Application Note

アジレント miRNA マイクロアレイを用いた exosomal miRNA の発現差解析
筆者

福岡 弥生

小髙 アラン

アジレント・テクノロジー株式会社
診断・ゲノミクス部門

要旨

近年、血液など体液に含まれる核酸は侵襲性の低いバイオマーカーとして期待されています。中でも血液中のエクソソームに含まれる miRNA は分解されにくく、エクソソーム自体が細胞間の情報のやり取りを担っていることから、疾患の進行状態や老化などに関与しているとして注目を集めています。

アジレント miRNA マイクロアレイは、RNA の逆転写や増幅を行わずに、サンプル中に含まれる miRNA を直接ラベル化・ハイブリダイズし検出します。高い再現性・広いダイナミッ
クレンジで miRNA を検出できますが、組織あるいは細胞由来 miRNA を対象に開発されました。そこで前アプリケーションノートでは、血清から抽出したエクソソーム由来 RNA に含まれる miRNA をアジレントの電気泳動装置バイオアナライザで評価し、アジレントmiRNA マイクロアレイで検出できることを示しました。

本アプリケーションノートでは、マイクロアレイでの解析に必要な血清量の検証を行い、さらに市販の肺癌患者および健常者の血清からエクソソーム由来 RNA を抽出しマイクロアレイでの発現差解析を行いました。その結果、血清量に応じてマイクロアレイのシグナル強度が変化すること、2 mL の血清サンプルから解析に十分な数の miRNA を検出でき、バイオロジカルな発現差解析が可能なことが示されました。

はじめに体液中に含まれる細胞外小胞のうち、直径 100 nm 前後の小胞がエクソソームと呼ばれています。近年、エクソソームに内包されている様々な RNA が、細胞間の情報伝達を担っていることが報告されています（ Takahashi RU. et al., 2017 ）。中でもがんにおいては、がん細胞から放出されたエクソソーム由来 miRNA が他の細胞に作用し、腫瘍化や転移、薬剤耐性の獲得に関与することが報告され注目が集まっています。

体液由来あるいはエクソソーム由来 miRNA は、分解されづらく侵襲性の低いマーカーとしても期待されていますが、生体内のメカニズムは未だ解明途中で、これからの解析に期待が持たれています。一方でエクソソーム由来 miRNA は、分光光度計を使用した測定方法では定量できないほど微量である等、実験面での難しさがあります（ Garcia-Elias A. etal., 2017 ）。前報のアプリケーションノート（ 5991-7468JAJP ）では、アジレントバイオア
ナライザや miRNA マイクロアレイで、エクソソーム由来 miRNA を検出可能であることを示しました。本アプリケーションノートでは、解析に用いる miRNA 数を検出するには、どのぐらいの量の血清が必要かを検証し、さらに健常人と肺がん患者のエクソソーム由来miRNA で発現差解析を試みました。

実験RNA 抽出

健常人 3 名分（ A~C、白人女性、70 歳代）および肺がん患者 3名分（ D~F、白人女性、70 歳代）の血清を PromedDx 社から購入し、株式会社 DNA チップ研究所にてエクソソーム由来 RNA を抽出しました。夾雑物を除くため、–80℃にて保存されていた血清 を融 解 後、 φ 0.22 µm のフィルター でろ過し、exoRNeasy
Maxi kit（ Qiagen P/N 77064 ）を用いて、RNA を抽出しました。
抽出はメーカー推奨プロトコルに従いました。健常人 A の血清サン
プルは 3.7 mL（ n=2 ）、2.0 mL（ n=3 ）、1.0 mL（ n=3 ）の血清サンプルから抽出し、マイクロアレイで検出される miRNA 数の検証に用いました。発現差解析には、健常人及び肺がん患者計 6 人の血清サンプル 2.0 mL から RNA 抽出を行いました。肺がん患者 Fのみ 1.0 mL からも抽出を行いました（サンプル G ）。

