放射光科学30年の歩みと展望

構造生物学における放射光利用
月原冨武
兵庫県立大学大学院
大阪大学蛋白質研究所

生命理学研究科〒6781297 兵庫県赤穂郡上郡町光都 3 丁目 21〒5650871 大阪府吹田市山田丘 32

1960年初頭にミオグロビンとヘモグロビンの結晶構造解析が成功して，構造生物学の誕生となった。強力で波長■
要旨

可変性に富んだ放射光は X 線結晶構造解析の可能性を広げた。我が国では1980年代から高エネルギー物理学研究所放射光実験施設が国内外の研究者に広く利用されて，構造生物学の発展に大きく寄与した。1990年末からはSPring 8 も供用を開始した。両施設は持続的に技術の革新を行って，常時最先端の実験環境を整えた。その結果，多くの世界に誇ることのできる成果を収めることができた。

集に通じるものである。

1. 結晶学が生んだ構造生物学
1913年にブラッグ父子は回折理論を提唱し1)，同じ分子が周期に整列した結晶に X 線を照射すると，回折斑点が2. 蛋白質結晶学における放射光利用の始まり得られることを示した。それから 20 年ほどたった 1934 年

1980 年代前半から，遺伝子工学をとりいれた蛋白質調に，バナールとクロフォートが，ペプシンの X 線回折像製法の開発や，コンピュータの進歩と相まった構造解析ソを観測し2)，同じ蛋白質は同じ立体構造であるということ

フトウエアーの開発が盛んに行われる中で，放射光施設がが明らかになった。これは，それぞれの蛋白質のアミノ酸稼動し始めて回折強度データ収集法の高度化が始まった。

配列が特定の決まったものであるということさえ分かって我が国では， 1983 年に供用を開始した高エネルギー物理いなかった時代に，同じ蛋白質はすべて同じ立体構造をし学研究所放射光実験施設（ PF ）で，坂部知平教授（名ていることを実証した画期的な発見であった。その後 20

古屋大学のち高エネルギー物理学研究所）は蛋白質結晶用

数年に及ぶ，バナールを中心とした英国での粘り強い研究に大型ワイセンベルグカメラ（坂部カメラ）の開発を行い，の積み重ねによって，1960年代初頭にミオグロビン3)とヘ

1980 年代後半から広く一般ユーザーに利用されるように

モグロビン4)の結晶構造解析が成功し，初めて蛋白質の立なった。この間，受光装置はフィルムからイメージングプ体構造が顕わになった。これらの結晶構造解析は，構造生レートに変わり，回折強度処理プログラム WEISS も東常物学の誕生となり，1953年の DNA の繊維回折像に基づい

株 ）によって開発された。
行博士（京都大学のち理学電機

た構造決定5)によって生まれた情報生物学と並んで，今日それまで，我が国では 4 軸型自動回折計が主流であったの生物学の発展の礎となった。

ために，欧米で進んでいた振動カメラの導入ははかどら

1960 年代は蛋白質結晶学の揺籃期であり，最初の酵素

ず，大きな格子の回折強度測定は困難に陥っていたが，坂の構造としてリゾチームの構造が決定された6)。1970年代

部カメラによって一挙に解決された。 PF の蛋白質結晶

は蛋白質結晶学の研究室が世界各地に拡がり，各国で蛋白ビームラインは極めて利用者本位に運営され，出張旅費も質結晶学の基礎が固められた。 1980 年前後には巨大な球支給された。結晶を得さえすれば，日本の何処にいても蛋状ウイルスの結晶構造解析がアメリカの 2 つのグループ

白質結晶構造解析を行うことが出来た。このビームライン

によってなされた7,8) 。 1980 年代前半に我が国の若い研究

は我が国の多くの研究者に世界と渡り合うことが出来る確者も加わったドイツのグループによって，光合成反応中心

信をもたらし，当時若かった我々蛋白質結晶学研究者にもの結晶構造決定に成功し9)，初めて膜蛋白質の構造が明ら

大きな夢と希望を与えた。 Fig. 1 は当時撮影したウシ心筋かになった。この時代に私自身が経験したことであるが，のチトクロム c 酸化酵素の 5 Å 分解能の回折像であり，

