論文

要旨

CD133 is a Positive Marker for a Distinct Class of Primitive Human Cord
Blood-derived CD34-negative Hematopoietic stem cells（CD133 はヒト臍帯血由来 CD34 抗原陰性未分化造血幹細胞の陽性マーカーである）

関西医科大学小児科学講座（紹介：金 子 一 成 教授）
関西医科大学衛生学講座（指導：薗 田 精 昭 教授）

高橋雅也

【研究目的】
ヒト造血幹細胞（HSC）は、自己複製能を持ち、全血球系統へ分化する多分化能を有する細胞と定義されている。Dick らは、ヒト未分化 HSC を重症免疫不全マウスに移植する異種間移植系において、ヒト造血を再構築する細胞（SCID-repopulating cell：SRC）を測定する方法を開発した。現在 SRC は、ヒトで測定可能な最も未分化な HSC と考えられている。
最近まで、ヒトでは最も未分化な HSC は CD34 抗原陽性（CD34+）と考えられていた。しかしながら、Sonoda らはヒト臍帯血中に CD34 抗原陰性（CD34-）
SRC の存在を、骨髄内直接移植（IBMI）法を用いて明らかにした（Blood, 2003）。
しかし、その頻度は 1/25,000 であり、CD34 SRC の特性を解明するためにはさらなる純化が必要であった。近年、Ishii, Sonoda らは 18 種類の Lineage（Lin）抗体を用いる純化法を開発し、その頻度を 1/1,000 にまで濃縮純化することに成功した（Exp Hematol, 2011）。
今回、私たちは CD34-SRC（HSC）の特性解明を目的として、CD34-SRC の陽性マーカーについて網羅的な検索を行い、さらなる高度純化法の開発を行った。
【方法】
ヒト臍帯血より比重遠心法で単核球を分離し、免疫磁気ビーズ（EasySep）でLin 陽性細胞を除去した。その後、18 種類の Lin 抗体、7AAD、抗 CD34 抗体、抗 CD45 抗体で多重染色を行った。さらに陽性マーカー検索目的で、既知の HSCマーカーや接着分子など多種類の抗原をスクリーニングした。その中で、CD34細胞分画を陽性および陰性分画に亜分画する抗体を選別した。次に、その陽性分画を FSC/SSC scattergram 上で backgate をかけ、blast-lymphocyte windows に濃縮される抗原を候補として選択した。
選択された抗原を用いて CD34+および CD34-細胞を陽性および陰性分画に亜分画し、この 4 つの分画を用いて以下の手順で本研究を行った。
① 造血前駆細胞（CFC）コロニー形成能の測定（ メ チ ルセルロース法を用いて SCF,TPO,IL-3,GM-CSF,G-CSF,Epo 存在下、30%FCS 添加、37℃,5%CO2,5%O2 で 12-14 日間培養）② ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（BM MSC）との共培養系における分化能の検討（SCF,FL,TPO,IL-3,IL-6,G-CSF 存在下、37℃,5%CO2,5%O2 で 7 日間無血清培養）③IBMI 法を用いる SRC 活性の測
（重症免疫不全（NOG）マウスを用いる SRC 活性の測定、および 2 次マウスへの移植による自己複製能の測定）【結果】
初めに多数の抗原分子に対する抗体を用いて、網羅的に 18Lin-CD45+CD34+/細胞を染色してパターン解析を行った。その結果、CD133、CD90、c-kit、CD49f、CXCR4、および CD93 抗体が、CD34-細胞分画を陽性および陰性に亜分画することを発見した。次に、CD34- 細胞分画の陽性分画を FSC/SSC scattergram 上でbackgate をかけて、パターン解析を行った。その結果、CD133 が最も信頼できるマーカーであることが確認された。この結果に基づいて、CD133 を候補抗原とし CD34-SRC の陽性マーカーとなり得るか検討を行った。
CFC コ ロ ニ ー 形 成 能 で は 、 18Lin-CD45+CD34+/-CD133+/- 細 胞 の plating
