No.84

2012年 4 月

http://peptide-soc.jp
生体内カリウムイオンの蛍光イメージングを目指したペプチド－オリゴヌクレオチド
コンジュゲートプローブの開発
1 ．はじめにカリウムイオン（K ＋ ）は人の体重の約0．
4％を占めており，
生体内で重要な役割を担っている。例えば，筋収縮，心拍，
神経伝播，腎機能などである。
従って生体内のK ＋ 濃度の異常な変動は様々な疾患と関連して
おり，アルコール依存症，拒食竹中 繁織症， 過 食 症， 心 臓 疾 患， 糖 尿病，AIDS，癌等のマーカーに利用されている1）。このことから生体内 K ＋のモニタリングは重要である。しかしながら，生体内では，K ＋と同時にナトリウムイ
オン（Na ＋）が共存して働いている。例えば，神経細胞や筋細胞においては，細胞内外のK ＋ とNa ＋ と濃度差によって膜電位が保たれており，これらの濃度変化によって活動電位が生ずる。特に細胞間においては145 mMのNa ＋下で数 mMのK ＋の変化が起こっており，これをモニタリングするためには，K ＋ /Na ＋ の選択性の高い蛍光プローブの開発が重要である。高性
能イオン選択性電極が開発されており，これによって
血液中のNa ＋，K ＋の濃度変化の検出が行われている。
また，パッチクランプ法を用いれば細胞一個のK ＋の濃度変化がモニタリングできる。しかしながら細胞集団のK ＋変化のモニタリングは，これらの手法では不可能であった。この観点から水溶液中で利用可能な
K ＋ 選択的蛍光イメージング試薬の開発が期待されている。要求される性能は，100 mM 程度の解離定数を有し，Na ＋ に対するK ＋ 選択性の高いものである。最近，triazacryptand（TAC）誘導体が高いK ＋ 選
択性を有することを利用してこれを基本骨格とした
K ＋蛍光プローブの開発が行われている。最近報告されているTACを利用した興味深い研究は，TAC-Redを利用した脳のK ＋ 波の蛍光イメージング 2） とKS 2による細胞からのK ＋ 流出の蛍光イメージングであ（図 1 ）。著者は，2002年頃からヒトテロメア配る3）
列 DNAを利用したK ＋ 選択的蛍光プローブの開発を行ってきた。これは，グアニン（G）により形成されたカルテット構造において中心部分にキャビティが生じ，これがK ＋のサイズに最適であることを利用したものである（図2A）。具体的には，ヒトテロメ
ア配列を有するDNA 断片の両末端に蛍光共鳴エネル

ギー移動（FRET）可能な色素ペア（ここではFAMとTAMRA）を導入した分子を合成した（図 2B）4）。
この分子は，K ＋ 非存在下ランダム構造を取っている の で，FAMの 励 起 に よ っ てFAM 由 来 の 蛍 光 を生じる。しかし，K ＋ が存在すると 4 本鎖構造を取り，FAMとTAMRAが 近 接 す る こ と に よ っ てFAMの励起によってTAMRAの蛍光を生ずると期待された（ 図 2C）。 従 っ てFAMに 対 す るTAMRAの 蛍 光 強度比を調べることによってK ＋量を見積もることが可能になると期待される。著者らは，本プローブおよびその誘導体によって水溶液中でのK ＋ 選択的蛍光イメージングを試みてきた。ここでは，高性能 K ＋選択的蛍光プローブ構築とそれを利用した生体内 K ＋の蛍光イメージングに関しての著者らのこれまでの検討結果についてまとめた。
2 ．ヒトテロメア配列を利用したPotassium Sensing
Oligonucleotide（PSO）の開発
著 者 ら が 初 め て 報 告 し たPSO-1の 構 造 を 図 2Bに 示 し た4）。PSO-1は， ヒ ト テ ロ メ アDNA 配 列（G G G T T A G G G T T A G G G T T A G G G ） の 両 置 換
基末端にFAMとTAMRAを導入した構造を有する。図2 CのようにK ＋ によってバスケット型 4 本鎖構造を形成し，FRETが誘起されると考えた。図 3AにK ＋ 存
在下，非存在下でのPSO-1の蛍光スペクトルを示した。K ＋ 非存在下では515 nmのFAM 由来のピークが見られたが，581 nmにもピークが見られた。K ＋ 存
在下では，515 nmのピークが減少して581 nmのピー
クが増大した。581 nmのピークはTMARA 由来と考えられるので期待したような蛍光変化が観測でき

図1

triazacryptand（TAC）骨格を利用したK ＋ 選択的蛍光プローブ，TAC-RedおよびKS 2

1

た。しかし，K ＋ 非存在下でもTAMRA 由来の蛍光が見られたことからPSO-1は溶液中伸びた構造ではなく一部 FRET 可能な距離まで近接していると考えられた。この蛍光変化を利用して解離定数を求めたところ
7 mMでNa ＋
PSO-1はK ＋，Na ＋の解離定数が0．28と57．
＋に対するK の選択性は208倍であった。しかし，細胞間で期待される145 mM Na ＋ 存在下でK ＋ 濃度変化
させるとTAMRAの蛍光減少のみしか観察されなかった。 こ れ は， 図 3Bに 示 し た よ う にPSO-1はK ＋ に 対
して高い親和性を有するが，大過剰のK ＋，Na ＋ 条件
下 で は， 最 終 的 に 到 達 す るF581/F515（FAMに 対 す る
TAMRAの蛍光強度）がK ＋に比べNa ＋の方が高い値を有するためである。Na ＋，K ＋ によって同じ 4 本鎖構造を有するのであれば，最終的には同じF581/F515比となるはずである。このような違いが出たのは，K ＋存在下でのPSO-1の構造は，Na ＋ のときのそれと異なっているためか，または，幾つかの異なった構造の混合体であると考えられた。最近になってヒトテロメア配列では過去に言われていたバスケット型の 4 本鎖構造
でなく，ハイブリッド型と呼ばれる 4 本鎖構造が主成分であることが示されており（図 4 ）5），ハイブリッ
ド型の両末端は離れているため効果的にFRETを示さないと期待されることを考えれば，ここでの結果はこれを反映したものと期待される。
3 ．トロンビン結合アプタマー配列を利用したPSOの開発
K ＋ により形成されるPSOの四本鎖構造の単純化のためにチェア型構造しか取らないと言われているトロンビン結合アプタマー配列 DNA（TBA, 5 ’
GGT TGG TGT GGT TGG-3’）の両置換基末端にFAMとTAMRAを 導 入 し たFAT-0を 調 整 し た（ 表 1 ）6）。
TBAは， 円 二 色 性 ス ペ ク ト ル を 用 い てK ＋，Na ＋ に対する解離定数を算出したところ，それぞれ0．29，
104 mMとなり，Na ＋ に対するK ＋ の選択性は350倍と極めて高いものであった。TBAは15量体であるので

図 2 （A）グアニン（G）カルテットによるK ＋の識別。（B）PSO-1の構造。（C）PSO-1によるK ＋のレシオ型蛍光検出の概念（ここでは 4 本鎖構造としてバスケット型を記載しているが，最近の研究からいくつかの混合物である可能性が高い。）

図 3 （A）3 mMのKCl 非存在下，存在下での0．
2μM PSO-1の蛍光（励起波長492 nm，5 mM Tris-HCl, pH 7．
0, 25℃）。（B）
KClまたはNaClの添加にともなう0．
2μ M PSO-1のAM（515 nm）に対するTAMRA（581 nm）の蛍光比。

2

両端は伸びた状態で約63Å 離れていると考えられる。
FAMとTAMRAのFörster 半 径 Ro ＝55Åと 期 待 さ れ る
ので，K ＋ 非存在下ではFRETは観察されず，K ＋ 存在
下で大きなFRETが観測されると期待された（図 5A）。
し か し，FAT-0の み で もFRETに よ るTAMRA 蛍 光 が観測され，K ＋ 添加によってチェア型 4 本鎖を形成するもののFAMとTAMRAの蛍光減少のみ観察された。
F585/F518よりFRET 効率は高いものであったが，蛍光減少のみ生じたのは二つの色素が近接しすぎるために
色素間の直接的な相互作用によってクエンチングが同時に起こったためであった。そこでFAMとTAMRA
を ピ レ ン に 置 き 換 え たPSO-pyを 合 成 し た（ 表 1 ）。
PSO-pyはK ＋添加に伴ってピレンエキシマー発光が観察された7）。このことは，先のクエンチングの理由を証明するものであった（図 5B）。更にトロンビンアプ
タマー配列の 5 ’末端にチミン連続配列を導入することによって二つの色素の距離をクエンチングが起こらない程度まで離すことを試みた6）。例えば，TBA 配列

図4の5’
末端に 5 個の塩基を導入したFAT-5（表 1 ）は，それ自体でのFRETは抑えられたもののNa ＋に対する
K ＋ の選択性は大きく減少した（図 5C）。これは新たに 4 本鎖形成に関与しないリン酸アニオン 5 個分が導入されたことによるものと考えられた。
4 ．PSO 誘導体の細胞への導入
上記で合成したPSO-1，FAT-0，FAT-5，PSO-pyの細胞導入を検討した。これらプローブは細胞に作用させただけでは細胞内へ導入されなかった。そこで，ビー
ズロード法によって細胞内へこれらのプローブを導入した。しかしながら，これらプローブは核に濃縮され，その後細胞死を起こすことが明らかとなった。例
えば，FAT-5においては，HeLa 細胞へ導入した場合，導入された57個の細胞中70％が 4 時間以内に細胞死を起こすことが明らかとなった。過去の論文においてTAB 配列は，核内のヌクレオリンと相互作用し，細胞死を促すことが知られており，本系の場合の同様の

