ニュースリリース
令和４年７⽉１５⽇
国⽴⼤学法⼈千葉⼤学

たんぱく質ナノモーターの回転メカニズムの全貌解明―多剤耐性腸球菌の抗菌薬開発に期待―
⽣物の体内に存在する V 型 ATPase は、回転運動によりイオンを細胞膜の内外に運ぶことで、⽣命活動を維持する役割をもつ「たんぱく質ナノモーター注 1）」です。千葉⼤学⼤学院理学研究院（膜タンパク質研究センター）の鈴⽊花野特任助教、村⽥武⼠教授らはアリゾナ州⼤学の Singharoy らとの国際共同研究で、院内感染の原因となる多剤耐性腸球菌注 2）の⽣育に重要な V 型 ATPase 回転モーター部分の新たな⽴体構造を解析することに成功しました。この構造に基づいてコンピュータによるシミュレーションで検証した結果、不明であった V 型 ATPase の加⽔分解直後の構造を含む回転メカニズムを明らかにし、アデノシン三リン酸（ATP）のエネルギーが回転運動に変換されるメカニズムの全貌を解明しました。本研究成果は、本酵素の⽴体構造に基づいた多剤耐性腸球菌の抗菌薬の開発につながるものと期待されます。
本論⽂は、2022 年 6 ⽉ 14 ⽇に⽶国科学雑誌「ACS Central Science」にオンラインで公開されました。
■研究の背景と経緯
V 型 ATPase は⽣体膜中に存在し、ATP のエネルギーを使ってイオンを膜の反対側に運ぶことで、細胞膜内外のイオン濃度を調整するたんぱく質ナノモーターです。回転モーター部分の V1 と膜たんぱく質の VO 部分から構成され（図 1A）、V1 部分にはヌクレオチド注３）が結合できるサイトが 3 ヶ所あり、そこで順々に ATPを ADP とリン酸（Pi）に加⽔分解することで運動して中⼼軸が回転し、これに伴い VO 部分でイオンを輸送します。
近年薬剤耐性菌の蔓延が国際社会の継続的な脅威となっていますが、上市される新規抗菌薬の数は年々減少しており、薬剤耐性菌に対する治療の選択肢は急速に狭まりつつあります。その結果、薬剤耐性菌による死者数は急増し 2050 年までにその数は年間 1000 万⼈を超えると推計されています。薬剤耐性菌の 1 つである
多剤耐性腸球菌の類縁菌（腸内連鎖球菌）にも V 型 ATPase が存在し、腸内のアルカリ性環境下での⽣育に重要な役割を担っています。V 型 ATPase の分⼦メカニズムを知ることにより、多剤耐性腸球菌が引き起こす疾病原因の解明につながり、V 型 ATPase の阻害剤が抗菌薬になり得ると考えています。
本研究グループは近年、腸内連鎖球菌に存在する V 型 ATPase の V1 部分（A3B3DF 複合体）の詳細なスナップショット構造注４）を X 線結晶構造解析注５）によって複数明らかにし、ATP のエネルギーが回転運動に変換されるメカニズムの⼤枠を原⼦レベルで解明しました（図 1B）。しかし ATP が加⽔分解された直後のスナップショット構造は唯⼀明らかになっていませんでした。そこで ATP 加⽔分解直後に相当する状態を作り出し、その⽴体構造解析と MD シミュレーション注 6）による検証を⾏いました。
(A)

(B)

図 1 (A): V 型 ATPase の構造モデル。V 型 ATPase は 9〜13 種類のたんぱく質からなる超分⼦複合体で⽔溶性たんぱく質部分（V1 部分）と膜たんぱく質部分（VO 部分）からなる。触媒頭部（A3B3︔⻘⾊と紫⾊の 6 量体）で ATP を加⽔分解し、中⼼軸（DFd）とローターリング（c）を回転させ⽔素イオン（またはナトリウムイオン）を細胞外（またはオルガネラ注７）内）へ輸送する。
図 1 (B): これまでに明らかになっている V1-ATPase の分⼦メカニズム。全て上から⾒た V1-ATPase のスナップショット構造。⾒やすくするために A3B3 複合体のＣ末端ドメイン、Ｄサブユニットのみを表⽰している。3 カ所あるヌクレオチド結合サイトを⾚い⽮印で⽰した。「ATP 加⽔分解待ち」構造と「ATP 結合待ち」構造の間のスナップショット構造が明らかになっていない。

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■研究成果加⽔分解直後のスナップショット構造を得るために V1-ATPase に ADP とリン酸の類似体であるフッ化ア。
ルミニウム注 8）を混ぜて結晶化を⾏い、新たな V1-ATPase の結晶構造を得ることに成功しました（図 2A,B）
既知の V1-ATPase 構造と⽐較すると「ATP 加⽔分解待ち」構造の「ATP 分解型（ATP 加⽔分解を待っているフォーム）」のヌクレオチド結合部位に ADP とフッ化アルミニウムが結合したことで、新しいフォーム「ADP・Pi 結合型」に変化していました。このため得られたスナップショット構造は「リン酸解離待ち」であると考えられます。
得られた構造に基づいて MD シミュレーションを⾏った結果、加⽔分解で⽣じたリン酸の排出経路は中⼼軸側とその反対側からの 2 ⽅向存在し（図 2C）、そしてリン酸が「ADP・Pi 結合型」から排出されることでV1-ATPase 全体の構造変化が引き起こされ、新たな ATP が結合できるようになることが確認されました。
これらの結果から、今まで明らかになっていなかった「リン酸解離待ち」構造と、「ATP 加⽔分解待ち」構造から「ATP 結合待ち」構造までの回転分⼦メカニズムを新たに提案することができました（図 3）。
■今後の展開本研究で V1-ATPase の唯⼀未解明であった「リン酸解離待ち」構造が解明されたことにより、V 型 ATPaseが ATP のエネルギーを回転運動に変換する分⼦メカニズムの全貌が明らかになりました。これにより、V 型
ATPase の⽣体エネルギー変換メカニズムの⼀般原理の理解が進展するものと期待できます。また、V1ATPase の回転の詳細な分⼦メカニズムの解明により、多剤耐性腸球菌などへの抗菌薬の開発につながることが期待されます。

