トピックス
細胞内の巨大な分子モーター「ダイニン」の構造解析
大山拓次
山梨大学生命環境学部〒4008510 山梨県甲府市武田 4437

栗栖源嗣
大阪大学蛋白質研究所

昆

隆英

大阪大学理学研究科

要 旨〒5650871 大阪府吹田市山田丘 32〒5600043 大阪府豊中市待兼山町 11

ダイニンは AAA＋ ファミリーに属する巨大なモータータンパク質であり，繊毛運動，細胞分裂，細胞遊走，細胞内物質輸送といった細胞イベントにて重要な役割を果たす。我々は質量380 kDa におよぶ細胞性粘菌由来細胞質ダイ
ニンモータードメインの完全な結晶構造を原子レベルで決定した。この構造から AAA＋ リングに結合したヌクレオチドの結合様式，新規に見出されたリングとリンカーの相互作用，さらにはリングとストークとの間の連結構造など，ダイニンの構造機能相関を理解するために重要な事実が明らかとなった。

主に利用することで 2.8 Å での構造解析に成功した巨大

1. はじめにモータータンパク質ダイニン（ Dynein ）の研究過程を紹

私たちの体を構成する個々の細胞の中では，高度に組織介する1)。

化され制御された膨大な種類の生物学的プロセスが進行し，その総和として生命活動が成り立っている。これら生
物学的プロセスの中核をなすのは，数千種類に及ぶタンパ
ク質複合体であり，各々に固有の立体構造が反応の特異性

2. 細胞中心方向への輸送エンジン「ダイニン」とはを決定するとともに，反応の高度な制御を可能にしてい私たちの体を構成する 37 兆個に及ぶ個々の細胞の中でる。そのため，生命活動を物理学化学的プロセスと捉は，細胞骨格系分子モーターと呼ばれる三種類のタンパクえ，その詳細を完全に理解するためには，タンパク質分子

質ファミリー―ミオシン，キネシン，そしてダイニン―が，の立体構造を高空間分解能で解明することが必須である。

ATP 加水分解で放出される化学エネルギーを力学的仕事

X 線結晶構造解析法は，この目的を達成できる最も強力へと変換することで，生命活動の基盤となる多種多様な生な手法の一つであり，現在までにおおよそ 10 万種類に及体運動を駆動している。なかでもダイニンは，細胞内に張ぶ生体高分子の立体構造解析に用いられてきた。その結り巡らされた微小管レール上をそのマイナス端方向（一般

果，多種多様な生命活動の原子レベルでの理解に多大に貢

的には細胞中心方向）へ直進運動することで，極めて多様献してきたことは広く知られているとおりである。

な細胞内機能を担っている2,3) 。その第一の機能は細胞内

しかし，生物学的に極めて重要であるにも関わらず，関物質輸送であり，様々なタンパク質 RNA 複合体，膜小与するタンパク質複合体の詳細な立体構造が明らかにされ胞，核やミトコンドリアなどの細胞小器官，そしてウイルていないため，謎に包まれている生物学的プロセスはいまスの輸送と配置に必須の役割を果たす。また，細胞小器官

だに相当数残されているのが現状である。 X 線結晶学での形成や維持管理にも重要で，繊毛鞭毛，エンドソー

は，一般に対象とする分子が巨大で複雑であればあるほム，ゴルジ体などはダイニンの機能なくして正常には機能

ど，柔軟であればあるほど構造解析の難易度は飛躍的に高しない。さらに，ダイニンの機能は，核膜崩壊紡錘体形

くなる。巨大タンパク質あるいは超分子複合体では，構造

成染色体分離などの細胞分裂の重要過程や成長円錐形成

解析に至るすべてのステップ―遺伝子組換えタンパク質の神経細胞移動など神経ネットワーク形成過程にも重要で大量発現精製系，結晶化条件と結晶化後処理条件，重原あることが示されている。これらダイニンの細胞内機能

子誘導体の調製法，そして放射光施設での回折データ収集

は，私たちが生きていくうえで必須なもので，その機能が法―が最高レベルで最適化されて初めて構造解析が達成さ部分的にでも失われると脳神経系疾病や発生異常などにつれることが多い。本稿では，その一例として， SPring 8

