Instructions for Use
380236-B
EnglishDNA, purified from synthesized oligonucleotides by HPLC.
*3: PC MTB contains a product resulting from in vitro amplificationof a template genome DNA of Mycobacterium tuberculosis
H37Rv ( GenBank No. NC_000962 ) origin.
The abbreviations of names of the following reagents and the Lot No.
are printed on the containers as below, and also manufacturer ( EKN )is printed.

972000LoopampTM MTBC Detection Kit
INTENDED USE

Reagents

Labelling on the tube
PC MTB
Positive control MTBC Lot No., EKN
NC MTB
Negative control MTBC Lot No., EKN

The LoopampTM MTBC Detection Kit is a qualitative in vitro
diagnostic test for the detection of Mycobacterium tuberculosis
complex ( MTBC ) DNA extracted from sputum in patients with any
symptom indicative of MTBC infection.

TEST PRINCIPLES

Code on the cap
PC
MTB
NC
MTB

WARNINGS AND PRECAUTIONSThis product is based on the nucleic acid amplification method,
LAMP ( Loop-mediated Isothermal Amplification ) developed by Eiken
Chemical Co., Ltd.
The LAMP method has the following characteristics: (1) Only one
enzyme is required and the amplification reaction proceeds underisothermal conditions;(1),(2) (2) it has extremely high specificity becauseof the use of four primers recognizing six distinct regions on thetarget; (3) it has high amplification efficiency and enables
amplification within a short time; and (4) it produces tremendous
amount of amplified product which makes simple visual detection
possible. (3), (4)The primers provided with this product have been designed in the
gyrB and IS region of the MTBC genome DNA. This region has been
confirmed by alignment analysis of selected base sequences of
MTBC and nontuberculous mycobacteria to have a relatively
well-preserved base sequence in MTBC.
DNA from untreated sputum or NALC-NaOH treated sputum is
extracted using the LoopampTM PURE DNA Extraction Kit ( available
for sale separately ) . The DNA solution is then dispensed into areaction tube. The strand displacement DNA polymerase,deoxynucleotide triphosphates ( dATP, dCTP, dGTP and dTTP ) ,calcein and MTBC-specific primers are stored in dried form in the capof the reaction tube. This dried LAMP reagent (MTBC detection
reagent (dMTB) ) is reconstituted when adding the DNA solution. The
reaction tube is then incubated at 67.0C and the DNA is amplified
through catalysis by the strand displacement DNA polymerase inaccordance with LAMP reaction.
The detection of amplified products is based on turbidity
measurement of a by-product, magnesium pyrophosphate ( white
precipitate). (3) Also, visual judgment under UV irradiation may be usedinstead of turbidity measurement. During amplification the calcein
contained in the dried LAMP reagent is released, generating
fluorescence light that can be detected by eye. (4) Before reaction,
calcein contained in the reagent is in the quenched state due to boundmanganese ions bound thereto; however, once the LAMP reaction isstarted, pyrophosphate ions are generated and bind out the
manganese ions, and calcein becomes fluorescent. (4)(1) For in vitro diagnostic use only.
(2) This product is designed only for clinical diagnosis of MTBC
from sputum samples of human origin. Do not use for otherpurposes.
(3) When using this product, always follow this package insert.
(4) Do not freeze the reagents.
(5) Do not use any expired reagent.
(6) Do not mix different lots.
(7) Do not replenish any reagent.
(8) Performance of the LoopampTM MTBC Detection Kit is dependenton operator proficiency and adherence to procedural directions.
Testing should be performed by properly trained personnel.
(9) Remove the required number of reaction tubes from thepackaging just before use and seal the aluminium pouch
immediately.
(10) Do not remove the desiccant from the aluminium pouch. Highlevel of humidity may deteriorate the dried LAMP reagent in thereaction tubes.
(11) Exposure to heat and light might deteriorate the dMTB. Remove
only the required number of reaction tubes ( number of samples+ number of controls ) and seal any unused tubes immediately.
(12) Read the instruction manual of equipment involved incubator
before use.
(13) Sputum samples pose a potential risk for infection. Take allnecessary preventive measures to avoid biohazard. (5)(14) PC MTB and NC MTB both contain a small amount of sodium
azide as preservative. Sodium azide is classified as toxic. Avoid
any contact with eyes, mouth, or skin.
(15) In case of accidental contact of any reagent with eyes, mouth, or
skin, immediately rinse the affected site with plenty of water and,if necessary, seek medical advice.
(16) Do not dilute or add the PC MTB to the samples. Use the PC
MTB only as described in this package insert in order to avoid
DNA contamination.
(17) Store the PC MTB positive control and any positive sputum
samples separately from the other kit reagents.
(18) The cap of each reaction tube contains dMTB in the dried form.
Do not touch the inside of the cap.
(19) Before using the reaction tubes, check carefully to see if they
have any cracks or scratches. Damaged tubes might give false
results and lead to DNA contamination of the incubator and workarea.
(20) Do not expose reaction tubes to UV light before the end of the
LAMP reaction. Prolonged exposure to UV light might damage
the tubes and lead to false results.
(21) When a UV lamp is used for visual fluorescence judgment, do
not stare directly at UV light. Since UV light is harmful to theeyes, even watching for a short period would irritate eyes andcause symptoms similar to conjunctivitis. Use a glass screen orwear goggles or a protective eye mask whenever looking
directly at the UV lamp.
(22) Refer to the manual of the incubator. When HumaLoop T or the
real-time turbidimeter HumaTurb C are used, be careful inremoving the reaction tube from the incubator to avoid burns.

CONTENTS OF THE KITReagents are stable until the date on the label assuming thecontainer remains unopened under a storage temperature of 2 – 30°C.
MTBC detection reagent ······························2 X 48 tubes
The following ingredients in dried form arecontained in each reaction tube.
Bst DNA polymerase*1
Deoxynucleotide triphosphates
Magnesium sulfate
Calcein
Manganese chloride
Primers*2
Positive control MTB (PC MTB)*3···················· 1 X 0.4 mL
Negative control MTB (NC MTB) ···················· 3 X 0.5 mL
30 µL dropper ······································· 1 X 18 droppers*1: Bst DNA polymerase derived from Bacillus stearothermophilus
is a strand displacement DNA polymerase that lacks 5’3’exonuclease activity.

WASTE DISPOSAL(1) Do not open the tubes after DNA amplification. Leave the cap
closed and dispose of the used tubes as medical waste by*2: Primers designed in the DNA gyrase subunit B ( gyrB ) andInsertion sequence IS6110 ( IS ) region of the MTBC genome1the tubes standing upside down for 2 minutes to reconstitute thedried reagent.
(7) Invert the reaction tubes five times to mix the content. Make
sure that the dried reagent in the cap is fully dissolved.
(8) Flick down ( Spin down ) all tubes to collect the solution to thebottom of the tubes.

incineration or after double bagging with sealable plastic bags.
(2) Never autoclave or re-use the reaction tubes, else amplified
products will disperse and cause contamination.
(3) The main material for the reaction tubes, reagent tubes, and 30µL
dropper is PP; for the reaction tube tray it is PET; for thealuminium pouch it is aluminium; for the kit case it is paper.
(4) Dispose of any used reagent, container, or lab ware inaccordance with local regulations.

Amplification
For Visual fluorescence detection（ For HumaLoop T）(1) Check that the temperature on the incubator is 67.0°C.
(2) Load the reaction tubes into the HumaLoop T incubator andpress the green button to start the LAMP reaction (40 minutes at
67.0°C ). See the HumaLoop T instruction manual for details on
how to operate the incubator.
(3) Confirm the completion of polymerase inactivation( automatically completed by the HumaLoop T). Take all
reaction tubes from the HumaLoop T.
（ For other incubator using UV lamp）(1) Set the temperature of the incubator ( with hot bonnet;
temperature accuracy :  0.5C ) at 67.0C. Wait until thetemperature displayed reaches the set value.
(2) Load the reaction tubes, and then start amplification reaction( for 40 minutes at 67.0C ).
(3) Forty minutes later, inactivate the polymerase using the heating
block ( f or 5 minutes at 80C, or for 2 minutes at 95C ) toterminate the reaction.

SPECIMEN COLLECTION(1) Use the most purulent part of the sputum sample.
(2) Sputum samples should be used immediately after collection.
(3) Collect sputum in a separate room from the LAMP amplification
room. Aerosols containing MTBC DNA can be generated during
sputum collection and may cause contamination.

MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
・ LoopampTM PURE DNA Extraction Kit
・ Pipette-60 Set
For Visual fluorescence detection（For HumaLoop T）
・ HumaLoop T（ For other incubator using UV lamp ）・ Incubator ( temperature accuracy :  0.5C; with hot bonnet )・ Heating block
・ UV lamp ( wavelength : 240 to 260 nm, and 350 to 370 nm )・ Goggles and a protective eye mask
For Real-time turbidity detection
・ HumaTurb C・ Centrifuge for eight connected tubes

For Real-time turbidity detection with HumaTurb C（see Flow chartof procedure）(1) Configure the real-time turbidimeter HumaTurb C for detection
with this product.
(2) Check if the temperature displayed reaches 67.0C ( Allow theturbidimeter to warm up for 20 minutes before use ).
(3) Load the reaction tubes, and start measurement.
(4) Watch the display of the turbidimeter to check the positive andnegative controls for any increase in turbidity. If the turbidity
increases in PC MTB but doesn’t in the negative control solution,
amplification reaction is proceeding properly ( Fig1 ). If any
other situation occurs, however, amplification reaction may beproceeding in a wrong way. In such a case, restart testing fromreagent preparation.
(5) Confirm the completion of polymerase inactivation( automatically completed by the turbidimeter ). Take all reaction
tubes from the turbidimeter and discard them without opening.

PREPARATION OF REAGENTS

1）MTBC detection reagent
Remove the required number of tubes from the aluminium pouchand put them on the rack provided. (number of samples + numberof controls).

Note: After removing the necessary tubes, seal any unused
tubes in the original aluminium pouch immediately.

2）Negative control MTB（NC MTB）
Flick down ( Spin down ) the tube before use to collect the content
in the bottom of the tube. Pipette 60 µL of NC MTB into the
Heating Tube provided in LoopampTM PURE DNA Extraction Kit.
Follow the instruction for use of the LoopampTM PURE DNA
Extraction Kit to process the NC.

Note: A negative control should be included in every LAMP
run.

Amplification plots3）Positive control MTB（PC MTB）
Flick down (Spin down) the tube before use in order to collect thecontent in the bottom of the tube.

Negative sample
Positive sample 1
Positive sample 2

Negative control
Positive control

MEASUREMENT PROCEDURE

Turbidity

DNA Extraction
To extract the DNA from a sputum sample, follow the instruction for
the LoopampTM PURE DNA Extraction Kit ( sold separately ).
Dispense 60 µL of sputum sample into the Heating Tube, and load
the Heating Tube into the heating block pre-heated at 90C. Use themost purulent sputum whenever possible.
Reagent and Sample Mixing(1) Turn on the incubator HumaLoop T or the real-time turbidimeter.
(2) Dispense 30 µL of sample solution into a reaction tube using the
Loopamp™ PURE DNA Extraction Kit, and close the cap.

0.7

0.7

0.6

0.6

0.5

0.5

Turbidity

Note: PC MTB should be measured every time.

0.4

0.4

0.3

0.3
0.2

0.2

0.1

0.1

0

0

5

10

15

20

25

Time ( min.)

30 35 40

Fig1：Amplification plots for controls

Note: The volume between the two lines on the reaction tube
corresponds to approx 30µL.

PROCEDURAL NOTES(3) Dispense 30 µL of NC MTB into a reaction tube using the
LoopampTM PURE DNA Extraction Kit and close the cap.

0

0

5

10

15

20

25

Time ( min.)

30 35 40

Fig2：Amplification plots for samples(1) Clean benches with over 0.5% sodium hypochlorite before
performing the test.
(2) The LAMP reaction is very sensitive, and contamination withsmall amounts of amplified product might lead to false positive
results.
(3) Separate the sputum collection and the LAMP testing areas.
(4) Take all measures necessary to avoid contamination, inparticular change gloves after transferring the sputum or if the
gloves come into contact with the DNA solution.
(5) When handling this product, avoid microbial contamination andnuclease contamination. Even a small amount of DNasetransmitted from sweat or saliva to the reaction tube might

Note: The volume between the two lines on the reaction tube
corresponds to approx 30µL.

(4) Dispense 30 µL of PC MTB into a reaction tube using the
dropper provided, and close the cap.
(5) Flick down ( Spin down ) all tubes to collect the solution to thebottom of the tubes.

Note: Make sure the liquid level is in the middle of the twolines on a reaction tube to ensure 30 µL of pipetting.

(6) Reconstitute the dried reagent in the cap by inverting thereaction tubes and collecting the DNA solution in the cap. Leave2

possibly acquire further variations in this region and becomeless sensitive to this product. Therefore, a negative test does
not always rule out infection by MTBC.
(3) Test results may be affected by specimen collection andtransport, specimen preparation, inhibitors, and other laboratory
procedural errors. A negative test does not exclude the presenceof MTBC from the specimen. In making a clinical diagnosis,
take into account the patient’s clinical condition and all otheravailable laboratory results.
(4) This product is a kit for qualitative detection; it is not designed forquantitative measurement. The intensity of fluorescent lightobserved or the rise time of turbidity measured by the real-time
turbidimeter does not correlate with the number of template DNA.

decompose DNA and cause false result.
(6) Do not use sputum samples containing a large amount of blood
since this may affect measurements.
(7) The DNA solution should ideally be used immediately after
preparation. If it is impossible, the DNA solution can be stored atroom temperature and used within 72 hours.
(8) When dispensing the solution into the reaction tube, avoid
contact between the Injection Cap on the LoopampTM PURE DNA
Extraction Kit and the inner wall of reaction tubes. Hold the tube
rack upright and fill the tube until the level of DNA solution is
between the two lines (30 µL).
(9)（For HumaLoop T or other incubator using UV lamp）
If bubbles are present, flick down the tubes to get rid of them.
（For Real-time turbidimeter HumaTurb C）
Since bubbles in reaction solution will interfere with turbidity
measurement and cause false judgment, try not to cause any
bubble when mixing reagent and sample solution. If bubbles arepresent, spin down to get rid of the bubbles.
(10) dMTB should be fully dissolved. Any undissolved portion may
influence performance, such as causing a decrease insensitivity.
(11) The PC MTB contains high copy number control DNA. Avoid
any contamination of other samples with the PC MTB. Dispense
the samples and the NC MTB and close all reaction tubes
before dispensing the PC MTB.
(12) Flick down ( Spin down ) the PC MTB tube before opening it, inorder to collect the content at the bottom of the tube. Close thetube immediately after dispensing the PC MTB.
(13) When the HumaLoop T incubator or the real-time turbidimeter
HumaTurb C is used, polymerase inactivation is automatically
performed.
(14) Never open the reaction tubes once the LAMP reaction has
started or after completion. Be particularly careful when
unloading the reaction tubes from the incubator to avoid
opening the tubes accidentally.
(15) Do not reuse any amplified product in the tubes forelectrophoresis or other applications.
(16) For other real-time turbidimeters or incubators, when visualfluorescence judgment is chosen, inactivate the polymerase ( for5 minutes at 80C, or for 2 minutes at 95C ) before judgment, or
false judgment will be caused.
(17) For the real-time turbidimeter or other incubator, when a UV
lamp is used, do not stare directly at UV light. Use a glass board
or wear goggles or a protective eye mask whenever looking at
the lamp.

