Instructions for Use
380263-A

975000EnglishThe abbreviations of names of the following reagents, their Lot No.
and the manufacturer (EKN), are printed on the containers.

LoopampTM MALARIA Pv

Reagents
Positive control Mal Pv

Detection Kit

Negative control Mal

INTENDED USELabelling on the tube
PC PV
Lot No., EKN
NC MalLot No., EKN

Code on the cap
PC
PV
NC
Mal

WARNINGS AND PRECAUTIONSThe LoopampTM MALARIA Pv Detection Kit is a qualitative in vitro
diagnostic test for the detection of Plasmodium vivax DNA extracted
from human blood samples.

(1) For in vitro diagnostic use only.
(2) This product is designed only for the detection of DNA of Pv
parasites in blood samples of human origin. Do not use for otherpurposes.
(3) When using this product, always follow this Instructions for Use.
(4) Do not freeze the reagents.
(5) Do not use any expired reagent.
(6) Do not mix reagents from different Lots.
(7) Do not replenish any reagent.
(8) Performance of the LoopampTM MALARIA Pv Detection Kit isdependent on operator proficiency and adherence to procedural
directions. Testing should be performed by properly trained
personnel strictly according to the instructions provided.
(9) Exposure to heat, humidity and light may cause deterioration of
the dMAL Pv. Remove only the required number of reaction tubes(sum of samples and controls) and reseal the aluminium pouch
immediately.
(10) Do not remove the desiccant from the aluminium pouch. Highhumidity can cause deterioration of the dried LAMP reagent in thereaction tubes.
(11) Read the instruction manual and ensure required equipment(turbidimeter or incubator) is available before commencing theprocedure.
(12) Blood samples pose a potential risk for infection. Use universal
precautions to minimize biohazard.5)(13) PC PV and NC Mal contain a small amount of sodium azide aspreservative. Sodium azide is classified as toxic. Avoid any
contact with eyes, mouth, or skin.
(14) In case of accidental contact of any reagent with eyes, mouth, or
skin, immediately rinse the affected site with running water andseek medical advice.
(15) Do not dilute or add the PC PV to the samples. Use the PC PV
only as described in this package insert in order to avoid DNA
contamination.
(16) Store the PC PV and any positive blood samples separately fromthe other kit reagents.
(17) The cap of each reaction tube contains dMAL Pv in dried form. Do
not touch the inside of the cap.
(18) Before using the reaction tubes, check carefully to see if they
have any cracks or scratches. Damaged tubes might give false
results and lead to DNA contamination of the incubator and workarea.
(19) Do not expose reaction tubes to UV light before the end of the
LAMP reaction. Prolonged exposure to UV light might damage thetubes and lead to false results.
(20) When a UV light is used for visual fluorescence judgment, do notstare directly at UV light. Since UV light is harmful to the eyes,
even watching for a short period may irritate eyes and cause
symptoms similar to conjunctivitis. Use a glass screen or wear
protective goggles/glasses/face shield whenever looking directlyat the UV light.
(21) Refer to the manual of the incubator. When the HumaLoop M or
the Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A is used, be carefulwhen removing the reaction tubes from the incubator to avoid
burns.
(22) Do not use PC PV as positive control of LoopampTM MALARIA
Pan/Pf Detection Kit or LoopampTM MALARIA Pan Detection Kit.
Do not use PC of LoopampTM MALARIA Pan/Pf Detection Kit or
LoopampTM MALARIA Pan Detection Kit as positive control of
LoopampTM MALARIA Pv Detection Kit.

TEST PRINCIPLESThis product is based on the nucleic acid amplification method, LAMP
(Loop-mediated Isothermal Amplification), developed by Eiken
Chemical Co., Ltd.
The LAMP method has the following characteristics: (1) Only one
polymerase enzyme is required and the amplification reaction
proceeds under isothermal conditions;1),2) (2) it has an extremely highspecificity because of the use of four primers recognizing six distinct
regions on the target; (3) it has a high amplification efficiency and can
produce a high concentration of amplified product in a short time,
which makes visual or automated detection possible. 3),4)
The targeted DNA sequences of the P. vivax (Pv)-specific primers
have been designed to detect the mitochondrial DNA and have been
confirmed by alignment analysis to be specific for Pv.
The test DNA solution extracted from blood samples is dispensed intoa reaction tube. The strand displacement DNA polymerase,deoxynucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dGTP and dTTP),
calcein, reaction buffers and Malaria Pv-specific primers are stored indried form in the cap of the reaction tube. These dried LAMP reagents(Malaria Pv detection reagents (dMAL Pv)) dissolve when the DNA
solution is added. The reaction tube is then incubated at 65.0C andthe DNA is amplified by the strand displacement DNA polymerase inaccordance with the LAMP reaction.
The detection of amplified products is based on turbidity ofmagnesium pyrophosphate (a white precipitate produced as aby-product of DNA amplification). 3) Alternatively, visual detection under
UV light may be used. Before the DNA amplification, calcein containedin the reagent is in the quenched state as it is bound to manganeseions. At the start of DNA amplification, the pyrophosphate ions that are
generated out-compete the manganese ions for binding sites, andthus the calcein becomes fluorescent. 4)

CONTENTS OF THE KITReagents are stable until the date on the label assuming thecontainer remains unopened at a storage temperature of 2 – 30°C.
Malaria Pv detection reagent (dMAL Pv)··············· 2 x 48 tubes
The following reagents in dried form are contained in eachreaction tube:
Bst DNA polymerase*1
Deoxynucleotide triphosphates
Magnesium sulfate
Calcein
Manganese chloride
Primers*2
Positive control Mal Pv (PC PV)*3 ····················· 1 x 1.0 mL
Negative control Mal (NC Mal)························· 3 x 0.5 mL
30µL dropper ······································· 5 x 12 droppers*1: Bst DNA polymerase derived from Bacillus stearothermophilus
is a strand displacement DNA polymerase that lacks 5’3’exonuclease activity.
*2: Primers designed for the mitochondrial DNA of Plasmodium
parasites, purified from synthesized oligonucleotides by HPLC.
*3: PC PV contains a product resulting from in vitro amplification ofan artificial gene designed from the mitochondrial DNA of Pv(GenBank No.AF055587).

1

WASTE DISPOSAL

using the pipette and close the cap.
(3) Dispense 30µL of NC Mal into a reaction tube using the pipette or
dropper, and close the cap.
(4) Dispense 30µL of PC PV into a reaction tube using the pipette or
dropper, and close the cap.
(5) Flick (or spin) down all tubes to collect the solution at the bottomof the tubes.

(1) Do not open the tubes after DNA amplification. Leave the cap
closed and dispose of the used tubes as medical waste byincineration or after double bagging with sealable plastic bags.
(2) Never autoclave or re-use the reaction tubes. Amplified products
will disperse and cause contamination.
(3) The main material for the reaction tubes and reagent tubes is PP;
for the reaction tube tray, PET; for the aluminium pouch,aluminium; and for the kit case, paper.
(4) Dispose of any other reagent, container, or lab ware inaccordance with local regulations.

Note: When using the PURE device make sure the liquid
level is closer to the upper line of the two lines on a reaction
tube to ensure that the correct volume has been dispensed.
(6) Reconstitute the dried reagents in the cap by inverting thereaction tubes and collecting the DNA solution in the cap. Leave
the tubes standing upside down for 2 minutes to reconstitute thedried reagents.
(7) Invert the reaction tubes 5 times to mix the contents. Make surethat the dried reagents in the cap are fully dissolved (the solution
should have a slight orange colour).
(8) Flick (or spin) down all tubes to collect the solution at the bottomof the tubes.
Amplification
For visual fluorescence detection（For HumaLoop M）(1) Check that the temperature of the HumaLoop M is 65.0°C.
(2) Load the reaction tubes into the HumaLoop M and press thegreen button to start the LAMP reaction (40 minutes at 65.0°C).
See the HumaLoop M instruction manual for details on how to
operate the incubator.
(3) Confirm the completion of polymerase inactivation (automaticallycompleted by the HumaLoop M). Take all reaction tubes from the
HumaLoop M.
（For other incubator using UV light）(1) Set the temperature of the incubator to 65.0°C (with hot bonnet
temperature set to 10 °C above the reaction temperature or asnear to this figure as possible – temperature accuracy: 0.5C).
Wait until the displayed temperature reaches the set value.
(2) Load the reaction tubes and then start amplification reaction (for40 minutes at 65.0C).
(3) 40 minutes later, inactivate the polymerase using the heating
block (for 5 minutes at 80C, or for 2 minutes at 95C) to terminate
the reaction.

SPECIMEN COLLECTION(1) Blood samples should be used immediately after collection.
(2) Collect blood in a separate room from the LAMP amplification
room. Aerosols containing Pv DNA can be generated during bloodcollection and may cause contamination.
(3) DO NOT USE EDTA and Citrate as anticoagulant for bloodcollection if the result is to be read by fluorescence. The use ofheparin as anticoagulant is recommended.

MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED

・LoopampTM PURE DNA Extraction Kit (optional)
・HumaHeat (optional)

For visual fluorescence detection（For HumaLoop M）
・HumaLoop M（For other incubator using UV light）
・Incubator (temperature accuracy: 0.5C; with hot bonnet)
・Heating block
・UV light or Blue LED light (wavelength: 240 to 260 nm, and 350
to 370 nm)
・Goggles/glasses or other UV-blocking eye mask
For real-time turbidity detection
・HumaTurb C+A
For reagent and sample mixing
・Micropipettes (10 to 100 µL, and 20 to 200 µL) and pipette tips
with filter・Centrifuge for micro-tubes (optional)
・Centrifuge for eight connected tubes (optional)
・HuMax ITA (optional)

PREPARATION OF SAMPLE DNA SOLUTION

For real-time turbidity detection with HumaTurb C+A（see Flow
chart of the procedure）(1) Configure the Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A for
detection with this product.
(2) Check if the displayed temperature reaches 65.0C (allow theturbidimeter to warm up for 20 minutes before use).
(3) Insert the reaction tubes and start measurement.
(4) Watch the display of the turbidimeter to check the positive andnegative controls for any increase in turbidity. If the turbidity
increases in the positive but not in the negative control solution,
amplification reaction is proceeding properly (Fig1). If this is not
the case, amplification reaction may be proceeding in a wrong
way. In such a case, retest affected samples from reagent
preparation.
(5) Confirm the completion of polymerase inactivation (automaticallycompleted by the turbidimeter). Take all reaction tubes from the
HumaTurb C+A and discard them without opening.

To extract the DNA from blood samples, boil & spin and PURE
method are recommended. The standard operating procedures (SOP)of both methods are provided athttps://www.finddx.org/wp-content/uploads/2016/04/SOP-LAMP-Malaria-Aug2012.pdf
Pay attention to the following critical points for PURE method.
・Samples：Blood samples collected by finger prick, collected inheparin tubes or whole blood dried on filter paper・Sample volume：30µL (fresh blood or blood with heparin) or
6mm blood spot punch (dried blood spot)
・Additive：Add 30µL of 334mM NaCl solution (not included in the
LoopampTM PURE DNA Extraction Kit) to the heatingtube before heating・Heating：For 5 minutes at 75℃

PREPARATION OF REAGENTS(1) Malaria Pv detection reagent
Remove the required number of tubes from the aluminium pouchand put them in the provided rack (sum of samples and controls).

Amplification plots by Malaria Pv detection reagent(Analyzer： Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A)

Note: After removing the required tubes, reseal thealuminium pouch with any unused tubes immediately.

Negative sample
Positive sample 1
Positive sample 2

Negative control
Positive control

Turbidity

Note: NC Mal should be used with every run.
(3) Positive control Mal Pv （PC PV）
Flick (or spin) down the tube before using, in order to collect thecontent at the bottom of the tube.

Note: PC PV should be used with every run.

0.7

0.7

0.6

0.6

0.5

0.5

Turbidity(2) Negative control Mal（NC Mal）
Flick (or spin) down the tube before using, in order to collect thecontent at the bottom of the tube.

0.4
0.3

0.4
0.3

0.2

0.2

MEASUREMENT PROCEDURE

0.1

0.1

Reagent and sample mixing(1) Turn on the HumaLoop M or the Real-Time Turbidimeter
HumaTurb C+A.
(2) Dispense 30µL of extracted DNA solution into a reaction tube

0

0
0

5

10

15

20

25

30 35 40

Time ( min.)Fig1：Amplification plots for controls

2

0

5

10

15

20

25

30 35 40

Time ( min.)Fig2：Amplification plots for samples

PROCEDURAL NOTES

symptoms. The patient’s clinical condition should always be taken
into account when making a final diagnosis and determining
management.
(2) Although the primers have been designed to target a region
containing a relatively small number of variations, it is conceivablethat Pv infections may occur with variations in this region that are
not well detected by this product. Therefore, a negative test does
not always rule out an infection by Pv.
(3) This product is a kit for a qualitative detection; it is not designed
for a quantitative measurement. The intensity of the fluorescentlight observed or the rise time of turbidity measured by the
Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A does not correlate withthe concentration of template DNA.