ながると考えられている。

生体超分子複合体構造解析ビームライン（ BL44XU ）を

このように多様な細胞内機能の共通のエンジンとして機82 ● 放射光 March 2016 Vol.29 No.2
(C) 2016 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

トピックス ■ 細胞内の巨大な分子モーター「ダイニン」の構造解析能するダイニンであるが，どのようなしくみで運動活性を発揮しているのかという根本的な問題については，分子が発見されてから半世紀以上が経つにもかかわらず，多くの未解決課題が残されている。ダイニンのメカニズム研究を困難にしてきた主要因のひとつは，その高分解能構造情報が十分ではないことにあった。ダイニンは，質量 1,000
kDa を超える分子としての巨大さと，多数のサブユニッ

トからなり複数の ATP 加水分解部位を有するといった分子としての複雑さゆえに高分解能構造解析が困難であり，私たちの構造的知見は，最近まで主に低分解能電子顕微鏡
解析に依存している状況にあった。このような状況を乗りFig. 1

Cartoon representation of the dynein motor complex.

越え，ダイニン運動メカニズムの分子レベルでの理解を進めるために，筆者らは 2004 年ごろからダイニン分子の X
線結晶構造解析に取り組んできた。

散性の高い，良質な試料であることが示唆された。
しかし，この最小モータードメインであっても，結晶構

3. ダイニンの試料調製
ダイニンの構造研究を開始した段階での，最大の問題点

造解析達成に至る過程には相当な困難を伴うことが予想された。ダイニン MD は，約3,300アミノ酸残基長という，それまで構造解析されたことがないほどの長大なポリペプ

は，遺伝子組換え体の大量発現系が確立されていないこと

チド鎖である。また， ATP 加水分解過程で構造を大きくであった。タンパク質超分子複合体の X 線結晶構造解析

変化させる柔軟性を持つことや，いびつな分子形状を示す

では，構造解析に適したタンパク質試料のデザイン，高純など，難結晶性タンパク質複合体に良く見られる特徴を示

度精製，重原子誘導体調製などの重要過程のハードルを，すことが電子顕微鏡構造解析から示唆されていた8) 。ま

組換え体大量発現系なしに乗り越えることは難しい。そこ

た，ダイニン MD を凍結保存できないことも大きな問題

で，筆者らはこの点から検討を開始し，細胞性粘菌（Dic-であった。さまざまな凍結条件を検討したが，ダイニンを

tyostelium discoideum ）を発現ホストとして，細胞性粘菌

安定して凍結保存する条件を確立することができなかった由来ダイニンをテトラサイクリン誘導発現制御系を用いてため，ダイニンタンパク質の精製を繰り返し行い，安定性

一過的に大量発現させる系を確立することで，高純度の組が保証される 3 日以内に結晶化実験に供することとなっ換えダイニンを結晶化条件検討に必要な量得ることに成功た。2.8 Å での構造解析を達成するまでの約 6 年間，延べした4,5) 。得られた精製組換えダイニンは，生体組織から数にして精製を200回以上繰り返すことが必要だった。

単離 された 天然 のダイ ニン と同程 度のモ ータ ー活 性やATP 加水分解活性を発揮することが明らかになり， 1965

年 に Gibbons と Rowe に よ り ダ イ ニ ン が 発 見 さ れ て 以来6)，約40年を経てようやく組換えダイニンを用いた構造研究が可能な状況となった。

4. 結晶化と結晶改良
筆者らは，約 30,000 条件を探索することで，わずか 1
種類ではあるが，幸運なことにダイニン MD の単結晶を

次の課題は，ダイニンの最小モーター領域を決定するこ

安定して得られる条件を確立することができた。しかし，とであった。ダイニン分子は，コア複合体と呼ばれる中核得られた結晶の X 線回折能は最高でも10 Å 程度と十分で領域だけでも12個のサブユニットからなる1,500 kDa にもはなく，構造解析を達成するには大幅な結晶性改良が必要

