低線量放射線の生物影響研究のための放射光 X 線マイクロビーム細胞照射装置
宇佐美徳子
小林 克己

高エネルギー加速器研究機構

物質構造科学研究所〒3050801 茨城県つくば市大穂 11

高エネルギー加速器研究機構

物質構造科学研究所〒3050801 茨城県つくば市大穂 11

要旨
低線量放射線の生物影響を理解することは社会的要請となっている。私たちは低線量光子放射線の生物影響を研究することを目的として放射光 X 線マイクロビーム細胞照射装置を開発した。この装置を用いてヒトの培養細胞にマイクロビーム細胞照射実験を行い，免疫染色法により DNA 損傷を検出した。狙った位置に正しくマイクロビームが照射できる
こと，照射した細胞の位置を正しく記憶し再現できることなどの性能が実現していることが確認できた。

線 量 の a 線 を照 射 し染 色体 に 現れ る 効果 を調 べ たと こ
.

はじめに

ろ，全体の 1 の細胞しか放射線を受けないような極微

私たちの周りには多くの放射線が常に存在する。宇宙や量の放射線を照射したのにもかかわらず， 30 の細胞に地表から放出される自然放射線はもちろんのこと，病院に染色体の変化が起こっていたのである1)。これは放射線を行けば数多くの放射線を用いた検査に出会う。また「放射直接受けていない細胞にも放射線の影響があらわれること光」の読者の方の多くは，日常的に放射線を駆使して研究を最初に示した報告であり，この現象は「バイスタンダーをされていることと思う。病気を初期のうちに発見でき正効果（bystander＝傍観者）」と呼ばれ，今では低線量の放しい治療ができるようになったり，他の手段では見えない

射線の生物影響にとって非常に重要なメカニズムであると物質の構造や電子状態に関する情報が得られたり，現代社

考えられるようになった。細胞集団が高線量と低線量の放会において放射線は他には代え難い便利なツールのひとつ

射線にさらされている場合の概念図を Fig. 1 に示す。低であろう。

線量というのは「放射線を直接受けていない細胞が大部分

一方放射線は人体に対して有害な影響を及ぼすこともよである」状態であり，「傍観者」の細胞に何らかの影響がく知られている。しかし，日常生活で出会うような微量の起こるとすれば，それを無視することはできなくなる。

放射線が生物に与える影響をきちんと知るのは大変難し

それでは身近な放射線はどのぐらい「低線量」なのだろい。ヒトに対する放射線の影響を推定する根拠となっていうか。年間の自然放射線の線量は，地域や環境にもよるがるのは，広島や長崎の被爆者等の疫学的調査か，あるいは

日本では約 2 mSv （シーベルト）であり，これは細胞あ

比較的精度良く得られている高線量域の放射線を用いた生たり 10 keV 程度の電子線が 1 年間に 1 個通過する線量に物学的実験データをもとに低線量での生物影響を推測評相当する（これを X 線の光電効果によって生じた光電子

価しているのが現状である。細胞が放射線を受けると，細とみなせば， 10 keV 程度のフォトンが 1 年間に 1 個，と胞死やがん化といった影響が起こるまでに，多くの細胞内

考えてもよい）。 a 線の場合はもっと極端で，単位飛跡長の応答機構が関与する複雑な過程をたどるが，特に低線量さあたりの付与エネルギー（LET, linear energy transfer）

放射線の場合はこれらの生物影響がどのようにして発現すが 100 keV /mm の a 線の場合，細胞の大きさを直径 20 mm

るか，そのメカニズムが十分に理解されているとはいえなの球と仮定すると，a 線が細胞を通過すると細胞に 2い。

MeV のエネルギーを与えることになり，これをジュール

本稿では，低線量放射線の生物影響を研究することを目に換算して細胞の質量で割ると，細胞あたり 80 mGy （グ的として，高エネルギー加速器研究機構放射光科学研究

レイ，1 Gy＝1 J/kg）という線量が得られる。自然放射線施設において開発した放射光 X 線マイクロビーム細胞照レベルの 2 mSv とは a 線ではどのような線量かと言うと射装置について報告する。

（Sv という単位には線質係数という物理的でない係数が入.

