分子系統樹を用いた比較法と祖先形質復元：	  膨大な生物多様性情報を活用するために	

奥山雄大	  国立科学博物館 植物研究部	  系統樹は何を語るか？	
• 種間比較のツール：多様な生物をつなぐ『架け橋』	  • 進化史上のイベントが、いつ、どこで、どのように起こったかが推定できる。	  
• 多様な種の形質を統計学的に扱うことで、形質進化の背景にある要因や一般則を理解できる。	  

Tree	  of	  Life	  Web	  Project	  h0p://tolweb.org/tree/	

本日のお話	• Mesquiteを使ってみよう	  • Mesquiteによる祖先形質復元法	  • （補足）BayesTraitsによる祖先形質復元法	  • Mesquiteによる系統的独立比較法	  • （補足）Rによる系統的独立比較法	  Mesquiteをインストールしよう	• h0p://mesquiteproject.org/mesquite/mesquite.html	  (“mesquite”でgoogle検索)	  • 色んなことが手軽に出来る反面、一部の解析では専門のソフトウェアに劣る場合も	Mesquiteを走らせるために最低限必要なデータ	
• 分子系統樹のツリーファイル（#Nexus形式の有根系統樹。タクソンブロック入り）	  • これをMesquiteで開けばOK!	  
M.  yamato

M.  yamato
M.  hayato

M.  hayato

M.  yoshinagae

M.  yoshinagae

M.  japonica

M.  japonica

M.  makinoi

M.  makinoi

M.  stylosa

M.  stylosa
M.  kiusiana

M.  kiusiana

M.  pauciflora

M.  pauciflora

M.  koshiensis

M.  koshiensis
M.  furusei

M.  furusei

M.  subramosa

M.  subramosa

M.  acerina
0.003

phylogram	

M.  acerina
0.09

chronogram	祖先形質の復元（推定）	
• ある形質がどの枝で、何度進化したかを推定する	
M.  yamato
M.  hayato
M.  yoshinagae?	

M.  japonica

釣鐘型の花	

M.  makinoi?	

M.  stylosa
M.  kiusiana
M.  pauciflora
M.  koshiensis
M.  furusei?	

M.  subramosa
M.  acerina

0.09

皿型の花	

祖先形質の復元（推定）	
• ある形質がどの枝で、何度進化したかを推定する	  • 最節約法による方法→形質の変化が最少となるように祖先形質を推定	  • 最尤法による方法→系統樹全体に適用される形質進化のモデル（連続時間マルコフモデル[Pagel,	  1994]）のパラメータを、最もデータ（分かっている種の形質状態＋系統樹）に当てはまりがよいように最適化して祖先形質を推定	Mesquiteに形質の打ち込み	

Mesquiteに形質の打ち込み	エクセルからまとめてペーストも可	祖先形質の推定	• Tree	  Windowを開きTrace	  Character	  HistoryからStored	  Characterを選択	  • Parsimony/Likelihoodによる祖先形質復元を選べる	  祖先形質の復元（最節約法）	
• 直感的に分かりやすい結果が得られる	  • 形質の変化が多い場合は誤りやすく、また推定不可能な枝が増える	  • ConXnuous	  dataでも同じようにして推定が可能	  祖先形質の復元（最尤法）	
• Current	  Probability	  Modelを選択	  • Square	  Treeでは結果が見にくいので、Tree	  FormのBalls&SXcksを選ぶ	  祖先形質の復元（最尤法）	
• 形質進化のモデルは0→1と1→0の起きる確率が同じとするモデルMk1と、異なるとするモデルAsymm.	  2	  param.を選べる（尤度比検定などで選択）	  祖先形質の復元（最尤法）	
• 曖昧な結果が出やすい	  • (Mesquiteでは)形質が３種類以上になった時にもパラメータは2までしか増やせない	  • (Mesquiteでは)祖先形質の推定の確からしさ（パイグラフ）が過大評価される“global	  esXmator”と呼ばれる推定法しかできない	  BayesTraits	
• 形質が３種類以上になった時にも全てのパラメーターを動かせる	• 大量のツリーを並行して解析できる	  • より厳密な手法(“local	  esXmator”)が使える	  BayesTraitsの入手	
• h0p://www.evoluXon.rdg.ac.uk/BayesTraits.html	

