生体高分子の微結晶構造解析における技術革新

X 線自由電子レーザーを用いた金属タンパク質試料の結晶構造解析と X 線分光測定
矢野淳子
Molecular Biophysics and Integrated Bioimaging Division, Lawrence Berkeley National Laboratory
1 Cyclotron Road, Berkeley, CA 94720, USA

フェムト秒 X 線レーザーが生体試料の研究に用いられるようになって以来，さまざまな系において室温での立体構造の決定および反応中間体を捉える上でその有用性が証明されている。そして結晶構造解析への応用に加えて，■
要
旨

生体分子の分光手法への応用も進んでいる。フェムト秒 X 線レーザーを用いることで従来難しかった金属タンパ
ク質のような希薄な系の室温におけるスペクトル測定が可能になる。本稿では，XFEL を用いた結晶構造及び X 線
分光法（X 線発光法および X 線吸収法），さらにそれらの同時測定手法に関して我々の最近の研究結果を中心に解説する。

特定の結晶部位あたりの X 線量を軽減し，放射線損傷の

1. はじめに影響を受けない結晶構造を得ることが可能である。これにフェムト秒 X 線レーザー（Xray Free Electron Laser,

対して， XFEL ではフェムト秒の非常に短いパルス X 線

XFEL）を用いた結晶構造解析は，構造生物学の研究分野

を測定に用いるため，放射線損傷がおきる以前に試料からにお いてこ こ数 年の間 に重 要な位 置を占 めつ つあ る。

のシグナルを測定することが可能である。従って，既に放2011年に Linac Coherent Light Source, LCLS（アメリカ

射光 X 線を用いて構造解析が行なわれている系において合衆国）が，そして2012年に SACLA（日本）が共用運転

も，放射線損傷のない構造を得るという点で新たな情報ををはじめユーザーに開放されて以来， XFEL は様々な生もたらす。そのような例は，ウシ心筋チトクロム酸化酵素

体高分子の構造研究に用いられている。 XFEL では，フや光化学系 II 複合体（photosystem II, PSII）単結晶の研ェムト秒パルス幅をもつ X 線を測定に用いることで試料究において実証されている1,2) 。通常結晶構造解析に用いが X 線によって 2 次的放射線損傷を起こす以前にシグナられる X 線量の基準値（つまり結晶の diŠractivity が保たルを測定することが可能である。したがって，放射線損傷れる X 線量）は， Henderson や Garman が提案しているを受けやすい生体高分子の構造研究において重要な進歩を値によると低温測定でおよそ2030 MGy，室温測定では 1

もたらすことが期待される。さらに，これまでごく一部の

MGy 程度である。しかし，PSII やチトクロム酸化酵素の系でしか行われていなかった X 線を用いた生体試料のような，酸化還元反応を行なう金属活性中心における放射‘室温’における‘動的構造解析’が可能になる。このよ

線損傷がおこる X 線量は，これよりもさらに一桁以上小うな手法は，構造解析のみならず X 線分光法の分野におさい。 XFEL では，パルス毎の線量がこれらの値より大いても重要な役割を果たす。

きいにも関わらず，フェムト秒の非常に短い発光時間を用いることで放射線損傷がおきる以前に試料からのシグナルを測定することが可能であることを証明している。上記の2. フェムト秒 X 線レーザーを用いた
結晶構造解
2.1.

研究例は XFEL を使った液体窒素温度での測定であるが，
XFEL を結晶構造解析に利用する最大の利点は測定を室

XFEL における結晶構造解析

温で行うことが可能である点であろう。このことは，室温試料の放射線損傷は X 線を用いる研究に常に存在するで存在するアミノ酸側鎖の異性体分布や，その酵素反応中問題であり，損傷の程度をいかにして評価し，かつ最低限の動的構造変化を知る上で非常に重要である。一方で，さに留めて放射線の影響のないデータを得るかが課題であらに大きな X 線量を試料に照射すると多重内殻イオン化る。生体試料で起こる放射線損傷の主たる原因は， X 線などの複雑な過程による電子損傷が起こることも知られてと水との相互作用によるヒドロキシルラジカルの形成とそおり，本来観測されるべき自然な構造や電子状態を観測での拡散による。従って，通常の放射光 X 線実験ではラジ