ヒトテロメア配列 DNAで見出された多様な 4 本鎖構造（左からバスケット，プロペラ，ハイブリッド型である。）

表1

TBAを基本骨格としたPSO 誘導体

3作用機構で細胞死へ導かれたものと考えられた。そこ
で，TBAをK ＋ センシング部位としてFAM，TAMRA，
ビオチンの導入を検討した。FAMをDNAへ導入し，
TAMRAとビオチン部分を導入したペプチド鎖の連結を試みた。これは，TBA 以外にDNA 鎖を導入するとK ＋に対する選択性が低下することを加味して中性のペプチド鎖の導入を行ったのである。また，導入されたビオチンは，アビジンと複合化することによってヌクレオリンとの相互作用と核膜への通過を阻害させる
ために導入したものである。
5 ．PSO- 5 の合成8）
上記の分子設計によってPSO-5の合成を行った。合成 経 路 を 図 6 に 示 し た。TBA 配 列 を 有 す る オ リ ゴ
ブクレオチドの5’- 末端にアミノ基を3’- 末端にFAM
を 導 入 し たPSO（FAM） とSulfo-SMCCと の 反 応 によ っ て5’- 末 端 に マ レ イ ン イ ミ ド が 導 入 さ れ たPSO
（FAM）-maleimideを 合 成 し た。 こ れ に 別 途 合 成 したN- 端にビオチン，C- 端にシステイン，側鎖の途中に リ ジ ン を 導 入 し た ペ プ チ ドBiotin-Acp（6）-Gly-GlyGly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Cysを連結させた。その 後 リ ジ ン 部 分 と5（6）-carboxytetramethyl-rodamine
succinimidyl esterを反応させることによってリジン部にTAMRAを導入した。各中間体および最終生成物であるPSO-5は逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって精製した。PSO-5とストレプトアビ
ジン（streptavidin, StAv）との 1 : 1 混合サンプルはゲル電気泳動の移動度が大きく減少したことよりPSO-5
がStAvと複合体を形成したことが示された。また，別途核排出ペプチドsnurportin 1 （SNUPN）の 1 から15残基までのペプチドのN- 末にビオチンを導入した

図5

図6

4

FAT-0（A），PSO-py（B），FAT-5（C） のK ＋ に よ る 4本鎖形成とその際の色素間の位置関係

B-NES（Biotin-Acp-Trp-Ser-Arg-Ser-Leu-Ala-Leu-L ysLeu-Ala-Gly-Leu-Asp-Ile-NH 2 ）を合成した。このペプチドはα -へリックス構造を形成する。最終的にPSO-5と三つのB-NESをStAvに導入した複合体を形成させ，これを細胞内 K ＋蛍光イメージングに利用した。
PSO- 5 のNa ＋，K ＋ に対する解離定数は，それぞれ
12．
1 mM，639 mMであり，Na ＋ に対する選択性は53であった。TBAのみの選択性が350倍であったので，それに比べ約 7 倍以下の選択性の低下であったが，この条件でさえ報告されているK ＋プローブの中で一番高いものであった。更に，StAv，B-NESとの複合化
2 mM，529
によってNa ＋，K ＋ に対する解離定数は2．
＋＋mMとなり，Na に対するK の選択性は241と極めて増大した（TBAのみに比べ 2 / 3 倍）。
6 ．細胞内へのPSO- 5 の導入と細胞内 K ＋ イメージ
ング8）
ビーズロード法によってPSO-5をHeLa 細胞へ導入した。PSO-5は 8 時間後において導入された85細胞中18％が細胞死したのみでそれ自体でも細胞死をかなり抑えることができた。しかし，核への局在化は観察された。そこでStAvと複合化させ細胞に導入した。これによっても同条件下152個の導入されたHeLa 細胞
中19％の細胞死が観察されたのみであったが，それでも核への局在化は観察された。フルオレセイン導
入 StAvのみをビーズロード法によってHeLa 細胞に導入した場合も核への局在化が観察されたので，StAvは核膜を通過できて，かつ核へ濃縮されやすいのかも知れない。しかし，ビオチン化核排出ペプチドB-NESス
トレプトアビジンの残りの三つの結合サイトへ導入した複合体の場合は，177個の導入細胞に対して14％の細胞死が観察されたが，細胞質にPSO- 5 を留まらせることに成功した（図 7 A）
。細胞内のK ＋濃度変化のリアルタイムイメージングのためにPSO- 5 複合体を導入したHeLa 細胞にAmphotericin B（細胞膜のエ
ルゴステロールと結合して細胞膜透過チャネルを形成する。K ＋ の細胞外への流失を促進），Bumetanide（Na ＋ /K ＋ / 2 Cl － 共輸送体阻害剤。K ＋ の細胞内流入を 阻 害 ），Ouabain（Na ＋ /K ＋ -ATPase 阻 害 剤。K ＋の細 胞内 流入を 阻害） を導 入後，リ ア ルタ イ ム蛍
光 イ メ ー ジ ン グ を 行 っ た。 結 果 を 図 7 Bに 示 し た。

PSO-5の 合 成 法。（i）: sulfo-SMCC/PBS buffer（pH 7．
4）,（ii）: Spacer peptide（Biotin-AcpGly 5 LysGly 5 Cys-amide）/100mM potassium phosphate buffer（pH 7．
0）,（iii）: Tetramethylrhodamine（TAMRA）succinimidyl ester/PBS buffer（pH 7．
4）.

F585/F517の時間経過から時間とともにF585/F517値の減少が見られた。これは，細胞内からのK ＋の流出に伴う， 濃 度 減 少 を 示 唆 す る も の で あ る。F585/F517値 の減少は約2．
5時間で一定になった。これまでリアル＋
タイムでK 流出を調べた例は報告されていないが，Anderssonらは，96ウェルプレートで培養したヒト肺ガン細胞に同様の薬剤を添加して細胞内カリウムイオン濃度変化を，PBFIをプローブとした蛍光測定により解析している。その研究では添加後 2 時間から 3 時
間でカリウムイオン濃度の減少が示されている。したがって本研究でのHeLa 細胞への薬剤添加後のカリウ
ムイオン濃度減少が2．
5時間で定常に達した結果は妥当であると考えられる。本系においてカリウムイオン
濃度変化を蛍光イメージングにおいて蛍光強度比というリアルタイムな情報として捉えることができた点は新規で意義深いものである。
7 ．細胞表面へのPSO-5の局在化と細胞間 K ＋イメー
ジング9）
PSO-5を細胞表面に局在化させることができれば細胞間の化学シグナルとしてのK ＋の流出が観測されるものと期待される。特に細胞間は145 mM Na ＋ 存在
下で数 mMのK ＋ の変化を観察する必要がある。このためには，Na ＋ に対して高いK ＋ 選択性を有するK ＋
蛍光プローブが要求されている。POS-5がこれに適していると期待される。PSO-5の細胞膜外への結合には，細胞膜に多く存在する糖鎖に結合するbiotin
化 Concanavalin A（Con A），StAvを 介 し て 結 合 さ せることを試みた。概念を図 8Aに示す。HeLa 細胞に7μ M Con A 100μ L, 14μ M StAv 100μL, 5μM PSO-5
50 μ Lの順で30 min ずつ， 5 ％ CO 2 37℃ でインキュベートした。培地としてDMEM（-）2 mLを用い，KCl
を 滴 下 し た と き のPSO-5の 応 答 を 共 焦 点 レ ー ザ ー
ス キャ ン顕 微 鏡で観 察 した（ 図 8 B）。KCl 添 加 前，

FAM 由来の蛍光が観察され，PSO-5が細胞外へ固定化されていることを確認出来た。これにKClを添加した
ところ，添加に伴いTAMRA 由来の蛍光へと変化した。
これより細胞表層のカリウムイオン濃度変化のモニタリングに成功した。PSO-5を細胞表層に固定化した状
態で，アポトーシス誘導剤（10μ M Amphotericin B,

図 8 （A）細胞表面へのPSO-5の局在化の手法と（B）これによる局在化させたPSO-5による細胞表面での 5 mM
または150 mM K ＋ の蛍光イメージング。励起光494
nm，写真はFAMに対するTAMRAの蛍光比を示している（F541-637 nm/F493-553 nm）。

図 7 （A）HeLa 細胞にアポトーシス誘導剤を添加したときのK ＋イメージング画像．（B）（A）のサークル内の蛍光変化．（C）
蛍光レシオ値 F585/F517の時間変化．

5

Bumetanide, Ouabain in DMEM（10 ％ FBS）300μL）
を加えてアポトーシスを誘導し，細胞内からカリウム
イオン流出を行わせた。薬剤添加直後から蛍光のレシ
オ値 Rの増大が観察され，約2．
5時間で一定になった。
＋＋
先のK 流出に伴う細胞内のK 濃度減少と一致するものであり，細胞内からK ＋が流出する様子をリアルタ
イムで観察できたものと考えられた。
8 ．おわりにPSO-5を利用して細胞内外のK ＋ のリアルタイム蛍光イメージングに成功した。このシステムを脳や神経細胞へ応用することができれば，K ＋波の時空間蛍光
イメージング等が可能になると期待される。また，創薬開発に関しても細胞にK ＋チャンネルに影響を与える薬剤のスクリーニングのために行われているパッチ
クランプ法に代わる簡便な手法を提供できる可能性がある。これらの可能性を実証すべく今後検討を加えていきたい。
本研究は，研究室のスタッフと学生の努力の結果であります。また，PSOを細胞レベルまで高めることができたのは大阪大学・永井健治教授の助けによるものです。さらに文科省のグラントの助けもなければ研究を進めることができませんでした。感謝いたします。
参考文献1 ）C.-C. Shieh, M. Coghlan, J. P. Sullivan, M. Gopalakrishnan, Pharmacol. Rev., 52, 557-593 (2000).
2 ）P. Padmawar, X. Yao, O. Bloch, G. T. Manley, A. S. Verkman, Nat. Methods, 2, 825-827 (2005).
3 ）X. Zhou, F. Su, Y. Tian, C. Youngbull, R. H. Johnson, D. R.
Meldrum, J. Am. Chem. Soc., 133, 18530-18533 (2011).
4 ）H. Ueyama, M. Takagi, S. Takenaka, J. Am. Chem. Soc.,
124, 14286-14287 (2002).
5 ）S. Burge, G. N. Parkinson, P. Hazel, A. K. Todd, and S.
Neidle, Nucl. Acids Res., 34, 5402-5415 (2006).

