体細胞におけるヘテロクロマチン領域記憶の分子装置の同定と機構に関する研究
Identification and characterization of molecular memories determining
heterochromatin regions in somatic cells（日本分子生物学会推薦）

代表研究者 国立遺伝学研究所

齋藤都暁

National Institute of Genetics

Kuniaki Saito

Large fractions of many eukaryotic genomes consist of transposable elements (TEs). Their movement andaccumulation contribute to the shaping of genomes; however, a mechanism is required to repress the expression andtransposition of TEs to ensure the stable inheritance of genomic information. How animals defend their genomes against
the enormous complexity of TEs remains one of the most intriguing questions in genome biology. PIWI-interacting
RNAs (piRNAs) protect the genome against selfish genetic elements such as transposable elements by transcriptional
and post-transcriptional silencing in animal gonads. However, it remains obscure how TEs are specifically recognized
and silenced in somatic cells where piRNAs are not expressed. To identify the molecular traits for TE silencing insomatic cells, we focused on genes screened in Drosophila ovary. Among the candidate genes, we identified CG14438
essential for TE silencing in ovarian somatic cells (OSCs). CG14438-knockdown (KD) increases the expressions ofretrotransposons, whereas it doesn’t affect the abundance of piRNAs in OSC. The expression pattern of transposons
from CG14438-KD OSC by mRNA-seq is similar to that from HP1a-KD. These results suggest that CG14438 isinvolved in the silencing of transposons, but not in the piRNA biogenesis. Our data suggest that CG14438 is a novel

TE silencing factor in somatic cells and collaborate with HP1a rather than the piRNA pathway.

研究目的

Effect Variegation(PEV)と呼ばれる斑入り位置効果現

ショウジョウバエのヘテロクロマチン領域の多く象が知られる。これは胚発生初期にヘテロクロマチはレトロトランスポゾンやトランスポゾンに占めらン領域がクロマチン上の位置によって確率論的に決れ、その発現は抑制状態にある。生殖細胞では PIWI定され、それが細胞分裂後も長期にわたって維持さ

サ ブ フ ァ ミ リ ー 蛋 白 質 に 結 合 す る 小 分 子 RNAれる現象である。遺伝学的なスクリーニング解析か（piRNA）がトランスポゾンの発現抑制シグナル、ら関連遺伝子が単離され、エピジェネティクス因子すなわち「ヘテロクロマチンメモリー」として機能群が同定された。代表例としてヘテロクロマチンタし、世代間伝搬される。一方、体細胞でもレトロト

ンパク質 HP1a が挙げられるが、それとともに Piwi

ランスポゾンの発現は抑制状態にあり、細胞分裂を遺伝子群が同定されている（Pal-Bhadra et al. 2004）。

経ても、娘細胞にはヘテロクロマチンメモリーが伝体細胞である眼では Piwi 遺伝子群や piRNA は発現搬する。一方、体細胞では piRNA 及び Piwi ファミしていない。それにもかかわらず斑入り効果が認めリータンパク質が発現しない。すなわち、一体どのられるという事実は、体細胞では発生初期にヘテロような分子がヘテロクロマチン領域を規定するのかクロマチン領域が規定され、それが細胞分裂を経て不明である。そこで、申請者は 2004 年の Sarah Elginも維持されることを意味している。すなわち、ヘテらの研究に着目した。ショウジョウバエでは Position

ロクロマチン領域の情報、すなわちヘテロクロマチンメモリーが維持された、と言い換えることができまた核移行シグナル(NLS)に類似する塩基性リッチる。本研究では生化学を駆使し、体細胞ヘテロクロな配列も存在していたことから、核内で働く因子でマチンメモリーの実体を同定することを試みた。その結果、ヘテロクロマチンの形成・維持に重要な新規遺伝子を 2 つ同定することに成功した。そのうち1 つに関して、Crispr/Cas9 システムを用いてノックアウトハエを作製した結果、胚発生初期において致死性を示した。
研究経過
ショウジョウバエ生殖細胞における RNAi スクリーニングによって 100 種以上のトランスポゾン制御因子が報告されている(Czech et al. 2013)。この中にはFig. 1 Relative mRNA levels of mdg1 transposon

piRNA 生合成因子群や、生殖細胞で特異的にトランスポゾンの抑制に機能する因子が多く含まれる。しあることが予測された。このように、CG14438 は核かし、これらの因子で分子機能が解明されているも内で機能する因子であることが予測されたが、実際のは少なく、今後の機能解明が待たれている。スクに piRNA 経路と関連するか否かについて検証する