INTERFERING SUBSTANCES

Our in-house studies have revealed that measurement was notaffected by the presence of free bilirubin ( 91.0 mg/dL ), conjugatedbilirubin ( 101.0 mg/dL ), chyle ( formazine turbidity : 7,300 ), andhemolytic hemoglobin ( 2,475 mg/dL ).
With regard to drugs, our in-house studies have revealed thatmeasurement was not affected by the presence of isoniazid( 100 µg/mL ) , ethambutol ( 20 µg/mL ) , rifampicin ( 100 µg/mL ) ,pyrazinamide ( 500 µg/mL ), kanamycin (20 µg/mL), and streptomycin(500 µg/mL).

PERFORMANCE CHARACTERISTICS

1. Sensitivity and Accuracy
In testing the following samples: negative sample ( concentration: 0 genome equivalent/test ) positive sample 1 (1.875 genomes equivalent/test ) positive sample 2 (125 genomes equivalent/test );The negative sample shall test negative, and the positive samples
1 and 2 shall test positive.
2. Within-run Reproducibility
In testing five negative and positive samples simultaneously, thenegative sample shall test negative throughout, and the positive
sample shall test positive throughout.
3. Limit of Detection
0.38 genomes equivalent/test
4. Cross-reactivity
As for nontuberculous mycobacteria and respiratory disease
bacteria, the measurement system tested negative for all bacterial
species as detailed in the table below; no cross-reaction occurred.
Nontuberculous mycobacteria
Mycobacterium asiaticum
Mycobacterium kansasii
Mycobacterium marinum
Mycobacterium simiae
Mycobacterium scrofulaceum
Mycobacterium szulgai
Mycobacterium gordonae
Mycobacterium xenopi
Mycobacterium avium
Mycobacterium intracellulare
Mycobacterium gastri
Mycobacterium haemophilum
Mycobacterium malmoense
Mycobacterium chelonae
Mycobacterium fortuitum
Mycobacterium flavescens

INTERPRETATION OF RESULTS

For Visual fluorescence detection（For HumaLoop T）
Set the each reaction tube into the Fluorescence Visual Check Unit,
irradiate and observe the tube from the side.
（For other incubator using UV lamp）
Irradiate the bottom of each reaction tube from the side throughgoggles or any other protective equipment.
For a valid run, the following results must be obtained: Positive Control: Green fluorescent light is emitted.
 Negative Control: No fluorescent light is emitted.
If any control is invalid, all samples in the run should be reported as
invalid and the test should be repeated.
After confirming that the run is valid, evaluate samples as follows: Positive Sample: Green fluorescent light is emitted.
 Negative Sample: No fluorescent light is emitted.
For Real-time turbidity detection with HumaTurb C
After confirming that the turbidity increases with PC MTB but
doesn’t in the negative control solution, evaluate samples inaccordance with the following criteria ( Fig 1 and 2 ).
 Positive: Some increase is observed in turbidity.
 Negative: No increase is observed in turbidity.
Notes:(1) The minimum detectable sensitivity of this product is 0.38
genomes equivalent per test. Even with a negative test, patientswith any persisting symptom indicative of infection by MTBC
should undergo re-examination.
(2) Although the primers have been designed to target a region
containing a relatively small number of variations, MTBC may

Respiratory disease bacteria

Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus
Haemophilus influenzae
Moraxella catarrhalis
Klebsiella pneumoniae
Escherichia coli
Legionella pneumophila
Pseudomonas aeruginosa
Mycoplasma pneumoniae（I）
Mycoplasma pneumoniae（II）

Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative

5. Reactivity against MTBC
Reactivity
againstMycobacterium
tuberculosis
andMycobacterium bovis , Mycobacterium africanum was confirmed.

3

6. Information about a Calibrator
The performance test for this product used plasmid DNA
containing the gyrB and IS region of the genome DNA of
Mycobacterium tuberculosis H37Rv (GenBank No. NC_000962)
as a calibrator.
7. Clinical performance
Tuberculosis is still one of the world’s largest infections. In
the world, the total estimated number of new cases of tuberculosis
is about 9.4 million, and that of sputum smear-positive is about
4.3 million (2008; data published by WHO). (6) In Japan, 24,760
patients were newly registered as affected with tuberculosis in
2008, and 2,216 of them have died (Kekkaku No Tokei 2009
Statistics of TB 2009). (7)This product was examined in two medical institutions
designated for Class-2 infectious diseases (designated medical
institutions that had beds exclusive for patients with tuberculosis)
for performance in diagnosing patients suspected of tuberculosis.
Along with PCR and TRC, both of which had already been
approved in Japan, this kit was used to test samples of sputum
collected for two days (320 samples from 160 subjects), andresults were compared between kits. Note that testing based on
this product included evaluations for DNA extract solution
obtained from untreated sputum (hereinafter, referred to as LAMP
for untreated sputum) and those for DNA extract solution obtained
from sputum pretreated by NALC-NaOH and some other processes(hereinafter, referred to as LAMP for pretreated sputum).
As shown in the tables below, the overall concordance rate
was favorable as follows: LAMP for untreated sputum vs. PCR:
91.5% (291/318 subjects); LAMP for pretreated sputum vs. PCR:
92.1% (293/318); LAMP for untreated sputum vs. TRC: 94.3%(230/244); LAMP for pretreated sputum vs. TRC: 93.0% (227/244).
In addition, the evaluations made by real-time turbidity detection
and those made by visual fluorescence detection were incomplete agreement except for one sample. (This sample wasbloody sputum and tested false negative in visual fluorescence
detection because of disturbance by blood). So, we regard thetwo types of evaluations as identical with each other, and thetables show test results obtained by real-time turbidity detection.
The results of the visual fluorescence detection by HumaLoop T
were the same results by the real-time turbidimeter.
LAMP
Positive
Negative
Positive
Negative

UntreatedsputumPretreatedsputumLAMP
Positive
Negative
Positive
Negative

UntreatedsputumPretreatedsputumhttp://www.who.int/tb/country/en/
http://www.who.int/tb/publications/global_report/2009/update/a-1_summary.pdf
http://www.who.int/tb/publications/global_report/2009/update/a-3_summary.pdf(7) Kekkaku No Tokei 2009 (Statistics of TB 2009): Japan AntiTuberculosis Associa

Flow chart
Operation procedure for Real-time turbidity detection
Preparation of sample solution and negative control solution
Pipette 60 µL of suitable sputum containing apurulent portion. Pipette 60 µL of NC MTB.
With the LoopampTM PURE DNA Extraction Kit,
extract DNA from the collected sputum and NC
MTB. The obtained solutions are used as sample
solution and negative control solution, respectively.
Reagent preparation( For samples, negative andpositive controls )Transfer 30 µL of sample or control solution into eachreaction tube.
Use the negative control solution as negative control.
Use PC MTB as positive control.
(The positive control should be prepared last.)
Invert the reaction tubes to collect the solution on thecap. Wait 2 minutes.
Invert the reaction tubes five times to mix the contents,
and then spin them down.
( Avoid any bubbles.)

PCR
Overall
Positive Negative concordance rate
196
7
91.5%
(291/318)
20
95
194
3
92.1%
(293/318)
22
99

Amplification
Load the reaction tubes onto the reaction block of theturbidimeter.
As directed in the instruction for use of the turbidimeter,
start reaction and measure and evaluate the turbidity( for 40 minutes at 67.0C).

TRC
Overall
Positive Negative concordance rate
163
5
94.3%
(230/244)
9
67
157
2
93.0%
(227/244)
15
70

Confirm the completion of polymerase inactivation ( for 5 minutes
at 80C, or for 2 minutes at 95C ). Take all reaction tubes from theturbidimeter and discard them without opening. Be careful not todamage the tubes.

ORDERING INFORMATION
Product
Code

Product Name

970000Loopamp™ MTBC
Detection Kit
Loopamp™ PUREDNA Extraction Kit

971000

Pipette-60 Set

972000961000

HumaLoop T

963200

HumaTurb C

Take a required number of reactior
tubes of dMTB.

Contents
96 tests
90 tests
1 pipette; 4 X 96 tips
1 Main unit
1 Fluorescence Visual Check Unit
1 Control unit
1 Amplification Unit

VD

REFERENCES

Exclusive distributor(1) Notomi T., et al.: Nucleic Acids Research 28, No. 12, e63 (2000)(2) Nagamine K., et al.: Clin. Chem. 47, No. 9, 1742–1743 (2001)(3) Mori Y., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, No. 1,
150–154 (2001)(4) Tomita N., et al.: Nat. Protoc. 3, No. 5, 877–882 (2008)(5) The guideline for the bio-safety and bio-hazard (by theJapanese Society for Bacteriology): Japanese Journal of
Bacteriology 54, No. 3, 667–715 (1999)(6) WHO global TB database:

HUMAN Gesellschaft für Biochemica
und Diagnostica mbH,
Max-Planck-Ring 21 65205 Wiesbaden Germany

Date of Revision: October 1, 20194

Instructions d'utilisation
Français

Les abréviations des noms des réactifs suivants, leur numéro
de lot, ainsi que le code du fabricant (EKN), sont imprimées sur lesboîtiers comme indiqué ci-dessous.

972000

Réactif
Contrôle positif
MTBC
Contrôle négatif
MTBC

LoopampTM MTBC Detection Kit
UTILISATION PRÉVUELe LoopampTM MTBC Detection Kit est un test qualitatif dediagnostic in vitro pour la détection de l’ADN du complexe
Mycobacterium tuberculosis ( MTBC ) extraites du crachat despatients présentant des symptômes d’infection au MTBC.

Étiquetage sur le tube
PC MTB
Lot No., EKN
NC MTB
Lot No., EKN

Code sur le bouchon
PC
MTB
NC
MTB

MISES EN GARDE ET PRÉCAUTIONS(1) Usage diagnostique in vitro uniquement.
(2) Ce produit est réservé aux diagnostics cliniques du MTBC sur desspécimens de prélèvements de crachats d’origine humaine. Ne
pas l’utiliser à d’autres fins.
(3) Respecter toujours la notice lors de l’utilisation de ce produit.
(4) Ne pas congeler les réactifs.
(5) Ne jamais utiliser un réactif périmé
(6) Ne pas mélanger les kits provenant de lots différents.
(7) Ne pas rajouter de réactif pour du re-remplissage.
(8) La performance du LoopampTM MTBC Detection Kit dépend de lacompétence de l’opérateur et du respect du mode d’emploi. Les
tests doivent être effectués par un personnel dûment formé.
(9) Sortir le nombre de tubes nécessaires de l’emballage juste avant
son utilisation, puis refermer la pochette en aluminium
immédiatement.
(10) Ne pas enlever le dessicant du sachet en aluminium. Une forte
humidité peut détériorer le réactif LAMP se trouvant dans lestubes.
(11) L’exposition à la chaleur et à la lumière peut détériorer le dMTB.
Sortir seulement le nombre de tubes nécessaires (nombre despécimens + nombre de contrôles) puis refermer la pochette
contenant les tubes restants.
(12) Lire le manuel d’utilisation des équipements concernés,
notamment l’incubateur, avant l’emploi du kit.
(13) Les spécimens de crachats présentent un risque potentiel
d’infection. Prendre toutes mesures préventives nécessaires pouréviter tout danger biologique potentiel. (5)(14) Aussi bien le PC MTB que le NC MTB contiennent une petite
quantité d’azoture de sodium comme agent de conservation.
L’azoture de sodium est classé toxique. Éviter tout contact avec
les yeux, la bouche ou la peau.
(15) Lors d’un contact accidentel d’un des réactifs avec les yeux, labouche ou la peau, rincer immédiatement et abondamment lapartie affectée avec de l’eau, et se référer à un service
médicalement compétent si nécessaire.
(16) Ne pas diluer ou ajouter du PC MTB aux spécimens. Afin d’éviter
une contamination de l’ADN, utiliser le PC MTB seulement
comme il est indiqué dans cette notice.
(17) Conserver le PC MTB (contrôle positif) et tout spécimen decrachat positif à l’écart des autres réactifs du kit.
(18) Le bouchon de chaque tube à réaction contient du dMTB sous
forme sèche. Ne pas toucher la partie interne du bouchon.
(19) Avant l’utilisation des tubes à réaction, vérifier avec soin laprésence de fissure ou de rayures. Les tubes abimés peuvent
fausser les résultats et provoquer une contamination del’incubateur ou de l’espace de travail par de l’ADN.
(20) Ne pas exposer les tubes à la lumière UV avant la fin de laréaction de LAMP. Une exposition prolongée des tubes à lalumière UV peut endommager les tubes et peut fausser lesrésultats.
(21) Lors de l’utilisation d’une lampe à UV pour l’évaluation de lafluorescence, ne pas fixer directement la source de lumière UV.
La lumière UV étant nocive pour les yeux. La regarder, mêmependant un temps court, pourrait irriter les yeux et provoquer dessymptômes similaires à la conjonctivite. Utiliser des plaquesd’écrans en verre, des lunettes ou des visières protectrices
lorsqu’on doit regarder directement une lampe UV.
(22) Se référer au manuel de l’incubateur. Lors de l’utilisation du
HumaLoop T ou d’un turbidimètre à temps réel HumaTurb C, faireattention à ne pas se brûler en retirant les tubes des appareils.

