Instructions for Use
380273-A
the manufacturer (EKN), are printed on the containers.

978000EnglishReagents
Positive control Mal

LoopampTM MALARIA Pf

Negative control Mal

Detection Kit

Labelling on the tube
PC MalLot No., EKN
NC MalLot No., EKN

Code on the cap
PC
Mal
NC
Mal

WARNINGS AND PRECAUTIONS(1) For in vitro diagnostic use only.
(2) This product is designed only for the detection of DNA of Pf parasites
in blood samples of human origin. Do not use for other purposes.
(3) When using this product, always follow this Instructions for Use.
(4) Do not freeze the reagents.
(5) Do not use any expired reagent.
(6) Do not mix reagents from different Lots.
(7) Do not replenish any reagent.
(8) Performance of the LoopampTM MALARIA Pf Detection Kit isdependent on operator proficiency and adherence to procedural
directions. Testing should be performed by properly trained personnel
strictly according to the instructions provided.
(9) Exposure to heat, humidity and light may cause deterioration of thedMAL Pf. Remove only the required number of reaction tubes (sum ofsamples and controls) and re-seal the aluminium pouch immediately.
(10) Do not remove the desiccant from the aluminium pouch. Highhumidity can cause deterioration of the dried LAMP reagent in thereaction tubes.
(11) Read the instruction manual and ensure required equipment(turbidimeter or incubator) is available before commencing theprocedure.
(12) Blood samples pose a potential risk for infection. Use universal
precautions to minimize biohazard.5)(13) PC Mal and NC Mal contain a small amount of sodium azide aspreservative. Sodium azide is classified as toxic. Avoid any contact
with eyes, mouth, or skin.
(14) In case of accidental contact of any reagent with eyes, mouth, or skin,
immediately rinse the affected site with running water and seek
medical advice.
(15) Do not dilute or add the PC Mal to the samples. Use the PC Mal only
as described in this package insert in order to avoid DNA
contamination.
(16) Store the PC Mal and any positive blood samples separately from theother kit reagents.
(17) The cap of each reaction tube contains dMAL Pf in dried form. Do nottouch the inside of the cap.
(18) Before using the reaction tubes, check carefully to see if they haveany cracks or scratches. Damaged tubes might give false results andlead to DNA contamination of the incubator and work area.
(19) Do not expose reaction tubes to UV light before the end of the LAMP
reaction. Prolonged exposure to UV light might damage the tubes andlead to false results.
(20) When a UV light is used for visual fluorescence judgment, do not stare
directly at UV light. Since UV light is harmful to the eyes, evenwatching for a short period may irritate eyes and cause symptoms
similar to conjunctivitis. Use a glass screen or wear protective
goggles/glasses/face mask whenever looking directly at the UV light.
(21) Refer to the manual of the incubator. When the HumaLoop M or the
Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A is used, be careful whenremoving the reaction tubes from the incubator to avoid burns.
(22) Do not use PC Mal as positive control for LoopampTM MALARIA Pan
Detection Kit, LoopampTM MALARIA Pv Detection Kit, LoopampTM
MALARIA Pan/Pf Detection Kit. Do not use PC of other kit as positive
control for this kit.

INTENDED USE
The LoopampTM MALARIA Pf Detection Kit is a qualitative in vitro
diagnostic test for the detection of Plasmodium falciparum DNA
extracted from human blood samples.

TEST PRINCIPLESThis product is based on the nucleic acid amplification method, LAMP
(Loop-mediated Isothermal Amplification), developed by Eiken ChemicalCo., Ltd.
The LAMP method has the following characteristics: (1) Only one
polymerase enzyme is required and the amplification reaction proceeds
under isothermal conditions;1),2) (2) it has an extremely high specificity
because of the use of four primers recognizing six distinct regions on thetarget; (3) it has a high amplification efficiency and can produce a highconcentration of amplified product in a short time, which makes visual or
automated detection possible. 3),4)
The targeted DNA sequences of the P. falciparum (Pf)-specific primers
have been designed to detect the mitochondrial DNA and have been
confirmed by alignment analysis to be specific for Pf-sequences.
The test DNA solution extracted from blood samples is dispensed into areaction tube. The strand displacement DNA polymerase, deoxynucleotide
triphosphates (dATP, dCTP, dGTP and dTTP), calcein, reaction buffers
and Malaria Pf-specific primers are stored in dried form in the cap of thereaction tube. These dried LAMP reagents (Malaria Pf detection reagents(dMAL Pf)) dissolve when the DNA solution is added. The reaction tube isthen incubated at 65.0C and the DNA is amplified by the strand
displacement DNA polymerase in accordance with the LAMP reaction.
The detection of amplified products is based on turbidity of magnesium
pyrophosphate (a white precipitate produced as a by-product of DNA
amplification). 3) Alternatively, visual detection under UV light may be used.
Before the DNA amplification, calcein contained in the reagent is in thequenched state as it is bound to manganese ions. At the start of the DNA
amplification, the pyrophosphate ions that are generated out-compete themanganese ions for binding sites, and thus the calcein becomes
fluorescent. 4)

CONTENTS OF THE KITReagents are stable until the date on the label assuming the container
remains unopened at a storage temperature of 2 – 30°C.
Malaria Pf detection reagent (dMAL Pf) ················ 2 x 48 tubes
The following reagents in dried form are contained in eachreaction tube:
Bst DNA polymerase*1
Deoxynucleotide triphosphates
Magnesium sulfate
Calcein
Manganese chloride
Primers*2
Positive control Mal (PC Mal)*3 ························ 1 x 1.0 mL
Negative control Mal (NC Mal)························· 3 x 0.5 mL
30µL dropper ······································· 5 x 12 droppers*1: Bst DNA polymerase derived from Bacillus stearothermophilus isa strand displacement DNA polymerase that lacks 5’3’exonuclease activity.
*2: Primers designed for the mitochondrial DNA of Pf, purified fromsynthesized oligonucleotides by HPLC.
*3: PC Mal contains a product resulting from in vitro amplification ofan artificial gene designed from the mitochondrial DNA of Pf(GenBank No.M76611).
The abbreviations of names of the following reagents, their Lot No. and

WASTE DISPOSAL(1) Do not open the tubes after DNA amplification. Leave the cap closed
and dispose the used tubes as medical waste by incineration or after
double bagging with sealable plastic bags.
(2) Never autoclave or reuse the reaction tubes. Amplified products will
disperse and cause contamination.
(3) The main material for the reaction tubes and reagent tubes is PP; forthe reaction tube tray, PET; for the aluminium pouch, aluminium; and1

for the kit case, paper.
(4) Dispose of any other reagent, container, or lab ware in accordancewith local regulations.

(4) Dispense 30 µL of PC Mal into a reaction tube using the pipette or
dropper, and close the cap.
(5) Flick (or spin) down all tubes to collect the solution at the bottom of
the tubes.

Note: When using the PURE device make sure the liquid level iscloser to the upper line of the two lines on a reaction tube toensure that the correct volume has been dispensed.

SPECIMEN COLLECTION(1) Blood samples should be used immediately after collection.
(2) Collect blood in a separate room from the LAMP amplification room.
Aerosols containing Pf DNA can be generated during blood collection
and may cause contamination.
(3) DO NOT USE EDTA and Citrate as anticoagulant for blood collection
if the result is to be read by fluorescence. The use of heparin as
anticoagulant is recommended.

(6) Reconstitute the dried reagents in the cap by inverting the reaction
tubes and collecting the DNA solution in the cap. Leave the tubes
standing upside down for 2 minutes to reconstitute the dried reagents.
(7) Invert the reaction tubes 5 times to mix the contents. Make sure thatthe dried reagents in the cap are fully dissolved (the solution shouldhave a slight orange colour).
(8) Flick (or spin) down all tubes to collect the solution at the bottom of
the tubes.
Amplification
For visual fluorescence detection（For HumaLoop M）(1) Check that the temperature of the HumaLoop M is 65.0°C.
(2) Load the reaction tubes into the HumaLoop M and press the green
button to start the LAMP reaction (40 minutes at 65.0°C). See the
HumaLoop M instruction manual for details on how to operate the
incubator.
(3) Confirm the completion of polymerase inactivation (automaticallycompleted by the HumaLoop M). Take all reaction tubes from the
HumaLoop M.
（For other incubator using UV light）(1) Set the temperature of the incubator to 65.0°C (with hot bonnet
temperature set to 10 degrees above the reaction temperature or asnear to this figure as possible – temperature accuracy: 0.5C). Wait
until the displayed temperature reaches the set value.
(2) Load the reaction tubes and then start amplification reaction (for 40
minutes at 65.0C).
(3) 40 minutes later, inactivate the polymerase using the heating block(for 5 minutes at 80C, or for 2 minutes at 95C) to terminate thereaction.

MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED

・LoopampTM PURE DNA Extraction Kit (optional)
・HumaHeat (optional)

For visual fluorescence detection（For HumaLoop M）
・HumaLoop M（For other incubator using UV light）
・Incubator (temperature accuracy: 0.5C; with hot bonnet)
・Heating block
・UV light or Blue LED light (wavelength: 240 to 260 nm, and 350 to
370 nm)・Goggles/glasses or other UV-blocking eye mask
For real-time turbidity detection
・HumaTurb C+A
For reagent and sample mixing
・Micropipettes (10 to 100 µL, and 20 to 200 µL) and pipette tips withfilter・Centrifuge for micro-tubes (optional)
・Centrifuge for eight connected tubes (optional)
・HuMax ITA (optional)

PREPARATION OF SAMPLE DNA SOLUTION
To extract the DNA from blood samples, boil & spin and PURE method
are recommended. The standard operating procedures (SOP) of bothmethods are provided athttps://www.finddx.org/wp-content/uploads/2016/04/SOP-LAMPMalaria-Aug2012.pdf

For real-time turbidity detection with HumaTurb C+A（see Flow chartof the procedure）(1) Configure the Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A for detection
with this product.
(2) Check if the displayed temperature reaches 65.0C (allow theturbidimeter to warm up for 20 minutes before use).
(3) Insert the reaction tubes and start measurement.
(4) Watch the display of the turbidimeter to check the positive andnegative controls for any increase in turbidity. If the turbidity
increases in the positive but not in the negative control solution,
amplification reaction is proceeding properly (Fig1). If this is not thecase, amplification reaction may be proceeding in a wrong way. Insuch a case, retest affected samples from reagent preparation.
(5) Confirm the completion of polymerase inactivation (automaticallycompleted by the turbidimeter). Take all reaction tubes from the
HumaTurb C+A and discard them without opening.

Pay attention to the following critical points for PURE method.
・Samples：Blood samples collected by finger prick, collected inheparin tubes or whole blood dried on filter paper・Sample volume：30µL (fresh blood or blood with heparin) or 6mm blood spot punch (dried blood spot)
・Additive：Add 30µL of 334mM NaCl solution (not included in the
LoopampTM PURE DNA Extraction Kit) to the heating tube
before heating・Heating：For 5 minutes at 75℃

PREPARATION OF REAGENTS
Amplification plots by Malaria Pf detection reagent(1) Malaria Pf detection reagent
Remove the required number of tubes from the aluminium pouchand put them in the provided rack. (sum of samples and controls).

(Analyzer： Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A)
Negative sample
Positive sample 1
Positive sample 2

Negative control
Positive control

Note: After removing the required tubes, reseal the aluminium
pouch with any unused tubes immediately.

Turbidity

Note: NC Mal should be used with every run.
(3) Positive control Mal（PC Mal）
Flick (or spin) down the tube before using, in order to collect thecontent at the bottom of the tube.

Note: PC Mal should be used with every run.

0.7

0.7

0.6

0.6

0.5

0.5

Turbidity(2) Negative control Mal（NC Mal）
Flick (or spin) down the tube before using, in order to collect thecontent at the bottom of the tube.

0.4
0.3

0.2

0.1

0.1
0
0

Reagent and sample mixing(1) Turn on the HumaLoop M or the Real-Time Turbidimeter HumaTurb
C+A.
(2) Dispense 30 µL of extracted DNA solution into a reaction tube using
the pipette and close the cap.
(3) Dispense 30 µL of NC Mal into a reaction tube using the pipette or
dropper, and close the cap.

0.3

0.2

0

MEASUREMENT PROCEDURE

0.4

5

10

15

20

25

30 35 40

Time ( min.)Fig1：Amplification plots for controls

0

5

10

15

20

25

30 35 40

Time ( min.)Fig2：Amplification plots for samples

PROCEDURAL NOTES(1) The LAMP reaction is very sensitive and a contamination with small
amounts of amplified product might lead to false positive results.
(2) Separate the sample preparation and the amplification areas.