及ぶ巨大な超分子複合体であり（Fig. 1），サブユニット構な状況であった。

成が非均一であることなどから，天然の状態での結晶化はタンパク質結晶構造解析では，このような場合，別の新極めて困難であることが予想された。そこで筆者らは，上規結晶化条件を探索する，あるいは別の生物種由来の同等

記組換え体発現系を利用して，ダイニンの本質的なモータンパク質（オルソログ）の結晶化を試みるなど，より良ター活性を保持している最小領域を検討した。その結果，質な新規結晶を探索するアプローチが一般的である。しかダイニン複合体中の最大のサブユニットである「重鎖」のし，ダイニン MD の場合，これらのアプローチは現実的

C 末端側約 2 / 3 の領域のみで，微小管モーターとして十ではなかったため，ダイニン MD のさまざまな変異体の分に機能することを見出した5,7) 。このダイニンモーター

結晶に対して，多様な結晶化後処理を施すことで，結晶改ドメイン（以下，「ダイニン MD 」と略す）は，ダイニン良を試みることにした。具体的には，機能解析に用いた数複合体の他のサブユニットへの結合領域を全て欠損してい十種類のダイニン変異体各々について，まず順次結晶化検るため，単一ポリペプチド鎖単量体として存在し，精密ゲ討を行い，次に約 30 種類の抗凍結化脱水化剤による結ルろ過分析や動的光散乱分析などの結果から，均一で単分晶化後処理を様々な組み合わせで施した後に，その効果を

放射光 March 2016 Vol.29 No.2 ●83

Fig. 2

A crystal of the dynein motor domain and improvement of diŠraction quality.

SPring 8 生 体 超 分 子 複 合 体 構 造 解 析 ビ ー ム ラ イ ン

問題となったのは，極低温条件下にも関わらず，ダイニン（ BL44XU）で評価することで，変異体選別と結晶化後処

MD 結晶は容易に放射線損傷を受けることだった。この結理条件の最適化を行った。最終的に見出された最良の条件

晶は空間群 P212121 に属しており，最低でも全振動範囲90は，ダイニン MD の微小管結合部位欠失変異体（Fig. 1 お°の回折データの収集が必要となる。しかし，回折データ

よび Fig. 4 参照）の結晶に対して，まず平均分子量 8,000の統計値から判断して十分な反射強度を得られる測定条件のポリエチレングリコール（PEG8000）を 8まで約 1

では 1 箇所につき，振動範囲わずか10°程度のイメージし

刻みで添加していき，次に PEG400を30まで 5刻みでか集められなかった。また，脱水処理に起因する結晶格子

添加し，最後に－180°
Cの窒素ガス流で急速凍結させるとの非均一性も大きな問題で，特に c 軸については結晶ごというものであった。この「脱水処理」によって，結晶の回に約 10 Å ものばらつきが見られた。これらの問題は，単折能は 2.8 Å にまで劇的に改善されることになった（ Fig.

一の良質な結晶に対して X 線照射位置を変えながら一気2）。ここで特筆すべきは，この劇的な脱水効果は極めて限に全データを取得するヘリカルスキャン法9)で解決するこ

定された条件下のみで起こるということである。回折能向と が で き た 。 な お ， X 線 が 高 強 度 ， 高 輝 度 化 する に つ

上のためには，PEG8000の終濃度を 8の代わりに 6あれ，結晶が受ける深刻なダメージの問題はより広く知られるいは10に変更する，あるいは PEG400の濃度上昇を 5るようになり，現在の放射光ビームラインでは，ヘリカル

ではなく 1刻みに変更するなどの，わずかな条件変更

スキャンモードが標準で備わっている。

でさえも許容されなかったのである。ダイニンのような巨

この段階で，重原子誘導体を用いた初期位相決定の検討

大な超分子複合体の構造解析の過程では，ここに示すようも開始した。巨大超分子複合体の初期位相決定には，極めな膨大な種類の条件検討を地道に行うことが必要な場合がて強い異常分散効果が得られるタンタルクラスター

