原索動物の尾の形成過程にみる新しい形づくりの原理の解明
New principles in tissue shaping in light of tail formation processes in primitive
chordates（日本発生生物学会推薦）

代表研究者

東北大学

熊野岳

Tohoku University

Gaku Kumano

Understanding how tissues become shaped is a fundamental issue in the field of developmental biology. We areinterested in understanding molecular and cellular mechanisms by which the tail of the ascidian embryo is formed. In
the ascidian late neurula embryo, the boundary between the trunk and tail regions can be first recognizedmorphologically as a bending of the epithelial layer, which we call “KUBIRE”. We report here that we havesuccessfully identified a factor that regulates “KUBIRE” formation and obtained a functional data that supports ourmodel. We have proposed a model in which epithelial cell divisions with different division orientations (i.e. around thecircumference of the embryo in the future trunk region vs. along the anterior-posterior axis in the future tail region) isinvolved in the “KUBIRE” formation. In this study, we used chemical inhibitors to block the function of dynein andobserved abrogation of spindle rotation before the cell divisions in the future tail region causing the similar divisionorientation pattern between the two regions, and, eventually, of “KUBIRE” formation. Therefore, with the identificationof a regulatory factor dynein, we show that cell divisions with different division orientations contribute to the tissue
shaping in the ascidian embryo.

研究目的れ」の位置がどう決まるのか、４）尾が伸長する発生過程において、「形をつくる」現象は長い間際の表皮細胞の形態形成運動の記載とその分子機研究者を魅了してきた。本研究では、構成する細構の解析、である。このうち、１）と２）につい胞数が少ないホヤ胚を用いて個々の細胞の動きにて特筆すべき成果をあげることができたのでここ着目しつつ、全体としてどのような制御のもとでで報告する。

個々の細胞が運動し、その結果新しい形がつくらホヤは我々ヒトを含む脊椎動物と同じ脊索動物れていくのかを明らかにすることを目的とした。

門に属す。他の脊索動物、特に脊椎動物の尾ので具体的には、ホヤ胚発生における最も顕著な形づき方は、後期神経胚の後端に存在する尾芽と呼ばくりの１つである尾の形成に着目し、胴部と尾部れる細胞群の後方への増殖によることが知られる。の境界である「くびれ」の形成にはじまり尾部の一方で、ホヤ胚における尾のでき方は、これとは伸長に至る一連の尾の形づくりがどのように制御著しく異なる。ホヤ胚では後期神経胚になると尾され進行しているのかを明らかにするために、以を作る初期段階として、体の前後半分あたりの場下の４つの計画を持って臨んだ。すなわち、１）「く所に「くびれ」ができ（次ページ、図１白矢頭）、びれ」形成に関わる分子の同定、２）明快な境界はじめて胴部と尾部の境界が目に見えて形成されを持って異方向に分裂する細胞分裂が「くびれ」る。この後尾部のみが、増殖を伴わず、尾部全体形成をもたらすか、３）胚の前後に沿った「くびで前後に沿って著しく伸長し、最終的には胴部のの制御には、細胞膜直下に局在する Pins/Gαi/Mud と呼ばれるタンパク質複合体か、Dsh と呼ばれるタンパク質が関わる２つの系が主に知られる(1)。どちらの系においても、それぞれの細胞膜直下局在タンパク質（複合体）と結合したダイニンと呼ばれるモータータンパク質が、中心体から伸びる微小管を局在４～５倍の長さにまで達する。このような他では地点に引き寄せて分裂装置自体を回転させる動力と見られないホヤに特徴的な尾づくりの様式には、なっていることが示されている。そこで２つの系に新規な形づくりの原理が働いているはずだと考え共通するダイニンに着目し、ホヤ神経胚表皮細胞のた。実際我々は、これまでにマボヤ胚において「く後方部で起こる分裂前の分裂装置の回転を阻害するびれ」形成時の個々の表皮細胞の動きに着目することを試みた。

ことで、胚の前後で明快な境界を持って異方向にダイニンは細胞分裂等の細胞の基本的な活動に必分裂する細胞分裂が生じ、「くびれ」の形成をもた須なタンパク質であると考えられたので、影響を観らすという、これまでにない新しい形づくり機構察したい時期以前の機能阻害による影響を避けるたのモデル(図 2)を提唱するに至った。すなわち、神め、市販の阻害剤 2 種（Ciliobrevin D と EHNA）を

