J Life Sci Res 2021; 18: 1-6© 2021 Osaka Prefecture University

Journal of Life Science Research
Online ISSN 2186-5809

速 報

大腸がん細胞における分子標的薬 foretinib 抵抗性獲得メカニズムの解明
永野ひかる†，松山知菜未，間部由佳理，砂川実乃莉，檜垣七菜子，吉田萌恵，近藤茂忠
1大阪府立大学総合リハビリテーション学研究科栄養支援系領域，大阪府羽曳野市はびきの 3 丁目 7 番 30 号

受付：2021 年 10 月 15 日，受理：2021 年 10 月 26 日

Elucidation of molecular mechanism of foretinib-induced adaptive resistance incolon cancer cells
Hikaru NAGANO † , Chinami MATSUYAMA, Yukari MANABE, Minori SUNAGAWA, Nanako HIGAKI, Moe YOSHIDA, Shigetada KONDO.
1Department of Clinical Nutrition, Graduate School of Comprehensive Rehabilitation, Osaka Prefecture University

Received 15 October 2021; accepted 26 October 2021

Key words: がん分子標的薬，大腸がん，獲得耐性

１

緒言
がん分子標的薬は，がん患者の治療成績を飛躍的に向上

がんにおいては EGF-R 分子標的薬と HGF-R 分子標的薬させた新しい抗がん剤である．種々の増殖因子受容体が伝の併用が特に行われている 11．乳がんや肺がんにおいては達する細胞増殖，浸潤，転移などのシグナルを直接特異的IGF-1R 分子標的薬と EGF-R 分子標的薬の併用が実施されに阻害することで，腫瘍縮小効果を示す．「夢の治療薬」ている 7, 8, 12．

として登場した分子標的薬であるが，臨床的問題点として我々はこれまでの研究で血管内皮細胞に作用し，がん血治療開始後数か月でほとんどの患者に薬剤抵抗性が出現す

管新生を阻害する分子標的薬抗 VEGF-R 阻害薬 sunitinib

ることが報告されている 1-4．

ががん細胞に直接作用すること，がん細胞の VEGF-R が近年，分子標的薬抵抗性獲得のメカニズムとして，別の増殖因子受容体をバイパス経路として活性化し，分子標的長期間阻害されるとバイパス経路として HGF-R 経路が活性化することを明らかにしてきた 13-18．

薬により阻害された増殖因子受容体を代償していることが本研究では，大腸がん細胞が獲得した sunitinib 抵抗性

報告されている 5．表皮細胞増殖因子受容体（EGF-R）は肺克服のために，VEGF-R と HGF-R を阻害するチロシンキがんや大腸がんにおいて，過剰発現してがんの悪性化に関ナーゼ阻害剤 foretinib を使用した結果，大腸がんが新た与している．分子標的薬によって EGF-R は長期間阻害さに foretinib 耐性を獲得することを明らかにした．またそれると，バイパス経路として，細胞遊走や浸潤に関わる肝のメカニズムとして，HGF-R が EGF-R と複合体を形成し，細胞増殖因子受容体（HGF-R）や 6，がん細胞生存やがん細再活性化していることを見出した．

胞増殖に関与するインスリン様増殖因子受容体（IGF-1R）が活性化される 7．また，分子標的薬によって IGF-1R が２研究方法長期間阻害されると，EGF-R がバイパス経路として活性2.1

試薬化する 8．

分子標的薬として，VEGF-R チロシンキナーゼおよびバイパス経路活性化によるがん分子標的薬抵抗性を解決

HGF-R チロシンキナーゼ阻害剤である foretinib，およびするアプローチとして，複数の異なる分子標的薬を多剤併

EGF-R チロシンキナーゼ阻害剤である erlotinib（いずれ用する研究が進んでいる．具体的には，大腸がん，肺がも Selleck Chemicals, Houston, USA）を使用した．ウェス