中性子ビームを用いた創薬標的タンパク質とペプチド性阻害剤の相互作用解析
1 ．はじめにタンパク質をはじめとする生体高分子の多くは，構成原子の約半数を水素原子が占めている。水素原子は，存在や位置を低分子で得られた知見から理論的に予測できるといわれるが，
本当にそうだろうか？タンパク質の複雑な機能の発現を担う水黒木 良太
素原子は，タンパク質が分子表面に作り出した特殊な場において，様々な有機反応に寄与する。このような特殊な場に存在する水素原子を観測し，生じる反応を精度良く予測することは，未だ難しい。予測精度を向上させるには，理論計算で予測された水素原子の位置や反応性を，実験的な結果と比較し，相互に検証する必要がある。それでは生体高分子を構成する水素原子の位置を正確に把握するにはど
うすれば良いであろうか？その一つの方法は，水素原子の検出に効果的な中性子ビームを用いて立体構造を解析することである。近年，量子ビームと呼ばれる言葉が使われる。量子ビームは，放射光やレーザー，イオンビームなどの高品位なビーム群の総称である。中性子ビームは，量子ビームの一つであり，主として実
験用原子炉や加速器によって作り出される。中性子
ビームを用いてペプチドや核酸，タンパク質などの生体高分子を作る水素原子の特徴を探ることにより，その複雑な構造と機能の相関を効果的に解明することができる。これらの科学技術は，わが国が世界に誇るべき有数のものであり，世界の生命科学研究の先端領域の開拓に貢献できるはずである。ここでは，中性子ビームを用いた生体高分子の構造・機能研究の最近のトピックスを紹介する。

6 ）S. Nagatoishi, T. Nojima, E. Galezowska, B. Juskowiak,
and S. Takenaka, ChemBioChem, 7, 1730-01737 (2006).
7 ）S. Nagatoish, T. Nojima, B. Juskowiak, and S. Takenaka,
Angew. Chem. Int. Ed., 44, 5067-5070 (2005).
8 ）K. Ohtsuka, S. Sato, Y. Sato, K. Sota, S. Ohzawa, T. Matsuda, K. Takemoto, N. Takamune, B. Juskowiak, T. Nagai,
S. Takenaka, Chem. Commun., 48, 4740-4742 (2012).
9 ）K. Sota, S. Ohzawa, S. Sato, T. Matsuda, K. Takemoto, B.
Juskowiak, T. Nagai, S. Takenaka, unpublished data.

6

券献献献鹸

兼献献献験

たけなか しげおり
九州工業大学大学院工学研究院
物質工学研究系応用化学部門
shige@che.kyutech.ac.jp

2 ．中性子の特徴と構造解析の意義
中性子を用いて生体高分子の水素原子の構造を観測するには，中性子結晶回折法が用いられる。この手法
による構造解析では，X 線の代わりに中性子ビームを用いるが，X 線結晶構造解析と同様に目的試料を結晶化する必要がある。したがって観測されるのは結晶場
における静的な構造であるが，それゆえに水素原子を高い分解能で観測できる。タンパク質を構成する水素
原子は電子数が 1 であり，X 線との相互作用が少ないため観測が難しい。しかしながら中性子は，各原子の原子核と相互作用し，相互作用の大きさは各原子固有の特徴を反映するため，水素原子やリチウム原子など軽い元素であっても検出を効果的に行うことができる（図 1 ）。水素原子をその同位体である重水素に置換す
ると，炭素原子と同様の大きさで相互作用するため，さらに観測が容易になる。
中性子を用いた水素原子の観測は，水分子との相互作用によって保持される立体構造や，分子認識において重要な水和構造に関する情報を与える。また様々な
生物有機反応を触媒するアミノ酸の解離状態に関する情報も与えてくれる。これらの知見から，タンパク質

所（ILL）およびロスアラモス国立研究所・中性子科学センター（LANSCE）にそれぞれ 1 台ずつが稼働中であるが，日本に 3 台の装置が稼働中というのは大きな強みである。
中性子ビームによる生体高分子の立体構造解析は，
現在多くの成果をあげているX 線結晶構造解析と，ビームの種類（X 線／中性子）が異なるだけで，ほとんど同じ手法（ソフトウエア）を使うことができる。
近年では， 1 つの結晶試料から，X 線回折データおよび中性子回折データの両方を取得し，同時に一つの構造を得る手法が主流である。すなわち水素原子以外の原子（炭素，酸素，窒素，イオウ）は，より精度の高いX 線回折データの寄与を多くして解析し，水素原子等の位置は主に中性子回折データを使って決定する手法である5）。
中性子回折実験には，いくつかの大きな制限がある。それは中性子ビームを当てる結晶試料に，大型の試料（結晶体積 1 ～ 10 mm3）が必要なことである。
これは中性子ビームの強度が低いからである。この体積はX 線結晶構造解析で用いられる試料（結晶体積0．01 ～ 0．
1 mm3）の千倍にも相当する。 1 mm3の結などの高分子が，どのようなメカニズムで相手の分子を認識し，どのように有機化学反応を触媒するのかを把握することができる。新たに得られた分子認識における知見は，新たな創薬プロセスの創生にも寄与すると期待される（図 2 ）。
3 ．中性子ビーム施設と結晶構造解析
日本国内には，生体高分子の立体構造解析を目的とした中性子回折計が 3 台設置されている。そのう
ち 2 台は，日本原子力研究開発機構の研究用原子炉の中性子ビームラインに設置された中性子回折計（BIX-31），42）） で あ る。 残 り の 一 台 は，2008年 に 稼動を開始した大強度陽子加速器施設・物質生命科学
実験施設のBL-3に設置されたiBIX3）である。iBIXは，
茨 城 県 が 産 業 利 用 を 目 的 に 建 設 し た も の で あ り，J-PARCの出力がまだ低いので生体高分子の本格的な解析には使われていない。前者のBIX-3, 4 は，世界中の中性子解析例の 1 / 3 ～ 1 / 2 に相当する18件の中性子構造解析に成功しており4），現在解析数においては最も大きな寄与がある（図 3 ）。世界的には中性子ビームラインは，フランスのラウエランジュバン研究

Fig.3
Fig.1

① 水素位置の予測（計算） ①水素の直接観測（中性子実験）
2H=D

(1)