2(3) Clean benches with over 0.5% sodium hypochlorite before and after
performing the test.
(4) Change gloves after transferring the blood or if the gloves come incontact with the DNA solution.
(5) When handling this product, avoid microbial contamination andnuclease contamination. Even a small amount of contamination of thereaction tube from sweat or saliva may decompose the DNA andcause a false result.
(6) Furthermore, read the SOP6) when performing DNA extraction.
(7) The DNA solution should ideally be used immediately after
preparation.
(8) (For HumaLoop M or other incubator using UV light）
If bubbles are present, flick the tubes to release them.
(For Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A）
Since bubbles in reaction solution may interfere with turbidity
measurement and cause a false result, avoid forming any bubble
when mixing reagent and sample solution. If bubbles occur, spin or
flick the tube to release them.
(9) dMAL Pf should be fully dissolved. Any undissolved portion may
influence the performance, such as causing a decrease in sensitivity.
(10) The PC Mal contains a high copy number of control DNA. Avoid any
contamination of other samples with the PC Mal. Dispense thesamples and the NC Mal and close all reaction tubes before
dispensing the PC Mal.
(11) Flick (or spin) down the PC Mal tube before opening it, in order tocollect the content at the bottom of the tube. Close the tube
immediately after dispensing the PC Mal.
(12) Never open the reaction tubes once the LAMP reaction has started orafter completion. Be particularly careful when unloading the reaction
tubes from the incubator to avoid opening the tubes accidentally.
(13) When the HumaLoop M or the Real-Time Turbidimeter HumaTurb
C+A is used, polymerase inactivation is automatically performed.
(14) For other incubators, when visual fluorescence judgment is chosen,
inactivate the polymerase (for 5 minutes at 80C, or for 2 minutes at
95C) before reading, or false results will be caused.
(15) Do not reuse any amplified product in the tubes for electrophoresis orother applications.

test does not always rule out an infection by Pf.
(3) This product is a kit for a qualitative detection; it is not designed for aquantitative measurement. The intensity of the fluorescent lightobserved or the rise time of turbidity measured by the Real-Time
Turbidimeter does not correlate with the concentration of template
DNA.

INTERFERING SUBSTANCES
Our in-house studies have revealed that the turbidimetry measurement
was not affected by the presence of EDTA (6.0 nmol/test), free bilirubin(1.2 µg/test), conjugated bilirubin (1.2 µg/test), chyle (formazine
turbidity:14,400) hemolytic hemoglobin (3.4 µg/test) and human genomic
DNA (1.2 µg/test). EDTA may cause false positive results when the result
is read by fluorescence.
With regard to drugs, our in-house studies have revealed that themeasurement was not affected by the presence of isoniazid (840 ng/test),
ethambutol (204 ng/test), rifampicin (958 ng/test), pyrazinamide (4.2µg/test), acetaminophen (322 ng/test), loxoprofen sodium (637 ng/test),
cefotaxime sodium (12 µg/test), levofloxacin (270 ng/test), atovaquone(1.59 µg/test), proguanil (20 ng/test), chloroquine (40 ng/test), quinine (960ng/test), doxycycline hydrochloride (360 ng/test), mefloquine (168 ng/test),
primaquine (18 ng /test) and artemisinin (93 ng/test).

PERFORMANCE CHARACTERISTICS(1) Sensitivity and accuracy
In testing the following samples: Negative sample (concentration: 0 copy/test) Positive sample 1 (100 copies/test) Positive sample 2 (1,000 copies/test);
The negative sample shall test negative and the positive samples 1
and 2 shall test positive.
(2) Within-run reproducibility
In testing five negative and five positive samples simultaneously, thenegative samples shall test negative throughout and the positive
samples shall test positive throughout.
(3) Limit of detection
7.5 copies/test(4) Cross-reactivity
The measurement system tested positive for Plasmodium falciparumand negative for other pathogens, as detailed in the table below:

INTERPRETATION OF RESULTS
For visual fluorescence detection（For HumaLoop M）
Set each reaction tube into the Fluorescence Detection Unit, irradiateand observe the tube from the side.
（For other incubator using UV light）
Irradiate the bottom of each reaction tube and observe from the sidethrough goggles or other UV-protective eye mask.

Plasmodium genus
Plasmodium falciparum
Plasmodium vivax
Plasmodium ovale
Plasmodium malariae

For a valid run, the following results must be obtained when read at the
specified time: Positive control: Green fluorescent light is emitted.
 Negative control: No fluorescent light is emitted.
If any control is invalid, all samples in the run should be reported as
invalid and the samples should be retested.

Positive
Negative
Negative
Negative

Other pathogens
Trypanosoma brucei
Trypanosoma cruzi
Leishmania donovani
Schistosoma mansoni
Theileria parva
Mycobacterium tuberculosis
Influenza A virus
Human immunodeficiency virus

After confirming that the run is valid, evaluate samples as follows: Positive sample: Green fluorescent light is emitted.
 Negative sample: No fluorescent light is emitted.
For real-time turbidity detection with HumaTurb C+A
After confirming that the turbidity increases in the positive control but
not in the negative control solution, evaluate samples in accordancewith the following criteria (Fig 1 and 2).
 Positive: Some increase is observed in turbidity.
 Negative: No increase is observed in turbidity.
Notes:(1) The minimum detection sensitivities of the MALARIA Pf Detection Kit
are 7.5 copies per test, respectively. In the case of a negative test
result, patients with any persisting or worsening symptoms should beconsidered for retesting and other possible causes of symptoms
should also be considered and investigated. The LAMP assay ishighly sensitive and may detect low-level parasitaemia that are not thedirect cause of the presenting symptoms. The patient’s clinicalcondition should always be taken into account when making a final
diagnosis and determining management.
(2) Although the primers have been designed to target a region
containing a relatively small number of variations, it is conceivable that
Plasmodium falciparum infections may occur with variations in thisregion that are not well detected by this product. Therefore, a negative

Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative(5) Information about a calibrator
The performance test for this product used plasmid DNA containing
the mitochondrial DNA of Pf as a calibrator.
(6) Clinical performance
Malaria is caused by certain parasites of the Plasmodium genus, which
are transmitted via the bites of infected mosquitoes. After a period ofdevelopment in the liver, blood stage parasites are released. The
blood-stage parasites enter red blood cells, lysing the cells during
subsequent reproduction and causing symptoms including fever. The
LAMP assay detects DNA from blood-stage parasites.
The Malaria LAMP was evaluated in blood samples sent for malaria
testing in a specialist laboratory. Following standard microscopy,
samples were anonymised, DNA was extracted from the blood
samples using the PURE6) method and tested by the Malaria LAMP kit
using Pf-specific primers, with two different read-out methods. Finally,
nested PCR was deployed as a reference method. 705 Malaria LAMP
tests, of which 56 were from patients positive by microscopy, werecompared to the nested PCR as a reference method. Sensitivity andspecificity of the LAMP Malaria Pf were 98.4% and 98.1%, respectively.

3

Flow chart
Sensitivity

Specificity(95% CI)(95% CI)

98.4%

98.1%

nested PCR
Malaria LAMP
vs91.4 – 100.0

96.8 – 99.0

100.0%

96.6%

microscopy

93.2 – 100.0

94.9 – 97.9

Malaria LAMP
vs

PPV*

NPV*

83.8%

99.8%

70.3%

100.0%

Operation procedure for real-time turbidity detection
Preparation of sample solution
Prepare sample DNA solutions by extracting DNA
from collected blood samples.

Reagent preparation*positive and negative predictive values

ORDERING INFORMATION
Product
Code

Product Name

Contents

978000Loopamp™
MALARIA Pf
Detection Kit

96 tests

962000

HumaLoop M

1 Main Unit
1 Fluorescence Detection Unit

970000Loopamp™ PUREDNA Extraction
Kit

90 tests

963200

HumaTurb C+A

1 Control Unit
1 Amplification Unit

964000

HumaHeat

Heating block

980000

HuMax ITABench-top centrifuge

Take the required number of reaction
tubes of dMAL Pf.
( For samples, negative andpositive controls )Mixing of reagent and sample solution
Transfer 3 0 µL of sample or control solution into eachreaction tube.
Use NC Mal as negative control.
Use PC Mal as positive control.
(The positive control should be prepared at last.)
Invert the reaction tubes to collect the solution in the cap.
Leave the tubes standing upside down for 2 minutes.

REFERENCES

Invert the reaction tubes 5 times to mix the contents andthen spin them down.
( Avoid making any bubbles.)

1) Notomi T., et al.: Nucleic Acids Research 28, No. 12, e63 (2000)
2) Nagamine K., et al.: Clin. Chem. 47, No. 9, 1742–1743 (2001)
3) Mori Y., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, No. 1, 150–
154 (2001)
4) Tomita N., et al.: Nat. Protoc. 3, No. 5, 877–882 (2008)
5) The guideline for the bio-safety and bio-hazard (by the JapaneseSociety for Bacteriology): Japanese Journal of Bacteriology 54, No.
3, 667–715 (1999)6) https://www.finddx.org/wp-content/uploads/2016/04/SOP-LAMPMalaria-Aug2012.pdf

Amplification
Load the reaction tubes onto the reaction block of theturbidimeter.
As directed in the instructions for use of the turbidimeter,
start reaction and measure and evaluate the turbidity (for40 minutes at 65.0C).
Confirm the completion of polymerase inactivation (for 5 minutes at
80C, or for 2 minutes at 95C). Take all reaction tubes from theturbidimeter and discard them without opening. Be careful not todamage the tubes.

Exclusive distributor

VD
HUMAN Gesellschaft für Biochemica
und Diagnostica mbH
Max-Planck-Ring 21, 65205 Wiesbaden, Germany

Date of Issue: October 1, 20184

Instructions d'utilisation
indiqué ci-dessous.

978000Français

Réactifs
Contrôle positif Mal

LoopampTM MALARIA Pf

Contrôle négatif Mal

Detection Kit

Étiquetage sur le tube
PC MalLot No., EKN
NC MalLot No., EKN

Code sur le bouchon
PC
Mal
NC
Mal

MISES EN GARDE ET PRÉCAUTIONS(1) Usage à des fins de diagnostic in vitro uniquement.
(2) Ce produit est réservé à la détection d’ADN des parasites Pf dans desspécimens de sang humain. Ne pas l’utiliser à d’autres fins.
(3) Respecter toujours ces instructions d’utilisation lors de l’utilisation dece produit.
(4) Ne pas congeler les réactifs.
(5) Ne jamais utiliser un réactif périmé.
(6) Ne pas mélanger les kits provenant de Lots différents.
(7) Ne pas rajouter de réactif pour re-remplir.
(8) La performance du LoopampTM MALARIA Pf Detection Kit dépend dela compétence de l’opérateur et du respect du mode d’emploi. Les
tests doivent être effectués par un personnel dûment formé.
(9) L’exposition à la chaleur, à l’humidité et à la lumière peut détériorer ledMAL Pf. Sortir le nombre de tubes nécessaires (nombre despécimens et témoins) de l’emballage juste avant son utilisation, puis
refermer la pochette en aluminium immédiatement.
(10) Ne pas enlever le dessicant du sachet en aluminium. Une forte
humidité peut détériorer le réactif LAMP se trouvant dans les tubes.
(11) Lire le manuel d’utilisation et s’assurer de la disponibilité deséquipements (turbidimètre ou incubateur) avant l’emploi du kit.
(12) Les spécimens de sang présentent un risque potentiel d’infection.
Prendre toutes mesures préventives nécessaires pour éviter tout
danger biologique potentiel. 5)(13) PC Mal et NC Mal contiennent tous deux une petite quantité d’azoturede sodiumcomme agent de conservation. L’azoture de sodium est
classé toxique. Éviter tout contact avec les yeux, la bouche ou la peau.
(14) Lors d’un contact accidentel d’un des réactifs avec les yeux, labouche ou la peau, rincer immédiatement et abondamment la partie
affectée avec de l’eau, et se référer à un service médicalement
compétent si nécessaire.
(15) Ne pas diluer ou ajouter du PC Mal aux spécimens. Afin d’éviter une
contamination de l’ADN, utiliser le PC Mal seulement comme il est
indiqué dans cette notice.
(16) Conserver le PC Mal et tout spécimen sanguin à l’écart des autres
réactifs du kit.
(17) Le bouchon de chaque tube de réaction contient du dMAL Pf sous
forme sèche. Ne pas toucher la partie interne du bouchon.
(18) Avant l’utilisation des tubes de réaction, vérifier avec soin la présencede fissure ou de rayures. Les tubes abîmés peuvent fausser lesrésultats et provoquer une contamination de l’incubateur ou del’espace de travail par de l’ADN.
(19) Ne pas exposer les tubes à la lumière UV avant la fin de la réaction
de LAMP. Une exposition prolongée des tubes à la lumière UV peut
endommager les tubes et peut fausser les résultats.
(20) Lors de l’utilisation lumière à UV pour l’évaluation de la fluorescence,ne pas fixer directement la source de lumière UV. La lumière UVétant nocive pour les yeux. La regarder, même pendant un temps
court, pourrait irriter les yeux et provoquer des symptômes similaires
à la conjonctivite. Utiliser des plaques d’écrans en verre, des lunettes
ou des visières protectrices lorsqu’on doit regarder directement unelumière UV.
(21) Se référer au manuel de l’incubateur. Lors de l’utilisation du
HumaLoop M ou du Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A, faireattention à ne pas se brûler en retirant les tubes de réactions desappareils.
(22) Ne pas utiliser le PC Mal comme contrôle positif pour LoopampTM
MALARIA Pan/Pf Detection Kit, LoopampTM MALARIA Pv Detection
Kit ou du LoopampTM MALARIA Pan Detection Kit. Ne pas utiliser le
PC d’un autre kits comme contrôle positif pour ce kit.

UTILISATION PRÉVUELe LoopampTM MALARIA Pf Detection Kit est un test qualitatif dediagnostic in vitro pour la détection de l’ADN de Plasmodium falciparum
extrait de prélèvements sanguins.