PRINCIPE DU TESTLe test est basé sur la méthode d’amplification d’acide nucléïque
LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification ; amplification isothermeinduite par boucle) developpée par Eiken Chemical Co., Ltd.
La méthode LAMP possède les caractéristiques suivantes : (1) Une
seule enzyme est requise et la réaction d’amplification se fait sous desconditions isothermiques ;(1), (2) (2) Elle présente une spécificité trèsélevée par son utilisation de quatre amorces reconnaissant six régions
distinctes de la cible ; (3) Elle présente une amplification à très haut
rendement et permet une amplification en un temps court, et (4) Ellegénère une quantité très élevée de produits d’amplification par le biais
duquel une simple détection visuelle devient possible. (3), (4)Les amorces fournies ont été construites dans les régions gyrB et ISde l’ADN du génome du MTBC. Ces régions ont été confirmées parl’analyse d’alignement sur des séquences sélectionnées du MTBC etd’autres mycobactéries comme étant des séquences d’oligonucléotides
bien conservées chez le MTBC.
L’ADN provenant d’un crachat, traité au NALC-NaOH ou non, est
extrait avec le LoopampTM PURE DNA Extraction Kit (vendu
séparément) . La solution de l’ADN sera transférée dans des tubes à
réaction. L’ADN polymérase à déplacement de brin, lesdésoxynucléotides triphosphatés ( dATP, dCTP, dGTP et dTTP ), lacalceine et les amorces spécifiques au MTBC sont stockés à l’état sec
dans le bouchon du tube à réaction. Le réactif LAMP à l’état sec (réactif
de détection du MTBC ; dMTB) est reconstitué par l’ introduction de lasolution d’ADN. Le tube à réaction est incubé à 67,0°C et l’ADN est
amplifié suivant la réaction LAMP par catalyse à l’aide de l’ADN
polymérase à déplacement de brin.
La détection du produit d’amplification est fondée sur la mesure de laturbidité d’un sous-produit, le pyrophosphate de magnésium (précipitat
blanc). (3) Une évaluation visuelle sous irradiation UV à la place demesure de turbidité est également. La calcéine contenue dans le réactif
LAMP est libérée durant l’amplification, ce qui produit une lumière
fluorescente détectable à l’œil nu.(4) Avant la réaction, la calcéinecontenue dans le réactif est dans son état latent par les ions demanganèse qui lui sont liés ; une fois la réaction de LAMP démarrée, lesions sont générés sur le pyrophosphate, et le calcéine devient
fluorescent.(4)CONTENU DU KIT

Les réactifs sont stables jusqu’à la date figurant sur l’étiquette, sousréserve que le boîtier n’ait pas été ouvert et qu’il ait été conservé à une
température de 2 à 30°C.
Réactif de détection du MTBC ···························· 2 X 48 tubes
Les réactifs suivants sont contenus à l’état sec dans chaquetube à réaction.
Bst DNA polymerase*1
Désoxynucléotides triphosphatésSulfate de magnésium
Calcéine
Chlorure de manganèse
Amorces* 2
Contrôle positif MTB (PC MTB)*3 ···························· 1 X 0,4 mL
Contrôle négatif MTB (NC MTB) ···························· 3 X 0,5 mL
Compte-goutte 30 µL ·························· 1 X 18 compte-gouttes*1: La Bst DNA polymérase dérivée du Bacillus stearothermophilus est
une polymérase à déplacement de brin d’ADN dépourvue d’activité
exonucléase 5'→3'.
*2: Amorces codant pour la sous-unité B de l’ADN gyrase (gyrB) et dansla région de la séquence d’insertion IS6110 (IS) de l’ADN génomiquedu MTBC purifié à partir d’oligonucléotides de synthèse purifiés par
HPLC.
*3: Le PC MTB contient un produit résultant d’une amplification in vitro
d’une matrice ADN provenant du génome du Mycobacterium
tuberculosis H37Rv (GenBank No. NC_000962) .

ÉLIMINATION DES DÉCHETS(1) Ne pas ouvrir les tubes après amplification de l’ADN. Laisser lebouchon fermé et jeter les tubes comme déchet médical à

5incinérer ou en double sac pouvant être scellé.
(2) Ne jamais passer à l'autoclave ou réutiliser les tubes à réaction au
risque de disperser les produits et provoquer contamination.
(3) Le matériau principal des tubes à réaction, des tubes de réactifs et
du compte-goutte de 30µL est le PP ; le plateau à tubes est en
PET ; la pochette en aluminium est en aluminium ; la boîte du kit est
en papier.
(4) Éliminer tout réactif non utilisé, boîtier ou matériel de laboratoire
conformément à la réglementation locale.

en inversant le tube afin de collecter la solution d’ADN. Laisser letube inversé pendant 2 minutes pour reconstituer le réactif à l’étatsec.
(7) Mélanger le contenu du tube par cinq inversions. S’assurer que leréactif à l’état sec est complètement dissout.
(8) Secouer le tube d’un mouvement sec ou le centrifuger pourcollecter la solution se trouvant au fond du tube.
Amplification
Pour une détection visuelle de fluorescence（ Pour le HumaLoop T）(1) Vérifier que la température de l’incubateur est à 67,0°C.
(2) Charger les tubes dans l’incubateur HumaLoop T et appuyer sur
le bouton vert pour démarrer la réaction de LAMP (40 minutes à
67,0°C ). Voir le manuel d’utilisation du HumaLoop T pour lesdétails sur l’opération de l’incubateur.
(3) Vérifier que l’inactivation de la polymérase est complète (complétée
automatiquement par le HumaLoop T). Sortir tous les tubes à
réaction du HumaLoop T.
(Autres incubateurs avec lampe UV）(1) Régler la température de l’incubateur (avec couvercle chauffant et
une précision de température de ±0,5°C) à 67,0°C. Attendre que latempérature affichée ait atteint la valeur du réglage.
(2) Charger les tubes à réaction dans l’appareil, puis démarrer laréaction d’amplification ( 40 minutes à 67,0C ).
(3) Après les quarante minutes, inactiver la polymérase à l’aide dubloc chauffant ( 5 minutes à 80C ou 2 minutes à 95C ) pourterminer la réaction.

PRÉLÈVEMENT D’ÉCHANTILLIONS(1) Utiliser la partie la plus purulente du prélèvent de crachat.
(2) Utiliser les crachats immédiatement après leur prélèvement.
(3) Prélever les crachats dans une salle séparée de celle pour effectuer
l’amplification LAMP. De l’aérosol contenant de l’ADN du MTBC
peut être produit durant le prélèvement du crachat, ce qui peut
provoquer une contamination.

MATÉRIELS NÉCESSAIRES NON FOURNIS

・LoopampTM PURE DNA Extraction Kit
・Pipette-60 Set
Pour la détection visuelle de fluorescence(Pour le HumaLoop T)
・HumaLoop T(Autres incubateurs avec lampe UV)・Incubateur ( précision en température : ±0,5°C, avec couvercle
chauffant)・Bloc chauffant・Lampe UV ( longueur d’onde : 240 à 260 nm et 350 à 370 nm )・Lunettes ou visière de protection
Détection de turbidité en temps réel・HumaTurb C・Centrifugeuse avec rotor pour barrettes de 8 tubes

Détection de turbidité en temps réel avec le HumaTurb C (voirdiagramme)(1) Configurer le turbidimètre à temps réel HumaTurb C pour une
détection avec ce produit.
(2) Vérifier que la température indiquée atteint les 67,0°C (préchauffer leturbidimètre pendant 20 minutes avant utilisation).
(3) Charger les tubes à réaction, puis démarrer la mesure.
(4) Surveiller l’affichage du turbidimètre pour vérifier si les contrôles
positifs et négatifs augmentent ou non. Si la turbidité augmente
uniquement chez le PC MTB alors que le contrôle négatif nechange pas, la réaction d’amplification se passe correctement ( Fig1 ).
Dans tout autre cas de figure, il peut y avoir une erreur dans laréaction d’amplification : si tel est le cas, recommencer le test
depuis la préparation des réactifs.
(5) Vérifier que l’inactivation de la polymérase est complète (complétée
automatiquement par le turbidimètre). Sortir tous les tubes à
réaction du turbidimètre et les jeter sans les ouvrir.

PRÉPARATION DES RÉACTIFS

1)Réactif de détection du MTBC
Sortir de la pochette en aluminium le nombre de tubes requis, puis
les placer dans le rack fourni (nombre de spécimens + nombre decontrôles).
Remarque : Après avoir sorti le nombre de tubes nécessaire, refermer
immédiatement la pochette en aluminium contenant les tubes restants.
2) Contrôle négatif MTB (NC MTB)
Secouer le tube d’un mouvement sec ou le centrifuger pourcollecter la solution se trouvant au fond du tube. Placer 60µL de NC
MTB dans le tube à chauffer fournis par le LoopampTM PURE DNA
Extraction Kit. Suivre la notice d’utilisation du LoopampTM PUREDNA Extraction Kit pour traiter le NC.
Remarque : chaque amplification LAMP doit toujours comporter uncontrôle négatif3) Contrôle positif MTB（PC MTB）
Avant utilisation, secouer le tube d’un mouvement sec ou lecentrifuger pour collecter le contenu du fond du tube.

Courbes d’amplification
Échantillon négatif
Échantillon positif 1
Échantillon positif 2

Contrôle négatif
Contrôle positif

Turbidité

PROCÉDURE DE MESURE

Extraction d’ADN
Pour extraire de l’ADN d’un prélèvement de crachat, suivre les
instructions du LoopampTM PURE DNA Extraction Kit (vendu
séparément). Utiliser la solution d’ADN obtenue pour l’amplification
LAMP. Verser 60µL d'échantillon de crachat dans le tube à chauffer,puis placer le tube dans le bloc chauffant pré-chauffée à 90°C.
utiliser le crachat le plus purulent à chaque fois que cela est
possible.

0,7

0,7

0,6

0,6

0,5

0,5

Turbidité

Remarque : le PC MTB doit être mesuré à chaque opération.

0,4

0,4

0,3

0,3
0,2

0,2

0,1

0,1

0

0

5

10

15

20

25

Temps ( min.)Fig1：Courbe d’amplification descontrôles

Préparation des réactifs et des spécimens(1) Allumer l’incubateur HumaLoop T ou le turbidimètre à temps réel.
(2) Transférer 30 µL de solution du spécimen dans un tube à réaction
à l’aide du Loopamp™ PURE DNA Extraction Kit, puis refermer lebouchon.

0

30 35 40

0

5

10

15

20

25

30 35 40

Temps ( min.)Fig2：Courbe d’amplification desspécimens

NOTES SUR LA PROCÉDURE(1) Nettoyer la paillasse avec une 0,5% solution d’hypochlorite desodium avant le test.
(2) La réaction de LAMP est très sensible et une contamination par
une quantité infime d’amplificat peut provoquer un résultat
faussement positif.
(3) Séparer la zone de prélèvement du crachat de la zone de test LAMP.
(4) Prendre toutes les mesures nécessaires pour éviter une
contamination. En particulier, changer les gants après avoir
transféré le crachat ou si les gants ont touché la solution d’ADN.
(5) Éviter toute contamination microbienne ou contamination par lenucléase lors de la manipulation du produit. Une quantité, mêmeinfime, de DNAse transmise aux tubes par la sueur ou par lasalive pourrait décomposer l’ADN et fausser les résultats.
(6) Ne pas utiliser de spécimens de crachat contenant quantité
importante de sang qui peut affecter les résultats des mesures.

Remarque : Le volume entre les deux traits sur le tube de réaction
correspond approximativement à 30µL.

(3) Transférer 30 µL de NC MTB dans un tube à réaction à l’aide du
Loopamp™ PURE DNA Extraction Kit, puis refermer le bouchon.

Remarque : Le volume entre les deux traits sur le tube de réaction
correspond approximativement à 30µL.

(4) Transférer 30 µL de PC MTB dans un tube à réaction à l’aide du
Loopamp™ PURE DNA Extraction Kit, puis refermer le bouchon.
(5) Secouer le tube d’un mouvement sec ou le centrifuger pourcollecter la solution se trouvant au fond du tube.

Remarque : s’assurer que le niveau du liquide se situe au milieu
de deux traits du tube à réaction pour vérifier que le pipetage abien transféré 30µL.

(6) Reconstituer le réactif à l’état sec qui se trouve dans le bouchon

6(7) Idéalement, la solution d’ADN devrait être utilisée immédiatement
après sa préparation. Dans l’impossibilité d’une utilisation immédiate,
la solution d’ADN peut être conservée à température ambiante
dans la limite de 72 heures avant utilisation.
(8) Pendant le transfert de solution dans un tube à réaction, éviter
tout contact entre les bouchons d’injection du LoopampTM PUREDNA Extraction Kit, ainsi que tout contact avec la paroi interne
des tubes à réaction. Maintenir le rack dans sa position verticale etremplir le tube jusqu’à ce que le niveau de la solution d’ADN soit
entre les deux traits marqués sur les tubes (30µL).
(9) (Pour le HumaLoop T ou autre incubateur avec lampe UV)
Si des bulles sont présentes, secouer le tube d’un coup sec versle bas pour les éliminer.
(Pour les turbidimètres à temps réel HumaTurb C)
Essayer de ne pas générer de bulles lors de la préparation desréactifs et des solutions de spécimens, car les bulles peuvent
interférer aux mesures de turbidité. Si la présence de bulles est
observée, centrifuger pour les éliminer.
(10) Le dMTB doit être complètement dissout. Toutes portions non
dissoutes peuvent influer sur la performance telles que provoquer
une perte en sensibilité.
(11) Le PC MTB contient un grand nombre de copies d’ADN decontrôle. Éviter toute contamination d’autres spécimens par le PC
MTB. Transférer les spécimens et le NC MTB, puis fermer tous
les tubes à réaction avant le pipetage du PC MTB.
(12) Secouer le tube de PC MTB d’un mouvement sec ou le centrifuger
avant son ouverture pour collecter la solution se trouvant au fonddu tube. Refermer le tube immédiatement après avoir transféré lePC MTB.
(13) Lors de l’utilisation de l' HumaLoop T ou du turbidimètre à temps réel
HumaTurb C, l' appareil inactivera automatiquement la polymérase.
(14) Ne jamais ouvrir un tube à réaction une fois la réaction de LAMP
démarré, même une fois la réaction terminée. Une attention
particulière est requise en sortant les tubes de l’incubateur pouréviter toute ouverture accidentelle des tubes.
(15) Ne pas réutiliser les amplificats produits dans les tubes pourl’électrophorèse ou autre application.
(16) Pour tout autres turbidimètres à temps réel ou incubateurs,
inactiver la polymérase ( 5 minutes à 80C ou 2 minutes à 95C )avant d'évaluer visuellement la fluorescence, faute de quoi lesrésultats peuvent être faussés.
(17) Lors de l’utilisation d’une lampe UV avec tout autres turbidimètres à
temps réel ou incubateurs, ne pas fixer directement la lumière UV.
Utiliser des lunettes ou une visière protectrice lorsqu’on doit regarderla lampe UV.

l’état clinique du patient et des résultats d’autres tests de laboratoire.
(4) Ce produit est un kit de détection qualitative, et non pas une mesure
quantitative. L’intensité de fluorescence observée ou une
augmentation de turbidité mesurée par un turbidimètre à temps
réel ne corrèlent pas avec le nombre d’ADN matrice.

