2023 年７⽉ 26 ⽇
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⼤学院理学研究院【プレスリリース】

回転式ナトリウムイオンポンプの６つの中間構造すべてを⽴体構築することに成功〜動⼒部とポンプ部をつなぐ回転⼦は不均⼀な回転挙動を⽰し、⼤きなイオン輸送リングをかき混ぜるように回転させる〜
⾃然科学研究機構⽣命創成探究センター/⽣理学研究所の村⽥和義特任教授の研究グループは、同機構分⼦科学研究所の飯野亮太教授、千葉⼤学の村⽥武⼠教授、東京⼤学の上野博史講師と共同で、腸球菌が持つ回転式ナトリウムイオンポンプがイオンを輸送する際に⽰す６つの中間構造すべてをクライオ電⼦顕微鏡※１を⽤いて明らかにしました。本イオンポンプでは、これまで⾦ナノ粒⼦標識による 1 分⼦計測実験から、主となる３つの構造の各あいだにそれぞれ副となる構造が観測され合計６つの中間構造があることが予想されていましたが、その実態は不明でした。また、動⼒部とポンプ部とをつなぐ細いシャフト（回転⼦）がこれよりもサイズの⼤きなナトリウムイオン輸送リングをどのように回転させているのかも謎でした。今回の解析により、（１）回転⼦は固定⼦と⼀部構造的に⼲渉し合うことで不均⼀な回転挙動を⽰すこと、（２）回転⼦が⼤きなイオン輸送リングの縁に結合しリングをかき混ぜるように回転させること、がわかりました。
本成果により、回転式ナトリウムポンプのユニークな分⼦メカニズムが明らかになりました。
本研究成果は、⽇本時間 2023 年 7 ⽉ 28 ⽇午後６時に、英国科学雑誌「CommunicationsBiology」にオンライン公開されました。

発表のポイント・ クライオ電⼦顕微鏡を⽤いて回転式ナトリウムポンプが⽰す６つの中間構造をすべて可視化することに成功した。
・ 以前の 1 分⼦計測実験において、回転⼦の 3 つの主停⽌点は 120°ずつ離れ、3 つの副停⽌点は主停⽌点から 40°進んだ位置（80°戻った位置）だと予想されていたが、実際は回転⼦が固定⼦の⼀部と⼲渉することで不均⼀な回転⾓度を⽰していた。
・ 回転⾓度のズレは、主に回転⼦末端のサブユニットｄが固定⼦のサブユニット a と構造的に⼲渉することによって引き起こされると考えられた。
・ 動⼒部とポンプ部とをつなぐ回転⼦はイオン輸送リングの中⼼からズレた縁に結合し、⼤きなサイズのイオン輸送リングをかき混ぜるように回転させていた。

・研究の背景細菌からヒトに⾄るまでほぼすべての⽣物は、回転式酵素の ATP 合成酵素またはイオンポンプをその細胞膜に持っています。これらは共通して ATP という化合物を分解または合成するための膜外部分と溶液中のイオンを通過させるための膜内部分とが細いシャフト（回転⼦“Rotor”）で連結された構造をしており、ATP 合成酵素では膜内外におけるイオンの流れのエネルギーを利⽤して ATP を合成し、逆にイオンポンプでは ATP を分解することで膜の間で特定のイオンを輸送することができます。
腸球菌（Enterococcus hirae）がもつ回転式ナトリウムポンプ（EhV-ATPase）（図１）は、細胞膜外の動⼒部（V1）で ATP を分解してその中⼼にある回転⼦を回転させ、これが膜内のポンプ部（Vo）のナトリウム輸送リング（c-ring）を回転させることによって、ナトリウムイオンを細胞内から外に輸送します。動⼒部は、対称に配置された３つの ATP 分解ドメイン（A/B）で構成され、これらが順番に ATP を分解することで、回転⼦を 120 度ずつ回転させることがわかっています。我々の共同研究グループでは以前、この動⼒部を⾦ナノ粒⼦で標識して 1 分⼦計測を⾏い、120°ずつ回転する回転⼦の主停⽌点（State１〜３）から 40°進んだ位置（主停⽌点から 80°戻った位置）に副停⽌点が存在し、合計６つの回転停⽌点からなる中間構造を持つことを⾒出しました。また、EhV-ATPase は⾼等⽣物の V-ATPase と同様に⼤きな c-ring を持っていますが、⾼等⽣物で⾒られるような、回転⼦を c-ring の中⼼に真っ直ぐにつなぐ別のタンパク質サブユニットは存在しません。よって EhV-ATPase では、（１）副停⽌点を含む６つの中間構造は実際どのような構造なのか、（２）細い回転⼦がどのように⼤きな c-ring を回転させるのか、が謎でした。

