さけ・ます
ふ研報， sCi Rep

BKD・・HOkkaido

Salmonり， (4U:HatChe

原因 菌 F salmoninwMm

ATCC・有する Pseu 血 monas

吉永寺 " ，紀H987)

121‑12733209 と共通抗原、を属 細菌の存在にっいて栄典 " ，野村 哲 ― "'，木村 喬久 "，A Falsepositive Reaction ;n the Indirect Fluorescent Antibody
Test for Renibacteriumsalmoninarum ATCC 33209
Caused by a Pseudomonas
MamoruYOSHIMIZU*1. ROngxing
andSp

Jr*1, Tetsuichi NOMURA*2,Takahisa

KIMURA*'

Abstract
During the routine examination
0f salmonid)

positiveantigens

0f matured salmonid, the BKD
observed

were0nthe kidney(bacterial kidney disease
0f matured

smears{Oncorhynchtts keta) and pink salmon (0. gorbnscha) returning to Shari River.
werenot observed fn these fish and their progenies appeared t0 be healthy.

isolated

when

thescreeningcolonies grown

0n

the KDM‑2The

isolateclassified

washowever, showed

aATCC

FAT,33209 bysalmoninarum.
FAT.

wasdonewhichaS

positiveTherabbit serum
FATsizeOf theisolate

notshow

ajudgedaorganism,

similar t0 that

wereBKDofR

organism bypositive reaction tn the coagglutination test and ge1‑aa

reaction with anti‑serum against the different strain of

The positive reactions On the kidney smears
t0 be

BKD

salmonantisera against Renibacterium salmoninarum

wasfound

the

among

Sp.

and

which

FAT

tissue of pink

Pseudomonas

shape

but

indirectthe kidney(Otobe), and partially purified IgG Of anti‑R.salmoninarum

by FAT.
wasantigen bySigns of BKD

An organism wasreaction withdiffusion test, and also did not show

with

BKD

inoculated with

Therefore this isolate could not be distinguished fromThe isolate did notR. salmoninarum

for thewaschum

false positive reaction caused

ATCC33209

0f chum and pink salmon

by this isolate緒
サケ科魚類の細菌性腎臓病 (BKD)

は，その原因菌 Remba

加れMmsalmoninarumとから，診断は血清学的診断法に頼らざるを得ない @木村・吉水

1981) 。 BKDの培養が困難であ るこの血清学的診断法としては

305 号
北海道さけ・ますふ化場研究業績第":北海道大学水産学部微生物学講座(LaboratoryMinato

れOf MiCrobiol0gy， Faculty

Of FiSherieS． HOkkaido

UniverSity，

3‑1‑1, Hakodate, 041 JAPAN);水産庁北海道さけ・ますふ化場(HOkkaidoTOyohira‑ku,SalmonHatCheryFiSherieS

Sappor0, 062 JAPAN)
121， AgenCyofJapan， 2‑2 NakainoShima，

吉水 紀 ・野村・木村・

種々の方法が報告されているが，著者らは病魚の場合には coaeglutination tast が，保菌魚の場合には螢光
抗体決 (FAT)の利用が望ましいことを報告してきた (YOshimizuand kimura

1985) 。

東北北部．北海道における採卵親魚の病原体保有状況の調査にあたり1984 年から BKn

FAT

保菌状況の調査を間接法により採卵親魚に実施してきたが，その過程で1984 年斜里川のサケ親魚が，また翌年同河川のサケ およびカラフトマス親魚が，抗 F ． Ssalmonfnna@rum

ATCC,33.3i209 家兎血清を用いた FATれた。しかし両魚種共に腎臓に病変はなく，その後の継続調査でも採卵燗化稚魚、に BKD

で陽性と判定さによる乾死は観察されず飼育経過は順調であ った。
ところで最近 BKD

原因菌 Rentihn.rtp.rivum
乃 5a1.mWnnninaaruMm に対する抗血清を用いた FAT

応陽性を示すグラム陽性細菌の存在が報告されている(Austinetal
フトマス腎臓中に見られるこれら抗 7?.salmomfna 川川 ATCC33209 家兎血清 と FAT示した抗原が F ysnalmmmnninza グu 川由来か否かを 明らかにするため，・間接法で交差反． 1985) 。 上記の斜里 川のサケおよびカラKDM‑間接法で反応陽性を2 培地 (Eve@yn1977)

菌の分離を試みたところ F ． salmnninnna./uMMは分離されず， 抗 R ． salmoninarumATCC33209

を用い，本家兎血清と交差反応陽性を示すグラム険性の運動性を有する細菌が分離された。
本報ではこの抗 R・@n. 肋 。m.n
乃ぱ n@mm,家兎血清と反応陽性を示した細菌の分離状況およびその性状。主として血清学的性状について報告する。