きない場合もありうるので注意が必要である。

カルの拡散速度を軽減するため液体窒素温度（100150 K）
で測定が行なわれている。さらに，複数の結晶を使用して放射光 July 2016 Vol.29 No.4 ● 213(C) 2016 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research2.2

連続フェムト秒結晶構造解析る点である（Fig. 1）。したがって，それぞれの回折スポッ

XFEL で 用 い ら れ る 連 続 フ ェ ム ト 秒 結 晶 構 造 解 析

トは部分強度しか反映しない（ partiality ）。 Uervirojnan-（Serial Femtosecond Xray Crystallography）法では3)，

gkoorn らは，ポストリファインメントをデータ解析に加タンパク質微小結晶を分散させた液体を試料として液体イえることによって部分強度から完全強度を見積もる手法をンジェクターから連続的に X 線レーザーの照射領域に導報告している6,7) 。また，微結晶自体に大きさや質，ある入し，数千から数百万個の微結晶からのシングルショット

いは格子定数の分布があること（Fig. 1），加えて測定に際回折像を積算して構造解析を行なう（Fig. 1)4,5)。非常に強しては X 線が結晶のどの位置に照射されるかを制御でき力なパルス X 線を用いることで，通常放射光施設では測ないことなど，1 つ 1 つの結晶から得られる回折像の質は定が難しいマイクロンサイズの微結晶から，しかも常温で大きく異なる。そのような非常に不均一な分布を持ったX 線回折像を得ることができる。LCLS の場合，パルス X

データから質のよい結晶構造を得るために，膨大な回折

線は120 Hz でやってくるが，パルス X 線が単結晶に命中

デー タを 測定 して立 体構 造を求 める方 法が とられ ていする確率（ヒット率）は液体中の結晶濃度に依存する。例る8)。しかし，現在の方法では限られた量しかえられない

えば光化学系 I 膜タンパク質結晶の場合3) ， X 線パルス

試料の高分解能構造解析は簡単ではないため，より少ない

185万ショット（約 4 時間の実験に相当）のうち，結晶のデータからいかにして高分解能な結晶構造を得るかが課題

ヒット率はおよそ 6，そのうち指数付けが可能であったである9,7)。

ものの割合はショット数に対して 1未満である。従って結晶化が難しい生体高分子の構造解析に加えて，XFEL

ヒット率を上げ試料の消費量を軽減するためには， X 線を結晶構造解析に用いることの本来の魅力は，化学反応，の周期と結晶試料の導入を同期させる drop-on-demand 等

光化学反応等によって引きおこされる生体分子内の構造変の概念を利用したインジェクターの導入が必要である。

化をリアルタイムで追うことにあろう。光化学反応を起こ加えて， XFEL データ解析に関して通常の X 線構造解

すタンパク質，例えば，光化学系 II 複合体やロドプシン

析と異なる点は， SFX で得られる一つ一つの回折像がフなどがその例としてあげられる10,11) 。このうち， PSII は

ェムト秒間に測定された‘静止画像’（ Still image ）であ植物やシアノバクテリアが行なう光合成反応における重要Fig. 1(Color online) Serial Femtosecond Xray crystallography (SFX) using a liquid jet, and the existing challenges.
DiŠraction data obtained from crystalline samples using fs XFEL pulses is fundamentally diŠerent from standard
diŠraction measurements at synchrotron sources. The crystal does not move during the pulse length, leading torecording of `stills' in contrast to oscillation images from standard diŠraction measurements. There are manypotential error sources in the determination of the actual Bragg intensities for each re‰ection, including the diŠerent sample volume for recording each individual diŠraction image and the inherent ‰uctuations in the intensityand energy spectrum of the XFEL pulses due to the stochastic nature of the lasing process at an XFEL. Anotherissue is to improve the crystal hit rate and the indexing rate.

214 ● 放射光 July 2016 Vol.29 No.4

小特集 ■ 生体高分子の微結晶構造解析における技術革新

なタンパク質であるが，そのクロロフィル反応中心が赤色線を放出して緩和する際のスペクトルを測定する。様々な光を吸収し，光励起が起動力となって金属活性中心におけ

発光スペクトルのうち， 3d 遷移金属の Kb1,3 スペクトルる水分解反応がおこる。その触媒反応中におこるタンパクとそのサテライトピークである Kb ′ピークは 3p から 1s質の構造変化を追うことは触媒機構解明において重要であ