ウイルス結晶の回折データ収集では，回転陽極 X 線によ高等生物の膜蛋白質複合体として先陣を切るものであり，る振動写真法， 0.6 度振動， 1 日 1 イメージずつ集めた。

構造解析に向けて計り知れない勇気を得た。 1990 年代半

なお 1 照射ごとに結晶を交換し方位を揃えて 0.1 度の重なばからは第 3 世代放射光施設の運用が始まり，我が国でりをとって24時間単位で繰り返し撮影したので，1 セット

も1997年から SPring8 の一般供用が開始された。我が国

90度撮影するのに正味180日要した。隔世の感がある実験のみならず欧米でも 2000 年代初頭以降蛋白質研究に関わであるが，1 照射しか得られない微小結晶の回折データ収る国家プロジェクトによる支援もあって蛋白質の構造研究

放射光 March 2018 Vol.31 No.2 ●65(C) 2018 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Researchン的に決定する手法として普及した。電子密度を精密化す
る計算法の進歩によって，単一波長での異常散乱効果のみで構造決定する単波長異常散乱法（ SAD 法）で多くの構造解析がなされるようになった。
さらに精密な回折実験を行い，蛋白質中に含まれる硫黄
原子の小さな異常散乱効果を利用して，ネイティブ結晶だけで構造決定することを目指す研究も進んだ。北海道大学の田中勲教授のグループは，回折 X 線への結晶の周囲にある水等による吸収の影響を軽減するために，ループレス
マウント法を開発した12) 。そのマウント法を使って，回転陽極 X 線発生機の Cr の特性 X 線によって硫黄の異常
散乱効果を利用した位相決定（SSAD 法）に成功した13)。
Fig. 1(Color online) DiŠraction pattern of bovine cytochrome coxidase by using Sakabe camera equipped with an imaging
plate at the Pfoton Factory. The image was digitized at the
Namba laboratory. Space group is P62 or P64 and cell constants are a＝b＝174.5 Å, c＝282.2 Å.

放 射 光 施 設 PF で は 受 光 装 置を 含 め ビ ー ム ラ イ ン を S 
SAD 法用に最適化し，硫黄原子の小さな異常散乱効果を精密に測定できるシステムが整備されて，新しい構造が出てきている14)。この SSAD 法は，新規構造の蛋白質結晶の位相をルーチン的に決定できる手法になってきた。一は質と量の両面において画期的な進歩を遂げた。そうした中で蛋白質結晶学と放射光の関わりの事例を拾ってみよう。

方，類似の構造の蛋白質がある場合も年々増えてきており，その類似の構造を利用して位相を決定する分子置換（MR）法もルーチン化されている。SSAD 法と MR 法の

3. 放射光 X 線による位相決定の進歩と構造解析の拡がり
蛋白質の結晶構造解析における回折斑点の位相決定は重原子同型置換法10) によって行われてきた。この方法では両方の位相決定法を組み込んで，あらゆる蛋白質結晶も回折計に乗せれば構造が出てくるシステムの構築は可能になって来た。その実施体制の確立は生命科学の基礎研究のみ
ならず，創薬等の応用研究への貢献の大きさは計り知れないものがある。

蛋白質の結晶（ネイティブ結晶）とそれに重原子を導入した重原子誘導体結晶が必要である。導入された重原子による回折強度の変化からネイティブ結晶の回折斑点の位相を決定する。

4. 放射光による回折強度測定法の進歩
4 軸型回折計による小さな蛋白質の回折データ収集でネイティブ結晶と同型で良好な重原子誘導体結晶を調製

は，斑点間のスケール合わせを容易にするために結晶全体することが容易でないときもしばしばある。一方，波長をに X 線を照射する完浴法が適用された。一方，写真法に自由に選ぶことができるという特徴を持っている放射光でよる格子が大きい結晶の場合は斑点間の重なりを避けるたは，特定の波長の X 線を選択することによって，特定のめにビームを絞った回折実験が行われた。強度の強い放射原子による異常散乱を大きくして，原子散乱因子を変える

