学位論文内容の要旨

博士の専攻分野の名称

博士（医 学）

氏 名

水柿 秀紀

学 位 論 文 題 名γ-secretase inhibitor と放射線照射併用による Notch 発現肺癌細胞株に対する抗腫瘍効果の検討【背景と目的】 Notch は膜貫通型受容体で、神経、造血、血管といった様々な組織の細胞分化にとって重要な役割を果たしており、多くの癌種において Notch pathway の異常活性が癌化に密接に関連していることが報告されている。我々は、Notch3 が非小細胞肺癌組織の約 40%に過剰発現し、Notch のインヒビターであるγ-secretase inhibitor （GSI）を用いて Notch3 を抑制すると in vitro
またマウスモデルにおいて肺癌の増殖が阻止されることを示してきた。一方で放射線は日常診療において肺癌患者の治療に広く用いられており、その抗腫瘍効果の１つはアポトーシスによるものであることが報告されている。しかし、放射線治療を行う上で放射線抵抗性は重要な問題の１つとしてあげられる。乳癌幹細胞では、放射線照射後に Notch1 とリガンドである Jagged1 の発現が増強することや、神経膠腫幹細胞では、放射線照射後に Notch pathway の標的遺伝子が増強することが報告されている。これらの報告から、Notch pathway の活性が放射線抵抗性のメカニズムの 1 つである可能性が示唆されるが、肺癌において放射線照射に伴う Notch pathway の動態や GSI と放射線照射併用による抗腫瘍効果に関しては in vitro と in vivo 共に報告は少ない。このため、我々は本研究において、GSI と放射線照射併用による Notch 発現肺癌細胞株に対する抗腫瘍効果について検討した。
【対象と方法】 細胞株は Notch の発現と GSI の抗腫瘍効果が既に確認されている非小細胞肺癌細胞株（HCC2429、H460、A549）を用いた。細胞株を一晩培養して、放射線照射 24 時間後に GSIを投与し、併用治療の抗腫瘍効果を MTT assay と clonogenic assay を用いて検討した。Notch1、Notch3、Notch pathway 下流の標的遺伝子（HES-1、HEY-1）の発現と細胞内シグナル伝達系（アポトーシスシグナル、MAPK pathway、PI3K/AKT pathway）に関連する蛋白の発現は Western Blot法で確認した。アポトーシスは Annexin V と propidium iodide を用い、フローサイトメトリーで解析した。また抗腫瘍効果と Notch との関連性については、siRNA を用いて検討した。in vitro の結果をもとに、ゼノグラフトマウスモデルを用い、in vivo での抗腫瘍効果についても検証した。また腫瘍を摘出し Notch の発現を Western Blot 法で、Ki67 の発現を免疫組織染色で確認した。
【結果】 はじめに併用治療の適正な治療スケジュールを MTT assay を用いて検討した。GSI、放射線同時併用群、GSI 投与 24 時間後に放射線併用群の 2 種類の併用治療スケジュールでは単独治療と比較して相乗効果を認めなかった。GSI、放射線照射後に GSI を投与する逐次併用群では放射線単独群と比べ、MTT assay において細胞増殖の抑制と clonogenic assay においてコロニー数の低下を認め、さらにフローサイトメトリーでは apoptosis 細胞の増加を認めた。このため以降の実験では放射線治療後に GSI を投与する方法を用いた。次に各種治療後の Notch 関連蛋白やアポトーシス関連蛋白の発現を検討した。放射線照射により、Notch と Notch pathway の標的遺伝子である Hey-1 の発現が増強し、更に放射線照射時に増強した Notch の発現は GSI の逐次併用により減弱した。逐次併用群では、アポトーシス抑制蛋白 （p-Bcl-2、Bcl-xL）と p-ERK の発現は単独治療と比較してより抑制され、アポトーシス促進蛋白（Bim）と PARP の発現はより増強した。H460において、siRNA を用いて Notch3 を抑制することで、GSI 単独群と逐次併用群の抗腫瘍効果は減弱した。さらにゼノグラフトマウスモデルにおいても併用群でより強い抗腫瘍効果を認め、治療後の腫瘍の NICD3 の発現を検討したところ増強した NICD3 の発現は併用群で抑制されており、in vitroの結果と同様であった。また、免疫組織染色で検討した腫瘍の Ki67 は、コントロールと比較して併用群では最も抑制されていた。全身毒性の指標として治療中のマウスの体重測定を施行したが、明らかな体重減少は認められなかった。
【考察】 本研究において、GSI と放射線照射併用は単独治療と比べて Notch 発現肺癌細胞に対して高い有効性を示した。併用治療スケジュールの検討を行ったところ、放射線照射後に GSI を投与する逐次併用療法が最も有意な抗腫瘍効果を認めた。放射線照射後の Notch pathway の活性化が放射線抵抗性の 1 つの要因であり、放射線照射後に GSI を投与することが、照射により活性化した Notch pathway を抑制し、より高い抗腫瘍効果を示すと考えられた。
併用治療群ではアポトーシス細胞数が有意に増加し、PARP の発現が誘導された。このことは、併用治療群の抗腫瘍効果がアポトーシスを介していることを示唆している。また、併用群では単独群と比べ、生存促進蛋白の p-ERK や抗アポトーシス蛋白の p-Bcl-2 と Bcl-xL が抑制されており、以上の結果は、GSI または放射線が Bcl-2 ファミリーを含むアポトーシス経路を活性化するという、過去の報告に矛盾しない。Bim は Bcl-2 のサブファミリーに属する BH3-only 蛋白であり、我々は肺癌において Notch3 を介したアポトーシスは Bim 依存的であることを報告してきた。本研究では、併用治療が Bim を介したアポトーシスにより肺癌細胞の増殖が抑制されることを示した。このため、肺癌治療において Notch pathway の他にも、MAPK pathway や Bcl-2 pathway など様々な分子が治療のターゲットとなりうる可能性が示唆された。
GSI は Notch 以外の膜貫通蛋白にも作用することが報告されている。そのため、併用効果のNotch 依存性について Notch3 siRNA を用いて検討したところ、GSI 単独群と併用群においてNotch3 siRNA 群でアポトーシス細胞が有意に低下しており、Notch 依存性であると考えられた。
さらにマウスモデルにおいても併用治療はより高い腫瘍抑制効果を認めた。GSI の臨床試験における制限毒性の 1 つが水様性の下痢であるが、今回の併用治療では重篤な副作用発現は認められず放射線との併用は認容性が高いと考えられた。
【結論】 本研究は、肺癌に対する GSI と放射線との併用効果の有用性に関する最初の報告である。
現在、GSI を用いた固形癌の臨床試験は肺癌を含め、乳癌、中枢神経系の悪性腫瘍を中心に進行している。今回の我々の結果から GSI 単独もしくは放射線単独では肺癌に対する治療効果はある程度限られており、両者を併用することで更なる抗腫瘍効果が認められた。このことから本治療が新たな肺癌の治療法となる可能性が示唆された。