2.3 低線量率放射線に対する分子細胞応答影響実験調査
2.3.1 低線量率放射線照射による応答分子への影響解析
2.3.1.1 低線量率放射線長期照射マウス肝臓の網羅的遺伝子発現解析
Genome-wide Gene Expression Analysis of the Liver from Low Dose-rate-irradiated Mice
藤川 勝義, 杉原 崇, 田中 聡, 田中 イグナシャ, 小村 潤一郎
生物影響研究部

Katsuyoshi FUJIKAWA, Takashi SUGIHARA, Satoshi TANAKA, Ignacia TANAKA,
Jun-ichiro KOMURA
Department of Radiobiology
Abstract
Previously we reported life span shortening and increased incidences of cancer and non-cancer
diseases in B6C3F1 mice irradiated with gamma-rays at 20 mGy/day for 400 days. In the present study, weinvestigated the genome-wide gene expression profile of the liver from male and female mice irradiated at
20 mGy/day for 100, 200, 300 and 400 days. In the Ingenuity Pathway Analysis, no significant alteration
was found in the “p53 signaling” pathway. Instead, female mice irradiated at 20 mGy/day for 200 and 300
days showed prominent upregulation of several pathways related to lipid metabolism, such as “Cholesterolbiosynthesis” and “Adipogenesis” pathways. In male mice, however, alterations in these pathways were notconspicuous. These results may correspond to the increased incidence of fatty liver and obesity, which may
promote hepatocarcinogenesis, in low dose-rate-irradiated female mice.
1. 目的
本調査では、平成 27〜28 年度に、前調査の「経時率長期連続照射の遺伝子発現への影響及びその性差について概括的な解析を行った。

的解剖実験」で得られた低線量率放射線照射マウス肝臓サンプルを用いて、定量 PCR 法による個別の遺2. 方法伝子の発現解析を行った。平成 29 年度からは、本調

2.1 マウス照射と臓器試料の採取

査の照射実験で得たマウス肝臓サンプルを用い、マ

6 週齢の Specific pathogen free（SPF）B6C3F1 マウ

イクロアレイ法による詳細な網羅的遺伝子発現解析

ス雌雄各 64 匹（日本クレア）を、8 匹ずつ雌雄各 8を行っている。昨年度は、集積線量を同じにした低組の実験群に分け、2 週間の検疫の後、SPF 環境下線量率照射群（20 mGy/日×100 日、集積線量 2,000で飼育した。LD100、LD200、LD300、LD400 群にmGy）及び中線量率照射群（400 mGy/日×5 日、集積は、8 週齢からそれぞれ 100、200、300、400 日間線量 2,000 mGy）の比較を行い、線量率による遺伝137Cs-γ 線連続照射（線量率 20 mGy/日）を行った。

子発現の違いを明らかにした。今年度は、低線量率これらの照射群に対応する同日齢の対照群（C100、照射各群（雌雄、20 mGy/日×100、200、300 もしくC200、C300、C400 群）を、非照射環境下で飼育しは 400 日、集積線量 2,000、4,000、6,000 もしくはた。全てのマウスは、解剖日の前日から 22 時間絶食

8,000 mGy）のサンプルがそろったことから、低線量させ、照射終了後速やかに解剖して肝臓サンプルを得た。

群での発現変動の有意性が高かった遺伝子群上位

2.2 マイクロアレイ解析

10 個について、LD100、LD200、LD300、LD400 群

採 取 し た マ ウ ス 肝 臓 （ 〜 5 mm3 ） へ 500μl のでの発現変動の有意性を示した。メス LD300 群に加ISOGEN 液（ニッポンジーン）を加えてホモジナイ

え LD200 群でも、コレステロール生合成関連遺伝子ズした後、-20 度で凍結保存した。保存試料から群や脂質代謝関連遺伝子群の有意な変動が検出されRNeasy（キアゲン）を用いて mRNA を抽出、精製た。Fig. 2 は、コレステロール生合成酵素の遺伝子 3した。得られた RNA 試料の精製度、収量は 2100

種（Cyp51、Sqle、Fdps）について個別の変動を表しBioanalyzer（アジレント）および Nanodrop 分光光度たものである。これらの酵素遺伝子については、メ計（サーモフィッシャー）で測定した。遺伝子発現

