Journal of Environmental Biotechnology（環境バイオテクノロジー学会誌）
Vol. 8, No. 1, 29–34, 2008

総

説（特集）

シロアリ腸内共生微生物群の多様性とゲノム解析
Diversity and Genome Analysis of Symbiotic Microbiota in Termite Guts
本郷裕一 *，大熊盛也

YUICHI HONGOH and MORIYA OHKUMA
環境分子分解科学研究チーム 〒 351–0198 埼玉県和光市広沢 2–1* TEL: 048–467–9648 FAX: 048–462–4672* E-mail: yhongo@riken.jp
Ecomolecular Biorecycling Science Research Team, RIKEN, Hirosawa 2-1, Wako, Saitama 351-0198, Japan
独立行政法人理化学研究所

キーワード：木質バイオマス，難培養，腸内細菌，多重共生系，昆虫
Key words: woody biomass, uncultivable, gut bacteria, multilayered symbiosis, insect
（原稿受付

1.

2008 年 4 月 23 日／原稿受理

はじめに

シロアリはゴキブリに近縁な社会性昆虫で，7 科 280
属 2600 種以上が記載されている。枯死木，枯葉，腐葉土などの植物枯死体のみを摂食し，温帯から熱帯にかけて分布する。特に熱帯と亜熱帯においては，最も生物量の多い動物群の一つであり，重要な分解者として位置づけられている。熱帯では植物枯死体の 1–2 割をシロアリが無機化しており，サバンナにおいては草食哺乳動物全体，森林ではシロアリ以外の動物全体に匹敵する貢献である26,35)。結果として，陸上二酸化炭素総排出量の約 2％，メタンの 2–4％がシロアリ由来と推定されている26)。畜産を含めた人間の社会活動を除けば，地球の炭素循環において，一つの動物群がこれほどの寄与をしている例は，ほかに知られていない。
枯死材を摂食することから，シロアリは木造建築物の害虫としても，人間社会に大きな影響を与えている。イ
エシロアリなど一部のシロアリは，その爆発的な繁殖力に伴う破壊的な食材性によって，世界規模で多大な被害をもたらしており，年あたりの被害総額は日本で 1,000
億円27)，米国で 2,000 億円2) を超えるとされている。一方，
近年，化石燃料に代わるバイオマスエネルギーの開発が急務となり，シロアリの高効率な木質分解能は世界的に脚光を浴びている。現在主流のバイオエタノールはサトウキビ，トウモロコシなど，人間の食料と競合する材料から生成されており，様々な問題を引き起こしている。
そこで，シロアリの木材消化能力を応用した木質バイオマス燃料開発の試みが，世界各地で始められている。
しかしながら，シロアリの木質消化機構は実はよくわ
かっていない。シロアリは唾液腺，あるいは中腸からセルラーゼを分泌しており，木片を自身で一部消化できる。
これが後腸で最終的な消化を受ける事で，セルロースとヘミセルロースの約 9 割を無機化できる。この後腸部で2008 年 5 月 1 日）の木質消化を担っているのが，原生生物（単細胞真核生物），真正細菌，古細菌とからなる共生微生物群である20)。これらは群集全体として，リグノセルロース嫌気発酵，窒素固定，尿酸を介した窒素再利用，還元的酢酸
生成，メタン発酵，などを行う事が知られている。ところが，群集を構成する微生物種の大部分が現在にいたるまで培養に成功しておらず，個々の機能や種間相互作用については，ほとんど未知のままである。
本稿では，シロアリ腸内共生微生物研究の成果を，培養を介さない手法により解明された腸内細菌叢の多様性と局在を中心に論じ，続いて，二つの対照的なゲノム解
析手法による最新の結果を紹介する。
2.

