生体高分子の微結晶構造解析における技術革新

マイクロビームを用いたタンパク質微小結晶
構造解析の現状
平田邦生
理化学研究所

放射光科学総合研究センター

ビームライン基盤研究部〒6795148 兵庫県佐用郡佐用町光都 111
国立研究開発法人科学技術振興機構さきがけ〒3320012 埼玉県川口市本町 418タンパク質 X 線結晶構造解析はタンパク質の高分解能構造を得るために非常に強力な手法のうちの一つであり，高輝度かつ波長可変の X 線が使用できる放射光施設は今や無くてはならない存在である。結晶化によって得られ■
要
旨るタンパク質の結晶の回折能や大きさは様々であるが，より結晶化が難しい場合には数 mm から数十 mm オーダーの微小結晶しか得られない場合もある。このような試料からも高精度データ収集を行い，より高分解能な構造解析を実現することを目指して放射光施設では高フラックス微小ビーム利用のための研究開発が推進されてきた。本稿ではタンパク質の微小結晶構造解析をテーマに，それに関わるビームラインのハードウェアやソフトウェア開発，実現した応用研究について簡単に紹介する。

晶構 造解 析に 必須で あろ うとい う紹介 記事 が報告 され

1. 歴史的背景

た1) 。フランスの放射光施設 ESRF （ European Synchro-

タンパク質は生命体の構築や生理現象で中心的な役割を

tron Radiation Facility ） ID13 において 40 × 20 mm サイズ

果たしている。生命活動はタンパク質が関わる化学反応にの微小ビームを用いて30×30×5 mm3 サイズの膜タンパク

よって担われており個々のタンパク質の機能やその発現の質（バクテリオロドプシン）結晶から2.4 Å 分解能のデーメカニズム解明は古くから重要な研究対象である。タンパ

タが得られたという事例も紹介されている（当時日本国内

ク質の構造はその機能と強い相関があるため，機能を深くで利用できた最小ビームは SPring 8 BL41XU で 100 mm

理解するためには詳細な構造情報が大きな手がかりとなる。

程度）。この頃から世界各地の放射光施設でミクロンサイ

X 線結晶構造解析はタンパク質の構造を詳細に知るためズの高フラックス微小ビームを作り出すための研究開発の強力な手法のうちの一つである。また結晶構造解析を行が加速した。

う上で放射光施設は今や無くてはならない存在である。放

2005年には同じく ESRF の ID13で KB（Kirkpatrick

射光 X 線を利用する場合のメリットは，波長の可変性

Baez）ミラーを利用し 1 mm に集光したビームで，ウシロ（構造因子の位相決定や結晶に含まれる重原子同定に利ドプシン（膜タンパク質）の 5×5×100 mm サイズの微小用），高強度であること（測定時間の劇的な短縮），高い指結晶から2.6 Å 分解能でデータ収集を達成したとの報告が向性（シグナルノイズ比の向上）などがあるが，特に微あった2)。ESRF では，この結果に基づきタンパク質結晶

小ビームの利用はこの分野に大きな恩恵を与えている。

構造解析用アンジュレータビームライン ID232の開発を

タンパク質結晶の大きさは様々だが，回折データ収集の進め，7.5 mm 集光ビームを実現した3)。

際に結晶サイズとビームサイズが同程度であることが望ま2008 年 に は ア メ リ カ の 放 射 光 施 設 APS （ Advanced

しい。結晶部分だけに X 線を照射し，溶媒や試料ホル

Photon Source）において，ミニビームと呼ばれるコンセ

ダーからの散乱 X 線を低減することで回折強度のシグナ

プトで 7 mm ビームの利用を実現したという報告があっルノイズ比を向上させることが可能になるからである。

た4) 。 APS 23ID B のミ ニビ ーム コン セプ ト は 125 × 25

生体内で特に重要な役割を果たしている超分子複合体や膜mm 程度に集光した高フラックスビームを種々のサイズのタンパク質などは試料を結晶化することが難しいことが知ピンホールで整形して微小ビームを作り出すというものでられており，たとえ結晶化がうまくいったとしても得られある。ミニビームコンセプトでは結晶サイズに合わせてる結晶のサイズが極端に小さい場合などがある。このよう

ビームサイズを容易に制御できるというメリットがある一な微小結晶からも良質なデータ収集を実現するべく放射光方，整形によってビーム強度が弱くなるというデメリット

施設では高フラックス微小ビームを作り出すビームラインもある。しかし，ビーム位置や強度の安定度を得やすいと技術開発が進められてきた。1998年に“Small is beautiful”