る），細胞集団で見て平均40個の細胞のうち 1 個に a 線がっているので，ここでは簡単のため 2 mSv ＝ 2 mGy とす
低線量放射線の生物影響研究

1990 年代の初めまでは，放射線の生物影響とは放射線

通過し，その細胞にのみ80 mGy という線量が与えられたが直接あたった細胞にのみ現れる効果であると考えられて状態，に相当する。このような状況を想像するだけで，放いた。ところが1992年に Nagasawa and Little によってこ射線が当たった細胞と当たっていない細胞を区別しないでの概念をくつがえす興味深い現象が発見された。細胞に低生物影響を調べる方法では低線量の生物影響発現のメカニ

July 2004 Vol.17 No.4 ● 213(C) 2004 The Japanese Society for Synchrotron Radiation ResearchGray Cancer Institute に超軟 X 線を利用するものがある
が6)，X 線領域のものとしては私たちの装置が世界初である。放射光を用いた同種の研究としては他に Advanced

Light

Source(ALS ) の X-ray

Microprobe

Beamline(10.3.1) において低線量光子放射線の生物影響に関する実験が行われており，マイクロビームの利用も視野に入れられているが，現在のところは 100 mm 幅のビームを用いた
予備的な実験の段階である7)。
放射光 X 線マイクロビーム細胞照射装置は以下の仕様を目指して設計した。
ビームサイズは 1 ミクロン程度であること。
細胞を個別に照射できるだけでなく，細胞小器官のレベルで標的を選択できることを目的とする。また，この仕様によって選択する X 線のエネルギーも制約を受ける。 X線のエネルギーが高いと，生体中にフォトンが吸収されたときに生じる光電子の飛程が長く，せっかくマイクロビー
ムを作ってもその領域外にエネルギー付与が起こってしまう。水中での 5 keV の光電子の飛程は 0.78 mm ， 10 keV
では2.5 mm であるので，5 keV 程度が望ましい。
ビームは試料の下方から垂直方向に照射されること。
実験に用いる試料は動物培養細胞で，通常は培養用のデFigure 1. (a) Poisson distribution for number of radiation tracks
traversed individual cell in various doses (L represents an average
number of tracks). (b) Schematic illustration of the cells irradiatedwith high dose (L＝5) and low dose (L＝0.2).

ィッシュに培地を入れて培養される。乾燥などの環境変化
は細胞の生理的条件を損なうので，再現性良くかつ生物学的に意味のある実験を行うには細胞の生理的条件の変化は避けたい。したがって，ディッシュに培地を満たしたままの状態で細胞を照射できるように，放射光 X 線ビームはSi(311 )面を用いて垂直に反射させ，ディッシュの下からズムを捉えることは不可能であることがわかる。このよう照射する方式を採用した。Si (311)面の反射を用いているな観点から，個々の細胞に個別に放射線を照射し，個別にので， X 線のエネルギーは 5.35 keV に限定されることに効果を分析する研究手法の必要性が認識され，それを可能なるが，これは，前述した「光電子の飛程が 1 ミクロンにするマイクロビーム細胞照射装置が開発されるようにな程度以下」の条件を満たしている。

