シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第9回

私のタンパク質科学回顧: RNase T1 の一次構造研究に関わった頃
高 橋 健 治 （たかはし けんじ）
私がタンパク質に関する研究に初めて関与して以来、すでに 60 年近くが経過した (1)。本稿では、1960 年
代前後に私が関わったリボヌクレアーゼ T1（以下 RNase T1 または T1）の一次構造に関連する研究を回顧し、我が国内外におけるタンパク質科学研究の発展の歴史の一端を、垣間見る事にさせて戴く。

タンパク質の一次構造研究における最初の輝か

ヒドロゲナーゼを共役させ、分子状水素とアンモしい業績は、1955 年、英国の F. Sanger 博士らに

ニウムイオンによりα-ケトグルタール酸を還元

よるウシインシュリン（51 残基）の全構造決定で的にアミノ化して L-グルタミン酸を合成する事がある (1958 年ノーベル化学賞受賞)(2)。彼等はこ目的だった。この研究テーマはすでに先輩が挑戦の研究に、DNP 法による N 末端分析や、ペーパークして成功しなかったものだったが、その主な原因

ロマトグラフィー、ろ紙電気泳動などの手法を用は用いた酵素の純度にあるように思われた。当時いていた。しかし、その後タンパク質の一次構造決

化学教室には低温実験室など無く、地階に粗末な定の主流は、分子量一万以上のタンパク質の構造

氷冷倉庫があるだけだったので、酵素の調製実験決定に移り、用いる手法も Edman 法による N 末端には至極不便だったが、実際、それぞれの酵素を十配列分析、イオン交換カラムクロマトグラフィー

分精製して用いることにより、所期の目的を初めによるペプチドの分離やアミノ酸分析など、よりて達成できた(3)。酵素の精製と活性測定、変性に

近代的な手法に取って代わって行った。1950 年代

よる不安定化などの体験を通して、タンパク質の後半、米国では S. Moore、 W.H. Stein らによる本体に僅かながら触れられたような気がした。

ウシすい臓リボヌクレアーゼ A（以下 RNase A）に

個々の酵素の精製については、関連原著論文を参関する研究などが、新規な研究手法の開発も含め、考にしたが、赤堀四郎編「酵素研究法」（朝倉書店、先端を切って進んでいた。しかし、1960 年以前に1955）の部厚な書も大いに役立ったことを覚えては、分子量が一万前後を越えるタンパク質で完全いる。

一次構造が決定されたものはまだ無かった。

「チトクローム c の構造と機能に関する研究」「タンパク質科学に関連する初めての実験」

卒業研究を通じて私の興味は酵素の化学構造と私は学部四年の卒業研究では生物化学研究室を構造・機能相関の研究に次第に傾いて行った。当時選び、そこで初めてタンパク質科学関連の研究と赤堀研究室でそのような目的でなされていた研究して酵素化学実験を経験することになった。指導は唯一「チトクローム c の構造と機能に関する研教授はタンパク質の C 末端残基決定法の一つであ究」だった。チトクローム c は酵素ではないが機能るヒドラジン分解法の開発でも著名な赤堀四郎先タンパク質として十分興味をひくものだったから生で、大阪大学を兼任されていた。与えられた研究

修士課程のテーマとしてこれを選ぶことにした。

テーマは｢気体水素と人工複合酵素系を用いるα-チトクローム c の研究は二年先輩の千谷晃一氏がケトグルタール酸からの L-グルタミン酸の合成｣

中心となって進められていた。私の最初の実験はというものだった。ヒドロゲナーゼ、ジアフォラー「チトクローム c のグアニジン化」というもので、ゼ（リポ酸デヒドロゲナーゼ）、L-グルタミン酸デ

この塩基性タンパク質が持つ多数のアミノ基が活56

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性発現に関与するか否かを、アミノ基の特異的化

ペプチド断片の分画法、Edman 法によるアミノ酸配学修飾の一つであるグアニジン化により調べると列分析法など、基本的手法の殆どを新たに導入すいうものだった。この場合も、修飾試薬の O-メチ

る必要があり、一つ一つがわが国においては初め

ルイソ尿素を純粋に合成して用いることがきめ手ての導入だった。それだけに当時は、タンパク質のとなった。結果は Lys のアミノ基は活性発現に必アミノ酸組成や N 末端アミノ酸残基を決めただけ

