Vitrification Protocol

卵子 / 胚の凍結保存

2ガラス化プロトコール

ガラス化保存の流れ
卵子胚ES 平衡（3 段階）（胚盤胞凍結前処理）

ES 平衡（1 段階）

VS 平衡

ガラス化保存PART1 必要な機器・消耗品
1. Vitriﬁcation Media（製品コード：VT525）
No.0BS（Basic Solution）1.5mL ×1

No.2VS（Vitriﬁcation Solution）1.5mL ×2

No.1

＊1
＊2＊1

ES（Equilibration Solution）1.5mL ×1

卵子凍結用
胚盤胞凍結 前処理用

※溶液は使用前に室温に平衡させます＊2
2．Shrinkage Solution（製品コード：VT525-4）

3．Cryotop（Cryotop1 本につき最大 3 個の卵子 / 胚を凍結保存できます）
4．Oocyte Cryo Plate（卵子凍結用）/ Repro Plate（胚凍結用）
5．卵子 / 胚操作用ピペット

6．カウントアップ機能付タイマー
7．冷却用液体窒素

8．液体窒素容器（製品コード：Cooling Rack）
9．液体窒素用ピンセット

10．マイクロピペット・チップ：20 μL 用（卵子凍結用）、300μL 用
11．保存備品類（ケーン等）

12．実体顕微鏡（加温プレートは全工程 OFF）

POINT
操作性を高めるため、ピぺットの内径は卵子または胚の大きさに合わせてご使用ください（卵子：約 140μm、胚：140-250μm）。

ガラス化の操作はすべて室温で行います。

Vitrification3ガラス化プロトコール

PART2 胚盤胞凍結 前処理

拡張胚盤胞以降（ガードナー分類のグレード 4 以上）では、水分と凍結保護物質の置換が不十分になる可能性が高まることから、ES 平衡開始前に収縮用 Shrinkage Solution(VT525-4) を用いた人工収縮の実施をお勧めします。

Shrinkage Solution 300µL

準備

Shrinkage Solution を室温にもどし、Repro Plate に 300µL 分注し使用するまで蓋をして静置します。
収縮が確認された時点で ES 平衡を開始するため、P.5 の ES 平衡の準備も同時に行います。

（Repro Plate に ES を 1 ウェル分、VS を 2 ウェル分、各 300μL 分注）

STEP1

胚の移動と収縮の確認

Shrinkage Solution に胚を移動させ、ピペッティングを行い収縮を促します。
胚の収縮を確認後、P.5 の ES 平衡に進みます。

※2 分間で胚の収縮が確認できなかった場合も、そのまま P.5 の ES 平衡に進みます。

Information
Shrinkage Solution 適応目安
胚盤胞の発育ステージ

Grade 1

Early blastocyst
初期胚盤胞

Grade 2

blastocyst
胚盤胞

Grade 3Full blastocyst
完全胚盤胞

Grade 4

Expanded blastocyst
拡張胚盤胞Grade 5Hatching blastocyst
孵化中胚盤胞Grade 6

Hatched blastocyst
孵化後胚盤胞S hri n kag e S oluti on ( VT5 2 5 - 4 ) による収縮の実施を推奨します
拡張期胚盤胞