N
2.0

O
0.75

Na
0.28

S
0.17

水和水

Cl
従来の普通のプロセス‐0.3 1.0

（相対比）

C

3.6

中性子
原子散乱長

x 10‐12cm（相対比）(‐0.37)2 (+0.67)2 (0.67)2(0.94)2

0.03 0.03 (1)1.4(0.58)21.8(0.36)2

3.7(0.28)2

7.1(1.17)2

H

H

検証

H

医薬品候補分子H

H
H(2.25)2(3.10)2(4.50)2(4.80)2

創薬標的タンパク質

観測しやすさは電子数に依存する

図1

図2

中性子およびX 線との各原子の相互作用の大きさ

H

創薬標的タンパク質H

医薬品候補分子X線(1.97)2H② 熱力学変化の解析

8.1

検証

原子散乱因子 (0.28)2 (0.28)2 (1.69)2

H

H

H
H

水和状態

創薬標的タンパク質

水和水

複合体

科学的新知見に基づくプロセス

1H

H

創薬標的タンパク質

水素原子位置の推定による従来の分子設計プロセスと水素原子位置の実測に基づく新しい分子設計プロ
セス

Fig.2

β-lactamase TOHO-1
1.5Å

図3

Porcine pancreatic
elastase (pD7.0)
1.9Å

Photo active
yellow protein
1.5Å, 2ZOI

Porcine pancreatic
elastase + Inhibitor(pD5.5)1.65Å, 3HGN

Human lysozyme
1.8Å, 2ZWB

2Zn insulin
2.1Å, 3FHP

ADP-ribose pyrophosphatase
2.1Å

Anti freeze protein(nfeAFP6, H2O)
2.4Å

HIV-1 protease + Inhibitor
1.9Å, 2ZYE

Deoxyhemoglobin
2.1Å, 2DXM

Cubic insulin(pD6.6)
2.7Å, 2EFA

Rubredoxin(Wild)
1.5Å,1VCX

Cubic insulin(pD9)
2.5Å, 2ZPP

Trypsin + BPTI
2.15Å, 3OJT

Metmyoglobin
1.5Å,1L2K

Rubredoxin(Mutant)
1.6Å,1IU6Ribonuclease A
1.7Å, 3A1R

Dissimilatory sulfite
reductase D
2.4Å,1WQ2

B-DNA
Z-DNA
d(CCATTAATGG) d(CGCGCG)
3.0Å,1WQZ
1.8Å,1V9G

原子力機構の研究用原子炉に設置された中性子回折計によるタンパク質や核酸の立体構造解析例

7

晶試料に約 1 mgの試料が含まれると仮定すると，少ない試料を用いて中性子解析用の結晶試料を作製するには，最低でも 1 バッチあたり数 mgの試料が必要であり，事前に結晶化条件の最適化を行う必要がある。
また中性子回折データの収集には，約 1 か月という極めて長いビームタイムが必要である。したがってさらに高強度の中性子ビームと，それを生かすことのでき
る中性子回折計が必要である。
4 ．中性子による分子間相互作用解明の実例
中性子を用いた生体高分子の構造解析では，水素原子や水和水の立体構造を含む重要な情報が得られる。
この手法をペプチド性阻害剤と創薬標的タンパク質の相互作用解析に用いた例を紹介する。
私たちが手がけた創薬標的タンパク質の中性子構
造解析は，ヒト免疫不全ウイルス由来のプロテアー
ゼ（HIV-PR）6）とブタ膵臓エラスターゼ（PPE）7）である。両者ともX 線回折データと中性子回折データの両方を用いて 1 つの立体構造座標を決定した。ペプチドの認識においては，アミノ酸側鎖だけでなくペプチド結合そのものをタンパク質がどの様に認識するか，そしてアミノ酸側鎖の特徴をどのように見分けるかが重要である。ペプチド結合の認識には水素結合が寄与する。水素結合においては，水素原子は水素供与体と水素受容体の間の直線上（水素供与体から見た水素原子の延長線上に水素受容体が存在）に存在すると思いがちであるが，多くの場合水素原子は直線上には存在していない8）。またヘリックスに存在する水素結合の一部に，分岐状の水素結合が見られることや8），低分子や無機物で観測された低障壁水素結合（Low Barrier
Hydrogen Bond）の存在も明らかになった9）。このよ
うにタンパク質には普通に見られる水素結合であっても，水素原子の観測が可能になることによって初めて，さまざまな特徴の違いが明らかになってきた。
さらに水素原子の観測によって，触媒基の解離状態を直接知ることができる。酵素による阻害剤の認識においては，触媒基の解離状態が阻害剤の親和性を左右する。ヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼ（HIV-PR）の中性子構造解析（図 4a）によって触媒基の水素原子の状態を観測した結果，触媒基として機能する 2 つのアスパラギン酸の一つ（Asp25）はプロトン化し，もう一つのAsp125は，脱プロトン化していることがわかった。一般にアスパラギン酸の側鎖カルボン酸のpKaは，3．
4程度であるが，近接した 2 つのカルボン酸では，一方のカルボン酸のpKaが上昇し，もう一方のカルボン酸のpKaが下がって異常値を示す。HIVPRへの阻害剤（KNI272）の結合では，これら異常なpKaを有する 2 つのカルボン酸をうまく認識するよう6）。
な構造を有していることがわかった（図 4b）
ブタ膵臓エラスターゼ（PPE）と阻害剤の複合体の中性子構造解析（図 5a）では，セリンプロテアーゼのオキシアニオンホール（セリンプロテアーゼの機能発現を担う共通の構造）における阻害剤との相互作用も明らかになった。セリンプロテアーゼはオキシアニオ
ンホールという特徴的な構造を用いて，ペプチド結合のカルボニル基を分極させることが知られる。PPEのオキシアニオンホールに結合した阻害剤の水酸基には8水素原子が結合しておらず（水酸基は中性域のpHでは通常解離しない），水酸基が解離していることがわ
7）。これらの知見は，酵素と阻害剤のかった（図 5b）親和性を向上させるために，どのような方策をとればよいのか重要なヒントを与える。
5 ．新しいビームラインの建設へ
中性子を用いた生物分子の結晶構造解析は，世界中でも40例ほどしか実施されていないが，新たな解析によって得られた水素原子の情報は，タンパク質の構造や機能に関わる新しい知見を次々と提供しており，水素原子の観測によって新しい発見が期待されている。原子力機構の研究用原子炉に設置された 2 台の中性子回折計は，ILLやLANSCEに設置された中性子回折計では難しい高い分解能の中性子回折データを取得することができる。しかしながらデータの収集には約 1 か月という極めて長いビームタイムが必要であり，回折実験に必要な結晶試料の体積も， 1 ～10mm3と大きいことが問題である。そこで中性子回折
データを効率よく収集する方法としてパルス中性子を用いる手法が開発されている。生体高分子の立体構造解析にパルス中性子を利用する回折計は，近年稼働を開始した大強度陽子加速器施設（J-PARC）の茨城
県生命物質構造解析装置（iBIX）やLANSCEのProtein
Crystallography Station（PCS）で実現されているが，両者とも大型蛋白質の解析には適していない。また前者は産業利用目的のビームラインであり，一般ユー
ザーに提供されるのは，全ビームタイムのわずか20％である。したがって結晶の格子長に関する制限が少な
い一般研究者の利用を目的とした中性子ビームラインの建設が急務である。
そこで筆者らは，J-PARCの高効率の特性を生かした生体高分子の構造解析を目的とした中性子回折計の建設提案を行っている。この装置は，iBIXの基本設計を踏襲しているが，より効果的なデータ収集を目標として，比較的小型の結晶試料から中性子回折データを短時間で収集可能な回折計と，膜タンパク質やタンパ
ク質複合体などの大型格子結晶試料から中性子回折
データを取得できる長格子長専用回折計の 2 台を 1 つのビームラインに配置する予定である。後者の長格子
長専用回折計では検出器をより大型のものに変更するとともに，大型格子長の試料に対応して回折点の分離を向上させるため，試料と検出器の間隔を広げた仕様とした。本装置の建設が実現し，水素原子の観測が可能となることによって，タンパク質と阻害剤の相互作用における新しい知見を得ることができる。ぜひ建設実現へのご支援をいただきたい。
6 ．終わりに
中性子を利用したタンパク質結晶解析の歴史は長い。その利用は，パルス中性子の登場によっていよい
よ身近なものになってきた。X 線結晶構造解析によって蓄積された膨大な数のデータに，数の上で追いつくのは不可能であるが，共通の機能を発揮するタンパク質の代表例を一つ一つ丁寧に解析していくことによって，タンパク質の機能解明により近づくことができる
はずである。また水素原子の観測は，タンパク質におFig.4aa)Fig.4bb)

阻害剤
KNI272水素原子

触媒残基
Asp125

触媒残基
Asp25

非プロトン化プロトン化

医薬品の候補分子（阻害剤）

図4

ヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼ（HIX-PR）の中性子構造解析
a）中性子を用いて観測したHIV-PRと阻害剤の全原子構造。炭素（白またはグレー），酸素（赤），窒素（青）。溶媒である水は各原子のvan der Waals 半径を反映させた球で表示した。
b）活性アミノ酸残基と阻害剤の相互作用にかかわる水素原子。メッシュは中性子によって観測した原子核密度分布を示す。

a)b)Fig.5b

Fig.5a正四面体形中間体
エラスターゼに共有結合した阻害剤

原子核密度分布青： +5.0σ
赤： −4.5σ

阻害剤

阻害剤(正四面体中間体を模倣)

O＝C

N－D O‐－C

Oxyanionhole

酸素原子の周囲には、原子核密度が見られない
水和水の水素原子タンパク質の水素原子

図5

ブタ膵臓エラスターゼ（PPE）の中性子構造解析
a）中性子を用いて観測したPPEと阻害剤の全原子構造。色分けは図 4 と同じ。
b）基質結合部位（オキシアニオンホール）と阻害剤の相互作用に関わる水素原子

ける水素原子位置の理論的な予測が正しかったのかどうかを検証することができる。検証の実現は，理論計算における予測の精度向上につながり，タンパク質と相互作用する医薬遺品候補分子の予測精度も飛躍的に向上すると期待される。
本研究は，日本原子力研究開発機構の量子ビーム応用研究部門を中心に，大学等との共同研究によって実施されたものであり，研究に参加された方々に感謝申し上げます。また執筆の機会を与えていただいた日本
ペプチド学会の野水先生・坂本先生に深謝致します。

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券献献献献 鹸兼献献献献 験くろき りょうた
日本原子力研究開発機構
量子ビーム応用研究部門
量子ビーム機能性分子解析技術研究ユニット
kuroki.ryota@jaea.go.jp
独立行政法人

1 ．はじめに一般的な細胞生物学の教科書には，細胞骨格の主要なタンパ
ク質繊維成分として，微小管，アクチンフィラメント（ミクロフィラメント）と並んで，中間径フィラメントの名前が必ず出てきます。しかし中間径フィラメントは，前二者と比べてあま安藤 祥司
りポピュラーという印象はありません。発見は1968年，故 石川春律先生（当時ペンシルベニア大学，群馬大学名誉教授）らによって培養
筋細胞の電子顕微鏡観察によって最初に報告されました1）。名称は，フィラメントの直径（10 nm）が微
小管の直径（25 nm）とアクチンフィラメントの直径（ 6 nm）の中間であることに由来しています。その後，中間径フィラメントの研究は生化学や分子生物学的手法の発展に伴って進展してきましたが，まだ解明されていない課題が多いことも現状です。ここでは中間径フィラメントの不思議さや面白みについて，私の研究に触れながら紹介したいと思います。
2 ．中間径フィラメントこそ最も細胞骨格らしい成分
中間径フィラメント（intermediate filament，以下IFと略）は多くの真核細胞に存在し，細胞質全体に広がるタンパク質繊維のネットワークを形成しています2）。特に上皮細胞内では，IFの一種であるケラチン
フィラメントがデスモソーム（細胞間の接着装置）に連結することによって，上皮層全体に広がるネット