BayesTraitsの実行	
• UNIXプログラム	  • ツリーファイルと形質を記入したテキストファイルの２つを必要とする	  • 改行コード等に注意	  BayesTraitsの実行	Local	  EsXmator	• 祖先形質を知りたい節（ノード）について、取りうるそれぞれの形質に固定した場合の全体の尤度を求める	  M.  yamato(1)	

M.  hayato(2)	

M.  yoshinagae (3)	M.  japonica(4)	

M.  makinoi(5)	

M.  stylosa(6)	

M.  kiusiana(7)	

M.  pauciflora(8)	

M.  koshiensis(9)	

M.  furusei(10)	

M.  subramosa (11)	
M.  acerina0.09(12)	

ここが の場合	  logL=-­‐6.290513	
ここが の場合	  logL=-­‐6.550491	

BayesTraitsの実行	
• 初期状態ではパラメータは全て自由に動くので、必要に応じてrestrictコマンドを用いてパラメータ数を減らす（例：restrict	  q01	  q10）	  • local	  esXmatorによる取りうる祖先形質の確からしさの比較にはfossilコマンドを用いる（例「タクソン5,6,10,12の最近共通祖先の形質を0に固定する」:fossil	  Node1	  0	  5	  6	  10	  12）	  • 全て設定したらrunコマンドで尤度の計算を開始	  • 同じnodeでもう一度fossil	  Node1	  1	  5	  6	  10	  12のように実行し、前の結果と尤度を比較する	  • 尤度の比をパイグラフなどで表現する	BayesTraitsによる祖先形質推定の応用例	

皿型花	  • チャルメルソウの仲間において、皿型花とキノコバエ媒の間に進化上の対応があることが明らかになった	
キノコ
バ
エ
媒	

チャルメルソウ類の種分化は	  どのように起こったか？	

コチャルメルソウ�
京都府芦生演習林�

チャルメルソウ�モミジチャルメルソウ�

シギキノコバエ�

口吻が伸長していない
キノコバエ�

チャルメルソウの種
チャルメルソウ
ヤマトチャルメルソウ

シギキノコバエ その他のキノコバエ
102
0069

その他（双翅目）
01

三重県赤目四十八滝の2種混生個体群で、
2人の観察者による計6時間の連続観察により得た訪花回数�

チャルメルソウの種 シギキノコバエ その他のキノコバエシコクチャルメルソウ

390

トサチャルメルソウ

06

徳島県穴吹町の2種混生個体群で、
2人の観察者による計2時間の連続観察により得た訪花回数�

はっきりと誘引する送粉者を決める因子が存在する�シギキノコバエがあまり訪花しない種	  シギキノコバエがよく訪花する種	  チャルメルソウ全種の花香成分組成	

Linalool	Lilac	  aldehyde	Lilac	  alcohol	

Okamoto	  et	  al., 未発表データ	  種間比較：種間で形質間の相関を調べる際に生じる問題	
送粉者の誘引	種	  1	
1	2	種	  2	3	4	有意?	

