関東森林研究論 文71-1(2020)

ポリクロス由来のスギ未熟種子からの不定胚形成細胞誘導
丸山 E.毅 1・金枝拓実 2・上野真義 1・平山聡子 3・伊藤由紀子 4・番塲由紀子 4・森口喜成 2
１ 森林総合研究所
２ 新潟大学３ 新潟県新潟地域振興局
４ 新潟県森林研究所
要旨：不定胚形成は，組織培養による植物体の大量増殖技術の一つである。我々の研究グループでは，不定胚形成技術によるスギ苗木の大量生産法の確立を目指している。遺伝的に多様な苗木を組織培養で省力的に作出する方法の一つとして，ポリクロス（複数親の混合花粉を使用する人工交配）由来の未熟種子の利用が考えられる。ポリクロスに由来する成熟種子の花粉親寄与率は期待値から有意に歪むことが報告されているが，ポリクロスに由来する未熟種子を用いた不定胚形成の各工程における花粉親寄与率を研究した事例はない。そこで我々は，遺伝マーカーを用いてポリクロスで生産された未熟種子から増殖させた不定胚形成細胞の花粉親を調べ，ポリクロス由来の未熟種子利用の有効性を検証する。今回は，3 親の混合花粉（3Mix）と 10 親の混合花粉（10Mix）を用いて人工交配を行い，それぞれのポリクロス由来の未熟種子から得られた不定胚形成細胞の誘導率について報告する。
キーワード：Cryptomeria japonica，ポリクロス，混合花粉，未熟種子，不定胚形成

Embryogenic cell induction from immature seeds derived from polycross of sugi (Cryptomeria japonica)
Tsuyoshi E. MARUYAMA1, Takumi KANEEDA2, Saneyoshi UENO1,
Satoko HIRAYAMA3, Yukiko ITOH4, Yukiko BANBA4, Yoshinari MORIGUCHI2
1 Forestry and Forest Products Research Institute2 Niigata University
3 Niigata Prefecture Regional Promotion Bureau
4 Niigata Prefecture Forestry Research Institute
Abstract: Somatic embryogenesis is one of the techniques for mass propagation of plants by tissue culture. Our research group aims
to establish a mass propagation method for sugi seedlings using somatic embryogenesis technology. As one of the methods for laborsaving production of genetically diverse seedlings, it is conceivable to use immature seeds derived from polycross (artificial mating
using mixed pollen of multiple parents). Although the pollen parent contribution rate of mature seeds derived from polycross hasbeen reported to be significantly distorted from the expected value, there is no case study of pollen parent contribution rate in eachprocess of somatic embryogenesis using immature seeds derived from polycross. Therefore, we investigate pollen parents of somatic
embryogenic cells grown from immature seeds produced by polycross using genetic markers and verify the effectiveness of using
immature seeds derived from polycross. This time, we report the induction rate of somatic embryogenic cells obtained fromimmature seeds derived from each polycross by artificial mating using 3 parents mixed pollen (3Mix) and 10 parents mixed pollen(10Mix).
Key-word: Cryptomeria japonica, polycross, mixed pollen, immature seeds, somatic embryogenesis

Ⅰ はじめに術による遺伝的に多様なスギ苗木の大量生産法の確立を不定胚形成は，組織培養による植物体の大量増殖技術目指している。遺伝的に多様な苗木を組織培養で省力的の一つである。我々の研究グループでは，不定胚形成技に作出する方法の一つとして，ポリクロス（複数親の混－49 －（受理日 2020 年 1 月 23 日）

合花粉を使用する人工交配）由来の未熟種子の利用が考スの形成開始が観察されたが，反応した多くの外植体にえられる。ポリクロスに由来する成熟種子の花粉親寄与

おける不定胚形成細胞の誘導は，４週間後に明らかとな率は期待値から有意に歪むことが報告されている（５）った（図－１）。
ポリクロスの由来の間に差が見られたが，が，ポリクロスに由来する未熟種子を用いた不定胚形成

3Mix と 10Mix 由来の種子からいずれも効率的に不定胚の各工程における花粉親寄与率を研究した事例はない。

形成細胞を誘導させることができた（図－２）。

そこで我々は，遺伝マーカーを用いてポリクロスで生産

２．種子の採取時期の不定胚形成細胞誘導効率への影

された未熟種子から増殖させた不定胚形成細胞の花粉親

響

７月の第１週目から第５週目にかけて採取した種を調べ，ポリクロス由来の未熟種子利用の有効性を検証子から不定胚形成細胞を誘導できた。誘導効率に関してする。今回は，3 親の混合花粉（3Mix）と 10 親の混合花

