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特別寄稿

阿波学会紀要第60号(pp.201-210)2015.3

阿南市石灰鉱山由来の炭酸カルシウム耐性微生物の探索―――――――――――――― 極限環境微生物班（徳島生物学会）―――――――――――――――
１＊

佐藤

高則

瀬部

直之

２

原

２

将希

２

牧野祐未子

２

n地 由衣
坂口

井上

３

２

翔太

３

雅俊

大岩由利恵

２

高橋

昇汰

石田

啓祐

中山

２

美咲

１

要旨：本研究では, 徳島県阿南市阿瀬比の石灰鉱山から20%炭酸カルシウム培地で生育可能な微生物をスクリーニング
し，単離した28種の微生物の各ゲノムDNAを鋳型として16S rRNA遺伝子のDNA塩基配列決定および系統解析を行った。
その結果，阿瀬比石灰鉱山土壌に生育する炭酸カルシウム耐性細菌は，Pseudomonas属，Bacillus属，Arthrobacter属，
Lysinibacillus属，Stenotrophomonas属，Staphylococcus属細菌であることが明らかになった。

キーワード：石灰鉱山，炭酸カルシウム，16S rRNA遺伝子，スクリーニング

2007）。試料を採取した阿瀬比石灰鉱山の位置を図１．はじめに１に示す。

四国山地には四国カルストをはじめ大小さまざま

２．実験方法な石灰岩地層が存在する。一般的にこうした石灰岩の主成分である炭酸カルシウム（CaCO3 ）は，その

１）阿南市阿瀬比石灰鉱山からの土壌試料の採取起源として化学反応起源と生物起源のものがあるとまず，2013年11月24日に徳島県阿南市阿瀬比の石考えられており，生物起源として塩湖，鍾乳洞，土灰鉱山（ 図２（A））において，本調査班の瀬部，牧壌などに存在する微生物による炭酸塩生成メカニズ

野，坂口，石田により５種の粒径の異なる土壌試料

ムが提案されている（幸村ら，2008）。しかしなが１〜５を採取した。採取地点の土壌写真を 図２（B）

ら，四国の石灰岩における微生物相や炭酸カルシウ〜（F）に示す。この石灰鉱山土壌は，中生代三畳紀

ム生成に関与する微生物についての報告はこれまで

後期の遠洋性石灰岩である。
２）炭酸カルシウム耐性微生物のスクリーニング

なされていない。そこで本論文では，徳島県阿南市
あせび

阿瀬比の石灰鉱山における炭酸カルシウム耐性微生採取した各土壌試料４gを滅菌水10mLに懸濁し静物をスクリーニングし，単離した細菌の16S rRNA

置後，得られた上清250μLを0.5%（w/v）CaCO3 を遺伝子を系統解析することにより，石灰岩中の炭酸含むLB寒天培地（0.5% Bacto Yeast Extract，１%

カルシウム耐性微生物の推定を行い，さらに炭酸カ

Bacto Tryptone，１% NaCl，ナカライテスク，pH

ルシウムの微生物による生成の可能性についても検7.0）に塗布し，30℃，２日間培養した（一次スクリー討した。なお，この阿南市阿瀬比の石灰岩地層からニング）。試料１〜５において一次スクリーニングほととぎす

産出した大理石は，「時鳥」として国会議事堂の門で得られたコロニーを，５%（w/v）CaCO3 を含む

柱や壁に使用されている（石田ら，2004；石田ら，

0.1×LB培地で培養し二次スクリーニングを行なっ１

徳島大学大学院SAS研究部

２

徳島大学総合科学部

３

徳島大学大学院総合科学教育部＊ 770−8502 徳島市南常三島町１−１ 徳島大学大学院ソシオ・アーツ・アンド・サイエンス研究部 tsatoh@tokushima-u.ac.jp201

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阿南市石灰鉱山由来の炭酸カルシウム耐性微生物の探索／極限環境微生物班

