トピックス
ガリウム置換が可能にした光化学系 Iフェレドキシン
電子伝達複合体の結晶構造解析
河合(久保田)寿子
山形大学

理学部

理学科

〒9908560 山形県山形市小白川町 1412村木則文
自然科学研究機構

分子科学研究所〒4448787 愛知県岡崎市明大寺町字東山 51

田中秀明
大阪大学

蛋白質研究所〒5650871 大阪府吹田市山田丘 3 番 2 号

栗栖源嗣
大阪大学

要 旨

蛋白質研究所〒5650871 大阪府吹田市山田丘 3 番 2 号

光化学系 I（PSI）は光エネルギーを用いて光合成生物に必要な還元力を生みだす色素タンパク質複合体であり，
PSI から生じた還元力はフェレドキシン（Fd）という電子伝達タンパク質を介して細胞内に分配される。我々は，PSI から Fd への効率のよい分子間電子伝達の仕組みを解明することを目指して，シアノバクテリア由来 PSIFd複合体の X 線結晶構造解析に取り組んだ。複合体結晶を作製するにあたり，天然型 Fd の酸化還元中心を構成する
鉄をガリウムに置換した「ガリウム置換再構成 Fd」を利用したことがブレイクスルーとなり，4.2 Å で PSIFd 複合体結晶構造を決定することに成功した。そして，PSI と Fd が複合体界面に作り出すアミノ酸の環境と酸化還元中
心間の距離から，PSI から Fd へ効率よく電子が伝達される構造基盤を解明した。さらに，Fd 結合前後の PSI の構造を比較することで，Fd の結合は PSI の構造変化を引き起こし， PSI の集光反応と酸化・還元反応の微調整を行っている可能性が示唆された。

ン，鉄硫黄クラスターという電子伝達分子がタンパク質

1. はじめにの骨格中に適切な距離と配向をもって正確に配置されてい生命体を構成する主要元素のうち炭素，窒素，硫黄などることが報告されていた。光化学系 II において水分子のの多くは，生体に摂取される前の大気や土壌中で酸化され酸化により生じた電子は PSI へ伝達され，スペシャルペ

た無機酸化物として存在している。我々ヒトを含む動物

アクロロフィルで再励起された電子が PSI 末端の FA/B ク

は，無機酸化物を還元同化する能力を備えておらず，植物

ラスターまで伝達されても，非常に低い酸化還元電位を示やシアノバクテリアが太陽光エネルギーを利用して無酸化す（ Em ＝－ 500 mV ）。この還元力は，最終的に生体内で物から有機物を作り出す能力に依存して生命活動を行って炭素，窒素，硫黄などの還元同化反応に利用されるが，還いる。

元同化酵素群は PSI から直接電子を受け取ることができ植物やシアノバクテリアの生体内で強力な還元力を作りない。PSI に直接結合し，電子を受け取ることができるのだしているのは，チラコイド膜に埋め込まれた色素タンパ

は植物型フェレドキシン（ Fd ）と呼ばれる電子伝達タン

ク質超分子複合体，光化学系 I (Photosystem I: PSI）であ

パク質である。Fd は分子サイズ約11 kDa の酸性タンパクる。葉緑体の起源とされるシアノバクテリアの PSI 単量質であり，酸化還元中心として[ 2Fe2S]クラスターを持

体は 12 種類のタンパク質サブユニットからなり，生体内つ。その酸化還元電位は－400 mV と低く，PSI から電子

では約1,000 kDa の三量体として存在している。2001年にを受け取った還元型 Fd は強力な還元剤となり，生体内の好 熱 性 シ ア ノ バ ク テ リ ア Thermosynechococcus elongatus

様々な還元酵素に電子を分配する（Fig. 1）。このように，( T. elongatus ) -BP1 がもつ PSI 三量体の X 線結晶構造がPSI を基点とした還元力の供給は Fd に依存し，分子状酸

2.5 Å 分解能で報告された1) 。それによると，太陽光エネ

素への還元力の漏洩を防ぎながら PSI から Fd へ効率よくルギーを効率よく吸収すべく約300分子のクロロフィルが電子を伝達するための巧妙な仕組みが存在すると考えられ

PSI 内部にネットワークを形成していた。さらに，クロロる。本研究では，PSI と Fd が実際に相互作用している複フィルにより吸収されたエネルギーを利用して電荷分離反合体状態の立体構造を解析することで，光合成生物が最適応を行うスペシャルペアクロロフィルや，フェオフィチ

化した電子伝達反応の仕組みを解き明かすことを目的とし

放射光 Nov. 2018 Vol.31 No.6 ● 373(C) 2018 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

