TCS-SP5
Ver2.0Manual2009/06/08

目次
Leica TCS SP5 について 1
Ⅰ. Start Up

4

Ⅱ. 基本操作 10
LAS AF について 10
Ⅱ－１．画像の取得 12
Ⅱ－２．XY 平面の画像取得 23
Ⅱ－３．XYZ 画像の取得 24
Ⅱ－４．シーケンシャルスキャン 27
Ⅱ-４-１．登録済みの設定を呼び出して使用する場合 27
Ⅱ-４-２．新規に設定を登録する場合 30
Ⅱ-４-３．終了する場合 34
Ⅱ－５．画像の保存 35
Ⅱ－６．Acquisition タブについて 48
Ⅱ－７．Beam Path Settings の新規登録 52
Ⅲ. Viewer について55

Ⅳ. スキャンバリエーション 60
１．TimeLapse（径時変化取り込み） 61
２．Lambda Scan 64
３．Z 方向に強度の補正をしながら Scan する 72
４．ROI Scan(任意エリアのスキャン) 75
５．Live Data Mode（高度なタイムラプス）（*オプションソフト） 78
６．スキャニングステージ使用法（Tile Scan, 多点タイムラプス） 84
Tile Scan 85
多点タイムラプス 88

Ⅴ.Process 92
Edit 93
Adjust 98
Deconvolution（*オプションソフト）
Noise Reduction 104
Segmentation 105
Visualization 107
Dye Separation 112
Topological 115

101

Ⅵ. Quantify 117
Intensity 118
Line Profile 119
Stack Profile 122
Histogram 126
Report ボタンによる結果出力 129
Ratio 測定 130
Colocalization

135

Ⅶ.Shut Down

140

Leica TCS SP5 について
Leica TCS SP5 は、いくつかある共焦点の種類の中で、最も解像度が高いピンポイン
トタイプのスキャニング方式を採用している製品です。
尚、TCS SP5 のスキャナーには以下３種類の仕様（オプション）があります。

●Conventional Scanner(コンベンショナルスキャナー)
高精細スキャン用スキャナー。
最大 8192x8192pixel で画像取得が可能。

●Resonant Scanner(レゾナントスキャナー)
高速スキャン用スキャナー。
多重染色＋透過画像を最大 250frame/sec で取得可能。
ラインスキャン、ディスクスキャンなどの高速スキャン技術に比べ、XYZ の分解能において最も高いパフォーマンスを得ることができます。

●Tandem Scanner(タンデムスキャナー)
上記２種類のスキャナーを 1 台に両方搭載しているスキャナー。
高精細＋高速スキャナー。
ソフトウエア起動時にどちらのスキャナーを使用するか選択することによって切り替え可能。

1

TCS SP5

Scanner 光学系

2

TCS SP5 プリズムスリット方式

3

Ⅰ．START UP
顕微鏡側からの画像の取り込みを行わない場合は、レーザーや水銀ランプの電源を入れる必
要はありません。

主電源部

①

②

レーザーOn/Off の③

パイロットランプ④④レーザーの発振キースイッチ①PC およびモニター主電源②スキャナー電源

4③レーザーの主電源

① PＣおよびモニターの電源 ＯＮ （左の緑のボタンをＯＮにする）② スキャナーの電源ＯＮ （真中の緑ボタンを ON にする）（（注意））ライカのアプリケーションソフト「LAS AF」がスキャナーを認識するためには、ソフトが起動される前にスキャナーの電源が入っている必要があります。もし作業の途中でソフトウエアＬＡＳ ＡＦのみを立ち上げ直す場合（コンピュータそのものの立ち上げ直しも含む）でも、スキャナーの電源を入れ直してからリスター
トしてください。その場合スキャナーの電源を入れてから 20 秒程待ってからソフ
トウエア「ＬＡＳ ＡＦ」を立ち上げてください。
③ レーザーの主電源ＯＮ （右の緑ボタンを ON にする）
④ レーザーの発振スイッチ（セキュリティキースイッチ）ＯＮ
黄色のパイロットランプが点灯します。
⑤ 水銀ランプ電源（蛍光観察でない場合には必要ない）白色の電源ボックスのスイッチを ON にする。（下記いずれかのモデルとなります。）（（注意））どちらも頻繁にＯＮ/ＯＦＦしないこと。

水銀ランプ（100Ｗ）
再点灯はランプハウスが冷えてから（15～30 分待って）行う。

超高圧水銀ランプ（120Ｗ）

またランプハウスは非常に高温となるた

再点灯は５分ほど待ってから行う。

め、使用後ビニールカバーをかけるとき（電源内部で点灯しているのでランプハウは注意すること。

スは無し）

5

⑥顕微鏡電源ＯＮ
電動顕微鏡のため、フォーカス移動・ハロゲンランプの電源などと連動しているので必ずＯＮにする。アプリケーションソフト起動時にＯＮになっていないと起動できませんので注意してください。
（下記どちらかのモデルとなります）⑥ ログイン
WindowsXP が立ち上がったら、TCS_User のユーザーアイコンを選択します。

⑦ 左側に並んだショートカットの中より次のアイコン（LAS AF）をダブルクリックする。

⑧ 以下のウインドウが開く。
OK ボタンを押す。立ち上げには数分かかります（購入時の仕様により時間は異なります）。
起動中はスキャナー、顕微鏡、ガルバノステージ（オプション）のイニシャライズを行いますので、焦点・光路が変わります。
サンプルのセッティングは起動が終了するまでお待ちください。

Resonant scanner モード（オプション）で立ち上げる場合にはチェックボックスにチェックをつける。
チェックをつけなければノーマルモードで立ち上がります。

6

⑨電動ＸＹステージが装着されている場合；オプション）はホーミングをするかどうかを聞いてくる
のでホーミングをする場合は、Ｙｅｓをクリックする。
Ｙｅｓ：Ｔｉｌｉｎｇ（マッピング）、Ｍａｒｋ＆Ｆｉｎｄ（多点タイムラプス）が可能となります。
Ｎｏ：上記機能はアクティブとなりませんが、ステージを電動で動かすことは可能です。

⑨ アプリケーションが立ち上がったら、サンプルを顕微鏡上にセットし、フォーカスを合わせる。
（（注意））ガルバノステージが接続されている場合は、ソフトの立ち上げ時に Z 軸のキャリブレーションを行うため、フォーカスが変わる。立ち上げが終了してからフォーカスあわせを行うこと。
⑩ レーザー光源のセットアップを行う。
Configuration タブ

Laser アイコンを開き、Hardware Configuration の中のをクリックする。使用する各レーザーのチェックボックスをシングルクリックでアクティベイトし、チェックを入れる。
Ar レーザー使用時は、レーザー出力も入力する。（目安として、20-30％）

注意）ダブルクリックすると、レーザーON の直後に OFF にすることとなり、頻繁に繰り返すと故障の原因になりますのでご注意ください。

7

⑪ （Resonant Scanner モードで立ち上げた場合）
共振ミラーへの負荷を軽減するため、立ち上げ時は Zoom Factor が４倍になっています。
Scanning エリアが狭くなっていますので、Zoom factor を最小（Resonant の場合は 1.7 倍まで）に落としてから使用を開始してください。（Conventional Scanner の場合は最小 Zoom Factor は１.0）

Resonant Scanner の場合：立ち上げ時は Zoom Factor が４→最小 1.7 にする

8レーザーについて
レーザー光源は、下記の光源のいずれかを装備し AOTF（Acoust-Optical Tunable Filter :音響光
学偏光素子）を用いてそれぞれの励起波長の選択と使用出力をコントロールしています。
レーザー

波長

観察できる試薬の例

１

半導体 Blue Diode レーザー

405nm

DAPI など

２

Diode レーザー

442nm

CFP など３

空冷 Aｒレーザー458 nm

CFP, Lucifer Yellow など

４〃476 nm

特に無し（元々ﾚｰｻﾞｰから出ている）

５〃

488 nm

FITC, Alexa488, GFP, PI, Cy2, Fluo3 など

６〃496 nm

特に無し（元々ﾚｰｻﾞｰから出ている）

７〃

514 nmYFP など８

空冷 Green He-Ne レーザー

543nm

Rhodamine, Alexa546, Cy3 など

９半導体Ｇｒｅｅｎ Diode レーザー

561nm

Alexa568, Ds-Red など

10

空冷 Kｒレーザー

568nm

Alexa568, Ds-Red など

11

空冷 Orange He-Ne レーザー

594nm

ＴｅｘＲｅｄ, Alexa594, mCherry など

12

空冷 Red He-Ne レーザー

633nm

TOTO3, Cy5 など

詳しい各蛍光色素の波長などについては、http://probes.invitrogen.com/ などを参照してください。
＜＜AOTF の原理図＞＞
AOTF は音響波（Radio Frequencies：RF）
を加えることで、結晶内の屈折率が変化します。この性質を用いることで、光源から特定の波長を選択することができます。光源から出ているレーザー光は AOTF に対して、角度をもって入光するように設計され、特定の RFを AOTF に与えることで、必要としている波長のレーザー光を光路へと導きます。また、
AOTF に与える RF を調整することで、波長の種類、および光量（パワー）の調節を行うことができます。

9

Ⅱ．基本操作
LAS AF について
画面左上に以下のようなメニューが表示されています。

Configuration：

Acquire：Process：

Quantify：

セットアップ画面。

Scan を実行し、画像画像処理を行うメニ

測定メニュー。

レーザーの電源 ON・の取得操作のためュー。

長さ、輝度、面積等

OFF に 必 ず 使 用すのメニュー。

の測定。

る。

操作の流れ：

レーザー等の画像の取り込み

必要に応じて画像処理

セットアップ10

必要に応じて測定メニューごとに異なる操作画面になりますので、まず、４つのうちのいずれかのメニューを開いて、その下に出てくるプログラムを操作していきます。
Configuration メニュー：
Acquire メニュー：

Process メニュー：

Quantify メニュー：

尚、以下のオプションソフトがインストールしてある場合は、以下のように画面左上からアクセスします。
ここをクリック
ここからアクセスできるオプショ
ンソフト：以下 4 点
FRAP
FRAP XT
FRET AB
FRET SE
Live Data Mode11

Ⅱ-１．画像の取得
１． Beam の設定
Acquire メニューを開きます。

操作画面にある Load/Save Setting から、FITC などサンプルの染色に近い設定を選択します。
レーザーの設定を選択、励起波長とパワーを登録、削除

AOTF により選択

ダイクロイックミラー
または AOBS

対物レンズ

検 出 波 長 域 を 表 示 。
この波長領域の蛍光を検出するということ。

蛍光用検出器。

になっていると、検出器が Active になっている状態。
透過光用検出器
Additional Channel の文字をクリックするとPMT Trans 検出器が追加されます。
Scan-BF：透過光観察
Scan-DIC：微分干渉観察（偏光板無し）
Scan-DIC-Pol：偏光板入り微分干渉観察

12Beam Path Settingｓ の登録名称について
登録は全ての試薬名称ではなく、一般的な試薬の代表名（FITC など）で行われています。
緑蛍光の代表として FITC、赤蛍光の代表として TRITC などです。
どの設定が良いかは、使用される試薬の励起波長と蛍光波長をご確認の上、登録されているものの中から近いものをお選びいただくことになりますが、下記表も参考にしてください。
登録名使用可能な試薬名使用される励起波長（nm）

FITC（緑蛍光）

FITC、Alexa488、GFP、Cy2、Fluo3、Fluo4 など

488

TRITC（赤蛍光）

TRITC（ローダミン）、Cy3、Alexa546・555・568、 543、561、（594）
PI、DsRed、TexRed など

Cy5（赤外蛍光）

Cy5、TOTO3、YOYO3、TOPRO3、YOPRO3 など

633

DAPI（青蛍光）

DAPI、Hoechst、Alexa350 など

405

CFP

CFP など458

YFP

YFP など514

GFP

GFP など488

DsRed

DsRed など

543、561、（594）Transmission

透過像

488

Reflection

反射像

488

*検出される蛍光波長は、プリズムスリット機能により自由に最適化することが可能です。最適化
後、Save ボタンで新規登録（ユーザーディレクトリー）を行い、次回の操作を簡略化することができます。