多く，強力な X 線による迅速かつ精密な評価が可能な放（Ta6Br12）やタングステンクラスター（PW12O40）の導入

射光施設なくして，本研究を進めることは不可能であったが有効とされ，リボソームや RNA ポリメラーゼの構造決と思われる。

定に大きな役割を果たしてきた10,11) 。ダイニン MD 結晶
では，脱水化処理を施した後の結晶に対する Ta6Br12 処理

5. X 線回折データ収集から中分解能構造解析が特に有効で，単波長異常分散法（ SAD 法）を適用する
ことで，主要な a へリックスを明確に区別できる程度の電子密度を得ることができた。さらに， PW12O40 クラス

上記ダイニン MD と脱水処理を組み合わせることで，ターを導入した誘導体結晶も用いて多重同型置換法

良好な回折能を示す単結晶が得られるようになったが，そ（ MIRAS 法）を適用したが，金属クラスター誘導体を用の回折データ収集についても最適化が必要であった。特にいた構造解析では，クラスター分子の位置は容易に決めら

84 ● 放射光 March 2016 Vol.29 No.2

トピックス ■ 細胞内の巨大な分子モーター「ダイニン」の構造解析れるが，精度の良い位相決定に必要なクラスター中の各金
属原子の位置決定は難しいため，位相決定への寄与は限定的だった。そのため，ダイニン MD では金属クラスター
のみを用いた構造解析は4.5 Å 分解能が限界であり，原子モデルは a へリックスのみからなるポリアラニンモデルの構築に留まり，各アミノ酸残基の位置を特定できなかった12)。

6. 高分解能構造解析
上述のように，ダイニン MD 結晶の回折能は2.8 Å 分解能に達していたため，より高分解能の構造解析を成功させるための最大の課題は，精密な位相情報をいかにして得るかにあった。そこで，筆者らは，成功例が多数報告されているセレノメチオニン（SeMet）置換体結晶を用いた位相決定を試みることにした。 SeMet 置換体タンパク質の調
製方法は大腸菌発現系やいくつかの真核細胞発現系では確立されている。しかし，本研究でダイニン発現系として用いている細胞性粘菌では，報告例が皆無であったため，新規に発現系開発を行った。細胞性粘菌では， SeMet の細胞毒性が非常に高いことが判明したため，メチオニン代謝系を遺伝子工学的に改変するなど様々な方法でこの問題の回避を試みた。しかし，最終的に良好に機能したのはより原始的な方法―細胞性粘菌を十分に生育させた後にダイニンの発現を誘導し，同時に高濃度 SeMet を投入する―というものであった。この方法によって，細胞性粘菌は 16時間以内に死滅するが，位相改善に有用な SeMet 置換体
ダイニンを安定して得ることができた。
金 属クラ スター 誘導体 と SeMet 置換 体の 回折デ ータ
は，互いに長所が短所を補完しあう。 SeMet 誘導体中の個々の Se 原子シグナルは弱く，巨大タンパク質の構造解
析では初期位相の計算には適さないが，逆に信頼できる初期位相があれば正確な Se の位置を決定することが可能となり，高分解能域のデータに正しい位相を与える。さらにSe はメチオニン残基の位置を示すため，主鎖トレースにおいて重要な鍵となる。ダイニン MD 結晶は非対称単位
中の 2 分子で計138個のメチオニン残基を含むが，そのう
ち 121 個の Se の位置を，タンタルクラスター誘導体からFig. 3(Color online) Electron density maps of the dynein motor
domain. (a) An anomalous diŠerence Fourier map (contoured at 3s) of the SeMet derivative calculated using theTa6Br14 SAD phases. (b) The MIRAS phases including the
SeMet derivative gave an improved experimental electron
density map (lower panel) as compared to the SAD phases(upper panel). The improvement was the most prominent
for the bsheet structures. (c) The ˆnal omit F0Fc electron
density map for the bound ADP molecule (3s ).