PSI と Fd[Ga]の試料調製や複合体結晶の調製法から構造解析について紹介する。

2. Fd と鉄硫黄クラスター
Fd の最大の特徴は鉄原子と硫黄原子から構成された鉄

硫黄クラスターと呼ばれる天然の鉄錯体を有していることにある。 Fd を構成するアミノ酸にはチオール基をもつシステインが 4 つあり，2 原子の鉄に配位している。これらの鉄は 2 原子の無機硫黄によって架橋され，[ 2Fe 2S ]型の鉄硫黄クラスターを形成している。このクラスターを利用して， Fd は低い酸化還元電位を生みだす PSI から電子
Fig. 1(Color online) Fd mediates electron transfer between PSI
and Fd dependent proteins.
Electrons which produced by PSI are transferred by Fd. The
complex-structural analysis revealed by NMR (Fd-FNR:
Kurisu et al. 2001, Xu et al. 2010, Kimata-Ariga et al. 2010,
Lee et al. 2011. Fd-SiR: Saitoh et al 2006. Fd-NiR:
Sakakibara et al. 2012) and X-ray crystallography (Fd-FNR:
Kurisu et al. 2001. Fd-FTR: Dai et al. 2005. Fd-SiR: Kim etal. 2016) are labeled by dotted line and gray respectively.

を受け取る。電子を受け取って還元型になった Fd は，鉄硫黄クラスターを取り巻くループ構造を変化させることが知られている。この構造変化によって，Fd は PSI から素早く解離すると考えられている。それゆえ，本研究において PSI と Fd の安定な複合体を得るためには，PSI から電子を受け取ることができない Fd を調製する必要がある。
しかし， Fd から鉄硫黄クラスターを除いてしまうと，安定な構造を維持できない。鉄硫黄クラスターは酸化還元中
心としての働きだけでなく，タンパク質構造の安定化にもた。

寄与しているからである。そこで，酸化型 Fd と同じ立体

これまでに Fd と Fd 依存酵素群，例えば Fd NADP＋構造をもつが電子伝達活性を持たない金属置換体を作製す

還元酵素（FNR)2)，フェレドキシンチオレドキシン還元

ることができれば，PSIFd 複合体調製に寄与できるので酵素（ FTR )3) ，亜硫酸還元酵素（ SiR )4) などとの複合体はないかと考えた。配位数 4 の Fe(III)のイオン半径 0.65

結晶構造が報告されている（Fig. 1）。多くの酵素で言われÅ に近い金属種としてイオン半径0.62 Å の Ga(III)が挙げているような鍵と鍵穴の関係とはほど遠く，Fd はそれぞられる。これまでにも，含鉄タンパク質において Fe の代

れのタンパク質と個別的な相互作用により複合体を形成しわりに Ga を導入した金属置換タンパク質の構造解析例はて，個別に電子伝達環境を最適化していることが明らかとあるものの，いずれも 1Ga に置換したという報告であっなってきた。さらに，電子伝達複合体を形成することで，

た7,8) 。 Fd も同様に 1Ga への置換例が多く，［ 2Ga 2S ]型

Fd 側もしくは Fd 依存酵素側に複合体形成に誘導されるクラスターは EXAFS によって確認された一例のみであ構造変化が引き起こされる例も示されていた。

る9)。そこで，最初に Fd [ Ga ]を調製して結晶構造解析を

これらの先行研究は，複数の構成成分を含む複合体であ行い，目的通り天然型 Fd の代替となりうるかを調べた。

っても単結晶を得ることができれば構造解析することが可能で あるこ とを 示して いる 。しか し，我 々が 目指 した
PSIFd 複合体の結晶構造解析は上記のような可溶性タン

パク質同士の複合体ではなく，弱い相互作用で一時的に形

3. Ga 置換再構成 Fd(Fd[Ga])の作製と結晶構造解析

成される「膜タンパク質可溶性タンパク質の過渡的電子Fd あるいは Fd に近縁な[2Fe2S]型クラスターを持つ伝達複合体」である。膜タンパク質の電子伝達複合体の解タンパク質は細菌から植物，動物にまで広く報告されてお析 例 は ， 酵 母 の cytochrome bc1 と cytochrome c1 と の 複り，いずれの生物も[2Fe 2S]型の鉄硫黄クラスターを生合 体5) や ミ ト コ ン ド リ ア cytochrome c 酸 化 酵 素 と合成することができる10,11)。我々は大腸菌を用いてシアノ

cytochrome c との複合体構造6)と限られており，困難が予バクテリア由来の組換え体 Fd を調製した。 Fd が酸性タ想された。実際，以下に示す通り，PSI と Fd を含む結晶

ンパク質であることを利用してイオン交換クロマトグラフは得られたが， Fd のタンパク質部分の電子密度がブロー

ィーなどを用いて単離精製した。単離精製した Fd は赤褐

ドで分子モデルを構築できないという問題に直面した。こ色を呈しており，[ 2Fe2S]型の鉄硫黄クラスターを含んの困難を克服するために，我々は天然型 Fd の酸化還元反でいることが分光学的手法からも確認できた。これまでに応中心にある鉄（Fe）をガリウム（Ga）に置換した[2Ga