シロアリ腸内微生物の多様性

シロアリは系統分類学的に，下等シロアリと高等シロ
アリという二つの大きなグループに分けられる。前者は温帯から熱帯に分布し，日本で普通に見られるヤマトシ
ロアリ（Reticulitermes speratus）やイエシロアリ（Coptotermes formosanus） を 含 む ミ ゾ ガ シ ラ シ ロ ア リ 科（Rhinotermitidae）などの 6 科から成り，セルロース分
解性の腸内共生原生生物を保有する。一方，高等シロア
リはシロアリ科（Termitidae）のみで構成され，亜熱帯から熱帯にかけて繁栄している。セルロース分解性腸内
原生生物を持たず，腸内微生物叢は原核生物のみで構成される。下等シロアリが全て食材性であるのに対し，高等シロアリは木材の他，枯葉，腐葉土，土壌，菌類，地衣類等，様々な食性をもつ種類がいる。
下等シロアリの腸内共生原生生物群は，Parabasalia
門と Preaxostyla 門に属する種類のみから構成されており，絶対嫌気性で，ほとんどがセルロース分解を行うとされている。これらはシロアリとキゴキブリ（Cryptocercus 属ゴキブリ）の腸だけに生息しており，他の環

30

本郷，大熊

境では見られない特異な系統群である。通常，1 種類のシロアリに数種類から 10 数種類が共生しており，1 匹培養に成功した例は稀である。
の腸に 104–105 個生息する。
シロアリ腸内に生息する古細菌はほとんどがメタン生成菌で，Methanobrevibacter 属のものが多いが，高等シ
ロ ア リ で は Methanomicrobiales 目，Methanosarcinales
目のものも見られる23)。腸内原核生物群集（106–109 個／腸）の数％を占めており，後腸液中に自由生活するもの，
腸壁に付着するもの，原生生物細胞内に共生するものが知られている。多様性は高くなく，16S rRNA 遺伝子ク
ローン解析の結果では，1 種類のシロアリから数種〜 10
数種類程度の配列しか得られない5,33)。メタン菌の炭化水素無機化への寄与は，シロアリの食性に大きく依存しており，最大で，土食性シロアリにおける 10％程度と考 え ら れ て い る29)。 今 ま で に 数 系 統 の Methanobrevibacter がシロアリ腸から単離培養されている。
一方，シロアリ腸内共生真正細菌の多様性は極めて高く，また優占種の単離培養成功例はほとんどない。これまでに，多様なシロアリ種における腸内真正細菌の網羅的な 16S rRNA 遺伝子クローン解析結果が報告されており（表 1），通常 100 クローンあたり 50 種程度の phylotype（97％の配列相同性で定義）が見出されている。一
つの DNA サンプルから最も多くの 16S クローンが解析されたのはヤマトシロアリの腸全体で，1923 クローンから 312 phylotype が得られている9,13)。これらの結果を基に，Curtis らの方法3) による一匹の腸あたりの真正細菌 phylotype 数推定を行ったところ，ヤマトシロアリで7009)，Microcerotermes spp. で 12007)，オオキノコシロ
アリ（Macrotermes）では 3000 phylotype8) も存在する
ことが明らかとなった。
これらの網羅的解析結果を含め，現在までに報告されているシロアリ腸内由来の真正細菌 16S rRNA 配列に基づいた系統樹が図 1 である。22 の多様な細菌門に分類されたが，特筆すべきは，シロアリ複数種由来の配列が，各細菌門の中で一つないし複数の単系統群を形成することである7)。その多くは既知の単離培養株配列とも他環
境からの未培養細菌配列とも大きく異なる系統で，明らかに属〜門レベルで新規な系統群であった。即ち，シロ
アリ腸内共生真正細菌の大部分はシロアリ特異的な系統であり，日和見的共生者ではない。
また重要なのは，これら多様な真正細菌は原生生物同様，宿主シロアリ種に特異的なことである。つまり，シロアリ種が同じならば，個体・コロニー・産地を問わず，その腸内微生物叢は高度に保存されている6–8)。これはシロアリと腸内微生物，及び微生物同士が極めて堅固な共生関係を結んでいることを示している。腸内共生微生物は吐き戻しと糞食によってコロニー内で共有され，有翅生殖虫が腸内に保持して次世代に伝える。
3.

