減数分裂過程の染色体ダイナ ミクスとその制御機構に関する研究

Chromosomal dynamics and its regulation during meiosis(日 本分子生物学会推薦 )Tohoku University

代表研究者

東北大学

東谷篤志

協 同研究者

東北大学

高浪タカ子 TOhOku University

Atsushi H:gashitani

Takako Takanaml

Me:osis :s essentia: for generating haploid gametes during sexual reproduction.

course of meiotic prophase i,chromosomal changes.

Thehomologous

recombinationln theis accompanied by dynamic

θθ―′″カーノ/′ ′″―J′ gene is the oniy bacterial′θ ーllke gene iǹズ

θga″ s genome.
the nenlatode θaθ ″θ′力′bグ ′′′sθ ノ

Upon depletion of θθ―r″ カーr/r′ ″―J′ using theRNA interference method, abnormal ''kinked" chromosomes can be observed in mature oocytes

at diakinesis, whereas synapsis between homologous chromosomes during the pachytene stage

is normal.

Following fertilization,embryogenesis.

θθ―′″カーr/ra″ ‑5′ ―depleted embryos die ear:y in

From epistasis analyses with θθ―sρ θ′ ′ defective mutant and ionizing

radiation, it is indicated that θθ―r″ カー′J′ functions after double… strand break(DSB)/ra″ ―

formation of meiotic recombination.

Under the rθ―ε力々―′ defective conditio■ , whosemeiotic synapsis and meiotic recombination between homologous chromosomes are completely

inhibited, the εθ―rσ カー′/r′ ″J′ is normal:y expressed in the gonadal cells.

Moreover, it

seems that exogenous DSBs in the θθ…ε力々―′ defective nuclei at pachytene stage can berepaired between sister chromatids byθθ―r′ 卜 r/r′ ″―J′ dependent manner.

These resu:ts

indicate that θθ―′″カーr/r′ ″5′ functions after both endoge■ ous and exogenous DSBs formationduring meiosis, but not as

pairing centers"

for lneiotic synapsis,

We also found thatthe syp― ′, syρ ―′and syρ ―′genes are essential for meiotic synapsis at pachytene stage.

〈〈冽t〉 〉
ドメ研究 目的
有性生殖を行 う生物は、配偶子の接合 によ り遺伝情報の混合を行 い子孫 に遺伝的多様性を与えている。配偶子の接合 によって染色体数が倍加する有性生殖サイクル において、染色体数の半減を行 う減数分裂は非常に重要な必須の過程である。 さらに この過程では、体細胞分裂 に比べて極めて高い頻度で相同染色体問遺伝子組換 えが起 こり、その結果、子孫の遺伝的多様性は、よ り高まることが知 られて いる。また減数第一分裂の前期過程は、その染色体ダイナミクスの特徴か ら、倍加 した姉妹染色分体が細糸状 に観察 される レプ トテン期、相同染色体間での対合形成が開始 されるザイゴテ ン期、相同染色体間全体に渡 ってシナプ トネ マ構造を介 した対合形成が完了するパ キテ ン期、対合が解かれ組換えの結果生じるキアズ マが観察されるデ ィプ ロテン期、染色体が凝集 し核膜か ら離れるデ ィアキネ シス期の 5つ の時期に分けることができ、 この過程は酵母か ら植物、動物 に至る真核生物全般に広 く保存 されている。
なかでも相同染色体間での遺伝子組換 えは、ザイゴテ ン期からパキテン期初めにかけて、減数分裂特異的な トポイソメラーゼ様酵素 SP011が DNA鎖 に二本鎖切断 (DSB)を 入れる こ′θ′′遺伝子は出芽酵母で最初に見出されたが、その後、線虫、シロイヌとで開始 される。∫
ナズナ、マ ウスや ヒ トにお いても普遍的に存在 し、その欠損変異では相同組換えが起 こらず、減数分裂は異常を来た し配偶子形成が不全となる ことが報告 されている。
本研究では、これ ら減数分裂過程のな かで最も特徴的な相同染色体間での対合、遺伝子組換え、そ してキアズ マ形成 に至る染色体ダイナ ミクスとその制御機構を分子 レベルで明らかにする ことを究極の 目的とし、研究材料と して、逆遺伝学的な らびに遺伝学的解析が比較的容易な線虫 (Cエ レガンス)を 用 いた。着 日した遺伝子 としては、線虫ゲノム上に存在する唯―の rθ― ― raグ ーJ′様遺伝子 θθ「″ ノ″′J LOmOIog l)、J′ ′(ク ノク rr/ノ ′対合形成