SUBSTANCE POUVANT INTERFÉRER

Une étude interne a montré que les mesures ne sont pas affectées
par la présence de bilirubine libre (91,0 mg/dL), de bilirubine conjuguée(101,0 mg/dL), de chyle (turbidité à la formazine : 7 300) et del’hémoglobine hémolytique (2 475 mg/dL).
Pour les médicaments, une étude interne a montré que les mesures
ne sont pas affectées pa la présence d’isoniazide (100 µg/mL),d’ethambutol (20 µg/mL), de rifampicine (100 µg/mL), de pyrazinamide(500 µg/mL), de kanamycine (20 µg/mL), et de streptomycine (500µg/mL).

CARACTÉRISTIQUES DES PERFORMANCES

1. Sensibilité et précision
En testant les spécimens suivants :・spécimen négatif (concentration : 0 équivalent génome/test)
・spécimen positif 1 (1,875 équivalents génome/test)
・spécimen positif 2 (125 équivalents génome/test),
Les spécimens négatifs doivent être négatifs et les spécimens
positifs 1 et 2 doivent être positifs.
2. Reproductibilité pendant le même test
En testant simultanément 5 spécimens positifs et négatifs, lesspécimens négatifs doivent rester négatifs et ceux positifs doivent
rester positifs tout au long de la procédure.
3. Limite de détection
0,38 équivalents génome/test
4. Réactions croiséesComme indiqué dans le tableau ci-après, le test a donné des résultats
négatifs sur toutes les souches mycobactériennes non tuberculeuses
et des maladies respiratoires : aucune réaction croisée n’a été
observée.
Mycobactéries non tuberculeuses
Mycobacterium asiaticum
Mycobacterium kansasii
Mycobacterium marinum
Mycobacterium simiae
Mycobacterium scrofulaceum
Mycobacterium szulgai
Mycobacterium gordonae
Mycobacterium xenopi
Mycobacterium avium
Mycobacterium intracellulare
Mycobacterium gastri
Mycobacterium haemophilum
Mycobacterium malmoense
Mycobacterium chelonae
Mycobacterium fortuitum
Mycobacterium flavescens

L’INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS

Détection visuelle de fluorescence（Pour le HumaLoop T）
Installer chaque tube à réaction dans l’Unité de Vérification Visuellede Fluorescence, irradier et observer le tube par le côté.
（Autres incubateurs avec lampe UV）
Irradier le fond de chaque tube à réaction et observer par le côté àtravers des lunettes ou un d’autres équipements protecteurs.
Pour qu’un test soit valide, les résultats obtenus doivent être comme suit :・Contrôle positif : émission d’une fluorescence verte.
・Contrôle négatif : pas de fluorescence émise.
Si un des contrôles n’est pas valide, tous les spécimens testés doiventêtre mentionnés comme non valide et le test doit être recommencé.
Après confirmation de la validité du test effectué, évaluer lesspécimens comme suit :・Contrôle positif : émission d’une fluorescence verte.
・Contrôle négatif : pas de fluorescence émise.
Détection à l’aide d’un turbidimètre à temps réel HumaTurb C
Après avoir vérifié que la turbidité augmente avec le PC MTB mais
pas avec le NC MTB, procéder a l’évaluation des spécimens enfonctions des critères suivants ( Fig 1 et 2 ).
・Positif : une augmentation de turbidité est observée.
・Négatif : pas d’augmentation de turbidité observée.
Remarques :(1) La sensibilité minimale de détection de ce produit en équivalentgénome est de 0,38 par test. Un patient présentant un symptôme
indicatif d’une infection au MTBC doit être réexaminé.
(2) Bien que les amorces aient été construites pour avoir commecible une région comportant relativement peu de variations, leMTBC peut acquérir de nouvelles variations dans cette région etprésenter une sensibilité moindre au test de ce produit. Ainsi, unrésultat de test négatif n’exclut pas une infection par le MTBC.
(3) Les résultats des tests peuvent être affectés par la façon dont lesspécimens sont prélevés et par leur transport, la préparation desspécimens, les inhibiteurs, et par des erreurs dans les procéduresde laboratoire. Un résultat négatif n’exclut pas la présence du MTBC
dans un spécimen : lors d’un diagnostic clinique, tenir compte deBactéries des maladies respiratoires
Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus
Haemophilus influenzae
Moraxella catarrhalis
Klebsiella pneumoniae
Escherichia coli
Legionella pneumophila
Pseudomonas aeruginosa
Mycoplasma pneumoniae（I）
Mycoplasma pneumoniae（II）

Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif

5. Réactivité contre le MTBC
Les réactivités sur le Mycobacterium tuberculosis, le Mycobacterium
bovis et le Mycobacterium africanum ont été confirmées.
6. Information sur le calibrateur
Le test de performance du produit a été effectué avec commecalibrateur l’ADN plasmidique contenant les régions gyrB et ISde l’ADN génomique du Mycobacterium tuberculosis H37Rv(GenBank No. NC_000962) .
7. Performance clinique
La tuberculose reste toujours l’une des infections les plus
importantes du monde. Le nombre annuel de nouveaux cas dans lemonde est estimé à environ 9,4 millions, et ceux avec frottis ducrachat sont d’environ 4,3 millions (2008; données publiées par
l’OMS). (6) Au japon, 24 760 nouveaux patients ont été enregistrés7comme ayant la tuberculose en 2008, et 2 216 d’entre eux sontdécédés (Kekkaku No Tokei 2009 : Statistique de la TB 2009). (7)Ce produit a été évalué par deux institutions médicales désignéespour les maladies infectieuses de classe 2 (institutions ayant des lits
exclusivement réservés aux patients ayant la tuberculose) pour sa
performance en matière de diagnostic des patients avec suspicion detuberculose. En parallèle avec les kits PCR et TRC (Transcription
Reverse transcription), tous deux approuvés au Japon, notre kit a été
utilisé sur des crachats collectés sur deux jours (320 prélèvements
provenant de 160 patients), et les résultats ont été comparés entre leskits. Il est à noter que le test sur notre produit incluait une évaluation
des solutions d’ADN extraits de crachats non traités (désignée
ci-après "LAMP sur crachat non traité") et une évaluation pour lessolutions d’ADN provenant des crachats préalablement traités au
NALC-NaOH et quelques autres procédures de prétraitements(désignés ci-après "LAMP sur crachat prétraités").
Comme indiqué dans les tableaux ci-après, les taux de deconcordance totaux se sont avérés favorables : LAMP sur crachat
non traité vs. PCR: 91,5% (291/318 sujets); LAMP sur crachat
prétraitésvs. PCR: 92,1% (293/318); LAMP sur crachat non traité vs.
TRC: 94,3% (230/244); LAMP sur crachat prétraité vs. TRC: 93,0%(227/244). De plus, les résultats par détection de la turbidité en temps
réel et ceux par la détection visuelle de la fluorescence concordaient
totalement, à l’exception d’un seul spécimen (ce dernier étant un
crachat avec beaucoup de sang, devenait faux-positif par la détection
visuelle de fluorescence par une interférence due à la présence dusang). Les deux types de résultats ont été considérés comme étant
identiques, et le tableau ci-dessous montre les résultats des Têts parla détection de turbidité en temps réel. Les résultats par détection
visuelle de fluorescence utilisant le HumaLoop T étaient similaires à
ceux par turbidimètre à temps réel.

Positif
Négatif
Positif
Négatif

PCR
Positif
Négatif
196
7
20
95
194
3
22
99

Taux deconcordance totale
91,5%(291/318)
92,1%(293/318)

Positif
Négatif
Positif
Négatif

TRC
Positif
Négatif
163
5
9
67
157
2
15
70

Taux deconcordance totale
94,3%(230/244)93,0%(227/244)

LAMP
Crachats nontraités
Crachats
prétraités
LAMP
Crachats nontraités
Crachats
prétraités

Diagramme

Procédure opératoire pour une détection au turbidimètreà temps réelPréparation des solutions des spécimens et de contrôles négatifs
Transférer 60 µL de crachat adéquat contenant une
portion purulente. Transférer 60 µL de NC MTB.
Extraire l’ADN du crachat collecté et du NC MTB à
l’aide du LoopampTM PURE DNA Extraction Kit.
Les solutions obtenues serviront respectivement desolution de spécimens et de contrôle négatif.
Préparation des réactifs

Prendre le nombre de tubes de dMTB
nécessaire.
( Pour les spécimens et lescontrôles positif et négatif)

Transférer 30 µL de solution du spécimen ou de contrôledans chaque tube.
Utiliser la solution de contrôle négatif comme contrôle
négatif.Utiliser le PC MTB comme contrôle positif.
(Préparer le contrôle positif en dernier)Retourner le tube à réaction pour récupérer la solution
dans le bouchon, puis attendre 2 minutes.
Mélanger le contenu des tubes par 5 inversions, puis
collecter par centrifugation.
( Éviter les bulles.)Amplification
Charger les tubes dans les blocs à réaction du turbidimètre.
Démarrer la réaction, mesurer et évaluer la turbidité ( 40minutes à 67.0C) comme indiqué dans le manueld’utilisation du turbidimètre.
Vérifier que l’inactivation de la polymérase est complète (5 minutes à
80C ou 2 minutes à 95C). Sortir tous les tubes du turbidimètre et les jeter
sans les ouvrir. Attention à ne pas abimer les tubes.

RÉFÉRENCES DE COMMANDE
Code produit
970000Nom du produit
Contenu
Loopamp™ MTBC
96 tests
Detection Kit
Loopamp™ PUREDNA Extraction Kit 90 tests

971000

Pipette-60 Set

961000

HumaLoop T

963200

HumaTurb C

972000

1 pipette; 4 X 96 cônes
1 unité principale
1 unité d’évaluation visuellede fluorescence
1 unité de contrôle
1 unité d'amplificationRÉFÉRENCES(1) Notomi T., et al.: Nucleic Acids Research 28, No. 12, e63 (2000)(2) Nagamine K., et al.: Clin. Chem. 47, No. 9, 1742–1743 (2001)(3) Mori Y., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, No. 1,
150–154 (2001)(4) Tomita N., et al.: Nat. Protoc. 3, No. 5, 877–882 (2008)(5) Directives pour la sécurité et risque biologique (Société
Japonaise de Bactériologie): Japanese Journal of Bacteriology
54, No. 3, 667–715 (1999)(6) WHO global TB database:
http://www.who.int/tb/country/en/
http://www.who.int/tb/publications/global_report/2009/update/a-1_summary.pdf
http://www.who.int/tb/publications/global_report/2009/update/a-3_summary.pdf(7) Kekkaku No Tokei 2009 (Statistics of TB 2009): Japan AntiTuberculosis Association

VD
Distributeur exclusif

HUMAN Gesellschaft für Biochemica
und Diagnostica mbH,
Max-Planck-Ring 21 65205 Wiesbaden Germany

Révisé le 1er octobre 20198

Instrucciones de uso
972000Español

LoopampTM

Reactivo

MTBC Detection Kit

Etiqueta en el tubo

MTB
Control positivo MTBC PC
N.º lote, EKN
MTBControl negativo MTBC NC
N.º lote, EKN

USO PREVISTOEl LoopampTM MTBC Detection kit es un dispositivo de diagnósticopara la detección cualitativa in vitro de ADN del complejo
Mycobacterium tuberculosis (MTBC) en muestras de esputo depacientes con síntomas indicativos de infección de MTBC.

Código en la tapa
PC
MTB
NC
MTB

ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES(1) Sólo para diagnóstico in vitro.
(2) Este producto está diseñado únicamente para diagnósticosclínicos de MTBC a partir de muestras de esputo de origen
humano. No debe utilizarse para otros propósitos.
(3) Cuando utilice este producto, siga siempre las instrucciones delprospecto.
(4) No congele los reactivos.
(5) No utilice reactivos caducados.
(6) No mezcle lotes distintos.
(7) No rellene ningún reactivo.
(8) El rendimiento del LoopampTM MTBC Detection Kit depende de lacompetencia del operario y del cumplimiento de las presentes
instrucciones. Las pruebas sólo deben ser realizadas por personal
debidamente capacitado.
(9) Retire del embalaje el número necesario de tubos de reacción
justo antes de utilizarlos y cierre inmediatamente la bolsa dealuminio.
(10) No retire el desecante de la bolsa de aluminio. Un elevado nivel
de humedad podría deteriorar el reactivo LAMP en polvo de lostubos de reacción.
(11) La exposición al calor y a la luz puede deteriorar el dMTB. Retireúnicamente el número necesario de tubos de reacción (número demuestras + número de controles) y cierre inmediatamente lostubos que no utilice.
(12) Lea las instrucciones de la incubadora antes de utilizarla.
(13) Las muestras de esputo son potencialmente infecciosas. Tometodas las medidas necesarias para evitar la exposición al riesgo
biológico. (5)(14) Tanto el PC MTB como el NC MTB contienen una pequeña
cantidad de azida sódica como conservante. La azida sódica es
considerada tóxica. Evite el contacto con los ojos, la boca o la piel.
(15) En caso de contacto accidental de cualquier reactivo con los ojos,
la boca o la piel, aclare inmediatamente la zona afectada con
agua abundante y, en caso necesario, consulte a un médico.
(16) No diluya ni añada el PC MTB a las muestras. Utilice el PC MTB
siguiendo las indicaciones del presente prospecto para evitar lacontaminación de ADN.
(17) Guarde el control positivo PC MTB y cualquier muestra positiva deesputo por separado de otros reactivos.
(18) La tapa de cada tubo de reacción contiene dMTB en polvo.No
toque el interior de la tapal .
(19) Antes de utilizar los tubos de reacción, compruebe que nopresenten grietas ni arañazos. Los tubos deteriorados pueden dar
resultados falsos y contaminar el ADN de la incubadora y del áreade trabajo.
(20) No exponga los tubos de reacción a una fuente de luz ultravioleta
antes de terminarse la reacción LAMP. La exposición prolongada
a la luz UV puede deteriorar los tubos y dar resultados falsos.
(21) Si utiliza una lámpara UV para evaluación visual de fluorescencia,
no mire directamente a la luz UV. La luz ultravioleta es perjudicial
para los ojos y mirarla incluso por un periodo breve puede
irritarlos y causar síntomas similares a la conjuntivitis. Utilice una
pantalla de vidrio, o lleve gafas o una máscara de protección
ocular cuando tenga que mirar directamente a la lámpara UV.
(22) Consulte el manual de la incubadora. Cuando utilice la HumaLoop
T o el turbidímetro en tiempo real HumaTurb C, preste atención alretirar los tubos de reacción de la incubadora para no quemarse.