図 2: 本研究で得られた V1-ATPase（A3B3DF 複合体）の結晶構造。
（A）は横から、（B）は上から⾒た⽴体構造。ADP をオレンジ⾊、フッ化アルミニウム（リン酸の類似体）を⽔⾊で表す。
（C）MD シミュレーションから得られたリン酸の排出される 2 ⽅向を⾚注９）と⻩⾊注１０）の⽮印で表す。

図 3: V1-ATPase の分⼦メカニズムモデル。全て上から⾒た V1-ATPase のスナップショット構造（A・E︓「ATP 加⽔分解待ち」構造、B︓「リン酸解離待ち」構造、C︓「ATP 結合待ち」構造、D︓「ADP 解離待ち」構造）。V 型 ATPase で ATPのエネルギーが回転運動に変換されるには、まず「ATP 加⽔分解待ち」構造（A）の「ATP 分解型」に結合している ATPが ADP とリン酸に加⽔分解して「ADP・Pi 結合型」に変化する（「リン酸解離待ち」構造︓B）。その後「ADP・Pi 結合型」からリン酸が解離して ADP のみが結合した状態になることで「ADP 結合型」に変化し、そして協同的に V1-ATPase構造変化が起こって「ATP 結合待ち」構造（C）になる。⽣じた「ATP 待機型」に ATP が結合することにより、さらに構造変化が起こり、「ADP 解離待ち」構造（D）になり、最終的に ADP が解離することで、中⼼軸が 120 度回転し、最初の「ATP 加⽔分解待ち」構造（E）に戻るという分⼦メカニズムモデルを提案した。

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■研究プロジェクトについて
本研究は新学術領域研究（発動分⼦科学）、新興・再興感染症に対する⾰新的医薬品等開発推進研究事業（AMED）、創薬等先端技術⽀援基盤プラットフォーム（BINDS）等の⽀援を受けて⾏われました。
■⽤語解説
注 1）たんぱく質ナノモーター︓⽣物の細胞内で ATP の加⽔分解によって得られたエネルギーを機械的な運動に変換するたんぱく質複合体の総称。ナノメートル（10-9 メートル）程度の⼤きさである。
注 2）多剤耐性腸球菌︓Vancomycin-resistant Enterococcus（VRE）。世界保健機構（WHO）が挙げた優先して研究開発に取り組むべき 12 種類の薬剤耐性菌の 1 つであり、⼼内膜炎や敗⾎症などの⽇和⾒感染を引き起こす。
注３）ヌクレオチド︓塩基、糖、リン酸から構成される物質で核酸の構成単位。ATP、ADP などを含む。
注４）スナップショット構造︓たんぱく質が機能するときの動的な構造変化の中の１つの静⽌構造のこと。
注５）X 線結晶構造解析︓解析対象のたんぱく質を結晶化し、X 線照射によって得られる回折データからたんぱく質の原⼦レベルでの⽴体構造を決定する⼿法。
注６）MD シミュレーション︓分⼦動⼒学シミュレーション。⽣体⾼分⼦の各原⼦・分⼦について時間に対する原⼦の位置と速度をコンピューターで計算し、その動きを解析する⼿法。
注７）オルガネラ︓細胞⼩器官。細胞の内部で特に分化した形態や機能を持つ構造の総称。
注 8）フッ化アルミニウム︓リン酸の類似体。F1-ATPase やその他の ATPase では、ATP 加⽔分解直後の構造を得るためにフッ化アルミニウムを⽤いて X 線結晶構造解析を⾏い、加⽔分解直後のスナップショット構造を得ることに成功している。
注９）⾚⽮印の排出経路（動画）︓
https://pubs.acs.org/doi/suppl/10.1021/acscentsci.1c01599/suppl_file/oc1c01599_si_001.mov
注１０）⻩⾊⽮印の排出経路（動画）︓
https://pubs.acs.org/doi/suppl/10.1021/acscentsci.1c01599/suppl_file/oc1c01599_si_002.mov■論⽂掲載情報
論⽂タイトル︓ Revealing a hidden intermediate of rotatory catalysis with X-ray crystallography andMolecular simulations
著 者 情 報 ︓ #Mrinal Shekhar, #Chitrak Gupta, #Kano Suzuki, Chun Kit Chan, *Takeshi Murata,*Abhishek Singharoy(#共同第⼀著者, *責任著者)
掲載誌︓ACS Central Science
DOI︓https://doi.org/10.1021/acscentsci.1c01599

本件に関するお問い合わせ＜研究に関すること＞
千葉⼤学⼤学院理学研究院 教授 村⽥武⼠
Tel︓043-290-2794 Fax︓043-290-2794
E-mail︓t.murata@faculty.chiba-u.jp＜報道に関すること＞
千葉⼤学企画部渉外企画課広報室
Tel︓043-290-2018
E-mail︓koho-press@chiba-u.jp

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