シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第8回

ペプチド  酵素  不和合性
蛋白質化学の一断面*1

﨑 山 文 夫 （さきやま ふみお）に反応させると、保護されるはずのイミダゾール環蛋白質化学の初期（ペプチドの化学）が開環（Bamberger 分解）してしまいます。この反応
私が大阪大学理学部化学科の赤堀四郎先生のもとについてはまた後に触れます。

で蛋白質の化学的研究を始めた頃は、Frederick

それから間もない1960 年に大阪大学蛋白質研究所

Sanger（1918-2013）がアミノ酸 51 残基からなるイン（阪大蛋白研）が全国共同利用研究所として発足しま

スリンの全一次構造を決めた 1955 年とほぼ重なり(1)、した。赤堀先生が初代所長で、私が所属した蛋白質化蛋白質化学（protein chemistry）の揺籃期といって学構造部門は成田耕造教授が担当されました。成田いい時代でした。Sanger はこの研究のために 1945 年

先生は、当時としては非常に困難であったタカアミに DNP 法として知られる N 末端アミノ酸同定法を自ラーゼＡの一次構造の決定に取り組んでおられましら開発しています。1950 年には早くも DNP 法に替わた。残基数の合計が 478 にもなるタカアミラーゼＡる、Pehr Edman（1917-1977）による N 末端アミノ酸の全アミノ酸配列は、1981 年に成田先生が亡くなっの逐次分解・同定法が提案され、急速に普及しましたて間もなく、ようやく解明されました。このような非(2)。それから間もない 1952 年に赤堀先生は N 末端の常に大きな蛋白質の一次構造を決定するには、まず反対側の C 末端アミノ酸同定法としてヒドラジン分トリプシンやキモトリプシンのような基質特異性の解法を発見されました(3)。その頃、私は大川乾次先生

異なるプロテアーゼで適当な長さに断片化してから、（後に関西学院大学理学部長）のもとでヒスチジン生じるペプチドごとに Edman 法を適用しなければな（His）を含むペプチドの合成法について研究していりません。このような限定的分解には、プロテアーゼました。当時、His のイミダゾール環の保護基の開発とともに化学的開裂法（chemical cleavage）が役には、ペプチド化学の優先課題の一つでした。私の修士立ちます。中でも Bernhard Witkop（1917-2010）に課程の研究で、His の-アミノ基とイミダゾール基のよるメチオニン（Met）のカルボキシル基側でペプチ両方をベンジルオキシカルボニル化した誘導体がペド結合を切断する BrCN 分解は今でも使われることがプチド合成に適していることを見つけ、その論文があります (5) 。私はまず、先ほど触れた His のNature 誌（1958 年）に掲載された背景には、国際的Bamberger 分解でγ-ケトアミノ酸が生じることに注な激しい競争があったと思われます (4)。一方、His に目して、γ-ケト基とヒドラジンとの反応を経る分子アルカリ性で塩化ベンジルオキシカルボニルを過剰
1 この原稿は 2013 年 6 月 14 日に行われた第 13 回蛋白質科学会（鳥取）・ヒストリカルレビューの講演を、使われた 34 枚のスライドと司会をした私の怪しい記憶と少々の思い込みをもとに大幅に圧縮したものである。読者の多くはこの講演を記憶されていることと思う。後日﨑山先生に全面改訂していただくことを期待して、しばらくはこの不完全なダイジェスト版でご辛抱願いたい。なお、会員の一部から強い要望のあった
﨑山先生ご自身による「赤堀四郎先生生誕 100 年に想う」（2001, 蛋白質核酸酵素 51, pp. 273-275）を、本稿の補足として末尾に加えた。転載を許可下さった共立出版株式会社のご厚意に深く感謝する。中沢 隆（奈良女子大学理学部）

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内環化によって、ケトアミノ酸のカルボキシル基ラーゼＡと同じく麹菌が生産するリボ核酸分解酵側でペプチド結合を切断する方法を試みました。

素（RNase T1）の Trp 59 を相手に、酵素の機能発その後、トリプトファン（Trp）のオゾン酸化によ

現とTrp 残基の役割について、オゾン酸化と 13C NMRって、N’-ホルミルキヌレニン（NFK）やキヌレニや円偏光二色性（CD）など各種分光法を組み合わせン（Kyn）のγ-位にもケト基がより簡単に生じるこた研究を展開していました(8)。とがわかりました。1962 年から約 2 年半、NIH の私たちが Trp 残基の化学修飾をもとに蛋白質のWitkop 先生のもとでの研究をはさんで Trp の化学構造機能相関の研究に力を入れていた頃、蛋白質修飾の研究を始めました。の 一 次 構 造 決 定 を は じ め と す る protein
chemistry は冬の時代を迎えていました。
Sanger の蛋白質の化学修飾