バイオアナライザでの電気泳動

溶 出した サンプル 溶 液 1.5 µL を 72 ℃ 2 分 で 熱 変 性した 後、Agilent 2100 バイオアナライザおよび RNA 6000 ピコ キット（ Agilent, 型番 5067-1513 ）を用いて RNA の電気泳動を行いました。RNA Pico キットでの泳動は、RNA 抽出時のバッファや塩等サンプル溶液の影響を受けやすいため、ポジティブコントロールとして Universal Human miRNA Reference RNA（ Agilent, 型番 750700 ）もチップごとに泳動しました。

サンプルの濃縮抽出した RNA はバイオアナライザでの泳動に用いた残り 10 µLの溶液を濃縮遠心機で濃縮し、Nuclease Free Water（ Thermo
Fisher Scientiﬁc, P/N 10977015 ）で 9 µL に 調 製 し ま し た。
miRNA マイクロアレイには濃縮後のサンプルを用いました。

2マイクロアレイ実験

miRNA マイクロ アレイ実 験 は、Input RNA 量 以 外 は Agilent
miRNA microarray protocol Version 3.1.1 August 2015
（ G4170-90011 ）の和文プロトコルに従いました。アジレント
miRNA マイクロアレイのプロトコルでは、吸光度測定結果をもとに Total RNA 100 ng をラベル化に用いますが、本検討では濃度に関わらず、濃縮遠心後の溶液から 2 µL をラベル化反応に用いました。

マイクロアレイ実験に問題が生じた際、サンプル由来の影響かどうかを判断するため、9 種のヒト組織および細胞由来の Universal
Human miRNA Reference RNA（ Agilent, 型 番 750700 ）100ng をポジティブコントロールとして、エクソソーム由来 RNA と同時にラベル化反応を行い、1 スライドごとに 2 アレイずつハイブリダイズしました。

miRNA Complete Labeling and Hyb キ ッ ト（ Agilent, 型 番5190-0456 ）を用いてラベル化を行う際、各 RNA サンプルにはmicroRNA Spike In キット（ Agilent, 型番 5190-1934 ）に含まれる Labeling Spike-In を添 加しました。またラベル 化 反 応 後、Hyb Spike-In を 添 加 し、2x Hi-RPM Hybridization Buffer と10x GE Blocking Agent を加えた後に 3 スライドの SurePrint G3
Human miRNA マイクロアレイ 8 × 60K Rel.21.0（ Agilent, 型番 G4870C ）に 55 ℃で 20 時間、20 RPM でハイブリダイゼーションしました。マイクロアレイは洗浄後、SureScan マイクロア
レイスキャナ（ Agilent, 型番 G4900DA ）でスキャンし、スキャナ付属の Feature Extraction ソフトウェアで数値化を行いました。ス
ポット位置の自動認識がずれたデータは、マニュアルでスポット位置の修正を行いました。

数値化データの発現差解析には GeneSpring GX（ Agilent ）を用いました。

結果と考察スタート血清量の検証

1.0~3.7 mL の血清から exoRNeasy Maxi kit で抽出したエクソソーム由来 RNA をバイオアナライザで泳動すると、small RNA領域にピークが見られた一方、高分子にもスメアなピークが観察されました（ Fig.1、3.7 mL の血清データはアプリケーションノー
ト 5991-7468JAJP より抜粋）。泳動結果からは small RNA あ
るいは miRNA のみの定量は難しい点、アジレント miRNA マイク
ロアレイは成熟 miRNA のみを検出する原理である点から、RNA量の調整は行わず、いずれのサンプルでも 2 µL をマイクロアレイのラベル化に用いました。プロトコルに従い、ハイブリダイゼーションおよびスキャン、数値化を行い得られたデータの評価を行いました。エクソソーム由来 miRNA は量が少なく、マイクロアレイのシグナル強度が低くなるため、99 percentile のシグナル強度を確 認しました。 ポ ジティブコントロ ール の Universal Human
miRNA Reference RNA（ UR ）と比 べると、エクソソーム由 来miRNA サンプルは、シグナル強度は低くなるものの、スタートの血 清 量が多い方がシグナル強 度が高くなる傾 向がありました（ Fig.2、左軸）。

