ATRX が関与するゲノム維持機能の分子ネットワークの解明と疾患理解への応用
ATRX and its molecular network for the maintenance of genomic integrity（日本分子生物学会推薦）

代表研究者

東京理科大学

定家 真人

Tokyo University of Science

Mahito SADAIEATRX forms a complex with DAXX to remodel nucleosome structure in DNA replication-independent manner.
Previous reports suggest an ATRX`s role in the maintenance of genomic integrity and its inhibitory function in Gquadruplex formation. However, it remains to be known how the genome becomes unstable under the condition whereATRX lacks its function. The current study aims to unveil a molecular network surrounding ATRX. To this end, we haveisolated a natural compound that inhibits the growth of cells lacking ATRX expression. Our analyses suggest that the cells
lacking ATRX may upregulate the oxidase of the compound and therefore show higher sensitivity to the compound. To
identify any genes that are involved in the compound sensitivity, we conducted CRISPR guide RNA (gRNA) screening
and found several gRNA hits that cancel the sensitivity. We will examine how the function of the identified genes andATRX are inter-connected to clarify a molecular network associated with ATRX in the maintenance of genomic integrity.

研究目的

特異性を持つ増殖阻害剤の作用機序の解明を行なっ

ATRX は、クロマチンリモデリング蛋白質としてた。本増殖阻害剤の作用機序を明らかにし、なぜ本知られており、ヒストン H3.3 と結合する DAXX 蛋剤が ATRX 欠損がん細胞に高い特異性を示すかを知白質と複合体を形成して、DNA 複製非依存的にヌクることで、ATRX の機能の理解につながると考えた。

レオソームの構築を行う。先行研究から、ATRX は染色体の末端には、テロメアと呼ばれる一定の配ゲノム完全性の維持や、転写調節に関わることが明列（ヒトでは TTAGGG）が繰り返した DNA と複数らかにされている。ATRX は、グアニン四重鎖（G4）の蛋白質からなる複合体が存在する。テロメアは染と呼ばれる、複製や転写の障害となり DNA 損傷発色体末端を保護するキャップのような機能を持ち、生の原因になりうる DNA 高次構造に結合できるこ染色体の維持に必須の構造体である。我々のほとんとから、ATRX 複合体は H3.3 を含むヌクレオソーム

どの正常体細胞ではテロメア長の維持機構が抑制さを構築することで G4 構造を解消し、ゲノム維持やれていて、テロメアは細胞分裂のたびに徐々に短小転写調節に関わると考えられている。しかし、ATRX化し、やがて細胞増殖を停止させる。一方で、がんは G4 解消活性を持たないため、ATRX が関わるゲノ細胞はテロメア維持機構を活性化させることで、テムの維持や転写調節の分子機構の理解は不完全であロメアの短小化を回避し無限増殖を維持する。全臨る。本研究では、ゲノム完全性やクロマチン構造の床がん症例のうち 90%はテロメア伸長酵素テロメラ維持に関わる ATRX の作用分子機構および分子ネッーゼを活性化しており、残りの 10%は主にテロメアトワークを明らかにすることを目的とする。

相 同 組 換 え を 活 性 化 さ せ て （ ALT: alternative
lengthening of telomeres と呼ばれる）テロメア長を維研究経過持している。

ゲノム完全性やクロマチン構造の維持に関わる

比較的最近になって、ALT がんでは ATRX の欠損

ATRX の作用分子機構を明らかにするという目的をや機能不全が高率で認められることが明らかにされ達成するため、第一に、ATRX 欠損がん細胞に高いた。ATRX は、ヒストン H3.3 と結合する DAXX と複合体を作って、DNA 複製非依存的にヘテロクロマにより減弱された（Figure 2）。逆に、この AusD にチンへの H3.3 の取り込みを行い、テロメアやセントよる ALT がん細胞の増殖阻害効果は、本酸化酵素をロメア周辺などのヘテロクロマチン維持に関わる。