図1

10

中間径フィラメント（IF）の電子顕微鏡像（a）と原子間力顕微鏡像（b，c）（c）は（b）を立体的に表示したもので，セグメント構造が確認できる。
スケールバー：（a）200 nm,（b）500 nm

ワークを形成し，上皮層の強度を増しています。また，神経細胞の軸索内にはニューロフィラメントが多数並行して存在し，さらにフィラメント間に架橋構造を形成しています。この三次元的な格子構造が軸索の形態形成と維持に働き，神経刺激の伝達を支えています。またIFは細胞核にも存在し，内膜の裏打ち構造である核ラミナを形成しています。特に有名なのはアフ
リカツメガエルの卵母細胞の核ラミナで，IFの一種であるラミンフィラメントが規則的に直交することでシート状の網目構造を形成し3），核の構造の形成と維持に働いています。このように，IFの主な機能は丈夫な“ナノ構造”をつくり，細胞を内側から支持することによって，外からの機械的・物理的刺激に対抗して細胞を保護することだと考えられています。実際，IFを構成するタンパク質が遺伝子変異などの原因でIFをうまく構築できないと，細胞は弱くなり，いろいろな皮膚疾患や筋疾患を発症します4）。またIFの機能異常
は，肝硬変，毛髪形成異常，白内障，脂質代謝異常にも関連することが報告されています。
IFの特徴の一つとして，不溶性が高く，細胞骨格成分の中で最も安定な構造体であることが挙げられます。微小管，アクチンフィラメントが，それぞれの可
溶型構成タンパク質（チューブリン，アクチン）との間で，重合・脱重合の平衡状態を保ちながらフィラメ
ント構造を維持しているのに対して，一度形成されたIFは極端に安定で，可溶型構成タンパク質への解離は
8 M 尿素のように高濃度の変性剤を加えないと起きません。このようにIFの極端な安定性と不溶性は，細胞“骨格”という名前に最もふさわしいと言えます。
ちなみに， 8 M 尿素で可溶化したIFの構成タンパク
質は，透析によって徐々に尿素を除くと，自発的に重合して再び安定なIFを形成します（図 1 ）。この性質を利用した試験管内でのIF 構築法は，細胞を用いた解析とともにIFを研究する上での重要な実験手法となっています。
3 ．IFを構成するタンパク質は多種類
IFを構成するタンパク質は多様で，ヒトの場合では75種類ほど存在します。IFタンパク質はアミノ酸配列の類似性などから，大きく 5 つのタイプに分類されています。 5 タイプのタンパク質はすべてが一つの細胞に存在するのではなく，組織や細胞の種類，また発生・分化の程度によって，それぞれ特異的なタンパク質が 1 ～数種類存在します。具体的には，タイプⅠ
は酸性ケラチン，タイプⅡは中・塩基性ケラチンで，上皮細胞に存在します。ケラチンはIFタンパク質ファミリーの中で最も種類が多く，ヒトでタイプⅠは28種
類，タイプⅡは26種類存在します。タイプⅢは間葉系細胞に存在するビメンチン，筋細胞のデスミン，アス
トログリア細胞のグリア線維酸性タンパク質です。タイプⅣは神経細胞のニューロフィラメントタンパク質で 3 種類，タイプⅤは核のラミンで数種類存在します。このようにIFタンパク質は多様で，その存在が細胞や組織の種類などによって異なることは，微小管とアクチンフィラメントの構成蛋白質であるチューブリ
ンとアクチンには見られず，IFの大きな特徴です。
IFタンパク質はいずれも繊維状のタンパク質で，共通する構造的特徴としてN 末端側からヘッド，中央のロッド，C 末端側のテイルと呼ばれる 3 つのドメイン構造をもっています（図 2 ）。ロッドドメインはア
ミノ酸残基数がほぼ一定で，細胞質型 IFタンパク質で約310，核ラミンで約350です。ロッドドメインの中には，α-へリックス構造をとるサブドメイン1A，1B，2A，2Bが存在します。細胞質型 IFと核ラミンのロッドの長さの違いは，核ラミンの1Bが細胞質型 IFより42残基だけ長いことに起因します。また，1AのN 末
端約20残基と，2BのC 末端約20残基は，生物種を超えて広く保存されていることが特徴です。皮膚や筋肉の疾患では，ケラチンやデスミンのこの領域に多くの変異が見つかっています。また，この領域に人工的に変異を導入した組換えタンパク質はIF 形成能を失うことが報告されています。一方，ヘッドとテイルの長さやアミノ酸配列はタンパク質ごとに異なるため，この両末端ドメインが各タンパク質の性質や機能に大きく影響している可能性があります。ラミンのテイルには，核移行シグナルと膜結合用のイソプレニル化部位があります。
4 ．IFのリン酸化による機能制御
IFは微小管やアクチンフィラメントに比べると安定な構造物ですが，細胞分裂のときには一旦 IFのネッ
トワーク構造が崩壊しないと分裂に支障をきたします。この変化を起こす因子が何であるかが問題となります。この点に関して1980年頃から，細胞の分裂期にIFタンパク質のリン酸化量が上昇することが報告されるようになり 5），それまで不明であったIFの機能制御因子としてリン酸化が注目されるようになりました。
そして1987年，愛知県がんセンター研究所の稲垣昌樹先生が，試験管内で構築したIFに，cAMP 依存性キナーゼあるいはCキナーゼを作用させると，IFが崩壊（脱重合）することを報告しました6）。私はその年の夏から同研究所で勤務を始めたのですが，着任早々，
稲垣先生は 2 枚の電顕写真を持ってこられました。 1
枚には，図 1 のようにビメンチンIFが複数本，ゆるやかなカーブを描きながら，互いに重なって写っていました。もう 1 枚は，そのIFにリン酸化酵素を働かせた結果生じた構造で，小さく不規則な形の粒がたくさん写っていました。私には，タンパク質が自発的に集合して直径10 nm，長さ数μ mのきれいなフィラメント
をつくることが驚きでした。そして何より，リン酸化という修飾によって見事にフィラメント構造が崩壊す