またマイクロアレイ実験評価の目安の 1 つとなるアレイ内再現性（ CV% ）を観察しました。その結果、全体のシグナル強度が低い
1 mL スタート時でも、ポジティブコントロールの UR と同等で、目安となる 15％未満となり、本検討では CV% はスタート血清量に依存せず、良好であることが示されました（ Fig.3 ）。
ノイズと区別して検出された miRNA の数は、同一スタート量の繰り返し実験間で同等であり、スタート血清量に応じて多くなりました（ Fig.2、右軸）。これらのことから、エクソソーム由来 miRNAの検出は、シグナル強度は低いものの安定した結果が得られることが示されました。

3.7 mL

3.7 mL

2 mL

2 mL

1 mL

1 mL

Fig.1 1 ～ 3.7 mL の血清由来 RNA の泳動図（バイオアナライザ RNA 6000 ピコアッセイ）

2145, 718
16.0

Detected miRNA 数

Fig.2 各アレイの 99 percentile のシグナル強度と検出された miRNA 数
UR：Universal Human miRNA Reference RNARRUULm
7m

L
3.

L

73.

m
2Lm

L

2L0m

1Percentile 99.0

2.0

204.0m0.0
UR30m
L1m
L
1m
L
2m
L2m
L
2m
3. L
7m
L
3.
7m
L
UR

5.0

6.0

L

60

8.0

1

10.0

10.0

L

90

12.0m

120

15.0

14.0

1150m

20.0

1180

検出された miRNA の数

99 percentile のシグナル強度

1626, 653

Fig.3 同じ配列のプローブから算出されるアレイ内再現性（ CV% ）3

99 percentile のシグナル強度

安定してマイクロアレイのデータが得られることが示されたので、2 mL の血清からRNA を抽出し、miRNA の発現差解析を
行 い ま し た。 健 常 人 3 人（ normal,A~C ）お よ び 肺 が ん 患 者 由 来 3 人（ cancer, D~F ）、スタート血清量の違いを観察するため、F のみ 1 mL での抽出
デ ー タ も 取 得 し ま し た（ G ）。99
percentile の シグナル 強 度 は、cancer
サンプル の 方 が シグナル 強 度 が 高く、miRNA の発現量が多いことが示唆されました（ Fig.4、左軸）。シグナル強度同様、ノイズと区別して検出された miRNA 数
は、cancer サンプルの方が多くなりました（ Fig.4、右軸）。F と同一の血清サンプ
ルを半量用いた G の 99 percentile シグ
ナル強度は、F の半分程度となり、検出
miRNA 数は、F と比べて減少しました。
クラスタリング解析を行うと、血清量の違い（ F および G ）よりもサンプル種の差が顕著となり、病態の差が検出されている
こ と が 示 唆 さ れ ま し た（ data notshown ）。

140.0

300

120.0

250

100.0

20080.015060.010040.050

20.00.0ABCDEFG
normal normal normal cancer cancer cancer cancer
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
Percentile 99.0

Fig.4 各アレイの 99 percentile のシグナル強度と検出 miRNA 数

またバイオロジカルレプリケートの再現性を確認すると、発現している miRNA の大部分が中心線に沿ったプロットとなり（ Fig.5 ）、normal 内、cancer 内それぞれで再現性のあるデータが得られていることを確認しました。

マイクロアレイで発現差解析をする際、実験誤差を補正するためアレイ間の補正を行うことが一般的です。アジレントは組織あるいは細胞株由来の total RNA を使用した場合は、各 miRNA マイクロアレイの 90 percentile で補正することを第一候補としていますが、エクソソーム由来RNA を解析した本検討では、アレイ全体のシグナル強度が低く 90 percentile のシグナル強度もノイズレベルとなりました。
血清由来 RNA をマイクロアレイで解析する際に、アレイ間補正に用いられている複数の miRNA は（ Shimomura A. et al.,2016 ）、本検討ではノイズレベルあるいは normal と cancer 間で発現差があり、アレイ間の補正には使用できませんでした。体液由来 RNA のアレイ間補正は議論が続いており、未だエクソソーム由来RNA 解析時のコントロールとして使用できる miRNA の報告はありません。本検討では、 同 一のがん患 者の血 清 2 mL