った。英国の Gray Cancer Institute2,3) ，米国の Columbia

細胞の認識は蛍光顕微鏡像で行うこと。

University4)では，それぞれ粒子線を用いたマイクロビー

最も一般的な細胞核を狙った照射では，細胞核を蛍光色

ム細胞照射装置がいち早く開発され，先駆的な研究が行わ

素で染色し，その蛍光顕微鏡像を取得することによって細れている。

胞の位置を認識することになるが，蛍光色素で染めた細胞

これらのマイクロビーム細胞照射装置は，陽子線やヘリに近紫外や可視光を照射すると細胞に損傷を与える可能性

ウムといった「重粒子」を用いた装置である。欧米では，があるので，蛍光色素の濃度および励起光の強度はなるべ

自然放射線の中でのラドンの寄与が大きく，ラドンは呼吸く低く抑える必要がある。そのために高感度の CCD カメ

によって肺に入り，体内で a 線を放出し，肺ガンの原因

ラを組み込む。

になると言われている。このような事情で欧米では低線量

短い時間で多くの細胞を照射できること（ハイスループの重粒子線の生物影響の研究が重要視されているが，日本ット）。

ではラドンによる自然放射線は世界平均の半分以下であ細胞の生理的条件を損なわないためには，なるべく短時

り，それ以外の放射線，つまり， X 線や g 線といった光間で照射を行いたい。そのため，細胞の認識および照射を子放射線の作用が相対的に重要になってくる。このような自動化するような制御用ソフトウェアを開発する。

理由で，私たちは，まだほとんど手がつけられていない低線量の光子放射線の生物影響を研究するために，放射光を用いた X 線マイクロビーム細胞照射装置を作ることを計
画した5)。
光子放射線のマイクロビーム細胞照射装置は，前述した

214 ● July 2004 Vol.17 No.4

.

放射光 X 線マイクロビーム細胞照射装置

放射光 X 線マイクロビーム細胞照射装置のシステム図
を Fig. 2 に，全体の写真を Fig. 3 に示す。この装置は，
 マイクロビームを作るための光学系，
 試料を設置する
実験技術 ■ 低線量放射線の生物影響研究のための放射光 X 線マイクロビーム細胞照射装置

Figure 2.

Microbeam irradiation system for radiobiology at the Photon Factory.

BL27B を選んだ。このビームラインには，動物細胞を培養する設備を備えた生物試料準備室が隣接されているため，細胞の準備や照射後の分析を速やかに行うことができる9)。光源は偏向電磁石で，4 keV～20 keV の X 線領域の光を使うことができる汎用ステーションであり，主として
生物照射実験，XAFS，X 線回折実験に用いられている10)。
. 光学系およびスリット
マイクロビームの作成には KirkpatrikBaez（K B ）ミ
ラー を採用し た。ビーム ラインの途中 に（光源点 から

19.84 m 下流位置）直径20 mm のピンホールを挿入し，疑似光 源点とし た。疑似 光源点から 9.84 m 下流に第 一ミ
Figure 3. Photograph of the microbeam irradiation system forradiobiology at the Photon Factory, BL27B.

ラー（R＝167.5 m ）を置き鉛直方向を集光，その105 mm
下流の第二ミラー（ R ＝ 145.6 m ）により水平方向を集光している。第二ミラーから集光点までの距離は 0.63 m であり，この間にビームは Si(311)結晶により真上にはね上

自動ステージと高感度 CCD カメラを備えた蛍光顕微鏡，

げられ，顕微鏡のステージに置かれた試料位置で集光点と 自動ステージ， CCD カメラ， X 線シャッター等を制御

なるように設計されている。この方式で集光したビームのする制御系，から成り立っている8)。単色化された放射光

水平方向を，精密ステージに取り付けたナイフエッジでX 線は，数ミクロンサイズに集光された後，蛍光顕微鏡

ビームをスキャンして測定したところ，最小で 2 mm 幅のの直下に置いたシリコン結晶で 90 度真上にはね上げらビームを作ることに成功した（ Fig. 4 ）。グラフからわかれ，顕微鏡ステージの上に置いた細胞試料に下方から照射るように，形成した 2 mm 幅のマイクロビームには数ミクされる。

ロンのテーリングが見られる。そこで，試料の直前に高精. ビームライン

度の四象限スリットを導入し，余分なテーリングはカット装置を設置するビームラインは，高エネルギー加速器研
究機構放射光科学研究施設（フォトンファクトリー）できるようにした。
これを執筆している 2004 年春現在までに行った細胞照July 2004 Vol.17 No.4 ● 215