図2

IFタンパク質の 3 つのドメイン構造11

ることが，大きな驚きでした。しかもこの現象は可逆的で，脱リン酸化酵素を働かせると，再びフィラメン
トを形成するとのこと。リン酸化によって，なぜこのようなことが起きるのか，その仕組みを探るため，リン酸化部位の解析をしようということで共同研究が始まりました。
用いた手法は当時では一般的なもので，まず，精製したビメンチンを試験管内で［γ-32P］ATP 存在下，cAMP 依存性キナーゼあるいはCキナーゼでリン酸化します。次に酵素による限定分解を行ったのち，放射線ラベルされたペプチド断片をHPLCで精製し，そのアミノ酸配列をプロテインシーケンサーで解析するというものでした。現在なら質量分析計を使うのでしょうが，当時はESIもMALDIもまだ普及していませんでした。当初，簡単だと思っていたものの結果はなかなか得られず，名古屋の暑い夜に，HPLCカラムから溶出された多数のフラクションの放射線量を測定していたことが懐かしく思い出されます。結局，イオン交換と逆相のHPLCでペプチドの純度をあげることと，
シーケンサーでリン酸化部位（主にSer）を決定する
のに，エドマン分解時にリン酸化部位からはずれるリ
ン酸基の放射線量を手がかりにするのではなく，リン酸化部位を化学的に他のアミノ酸誘導体に変換し，その位置をシーケンサーで決定することが鍵となって，結果が出るようになりました。この誘導化では，純化したリン酸化ペプチドを塩基性条件化でエタンチオー
ルと反応させて，リン酸化 Ser 残基をS-エチルシステ
インに変換します。この反応ではリン酸基がはずれて途中にデヒドロアラニンを経由するのですが，この不飽和アミノ酸は九州大学大学院の学生時代に，恩師である泉屋信夫先生（現 九州大学名誉教授）の研究室で抗菌性ペプチドのグラミシジンSに導入した経験があり，これも何かのご縁かと当時思いました。
最初に解析したビメンチンの結果は，cAMP 依存性
キナーゼとCキナーゼによるリン酸化部位はすべてN
末端のヘッドドメインに集中しているという興味あるものでした7）。その後，他のIFタンパク質について，
いろいろなキナーゼによるリン酸化部位を稲垣研究室の若い人達が尽力して次々と決めていきました。これ
らの結果，IFタンパク質のヘッドドメインは種々のキナーゼによってリン酸化を受け，それが引き金となってIFを脱重合させることがわかりました。ヘッドドメ
インの重要性は，酵素の限定分解やタンパク質工学的手法によってヘッドドメインを除去したタンパク質がIFを形成しないことから，それまでにも指摘されていました。また，ヘッドドメインはArg 残基を比較的多く含み，このアミノ酸の重要性も指摘されていました（ただし，Arg 残基の位置や配列がIFタンパク質間で保存されていることはない）。リン酸基は，IF 形成に重要なArg 残基の働きをマスクすることによって，脱重合を誘起する可能性があります。
リン酸化部位の決定はその後，リン酸化部位に特異的な抗体の開発に発展しました。最初，抗原に使うリン酸化ペプチドは合成ペプチドにキナーゼを作用させて調製していましたが，まもなく化学的に合成できるようになりました。リン酸化ペプチドの化学合成は，ペプチド化学の分野でも一時期トピックになっていま12した。この抗体は，リン酸化されたIFタンパク質のみを特異的に認識し，非リン酸化体には反応しません。
稲垣先生のグループはこの抗体を使って，細胞分裂期の前半（核分裂期）と後半（細胞質分裂期）で，異なる複数のキナーゼが，異なる細胞内局在でIFをリン酸化し，機能制御していることを見つけました8）。複数のキナーゼとしては，cdc2キナーゼ，Cキナーゼ，
Rhoキナーゼなどが挙げられます。リン酸化部位に特異的な抗体は，その後，いろいろなタンパク質の細胞生物学的解析に応用されています。一方，IFタンパク
質のリン酸化部位の解析は，各種キナーゼの基質認識機構の解析にも発展しました。中でも私が個人的に面白く感じたのはcdc2キナーゼで，この酵素は-Ser/ThrPro-Xxx-Arg/Lys-という配列のSer/Thrを好んでリン酸化するPro 指向性のキナーゼです。この配列をもつペプチドのPro 残基をGlyに置換してもリン酸化は起
き ま せ ん が，sarcosine（N-Me-Gly） やN-Me-Alaに 置換するとリン酸化が若干起こり， 6 員環のpiperidine2-carboxylic acid や 4 員環のazetidine-2-carboxylic acidではさらにリン酸化されやすくなり，やはり 5 員環のProが最もリン酸化されやすいという結果でした9）。
酵素の識別能の繊細さを改めて認識しました。
5 ．IFタンパク質がIFをつくる仕組みはまだよくわ
かっていない微小管とアクチンフィラメントの形成機構について
は，それぞれの構成タンパク質どうしが互いにどのような相対的な配置で重合しているのかが，既に解明されています。しかし，IFについてはまだ結論が出ていません。教科書によっては構成タンパク質からIFが組み立てられていくようすが図示されていますが，大部分は想像したものです。
IFタンパク質は多種類存在しますが，いずれも基本
的に直径約10 nmのIFをつくります。ただし， 1 種類
だけで重合してIFをつくるもの，複数の種類が重合することで初めてIFをつくるもの，単独でも複数でもIFをつくるものがあります。
IF 形成機構の解析は，前述した試験管内でのIF 形
成実験によって主に進められてきました。ただし，最終的にIFを形成する条件（pH，イオン強度，温度など）はタンパク質によって異なるので，最適化が必要になります。その最適化が非常に困難な場合もあり，
例えばラミンのIFはなかなか試験管内では形成できません10）。
今のところ，IFタンパク質がIFをつくる過程について，確かだと思われていることは，IF 形成のごく初期段階までです（図 3 ）。まず，単量体のIFタンパク
質が 2 本，平行にN 末端とC 末端をそろえて，ロッドドメインを介してコイルド-コイル構造をつくります。
この段階でケラチンは必ずタイプⅠとⅡが会合します。次に， 2 本の二量体が逆平行に並んで，半分の長さ程度ずれたように会合して四量体をつくります。そのずれ方にも 2 通りあって，N 末端側半分どうしが重なり合う場合と，C 末端側半分どうしで重なり合う場
合があります。この四量体までは，主にアメリカNIHのSteinertら11）や，ドイツMax Planck 研究所のWeberら12） が，緻密なタンパク質化学の手法や電顕などを用いて解明しました。しかし 2 通りの四量体がなぜできるのか，さらに四量体がどのような配置で会合しあうことでIFとなるのか，その詳細はまだわかっていません。このように解析が進まない大きな原因として，
IFタンパク質の不溶性が高く，結晶化しにくいことが挙げられます。
最近，ドイツがん研究所のHerrmannらは，電顕などの解析から，約 8 本の四量体が側面どうしで会合することで短いフィラメント（unit length filament，ULF）をつくり，このULFが縦方向に連結してIFをつくるという説を出しました2）。佐賀大学医学部に移った私は，理工学部の大石祐司先生に共同研究を申し込
み，ビメンチンのIF 形成過程を原子間力顕微鏡で立図3

IFの形成過程
四量体（Tetramer）のうち，A11とA22はそれぞれ二量体が 2 本，逆平行にN 末端側半分あるいはC 末端側半分で重なりあっている。A12は逆平行で両末端が揃っている。ACNはULF 1 個では存在せず，ULFの連結によって形成される構造。

図4

体的に観察することにしました。その結果， 1 個のULFは見かけ上の長さが約80 nmで， 4 つのセグメン
ト構造をもつことがわかりました。そしてULFに別のULFが 1 個連結するごとに長さにして平均40 nm， 2
つ分のセグメントずつ伸長するという結果を得ました。これらの結果から詳細は略しますが，ULFとそれが縦方向に多数連結したIFの中では，四量体はフィラメントの軸方向に平行に配置しているのではなく，フィラメントの軸に対して約10度の角度で（おそらく右回りに）互いにねじれあうように配置しているとい（図 4 ）。今後このモデルを
うモデルを提出しました13）
検証するには，例えば高分解能の電子顕微鏡を用いた三次元像解析などの手法が必要だと思われます。
6 ．ヘッドドメインの役割
リン酸化部位の決定以降，ヘッドドメインはIF 形成でどんな役割を担っているのかが気になります。可能性として，ヘッドドメインは他のドメインと相互作用することによってIFタンパク質間の会合に働くことが考えられます。そこで私は，ヘッドドメインと相互作用する相手領域の探索を行いました。まず，ビメン
チンをリジルエンドペプチダーゼで処理することに
よってヘッドドメイン（96残基）を切り出し，これを表面プラズモン共鳴装置（BIAcore）のセンサーチッ
プ上に固定化しました。そこにタンパク質工学の手法で調製したロッドドメインや各サブドメインを流し，結合するものを探しました。テイルドメインは欠失させてもIFを形成するので，候補から除外しました。その結果，ロッドのC 末端に位置する2Bサブドメイン（97残基）が濃度依存的に強く結合することが示されました。さらに2BサブドメインのN 末端を順次欠失させても結合には影響しませんが，保存されたC 末端
20残基を欠失させると結合が消失しました。次に，C

ULFの形成とその連結のモデル（a）（b）二量体がA11，A22，A12の様式で四量体を形成しながら合計16本（四量体としては 8 本）会合してULFを形成する。図の赤い四角はロッドドメインを表す。四量体はフィラメント軸（水平方向）に対して約10度の角度で互いにねじれあっている。ヘッドとロッド（図では省略）は重なり合って，セグメント構造の凸部分を形成する。（c） 2 つのULFは末端を櫛合わせるように連結する。その結果，軸方向に約40 nm， 2
つ分のセグメントの長さだけ伸長する。この連結でACNの配置が形成される。

13

末端20残基に相当する合成ペプチドをセンサーチップに固定化したところ，ヘッドドメインは結合しましたが，cAMP 依存性キナーゼでリン酸化したヘッドドメ
インは結合しませんでした14）。これらの結果から私達
は，ビメンチンのヘッドドメインは， 2 Bサブドメイ
ンのC 末端20残基と相互作用することで，IF 形成に働いていると結論しました。一方最近，カリフォルニ
ア大のグループは電子常磁性共鳴（EPR）スペクトルの解析から，四量体において，ビメンチンのヘッドドメインはロッドのN 末端に位置する 1 Aサブドメイ
ンと相互作用するという報告をしています15）。また，
Max Planck 研究所のTraubらは，溶液中で形成されたヘッドとロッドドメインの複合体を超遠心機で分離する手法を用いて，ヘッドはロッドのN 末端側半分
よりもC 末端側半分と強く結合することを示しています16）。IFタンパク質とそのフラグメントは，会合状態
によって表面構造が変化する可能性も考えられ，こう
いったところにもIF 研究の難しさがあります。
一方，ヘッドドメインのIF 形成に重要な構造要素を探る目的で，このドメインにアミノ酸置換や部分的な欠失を導入した変異体がこれまでに多数調製されました。一つ例をあげると，タイプⅢに属するIFタンパ
ク質は，ヘッドドメインのN 末端近傍に-Tyr-Arg-ArgXxx-Phe-という配列を共通してもつため，その意義について関心がもたれていました。Herrmannらは，この配列のArgと芳香族アミノ酸を別々に他のアミノ酸に置換したXenopusビメンチンの変異体を調製したところ，いずれも正常なIFを形成せず，電顕で凝集体のみを観察したことから，このタイプⅢの保存配列はIF形成に必須であると報告しました17）。しかし実験はやってみないとわからないもので，私達もmouseビメ
ンチンで同様な変異体を調製したのですが，Argを置換するとやはりIFを形成しませんが，芳香族アミノ酸（特にTyr）を置換すると意外にもULFの連結が野生型
よりも速く進行し，短時間でIFを形成することがわかりました18）。しかし形成されたIFは互いに集まって束になる傾向が見られたため，それを防ぐためには重合条件として加えるNaCl 濃度をビメンチンに最適な150mMから50 mMに下げる必要がありました。このNaCl
濃度では，ULFの連結速度は通常に戻りました。少なくともこの結果は，ヘッドドメインの配列がIF 形成に最適な塩濃度を左右することを示しています。理
由はまだわかりませんが，上記配列中のArg 残基がIF形成時のロッド（1A ？ 2B ？）との相互作用に重要で，そのArg 残基のコントロールに近傍の芳香族アミノ酸（特にTyr）が働いている可能性を考えています。
ご周知のようにArg 残基はフォールディングやタンパ
ク質間相互作用において重要で，水素結合，疎水性相
互作用，cation-π相互作用など多機能性を発揮しますが，Tyrはcation-π相互作用の最適な相手残基です。
7 ．IFタンパク質の分子進化の解析
上記 3 ．で述べたようにIFタンパク質は共通する構造的特徴をもつことから，ある祖先型タンパク質から分子進化してきた可能性が考えられます。前出のWeberらは無脊椎動物の細胞質に存在するIFタンパク
質やその遺伝子を解析し，その構造が核ラミンと脊椎
14

