No. 12 (2003 年 9 月)

1

巻頭言
出会い

2

青井 啓悟 （名古屋大学大学院生命農学研究科）
2

研究紹介
高分子ナノアーキテクチャーから医療への発信

3中山 泰秀 （国立循環器病センター研究所生体工学部）
ガス状小分子をセンシングするヘムタンパク質の構造･

9

機能相関を解明する
中島 洋 （名古屋大学大学院理学研究科）
3

4

論文紹介 「気になった論文」
加地 範匡

徳島大学大学院薬学研究科

14

長田 英也

徳島大学大学院薬学研究科

15

野島 高彦

九州大学大学院工学研究院

17

藤本 ゆかり大阪大学大学院理学研究科

19

松原 輝彦

慶應義塾大学理工学部

21

グラビアページ
第６回 生命化学研究会 in 福岡（2003 年 6 月 27 日）

523

お知らせコーナー
第 1 回生命化学国際シンポジウムへのお誘い

24

受賞のお知らせ26

会員異動のお知らせ

26

編集後記

27

生命化学研究レター No. 12 (2003. September) 2

出会い
名古屋大学大学院生命農学研究科
青井啓悟
生命化学研究会・・・実に懐の広い研究会だ。
生命、生物は、少々無案内であったとしても、いや無案内ならなおさら生命化学研究会で研究を見つめる価値があるだろう。このことを、体験として聞いていただきたいので、恥ずかしながら小生のことを正直に話したい。

私は、「生命」には縁遠い高分子合成を専門として育った。学生の時の研究には、生物色はまったく無かった。オキサゾリンの開環重合という研究に取り組んでいたが、強いて言えば後になって、その重合体を疑似ペプチドと呼んだことぐらいである。
名古屋大学の農学部の岡田鉦彦教授のもとで助手として探索をはじめ、生物あるいは生命と、合成高分子との接点を求めた。必要に迫られた。糖鎖デンドリマー「シュガーボール」は、そんな環境の中ではじめて生まれた。合成法がシンプルで、合成を専門としていた自分にとっては、自己満足からはほど遠い分子設計だったのだが。

生命化学研究会では、生物学的な言葉があまりわからなかったとしても、何も臆することはない。化学、物
理、材料、分析、計算科学など広い分野の研究者間で、新たな研究の接点が芽生えることを願っている。

発見。量子的な飛躍。ブレイクスルー。
研究の魅力であり、また醍醐味でもあったりする、そのような体験にたどりつくには、もちろん己の研究をつきつめて突破口を開くのも正攻法であるのだが、異分野との交点には秘宝がいくらでも眠っている。
別世界とも思えるロケーション：淡路島の夢舞台で、第１回生命化学国際シンポジウムが開かれる。大きな期待が寄せられている。またとない「出会い」の機会だ。

（あおい けいご: aoi@agr.nagoya-u.ac.jp ）生命化学研究レター No. 12 (2003. September) 3高分子ナノアーキテクチャーから医療への発信
国立循環器病センター研究所生体工学部 中山泰秀
（nakayama@ri.ncvc.go.jp）
1. はじめに
ゲノム解読に代表されるように生化学分野における輝かしい発展にともなって、対象とする精緻な生つ分子を意味する) 重合法を選択して高分子ナノア
ーキテクチャー技術として確立させ、その医療分野への適用を精力的に拡大させている。

体高分子を精密に構造解析する手法が種々確立され、さらに、それらの一部は人工的に自動で再現でき、

2. 表面高分子ナノアーキテクチャー

加えて新たな機能性分子を創生できることが既に現イニファタの一種であるベンジルジチオカルバメ

実のものとなって久しい。他方、人工合成高分子のート (Ph-CH2-SCSNEt2)に光を照射すると、ベンジ分野においては、生成物が複雑系であることも影響

ル炭素と硫黄間の結合を可逆的に解離させ、ベンジ

して、統計学的処理を超えるユニット分子レベルでルラジカル (Ph-CH2･)とジチオカルバミルラジカの精密な解析は未だ達成されておらず、合成面におル (･SCSNEt2）を生成させることができる。ここいては未だクラシカルな重合法が高分子化学工業ので、ベンジルラジカルのみがビニルモノマーの重合中心を支え続けている。しかし、ナノテクノロジー

開始剤として機能し、重合末端では常にジチオカル

を始めとする超微細精密構造化の波はナノメディシ

バミルラジカルによるキャッピングが起こる。従っンとして高分子材料を主構成成分とする医療デバイて、光照射時にのみにモノマーを重合させることがスのマイクロ化・多機能化にまで波及しつつある。

でき、照射条件（強度、時間）や溶液条件（モノマ

現在、医療の現場において、例えば循環器系疾患

ー濃度、モノマー/開始剤比）を選択すれば多くのモの領域では、従来の開頭や開腹を伴う一般的な標準

ノマーに対してリビング的にラジカル重合を進行さ的外科手術からＸ線透視下で行う血管内手術へと、せることができる。つまり、重合鎖長は照射時間に侵襲を低減させた経皮的手術が先端医療の一つとし

よって、鎖の成分はモノマーの組成によって、またて開発され、患者の Quality of Life（QOL）を高く

重合領域は照射領域によってほぼ厳密に規定するこ保つ治療が提供されている。血管内治療では口径がとが可能である。

僅か数 mm 以下の細い血管内を皮膚に開けた針穴をこのナノレベルで構造を自由に設計できる高分子

通して体外から自由に操作しなければならないため、ナノアーキテクチャー技術を用いると、高分子の多治療デバイスの小型化や表面の精密化が設計されて彩な表面設計が可能となる（図１）。例えば、一定時いる。今後、血管内手術のさらなる推進のためには間毎に照射領域を段階的にずらせていくことで数十治療デバイスのより高集積化・多機能化が必須であnm の段差を有する階段が作製でき（図２）、照射領

り、将来的にはマイクロマシン化が期待されている。

域を連続的に拡大させていくことで高低差数百 nm

そのためにはナノレベルでその材料となる高分子ののスロープを作製できた（図３）。その他、グラフト構造を厳密に制御できる分子設計法の開発が要求さ鎖の長さや密度の制御、グラフト重合領域の制御、れている。我々はその一つのアプローチとして大津加えて領域別での異種モノマーの重合によるマイク

ら に よ っ て 開 発 さ れ た イ ニ フ ァ タ (Iniferter ：ロパターン化、ならびにブロック化が容易に実現で

initiator-transfer agent-terminator の機能を合わせ持きた。

長さ(段階的) 長さ(連続的) 密度(段階的) 密度(連続的)

領域

パターン

ブロック

多分岐

図 1. 表面高分子ナノアーキテクチャー技術によって可能となった高分子表面の精密構造設計の例

生命化学研究レター No. 12 (2003. September) 4
Z

Z

X
X
Y

300 nm

Y

60
60

20
20
0 µm

図 2. グラフト鎖長の段階的変化表面の原子間力顕微鏡(AFM)観察像。領域毎に照射時間を変化させることで数十〜数百 nm の範囲で任意に高さを制御することが可能。

マイクロパターン化表面では微細領域毎に化学組

図 3. グラフト鎖長の連続的変化表面の共焦点レーザー
顕微鏡観察像。照射領域を連続的に拡大させることで数百nm の高低差を有するスロープが得られた。

例示できる。

成を任意に変化させることが可能である。蛋白質や一方、イニファタのマルチ化とグラフト鎖長の制細胞との相互作用の表面化学依存性を一度に同じ土御能を組み合わせることによってグラフト鎖の分岐

俵で評価することができるため、生命化学研究にお度と鎖長を自由に設計することが可能となり、ナノ

ける基材として有用である。現在、パターン化表面

レベルの木（多分岐型グラフト鎖）が作製できる。

を提供した Anderson らによって、医療デバイス表

すなわち、大地と見なせる高分子の基材表面に種と面の最適化設計をめざしてマクロファージとの相互なるイニファタであるジチオカルバミル基を植える。

作用等の詳細な検討が進められている。

そこに養分や水と見なせるモノマーと光を与えると、また、ブロック化を利用すると表面の階層性構造

グラフト重合による幹が育つ。モノマーとして水溶をナノメーターレベルの厚みで厳密に制御すること

性の N,N-ジメチルアクリルアミドを用いれば親水が可能である。これを医療デバイスの表面設計に応性の幹となる。この際、幹の一部として花とみなせ

用すれば以下のような機能化・生体適合化が獲得さるクロロメチルスチレンを共重合させておく。クロれる。１）内層のブロック鎖としてヘパリン（強力ライド基は容易にジチオカルバミル基に置換できるな抗血液凝固剤）をイオン結合により固定したポリ

ため花が新たな種を生む。この後、幹を育てた時とN,N-ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（カチオン性親水性高分子）鎖を、外層鎖としてポリ N,N‑