図１

土壌試料を採取した石灰鉱山の位置（阿南市阿瀬比町阿利田）地図は電子国土Webを用いて作成した。

図２ 石灰鉱山の写真（A）と採取土壌（B）〜（F）（B）〜（F）中の番号は, 本文中の試料番号（１〜５）に対応する。

た。二次スクリーニングで生育可能なコロニーを，程で，４℃にて増殖・分泌能を有する微生物を単離10%（w/v）CaCO 3 を含む0.1×LB培地で三次スクした（Asebi secretary bacteria；以下Asecと表記）。

リーニングを行った後，生育可能なコロニーに対しスクリーニングおよび単離細菌の培養は基本的にさらに20%（w/v）CaCO 3 を含む0.1×LB培地で四30℃で行ない，一部の単離細菌の培養は37℃で行な

次スクリーニングを行ない，生育可能な25種の炭酸った。

カルシウム耐性微生物を単離した（Asebi CaCO3 −３）炭酸カルシウム生成実験

Tolelant bacteria；以下ACTと表記）。また，この炭酸カルシウムの生物による生成には，微生物が炭酸カルシウムを含む培地でのスクリーニングの過産生する分泌型Ureaseが関与しているとの報告が202

16-04̲阿波学会̲201-210̲特別2校 2015.4.2 9:44 AM ページ 203

阿波学会紀要

表１

土壌
試料
１
２
３
４
５
合計

第60号(pp.201-210)2015.3

石灰鉱山土壌試料からの炭酸カルシウム耐性微生物のスクリーニング

形状

pH

砂状
砂状
粘土質
粘土質
粘土質

9.10
9.23
8.70
8.65
8.41

1st
screening
LB/
0.5%CaCO3
234
100
77
54
51
516

コロニー数
2nd
3rd
screening
screening
0.1×LB/
0.1×LB/
５%CaCO3
10%CaCO3
119
37
29
7
33
8
18
4
27
6
226
62

4th
screening
0.1×LB/
20%CaCO3
10
4
2
3
6
25

ある（Hammes et al.，2003）。そこで，1.5M Urea，0.5M CaCl2 を含む0.1×LB液体培地に微生物を接種し，４℃で静置し，白色沈殿の生成を観察した。対照としては微生物を接種しない1.5M Urea，0.5M
CaCl2 を含む0.1×LB液体培地を用いた。
４）単離した炭酸カルシウム耐性微生物の16S rRNA
遺伝子の解析
単離した炭酸カルシウム耐性微生物の同定を行う
ために，16S rRNA遺伝子を指標とした遺伝子解析を

図３ 土壌試料1の一次スクリーニング（LB+0.5%（w/v）CaCO3培地）行った。まず，単離した微生物をLB培地で37℃，20
時間振とう培養し，集菌後，各細菌のゲノムDNAを調製した。Beffaら（1996）の方法を参考に，大腸菌（E.coli）16S rRNA遺伝子の11-26位に相当するUpper
primer：5′-ATTCTAGAGTTTGATCATGGCTCA3′（24mer，Tm=53℃）およびE.coli 16S rRNA遺伝
子の1393-1411位に相当するLower primer：5′ATGGTACCGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3′（27mer，Tm=67℃）を用いて，得られたゲノムDNAを鋳型にして，ASTEC社製PC707サーマルサイクラーによりPCRを行った。ここでTmとは，二本鎖

図４

炭酸カルシウム培地での三次スクリーニング（0.1×LB+10%（w/v）CaCO3培地）

DNAが50%一本鎖DNAに解離する温度を示し，上記二種のprimerのTmを考慮して，PCRプログラム
を次のように設定した。98℃で10秒間DNAを変性させ，58℃で60秒間primerをアニーリング（徐冷再対合）し，72℃で90秒間DNA鎖の伸長を行うサ
イクルを30サイクル繰り返した。得られたPCR産物
をpGEM-Tベクター（Promega社製）に挿入し，構築したプラスミドをABI社製310 Genetic analyzer
でDNA塩基配列決定を行った。解析可能であった
約 1300bpに つ い て 塩 基 配 列 を NCBI BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）のblastn

図５

単離した炭酸カルシウム耐性微生物（ACT059，LB培地）

203

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阿南市石灰鉱山由来の炭酸カルシウム耐性微生物の探索／極限環境微生物班

