LC-MS を基盤とした天然物メタボロミクスにおけるベンチマーク型
包括的品質管理評価指標混合物の開発
Establishment of a quality control mixture for benchmarking LC-MS based
dereplication protocols in natural product research
徳島文理大学
派遣期間
研究機関
研究指導者

堂上（久保）美和
2016 年 9 月 1 日～2018 年 3 月 31 日
School of Pharmaceutical Sciences, EPGL, University of Geneva
Rue Michel-Servet, CH-1211 Geneva 4, Switzerland
Prof. Jean-Luc WolfenderIn natural products research, recent dereplication workflows are usually based on the treatment of data obtained
from generic untargeted metabolite profiling by UHPLC-HRMS/MS of crude extracts. When applied on large collectionof complex NPs extracts, the amount of information generated by such approaches is extremely important and requires
to finely tune the acquisition parameters. Additionally, various computational solutions, each presenting a great numbersof parametrical options, exists to mine the generated data. In order to assess the overall quality of the NPs profiling anddereplication workflows I propose to use a well-defined Quality Control sample mixture prepared from the combinationof 5 extensively described plants of the European Pharmacopeia for which extensive phytochemical studies have beenperformed. Plants were selected by mapping the chemical space of their constituents against the space occupied by all
NPs known to date for the best coverage and extended polarity range. This mixture was analyzed in different conditions
and MS/MS acquisition modes on different MS platforms. The quality of automated annotations was also assessed invarious chromatographic regions. The results suggested that this plant mixture easily generable in any laboratory could
become a universal QC for the quality evaluation of NPs profiling and annotation workflows.

研究目的

う話はよくあることである。効率良く新規骨格、構世界で市販されている医薬品の 80 % 以上は何ら造を有するリード化合物を見つけ出すために生まれかの形で天然物の骨格および情報が反映されている。

たのが Dereplication である。Dereplication とは「迅有用な植物から活性成分を明らかにする場合、複数速、かつ効率的な既知物質の同定」ということであの精製方法を組合せ、活性を指標にして活性成分をる。特に最近は LC-MS や UPLC-MS2 を利用した単離し、構造決定する戦略が従来の一般的な戦略でdereplication が開発されている。中でも Molecularある。この手法は、確実に構造を決定出来るというnetworking (MN) は MS2 データを活用し、MS フラ長所はあるものの、膨大な時間と労力と共に溶媒やグメント情報から類似構造を有する物質をクラスタシリカゲルなどのコストがかかる医薬品の開発を行ー化させ、データベースに基づいて既知物質を単離うためには、各テーマに合った生理活性を有し基本することなく同定できる手法である。1 この手法は生となる構造を持ったリード化合物の探索が不可欠で理活性情報を組み合わせることも可能であるため、あるが、様々な化合物の混合物である天然物から独植物エキスの MS2 データから目的とする物質を単自のリード化合物の探索する際に大きな労力を費や離することなく迅速に予測することも可能であるとしているのが既知物質の同定過程である。苦労して同時に、標的物質だけを狙って単離することが可能単離した化合物がごくありふれた物質であったといである。このように、MS を基盤とした天然物の迅速な単離、同定過程を天然物メタボロミクスという。の値は一般的な UPLC 分析で得られる値と同等であ天然物メタボロミクスの先駆者の一人であるジュネる。また、MSMS イオンピーク数は、1500~3000 個

ーブ大学 Jean-Luc Wolfender 教授のグループは、化合であり、例えば、MS-DIAL を用いて解析すると、測物の annotation 方法の１つとして in silico データベースを構築し、MN と組み合わせることによって、より多くの植物２次代謝産物を同定できる方法

定時間が 2 分ずつ変化させると MSMS イオン数が2~15%の範囲で変わることがわかった。(Fig. 1)(ISDB) を確立している。2 MN は天然物化学における有用化合物の強力な探索ツールとなることは間違いないと言える。しかし、複雑な混合物である植物エキスの dereplication は容易ではない。化合物の構造によって MS におけるイオン化のパターンは異なるため、それぞれの化合物の特性に合った MS のパラメータ設定などの条件を細かく設定する必要がある。また、得られた MS 情報を様々な解析ソフトを用いて化合物の annotation を行う過程においても、それぞれの化合物に応じてパラメータを調整しなければならない。得られた MS 情報だけを頼りに化合物を同定する dereplication 作業にとって、これらの条件設定は非常に重要なことであるが、各段階の作

Fig.1 Profiling of QC mixture

業が正確に行われているか品質を評価するための基準が必要となる。そこで、私は分析条件と化合物同定段階を評価できるベンチマーク型品質管理（QC）混合物を開発することとした。

確立した条件を使って約 15000 種類からなる植物エキスライブラリーのプロファイリングにおけるQC として使用した。96well プレートに 2.5mg/mL

研究経過

DMSO 溶液の各植物エキスを、1 プレートの 1 列にQC として適切な条件として、誰もが入手可能で、は QC 混合溶液を必ず加えることとし、慎重にサンかつ既に広範な植物化学的成分研究が行われているプルプレートを調整した。現段階で 20 プレート、ものが良いと考えられる。そこで、欧州薬局方に記1600 種類の植物エキスの測定を終えた。得られた載された数種類の植物エキスの組み合わせから調製