軌道への電子の遷移に相当し，（ 3p, 3d ）スピン交換相互り，現在 XFEL を用いて研究が進められている12)。

作用を通して 3d 軌道のスピン数，つまり電荷密度を反映する。さらに，その高エネルギー側に現れる Kb2,5 及び

3. フェムト秒 X 線レーザーを用いた
X 線発光及び吸収スペクトル測定
金属タンパク質中の金属活性中心の化学構造に関しては，

Kb ″スペクトルは配位子原子の 2s / 2p 軌道から金属の 1s軌道へのクロスオーバー遷移に相当する。 X 線発光スペ
クトルは XFEL の入射 X 線バンド幅（およそ0.5，つまり ， 7 keV 入 射 X 線 で お よ そ 40 eV, 9 keV で お よ そ 45

X 線吸収法や X 線発光法などの元素選択性のある分光法

eV ）に影響されないため， XFEL を用いたスペクトルのを用いることで X 線構造解析のみからは得られないより‘スナップショット’測定に適している。また後述するよ詳細な局所的構造および電子，スピン状態に関する情報をうに，同じ入射 X 線エネルギーを用いて X 線結晶構造解得ることができる。以下に，我々のグループで行った 2

析と XES の同時測定が可能である。そして溶液，結晶懸つの分光方法を述べる。

濁液試料いずれからもデータを得ることができる。ただし溶液試料の XFEL X 線照射率が100であるのに対して結3.1

X 線発光法

X 線発光法（Xray emission spectroscopy, XES）では，元素の内殻電子を外殻軌道に励起し，その励起状態が X

Fig. 2晶懸濁液の照射率は通常 10 以下におちるので，後者の場合より長時間のスペクトル積算が必要である。
XES のスナップショット測定には， Fig. 2 ( a )に示すよ(Color online) (a) von Hamos spectrometor, that consists of 16 analyzer crystals, for X
ray emission spectroscopy data collection.13,14) (b) A comparison of the Mn model compound solution spectra collected at XFEL
(room temperature) and those collected at a synchrotron facility (cryogenic temperature). (c) A simultaneous
XES data collextion of two elements using von Hamos spectrometer. For example, K b XES spectra of two
metals, M1 and M2, can be collected simultaneously by using the incident Xrays above the Kedge absorptionenergies of the two elements.

放射光 July 2016 Vol.29 No.4 ● 215

うな 16 個のアナライザー結晶からなるエネルギー分散型

クトルがよりシャープであること（ MnL 吸収端は～ 0.3（ von Hamos ） 分 光 器 を 用 い ， CSPAD （ Cornell SLAC

eV, MnK 吸収端は～1.2 eV），そして(ii)スピン軌道相互

hybrid Pixel Array Detector）や MPCCD（multiport CCD）

作用によって得られるスペクトルは電子のスピン状態に関

な ど の 2D 検 出 器 を 用 い て ス ペ ク ト ル 測 定 を 行 う 。

する情報も含むことがあげられる。3d 遷移金属の 2p から

MnKb1,3 スペクトルの場合， Si の 440 反射を用いる。カ

3d への遷移では，スピン軌道結合を反映してエネルギー

バーする立体角は全立体角の 1.3 ， 1 eV につきおよその異なる 2 つのピーク領域が現れる。LIII が 2p3/2 から 3d

0.04である13,14)。蛍光エネルギー6490 eV では，この分への遷移， LII が 2p1/2 から 3d への遷移に相当し，これら光器を用いた場合の最終的なエネルギー分解能はおよそのピークは，電子状態に加えて元素のスピン状態を反映す

0.44 eV である。

る。しかし，生物分野では軟 X 線領域の実験はその実験

XFEL の よ う な 非 常 に 強 力 な X 線 （ ～ 1012 photons /上の様々な制約のためほとんど行われていない。最大の問

pulse）を試料に照射した場合，多重内殻イオン化（multi-

題点は，軟 X 線領域における X 線の試料による吸収が大

ple ionization）等の原因によるスペクトルの形状変化がおきいことで，硬 X 線を用いた実験と比較すると生体高分こる可能性がある。我々のグループでは，マンガンのモデ子のように水を含む試料では X 線損傷のおこる速度がおル化合物を使って，～ 1012 photons / pulse, 50 100 フェム

よそ二桁ほど早いことがあげられる。加えて，多くの吸収ト秒の実験条件下で放射光実験と同一のスペクトルが得ら端が近接している（金属の L 吸収端および M 吸収端，それることを示した13) 。 Fig. 2 ( b )に XFEL で室温測定した