リーニングは生殖細胞で行われているが、得られたこととした。はじめに、piRNA 生合成に関与するか因子には体細胞で発現することが知られる遺伝子も検討するため piRNA の定量を行った。CG14438 ノッ

多く存在しており、この中には、体細胞においてトクダウン細胞とコントロール細胞から全 RNA を抽

ランスポゾンの抑制に機能する因子が含まれること出し、変性ポリアクリルアミドゲルで全 RNA を展も期待される。今回、スクリーニングで取られた因開 し た 。 Hybond N+ メ ン ブ レ ン に 転 写 後 、子の中で CG14438(Candidate Gene 14438)遺伝子に着[gamma-32P]ATP でラベルしたオリグヌクレオチド目した。CG14438 は mRNA レベルでは体細胞でも発プローブとハイブリダイゼーション反応を行った。

現することが予測され、体細胞ヘテロクロマチンメ

一晩、42 度で反応後、2xSSC, 0.1% SDS 溶液で洗浄モリーの実体候補になると予測した。個体レベルのした。メンブレンを乾燥後、BAS-2500 を用いて解析では生化学的アプローチが困難であることから、piRNA を検出した。その結果、CG14438 遺伝子をノトランスポゾンの抑制機構の解明において用いられックダウンしても piRNA 量に変動は認められなかている培養細胞 OSC(Ovarian Somatic Cell)を用いるった(Fig. 2)。すなわち、CG14438 は piRNA 生合成にこととした(Saito et al. 2009)。CG14438 に対するは関与せず、少なくとも piRNA 生合成以外の機能をsiRNA を 6 種設計し、それぞれ OSC に導入した。ネ介してトランスポゾンを抑制するものと予測された。

ガティブコントロールとして Luciferase (Luc)に対する siRNA を導入した。24 時間、48 時間後に細胞を回収し、全 RNA を取得した。DNaseI で Clean-up 後、逆転写反応を行い cDNA を得た。トランスポゾンに対するプライマーを用いて定量的 PCR を行い、リボソーマル蛋白質をコードする RP49 遺伝子をコントロールとして相対定量を行った。ノックダウンし、トランスポゾンの 1 つ、mdg1 の発現量を定量した。
その結果、期待通り CG14438 遺伝子のノックダウン

Fig. 2 Northern blot analysis of piRNAs

でトランスポゾンの発現が顕著に上昇することを見出した(Fig. 1)。
CG14438 遺伝子は 3313 アミノ酸残基からなる巨大蛋白質で、10 以上の Zn finger モチーフを有する。

CG14438 と他のトランスポゾン抑制因子との比較を行うため、次世代シーケンサーによる mRNA-seq解析を行った。コントロール細胞、ノックダウン細胞からそれぞれ全 RNA を回収し、poly(A)配列を有果、約 350kDa の位置にシグナルが認められた。RNAiする mRNA を取得した。Hiseq-2500 を用いて、それでノックダウンした細胞では、このシグナルが消失ぞれ約 2,000 万リードを取得した。アダプター配列すること、OSC で過剰発現させた蛋白質にも反応すを除去し、ショウジョウバエトランスポゾンの参照ることから、免疫したマウスには抗 CG14438 抗体が配列にマッピングした。TPM、RPKM 値から発現量存在することが強く示唆された。そこで、ミエローを算定し、コントロール細胞との相対的発現量を算

マ細胞とリンパ節由来細胞とのハイブリドーマを作出した。その結果、CG14438 は HP1a ノックダウン製し、CG14438 を認識するマウスモノクローナル抗細胞と非常に類似したトランスポゾン種が脱抑制さ体の樹立を試みた。ELISA、Western Blot、を指標にれ ることが 明らかと なった (Fig. 3)。した がってスクリーニングした結果、目的とするモノクローナ