同じ環境におくと、幹についた種から枝が育つ。さジメチルアクリルアミド（非イオン性親水性高分子）

せると小枝をつけることができる。すなわち、親水鎖を形成させることで、ヘパリン徐放後においても性高分子鎖の幹、枝、小枝を有する木が得られたこ

引き続いて血液凝固を抑制できる蛋白質・細胞の非とになる。この方法を用いてデバイス表面を加工す

吸着・非接着性表面。２）内層に緩衝層として機能

れば、グラフト鎖の空間密度を自在に設計できるこするポリ N,N-ジメチルアクリルアミド鎖を、外層にとから、血液や体液中の蛋白質等の吸着を大幅に抑IgG を固定化したポリアクリル酸（アニオン性親水

制させ、細胞非接着性を長期間維持させることがで性高分子）鎖を有する、生理活性を低減させない蛋きると考えられる。

らに先と同様の方法を繰り返すことで枝に花を咲か白質固定化表面。また、３）内層にモデル薬物としたプロプラノロール塩酸塩（高血圧・狭心症治療薬）

3. バイオチューブ人工血管の開発

を含浸させたポリ N,N-ジメチルアクリルアミド鎖

ヒトの冠動脈に相当する口径 3mm 以下の人工血を、外層に薬物放出制御膜となるポリ n‑ブチルアク管（小口径人工血管と呼ばれる）は、これまで医用

リレート鎖で皮膜化させた薬物貯蔵型表面、などが材料研究者の多大な努力にもかかわらず臨床に耐え生命化学研究レター No. 12 (2003. September) 5保が図られ、様々な組織工学的アプローチによってin vitro においてハイブリッド人工血管のプロトタイプが考案されている。しかし、免疫拒絶などの問題を考慮すれば移植物は全て自家組織から構成されることが最も望ましいと考える。
一方、生体内に人工物を埋入すると周囲にカプセ
ル状の組織体の形成が起こることは古くから知られており、既存の人工血管を Scaffold として生体内において血管壁構造の再構築の促進化が試みられてい図 4. 兎背部の皮下内に埋入させたポリメチルメタクリ
レート製の丸棒の周囲に形成されたカプセル状組織体。

る。我々は、このカプセル化を利用して自己組織のみからなる血管様管状組織体を作製し、人工血管への応用をめざしている。直径 3mm 長さ 2cm の高分子（アクリル、シリコーン、ポリウレタン、ポリエ
チレンなど）製の丸棒を鋳型として用いて、これらを兎の背部の皮下に埋入した（図４）。２週間ほどで鋳型の周囲にコラーゲンと繊維芽細胞を主成分とするカプセル化が起こり、管状組織体が得られた（図５）。埋入１月後の組織体の壁厚は数十〜数百 µm であり、いずれも 200mmHg の内圧に耐え得た。管状組織体は内腔面への加除圧に応じて拡張収縮を繰り返し、血管様の力学的性質を有していることが分か

図 5. 鋳型を除去して得られた管状組織体。

った（図６）。ここで、壁厚や拡張径は埋入した鋳型の材質に大きく依存し、シリコーンでは比較的硬く得るものは存在しない。単純な人工材料の改変やそ伸びにくく、アクリルでは柔軟な組織が形成されるの表面の改質のみでは、移植した際、フェーズ毎にことが分かった。この差を生む原因として鋳型材の複雑に変化する生体防衛機構からの攻撃をしのぎき

力学的物性、あるいは表面化学、表面構造の違いなれないからである。現在は単機能の人工材料のみでどが考えられた。

の対応はほぼ絶望視され、細胞の援助（ある意味主

そこで、鋳型の基材をポリメチルメタクリレート役）を得るために人工材料（Scaffold 材や人工細胞

製の丸棒に統一し、表面修飾によって異なる化学を

外マトリックス材など）と細胞とのハイブリッド化

付与し、組織体形成に及ぼす表面化学のみの影響をに望みが託され、再生医療の一つの柱として開花が調べてみた。表面化学を変化させる手段として先の期待されている。その中で、血管内皮前駆細胞を含表面高分子ナノアーキテクチャー技術を用いた。

External Diameter (mm)

む幹細胞や ES 細胞が利用されて細胞の供給源の確

3.3
3.2
3.1
3.0
2.9
2.8
2.7

0

100

200

100

0

100

200

100

0

100

200

100

Intraluminal Pressure (mmHg)

図 6. 管状組織体の内腔面への水圧の繰り返し付加による管径応答挙動。

0

生命化学研究レター No. 12 (2003. September) 6

A

BS[CH2-(CH2-CH)n-SCN(CH2CH3)2]1-6
C O
N H
CH2CH2CH2N(CH3)2

Linear

図 7. アニオン性親水性表面（A）と非イオン性親水性表面（B）から形成された管状組織体の断面の組織観察像（上段）と各拡大像（下段）。

3-Branch

4-Branch 6-Branch

図 9. スター型ベクターの化学構造と構造モデル。

計図としてコラーゲンの３次元網目構造と厚さがある程度規定できることがわかった。現在は、血管内皮増殖因子（VEGF）や繊維芽細胞増殖因子（bFGF）、
インスリン様増殖因子（IGF）の表面固定によって組織体の内皮化促進化、壁成長促進化、ならびに筋細胞誘導化などに加えて、鋳型の形状設計によるバイオチューブの分岐化、分枝化を併せて検討を行っている（図８）。移植を目的とする部位に応じた力学的性質や形状を自由に設計できるオーダーメイド移植医療が具体化しつつある。

図 8. 分岐型鋳型を用いた分岐型カプセル状組織体の形成。

4. スター型ベクターの開発
遺伝子導入の安全性と利便性から導入ベクターのこれによって使用するモノマーを変化させるだけ

脱ウイルス化が検討されており、ウイルス系ベクタ

で、非イオン性親水性（ポリジメチルアクリルアミ

ーの危険性回避から合成高分子ベクターの開発は現ド）、アニオン性親水性（ポリアクリル酸）、カチオ

実味を帯びてその速度を加速しつつある。非ウイル

ン性親水性（ポリジメチルアミノアミノプロピルア

ス系ベクターの代表選手としてカチオン性高分子がクリルアミド）、疎水性（ポリスチレン）、撥水性（ポ良く知られているが、その導入効率の低さが広く臨

リトリフルオロエチルメタクリレート）などを僅か

床応用される障害となっている。導入効率を高める

百 nm の厚さで基材に損傷を与えることなく表面にための合成化学的なアプローチとして、主として高付与することができた。いずれも１月間兎の背部皮

分子鎖のモノマーユニット組成や鎖長の影響が調べ

下内に埋入させると安定したカプセル化が起こり、られてきた。また、最近では体積を操作しやすいデ

管状組織体が得られた。疎水性表面から得られた組

ンドリマーを用いて構造工学的見地からも検討が加織体は比較的伸びにくかったが、イオン性表面からえられつつある。しかし、これまで合成高分子の鎖の組織体は伸縮性に富んでいた。生理的血圧範囲内

長や分岐度を容易に制御する方法論がほとんど存在

での力学的性質はアニオン性表面のものではヒト管しなかったため、高分子の立体構造と遺伝子導入効状動脈に、またカチオン性表面のものではヒト大腿率との相関関係はほとんど系統的に調べられていな動脈に相当した。壁構造を組織学的に観察すると、かった。

いずれも基材との接触面から外周方向にほぼ均一な高分子構造を厳密に制御できる高分子ナノアーキ

コラーゲンの網目構造が形成されており、その密度

テクチャー技術を利用すると、表面系以外の溶液系

はアニオン性で比較的密、非イオン性で疎であったにおいても高分子ナノ立体構造を比較的容易に設計（図７）。基材上のほぼ２次元のナノ表面化学を設することができる。そこで我々は分岐数を厳密にRelative Luciferase Activity

生命化学研究レター No. 12 (2003. September) 7

C/A ratio=10

分枝化

鎖長

分岐度
組成

0

3
4
6
Number of Branching

図 10．スター型ベクターを用いたトランスフェクション
効率の分岐度依存性。

図 11．高分子ナノアーキテクチャー技術を用いたスター型ベクターの基本骨格設計

調節したスター型のカチオン性高分子を分子設計し、遺伝子発現効率との相関関係を調べ、ベクターの基コアに近い部分には４級アミンを外層には非イオン

本骨格構造の最適化を追求している。合成は、ベン性など既存の合成法では困難である断面組成の調節

ゼン環をコアとしてジチオカルバミル基を１またはも容易である。また、さらに分岐数を増加させるた

３，４，６個導入したマルチイニファタを得、これめ、コア分子をベンゼン環からナフタレン環へ変更

らをカチオン性モノマー（ジメチルアミノプロピル

する、あるいはベンゼン環を複合化させることを検

アクリルアミド）中で置換基数に応じて所定時間紫討すると同時に、先に示したナノレベルの高分子の外光を照射することにより行った。分岐数はベンゼ

木を溶液系で作製することによってバースト構造をン環に導入されたジチオカルバミル基数によって、有するスター型高分子の合成や光機能性材料との複鎖長は照射時間によって制御することができ、分子合化を含めて、さらなる基本骨格の最適化と機能化

