5.4 低線量率放射線が加齢関連分子に及ぼす影響の解析（次世代シーケンシング技術導入に関するフィージビリティー試験）
Application of Next-generation Sequencing Technologies to Analysis of the Effectsof Aging and Low Dose- Irradiation on DNA Methylation
杉原 崇
生物影響研究部

Takashi SUGIHARA
Department of Radiobiology
Abstract
We have performed a feasibility study to apply next-generation sequencing (NGS) technologies to the analysisof the effects of aging and of low dose-rate irradiation on DNA methylation in the liver of mice. We examined
the level of DNA methylation, using NGS following bisulfite conversion, at individual CpG sites in the fourgenes, C1ql3, Srd5a2, Rfx4 and Ptk7, which have been reported to show age-dependent changes in DNAmethylation, in the liver of non-irradiated young (~60 days old), non-irradiated old (~660 days old), andirradiated (at 20 mGy/day for 400 days) old (~660 days old) female B6C3F1 mice. NGS revealed ageassociated increase in DNA methylation in all of the four genes. We also found regions in which low doserate irradiation specifically increased methylation in the Rfx4 and Ptk7 genes. RNAseq, an NGS-based methodof gene expression analysis, revealed the increase in the expression of the Ptk7 gene in irradiated mice. These
results suggest the usefulness of NGS technologies in studying the effects of low dose-rate radiation.
1. 目的

るものの、さまざまながんの発症頻度があまり変わ

これまで、我々はマイクロアレイを用いた網羅的らないという結果が得られており、これは、「放射線ゲノム解析や網羅的遺伝子発現解析を行ってきたが、照射が一般的にマウスの加齢を促進する」という古データ解析のスピード、解像度といった面で制限がくからある仮説を支持するもののように思われる。

あり、必要な遺伝情報を最大限に引き出すことは難そこで、本課題では、「ゲノム関連の加齢指標が低線しかった。一方、新しい技術である次世代シーケン量率放射線照射によって変動するか」及び「次世代シングの導入により、マイクロアレイに比べて格段シーケンシングを用いて解析することの有益性」のに情報量が大きな結果を得られることが期待される。

二点について検討することとした。

そこで、本課題では、加齢したマウス肝臓組織サンプルを「次世代シーケンシングによる DNA メチル

2. 方法化解析法」及び「次世代シーケンシングを用いた8 週齢の B6C3F1 メスマウスに低線量率（20ｍGy/RNAseq 解析法」により分析し、我々の今後の交付日）放射線照射を 400 日間行い、その後 204 日間非金調査事業にとって次世代シーケンシング利用が有照射条件下で飼育し、解剖、肝臓を採取した。これ

益かどうかを検討した。

ら照射群老齢（RO）マウス 3 匹、および同齢の非照

また、B6C3F1 マウスを用いた寿命試験において、射老齢（NO）メスマウス 3 匹に加え、非照射若齢照射マウスで早期発がんによる寿命の短縮がみられ（NY、9 週齢）メスマウス 2 匹の肝臓組織について、

0.7**p<0.01
chr10:84760001-84760500

chr10:84760497
chr10:84760468
chr10:84760453
chr10:84760419
chr10:84760371
chr10:84760327
chr10:84760324
chr10:84760322
chr10:84760310
chr10:84760296
chr10:84760293
chr10:84760267
chr10:84760265
chr10:84760256
chr10:84760241
chr10:84760210

