二本鎖 DNA を発現する新型遺伝子の発現機構の研究
A study for dsDNA expression from novel type genes（日本遺伝学会推薦）

代表研究者 理化学研究所

飯田 哲史

RIKEN

Tetsushi IIDA

協同研究者 京都大学

古谷 寛治

Kyoto UniversityKanji FURUYA

Genes on chromosomal DNA are expressed through RNA synthesis by transcription followed by protein
synthesis. From DNA analysis of budding yeast by next-generation sequencing (NGS), we found a new type of genethat expresses extra-chromosomal DNAs. The DNA named specDNA (short paired extra-chromosomal DNA) has
same sequence with a locus in the S. cerevisiae genome which overlap with NAT1 and SIR2 genes including theSIR2 promoter region. To clarify the structural features of specDNA, we purified total DNA from cells. Digestion
analysis of specDNA by a double-stranded DNA specific restriction enzyme revealed that specDNA is a linear
double-stranded DNA. To analyze the function of specDNA in vivo, we constructed partial deletion strains ofspecDNA and the SIR2 gene and analyzed. The cytoplasmic granule formation and mating defect phenotype had long
been believed as the sir2 deletion phenotype. The deletion mutant of the SIR2 promoter region (specDNA∆ mutant),

which can express SIR2 from the replaced marker gene, significantly elevated cytoplasmic granule formation ofabnormal proteins. While the specDNA∆ mutant shows normal mating as wild-type strain. These results of thespecDNA gene suggest that specDNA is a novel DNA expressing gene and functions for suppression of cytoplasmic
granule formation of abnormal proteins.

研究目的

る比較的短い DNA 断片が存在する可能性を見出し

ゲノム上の遺伝子情報は転写により RNA へと変た。本研究は、この DNA 断片が特定の遺伝子領域に換され、生成された RNA は機能性 RNA として機能由来すること、存在量が細胞の遺伝子型によって変したり、タンパク質へと翻訳されたりすることで生化することから、遺伝子の発現産物である可能性に体機能を発揮する。一方で、レトロウイルスやレト着目し、機能性 DNA 断片遺伝子の特徴を明らかにロトランスポゾンなど、RNA が逆転写され DNA 断するとともに、生体内における機能に迫ることを目片としてゲノムに DNA が入り込む因子は知られて的とした。

おりゲノム不安定化の要因になっていることが報告

また、この DNA 断片の遺伝子領域は、リボソームされている。もし、ウイルスやトランスポゾン以外RNA 遺伝子(rDNA)のコピー数に応答して、ゲノム安で、DNA 断片を発現する遺伝子が存在し、生体内で定性を制御する領域と重複する(参考文献 1)。そこで、機能を持っているとすれば、その研究は新しい遺伝

rDNA のコピー数応答制御に関連して、DNA 断片遺子の形態を提案する興味深い研究となる。

伝子が機能している可能性を考え、rDNA の安定性

これまで、リピート遺伝子のコピー数制御機構お維持に関わる因子を探索し、DNA 断片発現と関連すよびゲノムの安定性維持の研究を行ってきたが(参るかを検討することとした。また、コピー数に応答

考文献 1)、その過程で、次世代シークエンサー(NGS)に関連する遺伝子が細胞の分裂寿命に関連しているを 用 い た ゲ ノ ム 維 持 の 研 究 か ら 、 出 芽 酵 母 S.

