関東森林研究論 文70-1(2019)

ヒノキ亜科３種の葉条切片からの形態形成とサワラ単一細胞の誘導と培養の試み
細井佳久 1 ・丸山 E. 毅１
１ 森林総合研究所
要旨：ヒノキ，サワラ，ヒノキアスナロについて，葉条切片から多芽体を誘導した。誘導には，オーキシンとして2,4-D，サイトカイニンとして BAP または Zeatin を添加した LP，DCR，改変 MS 培地を用いた。得られた多芽体を，植物生長調節物質無添加の改変 MS 培地に移植し，シュート伸長させた。シュート切片を IBA や NAA 添加の改変 MS 培地で培養し発根させた。7 月上旬に採取したサワラの球果から未熟種子を取り出し，2,4-D と BAP を添加した EM 固形培地で培養した。その結果，約２ヵ月後に不定胚形成能力を持つ細胞を誘導することができた。誘導した細胞は，同一組成の EM 液体培地で２週間ごとに継代培養し，増殖させた。増殖中に遊離する単一細胞について，マイクロマニピュレーターで 96 ウェル培養プレートに移し培養すると，約２週間後に不定胚形成細胞が再分化した。
キーワード：ヒノキ，サワラ，ヒノキアスナロ，単一細胞，マイクロマニピュレーター

Organogenesis from leaflets of Chamaecyparis obtusa , Chamaecyparis pisifera and Thujopsis dolabratavar. Hondae and attempts at single cell culture derived from embryogenic cells of Chamaecyparis pisifera
Yoshihisa HOSOI1 , Tsuyoshi MARUYAMA1
Forestry and Forest Products Research Institute
Abstract: Multiple bud formation has been achieved from Hinoki, Sawara and Hinokiasunaro cypress planted at the Forestry andForest Products Research Institute (FFPRI) . For induction of multiple buds, LP, DCR and modified MS solid media containing 2,4D as auxin and BAP or Zeatin as cytokinin were employed. Proliferated buds were elongated on plant growth regulator free-MSmedium. Elongated shoots were transferred to modified MS solid medium supplemented with IBA alone or in combination withNAA for rooting. Immature seeds were collected from Sawara cones in early July. The seeds were cultured on EM solid medium
supplemented with 2,4-D and BAP. Embryogenic cell induction was observed after about 2 months of culture. For proliferation, thecells were subcultured in EM liquid medium every 2 weeks. The single cells released during subcultures were transferred to 96-wellculture plates using a micromanipulator and cultured in EM liquid medium. After about two weeks of culture, embryogenic cells
were formed.
Key-word: Chamaecyparis obtusa Sieb. & Zucc., Chamaecyparis pisifera (Sieb. & Zucc.) Endl., Thujopsis dolabrata (L.f.) Sieb.
et Zucc. var. hondae Makino, Single cell, Micromanipulator

Ⅰ はじめに植物体再生時にキメラ個体を形成してしまうことが予想

ヒノキ属のヒノキやサワラについて，選抜個体のクロされる。ところで，不定胚形成細胞の培養では，増殖中ーン増殖を目的とした実験を行い，ヒノキでは葉条切片に単一細胞が遊離することが顕微鏡下で確認できている。

から植物体を再生させることに成功している（３）。今回

そこで，マイクロマニピュレーターを用いて不定胚形成

は，新たな樹種としてヒノキアスナロを加え，ヒノキ，細胞由来の単一細胞を顕微鏡下で選別・培養し，キメラサワラについても再度別個体から多芽体を誘導し，植物化を回避した植物体再生系確立が可能であるかを検証し体再生の可否や効率について比較した。また，ゲノム編

た。

集などによる遺伝子改変を行う場合，増殖細胞やカルス，組織・器官などの多細胞集団を対象に遺伝子導入処理を行うと，処理後には様々な細胞が混在することになり，－Ⅱ 方法
１．多芽体誘導用葉条切片の調整と殺菌 茨城県つく57 －（受理日 2019 年 4 月 4 日）