んで血管内皮細胞増殖因子受容体（VEGF-R）分子標的薬

タンブロット解析では，ウサギモノクローナル抗リン酸化と EGF-R 分子標的薬の併用が行われている 9, 10．加えて肺HGF-R 抗体（D26），ウサギモノクローナル抗 HGF-R 抗体（D1C2），ウサギモノクローナル抗リン酸化 EGF-R 抗体†連絡著者

E-mail: nagano@rehab.osakafu-u.ac.jp（D7A5），ウサギモノクローナル抗 EGF-R 抗体（D38B1），

2

抗 ウ サ ギ IgG ホ ー ス ラ デ ィ ッ シ ュ ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ

2.5

遊走能の解析

（HRP）結合抗体（#7074），抗マウス IgG HRP 結合抗体

遊走能の解析は文献 7 に則して行った．5 × 10⁴ 個の細（#7076）（ 以 上 全 て Cell Signaling Technology, Danvers,胞 を，1%FBS を 含 む RPMI-1640 培 地 0.25ml で 懸 濁 し，USA），およびマウスモノクローナル抗ヒトβ- アクチン

8-µm pore membrane chamber（ノンコーティング）（BD抗体（clone AC-74）（Sigma-Aldrich）を使用した．共免疫

Bioscience, Franklin Lakes, USA）に播種した．下部コン沈降解析では，マウスモノクローナル抗 HGF-R 抗体（H-パートメントには 4%FBS を含む RPMI-1640 培地を 0.7510），およびマウスモノクローナル抗 EGF-R 抗体（528）（いml 入れた．標準条件下（37˚C/5％ CO₂）で 24 〜 48 時間のずれも Santa Cruz Biothechnology, Dallas, USA）を使用

培養後，上部コンパートメントから下部コンパートメントした．に移動した遊走細胞を，ヘマカラーキット（Merck）で染色した．メンブレンをスライドガラスに封入し，BZ-X710

2.2細胞培養

ヒト大腸がん細胞株 HCT116 は American Type CultureCollection（Rockville, USA）から入手し，1％ウシ胎児血蛍光顕微鏡（Keyence, Osaka, Japan）を用い観察した．遊走細胞の数は，高倍率視野（HPF）（20 倍）から 4 〜 6 視野をランダムに選択し，カウントした．

清（FBS）（SAFC Biosciences; Merck KGaA, Darmstadt,Germany），100U/ml ペニシリンおよび 0.1mg/ml ストレ

2.6

共免疫沈降解析プトマイシン（Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan）を含む

共 免 疫 沈 降 解 析 の 手 順 は 文 献 7 に 則 し て 行 っ た． 細RPMI-1640 培地（Nacalai Tesque Inc.）で 37℃，5％ CO₂胞 は HBSS（+）（Nakarai Tesque Inc.）で 2 回 洗 浄 し た下で培養した（HCT/parent）．細胞への分子標的薬処理は後，ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）（DSP）

全て，foretinib 10nM，erlotinib 5µM で行った．

（Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA）でタンパク質2.3（pH7.0），150mM NaCl，10mM EDTA，1.5mM MgCl₂，1％を架橋した．細胞をライシスバッファー［50mM HEPES
foretinib 適応細胞の樹立

HCT116 に foretinib（10nM）に 3 か月間継続的に処理す

Nonidet P-40，1％ Triton X-100，1mM フッ化フェニルメることで，foretinib 適応細胞（HCT/foretinib）を樹立した 11．

チルスルホニル，1mM オルトバナジン酸ナトリウム，0.5％デオキシコール酸ナトリウム，20mM フッ化ナトリウム，2.4

ウェスタンブロット解析

および 20mM ピロリン酸ナトリウム］を用いて氷上で抽ウェスタンブロッティングは文献 7 に則して解析を行っ出し，得られた細胞抽出液を 27 ゲージの注射針を用いてた．細胞抽出液はライシスバッファー［125mM Tris-HCl

ホモジナイズした後，16,000rpm，4℃で 20 分間遠心した．

（pH7.0），4％（v/v）ドデシル硫酸ナトリウム（SDS），おBCA キットを用いて上清細胞抽出液のタンパク質濃度をよび 10%（v/v）グリセロール］を用いて抽出した．タン

