受賞者講演要旨《農芸化学技術賞》

9l-グルタミン酸オキシダーゼの発見と応用開発①②③

日下部　　　均野 口 利 忠岡山大学大学院環境生命科学研究科 稲 垣 賢 二株式会社エンザイム・センサ
ヤマサ醤油株式会社

はじめに
1980 年の時点において，l-アミノ酸オキシダーゼは，その由

3.

①②③

LGOX の X 線結晶構造解析及び基質特異性変換酵素

LGOX の X 線結晶構造（図 1, 2）を，低基質特異性の蛇毒由来を問わず中性アミノ酸に対して広い基質特性を示し，l-グル来 l-アミノ酸オキシダーゼの構造と比較したところ，活性中心タミン酸には作用しにくいことが報告されていた．一方，l-グに特徴的な残基が確認され，それらの中で 305 番目のアルギニルタミン酸に特異性の高い酵素として，l-グルタミン酸脱炭酸ン残基が基質認識の鍵残基である事が明らかになった 3）. そこ

酵素と l-グルタミン酸脱水素酵素が古くから l-グルタミン酸測で，このアルギニン残基を他のアミノ酸に置換した 19 種類の定に使われていた．しかし，脱炭酸酵素の測定系では CO2 のR305X 変異酵素を作製した．その中で，R305D と R305E 変異測定が面倒なこと，また脱水素酵素の測定系では補酵素の吸光酵素は，l-グルタミン酸に作用しない，新規 l-アルギニンオキ度変化を測定するため，いずれも煩雑な方法となっていた．高シダーゼとなった．

基質特異性の l-グルタミン酸オキシダーゼが発見されれば，反応物である過酸化水素の発色系を応用することが出来ることから，l-グルタミン酸測定への応用のみならず，l-グルタミン酸が関与する酵素活性の測定にも応用できることが期待されていた．
1.

L-グルタミン酸オキシダーゼの発見

我々は土壌分離菌の固体培養によって生産される抗がん性物質を探索する過程で，糸状菌 Trichoderma viride Y-244-2 が生

図 1.

産する高分子抗がん性物質を見出し，1980 年に新酵素 l-リシンLGOX の結晶α-オキシダーゼと同定した．これは，高基質特異性を示す l-ア

図 2.

ミノ酸のオキシダーゼとしては初めての例であった．この経験

LGOX の X 線結晶構造をもとにして，特異的なアミノ酸オキシダーゼの探索を開始
し，1982 年に放線菌 Streptomyces sp. X-119-6 の固体培養によ4.

LGOX を応用した簡便な比色測定キットの商品化
L-グルタミン酸，L-グルタミン，GABA の測定意義

り，l-グルタミン酸だけに作用する新酵素 l-グルタミン酸オキ

4-1.

シダーゼ（LGOX）を発見した 1）.

l-グルタミン酸は調味料として大量製造されているが，生体

2.

LGOX と LGOX 前駆体の性質

LGOX は，安定性に優れたヘテロ六量体構造（α2β2γ2）を有内においては様々な生理的機能を担っている普遍性の高いアミノ酸である．l-グルタミンは，血中で一番多い遊離アミノ酸でする分子量 14 万のフラビン酵素であった．l-グルタミン酸以外あり，腸管粘膜細胞の再生や免疫機能促進などの様々な生理的のアミノ酸に全く作用せず，これまで報告されている l-アミノ機能が報告されている．γ-アミノ酪酸（GABA）は，抑制系の神酸オキシダーゼ群の中で，最も基質特異性の厳格な酵素であ経伝達物質であり，GABA を添加した多くの機能性表示食品

る．LGOX 遺伝子をクローニングして解析したところ，α, β, γが商品化されている．これら三つのアミノ酸は，代謝経路におの各サブユニットに相当する ORF は確認されず，LGOX 遺伝いてお互いに直接的な基質と反応生成物の関係にあり（図 3），子は組換え大腸菌により 1 本のポリペプチドとして発現した．

分析化学的な観点からは，同一の方法で簡便に測定することがこの分子量 7 万のポリペプチドはホモ二量体を形成し，l-グル求められている．

タミン酸オキシダーゼとしての弱い活性を有していたが，元菌由来の LGOX と比較して基質親和性に劣り，熱にも不安定であった．しかし，この発現したホモ二量体酵素を，プロテアーゼ処理すると，元菌由来の LGOX と全く同じ構造となり，酵素化学的性質も同等であった 2）. この前駆体を遺伝子組換え大腸菌で大量生産するとともに，成熟体酵素への効率的転換法を開発して，組換え LGOX の工業的製造法を確立した．

図 3.

l-グルタミン酸と l-グルタミン，GABA の関係

10《農芸化学技術賞》
4-2.

