ラクトフェリンは免疫アジュバント
腸溶性ラクトフェリン研究会
常任理事

安藤邦雄

本誌 2～3 月号で遺伝子組換ヒト・ラクトフェリン（Talactoferrin; TLF）が米国で非小細胞肺癌に対する治療効果を検証するため第三相臨床試験に入ったことを報告した。白金錯体/タキソールと併用した末期の非小細胞肺癌に対する臨床第二相の二重盲検試験において、TLF の経口投与(一日 3g、2 回分服)が有意な改善効果を示したからである。非小細胞肺癌末期のステージⅢb～Ⅳ患者を治療する第一選択は、白金錯体/タキサン系抗癌剤の併用である。これに TLF を付加すると、対照群と比べ①有効率の向上、②延命効果、③副作用の軽減等が認められた。また、TLF 単独使用の場合も、有意な延命効果が認められている。
作用機作は小腸パイエル板から吸収された TLF が、担がん患者の樹状細胞を成熟/活性化させ、癌を免疫的に破壊するエフェクター細胞、NK、NK-T 細胞及び CD4+、CD8+リンパ球を賦活するためとされている。つまり、TLF はエフェクター細胞の癌抗原に対する認識を高めるアジュバントとして抗癌作用を発揮するらしい。そこで今回は、ラクトフェリンのアジュバント効果について説明する。
ラクトフェリンは BCG の効果をたかめるアジュバント
東欧のポーランドは、1980 年代から Zimecki 博士が中心となってラクトフェリン研究に取り組んできた。彼の弟子数人は米国テキサス州ヒューストンに移住し、米国におけるラクトフェリン研究センターの一つになっている。昨年、ポーランドグループの Kruzel, Actor等はラクトフェリンが BCG の抗結核効果を増強するアジュバントであることを報告しているの紹介する(1)。
BCG は 1921 年、フランスのカルメットとゲランが経代培養を繰り返して弱毒化したウシ型結核菌で、結核予防用ワクチンとして実用化されている。その後、BCG を改良する幾多の試みは、ことごとく失敗に終わり(2)、今にいたるまで最初に導入された菌株がワクチンとして使われている。二の腕に瘢痕化した BCG 注射跡をお持ちの年配の読者が多数おられることだろう。乳児期～学齢期に BCG 注射を受けた名残である。かって我が国では肺結核は青年層の死亡原因第一位をしめ、亡国病といわれた時代があった。いつの間にか結核菌はおとなしくなり、現在では昔日の面影がない。
この研究の目的はラクトフェリンが BCG の感染防御効果を増強するかどうか検証することである。Actor 等は BCG をフロイント不完全アジュバントあるいは生理食塩水に懸濁して C57BL/6J マウスを免疫し、一定時間後に強毒の結核菌（エルドマン株）を経鼻感染させて、免疫時のラクトフェリンの付加が感染経過にどう影響するかを観察した。膨大な実験なので、フロイントの不完全アジュバントで懸濁して免疫した場合に限り紹介する。
図 1 は BCG を予防接種したマウスに結核菌強毒株を経鼻感染させた際における肺及び脾臓の結核菌数を示す。図**図 1．結核菌の経鼻感染マ菌数（Log CFU/organ)6

ウスにおける肺(上段)及び脾臓(下段)の生菌数

5BCG(106 CFU/mouse) で 免 疫4し、2 週間後に強毒結核菌(エル32菌数（Log CFU/organ)5てマウスに免疫すると、させ 28 日目に肺と脾臓の生菌ト型結核菌の菌数を有意数を計測した。ラクトフェリンに減少させた。BCG に添加するラクトフェリンの尾の基部に皮下注射した。図は有無が臓器の菌数に及ぼ

Mean ± SE ． **P<0.01 andす影響については、肺で***P<0.001 in Student’s t-test
N=44ュバント（IFA）に懸濁し肺及び脾臓に感染したヒ不完全アジュバントに混合し、***をフロイント不完全アジドマン株<100 CFU)を経鼻感染

は 100g/mouse をフロイント

6から明らかなように BCG

は影響がないが脾臓ではラクトフェリンを添加すると臓器あたりの菌数が3減少した。データは省略
2するが、BCG を生理食塩
非免疫対照

BCG免疫＋LF

BCG免疫対照

水に懸濁して予防接種した場合でも、BCG-ラクトフェリン群のほうが BCG単独と比べ菌数が少なかった。BCG 予防接種の感染防御効果は明らかだが、ラクトフェリンが BCG の感染防御能を増強するかどうかは明らかでない。
結核の感染経図２．BCG とラクトフェリンで免疫したマウス肺の病理所見