4Vitrification

PART3 ES 平衡

ガラス化プロトコール

胚と卵子とでは ES 平衡の手順が異なりますので、胚は本ページ、卵子は P.6 をご参照ください。

（VS 平衡以降は共通です。）

胚 ES 平衡ES 300µL

1

VS1 300µL

2VS2 300µL

ES

315 分間

準備

STEP1

STEP2

Vitriﬁcation Media（VT525）を準備します。

Repro Plate に ES を 1 ウェル分、VS を 2 ウェル分、各 300μL、分注し蓋をして使用するまで静置します。

胚の移動胚を培養液の持ち込みが最少になるようにピペット先端に吸引し（図 1）、胚を ES ウェル表面の中心に静かにのせます。

図1

ES 平衡

タイマーのカウントアップを始め、15 分静置します。

ES 表面に置かれた胚が 30 秒程度で沈降しながら収縮していくのが観察できます。

P.7 へ

Vitrification

5ガラス化プロトコール
卵子と胚とでは ES 平衡の手順が異なりますので、卵子は本ページ、胚は P.5 をご参照ください。

（VS 平衡以降は共通です。）

卵子ＥＳ平衡1. BS 20μL 2. ES 20μL
3min①②

4. ES 300μL ③ 9min

3min

3. ES 20μL

1 23 4

BS への ES 添加（1 回目）

BS への ES 添加（2 回目）

1. BS 20μL 2. ES 20μL
3min①

1. BS 20μL 2. ES 20μL
3min
①②②

卵子

3min

3. ES 20μL

3 分間

1ES3min3. ES 20μL

3 分間

19 分間
BS 20µL

準備

Vitriﬁcation Media（VT525）を準備します。
Oocyte Cryo Plate 上のES を 300µL、のエリアに BS を 20μL 、 のエリアにES 300µL
1. BS 20μL 2. ES 20μL
3min①②

4. ES 300μL ③ 9min3min

3. ES 20μL123 4の両エリアに VS を 300µL 分注し使用するまで蓋をして静置します（図 1）。

VS1 300µL

STEP1STEP2STEP4

卵子を培養液から BS ドロップ（20 μL）へ移します。
卵子

ES の添加（1 回目）

BS ドロップの右隣に ES を 20µL 分注し、分注したチップの先端

1. BS 20μL 2. ES 20μL
3min
①を使用して、BS ドロップと ES ドロップをつなげて 3 分間静置し②3min

13. ES 20μL

卵子

ES の添加（2 回目）

STEP2 のドロップの下に ES を 20µL 分注し、分注したチップの先端を使用して、上のドロップとつなげて 3 分間静置します（図 3）。

②3min

3. ES 20μL

1ESウェルへの卵子の移動
Oocyte Cryo Plate の

図2ES 20µL

図3エリアに分注した ES（300μL）表面に、卵子を移動させ 9 分間静置します（図 4）。

POINT
卵子は観察する角度によって回復の確認が困難な場合がありますが、その場合も 9 分間で STEP4 は終了します。
ドロップをつなげることで浸透圧変化が穏やかになりますので、卵子には触れずに静置させておきます。

Vitrification

ES 20µL

1. BS 20μL 2. ES 20μL
3min
①9 分間

6

図1

卵子の移動ます（図 2）。

STEP3

VS2 300µL

図4ガラス化プロトコール

PART4 VS 平衡
このページ以降は卵子と胚で共通の操作です。

冷却用の液体窒素と Cryotop を作業前に準備します。
VS1 平衡1VS2 平衡

2132×5

STEP1×590秒間

卵子/ 胚の移動

ES 平衡が完了した卵子 / 胚を、ES の持込みが最少になるようにピペット先端に吸引します（図 1）。

吸引した卵子 / 胚を VS1 ウェルの表面に移しタイマーのカウントアップを始めます。

STEP2
STEP3

図1

ピペットの洗浄

ピペット内の ES を全てウェル外へ排出し、VS を十分量 吸引・排出することでピペット内を洗います（図 2、3）。

VS1平衡

ES

卵子 / 胚を吸引し、VS1 のウェル内の 3 カ所で①②の操作を行います。
① 卵子 / 胚をピペットから VS 内に排出します。

VS
図2VS
図3

② 卵子 / 胚周辺を 5 秒かけて穏やかに 5 回かき混ぜます。

①②の操作を場所を変えて合計 3 回行うことで卵子 / 胚を VS に平衡させ脱水します。

STEP4VS2平衡

VS2 で STEP2 と同様にピペットの洗浄を行います（図 3）。

STEP3 の①②の操作を VS2 ウェル内で場所を変えて 2 回行います。

VS 平衡が完了していることが下記 2 点で確認できたら、卵子 / 胚を Cryotop にのせます。
・卵子 / 胚が収縮している。

・卵子 / 胚が浮き上がってこない（卵子 / 胚に合わせたピントがずれない）。

上記の 2 点が確認できない場合は、①②の操作を慌てずに再度行い確認します。

POINT
ピペット内を VS1 でしっかり洗浄することで VS 平衡を効率的に行います。

脱水が不十分にならないように、VS1 平衡と VS2 平衡の操作時間は合わせて 90 秒を目安に行います。

Vitrification

7

ガラス化プロトコール

PART5 ガラス化・保存準備

Cryotop を黒マークを上向きにして置きます。

液体窒素を液体窒素容器になるべく上限まで入れ、冷却時に素早く Cryotop を投入できるよう準備します。

1STEP12卵子/ 胚の移動

Cryotop の先端黒マークにピントを合わせ（図 1）、黒マークの近くに VS を横に伸ばすように排出して、卵子 / 胚を置きます（図 2）。

図1

STEP2

3

図2

余分なガラス化液の吸引除去

Cryotop 上にある余分な液を、横に伸ばしたドロップの端（なるべく卵子や胚から離れたところ）からピペットで吸引します（図 3）。ドロップから影が無くなる程度が最適な液量です（図 4）。

