J Life Sci Res 2021; 18: 7-13
© 2021 Osaka Prefecture University

Journal of Life Science Research
Online ISSN 2186-5809

速 報

がん分子標的薬耐性化に対するエピガロカテキンガレートの効果
間部由佳理，永野ひかる，吉田萌恵，檜垣七菜子，近藤茂忠†
1大阪府立大学大学院総合リハビリテーション学研究科栄養支援系領域，大阪府羽曳野市はびきの 3 丁目 7 番 30 号

受付：2021 年 10 月 15 日，受理：2021 年 10 月 26 日

Effect of epigallocatechin gallate on resistance to molecular targeted anti-cancer
drugs
Yukari MANABE, Hikaru NAGANO, Moe YOSHIDA, Nanako HIGAKI, Shigetada KONDO †1

Department of Clinical Nutrition, Graduate School of Comprehensive Rehabilitation, Osaka Prefecture University

Received 15 October 2021; accepted 26 October 2021

Key words: 大腸がん，がん分子標的薬，エピガロカテキンガレート

１

序文

阻害薬の併用療法が肺がんにおいて行われている 11, 12。まがん分子標的薬は，がん関連増殖因子受容体を特異的にた，HGF-R を阻害すると PI3K が活性化してくるため，阻害する新しい制がん剤であり、悪性腫瘍の主要な化学治

HGF-R および PI3K 阻害薬の併用が膠芽腫で実施されて療である。しかしながら、治療開始後数ヶ月以内に薬剤耐いる 13。

性を獲得してしまうことが大きな問題となっている 1-3。

しかしながら，がん分子標的薬の併用療法を行っても新近年の研究から分子標的薬耐性獲得の分子機構として，たな耐性が獲得されるため最終的には再発してしまい，根標的分子の変化（遺伝子増幅や遺伝子変異），バイパス経

治はきわめて困難である。このような状況を打開すべく，路の活性化，細胞形質変化，薬剤排出トランスポーターの本研究では全く新しいアプローチとして緑茶由来の食品機増加などが起因していることが明らかとなっている。肺が能成分であるエピガロカテキンガラート（EGCG）に着目しん細胞の EGF-R を長期間阻害すると，EGF-R にいくつかた。EGCG は大腸がん細胞の生存において重要な EGF-Rの活性型点変異（C797S/T790M など）が生じ、分子標的薬

経路だけでなく，バイパス経路である HGF-R, IGF-1R の4が効かなくなり、EGF-R が再活性化する 。また，EGF-R

活性化も阻害できることが報告されている 14-16。よって，

阻 害 は HGF-R や HER3 を 増 幅 さ せ，HGF-R 及 び HER3

本研究では EGCG による分子標的薬耐性の解除や耐性の

5-7

バイパス経路の活性化を促進する 。HGF-R, IGF-1R を阻抑止について検討した。

害すると，バイパス経路として EGF-R の活性化が生じる
8, 9。未分化リンパ腫キナーゼ（ALK）を阻害すると，細胞２

方法

膜上の薬剤排出トランスポーター（ABCB1）が過剰発現し

2.1

試薬

10

ALK 阻害剤を細胞外へ排出し耐性を誘導する 。
がん分子標的薬抵抗性を解決する臨床腫瘍学的なアプ

分子標的薬として，Erlotinib（EGF-R チロシンキナーゼ阻害剤）および Capmatinib（HGF-R チロシンキナーゼ阻害

ローチとして，バイパス経路も阻害できる分子標的薬を剤）（いずれも Selleck Chemicals, Houston, USA）
，NVP-

多剤併用する治療法の研究が進んでいる。具体的には，

AEW541（IGF-1R チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 ）（Cayman

EGF-R を阻害すると HGF-R および IGF-1R が活性化する

Chemical Company, USA）を使用した。EGCG は，Sigma-

ため EGF-R および HGF-R 阻害薬または EGF-R, IGF-1R

Aldrich（St. Louis, USA） か ら 入 手 し た EGCG［（-）-Epigallocatechin gallate］（E4143）を使用した。