報告されている Ga 置換体調製法にならい，以下の手法で2S]型 Fd（Fd[Ga]）を導入した。これが突破口となり，ガリウムクラスター再構成を試みた8,9) 。まず，単離精製

PSI Fd の複合体構造を解くことに成功した。本稿ではした Fd 溶液に塩酸を加えて白色沈殿を得た。これは Fd

374 ● 放射光 Nov. 2018 Vol.31 No.6

トピックス ■ ガリウム置換が可能にした光化学系 Iフェレドキシン電子伝達複合体の結晶構造解析

が鉄硫黄クラスターを失い，変性したことを意味する。沈殿を水に溶解し，そこに塩酸を加えるという作業を 3 回

4. 天然型 Fd と Fd[Ga]の構造比較

繰り返して系中から鉄と無機硫黄を除去した。ここで，試天然型 Fd と Fd [ Ga]の結晶構造を比較すると，タンパ料を嫌気条件（99 窒素， 1 水素）に移し，可溶化バ

ク 質 の 主 鎖 炭 素 Ca の r.m.s.d. は 0.286 Å ， 全 原 子 のッファー（ 100 mM Tris HCl pH8.0 ， 6 M グアニジン塩

r.m.s.d. は 0.549 Å であり，最末端部の違いを除けば，全酸塩， 50 mM ジチオナイト）を加えて溶解した。グアニ体構造は非常によく一致していた（ Fig. 2A ）。次に，金属

ジン塩酸塩はタンパク質変性剤として働き，高濃度のジチ

クラスター構造に着目した。［2Ga2S]型クラスターはタ

オナイトはクラスターの配位子となるチオール基を還元状

ンパク質では初めての報告であるため，Fd[Ga]の構造精態に保つ。可溶化したタンパク質を150倍量のリフォール

密化計算では，Cambridge Structural Database（CSD）にディングバッファー（2 mM Na2S, 2 mM GaCl3, 20 mM

登 録 さ れ て い る 4 配 位 Ga 二 核 錯 体 [ Et4N ]2TrisHCl, 2 mM DTT）に加え，4°
Cで15時間静置した後，[ Ga2S2 ( SPh )4 ]の高分解能構造を参照した。 CSD の構造

陰イオン交換クロマトグラフィーでタンパク質を回収しでは，GaGa 間の距離は2.943 Å である。この Ga 錯体にた。その結果，およそ15の収率で Fd[Ga]が得られた。

対応する 4 配位[2Fe2S]錯体である(NEt4)2[Fe2S2(Sp

Ga の再構成実験は嫌気条件下で行なったが，Fd[Ga]はtol )4 ]では， Fe Fe 距離はより長く， 2.691 Å である。こ天然型 Fd と同様に酸素存在下でも安定であり，結晶化実のような違いは Fd の金属クラスターにも反映されてお験は一般的な好気条件下で行なった。天然型 Fd の結晶はり，天然型 Fd 結晶構 造の[ 2Fe 2S ]の Fe Fe 間距離が高濃度の硫酸アンモニウム溶液を沈殿剤溶液として用いら

2.68 Å であるのに対して， Fd [ Ga ]結晶構造の Ga Ga 間

れることが多く， Fd [Ga]も硫酸アンモニウムを用いた条距離はより長く，3.00 Å だった。尚，GaS 間距離も Fe

件を中心に結晶化条件のスクリーニングを展開して， 20

S 間距離に比べて，やや長くなっている（Fig. 2B）。

°
Cに静置し，1 種類目の結晶を得た。得られた結晶は外形

次に，金属クラスター周辺の水素結合に着目した。 Fdから単結晶であると思われたが，回折点から non-mero-の[2Fe2S]型クラスターは主鎖との間に複数の NHS 水

hedral twin（反射が割れた双晶）であることがわかった。

素結合を形成している。この水素結合ネットワークはタン

タンパク質は温度によって運動性が大きく変化するため，パク質構造の維持だけでなく， Fd の重要な特徴の一つで結晶化条件のスクリーニングを 4 °
C で再検討した結果， 2ある著しく低い酸化還元電位をもたらすとされている。

種類目の結晶が得られた。 2 種類目の結晶は晶系が異なFe から Ga への置換は金属クラスター周辺の水素結合のり，回折点からも単結晶であることがわかった。最終的に，結合長と結合角に変化を与えた。最も顕著な差は Cys44

20 mg/ml の Fd[Ga]を用いて，3.24 M 硫酸アンモニウム，

Sg と Thr46 Og の原子間距離で，天然型 Fd では3.68 Å，

90 mM MES 緩衝液pH 6.5,

0.9 3メチル1, 5ペンタ

Fd[Ga]では3.02 Å だった。酸化還元電位のチューニング

ンジオール， 1.8 （ w / v ）ベンズアミジンを沈殿剤とすに重要とされる NHS 水素結合の中では，S2Cys39間にる条件で良質な単結晶が得られたので， SPring 8 における X 線実験に供した。
まず，結晶を用いて Fe と Ga の吸収端近傍の XAFS を測定した。Fe の K 殻励起による X 線吸収端波長は1.7433
Å で あ る が ，そ の 近 傍 に顕 著 な ピ ーク は 得 ら れな か った。一方， Ga の XAFS スペクトルでは K 殻励起による
X 線吸収端波長の文献値 1.1959 Å 近傍の 1.19513 Å に顕

