関東森林研究論 文69-1(2018)

ヒノキ葉条からの多芽体・植物体再分化とサワラ葉条からの多芽体誘導
Multiple buds formation and plant regeneration from leaflets of Chamaecyparis obtusa and Multiple
buds formation from leaflets of Chamaecyparis pisifera
細井佳久＊1・丸山 E.毅＊1
Yoshihisa HOSOI＊1, Tsuyoshi E. MARUYAMA＊1＊１ 森林総合研究所*1 Forestry and Forest Products research Institute, Tsukuba, Ibaraki 305-8687
要旨：ヒノキ，サワラについてはスギやマツ同様，種子胚から誘導した培養細胞を増殖させ，不定胚を形成させることで植物体再生が可能となってきている。しかし，種子胚ごとや親木により可否が大きく左右されるのが現状である。また，再生個体は，種子由来であるため，遺伝的に親木とは異なる。今回は，ヒノキ，サワラについて硝酸アンモニウムを 1/2 濃度に下げた MS，LP，DCR の３種の基本培地にオーキシンとして 2,4-D 0.6μM，サイトカイニンとして BAP を 6μM 添加した寒天培地を用いて葉条切片からの多芽体の誘導効率を調べた。その結果，個体による多芽体の形成効率に差が見られた。次に，2,4-D 0.6μM，BAP を 6μM 添加し，硝酸アンモニウムを 1/2 濃度に下げた MS 寒天培地で 10 年間継代培養により維持しているヒノキ多芽体について，植物体再生の条件を調べた。まず，多芽体を，無機塩濃度を 1/2 濃度に下げ，ショ糖を１%添加した MS 寒天培地で３ヵ月間培養し，シュートを伸長させた。次に 1.5cm 程度のシュートを切り出し，シュート伸長用培地にオーキシンとして３μM IBA を添加した発根用寒天培地に移植すると植物体を得ることができた。
キーワード：ヒノキ，サワラ，多芽体，組織培養，不定胚
Abstract: Plant regeneration about Hinoki and Sawara cypress has been enabled by tissue culture trough somatic embryogenesis
using immature or mature zygotic embryos as well as Japanese red cedar and pines. However, the ability of regeneration greatly
depends on every seed and tree. In addition, it is different from the parent tree hereditarily because the reproduction individual is ofseed origin. We checked the formation efficiency of the multiple buds from leaf tips cultured on the agar nutrient medium which
including 0.6μM of 2,4-D and 6μM of BAP about Hinoki and Sawara cypress. Three media, namely, MS which reduced ammonium
nitrate to 1/2 concentration, LP and DCR employed for multiple buds formation. As a result, a difference was observed in theformation efficiency of the buds by the individual. Then, Culture condition of plant regeneration was checked using multiple budsof Hinoki cypress maintained by subculture on the MS medium which reduced ammonium nitrate to 1/2 concentration supplemented
with 0.6μM of 2,4-D and 6μM of BAP for ten years. Shoot elongation was observed on MS medium reduced inorganic salt to 1/2
concentration which added 1% of sucrose after three months of culture. Elongated shoots were cut to approximately 1.5cm long andtransplanted on a shoot elongation medium added 3μM of IBA for rooting. After rooting from the shoot tips, regenerated plants wereacclimatized.
Key-word: Chamaecyparis obtusa Sieb. & Zucc., Chamaecyparis pisifera (Sieb. & Zucc.) Endl., Multiple buds, Tissue culture,
Somatic emryo
いていくつかの樹種で再生系の開発研究を行っている(3，Ⅰ はじめに組織培養による針葉樹の植物体再生系の開発手段とし5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15)。この場合，ては，種子胚を培養することにより得られた細胞を利用

増殖細胞の質にもよるが，培養条件により 90mm シャーして不定胚を形成させ，その不定胚を発芽させることでレあたり均質な不定胚が 1,000 から 2,000 個程度得られ植物体を形成させる方法が一般的である。我々も国産針ることもあり，不定胚利用による植物体再生手法は，優葉樹では，スギをはじめヒノキやマツ，トウヒなどにつれた大量増殖方法であるといえる。しかし，種子胚を利－7 －(受理日 2018 年 2 月 5 日)

用するため，遺伝子組成は種子ごとに異なり，もちろんげた MS 固形培地を用いた。培養は，90mm プラスチッ

親木そのもののクローンを増殖させることはできない。

クシャーレを用い，25℃，16 時間 3,000lx 蛍光灯照明下

さらに，種子ごと，親木ごとに不定胚形成能力を持つ増で行った。

殖細胞(不定胚形成細胞)を誘導できる効率が異なる。ま

４．シュートの発根と植物体培養 多芽体から得られた

た，細胞の持つ不定胚形成能力は，数ヶ月から数年の後シュートについて，約 1.5cm の長さで切り出して培養しに低下するか消失してしまう場合がほとんどである。さた。培地には 1％ショ糖，0.7%寒天を添加し，無機塩濃らに，成熟した種子胚からは不定胚形成細胞を誘導する