光では特別な場合を除いて，後者と同様に結晶の一部にサことができる。そこで放射光結晶構造解析では，複数の重イズの小さいビームを照射する方法によって回折データを

原子誘導体の代わりに，1 つの重原子誘導体について異な収集する。今日では 2000 Å を超える格子の結晶についてる波長での回折強度データに基づいた多波長異常散乱法

も高分解能の回折実験が可能になっている。

（MAD 法)11)による位相決定が可能になった。

結晶のセッティングに関しては放射光施設においても，多くの蛋白質ではその活性中心に大きな異常散乱を起こ

ごく初期の頃は結晶の方位を調整した上で，特定の軸の周す金属原子などを含んでいる。また，蛋白質を構成するア

りに結晶を回転させて独立な反射を最少の実験で収集する

ミノ酸にはメチオニンのように硫黄を含むものが有り，蛋方法が採用された。その後，回折データ処理法の進歩もあ

白質工学の手法によってこれらの硫黄原子を異常散乱効果って，任意の方位で180度回転させてデータを収集して，の大きいセレンに置き換えることができる。これらネイテ

反射ごとの多重度を上げて精度の高いデータにする方法がィブ結晶に異常散乱を生じる原子を含んでいる場合には，定着した。

重原子誘導体結晶を調製することなく，ネイティブ結晶の回折強度データ処理では連続したイメージ間で強度を足みで複数の波長で回折実験を行うことによって構造決定をし合わせて，各斑点の完全な強度を見積もる方法と，イ行うことができる。中でもセレノメチオニン置換蛋白質のメージごとで各反射の完全度を見積もって回折強度を求め調製法が急速に進歩して，セレノメチオニン置換結晶のる方法があった。後者はウイルスなど巨大で散乱強度が弱MAD 法による構造解析は，放射光によって位相をルーチ

くて，1 つの結晶で 1 イメージしか得られない場合に適用

66 ● 放射光 March 2018 Vol.31 No.2

特集 ■ 放射光科学30年の歩みと展望された。放射光実験では前者の場合が一般的である。
蛋白質の結晶は概ね 30 MGy の X 線照射によって回折能を 50 失うとされる15) 。しかし， X 線照射の影響は温5. 我が国の放射光施設における構造生物学の顕著な成果度によっても大きく変化する。 1990 年代まで回折実験は我が国の放射光施設 PF と SPring 8 は国家プロジェク

結晶の脱水を避けるためにガラスキャピラリー中に封入しト等の支援を得て持続的に最先端技術の開発と導入を計って，室温で回折実験を実施した。そのため， X 線照射にてきた。それによって広く国内外の研究者に対して献身的よる結晶の損傷は深刻であった。とりわけリボソームの結な支援を行って，数々の先進的な構造をもたらした。その晶では X 線損傷が極めて激しくデータ収集に苦しんでいうちの幾つかにつて紹介する。

た。そこで，100 K 程度の窒素気流中で急速凍結して回折

実験を行うことによって，回折強度の劣化を抑制すること

PF における代表的な研究はその引用件数の多さや当時

2 つのチトクロム c 酸化酵素ができた16) 。それ以降，徐々に他の蛋白質結晶でもキャのインパクトの大きさから言っても， 1995 年 8 月の同じ

ピラリー封入でなくループに乗せて凍結し，100 K で回折

週に Nature 誌17) と Science 誌1820) に掲載された細菌とウ実験を行うことが定着し，キャピラリーに封入する方法はシのチトクロム c 酸化酵素の構造であろう。これらは共に特殊な技術になった。

