Instructions for Use

SSP available in EUDAMED

380236-D
English972000b) Primers designed in the gyrB and IS region of the MTBC genome
DNA, purified from synthesized oligonucleotides by HPLC.
c) The PC MTB contains a product resulting from the in vitro
amplification of a template genome DNA of Mycobacterium
tuberculosis H37Rv (GenBank No. NC_000962 ) origin.
Abbreviations of the following reagents and Lot No., as well as
manufacturer (EKN), are printed on the containers as shown below:

Loopamp MTBC Detection Kit
INTENDED USE

Reagents

The Loopamp MTBC Detection Kit is a qualitative in vitro
diagnostic test to detect Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC)
DNA extracted from the sputum in patients with any symptom
indicative of MTBC infection. The kit aids in the diagnosis of MTBC
infection and is intended to be used in professional laboratories andhospitals by adequately trained personnel. The result can beinterpreted either by automated turbidimeter or visually under UV
irradiation.

Positive control MTB
Negative control MTB

Labelling on the tube
PC MTB
Lot No., EKN
NC MTB
Lot No., EKN

Code on the cap
PC
MTB
NC
MTB

*Metrological Traceability Information
The Positive Control is derived from the amplification product ofgenomic DNA originating from Mycobacterium tuberculosis H37Rv(GenBank No. NC_000962). The specific region of Mycobacterium
tuberculosis H37Rv, which is the target of interest, serves as the
template for the amplification of the PC MTB DNA fragment. Thisfragment is quantitated through photospectrometric analysis, and its
DNA concentration of PC MTB is adjusted at 1,000 copies/μL.

TEST PRINCIPLESThis product is based on the nucleic acid amplification method,
LAMP ( Loop-mediated Isothermal Amplification ), developed by Eiken
Chemical Co., Ltd.
The characteristics of the LAMP method are as follows: (1) only one
enzyme is required, and the amplification reaction proceeds underisothermal conditions;1),2) (2) it has extremely high specificity because of
the use of four primers recognizing six distinct regions on the target; (3)it has a high amplification efficiency and can produce a highconcentration of amplified product in a short time, which makes visual or
automated detection possible.3),4)
The primers provided with this product are designed in the DNA
gyrase subunit B (gyrB) and Insertion sequence IS6110 (IS) region of
the MTBC genome DNA, which has been confirmed by the alignment
analysis of the selected base sequences of MTBC and nontuberculous
mycobacteria to have a well-conserved base sequence in MTBC.
The DNA from untreated sputum or NALC-NaOH-treated sputum is
extracted using the Loopamp PURE DNA Extraction Kit (soldseparately). Then, the DNA solution is dispensed into a reaction tube.
The strand displacement DNA polymerase, deoxynucleotide
triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP ) , calcein, reaction buffers,
and MTBC-specific primers are stored in the dried form in the cap of thereaction tube. This dried LAMP reagent (MTBC detection reagent(dMTB)) is dissolved when the DNA solution is added. The reaction tube
is then incubated at 67.0 C, and the DNA is amplified through catalysis
by the strand displacement DNA polymerase per the LAMP reaction.
The detection of amplified products is based on the turbidity
measurement of a by-product, magnesium pyrophosphate ( white
precipitate).3) Alternatively, a visual judgment under UV irradiation canbe used instead of turbidity measurement. Before reaction, calcein in
the reagent is in the quenched state because of manganese ions boundto it; however, once the LAMP reaction is started, pyrophosphate ions
are generated and bind out the manganese ions, and calcein becomes
fluorescent.4)

WARNINGS AND PRECAUTIONS(1) For in vitro diagnostic use only.
(2) This product is designed only for clinical diagnosis of MTBC fromsputum samples of human origin. Do not use it for other purposes.
(3) When using this product, always follow these Instructions for Use.
(4) Do not freeze the reagents.
(5) Do not use any expired reagent.
(6) Do not mix different lots.
(7) Do not replenish any reagent.
(8) The performance of the Loopamp MTBC Detection Kit depends
on the operator proficiency and adherence to procedural
directions. Testing should be done by adequately trained
personnel strictly according to the instructions provided.
(9) Remove the required number of reaction tubes from the packaging
before using them and re-seal the aluminium pouch immediately.
(10) Do not remove the desiccant from the aluminium pouch. Highlevel humidity may deteriorate the dried LAMP reagent in thereaction tubes.
(11) Exposure to heat, humidity, and light might deteriorate the dMTB.
Thus, remove only the required number of reaction tubes ( sum ofsamples and controls ) and re-seal the aluminium pouch
immediately.
(12) Read the instruction manual and ensure that the required equipment(turbidimeter or incubator) is available before commencing theprocedure.
(13) Sputum samples pose a potential risk for infection. Take allnecessary preventive measures to avoid biohazard.5)(14) The PC MTB and the NC MTB contain a small amount of sodium
azide as a preservative. As sodium azide is classified as toxic,
avoid any contact with eyes, mouth, or skin.
(15) In case of accidental contact of any reagent with eyes, mouth, or
skin, immediately rinse the affected site with running water andseek medical advice.
(16) Do not dilute or add the PC MTB to the samples. Instead, use the
PC MTB only as described in this package insert to avoid DNA
contamination.
(17) Store the PC MTB and any positive sputum samples separatelyfrom the other kit reagents.
(18) The cap of each reaction tube contains the dMTB in the dried form.
Do not touch the inside of the cap.
(19) Before using the reaction tubes, check carefully if they have any
cracks or scratches. Damaged tubes might give false results andlead to DNA contamination of the incubator and work area.
(20) Do not expose reaction tubes to UV light before the end of the
LAMP reaction. Prolonged exposure to UV light might damage thetubes and lead to false results.
(21) When UV light is used for visual fluorescence judgment, do notstare directly at it. As UV light is harmful to the eyes, evenwatching for a short period can irritate eyes and cause symptoms
similar to conjunctivitis. Instead, use a glass screen or wear

KIT CONTENTS
Reagents are stable until the date on the label, assuming thecontainer remains unopened at a storage temperature of 230 C. The
reagents are also confirmed stable after opening the container whenadhered to these procedural directions.
MTBC detection reagent ······························ 2 x 48 tubes
The following reagents in the dried form are containedin each reaction tube.
Bst DNA polymerase a)
Deoxynucleotide triphosphates
Magnesium sulfate
Calcein
Manganese chloride
Primers b)
Positive control MTB (PC MTB) c) ···················· 1 x 0.4 mL
Negative control MTB (NC MTB) ····················· 3 x 0.5 mL
30 µL dropper ········································ 1 x 18 droppersa) Bst DNA polymerase derived from Bacillus stearothermophilus isa strand displacement DNA polymerase that lacks 53
exonuclease activity.

1

corresponds to approximately 30 µL.

protective goggles/glasses or a UV-blocking eye mask wheneverlooking directly at UV light.
(22) Refer to the manual of the incubator. When the HumaLoop T or
the Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A is used, remove thereaction tubes from the incubator carefully to avoid burns.

(3) Dispense 30 µL of the negative control solution into a reaction tube
using the Loopamp PURE DNA Extraction Kit and close the cap.

Note: The volume between the two lines on the reaction tube
corresponds to approximately 30 µL.
(4) Dispense 30 µL of the PC MTB into a reaction tube using theprovided dropper and close the cap.
(5) Flick (or spin) down all tubes to collect the solution to the bottomof the tubes.

WASTE DISPOSAL(1) Do not open the tubes after DNA amplification. Leave the cap
closed and dispose of the used tubes as medical waste byincineration or after double bagging with sealable plastic bags.
(2) Never autoclave or reuse the reaction tubes; else, amplified
products will disperse and cause contamination.
(3) The main material for the reaction tubes and reagent tubes is PP; forthe reaction tube tray, PET; for the aluminium pouch, aluminium; andfor the kit case, paper.
(4) Dispose of any used reagent, container, or labware per local
regulations.

Note: Ensure that the liquid level is in the middle of the twolines on a reaction tube to ensure 30 µL of pipetting.
(6) Reconstitute the dried reagents in the cap by inverting thereaction tubes and collecting the DNA solution in the cap. Leave
the tubes standing upside down for 2 minutes to reconstitute thedried reagents.
(7) Invert the reaction tubes five times to mix the content. Ensure thatthe dried reagents in the cap are fully dissolved.
(8) Flick (or spin) down all tubes to collect the solution to the bottomof the tubes.

SPECIMEN COLLECTION(1) Use the most purulent part of the sputum sample.
(2) Sputum samples should be used immediately after collection.
(3) Collect sputum in a separate room from the LAMP amplification
room. Aerosols containing the MTBC DNA can be generated
during sputum collection and may cause contamination.

Amplification
For visual fluorescence detection（ For HumaLoop T）(1) Check that the temperature on the HumaLoop T is 67.0 C.
(2) Place the reaction tubes in the HumaLoop T and press the green
button to start the LAMP reaction (40 minutes at 67.0 C). Referto the HumaLoop T instruction manual for details on how to
operate the incubator.
(3) Confirm the completion of polymerase inactivation (automaticallycompleted by the HumaLoop T). Take all reaction tubes out of the
HumaLoop T.
（ For other incubator using UV light）(1) Set the incubator temperature to 67.0 C (with hot bonnet
temperature set to 10 C above the reaction temperature or asnear to this figure as possible – temperature accuracy: 0.5 C).
(2) Place the reaction tubes, and then start amplification reaction ( for40 minutes at 67.0 C).
(3) After 40 minutes, inactivate the polymerase using the HumaHeator heating block (f or 5 minutes at 80 C or 2 minutes at 95 C) toterminate the reaction.

MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
・ Loopamp PURE DNA Extraction K it
・ Pipette-60 Set
For visual fluorescence detection(For HumaLoop T)
・ HumaLoop T(For other incubator using UV light)
・ Incubator (temperature accuracy :  0.5 C; with hot bonnet )・ HumaHeat or other heating block
・ UV light or Blue LED light (wavelength : 240260 nm and 350370
nm )・ Goggles/glasses or a UV-blocking eye mask (optional)
For real-time turbidity detection
・ HumaTurb C+A・ HumaHeat or other heating block
For reagent and sample mixing
・ Centrifuge for microtubes (optional)
・ Centrifuge for eight connected tubes (optional)・ HuMax ITA, Micro Centrifuge (optional)

For real-time turbidity detection with HumaTurb C+A （ see theflowchart of the procedure）(1) Configure the Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A for
detection with this product.
(2) Check whether the temperature displayed reaches 67.0 C( allow the turbidimeter to warm up for 20 minutes before use ).
(3) Place the reaction tubes and start measurement.
(4) Watch the turbidimeter display to check the positive and negative
controls for any increase in the turbidity. If the turbidity increases
in the positive control but does not in the negative control, theamplification reaction is proceeding correctly (Fig. 1 ). If any othersituation occurs, however, the amplification reaction might beproceeding in the wrong way. In such a case, retest the affected
samples.
(5) Confirm the completion of polymerase inactivation (automaticallycompleted by the turbidimeter ). Take all reaction tubes out of theReal-Time Turbidimeter HumaTurb C+A and discard them without
opening.

PREPARATION OF REAGENTS（1）MTBC detection reagent
Remove the required number of tubes from the aluminium pouchand place them on the rack. (sum of samples and controls).

Note: After removing the required tubes, re-seal the aluminium
pouch with any unused tubes immediately.
（2）Negative control MTB（NC MTB）
Flick (or spin) down the tube to collect the content to the bottomof the tube. Pipette 60 µL of the NC MTB into the Heating Tube
provided in the Loopamp PURE DNA Extraction Kit. Follow the
instructions for use to process the NC MTB (hereinafter extracted
NC MTB is called “negative control solution”).

Note: A negative control should be included every time.
（3）Positive control MTB（PC MTB）
Flick (or spin) down the tube to collect the content to the bottomof the tube.

Amplification plots

Note: The PC MTB should be measured every time.

Negative sample
Positive sample 1
Positive sample 2

Negative control
Positive control

Turbidity

DNA Extraction
To extract the DNA from 60 µL sputum sample, follow the
instructions for the Loopamp PURE DNA Extraction Kit ( soldseparately ). Dispense 60 µL of the sputum sample into the Heating
Tube and load it into the HumaHeat or heating block preheated at
90 C. Use the most purulent sputum whenever possible.
Reagent and Sample Mixing(1) Turn on the HumaLoop T or the Real-Time Turbidimeter
HumaTurb C+A.
(2) Dispense 30 µL of the sample solution into a reaction tube using the
Loopamp PURE DNA Extraction Kit and close the cap.

0.7

0.7

0.6

0.6

0.5

0.5

Turbidity

MEASUREMENT PROCEDURE

0.4
0.3

0.2

0.1

0.1
0
0

5

10

15

20

25

30 35 40

Ti me ( mi n.)

Fig. 1: Amplification plots for controls.

2

0.3

0.2

0

Note: The volume between the two lines on the reaction tube

0.4

0

5

10

15

20

25

30 35 40

Ti me ( mi n.)

Fig. 2: Amplification plots for samples.

as invalid, and the test should be repeated.
After confirming that the run is valid, evaluate samples as follows: Positive sample: green fluorescent light is emitted.
 Negative sample: no fluorescent light is emitted.
For real-time turbidity detection with HumaTurb C+A
After confirming that the turbidity increases in the positive control
but not in the negative control, evaluate samples per the following
criteria (Figs. 1 and 2 ).

PROCEDURAL NOTES(1) The LAMP reaction is very sensitive, and any contamination witheven small amounts of the amplified product could lead to falsepositive results.
(2) Separate the sputum collection and LAMP testing areas.
(3) Clean benches with over 0.5% sodium hypochlorite before andafter performing the test.
(4) Take all necessary measures to avoid contamination, in particular,change gloves after transferring the sputum or if the gloves comeinto contact with the DNA solution.
(5) When handling this product, avoid microbial contamination andnuclease contamination. Even a small amount of DNasetransmitted from sweat or saliva to the reaction tube might
decompose DNA and cause a false result.
(6) Do not use sputum samples containing a large amount of blood,as this may affect measurements. Refer to the “Manual of ClinicalMicrobiology, 12th edition”6) in a case requiring sample
pretreatment.
(7) The DNA solution should ideally be used immediately after
preparation; if it is impossible, the DNA solut ion can be stored atroom temperature and used within 72 hours.
(8) When dispensing the solution into the reaction tube, avoid contact
between the Injection Cap provided in the Loopamp PURE DNA
Extraction Kit and the inner wall of the reaction tubes. Hold thetube rack upright and fill the tube until the level of the DNA solution
is between the two lines (30 µL). It may influence the performance
if it is inappropriate (over the upper line or under the lower line).
(9)（For HumaLoop T or other incubator using UV light）
If bubbles are present, f lick (or spin) down the tubes to remove
them.
（For Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A）
As bubbles in the reaction solution interfere with the turbidity
measurement and cause false judgment, avoid causing any
bubble when mixing reagent and sample solution. If bubbles arepresent, spin down or flick to remove the bubbles.
(10) The dMTB should be fully dissolved. Any undissolved portion
could influence the performance, such as decreasing thesensitivity. In particular, keep the tubes standing upside down for 2
minutes.
(11) The PC MTB contains a high copy number of the control DNA.
Avoid any contamination of other samples with the PC MTB.
Dispense the samples and the negative control solution and close
all reaction tubes before dispensing the PC MTB.
(12) Flick (or spin) down the PC MTB tube before opening it to collectthe content to the bottom of the tube. Close the tube immediately
after dispensing the PC MTB.
(13) When the HumaLoop T or the Real-Time Turbidimeter HumaTurb
C+A is used, polymerase inactivation is automatically performed.
(14) For other incubators, when visual f luorescence judgment ischosen, inactivate the polymerase (for 5 minutes at 80 C or 2
minutes at 95 C) before judgment, or false judgment will becaused.
(15) For other incubators, when UV light is used, do not stare directly
at it. Instead, use a glass board or wear goggles or a protective
eye mask whenever looking at UV light.
(16) Never open the reaction tubes once the LAMP reaction has
started or after completion. Be particularly careful when taking thereaction tubes out of the incubator to avoid opening the tubes
accidentally.
(17) Do not reuse any amplif ied product in the tubes forelectrophoresis or other applications.

 Positive: some increase is observed in turbidity.
 Negative: no increase is observed in turbidity.