ジデオキシ法のような DNA の塩基配列決定法の急ニワトリの卵白リゾチームには 6 つの Trp 残基

速な発展により、核酸の塩基配列解析が蛋白質のがありますが、水溶液中でオゾン酸化すると Trp

アミノ酸配列分析より簡単になったためです。

62 が優先的に NFK に変換されると同時に酵素活性1978 年には Nature 誌に「protein chemistry は衰（溶菌活性）が元の 20%程度に低下します。ところ退するのか?」と題する記事が掲載されました (9)。

が NFK のホルミル基を選択的に加水分解して得ら

実際、タカアミラーゼＡよりも大きな蛋白質の遺れる Kyn 62-リゾチームでは活性が約 80%まで回復

伝子解析が次々と進み、蛋白質の化学修飾も遺伝しました 。これは、Kyn の o-アミノフェニルケ

子工学の手法による site-directed mutagenesis

トン基部分が分子内水素結合によって Trp のインで置き換えられようとしていました。それでも特ドール環と非常によく似た平面構造をとることを定のアミノ酸残基のみを同位体標識するといった示しています。これが蛋白質の構造と機能の相関

化学修飾を使わないとできないこともあるし、蛋についての研究につながりました。例えば Kyn は白質の翻訳後修飾も遺伝情報からは予測できませ波長 360 nm の紫外線で励起すると、波長 480 nm にん。同じ Nature 誌に「protein chemistry は蛍光極大を示しますが、蛋白質の内部では周辺のessential である」という記事で蛋白質を単なる配疎水性基や極性基のイオン化状態に大きく依存し列情報でなく、物質として認識する必要性を述べてこの蛍光特性が変化するため、Kyn は蛋白質内部た記事(10)が出るまで、約 10 年かかりました。このの蛍光プローブとして使えます。また、NFK は K13CN

間私たちは、リゾチームや RNase T1 から次のテーとの反応で環化して、その環化生成物を高濃度のマとなるプロテアーゼに研究対象を広げつつ、酵LiCl 溶液中、NaBH4 で還元すると、元のインドール素の触媒機構や構造・機能相関の研究を続けてい(6)

13環が再生すると同時に C2 位が C で標識できるこました。

(7)とがわかりました 。普通、ある化学修飾によって蛋白質の構造と機能 —
protease I と RNase T2 —酵素が失活すると、蛋白質の構造維持や機能発現に必須なアミノ酸残基が特定できますが、そのアAchromobacterミノ酸残基が天然の酵素の中でどのように振る舞

私たちが手がけた酵素の中でも特に興味深いもい、どのような役割を果たしていたかを知ることのは、副島・正木両先生（茨城大学）らによって発は困難です。ところが Trp の同位体標識や Kyn へ

見 さ れ た Lys-X の 結 合 に 特 異 性 を も つの変換は、側鎖の構造が全くあるいは微妙にしかAchromobacter protease I（API）です。この酵素はウ変わらないので、基質や阻害剤との相互作用や、周シ・トリプシン（BT）より活性が一桁高く、蛋白質辺の環境変化、さらにインドール環自体の動的挙の一次構造解析に汎用されるようになりました。

動も適当な方法で追跡することが可能になるといAPI を API 自身と V8 protease、それに BrCN 分解う利点があります。このようにして、1970 年代後した断片の一次構造を解析した結果、この酵素は半から数年間、リゾチームの Trp 62 や、タカアミアミノ酸 268 残基からなり、触媒部位の catalytic51

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triad が Asp 113、His 57、および Ser 194 で構成され作用の解明は今後の課題として残りました。

るセリンプロテアーゼであることがわかりました

API の研究と同じ頃、私たちは麹菌が分泌する(11)。
API と BT の X 線結晶構造を比べると、API のRNase T2 のアミノ酸配列を決定し、さらにピロ炭触媒部位の Asp 113 は His 210 と Trp 169 によって酸ジエチルやヨード酢酸による化学修飾実験から、溶媒から遮蔽されていて、API の His 210 と Trp 169

この酵素の触媒基を His 53 と His 115 と同定しましに相当するアミノ酸は BT では Ser 214 と Trp 215

た(14)。ところが、同じ麹菌が分泌する RNase T1 のです (12)。X 線結晶構造から、API の Asp 113 と His

アミノ酸配列にはこれらに相当する His がありま210 の間に何らかの相互作用があり、この構造がせん。そこで、アミノ酸配列の相同性の検索を西川

API の高い酵素活性に関係すると考えられたので、建博士（蛋白工学研）に依頼した結果、タバコ属

site-directed mutagenesis により His 210 を Ser に変換（Nicotiana alata）の花柱に存在する S 遺伝子特異した変異酵素（H210S）を調製しました。すると、的糖タンパク質に、高い類似性が認められました。

H210S は Lys に対する基質特異性を保持したまま面白いことに、私たちが RNase T2 の触媒基に同定

で、活性が至適 pH の 7-9 の領域で天然型 API よりした His 53 と His 115 に相当する 2 つの His 残基も数倍も増大するという意外な結果が得られました