いう手法上の特徴から，多くのビームラインでこのコンセというタイトルで高フラックス微小ビームがタンパク質結

プトによるビーム微小化が進められた5)。APS 23IDB で

放射光 July 2016 Vol.29 No.4 ● 189(C) 2016 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Researchは後述する脂質メソフェーズ法（ LCP ）法（注釈参照）

かつ正確なフィードバックシステムの構築が容易になってと呼ばれる結晶化技術の開発者らと共同して G タンパクいる。

質共役受容体（以下 GPCR ）などの膜タンパク質結晶か結晶から得られる回折強度シグナルを検出するためのら高分解能データ収集を行うための先駆的な技術開発が行X 線検出器の進歩も目覚ましい。特に微小結晶から得らわれた6,7)。

れる回折強度シグナルは微弱であり，それらを正確に検出するためには低ノイズかつ検出効率の高い X 線検出器の注釈結晶化の際の脂質の状態によってキュービック相，利用が必須である。また限られたマシンタイムの中でより

スポンジ相を利用した結晶化の方法が存在するためこれら

多くのデータ収集を行うために読み出し速度も重要であを併せた脂質メソフェーズ法と呼ぶ方が正確である。文中る。後述するように視認が困難な微小結晶を X 線で検出

では脂質メソフェーズ法の意味で“ LCP 法”の呼称を用する場合には，読み出し速度が直接結晶を探索する時間にいている。

影響をおよぼす。本分野で広く利用されている CCD 検出
器は X 線を蛍光スクリーンで可視光に変換し，そのシグ

2. 高フラックス微小ビームビームラインにおける研究開発

ナル像を光ファイバーで縮小し CCD チップで撮影するもので ある 。像 の縮小 倍率 ，蛍光 体の厚 みや 変換効 率，
CCD の感度などによって PSF（Point spread function; に高フラックス微小ビームを実現するための，また，それじみの大きさの指標）や検出効率は異なる。最近の CCDを利用したデータ収集に関連するいくつかの重要なハード検出器では波長 1 Å あたりで PSF が 100 mm 程度，検出ウェア開発について紹介する。

効率（ DQE ） 0.80.9のものが多く開発され利用されてい微小集光に重要な集光ミラーに関して，主には X 線がる。 2006 年頃には大面積のピクセルアレイ型フォトンカ

反射する鏡面の形状誤差を小さくするための研磨技術の発

ウンティング検出器が登場し16) ，タンパク質結晶構造解展があった。日本でも大阪大学で開発された EEM（Elas-

析に広く利用されるようになってきた。これまでの CCD

tic Emission Machining）という研磨技術により原子レベ検出器との根本的な違いは，入射する X 線光子を直接カルでミラー母材の表面を研磨する技術が開発され8) SPring

ウントできることである。これにより微弱な回折シグナル8 を 始め， X 線自 由電子 レー ザー （以 下 XFEL ）施 設を効率よく得るだけでなく， CCD 検出器では不可避であ

SACLA でも EEM 加工の集光ミラーが利用されている。

った読み出しノイズを無くした高精度データ収集が実現でまたバイモルフミラーと呼ばれるピエゾアクチュエータをき る よ う に な っ た17) 。 Dectris 社 の PILATUS 検 出 器多数有し，反射面の形状を変形させることが可能な集光ミ（ PILATUS3 X series ）ではピクセル分解能が 172 × 172

ラーの利用も進んでいる9)。バイモルフミラーを用いるメ

mm2 ，読み出し速度は最大 500 Hz であり，最近リリース

リットは形状を変形させることで柔軟にビームサイズや集された EIGER 検出器（EIGER 9M）ではピクセル分解能

光位置，発散角を調整できる点である10)。

が75×75 mm2 最大238 Hz での高速検出が可能となってき

高輝度光源を利用したビームラインでは，白色 X 線かている。フォトンカウンティング型検出器では入射するら必要なエネルギーの X 線を切り出すための分光結晶に

X 線光子数が多くなると数え落としが起きる。これは計

多くの熱負荷がかかる。この熱負荷を低減することにより算によって補正されるよう設計されているが，補正には限分光結晶の熱的歪みを低減して利用する X 線の強度や形界があるため特に高強度 X 線を利用する場合には実験条状を安定化することが重要である。多くの高フラックス

件をよく精査して利用方法を検討する必要があるだろう。

ビームラインでは現在，分光結晶を液体窒素により冷却す

10 mm 以下のサイズの結晶から回折データを収集する場

る方法が採用されている11) 。また分光結晶が液体窒素な合には結晶位置をアラインメントするためのゴニオメータ

どの媒体で振動することを低減することも安定な X 線利の位置再現精度についても要求が厳しくなる。ゴニオメー用には重要であり，計測および改善対策について多くの取タは通常， X 線の集光位置に試料結晶を移動し，安定にり組みがなされている1214)。