決定した．総タンパク質 500µg に，マウスモノクローナ

パク質濃度はビシンコニン酸タンパク質アッセイ（BCA）

ル抗 HGF-R 抗体（H-10），およびマウスモノクローナル抗キット（Nakarai tesque Inc.）により決定した．タンパク

EGF-R 抗体（528）をそれぞれ 2µg 加え，緩やかに転倒混質を SDS-PAGE サンプルバッファー［10%（v/v）グリセ和しながら 4℃，一晩反応させた . 次にプロテイン G マグ

ロールおよび 0.4%（v/v）メルカプトエタノール（2ME）］

ネットダイナビーズ（Thermo Fisher Scientific）を 4˚C でで SDS 化し，総タンパク質 50µg/ ウェルを 10％ SDS- ポ

2 時間反応させた後，免疫沈降物を洗浄し，SDS-PAGE サ

リアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）で分離した後，ンプルバッファー［125mM Tris-HCl（pH7.0），4％（v/v）

ポリフッ化ビニリデンメンブレン（Bio-Rad Laboratories,ドデシル硫酸ナトリウム（SDS），2%（v/v）メルカプトエ

California, USA）へと転写した．メンブレンを 5％スキム

タノール（2ME），および 10%（v/v）グリセロール］でタ

ミルクで室温，1 時間ブロッキングした後，一次抗体を 4℃

ンパク質を SDS 化した．その後，ウェスタンブロット解にて 18 時間反応させた . 使用した一次抗体は，ウサギモ析を行った．

ノクローナル抗リン酸化 HGF-R 抗体（1 : 1000），ウサギモ
ノクローナル抗 HGF-R 抗体（1 : 1000），ウサギモノクロー

2.7

統計処理

ナル抗リン酸化 EGF-R 抗体（1 : 1000），ウサギモノクロー

統計学的検討は Student t 検定を用い，有意差判定は 1％ナル抗 EGF-R 抗体（1 : 5000），およびマウスモノクローナとした．結果の誤差範囲は平均±標準偏差で表している．

ル抗ヒトβ- アクチン抗体（1 : 10000）である（カッコ内は希釈倍率）．その後，二次抗体の抗ウサギ IgG HRP 結合３抗体（1:10000）および抗マウス IgG HRP 結合抗体（1:10000）

3.1 分子標的薬 foretinib（VEGF-R/HGF-R 阻害薬）に対を，27℃にて 1 時間反応させた．メンブレンを ECL ウェ

結果する抵抗性の獲得

ス タ ン ブ ロ ット 検 出 試 薬（GE Healthcare Life Sciences,

我 々 は VEGF-R 分 子 標 的 薬（sunitinib）長 期 間 処 理 にLittle Chalfont, UK）で化学発光させ，ChemiDog imaging

よって，大腸がん細胞が sunitinib に対して抵抗性を獲得

system（Bio-Rad Laboratories）を用いて検出した．

することを報告した．またそのメカニズムとして HGF-Rバイパス経路の活性化することを見出した 15. そこで本研

3究では，VEGF-R に加え，バイパス経路の HGF-R を同時抗性出現を検討するため，HCT116 細胞を foretinib 存在に阻害すると抵抗性は獲得されずに済むのかどうかを検討

下で 3 か月間培養し，foretinib 適応細胞（HCT/foretinib）

するため，VEGF-R と HGF-R の両方を阻害できる分子標を樹立した 15．foretinib 適応細胞ではコントロール細胞的薬（foretinib）を用いた．

（HCT/parent）と比較し，遊走能の著しい増大が見られ，ま ず， ヒ ト 大 腸 が ん 細 胞 株 HCT116 に foretinib を 短foretinib 抵 抗 性 を 獲 得 し て い る こ と が 明 ら か に な っ た

期間（24 時間）処理した結果を示す．foretinib によって（Fig. 1C）．これらの結果から，大腸がん細胞は VEGF-R

HGF-R の活性化は強く阻害され（Fig. 1A），抵抗性獲得のと HGF-R の 2 つの経路を同時に阻害しても，長期間処理細胞表現型である遊走能の活性化は見られなかった（Fig.

