化液及びその構成糖の影響

3Mp01

遺伝子組換え微生物を用いた硫酸化ペプチド合成法の検討

学○彦坂 大幹, 渡辺 昌規（山形大院・農）mwata@tds1.tr.yamagata-u.ac.jp

学○池田 有輝, 黒木 勝久, 榊原 陽一（宮崎大・農）katsu1982@cc.miyazaki-u.ac.jp【目的】世界的な人口爆発により油脂需要は世界的に増加傾向にある。消費される油脂の殆どを海外からの輸入に頼っている本国において、油脂の安定供給・自給化が大きな課題となっている。これらを背景に当該研究室では、細胞内に油脂を生成・蓄積する油性酵母を用い、余剰バイオマスである脱脂米糠からの油脂生成の可能性について検討を進めてきた。しかし、油脂生成に与える脱脂
米糠糖化液を構成する糖質の影響については明らかとなっていない。そこで本研究では、主成分分析(PCA)により、油脂生成に与える各糖質(脱脂米糠由来)の影響への理解を目指した。
【方法・結果】本研究の油脂生成菌として、タイにて新規に分離された新規油性
酵 Rhodotorula sp.C7(C7 株 ) 、 Rhodosporidium paludigenum C10(C10 株 ) 、
Sporidiobolus pararoseus KX709872(KX 株)の 3 株を用いた。脱脂米糠糖化液、同糖化液を構成するグルコース、キシロース、アラビノースをそれぞれ炭素源とした油脂生産試験(好気-回分培養)を実施し、得られた培養結果(脱脂米糠糖化液を構成する糖質に対する糖資化能、菌体増殖、油脂生成能、EPS(菌体外多糖類)生産能、生成油脂の脂肪酸組成)を PCA に供した。その結果、C7 株は、供試菌体の中で最も高い糖資化能を示すとともに、脱脂米糠糖化液培地において菌体増殖量、油脂生産量はそれぞれ最大値を示した。また、PCA & biplot の結
果、生成油脂中のリノール酸及びリノレン酸含有率は菌体増殖や油脂生産量と負の相関関係を示し、脱脂米糠糖化液を炭素源とした場合、菌体増殖量は増大
し、生成油脂の TUD 値(脂肪酸不飽和度)は減少する傾向を示す事が明らかとなった。

チロシン硫酸化は、タンパク質やペプチドのチロシン残基に硫酸基を転移する
翻訳後修飾である。これは、ゴルジ膜に存在するチロシンタンパク質硫酸転移酵素( TPST ) により触媒される。生体内でのチロシン硫酸化は様々な生命活動の過程で重要な役割を果たすことが知られている。特に、硫酸化ペプチドや硫
酸化タンパク質の合成法と解析法が確立されていない。そのため、硫酸化ペプ
チドや硫酸化タンパク質を用いた機能解析や応用研究はあまり進展していない。
また、質量分析計を利用した硫酸化ペプチドの定量解析も実現化されていない。
現在、有機合成を用いた硫酸化ペプチドの合成や固相合成法を用いた合成が報告されている。しかしながら、収量が低く操作が煩雑になりやすいことが特徴として挙げられる。これまで、我々の研究室では大腸菌での活性型 TPST の調製に成功していことから、本研究では、硫酸化タンパク質合成も可能にさせる手法として、遺伝子組換え微生物を活用した簡便かつ低コストを実現する硫酸化ペプチド合成系の確立を目指し、同一細胞内での TPST2 と基質ペプチド発現系の構築を検討した。組換えペプチドおよびタンパク質を分泌発現できる
Brevibacillus を宿主にした発現システムを構築し、チロシン硫酸化部位を含む
モデル基質ペプチドの分泌発現と精製に成功した。さらに、精製した His タグ付きのペプチドが TPST2 で硫酸化されることも確認した。次に、TPST2 のBrevibacillus 菌体内発現と分泌発現システムを構築し、現在、酵素活性確認を行っている。本結果より、Brevibacillus は硫酸化ペプチド/タンパク質の簡便な合成法への応用に期待できる。

Effect of sugars derived from saccharified liquid of defatted-rice bran for
lipid production by using oleaginous yeast and its fatty acid composition.

Sulfated Peptide Synthesis Using Genetically Modified Microorganism

Key words
oleaginousyeast, defatted rice bran, total unsaturated fatty acid degree,
principal component analysis

Key words○Taiki Hikosaka, Masanori Watanabe(Grad. Sch. Agric., Yamagata Univ.)○Yuuki Ikeda, Katsuhisa Kurogi, Yoichi Sakakibara(Fac. Agric., Univ. Miyazaki)

post-translation, peptide, expression system, sulfation

274

3Mp02
学

ラクトフェリン融合単鎖抗体のニトロセルロースに対する吸着特性の解析と抗原結合活性評価

3Mp04○二田 諒 1, 笹岡 颯太 2
（1 京工繊大院・工芸科学, 2 京工繊大・工芸科学）
kumada@kit.ac.jp

カーボンマテリアルの生物学的な新規利用法の開発○山本 尚毅 1, 的場 直樹 2, 沖野 智也 2, 中西 昭仁 1,3（1 東京工科大院・バイオニクス, 2 関西熱化学, 3 東京工科大・応生）
nakanishiah@stf.teu.ac.jp[緒言]
イムノクロマト法は、簡便かつ迅速に抗原検出が可能であり感染症検査を中心に広く利用されている。より高感度なイムノクロマト検査を実施するためには、
ニトロセルロース膜（NC 膜）上にモノクローナル抗体を高密度かつ高活性な状態で吸着固定する必要があるが、NC 膜特有の多孔質性ならびに表面特性によって固相化された抗体のほとんどが抗原結合活性を喪失していることが明らかとなっている。これまでの研究において、NC 膜親和性タンパク質としてウ
シラクトフェリン（LF）を同定し、これを化学標識することで単鎖抗体 scFvの抗原結合活性を NC 膜上で高く維持できることを明らかにした。本研究では、
scFv の C 末端側に LF を連結した融合タンパク質（scFv-LF）を調製し、抗原結合活性の確認と NC 膜上における抗原検出について検討した。
[実験方法]
モデルとして抗 CRP scFv を用いた。scFv 遺伝子の 3'末端側に LF 遺伝子を連結した scFv-LF 遺伝子を合成し、ExpiCHO 細胞発現系により scFv-LF を培養上清中に分泌生産した。Protein L アフィニティクロマトグラフィおよび限外ろ過に
よって scFv-LF を精製した。scFv-LF の抗原結合活性は SPR センサを用いて評価した。さらに、ポリスチレンプレート（Maxisorp）並びに NC 膜に吸着固定し、固相化後の抗原結合活性について評価した。
[結果と考察]scFv-LF は培養上清中に 31.3 mg/mL の濃度で得られ、アフィニティクロマトグ
ラフィによって高純度に精製することが可能であった。scFv-LF の CRP に対する解離定数は、KD ＝ 21 pM と極めて高く、組換え大腸菌によって調製した scFvの解離定数（KD ＝ 82 nM）と比較して抗原親和力が向上していることが明らかとなった。scFv-LF を Maxisorp プレート上に固相化後、Sandwich ELISA を行ったところ、scFv と比較して高感度な抗原検出が可能であり、固定化密度が低下するほどその差は顕著であった。

【目的】カーボンマテリアルは、カーボンブラックを圧縮加工し、表面化学修飾性に富んだ新規素材である。
ただカーボンマテリアルはその機能物性を有しながらも、現存する複合材料としての利用方法に留まり、新たな利用方法の開発が望まれている。そこで、カーボンマテリアルをタンパク質の担体として用いた新たな生物学的利用方法を提案する。本提案は、カーボンマテリアルの多孔質性に基づく非特異的なタンパ
ク質の吸着ではなく、表層に化学修飾されたカルボキシ基を足場にビオチン提示を介した選択的タンパク質提示系の構築を目的とした。
【方法】 カーボンマテリアル表層カルボキシ基をターゲットにビオチン提示するために、1.3 mM ビオチンヒドラジドが溶媒を DMSO として調整された後、カーボンマテリアルに添加された。カーボンマテリアルは、縮合材のシアナミ
ドが添加され、2 h、23℃、20 rpm の条件下でビオチン提示された。さらに、ビオチン提示されたカーボンマテリアルは、ストレプトアビジン融合 HRP(horseradish peroxidase) と反応された。カーボンマテリアルのビオチン提示は、ビオチンの介在によって提示された HRP に対する TMB の酸化活性で評価された。
【結果・考察】 当該条件においては 5 分間で HRP 酸化活性がプラトーを示し
TMB が十分酸化されたことから、カーボンマテリアル上で HRP の存在が酵素
反応学的に証明された。カーボンマテリアル上で HRP 提示を示すため、洗浄を
はさみ、繰り返し利用することで HRP の非特異吸着を排除したところ、3 回の繰り返し利用によっても HRP 活性を 53%維持できた。従って、カーボンマテ
リアル表層カルボキシ基とビオチンヒドラジドのヒドラジド基が結合したことが示唆された。このことから、カーボンマテリアル表層カルボキシ基を足場にビオチン提示を介した選択的タンパク質提示系が構築できたと考えた。

Analysis of the adsorption properties of lactoferrin-fused single-chain
antibodies on nitrocellulose and evaluation of their antigen-binding activity.

Development of biological utilization with carbon materials○Makoto Nita1, Souta Sasaoka2(1 Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2 Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst.
Technol.)○Naotaka Yamamoto1, Naoki Matoba2, Tomoya Okino2, Akihito Nakanishi1,3(1 Grad. Sch. Bionics Comput. Media Sci., Tokyo Univ. Technol., 2 Kansai Coke andChemicals Co., Ltd., 3 Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Univ. Technol.)Key words

immobilization, antibody

Key words
interaction

3Mp03

焼成多孔性シリカゲルを用いたコレステロール吸収抑制
ペプチドの選択的濃縮

3Mp05○入山 桃羽, 羽川 瞳, 秋山 裕和, 清水 一憲, 本多 裕之（名大院・工）honda@chembio.nagoya-u.ac.jp

carbon materials, protein-displaying carbon materials, avidin-biotin

抗ウイルス性能を有する多孔性粒子○平尾 理恵, 重藤 啓輔, 稲垣 伸二, 石田 亘広（豊田中研）e1792@mosk.tytlabs.co.jp

食品や化粧品分野で、身体機能や恒常性維持にプラスの影響を与える機能性素材として、食品タンパク質由来の生理活性ペプチドが注目されている。生理活
性ペプチド普及には、食品タンパク質加水分解物から目的ペプチドを簡便に生産する方法の確立が必要である。生理活性ペプチドは、疎水性、等電点等の物
理化学的性質によって生理機能を発揮するものが多く、共通の物性を持つペプチドは共通の生理活性を持つ傾向がある。我々は、生理活性ペプチドのこの特徴に着目し、中性で負電荷性、酸性で電気的中性を示す焼成多孔性シリカゲルを用いて、pH 制御により苦味ペプチド除去 1 や抗菌ペプチド濃縮 2 に成功している。本研究では、焼成多孔性シリカゲルの新たな応用として、カゼイン加水分解物からのコレステロール吸収抑制ペプチドの濃縮を試みた。
本研究では、コレステロール吸収抑制効果を胆汁酸ミセル形成によるコレステ
ロールのミセル溶解度で評価した。また、コレステロール吸収抑制ペプチドが正電荷性・疎水性を持つとの先行研究 3 を基に、加水分解物を pH 7.4 でシリカゲルに吸着させ、pH 2.0 で脱着させることで濃縮を試みた。濃縮前後のコレス
テロール吸収抑制効果を比較したところ、濃縮後は濃縮前より非常に高い効果を持つことが確認できた。次に、LC-MS/MS により加水分解物を分析し、高濃縮のペプチド群を同定した。この中からランダムに選定したペプチドを合成し、個々にコレステロール吸収抑制効果を調べたところ、濃縮率の高さに応じて高い効果を持つ傾向が確認できた。以上より、焼成多孔性シリカゲルがコレステ
ロール吸収抑制ペプチド濃縮に応用可能であるとわかった。
1. Imai et al., Food Sci Technol Res., 25:179-186 (2019)
2. Hagawa et al., J Biosci Bioeng., 133:161-167 (2022)
3. Ito et al., J Biosci Bioeng., 130:514-519 (2020)【目的】 新型コロナウイルスに起因する感染症（COVID-19）は収束しつつある
が、公共空間では定期的かつ入念な清掃やエタノール消毒が行われており、この作業には多大な労力を要している。今後もウイルスを介した感染症の流行が予想されるため、さまざまなウイルスに迅速かつ安定的に不活化する衛生材料が求められている。本発表では、多孔性粒子であるメソポーラスシリカ（MS）の合成中間体をウイルス不活化材料として提案する 1)。
【方法】 試験には界面活性剤の塩化セチルトリメチルアンモニウム（CTAC）を担持した MS-CTAC 粒子を使用した。ウイルスは新型コロナウイルス等エンベ
ロープウイルスモデルとしてバクテリオファージ φ6、ノロウイルス等ノンエン
ベロープウイルスモデルとしてバクテリオファージ Qβ を使用した。さらに、
MS-CTAC 粒子を担持した紙を試作し、抗ウイルス効果と実使用環境での長期安定性を評価した。
【結果】 MS-CTAC 粒子は、エンベロープタイプのバクテリオファージ φ6 に対して 10 分間の接触で約 4 桁のウイルス不活化効果が確認された。また、ノンエ
ンベロープタイプのバクテリオファージ Qβ に対しても同様の効果を示した。
MS-CTAC 粒子を含む試作紙でも優れたウイルス不活化効果と長期安定性が認められた。そのため MS-CTAC 粒子を室内の壁紙や空調用フィルターに活用することで、エアロゾル中のウイルス不活化が期待できる。
1) R. Hirao et al., ACS Appl. Bio Mater. (2023) Vol. 6, No. 3, 1032–1040

Selective Concentration of Cholesterol Absorption Inhibitory Peptides Using
Heat-treated Silica Gel

Mesoporous particles with antiviral properties○Momoha Iriyama, Hitomi Hagawa, Hirokazu Akiyama, Kazunori Shimizu,
Hiroyuki Honda(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

Key words

cholesterol, micelle disruption, silica gel, bioactive peptide○Rie Hirao, Keisuke Shigetoh, Shinji Inagaki, Nobuhiro Ishida(Toyota Cent. R&D Labs. Inc.)

Key words

surfactant, antiviral material, mesoporous silica

275

3Mp06

低温菌シンプル酵素触媒における熱処理の細胞構造と酵素保持への影響○穴田 康太, 田島 誉久, 緋田 安希子, 加藤 純一（広島大院・統合生命科学）
ttajima@hiroshima-u.ac.jp

3Mp08
学

麹菌菌糸分散株の通気攪拌培養における混合時間の測定○薄田 隼弥 1, 武藤 清明 1, 市川 暉 1, 宮澤 拳 1, 吉見 啓 2,3,
加藤 好一 4, 阿部 敬悦 1,3（1 東北大院・農, 2 京大院・農, 3 東北大・未来研, 4 佐竹マルチミ
クス・攪拌研）keietsu.abe.b5@tohoku.ac.jp【背景と目的】
微生物による化学品生産は、反応条件や反応の特異性から化学合成より環境負荷を低減した物質変換に期待がもたれている。我々は低温菌を活用したシンプ
ル酵素触媒という新たな手法で酵素変換を簡便に行うプロセス構築を進めている。低温菌シンプル酵素触媒は、中温性酵素を発現させた低温菌を中温で熱処理することで低温菌代謝を失活し、副産物フリーで高収率な物質生産を可能にする。熱処理で基質の膜透過性も向上するが、変換酵素の細胞外漏出が懸念される。
そこで本研究では低温菌シンプル酵素触媒を持続的に利用するため、熱処理による低温菌細胞構造への影響や分子量と漏出の関係を解析し、変換酵素の細胞外漏出を抑制するための知見を得ることを目的とした。
【方法と結果】
熱処理による発現タンパク質の挙動を追跡するため、低温性 Shewanella 属細菌
2 株を用い、緑色蛍光タンパク質(GFP)発現株と分子量の異なるタンパク質(CAD,
LacZ)と GFP を融合したタンパク質発現株を構築した。それら発現株の細胞懸濁液を熱処理し、遠心分離によって細胞と上清を分離した。細胞は透過型電子顕微鏡(TEM)で観察し、上清は蛍光強度を測定し、漏出を評価した。その結果、熱処理による漏出が確認され、TEM 観察において熱処理サンプルでのみ細胞膜に突出部分が観察された。また、各菌株での漏出を比較したところ、分子量が大きいほど漏出は低下した。以上より、酵素漏出の原因は熱処理であり、タン
パク質の種類により漏出割合が変化することが示された。
次に、変換酵素の漏出を抑制するため、使用菌株が南極由来であることから人工海水を添加した培地で同様の実験を行った。その結果、融合タンパク質発現株において漏出割合の減少が確認された。以上より、低温菌は人工海水を含む培地で培養することで細胞膜の構造や組成が変化したことが考えられた。

麹菌をはじめとする糸状菌の通気攪拌培養では、菌体の生育とともに培養液の粘度が著しく上昇し、物質生産性を抑制することが知られている。槽内の混合状態の把握は生産性を評価するうえで重要であるが、懸濁した高粘度の培養液
は内部の観測が困難である。当研究室では、麹菌の細胞表層多糖である α-1,3glucan および galactosaminogalactan を欠損する株（分散株）が液体培地中で菌糸分散型の形態を示し、培養液粘度が低下することを示してきた 1), 2) 。槽内の混合状態を評価するため、Computational Fluid Dynamics（CFD）解析を実施したところ、野生株の培養液は著しく混合不良である一方、分散株では槽内の流れが改善することが示された。本研究では、CFD 解析の結果を実際の培養液を用いて実証することを目的に、通気攪拌時の混合時間を実測した。
懸濁した高粘度培養液の混合時間を多点温度測定法により計測した。計測には麹菌の野生株および分散株を、3 L 容培養槽内で 2.2 L の YPDS 培地にて 60 時
間培養して得られた培養液を使用した。測定中は、2 段に設置した攪拌翼によって 600 rpm にて攪拌しながら 1 vvm で通気し、25ºC に温調した。培養槽の槽底から少量の熱湯を注入し、槽内の 14 ヶ所に設置した熱電対によって温度変化を測定した。その結果、熱湯投入後，分散株では野生株と比べて液面付近の温度変化が迅速に起こり，その後の測定点間の値の分散も小さかった。混合時間は、分散株では野生株の約 1/5 倍となった。これらの結果は、CFD 解析による槽内の流れの特徴と合致し、温度測定法により培養液の混合作用を定量化することに成功した。また、分散株では粘度低下により混合が良好となり、混合時間が大幅に短縮されることが示された。
1) Miyazawa et al. Front. Microbiol. (2019) 10:2090
2) Ichikawa et al. J. Biosci. Bioeng. (2022) 133(1):39-45

Effects of heat treatment on cell structure and enzyme retention of
psychrophile-based simple biocatalyst

Determination of mixing time in fermentation of an Aspergillus oryzae
hyphal dispersed mutant○Kota Anada, Takahisa Tajima, Akiko Hida, Junichi Kato
(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)○Shunya Susukida1, Kiyoaki Muto1, Hikaru Ichikawa1, Ken Miyazawa1,
Akira Yoshimi2,3, Yoshikazu Kato4, Keietsu Abe1,3(1 Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ., 2 Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 3 NICHe,
Tohoku Univ., 4 Satake Multimix Corp.)

Key words

GFP, psychrophile, heat treatment, membrane permeability

Key words
timeAspergillus oryzae, bioreactor, computational fluid dynamics, mixing

3Mp07

微生物の振盪培養に用いる培養器の換気能に着目したガス制御システムの開発

3Mp09

MAXBLEND®リアクターを用いたサッカロミセス酵母の培養特性解析○高橋 将人, 青柳 秀紀（筑波大・生命環境系）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp○池谷 佳朗 1, 堀口 洋郎 1, 田中 彩 1, Kahar Prihardi 2, 荻野 千秋 2,
竹中 克英 1
（1 住友重機械プロセス機器, 2 神戸大院・工）katsuhide.takenaka@shi-g.com【目的】 小スケールで多用されている振盪培養では、サンプリング操作や微生物呼吸に依存するが、初発の気相環境を維持できないことがある。また、O2 に限らず CO2 を含めた気相部のガス環境は培地と同様に重要な培養因子である。
非意図的なガス濃度の変動が培養中の微生物に及ぼす影響を最小限にし、未開
拓なガス環境を提供するためには、振盪培養で用いる培養器の換気能を増大させ、ガス環境を制御する必要がある。そこで、独自に開発したデバイス（Nonelectric
Bellows Pump：NeBP）を利活用し、振盪培養法の特徴（並列性と簡便性）を維持したガス制御システムの開発を試みた。
【方法と結果】 培養器内の CO2 が自然換気するのに要する時間（半減期）を換
気能の指標として、三角フラスコに付与される通気性を有した従来の培養栓（約30〜70 分）に替わる独自の培養栓の素材を評価したが、換気能の改善は困難であった（ポリジメチルシロキサン製シートは 100 分、ウェルプレート用として市販されているガス透過性シールは 50 分を超過）。そこで、NeBP を最適化し、ガス制御システムを構築した。追加電力を要さない NeBP は、振盪基盤のデッドスペースに設置でき、振盪で生じる運動エネルギーを換気能に変換できるア
クチュエータである。振盪条件に応じて NeBP 内部で往復運動する硬球の素材を変更し、安定して収縮運動できるベローズを選定した。最適化した NeBP（半減期は約 10 分）と振盪基盤付きガスインキュベータを併用することで、培養器内外のガスが迅速に置換され、微生物（大腸菌など）培養中に生じるフラスコ
気相部の非意図的なガスの濃度変動を抑制でき、設定値に制御できた（従来の振盪フラスコ内［NeBP 無し］は設定値を超過）。培養器の換気能に着目したガス制御システムによって、これまで困難であった振盪培養法の特徴を維持した気相制御が可能となった。

【背景・目的】培養槽による好気性菌体増殖において一般的にはディスクタービン翼（DT）が付属されている。一方で、装置特性と菌体増殖との関係を明らかにした研究は少なく、さらに培養を行う際の装置側の操作因子は明確にされていない。そこ
で 本 研 究 で は 、 大 型 攪 拌 翼 で あ る MAXBLEND(R) 培 養 槽 を 用 い た 酵 母
Saccharomyces yeast の増殖速度に着目し、装置形状および操作因子に対する影響を明らかにすることを目的とした。
【方法】
培養槽には内径 φ123 mm の MAXBLEND(R)（MB）ジャーファーメンターと汎用 DT ジャーファーメンターを設置した。培養液の初期液量を 1.2L、最大液量を 1.5L とし 144 時間の流加培養を行った。ここで、流加により最大液量を超えた場合は初期液量になるよう培地を除去した。濁度は乾燥菌体重量濃度と相関関係にあることを予め確認しており、サンプリングした培養液の濁度を経時的に測定した。そこから目標の乾燥菌体重量濃度に必要な培地供給量を算出し、流加流速を調整した。サンプルは菌体量を濁度と乾燥菌体重量濃度、培地成分を HPLC（（株）島津製作所作製 Prominence）で評価した。
【結果・考察】流加流速を除く同一の培養条件で試験を行った結果、基準の DT ジャーの乾燥
菌体重量濃度（約 26g/L）に対して MB ジャーの乾燥菌体重量濃度（約 95g/L）
は約 3.7 倍となった。これは、ジャーファーメンターの種類（培養装置）を変更したことで培養槽内部における流動状態が変化し、菌体の増殖速度に差が生じたと考えられる。また、培養装置によってガス分散性能が異なるため、ガス分散性能が菌体増殖に寄与することが示唆される。今後は、装置の培養性能としてガス分散性能に着目し、菌体増殖との関連性について研究する予定である。

Development of a gas control system via the ventilation capacity of shakebottle for microbial cultivations

Characterization of cultures with Saccharomyces yeast using
MAXBLEND(R) reactor○Masato Takahashi, Hideki Aoyagi(Inst. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words
capacitygas control, non-electric bellows pump, shake-flask culture, ventilation○Yoshiro Ikeya1, Hiroo Horiguchi1, Aya Tanaka1, Prihardi Kahar2, Chiaki Ogino2,
Katsuhide Takenaka1(1 Sumitomo Heavy Industries Process Equipment Co.,Ltd., 2 Grad. Sch. Eng, Kobe
Univ.)

