Journal of Environmental Biotechnology（環境バイオテクノロジー学会誌）
Vol. 16, No. 1, 31–38, 2016

総

説（特集）

メタン生成高温海底油田環境中の微生物共生機構解析
Studies on Microbial Symbiosis in a Methanogenic High Temperature
Subsurface Petroleum Reservoir
加藤

雄大 1,2，漆畑亘 1,3，森川正章 1*Takahiro Kato, Wataru Urushibata and Masaaki Morikawa
北海道大学大学院環境科学院生物圏科学専攻 〒 060–0810 札幌市北区北 10 条西 5 丁目
現所属 清水建設株式会社技術研究所 〒 135-8530 東京都江東区越中島 3 丁目 4 番 17 号
3
現所属 キユーピー醸造株式会社研究所 〒 182-0002 東京都調布市仙川町 2-5-7*TEL & FAX: 011–706–2253* E-mail: morikawa@ees.hokudai.ac.jp
1
Division of Biosphere Science, Graduate School of Environmental Science, Hokkaido University,
N-10, W-5, Kita-ku, Sapporo 060-0810, Japan1

2

2

Institute of Technology, SHIMIZU CORPORATION, 3-4-17, Etchujima, Koto-ku, Tokyo 135-9530, Japan3
Kewpie Jyozo Co., Ltd, 2-5-7, Sengawa-cho, Chofu, Tokyo 182-0002, Japan

キーワード：高温海底油田，メタン生成，微生物共生，ナノワイヤ，Coprothermobacter proteolyticus
Key words: High temperature subsurface petroleum reservoir, Methanogenesis, Microbial symbiosis, Nanowire,
Coprothermobacter proteolyticus
（原稿受付

1.

2016 年 9 月 5 日／原稿受理

はじめに

地表から隔絶した深部地底環境は新たな生態系発見の可能性を秘めている。2001 年から 2005 年にかけておよ
そ 600 億円をかけて建造された我が国が世界に誇る地球深部探査船「ちきゅう」による第 337 次研究航海「下北八戸沖石炭層生命圏掘削」（2012）において，国立研究開発法人海洋研究開発機構およびドイツ・米国などの国
際共同チームが青森県八戸市沖の約 80 km の地点（水深 1,180 m）から採取された海底下 2,466 m までの堆積物コアサンプルを分析した結果，海底下に埋没した約2000 万年以上前の褐炭層地層に，陸性の微生物生態系（石炭の起源である森林土壌の微生物群集）に類似する
固有の微生物群集「海底下の森」が存在することを発見した 9)。一方，商業生産している海底油田は地表微生物のコンタミネーションのリスクはあるものの，比較的ア
クセスの容易な地底環境である。これまでにいくつかの海底油田において多様な微生物が生息し，太陽光に依存しない独自の生態系を築いていることが報告されている 2,11,18,22)。暗所嫌気的な海底油田の主な微生物は硫酸還元菌，発酵菌，メタン生成菌であり，これらが海底油田の物質循環を担っていると考えられている 14,17)。
油田の多くは最終産物として原油とともにメタンが生産されるが，南カナダのオイルサンドでは水素資化
性メタン生成菌 hydrogenotrophic methanogen が優占し，アラスカの中温海底油田では酢酸資化性メタン生成菌

2016 年 9 月 12 日）

acetogenotrophic methanogen が優占していると報告されている 18)。海底油田の微生物は石油生産プロセスにも影響を及ぼす。硫酸還元菌が生産する硫化水素は人体に有毒であると共に油田パイプラインの腐食を引き起こ
し，時には酸敗など石油の品質低下を招くこともある 8)。一方では，枯渇油田から石油を回収するためのMicrobial enhanced oil recovery（MEOR）技術は油田に土着あるいは外来の発酵微生物やバイオサーファクタン
ト生産菌あるいはメタン生成菌などの複合微生物活性を利用したものである 1)。すなわち海底油田微生物の生理や微生物同士の相互作用を解析することは地表と隔絶された環境の生態系の理解に加えて，より効率的な化石燃料の生産プロセスおよび品質管理技術への貢献も期待できる。
2.