13

２．対物レンズの交換
BeamPathSettings にある Objective を押し､使用する対物レンズを指定し、交換します。

光路に入っている

そ の シ ステ ム に対物レンズ取り付けてある
対物レンズ

液浸レンズ⇔ドライレンズの交換時は下記のメニューが表示されます。Yes ボタンでレンズが交換されます。
液浸レンズ使用時は、必ずサンプル側に付着している液浸（オイル、水、グリセリン）を拭いてから
ドライレンズに交換するようにしてください。

注意！
液浸（オイル、水、グリセリン）がサンプルに付着した状態でドライレンズに交換すると、ドライレン
ズの先端にオイルなどが付着してしまい、画像の劣化を招きます。
必ずオイルなどをふき取った上で、「Yes」をクリックしてドライレンズに交換してください。
オイルなどがドライレンズに付着してしまった場合には、画質の劣化を招きますので必ずクリーニングを行うようにしてください。

14

３． フォーカス駆動方式の選択
SP5 では、顕微鏡内臓モーターとガルバノステージ(Option)の２つのフォーカス駆動方式があります。
Z-Galvo：ガルバノステージを使用
Z-Wide：顕微鏡内臓モーターを使用

Z-Galvo

Z-Wideガルバノステージ

顕微鏡側モータードライブ（倒立：レンズ上下、正立：ステージ上下）

最小ステップ幅

10nm

15nm

最大駆動距離1500μmモジュールの稼動範囲（cm）

駆動
モジュール
操作モジュール

ガルバノステージ

正立顕微鏡の場合

倒立顕微鏡の場合

ステージ

レボルバー（レンズ）コントロールパネルまたはソフト

顕微鏡本体のフォーカスダイヤル、スマート上から操作

ムーブ、またはソフト上から操作（連続断層像取り込み時の（パネルボックスからも操作は可能ですが、Begin と End の設定時は、顕微

デフォルトでは微動になります）

鏡本体のフォーカスダイヤル及びスマートムーブからの操作は有効ではないので注意）

４． スキャニングの開始
Live
す る と 、 Stop
Stop

ボタンを押します。スキャニングがスタートします。一度、スキャンをと表示が変わります。スキャンを止めるときは、このボタンを押します。

15

５． フォーカス面の調整
パネルボックスの一番右のダイアルを回すと、ピントが移動していきます（ガルバノステージ・レ
ボルバーなどが移動）。サンプルのどのピント面の画像を取り込むかを選択します。

顕微鏡本体のフォーカスダイヤルまたはスマートムーブからも、Ｚフォーカスの調整が可能です。スマートムーブの右側にあるＦｉｎｅボタンを押してＺフォーカスダイアルを回し、フォーカス面の調整を行ってください。
注意：フォーカスの調整は可能ですが、Z 位置の登録（Begin、End）は Z-Wide モードでないと有効になりません。

スマートムーブ

Fine ボタン＜ダイアルの回転方向とサンプルの動き＞

パネルボックス の場合
時計回し
顕微鏡のステージ・
対物レンズの
移動方向

ガルバノステージ

反時計回し

正立顕微鏡：
倒立顕微鏡：
顕 微 鏡 の ス テ 対物レンズが上ー ジ が 上 に 移 に移動
動 （ ピン トは 下 （ ピ ン ト は 上 部
部へ）
へ）
正立・倒立顕微鏡ともにガルバノステージが下がる（ピントは上部へ）

正立顕微鏡：
顕微鏡のステージが下に移動（ピントは上部へ）倒立顕微鏡：
対物レンズが下に移動（ピントは下部へ）

正立・倒立顕微鏡ともにガルバノステージが上がる（ピントは下部へ）

スマートムーブ・顕微鏡のフォーカスダイヤル の場合
時計回し
顕微鏡のステージ・
対物レンズの
移動方向

正立顕微鏡：
ステージが上に移動（ピント
は下部へ）

反時計回し
倒立顕微鏡：
対物レンズが上に移動（ピントは上部へ）

16

正立顕微鏡：
ステージが下に移動 （ ピ ン ト は 上部へ）倒立顕微鏡：
対物レンズが下に移動（ピントは下部へ）

＜＜コントロールパネルの設定変更＞＞①BeamPathSettings 画面上で Control Paneｌをクリックする。

② 以下の画面が出るので、変更したいダイアルをクリックしてアクティブにし（赤色にする）、Assignment 内のパラメーターを変更する。
ダイアルの設定

それぞれのダイ
アルのステップ
サイズ
Illumination
コントロールパネ
ルにある液晶の明るさの変更17

６． 画像の感度調節
ここでは Gain と Offset の設定について説明します。
多重染色の場合は、モニター上でクリックしたチャンネルの設定をそれぞれ一つのダイヤルでコントロールできます。
Smart Gain

Smart Offset

Gain：（画像の明るさ）
パネルボックスの一番左のダイヤル（デフォルトで“SmartGain”になっています）を回し、検出器の電圧を調整して画像の明るさ調整を行います。
Offset（バックの明るさ）
パネルボックスの左から 2 番目のダイヤル（デフォルトで“SmartOffset”になっています）を回し、バックの明るさを調整します。
CH1

CH2

モニター上でチャンネ

CH3

ルをクリックし、そのチ
ャ ン ネ ル の Gain やOffset を変更する。

モニター上で、感度を変更したい画像（ch）をクリックすると、そのチャンネルの Gain、Offset の変更が可能になります。

18

Viewer にあるボタンを使うと輝度のチェックが容易になります。

ボタンを押すと、押すたびに表示色が一時的に下記のように変更されます。
Original（緑、赤などのオリジナルカラー）→Grow Over/Under（チェック用カラー）→Gray（白黒）→Original（緑、赤などのオリジナルカラー）
Grow Over/Under（チェック用カラー）は、表示諧調（８Bit のときは、0～255 の２５６階調）内にあるときに、白～茶で表示します。表示階調内を超えているときは、青（256 以
上）や緑（0 未満）で表示されます。感度を調節する際に、この青や緑がなくなるように感度の設定を行うと、適正感度の画像が得られます。青表示は、サチレーション輝度が飽和している部分を示しています。緑表示は、バックグラウンドを引きすぎているときに表示
されます。
>255

青（サチュレーチョン＝）

255

青

・

白

・

茶

・

黒

0

緑

0<

緑

サチュレーションしている部分
バックを引きすぎている部分

19

７． Zoom
必要に応じて、1x－64x までの Zoom をかけることが可能です（レゾナントスキャナ
ーの場合は 1.7ｘ-64ｘ）。
スキャンズームは、同じ画像解像度のま
ま、スキャン領域を Zoom します。Zoom した状態だと、矢印ボタンを使用することができます。
ZoomFactor(中心 Zoom)：スライダーを動かし、ズーム倍率を変更できます。また、倍率入力も可能です

ZoomIn：特定の位置を選択 Zoom
できます。ZoomIn をクリックした後、Viewer 左側の□ボタンを押して画像上で ROI を指定してください。
Zoom した状態で、矢印ボタンを使用し、スキャニ
ングエリアを移動することができます。
７－１．中心 Zoom
モニターに表示されている画像の中心を拡大します。Zoom Factor のスライダーを左右に移動させ、画像を拡大する。または、拡大したい倍率を数値入力します。
Zoom（中心 Zoom）は、パネルボックスからも操作できます。

Zoom x1

Zoom x220

Zoom x4

７－２．Zoom In （選択領域の Zoom）
Zoom

in にチェックを入れ、画像上で拡大したい部分を指定し、スキャンします。（コンベン

ショナルモードのときのみ有効、レゾナントモードでは使用できません。）

視野中心に戻る場合は、矢印キーの真ん中のボタンを押してください。

21

８．スキャニングローテーション
左から３番目のダイアルを回すとスキャニングローテーションを行うことができます。ダイア
ルを回すと、レーザーを操作する角度が変化します。スキャニングローテーションは、-１００°
から＋１００°まで回転可能です。

Rotation のスライダーでも、スキャニング
ローテーションを可能です

ダイアルを

ダイアルを

回すと

もっと回すと

９．スキャンニングの停止

Stop

ボタンを押し、スキャニングを停止します。

注）Live ボタンはユーザーが Stop しない限りレーザーが照射されつづけますので、こまめに切るようにしてください。
（Live ボタンを使用して取得した画像データは、Experiment タグ上では「Preview００１」などの名称で一時的に保管されますが、次回 Live ボタンを押したときには上書きされていきます。
後述の「CaptureImage」ボタン、「Start」ボタンは上書きされない仕上げ取り込みのボタンにな
ります。）

22

Ⅱ-２．XY 平面の画像取得 （１断面画像の取得）
１． 取得したい焦点面にあわせる
２． Average の設定
Averaging は同じ焦点面を複数回スキャンしてシグナルを平均することによって、画質を向上させる機能です。
Line：ラインごとに指定した回数を平均します。
スキャン時の時差が少ないため、生きているサン
プルのアプリケーションに有効です。
Frame：Frame ごとに指定した回数を平均します。
フレーム毎に平均された画像が表示されるため、何回の平均回数が必要かの判断に有効です。

３． Accumulation の設定
Accumulation は、同じ焦点面を複数回スキャンした画像を積算することによって、画像の明るさを、機能です。
バックがある場合、バックも上がってしまうので、あらかじめ多少バックを引いた設定にしておくとコントラストの良い画像になります。（→Ⅱ－１．画像の取得 6.画像の調整、Offset の設定）
Line：ラインごとに指定した回数を積算します。スキャン時の時差が少ないため、生きているサンプルのアプリケーションに有効です。
Frame：Frame ごとに指定した回数を積算します。
４． XY 平面画像の取得
Capture Image

ボタンを押し､画像の取り込みを行います。画像の取り込みが終了

しますと、自動的にレーザーが止まります。
（

ボタンで有効となるのは Line Accumulation のみですのでご注意ください。）

ボタンで取得したデータは、Experiment タブ上で「Image00１」などの名称となります。
この状態では、取得した画像は保存されていません。必要に応じて、画像の保存を行ってください。

23

Ⅱ-３．XYZ 画像の取得
１． 上限と下限の設定
Live

ボタンを使用し、スキャンニングしながら、Z position
ダイアルを回し、画像の取り込みをスタートさせる面で Begin ボタン（黒い部分）
をクリックします。取り込みを終了させる
面で End ボタンを押します。
Begin、End の設定が終了しましたら、一度

ボタンでスキャニ

ステージの現在

ングを止めます。

の位置を表示z-Volume
Begin と End 間
２． 取り込み枚数の決定の厚さ

画像の取り込み枚数の決定方法は、次の３つの方法があります。


Nr. of steps：取り込み枚数

z-step size：スライス時のステップ数system optimized：自動計算による光学スライス数

２－１．Nr. of steps（取り込み枚数）による設定
Begin と End で指定した間の厚さを何枚取得するか指定します。ステージのステップ幅よりも、取り込み枚数を優先させます。
Nr. of steps の項目をクリックしてアクティブの状態にし、横の欄に直接数値を入力し、リターンキーを押します（ｚ-step size が自動計算されます）。

24

２－２．z-step size（スライス時のステップ数）による設定
Begin と End で指定した間の厚さをどのくらいの幅でステージをステップさせながら画像を取得するか指定します。ステージのステップ幅により枚数を決定します。
ｚ-step size の項目をクリックしてアクティブの状態にし、横の欄に直接数値を入力し、リターンキーを押します（Nr. of steps が自動計算されます）。
＜＜Z-step size から入力する場合の目安＞＞（封入材の屈折率・サンプルのカバーガラスからの距離等によっても分解能は変わってきますのでご注意ください。）
倍率・開口数・液浸/乾燥

おおよその光学断層厚ｘ63/1.4oil、ｘ100/1.4oil

0.5um 前後x40/1.25oil

0.9um 前後x40/0.85dry

1.2um 前後x20/0.7dry

2.5um 前後x10/0.3dry

7.0um 前後

２－３．system optimized（自動計算による光学スライス数）による設定
対物レンズの Z 軸方向における分解能の半分の値でステージがステップするように自動設定
されます。

25

３． Average の設定
Averaging は同じ焦点面を複数回スキャンしてシグナルを平均することによって、画質を向上させる機能です。
Line：ラインごとに指定した回数を平均します。
スキャン時の時差が少ないため、生きているサンプルのアプリケーションに有効です。
Frame：Frame ごとに指定した回数を平均します。
フレーム毎に平均された画像が表示されるため、何回の平均回数が必要かの判断に有効です。

