高速原子間力顕微鏡を用いたタンパク質膜透過のリアルタイム動的探査
Elucidation of protein translocation across the membrane by high-speed AFM（日本生物物理学会推薦）

代表研究者 奈良先端科学技術大学院大学

塚崎智也

NAISTTomoya TSUKAZAKI

In eubacteria, the Sec translocon complex consisting of membrane proteins SecY, SecE, and SecG (SecYEG)
functions as a passive channel for protein translocation from the cytoplasm to the periplasm. A motor SecA ATPase forthe protein translocation pushes pre-proteins into the SecYEG. The detailed dynamics of how the conformational changeof SecA ATPase functions in concert with protein translocation is unclear. In this study, we attempted to visualize thestructural dynamics of the SecYEG-SecA complex in protein translocation using high-speed atomic force microscopy. We
were able to observe the binding of unfolded substrate proteins to the SecYAEG complex reconstituted into nanodiscs andthe transport of the substrate proteins in real-time. In addition, nucleotide-dependent conformational changes of a domainof the SecA ATPase were visualized.

研究目的

SecA はいくつかのドメインから構成されており、そタンパク質の合成は細胞質でリボソームによってのうちの一つで基質タンパク質と相互作用するとさ行われ、多くのタンパク質は膜を超えて輸送される。

れている PPXD ドメインの配置が変化することによこのタンパク質の膜透過は普遍的な生命現象の一つって、SecA は少なくとも Open 型と Closed 型とよばである。Sec パスウエイと呼ばれるしくみは、バクテる２つの状態をとるとされている。しかしながら、リアからヒトまで保存されている。タンパク質の通どのタイミングで、この構造遷移が起こっているのり道となるのが膜タンパク質複合体 Sec トランスロかについては不明のままである。

コンであり、タンパク質膜透過チャネルを形成する。

研究を困難としている要因として、SecA がモノマ

バクテリアでは Sec トランスロコンは SecY, SecE,ーとダイマーのオリゴマー状態の変化を起こすこと

SecG からなる複合体（SecYEG）である。真核細胞があげられる。さらに、基質タンパク質がアンフォにおいては、Sec61 複合体とよばれる。SecA ATPaseールドした不安定な状態であることに加え、SecY とは、輸送されるタンパク質（基質タンパク質）をアSecA が結合解離することなども提唱されており、未ンフォールドの状態を保ったまま SecYEG にリクルだ、これら複合体の状態すら解明されていない。そートし、ATP の加水分解のエネルギーを利用して Secのため、過去の解析例や解釈にも問題点が多い状況

トランスロコンの中に基質タンパク質を繰り返し押にある。具体的には、SecA のモノマーとダイマーのし込むことで、細胞内から基質タンパク質を段階的平衡状態や SecYEG との結合乖離が制御されていなに膜透過させている（図１）。この反応機構を理解すいことが起因して、精緻な解析が阻まれて誤った解るためには生化学的な解析だけでなく、高分解能の釈となっていると思われる例も少なくないため、Sec３次元構造情報が必要であり、2000 年代から Sec タのタンパク質膜透過の理解を大きく妨げているのがンパク質の X 線結晶構造解析や電子顕微鏡単粒子解現状である。これらを解決するために、海外のグル析が進められた。しかしながら、未だ、時間に依存ープがタンパク質膜透過反応のダイナミクスを可視したダイナミックな構造変化ともなうタンパク質の化させるために原子間力顕微鏡（AFM）を用いた解膜透過反応を測定するところまでは至っていない。

析を進めている。タンパク質の膜透過の時空間分解

能を考えると実際に膜透過を活写するには、高速ク（SecYAEG-ND）を作成し、これを、高速 AFM でAFM でモニターできるはずである。しかしながら、観察することにより、均一な粒子であることを確認

必須因子の SecYEG と SecA を含んだ状況のものでした。さらに、SecY をラベルして検証することで、は、ヌクレオチドや基質によってオリゴマー状態の可溶性の SecA の領域と膜タンパク質である SecYEG変化などが示されているが、リアルタイムでのドメナノディスクの領域が、高速 AFM で明確に区別でインの構造変化を追うまでには至っておらずさらなきることを示した 2。本研究では、SecYAEG ナノデる高分解能解析が待たれている。SecYEG と SecA のィスクと基質タンパク質を加えた条件に、さらに複合体の測定も行われたが、上記の通り SecA のオ