著なピークが検出された。すなわち，結晶中に Fe は存在
せず，Ga が存在することを示している。波長0.9000 Å と
1.19513 Å において，それぞれ回折データを収集した。天然型の Fd の構造を参照して構造解析を進め，最終的に非対称単位中に一分子の Fd（294 アミノ酸残基）と 2 原子の Ga ， 2 原子の無機硫黄（ S），結晶化溶液に含まれていた硫酸イオンとベンズアミジン分子を確認した。 Ga の位
置 は 波 長 1.19513 Å で 収 集 し た Ga の 異 常 散 乱 デ ー タ のピークでも確認している。結晶構造において，Ga と S は[2Fe 2S]型クラスターと同様の平面型クラスター構造，
すなわち[2Ga2S]型クラスターを形成していた。

Fig. 2(Color online) Structural comparison of native Fd and Fd[Ga].
A. Superimposed models of the overall structures of native
Fd (light cyan) and Fd[Ga] (deep cyan) are shown in alphacarbon traces. The metal clusters are shown in sphere modelin each color codes.
B. Close-up views of the structures around the metal clusterof native Fd (upper panel) and Fd[Ga] (down panel). The
coordinating cysteine side chains are shown in stick model inboth panels.
C. The hydrogen bond network around the metal cluster ofnative Fd (upper panel) and Fd[Ga] (down panel). The
hydrogen bonds are shown in dotted lines.

放射光 Nov. 2018 Vol.31 No.6 ● 375

顕 著 な 差 が あ り ， 天 然 型 Fd で は 3.24 Å ， Fd [ Ga ] で はの結果，反応中心あたりの脂質分子数は，ビーズ式では2.88 Å だった。天然型 Fd で確認されている他の水素結合

12 分子であるのに対し，ガス圧力式では 10 分子しか検出

では，原子間距離に 0.10.2 Å 程度の差が見られたが，水されなかった。このことから脂質分子をより多く結合して素結合の数や方向性は保持されており金属クラスターを取いるビーズ式破砕方法を採用した。 Ni アフィニティーク

り巻く水素結合ネットワークは維持されていると考えられロマトグラフィーとグリセロール密度勾配遠心法を用いて，る（Fig. 2C）。

Synechocystis での PSI 精製と同様に精製を行った。PSI とこのように， Fe から Ga への置換によって金属間距離

Fd の複合体を形成させるためには， PSI と酸化型 Fd をや配位子である硫黄原子との結合距離に変化が見られた。

混合する必要がある。そこで，PSI による Fd の還元脱離

しかしながら，Cys 側鎖の柔軟性や主鎖との水素結合ネッを防ぐ目的でクロロフィルによる光エネルギーの吸収を抑トワークによって，主鎖構造には大きな影響を与えなかっえるために， 525 nm の弱い緑色光下で全ての精製を行った。実際に， FNR を樹脂に固定したアフィニティークロ

た。

マトグラフィーを用いて Fd [Ga]と Fd との結合親和性を検証したところ，天然型と同等の親和性を示した。以上の知見から， Fd[Ga]は分子認識能を維持しつつも酸化還元
非活性な Fd として PSI との複合体構造解析に有用であると結論づけた12)。

6. PSIFd 複合体の結晶化
PSI と Fd は電子伝達反応を行う際に静電的な相互作用

により過渡的に複合体を形成し，生体内では常に解離会合を繰り返していると考えられる。複合体形成の際，塩濃度

5. PSI 三量体の結晶化サンプル調製が低すぎると非特異的な吸着が懸念されると同時に， Fdの構造が不安定化する。一方，塩が濃すぎる場合には静電

純度よくタンパク質を精製する手法の 1 つに， Ni アフ

相互作用が阻害され，複合体を形成できない。そこで PSIィニティークロマトグラフィーが挙げられる。遺伝子工学と Fd の共結晶を作製するにあたり，まず PSI と Fd の相に目的タンパク質に複数のヒスチジンをタグとして組み込互作用と塩濃度との関係を検討した。まず， Fd を共有結む。ヒスチジンの側鎖を構成するイミダゾール基は二価の合で樹脂（CNBractivated Sepharose）に固定した Fd カ

金属イオンに親和性が高いため， Ni などの金属イオンをラムを作製した。 AKTAÄsystem （ GE Healthcare ）を利キレートした樹脂を利用して特異的な精製が可能となる。

用して Fd カラムに PSI を吸着させ， NaCl の濃度を徐々筆者の一人は，光合成研究に古くから用いられている常温に上げることで PSI を溶出させた。溶出のピークは NaCl