図3

図4

POINT
卵子 / 胚をピペット先端に吸引します 。

VS を横に伸ばすように Cryotop にドロップを作ることで、余分な液を吸引する際に、卵子 / 胚を吸引してしまう可能性が低くなります。

STEP3
8Vitrification

卵子/ 胚の確認

ピペットを Cryotop から離し、卵子 / 胚が Cryotop にのっていることを確認します。

ガラス化プロトコール

STEP4

急速冷却

STEP5

ストローキャップの装着

Cryotop を液体窒素中に 1 秒以内に投入しガラス化します。

液体窒素中で、Cryotop シート先端部を確認しながら、ピンセットでストローキャップをつかみ、差し込みます（図 1）。

空気中でストローキャップ上部を指でつかみ、Cryotop をねじりながらしっかりと差し込みます（図 2、3）。
作業中には、Cryotop 先端が空気中に出ないように十分に注意してください。

保存
図1

STEP6

図2

図3

Cryotop にストローキャップが確実に固定されていることを確認し､ ケーンに移して液体窒素タンク内に保管します。

POINT
室温から急速に冷却させるため、液体窒素は容器になるべく満杯に入れておきます。

Information
Cryotop 1 本あたりの卵子/ 胚数
卵子胚

Cryotop1 本で保存する卵子数は 3 個までを推奨します。

Cryotop1 本にのせる胚の数は加温後の使用個数にあわせます。
例：1 胚移植の場合は、1 本に 1 個の胚を保存します。

Vitrification9加温プロトコール

加温の流れ
卵子 / 胚

加温準備

TS 平衡

DS 平衡

WS 平衡

洗浄PART1 必要な機器・消耗品
1．Thawing Media（製品コード：VT526）
No.1TS（Thawing Solution）3.8mL ×1

No.3

WS（Washing Solution）1.5mL ×2

No.2DS（Diluent Solution）1.5mL ×1

2．35mm ディッシュ※使用前に TS と 35mm ディッシュは 37℃に、DS と WS は室温に平衡させます。

3．Repro Plate

4．卵子 / 胚操作用ピペット

5．カウントアップ機能付タイマー
6．冷却用液体窒素

7．液体窒素容器（製品コード：Cooling Rack）
8．液体窒素用ピンセット

9．マイクロピペット・チップ：300μL 用

10．実体顕微鏡（加温プレートは全工程 OFF）

POINT
操作性を高めるため、ピぺットの内径は卵子または胚の大きさに合わせてご使用ください（卵子：約 140μm、胚：140-250μm）。

加温の操作は TS 平衡以外すべて室温で行います。

PART2 準備STEP1

TS の加温Thawing Media（VT526）を準備します。

加温する患者数分のTSチューブをキャップをしたまま、35mm ディッシュとともに37℃に加温しておきます。
※TS の加温時間（目安）：インキュベーターでは 30 分以上、ウォーターバス（40℃）では 5 分以上を目安に温めてください。加温は品質を保つため 8 時間を超えないようにしてください。