保持して X 線を照射することを可能にするものである。1

微小集光を行うビームラインでは，特に光学素子や回折

mm の結晶を正確に 1 mm のビーム位置に合わせようとす

計の振動を低減する対策も重要である。振動対策のコンセ

る場合，ゴニオメータの並進軸の位置精度はサブミクロン

プトとしては第一に振動の原因を排除することである。こでなければならない。また通常試料結晶は回転させながられには重量の大きな石定盤を光学素子や回折計の架台としデータ収集を行う（振動写真法）ため，ゴニオメータの回て利用する，極力振動源を光軸付近に設置しないなどの対転子の偏心誤差もサブミクロンオーダーであることが望ま策が含まれる12) 。第二に振動によるビーム位置のズレをしい。 SPring 8 では神津精機製のゴニオメータを利用し観測して，光学素子（二結晶分光器やミラー素子）にフィーており，回転子の偏心誤差が 0.5 mm 程度，並進軸の繰りドバックをかけてビーム位置を安定化するという方法もあ

返し位置精度は 0.1 mm 程度，さらに移動した並進軸にはる。高速 X 線位置強度モニター15) などの開発により高速エンコーダと呼ばれる位置読み出し機能も有しておりフ

190 ● 放射光 July 2016 Vol.29 No.4

小特集 ■ 生体高分子の微結晶構造解析における技術革新ィードバック制御が必要な場合にも対応可能な設計として

タンパク質結晶の放射線損傷についてであった。タンパクある。

質結晶の放射線損傷は結晶に X 線を照射した場合に必ず起こる現象で回折強度シグナルの低下や結晶格子定数の変3. SPring8 の高フラックス微小ビーム
ビームライン BL32XU の開発化など高精度データ収集を妨げる要因となる。損傷量は吸収線量（結晶が X 線照射によって単位重量あたりの吸収するエネルギー量 J/kg＝Gy）に依存し，凍結したタンパ

SPring 8 において 2007年から文部科学省ターゲットタ

ク質結晶試料の回折能は吸収線量20 MGy でおおよそ半分

ンパク研究プログラムの一環で，10 mm 以下の微小結晶かに な る と い う こ と が 広 く 知 ら れ て い る （ Henderson 限

らデータ収集を実現することを目標に高フラックス微小界)18) 。 BL32XU では 1 秒未満の露光でも Henderson 限

ビームビームラインの建設を開始した．当時， SPring 8

界である20 MGy 程度の吸収線量に到達してしまうため，で利用できていた最小ビームサイズは標準アンジュレータ

多くの実験者が「それまでの経験とカン」では使いこなす

ビームライン BL41XU の 20 mm であり解析可能な最小結ことができなかった。「結晶の寿命」をより定量的に評価

晶サイズは30 mm 程度であった。この最小限界を打破する

してその寿命の範囲内で回折データを収集するという測定ことが BL32XU の一つの大きな目標であったため 1 mm

コンセプトは，少なくとも当時の日本では広く受け入れら

集光X線を恒常的に利用でき，フラックス密度をれていなかった。例えば，あるビームラインで決めた「こBL41XU の 10 倍である 1010 photons / sec / mm2 にすること

あたり 5 秒程度 X 線を照射できる」といっの結晶には 1°を達成目標とした。またビームサイズを種々の微小結晶サた条件を， X 線エネルギー，ビームサイズ，フォトンフ

イズ に合わ せて 簡単に 変更 できる 設計と した 。光 源はラックスを意識せずにそのままフラックス密度の異なる

SPring 8 で開発されたハイブリッド真空封止アンジュ

ビームラインで適用する実験者も多かった。このためまずレータとし，液体窒素冷却型二結晶分光器で分光した単色

ビームライン BL32XU ではプログラム RADDOSE19,20)を

光を下流の輸送チャネルスリットで切り出して仮想光源を用いて予想される吸収線量からデータ収集時の露光条件を作り，試料上流の K B 配置の EEM ミラーで 1 mm に集決定するインストラクションを進めた。さらに「ヘリカル光する設計とした。ビームの位置強度の安定化のためにデータ収集法｣3) をビームラインの標準測定法として採用

極力光学素子の数を抑え，曲率固定の EEM ミラーを利用した。通常は結晶を回転させて構造解析に必要なデータ収するという極めてシンプルな光学設計とした。

集を行うが，ヘリカルデータ収集法ではこれに加えて例え2009 年 10 月に光学ハッチにファースト ビームを導入

ば一枚～数枚の回折像を得るごとに露光点を並進させる。

し，同年 11 月末には試料位置への 6 × 1010 photons / sec ，

並進させながら回転させるため「ヘリカルデータ収集」と0.9 mm 集光に成功した（Fig. 1）。このビームを利用して標いう名前がついている。この方法は特に結晶サイズに比べ準試料であるリゾチームの 2 mm サイズの結晶から 2 Å 分てビームサイズが小さい場合に有効である。運用開始当初