Notes:(1) The minimum detectable sensitivity of this product is 0.38
genomes equivalent per test. Even with a negative test, patientswith any persisting symptom indicative of infection by MTBC
should undergo re-examination.
(2) Al though the primers have been designed to target a region
containing a relatively small number of variations, MTBC might
acquire further variations in this region and become less sensitive
to this product. Hence, a negative test does not always rule out

infection by MTBC.
(3) Test resul ts could be affected by specimen collection andtransport, specimen preparation, inhibitors, and other laboratory
procedural errors. A negative test does not exclude the presenceof MTBC from the specimen. In making a clinical diagnosis,
consider the patient’s clinical condition and all other available
laboratory results.
(4) This product is a k it for qualitative detection; it is not designed forquantitative measurement. The intensity of f luorescent li ght observedor the rise time of turbidity measured by the Real-Time Turbidimeter
HumaTurb C+A does not correlate with the template DNA
concentration.

INTERFERING SUBSTANCES
Our in-house studies have revealed that measurement was notaffected by the presence of free bilirubin ( 91.0 mg/dL ), conjugatedbilirubin (101.0 mg/dL ), chyle ( formazine turbidity : 7,300 ), andhaemolytic haemoglobin ( 2,475 mg/dL ).
Regarding drugs, our in-house studies have revealed thatmeasurement was not affected by the presence of isoniazid(100 µg/mL), ethambutol (20 µg/mL), rifampicin (100 µg/mL),pyrazinamide (500 µg/mL), kanamycin (20 µg/mL), and streptomycin(500 µg/mL).

PERFORMANCE CHARACTERISTICS
1. Accuracy
In testing the following samples: negative sample (concentration: 0 genome equivalent/test ) positive sample 1 (1.875 genomes equivalent/test ) positive sample 2 (125 genomes equivalent/test )The negative sample should test negative, while the positive
samples 1 and 2 should test positive.
2. Within-run Reproducibility
In testing f ive negative and positive samples simultaneously, thenegative sample should test negative throughout, while the positive
sample should test positive throughout.
3. Limit of Detection
0.38 genomes equivalent / test
4. Cross-reactivity
Regarding nontuberculous mycobacteria (Mycobacterium
asiaticum, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium marinum,
Mycobacterium simiae, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium
szulgai,
Mycobacterium
gordonae,
Mycobacterium
xenopi,
Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium
gastri, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium malmoense,
Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium
flavescens) (1.0 x 104 genomes equivalent per test) and respiratory
disease bacteria (Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus,
Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae,
Escherichia coli, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa,
Mycoplasma pneumoniae（I）, Mycoplasma pneumoniae（II）) (1.0 x

INTERPRETATION OF RESULTS
For visual fluorescence detection(For HumaLoop T)
Place each reaction tube in the Fluorescence Detection Unit,
irradiate, and observe the tube from the side.
(For other incubator using UV light)
Irradiate the bottom of each reaction tube and observe from theside through goggles/glasses or a UV-blocking eye mask.
For a valid run, the following resu lts must be obtained: Positive Control: green fluorescent li ght is emitted
 Negative Control: no fluorescent light is emitted
I f any control is invalid, all samples in the run should be reported

105 genomes equivalent per test), the measurement system tested
negative for all bacterial species; no cross-reaction occurred.
5. Reactivity against MTBC
Reactivity against Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium3

bovis, and Mycobacterium africanum was confirmed.
6. Information about a Calibrator
The performance test for this product used the plasmid DNA
containing the gyrB and IS region of the genome DNA of
Mycobacterium tuberculosis H37Rv (GenBank No. NC_000962) asa calibrator.
7. Clinical performance
To date, tuberculosis remains one of the world’s largest infections.
Globally, the total estimated number of new tuberculosis cases isabout 10 m illion, and that of sputum smear-positive is about 4.3
m illion.7) In Japan, 24,760 patients were newly registered asaffected with tuberculosis in 2008, of whom 2,216 died.8)
This product was examined in two medical institutions
designated for Class-2 infectious diseases (designated medical
institutions that had beds exclusive for patients with tuberculosis)
for performance in diagnosing patients suspected of tuberculosis.
Along with PCR and TRC, both of which had already been approvedin Japan, this kit was used to test sputum samples collected for 2days (320 samples from 160 subjects), and the results werecompared between kits. Notably, testing based on this productincluded evaluations for the DNA extract solution obtained from theuntreated sputum (hereinafter LAMP for untreated sputum) andthose for the DNA extract solution obtained from the sputum
pretreated by NALC-NaOH and some other processes (hereinafter
LAMP for pretreated sputum).
As shown in the tables below, the overall concordance rate wasfavorable as follows: LAMP for untreated sputum vs. PCR: 91.5%(291/318 subjects); LAMP for pretreated sputum vs. PCR: 92.1%(293/318); LAMP for untreated sputum vs. TRC: 94.3% (230/244);
LAMP for pretreated sputum vs. TRC: 93.0% (227/244). In addition,
the evaluations made by real-time turbidity detection and visualf luorescence detection completely agreed, except for one sample(this sample was bloody sputum and tested false negative in visualf l uorescence detection because of the disturbance by blood). Thus,
we regard the two types of evaluations as identical to each other.
The tables below show test resu l ts obtained by real-time turbidity
detection. Of note, the resu l ts of visual f l uorescence detection by
the HumaLoop T were the same as those by the Real-Time
Turbidimeter HumaTurb C+A.

LAMP

Positive
Negative
Overall concordance rate
Diagnostic sensitivity
Diagnostic specificity
Positive predictive value
Negative predictive value
Likelihood ratio +(sensitivity/(1-specificity))

Untreated sputum

Likelihood ratio ((1-sensitivity)/specificity)
LAMP
Positive
Negative
Overall concordance rate
Diagnostic sensitivity
Diagnostic specificity
Positive predictive value
Negative predictive value
Likelihood ratio +(sensitivity/(1-specificity))
Likelihood ratio ((1-sensitivity)/specificity)

Pretreated sputum

LAMP

Positive
UntreatedsputumNegative
Overall concordance rate
Diagnostic sensitivity
Diagnostic specificity
Positive predictive value
Negative predictive value
Likelihood ratio +(sensitivity/(1-specificity))
Likelihood ratio ((1-sensitivity)/specificity)

LAMP

Positive
PretreatedsputumNegative
Overall concordance rate
Diagnostic sensitivity
Diagnostic specificity
Positive predictive value
Negative predictive value
Likelihood ratio +(sensitivity/(1-specificity))
Likelihood ratio ((1-sensitivity)/specificity)

TRC
Positive
Negative163
5967
94.3% (230/244)
94.8% (163/172)
93.1% (67/72)
97.0% (163/168)
88.2% (67/76)
13.9
0.0451TRC
Positive
Negative
157
2
15
70
93.0% (227/244)
91.3% (157/172)
97.2% (70/72)
98.7% (157/159)
82.4% (70/85)
32.6
0.0895ORDERING INFORMATION
Product
CodeContents

972000980000

HuMax ITA

964000Loopamp PUREDNA Extraction Kit
HumaHeat
Incubator

971000

Pipette-60 Set

961000

HumaLoop T

963200

HumaTurb C+A

970000PCR
Positive
Negative
196
7
20
95
91.5% (291/318)
90.7% (196/216)
93.1% (95/102)
96.6% (196/203)
82.6% (95/115)

Product Name

Loopamp MTBC
96 tests
Detection Kit

Micro Centrifuge
90 tests
Heating Block
1 pipette; 4 x 96 tips
1 Main unit
1 Fluorescence Detection Unit
1 Control unit
1 Amplification Unit

NOTICEIn case of occurrence of any serious incident that has occurred inrelation to the device shall be reported to the authorised representative,
the manufacturer and the competent authority of the Member State inwhich the user and/or the patient is established.

13.1

REFERENCES
1) Notomi T., et al.: Nucleic Acids Research 28, No. 12, e63 (2000)
2) Nagamine K., et al.: Clin. Chem. 47, No. 9, 1742–1743 (2001)
3) Mori Y., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, No. 1, 150–
154 (2001)
4) Tom ita N., et al.: Nat. Protoc. 3, No. 5, 877–882 (2008)
5) The guideline for the bio-safety and bio-hazard (by the JapaneseSociety for Bacteriology): Japanese Journal of Bacteriology 54,
No. 3, 667–715 (1999)
6) Isabella MGaby EP and Nicole P., et al.: Manual of ClinicalMicrobiology, 12th edition, ASM PRESS, 558–575 (2019)
7) WHO global TB database:https://www.who.int/teams/global-tuberculosis-programme/data
https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/336069/9789240
013131-eng.pdf
8) Kekkaku No Tokei 2009 (Statistics of TB 2009): Japan AntiTuberculosis Association

0.0999PCR
Positive
Negative
194
3
22
99
92.1% (293/318)
89.8% (194/216)
97.1% (99/102)
98.5% (194/197)
81.8% (99/121)
31.0
0.105

4

Flow chart
Operation procedure for real-time turbidity detection
Preparation of the sample solution and the negative control solution
Pipette 60 µL of sample and the NC MTB.
With the Loopamp PURE DNA Extraction Kit,
extract DNA from the collected sputum and the NC
MTB. The obtained solutions are used as the sample
solution and the negative control solution, respectively.
Reagent preparation
Mixing of reagent andsample solution

Take a required number of reaction
tubes of the dMTB.
( For samples, negative andpositive controls )Transfer 30 µL of sample or control solution into eachreaction tube.
Use the negative control solution as negative control.
Use the PC MTB as positive control.
(The positive control should be prepared at last.)
Invert the reaction tubes to collect the solution on thecap. Wait 2 minutes.
Wait two minutes with the reaction tubes inverted.
Invert the reaction tubes five times to mix the contents,
and then spin them down.
( Avoid any bubbles)
Amplification

Place the reaction tubes in the reaction block of theturbidimeter.
As directed in the instruction for use of the turbidimeter,
start reaction and measure and evaluate the turbidity (for40 minutes at 67.0 C.)
Confirm the complet ion of polymerase inactivation (for 5 mi nutes at
80 C or 2 minutes at 95 C). Take all reaction tubes out of theturbidimeter and discard them without opening. Be careful not todamage the tubes.

TABLE OF SYMBOLS
Catalog number

Consult instructions
for useExpiration dateIn vitro diagnostic
medical device

Manufacturer

Temperature limitation

Batch code

Contains sufficientfor <n> tests

Authorized
Representative in
the European
Community

Importer

HUMAN Gesellschaft für Biochemica
und Diagnostica mbH
Max-Planck-Ring 21, 65205 Wiesbaden, Germany

https://www.eiken.co.jp/en*Date of Revision: 2023-10-31

5Notice d'utilisation

RCSP disponible sur EUDAMED

380236-D
Français

972000Compte-gouttes 30 µl····················· 1 x 18 compte-gouttesa) La Bst DNA polymerase dérivée de Bacillus stearothermophilus
est un ADN polymérase à déplacement de brin qui manqued'activité exonucléase 53.

Loopamp MTBC Detection Kitb) Amorces conçues dans la région gyrB et IS de l'ADN génomiquedu CMTB, purifiées à partir des oligonucléotides synthétisés par
HPLC.
c) Le PC MTB contient un produit résultant de l'amplification in vitro
d'un ADN génomique matrice provenant de Mycobacterium
tuberculosis H37Rv (GenBank no NC_000962).
Les abréviations des réactifs suivants et le numéro de lot ainsi que lefabricant (EKN) sont imprimés sur les récipients comme indiqué cidessous :DESTINATION
Le Loopamp MTBC Detection Kit est un test de diagnostic qualitatif
in vitro permettant de détecter l'ADN du complexe Mycobacterium
tuberculosis (CMTB) extrait des expectorations de patients présentant
tout symptôme indiquant une infection par le CMTB. Le kit aide audiagnostic de l'infection par le CMTB et est destiné à être utilisé dans leslaboratoires professionnels et les hôpitaux par un personnel dûment
formé. Le résultat peut être interprété soit par un turbidimètre automatisé,soit visuellement sous irradiation UV.

Réactifs

Étiquetage sur le tube Code sur le bouchon
PC MTB
PC
Contrôle positif MTB No de lot, EKNMTBNC MTB
NC
Contrôle négatif MTB No de lot, EKN
MTB

PRINCIPE DU TESTCe produit est basé sur la méthode d'amplification des acides
nucléiques, LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification),développée par Eiken Chemical Co., Ltd.
Les caractéristiques de la méthode LAMP sont les suivantes : (1) une
seule enzyme est nécessaire, la réaction d'amplification se déroule dansdes conditions isothermes1),2) ; (2) elle présente une spécificitéextrêmement élevée en raison de l'utilisation de quatre amorces
reconnaissant six régions distinctes sur la cible ; (3) elle présente une
efficacité d'amplification élevée et peut produire une concentrationélevée de produit amplifié en peu de temps, ce qui rend possible une
détection visuelle ou automatisée.3),4)
Les amorces fournies avec ce produit ont été conçues dans la région
de la sous-unité B (gyrB) de l'ADN gyrase et de la séquence d'insertion(IS) IS6110 de l'ADN génomique du CMTB. L'analyse de l'alignement
des séquences de bases sélectionnées du CMTB et des mycobactéries
non tuberculeuses a confirmé que cette séquence possède uneséquence de bases bien conservée dans le CMTB.
L'ADN des expectorations non traitées ou des expectorations traitées
au NALC-NaOH est extrait à l'aide du Loopamp PURE DNA Extraction
Kit (vendu séparément). Ensuite, la solution d'ADN est versée dans un
tube de réaction. L'ADN polymérase à déplacement de brin, lesdésoxynucléotides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dTTP), lacalcéine, les tampons de réaction et les amorces spécifiques au CMTB
sont ensuite conservés sous forme séchée dans le bouchon du tube deréaction. Ce réactif LAMP séché (réactif de détection du CMTB (dMTB))
est dissous lorsque la solution d'ADN est ajoutée. Ensuite, le tube deréaction est incubé à 67,0 C et l'ADN est amplifié par catalyse par l'ADN
polymérase à déplacement de brin selon la réaction LAMP.
La détection des produits amplifiés est basée sur la mesure de laturbidité d'un sous-produit, le pyrophosphate de magnésium (précipité
blanc).3) Alternativement, à la place de la mesure de la turbidité, uneévaluation visuelle sous irradiation UV peut être utilisée. Avant laréaction, la calcéine dans le réactif est à l'état éteint en raison des ionsmanganèse qui lui sont liés ; cependant, une fois que la réaction LAMP
commence, des ions pyrophosphate sont générés et détachent les ionsmanganèse. La calcéine devient alors fluorescente.4)*Informations sur la traçabilité métrologique
Le contrôle positif est dérivé du produit d'amplification de l'ADN
génomique provenant de Mycobacterium tuberculosis H37Rv(GenBank no NC_000962). La région spécifique de Mycobacterium
tuberculosis H37Rv, qui est la cible d'intérêt, sert de modèle pourl'amplification du fragment d'ADN de PC MTB. Ce fragment est quantifié
à l'aide de la spectrophotométrie et sa concentration d'ADN est ajustéeà 1000 copies/μl.

AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONS(1) Utilisation pour le diagnostic in vitro seulement.
(2) Ce produit est conçu uniquement pour le diagnostic clinique du
CMTB à partir d'échantillons d'expectorations d'origine humaine.
Ne pas l'utiliser à d'autres fins.
(3) Lors de l'utilisation de ce produit, toujours suivre cette notice.
(4) Ne pas congeler les réactifs.
(5) Ne pas utiliser de réactif périmé.
(6) Ne pas mélanger des lots différents.
(7) Ne pas reremplir les réactifs.
(8) Les performances du Loopamp MTBC Detection Kit dépendentde la compétence de l'opérateur et du respect des instructions deprocédure. Les tests doivent être effectués par du personnel forméen conséquence en suivant strictement les instructions fournies.
(9) Retirer le nombre requis de tubes de réaction de l'emballage avantde les utiliser et refermer immédiatement la pochette en aluminium.
(10) Ne pas retirer le dessiccateur de la pochette en aluminium. Un tauxd'humidité élevé peut détériorer le réactif LAMP séché dans lestubes de réaction.
(11) L'exposition à la chaleur, à l'humidité et à la lumière peut détériorer
le dMTB. Ainsi, ne retirer que le nombre requis de tubes deréaction (somme des échantillons et des contrôles) et refermer
immédiatement la pochette en aluminium.
(12) Lire le manuel d'instructions et s'assurer que l'équipement requis(turbidimètre ou incubateur) est disponible avant de commencer laprocédure.
(13) Les échantillons d'expectorations présentent un risque potentiel
d'infection. Prendre toutes les mesures préventives nécessaires
pour éviter les risques biologiques.5)(14) Le PC MTB et le NC MTB contiennent une petite quantité d'azide
de sodium comme conservateur. L'azide de sodium étant classé
comme toxique, éviter tout contact avec les yeux, la bouche ou lapeau.
(15) En cas de contact accidentel d'un réactif avec les yeux, la bouche
ou la peau, rincer immédiatement la région concernée à l'eau
courante et consulter un médecin.
(16) Ne pas diluer ou ajouter le PC MTB aux échantillons. N'utiliser le
PC MTB que de la manière décrite dans cette notice pour éviter
toute contamination de l'ADN.
(17) Conserver le PC MTB et tout échantillon d'expectorations positif
séparément des autres réactifs du kit.
(18) Le bouchon de chaque tube de réaction contient le dMTB sous
forme séchée. Ne pas toucher l'intérieur du bouchon.
(19) Avant d'utiliser les tubes de réaction, vérifier soigneusement qu'ils

CONTENU DU KIT
Les réactifs sont stables jusqu'à la date indiquée sur l'étiquette tantque le récipient n'est pas ouvert et qu’il est stocké à une température de
stockage de 2-30 C. Les réactifs sont également confirmés stables
après ouverture du récipient si ces instructions de procédure sontrespectées.
Réactif de détection du CMTB ······················· 2 x 48 tubes
Les réactifs suivants, sous forme séchée, sontcontenus dans chaque tube de réaction.
Bst DNA polymerase a)
Désoxynucléotide triphosphates
Sulfate de magnésium
Calcéine
Chlorure de manganèse
Amorces b)
Contrôle positif MTB (PC MTB) c) ······················ 1 x 0,4 ml
Contrôle négatif MTB (NC MTB) ······················· 3 x 0,5 ml

6Remarque : un contrôle négatif doit être utilisé à chaque fois.

ne présentent pas de fissures ou de rayures. Des tubes
endommagés peuvent donner de faux résultats et entraîner une
contamination de l'incubateur et de la zone de travail par l'ADN.
(20) Ne pas exposer les tubes de réaction à la lumière UV avant la finde la réaction LAMP. Une exposition prolongée à la lumière UV
peut endommager les tubes et entraîner de faux résultats.
(21) Lorsque la lumière UV est utilisée pour évaluer visuellement lafluorescence, ne pas la fixer directement. La lumière UV étant
nocive pour les yeux, la regarder même pendant une courte
période peut irriter les yeux et provoquer des symptômessimilaires à ceux de la conjonctivite. Utiliser plutôt un écran enverre ou porter des lunettes de protection ou un masque oculaireanti-UV lorsque vous regardez directement la lumière UV.
(22) Se référer au manuel de l'incubateur. Lorsque le HumaLoop T ou
le turbidimètre en temps réel HumaTurb C+A est utilisé, retirer
soigneusement les tubes de réaction de l'incubateur pour éviter
les brûlures.

（3）Contrôle positif MTB（PC MTB）
Agiter (ou centrifuger) le tube pour recueillir le contenu au fonddu tube.

Remarque : le PC MTB doit être utilisé à chaque fois.

PROCÉDURE DE MESURE
Extraction de l'ADN
Pour extraire l'ADN de l'échantillon d'expectorations de 60 µl, suivre
les instructions du Loopamp PURE DNA Extraction Kit (vendu
séparément). Verser 60 µl d'échantillon d'expectorations dans le tube
chauffant et le placer dans le HumaHeat ou le bloc chauffantpréchauffé à 90 C. Dans la mesure du possible, utiliser les
expectorations les plus purulentes.
Mélange des réactifs et des échantillons(1) Mettre en marche le HumaLoop T ou le turbidimètre en temps réel
HumaTurb C+A.
(2) Déposer 30 µl de la solution d'échantillon dans un tube de réaction
à l'aide du Loopamp PURE DNA Extraction Kit et fermer le tube
avec le bouchon.

ÉLIMINATION DES DÉCHETS(1) Ne pas ouvrir les tubes après amplification de l'ADN. Laisser lebouchon fermé et éliminer les tubes usagés comme des déchets
médicaux par incinération ou après double ensachage avec dessacs plastiques scellables.
(2) Ne jamais autoclaver ou réutiliser les tubes de réaction, car les
produits amplifiés se disperseront et provoqueront une
contamination.
(3) Le matériau principal des tubes de réaction et des tubes de réactif
est le PP ; pour le plateau des tubes de réaction, le PET ; pour lapochette en aluminium, l’aluminium et pour l’emballage du kit, lepapier.
(4) Éliminer tout réactif, récipient ou matériel de laboratoire usagé
conformément aux réglementations locales.

Remarque : le volume entre les deux lignes du tube de réaction
correspond à environ 30 µl.
(3) Distribuer 30 µl de la solution de contrôle négatif dans un tube deréaction à l'aide du Loopamp PURE DNA Extraction Kit et fermer
le tube avec le bouchon.

Remarque : le volume entre les deux lignes du tube de réaction
correspond à environ 30 µl.
(4) Déposer 30 µl du PC MTB dans un tube de réaction à l'aide ducompte-gouttes fourni et fermer le tube avec le bouchon.
(5) Agiter (ou centrifuger) tous les tubes pour recueillir la solution au
fond des tubes.

Remarque : veiller à ce que le niveau de liquide se trouve au
milieu des deux lignes sur le tube de réaction afin de garantir
30 µl de pipetage.

PRÉLÈVEMENT D'ÉCHANTILLONS(1) Utiliser la partie la plus purulente de l'échantillon d'expectorations.
(2) Les échantillons d'expectorations doivent être utilisés
immédiatement après leur prélèvement.
(3) Prélever les expectorations dans une pièce séparée de la salled'amplification LAMP. Des aérosols contenant l'ADN du CMTB
peuvent être générés lors de la collecte d'expectorations etpeuvent entraîner une contamination.

(6) Reconstituer les réactifs séchés dans le bouchon en retournant les
tubes de réaction et en recueillant la solution d'ADN dans lebouchon. Laisser les tubes debout, tête en bas, pendant 2 minutes
pour reconstituer les réactifs séchés.
(7) Retourner les tubes de réaction cinq fois pour mélanger le contenu.
Faire attention à ce que les réactifs séchés dans le bouchon soiententièrement dissous.
(8) Agiter (ou centrifuger) tous les tubes pour recueillir la solution au
fond des tubes.

MATÉRIELS REQUIS MAIS NON FOURNIS
・ Loopamp PURE DNA Extraction Kit
・ Pipette-60 Set
Pour la détection visuelle de la fluorescence(pour HumaLoop T)
・ HumaLoop T

Amplification
Pour la détection visuelle de la fluorescence（pour HumaLoop T）(1) Vérifier que la température du HumaLoop T est de 67,0 C.
(2) Placer les tubes de réaction dans le HumaLoop T et appuyer sur
le bouton vert pour démarrer la réaction LAMP (40 minutes à
67,0 C). Se reporter au manuel d'instructions du HumaLoop T
pour plus de détails sur le fonctionnement de l'incubateur.
(3) Confirmer la fin de l'inactivation de la polymérase
(automatiquement réalisée par le HumaLoop T). Retirer tous lestubes de réaction du HumaLoop T.
（pour les autres incubateurs utilisant la lumière UV）(1) Régler la température de l'incubateur sur 67,0 C (avec latempérature du capot chauffant réglée 10 C au-dessus de latempérature de réaction ou aussi près de cette valeur que possible.
Précision de la température :  0,5 C).
(2) Placer les tubes de réaction, puis démarrer la réactiond'amplification (pendant 40 minutes à 67,0 C).
(3) Après 40 minutes, inactiver la polymérase en utilisant le
HumaHeat ou le bloc chauffant (pendant 5 minutes à 80 C ou
2 minutes à 95 C) pour terminer la réaction.

(pour les autres incubateurs utilisant la lumière UV)・ Incubateur (précision de la température :  0,5 C ; avec bonnet
chaud)
・ HumaHeat ou autre bloc chauffant
・ Lumière UV ou lumière LED bleue (longueur d'onde : 240-260 nm
et 350-370 nm)
・ Lunettes de protection ou masque oculaire anti-UV (facultatif)
Pour la détection de la turbidité en temps réel・ HumaTurb C+A・ HumaHeat ou autre bloc chauffant
Pour le mélange des réactifs et des échantillons
・ Centrifugeuse pour microtubes (facultatif)
・ Centrifugeuse pour huit tubes connectés (facultatif)
・ HuMax ITA, micro-centrifugeuse (facultatif)

PRÉPARATION DES RÉACTIFS（1）Réactif de détection du CMTB
Retirer le nombre requis de tubes de la pochette en aluminium etles placer sur le portoir (somme des échantillons et des contrôles).

Pour la détection de la turbidité en temps réel avec HumaTurb C+A(voir le diagramme de la procédure)(1) Configurer le turbidimètre en temps réel HumaTurb C+A pour ladétection avec ce produit.
(2) Vérifier que la température affichée atteint 67,0 C (laisser leturbidimètre se réchauffer pendant 20 minutes avant de l'utiliser).
(3) Placer les tubes de réaction et commencer la mesure.
(4) Surveiller l'affichage du turbidimètre et vérifier l’augmentation de laturbidité dans les contrôles positifs et pas dans les contrôles
négatifs. Si la turbidité augmente dans le contrôle positif mais pas

Remarque : après avoir retiré les tubes nécessaires, refermer
immédiatement la pochette en aluminium avec les tubes nonutilisés.
（2）Contrôle négatif MTB（NC MTB）
Agiter (ou centrifuger) le tube pour recueillir le contenu au fonddu tube. Pipetter 60 µl du NC MTB dans le tube chauffant fourni
dans le Loopamp PURE DNA Extraction Kit. Suivre la noticed'utilisation pour traiter le NC MTB (le NC MTB extrait est appelé ciaprès « solution de contrôle négatif »).

7

dans le contrôle négatif, la réaction d'amplification se déroule
correctement (Fig. 1). En revanche, si une autre situation se
produit, la réaction d'amplification peut se dérouler de manière
incorrecte. Dans ce cas, retester les échantillons concernés.
(5) Confirmer la fin de l'inactivation de la polymérase
(automatiquement réalisée par le turbidimètre). Retirer tous lestubes de réaction du turbidimètre en temps réel HumaTurb C+A et
les jeter sans les ouvrir.

PC MTB. Distribuer les échantillons et la solution de contrôle
négatif et fermer tous les tubes de réaction avant de distribuer le
PC MTB.
(12) Agiter (ou centrifuger) le tube de PC MTB avant de l'ouvrir pourrecueillir le contenu au fond du tube. Fermer le tube
immédiatement après avoir distribué le PC MTB.
(13) Lorsque le HumaLoop T ou le turbidimètre en temps réel
HumaTurb C+A est utilisé, l'inactivation de la polymérase est
effectuée automatiquement.
(14) Pour les autres incubateurs, lorsque l'évaluation visuelle de lafluorescence est choisie, inactiver la polymérase (pendant
5 minutes à 80 C ou 2 minutes à 95 C) avant de la lire, ou lesrésultats seront faussés.
(15) Pour les autres incubateurs, lorsque la lumière UV est utilisée, ne
pas la fixer directement. Utiliser plutôt un panneau en verre ou
porter des lunettes ou un masque oculaire lorsque vous regardez
les rayons UV.
(16) Ne jamais ouvrir les tubes de réaction une fois que la réaction
LAMP a commencé ou après son achèvement. Faire
particulièrement attention à ne pas ouvrir les tubes
accidentellement lors du déchargement des tubes de réaction del'incubateur.
(17) Ne pas réutiliser les produits amplifiés dans les tubes pourl'électrophorèse ou pour d'autres applications.

Graphiques d'amplification
Échantillon négatif
Échantillon positif 1
Échantillon positif 2

0,7

0,7

0,6

0,6

0,5

0,5

TurbiditéTurbiditéContrôle négatif
Contrôle positif

0,4
0,3

0,4
0,3

0,2

0,2

0,1

0,1

0
0

5 10

15 20 25 30 35 40

Temps (min)Fig. 1 : Graphique d'amplification pourles contrôles.

0
0

5 10

15 20 25 30 35 40

Temps (min)Fig. 2 : Graphique d'amplification
pour les échantillons.

INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
Pour la détection visuelle de la fluorescence(pour HumaLoop T)
Placer chaque tube de réaction dans l'unité de détection de lafluorescence, irradier et observer le tube de côté.
(pour les autres incubateurs utilisant la lumière UV)
Irradier le fond de chaque tube de réaction et observer de côté àtravers des lunettes ou un masque oculaire anti-UV.
Pour une exécution valide, les résultats suivants doivent êtreobtenus : Contrôle positif : une lumière fluorescente verte est émise.
 Contrôle négatif : aucune lumière fluorescente n'est émise.
Si l'un des contrôles n'est pas valide, tous les échantillons de lasérie doivent être signalés comme non valides et le test doit êtreréeffectué.
Après avoir confirmé que l'exécution est valide, évaluer leséchantillons comme suit : Échantillon positif : une lumière fluorescente verte estémise.
 Échantillon négatif : aucune lumière fluorescente n'estémise.
Pour la détection de la turbidité en temps réel avec le HumaTurb
C+A
Après avoir confirmé que la turbidité augmente dans le contrôle
positif mais pas dans le contrôle négatif, évaluer les échantillons selon
les critères suivants (Fig. 1 et 2).

NOTES DE PROCÉDURE(1) La réaction LAMP est très sensible et toute contamination, mêmepar de petites quantités du produit amplifié, peut entraîner desrésultats faussement positifs.
(2) Séparer les zones de prélèvement d’expectorations et de test
LAMP.
(3) Nettoyer les bancs avec plus de 0,5 % d'hypochlorite de sodium
avant et après la réalisation du dosage.
(4) Prendre toutes les mesures nécessaires pour éviter toutecontamination et en particulier, changer de gants après avoir
transféré les expectorations ou si les gants sont entrés en contact
avec la solution d'ADN.
(5) Lors de la manipulation de ce produit, éviter la contamination
microbienne et la contamination par les nucléases. Même unepetite quantité de DNase transmise par la sueur ou la salive dansle tube de réaction peut décomposer l'ADN et provoquer un fauxrésultat.
(6) Ne pas utiliser d'échantillons d'expectorations contenant une
grande quantité de sang, car cela peut affecter les mesures. Se
référer au « Manual of Clinical Microbiology, 12th edition »6) si unprétraitement de l'échantillon est nécessaire.
(7) La solution d'ADN doit idéalement être utilisée immédiatement
après sa préparation ; si cela est impossible, la solution d'ADN
peut être conservée à température ambiante et utilisée dans les
72 heures.
(8) Lors de la distribution de la solution dans le tube de réaction, éviter
tout contact entre le bouchon d'injection fourni dans le Loopamp
PURE DNA Extraction Kit et la paroi interne des tubes de réaction.
Tenir le porte-tubes à la verticale et remplir le tube jusqu'à ce que
le niveau de la solution d'ADN soit entre les deux lignes (30 µl). Si
le niveau est inapproprié (au-dessus de la ligne supérieure ou en
dessous de la ligne inférieure), cela peut influencer la performance
du test.
(9)（pour HumaLoop T ou un autre incubateur utilisant la lumière
UV）
Si des bulles sont présentes, tapoter (ou centrifuger) les tubes
pour les libérer.
（pour le turbidimètre en temps réel HumaTurb C+A）
Comme les bulles dans la solution de réaction peuvent interférer
avec la mesure de la turbidité et provoquer un faux résultat, éviter
la formation de bulles lors du mélange du réactif et de la solutiond'échantillon. S'il y a des bulles, centrifuger ou tapoter le tube pourles éliminer.
(10) Le dMTB doit être entièrement dissous. Toute partie non dissoute
peut influencer les performances, par exemple en diminuant lasensibilité. Maintenir en particulier les tubes debout tête à l'envers
pendant 2 minutes.
(11) Le PC MTB contient un nombre élevé de copies de l'ADN decontrôle. Éviter toute contamination d'autres échantillons avec le Échantillon positif : une certaine augmentation de laturbidité est observée.
 Échantillon négatif : aucune augmentation de la turbidité
n'est observée.
Remarques :(1) La sensibilité minimale détectable de ce produit est de
0,38 génome équivalent par test. Même si le test est négatif, lespatients présentant un symptôme persistant indiquant une
infection par le CMTB doivent être réexaminés.
(2) Bien que les amorces aient été conçues pour cibler une région
contenant un nombre relativement faible de variations, le CMTB
peut acquérir d'autres variations dans cette région et devenir
moins sensible à ce produit. Ainsi, un test négatif n'exclut pas
toujours une infection par le CMTB.
(3) Les résultats des tests peuvent être affectés par le prélèvement etle transport des échantillons, la préparation des échantillons, lesinhibiteurs et d'autres erreurs de procédure de laboratoire. Un test
négatif n'exclut pas la présence du CMTB dans l'échantillon. Pourétablir un diagnostic clinique, il faut tenir compte de l'état cliniquedu patient et de tous les autres résultats de laboratoire disponibles.
(4) Ce produit est un kit pour la détection qualitative ; il n'est pas conçu
pour la mesure quantitative. Par conséquent, l'intensité de lalumière fluorescente observée ou le temps d'augmentation de la8

turbidité mesurée par le turbidimètre en temps réel HumaTurb C+An'est pas lié à la concentration d'ADN matrice.

