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Technical Review

パーキンエルマー社ARVOTMMXを用いた
MultiReporter Assay System -Tripluc®- の解析例
東洋紡績（株）敦賀バイオ研究所

浅井 友実

はじめに
MultiReporter Assay System -Tripluc®-は、3色のルシフ
ェラーゼをレポーターとして用いる、遺伝子発現解析システムです。これら3種のルシフェラーゼ（SLG（緑）、SLO（橙）、SLR（赤））が、いずれもD-luciferinを基質とすることから、1ステップのアッセイで3つのレポーター活性の評価が可能な画期的なシステムです。

図2．パーキンエルマー社ARVOTMMX
510±30nmフィルター、595±30nmフィルター、660±50nmフィルターの3枚の光学フィルターを装着。

これらのルシフェラーゼの活性測定は、細胞を溶解剤で溶解し、発光基質と混ぜて測定するin vitro計測（破壊系計測）や、培養液にD-luciferinを溶解し、細胞内に浸透するD-luciferinによっィルター、②595±30 nmフィルター、③660±50 nmフィて、細胞を生かしたまま計測する in vivo 計測（非破壊系計測）ルターを装着しました。
測定は、あらかじめ各ルシフェラーゼの発光について、全光によって行うことが可能です。
弊社では今まで、「MultiReporter Assay System -Tripluc®-（フィルター無挿入）に対する各フィルター透過光の割合を決定

Detection Reagents」（細胞溶解剤、基質溶液を含む）を用いしました（Tij：i=1,2,3（フィルター①、②、③）、j=g,o,r（ルるin vitro計測実験の測定にシングルチューブタイプのルミノメ

シフェラーゼSLG、SLO、SLR））。つづいて、各サンプルプレーター「カラフルックアナライザー 」をお奨めしてきました。

ートについて、3枚のフィルター（F1、F2、F3）を用いて測定を行

しかし、最近の検討により、市販のマルチウェル型のルミノメー

い、測定値からMicrosoft® Excelを用いて下式を計算し、各ルターを用いることが可能であることが分かりました。

シフェラーゼの発光量（G、O、R）を算出しました（特許出願中）。

TM

本稿では、「MultiReporter Assay System -Tripluc ®-（ ）（GDetection Reagents」とパーキンエルマー社ARVOTMMXを用O

いたMultiReporter Assay System -Tripluc®-のプレートリー＝R

ダーによる解析例をご紹介いたします。

T1g T1o T1r
T2g T2o T2r
T3g T3o T3r-1）（ ）F1F2F31. 定量性の検討

方

白色不透明タイプの96ウェルプレートのcolumn A〜Hのそ法

れぞれに、各ルシフェラーゼを発現した細胞ライセートを表1

プレートリーダーを用いた in vitro計測のフローを図1に示しの要領で混合し、試料を調製しました。続いて、インジェクタます。ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドを導入し、種々のーを用いて、各ウェルに「Detection Reagents」Assay

アッセイが行われた細胞のプレートから培地を除去後、溶解剤Reagentを125μlずつ加え、3枚のフィルターの透過光を測

Lysis Solutionを加え、細胞を溶解します。続いて、基質溶液定し、各ルシフェラーゼの活性を算出しました。

Assay Reagentを加え、プレートリーダーで測定します。

表1. 試料の調製

今回、プレートリーダーとして、インジェクター付のパーキン

Row No.

エルマー社ARVOTMMX（図2）を用い、Assay Reagentの分注は同機に装備されたインジェクターを使用しました。また、3枚の光学フィルターとして、ARVOTMMXには、①510±30 nmフ

1,23,45,67,89,1011,12SLG lysate（μl）

111111

SLO lysate（μl）

2419.2

14.4

9.6

4.80

SLR lysate（μl）

04.89.6

14.419.2

242. 解析例（AP1及びNFκBレスポンスエレメントの活性化の検討）
評価用コンストラクトとして、pSLO-test、pSLR-testの各ルシフェラーゼの上流にSV40プロモーターのコア領域を挿入し、そのさらに上流にAP1レスポンスエレメント（pSLOtestのみ）、及びNFκBレスポンスエレメント（pSLR-testのみ）を挿入したプラスミド（pSLO-AP1、pSLR-NFκB）を調製しました。
アッセイは、白色不透明タイプの96ウェルプレートにHeLa S3細胞を4×104cells/wellずつ播種し、翌日、1ウェ
ルあたりpSLG-HSVtk SLG 0.03μg、pSLO-AP1 0.13μg、pSLR-NFκB 0.04μgを混合し、トランスフェクショ