４． Accumulation の設定
Accumulation は、同じ焦点面を複数回スキャンした
画像を積算することによって、画像の明るさを、機能です。
バックがある場合、バックも上がってしまうので、あらかじめ多少バックを引いた設定にしておくとコントラストの良い画像になります。（→Ⅱ－１．画像の取得 6.画像の調整、Offset の設定）
Line：ラインごとに指定した回数を積算します。スキャン時の時差が少ないため、生きているサンプルのアプリケーションに有効です。
Frame：Frame ごとに指定した回数を積算します。
５． 画像の取り込み
ボタンを押します。上記までに設定された条件で画像の取得を行います。指定した枚数の取り込みが終了しますと、自動的にレーザーが止まります。
ボタンで取得したデータは、Experiment タブ上で「Series00１」などの名称となります。この状態では、取得した画像は保存されていません。必要に応じて、画像の保存を行って
ください。

（

ボタンで有効となるのは Line Accumulation のみですのでご注意ください。）

26

Ⅱ-４．シーケンシャルスキャン
多重染色のとき、試薬同士の蛍光の漏れこみを回避するための方法です。
複数の試薬を同時に励起する方法に対し、一試薬づつ励起するという作業を行います。
例えば FITC/TRITC の取り込みの場合、FITC 単色の設定と TRITC 単色の設定を交互に行います。
Ⅱ-4-1.登録済みの設定を呼び出して使用する場合
１． Acquisition タブの上部にある Seq ボタンを押す。Seq ボタンが赤色になり、Sequential Scan パ
ネルが新たに開きます。

２． Load ボタンで、登録されているシーケンシャル設定を呼び出します。

27

３． 染色の数に従って複数のＳｃａｎボタンが表示されます。
（ここでは下記の２重染色の場合として説明します）
例） Ｓｃａｎ１：ＦＩＴＣ のみの設定
Ｓｃａｎ２：ＴＲＩＴＣ のみの設定などのボタンごとに、個別の設定（励起・蛍光波長）の設定が行われています。
（ボタンを押すことによって設定内容を確認することができます）

４．ボタン毎にサンプルの染色に合わせて調整を行います。
例）：ＦＩＴＣ＝488nm 励起、525nm 付近の蛍光検出
Scan1 のボタンをアクティブにした状態で、Live ボタンで画像を取り込みながら、必要に応じて下記のパラメーターを調節＜励起パワー＞＜検出波長範囲＞＜Gain、Offset＞
Smart Offset

Smart Gain

同様に Scan2 ボタンをアクティブにした状態で TRITC のパラメータを調節する。
Scan2：TRITC＝543 または 561nm 励起、600nm 付近の蛍光検出
注意：シーケンシャルの原則として、単染色毎の励起、検出設定ですので、一度に複数の励起波長を当てる設定にしないようにしてください。例）Scan１で 488 のみ、Scan2 で 543 のみ。

28

シーケンシャルモードについて
下記三つのモードがあります。
下記のような違いがありますので、必要に応じて使い分けてください。

between lines

時間差がほとんど無いので生細胞観察のときに有効
ほぼ同時に多重染色検出を行う
ので、染色の数だけ検出器が必要となる。

between frames

１フレーム分の時間差がある（固定サンプルなどでは問題無し）
染色毎に時間差があるため、最低ひとつの検出器さえあれば多重染
色の取り込みができる。

between stacks

スタック毎なので時間差が大きい

29

Ⅱ-4-2.新規に設定を登録する場合
１．Load Save Settings から、多重染色の設定（FITC-TRITC など）を選択する。

２．Acquisition Mode にある Seq ボタンを押す。Sequential Scan パネルが表示される。

３．シーケンシャルのモードは、デフォルトは between line(ラインモード)になっているので必要に応じて変更する。

30

４．１色目（Scan1）の設定を作ります。
例）FITC-TRITC の設定の場合、条件は下記のようになります。
FITC：488nm が ON、最初の検出器で FITC 蛍光の検出設定が行われている。
TRITC：543 または 561nm が ON、2 つ目の検出器で TRITC 蛍光が検出される設定となっている。
↓これを以下のように設定変更する① Scan１ボタン

を押してアクティブな状態とする② FITC のみの励起設定にする→488nm のみが ON、それ以外の波長が全て０％になるように設定し、検出器設定を FITC のみアクティブにし、それ以外の検出器は OFF にする。
488nm のみが ON、それ以外の波長（ここでは 543 または561nm）が全て“０％”にする

2 色目の PMT の Active のチェックを外す。

③フレームまたはスタックシーケンシャルを行う場合は、この設定で一度 Live ボタンを押して画像の明るさ等を確認し、488nm のパワー、Gain、Offset を決定する。（ラインシーケンシャルの場合は
このあとの 2 色目、３色目の設定をした後でよい。）

31

５．２色目の設定を作ります。
＋

ボタンを押して、Scan２

ボタンが表示されアクティブになっている状態で､2 色目の設定を行う。
例）FITC-TRITC の場合① Scan２ボタン

を押してアクティブな状態とする②TRITC のみの励起設定にする→543（または 561）nm のみが ON、それ以外の波長が全て０％になるように設定し、検出器設定を TRITC 用の検出器のみアクティブにし、それ以外の検出器はOFF にする。
488nm のレーザーパワー
を“０％”にし、それ以外の波長（ここでは 543 または 561nm）のみが ON になっている状態とする。

一色目の PMT の Active のチェックを外す。

③フレームまたはスタックシーケンシャルを行う場合は、この設定で一度 Live ボタンを押して画像の明るさ等を確認し、543,561nm のパワー、Gain、Offset を決定する。（ラインシーケンシャルの場
合はこのあとの 2 色目、３色目の設定をした後でよい。）

32

６．３色目以降の設定を作ります（３重染色以上の設定の時のみ）。
同様に＋ボタンを押して、Scan３の設定を行う。

７．ラインシーケンシャルモードの場合は、ここで Live ボタンを押し、それぞれの染色の画像の明るさ等を確認し、543,561nm のパワー、Gain、Offse を決定する。

８．設定がよければ、ここで Seq の設定の登録を行う。
Save ボタンを押して、登録名を入力し、保存する。

ここで登録される内容は、波長や検出器の設定だけでなく、XY パネルの内容も同時に保存され、Load 時に再現される(Bidirectional X 以外)。

33

Ⅱ-4-3.シーケンシャルスキャンを終了する場合
１．赤色表示になっている Seq．ボタンを押します。

２．Seq．ボタンが赤色から黒色に反転し、「３．」項のとおりメッセージが表示されます。

３．現在のシーケンシャルスキャンの設定を、保存するかどうかメッセージが表示されます。
Yes ：シーケンシャルスキャンの撮影条件を保存してから終了する場合に選択してください。
No ：シーケンシャルスキャンの撮影条件を保存せずに終了する場合に選択してください。

４．以上の操作により、シーケンシャルスキャンが終了します。

34

Ⅱ-５．画像の保存
Experiments に表示されているデータが、現在 RAM メモリー上で展開しているデータを表示しています。これらは一時保管されているものであり、保存作業を行う必要があります。
画像の保存方法として、次の４つから選択できます。
2～3 の保存データでは、SP5 での再解析は不可ですので、生データは“.lif”形式で保存してください。
１． 生データ Leica Image format “.lif” 形式で保存する。
SP５のソフト LAS AF でデータを読み出すときの形式。
データはフォルダ毎の一括保存となります。
２． 汎用ファイル “.Tiff” または “.JPEG” 形式で保存する。
データはフォルダ毎ではなく、個別のデータ毎の保存となります。
３． Snapshot（画面ハードコピー）として保存する。Tiff や JPEG で出力可能。
データはフォルダ毎ではなく、個別のデータ毎の保存となります。
４．アニメーションファイル“.Avi” 形式で保存する。
データはフォルダ毎ではなく、個別のデータ毎の保存となります。

35

１．生データ Leica Image format “.lif” 形式で保存する。
SP５のソフト LAS AF でデータを読み出すときの形式。
保存を行うと Experiment フォルダ内にあるデータが全て、ひとまとめになって一括保存されます。

Experiment 下にあるデータ全て
が、ひとつの「 *.lif 」ファイルになって、保存されます。

１－１．”Save Experiment ‘Experiment’ As”を選択します。
保存したいデータが含まれるフォルダ内のデータのどれかをアクティブにし、マウス右クリックをし、”Save Experiment ‘Experiment’ As”を選択します。
＊生データ.lif での保存は、フォルダ毎の一括保存となります。
従って、フォルダ内に複数のデータがある場合、Image001 や Series001 などの単独のデータをアクティブにして保存作業をしても、そのデータが含まれる
フォルダ全体が保存されます。

36

１－２．つぎのダイアログが開きます。
保存先とファイル名を決め､Save ボタンを押します。

２回目以降の保存は、Experiment 上でデータを選択し､右クリックを押し､Save Experiment’○○○○‘を選択すると、上書き保存できます。

37

１． 汎用ファイル “.Tiff” または “.Jpg” 形式で保存する
２－１．保存したいデータをアクティベイトし、
マウス右クリックをし、”Export‘○○○’ ”を選択し、さらに、”As Tiff...”または、”As JPEG..”を選択します。

２－２－１．（TIFF を選択したとき）つぎのダイアログが開きます。
データの保存先を決め、OK ボタンを押します。
Destination Folder
Browse ボタンを押し、保存先を決めます。

Overlay channels
チェックがあると、多重染色の重ね合わせた画像のみを TIFF 形
式に変換します。
チェックがないと、各チャンネルの画像を個別に TIFF 形式で保存します。

２－２－２．（JPEG を選択したとき）つぎのダイアログが開きます。

38データの保存先を決め、OK ボタンを押します。
Destination Folder
Browse ボタンを押し、保存先を決めます。

Overlay channels
チェックがあると、多重染色の重ね合わせた画像のみを
TIFF 形式に変換します。
チェックがないと、各チャンネ
ルの画像を個別に TIFF 形式
で保存します。

Quality
数値を小さくすると、画像が粗くなります。

39

２． Snapshot（画面ハードコピー）として保存する
モニターに表示している重ね合わせ画像などを保存します。Annotation Tool を用いて、コメントや矢印などを入れた状態でも保存可能です。モニターに表示されている画像数のままで保存されます。必要に応じて、ピクセル等倍表示ボタンを併用してください。
３－１．保存したい画像上でマウス右クリックをします。
３－２．“Snapshot”または、“SnapshotAll“を選択します。

ピクセル
等倍ボタン

Snapshot ： 画像上の選択した領域（白の破線で選択された領域）をスナップショット
します
SnapshotAll ： Viewer に表示されている画像をそのままスナップショットします
３－３．Experiment ダイアログに“Snapshot”または“SnapshotAll”画像が追加されます。

40

３－４．保存します。
Snapshot データを右クリックし､Save Experiment” ○○○○“を選択し、上書き保存します。
３－５．画像を出力します。
作製した Snapｓhot を選択し、アクティベイト
し 、 マ ウ ス 右 ク リ ッ ク をし、”Export‘Experiment’ ” を 選択 し、さらに、”As Tiff...” または、”As JPEG..”を選択し、Export します。

３－６－１．（TIFF を選択したとき）つぎのダイアログが開きます。
データの保存先を決め、OK ボタンを押します。
Destination Folder
Browse ボタンを押し、保存先を決めます。

Overlay channels
チェックがあると、多重染色の重ね合わせた画像のみを TIFF
形式に変換します。
チェックがないと、各チャンネルの画像を個別に TIFF 形式で保
存します。

41

３－６－２．（JPEG を選択したとき）つぎのダイアログが開きます。
データの保存先を決め、OK ボタンを押します。
Destination Folder
Browse ボタンを押し、保存先を決めます。

Overlay channels
チェックがあると、多重染色の重ね合わせた画像のみを
TIFF 形式に変換します。
チェックがないと、各チャンネ
ルの画像を個別に TIFF 形式
で保存します。

Quality
数値を小さくすると、画像が粗くなります。

42

４．アニメーションファイル“.Avi” 形式で保存する
４－１．データを Export します。
保存したいデータを反転させ、マウス右クリックをし、”Export‘Experiment’ ”を選択し、さらに、”As Avi...” を選択します。