得られた初期位相を用いて計算した異常分散差フーリエマップから決定することが出来た（ Fig. 3a ）。闇夜の森から
幼いヘンゼルとグレーテルを家まで導いた月光に光る小石することができたのである（Fig. 3b）。

のように，電子密度マップ上に散りばめられた Se のシグ

高精度の電子密度マップを得られれば，配列を基にアミナルは主鎖トレースにおける宝の地図となる。次にダイニノ酸残基の位置と側鎖構造を決めることができる。そのプン MD の Native, Ta6Br12 誘導体および SeMet 置換体の 3

ロセスは通常のタンパク質結晶構造解析と同じであるが，データセットを用いた MIRAS 法による位相計算を行っダイニン MD は約3,300アミノ酸残基からなる桁違いに巨た。計算の結果得られた実験電子密度マップは，予想を遥

大なポリペプチド鎖であり，しかも，結晶の非対称単位中

かに超えた高いクオリティを示した。例えば，4.5 Å 分解に 2 分子存在していることが，解析を複雑なものにして能解析ではマップが不明瞭でモデルを構築できなかった

いた。近年の洗練されたプログラムを駆使すれば，タンパb シートの構造も，高分解能マップ中でははっきり確認

ク質分子中のほぼ全てアミノ酸残基モデルを自動構築でき

放射光 March 2016 Vol.29 No.2 ●85

X-ray diŠraction data collection and reˆnement.

る場合もあるが，それはさらに高い分解能での解析に限ら

Table 1れる。ダイニン MD では，中分解能から劇的に改善されData collection

たとはいえ2.8 Å 分解能であり，全てのアミノ酸残基を手Dynein MD

3.8

Mutantdynein2.8

Ta6Br14

3.5

る ATP 加水分解領域は既知構造と相同性があり，アミノ

PW12O403.5

酸配置が予想できる箇所もあっため，この領域からモデル

SeMet

3.5

Observed/ CompletenessRmergeunique()()Re‰ections
518853/99.4( 92.3)a 7.8(39.7)
88530
1150120/98.3( 81.9) 9.2(77.9)
2094881670277/()()
110724 100.0 100.0 15.8 67.1
784176/()()
111160 100.0 100.0 14.2 86.2/
673900() 8.7(27.5)111290 100.0 99.9

Derivative

Riso

Numberof sitesの 2 分子（ A 分子と B 分子）の構造は本質的には同じで

Ta6Br14PW12O40
SeMet

16.2
28.0
14.2

4
2
121

ある こ とが 判 明し たた め ， A 分子 の 構造 を B 分 子に コ

Structure reˆnement

Resolution(Å )動で構築する必要があった。
何も無いところから 3,300アミノ酸残基を構築するとなれば，モデル構築は非常に長い道のりとなるが，幸いモデ
ル構築の材料が幾つも揃っていた。まず，中分解能解析で得たポリアラニンモデルがあり，サブドメインの配置とトポロジーは概ね把握できていた。また，分子中心に位置す

構築を始めた。特にアミノ酸配列と構造の関連の高い部分
を足掛かりとすることで，わずか 1 週間ほどで約700個の

MIRAS phasing

アミノ酸残基を構築もしくはアミノ酸残基の種類を帰属することができた。この700残基を含め，1 分子中の2,050残基のモデルを構築した時点で実験マップに基づくモデル構
築は収束した。電子密度を精査すると，結晶非対称単位中ピーして新たな電子密度改良計算を行った。この計算では
主に CCP4 の溶媒平滑化，ヒストグラムマッチング，2 分子間の電子密度平均化といったオプションを用いた。マップは有意に改良され， ATP 加水分解領域以外のダイニン
固有の構造領域のモデル構築が進み始めた。1 分子当たりの構築/帰属アミノ酸数が2,100/850個に到達した段階で，
MIRAS 位相（実験位相）と部分モデルから得られる計算

Dynein MD
MutantdyneinPhasing
power(centric/
acentric)
1.07/0.96
0.51/0.39
0.19/0.24

Figureof merit(centric/
acentric)

0.18/0.26

Resolution Total atoms(solvent
R/free Rb(Å )atoms)
3.8
46130( 0) 22.1/29.4

0.003/0.72

45241(45)0.010/1.42

2.8

26.3/32.1

Rmsd(bond/
angle)

a Values in parentheses indicate statistics for the highest resolu
tion shells.
b Free R factor was calculated using 5 of data.