解能の回折像を得ることに成功し，マイクロビーム利用にの BL32XU では 50 ～ 100 mm 以上の結晶が測定対象としよる微小結晶構造解析が実現できることを確認した。とこて多かったため，この方法を用いることで良質な回折デー

ろが，翌 2010 年 5 月からユーザ運転を開始すると同時にタ収集が実現できるようになった。

データ収集についていくつかの深刻な問題に直面した。
最初に直面した問題は建設前からの懸案事項でもあった

Fig. 1

2010年の中ごろから LCP 法で結晶化された膜タンパク

質結晶が BL32XU に多く持ち込まれるようになった。

(Color online) Left is the mirror chamber unit installed into the experimental hutch of BL32XU. Vertical andhorizontal focusing mirrors (referred to as VFM and HFM, respectively) are shown. Right is the vertical beamproˆle available at the sample position. FWHM of the proˆle corresponds to 0.9 mm . Horizontal proˆle is notshown but the same FWHM was available.

放射光 July 2016 Vol.29 No.4 ● 191

LCP 法はタンパク質を脂質二重層に再構成させた状態で定を行うのに試行実験を多く必要とした。また BL32XU

結晶化させる方法で，これまでの方法に比較して安定かつで利用できる最大ビームサイズ10 mm 角，試料ホルダーが回折能が高い結晶を得やすいという特徴がある21) 。 LCP

150～500 mm 角程度であったことから例えば150 mm 角の法で得られた結晶（以下 LCP 結晶）は高品質だがあまりホルダーでも縦15×横15＝225枚の走査イメージを取得す

大きく成長しないことがよくあるので，高フラックス微小る必要があった（Fig. 2）。さらに得られた走査イメージ上ビームの利用が有効である。 BL32XU では初期スクリーに回折点が観測されているかどうかを確認し結晶位置を特ニングが完了した直後の結晶からでも 3 Å 以上の高分解定する必要もある。ラスタースキャンで結晶を探索する際，

能回折が得られることもしばしばあった。しかし， LCP

X 線 検 出 器 の読 み 出 し 速 度 に 依 存 し て 測 定 時 間が 決 ま結晶の構造解析を行うための新たな問題に直面した。

る 。 当 時 ， BL32XU で 搭 載 し て い た Rayonix 社 の一つ目に LCP 結晶は可視光で視認が難しいという点でMX225HE 検出器は高い検出効率を有していたが読み出ある。結晶をピックアップする際に結晶が成長した環境でし速度は 1 秒程度かかっており，更にラスタースキャン 1

ある脂質を多く含んだ状態で試料ホルダーに載せて凍結す

枚ごとにシャッターを開閉する制御を行っていたため測定るため，これまでのタンパク質結晶のように「非晶質で透完了までに最低 15 ～ 20 分程度の時間を要していた。さら明な抗凍結剤に視認可能な結晶が浮いている」という状態にイメージ解析や高精度なセンタリングを完了する工程でではない。つまりビームラインの顕微鏡で結晶がどこにあ30 ～ 45 分程度の時間を要していた。微小ビームが利用でるのかを確認することができず， X 線と試料位置を合わきることで決定できる結晶位置精度は高かったが，この工せるという作業（以下センタリング）が基本的にはできな程にかかる時間を短縮することが測定効率向上の鍵であっい。この場合には X 線ビームを用いた二次元走査が必須

た。

となる（Fig. 2）（以下ラスタースキャン)7)。ゴニオメータ

二つ目は LCP 微小結晶の重篤な放射線損傷である。結を並進させながら試料ホルダーを X 線でラスタースキャ

晶が小さくなればなるほど放射線損傷の影響は大きくな

ンし，検出器上に回折像が確認された位置にセンタリング

る。結晶のサイズに関係なく結晶には吸収線量で規定されを行う方法である。ラスタースキャンは単に結晶を探索しる寿命があり，シグナルを得るために利用できる体積が小センタリングするために行う工程なので，ここでは放射線

さい微小結晶の方が得ることができるデータ量が少なくな損傷は極力抑える必要がある。つまり「結晶が見つかる程るためである。ヘリカルデータ収集法を用いることにより度」の回折シグナルが得られる低吸収線量でラスタースキ

大きな結晶では高分解能構造解析が可能なデータ収集も行ャンを行う必要があり，各試料の回折能に合わせた条件選えるようになってきたが， 30 ～ 50 mm 程度の結晶を用い

Fig. 2(Color online) The concept of `raster scan'. The dark region in the lefttop ˆgure shows a sample holder which
includes membrane protein crystals with lipidic mesophase medium. After deˆning the raster area and spatial
resolution of the 2dimensional grids, as shown with the yellow mesh, raster scan images are collected from eachgrid. SHIKA analyses the images and outputs the contour map of the results. The score of each grid is plotted tothe corresponding 2dimensional goniometer coordinates.