PRINCIPIOS DE LA PRUEBA

Este producto aplica el método de amplificación isotérmica deácidos nucleicos (método LAMP) desarrollado por Eiken Chemical Co.,Ltd.
El método LAMP presenta las siguientes características: (1) Sólo
se necesita una enzima para activar la reacción de amplificación
isotérmica;(1),(2) (2) esta técnica es altamente específica gracias a loscuatro cebadores que reconocen seis regiones distintas del blanco;(3)ofrece una gran eficiencia de amplificación, que realiza rápidamente; y(4) es capaz de generar una gran cantidad de producto amplificado
visualizable a simple vista. (3), (4)Los cebadores suministrados con este producto han sido
diseñados en el gen gyrB y la región IS del ADN del genoma de
MTBC. Esta región ha sido confirmada mediante análisis dealineamiento de secuencias de MTBC y micobacterias no
tuberculosas para tener una secuencia relativamente bien conservada
de MTBC.
El ADN de esputos no tratados o esputos tratados con NALCNaOH se extrae con el LoopampTM PURE DNA Extraction Kit (sevende por separado). Se dispensa entonces la solución de ADN en un
tubo de reacción. La ADN polimerasa con actividad dedesplazamiento de cadena, los trifosfatos deoxinucleótidos (dATP,
dCTP, dGTP y dTTP), la calceína y los cebadores específicos de
MTBC deben almacenarse en polvo dentro de la tapa del tubo dereacción. Este reactivo LAMP en polvo se reconstituye al añadir una
solución ADN. El tubo de reacción se incuba a 67,0°C y el ADN seamplifica mediante catálisis por la ADN polimerasa con actividad dedesplazamiento de cadena según la reacción LAMP.
La detección de productos amplificados se basa en la medición por
turbidez de un subproducto, pirofosfato de magnesio (precipitado
blanco). (3) También se puede visualizar con una fuente de luz
ultravioleta. Durante la amplificación, se libera la calceína contenida
en el reactivo LAMP en polvo, generando una luz fluorescente que sepuede ver a simple vista. (4) Antes de la reacción, la calceína contenida
en el reactivo se encuentra "apagada" debido a la proliferación deiones de manganeso; sin embargo, cuando la reacción LAMP
comienza, los iones de pirofosfato se unen a los iones de manganeso
y la calceína de vuelve fluorescente. (4)CONTENIDO DEL KIT

Sin abrir, los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad
indicada en la etiqueta, a una temperatura entre 2 – 30°C.
Reactivo de detección MTBC ·······················2 X 48 tubos
Cada tubo de reacción contiene los siguientes
ingredientes en polvo
ADN polimerasa Bst*1
Trifosfatos deoxinucleótidos
Sulfato manganésico
Calceína
Cloruro de manganeso*2
Cebadores
Control positivo MTB (PC MTB)*3 ···················· 1 X 0,4 mL
Control negativo MTB (NC MTB) ···················· 3 X 0,5 mL
Cuentagotas de 30 µL ·······················1 X 18 cuentagotas*1: la ADN polimerasa Bst derivada de Bacillus stearothermophilus es
una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena
que no presenta actividad exonucleasa 5’→3’.
*2: cebadores diseñados en la subunidad B de la ADN girasa (gyrB) y
la secuencia de inserción IS6110 (IS) en el ADN del genoma de
MTBC purificados con oligonucleótidos sintetizados por HPLC.
*3: PC MTB contiene un producto derivado de la amplificación in vitro
de un ADN genómico de una muestra de Mycobacterium
tuberculosis H37Rv (GenBank No. NC_000962).
En los recipientes están impresas las abreviaciones de losnombres de los siguientes reactivos, el nº de lote y el nombre delfabricante (EKN).

ELIMINACIÓN DE RESIDUOS(1) No abra los tubos después de la amplificación de ADN. Mantenga
la tapa cerrada y elimine los tubos usados como residuos médicos
por incineración o introdúzcalos en una bolsa doble plásticasellada.
(2) No esterilice con autoclave ni reutilice los tubos de reacción, ya
que los productos amplificados se dispersarían y provocarían una
contaminación.
(3) El material principal para los tubos de reacción, los tubos dereactivos y el cuentagotas de 30µL es PP; la bandeja de los tubos
de reacción es de PET; la bolsa de aluminio es de aluminio; elestuche es de papel.
(4) La eliminación de cualquier reactivo, recipiente o artículo de9Amplificación
Para detección visual de fluorescencia(Para HumaLoop T)(1) Compruebe que la temperatura de la incubadora sea 67,0°C.
(2) Coloque los tubos de reacción en la incubadora HumaLoop T ypulse el botón verde para lanzar la reacción LAMP (40 minutos a
67,0°C). Consulte el manual de instrucciones de la HumaLoop T
para más detalles sobre el funcionamiento de la incubadora.
(3) Confirme la finalización de la inactivación de polimerasa(automáticamente completada por la HumaLoop T). Tome todos
los tubos de reacción de la HumaLoop T.
(Para otra incubadora con lámpara UV)(1) Ajuste la temperatura de la incubadora (con cubierta térmica;
precisión de temperatura: ± 0,5°C) a 67,0°C. Espere a que latemperatura visualizada alcance el valor definido.
(2) Coloque los tubos de reacción y lance la reacción de amplificación(40 minutos a 67,0°C).
(3) 40 minutos después, inactive la polimerasa con el bloque térmico (5minutos a 80°C o 2 minutos a 95°C) para terminar la reacción.
Para la detección de turbidez en tiempo real con HumaTurb C(consulte el Diagrama)(1) Configure el turbidímetro en tiempo real HumaTurb C para la
detección con este producto.
(2) Compruebe que la temperatura visualizada alcanza 67,0°C (dejecalentar el turbidímetro 20 minutos antes de utilizarlo).
(3) Coloque los tubos de reacción y lance la medición.
(4) Compruebe en la pantalla del turbidímetro los controles positivo ynegativo para cada aumento de turbidez. Si la turbidez aumenta
en PC MTB pero no en la solución de control negativo significa
que la reacción de amplificación se realiza correctamente (Fig1).
Si no sucede esto, la reacción de amplificación puede no estar
ocurriendo correctamente. En tal caso, vuelva a realizar la prueba
desde la preparación del reactivo.
(5) Confirme la finalización de la inactivación de la polimerasa(automáticamente completada por el turbidímetro). Tome todos
los tubos de reacción del turbidímetro y deséchelos sin abrirlos.

laboratorio debe realizarse de acuerdo con la normativa local.

RECOLECCIÓN DE MUESTRAS(1) Utilice la parte más purulenta de la muestra de esputo.
(2) Las muestras de esputo se deben utilizar inmediatamente despuésde ser tomadas.
(3) Guarde las muestras de esputo en una habitación separada de lasala de amplificación LAMP. Durante la toma de esputo se pueden
generar aerosoles que contienen ADN de MTBC y pueden causar
una contaminación.

MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS
 LoopampTM PURE DNA Extraction Kit
 Pipette-60 Set
Para detección visual de fluorescencia(Para HumaLoop T) HumaLoop T(Para otra incubadora con lámpara UV)
 Incubadora (precisión de temperatura: ± 0,5°C; con cubierta
térmica) Bloque térmico
 Lámpara UV (longitud de onda: 240 a 260 nm y 350 a 370 nm)
 Gafas y máscara de protección ocularPara detección de turbidez en tiempo real
 HumaTurb C
 Centrifugadora para ocho tubos conectados

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

1) Reactivo de detección de MTBC
Retire de la bolsa de aluminio el número necesario de tubos dereacción y póngalos en el rack suministrado. (número de muestras+ número de controles).

Nota: tras retirar los tubos necesarios, cierre inmediatamentela bolsa de aluminio original con los tubos que no necesite.

2) Control negativo MTB (NC MTB)
Agite bien el tubo (centrifugar) antes de usarlo para recuperar elcontenido del fondo del tubo. Pipetee 60 µL de NC MTB en el tubo
térmico suministrado con el LoopampTM PURE DNA Extraction Kit.
Siga las instrucciones de uso del LoopampTM PURE DNA
Extraction Kit para preparar el NC.

Diagramas de amplificación
Muestra negativa
Muestra positiva 1
Muestra positiva 2Control negativo
Control positivo

3) Control positivo MTB (PC MTB)
Agite bien el tubo (centrifugar) antes de usarlo para recuperar elcontenido del fondo del tubo.

Turbidity

Nota: se debe medir el PC MTB cada vez.z

PROCEDIMIENTO DE MEDICIÓN

Extracción de ADN
Para extraer el ADN de una muestra de esputo, sigas las
instrucciones del LoopampTM PURE DNA Extraction Kit (se vende por
separado). Dispense 60 µL de muestra de esputo en el tubo dereacción y cargue el tubo de reacción en el bloque térmico
precalentado a 90°C. Utilice siempre que sea posible el esputo máspurulento.

0,7

0,7

0,6

0,6

0,5

0,5

0,4

0,4

Turbidity

Nota: se debe incluir un control negativo en cada prueba
LAMP.

0,3
0,2
0,1
0

0,3
0,2
0,1

0

5

10

15

20 25

30 35 40

Tiempo ( min.)Fig1：Diagramas de amplification para
controles

0

5

10 15

20 25

30 35 40

Tiempo ( min.)Fig2：Diagramas de amplification para
muestras

NOTAS SOBRE PROCEDIMIENTO

Mezcla de reactivo y muestra(1) Encienda la incubadora HumaLoop T o el turbidímetro en tiempo
real.
(2) Dispense 30 µL de solución de muestra en un tubo de reacción
mediante el LoopampTM PURE DNA Extraction Kit y cierre la tapa.
Nota: el volumen entre las dos líneas en el tubo de reacción
corresponde a 30µL aprox.
(3) Dispense 30 µL de NC MTB en un tubo de reacción mediante elLoopampTM PURE DNA Extraction Kit y cierre la tapa.
Nota: el volumen entre las dos líneas en el tubo de reacción
corresponde a 30µL aprox.
(4) Dispense 30 µL de PC MTB en un tubo de reacción mediante elcuentagotas suministrado y cierre la tapa.
(5) Agite bien todos los tubos (centrifugar) para recuperar la solucióndel fondo de los tubos.
Nota: asegúrese de que el nivel de líquido esté en medio de las dos líneas
del tubo de reacción para garantizar un pipeteado de 30 µL.
(6) Reconstituya el reactivo en polvo de la tapa invirtiendo los tubos dereacción y con la solución de ADN. Deje los tubos boca abajo durante
2 minutos para reconstituir el reactivo en polvo.
(7) Invierta los tubos de reacción cinco veces para mezclar elcontenido. Asegúrese de que el reactivo en polvo de la tapa estábien disuelto.
(8) Agite bien los tubos (centrifugar) para recuperar el contenido delfondo de los tubos.

0(1) Limpie las superficies de trabajo con hipoclorito de sodio al 0,5 %
mínimo antes de realizar la prueba.
(2) La reacción LAMP es muy sensible y la contaminación con una
pequeña cantidad de productos amplificados puede dar
resultados falsos.
(3) Separe la toma de esputo de las áreas de pruebas LAMP.
(4) Tome todas las medidas necesarias para evitar la contaminación, en
particular, cambie los guantes después de transferir el esputo o si
toca con ellos la solución de ADN.
(5) Al manejar este producto, evite la contaminación microbiana y de
nucleasas. Hasta una pequeña cantidad de DNasa transmitida apartir del sudor o la saliva al tubo de reacción puede descomponerel ADN y dar resultados falsos.
(6) No utilice muestras de esputo con gran cantidad de sangre, ya
que se pueden alterar las mediciones.
(7) La solución de ADN se debería idealmente utilizar justo despuésde la preparación. Si no es posible, la solución de ADN se puede
guardar a temperatura ambiente y utilizar dentro de las 72 horas
siguientes.
(8) Al dispensar la solución en el tubo de reacción, evite el contacto
entre el inyector del LoopampTM PURE DNA Extraction Kit y las
paredes interiores de los tubos de reacción. Mantenga recto elrack y llene el tubo hasta que el nivel de la solución de ADN
figure entre las dos líneas (30 µL).
(9) (Para HumaLoop T u otra incubadora con lámpara UV)
Si aparecen burbujas, agite los tubos para eliminarlas.
(Para turbidímetro en tiempo real HumaTurb C)
Las burbujas en la solución de reacción pueden interferir con la
medición de turbidez y dar resultados falsos, por lo que se debe

10

hemoglobina hemolítica (2.475 mg/dL).
Respecto a los fármacos, nuestros estudios internos han reveladoque dicha medición no se vio afectada por la presencia de isoniazida(100 µg/mL), etambutol (20 µg/mL), rifampicina (100 µg/mL),pirazinamida (500 µg/mL), kanamicina (20 µg/mL) y estreptomicina (500µg/mL).

evitar la aparición de burbujas al mezclar el reactivo y la solución
de muestra. Si aparecen burbujas, centrifugue los tubos paraeliminarlas.
(10) dMTB debería estar completamente disuelto. Cualquier porción sin
disolver puede alterar los resultados, por ejemplo, disminuyendo lasensibilidad.
(11) El PC MTB contiene un elevado número de copias de ADN. Evite
toda contaminación de otras muestras con el PC MTB. Dispenselas muestras y el NC MTB y cierre todos los tubos de reacción
antes de dispensar el PC MTB.
(12) Agite bien (centrifugar) el tubo de PC MTB antes de abrirlo pararecuperar el contenido del fondo del tubo. Cierre el tubo
inmediatamente después de dispensar el PC MTB.
(13) Si utiliza la incubadora HumaLoop T o el turbidímetro en tiempo
real HumaTurb C, la inactivación de polimerasa es realizada
automáticamente.
(14) No abra nunca los tubos de reacción una vez comenzada lareacción LAMP o tras su finalización. Preste mucha atención alretirar los tubos de reacción de la incubadora y que no se abranaccidentalmente.
(15) No reutilice ningún producto amplificado en los tubos paraelectroforesis u otras aplicaciones.
(16) Para otros turbidímetros en tiempo real o incubadoras, una vez
seleccionada la fluorescencia visual, inactive la polimerasa (5minutos a 80°C o 2 minutos a 95°C) antes de evaluar; de lo
contrario, se podrían alterar los resultados.
(17) Para el turbidímetro en tiempo real u otra incubadora, si se utiliza
una lámpara UV, no mire directamente a la luz UV. Utilice una
pantalla de vidrio, o lleve gafas o una máscara de protección
ocular cuando tenga que mirar directamente a la lámpara.

