学位論文内容の要旨

博士の専攻分野の名称

博士（医学）

氏 名

高橋有美

学 位 論 文 題 名
日本人 X 染色体連鎖精神遅滞における SLC9A6 遺伝子変異の意義および役割＜背景と目的＞精神遅滞(MR)は人口の約 3％に認められ、中等度以下の MR の 20～25%は遺伝学的要因により発症すると考えられている。中でも精神遅滞を来す遺伝子の約 10%が
X 染色体上に見つかっている。X 染色体が全ゲノムの 4%を占めるに過ぎないことを考えると、他の常染色体よりも相対的に大きな意味を持つと言える。本研究で対象とする
SLC9A6 遺伝子変異は、2008 年に Gilfillan らが Angelman 症候群(AS)類似の表現系を持つ X染色体連鎖精神遅滞(XMR)の家系で 4 例を報告し、日本人ではまだ報告がない。Gilfillanらは 4 つの機能喪失型と考えられる変異を報告しており、その後 Schroer らがさらに 1 つの新規の変異と Gilfillan らの報告と同じ変異を 1 例報告した。SLC9A6 遺伝子は Xq26.3 に存在し、Na/H+交換輸送体 NHE6 をコードする遺伝子である。NHE 1-5 は細胞膜、NHE 6-9は細胞小器官の形質膜に存在する。NHE6 蛋白は全身の early recycling endosomes で発現しており、early recycling endosomes は LTP 刺激下で脳樹状突起棘の成長に関与していることがわかっている。AS のモデルマウスでは、すでに樹状突起棘の形態変化が報告されており、本遺伝子異常と表現型が似る一要因と類推できる。本研究の目的は、本変異の日本人
XMR における頻度を明らかにすること、また、精神遅滞において果たす役割を分子遺伝学的あるいは生化学的に解明することである。さらに、診断の難しい XMR の原因検索において、臨床的に意義のある情報を提供することも目指している。＜対象＞AS が疑われ、既存の遺伝学的異常（15q11-q13 の欠失、メチル化異常、UBE3A 変異）が否定された男児
22 例を Group A、国立精神・神経センターにて集積された XMR 家系の児 104 例を Group Bとする。ただし、研究の途中で染色体異常、既存の遺伝子異常が診断された症例は除外してある。なお、AS の遺伝学的解析および XMR の解析は北海道大学医学研究科医の倫理委員会で承認され、書面の同意を得ている。＜方法＞GenBank で得られた塩基配列を基に、16 個の蛋白コード領域に対するプライマーを作成した。患者らから抽出された末梢血由来ゲノム DNA を鋳型に、上記のプライマーを用いて PCR 法により目的とする DNA を増幅した。エクソン 1 は Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase(Finnzymes)を用い、推奨の 5xGC Buffer、3%DMSO 添加の上 PCR を行った。PCR 産物は 3%アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロマイド染色により確認した。これを Wizard PCR Preps DNA PurificationSystem(Promega)で精製し、Big Dye Kit を用いて直接シークエンス法にて塩基配列解析を行った。解析には ABI 3130 シークエンサーを用いた。さらに、患者、正常コントロール（男女各 2 名ずつ）のリンパ芽球由来培養細胞から RNA queous Kit（Applied Biosystems）で total RNA を抽出し、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（AppliedBiosystems）を用いて各々の cDNA を作成した。この cDNA から、SLC9A6 遺伝子のエクソン 2 からエクソン 5 を増幅するよう設計したプライマーを用いて、PCR 法により増幅して転写産物の発現量を解析した。また、nonsense-mediated mRNA decay（NMD）による転写産物の除去を避けるため、各々の細胞を NMD の阻害物質である cycloheximide（CHX）で処理した。Carter らの報告の通り、患者から抽出した RNA と正常コントロール（男女各2 名ずつ）から抽出した RNA を、CHX 100g/ml と、コントロールとして CHX の調整に用いた 0.1% DMSO で 4 時間ずつ処理した（Carter et al., 1995）。
その後上記と同様の方法で total
RNA を抽出して cDNA を作成し transcript variant 1 および variant 2 の発現量を解析した。
から同様に転写産物の発現量を解析した。さらにこれらを定量化するため transcript variant
1/variant 2 それぞれに特異的なプライマーと TaqMan MGB プローブを作成し quantitativeRT-PCR（qPCR）を行った。各々のプローブは、variant 1 の 3’側とエクソン 3 の 5’側、variant2 の 3’側とエクソン 3 の 5’側でエクソン-エクソンジャンクションにかかるように設計し、異なる isoform の配列特異的に発現量を検出し得た。さらに NHE6 蛋白の発現を確認するため抗 NHE6 抗体を用いた Western blotting（WB）を行った。＜結果＞Group A の AS 疑い
男児 22 例中 1 例にエクソン 2 の一塩基欠失変異(c.516Gdel, p.S147fs)を見出した。この変異は、一塩基欠失によりアミノ酸 7 残基の後にエクソン 3 内に停止コドンが入り、以降の蛋白は失われる機能喪失型変異と考えられる。母親はこの変異のヘテロ接合体であった。本変異はエクソン 2 の alternative splicing によって生じる 2 種類の isoform のうち、96 塩基対長い transcript variant 1 による isoform a でのみ見られる。Group B は 104 例の解析を行い、変異は同定されなかった。RT-PCR では、患者の検体で variant 1 の発現量低下、variant 2の発現量増加を認めた。qPCR では、正常コントロールと比較してこれらの変化が有意差を持って証明された。また CHX 処理によって variant 1 の発現量が増加することから、nonsense mediated mRNA decay（NMD）が関与していることが推測された。患者の variant 2に関しては明らかな変化を認めなかった。WB では、患者において NHE6 isoform a およびisoform b いずれの発現も認めなかった。＜考察＞上述の通り、本変異は SLC9A6 variant 1でしか見られない。しかし患者の表現型はこれまでの報告例と重症度において変わらない。
このため、自験例の変異は MR 発症に有意に関わるものと考えられ、さらに NHE6 isoforma が発達脳において重要な役割を担っていることが示唆された。この例は、重度の精神運動発達遅滞、全身の筋緊張低下、身体発育不良、内斜視、音声言語が未獲得であること、難治性てんかん、色白、毛髪が褐色、容易に誘発される笑いなど、Gilfillan らの報告例と同様に AS と酷似する臨床像を呈した。また Gilfillan らの報告では、AS では成長に伴い肥満が見られるのに対して、本遺伝子異常ではやせていくことや、加齢に伴い重症化するという進行性の経過、MRI で小脳萎縮が進行するなど画像上の相違点も指摘されており、今後も本児の成長に合わせた表現型の比較が必要である。また NHE6 isoform a の発現が見られない WB の結果から、本変異が機能喪失型変異であることが証明された。＜結論＞既知の遺伝学的異常のない AS 疑い例で、SLC9A6 遺伝子の一塩基欠失によるフレームシフト変異を同定した。母親はこの変異のヘテロ接合体であった。XMR 疑い例の解析では変異は同定し得ず、XMR 家系における本遺伝子変異の頻度は大きくないと考えられた。本患者の臨床像は Gilfillan らによる報告例とほぼ一致していたが、彼らが指摘した相違点の内、進行性の経過、小脳萎縮に関しては患者の経過を追う必要がある。また、SLC9A6 transcript
variant 1 の発現量低下に NMD が関与していることを証明し得た。variant 2 に関しては、本変異が alternative splicing に影響を与えた可能性があった。今回同定した変異は、RT-PCR、qPCR、WB の結果から機能喪失型変異であった。