過剰発現させることにより増強された。AusD 高感受

また、ATRX はグアニンに富む DNA 領域に局在して性を示す ALT がん細胞ではこの酸化酵素の発現量がG4 を解消する機能をもつのではないかと考えられ亢進していたこと、ALT がんでの欠損が高率で認めている。ATRX を抑制すると、テロメアのヌクレオられる ATRX 遺伝子の欠損細胞でもその酵素の発現ソームや H3.3 の密度が低下したり、転写が亢進した量の亢進が認められたことから、骨肉腫由来の ALTり、G4 の蓄積と DNA 損傷が誘導されたりする。しがん細胞では、ATRX の欠損や機能不全により AusDたがって、ALT がんは、ATRX の欠損を介してテロ酸化酵素の発現が亢進し、AusD に対する感受性が高メアヘテロクロマチンを不完全にし、繰り返し DNAまっていることが示唆された。

を露出させたり、不必要な転写を活性化させたりして、DNA 損傷を誘発し、相同組換えが起きやすい環境を作出しているのではないかと考えられている。
本研究を始めるにあたって、共同研究により、骨肉腫由来の ALT がん細胞の増殖を抑制する小分子化合物を探索することで、AusD という天然化合物を見出していた。この化合物は、細胞内で酸化されてDNA と共有結合する活性を持つようになると考えられている。我々が保有する複数の骨肉腫細胞株のAusD 感受性を調べたところ、ALT がん細胞の方がAusD に高い感受性を示すことが確認された（Figure1）。また、AusD 処理した細胞では DNA 損傷の蓄積が認められることもわかった（Figure 2）。その後、
AusD 高感受性を示す細胞と感受性の低い細胞の違いを探る過程で、AusD 高感受性と相関のある高発現

Figure 2 Inhibition of AusD oxidases cancels thegrowth inhibition by AusD in ALT cells.

遺伝子の中に、AusD の酸化酵素の候補が見出された。
しかし、ATRX の単独欠損細胞は、AusD に対して感受性が増強されないことがわかった。このことか
ら、ATRX の欠損や機能不全が AusD の高感受性に関わっていると仮定した場合、ATRX の機能欠損による AusD 高感受性が、別の因子がもつ機能により打ち消される可能性が考えられた。
この可能性について検証するために、ALT がん細胞が示す AusD 高感受性に関わる因子を網羅的に探索することにした。この実験では、CRISPR-Cas9 システムを利用した、ガイド RNA 発現ライブラリーのスクリーニングを行い、 ALT がん細胞の AusD 高感

Figure 1 Osteosarcoma ALT cells show higher

受性を打ち消すガイド RNA の取得を目指した。このsensitivity to AusD.

スクリーニングで得られるガイド RNA の標的は、AusD による ALT 細胞の増殖抑制に深く関わる因子

AusD による ALT がん細胞の増殖阻害効果は、AusD の酸化酵素を阻害剤（Figure 2）、または遺伝子ノックアウト（Figure 3）で抑制することにより減弱された。AusD による DNA 損傷の誘導も、本阻害剤（例えば AusD を毒性のある化合物に変換する酵素）であることが期待された。
本実験では、ヒトの 19,052 遺伝子を標的としたガイド RNA（1 つの遺伝子に対して 3 つのガイド RNA含まれることがわかった。
以上のように、ATRX を欠損するがん細胞が示すALT細胞

100AusD 高感受性の分子機構解明を通じて、ATRX が関生存率（%）

与するゲノム維持機能の分子ネットワークの解明を行うことと並行して、遺伝学的スクリーニングによ酸化酵素
ノックアウト50

感受性軽減

同定についても研究を行なった。本研究では、ATRXを欠損する細胞の増殖には関与するが、正常なATRX をもつ細胞の増殖には影響を与えない遺伝子コントロール
0る ATRX 欠損がん細胞の増殖に必須な新規遺伝子のを探索するため、まずは ATRX 遺伝子をノックアウトした細胞の樹立を目指した。ATRX 遺伝子をノッ

0500

AusD濃度（nM）

1000

クアウトした細胞と当該遺伝子が正常である細胞を直接比較することによって、ATRX 欠損細胞の増殖に必須な新規遺伝子の同定を精度高く行えることがFigure 3 Knockout of AusD oxidase gene cancels
the growth inhibition by AusD in ALT cells.