阿瀬比町阿利田の石灰鉱山より採取した土壌試料１〜５より，炭酸カルシウム耐性微生物のスクリーニ
ングを行なった（ 表１）。使用した土壌試料を滅菌
水で懸濁した懸濁液のpHは8.4〜9.2の弱アルカリ性であった。各懸濁液上清250μLを0.5%（w/v）
CaCO 3 を含むLB寒天培地で一次スクリーニングを行なったところ（図３），516個のコロニーが得られた。次にこれらのコロニーを，より培地の栄養条件
図６

単離した分泌型炭酸カルシウム耐性微生物（Asec004，LB培地）を厳しくした５%（w/v）CaCO 3 を含む0.1×LB培
地に植え継ぎ，二次スクリーニングを行なったとこ
ろ，226個のコロニーの生育が観察された。さらに，プログラムでDNA塩基配列データベースと照合し，10%（w/v）CaCO 3 を含む0.1×LB培地で三次スク

炭酸カルシウム耐性微生物の菌種の推定を行なっリーニングを行なったところ（ 図４），62個の生育た。一方，塩基配列の相同性解析はDDBJ（DNA可能なコロニーが得られた。これらを20%（w/v）

Data Bank of Japan）のClustal W ver.2.1プログラ

CaCO3 を含む0.1×LB培地で四次スクリーニングをム（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/）を用い，系統

行ない，最終的に25種の炭酸カルシウム耐性微生物

樹の作成・解析はTreeViewプログラムによりNJを単離した（ACT001，0051，0052，008，0091，（Neighbor joining method）法により行なった。

0092，010，013，016，031，035，039，041，045，

OutgroupにはBacillus subtilis（枯草菌）の16S rRNA

048，058，059（図５），060，061，064，065，066，

遺伝子の塩基配列を用い，Bootstrap 値の計算は

068，071，104）。一方，三次スクリーニングの過程

1000回行ない，結果を進化距離として表わした。

で，低温にて増殖・分泌能を有する３個のコロニーが観察されたため，別途単離しこれらを分泌型微生３．実験結果物とした（Asec003，Asec004（図６），Asec005）。

１）阿瀬比石灰鉱山土壌試料からの炭酸カルシウ
ム耐性微生物のスクリーニング２.２）の実験方法に述べた方法により，阿南市

図７

以上の阿瀬比石灰鉱山土壌からのスクリーニングにより，28種の炭酸カルシウム耐性微生物を単離した（表１）。

単離した炭酸カルシウム耐性細菌由来16S rRNA遺伝子のPCR増幅
石灰鉱山土壌より単離した細菌のゲノムDNAを鋳型とし，E.coli 16S rRNA遺伝子に相補的なprimerおよびTakara ExTaq DNA polymeraseを用いてPCRを行った。このうち反応液10μLを電気泳動に用いた。
PCR産物（太矢印）を切り出し後，pGEM-Tベクターに挿入し，DNA塩基配列を決定した。図中に示されていないACT0051，0052，0091，066，104についても，PCR産物を別途確認後,同様の実験を行った。
Mは分子量マーカー（λ/Hin d III）であり，予想されるPCR産物は1300〜1500bpである。

204

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阿波学会紀要表２第60号(pp.201-210)2015.3

単離した炭酸カルシウム耐性細菌の16S rRNA遺伝子解析による菌種の同定

Samples
Determined
DDBJ＊
Isolated length（bp）ofAccession
bacteria
16S rRNA
Numbergene
Asec bacteria
Asec003
1363
AB987914
Asec004
1362
AB987915
Asec005
1365
AB987916
ACT bacteria
ACT001
1362
AB987917
ACT0051
1361
AB987918
ACT0052
1364
AB987919
ACT0081372
AB987920
ACT0091
1362
AB987921
ACT0092
1380
AB987922
ACT0101372
AB987923
ACT0131367
AB987924
ACT0161363
AB987925
ACT031
1343
AB987926
ACT0351363
AB987927
ACT0391377
AB987928
ACT0411372
AB987929
ACT0451362
AB987930
ACT0481346
AB987931
ACT0581345
AB987932
ACT0591344
AB987933
ACT0601344
AB987934
ACT061
1364
AB987935
ACT0641365
AB987936
ACT0651343
AB987937
ACT0661370
AB987938
ACT0681344
AB987939
ACT071
1343
AB987940
ACT1041362
AB987941