生シアノバクテリアの一種，Synechocystis sp. PCC6803を濃度が約100 mM であり，この周辺の塩濃度で適切な複合用いて，ヒスチジンタグを付加した PsaF （ PSI 構成サブ体が形成されると考えた。

ユニットの 1 つ）を発現する株を作製し，高活性 PSI を精製した三量体 PSI と Fd を 1 : 3 のモル比で混合しタ

純度よく大量に精製する方法13) を確立した経験を持ってン パ ク 質 溶 液 を 作 製 し た （ 44.3 mM HEPES NaOH

いた。PSI と Fd との電子伝達複合体の結晶化を進める前

buŠer （ pH 7.8 ）， 2 mM Tris HCI （ pH 7.5 ）， 156 mMに，まず PSI 単独の結晶化スクリーニングを開始した。

NaCl, 8.9 mM MgCl2, 4.4 mM CaCl2, 2.7 glycerol, 0.035

多くの条件で単結晶が得られたが，いずれも結晶の厚みが nDodecylbDmaltopyranoside）。そして，結晶化溶

なく異方性が高いという問題点があった。再結晶や結晶化

液と 1 : 1 で混合し，蒸気拡散法（4°C）にて結晶化スクリー法の改良によってモザイク性が改善されたが，回折分解能

ニングを行った。800条件のスクリーニングの後，複数条

5 Å の壁を乗り越えることが困難であった。そこで筆者ら件 で 初 期 結 晶 が 得 ら れ た 。 し か し ， PSI の み の 結 晶 とは生物種を変更するというアプローチをとった。使用した

PSIFd 複合体結晶をその色から判断することはできないのは，既に PSI 単独の結晶構造が報告されている好熱性ため，得られた結晶を溶かし SDSPAGE にてサブユニッのシアノバクテリア Thermosynechococcus elongatus BP 1

ト分析を行ったところ， 1 条件のみではあったが Fd が含である。 Synechocystis と同様に PsaF に不可したヒスチジ

まれている共結晶が得られていることを確認できた。そのンタグを利用する手法をとった。細胞を破砕するには，超後，結晶化条件の最適化を行い，最終的にバッチ法

音波やビーズ，ガス圧を用いたものなどが知られている。

（ 96well バッチプレートに 3 mL のタンパク質溶液と結晶

T. elongatus BP 1 の細胞を破砕するには，その中でもマ化溶液を混合，透明のテープにて蓋をして 4 °C 暗所に静イルドなガス圧力式破砕が適しているとされてきたが，こ地）にて良質の結晶を得た（結晶化溶液41 PEG 200,の方法ではチラコイド膜の収量が低いという問題点があっ

100 mM acetate buŠer（pH 4.6），100 mM NaCl）。

た。そこで，筆者らが用いているビードビーターによる回折実験をするにあたり，結晶の抗凍結処理が必須であ

ビーズ式細胞破砕と Parr Bomb によるガス圧力式細胞破る。本研究では， SPring 8 生体超分子複合体構造解析

砕の比較を行った。双方の方法で得られたチラコイド膜かビームライン（ BL44XU ）にて回折実験を行い，抗凍結

ら PSI を精製し，複合体に含まれる脂質を分析した。そ

処理の効果を評価しながら条件を決定した。グルコース，

376 ● 放射光 Nov. 2018 Vol.31 No.6

トピックス ■ ガリウム置換が可能にした光化学系 Iフェレドキシン電子伝達複合体の結晶構造解析

エチレングリコール，グリセロールなど一般的な抗凍結剤を添加すると結晶が溶解してしまったため，アルコール，
塩，ポリエチレングリコール（PEG），オイルの中から20種類について，その浸透方法，浸透時間を様々な組み合わせで詳細に検討した。最終的に見いだされた最適な条件
は，結晶化条件にも含まれる PEG200 の濃度を 1 分おきに 1ずつ38まで上昇させ，直接液体窒素中に入れて結晶を凍結するという方法であった。抗凍結剤の濃度を上昇させる際は，まず結晶が含まれる体積 6 mL のバッチウェ
ルに安定化溶液よりも 1高い PEG200を含む溶液を直接添加した。1 分後に添加した体積の溶液を抜きとり，その後さらに 1高い PEG200を含む溶液を添加した。この作
業を最終的に PEG200 が 38 になるまで繰り返した。結Fig. 3(Color online) Electron density maps of the PSI and wild
type Fd. Densities colored in blue and red are 2|Fo|-|Fc|and anomalous Fourier maps. [2Fe-2S] of Fd, PsaC, PsaD,
PsaE, FA, FB, and FX are indicated.