路はほとんどBCG(106 CFU/mouse)で免疫し、2 週間後に強毒結核菌(エルドマン株<100 CFU)を経気道性であ経 鼻 感 染 さ せ 28 日 目 に 肺 と 脾 臓 の 生 菌 数 を 計 測 し た 。 ラ ク ト フ ェ リ ン は100g/mouse をフロイント不完全アジュバントに混合し、尾の基部に皮下注射した。

る。一般にごく

図左；非免疫対照、図中；BCG/IFA で免疫、図右；BCG/ラクトフェリン/IFA で免少量の結核菌疫。ヘマトキシリン・エオジン染色(40 倍)。一群 6 頭のマウスから選んだ代表例。

が気道深く侵入して肺胞内に達し、肺胞マクロファージ中で増殖を始める。マクロファージは細胞内寄生菌に対しては自然抵抗性を持っているが、結核菌のような強毒菌は細胞の抗菌作用を破壊し、菌が増殖して細胞は死滅しする。死細胞は他のマクロファージによって貪食されてさらに菌は増殖を続け、肺に定着して初感染病巣を形成する。この間に、マクロファージによって結核菌の抗原提示を受けた T リンパ球が特異的に感作され、免疫が成立する。感作 T 細胞は抗原刺激によって多種類のインターロイキンを産生し、これによって活性化したマクロファージが結核菌の局在する病巣部分に集積し、類上皮細胞肉芽腫組織となって病巣は被包され、やがて乾酪化に陥る。図 2、左の濃く赤紫色に染まる部分は、上記の炎症性肉芽腫である。BCG/IFA で免疫したマウス肺の肉芽腫は、対照群のそれと対比すると肉芽腫の部分が明らかに小さい。さらに、図 2 右のようにマウスを BCG/ラクトフェリン/IFA で免疫すると、肉芽腫は縮小し、肺胞における炎症と浸出液は減少していた。すなわち、ラクトフェリンを含むフロイント不完全アジュバントに BCG を懸濁して免疫すると、含まない場合と比べ感染症が改善されたように見える。
結核菌が肺に感染して病巣をつくると、炎症による浮腫と蛋白質を肺/体重比含む滲出水が肺胞に貯留するため
図 3 に示すように肺重量が増加する。赤実線で示す BCG/ラクトフ
ェリン群は、対照群並びに BCG免疫群と比べて肺重量の増加が有感染後の日数

図 3．各群における肺/体重比の変化
黒点線；非免疫対照群、青点線；BCG 免疫群、赤実線；BCG/ラクトフェリン群。結核菌の経鼻感染 7 日，28 日並びに 63 日

意に抑制された。この結果は図 2に示した BCG/ラクトフェリン群
肺における肉芽腫抑制を支持している。一方、BCG/ラクトフェリン

目に肺を摘出して重量を測定した。各点；Mean±SE (n=6). 63/IFA で免疫して 2 週間後のマウス

日目では BCG/ラクトフェリン群とその他の群とのあいだに脾臓から得た脾細胞は、BCG 抗原

P<0.01 で有意差がある。

で刺激すると BCG/IFA で免疫したマウスから得た脾細胞と比べ有意に多量の IFN-γ、TNF-α、IL－6 及び IL-1βを産生する。したがって、結核菌の感染防御用ワクチンは、BCG 浮遊液にラクトフェリンを添加すると防御効果がさらに高まる可能性がある。

ラクトフェリンは旅行者下痢症ワクチンの防御能を強化するアジュバント
最近になって論文化されたが、ラクトフェリンが旅行者下痢症の予防に有効であることは以前から知られていた(3)。この研究でアジュバントの原料として使われる Hafnia
alvei は、ヒスタミン食中毒の原因菌である。中毒はヒスタミンが蓄積した赤身魚を摂取して惹起される化学性食中毒であり、喫食後 30 分ほどで顔面紅潮や発疹などのアレルギー様症状を呈する。ヒスタミン食中毒は化学性食中毒に分類されているために原因菌に対する関心が低く、現在までにヒスタミン食中毒事例において実際に原因菌として分離・特定されたのは Morganella morganii、Klebsiella pneumoniae および Hafnia alvei のみであった。
これらは腸内細菌科細菌であり、腸内細菌科ヒスタミン生成菌はヒスタミン生成能が高く、赤身魚から頻繁に分離されることから主要な食中毒原因菌とされてきた。ポーランド学派の Zimecki 等は H. alvei の LPS 複合体（MPLH a）を免疫アジュバントとして研究し、その LPS から単離したモノフォスフォリル・リピッド A とラクトフェリンとの複合体は、一般的な抗原に対し体液性及び細胞性免疫を亢進させるアジュバントになる可能性があることを指摘した。
彼らは今年発表した論文で旅行者
0.5

下 痢 症 の 原 因 に な る Plesiomonas

吸光度0.4shigelloides DNCTC 138/92 の死菌

P<0.05ワクチンに加え MPLH a/ラクトフ

0.3

ェリン複合体をアジュバントとして0.2

免 疫 し た BALB/c マ ウ ス は 、 P.