海底油田由来高度好熱性細菌 PM9-2

私たちは 2000 年にマレーシア国営のペトロナス社の協力を得て，マレー半島沖南シナ海の海上プラット
フォーム PM9 で海底油田随伴水を採取する機会を得た。
この油田では，原油と共にメタンを含む天然ガスが生成していたが後者は燃焼廃棄されていた。また，この油田
随伴水を微生物学的に調査するのはこれがはじめてであった。
この油田随伴水は Na，Mg，K，Ca が周辺海水と比べて極端に少なく，Si が海水に比べて顕著に多いことか

加藤

32

Fig. 1.

他

周辺海水（□）と PM9 海底油田随伴水（■）の元素組成比較。

Fig. 2. 16S rRNA に基づいた分子系統樹。
ボールド体は 75°C 以上で生育可能な高度好熱菌および超好熱菌，数字はブートストラップ値を表わす。Coprothermobacter 属はThermotoga 属などとともに超好熱性アーキアに近い。

ら海水由来ではなく，プラットフォーム PM9 油田は海洋 か ら 隔 絶・ 孤 立 し た 環 境 で あ る こ と が わ か る（Fig. 1）。特に Si が多いことは地殻に含まれる成分が溶
け出していると考えられる。さまざまな条件で集積培養した結果，この環境から 3 種類の高度好熱性嫌気性微生物の取得に成功し，その中で最も生育速度の大きいもの
を PM9-2 と名付けて諸特性解析を行った。PM9-2 は 16S
rRNA 遺伝子配列解析の結果，Coprothermobacter 属細菌であることが判明し，驚いたことにフランスの有機廃棄物の高温メタン発酵槽から単離された Coprothermobacter
proteolyticus DSM5265T と 99.5％の塩基同一性を有していた。PM9-2 の 16S rRNA 遺伝子配列をもとに作成した分子系統樹を Fig. 2 に示す。
Coprothermobacter 属細菌は現在 Coprothermobacter
proteolyticus と Coprothermobacter platensis の 2 種が報告されており 3,4,16)，報告されているものは PM9-2 株を除いて全て嫌気性高温あるいは中温消化槽（メタン発酵槽）から単離されたものである 5)。Coprothermobacter
属細菌は嫌気性メタン発酵槽における初期処理（タンパク分解期）で頻出し，ある消化槽内では Coprothermobacter属細菌が全細菌中の 93％を占めているという報告もある 6,7)。
16S rRNA による系統解析からは Coprothermobacter
属 は Firmicutes 門 に 分 類 さ れ Thermodesulfobium 属 と近縁であるが，あるタンパク質遺伝子や全ゲノム比較によると他の門に分類するのが適当という意見もある 15)。
実際，C. platensis 3RT はチオ硫酸還元活性を有している点やグルコースの代謝でアラニンを生産する Pyrococcus
furiosus などのアーキアに近い生物が持つ代謝経路を有している点がユニークである 3)。
今回，高温海底油田からはじめて単離された PM9-2は至適生育温度が 65°C の絶対嫌気性高度好熱菌であり，他の同属細菌と同様に代謝産物として，水素，二酸化炭素，酢酸を発酵生産する。酵母エキスやペプトンなどの高温海底油田の微生物共生
Table 1.

33

Coprothermobacter proteolyticus PM9-2 および DSM5265T とメタン生成アーキア ΔH との共培養。
共培養はメタン生成アーキア用の DSM334 培地に Coprothermobacter proteolyticus PM9-2 および DSM5265T の生育基質としてグルコースと酵母エキスをそれぞれ 10 mM，1 g/L になるように添加したものを用いた。

StrainsPM9-2 single culture
DSM5265T single culture
PM9-2 & ΔH co-culture
ΔH
PM9-2
DSM5265T & ΔH co-culture
ΔH
DSM5265T