力々―′様キナーゼ遺伝子、その他、対合 に関わるシナプ トネ マ構造蛋白質、減に必須な θθ―θ
数分裂特異的な染色体接着因子などで、これ らの機能解析を通 して有性生殖を行 う真核生

物の配偶子形成 に広 く保存 された減数分裂機構を分子 レベルで理解することに努めた。

研究経過

1.線 虫

r″ ―r/ra″ J′ 遺伝子の機能解析"―

モデル生物 の一つである線虫雌雄同体の成虫体内には、大きく発達 した 1対 の生殖腺が存在 し、その先端部では減数分裂前の生殖幹細胞が盛んに体細胞分裂を行い、生殖腺の途
中か らそれ らは減数分裂 へ と移行 し卵母細胞が形成 され、さらに自家受精 した後、初期胚形成までの連続的な発 生 0分 化が観 とめ られる。なかでも、卵母細胞形成 における減数第一分裂前期の染色体ダイナ ミクスは大変観察 し易い (Fig.1)。 成熟 した卵母細胞では、第一分裂前期のデ ィアキネ シス期で停止 し、倍加 した二価相同染色体が最 も凝縮 しキアズ
マを介 して繋がつた常染色体 5対 と性染色体 1対 の計 6対 がみとめ られ、貯精巣を通過する際に受精 し、その後、減数第一、第二分裂が引き続き生 じる。従 って、 ″θ′′の発現をRNA干 渉法 (RNAi)で 抑制 した場合やその欠失変異体 においては、キアズマが形成されず成熟 した卵母細胞において凝縮 した相同染色体が離れて計 12本 の染色体 ドッ トとして観察される (Fig。

2).

ザイゴテン

減数分裂前複製

ディプロテン

ディアキネシス

Figl l. Chromosomal dynamics during melotic prophase l in the nematodeθ′θ″θ′力′力σ′′′s

θノθg′ ″s.

′様遺伝子には、大きく 2つ の夕θθ
また真核生物の相同的遺伝子組換 えに関わる大腸菌 ′イプ、ル″Jノ と 助ε′とが存在する ことが、酵母か ら植物、 ヒ トに至る多くの真核生物 において報告 されている。 これ ら両者のア ミノ酸配列は大変類似性が高 く、構造的にも生化学的な酵素活性と しても大変類似 している。 しか しなが ら、遺伝子発現の組織特異性 に関 しては、ルσJノ タイプは体細胞 と減数分裂細胞の両方で、勤θノタイプは減数分裂細胞 で特異的に発現 し、減数分裂過程における相同染色体間での遺伝子組換えには 勿θ′タイプがよ り深 く関わる ことが示唆されている。T方 、全ゲノム構造が明 らか にな った線虫のゲノム上″′JLOmO10g上 と命名)
/ノ ′″―′:r.fノ θ′様遺伝子が一種類 (θ θ―′″ ″sf′ σJ′ ′ク θ′には、 /θ εしか見出せないこと、またその遺伝子の発現を RNA干 渉法 (RNA interference:RNAi)で 抑制 した場合、正常な減数分裂デ ィアキネ シス期への移行が さまたげられ、染色体がランダ

ム に絡 ま った状態 とな り減数第 一 分裂前期の異常 とな る こと (Fig.2)、 な らび に放射線による DNA損 傷 に高感受性 となる ことな どを見 出 して きた。

Ce―spο ―ノI+/―/―=/―

X― rayirradiation

Fig。

2. influence of the θθ―sρ θ―′′mutant background on abnormal diakinesis chromosomes

induced by θθ―r″ カーノ/raグ ーJ′ RNAi treatment.