射実験は， K B ミラー系による集光は用いずに，この高この方法では放射光 X 線ビームは集光されていないの

精度スリットでのみマイクロビームを形成して使用していで，光子密度は集光ビームより 1 桁程度低くなるが，調る。 前 述し たよ う に BL 27B は 汎用 ステ ー ショ ン であ整が簡単なことと，光子密度を変えずにビームの大きさをり，マイクロビーム照射装置はビームタイム毎のセットア

簡単に変更できるという利点がある。この方法で作成したップが必要で，強度とビームサイズを犠牲にしても，最適

マイクロビームのサイズは最小 5 mm 角である。

な集光条件を見つけるために必要となるミラー調整の時間

2004 年秋からは集光系も含めたマイクロビーム細胞照を省いたほうがビームタイムを有効に使えるからである。

射装置は BL 27B ハッチ内に常設されるので，常時集光ビームを使えるようになる予定である。
. 蛍光顕微鏡および精密ステージ，CCD カメラ
蛍光顕微鏡は，Olympus 生物顕微鏡 BX51WI をベースとして用いた。この顕微鏡は，通常の顕微鏡がステージを上下に動かしてフォーカスを合わせるのに対し，対物レン
ズユニットを上下させてフォーカスを合わせるステージ固定式が採用されている。試料を載せる精密ステージは，Prior 社の ProScan 電動ステージ H101 を用いた。これは現在市販されている顕微鏡用電動ステージでは最高精度のものである。直径 5 mm の蛍光マイクロスフィアを固定し マイクロスフィアの位置を記たディッシュを用いて， ステージを数十 mm 動かし，記録した位置に戻す，
録，
 位置のずれを測定，という手順でステージの再現性のテ

Figure 4. Size of microbeam focused by the KB mirror system.
FWHM is about 2 micrometer.

ストを行ったところ，ずれの平均値は0.91 ±0.48 mm であった。これは，1 ミクロンオーダーの標的を狙うにはまだFigure 5. Control software for the microbeam irradiation system. The software can control all of the processes including image-capturing, image analysis, stage movement and X-ray irradiation.

216 ● July 2004 Vol.17 No.4

実験技術 ■ 低線量放射線の生物影響研究のための放射光 X 線マイクロビーム細胞照射装置

十分な精度とは言えないが，動物培養細胞の核（直径 10

らいったんディッシュを外した後でも細胞を追跡できる。

mm 程度）を個別に選んで照射するためには十分な精度で薄膜を固定した状態のディッシュはオートクレーブによある。
画像取得のための CCD カメラは，浜松ホトニクスのデり滅菌することが可能である。細胞はこのデュッシュ上で通常の培養方法と同様に培養され，培地を満たしたまま照ジタル冷却 CCD カメラ ORCA ER を用いている。 1 ～ 2

射することができる。薄膜には現在 Mylar または poly-mM の Hoechst33258で細胞核を染色した場合，通常の露propylene が用いられており， polypropylene の方が薄膜

光時間は数 10 ミリ秒である。励起光は，画像取り込み時自身のバックグラウンド蛍光が小さく質の良い蛍光像が得のみ照射されるように，次項で説明する制御系によって励られるが，細胞の接着能は Mylar に比べると劣るため，

起光シャッターと CCD カメラを連動して制御している。

実験によって使い分けている。

. 制御系

. 強度測定

照射システム全体の制御は，制御用ソフトウェアを用い

現在用いている非集光ビームではフラックス分布が比較て行われる。ソフトウェアは Visual Basic を用いて開発

高的一定であるので，以下の方法で測定を行っている。

され， CCD カメラによる画像取得および画像処理部分に

精度スリットを調整して310 mm 角のビームを形成する，は Media Cybernetics 社の画像処理ソフトウェア Image- 強度をフォトダイオードで測定，
 ビームの面積比を


Pro Plus を用いている。制御用ソフトウェアのウィンド

乗じてマイクロビームの強度とする。マイクロビームのウを Fig. 5 に示す。

ビーム面積は，照射用ディッシュの底面にシンチレータ板を組み込んだものをステージに取り付けビームの蛍光像を

.

