Vol. 15, No. 9 (2015)

日本蛋白質科学会ニュースレター

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」
第 7～9 回原稿配信のお知らせ
平成 27 年 7 月 21 日
今回は、第 7 回から第 9 回の原稿を配信いたします。
今回配信原稿
第7回

八木達彦先生

第8回

崎山文夫先生

第9回

高橋健治先生

今後配信予定原稿
第 10 回

田隅三生先生

第 11 回

北川禎三先生

第 12 回

森川耿右先生

第 13 回

伊藤維昭先生

第 14 回

福山恵一先生

第 15 回

桑島邦博先生

配信済み原稿
第1回

石井信一先生

第2回

大村恒雄先生

第3回

福井俊郎先生

第4回

香川靖雄先生

第5回

岩永貞昭先生

第6回

高木俊夫先生日本蛋白質科学会 広報担当
内山

進

池口満徳
本文は PDF をご覧ください。

電子メール版ニュースレター発行〒562-8686 大阪府箕面市稲 4-1-2 千里インターナショナル内
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編集：内山 進（大阪大学大学院工学研究科）

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第7回

私の蛋白研究、ヒドロゲナーゼとその周辺
八 木 達 彦 （やぎ たつひこ）
蛋白質の重要性に初めて気づいたオランダの Johannes Mulder がギリシャ語の προτειος (第一級の重要性)から protein という言葉をつくったのは 1838 年、日本では宇田川榕庵が《舎密開宗》の出版を始めたころだ。
Mulder の研究に対する評価が高いとは思えないが、命名の先見性は称賛に値する。Emil Fischer が蛋白の化学構造としてペプチド説をとなえたのが 20 世紀初め、ジケトピペラジン説が葬られて蛋白化学が軌道に乗ってきたのは 1930 年代だろう。当時の日本では高峰讓吉博士のアドレナリン発見(1900)、鈴木梅太郎教授のオリザニン(ビタミン B1)発見(1910)など生命科学の研究で世界に燦たる成果も出始めてはいたが、蛋白化学はまだ未熟な段階だった。しかし地道な研究は始まっていたようで、大阪大学の赤堀四郎先生は太平洋戦争中に《アミノ酸及蛋白質、共立出版 1944》、戦後間もなく谷久也当時助教授との共著で小冊子《蛋白質、三共出版
1948》を上梓されている。Linus Pauling の α ヘリックスと Frederick Sanger のインスリン B 鎖アミノ酸配列決定はともに 1951 年、赤堀先生と水島三一郎先生の共同編集になる本格的な専門書《蛋白質化学、全 5 巻、共立出版》が刊行されたのは 1954 年から 1957 年にかけてである。

私が東大理学部化学科で授業を受けていた大学院で生化学を基礎から指導してくださった

1954-1955 年頃は蛋白化学をメインとする授業はのは石本眞助手(のち北大教授)、硫酸還元菌から新なかった。生化学を担当していらした左右田德郎

シトクロムを発見(1954)した直後である。彼は、非教授が定年退官されたあと後任の生化学専門の教

光合成嫌気細菌にはシトクロムが存在しないとい授は着任されず、赤堀先生が東大理学部化学科とう当時の定説を覆したと意気軒昂だったが、論文

応用微生物研究所(現分子細胞生物学研究所)の教授

発表がイギリスの John Postgate より少し遅れたこを併任する形で着任された。赤堀先生が蛋白化学とを悔しがっていた(このシトクロムは Postgate がに関して指示された方針は、当時のレベルを考慮

シトクロム c3 と命名)。当然、研究テーマはこの菌し『簡単な基質に働く酵素を選びなさい。または、の酸化還元代謝系におけるシトクロム c3 の役割で簡単な蛋白質を選びなさい』というものであった。

ある。硫酸還元菌は乳酸イオンを炭素源と電子供

先生は阪大での蛋白質研究所(発足時たんぱく質研究

与体、硫酸イオンを電子受容体として生育する嫌所)設置の準備が忙しく、4 年時の生物化学の授業

気細菌だが、水素による硫酸イオン、亜硫酸イオン、は先生が大阪から連れてこられた佐竹一夫助教授

チオ硫酸イオンなど硫黄オキソ酸イオンの還元も(のち東京都立大教授)が担当された。先生の著書《ク活発に行って硫化水素を発生する。菌体を破壊しロマトグラフ、共立出版 1952》を読んだ印象からて無細胞抽出液にすると、水素による硫酸イオン

楽しみにしていた授業は酵素と代謝がメインで、の還元活性は失われるが亜硫酸イオンとチオ硫酸

期待通り秩序だって分かりやすく興味深いものでイオンの還元活性は残るので、これからシトクロあった。私が生化学に引きずり込まれる主因の一ム c3 を除去し、精製シトクロム c3 を加えて亜硫酸

つは佐竹先生の授業だったが、蛋白化学に触れる

イオンとチオ硫酸イオンの水素による還元活性が機会は少なく、卒業研究で千谷晃一君(のち藤田保健復活するかどうかというのが最初の論文[1]だ。い

衛生大教授)が N 末端アミノ酸の決定法など実験し

ま読み返してみるとせっかく精製したシトクロムていたのを横目で見る程度だった。

c3 の分子量も、ヘム含量、鉄含量も測ってない。そ44

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第7回の頃はゲル濾過クロマトグラフィも SDS-PAGE もなてマスを使う研究を始めようとしていたときであくて、分子量測定には分析用超遠心機が必須、これる。マスといえば今では蛋白構造決定の重要手段

は港区の伝染病研究所(現東大医科学研究所)に行だが、当時のマスは小分子専用だから H2 とか CO2

かないと使えない、ということでパスしてしまっなどの同位体分析が主な用途だった。

た。その後、石本さんに反発するようになり、一人

アメリカ留学と帰国で新発見の酵素、一酸化炭素デヒドロゲナーゼの研究に専念したが、蛋白精製が苦手で、新酵素の KM

その頃急にアメリカ留学の話がもち上がったや最適 pH など通り一遍のデータはとったが[2]、(1960、写真 1)。Melvin Calvin 教授の光合成研究を

精製はあきらめていたようだ。DEAE セルロースを支 え た Andrew Benson 教 授 (Pennsylvania State

つくろうとしたことは覚えているが、これを使っUniversity、のち University of California, San Diego)のて酵素精製を試みたかどうかは記憶がない。嫌気研究室で、テーマは植物スルホリピドの研究であ条件で精製するなどの工夫も足りなかった。見るる。この糖脂質は彼が発見し PNAS に論文も発表に見かねた田宮信雄助教授は、東京医科歯科大学

していたが、推定構造に自信がなかったようで、構硬組織生理研究施設(現難治疾患研究所)に新設さ造をきっちりと確かめよ、というのがテーマ。慣れれる生化学講座に教授として迎えられるときに助ない有機合成で糖部分が PNAS に出ていた 6-スル

手として連れてってくださった(1958)。石本さん

ホフコースではないことと、リゾ型ではなく通常と隔離すれば少しはましな研究者になるだろう、のジアシルグリセロ構造であることを証明してしというありがたい思し召しだ。田宮先生はアメリまった。ここで Benson 先生が有機合成の名人とし

カ留学時代に David Rittenberg 教授の研究室でヒて連れてきた宮野真光さん(Dr Masateru Miyano)にドロゲナーゼをテーマに選ばれた。赤堀先生のいバトンタッチ、糖部分の構造は彼が合成した 6-ス

う《簡単な基質に働く酵素》だ。Stanley Miller とルホキノボースと一致した。そのあとはリコイルの共同研究の成果は Rittenberg 教授に高く評価さ

32P 原子の化学、
つまりリン酸に中性子をあてて 31Pれ、帰国土産に旧式の質量分析計(マス)を贈られを 32P に変換するとリン酸分子から 32P が飛び出した。これを医科歯科大の研究室に自力でセットして周囲の有機分子と反応、生じた有機ホスホン酸

写真 1. 当時は外国留学が珍しく、大勢で羽田まで見送りに来てくださった。左から大島泰郎君、小沢均助教授、田宮先生、高橋
健治君、筆者、妹道子、母薫、細田淳子さん(のち渡米して細胞分子生物学で成果)、石田美穗子さん(のち横浜でクリニックを開業)、
西村暹君(RNA の修飾塩基で有名)。1960 年 5 月羽田空港にて。