量を約 2 万に揃えて、直鎖状に加えて３，４，６分を追求している。

岐型のスター型カチオン性高分子を得た（図９）。
これらをルシフェラーゼをコードする

5. おわりに

pGL3-control プラスミドと共存させると、すみやか

本稿では高分子ナノアーキテクチャー技術を共通にポリイオンコンプレックスを形成し、いずれも約項として人工血管やベクターの開発研究への展開に

250nm のナノ粒子を生成した。
COS-1 細胞へトラン

ついて概説させていただいた。現在、これらに加えスフェクションを行うと、ルシフェラーゼ活性は分て機能性ステントを含む血管内治療デバイスの開発

岐数が増加するのに伴って大幅な増加を認め、６分に関しても主要テーマとして取り組んでいる。今後、岐において最も高い活性を示した（図 10）。多分岐高分子ナノアーキテクチャー技術は、高集積化・多化による活性の増加の原因に関しては、電荷の凝集機能化が要求される先端医療デバイスの表面ならび性の影響を含めて現在検討中である。使用するモノに骨格の高精密・微細設計の基盤ツールの一つとしマー種によって高分子の鎖の組成が、また照射時間て有望であると考える。我々の研究グループでは、

によって分子量が調節可能であるため、基本骨格構

高分子材料工学から医学・医療に貢献することに使造に加えて高分子鎖の組成と長さの最適化が容易に命感を持って発信しつづけていきたいと願っている。

獲得できることになる（図 11）。また、先の表面ブ

なお高分子ナノアーキテクチャー技術の開発は、現ロック化で例示したようにモノマー種を変化させて九州大学大学院医学研究院松田武久教授の指導のも重合を継続させることで、高分子鎖の成分を段階的、と行われました。この場をお借りして深く感謝いたあるいは連続的に変化させることが可能である。

します。最後に研究紹介を書く機会を与えていただ
きましたことにお礼申し上げます。

参考文献

1)

Otsu, T., and Matsumoto, A. Adv. Polym. Sci.,
75. 136 (1998).
2) Nakayama,Y.,
andMatsuda,T.
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5) Lee, H.J., Nakayama, Y., and Matsuda, T.
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6) Nakayama, Y., Anderson, J.M., and Matsuda, T.
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7) Kidoaki, S., Nakayama, Y., and Matsuda, T.
Langmuir, 17, 1080-1087 (2001).
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9) Brodbeck, W.G., Shive, M.S., Colton, E.,
Nakayama, Y., Matsuda, T., and Anderson, J.M.
J. Biomed. Mater. Res., 55, 661-668 (2001).
10) Brodbeck, W.G., Patel, J., Voskerician, G.,
Christenson, E., Shive, M.S., Nakayama, Y.,
Matsuda, T., Ziats, N.P., Anderson, J.M. Proc.
Natl. Acad. Sci., 99, 10287-10292 (2002).

生命化学研究レター No. 12 (2003. September) 8
11) Nakayama, Y., Ueda, H., Takamizawa, K., J.

Art. Org., 25, 717 (2002).
12) Nakayama Y., and Matsuda, T. J. Control.
Release, 89, 213-224 (2003).

中山泰秀（Yasuhide Nakayama）
1986年大阪大学工学部応用精密化学科卒業。1991年
大阪大学大学院工学研究科博士課程修了。ヒューマ
ンサイエンス振興財団研究員を経て、1992年より国立循環器病センター研究所生体工学部研究員。1997
年より研究室長。

生命化学研究レター No. 12 (2003. September) 9

ガス状小分子をセンシングするヘムタンパク質の構造･機能相関を解明する
名古屋大学大学院 理学研究科
中島 洋
はじめに
近年、一酸化窒素に代表されるようなガス状小分子がシグナル分子として認識され、生体内で生理機能の制御に寄与していることが、広く知られるようになってきた。ガス状小分子がシグナルとして機能するには、それと反応、感知するタンパクの存在が必要不可欠である。但し、生理的条件下におけるガス状小分子と単純タンパクとの反応は、酸素によるシステイン側鎖間のチオール･ジスルフィド変換および一酸化窒素とシステイン側鎖によるニトロソチオールの生成に限られる。このためタンパクは、ガス状小分子感知のための分子機構として、センサー部分に金属原子を含有する補欠分子族を利用している。これまでに、明らかとなったガス状小分子のセンサー部位では、いずれもヘムが中心的な役割を果たしており、既知のヘムタ
ンパクの機能（酸素輸送･貯蔵、電子伝達、酵素反応）に続く新規な機能として注目されている。我々は、ヘムタンパクのこの新たな機能が、どのような分子構造、機構で実現され、従来のヘムタンパクとはどのような違いがあるのか、構造･機能相関の観点から研究を行っている。以下にこれまで我々が研究対象としている一酸化炭素(CO)センサータンパク CooA（CO 酸化酵素遺伝子群、coo operon の転写調節因子であることからこう呼ばれている）と酸素センサータンパク HemAT(Heme-based Aerotactic Transducer)について述
べる。

一酸化炭素(CO)センサータンパク CooA による CO 選択的感知の分子機構
CooA 中ヘムのユニークな配位構造

CooA は紅色非硫黄光合成細菌 Rhodospirillum rubrum 中に見出された転写調節因子であり、生育環境に存在する CO を感知して CO 代謝に必要な酵素群の生合成を転写レベルで制御する。CooA は、分子量約 24000 のサブユニット 2 つが会合したホモダイマー構造を有しており、各サブユニットに 1 つのプロトヘム IX が包含されている。このヘムが CO センサーの本体であるが、その配位構造は、これまでのヘムタンパクにない極めてユニークなものであり、CO 感知に対する自然の巧
妙さを感じる。その特徴を挙げると
1. ヘムは常に 2 つの軸配位子を有する 6 配位構造であり、そのうちの一つは N 末端 Pro2（Met1 は翻訳後修飾により切除されている）のイミノ基である。この際、一方のサブユニットの Pro2 は、他方のサブユ
ニット中のヘムに配位しており、Pro2 の配位を介して二つのサブユニットがたすきがけされている。しかも Pro2 残基を含む N 末端近傍の主鎖骨格は極めて柔軟である。後述のように Pro2 のトランス位では、中心鉄の酸化還元に伴なう軸配位子の交換反応が生じるが、Pro2 は配位子交換に伴なうヘムの動きに追随し、ヘム鉄に配位し続ける。
2. Pro2 配位子のトランス位では、軸配位子の交換反応が生じる。すなわち、中心鉄が 3 価の酸化型では

生命化学研究レター No. 12 (2003. September) 10
75

77

Cys が、また 2 価の還元型では His が軸配位子として機能する。また EPR スペクトルの結果より
Cys75 はチオレートアニオンとして配位している事が分かった。このため CooA の酸化還元電位は–300
mV (vs. SHE)に近い極めて低い値を示す。ただし、この軸配位子の交換反応がどのような生理的意義を有するのかは、未だ明らかではない。
3. CO とヘムとの反応は、配位飽和の還元型 CooA との間で生じる。CO のヘムへの配位に伴なって Pro2は脱離し、His77 をトランス位に有するカルボニルヘム錯体が生成する。この CO 配位子を有する CooA
（CO 付加型）が転写活性化能を示す活性型 CooA である。
以上のことをまとめると図 1 のようになる。これら

Pro2

CO Pro2Pro2の配位構造変化を解明した当初、我々は CO
による CooA の活性化機構について次のよう

3+

Fe

+e-e-

2+

Fe

CO

2+

Fe

に考えた。すなわち、CO 配位に伴なう Pro2 の脱離が N 末端近傍での主鎖構造変化を誘起

Cys75

His77

His77

し、それが活性型 CooA への高次構造変化の

酸化型

還元型

CO付加型

トリガーとなる。しかしこのアイデアは、その後に行った XAFS による軸配位子の立体構造解

図1. CooA の配位構造変化

析ならびにいくつかの変異体の転写活性化能の測定により、正確な描写ではない事が明らかになった。
Pro2 配位、脱離は CooA 機能の本質ではない?! XAFS による配位子の立体構造解析の結果、CooA のN 末端主鎖部分は極めて柔軟性が高いことが示唆された。このため Pro2 の脱離に伴なう移動で、N 末端主鎖部分からタンパクの高次構造変化を誘起できるのかという疑問が生じた。実際、Pro2 を含む N 末端のアミノ酸残基を４（ N5）ないし 9 残基削除した CooA 変異体中のヘムは、野生型と同様に 6 配位構造を有し、CO 選択的な転写調節因子として機能する事が明らかとなった（表 1）。また、一酸化窒素(NO)と野生型
表 1. CooA 転写活性化能の比較
β-gal activity
Miller units/ mg of protein+CO-CO
Wild type
16.0
0.2
13.0
0.3
∆N5
H77A
0.3
0.3
+CO: CO 存在下 -CO: CO 非存在下

CooA を反応させた場合、CO の時と同様 Pro2 の脱離が生じるにも拘わらず、転写活性化能を示さない事が分かった。これらの結果から Pro2 の配位や、外部配位子の存在に伴なうその脱離という極めてユニークな配位構造が意外にも CooAの機能にとって本質ではないことが示された。それでは、
CooA 活性化機構の鍵はどこにあるのであろうか。