を継続すると sunitinib と同様に抵抗性を獲得することが1B）．そこで次に，foretinib 長期処理（3 ヶ月）における抵示された．

Fig. 1分子標的薬 foretinib（VEGF-R/HGF-R 阻害薬）に対する抵抗性の獲得（A, B）HCT116 細胞に foretinib を 24 時間処理し，（A）HGF-R およびリン酸化 HGF-R のウェスタンブロット解析と，（B）遊走能の解析（n = 4, means ± SD）を行った．（C）HCT116 に foretinib を 3 か月間（90 日間）継続的に処理し，foretinib 適応細胞（HCT/foretinib）を樹立した．コントロールとして HCT116 細胞の未処理群を HCT/parent 細胞とし，それぞれの遊走能を解析した（n = 4, means ± SD）．*P < 0.01（Student t 検定）

3.2

foretinib 抵抗性の分子メカニズムの解明いるか解析したところ，完全に阻害されることが明らかにforetinib 抵抗性獲得の分子機構を明らかにするため，なった（Fig. 2D）．これらの結果から，foretinib 適応細胞

foretinib の標的分子である HGF-R のリン酸化レベルのにおける HGF-R の再活性化は EGF-R 活性化に依存して経時的な変化をウェスタンブロット解析にて検出した．

いることが解った .

foretinib 処理 15 日間時点では，HGF-R はほぼ完全に阻害

次に，foretinib 適応細胞において HGF-R は EGF-R とされていた（Fig. 2A）．しかし，foretinib 処理期間が 60 日

ヘテロ複合体を形成しているのか，またその場合ヘテロを超えると，HGF-R が再び活性化していることが明らか

複合体が HGF-R の再活性化に関与しているのかを解析すになった（Fig. 2A）．

るため，タンパク質の架橋を行い，共免疫沈降実験とウェ

増殖因子受容体である EGF-R は，肺がん細胞においてスタンブロット解析を行った．HGF-R を HGF-R 特異的

HGF-R とヘテロ複合体を形成し，HGF-R をリガンド非依抗体で免疫沈降し，HGF-R と共沈降する EGF-R のタンパ存的に活性化すること（トランスアクチベーション）が知ク量とそのリン酸化レベルをウェスタンブロット解析しられている 19．そこで本研究で用いる foretinib 適応細胞

た．その結果，コントロール細胞と比較し，foretinib 適応においても同様の機構が働き，HGF-R が再活性化された細胞で HGF-R/EGF-R 複合体形成が増加していることがのではないかと仮説を立てた．この仮説を証明するため，解った（Fig. 2E）．さらに，複合体を形成する EGF-R は活

EGF-R のリン酸化レベルの経時的な変化をウェスタンブ性化していた（Fig. 2E）．同様に EGF-R を EGF-R 特異的ロット解析で検討した . その結果，HGF-R の再活性化と抗体で免疫沈降し，ヘテロ複合体形成能と HGF-R のリン

EGF-R の活性化亢進が同時期に起こっていることが解っ酸化レベルを解析すると，EGF-R/HGF-R ヘテロ複合体のた（Fig. 2B）．
foretinib 適 応 細 胞 に お け る HGF-R の 再 活 性 化 に形成及び HGF-R のリン酸化は foretinib 適応細胞で増加していた（Fig. 2F）．これらの結果から，上述の仮説の通り，

EGF-R の活性化が必須であるのかどうかを検討するた

foretinib 適応細胞では HGF-R と EGF-R のヘテロ複合体

め，foretinib 適 応 細 胞 に EGF-R 特 異 的 な 分 子 標 的 薬の形成が促進される．さらに，トランスアクチベーショ（erlotinib）を 24 時間処理し，EGF-R の活性化を完全に阻ンにより EGF-R/HGF-R の共活性化が促進されることが害した（Fig. 2C）．このとき HGF-R の活性化が維持されてforetinib 抵抗性獲得のメカニズムであることが示唆され