(1) The LAMP reaction is very sensitive and contamination with small
amounts of amplified product might lead to false positive results.
(2) Separate the sample preparation and the amplification areas.
(3) Clean benches with over 0.5% sodium hypochlorite before andafter performing the test.
(4) Change gloves after transferring the blood or if the gloves come incontact with the DNA solution.
(5) When handling this product, avoid parasitolological contaminationand nuclease contamination. Even a small amount ofcontamination of the reaction tube from sweat or saliva may
decompose the DNA and cause a false result.
(6) Furthermore, read the SOP when performing DNA extraction.
(7) The DNA solution should ideally be used immediately after
preparation.
(8) (For HumaLoop M or other incubator using UV light）
If bubbles are present, flick the tubes to release them.
(For Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A）
Since bubbles in reaction solution may interfere with turbidity
measurement and cause a false result, avoid forming any bubble
when mixing reagent and sample solution. If bubbles occur, spinor flick the tube to release them.
(9) dMAL Pv should be fully dissolved. Any undissolved portion may
influence the performance, such as causing a decrease insensitivity.
(10) The PC PV contains a high copy number of control DNA. Avoid
any contamination of other samples with the PC PV. Dispense thesamples and the NC Mal and close all reaction tubes before
dispensing the PC PV.
(11) Flick (or spin) down the PC PV tube before opening it, in order tocollect the content at the bottom of the tube. Close the tube
immediately after dispensing the PC PV.
(12) Never open the reaction tubes once the LAMP reaction has
started or after completion. Be particularly careful when unloading
the reaction tubes from the incubator to avoid opening the tubes
accidentally.
(13) When the HumaLoop M or the Real-Time Turbidimeter HumaTurb
C+A is used, polymerase inactivation is automatically performed.
(14) For other incubators, when visual fluorescence judgment ischosen, inactivate the polymerase (for 5 minutes at 80C, or for 2
minutes at 95C) before reading, or false results will be caused.
(15) Do not reuse any amplified product in the tubes forelectrophoresis or other applications.

INTERFERING SUBSTANCES
Our in-house studies have revealed that the turbidimetry measurement was not affected by the presence of free bilirubin (3 µg/µL),
conjugated bilirubin (0.6 µg/µL), chyle (formazine turbidity:16,600),
and hemolytic hemoglobin (520 µg/µL), and human genomic DNA (0.2µg/µL).
With regard to drugs, our in-house studies have revealed that themeasurement was not affected by the presence of isoniazid(700 ng/test), ethambutol (170 ng/test), rifampicin (3.5 µg/test),
pyrazinamide (799 ng/test), acetaminophen (269 ng/test),
clarithromycin (372 ng/test), streptomycin (4 µg/test), atovaquone(1.33 µg/test)chloroquine (34 ng/test), quinine (800 ng/test),
doxycycline hydrochloride (300 ng/test), mefloquine (140 ng/test),
primaquine (15 ng/test), and artemisinin (77.6 ng/test).

PERFORMANCE CHARACTERISTICS(1) Sensitivity and accuracy
In testing the following samples: Negative sample (concentration: 0 copy/test) Positive sample 1 (100 copies/test) Positive sample 2 (1,000 copies/test);
The negative sample shall test negative and the positive samples
1 and 2 shall test positive.
(2) Within-run reproducibility
In testing five negative and five positive samples simultaneously,
the negative samples shall test negative throughout and thepositive samples shall test positive throughout.
(3) Limit of detection
7.5 copies/test(4) Cross-reactivity
The measurement system tested positive for Pv and negative forother pathogens, as detailed in the table below:

INTERPRETATION OF RESULTS
For visual fluorescence detection（For HumaLoop M）
Set each reaction tube into the Fluorescence Detection Unit,
irradiate and observe the tube from the side.
（For other incubator using UV light）
Irradiate the bottom of each reaction tube and observe from theside through goggles or other UV-protective eye mask.

Plasmodium genus
Plasmodium vivax
Plasmodium falciparum
Plasmodium ovale
Plasmodium malariae

For a valid run, the following results must be obtained when read at
the specified time: Positive control: Green fluorescent light is emitted.
 Negative control: No fluorescent light is emitted.
If any control is invalid, all samples in the run should be reported as
invalid and the samples should be retested.

Positive
Negative
Negative
Negative

Other pathogens
Trypanosoma brucei rhodesiense
Trypanosoma brucei gambiense
Trypanosoma cruzi
Trypanosoma rangeli
Leishmania donovani
Leishmania infantum
Leishmania chagasi
Leishmania gyuanesis
Leishmania tropica
Schistosoma mansoni
Theileria parva
Mycobacterium tuberculosis
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenza
Human immunodeficiency virus

After confirming that the run is valid, evaluate samples as follows: Positive sample: Green fluorescent light is emitted.
 Negative sample: No fluorescent light is emitted.
For real-time turbidity detection with HumaTurb C+A
After confirming that the turbidity increases in the positive control
but not in the negative control solution, evaluate samples inaccordance with the following criteria (Fig 1 and 2).
 Positive: Some increase is observed in turbidity.
 Negative: No increase is observed in turbidity.
Notes:(1) The minimum detection sensitivity of the MALARIA Pv Detection
Kit is 7.5 copies per test, respectively. In the case of a negative
test result, patients with any persisting or worsening symptoms
should be considered for retesting and other possible causes ofsymptoms should also be considered and investigated. The
LAMP assay is highly sensitive and may detect low-levelparasitaemia that are not the direct cause of the presenting

Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative(5) Information about a calibrator
The performance test for this product used plasmid DNA
containing the mitochondrial DNA of Pv as a calibrator.
(6) Clinical performance
Malaria is caused by certain parasites of the Plasmodium genus,
which are transmitted via the bites of infected mosquitoes. After a3period of development in the liver, blood stage parasites are
released. The blood-stage parasites enter red blood cells, lysing
the cells during subsequent reproduction and causing symptoms
including fever. The LAMP assay detects DNA from blood-stage
parasites.
From 560 blood samples collected in a study in Peru6), DNA wasextracted using the Boil&Spin method7) and tested by the
MALARIA Pv Detection Kit. The sensitivity and specificity of
MALARIA Pv Detection Kit against nested PCR were 84.6% and92.0%, respectively.

MALARIA Pv
Detection Kit
vsnested PCR

Sensitivity

Specificity(95% CI)(95% CI)

84.6%

92.0%

(78.4-89.6)(88.8-94.5)

Flow chart
Operation procedure for real-time turbidity detection
Preparation of sample solution
Prepare sample DNA solutions by extracting DNA
from collected blood samples.

Reagent preparation

Take the required number of reaction
tubes of dMAL Pv.
( For samples, negative andpositive controls )Mixing of reagent and sample solution

ORDERING INFORMATION
Product
Code

Product Name

Contents

975000Loopamp™
MALARIA Pv
Detection Kit

96 tests

962000

HumaLoop M

1 Main Unit
1 Fluorescence Detection Unit

970000Loopamp™ PUREDNA Extraction
Kit

90 tests

963200

HumaTurb C+A

1 Control Unit
1 Amplification Unit

980000

HuMax ITABench-top centrifuge

964000

HumaHeat

Heating blockTransfer 3 0 µL of sample or control solution into eachreaction tube.
Use NC Mal as negative control.
Use PC PV as positive control.
(The positive control should be prepared at last.)
Invert the reaction tubes to collect the solution in thecap. Leave the tubes standing upside down for 2
minutes.

Invert the reaction tubes 5 times to mix the contents
and then spin them down.
( Avoid making any bubbles.)Amplification
Load the reaction tubes onto the reaction block of theturbidimeter.

REFERENCES
1) Notomi T., et al.: Nucleic Acids Research 28, No. 12, e63 (2000)
2) Nagamine K., et al.: Clin. Chem. 47, No. 9, 1742–1743 (2001)
3) Mori Y., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, No. 1,
150–154 (2001)
4) Tomita N., et al.: Nat. Protoc. 3, No. 5, 877–882 (2008)
5) The guideline for the bio-safety and bio-hazard (by the JapaneseSociety for Bacteriology): Japanese Journal of Bacteriology 54,
No. 3, 667–715 (1999)
6) The study was conducted in collaboration between FIND and the
University Peruana Cayetano Heredia (UPCH).
7) https://www.finddx.org/wp-content/uploads/2016/04/SOP-LAMPMalaria-Aug2012.pdf

As directed in the instructions for use of theturbidimeter, start reaction and measure and evaluate
the turbidity ( for 40 minutes at 65.0C).
Confirm the completion of polymerase inactivation (for 5 minutes at
80C, or for 2 minutes at 95C). Take all reaction tubes from theturbidimeter and discard them without opening. Be careful not todamage the tubes.

VD
Exclusive distributor

Max-Planck-Ring 21, 65205 Wiesbaden, Germany

Date of Issue: October 1, 20184

Instructions d'utilisation
Les abréviations des noms des réactifs suivants, leur numéro de lot,ainsi que le code du fabricant (EKN), sont imprimées sur les boîtierscomme indiqué ci-dessous.

975000Français

LoopampTM MALARIA Pv

Réactifs
Contrôle positif Mal
Pv

Detection Kit

Contrôle négatif Mal

Étiquetage sur le tube
PC PV
Lot No., EKN
NC MalLot No., EKN

Code sur le bouchon
PC
PV
NC
Mal

MISES EN GARDE ET PRÉCAUTIONSUTILISATION PRÉVUE(1) Usage à des fins de diagnostic in vitro uniquement.
(2) Ce produit est réservé à la détection d’ADN des parasites Pv dansdes spécimens de sang humain. Ne pas l’utiliser à d’autres fins.
(3) Respecter toujours ces instructions d’utilisation lors de l’utilisationde ce produit.
(4) Ne pas congeler les réactifs.
(5) Ne jamais utiliser un réactif périmé.
(6) Ne pas mélanger les kits provenant de Lots différents.
(7) Ne pas rajouter de réactif pour re-remplir.
(8) La performance du LoopampTM MALARIA Pv Detection Kit dépend
de la compétence de l’opérateur et du respect du mode d’emploi.
Les tests doivent être effectués par un personnel dûment formé.
(9) L’exposition à la chaleur, à l’humidité et à la lumière peut détériorer
le dMAL Pv. Sortir le nombre de tubes nécessaires (nombre despécimens et témoins) de l’emballage juste avant son utilisation,
puis refermer la pochette en aluminium immédiatement.
(10) Ne pas enlever le dessicant du sachet en aluminium. Une forte
humidité peut détériorer le réactif LAMP se trouvant dans les tubes.
(11) Lire le manuel d’utilisation et s’assurer de la disponibilité deséquipements (turbidimètre ou incubateur) avant l’emploi du kit.
(12) Les spécimens de sang présentent un risque potentiel d’infection.
Prendre toutes mesures préventives nécessaires pour éviter tout
danger biologique potentiel. 5)(13) PC PV et NC Mal contiennent tous deux une petite quantitéd’azoture de sodiumcomme agent de conservation. L’azoture desodium est classé toxique. Éviter tout contact avec les yeux, labouche ou la peau.
(14) Lors d’un contact accidentel d’un des réactifs avec les yeux, labouche ou la peau, rincer immédiatement et abondamment lapartie affectée avec de l’eau, et se référer à un service
médicalement compétent si nécessaire.
(15) Ne pas diluer ou ajouter du PC PV aux spécimens. Afin d’éviter
une contamination de l’ADN, utiliser le PC PV seulement commeil est indiqué dans cette notice.
(16) Conserver le PC PV et tout spécimen sanguin à l’écart des autres
réactifs du kit.
(17) Le bouchon de chaque tube de réaction contient du dMAL Pv sous
forme sèche. Ne pas toucher la partie interne du bouchon.
(18) Avant l’utilisation des tubes de réaction, vérifier avec soin laprésence de fissure ou de rayures. Les tubes abîmés peuvent
fausser les résultats et provoquer une contamination del’incubateur ou de l’espace de travail par de l’ADN.
(19) Ne pas exposer les tubes à la lumière UV avant la fin de la réaction
de LAMP. Une exposition prolongée des tubes à la lumière UV
peut endommager les tubes et peut fausser les résultats.
(20) Lors de l’utilisation lumière UV pour l’évaluation de la fluorescence,ne pas fixer directement la source de lumière UV. La lumière UVétant nocive pour les yeux. La regarder, même pendant un temps
court, pourrait irriter les yeux et provoquer des symptômessimilaires à la conjonctivite. Utiliser des plaques d’écrans en verre,
des lunettes ou des visières protectrices lorsqu’on doit regarderdirectement une lumière UV.
(21) Se référer au manuel de l’incubateur. Lors de l’utilisation du
HumaLoop M ou du Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A, faireattention à ne pas se brûler en retirant les tubes de réactions desappareils.
(22) Ne pas utiliser le PC PV comme contrôle positif du LoopampTM
MALARIA Pan/Pf Detection Kit ou du LoopampTM MALARIA Pan
Detection Kit. Ne pas utiliser le PC du LoopampTM MALARIA
Pan/Pf Detection Kit ou du LoopampTM MALARIA Pan Detection Kit
comme contrôle positif du LoopampTM MALARIA Pv Detection Kit.

Le LoopampTM MALARIA Pv Detection Kit est un test qualitatif dediagnostic in vitro pour la détection de l’ADN de Plasmodium vivax
extrait de prélèvements sanguins.