Key words
yeast, Saccharomyces cerevisiae, High cell density cultures,
MAXBLEND(R) reactor

276

3Mp10

3Mp12

A novel inverse membrane bioreactor for methane/methanol gas-to-liquid bioconversion using a microbial
gas-phase reaction

画像解析技術を用いた Saccharomyces cerevisiae の培養
フェーズ予測○中倉 稜也 1, 邱 泰瑛 2, 小西 正朗 2
（1 北見工大院・工, 2 北見工大）
konishim@mail.kitami-it.ac.jp○Yan-Yu Chen, Ishikawa Masahito, Katsutoshi Hori
(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)
khori@chembio.nagoya-u.ac.jp

This study proposed and demonstrated a novel inverse membrane bioreactor (IMBR)
as a means to effectively capture and convert methane, a potent greenhouse gas. The
IMBR, with filtered cells positioned to face a gas phase, represents a promising
approach for advancing gas-to-liquid (GTL) bioconversion processes. This innovative
design overcomes limitations associated with conventional bioreactors in which cells
are immersed in an aqueous phase. By enabling direct interaction between the gas
phase and filtered cells, the IMBR optimizes substrate mass transfer, increasing theefficiency of methane bioconversion. To validate the effectiveness of the IMBR,
Methylococcus capsulatus (Bath), a representative methanotrophic bacterium, wasused to successfully convert methane to methanol in the IMBR. The regulation of
methanol production was achieved by introducing cyclopropanol as an inhibitor toprevent further oxidation of methanol and sodium formate as an electron donor tofacilitate the production of NADH. Through optimization of various key parameters,
continuous methanol production was achieved in the IMBR over a 72-hour operating
period. Notably, the IMBR exhibited a significantly higher productivity of 0.88 mmol
L-1 h-1 compared to other membrane bioreactor configurations reported in the scientific
literature. The results of this study contribute to the growing body of knowledge in
GTL technologies and highlight the IMBR as a promising tool for sustainable methane
utilization and greenhouse gas mitigation.

微生物によって得られる物質は飲料やバイオ燃料等に利用され、現代社会に貢献している。適切な培養プロセス設計により物質生産性の向上が期待でき、そのためには培養層内の状態把握が不可欠である。特に流加培養等の培養法では流加の開始時間や培養時間の設定等の判断をするために迅速な培養状態の把握が必要であるが、既存の培養観察法は時間や手間がかかる。そこで我々は AIに着目し、既存の培養フェーズ判定方法におけるリアルタイム性の課題解決を目指した。本研究ではリアルタイム性の高い培養観察手法開発の第一段階として、画像の特徴を自動抽出する能力に秀でる Convolutional Neural Network による画像解析を用いて細胞の形態情報から培養フェーズを判断できるモデルの作成を試みた。出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae S288c 株を培養し、増殖曲線から誘導期、対数増殖期、定常期を判定した。また、フェーズ毎に採取した細胞をフローサイトメーターにて蛍光波長測定した。得られたヒストグラムを比較することでフェーズ毎の細胞集団に異なる特徴が含まれていることを確認した。
フェーズ毎に撮影した顕微鏡画像を使用し、当研究室オリジナルの CNN モデ
ル及び、画像判定に多用される VGG16 の転移学習を用いて AI によるフェーズ
判定モデルを作成した。本実験で使用したフェーズ判定モデルでは明確に細胞形状が異なる対数増殖期を精度よく判別できることがわかった。しかし作成したモデルに対し別日撮影の写真でテストした際の正答率は 50%程度に留まり、汎化性に問題があることがわかった。原因として考えられたバックグラウンドの影響を最小化するために画像を二値化処理したところ、汎化性能は 10%以上向上し、誘導期と定常期間の判定精度も向上した。これらの結果から、細胞形状に関する画像データのみから培養フェーズを判定できる可能性が示された。

A novel inverse membrane bioreactor for methane/methanol gas-to-liquidbioconversion using a microbial gas-phase reaction

Prediction of culture phase of Saccharomyces cerevisiae using image
analysis technology

Key words

methane fermentation, methanol, membrane reactor, bioconversion

Key words
Saccharomyces cerevisiae, culture phase, convoltional nernal
network(CNN)

3Mp11

培養作業の２視点撮影画像による細胞培養初心者の技
術評価

3Mp13

○Yan-Yu Chen, Ishikawa Masahito, Katsutoshi Hori
(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)○Ryoya Nakakura1, Tai-Yang Chiou2, Masaaki Konishi2(1 Grad. Sch. Eng., Kitami Inst. Technol., 2 Kitami Inst. Technol.)○片岡 健 1, 川嶋 心 1, 呉屋 七海 1, 富恵 悠 1, 荘子 万能 2
（1 岡山理大・理, 2 BonBon Inc.）
kenk@ous.ac.jp

大腸菌 oxyR 欠損株を用いた寒天中のコロニー形成阻害
成分の特定○坂元 仁 1,2, 朝田 良子 1,3, 古田 雅一 1,3, 土戸 哲明 1
（1 大阪公大・微制研セ, 2 関西大・化生工, 3 大阪公大院・工）Sakamoto.jj@gmail.com

安全かつ高品質な培養細胞を維持し科学的に安定した結果を得るためには、一定レベルの細胞培養技術が必要である。本研究では技術評価のため培養作業を動画撮影し、非同期型動画レビューツール「tsucom」を用いて細胞培養技術の問題点を抽出した。
「tsucom」は共同発表者の荘子 万能医師らが開発した非同期型のコミュニケー
ションプラットフォームで、アップロードした動画を確認しながら音声あるいはテキストでコメントを入れることができる。このツールの特徴として、指導者がリアルタイムで作業を見守る必要がないため、時間的・空間的に制約されない点が挙げられる。すなわち作業者と指導者が時間調整をして細胞培養を行う必要がないため、「tsucom」を利用することにより一人の指導者が多くの作業者を評価することができる。
具体的には細胞培養初心者を中心に継代操作の動画撮影を行い、細胞培養指導士（日本組織培養学会認定）の有資格者がコメントを加えて評価したところ、初心者に共通するいくつかの問題点が明らかになった。コメント総数やそのタイミングなどは個人によって違いが大きかったが、初心者の中にはコンタミネー
ションの原因となるような重大なミスが認められた。コメント内容を分類した
ところ、「作業をベンチの手前で行なっている」「ベンチ内吸気口の上に物を置いている」「チューブなどの蓋の取り扱い」の３項目が約８割を占めていた。
また作業者も２視点カメラの画像を何度も見返すことで、自分自身の培養操作の問題点を意識しながら振り返ることができた。
今後はさらに多くの培養操作動画を撮影し、このシステムの有用性を検証する方針である。

寒天を用いた平板培養法は微生物実験に広く用いられる一方、環境微生物のス
クリーニングにおいてゲランガムなら培養可能な例も報告され、寒天の毒性が示唆されている。我々は大腸菌の過酸化水素ストレス応答の転写調節因子 oxyR
欠損株で親株に対して 4 桁ほど低いコロニー形成能を見出した。この株は過酸化水素スカベンジャーであるピルビン酸 Na の添加や軟寒天培地でのコロニー形成能の回復から当初は自己産生した過酸化水素の拡散モデルを考えていたが、試薬寒天ロットが変わったところ再現性がとれず、ロット間の微量成分の影響が示唆された。そこで食用寒天 1 品と培地用寒天 3 社 5 品を用いて調査した結果、2 品の培地用寒天以外はコロニー形成が阻害された。コロニー形成が阻害される培地用寒天はキレート剤洗浄後にコロニー形成阻害現象が消失し、また重金属解毒薬 BAL やチオ硫酸 Na の添加でもコロニー形成阻害が消失した。一方、嫌気培養ではコロニー形成阻害は消失しなかった。このことから呼吸に依存した ROS の発生がコロニー形成阻害の主因ではなく、寒天中の金属イオン由来で発生する ROS の毒性である可能性が示唆された。次にコロニー形成が阻害されない培地用寒天をベースに寒天で報告される微量成分の添加実験を行った。
その結果、四ホウ酸 Na、CaCl2、FeCl2、CuCl2、As2Cl3 の添加ではコロニー形成は阻害されず、唯一、コロニー形成が阻害されたのは ZnCl2 であった。各種寒天の原子吸光法による分析もコロニー形成阻害と Zn 濃度の高さに相関性があった。oxyR レギュロンにはペリプラズムの Zn 結合タンパク質 ZinT と亜鉛取り込
みトランスポーター ZnuACB があり、znuACB 欠損株でも著しく低いコロニー形成能が確認された。細胞質に取り込まれずペリプラズム空間に高濃度に存在する Zn2+が ROS の発生源として細胞を死滅させた結果がコロニー形成阻害の要因であろう。

Technical evaluation of cell culture beginners using two-angle videos ofculture work

Identification of colony-forming inhibitors in agar using Escherichia coli
oxyR mutant○Ken Kataoka , Kokoro Kawashima , Nanami Goya , Hisashi Tomie , Mano Soshi(1 Fac. Sci., Okayama Univ. Sci., 2 BonBon Inc.)
1

Key words

1

1cell culture technique, technical assessment

12○Jin Sakamoto1,2, Ryoko Asada1,3, Masakazu Furuta1,3, Tetsuaki Tsuchido1(1 Microorganisms Cntr. Res. Ctr., Osaka Metro. Univ., 2 Fac. Chem. Mater. Bioeng.,
Kansai Univ., 3 Grad. Sch. Eng., Osaka Metro. Univ.)

Key words

reactive oxygen species, oxidative stress, agar, Escherichia coli

277

3Mp14

膜内外に異種タンパク質を連結した、バクテリアサイズ
ユニラメラリポソームの簡便な作製法

3Mp16

UVC-LED を用いた医薬品の製造工程に導入可能なウイ
ルス不活化技術の検討○瀬川 和也, 井上 隆昌, 西口 優吾, 浦山 健
（日本血液製剤機構）
segawa-kazuya@jbpo.or.jp○野場 考策 1, 吉本 将悟 1, 田中 良和 2, 横山 武志 2, 松浦 友亮 3,
堀 克敏 1（1 名大院・工, 2 東北大院・生命科学, 3 東工大）
khori@chembio.nagoya-u.ac.jp

人工細胞とは、細胞機能を模倣した膜小胞のことであり、従来の研究においては直径 10 μm 以上の脂質膜からなる Giant unilamellar vesicle(GUV)が用いられてきた。従来のリポソーム調製法には界面通過法や Extruder 法と呼ばれる方法論が提示されているが、技術的制約からバクテリアの膜構造やサイズを模倣した
人工細胞の作成は限られている。本発表では、脂質二重膜に非対称にタンパク質が局在する細菌サイズの Large unilamellar vesicle（LUV）の作成に成功した。
界面通過法や Extruder 法を組み合わせることで、ベンジルグアニンで修飾されたリン脂質を含むリポソームを調製し、SNAP タグを融合した緑色蛍光タンパ
ク質(SNAP-GFP)を脂質二重膜の内葉に局在させた。その後、ビオチン化した脂質分子を外側から挿入し外葉を alexafluor 647 で標識したストレプトアビジンで修飾することによって内外で異なるタンパク質組成を有するバクテリアサイズ
リポソームを作成した。得られたリポソームは、841 nm にピークを持つサイズ分布を持ち（変動係数: 10.3％）、球菌と類似したサイズ分布であった。さらに、共焦点レーザー顕微鏡による観察及びフローサイトメトリーによる定量評価により、外葉にストレプトアビジン、内葉に SNAP-GFP が局在していることを明らかとした。最後に、作成したリポソームがユニラメラで構成されているかを明らかとするためにクライオ電子顕微鏡観察および α-ヘモリシン挿入による定量評価を行った結果、作成したリポソームの 90%近くがユニラメラであった。
本研究で創出したタンパク質を非対称に局在化させた細菌サイズ LUV の調製
方法は、人工細菌細胞の作製に貢献すると考えられ表面構造やサイズの機能を評価可能であると期待される。

【背景・目的】
血液製剤やバイオ医薬品等の生物由来医薬品は、原材料からの病原体等の混入リスクが常に伴う。紫外線(UVC)照射はこれら病原体等に対する一般的な滅菌法であるが、工程液中の製剤タンパクに不可逆的な変性を及ぼす場合がある。
そのため、病原体等の不活化に十分、かつ製剤タンパクに影響の少ない照射条
件を設計する必要がある。また、従来の水銀灯を照射源とする手法では、被験検体へ一様に照射する事が困難であった。本研究では、物理化学的処理に抵抗性の高いウイルスを指標とし、UVC-LED を用いて医薬品の製造工程に導入可
能なウイルス不活化法を検討した。
【方法】
被験検体として人血漿製剤(FFP)、UVC-LED は旭化成社製 Klaran WD（試作品）を用いた。UVC-LED の中心波長、照射線量等のパラメータを検討し、検体中の複数の血液凝固因子のタンパク活性が一定以上に維持される UVC 処理条件
からデザインスペースを設定し、豚パルボウイルス(PPV)またはマウス脳心筋炎
ウイルス(EMC)を添加して照射実験を行った。ウイルスの不活化効果は、照射前後のウイルス感染価の減衰率から評価した。
【結果・考察】UVC-LED を用いた検討により、指標ウイルスを検出限界以下まで不活化し、かつ血液凝固因子活性を高水準に維持し得る照射条件を見出した。一方、水銀灯を用いた場合、同一照射条件下にもかかわらず、ウイルスを十分に不活化することはできなかった。これは波長の特異性と照射均一性がもたらすものであり、UVC-LED は水銀灯に代わる優れた光源になり得ると考えられた。UVCLED を用いたウイルス不活化技術はまだ十分に確立されておらず、装置開発を含めたさらなる検討により、生物由来医薬品の安全性向上への寄与が期待される。

A simple method for the creation of a bacteria-sized unilamellar liposome
with different proteins localized to the respective sides of the membrane

Evaluation studies on virus inactivation technology that can be introduced
into the manufacturing process of pharmaceutical products using UVC-LED○Kosaku Noba1, Shogo Yoshimoto1, Yoshikazu Tanaka2, Takeshi Yokoyama2,
Tomoaki Matsuura3, Katsutoshi Hori1(1 Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2 Grad. Sch. Life Sci., Tohoku Univ., 3 Tokyo
Tech)○Kazuya Segawa, Takamasa Inoue, Yugo Nishiguchi, Takeru Urayama(Japan Blood Products Organization)

Key words

lipid vesicle

Key words

3Mp15

三量体接着タンパク質 AtaA の小型化とそれを用いた大腸菌の固定化

3Np01○吉本 将悟 1, 青木 壮太 1, 小原 優季 1, 石川 聖人 2, 鈴木 淳巨 1,
Linke Dirk 3, Lupas Andrei 4, 堀 克敏 1
（1 名大院・工, 2 長浜バイオ大・バイオ, 3 オスロ大, 4 マックスプ
ランク研）
khori@chembio.nagoya-u.ac.jp

学LED, virus, UVC, biopharmaceutical

タバコ野火病菌におけるホウ酸を介した感染機構の解明○藤川 晃太朗, 緋田 安希子, 田島 誉久, 加藤 純一（広島大院・統合生命科学）
akhida@hiroshima-u.ac.jp

生体触媒を用いたバイオプロセスは、環境負荷の小さい物質生産技術としてカーボンニュートラルに寄与することが期待されている。触媒である微生物細胞を効率的に利用するため担体への固定化が行われるが、物質移動律速や担体からの細胞の漏出、細胞の生存率や触媒活性への悪影響など様々な課題がある。これまでに我々のグループは、独自に発見した Acinetobacter sp. Tol 5 由来の接着蛋白質 AtaA を用いた細菌固定化法を開発してきた。この方法では、AtaA をコードする遺伝子を他の有用細菌に導入し、AtaA を生やすことで有用細菌に接着性を付与し、担体に固定化することができる。しかし、AtaA は 3630 アミノ酸残基からなるポリペプチド鎖が三量体を形成した非常に巨大な蛋白質であるため、異種細菌で AtaA を生やすことは容易ではなく、適用できる細菌種が限られていた。そこで本研究では、AtaA の接着に関わる領域を特定し、その知見を基に接着性を維持したまま AtaA を小型化することを試みた。
AtaA の各ドメインを欠損させた変異体を網羅的に作製しそれを Tol 5 の ataA 欠損株に発現させ接着性を評価したところ、N 末端 head ドメイン（Nhead）を欠損した変異体のみ接着性が低下した。続いて、この Nhead と AtaA ファイバーの根元部分だけのわずか 775 アミノ酸残基で構成される小型の AtaA（miniAtaA）を設計した。これまで AtaA を生やすことが難しかった大腸菌で miniAtaA を発現させたところ、細胞表層への提示量が顕著に向上した。その菌懸濁液に多孔性のポリウレタン担体を加えて 30 分間振とうしたところ、多くの大腸菌が固定化された。大腸菌が固定化された担体は反応溶液に繰り返し浸漬することで、物質変換反応を複数回行うことができた。今後、mini-AtaA を用いることで大腸菌をはじめとする様々な有用細菌を固定化触媒として利用できるよ
うになることが期待される。

【目的】近年の研究により、ホウ酸への集積行動（走化性）が世界で初めて発見され、それに関わる受容体 McpB は植物病原細菌のみ特異的に存在することが証明された。このことから、ホウ酸走化性は植物への感染に重要であることが示唆されたが、その具体的な役割は不明であった。そこで本研究では、葉から感染するタバコ野火病菌 Pseudomonas syringae pv. tabaci 6605 をモデルとして、
植物病原細菌におけるホウ酸走化性の役割を解析した。
【方法・結果】ホウ酸は植物体内に存在する物質であるが、それが体外へと分泌されるという報告はないことから、「ホウ酸は植物に傷が入ることで漏出し、植物病原細菌はそれを感染時の侵入口の目印としている」のではないかと考えた。
はじめに植物の傷口からホウ酸が漏出しうるかを検証した。タバコ葉に針で穴をあけ、その傷口上に超純水を滴下し 2 時間保持後、その液滴に含まれる元素
を ICP-MS で分析した。その結果、傷なしでは 0.6 μM のホウ素が検出されたのに対して、傷ありでは 2.6 μM のホウ素が検出され、傷口特異的にホウ素（おそらくはホウ酸）が漏出することが確認された。さらに、走化性測定の結果、検出されたこの濃度はタバコ野火病菌が十分に感知できる濃度であると推定された。次に、ホウ酸走化性が植物感染に寄与するかを検証した。傷口からの侵入を評価するために、ホウ素の漏出試験と同様の手法で、超純水のかわりに菌懸濁液を滴下し、２時間保持した後、葉内部に侵入した菌数を測定した。その結果、傷口からの侵入率が、ホウ酸走化性欠損株 ΔmcpB では野生株よりも有意に低下し、その相補株では回復した。このことから、傷口からの侵入にホウ酸走化性が寄与することが証明された。以上の結果から、上記仮説のとおり、植物体の傷口から漏出するホウ酸が侵入時の走化性標的となっていることが強く示唆された。

Downsizing of AtaA from Acinetobacter sp. Tol 5 and its application in
immobilizing Escherichia coli

Elucidation of the boric acid-mediated infection mechanism in Pseudmonas
syringae pv. tabaci 6605

○Shogo Yoshimoto , Sota Aoki , Yuki Ohara , Masahito Ishikawa , Atsuo Suzuki ,Dirk Linke3, Andrei Lupas4, Katsutoshi Hori1(1 Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2 Dept. Biosci., Nagahama Inst. Bio-Sci. Technol.,3
Dept. Biosci., Univ. Oslo, 4 Dept. Protein Evol, Max Planck Inst. Biol.)1

Key words

1

1

Escherichia coli, immobilization, adhesion

2

1○Kotaro Fujikawa, Akiko Hida, Takahisa Tajima, Junichi Kato
(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)

Key words

chemotaxis, plant pathogen, boric acid, Pseudomonas syringae

278

3Np02

グラム陽性土壌細菌 Leifsonia sp.の走化性に関する研究○中川 直美, 緋田 安希子, 田島 誉久, 加藤 純一（広島大院・統合生命科学）
jun@hiroshima-u.ac.jp

3Np04

有機資材施肥による根こぶ病菌の抑制○平野 嵩典, Tran Quoc Thinh, 久保 幹
（立命館大院・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp

サツマイモはアグロシノピン A を合成することで貧栄養下でも生育可能だが、自身はこの化合物を利用できない。このことから、これを標的としてサツマイ
モ根圏に集まり、生育に有益な作用をもたらす土壌微生物の存在が示唆された。
その有力な候補として、アグロシノピン A 高生産組換えタバコの根圏より単離された Leifsonia sp.が挙げられたが、本菌の走化性に関する報告は一切なく未知な部分が多い。そこで本研究では、Leifsonia sp.の走化性の解析を試みた。
本菌のゲノム上には、既存の鞭毛関連遺伝子群は存在するが、既存の走化性関連遺伝子は存在しない。しかし、トリプトン含有の軟寒天培地を用いて解析した結果、走化性様の広がりが確認され、既存のものとは異なる走化性システムの存在が示唆された。そこで、走化性の存在をより確かに示すために、顕微鏡下にてリアルタイムで走化性応答を確認するキャピラリアッセイを試みた。この手法では、液体培養した細胞に対して培地成分を取り除くための洗浄操作が必要となる。調査の結果、HEPES 緩衝液を用いた場合には運動性が失われ、CGM(クエン酸、グルコース、マグネシウム)溶液を用いた場合には運動性が保持されることが判明した。そこで CGM 溶液で洗浄した菌体を用いて解析を試みたが、トリプトンへの集積応答は確認できなかった。そのためさらに手法を変え、アガロースプラグアッセイを試みた。この手法では、走化性を有する場
合、試験物質を含むプラグ周辺に菌による濃い濁りができるはずだが、CGM溶液で洗浄した菌体を用いた解析では、トリプトンを含むプラグ周辺に菌のいないクリアゾーンが形成された。一方、運動性を失う HEPES 緩衝液ではこの現象は起きなかった。現在、この現象や軟寒天培地での走化性様の広がりが運動性に関与するかを評価するため、鞭毛遺伝子欠損株の構築を試みている。

【背景・目的】植物に寄生する微生物の一つに、ネコブ病菌がある。植物がネコ
ブ病に感染すると、根がこぶ状に肥大化し吸水能力が低下する。また、ネコブ病菌の感染には植物種および土壌環境が大きく関係していることが知られている。先行研究では、有機土壌と化学土壌に根こぶ病菌休眠胞子を接種し発症指数を比較した。その結果、有機肥料を使うことにより発症指数が抑えられること、またコマツナの収量は有機土壌でより大きいことが分かった。しかし、対照実験として用いた根こぶ病菌の接種を行っていない土壌条件でも有機土壌の方が、収量が大きかった。有機土壌で発症指数が抑えられたのは土壌環境ではなく、植物自身の抵抗力が大きく影響していると考えられた。本研究では土壌環境の違いによる影響を評価するため、土壌間でのコマツナの収量を同程度にする方法を探索し、決定した施肥条件で発症指数にどのような影響を及ぼすかを調べることを目的とした。
【方法・結果】はじめに、有機土壌および化学土壌で生育したコマツナの収量を同程度にするため、化学肥料の施肥量探索を行った。有機肥料は土壌に対して5%(w/w)施肥した。化学肥料は土壌 1 kg に対して、窒素・リン・カリウムそれぞれを 300, 350, 400mg 施肥する 3 つの条件を用意した。その結果、300mg/kg
が有機土壌の収量と同程度になる施肥量であることが分かった。以上の施肥条件をもとに、化学土壌・有機土壌それぞれに根こぶ病菌休眠胞子を接種し、コマツナを 4 週間生育させた。その結果、有機土壌の発症指数は 28 %、化学土壌の発症指数は 90 %であった。有機土壌の収量が 38.8 g であるのに対し、化学土壌の収量は 24.7 g であり、有機土壌に比べて低かった。これらの結果から、有機土壌条件における発症指数の低下は、植物自身の抵抗性だけでなく、土壌条件が大きく関与していることが明らかとなった。

Study on chemotaxis of Leifsonia sp.

Suppression of Plasmodiophora brassicae using organic materials○Naomi Nakagawa, Akiko Hida, Takahisa Tazima, Junichi Kato
(Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.)

Key words

3Np03○Kosuke Hirano, Quoc Thinh Tran, Motoki Kubo
(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

chemotaxis, Leifsonia sp.