ことから、得られた因子と分裂寿命との関連を明ら

cerevisiae の細胞内に、染色体やプラスミドとは異なかにすることも目的とした。

DNA 断片のシグナルを検出したことから、染色体外研究経過の DNA 断片が直鎖状の二本鎖 DNA であることが明タンパク質のゲノムへの相互作用を解析する方法

ら か と な っ た 。 そ こ で 、 こ の 染 色 体 外 DNA をとして「クロマチン免疫沈降シークエンシング法

specDNA (short paired extra-chromosomal DNA)と名付(ChIP-seq 法)」が知られている。この解析法では、断け解析を進めた。

片化したクロマチン(DNA にタンパク質が結合した高次構造)や DNA 断片を精製し、アダプターを付加することで、細胞やクロマチン抽出液から免疫沈降により濃縮された DNA を NGS 網羅的に同定することが可能となる。あるエピトープタグに特異的なモノクローナル抗体を用いて、出芽酵母 S. cerevisiae の特定のタンパク質にタグを付加していないコントロールとなる細胞株において、ChIP-seq 解析を行った
ところ、ゲノム全体で一箇所のみ異常に DNA が濃縮されている領域を見出した。この領域では、抗体による免疫沈降で濃縮したサンプル・濃縮していないサンプルどちらにおいてもランダムに断片化されたはずの DNA 断片の末端が揃ってマップされており、決まった領域の特定の長さの DNA 断片が染色体外の DNA として存在する可能性を示唆していた。
NGS で解析した DNA 配列(リード)が一致する領域
か ら 、 DNA 断 片 の 長 さ を 推 定 し た と こ ろ 、 S.
cerevisiae の NAT1 遺伝子から SIR2 遺伝子にかけての 756 塩基の領域で、染色体外の DNA 断片が存在している可能性が示唆された。NGS を用いた解析では、一般的に DNA の断片化が必要であり、ゲノムDNA と染色体外の DNA を厳密に区別することが困難である。そこで、細胞から調製した断片化していない全 DNA をアガロースゲル電気泳動により分離後、DNA 断片が検出された領域と隣り合う同じ長さの領域のプローブを用いて、サザン解析を行った。
その結果、NGS で予測された領域にのみ、756 塩基対の DNA のシグナルが検出されたことから、NAT1遺伝子から SIR2 プロモーター、SIR2 遺伝子にまたがる領域と一致する染色体外 DNA が細胞内に存在していることが確認された(Fig. 1)。次に、調製した
全 DNA を、二本鎖 DNA 特異的な制限酵素で処理し、断片化した DNA のパターンからその構造を解析した。この解析では、DNA を一箇所でのみ切断する二本鎖 DNA 特異的な制限酵素を選択することで、環状 DNA の場合はゲノム DNA のシグナルに加えて一本のシグナルが生じ、直鎖状 DNA の場合は二本のシグナルが生じる。実際に解析してみると、ゲノムDNA のシグナルに加えて予想された長さの二つのspecDNA をコードする領域は、NAT1 遺伝子の 3’側の一部、SIR2 プロモーターと SIR2 の 5’側約 250 塩基を含む(Fig. 1)。したがって、specDNA の機能が SIR2遺伝子や SIR2 プロモーターの機能と重複している可能性が考えられる。そこで、specDNA 遺伝子の細胞における機能を明らかにするため、specDNA 遺伝子の欠失変異として SIR2 プロモーターの欠失変異を(specDNA∆)、SIR2 の欠失変異として SIR2 のコード領域の 3’側約半分の欠失変異(sir2∆C)を作成した。
更に、specDNA と SIR2 遺伝子の二重変異として、これまで SIR2 遺伝子破壊株として一般的に用いられてきた SIR2 の全コード領域の欠失変異(sir2∆)についても解析を行った。specDNA∆は、野生型同様に生育したことから、specDNA∆は、遺伝子欠損が細胞増殖にはほとんど影響を与えないと推察される。また、
specDNA∆においては、遺伝子破壊に用いたマーカー
遺伝子 URA3 の下流に機能未知遺伝子のプロモーターが存在するため、このプロモーターからの転写により正常な SIR2 を発現することが可能である。従って、specDNA∆は、SIR2 欠失変異と機能を区別することが可能である。これらの変異体を利用して、SIR2遺伝子破壊株の表現型として知られる、接合不能性(参考文献 2)とハンチントン舞踏病原因タンパク質発現による細胞質の異常タンパク質顆粒形成(参考文献 3)を観察した。接合不能性は、sir2∆と sir2∆C が示したことから、specDNA∆は、SIR2 遺伝子の機能を維持していることが確認された。異常タンパク質顆