Identification of bacteria by 16S rRNA sequence
Length（bp）of 16S rRNA Accession Homology
Identified species
gene innumber（%）
database

Sampling
point

4
5
5

Pseudomonas frederiksbergensis
Bacillus indicus
Pseudomonas frederiksbergensis

1481
1505
1481

KF475871
NR̲029022
KF475871

99.8
99.6
99.3

1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
4
4
4
5
5
5
5
5

Pseudomonas chlororaphis
Bacillus indicus
Bacillus indicus
Bacillus nanhaiensis
Bacillus cibi
Lysinibacillus boronitolerans
Bacillus nanhaiensis
Bacillus indicus
Bacillus indicus
Arthrobacter aurescens
Bacillus indicus
Staphylococcus warneri
Stenotrophomonas maltophilia
Bacillus indicus
Arthrobacter oxydans
Arthrobacter oxydans
Arthrobacter oxydans
Arthrobacter oxydans
Bacillus indicus
Bacillus indicus
Arthrobacter aurescens
Bacillus cibi
Arthrobacter oxydans
Arthrobacter oxydans
Bacillus cibi

1550
1505
1505
1504
1502
1478
1504
1502
1502
1441
1502
1557
1539
1505
1488
1488
1488
1488
1505
1502
1441
1502
1488
1488
1502

JF682516
NR̲029022
NR̲029022
JQ799091
JF772067
NR̲114207
JQ799091
JX393081
JX393081
EU086809
JX393081
NR̲102499
EU442189
NR̲029022
KC934768
KC934768
KC934768
KC934768
NR̲029022
JX393081
EU086809
JF772067
KC934768
KC934768
JF772067

99.8
99.1
99.6
99.9
99.9
99.4
99.8
99.3
99.8
99.8
99.7
99.9
99.6
99.7
99.8
99.7
100
100
99.7
99.7
99.9
98.4
99.9
99.9
99.7

＊

本研究で単離した細菌の16S rRNA遺伝子の塩基配列データは，表に示したAccession Number（AB987917〜987941）によりDDBJ（DNA Data
Bank of Japan）に登録されている。

２）単離した炭酸カルシウム耐性微生物の16S rRNA
遺伝子の解析

ムでDNAの塩基配列データベースと照合したところ（ 表２ ），分泌型細菌Asec003およびAsec005は

上記で述べたように，石灰鉱山土壌試料中には炭Pseudomonas frederiksbergensisの16S rRNA遺伝子

酸カルシウムに耐性を示す微生物の存在が明らかとの塩基配列と99.3%以上一致し，Asec004はBacillus

なった。そこで，この炭酸カルシウム耐性微生物のindicusと99.6%一致した。一方，炭酸カルシウム耐性同定を行うために，16S rRNA遺伝子を指標とした

細菌ACTでは，ACT001がPseudomonas chlororaphis

遺伝子解析を行った。単離された微生物が細菌であと99.8%一致し，ACT0051，ACT0052，ACT013，

れば16S rRNA遺伝子を有するため，PCRでこの遺ACT016，ACT035，ACT045，ACT061，ACT064は伝子が増幅される。

Bacillus indicusと99.1%以上一致した。また，ACT008

単離した各微生物よりゲノムDNAを調製し，こおよびACT010はBacillus nanhaiensisと99.8〜99.9%

れらを鋳型としてPCRを行った結果，予想される約一致し，ACT0091，ACT066，ACT104はBacillus cibi

1.5kbpの位置にPCR産物が確認され，単離した微生と高い相同性を示した。Pseudomonas属とBacillus

物は細菌であることが示唆された（図７）。さらに，属以外の細菌では，ACT0092がLysinibacillus

得られたPCR産物をpGEM-Tベクターに挿入し，boronitoleransと，ACT039がStaphylococcus warneri

16S rRNA遺伝子の塩基配列決定を行なった。

と，ACT041がStenotrophomonas maltophiliaと99.4〜

得られた結果をNCBI BLASTのblastnプログラ

99.9%一致した。またACT031とACT065はArthrobacter205

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阿南市石灰鉱山由来の炭酸カルシウム耐性微生物の探索／極限環境微生物班

