学位論文内容の要旨
博士の専攻分野の名称

博士（医 学）氏 名丸 晋太朗

学 位 論 文 題 名Impact of mTORC2-HIF-2α signaling pathway on the regulation of E-cadherin
expression and cell motility in renal cell carcinoma（腎癌細胞における E-cadherin 発現および細胞運動能に及ぼす mTORC2-HIF-2α シグナ
ルの重要性に関する研究）【背景・目的】腎細胞癌は病理学的所見から淡明細胞型腎細胞癌と非淡明細胞型腎細胞癌の 2 つに大別され、淡明腎細胞癌は腎癌全体の約 75-80%を占めている。淡明腎細胞癌が生じる原因のひとつに Von Hipple-Lindau(VHL)遺伝子の欠損があり、VHL 遺伝子は通常酸素下において hypoxia-inducible factor (HIF)の分解に関与している。従って VHL 遺伝子を有する細胞では、通常酸素下で HIF の活性は極めて低い。しかしながら、VHL 遺伝子の欠損した淡明腎細胞癌においては、転写因子である HIF が恒常的に維持されている。局所腎細胞癌の治療は根治的摘除術が第一選択であるが、転移を有する進行性腎細胞癌に対しては分子標的治療薬 mTOR 阻害剤(everolimus, temsirolimus)が広く使用されている。mTORは mTORComplex1 (mTORC1)と Complex2 (mTORC2)からなるが、既存の mTOR 阻害剤は mTORC1 阻害による細胞増殖抑制効果と血管新生阻害効果が報告されている。一方、
mTORC2 も腎癌の進展に重要である事が示唆されているが、まだそのメカニズムは十分に解明されていない。近年 mTORC2 シグナルの下流にある HIF-2α の活性化により癌細胞のE-cadherin の発現抑制が起こることが報告されている。E-cadherin は上皮細胞における代表的な細胞間接着因子であり、その発現の減弱・消失が癌の悪性度や転移と相関する。我々は、mTORC2- HIF-2α 経路の阻害が腎癌細胞の E-cadherin の発現や細胞の運動能に及ぼす効果を解析するとともに、mTORC2 が腎癌治療の新たなターゲットとなりうるか検討を加えた【方法】1) VHL を導入した腎がん細胞株 RCC4/VHL を指標として、VHL 欠損腎がん細胞株 RCC4 および 786-O について E-cadherin の発現と局在を real time-PCR 法、Westernblot 法、免疫蛍光染色法にて検討し、time-lapse 顕微鏡にて個々の細胞の運動能を検討した。2) VHL 欠損細胞株 786-O において、作用機序の異なる mTOR 阻害剤、Rapamycin(mTORC1 阻害剤)および PP242 (mTORC1C2 阻害剤)を用いて、用量時間依存性によるE-cadherin の発現変化を real-time PCR 法、Western blot 法で検討し、その局在を免疫蛍光染色法で確認した。また time-lapse 顕微鏡と wound healing assay を用いて、細胞の運動能と遊走能を検討した。
【結果】1) RCC4/VHL 細胞が HIF-2α の発現低下および細胞の junction に E-cadherin の発現を認めるのに対し VHL 欠損腎がん細胞株 RCC4、786-O 細胞では、HIF-2α の発現亢
進と E-cadherin の発現低下を認めた。また time-lapse 顕微鏡にて細胞の移動距離を測定す
ると、RCC4/VHL 細胞に比較して、RCC4 および 786-O 細胞では、細胞の移動距離が有意に長く、運動能が亢進していた。 従って VHL 欠損腎がん細胞株 RCC4 と 786-O では、HIF-2α の発現亢進と E-cadherin の発現低下を認め、RCC4/VHL 細胞に比べて運動能が亢進している事を確認した。 2) 786-O 細胞に対して 0.05～0.5μM の PP242 で処理すると、HIF-2α の発現低下に伴い、用量依存的に E-cadherin の蛋白/遺伝子レベルでの発現が確認され 0.5μM で有意に増強した。また PP242 を同濃度で 8,16,24 時間作用させると、時間を追って E-cadherin の発現が増加し 24 時間で有意に増強した。さらに PP242 投与により免疫蛍光染色にて細胞の junction に E-cadherin の局在が確認された。一方、rapamycin 投与ではこれらの効果を認めなかった。また 786-O 細胞の移動距離を測定すると PP242 投与群では rapamycin 投与群に比べて有意に移動距離が短く、運動能の低下を認めた。さらに
創 傷 治 癒 面 積を 比 較 する と PP242 投 与群 では 濃 度 依 存 的に 治 癒 面積 が 抑 制 さ れ、rapamycin 投与群に比べて遊走能も低下している事が明らかとなった。
【考察】mTORC1 は数多くの癌腫を活性化している事で知られる phosphatidylinositol3-kinase (PI3K)/Akt 経路により活性化されており、mTORC1 は癌治療の標的分子として優れていると考えられている。
しかしながら mTORC1 の下流に存在する S6K1 は PI3K/Akt経路を負のフィードバックで抑制しており、mTORC1 の持続的な阻害は、PI3K/Akt 経路の活性化を誘導してしまうという欠点がある。それに対して近年 mTORC2 は直接的に Aktをリン酸化することで Akt 活性を完全に制御出来る事が報告された。それゆえ癌治療における mTORC2 の制御の重要性が認識されはじめている。PP242 は mTORC2 の Akt リン酸化を阻害する作用があり、mTORC2 および Akt の下流に存在する mTORC1 の両方の制御を可能にしている事から、今後臨床応用が期待される。我々の研究では 786-O 細胞株への PP242 投与は E-cadherin の遺伝子および蛋白レベルでの発現増強を認め、これらの効果は HIF-2α の抑制に付随するものと考えられる。遺伝子操作により HIF 活性を抑制する
事 で E-cadherin の 発 現 が 増 強 す る 事 は 、 近 年 明 ら か と な っ て お り 、 我 々 の 実 験 は
mTORC1/C2 阻害剤 PP242 投与による HIF-2α の抑制が E-cadherin の発現を増強させ、薬剤の使用によっても同様の結果であった事を証明した。また我々の研究はmTORC2/HIF-2α 経路の抑制が 786-O 細胞の運動能や遊走能も抑制し得る事を証明した。
E-cadherin の制御は細胞の運動能や腫瘍増殖および転移に密接に関連する事が知られている。また E-cadherin の発現は予後にも影響しており、E-cadherin の発現が低下した腎細胞癌患者は予後が悪かったとの報告もあり、PP242 投与による E-cadherin の発現増強には腫瘍の増殖や転移を抑制する可能性がある。
【結論】我々の研究は mTORC2、HIF-2α そして E-cadherin の経路を制御する事で細胞の接着能を亢進させ細胞の運動能を抑制するという観点から、進行性腎細胞癌治療における新規治療戦略の基礎になり得ることを示した。それゆえに mTORC2 は腎細胞癌の浸潤や転移を抑制するための重要な標的であると言える。さらに mTORC1/C2 阻害剤は cadherinを制御する薬剤として進行性腎細胞癌における新規治療戦略のひとつになる可能性がある。