して軽元素の K 吸収端）ため，軽元素からのバックグラ

Mn モデル化合物の MnKb1,3 スペクトルと，放射光ビー

ウンドシグナルの寄与が大きいこと，そして X 線の空気

ムラインで測定（液体ヘリウム温度）した同化合物のスペや溶媒による吸収が大きいため，大気中や溶液での測定がクトルを示す15) 。異なる温度と X 線量にもかかわらず，困難で測定環境を高真空状態に保つ必要があることなどの両者のスペクトルは非常によく一致している。本実験で使難しさがある。しかし，材料化学の分野では軟 X 線を用用した X 線量では，単純計算すると 1 パルス毎にマンガいた研究は幅広く行われており，金属タンパク質の研究分

ン一原子につき 0.1 個の光子が照射されていることにな

野においても軟 X 線領域のエネルギーを用いた X 線分光る。つまり，この実験条件下では試料の多重内殻イオン化法の潜在的可能性は高い。

状態はおきておらず， XFEL において電子損傷が起こる

われわれの共同研究グループでは，上記の問題点を克服

以前にスペクトル測定が可能であること，そして常温におして生体高分子中の 3d 遷移金属の L 吸収端 XANES 実験

いても放射線損傷のないデータが得られることを示していの汎用性を広げることを目的として， XFEL で応用可能

る。一方で，高 X 線量の入射線を用いた場合 XFEL によなゾーンプレートを用いた分光器を作成した17)。Fig. 3(a)る試料の電子損傷もみられるので X 線のビームサイズ等に示すように，溶液試料を液体インジェクターを用いてに注意する必要がある。

X 線照射領域に導入し，そこから得られる蛍光シグナル

XES 測定は，吸収端より大きな入射光エネルギーを用をゾーンプレートからのマイナス一次反射を用いて二次元いることによって複数の元素の発光スペクトルの同時測定検出器で測定する。光化学系 II 複合体膜タンパク質の触にも応用することができる（ Fig. 2 ( c )）。この方法は，試媒反応中心である Mn4CaO5 クラスターの例をあげると，料中に存在する複数の金属元素の反応誘起後の電子伝達やその Mn からの La 蛍光線（637 eV）はタンパク質中の大触媒反応に伴う電子状態の経時変化を追うのに威力を発揮

部分を占める酸素原子の Ka 線（525 eV）が非常に大きなする。例えば， Mn と Ti を含むクロモフォア化合物の場

バ ッ ク グ ラ ウ ン ド に な る た め 全 蛍 光 収 量 TFY （ total

合，～400 nm の光励起によって金属間の MMCT（metal-‰uorescence yield ） や 全 電 子 収 量 TEY （ total electron

to-metal charge transfer）が起こると考えられているが，

yield）を用いた XAS 測定は困難である。そこで，ゾーンそのような連続的な金属間の電子伝達を追うのにも用いる

プレートを用いて特定エネルギーの蛍光線を選択的に集光ことができる16)。

することで，バックグラウンドシグナルと目的とする元素

3.2

partial ‰uorescence yield）を用いた XAS 測定を行うことからのシグナルを空間的に選別し，部分蛍光収量（ PFY,

軟 X 線を用いた金属タンパク質の XAFS 測定

金属タンパク質の X 線分光測定では，その金属の酸化ができる。

還元状態や局所構造に関する情報を得るため硬 X 線領域

LCLS SXR（Soft Xray Research）ビームラインのモのエネルギーを用いた X 線吸収法，発光分光法などが通ノクロメターを用いて0.25 eV 間隔で MnCl2 溶液の LIII 及

常用いられる。同様の，あるいはより詳細な電子状態に関び LII 吸収端のスペクトル測定を行った例を Fig. 3 ( b )示

する情報は軟 X 線領域の X 線を用いて行う金属の L 吸収

す。ゾーンプレートによって Mn の La と O の Ka を区別

端測定からも得ることができる。L 吸収端測定を行う利点する。ゾーンプレートのエネルギー分解能は20 eV 程度で，は，( i)内殻正孔寿命に依存したスペクトルのもつ自然幅

grating （分解能 0.2 eV ）に比較するとかなり低いが，金が K 吸収端と比較して小さいことから，測定されるスペ属タンパク質溶液のような本来金属濃度が非常に希薄な系