４－２．Export to AVI ウインドウが開きます。
データの保存先を決め、OK ボタンを押します。

Frames/sec
画像のフレームレートを決めます
Use Compression

Overlay channels

チェックがあるとこの後（３－３．）

チェックがあると、多重染色の重で、データを圧縮するか聞かれまね合わせた画像のみを TIFF 形

す。チェックがないときはデータを圧式に変換します。

縮しないで保存されます

チェックがないと、各チャンネ
ルの画像を個別に TIFF 形式で保存します。

４－３．ビデオの圧縮ウインドウが開きます（Use Compression にチェックがあるとき）データを圧縮するかを決め、OK ボタンを押します。

43

５．画像取得条件の確認
５－１．Properties を選択する
画像取得条件を確認したいデータのところで、マウス右クリックをし、Properties of “○○○”を選択する。

５－２．Experiment Data ウインドウが開きます。
このデータシートから、画像を取得したときの条件がわかります。
５－３．Description 欄に文字をいれることができます。
Description 欄に文字をいれ、View
Descriptionを押すと、データシートに追加されます。

ApplySettings

Save As ボタンをこのデータを取得した時のセッティングに戻します。

押すと、「*.xml」フ

レーザーパワー（AOTF）、PMT 感度、ピンホールサイズ、蛍光検出ァイルとして、保幅が再現されます。（Experiment タブからも可→次項目）

存することができます。

44

Apply Setteings は、Experiment タブからも可能です。
該当データを取得した時のセッティングに戻します。
レーザーパワー（AOTF）、PMT 感度、ピンホールサイズ、蛍光検出幅が再現されます。

45

６．その他
experiments タグ内にあるデータを選択し、右クリックをすると、次のようなウインドウが開き、個別のデータの保存、編集などが可能になります。

Close Experiment “ ○○○○ ” ： ○○○○のフォルダ全体を閉じるときに使用します。
この作業は、単独のデータに対するものではありませんのでご注意ください。
例えばフォルダ内に複数のデータが存在した場合、保存せずに閉じてしまうと、個別のデータ（例えば Series001 など）だけではなく、全てのデータが失われることになります。
このとき、データが保存済みでなければ、保存するか否かの確認ウインドウが表示されます。
Save Experiment “ ○○○○ ” ： ○○○○のデータを追記して、保存するときに使用します。
Save Aｌｌ “ ○○○○ ” ： 展開されている全てのフォルダの保存を行います。一つ目のフォ
ルダの保存が終了すると、自動的に次のフォルダ用の保存用ウインドウが表示されます。
Save Experiment “ ○○○○ ” As ： ○○○○のデータに名前を付けて保存します。（詳しくは、「Ⅱ-4.取得画像の保存 １．Leica Image Format “.lif”形式で保存する」を参照。）
Create Collection：フォルダ内にフォルダを作成し、複数のデータをまとめることができます。
Delete “ ○○○○ ” ： ○○○○のデータを削除します。

46

Rename “ ○○○○ ” ： ○○○○のデータの名前を変更します。
Cut “ ○○○○ ” ： ○○○○のデータを切り取ります。
Copy “ ○○○○ ” ： ○○○○のデータをコピーします。
Export “ ○○○○ ” ： ○○○○のデータを TIFF や JPEG、AVI といったファイル形式にし、出力します。（詳しくは、「Ⅱ-4.取得画像の保存 ２．汎用ファイル“.Tiff”、または“.Jpg”形式で保存する」､及び､「Ⅱ-4.取得画像の保存 ４．アニメーションファイル “.Avi”形式で保存する」を参照。）
Properties of “ ○○○○ ” ： ○○○○のデータの取得条件などを確認します。（詳しくは、「Ⅱ-4.取得画像の保存 ５．画像取得条件の確認」を参照）
Open in New Viewer：アクティブにしたデータを、別のウインドウで表示します。

47

Ⅱ-６．Acquisition タブについて

画像取得時のさまざまな設定を行うタブです。
使用するスキャンモード等によって、新規にパネルが Open/Close します。
パネル：XY、Z-Stack など機能ごとに分かれたメニューのこと。下図は「XY パネル」

48

以下、パネル毎に機能の説明を行います。
１．Acquisition Mode パネル ： スキャニングの方法を指定します。

シーケンシャルを行うときに使用します。このボ タンを押す と､Sequential
Scan が追加されます。
スキャンモードを選択するときに使用します。
xyz ： ｘｙ面画像やｘｙ面のｚ方向における連続画像を取得します
xzy ： ｘｚ面画像やｘｚ面のｙ方向における連続画像を取得します
xyｔ ： ｘｙ面画像を時間軸方向における連続画像を取得します
xyzｔ ： ｘｙｚ画像の時間軸方向における連続画像を取得します
xzyt ： ｘｚｙ画像の時間軸方向における連続画像を取得します
２．XY パネル ： スキャン条件を設定します。
Formatスキャニングエリアを指定します。デフォルトでは、
512 x 512 フォーマットになっています。また、More を選択すると、任意にサイズを指定できます。
Pinholeピンホールの大きさを変更します

Speed

Bidirectional X

スキ ャニ ング スピー ド を変 更 しま

双方向スキャンにします（高速ｽｷｬﾝ）。

す。デフォルトで 400Hz に設定されており、More…を選択すると、1Hz 単位から設定可能です。

Bidirectional の場合は、位相（Phase；左右の画像一方向のずれ）の調整が必要になります。
画面上のスライダーで調整するか、コントロールパネルのダイヤルに Phase の機能を割り当てて調整をしてください。（コントロールパネルの設定：17 ページ参照。）

49

双方向２．XY パネル（続き）
Zoom in

Zoom factor

現在の Zoom 倍率を表

任意の場所指定してズ

中心 Zoom を行います。

示しています。レゾナンームします。レゾナントのコントロールパネルからトの場合は 1.7 が最小場合は使用できません。

も操作可能です。

ズームです。
Zoom をした状態で、スキャニングエリアを移動できます。
Zoom が 1 倍のときは使用できません。

Image Size
スキャン領域の大きさ X 方向 * Y 方向 [μm]Pixel Size
1 ピクセルあたりの大きさ X 方向 * Y 方向 [nm]AverageAccumulation

画像取得時に行う平均の回数を指

画像取得時に、行定します。

う画像の積算の回数を指定します。

Auto Gain
モニターに表示されている面の感度を自動調整します
Rotation ： 取得画像の回転を行います。

Pinholeピンホールの大きさを変更します。

Unit

Airy１

ピンホールサイズの単位のピンホールの大きさを理論上の最変更を行います。

適値に変更します。

50

３．Z-stack パネル：連続断層画像を取得するときの条件を決めます。
Set Plane
ピント面の登録を
行います。
Begin
連続断層画像のEnd取得時に、画像の撮

連続断層画像のり始めの面を指定し取得時に、画像の撮ます。

り終わりの面を指定します。

z-Position
現在のステージ位置

Nr. of steps
スライス数を優先して、連続断層画
像の取得を行います
z-step size
ステージなどのステップ幅を優先して、連続断層画像を取得します。
System optimized

z-Volume

システムの自動計算

Begin と End で指定した間の厚さの絶によるスライス数対値

51

Ⅱ-７．Beam Path Settings の新規登録
Beam Path Settings 上で、励起波長や検出器、ダイクロイックミラーなどの新しい組み合わせを設定し、Load/Save Setting に User Settings として名前を付けて登録します。
１． 使用する励起波長とパワーを、AOTF から設定します。

レーザーのボタンをクリック
し、アクティブにする。

使用する励起波長のパワーを設定する。

２． 使用する検出器を選択します。

使用する検出器にチェックマークを入れる。

52

３． 検出器の設定ボックスのカラーバーをクリックして、擬似カラー一覧を表示し、使用する色を選択します。

擬似カラー一覧

４． 蛍光色素名称リストから使用する蛍光色素の名称を選択し、蛍光スペクトルを表示します。

蛍光スペクトル

矢印をクリックして蛍光色素名称リストを表示
し、使用する蛍光色素を選択する。

53

５． 各検出器の蛍光波長取り込み領域（スリット幅）を設定します。

スリット幅を設定する。
※ダブルクリックで数値入力も可能。

６． ダイクロイックミラーを選択します。

名称をクリックして、使用するダイクロイックミラ
ーを選択する。

７． 上記の新規設定を、「Save」ボタンから名前を付けて登録します。

「Save」ボタンをクリックし、新規設定の名称を入力して「OK」ボタンを押す。

８． 登録内容を呼び起こして使用する場合は、Load/Save Setting の User Setting から名称を選択して使用します。

54

Ⅲ.Viewer について
Viewer：画像が表示されているウインドウを指します。画像の左右にあるボタンで、取得した画像の表示方法を変更などを行います。

画 像取得 後に色 を変更したい場合はカラーバーをクリックして Lut 設定の中から色を選択します。

画像上でのダブルクリック
で分割画面⇔フル画面の表示を切り替えられま
す。
分割画面

フル画面

55

ボタンの機能挿入した注釈を選択し、移動できます。
選択した注釈などを削除します。
スケールを挿入します。長さを計測できます。
スケールを選択後、マウスを右クリックして、“Properties”を選択し、長さを入力すると、任意スケールを作成できます。

画面表示拡大ボタン
取り込み画像を拡大します。
画面表示縮小ボタン
取り込み画像を縮小します。
画面表示切替ボタン
取り込み画像を１：１表示にします。デフォルトで、Viewer の大きさに合わせた表示になっています
Quick Look Up Table ボタン
ボタンを押すと、Grow Over/Under→Gray→Original と表示が変わります。

56

Original

Grow over/underGray

検出器の表示切替ボタン
赤くなっているチャンネルの画像を表示します。そのチャンネルの画像を非表示にしたい場合はクリックして黒い状態にします。
Overlay 表示ボタン
複数チャンネルでの取り込み（多重染色）のとき、重ね合わせ表示を行います。再度、ボタンを押すと、解除されます。
Maximum projection ボタン
連続断層像の画像の重ね合わせを行います。連続断層像方向に最高輝度のシグナルのみをつなぎ合わせて１枚の画像を合成します。サンプルの構造を観察する場合に使用するための重ね合わせ機能です。

ギャラリー表示ボタン
連続画像をギャラリー表示します。

57

Orthogonal Sectioning
３D データの XZ、YZ 断面を表示します。
YZ 画像
XY 画像

XZ 画像

Auto Contrast ボタン
自動で、取得した画像のコントラストをチャンネルごとに調整を行います。

58

Contrast 調整ボタン
コントラストやガンマレベルの調整を行うときに押すボタンです。

コントラスト調整
Reset ボタン。ひとつ

ガンマレベル調整

前の状態に戻ります

連続断層画像の先頭ページを表示する。
前ページを表示する。
連続断層画像を動画で再生。
次ページを表示する。
連続断層画像の最終ページを表示する。
連続断層画像の動画再生時のリピート機能。巻き戻し無し、常に先頭ページ
からのリピート。
連続断層画像の動画再生時のリピート機能。巻き戻しのリピート。

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Ⅳ．スキャンバリエーション
１．TimeLapse（経時変化取り込み）２．Lambda Scan

３．Z 方向に強度の補正をしながら Scan する

４．ROI Scan(任意エリアのスキャン)

５．Live Data Mode（高度なタイムラプス）（＊オプションソフト）

６．スキャニングステージ使用法（Tile Scan、多点タイムラプス）

60

１．TimeLapse（経時変化取り込み）
１．ｘｙｔ、ｘｙｚｔの選択
Acquisition Mode から XYｔ、XYZｔを選択します。
ｘｙｔ ： XY 画像（通常の平面画像）の TimeLapse スキャン
ｘｙｚｔ ： XYZ 画像取り込みの TimeLapse スキャン

下図のタイムラプス用パネルが開きます。

この項目は、XYT の時は Frame、XYZT の時は Stack となります。
（XYZT のときは Z Stack パネルで Frame 数を決める）

２． 画像の調整
画像の調整は、「Ⅱ.基本操作」を参考にしてください。

61

３． 時間軸方向の取り込み条件を設定
時間軸方向の取り込み条件を設定し、Accept

ボタンを押します。

Time Interval
スキャンの時間を入力します。
Minimizeにチェックを入れると、常にスキャンをしている設定になります。

Time

例えば 1 フレームの取得に 1.6 秒かかる場合で、5秒置きに画像を取得したい場合、ここに 5s0ms と入力すると、1 枚撮り終わった後 3.4 秒待機し 2 枚目を取り込む設定になります。
Time