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シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第7回

研究の新技術をいろいろと教えてくださった。田宮先生の転出後に永井さんが後任教授に昇進、私は静岡大学に赴任して(1966)、初めて自分の研究室
をもった。

静岡大学で
研究テーマは硫酸還元菌 Desulfovibrio のヒドロ
ゲナーゼ、シトクロム c3、および関連蛋白に絞った。
シトクロム c3 は特に新しい方法を工夫、開発しな
くても陽イオン交換体で簡単に精製できた。この精製シトクロム c3 を使い、Postgate の報告にある分
写真 2. Benson 先生、1988 ころの来日時に妻宏子と用宗の子内ヘム 2 個を 4 個に、平均標準還元電位-205 mV

寿司国にご案内。時期は違うが 14C の生みの親 Martin Kamen

を-290 mV に大幅修正する結果を出した[4]。C 型シ

教授もここの寿司を喜んで下さった。

トクロムの標準還元電位としてマイナス側の新記やホスフィン酸の構造を決定してリコイル反応メ録である。そのころ東大物性研の井口洋夫先生(のちカニズムを探るという研究に熱中し、あっという分子科学研究所長)が有機半導体による H2 活性化

間に留学期間が終了、医科歯科大の田宮研に戻っとの関連でヒドロゲナーゼに大きな関心を示され、た(1962)。その後 Benson 先生は何度も来日された先生の逝去(2014)までの息の長い共同研究が始ま(写真 2)。

った。なおシトクロム c3 の 4 個のヘムの標準還元

田宮研では、藤本大三郎君(のち東京農工大教授)

電位は、だいぶのちになるが、フランス Université

がマスを駆使してコラーゲンのヒドロキシプロリ

de Provence の Gayda 教授グループとの共同研究でンの OH が O2 に由来するという論文を発表したと

電位差滴定と EPR を組合わせ -235, -323, -337, -357ころである。翻訳後修飾という言葉さえなかった

mV と測定された[5]。シトクロム c3 を電子受容体時代だから画期的な成果で、藤本君はその後コラとするヒドロゲナーゼの精製では阪大蛋白研の堀ーゲン研究のオーソリティになった。私は田宮先尾武一助教授(のち教授)に教えていただいた等電点

生のお勧めでヒドロゲナーゼの研究に切り替えた。

電気泳動や、蛋白溶液を透析しながら濃縮できる

先生はコラーゲンでの成功後もヒドロゲナーゼに

Diaflo cell が威力を発揮し、1976 年には当時の最高は愛着があったようだが、同僚の加納六郎教授に純度のヒドロゲナーゼ標品を得ることができた[6]。

誘われて海蛇毒素(のちエラブトキシンと命名されヒドロゲナーゼ研究の初期の総説[7]はヒドロゲナ

る 62 残基蛋白)の研究に転換された。赤堀先生のもーゼ研究の入門書として評判が良い。定年後に研う一つの助言《簡単な蛋白》に巡り合ったわけだ。

究を振り返った集大成も総説[8]としてまとめた。

田宮先生は赤堀先生の強い要請で東北大理学部に《ヒドロゲナーゼ》という本も書きたかったが、進転出後も蛇毒素を愛し続け、トキシコロジーのオ

歩が速すぎて手に負えなくなってしまった。

ーソリティになられたことは御承知の通り。後の静大教育学部化学教室では教授、助教授、助手、ことだが、北大の稲垣冬彦教授と組んでエラブト

みんな独立な研究者で全く別テーマで好きな研究

キシンの NMR 主要シグナルのアサインメントにをしている。研究の自由は満喫できるが、卒業研究成功し[3]、これはすごいことなんだぞ、と無邪気にの学生さん達に教えながら一人で行う研究はたか

興奮しておられたのを思い出す。医科歯科大ではが知れている。しかし幸運にも 1976 年に教養部にコラーゲンとコラゲナーゼの研究で成果を上げた

赴任してきた物理化学の尾形照彦助教授(のち教授)

永井裕助教授がゲル濾過、Disc 電気泳動など蛋白の奥様、真理さん(写真 3)が東京での研究職を辞して来静され、生化学の研究を続けたい、ということ

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シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第7回

則武助教授(のち姫路工大教授)、院生の樋口芳樹さん(現兵庫県立大教授)が中心になり 1981 年に成功した[12]。ヨーロッパグループが 1979 年に決定した
他の菌株のシトクロム c3 の構造[13]には 2 残基の見逃しがあり、NMR、EPR などを総合して出した
1974 年の構造モデル[14]には大きな間違いがあったから、正しい構造は私たちのが最初である。当時の NMR は今ほどの信頼性がなかったのだろうか？安岡-樋口グループはその後ヒドロゲナーゼのX 線構造も決定した[15]。ヒドロゲナーゼ立体構造
写真 3. 尾形真理さん。静大の八木研実験室で(1983)。

のカラー写真は、まず田宮先生にお贈りした。

で研究メンバーに加わってくださった。尾形さん

再び田宮先生とには非常勤講師として学生実験なども担当していある日、田宮先生から電話がかかり《非分散進ただき、研究、教育の面でどれだけ助けていただい化論》の共同提案者に誘われた。あとで知ったこと

たか計り知れない。おかげで硫酸還元菌のシトクだがお膝元の東北大では不評で、みんなに振られロム c3 以外の電子キャリア蛋白にも手を広げるこ

た後のお誘いだったようだ。進化の系統樹はオルとができ、この菌に存在することだけは分かって

トログ蛋白の配列比較でつくるから異なる蛋白かいたがヒドロゲナーゼとは反応しないフェレドキ

らつくる系統樹は同じになるはずなのに、そうとシンを始め、数々の電子キャリア蛋白を単離精製は限らない。硫酸還元菌でいえば日本の宮崎株とし、物性や機能解析を行うことができた[9]。しかしイギリスの Hildenborough 株のシトクロム c3 とシト

アミノ酸配列はできなかったので、卒論の学生さ

クロム c-553 は高い相同性を示すのにヒドロゲナ

んを阪大の松原央教授の研究室に派遣して配列決ーゼは全く違うという矛盾を抱えていたので、す定した[10]。配列決定でのトピック一つ： 理学部かぐ飛び乗ることにした。仙台でのタンパク質構造ら当研究室に来て卒論を書き、阪大福井俊郎教授

討論会(1985)発表後の休憩時間では『あの考えにはのところに進学し、ポテトホスホリラーゼ(916 残

無理がある』という会話を耳にしたが、自然界での基)の配列決定に奮闘中の中野憲一君がシトクロム

遺伝子の種を超えた伝播が原核生物だけでなく真c-553 の配列を決めたときのことだ。硫酸還元菌

核生物間でも広がりを見せ、horizontal transfer of

Hildenborough 株のシトクロム c-553 の既発表配列

genes も当たり前になってきた。突然変異に起因すとは N 端と C 端付近以外が全く似ていない。しかしトリプシンペプチドどうしはよく似ていたので、Hildenborough 株の論文にはトリプシンペプチドのる進化と並んで、複数祖先から発生した生物間の遺伝子交流で新たな情報をもつ生物へと進化する可能性を考えるべきではないか？言語や文化も祖

つなぎ間違えの可能性があり、配列再検討の必要

先からの縦の流れだけでなく、交易、観光、布教、性を指摘した[11]。DNA 配列からアミノ酸配列を侵略といった横との交流の影響が大きい。人類の決める現在の方法ではあり得ないできごとだ。

言語や文化が単一オリジンからの変異だけで今の井口先生との共同研究では、広い視野と人脈を形になったわけではあるまい。田宮説を補強する

もつ先生のおかげで、自力では解決できない問題

証拠集めもお手伝いし先生との共著論文[16]も発にも取組むことができた。ヒドロゲナーゼの電子表した。この論文では遺伝子の水平移動の重要性

キャリアであると同時に有機半導体としての性質を強調し、同時に生命が複数オリジンでもよいとももつシトクロム c3 の立体構造決定は、井口先生いう議論を展開するとともに、生命の起源に関すと親しい阪大蛋白研角戸正夫所長のご紹介で安岡る非標準的な説もいくつか紹介した。今では進化47