PRINCIPE DU TESTLe test est basé sur la méthode d’amplification d’acide nucléaire LAMP
(Loop-mediated Isothermal Amplification ; amplification isothermeinduite par boucle) développée par Eiken Chemical Co., Ltd.
La méthode LAMP possède les caractéristiques suivantes : (1) Une
seule enzyme est requise et la réaction d’amplification se fait sous desconditions isothermiques ;1), 2) (2) Elle présente une spécificité trèsélevée par son utilisation de quatre amorces reconnaissant six régions
distinctes de la cible ; (3) Elle présente une amplification à très haut
rendement et permet une amplification en un temps court, et (4) Ellegénère une quantité très élevée de produits d’amplification par le biais
duquel une simple détection visuelle devient possible. 3), 4)
Les séquences cibles d’ADN des amorces spécifique au P. vivax (Pv)ont été construites pour détecter l’ADN mitochondrial et ont été
confirmées par l’analyse d’alignement comme étant spécifiques au Pv.
La solution d’ADN à tester, extrait d’un spécimen de sang, esttransférée dans un tube à réaction. L’ADN polymérase à déplacement
de brin, les désoxynucléotide triphosphatés ( dATP, dCTP, dGTP etdTTP ), la calcéine, les tampons de réactions et les amorces
spécifiques Malaria Pv sont conservés sous forme sèche dans lebouchon des tubes de réaction. Le réactif LAMP à l’état sec (réactif dedétection du Malaria Pv (dMAL Pv)) sera dissout par l’ajout de lasolution d’ADN. Le tube de réaction est incubé à 65,0°C et l’ADN est
amplifié suivant la réaction LAMP à l’aide de l’ADN polymérase àdéplacement de brin.
La détection du produit d’amplification est fondée sur la mesure de laturbidité d’un sous-produit, le pyrophosphate de magnésium (précipité
blanc). 3) Une évaluation visuelle sous irradiation UV à la place demesure de turbidité est également possible. La calcéine contenue
dans le réactif LAMP est libérée durant l’amplification, ce qui produit
une lumière fluorescente détectable à l'œil nu.4) Avant la réactiond’amplification de l’ADN, la calcéine contenue dans le réactif estéteinte car les ions de manganèse lui sont liés ; une fois la réaction de
LAMP démarrée, les ions pyrophosphate qui sont générés prennent laplace des ions manganèse sur les sites de liaison, et la calcéine
devient fluorescente.4)

CONTENU DU KIT
Les réactifs sont stables jusqu’à la date figurant sur l’étiquette, sousréserve que le container n’ait pas été ouvert et qu’il ait été conservé à
une température de 2 à 30°C.
Réactif de détection du Malaria Pv (dMAL Pv)········2 x 48 tubes
Les réactifs suivants sont contenus à l’état sec dans chaquetube à réaction.
Bst ADN polymérase *1
Déoxynucleotide triphosphates
Sulfate de magnésium
Calcéine
Chlorure de manganèse
Amorces* 2
Contrôle positif Mal Pv (PC PV)*3 ························1 x 1,0 mL
Contrôle négatif Mal (NC Mal) ····························3 x 0,5 mL
Compte-goutte 30µL ·························5 x 12 compte-goutte*1: La Bst ADN polymérase dérivée du Bacillus stearothermophilus
est une polymérase à déplacement de brin d’ADN qui est
dépourvu d’activité exonucléase 5'→3'.
*2: Amorces pour l’ADN mitochondrial de parasites Plasmodium,
purifiés par HPLC à partir d’oligonucléotides de synthèse.
*3: PC PV contient un produit résultant d’une amplification in vitro d’ungène artificiel conçu à partir de l’ADN mitochondrial du Pv(GenBank No.AF055587).

ÉLIMINATION DES DÉCHETS(1) Ne pas ouvrir les tubes après amplification de l’ADN. Laisser lebouchon fermé et jeter les tubes comme déchet médical à incinérer

5

C+A.
(2) Transférer 30 µL de solution d’échantillon d’ADN dans un tube àréaction à l’aide d’une pipette, puis refermer le bouchon.
(3) Transférer 30 µL de NC Mal dans un tube à réaction à l’aide d’une
pipette ou compte-goutte, puis refermer le bouchon.
(4) Transférer 30 µL de PC PV dans un tube à réaction à l’aide d’une
pipette ou compte-goutte, puis refermer le bouchon.
(5) Secouer le tube d’un mouvement sec ou le centrifuger pourcollecter la solution se trouvant au fond du tube.

ou sac double scellé.
(2) Ne jamais passer à l’autoclave ou réutiliser les tubes de réaction
au risque de disperser les produits et provoquer une
contamination.
(3) Le matériau principal des tubes de réaction, des tubes de réactifs
et du compte-goutte de 30µL est PP ; Le plateau à tubes est en
PET; la pochette en aluminium est en aluminium ; la boîte du kit
est en papier.
(4) Éliminer tout réactif non utilisé, boîtier ou matériel de laboratoire
conformément à la réglementation locale.

Remarque : s’assurer que le niveau du liquide se situe au
milieu de deux traits du tube à réaction pour vérifier que levolume transféré par le pipetage est correct.

PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS(1) Utiliser les spécimens sanguins immédiatement après leurprélèvement.
(2) Prélever le sang dans une salle séparée de celle pour effectuer
l’amplification LAMP. Les aérosols contenant de l’ADN de Pv
peuvent être produits durant le prélèvement sanguin, ce qui peut
provoquer une contamination.
(3) NE PAS UTILISER D’ EDTA ou de Citrate comme anticoagulant
lors du prélèvement sanguin si la lecture du résultat doit se faire
par fluorescence. Il est recommandé d’utiliser de l’héparine
comme anticoagulant.

(6) Reconstituer les réactifs à l’état sec qui se trouve dans le bouchon
en inversant le tube afin de collecter la solution d’ADN. Laisser les
tubes inversé pendant 2 minutes pour reconstituer les réactifs àl’état sec.
(7) Mélanger le contenu du tube par 5 inversions. S’assurer que lesréactifs à l’état sec est complètement dissout (la solution doit êtred’une couleur légèrement orangée).
(8) Secouer le tube d’un mouvement sec ou le centrifuger pourcollecter la solution se trouvant au fond du tube.
Amplification
Pour une détection visuelle de fluorescence(Pour le HumaLoop M)(1) Vérifier que la température de la HumaLoop M est à 65,0°C.
(2) Disposer les tubes dans l’incubateur HumaLoop M et appuyer sur
le bouton vert pour démarrer la réaction de LAMP (40 minutes à
65,0°C). Voir le manuel d’utilisation du HumaLoop M pour lesdétails sur l’opération de l’incubateur.
(3) Vérifier que l’inactivation de la polymérase est complète(complétée automatiquement par le HumaLoop M). Sortir tous lestubes à réaction du HumaLoop M.
(Pour d’autres incubateurs avec lumière UV)(1) Régler la température de l’incubateur à 65,0°C (avec latempérature du couvercle chauffant réglée 10°C au-dessus de latempérature de réaction. Précision de température : ±0,5°C).
Attendre que la température affichée ait atteint la valeur duréglage.
(2) Charger les tubes à réaction dans l’appareil, puis démarrer laréaction d’amplification (40 minutes à 65,0C).
(3) Après les 40 minutes, inactiver la polymérase à l’aide du bloc
chauffant (5 minutes à 80C ou 2 minutes à 95C) pour terminer laréaction.

MATÉRIELS NÉCESSAIRES NON FOURNIS

 Loopamp PURE DNA Extraction Kit (optionnel) HumaHeat (optionnel)
Pour la détection visuelle de fluorescence(Pour le HumaLoop M)
 HumaLoop M(Autres incubateurs avec lumière UV)
 Incubateur ( précision de température : ±0,5°C, avec couvercle
chauffant) Bloc chauffant Lumière UV ou lumière LED BLEU ( longueur d’onde : 240 à
260 nm et 350 à 370 nm )
 Lunettes ou visière de protection
Détection de turbidité en temps réel
 HumaTurb C+A
Mélange et préparation des réactifs et des spécimens
 Pipettes (de 10 à 100 µL, et de 20 à 200 µL), cônes filtrés pourpipettes Centrifugeuse pour microtubes (optionnel)
 Centrifugeuse avec rotor pour barrettes de 8 tubes (optionnel)
 HuMax ITA (optionnel)
TM

PRÉPARATION DE LA SOLUTION D’ADN ÉCHANTILLONS

Détection de turbidité en temps réel HumaTurb C+A (voirdiagramme de la procédure)(1) Configurer le Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A pour une
détection avec le kit (à moins que l’appareil soit déjà réglé).
(2) Vérifier que la température indiquée atteint les 65,0°C (préchauffer
le turbidimètre pendant 20 minutes avant utilisation).
(3) Insérer les tubes de réaction, puis démarrer la mesure.
(4) Surveiller l’affichage du turbidimètre pour vérifier si les témoins
positifs et négatifs augmentent ou non. Si la turbidité augmente
uniquement chez le témoin positif alors que le témoin négatif nechange pas, la réaction d’amplification se passe correctement(Fig1). Dans tout autre cas de figure, il peut y avoir une erreur dansla réaction d’amplification : si tel est le cas, réexaminer lesspécimens affectés depuis la préparation des réactifs.
(5) Vérifier que l’inactivation de la polymérase est complète(complétée automatiquement par le turbidimètre). Sortir tous lestubes de réaction du HumaTurb C+A et les jeter sans les ouvrir.

Il est recommandé d'extraire l'ADN par la méthode "Bouillir etcentrifuger" ou par la méthode PURE. Les procédures opératoires
standards de ces deux méthodes se trouvent à :https://www.finddx.org/wp-content/uploads/2016/04/SOP-LAMP-Malaria-Aug2012.pdf
Une attention particulière est demandée sur les points critiquessuovants de la méthode PURE.
·Les échantillons : Du sang prélevé au bout du doigt dans un
tube hépariné, ou du sang total séché sur papier filtre·Volume d'échantillon : 30µL (sang frais ou hépariné) ou confettide 6mm de sang séché sur papier filtre·Additif : Ajouter 30µL de solution de NaCl à 334mM (non fourni
dans le kit d'extraction LoopampTM PURE DNA
Extraction Kit) au tube de chauffage avant de chauffer·Chauffage : Pendant 5 minutes à 75CPRÉPARATION DES RÉACTIFS(1) Réactifs de détection du Malaria Pv
Sortir de la pochette en aluminium le nombre de tubes requis,
puis les placer dans le rack fourni (nombre de spécimens etcontrôles).
Remarque : Après avoir sorti le nombre de tubes nécessaire,

Courbes avec les réactifs de détection Malaria Pv(Analyseur : Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A)
Échantillon négatif
Échantillon positif 1
Échantillon positif 2

Contrôle négatif
Contrôle positif

Turbidité(2) Contrôle négatif Mal (NC Mal)
Avant utilisation, secouer le tube d’un mouvement sec ou lecentrifuger pour collecter le contenu du fond du tube.
Remarque : le NC Mal doit être utilisé à chaque opération.
(3) Contrôle positif Mal Pv (PC PV)
Avant utilisation, secouer le tube d’un mouvement sec ou lecentrifuger pour collecter le contenu du fond du tube.
Remarque : le PC PV doit être utilisé à chaque opération.

0,7

0,7

0,6

0,6

0,5

0,5

Turbidité

refermer immédiatement la pochette en aluminium contenant les
tubes restants.

0,4
0,3

0,2

0,1

0,1
0
0

5

10

15

20

25

30 35 40

Temps ( min.)Préparation des réactifs et des spécimens(1) Allumer laHumaLoop M ou le Real-Time Turbidimeter HumaTurb

Fig1 : Courbe d'amplification destémoins

6

0,3

0,2

0

PROCÉDURE DE MESURE

0,4

0

5

10

15

20

25

30 35 40

Temps ( min.)Fig2 : Courbe d'amplification desspécimens

Remarques :(1) La sensibilité minimale de détection du MALARIA Pv Detection Kit
est de 7,5 copies par test. Dans le cas d’un résultat négatif chez unpatient présentant une persistance ou une aggravation dessymptômes, considérer de répéter le test, tout en recherchantd’autres causes aux symptômes. Les tests LAMP sont d’une très
grande sensibilité, capable de détecter une parasitémie faible qui
ne serait pas la cause directe des symptômes présentés. Toujours
tenir compte du tableau clinique du patient pour établir lediagnostic final pour définir la prise en charge de la maladie.
(2) Bien que les amorces aient été construites pour avoir comme cible
une région comportant relativement peu de variations, il est
concevable que des infections au Pv avec des variations pour ces
régions ne seront pas forcément détectables par ce kit. Ainsi, unrésultat négatif n’exclut pas de façon absolue une présence de Pv.
(3) Ce produit est un kit pour une détection qualitative, il n’a pas été
conçu pour une mesure quantitative. L’intensité de fluorescenceobservée ou une augmentation de turbidité mesurée par leReal-Time Turbidimeter ne corrèlent pas avec la quantité d’ADN
matrice.