77

His 配位の重要性。CooA の機能はこの配位子に集約される His77 を Ala に置換した変異体(H77A)
中のヘムは、還元型においても 6 配位構造を示す。この際、置換された His77 の代わりに Cys75 が酸化型と同様に配位している。野生型と同じく、この変異体の還元型も CO と反応し、カルボニルヘムの生成、Pro2の脱離を生じるが、転写活性化能は全く示さない（表 1）。His77 の変異体は、H77A 限らず、配位性残基への置換も含めて転写調節能が消失する。また先ほど NO と野生型 CooA との反応で Pro2 の脱離が生じると述べたが、この際、同時に His77 の解離反応も進行し、CooA 中には５配位型ニトロシルへムが生成する。これらの事実から言えることは、CooA が CO との反応によって転写活性化能を発現するには、ヘムへの His77の軸配位が必要不可欠であるということである。以上のことより我々は現在、CooA の活性化機構について

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図２のような機構を予想している。Pro2 はPro2ヘムの配向を活性型とは異なる方向に固

CO N

N
2+

Fe

CO

HN

2+

2+

N
His77

N CO

定するためのフックの役割を果たしている。

FeFe

CO のヘムへの配位によって、このフックがNNはずれるとヘムは His77 を基点としてその

HN

HN

図2. CO による CooA の活性化機構

配向を変化させる。その結果、ヘムとタン
パク主鎖との直接的な相互作用に変化が生じ、この変化が、タンパク主鎖の高次構
造を活性型 CooA へと誘導する。この機構

は、変異体 G117A の転写活性化能の測定結果からも支持されている。Gly117 はヘムから 5Å の位置にあるアミノ酸残基であり、CooA のダイマー形成に関与する疎水性残基の近傍に位置する。この Gly 残基を Alaに置換した G117A では、ヘムの配位構造に変化がないにもかかわらず、転写活性化能に著しい低下が見られる。これは、Ala117 のメチル基の立体障害によって、ヘムとタンパク主鎖との直接的な相互作用に変化が生じ、活性型 CooA への正常な構造変化が妨げられたためと考えられる。このように、CO の結合した
CooA が活性化するには、Pro2 の支持を失ったカルボニルヘムがタンパク主鎖と「正しく」相互作用する必要があり、His77 の配位は、ヘムのを「正しく」配向するためのアンカーの役割を果たすものと考えられる。
CＯ選択性の分子機構、NO 選択性の分子機構 NO と CooA との反応では、His77 のヘムからの解離反応が進行し、CooA が活性化されない。一方 CO との反応では His77 の配位した 6 配位型カルボニルヘムが生成し、CooA が活性化する。CooA は、立体的には区別が困難な NO と CＯを、化学者なら誰もが知っている両分子の反応性の差異を利用して明確に区別している。同様のことは NO 選択性に関しても報告されている。哺乳類の細胞に存在する可溶性グアニル酸シクラーゼ(sGC)は、NO を選択的に認識し、グアニル酸の環化反応を触媒するシグナル伝達タンパク質である。sGC の NO センサーも His の配位した 5 配位型ヘムであり、NO がヘムに配位すると His 配位子が解離し、これが環化反応活性化のトリガーとなる。一方 COが sGC のヘムと反応すると His が配位したままの 6 配位型カルボニルへムが生成する。このため sGC が活性化されず、結果、NO の選択性が実現されている。このように CooA と sGC では、NO, CO の選択性に全く同じ化学反応を用いており、生成してくる 5 配位型ヘムを利用するのか 6 配位型へムを利用するのかによって、選択性が切り替わっている。タンパクの存在する種やその目的、機能が異なるにもかかわらず、NO とCO の認識において同じ分子機構を採用していることは、極めて興味深い事実である。今後、様々な種や機能が異なる CO センサータンパクや NO センサータンパクが発見され、そのセンサー機構が解明されれば、タンパクにおける NO, CO センサーの汎用機構の存在が示されるかもしれない。

酸素センサータンパク HemAT
HemAT とは HemAT は枯草菌 Bacillus subtilis 中に見出されたシグナル伝達タンパクの一種で、酸素走化性制御系における酸素センサーの役割を担っている。サブユニットの分子量は約 48000 で酸素の存在を感知するセンサー部位と内部シグナル物質を産生するシグナル生成部位から構成される。HemAT が酸素の存在を感知するとシグナル生成部位でのキナーゼ活性が上昇し、走化性制御系の次のタンパクのリ

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ン酸化が進行する。最終的に菌の鞭毛モーターの回転方向の制御に至り、酸素濃度の高いほうに向かって菌体を駆動する。
HemAT の酸素センサー HemAT の酸素

L
OH2

O

3+/2+

O
2+

センサー部位はミオグロビンと一次構造のCO
2+レベルにおいて相同性を示す。実際、組換え体として大腸菌より発現させた

Fe

Fe

Fe

His123

His123

His123

して有する事が明らかとなり、その電子吸

酸素化型

CO付加型

収スペクトルは、ミオグロビンの各状態（メトHemAT は、プロトヘム IX を補欠分子族とメト型/デオキシ型(酸化型/還元型)

図3. HemATの予想配位構造型、酸素化型、デオキシ型、CO 付加型）と比較して吸収帯のピーク波長、吸光係数とも高い類似性を示した。また、変異体を用いた実験並びに CO 付加型に対するラマンスペクトルの結果より、His123 がヘムの配位子である事が分かった。His123 は、ミオグロビンにおけるヘムの軸配位子 His93 に相当する位置のアミノ酸残基である。これまでの知見から予想される HemAT 中のヘム配位構造を図 3 に示す。
ミオグロビンと同様に HemAT も安定な酸素化型を生成し、自動酸化の速度定数 0.055 (h-1)は、ミオグロビンと同程度であった。このことから、HemAT のヘムポケット内にもミオグロビンの His64 に対応する残基が存在し、配位酸素との水素結合によって酸素の配位を安定化しているものと考えられる。ただ、HemAT には、ミオグロビンの His64 に当たる位置に His 残基が保存されていない。また、水素結合可能な残基に対する変異導入においても著しく酸素配位が不安定化な変異体は得られておらず、酸素配位に関与する残基の特定には至っていない。いまのところ、未同定の水素結合アミノ酸残基(L)と配位酸素との水素結合は、鉄に直接結合した酸素原子との間で形成されていることがラマンスペクトルによる(Fe-O2)伸縮の解析より示唆するに留まっている。
HemAT のこれから HemAT の酸素センサー部位はミオグロビンと一次構造レベルで相同性を示し、同じ配位構造のヘムを有しており、機能発現のための構造上のユニークさは一見感じられない。しかし HemAＴには、酸素を安定に配位すると共に酸素が配位したという情報を生体内シグナル発生部位に伝達する分子機構が存在するはずである。今後、酸素を貯蔵と目的とする構造にどのような修飾がなされ、シグナル伝
達の機構が付与されているのか、明らかにしてゆく必要があると考える。

ここで紹介した研究は、2002 年 12 月まで、青野重利先生（現 国立共同研究機構 統合バイオ研究センター教授）のもとで主に北陸先端科技大にて行ったものです。現在は名古屋大学の理学部に異動し、新たに研究を開始しております。

文献
CooA に関して:
Ligand-switching Intermediates for the CO-sensing transcriptional activator CooA measured by pulse
radiolysis.

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Nakajima, H.;Nakagawa, E.;Kobayashi, K.;Tagawa, S.; Aono, S.
J. Biol. Chem., 276, 37895 (2001)

Redox properties and coordination structure of the heme in the CO-sensing transcriptional activator CooA.
Nakajima, H.; Honma, Y.; Tawara, T.; Kato, T.; Park, S.; Miyatake, H.; Shiro, Y.; Aono, S.
J. Biol. Chem., 276, 7055 (2001).