PRINCIPE DU TESTLe test est basé sur la méthode d’amplification d’acide nucléaire LAMP
(Loop-mediated Isothermal Amplification ; amplification isotherme induite
par boucle) développée par Eiken Chemical Co., Ltd.
La méthode LAMP possède les caractéristiques suivantes : (1) Une
seule enzyme est requise et la réaction d’amplification se fait sous desconditions isothermiques ;1), 2) (2) Elle présente une spécificité très élevéepar son utilisation de quatre amorces reconnaissant six régions distinctes
de la cible ; (3) Elle présente une amplification à très haut rendement etpermet une amplification en un temps court, et (4) Elle génère unequantité très élevée de produits d’amplification par le biais duquel une
simple détection visuelle devient possible. 3), 4)
Les séquences cibles d’ADN des amorces spécifique au P.falciparum(Pf) ont été construites pour détecter l’ADN mitochondrial et ont été
confirmées par l’analyse d’alignement comme étant spécifiques au Pf.
La solution d’ADN à tester, extrait d’un spécimen de sang, est transféréedans un tube à réaction. L’ADN polymérase à déplacement de brin, lesdésoxynucléotide triphosphatés ( dATP, dCTP, dGTP et dTTP ), lacalcéine, les tampons de réactions et les amorces spécifiques Malaria Pf
sont conservés sous forme sèche dans le bouchon des tubes de réaction.
Le réactif LAMP à l’état sec (réactif de détection du Malaria Pf (dMAL Pf))
sera dissout par l’ajout de la solution d’ADN. Le tube de réaction est
incubé à 65,0°C et l’ADN est amplifié suivant la réaction LAMP à l’aide
de l’ADN polymérase à déplacement de brin.
La détection du produit d’amplification est fondée sur la mesure de laturbidité d’un sous-produit, le pyrophosphate de magnésium (précipité
blanc). 3) Une évaluation visuelle sous irradiation UV à la place de mesurede turbidité est également possible. La calcéine contenue dans le réactif
LAMP est libérée durant l’amplification, ce qui produit une lumière
fluorescente détectable à l'œil nu.4) Avant la réaction d’amplification del’ADN, la calcéine contenue dans le réactif est éteinte car les ions demanganèse lui sont liés ; une fois la réaction de LAMP démarrée, les ionspyrophosphate qui sont générés prennent la place des ions manganèse
sur les sites de liaison, et la calcéine devient fluorescente.4)

CONTENU DU KIT
Les réactifs sont stables jusqu’à la date figurant sur l’étiquette, sousréserve que le container n’ait pas été ouvert et qu’il ait été conservé à
une température de 2 à 30°C.
Réactif de détection du Malaria Pf (dMAL Pf)····2 x 48 tubes
Les réactifs suivants sont contenus à l’état sec dans chaquetube à réaction.
Bst ADN polymérase *1
Déoxynucleotide triphosphates
Sulfate de magnésium
Calcéine
Chlorure de manganèse
Amorces* 2
Contrôle positif Mal (PC Mal)*3 ·······················1 x 1,0 mL
Contrôle négatif Mal (NC Mal) ·······················3 x 0,5 mL
Compte-goutte 30µL ····················5 x 12 compte-goutte*1: La Bst DNA polymérase dérivée du Bacillus stearothermophilus est
une polymérase à déplacement de brin d’ADN qui est dépourvu
d’activité exonucléase 5'→3'.
*2: Amorces pour l’ADN mitochondrial de Pf, purifiés par HPLC à partird’oligonucléotides de synthèse.
*3: PC Mal contient un produit résultant d’une amplification in vitro d’ungène artificiel conçu à partir de l’ADN mitochondrial du Pf(GenBank No.M76611).
Les abréviations des noms des réactifs suivants, leur numéro de lot, ainsi
que le code du fabricant (EKN), sont imprimées sur les boîtiers commeÉLIMINATION DES DÉCHETS(1) Ne pas ouvrir les tubes après amplification de l’ADN. Laisser lebouchon fermé et jeter les tubes comme déchet médical à incinérer
ou sac double scellé.
(2) Ne jamais passer à l’autoclave ou réutiliser les tubes de réaction au
risque de disperser les produits et provoquer une contamination.
(3) Le matériau principal des tubes de réaction, des tubes de réactifs et5

du compte-goutte de 30µL est PP ; Le plateau à tubes est en PET;
la pochette en aluminium est en aluminium ; la boîte du kit est en
papier.
(4) Éliminer tout réactif non utilisé, boîtier ou matériel de laboratoire
conformément à la réglementation locale.

pipette ou compte-goutte, puis refermer le bouchon.
(4) Transférer 30 µL de PC Mal dans un tube à réaction à l’aide d’une
pipette ou compte-goutte, puis refermer le bouchon.
(5) Secouer le tube d’un mouvement sec ou le centrifuger pour collecter
la solution se trouvant au fond du tube.

Remarque : s’assurer que le niveau du liquide se situe au milieu
de deux traits du tube à réaction pour vérifier que le volumetransféré par le pipetage est correct.

PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS(1) Utiliser les spécimens sanguins immédiatement après leurprélèvement.
(2) Prélever le sang dans une salle séparée de celle pour effectuer
l’amplification LAMP. Les aérosols contenant de l’ADN de Pf peuventêtre produits durant le prélèvement sanguin, ce qui peut provoquer
une contamination.
(3) NE PAS UTILISER D’ EDTA ou de Citrate comme anticoagulant lors
du prélèvement sanguin si la lecture du résultat doit se faire parfluorescence. Il est recommandé d’utiliser de l’héparine comme
anticoagulant.

(6) Reconstituer les réactifs à l’état sec qui se trouve dans le bouchon en
inversant le tube afin de collecter la solution d’ADN. Laisser le tube
inversé pendant 2 minutes pour reconstituer les réactifs à l’état sec.
(7) Mélanger le contenu du tube par 5 inversions. S’assurer que lesréactifs à l’état sec est complètement dissout (la solution doit êtred’une couleur légèrement orangée).
(8) Secouer le tube d’un mouvement sec ou le centrifuger pour collecter
la solution se trouvant au fond du tube.
Amplification
Pour une détection visuelle de fluorescence(Pour le HumaLoop M)(1) Vérifier que la température de la HumaLoop M est à 65,0°C.
(2) Disposer les tubes dans l’incubateur HumaLoop M et appuyer sur lebouton vert pour démarrer la réaction de LAMP (40 minutes à 65,0°C).
Voir le manuel d’utilisation du HumaLoop M pour les détails surl’opération de l’incubateur.
(3) Vérifier que l’inactivation de la polymérase est complète (complétée
automatiquement par le HumaLoop M). Sortir tous les tubes à
réaction du HumaLoop M.
(Pour d’autres incubateurs avec lumière UV)(1) Régler la température de l’incubateur à 65,0°C (avec la température
du couvercle chauffant réglée 10°C au-dessus de la température deréaction. Précision de température : ±0,5°C). Attendre que latempérature affichée ait atteint la valeur du réglage.
(2) Charger les tubes à réaction dans l’appareil, puis démarrer la réactiond’amplification (40 minutes à 65,0C).
(3) Après les 40 minutes, inactiver la polymérase à l’aide du bloc
chauffant (5 minutes à 80C ou 2 minutes à 95C) pour terminer laréaction.
Détection de turbidité en temps réel HumaTurb C+A (voir diagrammede la procédure)(1) Configurer le Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A pour une
détection avec le kit (à moins que l’appareil soit déjà réglé).
(2) Vérifier que la température indiquée atteint les 65,0°C (préchauffer leturbidimètre pendant 20 minutes avant utilisation).
(3) Insérer les tubes de réaction, puis démarrer la mesure.
(4) Surveiller l’affichage du turbidimètre pour vérifier si les témoins
positifs et négatifs augmentent ou non. Si la turbidité augmente
uniquement chez le témoin positif alors que le témoin négatif nechange pas, la réaction d’amplification se passe correctement (Fig1).
Dans tout autre cas de figure, il peut y avoir une erreur dans laréaction d’amplification : si tel est le cas, réexaminer les spécimens
affectés depuis la préparation des réactifs.
(5) Vérifier que l’inactivation de la polymérase est complète (complétée
automatiquement par le turbidimètre). Sortir tous les tubes de réactiondu Huma Turb C+A et les jeter sans les ouvrir.

MATÉRIELS NÉCESSAIRES NON FOURNIS

 LoopampTM PURE DNA Extraction Kit (optionnel) HumaHeat (optionnel)
Pour la détection visuelle de fluorescence(Pour le HumaLoop M)
 HumaLoop M(Autres incubateurs avec lumière UV)
 Incubateur ( précision de température : ±0,5°C, avec couvercle
chauffant) Bloc chauffant Lumière UV ou lumière LED BLEU ( longueur d’onde : 240 à
260 nm et 350 à 370 nm )
 Lunettes ou visière de protection
Détection de turbidité en temps réel
 HumaTurb C+A
Mélange et préparation des réactifs et des spécimens
 Pipettes (de 10 à 100 µL, et de 20 à 200 µL), cônes filtrés pourpipettes Centrifugeuse pour microtubes (optionnel)
 Centrifugeuse avec rotor pour barrettes de 8 tubes (optionnel)
 HuMax ITA (optionnel)

PRÉPARATION DE LA SOLUTION D’ADN ÉCHANTILLONSIl est recommandé d'extraire l'ADN par la méthode "Bouillir etcentrifuger" ou par la méthode PURE. Les procédures opératoires
standards de ces deux méthodes se trouvent à :https://www.finddx.org/wp-content/uploads/2016/04/SOP-LAMPMalaria-Aug2012.pdf
Une attention particulière est demandée sur les points critiquessuovants de la méthode PURE.
·Les échantillons : Du sang prélevé au bout du doigt dans un tube
hépariné, ou du sang total séché sur papier filtre·Volume d'échantillon : 30µL (sang frais ou hépariné) ou confetti de
6 mm de sang séché sur papier filtre· Additif : Ajouter 30µL de solution de NaCl à 334mM (non fourni
dans le kit d'extraction LoopampTM PURE DNA ExtractionKit) au tube de chauffage avant de chauffer·Chauffage : Pendant 5 minutes à 75C

Courbes avec les réactifs de détection Malaria Pf(Analyseur : Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A)PRÉPARATION DES RÉACTIFS

Échantillon négatif
Échantillon positif 1
Échantillon positif 2

Contrôle négatif
Contrôle positif
0,7

0,6

0,6

refermer immédiatement la pochette en aluminium contenant les
tubes restants.

0,5

0,5

(2) Contrôle négatif Mal (NC Mal)
Avant utilisation, secouer le tube d’un mouvement sec ou lecentrifuger pour collecter le contenu du fond du tube.
Remarque : le NC Mal doit être utilisé à chaque opération.
(3) Contrôle positif Mal (PC Mal)
Avant utilisation, secouer le tube d’un mouvement sec ou lecentrifuger pour collecter le contenu du fond du tube.
Remarque : le PC Mal doit être utilisé à chaque opération.

Turbidité0,7Turbidité(1) Réactifs de détection du Malaria Pf
Sortir de la pochette en aluminium le nombre de tubes requis, puis
les placer dans le rack fourni (nombre de spécimens et contrôles).
Remarque : Après avoir sorti le nombre de tubes nécessaire,

0,4
0,3

0,3

0,2

0,2

0,1

0,1
0

0
0

5

10

15

20

25

30 35 40

Temps ( min.)Fig1 : Courbe d'amplification destémoins

PROCÉDURE DE MESURE

0,4

0

5

10

15

20

25

30 35 40

Temps ( min.)Fig2 : Courbe d'amplification desspécimens

NOTES SUR LA PROCÉDURE

Préparation des réactifs et des spécimens(1) Allumer la HumaLoop M ou le Real-Time Turbidimeter HumaTurb
C+A.
(2) Transférer 30 µL de solution d’échantillon d’ADN dans un tube àréaction à l’aide d’une pipette, puis refermer le bouchon.
(3) Transférer 30 µL de NC Mal dans un tube à réaction à l’aide d’une(1) La réaction de LAMP est très sensible et une contamination par unequantité infime de produit d’amplification peut provoquer un résultat
faussement positif.
(2) Séparer la zone de préparation de la zone de test LAMP.
(3) Nettoyer la paillasse avec une solution d’hypochlorite supérieure à6

0,5% avant et après le test.
(4) Changer de gants après avoir transféré le sang ou si les gants ont
touché la solution d’ADN.
(5) Éviter toute contamination parasitologique ou contamination par lanucléase lors de la manipulation du produit. Une quantité, mêmeinfime, de DNAse transmise aux tubes par la sueur ou par la salive
pourrait décomposer l’ADN et fausser les résultats.
(6)Il est aussi important de lire attentivement la SOP6) lors de l’utilisation.
(7) Idéalement, la solution d’ADN devrait être utilisée immédiatement
après sa préparation.
(8) (Pour le HumaLoop M ou autre incubateur avec lumière UV)
Si des bulles sont présentes, secouer le tube d’un coup sec vers lebas pour les éliminer.
(Pour le Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A)
Essayer de ne pas générer de bulles lors de la préparation desréactifs et des solutions de spécimens, car les bulles peuvent
interférer aux mesures de turbidité. Si la présence de bulles est
observée, centrifuger pour les éliminer.
(9) Le dMAL Pf doit être complètement dissout. Toutes portions non
dissoutes peuvent influer sur la performance et provoquer une perte
de sensibilité.
(10) Le PC Mal contient un grand nombre de copies d’ADN de contrôle.
Éviter toute contamination d’autres spécimens par le PC Mal.
Transférer les spécimens et le NC Mal, puis refermer tous les tubes
à réaction avant le pipetage du PC Mal.
(11) Secouer le tube de PC Mal d’un mouvement sec ou le centrifuger
avant son ouverture pour collecter la solution se trouvant au fond du
tube. Refermer le tube immédiatement après avoir transféré le PCMal.
(12) Ne jamais ouvrir un tube à réaction une fois la réaction de LAMP
démarrée, même une fois la réaction terminée. Une attention
particulière est requise en sortant les tubes de l’incubateur pouréviter toute ouverture accidentelle.
(13) Lors de l’utilisation la HumaLoop M ou d’un Real-time Turbidimeter
HumaTurb C+A, l’inactivation de la polymérase se fait
automatiquement par l’appareil.
(14) Pour les autres incubateurs, inactiver la polymérase (5 minutes à
80C ou 2 minutes à 95C) avant lecture, faute de quoi les résultats
peuvent être faussés.
(15) Ne pas réutiliser produits d’amplification des tubes pourl’électrophorèse ou autres.