OD600
0.187±0.008
0.145±0.011
0.229±0.019

CFU/ml1.8×108±7.4×106
1.4×108±1.1×107

acetate (mg/L)
637±129383±33450±120

H2 (mg/L)
448±29281±93.1±0.7

CO2 (g/L)
12.1±1.3
6.4±0.3
10.4±1.3

CH4 (mg/L)̶̶
394±28917±355.0±2.6

11.9±0.4437±21

6.2×107±5.2×106
3.6×108±3.1×107
0.277±0.008
7.5×107±2.0×106
4.4×108±1.2×107

Fig. 3. DAPI 染色および F420 自家蛍光による細胞の観察。
a．PM9-2 単独培養（DAPI）
b．DSM5265T 単独培養（DAPI）
c．ΔH 単独培養（DAPI&F420）
d．PM9-2 & ΔH 共培養（DAPI&F420）

タンパク質を含む培地でよく生育する従属栄養細菌であり，炭素源としてグルコースを用いた際に最も効率良く水素を生産したが生育速度の低下が観察された。電力中央研究所のグループによって高温メタン発酵槽から単離された Coprotermobacter proteolyticus CT-1 も自身が生産した水素によって生育が阻害され，水素資化性の好熱
性メタン生成アーキア Methanothermobacter thermautotrophicus ΔH と共培養することによってタンパク質分解が促進されることが報告されている 20)。そこで，PM9-2
を M. thermautotrophicus ΔH と共培養したところ PM9-2の増殖抑制が改善されるとともに水素の蓄積量は激減し旺盛なメタン生成が認められた（Table 1）。ΔH との栄
養共生によるメタン生産能力は C. proteolyticus 標準株
DSM5265T とほぼ同程度であった。

3.

PM9-2 とメタン生成アーキアによる細胞凝集体形成

つぎにこの共培養液を光学顕微鏡で観察したところ，
PM9-2 と ΔH の細胞が凝集体を形成している様子が観察された。水素は酸素や二酸化炭素などに比べて水に対する溶存濃度は非常に低く，細胞凝集体を形成することによって細胞間の距離を最小にして水素を介した栄養共生を成功させているものと思われる。
PM9-2 と ΔH を 7 日間共培養して DAPI で核酸を染色し，DAPI-BP ﬁlter と CFP ﬁlter で観察した画像を重ね合わせ疑似カラー表示したものを Fig. 3 に示す。DAPI
染色では DNA と結合して発した蛍光が青色で観察され，メタン生成菌が持っている固有の補酵素 F420 による蛍光は赤色で観察される。そのため PM9-2 の細胞は青

34

加藤

他

Fig. 4 培養 3 日目の走査型電子顕微鏡観察。
a．PM9-2 単独培養
b．DSM5265T 単独培養
c．ΔH 単独培養
d．PM9-2 & ΔH 共培養 細胞間にナノワイヤ様の繊維状構造体が見える
e．DSM5265T & ΔH 共培養
f．DSM5265T & ΔH 共培養（低倍率）ナノワイヤ様構造体とべん毛が見える

色に，ΔH は紫色に観察される。PM9-2，DSM5265T お
よび ΔH はいずれも単独培養の場合では細胞は分散して生育しているが（Fig. 3a, 3b, 3c），PM9-2 と ΔH 共培養
下では凝集体を形成していることが観察された（Fig. 3d）。DSM5265T と ΔH 共培養においても同様の凝集体が観察された。最も大きな凝集体はおよそ 30 μm×
50 μm 程度の大きさであった。
次に，単独あるいは共培養したそれぞれの細胞を走査型
電子顕微鏡で観察した（Fig. 4）。PM9-2 および DSM5265Tと ΔH の細胞はいずれも長桿状で両者を区別することは困難であった。一方，ΔH との共培養において，PM9-2
および DSM5265T いずれの場合も鞭毛よりも明らかに太く伸張したナノワイヤ様構造体の形成と細胞間連絡が観察された（Fig. 4d, 4e, 4f）。このナノワイヤ様構造体
は 3 日目で最も明瞭に観察することができ，その事徐々に観察されなくなった。