192 ● 放射光 July 2016 Vol.29 No.4

小特集 ■ 生体高分子の微結晶構造解析における技術革新

る場合にはより正確な吸収線量の見積もりとそれに基づくため，放射線損傷に規定される寿命が例えば露光時間100

実験条件の選定が必要であった。このため我々は異なる

秒と決まっていて 100 °分のデータ収集をしなければなら

X 線エネルギー，ビームサイズを用いた場合に凍結タン

ない場合には，1°分の回折イメージを収集するために結晶

パク質結晶上をどのように放射線損傷が伝播するかというに照射できる X 線は 1 秒と決まる。ヘリカルデータ収集ことを実験的に決定し，ヘリカルデータ収集時に結晶が吸法を用いてこの角度あたりの露光量を増やせる場合もある

収する線量を正確に予測することに成功した。その結果，が，数 mm の結晶しか得られない場合にはその量の変化は利用するビームサイズと結晶のサイズ，必要なデータ量か

劇的ではない。

ら，重篤な放射線損傷を回避するための露光条件を自動的

ここで複数の試料結晶からのデータ収集を許容した場合に選定して実験者に提案するプログラム KUMA の開発をには，その露光量を劇的に増やすことができる。例えば先行った。このプログラムの利用により，どのようなサイズ分とした場合， 1の結晶について収集するデータ量を 10 °の結晶からも微小ビームを用いた高効率なデータ収集を行°あたりに照射できる X 線量は10倍となるため同じ回折能うことを実現した。

を有する結晶からでも得られる回折分解能は向上する。たまた LCP 微小結晶からのデータ収集を通して，微小だし構造解析に必要な全データ量が集まるわけではないた

ビームを用いた測定において解決するべき装置的問題を洗分のデータを収集するためには少なくとも 10 個
め， 100 °い出すこともできた。例えば，回折計の温度変化によるゴの結晶を用いて必要なデータ量を完成することが必須とな

ニオメータ回転中心とビーム中心の位置ずれは微小ビームる。実際に LCP 結晶を用いた GPCR などの高難度タンパ

利用ならではの問題であった。通常，ユーザ運転を開始す

ク質結晶構造解析ではこのような方法がとられている報告

る前にビームラインの光軸調整を行い，回転中心とビームが 多 数 あ る28,29) （ 以 下 ， 複 数 結 晶 デ ー タ 収 集 法 ）。

中心のズレが無いようにしてユーザ実験を開始するが，調BL32XU でも結晶サイズが 30 ～ 50 mm よりも大きい場合

整後 2～3 時間で回転中心とビーム中心に 4～5 mm のズレにはヘリカルデータ収集が高効率ではあるが，それよりもが起きるという問題が頻発した。原因を調査した結果，結小さな結晶，もしくは回折能が著しく低い試料に対して複晶観察用顕微鏡架台の温度変化であることがわかった。調数結晶データ収集法を採用する必要に迫られた。

整中にハッチ内で利用していた液体窒素容器乾燥機の影響

複数結晶データ収集法を用いる上で重要な技術開発はラで架台温度が通常時より 1°
C程度高くなっていた。回転中

スタースキャンの高速化であった。ラスタースキャンは測心を観察するために設置した微小針の先端を観察するカメ

定時間の大半を占めていたためこの工程の高速化は実験効

ラは調整時には 4～ 5 mm 程度高い位置にあり， 2～ 3 時間率の向上に直結する。我々はピクセル分解能78 mm におい

かけて徐々に通常運転時の温度に近づき，架台が収縮してて 10 Hz 読み出しが可能な X 線 CCD 検出器（ Rayonix 社

回転中心とビーム位置ズレが起きていた。このため液体窒製 MX225HS ）を導入した。検出器はピクセル分解能を素容器の乾燥方法を変更すると共に，試料観察用顕微鏡架

312 mm まで落とせば100 Hz の読み出しが可能である。こ台を熱膨張係数が元素材の 1/ 10程度の素材で製作しこのれと同時に X 線シャッターを開けたままゴニオメータを問題を解決した。現在では自動光軸調整プログラムを開発