4Detected miRNA 数

Fig.5 サンプル A~C および D~F のスキャタープロット
赤枠内がバイオロジカルレプリケート0

検出された miRNA の数

マイクロアレイによる発現差解析

あるいは 1 mL から抽出したエクソソーム由来 miRNA をスキャタープロットで比較すると、ほぼ 1/2 のラインに沿ってプロットされ、抽出血清サンプルの量がマイクロアレイでのシグナル強度にある程度反映されていることが示されました（ Fig.6 ）。がん組織ではエクソソームの放出が増えるという報告があること（ Bhome
R. et al., 2018 ）、抽出血清量を 2 mL と統一していることから、本検討では検出 miRNA 数の差自体を病態の差とみなし、アレイ間補正を行わずに発現差解析を行うこととしました。

GeneSpring GX を用い、normal A~C および cancer D~F の発現差解析を行いました。2 群のうち、どちらか 3 データ全てでノイズと区別して発現が検出された miRNA から、volcano plot 機能で（ T Test unpaired, corrected p-value cut-off < 0.05, Foldchange > 2.0 ）、185 個の miRNA で発現差が検出され、184個が cancer で発現が上昇していました（ Fig.7 ）。この 184 個のmiRNA を Table1 にまとめました。miR-150-5p は唯一発現がCancer F

下がり、予測ターゲット遺伝子には、がんへの関与が報告されている MYB や MDM4 などの転写因子が含まれていました。

cancer で発現が上昇した miRNA のうち miR-6794-5p や miR4476 は肺がん患者での発現上昇が報告されています（ Dejima H.
et al., 2017 ）。 ま た miR-3195、miR-4459 や miR-1273g-3p
は他の miRNA と合わせて卵巣がんのマーカー候補となっています（ Yokoi A. et al., 2018 ）。

Cancer G

Fig.6 同一個人の 2 mL（ F ）または 1 mL（ G ）の血清から抽出したエクソソーム由来 miRNA のスキャタープロット
Log10 signal intensity without normalization
緑のライン：中心線および 2 倍の差

Cancer

GeneSpring の TargetScan 機能を使用して、発現が上昇した
184 個の miRNA がターゲットとしている遺伝子を予測しました。
2073 遺伝子がターゲット候補として検索され、さらにそれらの遺伝子を GeneOntology 解析したところ、各種 Develotment の他、

miR-4459
miR-4459

ニューロン新生などに関わる遺伝子をターゲットとしている傾向が見られました（ Table 2 ）。

miR-1273g-3p

miR-6794-5p
miR-4476

miR-3195

miR-150-5p

NormalFig.7 健常者およびがん患者の発現差解析。
Log10 signal intensity without normalization
赤ドット：発現差がコールされた 185 個の miRNA5Table 1. 発現差がコールされた 184 個の miRNAhsa-miR-30c-2-3p