(2) Bien que les amorces aient été construites pour avoir comme cible
une région comportant relativement peu de variations, il est
concevable que des infections au Pf avec des variations pour ces
régions ne seront pas forcément détectables par ce kit. Ainsi, unrésultat négatif n’exclut pas de façon absolue une présence de Pf.
(3) Ce produit est un kit pour une détection qualitative, il n’a pas été
conçu pour une mesure quantitative. L’intensité de fluorescenceobservée ou une augmentation de turbidité mesurée par le Real-Time
Turbidimeter ne corrèlent pas avec la quantité d’ADN matrice.

SUBSTANCE POUVANT INTERFÉRER
Une étude interne a montré que les mesures par turbidimètre ne sont pas
affectées par la présence d’EDTA (6,0 nmol/test), de bilirubine libre (1,2µg/test), de bilirubine conjuguée (1,2 µg/ test ), du chyle (turbidité à laformazine :14 400), d’hémoglobine hémolytique (3,4 µg/ test), et d’ADN
génomique humain (1,2 µg/ test). L’EDTA peut provoquer des faux positifs
lors des lectures de fluorescence.
Pour les médicaments, une étude interne a montré que les mesures nesont pas affectées Pa la présence de : Isoniazide (840 ng/test),
Ethambutol (204 ng/test), Rifampicine (958 ng/test), Pyrazinamide (4.2
ng/test), Acetaminophen (322 ng/test), Loxoprofen sodium (637 ng/test),
Cefotaxime sodique (12 µg/test), Levofloxacine (270 ng/test), Atovaquone(1,59 µg/test), Proguanil (20 ng/test), Chloroquine (40 ng/test), Quinine(960 ng/test), Doxycycline chlorhydrique (360 ng/test), Méfloquine (168ng/test), Primaquine (18 ng /test), et Artémisinine (93 ng/test).

CARACTÉRISTIQUES DES PERFORMANCES(1) Sensibilité et précision
En testant les spécimens suivants : Spécimen Négatif (concentration : 0 équivalent génome/test) Spécimen Positif 1 (100 équivalents génome/test) Spécimen Positif 2 (1 000 équivalents génome/test),
Les spécimens négatifs doivent être négatifs et les spécimens positifs
1 et 2 doivent être positifs.
(2) Reproductibilité pendant le même test
En testant simultanément 5 spécimens positifs et négatifs, lesspécimens négatifs doivent rester négatifs et ceux positifs doivent
rester positifs tout au long de la procédure.
(3) Limite de détection
7,5 copies/test(4) Réactions croisées
Le tableau ci-après détaille les résultats des tests qui ont été positifs
pour Pf et négatifs pour d'autres pathogènes.

L’INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
Détection visuelle de fluorescence(Pour le HumaLoop M)
Installer chaque tube à réaction dans l’Unité de Détection de
Fluorescence, irradier et observer le tube par le côté.
(Autres incubateurs avec lumière UV)
Irradier le fond de chaque tube de réaction et observer par le côté àtravers des lunettes ou un d’autres équipements protecteurs.

Genre Plasmodium
Plasmodium falciparum
Plasmodium vivax
Plasmodium ovale
Plasmodium malariae

Pour qu’un test soit valide, les résultats obtenus doivent être commesuit :
 Contrôle Positif : émission d’une fluorescence verte.
 Contrôle Négatif : pas de fluorescence émise.
Si un des contrôles n’est pas valide, tous les spécimens testés doiventêtre mentionnés comme non valide et les spécimens doivent êtreréexaminés.

Positif
Négatif
Négatif
Négatif

Autres pathogènes
Trypanosoma brucei
Trypanosoma cruzi
Leishmania donovani
Schistosoma mansoni
Theileria parva
Mycobacterium tuberculosis
Influenza A virus
Human immunodeficiency virus

Après confirmation de la validité du test effectué, évaluer les spécimens
comme suit : Contrôle Positif : émission d’une fluorescence verte.
 Contrôle Négatif : pas de fluorescence émise.
Détection à l’aide d’un turbidimètre à temps réel HumaTurb C+A
Après avoir vérifié que la turbidité de la solution témoin positif augmente,mais pas celle de la solution témoin négatif, procéder a l’évaluation desspécimens en fonctions des critères suivants (Fig 1 et 2).
 Positif : une augmentation de turbidité est observée.
 Négatif : pas d’augmentation de turbidité observée.
Remarques :(1) La sensibilité minimale de détection du MALARIA Pf Detection Kit est
de 7,5 copies par test. Dans le cas d’un résultat négatif chez unpatient présentant une persistance ou une aggravation dessymptômes, considérer de répéter le test, tout en recherchantd’autres causes aux symptômes. Les tests LAMP sont d’une très
grande sensibilité, capable de détecter une parasitémie faible qui neserait pas la cause directe des symptômes présentés. Toujours tenir
compte du tableau clinique du patient pour établir le diagnostic final
pour définir la prise en charge de la maladie.

Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif(5) Information sur le calibrateur
Le test de performance du produit a été effectué avec commecalibrateur l’ADN plasmidique contenant l’ADN mitochondrial du Pf.
(6) Performance clinique
Le paludisme est causé par certains parasites du genre Plasmodium
qui sont transmis par des piqûres de moustiques. Après une phasede développement dans le foie, les parasites atteignent le milieu
sanguin. Les parasites en phase sanguine envahissent les hématies
et les lysent durant la phase de reproduction, induisant dessymptômes tels que la fièvre. Le test LAMP détecte l’ADN desparasites de la phase sanguine.
Le test LAMP pour le paludisme a été évalué sur des specimen desang envoyés dans un centre spécialisé. Après un examen
microscopique, les specimen ont été anonymisés et l’ADN a été
extrait du sang par la méthode PURE6) pour être testé par le kit LAMP
pour le paludisme qui utilise parallèlement des amorces spécifiquespour le P. falciparum, avec deux méthodes de lecture différentes.
Enfin, une PCR nichée a été effectuée comme méthode de référence.

7

Les résultats de 705 tests LAMP pour le paludisme, dont 56
provenant de patients positifs à l’examen microscopique, ont été
comparés aux résultats de la PCR nichée de référence. La sensibilité
et la spécificité du LAMP Malaria Pf étaient respectivement de 98,4%
et 98,1%.

LAMP paludisme
vs nested PCR
LAMP paludisme
vs microscopie

Sensibilité

Spécificité(95% CI)(95% CI)

98,4%

98,1%

91,4-100,0

96,8-99,0

100,0%

96,6%

93,2-100,0

94,9-97,9

VPP*

VPN*

83,8%

99,8%

DIAGRAMME
Procédure opératoire pour une détection au turbidimètre àtemps réelPréparation des solutions des spécimens
Préparer les solutions de spécimens par extractiond’ADN du sang prélevé.

Préparation des réactifs
70,3%

Prendre le nombre de tubes de dMAL
Pf nécessaire.

100,0%( Pour les spécimens et lestémoins positif et négatif)* valeurs prédictives positives et négatives

RÉFÉRENCES DE COMMANDE
Code
produitNom du produit

Contenu

978000Loopamp™
MALARIA Pf
Detection Kit

96 tests

962000

HumaLoop M

1 unité Principale
1 unité d’évaluation Visuelle deFluorescence

970000Loopamp™ PUREDNA Extraction Kit

90 tests

963200

HumaTurb C+A

1 unité de Contrôle
1 unité d’amplification

980000

HuMax ITA

Centrifugeuse de Paillasse

964000

HumaHeat

Bloc ChauffantMélange du réactif et de la solution d’échantillon
Transférer 30 µL de solution du spécimen ou de témoin
dans chaque tube.
Utiliser le NC Mal comme témoin négatif.
Utiliser le PC Mal comme témoin positif.
(le témoin positif doit être préparé en dernier)Retourner le tube de réaction pour récupérer la solution
dans le bouchon. Laisser le tube retourné pendant 2
minutes.

Mélanger le contenu des tubes par 5 inversions, puis
collecter par centrifugation.
( Éviter les bulles.)Amplification
Disposer les tubes dans le bloc de réaction du turbidimètre.

RÉFÉRENCES
1) Notomi T., et al.: Nucleic Acids Research 28, No. 12, e63 (2000)
2) Nagamine K., et al.: Clin. Chem. 47, No. 9, 1742–1743 (2001)
3) Mori Y., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, No. 1, 150–
154 (2001)
4) Tomita N., et al.: Nat. Protoc. 3, No. 5, 877–882 (2008)
5) La ligne directrice pour la biosécurité et le bio-risque (par la Société
Japonaise de Bactériologie): Japanese Journal of Bacteriology 54,
No. 3, 667–715 (1999)6) https://www.finddx.org/wp-content/uploads/2016/04/SOP-LAMPMalaria-Aug2012.pdf

Démarrer la réaction, mesurer et évaluer la turbidité ( 40minutes à 65,0C) comme indiqué dans le manueld’utilisation du turbidimètre.
Vérifier que l’inactivation de la polymérase est complète (5 minutes à
80C ou 2 minutes à 95C). Sortir tous les tubes du turbidimètre et les jeter
sans les ouvrir. Attention à ne pas abimer les tubes.

VD
Distributeur exclusif

HUMAN Gesellschaft für Biochemica
und Diagnostica mbH
Max-Planck-Ring 21, 65205 Wiesbaden, Germany

Révisé le 1er octobre 20188

Instrucciones de uso
Reactivos

978000Español

Control positivo Mal

LoopampTM MALARIA Pf

Control negativo Mal

Etiqueta en el tubo
PC MalN.º lote., EKN
NC MalN.º lote., EKN

Código en la tapa
PC
Mal
NC
Mal

ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES(1) Solo para diagnóstico in vitro.
(2) Este producto está diseñado únicamente para la detección de ADN deparásitos Pf en muestras de sangre de origen humano. No debe utilizarse
para otros propósitos.
(3) Cuando utilice este producto, siga siempre las instrucciones de uso.
(4) No congele los reactivos.
(5) No utilice reactivos caducados.
(6) No mezcle reactivos de lotes distintos.
(7) No rellene ningún reactivo.
(8) El rendimiento del LoopampTM MALARIA Pf Detection Kit dependede lacompetencia del operario y del cumplimiento de las presentes instrucciones.
Las pruebas solo deben ser realizadas por personal debidamente
capatidado.
(9) La exposición al calor, a la humedad y a la luz puede deteriorar el dMAL Pf.
Retire solo el número necesario de tubos de reacción (número de muestras
y controles) y cierre inmediatamente la bolsa de aluminio.
(10) No retire el desecante de la bolsa de aluminio. Un elevado nivel dehumedad podría deteriorar el reactivo LAMP en polvo de los tubos dereacción.
(11) Antes de comenzar el procedimiento, lea el manual de instrucciones ycompruebe el correcto funcionamiento del equipo (turbidímetro o
incubadora).
(12) Las muestras de sangre suponen un potencial riesgo de infección. Respete
5)
las precauciones universales para evitar la exposición al riesgo biológico.
(13) PC Mal y NC Mal contienen una pequeña cantidad de azida sódica comoconservante. La azida sódica es considerada tóxica. Evite el contacto con
los ojos, la boca o la piel.
(14) En caso de contacto accidental de cualquier reactivo con los ojos, la bocao la piel, aclare inmediatamente la zona afectada con agua abundante y, encaso necesario, consulte a un médico.
(15) No diluya ni añada el PC Mal a las muestras. Utilice el PC Mal siguiendolas indicaciones del presente prospecto para evitar la contaminación deADN.
(16) Guarde el PC Mal y cualquier muestra positiva de sangre por separado deotros reactivos.
(17) La tapa de cada tubo de reacción contiene dMAL Pf en polvo. No toque elinterior de la tapa.
(18) Antes de utilizar los tubos de reacción, compruebe que no presenten grietas
ni arañazos. Los tubos deteriorados pueden dar resultados falsos ycontaminar el ADN de la incubadora y del área de trabajo.
(19) No exponga los tubos de reacción a una fuente de luz ultravioleta antes determinarse la reacción LAMP. La exposición prolongada a la luz UV puede
deteriorar los tubos y dar resultados falsos.
(20) Si utiliza luz UV para evaluación visual de fluorescencia, no miredirectamente a la luz UV. La luz UV es perjudicial para los ojos y mirarla
incluso por un periodo breve puede irritarlos y causar síntomas similares ala conjuntivitis. Utilice una pantalla de vidrio, o lleve gafas o una máscara
de protección ocular cuando tenga que mirar directamente a luz UV.
(21) Consulte el manual de la incubadora. Cuando utilice la HumaLoop M o elturbidímetro en tiempo real HumaTurb C+A, tenga cuidado al retirar lostubos de reacción de la incubadora para evitar posibles quemaduras.
(22) No usar PC Mal como un control positivo para LoopampTM MALARIA Pan
Detection Kit, LoopampTM MALARIA Pv Detection Kit o LoopampTM
MALARIA Pan/Pf Detection Kit. No usar PC de otro kit como un control
positivo para este kit.