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第7回

文 献における遠縁種間の遺伝子の水平移動の役割は理解されてきたが、生命が複数オリジンから進化したとの主張は孤立無援だ。地球上に生命が誕生す
るような環境(地球表面の分子組成、温度、圧、電磁波など)が整えば、あちこちで生命が誕生し、遺伝子(といえるほど完成したものではないだろうが)、その他の成分を交換しながら進化してきたはずだ。地球の歴史のある時期にただ一度の《Themost improbable and the most significant event in thehistory of Universe; FG Hopkins, 1933》が起きたとい
えは奇跡と同じこと、科学的説明がない点で《神様がおつくりになった》というのと変わらない。ビッ
グバンは神の為せる御業だと説く宗教もあるようだが、それ以降のできごとはサイエンスだけで説明したい。

定年退官前後から今日まで定年直前だが、シトクロム、フェレドキシン、
ルブレドキシンなど多くの電子キャリア蛋白が共通な Cys-X-Y-Cys 配列をもちながら互いに S-S 間
距離の異なる補因子を結合し、チオレドキシンでは補因子なしでジスルフィド結合するほど S-S 間
距離が近い理由を説明するため、コンピュータ化
学の広田文彦教授に協力を求め、いろいろな CysX-Y-Cys テトラペプチドの安定コンホメーション
を半経験的分子軌道法により求めた。その結果、XY の組合せにより S-S 間距離が決定されて補因子
選択の決め手になること、これが蛋白フォールデ
ィングの核になりうるという議論を展開した[17]。
定年退官後は生化学研究を続ける実験室がないので、アメリカ留学時代の放射化学を活かし、静大の澤渡千枝助教授(現教授、副学長)と共同でポリエ
チレン、ポリエステル、ポリアミドなど合成ポリマのガンマ線照射による化学修飾で特定リガンドへの親和性や触媒活性、防炎性、染色性、濡れ性などの機能を付与する研究を行っている[18]。蛋白以
外にも面白いポリマはある。ヒドロゲナーゼ活性をもつ合成ポリマができれば嬉しいが、とりあえ
ずは日本蛋白質科学会で発表できるレベルの成果を目指している。

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1. Ishimoto M, Yagi T, Shiraki M (1957) J Biochem
44, 413-423, 707-714. (オリジナル論文)
2. Yagi T (1959) J Biochem 46, 949-955. (オリジナル論文)
3. Inagaki F, Tamiya N, Miyazawa T (1980) Eur J
Biochem 109, 129-138. (オリジナル論文)
4. Yagi T, Maruyama K (1971) Biochim Biophys Acta
243, 214-224. (オリジナル論文)
5. Benosman H, Asso M, Bertrand P, Yagi T, Gayda
JP (1989) Eur J Biochem 182, 51-55. (オリジナル
論文)
6. Yagi T, Kimura K, Daidoji H, Sakai F, Tamura S,
Inokuchi H (1976) J Biochem 79, 661-671. (オリジナル論文)
7. 八木達彦 (1975) ヒドロゲナーゼ 蛋白質核酸酵
素 20, 493-515. (総説･解説)
8. Yagi T, Higuchi Y (2013) Proc Japan Acad B89,
16-33. (レビュー)
9. Ogata M, Kondo S, Okawara N, Yagi T (1988) J
Biochem 103, 121-125. (オリジナル論文)
10. Okawara N, Ogata M, Yagi T, Wakabayashi S,
Matsubara H (1988) Biochimie 70, 1815-1820. (オリジナル論文)11. Nakano K, Kikumoto Y, Yagi T (1983) J Biol
Chem 258, 12409-12412. (オリジナル論文)
12. Higuchi Y, Bando S, Kusunoki M, Matsuura Y,
Yasuoka N, Kakudo M, Yamanaka T, Yagi T,
Inokuchi H (1981) J Biochem 89, 1659-1662. (オリジナル論文)13. Haser R, Pierrot M, Frey M, Payan F, Astier
JP, Bruschi M, Le Gall J (1979) Nature 282, 806810. (オリジナル論文)
14. Dobson CM, Hoyle NJ, Geraldes CF, Wright PE,
Williams RJ, Bruschi M, LeGall J (1974) Nature
249, 425-429. (オリジナル論文)
15. Higuchi Y, Yagi T, Yasuoka N (1997) Structure
5, 1671-1680. (オリジナル論文)
16. Yagi T, Tamiya N (2009) Viva Origino 37, 7382. (オリジナル論文)
17. Shimura M, Hirota F, Yagi T (1994) Biochimie
76, 614-621. (オリジナル論文)
18. Nakada S, Sawatari C, Tamura K, Yagi T (2001)
Colloid Polym Sci 279, 754-762. (オリジナル論
文)シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第7回

八木達彦先生ご略歴：
1933 年 唐津市に生まれる
1955 年 東京大学理学部化学科卒業
1958 年 東京大学大学院博士課程中退
1958 年 東京医科歯科大学助手
1966 年 東京大学、理学博士
1966 年 静岡大学助教授
1972 年 静岡大学教授
1993 年 静岡大学大学院教授併任
1996 年 静岡大学名誉教授

49シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第8回

ペプチド  酵素  不和合性
蛋白質化学の一断面*1

﨑 山 文 夫 （さきやま ふみお）に反応させると、保護されるはずのイミダゾール環

蛋白質化学の初期（ペプチドの化学）が開環（Bamberger 分解）してしまいます。この反応
私が大阪大学理学部化学科の赤堀四郎先生のもとについてはまた後に触れます。

で蛋白質の化学的研究を始めた頃は、Frederick

それから間もない1960 年に大阪大学蛋白質研究所

Sanger（1918-2013）がアミノ酸 51 残基からなるイン（阪大蛋白研）が全国共同利用研究所として発足しま

スリンの全一次構造を決めた 1955 年とほぼ重なり(1)、した。赤堀先生が初代所長で、私が所属した蛋白質化

蛋白質化学（protein chemistry）の揺籃期といって学構造部門は成田耕造教授が担当されました。成田いい時代でした。Sanger はこの研究のために 1945 年

先生は、当時としては非常に困難であったタカアミに DNP 法として知られる N 末端アミノ酸同定法を自ラーゼＡの一次構造の決定に取り組んでおられましら開発しています。1950 年には早くも DNP 法に替わた。残基数の合計が 478 にもなるタカアミラーゼＡる、Pehr Edman（1917-1977）による N 末端アミノ酸の全アミノ酸配列は、1981 年に成田先生が亡くなっの逐次分解・同定法が提案され、急速に普及しましたて間もなく、ようやく解明されました。このような非(2)。それから間もない 1952 年に赤堀先生は N 末端の

常に大きな蛋白質の一次構造を決定するには、まず反対側の C 末端アミノ酸同定法としてヒドラジン分

トリプシンやキモトリプシンのような基質特異性の解法を発見されました(3)。その頃、私は大川乾次先生

異なるプロテアーゼで適当な長さに断片化してから、（後に関西学院大学理学部長）のもとでヒスチジン

生じるペプチドごとに Edman 法を適用しなければな（His）を含むペプチドの合成法について研究していりません。このような限定的分解には、プロテアーゼました。当時、His のイミダゾール環の保護基の開発

とともに化学的開裂法（chemical cleavage）が役には、ペプチド化学の優先課題の一つでした。私の修士立ちます。中でも Bernhard Witkop（1917-2010）に課程の研究で、His の-アミノ基とイミダゾール基のよるメチオニン（Met）のカルボキシル基側でペプチ両方をベンジルオキシカルボニル化した誘導体がペド結合を切断する BrCN 分解は今でも使われることがプチド合成に適していることを見つけ、その論文があります (5) 。私はまず、先ほど触れた His のNature 誌（1958 年）に掲載された背景には、国際的Bamberger 分解でγ-ケトアミノ酸が生じることに注な激しい競争があったと思われます (4)。一方、His に目して、γ-ケト基とヒドラジンとの反応を経る分子

アルカリ性で塩化ベンジルオキシカルボニルを過剰
1 この原稿は 2013 年 6 月 14 日に行われた第 13 回蛋白質科学会（鳥取）・ヒストリカルレビューの講演を、使われた 34 枚のスライドと司会をした私の怪しい記憶と少々の思い込みをもとに大幅に圧縮したものである。読者の多くはこの講演を記憶されていることと思う。後日﨑山先生に全面改訂していただくことを期待して、しばらくはこの不完全なダイジェスト版でご辛抱願いたい。なお、会員の一部から強い要望のあった
﨑山先生ご自身による「赤堀四郎先生生誕 100 年に想う」（2001, 蛋白質核酸酵素 51, pp. 273-275）を、本稿の補足として末尾に加えた。転載を許可下さった共立出版株式会社のご厚意に深く感謝する。中沢 隆（奈良女子大学理学部）50