NOTES SUR LA PROCÉDURE(1) La réaction de LAMP est très sensible et une contamination par
une quantité infime de produit d’amplification peut provoquer unrésultat faussement positif.
(2) Séparer la zone de préparation de la zone de test LAMP.
(3) Nettoyer la paillasse avec une solution d’hypochlorite supérieure à
0,5% avant et après le test.
(4) Changer de gants après avoir transféré le sang ou si les gants ont
touché la solution d’ADN.
(5) Éviter toute contamination parasitologique ou contamination parla nucléase lors de la manipulation du produit. Une quantité,même infime, de DNAse transmise aux tubes par la sueur ou parla salive pourrait décomposer l’ADN et fausser les résultats.
(6) Il est aussi important de lire attentivement la SOP6) lors del’utilisation(7) Idéalement, la solution d’ADN devrait être utilisée immédiatement
après sa préparation.
(8) (Pour le HumaLoop M ou autre incubateur avec lumière UV)
Si des bulles sont présentes, secouer le tube d’un coup sec versle bas pour les éliminer.
(Pour le Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A)
Essayer de ne pas générer de bulles lors de la préparation desréactifs et des solutions de spécimens, car les bulles peuvent
interférer aux mesures de turbidité. Si la présence de bulles est
observée, centrifuger pour les éliminer.
(9) Le dMAL Pv doit être complètement dissout. Toutes portions non
dissoutes peuvent influer sur la performance et provoquer une
perte de sensibilité.
(10) Le PC PV contient un grand nombre de copies d’ADN decontrôle. Éviter toute contamination d’autres spécimens par le PC
PV. Transférer les spécimens et le NC Mal, puis refermer tous lestubes à réaction avant le pipetage du PC PV.
(11) Secouer le tube de PC PV d’un mouvement sec ou le centrifuger
avant son ouverture pour collecter la solution se trouvant au fonddu tube. Refermer le tube immédiatement après avoir transféré le
PC PV.
(12) Ne jamais ouvrir un tube à réaction une fois la réaction de LAMP
démarrée, même une fois la réaction terminée. Une attention
particulière est requise en sortant les tubes de l’incubateur pouréviter toute ouverture accidentelle.
(13) Lors de l’utilisation la HumaLoop M ou d’un Real-time
Turbidimeter HumaTurb C+A, l’inactivation de la polymérase se
fait automatiquement par l’appareil.
(14) Pour les autres incubateurs, inactiver la polymérase (5 minutes à
80C ou 2 minutes à 95C) avant lecture, faute de quoi lesrésultats peuvent être faussés.
(15) Ne pas réutiliser produits d’amplification des tubes pourl’électrophorèse ou autres.

SUBSTANCE POUVANT INTERFÉRER
Une étude interne a montré que les mesures par turbidimètre ne sont
pas affectées par la présence de bilirubine libre (3 µg/µL), de bilirubine
conjuguée (0,6 µg/µL), du chyle (turbidité à la formazine :16 600),
d’hémoglobine hémolytique (520 µg/µL), et d’ADN génomique humain(0,2 µg/µL).
Pour les médicaments, une étude interne a montré que les mesures
ne sont pas affectées Pa la présence de : Isoniazide (700 ng/test),
Ethambutol (170 ng/test), Rifampicine (3,5 µg/test), Pyrazinamide (799ng/test), Paracétamol (269 ng/test), Clarithromycin (372 ng/test),
Streptomycin (4µg/test), Atovaquone (1,33 µg/test), Chloroquine (34ng/test), Quinine (800 ng/test), Doxycycline chlorhydrique (300 ng/test),
Méfloquine (140 ng/test), Primaquine (15 ng /test), et Artémisinine (77,6ng/test).

CARACTÉRISTIQUES DES PERFORMANCES(1) Sensibilité et précision
En testant les spécimens suivants : Spécimen Négatif (concentration : 0 équivalent génome/test) Spécimen Positif 1 (100 équivalents génome/test) Spécimen Positif 2 (1 000 équivalents génome/test),
Les spécimens négatifs doivent être négatifs et les spécimens
positifs 1 et 2 doivent être positifs.
(2) Reproductibilité pendant le même test
En testant simultanément 5 spécimens positifs et négatifs, lesspécimens négatifs doivent rester négatifs et ceux positifs doivent
rester positifs tout au long de la procédure.
(3) Limite de détection
7,5 copies/test(4) Réactions croisées
Le tableau ci-après détaille les résultats des tests qui ont été positifs
pour le Pv et négatifs pour d'autres pathogènes.

L’INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
Détection visuelle de fluorescence(Pour le HumaLoop M)
Installer chaque tube à réaction dans l’Unité de Détection de
Fluorescence, irradier et observer le tube par le côté.
(Autres incubateurs avec lumière UV)
Irradier le fond de chaque tube de réaction et observer par le côté àtravers des lunettes ou un d’autres équipements protecteurs.

Genre Plasmodium
Plasmodium vivax
Plasmodium falciparum
Plasmodium ovale
Plasmodium malariae

Pour qu’un test soit valide, les résultats obtenus doivent être commesuit :
 Contrôle Positif : émission d’une fluorescence verte.
 Contrôle Négatif : pas de fluorescence émise.
Si un des contrôles n’est pas valide, tous les spécimens testés
doivent être mentionnés comme non valide et les spécimens doiventêtre réexaminés.

Positif
Négatif
Négatif
Négatif

Autres pathogènes
Trypanosoma brucei rhodesiense
Trypanosoma brucei gambiense
Trypanosoma cruzi
Trypanosoma rangeli
Leishmania donovani
Leishmania infantum
Leishmania chagasi
Leishmania gyuanesis
Leishmania tropica
Schistosoma mansoni
Theileria parva
Mycobacterium tuberculosis
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenza
Human immunodeficiency virus

Après confirmation de la validité du test effectué, évaluer lesspécimens comme suit : Contrôle Positif : émission d’une fluorescence verte.
 Contrôle Négatif : pas de fluorescence émise.
Détection à l’aide d’un turbidimètre à temps réel HumaTurb C+A
Après avoir vérifié que la turbidité de la solution témoin positif
augmente, mais pas celle de la solution témoin négatif, procéder al’évaluation des spécimens en fonctions des critères suivants (Fig 1
et 2).
 Positif : une augmentation de turbidité est observée.
 Négatif : pas d’augmentation de turbidité observée.

7

Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif(5) Information sur le calibrateur
Le test de performance du produit a été effectué avec commecalibrateur l’ADN plasmidique contenant l’ADN mitochondrial duPv.
(6) Performance clinique
Le paludisme est causé par certains parasites du genre
Plasmodium qui sont transmis par des piqûres de moustiques.
Après une phase de développement dans le foie, les parasites
atteignent le milieu sanguin. Les parasites en phase sanguine
envahissent les hématies et les lysent durant la phase dereproduction, induisant des symptômes tels que la fièvre. Le test
LAMP détecte l’ADN des parasites de la phase sanguine.
Dans une etude réalisée au Pérou6), l’ADN a été extrait de 560
échantillons sanguins avec la méthode « boullir et centtrifuger »7)
et a été analysé avec le MALARIA Pv Detection Kit. ´La sensibilité
et la spécifité du MALARIA Pv Detection Kit comparées à un testde PCR nichée (nested PCR) ont été déterminée à 84,6% et
92,0%, respectivement.

DIAGRAMME
Procédure opératoire pour une détection au turbidimètre àtemps réelPréparation des solutions des spécimens
Préparer les solutions de spécimens par extractiond’ADN du sang prélevé.

Préparation des réactifs

Prendre le nombre de tubes de dMALPv nécessaire.
( Pour les spécimens et lestémoins positif et négatif)

Mélange du réactif et de la solution d’échantillon

MALARIA Pv
Detection Kit
vsnested PCR

Sensibilité

Spécificité(95% CI)(95% CI)

84,6%

92,0%

(78,9-89,6)(88,8-94,5)

Transférer 30 µL de solution du spécimen ou de témoin
dans chaque tube.
Utiliser le NC Mal comme témoin négatif.
Utiliser le PV comme témoin positif.
(le témoin positif doit être préparé en dernier)RÉFÉRENCES DE COMMANDE
Code
produitNom du produit

Contenu

975000Loopamp™
MALARIA Pv
Detection Kit

96 tests

962000

HumaLoop M

1 unité Principale
1 unité d’évaluation Visuelle deFluorescence

970000Loopamp™ PUREDNA Extraction
Kit

90 tests

963200

HumaTurb C+A

1 unité de Contrôle
1 unité d’amplification

980000

HuMax ITA

Centrifugeuse de Paillasse

964000

HumaHeat

Bloc ChauffantRetourner le tube de réaction pour récupérer la solution
dans le bouchon. Laisser le tube retourné pendant 2
minutes.

Mélanger le contenu des tubes par 5 inversions, puis
collecter par centrifugation.
( Éviter les bulles.)Amplification
Disposer les tubes dans le bloc de réaction du turbidimètre.

Démarrer la réaction, mesurer et évaluer la turbidité ( 40minutes à 65,0C) comme indiqué dans le manueld’utilisation du turbidimètre.
Vérifier que l’inactivation de la polymérase est complète (5 minutes à
80C ou 2 minutes à 95C). Sortir tous les tubes du turbidimètre et lesjeter sans les ouvrir. Attention à ne pas abimer les tubes.

RÉFÉRENCES
1) Notomi T., et al.: Nucleic Acids Research 28, No. 12, e63 (2000)
2) Nagamine K., et al.: Clin. Chem. 47, No. 9, 1742–1743 (2001)
3) Mori Y., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, No. 1, 150–
154 (2001)
4) Tomita N., et al.: Nat. Protoc. 3, No. 5, 877–882 (2008)
5) La ligne directrice pour la biosécurité et le bio-risque (par laSociété Japonaise de Bactériologie): Japanese Journal of
Bacteriology 54, No. 3, 667–715 (1999)
6) L’étude a été réalisée en collaboration de FIND et l’université
Peruana Cayetano Heredia (UPCH).
7) https://www.finddx.org/wp-content/uploads/2016/04/SOP-LAMPMalaria-Aug2012.pdf

VD
Distributeur exclusif

Max-Planck-Ring 21, 65205 Wiesbaden, Germany

Révisé le 1er octobre 20188

Instrucciones de uso
de lote y el fabricante (EKN) figuran en los recipientes.

975000Español

Reactivos
Control positivo Mal Pv

LoopampTM MALARIA Pv

Control negativo Mal

Etiqueta en el tubo
PC PV
N.º lote., EKN
NC MalN.º lote., EKN

Código en la tapa
PC
PV
NC
Mal

ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES

Detection Kit(1) Solo para diagnóstico in vitro.
(2) Este producto está diseñado únicamente para la detección de ADN deparásitos Pv en muestras de sangre de origen humano. No debe
utilizarse para otros propósitos.
(3) Cuando utilice este producto, siga siempre las instrucciones de uso.
(4) No congele los reactivos.
(5) No utilice reactivos caducados.
(6) No mezcle reactivos de lotes distintos.
(7) No rellene ningún reactivo.
(8) El rendimiento del LoopampTM MALARIA Pv Detection Kit dependede lacompetencia del operario y del cumplimiento de las presentes
instrucciones. Las pruebas solo deben ser realizadas por personal
debidamente capatidado.
(9) La exposición al calor, a la humedad y a la luz puede deteriorar el dMAL
Pv. Retire solo el número necesario de tubos de reacción (número demuestras y controles) y cierre inmediatamente la bolsa de aluminio.
(10) No retire el desecante de la bolsa de aluminio. Un elevado nivel dehumedad podría deteriorar el reactivo LAMP en polvo de los tubos dereacción.
(11) Antes de comenzar el procedimiento, lea el manual de instrucciones ycompruebe el correcto funcionamiento del equipo (turbidímetro o
incubadora).
(12) Las muestras de sangre suponen un potencial riesgo de infección.
Respete las precauciones universales para evitar la exposición al riesgo
5)
biológico.
(13) PC PV y NC Mal contienen una pequeña cantidad de azida sódica comoconservante. La azida sódica es considerada tóxica. Evite el contacto
con los ojos, la boca o la piel.
(14) En caso de contacto accidental de cualquier reactivo con los ojos, la bocao la piel, aclare inmediatamente la zona afectada con agua abundante y,en caso necesario, consulte a un médico.
(15) No diluya ni añada el PC PV a las muestras. Utilice el PC PV siguiendolas indicaciones del presente prospecto para evitar la contaminación deADN.
(16) Guarde el PC PV y cualquier muestra positiva de sangre por separado
de otros reactivos.
(17) La tapa de cada tubo de reacción contiene dMAL Pv en polvo. No toqueel interior de la tapa.
(18) Antes de utilizar los tubos de reacción, compruebe que no presenten
grietas ni arañazos. Los tubos deteriorados pueden dar resultados falsos
y contaminar el ADN de la incubadora y del área de trabajo.
(19) No exponga los tubos de reacción a una fuente de luz ultravioleta antes
de terminarse la reacción LAMP. La exposición prolongada a la luz UV
puede deteriorar los tubos y dar resultados falsos.
(20) Si utiliza luz UV para evaluación visual de fluorescencia, no miredirectamente a la luz UV. La luz UV es perjudicial para los ojos y mirarla
incluso por un periodo breve puede irritarlos y causar síntomas similaresa la conjuntivitis. Utilice una pantalla de vidrio, o lleve gafas o una
máscara de protección ocular cuando tenga que mirar directamente a luz
UV.
(21) Consulte el manual de la incubadora. Cuando utilice la HumaLoop M o elturbidímetro en tiempo real Humaturb C+A, tenga cuidado al retirar lostubos de reacción de la incubadora para evitar posibles quemaduras.
(22) No usar PC PV como un control positivo de LoopampTM MALARIA
Pan/Pf Detection Kit o LoopampTM MALARIA Pan Detection Kit. No usar
PC de LoopampTM MALARIA Pan/Pf Detection Kit o LoopampTM
MALARIA Pan Detection Kit como un control positivo de LoopampTM
MALARIA Pv Detection Kit.