度を 1/2 に下げた MS 固形培地を用い，発根用に IBA をことが困難な場合が多く，ある一定時期の未熟な種子を3μM 添加した。培養は，90mm プラスチックシャーレ採取して材料とすることが多い。そのため，貯蔵種子をを用い，25℃，16 時間 3,000lx 蛍光灯照明下で行った。

利用することが難しく，毎年のように未熟種子を採取し，発根が見られたシュートについては，100ml 広口培養フ増殖細胞の誘導を行う必要がある。スギやマツなどではラスコに移して培養した。
培養には，発根用培地から IBA種子や実生以外の組織・器官から培養により植物体の大を除いた培地を用いた。

量増殖を行うことは非常に困難であるが，ヒノキでは葉条切片の培養により，多芽の形成が可能であることを以Ⅲ 結果と考察

前報告した(4)。今回は，ヒノキに加え，サワラについて１．実験材料の殺菌 それぞれの葉条切片についての殺多芽体の形成条件について比較した。また，約 10 年間菌効果を表－１に示した。個体ごとにかなりのバラツキ継代培養により維持しているヒノキの多芽体について，が見られたが，ヒノキの C 個体においてコンタミネーシ植物体再生条件を調べた。

ョン率が 10%と低く，最も殺菌効率が高かった。今回試した次亜塩素酸ナトリウムの濃度を上げたり，処理時間Ⅱ 方法を延ばしたりすると，葉条が褐変し，枯死する場合が増

１．多芽体誘導用葉条切片の調整と殺菌 茨城県つくば加した。この場合，次亜塩素酸ナトリウムに対する耐性

市の森林総合研究所構内に植栽されている樹高約 11m，はヒノキ，サワラで大きな差はなかった。

胸高直径約 30cm のヒノキ成木５個体と，樹高約 13ｍ，２．多芽体の形成効率 コンタミネーション率を比較し

胸高直径約 30cm のサワラ成木５個体について，葉条をた個体のうち，ヒノキの A， C，D 個体とサワラの c，約 2cm に切り出して培養材料とした。採取は 6 月上旬

d 個体について形成効率を比較した(表－２)。多芽は，置に行った。殺菌は，まず 100%エタノールで１分間浸漬

床した葉条切片の先端部や鱗片葉の一部が肥大し，芽をして表面のワックスを取り除いた後，3％次亜塩素酸ナ形成しながら分裂増殖し，4 ヶ月程度で形成された。そトリウムで 40 分間，ビーカー内で撹拌殺菌した。そのれぞれ４個以上の多芽を形成した場合に多芽体として計後，滅菌水で 30 分間撹拌洗浄した後，固形培地に置床数した。培地別に効率を比較すると，ヒノキの A 個体にした。

ついて DCR 培地で培養した場合に形成効率が 87%とな２．多芽体誘導に使用した培地と培養方法 培養には基り，最高値を示した。しかし，C 個体をはじめ，培地に本培地として，硝酸アンモニウム濃度を 1/2 に下げたよる違いがはっきりしない場合も多かった。今回，多芽MS(16)と，LP(2)，DCR(1)の 3 種類の培地を用いた。の形成数についての比較は行わなかったが，ヒノキに比0.7%寒天を加え，ショ糖は２％とし，植物生長調節物質べ，サワラでは明確な芽の形成が見られない場合があっとして 2,4-D を 0.6μM，BAP を６μM 添加した。培養た。(図－１)。今回は，筆者らが以前から広葉樹や針葉樹

は，90mm プラスチックシャーレを用い，25℃，16 時間の多芽の形成に利用している 2,4-D と BAP の組み合わ

3,000lx 蛍光灯照明下で行った。

せと濃度で培養したが，濃度の組合せを変化させたり，３．10 年間継代培養したヒノキ多芽体からのシュート伸異なるオーキシン、サイトカイニンを使用することで，長培養 材料には，10 年間，25℃，16 時間 3,000lx 蛍

さらに分化効率を上げることが可能かもしれない。

光灯照明下，90mm プラスチックシャーレ内で，2,4-D３．10 年間継代培養後のヒノキ多芽体からのシュート伸を 0.6μM，BAP を６μM 添加し，硝酸アンモニウム濃長 シュート伸長用培地に置床すると，多芽は伸長し始度を 1/2 に下げた MS 寒天培地で，2 ヵ月から 3 ヵ月ごめ，約 3 ヶ月後には 2cm 程度に伸長した(図－２)。材料とに継代培養した精英樹由来の多芽体を用いた。多芽体として精英樹 5 個体の多芽体を培養したが，すべての多を約 5mm 角に切り出して培地に置床した。培地には芽体で伸長した。

