エンド開裂反応による異性化を利用したヘパリン合成研究
Synthesis of Heparin by Anomerization Reaction via Endocylic Cleavage Reaction（日本糖質学会推薦）

代表研究者 理化学研究所

眞鍋 史乃

RIKEN

Shino MANABE

Heparin, which is a sulfated polysaccharide comprising 1,4-glucosamine-glucuronic acid/iduronic acid, is ananticoagulant drug and affects various biological events. Because of the wide range of its molecular weight as well as
sulfation number and position, heparin is the most diversified polysaccharide. Homogeneous heparin is important fromthe viewpoint of clinical and basic research. In the chemical synthesis of homogeneous heparin, the most challenging
step is the preparation of 1,2-cis aminoglycoside. Pyranosides containing the N-acetyl 2,3-trans carbamate group areanomerized from the β- to the α-form via endocyclic cleavage. By exploiting the anomerization, we synthesized
heparosan, the biosynthetic precursor of heparin. The N-substituent of the carbamate had a significant effect on theanomerization reaction; in particular, the N-acetyl group facilitated rapid and complete α-anomerization. Two 1,2-transaminosugar linkages in the tetrasaccharide were anomerized to the 1,2-cis form. By using the anomerization
methodology, aminoglycosides containing multiple 1,2-cis glycosidic bonds were formed from 1,2-trans glycosides in a
one-step process. Moreover, a operationally simple glycosyl fluoride activation method using Hf(OTf)4, and a novelprotecting group, namely sulfonyl carbamate were developed. Compared with conventional acyl protecting groups, thenovel protecting group was stable under harsh alkaline conditions; however, it could be removed under mild basicconditions.
研究目的
ヘパリンは、グルクロン酸/イズロン酸４位にグルコサミンが 1,2-cis 結合した繰り返し２糖骨格に硫酸化修飾を受けた糖鎖であるが、分子量、硫酸化の数と位置の違いに起因する最も多様性を持つ糖鎖群である（Figure １）。医薬品としては、抗血液凝固薬としてブタ小腸から単離された混合物が使用されているが、品質が均一でないことからの副作用の問与しており、糖鎖生物学研究のためにも純粋な化合題から、より厳密な品質管理を目的として、分画ヘ物が渇望されている。ヘパリンの化学合成は、欧米パリンや超低分子量ヘパリンへの移行がなされつつにおいて糖化学の一大潮流となっているが、合成上ある。特に、近年、過硫酸化コンドロイチン硫酸が最も困難なポイントは、1,2-cis 結合のアミノ糖の構人為的に混入されたことが原因とされる死者が出た築である。1,2-cis アミノグリコシドの形成は、1970

ことから、厳密な品質保証が可能である化学合成品

年代に開発された２位にアジド基を持つ糖供与体がへの移行が望まれており、ハラル対応の面からも合現在においても第一選択肢として用いられている。

成品の市場拡大が期待される。ヘパリンは、抗血液

しかしながら、2-アジド糖は、安全面、操作面にお凝固作用の他にも炎症反応など様々な生命現象に関いて調製に問題点があることに加え、グリコシル化反応においての選択性も高くない。この問題点を解決するために、我々は、２位アミノ基と３位水酸基をカーバメート基で保護した糖供与体がグリコシル化反応において、高い 1,2-cis 選択性を示すこと、さらに弱いルイス酸存在下、2,3-trans カーバメート基を持つピラノシドの 1,2-trans 結合が容易に 1,2-cis結合に異性化することを見出していた。また、この続いて、異性化反応を 1,2-cis アミノグリコシドの異性化反応が、アノマー炭素と環内酸素の間の結合構築に適用してヘパリンを合成することとした。完が切断されて鎖状カチオンを経て再環化する