須ではないというものだった。当時は機能タンパ

でも論文が書けるほどの時代だった。このようにク質中の特定残基が必ずしも必須でないことを明して、カラムクロマトグラフィーによるアミノ酸瞭に示した例はほとんど知られていない時代だっ分析やペプチドの分画が可能となり、ウマ心筋おたので、結構目新しい成果だったと思う。

よびパン酵母のチトクローム c について研究を進

修士一年の初夏に東京と京都で国際酵素化学会

めた。当時はコピー機もパソコンも無い時代で、議が開催され、チトクローム c の構造と機能に関

RNase A の構造決定に関する原著論文の要所要所

する研究発表の協同研究者としてこれに参加できを大学ノートにびっしりと写し取って参照したこ

た(4)。私にとっては初めての国際学会であり、そとを覚えている。これは、論文内容を細部まで理解のインパクトは絶大だった。当時、生化学研究の主するのに役立つだけでなく、参照した論文が優れ

流は酵素化学にあり、多数の錚々たる生化学者がた文章で書かれていたので、図らずも英文科学論

世界中から参加し学会は壮観を極めた。これに関文の作製力の向上にも大いに役立ってくれた。タ

連して同年秋に東京で “Symposium on Chemical

ンパク質についての理解を深めるため、研究室内

Structure of Proteins”が開催され、一次構造関では H. Neurath, K. Bailey 編 “The Proteins”

係では、赤堀教授ら（阪大）、佐竹一夫教授ら（都(Academic Press, 1953)などを毎週輪講した事を立大）がそれぞれ、タカアミラーゼ A およびヘモグ

覚えている。

ロビンの N-末端配列について、安藤鋭郎教授（東「チトクローム c から RNase T1 へ」大）らがクルペインおよびサルミンのトリプシン
ペプチドについて、また C. Fromageot 教授（パリ

修士二年時、赤堀教授が兼任を辞められ、江上不大）が招待講演で卵白リゾチームのトリプシンペ

二夫教授が着任された時点でチトクローム c グル

プチドの構造について講演した。

ープはほぼ発展的に解散し、千谷氏はやがて新設

その後、私の研究はチトクローム c の化学構造された阪大蛋白質研究所（初代所長赤堀教授）の化（一次構造）決定を目指して進み出した。当時我が学構造部門に助教授として転出した。その後のチ国では、東大の安藤研究室でニシン精子核のポリ

トクローム c の一次構造研究は成田耕造教授、千ペプチド性タンパク質クルペインの一次構造研究

谷氏らにより進められ、1963 年にパン酵母チトクが進められていたが、分子量一万前後以上のタン

ローム c の一次構造が決定された。これは我が国

パク質の全化学構造を目指した本格的研究はまだにおける最初の分子量一万を越える蛋白質の一次例がなかった。 従来の構造分析は Sanger 以来の構造決定となった。

DNP 法やペーパークロマトグラフィー、ろ紙電気泳

一方、私は江上教授を指導教官として新しいテ動などを主力としていたが、分子量一万を越えるーマ「RNase T1 の構造と機能に関する研究」に取りタンパク質の構造決定には、より定量的な手法の組むことになった。この酵素は 1957 年、江上教授

導入が求められていた。1950 年代の後半より欧米らによりタカジアスターゼ（Aspergillus oryzae

における一次構造決定法の主流は、RNase A の研究由来）中に発見された RNA 分解酵素である。従来よに代表されるカラムクロマトグラフィーを主力とく研究されていた RNase A（ピリミジン特異的）とする方法に取って代わりつつあった。したがって、は塩基特異性が異なる（グアニン特異的）ことから、我が国でもそのための基本技術を導入する事が、RNA の構造決定において特異的分解試薬として役

まず先決課題であった。定量的アミノ酸分析法や57

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立つ可能性がある点、また酵素の構造・機能相関のれなかった主因は、tRNA の精製に遅れをとったた

研究対象として興味深い点から当時国の内外で注めであり、極めて遺憾であった。

目を集めていた。既に一次構造決定の予備的研究

一次構造決定には博士課程二年頃からとりかかを進めていたチトクローム c にいささか後ろ髪をった。この年（1960 年）、S-S 結合の位置も含めた引かれつつも、これこそ研究すべき本物の酵素だ