10Thawing加温プロトコール
STEP2

Cryotop の移動

Cryotop を保管タンクから取り出し、液体窒素を満たした容器に素早く移します｡

Cryotop 先端が液体窒素から出ないように

十 分 注 意 し て ス ト ロ ー キ ャ ッ プ を 外 し、Cryotop を顕微鏡側に立てかけておきます（図 1、2）。

図1

POINT
液体窒素容器には液体窒素をなるべく上限までいれ、加温時に短距離で素早く Cryotop を TS に投入できるよう準備します。

図2

STEP3

ディッシュの作製

Repro Plate に DS を 1 ウェル、WS を 2 ウェル分、各 300μL 分注し蓋をします。

DS、WS を準備した後、インキュベーター等から加温しTS
全量

WS1300μL

DS300μL

12た TS チューブと 35 mm ディッシュを取り出し、全量をディッシュに空けます（図 3）。

POINT

WS2300μL3

図3

TS 液は凍結保護物質が高濃度に含まれるため、使用前に必ず 5 回転倒混和させ、全量をディッシュに空けます。

STEP4

顕微鏡セッティング

予め TS の中心部にパスツールを使用してフォーカスを合わせ（図 4）、顕微鏡の倍率を最小（視野を広く）にしておきます。

図4Thawing11加温プロトコール

PART3 TS・DS・WS 平衡
TSDS

WS1

1 分間（37℃）

3 分間

5 分間

TS 平衡

STEP1タイマーをスタートします（カウントアップで表示すると時間経過が分かりやすいです）。
Cryotop のシート部分を、すばやく 1 秒以内に液体窒素から TS に投入して加温します 。
シート先端にフォーカスを合わせ、卵子 / 胚を確認します。

卵子 / 胚がシートから自然に離れても観察を続け、1 分間なるべく触らずに待ちます。

POINT
卵子 / 胚がシート部に付着したままの場合は、TS 平衡開始から 1 分後にピペットで液を吹きかけてはがすか、ピペットでシート先端を静かに触れて振動を与えてはがします。

いずれの方法においても TS 平衡開始からの経過時間は気にせず、卵子 / 胚を傷つけないように慎重に行います。

DS 平衡

STEP2

TS平衡終了後、卵子/胚をピペットで吸い上げ、さらにピペット先端に約2mmのTSを余分に吸います（図1）。
そのまま DS ウェル底面の中央にピペット先端を置き、卵子 / 胚を静かに排出させ 3 分間静置します（図 2）。

DS2mm

TS12Thawing

図1TS

DS3 分間図2加温プロトコール
STEP3

WS 平衡

ピペットを DS で洗浄します。

卵子 / 胚をピペットに吸引した後に DS を 2mm ピペット先端に吸引し、STEP2 と同様に WS1 ウェルの底面に排出させ、5 分間静置します。

POINT
希釈の工程は、卵子 / 胚の周囲の液が徐々に混ざり、浸透圧変化が緩やかになることが重要です。

ピペット先端の 2mm はおおよそで構いませんが、前工程の試薬を次工程の試薬に持ち込むことが目的です。

2mm の見当を付ける際は、Cryotop の先端が 1mm 幅であることや卵子 / 胚の直径を目安に行ってください。

PART4 洗浄
STEP1

WS2 洗浄ピペットを WS2 で洗浄します。

卵子 / 胚を WS1 の持込みが最少になるようにピペットの先端に吸引し（図 1）、WS2 の表面に移します。

卵子 / 胚が底面まで沈んだら、再度ピペットで吸引し WS2 の表面に移し、底面まで沈むのを待ちます（図 2）。
各操作時間の計測は不要です。
1

図1

STEP2

2WS2

図2

回復培養

卵子 / 胚は洗浄完了後に回復培養を行います。

回復培養時間の目安は、卵子：2 ～ 3 時間、胚：30 分～ 2 時間です。

胚の回復培養は生存確認のために行います。生存が確認されたら時間に関わらず次の工程に移します。
卵子はスピンドルの回復に約 2 ～ 3 時間要しますので、ICSI など次の工程はスピンドルの回復が確認できた後、あるいは回復培養を 2 ～ 3 時間行った後に実施します。

Thawing13

14

Oocyte Vitrification Protocol

卵子プロトコール

ガラス化ES step

VS step

BS（20µL）＋ES（20µL）（1 回目）＋ES(20µL)（2 回目）

ES（300µL）

ガラス化 保存

VS1（300µL）
1VS2（300µL）

2

13卵子

2×5

3 分間

3 分間

DS step

WS step

TS（3.8mL）

DS（300µL）

WS1（300µL）

1 分間 37℃

3 分間

5 分間

TS step

37℃

×59 分間室温

加温液体窒素90秒間

1室温

WS2（300µL）
2胚プロトコール

ガラス化
ES step

VS step

ES（300µL）

ガラス化 保存

VS1（300µL）
1VS2（300µL）

213液体窒素

2×5×515 分間

室温

加温90秒間Embryo Vitrification Protocol

DS step

WS step

TS（3.8mL）

DS（300µL）

WS1（300µL）

1 分間 37℃

3 分間

5 分間

TS step

1537℃

1

室温

WS2（300µL）
2

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