細胞照射実験

. マイクロビーム照射用ディッシュ
細胞試料を載せるディッシュは，底面から X 線マイク

取得し，画像処理ソフトウェア上で面積を計測している。
この方法で測定した非集光マイクロビームの強度は，毎秒 1.4 × 104 photons /( 10 mm )2 であり，これは毎秒 0.4 Gy

ロビームが照射できるように，底面が薄膜でできた特殊なと同等のフルエンスに相当する。

ディッシュを設計した。精密ステージ上に載せたディッシ

. 照射実験の手順

ュの写真およびディッシュの断面図を Fig. 6 に示す。フ シンチ
典型的な細胞照射実験の手順を以下に記す。

レームはステンレス製で，2 枚のフレームの間に薄膜をはレータを組み込んだディッシュでマイクロビームの蛍光像

さんで固定する方式になっている。フレームの角の切り欠を取得し，制御用ソフトウェア上でビーム位置を記録す

き部分を精密ステージ上のガイドピンに合わせることによ 細胞核を 1 ～ 2 mM の Hoechst33258 で染色した細る。

って正確に位置決めができるので，分析のためステージか 照射する胞（を載せたディッシュ）の画像を取得する。

目標（現在は細胞核）の位置を記録する。手動で選ぶこともできるし，ある領域を指定し，その中にある細胞核をす
 個々の細胞に照射する
べて自動認識することもできる。

線量（ X 線シャッター開放時間で制御）を入力すると，記録した位置の細胞すべてにマイクロビーム X 線が照射される。
. gH2AX 抗体による DNA 損傷の可視化
実際にマイクロビームが照射された領域に DNA 損傷が生じていることを確かめるため，ヒト繊維芽細胞（NB1

RGB）にマイクロビームを照射し，生じた DNA 損傷を可視化して観測することを試みた。細胞核内の DNA に二重鎖切断が起こると，核内タンパク質であるヒストン

H2AX がリン酸化される。これを利用して，リン酸化ヒ
ストン H2AX を抗原とする抗体（g H2AX 抗体）で標識すると， DNA 損傷（ DNA 二重鎖切断）をその場で検出することができる11)。
照射後の細胞は通常の培養条件である37 °C ，5 CO2 存
在 下に 15 分 間保 持し， H2AX のリ ン酸 化を誘 発させ た
後，メタノール―アセトンで固定し， g H2AX 抗体（一Figure 6. (a) Photograph of the microbeam dish installed on the
motorized stage in the microbeam irradiation system. (b) Sectionalview of the microbeam dish.

次抗体）および FITC 結合二次抗体でリン酸化 H2AX を標識した。また，核の外形を同時に観測するために

Propidium Iodide ( PI ) で二重染色を行い，再度マイクロ

July 2004 Vol.17 No.4 ● 217

.

おわりに
低線量放射線の生物影響研究のために開発された放射光X 線マイクロビーム照射装置について，装置を設計製
作し，細胞照射実験を行いながら少しずつ改良していくことによって，ほぼ設計性能を達成するところまで到達することができた。今後は，個々の細胞で起こる微小な変化を
感度良く検出できる系を用いて，低線量放射線の生物影響のメカニズムに少しでも迫れるような研究を進めて行きた
い。また，この装置は共同利用実験に公開されているので，いろいろなアイディアを持った方に使っていただき，
良い成果をあげてもらいたいと思っている。
Figure 7. (a) Human ˆbroblast cells irradiated with X-ray
microbeam. Irradiated area in the cell nucleus could be successfully
visualized with gH2AX immunostaining (green). Nuclei were
stained with propydium iodide (red). DiŠerence in size of thestained area can be easily recognized when compared between cells
irradiated 5 mm beam and those irradiated with 10 mm beam. (b)Size of the microbeam visualized with the scintillator dish. The scale
is same as (a).