坂部カメラによる回折像から得られた構造因子を使って決放 射光施 設も 日進 月歩で X 線の 輝度が 上が るに つれ定されたものである。Fig. 2 は細菌の酵素の全体構造とウて，回折実験の律速は受光装置の読み取り速度になった。

シ酵素の活性中心の構造である。膜蛋白質複合体の全体構

それが近年受光装置の読み取り速度の高速化によって，シ造としては光合成反応中心に続く 2 例目であり，呼吸とャッターレスの連続測定も可能になった。その結果，数分いう生命の根幹に関わる膜蛋白質の構造として注目されのうちに 1データセットの収集が行えるほどにまで高速化た。蛋白質結晶学及び放射光施設としては後発の日本からされた。高速化にとどまらず，シャッターレスの高速連続発信されたことで米国を中心に大きな衝撃となった。

測定は新しい回折データ収集法をもたらしている。



ウシロドプシン

こうした技術の進歩は迅速な回折実験に止まらず，結晶運用開始間もない SPring8 での画期的な研究としてロ化可能な如何なる生体物質の大きな格子の結晶の構造解

ドプシンの構造決定を挙げることができる。ロドプシンは

析，水素の位置のみならず電子密度分布と結合の性質の関網膜において光の認識に関わる蛋白質である。生体内で情係などの精密構造解析，ミクロンオーダーの微小結晶の構報伝達を担う G 蛋白質共役受容体（ GPCR ）の一つとし造解析に道を拓いている。

ても知られている。 GPCR は基礎生物学のみならず，医学的にも重要であり創薬ターゲットとしても注目されていFig. 2(Color online) (Left) The structure of bacterial cytochrome c oxidase complexed with an Fv fragment17) (PDB
ID, 1AR1), and (right) the structure of active sites of bovine cytochrome c oxidase18).

放射光 March 2018 Vol.31 No.2 ●67

る蛋白質群である。ワシントン大学のパルチェフスキー教

よって蛋白質が機能する動的過程を原子レベルの精度で捉授，岡田哲二研究員らと理研の宮野主任研究員のグループえることに成功した代表的な研究として高く評価されていは，ウシロドプシンの構造を異常散乱効果測定に最適化さる。

れた SPring8 のビームラインで得られた回折データによ

光合成系 II（PSII）って MAD 法によって構造を決定した21) 。ウシロドプシ

PSII は光エネルギーを利用して水を酸素分子，水素インの構造は， 7 回の膜貫通 a ヘリックス，細胞外の 4 本

オンと電子に変換する。水素イオンは膜の一方側に蓄えらの bシートで構成される GPCR を代表する構造となった

れて ATP を生産するエネルギーとなる。電子も他の酵素（Fig. 3）。情報伝達に関わる G蛋白質との結合部位のあるに伝達されて， NADPH の生産に使われる。このように細胞質側の構造は，分子スイッチとして働く GPCR であPSII は光エネルギー変換の根幹を担う蛋白質であること

るロドプシンの分子機構を明らかにする第一歩にもなった。

から長年結晶構造解析の対象として注目されてきた。大阪

スナップショットを集めたカルシウム ATPase の市立大学の神谷信夫教授と岡山大学の沈建仁教授のグルー

動的構造

プは，ラン藻の PSII の全サブユニットを含む構造（ Fig.

蛋白質はしばしば，あたかも意思を持っているかのよう

5 )28) を決定するとともに，懸案であった活性中心の歪んに構造を変えて働くことがある。東京大学の豊島近教授にだ椅子型構造の Mn4CaO5 とそれに配位している 4 個の水よる Ca2＋ATPase の構造解析は，そのように働く蛋白質を確定した。しかし，一部の酸素原子と金属間距離が他のが機 能する 姿の 全容を 捉え た比類 のない 研究 であ る。

分光学的研究や理論との不一致が指摘された。その原因とCa2＋ATPase は細胞膜や小胞体などの細胞内小器官の膜して X 線損 傷の影 響が考 えられ たので ， X 線自 由電子にあって， ATP を分解して得たエネルギーによってそれレーザー（XFEL）による回折実験に基づいた構造解析を