HemAT に関して:
Resonance Raman and ligand binding studies of the oxygen-sensing signal transducer protein HemAT from
Bacillus subtilis.
Aono S, Kato T, Matsuki M, Nakajima H, Ohta T, Uchida T, Kitagawa T.
J. Biol. Chem., 277, 13528 (2002)（なかじま ひろし hnakajima@mbox.chem.nagoya-u.ac.jp）

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気になった論文

加地 範匡（かじ のりただ） 徳島大学大学院薬学研究科 博士後期課程
c400241002@stud.tokushima‑u.ac.jp

現在、マイクロチャネルやナノチャネルのような微小な空間場を、いかに DNA などの生体高分子解析に応用できるかをテーマに研究を進めております。ナノサイズの微小な空間場は、生体高分子を１分子レベルで観察・ハンドリングするのに非常に適した空間サイズであることから、この微小空間を利用した１分子解析がすすめられつつあります。そこで、今回は、最近気になった１分子解析に関する論文を２報、紹介させていただきます。

(1) Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at High Concentrations
M. J. Levene, J. Korlach, S. W. Turner, M. Foquet, H. G. Craighead, W. W. Webb, Science, 2003, 299,
682-686.
１分子レベルでの分子ダイナミクス観察のための新しい光学的手法である、ゼロモード導波路＊を１分子解析に応用した論文で、１月３１日号の Science 誌の表紙をかざったのでご存知の方も多いかと思います。光学的手法（主に蛍光）を利用した１分子観察においては、観察対象分子自身が十分な蛍光強度をもつと同時に、バックグラウンドノイズに埋もれない（高 SN 比である）ことが要求されます。このためには、励起光照射部位に観察対象分子が１分子だけ存在する状態で観察することが理想ですが、光を用いた観察ゆえに、共焦点顕微鏡を用いても光の解像限界（可視光の場合〜250 nm）以下の体積、約 0.2 fl (1 fl = 10-15 l）以下の空間を照射することは不可能です。全反射顕微鏡や近接場光顕微鏡でも、1 al (1 al = 10-18 l)が限界です。そこ
で、サンプルを pM から nM オーダーにまで希釈して１分子観察が行われてきました。しかし、実際の生理的条件下での酵素反応などは、µM から mM オーダーで進行しており、１分子レベルでのキネティックを解析す
るには、このオーダーの系で１分子観察を行う必要があります。
本論文では、スライドガラス上のアルミ薄膜に直径 50 nm 程度の穴のゼロモード導波路を作成し、これに励起光を照射することにより、スライドガラスから 20 nm 程度の空間のみ、励起することに成功しました。この結果、20 zl（1 zl = 10-21 l）程度の空間のみを照射することが可能となり、この空間では、たとえ 250 µM のサンプ
ルでも、実質１分子しか存在しないので、シグナルの弱い観察対象でも十分に検出が可能です。このゼロモード導波路に DNA ポリメラーゼを固定し、蛍光標識した dCTP が DNA 合成時にポリメラーゼに取り込まれる際の蛍光を、連続的に検出することに成功しています。１分子レベルで解析した DNA ポリメラーゼの DNA 合成速度と、バルク中での合成速度が同じであったことから、このゼロモード導波路を用いると、高濃度溶液中にも関わらず、１分子解析が可能であることが示唆されました。この論文は、１分子解析のための新しいプラッ生命化学研究レター No. 12 (2003. September) 15

トフォーム技術を提示している点で、非常に重要なものではないでしょうか。
＊

光導波路には、マルチモード、シングルモードがあり、より低次モードのほうが光の閉じ込めが強くなります。

ここでは、光の波長よりも短い空間を有する光導波路を用いているので、これを著者らはゼロモード導波路と呼んでいます(2) Sequence Information Can Be Obtained from Single DNA Molecules
I. Braslavsky, B. Hebert, E. Kartalov, S. R. Quake, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100, 3960-3964.
DNA を１分子レベルでシークエンシングするというアイデアそのものは、以前からも提唱されていましたが、それを実験的に実証した論文です。ガラス基板上に固定した ssDNA の鋳型鎖がポリメラーゼにより合成されていく際に取り込まれる Cy3 と Cy5 で蛍光標識した dNTP を、FRET 法と全反射顕微鏡を用いることにより連続的に検出し、シークエンシングを行っています。ただ、ここで問題になっているのは、ポリメラーゼが鋳型鎖を合成する際に、連続して蛍光標識 dNTP が取り込まれるシークエンスの場合、伸長が進まないということです。より精度の低いポリメラーゼ変異体を使用したり、蛍光標識した核酸アナログにより鋳型鎖が合成された
後、化学的に蛍光分子を分解するなどの方法により、この障壁は乗り越えられると著者らは考えております。
ポリメラーゼを用いた１分子解析という点では、(1)の論文と、基本的に全く同じ考え方で解析を進めています。(1)のグループも、ゼロモード導波路を DNA１分子のシークエンシングへ応用することを考え、蛍光色素の検討を進めていますので、これからの展開が楽しみです。DNA１分子のシークエンシングが実現されることで、従来、研究レベルにとどまっていた１分子研究が、一気に産業レベルにまでその裾野を広げられることが期待されます。

長田 英也（ながた ひでや） 徳島大学大学院薬学研究科 博士後期課程
c400241009@stud.tokushima‑u.ac.jp

近年、活発に行われている自己集合化／組織化に関する研究は興味深いものがあります。単にボトムアップの一手法としてではなく、そこに特殊な現象が見られることが多いからですが、今回はそのような論文を２つ紹介させていただきます。

(1) A Discrete Self-Assembled Metal Array in Artificial DNA
K. Tanaka, A. Tengeiji, T. Kato, N. Toyama, and M. Shionoya, Science , 2003, 299, 1212-1213.
この論文に関しては、もう紹介する必要はないかと存じますが、御紹介させていただくことをご了承お願い致します。内容について少し触れますと、筆者らは、DNA の一つの性質、機能性ユニットを（分子レベルで）配列化する構造基盤を有していることに着目し、この機能を利用した人工 DNA を用いて、溶液中で金属イオンを一列に並べる挑戦をしています。その結果、平面状の二座金属配位子であるヒドロキシピリドン核酸塩

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基（H）を導入した一連の人工オリゴヌクレオチド d(5'-GHnC-3')（n＝1 から 5）を合成して、銅イオン（Cu2+）を介し て 交 互 に 人 工 塩 基 対 （ H-Cu2+-H ） を 形 成 さ せ 、 右 巻 き 二 重 ら せ ん の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド （ nCu2+ ・d(5'-GHnC-3')2（n＝1 から 5））を定量的に構築することに成功しています。それぞれの錯体型塩基対にとり込
まれた Cu2+イオンは、Cu2+-Cu2+間距離 3.7±0.1Åと見積られる間隔で、人工 DNA 二本鎖内で、らせん軸に沿って配列しており、Cu2+イオンは d 不対電子を介して、お互いに強磁性的な相互作用を示し、磁性鎖を形成したと述べられています。
Cu2+イオンを溶液中において、これほど近い間隔で、多少のフレキシビリティはあるにしても一列に固定しただけでも興味深いのですが、もっと興味深いことに、この技術で合成したメタルアレイ人工 DNA 配列は、
天然の DNA の任意の配列に導入可能ということで、その応用の可能性は大変大きなものであると言えるでしょう。例えば、磁性ビーズを用いていたソーティングもこの人工 DNA を用いれば楽になる可能性もあるだろう
し、このメタルアレイ人工 DNA 配列の熱的安定性を利用して、一箇所だけ変成しない DNA 等が作れると、何か面白い応用が出来そうな気がします。そんなインスピレーションが沸いてくるような、大変面白い論文ですので、まだ読まれていない方がございましたら、ぜひご一読を。それにしても、この読者を畳み掛けるような論理展開とデータの挙げ方の上手さは、大変勉強になりました。

(2)

DNA-templated Assembly And Electrode Attachment of A Conducting Silver Wire

E. Braun, Y. Eichen, U. Sivan ,and G. Ben-Yoseph, Nature , 1998, 391, 775 - 778
こちらは多少古いのですが、同じく自己集合化に関するところで選んでみました。短く御紹介させていただ
きますと、幅 12〜16μm の金電極間に DNA をトラップし、その DNA 鎖骨格をテンプレートにして、DNA の周りに金属銀を析出させて銀ワイヤーを配線しています。
実際には、両方の金電極にその電極間を橋渡しする DNA の末端の相補的配列を持ったオリゴヌクレオチ
ドを付けておき、その電極間に橋渡しする DNA 鎖を流すことでハイブリダイズさせて橋渡しを行っています。
その後、銀イオンをこの DNA の周りに吸着させて、この銀イオンを還元することで金属銀として析出させています。その結果、電極間を橋渡しした 100 nm 幅の伝導性の銀ワイヤーを配線しています。
その結果、出来た銀ワイヤーは他には見られない電気特性を示したと述べられていますが、流れている電流値を見ると測定装置の誤差なのではと思ってしまいましたのは、私だけでしょうか。
当然既存の技術より細い配線が出来るということで、将来的にますます集積化する電子回路の配線技術として期待が出来ますし、DNA の特異的結合を利用していますので、好きな所に配線できることも意味しています。これはこれで、大変面白いのですが、もう一つ私の感じたこの論文の面白さは、二重の意味で自己集積化が行われているところです。一つは、DNA を相補的にハイブリさせるところで、もう一つは、橋渡しされたDNA を陽イオン交換体と見立て、銀イオンを溶液中で、DNA の近傍に集めているところです。こんなの自己集合化とは言わないとお叱りを受けるかもしれませんが、この DNA を陽イオン交換体と見立てた、大胆なほどの発想の転換に面白さがありました。(1)で御紹介した論文でも、機能性ユニットを（分子レベルで）配列化する構造基盤を有していることから、DNA を金属イオンを並べる道具として、そのアーキテクチュアを大胆なほど抽象化して捉える、この発想の転換に感嘆を覚えました。
二つの論文を並べてみると、両方の技術を組み合わせたら、一分子電池などが出来るのではないかとか、