†

連絡著者

E-mail: kondoshi@rehab.osakafu-u.ac.jp

82.2 細胞培養および Erlotinib 耐性化大腸がん細胞モデル

こで本研究では，Erlotinib を 3 か月間継続して長期処理の樹立することで，大腸がん細胞が Erlotinib 抵抗性を獲得する

ヒ ト 大 腸 が ん 細 胞 株 HCT116 は American Type

かどうかについて検討した。Erlotinib 抵抗性として，報Culture Collection（Rockville, USA）から入手し，37℃，5％

告のある EGF-R の再活性化を指標とした。

ストレプトマイシン，100

ヒト大腸がん細胞株 HCT116 において EGF-R は恒常的

ペニシリン（Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan），に活性化（リン酸化）していた（Fig.1，lane 1）。HCT116

1% 牛胎児血清（FBS）（SAFC Biosciences; Merck KGaA,細胞に Erlotinib を 24 時間処理すると，EGF-R のリン酸

Darmstadt, Germany）を 含 む RPMI1640 培 地 で 培 養 し，化は強く阻害された（Fig. 1，lane 2）。しかし，Erlotinib

コ ン ト ロ ー ル 細 胞 と し た。 細 胞 へ の 試 薬 処 理 は 全 て，処理 2 日目から EGF-R の再活性化が起こり，その後 100

Erlotinib 1µM，NVP-AEW541 100nM，Capmatinib 2

日 目 ま で 経 時 的 に 強 い 再 活 性 化 が 認 め ら れ た（Fig. 1，

nM，
EGCG 1µM で行った。Erlotinib 耐性化細胞モデルは，

lanes 3-8）。これらの結果から，Erlotinib 抵抗性がわずか同細胞に Erlotinib（1µM）を 3 か月間連続投与することで2 日間で獲得されることが解った。

CO₂ の条件下で，100 µg/ml
U/ml

17

樹立した 。
2.3

ウェスタンブロット解析

ウェスタンブロッティングの手順は文献 18 に則して行った。セルライセートはライシスバッファー［125mM
Tris-HCl（pH7.0），4 ％（v/v）ド デ シ ル 硫 酸 ナ ト リ ウ ム（SDS），および 10%（v/v）グリセロール］を用いて抽出した。タンパク質濃度はビシンコニン酸タンパク質アッセイ（BCA）キット（Nakarai tesque, Osaka, Japan）により決定した。タンパク質を SDS-PAGE サンプルバッファー［10%（v/v）グリセロールおよび 0.4%（v/v）メルカプト
エタノール（2ME）］で SDS 化し，総タンパク質 50µg/ ウェ
ルを 10％ SDS- ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）
で分離した後，ポリフッ化ビニリデンメンブレン（BioRad Laboratories, California, USA）へと転写した。メン
ブレンを 5％スキムミルクで室温，1 時間ブロッキングしFig. 1 EGF-R 分子標的薬（Erlotinib）に対する抵抗性の獲得
HCT116 細胞に Erlotinib を図に示す日数処理し，サン
プルを採取した。ウェスタンブロット解析により，リン酸
化 EGF-R 及び EGF-R の発現量の経時的変化を測定した。
β-actin の発現量を内部標準とした。

た後，一次抗体を 4℃にて 16 時間反応させた。使用した一次抗体は，ウサギモノクローナル抗リン酸化 HGF-R 抗

3.2

Erlotinib 抵抗性におけるバイパス経路の同定

体（D26）（1:1000）， ウ サ ギ モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 HGF-R 抗

EGF-R を阻害した時，HGF-R 及び IGF-1R が代償的に体（D1C2）（1:1000），ウサギモノクローナル抗リン酸化

活性化することが報告されている 19, 20。そこで，Erlotinib

EGF-R 抗体（D7A5）（1:1000），ウサギモノクローナル抗抵抗性に HGF-R や IGF-1R が関与しているかについて検EGF-R 抗体（D38B1）（1:5000），ウサギモノクローナル抗討した。