シロアリ共生微生物の腸内における局在

シロアリ腸内共生微生物は，腸内にランダムに存在しているわけではなく，明らかな局在性を有していることが，顕微鏡観察や，腸の部位ごとの多様性解析，細菌の16S rRNA 配列を標的にした蛍光ハイブリダイゼーション法（fluorescent in situ hybridization; FISH）などによっ

図 1．シロアリ腸内共生真正細菌の 16S rRNA 遺伝子配列に基づく系統樹
現在（2008 年 4 月）までに DDBJ などのデータベース上に公開されているシロアリ腸由来配列を 97％の配列相同性で定義された phylotype に分類した。得られた 1650 phylotype から各 1 クローンを代表として，ARB software16) を用いて最節約法によって系統解析した。台形のサイズは，各細菌門に分類されたシロアリ腸由来配列の多様性を大まかに示す。

て，明らかとなってきた。腸内微生物の大部分は後腸肥
大部（図 2）に高密度に存在している。原生生物の多くは，
後腸液中を互いの細胞表面を這い回る形で存在するが，Preaxostyla 門の Oxymonas 属や Pyrsonympha 属は，特殊な突起様細胞構造を用いて腸壁に付着することができる。古細菌の局在は前述の通りである。真正細菌は腸液中を自由遊泳する種類の他，腸壁に固着するもの，原生生物の細胞内に共生するもの，原生生物細胞表面に付着共生するもの，などが見つかっている。
とりわけ注目されるのは，極めて多様な細菌系統群が原生生物と細胞共生していることである。スピロヘータ
が原生生物細胞表面に付着共生していることは古くから知られていたが1,14,19)，筆者らの研究では，Spirochaetes
門の他，Bacteroidetes 門と Synergistes 門の細菌が付着共生していることも明らかとなった。前者は Spirochaetes 門と同程度に普遍的に，多様な種類が様々な形
態で多くの原生生物種の細胞表面に付着共生している10,11,18)。後者は Caduceia versatilis という原生生物種のみに見られるが，宿主と接していない面にだけ鞭毛を保有し，この鞭毛によってのみ宿主原生生物が遊泳できるという，非常に特異な共生をしている10,28)（図 3）。
また，原生生物細胞内にも様々な系統の細菌が共生していることがわかってきた。筆者らの研究では，Bacteroidetes 門，Termite Group 1 門など 7 門に属する多様なシロアリ腸内共生系のゲノミクス

31

細菌系統群が細胞内共生していた17,22)（一部未発表）。このうち Termite Group 1 門は，Ohkuma & Kudo21) が 1996
年に初めて 16S rRNA 遺伝子配列を報告した未培養新門
だが，高等シロアリを含むほぼ全てのシロアリ種に共生し，腸内細菌叢の約 1 割を占めることがわかってきた。
下等シロアリにおいては，これらは多様な原生生物の種
特異的な細胞内共生体として見出されている22)。このよ
うに多様な系統，形態，組み合わせの細胞共生が観察される系は他に知られていない。
4.

図 2．シロアリと腸内共生微生物
A．ヤマトシロアリ。日本で最も普通なシロアリ。B．同
シロアリの腸。C．同シロアリ後腸内の共生微生物。1 匹の腸には約 6 万匹の原生生物と 1 千万個の細菌が共生する。矢印は原生生物 Trichonympha agilis。D．マイクロマ
ニピュレーターで分離した T. agilis 細胞。界面活性剤で細胞後半部の膜を破裂させ，細胞内共生する Termite Group
1 門細菌 Rs-D17（矢印）を漏出させたところ。T. agilis 細胞内の小球は核。参考文献12) より改変。

図 3．原生生物細胞に付着共生する細菌の例
A．米国産シロアリ Cryptotermes cavifrons 腸内に共生する原生生物 Caduceia versatilis の位相差顕微鏡像。バーは100 μm。B．16S rRNA 配列を標的とした特異的蛍光プロー
ブによって標識された未培養共生細菌 Candidatus Tammella caduceiae 。細菌細胞は 3 分の 2 だけ原生生物細胞表層に埋まり，開放されている部分から伸びる 12 本の鞭毛が，隣接する共生細菌の鞭毛とともに太い鞭毛束を形成する。これが波打つ事で宿主原生生物はかなりのスピードで遊泳できる。強い不定形のシグナルは原生生物細胞内に取り込まれた木片の自家蛍光。参考文献10) より改変。