Key words

Plasmodiophora brassicae, Rhizobacteria, organic fertilizers

植物発酵物（FBP）による青枯病抑制機構の解明

3Np05

Isolation of plant growth-promoting rhizobacteria
mutant with high resistance to hostile environment○田所 千佳 1, 緋田 安希子 1, 鳥居 英人 2, 竹中 航平 2,
藤岡 耕太郎 2, 岸田 晋輔 2, 加藤 純一 1
（1 広島大院・統合生命科学, 2 万田発酵）
akhida@hiroshima-u.ac.jp○Fathiah Rizky Kosasih1,2, Kentaro Miyazaki1, Hiroya Tomita1,3,
Kohsuke Honda1,3(1 ICBiotech, Osaka Univ., 2 PT Pupuk Sriwidjaja PalembangIndonesia, 3 OTRI, Osaka Univ.)
honda.kohsuke.icb@icb.osaka-u.ac.jp

青枯病とは、Ralstonia solanacearum という土壌細菌によって引き起こされる植物病である。この被害は世界各地で深刻であることから、有効な防除法の確立が求められている。近年の研究で、植物発酵物（FBP：Fermented Botanical
Product，万田発酵株式会社製）が青枯病の防除に有用であることが証明されたが、その作用機序は不明であった。そこで本研究では、FBP による青枯病抑制機構の解明を試みた。
青枯病菌は植物の根の傷口から侵入し、導管内部で増殖後、病原性遺伝子を発現し、通水阻害を引き起こす。病原性遺伝子の発現は細胞密度によって制御されるため、感染時の宿主植物体内における青枯病菌の細胞数を調べた。FBP 溶
液または蒸留水で２日間根部を浸漬処理したトマトに対して青枯病菌を土に間接接種した後、青枯病を発症した個体と無症状の個体の地上部を回収し、すりつぶして CFU を測定した。その結果、発症した個体では多くの青枯病菌が検出されたが、FBP 処理区の大半を占める無症状のトマトの体内では青枯病菌が十分に存在しないことが判明した。このことから、FBP は病原性遺伝子の発現以前の過程である植物体内への侵入または侵入後の植物体内での増殖を阻害するものと考えられた。FBP 自体には青枯病菌に対する直接的な殺菌効果がないた
め、FBP により植物の防御応答が向上し、間接的に青枯病菌の侵入または増殖が阻害された可能性が示唆された。そこで、宿主植物であるトマトとモデル植物であるシロイヌナズナを用いて RNA-seq による遺伝子発現解析を行った。その結果、FBP 処理により多数の遺伝子の発現変動が見られたが、その中で防御応答に寄与するとされるいくつかの因子について発現の向上が確認された。これらの因子の発現向上はトマトとシロイヌナズナに共通しており、FBP の青枯病防除効果に寄与する可能性が示唆された。

Agricultural intensification through the application of Plant Growth Promoting
Rhizobacteria (PGPR)-based biofertilizer was recently introduced. PGPR promotes
plant growth through the solubilization of soil nutrients, and the production of plant
growth-stimulating hormones and iron-sequestering metabolites called siderophores.
However, misusage of chemical fertilizer and environment stress can lower theabundance and activity of PGPR in the soil. Here, we applied adaptive evolution
technique to isolate PGPR mutants that are tolerant to high concentration of chemical
stresses. Prior to adaptive evolution experiments, Bacillus thuringiensis NBRC
101235, a model PGPR strain, was exposed to several stresses, i.e., Nitrogen (N 1-5%w/v), Phosphorus (P2O5 1-5%-w/v), Potassium (K2O 1-5%-w/v), high salinity (NaCl
1-6%-w/v), and various acidity (pH 4-6) in liquid culture. It was found that this strain
was most susceptible to Nitrogen, where 2%-w/v is the growth limit. Through adaptive
evolution, we have isolated mutants that were resistance to 5%-w/v of Nitrogen while
retain the PGPR traits. We investigated the phenotype and genotype of these mutants tounveil the genetic basis of stress adaptation.

Studies on the control of bacterial wilt by fermented botanical product

Isolation of plant growth-promoting rhizobacteria mutant with highresistance to hostile environment○Chika Tadokoro1, Akiko Hida1, Hideto Torii2, Kohei Takenaka2, Kotaro Fujioka2,
Shinsuke Kishida2, Junichi Kato1(1 Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ., 2 Manda Fermentation)

Key words

bacterial wilt, disease control, fermented botanical product, RNA-seq○Fathiah Rizky Kosasih1,2, Kentaro Miyazaki1, Hiroya Tomita1,3, Kohsuke Honda1,3(1 ICBiotech, Osaka Univ., 2 PT Pupuk Sriwidjaja Palembang-Indonesia, 3 OTRI,Osaka Univ.)

Key words
resistancebiofertilizer, plant growth promoting rhizobacteria, adaptive evolution,

279

3Np06

木質バイオマスを用いた新規有機土壌の開発○玉田 佑貴, Tran Quoc Thinh, 久保 幹
（立命館大院・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp

3Np08

Study on properties of organic fertilizer in Japan○Yihao Huang, Quoc Thinh Tran, Motoki Kubo
(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)
kubo@sk.ritsumei.ac.jp【背景・目的】
本研究では、木質バイオマスの有効利用と持続可能な農業を目指した新規有機土壌の開発を目的とした。
【方法・結果】
木質資材の土壌への投入が適切であるのかを検証した。木質資材は、スギ（繊維状）、ヒノキ（粉状）、ココナッツ（繊維状）、タケ（粉状）、竹スギ混合（粉状）を使用した。土壌における木質資材の体積分立が 30 ~ 90%になるように土壌を作製後、コマツナの生育を、有機質肥料を用いて調整した土壌のものと比較した。その結果、スギ、ココナッツを 60%を施肥した土壌で、有機標準土壌の 80%以上の生育を示したため、木質資材の土壌への投入は可能だと示唆された。
次に、土壌の物理性と植物成長の関係を解析するため、木質資材の粒形サイズ
を 125 µm ~ 1,000 µm 又は 125 µm 以下に分類し、再度コマツナの栽培実験を行った。土壌の体積当たりの木質重量が 100 mg/cm3 の条件下では、スギ、ヒノ
キ、ココナッツ含有土壌で 80%程度の生育を示したが、タケ、竹スギ混合土壌
では 30%以下となった。また、粒形サイズの違いでも生育に差が生じ、125 µm以下の木質資材を用いた土壌ではコマツナの生育が 50%を下回った。
最後に、総細菌数・真菌数をバーミキュライト土壌と比較した。総細菌数はバー
ミキュライト土壌と木質含有土壌では(4.1 ~ 4.9)×108 cells/g-soil と同程度であった。真菌数はバーミキュライト土壌で 8.9×104 cfu/g-soil、木質含有土壌で(1.2 ~1.8)×105 cfu/g-soil となり増加した。
以上の結果から、コマツナにおいては、スギ、ココナッツを体積が全体の 60%程度になるように使用し、粒形サイズを 125 µm ~ 1000 µm にすると、通気性・排水性の影響により植物生育が促進した。

Study on properties of organic fertilizer in Japan
Author: HUANG YIHAO, TRAN QUOC THINH, KUBO MOTOKI
Long-term application of chemical fertilizers and agrochemicals leads to poor of soil
fertility, especially biomass of soil microorganisms. Organic fertilizers can bealternative fertilizer sources to increase soil quality and initiate the transition tosustainable development goals (SDGs). Unlike chemical fertilizers, the characteristicsof organic fertilizers are relatively variable depending on their raw materials andchemical and biological properties are still limited. This study aims to investigate thefeatures of common organic fertilizers in Japan.
Common organic fertilizer samples were used in this study. (68 chicken manuresamples, 112 cow manure samples, 22 horse manure samples, 42 pig manure samples,
12 food residue samples, 131 plant residue samples, and 67 other fertilizer samples.)Total carbon (TC), total nitrogen (TN), total phosphorus (TP), total potassium (TK),amino acid nitrogen (NH4+), nitrate nitrogen (NO3-), bacterial biomass, and watercontent were analyzed. The results showed chicken manure fertilizers had highest
values of TN compared to the other fertilizers. Pig manure was rich in TP. TK wereabundant in cow manure and chicken manure. As for bacterial biomass, cow manureand pig manure showed the highest values. However, water content values were over
30% in all types of fertilizer except for chicken manure. To improve the quality oforganic fertilizers, water content was dried to reduce.

Ultilization of wood biomass for constructing new organic soil

Study on properties of organic fertilizer in Japan○Yuki Tamada, Quoc Thinh Tran, Motoki Kubo
(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)○Yihao Huang, Quoc Thinh Tran, Motoki Kubo
(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words

biomass, soil, soil bacteria

Key words

3Np07

堆肥のミネラル成分解析による高度化

3Np09○神谷 康平, Tran Quoc Thinh, 久保 幹
（立命館大院・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp

agricultural waste, environmental bacteria, waste

有機物による土壌肥沃度向上に関する研究○大西 智也, Tran Quoc Thinh, 久保 幹
（立命館大院・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp【背景・目的】近年、野菜のミネラル含有量は昔と比べて大幅に減少している。
この原因の一つとして、有機農法において栄養分として土壌に加える堆肥のミ
ネラル含有量が低下している可能性が示唆された。堆肥のミネラル含有量の特徴を調査することで、十分にミネラルを含む肥料の設計が可能となる。本研究では、適切な肥料設計を可能にするため、様々な堆肥および有機資材の成分含有量のデータベースを作成し、それぞれの堆肥の特徴を分析することを目的とした。
【方法・結果】それぞれの堆肥の特徴を分析するため、堆肥（牛糞, 鶏糞, 馬糞,
豚糞, 植物由来）ついて、多量要素（C, N, P, K）および中量・微量要素である
ミネラル (Ca, Mg, Fe, Mn, Zn) 含有量の測定を行い、データベースを作成した。
堆肥の種類ごとの多量要素含有量の平均値を比較すると、C, N, P, K の最大は鶏糞堆肥で 241,200 mg/kg, 30,700 mg/kg, 17,600 mg/kg, 25,300 mg/kg であった。豚糞堆肥は C, N, P の含有量が鶏糞堆肥の次に高く、鶏糞堆肥と豚糞堆肥は肥料的効果が高いことが分かった。次に、ミネラル含有量の平均値を比較すると、Ca,
Mg の最大は鶏糞堆肥で 82,800 mg/kg, 9,700 mg/kg であった。Fe, Mn の最大は植物由来堆肥で 5,000 mg/kg, 680 mg/kg であった。Zn の最大は豚糞堆肥で 650
mg/kg であった。これらの結果から、堆肥の中でも鶏糞堆肥と豚糞堆肥は、肥料的効果を持つだけでなく、Ca, Mg 供給源となる可能性が示唆された。同様に、植物由来堆肥についても Fe, Mn の供給源となる可能性が示唆された。

【背景・目的】発酵有機資材（堆肥）と未発酵有機資材の組み合わせによる施肥
により、農地の肥沃度や物質循環の向上する方法を確立してきた。しかし、肥沃土の低い土地において適切な有機資材施肥がどのような影響を及ぼすかは分
かっていない。本研究では、土壌肥沃度指標 (SOFIX) に基づく新規有機肥料を開発するとともに、肥沃土の低い土地に活用できるか否かを検証した。
【方法・結果】有機資材施肥の肥沃度向上に及ぼす影響を調べるため、3 つの実験を行った。荒地の肥沃度を向上させるための新規の有機肥料を作製し、SOFIXに基づいた施肥前の土壌の分析 (全炭素量、全窒素量、全リン量、全カリウム量) を行い、有機資材 (牛糞堆肥、鶏糞堆肥、米ぬか、油カス、大豆カス、骨粉) を用いて有機肥料を作製した。1 週間ごとに土壌の生物性(総細菌数、窒素循環活性評価値、リン循環活性評価値) を 1 ヶ月間測定し、経時変化を解析した。その後、作製した有機肥料が実圃場にも使用できるか調査した。土壌の生物性の経時変化、化学性、物理性の変化を測定し、荒地に対する有機資材の効果を調査した。リンを豊富に含む資材である米ぬかや鶏糞を中心に新規の有機肥料の投入により、施肥前に不足していた全炭素量、全窒素量、全リン量が改善され、有機資材を施肥したことで土壌総細菌数は増加した。実圃場では、有機資材の適切な施肥によりリン循環活性評価値が増加した。また、総細菌数、窒素循環活性評価値も有機施肥によって増加した。これらにより土壌の物質循
環が向上し、無機態栄養素であるアンモニア態窒素、硝酸態窒素、可給態リンも大きく増加した。さらに、最大保水容量、土壌の三相分析 (気相:液相:固相)の割合も改善された。これらの結果から、適切な有機物施肥により土壌肥沃度が向上し、荒地が実圃場としての活用に繋がったことが示唆された。

Advancement through analysis of mineral composition of compost

Study on improvement of soil fertility by using organic fertilizers○Kohei Kamitani, Quoc Thinh Tran, Motoki Kubo
(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words

compost, micronutrients○Tomoya Onishi, Thinh Tran Quoc, Motoki Kubo
(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words

soil, organic fertilizer, soil fertility

280

3Np10
学

コーヒーかす抽出液を利用した出芽酵母によるバイオス
ティミュラントの生産

3Np12

クロレラ残渣が植物成長に対する生物刺激剤としての効果○岡崎 飛鳥, 久保 幹, Tran Quoc Thinh（立命館大院・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp○河智 夏希 1, 高木 啓詞 2, 弘埜 陽子 1, 菊川 寛史 1, 原 清敬 1
（1 静県大院・薬食生命, 2 静岡県工業技術研究所 沼津工業技術支援センター）k-hara@u-shizuoka-ken.ac.jp

現在、コーヒー飲料製造会社やカフェ、コンビニエンスストアからコーヒーかすが大量に排出されており、一部は堆肥化や燃料化がされているが、大部分はそのまま廃棄されているため、高機能化によるさらなる活用が求められている。
そこで本研究では、コーヒーかす抽出液を利用して植物活性化作用をもつグル
タチオンと 5-アミノレブリン酸（5-ALA）を酵母で同時生産することを目的とし、その最適培養条件を検討した。
実際にカフェから排出されたコーヒーかすを乾燥させ、蒸留水を加えてオート
クレーブで成分抽出したろ液をコーヒーかす抽出液とした。カフェイン濃度を指標にしてコーヒーかす抽出液を培養液に添加し、コーヒーかす抽出液耐性株
である Saccharomyces cerevisiae を培養した。培養後の細胞増殖、グルタチオン
生産量、5-ALA 生産量を測定した。
本株における培養 24 時間後の細胞増殖、グルタチオン生産量および 5-ALA 生
産量は、カフェイン濃度を 700〜1700 mg/L に調節したコーヒーかす抽出液を添加した培地で高くなった。カフェイン試薬を添加した培地では細胞増殖促進は見られなかったが、コーヒーかす抽出液をカフェイン濃度 0〜1700 mg/L の範囲で添加した培地において、コーヒーかす抽出液濃度増加に伴う細胞濃度の増加が見られ、さらに、グルタチオン生産量の増加も見られた。
コーヒーかす抽出液を添加した培地での、コーヒーかす抽出液耐性を持つ出芽酵母の培養において、コーヒーかす抽出液に含まれる細胞増殖促進成分により、グルタチオン生産量、5-ALA 生産量が増加することが明らかとなった。

【背景】
クロレラはタンパク質や脂質、炭水化物、ミネラルなどの豊富な栄養成分を含
み、、ヘルスケア食品、バイオ燃料、動物/水産養殖飼料、土壌添加物、栄養補
助食品、顔料、化粧品の原料として幅広く利用されている。これらの利用のために、クロレラから脂質やタンパク質を抽出後、多くのクロレラ残渣が副生成物として生産される。現在、副生成物であるクロレラ残渣は利用されておらず、新たな利用方法が模索されている。本研究では農業用資材に利用することを目的として、植物に対する生物刺激剤としての効果を検証した。
【方法・結果】
本実験では、クロレラ残渣に含まれる成分分析を行い、農業用資材として利用可能か調べた。クロレラ残渣が土壌微生物に与える影響を eDNA 法で測定した。クロレラ残渣の植物に対する生物刺激剤としての効果を検証するために、
アブラナ科アブラナ属のコマツナ（Brassica rapa var. perviridis）とヒユ科アカザ亜科ホウレンソウ属のホウレンソウ（Spinacia oleracea）を対象として、可食部室重量に与える影響について調べた。クロレラ残渣を投与した際の、土壌中に存在する微生物量を測定した。元の土壌中に存在していた総細菌数（9.9×108
cells/g）に対して、クロレラ残渣 1%添加資材では、総細菌数（2.42×109 cells/g）、
クロレラ残渣 5%添加資材では、総細菌数（2.11×109 cells/g）と増加傾向が見られた。クロレラ残渣が植物成長に及ぼす影響について、小松菜とほうれん草を実験植物として実験をおこなった。小松菜ではクロレラ残渣 0.5%、1.0%を添加して、可食部室重量がそれぞれ 1.64 倍、1.75 倍に増加した。同様にほうれん草
でもクロレラ残渣 0.5%、1.0%を添加して、可食部室重量がそれぞれ 1.25 倍、1.55 倍に増加した。このことから、クロレラ残渣は小松菜およびほうれん草に
生物刺激剤としての効果が示唆された。

Biostimulant production by Saccharomyces cerevisiae using spent coffee
grounds extract

Biostimulant effect of chlorella residue for plant growth and soil fertility○Natsuki Kawachi1, Hiroshi Takagi2, Yoko Hirono1, Hiroshi Kikukawa1,
Kiyotaka Hara1(1 Grad. Sch. Integr. Pharm. Nutr. Sci., Univ. Shizuoka, 2 Numazu Technical Support
Center Industrial Research Institute of Shizuoka Prefecture)○Asuka Okazaki, Motoki Kubo, Quoc Thinh Tran
(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, glutathione, 5-amino levulinic acidKey words

biostimulant, chlorella, soil bacteria

3Np11

Photothermal Applications of Spent Coffee Grounds

3Np13

植物生長に対する藻類培養液のバイオスティミュラント
効果○Chien Hsiu-Wen(National Kaohsiung University of Science and Technology)
hsiu-wen.chien@nkust.edu.tw○沖本 和香奈, Tran Quoc Thinh, 久保 幹
（立命館大院・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp

This study investigates the remarkable photothermal properties and potential
applications of melanoidin-enriched spent coffee grounds (SCGs). Photothermal
effects, which involve the conversion of electromagnetic radiation into heat, have been
observed in various materials, including metals, carbon-based materials, and organics.
However, these materials are often artificial and not environmentally friendly. To
address this, we directly utilize SCGs as photothermal materials, exploring theirperformance under near-infrared (NIR) light at 808 nm. We also aim to incorporate
SCGs with polymer materials for applications in water purification. Our findings
confirm the photothermal capability of SCGs, with a rapid temperature rise to 344°C
within 2 mins of NIR irradiation. Moreover, SCGs exhibit excellent heating
reproducibility and stability, making them suitable for repeated use. Subsequently, we
combine SCGs with chitosan (CS) to create homogeneous and porous CS/SCGs
composites, utilizing waste materials in an affordable and eco-friendly manner. These
CS/SCGs composites not only exhibit photothermal properties under NIR irradiation
but also demonstrate outstanding performance in water evaporation experiments. Byleveraging the photothermal effect, these composites exhibit remarkable bacteria
removal capabilities while effectively eliminating heavy metal ions from the water.
This dual functionality highlights the potential of CS/SCGs composites as a sustainable
solution for water purification applications.

【背景】近年では食料増収のために主に農薬や化学肥料が用いられているが、これらを長期間使用することは環境への負荷が大きい。そこで、それらよりも環境に優しいバイオスティミュラント（以下 BS）の利用が進められている。BS
とは、植物やその周辺環境が本来持つ自然な力を活用することにより、植物や土壌により良い生理状態をもたらす、様々な物質や微生物のことである。BS の例に、微細藻類の一種であるクロレラやスピルリナなどがある。一方で、藻類を培養する際に副産物として得られる藻類培養液の有用な利用方法はまだ確立されていない。本研究では、藻類培養液を散布した土壌でコマツナを栽培し、その植物生長への影響を評価することによって、藻類培養液の BS としての効果を調査することを目的とした。
【方法及び結果】藻類培養液の散布による植物生長への影響を調査するため、各藻類培養液を散布し、コマツナを栽培した。ワグネルポットに有機標準土壌を充填し、ポット 1 つあたりコマツナの苗を 3 つずつ定植した。その後、3 日おきに各液 50 mL/kg ずつを散布し、土壌含水率 20〜30%で 4 週間コマツナを栽培した。また、水を散布した条件をコントロールとした。栽培終了後、可食部の重量測定、根の形成調査、およびコマツナ内の含有物分析（全炭素量（TC）、
全窒素量（TN）、全リン量（TP）、全カリウム量（TK））を行った。その結果、
可食部重量は藻類培養液を散布した方が無添加より 1.2〜1.5 倍増加した。また、根に関しても、藻類培養液を散布した方が無添加より発達していた。含有物分析に関しては、TC、TN、TP は藻類培養液の方が無添加より高かった。一方、TK は藻類培養液の方が無添加より低かった。したがって、藻類培養液には植物生育を促進する効果がある。

Photothermal Applications of Spent Coffee Grounds

Effects of microalgae liquid as a biostimulant on plant growth○Chien Hsiu-Wen(National Kaohsiung University of Science and Technology)

Key words

waste, chitosan, coffee grounds, wastewater treatment○Wakana Okimoto, Quoc Thinh Tran, Motoki Kubo
(Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words

microalgae, biostimulant, plant growth

281

3Np14
学

竹を固体培地として用いた有用酵素生産に関する研究○角南 茉耶 1, 佐々木 千鶴 2, 松浦 一雄 3, 大政 健史 4
（1 徳島大院・創成科学, 2 徳島大院・社会産理工, 3 ナノミストテ
クノロジーズ(株), 4 阪大院・工）chizurusasaki@tokushima-u.ac.jp

3Np16

Toward Net-Zero agrifood industrial cycle throughinsect-based biorefinery○Yu-Shen Cheng1,2(1 Dept. Chem. & Mater. Eng., Coll. Eng., Nat'l Yunlin U. Sci. Tech.,
2
Coll. Future., Nat'l Yunlin U. Sci. Tech.)yscheng@yuntech.edu.tw

本研究では安価かつ高力価なセルラーゼの生産を目的として、我が国で有効利用が望まれている植物バイオマスの１つである竹を基質とした固体培養法によるセルラーゼの生産に着目した。固体培養法のメリットは、高重量の培地を振盪する動力エネルギーが必要ないこと、セルラーゼ生産菌（カビ）の生育環境を模倣することで、特異機能活性の産生が期待できることなどがある。
タケ（孟宗竹）は、500 μm 以下に粉砕されたものを使用した。セルラーゼ生産
菌はセルラーゼ生産性が高いとされるトリコデルマ属の Trichoderma reesei を使用した。培養温度は一般的な温度である 30℃を基準とし、26℃、22℃、18℃を検討した。培地の C/N 比を変化させるため、小麦ふすまを重量比でタケ:小麦ふ
すま=4：1、1：1、1：4 で添加し、産生セルラーゼ活性を比較した。T. reesei を前培養（30℃、48h、180 rpm で振盪培養）し、生育した菌体を集菌後、培地に接種し、10 日間培養した。培養終了後、培地に緩衝液を添加し、セルラーゼを抽出した。セルラーゼ活性は、ろ紙分解活性（Filter Paper Unit、FPU）により総合的に評価した。加えて CMCase 活性、Xylanase 活性、β-glucosidase 活性を測定し、それぞれ評価した。
タケを固体培地として T. reesei によりセルラーゼが生産されることがわかった（30℃、2.3 FPU/g-タケ、10 日目）。また、22℃の培養温度では、30℃で得られたものより高いセルラーゼ活性（4.4 FPU/g-タケ、8 日目）が得られることがわかった。タケと小麦ふすまを 1:1 で混合した培地（C/N 比=29.7、22℃）では、最大 FPU 活性（6.8 FPU/g-培地、8 日目）が得られた。加えて、本培養条件において高い β-glucosidase 活性（55.5 U/g-培地）が得られることが明らかとなった。これはタケのみを基質として 30℃で培養して得られる β-glucosidase 活性（4.5 U/g-タケ）の約 12 倍に相当した。

In the global agrifood industry, substantial waste material is generated, often discardedin ways that exacerbate environmental issues such as air, soil, and water pollution. This
waste comprises agricultural residues, food processing byproducts, and animal manure,which, if improperly managed, lead to resource wastage, environmental pollution, andcommunity disturbances. Insect-based biorefinery is seen as an integrated solution for
the agrifood industry. This emerging technology employs insects to transform waste
into valuable outputs such as proteins, lipids, and frass (insect waste), which can beused in animal feed, biofuel production, and biogas generation. Not only does thisapproach help mitigate the environmental impact of waste, it also reduces dependenceon traditional energy sources. Insect-based biorefinery represents a green and circular
economy model for the agrifood sector, effectively closing the loop between waste
generation and resource use. Our research aims to further develop and optimize thistechnology, with a focus on key aspects such as insect breeding, species selection, andfeed formulation. The ultimate goal of insect-based biorefinery is to create a net-zerocarbon emission strategy for the agrifood industry, by integrating waste management,
energy production, and product development through insect biorefinery. By developing
this system, we aim to create a sustainable environment and promote industryacademia collaboration, contributing to the larger goal of global sustainability.

Enzyme production through solid state fermentation using bamboo

Toward Net-Zero agrifood industrial cycle through insect-based biorefinery○Maya Sunami1, Chizuru Sasaki2, Kazuo Matsuura3, Takeshi Omasa4(1 Grad. Sch. Sci. Technol, Tokushima Univ., 2 Grad. Sch. Biosci. Bioind, Tokushima
Univ., 3 NanoMist Technologies Co., Ltd., 4 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)○Yu-Shen Cheng1,2(1 Dept. Chem. & Mater. Eng., Coll. Eng., Nat'l Yunlin U. Sci. Tech., 2 Coll. Future.,
Nat'l Yunlin U. Sci. Tech.)