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第8回

内環化によって、ケトアミノ酸のカルボキシル基ラーゼＡと同じく麹菌が生産するリボ核酸分解酵側でペプチド結合を切断する方法を試みました。

素（RNase T1）の Trp 59 を相手に、酵素の機能発

その後、トリプトファン（Trp）のオゾン酸化によ

現とTrp 残基の役割について、
オゾン酸化と 13C NMRって、N’-ホルミルキヌレニン（NFK）やキヌレニ

や円偏光二色性（CD）など各種分光法を組み合わせン（Kyn）のγ-位にもケト基がより簡単に生じるこた研究を展開していました(8)。

とがわかりました。1962 年から約 2 年半、NIH の

私たちが Trp 残基の化学修飾をもとに蛋白質のWitkop 先生のもとでの研究をはさんで Trp の化学構造機能相関の研究に力を入れていた頃、蛋白質修飾の研究を始めました。

の 一 次 構 造 決 定 を は じ め と す る protein
chemistry は冬の時代を迎えていました。
Sanger の蛋白質の化学修飾

ジデオキシ法のような DNA の塩基配列決定法の急ニワトリの卵白リゾチームには 6 つの Trp 残基

速な発展により、核酸の塩基配列解析が蛋白質のがありますが、水溶液中でオゾン酸化すると Trp

アミノ酸配列分析より簡単になったためです。

62 が優先的に NFK に変換されると同時に酵素活性1978 年には Nature 誌に「protein chemistry は衰（溶菌活性）が元の 20%程度に低下します。ところ

退するのか?」と題する記事が掲載されました (9)。

が NFK のホルミル基を選択的に加水分解して得ら

実際、タカアミラーゼＡよりも大きな蛋白質の遺れる Kyn 62-リゾチームでは活性が約 80%まで回復

伝子解析が次々と進み、蛋白質の化学修飾も遺伝しました 。これは、Kyn の o-アミノフェニルケ

子工学の手法による site-directed mutagenesis

トン基部分が分子内水素結合によって Trp のインで置き換えられようとしていました。それでも特ドール環と非常によく似た平面構造をとることを定のアミノ酸残基のみを同位体標識するといった示しています。これが蛋白質の構造と機能の相関

化学修飾を使わないとできないこともあるし、蛋についての研究につながりました。例えば Kyn は白質の翻訳後修飾も遺伝情報からは予測できませ波長 360 nm の紫外線で励起すると、波長 480 nm にん。同じ Nature 誌に「protein chemistry は蛍光極大を示しますが、蛋白質の内部では周辺のessential である」という記事で蛋白質を単なる配疎水性基や極性基のイオン化状態に大きく依存し列情報でなく、物質として認識する必要性を述べてこの蛍光特性が変化するため、Kyn は蛋白質内部た記事(10)が出るまで、約 10 年かかりました。このの蛍光プローブとして使えます。また、NFK は K13CN

間私たちは、リゾチームや RNase T1 から次のテーとの反応で環化して、その環化生成物を高濃度のマとなるプロテアーゼに研究対象を広げつつ、酵

LiCl 溶液中、NaBH4 で還元すると、元のインドール

素の触媒機構や構造・機能相関の研究を続けてい

(6)

13

環が再生すると同時に C2 位が C で標識できるこ

ました。

(7)

とがわかりました 。普通、ある化学修飾によって蛋白質の構造と機能 —
protease I と RNase T2 —酵素が失活すると、蛋白質の構造維持や機能発現に必須なアミノ酸残基が特定できますが、そのア

Achromobacter

ミノ酸残基が天然の酵素の中でどのように振る舞

私たちが手がけた酵素の中でも特に興味深いもい、どのような役割を果たしていたかを知ることのは、副島・正木両先生（茨城大学）らによって発は困難です。ところが Trp の同位体標識や Kyn へ

見 さ れ た Lys-X の 結 合 に 特 異 性 を も つの変換は、側鎖の構造が全くあるいは微妙にしかAchromobacter protease I（API）です。この酵素はウ変わらないので、基質や阻害剤との相互作用や、周シ・トリプシン（BT）より活性が一桁高く、蛋白質

辺の環境変化、さらにインドール環自体の動的挙の一次構造解析に汎用されるようになりました。

動も適当な方法で追跡することが可能になるといAPI を API 自身と V8 protease、それに BrCN 分解う利点があります。このようにして、1970 年代後した断片の一次構造を解析した結果、この酵素は半から数年間、リゾチームの Trp 62 や、タカアミ

アミノ酸 268 残基からなり、触媒部位の catalytic

51シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第8回

triad が Asp 113、His 57、および Ser 194 で構成され作用の解明は今後の課題として残りました。

るセリンプロテアーゼであることがわかりました

API の研究と同じ頃、私たちは麹菌が分泌する(11)。
API と BT の X 線結晶構造を比べると、API の

RNase T2 のアミノ酸配列を決定し、さらにピロ炭

触媒部位の Asp 113 は His 210 と Trp 169 によって酸ジエチルやヨード酢酸による化学修飾実験から、溶媒から遮蔽されていて、API の His 210 と Trp 169

この酵素の触媒基を His 53 と His 115 と同定しましに相当するアミノ酸は BT では Ser 214 と Trp 215

た(14)。ところが、同じ麹菌が分泌する RNase T1 のです (12)。X 線結晶構造から、API の Asp 113 と His

アミノ酸配列にはこれらに相当する His がありま

210 の間に何らかの相互作用があり、この構造がせん。そこで、アミノ酸配列の相同性の検索を西川

API の高い酵素活性に関係すると考えられたので、

建博士（蛋白工学研）に依頼した結果、タバコ属

site-directed mutagenesis により His 210 を Ser に変換（Nicotiana alata）の花柱に存在する S 遺伝子特異

した変異酵素（H210S）を調製しました。すると、

的糖タンパク質に、高い類似性が認められました。

H210S は Lys に対する基質特異性を保持したまま面白いことに、私たちが RNase T2 の触媒基に同定

で、活性が至適 pH の 7-9 の領域で天然型 API よりした His 53 と His 115 に相当する 2 つの His 残基も数倍も増大するという意外な結果が得られました

この S-糖蛋白質で保存されていた上に、その周辺(13)。その後の研究で、API の活性の調節に His 210のアミノ酸配列まで一致していたのです。そこで、と Asp 113 の静電相互作用が重要な役割を果たし1989 年の 6 月に、RNase T2 の触媒基に関する論文ていることは突きとめられたと思いますが、それ(14)を投稿してから、問題の S-糖蛋白質の一次構造以外の His 57 と His 210、His 210 と Trp 169 の相互を研究している Richard Simpson 博士 (Melbourne)

メルボルンの Richard Simpson 邸にて（1992 年 2 月 24 日）。文献 14 の主著者である河田康志・鳥取大学
教授（右から 2 人目）、Richard Simpson（同 2 人目）。写真提供：河田教授

52

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第8回に、「タバコの S-糖蛋白質は RNase なのではない

酵素は、リボソーム RNA のターンオーバーを通じか」と問い合わせました。それから一月も経たないて細胞の恒常性を保つ“housekeeping”の役割や、他

うちに、電話がありました。
「RNase 活性があった！」の微生物に対する防御の機能をもつとされていまという知らせです。S-RNase は、N. alata の自己とす (17) 。S-RNase の機能もまた多様で、RNase T2

非自己の認識に関わる蛋白質だったのです (15)。こFamily の酵素群がこれほど多様な生体機能を示す

うして機能が不明であった S-糖蛋白質は S-RNase

ことは驚くばかりです。S-RNase の多様な機能が自と呼ぶことになりました。写真は 1992 年に私の家

家不和合性にどう関係するか、蛋白質部分の相同族と Simpson 先生のお宅に伺った時のものです。

性が高い以上、糖鎖構造による機能の違いを明ら同じ品種の植物間では自家受精が妨げられて結かにするために、今後は糖鎖構造解析の重要性が実 し な い 遺 伝 的 性 質 を 自 家 不 和 合 性 （ self-