らの膜を横切って Ca2＋ を輸送して，細胞内の Ca2＋ 濃度

行ったところ， X 線損傷を受けていない構造を決定するを調節する酵素である。 Ca2＋ 濃度の調節によって筋肉のことができた29) （ Fig. 5 右）。その構造は多くの研究者に

収縮や脳における記憶が制御されており，本酵素は生命活

よって人工光合成を目指す化合物設計のために盛んに利用

動を恒常的に維持する上で極めて重要な酵素である。豊島されている。

近教授のグループは， 2000 年に筋小胞体の Ca2＋ATPaseの構造を最初に決定してから， SPring 8 で実験を重ねてCa2＋ ポンプとして働く際に生じる 10種の中間体の構造を

6. 回折構造生物学の近未来決定した2227) 。それら一連の構造に基づいて，膜に結合蛋白質の X 線結晶構造解析は 3 つの方向性を持って進した状態で蛋白質が大きく構造を変化させて Ca2＋ を運ぶ

歩してきた。それらは多様な構造，精密な構造，巨大な構

精密な動きを明らかにした（Fig. 4）。この研究は放射光に造を追求する方向である。それぞれの観点から近未来の姿を描いてみよう。


調製困難な蛋白質の微小結晶構造解析

構造決定された蛋白質の数は 13 万件を超えているが，生命現象の様々な局面で鍵を握っている蛋白質が構造未知のまま多く残されている。それらは大抵大量精製結晶化が容易でない。こうした大量精製が困難な蛋白質では，大きな結晶を調製することは難しく，微小結晶による構造解析は必須である。また，結晶化が困難とされてきた膜蛋白質のために開発された立方液晶法（ LCP 法）でも大きな結晶を作ることは容易でない。従って微小結晶による構造解析は近々の課題といえる。
そした状況で，微小結晶に対応できる微焦点ビームラインが開発され，微小結晶構造解析に適用されている30) 。
例えば， SPring 8 の BL32XU では， LCP 法で結晶化した膜蛋白質の 13× 13× 13 mm3 の微小結晶 1 個からの精度の高い回折データによって，異常散乱を利用した位相決定に成功した31)。
Fig. 3(Color online) The structure of bovine rhodopsin consistingof seven transmembrane helices21). A retinal molecule in thecentral region of the protein and sugar chains are drawn byspheres, whose carbon and oxygen atoms are in light blue
and red colores, rspectively. (PDB ID,1F88).

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肉眼では見えない微小結晶に対する回折実験法も開発されている。数 10 個の微小結晶がのっているループ上をビームで二次元スキャンをして回折が得られる位置を特定
し，それぞれの結晶の位置でシャッターレス測定が可能な

特集 ■ 放射光科学30年の歩みと展望

Fig. 4(Color online) Ca2＋ pumping mechanism of Ca2＋ATPase2227). The mechanism was elucidated by 10 structuresof reaction intermediates. The ˆgure was kindly supplied by Professor C. Toyoshima, The University of Tokyo.

Fig. 5(Color online) (Left) The structure of PSII with water molecules shown by lightblue sheres. (Right) The
damage-free structure of Mn4CaO5 center with four water molecules determine at SACLA. The ˆgure was kindly
supplied by Professor J.-R. Shen, Okayama University.

放射光 March 2018 Vol.31 No.2 ●69

受光装置によって 5 度～ 10 度分データを収集して，最終

折実験を行った。構造解析の結果，ペプチドの平面性の指的にすべての結晶のデータを合わせる30)。

標である v が10度以上ずれたペプチドの存在，［4Fe4S］

さらに結晶が小さくなれば，1 個の結晶での走査角度範クラスター内での電子密度の偏り，システイン残基の Sg

囲を狭くしなければならなくなる。1980年前後，1 結晶 1

原子の 3p 電子と非極性基（フェニル基等）の水素との相照射， 0.6度振動でデータ収集していたウイルス結晶のこ互作用による Sg 原子の負電荷の減少， FAD のイソアロとを考慮すれば， 0.5度までは十分対応できるであろう。