Scale bars represent 2μm.

そ こで、は じめ に θθ―r昴 ―//ra″ Jノ と θθ―sρ θ―′′遺伝子 との減数分裂過程 における遺伝 的エ ビスタ シスを調 べ る 目的で、θθ―sρ θ―′ノの遺伝的変異体 に対 して、θθ―r″ ―r/r′ σJ′ の RNAi
グJノ の RNAIに よる染色体が ラ/′ ′を行 い、その影響 につ いて 検討 した。その結果、θθ―/励 ―ノンダム に絡 ま った状態 とな る減数第 一 分裂前期の異常 が、θθ―sρ θ―/ノ の遺伝 的変異 バ ックグ―′′単独の変異である相同染色体が離れた計 12本 の染色体sρ θ
ラン ドでは観察されず、 θθ――sρ ο―ノノの下流で機能すドッ トとして観察 された (Fig.2)。 従 つて、θθ―r働 ―//raσ J′ は θθ―sρ θ―′′単独の変異 に放射線を照射 し、人為る遺伝子である ことが確かめ られた。また、θθ

的な DNAの DSBを 導入する ことで、正常な 6対 の二価相同染色体 となる ことが高頻度に観―′′の二重抑制 においてみ られた上記の 12本 の染色″―r/′ ′〃′と θθ―sρ θ
察 されたが、 ′"―体 ドッ トは、放射線の照射によ り、正常な 6対 ではなく染色体がラ ンダムに絡 まった状態となる ことが明らかにな った (Fig.2)。
次に、減数分裂過程 の相同染色体間の対合形成において:θθ―r″ ―//′ ′″ノが必要である
励―r/′ ′″′の RNA:を 行った際の生殖腺内パ キテ ン期の減数分裂核か確かめる目的で、θθ―′につ いて 、 5S― リボ ソ ー ム 遺伝子 を プ ロー プと した F:SH観 察 を行 つた。 その結果 、″―ノ″′の RNAiに よる発現抑制においても、相同染色体間の対合形成 は正常に行わθθ―′/′ ′れることが明らかになった。
働―r/′ ′″′は減数分裂過程の遺伝子組換えに必須であ り、そのこれ らの結果から、 θθ―′
機能 としては、組換えの初期反応である SP011に よる DNAの DSBや 放射線など外国的な DNA′様遺θθの DSB損 傷 に対 して、相同的組換え修復を行 うことが明らかにな った。一方で、 ′伝子は、生化学的 に DNAの アニーリング活性や DNAの 相同性認識を行 うことが知 られて いるが、線虫における減数分裂過程の相同染色体間の対合形成 には必須でない ことが示唆された。

2.相 同染色体間の対合形成 に関わる遺伝子群

酵母や ヒ トにおいて細胞周期のチェックポイン トシグナル伝達に関わる CHK2/CDSlキ ナーゼの線虫における構造的相同な遺伝子 θθ―ε
力々―′の解析を行つた。その結果、力々―′線虫 θθ―θは、DNA損 傷のチェックポイ ン ト修復系 には必要性が認め られなかったが、減数分裂過程のキアズマ形成 には必須であることを見出 してきた。その発現を RNA:に よ り抑制 した個体の減数分裂過程にお いては、減数第一分裂前期デ ィプ ロテン期の染色体上 にキアズマが形成―sρ θイ′単独の変異である相同染色体が離れた計 12本 の染色体 ドッ トと同様 にされず、 θθなる ことを見出した (Fig。

3C)。

々―力′の RNAi個 体 におけるパキテ ン期の相同染色体間の対合状況について FISH
次に、θθ―θ
法によ り調 べた.そ の結果、正常な対合が形成されていれば本来 lヶ 所 にシグナルが検出されるところ、F:g。

33に 見 られるように RNAi個 体では相同染色体間の対合形成が阻害 され、シグナルが大きく 2ヶ 所に離れて検出され、さらに各 lヶ 所のシグナルがそれぞれ姉力々―′の遺伝的変異バ ックグラ
妹染色体由来の 2個 として高頻度に観察された。また、 θθ―θ―r″ ―r/′ ′″ノの RNAiの 効果がみ られず (絡 まった染色体 とな らな い)、 相同ン ドでは、 θθ染色体間の遺伝子組換 えの初期反応である SPOHに よる DNAの 二本鎖切断が導入されないことが示唆された (Fig。