同様のメタン生成アーキアと共生細菌による細胞凝集
体とナノワイヤ様構造体形成は渡邊一哉博士（現在，東京薬科大学）らのグループによってプロピオン酸酸化細菌 Pelotomaculum thermopropionicum SI とメタン生成
菌 ΔH の共培養時にも報告されている 10)。このナノワイ
ヤ様構造体は鞭毛であることが示唆されており，さらには P. thermopropionicum（水素生産者）が生産する鞭毛タンパク質 FliD を培地に添加することによってメタン生成が促進されるという結果からメタン生成アーキアも共生すべき相手を何らかの方法で認識していると考えられている 19)。一方，Fig. 4f をよくみるとナノワイヤ様構
造体とは別に屈曲した鞭毛も多数観察されており，その太さの違いからもこの構造体は鞭毛以外のもので構成されているのではないかと考えている。近年，有機物から取り出した電子を電極に転送できる鉄呼吸（＝還元）細菌による微生物燃料電池が新たなバイオエネルギーとし高温海底油田の微生物共生て注目されているが，これらの細菌も電極との間に導電性ナノワイヤを形成していることが知られており，その構成成分は Geobacter surfurreducens 細菌では線毛（pilli）であるのに対して，Shewanella oneidensis MR-1 においてはチトクロームを豊富に含む外膜およびペリプ
ラズムが伸張したものであり，細菌は非常に多様な種類のナノワイヤを作ることができるようである 13)。また，今回の電子顕微鏡観察では確認できなかったが M.
thermautotrophicus の線毛タンパク質である Mth60 が細胞の凝集や固体への付着に関与する接着タンパク質ア
ドヘシンとして機能することも報告されていることもここに記しておきたい 20)。
残念ながら，PM9-2 起源の油田随伴水からメタン生成菌の単離はできていないが，今回，海底油田から単離された PM9-2 とメタン生成菌において陸性のメタン発酵槽と同様の共生関係が観察されたことから，このようなメタン生成を伴った共生関係は地球上のさまざまな環
境において広く分布していることが示唆された。
4.

PM9-2 が分泌生産するプロテアーゼ

C. proteolyticus はその名前の通りタンパク質分解活性を有している。そこで，C. proteolyticus DSM5265T とPM9-2 の培養上清について，SDS-PAGE による細胞外タンパク質解析およびゼラチンゲル上においてプロテアーゼ活性染色を行った（Fig. 5a, 5b）。PM9-2 培養上清は 76 kDa 付近にプロテアーゼ活性が観察され，標準
株 DSM5265T はそれよりも大きい 150〜200 kDa 付近に
プロテアーゼ活性が検出された。このことから PM9-2
は DSM5265T とは異なるプロテアーゼを細胞外に分泌していることが分かった。前者を以降，“P76 プロテアー
ゼ と呼ぶ。また，PM9-2 と DSM5265T では細胞外タ
ンパク質のパターンも異なっていた。PM9-2 が生産す

35

る主要な細胞外タンパク質 75 kDa が P76 プロテアーゼである可能性を調べるために，タンパク質バンドを切り出して PVDF 膜に転写した後エドマン分解法によってN 末端アミノ酸配列を解析した結果，これはプロテアー
ゼではなく細胞表層を覆っている S-layer protein である
ことが分かった。
P76 プロテアーゼの培地中への生産量は多くなく，精製することが困難であったため，PM9-2 のドラフトゲノム（1,392,495 bp：C. proteolyticus DSM5265T の 全 ゲ ノ ム
1,424,912 bp の 97.7％に相当）からプロテアーゼと推測される ORF を検索した結果，分泌型すなわち N 末端にシグナルペプチドを持ち，推定分子量が 70 kDa を超えるものは NODE4_cov51_5526_9044 遺伝子産物 “Peptidase S8and S53, subtilisin, kexin, sedolisin”（1,172 amino acids）
だけであり，シグナルペプチドを除いた成熟タンパク質の分子量は 121 kDa と推定された。培養上清の SDSPAGE によるタンパク質バンドの推定分子量 76 kDa との違いは，多くのプロテアーゼが N 末端領域に保有するプロ配列が切断除去されるいわゆるプロセシングによる も の で は な い か と 予 想 し て い る。 こ の NODE4_
cov51_5526_9044 遺伝子 ORF を pET vector system を用
いて大腸菌内で大量発現した結果，菌体内画分および菌体外画分いずれにおいてもプロテアーゼ活性が検出された。IPTG 添加による遺伝子発現誘導後 0〜18 時間のサ
ンプルのプロテアーゼ活性を測定するとともに SDSPAGE に よ る タ ン パ ク 質 発 現 解 析 を 行 っ た（Fig. 6）。
IPTG 添加 2 時間後から菌体内画分においてプロテアー
ゼ活性が確認できた。その後，菌体内プロテアーゼ活性は 4 時間以降 18 時間まで徐々に減少していくのに対して菌体外のプロテアーゼ活性は IPTG 添加後 18 時間まで徐々に増加した。SDS-PAGE 解析では菌体内において 250 kDa 付近のタンパク質（二量体？）と 44 kDa 付
近のタンパク質が誘導時間とともに増加していた