晶を濃度の異なる抗凍結剤に直接移動させると急激な濃度変化にさらされることとなるが，この手法を用いることで抗凍結剤が緩やかに拡散し，よりリニアに濃度を上げることが可能になる。実際，濃度上昇のステップを2.5，5

8. PSIFd[Ga]複合体の結晶構造解析刻みにした場合は回折能向上には繋がらなかったため，抗そこで前述の生理条件下では酸化還元活性を持たない

凍結剤を緩やかに浸透させることが重要だったと考えられFd [ Ga ]を導入することで， Fd が還元されることによるる。また，膜タンパク質の結晶は非常に柔らかいため，ワFd[Ga]の構造変化を抑制できると期待した。Fd[Ga]を用ンドに取り付けたループで結晶をすくい，1 分おきに何度いた場合も，天然型 Fd での結晶化，抗凍結条件をそのまも異なる抗凍結溶液に移し替えることで物理的にダメージま適用することができた。得られた単結晶に対して位置をを与えてしまう可能性が高まる。結晶が含まれるウェルの変えて 3 箇所 X 線を照射し，それぞれ振動範囲 180 °の回中で直接，抗凍結処理を行うことでそのリスクを減らすこ

折データを取得した。得られた 3 つの回折データをマーとができた。このように，結晶化と抗凍結条件の検討におジし SCALA を用いてスケーリングを行った。その後，

いて，膨大な種類のスクリーニングができたのは，放射光1JB0 を初期モデルとした分子置換法により PSI Fd [ Ga ]

施設において迅速に結晶の質を評価することができたため複合体の構造を 6 Å で決定した。その結果，見込み通りであった。

複合体の構造は安定化され， Fd のタンパク質部分の電子密度を得ることに成功した。6 Å の電子密度に Fd の分子7. 回折実験・構造解析

モデル（ PDB ID: 5AUI ）を配置した後， CCP4 の dm を用いて電子密度の平均化および溶媒領域の平滑化を行いな得られた良質な単結晶を用いて，SPring8 BL44XU にがら 4.2 Å まで位相拡張を行った。今回得られた PSI Fdて最適な露光時間や振動角， X 線照射箇所当たり何枚の[ Ga ]複合体構造は，分解能が高くないため，既に高分解回折データを取ることができるかを検討した。この結晶の能で構造決定されている PSI モデルを reference structure

空間群は P21 であったため全振動範囲 180 °の X 線回折強（参照構造）として ProSMART により立体化学的束縛制度データを収集した。その後， T. elongatus BP 1 の PSI

限をかけながら Refmac により精密化を行った。最終的に単独の結晶構造1) （ PDB ID: 1JB0 ）をモデルとした分子

PSIFd [ Ga ]の全体構造を 4.2 Å 分解能で決定した（ PDB

置換法で初期位相を決定し，4.3 Å 分解能で構造を決定し

ID: 5ZF0）（Fig. 4A）。

た。異常分散差マップを計算したところ，PSI の末端電子伝達成分 FB から 8 Å の距離に Fd の鉄硫黄クラスター由来と思われる強い異常散乱シグナルを確認できた。しかし

9. 複合体の構造からみえてきたことながら， Fd の主鎖をトレースできるレベルではなかった

結晶の非対称単位中には PSI 三量体が 2 分子含まれ，（Fig. 3）。Fd は PSI から電子が受け渡されて還元型となる

PSI がルーメン側を向かい合わせるように back-to-backと構造が変化し，前述のような仕組みで PSI から解離すでパッキングしていた。そして，全ての PSI プロトマーる。野生型 Fd を用いた場合に Fd 分子モデルを構築出来に Fd が結合していた。 2 セットの PSI Fd 複合体は互いなかった理由として，X 線照射実験中に Fd が還元され，にほとんど変わらない構造をしていたため，以下は上側とFd の PSI からの解離が進んで Fd の占有率が低下したこ

名付けた片方の PSIFd 構造について記述する。

とが原因であると考えた。

これまでの通説では，Fd は PSI の表在性タンパク質である PsaC ， PsaD ， PsaE と相互作用して PSI と複合体を放射光 Nov. 2018 Vol.31 No.6 ● 377

Fig. 5

(Color online) PsaF piston model.
The binding of Fd induces the indirect conformationalchange to the transmembrane subunit PsaF to the luminal
side. It may facilitate the e‹cient electron transfer by sharing the information from the Fd binding site to the Cyt c6
docking site.

まず注目したのは，チラコイド膜を隔てた細胞質側とルーメン側をつなぐ垂直方向の構造変化である。Fd が細胞質側に存在する PsaC と PsaE に直接相互作用すること
で，それらが PSI 三量体の疑似三回回転中心から外側にFig. 4(Color online) Overall structure of the PSI-Fd complex.
A. Three-dimensional arrangement of the two sets of PSI-Fd
trimers in the crystallographic asymmetric unit. B. A cytosolic view of the PSI-Fd complex. C. A side view of the PSIFd complex.

