無脊椎動物視物質の X 線結晶構造解析
Crystallographic Study of Invertebrate Rhodopsin
名古屋大学
派遣期間
研究機関
研究指導者

村上 緑
2016 年 4 月 3 日～2017 年 3 月 23 日
Laboratory of Biomolecular Research, Paul Scherrer InstitutVilligen PSI, 5232 Villigen, Switzerland
Prof. Gebhard F. X. Schertler

The extraordinary properties of a new X-ray source using a Free-Electron Laser with a brilliance three orders ofmagnitude higher than what is achieved at synchrotrons, a very short pulse duration and a high spatial coherence incombination with a pump probe laser make it possible to perform time-resolved serial femtosecond crystallography which
will allow us to make a 3-D movie of photo-sensitive protein conformational changes upon photo-activation. Uponabsorption of light the photo-cycle of squid rhodopsin proceeds Rhodopsin -> Batho -> Lumi -> LM, and then its photoproduct Acid Meta form has an absorption maximum in visible light with protonated retinylidene Schiff base and can be
hit back to the initial state by absorbing a photon again.

In addition, in contrast to vertebrate rhodopsins, which havedeveloped evolutionally as an ultimate photo-sensor, other rhodopsins have developed to obtain functional diversity as
well as vision. In this study we have tried to crystallization of squid rhodopsin in the dark and photo-activated acid-metastates, which are suitable for SFX experiments. It promises to elucidate some common structural features in the activation
mechanism of rhodopsins and GPCRs, and some distinct components contributing for their divergent functions.

研究目的

ロドプシンが多数発見されつつあり、また、ウシロ

視物質ロドプシンは網膜視細胞に存在する光受容ドプシンの Gt 蛋白質（トランスデューシン）の活膜蛋白質で、7 本膜貫通 α ヘリックス構造を特徴と性化効率は極めて高いのに対し、無脊椎動物のロドする G 蛋白質共役型受容体（GPCR）のメンバーでプシンが共役する Gq 蛋白質は多くの一般 GPCRある。膜内に含まれる発色団レチナールが光を吸が共役し、また活性化効率も同程度に高くない。こ収すると、蛋白質全体の構造が変化し細胞質側表面れらのことから、無脊椎動物ロドプシンの光活性に結合した G 蛋白質へと光情報が伝えられ、視細化にともなう構造変化や情報伝達の様式が多種多様胞を興奮へと導く。ロドプシンは網膜から大量調製な脊椎動物視物質以外のロドプシン群および一般可能であることから、世界中でウシロドプシンを標

GPCR と共通であると考えられ、注目が高まってい準試料として徹底的に構造機能解析がなされている。

る。

一方、無脊椎動物のロドプシンの光活性化メタ状態

われわれはイカロドプシンを脊椎動物視物質以外のは生理的条件下で安定であり、さらに光子を吸収多くのロドプシンタンパク質のモデルとして捉え、し基底状態へと戻る双安定性を示す（図１）。これは構造生物学的観点からロドプシンの光活性化機構を活性化過程を追跡する上で大変有利であるにもか解明することを目標に X 線結晶構造解析に取り組かわらず、大量培養系が確立されていないこともあんできた。これまでに暗順応状態の構造を決定し、り無脊椎動物ロドプシンを用いた構造機能連関研究

低温トラップ法にて反応中間体を捕捉し構造解析にはあまり進展していなかった。最近になってゲノム取り組んだ結果バソ中間体、ルミ中間体およびイソ科学の進展によりさまざまな生物で新機能を持ったロドプシン状態の構造を求めている。それらの結果

から示されたイカロドプシンの暗順応状態から熱緩追跡できるはずである。したがってこの２種を用い和した LM 状態に至るまでの光反応過程におけるて微結晶化を行った。

構造変化はレチナールや周辺残基を含む活性部位近サンプルには従来用いてきた天然のイカ眼球から単離した微絨毛膜より亜鉛存在下で界面活性剤によ傍の変化にとどまっていた。
近年 X 線自由レーザー（XFEL）の開発に伴い、放り抽出したロドプシン溶液、および微絨毛膜を可溶

射線損傷のない構造解析手法としてシリアルフェム

化し陰イオン交換カラムにより精製し濃縮したロドト秒結晶構造解析（SFX）が本格的に運用されている。

プシン溶液を用いた。アシッドメタ状態は暗順応ロ

本課題では、ウシロドプシンおよび GPCR の構造研

ドプシンにアルカリ性条件（pH10）下で青色光を照究で世界的権威であるスイスポールシェラー研究所

射しアルカリメタ状態を 100%生成させた後、アシッのシャートラー教授と共同研究を行い、先行していドメタ状態の生成率が 100%となる pH7 以下で結晶るウシロドプシンの技術をイカロドプシンにも導入化を行った。