は第３週目に採取したものが最も良い結果を示し，62.1粉（10Mix）を用いて人工交配を行い，それぞれのポリク～71.2％の範囲で不定胚形成細胞の誘導が認められたロス由来の未熟種子からの不定胚形成細胞の誘導を行い，（図－３）。７月の第 1 週目に採取した種子の場合は，得られた誘導率の結果について報告する。

38.9～41.8％の誘導率が得られ，７月の第３週目の結果に対して約４割減の誘導率となった。また，第５週目に採Ⅱ 材料と方法取した種子を試料にした場合は，44.6～56.0％の誘導率が１．人工交配 2019 年３月に２種類の混合花粉（3 親得られ，７月上旬から下旬までの中間的誘導率の結果との花粉を等量混合した 3Mix，10 親の花粉を等量混合しなった（図－３）。種子採取時期間差の不定胚形成細胞誘た 10Mix）を用いた人工交配を行った。母樹と人工交配導効率への影響については，スギだけではなく、他の針に用いた花粉親を表‐１に示した。

葉樹においても報告されている（１，２，３，４）。

２．球果・種子の採取 人工交配で得られたポリクロ

３．不定胚形成細胞の維持・増殖 得られた不定胚形

ス由来の球果を 2019 年７月上旬から下旬にかけて（第成細胞は誘導時と同じ培養条件で２～３週間ごとに継代１週、第３週と第５週に）採取し，取り出した種子を実培養することで維持・増殖が可能であった（図－４）。

験材料として用いた。

４．不定胚形成細胞系統の初期と継代可能誘導率 初３．種子の表面殺菌 種子表面の殺菌は，１％次亜塩代培養で得られた不定胚形成細胞系統を２～３週間ごと素酸ナトリウム溶液に 15 分浸漬・撹拌し，滅菌水で３回に継代培養し，安定的に維持増殖できる細胞系統を選抜洗浄して行った。

した。
その結果，初期誘導と継代可能誘導の割合が 88.0％

４．不定胚形成細胞の誘導 表面殺菌処理後，種皮をであった（表－４）。

剥ぎ取り，種子胚を含む雌性配偶体（megagametophyte）を不定胚形成細胞誘導用の培地に置床した。
容器として，

IV おわりに直径 90 mm の４分割シャーレを用い，培地には無機塩を今回は，3 親の混合花粉（3Mix）と 10 親の混合花粉1/2 濃度に下げた EM 培地（３）に，ショ糖 10 g/L，グル（10Mix）を用いたポリクロス由来の未熟種子から，不タミン１ g/L，カゼイン 0.5 g/L，ゲルライト 3 g/L，2,4-定胚形成細胞の誘導が可能であることを確認できた。

ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）10 μM，6-ベンジルア

今後，得られた培養細胞系統を維持増殖し，成熟不定ミノプリン（BAP）5 μM を添加した固形培地を用いた（表胚の誘導率、発芽率や個体再生率を評価し，ポリクロ－２）。培養は暗黒下，25℃で行った。

ス由来の未熟種子利用の有効性を検証する。

５．不定胚形成細胞の継代培養 誘導後の不定胚形成細胞は，誘導時の同一の 1/2 EM 培地にショ糖 30 g/L，グ

引用文献

ルタミン 1.5 g/L，ゲルライト 3 g/L，2,4-ジクロロフェノ(1) FIND, J.I., HARGREAVES, C.L., REEVES, C.B.

キシ酢酸 3 μM，6-ベンジルアミノプリン 1 μM を添加し(2014)（表－３）, 暗黒下，25℃の培養環境で維持し，増殖させembryogenesis from differentiated tissues of radiate

た。

pine (Pinus radiata D. Don) using cotyledonary

Progress towards initiation of somaticembryos. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 50: 190-198.
(2) FINER, J.J., KRIEBEL, H.B., BECWAR, M.R.

Ⅲ 結果と考察
１．親の混合花粉由来の不定胚形成細胞誘導効率への(1989) Initiation of embryogenic callus and suspension

影響 培養開始から１週間ごとに，実体顕微鏡を用いて

cultures of eastern white pine (Pinus strobus L.). Plant

培養物の観察を行った。培養開始の約２週間後に，カルCell Rep. 8: 203-206.

－50 －関東森林研究71-1(2020)(3) MARUYAMA, E., TANAKA, T., HOSOI, Y., ISHII,K., MOROHOSHI, N. (2000) Embryogenic cell culture,

表－３. 不定胚形成細胞の維持増殖用培地組成

protoplast regeneration, cryopreservation, biolistic

Table 3 Compostion of maintenance-proliferation mediumgene transfer and plant regeneration in Japanesecedar(CryptomeriajaponicaD.