Key words

cellulase, solid state fermentation, fungus

Key words

insect, biomass, biorefinery, circular economy

3Np15

緑膿菌バイオフィルム形成を抑制する Bacillus sp. A13
株代謝物の特性解析

3Op01

リグニンからの芳香族ポリマー原料の選択的生産 (第 2報)： Pseudomonas sp. MHK4 株由来アセトバニロン変換酵素系 のバニリン酸生産への適用

学○八又 翔風 1, 松村 吉信 2,3（1 関西大院・理工, 2 関西大・化生工, 3 関西大・ORDIST）
ymatsu@kansai-u.ac.jp

学○入山 就 1, 鎌田 真未 2, 増井 ゆい 1, 樋口 雄大 2, 大関 さおり 2,
坂本 千穂 2, 上村 直史 3, 政井 英司 3, 園木 和典 2
（1 弘前大院・農生, 2 弘前大・農生, 3 長岡技科大・物質生物）
sonoki@hirosaki-u.ac.jp【背景】バイオフィルム（BF）は、多種多様な細菌が高密度で生息する集団で、固体表面への強力な付着や BF 細胞の高い薬剤耐性といった単一の浮遊細菌の性質を超えた特徴を示し、その殺菌・除去が困難となっている。そこで当研究室では、BF が成熟する前に細胞の機能を変化させ、BF 形成を抑制する物質の探索を行っている。これまでに自然界から単離した微生物の培養液を用いて、Pseudomonas aeruginosa PAO1 株の BF 形成能を抑制する天然物を探索した結果、Bacillus sp. A13 株の培養液にその活性が確認された。本研究では A13 株の、BF 形成抑制に関わる本物質の精製と PAO1 株以外の BF 形成細菌に対するBF 抑制効果について検証を行った。
【方法】BF 形成菌株として PAO1 株と Staphylococcus aureus NBRC13276 株、
Serratia marcescens ATCC274 株、Klebsiella pneumoniae IAM12351 株を使用した。
BF 形成に影響を及ぼす菌株として A13 株を用いた。BF は、ポリスチレン製マ
イクロタイタープレートを用い、37℃、2 時間で形成させた。BF 定量はクリス
タルバイオレット染色法を用いて A570 で評価した。
【結果】A13 株の 2〜48 時間培養した培養液に含まれる BF 形成抑制物質の生産量を調査した。その結果、PAO1 株の BF 形成は、24 時間培養した A13 株培養液で最も高い抑制効果が確認された。さらに、その他の BF 形成菌、S. aureus、
S. marcescens、K. pneumoniae に対する BF 形成抑制効果を検証した結果、どの菌株においても抑制効果が見られた。A13 株培養液を、HPTLC シリカゲル 60
RP-8 F254s を用いた薄層クロマトグラフィー分析と InertSustain C8 カラムとDAD 検出器を用いた高速液体クロマトグラフィー分析した結果、BF 形成抑制物質の可能性がある物質の検出に成功した。今後は本物質を回収し、BF 形成抑制効果の確認と構造特定を行う予定である。

我々はリグニンに由来する多様な芳香族化合物を資化する Pseudomonas sp.
NGC7 株を利用して, リグニンを化学的に低分子化して生成する芳香族化合物の混合物から, ポリマー原料等の有用物質を効率よく生産する微生物株の作出に取り組んでいる。これまでに, 針葉樹由来のサルファイトリグニンをアルカリ酸化
分解して得られるアセトバニロン (AV), バニリン, バニリン酸 (VA) を主成分とする混合物から, PET 様ポリマー等の合成原料である VA を高収率で生産する微生物株の作出について報告した 1)。この株では Sphingobium sp. SYK-6 株由来の
8 つの遺伝子 [acvABCDEF, vceA, vceB (以下, acv, vce)] を導入し, カルボキシル化
等 5 段階の反応により AV を VA へと変換した。一方で, 我々は Pseudomonas sp.
MHK4 株由来の 3 つの遺伝子 (acpCAB) から成る酵素系が, 2 段階の酸素添加反応により AV を VA へと変換することを明らかにした 2)。そこで本研究では, 針葉樹サルファイトリグニン分解物からの VA 生産能に対する acpCAB 発現の効果を評価した。
NGC7 株に acpCAB をプラスミドで導入した組換え体の AV 変換速度は, acv, vce
導入株の約 0.6 倍であった。しかしコドンの使用頻度とリボソーム結合部位の改良により (acpCABopt), 変換速度は約 35 倍に向上した。そこで VA 収率を向上させるために VA O-demethylase 遺伝子群と vanillin reductase 遺伝子を破壊した
NGC7 株のゲノム DNA に, tac promoter 配列下へ連結した acpCABopt を挿入し,VA 生産株を作出した。acpCABopt 導入株は針葉樹サルファイトリグニン分解物
モデル中の AV を速やかに VA ヘと変換した。
本 研 究 は JSPS 科 研 費 (JP20K22560, JP22K14808), JST 未 来 社 会 創 造 事 業(JPMJMI19E2) の支援を受けて実施した。
1) 鎌田真未ら, 第 74 回日本生物工学会要旨集, p.173, 2022.
2) 増井ゆいら, 日本農芸化学会 2023 年度大会要旨集, p.928, 2023.

Characterization of metabolites from Bacillus sp. A13 that inhibit biofilm
formation in Pseudomonas aeruginosa.

Selective production of aromatic compounds from lignin (II): Application of
the enzymes for acetovanillone catabolism from Pseudomonas sp. MHK4 tovanillate production.

○Shobu Hachimata , Yoshinobu Matsumura(1 Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ., 2 Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ.,
3
ORDIST. Kansai Univ.)
1

Key words

2,3

biofilm, Pseudomonas aeruginosa○Shu Iriyama1, Mami Kamada2, Yui Masui1, Yudai Higuchi2, Saori Ozeki2,
Chiho Sakamoto2, Naofumi Kamimura3, Eiji Masai3, Tomonori Sonoki2(1 Grad. Sch. Agric. Life Sci., Hirosaki Univ., 2 Fac. Agric. Life Sci., Hirosaki Univ.,
3
Dept. Mater. Sci. Bioeng., Nagaoka Univ. Technol.)Key words
lignin, Pseudomonas, acetovanillone, vanillic acid

282

3Op02
学

リグニンからの芳香族ポリマー原料の選択的生産 (第 3報): バガスオルガノソルブリグニン由来の多様な芳香族化合物からバニリン酸を選択的に生産する微生物株の作出○村木 香渚美 1, 鎌田 真未 1, 大関 さおり 1, 池田 和磨 1,
児玉 直弥 2, 石丸 裕也 3, 樋口 雄大 1, 吉川 琢也 4, 吉田 曉弘 5,
上村 直史 6, 政井 英司 6, 中坂 佑太 3, 増田 隆夫 3, 園木 和典 1
（1 弘前大・農生, 2 弘前大院・農生, 3 北大院・工, 4 帯広畜産大・
環境農学, 5 弘前大・地域戦略研, 6 長岡技科大・物質生物）
sonoki@hirosaki-u.ac.jp

本研究では, 草本・木質系バイオマスの主要成分であるリグニンに由来する多様な芳香族化合物を資化する Pseudomonas sp. NGC7 株を利用して, サトウキビバ
ガス由来のオルガノソルブリグニンから PET 様ポリマー等の合成原料であるバ
ニリン酸 (VA) を選択的に生産できる微生物株の作出を目的とした。
水酸化銅を触媒としたアルカリ酸化分解反応によりリグニンを処理した後, 溶剤分画をして低分子量の画分を得た。この画分には, グアイアシル核, シリンギル
核, p-ヒドロキシフェニル核を有する化合物を含む少なくとも 11 種類の芳香族モノマーが含まれていた。これらの混合物から VA を選択的に生産するために,
VA 分解に主要に関わる vanA4B4 を破壊した。また, VA の前駆体であるバニリン (VN) をバニリルアルコールへ還元する VN reductase 遺伝子 (areA) も破壊した。そして Sphingobium sp. SYK-6 株由来のアセトフェノン類変換酵素遺伝子群[acvABCDEF, vceA, vceB (以下 acv, vce)] をプラスミドで導入し, アセトフェノン類の変換能を付与した。作出した株を用いてバガスオルガノソルブリグニン分
解物モデルからの VA 生産能を評価した結果, シリンガ酸 (SA) の分解に主要に関わる vanA1B1 を保持しているにもかかわらず, SA が VA とともに蓄積した。
VA と SA は互いにアナログであるため, 蓄積した VA が SA 代謝に競合的に作用したと考えられた。ニトロソグアニジンを用いて NGC7ΔvanA4B4 株に突然変異を誘発した結果, 変異株集団から SA を良好に分解しながら VA を蓄積する株を取得できた。この変異株の areA を破壊し, acv, vce をプラスミドで導入した組換え体は, 分解物モデルから高収率で VA を生産できた。現在, バガスオルガノソ
ルブリグニン分解物からの VA 生産評価を進めている。
本研究は JST 未来社会創造事業 (JPMJMI19E2), 弘前大学若手研究者支援事業の支援を受けて実施した。

Selective production of aromatic compounds from lignin (III): An
engineered bacterial strain that produces vanillate from a mixture ofaromatic compounds derived from bagasse organosolv lignin.

○Kanami Muraki1, Mami Kamada1, Saori Ozeki1, Kazuma Ikeda1, Naoya Kodama2,
Hiroya Ishimaru3, Yudai Higuchi1, Takuya Yoshikawa4, Akihiro Yoshida5,
Naofumi Kamimura6, Eiji Masai6, Yuta Nakasaka3, Takao Masuda3,
Tomonori Sonoki1(1 Fac. Agric. Life Sci., Hirosaki Univ., 2 Grad. Sch. Agric. Life Sci., Hirosaki Univ.,
3
Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ., 4 Div. Environ. Agric. Eng., Obihiro Univ. Agric.
Vet. Med., 5 Inst. Regional Innovation, Hirosaki Univ., 6 Dept. Mater. Sci. Bioeng.,
Nagaoka Univ. Technol.)Key words
lignin, Pseudomonas, vanillic acid

3Op03
学

リグニンからの芳香族ポリマー原料の選択的生産 (第 4報) : バガスオルガノソルブリグニン由来の多様な芳香族化合物からバニリン酸の生産を可能にする有効変異の
同定

3Op04

Enrichment of halotolerant hydrogen-oxidizing bacteria
and production of high-value-added hydroxyectoine
using a hybrid biological inorganic system○Xiang Feng1, Daichi Kazama1, Sijia He1, Hideki Nakayama2,
Kozo Sato1, Hajime Kobayashi1(1 Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo, 2 Grad. Sch. Fish. Sci. Environ.
Stud., Nagasaki Univ.)
kobayashi@frcer.t.u-tokyo.ac.jp

Hybrid biological–inorganic (HBI) systems show great promise as CO2 conversion
platforms combining CO2 fixation by hydrogen-oxidizing bacteria (HOB) with water
splitting. Herein, to identify new biocatalysts, halotolerant HOB were enriched using
an HBI system with a high-ionic-strength medium containing 180 mM phosphatebuffer. The reactors were inoculated with samples from saline environments andoperated at an applied voltage of 2.0 V. Once an increase in biomass was observed with
CO2 consumption, an aliquot of the reactor medium was transferred to a new reactor.
After two successive subcultures, Achromobacter xylosoxidans strain H1_3_1 andMycolicibacterium mageritense strain H4_3_1 were isolated from the reactor media.
Genome sequencing confirmed the presence of genes for aerobic hydrogen-oxidizing
chemolithoautotrophy and synthesis of the compatible solute hydroxyectoine in bothstrains. Furthermore, both strains produced hydroxyectoine in the reactors under thehigh-ionic-strength condition, suggesting the potential for new HBI systems using
halotolerant HOB to produce high-value-added chemicals.

Enrichment of halotolerant hydrogen-oxidizing bacteria and production ofhigh-value-added hydroxyectoine using a hybrid biological inorganic system○Xiang Feng1, Daichi Kazama1, Sijia He1, Hideki Nakayama2, Kozo Sato1,
Hajime Kobayashi1(1 Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo, 2 Grad. Sch. Fish. Sci. Environ. Stud., Nagasaki
Univ.)

Key words
hydrogen-oxidizing bacteria, hybrid biological–inorganic system,
carbon dioxide fixition, bioelectrochemical synthesis

3Op05
学

○池田 和磨 1, 児玉 直弥 2, 村木 香渚美 1, 大川 全 3, 樋口 雄大 1,
上村 直史 3, 政井 英司 3, 園木 和典 1
（1 弘前大・農生, 2 弘前大院・農生, 3 長岡技科大）sonoki@hirosaki-u.ac.jp

Rhizopus 属糸状菌によるペーパースラッジからのコハ
ク酸生産○海谷 美佳, 森脇 真希（富山大院・理工）mtakano@eng.u-toyama.ac.jp

我々はリグニン由来の多様な芳香族化合物を資化する Pseudomonas sp. NGC7 株を用いて, サトウキビバガスから調製したオルガノソルブリグニンをアルカリ水
酸化銅酸化分解して得られる芳香族化合物の混合物から, PET 様ポリマー等の合成原料であるバニリン酸 (VA) を選択的に生産できる微生物株を作出した 1)。
この作出過程では, VA の蓄積に伴って VA のアナログであるシリンガ酸 (SA) も蓄積されたが, ニトロソグアニジン (NTG) を用いた突然変異誘発によって VAを蓄積しながら SA を分解できる変異株 (NTG 変異株) が複数得られた。そこで
本研究では VA を蓄積しながら SA を分解する表現型の獲得に関わる変異点を明らかにすることを目的とした。
ゲノム DNA 解析から, 複数の NTG 変異株に共通して GntR family transcriptional
regulator 遺伝子 (vanR2) のコード領域に点変異が確認された。VanR2 は SA の分解に主要に関与する vanA1B1 を含む vanB2-B1 オペロンの発現を負に制御する
転写制御因子であることから 2), vanR2 への点変異が NTG 変異株の表現型に関わることが推定された。そこで野生型 vanR2 を点変異型 vanR2 で置換し, VA 蓄積条件下での SA 分解能を評価した結果, vanR2 への点変異が NTG 変異株の表
現型に関わることが示された。また vanR2 を欠失させて同条件での SA 分解能を評価した結果, 同じく VA を蓄積しながら SA を分解した。以上より, グアイ
アシル核, シリンギル核, p-ヒドロキシフェニル核を有する化合物が混在するバ
ガスオルガノソルブリグニン分解物から VA を選択的に生産するためには, vanR2の欠失が有効であることを明らかにした。
本研究は JST 未来社会創造事業 (JPMJMI19E2), 弘前大学若手研究者支援事業の支援を受けて実施した。
1) 村木香渚美ら, 第 75 回日本生物工学会大会, 2023.
2) 大川全ら, 第 67 回リグニン討論会要旨集, p 60, 2022.

コハク酸は様々な化学製品の原料として利用されている。近年は環境への配慮のため、微生物によるバイオマスからのコハク酸発酵生産が注目されている。
本研究では Rhizopus 属糸状菌を用いて、廃棄物系バイオマスであるペーパース
ラッジ（PS）からのコハク酸生産について検討した。本研究では Rhizopus delemar
NBRC4754 を使用し、グルコース 50 g/L、28℃で好気振とう培養を行った。また、培地組成の検討を行った。変異株のスクリーニングにはアリルアルコール添加培地や変異株の有機酸高生産の指標として BPB 添加培地を用いた。また、PS（中越パルプ工業(株)）の前処理には炭酸ガス処理を行った。さらに、セルラーゼと NBRC4754 を用いた PS の同時糖化発酵（SSF）によるコハク酸生産について検討した。培養液内の糖質と有機酸は HPLC によって定量分析した。
NBRC4754 は好気条件において 50 g/L のグルコースから 0.9 g/L のコハク酸を生産するとともに、エタノールや TCA サイクル下流のフマル酸やリンゴ酸が蓄積していた。そこで、コハク酸からこれらへの変換を抑制するために培地成分の検討を行った。その結果、培養中期での CaCO3 添加やチアミン添加などにより、コハク酸生産量は 1.5 倍増加した。一方、バイオマスとして利用する PS について、未処理 PS の糖質含量は 188 g/kg であった。この未処理 PS について、
セルラーゼおよび NBRC4754 を用いて SSF を行った結果、0.33 g/L のコハク酸しか生産できなかった。PS 中の無機成分がコハク酸生産を阻害していると考えられたため、PS の炭酸ガス処理による無機成分除去を行った。その結果、炭酸ガスにより PS 中の無機成分が中和除去されセルロースが露出することにより、処理 PS の糖質含量は 303 g/kg に改善された。現在、さらなる培地条件の検討
や炭酸ガス処理 PS を用いた SSF、有用変異株の取得、変異株の酵素活性について検討中である。

Selective production of aromatic compounds from lignin (IV): Identificationof an effective mutation for the development of a bacterial strain that
produces vanillate from bagasse organosolve lignin.

Production of succinic acid from paper sludge using Rhizopus fungus○Kazuma Ikeda1, Naoya Kodama2, Kanami Muraki1, Zen Okawa3, Yudai Higuchi1,
Naofumi Kamimura3, Eiji Masai3, Tomonori Sonoki1(1 Fac. Agric. Life Sci., Hirosaki Univ., 2 Grad. Sch. Agric. Life Sci., Hirosaki Univ.,
3
Nagaoka Univ. Technol.)Key words
lignin, Pseudomonas, vanillic acid, transcriptional regulation○Mika Kaiya, Maki Moriwaki(Grad. Sch. Sci. Eng., Univ. Toyama)

Key words

Rhizopus sp., fermentation, biomass, succinate

283

3Op06

Utilization of nipa sap as inexpensive nutrient source for
Moorella thermoacetica (f. Clostridium thermoaceticum)
Nguyen Dung Van, ○Harifara Rabemanolontsoa(Grad. Sch. Energy Sci., Kyoto Univ.)
rabemanolontsoa.harifara.5c@kyoto-u.ac.jp

3Op08
学

細胞プラスチックス形成における細胞内容物の多角的な特性評価○根本 進太郎 1, 入谷 康平 2, 中西 昭仁 1,3（1 東京工科大院・バイオニクス, 2 東京工科大・工, 3 東京工科大・応生）
nakanishiah@stf.teu.ac.jp

Nipa sap is the liquid or sap obtained from the inflorescence or flower stalk of nipa
palm (Nypa fruticans). It contains essential minerals, vitamins, and sugar and can be avaluable microbial nutrient and carbon source.
In this study, the industrially important Moorella thermoacetica successfully fermented
nipa sap into acetic acid without the need for additional trace metals, inorganics, or
yeast extract supplements. While microbial growth kinetics varied under different
nutrient conditions, the acetic acid concentrations achieved without these supplements
were comparable to those obtained with full nutrients. These findings confirm that nipa
sap is a valuable nutrient source for M. thermoacetica. Both vial and fermenter-based
fermentations exhibited similar trends in acetic acid production, although fermenters
yielded higher concentrations. Economic analysis revealed that the most profitable
nutrient condition was without yeast extract, resulting in a significant reduction in
culture medium cost from $1.7 to only $0.3 per liter. This cost reduction was possible
due to the availability of nipa sap at a price of $0.08 per kilogram, while yeast extract
costs $281 per kilogram.
The utilization of a minimal medium instead of a complex nutrient simplifies theprocess. Moreover, this research paves the way for economically viable anaerobic codigestion and co-fermentation of nipa sap with other biomass resources, leveraging
nipa sap as an affordable nutrient source and substrate.

【目的】単細胞緑藻細胞を材料とした細胞プラスチックスが提案されている。単細胞緑藻でプラスチックスを作製するには母材による細胞間の接合が必要であったことから、母材成分に細胞が産生する細胞接合因子の含有を期待して、当該株の細胞破砕液を利用した。以前の研究結果から緑藻細胞破砕液が母材として細胞間を接合することが示唆されたため、本研究では緑藻細胞破砕液をヘキサン分画し母材として準備した後に、各々を母材とした細胞プラスチックスの引張特性を評価することで、細胞内容物の何が細胞接合に寄与したかを明らかにすることを目的とした。
【方法】乾燥緑藻細胞 Chlamydomonas reinhardtii 200 mg は DW 20 mL で懸濁された。細胞懸濁液は超音波破砕され、細胞破砕液が得られた。細胞破砕液は遠心分離後、上清が回収された。回収上清全量が 20 ｍ L のヘキサンと混和され分画された。分画後、特定の画分はヘキサン 20 ｍ L が添加され、精製層として回収された。精製層を用いて細胞プラスチックスが作製され、引張強度試験
で力学特性が評価された。また、精製層はアンスロン法、GC-FID、BCA アッセイにより各成分が定量され、プロテオミクス解析された。
【結果と考察】精製層を 0.5wt%で母材として含む細胞プラチックスの引張特性
は 0.5wt%の含有率にも関わらず、分画前の細胞破砕液を 21wt%で母材として含む細胞プラスチックスの引張特性と同程度であった。従って、精製層における接合因子の含有が示唆された。精製層の各成分分析の結果、タンパク質が約60wt%を占めていたことから、より詳細な接合因子特定のために、精製層がプ
ロテオミクス解析された。その結果、タンパク質の大半は特定のアミノ酸高含
有の低次構造を外郭に持つことが判明した。このことから、これらの特徴を持
つタンパク質が細胞同士の接合に寄与した可能性が示された。

Utilization of nipa sap as inexpensive nutrient source for Moorella
thermoacetica (f. Clostridium thermoaceticum)

Evaluations of functions of intracellular contents as matrices in cell-plastic
formation

Nguyen Dung Van, ○Harifara Rabemanolontsoa(Grad. Sch. Energy Sci., Kyoto Univ.)○Shintaro Nemoto1, Kouhei Iritani2, Akihito Nakanishi1,3(1 Grad. Sch. Bionics Comput. Media Sci., Tokyo Univ. Technol., 2 Sch. Engr. Tokyo
Univ. Technol., 3 Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Univ. Technol.)Key words

acetic acid, Clostridium, medium, fermentation

Key words
proteome

Chlamydomonas reinhardtii, CO2 fixation, biodegradable plastic,

3Op07

硫酸化修飾による酵母の水溶液中からの重金属イオン回収能力の改善3Op09

持続可能な光触媒メッシュ微細藻類バイオリファイナ
リーシステムの開発

学○山田 こころ, 尾島 由紘, 東 雅之
（大阪公大院・工）azuma@omu.ac.jp○楊 英男, 張 程, 安 広キ
（筑波大院・生命環境）
yo.innan.fu@u.tsukuba.ac.jp【緒言】鉱工業排水に含まれる有害重金属に対して厳しい排水基準が設けられており、安価で環境負荷の少ない重金属除去技術が求められている。このような技術は有価重金属回収への応用も期待される。微生物等のバイオマスを吸着剤として用いる方法が検討されているが、低い吸着能が課題となっている。当研
究室では酵母に着目し細胞表面の多糖を化学修飾したリン酸基修飾酵母 (Pyeast)を作製し、重金属吸着能が高まり HCl 濃度の調整により希土類元素を優先的に吸着できることを明らかにした 1, 2)。本研究では、硫酸基修飾を加えた
酵母 (S-yeast)を作製し吸着性能のさらなる改善を目指した。
【実験方法】S-yeast は二つの方法で作製した。一つは、市販の乾燥酵母を DMFに懸濁し、SO3-Py 錯体とピリジンを添加後、75℃で 2 時間撹拌し作製した。他方は、乾燥酵母を N,N-ジメチルアセトアミドに懸濁し、アミド硫酸と 4-ジメチ
ルアミノピリジンを添加後、70℃で 3 時間撹拌し作製した。金属吸着量は吸着前後の溶液の金属濃度から算出した。
【結果と考察】元素分析によって酵母中のＳ含量を測定した。反応前は 0.1 mmol/
g-DW 程度に対し、S-yeast は SO3-Py 錯体を用いた場合は 3.2 mmol/g-DW、アミド硫酸を用いた場合は 3.9 mmol/g-DW となり大幅に増加した。Cu2+に対する吸着量は、100 ppm の溶液 4 mL に対して 2 mg 添加した場合、アミド硫酸で 2.0mmol/g-DW 程度、SO3-Py 錯体で 1.6 mmol/g-DW 程度を示し、P-yeast の重金属
(Cu2+) 吸着能 (約 1 mmol/g-DW) に比べ高い重金属吸着能を示した。また、2 価と 3 価(Dy3+) の重金属イオン混合溶液では、HCl 濃度の調整により Dy3+の優先的な吸着が可能であることが分かった。発表では S-yeast の特性と重金属吸着性能について報告する。
1) Ojima et al., Sci. Rep., 9:225 (2019).
2) Kihara et al., Environ. Technol. Innov., 30:103093 (2023).