Detection Kit
USO PREVISTOEl LoopampTM MALARIA Pf Detection Kit es un método de prueba
diagnóstica cualitativa in vitro para la detección de ADN de Plasmodium
falciparum extraído de muestras de sangre humana.

PRINCIPIOS DE LA PRUEBA
Este producto aplica el método de amplificación de ácidos nucleicos,
LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification), desarrollado por Eiken
Chemical Co., Ltd.
El método LAMP presenta las siguientes características: (1) Solo senecesita una enzima de polimerasa para activar la reacción deamplificación isotérmica; 1),2) (2) esta técnica es altamente específica
gracias a los cuatro cebadores que reconocen seis regiones distintas delblanco; (3) ofrece una gran eficiencia de amplificación, que realiza
rápidamente y es capaz de generar una gran cantidad de producto
amplificado visualizable a simple vista. 3),4)
Las secuencias de ADN objetivo de los cebadores específicos para laespecie P. falciparum (Pf) se han diseñado para detectar el ADN
mitocondrial ADN han sido confirmadas mediante análisis de alineamientopara ser específicas para las secuencias Pf.
La solución de ADN extraída de las muestras de sangre se dispensa en
un tubo de reacción. La ADN polimerasa con actividad de desplazamientode cadena, los trifosfatos deoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), lacalceína, los amortiguadores de reacción y los cebadores específicos para
la Malaria Pf se almacenan en polvo en el tapón del tubo de reacción. Estos
reactivos LAMP en polvo (reactivos de detección de Malaria Pf (dMAL Pf))
se disuelven al añadir la solución de ADN. El tubo de reacción se incuba a
65,0°C y el ADN se amplifica por la ADN polimerasa con actividad dedesplazamiento de cadena de acuerdo con la reacción LAMP.
La detección de productos amplificados se basa en una medición
turbidimétrica de pirofosfato de magnesio (un precipitado blanco
subproducto de la reacción de amplificación de ADN).5) También se puede
recurrir a la detección visual con luz UV. Antes de la amplificación de ADN,
la calceína contenida en el reactivo se encuentra "apagada" debido a laproliferación de iones de manganeso; sin embargo, cuando comienza laamplificación de ADN, los iones de pirofosfato se unen a los iones demanganeso y la calceína de vuelve fluorescente.4)

CONTENIDO DEL KIT
Sin abrir, los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada
en la etiqueta, sin abrir y a una temperatura entre 2 – 30°C.
Reactivo de detección de Malaria Pf (dMAL Pf)········· 2 x 48 tubos
Cada tubo de reacción contiene los siguientes reactivos en polvo:
ADN polimerasa Bst*1
Trifosfatos deoxinucleótidos
Sulfato manganésico
Calceína
Cloruro de manganeso
Cebadores*2
Control positivo Mal (PC Mal)*3 ································· 1 x 1,0 mL
Control negativo Mal (NC Mal) ································· 3 x 0,5 mL
Cuentagotas de 30 µL ································· 5 x 12 cuentagotas*1: La ADN polimerasa Bst derivada de Bacillus stearothermophilus es
una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena que
no presenta actividad exonucleasa 5’→3’.
*2: Los cebadores diseñados para el ADN mitocondrial de Pf, conpurificación de oligonucleótidos sintetizados por HPLC.
*3: PC Mal contiene un producto resultante de una amplificación in vitro
de un gen artificial específico para el ADN mitocondrial de parásitos
de Pf (GenBank No. M76611).

ELIMINACIÓN DE RESIDUOS(1) No abra los tubos después de la amplificación de ADN. Mantenga el
la tapa cerrada y elimine los tubos usados como residuos médicos por
incineración o introdúzcalos en una bolsa doble plástica sellada.
(2) No esterilice con autoclave ni reutilice los tubos de reacción, ya quelos productos amplificados se dispersarían y provocarían una
contaminación.
(3) El material principal para los tubos de reacción y los tubos de reactivos
es el PP; la bandeja de los tubos de reacción es de PET; la bolsa dealuminio es de aluminio; y el estuche es de papel.

Las abreviaciones de los nombres de los siguientes reactivos, su número
de lote y el fabricante (EKN) figuran en los recipientes.

9o cuentagotas y cierre la tapa.
(5) Agite bien los tubos (centrifugar) para recuperar el contenido del fondo
de los tubos.
Nota: cuando utilice el equipo PURE compruebe que el nivel delíquido se acerca a la línea superior de las dos líneas del tubo dereacción para asegurarse de haber dispensado el volumen adecuado(6) Reconstituya los reactivos en polvo del tapón invirtiendo los tubos dereacción y con la solución de ADN de la tapa. Deje los tubos boca
abajo durante 2 minutos para reconstituir los reactivos en polvo.
(7) Invierta los tubos de reacción 5 veces para mezclar el contenido.
Asegúrese de que los reactivos en polvo de la tapa estén bien
disueltos (la solución debe tener un leve color anaranjado).
(8) Agite bien los tubos (centrifugar) para recuperar el contenido del fondo
de los tubos.
Amplificación(4) Deseche cualquier otro reactivo, recipiente o material de laboratorio
usados de acuerdo con la normativa local.

RECOLECCIÓN DE MUESTRAS(1) Las muestras de sangre se deben utilizar inmediatamente después de
ser tomadas.
(2) Tome las muestras de sangre en una habitación separada de la salade amplificación LAMP. Durante la toma de sangre se pueden generar
aerosoles que contienen ADN Pf y pueden causar una contaminación.
(3) NO USE EDTA ni citrato como anticoagulantes para la toma de sangre
si el resultado debe ser leído con fluorescencia. Conviene utilizar
heparina como anticoagulante.

MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS

 LoopampTM PURE DNA Extraction Kit (opcional) HumaHeat (opcional)
Para detección visual de fluorescencia(Para incubadora HumaLoop M)
 HumaLoop M(Para otra incubadora con luz UV)
 Incubadora (precisión de temperatura: ± 0,5°C; con cubierta térmica)
 Bloque térmico
 Luz UV o Luz LED Azul (longitud de onda: 240 a 260 nm y 350 a 370
nm) Gafas, máscara o cualquier material de protección ocular para rayos
UV.
Para detección de turbidez en tiempo real
 HumaTurb C+A
Para mezcla de reactivo y muestra
 Micropipetas (10 a 100 µL, y 20 a 200 µL) y puntas de pipeta con filtro Centrifugadora para microtubos (opcional)
 Centrifugadora para ocho tubos conectados (opcional)
 HuMax ITA (opcional)

Para detección visual de fluorescencia(Para HumaLoop M)(1) Compruebe que la temperatura mostrada en la HumaLoop M es
65,0°C.
(2) Coloque los tubos de reacción en la HumaLoop M y pulse el botón
verde para lanzar la reacción LAMP (40 minutos a 65,0°C). Consulteel manual de instrucciones de la HumaLoop M para más detalles
sobre el funcionamiento de la incubadora.
(3) Confirme la finalización de la inactivación de la polimerasa(automáticamente completada por la HumaLoop M). Retire todos lostubos de reacción de la HumaLoop M.
(Para otra incubadora con luz UV)(1) Ajuste la temperatura de la incubadora a 65,0°C (temperatura de lacubierta térmica a 10°C por encima de la temperatura de reacción olo más próxima posible; precisión de temperatura: ± 0,5°C). Espere
hasta que la temperatura mostrada alcance el valor predefinido.
(2) Coloque los tubos de reacción y lance la reacción de amplificación (40minutos a 65,0°C).
(3) 40 minutos después, inactive la polimerasa con el bloque térmico (5minutos a 80°C o 2 minutos a 95°C) para terminar la reacción.
Para la detección de turbidez en tiempo real HumaTurb C+A (verDiagrama del procedimiento)(1) Si aún no está bien configurado, ajuste el turbidímetro en tiempo real
HumaTurb C+A para la detección con este producto.
(2) Compruebe que la temperatura visualizada alcanza 65,0°C (dejecalentar el turbidímetro 20 minutos antes de utilizarlo).
(3) Coloque los tubos de reacción y lance la medición.
(4) Compruebe en la pantalla del turbidímetro los controles positivo ynegativo para cada aumento de turbidez. Si la turbidez aumenta en elpositivo, pero no en la solución de control negativo, significa que lareacción de amplificación se realiza correctamente (Fig1). Si no es así,la reacción de amplificación no se está realizando adecuadamente.
En tal caso, vuelva a comprobar las muestras afectadas desde la
preparación del reactivo.
(5) Confirme la finalización de la inactivación de la polimerasa(automáticamente completada por el turbidímetro). Tome todos lostubos de reacción del turbidímetro y deséchelos sin abrirlos.

PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE ADN DE
MUESTRAPara extraer el ADN de muestras de sangre, conviene utilizar el método
de ebullición y centrfugación, y el método PURE. Los procedimientos
operativos estándar (SOP, por sus siglas en inglés) de ambos métodos se
describen en
https://www.finddx.org/wp-content/uploads/2016/04/SOP-LAMP-MalariaAug2012.pdf
Hay que prestar mucha atención a los siguientes puntos críticos delmétodo PURE.
·Muestras: Muestras de sangre tomadas mediante pinchazo en el
dedo y guardadas en tubos con heparina o sangre secaen papel de filtro·Volumen de la muestra: 30 µL (sangre fresca o sangre con heparina)
o sacabocado de sangre de 6-mm (mancha de sangre
seca)·Aditivos: Añadir 30 µL de solución 334mM NaCl (no incluido en el kit
de extracción de LoopampTM PURE DNA Extraction Kit)
para tubo térmico antes de calentar·Calentamiento: 5 minutos a 75°C

Diagramas de amplificación de reactivo de detección deMalaria Pf(Analizador : turbidímetro en tiempo real HumaTurb C+A)PRÉPARACIÓN DES RÉACTIVOS

Muestra negativa
Muestra positiva 1
Muestra positiva 2Control negativo
Control positivo
0,7

0,7

0,6

0,6

0,5

0,5

Turbidez

Turbidez(1) Reactivo de detección de Malaria Pf
Retire de la bolsa de aluminio el número necesario de tubos dereacción y póngalos en el rack suministrado. (número de muestras y
ntroles).
Nota: tras retirar los tubos necesarios, cierre inmediatamente la bolsa
con los tubos que no utilice.
(2) Control negativo Mal (NC Mal)
Agite bien el tubo (centrifugar) para recuperar el contenido del fondodel tubo.
Nota: NC Mal se debe utilizar en cada prueba.
(3) Control positivo Mal (PC Mal)
Agite bien el tubo (centrifugar) para recuperar el contenido del fondodel tubo.
Nota: PC Mal se debe utilizar en cada prueba.

0,4
0,3

0,4
0,3

0,2

0,2

0,1

0,1
0

0
0

5

10

15

20

25

30 35 40

0Tiempo ( min.)PROCEDIMIENTO DE MEDICIÓN

Fig1 : Diagramas de amplificaciónpara controles

Mezcla de reactivo y muestra(1) Encienda la HumaLoop M o el turbidímetro en tiempo real HumaTurb
C+A.
(2) Dispense 30 µL de la solución de ADN extraída en un tubo de reacción
utilizando la pipeta y cierre el tapón.
(3) Dispense 30 µL de NC Mal en un tubo de reacción utilizando la pipeta
o cuentagotas y cierre el tapón(4) Dispense 30 µL de PC Mal en un tubo de reacción utilizando la pipeta

5

10

15

20

25 30 35 40

Tiempo ( min.)Fig2 : Diagramas de amplificaciónpara muestras

NOTAS SOBRE PROCEDIMIENTO(1) La reacción LAMP es muy sensible y la contaminación con pequeñas
cantidades de producto amplificado puede dar falsos resultados
positivos.
(2) Separe la preparación de la muestra de las áreas de amplificación.
(3) Limpie las superficies de trabajo con hipoclorito de sodio al 0,5 %10

mínimo antes y después de realizar la prueba.
(4) Cambie los guantes después de transferir la sangre o si toca con ellos
la solución de ADN.
(5) Al manejar este producto, evite la contaminación parasitológica y de
nucleasas. Hasta una pequeña cantidad de contaminación del tubo
de reacción a partir del sudor o la saliva al tubo de reacción puede
descomponer el ADN y dar resultados falsos.
(6) Lea el SOP6) cuando vaya a realizar una extracción de ADN.
(7) Conviene utilizar la solución de ADN inmediatamente después de su
preparación.
(8) (Para HumaLoop M u otra incubadora con luz UV)
Si aparecen burbujas, agite los tubos para eliminarlas.
(Para el turbidímetro en tiempo real HumaTurb C+A)
Las burbujas en la solución de reacción pueden interferir con la
medición de turbidez y dar resultados falsos, por lo que se debe evitar
la aparición de burbujas al mezclar el reactivo y la solución de muestra.
Si aparecen burbujas, agite o centrifugue los tubos para eliminarlas.
(9) dMAL Pf debería estar completamente disuelto. Cualquier porción sin
disolver puede alterar los resultados, por ejemplo, disminuyendo lasensibilidad.
(10) El PC Mal contiene un elevado número de copias de ADN. Evite toda
contaminación de otras muestras con el PC Mal. Dispense lasmuestras y el NC Mal y cierre todos los tubos de reacción antes dedispensar el PC Mal.
(11) Agite bien (centrifugar) el tubo de PC Mal antes de abrirlo pararecuperar el contenido del fondo del tubo. Cierre el tubo
inmediatamente después de dispensar el PC Mal.
(12) No abra nunca los tubos de reacción una vez comenzada la reacción
LAMP o tras su finalización. Preste mucha atención al retirar los tubos
de reacción de la incubadora y que no se abran accidentalmente.
(13) Con la HumaLoop M o el turbidímetro en tiempo real HumaTurb C+A,
se realiza automáticamente la inactivación de polimerasa.
(14) Para otras incubadoras, una vez seleccionada la fluorescencia visual,
inactive la polimerasa (5 minutos a 80°C o 2 minutos a 95°C) antes deevaluar; de lo contrario, se podrían alterar los resultados.
(15) No reutilice ningún producto amplificado en los tubos paraelectroforesis u otras aplicaciones.