全化学合成によるヘパリン合成は、硫酸基の位置をendocyclic cleavage 反応を経ることを還元、分子内Friedel-Crafts 反応により中間体鎖状カチオンを捕制御するために、選択的除去可能である多くの保護基の使用が必要となる。一方で、ヘパリン生合成にかかる酵素を駆使した全酵素合成の試みも行われて捉することにより明らかにしている (Scheme 1)。本いるが、合成可能量が限られる。酵素法と化学法を課題においては、より効率がよい異性化反応条件を組み合わせることにより、少ない種類の保護基で、見出し、ヘパリン合成へと展開することを目的としヘパリン骨格を化学合成し、さらにヘパリン生合成た。に関係する酵素による修飾を行うことで、効率的なヘパリン合成、及び、化学合成したひとつの中間体からのヘパリンライブラリーを合成できると期待される。硫酸基修飾が行われていない、N-アセチルグ
ルコサミンがグルクロン酸に 1,4-結合した２糖繰り返し構造であるヘパロサンは、生合成の上でもヘパリン前駆体である。ヘパリン合成研究の第一段階として、ヘパロサンの化学合成を行うことで、異性化反応の合成化学的有用性を示すとともに、硫酸基を酵素により位置選択的に導入する基質を合成することができると考えた。また、合成中間体を用いて保研究経過
まず、2,3-trans カーバメート基を持つピラノシドの異性化反応の最適化を行うために、カーバメート基窒素上置換基の異性化反応への影響を検討した。
系統的に置換基を変化させたところ、置換基がアルキル基の場合には、中程度の異性化反応が観測されるが、カーバメート基やアセチル基などに置換すると、BF3•OEt2 存在下、完全な異性化反応がおこることが明らかになった (Scheme 2)。特に、アセチル基の場合に効率的に異性化し、BF3•OEt2 の当量を 0.1当量まで減らせることや、1 分以内に異性化反応が完結していることが、明らかになった。溶媒効果も顕著であり、エーテル中では異性化がほとんどおこらないが、ジクロロメタン、特にアセトニトリル中では、幅広い基質において異性化反応がおこることを明らかにした。

護基の選択的除去に続く硫酸化を行うことにより、ヘパリン全化学合成へ展開することも可能である。
以上の合成戦略にのっとり、1,2-trans グリコシド結合を形成させるために、グルコサミンの２位アミノ基をフタルイミド基として保護、グルコースの２位水酸基をベンゾイル基として保護、他の水酸基も適宜、適切に保護した。これらの糖供与体を用いて、グリコシル化反応、一時的保護基の除去の繰り返しにより、グルコースとグルコサミンからなる４糖への伸張を行った。グルコースの６位水酸基には、後に必要とされるカルボン酸への変換のために選択的に除去可能であるシリル基を導入した。４糖構築後、フタルイミド基とアシル基を除去、トリホスゲンによりカーバメート基を導入、シリル基を除去後、DMAP 存在下無水酢酸により水酸基とカーバメート窒素上にアセチル基を導入した。４糖のうち、Nアセチル 2,3-trans カーバメート基を持つアミノ糖

の２つの 1,2-trans グリコシドは、BF3•OEt2 存在下、いる p − トルエンスルホニルイソシアネートを反応

1,2-cis 体へと完全に異性化した。LiOH•H2O 存在下、させることにより、中性条件において高収率で行うアリルアルコールを作用させ、カーバメート基を除ことができる。生じたスルホニルカーバメート基は、去し、アリルオキシカルボニル基を除去し、アセト酸化反応、Grignard 試薬などの条件に安定である。

アミド基へと変換した。TEMPO により 2 級水酸基

また、強塩基性条件 (1 M ~5 M NaOH aq. など) にお存在下、１級水酸基のカルボン酸への酸化を選択的いて、安定である一方で、弱塩基性条件に行い、現在、最終脱保護を行っている。

(pyridine:MeOH 7:3) で除去可能である (Scheme 4)。
この特異な性質は、スルホニルカーバメート基上の窒素上水素の酸性度によって説明できる (Scheme 5)。
スルホニルカーバメート基の強い電子求引性のため、スルホニルカーバメート基窒素上水素は、カルボン酸程度の酸性度を持つ。そのため、強い塩基性条件においては、窒素原子上水素の引き抜きが起こり、窒素上にアニオンが生じるために、求核剤の攻撃がおこらない。一方、弱い塩基性条件においては、水素原子の引き抜きがおこらず、スルホニルカーバメート基が非常に強い電子求引性を持つので、求核剤の攻撃が容易におこり、保護基の除去がおこる。スルホニルカーバメート基を用いて糖の水酸基をオルソゴナルに保護•脱保護することが可能であった。

また、本研究遂行に当たり、副次的成果として、フッ化糖の新規活性化法の開拓と、新規保護基の開発を行うことができた。フッ化糖は、チオグリコシ
ド、イミデートと並び、汎用される糖供与体であるが、活性化に複数の試薬が必要であることや試薬調製 の 煩 雑 さ の 問 題 点 が あっ た 。 市 販 さ れ て い る
Hf(OTf)4 は、これまでのフッ化糖活性化法と同等の活性化能力を持ち、実験操作も簡便であることを示した。
加えて、弱い塩基性条件で除去可能で、強い塩基性条件他において安定である保護基を開発した。新規保護基は、一般的に使用される、強い塩基性で除考察去され、弱い塩基性では安定である保護基とは逆のE. Fisher によるグリコシル化反応の開発以来、糖反応性を持つ。水酸基の保護は、基質と市販されて供与体と糖受容体のユニットを用いてのグリコシド結合生成時にアノマー位の立体配置が決定されてきた。一方、今回見出した異性化反応では、既存の複Teodoro Laino, 伊藤幸成: 鎖状カチオンを経由数のグリコシド結合の立体配置を一挙に変換可能でしたピラノシドの異性化反応による 1,2-cis アあることを示した。特に、1,2-cis 型のアミノグリコミノグリコシドオリゴマーの合成、第 39 回反応

シド結合の選択的形成は、これまでの合成法では困と合成の進歩シンポジウム、福岡、2013 年 11

難であることが知られており、本異性化反応は、有月。

機合成化学的にも非常に有用な手法になる。

6.