より一層高まると予想されます(18)。このように多incompatibility）といいます。私たちは自家不和合性様な役割を担う RNase T2 Family の酵素は、動物やといった生命現象が、S-RNase の酵素作用として分植物ばかりでなく、細菌、原生動物からウイルスに子レベルで説明できると期待して、次の研究対象至るまで広く存在することが知られています (19)。

にニホンナシの S-RNase を選びました。
ナシ（Pyrus

これらの多様な生命現象を解明するには、protein

pyrifolia）は普通自家不和合性のため人工授粉が必

chemistry の立場から酵素を物質として認識するこ

要ですが、「おさ二十世紀ナシ」は自家受粉で実をとが非常に大切だと思います。

つけられるという面白い性質があります。実際にこれまでの研究を振り返ると、当然のことなが調べてみると、ナシには主に糖鎖構造の違いによら赤堀先生と Witkop 先生の影響を強く感じます。

って S1-RNase、S2-RNase、・・のように多くの S-

そのほか、私の蛋白質への興味をかき立てた本がRNase が存在することがわかりました。ところが「生命の起源と生化学」（オパーリン著, 江上不二

「おさ二十世紀ナシ」は S-RNase を欠いていまし

夫編, 岩波新書 1956 ）で、その中には赤堀先生のた。こうなると自家不和合性に S-RNase が関係す

ポリグリシン説が紹介されています。最後に、蛋白ることはほぼ間違いなさそうです。一方、S3-RNase質の研究の歴史を探る貴重な資料として、赤堀先の X 線結晶構造から、RNase T2 の His 53 と His 115

生の「生命の世界 — タンパク質と生命の起源 —に相当する触媒基を、それぞれ His 33 と His 88 と（なにわ塾叢書 15, 1984）と、Witkop 先生の 2 編(5,

推定しました。アミノ酸配列の相同性から見ても20)を挙げておきたいと思います。

この推定は妥当であったと思われます（図 1）(16)。
アミノ酸配列の相同性が高く、共通の触媒基が保存されている点を除いて、分子量も至適 pH もあまり共通しない RNase T2 Family の中で、ある一群の図 1. RNase T2 と S2-RNase のアミノ酸配列の比較。触媒基（H）は RNase T2 で 53 と 115 位、S2-RNase では 31 と 91 位。
配列を H が重なるように並べると、同一のアミノ酸（青）と類似するアミノ酸（緑）が H の近傍に集中して並ぶ。

53

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第8回

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シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第8回

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Elsevier Science Ltd., 4, 38, 109-162.

﨑山文夫先生ご略歴
1934 年 大阪に生まれる。
1956 年 大阪大学理学部化学科卒業
1958 年 大阪大学大学院理学研究科修士課程修了
1960 年 大阪大学蛋白質研究所助手
1962 年 米国 NIH, B. Witcop 研究室にて研究
1962 年 理学博士（大阪大学）：学位論文題目は「ヒスチジルペプチドの合成研究」
1971 年 大阪大学蛋白質研究所助教授
1982 年 大阪大学蛋白質研究所教授
1995 年 大阪大学蛋白質研究所所長
1997 年 大阪大学名誉教授
1998 年 四天王寺国際仏教大学教授

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シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第9回

私のタンパク質科学回顧: RNase T1 の一次構造研究に関わった頃
高 橋 健 治 （たかはし けんじ）
私がタンパク質に関する研究に初めて関与して以来、すでに 60 年近くが経過した (1)。本稿では、1960 年
代前後に私が関わったリボヌクレアーゼ T1（以下 RNase T1 または T1）の一次構造に関連する研究を回顧し、我が国内外におけるタンパク質科学研究の発展の歴史の一端を、垣間見る事にさせて戴く。

タンパク質の一次構造研究における最初の輝か

ヒドロゲナーゼを共役させ、分子状水素とアンモしい業績は、1955 年、英国の F. Sanger 博士らに

ニウムイオンによりα-ケトグルタール酸を還元

よるウシインシュリン（51 残基）の全構造決定で的にアミノ化して L-グルタミン酸を合成する事がある (1958 年ノーベル化学賞受賞)(2)。彼等はこ目的だった。この研究テーマはすでに先輩が挑戦の研究に、DNP 法による N 末端分析や、ペーパークして成功しなかったものだったが、その主な原因

ロマトグラフィー、ろ紙電気泳動などの手法を用は用いた酵素の純度にあるように思われた。当時いていた。しかし、その後タンパク質の一次構造決

化学教室には低温実験室など無く、地階に粗末な定の主流は、分子量一万以上のタンパク質の構造

氷冷倉庫があるだけだったので、酵素の調製実験決定に移り、用いる手法も Edman 法による N 末端には至極不便だったが、実際、それぞれの酵素を十配列分析、イオン交換カラムクロマトグラフィー

分精製して用いることにより、所期の目的を初めによるペプチドの分離やアミノ酸分析など、よりて達成できた(3)。酵素の精製と活性測定、変性に

近代的な手法に取って代わって行った。1950 年代

よる不安定化などの体験を通して、タンパク質の後半、米国では S. Moore、 W.H. Stein らによる本体に僅かながら触れられたような気がした。

ウシすい臓リボヌクレアーゼ A（以下 RNase A）に

個々の酵素の精製については、関連原著論文を参関する研究などが、新規な研究手法の開発も含め、考にしたが、赤堀四郎編「酵素研究法」（朝倉書店、先端を切って進んでいた。しかし、1960 年以前に1955）の部厚な書も大いに役立ったことを覚えては、分子量が一万前後を越えるタンパク質で完全いる。

一次構造が決定されたものはまだ無かった。

「チトクローム c の構造と機能に関する研究」「タンパク質科学に関連する初めての実験」

卒業研究を通じて私の興味は酵素の化学構造と私は学部四年の卒業研究では生物化学研究室を構造・機能相関の研究に次第に傾いて行った。当時選び、そこで初めてタンパク質科学関連の研究と赤堀研究室でそのような目的でなされていた研究して酵素化学実験を経験することになった。指導は唯一「チトクローム c の構造と機能に関する研教授はタンパク質の C 末端残基決定法の一つであ究」だった。チトクローム c は酵素ではないが機能るヒドラジン分解法の開発でも著名な赤堀四郎先タンパク質として十分興味をひくものだったから生で、大阪大学を兼任されていた。与えられた研究

修士課程のテーマとしてこれを選ぶことにした。

テーマは｢気体水素と人工複合酵素系を用いるα-チトクローム c の研究は二年先輩の千谷晃一氏がケトグルタール酸からの L-グルタミン酸の合成｣

中心となって進められていた。私の最初の実験はというものだった。ヒドロゲナーゼ、ジアフォラー「チトクローム c のグアニジン化」というもので、ゼ（リポ酸デヒドロゲナーゼ）、L-グルタミン酸デ

この塩基性タンパク質が持つ多数のアミノ基が活56

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第9回

性発現に関与するか否かを、アミノ基の特異的化

ペプチド断片の分画法、Edman 法によるアミノ酸配学修飾の一つであるグアニジン化により調べると列分析法など、基本的手法の殆どを新たに導入すいうものだった。この場合も、修飾試薬の O-メチ

る必要があり、一つ一つがわが国においては初め

ルイソ尿素を純粋に合成して用いることがきめ手ての導入だった。それだけに当時は、タンパク質のとなった。結果は Lys のアミノ基は活性発現に必アミノ酸組成や N 末端アミノ酸残基を決めただけ

須ではないというものだった。当時は機能タンパ

でも論文が書けるほどの時代だった。このようにク質中の特定残基が必ずしも必須でないことを明して、カラムクロマトグラフィーによるアミノ酸瞭に示した例はほとんど知られていない時代だっ分析やペプチドの分画が可能となり、ウマ心筋おたので、結構目新しい成果だったと思う。

よびパン酵母のチトクローム c について研究を進

修士一年の初夏に東京と京都で国際酵素化学会

めた。当時はコピー機もパソコンも無い時代で、議が開催され、チトクローム c の構造と機能に関

RNase A の構造決定に関する原著論文の要所要所

する研究発表の協同研究者としてこれに参加できを大学ノートにびっしりと写し取って参照したこ

た(4)。私にとっては初めての国際学会であり、そとを覚えている。これは、論文内容を細部まで理解のインパクトは絶大だった。当時、生化学研究の主するのに役立つだけでなく、参照した論文が優れ