Microalgae biorefinery, which produces carbohydrates, proteins and lipids, is apromising solution for addressing the energy crisis and food shortages. Sunlightactivated photocatalytic reactions have emerged as green strategies for microalgae
biorefinery. In this study, a photocatalytic mesh microalgae biorefinery (PMMB)
system was developed for the first time, which employed durable photocatalytic
meshes to destroy algal cells while maintaining smooth fluid flow and preventing
blockages. High efficiency was achieved by stacking photocatalytic meshes using
appropriate parameters and providing the suitable temperature and UV irradiancethrough solar energy control. In addition, the optimal algal concentration of 4 g·L-1,
which was used in the PMMB system, maximized biorefinery efficiency. Under actual
weather conditions, the PMMB system converted microalgae into carbohydrates (293mg·L-1), proteins (121 mg·L-1) and lipids (345 mg·L-1) within 60 hours,
demonstrating its practical feasibility. Compared with traditional microalgae
biorefinery methods, PMMB has demonstrated superior economics, practicalapplicability, and effectiveness. The global applicability evaluation also suggested that
the PMMB system could be accessible to all countries. Therefore, the PMMB system
could be a green and efficient microalgae biorefinery system to support sustainableglobal development.

Improvement of yeast adsorption performance for heavy metal ions inaqueous solution by sulfate modification

Development of a photocatalytic mesh microalgae biorefinery (PMMB)
system for sustainable biomass conversion○Kokoro Yamada, Yoshihiro Ojima, Masayuki Azuma(Grad. Sch. Eng., Osaka Metro. Univ.)

Key words

biosorption, yeast, wastewater treatment, sulfate modification○Yingnan Yang, Cheng Zhang, Guangqi An(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

sunlight, microalgae, biomass, titanium dioxide

284

3Op10
学

閉鎖型レースウェイ水槽における微細藻類沈殿機構に関する研究（水車パドルの回転によって形成される流路方
向縦渦の影響）3Op12

外部循環型フォトバイオリアクターを用いた遺伝子組換
えシアノバクテリアによるグリセロール生産○叶 静遠 1, 堀内 淳一 1, 熊田 陽一 1, 広川 安孝 2, 花井 泰三 2,
村上 明男 3, 小倉 慎也 1, 端 暸太 1, 武田 真由子 1（1 京工繊大院・工芸科学, 2 九大院・農, 3 神戸大院・工）horiuchi@kit.ac.jp○森野 魁人 1, 植田 芳昭 2, 酒井 祐介 3, 逢坂 竜之介 3（1 摂南大院・理工, 2 摂南大・理工, 3 熊谷組）
yoshiaki.ueda@mec.setsunan.ac.jp

近年、CO2 排出削減を目的とした活動の一環として、バイオ燃料が注目されており、原料となる微細藻類の生成が急がれている。微細藻類の培養には、主に開放型のレースウェイ水槽が使用され、水車を用いて内部を回流させる仕組みとなっている。しかし、時間経過ごとに微細藻類が水槽底部に堆積し、溜まった箇所で菌が繁殖することによる微細藻類の生産性低下が問題となっている。
そこで本研究では、微細藻類が堆積する箇所を導き出すことを目的とし、小型模型水槽を用いて堆積箇所の調査を行った。また、堆積する要因として、水車によって生成される水面波動の影響と水槽内部で発生する渦の影響の２つが挙げられる。本研究では内部流れを簡素化するため、水面に平板を被せて水面波動の影響を無くし、渦の影響だけに着目して実験を行った。さらに実機の水車は、特定の形状が決まっている訳ではなく、様々な形状の水車が使用されている。そこで、本研究では水車の形状に着目し、形状の違いによって堆積する箇所や流路内の渦構造に変化が生じるかを、流れの可視化実験を通して調査することにした。本実験では再現性を高めるため、微細藻類を模擬したトレーサ粒子を用いた。
結果は、水車の形状を変更することによって、異なった場所で粒子が堆積する
ことが確認できた。また、内部流れの調査をし、それぞれの水車で異なった渦が流路内に形成されていることも確認できた。
この結果は、実際のレースウェイ水槽において、微細藻類を重点的に撹拌させなければならないポイントの目安として非常に重要なものであると言える。さらに、堆積した箇所から集中的に微細藻類を回収することによって、効率的な微細藻類の回収ができ、大いに役立つと言える。
本学会では、水車によって流路内に形成される渦構造と、それに伴う粒子の堆積箇所の詳細について報告する予定である。

【背景・目的】地球環境問題や資源枯渇を背景として、微細藻類による光合成反応を利用して太陽エネルギーと二酸化炭素から直接有用物質生産を行う第三世
代型バイオリファイナリーが注目されている。本研究では、グリセロール合成
代謝経路を導入したシアノバクテリア Synechococcus elongatus によるグリセロー
ル生産に関する基礎的培養条件を検討するとともに、高菌体濃度時の光供給律速の改善のため、外部循環型ループを導入したフォトバイオリアクターを用いて、光照射面積の拡大によるグリセロール生産性の向上を目指した。
【方法】菌株には Synechococcus elongatus PCC7942 にグリセロール合成代謝経路を導入した TA3800 株 1) を使用した。培地には BG-11 に Spectinomycin (25 μg/mL)、IPTG (1 mM)を添加した。炭酸ガスを供給し pH を制御する pH-stat システ
ムと外部循環型ループを導入したフォトバイオリアクターを用いて種々の条件で回分培養を行なった。
【結果・考察】pH-stat システムを用いてグリセロール生産に最適な pH 条件と光強度の検討を行なったところ、エアリフト型バイオリアクターを用いた回分培養において、pH 8.0, 光強度 500 μE/m2/s の培養条件がグリセロール生産を促進させることが明らかとなった。一方、この条件において培養後期に高菌体濃度のため光供給律速となりグリセロール生産が抑制されたことから、外部循環型
ループを導入したフォトバイオリアクターを用いて更に検討を進めている。
1)Hirokawa, Y., et al., Metab. Eng. 34, 97-103 (2016)

Sedimentation mechanism of microalgae particles in a closed raceway pond
(Influence of streamwise vortices caused by a paddle rotation)

Glycerol production using genetically engineered cyanobacteria employing
photobioreactor with external circulation loop

○Kaito Morino1, Yoshiaki Ueda2, Yusuke Sakai3, Ryunosuke Osaka3(1 Grad. Sch. Sci. Eng., Setsunan Univ., 2 Setsunan Univ., 3 Kumagai Gumi Co., Ltd.)○Jingyuan Ye1, Jun-ichi Horiuchi1, Yoichi Kumada1, Yasutaka Hirokawa2,
Taizo Hanai2, Akio Murakami3, Sinya Ogura1, Ryouta Hasi1, Mayuko Takeda1(1 Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2 Grad. Sch. Agric., Kyushu Univ.,
3
Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)

Key words

biomass, raceway pond, algae cultivation, visualization

Key words

cyanobacteria, glycerol, airlift bioreactor

3Op11

Lipid production by Lipomyces starkeyi using a twostage continuous feeding strategy with a synthetic
medium

3Op13

油脂酵母 Lipomyces starkeyi における油脂超高蓄積株
N5-15 株の育種
○三根 健太郎 1,2, 高城 博也 1, 松尾 伸二 1, 吹井 真緒 2,
山吉 陵平 2, 佐藤 里佳子 2, 高久 洋暁 2
（1 日清食品ホールディングス, 2 新潟薬大・応生命）
htakaku@nupals.ac.jp○Chih Chan Wu1, Kenji Okano2, Kohsuke Honda1,3(1 ICBiotech, Osaka Univ., 2 Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai
Univ., 3 OTRI, Osaka Univ.)
honda.kohsuke.icb@osaka-u.ac.jp
Oleaginous yeast Lipomyces starkeyi is a highly effective lipid producer that canaccumulate over 70% of dry biomass under optimal conditions. However, producing
microbial lipids with synthetic media remains challenging due to limited knowledge ofnutrient requirements in L. starkeyi. We established a two-stage continuous fed-batch
fermentation process using a glucose-based synthetic medium in a 5-L bioreactor to
overcome this limitation and enable economically feasible lipid production in industry.
Firstly, we obtained a high cell density of 487×107 cells/mL using an exponential
feeding strategy (μset: 0.125 h-1; YX/S set: 0.45), optimized molar C/N ratio (16), andphosphate concentration (6 g/L) in the feeding medium during the cell growth phase.
Secondly, by further optimizing the molar C/N ratio (100) of the fed media during lipid
production stage, we achieved a high lipid titer (65 g/L) and lipid content (60% of dry
biomass). This lipid titer is comparable to the highest reported value of 68 g/Lachieved using nutrient media. Our findings suggest that L. starkeyi can produce lipids
using synthetic media, and our optimized fed-batch fermentation process could be used
to broaden the applications of L. starkeyi.

日本の油脂自給率はカロリーベースで 3 % と他の先進国と比較しても非常に低い。自給率の向上に効率的な手段として油糧植物からの油脂供給が挙げられる
が、生産効率が高い油糧植物であるアブラヤシは熱帯性の植物かつ栽培に広大な耕作面積を必要とするため、日本での栽培は困難である。そこで我々は様々な糖を油脂に変換し細胞内に油脂を高蓄積する油脂酵母 Lipomyces starkeyi に着目した。本酵母由来の油脂（以降、酵母油）の脂肪酸組成は、アブラヤシから採れるパーム油の脂肪酸組成と非常に類似しており、代替パーム油としての適性が高いと考えられる。我々はこれまでに酵母油の食品適性や食品残さ培地への適応性の高さを確認してきた。しかし、酵母油を産業化するためには、油脂生産速度や油脂変換効率などの課題を解決する必要がある。そこで本研究では、
L.starkeyi に対して突然変異を誘発することで、油脂高蓄積株を取得することを目指した。まず、L. starkeyi 野生株 CBS 1807 に対して、UV を用いた変異誘発を行い、Percoll 密度勾配遠心分離法によって油脂蓄積細胞を濃縮し、スクリー
ニングすることで、油脂高蓄積株 N5 株を取得した。野生株と比較して、N5 株における培地あたりの TAG 量は 2.51 倍、細胞あたりの TAG 量は 2.83 倍となった（培養 3 日目）。続いて、取得した N5 株を親株として、上記と同様に再度変
異誘発および濃縮・スクリーニングを実施した結果、新規油脂高蓄積変異株である N5-15 株の取得に成功した。N5 株と比較して、N5-15 株における培地あた
りの TAG 量は 1.35 倍、細胞あたりの TAG 量は 1.82 倍となった（培養 6 日目）。
現在は、さらなる油脂高蓄積株の育種および産業化を目指したコストダウン・
スケールアップ検討に加えて、N5-15 株の油脂高蓄積原因遺伝子の同定を進めている。

Lipid production by Lipomyces starkeyi using a two-stage continuous
feeding strategy with a synthetic medium

Breeding of Lipomyces starkeyi N5-15 strain, a hyperaccumulator of lipids○Chih Chan Wu , Kenji Okano , Kohsuke Honda(1 ICBiotech, Osaka Univ., 2 Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ., 3 OTRI,Osaka Univ.)
1

Key words

2

1,3

microbial lipid, oleaginous yeast, synthetic medium, fermentation○Kentaro Mine1,2, Hiroya Taki1, Shinji Matsuo1, Mao Fukii2, Ryohei Yamayoshi2,
Rikako Sato2, Hiroaki Takaku2(1 Nissin Foods Holdings Co., Ltd., 2 Fac. Appl. Life Sci., Niigata Univ. Pharm.
Appl. Life Sci.)

Key words

lipid, oil palm plantation, yeast

285

3Op14
学

海洋珪藻 Fistulifera solaris のオープンポンド型屋外培養におけるオイル蓄積機構の解析

3Op16

微細藻類 Chlamydomonas reinhardtii におけるグリセリ
ド蓄積誘導欠損株の変異育種と解析○加藤 悠一 1,2, 蓮沼 誠久 1,2（1 神戸大・先端バイオ工研セ, 2 神戸大院・科技イノベ）
hasunuma@port.kobe-u.ac.jp○福田 晴 1, 熊久保 涼太 1, 村田 智志 1, 西村 恭彦 2, 吉野 知子 1,
田中 剛 1（1 農工大院・工, 2 電源開発）
tsuyo@cc.tuat.ac.jp【目的】海洋珪藻 Fistulifera solaris は高い増殖能及びオイル蓄積能からバイオ
ジェット燃料に向けたオイル生産ホストとして期待されている。しかし、屋外培養では、微生物の混入や環境パラメータの変動によって、生育やオイル蓄積が不安定であることが課題である。近年、混入微生物に依存した微細藻類のオイル生産性の変化が報告されている。しかし、F. solaris 屋外培養における混入微生物の菌叢及びそれに伴う細胞内オイル代謝の変動は明らかとなっていない。
そこで本研究では、屋外培養における微生物叢解析及びトランスクリプト―ム
解析を行い、安定した屋外培養のための指標獲得を目指した。
【方法】F. solaris オープンポンド型屋外大量培養 (6.2 kl)を実施した。各段階の培養液から DNA を抽出し、16S/18SrDNA を対象としたアンプリコンシーケン
ス解析を実施した。さらに、各段階で回収した藻体より RNA を抽出し、トラ
ンスクリプトーム解析を行った。
【結果と考察】屋外培養において、最終藻体濃度は 8.7×106 cells/ml に達し、ラボ
スケールでの培養試験と同等の結果が得られた。菌叢解析の結果、γ-プロテオ
バクテリア綱ビブリオ目の存在量が多く、捕食性のある真核生物はほとんど確認されなかった。このことから、本培養試験において微生物混入が制御できており、安定的に細胞が生育したと考えられた。一方で、トランスクリプト―ム
解析の結果、培養後期において中央代謝及びオイル代謝関連遺伝子群の発現量低下が認められた。本屋外培養時のオイル含有率は 19%と低く、細胞機能の低下によるオイル蓄積誘導の阻害が示唆された。本研究で明らかとなった微生物
叢及び遺伝子発現挙動は、屋外培養の安定性評価に向けた分子マーカーとなることが期待される。

微細藻類は、光合成によって二酸化炭素から油脂（グリセリド）を合成して細胞内に多く蓄積できることから、バイオ燃料生産者として期待されている。緑藻 Chlamydomonas reinhardtii の油脂蓄積は窒素欠乏によって誘導されるが、そのメカニズムは十分解明されていない。本研究は、ランダムな遺伝子破壊によって油指低蓄積株を育種し、その解析を通じて油脂蓄積誘導のメカニズムを解明することを目的とした。
本研究ではまず、C. reinhardtii ゲノムにパロモマイシン耐性遺伝子 aphVIII カ
セットをランダムに挿入することで変異体ライブラリを作製した。この変異体
ライブラリを窒素欠乏条件で培養した後、細胞内の油滴を BODIPY 染色し、蛍光活性セルソーターで BODIPY 蛍光の弱い細胞を分取した。これにより、油脂含有率が低下した変異株 LL-1 を獲得した。
LL-1 の特徴として、細胞内に油滴をほとんど形成せず、グリセリド含有率が窒素欠乏によっても増加しないことが明らかになった。総脂肪酸含有率（グリセリド+遊離脂肪酸の総和として測定）は増加したことから、LL-1 では遊離脂肪酸が細胞内に多く蓄積することが示唆された。加えて、メタボローム解析により、LL-1 ではグリセロール-3-リン酸が窒素欠乏条件で細胞内に蓄積することがわかった。トランスクリプトーム解析により、LL-1 ではアシル CoA チオエス
テラーゼ遺伝子の発現量が窒素欠乏条件で顕著に高いことが明らかになった。
これらの結果から、LL-1 におけるグリセリド蓄積誘導の喪失は、アシル CoAが遊離脂肪酸に変換されてグリセリド合成に利用されないことが原因であると考えられた。LL-1 における aphVIII カセット導入部位も特定しており、これらの知見に基づいて今後、グリセリド合成誘導の分子メカニズム解明、およびグリセリド合成制御技術の開発が期待される。

Analysis of Oil Accumulation Mechanism in Open-Pond Outdoor
Cultivation of Fistulifera solaris

Mutational breeding and analysis of an induced glyceride accumulationdeficient strain in Chlamydomonas reinhardtii○Haru Fukuda1, Ryota Kumakubo1, Satoshi Murata1, Yasuhiko Nishimura2,
Tomoko Yoshino1, Tsuyoshi Tanaka1(1 Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2 J-POWER)

Key words

microalgae, lipid, biomass, transcriptome

3Op15

Aurantiochytrium sp.産不飽和脂肪酸を原料とした 1,4シクロヘキサジエンの合成○富澤 哲, 河本 青空, 大島 賢治（熊本高専）
tomizawa@kumamoto-nct.ac.jp

微細藻類である Aurantiochytrium 属の一部は、グルコースを炭素源として不飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン酸（DHA，Docosahexaenoic acid）を細胞内に蓄積する。オレフィンメタセシス反応は、2 種のオレフィン間で結合が入れ替わる反応である。不飽和脂肪酸に対してオレフィンメタセシス反応を適応すれば、ベンゼンの前駆体である 1,4-シクロヘキサジエン（1,4-CHD）への変換が予想できる 1)。本研究では、バイオマス資源から取得可能なグルコースを出発物質として、微生物と触媒反応を用いて、1,4-CHD を得る経路の確立を目的とした。
Aurantiochytrium sp.（NBRC 111922）を 100 mL の DHA 生産培地（グルコース60 g/L、酵母エキス 20 g/L、ビタミン B、人工海水）で振とう培養した。遠心分
離機にて集菌し、凍結乾燥した。DHA を含む不飽和脂肪酸の蓄積はメタノリシ
ス後、GC（ガスクロマトグラフィー）にて分析した。30 ℃で 5 日間培養した結果、乾燥菌体重量 18 g/L を得た。脂肪酸の蓄積量は 5.1 g/L であり、DHA の蓄積量は 2.2 g/L であった。乾燥菌体 10 mg にジクロロメタン 2 ml、グラブス触媒 2 wt%を加え、オレフィンメタセシス反応を行った。1,4-CHD の分析は GCを用いた。培養液 100ml あたり 61.2 mg の 1,4-CHD が確認できた。以上より、グルコースを出発物質とした 1,4-CHD の生産経路を確立できた。
1）
大島賢治, 魚類残滓からの芳香族化合物の生産：魚油のオレフィンメタセシス
を経由するハロベンゼンの合成 熊本高等専門学校研究紀要 13 (2021): 63-66

Synthesis of 1,4-Cyclohexadiene from unsaturated fatty acids produced by
Aurantiochytrium sp.
○Satoshi Tomizawa, Aozora Kawamoto, Kenji Oshima(Kumamoto Natl. coll. Technol.)Key words

unsaturated fatty acids, docosahexaenoic acid, Aurantiochytrium○Yuichi Kato1,2, Tomohisa Hasunuma1,2(1 EGBRC, Kobe Univ., 2 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

microalgae, Chlamydomonas reinhardtii, lipid, triglyceride

287

人名索引

A

F

Abdel-Hady Gamal Nasser
Achadu Ojodomo
Adithya Nair
Akechi Satoshi
Aki Tsunehiro
An Guangqi
An Zhuo-Jun
Anam Khairul
Ang Kai Torng
Anggorowati Dien
Arakawa Tomoko
Arrad Ares
Asami Soichiro
Asif Ali Mohammad
Astawan Made

1Bp13
1Kp10
3Dp10
3Kp14
1Jp16
1Np01
3Ip02
3S-Ja03
2Mp10
3S-Ja03
3S-Ja03
3Kp14
3Hp02
2Np03
2Gp06

B
Baihaqqi Fahmi
Baik Jong Youn
Boonyakida Jirayu
Bussadee Piyada

3Ap15
2S-Jp05
2Cp01
2S-Jp08C
Cai Haoliang
Camagna Maurizio
Chaiyen PimchaiChampreda Verawat
Chang Jo-Shu
Chang Matthew
Chang TeSheng
Chang Ya-Chun
Chang Yu-Han
Chen Boryann
Chen Chuen-Yau
Chen Chun-Yen
Chen Yan-Yu
Cheng Yu-Shen
Ciou Jing-Chen

2Ip02
1Ap05
2S-Ba01
2S-Jp08
2A-Jp02
2S-Jp09
2Bp04
1Kp13
2A-Jp02
1Lp15
1Kp08, 3Ip02
2A-Jp02
3Mp10
3Np16
1Kp08

D
Dairi Tohru
3Lp06
Damnjanović Jasmina
1Ap05, 2S-Ja01, 3S-Ka04
de Sousa Cunha Eva Mariana 3S-Jp02
Devanadera Allan
3Kp13
Ding Hsiou-Yuf
2Bp04
Donnelly Ann
3Ap05
Dossou-Yovo Mikhael-Christ 3Gp06
Dung Van Nguyen
3Op06

EEﬀendi Seﬂi Sri Wahyu
Eljonaid Mohamed Yahai

3Kp04
1Op11

J

Fan Enguo
3S-Ja02
Farestiani Eliza
3Fp14
Feng Xiang
3Op04
Fraaije Marco W
1Ap12
Fujita Ken-ichi
3Ip04
Fukui Toshiaki 1Ip12, 3Kp13, 3Kp14
Fukunaga Keisuke
2S-Ba02
Fukusaki Eiichiro
2Gp06, 2Gp07,
3Fp14
Funabashi Hisakage
1Bp13

G
Garrido Sharon Marie Bahena
Gates Michael
Ghiglieri Meghan
Gomi Katsuya
Guo Jason

2Fp04
3Hp16
3Hp16
1Jp15
3Hp16

H
Habimana Silas
1Dp10
Hanai Taizo
2S-Ja05
Harada Ryuhei
1Gp03
Haugen Havard Jostein
3S-Jp03
He Sijia
3Op04
Hecht Michael
3Ap05
Hengphasatporn Kowit
1Gp03
Hirota Ryuichi
1Bp13
Hitomi Kiyotaka
1Ap05
Hjort Carsten Mailand
2S-Fa03
Honda Kohsuke
1Bp14, 3Bp16, 3Np05, 3Op11
Honrao Chandrashekhar
3Hp16
Hori Katsutoshi
3S-Ja03, 3S-Jp04, 3Mp10
Hsiu-Wen Chien
3Np11
Hsu Jhuan-Ling
2A-Jp02
Huang Yihao
3Np08
Hui Chun Wai
1Ip02
Huong Kai-Hee
1Ip12
Hussain Badra
3S-Jp03
Huynh Cong Khanh
1Ip15

I
Ikeda Takeshi
Ilhamzah
Iman Marvin Nathanael
Imanaka Matthew
Inoue Akihito
Irdiani Raﬁdha
Ishida Takenori
Ishii-Hyakutake Manami

1Bp13
3Ip04
2Gp06
3Bp16
3Cp14
2Gp06
1Bp13
3Ip12

Jeong Da Min
Jia Beixi
Jin Jian-qiang
Jo Jeong Wook
Joo Yunheui

1Jp15
3Cp16
3Ap12
1Np13, 1Np14
1Ip14

KKadonosono Tetsuya
3Cp09
Kahar Prihardi
3Ap15, 3Mp09
Kalhor Reza
3Hp02
Kamihira Masamichi
1Dp10
Kang Sung Gyun
2S-Ep03
Kato Amane
3S-Jp04
Kato Ryuji
2S-Jp03
Kawabe Yoshinori
1Dp10
Kazama Daichi
3Op04
Kharral Muhammad Akram
1Np16
Khoris memdi Indra
1Kp10
Kim Chang Sup
2S-Ja04
Kim Hyung Joo
1Np13, 1Np14
Kim Jae Hun
1Np13, 1Np14
Kim Ye Jin
1Np13, 1Np14
Kisailus David
1Jp12
Kitaguchi Tetsuya
2Cp05, 3Cp14
Kitano Hiroyuki
1Dp10
Kobayashi Hajime
3Op04
Kobayashi Ken
2Cp05
Koma Daisuke
2S-Jp06, 3Lp06
Kondo Akihiko
3Ap15
Kosasih Fathiah Rizky
3Np05
Krabberoed Anders
3S-Jp01
Kubo Motoki
1Np16, 3Np08
Kuo Chia Hung
3Gp09
Kuroda Akio
1Bp13
Kusumoto Ken-Ichi
1Fp03

L
Langlete Petter
3S-Jp01
Lee Gyu Won
1Np13, 1Np14
Lee Hyun Sook
2S-Ep03
Lee Jeong Wook
2S-Ba03
Lee Mei-Hwa 1Kp08, 1Kp13, 3Ip02
Lee Sung-Jae
3Kp10
Lewis Kim
3Hp16
Li Xueyang
2Mp09
Liang Libang
3Hp16
Lie Stephanie
1Mp06
Lin Cheng-Chih
3Ip02
Lin Hung-Yin 1Kp08, 1Kp13, 3Ip02
Lin Ning
3Cp09
Lin Yu-Ling
1Kp13
Linke Dirk 3S-Ja01, 3S-Jp02, 3Mp15
Liu Kai-Hsi
1Kp08