MS2 データは数百万スペクトルにも及ぶ膨大なデーされた品質管理（QC）サンプル混合物を基準としてタ数となった。このような膨大なデータの処理を迅使用することを提案することとした。まずは、テル速かつ容易に行うためのツールを開発する必要が課

ペノイド、アルカロイド、フラボノイド、脂肪酸、題として残ってはいるが、まずは 6 プレート分、約糖類など疎水性から親水性化合物を含む 5 種類の植500 種の MN 解析を行ったところ、23000 node から物を選択した。天然物化学データベースから、これなる MN を作成することができた。まず、QC 混合

ら植物から単離報告されている化学成分を抜き出し、物の MS/MS スペクトルデータは先の結果とほぼ一chemical space mapping を行ったところ、ほとんどの致していることから、LC 分析は適切に測定できてい空間を広範囲に網羅していることが確認できた。続ると判断した。また、QC 由来のクラスター分析をいて、QC 混合物を異なる LC 条件及び MS/MS 条件行ったところ、同定できた化合物群は先の解析結果下で分析した。UPLC-MS の条件検討を繰り返し行っとほぼ一致し、得られた MN は信頼できるものであて条件を最適化し、測定時間の異なる最適条件を 2ると評価した。植物の科目ごとにグループマッピンつ決定した。それぞれの条件で測定したデータからグを作成して色分けをすることによって、各々のク得られたピークキャパシティは 300~500 となり、こラスターのケモタキソノミーも一気に確認することができ、例えば、1 色からなるクラスターは、このな解析作業が必要とされる膨大な植物抽出物ライブ植物特有の成分であると判断することができる。得

ラリーのモレキュラーネットワーキングと、生理活られた MN から ISDB による推定構造をを抜き出し、性評価を組み合わせた創薬指向型モレキュラーネッ

3Scaffold-Hunter などの解析ソフトを用いて、化学構

トワークプロファイリング構築の例は私の知る限り造類似性を元にグループ化させたケミカルツリーを知られおらず、チャレンジングな課題であり、その作成し、グループ内の化合物の共通部分構造を見出手法は今後の天然物メタボロミクスの発展に大きくした。現在、このファーマコフォア情報をもとに活貢献するものと期待できる。質量分析を基盤とする性化合物の探索研究を進めている。

メタボロミクス研究、特に天然物メタボロミクスは、一方、化合物を同定する方法として、実測マススペ

近年急速に発展してきているものの、プロテオミク

クトルデータベースの活用、in silicoマススペクトルス研究などと比較して決定的かつもっとも遅れていデータベース、代謝物データベース検索とるのが検出されたピークからの化合物推定であり、Computational mass fragmentation法の活用などがある。 大きな研究領域となっている。最大の問題点は天然
本QCmixのベンチマークとしての機能を検証するた物化合物の最大の魅力である物理化学的性質の多様め、QCに含まれる化学成分の同定を上記手法を用い性である。課題は山積みではあるものの、天然物化て試みた。用いたソフトウェアは主にMS-FINDER、学の領域においてメタボロミクスは間違いなく必要

3

SIRIUS、 MetFrag など未知化合物の組成式の決定な技術であり、将来主流となる手法である。本研究とComputational mass fragmentation法の両方法を兼ねがこれからメタボロミクスを始めようとする多くの備えた構造推定能力が高いと評価されているもの及研究者の一助になることを期待する。

45びISDBを用いた。QCに含まれている植物はすでに十分な化学成分研究が行われているものであること

参考文献

から、文献情報をもとにソフトウェアが提案した候1.

Wang, M. et al., Nat. Biotechnol. 2016, 828.

補化合物を検証していくと、いくつか問題点が浮か

2.

Allard, PM. et al., Anal Chem., 2016, 88, 3317.

び上がってきた。そこで、スペクトル類似性、植物

3.

Till S. et al., J. Cheminfor. 2017, 9.

学的分類、構造類似性、物理化学的性質の4つをスコ

4.

Tsugawa, H. et al., Anal Chem., 2016, 88, 7946.

ア化して統合したメタスコアを提唱し、これを組み

5.

Kai Dührkop et al., Proc. Natl Acad Sci, 2015, 112,12580.

込んだオリジナルのアプリケーションの開発を目指すこととした。 まずは、各アプリケーションから

6.

Ruttkies C., et al., J Cheminfo., 2016, 803.

exportされた結果を手作業で解析していたが、それぞれのアプリケーションに対応したスクリプトを作成

研究の発表し、結果解析を自動化できるようにした。現在、ア

口頭発表

プリケーション開発を目指して、スクリプトの統合、

1.

Miwa

Kubo,

Pierre-Marie

Allard,Jean-Luc

Wolfender, 65th International Congress and Annual

プログラミングを進めているところである。

Meeting of the Society for Medicinal Plant andNatural Product Research, Basel, Switzerland,

考察

本研究では、5つの植物からなる品質管理混合物

September 2017.
2.

Miwa

Kubo,

Pierre-Marie

Allard,Jean-Luc

QC mixを開発した。これは、誰もが容易に調整可能

Wolfender, Swiss Group for Mass Spectrometry

であり、NPプロファイリングおよびメタボロミクス

2017, Beatnbarg, Switzerland, Nobember 2017.

における構造推定ワークフローの品質評価のための普遍的なQCとなり得ることを示唆した。また、複雑