動物の細胞質型 IFタンパク質の中間的な構造である
ことを報告しました19）。具体的には，ロッドドメイン
は核ラミンのように約350残基なのですが，テイルの核移行シグナルと膜結合用のイソプレニル化部位を欠いていたのです。私は佐賀大学医学部の高井成幸先生（現 佐賀大学名誉教授）から，プラナリア（左右対称な動物の中で最も単純な構造をもつ扁形動物）の面白さについて伺っていたこともあり，この動物がもつIFタンパク質の遺伝子解析を始めました。佐賀市近郊の古湯温泉から少し山登りした小川で，プラナリアを採集しました。余談ですが，採集方法は高井先生のオリジナルで，30分程で大きいのから小さいものまで，ウ
ヨウヨ獲れました。採集後は，温泉に入ってから大学に帰るのが習慣でした。ちなみにその小川のプラナリ
アは，既に高井先生らが5S rRNAの配列を決めた血統書つきです。遺伝子技術を農学部の穴井豊昭先生に教えていただきながら，cDNAクローニングとシーケン
ス解析を行いました。その結果，ロッドドメインは約350残基で核ラミンに長さが匹敵するのですが，核移行シグナルとイソプレニル化部位を欠く細胞質型のIFタンパク質をコードしていました。その後，in situ
hybridizationや医学部の河野 史先生からご指導いた
だいた免疫電顕などで，このタンパク質はプラナリア
が岩などに粘着する際に働く細胞で特異的に発現されていることがわかりました［論文作成中］。
これまでのところ，IFタンパク質の祖先型は核ラミンの構造に近く，その後，核移行シグナルとイソプレニル化部位を失って無脊椎動物の細胞質型 IFタンパ
ク質に進化し，さらにロッドドメインの1Bサブドメ
イン42残基を失って脊椎動物の細胞質型 IFタンパク質へと進化したと考えられています。脊椎動物の細胞質型 IFタンパク質は，多様に分化した細胞の機能に対応できるように，さらに分子進化してきた可能性があります。
8 ．IFのナノ素材としての解析と応用
2 ．でIFは細胞骨格成分の中で最も安定な構造体であると記述しましたが，IFの材料科学的な特性を明らかにする解析が種々進められています。例えば，粘弾性を解析した報告がなされており，IFのネットワーク
はアクチンフィラメントや微小管に比べてやわらか
く弾性があり，剪断されにくいことが示されています20）。また，ビメンチンとデスミンはどちらもタイプ
Ⅲに属しますが，後者の方がより剪断されにくいな
どの違いが指摘されています21）。最近では，九州大学
理学部の水野大介先生らのグループが，ビメンチンIFのネットワーク中に微小なコロイド粒子を埋め込み，
その運動性から力学的特性を評価するマイクロレオ
ロジーの解析を進めておられます［論文作成中］。一方，原子間力顕微鏡のカンチレバーで直接，IFの 1 本ずつに力刺激を加えて，その変形（伸張や崩壊）のよ
うすからIFの力学特性を評価する解析も行われています22）。今後は，IFタンパク質の種類や疾患関連の変異によって，IFの力学特性がどのように異なるのかについても解析が進められるでしょう。
IF 構造の特殊性を利用して，新たなナノ構造を構築することも，今後の興味あるテーマです。最近，佐560-564.
4 ）J.E. Eriksson, T. Dechat, B. Grin, B. Helfand, M. Mendez,
H.M. Pallari, R.D. Goldman, J. Clin. Invest. 119 (2009)
1763-1771.
5 ）R.M. Evans, L.M. Fink, Cell 29 (1982) 43-52.
6 ）M. Inagaki, Y. Nishi, K. Nishizawa, M. Matsuyama, C.
Sato, Nature 328 (1987) 649-652.
7 ）S. Ando, K. Tanabe, Y. Gonda, C. Sato, M. Inagaki,
Biochemistry 28 (1989) 2974-2979.
8 ）M. Inagaki, Y. Matsuoka, K. Tsujimura, S. Ando, T. Tokui,
T. Takahashi, N. Inagaki, BioEssays 18 (1996) 481-487.
9 ）S. Ando, T. Ikuhara, T. Kamata, Y. Sasaki, S. Hisanaga,
図5

ビメンチンIFを鋳型にしてつくったシリカナノチュー
ブの透過型電子顕微鏡像（スケールバー：50 nm）

T. Kishimoto, H. Ito, M. Inagaki, J. Biochem. 122 (1997)
409-414.
10）K. Isobe, R. Gohara, T. Ueda, Y. Takasaki, S. Ando, Biosci.
Biotechnol. Biochem. 71 (2007) 1252-1259.

賀大学理工学部の中島謙一先生との共同研究で，ビメンチンのIFを鋳型にしてtetraethoxysilaneの重合を行わせ，その後，サンプルを焼結することでシリカのナノチューブを形成することに成功しました23）（図 5 ）。
このナノチューブは長さ数μm，外径35-55 nm，内径約10 nmで，その表面に見られる周期的な“こぶ”状の構造はIFのセグメント構造を反映している可能性があります。今後は，IFタンパク質と他のタンパク質のキメラを作製することにより，新しい機能性ナノ素材をつくり出せるのではないかと期待しています。

11）P.M. Steinert, L.N. Marekov, D.A. Parry, J. Biol. Chem.
268 (1993) 24916-24925.
12）N. Geisler, J. Schunemann, K. Weber, Eur. J. Biochem. 206(1992) 841-852.
13）S. Ando, K. Nakao, R. Gohara, Y. Takasaki, K. Suehiro, Y.
Oishi, Biochim. Biophys. Acta 1702 (2004) 53-65.
14）R. Gohara, D. Tang, H. Inada, M. Inagaki, Y. Takasaki, S.
Ando, FEBS Lett. 489 (2001) 182-186.
15）A. Aziz, J.F. Hess, M.S. Budamagunta, J.C. Voss, P.G.
Fitzgerald, J. Biol. Chem. 285 (2010) 15278-15285.
16）P. Traub, A. Scherbarth, W. Wiegers, R.L. Shoeman, J.
Cell Sci. 101 ( Pt 2 ) (1992) 363-381.
17）H. Herrmann, I. Hofmann, W.W. Franke, J. Mol. Biol. 223(1992) 637-650.
18）R. Gohara, S. Nishikawa, Y. Takasaki, S. Ando, J. Biochem.
144 (2008) 675-684.
19）A. Erber, D. Riemer, M. Bovenschulte, K. Weber, J. Mol.
Evol. 47 (1998) 751-762.
20）P.A. Janmey, U. Euteneuer, P. Traub, M. Schliwa, J. Cell
Biol. 113 (1991) 155-160.
21）M. Schopferer, H. Bar, B. Hochstein, S. Sharma, N.
Mucke, H. Herrmann, N. Willenbacher, J. Mol. Biol. 388(2009) 133-143.
22）L. Kreplak, H. Herrmann, U. Aebi, Biophys. J. 94 (2008)
2790-2799.
23）R. Gohara, D. Liu, K. Nakashima, Y. Takasaki, S. Ando, J.
Biochem. 146 (2009) 627-631.

崇城大学

あんどう しょうじ
生物生命学部 応用微生物工学科
andosho@bio.sojo-u.ac.jp

券献献献鹸

兼献献献験

9 ．おわりに
近年，IFは単なる細胞の機械的支持体として機能するばかりではなく，細胞内シグナル伝達，アポトーシ
ス，組織の損傷治癒などにも深く関連することが報告されるようになりました。IFは縁の下の力持ちとして派手さはありませんが，最初考えられていたよりも広範な機能を細胞内で果たしている可能性があります。
IFタンパク質が分子進化によって種類を増やしてきた
理由や意義が，これからの構造‐機能相関の研究で解明されていくと思います。さらに，こうしたIFに関する基礎研究の成果が，今後，医療現場での病気の診断
や，組織再生などの分野で応用されることを期待しています。IFの研究人口は，欧米に比較して日本では少ないのが現状です。この拙文がきっかけとなって，IFに関心をもって頂ける方が増えれば幸いです。
ここで紹介した研究では，本文中にお名前を記させていただいた多くの先生方にお世話になりました。改めて心よりお礼申し上げます。また，実際に実験に取り組んでくれた佐賀大学医学部 郷原るみさん，田端寿美氏，学生諸氏に感謝いたします。
最後にペプチドニュースレターに寄稿の機会を与えていただきました九州工業大学の坂本 寛先生に厚くお礼申し上げます。
参考文献1 ）H. Ishikawa, R. Bischoff, H. Holtzer, J. Cell Biol. 38 (1968)
538-555.
2 ）H. Herrmann, U. Aebi, Annu. Rev. Biochem. 73 (2004)
749-789.
3 ）U. Aebi, J. Cohn, L. Buhle, L. Gerace, Nature 323 (1986)