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いろいろインスピレーションが沸いてくる論文でした。

野島 高彦（のじま たかひこ） 九州大学大学院工学研究院応用化学部門助手
http://www.takenaka.cstm.kyushu‑u.ac.jp/takahiko/nojimtcm@mbox.nc.kyushu‑u.ac.jp

昨年春より九州大学大学院工学研究院の竹中繁織助教授のグループに加わり、生体分子アレイ技術をはじめとする種々のバイオ分析研究に携わっています。よろしくお願いします。
生体分子アレイは、生命現象を包括的に理解するために必要な技術です。最初に実用化された DNA アレイに続き、現在は蛋白質や糖鎖、それに細胞をアレイ化したシステムも開発されています。今回はこのような生体分子アレイ技術に関係する報告で目にとまったものを紹介します。

(1) Synthesis of Protein-Nucleic Acid Conjugates by Expressed Protein Ligation
Marina Lovrinovic, Ralf Seidel, Ron Wacker, Hendrik Schroeder, Oliver Seitz, Martin Engelhard, Roger S.
Goody & Christof M. Niemeyer, Chem. Commun. 2003, 822-823.
蛋白質アレイを作製するためには、固相表面に蛋白質分子を配列・固定しなければなりません。しかし固定化に伴って蛋白質分子の立体構造に影響が生じることがあり、これを回避する技術が求められています。
このための一つの方法は、蛋白質を直接固体表面に固定せず、適切なリンカーを介して固定するというものです。この報告では遺伝子工学的に調製した蛋白質に一本鎖ペプチド核酸(PNA)を共有結合させたコンジ
ュゲートを調製し、これを DNA アレイにハイブリダイゼーションさせることによって、蛋白質アレイを構築する手法が紹介されています。アレイ化された蛋白質が機能を失うことなく固定化されたことも確認しています。

(2) Self-Assembling Protein Arrays Using Electronic Semiconductor Microchips and in Vitro Translation
Andrew V. Oleinikov,Matthew D Gray, Jun Zhao, Donald D. Montgomery, Andrey L. Ghindilis, and Kilian Dill,
J. Proteome Research, 2003, ASAP article 10.1021/pr0300011.
同じく核酸を介して蛋白質分子をアレイ化する手法が報告されています。アレイ化される蛋白質は無細胞
翻訳反応で調製され、この際にリジン残基のεアミノ基にビオチンを導入しています。これを利用してストレ
プトアビジンを経由してビオチン化オリゴ DNA が連結されることにより、蛋白質と DNA とのコンジュゲートが構築されます。このオリゴ DNA と相補的配列が固定化された DNA アレイにコンジュゲートが与えられること
により、蛋白質アレイが構築されます。無細胞蛋白質合成系は、遺伝情報を実際の物質に変換することのできる非常に有用な手法です。以前は反応効率が非常に低く、ライジオアイソトープレベルでの検出感度が一
般的な分析手法でしたが、この数年間で技術が大幅に進歩した結果、一般的なバイオ実験の一つになりつつあります。ここで述べられている一連の実験には生細胞を用いるステップは含まれておらず、遺伝子組換

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え施設では無い通常の化学実験室で行えるという点でも注目に値します。

(3) Prediction of Feature Spread for Microarray Printing Using Protein and DNA Solutions
Jason T. Smith and Monty Reichert, Langmuir, 19, 3078-3080 (2003).
生体分子アレイを自前で作製する際、もっともシンプルな手法は、ピンで試料溶液をガラス板に打ち付けるものです。アレイ上の液滴の直径は 100 マイクロメートルから 200 マイクロメートルの微小スケールなので、この直径はガラス表面の状態や溶液の組成に大きく影響されます。生体分子アレイを用いた実験において信頼性を高めるためには、できるかぎり液滴の大きさにばらつきが無いことが求められます。この報告では、種々の組成の生体分子試料溶液を、種々の市販アレイ用ガラス板にスポットした際の、液滴のサイズとばら
つきに関して詳細に検討しています。経験的に液の組成からスポット径をある程度は予測できることが示されていますが、各種パラメータと液滴との関連性に関しては未知の部分が多く残されています。

(4) Arrays of Mobile Tethered Vesicles on Supported Lipid Bilayers
Chiaki Yoshina-Ishii and Steven G. Boxer, J. Am. Chem. Soc. 2003, ASAP article 10.1021/ja029783+
ベシクルを固定化したアレイも報告されています。ベシクルから 24 残基のオリゴヌクレオチドが外部に伸びており、これと相補的配列のオリゴヌクレオチドが基板上の脂質二重膜から伸びています。両者をオリゴヌク
レオチドのハイブリダイゼーションで結合させることにより、固体表面上にベシクルをアレイ化させることに成功しています。膜蛋白のアレイ化などへの応用が考えられる興味深い手法です。

(5) Direct Detection of Single Nucleotide Polymorphism (SNP) with Genomic DNA by the
Ferrocenylnaphthalene Diimide-based Electrochemical Hybridization Assay (FND-EHA)
Takahiko Nojima, Kenichi Yamashita, Makoto Takagi, Atsuko Takagi, Yasuyuki Ikeda, Hiroki Kondo, andShigeori Takenaka, Analytical Sciences, 19, 79-83 (2003).
最後に筆者の所属する講座からの報告を。生体分子アレイ技術では、アレイ作製技術に加えて、アレイ上の生体分子計測技術も鍵となります。電気化学的な検出法には様々なメリットがあり、微少サンプルの検出に適しています。ここでは染色体 DNA 上の一塩基多型の検出に電気化学的手法を用いています。血液から染色体 DNA を精製し、PCR もラベル化も施すことなく、そのまま金電極上に固定されたプローブオリゴヌクレ
オチドとハイブリダイゼーションさせることによって、一塩基多型の違いを確実に判別可能であることを示しました。

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藤本 ゆかり（ふじもと ゆかり） 大阪大学大学院理学研究科化学専攻助手
yukarif@chem.sci.osaka‑u.ac.jp

今年３月に阪大に戻って来て仕事を始めたところですが、現在の研究に関連する論文２報（自然免疫における受容体である NOD2 に関するもの）と、少し仕事から離れて興味のある、タンパク質の knot（結び目）構
造関連の論文を紹介したいと思います。

Host Recognition of Bacterial Muramyl Dipeptide Mediated through NOD2. Implications for Crohn's Disease.
Naohiro Inohara, Yasunori Ogura, Ana Fontalba, Olga Gutierrez, Fernando Pons, Javier Crespo, Koichi Fukase,Seiichi Inamura, Shoichi Kusumoto, Masahito Hashimoto, Simon J. Foster, Anthony P. Moran, Jose L.
Fernandez-Luna, and Gabriel Nuñez. J. Biol. Chem., 2003, 278, 5509-5512.
抗原抗体反応による防御である 獲得免疫 が脊椎動物のみに備わっているのに対し、 自然免疫 と呼ばれる生体防御機構は多細胞生物全般に共通に存在するシステムであり、細菌由来物質を受容体が認識することによってサイトカインの誘導が起こり免疫系が活性化される。マクロファージなどの細胞膜に発現し細菌の細胞壁成分等を認識する受容体として Toll-like receptor（TLR)が知られているが、最近になって細胞質に存在している NOD ファミリー（NODs）と呼ばれるタンパク質群も、細菌の細胞壁成分を認識して自然免疫を誘 導 す る こ と が わ か っ て き た 。 NODs は 、 共 通 の 構 造 と し て ヌ ク レ オ チ ド 結 合 性 多 量 化 ド メ イ ン（Nucleotide-binding oligomerization domain, NOD）を中央部に持つタンパク質群であり、現在のところヒトのNOD１、NOD2、Apaf-1（アポトーシス誘導カスパーゼ活性化因子）、線虫の Ced-４、植物の病原抵抗性（R）
因子等が発見されている
この論文では、最近発見された NOD2（その遺伝子変異が、難治性の炎症性腸疾患である Crohn 病の原因の一つと言われている）が、細菌の細胞壁を構成しているペプチドグリカン（PGN）の免疫活性を発現する最小構造であるムラミルジペプチド（MDP）を認識し、核内転写因子である nuclear factor-κB（NF-κB）を誘導して自然免疫を引き起こすことを示した。一方、PGN を認識する TLR2 は MDP を認識しなかった。また、Crohn
病患者の変異型 NOD2 については、MDP による NF- B 誘導が弱いかほとんど観察されず、NOD2 による細菌由来成分の認識が Crohn 病の発病機構に関わっていることが示された。

Nod2 Is a General Sensor of Peptidoglycan through Muramyl Dipeptide (MDP) Detection.
Stephen E. Girardin, Ivo G. Boneca, Jérôe Viala, Mathias Chamaillard, Agnès Labigne, Gilles Thomas, Dana J.
Philpott, and Philippe J. Sansonetti. J. Biol. Chem., 2003, 278, 8869-8872.
上記の論文の直後に発表された非常に似た内容の報告。数種類の細菌のペプチドグリカンおよびムラミル
ジペプチドが NOD2 により認識されて NF-κB 誘導が起こるのに対し、Crohn 病患者の変異型 NOD2 の場合には NF-κB 誘導が起こらないことが示されている。