向かって移動する。その動きは， PsaE を介して膜貫通サ
ブユニットである PsaF に伝わり， PsaF が膜の上下に移動することで最終的にルーメン側まで構造変化が伝搬してい た 。 PsaF の N 末 端 近 傍 は ， PSI を 還 元 す る
cytochrome c6 と呼ばれる小型の電子伝達タンパク質が結合する部位である。 PSI は PsaF を介して Fd が結合して形 成 す る と さ れ て き た 。 し か し 本 構 造 か ら ， PsaC ，いるという情報をチラコイド膜の反対側に伝えて別の電子

PsaE ，また膜貫通サブユニットである PsaA と相互作用

伝達 タン パク 質の結 合を 制御す る可能 性が 指摘で き，して複合体を形成することが明らかとなった（ Fig. 4B ）。

PsaF ピストンモデルとして提唱した（Fig. 5）。

ま た ， PSI か ら Fd へ の 電 子 伝 達 は FA / FB の ど ち ら の

もう一つの興味深い構造変化は，チラコイド膜に対して[ 4Fe 4S ]クラスターから伝達されるのか議論があった

水平方向の動きである。 Fd が結合することで， PSI 三量が，酸化還元中心間の距離から PsaC の FB と Fd の[2Fe

体を形成する各プロトマー間の距離が不均一になってい2S ]クラスター（結晶構造中では[ 2Ga 2S ]クラスター）

た。これは， PSI の三量体は各プロトマー間で光エネル間で起こることを確認できた。結晶構造中において，クラギーを共有できるという生化学的な知見14) を支持する構

スター間の距離は， 3 つのプロトマーで異なっており 8.3

造変化であり，PSI 三量体の各プロトマーが協調して効率Å から 9.6 Å の開きがあった。 FB と Fd の[ 2Fe 2S ]クラ

よく電荷分離反応を行うための仕組みであるとも考えられ

スター周辺の化学環境は，補欠分子属間で直接電子伝達をる。

行うのに適した疎水的環境となっていた。さらにこの疎水

このように，PSI 三量体は Fd が結合したという情報を性領域は，Fd と PsaA， PsaE との静電的相互作用と水素分子内で共有し，垂直・水平方向に構造を微調製すること結合で取り囲まれ，複合体が安定化されていた。このようで効率のよい電子伝達反応及び集光反応を行っている可能に PSI と Fd は階層的な相互作用により分子状酸素への電性が示された。

子を漏洩することなく効率のよい電子伝達反応を行っていることが構造的に示された。
Protein Data Bank に登録されている PSI の単独の立体

10. おわりに構造と，本複合体構造を比較することで， Fd の結合は

本稿では， PSI Fd [ Ga ]複合体の 4.2 Å 分解能の結晶構

PSI 全体の構造変化を引き起こし，効率よく電子伝達や集造解析の過程を記述した。 PSI と Fd の複合体は，電子伝光反応を行うための微調整を行っている可能性が見いださ達の際に過渡的に形成され， Fd が還元されると直ちにれたことできた。

PSI から解離する不安定な複合体である。生体内において378 ● 放射光 Nov. 2018 Vol.31 No.6

トピックス ■ ガリウム置換が可能にした光化学系 Iフェレドキシン電子伝達複合体の結晶構造解析

電子伝達後の複合体が迅速に解離することは，電子が淀み方々に感謝申し上げます。また，ヒスチジンタグ付きのなく流れる上で重要であるが，その性質がゆえに電子伝達

PSI を発現する株を提供してくださった，ルール大学ボー複合体を安定な単結晶として調製することは非常に困難でフ ム の Matthias R äogner 教 授 と Marc M. Nowaczyk 先 生

あった。このような複合体の結晶構造解析を達成するために御礼申し上げます。最後になりましたが，本稿執筆の機には，立体構造が天然型と同等であるが電子伝達活性を持会を与えてくださった日本放射光学会，編集委員の方々にたない「金属置換再構成タンパク質」の存在が欠かせなか

感謝申し上げます。

った。このような手法で複合体形成の理解を深める研究

本研究は日本学術振興会科学研究費補助金（13J03550，

は，本稿で紹介した例に留まらず，生体内の電子伝達反応

26870354 ， 16H06560 ）， JST CREST 及び，大阪大学のを理解する上で有用なアプローチだと考えられる。実際，国際共同研究促進プログラムの支援を受けたものです。

PSI を還元する電子伝達タンパク質であるプラストシアニ

参考文献

ン（PC）は，中心金属である銅をカドミウム（Cd）や亜鉛，銀（ Ag ）に置換することで構造は保持したまま電子

1)

伝達活性を失活させることが可能である。また，還元型アナログである Ag PC は酸化型アナログである Cd PC よ2)

り 24 倍 も 強 く PSI に 結 合 す る こ と が 報 告 さ れ て い
る15,16) 。今後 PSI 側の相互作用残基を同定することを目3)

指す場合は，AgPC を利用した PSIPC 複合体の X 線結晶構造解析が有効であろう。また，金属置換再構成タンパ

4)

ク質は，タンパク質が機能している中間体の構造解析にも利用できるかもしれない。その例として，ヘム輸送タンパ
ク質や酸素センサータンパク質が挙げられる。生体内でヘ

5)
6)
7)