USO PREVISTOEl LoopampTM MALARIA Pv Detection Kit es un método de prueba
diagnóstica cualitativa in vitro para la detección de ADN de Plasmodium
vivax extraído de muestras de sangre humana.

PRINCIPIOS DE LA PRUEBA
Este producto aplica el método de amplificación de ácidos nucleicos,
LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification), desarrollado por Eiken
Chemical Co., Ltd.
El método LAMP presenta las siguientes características: (1) Solo senecesita una enzima de polimerasa para activar la reacción deamplificación isotérmica; 1),2) (2) esta técnica es altamente específica
gracias a los cuatro cebadores que reconocen seis regiones distintas delblanco; (3) ofrece una gran eficiencia de amplificación, que realiza
rápidamente y es capaz de generar una gran cantidad de producto
amplificado visualizable a simple vista. 3),4)
Las secuencias de ADN objetivo de los cebadores específicos para laespecie P. vivax (Pv) se han diseñado para detectar el ADN mitocondrial
ADN han sido confirmadas mediante análisis de alineamiento para ser
específicas para las secuencias Pv.
La solución de ADN extraída de las muestras de sangre se dispensa en
un tubo de reacción. La ADN polimerasa con actividad de desplazamientode cadena, los trifosfatos deoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), lacalceína, los amortiguadores de reacción y los cebadores específicos para
la Malaria Pv se almacenan en polvo en el tapón del tubo de reacción.
Estos reactivos LAMP en polvo (reactivos de detección de Malaria Pv(dMAL Pv)) se disuelven al añadir la solución de ADN. El tubo de reacción
se incuba a 65,0°C y el ADN se amplifica por la ADN polimerasa con
actividad de desplazamiento de cadena de acuerdo con la reacción LAMP.
La detección de productos amplificados se basa en una medición
turbidimétrica de pirofosfato de magnesio (un precipitado blanco
subproducto de la reacción de amplificación de ADN).3) También se puede
recurrir a la detección visual con luz UV. Antes de la amplificación de ADN,
la calceína contenida en el reactivo se encuentra "apagada" debido a laproliferación de iones de manganeso; sin embargo, cuando comienza laamplificación de ADN, los iones de pirofosfato se unen a los iones demanganeso y la calceína de vuelve fluorescente.4)

CONTENIDO DEL KIT
Sin abrir, los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada
en la etiqueta, sin abrir y a una temperatura entre 2 – 30°C.
Reactivo de detección de Malaria Pv (dMAL Pv)········· 2 x 48 tubos
Cada tubo de reacción contiene los siguientes reactivos en polvo:
ADN polimerasa Bst*1
Trifosfatos deoxinucleótidos
Sulfato manganésico
Calceína
Cloruro de manganeso
Cebadores*2
Control positivo Mal Pv (PC PV)*3 ······························· 1 x 1,0 mL
Control negativo Mal (NC Mal) ··································· 3 x 0,5 mL
Cuentagotas de 30 µL ································· 5 x 12 cuentagotas*1: La ADN polimerasa Bst derivada de Bacillus stearothermophilus es
una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena que
no presenta actividad exonucleasa 5’→3’.
*2: Los cebadores diseñados para el ADN mitocondrial de parásitos de
Plasmodium, con purificación de oligonucleótidos sintetizados por
HPLC.
*3: PC PV contiene un producto resultante de una amplificación in vitro
de un gen artificial específico para el ADN mitocondrial de parásitos
de Pv (GenBank No. AF055587).
Las abreviaciones de los nombres de los siguientes reactivos, su númeroELIMINACIÓN DE RESIDUOS(1) No abra los tubos después de la amplificación de ADN. Mantenga el
la tapa cerrada y elimine los tubos usados como residuos médicos
por incineración o introdúzcalos en una bolsa doble plástica sellada.
(2) No esterilice con autoclave ni reutilice los tubos de reacción, ya quelos productos amplificados se dispersarían y provocarían una

9(2) Dispense 30 µL de la solución de ADN extraída en un tubo dereacción utilizando la pipeta y cierre el tapón.
(3) Dispense 30 µL de NC Mal en un tubo de reacción utilizando lapipeta o cuentagotas y cierre el tapón(4) Dispense 30 µL de PC PV en un tubo de reacción utilizando lapipeta o cuentagotas y cierre la tapa.
(5) Agite bien los tubos (centrifugar) para recuperar el contenido delfondo de los tubos.
Nota: cuando utilice el equipo PURE compruebe que el nivel delíquido se acerca a la línea superior de las dos líneas del tubo dereacción para asegurarse de haber dispensado el volumen adecuado(6) Reconstituya los reactivos en polvo del tapón invirtiendo los tubos
de reacción y con la solución de ADN de la tapa. Deje los tubos
boca abajo durante 2 minutos para reconstituir los reactivos en
polvo.
(7) Invierta los tubos de reacción 5 veces para mezclar el contenido.
Asegúrese de que los reactivos en polvo de la tapa estén bien
disueltos (la solución debe tener un leve color anaranjado).
(8) Agite bien los tubos (centrifugar) para recuperar el contenido delfondo de los tubos.
Amplificación
Para detección visual de fluorescencia(Para HumaLoop M)(1) Compruebe que la temperatura mostrada en la HumaLoop M es
65,0°C.
(2) Coloque los tubos de reacción en la HumaLoop M y pulse el botón
verde para lanzar la reacción LAMP (40 minutos a 65,0°C).
Consulte el manual de instrucciones de la HumaLoop M para más
detalles sobre el funcionamiento de la incubadora.
(3) Confirme la finalización de la inactivación de la polimerasa(automáticamente completada por la HumaLoop M). Retire todos
los tubos de reacción de la HumaLoop M.
(Para otra incubadora con luz UV)(1) Ajuste la temperatura de la incubadora a 65,0°C (temperatura de lacubierta térmica a 10°C por encima de la temperatura de reacción olo más próxima posible; precisión de temperatura: ± 0,5°C). Espere
hasta que la temperatura mostrada alcance el valor predefinido.
(2) Coloque los tubos de reacción y lance la reacción de amplificación(40 minutos a 65,0°C).
(3) 40 minutos después, inactive la polimerasa con el bloque térmico (5minutos a 80°C o 2 minutos a 95°C) para terminar la reacción.
Para la detección de turbidez en tiempo real HumaTurb C+A (verDiagrama del procedimiento)(1) Si aún no está bien configurado, ajuste el turbidímetro en tiempo
real HumaTurb C+A para la detección con este producto.
(2) Compruebe que la temperatura visualizada alcanza 65,0°C (dejecalentar el turbidímetro 20 minutos antes de utilizarlo).
(3) Coloque los tubos de reacción y lance la medición.
(4) Compruebe en la pantalla del turbidímetro los controles positivo ynegativo para cada aumento de turbidez. Si la turbidez aumenta en
el positivo, pero no en la solución de control negativo, significa quela reacción de amplificación se realiza correctamente (Fig1). Si noes así, la reacción de amplificación no se está realizando
adecuadamente. En tal caso, vuelva a comprobar las muestras
afectadas desde la preparación del reactivo.
(5) Confirme la finalización de la inactivación de la polimerasa(automáticamente completada por el turbidímetro). Tome todos lostubos de reacción del HumaTurb C+A y deséchelos sin abrirlos.

contaminación.
(3) El material principal para los tubos de reacción y los tubos dereactivos es el PP; la bandeja de los tubos de reacción es de PET; labolsa de aluminio es de aluminio; y el estuche es de papel.
(4) Deseche cualquier otro reactivo, recipiente o material de laboratorio
usados de acuerdo con la normativa local.

RECOLECCIÓN DE MUESTRAS(1) Las muestras de sangre se deben utilizar inmediatamente despuésde ser tomadas.
(2) Tome las muestras de sangre en una habitación separada de la salade amplificación LAMP. Durante la toma de sangre se pueden
generar aerosoles que contienen ADN Pv y pueden causar una
contaminación.
(3) NO USE EDTA ni citrato como anticoagulantes para la toma desangre si el resultado debe ser leído con fluorescencia. Conviene
utilizar heparina como anticoagulante.

MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS

 LoopampTM PURE DNA Extraction Kit (opcional) HumaHeat (opcional)
Para detección visual de fluorescencia(Para incubadora HumaLoop M)
 HumaLoop M(Para otra incubadora con luz UV)
 Incubadora (precisión de temperatura: ± 0,5°C; con cubierta
térmica) Bloque térmico
 Luz UV o Luz LED Azul (longitud de onda: 240 a 260 nm y 350 a
370 nm) Gafas, máscara o cualquier material de protección ocular para
rayos UV.
Para detección de turbidez en tiempo real
 HumaTurb C+A
Para mezcla de reactivo y muestra
 Micropipetas (10 a 100 µL, y 20 a 200 µL) y puntas de pipeta con
filtro Centrifugadora para microtubos (opcional)
 Centrifugadora para ocho tubos conectados (opcional)
 HuMax ITA (opcional)

PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE ADN DE
MUESTRAPara extraer el ADN de muestras de sangre, conviene utilizar el método
de ebullición y centrfugación, y el método PURE. Los procedimientos
operativos estándar (SOP, por sus siglas en inglés) de ambos métodos
se describen en
https://www.finddx.org/wp-content/uploads/2016/04/SOP-LAMP-Malaria-Aug2012.pdf
Hay que prestar mucha atención a los siguientes puntos críticos delmétodo PURE.
·Muestras: Muestras de sangre tomadas mediante pinchazo en el
dedo y guardadas en tubos con heparina o sangre
seca en papel de filtro·Volumen de la muestra: 30 µL (sangre fresca o sangre con
heparina) o sacabocado de sangre de 6mm (mancha
de sangre seca)·Aditivos: Añadir 30 µL de solución 334mM NaCl (no incluido en el
kit de extracción de LoopampTM PURE DNA ExtractionKit) para tubo térmico antes de calentar·Calentamiento: 5 minutos a 75°C

Diagramas de amplificación de reactivo de detección deMalaria Pv(Analizador : turbidímetro en tiempo real HumaTurb C+A )PRÉPARACIÓN DES RÉACTIVOS

Muestra negativa
Muestra positiva 1
Muestra positiva 2Control negativo
Control positivo
0,7

0,7

0,6

0,6

0,5

0,5

Turbidez

Turbidez(1) Reactivo de detección de Malaria Pv
Retire de la bolsa de aluminio el número necesario de tubos dereacción y póngalos en el rack suministrado. (número de muestras ycontroles).
Nota: tras retirar los tubos necesarios, cierre inmediatamente labolsa con los tubos que no utilice.
(2) Control negativo Mal (NC Mal)
Agite bien el tubo (centrifugar) para recuperar el contenido del fondodel tubo.
Nota: NC Mal se debe utilizar en cada prueba.
(3) Control positivo Mal Pv (PC PV)
Agite bien el tubo (centrifugar) para recuperar el contenido del fondodel tubo.
Nota: PC PV se debe utilizar en cada prueba.

0,4
0,3

0,2

0,1

0,1
0
0

5

10

15

20 25

30 35 40

Tiempo ( min.)Fig1 : Diagramas de amplificaciónpara controles

Mezcla de reactivo y muestra(1) Encienda la HumaLoop M o el turbidímetro en tiempo real
HumaTurb C+A.

10

0,3

0,2

0

PROCEDIMIENTO DE MEDICIÓN

0,4

0

5

10 15

20 25

30 35

40

Tiempo ( min.)Fig2 : Diagramas de amplificaciónpara muestras

NOTAS SOBRE PROCEDIMIENTO

pacientes con persistencia o empeoramiento de los síntomas yhabrá que considerar e investigar otras posibles causas de tales
síntomas. El ensayo LAMP es altamente sensible y puede detectar
hasta los niveles más bajos de parasitemia que no son la causa
directa de los síntomas manifestados. El estado clínico del paciente
debe ser siempre considerado a la hora de realizar un diagnóstico
final y determinar el tratamiento médico adecuado.
(2) Aunque los cebadores se han diseñado para una región con pocas
variaciones, las infecciones por Pv podrían tener más variaciones
en esta región y reducirse así la sensibilidad de este producto. Portanto, una prueba negativa no siempre permite descartar una
infección por Pv.
(3) Este producto es un kit para una detección cualitativa; no estádiseñado para una medición cuantitativa. La intensidad de la luz
fluorescente observada o el aumento de la turbidez medido con elturbidímetro en tiempo real HumaTurb C+A no se corresponden con
el número de matrices de ADN.