RNase A の完全一次構造が C.H.W. Hirs, Moore,と思った。

Stein らによって発表された (7)。これは、分子T1 の研究をさらに進めるためには、
まず純粋な酵量一万を越えるタンパク質として、また酵素とし素が必要だった。従来の古典的精製法は不十分で、て初めての構造決定であった（1972 年、Moore と新たな精製法の導入が不可欠だった。当時は T1 のStein はノーベル化学賞受賞）。私は三年の後半かような酸性タンパク質の精製に有効なイオン交換

らは、籍を江上研に残して新設された理学部三号

クロマトグラフィー法は皆無だった。しかし、幸運館の安藤研に席を移した。当時はクルペインの構にも 1956 年に米国で開発された DEAE-セルロース造研究を進めていた安藤研に、幸運にも D.H.

を用いる陰イオン交換クロマトグラフィー法が有Spackman, Stein, Moore によって開発された効である事が判明した。この方法の導入により、つBeckman-Spinco 社の自動アミノ酸分析機が日本でいに本酵素を初めてタンパク質として完全精製す初めて導入されて間もない頃だった。使用希望がることができた(5)。

多いため私の分析はほとんどが深夜か休日に回る

精製酵素について、光酸化の実験から、本酵素がことになったが、これを有効に利用することがで活性発現に必須な His 残基を持つこと、8 M 尿素存きた。その結果、二年余で部分一次構造に到達し、在下で２-メルカプトエタノールにより 2 個の S-S

大学院を修了した。
研究方法は主にMoore-Stein ら

結合を還元、切断し、酵素を変性、失活させた後、の方法に準拠したが、必要に応じ高圧ろ紙電気泳尿素を除去し、空気酸化することにより正しいコ動やペーパークロマトなども併用した。当時はンホメーションを再構築させ、活性を回復させらEdman 法での PTH アミノ酸の同定が難しかったのれることなどの知見が得られた (6)。これらの実で、Edman 分解後の残存ペプチド鎖の N 末端残基を

験は、RNase A についての実験に範を得たものであDNP 法で順次決定する「DNP-Edman 法」を考案し、り、両酵素がこれらの点では類似することを示し

これは T1 の N 末端配列決定に有効に利用できた。

た興味深い結果だった。

しかしこの方法は、後年 B.S. Hartley(1970)によ

しかし、より精確な結論を得るためには、T1 の完って開発されたダンシル-Edman 法に比べ感度が低

全一次構造を決定し、その上に立って分析を進めかったため、一般に普及するには至らなかった。な

る必要があるという信念から、私は一次構造決定

お、当時は微生物のタンパク質の一次構造決定例に挑戦する決意をした。ここでは幸い、チトクロー

が無く、微生物酵素の場合にはおそらく多様性が

ム c の研究で得た技術が役に立った。当時一次構著しいために、特定のアミノ酸配列を決めること

造決定には現在と比べて少なくとも百倍程度以上は難しいだろうと考える人さえいる状況だった。

の試料が必要だった。そこで、5 グラムの酵素の精製をめざし、数ヶ月をかけて、数十キログラムのタ「RNase T1 の全一次構造決定と国内外の状況」

カジアスターゼ原末より、最終的に約 3 グラムの日本学術振興会奨励研究生として一年、同学科

完全精製酵素を得た。この精製酵素の一部は米国

安藤研究室の助手として一年余を T1 の構造研究にの R.W.Holley 博士に送られ、Ala-tRNA の全塩基配費やした。またこの間に、F.Sanger 博士、S.Moore

列決定（1968 年ノーベル生理学・医学賞受賞）に博士、H. Fraenkel-Conrat 博士などが研究室に来不可欠な分解酵素として役立つことにもなった。

訪され、仕事の話をする機会が持てたのは大変刺

余談ではあるが、T1 という優れた武器に恵まれなが激になった。研究が本格的に進んだのは学振の奨ら、tRNA の構造を世界に先駆けて我が国で決めら58

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励研究生になった前後からだったと思う。
T1 の場合、さらにアミノペプチダーゼによる N 末端配列分析

酵素の原料が日本産のタカジアスターゼであり、およびカルボキシペプチダーゼ A とヒドラジン分

自分の手で完全精製も行ったわけで、当面試料に解による C 末端域配列分析を併用して全配列を決

ついては完全独走態勢にあったことが最も有利な定していった。

点であった。
T1 は後年三共株式会社から市販された

これらのペプチド分画とアミノ酸配列分析法はが、初めから市販されていたら別の展開になって

基本的には Moore-Stein らの方法に準拠するもの

いた可能性も強い。

であったが、一種類の酵素分解物のカラムクロマ

全構造決定のためには、各種のプロテアーゼ分

トグラフィーに十日間近くかかり、分画を集めた解で生じたペプチドを分別精製し、それらの構造試験管も千本近くに達した。HPLC もまともなフラ決定を行い、それらの結果を組み合わせて全構造