位相の組み合わせ（ phase combination ）と呼ばれるオプ
ションも追加した。この計算でも有意に電子密度が改良され，モデル構築がさらに進展した。
1 分子当たりの構築/帰属アミノ酸残基数が約 2,400 /は完了とした（ Table 1 ）。モデル構築開始から約 4 か月後のことであった。

1,100個に到達した段階で，結晶学的精密化計算を開始し一方，野生型ダイニン MD についても上述の変異体ダた。精密化計算が順調に進めば電子密度が劇的に改善さイニン MD と並行して実験を継続し，分解能は3.8 Å まで

れ，モデル構築は加速度的に進む。一方，初期モデルの質改善され，変異体ダイニン MD をサーチモデルとした分が低いと計算はうまくいかず，実験マップに戻り，モデル

子置換法により初期構造を決定した。その後，ドメイン単の改善を余儀なくされる。つまり，初期の精密化計算が成位の rigid body reˆnement に続き，二次構造をベースと功するかどうかは解析終了までに要する時間を大きく左右した小セグメント単位での電子密度マップへのフィッティ

する。幸い，最初の計算後の R/free R 因子は0.373/0.425

ングを行った。精密化計算では，二次構造が崩れにくいオと良好であった。また，精密化計算で得られる新たなマップション（プログラム CNS の DEN: Deformable Elastic

プは実験マップよりも格段に精度が良くなり，モデル構築

Network ）を用いた。変異体ダイニン MD で欠失させたも加速された。ダイニン分子に結合している ATP / ADP

微小管結合部位は，ホモロジーモデルを作成してマップに分子については，構造解析の初期段階から確認できていた

フィットした。最終構造は， 1 分子当たり約 2,900 個（ダが，精密化計算が進むにつれて電子密度マップ中でそのコイニン MD の約 86 ）のアミノ酸残基を含んでいた。野ンフォメーションが特定できるほど鮮明なものとなった

生型および変異体ダイニン MD の構造には大きな違いは（ Fig. 3c ）。解析終盤では， 100 アミノ酸残基に及ぶ長いコ

無く，微小管結合部位を除く大部分について，高分解能のイルドコイル領域のアミノ酸残基も帰属が可能となった。

変異体ダイニン MD にもとづき運動メカニズムを議論可このようなプロセスを経て 1 分子当たりの構築アミノ酸能である。なお，筆者らは，微小管結合部位およびそれに残基数が約2,900（ダイニン MD の89）に達し，全ての繋がるコイルドコイルを含む領域については，別途結晶構

ア ミ ノ 酸 残 基の 種 類 を 帰 属 し ， R / free R 因 子 が 0.265 /造を決定し，分子動力学シミュレーションと併せて微小管

0.322で収束した段階で変異体ダイニン MD の精密化計算との相互作用について詳しく議論している13)。

86 ● 放射光 March 2016 Vol.29 No.2

トピックス ■ 細胞内の巨大な分子モーター「ダイニン」の構造解析

7. 結晶構造から見えてきたこと＋（

ニットとして機能する「リンカー」で， 19本の a へリッ
クスと 8 本の b ストランドからなるロッド状の構造体とATPases associated with diverse

して，リングのおもて面を跨ぐように横たわっている。リ

cellular activities）と呼ばれる ATP 加水分解酵素ファミ

ンカーは，リング上をスイング運動することで，ダイニン

リーのメンバーである14) 。このファミリーに含まれるタの力発生と微小管上の変位運動を生み出すと考えられていンパク質は，リング状に配置される 67 個の ATP 加水分

る16,17)。

ダイニンは，AAA

解ドメインを持つことを共通の構造的特徴としているが，ダイニン MD の結晶構造からもたらされた重要知見とその名のとおり，個々ファミリーメンバーの細胞内機能はしては，まず， ATP 加水分解を担うリングとエネルギー