CG14438 は HP1a と協調して働く因子ではないかとル抗体を得ることに成功した。そこで、この抗体を用いて、HP1a 免疫沈降物中に CG14438 が含まれるか否か検討した結果、HP1a 免疫沈降物中に CG14438蛋白質を見出した。したがって、CG14438 は HP1aと相互作用し、トランスポゾンの発現を抑制する因子であると考えられた。
個体レベルにおいて CG14438 はトランスポゾンの制御因子として機能するか検討するため、
CRISPR/Cas9 システムを用いてノックアウトショウジョウバエを作製することとした(Kondo & Ueda,
2013)。CG14438 に対する guideRNA を 3 カ所設定し、ノックアウトハエを作製したところ、胚発生致死の表現型を示すことが明らかとなった。これは HP1a
ノックアウトハエと同様の表現型であることから、
CG14438 は HP1a 同様に体細胞においてトランスポゾンの発現を抑制する因子であると期待された。

期待された。
Fig. 3 mRNA-seq analysis of CG14438-KD cells

考察
本研究により、CG14438 が新たなトランスポゾン抑制因子の一つとして働くことがわかった。したが以上の解析から CG14438 ノックダウン細胞はヘって、CG14438 は HP1a 同様に、体細胞ヘテロクロテロクロマチン蛋白質 HP1a をノックダウンした細マチンメモリーの構成因子の一つであると考えられ胞と類似したトランスポゾンの発現パターンとなるる。また、CG14438 ノックアウトハエは HP1a 同様ことが分かった。したがって、HP1a と機能的に関連に胚致死となることから生存に必須な遺伝子であるするのではないかと予測された。はじめに HP1a とと考えられた。また、CG14438 は HP1a と協調してC14438 が物理的に相互作用する可能性を検証する働く因子であることも mRNA-seq 解析から期待されこととした。HP1a に対するモノクローナル抗体た。HP1a は H3K9me3 と特異的に相互作用すること(C1A9)を Drosophila Hybridoma bank から入手し、こから、CG14438 も抑制性ヒストンマークと相互作用れを用いて免疫沈降解析を行うこととした。一方で、し、レトロトランスポゾンの発現を抑制する可能性

CG14438 を認識する抗体は存在しないことから、以が高い。最近、海外のグループによって CG14438 遺前と同様の手法でマウスモノクローナル抗体を作製

伝子の機能解明について報告がなされた(Jankovics

することとした(Iwasaki et al. 2016)。GST と N 末端側et al. 2018)。多くの結論において私たちが得たデータの CG14438 蛋白質との融合蛋白質を大腸菌で発現、と類似した報告であった。その論文においても精製し、抗原とした。複数回免疫後、マウスの血清CG14438 の分子機能解明というところまでは到達しが CG14438 蛋白質を認識するか否かを検証した結ておらず、今後さらなる解明が必要だろうと考える。

CG14438 は多数の Zn-finger motif を有する巨大蛋白

by germline-specific Cas9 expression in Drosophila.

質である。ショウジョウバエ属では保存されている

Genetics, 195, 715-721 (2013).

が、他の昆虫や哺乳類では相同蛋白質が見つからな6.

Jankovics F, Bence M, Sinka R, Faragó A, Bodai L,

い。したがって、ショウジョウバエに特異的なヘテ

Pettkó-Szandtner

ロクロマチンメモリーの構成因子である可能性が高Szarka-Kovács AB, Erdélyi M: Drosophila small

い。一方、HP1a は種間で高度に保存された因子であovary gene is required for transposon silencing andることから、ショウジョウバエ以外の生物種では、

heterochromatin organization, and ensures germline

CG14438 とアミノ酸配列は異なるものの機能的相同stem性を有する遺伝子が存在する可能性もあり、今後のDevelopment, 145, dev170639 (2018).

cellA,Ibrahim

maintenance

K,andTakács

Z,differentiation.

研究過程で明らかにしたいと考えている。
参考文献

研究の発表

1.

Saito K, Inagaki S, Mituyama T, Kawamura Y, Ono

口頭発表

Y, Sakota E, Kotani H, Asai K, Siomi H, Siomi MC :1.

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誌上発表

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the fourth Japanese meeting on host-transposon

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