リン酸化 IGF-1R 抗体（D6D5L）（1:1000），マウスモノクロー

HCT116 細胞において HGF-R は恒常的に活性化していナル抗 IGF-1R 抗体（7G11）（1:1000），およびマウスモノ

た（Fig. 2A，lane 1）。この活性化は，Erlotinib を 24 時間

クローナル抗ヒトβ- アクチン抗体（cloneAC-74）（1:10000）処理したとき強く阻害された（Fig. 2A，lane 1）。この結である（カッコ内は希釈倍率）。その後，二次抗体の抗ウ

果より HGFR は EGFR に依存していることが示唆された。

サギ IgG HRP 結合抗体（#7074）（1:10000）および抗マウ

Erlotinib 処理 2 日目から HGF-R の再活性化が起こりはじス IgG HRP 結合抗体（#7076）（1:10000）を，27℃にて 1

め，その後 100 日目まで経時的に強い再活性化が認められ時間反応させた。メンブレンを ECL ウェスタンブロット

た（Fig. 2A）。この結果から，EGF-R と HGF-R が相互作

検 出 試 薬（GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont,

用している可能性が示唆された。

UK）で化学発光させ，ChemiDog imaging system（Bio-Rad
Laboratories, USA）を用いて検出した。

次に Erlotinib 処理による IGF-1R の活性化について検討した。未処理の HCT116 細胞において IGF-1R の活性化はほとんど認められなかった。一方，Erlotinib 処理わ3

結果

ずか 1 日で強い活性化が惹起され，その後 100 日目まで

3.1

Erlotinib に対する抵抗性の獲得

活性化の持続が認められた（Fig. 2B）。以上の結果から，

EGF-R 分子標的薬である Erlotinib は，大腸がん細胞でEGF-R 経路を阻害しても，バイパス経路として HGF-R 及

過剰発現している EGF-R を特異的に阻害し腫瘍抑制効果

び IGF-1R の強い活性化が短期間のうちに惹起されることを示す。しかしながら，治療開始 3 か月以内にがん細胞がが明らかとなった。

薬剤抵抗性を獲得してしまうことが報告されている 1-3。そ本研究では，この EGF-R，HGF-R 及び IGF-1R が活性9化している Erlotinib 処理期間 3 か月の細胞を Erlotinib 耐性化細胞（HCT/Erlotinib cells）とし，耐性化メカニズムについて検討した。

Fig. 3 EGF-R 分子標的薬（Erlotinib）耐性化細胞におけるヘテロ複合体の形成（A）HCT/parent 細胞および HCT/Erlotinib 細胞において，EGF-R を EGF-R 特異的抗体で免疫沈降し，EGF-Rと共沈降する HGF-R および IGF-1R の量をウェスタンブ
ロット解析した。（B）A と同様に，HGF-R を HGF-R 特
異的抗体で免疫沈降し，HGF-R と共沈降する EGF-R および IGF-1R の量をウェスタンブロット解析した。
3.4

EGCG 処理による Erlotinib 耐性化の解除

これまでの報告で，緑茶に含まれる食品機能性成分
Fig. 2 EGF-R 分子標的薬（Erlotinib）抵抗性におけるバ
イパス経路の活性化（A,B）HCT116 細胞に Erlotinib を図に示す日数処理し，サンプルを採取した。ウェスタンブロット解析により，（A）
リン酸化 HGF-R と HGF-R の発現量および（B）リン酸化
IGF-1R と IGF-1R の発現量の経時的変化を測定した。β-actin の発現量を内部標準とした。
3.3 EGF-R 分子標的薬（Erlotinib）耐性化細胞におけるヘテロ複合体の形成
Erlotinib 耐性化細胞において HGF-R は EGF-R とヘテロ複合体を形成しているのかを解析するため，DSP でク
ロスリンクした後，共免疫沈降実験とウェスタンブロット
解析を行った。EGF-R を EGF-R 特異的抗体で免疫沈降し，EGCG は，Erlotinib 耐性化細胞で活性化していた 3 つの受容体（EGF-R，HGF-R および IGF-1R）を抑制できることが知られている 14-16。そこで，分子標的薬抵抗性を解除するために，本研究では EGCG に着目した。日常的な緑茶摂取による EGCG 血漿濃度は 1µM と報告されていることから，本研究ではこの濃度を採用し，検討した 21。
Erlotinib 耐 性 化 細 胞 に 1µM の EGCG を 2 週 間 処 理
し，Erlotinib 抵抗性に与える影響を検討した。EGF-R 及
び HGF-R，IGF-1R の リ ン 酸 化 レ ベ ル を 解 析 し た 結 果，
EGCG によりこれら受容体のリン酸化が抑制されることが解った（Fig. 4ABC）。これらの結果から，EGCG は
Erlotinib 耐性化関連受容体をマルチに阻害することで，既に獲得された Erlotinib 耐性化を解除できることが示唆された。

