学位論文内容の要旨

博士の専攻分野の名称

博士（医 学）

氏 名

川本 泰之

学 位 論 文 題 名
A study of KRAS mutations in the primary tumors and post-FOLFOX metastatic lesions incases of colorectal cancer（FOLFOX 療法の前後の原発病変と再発病変における大腸癌 KRAS 遺伝子変異一致率の検討）【背景と目的】切除不能進行・再発大腸癌に対する化学療法は，薬剤の開発や投与法の考案などにより様々な変遷と発展を続け，抗 vascular endothelial growth factor (VEGF) 抗体薬や，抗epidermal growth factor receptor (EGFR) 抗体薬といった分子標的治療薬の導入により生存期間中央値 24 ヵ月を超える成績が報告されるようになった。特定のタンパク質の機能の阻害を目的とした分子標的薬は，がん細胞など目的の組織，細胞にその標的となる分子が発現していなければ効果を発揮しない。また標的分子およびその下流の細胞内シグナル伝達経路のタンパク質に変異などが生じることで，効果が増強ないし減弱することも知られている。KRAS 遺伝子は第 12染色体短腕上に位置し，RASp21 と呼ばれる GTPase 活性をもつ GTP・GDP 結合タンパク質をコードしている。RASp21 は細胞膜の内側に存在し EGFR からのシグナルを下流の RAF-MAPK経路に伝達する役割をもっている。KRAS 遺伝子変異は exon 2 のコドン 12, 13 にその 90%以上が集中している。KRAS 遺伝子の DNA に点突然変異が起こると，RASp21 に結合した GTP をGDP に加水分解する GTPase 活性が低下し，恒常的に下流分子の活性化を誘導する GTP 結合型の状態にとどまる。そのため抗 EGFR 抗体薬により EGFR の阻害を行っても RAS より下流へのシグナル伝達がブロックされず治療効果が得られないとされている。現在，KRAS 遺伝子変異は切除不能進行・再発大腸癌における抗 EGFR 抗体薬の治療効果予測因子と考えられており，すでに多数の臨床試験において KRAS 変異型の大腸癌患者群では，抗 EGFR 抗体薬による治療効果が不良であることが報告されている。さらに，EGFR からのシグナル伝達経路の下流に位置するNRAS，BRAF，PIK3CA などにも活性型変異がみられることがある。これらの遺伝子変異も抗EGFR 抗体薬の効果を修飾する可能性があると報告されているが，多数の変異陽性症例の治療効果を検討した十分な報告はまだなされていない。Oxaliplatin は第三世代プラチナ製剤であり，大腸癌患者において 5-fluorouracil (5-FU) との併用で FOLFOX 療法として頻用されている。
Oxaliplatin は DNA 二本鎖内及び二本鎖間に架橋するが、特に連続したグアニン塩基間に付加体(Pt-GG adduct) を形成して DNA 損傷を引き起こす薬剤である。また，培養細胞実験系による研究では oxaliplatin に長期曝露することによって遺伝子変異が促進する可能性についても報告されている。大腸癌の原発部位と転移部位においての KRAS 遺伝子変異の比較では，その状態は高率に一致すると報告されているが，DNA 損傷を誘導する oxaliplatin のような化学療法薬が長期間投与された後の異時性の再発癌で KRAS 遺伝子の獲得変異の有無や，変異の変化の有無は，詳細な検討の報告はなく現時点では不明である。以上のような背景の中で，KRAS 遺伝子のような治療効果を予測するバイオマーカーとなり得る遺伝子の変異が FOLFOX 療法によって修飾されるとすれば，抗 EGFR 抗体薬による治療前にバイオマーカーを検索する DNA ソースとして，原発病変と異時性再発病変のどちらを用いるべきかについては再考する必要がある。このことを明らかにするために，本研究では大腸癌 Stage III, IV 根治切除後の術後補助 FOLFOX 療法施行後に再発した症例のうち，組織検索が可能であった症例について，化学療法施行前後のそれぞれの病変の KRAS およびその他のバイオマーカー候補である NRAS，BRAF，PIK3CA の遺伝子変異を検討した。
【対象と方法】Stage III, IV 期大腸癌の根治切除後に術後補助化学療法として FOLFOX 療法を施行した後に再発し，転移巣切除を施行した 21 症例の 63 病変を対象とした。内訳は原発巣/化学療法前転移巣/化学療法後転移巣が 21/18/24 検体であった。パラフィンブロック標本から
macro-dissection 法により癌部を削り出し，得られた DNA を ARMS-Scorpion 法と multiplex
PCR-Luminex 法にて KRAS，NRAS，BRAF，PIK3CA の遺伝子変異の状態を解析した。
【結果】21 症例における原発病変は結腸/直腸：8/13 例であった。初回原発病変切除の時点ではStage III/IV：12/9 例であった。同時性転移病変を有する Stage IV の 9 症例の転移病変の総数は12 病変であった。さらに， Stage III 症例のうちの 5 症例 6 病変は初回手術後 FOLFOX 療法施行前の異時性再発の病変であり切除が行われていた。これらの計 18 病変を pre-FOLFOX 病変と定義した。一方，21 症例の 24 病変が FOLFOX 療法施行中または施行後に再発し、その後外科的切除が行われた病変であった。これらの病変を post-FOLFOX 病変と定義した。全ての転移病
変は大腸腺癌からの転移であるとして矛盾しない病理組織学的形態像を示していた。原発巣のKRAS codon 12 および 13 遺伝子変異は，野生型/変異型がそれぞれ 8/13 症例であった。まず，
原発病変と pre-FOLFOX 病変の一致性について検討した。原発病変において KRAS G12A の変
異 を 認 め ， 肺 転 移 病 変 に お い て KRAS 野 生 型 の 症 例 を 1 例 認 め た 。 病 理 組 織 は 結 腸
adenocarcinoma からの肺転移として矛盾なく，FFPE 標本よりゲノム DNA を再抽出し ARMS法による再検を 2 回行ったが変異は認められなかった。その他の 14 症例における pre-FOLFOX
17 病変では，検索した遺伝子変異の有無と変異パターンは全て原発病変と一致していた。一方，
post-FOLFOX 病変の 24 病変においては，すべての症例において原発病変と再発転移病変において遺伝子変異のパターンに変化はなかった。
【考察】抗 EGFR 抗体薬投与前の治療果予測因子である KRAS 遺伝子変異検査に用いる DNA 検体は，FOLFOX 療法施行中または施行後の症例であっても，原発病変や転移病変のどの病変を用いても問題なく，新たな検体の採取は必須ではない可能性が示唆された。しかし，本研究は少数例の検討であり，KRAS 等の遺伝子変異が FOLFOX 療法により変化しないかどうか，さらに多くの症例で確認する必要があるが，手術検体のみを対象とすると症例集積は困難であると予想される。FOLFOX 療法施行前後の末梢血から circulating tumor cells を回収し，高感度の検出法を用いた遺伝子変異の解析法の開発も今後考慮すべきである。
【結論】FOLFOX 療法施行症例においても，効果予測因子となり得るバイオマーカー遺伝子の変異はみられず，原発病変，FOLFOX 療法施行後の転移病変のいずれの検体を用いても DNA によるバイオマーカー検索は実施できる可能性が示唆された。