実験材料と方法
供試 魚の RKD

検査法 : 1984 年 9 。 10, 11 月，翌年9 および10 月に．斜里川に遡土中捕獲され薔養池に蓄養中のサクラマス，カラフトマスおよびサケ各々fin尾の腎臓表面より襟を無菌的に外し滅菌綿棒の柄にて腎臓表面に穴を開け， 綿棒で腎臓組織の ―部をスライドグラス表面に塗抹した。火炎固定後，FAT他

1986) により RKD

間接法 (木村

原因菌の有無を観察した。さらに，1985 年 H 乃 カラフトマス60 尾を対象に。腎臓の塗抹標本の作成と共に綿棒を用いて 腎臓組織の―部を KDM‑2週間培養し RKD原因菌の分離を試みた。

供試菌 : RKD

原因菌 としてR ． aalmoninarum

りカラフトマス腎臓から分離された SKATCC

33209 抹および IG 840i 抹を， また後述の方法によ850i 抹 の 3 株を本実験に供した。

供試抗血清 : 抗血清として 自家製の F ． svilmoninnaグum
清ならびに上記抗 F ． snalmoninarum(Evelyn 1977) 培地表面に塗抹し I5@C で 3ATCC33209 株および Otobe 株に対する家兎抗血

家兎血清の硫安分回 IgG を本実験に供した。

定呈凝集抗体価の測定法，共同凝集反応およびゲル内沈降反応 : 定量凝集抗体価は McFarlandN0.3

濃度に調製した供試菌の ホルマリン死菌懸濁液 に倍々 希釈した抗血清を等量加え， ?3rc で 2 時間反応後，さらにvc で―晩反応させ，凝集が認められた血清の最高希釈率を求め凝集抗体価とした。共同凝集反応およびゲル内 沈降反応は木村他 u986) の方法によった。
分離菌の性状検査 : 前述の KDM‑る FAT

2 培地上に出現した コ 口二―のうち抗 R ． sam* 仰 市川 川川家 兎血清によ間接法により反応陽性となった コ 口二―を釣菌し純分離を繰り返し供試分離菌 SK‑ 8501 を得た。
分離菌については常法通り， グラム染色性， 菌型，運動性，鞭毛の有無。 グルコースの酸化発酵性，―ム オキシダーゼ活性の有無を観察した。

122

チトクロ

RKD 原因菌 と共通抗原を有する細菌の存在にっいて結
斜里川のサケおよびカラフトマスの FAT

果

間接法による BKD

検査結果 : 1984 年および 19S5 年斜里 川に遡止中捕獲され蓄養中のサクラマス，カラフトマス，サケの腎臓塗抹標本を対象に抗 F ． SMmowf%0/MmATCC

33209 家兎血清を用いて FAT

間接法による BKD検査を実施した。結果は表 I に示すごとくて。1984 年のサクラマス およびカラフトマスは険性であ ったが，サケで60 尾中 ? 尾が反応陽性を示し，1985 年のサクラマ スは陰 件であったが，サケで60 尾中 2 尾，カラフトマスでもfin尾中16 尾が反応陽性を示した。

表 I 斜里川のサクラマス，カラフトマスおよびサケのFAT 間接法によるBKD 検査結果
Table 1. Detection of the BKD antigens in the kidney tissues 0f matured salmon collected at the catchingstation 0f Shari River by indirect FAT using anti‑7?. salinoninanim ATCC
33209 rabbit serum

speciessampling

0f fishdateemployed

5 sep ． '84
27.
"
29. NOv.
"
3 ． sep ． '85
16. Oct. "17.
"60salmon"pink

salmon*2

chum

salmon*3

masu

salmonchum

salmonpink

salmon・masunumber0f specimen
BKD

positive*

0/60
0/60
7/60
0/60
2/60
16/60

6060
606060* : Oncorhync ん 硲 川四りび
: O クnco 幼wch 硲 BO 比硲C加
ハ : 0%CO 所刈所硲 Agfd
*2KDM‑?