288

Liu Liyun
Luecke Hartmut
Lupas Andrei
Lyu Xiaofang

1Fp03
3S-Jp02
3Mp15
1Mp02

M
Ma Xiaoyu
3Hp16
Maekawa Toshihiko
2S-Jp04
Masahito Ishikawa
3Mp10
Matsubara Hirotaka
2S-Ja03
Mercy Bientri Yunindanova
2Gp07
Miyahara Yuki
3Ip12
Miyazaki Kentaro
1Bp14, 3Bp16, 3Np05
Mizutani Keisuke
2Cp05
Mukherjee Samrat
3Dp01
Munaweera T.I.K.
1Ap05

N
Nakamura Chikashi
3Dp01
Nakano Hideo
1Ap05, 2S-Ja01, 3S-Ka04
Nakatani Hajime
3S-Ja03
Nakayama Hideki
1Ip15, 1Ip16, 3Op04
Nemoto Naoto
1Ap05, 3S-Ka04
Ng I-Son
2S-Ja06, 3Kp04
Nguyet Vo Thi Anh
1Fp11
Niimoto Kako
1Jp16
Nishiura Mutsumi
1Jp16
Novarianto Hengky
2Gp07

S
Sakai Kanae
1Fp03
Salakkam Apilak
2S-Jp07
Samnaknit Ngoentra
2S-Jp08
Samuel Ashok Z.
2Ep03
Sanz Gaitero Marta
3S-Jp02
Sasahara Jun
3S-Jp04
Sato Kozo
3Op04
Satoh Yasuharu
3Lp06
Seo Jieun
1Dp04
Seo SangWoo
2S-Ja07
Shen Ning
3Lp06
Shigeta Yasuteru
1Gp03
Shimma Shuichi
3Fp14
Shin Kwanwoo
2S-Ba05
Shintani Takahiro
1Jp15
Show Pau-Loke
2A-Jp01
Siddiqa Ayesha
1Gp15
Simm Roger
3S-Jp03
Son Sangkeun
3Hp16
Suryatin Alim Gladwin 1Bp14, 1Bp05
Susilaningsih Dwi
3S-Ja03
Suwannarangsee Surisa
2S-Jp08
Suwatthanarak Thanawat
3Dp05
Suzuki Takuma
1Bp14
Suzuki Tomohiro
3Ap15

T

Pada Soa Christina Aryanti
1Bp14
Park Enoch Y.
2Cp01
Park Hee Ho
2S-Jp01
Phanduang Prawan
2S-Jp07
Pilakka Veedu Anju
2Np01
Purwani Ni Nyoman
1Ap12
Putri Sastia Prama
2Gp06, 2Gp07

Tajima Takahisa
1Bp13
Takai Madoka
2S-Ba04
Tamaru Yutaka
1Op11, 3S-Ja03
Tanaka Takumi
1Fp03
Tang Wen Rui
3Gp09
Tan Pei Yu
1Op14
Tan Shao Ying
3Dp16
Tanudjaja Ellen
1Ap07, 3Bp09
Theeragool Gunjana
2Bp07
Tippayasak Uraiwan
2Bp07
Tokashiki Jikian
1Jp15
Tomita Hiroya 1Bp14, 3Bp16, 3Np05
Tomita Hisao
1Op11
Tran Quoc Thinh
1Np15, 1Np16,
3Np04, 3Np06, 3Np07,
3Np08, 3Np09, 3Np12, 3Np13
Tran Thinh
2Ep02
Tsai Ming Fong
3Gp09
Tsai Shen-Long
2Np02
Tsuge Takeharu
3Ip12
Tulsook Kan
2S-Jp08

Q

U

O
Ogasawara Yasushi
3Lp06
Ogino Chiaki
3Ap15
Ogita Akira
3Ip04
Okamoto Akimitsu
2Mp09
Okano Kenji
3Op11
Okazaki Fumiyoshi
1Op11, 3S-Ja03
Omasa Takeshi
1Mp02, 1Mp06
Orita Izumi
1Ip12, 3Kp13, 3Kp14

P

Qiu Zhirou

2Cp05

Ueda Hiroshi

R
Rabemanolontsoa Harifara
Rahmawati Della
Reungsang Alissara

2Cp05, 3Cp14

W
3Op06
2Gp06
2S-Jp07

Wakai Satoshi
Wang Chih Ting
Wang Tzi-Yuan
Watanabe Kenshi

3Ap15
3Ip12
2Bp04
1Jp16

Watanabe Masanori
Winther-Larsen Hanne C
Wu Chih Chan
Wu Jiumn-Yih

3Gp06
3S-Jp01
3Op11
2Bp04

X
Xiao Suyi

3Ap12

Y
Yamagishi Ayana
3Dp01
Yamaguchi Satoshi
2Mp09
Yamaguchi Yoshihiro
3Ip04
Yamano-Adachi Noriko
1Mp02, 1Mp06
Yang Kai Ruei
3Gp09
Yang Sung Woo
1Np13, 1Np14
Yang Yinghui
3Cp14
Yang Yingnan
1Np01
Yao Chao-Ling
2S-Jp02
Yasuda Takanobu
3Cp14
Yeom Soo-Jin
2S-Ja02
Yoshimoto Shogo
3S-Jp04

Z
Zhang Hongjian
Zhang Jun Rong
Zhang Yunchi
Zhu BoZhu Heqian
Zhu Junzhang
Zou Ziyan

1Np01
3Gp09
1Mp02
2Cp05, 3Cp14
1Jp16
2Ip02
1Ip16

あ
愛澤
相澤
青井
青木
青木
青木
青木
青西
青柳
青柳

秀信
康則
議輝
壮太
崇
秀之
航
洋平
智
秀紀

赤尾
赤尾

賢一
健

赤木
赤澤
明石
赤田
赤堀
赤嶺
秋葉
秋元
穐山
秋山

駿斗
真一
貴裕
倫治
文雄
晴香
憲二
美月
太一
拓也

1Np04
1Kp14, 2Kp09
1Ip09, 1Ip10, 2Mp03
3Mp15
2Mp08
3Gp02
1Ap06, 1Gp01, 3Hp13
1Jp10
1Np04
1A-Aa03, 1Lp16, 1Np02,
1Op08, 2Lp03, 2Lp04,
2Lp05, 2Lp08, 2Mp02,
2Mp04, 3Mp07
3S-Aa02
1Fp02, 2Fp05,
3Fp09, 3Fp02
3Hp08
1Jp14
1Fp06, 1Fp08
1Fp07, 3Lp14
1Gp13
1Jp12
3Gp05
1Hp01
3Dp15
3S-Fa01

289

秋山

裕和

1Mp14, 3Dp14, 3Gp07,
3Gp08, 3Mp03
秋山 真那斗
1Hp02
秋山 佳穂
1Kp02
明戸 剛
1Op12, 1Op15
浅井 潔
1Jp01
浅井 拓也
1Fp06, 1Fp08
浅井 禎吾
2S-Kp03
浅井 良樹
3Fp03, 3Fp04
朝田 良子
3Mp13
浅沼 和佳奈3Ap10
浅野 風斗
2Lp02, 3Hp03
浅野 泰久
3Ap08
浅野 泰英
3Hp10
阿座上 弘行
1Gp15
芦沢 紬希
2Lp05
芦葉 裕樹
1Kp03
東 雅之
1Hp07, 1Np12, 2Kp01,
2Kp02, 2Op08, 3Cp06, 3Op07
跡見 晴幸
2S-Ep01, 3Ap12, 3Kp10
穴井 豊昭
1Lp06, 3Ip08
穴田 康太
3Mp06
阿野 嘉孝
3Ap13, 3Ap16
油谷 幸代 2Ip04, 2Ip05, 2Ip06, 2Ip09
油屋 駿介
1Ap06, 3Hp13
阿部 敬悦
1Cp11, 1Cp12, 3Mp08
阿部 菜月
1Cp11
阿部 英喜
1Bp06
安部川 直紀
1Ip11
天羽 宏枝
2Dp08
荒 学志
2Ip04, 2Ip05, 2Ip06,
2Ip07, 2Ip08, 2Ip09
新井 世望
1Mp09
荒井 広志
3Gp05
新井 博之
2Hp07, 3Fp07, 3Hp10
新井 亮一
2S-Bp05, 3Ap05
新垣 篤史
1Op15
荒川 弦矢
2Fp03
荒木 拓馬
3S-Fa04
荒木 秀雄 2Ip05, 2Ip07, 2Ip08, 2Ip09
荒瀬 雄也
3Fp09
有田 誠
1Kp04
有谷 博文
2Op01
有馬 二朗
1Bp09, 2Ap04, 2Hp03
安 広キ
3Op09
安藤 晃規
2Hp09
安藤 英紀
2Dp06
安藤 正浩
3Ip08
安東 稜子
1Fp11

い
飯島 信司
飯田 健太
飯田 順子
飯田 泰広
飯田 龍哉
飯生 紗矢
五十嵐 郁
五十嵐 陽子1Np11, 2Hp04
1Np09
1Hp12
1Ap01, 1Kp02
3Bp05
1Op13
1Np15
1Dp05

五十君 靜信生田 宗一郎

3Ip07
1Cp15, 2Hp05, 3Fp13,
3Gp13, 3Kp07
生田 昂
2S-Bp06
生田 昴
2Cp09
池 道彦
1Np03, 1Op07
池内 元太
2Op09
池田 篤志
3Dp07
池田 翔
2Ap02
池田 和磨
3Op02, 3Op03
池田 丈
1Cp07, 1Lp08,
1Lp09, 1Np07
池田 有輝
3Mp01
池田 優理子
2Fp05
池田 麗
1Op02
池野 慎也
1Gp04
池谷 佳朗
3Mp09
井沢 真吾
1Fp11
石井 彩夏
3Dp03
石井 純
1S-Ep02, 1Dp13, 1Jp01,
1Jp02, 1Jp03, 2Dp08, 3Hp05
石井 誠
3Cp11
石井 正治
2Hp07, 3Fp07, 3Hp10
石井 湧大
2Mp04
石井 義孝
1Bp04, 1Bp10
石川 大空
3Ap11
石川 一彦
1Ap09, 2Bp02
石川 周
3Lp11
石川 周太郎2S-Ap04, 2Mp08
石川 伸一
2S-Aa05
石川 卓
1Fp09
石川 千秋
3Gp12
石川 正英
3Ip09
石川 聖人
1Cp16, 2S-Ha02,
2Kp10, 3Mp15
石川 森夫
1Fp12, 2Bp07
石上 美佐
1Jp01
石黒 早紀
2Op05
石澤 秀紘
3Hp11
石田 快
3Gp03
石田 拓真
3Kp08
石田 丈典
1Cp07, 1Lp08,
1Lp09, 1Np07
石田 竜弘
2Dp06
石田 亘広
3Mp05
石田 隼斗
1Ip10
石田 博樹
1Hp16, 2Np08,
3Fp03, 3Fp04
石田 奨
1Op14
石塚 大輔
2S-Fa02
石野 真里衣
3Ip13
石畑 宏明
2Dp04
石原 静流
1Ip13
石原 慎也
2Ep01
石原 達己
2Op10
石橋 真衣
3Hp06
石橋 勇作
1Fp13
石丸 隆行
1Gp15
石丸 裕也
3Op02

石丸
石水
石谷

泰寛
毅
孔司

石渡
和泉
磯谷
磯貝
礒崎
磯﨑
磯部
板倉
板谷
井田
市川
市川
市田
一瀬
一瀬
一柳
一色
出雲
伊出
井藤
伊藤
伊藤

悠介
自泰
敦子
章太
達大
勇志
紀之
真優
光泰
正幸
京香
暉
春音
桜子
涼
敦
衣香
貴幸
健太郎
彰
光次朗
創平

伊藤
伊東
伊藤
伊藤

智之
優依
雄大
洋一郎

伊藤 里緒子
稲垣 伸二
稲垣 史生
稲葉 知大
稲谷 博征
井上 健一
井上 謙吾
井上 皓太
井上 翔理
井上 隆昌
井上 大介
井上 英俊
井上 雄介
井上 善晴
猪又 俊輔
井元 乃絵
井原 邦夫
今 拓海
今井 友也
今井 優
今田 辰海
今中 洋行
今村 維克
今村 沙弥香
今村 美穂
今村 百花
入江 健太

1Ap07, 3Bp09
1Gp09
2Ip04, 2Ip05,
2Ip06, 2Ip09
1Cp06
2Ip05
2Fp05
1Bp01, 1Hp16
1Bp15
3Cp15
2Np03
3Lp08
1Hp02
3Gp10
1Cp07
3Mp08
3Cp03
1Jp13
3Lp13
2Cp04
1Ip06
3Gp10
2Np08
1Dp07, 3Dp04, 3Dp06
3Ip07
1Ap11, 1Bp16,
2Ap08, 3Ap03
3Bp12
3Cp08
1Kp15, 1Kp16
1Dp13, 1Jp01,
1Jp03, 2Dp08
3Ap01
3Mp05
1Op03
1Np04
1Gp13
3Gp12
1A-Lp01
1Mp12
1Lp02
3Mp16
1Np03, 1Op07
2Lp09
1Dp08
3Hp12
1Hp02
1Dp13
3Bp09
1Mp10
1Mp15
3Hp16
1Hp06
3Bp14
3Bp14
1Cp06
1Hp15
1Lp16
1Mp15

290

入谷
入山
入山
岩井
岩井
岩井
岩井
岩木
岩切
岩倉
岩崎
岩崎
岩崎
岩下
岩田
岩田
岩永
岩間
岩本

康平
就
桃羽
空都
直哉
伯隆
良輔
宏明
裕哉
崇文
政和
雄吾
渉
和裕
葵
寛
直樹
蒼平
康成

3Op08
3Op01
3Mp03
2Gp09
2Kp07
1Hp01, 2Hp02
1Dp02, 1Dp09
2Lp06
3Gp11
2Ip03
3Ip09
2Bp06
3S-Ea01
2Fp04
3Lp04
3Lp04
3Bp03
1Op08
1Lp10

う
上垣 浩一
1Ap14, 1Gp06, 1Mp15
上田 大次郎2Bp02, 2Bp03, 2Bp05
植田 浩一
2Np07
上田 宏
2Cp06
上田 誠
3Ap11, 3Bp01, 3Bp02
上田 政宏
1Kp04
植田 充美
1Ap06
上田 優弥
1Np03
植田 芳昭
3Op10
上野 航一郎
3Hp06
上野 義栄
3Gp02
上原 美夏
1Hp02
上原 悠太郎
1Op01
魚住 奎太
1Cp15
魚住 信之
1Ap07, 3Bp09
宇佐美 徹
3Ip11
牛丸 和乗
2Ip01
臼井 昭子
2S-Aa04
歌島 ( 法土 ) 咲菜恵
3Ap12
宇田 泰三
3Cp08
宇田 佳乃
3Lp11
宇田 竜成
3Hp12
内田 和希
1Cp14
内山 進
3S-Aa01
内山 航
1Gp01
宇都宮 大貴3Ap13
宇都 甲一郎
1Dp15
梅澤 公二
3Ap05
梅田 尚希
1Mp05, 1Mp13
梅津 光央
2Dp08, 3Bp12, 3Cp10
梅野 太輔
2Bp03, 2Cp07,
梅原
梅林
浦瀬
浦山
海野
海野

嘉宏
勇気
太郎
健
伊吹
良輔

2Cp08, 2Cp10
2Mp02
3Kp08
1Lp01
3Mp16
2Ap08
1Fp12

呉

恒寧

3Kp07

え
江澤
枝並
荏原
江部
遠藤
遠藤
遠藤

理徳
研一郎
充宏
聡
快斗
力也
隆平

3Bp04
1Bp09
1Dp15
1Fp07
3Gp07
3S-Ha04
2Fp07

お
及川 英秋
1Ip01
大浦 智之
2Lp09
大川 全
3Op03
大川 優生
3Ap04
大木 隆生
1Dp09
大久保 詠一郎
1Cp10
大河内 美奈
1Gp05, 2Ap10, 3Dp05
大越 健嗣
1Jp12
逢坂 竜之介
3Op10
大島 賢治
3Op15
大城 隆
1Cp08, 3Kp09
大城 麦人
2Mp01
大関 さおり3Op01, 3Op02
太田 大策
2Ep06
太田 陽介
3Lp12
大瀧 結衣
3Kp05
大谷 悠介
2Bp03
大嶽 七菜
2Ap02, 3Cp04
大塚 祐一郎3S-Fa04
大槻 隆司
1Np06, 1Op16
大土 光経
2Op01, 3Ip09
大坪 瑶子
3S-Ha02
大寺 史織
2Op02
大土井 律之
3Fp09
大西 喬也
1Hp14
大西 智也
3Np09
大西 真代
1Op06
大沼 司
1Jp10
大沼 浩輝
1Lp01
大野 孝紘
3Dp04
大野 豊
1Fp14
大橋 貴生
1Gp09, 2Ap09
大橋 正孝
1Bp01
大畠 昌也
1Cp10
大畑 実咲
3Ap03
大場 健司
3Fp09
大前 奈月
3Lp10
大政 健史
1Hp12, 1Hp13, 2S-Ap02,

大本 貴士
大山 泰史
岡 大椰
岡 芳樹
岡崎 飛鳥
岡崎 直人
岡﨑 文美

2Dp10, 3Bp03, 3Bp08,
3Bp13, 3Np14
1Ap14, 2Op08
3S-Aa02
1Cp04, 1Lp02, 1Lp03
1Kp01
3Np12
1Fp02
2Op05

岡澤
岡澤
岡田
岡田
岡田
岡田
岡田
岡田
岡田
岡田
岡野

敦司
空汰
憲典
崇
宣宏
真幸
眞里子
美玖
康志
行夫
憲司

2Ep06
1Lp07
1Hp05
1Op02
3Bp10
1Kp05
1S-Ep04
1Mp15
1S-Ep01
3Lp05
2Bp08, 2Lp06,
2Op06, 3Kp01
岡野 ジェイムス洋尚
1Dp09
岡橋 伸幸
1Hp05, 1Hp09,
1Hp11, 1Kp04, 2Ip03
岡畑 俊輔
1Np03
岡部 航也
1Op12
岡村 好子
1Cp02, 3Kp06
岡本 晃充
3Cp01
岡本 棟悦
2Dp07
小笠原 渉
2Ip04
緒方 藍歌
1Dp15
小川 亜希子
1Lp04
小川 順
1Ip02
小川 純
2S-Aa04
小川 順
2Hp08, 2Hp09, 3Ap11,
3Bp01, 3Bp02
小川 拓水
2Ep06
小河 優玖
3Dp06
小川原 巧
3Cp05
沖田 大和
2Dp08
沖野 智也
3Mp04
沖本 和香奈3Np13
荻田 亮
3Ip03, 3Ip05
荻根 千博
1Jp08
荻野 千秋
3Dp02, 3Lp07, 3Mp09
奥迫 拓也
1Ap10
奥嵜 雄也
2Dp09
奥田 将生
3Fp10
奥平 美里
2Ep03
奥津 果優
1Fp16
奥原 太生
1Kp09
奥原 宏明
2Gp08
小倉 慎也
3Op12
桶川 隆嗣
3Dp03
刑部 敬史
1Kp12
刑部 祐里子
1Kp12
長村 達也
3Lp01
小座間 梓
3Gp05
小澤 洋樹
2Ap08
尾島 由紘
1Hp07, 1Np12, 2Kp01,
2Kp02, 2Op08,
3Cp06, 3Op07
尾関 健二
1Fp13, 3Fp16
尾高 雅文
1Cp10, 3Bp04
鬼塚 正義
2Dp07, 2Dp08, 3S-Aa03
小野 裕嗣
3Gp12
小野 和奏
1Kp15
斧田 優志
3Ap12

291

小原
尾山
折田

優季
廣
和泉

折田 兼成
織部 恭宏
オンゴノ スワンディ

1Op09, 3Mp15
3Gp02
1Ip13, 2Np09,
3Kp11, 3Kp12
3Ap04
1Bp08
3Bp11

か
甲斐 達己
2Hp04
甲斐 穂高
1Kp01
海蔵寺 早希1Bp10
貝沼 友紀
2S-Aa04
海谷 美佳
3Op05
加々美 龍大
3Ip11
柿沼 亜望
3Ap02
景山 達斗
1Dp01, 1Dp04, 2A-Gp01
影山 泰
2Lp09
圍 彰吾
1Fp06
笠井 智成
2Dp04
風間 春香
1Cp03
柏木 明子
3Kp05
梶 蒼依
2Op05
梶 亘佑
1Jp02
梶浦 裕之
1Gp07, 1Gp08,

1Mp03, 2Ep04

梶川
梶川
梶田
梶山
春日
数岡
片岡
片岡
片岡
片岡
片岡
片倉
片所
片山
片山
勝木
勝田
勝又
勝矢
加藤
加藤

揚申
3Ip07
彩香
3Ip01
真也
3S-Fa02
慎一郎
3Ip11
友明
1Op12, 1Op15
孝幸
3Fp05, 3Fp06
健
3Mp11
笙
2Dp05
尚也
1Ip08, 2A-Ip01, 2Bp07
正和
1Hp02, 1Mp01, 2S-Ka04
道彦
3Ap01, 3Ap02
啓雄
3Gp01, 3Lp13
杏野
2Hp08
琢也
1Ip01
陽介
1Mp14
泰司
3Cp10
亮
3Fp08
忠与次
3Hp15
祥平
2Hp09
周
1Cp13
純一
3Mp06, 3Np01,

加藤
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤

淳也
節
創一郎
多貴
太一郎
晃代

加藤
加藤
加藤
加藤

宏明
大志
将城
雅士

3Np02, 3Np03
1Ip09, 1Ip10, 1Np07
1Ip09, 1Ip10, 2Mp03
2S-Ep04
1Mp16
1Bp06
2Bp09, 3S-Ka02,
3Cp04, 3Cp11, 3Cp16
2Dp07
1Bp02, 1Bp07
1Bp08
1Bp02, 1Bp07,

2Gp09, 3Fp02
3Ip10
3Op16
1Op14
3Mp08
1Dp05, 1Dp14, 1Dp15,
2Dp01, 2Dp02, 2Dp03
門岡 千尋
1Fp16
門倉 利守
1Cp01, 2Fp02
門之園 哲哉
3Bp11, 3Cp02, 3Cp05
門屋 亨介
2Np04
金井 貴蓉
2Dp10
金井 保 1Ip03, 3Bp15, 3Cp07, 3Kp10
金井 宗良
1Fp02, 2Fp05, 3Fp09
金尾 忠芳
1Gp13, 1Gp14, 1Jp12
金政 真
1Lp13
金森 崇
3S-Ka01
金山 直樹
1Kp15, 1Kp16
蟹江 慧
1Dp15, 2Dp01,
2Dp02, 2Dp03
蟹江 純一
1Op09
金岡 英徳
1Np11, 2Hp04
金子 瑛一郎
2Dp06
金子 真也
2Kp09
金子 達雄
2Np03
金子 真大
1Dp07, 3Dp04, 3Dp06
金田 梨沙
3Ap16
金枚 玲奈
3Gp14
鹿子沢 陸央3Lp04
カハル プリハルディ
3Dp02
鎌田 修平
3Kp06
鎌田 真未
3Op01, 3Op02
神谷 康平
3Np07
上平 正道
2Dp05, 2Lp07
上村 一雄
1Gp13
上村 直史
3S-Fa04, 3Op01,
3Op02, 3Op03
蒲生 智郷
1Np12
神谷 愛香
1Ap02
神谷 克政
2Cp10
神谷 幸太郎
1Cp09
神谷 典穂
1Cp14, 1Cp16,
1Dp13, 2S-Bp04,
3Ap04, 3Bp05
神谷 美欧
2Mp08
神山 歩夢
1Hp10
亀田 弘之
2Dp04
亀谷 太一
2Bp02
亀谷 将史
2Hp07, 3Fp07, 3Hp10
亀山 良貴
3S-Aa05
茅森 俊介
1Ap07
辛島 健文
3Gp07
刈屋 佑美
3Bp04
河合 哲志
2S-Hp04
川合 哲也
1Lp13
河合 頼央
3Bp14
河合（野間） 繁子
2Cp10
川上 歩夏
3Gp01
川崎 了
1Cp06, 2Ap07, 2Np01
加藤
加藤
加藤
加藤
加藤

康夫
悠一
勇太
好一
竜司

川﨑
川崎
河崎
河崎
川島
川島
川嶋
川瀬
河田
河智
川西
河野
河野
川野

了
ナナ
美哉
陸
一公
京介
心
雅也
早矢
夏希
寿和
恵美
健一
竜司

1Np02, 1Op08
3S-Ba04
1Dp05
3Dp07
3S-Ba05
2Op09
3Mp11
1A-Aa01
3Bp12
3Np10
3Hp09
2Np08
1Gp06
1Gp02, 1Kp06,
2Cp03, 2Cp04
2Gp01
2Lp09
2S-Bp03
1Fp09
2Dp05, 2Lp07
1Gp02
3Dp07
1Bp16
3Op15
1Mp15
3Dp07
1Jp05, 1Jp11
2S-Fp05
3Bp01
3Ap12
3S-Aa05
3Hp06
3Gp15
2Kp03

