XL-Bradford [SDS-PAGE 適応]
Cat No. KY-1030、1031【1mL 反応系 プロトコール】【目的・用途】
一般的な Bradford 法によるタンパク質定量試薬は、界面活性剤の影響を大１） BSA スタンダード溶液の調製きく受けてしまいます。本試薬は、SDS-PAGE サンプルバッファー（2%SDS0.0〜1.0mg/mL の範囲で 6 点以上、n=2 で BSA スタンダード溶液を調製含有）中のタンパク質濃度を正確に測定できるよう、Bradford 試薬を改良しします。

たものです。BPB 色素や還元剤を含んだサンプルバッファーでも測定可能です。
操作手順は通常の Bradford 法と同様で、本試薬とタンパク質溶液を混合して 595nm の吸光度を測定するだけです。混合してから加温する必要なく、また、混合後 1 時間程度は吸光度が変化しませんので、多検体を処理する場合にも最適です。
SDS 以外の界面活性剤が含まれる場合は、XL-Bradford[界面活性剤適応]（Cat No. KY-1040）をご使用ください。

※BSA 以外のタンパク質をスタンダードとして用いることもできます。
（例）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL の BSA スタンダードを調製する場合①2mg/mL の BSA 溶液を調製します。
BSA 粉末を溶解して調製する場合は、測定する濃度未知サンプルと同じバッファーで溶解します。BSA 溶液を希釈して調製する場合は、測定する濃度未知サンプルと同じ終濃度のバッファー組成となるように希釈します。

【特徴】②表の通り、BSA スタンダード溶液の希釈系列を調製します。

● SDS-PAGE サンプルバッファーに溶解したタンパク質の定量が可能※BSA スタンダードは n=2 で調製してください。

● 還元剤や BPB 色素を含有したサンプルバッファーもそのまま適応可能● 簡便な操作

BSA 溶液の2mg/mL

終濃度BSA 溶液(mg/mL)(μL)

1.050500.840600.630700.420800.210900.00100【内容・保存方法】
Cat No.

容量KY-1030

100mL（5×）

KY-1031500mL（5×）

保管温度
4℃

使用期限
1年

【基本情報】[×5] XL-Bradford 試薬を室温に戻し、超純水で 5 倍希釈した後に十分混合

0.1~1.0mg/mL

します。XL-Bradford 試薬（1×）は 1 サンプルにつき 1mL 必要です。

表 1 サンプルに含まれていても測定に影響がない化学物質の上限濃度
成分

バッファー

界面活性剤
還元剤

その他(μL)

２） XL-Bradford 試薬の準備定量できるタンパク質濃度の範囲

酸・塩基希釈溶液

HCl
NaOH
AcetateAmmonium sulfate
CitrateGlycine
HEPES
Phosphate
TrisSDS
Dithiothreitol
2-Mercaptoethanol
EDTA
Glycerol
KCl
NaCl
SucroseUrea許容上限
通常法
100mM
100mM
600mM
1M
50mM
100mM
100mM
2M
2M
2%
1M
1M
100mM
100%
1M
5M
300mM
6M

微量法
2.5mM
2.5mM
15mM
25mM
1.25mM
2.5mM
2.5mM
50mM
50mM
0.05%
25mM
25mM
2.5mM
2.5%
25mM
125mM
7.5mM
150mM

※沈殿が見られる場合はろ紙などを用いてフィルトレイトします。
※5 倍希釈した試薬は、当日中に使い切ってください。
３） サンプルと XL-Bradford 試薬の混合①濃度未知サンプル及びスタンダードタンパク質溶液を、それぞれ別のチューブに 20μL ずつ分注します。
②２）で調製した XL-Bradford 試薬（1×）を各チューブに 1mL 加え、混合します。
※使用機器によって液量を変更する場合は、サンプル：試薬の比率を変えないでください。
４） インキュベート
室温で 5 分間インキュベートします。
※インキュベート時間が⻑くなると徐々に吸光度が⾼くなりますので、室温で 1 時間以内にしてください。
５） 測定
濃度未知サンプル及びスタンダードを、キュベットに分注し、595nm における吸光度を測定します。
※ブランク(0mg/mL スタンダード溶液)の吸光度を 0 に合わせ、1 本の【本品以外に準備が必要な器具】

 595nm の吸光度測定が可能な分光光度計またはプレートリーダー
 分光光度計に適合したプラスチック製ディスポーサブル キュベット(試験管・チューブを使用する場合)
 試験管・チューブまたはマイクロプレート
 ボルテックスミキサー
 正確なマイクロピペット
 0.45μm フィルター（必要な場合）