hsa-miR-1207-5p

hsa-miR-3679-5p

hsa-miR-4669

hsa-miR-6090

hsa-miR-6819-5p

hsa-miR-134-5p

hsa-miR-1225-5p

hsa-miR-3911

hsa-miR-4673

hsa-miR-6124

hsa-miR-6821-5p

hsa-miR-135a-3p

hsa-miR-1229-5p

hsa-miR-3940-5p

hsa-miR-4687-3p

hsa-miR-6125

hsa-miR-6826-5p

hsa-miR-150-3p

hsa-miR-1236-5p

hsa-miR-3960

hsa-miR-4707-3p

hsa-miR-6126

hsa-miR-6829-5p

hsa-miR-187-5p

hsa-miR-1249-5p

hsa-miR-4270

hsa-miR-4716-3p

hsa-miR-6127

hsa-miR-6831-5p

hsa-miR-188-5p

hsa-miR-1268a

hsa-miR-4271

hsa-miR-4739

hsa-miR-6165

hsa-miR-6833-5p

hsa-miR-197-5p

hsa-miR-1268b

hsa-miR-4281

hsa-miR-4741

hsa-miR-6510-5p

hsa-miR-6848-3p

hsa-miR-198

hsa-miR-1273f

hsa-miR-4298

hsa-miR-4745-5p

hsa-miR-6722-3p

hsa-miR-6850-5p

hsa-miR-320chsa-miR-1273g-3p

hsa-miR-4306

hsa-miR-4763-3p

hsa-miR-6723-5p

hsa-miR-6865-5p

hsa-miR-328-5p

hsa-miR-1275

hsa-miR-4314

hsa-miR-4767

hsa-miR-6724-5p

hsa-miR-6867-5p

hsa-miR-483-5p

hsa-miR-1471

hsa-miR-4327

hsa-miR-4778-5p

hsa-miR-6727-5p

hsa-miR-6869-5p

hsa-miR-514b-5p

hsa-miR-1587

hsa-miR-4419a

hsa-miR-4785

hsa-miR-6728-5p

hsa-miR-6875-5p

hsa-miR-516a-5p

hsa-miR-1908-3p

hsa-miR-4429

hsa-miR-4787-3p

hsa-miR-6740-5p

hsa-miR-6879-5p

hsa-miR-557

hsa-miR-1915-3p

hsa-miR-4433a-3p

hsa-miR-4787-5p

hsa-miR-6745

hsa-miR-6891-5p

hsa-miR-630

hsa-miR-2392

hsa-miR-4442

hsa-miR-4788

hsa-miR-6749-5p

hsa-miR-6893-5p

hsa-miR-638

hsa-miR-2861

hsa-miR-4443

hsa-miR-4800-5p

hsa-miR-6752-5p

hsa-miR-7106-5p

hsa-miR-642a-3p

hsa-miR-3074-3p

hsa-miR-4459

hsa-miR-5006-5p

hsa-miR-6756-5p

hsa-miR-7107-5p

hsa-miR-642b-3p

hsa-miR-3135b

hsa-miR-4463

hsa-miR-5100

hsa-miR-6763-5p

hsa-miR-7108-5p

hsa-miR-652-5p

hsa-miR-3138

hsa-miR-4466

hsa-miR-5195-3p

hsa-miR-6768-5p

hsa-miR-7109-5p

hsa-miR-671-5p

hsa-miR-3141

hsa-miR-4476

hsa-miR-5585-3p

hsa-miR-6775-5p

hsa-miR-7110-5p

hsa-miR-711

hsa-miR-3162-5p

hsa-miR-4484

hsa-miR-5703

hsa-miR-6780b-5p

hsa-miR-7150

hsa-miR-718

hsa-miR-3195

hsa-miR-4499

hsa-miR-5739

hsa-miR-6785-5p

hsa-miR-7641

hsa-miR-762

hsa-miR-3196

hsa-miR-4505

hsa-miR-5787

hsa-miR-6789-5p

hsa-miR-7704

hsa-miR-765

hsa-miR-3202

hsa-miR-4507

hsa-miR-6068

hsa-miR-6791-5p

hsa-miR-7845-5p

hsa-miR-937-5p

hsa-miR-3610

hsa-miR-4516

hsa-miR-6071

hsa-miR-6794-5p

hsa-miR-7846-3p

hsa-miR-939-5p

hsa-miR-3620-3p

hsa-miR-4530

hsa-miR-6076

hsa-miR-6800-5p

hsa-miR-7847-3p

hsa-miR-1181

hsa-miR-3648

hsa-miR-4532

hsa-miR-6085

hsa-miR-6803-5p

hsa-miR-8063

hsa-miR-1183

hsa-miR-3656

hsa-miR-4534

hsa-miR-6086

hsa-miR-6808-5p

hsa-miR-8069

hsa-miR-1185-1-3p

hsa-miR-3663-3p

hsa-miR-4634

hsa-miR-6087

hsa-miR-6809-5p

hsa-miR-8072

hsa-miR-1185-2-3p

hsa-miR-3665

hsa-miR-4655-3p

hsa-miR-6088

hsa-miR-6812-5p

hsa-miR-1202

hsa-miR-3667-5p

hsa-miR-4667-5p

hsa-miR-6089

hsa-miR-6819-3p