流は酵素化学にあり、多数の錚々たる生化学者がた文章で書かれていたので、図らずも英文科学論

世界中から参加し学会は壮観を極めた。これに関文の作製力の向上にも大いに役立ってくれた。タ

連して同年秋に東京で “Symposium on Chemical

ンパク質についての理解を深めるため、研究室内

Structure of Proteins”が開催され、一次構造関では H. Neurath, K. Bailey 編 “The Proteins”

係では、赤堀教授ら（阪大）、佐竹一夫教授ら（都(Academic Press, 1953)などを毎週輪講した事を立大）がそれぞれ、タカアミラーゼ A およびヘモグ

覚えている。

ロビンの N-末端配列について、安藤鋭郎教授（東「チトクローム c から RNase T1 へ」大）らがクルペインおよびサルミンのトリプシン
ペプチドについて、また C. Fromageot 教授（パリ

修士二年時、赤堀教授が兼任を辞められ、江上不大）が招待講演で卵白リゾチームのトリプシンペ

二夫教授が着任された時点でチトクローム c グル

プチドの構造について講演した。

ープはほぼ発展的に解散し、千谷氏はやがて新設

その後、私の研究はチトクローム c の化学構造された阪大蛋白質研究所（初代所長赤堀教授）の化（一次構造）決定を目指して進み出した。当時我が学構造部門に助教授として転出した。その後のチ国では、東大の安藤研究室でニシン精子核のポリ

トクローム c の一次構造研究は成田耕造教授、千ペプチド性タンパク質クルペインの一次構造研究

谷氏らにより進められ、1963 年にパン酵母チトクが進められていたが、分子量一万前後以上のタン

ローム c の一次構造が決定された。これは我が国

パク質の全化学構造を目指した本格的研究はまだにおける最初の分子量一万を越える蛋白質の一次例がなかった。 従来の構造分析は Sanger 以来の構造決定となった。

DNP 法やペーパークロマトグラフィー、ろ紙電気泳

一方、私は江上教授を指導教官として新しいテ動などを主力としていたが、分子量一万を越えるーマ「RNase T1 の構造と機能に関する研究」に取りタンパク質の構造決定には、より定量的な手法の組むことになった。この酵素は 1957 年、江上教授

導入が求められていた。1950 年代の後半より欧米らによりタカジアスターゼ（Aspergillus oryzae

における一次構造決定法の主流は、RNase A の研究由来）中に発見された RNA 分解酵素である。従来よに代表されるカラムクロマトグラフィーを主力とく研究されていた RNase A（ピリミジン特異的）とする方法に取って代わりつつあった。したがって、は塩基特異性が異なる（グアニン特異的）ことから、我が国でもそのための基本技術を導入する事が、RNA の構造決定において特異的分解試薬として役

まず先決課題であった。定量的アミノ酸分析法や57

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第9回

立つ可能性がある点、また酵素の構造・機能相関のれなかった主因は、tRNA の精製に遅れをとったた

研究対象として興味深い点から当時国の内外で注めであり、極めて遺憾であった。

目を集めていた。既に一次構造決定の予備的研究

一次構造決定には博士課程二年頃からとりかかを進めていたチトクローム c にいささか後ろ髪をった。この年（1960 年）、S-S 結合の位置も含めた引かれつつも、これこそ研究すべき本物の酵素だ

RNase A の完全一次構造が C.H.W. Hirs, Moore,と思った。

Stein らによって発表された (7)。これは、分子T1 の研究をさらに進めるためには、
まず純粋な酵量一万を越えるタンパク質として、また酵素とし素が必要だった。従来の古典的精製法は不十分で、て初めての構造決定であった（1972 年、Moore と新たな精製法の導入が不可欠だった。当時は T1 のStein はノーベル化学賞受賞）。私は三年の後半かような酸性タンパク質の精製に有効なイオン交換

らは、籍を江上研に残して新設された理学部三号

クロマトグラフィー法は皆無だった。しかし、幸運館の安藤研に席を移した。当時はクルペインの構にも 1956 年に米国で開発された DEAE-セルロース造研究を進めていた安藤研に、幸運にも D.H.

を用いる陰イオン交換クロマトグラフィー法が有Spackman, Stein, Moore によって開発された効である事が判明した。この方法の導入により、つBeckman-Spinco 社の自動アミノ酸分析機が日本でいに本酵素を初めてタンパク質として完全精製す初めて導入されて間もない頃だった。使用希望がることができた(5)。

多いため私の分析はほとんどが深夜か休日に回る

精製酵素について、光酸化の実験から、本酵素がことになったが、これを有効に利用することがで活性発現に必須な His 残基を持つこと、8 M 尿素存きた。その結果、二年余で部分一次構造に到達し、在下で２-メルカプトエタノールにより 2 個の S-S

大学院を修了した。
研究方法は主にMoore-Stein ら

結合を還元、切断し、酵素を変性、失活させた後、の方法に準拠したが、必要に応じ高圧ろ紙電気泳尿素を除去し、空気酸化することにより正しいコ動やペーパークロマトなども併用した。当時はンホメーションを再構築させ、活性を回復させらEdman 法での PTH アミノ酸の同定が難しかったのれることなどの知見が得られた (6)。これらの実で、Edman 分解後の残存ペプチド鎖の N 末端残基を

験は、RNase A についての実験に範を得たものであDNP 法で順次決定する「DNP-Edman 法」を考案し、り、両酵素がこれらの点では類似することを示し

これは T1 の N 末端配列決定に有効に利用できた。

た興味深い結果だった。

しかしこの方法は、後年 B.S. Hartley(1970)によ

しかし、より精確な結論を得るためには、T1 の完って開発されたダンシル-Edman 法に比べ感度が低

全一次構造を決定し、その上に立って分析を進めかったため、一般に普及するには至らなかった。な

る必要があるという信念から、私は一次構造決定

お、当時は微生物のタンパク質の一次構造決定例に挑戦する決意をした。ここでは幸い、チトクロー

が無く、微生物酵素の場合にはおそらく多様性が

ム c の研究で得た技術が役に立った。当時一次構著しいために、特定のアミノ酸配列を決めること

造決定には現在と比べて少なくとも百倍程度以上は難しいだろうと考える人さえいる状況だった。

の試料が必要だった。そこで、5 グラムの酵素の精製をめざし、数ヶ月をかけて、数十キログラムのタ「RNase T1 の全一次構造決定と国内外の状況」

カジアスターゼ原末より、最終的に約 3 グラムの日本学術振興会奨励研究生として一年、同学科

完全精製酵素を得た。この精製酵素の一部は米国

安藤研究室の助手として一年余を T1 の構造研究にの R.W.Holley 博士に送られ、Ala-tRNA の全塩基配費やした。またこの間に、F.Sanger 博士、S.Moore

列決定（1968 年ノーベル生理学・医学賞受賞）に博士、H. Fraenkel-Conrat 博士などが研究室に来不可欠な分解酵素として役立つことにもなった。

訪され、仕事の話をする機会が持てたのは大変刺

余談ではあるが、T1 という優れた武器に恵まれなが激になった。研究が本格的に進んだのは学振の奨ら、tRNA の構造を世界に先駆けて我が国で決めら58

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第9回

励研究生になった前後からだったと思う。
T1 の場合、さらにアミノペプチダーゼによる N 末端配列分析

酵素の原料が日本産のタカジアスターゼであり、およびカルボキシペプチダーゼ A とヒドラジン分

自分の手で完全精製も行ったわけで、当面試料に解による C 末端域配列分析を併用して全配列を決

ついては完全独走態勢にあったことが最も有利な定していった。

点であった。
T1 は後年三共株式会社から市販された

これらのペプチド分画とアミノ酸配列分析法はが、初めから市販されていたら別の展開になって

基本的には Moore-Stein らの方法に準拠するもの

いた可能性も強い。

であったが、一種類の酵素分解物のカラムクロマ

全構造決定のためには、各種のプロテアーゼ分

トグラフィーに十日間近くかかり、分画を集めた解で生じたペプチドを分別精製し、それらの構造試験管も千本近くに達した。HPLC もまともなフラ決定を行い、それらの結果を組み合わせて全構造