高等シロアリ後腸内細菌叢のメタゲノム解析

これまで述べてきたとおり，シロアリ腸内に共生する微生物は，ほとんどが現時点で培養不能である。腸全体
あるいはシロアリ個体を用いた生理化学実験によって，微生物群集全体としての機能がわかっていても，その分子機構に関する知見は極めて乏しかった。米国の JGI（Joint Genome Institute）の Warnecke と，Caltech（California Institute of Technology） の Leadbetter， そ し てVerenium（旧 Diversa）社の Luginbühl らは，南米産高等シロアリの一種 Nasutitermes ephratae の後腸液中の細菌叢のメタゲノム解析とプロテオーム解析を行い，2007 年 11 月に Nature に発表した34)。彼らは当初，下等シロアリの一種のメタゲノム解析を計画していたようだ
が，巨大なゲノムサイズをもつ真核生物（原生生物）を含む微生物叢のメタゲノム解析は困難であることから，
共生原生生物を持たない高等シロアリを材料にしたと思われる。
単一の巣から採集した 165 匹のシロアリ個体の後腸肥大部（P3 領域）を，個々に微量の緩衝液中で破裂させて腸液を回収し，混合して DNA 抽出を行った。Sanger
法によるショットガンクローンの配列解析によって，合計 71 Mb が読まれた。得られた配列断片の assemble は困難で，断片を結合してできた contig の最大長は 15 kbにとどまった。これは，腸内細菌種があまりに多様で，配列断片同士が結合できなかったためである。加えて，シロアリ腸内細菌は新規な系統で占められるため，各断片の系統分類学的解析も困難を極め，わずか 9％の断片のみが，門以下に分類可能であった。つまり断片の 9 割
以上は由来不明のままである。
平行して行われた 16S rRNA 遺伝子クローン解析では，PCR 増幅で得られた 1750 クローンから，12 門 216
phylotype（99％相同性で定義；筆者の再解析では 97％
相同性で 85 種類，表 1）が得られた。近縁の八重山産
タカサゴシロアリ（Nasutitermes takasagoensis，表 1）について，筆者ら（Hongoh et al.）がその前年に発表した腸内細菌叢の 16S クローン解析及び FISH による群集
構造解析結果6) 同様に，Spirochaetes 門の Treponema 属と Fibrobacetres 門の新規綱（あるいは亜門），及び Termite Group 3（TG3）門（Warneck らは Fibrobacteres 門に含めている）が優占していた。配列のほとんどは N.
takasagoensis 由来のものと単系統群を形成した（注：筆者・本郷の解析）。
Warnecke らの最も重要な成果は，700 以上もの糖加
水分解酵素（glycosyl hydrolase，GH）活性ドメイン配列を発見したことである。これらは 45 種類の GH family

32

本郷，大熊
表 1．シロアリ全腸内細菌の 16S rRNA 遺伝子クローン配列に基づく多様性解析
Phylotype 数*1

解析クローン数

レイビシロアリ科（Kalotermitidae）
Cryptotermes cavifrons

51

112

10

ミゾガシラシロアリ科（Rhinotermitidae）
Reticulitermes speratus（越生産）
R. speratus（丹沢産）
R. speratus（対馬産）
Reticulitermes sp. RPK
Coptotermes formosanus

312
55
53
50
49

1923
96
96
96
261

9, 13
7
7
7
24

88
82

114
118

8
8

56
27
56
48
53
60
69

280
71
96
96
96
96
96

25
30
7
7
7
7
7

59
51
85

96
170
1703*27
634

シロアリの種類

シロアリ科（Termitidae）
キノコシロアリ亜科（Macrotermitinae）
Macrotermes gilvus 老齢虫
M. gilvus 若齢虫
Odontotermes formosanus
シロアリ亜科（Termitinae）
Termes comis
Microcerotermes sp. 1（Nakhon Pathom 産）
Microcerotermes sp. 1（Nakhon Pathom 産）
Microcerotermes sp. 1（Pitsanulok 産）
Microcerotermes sp. 1（Pathum Thani 産）
Microcerotermes sp. 2（Pathum Thani 産）
Microcerotermes sp. 2（Prachinburi 産）
テングシロアリ亜科（Nasutitermitinae）
Nasutitermes takasagoensis
N. ephratae*1*2