1.6sec 3.4sec
5sec

Scanning のパターンは、次の 3 つの方法があります。

が Active になっています

Acquire until stopped
画像取り込み開始後、指定した条件で画像の取り込みを続けます。Stop ボタンを押すまで、
画像取り込みを行う設定になります。
Duration
画像取り込み時間を設定します。
Frames / Stacks
XYｔモードのときは、画像を取り込む枚数を、XYZｔモードのときは、Z スタックを取り込むスタック数を設定します。

62

４． データ取得の開始
Start

ボタンを押します。上記までに設定された条件で画像の取得を行います。画像の取り込みが終了しますと、自動的にレーザーが止まります。この状態では、取得した画像は保存されていません。必要に応じて、画像の保存を行ってください。

63

２．Lambda Scan
Lambda Scan は、スリットの幅を波長方向に少しずつ、変更し、その蛍光のスペクトルを取得する方法です。また、このときに取得したスペクトルを用いて、蛍光スペクトルを元にし、近接した波長の分離を行うことができます。
１． まず、Live ボタンで画像の取り込みを行う
視野、ピント等をおおよそ合わせます。
２． XYλ、または XYZλを選択
Acquisition Mode から、XYλ、XYZλを選択します。

３． 励起光の設定
必要な励起光及びパワーを設定する。（下図は 488nm を 15％に設定した例。）

64

４． ダイクロイックミラーの設定（AOBS（オプション）の場合は設定の必要無し）
使用する励起光に応じて設定する。

使用する励起光
405nm
458nm
488nm
514nm
543nm
561nm
594nm
633nm

使用するダイクロイックミラー
Substrat
RT30/70
RSP500DD458/514
DD488/543
DD488/561
DD488/594 または TD458/514/594
TD488/543（または 561）/633

ダイクロイックミラー（右図は AOBS の場
合）

５． スペクトルの取得範囲を設定します
取得をはじめる波長（Begin）、及び、取得を終わらせる波長（End）を数値入力します。
Begin

65

End

６． 蛍光検出波長域（Band Width）の設定

ここの幅を決定します

最小 5nm まで蛍光検出波長域を狭めること（=>波長方向の分解能の向上）ができます。
ただ、検出波長息を狭くすることで、画像の取得を行いにくくなるため、そのような時は､検出波長域を広げて、測定します。

７． 画像の取り込み枚数の指定
No. of steps、または、Lambda Stepsize のどちらかの方法で画像取得を行うかを決め､数値入力します。最小ステップサイズは３nm です。
No. of steps：Begin と End の間を何枚取得するかを優先して、画像を取得します。
Lambda Stepsize：波長方向のステップサイズを優先して画像を取得します。

66

８． 感度調節
Live ボタンを押し､スキャニングを行った状態で､狭めた蛍光検出波長域のブロックを波長方向に左右に動かし、最も画像が明るくなる波長域（蛍光が最も強くなる波長域）で、感度を設定する。（その場所の明るさが飽和（サチュレーション）しないように設定する）
蛍光検出波長域ブロックを動かし、最も感度の高い領域を探す。
一度ブロックをクリックした後は、マウスのホィール、キーボードの←→キーでも移動可能です。
感度調節を行う

９． データ取得の開始
Start

ボタンを押します。上記までに設定された条件で画像の取得を行います。画像の取り込みが終了しますと、自動的にレーザーが止まります。この状態では、取得した画像は保存されていません。必要に応じて、画像の保存を行ってください。

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１０．スペクトル情報をグラフ化
10-１．Process

メニューを開く

Tools タブの Dye Separation の Spectral を選択します

10-２．Viewer にある ROI を動かし､スペクトルを表示します。
ROI で指定している場所のスペクトルデータが左側のモニターに自動的に表示されます。

68

10-３．グラフデータの抽出
グラフデータを Excel ファイルとして保存できます。
10-３-１．グラフ上で右クリック → Export → Excel を選択する。

10-３-２．名前を付けて保存する。

69

11．スペクトルデータの登録11-１．Save Current Spectrum を押す
スペクトルデータの保存を行うときは“Save Current Spectrum”を押し、Spectra DataBase ウイ
ンドウを開きます。

11-２．保存します
名前を付けて、保存します

名前をつけます

保存します70

1２．スペクトルデータからの蛍光の分離
Select Spectrum from Database の Select spectrum から、使用した蛍光色素を選択します。
Apply ボタンを実行します。このとき、１で選択したものを緑色で表示し、２で選択したものを赤で表
示します。

71

３．Z 方向に強度の補正をしながら Scan する①Z-Stack パネル上の Z-Compensation をクリックする。

以下のウインドウが開く。

72

②Method がデフォルトでは No Compensation になっているが、以下のいずれかを選択する。

No Compensation：
補正無し
Linear Compensation by AOTF：
AOTF（照射するレーザー強度）を変更することにより補正する
Linear Compensation by PMT：
PMT（検出器の電圧）を変更することにより補正する
Linear Compensation by AOTF and PMT：AOTF と PMT の両方を同時に変更することにより補正する。

73

以下、Linear Compensation by AOTF and PMT のモードで説明します。
③Begin./End のポジションを決める時に、それぞれの Z 位置で最適と思われる AOTF 強度、PMT
電圧を変えて設定する。
Begin,End ボタンを押した時点で設定されている AOTF、PMT の数値が記憶され、その 2 点間をリニアで補正します。
例）
サンプル表面（明るく観察される Z 位置）にて、AOTF１０％、PMT８００で Begin ボタンを押す
サンプル内部（暗く観察される Z 位置）にて、AOTF５０％、PMT１０００で End ボタンを押す＊AOTF を上げると退色が起こる場合があるので注意してください。

④Begin,End の位置以外に Z 位置を追加したい場合は、Add ボタンを使用して同様に設定する。
⑤その他のボタンについて
Add：補間点の追加
Remove：選択した補間点の削除
Remove All：全ての補間点の削除
Move to：設定した補間点の位置に移動
Restore Settings：設定した補間点の条件の呼び出し

74

４．ROI Scan（任意エリアのスキャン）
レーザーを任意のエリアのみに照射することにより、その部分のみのスキャニング、あるいは退色をさせます。

①まず画像を取り込み、レーザーパワー、Gain 等の設定を行います。
②ROI をアクティブにし、画像上に ROI を描きます。

ROI 描画ボタン
多角形

はダブルク

リックで始点と終点がつながります。

75

③ROI の内側に照射するレーザー強度を設定します。
照射しない場合はゼロパーセントにします。

④ROI の外側に照射するレーザー波長及び強度を設定します（通常ゼロ）。

⑤ROI 毎に照射する波長を設定します。

76

⑥連続断層取得時に、任意のフレームでのみ ROI を実行したい場合は、Set 3D の設定を行います。（Seq 時には有効となりません）
ここでは 3～8 フレーム目のみ
で ROI を実行

⑦スキャンを実行します。ROI の内側だけのイメージングが行われます。

77

５．Live Data Mode（高度なタイムラプス） （＊オプションソフト）
前述１．のタイムラプスの項で説明したタイムラプスは、インターバルタイムが一定のシンプルなタイムラプスですが、これに対して、Live Data Mode(以下 LDM)では、より高度なタイムラプス設定が可能となり、複数の異なるセットアップ（タイムラプスのインターバル、取得時間、蛍光取得のセッティング等、全てのパラメータ）をあらかじめ Job1、Job2 という名称で登録しておき、それをマクロのように組み合わせてタイムラプスを実行します。

例）
繰り返し（ループ）４回＝１時間

Job1：

ポーズ

Job２：

XYZT

10 分間

XYZT

連続取り込みインター

30 分おき取り込み

5 分間

バル

24 分間

78

自動終了

①まず LDM モードに入ります。画面左上のメニュー「Leica Microsystems LAS AF-TCS SP5」をクリックし、Live Data Mode を選択します。

②画面が切り替わり、画面上に Monitor、Default などのタブが表示された LDM 画面となります。このモードを抜けるときは①のように画面左上をクリックして、TCS-SP5 の項を選択すると標準メニューに戻ります。

79

③LDM メニュー右上のプラスマークをクリックし、Job を選択して新規の Job を追加、セットアップをしていきます。

、④新規に Job１のタブが開きます。このタブ上で、Job１のセットアップ（蛍光、透過等 Beam の設定、
画像取得のための設定、XYT、XYZ、XYZT などのモードの設定、タイムラプスの設定等）を行いま
す。
モードの
設定

蛍 光 、 透 過 等
Beam の設定
画像取得の設定

タイムラプスの設定⑤スキャンの実行は、操作画面右下の Scan ボタン（タブと同じ名称のボタン）を押します。
例）Job1 のスキャンを実行するときは Job１のボタンを押す。

⑥作成した Job を削除するには、その Job のタブをアクティブにし（開き）、操作画面右下の「-」ボ
タンを押します。

80

⑦同様にして必要に応じて Job２、Job３の設定を行います。
⑧作成した Job の組み合わせ（マクロ）を行います。操作画面右上のプラスボタンを押して、
JobMacro を選択します。

⑨以下の画面が開きます。
左にリストアップされた Job の中から必要なものをクリックして Add ボタンを押すとマクロのようにセットアップが行われていきます。

81⑩ループ、ポーズの設定は操作画面右上から行います。
ループ

ポーズ

ループの設定：どの Job からどの Job までを何回繰り返すかを設定し、DefineLoop ボタンを押します。

ポーズの設定：ポーズを入れるタイミングの後にあたる Job をアクティベイトし、ポーズボタンを押します。
例）Job２をアクティベイトして、ポーズボタンを押す。

デフォルトで 10 秒のポーズが入ります。
時間の変更はポーズの部分をダブルクリックすると入力画面が表示されます。

82

⑪JobMacro１を実行する場合は、操作画面右下の JobMacro１ボタンを押してタイムラプスをスタートします。

83

６．スキャニングステージ使用法（Tile Scan、多点タイムラプス）＊この機能は、スキャニング（電動）ステージ（オプション）が搭載されているシステムで有効となる機能です。
スキャニングステージで使用できる機能は下記の通りです。
１． Tile Scan（Mapping）
１視野を連続的にスキャンし、1 枚の画像に貼り合わせることにより、より広い視野の画像を取得することが可能となります。

1 画像として仕上げる
１視野

タイルスキャン

２．多点タイムラプス（Mark & Find）
複数の測定ポイントをあらかじめ登録し、それらを連続してタイムラプスでスキャンを行う。

１
2
3

84

１．Tile Scan(Mapping)
１． Tile Scan 機能に入る前に、Zstack パネルで Begin と End をアクティブにする。

実際に測定する位置は、後ほど決
めるのでここではアクティブになっていれば良い。
＊左図のように Begin と End の欄に数字が入っていればアクティブとなっている。

２．スキャンモードを選択する（ＸＹＺ，ＸＹＺＴなど）

85

３．Tilｅ Scan ボタンを押します。TileScan パネルが開きます。
マップの位置表示縮小
現在指定されている測定ポイントをマップに表示
マップの表示拡大
測定ポイント登録
測定ポイント削除（1 点）
測定ポイント削除（全部）ステージ位置補正機能

4ｘ3 など、取り込み画像枚数の設定。

取り込んだ複数画像を、取り込み終了と同時に 1 枚の画
像に張り合わせる（元の 1 枚 1 枚の画像は残らない）
OFF にすると、貼りあわせ画像は作成できなくなりますのでご注意ください。

取り込み終了と同時に 1 枚の画像に張り合わせるときに、元の 1 枚 1 枚の画像も残す。

86

４．Ｚ ＳｔａｃｋパネルでＢｅｇｉｎとＥｎｄを登録し、枚数や平均回数を設定します。
このとき、視野が広い場合は、端から端までカバーできる Begin と End を設定するようにします。

５．スマートムーブからステージを操作して観察するポジション（XY）に移動します。

Tile Scan ポジションの登録は次の 2 通りの方法があります。
５－１．目的とする全視野の対角位置の 2 箇所を設定することにより自動設定
５－２．現在位置で３ｘ３などの数字を入力する。

５－１．目的とする全視野の対角位置の 2 箇所を設定することにより自動設定
スマートムーブでスタート位置と終了位置をそれぞれ
2 点目を設定した時点で、で設定します。
に３ｘ4 などの数字が自動的に入力され、Tile Scan 範囲が決定されます。