この S-糖蛋白質で保存されていた上に、その周辺(13)。その後の研究で、API の活性の調節に His 210のアミノ酸配列まで一致していたのです。そこで、と Asp 113 の静電相互作用が重要な役割を果たし1989 年の 6 月に、RNase T2 の触媒基に関する論文ていることは突きとめられたと思いますが、それ(14)を投稿してから、問題の S-糖蛋白質の一次構造以外の His 57 と His 210、His 210 と Trp 169 の相互を研究している Richard Simpson 博士 (Melbourne)

メルボルンの Richard Simpson 邸にて（1992 年 2 月 24 日）。文献 14 の主著者である河田康志・鳥取大学教授（右から 2 人目）、Richard Simpson（同 2 人目）。写真提供：河田教授

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シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第8回に、「タバコの S-糖蛋白質は RNase なのではない

酵素は、リボソーム RNA のターンオーバーを通じか」と問い合わせました。それから一月も経たないて細胞の恒常性を保つ“housekeeping”の役割や、他うちに、電話がありました。
「RNase 活性があった！」の微生物に対する防御の機能をもつとされていまという知らせです。S-RNase は、N. alata の自己とす (17) 。S-RNase の機能もまた多様で、RNase T2

非自己の認識に関わる蛋白質だったのです (15)。こFamily の酵素群がこれほど多様な生体機能を示す

うして機能が不明であった S-糖蛋白質は S-RNaseことは驚くばかりです。S-RNase の多様な機能が自と呼ぶことになりました。写真は 1992 年に私の家

家不和合性にどう関係するか、蛋白質部分の相同族と Simpson 先生のお宅に伺った時のものです。

性が高い以上、糖鎖構造による機能の違いを明ら同じ品種の植物間では自家受精が妨げられて結かにするために、今後は糖鎖構造解析の重要性が実 し な い 遺 伝 的 性 質 を 自 家 不 和 合 性 （ self-より一層高まると予想されます(18)。このように多incompatibility）といいます。私たちは自家不和合性様な役割を担う RNase T2 Family の酵素は、動物やといった生命現象が、S-RNase の酵素作用として分植物ばかりでなく、細菌、原生動物からウイルスに子レベルで説明できると期待して、次の研究対象至るまで広く存在することが知られています (19)。にニホンナシの S-RNase を選びました。
ナシ（Pyrus

これらの多様な生命現象を解明するには、proteinpyrifolia）は普通自家不和合性のため人工授粉が必

chemistry の立場から酵素を物質として認識するこ要ですが、「おさ二十世紀ナシ」は自家受粉で実をとが非常に大切だと思います。

つけられるという面白い性質があります。実際にこれまでの研究を振り返ると、当然のことなが調べてみると、ナシには主に糖鎖構造の違いによら赤堀先生と Witkop 先生の影響を強く感じます。って S1-RNase、S2-RNase、・・のように多くの S-そのほか、私の蛋白質への興味をかき立てた本がRNase が存在することがわかりました。ところが「生命の起源と生化学」（オパーリン著, 江上不二

「おさ二十世紀ナシ」は S-RNase を欠いていまし夫編, 岩波新書 1956 ）で、その中には赤堀先生のた。こうなると自家不和合性に S-RNase が関係すポリグリシン説が紹介されています。最後に、蛋白ることはほぼ間違いなさそうです。一方、S3-RNase質の研究の歴史を探る貴重な資料として、赤堀先の X 線結晶構造から、RNase T2 の His 53 と His 115

生の「生命の世界 — タンパク質と生命の起源 —に相当する触媒基を、それぞれ His 33 と His 88 と（なにわ塾叢書 15, 1984）と、Witkop 先生の 2 編(5,推定しました。アミノ酸配列の相同性から見ても20)を挙げておきたいと思います。

この推定は妥当であったと思われます（図 1）(16)。
アミノ酸配列の相同性が高く、共通の触媒基が保存されている点を除いて、分子量も至適 pH もあまり共通しない RNase T2 Family の中で、ある一群の図 1. RNase T2 と S2-RNase のアミノ酸配列の比較。触媒基（H）は RNase T2 で 53 と 115 位、S2-RNase では 31 と 91 位。
配列を H が重なるように並べると、同一のアミノ酸（青）と類似するアミノ酸（緑）が H の近傍に集中して並ぶ。

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﨑山文夫先生ご略歴
1934 年 大阪に生まれる。
1956 年 大阪大学理学部化学科卒業
1958 年 大阪大学大学院理学研究科修士課程修了
1960 年 大阪大学蛋白質研究所助手
1962 年 米国 NIH, B. Witcop 研究室にて研究
1962 年 理学博士（大阪大学）：学位論文題目は「ヒスチジルペプチドの合成研究」
1971 年 大阪大学蛋白質研究所助教授
1982 年 大阪大学蛋白質研究所教授
1995 年 大阪大学蛋白質研究所所長
1997 年 大阪大学名誉教授
1998 年 四天王寺国際仏教大学教授

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