Fig. 5. PM9-2 と DSM5265T の菌体外タンパク質および菌体外プロテアーゼ活性の解析。
a．菌体外タンパク質の SDS-PAGE ×1：培養上清原液 ×10：10 倍濃縮液 ×100：100 倍濃縮液
b．菌体外プロテアーゼの活性染色 ×1：培養上清原液 ×10：10 倍濃縮液 ×100：100 倍濃縮液 PM9-2：PM9-2の培養上清濃縮液 DSM5265T：DSM5265T の培養上清濃縮液 L：培地濃縮液 M：タンパク分子量マーカー

36

加藤

他

Fig. 6. 大腸菌における NODE4_cov51_5526_9044（P76 プロテアーゼ）遺伝子発現誘導の経時変化 .
a．プロテアーゼ活性の経時変化 □：培養上清 10 倍濃縮液 ■：全菌体 10 倍濃縮液
b．タンパク濃度の経時変化 □：菌体外画分（培養上清） ■：菌体内画分（全菌体）
c．菌体内タンパク質（全菌体）の SDS-PAGE ▲，△：誘導されたタンパク質
d．菌体外タンパク質（培養上清）の SDS-PAGE ▲，△：誘導されたタンパク質

高温海底油田の微生物共生（Fig. 6c）。一方，培養上清（Fig. 6d）では 76 kDa 付近のタンパク質が誘導時間に従って増加していた。これ
は，NODE4_cov51_5526_9044 遺伝子産物が大腸菌においてもシグナルペプチドの切断およびプロ領域のプロセシングが起こり，P76 プロテアーゼとして分泌されていることを示唆する。27 kDa 付近にも誘導時間に伴って増加するタンパク質バンドが見られるがこれは P76
プロテアーゼの自己分解による産物の可能性があると考えている。
P76 プロテアーゼ発現株の培養上清をアセトン沈殿，熱処理，疎水性相互作用クロマトグラフィーによって酵素の精製を試みた。2 倍量の氷冷アセトンによる沈殿濃縮後も 64％の活性を有していたことから本酵素は有機溶媒に対して耐性のあるプロテアーゼといえる。ほぼ単一のタンパク質まで精製したサンプルを用いて P76 プ
ロテアーゼの特性解析を行った。その結果，反応最適温
度は 70°C であった。また，pH 7〜10 の範囲でほぼ同程度の活性を持つことがわかった。65°C 60 分間処理後も90％程度の活性を維持し，活性の半減期は 90°C 15 分付
近であった。つぎに様々な添加物を 5 mM の濃度で加えたときのプロテアーゼ活性の変化を調べた。二価金属
イオンのうち塩化カルシウムを加えた場合 32％活性が増加した。プロテアーゼ阻害剤についてはセリンプロテ
アーゼ阻害剤である PMSF によって活性が減少したが，その阻害の程度は低く約 80％の活性が残存していた。
さらに驚くべきことに非イオン界面活性剤である Triton
X-100 あるいは Tween 20 を添加した場合に活性がそれ
ぞれ 5.2 倍および 1.4 倍に上昇した。一方で陰イオン性
界面活性剤である SDS によって活性は約 40％まで減少した。興味深いことにメタン発酵槽から単離された
C. proteolyticus DSM5265T もやはりドラフトゲノムに見つかった候補遺伝子の大腸菌での異種発現によって有機溶媒や界面活性剤に耐性をもつ subtilisin-family に属する分子量 44 kDa のセリンプロテアーゼ “Proteolysin”（WP_012544358）を分泌生産していることが示唆されている 21)。しかしながら，今回 Fig. 5b において DSM5265T
培養上清に検出されたプロテアーゼ活性の分子量が44 kDa よりもはるかに大きな分子量 150 kDa< であったことは，DSM5265T のドラフトゲノムに存在するもう一 つ の 推 定 分 子 量 195 kDa の subtilisin-family protease（WP_012543598, 1,851 amino acids）が実際に生産している主要プロテアーゼである可能性が高い。P76 プロテ
アーゼと WP_012543598 プロテアーゼは分子量こそ異なるが，その一次構造を比較するとほぼ全長にわたって
66％ものアミノ酸配列同一性を有していた。すなわち，人為的な高温メタン発酵槽と地表から隔絶した海底油田
環境において，同種の祖先型 subtilisin-family protease がそれぞれの環境に応じて分散型の進化を遂げたことが示唆される 13)。今回は残念ながら，油田随伴水の菌叢解析や有機物量分析はできなかったが，高温海底油田も意外に豊かな微生物圏を育んでいる環境なのかも知れない。
5.