ATP を加えて１ユニットの SecYAEG でタンパク質リゴマー状態の制御が困難であること、また分解能の膜透過反応を開始させ、タンパク質膜透過の動態の問題から決定的な画像を得られていない状況にあ観察を進め、タンパク質輸送のリアルタイム動的探る。詳細に解析するには、系の純化をし高分解能で査をすることが目的である。

観測することが極めて重要である。すなわち、厳密に SecA-SecYEG のストイキオメトリーを合わせる

図１

バクテリアのタンパク質の膜透過Fig. 1Bacterial protein translocation

とこと、タンパク質膜透過に必要な膜環境が与えられていること、１ユニットを完全に単離することが必要である。
従来の 1 分子観察で、１ユニットの SecYEG が基質タンパク質を透過させることが示されたが、SecAのオリゴマー状態については制御ができていなかった。
私たちは、安定な高度好熱菌 Thermus thermophilus
由来のタンパク質に着目して Sec タンパク質の解析を進めてきた。系の純化のため SecY と SecA をペプチドリンカーで繋いだ融合タンパク質を構築した。

研究経過

これにより間違いなく SecYEG-SecA のストイキオ

本研究では、タンパク質の膜透過のダイナミクスメトリーが１：１となる。この融合タンパク質を解明すべく研究を進めているが、高速 AFM でそ（SecYAEG）を精製した再構成リポソームはタンパの詳細を可視化するためには、上述の１ユニットのク質膜透過活性を示した 1。この状況下において、活観察だけでは、詳細な議論が不可能であった。なぜ性化するときにリポソーム上で SecY、SecA がオリなら、粒子が雪だるま状に見えており、どの領域でゴマー状態をとるということを排除できていないと基盤に結合しているのが不明であったからであるいう懸案事項があった。膜環境かつ１ユニットを同（図２）。詳細な解析のためには、SecYAEG-ND がど時に達成させる方法として、ナノディスクがある。の向きで基盤に結合しているのかを決定する必要がナノディスクは、膜骨格タンパク質と脂質から構成あった。そこで、SecA に特徴的な独立した一つのドされるディスク状のナノ粒子である。脂質は２重層メインを欠失させた YAEG 複合体（SecYAΔEG）を構造となっている。この脂質層の中に膜タンパク質作製し、SecYAEG-ND の基盤への結合する向きを決を埋め込むことができるため、近年さまざまな膜タ定すべく観察を進めた。

ンパク質の解析に用いられている。ナノディスクにSecYAEG-ND の高速 AFM 画像では SecA の領域埋め込むことで、界面活性剤を使わなくても膜タンは楕円状に観察された一方で、SecYAΔEG-ND の観パク質が安定に存在でき、膜環境を維持していると察像では、SecA の部分の一部が三日月のように欠けいことが利点である。SecYEG の電子顕微鏡構造解たような形で、観察できた。観察されるどの粒子に析にも、１ユニット解析にもナノディスクは用いらおいても、同じ部分が欠けていたため、SecYAEG-NDれた実績がある。

は同一面で基盤に結合していること考えられる。さこれまでに、純化した均一な１ユニットのシステらに精緻な解析を行うためには、次に具体的に SecAム構築のため、SecYAEG を大腸菌のリン脂質と一緒のどの領域が結合しているのかを明らかとする必要に、ナノディスクに再構成し、SecYAEG-ナノディスがあった。そこで、近年急激に精度の上がった AI によるタンパク質の構造予測プログラム AlphaFold2

SecA は open 状態と closed 状態を繰り返しているとを用いて SecYAEG と、SecYAΔEG の構造予測を行考えられた。現在は、タンパク質膜透過反応が進む