Comme le montrent les tableaux ci-dessous, le taux deconcordance global était favorable : LAMP pour expectorations nontraitées vs. PCR : 91,5 % (291/318 sujets) ; LAMP pourexpectorations prétraitées vs. PCR : 92,1 % (293/318) ; LAMP pourexpectorations non traitées vs. TRC : 94,3 % (230/244) ; LAMP pourexpectorations prétraitées vs. TRC : 93,0 % (227/244). En outre, lesévaluations réalisées par détection de la turbidité en temps réel etpar détection visuelle de la fluorescence concordaient totalement, àl'exception d'un échantillon (cet échantillon était une expectoration
sanglante et a donné un résultat faussement négatif lors de ladétection visuelle de la fluorescence en raison de la perturbation parle sang). Ainsi, les deux types d'évaluation sont considérés comme
identiques l'un à l'autre. Les tableaux ci-dessous présentent lesrésultats des tests obtenus par la détection de la turbidité en temps
réel. Il est à noter que les résultats de la détection visuelle de lafluorescence par le HumaLoop T étaient les mêmes que ceux duturbidimètre en temps réel HumaTurb C+A.

SUBSTANCES INTERFÉRENTES
Nos études internes ont révélé que la mesure n'était pas affectée parla présence de bilirubine libre (91,0 mg/dl), de bilirubine conjuguée(101,0 mg/dl), de chyle (turbidité de la formazine : 7300) etd'hémoglobine hémolytique (2475 mg/dl).
Concernant les médicaments, nos études internes ont révélé que lamesure n'était pas affectée par la présence d'isoniazide (100 µg/ml),d'éthambutol (20 µg/ml), de rifampicine (100 µg/ml), de pyrazinamide(500 µg/ml), de kanamycine (20 µg/ml) et de streptomycine (500 µg/ml).

CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCES
1. ExactitudeLors des tests des échantillons suivants : échantillon négatif (concentration : 0 génome équivalent/test) échantillon positif 1 (1,875 génomes équivalents/test) échantillon positif 2 (125 génomes équivalents/test)
L'échantillon négatif doit être négatif, tandis que les échantillons
positifs 1 et 2 doivent être positifs.
2. Reproductibilité intra-cycle
Lors du test simultané de cinq échantillons négatifs etcinq échantillons positifs, les échantillons négatifs doivent êtrenégatifs tout au long du test, tandis que les échantillons positifs
doivent être positifs tout au long du test.
3. Limite de détection
0,38 génome équivalent/test.
4. Réactivité croisée
En ce qui concerne les mycobactéries non tuberculeuses(Mycobacterium asiaticum, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium

LAMP
Positif
Expectorations nontraitées
Négatif
Taux de concordance général
Sensibilité diagnostique
Spécificité diagnostique
Valeur prédictive positive
Valeur prédictive négative
Rapport de vraisemblance +(sensibilité/(1-spécificité))Rapport de vraisemblance ((1-sensibilité)/spécificité)

marinum, Mycobacterium simiae, Mycobacterium scrofulaceum,
Mycobacterium szulgai, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium
xenopi, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare,
Mycobacterium gastri, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium
malmoense, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum,
Mycobacterium flavescens) (1,0 x 104 génomes équivalents par test)
et les bactéries des maladies respiratoires (Streptococcus
pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae,
Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli,
Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Mycoplasma
pneumoniae（I）, Mycoplasma pneumoniae（II）) (1,0 x 105 génomes

LAMP
Positif
Expectorations
prétraitées
Négatif
Taux de concordance général
Sensibilité diagnostique
Spécificité diagnostique
Valeur prédictive positive
Valeur prédictive négative
Rapport de vraisemblance +(sensibilité/(1-spécificité))Rapport de vraisemblance ((1-sensibilité)/spécificité)équivalents par test), le système de mesure a été testé négatif pour
toutes les espèces bactériennes comme détaillé dans le tableau cidessous ; aucune réaction croisée n'a été observée.
5. Réactivité contre le CMTB
La réactivité contre Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium
bovis, et Mycobacterium africanum a été confirmée.
6. Informations sur le calibrateur
Pour le test de performance de ce produit, l'ADN plasmidiquecontenant la région gyrB et IS de l'ADN génomique deMycobacterium tuberculosis H37Rv (GenBank no NC_000962) a été
utilisé comme calibrateur.
7. Performances cliniquesÀ ce jour, la tuberculose reste l'une des plus grandes infections aumonde. Au niveau mondial, le nombre total estimé de nouveaux cas
de tuberculose est d'environ 10 millions, et celui des frottis
d'expectorations positifs d'environ 4,3 millions.7) Au Japon,
24 760 patients ont été nouvellement enregistrés comme atteints detuberculose en 2008, dont 2216 en sont décédés.8)
Ce produit a été examiné dans deux institutions médicalesdésignées pour les maladies infectieuses de classe 2 (institutions
médicales désignées disposant de lits réservés aux patients atteints
de tuberculose) pour ses performances dans le diagnostic despatients supposément atteints de tuberculose. Avec les kits PCR et
TRC, tous deux déjà approuvés au Japon, ce kit a été utilisé pourtester des échantillons d'expectorations collectés pendant 2 jours(320 échantillons provenant de 160 sujets) et les résultats ont été
comparés entre les kits. Les tests basés sur ce produit
particulièrement comprenaient des évaluations pour la solution
d'extrait d'ADN obtenue à partir d'expectorations non traitées (ciaprès LAMP pour expectorations non traitées) et pour la solution
d'extrait d'ADN obtenue à partir d'expectorations prétraitées par
NALC-NaOH et par d'autres procédés (ci-après LAMP pourexpectorations prétraitées).

LAMP
Positif
Expectorations nontraitées
Négatif
Taux de concordance général
Sensibilité diagnostique
Spécificité diagnostique
Valeur prédictive positive
Valeur prédictive négative
Rapport de vraisemblance +(sensibilité/(1-spécificité))Rapport de vraisemblance ((1-sensibilité)/spécificité)

LAMP
Positif
Expectorations
prétraitées
Négatif
Taux de concordance général
Sensibilité diagnostique
Spécificité diagnostique
Valeur prédictive positive
Valeur prédictive négative
Rapport de vraisemblance +(sensibilité/(1-spécificité))Rapport de vraisemblance ((1-sensibilité)/spécificité)

9

PCR
Positif
Négatif
196
7
20
95
91,5 % (291/318)
90,7 % (196/216)
93,1 % (95/102)
96,6 % (196/203)
82,6 % (95/115)
13,1
0,0999PCR
Positif
Négatif
194
3
22
99
92,1 % (293/318)
89,8 % (194/216)
97,1 % (99/102)
98,5 % (194/197)
81,8 % (99/121)
31,0
0,105

TRC
Positif
Négatif
163
5
9
67
94,3 % (230/244)
94,8 % (163/172)
93,1 % (67/72)
97,0 % (163/168)
88,2 % (67/76)
13,90,0451TRC
Positif
Négatif
157
2
15
70
93,0 % (227/244)
91,3 % (157/172)
97,2 % (70/72)
98,7 % (157/159)
82,4 % (70/85)
32,6
0,0895

INFORMATIONS POUR COMMANDER
CodeproduitNom du produit

972000Loopamp MTBC
96 tests
Detection Kit

980000

HuMax ITA

964000Loopamp PUREDNA Extraction Kit
Incubateur
HumaHeat971000

Pipette-60 Set

961000

HumaLoop T

963200

HumaTurb C+A

970000Confirmer la fin de l'inactivation de la polymérase (pendant 5 minutes
à 80 C ou 2 minutes à 95 C). Retirer tous les tubes de réaction duturbidimètre et les jeter sans les ouvrir. Ne pas endommager les tubes.

Contenu

TABLE DES SYMBOLES

Micro-centrifugeuse

Référence ducatalogue

Consulter la noticed'utilisation

Date d'expiration

90 tests

Dispositif médical
de diagnostic
in vitro

Fabricant

Limitation de latempérature

Numéro de lot

Contenu suffisantpour <n> tests

Bloc chauffant
1 pipette, 4 x 96 embouts

Représentant autorisé
dans la Communauté
européenne

1 unité principale
1 unité de détection de lafluorescence
1 unité de contrôle
1 unité d'amplification

AVIS
Veuillez signaler tout incident grave survenu avec le dispositif aureprésentant autorisé, au fabricant et à l'autorité compétente de l'État
membre dans lequel l'utilisateur et/ou le patient est établi.

BIBLIOGRAPHIE
1) Notomi T., et al.: Nucleic Acids Research 28, No. 12, e63 (2000)
2) Nagamine K., et al.: Clin. Chem. 47, No. 9, 1742–1743 (2001)
3) Mori Y., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, No. 1, 150–
154 (2001)
4) Tomita N., et al.: Nat. Protoc. 3, No. 5, 877–882 (2008)
5) The guideline for the bio-safety and bio-hazard (by the JapaneseSociety for Bacteriology): Japanese Journal of Bacteriology 54, No.
3, 667–715 (1999)
6) Isabella MGaby EP and Nicole P., et al.: Manual of ClinicalMicrobiology, 12th edition, ASM PRESS, 558–575 (2019)
7) WHO global TB database:https://www.who.int/teams/global-tuberculosis-programme/data
https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/336069/9789240
013131-eng.pdf
8) Kekkaku No Tokei 2009 (Statistics of TB 2009): Japan AntiTuberculosis Association

Diagramme
Procédure opérationnelle pour la détection de la turbidité
en temps réelPréparation de la solution d'échantillon et de la solution de contrôle
négatif
Pipetter 60 µl d'échantillon et de NC MTB.
À l'aide du Loopamp PURE DNA Extraction Kit,
extraire l'ADN des expectorations recueillies et du NC
MTB. Les solutions obtenues sont utilisées commesolution d'échantillon et solution de contrôle négatif,
respectivement.
Préparation des réactifs
Mélange du réactif et dela solution d'échantillon

Prendre le nombre requis de tubes deréaction du dMTB.
(Pour les échantillons et les contrôles
négatifs et positifs)

Transférer 30 µl de solution d'échantillon ou de contrôledans chaque tube de réaction.
Utiliser la solution de contrôle négatif comme contrôle
négatif. Utiliser le PC MTB comme contrôle positif.
(Le contrôle positif doit être préparé en dernier.)
Retourner les tubes de réaction pour recueillir la solution
dans le bouchon. Patienter 2 minutes.
Patienter 2 minutes avec les tubes de réaction à

Importateur

HUMAN Gesellschaft für Biochemica
und Diagnostica mbH

Retourner les tubes de réaction cinq fois pour mélanger
le contenu, puis les centrifuger à nouveau.
Amplification(Éviter la formation de bulles)

Max-Planck-Ring 21, 65205 Wiesbaden, Germany

Placer les tubes de réaction dans le bloc de réaction duturbidimètre.
https://www.eiken.co.jp/enComme indiqué dans la notice d'utilisation duturbidimètre, lancer la réaction, mesurer et évaluer laturbidité (pendant 40 minutes à 67,0 C).

*Date de révision : 2023-10-31

10Instrucciones de uso

SSP disponible en EUDAMED

380236-D
Español

972000a) La ADN polimerasa de Bst obtenida a partir de Bacillus
stearothermophilus es una ADN polimerasa con actividad dedesplazamiento de la hebra que carece de actividad exonucleasa
en sentido 53.
b) Cebadores diseñados en la gyrB y la región de la SI del ADN
genómico de MTBC, purificados por HPLC a partir deoligonucleótidos sintéticos.
c) El PC MTB contiene un producto resultante de la amplificación invitro de un ADN genómico molde procedente de Mycobacterium
tuberculosis H37Rv (núm. de GenBank NC_000962).
Las abreviaturas de los siguientes reactivos, el n.º de lote y elfabricante (EKN) figuran en los envases como se muestra en la tabla:

Loopamp MTBC Detection Kit
USO PREVISTO
Loopamp MTBC Detection Kit es una prueba cualitativa dediagnóstico in vitro para detectar el ADN del complejo de Mycobacterium
tuberculosis (MTBC) extraído del esputo de pacientes con síntomas
indicativos de infección por MTBC. El kit sirve de ayuda en el
diagnóstico de la infección por MTBC y está destinado a ser utilizado enlaboratorios profesionales y hospitales por personal debidamente
capacitado. El resultado puede interpretarse mediante un turbidímetro
automático o visualmente bajo irradiación UV.

Reactivos
Control positivo MTBControl negativo MTB

PRINCIPIOS DE LA PRUEBA
Este producto se basa en la amplificación isotérmica mediada por
bucle (LAMP), un método de amplificación de ácidos nucleicosdesarrollado por Eiken Chemical Co., Ltd.
Estas son las características del método de LAMP: (1) solo necesita
una enzima y la reacción de amplificación se produce en condiciones
isotérmicas;1),2) (2) tiene una especificidad extremadamente alta gracias
al uso de cuatro cebadores que reconocen seis regiones distintas en laregión de interés; (3) tiene una alta eficiencia de amplificación y puede
producir una alta concentración de producto amplificado en poco tiempo,
lo que hace posible la detección visual o automatizada.3),4)
Los cebadores proporcionados con este producto están diseñados enla subunidad B de la ADN girasa (gyrB) y la región de la secuencia deinserción (SI) IS6110 del ADN genómico del MTBC, que se haconfirmado mediante análisis de la alineación de las secuencias debases seleccionadas del MTBC y micobacterias no tuberculosas quetienen una secuencia de bases bien conservada en el MTBC.
El ADN del esputo no tratado o tratado con NALC-NaOH se extrae
con el Loopamp PURE DNA Extraction Kit (vendido por separado). A
continuación, la solución de ADN se dispensa en un tubo de reacción.
La ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de la hebra, losdesoxinucleótidos trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), la calceína,
los tampones de reacción y los cebadores específicos para MTBC seconservan en seco en la tapa del tubo de reacción. Este reactivo LAMP
seco (reactivo de detección de MTBC (dMTB)) se disuelve al añadir lasolución de ADN. A continuación, el tubo de reacción se incuba a 67 °C
y el ADN se amplifica mediante catálisis por la ADN polimerasa con
actividad de desplazamiento de la hebra en la reacción de LAMP.
La detección de los productos amplificados se hace mediante
determinación de la turbidez producida por un subproducto, el
pirofosfato de magnesio (precipitado de color blanco).3) Comoalternativa, en lugar de mediante determinación de la turbidez, ladetección se puede hacer a simple vista con radiación UV. Antes de lareacción, la calceína en el reactivo se encuentra en estado apagado
debido a los iones de manganeso unidos a ella; sin embargo, una vez
iniciada la reacción LAMP, se generan iones de pirofosfato que se unena los iones de manganeso y la calceína se vuelve fluorescente.4)

Etiquetado en el tubo
PC MTB
N.º de lote, EKN
NC MTB
N.º de lote, EKN

Cód. en la tapa
PC
MTB
NC
MTB

*Información de trazabilidad metrológica
El control positivo procede del producto de la amplificación de un ADN
genómico procedente de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (núm. de
GenBank NC_000962). La región específica de Mycobacterium
tuberculosis H37Rv, que es la región de interés, sirve como molde parala amplificación del fragmento de ADN de PC MTB. Este fragmento se
cuantifica con un análisis fotoespectrométrico, y su concentración de
ADN de PC MTB se ajusta a 1000 copias/μL.

ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES(1) Únicamente para uso diagnóstico in vitro.
(2) Este producto está diseñado únicamente para el diagnósticoclínico de MTBC a partir de muestras de esputo de origen humano.
No utilizar para otros fines.
(3) Siga siempre estas instrucciones de uso al utilizar este producto.
(4) No congele los reactivos.
(5) No utilice reactivos caducados.
(6) No mezcle lotes diferentes.
(7) No reponga ningún reactivo.
(8) La calidad de los resultados obtenidos con el Loopamp MTBC
Detection Kit depende de la destreza del operador y delcumplimiento de las instrucciones del procedimiento. Las pruebas
deben ser realizadas por personal debidamente cualificado
siguiendo estrictamente las instrucciones proporcionadas.
(9) Retire solo el número necesario de tubos de reacción del embalajeantes de utilizarlos y vuelva a sellar la bolsa de aluminio
inmediatamente.
(10) No retire el desecante de la bolsa de aluminio. Un exceso de
humedad puede deteriorar el reactivo seco de LAMP en los tubos
de reacción.
(11) La exposición al calor, la humedad y la luz podría deteriorar eldMTB. Por lo tanto, retire solo el número necesario de tubos dereacción (total de muestras y controles) y vuelva a sellar la bolsa
de aluminio inmediatamente.
(12) Lea el manual de instrucciones y asegúrese de que dispone de losequipos necesarios (turbidímetro o incubadora) antes decomenzar el procedimiento.
(13) Las muestras de esputo suponen un riesgo de infección. Tometodas las medidas preventivas necesarias para evitar el riesgo
biológico.5)(14) El PC MTB y el NC MTB contienen una pequeña cantidad de azida
sódica que actúa como conservante. La azida sódica está
clasificada como tóxica, por lo que debe evitar todo contacto con
los ojos, la boca o la piel.
(15) En caso de contacto accidental de cualquiera de los reactivos con
los ojos, la boca o la piel, enjuague inmediatamente la zona
afectada con agua abundante y acuda al médico.
(16) No diluya ni añada PC MTB a las muestras. En su lugar, utilice el
PC MTB solo según se detalla en este manual para evitar lacontaminación con ADN.
(17) Conserve el PC MTB y todas las muestras de esputo positivas por
separado de los demás reactivos del kit.
(18) La tapa de cada uno de los tubos de reacción contiene dMTB en
forma seca. No toque el interior de la tapa.

CONTENIDO DEL KIT
Los reactivos son estables hasta la fecha que figura en la etiqueta,
suponiendo que el envase permanezca sin abrir a una temperatura deconservación de 230 °C. Los reactivos también son estables despuésde abrir el envase si se siguen estas instrucciones de uso.
Reactivo de detección de MTBC ···················· 2 x 48 tubos
Cada uno de los tubos de reacción contiene lossiguientes reactivos en forma seca:
ADN polimerasa de Bst a)
Desoxinucleótidos trifosfato
Sulfato de magnesio
Calceína
Cloruro de manganeso
Cebadores b)
Control positivo de MTB (PC MTB) c) ················· 1 × 0,4 ml
Control negativo de MTB (NC MTB) ·················· 3 × 0,5 ml
Cuentagotas de 30 µl ························· 1 × 18 cuentagotas

11(19) Antes de utilizar los tubos de reacción, compruebe detenidamente
si presentan grietas o arañazos. Los tubos dañados podrían dar
resultados falsos y provocar la contaminación con ADN de la
incubadora y de la zona de trabajo.
(20) No exponga los tubos de reacción a la luz UV antes de la
finalización de la reacción de LAMP. La exposición prolongada ala luz UV podría dañar los tubos y dar resultados falsos.
(21) No mire directamente la luz UV cuando esta se utilice para lavaloración de la fluorescencia a simple vista. Dado que la luz UV
es perjudicial para la vista, incluso si se observa durante un breve
periodo de tiempo, puede producir irritación ocular y síntomas
similares a los de la conjuntivitis. Por lo tanto, utilice una pantalla
de cristal, gafas de seguridad o una máscara ocular con
protección UV siempre que mire directamente a la luz UV.
(22) Consulte el manual de la incubadora. Si utiliza el HumaLoop M oel turbidímetro en tiempo real HumaTurb C+A, retire
cuidadosamente los tubos de reacción de la incubadora paraevitar quemaduras.

denominará «solución de control negativo») siguiendo las
instrucciones.

Nota: Siempre se debe incluir un control negativo.
（3）Control positivo de MTB（PC MTB）
Golpetee o centrifugue el tubo para que el contenido se acumule
en el fondo.

Nota: El PC MTB se debe analizar siempre.

PROCEDIMIENTO ANALÍTICO
Extracción de ADN
Para extraer el ADN de la muestra de esputo de 60 µl, siga las
instrucciones del Loopamp PURE DNA Extraction Kit (se vende por
separado). Dispense 60 µl de la muestra de esputo en el tubo decalentamiento y colóquelo en el HumaHeat o en el termobloqueprecalentado a 90 °C. Utilice el esputo más purulento posible.
Mezcla de reactivos y muestras(1) Encienda el HumaLoop M o el turbidímetro en tiempo real
HumaTurb C+A.
(2) Dispense 30 µl de la solución de la muestra en un tubo de reacción
utilizando el Loopamp PURE DNA Extraction Kit y cierre la tapa.

ELIMINACIÓN DE DESECHOS(1) No abra los tubos después de la amplificación del ADN. Deje latapa cerrada y deseche los tubos usados con los residuos
biológicos para su incineración o deséchelos mediante embolsado
doble con bolsas de plástico sellables.
(2) Nunca esterilice en autoclave los tubos de reacción ni los reutilice,
de lo contrario, los productos amplificados se dispersaránproduciendo contaminación.
(3) El material principal de los tubos de reacción y los tubos dereactivos es el PP; de la bandeja de los tubos de reacción, el PET;de la bolsa de aluminio, el aluminio; y del estuche del kit, el papel.
(4) Deseche todos los demás reactivos, el envase o el material delaboratorio usados de acuerdo con la normativa local.

Nota: El volumen entre las dos líneas del tubo de reacción
corresponde a aproximadamente 30 µl.
(3) Dispense 30 µl de solución de control negativo en un tubo dereacción utilizando el Loopamp PURE DNA Extraction Kit ycierre la tapa.

Nota: El volumen entre las dos líneas del tubo de reacción
corresponde a aproximadamente 30 µl.
(4) Dispense 30 µl de PC MTB en un tubo de reacción utilizando elcuentagotas suministrado y cierre la tapa.
(5) Golpetee o centrifugue todos los tubos para que la solución seacumule en el fondo.

Nota: Asegúrese de que el nivel de líquido se encuentra entre
las dos líneas del tubo de reacción para garantizar que se
pipetean 30 µl.

RECOGIDA DE MUESTRAS(1) Utilice la parte más purulenta de la muestra de esputo.
(2) Las muestras de esputo se deben utilizar inmediatamente
después de su recogida.
(3) La recogida de muestras de esputo se ha de hacer en una salaindependiente de la sala de amplificación por LAMP. Durante larecogida de muestras de esputo se pueden generar aerosoles que
contienen ADN de MTBC, lo que podría provocar contaminación.

(6) Reconstituya los reactivos secos en la tapa invirtiendo los tubos
de reacción y recogiendo la solución de ADN en la tapa. Deje lostubos boca abajo durante 2 minutos para reconstituir los reactivos
secos.
(7) Invierta los tubos de reacción cinco veces para mezclar elcontenido. Asegúrese de que los reactivos secos en la tapa estáncompletamente disueltos.
(8) Golpetee o centrifugue todos los tubos para que la solución seacumule en el fondo.

MATERIALES REQUERIDOS, PERO NO INCLUIDOS
・ Loopamp PURE DNA Extraction Kit
・ Pipette-60 Set
Para la detección de fluorescencia a simple vista(Para HumaLoop T)
・ HumaLoop T

Amplificación
Para la detección de fluorescencia a simple vista（Para HumaLoop T）(1) Compruebe que la temperatura en el HumaLoop T es de 67,0 °C.
(2) Coloque los tubos de reacción en el HumaLoop T y pulse el botón
verde para iniciar la reacción de LAMP (40 minutos a 67,0 °C).
Consulte el manual de instrucciones del HumaLoop T paraobtener información sobre el funcionamiento de la incubadora.
(3) Confirme la finalización de la inactivación de la polimerasa(completada automáticamente por el HumaLoop T). Retire todos
los tubos de reacción del HumaLoop T.
（Para otra incubadora con luz UV）(1) Fije la temperatura de la incubadora a 67,0 °C (con la temperaturadel capó caliente fijada a 10 °C por encima de la temperatura dereacción o lo más cerca posible de esta cifra; exactitud de latemperatura: 0,5 °C).
(2) Coloque los tubos de reacción y, a continuación, inicie la reacciónde amplificación (durante 40 minutos a 67,0 °C).
(3) Después de 40 minutos, inactive la polimerasa utilizando el
HumaHeat o el termobloque (durante 5 minutos a 80 °C o durante
2 minutos a 95 °C) para parar la reacción.

(Para otra incubadora con luz UV)・ Incubadora (precisión de la temperatura: 0,5 °C; con cubierta
caliente)・ HumaHeat u otro termobloque・ Luz UV o luz LED azul (longitud de onda: 240-260 nm y350-370 nm)
・ Gafas de seguridad o máscara ocular con protección UV(opcional)
Para la detección de la turbidez en tiempo real・ HumaTurb C+A・ HumaHeat u otro termobloquePara la mezcla de reactivos y muestras
・ Centrífuga para microtubos (opcional)
・ Centrífuga para ocho tubos conectados (opcional)・ HuMax ITA, microcentrífuga (opcional)

PREPARACIÓN DE REACTIVOS（1）Reactivo de detección de MTBC
Retire el número necesario de tubos de la bolsa de aluminio ycolóquelos en la gradilla (total de muestras y controles).

Para la detección de la turbidez en tiempo real con HumaTurb C+A(véase el diagrama de flujo del procedimiento)(1) Configure el turbidímetro en tiempo real HumaTurb C+A para la
detección con este producto.
(2) Compruebe si la temperatura mostrada en la pantalla alcanza los
67,0 °C (deje que el turbidímetro se caliente durante 20 minutos
antes de utilizarlo).
(3) Coloque los tubos de reacción e inicie el análisis.
(4) Observe la pantalla del turbidímetro para comprobar si loscontroles positivo y negativo presentan un aumento de la turbidez.

Nota: una vez retirados los tubos necesarios, vuelva a sellar
inmediatamente la bolsa de aluminio con los tubos que no hayautilizado.
（2）Control negativo MTB（NC MTB）
Golpetee o centrifugue el tubo para que el contenido se acumule
en el fondo. Pipetee 60 µl de NC MTB en el tubo de calentamiento
suministrado en el LoopampPURE DNA Extraction Kit. Realice eltratamiento del NC MTB (en adelante, el NC MTB extraído se12Si la turbidez aumenta en el control positivo, pero no en el control
negativo, la reacción de amplificación está teniendo lugar
correctamente (Fig. 1). Si no es así, la reacción de amplificación
podría estar teniendo lugar de manera incorrecta. En ese caso,
vuelva a analizar las muestras afectadas.
(5) Confirme la finalización de la inactivación de la polimerasa(completada automáticamente por el turbidímetro). Retire todos
los tubos de reacción del turbidímetro en tiempo real
HumaTurb C+A y deséchelos sin abrirlos.

(12) Golpetee o centrifugue el tubo de PC MTB antes de utilizarlo paraque el contenido se acumule en el fondo. Cierre el tubo
inmediatamente después de dispensar el PC MTB.
(13) Cuando se utiliza el HumaLoop T o el turbidímetro en tiempo real
HumaTurb C+A, la inactivación de la polimerasa se realiza
automáticamente.
(14) Para otras incubadoras, cuando se seleccione como criterio la
fluorescencia a simple vista, inactive la polimerasa (durante
5 minutos a 80 °C o durante 2 minutos a 95 °C) antes de hacer lalectura, o de lo contrario se generarán resultados falsos.
(15) Para otras incubadoras, cuando la detección se hace por luz UV,
no la mire directamente. En su lugar, utilice una pantalla de cristal,gafas de seguridad o una máscara ocular con protección UV
siempre que mire directamente a la luz UV.
(16) Nunca abra los tubos de reacción una vez iniciada la reacción de
LAMP o después de terminada. Tenga cuidado al retirar los tubos
de reacción de la incubadora para no abrirlos accidentalmente.
(17) No reutilice ningún producto amplificado en los tubos paraelectroforesis u otras aplicaciones.

Gráfico de amplificación
Muestra negativa
Muestra positiva 1
Muestra positiva 2

0,7

0,7

0,6

0,6

0,5

0,5

Turbidez

Turbidez

Control negativo
Control positivo

0,4
0,3

0,4
0,3

0,2

0,2

0,1

0,1

0

0
0

0

5 10 15 20 25 30 35 40

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

5 10 15 20 25 30 35 40

Tiempo (min)Fig. 1: Gráficas de amplificación
correspondientes a los controles.

Detección de fluorescencia a simple vista(Para HumaLoop T)
Coloque cada uno de los tubos de reacción en la unidad dedetección de fluorescencia, y a continuación irradie y observe el tubo
desde un lado.
(Para otra incubadora con luz UV)
Irradie el fondo de cada uno de los tubos de reacción y observe
desde un lado a través de gafas de seguridad o de una máscaraocular con protección UV.
Para que la tanda analítica sea válida, se deben obtener lossiguientes resultados: Control positivo: se emite luz fluorescente verde Control negativo: no se emite luz fluorescente
Si algún control es inválido, todas las muestras de la serie analítica
deben reportarse como inválidas y la prueba debe repetirse.
Una vez se haya confirmado que la serie analítica es válida, evalúe
las muestras de la siguiente manera:
 Muestra positiva: se emite luz fluorescente verde.
 Muestra negativa: no se emite luz fluorescente.
Detección de la turbidez en tiempo real con el HumaTurb C+A
Una vez se haya confirmado que la turbidez aumenta en el control
positivo, pero no en el control negativo, evalúe las muestras
atendiendo a los siguientes criterios (Figs. 1 y 2).
 Positivo: se observa un cierto aumento de la turbidez.
 Negativo: no se observa un aumento de la turbidez.
Notas:(1) La sensibilidad mínima detectable de este producto es de 0,38
equivalentes genómicos por prueba. Incluso con una prueba
negativa, los pacientes con cualquier síntoma persistenteindicativo de una infección por MTBC deben hacerse otra prueba.
(2) Aunque los cebadores se han diseñado para dirigirse a una región
que contenga un número relativamente pequeño de variaciones,
es posible que el MTBC adquiera variaciones adicionales en esta
región y se vuelva menos sensible a este producto. Por lo tanto,
que una prueba haya dado negativo no siempre permite descartar
la infección por MTBC.
(3) Los resultados analíticos se pueden ver afectados por la recogida
y el transporte de las muestras, la preparación de las muestras,
los inhibidores y otros errores del procedimiento en el laboratorio.
Una prueba que haya dado negativo no permite descartar lapresencia de MTBC en la muestra. Al hacer un diagnóstico clínico,
hay que tener en cuenta el estado clínico del paciente y todos losdemás resultados analíticos disponibles.
(4) Este producto es un kit para la detección cualitativa; no estádiseñado para la determinación cuantitativa. La intensidad de laluz fluorescente observada o el tiempo de aumento de la turbidez
determinado por el turbidímetro en tiempo real HumaTurb C+A no
guarda relación con la concentración de ADN molde.

Tiempo (min)Fig. 2: Gráficas de amplificación
correspondientes a las muestras.

NOTAS SOBRE EL PROCEDIMIENTO(1) La reacción de LAMP es muy sensible y cualquier contaminante,
incluso con pequeñas cantidades de producto amplificado, podría
dar falsos positivos.
(2) Separe las zonas de recogida de muestras de esputo de la zonadonde se realizan las pruebas de LAMP.
(3) Antes y después de realizar la prueba, limpie las mesas de trabajo
con una solución de hipoclorito de sodio con una concentraciónde al menos un 0,5 %.
(4) Adopte las medidas necesarias para evitar la contaminación, en
particular, cámbiese los guantes después de transferir el esputo osi los guantes entran en contacto con la solución de ADN.
(5) Al manipular este producto, evite la contaminación con microbios
ynucleasas.
Inclusounapequeña
cantidaddedesoxirribonucleasa transmitida por el sudor o la saliva al tubo dereacción podría descomponer el ADN y causar un resultado falso.
(6) No utilice muestras de esputo que contengan una gran cantidad
de sangre, ya que esto puede afectar a las determinaciones.
Consulte el «Manual de Microbiología Clínica, 12ª edición»6) si
tuviera que realizar un pretratamiento de la muestra.
(7) Lo ideal es utilizar la solución de ADN inmediatamente despuésde su preparación; si no es posible, la solución de ADN se puede
conservar a temperatura ambiente y usar en un plazo de 72 horas.
(8) Al dispensar la solución en el tubo de reacción, evite el contacto
entre la tapa de inyección suministrada en el Loopamp PUREDNA Extraction Kit y la pared interior de los tubos de reacción.
Mantenga la gradilla del tubo en posición vertical y llene el tubo
hasta que el nivel de la solución de ADN esté entre las dos líneas
(30 µl). De no hacer esto correctamente (por encima de la línea
superior o por debajo de la línea inferior), la calidad de losresultados se podría ver afectada.
(9)（Para HumaLoop T o cualquier otra incubadora con luz UV）
Si hubiera burbujas, golpetee los tubos (o centrifúguelos) paraeliminarlas.
（Para el turbidímetro en tiempo real HumaTurb C+A）
Las burbujas en la solución de reacción interfieren con ladeterminación de la turbidez y producen resultados falsos. Evite laformación de burbujas al mezclar el reactivo y la solución
problema. Si hubiera burbujas, golpetee los tubos o centrifúguelos
para eliminarlas.
(10) El dMTB debe estar completamente disuelto. Toda porción nodisuelta podría afectar a la calidad de los resultados, por ejemplo,
causando una disminución de la sensibilidad. En particular,mantenga los tubos en posición invertida durante 2 minutos.
(11) El PC MTB contiene un elevado número de copias de ADN decontrol. Evite la contaminación de otras muestras con el PC MTB.
Dispense las muestras y la solución de control negativo y cierre
todos los tubos de reacción antes de dispensar el PC MTB.