CARACTERÍSTICAS DE RESULTADOS

1. Sensibilidad y precisión
Al realizar la prueba de las siguientes muestras:

・muestra negativa (concentración: 0 equivalente de genoma/prueba)・muestra positiva 1 (1,875 equivalentes de genoma/prueba)
・muestra positiva 2 (125 equivalentes de genoma/prueba)
La muestra negativa debe dar negativo y las muestras positivas 1y 2 debe dar positivo.
2. Reproducibilidad del método
Al probar cinco muestras negativas y positivas simultáneamente,
la muestra negativa debe dar negativo y la muestra positiva
debe dar positivo.
3. Límite de detección
0,38 equivalentes de genoma /prueba
4. Reactividad cruzada
En cuanto a la micobacteria no tuberculosa y a la bacteria
respiratoria, el sistema de medición da resultados negativospara todas las especies bacterianas como se describe en lasiguiente tabla; no se produce reactividad cruzada.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Nontuberculosa mycobacteria

Para detección visual de fluorescencia(Para HumaLoop T)
Coloque cada tubo de reacción en la unidad de control visual defluorescencia, irradie y observe el tubo por un lado.
(Para otra incubadora con lámpara UV)
Irradie la base de cada tubo de reacción desde un lado utilizando
gafas o un equipo de protección adecuado.
Para que la ejecución de una prueba sea válida, hay que
obtener los siguientes resultados:- Control positivo: se emite una luz verde fluorescente.
- Control negativo: no se emite una luz verde fluorescente.
Si ningún control es válido, todas las muestras deben serconsideradas inválidas y habrá que repetir la prueba.
Una vez que se confirma que la ejecución de la prueba es válida,
evalúe las muestras como se indica a continuación:- Muestra positiva: se emite una luz verde fluorescente.
- Muestra negativa: no se emite una luz verde fluorescente.
Para detección de turbidez en tiempo real HumaTurb C
Una vez que se confirma que la turbidez aumenta con el PC MTB,
pero no en la solución de control negativo, evalúe las muestras deacuerdo con los siguientes criterios (Fig1 y 2).
- Positivo: se observa cierto aumento de la turbidez.
- Negativo: no se observa aumento de la turbidez.
Notas:(1) La sensibilidad detectable mínima de este producto es de 0,38
equivalentes de genoma por prueba. Incluso con una prueba
negativa, los pacientes con síntomas persistentes indicativos deinfección por MTBC deben pasar una nueva revisión.
(2) Aunque los cebadores se han diseñado para una región con
pocas variaciones, el MTBC podría tener más variaciones en
esta región y reducir su sensibilidad al producto. Por tanto,
una prueba negativa no siempre permite descartar lainfección por MTBC.
(3) Los resultados de la prueba pueden verse alterados en el
proceso de recolección y transporte de las muestras, lapreparación de las muestras, los inhibidores y otros erroresde procedimiento de laboratorio. Una prueba negativa no
excluye la presencia de MTBC en la muestra. A la hora derealizar un diagnóstico clínico, hay que considerar el estado
clínico del paciente y todos los resultados de laboratorio
disponibles.
(4) Este producto es un kit para detección cualitativa; no estádiseñado para medición cuantitativa. La intensidad de la luz
fluorescente observada o el aumento de la turbidez medido
con el turbidímetro en tiempo real no se corresponden con elnúmero de matrices de ADN.

Mycobacterium asiaticum
Mycobacterium kansasii

Negativo
Negativo

Mycobacterium marinum

Negativo

Mycobacterium simiae

Negativo

Mycobacterium scrofulaceum

Negativo

Mycobacterium szulgai

Negativo

Mycobacterium gordonae

Negativo

Mycobacterium xenopi

Negativo

Mycobacterium avium

Negativo

Mycobacterium intracellulare

Negativo

Mycobacterium gastri

Negativo

Mycobacterium haemophilum

Negativo

Mycobacterium malmoense

Negativo

Mycobacterium chelonae

Negativo

Mycobacterium fortuitum

Negativo

Mycobacterium flavescens

Negativo

Bacteria respiratoria
Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus

Negativo
Negativo

Haemophilus influenzae

Negativo

Moraxella catarrhalis

Negativo

Klebsiella pneumoniae

Negativo

Escherichia coli

Negativo

Legionella pneumophila

Negativo

Pseudomonas aeruginosa

Negativo

Mycoplasma pneumoniae (I)Negativo

Mycoplasma pneumoniae (II)Negativo

5. Reactividad ante MTBC
Reactividad ante Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, yMycobacterium africanum confirmada.
6. Información sobre calibrador
En la prueba de rendimiento para este producto se utilizó ADN
plasmídico con gyrB y región IS del genoma ADN de
Mycobacterium tuberculosis H37Rv (GenBank No. NC_000962)
como calibrador.
7. Resultados clínicos
La tuberculosis sigue siendo una de las infecciones más extendidas enel mundo. El número total estimado de nuevos casos de tuberculosis
ronda los 9,4 millones de personas en todo el mundo y el de enfermos con
baciloscoía positiva del esputo alcanza los 4,3 millones (2008; datos
publicados por la OMS).(6) En Japón, se registraron 24.760 nuevos casosde tuberculosis en 2008, 2.216 de los cuales fallecieron (Kekkaku No
Tokei 2009, Estadísticas de TB 2009). (7)Este producto fue examinado en dos instituciones de atención
médica especializadas en enfermedades infecciosas de Clase 2(instituciones de atención médica designadas que disponen decamas exclusivas para pacientes con Tuberculosis) para realizar en
pacientes con sospecha de tuberculosis. Junto con PCR y TRC,SUSTANCIAS INTERFERENTES

Nuestros estudios internos han revelado que dicha medición no se vio
afectada por la presencia de bilirrubina libre (91,0 mg/dL), bilirrubina
conjugada (101,0 mg/dL), quilo (turbidez de formacina: 7.300) y

11

Diagramaambos aprobados en Japón, este kit se utilizó para probar muestras
de esputo recolectado durante dos días (320 muestras de 160
sujetos) y se compararon los resultados obtenidos con los distintos
kits. Las pruebas realizadas con este producto incluían evaluaciones
a partir de solución de extracto de ADN obtenido de esputo no tratado(en lo sucesivo, denominado LAMP para esputo no tratado) y a partirde solución de extracto de ADN obtenida de esputo pretratado con
NALC-NaOH y otros procesos (en lo sucesivo, denominado LAMP
para esputo pretratado).
Como indican las tablas a continuación, el porcentaje deconcordancia global fue favorable: LAMP para esputo no tratado vs
PCR: 91,5 % (291/318 sujetos); LAMP para esputo pretratado vs
PCR: 92,1 % (293/318); LAMP para esputo no tratado vs TRC:
94,3 % (230/244); LAMP para esputo pretratado vs TRC: 93,0 %(227/244). Asimismo, las evaluaciones realizadas mediante detecciónde turbidez en tiempo real y las efectuadas mediante detección visualde fluorescencia coincidieron totalmente, salvo en una muestra. (Esta
muestra fue esputo sanguinolento y dio falso negativo en la detección
visual de fluorescencia debido a la alteración producida por la sangre).
Por tanto, consideramos los dos tipos de evaluaciones idénticas y las
tablas muestran los resultados de las pruebas obtenidos mediante losobtenidos con el turbidímetro en tiempo real.
PCR

LAMP
Esputo no
tratadoEsputopretratado

Positivo
Negativo
Positivo
Negativo

Esputopretratado

Positivo
Negativo
Positivo
Negativo

Positivo
163
9
157
15

INFORMACIÓN DE PEDIDOS
Código deproducto
972000

Negativo
567
270

Nombre de producto

Contenido

Loopamp™ MTBC

96 pruebas

971000Detection Kit
Loopamp™ PURE DNA
Extraction Kit
Pipette-60 Set

961000

HumaLoop T

963200

HumaTurb C

970000

Negativo
7
95
3
99
TRC

LAMP
Esputo no
tratadoPositivo
196
20
194
22

Principios de funcionamiento para la detección de turbidez entiempo real
Preparación de la solución de muestra y la solución de control
negativo
Pipetee 60 µL de esputo idóneo con una porción
purulenta. Pipetee 60 µL de NC MTB.
Con el Loopamp™ PURE DNA Extraction Kit, extragia ADN
del esputo recolectado y NC MTB. Las soluciones obtenidas
se utilizarán como solución de muestra y solución de control
negativo respectivamente.

Preparación dereactivo

número necesario de tubos dereacción de dMTB.
(para muestras, controles
negativos y positivos)

Vierta 30 µL de muestra o solución de control en cada tubo
de reacción.

Porcentaje deconcordancia
91,5%(291/318)
92,1%(293/318)

Utilice la solución de control negativo como control
negativo. Utilice PC MTB como control positivo.
(El control positivo se debe preparar al final)

Porcentaje deconcordancia

Invierta los tubos de reacción para tomar la solución
de la tapa. Espere 2 minutos.

94,3%(230/244)93,0%(227/244)

Invierta los tubos de reacción cinco veces para mezclar
el contenido y centrifúguelos.
(Evite la formación de burbujas)
Amplificación

90 pruebas

Coloque los tubos de reacción en el bloque de reaccióndel turbidímetro.

1 pipeta; 4 x 96 puntas
1 unidad principal
1 Unidad de control visual defluorescencia
1 unidat principal
1 unidad de amplificación

Como se indica en las instrucciones de uso del turbidímetro,lance la reacción y mida y evalúe la turbidez (40 minutos
a 67,0°C).

BIBLIOGRAFÍA

(1) Notomi T., et al.: Nucleic Acids Research 28, No. 12, e63 (2000)(2) Nagamine K., et al.: Clin. Chem. 47, No. 9, 1742–1743 (2001)(3) Mori Y., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, No. 1,
150–154 (2001)(4) Tomita N., et al.: Nat. Protoc. 3, No. 5, 877–882 (2008)(5) The guideline for the bio-safety and bio-hazard (by the JapaneseSociety for
Bacteriology): Japanese Journal of Bacteriology
54, No. 3, 667–715 (1999)(6) WHO global TB database:
http://www.who.int/tb/country/en/
http://www.who.int/tb/publications/global_report/2009/update/a-1_summary.pdf
http://www.who.int/tb/publications/global_report/2009/update/a-3_summary.pdf(7) Kekkaku No Tokei 2009 (Statistics of TB 2009): Japan AntiTuberculosis
Association

Confirme la finalización de la inactivación de polimerasa (5 minutos
a 80°C o 2 minutos a 95°C). Tome todos los tubos de reacción delturbidímetro y deséchelos sin abrirlos. Tenga mucho cuidado de nodañar los tubos

VD
Distribuidor exclusivo

HUMAN Gesellschaft für Biochemica
und Diagnostica mbH,
Max-Planck-Ring 21 65205 Wiesbaden Germany

12

Fecha de revisión: 1 de octubres de 2019

Gebrauchsanweisung
Deutsch

Die Abkürzungen der Namen folgender Reagenzien, die Lot
Nummer und der Hersteller (EKN) sind auf die Boxen gedruckt und die
Reagenzbezeichnungen befinden sich auf dem Deckelcode.

972000LoopampTM MTBC Detection Kit

Reagenzien

Positivkontrolle MTBCVERWENDUNGSZWECK

Negativkontrolle MTBC

Das LoopampTM MTBC Detection Kit ist ein qualitativer In Vitro
diagnostischer Test für den Nachweis von Mycobacterium tuberculosis
complex (MTBC) DNA, die aus Sputum von Patienten mit Verdacht auf
eine MTBC Infektion isoliert wurde.

Beschriftung
PC MTB
Lot No., EKN
NC MTB
Lot No., EKN

Deckelcode
PC
MTB
NC
MTB

WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN(1) Nur für den Gebrauch in der In Vitro Diagnostik.
(2) Dieses Produkt wurde nur für die klinische Diagnose von MTBC
aus Sputumproben menschlichen Ursprungs hergestellt. Nicht für
andere Zwecke verwenden.
(3) Immer die Gebrauchsanweisung beachten, wenn das Produkt
verwendet wird.
(4) Reagenzien nicht einfrieren.
(5) Keine abgelaufenen Reagenzien verwenden.
(6) Unterschiedliche Lots nicht mischen.
(7) Reagenzien nicht wieder auffüllen.
(8) Die Testleistung des LoopampTM MTBC Detection Kit ist von den
Fähigkeiten des Anwenders und dem Beachten derGebrauchsanweisung abhängig. Der Test sollte nur vongeschultem Personal durchgeführt werden.
(9) Die benötigte Anzahl der Reaktionsröhrchen entnehmen und den
Aluminiumbeutel sofort danach wieder verschließen.
(10) Das Trockenmittel nicht aus dem Aluminiumbeutel entfernen. Hohe
Feuchtigkeit kann das getrocknete LAMP Reagenz in den
Reaktionsröhrchen verderben.
(11) Licht- und Hitzeexposition können dMTB unbrauchbar machen.
Nur die benötigte Anzahl von Reaktionsröhrchen (Anzahl der
Proben +Kontrollen) entnehmen und nicht verwendete Röhrchen
sofort wieder verschließen.
(12) Vor Verwendung die Gebrauchsanweisung des Inkubators lesen.
(13) Sputumproben sind potenziell infektiös und müssen entsprechendbehandelt werden, um Biogefährdung zu vermeiden. (5)(14) PC MTB und NC MTB enthalten geringen Mengen vonNatriumazid als Konservierungsmittel. Natriumazid wird als toxisch
eingestuft. Kontakt mit Augen, Mund oder Haut vermeiden.
(15) Bei Kontakt von Augen, Mund und Haut mit Reagenzien, sofort
mit viel Wasser abspülen. Wenn notwendig, medizinische Hilfe in
Anspruch nehmen.
(16) PC MTB nicht zur Patientenprobe geben oder damit verdünnen.
PC MTB nur so verwenden, wie es in der Gebrauchsanweisung
steht, um DNA Kontaminationen zu vermeiden.
(17) PC MTB und positive Sputumproben getrennt von anderen
Kitkomponenten aufbewahren.
(18) Der Deckel jedes Reaktionsröhrchens enthält dMTB in
getrockneter Form. Die Innenseite des Deckels nicht berühren.
(19) Vor Verwendung der Reaktionsröhrchen prüfen, ob es Brüche oderKratzer aufweist. Beschädigte Röhrchen können zu falschen
Ergebnissen und DNA Kontaminationen im Inkubator oder desArbeitsbereiches führen.
(20) Die Reaktionsröhrchen nicht UV Licht vor Ende der LAMP
Reaktion aussetzen. Dies kann zu Beschädigungen desRöhrchens oder falschen Ergebnissen führen.
(21) Wird eine UV Lampe für den visuellen Nachweis verwendet, nicht
direkt in das UV Licht sehen. Eine kurze Exposition mit UV Licht ist
für Augen schädlich und kann schon nach kurzer Zeit zu
Augenirritationen und Symptomen ähnlich einer Konjunktivitis
führen. Glasschirme, Brillen oder Augenmasken verwenden, wenndirekt in die UV Lampe gesehen wird.
(22) Vor Gebrauch, User Manual für den Inkubator lesen. Wenn
HumaLoop T oder HumaTurb verwendet werden, die
Reaktionsröhrchen vorsichtig aus dem Inkubator nehmen, um
Verbrennungen zu vermeiden.