efficiencies はそれぞれ 57%、65%、39%、19%であった。CD34+CD133+細胞ではすべてのコロニー（BFU-E、CFU-GM、CFU-mix）が形成された。CD34+CD133細胞は 68%が BFU-E で 30%が CFU-mix であり、ほとんど CFU-GM コロニー（2%）
を認めなかった。一方、CD34-CD133+/-細胞は、主に BFU-E コロニー（71%、73%）と CFU-mix（25%、27%）コロニーの形成を認め、CFU-GM コロニーはわずかしか形成されなかった。この結果は Ishii らの報告を支持する結果であり、18Lin-CD45+CD34-細胞分画には造血前駆細胞が含まれることが示された。
次に 18Lin-CD45+CD34+/-CD133+/-細胞を BM MSC と共培養し、CD34+細胞の産生・維持や分化能の解析を行った。CD34+CD133+/-細胞の増殖率は、各々450 倍、130 倍であり、CD34+細胞は 39%と 31%の割合で認められた。一方、CD34-CD133+/細胞の増殖率は各々130 倍、30 倍であり、CD34+細胞は 32%と 13%の割合で認められた。以上の結果から、CD34+/-細胞ともに CD133+細胞分画に CD34+細胞の産生・維持能が有意に高いことが示された。また、CD34+/-細胞は、CD133+細胞分画に CD33+細胞、CD14+細胞、CD11b+細胞等の顆粒球系細胞の産生能が有意に高いことが示された。一方、CD41+細胞の産生能においては、CD34+細胞ではCD133-細胞分画が有意に高い結果であり、CD34- 細胞では CD133+ 細胞分画とCD133-細胞分画に有意差は認められなかった。以上の結果から、in vitro における CD34+/-CD133+/-細胞分画の分化能は異なっていることが示唆された。
さらに SRC 活性の測定のため NOG マウスを用いた異種間移植実験を行った。
各々、5,000 個の 18Lin-CD45+CD34+/-CD133+/-細胞を IBMI 法でマウス左脛骨内に移植し、骨髄吸引法を用いてヒト CD45+細胞の生着率を経時的に解析した。その結果、CD34+ および CD34-細胞ともに CD133+ 細胞分画を移植したすべてのNOG マウスでヒト CD45+細胞の生着を認めた。一方、CD133-細胞分画を移植した NOG マウスでは、ヒト CD45+細胞の生着を認めなかった。この結果から、
CD133 が CD34-SRC の陽性マーカーであることが明確に示された。加えて、
CD133 が CD34+SRC の陽性マーカーであることも明らかにされた。さらに、長期骨髄再構築能の検討のため、生着した 1 次マウスすべてで 2 次移植を行った。
その結果、CD34+/-CD133+細胞ともにすべての NOG マウスでヒト CD45+細胞の生着を認め、CD34+/-CD133+SRC が、共に長期骨髄再構築能（～38 週）を持つHSC であることが確認された。また、1 次および 2 次マウスともに移植 18-20 週で犠牲死させ、末梢血、骨髄、脾臓、および胸腺を採取し、多分化能について解析した。その結果、B および T 細胞系、骨髄球系、赤芽球系、巨核球系、NK細胞への多分化能を示すことが確認された。
最後に、CD34-CD133+SRC の頻度を限界希釈法で測定したところ、1/142 であり、Ishii らの報告比べて約 7 倍に濃縮・純化することに成功した。

【考察】従来の純化法は negative selection 法であり、CD34-HSC のさらなる純化には陽性マーカーを用いる positive selection 法の開発が必須不可欠であった。本研究により、CD133 が信頼できる陽性マーカーであることが初めて明らかにされた。
加えて、CD133 が CD34-HSC だけでなく、CD34+HSC の陽性マーカーであり、すべての SRC 活性を同定する機能性マーカーであることが示された。このことは、臍帯血移植の実地臨床おいて重要な意義を持っている。すなわち、現在、HSC 活性の指標として用いられている CD34+細胞数に比べて、CD133+細胞数を用いる方がより正確に HSC 活性を測定可能なことが示されたことである。以上の結果より、今後、CD133+細胞の移植医療への応用が期待される。