キサジン環内での CC 及び CN 結合の次数，非極性基のどこまで小さな結晶での回折データ収集を行うことができ

水素原子が関わる水素結合などを明らかにすることができ

るかは X 線損傷によって決まる。

た。これらの研究成果は，2 つの電子伝達蛋白質の電子伝

一方，X 線自由電子レーザー（XFEL）による回折実験

達の仕組みを解き明かす貴重な成果にとどまらず， X 線

では無数の静止回折像を集めて構造因子を求めている。損

結晶構造解析による電子密度およびその分布の形状に基づ傷を受ける前に回折が起こるということで X 線損傷の激いて，結合や原子の化学的性質を解き明かすことがでできしい結晶の回折データ収集に活用され， X 線損傷が問題ることを強く示唆している。今後，このレベルの研究を蓄になっていたチトクロム c 酸化酵素と PSII の結晶に適用

積することによって，構造電子密度から化学物理を介されて損傷を受けない状態の構造が決められた29,32)。

して蛋白質機能の理解を深める研究分野が広がることを期

損傷が起こる前に回折が起こることが完全に成り立つと待する。

すれば XFEL の強度が強くなりさえすれば小さな結晶か

さらにこのレベルの構造の蓄積は，従来の蛋白質構造にら回折像を得ることができることになる。しかし，実際に関する経験則をより真実を反映したものに近づけることには 108 photons / Å2 のパルスで酸素の原子散乱因子が 5 fs

も有用である。そのことは，通常の分解能での構造解析の以内に 75 以上減少するというシミュレーションもあ

適正化にも繋がる。

り33) ，強力な XFEL だけで微小結晶による回折実験が可能になる訳ではないようである。将来 XFEL での X 線強蛋白質中の化学反応過程を可視化する時分割構造解析

度が桁違いに強くなると，10 fs 以内にも X 線損傷が起こ

蛋白質が働く際の構造変化を追跡する場合，順次生じる

り無損傷構造解析とはならない可能性がある。実際の蛋白状態を止めてスナップショットを撮る方法と変化する構造質結晶で無損傷構造解析の限界となるパルス強度はまだ分を直接観測する方法が考えられる。前者は先に述べたよう

かっていない。

に CaATPase において成功し，酵素の働きの全容を見事

現在，構造解析に適用されているのは干渉性散乱であるに捉えた。後者は強力なフェムト秒パルスである XFELが， XFEL のパルスがさらに短くになると非干渉性散乱の出現によって現実にものになった。岩田想教授（理化学が構造解析に活用できる可能性が示されており34) ，新し研究所京都大学）のグループは SACLA においてバク

い構造解析法として期待される。

テリオロドプシンの時分割構造解析を行いプロトン輸送機



電子密度から化学に迫る超精密構造解析

構の解明に成功した37)。その研究では，光励起後16 ns 後X 線結晶構造解析で得られる電子密度分布はその分解から1725 ms 後まで合計13段階の構造を決定した（Fig. 6）。

能によって得られる情報の質が変化する。1.5 Å を超える

それらの構造を光照射前の構造と比較して構造変化の詳細

分解能になると非水素原子の電子密度が原子ごとに分離しを捉え，プロトン輸送機構の理解を深めることができた。

始める。0.8 Å 分解能以上では水素原子の位置を確認でき

この研究に続いて SACLA ではチトクロム酸化酵素の COる。蛋白質によって駆動される化学反応では多くの場合水光解離38)及び PSII の光励起39)の時分割構造解析が行われ素が関与するので，蛋白質中の水素原子位置を決めるだけて，それらの酵素の働きの仕組みの解明が進んだ。これら