経胚の前方部では胚の周囲に沿った方向に表皮細用いて、特定の発生時期から阻害剤処理をすること

胞は分裂し、後方部は胚の前後に沿った方向に分でダイニンの機能を阻害することにした。阻害剤処裂する。これら細胞分裂の結果、胚の周囲の細胞理開始の時期と処理濃度の 2 つについて様々な条件数/長さが後方部では前方部より少なく/短くなるを検討した結果、神経胚回転（神経胚全体が頭からため「くびれ」が生じると考えた。また、さらに見て時計回りに 90 度回転して胚の左側面を下にす

興味深いことに、「くびれ」形成前の表皮細胞の分る現象）後 1 時間後から 30 µM Ciliobrevin D 処理を

裂装置は、前方部後方部に関わらず全て胚の周囲1 時間した場合と、同じく神経胚回転後 1 時間後かに沿った方向を向くなかで、後方表皮細胞でのみ

ら 2 mM EHNA 処理を 1 時間、その後 1mM EHNA 処

分裂直前に分裂装置が 90°回転し、前後で異なる理を 30 分間した場合に、細胞分裂を阻害することな方向の細胞分裂をすることがわかった。

く分裂装置の回転、すなわち胚後方部での前後軸に上記モデルは、現時点では、細胞の動きの記載沿った回転を抑制することに成功した（5 つの正常のみを基に提唱された不完全なものであり、実験胚における 72 個の細胞で分裂方向を測定；7 つの的に検証する必要がある。したがって、分裂方向の違いを生み出す過程に関わる分子を同定し、その機能を阻害することで分裂方向を乱した際に、「くびれ」の形成にどのような影響を与えるのかを観察することを具体的な目的とし（上記計画の１）と２））、「くびれ」形成に関わる新しい形づくりの原理の解明に挑んだ。
研究経過
分裂方向の違いを生み出す過程に関わる分子の候補として、他の系で明らかになっている分裂装置の方向を制御する因子群に着目した。分裂装置の方向

Ciliobrevin D 処理胚における 105 個の細胞で分裂方た方向に向かせると考えられる。実際、分裂が起こ向を測定）。そしてこれらの阻害剤処理胚では、「くる前後の胚後方部の表皮細胞において、細胞同士がびれ」の形成が著しく抑えられることが明らかにな前後に接する境界面にダイニンの強いシグナルが観った。
「くびれ」の形成度合は、2 つの独立した定量察される結果を得ている。ただし、このシグナルが的測定方法を用い、両者で統計的に優位な差を示し個々の細胞の前側に局在するのか後側に局在するのた（正常胚 n = 10；Ciliobrevin D 処理胚 n = 19）。

かは、現時点では特定できておらず今後の課題といしかしながら、上記 Ciliobrevin D 処理の場合、表える。

皮細胞の分裂の開始時期が正常胚に比べ 1 時間ほど（平均 59 分、n = 20）遅れ、さらに表皮細胞分裂の考察開始から終了（表皮細胞のうち最初に分裂する細胞

ここで紹介した「くびれ」のような上皮層が湾曲の分裂時期から最後に分裂する細胞の分裂時期のした構造は、これまでショウジョウバエを中心とし間）までにかかる時間が、正常胚に比べて 1 時間ほた モ デ ル 動 物 に お け る 研 究 に よ り 、 apicalど（平均 49 分、n = 20）伸びた。したがって、上記constriction(2)、細胞分裂による細胞の球状化(3)、細胞処理濃度より低い 10 µM Ciliobrevin D 処理をその他死(4)等によって引き起こされることがわかっていた。の条件は同じにして行ったところ、同程度の分裂開今回、多くの動物種で見られる尾の形成機構とは異始のタイミングの遅延（平均 78 分、n = 8）と分裂のなる様式を採るホヤの尾の形成に着目したことで、開始から終了にかかる時間の延長（平均 48 分、n = 8）