粒形成は、ハンチントン舞踏病原因タンパク質(Htt)ル抗体を用いることで specDNA を濃縮できることのポリグルタミン配列を含む Htt103QP-GFP を細胞から、このモノクローナル抗体を用いた specDNA-タ内で発現させ、細胞内に凝集体形成による輝点形成ンパク質複合体の精製を試みた。モノクローナル抗頻度を蛍光顕微鏡下で解析した(参考文献 4)。野生型体を用いて、細胞抽出液に対して免疫沈降により複に 対 し て 、 specDNA∆ と sir2∆ で は 、 細 胞 内 に合体を精製した後、共沈降してきたタンパク質を質

Htt103QP-GFP の凝集体形成率が二倍程度に上昇し、量分析により同定したこところ 100 以上のタンパク

sir2∆C では野生型と同程度の凝集体形成しか観察さ質が候補として検出された。これらの候補遺伝子にれなかった。このことは、これまで SIR2 遺伝子の機簡易精製が可能な TAP タグを付加し細胞内で発現後、能とされてきた異常タンパク質顆粒形成の抑制こそ複合体精製物の中に specDNA が含まれているかをが、specDNA 遺伝子特異的な機能であり(Fig. 1)、SIR2検討した。その結果、種間で高度に保存されたタン遺伝子の機能とは区別できることを示している。まパク質一つについて、精製した画分に specDNA が濃た、これまで sir2∆を用いてのみ SIR2 遺伝子機能を縮されていることがわかった。このタンパク質をコ解析してきた研究は、厳密には SIR2 遺伝子の機能をードする遺伝子 SDI1 (specDNA interactor1)は細胞増解析出来ていなかったことを示唆している。

殖に必須であり、遺伝子破壊は出来ない。そこで、NGS の解析とサザン解析の結果では、非常に少量既に報告されている温度感受性変異の導入を検討しながら、NAT1 側に延長した DNA 断片の存在が示唆ているが、現在使用している細胞株の系統では致死されていた。このことは、specDNA が発現する際、となるなど specDNA 遺伝子の機能解析に使用可能な何らかの課程を経て、長い前駆体から成熟した変異体は現存しない。今後は、specDNA∆に関連したspecDNA が生成される可能性や、specDNA 遺伝子発表 現 型 を 示 す SDI1 遺 伝 子 の 変 異 体 を 探 索 し 、現には、プロモーターのような制御領域が必要であ

specDNA 遺伝子の機能解析を進めたい。

る可能性を示唆している。そこで、異常タンパク質

specDNA 遺伝子領域は、SIR2 プロモーターにおけ顆粒形成の抑制の機能が specDNA 遺伝子によるもの

る rDNA コピー数制御領域を含むことから、rDNA リであることに着目し、Htt103QP-GFP の凝集体形成率ピートの安定性制御に関与する可能性が考えられた。

を指標に、specDNA 遺伝子の機能に必要な遺伝子領

そこで、specDNA 遺伝子の解析と平行して、rDNA の域の特定を行った。specDNA 遺伝子を含むさまざま安定性に関わる因子のスクリーニングによりな DNA 断片を調製し、specDNA∆の表現型を相補す

specDNA に関連する因子の探索も行った。specDNAるかを調べた。その結果、specDNA 遺伝子から SIR2遺伝子領域も単離される可能性のある変異体のスク側更に 250 塩基、NAT1 側更に 500 塩基を含む断片リーニングを行った結果、specDNA に関連する因子が、野生型レベルまで specDNA∆の表現型を相補するは単離されなかったが、細胞分裂寿命に関わる二つことがわかった。この結果から、specDNA 遺伝子のの因子を同定し報告した(誌上発表 1)。