河原 あい
川原 彰人
河原 正浩
河原 航
河邉 佳典
川村 出
河村 昇吾
川村 ゆい
河本 青空
川本 純
河本 正次
河原崎 泰昌簡 梅芳
勘澤 良介
神田 脩一郎
神田 浩幸
神田 義貴
河南 翔馬
菅野 美月

き
菊川

寛史

菊地 淳
菊地 駿斗
岸 裕亮
岸川 颯真
岸谷 有倭
岸田 晋輔
岸野 重信
岸本 真治
喜多 晃久
北口 哲也
北本 宏子
木野 邦器
紀ノ岡 正博城代 隆貴
木原 もなみ
木伏 真子
木股 敬裕
金 美海
木村 和恵

2S-Ha03, 2Ip02,
3Hp04, 3Np10
2S-Fp03
2Mp08
1Ap08
1Gp04
1Dp06
3Np03
1Ip02, 2Hp08
3Ip06
1Op06
2S-Bp02, 2Cp06
1Jp05, 2Np07, 3Lp10
1Ap02, 1Ap03, 3Lp05
1Mp16, 2Mp10,
3S-Ba02, 3Dp10,
3Dp12, 3Dp13, 3Dp16
2Op01
3Cp11
1Lp06
1Dp02
3Dp13, 3Dp16
2Dp01

292

木村 洋
木村 道夫
木村 元彦
木村 友紀
木村 行宏
邱 泰瑛
清 啓自
桐村 光太郎

3Hp01
3Bp05
1Op02
2Cp08
1Bp08
1Lp07, 1Op14, 2Mp05,
2Mp06, 3Mp12
1Gp12, 1Np09, 1Np10
1Bp04, 1Bp10

く
日下
楠本
楠元
工藤
工藤
工藤
久保
久保

勝弘
憲一
拓真
慧
宏史
眞丈
早友理
幹

久保田 智巳久保田 麻友
窪寺 隆文
窪野 一郎
熊谷 吉峻
熊久保 涼太
熊添 優希
熊田 陽一
熊野 匠人
久米田 博之
雲北 涼太
公文 翔一
倉掛 昌裕
倉澤 光
倉田 淳志
倉田 佳祐
倉本 歩
栗栖 太
栗田 涼子
栗原 勝範
栗原 航大
栗原 達夫
栗原 宏征
栗原 優花
栗林 怜汰
黒木 勝久
黒滝 智子
黒田 章夫
黒田
桒原
郡司

博隆
智也
萌

3Bp04
1Fp05, 2Fp04
3Fp12
2S-Kp02
2S-Fp05
2Hp08
2Op06
1Np15, 2Ep02, 3Np04,
3Np06, 3Np07, 3Np09,
3Np12, 3Np13
2Bp02
3Hp12
1Fp06, 1Fp08
2Op09
1Ap08
3Op14
2Kp01
2Lp10, 2Op04, 2Op06,
3Cp12, 3Cp13, 3Op12
1Bp11, 1Bp12
3Ip01
1Hp08, 1Jp01
1Gp13
3Ap14
1Kp14
1Gp06, 1Mp15
3Ap14
3Lp05
1Op01
1Jp11
2S-Hp01
3Ap05
1Mp15
3S-Fa07
1Lp14
3Hp11
3Gp11, 3Mp01
2Ap07
1Cp07, 1Lp08,
1Lp09, 1Np07
1Hp12, 1Hp13
3Fp01
3Ip07

け
解良

康太

1Ap07

こ
コースラ アジット
2S-Aa04
小泉 誠
1Dp09
小板橋 基夫
2Np07
小乾 彰紘
3Gp03
高 相昊
3Lp09
幸田 明生
1Ap09
髙津 あゆみ
2Lp08
河野 愛
3Ap09
河野 翔吾
2Ip05
河野 弘美
3Fp10
河毛 響平
3Ap14
甲元 一也
3Dp08, 3Gp15
高屋 朋彰
2Np05
肥塚 梨菜
1Kp07
古閑 友紀
2Mp01
古賀 雄一
3Bp03, 3Bp08, 3Bp13
古賀 優梨
3Hp01
小久保 晋
1Jp07, 1Jp08
小坂 唯心
1Ap06, 3Hp13
小澤 拓真
2Lp08
小島 幸治
3Fp12, 3Fp15
五島 剛太
3S-Ha03
兒島 孝明
2Gp09, 3Cp11, 3Cp16
兒嶋 孝明
3Fp02
小島 拓真
1Ip07
五島 徹也
1Fp02, 2Fp05, 3Fp09
小島 伸彦
1Dp06
小島 幹生
2Hp09
小島 凌
1Jp14
小薗 拓馬
3S-Aa05
小高 敦史
1Hp16
小高 雄也
3Dp15
児玉 智基
3Dp07
児玉 直弥
3Op02, 3Op03
児玉 浩明
1Lp14, 2Lp02, 3Hp03
後藤 香秋
1Kp07
後藤 早希
1Lp01
後藤 正利
1Fp01, 1Fp16
後藤 雅宏
1Cp14, 2S-Ap01
小西 正朗
1Lp07, 1Op14, 2Mp05,
小林 歩夢
小林 泉美
小林 和也
小林 元太
小林 日花梨
小林 美稀
小林 達彦
小林 祐摩
小林 洋介
小林 和香子
駒 大輔
五味 勝也
呉屋 七海
小山 幸祐
小山 伸吾
小山 純弘

2Mp06, 2Mp07, 3Mp12
1Ap07
3Fp08
2Gp08
1Fp01
1Jp07
1Gp09
1Bp11, 1Bp12
3Hp05, 3Kp03
2Ip01
1Mp08
2Op08
1Jp10
3Mp11
1Cp08
1Jp13, 2Lp09, 3Lp01
2Mp08

黒羽
近藤

ことみ
昭彦

3Dp05
1Dp13, 1Hp08, 1Ip04,
1Ip05, 1Ip11, 1Jp01, 1Jp02,
1Jp03, 2S-Fa01, 2Dp08,
2Op06, 3Dp02, 3Hp14
近藤 和馬
1Np10
近藤 倫生
2S-Fp01
近藤 涼太
1Kp09

さ
雜賀 あずさ雑賀 あずさ
三枝 敬明
齊藤 彰吾
齋藤 嵩典
齋藤 努
齋藤 直也
齋藤 虹帆
齋藤 肇
斉藤 遥
齋藤 愛弥
齋藤 芽生
斎藤 保久
齋藤 佑衣
齋藤 祐介
齊藤 悠希
齋藤 裕
酒井 香奈江
酒井 謙二
酒井 真弥
酒井 康行
阪井 康能
酒井 祐介
榊原 一紀
榊原 早也果
榊原 誠也
榊原 康文
榊原 陽一
坂本 心
坂元 仁
坂本 竜朗
坂本 千穂
坂本 祐基
櫻井 省吾
櫻井 翔太
迫野 昌文
笹岡 颯太
佐々木 匠
佐々木 千鶴佐々木 美穂笹野 佑
笹原 純
佐々本 康平
里 実優
佐藤 瑛美
佐藤 勝也
佐藤 伽音
佐藤 王高
佐藤 謙一郎1Jp09
2Np07
3Fp12, 3Fp15
1Gp05
2Fp01
3Gp08
1Ip01
3Cp07
1Hp07
3Gp14
2Lp03
3Gp14
1Op02
1Bp03
1Bp06
3Hp15
3Ip06
1Fp05, 2Fp04
2Mp01
3Fp02
2S-Ap032S-Ep05
3Op10
3Ap08
3Ip01
3Fp02
1Hp02
3Gp11, 3Mp01
3Fp06
3Mp13
1Mp10
3Op01
3Cp02
1Fp02
3Hp07, 3Hp09
3Cp03
3Mp02
2Ep02
3Np14
1Op04
2Op02, 2Op03
1Cp13, 2Cp02, 2Cp03
1Ap14, 1Ap13
1Fp12
3S-Aa05
1Fp14
1Bp12
1Gp13
3Lp05

293

佐藤
佐藤
佐藤
佐藤
佐藤
佐藤
佐藤
佐藤
佐藤
佐藤
佐藤
佐藤
佐藤
佐藤
佐藤
佐藤
佐藤
里村
佐貫
佐野
佐野
澤田
澤田

秀祐
俊
俊輔
伸
喬章
孝
岳大
努
雅英
道夫
光徳
康史
悠
由也
里佳子

3Bp07
2Np07
3Lp09
1Op05
3Ap12
3S-Aa05
2Np01
2Bp02, 2Bp03, 2Bp05
2S-Ea04
2Np04
3Gp12
1Dp08, 2S-Ha06
3Kp01
1Np04
2Ip04, 2Ip05, 2Ip06,
2Ip07, 2Ip08, 2Ip09, 3Op13
諒
2Bp03
崚
3Bp05
武範
3Bp06
理佳子
2Np08
絢子
1Fp10
海瑚人
3Hp05
和敬
1Fp01, 1Fp16
将吾
1Hp03, 3Hp06

し
椎名 健
2Dp03
塩川 つぐみ
3Bp10
重藤 啓輔
3Mp05
志田 洋介
2Ip04
實野 佳奈
1Op03
篠田 あかり
3Hp01
篠原 菜穂
2Bp01
篠原 寛明
1Kp09
篠原 優佳
2Op10
篠原 結子
3Gp03
柴田 望
1Jp13
柴田 裕介
2Fp05
柴藤 祐介
1Mp07
渋田 真結
2S-Ha01
渋谷 啓介
2Dp07
シブリ ナヒン
2S-Aa04
嶋川 銀河
3Bp07
島田 健太
2Np05
島田 幸輝
1Cp09
島田 昌也
2Ip02
嶋田 みな
2Kp08
清水 一憲
1Mp14, 3Dp14, 3Gp07,
清水
清水
清水
清水
清水

克彦
翔太
達也
尚樹
浩

志水

元亨

3Gp08, 3Gp10, 3Mp03
2Ap04
3Gp08
1Mp16
1Mp13
1Cp05, 1Hp03, 1Hp06,
1Ip06, 3Ap06, 3Ap07,
3Hp05, 3Hp06, 3Hp07,
3Hp08, 3Hp09, 3Kp03
1Bp02, 1Bp07,
2Gp09, 3Fp02

志村 英則
下飯 仁
下川 直史
下澤 勇弥
下谷 朋輝
下野 晴子
下村 有美
朱 博
周 延
周 哲
城内 孝俊
庄野 陸太
上用 みどり
白井 智量
白須 尊大
城間 一輝
進 和美
新谷 尚弘
進藤 菖
進藤 斉
新間 秀一
新家 一男

2Op01
1Fp02
1Cp14
2Ap05
1Hp03
3Dp09
2Mp03
2Cp06
1Fp02
3Hp15
3Ip09
2Gp03
3Fp10
2Ip05
3Bp08
3Ap10
1Dp03
1Jp10
3Fp16
3Fp08
2Bp01
2S-Kp02

す
水津 暁生
末 信一朗
須加 実
菅瀬 謙治
菅沼 寛
菅沼 佑奈
菅原 駿平
菅原 知宏
杉浦 紗也加
杉浦 俊作
杉浦 慎治
杉木 創
杉原 伸治
杉本 利和
杉本 幸子
杉森 大助
杉山 あい
杉山 晶彦
杉山 亜矢斗
杉山 勝紀
杉山 友康
杉山 由花
薄田 隼弥
鈴木 淳巨
鈴木 石根
鈴木 研志
鈴木 皓大
鈴木 仁子
鈴木 伸
鈴木 孝征
鈴木 琢磨
鈴木 忠宏
鈴木 敏弘
鈴木 直也
鈴木 宏和

1Np11
3Bp06
1Kp09
1Gp01, 3Hp13
1Dp05
1Jp05
1Cp06
1Jp09
1Bp16
3Hp01
1Dp03
3Ap06
3Bp06
2S-Hp03
1Fp04
2Bp06
2Ap01
1Dp02
1Dp15
1Ap08
2Dp04
1Cp10
3Mp08
3Mp15
1Ap07
1Hp05, 1Op01
3Ap08
3S-Aa02
1Ap02, 1Ap03
1Lp13
1Bp05
1Fp05
1Fp12
1Cp09
1Cp08, 3Kp09

鈴木 大斗
鈴木 雅登
鈴木 道生
鈴木 悠造
鈴木 陸太
砂 和樹
角南 茉耶
須之内 愛
諏訪 駿之介

2Lp05
3Cp15
1Jp12
3S-Fa04
2Mp03
2Dp10
3Np14
2Hp02
3Ip08

せ
勢井
清家

洋史
泰介

瀬川 和也
関 貴洋
関根 遼平
関野 七海
芹田 達郎
善藤 威史
仙波 弘雅

2S-Aa04
1Fp15, 1Hp09, 1Hp10,
2Ip03, 3S-Ha01
3Mp16
2Cp07, 2Cp08
2Ap08
2Ep04
1Cp03
2Gp01, 2Gp02, 2Gp03
1Ap09

そ
蘇 千雅
曹 偉
荘子 万能
相馬 悠希
副島 春香
曽我 瞳
曽我部 敦
園井 理惠
園木 和典

2Ep03
1Bp04
3Mp11
2Ip05
2Kp04
2Np04
1Jp09
2Dp05
3S-Fa06, 3Op01,
3Op02, 3Op03
2Op01
3Lp03
1Mp09, 1Mp10,
1Mp11, 1Mp12
1Gp11, 2Kp05
1Hp12, 1Hp13

園部 裕也
祖父江 史明
曽福 重光
染谷
空田

信孝
和也

た
ターシャ ウィンダ
3Dp02
大長 薫
3Hp04
高井 陸杜
3Cp04
高木 京馬
1Mp11
髙木 博史
1A-Aa02, 1Bp01, 1Hp16
高木 啓詞
3Np10
髙木 昌宏
1Cp14
高久 洋暁
1Cp03, 2Ip03, 2Ip04,

髙下
高下
高田
高野
高野
高野

秀春
秀春
悟郎
温
翔
力

高橋

圭

2Ip05, 2Ip06, 2Ip07,
2Ip08, 2Ip09, 3Op13
1Fp07
3Gp07
1Ap04
2Mp10
3Fp11
1Cp06, 1Np02, 1Op08,
2Ap07, 2Np01
3Fp10

294

高橋
高橋
高橋
高橋
高橋
高橋
髙橋
高橋
高橋
高橋
高橋
高橋
高橋
髙畑
高畑
髙峯
高山
高山
多賀
高城
滝口
瀧村
田口
田口
田口
竹内
竹内
竹内
竹尾
武尾
竹田
武田
武田
武智
竹中
竹中
竹原
竹俣
竹村
竹本
竹山

恒一
潤
佑
俊成
朋子
尚央
尚央
宣博
宏和
史員
将人
政友
優輔
美優
陽
和則
郁美
宗幸
直彦
博也
昇
靖
航暉
精一
久貴
明彦
道樹
悠貴
将俊
正弘
浩之
真由子
悠杜
大樹
航平
慎治
宗範
直道
海生
悠人
春子

武輪
田代
田代
田代
田島
田島
田島

能明
元彦
幸寛
陽介
健次
創
誉久

多田 周作
多田 慎之輔
多田 宏子
巽 慶太郎
巽 謙太
巽 祐介
伊達 実鈴
伊達 康博
田所 千佳

1S-Ep05
1Mp05, 1Mp13
1Np11
2Fp05
2S-Ea02
1Cp11
1Cp12
1Op02
1Cp02, 3Kp06
1Jp13, 3Lp01
3Mp07
2Ip05
3Ap11
1Ap15
3S-Ea04
1Fp16
2S-Bp06, 2Cp09
1Fp13
2Lp01
3Op13
1Np05
2Lp09
1Cp15
2Np04, 3Lp08, 3Lp09
2Op02, 2Op03
2Np07
3Ap11, 3Bp02
3Ap11
1Mp05
3Hp11
1Ap11
3Op12
1Ap13, 1Ap14
1Gp07
3Np03
1Bp08
1Ap08, 1Lp12
3Kp10
1Ip09
2Dp03
1Lp06, 1Op03, 2Ep03,
2Kp06, 2Kp07, 3Ip08
1Dp08
1Hp02
1Cp01, 2Mp01
2Kp03
2Dp06
1Fp14
1Np07, 3Mp06,
3Np01, 3Np02
1Fp13
1Jp14
3Bp10
3Kp03
1Ap10
3Bp08
3Bp10
3Gp12
3Np03

田中
竹中
田中
田中

彩
克英
賢二
健二郎

3Mp09
3Mp09
2Np09, 3Lp08
1Dp05, 1Dp14, 1Dp15,
2Dp01, 2Dp02, 2Dp03
田中 謙也
3Hp14
田中 琴葉
2Cp07, 2Cp08
田中 咲衣
2Op05
田中 伸一
1Bp08
田中 蒼磨
1Ap15
田中 拓未
1Cp11, 1Cp12,
1Jp05, 2Fp04
田中 勉
2Op06
田中 剛
1Op15, 2Bp10,
3Dp03, 3Op14
田中 友樹
2Lp06
田中 伸哉
1Fp15
田中 祐圭
1Gp05, 2Ap10, 3Dp05
田中 瑞己
1Jp05, 1Jp11
田中 美優
2Gp08
田中 桃未
1Jp08
田中 良和
3Cp10, 3Mp14
田中 里緒菜
2Gp03
棚倉 有哉
3Kp07
谷 博文
2Dp06
谷口 赳夫
1Hp11
谷村 雨音
1Lp12
種田 瞳
2Ap06
田原 悠平
2Kp02
田端 芽依
3Cp12, 3Cp13
玉置 尚徳
1Fp16
玉田 太郎
3Bp04
玉田 佑貴
3Np06
ダムナニョビッチ ヤスミナ
3Cp04
ダムナニョヴィッチ
田村 佳都
田村 謙太郎
田村 康一
田村 隆
田村 桃子
田谷 明香
多和田 悠貴陳 政霖

ヤスミナ

2Ap01, 2Ap02
1Bp04, 1Bp10
3Hp04
1Bp15
1Gp14, 1Jp12
3Ip03
2Np05
3Hp15
1Kp03

ち
銭 成
力石 佑紀
千菅 太一
知野 颯稀
千葉 恒慶
張 傛喆
張 宇琪
張 再軍
張 程

2Cp06
1Ap16
3Ap03
2Ip07
3Kp12
2Np06, 2Np10
1Ap13, 1Ap14
2Dp04
3Op09

つ
辻井
塚越

雅
勇斗

3Bp09
3Ip09

塚谷 京
塚田 銀志
塚原 正義
塚本 雅士
月俣 太飛
月元 漱介
柘植 圭介
柘植 丈治
柘植 陽太
辻 省吾
辻 雅晴
辻井 雅
辻井 竜太郎
辻崎 晴人
辻田 萌
津田 宗一郎
土戸 哲明
恒松 雄太
坪井 輝道
坪井 宏和
壺井 雄一
坪田 潤
湊元 幹太
釣上 竜河
釣本 真弘
鶴 廣太郎
鶴貝 龍聖
鶴田 爽

2Np03
2Mp04
3S-Ba03
3Hp09
2Hp09
3Bp13
1Fp01
3Ip13
1Hp04
1Ap16
3S-Ha05
1Ap07
2Dp09
2Dp06
3Cp08
2S-Fa04
3Mp13
2S-Kp01
1Hp07
1Ap09
2Lp09
2Hp09
3Cp15
1Bp02, 1Bp07
1Op06
2Bp08
2Op01, 3Ip09
3Kp11

て
鄭 暁紅
出来 真弓
寺井 悟朗
寺内 裕貴
寺澤 武
寺田 聡
寺本 祐司
寺山 拓臣

1Fp02
3Dp03
1Jp01
1Cp11, 1Cp12
1Dp08
1Mp05, 1Mp13
3Fp12, 3Fp15
2Np06

と
土居 克実
土居 菜々子
土居 幹治
滕 魯鵬
東樹 宏和
東條 卓人
堂前 直
徳王 亮太
徳岡 昌文
德永 成美
徳山 健斗
戸田 佳歩
戸田 成美
戸田 弘
戸所 健彦
殿塚 隆史
鳥羽 慶
飛田 啓輔
富恵 悠

2Kp04
3Gp15
1Bp08
1Dp09
2S-Fp02
2Lp09
1Cp10
3Ap04
1A-Ap01, 3Fp08
1Lp16
2S-Ha04
2Kp02
1Lp08
1Ip03
2Np08
3S-Aa05
2S-Aa04
1Fp09
3Mp11

295

富澤
富田
富田
冨田

哲
一輝
駿
宏矢

冨田 昌弘
富田 因則
冨髙 美佐
冨永 将大
巴 瞭斗
友永 佳津子
戸谷 吉博

外山
豊川
豊竹
豊竹
鳥居

二卯佳
洋一
洋祐
洋佑
英人

3Op15
1Ip04
3Ip07
1Bp05, 2Bp08,
3Ip01, 3Kp02
3Cp15
2Ep07
3Hp15
1Dp13, 1Jp02, 1Jp03
2Bp10
2Fp02
1Cp05, 1Hp03, 1Hp06,
1Ip06, 3Ap06, 3Ap07,
3Hp05, 3Hp06, 3Hp07,
3Hp08, 3Hp09, 3Kp03
2Ap06, 2Ap03
1Hp16
3Ap09
3Ap10
3Np03

な
直田
中井
中井
中尾
中岡
仲上
中川
中川
中川
中川
中川
中倉
中倉
中坂
中澤
中澤
中澤
中島

亮
正晃
雄也
匡志
慎治
侑友
拓郎
智行
直美
洋史
凜久
快斗
稜也
佑太
胡桃
堅太朗
光
一紀

中島 琢自
中島田 豊
中島
中島
中島
中嶋
中島
中嶋
中瀬
中瀬
中田

賢則
拓都
奈津子
幹男
美咲
義隆
舞
由起子
二郎

中谷
中谷
中西

正義
友樹
昭仁

中西

利樹

2Ap07
3Gp10
1Ap08
1Mp05
1Lp06
1Mp09
3Fp13
2Ip02
3Np02
1Jp07, 1Jp08
1Dp16
1Lp01
3Mp12
3Op02
3Dp03
1Hp04
3Bp12, 3Cp10
1Cp06, 1Np02, 1Op08,
2Ap07, 2Np01
3Ip08
1Ip09, 1Ip10,
1Np07, 2Mp03
2Hp08
2Mp06
2Fp01
1Mp01
2Op01, 3Ip09
1Ap13
1Fp08
1Fp04
1Mp09, 1Mp10,
1Mp11, 1Mp12
3Gp03
1Ip02
1Lp05, 1Lp11,
3Mp04, 3Op08
1Ap04

中野
中野
中野

一成
慧悟
祥吾

中野

秀雄

中野
中原
中原
中道
中村
中村
中村
中村
中村
中村
中村
中村
中村
中村
中村
中村
中村
中村
仲矢
中山
中山
中山
仲山
永井
永井
長尾
長尾
長岡
永倉
永嶋
長嶋
永田
永田
長谷
永谷
長門
長野
永野
永濱
長森
永山
七谷
鍋島
鍋田
成田
成田
成廣
成瀬

美貴子
歩汰
遥
優介
謙介
光希
努
颯斗
正樹
正宗
雅哉
美月
百花
泰之
雄
祐茉
祐哉
隆太郎
颯太
俊一
二郎
亨
英樹
研迅
美希
信義
征秀
未久
佑真
悠人
優芽
妃奈子
理彩子
彩沙
尚紀
直希
太志朗
幸生
清子
英二
達也
圭
優夏
友美
有輝
裕司
隆
陸

1Mp11
1Dp05
1Ap11, 1Bp16,
2Ap08, 3Ap03
2Ap01, 2Ap02,
2Bp09, 3S-Ka02,
3Cp04, 3Cp11, 3Cp16
1Mp03
3Ap09
1Bp04
1Ip09, 1Ip10
1Ap07
1Bp02
1Ap13, 1Ap14
1Gp04
3Ap08
1Ap07
3S-Fa04
1Hp15
2Ap05
1Jp01
3Dp03
1Jp06
1Bp15
1Cp10
1Hp09
1Cp01, 2Fp02
2Gp03, 3Hp01
1A-Aa01
1Ip14, 2Op05
3Gp10
1Dp05
1Mp07
3Bp13
2Kp04
1Gp10, 1Op10
1Mp04
1Jp11
2Gp02
1Ap03
1Cp16
1Kp07
1Kp16
1Gp08
1Fp01
3Gp11
2S-Aa03
1Ap07
1Ap07
3Gp02
1Jp05
3Gp04
1Dp15
3S-Ea03
3Dp10