(3) Este producto es un kit para una detección cualitativa; no estádiseñado para una medición cuantitativa. La intensidad de la luz
fluorescente observada o el aumento de la turbidez medido con elturbidímetro en tiempo real no se corresponden con el número dematrices de ADN.

SUSTANCIAS INTERFERENTES
Nuestros estudios internos han revelado que la medición de turbidimetria
no se vio afectada por la presencia de EDTA (6,0 nmol/prueba), bilirrubina
libre (1,2 µg/prueba), bilirrubina conjugada (1,2 µg/prueba), quilo (turbidez
de formacina: 14.400) y hemoglobina hemolítica (3,4 µg/prueba) y ADN
genómico humano (1,2 µg/prueba). EDTA puede dar falsos resultados
positivos cuando el resultado es leído mediante fluorescencia.
Respecto a los fármacos, nuestros estudios internos han revelado que
dicha medición no se vio afectada por la presencia de Isoniazida (840ng/prueba), Etambutol (204 ng/prueba), Rifampicina (958 ng/prueba),
Pirazinamida (4,2 µg/prueba), Acetaminofén (322 ng/prueba), Loxoprofeno
sódico (637 ng/prueba), Cefotaxima sódica (12 µg/prueba), Levofloxacina(270 ng/prueba), Atovaquona (1,59 µg/prueba), Proguanil (20 ng/prueba),
Cloroquina (40 ng/prueba), Quinina (960 ng/prueba), Clorhidrato dedoxiciclina (360 ng/prueba), Mefloquina (168 ng/prueba), Primaquina (18ng/prueba) y Artemisinin (93 ng/prueba).

CARACTERÍSTICAS DE RESULTADOS(1) Sensibilidad y precisión
Al realizar la prueba de las siguientes muestras:
 Muestra Negativa (concentración: 0 copia/prueba) Muestra Positiva 1 (100 copias/prueba) Muestra Positiva 2 (1.000 copias/prueba);
La muestra negativa debe dar negativo y las muestras positivas 1 y 2
deben dar positivo.
(2) Reproducibilidad del método
Al probar cinco muestras negativas y positivas simultáneamente, lamuestra negativa debe dar negativo y la muestra positiva debe darpositivo.
(3) Límite de detección
7,5 copias/prueba(4) Reactividad cruzada
El sistema de medición da resultados positivos para Pf y negativospara otros patógenas como se describe en la siguiente tabla:

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Para detección visual de fluorescencia(Para HumaLoop M)
Coloque cada tubo de reacción en la unidad de detección defluorescencia, irradie y observe el tubo por un lado.
(Para otra incubadora con luz UV)
Irradie la base de cada tubo de reacción desde un lado utilizando gafas oun equipo de protección UV adecuado.
Para que la ejecución de una prueba sea válida, hay que obtener lossiguientes resultados: Control Positivo: Se emite una luz verde fluorescente.
 Control Negativo: No se emite una luz verde fluorescente.

Genre Plasmodium
Plasmodium falciparum
Plasmodium vivax
Plasmodium ovale
Plasmodium malariae

Positivo
Negativo
Negativo
Negativo

Otros patógenos
Trypanosoma brucei
Trypanosoma cruzi
Leishmania donovani
Schistosoma mansoni
Theileria parva
Mycobacterium tuberculosis
Virus de la gripe A
Virus de inmunodeficiencia humana

Si ningún control es válido, todas las muestras deben ser consideradas
inválidas y habrá que volver a comprobar las muestras.
Una vez que se confirma que la ejecución de la prueba es válida, evalúe
las muestras como se indica a continuación: Muestra Positiva: Se emite una luz verde fluorescente.
 Muestra Negativa: No se emite una luz verde fluorescente.
Para detección de turbidez en tiempo real HumaTurb C+A
Una vez que se confirma que la turbidez aumenta en de control positivo,
pero no en la solución de control negativo, evalúe las muestras deacuerdo con los siguientes criterios (Fig1 y 2).
 Positivo: Se observa cierto aumento de la turbidez.
 Negativo: No se observa aumento de la turbidez.
Notas :
(1) La sensibilidad de detección mínima de MALARIA Pf Detection Kit esde 7,5 copias por prueba respectivamente. En caso de un resultado
de prueba negativo, se deberán repetir las pruebas a los pacientes
con persistencia o empeoramiento de los síntomas y habrá queconsiderar e investigar otras posibles causas de tales síntomas. El
ensayo LAMP es altamente sensible y puede detectar hasta losniveles más bajos de parasitemia que no son la causa directa de lossíntomas manifestados. El estado clínico del paciente debe sersiempre considerado a la hora de realizar un diagnóstico final ydeterminar el tratamiento médico adecuado.
(2) Aunque los cebadores se han diseñado para una región con pocas
variaciones, las infecciones por Pf podrían tener más variaciones en
esta región y reducirse así la sensibilidad de este producto. Por tanto,
una prueba negativa no siempre permite descartar una infección por
Pf.

Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo(5) Información sobre el calibrador
En la prueba de rendimiento para este producto se utilizó ADN
plasmídico con ADN mitocondrial de Pf como calibrador.
(6) Desempeño clínico
La malaria es una enfermedad producida por parásitos del género
Plasmodium y transmitida por la picadura de mosquitos infectados.
Tras madurar en el hígado, se liberan más parásitos en el torrente
sanguíneo que infectan los glóbulos rojos, donde se reproducen parasalir e infectar más células y aparecen entonces los primeros síntomas,
como la fiebre. El ensayo LAMP detecta el ADN de los parásitos ensangre.
El LAMP para malaria fue evaluado en muestras de sangre enviadas
para pruebas de malaria en un laboratorio especializado. Siguiendo el
protocolo estándar para microscopía, todas las muestras fueron
anónimas, el ADN se extrajo de las muestras de sangre utilizando elmétodo PURE6) y se probaron con el kit LAMP para malaria utilizando
cebadores específicos para P. falciparum simultáneamente, con dos
métodos diferentes de lectura. Por último, se realizó PCR anidadacomo estándar de oro. 705 pruebas LAMP de malaria, 56 de lascuales asociadas a pacientes con microscopía positiva comparadas
con la PCR anidada como estándar de referencia. La sensibilidad y la11especificidad de LAMP Malaria Pf fueron de 98,4 % y 98,1 %
respectivamente.

Malaria LAMP
vsla PCR anidada
Malaria LAMPvsmicroscopio

Sensibilidad

Especifidad(95% CI)(95% CI)

98,4%

98,1%

91,4-100.0

96,8-99,0

100,0%

96,6%

93,2-100,0

94,9-97,9

VPP*

VPN*

83,8%

99,8%

70,3%

100,0%DIAGRAMA
Principios de funcionamiento para la detección de turbidez entiempo real
Preparación de la solución de muestra
Prepare soluciones de ADN de muestra extrayendo
ADN de las muestras de sangre tomadas.

Preparación del reactivo

Tome el número necesario de tubos dereacción de dMAL Pf.

*valores predictivos positivos y negativos

INFORMACIÓN DE PEDIDOS
Código deNombre deproducto

producto(para muestras, controles
negativos y positivos)
Contenido
Mezcla del reactivo y la solución de la muestra

Loopamp™
978000

MALARIA Pf

Vierta 30 µL de muestra o solución de control en cadatubo de reacción.

96 pruebas

Detection Kit

Utilice NC Mal como control negativo.
Utilice PC Mal como control positivo.
(El control positivo se debe preparar al final)

1 Unidad Principal
962000

HumaLoop M

1 Unidad de Control Visual deFluorescencia™

970000Loopamp PUREDNA Extraction Kit

Invierta los tubos de reacción para tomar la solución deltapón. Deje los tubos boca abajo durante 2 minutos.

90 Pruebas
1 Unidad de Control

963200

HumaTurb C+A

980000

Humax ITA

Centrífugas de Sobremesa

964000

HumaHeat

Bloque Térmico

1 Unidad de Amplificación

Invierta los tubos de reacción 5 veces para mezclar elcontenido y centrifúguelos.
(Evite la formación de burbujas)
Amplificación
Coloque los tubos de reacción en el bloque de reacción delturbidímetro.

BIBLIOGRAFÍA
1) Notomi T., et al.: Nucleic Acids Research 28, No. 12, e63 (2000)
2) Nagamine K., et al.: Clin. Chem. 47, No. 9, 1742–1743 (2001)
3) Mori Y., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, No. 1, 150–154(2001)
4) Tomita N., et al.: Nat. Protoc. 3, No. 5, 877–882 (2008)
5) La directriz para la bioseguridad y el riesgo biologico (por la Sociedad
Japonesa de Bacteriologia): Japanese Journal of Bacteriology 54, No.
3, 667–715 (1999)6) https://www.finddx.org/wp-content/uploads/2016/04/SOP-LAMPMalaria-Aug2012.pdf

Como se indica en las instrucciones de uso delturbidímetro, lance la reacción y mida y evalúe la turbidez(40 minutos a 65,0°C).
Confirme la finalización de la inactivación de polimerasa (5 minutos a
80°C o 2 minutos a 95°C). Tome todos los tubos de reacción delturbidímetro y deséchelos sin abrirlos. Tenga mucho cuidado de no dañar
los tubos.

VD
Distribuidor exclusivo

HUMAN Gesellschaft für Biochemica
und Diagnostica mbH
Max-Planck-Ring 21, 65205 Wiesbaden, Germany

Fecha de revisión: 1 de octubres de 201812

Gebrauchsanweisung
artifiziellen Gens der mitochondrialen Pf DNA (GenBank No.
M76611) hergestellt wurde.

978000Deutsch

Die Abkürzungen der Namen folgender Reagenzien, die Lot Nummer
und der Hersteller (EKN) sind auf die Boxen gedruckt. Die
Reagenzbezeichnung ist Teil des Codes auf dem Deckel.

LoopampTM MALARIA Pf

Reagenzien

Detection Kit

Positivkontrolle Mal

VERWENDUNGSZWECK
Das LoopampTM MALARIA Pf Detection Kit ist ein qualitativer, In-vitro
diagnostischer Test für den Nachweis von Plasmodium falciparum DNA
in menschlichem Blut.

