PRESS RELEASE

令和５年 4 ⽉ 26 ⽇

⾃然科学研究機構 ⽣命創成探究センター
東海国⽴⼤学機構 名古屋⼤学
東海国⽴⼤学機構 岐⾩⼤学

細胞の極性形成に重要な細胞間接着分⼦の結合メカニズムを解明－1 分⼦蛍光顕微鏡と⾼速原⼦間⼒顕微鏡で明らかになった 2 分⼦間のらせん形結合－

⼤学共同利⽤機関法⼈⾃然科学研究機構 ⽣命創成探究センター (ExCELLS) の⻄⼝茂孝特任研究員 (現職: 国⽴⼤学法⼈ ⼤阪⼤学⼤学院⼯学研究科 特任助教) と、ExCELLS/国⽴⼤学法⼈東海国⽴⼤学機構 名古屋⼤学⼤学院理学研究科の内橋貴之教授のグループは、国⽴
⼤学法⼈東海国⽴⼤学機構 岐⾩⼤学糖鎖⽣命コア研究所の笠井倫志特任准教授と共同で、細胞の極性形成に重要な細胞と細胞をつなぐ細胞間接着分⼦であるセルサーカドヘリン*1 の結合構造をナノメートル (100 万分の 1 ミリメートル) のスケールで可視化することに世界で初めて成功しました。研究グループは、1 分⼦蛍光顕微鏡*2 と⾼速原⼦間⼒顕微鏡*3 を⽤いて、セルサーカドヘリン 2 分⼦がらせん状に絡み合って結合する結合メカニズムを明らかにしました。セルサーカドヘリンを介した細胞間接着は、体⽑の⽣える⽅向を決める細胞の極性形成や、脳神経のネットワークの形成等に重要であることから、セルサーカドヘリンの結合メカニズムを解明することで、私たちの複雑なからだの形作りやセルサーカドヘリンの結合障害によって⽣じる疾患発症の原理解明に繋がることが期待されます。
本研究成果は、国際科学雑誌 「Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America (⽶国科学アカデミー紀要)」 (⽶国東部時間 2023 年 4 ⽉ 24⽇) に掲載されました。

図 本研究で明らかになったセルサーカドヘリンの結合様式

発表のポイント1.

細胞の極性形成に重要な細胞間接着分⼦であるセルサーカドヘリンの液中における結合構造を世界で初めて観察した。

2.

1 分⼦蛍光顕微鏡と⾼速原⼦間⼒顕微鏡を⽤いて、セルサーカドヘリンの 2 分⼦が逆平⾏に相対して、らせん状に結合する結合メカニズムを明らかにした。

3.

セルサーカドヘリンの結合メカニズムを解明することで、私たちの複雑なからだの形作りや、セルサーカドヘリンの結合障害によって⽣じる疾患発症の原理解明に繋がることが期待される。

背景
私たちの複雑なからだの形作りは、臓器や組織を構成する細胞同⼠の接着 (細胞間接着) によって制御されています。細胞間接着分⼦の⼀種であるセルサーカドヘリンは、体⽑の⽣える⽅向や、神経細胞が移動する⽅向等の細胞の極性形成に重要であり、脳神経のネットワーク形成等の組織の複雑化にも関与することが知られています。細胞や臓器を⽤いた実験により、セルサーカドヘリンの⽣理学的な重要性は明らかになっていましたが、セルサーカドヘリンがどのようにして細胞と細胞をつなぐのかという結合メカニズムについては、セルサーカドヘリンを１分⼦のスケールで解析することが技術的に難しいため、これまで明らかにされていませんでした。

本研究の内容研究グループは、異なる 2 ⾊の蛍光分⼦で標識したセルサーカドヘリン (CELSR2-mGFP、CELSR2-Halo) を個別に発現する 2 種類の細胞を混合し、2 種類の細胞と細胞の境界におけるCELSR2-mGFP と CELSR2-Halo の動きを 1 分⼦蛍光顕微鏡で追跡しました。1 分⼦蛍光顕微鏡
による観察の結果、細胞と細胞の境界において、2 ⾊の蛍光分⼦が同⼀箇所に局在しながら⻑時間(〜1 秒) ・⻑距離 (〜1 マイクロメートル) 移動することが明らかとなり、セルサーカドヘリン 2 分⼦が細胞と細胞の間で結合することで細胞をつないでいることが⽰唆されました (図 1)。