に
二井手

哲平

1Cp05, 1Ip06,
3Ap06, 3Ap07

仁木
西井
西岡
西河
西河
西川
西川
西口
西口
西澤
西島
西谷
西田
西原
西峯
西向
西村
西村
西村
西村
西村
西村
西矢

大輔
圭
莉子
淳
佑馬
優里
洋平
大貴
優吾
知里
謙一
篤
奈央
宏史
隆悟
めぐみ
聡子
明
拓朗
美郁
泰風
恭彦
芳昭

西山
二塚
二田
新田
二宮
仁宮

千遥
美紀
諒
優香
歩武
一章

1Bp09, 2Ap04, 2Hp03
2Np05
3Bp05
3S-Aa05
2Bp09
2Ap09
1Lp06, 1Op03
2Lp09
3Mp16
3Hp13
2Dp09
1Fp16
2S-Ha05
1Op12, 1Op13
1Op07
3Kp05
1Np11, 2Hp04
1Hp16
1Np04
2Kp06
3Gp01
3Op14
1Ap10, 1Ap13, 1Ap14,
2Ap03, 2Ap05, 2Ap06
2Op05
3Cp06
3Mp02
1Gp14
2Cp06
1Mp09, 1Mp10,
1Mp11, 1Mp12

ぬ
額川
布浦
沼田
沼波

裕矢
拓郎
龍範
凜

2Fp09
2S-Ep02
3Cp12, 3Cp13
3Fp02

ね
根来
根本
根本
根本

宏明
進太郎
直人
理子

3Fp03, 3Fp04
3Op08
2Ap01, 2Ap02, 3S-Ka03
1Gp14, 1Jp12

の
野上
野口
野口
野口
野口
野尻
野田
野田
野田
野田
野中
野場
野間
野間

莉菜
綾子
恵一
紘志
友嗣
秀昭
蒼士
秀夫
陽一
凌太郎
鏡士朗
考策
あかり
陽太

3Lp11
3Ap12
1Cp10
3Cp06
1Fp09
1Hp05, 1Op01
1Op13
3Lp07
2S-Ea01
1Kp16
3Lp01
3Mp14
1Hp12, 1Hp13
1Dp12

296

野牧 秀隆
野見山 泰成
野村 一樹
野村 泰治
野村 暢彦
野村 亮
野村 亘

2Np03
2Gp03
3Fp11
3Ip10
1Cp03, 2S-Ka01
2Gp09
3Hp12

は
羽川 瞳
萩原 大祐
朴 龍洙
端 暸太
橋場 倫子
橋本 真悟
橋本 義輝
蓮沼 誠久

3Mp03
2S-Aa01
1Kp10
3Op12
1Jp01
1Dp02
1Bp11, 1Bp12
1Hp08, 1Ip04, 1Ip05,
1Ip11, 1Jp01, 2S-Ka02,
3Hp14, 3Op16
蓮見 惠司
2S-Kp05
長谷 純崇
1Hp02
長谷 哲成
3Cp11
長谷川 隆則2S-Aa02長谷川 智一3S-Aa05
長谷川 実奈美
1Dp09
長谷川 芽女
3Kp05
秦 喜久美
3Dp09
幡多 徳彦
2Mp10
秦田 勇二
2Op01, 3Ip09
畠中 治代
2S-Ea05
秦野 琢之
1Jp06
八久保 晶弘
1Op14
八又 翔風
3Np15
服部 大河
3Kp09
花井 泰三
3Op12
花田 晶子
1Op12, 1Op15
羽田 知由
2Gp08
羽部 浩
1Np04
濵 真司
3Lp07
浜口 愛勇生
2Op02, 2Op03
濱崎 英史
2Ep03
濱﨑 奈津香
3Dp15
濱治 百々子
1Gp15
濵嶋 梨紅
1Bp07
濱田 健作
3Fp07
早川 正幸
1Jp07, 1Jp08
早川 芳弘
1Ap07
早坂 実夏
1Bp07
林 咲希
1Dp05
林 咲楽
3Bp15
林 修平
1Lp10
林 秀謙
1Ap15, 1Ap16
林 真央
1Ap01, 1Kp02
林 怜生
3Bp06
早瀬 伸樹
1Op06
原 清敬
2Op05, 3Hp04,
3Hp05, 3Np10
原 正之
1Dp11, 1Dp12,
1Dp16, 3Dp11

原 良太郎
原口 裕次
原山 魁
張本 乾一
伴 直輝
番場 崇弘
馬場

健史

3Ap11, 3Bp01, 3Bp02
1Mp16
1Gp08
2Mp10
1Kp02
1Hp08, 1Ip04,
1Ip05, 1Jp01
2Ip05

ひ
稗田
東浦
東野
疋田
樋口
樋口
樋口
彦坂
久田
緋田

莉奈
優希
恭明
慶史
敬太
裕太
雄大
大幹
拓海
安希子

日高 聖覚
秀瀬 涼太
美藤 友博
日比 慎
一二三 恵美氷見山 幹基
姫野 南実
平井 知愛
平尾 理恵
平川 遥
平川 夕貴
平田 晃右
平田 悠人
平田 竜一
平谷 航
平野 啓太
平野 嵩典
平野 成菜
平野 優
平松 健太郎
平山 智弘
広川 安孝
廣瀬 航希
廣田 真
廣田 隆一
弘埜

陽子

3Ap13
2Ap06
2Op04
2Ip02
2Fp09
2Ip06
3Op01, 3Op02, 3Op03
3Lp15
2Dp02
3Mp06, 3Np01,
3Np02, 3Np03
1Hp05
1Ip11
2Ap04
3Bp02
3Cp08
1Ap13, 1Ap14
1Bp11
2Bp05
3Mp05
3Lp14
1Lp10
3Ap12
1Cp02
3Fp15
1Hp02
3Gp08
3Np04
3Ap16
3Bp04
1Fp16
1Cp03
3Op12
2Kp05
2Ip01
1Cp07, 1Lp08,
1Lp09, 1Np07
3Hp04, 3Hp05, 3Np10

ふ
黄 泰賢
深瀬 浩一
深野 和紘
吹井 真緒
吹谷 智
福居 俊昭
福井
福岡

学
徳馬

2Cp03
3Ap12
3Hp15
3Op13
2Kp08
1Ip13, 2Np09,
3Kp11, 3Kp12
2S-Ka03
1Jp09, 2Ip01, 2Np07

福崎 英一郎福島 宗一郎福島 ひかる
福谷 洋介
福田 淳二
福田 隆史
福田 隆志
福田 展雄
福田 晴
福田 紘子
福田 裕斗
福田 青郎
福永 浩一
福間 奈々子
福本 吉洋
福守 一浩
福山 真央
藤井 暁
藤井 明日香
藤猪 志歩
藤井 達也
藤井 力
藤井 浩
藤井 佑弥
藤岡 耕太郎
藤川 晃太朗冨士川 成美
藤川 璃子
藤島 皓介
藤田 憲一
藤田 祥子
藤田 雅也
藤田 友紀
藤野 泰寛
藤平 萌
藤巻 貴宏
藤本 瑛代
藤本 和士
藤山 和仁
藤原

伸介

藤原 政司
二神 泰基
二田 昴志郎
二ツ橋 龍
二又 裕之
二見 淳一郎
舩田 茂行
舟橋 久景
古内
古川
古田
古田
古舘
古谷
古野
古野

有希
英光
忠臣
雅一
祥
昇
正浩
洋子

1Hp14, 1Hp15, 2Bp01
1Dp09
3Ap12
2S-Bp06, 2Cp09, 3Gp14
1Dp01, 1Dp04
1Kp03
1Mp15
2Fp06
3Op14
1Mp01
2Lp01
2Hp05
1Hp07
2Dp08
1Np12
3Dp10
1Ap06
3Fp07
2Bp03
1Hp02
1Ip09, 1Ip10, 2Op07
2Fp05
2Op10
2Ip04
3Np03
3Np01
2Bp05
2Bp09
1Cp09
3Ip03, 3Ip05
1Gp02
1Mp05
2Cp04
2Kp04
2Op08
3Ip07
1Dp14
2Cp02
1Gp07, 1Gp08,
1Mp03, 2Ep04
1Cp15, 2Hp05, 3Fp13,
3Gp13, 3Kp07
2Dp06
1Fp16
3Hp15
1Dp07
1Op01, 1Op02, 2Op09
3Bp10
3S-Fa07
1Cp07, 1Lp08,
1Lp09, 1Np07
1Ap07
2S-Aa04
1Ap07, 3Bp09
3Mp13
3Lp09
1Fp11
1Hp14
1Bp06

297

へ
逸見

明央

1Cp09

ほ
北條 佑斗
穂坂 賢
星 直美
星田 栄紀
星田 尚司
星野 辰彦
星野 遥輝
細川 正人

3Ap08
3Fp08
3Bp09
3Fp07
1Fp07, 3Lp14
1Op03
3Ap13
1Lp06, 2S-Kp04,
2Kp06, 2Kp07
堀田 詩織
2Fp07
堀田 夏紀
1Hp16
堀 克敏
1A-Aa04, 1Cp04, 1Cp13,
1Cp16, 1Lp02, 1Lp03,
1Op09, 2Cp02, 2Cp03,
2Kp10, 3Mp14, 3Mp15
堀 智彦
1Jp02
堀 知行
1Np04, 2S-Fp04
堀井 俊平
3Ip08
堀井 悠一郎
1Fp05
堀内 淳一
2Lp10, 2Op04, 2Op06,
3Cp12, 3Cp13, 3Op12堀江 正信
3S-Ba06
堀川 拓
3Kp10
堀口 洋郎
3Mp09
堀口 諭吉
1Kp03
堀田 靖人
3Ap13
堀之内 貴明
3Dp09
堀本 智仁
1Lp05
本莊 知子
3Bp10
本荘 雅宏
1Op02
本田 絢郁
2Gp01
本田 孝祐
1Bp05, 2Bp08,
3Kp01, 3Kp02
本田 千尋
3Fp08
本多 裕之
1Mp14, 3Dp14, 3Gp07,
3Gp08, 3Gp10, 3Mp03
本田 正義
1Bp06
本田 裕樹
2Op10
本間 真樹
1Jp14

ま
前川 佳花
前田 陽
前田 朝海
前田 智也
前田 大翔
前田 将治
眞榮田 麻友美
前田 瑞歩
前田 泰一
前田 結衣
前田 幸嗣
前橋 健二
前橋 兼三

1Hp15
3Dp07
1Gp06
1Ip08, 2Kp08
1Cp02
2Dp10
1Bp03, 3Lp04
1Mp15
2Cp04
3Dp11
3Ap14
1Bp03, 3Lp04
2S-Bp06, 2Cp09

前畑 秀叡
牧 孝昭
牧野 恒平
牧野 祥嗣
政井 英司
増井
益江
真杉
増子
増子
増田
増田
増田
増原
松井
松井
松井
松井
松井
松内
松浦
松浦
松浦
松浦
松尾
松尾
松尾
松川
松崎
松﨑
松崎
松澤
松鹿
松下
松下
松島
松谷
松田
松田

ゆい
広稀
遼
貴彦
祐介
翔
真二
隆夫
誠
旺大
杏美
崇
大亮
南
愛美
一雄
健介
友亮
大空
伸二
赳志
弥俊
哲也
弘美
大典
浩明
翼
昭則
一信
拓磨
歩夢
峰之介
明香里
史生

松田
松田
松田
松永
松原
松原
松村
松村
松本
松本
松元
松本
松本
松本
的場
真鍋
丸井

美樹
祐介
理奈
浩子
さやか
未佳
洋寿
吉信
厚子
謙一郎
琴音
淳一
崇
拓
直樹
良幸
和也

1Kp10
1Lp10
1Ap07
3Bp15, 3Cp07
3S-Fa03, 3S-Fa04,
3Op01, 3Op02, 3Op03
3Op01
2Hp03
1Mp05, 1Mp13
3Gp05
3Gp05
3Fp12
1Ip07
3Op02
2Dp05
1Lp12
3Ip11
3Cp10
3Ap08, 3Ap09, 3Ap10
2Ep03
1Op12
3Np14
3Lp07
3Mp14
2Ep06
3Op13
1Ip09
1Fp12
3Ip11
2Gp01, 2Gp02, 3Lp08
2Lp04
1Jp06
3Dp02
1Ip09, 1Ip10
1Ip08, 2Bp07
3Ip06
3Dp14
2Bp07, 3Ip07
2Gp01
1Fp15, 1Hp09, 1Hp10,
1Hp11, 1Kp04,
2Ip03, 3Hp05
2Np04
3Bp07
3Fp16
2Ep03
1Np12
2Hp04
1Cp10, 3Bp04
1Op04, 3Np15
3Ip08
1Ip13, 3Ip01
1Dp04
1Bp08
3S-Aa05
3Fp12
3Mp04
3Ap12
1Kp12

丸岡
丸山
丸山
丸山
丸山
丸山

生行
彩乃
魁斗
潤一
竜人
稜介

1Fp07
1Fp12
2Ip09
1Ip01, 2Hp05
2Dp04
1Ap08

み
三浦
三浦
三木
三木
三﨑

敦宏
夏子
夏凛
健夫
亮

三品 登生
水崎 圭
水島 良太
水谷 拓
水野 裕一
溝尻 怜史
三井 亮司
三石 秋澄
光増 遼太郎
光山 統泰
水口 千穂
南 篤志
南 瞭子
南薗 洸佑
南野 淳
南畑 孝介
三根 健太郎
三原 明大
三本 麗華
三宅 克英
三宅 貴大
宮坂 均
宮崎 健太郎
宮澤 拳
宮下 聖也
宮地 輝光
宮副 こころ宮田 梓
宮田 真人
宮原 しろ沙
宮原 平
宮原 佑宜
宮本 愛
宮本 憲二
宮本 菜柚
宮本 浩邦
宮本 風俊
宮本 義孝
宮脇 佳汰
宮脇 佑実
幸 慎太郎
三吉 健太
三好 怜
三和 正弥
三輪 真由

1Jp05
3Ap01, 3Ap02
2Lp04
1Fp10
1Gp07, 1Gp08,
1Mp03, 2Ep04
3Bp06
1Np11
1Cp09
3Bp01, 3Bp02
1Fp01
2Hp03
2Hp06
1Gp07
3Lp03
3Dp09
1Hp05, 1Op01
1Ip01
3Ap12
1Op07
3S-Fa07
1Cp16, 3Ap04, 3Bp05
3Op13
3Cp12, 3Cp13
1Op02
1Gp10, 1Op10
2Ap10
1Lp10
1Bp05, 2Bp08, 3Kp02
3Mp08
2Kp08
3Lp16
2Lp07
1Ap11, 3Ap03
2Kp02
3Lp08
3Hp03
3Ip13
3Bp10
1Hp02
1Ap04
2Mp01
2Mp10
3S-Ba01
3Ap07
1Ap06
1Hp07
1Ip06
2Op01
3Dp08
3Ip07

298

む
向田
武藤
村上
村上
村上
村上
村上
村上
村上
村上
村木
村田
村田
村中
村松
村山
村山

忠弘
清明
明男
明一
愛美
克治
直之
裕
優衣
悠也
香渚美
智志
和加惠
俊哉
和明
拳午
大空

3Lp07
3Mp08
3Op12
3Bp12
1Kp12
1Ip09, 1Ip10
1Hp16
3S-Ka05
2Hp05
1Mp13
3Op02, 3Op03
3Op14
3Ip05
2Ep05
3Dp15
1Op16
3Kp02

め
メトワリー

キャレド

1Gp04

も
茂木 喜信
茂田 一郎
望月 智弘
本門 慧史
桃井 玲香
百瀬 賢吾
森 康一
森 浩二
森 光太郎
森 さくら
森 聖也
森 朋子
森 英樹
森 宙史
森 浩禎
森 美乃莉
森 美穂
森 めぐみ
森 裕太郎
森川 眞有
森茂 真菜
森島 菜月
森田 友岳
森野
森山
守山
森芳
森脇
両角
諸星

魁人
桐
千晴
邦彦
真希
佑一
知広

2Fp07, 2Fp08, 2Fp09
2S-Hp02
1Ip11
1Np08
2Lp05
2Dp03
1Lp10
1Cp03
1Fp15
1Lp03
1Cp05, 3Ap06
3Gp02
1Dp11, 1Dp12,
1Dp16, 3Dp11
3S-Ea02
1Mp01
1Lp11
3Hp16
1Ap06
3Dp02
1Gp15
3Hp11
1Ip05
1Ip09, 1Ip10, 1Jp09,
2Ip01, 2Op07, 3Lp10
3Op10
1Jp14
3Cp01
1Ap14
3Gp04, 3Op05
1Fp04
1Gp11, 2Kp05

や
藥師

寿治

1Ip08, 2Bp07

谷口 尚哉
矢倉 一樹
安浦 雅人
保川 清
安川 智之
安田 貴信
安福 希
安本 周平
八塚 優衣
八代 祐典
柳川 謙吾
柳原 格
栁原 隆志
矢野 嵩典
藪 浩
山形 洋平
山岸 まなみ山口 哲志
山口 翔太郎
山口 颯太
山口 大介
山口 響
山口 良弘
山口 諒
山崎 思乃
山崎 広顕
山﨑 梨沙
山崎 晴丈

1Gp11
1Ap10
1Kp03
3Kp07
3Cp15
2Cp06
1Kp15
2Ep05
1Gp13, 1Gp14
2Lp02
3Ip01
3Kp07
1Np06
2Hp06
1Cp11, 1Cp12
1Jp05
1Jp07
2S-Bp01, 3Cp01
2Ap05
1Cp08
2Lp10
1Kp11
3Ip03, 3Ip05
2Cp10
3Gp01, 3Lp13
3Lp03
3Fp09
2Ip04, 2Ip05, 2Ip06,
2Ip07, 2Ip08, 2Ip09
山澤 友葉
2Bp02
山下 朗
3S-Ha02
山下 秀行
2Fp04, 3Fp13
山下 雅揮
3Ap14
山下 結香
2Np07
山下（鮫島） 結香
3Lp10
山下 璃貢
2Bp07
山地 未紗
1Kp06
山瀨 優日
3Ip05
山田 明日香
3Fp08
山田 健人
1Dp11
山田 康矢
3Dp12
山田 こころ
3Op07
山田 翼
1Fp15, 2Fp05
山田 直樹
1Lp10
山田 守
2S-Ka05
山田 美和
1Bp06, 3Kp05,
3Kp08, 3Lp12
山田 芳香
1Ap08
山手 康輝
3Dp02
山名 啓太
3Dp07
山中 享史
1Np07
山根 愛
3S-Aa02
山野 - 足立 範子
1Hp12, 1Hp13,
3Bp03, 3Bp08,
3Bp13, 2Dp10
山村 晃
1Ap01
山村 英樹
1Jp07, 1Jp08
山本 明菜
2Mp03
山本 一貴
3Dp14

山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山吉
山脇
八幡
八幡

兼由
紗生
周平
省吾
進二郎
純子
純也
哲晃
尚毅
浩明
真帆
万結
康之
陸
涼太郎
陵平
大輝
志央美
穣

3Bp09
2Ap03
1Jp09
1Hp04
1Lp10
1Hp02
3Lp11
2Cp10
3Mp04
2Hp08
2Op10
2Hp06
3Kp10
1Mp16, 3Dp12
3Cp01
3Op13
2Op04
1Cp03
1Cp03

ゆ
柚木 克之
由里本 博也

1S-Ep032S-Ep05

よ
楊 英男
叶 静遠
養王田 正文

3Op09
3Op12
1Cp10, 1Mp07,
2S-Bp06, 2Cp09, 3Gp14
横井 健二
2Fp03
横井 智広
1Dp15
横井 佑果
1Op15
横田 篤
1Ip08, 2Kp08
横田 健治
3Ip07
横山 元蔵
3Fp05
横山 武志
3Mp14
吉井 智哉
2S-Bp06, 2Cp09
吉井 祐太
3Ap12
吉岡 美紗
3Fp13
吉川 潤
1Bp03
𠮷川 潤
3Lp04
吉川 琢也
3S-Fa05, 3Op02
吉﨑 由美子
1Fp01, 1Fp16
吉澤 耕
3Fp08
吉田 曉弘
3Op02
吉田 修
1Lp12
吉田 佳鼓
2Kp08
吉田 健一
3Lp11
吉田 昭介
2Np08
𠮷田 智美
2Kp04
吉田 ナオト1Gp12, 1Np09, 1Np10
吉田 亮介
1Lp08, 1Lp09
吉野 知子
1A-Jp01, 1Op15, 2Bp10,
3Dp03, 3Op14
吉見 啓
1Cp11, 1Cp12, 3Mp08
吉村 臣史
1Fp01
吉村 瑞花
3Fp13
吉本 将悟
1Cp04, 1Cp13, 1Cp16,
1Lp02, 1Lp03, 2Cp02,

299

善本
依田
米山
蓬田

裕之
毅
史紀
美紗樹

2Cp03, 3Mp14, 3Mp15
2S-Ea03
3Gp16
1Op05
1Lp05

り
李 秋実
李 ユウナ
劉 利雲
リュウ ロ

2Ip01
3Dp11
2Fp04
1Op04

わ
若井
若林
若林
若林
若山
和賀
脇中
涌井
和久
鷲尾
渡部
渡辺
渡辺
渡邊
渡邉
渡辺
渡部
渡部
渡辺
渡邉
渡邊
渡辺
渡邊
渡邊
渡邉
渡部
渡来
和田
和田
和田
和田
和田
和地

暁
慧
壮吾
里衣
守
健太郎
琢良
秀樹
豊
周
昭
一樹
賢二
暉己
康太
智
潤
貴志
大輔
友浩
寛子
昌規
真宏
源規
洋輔
凌
直生
圭介
直樹
大
真由美
善成
正明

2Np03
3S-Aa04
1Mp12
1Cp14
3Ap09, 3Ap10
1Op15
2Fp07, 2Fp08, 2Fp09
3Bp04
1Fp05
3Dp02
1Jp10
2Mp05
3Ip06
1Np05
1Cp01, 2Fp02
1Lp08, 1Lp09
2Fp07, 2Fp08, 2Fp09
1Fp14, 2Np07
1Fp04, 3S-Ha06
2S-Ka03
2Hp08
3Gp05, 3Lp15
1Ip09, 1Ip10
2Op10
2S-Aa04
2Ip04, 2Ip08
1Bp15
1Ip09, 1Ip10
1Kp12
1Ip08
2Lp09
1Ap01
1Hp01, 2Hp02

301

ランチョンセミナー
各日の昼休憩を利用して開催します．事前登録不要・参加費無料です．
開催日の朝，受付にて整理券を配布いたしますので，参加ご希望の方は整理券をお受け取りください．セミナー
開始時刻を過ぎると，整理券は無効となりますのでご注意ください．整理券をお持ちでない方も聴講することは可能ですので，参加される場合は直接会場にお越しください．ただし，お弁当を提供できない場合がありますのでご了承ください．

《大会 1 日目》9 月 3 日（日）11：45 ～ 12：45
1L-B01 （B 会場〈IB 電子情報館・IB015〉） 株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ
1L-C01 （C 会場〈IB 電子情報館・IB014〉） 東ソー 株式会社
1L-D01 （D 会場〈IB 電子情報館・IB013〉） 日本ウォーターズ株式会社《大会 2 日目》9 月 4 日（月）11：30 ～ 12：30
2L-B01 （B 会場〈IB 電子情報館・IB015〉） 株式会社島津製作所
2L-D01 （D 会場〈IB 電子情報館・IB013〉） 株式会社テクノスルガ・ラボ
2L-G01 （G 会場〈ES 総合館・ES022〉）

ブルカージャパン株式会社

2L-I01 （I 会場〈ES 総合館・ES025〉）

辻製油株式会社《大会 3 日目》9 月 5 日（火）11：30 ～ 12：30
3L-B01 （B 会場〈IB 電子情報館・IB015〉） 株式会社バッカス・バイオイノベーション
3L-D01 （D 会場〈IB 電子情報館・IB013〉） 株式会社エービー・サイエックス
3L-G01 （G 会場〈ES 総合館・ES022〉）

レフェイン・ジャパン株式会社

3L-I01 （I 会場〈ES 総合館・ES025〉）

株式会社豊田中央研究所

302

ランチョンセミナー

月
9

日（日）
3

303

ランチョンセミナー

月

9

日（日）

3

304

ランチョンセミナー

月
9

日（日）
3

305

ランチョンセミナー

月

9

日（月）

4

306

ランチョンセミナー

月
9

日（月）
4

307

ランチョンセミナー

月

9

日（月）

4

308

ランチョンセミナー

月
9

日（月）
4

309

ランチョンセミナー

月

9

日（火）

5

310

ランチョンセミナー

月
9

日（火）
5

311

ランチョンセミナー

月

9

日（火）

5

312

ランチョンセミナー

月
9

日（火）
5

– 後付1 –– 後付2 –– 後付3 –– 後付4 –– 後付5 –– 後付6 –– 後付7 –第 75 回日本生物工学会大会講演要旨集
2023 年 8 月 21 日発行
発行所

公益社団法人 日本生物工学会〒 565-0871 大阪府吹田市山田丘 2-1
大阪大学工学部内
TEL. 06-6876-2731 FAX. 06-6879-2034
E-mail: info@sbj.or.jp
https://www.sbj.or.jp