培地に出現」 @‑ コ 口二―の FAT

間接法によるスクリーニング結果 : 1985 年II 月のヵラフトマスに間接法による R ． M 肋 Owf%&mW

ついて上記同様腎臓の塗抹標本を用いた FAT培地を用いた BKD

抗原の検索と共に，KDM‑2原因菌の分離を試みた。尺 ． sdf)%0血脚柑川 類似の コ 口二―を含め出現 コ 口二―の FAT

間接法によるスクリーニング結果を表 2 に示したが，腎臓の塗抹標本における FAT
培地平板上に 出現した コ 口二一36 個の 内 ，であ った。
抗 F ． salmoninaruMmATCC33209

F ． salmoninarumと陽， 庄 13 個体の KDM‑2

類似の色調，形態を示したものは 5 コ 口二―

家兎血清を用いた FAT

間接法により反応陽性を示した コ 口二―は魚体 NO ． 54 に見られた I コ a 二―のみであ った。

分離菌 SK‑8501
SK‑8501の性状 : FAT

間接法によるスクリーニングにより 反応陽性を示した 魚体 NO ． 54 由来株

はグラム陰性の運動性を有する，大きさ0 ． 6‑0

ダーゼ試験陽性，グルコースを酸化せず PseudoW． 7X1． 0‑1． 51ym の短桿菌であ り， KOvacs'のオキシ

F aaim 。血W 川川とは明らかに 異なる。れ山 属 に分類され， ．

細菌であ った。
分雑菌 SK‑S501
MMOHf%dmW
ATCC33209
次に FAT株の血清学的性状 : 分離菌 SK‑a.smI 株の血清学的性状を 表 3 に示した。供試した 抗 F
ATCC33209

および 0tobe

株家兎 血清に対する定量凝集抗体価はホモの F ． SdMo 血川 mW

株の I : 640 および 1 : 1280 に対し SK‑8501
間接法では F ． Mlm.nninn.rum.

あ ったが。
SK‑ a5mI 株は抗 7? ， salmoninaruMm

株は共に I : 8 以下であった。

ATCC.33209および IG8401 抹は供試した両血清共に反応陽性でATCC33209 血清とのみ反応陽性を示したが，抗 Otohe 株血清とは反応陰性であ った。さらに共同凝集反応およびゲル内 沈降反応では， 7R ． salmnninarumATCC33209

および IG84(nI株は供試した両血清共に反応陽性であ ったが SK‑850m 株はいずれも反応険性であった。
分離菌 SK‑8501

株抗原の熱安定性 : 分離菌 SK‑8501 株の FAT

間接法における 反応抗原の 熱安定性を表4 に示した。innc30 分の加熱により反応は険性となり。反応抗原は易熱性であ ることが明らかとなったが，塗抹標本を火炎固定した場合，30 秒間の固定でも反応性を消失することは出来なかった。
123

吉水 紀 ・野村・木村・ング結果
Table 2. Screaning Of R.salmoninarum
by indirect FAT amonga colonies growing uD KDM‑
2 medium
inoculated with kidney tissue Of pink salmon collected at the catching station of Shari River inNOvember
'85

grown

0f the colonies
100ksonthe KDM‑

similar to2medium

R.salmoninarum
0000dili0789mHLHW

三 30
三 30
主 30
三 30

nF
epO
wsith
hn t
w l・t
OC he S awO 0p

numberK ・B ビNo
mMshfish

三 30

三 30

ー上 C@一@ 一工

吐吐仰北M

1 (SK‑8501)

total 13/60*' : by indirect FAT*2 '.isolate employedusing the smear 0f kidney tissue
for following experiments ; Pseudomonas

表 3 分離菌 Pseu 山川。
乃仏 sp. SK‑ 8501 抹の血清学的性状
Table 3. Serological characteristics 0f isolate, Pseudomonas

sp.

sp.

(SK‑8501)

SK‑8501

aati‑R.salmoninarum
ATCC

antigenP.sQlryi。

%znytnaATCCIG"notOtobe

33209

SK‑8501
R.sal

*2

亘 36

ATCC

Otobe

33209
indirecttiter

FAT川m33209

ノ。nw@nyiaa)U@v
乃8401<86401280

NT"'

NTsera

Otobe

33209

agglutination<8rabbit
ATCC

ATCC

Otobe

33209

coagglutination
test

ge1‑difusion
test

tested

硫安分回折 R salmoninarum
・ATCC33209

ウサギ血清と分離菌 SK‑8501との FAT

間接法における反応性 : 分離菌 SK‑ 8501 株の生菌，ホルマリン死菌，あるいは加熱死菌吸収抗 R ． salmoninarumATCC33209
兎血清および抗 F 5almnninarum
・ATCC33209