表３単離した炭酸カルシウム耐性細菌の16S rRNA遺伝子の相同性

aurescensと，ACT048，ACT058，ACT059，ACT060，

グループであると推定される。また，Arthrobacter

ACT068，ACT071はArthrobacter oxydansと99.7

aurescensと相同なACT031はACT065と最も相同性〜100%一致した。以上より，石灰鉱山土壌に生育が高く（99%），Arthrobacter oxydansと相同なする炭酸カルシウム耐性細菌は，Pseudomonas属，

ACT048，ACT058，ACT059，ACT060，ACT068，

Bacillus属，Arthrobacter属，Lysinibacillus属，

ACT071とも高い相同性（97%）が見られた。このStenotrophomonas属，Staphylococcus属細菌であArthrobacter oxydansと相同な細菌群のうち，ることが明らかとなった。

ACT059，ACT060，ACT071の16S rRNA遺伝子の塩

次に単離した細菌の16S rRNA遺伝子の決定した塩基配列は完全に一致した（100%）。一方，ACT0092，

基配列（1343〜1380bp）について，DDBJのClustal

ACT039，ACT041の三種の細菌に関しては，それW ver2.1を用いて，多重アライメント解析を行なっ

ぞれLysinibacillus boronitolerans，Staphylococcus。Pseudomonas frederiksbergensisと相同た（表３）

warneri，Stenotrophomonas maltophiliaと推定しなAsec003は，Asec005，ACT001と相同性が高くたが，他の炭酸カルシウム耐性細菌とは相同性が（98〜99%），この３種の細菌はPseudomonas属の95%を超えるものは無く，他の細菌との類似性は低近縁種であることが示唆された。

いと考えられる。

同様に表３の結果より，Bacillus indicusと相同な

さらに，これら炭酸カルシウム耐性細菌の16S rRNA

Asec004は，ACT0051，ACT0052，ACT0091，ACT013，

遺伝子のアライメントを元に，系統樹による系統解

ACT016，ACT035，ACT045，ACT061，ACT064，

析を行なった（ 図８）。その結果，本研究で単離し

ACT066，ACT104と高い相同性（98〜99%）を示し，た細菌は，その属に基づいて大きく６つのグループ

Bacillus nanhaiensisと相同なACT008とACT010（グループＩ〜VI）に分類されることが示唆された。

は99%の相同性であった。このBacillus nanhaiensis

グループＩはBacillus属細菌で，これは一般的にグと相同なグループと上記のBacillus indicusと相同な

ラム陽性の桿菌であり自然界に広く分布している。

グループでは相同性に約７%の差が見られることか

このグループＩはさらにIa（Bacillus nanhaiensis），

ら相同性は比較的低く，同じBacillus属でも異なる

Ib（Bacillus cibi），Ic（Bacillus indicus）のサブ

206

16-04̲阿波学会̲201-210̲特別2校 2015.4.2 9:44 AM ページ 207

阿波学会紀要図８第60号(pp.201-210)2015.3

炭酸カルシウム耐性細菌の16S rRNA遺伝子塩基配列に基づく系統樹（近接結合（NJ）法）
図中の数字は1000回計算のBootstrap値を，バーは10%の塩基配列の相違をそれぞれ示す。Outgroupは，Bacillus subtilisの
16S rRNA遺伝子の塩基配列を使用した。細菌属に基づくグループ，I：Bacillus属，II：Lysinibacillus属，III：Arthrobacter属，
IV：Pseudomonas属，V；Stenotrophomonas属，VI：Staphylococcus属