・研究成果本研究では、これらの謎に答えるため、界⾯活性剤で可溶化した EhV-ATPase に ATP とナトリウムイオンを加えて回転を誘導した試料を急速凍結し、クライオ電⼦顕微鏡を⽤いて画像を多数収集しました。そして、得られた像を分類して⽴体再構成し、３つの主停⽌点に加えて３つの副停⽌点の合計６つの中間構造を⽴体再構築することに初めて成功しました（図２A）。
その結果、EhV-ATPase の回転は、理想的には 120°ごとに主停⽌点（State1〜3）で⽌まると想定されており、State1 と State2 ではその理論通りでしたが、State３においては、-10°の回転⼦の⾓度のズレがあることがわかりました（図２A）。またその間の副停⽌点（State1ʼ〜3ʼ）においては、State1ʼで+13°、State2ʼで+32°、State3ʼで+28°の⾓度のズレが観察されました。
そして、回転⼦は c-ring の中⼼から外れてリングの縁に結合し、c-ring をかき混ぜるようにして回転させることがわかりました（図２B）。この回転⾓度のズレは State2~State3ʼの間で特に⼤きくなっており、これらは回転⼦の末端のサブユニットｄが、隣接する固定⼦のサブユニット aと構造的に⼲渉し合うことによって引き起こされると考えられました（図２C）。
動⼒部 V1 では、回転運動中の ATP の結合・分解状態の変化を部分的に確認することができました（図３A）。これまでの研究から対称に配置された３つの ATP 分解ドメインには、ATP が結合した“Closed”、ATP が ADP とリン酸（Pi）に分解された“Semi-closed”、ATP が結合していない“Open”の３つの状態が連続的に出現すると考えられています。これらを得られた構造マップに当てはめると、３つの主停⽌点においては、これに合致した ATP 分解ドメインの構造を確認することができました。⼀⽅、３つの副停⽌点においては、State２ʼを除いて、分解産物の ADP が外れて“Open”になる前の、すべての ATP 分解ドメインが化合物で満たされた状態と考えられる構造が得られました（図 3）。State２ʼでは先に述べたように、回転⼦と固定⼦が構造的に⼲渉することにより、ATP 分解ドメインが次の State３と同じ状態まで進んで停⽌すると考えられました（図３B）。
・成果の意義および今後の展開
本研究では、EhV-ATPase の構造変化を積極的に誘導してクライオ電⼦顕微鏡を⽤いて解析することで、EhV-ATPase が⽰す６つの中間構造（停⽌点）すべてを可視化することができました。
また、EhV-ATPase では回転⼦が⼤きなサイズの c-ring をかき混ぜるように回転させてナトリウムイオンを輸送することが明らかになっただけでなく、回転⼦が固定⼦の⼀部（サブユニット a）と構造的に⼲渉することで、部分的に回転⾓度のズレが引き起こされていることがわかりました。
これらのことは、細菌から⾼等⽣物にまで広く偏在する回転式イオンポンプが、単純な構造からより複雑な構造に進化を遂げていく上での適応過程を⽰唆するとともに、阻害剤の開発や酵素の機能改変を⾏うために基礎となる構造的基盤を多く提供することができました。本成果をもとに、今後、本イオンポンプを対象にした創薬開発が⼤きく進むことが期待されます。

図１

回転式ナトリウムイオンポンプ EhV-ATPase の構造。細胞膜外で ATP を分解して中⼼の回転⼦（Rotor）サブユニット D/F/d を回転させる V1 と、細胞膜内で c-ring を回転させることでナトリウムイオン（Na+）を細胞内から細胞外に輸送する Vo からなる。V1 は、A, B, D, E, F,G, d の 7 種類の、Vo は a, c (c-ring)の 2 種類のタンパク質サブユニットで構成される。V1 と Vo
は“Stalk”と呼ばれるサブユニット E/G でつながり空回りを防いでいる。これまでの研究で、回転⼦が傾いてｃ-ring と結合することがわかっていた（挿⼊図）が、どのようにして回転⼦がｃ-ringを回転させるかは謎であった。

図２

EhV-ATPase が⽰す６つの構造変化。State1〜3 は主停⽌点、State1ʼ~3ʼは副停⽌点を⽰す。主停⽌点は回転⼦が 120°ずつ回転した構造であるが、State3 では-10°⾓度がズレていた。
また、副停⽌点では State1ʼでは+13°、State2ʼでは+32°、State3ʼでは+28°ズレていた。（A）
EhV-ATPase の全体構造。
（B）回転⼦末端のサブユニットｄと c-ring との位置関係。サブユニットｄ（⾚の“＋”は重⼼位置を⽰す）は c-ring の中⼼（⿊の“＋”）から離れた位置で c-ring と接している。結果、（A）の⻩⾊の線で⽰すように回転⼦はｃ-ring をかき混ぜるように回転させる。
（C）回転⼦末端のサブユニットｄと固定⼦のサブユニット a とが構造的に⼲渉する様⼦。

図 3 EhV-ATPase の６つの中間構造における V1 の ATP 分解ドメインの構造変化（A）およびATP 分解反応と回転⼦の回転運動の関係の模式図（B）。

・研究サポート
本研究は、科学研究費補助⾦（JP16H06280, JP22H04926, JP19H05380, JP18H05425,JP18H05424）、⽣理学研究所⼀般共同研究（16-038）、⽣理学研究所若⼿研究者⽀援、AMEDBINDS（JP17am0101001, JP22ama121005j0001）等の⽀援を受けて⾏われました。
・掲載論⽂
雑誌名︓Communications Biology
論⽂タイトル︓Six states of Enterococcus hirae V-type ATPase reveals non-uniform rotor
rotation during turnover
著者︓ Raymond N. Burton Smith, Chihong Song, Hiroshi Ueno, Takeshi Murata, RyotaIino, Kazuyoshi Murata*（*責任著者）掲載⽇︓⽇本時間 2023 年７⽉ 28 ⽇午後６時
DOI︓ 10.1038/s42003-023-05110-8

・発表者
Raymond N. Burton-Smith、 Chihong Song、 村⽥ 和義（⽣命創成探究センター/⽣理学研究所）、上野 博史（東京⼤学）、村⽥ 武⼠（千葉⼤学）、飯野 亮太（分⼦科学研究所）
・⽤語解説※1︓クライオ電⼦顕微鏡
⽣物試料を低温（約-170℃）で観察することができる電⼦顕微鏡。⽣物試料を⽔溶液環境中で凍結させて、そのまま観察することができる。
・本研究に関するお問い合わせ先（研究全般に関するお問い合わせ先）
⾃然科学研究機構 ⽣命創成探究センター/⽣理学研究所
特任教授

村⽥ 和義

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