EGF-R と共沈降する HGF-R のタンパク量をウェスタンブ
ロット解析した。その結果，EGF-R/HGF-R 複合体はコントロール細胞と比較し，Erlotinib 耐性化細胞で増加していることが解った（Fig. 3A）。同様に HGF-R を HGF-R 特
異的抗体で免疫沈降し，ヘテロ複合体形成能を解析すると，
HGF-R/EGF-R ヘテロ複合体の形成は Erlotinib 耐性化細胞で増加していた（Fig. 3B）。これらの結果から，上述の仮説の通り，Erlotinib 耐性化細胞では EGF-R と HGF-R，
EGF-R と IGF-1R および，HGF-R と IGF-1R のヘテロ複合体の形成が促進されことが明らかになった。

Fig. 4EGCG 処理による Erlotinib 耐性の解除（A, B, C）HCT/Erlotinib 細胞に EGCG を 2 週間処理し，ウェスタンブロット解析により（A）リン酸化 EGF-R 及びEGF-R，（B）リン酸化 HGF-R 及び HGF-R，（C）リン酸化
IGF-1R 及び IGF-1R の発現量を測定した。β-actin の発現量を内部標準とした。

10

3.5

EGCG による Erlotinib 耐性化の抑止

EGCG により既に獲得された Erlotinib 耐性化が解除さ

preconditioning 細胞を樹立し，Erlotinib 耐性化について検討した。

れ た こ と か ら，Erlotinib 及 び EGCG を 同 時 に 処 理 す れ

まず，EGCG preconditioning した細胞（HCT/EGCG 細ば，Erlotinib 耐性の獲得を抑止できるのではないかと仮胞）と EGCG preconditioning していない親株細胞（HCT/説を立てた。Erlotinib 5 週間処理では EGF-R は再活性化

parent 細胞）における EGF-R，HGF-R，IGF-1R の活性化

しているが，Erlotinib 及び EGCG の併用処理では未処理レベルを検討した。その結果，HGF-R と IGF-1R の恒常的の細胞より抑制されていた（Fig. 5A）。同様に，Erlotinib

な活性化は EGCG preconditioning によって抑制されてい及び EGCG の併用処理おいて HGF-R，IGF-1R の活性化

ることが解った（Fig. 6BC）。EGF-R の恒常的な活性化には Erlotinib 処理より抑制されていた（Fig. 5BC）。5 週間

は差は見られなかった（Fig. 6A）。

の EGCG 処理では，EGF-R の活性化が抑制され，さらに次 に，EGCG preconditioning 細 胞 に Erlotinib を 処

バイパス経路である HGF-R，IGF-1R の活性化の亢進は起理 し た と き の EGF-R，HGF-R，IGF-1R の 活 性 化 レ ベ ル

こらなかった（Fig. 5ABC）。これらの結果から，EGCG をを 検 討 し た。 そ の 結 果，EGCG preconditioning 細 胞 にErlotinib と同時に処理しておけば，Erlotinib 耐性の獲得