TESTPRINZIP

Dieses Produkt basiert auf eine Loop-vermittelten, isothermalen
Amplifikation (LAMP) von Nukleinsäuren, die von Eiken Chemical Co.,
Ltd. entwickelt wurde. Diese Methode hat die folgenden Eigenschaften:(1) Es wird nur ein Enzym benötigt und die Amplifikationsreaktion läuft
unter isothermalen Bedingungen ab;(1), (2) (2) Durch die Verwendung vonvier Primerpaaren, die sechs verschiedene Regionen auf der Ziel-DNA
erkennen, wird eine sehr hohe Spezifität erreicht;(3) Die Amplifikation
findet in einer kurzen Zeit mit einer sehr hohen Effizienz statt und (4)Der visuelle oder automatisierte Nachweis wird durch die Herstellung
großer Mengen des amplifizierten Produktes ermöglicht. (3), (4)Die Primer in diesem Produkt erkennen Abschnitte in der gyrB und
IS Region im MTBC Genom. Diese Regionen wurden durchÜbereinstimmungsanalysen der ausgewählten Nukleinsäuresequenz
von MTBC und nichttuberkulösen Mykobakterien als gut konservierte
Regionen in MTBC identifiziert.
Die DNA von unbehandeltem oder NALC-NaOH behandeltem
Sputum wird mit dem LoopampTM PURE DNA Extraction Kit (separat
erhältlich) extrahiert. Anschließend wird die DNA Lösung in ein
Reaktionsröhrchen überführt. Die Strang-Displacement DNA
Polymerase, die Nukleotidtriphosphate (dATP, dCTP, dGTP and dTTP),
Calcein und MTBC spezifische Primer liegen getrocknet im Deckel desReaktionsröhrchens vor. Diese getrockneten LAMP Reagenzien(MTBC Detektionsreagenz, dMTB) werden rekonstituiert, wenn die
DNA Lösung dazugegeben wird. Die Reaktion wird bei 67°C inkubiert
und die DNA durch die Katalyse mittels Strang-Displacement DNA
Polymerase während der LAMP Reaktion amplifiziert. Der Nachweis
der amplifizierten Produkte basiert auf Trübungsmessung desNebenproduktes Magnesiumpyrophosphat (weißes Präzipitat) (3).
Während der Amplifikation wird das im Calcein getrocknete LAMP
Reagenz freigesetzt und das dabei entstehende Fluoreszenzlicht kannmit dem Auge detektiert werden. (4) Vor der Reaktion ist das Calcein imgetrockneten Reagenz, bedingt durch die Bindung von Manganionen,
im gehemmten Zustand. Nach dem Start der LAMP Reaktion werden
Pyrophosphationen gebildet, welche die Manganionen binden und
das Calcein kann fluoreszieren. (4)

KITBESTANDTEILE

Die Reagenzien sind bis zum angegebenen Datum auf dem Etikett
stabil, wenn die Testbox ungeöffnet bei einer Temperatur von 2-30°C
gelagert wird
MTBC Detektionsreagenz ··················· 2 X 48 Röhrchen
Die folgenden Bestandteile sind in jedem Röhrchen ingetrockneter Form vorhanden:
Bst DNA Polymerase*1
Desoxynuleotidtriphosphat
Magnesiumsulfat
Calcein
Manganchlorid
Primer*2
Positivkontrolle MTB (PC MTB)*3 ··················· 1 X 0.4 mL
Negativkontrolle MTB (NC MTB) ···················· 3 X 0.5 mL
30 µL Tropfkapillare ································ 1 X 18 Stück*1: Bst DNA Polymerase aus Bacillus stearothermophilus ist eine
Strang-Displacement DNA Polymerase, der die 5’→3’
Exonucleaseaktivität fehlt.
*2: Primer wurden zum Nachweis der DNA Gyrase Untereinheit B( gyrB ) und der Insertionssequenz IS6110 ( IS ) in der
genomischen DNA von MTBC hergestellt und aus synthetisierten
Oligonukleotiden mittels HPLC aufgereinigt.
*3: PC MTB enthält ein Produkt, das durch in vitro Amplifikation einer
Template DNA aus dem Genom von Mycobacterium tuberculosis
H37Rv ( GenBank No. NC_000962 ) gewonnen wurde.

ABFALLENTSORGUNG(1) Röhrchen nicht nach der DNA Amplifikation öffnen. Das Röhrchen
geschlossen lassen und als medizinischen Abfall in zweiübereinandergezogenen,
verschlossenen
Plastikbeuteln
entsorgen.
(2) Reaktionsröhrchen niemals autoklavieren und wieder verwenden.
Die Röhrchen würden auslaufen und Kontaminationen
verursachen.

13

(3) Reaktionsröhrchen, Reagenzienröhrchen und die 30 µL
Tropfpipetten bestehen aus PP, der Reagenzienständer aus PET,
der Beutel aus Aluminium und die Kitbox aus Papier.
(4) Verwendete Reagenzien, Labormaterial und Boxen nach den
lokalen Bestimmungen entsorgen.

(5) Alle Röhrchen anzentrifugieren, um die Lösungen auf dem Boden
des Röhrchens zu sammeln..

Beachte: Sicherstellen, dass der Flüssigkeitsstand zwischen den
zwei Linien auf dem Reaktionsröhrchen liegt. Das entspricht
ungefähr 30 μL.

PROBENENTNAHME(6) Die getrockneten Reagenzien im Deckel durch Invertieren desReaktionsröhrchens lösen und die DNA Lösung im Deckel
sammeln. Die Röhrchen umgekehrt für 2 Min. stehenlassen, damit
die getrockneten Reagenzien in Lösung gebracht werden.
(7) Die Reaktionsröhrchen fünfmal invertieren, um die Bestandteile zu
mischen. Sicherstellen, dass die getrockneten Reagenzien im
Deckel vollständig gelöst sind.
(8) Alle Röhrchen anzentrifugieren oder Röhrchen mit dem Finger
anschnippen, damit sich die Lösungen auf dem Boden der
Röhrchen sammeln.
Amplifikation
Für den visuellen Fluorezenznachweis（ Mit HumaLoop T）(1) Überprüfen, dass die Temperatur des Inkubators 67,0°C erreicht
hat.
(2) Die Reaktionsröhrchen in den HumaLoop stellen und den grünen
Schalter betätigen, um die LAMP Reaktion zu starten (40 Min. Bei
67,0°C).
(3) Überprüfen, dass die Inaktivierung der Polymerase stattgefunden
Hat (erfolgt automatisch beim HumaLoop). Alle Reaktionsröhrchen
aus dem HumaLoop nehmen.
（ Für andere Inkubatoren und UV Lampen）(1) Die
TemperaturdesInkubators(mit
Heizdeckel;
Temperaturgenauigkeit: ±0,5°C) auf 67,0°C einstellen. Warten, bis
die Temperatur die gewünschte Temperatur erreicht hat.
(2) Alle Reaktionsröhrchen in den Inkubator stellen und die
Amplifikationsreaktion starten (40 Min. bei 67,0°C).
(3) Nach Ablauf der 40 min Inkubationszeit, Polymerase durch
Erhitzen für 5 Min. bei 80°C oder 2 Min. bei 95°C inaktivieren.
Für den Nachweis mit dem Real-Time Turbidimeter HumaTurb C（siehe Methodenübersicht）(1) Real-Time Turbidimeter HumaTurb C für den MTBC Nachweis
konfigurieren.
(2) Überprüfen, dass die Temperatur 67°C erreicht hat (Den
Turbidimeter 20 Min. vor Verwendung vorwärmen).
(3) Die Reaktionsröhrchen in den Real-Time Turbidimeter stellen und
die Messung starten.
(4) Während der Inkubation überprüfen, ob die Trübung in PC MTBC
zunimmt. Wenn die Trübung in PC MTBC zunimmt, aber nicht in
NC MTBC, verläuft die Amplifikationsreaktion erwartungsgemäß(Fig1). Ist dies nicht der Fall, läuft die Amplifikationsreaktion nicht
richtig. Den Test ab Vorbereitung der Reagenzien wiederholen.
(5) Überprüfen der Inaktivierung der Polymerase (erfolgt automatischdurch den Turbidimeter). Alle Reaktionsröhrchen aus dem
Real-Time Turbidimeter nehmen, ohne sie zu öffnen.

(1) Den eitrigsten Teil der Sputumprobe verwenden.
(2) Sputumproben unmittelbar nach Probengewinnung verwenden.
(3) Sputum in einem von der LAMP Reaktion getrennten Raumgewinnen. Aerosole, die während der Proben- entnahme
entstehen und MTBC DNA enthalten, können Kontaminationen
verursachen.

BENÖTIGTES MATERIAL, NICHT ENTHALTEN

・LoopampTM PURE DNA Extraction Kit
・Pipette-60 Set

Für den visuellen Fluoreszenznachweis(Mit HumaLoop T)
・HumaLoop T（ Für andere Inkubatoren und UV Lampen）
・Inkubator ( Temperaturgenauigkeit:  0,5C; mit Heizdeckel)
・Heizblock
・UV Lampe (Wellenlänge: 240- 260 nm und 350- 370 nm)
・Brille und Augenschutzmaske
Für den Nachweis mit dem Real-Time Turbidimeter
・Zentrifuge für acht verbunden Röhrchen（Mit HumaTurb C)
・Real-Time Turbidimeter (nur zur Verwendung mit der LAMP
Methode; Wellenlänge: 600-700 nm; Amplifikationstemperatur:
67,0C)VORBEREITUNG DER REAGENZIEN

1）MTBC Detektionsreagenz
Die benötigte Anzahl Röhrchen aus dem Aluminiumbeutel
entnehmen und in den mitgelieferten Röhrchenständer stellen(Anzahl der Proben + Anzahl der Kontrollen).

Beachte: Nach Entnahme der benötigten Röhrchen, den
Aluminiumbeutel mit den nicht benötigten Röhrchen sofort
verschließen.

2）Negativkontrolle MTB（NC MTB）
Vor Verwendung Röhrchen anzentrifugieren, damit sich der Inhalt
auf dem Boden des Röhrchens sammelt. 60 µL NC MTB in das
Lyseröhrchen, das in dem LoopampTM PURE DNA Extraction Kit
enthalten ist, pipettieren. Der Gebrauchsanweisung desLoopampTM PURE DNA Extraction Kit für die Aufarbeitung der
NC folgen.

Beachte: NC Mal sollte bei jeder LAMP Reaktion gemessen
werden.

3）Positivkontrolle MTB（PC MTB）
Vor Verwendung Röhrchen anzentrifugieren, damit sich der Inhalt
auf dem Boden des Röhrchens sammelt.

Beachte: PC Mal sollte bei jeder LAMP Reaktion gemessen
werden.

Amplifikationsplots

MESSMETHODE

Negative Probe
Positive Probe 1
Positive Probe 2

Negativkontrolle
Positivkontrolle
0,7

0,7

0,6

0,6

0,5

0,5

Trübung

Trübung

DNA Extraktion
Um DNA aus der Sputumprobe zu extrahieren, dieGebrauchsanweisung des LoopampTM PURE DNA Extraction Kit(separat erhältlich) beachten. Verzichtet werden 60 µL von Sputum
Probe in das Heizrohr, und laden Sie das Heizrohr in den Heizblock bei
90°C vorgewärmt. Verwenden Sie die meisten eitrigen Auswurf, wannimmer möglich.
Mischen von Reagenzien und Probe(1) Den Inkubator HumaLoop T oder Real-Time Turbidimeter
HumaTurb C einschalten.
(2) 30 μL der mit dem the LoopampTM PURE DNA Extraction Kit
gewonnenen DNA Lösung in das Reaktionsröhrchen pipettieren
und das Röhrchen verschließen.

0,4

0,4

0,3

0,3

0,2

0,2

0,1

0,1

0

0
0

5

10

15

20

25

30 35 40

Zeit (Min.)
Fig1：Amplifikationplots Kontrollen

Beachte: Der Flüssigkeitsstand sollte zwischen den zwei Linien
auf dem Reaktionsröhrchens liegen. Das entspricht ungefähr
30μL.

HINWEISE(3) 30 μL der mit dem LoopampTM PURE DNA Extraction Kit
gewonnenen NC MTB in ein Reaktionsröhrchen pipettieren und
das Röhrchen verschließen.

0

5

10

15

20

25

30 35 40

Zeit ( Min.)
Fig2：Amplifikationplots Proben(1) Alle Arbeitsbereiche vor Durchführung des Tests mit > 0,5%Natriumhypochloridlösung reinigen.
(2) Die LAMP Reaktion ist sehr sensitive und Kontaminationen mit
kleinen Mengen des amplifizierten Produktes können zu falschpositiven Ergebnissen führen.
(3) Probengewinnung räumlich von der LAMP Reaktion trennen.
(4) Alle Vorsichtsmaßnahmen ergreifen, um Kontaminationen zu
vermeiden. Handschuhe nach dem Transfer des Sputum oder

Beachte: Der Flüssigkeitsstand sollte zwischen den zwei Linien
auf dem Reaktionsröhrchen liegen. Das entspricht ungefähr
30μL.

(4) 30 μLPC MTB mit dem the LoopampTM PURE DNA Extraction Kit
in ein Reaktionsröhrchen geben und das Röhrchen verschließen.