クションコレクターも無い時代で、日本式の非電を推定するというのが常套手段であった。RNase A

動型、回転式フラクションコレクターが故障なくと較べ、不利な点が二つあった。第一点はプロテア

十日間も連続して回り続けるのを調整、監視するーゼ分解に通常最初に用いられるプロテアーゼで、のも大変な仕事だった。夜間コレクターの横に添

特異性が最も厳密だったトリプシンがあまり役にい寝して、時々目を覚ましてはその正常な作動を立たなかったことである。これは T1 が酸性タンパ

確認したことを覚えている。ポリエチレンラップ

クであり、トリプシンが作用する Lys および Arg をもパラフィルムも、またボルテックス・ミキサーも各一残基しか含まず、分解点が少ないためにトリ無い時代で、ニンヒドリン反応をする際、反応前にプシン処理で大型ペプチド片が不溶化してしまい，

試料液と試薬液を混ぜるために試験管に直接親指その後の分析を難しくしたためである。第二点はで蓋をして振り混ぜたため、数時間後に親指とそ

それほど大きな問題ではないが T1 がトリプトファのまわりが青紫色に染め上がり、その後一週間ほンを一残基含み、これが S-S 結合切断の常法であど色が消えなかったこともしばしばだった。
T1 の全構造はキモトリプシンペプチドとトリプった過蟻酸酸化では酸化分解し、同定困難だった

シンペプチドの分析結果から決定されたが、別のことである。
このためまず過蟻酸酸化 T1 を用い、そのトリプ方法によっても確認されることが望ましいと考え、シン分解で得られたペプチドも利用しつつ、主に特異性の異なるペプシン、パパインおよびサチラ

キモトリプシン分解で得られるペプチドを詳しくイシンによる分解で得られるペプチドの分析も行分析した。また、これに加えて未変性 T1 のペプシった。この結果、キモトリプシンペプチドとペプシ

ン、パパインおよびサチライシンによる個別分解

ンペプチドおよび一個のパパインペプチドの分析も併用した。各酵素分解で得られたペプチド混合

結果だけからも同一の完全アミノ酸配列が得られ物は Dowex 50 X-2 のカラム（0.9 x 150 cm）を用ることが示された。またサチライシンペプチドのい、ピリジン・酢酸緩衝液のグラジエント溶出によ

配列も矛盾がなかった。これらの結果は最終決定

り分画した。カラムからの溶離液はヤジロベー式

配列の正当性を強く支持するものであった。また、の日本式フラクションコレクター（東洋濾紙社製）

S-S 結合の位置は、サチライシンペプチドの分析かを用いて集め、アルカリ分解有無下でニンヒドリ

ら決定できた。

ン比色分析した。各ピーク分画について高圧ろ紙

このようにして、昭和 40 年（1965 年）T1 の完全電気泳動とぺーパークロマトグラフィーにより純構造に到達することができた(8)。最初の本格的な度を検査し、複数のペプチドを含む分画はさらに構造決定実験として T1 約 200mg を過蟻酸酸化した

これらの方法により構成ペプチドを分離精製した。

のが、大学院博士課程三年生の二月（昭和 37 年）

各精製ペプチドの配列分析は、そのままあるいはであったから、それから三年余のことだった。T1 のさらにプロテアーゼによる小断片化後、アミノ酸

全構造決定の論文はまず速報として短くまとめ、分析を利用する subtractive Edman 法を主に用い、J.Biol.Chem.に投稿した。
T1 の構造に関する中間報59シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第9回

告は、蛋白質構造討論会（第 10 回、1959 年 — 第

この間我が国では安藤教授、岩井浩一、石井信一氏

15 回、1964 年）や日本生化学会大会で行い、それ（東大）らによりタンパク性ポリペプチドであるぞれの予講集に概略が載っている。なお、蛋白質構

クルペイン Z（31 残基, 1962）が構造決定されて造討論会は、日本化学会主催で、タンパク質化学をいる。これは、我が国で構造決定された最初のタン中心にしたタンパク質の構造と機能に関する討論