216 ● 放射光 July 2016 Vol.29 No.4

小特集 ■ 生体高分子の微結晶構造解析における技術革新

Fig. 3(Color online) (a) Experimental setup of the high-transmission Xray spectrometer for collecting Mn Ledge
XAS using a liquid injector at XFELs. Inset (top) shows the CCD images of the ‰uorescence from a solid MnOsample as diŠracted oŠ one zone plate taken at an incident photon energy below (600 eV) and above the Mn Ledge (653 eV). The intensity is encoded in color: red high, blue low). (b) Mn Ledge spectrum of 500 mM MnCl2
solution collected using a RZP (re‰ection zone plate) spectrometer (PFY, Partial Fluorescence Yield). Adaptedfrom Mitzner et al.17)の PFY を用いた X 線吸収スペクトル測定では，蛍光線のいておこる。その活性中心は 4 つの Mn と 1 つの Ca が酸

高エネルギー分解能は必要としない。一方で，たんぱく溶

素架橋したクラスター（Mn4CaO5），そしてリガンドであ

液中の Mn 濃度が～1 mM 程度であるため，効率の良い集るカルボキシル基，ヒスチジル基及び水分子によって構成光が求められる。このような場合，gratings を用いるよりされている。水分解反応は， Mn4CaO5 クラスターが 5 つもバンド幅が大きく（gratings: 0.5 eV, HZP: 20 eV），立の反応中間体 Sn（n＝0～4）を経る光駆動サイクル（Kok

体角が一桁から二桁大きいゾーンプレートの方が適していcycle ）によっておこるが， n が大きいほどより酸化が進る。

んだ状態を表す。PSII を暗順応させると S1 状態で安定化

XFEL における軟 X 線を用いたこのような実験手法のされるが，反応中心であるスペシャルペアクロロフィルの確立は， L 吸収端 XAS の汎用性を広げるとともに，将来光誘起に伴って S1 状態は S2，S3 へと 1 電子ずつ酸化され生体高分子系において，より高いエネルギー分解能が要求る。そして 3 回めの光照射後に寿命の短い過渡状態であされる 2p3d 共鳴非弾性 X 線散乱法などの実現につながる。

る S4 を経て 1 酸素分子を遊離した後，S0 状態へ戻る。
Fig. 4 に示すように，液体インジェクターのガラスキャ

4. X 線回折と X 線分光法の同時測定

ピラリーに装着した 3 つの光ファイバーと，1 つのフリー
スペースレーザーを組み合わせて使用することによってそX 線回折パターンからは結晶構造に関する情報が，それそれの S 状態リッチな結晶，あるいは溶液試料を作成して同時に X 線発光スペクトルからは金属部位の電荷状することができる。そして， XRD と XES の同時測定と態や化学構造変化に関する情報が得られるが，金属タンパ

可視光ポンプレーザーを組み合わせることによって Mn4

ク質試料の場合，両者を同時測定すれば，タンパク質の動CaO5 の触媒反応機構とそれを可能にしているタンパク質

的立体構造解析と金属活性中心の化学変化を同じタンパクの構造に関する情報が得られると期待される。

微結晶を用いて追跡することができる（Fig. 4）。我々のグループでは，本方法を用いてミクロンサイズの光化学系
II 複合体単結晶の X 線回折測定と XES の同時測定を行な

5. 今後の展望

い，水分解反応過程で現れる中間体の構造と化学的性質に

XFEL は，今後さらに新規のタンパク質の構造解析，関する研究を行っている10,15)。植物やシアノバクテリアがより高度な 2 次元 X 線分光法等への応用，そして生体高行なう光合成による水分解反応は，チラコイド膜タンパク

分子の動態変化を追う手法として発展することが期待され質である PSII のルーメン側に位置する触媒活性中心におる。現在様々な国で新たな XFEL の建設あるいはその計

放射光 July 2016 Vol.29 No.4 ● 217

Fig. 4

(Color online) A. Simultaneous collection of Xray diŠraction data (downstream) providing overall structural
information and Xray emission spectra (at 90 degrees) using the wavelength-dispersive spectrometer providing
electronic structure information of the metal site. Adapted from Kern et al.10) (Bottom left) An example of a
diŠraction image on the CSPAD. (Bottom right) XES spectra of PSII from solution and crystalline samples.