クションコレクターも無い時代で、日本式の非電を推定するというのが常套手段であった。RNase A

動型、回転式フラクションコレクターが故障なくと較べ、不利な点が二つあった。第一点はプロテア

十日間も連続して回り続けるのを調整、監視するーゼ分解に通常最初に用いられるプロテアーゼで、のも大変な仕事だった。夜間コレクターの横に添

特異性が最も厳密だったトリプシンがあまり役にい寝して、時々目を覚ましてはその正常な作動を立たなかったことである。これは T1 が酸性タンパ

確認したことを覚えている。ポリエチレンラップ

クであり、トリプシンが作用する Lys および Arg をもパラフィルムも、またボルテックス・ミキサーも各一残基しか含まず、分解点が少ないためにトリ無い時代で、ニンヒドリン反応をする際、反応前にプシン処理で大型ペプチド片が不溶化してしまい，

試料液と試薬液を混ぜるために試験管に直接親指その後の分析を難しくしたためである。第二点はで蓋をして振り混ぜたため、数時間後に親指とそ

それほど大きな問題ではないが T1 がトリプトファのまわりが青紫色に染め上がり、その後一週間ほンを一残基含み、これが S-S 結合切断の常法であど色が消えなかったこともしばしばだった。
T1 の全構造はキモトリプシンペプチドとトリプった過蟻酸酸化では酸化分解し、同定困難だった

シンペプチドの分析結果から決定されたが、別のことである。
このためまず過蟻酸酸化 T1 を用い、そのトリプ方法によっても確認されることが望ましいと考え、シン分解で得られたペプチドも利用しつつ、主に特異性の異なるペプシン、パパインおよびサチラ

キモトリプシン分解で得られるペプチドを詳しくイシンによる分解で得られるペプチドの分析も行分析した。また、これに加えて未変性 T1 のペプシった。この結果、キモトリプシンペプチドとペプシ

ン、パパインおよびサチライシンによる個別分解

ンペプチドおよび一個のパパインペプチドの分析も併用した。各酵素分解で得られたペプチド混合

結果だけからも同一の完全アミノ酸配列が得られ物は Dowex 50 X-2 のカラム（0.9 x 150 cm）を用ることが示された。またサチライシンペプチドのい、ピリジン・酢酸緩衝液のグラジエント溶出によ

配列も矛盾がなかった。これらの結果は最終決定

り分画した。カラムからの溶離液はヤジロベー式

配列の正当性を強く支持するものであった。また、の日本式フラクションコレクター（東洋濾紙社製）

S-S 結合の位置は、サチライシンペプチドの分析かを用いて集め、アルカリ分解有無下でニンヒドリ

ら決定できた。

ン比色分析した。各ピーク分画について高圧ろ紙

このようにして、昭和 40 年（1965 年）T1 の完全電気泳動とぺーパークロマトグラフィーにより純構造に到達することができた(8)。最初の本格的な度を検査し、複数のペプチドを含む分画はさらに構造決定実験として T1 約 200mg を過蟻酸酸化した

これらの方法により構成ペプチドを分離精製した。

のが、大学院博士課程三年生の二月（昭和 37 年）

各精製ペプチドの配列分析は、そのままあるいはであったから、それから三年余のことだった。T1 のさらにプロテアーゼによる小断片化後、アミノ酸

全構造決定の論文はまず速報として短くまとめ、分析を利用する subtractive Edman 法を主に用い、J.Biol.Chem.に投稿した。
T1 の構造に関する中間報59シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第9回

告は、蛋白質構造討論会（第 10 回、1959 年 — 第

この間我が国では安藤教授、岩井浩一、石井信一氏

15 回、1964 年）や日本生化学会大会で行い、それ（東大）らによりタンパク性ポリペプチドであるぞれの予講集に概略が載っている。なお、蛋白質構

クルペイン Z（31 残基, 1962）が構造決定されて造討論会は、日本化学会主催で、タンパク質化学をいる。これは、我が国で構造決定された最初のタン中心にしたタンパク質の構造と機能に関する討論

パク性ポリペプチドである。また、1965 年までに会（年一回開催）である。2000 年（第 51 回）まで

ヒトチトクローム c（E. Smith 研で松原 央氏（阪続き、翌年日本蛋白工学会、蛋白質立体構造構築原大）が構造決定に寄与）、ウシトリプシノゲンおよ理研究会などと共に母体となり、日本蛋白質科学

びキモトリプシノゲンなどの構造も大部分決まっ

会が新たな学会として創設された。我が国の蛋白ており、ウマヘモグロビンα鎖（G. Braunitzer 研

質科学研究発展への蛋白質構造討論会の寄与は極で松田源治氏（長崎大）が構造決定に寄与）の構造

めて大きい。

も決まっていた。1965 年に M.O. Dayhoff により”Atlas of Protein Sequence and Structure,

この結果、T1 は 104 個のアミノ酸残基を含む一本のポリペプチド鎖からなり、2 個の S-S 結合を持Vol.

1” （ National

Biomedical

Research

つタンパク質であることが明らかになった。また、Foundation）が出版され、1978 年迄続刊された。

アミノ酸配列は RNase A とは全く異なり、両者はタンパク質のアミノ酸配列に関する最初のデータ

進化上無関係なタンパク質であることが判明した。

ベースとも言うべきものであり、後の GenBank な

酵素としては、すでに RNase A（124 残基、Hirs,

どのデータベースのモデルとなった。

Moore, Stein、1960 年）の S-S 結合の位置を含む「化学修飾法による T1 の活性部位の研究」

全一次構造が報告されていたので、これに次いでニワトリ卵白リゾチーム（129 残基、Canfield、1965 年より三年間、米国ロックフェラー大学のJollès ら、1965 年）と並ぶことになった。因に、Moore-Stein 研に留学し、T1 の活性部位の研究をさ1960 年から 1965 年までの間に完全一次構造が報らに続けることになった。 当時、同大には R.B.

告されたタンパク質（分子量約一万以上）としては、

Merrifield（1984 年、RNase A の固相法化学合成な

他にタバコモザイクウイルスコートタンパク質、どによりノーベル化学賞受賞）、G. M. Edelmann

ヒトヘモグロビン（α鎖+β鎖）、チトクローム c（ウ（1972 年、抗体分子の構造解明によりノーベル生

マ、ブタ、P.aeruginosa、パン酵母）、マッコウク

理学・医学賞受賞）、L.C. Craig(向流分配法の創始

ジラミオグロビンがある(9)。これらの構造決定の者)などを筆頭に多数の著名なタンパク質科学関

殆どは米国を中心とした欧米諸国でなされたもの

連の研究者がいた。また、G. Blobel（1999 年、タであり、我が国で決定されたものは、パン酵母チト

ンパク質の細胞内局在化シグナルの発見でノーベ

クローム c（104 残基、1963）と RNase T1 のみであル生理学・医学賞受賞）はまだ大学院生だった。

る。なお、タバコモザイクウィルスコートタンパク

Moore-Stein 研ではすでに、A.M. Crestfield らのの構造決定には、次田 皓氏(阪大)が留学先での H.

ヨード酢酸による化学修飾実験（His 残基の特異的Fraenkel-Conrat らとの協同研究において重要なカルボキシメチル化による失活）から、RNase A の寄与をしている。従って、1960-1965 年間に完全構

活性部位残基として His12 と His119 が推定されて造が報告された分子量約一万以上のタンパク質は、いた。当時、化学修飾法は X 腺結晶構造解析ととも

ヘモグロビンあるいはチトクローム c などをそれに、最も有力な活性部位残基の特定法であった。一ぞれまとめて 1 種として数えると 7 種類（異なる方、T1 も同様な条件下でヨード酢酸により不活性化

生物種由来の同種タンパク質を別々に数えると 10することが日本での予備実験で分かっていたが、種類）となる。この数はその後加速度的に増加し、反応するアミノ酸残基は不明であった。

1982 年までには約 200 種（同種タンパク質を別々T1 でのヨード酢酸の反応部位を明らかにするたに数えると 1100 種類余）に達している(10)。
また、60シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第9回

めに、14C 標識試薬を用いたところ、反応は 1:1 のったくその役割は不明だった。当時、タンパク質中モル比で起こり、反応産物は酸加水分解で完全にの特定の Arg 残基の役割を明らかにした研究は皆14分解して C 標識グリコール酸を生じることが判明無だった。その理由の一つは中性付近の温和な pHした。この結果から、当時想定外であったが、諸般下で Arg 残基を特異的に化学修飾出来る試薬がほの証拠から反応はカルボキシル基との間に起こっ