ば市の森林総合研究所構内に植栽されているヒノキ成木あたり１細胞ずつ移して培養した。培養は 25℃，暗黒下３個体と，サワラ成木３個体，ヒノキアスナロ成木１個で行った。

体について，2016 年５月に採取した葉条を約３cm に切７．再分化不定胚形成細胞の成熟化・不定胚の発芽り出して培養材料とした。殺菌は，３％次亜塩素酸ナト

単一細胞から分化した不定胚形成細胞を EM 固形培地にリウムで 30 分間ビーカー内で撹拌殺菌した後，滅菌水移植し，増殖させたのち，不定胚成熟用培地（４）へ移で 30 分間撹拌洗浄した。

植した。培養は 25℃，暗黒下，90mm プラスチックシャー２．多芽体誘導に使用した培地と培養方法 培養にはレで行った。得られた不定胚は，100ml 広口培養フラス

基本培地として，ヒノキとサワラについては，硝酸アンコに移し，無機塩濃度を 1/2 に下げた MS 固形培地で培モニウム濃度を 1/2 に下げた MS（６）の１種類，ヒノキ養した。培養は，25℃，16 時間 3,000lx 蛍光灯照明下でアスナロについては，それに加え，LP（２），DCR（１）行った。の３種類の培地を用いた。
0.7%寒天を加え，ショ糖は２％とし，植物生長調節物質として 2,4-D を 0.6µM，BAP を６Ⅲ 結果と考察µM 添加した。ヒノキアスナロでは，DCR 培地について，１．実験材料の殺菌と多芽体の形成効率 それぞれのさらに 2,4-D を 0.6µM と Zeatin を６µM 添加した培地も葉条切片について，置床 40 日後の殺菌効果を表-１に示用意した。培養は，90mm プラスチックシャーレを用い，した。個体ごとのバラツキは見られたが，ヒノキの場合25℃，16 時間 3,000lx 蛍光灯照明下で行った。に生存率が高く，最高で 82%であり，ヒノキアスナロ個３．多芽体からのシュート伸長培養 材料には，硝酸体の生存率が 35%と低かった。葉条の形態上の違いが影アンモニウム濃度を 1/2 に下げた MS に，2,4-D を 0.6µM，響しているのかもしれない。次に置床３ヵ月後の多芽体

BAP を６µM 添加した寒天培地で誘導した多芽体を用いた。

形成率を表-２に示した。ヒノキの場合に形成率が高く，多芽体を約 5mm 角に切り出してシュート伸長用培地に置

サワラの場合，10%台と最も低かった。ヒノキアスナロの床した。培地には１％ショ糖，0.7%寒天を添加し，無機場合，DCR 培地にサイトカイニンとして Zeatin を添加し塩濃度を 1/2 に下げた MS 固形培地を用いた。培養は，た場合に 61%と高い形成率であった。他の樹種や，他の90mm プラスチックシャーレを用い，25℃，16 時間 3,000lx

培地についても BAP に代えて Zeatin を用いた方が形成蛍光灯照明下で行った。

率が高くなる可能性がある。また，実際に得られた多芽４．シュートの発根と植物体培養 多芽体から得られたシュートについて，約 1.5cm に切り出して培養した。

体の形状については，サワラについては多芽の形成が不完全で不明瞭な場合も多く見られた（図-１）。

培地には１％ショ糖，0.7%寒天を添加し，無機塩濃度を２．多芽体からのシュート伸長と発根 シュート伸長1/2 に下げた MS 固形培地を用い，発根用には IBA 単独で用培地に移植すると，３樹種とも４ヵ月後には１～２cm３µM（A 培地)，12µM（B 培地），また，IBA 12µM と NAA程度のシュートを形成した（図-２）。発根培地へ移植３1µM（C 培地）の２種のオーキシンを添加した３つの培地

ヵ月後の各樹種の発根効率を表-３に示した。
発根効率は，を用意した。培養は，90mm プラスチックシャーレを用い，ヒノキアスナロの場合に３µM IBA を添加した培地で培