総

括

本研究では南シナ海の高温海底油田随伴水から絶対嫌気性高度好熱菌 Coprothermobacter proteolyticus PM9-237を単離し，その諸特性解析によって海底油田における微生物間相互作用および物質循環を示唆する情報を得ることができた。PM9-2 はナノワイヤ様構造体や細胞外多糖類を介して好熱性メタン生成菌 Methanothermobacter
thermautotrophicus ΔH と細胞凝集体を形成し，有機物代謝によって生成した水素を介した栄養共生によってメタン生成プロセスに貢献し得ることを確認した。また，
PM9-2 は海底油田随伴水中に有機溶媒や界面活性剤などに耐性を有するプロテアーゼを分泌生産していると考えられ，本酵素によってタンパク質をより利用しやすいペプチドにまで分解して自身や他の微生物群に炭素源や窒素源を供給していると考えられる。
謝辞Methanothermobacter thermautotrophicus ΔH を提供
頂くとともに，さまざまな助言を賜りました産業技術総合研究所鎌形洋一博士，加藤創一郎博士に感謝申し上げます。
また，N 末端アミノ酸配列解析および質量分析は北海道大学グローバルファシリティセンターにて行なわれたものである。
文献1) Brown, L.R. 2010. Microbial enhanced oil recovery (MEOR).
Curr. Opin. Microbiol. 13: 316–320.
2) Dahle, H., F. Garshol, M. Madsen, and N. Birkenland. 2008.
Microbial community structure analysis of produced waterfrom a high-temperature North Sea oil-ﬁeld. Antonie van
Leeuwenhoek. 93: 37–49.
3) Etchebehere, C. and L. Muxi. 2000. Thiosulfate reduction andalanine production in glucose fermentation by members of thegenus Coprothermobacter. Antonie van Leeuwenhock. 77:
321–327.
4) Etchebehere, C., M.E. Pavan, J. Zorzopulos, M. Soubes, and L.
Muxi. 1998. Coprothermobacter platensis sp. nov., a newanaerobic proteolytic bacterium isolated from an anaerobic
mesophilic sludge. Int. J. Syst. Bacteriol. 48: 1297–1304.
5) Gagliano, M.C., C.M. Braguglia, M. Petruccioli, and S.
Rossetti. 2015. Ecology and biotechnological potential of thethermophilic Coprothermobacter spp. FEMS Microbiol. Ecol.
91: ﬁv018.
6) Gagliano, M.C., C.M. Braguglia, and S. Rossetti. 2014. In situ
identification of the syntrophic protein fermentative
Coprothermobacter spp. involved in the thermophilic anaerobic digestion process. FEMS Microbiol. Lett. 358: 55–63.
7) Gianico, A., C. Braguglia, R. Cesarini, and G. Mininni. 2013.
Reduced temperature hydrolysis at 134˚C before thermophilicanaerobic digestion of waste activated sludge at increasing organic load. Bioresource Technol. 143: 96–103.
8) Gieg, L.M., R.R. Jack, and J.M. Foght. 2011. Biological souring and mitigation in oil reservoirs. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 92: 263–282.
9) Inagaki, F., K.U. Hinrichs, et al. 2015. Exploring deep microbial life in coal-bearing sediment down to ~2.5 km below theocean ﬂoor. Science 349: 420–424.
10) Ishii, S., T. Kosaka, K. Hori, Y. Hotta, and K. Watanabe.
2005. Coaggregation facilitates interspecies hydrogen transferb e t we e n Pelo toma c u l u m t h er m op rop i on i c u m a n dMethanothermobacter thermautotrophicus. Appl. Environ.
Microbiol. 71: 7838–7845.
11) Li, D., D.J. Midgley, J.P. Ross, Y. Oytam, G.C.J. Abell, H.