これまで知られていなかった異方向細胞分裂によるが同様に観察されたが、「くびれ」の形成に異常は見形づくりという新しい形作りの原理の証拠を得るこられなかった。よって、阻害剤処理による細胞分裂とができた。のタイミングのずれは「くびれ」形成には影響を与えないと考えられる。

しかしながら、本結果をもってしても、「くびれ」形成機構の全容解明には程遠いと言わざるを得ない。

以上のことより、本実験の結果、「くびれ」形成に実際、ダイニン阻害剤処理胚においては、「くびれ」関して 2 つの重要なことを明らかにすることができ形成が著しく抑制されるものの、いまだ「くびれ」た。1 つ目は、「くびれ」形成に関わる分子を同定す構造を見て取ることができる。すなわち分裂方向のることができたこと、すなわち、ダイニンが分裂装制御以外に別の機構が存在する可能性が考えられる。

置の回転を介した表皮細胞後方部の細胞分裂方向を一つの可能性は、中胚葉性の内部組織からの作用で制御することで、「くびれ」形成に関与することが明ある。教科書的には、体や組織の形づくりは上皮細らかになった。2 つ目は、上記分子の機能阻害実験胞層の変形により起こるよう記載されているが、内により、明快な境界を持って異方向に分裂する細胞部組織からの影響があるのは間違いないことと思わ分裂が、確かに「くびれ」形成をもたらすであろうれる。幸い、ホヤ胚はその大きさゆえ顕微胚操作にことを支持する実験的証拠を掴んだことである。

優れ、上皮細胞層だけを単離することが可能かもし現在は、さらに上記モデルをより強固なものとすれない。また、上皮層と内部組織を構成する細胞系るために、ダイニンの細胞内局在を、ダイニンに対譜は発生の非常に早い時期に分かれる（8 細胞期）する抗体を用いた抗体染色により明らかにしようとため、どちらかの系譜の細胞にだけ阻害剤顕微注入している。モデルが正しいとするならば、ダイニン等による機能阻害のための実験操作を加えて、「くび（及びそれに結合する Pins/Gαi/Mud 複合体、または、れ」形成への影響を見ることも可能である。したがDsh）は、分裂装置が回転する表皮細胞内においてって、このような教科書的な常識を超えて、新しい前方部または後方部に局在し、局在方向へと中心体現象を解明するうえでもホヤは良い実験動物といえの一方を引っ張り、分裂装置の向きを前後軸に沿っる。

最後に、今後は、当初本研究の目的としていた「くSchott, S., Guarner, A. and Suzanne, M. Apico-basalびれ」形成以降の尾部の伸長過程（上記計画の４））

forces exerted by apoptiotic cells drive epitheliumについてもその仕組みを解明することで、ある特定

folding. Nature 518, 245-248.の動物胚において、尾という形がどのように形成されるのかその全体像を明らかにしていきたいと考え研究の発表ている。

口頭発表
1.

仕組みの理解へ向けて、シンポジウム「海鮮無参考文献

脊椎動物(1) Li, M. S. and Johnston, C. A. (2013) Molecularpathways regulating mitotic spindle orientation in2.

ascidian, Halocynthia roretzi. 8th International(2009) Pulsed contractions of an actin-myosin(3) Kondo, T. and Hayashi, S. (2013) Mitotic cell

Kumano, G.. and Nakamoto, A. Mechanisms of the“KUBIRE” formation in the neurula embryo of the(2) Martin, A. C., Kaschube, M. and Wieschaus, E. F.

495-499.

―生命情報の宝の山 II―」、第 85 回

日本動物学会、仙台、2014 年 9 月 11～13 日.

animal cells. Development 140, 1843-1856.

network drive apical constriction. Nature 457,

熊野岳、中本章貴：ホヤ胚における形づくりのTunicate Meeting, Aomori. July 13-17, 2015.
ポスター発表1.

Nakamoto A. and Kumano, G. Analyses of themechanisms of epithelial morphogenesis during therounding accelerates epithelial invagination. Naturetail494, 125-129.

Halocynthia roretzi. 8th International Tunicate(4) Monier, B., Gettings, M., Gay, G., Mangeat, T.,

formation

intheembryos

Meeting, Aomori. July 13-17, 2015.

ofascidian