し、SFX 実験に適した結晶を得ることを目指した。

これらの溶液を市販の結晶化スクリーニングキットを用いて蒸気拡散法にて結晶化したところ、複数研究経過の条件において１週間程で多数の結晶を得ることが１．イカロドプシン暗順応状態および光活性化状態できた。これらの溶液条件は主に PEG を沈殿剤に用の微結晶化いたものであり、高濃度硫酸アンモニウム溶液を用SFX 実験では多数の結晶を高粘度媒体に懸濁しイいた従来のイカロドプシンの結晶化条件とは異なるンジェクターから連続的に流したものに XFEL のパものであった。高塩濃度溶液を用いたウシロドプシルス光を照射する。結晶はインジェクターのノズルン結晶は SFX 実験に適さないため PEG を用いて微部分から離散的に押し出されるため、その大きさに結晶化しており、本課題で見出した条件もこれに近およそ 50 um 以下に制限される必要がある。また、

いものであった。均質化を図るためにこれらの条件結晶が高密度であればパルス光が結晶を照射するヒに基づいてバッチ法を適用し結晶化を行った結果、ット確率も高くなるが、高密度すぎるとインジェクいくつかの条件で適切な大きさ、数の微結晶を得る

ターのノズルが詰まりやすいために、ヒット確率をことができた（Figure 1）。

犠牲にしても適切な密度に調整する必要がある。したがって、SFX 実験には均質で高分解能の微結晶が２．イカロドプシンの大量発現系の構築
従来用いている天然試料では生育条件の違い、つ多数必要となる。
イカロドプシンは双安定性の光反応サイクルを示

まり捕獲した海域や月齢の違い、あるいは個体差なすので、暗順応型、光活性型の２つを始状態としてどが原因で試料が不均一となることは避けきれず結SFX 実験を行えば光反応サイクル全体の構造変化を晶化の成功率は低かった。SFX 実験においては結晶

Figure 1 SONICC images of squid rhodopsin crystalsLeft) Acid-Meta state

Right) Dark state

Figure 2 Design of Constructs

の均質化は必須であり、培養細胞に組換え蛋白質を可能性がある。また、結晶中の分子間接触により生発現させることを試みた。

理的な構造変化が観測される保証もない。無脊椎動

イカロドプシンはこれまでに発現系が構築されて物の視物質は光反応過程が双安定性を示すことから、いないので、他の無脊椎動物ロドプシンの発現系を本課題ではイカロドプシンの暗順応状態に加えてア参考にして実験を計画した。野生型イカロドプシン

シッドメタ結晶を用いることで光反応サイクルの構の全長クローンは京大の七田先生より譲渡を受け、造変化を明らかにすることを試み、微結晶を得るこ

われわれが発表したイカロドプシンの立体構造モデとができた。今後、各ステップでの条件検討を行いルを参考に遺伝子配列を設計した。揺らぎが大きい

結晶の分解能を向上させ、新たに運用を開始する

ために電子密度マップが見えなかった N、C 末端のSwissFEL で回折実験を行う予定である。

ループ領域を削除し、N 末端に翻訳を促進するとされるコザック配列を、さらに C 末端には後のロドプ研究の発表

シンの精製のためにロドプシン抗体の 1D4 タグ口頭発表(ETSQVAPA)を付加し PCR により増幅、制限酵素

1.

Murakami M, "Crystallography of squid rhodopsin

KpnI お よ び NotI に よ り 哺 乳 類 発 現 ベ ク タ ーtowards characterizing structural dynamics and bi-pcDNA3.1+に組み込んだ（Figure 2）。XL1-Blue 株にstability”, IGER International Symposium on Physics

導入し培養した後、目的遺伝子が十分に発現していof Life, Nagoya, March 25-26, 2017

ることを確認した。

2.

それぞれのコンストラクトを用いて HEK293 株にStructure and Function of squid rhodopsin", jLBR
Seminar, Villigen, March 22, 2017

導入し発現を試みたが、滞在中にはうまくいかなかった。帰国後異なる培養系を用いて発現を試みていMurakami M, "Another world of Rhodopsin;

3.

Murakami M, " Crystal structure of the LM
intermediate of squid rhodopsin", 16th International

る。

Conference on Retinal Proteins, Potsdam, October 2 7, 2016

考察最近報告された好塩菌の光駆動プロトンポンプバ

4.

Murakami M, " Crystallographic studies of squid

クテリオロドプシンの SFX 実験では光活性化により

rhodopsin", Membrane Protein Meeting, Villigen,

M 中間体での膜貫通へリックスの動きが観測されてSeptember 29, 2016

いる。視物質ではへリックスの再配置が惹起されると予想されるので、暗順応状態からメタ状態までの誌上発表

反応を結晶中で進行させるのは結晶性が損なわれるなし