38

加藤

Volk, W.A.W. Duad, and P. Hendry. 2012. Microbial biodiversity in a Malaysian oil ﬁeld and a systematic comparison withoil reservoirs worldwide. Arch. Microbiol. 194: 513–523.
12) Liszka, M., M. Clark, E. Schneider, and D. Clark. 2012.
Nature versus nurture: developing enzymes that function under
extreme conditions. Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng. 3: 77–
102.
13) Lovley, D.R. and N.S. Malvankar. 2015. Seeing is believing:novel imaging techniques help clarify microbial nanowire
structure and function. Environ. Microbiol. 17: 2209–2215.
14) Magot, M., B. Ollivier, and B.K.C. Patel. 2000. Microbiologyof petroleum reservoirs. Antonie van Leeuwenhoek. 77: 103–
116.
15) Nishida, H., T. Beppu, and K. Ueda. 2011. Whole-genome
comparison clariﬁes close phylogenetic relationships between
the phyla Dictyoglomi and Thermotogae. Genomics. 98: 370–
375.
16) Ollivier, B.M., R.A. Mar, T.J. Ferguson, D.R. Boone, J.L.
Garcia, and R. Robinson. 1985. Emendation of the Genus
Thermobacteroides: Thermobacteroides proteolyticus sp.
nov., a Proteolytic Acetogen from a Methanogenic
Enrichment. Int. J. Syst. Bacteriol. 35: 425–428.
17) Orphan, V.J., L.T. Taylor, D. Hafenbradl, and E.F. Delong.
2000. Culture-dependent and culture-independent characteriza-

他
tion of microbial assemblages associated with high-temperature
petroleum reservoirs. Appl. Environ. Microbiol. 66: 700–711.
18) Pham, V.D., L.L. Hnatow, S. Zhang, R.D. Fallon, S.C.
Jackson, J. Tomb, E.F. Delong, and S.J. Keeler. 2009.
Characterizing microbial diversity in production water fromand Alaskan mesothermic petroleum reservoir with two independent molecular methods. Environ. Microbiol. 11: 176–187.
19) Shimoyama, T., S. Kato, S. Ishii, and K. Watanabe. 2009.
Flagellum Mediates Symbiosis. Science. 323: 1574.
20) Thoma, C., M. Frank, R. Rachel, S. Schmid, D. Nather, G.
Wanner, and R. Wirth. 2008. The Mth60 fimbriae of
Methanothermobacter thermoautotrophicus are functional
adhesins. Environ. Microbiol. 10: 2785–2795.
21) Toplak, A., B. Wu, F. Fusettl, P. Quaedﬂleg, and D. Janssen.
2013. Proteolysin, a novel highly thermostable and cosolventcompatible protease from the thermophilic bacterium
Coprothermobacter proteolyticus. Appl. Environ. Microbiol.
79: 5625–5632.
22) van der Kraan, G.M., J. Bruining, B.P. Lomans, M.C. van
Loosdrecht, and G. Muyzer. 2010. Microbial diversity of anoil-water processing site and its associated oil ﬁeld: the possible role of microorganisms as information carriers from oilassociated environments. FEMS Microbial. Ecol. 71: 428–443.