でも蛋白質の働きの仕組みの解明に大きく貢献できる。さは蛋白質機能の理解に向けて，位置及び時間の両次元で十らに高い分解能では，経験則による束縛を取り去った構造

分高い分解能の動的構造解析が開始されたことを示すもの

決定及び，電子密度とその分布の形状と化学結合の関係をである。今後の拡がりが期待される構造生物学の新しい分議論できるようになり，新しい研究分野を切り開かれてい野が現実のもになった。

る。
京都大学の三木邦夫教授のグループは高電位鉄硫黄蛋白質（HiPIP）と NADHチトクロム b6 還元酵素（b6R）の

電子線と X 線の融合によるオルガネラや巨大な複合体の構造解析

極低温電子顕微鏡（cryoEM）による巨大な複合体の単電 子 密 度 分 布 解 析 を そ れ ぞ れ 0.48 Å35), 0.78 Å36) で 行 っ

粒子構造解析の急速な進展には目を見張るものがある。

た。その詳細は本誌既報の論文等に譲るが，その要点と意

cryoEM 単粒子構造解析は，像を数多く観測して平均し，義について述べる。その研究では電子密度とその分布の形

異なる方位の像を合わせて精度の高い構造を得る。その過状を求めることを目指しており，高分解能の回折データで程で互いの像の間で相対的な方位を決める。方位を決める

且つ， X 線損傷の影響を避けることが強く求められる。

際に，同じ鮮明さの像であった場合には対象が大きいほどそのため， X 線吸収線量を 0.1 MGy に抑えた高分解能回

正確に決めることができる。ここに電子顕微鏡単粒子構造

70 ● 放射光 March 2018 Vol.31 No.2

特集 ■ 放射光科学30年の歩みと展望

Fig. 6(Color online) Dynamical structure determination of bacteriorhodopsin at SACLA37). Thirteen structures ofreaction intermediates after photo-activation were determined by SFX method at SACLA. Structures at 16 ns,
760 ns, 36.2 ms, 1725 ms after photo-activation, which correspond to K, L, M1, M2, respectively, are shown. Proton pumping mechanism was clearly shown by structural change. The ˆgure was kindly supplied by Dr. E. Nango,
Riken.

解析が小さな対象に比べて大きい対象を得意とする理由が子座標が求められている。それらの中には一部乱れた部分ある。

もあり，そのままでは結晶化は難しいと思われるものも少しかし，cryoEM 単粒子構造解析の最大の特徴は結晶化なくない。そうした試料であっても重要な部分の構造を決を経ずして構造を決定できることである。オルガネラをは

め る こ と が で き る の は cryoEM の 利 点 で あ る 。 一 方 ，じめ，結晶化が困難な対象は EM と X 線の融合による全cryoEM 単粒子構造解析も分解能を上げるためには構造が体構造の解析は当然の戦略である。その典型例は，難波啓揃った試料の調製が必須である。即ち cryoEM 単粒子構一教授（大阪大学）のグループによる細菌のベン毛の構造造解析の高分解能化は結晶化の可能性を切り開くものでも研究である。 1989 年に X 線繊維写真によって細菌のベンある。 2 次元， 3 次元結晶の利用は，構造解析の精度を上毛の低分解能構造を報告して4051) 以来， X 線結晶学と電げるために最も効果的な手段であり，cryoEM 単粒子構造

子顕微鏡構造解析の技術を存分に活用して細菌のベン毛の解析と並行して結晶化を行うことは賢明なことである。

構造，構造構築機構と作動原理の解明を行ってきた。最近
は cryoEM 単粒子構造解析の高分解能化を計って一層研究を進展させている。一連の研究はべん毛というナノマシ

7. おわりにンの見事な回転方向をスイッチする仕組みを明らかにし構造生物学は分子から細胞まで異なった階層での構造をて，この分野で世界をリードしている。 X 線構造解析と原子レベルの精度で解き明かすことを目指している。そのcryoEM 単粒子構造解析を融合した超分子構造研究法を構ために様々な手法がそれぞれの特徴を生かして，適用され築して，べん毛の構造の全容の解明している研究の成果のている。当面， X 線構造解析では，多様な構造，精密な概要を Fig. 7 に示している。