画が進んでいるが，近い将来，放射光 X 線のようにより汎用性の高い X 線源となるであろう。

参考文献
1)

K. Hirata, K. Shinzawa-Itoh, N. Yano, S. Takemura, K.
Kato, M. Hatanaka, K. Muramoto, T. Kawahara, T. Tsukihara, E. Yamashita, K. Tono, G. Ueno, T. Hikima, H.
Murakami, Y. Inubushi, M. Yabashi, T. Ishikawa, M.
Yamamoto, T. Ogura, H. Sugimoto, J.-R. Shen, S. Yoshikawa and H. Ago: Nat. Methods 11, 734 (2014).
2) M. Suga, F. Akita, K. Hirata, G. Ueno, H. Murakami, Y.
Nakajima, T. Shimizu, K. Yamashita, M. Yamamoto, H.
Ago and J. R. Shen: Nature 517, 99 (2015).
3) H. N. Chapman, P. Fromme, A. Barty, T. A. White, R. A.
Kirian, A. Aquila, M. S. Hunter, J. Schulz, D. P. DePonte, U.
Weierstall, R. B. Doak, F. R. N. C. Maia, A. V. Martin, I.
Schlichting, L. Lomb, N. Coppola, R. L. Shoeman, S. W.
Epp, R. Hartmann, D. Rolles, A. Rudenko, L. Foucar, N.
Kimmel, G. Weidenspointner, P. Holl, M. N. Liang, M. Barthelmess, C. Caleman, S. Boutet, M. J. Bogan, J. Krzywinski, C. Bostedt, S. Bajt, L. Gumprecht, B. Rudek, B. Erk, C.
Schmidt, A. Homke, C. Reich, D. Pietschner, L. Struder, G.
Hauser, H. Gorke, J. Ullrich, S. Herrmann, G. Schaller, F.
Schopper, H. Soltau, K. U. Kuhnel, M. Messerschmidt, J. D.

218 ● 放射光 July 2016 Vol.29 No.4

Bozek, S. P. Hau-Riege, M. Frank, C. Y. Hampton, R. G.
Sierra, D. Starodub, G. J. Williams, J. Hajdu, N. Timneanu,
M. M. Seibert, J. Andreasson, A. Rocker, O. Jonsson, M.
Svenda, S. Stern, K. Nass, R. Andritschke, C. D. Schroter,
F. Krasniqi, M. Bott, K. E. Schmidt, X. Y. Wang, I. Grotjohann, J. M. Holton, T. R. M. Barends, R. Neutze, S.
Marchesini, R. Fromme, S. Schorb, D. Rupp, M. Adolph, T.
Gorkhover, I. Andersson, H. Hirsemann, G. Potdevin, H.
Graafsma, B. Nilsson and J. C. H. Spence: Nature 470, 73(2011).
4) D. P. DePonte, U. Weierstall, K. Schmidt, J. Warner, D.
Starodub, J. C. H. Spence and R. B. Doak: J. Phys. D Appl.
Phys. 41, 195505 (2008).
5) R. G. Sierra, H. Laksmono, J. Kern, R. Tran, J. Hattne, R.
Alonso-Mori, B. Lassalle-Kaiser, C. Glockner, J. Hellmich,
D. W. Schafer, N. Echols, R. J. Gildea, R. W. GrosseKunstleve, J. Sellberg, T. A. McQueen, A. R. Fry, M. M.
Messerschmidt, A. Miahnahri, M. M. Seibert, C. Y. Hampton, D. Starodub, N. D. Loh, D. Sokaras, T.-C. Weng, P. H.
Zwart, P. Glatzel, D. Milathianaki, W. E. White, P. D.
Adams, G. J. Williams, S. Boutet, A. Zouni, J. Messinger, N.
K. Sauter, U. Bergmann, J. Yano, V. K. Yachandra and M. J.
Bogan: Acta Crystallogr, D 68, 1584 (2012).
6) M. Uervirojnangkoorn, O. B. Zeldin, A. Y. Lyubimov, J.
Hattne, A. S. Brewster, N. K. Sauter, A. T. Brunger and W.
I. Weis: Elife 4, e05421 (2015).