Table 2. GeneOntology 結果（上位 15 個）

GO ACCESSION

GO Termp-value

corrected p-value

GO:0048731

system development

1.25538E-30

1.51032E-25

GO:0007399

nervous system development

6.07322E-29

3.65326E-24

GO:0007275

mµLticellµLar organism development

1.42849E-27

5.72861E-23

GO:0048856

anatomical structure development

1.48083E-26

4.45387E-22

GO:0032502|GO:0044767

developmental process

2.77794E-25

6.68414E-21

GO:0097458

neuron part5.57105E-23

1.11706E-18

GO:0045202

synapse1.24013E-22

2.13138E-18

GO:0044456

synapse part2.40977E-21

3.62392E-17

GO:0030054

cell junction

3.43148E-21

4.58702E-17

GO:0005515|GO:0001948|GO:0045308

protein binding

5.26826E-21

6.33811E-17

GO:0023051

regµLation of signaling

2.6237E-20

2.86955E-16

GO:0003674|GO:0005554

molecµLar_function

1.69804E-19

1.70239E-15

GO:0005488

binding2.1747E-19

2.01256E-15

GO:0048522|GO:0051242

positive regµLation of cellµLar process

1.77038E-18

1.52135E-14

GO:0022008

neurogenesis

3.87768E-18

2.91571E-146

まとめ

参考文献とが可能です。

Garcia-Elias A. et al., Defining quantification methods andoptimizing protocols for microarray hybridization ofcircµLating microRNAs. Sci Rep. 2017 Aug 10;7 (1) :7725.

Small RNA-seq での解析は、ライブラリ調製が煩雑、miRNA 以
外 の small RNA も多 数 検 出 されるという課 題 が あります が（ Buschmann D. et al., 2018 ）、アジレント miRNA マイクロア
レイは迅速に簡便に実験ができ、成熟 miRNA だけを検出するこ
前 報でアジレント miRNA マイクロアレイでエクソソーム由 来miRNA を検出できることを示しました。本検討では、抽出する血清量がマイクロアレイのデータに影響を与えるため、比較するデータ間で抽出血清量を統一したほうが良いことが示されました。さらに、がんサンプルでは健常者に比べ検出される miRNA が多いことがわかりました。本検討ではがん患者および健常者間で優位なシグナル強度の違いが観察されたため、アレイ間補正を行わずに発現差解析を行いました。その結果、がんに関連すると報告のある miRNA 含め複数の miRNA で発現差が見られ、マイクロアレイでエクソソーム由来の miRNA の発現差を解析できることが示されました。

Takahashi RU. et al., The role of extracell µ Lar vesicle
microRNAs in cancer biology. Clin Chem Lab Med. 2017 May
1;55 (5) :648-656.

Shimomura A. et al., Novel combination of serum microRNAfor detecting breast cancer in the early stage. Cancer Sci.
2016 Mar;107 (3) :326-34.
「アジレント miRNA マイクロアレイおよびバイオアナライザを用いた exosomal miRNA の検出」5991-7468JAJP

Bhome R. et al., Exosomal microRNAs (exomiRs) : Small
molecµLes with a big role in cancer. Cancer Lett. 2018 Apr
28;420:228-235.
Dejima H. et al., Exosomal microRNA in plasma as a noninvasive biomarker for the recurrence of non-small cell lungcancer. Oncol Lett. 2017 Mar;13 (3) :1256-1263.
Yokoi A. et al., Integrated extracellµLar microRNA proﬁlingfor ovarian cancer screening. Nat Commun. 2018 Oct 17;9(1) :4319.
Buschmann D. et al., Evaluation of serum extracell µ Lar
vesicle isolation methods for profiling miRNAs by nextgeneration sequencing. J Extracell Vesicles. 2018 Jun 4;7 (1):1481321.
謝辞

本アプリケーションノートの作成にあたり、株式会社 DNA チップ
研究所の上田様、石澤様には RNA の抽出を始め多大なご協力を頂きました。ここに感謝の意を表します。

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［ お問い合わせ窓口 ］
アジレント・テクノロジー株式会社
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