ム鉄を輸送する際，タンパク質同士が過渡的な複合体を形成してヘム鉄を受け渡すことによって，生体毒性をもつヘム鉄が細胞内外に漏れ出すことを防いでいる17) 。また，
一部の鉄硫黄クラスターは高い酸素感受性を有しており，
鉄硫黄クラスターの構造変化を利用して酸素センサーとして機能するシグナルタンパク質も知られている18) 。これらのタンパク質に不活性な金属を取り込ませることができ
れば，輸送反応や酸素センシングの中間状態を捉えられると期待できる。

8)
9)
10)
11)
12)
13)

生体内に存在する多種多様なタンパク質のうち，3 割は何らかの金属を利用すると言われている19) 。今後，金属置換再構成タンパク質を利用することがブレイクスルーと14)なり，生体内に存在する様々な金属タンパク質やその複合体の構造解析が飛躍的に進むことを期待している。

15)
16)

謝辞
本研究は，SPring8 BL44XU ビームラインの関係者の方々の支援があって初めて達成されたものです。また Fd[ Ga ]の調製は大阪大学の新村研究員，また本文中では触れていないが NMR による PSI と Fd の相互作用解析については横浜市立大学池上貴久教授と武藤梨沙博士（現，福

17)
18)
19)

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岡大学理学部助教）に担当していただきました。これらの

放射光 Nov. 2018 Vol.31 No.6 ● 379著者紹介
河合(久保田)寿子

田中秀明

山形大学 理学部 理学科 助教
E-mail: hkawai＠nibb.ac.jp
専門植物生化学［略歴］
2010 年 3 月東京大学大学院総合文化研究科博士課程修了。 2010 年 4 月大阪大学蛋
白質研究所 研究員， 2013 年 4 月から大阪，大学にて日本学術振興会特別研究員（PD）
2016 年 9 月 か ら 基 礎 生 物 学 研 究 所 に てCREST 研究員，2017年 4 月から基礎生物学研究所にて日本学術振興会特別研究員（RPD）を経て2018年10月から現職。

大阪大学 蛋白質研究所 准教授
E-mail: tana＠protein.osaka-u.ac.jp
専門構造生物学，タンパク質結晶学［略歴］
2000 年 3 月大阪大学大学院理学研究科高分子科学専攻博士後期課程単位取得退学。
2002 年 4 月 大 阪 大 学 蛋 白 質 研 究 所 助 手（ 2007 年 4 月より名称変更により助教）。
2014年 4 月より現職。

村木則文
自然科学研究機構 分子科学研究所 助教
E-mail: nmuraki＠ims.ac.jp
専門構造生物学，生物無機化学，タンパ
ク質結晶学
［略歴］
2010 年 5 月東京大学大学院総合文化研究科博士課程修了。 2010 年 6 月から大阪大
学において日本学術振興会特別研究員（ PD ）， 2011 年 4 月から日本学術振興会特別研究員（ SPD ）。 2013 年 6 月から分子科学研究所特任助教，2016年 4 月から現職。

栗栖源嗣
大阪大学 蛋白質研究所 教授
E-mail: gkurisu＠protein.osaka-u.ac.jp
専門構造生物学，タンパク質結晶学［略歴］
1997 年 3 月大阪大学大学院工学研究科博士後期課程修了。 1997 年 4 月大阪大学蛋
白質研究所助手。 2002 年 4 月から 2003 年
10 月 ま で 米 国 Purdue 大 学 で 在 外 研 究 。
2004 年 4 月東京大学大学院総合文化研究科助教授（ 2007 年 4 月より名称変更により准教授）。2009年 4 月より現職。

Structural analysis of photosystem I-ferredoxin
complex using gallium substituted ferredoxin
Hisako KUBOTAKAWAI

Faculty of Science, Yamagata University
1412 Kojirakawa-machi, Yamagata, Yamagata, 9908560, Japan.

Norifumi MURAKI

Institute for Molecular Science, National Institute of Natural Sciences,
Higashiyama 51, Myodaiji, Okazaki, Aichi, 4448787, Japan

Hideaki TANAKA

Institute for Protein Research, Osaka University
32 Yamadaoka, Suita-shi, Osaka 5650871, Japan

Genji KURISU

Institute for Protein Research, Osaka University
32 Yamadaoka, Suita-shi, Osaka 5650871, Japan

Abstract

Photosystem I (PSI) is a large pigment-protein complex that mediates light-driven charge separation and generates the most negative redox potential in nature, to reduce the electron carrier protein ferredoxin (Fd). Here we report the X-ray crystal structure of cyanobacterial PSI-Fd complex
using gallium substituted Fd. The structure provides a structural basis of electron transfer between PSI and Fd. Furthermore, the structural change of PSI induced by Fd binding revealed that
Fd may tune the light harvesting and redox reaction of cyanobacterial PSI trimer.

380 ● 放射光 Nov. 2018 Vol.31 No.6