小特集 ■ 生体高分子の微結晶構造解析における技術革新

7)
8)

9)

10)

11)

12)
13)

N. Sauter: J. Synchrotron Radiat. 22, 239 (2015).
R. A. Kirian, X. Wang, U. Weierstall, K. E. Schmidt, J. C.
H. Spence, M. Hunter, P. Fromme, T. White, H. N. Chapman and J. Holton: Opt. Express 18, 5713 (2010).
J. Hattne, N. Echols, R. Tran, J. Kern, R. J. Gildea, A. S.
Brewster, R. Alonso-Mori, C. Glockner, J. Hellmich, H. Laksmono, R. G. Sierra, B. Lassalle-Kaiser, A. Lampe, G. Han,
S. Gul, D. DiFiore, D. Milathianaki, A. R. Fry, A. Miahnahri,
W. E. White, D. W. Schafer, M. M. Seibert, J. E. Koglin, D.
Sokaras, T. C. Weng, J. Sellberg, M. J. Latimers, P. Glatzel,
P. H. Zwart, R. W. Grosse-Kunstleve, M. J. Bogan, M. Messerschmidt, G. J. Williams, S. Boutet, J. Messinger, A. Zouni, J. Yano, U. Bergmann, V. K. Yachandra, P. D. Adams
and N. K. Sauter: Nat. Methods 11, 545 (2014).
J. Kern, R. Alonso-Mori, R. Tran, J. Hattne, R. J. Gildea, N.
Echols, C. Glockner, J. Hellmich, H. Laksmono, R. G.
Sierra, B. Lassalle-Kaiser, S. Koroidov, A. Lampe, G. Y.
Han, S. Gul, D. DiFiore, D. Milathianaki, A. R. Fry, A.
Miahnahri, D. W. Schafer, M. Messerschmidt, M. M.
Seibert, J. E. Koglin, D. Sokaras, T. C. Weng, J. Sellberg,
M. J. Latimer, R. W. Grosse-Kunstleve, P. H. Zwart, W. E.
White, P. Glatzel, P. D. Adams, M. J. Bogan, G. J. Williams,
S. Boutet, J. Messinger, A. Zouni, N. K. Sauter, V. K.
Yachandra, U. Bergmann and J. Yano: Science 340, 491(2013).
C. Kupitz, S. Basu, I. Grotjohann, R. Fromme, N. A. Zatsepin, K. N. Rendek, M. S. Hunter, R. L. Shoeman, T. A.
White, D. J. Wang, D. James, J. H. Yang, D. E. Cobb, B.
Reeder, R. G. Sierra, H. G. Liu, A. Barty, A. L. Aquila, D.
Deponte, R. A. Kirian, S. Bari, J. J. Bergkamp, K. R. Beyerlein, M. J. Bogan, C. Caleman, T. C. Chao, C. E. Conrad, K.
M. Davis, H. Fleckenstein, L. Galli, S. P. Hau-Riege, S. Kassemeyer, H. Laksmono, M. N. Liang, L. Lomb, S. Marchesini, A. V. Martin, M. Messerschmidt, D. Milathianaki, K.
Nass, A. Ros, S. Roy-Chowdhury, K. Schmidt, M. Seibert, J.
Steinbrener, F. Stellato, L. F. Yan, C. Yoon, T. A. Moore, A.
L. Moore, Y. Pushkar, G. J. Williams, S. Boutet, R. B. Doak,U. Weierstall, M. Frank, H. N. Chapman, J. C. H. Spenceand P. Fromme: Nature 513, 261 (2014).
J. Kern, V. K. Yachandra and J. Yano: Curr. Opin. Struc.
Biol. 34, 87 (2015).
R. Alonso-Mori, J. Kern, R. J. Gildea, D. Sokaras, T. C.
Weng, B. Lassalle-Kaiser, R. Tran, J. Hattne, H. Laksmono,
J. Hellmich, C. Glockner, N. Echols, R. G. Sierra, D. W.
Schafer, J. Sellberg, C. Kenney, R. Herbst, J. Pines, P. Hart,
S. Herrmann, R. W. Grosse-Kunstleve, M. J. Latimer, A. R.
Fry, M. M. Messerschmidt, A. Miahnahri, M. M. Seibert, P.
H. Zwart, W. E. White, P. D. Adams, M. J. Bogan, S. Boutet, G. J. Williams, A. Zouni, J. Messinger, P. Glatzel, N. K.