パク性ポリペプチドである。また、1965 年までに会（年一回開催）である。2000 年（第 51 回）まで

ヒトチトクローム c（E. Smith 研で松原 央氏（阪続き、翌年日本蛋白工学会、蛋白質立体構造構築原大）が構造決定に寄与）、ウシトリプシノゲンおよ理研究会などと共に母体となり、日本蛋白質科学

びキモトリプシノゲンなどの構造も大部分決まっ

会が新たな学会として創設された。我が国の蛋白ており、ウマヘモグロビンα鎖（G. Braunitzer 研

質科学研究発展への蛋白質構造討論会の寄与は極で松田源治氏（長崎大）が構造決定に寄与）の構造

めて大きい。

も決まっていた。1965 年に M.O. Dayhoff により”Atlas of Protein Sequence and Structure,

この結果、T1 は 104 個のアミノ酸残基を含む一本のポリペプチド鎖からなり、2 個の S-S 結合を持Vol.

1” （ National

Biomedical

Research

つタンパク質であることが明らかになった。また、Foundation）が出版され、1978 年迄続刊された。

アミノ酸配列は RNase A とは全く異なり、両者はタンパク質のアミノ酸配列に関する最初のデータ

進化上無関係なタンパク質であることが判明した。

ベースとも言うべきものであり、後の GenBank な

酵素としては、すでに RNase A（124 残基、Hirs,

どのデータベースのモデルとなった。

Moore, Stein、1960 年）の S-S 結合の位置を含む「化学修飾法による T1 の活性部位の研究」

全一次構造が報告されていたので、これに次いでニワトリ卵白リゾチーム（129 残基、Canfield、1965 年より三年間、米国ロックフェラー大学のJollès ら、1965 年）と並ぶことになった。因に、Moore-Stein 研に留学し、T1 の活性部位の研究をさ1960 年から 1965 年までの間に完全一次構造が報らに続けることになった。 当時、同大には R.B.

告されたタンパク質（分子量約一万以上）としては、

Merrifield（1984 年、RNase A の固相法化学合成な

他にタバコモザイクウイルスコートタンパク質、どによりノーベル化学賞受賞）、G. M. Edelmann

ヒトヘモグロビン（α鎖+β鎖）、チトクローム c（ウ（1972 年、抗体分子の構造解明によりノーベル生

マ、ブタ、P.aeruginosa、パン酵母）、マッコウク

理学・医学賞受賞）、L.C. Craig(向流分配法の創始

ジラミオグロビンがある(9)。これらの構造決定の者)などを筆頭に多数の著名なタンパク質科学関

殆どは米国を中心とした欧米諸国でなされたもの

連の研究者がいた。また、G. Blobel（1999 年、タであり、我が国で決定されたものは、パン酵母チト

ンパク質の細胞内局在化シグナルの発見でノーベ

クローム c（104 残基、1963）と RNase T1 のみであル生理学・医学賞受賞）はまだ大学院生だった。

る。なお、タバコモザイクウィルスコートタンパク

Moore-Stein 研ではすでに、A.M. Crestfield らのの構造決定には、次田 皓氏(阪大)が留学先での H.

ヨード酢酸による化学修飾実験（His 残基の特異的Fraenkel-Conrat らとの協同研究において重要なカルボキシメチル化による失活）から、RNase A の寄与をしている。従って、1960-1965 年間に完全構

活性部位残基として His12 と His119 が推定されて造が報告された分子量約一万以上のタンパク質は、いた。当時、化学修飾法は X 腺結晶構造解析ととも

ヘモグロビンあるいはチトクローム c などをそれに、最も有力な活性部位残基の特定法であった。一ぞれまとめて 1 種として数えると 7 種類（異なる方、T1 も同様な条件下でヨード酢酸により不活性化

生物種由来の同種タンパク質を別々に数えると 10することが日本での予備実験で分かっていたが、種類）となる。この数はその後加速度的に増加し、反応するアミノ酸残基は不明であった。

1982 年までには約 200 種（同種タンパク質を別々T1 でのヨード酢酸の反応部位を明らかにするたに数えると 1100 種類余）に達している(10)。
また、60シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第9回