１％ショ糖，0.7%寒天を添加し，無機塩濃度を 1/2 に下４．シュートの発根と植物体の再生・順化 得られたシ－

8 －関東森林研究69-1(2018)

ュートは，約 1.5cm の長さで切り出し，発根用培地に移植した。培地へ移植後，2 ヵ月程度で発根が観察された。
精英樹ごとのシュート発根効率について表－３に示した。
野尻７号で 74%が発根し，最高効率を示した。発根がみられたシュートは，100ml 培養広口フラスコに移植し，2cm培養した(図－３)。培養 5 ヵ月後にフラスコから出し，鹿沼土の入ったビニールポットで栽培した。はじめの 10

図－３．切り出したシュートからの発根(野尻７号)

日間はラップをかけて栽培し，その後はラップをはずしFig.3 Rooting from the shoot tipsて栽培することで順化した(図－４)。
一般に不定胚を利用した培養では，誘導した不定胚形成細胞の分化能力の低下が大きな問題となっており，能力を保持した細胞の長期培養法や凍結保存技術の開発が行われている(17,18)。しかし，研究は途上であり，ヒノキやサワラでの研究報告はない。不定胚形成細胞の継代培養の間隔も 2 週間程度と短く，複数の系統を維持する場

2cm

合，培地作成や継代作業にかなりの労力を必要とする。
これに対し，多芽体の場合，継代培養間隔は 2 ヵ月程度

図－４．順化中の植物体(久慈７号)で十分であり，10 年以上の植物体分化能力の維持が可能

Fig.4 Plants in acclimatizationであることがわかった。
Ⅳ

最後に今回行わなかったサワラ多芽体の植物体分化実験について，ヒノキの培養条件を比較参考として，表－１．個体によるコンタミネーション率の違い
Table 1 Difference of the contamination rate due tothe individual

いずれ行いたい。また，ヒノキ属だけでなく，他のヒノ

ヒノキ

キ科の樹種にも林業上重要な種が多い。これら他の樹種についても機会があれば多芽体誘導の可否を調べたい。

1cm1cmヒノキ (C)

コンタミネーション率[%]

サワラ

コンタミネーション率[%]

A50a78

B67b95

C10c62D85d43E68e68＊各 60 葉条切片あたりの数値

サワラ (d)

図－１．ヒノキとサワラの多芽の形態の違い
Fig.1 Difference of the multiple buds in the form ofHinoki and Sawara cypress1cm
図－２．多芽体から伸長したシュート(野尻 7 号)
Fig.2 Shoots extending from the multiple buds

表－２．個体による多芽体形成率の違い
Table 2 Difference of the multiple bud formation rate
due to the individual
個体改変 MSLP

DCR

A

44/55(80)27/43(63)68/78(87)C

31/40(78)30/38(79)

33/42(79)D

3/37(8)10/40(25)

6/29(21)c

8/16(50)

29/48(60)30/52(58)

d1/15(7)18/32(56)37/59(63)＊数値は(多芽体形成切片 / 置床全切片)，括弧内は形成効率[%]－9 －(7) MARUYAMA, E., ISHII, K., HOSOI, Y. (2005)

表－３．個体別発根効率
Table 3 Individual rooting efficiency

Efficient plant regenerationofHinokicypress(Chamaecyparis obtusa) via somatic embryogenesis.

用いた個体

発根効率

久慈７号

18/27(67)宇治１号

11/27(41)大田原２号

13/26(50)鬼泪７号

10/27(37)

野尻７号

20/27(74)Journal of Forest Research 10：73-77(8) MARUYAMA, E., HOSOI, Y., ISHII, K. (2005)
Somatic embryogenesis and plant regeneration ofJapanese Black pine.

Journal of Forest Research

10(5) : 403-407＊数値は(発根したシュート / 置床全シュート)，括弧内は発根効率[%](9) MARUYAMA, E., HOSOI, Y., ISHII, K. (2005)
Propagation of Japanese red pine (Pinus densiflora
Sieb. et Zucc.) via somatic embryogenesis. Propagation

謝辞：本研究は JSPS 科研費 JP17K07867 の助成を受

of Ornamental Plants 5(4)：199-204

けて行った。

(10) MARUYAMA, E., HOSOI, Y., ISHII, K. (2007)
Somatic embryogenesis and plant regeneration inPinusarmandii

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