５－２．現在位置で３ｘ３などの数字を入力する。
スマートムーブで目的周辺に移動し、そこでに任意の画像枚数（2ｘ2 など）を入力します。（ｘはアルファベットのエックス「ｘ」またはアスタリスク「*」が使用できます）

６．スタートボタン

で実行します。
がアクティブでがオフの場合は（初期設定）、スキャンが終了すると、自動的にマージされた画像が作成され、各々の画像は残りません。

87

２．多点タイムラプス（Mark & Find）
１． Ｍark & Find 機能に入る前に、Zstack パネルで Begin と End をアクティブにする。

実際に測定する位置は、後ほど決
めるのでここではアクティブになっていれば良い。
＊左図のように Begin と End の欄に数字が入っていればアクティブとなっている。

２．スキャンモードを選択する（ＸＹＴ，ＸＹＺＴなど）

88

３．Mark & Find ボタンを押します。Mark & Find パネルが開きます。
パネル上部の機能：
マップの位置表示縮小
マップの表示拡大
現在指定されている測定ポイントをマップに表示
ステージ位置補正機能
ポイントをボタンで登録すると、順番にナンバーリングされます。またここからポイントを指定すると、その位置にステージが移動します。

パネル左側の機能：
測定ポイント登録

全てのポイントを同じ Z スタック位置で取り込むか否かの設定

測定ポイント削除（1 点）
測定ポイント削除（全部）各測定ポイントにおいて、異なる Z スタックの設定を行うときに、このボタンで Z 位置の登録を行う。（測定ポイントを登録後、Z スタックパネル

測定ポイントの入れ替え
にて BeginEnd を設定し、その後設定の呼び出し設定の登録

89

ボタンを押す）４．スマートムーブで位置を移動し、ボタンを押して測定ポイントを登録します。

欄に順番に登録が行われていきます。この欄で Position2 などのポイントを選択すると、その位置に自動的に移動します。
登録ポイントの削除はます。

で目的のポイントを選択した上で、ボタンで実行しは全ポイントの削除となります。

５． ＸＹＺＴの場合は、各ポイントにおけるＺ位置の登録を行います（ＸＹＴの場合は必要無
し）。
５－１．

をディアクティベイトします。

５－２．

欄でポイントを選択します。

５－３．Ｚ ＳｔａｃｋパネルでＢｅｇｉｎとＥｎｄを登録し、枚数や平均回数を設定します。

５－４．Ｍａｒｋ & Find パネル上でボタンを押します。

５－５．同様に次のポイントを登録します。
６． タイムラプスパネルで時間等の設定後、Start ボタンを押してタイムラプスを実行します。

90

7.取り込まれたデータは下記のようにポイント別データとなっています。
Z 軸方向の重ね合わせを作成する場合は、Process メニューの３D Projection ツールで重ね合わせを実行し、必要に応じて保存してください。

91Ⅴ．Process
Process メニューでは、Acquire メニューで取り終わった画像に対して、様々な画像処理を行います。

Edit
画像の抽出、リサイズ、マージ等の編集

Adjust
画像のコントラスト、バックグラウンド等の調整
３D Deconvolution（*オプション）
デコンボリューション

Noise Reduction
フィルタリングによるノイズの除去

Segmentation
スレッシュホールド、フィルタリング、二値化
Visualization
３次元画像の構築

Dye Separation
多重染色時の蛍光漏れこみ補正、スペク
トルデータの解析

Topological
高さ表示の画像の作成

92

Edit
Crop
Crop は、取得した画像（XYZ、Time Series）から任意のもののみの抽出を行います。
１．チャンネルの抽出
多重染色データから、任意のチャンネルのみのデータを抽出する。
必要なチャンネル以外のチャンネルボタンを押してオフにし（黒くする）、右下のApply ボタンを押します。アクティベイトされたままのチャンネル

のみのデータとなります。

OFF にしたチャンネル

93

２． XY 方向の抽出（切り取り）① Experiment タブにあるデータを選択し、Tools タブの Crop を選択します②

ボタンを押し､画像上に四角形を描き、右下の Apply ボタンを押します。この部分が切り抜かれる領域になります。

３． 連続データ方向の抽出（XYZ、XYT、XYZT 等）①Z series または Time Series のときは、Select Required Image Component にある From と To とに数値を入力し、切り抜く画像の範囲を決定します。From または、To の値を変更したときは、Set
Start または、Set End を押し､決定を行ってください② Every ○○th Position の値を必要に応じて変更します。“１”の場合、Series 画像全てを切り取ります。“２”の場合、1 枚おきに画像を切り取ります。
③ 設定が終了したら、Apply

ボタンを押します。切り抜かれた画像が、Viewer に表示されます。

94Resize
Resize は、取得した画像の大きさや、Bit の値を変更するときに使用します。
１． Experiment タブにあるデータを選択し、Tools タブの Resize を選択します。
２． 任意に Required Size、Required Bit Depth を選択します

３． 設定が終了したら、Apply

ボタンを押します。Resize された画像が Viewer に表示されます。
CombineCombine は、取得した画像シリーズ同士を結合します。
１． Experiment タブにあるデータを選択し、Tools タブの Combine を選択します。

First と Second に任意の画像シリーズを選択します。
Operation から、結合作業内容を選択します。
Output Operations、Use Constant が必要な場合は、チェックをつけます
２． 設定が終了したら、Apply

ボタンを押します。Combine された画像が、Viewerに表示されます。

95

MergeMerge は、別々に取得画像をひとつの画像にする機能です。
１． 合成したい画像を Experiment タブから選択し、First ボタンを押します。

２． もうひとつの合成したい画像を Experiment タブから選択し、Second ボタンを押します。
３． Options にある Merge Dimension から、合成方法を選択します。それぞれのパラメーターは次のように合成します。

Channel

多 Channel でデータを取得したときのように画像を合成します。

A
ｔ

B

A

B

時間軸方向に画像を合成します。（表示される色は、First に指定した色に依存します。）

A

A

B

B
ｔ

ｘ

画像を x 軸方向（左右）に並べます。（表示される色は、First に指定した色に依存します。）

A

B

A

96

B

ｙ

画像をｙ軸方向（上下）に並べます。（表示される色は、First に指定した色に依存します。）

A
A

B

B

97

AdjustSharpness
画像を鮮鋭化します。
１．Experiment タブにあるデータを選択し、Adjust タブの Sharpness を選択します。
２．Kernel Size の数値を選択します。Kernel Size では、何 Pixel 数を Filter 処理後に、１Pixel とするかを指定します。例えば､Kernel Size を 5 すると、元画像の 5pixel がフィルター処理後に、
1pixel となるように計算を行います。

３．Strength の数値を選択します（Strength の値が“０”だと、Sharpness の効果は得られません）。
４．設定終了後に、Preview ボタンを押すと､画像の確認ができます。
５．設定終了後に、Apply

ボタンを押すと、その設定が適用されます。

Phase
双方向スキャン（BidirectionalMode）を使用した場合、画像の位相がずれる場合があります。
Phase 機能では、このずれた位相をそろえます。
１． Experiment タブにあるデータを選択し、Adjust タブの Phase を選択します。
２． Pixel Displacement にあるスライダーを動かすか、数値入力を行い、位相を合わせます。
３． Border Style を選択します。
４． 設定終了後に、Preview ボタンを押すと､画像の確認ができます。
５． 設定終了後に、Apply

ボタンを押すと、その設定が適用されます。

98Colours
Colours では、Contrast、Brightness、Gamma の補正を行うことが可能です。
１． Experiment タブにあるデータを選択し、Adjust タブの Colours を選択します。
２． Channel から、どのチャンネルに対し、補正を行うのかを決めます。

３． Contrast、Brightness、Gamma のスライダーまたは、数値入力を行います。

４． Apply

ボタンを押し､その設定を適用します。

Background
チャンネル毎にバックグラウンド処理を行います。
１．Experiment タブにあるデータを選択し、Adjust タブの Background を選択します。
２．Channnel から、どのチャンネルに対し処理を行うのかを選択します。

３．Background の値を設定し、APｐｌｙボタンを押します。

99Baseline
Baseline の設定を変更することで、背景の不要な明るさを除去することができます。
１． Experiment タブにあるデータを選択し、Adjust タブの Baseline を選択します。
２． Correction から、Minimum、Mean、Eliminate Autofluorescence のいずれかを選択します。
Minimum

その画像における輝度の最小値を Baseline とし、その値を“0”に
します。

Mean

その画像における輝度の“０”から Threshold までの値の平均値を計算し、その値をその平均値を“0”にします。

Eliminate

低輝度の Pixel を２値化し、その結果を画像に適応します。

Autofluorescence
３． 必要に応じて､Increase Dynamics をチェックします。Increase Dynamics は、最小輝度値が“0”になるようにします。
４． 設定終了後に、Preview ボタンを押すと､画像の確認ができます。
５． 設定終了後に、Apply

ボタンを押すと、その設定が適用されます。

100

３D Deconvolution（*オプションソフト）

非焦点面にある輝点からの拡散光を取り除き、擬似的に光学断層像を作ります。
１． Experiment タブにあるデータを選択し、Deconvolution タブの３D Deconvolution を選択します。
２． Method から、Blind、Maximum Likelihood、Inverse Filter、Gold’s Method のいずれかを選択し
ます。
Blind

Blind は、PSF（Point Spread Function）を必要としない方式
であり、PSF を必要とする方式より柔軟性があり、例えば対物レンズ等の情報がなくても処理が出来ます。

Maximum Likelihood

Blind の方式に似ており、柔軟性があります。PSF が出来ていれば、Blind より処理が高速になります。
TimeLapse データ処理に一番適してます。

Inverse Filter

処理方式の中で一番高速です。デコンボリューションの下調べに使用する場合が多いです。

Gold’s Method

Blind、Maximum Likelihood より高速に処理できます。
Inverse Filter より結果が綺麗です。

３－１ Blind

TotalIterationｓ（計算回数）を入力する。Defoult は１０回です。
RefractiveIndex は、使用した対物レンズの屈折率が自動的に入力されます。
FasterProcessing/LowerRes.は、処理は早いですが解像度が低いです。

101

３－２ Maximum Likelihood

Auto Generate PSF は、PSF を作成していない時に選択します。

３－３ Inverse Filter

TotalIteration、FasterProcessing/LowerRes.は、選択できません。
Auto Generate PSF は、PSF を作成していない時に選択します。

102

３－４ Gold’s Method

３． 設定終了後に、Preview ボタンを押すと､画像の確認ができます。
４． 設定終了後に、Apply

ボタンを押すと、その設定が適用されます。

103

Noise Reduction
Medianノイズを軽減して画像をスムースにする画像処理フィルター（Median アルゴリズム）です。
１．Experiment タブにあるデータを選択します。
２．必要に応じて Radius、Iterations、３D Filtering を設定します。
Radius：処理を行うピクセル数；５の場合は該当ピクセルを含め、円を構造要素として５ピクセル分の処理を行うIterations：処理の繰り返し回数
３D Filtering：アクティブにすると Z 方向にも処理を行います。

３．Preview ボタンでプレビュー画像の確認ができます。
４．Apply ボタン

で実際に処理を行い、Experiment タブに処理後のデータが作成さ

れます。
Blur
ノイズを軽減して画像をスムースにする画像処理フィルター（Blur アルゴリズム）です。
１．Experiment タブにあるデータを選択します。
２．必要に応じて KernelSize の設定を行います。
KernelSize：処理を行うピクセル数；５の場合は該当ピクセルを含め、長方形を構造要素として５ピ
クセル分の処理を行う

３．Preview ボタンでプレビュー画像の確認ができます。
４．Apply ボタン

で実際に処理を行い、Experiment タブに処理後のデータが作成さ

れます。

104

Segmentation
Thresholding
スレッシュホールド値の設定を行います。
階調の上位、下位のスレッシュホールドを個別に設定することができます。

Morphological Filters
画像処理フィルター（Erosion、Dilation、Open、Close）の処理をかけます。
１． Experiment タブにあるデータを選択し、Filter の種類を選択します。
２．必要に応じて Radius、Iterations、３D Filtering を設定します。
Radius：処理を行うピクセル数；５の場合は該当ピクセルを含め５ピクセル分の処理を行う
Iterations：処理の繰り返し回数
３D Filtering：アクティブにすると Z 方向にも処理を行います。