3E、 F)。

さらに θθ―sρ O― ノ′単独の変異に放射線を照射 した場合 と力″―′の遺伝的変異に放射線を照射 した場合では計 12本 の染色体 ドッ トのまま異な り、θθ―σ
変化せず、人為的な DSBを 導入 しても対合が形成 されないため相同染色体間での遺伝子組換えが生 じず、結果としてキアズ マが形成 されな いことが明 らかになった。一方で、 これ

―r″ ―//ra″ ノに依存 した形で、姉妹染色体間で組換え修復 される ことら人為的な DSBは θθが明らかにな つた (Fig。

3G H)。

0,一 σ力″■2 RNAlpachyteno:DAPl,DAPI+nSHkの ■渤a― aら 々=2 mutant: ―/―mockFig。

/―+/―ー々.2 mutant:― ノae― αら

mo●diakinesis:DAPI′RNAi―/― and― /+Oθ ―rdh― ′RNAi

3. The effects of θθ―θ力々―′ RNA: on meiotic synapsis and the influence of theθθ―θ力々―′ null mutant background on the abnormal diakinesis chromosomes produced byθθ―r′ 卜 ′/raσ ―J′ RNAi treatment.

また 同様 に、 シナ プ トネ マ 構造 タ ンパ ク質 SYPl、

SYP2、

SYP3や HIM3タ ンパ ク質 の発 現抑制や欠失変異 においても、相同染色体間での対合形成が阻害され、その結果、相同組換えが生 じず、ディアキネシス期の卵母細胞で計 12本 の染色体 ドッ トとして観察 されことも明らかにした。

考察
本研究では、減数分裂過程の染色体ダイナ ミクス、なかでも最 も特徴的な第 一分裂前期
θ″にみ られる相同染色体間での対合形成 と遺伝子組換えの関係 について、線虫の唯―の ′Jノ″―r/ra″ ―様遺伝子 θθ―′(faグ J′ ′ク θr/ノ li7ノ J homolog l)と― 々―θθ
′様キナーゼ遺伝子
̀力の機能解析を通 した研究を中心に展開 してきた。 これまでマウスな どでは、減数分裂期の′様遺伝子θθ
遺伝子組換えに関わる ′"りの遺伝子破壊 によつて、減数分裂パ キテン期以降の生殖細胞 にアポ トー シスが生 じ、遺伝子機能の欠損に起因する染色体異常 を観察することが大変難 しかつた。 しか しなが ら、線虫にお いては本研究にみ られるよ うに比較的アポ トーシス活性が弱 く、また RNAiな ど簡便な遺伝子発現の抑制法 による影響を容易 に観察
J′ 遺伝子は、減数分裂期の遺伝子組換えに必須で、組換え″‑7/r′ σ―する ことができ、θθ―′の初期反応である SP011に よる DNAの DSB後 に働 くことが 明らかにな った。
″θノノ遺伝子や /θ 翻 様遺伝子などは、酵母から線虫、 シロイヌナズナ、マ ウスや ヒ トにおいても普遍的に存在 し、このことは、真核生物全般 において減数分裂過程が大変高度 に

保存 された分子 機構で ある ことを 伺わせ る。一方で、相 同染色体 間での組換 え と対合 形成との関係 にお いて、酵母や マ ウスな どの ∫″ ′′変異で は組換え と対合 形成 の両方が起 こ らな くな る こと、 しか しなが ら、線 虫や シ ョウジ ョウバ エ の ″θ″ 変異 にお いては、 組換えは阻害 され るが対合形 成 は正 常 に行 われ る ことか ら、組換 え と対合 形成 の制 御 関係 には生物種 による違 いが ある こ とが示唆 され る。また本研究か ら、rθ様遺伝子 は生化学的 に DNAレベ ルでの相 同性認識 を行 うことが知 られ ているが、線 虫の唯―の ′θ″ 様遺伝子 も相同染
色体 間の対合形成 には必 要 でな く、従 って、対 合形成 には染色体 レベ ル での相 同性 を認識する何 らかの機構 (pairing center)が 存在す ることが強 く示唆 された。
今後 、 この pairing centerの 分子機構 を理解する上で、対 合 に関わ るシナ プ トネ マ構造
タ ンパ ク質 SYPl、