図 1. 1 分⼦蛍光顕微鏡による蛍光分⼦で標識したセルサーカドヘリンの観察. (A) セルサーカドヘリンのドメイン構成。セルサーカドヘリン間の結合を担う細胞外領域は 9 個のカドヘリンドメインとその他の複数のドメインから構成される。(B) 蛍光標識したセルサーカドヘリンを発現する細胞と細胞の境界の蛍光顕微鏡画像。緑とマゼンタで⽰した破線が隣り合う細胞の辺縁部を⽰している。隣り合う細胞が重なった領域でセルサーカドヘリンが濃縮していることから、細胞間界⾯で細胞間接着が⽣じている。 (C) 異なる 2⾊の蛍光分⼦で標識したセルサーカドヘリンの 1 分⼦蛍光顕微鏡画像。2 ⾊の蛍光分⼦で標識したセルサーカドヘリン (CELSR2-mGFP と CELSR2-Halo) を別々に発現する細胞と細胞の境界で、2 ⾊の蛍光標識セルサーカドヘリンが同⼀箇所を移動していることから、2 つの分⼦が細胞間で結合していることがわかる。
続いて、哺乳動物細胞から精製したセルサーカドヘリンの液中構造を、⾼速原⼦間⼒顕微鏡 (⾼速AFM) で観察した結果、セルサーカドヘリンはカドヘリンドメインと呼ばれるドメイン群から構成される棒状構造と、それ以外のドメイン群から構成される球状構造の 2 つの特徴的な構造を有しており、さらにカドヘリンドメインから成る棒状構造が逆平⾏に重なることで 2 つの分⼦が結合していることがわかりました (図2)。⾼速 AFM で観察したセルサーカドヘリン 2 分⼦が逆平⾏に相対した結合構造は、１分⼦蛍光顕微鏡で観察した、隣り合う細胞間における 2 分⼦間の結合状態を反映していると考えられます。さらに、
⾼速 AFM で取得したセルサーカドヘリンの画像データに、近年開発された⾼分解能画像解析⼿法である局在化 AFM 法*4 を適⽤した結果、セルサーカドヘリンを構成する細胞膜遠位側の 8 個のカドヘリンドメインが、らせん状に絡み合って相互作⽤することで、2 分⼦間の結合構造が形成されることがわかりました (図 2)。また、ビーズを⽤いたセルサーカドヘリンの結合活性評価により、8 個のカドヘリンドメインの内、細胞膜遠位側から数えて 4 番⽬のカドヘリンドメインが 2 分⼦間の結合に特に重要であることが明らかになりました。

図 2. セルサーカドヘリンの⾼速 AFM 画像. (A) セルサーカドヘリン 1 分⼦ (単量体) とセルサーカドヘリン 2 分⼦ (⼆量体) の⾼速 AFM 画像。カドヘリンドメインから構成される棒状構造体が逆平⾏に重なることで⼆量体が形成されている。 (B) 8 個のカドヘリンドメインから成る分⼦の⼆量体の⾼速AFM 画像 (左図) と局在化 AFM 法を適⽤した⾼分解能画像 (右図)。8 個のカドヘリンドメインが全て重なり、かつらせん状に絡み合うことで⼆量体を形成している。⾊付きの⽮頭は⼆量体を構成する個々の分⼦の両端を⽰す。 (C) ⾼速 AFM と局在化 AFM 法によって明らかになったセルサーカドヘリンの結合モデル。A と B の⾼速 AFM 画像のスケールバーは 10 nm。
本研究の発⾒の意義
本研究結果は、これまで⽣理学的な重要性が報告されていたセルサーカドヘリンによる細胞間接着メカニズムの解明に⼤きく貢献する成果です。セルサーカドヘリンはカドヘリンと呼ばれる細胞間接着分⼦の⼀種ですが、過去に結合様式が報告されているクラシカルカドヘリン*5 では、2 個のカドヘリンドメインが 2分⼦間の結合に必要であることに対して、セルサーカドヘリンではこれまでに報告されているカドヘリンの中で最も多い、8 個のカドヘリンドメインが細胞間の結合に関与することが本研究で明らかになりました。8 個のカドヘリンドメインを介した 2 量体*6 は、クラシカルカドヘリンの 2 量体 (37.3－38.5 nm) よりも 2倍近く⼤きい (~66.7 nm) ことから、セルサーカドヘリンが細胞間の距離を⼤きく保つことで、細胞間の情報交換に必要な細胞外⼩胞*7 等の分⼦を通過させるためのスペーサーとして働く可能性を⽰しています。今後さらに詳細な解析を進めることで、本研究で発⾒したセルサーカドヘリンの結合構造の機能的意義を明らかにすることが期待されます。

今後の研究の展望
1.

本研究では、セルサーカドヘリンの結合様式および結合に必要な領域が明らかになった⼀⽅で、セルサーカドヘリンを構成する個々のドメインの詳細な役割について明らかにする必要があります。今後、
X 線結晶構造解析*8 やクライオ電⼦顕微鏡*9 を⽤いた構造解析により、セルサーカドヘリンの各ドメインが 2 分⼦間の結合に与える影響を明らかにすることを予定しています。

2.

精製したセルサーカドヘリンの 90%以上が、カドヘリンドメインから成る棒状構造を介した 2 量体を形成していた⼀⽅で、その他のドメインから成る球状構造を介した複合体もわずかに観察されたことから、セルサーカドヘリンは細胞膜の⾜場が存在する実際の細胞間隙では多様な結合構造を形成する可能性があります。今後は、セルサーカドヘリンを発現する細胞や、セルサーカドヘリンを固定したリポソーム*10 を⾼速 AFM やクライオ電⼦顕微鏡を⽤いて観察することで、より⽣理環境に近い条件での構造解析を予定しています。

3.