Negativkontrolle Mal

Beschriftung
PC MalLot No., EKN
NC MalLot No., EKN

Deckelcode
PC
Mal
NC
Mal

WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN(1) Nur für den Gebrauch in der In-vitro Diagnostik.
(2) Dieses Produkt wurde nur für den Nachweis der DNA von Pf
Parasiten in menschlichem Blut hergestellt. Nicht für andere
Zwecke verwenden.
(3) Immer die Gebrauchsanweisung beachten, wenn das Produkt
verwendet wird.
(4) Reagenzien nicht einfrieren.
(5) Keine abgelaufenen Reagenzien verwenden.
(6) Unterschiedliche Lots nicht mischen.
(7) Reagenzien nicht wieder auffüllen.
(8) Die Testleistung des Loopamp™ MALARIA Pf Detection Kit ist vonden Fähigkeiten des Anwenders und dem Beachten derGebrauchsanweisung abhängig. Der Test sollte nur vongeschultem Personal durchgeführt werden.
(9) Licht- und Hitzeexposition könnten dMAL Pf unbrauchbar machen.
Nur die benötigte Anzahl der Reaktionsröhrchen entnehmen(Anzahl der Proben und Kontrollen) und den Aluminiumbeutel
unmittelbar danach wieder verschließen.
(10) Das Trockenmittel nicht aus dem Aluminiumbeutel entfernen.
Hohe Feuchtigkeit kann zum Verderben des getrockneten LAMP
Reagenz in den Reaktionsröhrchen führen.
(11) Gebrauchsanweisung lesen und vor Beginn des Testes
sicherstellen, dass die benötigten Geräte (Real-Time Turbidimeteroder Inkubator etc.) vorhanden sind.
(12) Blutproben stellen ein potenzielles Risiko für Infektionen dar undmüssen entsprechend behandelt werden, um Biogefährdung zu
vermeiden.5)(13) PC Mal und NC Mal enthalten geringe Mengen Natriumazid als
Konservierungsmittel. Natriumazid wird als toxisch eingestuft.
Kontakt mit Augen, Mund oder Haut vermeiden.
(14) Bei Kontakt von Augen, Mund und Haut mit Reagenzien sofort mit
viel Wasser abspülen. Wenn notwendig, medizinische Hilfe in
Anspruch nehmen.
(15) PC Mal nicht zur Patientenprobe geben oder damit verdünnen. PC
Mal nur so verwenden, wie es in der Gebrauchsanweisung steht,
um DNA Kontaminationen zu vermeiden.
(16) PC Mal und positive Blutproben getrennt von anderen
Kitkomponenten aufbewahren.
(17) Der Deckel jedes Reaktionsröhrchens enthält dMAL Pf in
getrockneter Form. Die Innenseite des Deckels nicht berühren.
(18) Vor Verwendung der Reaktionsröhrchen prüfen, ob es Brüche
oder Kratzer aufweist. Beschädigte Röhrchen können zu falschen
Ergebnissen und DNA Kontaminationen im Inkubator oder desArbeitsbereiches führen.
(19) Die Reaktionsröhrchen nicht dem UV Licht vor Ende der LAMP
Reaktion aussetzen. Dies kann zu Beschädigungen desRöhrchens oder falschen Ergebnissen führen.
(20) Wird ein UV Licht für den visuellen Nachweis verwendet, nicht
direkt in das UV Licht sehen. Eine kurze Exposition mit UV Licht
ist für Augen schädlich und kann schon nach kurzer Zeit zu
Augenirritationen und Symptomen ähnlich einer Konjunktivitis
führen. Glasschirme, Brillen oder Augenmasken verwenden, wenndirekt in die UV Licht gesehen wird.
(21)Vor Verwendung die Gebrauchsanweisung für den Inkubator lesen.
Wenn HumaLoop M oder HumaTurb C+A verwendet werden, die
Reaktionsröhrchen vorsichtig aus dem Inkubator nehmen, um
Verbrennungen zu vermeiden.
(22) PC Mal nicht als Positivkontrolle für das LoopampTM MALARIATEST PRINZIP
Dieses Produkt basiert auf einer Loop-vermittelten Amplifikation(LAMP) von Nukleinsäuren, die von Eiken Chemical Co., Ltd.
entwickelt wurde.
Die LAMP Methode hat folgende Eigenschaften: (1) Die
Amplifikationsreaktion läuft unter isothermalen Bedingungen ab, bei
der nur ein Enzym benötigt wird;1),2) (2) Durch die Verwendung von vierPrimerpaaren, die sechs verschiedene Regionen auf der Ziel-DNA
erkennen, wird eine sehr hohe Spezifität erreicht; (3) Die Amplifikation
findet in einer kurzen Zeit mit einer sehr hohen Effizienz statt und dervisuelle oder automatisierte Nachweis wird durch die Herstellung
großer Mengen des amplifizierten Produktes ermöglicht. 3),4)
Die zielgerichteten DNA-Sequenzen der P. falciparum (Pf) Primer
erkennen Abschnitte auf der mitochondrialen DNA. Die ausgesuchten
DNA Sequenzen wurden mit Übereinstimmungsanalysen als spezifischfür Pf identifiziert.
Die DNA Lösung, die aus Blut extrahiert wurde, wird in ein
Reaktionsröhrchen gegeben. Die Strang-Displacement DNA
Polymerase, Desxoynukleotidtriphosphate (dATP, dCTP, dGTP unddTTP), Calcein und Malaria Pf oder P. falciparum (Pf) spezifische
Primer liegen getrocknet im Deckel des Reaktionsröhrchens vor. Diese
getrockneten LAMP Reagenzien (Malaria Pf Detektionsreagenz, dMALPf) werden gelöst, wenn die DNA Lösung dazugegeben wird. Die
Reaktion wird bei 65,0°C inkubiert und die DNA durch Katalyse derStrang-Displacement DNA Polymerase während der LAMP Reaktion
amplifiziert.
Der Nachweis der amplifizierten Produkte basiert auf
Trübungsmessung des Nebenproduktes Magnesiumpyrophosphat(weißes Präzipitat).3) Anstelle der Trübungsmessung kann der Testauch visuell unter UV Licht ausgewertet werden. Vor der Reaktion liegt
Calcein im Reagenz, bedingt durch die Bindung von Manganionen, im
gehemmten Zustand vor. Nach Start der LAMP Reaktion werden
Pyrophosphationen gebildet, welche die Manganionen binden und
das Calcein kann fluoreszieren. 4)

KITBESTANDTEILE
Die Reagenzien sind bis zum angegebenen Datum auf dem Etikett
stabil, wenn die Testbox ungeöffnet bei einer Temperatur von 2-30°C
gelagert wird.
Malaria Pf Detektionsreagenz (dMAL Pf)············· 2 x 48 Röhrchen
Die folgenden Bestandteile sind in jedem Röhrchen ingetrockneter Form vorhanden:
Bst DNA Polymerase*1
Desoxynuleotidtriphosphate
Magnesiumsulfat
Calcein
Manganchlorid
Primer*2
Positivkontrolle Mal (PC Mal)*3························ 1 x 1,0 mL
Negativkontrolle Mal (NC Mal) ························ 3 x 0,5 mL
30 µL Pipette ········································· 5 x 12 Pipetten*1: Bst DNA Polymerase aus Bacillus stearothermophilus ist eine
Strang-Displacement DNA Polymerase, der die 5’→3’
Exonucleaseaktivität fehlt.
*2: Primer wurden zum Nachweis der mitochondrialen DNA von
Plasmodium Parasiten hergestellt und aus synthetisierten
Oligonukleotiden mittels HPLC aufgereinigt.
*3: PC Mal enthält ein Produkt, das durch in vitro Amplifikation eines13Pan/Pf Detection Kit, LoopampTM MALARIA Pv Detection Kit oder
LoopampTM MALARIA Pan Detection Kit verwenden.
Positivkontrolle von anderen Kits nicht als Positivkontrolle fürdieses Kit verwenden.

auf dem Boden des Röhrchens sammelt.

Beachte: Eine Negativkontrolle sollte bei jeder LAMP
Reaktion gemessen werden.
(3) Positivkontrolle Mal (PC Mal)
Vor Verwendung Röhrchen anzentrifugieren, damit sich der Inhalt
auf dem Boden des Röhrchens sammelt.

ABFALLENTSORGUNG(1) Die Röhrchen nicht nach der DNA Amplifikation öffnen. Das
Röhrchen geschlossen lassen und als medizinischen Abfall in zweiübereinander gezogene, verschlossene Plastikbeutel entsorgen.
(2) Reaktionsröhrchen niemals autoklavieren und wieder verwenden.
Die Röhrchen würden auslaufen und Kontaminationen
verursachen.
(3) Die Reaktionsröhrchen und die Reagenzienröhrchen bestehen
aus PP, der Reagenzienständer aus PET, der Beutel aus
Aluminium und die Kitbox aus Papier.
(4) Verwendete Reagenzien, Labormaterial und Boxen nach den
lokalen Bestimmungen entsorgen.

Beachte: PC Mal sollte bei jeder LAMP Reaktion gemessen
werden.

MESSMETHODE
Mischen von Reagenzien und Probe(1) Den HumaLoop M oder den Real-Time Turbidimeter HumaTurb
C+A einschalten.
(2) 30 μL der extrahierten DNA Lösung in das Reaktionsröhrchen
geben und das Röhrchen verschließen.
(3) 30 μL NC Mal mit der Pipette oder der delieferten Pipette in ein
Reaktionsröhrchen geben und das Röhrchen verschließen.
(4) 30 μL PC Mal mit der Pipette oder der delieferten Pipette in ein
Reaktionsröhrchen geben und das Röhrchen verschließen.
(5) Alle Röhrchen anzentrifugieren, damit die Lösungen auf den
Boden des Röhrchens gesammelt werden.

PROBENENTNAHME(1) Blutproben sollten unmittelbar nach Probengewinnung verwendet
werden.
(2) Blut in einem separaten, von der LAMP Reaktion abgetrennten
Raum abnehmen. Aerosole, die während der Probengewinnung
entstehen und Pf DNA enthalten, können Kontaminationen
verursachen.
(3) KEIN EDTA und Citrat als Antikoagulanzien bei der Blutentnahmeverwenden,wenn
dasErgebnismittelsvisuellen
Fluoreszenznachweis generiert wird. Die Verwendung vonHeparin als Antikoagulanz wird empfohlen.

Beachte: Bei Verwendung des Loopamp™ PURE DNA
Extraction Kit sicherstellen, dass sich der Flüssigkeitsstandnäher an der oberen Linie des Reaktionsröhrchens befindet.
(6) Die getrockneten Reagenzien im Deckel durch Invertieren desReaktionsröhrchens lösen und die DNA Lösung im Deckel
sammeln. Die Röhrchen umgekehrt für 2 Minuten stehenlassen,
damit die getrockneten Reagenzien gelöst werden.
(7) Die Reaktionsröhrchen fünfmal invertieren, um die Bestandteile zu
mischen. Sicherstellen, dass die getrockneten Reagenzien im
Deckel vollständig gemischt werden (die Lösung sollte eine orange
Farbe haben).
(8) Alle Röhrchen anzentrifugieren, damit die Lösungen auf den
Boden der Röhrchen gelangen.
Amplifikation
Für den visuellen Fluoreszenznachweis(Mit HumaLoop M)(1) Überprüfen, dass die Temperatur des HumaLoop M 65,0°C
erreicht hat.
(2) Die Reaktionsröhrchen in den HumaLoop M stellen und den
grünen Schalter betätigen, um die LAMP Reaktion zu starten (40Min. bei 65,0°C). Die Gebrauchsanweisung für den HumaLoop M
befolgen.
(3) Überprüfen, ob die Inaktivierung der Polymerase stattgefunden hat(erfolgt automatisch beim HumaLoop M). Alle Reaktionsröhrchen
aus dem HumaLoop M nehmen.
(Für andere Inkubatoren und UV Licht)(1) Die
TemperaturdesInkubators(mit
Heizdeckel;
Temperaturgenauigkeit: ± 0,5°C) auf 65,0°C einstellen. (Miteinem beheizbaren Deckel sollte die Temperatur ca. 10°C über der
Reaktionstemperatur eingestellt werden). Warten bis die
eingestellte Temperatur erreicht ist und auf dem Display angezeigt
wird.
(2) Alle Reaktionsröhrchen in den Inkubator stellen und die
Amplifikationsreaktion starten (40 Min. bei 65,0°C).
(3) Nach Ablauf der 40 Min. Inkubationszeit, die Polymerase durch
Erhitzen für 5 Min. bei 80°C oder 2 Min. bei 95°C inaktivieren.
Für den Nachweis mit Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A(siehe Methodenübersicht)(1) Den Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A für den Mal Pf
Nachweis konfigurieren.
(2) Überprüfen, dass die Temperatur 65,0°C erreicht ist. (Turbidimeter
20 Min. vor Gebrauch vorwärmen).
(3) Die Reaktionsröhrchen in den HumaTurb C+A stellen und
Messung starten.
(4) Während der Inkubation überprüfen, ob die Trübung derPositivkontrolle zunimmt. Diese wird auf dem Display angezeigt.
Wenn die Trübung in PC Mal zunimmt, aber nicht die von NC Mal,
verläuft die Amplifikationsreaktion erwartungsgemäß (Fig1). Ist
dies nicht der Fall, läuft die Amplifikationsreaktion nicht richtig. Den
Test ab Vorbereitung der Reagenzien mit den betroffenen Proben
wiederholen.
(5) Überprüfen der Inaktivierung der Polymerase (erfolgt automatischdurch den Turbidimeter). Alle Reaktionsröhrchen aus dem
HumaTurb C+A nehmen, ohne sie zu öffnen.

BENÖTIGTES MATERIAL, NICHT ENTHALTEN· LoopampTM PURE DNA Extraction Kit (optional)· HumaHeat (optional)

Für den visuellen Fluoreszenznachweis(Mit HumaLoop M)· HumaLoop M(Für andere Inkubatoren mit UV Licht)· Inkubator ( Temperaturgenauigkeit:  0,5C; mit Heizdeckel)· Heizblock· UV Licht oder blaues LED Licht ( We l l e n l ä n g e : 240-260 nm und
350-370 nm )· Brille und Augenschutzmaske
Für den Nachweis mit dem Real-Time Turbidimeter· HumaTurb C+A
Zum Mischen von Reagenz und Probe· Mikropipetten (10-100 µL und 20-200 µL) und Filterspitzen· Zentrifuge für PCR Röhrchen (optional)· Zentrifuge für acht verbundene Röhrchen (optional)· HuMax ITA (optional)

HERSTELLUNG DER DNA LÖSUNG
Um DNA aus Blut zu extrahieren, werden die Kochen & Zentrifugieren
sowie
die
PURE
Methodeempfohlen.
Die
Standardarbeitsanweisungen für beide Methoden sind auf derfolgenden Internetseite zu finden:
https://www.finddx.org/wp-content/uploads/2016/04/SOP-LAMPMalaria-Aug2012.pdf
Für die PURE Methode folgende kritische Punkte beachten:· Proben: Blutproben, die durch Stechen in die Fingerbeere(Fingerprick), erhalten wurden, in Heparinröhrchen
aufgenommen wurden oder Vollblut, das auf
Filterpapier getropft wurde·Probenvolumen: 30µL (frisches Blut oder Blut mit Heparin) oder
6-mm Blutstropfenstanze (getrockneter Blutstropfen)·Zusätze: 30µL 334mM NaCl Lösung (nicht im LoopampTM PUREDNA Extraction Kit enthalten) zum Lyseröhrchen vor
Erhitzen zugeben·Erhitzen: Für 5 Min. bei 75°C

VORBEREITUNG DER REAGENZIEN(1) Malaria Pf Detektionsreagenz
Die benötigte Anzahl Röhrchen aus dem Aluminiumbeutel
entnehmen und in den mitgelieferten Röhrchenständer stellen(Anzahl der Proben und Kontrollen).