グループに分類され，IbとIcは系統的に進化距離がpH6.0〜7.0，16〜45℃で生育可能な好塩性グラム陽短く近縁であった。IaサブグループのBacillus

性桿菌と報告されており（Ahmed et al.，2007），単nanhaiensisは好アルカリ・好塩性の15〜45℃で生離した細菌ではACT0092がこのグループに分類さ育可能な好気性グラム陽性桿菌と報告されておりれる。

（Chen et al.，2011），単離した細菌ではACT008お

グループIIIは Arthrobacter 属細菌で，これは好気

よびACT010が属すると考えられる。Ibサブグルー

性グラム陽性桿菌/球菌で，至適生育温度は30℃程度

プのBacillus cibiは好塩性の10〜45℃，pH6.5〜7.5でと低く，DNA中の高いG+C含量とペプチドグリカン

生育可能な好気性グラム陽性桿菌と報告されており産生能を有する特徴があり，土壌などからに単離さ（Yoon et al.，2005），本研究の細菌ではACT0051，

れている（Koch et al.，
1995；Wauters et al.，2000）。

ACT0091，ACT016，ACT035，ACT064が該当す

このグループIIIはさらにIIIa（Arthrobacter aurescens），

る。IcのBacillus indicusはヒ素に耐性を示すグラム

IIIb（Arthrobacter oxydans）のサブグループに分類

陽性桿菌で15〜37℃，pH6.0〜7.0で生育可能であるされる。IIIaのArthrobacter aurescensは除草剤アトと報告されており（Suresh et al.，2004），このサブ

ラジンや六価クロムに耐性を示すグラム陽性細菌とグループにはAsec004，ACT0052，ACT045，ACT061，

して単離され（Strong et al.，2002；Horton et al.，

ACT104が分類される。

2006），Arthrobacter aurescens TC1株では全ゲノム

グループIIはLysinibacillus属細菌で，標準株の解析がなされている（Mongodin et al.，2006）。本研

Lysinibacillus boronitoleransはホウ素耐性を有し，究で単離した細菌ではACT031およびACT065がIIIa207

16-04̲阿波学会̲201-210̲特別2校 2015.4.2 9:44 AM ページ 208

阿南市石灰鉱山由来の炭酸カルシウム耐性微生物の探索／極限環境微生物班

サブグループに該当する。一方IIIbのArthrobacter

ACT039がこのグループに分類される。

oxydansは，好気性グラム陽性細菌で，厚いペプチド

以上の本研究で単離した細菌グループのうち，グルグリカン層と高い脂肪酸含量を有する（Kodama et

ープＩのBacillus属細菌，グループIVのPseudomonas

al.，
1992）
。
このサブグループにはACT048，
ACT058，属細菌，グループVIのStaphylococcus属細菌につい

ACT059，ACT060，ACT068，ACT071が分類される。

ては，炭酸塩形成菌として報告があるが（幸村ら，グループIVは好気性グラム陰性桿菌のPseudomonas

2008），その他のグループの細菌の炭酸カルシウム属細菌で，これまで100種以上報告されており，さま耐性に関する報告はなく，本研究による新たな知見

ざまな有機化合物の分解に関与している（Anzai etである。

al.，2000）。グループIVはさらにIVa（Pseudomonas
frederiksbergensis）とIVb（Pseudomonas chlororaphis）のサブグループに分類される。IVaのPseudomonas３）分泌型炭酸カルシウム耐性微生物の炭酸カル
シウム生成の検討

frederiksbergensisはフェナントレン分解能を示す

Hammesらによると，Ureaseを産生する微生物を

グラム陰性桿菌で，生育温度は４〜30℃である

用いて炭酸カルシウムを生成したとの報告がある（Andersen et al.，2000）。単離した細菌ではAsec003（Hammes et al.，2003）。それによると，下記の化学

およびAsec005がこのグループに分類される。また

反応によりアンモニアの共存下（下式５）で，炭酸

IVbのPseudomonas chlororaphisはグラム陰性桿菌

カルシウムが生成する（下式６）と報告されている。

で，脂肪酸含量やDNA中のG+C含量が高いことが知られている（Moore et al.，1996；Peix et al.，2007）。
このサブグループにはACT001が該当する。
グループVは自然界の土壌や水環境に存在する
Stenotrophomonas属細菌で，標準株のStenotrophomonas
maltophiliaは42℃でも生育可能な好気性好塩性グラ
ム陰性桿菌である（Moore et al.，1997；Coenye etal.，2004）。本研究の単離した細菌では，ACT041
がこのグループに分類される。

