Single Guide RNA Library Design and Construction
20240702 Inui Hiiro[Reagents]
・Agarose gels (1.0% and 2.0%)
・BsmBI・MegaX DH10B T1R Electrocomp™ Cells (C640003)
・Ethidium bromide
・Gel Extraction Kit
・NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning Kit (E5520S)
・LB-ampicillin agar plates
・LB liquid medium
・Lentiviral single guide RNA (sgRNA) expression plasmid (Addgene 52963)
・Library polymerase chain reaction (PCR) primers
・NEBuffer 3.1
・Oligonucleotides, custom-made/ordered・Plasmid Plus Maxi Kit (QIAGEN 12963)
・Recovery medium・Water (H2O)[Method]■sgRNA Sequence Design- 標的遺伝⼦の sgRNA sequence list を作成- 5ʼ末端にアダプター配列として、TATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG を付加- 3ʼ末端にアダプター配列として、GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAAT を付加- カスタムオリゴヌクレオチド pool を GenScript 社にオーダー (~6K variation で 25 万円程度)※Custom Oligo の設計、オーダー⽅法は備考欄に記載

■Vector Preparation- Lentiviral sgRNA expression plasmid を以下の組成で制限酵素処理- 55℃、Over night でインキュベーション- 1% Agarose gel を作製、DNA マーカーとサンプルをアプライして泳動 (20-30min)- サンプルは切り出しするため少し太めのコームを使⽤し、全てアプライする (10 uL/well)- 泳動後、撮影、プリント- Fast GENE ゲル/PCR 抽出キットを使⽤し、DNA を抽出する- ゲルを回収したエッペンチューブに GP1 を 600 uL 添加し、55℃、10-15min インキュベーション＋転倒混和- カラムにサンプルを分注し 13000rpm,30sec 遠⼼- フロースルーを捨て、GP2 を 600 uL 添加し、13000rpm,30sec 遠⼼- フロースルーを捨て、13000rpm,2min 遠⼼ (ｘ2 回)し、メンブレン乾燥させる- 10 uL の GP3 をメンブレンへ添加し、室温 2min インキュベーション- 13000rpm,室温、2min 遠⼼- 濃度測定 (ng/ul)■Library Cloning- HiFi DNA Assembly を以下の組成で⾏うHiFi DNA assembly Master Mix: 50ul
Vector (about 8000bp): 500ng
Oligo Pool: 45nM
Total volume: 100ul (water up to 100ul)- 50℃、1h インキュベーション- エレクトロポレーションを阻害する塩やバッファーを除去するため、反応液を精製キットを使⽤し、DNA を15 ul MQ で溶出する。※塩を含むので Elution buffer 使⽤しない︕- 4℃で保存 (以下の self-ligation check 後に使⽤するかどうか判断する)■Self-ligation check- Negative control として Hifi DNA Assembly を以下の組成で⾏うHiFi DNA assembly Master Mix: 5ulVector (about 8000bp): 50ng

Total volume: 10ul
- 50℃、1h インキュベーション- 上記

insertion vector( 精 製 前 ) と negative control を 1ul ピ ッ ク し て 、 DH5a へTransformation (ヒートショックで OK) 翌⽇のコロニー数を⽐較することで insertion と selfligation vector の割合を確認する。Self-ligation の 5 倍以上 insertion で⽣えていればライゲーシ
ョン⼯程に問題はないと判断する■Library Transformation- Recovery Medium を 37℃で 30 分以上温めておく。低温培地を使うと増えない- LB プレートを 37℃で 30 分以上温めておく- Electrocompetent Cells (MegaX DH10B)を 1 vial 氷上で 15 分、静置
- MegaX DH10B 100ul に 5ul の精製後の反応液を加える- 2.0 kV, 200 Ω, 25 µF の条件でエレクトロポレーションを⾏う。
- リカバリーメディウム(キットに⼊っている。なければ SOC)を出来るだけ早く 4ml 加えピペッティング（キュベットを洗うように 4ml 加える）
- 15 ml チューブへ移す- 37℃で 1 時間培養する■Quality check- 4ml から 4ul を pick (1/1000)、1ml 培地に懸濁1m から 100 ul を pick(1/10000)LB に撒く- それぞれを抗⽣剤⼊り LB プレートに撒く- 翌⽇コロニー数を確認する※Quality check 計算⽅法例)標的遺伝⼦ 500gene の場合。それぞれに対する sgRNA の数(x3)=1500 variation。
ライブラリーvariation の 500 倍以上が望ましいので、750,000 コロニーが必要。上記、希釈した⼤腸菌液を使⽤する場合、75 コロニー以上が⽣えていればクオリティーとして問題ないと判断できる。
■Plate 播種- 残りすべての⼤腸菌懸濁液 4ml を 10cm dish 8 枚程度に播種、翌⽇コロニーを確認- LB（液体）を表⾯に１０ml 程度加えて、セルスクレーパーでかき集めチューブに回収。この操作を 2〜３回繰り返して⼀本のチューブにまとめ、Maxi Prep で精製。

[備考欄]☆Custom Oligo の設計、オーダー⽅法- Library 遺伝⼦をリスト化する- Broad 社の CRISPick を検索
https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public- 以下の設定で Target(s)に標的を記載- sgRNA の数を設定(3~5 くらい)- submit し、report を txt として保存、EXCEL data へ paste- 確認の為に IDT の以下のサイトで guide RNA デザインをいくつか確認する
https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM

- Variation の 10%が NT になるように NT gene を List に加える
(GeCKO library から NT を抽出してよい)- 5ʼ末端にアダプターに TATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG を加える
- 3ʼ末端にアダプターに GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAAT を加える
- custom oligo pool の合成委託が可能なメーカーのオーダーシートに各配列を記載して発注