スの非照射群では加齢に伴う発現上昇がみられたが、マイクロアレイ解析は、アジレントの 1 色法プロト照射群（LD200、LD300）では非照射群に比べて有コルに従って行った。mRNA 試料 400 ng を、Low意に発現上昇していた。これらの加齢や照射によるInput Quick-Amp Labeling Kit（アジレント）を用い遺伝子発現変動は、オスでは認められなかった。一Cyanine-3 蛍光標識した。標識された cDNA 試料を、方、酵素ではなく脂質代謝制御因子の遺伝子（Srebf1、8×60K フ ォ ー マ ッ ト の マ ウ ス カ タ ロ グ ア レ イPparg）の発現量を個別に検討したところ、メスでは（SurePrintG3 Mouse GE マイクロアレイ G4852B、加齢に伴う発現上昇がみられ、また LD200 以降の照アジレント）にハイブリダイズした。蛍光シグナル

射群で非照射群に比べて有意に発現上昇していた。の検出には、DNA マイクロアレイスキャナー（アジオスにおいても、これら制御因子の遺伝子の場合、レント）を用い、取り込んだ画像データの数値化に酵素の遺伝子の場合とは異なり、加齢や照射によるは、数値化ソフトウェア FeatureExtraction（アジレン発現上昇が認められた。上記のメス照射群におけるト）を用いた。数値化された遺伝子発現データの解

コレステロール生合成関連遺伝子群や脂質代謝関連析
（発現量に基づく遺伝子情報の抽出や統計解析等）

遺伝子群の発現変動は、これまで環境研で行われたには、統計解析ソフトウェア GeneSpringGX（アジレ調査（寿命試験、経時的剖検実験、低線量放射線生ント）及びパスウェイ解析ソフトウェア Ingenuity®

体防御機能影響実験調査、低線量率放射線に対するPathway Analysis（IPA、キアゲン）を用いた。

生理応答影響実験調査）で明確になった照射メスマ
ウスにおける肥満と関連していると考えられる。

3. 成果の概要

オスマウスのパスウェイ解析の結果、コレステロ

3.1 低線量率放射線照射マウス肝臓で発現変化するール生合成関連遺伝子群の変化が一部認められるも遺伝子の解析のの、メスほど顕著ではなかった。一方、DNA 複製・

B6C3F1 マウスの雌雄各 8 つの実験群（C100〜400

修復関連の遺伝子群の有意な発現変動が認められた。

群、LD100〜400 群）各 8 匹の肝臓サンプルから得DNA 複製・修復に関与する主要なタンパク質の遺伝られた mRNA を用いた遺伝子発現マイクロアレイ

子のいくつか（Mcm4、Rpa1、Lig4、Chaf1a、Gtf2h5）解析により、各群の遺伝子発現プロファイルを得た。

は、オス LD300 群で有意に上昇していたが、他の群非照射群に比べて有意（p<0.05、fold change>=1.5）

では変動は顕著ではなかった。また、遺伝子発現のに発現変化していた遺伝子を抽出した。抽出された変動が認められた二つの DNA 修復経路（ミスマッ遺伝子について、IPA によるパスウェイ解析（遺伝チ修復、Mismatch Repair 及びヌクレオチド除去修復、子を機能および活性化経路ごとにグループ化して発NER）は、放射線の生物作用を考える上で最も重要現変動を解析）を行った。各照射群で有意な変動をとされる DNA 損傷（二本鎖切断）を修復するため示した遺伝子群のうち上位に来るものがどのようなの経路ではないことから、これらの意義についてはものであるかを検討したが、特にメス LD300 群の解さらに検討する必要があると考えられる。

析で顕著な結果が得られた。Fig. 1 には、メス LD300

上記の雌雄の LD300 群での発現変動の有意性の高さによって検出されてきた遺伝子群の多くは、今後、これまでに検出された経時的変動や性差のよ

LD400 群では有意性を示さなくなっており（Fig. 1）、り詳細な解析を行うとともに、これらの変動のうち総線量（照射期間）が増加するとともにより影響がでどれが低線量率放射線の影響として本質的なもの顕著になって行くものではないことが示唆される。

であるかを検討していく必要があると考えられる。

Fig. 1

Alterations in gene expression in low dose-rate-irradiated female mice. Ten most significantly alteredcanonical pathways in the liver from female mice irradiated for 300 days were identified by the gene
ontology algorithm of Ingenuity Pathway Analysis. Columns represent groups with different irradiation
periods. The y-axis represents the negative log of the p-value from Fisher's exact test. The dashed line
indicates a p value of 0.05 as a threshold of significance. The pathways related to lipid metabolism aremarked by red boxes.

Fig. 2

Box-and-whisker plots of the expression of the genes encoding cholesterol biosynthesis enzymes. The y-axis
indicates normalized gene expression signals processed by GeneSpring. Tiny red lines in graph areas
indicate outliers.