３．Preview ボタンでプレビュー画像の確認ができます。
４．Apply ボタン

で実際に処理を行い、Experiment タブに処理後のデータが作成さ

れます。

105

Seeding
スレッシュホールドを設定し、構造の 3 次元的な抽出を行います。

１．Experiment にあるデータを選択します。
２．Previeｗ画像上で、抽出を行いたい構造部分を十字で指定し、その構造をスレッシュホールド
を設定することにより抽出します。Create Binary Image がアクティブになっていると、画像の２値化を行います。
３．Preview ボタンでプレビュー画像を確認できます。

４．Apply ボタン

で実際に処理を行い、Experiment タブに処理後のデータが作成さ

れます。

106

Visualization
3D Projection
三次元画像の構築を行います。
１角度のみの３次元画像の作成
１． Experiment タブにあるデータを選択し、Tools タブの Visualization / 3D Projection を選択します。
２． Method から Projection のタイプを選択します。（通常はデフォルトの Maximum を使用します）

Slice Thickness
Section の厚さを変更します。通常“1.00”のままにして使用します。
Viewing Angle
Projection を行う方向を変更します。X、Y、Z それぞれに数値を入力する、または、マウスのクリックを押しながら、画像を回転して方向を変更します。

107

画像の構築方法は次の 4 種類があります。
Maximum Projection

Average Projection

Z-Stack 画像を構成しているそれぞれのピ

Z-Stack 画像を構成しているそれぞれのピ

クセルを Z 軸方向にみたとき、輝度の最も高 クセルを Z 軸方向にみたとき、輝度の平均値
いものを抽出し、構築した画像。

を計算し、構築した画像。

Transparent Projection

Color Coded Projection

Z-Stack 画像を構成しているそれぞれのピ Z-Stack 画像を Z 方向の位置の違いを色にクセルを Z 軸方向にみたとき、すべての輝度 よって識別した画像。
から加重平均を計算し、それをもとに構成した画像。

３． 設定が終了したら、Apply

ボタンを押します。Projection された画像が、Viewer に表示されます。

108

３D アニメーションの作成
１． Experiment タブにあるデータを選択し、Tools タブの Visualization / 3D Projection を選択します。
２． Method から Projection のタイプを選択します（デフォルトは Maximum）。

３． Create Movie にチェックを入れます。チェックをいれると、表示がアニメーション作製画面に変わります。
アニメーションの開始面と終了面を決め、Frame 数を Number of Frames に入力します。

Create Movie にチ
ェックを入れると、表示が変わります動画の終了角度動画の開始角度

Viewing Angle
Projection を行う方向を変更します。X、Y、Z それぞれに数値を入力する、または、マウスのクリックを押しながら、画像を回転して方向を変更します。

109

４． 設定が終了したら、Apply

ボタンを押します。作製されたアニメーションが、

Viewer に表示されます。
５．作成されたアニメーションのデータは、Experiment タブで下記のように表示されます。
必要に応じて保存、また AVI での出力を行います。

110ステレオ画像の作成
１． Experiment タブにあるデータを選択し、Tools タブの Visualization / 3D Projection を選択します。
２． Stereo On をアクティブにし、ステレオ画像を作成する元データ（チャンネル）、角度を設定します。

Stereo Channel
多重染色の場合はどのチャンネルのデータでステレオ画像を作成するかを選択する。
（ステレオ画像は、複数チャンネルでは作成できません）
Stereo Angle
ステレオ表示で使用される 2 色（赤緑）の角度設定を行います。

５． Apply

ボタンを押します。作製されたステレオ画像が、Viewer に表示されます。

作成されたステレオ画像は、赤と緑の２チャンネルをオーバーレイした状態で完成します。
オーバーレイボタン

がアクティブになっていなければアクティブにします。

ステレオ画像111

Dye Separation
Automatic
複数チャンネルで取り込んだ多重染色の画像データに対して散布図のアルゴリズムに従って処理を行い、蛍光の漏れこみの補正を行います。
１． Experiment タブにあるデータを選択し、Tools タブの Dye Separation / Channel を選択します。
２． Method から、Strong または、Weak を選択します。
データ取得に使用したチャンネル数を表示します

Strong
散布図の中心を基準に分離します

Weak
散布図の対応するチャンネル側を基準に分離します３． 設定が終了したら、Apply

ボタンを押します。

112

Channel
複数チャンネルで取り込んだ多重染色の画像データに対して、ユーザーが画像上で任意の蛍光シグナルの XY 座標を指定して処理を行い、蛍光の漏れこみの補正を行います。
１． Experiment タブにあるデータを選択し、Tools タブの Dye Separation / Channel を選択します。
２． 多重染色の画像上で単一の染色のみである領域を ROI で指定して、クリックします。ROI 上の領域における各色素の割合が、グラフとして、画像左側の画面に表示されます。

３． Add ボタンを押して登録します。

画像上にある ROIの大きさを変更します
４． ２色目の単一の染色のみである領域を指定して，クリックします。
５． Add ボタンを押して登録します。
６． ３色目がある場合は、同様に指定してクリックしてください
７． Apply

ボタンを押して､実行します。

113

Spectral

ラムダスキャン（＝波長方向に連続して取り込んだデータ、複数のチャンネルで取り込んだデータではない）によって取得したデータに対して解析を行うソフトです。
操作法については、Ⅳスキャンバリエーションの２．Lambda Scan の「10．スペクトル情報をグラフ化」の項をご参照ください。

114

Topological
Topo Filter
深さ方向に取り込んだ連続断層像から、高さ表示の画像（Topo 画像）を作成します。
１． Experiment タブにある深さ方向の連続断層データを選択し、Tools タブの Topo Filter を選択します。
２． Method を Maximum Intensity または Center of Mass から選択します。
Maximum Intensity
深さ方向に輝度をモニターし、最高輝度が得られた Z 位置を高さと認識する。
Center of Mass
深さ方向に輝度をモニターし、輝度のカーブが描く全体のボリュームの中心を計算し、その Z 位置を高さと認識する。
Invert深さの向きを逆にする。Topo 画像は、その元データとなる連続断層像取得時に設定した Z 方向の
Begin と End の位置を元に作成されるので、深さの向きが逆の場合はアクティブにする。
３． Applyを押します。Topo 画像が作成されます。

色は自動的に設定されるので、必要に応じて変更してください。

画像の色を変更する
カラーバー

Topo 画像：
高さ情報を明るさ（輝度に切り替えて表示するので、画像の意味合いは下記のようになります。
輝度（高）：高い位置に存在するシグナル
輝度（低）：低い位置に存在するシグナル

115

Topo ３D View
Topo 画像（前項目）から、鳥瞰図を作成します。
１． Experiment タブにある Topo 画像データ選択し、Tools タブの Topo ３D View を選択します。
表示された鳥瞰図をクリック＆ドラッグするか、操作パネルに角度を入力して鳥瞰図の角度を設定します。

鳥瞰図の角度設定

厚み表示の補正

２． Applyを押します。Topo 画像が作成されます。

Experiment タブに鳥瞰図データが作成されているので、必要に応じて保存します。
このデータは、Snapshot 形式で作成されます。

116

Ⅵ．Quantify
Quantify メニューは以下２つのモードに分かれています。
Intensity：
画像上での長さ､面積、輝度などの測定、及びレシオの設定とグラフの表示等。
Colocalization：（*オプションソフト）
多重染色時の共局在解析。
画像上で共局在している部分を特定し蛍光強度や面積等を数値化する。

ここからモードを選択します。
デフォルトは Intensity になっています。

117

Ⅵ－１．Intensity
画像上での長さ､面積、輝度などの測定、及びレシオの設定とグラフの表示等。
モードは以下３つがあります。それぞれのボタンを押して測定モードを選択してから、実際の測定作業に入ります。

ラインプロフィールツールは線に沿って強度分布の測定を行います。取得した画像に描いた線に沿って、強度デー
Line

タを画像から読み込んで、グラフや簡単な統計処理を行います。 グラフをチャンネルごとに表示するか、ROI ごとに表示するか選択することができます。
Stack Profile 機能は、ROI（Region of Interest）の中で輝度強度を測定して、それをグラフ表示や、様々な統計的なStack

値について計算します。Stack Profile は、XYZ 画像や、
Time－Lapse 画像に対して使用します。
Histogram はサンプル中で強度分布と頻度を測定します。 Histogram 機能は、強度の頻度を測定して、カーブをHistogram表示して、様々な統計的な値について計算します。一平面において、設定された ROI 内のヒストグラムを表示させます。

また、Stack Profile 機能で Calculator を用いると、ROI の中でチャンネルごとに測定した輝度強度から、Ratio データを取ることができます（後述の説明をご覧ください）。

118

Line Profile
ラインプロフィールツールは線に沿って強度分布の測定を行います。取得した画像に描いた線に沿って、強度データを画像から読み込んで、グラフや簡単な統計処理を行います。 グラフをチ
ャンネルごとに表示するか、ROI ごとに表示するか選択することができます。

１． Tools

タグから Line Profile

を選択します。

２． Viewer（画像が表示されているウインドウ）の左側に並んでいる
画像上に線を描きます。

（（注意））
Line Profile の時に、、、できますが、グラフや統計に反映されません。

119も選択することが

または

を使用し､

３． Graphs タグを押すと、２．で指定した線上値の結果をグラフで表示します。
Tools

タグにある Select Channels and ROIs でグラフ表示する条件を変更できます。チェックがついているものについて、表示するようになります。

Tools

タグにある Sort charts by Channels and ROIs でグラフ表示する方法を変更できます。
Sort Channels：
検出器ごとに結果を表示します。
Sort ROIｓ：
ROI ごとに結果を表示します。
All in One：全てまとめて表示します。

グラフの数値データを抽出する
それぞれの輝度データは Excel ファイル形式で保存することが可能です。
１． ROI により、グラフ画面上で、マウス右クリックし、Export→Excel を選択する。

２． ファイルの種類が Excel Files になっていることを確認して、ファイル名を入力して保存します。

120

４． Statistics を押すと、２．で指定した場所の結果を表示します。
Tools

タグにある Select Channels and ROIs でグラフ表示する条件を変更できます。チェックがついているものについて、表示するようになります。

Tools タグにある Sort charts by Channels and ROIs でグラフ表示する方法を変更できます。
Sort Channels：
検出器ごとに結果を表示します。
Sort ROIｓ：
ROI ごとに結果を表示します。
All in One：全てまとめて表示します。
Line Profile における Statistics の Prameter について
Parameter意味

LengthROI で指定した領域の線の長さ

Pixels CountROI で指定した領域のピクセル数

Mean

ROI で指定した領域の平均輝度

Variance

ROI で指定した領域の分散Standard Deviation

ROI で指定した領域の標準偏差Average Deviation

ROI で指定した領域の平均偏差Max. Amplitude

ROI で指定した領域の輝度の最大値

Max. Position

ROI の始点から、最大値を指名した位置の距離

Min. Amplitude

ROI で指定した領域の輝度の最小値

Min. Position

ROI の始点から、最小値を指名した位置の距離

Center of Mass Pos.

X 軸方向のシグナル全体のボリュームの中心値

121

Stack Profile
Stack Profile 機能は、ROI（Region of Interest）の中で輝度強度を測定して、それをグラフ表示
や、様々な統計的な値について計算します。Stack Profile は、XYZ 画像や、Time－Lapse 画像に対して使用します。

１． Tools

から Stack Profile

を選択します。

２． Viewer（画像が表示されているウインドウ）の左側に並んでいる
または

または

を使用し､画像上に線を描きま

す。

122

３． Graphsを押すと、２．で指定した場所の結果を Graphs で表示します。

Tools

タグにある Select Channels and ROIs でグラフ表示する条件を変更できます。チェックがついているものについて、表示するようになります。

Tools

タグにある Sort charts by Channels and ROIs でグラフ表示する方法を変更できます。
Sort Channels：
検出器ごとに結果を表示します。
Sort ROIｓ：
ROI ごとに結果を表示します。
All in One：全てまとめて表示します。

123

グラフの数値データを抽出する
それぞれの輝度データは Excel ファイル形式で保存することが可能です。
３． ROI により、グラフ画面上で、マウス右クリックし、Export→Excel を選択する。

４． ファイルの種類が Excel Files になっていることを確認して、ファイル名を入力して保存します。

４．Statistics を押すと、２．で指定した場所の結果を表示します。
Tools

タグにある Select Channels and ROIs でグラフ表示する条件を変更できます。チェックがついているものについて、表示するようになります。

Tools タグにある Sort charts by Channels and ROIs でグラフ表示する方法を変更できます。
Sort Channels：
検出器ごとに結果を表示します。
Sort ROIｓ：
ROI ごとに結果を表示します。
All in One：全てまとめて表示します。

124

Stack Profile における Statistics の Prameter について
Parameter意味Mean Value

ROI で指定した領域（体積）の平均輝度

Pixel CountROI で指定した領域のピクセル数

Pixel sum

ROI で指定した領域（体積）のピクセル総数

Length

画像の取得開始点から終了点までの厚さ

Frame Counts取得したフレーム数

Standard Deviation

ROI で指定した領域（体積）の標準偏差Average Deviation

ROI で指定した領域（体積）の平均偏差Max. Amplitude

ROI で指定した領域（体積）の輝度の最大値

Max. Position
Min. Amplitude

Max.Amplitude が得られた位置（X 軸）
ROI で指定した領域（体積）の輝度の最小値

Min. Position

Min.Amplitude が得られた位置（X 軸）

Center of Mass Pos.