期待される。
本研究では、遺伝子ノックアウトの解析で汎用される HCT-116 細胞と骨肉腫細胞のそれぞれについて、が設計されている）のライブラリーを用いた。Cas9

CRISPR-Cas9 システムを用いて ATRX 遺伝子のノッ遺伝子とともにこれらのガイド RNA の遺伝子をゲクアウト細胞を得た。ノックアウト細胞については、

ノム DNA に挿入した ALT がん細胞を作製し、このコロニー単離により複数のクローンを得た。これら細胞集団を 2 つのグループに分けた。一方のグルーのクローンの中から、ウエスタンブロッティングにプは AusD の存在下で 14 日間培養し、もう一方のグより ATRX 蛋白質の発現が認められないものを選抜

ループは AusD を加えずに 14 日間培養した。
その後、したのち（Figure 4）、ATRX 遺伝子への変異導入もそれぞれの細胞グループから、まとめてゲノム DNA確認した。このようにして ATRX 欠損細胞が得られを抽出し、これを鋳型として、ガイド RNA 遺伝子のたので、ATRX 欠損細胞の増殖に必要な遺伝子の同部分を PCR で増幅させた。

定を目的とした、CRISPR-Cas9 システムを用いたガ

最後に、この PCR 産物の塩基配列を次世代シーケ

イド RNA 発現ライブラリーのスクリーニングを開ンサーで解読し、検出されたガイド RNA 遺伝子の配始した。ガイド RNA のスクリーニングと並行して、列と、ライブラリーに含まれるガイド RNA 遺伝子のATRX 欠損細胞の増殖を特異的に阻害する既知薬化配列としてすでに公開されている配列を照合した。

合物のスクリーニングにも着手した。化合物のスク検出され同定されたガイド RNA 遺伝子について、そリーニングについては複数のヒット化合物が得られれぞれの検出頻度を計算し、AusD で処理しない細胞たので、ヒット同定の確認を行い、化合物の標的蛋グループに比べて、明らかに AusD で処理した細胞白質の同定につなげる。のグループで検出頻度の高かったガイド RNA を見出し、ヒットガイド RNA とした。その結果、ヒットガイド RNA の中に Figure 3 で対象にした AusD 酸化酵素を標的とするガイド RNA が含まれていたことから、本ガイド RNA スクリーニングの有効性は高いと考えられた。
STRING データベースを利用して、ヒットガイドRNA の標的遺伝子のパスウェイ解析を行ったとこ
ろ、複数の経路が見出された。この中には、酸化酵素の遺伝子発現や活性調節の経路、シグナル伝達経路、転写調節に関わるクロマチン修飾酵素の経路がFigure 4 Isolation of the cells lacking ATRX gene.

Biol 52, 57-73.

考察

これまでの研究で、骨肉腫由来の ALT がん細胞で2.

Clynes, D., Higgs, D.R., and Gibbons, R.J. (2013).

は、ATRX の欠損や機能不全により AusD 酸化酵素

The chromatin remodeller ATRX: a repeat offender inの発現が亢進し、AusD に対する感受性が高まっていhuman disease. Trends Biochem Sci 38, 461-466.

ることが示唆された。しかし同時に、ATRX の欠損

3.

Shay, J.W., and Wright, W.E. (2019). Telomeres andによる不都合を解消する機構の存在も示唆された。

telomerase: three decades of progress. Nat Rev Genet

今後さらに本研究を発展させまとめることで、ATRX

20, 299-309.

が関与するゲノム維持機能の分子ネットワークの解明と疾患理解への応用につなげたい。

研究の発表

口頭発表
参考文献

1.

1.

小島由紀子、定家真人：天然化合物 AusD に高い

Apte, M.S., and Cooper, J.P. (2017). Life and cancer

感受性を示すがん細胞の分子遺伝学的特徴の解

without telomerase: ALT and other strategies for明. 第 6 回北陸エピジェネティクス研究会. 福井

making sure ends (don't) meet. Crit Rev Biochem Mol（2019 年 10 月）