L-グルタミン酸測定キットと「うまミエール」

受賞者講演要旨れている．また，マウスやラットの脳内へ挿入する，無線のLGOX を応用して，l-グルタミン酸から生成する過酸化水素

in vivo 実験用 l-グルタミン酸センサーにも LGOX が使用されの発色系による l-グルタミン酸測定キットを 1986 年に発売している．今後，精神神経疾患の基礎研究あるいは新薬開発におた．その後，組換え LGOX を使用して，常温で安定な二つの試いても，LGOX による脳内の l-グルタミン酸測定が大いに寄与

薬溶液で構成した l-グルタミン酸測定キットを開発し，凍結乾すると期待される．また，LGOX から創製した部位特異的変燥試薬を用いる上記のキットに替えて販売している．さらに，

換酵素 l-アルギニンオキシダーゼを応用した l-アルギニンセン

専用 LED 比色計付の l-グルタミン酸測定セット「うまミエーサーをセンサーメーカーと共同開発した．

ル」（図 4）を製品化した．測定に必要な機器と器具が全て揃っおわりにており，これだけで，誰でも簡単に，l-グルタミン酸を色の濃さで測ることができる．
4-3.

LGOX は，l-グルタミン酸が関与する数多くの酵素の活性測定に応用が可能である．例えば，醤油麹のグルタミナーゼ活性は，醤油醸造の重要な指標となっているが，LGOX によってL-グルタミン測定キット

LGOX, グルタミナーゼ及びパーオキシダーゼ（POD）の同時酵素活性の測定が大幅に簡便化されている．

反応による，A と B の二つの安定な試薬溶液で構成した，新しまた，l-グルタミン酸測定セット「うまミエール」のために開い l-グルタミン測定キットを発売した．このキットは，試料に発した，安価で小型の専用 LED 比色計は，同一の波長と手順でl-グルタミン酸やビタミン C が共存していても，l-グルタミン測定する糖類の測定キットにも応用することができる．l-グルだけを正確に定量することができる．

タミン酸・グルコース・ショ糖・果糖の各測定キットと専用

4-4.

GABA 測定キットと「GABA ミエール」

LED 比色計又は色見本のセットにより，小学生から大学生まGABA トランスアミナーゼ反応，LGOX 反応及び POD 反応で，うま味と甘味を目で確認しながら測定することができる．

をカップリングして酵素サイクルを回し，エンドポイント法にやさしい食品分析あるいは酵素の学習に，理科実験教材としてよる新しい GABA 測定キットを開発した ．LED 比色計付測の利用が期待される．

定セット「GABA ミエール」（図 5）として近日中に発売予定で（引用文献）

4）ある．
5.

LGOX のバイオセンサーへの応用
5-1.

LGOX のバイオセンサーへの応用研究

1982 年，LGOX を酸素電極へ固定化したバイオセンサーを構築し，1984 年に欧州バイオテクノロジー会議で発表した．
その後，大学及びセンサーメーカーとの共同開発で，醤油分析用の卓上型 l-グルタミン酸センサー及び肝機能測定センサーチップの研究開発を行った．特に肝機能測定センサーによる
GOT/GPT 測定値は，市販診断薬キットの測定値と高い相関性を示し，今後のさらなる開発が期待される．
5-2.

LGOX を使用した国内外各社のセンサー製品

LGOX を長年にわたり市場へ供給したことにより，国内外の会社が，l-グルタミン酸センサー及び l-グルタミンセンサー

1）Kusakabe, H., Midorikawa, Y., Fujishima, T., Kuni- naka, A.,
Yoshino, H., Purification and properties of a new enzyme, lglutamate oxidase, from Streptomyces sp. X-119-6 grown on
wheat bran, Agric. Biol. Chem., 47, 1323–1328（1983）
2）Arima, J., Tamura, T., Kusakabe, H., Ashiuchi, M., Yagi, T.,
Tanaka, H., Inagaki, K., Recombinant expression, biochemicalcharacterization and stabilization through proteolysis of l-glutamate oxidase from Streptomyces sp. X-119-6, J. Biochem.,
134, 805–812（2003）
3）Utsumi, T., Arima, J., Sakaguchi, C., Tamura, T., Sasaki , C.,
Kusakabe, H., Sugo, S., Inagaki, K., Arg305 of Streptomyces lglutamate oxidase plays a crucial role for substrate recognition, Biochem. Biophys. Res. Commun., 417, 951–955（2012）4）Nishiyama, T., Woro, T.S., Ueda, T., Kusakabe, H., GABA enzymatic assay kit, Biosci. Biotechnol. Biochem., 84, 118–125（2020）に応用した多項目センサー分析機を商品化した．食品分析のみならず，抗体医薬品の細胞培養による生産工程管理に広く使わ謝辞

本賞にご推薦頂きました筑波大学小林達彦教授に深く感謝いたします．本研究を共に遂行して頂きましたヤマサ醤
油株式会社，株式会社エンザイム・センサ及び岡山大学微生物遺伝子化学研究室の皆様に深く感謝いたします．筑波大学鈴木博章教授，筑波大学橋本義輝准教授，日本大学上田賢志教授及び日本大学西山辰也博士他の共同研究者の皆様に厚くお礼申し上げます．また，ご指導頂きました京都大学左右田健次名誉教授及びヤマサ醤油株式会社故国中明博士に深く感謝いたしま
図 4. 「うまミエール」

図 5. 「GABA ミエール」

す．