並進させるシャッターレス測定を採用した。これによりシし光軸調整時の人為的な誤差の介入を防ぐこと，さらに調ャッターの開閉とゴニオメータの位置合わせにかかる時間

整結果は自動的に記録し光軸ズレが起きた際の問題特定をを短縮することができた。ラスタースキャンで最も重要な

迅速に行えるような工夫をしている。

ことは，イメージを取得した時のゴニオメータ座標が正確に分かることである。このため，我々は SPring8 で開発

4. 複数微小結晶を用いたデータ収集法の開発された同期制御システム Blanc30)を導入することで，ラスターイメージを取得する検出器へのトリガーパルスとゴニ

上記のようにビームラインにおける応用にも即した開発

オメータを並進させるパルスを同期させている。現時点でにより，多くのインパクトの高い成果2227) が創出できるのラスタースキャンの標準条件は10 mm 角のビーム，ゴニ

ようになった反面で残された問題点もいくつかあった。

オメータ並進速度 500 mm / sec ，検出器読み出し 50 Hz で

LCP 結晶は回折能が比較的高いものが多いが，もちろんある。この速度では一連の制御を含め，600 mm 角で3,600

そうでないものも多く存在する。このような場合には結局枚の走査をおおよそ 3 分程で完了することができる。

のところ結晶化条件を再検討し，スクリーニングを行ってデータ収集が現実的である回折能を有する LCP 結晶の探結晶品質を向上するということが求められる。このことは索であればおよそ 30 ～ 100 kGy という非常に少ない吸収

ヘリカルデータ収集をはじめとした「1 つの結晶から 1 つ

線量で行うことができる。

のデータセットを収集する」ということを前提にした測定

ラスタースキャンの高速化の一方で，得られた回折イに共通の問題点であるとも言える。構造解析を行うためにメージの解析の高速化も重要である。我々はストレージ上分～ 360°分は前述したとおり，結晶を回転させながら90°に高速に撮りためられた走査イメージを認識し，ブラッグなどのデータ収集を行うということが一般的である。この反射ピークを自動的に解析するプログラム SHIKA を開発

放射光 July 2016 Vol.29 No.4 ● 193

した。24コア CPU を搭載したクラスタマシンでバックエ

備中］のデータ収集に成功した（Fig. 3）。このデータ収集

ンド回折強度解析プログラム distl31) を利用した並列計算には 400 個以上もの結晶を用いて 16 時間もの時間をかけによりスキャン終了後30秒程度で結果のスコア（各イメーた。しかしこの経験を通してこの手動データ収集プロトコ

ジ上に観測されたブラッグ反射の数など）をゴニオメータ

ルを自動化できることを確信した。また同時に得られた大の三 次元座 標上 にマッ プと して表 示する こと がで きる

量のデータをその品質性状に基づいて取捨選択し，うま（ Fig. 2 ）。マップ上のグリッドをクリックすると対応する

くスケール合わせとマージを行うプログラム開発の必要性

ゴニオメータ座標へ移動することができる。高速ラスターもあると認識した。

スキャンシステムの構築と SHIKA の開発により微小結晶探索の時間と労力に関する効率は劇的に向上した。ラス
タースキャンに時間がかかっていた頃は，走査領域が小さ

5. 手動測定から自動測定へくなるように試料結晶を少量ずつピックアップするなど実新たに試料結晶ホルダーの外形を自動的に認識してラス

験者の手技が測定効率向上に重要であったが，この高速ラター領域を自動的に決定するためのプログラム INOCC を

スタースキャンおよび高速解析プログラムの開発により実新たに開発した。さらに SPring8 の構造生物学ビームラ

験者の試料準備の簡便化にもつながった。

インで標準的に利用されているビームライン制御プログラ

我 々は まず 各試 料ホ ルダ ー上 に数 個～ 50 個 凍結し た

ム BSS32) の機能を利用した自動データ収集システムを開LCP 微小結晶を測定対象とした手動データ収集プロトコ発した。自動データ収集システムのナビゲータプログラム

ルを確立した。試料ホルダーの形状に合わせてラスター領

は BSS に コ マ ン ド を 送 信 し て 自 動 試 料 交 換 ロ ボ ッ ト

域を設定し，10 mm 角のビームを利用して高速ラスタース

SPACE33)を用いた試料交換やラスタースキャン，さらにキャンを行い，SHIKA の解析結果から見出された結晶位はデータ収集などの高度な装置制御が必要な工程の自動化

置を記録する。マークした全ての結晶に10 mm 角のビームを実現する。また自動ループセンタリングラスター領域

分の回折データ収集を行う。SHIKA でを照射して 5～10°

自動決定プログラム INOCC，ラスタースキャン結果自動マークした座標はプログラム KUMA に転送し，利用する解析プログラム SHIKA ，露光条件自動決定プログラム