眞鍋史乃、伊藤幸成：異性化反応による 1,2-cisアミノグリコシドの合成、第 94 回日本化学会年共同研究による Density Functional Theory 計算の結会、名古屋、2014 年 3 月。

果、2,3-trans カーバメート基を導入することにより、ピラノシドと５員環カーバメートからにひずみが生じるためにアノマー炭素—環内酸素間の結合が切断

誌上発表されやすくなることが示唆された。また、異性化反1.

“Hafnium(IV) Tetratriflate as a Glycosyl Fluoride

応における窒素上置換基の効果については、アシル

Activation Reagent” Shino Manabe, Yuksihige Ito, J.

基のカルボニル酸素がアノマー炭素近傍に位置して、Org. Chem. 2013, 78, 4568–4572.

生じたカチオンを安定化することが明らかになった。

2.

“Sulfonylcarbamate as a Versatile and Unique

オキシカルボニル基に対するアセチル基の優位性にHydroxy-Protecting Group: Protecting Group Stable

ついては、オキシカルボニル基よりもカーバメート

under Severe Conditions and Labile under Mild

基窒素—置換基炭素単結合の回転障壁が低く、アセチ

Conditions” Shino Manabe, Masanori Yamaguchi,

ル基のカルボニル基のアノマー付近への存在確率がYukishige Ito, Chem. Comm. 2013, 49, 8332–8334.

上昇するためであると説明できる。

3.

“Hafnium(IV) Tetratriflate in Selective Reductive

Endocyclic cleavage 反応は、糖科学において非常Carbohydrate Benzylidene Acetal Opening Reactionに珍しい反応であり、その存在が議論の対象となっand Direct Silylation Reaction” Shino Manabe,ていたが、中間体の捕捉を契機として、合成化学的Yukishige

有用性を示す段階まで展開することができた。今後、

6838–6840.

様々な生理活性物質や新規糖鎖高分子の創製が可能

4.になると期待される。

Ito,Tetrahedron

Lett.

2013,

54,

“Significant substituent effect on the anomerizationof pyranosides: mechanism of anomerization andsynthesis of a 1,2-cis glucosamine oligomer from the

研究の発表

1,2-trans anomer” Shino Manabe, Hiroko Satoh,

口頭発表

Jürg Hutter, Hans Peter Lüthi, Teodoro Laino,1.

眞鍋史乃、石井一之、越野広雪、伊藤幸成：ピYukishige Ito, Chem. Eur. J. 2014, 20, 124–132.

ラノシドのエンド開裂反応と置換基効果、第 133(Selected in ChemistryViews)

回日本薬学会年会、横浜、2013 年 3 月。
2.

3.

4.

5.

Reaction:Relationshipbetween

眞鍋史乃、伊藤幸成：既存グリコシドの異性化

Conformation and Reactivity, Investigation From反応を利用した新規糖鎖合成、日本プロセス化

Experimental and Computational Chemistry” Hiroko

学会 2013 サマーシンポジウム、筑波、2013 年 7Satoh, Shino Manabe, Chem. Soc. Rev. 2013, 42,月。

4297–4309.

眞鍋史乃、伊藤幸成：鎖状カチオンを経由する

6. 「2,3-trans カーバメート基を持つ糖構造の特異

1,2-cis グルコサミンオリゴマーの合成：第 32 回な反応性:糖化学におけるエンド開裂反応の再日本糖質学会、大阪、2013 年 8 月。

発見」
、有機合成化学協会誌、眞鍋史乃、佐藤寛ShinoManabe,

α-glycosamine

Yukishigeoligomer

Ito:fromSynthesisofβ-glucosamine

oligomer by endocyclic cleavage reaction, 10th5.

“Glycosylation子、2013, 71, 616–624.
7.

“Pyranosides with 2,3-trans Carbamate groups:

Asia-Pacific Chitin & Chitosan Symposium, Yonago,

Exocyclic or Endocyclic Cleavage Reaction?” Shino

Oct. 2013.

Manabe, Yukishige Ito, Chem. Rec. in press.

眞鍋史乃、佐藤寛子、Jurg Hutter, Hans Peter Luthi,

10.1002/tcr.201402004.