chr17:46,629,430
chr17:46,629,426
chr17:46,629,421
chr17:46,629,415
chr17:46,629,399
chr17:46,629,396
chr17:46,629,389
chr17:46,629,387
chr17:46,629,382
chr17:46,629,377
chr17:46,629,375
chr17:46,629,373
chr17:46,629,.369
chr17:46,629,365
chr17:46,629,362
chr17:46,629,346
chr17:46,629,339
chr17:46,629,328
chr17:46,629,312
chr17:46,629,308
chr17:46,629,278
chr17:46,629,268
chr17:46,629,249
chr17:46,629,239
chr17:46,629,220
chr17:46,629,218
chr17:46,629,209
chr17:46,629,084
chr17:46,629,078
chr17:46,629,076
chr17:46,629,056
chr17:46,629,052
chr17:46,629,047
chr17:46,629,035
chr17:46,629,031
chr17:46,629,024
chr17:46,629018
chr17:46,628,960
chr17:46,628,948
chr17:46,628,944
chr17:46,628,942
chr17:46,628,923
chr17:46,628,883
chr17:46,628,877
chr17:46,628,873
chr17:46,628,858
chr17:46,628,856
chr17:46,628,849
chr17:46,628,847
chr17:46,628,827
chr17:46,628,822
chr17:46,628,819
chr17:46,628,817
chr17:46,628,813
chr17:46,628,792
chr17:46,628,761
chr17:46,628,630
chr17:46,628,618
chr17:46,628,608

46,629,500 (Ptk7 gene).

chr10:84760203
chr10:84760196
chr10:84760193
chr10:84760188

chr10:84760185
chr10:84760183
chr10:84760177
chr10:84760142

chr10:84760140
chr10:84760121
chr10:84760104

1

Non-irradiated Young (NY), n=2
Non-irradiated Old (NO), n=3
Irradiated Old (RO), n=3
0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0

Ratio of Methylation

0.8

Rfx40.9

Ptk7
1.2

0.8

0.6

0.4

0.2

0

Ratio of Methylation

バイサルファイト法と次世代シーケンシング技術にメチル化の増加する領域を見出した（Fig. 1）。さらより DNA メチル化解析を行った。さらに、同じ肝に、RNAseq 法を用いて、これらの 4 遺伝子につい臓組織を次世代シーケンシング技術を用いた遺伝子ての遺伝子発現解析を行った。その結果、Ptk7 遺伝発現解析法である RNAseq 法により解析した。

子において照射による有意な発現増加が示された

3. 成果の概要（Fig. 2）。以上の結果から、加齢による DNA メチルマウスの加齢に伴い DNA メチル化が変化する領化変化が次世代シーケンシングにより検出できるこ域を持つ遺伝子として 4 遺伝子（C1ql3, Srd5a2, Rfx4,とが確認された。また、低線量率放射線照射によるPtk7 ） が 報 告 さ れ て い る （ Mozhui K.er al., Mech.

DNA メチル化の変化や遺伝子発現変化も解析でき
Ageing Dev., 2017, 162:27–37）ことから、これらの遺ることが示された。次に、これら遺伝子内において伝子にターゲットを絞り DNA メチル化解析を行っ

照射あるいは加齢によってメチル化に変化が見られた。その結果、非照射老齢マウスでは、4 つの遺伝る上位 3000 個の CpG 部位に関してヒートマップ解子全てにおいて、メチル化頻度の増加が確認できた。

析を行った。その結果、照射あるいは加齢によってさらに照射老齢マウスにおいて特異的に変化する領特異的にメチル化が変化している部位が多数存在す域を探索したところ、Rfx4、Ptk7 遺伝子内の一部にることが示された（Fig. 3）。

chr17:46,628,501-46,629,500 *p<0.05

Fig.1 Analysis of methylation at individual CpG sites in the Rfx4 and Ptk7 genes using NGS. Upper panel: methylationin the region chr10:8,476,0001-8,4760,500 (Rfx4 gene). Lower panel: methylation in the region chr17:46,628,501-C1ql3

Srd5a2

0.012
0.01
0.008
0.006

0.004
0.002
0-0.002-0.004NORONY

Rfx4

4.52
1.5
10.50NO

RONY4

3.532.5NORO

Ptk7

0.35

TPM (transcripts per million)

0.014

2.5

TPM (transcripts per million)

TPM (transcripts per million)

TPM (transcripts per million)

0.016

0.3

*p<0.05

0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0NYNO

RONY

Fig.2. Expression analysis of four genes using RNAseq. RNA molecules for the C1ql3 gene in NO and NY samples were
not successfully detected in this experiment.

NO vs RONO

NY vs NORONYNO

Fig.3. Heatmaps for comparison of methylation at the CpG sites in the four genes between NO mice and RO mice (leftpanel) and between NY mice and NO mice (right panel).