14)

15)

16)

17)

Sauter, V. K. Yachandra, J. Yano and U. Bergmann: P. Natl.
Acad. Sci. USA 109, 19103 (2012).
R. Alonso-Mori, J. Kern, D. Sokaras, T. C. Weng, D.
Nordlund, R. Tran, P. Montanez, J. Delor, V. K. Yachandra,
J. Yano and U. Bergmann: Rev. Sci. Instrum. 83, 073114(2012).
J. Kern, R. Tran, R. Alonso-Mori, S. Koroidov, N. Echols, J.
Hattne, M. Ibrahim, S. Gul, H. Laksmono, R. G. Sierra, R. J.
Gildea, G. Han, J. Hellmich, B. Lassalle-Kaiser, R. Chatterjee, A. S. Brewster, C. A. Stan, C. Glockner, A. Lampe, D.
DiFiore, D. Milathianaki, A. R. Fry, M. M. Seibert, J. E.
Koglin, E. Gallo, J. Uhlig, D. Sokaras, T. C. Weng, P. H.
Zwart, D. E. Skinner, M. J. Bogan, M. Messerschmidt, P.
Glatzel, G. J. Williams, S. Boutet, P. D. Adams, A. Zouni, J.
Messinger, N. K. Sauter, U. Bergmann, J. Yano and V. K.
Yachandra: Nat. Commun. 5, 5371 (2014).
S. Gul, J. W. D. Ng, R. Alonso-Mori, J. Kern, D. Sokaras, E.
Anzenberg, B. Lassalle-Kaiser, Y. Gorlin, T.-C. Weng, P. H.
Zwart, J. Z. Zhang, U. Bergmann, V. K. Yachandra, T. F.
Jaramillo and J. Yano: Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 8901
(2015).
R. Mitzner, J. Rehanek, J. Kern, S. Gul, J. Hattne, T.
Taguchi, R. Alonso-Mori, R. Tran, C. Weniger, H. Schroder,
W. Quevedo, H. Laksmono, R. G. Sierra, G. Y. Han, B. Lassalle-Kaiser, S. Koroidov, K. Kubicek, S. Schreck, K. Kunnus, M. Brzhezinskaya, A. Firsov, M. P. Minitti, J. J. Turner, S. Moeller, N. K. Sauter, M. J. Bogan, D. Nordlund, W.
F. Schlotter, J. Messinger, A. Borovik, S. Techert, F. M. F.
de Groot, A. Fohlisch, A. Erko, U. Bergmann, V. K. Yachandra, P. Wernet and J. Yano: J. Phys. Chem. Lett. 4, 3641
(2013).

著者紹介
矢野淳子
Lawrence Berkeley National Laboratory,
Molecular Biophysics and Integrated
Bioimaging Division, Senior Scientist
E-mail: JYano＠lbl.gov
専門振動分光，生物物理化学，X 線分光［略歴］
広島大学生物圏科学研究科博士課程前期修了，広島大学生物生産学部助手，大阪大学
理学部高分子学科論文博士（理学），GoldaMeir Research Fellow, Lawrence Berkeley
National Laboratory 研究員を経て現職。
振動分光，生物物理化学。

放射光 July 2016 Vol.29 No.4 ● 219

X
ray spectroscopy and X
ray crystallography ofmetalloenzymes at XFELs
Junko YANO

Abstract

Molecular Biophysics and Integrated Bioimaging Division Lawrence Berkeley National
Laboratory
1 Cyclotron Road, Berkeley, CA 94720, USA

The ultra-bright femtosecond X-ray pulses provided by X-ray Free Electron Lasers (XFELs) open
capabilities for studying the structure and dynamics of a wide variety of biological and inorganic
systems beyond what is possible at synchrotron sources. Although the structure and chemistry at
the catalytic sites have been studied intensively in both biological and inorganic systems, a full understanding of the atomic-scale chemistry requires new approaches beyond the steady state X
ray crystallography and Xray spectroscopy at cryogenic temperatures. Following the dynamicchanges in the geometric and electronic structure at ambient conditions, while overcoming Xraydamage to the redox active catalytic center, is key for deriving reaction mechanisms. Such studies
become possible by using the intense and ultra-short femtosecond Xray pulses from an XFEL,
where sample is probed before it is damaged. We have developed methodology for simultaneously
collecting crystallography data and Xray emission spectra, using an energy dispersive spectrometer at ambient conditions. In addition, we have developed a way to collect metal Ledge data ofdilute samples using soft Xrays at XFELs. The advantages and challenges of these methods will
be described in this review.

220 ● 放射光 July 2016 Vol.29 No.4