(1) La reacción LAMP es muy sensible y la contaminación con
pequeñas cantidades de producto amplificado puede dar falsos
resultados positivos.
(2) Separe la preparación de la muestra de las áreas de amplificación.
(3) Limpie las superficies de trabajo con hipoclorito de sodio al 0,5 %
mínimo antes y después de realizar la prueba.
(4) Cambie los guantes después de transferir la sangre o si toca con
ellos la solución de ADN.
(5) Al manejar este producto, evite la contaminación parasitológica y de
nucleasas. Hasta una pequeña cantidad de contaminación del tubo
de reacción a partir del sudor o la saliva al tubo de reacción puede
descomponer el ADN y dar resultados falsos.
(6) Lea el manual de SOP cuando vaya a realizar una extracción de
ADN.
(7) Conviene utilizar la solución de ADN inmediatamente después desu preparación.
(8) (Para HumaLoop M u otra incubadora con luz UV)
Si aparecen burbujas, agite los tubos para eliminarlas.
(Para el turbidímetro en tiempo real HumaTurb C+A)
Las burbujas en la solución de reacción pueden interferir con la
medición de turbidez y dar resultados falsos, por lo que se debe
evitar la aparición de burbujas al mezclar el reactivo y la solución demuestra. Si aparecen burbujas, agite o centrifugue los tubos paraeliminarlas.
(9) dMAL Pv debería estar completamente disuelto. Cualquier porción
sin disolver puede alterar los resultados, por ejemplo, disminuyendo
la sensibilidad.
(10) El PC PV contiene un elevado número de copias de ADN. Evite
toda contaminación de otras muestras con el PC PV. Dispense lasmuestras y el NC Mal y cierre todos los tubos de reacción antes dedispensar el PC PV.
(11) Agite bien (centrifugar) el tubo de PC PV antes de abrirlo pararecuperar el contenido del fondo del tubo. Cierre el tubo
inmediatamente después de dispensar el PC PV.
(12) No abra nunca los tubos de reacción una vez comenzada lareacción LAMP o tras su finalización. Preste mucha atención alretirar los tubos de reacción de la incubadora y que no se abranaccidentalmente.
(13) Con la HumaLoop M o el turbidímetro en tiempo real HumaTurb
C+A, se realiza automáticamente la inactivación de polimerasa.
(14) Para otras incubadoras, una vez seleccionada la fluorescencia
visual, inactive la polimerasa (5 minutos a 80°C o 2 minutos a 95°C)
antes de evaluar; de lo contrario, se podrían alterar los resultados.
(15) No reutilice ningún producto amplificado en los tubos paraelectroforesis u otras aplicaciones.

SUSTANCIAS INTERFERENTES
Nuestros estudios internos han revelado que la medición deturbidimetria no se vio afectada por la presencia de bilirrubina libre (3µg/µL), bilirrubina conjugada (0,6 µg/µL), quilo (turbidez de formacina:
16.600) y hemoglobina hemolítica (520 µg/µL) y ADN genómico humano(0,2 µg/µL).
Respecto a los fármacos, nuestros estudios internos han revelado que
dicha medición no se vio afectada por la presencia de Isoniazida (700ng/prueba), Etambutol (170 ng/prueba), Rifampicina (3,5µg/prueba),
Pirazinamida (799 ng/prueba), Acetaminofén (269 ng/prueba),
Clarithromycin (372 ng/prueba), Streptomycin (4µg/prueba), Atovaquona(1,33 µg/prueba), Cloroquina (34 ng/prueba), Quinina (800 ng/prueba),
Clorhidrato de doxiciclina (300 ng/prueba), Mefloquina (140 ng/prueba),
Primaquina (15 ng/prueba) y Artemisinin (77,6 ng/prueba).

CARACTERÍSTICAS DE RESULTADOS(1) Sensibilidad y precisión
Al realizar la prueba de las siguientes muestras:
 Muestra Negativa (concentración: 0 copia/prueba) Muestra Positiva 1 (100 copias/prueba) Muestra Positiva 2 (1.000 copias/prueba);
La muestra negativa debe dar negativo y las muestras positivas 1 y 2
deben dar positivo.
(2) Reproducibilidad del método
Al probar cinco muestras negativas y positivas simultáneamente, lamuestra negativa debe dar negativo y la muestra positiva debe darpositivo.
(3) Límite de detección
7,5 copias/prueba(4) Reactividad cruzada
El sistema de medición da resultados positivos para Pv y negativospara otros patógenas como se describe en la siguiente tabla:

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Para detección visual de fluorescencia(Para HumaLoop M)
Coloque cada tubo de reacción en la unidad de detección defluorescencia, irradie y observe el tubo por un lado.
(Para otra incubadora con luz UV)
Irradie la base de cada tubo de reacción desde un lado utilizando gafas
o un equipo de protección UV adecuado.
Para que la ejecución de una prueba sea válida, hay que obtener lossiguientes resultados: Control Positivo: Se emite una luz verde fluorescente.
 Control Negativo: No se emite una luz verde fluorescente.

Genre Plasmodium
Plasmodium vivax
Plasmodium falciparum
Plasmodium ovale
Plasmodium malariae

Positivo
Negativo
Negativo
Negativo

Otros patógenos
Trypanosoma brucei rhodesiense
Trypanosoma brucei gambiense
Trypanosoma cruzi
Trypanosoma rangeli
Leishmania donovani
Leishmania infantum
Leishmania chagasi
Leishmania gyuanesis
Leishmania tropica
Schistosoma mansoni
Theileria parva
Mycobacterium tuberculosis
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenza
Virus de inmunodeficiencia humana

Si ningún control es válido, todas las muestras deben ser consideradas
inválidas y habrá que volver a comprobar las muestras.
Una vez que se confirma que la ejecución de la prueba es válida,
evalúe las muestras como se indica a continuación: Muestra Positiva: Se emite una luz verde fluorescente.
 Muestra Negativa: No se emite una luz verde fluorescente.
Para detección de turbidez en tiempo real HumaTurb C+A
Una vez que se confirma que la turbidez aumenta en de control
positivo, pero no en la solución de control negativo, evalúe las muestras
de acuerdo con los siguientes criterios (Fig1 y 2).
 Positivo: Se observa cierto aumento de la turbidez.
 Negativo: No se observa aumento de la turbidez.
Notas :
(1) La sensibilidad de detección mínima de MALARIA Pv Detection Kit
es de 7,5 copias por prueba respectivamente. En caso de un
resultado de prueba negativo, se deberán repetir las pruebas a los

Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo(5) Información sobre el calibrador
En la prueba de rendimiento para este producto se utilizó ADN
plasmídico con ADN mitocondrial de Pv como calibrador.

11(6) Desempeño clínico
La malaria es una enfermedad producida por parásitos del género
Plasmodium y transmitida por la picadura de mosquitos infectados.
Tras madurar en el hígado, se liberan más parásitos en el torrente
sanguíneo que infectan los glóbulos rojos, donde se reproducen parasalir e infectar más células y aparecen entonces los primeros
síntomas, como la fiebre. El ensayo LAMP detecta el ADN de losparásitos en sangre.

DIAGRAMA
Principios de funcionamiento para la detección de turbidez
en tiempo real
Preparación de la solución de muestra
Prepare soluciones de ADN de muestra extrayendo
ADN de las muestras de sangre tomadas.

De 560 muestras de sangre recolectadas para un estudio realizado
en Perú6), se extrajo ADN mediante el método de baño de maría ycentrífuga7) y se analizó utilizando MALARIA Pv Detection Kit. La
sensibilidad y especificidad de MALARIA Pv Detection Kit frente a la
PCR anidada fue de 84,6% y 92,0%, respectivamente.

MALARIA Pv
Detection Kit
vsnested PCR

Sensibilidad

Especifidad(95% CI)(95% CI)

84,6%

92,0%

(78,9-89,6)(88,8-94,5)

Preparación del reactivo

Tome el número necesario de tubos dereacción de dMAL Pv.
(para muestras, controles
negativos y positivos)

Mezcla del reactivo y la solución de la muestra
Vierta 30 µL de muestra o solución de control en cadatubo de reacción.

INFORMACIÓN DE PEDIDOS
Código deNombre deproducto

producto

Contenido

Utilice NC Mal como control negativo.
Utilice PC PV como control positivo.
(El control positivo se debe preparar al final)

96 pruebas

Invierta los tubos de reacción para tomar la solución deltapón. Deje los tubos boca abajo durante 2 minutos.

Loopamp™
975000

MALARIA Pv
Detection Kit

1 Unidad Principal
962000

HumaLoop M

1 Unidad de Control Visual deInvierta los tubos de reacción 5 veces para mezclar elcontenido y centrifúguelos.
(Evite la formación de burbujas)

Fluorescencia
970000Loopamp™ PUREDNA Extraction Kit

90 Pruebas

Amplificación
Coloque los tubos de reacción en el bloque de reacción delturbidímetro.

1 Unidad de Control

963200

HumaTurb C+A

980000

HuMax ITA

Centrífugas de Sobremesa

964000

HumaHeat

Bloque Térmico

1 Unidad de Amplificación

Como se indica en las instrucciones de uso delturbidímetro, lance la reacción y mida y evalúe laturbidez (40 minutos a 65,0°C).

BIBLIOGRAFÍA
1) Notomi T., et al.: Nucleic Acids Research 28, No. 12, e63 (2000)
2) Nagamine K., et al.: Clin. Chem. 47, No. 9, 1742–1743 (2001)
3) Mori Y., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, No. 1, 150–
154 (2001)
4) Tomita N., et al.: Nat. Protoc. 3, No. 5, 877–882 (2008)
5) La directriz para la bioseguridad y el riesgo biologico (por laSociedad Japonesa de Bacteriologia): Japanese Journal of
Bacteriology 54, No. 3, 667–715 (1999)
6) El estudio se realizó en una colaboración entre FIND y la
Universidad Peruana Cayetano Heredia (UPCH).
7) https://www.finddx.org/wp-content/uploads/2016/04/SOP-LAMPMalaria-Aug2012.pdf

Confirme la finalización de la inactivación de polimerasa (5 minutos a
80°C o 2 minutos a 95°C). Tome todos los tubos de reacción delturbidímetro y deséchelos sin abrirlos. Tenga mucho cuidado de nodañar los tubos.

VD
Distribuidor exclusivo

Max-Planck-Ring 21, 65205 Wiesbaden, Germany

Fecha de revisión: 1 de octubres de 201812

Gebrauchsanweisung*3: PC PV enthält ein Produkt, das durch in vitro Amplifikation eines
artifiziellen Gens der mitochondrialen Pv DNA (GenBank
No.AF055587) hergestellt wurde.

975000DeutschLoopampTM MALARIA Pv

Die Abkürzungen der Namen folgender Reagenzien, die Lot Nummer
und der Hersteller (EKN) sind auf die Boxen gedruckt. Die
Reagenzbezeichnung ist Teil des Codes auf dem Deckel.

Detection Kit

Reagenzien
Positivkontrolle Mal Pv

VERWENDUNGSZWECK
Das LoopampTM MALARIA Pv Detection Kit ist ein qualitativer, In
Vitro diagnostischer Test für den Nachweis von Plasmodium vivax
DNA in menschlichem Blut.

Negativkontrolle Mal

Beschriftung
PC PV
Lot No., EKN
NC MalLot No., EKN

Deckelcode
PC
PV
NC
Mal

WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMENTEST PRINZIP(1) Nur für den Gebrauch in der In-vitro Diagnostik.
(2) Dieses Produkt wurde nur für den Nachweis der DNA von Pv
Parasiten in menschlichem Blut hergestellt. Nicht für andere
Zwecke verwenden.
(3) Immer die Gebrauchsanweisung beachten, wenn das Produkt
verwendet wird.
(4) Reagenzien nicht einfrieren.
(5) Keine abgelaufenen Reagenzien verwenden.
(6) Unterschiedliche Lots nicht mischen.
(7) Reagenzien nicht wieder auffüllen.
(8) Die Testleistung des Loopamp™ MALARIA Pv Detection Kit ist vonden Fähigkeiten des Anwenders und dem Beachten derGebrauchsanweisung abhängig. Der Test sollte nur vongeschultem Personal durchgeführt werden.
(9) Licht- und Hitzeexposition könnten dMAL Pv unbrauchbar machen.
Nur die benötigte Anzahl der Reaktionsröhrchen entnehmen(Anzahl der Proben und Kontrollen) und den Aluminiumbeutel
unmittelbar danach wieder verschließen.
(10) Das Trockenmittel nicht aus dem Aluminiumbeutel entfernen. Hohe
Feuchtigkeit kann zum Verderben des getrockneten LAMP
Reagenz in den Reaktionsröhrchen führen.
(11) Gebrauchsanweisung lesen und vor Beginn des Testes
sicherstellen, dass die benötigten Geräte (Real-Time Turbidimeteroder Inkubator etc.) vorhanden sind.
(12) Blutproben stellen ein potenzielles Risiko für Infektionen dar undmüssen entsprechend behandelt werden, um Biogefährdung zu
vermeiden.5)(13) PC PV und NC Mal enthalten geringe Mengen Natriumazid als
Konservierungsmittel. Natriumazid wird als toxisch eingestuft.
Kontakt mit Augen, Mund oder Haut vermeiden.
(14) Bei Kontakt von Augen, Mund und Haut mit Reagenzien sofort mit
viel Wasser abspülen. Wenn notwendig, medizinische Hilfe in
Anspruch nehmen.
(15) PC PV nicht zur Patientenprobe geben oder damit verdünnen. PC
PV nur so verwenden, wie es in der Gebrauchsanweisung steht,
um DNA Kontaminationen zu vermeiden.
(16) PC PV und positive Blutproben getrennt von anderen
Kitkomponenten aufbewahren.
(17) Der Deckel jedes Reaktionsröhrchens enthält dMAL Pv ingetrockneter Form. Die Innenseite des Deckels nicht berühren.
(18) Vor Verwendung der Reaktionsröhrchen prüfen, ob es Brüche oderKratzer aufweist. Beschädigte Röhrchen können zu falschen
Ergebnissen und DNA Kontaminationen im Inkubator oder desArbeitsbereiches führen.
(19) Die Reaktionsröhrchen nicht dem UV Licht vor Ende der LAMP
Reaktion aussetzen. Dies kann zu Beschädigungen desRöhrchens oder falschen Ergebnissen führen.
(20) Wird ein UV Licht für den visuellen Nachweis verwendet, nicht
direkt in das UV Licht sehen. Eine kurze Exposition mit UV Licht ist
für Augen schädlich und kann schon nach kurzer Zeit zu
Augenirritationen und Symptomen ähnlich einer Konjunktivitis
führen. Glasschirme, Brillen oder Augenmasken verwenden, wenndirekt in die UV Licht gesehen wird.
(21) Vor Verwendung die Gebrauchsanweisung für den Inkubatorlesen. Wenn HumaLoop M oder HumaTurb C+A verwendet
werden, die Reaktionsröhrchen vorsichtig aus dem Inkubatornehmen, um Verbrennungen zu vermeiden.