X 軸方向のシグナル全体のボリュームの中心値

125Histogram
Histogram はサンプル中で強度分布と頻度を測定します。 Histogram 機能は、強度の頻度を測定して、カーブを表示して、様々な統計的な値について計算します。

１． Tools から Histogramを選択します。

２． Viewer（画像が表示されているウインドウ）の左側に並んでいるを使用し､画像上に線を描きます。

３． Graphs を押すと、２．で指定した場所の結果を Graphs で表示します。
Tools

タグにある SelectChannels and ROIs でグラフ表示する
条件を変更できます。チェックがついているものについて、表示するようになり
ます。

126

または

または

Toolsタグにある Sort charts by Channels and ROIs でグラフ表示する方法を変更できます。
Sort Channels：
検出器ごとに結果を表示します。
Sort ROIｓ：
ROI ごとに結果を表示します。
All in One：全てまとめて表示します。

グラフの数値データを抽出する
それぞれの輝度データは Excel ファイル形式で保存することが可能です。
１．ROI により、グラフ画面上で、マウス右クリックし、Export→Excel を選択する。

２．ファイルの種類が Excel Files になっていることを確認して、ファイル名を入力して保存します。

４． Statistics を押すと、２．で指定した場所の結果を表示します。
Tools

タグにある Select Channels and ROIs でグラフ表示する条件を変更できます。チェックがついているものについて、表示するようになります。

127

Tools タグにある Sort charts by Channels and ROIs でグラフ表示する方法を変更できます。
Sort Channels：
検出器ごとに結果を表示します。
Sort ROIｓ：
ROI ごとに結果を表示します。
All in One：全てまとめて表示します。

Histogram における Statistics の Prameter について
Parameter

意味

Area

ROI で指定した領域の面積（表面の凹凸を含まない）

Mean Value

ROI で指定した領域の平均輝度

Pixel CountROI で指定した領域のピクセル数

Pixel sum

ROI で指定した領域の総ピクセルの輝度の総和

Maximum

ROI で指定した領域の輝度の最大値

Minimum

ROI で指定した領域の輝度の最小値

Variance

ROI で指定した領域の輝度の分散Standard Diviation

ROI で指定した領域の輝度の標準偏差Average Diviation

ROI で指定した領域の輝度の平均偏差

Maximum peak

ROI で指定した領域の輝度の最高値

Minimum Valley

ROI で指定した領域の輝度の最高値

Volume

ROI で指定した領域の体積（Z 方向は垂直に測定）

Surface area

ROI で指定した領域の表面積（表面の凹凸込み）

Surface ara/area

ROI で指定した領域の表面積（凹凸込み）/面積（凹凸含まず）

128

Report ボタンによる結果出力
Report ボタンによって、測定結果を．ｘｍｌ形式で出力が可能です。

測定を行ったら Report ボタンを押します。まず保存画面が表示されますので、保存作業を行います。保存が終了すると、下記のように保存された xml ファイルが表示されます。

Report ボタンによって保存されたデータはフォルダ形式で保存されています。
その中に複数のファイルが入っていますが、保存時のファイルネームを開くと上記のｘｍｌファイルが開きます。また、個別の画像、グラフなども別々に保存されていますので、個別に開くこともできます。また、グラフデータはｃｓｖデータ（テキストデータ）としても保存されていますので、そのデー
タをエクセルで使用することも可能です。

129

Ratio 測定
ここでは Time Lapse との併用を例にご説明します。
１． タイムラプスの設定（「Ⅳ－２．Time Lapse」を参考にしてください）
１）Acquisition Mode から XYｔなどのタイムラプスモードを選択します
２)取得画像の調整をします(「Ⅱ.基本操作」を参考にしてください)３）時間軸方向の取り込み条件を設定します

２．Quantify メニューから Stack Profile

を選択する

３．計測範囲を指定
Viewer 画面に表示されている画像上に ROI を描き、計測範囲を指定します。
または

または

を使用し､画像上に線を描きます。

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５．Tools タブの Select a Calculator で Calsium Imaging を選択します。

６．計測の設定を入力
Analysis タブを開き、必要項目を設定します。
設定後、右下の Apply ボタンをクリックしてください。Ratio 画像が表示されます。
Kd 値を入力する場合はアクテ
ィブにするチャンネル間割り算の設定（分母、分子）バックグラウンドの補正：アクティブにし、画像上で ROI（矩形）を描くと、その部分をバッ
クグラウンドとして計算式から差し引きます。
ア ク テ ィブ に せ ず に
数値を手入力することも可能です。
Ratio 画像のスケール設定

Kd 値 を 設 定 し た 場 合 のRmin,Rmax の指定設定した計算式の保存、呼び出しが上記各設定項目可能です。

の 実 行 ボ タン 。押
すと Ratio が表示さ
れます。

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Back Ground の設定
Ratio 画像のON/OFF

Ratio 画像

Ratio 画像の色設定（スケール設定は前頁の Image Scaling で設定）

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６．データ取得の開始
Start

ボタンを押します。

グラフのタブを開くと、時間経過にしたがって、チャンネルごとの蛍光強度の変化がライブでグラフ表示されます。

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７．グラフの数値データを抽出する
それぞれの輝度データは Excel ファイル形式で保存することが可能です。
１）グラフ画面上で、マウス右クリックし、Export→Excel を選択します。

２）ファイルの種類が Excel Files になっていることを確認して、ファイル名を入力して保存します。

134Ⅵ－２．Colocalization（*オプションソフト）
多重染色時の共局在解析。
画像上で共局在している部分を特定し蛍光強度や面積等を数値化する。

Scatter グラフ

135

① まず 2 重染色の画像を取り込むか、ファイルから開きます。
②Quantify メニューの Tools タブで、「Intensity」になっているモードを Colocalization に変更します。（オプションソフトですのでインストールされていない場合は Intensity モードのみになります）③Colocalization メニューが開き、Viewer には Scattergram（散布図）が表示されます。

測定結果

測定メニュー

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Scattergram

Scattergram（散布図）は画像上の２チャンネル間のシグナル分布を表しているものです。
シグナルが横軸に近ければ近いほど、純粋なチャンネル１のシグナル、縦軸に近ければ近いほど純粋なチャンネル２のシグナルを意味します。
点線で示すような、対角線上にシグナルがある場合（縦軸や横軸から遠い）、双方のチャンネルで同じ割合でシグナルが存在（共局在）していることになります。

④メニューの Threshold と BackGround を操作して、Scattergraｍ上の共局在領域を指定します。
Background はデフォルトで２チャンネルがリンクするように設定されています。
Threshold で指定された領域

Background で指定された領域

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⑤共局在領域の画像上への表示方法を選択します。
Overlay：
オリジナル画像の上に共局在を指定した部分が白で表示される。
Colocalization Only(Black & White)：
共局在を指定した部分のみを白で表示
Colocalization Only(Color)：
共局在を指定した部分のみをオリジナルカラー
で表示
Off：
共局在を指定した部分を表示せず、オリジナルの画像のみを表示する。

⑥指定した共局在領域の測定値が表示されています。
Peason’s Correlation：
ピアソンの相関係数。計算された相関係数がゼロでないという確率。相関係数の有意水準。
Overlap Coefficient：オーバーラップ係数
Colocalization Rate ： Colocalization Area を
Area Foreground で割った値
Colocalization Area：指定した共局在領域
Area mage：画像全体の面積
Area Foreground ： 画 像 全 体 の 面 積 か ら
Background を差し引いた面積
Area Background：Background で指定した面積

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Mean Intensity Image：画像全体の蛍光強度の平均値。
Mean Intensity Colocalization：指定された共局在領域の蛍光強度の平均値
Intensity Sum Image：画像全体の蛍光強度の総和
Intensity Sum Colocalization：指定された共局在領域の蛍光強度の総和⑦これら二つの表の数値データは、表上で右クリックすることによって出力できます。
右クリックで Export という表示になりますので、Export を左クリックすると数値データを保存する画
面になります。Excel でインポートできるデータです。

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Ⅶ．SHUT DOWN
１． ソフト上からレーザー OFF
Configuration タブ

Laser アイコンを開き、Hardware Configuration の中のをクリックし、アクティブになっているチェックボックスをシングルクリックでディアクティベイトし、オフにします。Ar レーザーを使用していた場合はパワーを０％に落としてからチェックボックスをオフにしてください。
注意）ダブルクリックすると、レーザーOFF の直後に ON にすることとなり、頻繁に繰り返すと故障の原因になりますのでご注意ください。

２． ソフトウェア LAS AF 及び PC を終了
必要なデータを保存後ソフトを終了し、画面左下 Start ボタンから XP を Shutdown してくださ
い。

140

4

3．

5

6

レーザーOn/Off のパイロットランプ⑤レーザーの発振
キースイッチ④PC および③スキャナー

モニター元電源

電源⑥レーザーの電源
注！①のチェックをはずした後、冷却が終了するまでオフにしないこと。キースイッチオフの前にこのボタンをオフにするとレーザー故障の原
因となります。

３． スキャナーの電源 OFF （真中の緑のボタンを OFF）

４． PＣおよびモニターの電源 OFF （左の緑のボタンを OFF）
XP が終了するまで待ち、モニターが暗くなるのを確認してからオフにしてください。

５． １．でレーザーをＯＦＦにした後、約 5 分位でＡｒレーザーのファンが自動的に止まるので、それを確認してレーザーの発振キースイッチを OFF

６．レーザーの電源ＯFF（一番右の緑のボタンを OFF にする。）
注意！”１“ および ”５ “のレーザーのオフより前に” 6 ”のレーザーの電源（冷却）をオフにしないこと。レーザーオフの前に冷却が止まることになり、レーザー故障の原因となります。

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７．水銀ランプの電源ボックスのスイッチを OFF
１～２時間位使用しない場合はＯｆｆにする。点灯直後に消灯しないこと、また再点灯はランプが冷えてから行う。ランプハウスは非常に高温になるため注意のこと。作業終了後、ビニールのカバーをかぶせるときにランプハウスが充分冷えているのを確認すること。
下記いずれかのモデルとなります。 注意）どちらも頻繁にＯＮ/ＯＦＦしないこと。

水銀ランプ（100Ｗ）
再点灯はランプハウスが冷えてから（15～30 分待って）行う。

超高圧水銀ランプ（120Ｗ）

またランプハウスは非常に高温となるた

再点灯は５分ほど待ってから行う。

め、使用後ビニールカバーをかけるとき（電源内部で点灯しているのでランプハウは注意すること。

スは無し）

８．液浸（オイル・水・グリセリン）対物レンズのクリーニング
９．顕微鏡の電源を OFF（下記どちらかのモデルとなります）

142ライカマイクロシステムズ株式会社 連絡先＜東京本社＞〒108-0072 東京都港区白金 1-27-6
白金高輪ステーションビル 6Ｆ
TEL：03-5421-2815
FAX：03-5421-2891＜大阪セールスオフィス＞〒531-0072 大阪市北区豊崎 5-4-9
商業第二ビル 10F
TEL：06-6374-9771
FAX：06-6374-9772

日本語サイト：
http://www.leica-microsystems.co.jp/website/su_jp.nsf
English site:
http://www.confocal-microscopy.com/website/sc_llt.nsf

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