キュベットを使用する場合は濃度の低い順に測定してください。
６） 検量線の作成①n=2 で測定した BSA スタンダードの、吸光度(Abs.595)の平均値を算出します。
② ①で算出した吸光度(Abs.595)の平均値を Y 軸、BSA スタンダードの濃度(mg/mL)を X 軸にとり、最小二乗法により近似曲線を引き、検量線を作成します。

【微量法プロトコール】

例）１） XL-Bradford 試薬の準備

Standard curve[×5] XL-Bradford 試薬を室温に戻します。希釈はしません。

0.30

２） スタンダードの調製⊿Abs.595

0.25①スタンダードを 100μg/mL の濃度に希釈します。

0.20※サンプルと同じ溶液組成になるように調製してください。

0.150.10

y = 0.2688x-0.0004

0.05

R2 = 0.9966
00.20.4

0.60.81

表の通り「100μg /mL スタンダード」と「希釈溶液」を混合し、0.0〜50μg/mL の範囲で 6 段階のスタンダードタンパク質溶液を作製

0.00-0.05②スタンダードタンパク質溶液の希釈系列を作製します(n=2)。

1.2mg/mL

します。
※希釈溶液はスタンダードと同様に、サンプルと同じ溶液組成となるように調製してください。

７） 濃度未知サンプルのタンパク質濃度の算出

スタンダード100μg/mL

タンパク質溶液

スタンダード(μg/mL)

(μL)

(μL)

00100010100900202008003030070040400600

50500500

作成した検量線の数式を用いて、濃度未知サンプルのタンパク質濃度を算出します。
例）濃度未知サンプルの吸光度が 0.4015 の場合、（吸光度）ー（ブランク）
一次式の y に代入

0.4015ー0.2468＝0.1547
0.1547＝0.2688ｘ−0.0004
ｘ＝0.5770 mg/mL【200μL 反応系 プロトコール】
１)

BSA スタンダード溶液の調製
1mL 反応系と同様に BSA スタンダード溶液を調製します。

２)

XL-Bradford 試薬の準備[×5] XL-Bradford 試薬を室温に戻し、超純水で 5 倍希釈した後に十分混合します。XL-Bradford 試薬（1×）は 1 サンプルにつき 200μL 必要です。
※沈殿が見られる場合は 0.45μm フィルターなどを用いてフィルトレイトします。
※5 倍希釈した試薬は、当日中に使い切ってください。

３)

サンプルと XL-Bradofrd 試薬の混合①濃度未知サンプル及びスタンダードタンパク質溶液を、マイクロプレートの各ウェルへ 4μL ずつ分注します。
②２）で調製した XL-Bradford 試薬（1×）を各ウェルに 200μL 加え、よく混合します。
※使用機器によって液量を変更する場合は、サンプル：試薬の比率を変えないでください。

４)

インキュベート
室温で 5 分間インキュベートします。
※インキュベート時間が⻑くなると徐々に吸光度が⾼くなりますので、室温で 1 時間以内にしてください。

５)

測定
プレートリーダーを用いて、595nm の吸光度を測定します。

６)

検量線の作成①n=2 で測定した BSA スタンダードの、吸光度(Abs.595)の平均値を算出します。
② ①で算出した吸光度の平均値から Blank 値を差し引きます。
③ ②で算出した、Blank 値を差し引いた吸光度(Abs.595)を Y 軸、BSA スタンダードの濃度(mg/mL)を X 軸にとり、最小二乗法により近似曲線を引き、検量線を作成します。

７)

濃度未知サンプルのタンパク質濃度の算出
作成した検量線の数式を用いて、濃度未知サンプルのタンパク質濃度を算出します。

希釈溶液

３） 試薬の混合

サンプル及びスタンダード 400μL に対して、[×5] XL-Bradford 試薬を100μL 加え、混合します。

※使用機器によって液量を変更する場合は、サンプル：試薬の比率を変えないでください。
４） インキュベート

室温で 5 分間インキュベートします。インキュベート時間が⻑くなると徐々に吸光度が高くなりますので、室温で 1 時間以内にしてください。

５） 測定

595nm で吸光度を測定します。

６） 検量線の作成① n=2 で測定したスタンダードタンパク質溶液の、吸光度(OD595)の平均値を算出します。
② ①で算出した吸光度の平均値から Blank 値を差し引きます。
③ ②で算出した吸光度(OD595)/ 濃度(mg/mL)の検量線を作成しサンプルの濃度を算出します。
７） 濃度未知のタンパク質濃度の算出
作成した検量線の数式を用いて、濃度未知サンプルのタンパク質濃度を算出します。