0.1

shigelloides 感染に対する強い感染防御能を獲得することを見出した(4)。

0.0

抗原+LF+MPL+LF, MPL

図 4．Hafnia alvei のリピド A とラクトフェリン併用による Plesiomonas shigelloides の死菌ワクチンの特異的 IgG 抗体産生増強

ちなみに、MPLH a はラクトフェリンと強い親和性を持って結合する性質がある。
図 4 に示すように、そのアジュバ

BALB/c マウスを P. shigelloides DNCTC 138/92 の死菌ワクチ

ント効果は、血清中の抗原特異的なンにアジュバントを加え皮下注射して免疫。注射死菌体は 0.1g/IgG の上昇によって証拠立てられる。

マウス、LF 50g, MPL 2.5g, LF-MPLH 50/2.5g である。

ラクトフェリンと MPL を良好者下

MPLH a は図で MPL と省略した。免疫注射は毎週行い、最終免

痢症病原菌の死菌と混合して注射す

疫の 1 週間後に採血し、血清の抗 P. shigelloides 抗体を測定した。

ると、抗原を単独注射した場合と比べ、血清の抗 Plesiomonas shigelloide 特異抗体は有意に上昇し、さらにデータは省略する
が 抗原特異的な血清 IgG2a, IgG1 及び IgA も有意に増加した。
加えて、アジュバントが MPLH a 単独の場合と比べ、ラクトフェリンとの複合体を投与すると、感染マウスの肝臓から検出される病原菌が有意に減少する(図 5)。すなわち、死菌

ワクチンだけを注射した場合と比べ、ラクトフェリン-MPLH a 複合体をアジュバントとして注射すると、肝臓から検出される菌数は 1/10 以下に減少した。脾臓から検出される菌数も肝臓の場合と同様な傾向であった。
予防接種にはアジュバントが必須である。アジュバントのなかでも Salmonella minnesota
R595 から単離したリン酸CFU/mg 肝臓1500
P<0.05

1200

化リピッド A は、アジュバントとして最有望と言わP<0.05

900

れていて、部分的に実用化600されている。重要なのはラ300

ク ト フ ェ リ ン –MPLH.a.
複合体 がマウスのフット

0

対照抗原

抗原+ 抗原+LF
MPL a抗原+LF-MPL a

図 5．P. shigelloides 感染 24 時間後における免疫マウス
における肝臓の菌数

パッドを用いる起炎テス
トで炎症性が弱いことで、水酸化アルミニウムゲルのように体内に残留する

3 回抗原+アジュバントで免疫して 1 週間後に 1.5 X 108 CFU の P.

危険が低いことである。さshigelloides を静脈内感染させ、24 時間後に肝臓を摘出して菌数らに細胞培養に加えると、を計測した。抗原及びアジュバントの量は図 4 と同じである。
Mean±SE, n=7

MPLH a より TNF-αの誘発能が低いことはアジュバントとして有利な条件である。これらの特徴は新しい MPLH a とラクトフェリンの複合体がアジュバントがヒトへのワクチン投与に当たっても有用かもしれない。
BCG で免疫する場合、ラクトフェリンを同時に注射すると結核菌感染に対する防御能が有意に高まること、グラム陰性細菌のリポ多糖とラクトフェリンからなる複合体をアジュバントとして旅行者下痢症の病原菌の死菌ワクチンに混合してアジュバントとして注射すると、病原体に対する体液性及び細胞性が亢進することも明らかになった。これらの結果からラクトフェリンが体内で免疫アジュバントとして作用していることはほぼ確実である。
しかし、これらの知見はウシのラクトフェリンを使って得られたものである。ヒトに応用するためには、さらなる検討が必要なことは云うまでもない。一方、ラクトフェリンが樹状細胞の成熟/活性化を通じ、癌抗原を識別して破壊するエフェクター細胞を賦活することを強く示唆する論文がニューランドのオークランド大から発表された。この論文の紹介は次号以降に譲ることにする。

(1) Shen-An Hwanget al. Lactoferrin enhanced efficacy of the BCG vaccine togenerate host protective responses against challenge with virulent Mycobacterium
tuberculosis. Vaccine. 25: 6730–6743, 2007
(2) Behr MA. BCG-different strains, different vaccines? Lancet Infect Dis 2002; 2:
86-92(3) Mohamed JA et al. A novel single-nucleotide polymorphism in the lactoferrin geneis associated with susceptibility to diarrhea in North American travelers to Mexico.
Clin Infect Dis. 44: 945-52, 2007.
(4) Chodaczek G et al. Lactoferrin-monophosphoryl lipid a complex enhances
immunity of mice to Plesiomonas shigelloides CNCTC 138/92. Acta Biochim Pol.
55: 91-6, 2008.