SUSTANCIAS INTERFERENTES
Nuestros estudios internos han revelado que la determinación no seve afectada por la presencia de bilirrubina libre (91,0 mg/dl), bilirrubina
conjugada (101,0 mg/dl), quilo (turbidez de formazina: 7,300) y
hemoglobina hemolítica (2,475 mg/dl).

13

En cuanto a los fármacos, nuestros estudios internos han revelado
que la determinación no se ve afectada por la presencia de isoniazida(100 µg/ml), etambutol (20 µg/ml), rifampicina (100 µg/ml), pirazinamida(500 µg/ml), kanamicina (20 µg/ml), y estreptomicina (500 µg/ml).

producida por la sangre). Por lo tanto, consideramos que los dos
tipos de evaluaciones son idénticas. Las tablas a continuación
muestran los resultados obtenidos mediante detección de laturbidez en tiempo real. Cabe destacar que los resultados obtenidos
mediante detección de la fluorescencia a simple vista por el
HumaLoop T fueron los mismos que los obtenidos mediante elturbidímetro en tiempo real HumaTurb C+A.

PARÁMETROS DE CALIDAD
1. Exactitud
En los análisis de las siguientes muestras:
 muestra
negativa(concentración:0
equivalentes
genómicos/prueba)
 muestra positiva 1 (1,875 equivalentes genómicos/prueba)
 muestra positiva 2 (125 equivalentes genómicos/prueba)
La muestra negativa debe dar negativo, mientras que lasmuestras positivas 1 y 2 deben dar positivo.
2. Reproducibilidad intraserie
Si se analizan simultáneamente cinco muestras negativas y cinco
positivas, las muestras negativas deben dar siempre negativo,
mientras que las muestras positivas deben dar siempre positivo.
3. Límite de detección
0,38 genomas equivalentes/prueba
4. Reactividad cruzada
En cuanto a las micobacterias no tuberculosas (Mycobacterium
asiaticum, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium marinum,

LAMP
Positivos
Negativos
Tasa de concordancia global
Sensibilidad diagnóstica
Especificidad diagnóstica
Valor predictivo positivo
Valor predictivo negativo
Coeficiente de probabilidad +(sensibilidad/(1-especificidad))

Esputo no tratado

PCR
Positivos
Negativos
196
7
20
95
91,5% (291/318)
90,7% (196/216)
93,1% (95/102)
96,6% (196/203)
82,6% (95/115)
13,1

Coeficiente de probabilidad ((1-sensibilidad)/especificidad)

0,0999LAMP

Mycobacterium simiae, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium
szulgai,
Mycobacterium
gordonae,
Mycobacterium
xenopi
Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium
gastri, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium malmoense,
Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium

Positivos
Negativos
Tasa de concordancia global
Sensibilidad diagnóstica
Especificidad diagnóstica
Valor predictivo positivo
Valor predictivo negativo
Coeficiente de probabilidad +(sensibilidad/(1-especificidad))
Coeficiente de probabilidad ((1-sensibilidad)/especificidad)

Esputo pretratado

flavescens) (1,0 x 104 genomas equivalentes por prueba) y bacteriasde enfermedades respiratorias (Streptococcus pneumoniae,
Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis,
Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Legionella pneumophila,
Pseudomonas aeruginosa, Mycoplasma pneumoniae (I), Mycoplasma
pneumoniae (II)) (1,0 x 105 genomas equivalentes por prueba), el

sistema de medición dio resultados negativos para todas las
especies bacterianas; no se produjo ninguna reacción cruzada.
5. Reactividad frente a MTBC
Se confirmó la reactividad frente a Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium bovis y Mycobacterium africanum.
6. Información sobre un calibrador
En la evaluación de los parámetros de calidad de este producto
se utilizó el ADN plásmídico que contiene el gyrB y la región IS delADN del genoma de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (núm. de
GenBank NC_000962) como calibrador.
7. Rendimiento clínico
Hasta la fecha, la tuberculosis sigue siendo una de las infecciones
más importantes del mundo. A nivel mundial, el número total
estimado de nuevos casos de tuberculosis es de unos 10 millones,y el de esputo con baciloscopia positiva es de unos 4,3 millones.7)
En Japón, en 2008 se registraron 24 760 nuevos pacientes
afectados por la tuberculosis, de los cuales 2216 fallecieron.8)
A fin de comprobar la eficiencia en el diagnóstico de pacientes
que podrían tener tuberculosis, este producto se examinó en dos
centros médicos designados para enfermedades infecciosas declase 2 (centros médicos designados que tenían camas exclusivas
para pacientes con tuberculosis). Junto con la PCR y TRC, ambos
ya aprobados en Japón, este kit se utilizó para analizar muestras deesputo recogidas durante 2 días (320 muestras de 160 sujetos), yse compararon los resultados obtenidos con cada kit. En particular,las pruebas realizadas con este producto incluían evaluaciones dela solución de ADN extraído de esputo no tratado (en adelante,
LAMP para esputo no tratado) y de la solución de ADN extraído deesputo pretratado con NALC-NaOH y algún otro proceso (enadelante, LAMP para esputo pretratado).
Como se muestra en las tablas siguientes, la tasa deconcordancia global fue favorable, como se indica a continuación:
LAMP para esputo no tratado frente a PCR: 91,5% (291/318
sujetos); LAMP para esputo pretratado frente a PCR: 92,1%(293/318); LAMP para esputo no tratado frente a TRC: 94,3%(230/244); LAMP para esputo pretratado frente a TRC: 93,0%(227/244) Además, las evaluaciones realizadas mediante detecciónde la turbidez en tiempo real y detección de la fluorescencia a simple
vista concordaban perfectamente, excepto para una muestra (esta
muestra era esputo sanguinolento y dio un falso negativo en ladetección de la fluorescencia a simple vista debido a la alteración

PCR
Positivos
Negativos
194
3
22
99
92,1% (293/318)
89,8% (194/216)
97,1% (99/102)
98,5% (194/197)
81,8% (99/121)
31,0
0,105

TRC
Positivos
Negativos
163
5
9
67
94,3% (230/244)
94,8% (163/172)
93,1% (67/72)
97,0% (163/168)
88,2% (67/76)

LAMP
Positivos
Esputo no
tratadoNegativos
Tasa de concordancia global
Sensibilidad diagnóstica
Especificidad diagnóstica
Valor predictivo positivo
Valor predictivo negativo
Coeficiente de probabilidad +(sensibilidad/(1-especificidad))
Coeficiente de probabilidad ((1-sensibilidad)/especificidad)

13,9
0,0451TRC
Positivos
Negativos
157
2
15
70
93,0% (227/244)
91,3% (157/172)
97,2% (70/72)
98,7% (157/159)
82,4% (70/85)

LAMP
Positivos
Esputopretratado
Negativos
Tasa de concordancia global
Sensibilidad diagnóstica
Especificidad diagnóstica
Valor predictivo positivo
Valor predictivo negativo
Coeficiente de probabilidad +(sensibilidad/(1-especificidad))
Coeficiente de probabilidad ((1-sensibilidad)/especificidad)

32,6
0,0895

INFORMACIÓN PARA PEDIDOS
Cód. del Nombre delContenido
producto producto
Loopamp MTBC
97200096 pruebas
Detection Kit
980000970000964000

14

HuMax ITA
Loopamp PUREDNA Extraction Kit
Incubadora
HumaHeat

Microcentrífuga
90 pruebas
TermobloqueCód. del Nombre delproducto producto

Contenido

971000

1 pipeta, 4 x 96 puntas

961000963200

Pipette-60 Set
HumaLoop T
HumaTurb C+A

1 unidad principal
1 unidad de detección
fluorescencia
1 unidad de control
1 unidad de amplificación

TABLA DE SÍMBOLOS
Número decatálogo
Dispositivo médico
para diagnóstico in
vitro

de

Código del lote

Consulte las
instrucciones de uso

Fecha de caducidad

Fabricante

Límite de temperatura

Contenido suficientepara <n> pruebas

Representante
autorizado en la
Comunidad Europea

AVISO
En caso de producirse cualquier incidente grave relacionado con el
producto, notifique al representante autorizado, al fabricante y a laautoridad competente del Estado miembro en el que esté establecido elusuario y/o el paciente.

REFERENCIAS
1) Notomi T., et al.: Nucleic Acids Research 28, No. 12, e63 (2000)
2) Nagamine K., et al.: Clin. Chem. 47, No. 9, 1742–1743 (2001)
3) Mori Y., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, No. 1, 150–
154 (2001)
4) Tomita N., et al.: Nat. Protoc. 3, No. 5, 877–882 (2008)
5) The guideline for the bio-safety and bio-hazard (by the JapaneseSociety for Bacteriology): Japanese Journal of Bacteriology 54, No.
3, 667–715 (1999)
6) Isabella MGaby EP and Nicole P., et al.: Manual of ClinicalMicrobiology, 12th edition, ASM PRESS, 558–575 (2019)
7) WHO global TB database:https://www.who.int/teams/global-tuberculosis-programme/data
https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/336069/9789240
013131-eng.pdf
8) Kekkaku No Tokei 2009 (Statistics of TB 2009): Japan AntiTuberculosis Association

Diagrama de flujo
Procedimiento para la detección de la turbidez en tiempo
real
Preparación de la solución problema y de la solución de control
Pipetee 60 µl de muestra y de NC MTB.
Con el Loopamp PURE DNA Extraction Kit,
extraiga el ADN de la muestra de esputo recogida ydel NC MTB. Las soluciones obtenidas se utilizan
como la solución problema y la solución de control
negativo, respectivamente.
Preparación de losreactivos

Retire el número necesario de tubos dereacción del dMTB.

Mezcla del reactivo yla solución problema(Para las muestras, el control
negativo y el control positivo)

Transfiera 30 µl de solución problema o solución decontrol a cada uno de los tubos de reacción.
Utilice la solución de control negativo como control
negativo.
Utilice el PC MTB como control positivo.
(El control positivo debe prepararse al final).
Invierta los tubos de reacción para recoger la solución
en la tapa. Espere 2 minutos.
Espere 2 minutos con los tubos de reacción invertidos.
Invierta los tubos de reacción cinco veces para mezclar
el contenido y, a continuación, centrifúguelos.
(Evite la formación de burbujas)
Amplificación
Coloque los tubos de reacción en el bloque de reaccióndel turbidímetro.

Importador

HUMAN Gesellschaft für Biochemica
und Diagnostica mbH
Max-Planck-Ring 21, 65205 Wiesbaden (Alemania)

Como se indica en las instrucciones de uso delturbidímetro, inicie la reacción y, a continuación,
determine y evalúe la turbidez (durante 40 minutos a
67,0 °C).
Confirme la finalización de la inactivación de la polimerasa (durante
5 minutos a 80 °C o durante 2 minutos a 95 °C). Retire todos los tubos
de reacción del turbidímetro y deséchelos sin abrirlos. Tenga cuidado
de no dañar los tubos.

https://www.eiken.co.jp/en*Fecha de revisión: 2023-10-31

15

Gebrauchsanweisung

SSP in EUDAMED verfügbar

380236-D
Deutsch972000

Negativkontrolle MTB (NC MTB) ······················· 3 x 0,5 ml
30 µl Tropfer ··········································· 1 x 18 Tropfera) Die aus Geobacillus stearothermophilus stammende Bst DNAPolymerase ist eine strangversetzende DNA-Polymerase ohne
53-Exonukleaseaktivität.

Loopamp MTBC Detection Kitb) Primer, die in der gyrB- und IS-Region der MTBC-Genom-DNA
entwickelt wurden, die durch HPLC von synthetisierten
Oligonukleotiden gereinigt wurden.
c) PC MTB enthält ein Produkt, das aus der In-vitro-Amplifikation
einer Template-Genom-DNA von Mycobacterium tuberculosis
H37Rv (GenBank Nr. NC_000962) stammt.
Die Abkürzungen der folgenden Reagenzien und die
Chargennummer sowie der Hersteller (EKN) sind wie unten gezeigt auf
den Behältern aufgedruckt:

VERWENDUNGSZWECK
Das Loopamp MTBC Detection Kit ist ein qualitativer In-vitroDiagnosetest zum Nachweis von Mycobakterium tuberculosis-Komplex(MTBC)-DNA aus dem Sputum von Patienten mit Symptomen, die auf
eine MTBC-Infektion hinweisen. Das Kit hilft bei der Diagnose einer
MTBC-Infektion und ist für die Verwendung in professionellen Labors
und Krankenhäusern durch entsprechend geschultes Personal
vorgesehen. Das Ergebnis kann entweder mit einem automatischen
Turbidimeter oder visuell unter UV-Bestrahlung interpretiert werden.

Reagenzien
Positivkontrolle MTBTESTPRINZIP
Dieses Produkt basiert auf dem von der Eiken Chemical Co., Ltd.
entwickelten Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren „Loop-mediatedisothermal amplification“ (LAMP).
Die LAMP-Methode zeichnet sich durch folgende Merkmale aus: (1)Es wird nur ein Enzym benötigt und die Amplifikationsreaktion läuft unter
isothermen Bedingungen ab.1),2) (2) Sie hat eine extrem hohe Spezifität
aufgrund der Verwendung von vier Primern, die sechs verschiedene
Regionen auf der Ziel-DNA erkennen. (3) Sie hat eine hohe
Amplifikationseffizienz und kann in kurzer Zeit eine hohe Konzentration
an Amplifikat erzeugen, was einen optischen oder automatischen
Nachweis ermöglicht.3),4)
Die mit diesem Produkt gelieferten Primer wurden in der GyraseUntereinheit B (gyrB) und der Insertionssequenz IS6110 (IS) Region der
MTBC-Genom-DNA entwickelt, die durch die Alignment-Analyse derausgewählten Basensequenzen von MTBC und nichttuberkulösen
Mykobakterien als gut konservierte Basensequenz in MTBC bestätigt
wurde.
Die DNA aus unbehandeltem Sputum oder NALC-NaOHbehandeltem Sputum wird mit dem Loopamp PURE DNA Extraction
Kit (separat erhältlich) extrahiert. Dann wird die DNA-Lösung in ein
Reaktionsgefäß gegeben. Die strangversetzende DNA-Polymerase,
Desoxyribonukleosidtriphosphate (dATP, dCTP, dGTP und dTTP),
Calcein, Reaktionspuffer und MTBC-spezifische Primer werden ingetrockneter Form in der Verschlusskappe des Reaktionsgefäßes
aufbewahrt.
Diesesgetrocknete
LAMP-Reagenz(MTBCNachweisreagenz (dMTB)) löst sich auf, wenn die DNA-Lösung
hinzugefügt wird. Das Reaktionsgefäß wird dann bei 67,0 C inkubiert
und die DNA wird durch die Katalyse der strangversetzenden DNAPolymerase in der LAMP-Reaktion amplifiziert.
Der Nachweis der Amplifikaten basiert auf der Trübungsmessungeines Nebenprodukts, Magnesiumpyrophosphat (weißes Präzipitat).3)
Alternativ kann anstelle der Trübungsmessung auch eine optische
Beurteilung unter UV-Bestrahlung durchgeführt werden. Vor der
Reaktion befindet sich das Calcein im Reagenz in einem gehemmten
Zustand, da Manganionen daran gebunden sind. Sobald die LAMPReaktion jedoch beginnt, werden Pyrophosphationen gebildet, die die
Manganionen binden, und das Calcein wird fluoreszierend.4)

Negativkontrolle MTB

Beschriftung am Röhrchen Deckelcode
PC MTBPC
Lot No., EKNMTBNC MTBNC
Lot No., EKN
MTB*Informationen zur Metrologischen Rückverfolgbarkeit
Die Positivkontrolle stammt aus dem Amplifikationsprodukt
genomischer DNA von Mycobacterium tuberculosis H37Rv (GenBank
Nr. NC_000962). Die spezifische Region von Mycobacterium
tuberculosis H37Rv, die Region von Interesse, dient als Vorlage für die
Amplifikation des PC-MTBDNA-Fragments. Dieses Fragment wird
durch photospektrometrische Analyse quantifiziert und die DNAKonzentration von PC MTB wird auf 1000 Kopien/μl eingestellt.

WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN(1) Nur zum Gebrauch in der In-vitro-Diagnostik.
(2) Dieses Produkt ist für die klinische Diagnose von MTBC anhand
von Sputumproben menschlichen Ursprungs vorgesehen. Nicht
für andere Zwecke verwenden.
(3) Bei Verwendung dieses Produkts immer diese Serviceanleitung
beachten.
(4) Reagenzien nicht einfrieren.
(5) Keine abgelaufenen Reagenzien verwenden.
(6) Verschiedene Chargen nicht mischen.
(7) Reagenzien nicht nachfüllen.
(8) Die Leistung des Loopamp MTBC Detection Kit hängt von derKompetenz des Anwenders und der Einhaltung der
Verfahrensanweisungen ab. Die Tests sollten von entsprechendgeschultem Personal unter strikter Einhaltung der mitgelieferten
Anweisungen durchgeführt werden.
(9) Kurz vor Verwendung die erforderliche Anzahl Reaktionsgefäße
aus der Verpackung entnehmen und den Aluminiumbeutel sofort
wieder verschließen.
(10) Trockenmittel im Aluminiumbeutel belassen. Hohe Feuchtigkeit
kann das getrocknete LAMP-Reagenz in den Reaktionsgefäßen
zersetzen.
(11) Hitze, Feuchtigkeit und Licht können das dMTB beschädigen.
Daher nur die erforderliche Anzahl Reaktionsgefäße (Anzahl
Proben + Anzahl Kontrollen) entnehmen und den Aluminiumbeutel
sofort wieder verschließen.
(12) Benutzerhandbuch lesen und vor Beginn des Verfahrens
vergewissern, dass die erforderliche Ausrüstung (Turbidimeteroder Inkubator) verfügbar ist.
(13) Sputumproben stellen ein potenzielles Infektionsrisiko dar. Alle
notwendigen Vorsichtsmaßnahmen zur Vermeidung von
Biogefährdung treffen.5)(14) PC MTB und NC MTB enthalten geringe Mengen an Natriumazid
als Konservierungsmittel. Da Natriumazid als giftig eingestuft ist,
jeglichen Kontakt mit Augen, Mund oder Haut vermeiden.
(15) Bei versehentlichem Kontakt von Reagenzien mit Augen, Mundoder Haut die betroffene Stelle sofort mit reichlich Wasser
abspülen und, falls notwendig, einen Arzt konsultieren.
(16) PC MTB nicht diluieren oder den Proben beifügen. Stattdessen PC
MTB nur wie in dieser Packungsbeilage beschrieben verwenden,
um eine DNA-Kontamination zu vermeiden.
(17) PC MTB und alle positiven Sputumproben getrennt von den
anderen Kit-Reagenzien aufbewahren.

KITBESTANDTEILE
Die Reagenzien sind bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Datum
haltbar, vorausgesetzt, der Behälter bleibt ungeöffnet bei einer
Lagertemperatur
von230 C.
Bei
Beachtungdieser
Verfahrensanweisungen sind die Reagenzien auch nach dem Öffnen
des Behälters stabil.
MTBC-Nachweisreagenz ························2 x 48 Röhrchen
Die folgenden Reagenzien in getrockneter Form sindin jedem Reaktionsgefäß enthalten.
Bst DNA-Polymerase a)
Desoxyribonukleosidtriphosphate
Magnesiumsulfat
Calcein
Manganchlorid
Primer b)
Positivkontrolle MTB (PC MTB) c) ······················ 1 x 0,4 ml

16

(18) Die Verschlusskappe jedes Reaktionsgefäßes enthält das dMTB
in getrockneter Form. Verschlussinnenseite nicht berühren.
(19) Reaktionsgefäße vor Verwendung sorgfältig auf Risse oderKratzer prüfen. Beschädigte Gefäße können falsche Ergebnisse
liefern und zu DNA-Kontamination von Inkubator undArbeitsbereich führen.
(20) Reaktionsgefäße vor Ende der LAMP-Reaktion keinem UV-Licht
aussetzen. Längere UV-Lichtbestrahlung kann die Gefäße
beschädigen und zu falschen Ergebnissen führen.
(21) Bei
Verwendung
von
UV-Lichtfürdieoptische
Fluoreszenzbeurteilung nicht direkt in die UV-Lichtquelle schauen.
Schon ein kurzer Blick in das UV-Licht kann die Augen reizen und
konjunktivitisähnliche Symptome hervorrufen. Bei direktem
Blickkontakt mit dem UV-Licht sollte eine Glasscheibe verwendet
oder eine Schutzbrille bzw. Augenmaske getragen werden.
(22) Im Benutzerhandbuch des Inkubators nachschlagen. Bei
Verwendung von HumaLoop T oder Real-Time Turbidimeter
HumaTurb C+A die Reaktionsgefäße vorsichtig aus dem Inkubator
entnehmen, um Verbrennungen zu vermeiden.

Loopamp PURE DNA Extraction Kit enthalten ist. Zur
Verarbeitung der NC MTB die Gebrauchsanweisung beachten (imFolgenden
wird
extrahierte
NC
MTB
als
„Negativkontrolllösung“ bezeichnet).

Hinweis: Eine Negativkontrolle sollte jedes Mal enthalten sein.
（3）Positivkontrolle MTB（PC MTB）
Röhrchen anschnippen (oder abzentrifugieren), um den Inhalt
auf dem Boden des Röhrchens zu sammeln.

Hinweis: Die PC MTB sollte jedes Mal gemessen werden.

MESSVERFAHREN
DNA-Extraktion
Zur Extraktion der DNA aus 60 µl Sputumprobe die Anweisungenfür das Loopamp PURE DNA Extraction Kit (separat erhältlich)befolgen. 60 µl der Sputumprobe in das Heizgefäß geben und in den
HumaHeat oder den auf 90 C vorgeheizten Thermoblock legen.
Wann immer möglich, das purulenteste Sputum verwenden.
Reagenzien- und Probenmischung(1) HumaLoop T oder Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A
einschalten.
(2) 30 µl der Probenlösung unter Verwendung des Loopamp PUREDNA Extraction Kit in ein Reaktionsgefäß geben und die
Verschlusskappe schließen.

ABFALLENTSORGUNG(1) Röhrchen nicht
nach der DNA-Amplifikation öffnen.
Verschlusskappe geschlossen halten und benutzte Röhrchen als
medizinische Abfälle mittels Verbrennung oder doppelt verpackt inverschließbaren Plastikbeuteln entsorgen.
(2) Reaktionsgefäße niemals autoklavieren oder wiederverwenden,
da anderenfalls Amplifikate dispergieren und zu Kontamination
führen würden.
(3) Das Hauptmaterial der Reaktionsgefäße und Reagenzröhrchen ist
PP, des Reaktionsgefäßhalters PET, des Aluminiumbeutels
Aluminium und des Kit-Koffers Papier.
(4) Gebrauchte Reagenzien, Behälter oder Laborutensilien gemäß
lokalen Vorschriften entsorgen.

Hinweis: Das Volumen zwischen den beiden Linien auf dem
Reaktionsgefäß entspricht ca. 30 µl.
(3) 30 µl der Negativkontrolllösung unter Verwendung des Loopamp
PURE DNA Extraction Kit in ein Reaktionsgefäß geben und die
Verschlusskappe schließen.

Hinweis: Das Volumen zwischen den beiden Linien auf dem
Reaktionsgefäß entspricht ca. 30 µl.
(4) 30 µl der PC MTB mit dem mitgelieferten Tropfer in ein
Reaktionsgefäß geben und Verschlusskappe schließen.
(5) Alle Reaktionsgefäße anschnippen (oder abzentrifugieren), um die
Lösung auf dem Boden der Gefäße aufzufangen.

PROBENAHME

Hinweis: Nur wenn sich der Flüssigkeitsstand mittig der beiden
Linien auf einem Reaktionsgefäß befindet, wurden 30 µl
pipettiert.

(1) Den purulentesten Teil der Sputumprobe verwenden.
(2) Sputumproben sollten sofort nach der Entnahme verwendet
werden.
(3) Sputum in einem vom LAMP-Amplifikationsraum getrennten
Raum entnehmen. Aerosole, die die MTBC-DNA enthalten,
können bei der Sputumentnahme entstehen und eine
Kontamination verursachen.

ERFORDERLICHEENTHALTEN

MATERIALIEN,

NICHT

IM

(6) Die getrockneten Reagenzien durch Umdrehen der
Reaktionsgefäße und Sammeln der DNA-Lösung in der
Verschlusskappe rekonstituieren. Zur Rekonstitution dergetrockneten Reagenzien die Reaktionsgefäße 2 Minuten
verkehrt herum lagern.
(7) Zum Mischen des Inhalts die Reaktionsgefäße fünfmal drehen.
Vollständige Auflösung der getrockneten Reagenzien in der
Verschlusskappe prüfen.
(8) Alle Reaktionsgefäße anschnippen (oder abzentrifugieren), um die
Lösung auf dem Boden der Gefäße aufzufangen.

KIT

・ Loopamp PURE DNA Extraction Kit
・ Pipette-60 Set
Für optischen Fluoreszenznachweis(Für HumaLoop T)
・ HumaLoop T

Amplifikation
Für optischen Fluoreszenznachweis（Für HumaLoop T）(1) Überprüfen, ob die Temperatur des HumaLoop T 67,0 C beträgt.
(2) Reaktionsgefäße in den HumaLoop T legen und die grüne Taste
drücken, um die LAMP-Reaktion zu starten (40 Minuten bei
67,0 C). Einzelheiten zur Bedienung des HumaLoop T sind im
Benutzerhandbuch des HumaLoop T zu finden.
(3) Fertigstellung der Polymerase-Inaktivierung bestätigen (wird vom
HumaLoop T automatisch abgeschlossen). Alle Reaktionsgefäße
aus dem HumaLoop T entnehmen.
（Für anderen Inkubator mit UV-Licht）(1) Die Temperatur des Inkubators auf 67,0 C einstellen (wobei die
Temperatur der heißen Haube auf 10 C über der
Reaktionstemperatur oder so nahe wie möglich an diesem Wert
eingestellt werden sollte – Temperaturgenauigkeit: 0,5 C).
(2) Reaktionsgefäße
einsetzenundanschließend
dieAmplifikationsreaktion (40 Minuten bei 67,0 C) starten.
(3) Nach 40 Minuten die Polymerase mittels HumaHeat oder
Thermoblock (5 Minuten bei 80 C oder 2 Minuten bei 95 C)inaktivieren, um die Reaktion zu beenden.

(Für anderen Inkubator mit UV-Licht)
・ Inkubator (Temperaturgenauigkeit: 0,5 C; mit heißer Haube)
・ HumaHeat oder ein anderer Thermoblock
・ UV-Licht oder blaues LED-Licht (Wellenlänge: 240260 nm und
350370 nm)
・ Schutzbrille oder eine UV-blockierende Augenmaske (optional)
Für Echtzeit-Trübungsmessung・ HumaTurb C+A・ HumaHeat oder ein anderer ThermoblockZum Mischen von Reagenzien und Proben
・ Zentrifuge für Mikroreaktionsgefäße (optional)
・ Zentrifuge für acht verbundene Röhrchen (optional)・ HuMax ITA, Mikrozentrifuge (optional)

REAGENZVORBEREITUNG（1）MTBC-Nachweisreagenz
Die erforderliche Anzahl von Röhrchen aus dem
Aluminiumbeutel entnehmen und auf das Gestell legen. (Summe
der Proben und Kontrollen).

Hinweis: Nach Entnahme der benötigten Röhrchen den
Aluminiumbeutel mit den unbenutzten Röhrchen sofort wieder
verschließen.

Für die Echtzeit-Trübungsmessung mit HumaTurb C+A (siehe
Verfahrensablaufdiagramm)(1) Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A für den Nachweis mit
diesem Produkt konfigurieren.
(2) Prüfen, ob die angezeigte Temperatur 67,0 C erreicht(Turbidimeter sollte vor Gebrauch 20 Minuten vorgeheizt werden).

（2）Negativkontrolle MTB（NC MTB）
Röhrchen anschnippen (oder abzentrifugieren), um den Inhalt
auf dem Boden des Röhrchens zu sammeln. 60 µl der NC MTB in
der NC MTB in das Heizgefäß pipettieren, das im

17

(3) Reaktionsgefäße einsetzen und Messung starten.
(4) Turbidimeter-Anzeige auf einen Trübungsanstieg der Positiv- und
Negativkontrollen prüfen. Steigt die Trübung in der Positivkontrollean, in der Negativkontrolle jedoch nicht, läuft die
Amplifikationsreaktion korrekt ab (Abb. 1). Bei anderen
Bedingungen verläuft die Amplifikationsreaktion möglicherweise
nicht ordnungsgemäß. In einem solchen Fall sind die betroffenen
Proben erneut zu testen.
(5) Fertigstellung der Polymerase-Inaktivierung bestätigen (wird vom
Turbidimeter automatisch abgeschlossen). Alle Reaktionsgefäße
aus dem Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A entnehmen undungeöffnet entsorgen.

Jegliche Kontamination anderer Proben mit der PC MTB
vermeiden. Die Proben und die Negativkontrolllösung
dispensieren und vor der Dispension der PC MTB alle
Reaktionsgefäße verschließen.
(12) Zum Sammeln der Bestandteile auf dem Boden des Gefäßes das
Gefäß mit PC MTB vor dem Öffnen abzentrifugieren odervorsichtig anschnippen. Gefäß unmittelbar nach Dispension von
PC MTB verschließen.
(13) Bei Verwendung des HumaLoop T oder des Real-Time
Turbidimeter HumaTurb C+A wird die Polymerase-Inaktivierung
automatisch durchgeführt.
(14) Bei anderen Inkubatoren ist bei einem optischen
Fluoreszenznachweis vor der Beurteilung eine PolymeraseInaktivierung (5 Minuten bei 80 C oder 2 Minuten bei 95 C)durchzuführen, um Fehlbeurteilungen zu vermeiden.
(15) Bei einem anderen Inkubator darf bei UV-Bestrahlung nicht direkt
in das UV-Licht geschaut werden. Bei jedem direkten Blick in das
UV-Licht sollte eine Glasscheibe verwendet oder eine Schutzbrillebzw. Augenmaske getragen werden.
(16) Reaktionsgefäße nach Beginn oder Abschluss der LAMPReaktion niemals öffnen. Insbesondere ist darauf zu achten, dassdie Reaktionsgefäße beim Entladen aus dem Inkubator nichtversehentlich aufgehen.
(17) Amplifikate in den Röhrchen nicht zur Elektrophorese oder fürandere Anwendungen wiederverwenden.

Amplifikationsplots
Negative Probe
Positive Probe 1
Positive Probe 2

0,7

0,7

0,6

0,6

0,5

0,5

Trübung

Trübung

Negativkontrolle
Positivkontrolle

0,4
0,3

0,4
0,3

0,2

0,2

0,1

0,1

0
0

5 10

15 20 25 30 35 40

0
0

5 10

INTERPRETATION DER ERGEBNISSE

15 20 25 30 35 40

Zeit (min)Zeit (min)Abb. 1: Amplifikationsplots für
Kontrollen

Abb. 2: Amplifikationsplots fürProbenFür optischen Fluoreszenznachweis(Für HumaLoop T)
Jedes Reaktionsgefäß in die Fluoreszenz-Detektionseinheit stellen,
bestrahlen und von der Seite beobachten.
(Für Inkubator mit UV-Licht)
Den Boden jedes Reaktionsgefäßes bestrahlen und von der Seite
durch eine Schutzbrille oder eine UV-blockierende Augenmaske
beobachten.
Für eine gültige Testserie müssen folgende Ergebnisse erzielt
werden: Positivkontrolle: Emission von grünem Fluoreszenzlicht
 Negativkontrolle: keine Emission von Fluoreszenzlicht
Falls eine der Kontrollen ungültig ist, sollten alle Proben derTestserie als ungültig gemeldet und der Test wiederholt werden.
Nach erfolgter Bestätigung der Gültigkeit der Testserie sind die
Proben wie folgt zu beurteilen: Positive Probe: Emission von grünem Fluoreszenzlicht.
 Negative Probe: keine Emission von Fluoreszenzlicht.
Für die Echtzeit-Trübungsmessung mit HumaTurb C+A
Nachdem bestätigt wurde, dass die Trübung in der Positivkontrolle
zunimmt, in der Negativkontrolle jedoch nicht, sind die Proben nachden folgenden Kriterien (Abb. 1 und 2) zu bewerten.
 Positiv: leichter Trübungsanstieg zu beobachten Negativ: kein Trübungsanstieg zu beobachten
Anmerkungen:(1) Die
Nachweisgrenze
fürdieses
Produkt
sind
0,38 Genomäquivalente pro Test. Auch bei einem negativen Test
sollten sich Patienten mit einem anhaltenden, auf eine MTBCInfektion hindeutenden Symptom erneut ärztlich untersuchen
lassen.
(2) Obwohl Primer auf eine bestimmte Genregion mit einer relativ
geringen Anzahl von Variationen ausgerichtet sind, kann MTBC
möglicherweise weitere Variationen in dieser Region annehmen
und die Sensitivität dieses Produkts verringern. Deshalb kann eine
MTBC-Infektion trotz negativen Tests nicht immer ausgeschlossen
werden.
(3) Die Testergebnisse können durch Probenahme und -transport,
Probenvorbereitung, Inhibitoren und andere Verfahrensfehler imLabor beeinträchtigt werden. Ein negativer Test schließt das
Vorhandensein von MTBC in der Probe nicht aus. Für eineklinische Diagnose sind das Krankheitsbild des Patienten und alle
weiteren vorliegenden Laborergebnisse zu berücksichtigen.
(4) Dieses Produkt ist ein Kit für den qualitativen Nachweis. Es ist
nicht für die quantitative Messung konzipiert. Die Intensität desbeobachteten Fluoreszenzlichts oder die Anstiegszeit der vom
Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A gemessenen Trübung
korreliert nicht mit der Menge an Template-DNA.