25℃，16 時間 3,000lx 蛍光灯照明下で行った。

養すると 56%となり最高値を示した。ヒノキ，ヒノキア

５．不定胚形成細胞の誘導と増殖 ７月初旬に採取しスナロとも IBA 濃度を上げたり，１µM NAA を加えたりしたサワラの球果から未熟種子を取り出し，培養材料とした場合には効率が下がった。サワラについてはどの条件た。殺菌はビーカー内で１％アンチホルミン 20 分撹拌

でも発根は見られず，全ての条件でカルス化した（図-３）。

して行った。滅菌水で洗浄後，３µM 2,4-D，１µM BAP 添

サワラの場合，添加するオーキシンの種類を変更した方加した EM 固形培地（５）で培養した。得られた不定胚形がよいかもしれない。また，今回，１％ショ糖を添加し成細胞は，誘導時と同一組成の液体培地で継代培養し，たが，カルス化を防ぐためにはさらに低濃度か，無添加増殖させた。培養は 25℃，暗黒下，90mm プラスチックシにした方がよいと思われる。得られたヒノキ，ヒノキア

ャーレで行った。

スナロの発根個体の一部については，人工気象機内で順６．マニピュレーターによる単一細胞の選別・培養化・育成中である。

不定胚形成細胞から遊離した細胞のうち，健全な単一細３．不定胚形成細胞の誘導と増殖 培養 50 日後，培地胞のみを倒立顕微鏡下，マイクロマニピュレーターを用に置床した種子の幼根部付近の細胞が分裂し，不定胚形いてピックアップし，ゲルライト無添加の EM 液体培地成細胞が生じた。不定胚形成細胞は，胚形成能力を持つ(100µl)を分注した 96 ウェル培養プレートに，１ウェル分裂活性の高い細胞塊と，サスペンサー細胞で構成され－58 －70-1(2019)

関東森林研究ていた（図-４）。構造としては他の針葉樹と同様であっ

表-2. 各樹種の多芽体形成率たが，サスペンサー細胞はスギやヒノキと比べ短い傾向

Table 2にあった。液体培地に移植して継代培養し，増殖させる

species

The rate of multiple bud formation in each treeと不定胚形成細胞から遊離する単一細胞が観察された

培地

（図-５）
。

改変 MS(+BAP)

４．マイクロマニピュレーターによる単一細胞の選別

個体と個別培養 遊離した単一細胞の選別・移動は，倒立顕H-130/44 (68)

微鏡に取り付けたマイクロマニピュレーターを介して行

H-219/41 (46)った。先端径を 150µm 程度に加工したガラスキャピラリ

H-324/35 (69)S-1

6/33 (18)S-2

4/29 (14)S-3

3/27 (11)HA-1

17/38 (45)ーを使用し，96 ウェル培養プレートに１ウェルに１細胞ずつ移植した（図-６）。その結果，置床した 192 細胞のうち，46 細胞が不定胚形成細胞に再分化した（図-７）。

LP(+BAP)DCR(+BAP)DCR(+Zeatin)

8/27 (30)

12/39 (31)17/28 (61)

再分化した不定胚形成細胞について，１ウェルから増殖させた不定胚形成細胞を，不定胚成熟用培地に移植した。

＊数値は（多芽体形成切片数／全置床切片数）括弧内は形成率[%]

その結果，不定胚が形成され，一部を発芽用培地に移植表-3. 各樹種の発根効率すると植物体を形成した（図-８）。

Table 3 Rooting efficiency in each tree species
Ⅳ

最後に培地

ヒノキ属以外のヒノキアスナロについても葉条切片から植物体再生が可能であることがわかった。
この培養技術は，種子胚由来の不定胚形成細胞からの植物体再生系とは違い，選抜木そのものの遺伝子改変や遺伝資源保存に有効である。また，単一細胞からの安定し個体
H-1

5/18 (28)