多岐に渡る。機能的共通性を挙げるとすれば， ATP の加源である ATP / ADP 分子との結合様式が原子レベルで明

水分解を利用してターゲットとするタンパク質DNA のらかになったことが挙げられる（ Fig. 4b ）。ダイニン MD

構造をほどく，あるいは歪めるといった機械的仕事を担うには 4 個の ATP / ADP 結合部位が存在することが直接示ことである15)。

され，構造に基づく速度論的機能解析により，そのうち 1

今 回 明 ら か に な っ た ダ イ ニ ン MD の 結 晶 構 造 は ，個がダイニンモーターを直接駆動すること，また，残り 3

AAA＋ ファミリーとしての構造的特徴を如実に示すもの

個がダイニンのモーター活性の制御を担うことが明らかにだった1)（Fig. 4a）。ダイニン MD の中心となる ATP 加水なった。さらに， ATP 加水分解を力学的運動に変換する

分解ユニット「リング」は， AAA＋ タンパク質に特徴的

上で鍵となる，リングとリンカーやストークをつなぐ構造

な ATP 加水分解モジュールを 6 個（AAA1AAA6）含み，が明らかになったことも重要である。

これらがおもて面から見て時計回りに配置されることで，特に興味深いのは，ダイニンが AAA＋ タンパク質に共直径 130 Å ，厚さ 65 Å ，中心孔径 35 Å の大きなリング構

通の「リモデリング機構」をモーター活性発揮に利用して造が形作られている。このリング構造には，ダイニン特有いることを示唆するリングリンカー間の相互作用様式での構造機能ユニットが 2 個付随している。ひとつは，微ある（ Fig. 4c ）。本結晶構造では，リングとリンカーの相

小管結合ユニットとして機能する「ストーク」で，リング互作用は極めて限定的で，リングから飛び出した二つのから飛び出した長さ100 Å に及ぶ長大なコイルドコイル構

ループ構造が主要な相互作用部位であり，リンカーの最も造から成っている。ダイニンの微小管結合部位は，ストー

細い部分を挟み込むように結合している。これら特徴的な

ク先端の小さな球状領域である。もうひとつは，力発生ユループ構造は，一部の AAA＋ タンパク質に共通して見らFig. 4(Color online) The atomic structure of the dynein motor domain. (a) Overall structure is shown as a ribbon
representation. The stalk and linker are highlighted with diŠerent colors. A dashed line indicates the disordered
portion connecting the stalk and the microtubule binding domain. (b) The nucleotide binding to the AAA＋ ATPase ring. The four bound nucleotide molecules are shown as thick stick models with the six AAA＋ modules
colored separately. (c) Side view showing the ring-linker interaction. The close-up view of the contact region is
also shown. The two linker-interacting loops are highlighted by arrows.

放射光 March 2016 Vol.29 No.2 ●87

れるもので，各々のターゲット分子に直接相互作用し構造

んだ構造など，輸送システムを構成するより高次な複合体

変化を引き起こすリモデリングインターフェースとして働構造を高分解能で構造解析していくことも必要である。筆くことが知られている18) 。ダイニンは，この共通のイン者らは，大型放射光施設を利用した X 線結晶学と近年革ターフェースを利用してモーター活性を発揮しているのか