Dieses Produkt basiert auf einer Loop-vermittelten Amplifikation(LAMP) von Nukleinsäuren, die von Eiken Chemical Co., Ltd.
entwickelt wurde.
Die LAMP Methode hat folgende Eigenschaften: (1) Die
Amplifikationsreaktion läuft unter isothermalen Bedingungen ab, bei
der nur ein Enzym benötigt wird;1),2) (2) Durch die Verwendung von vierPrimerpaaren, die sechs verschiedene Regionen auf der Ziel-DNA
erkennen, wird eine sehr hohe Spezifität erreicht; (3) Die Amplifikation
findet in einer kurzen Zeit mit einer sehr hohen Effizienz statt und dervisuelle oder automatisierte Nachweis wird durch die Herstellung
großer Mengen des amplifizierten Produktes ermöglicht. 3),4)
Die zielgerichteten DNA-Sequenzen der P. vivax (Pv) Primer
erkennen Abschnitte auf der mitochondrialen DNA. Die ausgesuchten
DNA Sequenzen wurden mit Übereinstimmungsanalysen als
spezifisch für Pv identifiziert.
Die DNA Lösung, die aus Blut extrahiert wurde, wird in ein
Reaktionsröhrchen gegeben. Die Strang-Displacement DNA
Polymerase, Desxoynukleotidtriphosphate (dATP, dCTP, dGTP unddTTP), Calcein und Malaria Pv oder P. vivax (Pv) spezifische Primer
liegen getrocknet im Deckel des Reaktionsröhrchens vor. Diese
getrockneten LAMP Reagenzien (Malaria Pv Detektionsreagenz,
dMAL Pv) werden gelöst, wenn die DNA Lösung dazugegeben wird.
Die Reaktion wird bei 65,0°C inkubiert und die DNA durch Katalyse
der Strang-Displacement DNA Polymerase während der LAMP
Reaktion amplifiziert.
Der Nachweis der amplifizierten Produkte basiert auf
Trübungsmessung des Nebenproduktes Magnesiumpyrophosphat(weißes Präzipitat).3) Anstelle der Trübungsmessung kann der Testauch visuell unter UV Licht ausgewertet werden. Vor der Reaktion liegt
Calcein im Reagenz, bedingt durch die Bindung von Manganionen, im
gehemmten Zustand vor. Nach Start der LAMP Reaktion werden
Pyrophosphationen gebildet, welche die Manganionen binden und
das Calcein kann fluoreszieren. 4)

KITBESTANDTEILE
Die Reagenzien sind bis zum angegebenen Datum auf dem Etikett
stabil, wenn die Testbox ungeöffnet bei einer Temperatur von 2-30°C
gelagert wird.
Malaria Pv Detektionsreagenz (dMAL Pv) ··········· 2 x 48 Röhrchen
Die folgenden Bestandteile sind in jedem Röhrchen ingetrockneter Form vorhanden:
Bst DNA Polymerase*1
Desoxynuleotidtriphosphate
Magnesiumsulfat
Calcein
Manganchlorid
Primer*2
Positivkontrolle Mal Pv (PC PV)*3 ···················· 1 x 1,0 mL
Negativkontrolle Mal (NC Mal) ························ 3 x 0,5 mL
30 µL Pipette ········································· 5 x 12 Pipetten*1: Bst DNA Polymerase aus Bacillus stearothermophilus ist eine
Strang-Displacement DNA Polymerase, der die 5’→3’
Exonucleaseaktivität fehlt.
*2: Primer wurden zum Nachweis der mitochondrialen DNA von
Plasmodium Parasiten hergestellt und aus synthetisierten
Oligonukleotiden mittels HPLC aufgereinigt.

13

(22) PC PV nicht als Positivkontrolle für das LoopampTM MALARIA Pf
Detection Kit oder LoopampTM MALARIA Pan Detection Kit
verwenden. Positivkontrolle von LoopampTM MALARIA Pf
Detection Kit oder LoopampTM MALARIA Pan Detection Kit nicht
als Positivkontrolle für das LoopampTM MALARIA Pv Detection Kit
verwenden.

Aluminiumbeutel mit den nicht benötigten Röhrchen sofort
verschließen.
(2) Negativkontrolle Mal (NC Mal)
Vor Verwendung Röhrchen anzentrifugieren, damit sich der Inhalt
auf dem Boden des Röhrchens sammelt.

Beachte: Eine Negativkontrolle sollte bei jeder LAMP
Reaktion gemessen werden.

ABFALLENTSORGUNG(3) Positivkontrolle Mal Pv (PC PV)
Vor Verwendung Röhrchen anzentrifugieren, damit sich der Inhalt
auf dem Boden des Röhrchens sammelt.

(1) Die Röhrchen nicht nach der DNA Amplifikation öffnen. Das
Röhrchen geschlossen lassen und als medizinischen Abfall in zweiübereinander gezogene, verschlossene Plastikbeutel entsorgen.
(2) Reaktionsröhrchen niemals autoklavieren und wieder verwenden.
Die Röhrchen würden auslaufen und Kontaminationen
verursachen.
(3) Die Reaktionsröhrchen und die Reagenzienröhrchen bestehen aus
PP, der Reagenzienständer aus PET, der Beutel aus Aluminium
und die Kitbox aus Papier.
(4) Verwendete Reagenzien, Labormaterial und Boxen nach den
lokalen Bestimmungen entsorgen.

Beachte: PC PV sollte bei jeder LAMP Reaktion gemessen
werden.

MESSMETHODE
Mischen von Reagenzien und Probe(1) Den HumaLoop M oder den Real-Time Turbidimeter HumaTurb
C+A einschalten.
(2) 30 μL der extrahierten DNA Lösung in das Reaktionsröhrchen
geben und das Röhrchen verschließen.
(3) 30 μL NC Mal mit der Pipette oder der delieferten Pipette in ein
Reaktionsröhrchen geben und das Röhrchen verschließen.
(4) 30 μL PC PV mit der Pipette oder der delieferten Pipette in ein
Reaktionsröhrchen geben und das Röhrchen verschließen.
(5) Alle Röhrchen anzentrifugieren, damit die Lösungen auf den
Boden des Röhrchens gesammelt werden.

PROBENENTNAHME(1) Blutproben sollten unmittelbar nach Probengewinnung verwendet
werden.
(2) Blut in einem separaten, von der LAMP Reaktion abgetrennten
Raum abnehmen. Aerosole, die während der Probengewinnung
entstehen und Pv DNA enthalten, können Kontaminationen
verursachen.
(3) KEIN EDTA und Citrat als Antikoagulanzien bei der Blutentnahmeverwenden,wenn
dasErgebnismittelsvisuellen
Fluoreszenznachweis generiert wird. Die Verwendung von Heparin
als Antikoagulanz wird empfohlen.

Beachte: Bei Verwendung des Loopamp™ PURE DNA
Extraction Kit sicherstellen, dass sich der Flüssigkeitsstandnäher an der oberen Linie des Reaktionsröhrchens befindet.
(6) Die getrockneten Reagenzien im Deckel durch Invertieren desReaktionsröhrchens lösen und die DNA Lösung im Deckel
sammeln. Die Röhrchen umgekehrt für 2 Minuten stehenlassen,
damit die getrockneten Reagenzien gelöst werden.
(7) Die Reaktionsröhrchen fünfmal invertieren, um die Bestandteile zu
mischen. Sicherstellen, dass die getrockneten Reagenzien im
Deckel vollständig gemischt werden (die Lösung sollte eine orange
Farbe haben).
(8) Alle Röhrchen anzentrifugieren, damit die Lösungen auf den
Boden der Röhrchen gelangen.
Amplifikation
Für den visuellen Fluoreszenznachweis(Mit HumaLoop M)(1) Überprüfen, dass die Temperatur des HumaLoop M 65,0°C
erreicht hat.
(2) Die Reaktionsröhrchen in den HumaLoop M stellen und den
grünen Schalter betätigen, um die LAMP Reaktion zu starten (40Min. bei 65,0°C). Die Gebrauchsanweisung für den HumaLoop M
befolgen.
(3) Überprüfen, ob die Inaktivierung der Polymerase stattgefunden hat(erfolgt automatisch beim HumaLoop M). Alle Reaktionsröhrchen
aus dem HumaLoop M nehmen.
(Für andere Inkubatoren und UV Licht)(1) Die
TemperaturdesInkubators(mit
Heizdeckel;
Temperaturgenauigkeit: ± 0,5°C) auf 65,0°C einstellen. (Miteinem beheizbaren Deckel sollte die Temperatur ca. 10°C über der
Reaktionstemperatur eingestellt werden). Warten bis die
eingestellte Temperatur erreicht ist und auf dem Display
angezeigt wird.
(2) Alle Reaktionsröhrchen in den Inkubator stellen und die
Amplifikationsreaktion starten (40 Min. bei 65,0°C).
(3) Nach Ablauf der 40 Min. Inkubationszeit, die Polymerase durch
Erhitzen für 5 Min. bei 80°C oder 2 Min. bei 95°C inaktivieren.
Für den Nachweis mit Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A(siehe Methodenübersicht)(1) Den Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A für den dieses
produkt Nachweis konfigurieren.
(2) Überprüfen, dass die Temperatur von 65,0°C erreicht hat.
(Turbidimeter 20 Min. vor Gebrauch vorwärmen).
(3) Die Reaktionsröhrchen in den HumaTurb C+A stellen und
Messung starten.
(4) Während der Inkubation überprüfen, ob die Trübung derPositivkontrolle zunimmt. Diese wird auf dem Display angezeigt.
Wenn die Trübung in PC Mal zunimmt, aber nicht die von NC Mal,
verläuft die Amplifikationsreaktion erwartungsgemäß (Fig1). Ist
dies nicht der Fall, läuft die Amplifikationsreaktion nicht richtig. Den
Test ab Vorbereitung der Reagenzien mit den betroffenen Proben
wiederholen.

BENÖTIGTES MATERIAL, NICHT ENTHALTEN· LoopampTM PURE DNA Extraction Kit (optional)· HumaHeat (optional)

Für den visuellen Fluoreszenznachweis(Mit HumaLoop M)· HumaLoop M(Für andere Inkubatoren mit UV Licht)· Inkubator ( Temperaturgenauigkeit:  0,5C; mit Heizdeckel)· Heizblock· UV Licht oder blaues LED Licht ( We l l e n l ä n g e : 240-260 nm und
350-370 nm )· Brille und Augenschutzmaske
Für den Nachweis mit dem Real-Time Turbidimeter· HumaTurb C+A
Zum Mischen von Reagenz und Probe· Mikropipetten (10-100 µL und 20-200 µL) und Filterspitzen· Zentrifuge für PCR Röhrchen (optional)· Zentrifuge für acht verbundene Röhrchen (optional)· HuMax ITA (optional)

HERSTELLUNG DER DNA LÖSUNG
Um DNA aus Blut zu extrahieren, werden die Kochen & Zentrifugieren
sowie
die
PURE
Methodeempfohlen.
Die
Standardarbeitsanweisungen für beide Methoden sind auf derfolgenden Internetseite zufinden:
https://www.finddx.org/wp-content/uploads/2016/04/SOP-LAMP-Malaria-Aug2012.pdf
Für die PURE Methode folgende kritische Punkte beachten:· Proben: Blutproben, die durch Stechen in die Fingerbeere(Fingerprick), erhalten wurden, in Heparinröhrchen
aufgenommen wurden oder Vollblut, das auf
Filterpapier getropft wurde·Probenvolumen: 30µL (frisches Blut oder Blut mit Heparin) oder
6mm Blutstropfenstanze (getrockneter Blutstropfen)·Zusätze: 30µL 334mM NaCl Lösung (nicht im LoopampTM PUREDNA Extraction Kit enthalten) zum Lyseröhrchen vor
Erhitzen zugeben·Erhitzen: Für 5 Min. bei 75°C

VORBEREITUNG DER REAGENZIEN(1) Malaria Pv Detektionsreagenz
Die benötigte Anzahl Röhrchen aus dem Aluminiumbeutel
entnehmen und in den mitgelieferten Röhrchenständer stellen(Anzahl der Proben und Kontrollen).