3/18 (17)0/18 (0)H-2

2/18 (11)

2/18 (11)0/18 (0)H-3

3/18 (17)0/18 (0)0/18 (0)S-1

0/18 (0)0/18 (0)0/18 (0)S-2

0/18 (0)0/18 (0)0/18 (0)S-3

0/18 (0)0/18 (0)0/18 (0)HA-110/18(56)6/18 (33)

4/18 (22)サワラ

表-1. 葉条切片の殺菌後の生存率
The survival rate after sterilization of each leaf

C

樹種

ゲノム編集などによる遺伝子改変の際にも，キメラの形

Table 1B

ヒノキ

た植物体再生系が確立できれば，従来の遺伝子組換えや，成を回避できる有効な培養方法と考えられる。

A

ヒノキアスナロ＊数値は（発根シュート数／置床全シュート数）、括弧内は発根率[%]

sections
樹種

個体

ヒノキ

H-144/50 (80)

H-241/50 (82)H-335/50 (70)S-1

33/50 (66)S-2

29/50 (58)S-327/50 (54)HA-1

138/400 (35)

5mm
サワラ

ヒノキアスナロ

ヒノキ

サワラ

ヒノキアスナロ

図-1. 誘導された多芽体（継代培養開始３ヵ月後）
Fig.1 Induced multiple buds (3 months of subculture)＊数値は（生存切片数／全置床切片数）括弧内は生存率[%]

10mm

ヒノキ

サワラ

ヒノキアスナロ

図-2. 多芽体からのシュート伸長
Fig.2 Shoot elongation from the multiple buds－59 －20mm

ヒノキ

サワラ

5mm

ヒノキアスナロ

10mm

図-3. 発根培地での各樹種の比較

図-8. 不定胚の形成、その発芽による植物体再生

Fig.3

Fig.8

Comparison of each tree species on the rooting

mediumSomatic embryogenesis, plant regeneration by

germination of a somatic embryo
謝辞：本研究の一部は、JSPS 科研費 JP17K07867「ヒノキ栄養組織由来シングルセルからの効率的なクローン増殖技術の開発」の助成を受けて行った。
200µm3mm

引用文献

図-4. 未熟種子から誘導したサワラ不定胚形成細胞(1) Gupta, P. K., Durzan, D. J. (1985) Shoot multiplication

Fig.4 Sawara embryogenic cells derived from immature seeds

from mature trees of Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii) and(After 50 days of culture)sugar pine (Pinus lambertiana). Plant Cell Reports 4：177-179(2) Horgan, K. (1987) Pinus radiata. In Tissue culture inforestry. Vol. 3. Edited by J.M. Bonga and D.J. Durzan.
Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, the Netherlands. pp.
128–145.
(3) 細井佳久・丸山 E. 毅 (2018)ヒノキ葉条からの多芽30µm体・植物体再分化とサワラ葉条からの多芽体誘導．関東

図-5. 不定胚形成細胞から遊離した単一細胞（矢印）

森林研究．69: 7-10

Fig.5 A single cell released from the embryogenic cells(4) 丸山 E. 毅・細井佳久・勝木俊雄 (2012) ヒメバラ
モミ未熟種子からの不定胚誘導．関東森林研究．63: 6771
(5) 丸山 E. 毅・細井佳久・二村典宏・斎藤真己 (2014)
無花粉スギ未熟種子からの不定胚形成細胞の誘導．関東50µm

森林研究．65: 107-110

図-6. マイクロマニピュレーターで単一細胞を選別後、(6) Murashige, T., Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid

96 ウェル培養プレートで培養

growth and bioassays with tobacco cultures. Physiologia

Fig.6 After sorting single cells with a micromanipulator, cultured inPlantarum 15:473-497.

96-well culture plates

100µm

図-7. 単一細胞から分化した不定胚形成細胞（培養開始２週間後）
Fig.7

Differentiated embryogenic cells from a single cell

(After 2 weeks of culture in 96-well culture plates)－60 －