命的進展を遂げている極低温電子顕微鏡法を組み合わせたもしれない。 ATP 加水分解過程で，二つのループ構造がアプローチにより，これらの課題を一歩一歩解明していき

リンカーをキャッチしその構造を変化させる，すなわちリたいと考えている。

ンカー構造をほどいて曲げることでリンカーのスイング運
動を引き起こすのではないだろうか。実際，極低温電子顕謝辞

微鏡像単粒子解析の結果19) や，ループ構造の変異体解析

本研究は，SPring8 BL44XU および，高エネルギー加の結果1)もこの「リンカーリモデリング仮説」を支持して

速器研究機構 PF 17A ビームラインの関係者の方々ならいる。

びに，大阪大学蛋白質研究所の諸先生方をはじめとする多くの研究者の方々の支援があって初めて達成されたもので

8. 今後の展開ある。紙面をお借りして御礼申し上げる。

参考文献

本 稿で は ， 2012 年 に達 成し た 細胞 性粘 菌 のダ イニ ン
MD の2.8 Å 分解能の構造解析の過程を詳述したが，その後，ダイニン中核領域の高分解能構造解析は急速な進展を見せている。筆者らの報告の直後には3.3 Å 分解能の出芽
酵母のダイニン MD 結晶構造20)，そして2015年には3.4 Å
分解能のヒトダイニン2 MD の結晶構造21) と，アミノ酸残基レベルの信頼性を有するダイニンの原子構造が相次いで報告されている。現在では，これら 3 種類の結晶構造を比較することで，ダイニンの力発生機構の概略を議論することが可能となっている。
しかし，ダイニンをエンジンとする細胞内物質輸送シス
テムの全貌を理解するために，今後明らかにしなくてはな
らない構造生物学的課題は極めて多い。まず，中核をなす
ダイニン MD の力発生機構の完全解明のためには，さらに多くの反応中間状態の原子構造が必要である。また，今回原子構造が明らかになったダイニン MD は，ダイニン
輸送複合体の一部をなすにしか過ぎないため，ダイニン複合体の全体構造，レールである微小管との結合構造，運動活性調節タンパク質との結合構造，さらに多様な積荷を積88 ● 放射光 March 2016 Vol.29 No.2

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トピックス ■ 細胞内の巨大な分子モーター「ダイニン」の構造解析

著者紹介
大山拓次

昆

山梨大学生命環境学部 准教授
E-mail: takujio＠yamanashi.ac.jp
専門構造生物学［略歴］
1999 年 3 月 大阪府立大学大学院農学研究科博士後期課程修了。 1999 年 4 月 生物分子工学研究所ポストドクトラルフェロー。
2001 年 4 月 同研究所研究員。 2005 年 4 月
同研究所主任研究員。 2005 年 10 月 大阪大学蛋白質研究所寄附研究部門助教。 2008
年 10 月 同研究所特任研究員。 2012 年 4 月
山梨大学生命環境学部助教。 2015 年 4 月より現職。

大阪大学 大学院理学研究科 生物科学専
攻 教授
E-mail: takahide.kon＠bio.sci.osaka-u.ac.
jp
専門生物物理学タンパク質科学［略歴］
2000 年 3 月 東京大学大学院総合文化研究科博士課程修了。 2000 年 4 月 同研究科助手。2007年 4 月 同研究科助教。 2010年11月 大阪大学蛋白質研究所准教授。 2012 年
10 月 JST さ き が け 研 究 者 兼 任 。 2013 年
法政大学生命科学部教授。 2015 年 4 月よ
り現職。

隆英

栗栖源嗣
大阪大学 蛋白質研究所 教授
E-mail: gkurisu＠protein.osaka-u.ac.jp
専門構造生物化学，蛋白質結晶学［略歴］
1997 年 3 月 大阪大学大学院工学研究科博士後期課程修了。 1997 年 4 月 大阪大学蛋
白質研究所助手。この間， 2002 年 4 月から2003年10月まで米国 Purdue 大学で在外研究。 2004 年 4 月 東京大学大学院総合文化研究科助教授（ 2007 年 4 月より名称変
更により准教授）。2009年 4 月より現職。

Structural analysis of ``dynein'', a huge molecularmotor working in the cells
Takuji OYAMA

Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Yamanashi
4437 Taketa, Kofu, Yamanashi 4008510

Genji KURISU

Institute for Protein Research, Osaka University
32 Yamadaoka, Suita, Osaka 5650871

Takahide KON

Graduate School of Science, Osaka University
11 Machikaneyama, Toyonaka, Osaka 5600043

Abstract

Dynein is a huge molecular, microtubule-based motor complex belonging to the AAA＋ superfamily, and powers important cellular events such as ciliary beating, cell division, cell migration and intracellular transport. We have determined the complete structure of the 380kDa motor domainfrom Dictyostelium discoideum cytoplasmic dynein at atomic level. The structure provides a number of important aspects to understand the structure-function relationship, which includes thecoordination of the bound nucleotides in the four nucleotide-binding sites in the ring-shaped AAA＋
ATPase unit, a newly identiˆed interaction interface between the ring and mechanical linker, andjunction structures between the ring and microtubule-binding stalk.

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