CO（NH2 ）2 +H2 O→NH2 COOH+NH3

（1）
（2）
（3）
（4）

NH2 COOH+H2 O→NH3 + H2 CO3
H2 CO3 ⇔HCO3 −+H+
2NH3 +2H2 O⇔2NH4 ++2OH−（3）および（4）式より，
HCO3 −+H++2NH4 ++2OH−⇔CO3 2−+2NH4 ++2H2 O（5）2
2−
CO3 +Ca +⇔CaCO3（6）
そこで，1.5M Urea，0.5M CaCl2を含む0.1×LB液

グループVIはStaphylococcus属細菌で，自然界や体培地に分泌型炭酸カルシウム耐性微生物（Asec003，

生物表皮などに存在するグラム陽性球菌である。標Asec004，Asec005）を接種し，４℃にて静置し，準株のStaphylococcus warneriは至適生育温度が45℃，

白色沈殿の生成を観察した。その結果，３週間後に10% NaCl培地でも生育可能であるなどの特徴を持つ

Asec003を接種した培地において白沈の生成が観察（Kloos et al.，1975）。本研究の単離した細菌では，された（ 図９ ）。先に述べたように，Asec003は

Asec
003

Control

Pseudomonas frederiksbergensisと同定され，これまでこの細菌による炭酸カルシウム生成の報告はな
されていない。一方，Pseudomonas属細菌による
炭酸カルシウムの生成は報告例があることから（Connolly，2013），現段階ではこの白沈が炭酸カルシウムであるかどうかについて言及できないが，今後この細菌のUrease産生能や機能解析を行い，またこの生成した沈殿が炭酸カルシウムであるかを化学分析することで，阿南市の石灰鉱山より単離した

図９

分泌型炭酸カルシウム耐性微生物Asec003の尿素―カルシウム培地での沈殿生成（1.5M Urea，0.5M CaCl2を含む0.1×LB液体培地）

208

Asec003が，炭酸カルシウム生成に関与しているかを検討する予定である。

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阿波学会紀要４．まとめ
本論文では，徳島県阿南市阿瀬比の石灰鉱山から
炭酸カルシウム耐性微生物をスクリーニングし，単離した細菌の16S rRNA遺伝子を解析することにより微生物の推定を行った。
まず，徳島県阿南市阿瀬比の石灰鉱山より，５種の粒径の異なる土壌試料を採取した（図２）。これらを0.5〜20%炭酸カルシウムを含むLB培地にて，炭酸カルシウム耐性微生物のスクリーニングを行ない（図３，４），炭酸カルシウム耐性を有する25種の微生物（ACT）および低温にて増殖・分泌能を有する
３種の微生物（Asec）を単離した。
次に，単離したACT25種およびAsec３種の微生物からゲノムDNAを抽出し，これらを鋳型として
16S rRNA遺伝子（約1.5kbp，図７）のPCRクローニ
ングを行ない，それぞれDNA塩基配列決定，相同性
解析（表２）および系統学的解析（図８）を行った。
その結果，阿南市阿瀬比の石灰鉱山に生育する炭酸カルシウム耐性微生物は，大きく６つのグループ（Ｉ〜VI）に分類され，分泌型細菌AsecはPseudomonas
属およびBacillus属細菌であり，炭酸カルシウム耐性細菌ACTは上記２属の他に，Arthrobacter属，
Lysinibacillus属，Stenotrophomonas属，
Staphylococcus属細菌であることが明らかとなった。
さらに，分泌型Asec003では尿素―カルシウム液体培地で白沈生成が見られたことから（ 図９），今回単離した炭酸カルシウム耐性細菌の炭酸カルシウム
生成の可能性について，関連遺伝子・酵素等の詳細な検討を行う必要がある。
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阿南市石灰鉱山由来の炭酸カルシウム耐性微生物の探索／極限環境微生物班

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