Erlotinib を 6 日間処理すると，EGF-R の再活性化は起きず，を阻止できることが示唆された。

Erlotinib の効果が持続していることが解った（Fig. 6A）。

3.6

EGCG preconditioning による Erlotinib 耐性化の抑止

HGF-R の活性化は，EGCG preconditioning 細胞において次に，EGCG を予め長期間処理しておけば Erlotinib 耐

未処理の細胞より抑制され，EGCG preconditioning 細胞性化をさらに強く抑止できるのではないかと考えた。そこに Erlotinib を 6 日 間 処 理 す る と，HGF-R の 活 性 化 は さ

で，1µM の EGCG を予め 3 か月間処理しておいた EGCG

らに抑制された（Fig. 6B）。同様に，IGF-1R の活性化はFig. 5

Fig. 6 EGCG preconditioning による Erlotinib 耐性化の抑止

Erlotinib 耐性化の抑止（A, B, C）HCT116 細胞に Erlotinib を 5 週間処理した（A, B, C）HCT116 細胞に Erlotinib を 6 日間処理した

サ ン プ ル（HCT/Erlotinib），HCT116 細 胞 に Erlotinib 及サンプル（HCT/Erlotinib），HCT116 細胞に EGCG を 3 かび EGCG を 5 週 間 処 理 し た サ ン プ ル（HCT/Erlotinib+

月間処理したサンプル（HCT/EGCG）及び，HCT/EGCG

EGCG）及び，HCT116 細胞に EGCG を 5 週間処理したサに EGCG お よ び Erlotinib を 6 日 間 処 理 し た サ ン プ ル

ンプル（HCT/parent+ EGCG）をそれぞれ採取した。ウェ（HCT/EGCG + Erlotinib）をそれぞれ採取した。ウェスタ

スタンブロット解析により，（A）リン酸化 EGF-R 及びンブロット解析により（A）リン酸化 EGF-R 及び EGF-R，

EGF-R，（B）リン酸化 HGF-R 及び HGF-R，（C）リン酸化（B）リン酸化 HGF-R 及び HGF-R，（C）リン酸化 IGF-1R

IGF-1R 及び IGF-1R の発現量を測定した。β -actin の発及び IGF-1R の発現量を測定した。β-actin の発現量を内

現量を内部標準とした。

部標準とした。

11

EGCG preconditioning 細胞では未処理の細胞より抑制さと IGF-1R のすべての活性化が抑制できることを明らかにれ，EGCG preconditioning 細胞に Erlotinib を 6 日間処理した（Fig. 4）。このメカニズムの一つとして EGCG によ

しても，バイパス経路としての活性化の亢進は起こらな

る Lipid raft 崩壊の可能性がある 27。EGF-R，HGF-R およかった（Fig. 6C）。

び IGF-1R を含む多くの受容体型チロシンキナーゼ（RTK）

以上の結果から，EGCG を preconditioning しておくこ

は Lipid raft と呼ばれる細胞膜の特定の組織化されたドメとで，Erlotinib に対する感受性が亢進し Erlotinib 耐性化

インに局在する 28-33。これらの RTK は Lipid raft で 2 量体を抑止できる可能性が示唆された。

を形成し活性化する。そのため，EGCG により Lipid raft
が不安定化されると 2 量体が形成できなくなり，結果とし

4

考察て活性化を抑制することができた可能性が考えられる。

本研究では，まず大腸がん細胞における分子標的薬

本研究ではさらに，EGCG 単剤での長期処理細胞におい（Erlotinib）の長期間処理（3 ヶ月）による薬剤抵抗性の出ても 3 つの受容体の活性化が抑制され，EGCG の効果が持現とその分子メカニズムを解明した。これまでの我々の続できることを明らかにした（Fig. 6）。このメカニズムと研究によって，VEGF-R を長期間阻害すると，HGF-R がして，Lipid raft 崩壊の他にもう一つの作用機序が考えら