エネルギーやビームサイズなどから放射線損傷を考慮した

KUMA をつなぐ役割も担っており，ユーザが測定前に設

最適露光条件を設定しデータを順次測定する。ラスタース

定した試料情報や測定条件に従って複数結晶を用いたデー

キャンを行った角度を中心として，例えば 5 °分ならば±分といった測定をすればビームから結晶が外れること
2.5°
なくデータ収集が行える。各結晶は互いに独立にランダムに配向しているものと仮定すれば，数十～数百の結晶からデータを得れば必要な回折強度データを全て得ることができる。我々はこの手動データ収集プロトコルを利用することにより，ある GPCR の高分解能（1.95 Å）［論文投稿準

Fig. 3(Color online) Electron density map of a GPCR crystal
structure at 1.95 Å resolution.

194 ● 放射光 July 2016 Vol.29 No.4

Fig. 4(Color online) Experimental ‰ow chart in our automatic
data collection system.

小特集 ■ 生体高分子の微結晶構造解析における技術革新

タ収集を全て自動的に行うことを実現した（Fig. 4）。実績

ォーカスビームラインにて凍結結晶を利用した SSX 法としては16個の試料ホルダーを2.5～3.5時間程度で完了す（ Serial Synchrotron Crystallography の略）を開発した。

ることができている。測定自動化に加え，全自動データ処

1 mm ほどの大量の微小結晶を 600 ～ 1,000 mm サイズの試理システムの開発も行った。開発したプログラム KAMO

料ホルダー上に凍結し，サイズ 5 mm の高フラックスビー

は，大量の結晶から収集した回折データを認識して指数付

ムで高速に走査しつつ，フォトンカウンティング検出器

け積分を行い個々の格子定数やデータ間の相関係数を利（Dectris 社製 PILATUS 6M）で高速データ収集を行って用して同型結晶をグルーピングマージする機能を有している。試料ホルダーは並進させる際に同時に回転も加えている。開発した Zoo システム（ INOCC, SHIKA, KUMA,いるため，1 結晶 1 照射であっても必要な回折強度をよりKAMO ）を用いて 2015年度には微小結晶を用いたタンパ

効率的に取得できる。この報告をきっかけにヨーロッパでク質の高分解能構造解析を既に 20 個以上も実現しておりは SFX 法と同じように液体ジェットを利用した常温結晶

中には重原子を利用した GPCR の位相決定も含まれていの SSX 法が提案されたり37) ，大量の微小結晶を大面積のる。現在，さらに広範な測定に対応するべく，通常の単一試料ホルダー上にマウントして測定に利用する手法が盛ん

分のデータ収露光点データ収集（露光点を 1 点とし 360 °に開発されるようになった3843)。XFELシンクロトロン

集が可能），ヘリカルデータ収集（前述），シリアル放射光

問わず，今後もこのような微小結晶構造解析における高速

データ収集（後述SMX 法）などの機能を有するシステ

データ収集に必要な技術開発が活発になると考えられる。

ムとして高度化を進めている。

SFX のデータ処理方法の開発では検出器の幾何学的配置を精密化するなどマルチパネル検出器に特化したデータ

6. XFEL 施設を用いたタンパク質微小結晶構造解析

処理法の最適化がデータ精度向上に重要であるという報告もある。 BL32XU では取得したデータの取捨選択，クラスタリングやマージの技術（プログラム KAMO）により2011 年に XFEL を用いた最初のタンパク質結晶構造解

大量微小結晶からの高分解能データ収集と解析を実現し析の事例が Nature に掲載された34)。 XFEL 施設ではフェた。さらに SFX で部分反射強度から完全反射強度を見積

ムト秒オーダーの極短パルス X 線が数百 nm～数 mm 集光もるプログラムの開発も進んでいる44,45)。このようなデー

サイズ，強度 1010～ 1011 phs / pulse 程度，繰り返し周波数

タ処理プログラムの発展は既存の実験手法の効率向上だけ

30～ 120 Hz で試料位置に供給される。上記構造解析で採でなく，上述した測定技術などと組み合わせることで，相用された方法（シリアルフェムト秒結晶構造解析Serial乗的に新たなハードウェア開発や手法開発にもつながって

Femtosecond Crystallography: 略称 SFX）は当該分野のいくことが期待できる。

測定手法として革新的であった。現在も広く利用されているこの SFX は数 mm に集光した XFEL 光路上に液体ジェット等でミクロンオーダーの微小結晶を連続的に供給し，7. 今後の展望