めに、14C 標識試薬を用いたところ、反応は 1:1 のったくその役割は不明だった。当時、タンパク質中モル比で起こり、反応産物は酸加水分解で完全にの特定の Arg 残基の役割を明らかにした研究は皆14分解して C 標識グリコール酸を生じることが判明無だった。その理由の一つは中性付近の温和な pHした。この結果から、当時想定外であったが、諸般下で Arg 残基を特異的に化学修飾出来る試薬がほの証拠から反応はカルボキシル基との間に起こっ

とんど無かったからである。そこで、このような試ている可能性が最も高いと推定された。そこで、カ薬を探し、まず T1 に応用することをめざした。

ルボキシメチル化 T1 をプロテアーゼ分解し、カル

当時、グリオキサルのようなジカルボニル化合

ボキシメチル化ペプチド断片を得て、反応残基を物が Arg のグアニジン基と特異性は低いが反応す同定することにした。断片化とその後のクロマトることが、柴田和雄氏（東工大）らの研究により知14の際に、 C 標識カルボキシメチル基が容易にペプられていた。これにヒントを得て、多数のジカルボチドからはずれてしまう事実に悩まされながら、ニル化合物の反応性と特異性を、タンパク質とし最終的には比較的安定な限定分解／単離条件を見ては RNase A を用いて、比較解析した結果、フェニ

出し、ついに修飾された残基の同定ができた。何とルグリオキサル（PGO）が目的に最も合う化合物でこのアミノ酸は Glu58 であり、反応産物はγ-カルあるとの結論を得た (13). Arg の PGO 誘導体は、

ボキシメチルグルタミン酸だった（11）。タンパク

通常の酸加水分解では変化はするものの，遊離の質中のカルボキシル基にヨード酢酸が作用してこ

Arg を生じないので、Arg の修飾度は酸加水分解後れをエステル化(カルボキシメチル化)した例は初のアミノ酸分析で、Arg の減少として定量できる。

14

めてであった。この結果を得るのに C 標識ヨード

また，PGO と Arg は 2:1 のモル比で反応することが酢酸を使えたことは決定的に重要だった。当時東判った。

大の生物化学教室には液体シンチレーションカウ

後にこの試薬による T1 の修飾を行った結果、ンターが一台も無く、放射性実験は不可能だった。

Arg77 が特異的に修飾されることにより活性が失ニ ワ ト リ 卵 白 リ ゾ チ ー ム に つ い て は 、 D.

われることを示すことができた (14)。タンパク分

Phillips らが 1965 年に X 線結晶構造解析による立子中の特定の Arg 残基が酵素活性発現に関与する

体構造研究から Glu35 と Asp52 を触媒残基としてことを化学修飾法によって示したのはこれが最初推定していたが、タンパク分子中の特定位置にあの例である。リン酸化合物など負の荷電を持つ化る残基のカルボキシル基が活性発現に必須な基と合物は生体内に非常に多く、それと特異的に結合して化学修飾により同定された例は T1 が初めてでするタンパク質や酵素がしばしばその結合部位にある。当時，Moore-Stein 研をはじめ他のいくつか

特定の Arg 残基を持つ例は珍しくない、以後、このの研究グループによってブタペプシンならびに類

試薬は、同時期に米国で研究されていたジアセチ

縁酵素の活性部位残基の同定が進められており、

ル（2,3-ブタンジオン）とともに、多数のタンパク

特定の Asp 残基（後にブタペプシンでは Asp32 と質や酵素に応用され、機能残基としての Arg 残基判明）が触媒残基の一つである証拠が得られつつの同定に広く役立っている。

あった。現在、触媒基としてカルボキシル基を持つ

その後、活性部位 His 残基の同定の方向に仕事を酵素(12)は極めて多数知られているが、その草分進めた。まず、光酸化の実験で、3 個の His の中で、け時代の仕事ということになる。

His 1,2 個が活性発現に関与することが示唆され

T1 についてのもう一つ興味深い点は、この酵素がた。そして、これらの結果を総合して、1970 年に酸性タンパク質であり、塩基性アミノ酸としては

T1 の推定反応機構を提案した(15)。これは、Glu58

Lys 1 個、His 3 個、Arg 1 個のみを含むことであと His が一般塩基、一般酸として関与するというる。初期の実験から Lys は活性発現に関与せず、機構である。更にその後の光酸化およびヨードア