SYP2、

SYP3や HIM3タ ンパ ク質、減数分裂特異的な染色体接着因子 REC8

コ ヒー シンな どにつ いての研究を展開 した い と考えて いる。 また θθ―ε力々―′の RNAiや 変異体 において、相 同染色体間の対合形成が全 く生 じな いため、 この pairing centerの 機構 に何 らかのタ ンパ ク質 リン酸化制御機 構が存在する こ とが強 く示唆 された。
また何れの生 物種 にお いて も、 一 般 的 には、相 同組換 えが阻 害 され た場合 、その 後の減数分裂で異常を来た し配偶子形 成が不全 となる。線 虫の sρ θ―′ノ変異 や θθ―ε
力々―′変異な どにみ られたキアズ マがな く相 同染色体 間が離れた 12本 の染色体 を持 つ 卵母細胞 は、正 常な
精子 と受精 して も、受精 直後 に起 こる減数第 一 分裂過程で 、 ラ ンダ ム にこれ ら染色体 が分離分配 され、その後 の卵の孵化 率 は数 %に まで低下す る。従 って、減数分裂過 程 における相同組換えは、子孫の遺伝的多様性を高めるための生物戦略の一つで あると考え られがちであったが、組換えの結果で あるキアズマ によ り、減数第一分裂まで相同染色体間を繋ぎ止め、配偶子に正 しい染色体セッ トを分離分配するために必須の過程であるといえる。
また、 これ まで私たちは、線虫のパキテン期の核が放射線 による DNA損 傷 に超抵抗性を示す ことを 明 らか に してきた。 さらに この超 抵抗性は、減数分裂の相 同組換え に関わる働―′J′ を含めた酵素群が高発現 していることに起因する ことを実き止めてきた。
θθ―′/ra″ ―そこで減数分裂の組換えは、親個体において生 じたランダムな DNA損 傷を最 も正確な修復機構である相同的な組換え修復機構によ り、配偶子 には損傷のない DNAへ と浄化 (タ イム
リセッ ト)す る役割を担 うものとも考える ことができる。

研究発表
学会発表
Takako Takanami,Yongzhao Zhang, Hidetosh: Aoki, Hideyuki Takahashi, Tomoko Abe,Shigeo Yoshida, and Atsushi Higashitani: Repair system for DNA damages in meiotic

cells of θ′θ″0′ 力′タノ′′′s θノθga″
̀; 2nd international Workshop on Space Radiation

Research(IWSSRR‑2),2002,3,奈 良
2. Takako Takanami and Atsushi Higash:tani: Characterization of meiotic

recombination and DNA damage repa:r in the nematodega″ s;
σ′θ″θ′力′bσ ′′′s θノθlnternational Congress of Ecology VII!

Symposium 146 Molecular ecology andgenetic divers:ty" , 2002, 8, Seoul

3.東 谷篤志、高浪タカ子、堀内二郎、高橋秀幸 :線 虫を用いた減数分裂染色体ダイナミクスの研究 :ra馘 様遺伝子の機能を中心に。日本分子生物学会第 25回 大会、ワークショップ、
2002,12, 蒲民黄刃

論文発表

1 . Takako Takanami, Akiyuki Mori, Hideyuki Takahashl, Saburo Horiuchi, and Atsushi
Higashitani: θ′θ″0/力 ′ισ′′′s θノθga″ s σθ―′σカー//r′ ″―J′ functions after double― strand

break formation of meiotic recombination; Chrο J7ο sθ ″θ ′θs. 2003, in press

2.高 浪タカ子 ,東 谷篤志 :減 数分裂過程 における染色体ダイナ ミクスと放射線 の影響
化学と生物 2003,41,138‑141;