XFEL の繰り返し周波数と同期した高フレームレートの

本稿ではタンパク質の微小結晶構造解析にテーマを絞っ

X 線検出器で撮像を繰り返す。 XFEL が結晶に当たったて執筆を進めてきたが，最後に私が今思うところを述べた

場合には検出器上に回折点が観測され，観測されたイメー

い。私はどんなタンパク質に対しても微小結晶構造解析を

ジを選別して指数付け積分の後でモンテカルロ積分法に適用したいと思っているわけではない。タンパク質の結晶

よってマージを行う。従来法（シンクロトロン放射光施設

は大きければ大きいほど理想的には回折能は高いし，放射などで採用されている振動写真法）と異なり，1 結晶 1 枚

線損傷量という制限がある以上，微小結晶より高分解能構限りの回折データ，しかも結晶を回転しない（できない）

造解析も容易である。本稿で述べたいことは加速器や放射静止写真法である。上記論文中の解析では 3,000,000 枚の

光施設のたゆまぬ発展と共に種々のハードウェアやソフト

データ収集（現在はもっと少ない枚数で構造解析が実現でウェアの技術が成熟した結果，微小結晶しか得ることができることが示されている）を行い，強度積分を行った後，きなかったタンパク質の構造解析を効率化できた，という結晶学的に等価な反射強度をすべて平均化し（モンテカル

ことである。

ロ積分），平均値が収束するまで測定を繰り返す方法が採冒頭に述べたようにタンパク質の機能を深く理解するた

用されている。 SFX は先に述べた「複数微小結晶からのめには構造をより高分解能で解析できた方が良い。私はこ

データ収集法」の究極の形とも言える。

の「高分解能」は分解能 2 Å 以上であると思っている。

SFX はタンパク質結晶構造解析分野において「複数結もしこの高分解能構造解析が「どんなタンパク質でも微小晶からデータ収集する」ことに対する価値観を変えたので結晶で」実現できるのであれば微小結晶構造解析だけを推はなかろうか。例えば Redecke らはアメリカ XFEL 施設

進すれば良いと思う。しかし，現時点でも微小結晶を利用

LCLS で行った SFX35) の実験と同じ結晶を利用して，ドして 2 Å 分解能を超える構造解析が実現した膜タンパク

イツのシンクロトロン放射光施設 DESY36) のマイクロフ質は希少であるし，今後の結晶構造解析の対象として残さ

放射光 July 2016 Vol.29 No.4 ● 195

れているタンパク質はこれまで以上に結晶化も高分解能化も困難になると予想できる。これらの高分解能データ収集を実現するためのビームライン技術開発を継続することは今後も重要である。
「過去の不可能を可能にした」という意味で高フラック
ス微小ビームビームラインは非常に重要な開発であった。
SFX がシンクロトロンでの測定方法を進化させたように，シンクロトロンでの微小ビームの利用技術が XFEL
施設を含めた他のビームラインの進化を促し，より多くの

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タンパク質の高分解能構造解析が実現できるようこれから
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も尽力したい。
謝辞
SPring8 ビームライン BL32XU の建設開発は文部科関係者の方々のご指導ご協力の下継続して行っている。

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また利用実験者には高度化に関する多くのアイディア，時39)

学省ターゲットタンパク研究プログラムの一環として建設され，現在は AMED 創薬等支援技術基盤プラットフォー
ムプロジェクトによって高度化とユーザ支援を継続している。ビームラインの建設高度化運用は理研放射光科
学総合研究センターならびに高輝度光科学研究センターのには試料結晶を提供して頂いている。関係して頂いた方々に深く感謝を申し上げます。

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著者紹介
平田邦生
理化学研究所放射光科学総合研究センター
専任技師
Email: hirata＠spring8.or.jp
専門放射光科学，構造生物学［略歴］
2003 年大阪大学大学院理学研究科高分子科学専攻博士課程修了，博士（理学），高輝度光科学研究センター博士研究員，理化学研究所放射光科学総合研究センター博士研究員， 2009 年同センター技師を経て2012年より現職。

小特集 ■ 生体高分子の微結晶構造解析における技術革新

Current status of protein micro-crystallography
Kunio HIRATA
Abstract

RIKEN SPring-8 Center SR Life Science Instrumentation Unit, 111, Kouto, Sayo-cho,
Sayo-gun, Hyogo 6795148, JapanThe beamline BL32XU at SPring-8 is dedicated to protein micro-crystallography. Available beam
size ranges 110 mm squares with ‰ux density of 1010 photons/sec/mm2. This high ‰ux microbeam enabled the high resolution data acquisition from protein micro-crystals. Through the 5
years operation of the beamline BL32XU, we had successfully determined several structures ofchallenging membrane proteins by the developed method, coupled with the maturity of the novel
crystallization techniques. Developments related to protein micro-crystallography at synchrotron
and also at X-ray free electron laser facilities are introduced.

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