A Knot or Not a Knot? SETting the Record ‘Straight’ on Proteins
William R. Taylor, Bing Xiao, Steven J. Gamblin, Kuang Lin. Comp. Biol. Chem. 2003, 27, 11-/15

生命化学研究レター No. 12 (2003. September) 20

著者らは、彼らの開発したアルゴリズムを用いて Protein Data Bank（PDB）を検索することにより、タンパク質が knot（結び目）構造を持つものを 10 種発見しているが（Nature, 2000, 406, 916-919）、その構造は主鎖自体が knot（結び目）を作った構造であり、彼らは (true) ‘topological knot’と呼んでいる。一方、最近出されたこの論文では、昨年ほぼ同時期に５つの独立したグループから報告のあった histone lysyl methyltransferase のcatalytic domain（SET domain）に存在する knot 様構造について議論している。これは水素結合により生成したループがＣ末端のペプチド鎖をトラップした構造であり、厳密には著者らの定義する’knot’ではないが、著者曰く、数学的な knot の定義とは異なり単にロジックの問題だけではなく、こうした hydrogen-bonded knot に
ついては’pseudo-knot’と呼ぶのはどうかと言った提案をしている。また cystine knot と呼ばれるジスルフィド結合による knot 構造が知られているが、こうした構造については’covalent-knot’と呼ぶのが良いのではないかとも述べている（Nature, 2003, 421, 25）。また、’topological knot’と、水素結合やジスルフィド結合によってできる
knot 様構造は、単に呼び名の問題だけではなく、フォールディングの際に knot 構造がいかに生成するかを考えた場合でも本質的に違ったものになる─すなわち’pseudo-knot’や’covalent-knot’はタンパク質分子内での crosslink により比較的容易に生成しうると考えられるが、’topological knot’の場合は、ポリペプチド鎖がまずループを作り、その部分に末端のアミノ酸残基が十分な長さ通り抜けなければならず、低い頻度でしか起こらない現象である、と述べている。タンパク質の knot という言葉が幾つかの場面で使われていることに、数学的な knot の定義に基づいた著者の困惑（?）が窺える気がする。

The Cystine Knot Promotes Folding and Not Thermodynamic Stability in Vascular Endothelial Growth Factor.
Yves A. Muller, Christoph Heiring, Rolf Misselwitz, Karin Welfle, and Heinz Welfle. J. Biol. Chem., 2002,
277(45), 43410-43416.
これは cystine knot、すなわち Taylor の言う’covalent-knots’を持つタンパク質の話である。それはさておき、
ここでは血管内皮増殖因子(VEGF)の ３つの絡み合ったジスルフィド結合−cystine knot の存在が、熱力学的安定性にはほとんど寄与しておらず、 むしろフォールディングが正しく起こるために必要であると述べている。ジスルフィド結合生成を妨げるため Cys を Ala に置換した３種の変異体を作り、その熱力学的安定性、結晶構造を示した。変異の導入によってもフォールド状態の熱力学的安定性は低下せず、逆に 2 kcal/mol
程度上昇するのに対し、wild type の場合の 108 °C という高い熱安定性は 40 °C 程度低下し、エントロピック
な安定化が失われた。また、最近 cystine knot を持つ grouwth factor glycoprotein hormone α-subunit のフォー
ルディングにおけるジスルフィド結合の生成順を考察した結果が報告されている（Biochemistry 2001, 40,577）が、著者らはその結果と比較し、最後にジスルフィド結合が生成すると推測される部位の変異体の構造
は、フォールディングの中間体の構造と近いと考えられるが、その構造は native の構造と比較してより
compact な構造であると述べている。

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松原 輝彦（まつばらてるひこ） 慶應義塾大学理工学部生命情報学科 助手
matsubara@bio.keio.ac.jp

博士課程修了後しばらく徳島にいましたが、本年 4 月より再び佐藤研に所属させていただくことになりました。
宜しくお願いいたします。

Structure of A Protein Determined by Solid-State Magic-Angle-Spinning NMR Spectroscopy
Castellani F, van Rossum B, Diehl A, Schubert M, Rehbein K, Oschkinat H. Nature, 420, 98-102 (2002).
Molecular Conformation of A Peptide Fragment of Transthyretin in An Amyloid Fibril
Jaroniec CP, MacPhee CE, Astrof NS, Dobson CM, Griffin RG., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 16748-53(2002)
SH3 (Src-homology 3)ドメイン、およびアミロイド繊維のアミノ酸レベルでの高次構造の固体 NMR 解析の論文。昨年溶液 NMR によるタンパク質の構造決定法がノーベル賞を受賞したが、いわゆる CP/MAS(cross-polarization/magic angle spinning)固体 NMR によるタンパク質の構造決定法が近年進歩しつつある。
この方法の利点は、溶液に溶けず結晶化もできない固体粉末の生体試料（例えばアモルファス状態など）を測定できることである。また膜タンパク質や分子量の大きいタンパク質にも有用であるらしい（たまたま固体
NMR を使っていて見つけた論文ですが、「現代化学」2003 年 6 月号に固体 NMR の有用性を説いた総説中でも紹介されています）。

Natural Killer Cells Attack Tumor Cells Expressing High Levels of Sialyl Lewis x Oligosaccharides
C. Ohyama, S. Kanto, K. Kato, O. Nakano, Y. Arai, T. Kato, S. Chen, M. N. Fukuda, and M. Fukuda, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 99, 13789-13794 (2002).
sialyl Lewis x が NK 細胞に認識されることを示した論文。ガン化された細胞には特殊な構造をもった糖鎖抗原が発現され、sialyl Lewis x (NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ-)もその一つである。ヒト黒色種
細胞 MeWo 細胞に sialyl Lewis x を発現できるようにα1,3-fucosyltransferase III (FTIII)を遺伝子導入し、sialyl Lewis x の発現量の異なる細胞を３種（high, moderate, negative）得た。ベージュマウス（NK 活性が低い）にそれぞれの細胞を投与して肺腫瘍を起こさせたところ、sialyl Lewis x の発現量に依存してマウスでの転移量が増えていた。以前の研究でヌードマウス（T 細胞がないが NK 活性はある）では sialyl Lewis x を高発現している細胞よりも中程度の細胞の方が転移能が高かったことから、NK 細胞が sialyl Lewis x を認識して攻撃していることが示された。

Creation of A Zymogen
Plainkum P, Fuchs SM, Wiyakrutta S, Raines RT., Nat. Struct. Biol., 10, 115-9 (2003).
プロテアーゼなどの酵素は細胞中で不活性な前駆体（zymogen）として発現され、限定分解を受けて活性状態に移行する。この研究では ribonuclease A（RNase A）にプロテアーゼ（plasmepsin II）の基質配列（GAKLELFEIPKGSG）を活性部位付近に挿入させ、不活性化させた RNase A 前駆体を設計した。この前駆生命化学研究レター No. 12 (2003. September) 22

体に plasmepsin II を作用させると基質配列部位が切断され、RNase A 活性を示した。特に特別なアイデアや技術を使っている訳ではないが、この類の研究は DDS で有用であろう。例えば前駆体の状態で標的部位に輸送させたあと、活性化状態にすることで特異的な治療効果が得られると考えられる。

The complete folding pathway of a protein from nanoseconds to microseconds
U. Mayor, N. R. Guydosh, C. M. Johnson, J. G. Grossmann, S. Sato, G. S. Jas, S. M. Freund, D. O. Alonso, V.
Daggett, A. R. Fersht, Nature, 421, 863-867 (2003).
3 つのヘリックスバンドル構造を持つ Engrailed ホモドメイン（61aa のヘリックス）および変異体のナノ〜マイク
ロ秒単位の折れたたみ過程を解析した論文。NMR、CD および蛍光の kinetics 解析を行い、動力学計算を行って分子モデルを組んでいる。（モデリングがどれほど正しいのかよくわからないが）タンパク質が部分的に少しずつほどけていく（折れたたまれていく）様の図は直感的に理解しやすく、美しい。

Targeting Therapeutics to An Exposed and Conserved Binding Element of the HIV-1 Fusion Protein
Root M.J. and Hamer D.H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 5016-21 (2003).
HIV ウィルスは変異の割合が高く、感染阻害を行うには亜型間でも共通な部位を標的にしなくてはならない。
しかし HIV-1 外被糖タンパク質(Env) の亜型間に共通な部位は複合糖質で覆い隠されており、膜融合過程
以外は露出することがない。そこでウィルスが膜融合過程で露出する Env の gp41 の C 末端領域と相互作用する 5-helix を作成した。Env はウィルス表面に提示されているが、感染細胞の表面にも存在する。5-helix はウィルスの感染阻害を起こすとともに、毒素との融合タンパク質として発現させると感染した細胞を選択的に死滅させることができた。HIV ウィルスの表面糖鎖のように、糖鎖はさりげなく（？）さまざまな生理活性に関与している。我々は微生物で発現されたタンパク質ではなく、きちんと翻訳後修飾されたタンパク質を用いて研究を行わなくてはならないのだが、技術的にまだ確立されていないのが現状である。