97.0％の相同性で分類
後腸の一部（P3 領域）の腸液のみに分類され，100 個以上の新規セルラーゼおよび cellobiose/cellodextrin phosphorylase などの関連酵素遺伝子配列を含んでいた。また，xylanase などのヘミセルラーゼ
遺伝子も約 100 個見出された。ほとんどの GH は配列
組成から Treponema 属細菌由来と推定され，一部は Fibrobacteres 門細菌由来と推定された。これらの遺伝子の一部は，Verenium 社によって異種発現と活性検定が試みられており，産業応用への期待が高まっている。高等シロアリ後腸における共生細菌によるセルロース分解
活性確認は，この論文以前の 2007 年 2 月に Tokuda &Watanabe が発表している32)。
Warnecke らが注目したもう一つの酵素群はヒドロゲナーゼである。バイオエタノールに次いで，水素燃料は
クリーンエネルギーとして注目されている。発見されたヒドロゲナーゼはほぼ全て iron-only hydrogenase で，
159 個 あ っ た。 多 く は 配 列 相 同 性 と 配 列 組 成 か ら
Treponema 属由来と推定され，このシロアリにおける水素主生産者はスピロヘータであることが示唆された。
この他，腸内細菌の重要な役割である窒素固定に関与する遺伝子も 100 個程度発見されたが，由来は特定できな
かった。
5.

文献

全ゲノム増幅法を用いた単一細菌種のゲノム解析

Warnecke らのメタゲノム解析によって，シロアリ腸内細菌群集全体の機能が，遺伝子レベルで網羅的に解明されたが，上記のように，ゲノム断片の 9 割は由来不明
であり，個々の細菌種の機能推定にはほとんど寄与しなかった。個々の細菌種の機能がわからなければ，種間相互作用，つまりシロアリ腸内共生系の実体は解明できない。筆者・本郷らは，個々の共生細菌種の機能解明を目
指し，典型的なメタゲノム解析とは異なるアプローチを取った。筆者らは，ファージ由来の Phi29 DNA polymerase を用いた等温全ゲノム増幅法に着目し，これを利用して少数の培養不能細菌細胞からのゲノム完全長取得を試みた。同法は Multiple Displacement Amplification（MDA）に基づく全ゲノム増幅法で4,15)，図 4 に示した
ように，DNA 二重鎖をほどきながら，ランダムプライ
マーから数 10 kb にわたり DNA 合成していく。PCR 法を応用した各種全ゲノム増幅法に比べて増幅バイアスがかかりにくく，複製エラー率も驚異的に低い。
筆 者 ら が 標 的 と し た の は， 未 培 養 細 菌 門 Termite
Group 1 の一種，phylotype Rs-D17 である。この細菌種は，
ヤマトシロアリ腸内に共生するセルロース分解性原生生物 Trichonympha agilis（図 2C，D）の細胞内にのみ特異的に生息しており，1 個の宿主細胞に 4,000 個程度含まれる22)。合計で腸内原核生物叢の約 4％に相当する優占種である。前述のように，Termite Group 1 門細菌は
シロアリ腸に普遍的かつ優占的に存在し，セルロース分
解性原生生物細胞内にのみ見られることから，腸内共生系において重要な役割を果たしている可能性が高い。
宿主の T. agilis も培養不能であり，筆者らはまず宿主

33

シロアリ腸内共生系のゲノミクス

図 4．Phi29 DNA polymerase による Multiple Displacement Amplification の概念図 DNA 二重鎖をほどきながら，ランダ
ムプライマーから数 10 kb の DNA を複製できる。最近では，同法を応用した細菌 1 細胞からのゲノム配列解析も試みられているが，キメラ生成，増幅バイアス，コンタミネー
ションなど，克服すべき問題点は多い。