セルサーカドヘリンが細胞間隙を広げるスペーサーとして働くことで、細胞間の情報交換に必要な分⼦を通すという仮説を検証することは、セルサーカドヘリンの結合様式の機能的意義の解明に必要です。今後は⼀部のドメインを⽋損させた分⼦を培養細胞や動物個体で発現させることで、どのような影響が⽣じるか解析することを予定しています。

⽤語説明
*1

セルサーカドヘリン細胞と細胞をつなぐ細胞外領域、細胞膜を貫通する 7 回膜貫通領域、細胞内領域から構成される。
カドヘリンスーパーファミリーおよび接着型 G タンパク質共役受容体に分類され、細胞の極性形成に必須の分⼦である。相⼿側の分⼦と結合することで細胞と細胞をつなぐ。
*2

1 分⼦蛍光顕微鏡

蛍光 1 分⼦由来の微弱な蛍光を輝点として検出可能な蛍光顕微鏡。個々の蛍光輝点を識別することで、分⼦の拡散計数や、相互作⽤する分⼦の数、移動量、結合時間等を計測することが出来る。
*3

⾼速原⼦間⼒顕微鏡 (⾼速 AFM)

先端の直径が数ナノメートルの針を、観察対象物 (タンパク質等) に接触することで、その表⾯形状を観察する顕微鏡。溶液中において、観察基板に吸着させた観察対象物を⾼速 (〜10 フレーム/秒)でスキャンすることにより、その動きをリアルタイムに画像化することが出来る。
*4

局在化 AFM 法

AFM 画像の⾼分解能解析⼿法。1 分⼦あるいは異なる分⼦の複数枚の画像信号の局所的最⼤値を重ね合わせることで、AFM の針の先端の⼤きさに由来する分解能の低下を排除した、⾼分解能画像を再構成することが出来る。
*5

クラシカルカドヘリン細胞と細胞をつなぐ細胞外領域、細胞膜を貫通する 1 回膜貫通領域、細胞内領域から構成される。
セルサーカドヘリンと同じく、カドヘリンスーパーファミリーに分類される細胞間接着分⼦であり、からだの形作りに必要不可⽋の分⼦。
*6

2 量体

2 つの分⼦が物理的・化学的な⼒によって集合した分⼦。
*7

細胞外⼩胞

細胞から分泌される脂質⼆重膜からなる⼩胞。細胞が相⼿側の細胞にタンパク質や核酸を内包した細胞外⼩胞を送ることで情報を伝達することが知られている。
*8

X 線結晶構造解析

タンパク質の結晶を X 線を⽤いて解析することで、タンパク質を構成する原⼦の配置を特定する解析⼿法。
*9クライオ電⼦顕微鏡

急速凍結した分⼦に電⼦線を照射することで分⼦の微細構造を観察することが出来る顕微鏡。
*10

リポソーム

⼈⼯的に作製された脂質⼆重膜からなる球体。細胞を模倣した⾜場として、細胞膜に提⽰される分⼦間の相互作⽤を解析するための有効な材料の⼀つ。
研究サポート
本研究は、科学研究費補助⾦ 若⼿研究 (22K14577; ⻄⼝茂孝)、基盤研究 (17K07333;18H05269; 20H03225; 笠井倫志; 21H01772; 内橋貴之)、挑戦的研究 (22K18943; 内橋貴之)、新学術領域研究 (18H05424; 笠井倫志; 21H00393; 内橋貴之)、ExCELLS 連携研究 (18-101; 内橋貴之)、ExCELLS ⼀般共同利⽤研究 (22EXC312; 笠井倫志) 等の⽀援を受けて実施されました。
論⽂情報
雑誌名:
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America論⽂名:
Antiparallel dimer structure of CELSR cadherin in solution revealed by high-speed
atomic force microscopy
著者: Shigetaka Nishiguchi*, Rinshi S. Kasai*, Takayuki Uchihashi* (*責任著者)
DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.2302047120
本件に関するお問い合わせ先研究内容について
国⽴⼤学法⼈ ⼤阪⼤学⼤学院⼯学研究科 特任助教
（研究当時︓ ⾃然科学研究機構 ⽣命創成探究センター 特任研究員 ）⻄⼝茂孝TEL: 0564-59-5226 （⽣命創成探究センター）
E-mail: nishiguchi.shigetaka.hyf_at_osaka-u.ac.jp
⾃然科学研究機構 ⽣命創成探究センター 客員教授
東海国⽴⼤学機構 名古屋⼤学理学研究科 教授
内橋貴之
TEL: 052-789-2885
E-mail: uchihast_at_d.phys.nagoya-u.ac.jp東海国⽴⼤学機構 岐⾩⼤学糖鎖⽣命コア研究所(iGCORE)
特任准教授 笠井倫志
TEL: 058-293-3340
E-mail: rkasai_at_gifu-u.ac.jp
報道について⾃然科学研究機構 ⽣命創成探究センター 研究戦略室
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