Beachte: Nach Entnahme der benötigten Röhrchen, den
Aluminiumbeutel mit den nicht benötigten Röhrchen sofort
verschließen.
(2) Negativkontrolle Mal (NC Mal)
Vor Verwendung Röhrchen anzentrifugieren, damit sich der Inhalt

14

Amplifikationplots Malaria Pf Detektionsreagenz(Analysator : Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A)
Negative Probe
Positive Probe 1
Positive Probe 2

0,7

0,7

0,6

0,6

0,5

0,5

Trübung

Trübung

Negativkontrolle
Positivkontrolle

0,4
0,3

0,4
0,3

0,2

0,2

0,1

0,1
0

0
0

5

10

15

20

25

30 35 40

Zeit ( Min.)
Fig1:Amplifikationsplots Kontrollen

0

5

10

15

20

25

30 35 40

Zeit ( Min.)
Fig2:Amplifikationsplots Proben

HINWEISE(1) Die LAMP Reaktion ist sehr sensitiv und Kontaminationen mit
kleinen Mengen des amplifizierten Produktes können zu falschpositiven Ergebnissen führen.
(2) Probengewinnung räumlich von der LAMP Reaktion trennen.
(3) Alle Arbeitsbereiche vor und nach Durchführung des Testes mit >
0,5% Natriumhypochloridlösung behandeln.
(4) Handschuhe nach Transfer des Blutes oder nach Kontakt mit der
DNA Lösung wechseln.
(5) BeiVerwendung
dieses
Produktes
parasitologische
Kontaminationen und Kontaminationen mit Nukleasen vermeiden.
Der Transfer von kleinen Mengen DNAse aus Schweiß oder
Speichel in die Reaktionsröhrchen kann falsche Ergebnisseverursachen.
(6) Vor Verwendung die SOP6) lesen.
(7) Die DNA Lösung sollte idealerweise unmittelbar nach derPräparation verwendet werden.
(8) (Für HumaLoop M oder andere Inkubatoren mit UV Licht)
Wenn Blasen erkennbar sind, Röhrchen mit dem Finger
anschnippen.
(Für Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A)
Blasen in der Reaktionslösung können mit der Trübung
interferieren und zu falschen Ergebnissen führen. Deshalb
Blasenbildung beim Mischen der DNA Lösung und derReagenzien vermeiden. Treten dennoch Blasen auf, Röhrchen mit
dem Finger anschnippen.
(9) dMAL Pf sollte vollständig gelöst sein. Ungelöstes Material
beeinflusst die Testleistung und kann eine geringere Sensitivität
zur Folge haben.
(10) PC Mal enthält eine große Menge Kontroll-DNA. Jegliche
Kontamination der PC Mal mit anderen Proben vermeiden. Proben
und NC Mal in die Reaktionsröhrchen geben und alle Röhrchen
gut verschließen, bevor PC Mal verwendet wird.
(11) Vor dem Öffnen, PC Mal anzentrifugieren, damit sich die
Flüssigkeit auf den Boden des Röhrchens sammelt. Das Röhrchen
sofort nach Aufteilung von PC Mal verschließen.
(12) Reaktionsröhrchen niemals nach Start oder Beendigung der LAMP
Reaktion öffnen. Besonders vorsichtig sein, wenn die Röhrchen
aus dem Inkubator genommen werden, um unbeabsichtigtesÖffnen zu vermeiden.
(13) Werden HumaLoop M oder der Real-Time Turbidimeter HumaTurb
C+A verwendet, wird die Polymerase automatisch inaktiviert.
(14) Für den visuellen Fluoreszenznachweis mit Inkubatoren undanderen UV Lampen, Polymerase für 5 Min. bei 80°C oder 2 Min.
bei 95°C inaktivieren. Anderenfalls können falsche Ergebnisse
entstehen.
(15) Das amplifizierte Produkt nicht für Gelelektrophorese und andere
Applikationen verwenden.

Für eine gültige LAMP Reaktion sollten die folgenden Ergebnisse
erhalten werden: Positivkontrolle: Grünes Fluoreszenzlicht wird ausgestrahlt.
 Negativkontrolle: Kein Fluoreszenzlicht wird ausgestrahlt.
Wenn eine Kontrolle ungültig ist, sollten alle Proben als ungültig
beurteilt und erneut getestet werden. Nach Bestätigung einer gültigen
LAMP-Reaktion sollten die Proben
wie folgt beurteilt werden: Positive Probe: Grünes Fluoreszenzlicht wird ausgestrahlt.
 Negative Probe: Kein Fluoreszenzlicht wird ausgestrahlt.
Für den Nachweis mit Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+ANach Bestätigung der Trübungszunahme in der Positivkontrolle (abernicht in der Negativkontrolle), sollten die Proben nach folgenden
Kriterien beurteilt werden (Fig 1 und 2):
 Positiv: Zunahme der Trübung.
 Negativ: Keine Zunahme der Trübung.
Beachte:(1) Die minimale Detektionssensitivität des MALARIA Pf Kits ist 7,5Kopien/Test. Bei einem negativen Testergebnis bei Patienten mit
persistierenden Symptomen, die für eine Infektion mit Malaria
sprechen oder bei Verschlechterung der Symptomatik, sollte
erneut getestet werden. Jedoch müssen auch andere Ursachen
für die verschlechterte Symptomatik in Betracht gezogen werden.
Der LAMP Assay ist hoch sensitiv und kann niedrige
Konzentrationen bei Parasitämien nachweisen, die nicht indirektem Zusammenhang mit den Symptomen des Patienten
stehen. Für die letztendliche Diagnose und bei der Festlegung derTherapie sollten immer alle klinischen Umstände einbezogen
werden.
(2) Obwohl die Primer für eine Region mit sehr wenigen Variationen
hergestellt wurden, ist es denkbar, dass Infektionen mit Pf
stattfinden können, die Variationen in der Zielregion aufweisen, diediese Produkt nicht detektiert. Deshalb schließt ein negatives
Testergebnis eine Infektion mit Pf nicht aus.
(3) Dieses Produkt wurde für den qualitativen Nachweis entwickelt undnicht für quantitative Messungen. Die Intensität der Fluoreszenz
oder die Zunahme der Trübung über die Zeit, die mit dem Real-Time
Turbidimeter gemessen wird, korreliert nicht mit der Konzentration
der Template DNA.

INTERFERIERENDE SUBSTANZENInterne Untersuchungen haben gezeigt, dass die Messungen durch
folgende Substanzen nicht beeinflusst werden: EDTA (6,0 nmol/Test),freies Bilirubin (1,2 μg/Test), konjugiertes Bilirubin (1,2 μg/Test),
Darmlymphe (Formazin Trübung:14.400), hämolytisches Hämoglobin(3,4 μg/Test) und humane genomische DNA (1,2 μg/Test). EDTA kannfalsch-positive Ergebnisse verursachen, wenn die Ergebnisse durch
visuellen Fluoreszenznachweis erhalten werden.
Interne Untersuchungen zum Einfluss von Medikamenten haben
gezeigt, dass die Messungen durch folgende Substanzen nicht
beeinflusst werden: Isoniazid (840 ng/Test), Ethambutol (204 ng/Test),
Rifampicin (958 ng/Test), Pyrazinamid (4,2 μg/Test), AcetaMin.ophen(322 ng/Test), Loxoprofen natrium (637 ng/Test), Cefotaxim natrium (12μg/Test), Levofloxacin (270 ng/Test), Atovaquon (1,59 μg/Test),
Proguanil (20 ng/Test), Chloroquine (40 ng/Test), Quinine (960 ng/Test),
Doxycyclinehydrochlorid (360 ng/Test), Mefloquin (168 ng/Test),
Primaquin (18 ng/Test) und Artemisinin (93 ng/Test).

LEISTUNGSDATEN(1) Sensitivität und Genauigkeit
Folgende Proben wurden getestet: Negative Probe ( K onzentration : 0 Kopien/Test ) Positive Probe 1 (100 Kopien/Test ) Positive Probe 2 (1.000 Kopien/Test ) ;Die negative Probe wurde negativ und die positiven Proben 1 und
2
positiv getestet.
(2) Intra-Assay Reproduzierbarkeit
5 negative und 5 positive Proben wurden gleichzeitig getestet. Die
negativen Proben wurden negativ, die positiven Proben wurden
positiv getestet.
(3) Nachweisgrenze
7,5 Kopien/Test(4) Kreuzreaktivität
Das Messsystem testete positiv für Pf und negativ für alle anderen
Pathogene, wie in der folgenden Tabelle angegeben:

INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
Für den visuellen Fluoreszenznachweis(Mit HumaLoop M)
Das
Reaktionsröhrcheninden
Röhrchenständer
derFluoreszenzdetektionseinheit stellen, UV Lampe einschalten und das
Röhrchen von der Seite betrachten.
(Für andere Inkubatoren mit UV Licht)
UV Licht einschalten und den Boden jedes Röhrchens von der Seite
mit Schutzbrille oder anderen schützendem Equipment betrachten.

15Gattung Plasmodium
Plasmodium falciparum
Plasmodium vivax
Plasmodium ovale
Plasmodium malariae

Bacteriology 54, No. 3, 667–715 (1999)6) https://www.finddx.org/wp-content/uploads/2016/04/SOP-LAMPMalaria-Aug2012.pdf

Positiv
Negativ
Negativ
Negativ

Methodenübersicht

Andere Pathogene

Durchführung mit Real-Time Turbidmeter

Trypanosoma brucei
Trypanosoma cruzi
Leishmania donovani
Schistosoma mansoni
Theileria parva
Mycobacterium tuberculosis
Influenza A virus
Human immunodeficiency virus

Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ

Herstellung der Probenlösung
Herstellen der DNA Lösungen durch Extraktion aus
Blutproben.

Herstellung Reagenzien(5) Informationen zum Kalibrator
Für die Erhebung der Leistungsdaten des Testes wurde eine
Plasmid-DNA verwendet, die mitochondriale DNA von Pf als
Kalibrator enthält.
(6) Klinische Leistung
Malaria wird durch verschiedene Parasiten verursacht, die zum
Genus Plasmodium gehören und über Bisse von infizierten
Moskitos übertragen werden. Nach einem Entwicklungszyklus inder Leber werden die Parasiten ins Blut abgegeben. Dort lysieren
die Plasmodien Zellen während ihrer Reproduktion undverursachen Symptome inkl Fieber.
Der Malaria LAMP Assay weist Plasmodium im Blut nach und wurde
mit Blutproben evaluiert, die zur Malariatestung in ein Speziallaborgebracht wurden. Nach der Standardmikroskopie wurden die
Proben anonymisiert. DNA wurde mit dem Loopamp™ PURE DNA
Extraction Kit extrahiert und anschließend mit dem LAMP Malaria
Pf mit zwei unterschiedlichen Auslesemethoden getestet. Als
Goldstandard wurde nested PCR verwendet. 705 Malaria LAMP
Tests, von denen 56 in der Mikroskopie positiv waren, wurden mit
den Ergebnissen der nested PCR als Referenzstandard verglichen.
Die Sensitivität und Spezifität des LAMP Malaria Pf wurde mit
98,4% und 98,1% angegeben.

Die benötigte Anzahl Reaktionsröhrchen
dMAL Pf entnehmen.
( Für Proben, Negativ- und
Positivkontrollen)

Mischen der Reagenzien mit der Probenlösung
3 0 µL
Probeoder
Kontrolllösung
Reaktionsröhrchen geben.

in

jedes

NC Mal als Negativkontrolle.
PC Mal als Positivkontrolle verwenden.
(Die Positivkontrolle sollte zuletzt angesetzt werden.
Reaktionsröhrchen umdrehen, damit sich die
Flüssigkeit im Deckel sammelt. 2 Min. umgekehrt
stehenlassen.

Um Reagenzien zu mischen, Röhrchen 5 mal
invertieren und anzentrifugieren.
(Blasen vermeiden)
Amplifikation

Malaria LAMP
vsnested PCR
Malaria LAMP
vsMicroskopie

Sensitivität

Spezifität(95% CI)(95% CI)

98,4%

98,1%

91,4-100.0

96,8-99,0

100,0%

96,6%

93,2-100,0

94,9-97,9

PPW*

NPW*

Röhrchen in den Reaktionsblock des Turbidimetersstellen.

83,8%

99,8%

Wie in der Gebrauchsanweisung angegeben, Reaktion
starten und Trübung messen (40 Min. bei 65,0C).

70,3%100,0%

Überprüfen, ob die Polymerase vollständig inaktiviert wurde (5 Min.
bei 80°C oder 2 Min. bei 95°C). Alle Reaktionsröhrchen aus dem RealTime Turbidimeter nehmen, ohne sie zu öffnen. Röhrchen nichtbeschädigen.

*positive und negative prädiktive Werte

BESTELLINFORMATIONEN
Bestellnr.

Produktname

Inhalt978000Loopamp™
MALARIA Pf
Detection Kit

96 Tests

962000

HumaLoop M

1 Inkubationseinheit
1 Fluoreszenzdetektionseinheit

970000Loopamp™ PUREDNA Extraction Kit

90 Tests

963200

HumaTurb C+A

1 Kontrolleinheit
1 Amplifikationseinheit

980000

HuMax ITA

Tischzentrifuge

964000

HumaHeat

Heizblock

VD
Exklusiver Distributor

HUMAN Gesellschaft für Biochemica
und Diagnostica mbH

REFERENZEN

Max-Planck-Ring 21, 65205 Wiesbaden, Germany1) Notomi T., et al.: Nucleic Acids Research 28, No. 12, e63 (2000)
2) NagaMin.e K., et al.: Clin. Chem. 47, No. 9, 1742–1743 (2001)
3) Mori Y., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, No. 1, 150–
154 (2001)
4) Tomita N., et al.: Nat. Protoc. 3, No. 5, 877–882 (2008)
5) Die Leitlinie für die Bio-Sicherheit und Bio-Hazard (von derJapanischen Gesellschaft für Bakteriologie): Japanese Journal of

Revisisonsdatum: 1. Oktober, 201816

380273-A