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世話人

第 6 回生命化学研究会
2003 年 6 月 27 日（金）九州大学国際交流プラザ
浜地 格氏
竹中繁織氏
九州大学
芳坂貴弘（北陸先端科学技術大学）「遺伝暗号の拡張による非天然アミノ酸のタンパク質への導入」
芹澤 武（鹿児島大学）「高分子超薄膜のナノ構造制御と機能発現」

宇都義浩（徳島大学工学部）「イソプレノミクスを基盤としたフェノール性抗酸化剤の分子設計とミトコ
ンドリア機能修飾」

末田慎二（ 九州工業大学情報工学部）「タンパク質工学的手法を利用したビ
オチン依存カルボキシラーゼの解析」

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お知らせコーナー
第 1 回生命化学国際シンポジウムへのお誘い
組織委員会・プログラム委員会

会員の方々は、既にご存知のことと思いますが、今年の 12 月 2 日〜5 日に兵庫県立淡路夢舞台国際会議場で第 1 回生命化学国際シンポジウムを開催いたします。
組織委員会・プログラム委員会として、
この国際シンポジウムの特徴や見所をご紹介させていただきたいと思います。大変エキサイティング
な国際シンポジウムになることは間違いありませんので、是非ご出席いただきたいと思います。
1）

世界最先端の研究者が 20 名以上招待講演者としてエキサイティングな講演を行います。

2）

ポスター発表は、予想を大幅に超えて 116 件もの申込がありました。特に、新進気鋭の研究者のポスターが多く、ポスター会場では、熱気あふれるホットな議論が展開されます。当初、予定していたポスター会場は、80 件しか発表できませんでしたので、急遽、ポスター会場を増やし、全てのポスターが、会期中ずっと掲示できるようにしました。また、これからの予算次第
ではありますが、ポスター賞を設ける予定です。皆さん、張り切って発表準備してください。

3）

国際シンポジウムを記念して丸善から発行するプロシーディングス（ハードカバー）は、各自
2−4 ページの論文形式で、トータル 400−600 ページになる予定です。この本を読めば、生命化学の現在の最先端の研究動向が手に取るように分かるとともに、将来が見えてきます。このプロシーディングスは、学会当日お渡しいたします。

4）

参加登録は、advanced registration が 10 月 1 日締め切りです。お早めに登録お願いします。

5）

学会会場は、2000 年に安藤忠雄氏の設計によりできた会場です。講演・ポスターともに素晴らしい環境の中で満喫していただけるものと思います。

6）

国際シンポジウムのオフィシャルホテルは、ウェスティンホテル淡路です。ワールドカップの時に、ベッカムが宿泊して一躍有名になったホテルです。当初、これだけのポスター発表を申し込んでいただけるとは予想していなかったので、あまり部屋数を確保しておりませんでした。
お早めにご予約ください。

7）

本国際シンポジウムは、文部科学省ナノテクノロジー総合支援プロジェクト、大阪大学大学院
化学系 21 世紀 COE プログラム拠点、日本化学会生体機能関連化学部会、コンビケム研究会などから支援をいただく予定になっております。さらに、他のいくつかの財団等からも支援をいただく準備をしております。また、組織委員会で手分けして支援していただける企業を募っております。これらの援助は、国際シンポジウムの成功のために活用することはもちろんのこと、
特に、若手研究者（学生、院生、ポスドク）を支援するために、できるだけ活用したいと思っております。

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以下に国際シンポジウムの会告を掲載します。

第１回生命化学国際シンポジウム
First International Symposium on Biomolecular Chemistry (ISBC2003)
http://www.chem.eng.osaka-u.ac.jp/~ISBC2003/
主 催 日本化学会生命化学研究会 共 催 ナノテクノロジー総合支援プロジェクトセンター・大阪大学大学院化学系 21 世紀 COE プログラム拠点・日本化学会生体機能関連化学部会・コンビケム研究会 協 賛 日本化学会・日本薬学会・日本生化学会・高分子学会ほか
会 期 平成 15 年 12 月 2 日(火)〜5 日(金)会場

兵庫県立淡路夢舞台国際会議場（兵庫県津名郡東浦町夢舞台 1 番地〔ホームページ〕

http://www.yumebutai.org/
討論主題 生命化学に関する世界第一線の研究者が会し、最新の研究成果および今後の展開について
発表・意見交換を行い、国際交流と発展を促進することを目的として、第 1 回生命化学国際会議（ISBC2003）を開催する。世界的レベルの研究者による招待講演およびポスター発表により下記に示す５つのセッションを設け、生命化学の現状と展望について討論を行うとともに、生命化学分野の意
義と重要性を追求し、当該分野における基礎研究および応用への発展に寄与することを目的とする。
主要テーマ（セッション名）I

Functional DNA/RNAII

Cell Function of Macromolecules

III

Metals in Chemical Biology

IVProtein-Protein Interaction

V

Technology Innovation in Biomolecular Chemistry

主な招待講演者：S. AONO (Japan), H. ARIKUNI (Japan), Y. BABA (Japan), C. F. BARBAS (USA), Y.
CHANG (USA), D. P. FAIRLIE (Australia), D. P. GIEDROC (USA), D. HILVERT (Switzerland), S. HIROTA(Japan), S. ITOH (Japan), R. KANNAGI (Japan), K. H. KHOO (Taiwan), B. H. KIM (Korea), Y. S. LEE(Korea), C. H. LIN (Taiwan), T. W. MUIR (USA), P. E. NIELSEN (Denmark), P. SEEBERGER (USA), K. M.
SHOKAT (USA), H. SUGA (USA), S. TAKENAKA (Japan), S. Q. YAO (Singapore), Y. YONEDA (Japan) 他
参加登録費：10 月 1 日まで一般 50,000 円、官公庁・大学 30,000 円；10 月１日以降各 1 万円増（含講演要旨代）、学生：10 月 1 日まで 5,000 円、以降 6,000 円（講演要旨代 5,000 円別途）
申込先 〒770-8505 徳島市庄町 1−78 徳島大学薬学部 馬場嘉信
Tel: 088-633−7285 Fax: 088-633−9507 E–mail: isbc2003@chem.eng.osaka-u.ac.jp

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受賞のお知らせ坂本 寛氏 （久留米大学医学部医化学講座）
受賞名： 平成１５年度（第１回）日本生化学会九州支部学術奨励賞 (2003 年 6 月 1 日)「結晶構造に基づくヘムオキシゲナーゼによるヘム分解機構の解明」

芳坂 貴弘氏 （北陸先端科学技術大学院大学材料科学研究科）
平成１４年度日本化学会進歩賞 (2003 年 3 月 20 日)「遺伝暗号の拡張による非天然アミノ酸のタンパク質への導入」
平成１５年度東京テクノフォーラム 21・ゴールドメダル賞 (2003 年 4 月 16 日)「遺伝暗号を拡張した人工蛋白質合成システムの開発と応用」

会員異動のお知らせ
片山 佳樹氏 （2003 年 4 月より）
九州大学工学研究院 応用化学部門 応化分子教室 教授〒812-8581 福岡市東区箱崎 6-10-1
TEL: 092-642-3608
FAX: 092-642-3611
e-mail: ykatatcm@mbox.nc.kyushu-u.ac.jp

坂口 和靖氏 （2003 年 4 月より）北海道大学大学院理学研究科化学専攻 生命分子化学講座 生物化学研究室〒060-0810 札幌市北区北 10 条西 8 丁目
TEL: 011-706-2698
FAX: 011-736-2074
e-mail: kazuyasu@sci.hokudai.ac.jp

篠原 寛明氏 （2003 年 4 月より）富山大学工学部物質生命システム工学科 生命工学講座 教授〒930-8555 富山市五福 3190
TEL/FAX: 076-445-6832
e-mail: hshinoha@eng.toyama-u.ac.jp

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新留 琢郎氏 （2003 年 4 月より）長崎大学 大学院生産科学研究科 物質科学専攻 助手〒852-8521 長崎市文教町 1-14
Tel&Fax: 095-819-2687
E-mail: tanido@net.nagasaki-u.ac.jp

芳坂 貴弘氏 （2003 年 4 月より）
北陸先端科学技術大学院大学 材料科学研究科 機能科学専攻 助教授〒923-1292 石川県能美郡辰口町旭台 1-1
TEL: 0761-51-1681
FAX: 0761-51-1149
E-mail: hohsaka@jaist.ac.jp

編集後記
誠に申し訳ないのですが､都合により、今号の発行が大変遅くなりました。早くから原稿をいただ
けた執筆者の方々､会告原稿が間に合わなくなってしまった方々に、この場をお借りして、深くお詫び申し上げます。今後､このようなことのないよう、注意して取り組んでいきたいと思いますので、今後とも宜しく御願い申し上げます。

石田 斉（北里大学理学部）