Beachte: Nach Entnahme der benötigten Röhrchen, den

14

(5) Überprüfen der Inaktivierung der Polymerase (erfolgt automatischdurch den Turbidimeter). Alle Reaktionsröhrchen aus dem
HumaTurb C+A nehmen, ohne sie zu öffnen.

Röhrchen von der Seite betrachten.
(Für andere Inkubatoren mit UV Licht)
UV Lampe einschalten und den Boden jedes Röhrchens von der Seite
mit Schutzbrille oder anderen schützendem Equipment betrachten.
Für eine gültige LAMP Reaktion sollten die folgenden Ergebnisse
erhalten werden: Positivkontrolle: Grünes fluoreszenzlicht wird ausgestrahlt.
 Negativkontrolle: Kein fluoreszenzlicht wird ausgestrahlt.
Wenn eine Kontrolle ungültig ist, sollten alle Proben als ungültig
beurteilt und erneut getestet werden. Nach Bestätigung einer gültigen
LAMP-Reaktion sollten die Proben
wie folgt beurteilt werden: Positive Probe: Grünes Fluoreszenzlicht wird ausgestrahlt.
 Negative Probe: Kein Fluoreszenzlicht wird ausgestrahlt.
Für den Nachweis mit Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+ANach Bestätigung der Trübungszunahme in der Positivkontrolle (abernicht in der Negativkontrolle), sollten die Proben nach folgenden
Kriterien beurteilt werden (Fig 1 und 2):
 Positiv: Zunahme der Trübung.
 Negativ: Keine Zunahme der Trübung.
Beachte:(1) Die minimale Detektionssensitivität des MALARIA Pv Kits ist 7,5Kopien/Test. Bei einem negativen Testergebnis bei Patienten mit
persistierenden Symptomen, die für eine Infektion mit Malaria
sprechen oder bei Verschlechterung der Symptomatik, sollte
erneut getestet werden. Jedoch müssen auch andere Ursachen für
die verschlechterte Symptomatik in Betracht gezogen werden. Der
LAMP Assay ist hoch sensitiv und kann niedrige Konzentrationen
bei Parasitämien nachweisen, die nicht in direktem
Zusammenhang mit den Symptomen des Patienten stehen. Fürdie letztendliche Diagnose und bei der Festlegung der Therapie
sollten immer alle klinischen Umstände einbezogen werden.
(2) Obwohl die Primer für eine Region mit sehr wenigen Variationen
hergestellt wurden, ist es denkbar, dass Infektionen mit Pv
stattfinden können, die Variationen in der Zielregion aufweisen, diediese Produkt nicht detektiert. Deshalb schließt ein negatives
Testergebnis eine Infektion mit Pv nicht aus.
(3) Dieses Produkt wurde für den qualitativen Nachweis entwickelt undnicht für quantitative Messungen. Die Intensität der Fluoreszenz
oder die Zunahme der Trübung über die Zeit, die mit dem
Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A gemessen wird, korreliert
nicht mit der Konzentration der Template DNA.

Amplifikationplots Malaria Pv Detektionsreagenz(Analysator : Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A)
Negative Probe
Positive Probe 1
Positive Probe 2

0,7

0,7

0,6

0,6

0,5

0,5

Trübung

Trübung

Negativkontrolle
Positivkontrolle

0,4
0,3

0,4
0,3

0,2

0,2

0,1

0,1
0

0
0

5

10

15

20

25

30 35 40

Zeit ( Min.)
Fig1:Amplifikationsplots Kontrollen

0

5

10

15

20

25

30 35 40

Zeit ( Min.)
Fig2:Amplifikationsplots Proben

HINWEISE(1) Die LAMP Reaktion ist sehr sensitiv und Kontaminationen mit
kleinen Mengen des amplifizierten Produktes können zu falschpositiven Ergebnissen führen.
(2) Probengewinnung räumlich von der LAMP Reaktion trennen.
(3) Alle Arbeitsbereiche vor und nach Durchführung des Testes mit >
0,5% Natriumhypochloridlösung behandeln.
(4) Handschuhe nach Transfer des Blutes oder nach Kontakt mit der
DNA Lösung wechseln.
(5) BeiVerwendung
dieses
Produktes
parasitologische
Kontaminationen und Kontaminationen mit Nukleasen vermeiden.
Der Transfer von kleinen Mengen DNAse aus Schweiß oder
Speichel in die Reaktionsröhrchen kann falsche Ergebnisseverursachen.
(6) Vor Verwendung die SOP lesen.
(7) Die DNA Lösung sollte idealerweise unmittelbar nach derPräparation verwendet werden.
(8) (Für HumaLoop M oder andere Inkubatoren mit UV Licht)
Wenn Blasen erkennbar sind, Röhrchen mit dem Finger
anschnippen.
(Für Real-Time Turbidimeter HumaTurb C+A)
Blasen in der Reaktionslösung können mit der Trübung
interferieren und zu falschen Ergebnissen führen. Deshalb
Blasenbildung beim Mischen der DNA Lösung und derReagenzien vermeiden. Treten dennoch Blasen auf, Röhrchen mit
dem Finger anschnippen.
(9) dMAL Pv sollte vollständig gelöst sein. Ungelöstes Material
beeinflusst die Testleistung und kann eine geringere Sensitivität
zur Folge haben.
(10) PC PV enthält eine große Menge Kontroll-DNA. Jegliche
Kontamination der PC PV mit anderen Proben vermeiden. Proben
und NC Mal in die Reaktionsröhrchen geben und alle Röhrchen
gut verschließen, bevor PC PV verwendet wird.
(11) Vor dem Öffnen, PC PV anzentrifugieren, damit sich die Flüssigkeit
auf den Boden des Röhrchens sammelt. Das Röhrchen sofort
nach Aufteilung von PC PV verschließen.
(12) Reaktionsröhrchen niemals nach Start oder Beendigung der LAMP
Reaktion öffnen. Besonders vorsichtig sein, wenn die Röhrchen
aus dem Inkubator genommen werden, um unbeabsichtigtesÖffnen zu vermeiden.
(13) Werden HumaLoop M oder der Real-Time Turbidimeter HumaTurb
C+A verwendet, wird die Polymerase automatisch inaktiviert.
(14) Für den visuellen Fluoreszenznachweis mit Inkubatoren undanderen UV Lampen, Polymerase für 5 Min. bei 80°C oder 2 Min.
bei 95°C inaktivieren. Anderenfalls können falsche Ergebnisse
entstehen.
(15) Das amplifizierte Produkt nicht für Gelelektrophorese und andere
Applikationen verwenden.

INTERFERIERENDE SUBSTANZENInterne Untersuchungen haben gezeigt, dass die Messungen durch
folgende Substanzen nicht beeinflusst werden: freies Bilirubin (3 μg/μL),
konjugiertes Bilirubin (0,6 μg/μL), Darmlymphe (Formazin
Trübung:16.600), hämolytisches Hämoglobin (520 μg/μL) und humane
genomische DNA (0,2 μg/μL).
Interne Untersuchungen zum Einfluss von Medikamenten haben
gezeigt, dass die Messungen durch folgende Substanzen nicht
beeinflusst werden: Isoniazid (700 ng/Test), Ethambutol (170 ng/Test),
Rifampicin (3,5 μg/Test), Pyrazinamid (799 ng/Test), AcetaMin.ophen(269 ng/Test), Clarithromycin (372ng/Test), Streptomycin (μg/Test),
Atovaquon (1,33 μg/Test), Chloroquine (34 ng/Test), Quinine (800ng/Test), Doxycyclinehydrochlorid (300 ng/Test), Mefloquin (140ng/Test), Primaquin (15 ng/Test) und Artemisinin (77,6 ng/Test).

LEISTUNGSDATEN(1) Sensitivität und Genauigkeit
Folgende Proben wurden getestet: Negative Probe ( K onzentration : 0 Kopien/Test ) Positive Probe 1 (100 Kopien/Test ) Positive Probe 2 (1.000 Kopien/Test ) ;Die negative Probe wurde negativ und die positiven Proben 1 und 2
positiv getestet.
(2) Intra-Assay Reproduzierbarkeit
5 negative und 5 positive Proben wurden gleichzeitig getestet. Die
negativen Proben wurden negativ, die positiven Proben wurden
positiv getestet.
(3) Nachweisgrenze
7,5 Kopien/Test(4) Kreuzreaktivität
Das Messsystem testete positiv für Pv und negativ für alle anderen
Pathogene, wie in der folgenden Tabelle angegeben:

INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
Für den visuellen Fluoreszenznachweis(Mit HumaLoop M)
Das
Reaktionsröhrcheninden
Röhrchenständer
derFluoreszenzdetektionseinheit stellen, UV Lampe einschalten und das

15

Gattung Plasmodium
Plasmodium vivax
Plasmodium falciparum
Plasmodium ovale
Plasmodium malariae7) https://www.finddx.org/wp-content/uploads/2016/04/SOP-LAMPMalaria-Aug2012.pdf

Positiv
Negativ
Negativ
Negativ

Methodenübersicht
Durchführung mit Real-Time Turbidmeter

Andere Pathogene

Herstellung der Probenlösung

Trypanosoma brucei rhodesiense
Trypanosoma brucei gambiense
Trypanosoma cruzi
Trypanosoma rangeli
Leishmania donovani
Leishmania infantum
Leishmania chagasi
Leishmania gyuanesis
Leishmania tropica
Schistosoma mansoni
Theileria parva
Mycobacterium tuberculosis
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenza
Human immunodeficiency virus

Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ

Herstellen der DNA Lösungen durch Extraktion
aus Blutproben.

Herstellung Reagenzien( Für Proben, Negativ- und
Positivkontrollen)

Mischen der Reagenzien mit der Probenlösung
3 0 µL
Probeoder
Kontrolllösung
Reaktionsröhrchen geben.

(5) Informationen zum Kalibrator
Für die Erhebung der Leistungsdaten des Testes wurde eine
Plasmid-DNA verwendet, die mitochondriale DNA von Pv als
Kalibrator enthält.
(6) Klinische Leistung
Malaria wird durch verschiedene Parasiten verursacht, die zum
Genus Plasmodium gehören und über Bisse von infizierten
Moskitos übertragen werden. Nach einem Entwicklungszyklus inder Leber werden die Parasiten ins Blut abgegeben. Dort lysieren
die Plasmodien Zellen während ihrer Reproduktion undverursachen Symptome inkl Fieber.
Von 560 Blutproben, die in einer Studie in Peru6) gesammelt wurden,
wurde die DNA mithilfe der Kochen + Zentrifugieren Methode7)
extrahiert und mit dem MALARIA Pv Detection Kit getestet. Die
Sensitivität und Spezifität des MALARIA Pv Detection Kit gegenüber
der nested PCR lag bei 84,6% und 92,0%.

MALARIA Pv
Detection Kit
vsnested PCR

Die benötigte Anzahl Reaktionsröhrchen
dMAL Pv entnehmen.

Sensitivität

Spezifität(95% CI)(95% CI)

84,6%

92,0%

(78,9-89,6)(88,8-94,5)

Produktname

Inhalt975000Loopamp™
MALARIA Pv
Detection Kit

96 Tests

962000

HumaLoop M

1 Inkubatioseinheit
1 Fluoreszenzdetektionseinheit

970000Loopamp™ PUREDNA Extraction
Kit

90 Tests

963200

HumaTurb C+A

1 Kontrolleinheit
1 Amplifikationseinheit

980000

HuMax ITA

Tischzentrifuge

964000

HumaHeat

Heizblockjedes

NC Mal als Negativkontrolle.
PC PV als Positivkontrolle verwenden.
(Die Positivkontrolle sollte zuletzt angesetzt werden.
Reaktionsröhrchen umdrehen, damit sich die
Flüssigkeit im Deckel sammelt. 2 Min.
umgekehrt stehenlassen.

Um Reagenzien zu mischen, Röhrchen 5 mal
invertieren und an zentrifugieren.
(Blasen vermeiden)
Amplifikation
Röhrchen in den Reaktionsblock des Turbidimetersstellen.
Wie in der Gebrauchsanweisung angegeben, Reaktion
starten und Trübung messen (40 Min. bei 65,0C).
Überprüfen, ob die Polymerase vollständig inaktiviert wurde (5 Min.
bei 80°C oder 2 Min. bei 95°C). Alle Reaktionsröhrchen aus dem
Real-Time Turbidimeter nehmen, ohne sie zu öffnen. Röhrchen nichtbeschädigen.

BESTELLINFORMATIONEN
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REFERENZEN
1) Notomi T., et al.: Nucleic Acids Research 28, No. 12, e63 (2000)
2) NagaMin.e K., et al.: Clin. Chem. 47, No. 9, 1742–1743 (2001)
3) Mori Y., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, No. 1,
150–154 (2001)
4) Tomita N., et al.: Nat. Protoc. 3, No. 5, 877–882 (2008)
5) Die Leitlinie für die Bio-Sicherheit und Bio-Hazard (von derJapanischen Gesellschaft für Bakteriologie): Japanese Journalof Bacteriology 54, No. 3, 667–715 (1999)
6) Die Studie wurde in Zusammenarbeit zwischen FIND und derUniversität Peruana Cayetano Heredia (UPCH) durchgeführt.

Max-Planck-Ring 21, 65205 Wiesbaden, Germany

Revisisonsdatum: 1. Oktober, 201816380263-A