ウサギ血清の硫安分回 IgG

雑菌の生菌，ホルマリン死菌。 加数死菌を用いた吸収操作によっても FATが， 抗 R Sn.1m 。ぬ脚 rumATCC33209
・

ウサギ血清の硫安分回 IgG
124との FAT

家との反応性を表 5 に示した。分による反応性は消失しなかったによる反応は陰性となった。

BKD 原因菌 と共通抗原を有する細菌の存在にっいて
表 4

必 Sp ． sK‑8501

分離菌 RgM0m0w

Table4Heat・

StabHity OfRcMdomo

硫安分回航 A ． M 肋 。ぬ畑川 W 家兎 血

株抗原の熱安定性
乃m Sp ． SK‑8501
FATantigen

清および 抗 Otobe 株家兎 血清を用いた

FAT

reaction"untreated' with

*2 ' by

再検査の結果 :fixed"

1985 ヰH 月のヵラフトマスの腎臓塗抹標

5sec

本にっいて再度硫安分回10sec

切肋 0%FwdrMm

I5secIgG および 抗 Otobe 株家兎 血清を用い

20sec

た FAT

25sec

30sec

100'C30heat"

間接法による 斜里川 カラフトマス

腎肛 塗抹標本の BKD

ATCC

抗 F ．

33209 家兎血清

間接法による診断を試みた 結果を表 6 に示した。供試したカラフトマス

NO1 ‑30 の腎臓塗抹標本のうち，無処理

minaf¥t¥‑R.salmoninarum

ATCC33209の抗血清で反応陽性を示した 8 検体 はい

rabbit serum

ずれも供試した両血清で反応は陰， 庄 となflameった。

考宏木

サケマス類の増養殖を計るに際し， その障害となる病原体の分布の実態把握を目的に，1976 年から東北北部， 北海道における採卯親魚の病原体保有状況の調査を実施しているが・ 1984 年からはサケ科魚類の細菌性腎臓病 (BKD)原因菌を調査対象に加え採卵親魚の腎臓塗抹標本を作成し FATによる検査を実施した。

が，また翌年同河川のサケおよびカラフトマス親魚、が， FAT
その過程で1984 年斜里川のサケ親魚、BKD陽性と判定された。 しかし両魚種共に腎臓に病変はなく，間接法でその後の継続調査でも採卵牌化推魚、 に BKDによる幣死は観察されず飼育経過も順調であ った。
そこで斜里川のサケおよびカラフトマス腎臓中に見られるこれら 抗 RKD
陽，性を示した抗原が F salmoninaru

KDM‑・川由来か否か ，iw&Zwi@nninn.@rM.niは分離されず， 抗 RKn

家兎血清 と FAT

間接法で反応2 培地を用い原因 菌 の分離を試みたところ・ F ．

家兎血清と交差反応陽性を示すグラム険性の 運動性を有する 細菌がで R sailmnmfnaru%m・

Pseudomon・

仏 sp ． SK‑8501

研m

ATCC3m3209

株とのFAT

antigen*

ATCC332n9□E8501 antigen andrabbit serum byATCC

rabbit serumぬm

SK‑8501
1iving cell

0‑15umウサギ血清と分離菌

aati‑R.salmommzmm
unpurified・・間接法における反応性

Table 5. Reactionbetween
Pseudomonas
sp. SKIgG Of anti‑R.salm
れ oninaru7m ATCC33209@ndirect FAT

H salmonind

7X1

で，時に対を成してと区別することは困難であ ったが，その性状から Psseudo 棚乃ぬ so ．に分類

硫安分回抗 F ． salmonina

表5大きさがQ 6‑0・

このグラム険性で運動性を有する細菌 SK‑ 8501 は ，存在し FAT・分離された。

suspension125IgG33209

吉水 紀 ・野村・木村・

用査由
兎Kfi

︐の し表 Ta.Cm・
R汁 lbeO 叩bbie

W8wa
00 W2 3
方 cra

網九 F まtnL5c
ム協比A叢C
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海殖
すら九増た
すd頂 いま
てけっ
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血診
計を道海げ
上立
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便に申
ごび
謝
種々臓
し位深 0pCa

収関 各
採場係
科
回
関試
ひょび金8
協 ・z
お夫
氏よぴ W th
供の 口氏
v 80 几 9料坂治
J%りd
重場鎌︐り事長責業の 北里
us
す走 A

BKD

原因菌 と共通抗原を有する細菌の存在にっいて35 ，社団法人日本水産資源保護協会， p ． 61 ．
木村喬久

・吉水

守口 98L: 特異抗体感作

類の細菌性腎臓病 (BKD@YOShimiZu， M ． andT ． KimUra

Staphy@0coCCi を用いた COagg@utination teSt によるサケ科魚、の迅速診断法について． 日水誌， 47 ． I173‑L83(1985): A COagg@utinaHon．

teStwith antibody‑SenSMzedStaphyl0CoCCifor

rapid and simple diagnosis 0f bacterial and viral disease Of fish. Fish Pathology,

127

20. 243‑261