4Fig. 2

foretinib 抵抗性の分子メカニズムの解明（A, B）HCT116 細胞に foretinib を処理し，処理期間 0,15,60,120 日でサンプルを採取した．ウェスタンブロット解析により（A）リン酸化 HGF-R および HGF-R，（B）リン酸化 EGF-R および EGF-R の発現量の経時的変化を測定した．
（C,D）
HCT/foretinib 細胞に erlotinib を 24 時間処理し，ウェスタンブロット解析により（C）リン酸化 EGF-R および EGF-R，（D）
リン酸化 HGF-R および HGF-R の発現量を測定した．（E）HCT/parent 細胞および HCT/foretinib 細胞において，HGF-Rを HGF-R 特異的抗体で免疫沈降し，HGF-R と共沈降する EGF-R およびリン酸化 EGF-R の量をウェスタンブロット解析した．（F）E と同様に，EGF-R を EGF-R 特異的抗体で免疫沈降し，EGF-R と共沈降する HGF-R およびリン酸化 HGF-R の量をウェスタンブロット解析した．（G）HCT/foretinib 細胞に erlotinib を（5µM）を 24 時間処理し，遊走能を解析した（n =4, means ± SD）．*P < 0.01（Student t 検定）

た．

４考察

さらに foretinib 適応細胞に erlotinib を併用し，VEGF-R，

本研究では，大腸がん細胞における分子標的薬に対するHGF-R，および EGF-R を全て同時に阻害すると，抵抗性多剤抵抗性の出現とその分子機構を解明した．我々の研究の表現型である遊走能は抑制されるのかどうかを解析しグループを含め複数の研究グループが VEGF-R 分子標的薬た．24 時間の erlotinib の併用は，遊走能の活性化をキャである sunitinib への抵抗性を獲得したがん細胞において，ンセルした（Fig. 2G）．このことから，erlotinib の併用は，阻害された VEGF-R 経路の代わりに HGF-R バイパス経路

foretinib 抵抗性を解除できることが明らかとなった．

が活性化され，遊走，浸潤，および転移の活性化などが生じ，5がんが悪性化することが報告されている 13-18．本研究では，

to HER2-targeted therapy in human breast cancer.

大腸がん細胞が獲得した sunitinib 抵抗性を解除する方法

Nat Clin Pract Oncol, 3: 269-280.

として，VEGF-R および HGF-R バイパス経路の両方を阻

2Zhang Z, Lee JC, Lin L, et al. (2012) Activation

害できる分子標的薬 foretinib を用いた．foretinib は短期of the AXL kinase causes resistance to EGFR-間（〜 15days）の使用では抗腫瘍効果を示したが，2 か月

targeted therapy in lung cancer. Nat Genet, 44:

以上の使用を続けると遊走能が亢進し，抵抗性が出現し852-860.

た．近年の研究で，VEGF-R に対する分子標的薬の他にも，34592-603.

る ．分子標的薬抵抗性獲得メカニズムには，代償的な増殖因子受容体の遺伝子増幅，発現亢進，リン酸化の亢進なBergers G, Hanahan D (2008) Modes of resistanceto anti-angiogenic therapy. Nat Rev Cancer, 8:

数多くのがん分子標的薬に抵抗性が生じることが解ってい4Engelman JA, Settleman J (2008) Acquired

どのバイパス経路の活性化が起こっていることが様々な研

resistance to tyrosine kinase inhibitors during

究グループにより明らかにされている 5．抵抗性獲得の責cancer therapy. Curr Opin Genet Dev, 18: 73-79.

任分子を標的とするアプローチが抵抗性を克服する研究と5して，数多く行われている 7, 9-12, 20．がん細胞が foretinib 抵

resistance to targeted therapies. Cancer Res, 75:
4247-4251.