謝辞
放射光 X 線マイクロビーム細胞照射装置の開発にあたっ て は ， 英 国 Gray Cancer Institute の Barry D. Michael
教授のグループに感謝します。宇佐美は 1997 年～ 1998 年に文部省在外研究員として滞在する機会を得て粒子線マイ
クロビーム照射装置を用いた細胞照射実験を体験し，小林は 2002 年の訪問で，システム全体や制御ソフトウェアに関する貴重な情報をいただきました。これらの情報や経験が私たちの装置の基本となっています。
また，免疫染色に関しては，奈良県立医科大学の森俊雄
助教授，放射線医学総合研究所の江口笠井清美博士に多くの技術的指導をいただきました。
この研究は，徳島大学の前澤博教授，立教大学の檜枝光
株 林創研
太郎教授，国際基督教大学の高倉かほる準教授，の林徹氏との共同プロジェクトです。
装置の製作は科学研究費補助金基盤（A ）（ 14208069 ）の援助を得ておこなわれました。
Figure 8. Dose dependence of DNA double strand breaks visualized with gH2AX.

参考文献
1)
2)

ビーム装置にセットして，照射した細胞を観測した。
照射された領域と DNA 損傷が生じる領域に相関がある

3)かどうかを調べるため，ビームサイズをスリットで調整
し，10 mm 角，および 5 mm 角の 2 種類のマイクロビーム

4)を照射した。得られた蛍光顕微鏡像を Fig. 7 に示す。照射したすべての細胞は，照射時に記録された座標で観測さ5)

れ，周りの非照射細胞に比べてリン酸化 H2AX の存在をあらわす緑の蛍光が明らかに多く生じていた。またリン酸

6)

化 H2AX はビームサイズにほぼ対応した領域に特異的に誘発され， DNA 二重鎖切断がマイクロビームで照射され7)た領域に集中して生じていることが確認できた。同様な照射を，ビームサイズだけでなく線量も変えて照射した細胞の蛍光顕微鏡像を Fig. 8 に示す。線量に依存してリン酸

8)

化 H2AX の量が増加していることがわかる。
9)218 ● July 2004 Vol.17 No.4

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実験技術 ■ 低線量放射線の生物影響研究のための放射光 X 線マイクロビーム細胞照射装置

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著者紹介

小林克己

宇佐美徳子

高エネルギー加速器研究機構物質構高エネルギー加速器研究機構物質構造科学研究所助教授

造科学研究所助手

E-mail: katsumi.kobayashi＠kek.jp

E-mail: noriko.usami＠kek.jp

専門放射線生物物理

専門放射線生物学

略歴

略歴

1991 年

高エネルギー物理学研究所（現

放射光実験施設

高エネルギー加速器研究機構

学研究所

物質構造科

放射光科学研究施設）助手

至る

現在に

1978年

筑波大学生物科学系

1986 年

高エネルギー物理学研究所（現常勤講師
放射光実験施設

高エネルギー加速器研究機構

学研究所

物質構造科

放射光科学研究施設）助教授

現在

に至る

Development of photon microbeam irradiation system for
low-dose radiobiology
Noriko USAMI
Katsumi KOBAYASHI

Photon Factory, High Energy Accelerator Research Organization (KEK),
Oho, Tsukuba 3050801, JAPAN
Photon Factory, High Energy Accelerator Research Organization (KEK),
Oho, Tsukuba 3050801, JAPAN

Abstract
Risk evaluation of low dose irradiation has been great concern for human societies utilizing modern technologies.
We have succeeded in developing an X-ray microbeam irradiation system using synchrotron radiation, by which
we can recognize cells individually and irradiate one by one with desired dose of monochromatic X-rays. For the
performance test of the system, especially accuracy and repeatability of the positioning, the cell irradiation experiments were performed. Irradiated area in the nucleus of human ˆbroblast cell could be successfully visualized withgammaH2AX immunostaining.

July 2004 Vol.17 No.4 ● 219