バイパス経路として活性化し耐性化することを明らかにしれる。ひとつは，EGCG が増殖因子受容体の ATP 結合部

17てきた 。そこで，本研究では，大腸がん治療において，位に入り込み，ATP 競合的に受容体の活性化を阻害する

VEGF-R 阻害剤と並びよく用いられている EGF-R 阻害剤

メカニズムである。受容体の動態解析とドッキングシミュ

である Erlotinib に対する薬剤抵抗性について検討した。

レーションの解析から，EGCG が HGF-R および IGF-1R

Erlotinib は，24 時間の使用では EGF-R が抑制され効果の ATP 結合部位に結合し，HGF-R および IGF-1R の活性を示した。しかし，Erlotinib を 2 日以上処理すると，バ化を阻害することが報告されている 34, 35。EGCG はこれら

イパス経路である HGF-R および IGF-1R の活性化亢進にの作用メカニズムから，単剤で幅広い受容体分子を同時に伴う EGF-R の再活性化がみられ，これが Erlotinib 抵抗性阻害することができると考えられる。

の分子メカニズムであることが解った。また，Erlotinib
耐性化細胞において，EGF-R/HGF-R, EGF-R/IGF-1R およ

5

結論び HGF-R/IGF-1R のヘテロ複合体の形成が促進されてい本 研 究 で は 分 子 標 的 薬（Erlotinib）の 長 期 使 用 はることが明らかとなった。表皮がん細胞，肝がん細胞では

Erlotinib 耐性を引き起こすことを明らかにした。そして，

EGF-R/HGF-R がヘテロダイマーを形成し，お互いを活性

この分子標的薬耐性を根本から解決する新しい栄養学的ア化すること 22，肺がん細胞において Erlotinib 処理によりプローチとして，茶カテキンである EGCG の有用性を示

EGF-R/IGF-1R のヘテロダイマー形成を増加させ EGF-R

した。

を再活性化させ Erlotinib 耐性化を引き起こす 23 という報告がある。これは，Erlotinib 耐性化細胞における HGF-R，
IGF-1R の恒常的な活性化の亢進および EGF-R の再活性化

6

文献
1

Presutti D, Santini S, Cardinali B, et al.（2015）

は，EGF-R が HGF-R および IGF-1R とヘテロ複合体を形

MET gene amplification and MET receptor

成し，かつトランスアクチベーションしている可能性を示

activation are not sufficient to predict efficacy of唆している。Erlotinib 耐性化細胞において，これらの受

combined MET and EGFR inhibitors in EGFR

容体がトランスアクチベーションしているのかを今後明ら

TKI-resistant NSCLC cells. PLoS One. 10（11）:

かにしていく必要がある。

e0143333.

EGF-R 分子標的薬の他にも，種々のがん分子標的薬

2

Qi J, McTigue MA, Rogers A, et al.（2011）（HGF-R, IGF-1R, PDGF-R, FGF-R, VEGF-R）に抵抗性が生

Multiple mutations and bypass mechanisms can

じることが解っている 17。この抵抗性を克服するために，

contribute to development of acquired resistance

分子標的薬の併用研究が盛んに行われてる 24, 25。しかしな

to MET inhibitors. Cancer Res. 71: 1081-1091.

がら，次々に薬剤耐性化が惹起されてしまうことが解って

3

Wu SG, Shih JY（2018）Management of acquired

いる 26。これらのことを踏まえると，現在，分子標的薬抵

resistance to EGFR TKI-targeted therapy in

抗性を克服する主流なアプローチとなっている分子標的薬

advanced non-small cell lung cancer. Mol. Cancer.

の併用療法では，抑制効果は一時的で，根本的な解決に至17: 38-52.

らないことは明らかである。分子標的薬の併用療法に代わ4Uchibori K, Inase N, Nishio M（2018）Identification

る，全く新しいアプロ―チの探索が必要であると考えられof Mutation Accumulation as Resistanceる。

Mechanism Emerging in First-Line Osimertinib

本研究では，分子標的薬抵抗性を栄養学的なアプロー
チとして，茶カテキンである EGCG によって解決できる

Treatment. J Thorac Oncol. 13: 915-925.
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inhibitors for targeted therapy of EGFR TKI-

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