抗性を獲得する１つのメカニズムとして，がん細胞が上皮間葉転換（EMT）の形質を獲得することがこれまでに報告

Wood KC (2015) Mapping the pathways of621

Bardelli A, Corso S, Bertotti A, et al. (2013)

されているが ，それ以上の詳細な分子機構及びバイパス

Amplification of the MET receptor drives

経路についてはこれまで明らかにされていなかった．

resistance to anti-EGFR therapies in colorectalcancer. Cancer Discov, 3: 658-673.

本研究では，foretinib 抵抗性獲得の責任分子が EGF-Rであることを同定した．VEGF-R/HGF-R 共阻害実験によ7

Morgillo F, Woo JK, Kim ES, et al. (2006)

り，HGF-R は EGF-R とヘテロ複合体を形成して，トラン

Heterodimerization of insulin-like growth factor

スアクチベーションにより自身の活性化を恒常的に維持しreceptor/epidermal growth factor receptor andていることを明らかにした．更に，foretinib と EGF-R にinduction of survivin expression counteract the

対する分子標的薬である erlotinib を併用し，抵抗性の責antitumor action of erlotinib.

任分子である EGF-R と，VEGF-R および HGF-R をマル

10100-10111.

チに阻害した．その結果，抗腫瘍効果が得られ，foretinib

8suggests dominance of IGF signaling in human

分子標的薬の治療が当初は有効であった患者においてbreast cancer cells.

も，治療開始後数か月で抵抗性を生じることが報告されている

Riedemann J, Sohail M, Macaulay VM (2007)Dualsilencing of the EGF and type 1 IGF receptors

抵抗性を解除することができた．

22, 23．また，これまでの分子標的薬の多剤併用により抵抗性が克服される in vitro の結果も多く報告されている

Cancer Res, 66:

Biochem Biophys Res

Commun, 355: 700-706.
9Ramalingam S, Forster J, Naret C, et al. (2008)

が，いずれの研究も数時間～数日の短期的な薬剤処理によDual inhibition of the epidermal growth factor

る結果であり，多剤併用の長期的な影響が考慮されていな

receptor with cetuximab, an IgG1 monoclonal

い．本研究の erlotinib 処理期間も 24 時間と短期間の処理

antibody, and gefitinib, a tyrosine kinase inhibitor,にとどまっている．このことから，今後 erlotinib の併用

in patients with refractory non-small cell lungを長期間続けていくと，foretinib 抵抗性と同様に erlotinib

cancer (NSCLC): A phase I study.
Oncol, 3: 258-264.

抵抗性が引き起こされることは，予想に難くない．将来的には分子標的薬の多剤併用によるアプローチとは異なる全J Thorac

10Falchook GS, Kurzrock R (2015) VEGF and dualEGFR inhibition in colorectal cancer. Cell Cycle,

く別のアプローチを実施する必要があると考える．

14: 1129-1130.
５

結論

11

Leighl NB, Tsao MS, Liu G,et al. (2017) A phase

本 研 究 で は， が ん 細 胞 が VEGF-R 阻 害 剤 で あ るI study of foretinib plus erlotinib in patients withforetinib に対する抵抗性が EGF-R 阻害剤である erlotinib

previously treated advanced non-small cell lungに よ っ て 解 除 で き る こ と を 示 し た． し か し な が ら，cancer: Canadian cancer trials group IND. 196.

erlotinib 抵抗性が生じる可能性は大きく，今後，分子標的

Oncotarget, 8: 69651-69662.

薬の多剤抵抗性を解除する新たなアプローチを探索する必

12

要がある．

Tandon R, Kapoor S, Vali S, et al. (2011) Dualepidermal growth factor receptor (EGFR)/insulinlike growth factor-1 receptor (IGF-1R) inhibitor:

６

文献
1

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6

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HGF/c-Met pathway is one of the mediators

HER2, HER3, and RET as heterodimerisationof sunitinib-induced tumor cell type-dependent

partners of MET in lung cancer with MET
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