図1．in vitro 計測（プレートリーダー測定）

ン試薬LipofectamineTM2000（インビトロジェン社）を用い

7

No.83.qx 06.5.29 19:22 ページ 8て無血清培地下でトランスフェクションを実施しました。24

2. 解析例（図4、5）

時間後に、0〜10ng/ml TNFα、0〜100nM PMAを含む培SLO、SLRルシフェラーゼ遺伝子にAP1レスポンスエレメ地に置換し、4時間インキュベートしました（図4）。

ント、NFκBレスポンスエレメントを連結し、TNFα、PMA

イ ン キ ュ ベ ー ト 終 了 後 、 培 地 を 除 去 し 、「 D e t e c t i o nに対する応答性を検証しました。

Reagents」Lysis Solutionを25μl/well加え、軽く振とう測定値よりSLG、SLO、SLRの相対光量を算出しました。

しながら20分間室温でインキュベートしました。続いて、イ

次に、内部標準としてトランスフェクションしたHSVtkプロンジェクターを用いて、各ウェルに「Detection Reagents」

モーター下のSLGに対する相対活性としてSLO及びSLR値をAssay Reagentを125μlずつ加え、3枚のフィルターの透図5にプロットしました。この結果、それぞれTNFαやPMA過光を測定し、各ルシフェラーゼの活性を算出しました。

に対し、濃度依存的なルシフェラーゼの発現活性を確認することができました。

結果及び考察1. 定量性の検討（図3）
3枚のフィルターの測定値より算出されたSLG、SLO、SLRの相対光量を図3にプロットしています。各ウェルに一定量を添加しているSLGについてはほぼ一定の値を、20%ずつ添加量を変えたSLOやSLRについてはその増減に応じた値が
図4． 解析例で用いたアッセイ条件●のウェルにpSLG-HSVtk control、pSLO-AP1、pSLR-NFκBを同量トランスフェクションし、上記条件でインキュベートしました。

得られ、測定・算出の方法が適正であることが分かりました。
また、それらの値がプレート全体96サンプルにわたって安定していることから、96ウェルプレートを用いるハイスルー
プットアッセイが可能であることが示唆されました。
6.0

A

4.0E+04B

3.0E+04

CDE
FG14.0A
B

8.0E+04C

6.0E+04D

4.0E+04

E

10.0
8.0
6.04.0F2.0G0.0

12.0E+04

12.012345678

発光強度（CPS）

1.0E+04

91011 12SLRH

0.

0.0E+00

図5．AP1及びNFκBレスポンスエレメント活性化実験測定結果

A

8.0E+03B

6.0E+03C

4.0E+03
2.0E+03

D

本稿では、「MultiReporter Assay System -Tripluc®-」をプE

レートリーダーを用いて測定が可能であることをご紹介いたしまFした。

G0.0E+00

12345678910

11 120SLO

1.0E+050.0H-

発光強度（CPS）

1.2E+05

11 12101010918-710615041031.0022.00.

1

relative activity

0.0E+00

3.001

1.0E+04

4.00.

2.0E+04

5.000

SLG

relative activity

発光強度（CPS）

5.0E+04

H

詳細なパラメーターや実験条件にご関心のある方は是非弊社テ

図3．96ウェルプレートを用いた発光強度測定結果
A〜H及び1〜12は96ウェルプレートの行と列を示しています。

クニカルラインまでお問い合わせください。

装保存温度

Code No.

価

プロモーター挿入用ベクター

品 名 及 び 内 容
pSLO-test

20μg

包-20℃

MRV-102¥80,000

プロモーター挿入用ベクター

pSLR-test

20μg

-20℃

MRV-103¥80,000

HSVtkコントロールベクター

pSLG-HSVtk control

20μg

-20℃

MRV-301¥80,000

100回用
500回用
10,000回用-80℃

MRA-101
MRA-102
MRA-103¥30,000¥99,000¥1,350,000

MultiReporter Assay System -Tripluc®- in vitro アッセイ用試薬

Detection Reagents（Lysis Solution, Assay Reagent）

格※特許の関係上、ご購入の際には購入申込書への記入が必要です。企業の方のご購入に関しては、ライセンス契約が必要です。詳しくは弊社までお問い合わせください。
※ベクターに関しては別途セット販売をしております。詳しくは、弊社までお問い合わせください。

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