機能には隣接する領域が必要であることが示唆された(Fig. 1)。今回同定された specDNA 遺伝子の機能に考察必要な領域は、specDNA 遺伝子にプロモーターやタ

specDNA 遺伝子が rDNA コピー数制御領域を含むーミネーターのような制御領域が必要である可能性形で存在することから、当初 specDNA が SIR2 を介を示唆している。

した rDNA 安定性制御に関与することを想定して研一般に、直鎖状の二本鎖 DNA は、細胞内で DNA究を開始したが、結果として、specDNA 遺伝子は SIR2二本鎖切断として認識され、DNA 修復因子により分とは独立した機能を有していることが明らかとなっ解や修飾を受ける。specDNA が、全 DNA からゲノた。この結果は、老化に関連するさまざまな機能がム DNA と 比 較 可 能 な 量 で 検 出 で き る こ と は 、SIR2 遺伝子にあるという先入観を取り除くものであ

specDNA が何らかの方法で、DNA 異常の感知機構かり、細胞老化に関連した異常タンパク質によるストら逃れている可能性を示唆している。そこで、レス応答の機能を specDNA が担っていることを明ら

specDNA が特定のタンパク質と相互作用し機能するかにした本研究の意義は大きい。直鎖状の染色体外ことで、細胞内で安定に維持されている可能性に着DNA は、細胞内で不安定であることが知られている。

目した。NGS を用いた解析では特定のモノクローナ

従って、specDNA の複合体として精製された Sdi1 タンパク質は、specDNA とともに異常タンパク質の凝required for spatial sequestration and asymmetrical

集体形成を抑えている可能性が考えられる。Sdi1 はinheritance of protein aggregates. " PLoS Genet. 2014

さまざまなタンパク質と相互作用していることが知Jul 31;10(7):e1004539. doi: 10.1371/journal.pgen.

られており、specDNA は Sdi1 の新しいパートナーと1004539. PMID: 25079602

して Sdi の機能を制御する DNA サブユニットとし

4.

Higgins R, etal. "The absence of specific yeast heat-て機能するモデルも考えられる。今後、specDNA-Sdi1

shock proteins leads to abnormal aggregation and複合体の機能を生化学的に明らかにするとともに、compromised

細胞内のどこで機能しているのかについても解析をHuntingtin

進めたい。未だ、specDNA の発現機構は不明である

18;13(1):e0191490.

が、相補性試験で見出された NAT1 側の断片は、0191490. PMID: 29346421

autophagicproteins."

clearance

PLoS
doi:

One.

ofmutant

2018

Jan10.1371/journal.pone.

specDNA 発現がプロモーター様の領域により制御されている可能性が考えられる。今後、他生物におい研究の発表ても DNA 断片発現遺伝子を探索し、DNA を発現す

口頭発表

る新たな遺伝子カテゴリーを提案する研究に発展し1.

飯田哲史：出芽酵母が持つゲノムの記憶の分子機構、国立遺伝学研究所 研究集会、オンライン、たい。

2020 年 11 月
参考文献
1.

2.

Tetsushi Iida: Mechanism of genome recovery by aIida T, Kobayashi T. "RNA Polymerase I Activators

copy-number surveillance system of the ribosomal

Count and Adjust Ribosomal RNA Gene Copy

RNA genes, 日本分子生物学会 第 43 回年会、オ

Number. " Mol Cell. 2019 Feb 21;73(4):645-654.e13.

ンライン、2020 年 12 月

doi: 10.1016/j.molcel.2018.11.029. PMID: 30612878
2.

3.

Gartenberg MR. "The Sir proteins of Saccharomyces

誌上発表

cerevisiae: mediators of transcriptional silencing and1.

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much more. " Curr Opin Microbiol. 2000 Apr;3(2):Related to Senescence Signal Production in the132-7. doi: 10.1016/s1369-5274(00)00064-3. PMID:

Ribosomal RNA Gene Cluster." Mol Cell Biol. 2022

10744999.

Apr 6:e0002822. doi: 10.1128/mcb.00028-22. PMID:Song J, etal. "Essential genetic interactors of SIR2

35384721.