14nach Kontakt mit der DNA Lösung wechseln.
(5) Bei Verwendung diese Produktes, mikrobielle Kontaminationen
und Kontaminationen mit Nukleasen vermeiden. Der Transfer vonkleinen Mengen DNAse aus Schweiß oder Speichel in die
Reaktionsröhrchen kann falsche Ergebnisse verursachen.
(6) Keine Sputumproben verwenden, die große Mengen Blut enthalten.
Dies kann die Messungen beeinflussen.
(7) Die DNA Lösung sollte idealerweise sofort nach der Präparation
verwendet werden. Wenn dies nicht möglich ist, kann die DNA
Lösung bei Raumtemperatur gelagert und innerhalb von 72h
verwendet werden.
(8) Wenn die DNA Lösung in das Reaktionsröhrchen pipettiert wird,
Kontakt zwischen Injektionsvorrichtung des Loopamp™ PUREDNA Extraction Kit und der inneren Wand des Reaktionsröhrchensvermeiden. Den Röhrchenständer aufrecht stellen und das
Röhrchen so füllen, dass der Flüssigkeitsstand zwischen den zwei
Linien (30 µL) liegt.
(9)（Für HumaLoop T oder andere Inkubatoren mit UV Lampen）
Wenn Blasen erkennbar sind, mit dem Finger gegen das Röhrchen
schnippen, bis diese verschwunden sind.
（Für Real-Time Turbidimeter HumaTurb C）
Blasen in der Reaktionslösung können mit der Trübung
interferieren und zu falschen Ergebnissen führen. Deshalb
Blasenbildung beim Mischen der DNA Lösung und derReagenzien vermeiden. Treten dennoch Blasen auf, mit dem
Finger gegen das Röhrchen schnippen.
(10) DMTB sollte vollständig gelöst sein. Ungelöstes Material
beeinflusst die Testleistung und kann eine geringere Sensitivität
zur Folge haben.
(11) PC MTB enthält eine große Menge Kontroll-DNA. Jegliche
Kontamination der PC MTB mit anderen Proben vermeiden.
Proben und NC MTB in die Reaktionsröhrchen geben und alleRöhrchen gut verschließen, bevor PC MTB verwendet wird.
(12) Vor dem Öffnen PC MTB anzentrifugieren, damit sich die
Flüssigkeit am Boden des Röhrchens sammelt. Röhrchen sofort
verschließen.
(13) Wenn HumaLoop T oder der Real-Time Turbidimeter HumaTurb C
verwendet werden, wird die Polymerase automatisch inaktiviert.
(14) Niemals die Reaktionsröhrchen nach Start oder Beendigung der
LAMP Reaktion öffnen. Besonders vorsichtig sein, wenn die
Röhrchen aus dem Inkubator genommen werden, um
unbeabsichtigtes Öffnen zu vermeiden.
(15) Das amplifizierte Produkt nicht für Gelelektophorese und andere
Applikationen verwenden.
(16) Für den visuellen Fluoreszenznachweis mit anderen Inkubatoren
mit UV Lampen, Polymerase für 5 Min. bei 80°C oder 2 Min. bei
95°C inaktivieren. Anderenfalls können falsche Ergebnisse
entstehen.
(17) Bei Verwendung einer UV Lampe, nicht direkt in das UV Lichtsehen. Einen Glasschirm, Schutzbrille oder eine schützende
Augenmaske verwenden.

 Negativ: Keine Zunahme der Trübung.
Beachte:(1) Die minimal detektierbare Sensitivität dieses Produktes sind 0.38
Genomäquivalente/Test. Bei einem negativen Testergebnis bei
Patienten mit persistierenden Symptomen, die für eine Infektion
mit MTBC sprechen, sollte erneut getestet werden.
(2) Obwohl die Primer für eine Region mit sehr wenigen Variationen
hergestellt wurden, könnten weitere Variationen bei MTBC
auftreten, die zu einer geringeren Sensitivität dieses Testes führen
könnten. Deshalb schließt ein negatives Testergebnis eine
Infektion mit MTBC nicht aus.
(3) Die Testergebnisse können durch die Qualität derProbenentnahme, Probenaufarbeitung, Inhibitoren und andere
Fehler bei der Durchführung der Methode beeinflusst werden.
Ein negatives Testergebnis schließt die Anwesenheit von MTBC in
der Patientenprobe nicht aus. Für die klinische Diagnose müssen
alle Labortests, die Verfassung des Patienten und die Symptomatikeinbezogen werden.
(4) Dieses Produkt wurde für den qualitative Nachweis von MTBC
entwickelt und nicht für quantitative Messungen. Die
Fluoreszenzintensität, die mit der Trübung der Probe zunimmt,
korreliert nicht mit der Menge von Template DNA.

INTERFERIERENDE SUBSTANZENInterne Untersuchungen haben gezeigt, dass die Messungen durch
folgende Substanzen nicht beeinflusst werden: freies Bilirubin ( 91,0
mg/dL ), konjugiertes Bilirubin ( 101,0 mg/dL ), Darmlypmphe( F ormazintrübung: 7.300 ) und hämolytisches Hämoglobin ( 2.475
mg/dL ).
Interne Untersuchungen zum Einfluss von Medikamenten haben
gezeigt, dass die Messungen durch folgende Medikamente nicht
beeinflusst werden: Isoniazid ( 100 µg/mL ) , Ethambutol ( 20 µg/mL ) ,Rifampicin ( 100 µg/mL ) , Pyrazinamid ( 500 µg/mL ), Kanamycin (20µg/mL), and Streptomycin (500 µg/mL).

LEISTUNGSDATEN

1. Sensitivität und Genauigkeit
Folgende Proben wurden getestet: Negative Probe ( K onzentration: 0 Genomäquivalente/Test ) Positive Probe 1 (1,875 Genomäquivalente/Test ) Positive Probe 2 (125 Genomäquivalente/Test );Die negative Probe wurde negativ und die positive Proben 1 und
2 positiv getestet.
2. Intra-Assay Reproduzierbarkeit
5 negative und 5 positive Proben wurden gleichzeitig getestet. Die
negativen Proben wurden negativ, die positiven Proben wurden
positiv getestet.
3. Nachweisgrenze
0,38 Genomäquivalente/Test
4. Kreuzreaktivität
Nichtuberkulöse Mykobakterien und Bakterien, die respiratorische
Erkrankungen hervorrufen, wurden mit dem Testsystem negativ
getestet. Darüber hinaus wurde keine Kreuzreaktivität mit allen
Bakterien, die in der nachfolgenden Tabelle aufgelistet sind,nachgewiesen.
Nichttuberkulöse Mykobakterien

INTERPRETATION DER ERGEBNISSE

Für den visuellen Fluoreszenznachweis（Mit HumaLoop T）
Das
Reaktionsröhrcheninden
Röhrchenständer
derFluoreszenzeinheit stellen, UV Lampe einschalten und das Röhrchen
von der Seite betrachten.
（Für andere Inkubatoren mit UV Lampen）
UV Lampe einschalten und den Boden jeden Röhrchens von der
Seite mit Schutzbrille oder anderen schützendem Equipment
betrachten.
Für eine gültige LAMP Reaktion sollten die folgenden Ergebnisse
erhalten werden: Positivkontrolle: Grünes Fluoreszenzlicht wird ausgestrahlt.
 Negativkontrolle: Es wird kein Fluoreszenzlicht ausgestrahlt.
Wenn eine Kontrolle ungültig ist, sollten alle Proben als ungültig
beurteilt und die Messung wiederholt werden. Nach Bestätigung
einer gültigen LAMP-Reaktion sollten die Proben wie folgt beurteilt
werden: Positive Probe: Grünes Fluoreszenzlicht wird ausgestrahlt.
 Negative Probe: Es wird kein Fluoreszenzlicht ausgestrahlt.
Für den Nachweis mit Real-Time Turbidimeter HumaTurb C
Nach Bestätigung der Trübungszunahme in der Positivkontrolle (abernicht in der Negativkontrolle), sollten die Proben nach folgenden
Kriterien beurteilt werden (Fig 1 und 2):
 Positiv: Zunahme der Trübung.

Mycobacterium asiaticum

Negativ

Mycobacterium kansasii

Negativ

Mycobacterium marinum

Negativ

Mycobacterium simiae

Negativ

Mycobacterium scrofulaceum

Negativ

Mycobacterium szulgai

Negativ

Mycobacterium gordonae

Negativ

Mycobacterium xenopi

Negativ

Mycobacterium avium

Negativ

Mycobacterium intracellulare

Negativ

Mycobacterium gastri

Negativ

Mycobacterium haemophilum

Negativ

Mycobacterium malmoense

Negativ

Mycobacterium chelonae

Negativ

Mycobacterium fortuitum

Negativ

Mycobacterium flavescens

Negativ

Bakterien, die respiratorische Erkrankungen verursachen

15

Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus

Negativ
Negativ

Haemophilus influenzae

Negativ

Moraxella catarrhalis

Negativ

Klebsiella pneumoniae

Negativ

Escherichia coli

Negativ

Legionella pneumophila

Negativ

Pseudomonas aeruginosa

Negativ

Mycoplasma pneumoniae（I）

Negativ

Mycoplasma pneumoniae（II）

Negativ(4) Tomita N., et al.: Nat. Protoc. 3, No. 5, 877–882 (2008)(5) The guideline for the bio-safety and bio-hazard (by the JapaneseSociety for Bacteriology): Japanese Journal of Bacteriology 54, No.
3, 667–715 (1999)(6) WHO global TB database:
http://www.who.int/tb/country/en/
http://www.who.int/tb/publications/global_report/2009/update/a-1_
summary.pdf
http://www.who.int/tb/publications/global_report/2009/update/a-3_
summary.pdf(7) Kekkaku No Tokei 2009 (Statistics of TB 2009): Japan AntiTuberculosis Associa

5. Reaktivität gegen MTBC
gegen
Mycobacterium
tuberculosis,
Die
Reaktivität
wurde
Mycobacterium bovis und Mycobacterium africanum
bestätigt.
6. Informationen zum Kalibrator
Die Leistung dieses Testes wurde mit Plasmid-DNA als Kalibrator
validiert, welche die gyrB und IS Region der genomischen DNA
von Mycobacterium tuberculosis H37Rv (GenBank No.
NC_000962) enthält.
7. Klinische Leistung
Tuberkulose ist immer noch eine der weltgrößten Infektionen.
Die eschätzten Neuinfektionen von Tuberkulose liegen weltweit bei
ca. 9,4 Mio. und Sputum-Abstrich positive bei 4,3. Mio. (2008,
Daten publiziert von der WHO). (6) In Japan wurden 2008 24.760
neue Fälle registriert von denen 2.216 starben (Kekkaku No Tokei
2009 Statistics of TB 2009). (7)Dieses Produkt wurde in 2 medizinischen Einrichtungen mit
Klasse 2 Infektionskrankheiten (Einrichtung nur mit Betten fürTuberkulosepatienten) auf seine Testleistung im Hinblick auf die
Diagnose von Patienten mit Verdacht auf TB getestet. Neben PCR
und TRC, beide Methoden sind in Japan bereits zugelassen,
wurde das Kit verwendet, um Sputumproben, die über 2 Tage
gesammelt wurden (320 Proben von 160 Patienten) zu
untersuchen. Die Ergebnisse wurden mit denen der PCR und TRC
verglichen. Zusätzlich wurde die DNA Extraktion vonunbehandelten Sputumproben (LAMP mit unbehandeltem
Sputum) und NALC-NaOH behandeltem Sputum und einigen
anderen Prozessen (LAMP mit vorbehandeltem Sputum) im
Zusammenhang mit diesem Kit evaluiert.
Wie in der Tabelle unten gezeigt, ist die Gesamtübereinstimmungs rate wie folgt: LAMP mit unbehandeltem
Sputum vs. PCR: 91,5% (291/318 Patienten); LAMP mit
vorbehandeltem Sputum vs. PCR: 92,1% (293/318); LAMP mit
unbehandeltem Sputum vs. TRC: 94,3% (230/244); LAMP mit
vorbehandeltem Sputum vs. TRC: 93,0% (227/244). Darüber
hinaus stimmten die Ergebnisse, die mit dem Real-Time
Turbidimeter erhalten wurden, mit denen des visuellen
Fluoreszenznachweises, mit Ausnahme einer Probe, überein.
(Diese Probe bestand aus blutigem Sputum und wurde mit dem
visuellen Fluoreszenznachweis durch den Einfluss von Blut falschnegativ getestet). Deshalb wurde geschlussfolgert, dass die
Testleistung beider Nachweismethoden identisch ist.
LAMP
Unbehandeltes
SputumVorbehandeltes
SputumPositiv
Negativ
Positiv
Negativ

LAMP
Unbehandeltes
SputumVorbehandeltes
SputumPositiv

PCR
Positiv Negativ
196
7
20
95
194
3
22
99
TRC
Positiv Negativ
163
5

Negativ
Positiv

9
157

67
2

Negativ

15

70

BESTELLINFORMATION
Bestellnr.

Produktname

Inhalt972000Loopamp™ MTBC
Detection Kit

96 Tests

970000Loopamp™ PUREDNA Extraction Kit

90 Tests

971000

Pipette-60 Set

961000

HumaLoop T

963200

HumaTurb C

REFERENZEN

Methodenübersicht
Durchführung mit dem Real-Time Turbidimeter
Herstellung der Probenlösung und Negativkontrolle

60 µL geeignetes Sputum mit einem eitrigen Anteil
pipettieren. 60 µL NC MTB pipettieren.
Mit dem LoopampTM PURE DNA Extraction Kit
DNA aus dem gewonnenen Sputum und NC MTB
extrahieren. Die erhaltenen Lösungen werden als
Probenlösung und Negativkontrolle verwendet.
Herstellung Reagenzien

Die benötigte Anzahl Reaktionsröhrchen dMTB entnehmen.
( Für Proben, Negativ- und
Positivkontrolle)

30µL Proben- oder Kontrolllösung
Reaktionsröhrchen pipettieren.

in

jedes

NC MTBC als Negativkontrolle verwenden.
PC MTBC als Positivkontrolle verwenden.
(Die Positivkontrolle zuletzt ansetzen.)
Reaktionsröhrchen umdrehen, damit sich die
Flüssigkeit im Deckel sammelt. 2 Min. warten.
Um Reagenzien zu mischen, Röhrchen fünfmal
invertieren und anzentrifugieren.
( Blasen vermeiden.)
Amplifikation
Röhrchen in den Reaktionsblock des Turbidimetersstellen.
Wie in der Gebrauchsanweisung angegeben, Reaktion
starten und Trübung messen (40 Min. bei 67,0C).

Gesamtübereinstimmungsrate
91,5%(291/318)
92,1%(293/318)
GesamtübereinstimmungsrateÜberprüfen, ob die Polymerase vollständig inaktiviert wurde (5 Min.
bei 80°C oder 2 Min. bei 95°C). Alle Reaktionsröhrchen aus dem
Real-Time Turbidimeter nehmen, ohne sie zu öffnen. Röhrchen nichtbeschädigen.

94,3%(230/244)93,0%(227/244)

VD

1 Pipette; 4 X 96 Pipettenspitzen
1 Inkubationseinheit
1 Fluoreszenzdetektionseinheit
1 Kontrolleinheit
1 Amplifikationseinheit

Exklusiver Distributor

HUMAN Gesellschaft für Biochemica
und Diagnostica mbH,
Max-Planck-Ring 21 65205 Wiesbaden Germany(1) Notomi T., et al.: Nucleic Acids Research 28, No. 12, e63 (2000)(2) Nagamine K., et al.: Clin. Chem. 47, No. 9, 1742–1743 (2001)(3) Mori Y., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, No. 1,
150–154 (2001)

Revisionsdatum: 1. Oktober, 201916380236-B