い、それらをナノディスクに再構成した構造モデル

ATP の条件だけではなく、ATP の代わりに ADP やを準備した。その構造をもとに、高速 AFM による観AMP-PNP などを使用した条件で、SecA の構造変化測される像の推定モデルを作成することができる。

がどのように変化するのかを統計的に調査し、原著構造モデルを 360 度回転させながら、各角度におけ論文の準備を進めた。

る推定モデルを作成した。これら推定モデルと実際の高速 AFM の SecYAEG と SecYAΔEG の観察像と考察を比較し、各角度における類似相関を調べたところ、タンパク質膜透過反応中の SecA の構造変化を精ある特定の角度において類似相関が高くなることと密に測定した例は少ないが、2019 年に発表されたが判明した。ここまでの準備実験で、SecYAEG-ND のSecA 分子内の蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を基盤への結合配向が明らかとなった。

用いた解析がヌクレオチドに依存した構造変化を議論している。この論文では、ADP 存在下では SecA はopen 型が多く、ATP 存在下では closed 型増加することを示している。この FRET の実験と現在解析中の高速 AFM の像が示す構造変化のパターンは類似しているように見られ、詳細な解析を進めてた。
FoF1 ATPase やダイニンなどは ATP の加水分解に

図２ SecYAEG-ND の高速 AFM 画像
Fig. 2High-speed AFM images of SecYAEG-ND

より，どのように作用しているのかが，かなり詳細にわかってきているが，それは多くの生物物理学的手法がこれらに適応されたことによる。本研究によ次に、SecYAEG-ND 溶液に、変性状態のアンフォり，SecYEG-SecA の１ユニット系による測定が安定ールドした基質タンパク質と ATP を混合することでにできる状況となった。今後、さまざまな Sec タンタンパク質の膜透過反応を開始させ、高速 AFM でパク質の精緻な生物物理学解析を行うことができる観察を進めた。測定された多くの粒子で、SecYAEG-であろう。

ND の単独粒子では観察できなかった、紐状の物体

膜タンパク質含有ナノディスクの高速 AFM によが SecYAEG-ND から生えているような像が確認される測定は、本研究課題の Sec だけでなく、別の膜タた。基質は３種類準備して観測を行ったが、どれもンパク質の解析にも極めて有用である。実際、マグ同じ傾向が見られた。これらは、タンパク質輸送過ネシウムトランスポーター MgtE の解析に適応した程途中の基質タンパク質であると考えられる。一方、際は、マグネシウムの濃度と依存した構造変化をリ基質タンパク質のシグナル配列に、その機能を失うアルタイムで追跡ができた 2。

変異を導入したところ、SecYAEG-ND の粒子から見本稿でふれなかったが，Sec トランスロコンは膜られる紐状の像が確認されなかった。また、SecYAΔ

タンパク質 SecDF, YfgM, PpiD などと複合体を形成

EG-ND を用いたときにも、紐状の像が確認されなかして膜組み込み過程にも関わる。将来的には，Sec トったため、欠失させた SecA の領域は機能に必須でランスロコンを含む巨大な複合体が活きて働く姿をあることが判明した。

捉えたい。

SecYAEG-ND が起こすタンパク質膜透過反応の像を精査しているときに周期的に SecA の高さが変化参考文献することを確認した。この構造変化は、基質タンパ

1.

Sugano Y, Furukawa A, Nureki O, Tanaka Y, and

ク質が存在していないときには観察できなかったた

Tsukazaki T. SecY-SecA fusion protein retains theめ、タンパク質膜透過反応と連動していることが強ability to mediate protein transport. PLoS One, 18,

く示唆される。上記の準備実験で SecYAEG-ND の配e0183434, (2017).

向も決定できているため、SecA の構造変化をシミュレーションし高速 AFM 画像と比較検討したところ、

2.

Haruyama T, Sugano Y, Kodera N, Uchihashi T, AndoT, Tanaka Y, Konno H, and Tsukazaki T. Single-UnitImaging of Membrane Protein-Embedded Nanodiscsの動態観察. 日本生体エネルギー研究会第 46 回

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誌上発表

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研究の発表

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ペプチドグ

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膜透過駆動モーター膜タンパク質 SecDF の仕組

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