細胞を 1 個だけ，腸内微生物群集からマイクロマニピュ
レーターで分離した。ゲノム増幅のための鋳型 DNA 量
は多い方が良いが，T. agilis は多様な系統が腸内で混在しているため，複数の宿主細胞を用いると，細胞内共生する標的細菌も異なる系統が混在してしまう。そうすると，得られたゲノム断片同士を assemble できない可能性が高いため，単一の宿主細胞を用いた。また，T. agilis は Rs-D17 以外の細菌も細胞内外に共生させているた
め，Rs-D17 が優占する原生生物細胞後半部の細胞膜を壊して Rs-D17 細菌を漏出させ，数百細胞を毛細管で回収した（図 2D）。回収した細菌細胞を 0.4 N KOH で融解，
タ ン パ ク 変 性，DNA 変 性 さ せ， 中 和 し た 後，Phi29
DNA polymerase を 含 む Qiagen 社 の Repli-g キ ッ ト で37°C，8 時間の等温全ゲノム増幅反応を行った。これによって鋳型 DNA を 1 千万倍以上に増幅し，50 μg の数
kb 〜数 10 kb の産物を得た。
増 幅 産 物 か ら 16S rRNA 遺 伝 子 を PCR 増 幅 し て ク
ローン解析したところ，95％が Rs-D17 の配列であり，それらのほとんどが 100％相同であった。さらに 16S23S の internal transcribed spacer（ITS）のクローン解析をしたところ，配列 variation はほとんど無く，一つの宿主細胞内の Rs-D17 細菌は，ほほ単一系統であることがわかった。ゲノム配列解析は，理化学研究所ゲノム科
学総合研究センターの豊田敦上級研究員らによって，Sanger 法と 454 pyrosequence 法を組み合わせて行われた。最終的に，Sanger 法で完全長，454 法で 98％をカバー
した，1.1 Mb の単一の環状染色体配列再構築に成功した12)。配列の変異や曖昧な部分はほとんどなく，わずか数百細胞の細菌からゲノムの完全長を再構築できることが実証された。
Rs-D17 のゲノムは 761 個のタンパク遺伝子と 1 個のrRNA 遺伝子オペロン，45 個の tRNA 遺伝子をコードしていたが，さらに 121 個もの偽遺伝子が発見された。
1.1 Mb という小さなゲノムサイズと合わせて，この細菌ゲノムが縮小進化の過程にあることは明らかである。
偽遺伝子は，細胞壁合成系，DNA 修復・複製系，防御系，

図 5．ゲノム解析で明らかとなった Termite Group 1（TG1）細菌の役割
TG1 細菌は原生生物細胞内のグルコース-6 リン酸を取り込んで C 源・エネルギー源とし，グルタミンを様々な窒素化合物に変換する。宿主原生生物は，TG1 細菌を消化することで，これらの栄養を得ていると考えられる。参考
文献12) より改変。

調節系，膜輸送系などに集中しており，通常の細菌に必須の dnaA 遺伝子までもが偽遺伝子化していた。一方，
アミノ酸や補因子合成系は潤沢に残されていた。宿主シ
ロアリは窒素分に乏しい枯死材のみを摂食するため，シロアリや共生原生生物は，自身で合成できない必須窒素化合物の合成を，共生細菌に依拠せざるを得ない。原生生物の種特異的細胞内共生体である Termite Group 1 細菌は，原生生物やシロアリに必須な窒素化合物を合成するための，いわば細胞内小器官のように進化してきたものと考えられる（図 5）。
6.

おわりに

今回，筆者らが確立したゲノム解析系により，シロア
リ腸内共生原生生物に細胞共生する多様な細菌群の，個々の機能推定が可能となった。今後得られていくであろうこれらの知見と，原生生物のメタトランスクリプ
トーム解析31) などの結果を組み合わせれば，この複雑な多重共生系をかなりの程度まで解明できるであろう。
その過程で得られる新規有用遺伝子や，解明されていく
高効率な木質分解機構は，バイオ燃料開発などの産業応用へつながっていくことが期待される。
謝辞

本稿で紹介した筆者らの研究は，理化学研究所の工藤俊章主任研究員，野田悟子博士ら，環境分子生物学研究室のメンバーと，東京大学の服部正平教授，理研・ゲノ
ム科学総合研究センターの豊田敦上級研究員，Vineet K.
Sharma 博士らとの共同研究によって得られたものである。理研および，日本学術振興会，科学技術振興機構の助成金によって遂行された。
文

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34

本郷，大熊

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