構造，複雑系の構造のうち何を求めるにしても結晶による巨大な複合体の構造研究が cryoEM 単粒子構造解析によっ て続々 と出 されて いる 中で， リボソ ーム のよ うに

回折の利用が中心になり，他の方法では取って代わることのできない質の構造を提供できる。

RNA 主 体 の も の や ， 対 称 性 の 高 い ウ イ ル ス の 場 合 はしかし，いずれの方法の場合にも試料の精製に加えて結cryoEM 単独で全体構造が出されている。多くの複合体は晶化という難題を抱える。結晶化の成否及び結晶の質を決

個々のサブユニットは X 線結晶構造解析による高分解能

める第 1 要因は，調製した試料の立体構造の均一性の高構造と cryoEM による全体構造の融合によって全体の原さである。その均一性をモニターしながら結晶化を行う方

放射光 March 2018 Vol.31 No.2 ●71

Fig. 7

(Color online) The structure of bacterial ‰agellum determine by cryoEM and X-ray crystallography4051). Theˆgure was kindly supplied by Professor K. Namba, Osaka University.

法としては水溶性蛋白質については動的光散乱などが有効晶化を行うことは重要である。

に使われている。膜蛋白質を含む大きな複合体については参考文献

EM の低分解能画像が均一性の確認には極めて有効である。

蛋白質の結晶構造解析を振り返ってみると，3.0 Å，1.5

1)

Å ， 0.8 Å と分解能が上がってくると全く質の違った構造が見えてくるにも拘らず，最初に出た分解能での構造解析で止まるのが通例である。結晶が出るか出ないかの研究は

2)3)

多くあるが，例えば 3.0 Å 分解能から 1.5 Å 分解能へ向上させる方法の系統的な研究は見られない。 3.0 Å ～ 2.0 Å

4)

分解能の結晶を 1.5 Å さらに 0.8 Å 分解能に高品位化する研究は X 線結晶構造解析が生命科学で新たな研究を切り拓く上で鍵になる研究である。
巨大な複合体の構造解析も座標精度の向上が求められる

5)
6)
7)

ようになるのは自明である。低分解能の cryoEM 単粒子
構造と X 線高分解能構造との融合による擬似原子分解能8)

構造では機能メカニズムの理解にとって致命的な限界が生じる。回折実験法は如何なる大きさの対象にも対応できるようになっており，cryoEM による構造解析と並行して結72 ● 放射光 March 2018 Vol.31 No.2

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放射光 March 2018 Vol.31 No.2 ●

73

著者紹介
月原冨武
兵庫県立大学大学院 生命理学研究科，
大阪大学蛋白質研究所
専門構造生物学，蛋白質結晶学［略歴］
1969 年大阪大学大学院理学研究科修士課
程修了
1970年同博士課程中途退学，（理学博士）
1971年鳥取大学工学部助手
1973年同講師
1978年同助教授
1991年徳島大学工学部教授
1995年大阪大学蛋白質研究所教授
2008年兵庫県立大学特任教授

Synchrotron radiation in srtuctural biology
Tomitake TSUKIHARA

Abstract

Department of Life Science, University of Hyogo, 3-2-1 Koto, Kamighori,
Akoh, Hyogo 678-1297, Japan
Institute for Protein Research,Osaka University, 3-2 Yamadaoka, Suita,
Osaka 565-0871, Japan

Structures of myoglobin and hemoglobin determined by X-ray crystallography around 1960
eŠected the birth of structural biology. Synchrotron radiation which was tunable and extreamly
strong expanded possibility of X-ray crystallography in structural biology. In our country Photon
Factory has provided structural biologists with beamlines since 1980th to produce novel protein
structures. SPring-8 has oŠered beamlines since end of 1990th. Both facilities have continuously
conducted technological revolution to keep the cutting edge of experimental conditions. Many
structures that were highly evaluated have been produced by both facilities.

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