とんど無かったからである。そこで、このような試ている可能性が最も高いと推定された。そこで、カ薬を探し、まず T1 に応用することをめざした。

ルボキシメチル化 T1 をプロテアーゼ分解し、カル

当時、グリオキサルのようなジカルボニル化合

ボキシメチル化ペプチド断片を得て、反応残基を物が Arg のグアニジン基と特異性は低いが反応す同定することにした。断片化とその後のクロマトることが、柴田和雄氏（東工大）らの研究により知14の際に、 C 標識カルボキシメチル基が容易にペプられていた。これにヒントを得て、多数のジカルボチドからはずれてしまう事実に悩まされながら、ニル化合物の反応性と特異性を、タンパク質とし最終的には比較的安定な限定分解／単離条件を見ては RNase A を用いて、比較解析した結果、フェニ

出し、ついに修飾された残基の同定ができた。何とルグリオキサル（PGO）が目的に最も合う化合物でこのアミノ酸は Glu58 であり、反応産物はγ-カルあるとの結論を得た (13). Arg の PGO 誘導体は、

ボキシメチルグルタミン酸だった（11）。タンパク

通常の酸加水分解では変化はするものの，遊離の質中のカルボキシル基にヨード酢酸が作用してこ

Arg を生じないので、Arg の修飾度は酸加水分解後れをエステル化(カルボキシメチル化)した例は初のアミノ酸分析で、Arg の減少として定量できる。

14

めてであった。この結果を得るのに C 標識ヨード

また，PGO と Arg は 2:1 のモル比で反応することが酢酸を使えたことは決定的に重要だった。当時東判った。

大の生物化学教室には液体シンチレーションカウ

後にこの試薬による T1 の修飾を行った結果、ンターが一台も無く、放射性実験は不可能だった。

Arg77 が特異的に修飾されることにより活性が失ニ ワ ト リ 卵 白 リ ゾ チ ー ム に つ い て は 、 D.

われることを示すことができた (14)。タンパク分

Phillips らが 1965 年に X 線結晶構造解析による立子中の特定の Arg 残基が酵素活性発現に関与する

体構造研究から Glu35 と Asp52 を触媒残基としてことを化学修飾法によって示したのはこれが最初推定していたが、タンパク分子中の特定位置にあの例である。リン酸化合物など負の荷電を持つ化る残基のカルボキシル基が活性発現に必須な基と合物は生体内に非常に多く、それと特異的に結合して化学修飾により同定された例は T1 が初めてでするタンパク質や酵素がしばしばその結合部位にある。当時，Moore-Stein 研をはじめ他のいくつか

特定の Arg 残基を持つ例は珍しくない、以後、このの研究グループによってブタペプシンならびに類

試薬は、同時期に米国で研究されていたジアセチ

縁酵素の活性部位残基の同定が進められており、

ル（2,3-ブタンジオン）とともに、多数のタンパク

特定の Asp 残基（後にブタペプシンでは Asp32 と質や酵素に応用され、機能残基としての Arg 残基判明）が触媒残基の一つである証拠が得られつつの同定に広く役立っている。

あった。現在、触媒基としてカルボキシル基を持つ

その後、活性部位 His 残基の同定の方向に仕事を酵素(12)は極めて多数知られているが、その草分進めた。まず、光酸化の実験で、3 個の His の中で、け時代の仕事ということになる。

His 1,2 個が活性発現に関与することが示唆され

T1 についてのもう一つ興味深い点は、この酵素がた。そして、これらの結果を総合して、1970 年に酸性タンパク質であり、塩基性アミノ酸としては

T1 の推定反応機構を提案した(15)。これは、Glu58

Lys 1 個、His 3 個、Arg 1 個のみを含むことであと His が一般塩基、一般酸として関与するというる。初期の実験から Lys は活性発現に関与せず、機構である。更にその後の光酸化およびヨードア

His は全 3 個のうちいずれか 1, 2 個が重要である

セトアミドによるアルキル化の実験から、活性部ことが推定されていた。しかし，Arg についてはま

位に His40 と His92 が関与する事が示唆された

61

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第9回

また、
T1 と基質との相互作用のメカニズムを解明「RNase T1 からプロテアーゼおよび関連タンパク質へ」するために、J.P. Hummel と W.J. Dreyer によって一方、1970 年代以降、私の興味は次第にプロテ開発されたゲルろ過法を用いて、多数のヌクレオ

アーゼおよびその関連タンパク質に移って行った

チド、ヌクレオシドおよびそれらの誘導体等との(12)。Moore-Stein 研でペプシン等のプロテアーゼ結合を測定した。
この結果、グアニン塩基の N1 位、に関する研究を見聞きしたことも引き金となった

2-アミノ基、6-オキソ基、7-アミノ基およびリン酸

が、また、生理的機能という観点からもより興味を

基（特に 3’位）が酵素との結合に関与することが推ひかれて行った。その後、京大・霊長類研、次いで定された(19, 20)。しかし、酵素側のグループにつ

東大・理学部、最後は東京薬科大・生命科学部で延いてはグアニン部分との特異的結合に関与するア

べ三十年余にわたり研究に従事し、多くのタンパ

ミノ酸残基を推定するところまでは至らなかった。

ク質や酵素の構造や機能、構造・機能相関の研究に

なお、この分野では、今堀和友、大島泰郎氏（東大）携わった(1)。特に力を入れたのは、ペプシノゲン

らなども差スペクトル法を用い、有意な結果を得／ペプシンと類縁カルボキシルペプチダーゼおよている。

びグルタチオン S−トランスフェラーゼなどである。

(16-18)。

後に、T1 と類縁酵素 U1 および N1 の一次構造比較

この間、一次構造研究はプロテインシーケンサー

から一箇所 T1 の配列中に問題があることに気付い

や HPLC の導入などで迅速化し、また分子生物学のた。そこで， T1 の全配列を再検討したところ、71-

目覚ましい発展とともに、一次構造研究も DNA レ

73 位の Pro-Gly-Ser は Gly-Ser-Pro が正しいと結ベルでなされる事が多くなり、化学修飾による研論された。残念ながら誌上で修正した。1960 年代

究も部位特異的変異法に取って代わっていった。

に化学的方法で構造決定されたものには、RNase A

残念ながら、この間の研究については紙面の制限を含めその後の訂正がしばしばあったものである。

のため割愛させて戴く。

この間、U. Heinemann、W. Saenger（1982）が T1-

1960 年前後、タンパク質の一次構造研究の草創

2’-GMP 複合体の X 線結晶構造解析に成功し，活性期に参画できた幸運に感謝している。

部位の立体構造が明らかになった (21)。彼らの結果は、私が先に提案した反応機構(15)を支持するものであった。また、Tyr42-Tyr45 の領域が多数の水素結合を介してグアニン部位との特異的結合に関与し、Tyr45 がグアニンと stacking することが示された。ゲルろ過法で先に推定したグアニン側の推定水素結合部位はこれらの結果とよく一致した。後年、部位特異的突然変異導入体の解析から、反応機構における Glu58, His40, His92 の役割については種々議論されることになるが、Glu58 の触媒残基としての重要性に変わりはない（12）。なお、
立体構造解析を目的とした T１の結晶化は早くから
三井幸雄氏ら（東大）により試みられていたが、成功せず、我が国で最初に達成出来なかったことは実に残念だった。

62

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第9回

文 献
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Sequence and Structure 1972, Vol. 5, National
Biomedical Research Foundation.

高橋健治先生ご略歴：
1934 年 長野県に生まれる。
1957 年 東京大学理学部化学科卒業
1962 年 東京大学大学院理学系研究科生物化学
専門課程博士課程修了，理学博士
1962 年 日本学術振興会奨励研究生
1963 年 東京大学理学部生物化学科助手
1965 年 ロックフェラー大学博士研究員（〜1968）
1973 年 東京大学理学部生物化学科講師
1974 年 京都大学霊長類研究所生化学研究部門教授
1984 年 東京大学理学部生物化学科教授
1993 年 東京大学大学院理学系研究科生物化学専攻
教授
1995 年 東京大学名誉教授
1995 年 東京薬科大学生命科学部教授
2005 年 東京薬科大学名誉教授
2005 年 首都大学東京客員教授

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