VERFAHRENSHINWEISE(1) Die LAMP-Reaktion ist sehr empfindlich, und jede Kontamination
mit selbst kleinen Mengen des amplifizierten Produkts könnte zu
falsch-positiven Ergebnissen führen.
(2) Bereiche für Sputumprobenahme und LAMP-Testung trennen.
(3) Arbeitsplätze vor und nach dem Testen mit > 0,5 %Natriumhypochloritlösung reinigen.
(4) Alle notwendigen Maßnahmen zur Kontaminationsvermeidung
treffen,insbesondereHandschuhwechselnachSputumprobenübertragung oder bei Kontakt der Handschuhe mit
der DNA-Lösung.
(5) Beim Umgang mit diesem Produkt mikrobielle Kontamination und
Nuklease-Kontamination vermeiden. Selbst eine kleine Menge
DNase, die aus Schweiß oder Speichel in das Reaktionsgefäß
gelangt, kann die DNA zersetzen und ein falsches Ergebnis
verursachen.
(6) Keine Sputumproben verwenden, die eine große Menge Blutenthalten, da dies die Messungen beeinträchtigen kann. Sollte
eine Vorbehandlung der Probe erforderlich sein, bitte im „Manualof Clinical Microbiology“ (12. Auflage)6) nachschlagen.
(7) Die DNA-Lösung sollte idealerweise sofort nach der Herstellung
verwendet werden. Wenn dies nicht möglich ist, kann die DNALösung bei Raumtemperatur gelagert und innerhalb von
72 Stunden verwendet werden.
(8) Beim Einfüllen der Lösung in das Reaktionsgefäß den Kontakt
zwischen der Injektionskappe des Loopamp PURE DNA
Extraction Kit und der Innenwand der Reaktionsgefäße vermeiden.
Das Röhrchengestell aufrecht halten und das Röhrchen befüllen,
bis der Füllstand der DNA-Lösung zwischen den beiden Linien
liegt (30 µl). Inkorrekte Befüllung (über der oberen Linie oder unter
der unteren Linie) kann die Leistung beeinflussen.
(9)（Für HumaLoop T oder einen anderen Inkubator mit UV-Licht)
Wenn Bläschen vorhanden sind, die Röhrchen anschnippen (oderabzentrifugieren), um die Bläschen zu entfernen.
（Für Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A）
Da Bläschen in der Reaktionslösung die Trübungsmessung
beeinträchtigen und zu einer Fehlbeurteilung führen können, sollte
Bläschenbildung beim Mischen von Reagenz und Probenlösung
vermieden werden. Eventuelle Bläschen durch Abzentrifugierenoder Anschnippen entfernen.
(10) Das dMTB sollte vollständig aufgelöst sein. Nicht diluierte
Bestandteile können die Leistung beeinträchtigen, z. B. in Formeiner verminderten Sensitivität. Die Röhrchen insbesondere
2 Minuten lang auf dem Kopf stehend lagern.
(11) Die PC MTB enthält eine hohe Kopienzahl der Kontroll-DNA.

18

INTERFERENZEN

LAMP für unbehandeltes Sputum vs. TRC: 94,3 % (230/244); LAMP
für vorbehandeltes Sputum vs. TRC: 93,0 % (227/244). Außerdem
stimmten die Auswertungen der Echtzeit-Trübungsmessung und
des optischen Fluoreszenznachweises vollständig überein, mit
Ausnahme einer Probe (diese Probe war blutiges Sputum undwurde beim optischen Fluoreszenznachweis aufgrund der Störung
durch Blut falsch negativ getestet). Daher betrachten wir die beiden
Arten von Bewertungen als identisch miteinander. Die folgenden
Tabellen zeigen die Testergebnisse, die mit der EchtzeitTrübungsmessung erzielt wurden. Bemerkenswert ist, dass die
Ergebnisse des optischen Fluoreszenznachweises mit dem
HumaLoop T dieselben waren wie mit dem Real-Time Turbidimeter
HumaTurb C+A.

Interne Studien zeigten keine Beeinflussung der Messung durch das
Vorhandensein von freiem Bilirubin (91,0 mg/dl), konjugiertem Bilirubin(101,0 mg/dl), Chylus (Formazin-Trübung: 7300) und hämolisiertem
Hämoglobin (2475 mg/dl).
Hinsichtlich Arzneimitteln ergaben interne Studien keine
Beeinflussung der Messung durch das Vorhandensein von Isoniazid(100 µg/ml),
Ethambutol(20 µg/ml),
Rifampicin(100 µg/ml),
Pyrazinamid (500 µg/ml), Kanamycin (20 µg/ml) und Streptomycin(500 µg/ml).

LEISTUNGSDATEN
1. Genauigkeit
Beim Testen der folgenden Proben:
 Negative Probe (Konzentration: 0 Genomäquivalente/Test)
 Positive Probe 1 (1,875 Genomäquivalente/Test)
 Positive Probe 2 (125 Genomäquivalente/Test)
Die negative Probe sollte negativ getestet und die positiven
Proben 1 und 2 positiv getestet werden.
2. Reproduzierbarkeit innerhalb einer Testserie
Beim Testen von fünf negativen und positiven Proben gleichzeitig
sollte die negative Probe durchgehend negativ getestet und die
positive Probe durchgehend positiv getestet werden.
3. Nachweisgrenze
0,38 Genomäquivalente/Test
4. Kreuzreaktivität
In Bezug auf nichttuberkulöse Mykobakterien (Mycobacterium
asiaticum, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium marinum,

LAMP
Positiv
Unbehandeltes
SputumNegativ
Gesamtübereinstimmungsrate
Diagnostische Sensitivität
Diagnostische Spezifität
Positiver prädiktiver Wert
Negativer prädiktiver Wert
Wahrscheinlichkeitsverhältnis +(Sensitivität/(1-Spezifität))
Wahrscheinlichkeitsverhältnis ((1-Sensitivität)/Spezifität)

Mycobacterium simiae, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium
szulgai,
Mycobacterium
gordonae,
Mycobacterium
xenopi,
Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium
gastri, Mycobacterium haemophilum, Mycobacterium malmoense,
Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium
flavescens) (1,0 x 104 Genomäquivalente pro Test) und Bakterien fürAtemwegserkrankungen (Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus
aureus, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Klebsiellapneumoniae, Escherichia coli, Legionella pneumophila, Pseudomonas
aeruginosa, Mycoplasma pneumoniae（I）, Mycoplasma pneumoniae
（II）)

LAMP
Positiv
Vorbehandeltes
SputumNegativ
Gesamtübereinstimmungsrate
Diagnostische Sensitivität
Diagnostische Spezifität
Positiver prädiktiver Wert
Negativer prädiktiver Wert
Wahrscheinlichkeitsverhältnis +(Sensitivität/(1-Spezifität))(1,0 x 105 Genomaquivalente pro Test) testete das Messsystem
negativ auf alle Bakterienarten. Es trat keine Kreuzreaktion auf.

Wahrscheinlichkeitsverhältnis ((1-Sensitivität)/Spezifität)

5. Reaktivität gegen MTBC
Reaktivität gegen Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium
bovis und Mycobacterium africanum wurde bestätigt.
6. Information über Kalibrator
Beim Leistungstest für dieses Produkt wurde die Plasmid-DNA
verwendet, die das gyrB und die IS-Region der Genom-DNA von
Mycobacterium tuberculosis H37Rv (GenBank Nr. NC_000962) als
Kalibrator verwendet.
7. Klinische LeistungBis heute ist die Tuberkulose eine der bedeutendsten
Infektionskrankheiten der Welt. Weltweit wird die Gesamtzahl derneuen Tuberkulosefälle auf etwa 10 Millionen geschätzt, und die
Zahl der Sputumabstrich-positiven Fälle liegt bei etwa 4,3Millionen.7) In Japan wurden im Jahr 2008 24.760 Patienten neu alsan Tuberkulose erkrankt registriert, von denen 2216 starben.8)
Dieses Produkt wurde in zwei medizinischen Einrichtungen, die
für Infektionskrankheiten der Klasse 2 ausgewiesen sind(ausgewiesene medizinische Einrichtungen, die über Betten
ausschließlich für Patienten mit Tuberkulose verfügen), auf seine
Leistungsfähigkeit bei der Diagnose von Patienten mit Verdacht auf
Tuberkulose untersucht. Zusammen mit PCR und TRC, die beide
bereits in Japan zugelassen waren, wurde dieses Kit verwendet, um
zwei Tage lang gesammelte Sputumproben zu testen (320 Proben
von 160 Probanden), und die Ergebnisse wurden zwischen den Kits
verglichen. Die auf diesem Produkt basierenden Tests umfassten
insbesondere Bewertungen für die DNA-Extraktlösung, die aus dem
unbehandelten Sputum gewonnen wurde (im Folgenden LAMP fürunbehandeltes Sputum), und solche für die DNA-Extraktlösung, dieaus dem mit NALC-NaOH und einigen anderen Verfahren
vorbehandelten Sputum gewonnen wurde (im Folgenden LAMP fürvorbehandeltes Sputum).
Wie aus den folgenden Tabellen hervorgeht, war die
Gesamtübereinstimmungsrate wie folgt günstig: LAMP fürunbehandeltes Sputum vs. PCR: 91,5 % (291/318 Probanden);
LAMP für vorbehandeltes Sputum vs. PCR: 92,1 % (293/318);

13,1
0,0999PCR
Positiv
Negativ
194
3
22
99
92,1 % (293/318)
89,8 % (194/216)
97,1 % (99/102)
98,5 % (194/197)
81,8 % (99/121)
31,0
0,105

Positiv
Unbehandeltes
SputumNegativ
Gesamtübereinstimmungsrate
Diagnostische Sensitivität
Diagnostische Spezifität
Positiver prädiktiver Wert
Negativer prädiktiver Wert

TRC
Positiv
Negativ
163
5
9
67
94,3 % (230/244)
94,8 % (163/172)
93,1 % (67/72)
97,0 % (163/168)
88,2 % (67/76)

Wahrscheinlichkeitsverhältnis +(Sensitivität/(1-Spezifität))

13,9

Wahrscheinlichkeitsverhältnis ((1-Sensitivität)/Spezifität)

0,0451LAMP

Positiv
Vorbehandeltes
SputumNegativ
Gesamtübereinstimmungsrate
Diagnostische Sensitivität
Diagnostische Spezifität
Positiver prädiktiver Wert
Negativer prädiktiver Wert

TRC
Positiv
Negativ
157
2
15
70
93,0 % (227/244)
91,3 % (157/172)
97,2 % (70/72)
98,7 % (157/159)
82,4 % (70/85)

Wahrscheinlichkeitsverhältnis +(Sensitivität/(1-Spezifität))

32,6Wahrscheinlichkeitsverhältnis ((1-Sensitivität)/Spezifität)

0,0895

LAMP

19

PCR
Positiv
Negativ
196
7
20
95
91,5 % (291/318)
90,7 % (196/216)
93,1 % (95/102)
96,6 % (196/203)
82,6 % (95/115)

BESTELLINFORMATIONEN

Ablaufdiagramm

ProduktNr.

Produktbezeichnung

Wirksame Bestandteile

Vorgehensweise für Echtzeit-Trübungsmessung

972000Loopamp MTBC
Detection Kit

96 Tests

Zubereitung der Probenlösung und der Negativkontrolllösung

980000

HuMax ITA

Mikrozentrifuge

970000Loopamp PURE DNA
Extraction Kit

90 Tests

964000

HumaHeat Incubator

Thermoblock971000

Pipette-60 Set

1 Pipette; 4 x 96 Spitzen

961000

HumaLoop T

963200

HumaTurb C+A

60 µl der Probe und die NC MTB pipettieren.
Mit dem Loopamp PURE DNA Extraction Kit die
DNA aus dem gesammelten Sputum und der NC
MTB extrahieren. Die erhaltenen Lösungen werden
als Probenlösung bzw. als Negativkontrolllösung
verwendet.

1 Haupteinheit
1 FluoreszenzDetektionseinheit
1 Kontrollgerät
1 Amplifikationsgerät

Reagenzvorbereitung

Erforderliche Anzahl von Reaktionsgefäßen des dMTB nehmen.

Mischen von Reagenz
und Probenlösung

(Für Proben, Negativ- und
Positivkontrollen)

HINWEIS30 µl der Proben- oder Kontrolllösung in jedes
Reaktionsgefäß geben.

Bitte melden Sie jegliche schwerwiegenden Zwischenfälle, die im
Zusammenhang mit dem Gerät auftreten, dem Hersteller oder derzuständigen Behörde des Mitgliedsstaates, in dem sich der Benutzer
und/oder der Patient aufhält.

Die Negativkontrolllösung als Negativkontrolle
verwenden.
PC-MTB als Positivkontrolle verwenden.
(Positivkontrolle zuletzt vorbereiten.)

LITERATUR(1) Notomi T., et al.: Nucleic Acids Research 28, No. 12, e63 (2000)(2) Nagamine K., et al.: Clin. Chem. 47, No. 9, 1742–1743 (2001)(3) Mori Y., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, No. 1, 150–
154 (2001)(4) Tomita N., et al.: Nat. Protoc. 3, No. 5, 877–882 (2008)(5) The guideline for the bio-safety and bio-hazard (by the JapaneseSociety for Bacteriology): Japanese Journal of Bacteriology 54, No.
3, 667–715 (1999)
6) Isabella MGaby EP and Nicole P., et al.: Manual of ClinicalMicrobiology, 12th edition, ASM PRESS, 558–575 (2019)
7) WHO global TB database:https://www.who.int/teams/global-tuberculosis-programme/data
https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/336069/9789240
013131-eng.pdf
8) Kekkaku No Tokei 2009 (Statistics of TB 2009): Japan AntiTuberculosis Association

Reaktionsgefäße umdrehen, um die Lösung in der
Verschlusskappe zu sammeln. 2 Minuten warten.
Zwei Minuten warten, während die Reaktionsgefäße
auf dem Kopf stehen.

Reaktionsgefäße zum Mischen des Inhalts fünf Mal
drehen und anschließend abzentrifugieren.
Amplifikation(Bläschenbildung vermeiden.)

Reaktionsgefäße in den Reaktionsblock des Turbidimeters einsetzen.
Reaktion gemäß Beschreibung in der Gebrauchsanweisung des Turbidimeters starten und die Trübung
messen und beurteilen (40 Minuten bei 67,0 C.)
Abschluss der Polymerase-Inaktivierung (5 Minuten bei 80 C oder
2 Minuten bei 95 C) bestätigen. Alle Reaktionsgefäße aus dem
Turbidimeter entnehmen und ungeöffnet entsorgen. Dabei darauf
achten, die Gefäße nicht zu beschädigen.

TABELLE DER SYMBOLE
Katalognummer

In Serviceanleitung
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Verfallsdatum

Medizinprodukt für
In-vitro-Diagnostik

Hersteller

Temperaturbegrenzung

Chargennummer

Inhalt ausreichendfür <n> Tests

Bevollmächtigter
Vertreter in derEuropäischen
Gemeinschaft

Importeur

HUMAN Gesellschaft für Biochemica
und Diagnostica mbH
Max-Planck-Ring 21, 65205 Wiesbaden, Germany

https://www.eiken.co.jp/en20*Datum der Revision: 2023-10-31