His は全 3 個のうちいずれか 1, 2 個が重要である

セトアミドによるアルキル化の実験から、活性部ことが推定されていた。しかし，Arg についてはま

位に His40 と His92 が関与する事が示唆された

61

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第9回

また、
T1 と基質との相互作用のメカニズムを解明「RNase T1 からプロテアーゼおよび関連タンパク質へ」するために、J.P. Hummel と W.J. Dreyer によって一方、1970 年代以降、私の興味は次第にプロテ開発されたゲルろ過法を用いて、多数のヌクレオ

アーゼおよびその関連タンパク質に移って行った

チド、ヌクレオシドおよびそれらの誘導体等との(12)。Moore-Stein 研でペプシン等のプロテアーゼ結合を測定した。
この結果、グアニン塩基の N1 位、に関する研究を見聞きしたことも引き金となった

2-アミノ基、6-オキソ基、7-アミノ基およびリン酸

が、また、生理的機能という観点からもより興味を

基（特に 3’位）が酵素との結合に関与することが推ひかれて行った。その後、京大・霊長類研、次いで定された(19, 20)。しかし、酵素側のグループにつ

東大・理学部、最後は東京薬科大・生命科学部で延いてはグアニン部分との特異的結合に関与するア

べ三十年余にわたり研究に従事し、多くのタンパ

ミノ酸残基を推定するところまでは至らなかった。

ク質や酵素の構造や機能、構造・機能相関の研究に

なお、この分野では、今堀和友、大島泰郎氏（東大）携わった(1)。特に力を入れたのは、ペプシノゲン

らなども差スペクトル法を用い、有意な結果を得／ペプシンと類縁カルボキシルペプチダーゼおよている。

びグルタチオン S−トランスフェラーゼなどである。

(16-18)。

後に、T1 と類縁酵素 U1 および N1 の一次構造比較

この間、一次構造研究はプロテインシーケンサー

から一箇所 T1 の配列中に問題があることに気付い

や HPLC の導入などで迅速化し、また分子生物学のた。そこで， T1 の全配列を再検討したところ、71-

目覚ましい発展とともに、一次構造研究も DNA レ

73 位の Pro-Gly-Ser は Gly-Ser-Pro が正しいと結ベルでなされる事が多くなり、化学修飾による研論された。残念ながら誌上で修正した。1960 年代

究も部位特異的変異法に取って代わっていった。

に化学的方法で構造決定されたものには、RNase A

残念ながら、この間の研究については紙面の制限を含めその後の訂正がしばしばあったものである。

のため割愛させて戴く。

この間、U. Heinemann、W. Saenger（1982）が T1-

1960 年前後、タンパク質の一次構造研究の草創

2’-GMP 複合体の X 線結晶構造解析に成功し，活性期に参画できた幸運に感謝している。

部位の立体構造が明らかになった (21)。彼らの結果は、私が先に提案した反応機構(15)を支持するものであった。また、Tyr42-Tyr45 の領域が多数の水素結合を介してグアニン部位との特異的結合に関与し、Tyr45 がグアニンと stacking することが示された。ゲルろ過法で先に推定したグアニン側の推定水素結合部位はこれらの結果とよく一致した。後年、部位特異的突然変異導入体の解析から、反応機構における Glu58, His40, His92 の役割については種々議論されることになるが、Glu58 の触媒残基としての重要性に変わりはない（12）。なお、
立体構造解析を目的とした T１の結晶化は早くから
三井幸雄氏ら（東大）により試みられていたが、成功せず、我が国で最初に達成出来なかったことは実に残念だった。

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シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第9回

文 献
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9. Dayhoff, M.O. ed. (1972) Atlas of Protein
Sequence and Structure 1972, Vol. 5, National
Biomedical Research Foundation.

高橋健治先生ご略歴：
1934 年 長野県に生まれる。
1957 年 東京大学理学部化学科卒業
1962 年 東京大学大学院理学系研究科生物化学
専門課程博士課程修了，理学博士
1962 年 日本学術振興会奨励研究生
1963 年 東京大学理学部生物化学科助手
1965 年 ロックフェラー大学博士研究員（〜1968）
1973 年 東京大学理学部生物化学科講師
1974 年 京都大学霊長類研究所生化学研究部門教授
1984 年 東京大学理学部生物化学科教授
1993 年 東京大学大学院理学系研究科生物化学専攻
教授
1995 年 東京大学名誉教授
1995 年 東京薬科大学生命科学部教授
2005 年 東京薬科大学名誉教授
2005 年 首都大学東京客員教授

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