15

15th Korean Peptide and Protein Symposiumの参加報告
昨年の12月 1 日に15th Korean
Peptide and Protein Symposium（KPPS） が 韓 国 のOchangに て 開 催 さ れ ま し た。 本 学会 のChairはSeoul National
UniversityのYoon-Sik Lee 先 生です。私は今回幸運にもTravel
awardを頂き，この学会に参加
畠中 孝彰
してきました。
開 催 地 で あ るOchang は ソ
ウ ル よ り100 km 程 南 の 韓 国 中 部 に 位 置 し て お り，Incheon 空港からはバスとタクシーを乗り継いで 3 時間程度かかります。今回の学会が私の初の韓国遠征であり，行きは私一人だったため，当初は目的地に到着できるかどうかも非常に不安でした。しかし，なんとかなるものですね。交通機関がよく整っていたのが大きいですが（特にタクシーの数が多い上に安い），
意外にもすんなり開催場所のKorean Basic Science In
statute（KBSI）Ochang Centerに到着することが出来ました。Ochang Centerに到着後も，ゲートの管理人さんに訪問理由を告げると，夜中であったにもかかわらず，すぐに今回のシンポジウムの世話人の一人であるJeong Kyu Bang 先生が迎えに来てくれました。
Bang 先生は日本での研究経験があるとのことでしたが，それにしても日本語が上手く，フランクな方だったのが印象的でした。その後，Bang 先生に 2 日間お世話になるドミトリーへ案内していただいたのですが，部屋に入った瞬間のほっとした気持ちは忘れることができません。トラブルに合うことはなかったのですが，長距離を移動したことや，日本からのフライトの都合により，Ochang Centerに到着したのが21時前後になってしまったこと，さらには，Ochang
Centaerは研究施設ですので周辺にはほとんど何もな
く，200 mほど先に一軒コンビニの光が見えるだけだったことなど，不安だらけの一日目でした。余談ですが，ドミトリーは非常に新しく，トレーニングルー
ムも併設されており，夜中にもかかわらずトレーニン
グされている方がいらっしゃいました。また，各部屋にはエアコンと床暖房，シャワールームが整備されてKBSI Ochang crener 入場ゲート

16

おり，エアコンは操作リモコンがハングル文字で表記されていたため全く使いこなせませんでしたが，床暖房が暖かく 2 日間快適に過ごすことが出来ました。
シンポジウム当日，受付には多くの人が集まっており，外見だけでは日本人と韓国人を区別するのはなか
なか困難でしたが，よく観察してみると，話しをしている人々が韓国の学生もしくは先生方，おとなしい
人々が日本人学生という非常にわかりやすい構図でした。同じような外見の集団の中で，聞こえてくる言葉が全く理解できないというのは不思議な感覚ですね。
シ ン ポ ジ ウ ム はYoung scientist symposiumか ら 始
ま り，Plenar y Lecture，Structure of Peptide andProteins，Synthetic Methods，Peptide Discoveryと 5
つのトピックで計17人の方の研究発表を聞くことができました。Young scientist symposiumにおいては，韓国人学生 8 人が熱心にそれぞれの研究内容を英語で発表されました。彼らの英語が非常に流暢であることに驚きつつも感心し，とても良い刺激を受けました。彼
ら全員が賞をもらっていたのも頷けます。また，日本人研究者としては，東海大学の北條裕信先生が糖タンパクの合成法について，私の担当教官である鹿児島大学の伊東祐二先生がIgA 結合ペプチドのデザインについてそれぞれ発表され，熱いディスカッションを交わされておりました。私もポスターセッションに演題を登録しており，前日から発表のイメトレをばっちりとしていたのですが，いざ出番がきてみると，ほとんど発表を聞きに来てもらえないという初めての経験をしました。ポスターを眺めに来た学生に「Can I explain?」と声をかけもしたのですが，首を横に振られる結果となり，やるせない気持ちになると共に，発音が悪かったのか？それとも表現？いやどちらも？それともまさか怖かった？と，自分に足りない英語力を再認識する良い機会になりました。いえ，本当はちょっと凹みました。発表を聞きに来てもらえないのがこんなに辛いとは。。。。日本の学会でも，海外の方のポスター発表を聞きに行く学生は少ないですが，彼らの気持ちを何となく感じることができたので，これからは積極的に聞きに行こうと思います。
その後の発表においても，The Catholic University（ソウル）のEun Seong Lee 先生が発表されたpHセン
シティブな多糖を用いた薬剤のデリバリーに関する研究や，Dongguk University（ソウル）のTak Jin Kang
先生が発表されたpeptidyl-tRNAのdrop-offを利用した
環状ペプチドの合成など，興味深い内容のものが多く，非常に良い勉強になるとともに，今後の研究にさらに意欲が沸く機会となりました。その夜のBanquet
でお酒が出なかったのは少々残念でしたが，終始和やかな雰囲気で美味しい韓国料理を楽しめたのはいい思い出です。
翌 日， ソ ウ ル ま で 戻 る 際 に は， 韓 国 版 の 新 幹 線
KTX（Korea Train eXpress）を利用しました。日本の新幹線と同じようにあまり揺れることもなく，バスとタクシーで 3 時間近くかかった距離も40分程度で走破
し，車内は無線 LANも使える非常に便利な電車でした。また，韓国といえば焼肉という安易な発想から，
ソウル市内にて焼肉をいただいたのですが，当時日本では幻と化していたユッケを食べることができたのは

感動的でした。
以上今回の15th KPPSにおいては，日本の学会とは勝手が違ったためいろいろと戸惑うこともありましたが，興味深い話を沢山聞くことができ，海外での貴重な体験も多くしました。これらの経験を今後の研究
や，次の国際学会に生かしていきたいと思います。ま2013年 大 阪 に て 開 催 さ れ るAsia-Pacific international peptide
symposiumと50回日本ペプチド討論会の宣伝

Osong 駅構内にて 左から，東海大学 朝比奈雄也さん，私，東海大学 北條裕信先生

た，最後になりましたが，今回の15th KPPSへの参加をご支援して頂きました日本ペプチド学会の学会役員
及び選考委員会の先生方，そしてこのような執筆の機会を与えて下さった九州工業大学大学院の坂本寛先生，その他ペプチドニュースレター編集委員の先生方に心より感謝申し上げます。

KTX（Korea Train eXpress）

ソウル市内の焼肉屋にて

左 私，右 伊東先生

券献献献鹸

兼献献献験

はたなか たかあき
鹿児島大学大学院 理工学研究科
システム情報科学専攻
k7808291@kadai.jp

ソウル駅構内17

AKABORI MEMORIAL AWARD 2012
Call for Nominations
This award was established in 2000 by the JapanesePeptide Society in commemoration of Dr. Shiro Akaboribased on the donation by Dr. Rao Makineni. We are
now calling for Nominations for the Akabori Memorial
Award 2012 until June 30, 2012. The recipient of the
Akabori Memorial Award 2012 will present his/herAward Lecture at 49th Japanese Peptide Symposium tobe held in Kagashima, Japan from November 7th to 9th,
2012.
Past recipients
2000 Gunther Jung (University of Tubingen, Germany)
2002 Yasutsugu Shimonishi (Osaka University)
2004 Geof frey Tregear (Howard Florey Institute,
Melbourne, Australia)
2006 Jean Martinez (Universités Montpellier I et II,
France)2008 Yoshiaki Kiso (Kyoto Pharmaceutical University)
2010 Stephen Kent (University of Chicago)
How to submit a nomination:
1 . A brief statement of nomination (no more than
1 ,000 words).
2 . The nominee's Cur riculum V itae and List of
Publications.
3 . One additional recommendation letter in support
for the nominee.
4 . No more than 5 selected reprints (PDF files).
PDF files of all the documents should be sent by e-mail.

第44回若手ペプチド夏の勉強会開催のお知らせ
昨年は，東日本大震災の影響で開催を見合わせましたが，今年は44回目の勉強会を大阪にて開催いたします。今回は，大阪府大阪市にあります「ロッジ舞洲」（JR 大阪駅からJR 桜島駅まで約15分，JR 桜島駅から施設までバスで約15分）にて， 2 泊 3 日で行います。
若手研究者の相互親睦ならびに，それぞれのペプチド研究領域を超えた活発な議論ができる勉強会を目指して現在準備を進めています。参加方法等の詳細に関しては，追ってメール等にてお知らせいたします。夏の暑さに負けない，多数の「熱い」若手参加者をお待ちしております。
日時：平成24年 8 月 5 日（日）～ 7 日（火）場所：ロッジ舞洲 LODGE MAISHIMA〒554-0042 大阪市此花区北港緑地2-3-75
TEL 06-6460-6688, FAX 06-6460-6700
http://lodge.maishima.jp/
世話人：島本 茂（近畿大学理工学部）
真鍋良幸（大阪大学大学院理学研究科）（第44回若手ペプチド夏の勉強会に関してのお問い合
わ せ は，E-mail: sshimamoto@life.kindai.ac.jp（ 島 本 ）までお願い致します）

Deadline, June 30, 2012.
The nominating documents should be sent to:
Dr. Yoshiaki Kiso
Chair, Akabori Memorial Award Committee
Laboratory of Peptide Science
Nagahama Institute of Bio-Science and Technology
1266 Tamura Cho, Nagahama City, Shiga 526-0829,
JAPAN
Tel: 81-749-64-8100
Fax: 81-749-64-8140
E-mail: y_kiso@nagahama-i-bio.ac.jp

PEPTIDE NEWSLETTER JAPAN
編集・発行 : 日本ペプチド学会〒 562-8686 箕面市稲 4-1-2㈱千里インターナショナル内
編集委員
野水 基義（担当理事）（東京薬科大学薬学部）
TEL・FAX 042-676-5662
e-mail: nomizu@toyaku.ac.jp
坂本寛（九州工業大学大学院情報工学研究院）
TEL 0948-29-7815，FAX 0948-29-7801
e-mail: sakakan@bio.kyutech.ac.jp
小出 隆規（早稲田大学先進理工学部）
TEL 03-5286-2569，FAX 03-5286-2569
e-mail: koi@waseda.jp
川上徹（大阪大学蛋白質研究所）
TEL 06-6879-8602，FAX 06-6879-8603
e-mail: kawa@protein.osaka-u.ac.jp
松島 綾美（九州大学大学院理学研究院）
TEL 092-642-4353，FAX 092-642-2607
e-mail: ayami@chem.kyushu-univ.jp（本号編集担当：坂本

18寛）