Don).

Plant

Biotechnology 17: 281-296.
(4) MIGUEL, C., GONCALVES, S., TERESO, S., MARUM,
L., MAROCO, J., OLIVEIRA, M. (2004). Somatic
embryogenesis from 20 open-pollinated families of Portuguese
plus trees of maritime pine. Plant Cell, Tissue and OrganCulture 76: 121-130.
(5) MORIGUCHI, Y., ISHIDUKA, D., KANEKO, T., ITOO,S., TAIRA, H., TSUMURA, Y. (2009). The contribution ofpollen germination rates to uneven paternity among polycrossesof Cryptomeria japonica. Silva Genetica 58, 3: 139-144.
表‐１．ポリクロスに用いた母樹と花粉親
Table 1 Mother tree and pollen parents used for polycross
母樹

新大 11 号

3Mix

10Mix

花粉親

花粉親

東蒲原 5 号

東蒲原 5 号

両津市 1 号

岩船 9 号

岩船 9 号

岩船 2 号

中頸城 2 号

中頸城 2 号

岩船 8 号

中頸城 4 号

岩船 16 号

南蒲原 3 号

岩船 17 号

CompoundKNO3
MgSO4・7H2O
CaCl2・2H2O
Ca(NO3)2・4H2O
NaNO3
KH2PO4
NaH2PO4・2H2O
KCl
MnSO4・4H2O
H3BO3
ZnSO4・7H2O
KICuSO4・5H2O
Na2MoO4・2H2O
CoCl2・6H2O
FeSO4・7H2O
NaEDTA
Thiamine HClPyridoxine HCl
Nicotinic acid
Glycinemyo-Inositol
Casein Acid Hydrolysate
L-glutamine
SucroseGelrite
2,4-D
BAP
pH5.6-5.8

Amounts
500
250
37.5
30
30
35
80
40
1020
12.5
0.5
1.2
0.1
0.1
15
20
2.5
0.25
2.5
2.5
500
0
1500
30000
3000
31

[mg/L][μM]＊表－２と組成の違う部分を太字にした

表－２. 不定胚形成細胞の誘導用培地組成
Table 2 Composition of induction medium[mg/L]

図－１. 不定胚形成細胞の誘導（バー：1cm）率（％）

Fig. 1 Induction of embryogenic cells (Bar: 1cm)80

導Amounts
500
250
37.530303580
40102012.50.5
1.20.10.1
15202.50.25
2.5
2.5500
500
1000
10000
3000
10520

誘Compound
KNO3
MgSO4・7H2O
CaCl2・2H2O
Ca(NO3)2・4H2O
NaNO3
KH2PO4
NaH2PO4・2H2O
KCl
MnSO4・4H2O
H3BO3
ZnSO4・7H2O
KI
CuSO4・5H2O
Na2MoO4・2H2O
CoCl2・6H2O
FeSO4・7H2O
NaEDTA
Thiamine HCl
Pyridoxine HCl
Nicotinic acidGlycine
myo-Inositol
Casein Acid Hydrolysate
L-glutamine
SucroseGelrite
2,4-DBAP
pH5.6-5.8

060

58.7

50.2

403Mix

10Mix

ポリクロス
図－２. ポリクロス別の不定胚形成細胞の誘導率[μM]

Fig. 2 Embryogenic cell induction rate from polycross－51 －71.2
62.1

56.0

60.0
38.9

40.0

44.6

41.8

誘導率（％）

80.0

20.0
0.0
7月第1週

7月第3週

7月第5週

採収時期（2019）

3Mix
図－３.

10Mix

ポリクロス由来の種子採取時期が不定胚形成細胞の誘導率に及ぼす影響

Fig. 3 Effects of polycross-derived seed collection time on the induction rate of somatic embryogenic cells
表‐4．ポリクロス由来の不定胚形成細胞系統の初期と継代可能誘導率
Table 4 Initial and stable induction rates of polycross-derived embryogenic cell lines
外植体細胞系統

初期誘導率

継代可能

継代可能誘導率

初期誘導と置床数

誘導数

（％）

系統数

（％）

継代可能誘導(A)(B)(B / A)(C)(C / A)の割合（％）

3Mix

2,064

1,211

58.7

1,073

52.0

88.6

10Mix

2,013

1,011

50.2

882

43.8

87.2

合計

4,077

2,22254.5

1,955

48.0

88.0

ポリクロス

謝辞：本研究は、農研機構生研支援センター「イノベーション創出強化研究推進事業」の支援によって実施した。

図－４. 不定胚形成細胞の維持増殖（バー：1cm）
Fig. 4 Maintenance-proliferation of embryogenic cells (Bar: 1cm)

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