5	

匂いの放出量	6	種	  3	種	  4	種	  5	種	  6	

系統学的独立比較:	  PIC	
データ点の値から系統関係の影響を差し引く	
データ点の数は１つ減少する	  （n種を比較した場合はn-­‐1個のデータ点)	

種	  1	

進化のチャンス＝樹長で比較値を標準化	
送粉者の誘引	種	  2	有意性無し	
種	  3	種	  4	種	  5	匂いの放出量	

種	  6	

系統的独立比較の実際	  6292

147
形質 2 比較値

51形質	  1:	  (6-­‐5=1)	  形質	  2:	  (2-­‐1=1)	  比較値:	  (1,1)/√2	  Felsenstein 1985

形質 1 比較値

系統的独立比較の実際	  6292147形質 2 比較値

51

形質	  1:	  (14-­‐9=5)	  形質	  2:	  (7-­‐2=5)	  比較値:	  (5,5)/√2	  形質 1 比較値

系統的独立比較の実際	  6292

147

子孫の平均値
5.5
1.5

11.5
4.5

形質 2 比較値

51形質	  1:	  11.5-­‐5.5=6	  形質	  2:	  4.5-­‐1.5=3	  比較値:	  (6,3)/√4	  形質 1 比較値

系統的独立比較の実際	
• 比較の方向は任意	  • 比較値が一意に決まらないので、片方の値を正にする(posiXvized)	  • 符号検定による形質間の相関の検定も行える（xを正に固定した時にyが正になるものと負になるものの数で検定）	  • 回帰をする場合は原点から(切片=0）	  Mesquiteで実行するには	
• h0p://mesquiteproject.org/pdap_mesquite/から
PDAP:PDTREEをダウンロード、解凍	  • Put	  in	  Mesquite	  Directoryフォルダの中の、PDAPフォル
ダをMesquiteのmesquiteフォルダに入れて、Mesquiteを起動	  Mesquiteに形質の打ち込み	
• 上のバーからCharacters>New	  Empty	  Matrixを選択	  • ConXnuous	  Dataを選択	  系統的独立比較の実行	
• Tree	  windowからNew	  Chart	  for	  Tree>PDAP	  DiagonisXc	  Chartを選択	

系統的独立比較の仮定と適合するかを確認	  (PDAP	  diagonisXc	  chart)	  標準化された比較値	

•標準化した比較値と樹長が相関しない	  •比較値（Y軸の値）は正規分布している	  •明らかな外れ値が存在しない	  樹長和の平方根	系統的独立比較の実行	
• 上のバーからY	  Contrast	  vs.	  X	  Contrast	  (posiXvized)を選択	  系統的独立比較の実行	

lilac	  aldehyde	  B放出割合	  についての比較値	

• 回帰係数についての検定結果を見て、形質間の相関の有無を見る	  シギキノコバエ誘引の程度についての比較値	

PDAP/PDTREEによる系統的独立比較	
• 通常のデータ量では解析内容に特に問題ない	  • 大量の形質データを扱うには不向き	  • Rのパッケージ“ape”の利用	  • apeはそのままではposiXvized処理に非対応なので、必ずしもMesquiteの結果と一致しない	apeによる系統的独立比較	
• Rをインストールした後、パッケージgee、apeの順でインストール	  • h0p://www.r-­‐phylo.org/wiki/HowTo/PhylogeneXc	  _Independent_	  Contrastsに詳しく解説あり	

apeによる系統的独立比較	
• 結果の出力が自在にできる	  • 自動化による大量データの処理に向いている	大量データを用いた応用例：	  遺伝子発現と表現型の間での連関解析	
遺伝子のリスト（5000以上)	

種のリスト	・	  ・	  ・	

×	物質のリスト（32種類)	

種のリスト	・	  ・	  ・	形質との相関から形質、生活史特性の多様性を特徴づける遺伝子そのものを同定する	

まとめ	• 正確な（分子）系統樹は、現生する生物の多様な形質を進化の軸でつなぎ、解析するために必須なツールである	  • Mesquiteは祖先形質復元や系統的独立比較を手軽に行える便利なソフトウェアである	  • 最尤法を用いた厳密な祖先形質復元にはPagelのBayesTraitsを用いるべきである	  • 系統的独立比較において大量の形質データを処理する
際には、Rのパッケージapeが利用できる	  • 系統樹を考慮した比較解析は、近年発展が目覚ましい「オミクス」的研究にも応用できる