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高効率・高成功率PCR酵素

難配列・Long PCR・クルードサンプルにお薦め

KOD FX Neo

伸長性・クルードサンプルからの増幅性能が格段にアップしました。
KOD DNA polymerase＊は、優れた伸長性を有し、クルード成分の阻害にKOD FX Neo強いといった特長を持っております。KOD FXは、この特性を利用して開発された高成功率PCR酵素であり、難配列やクルードサンプルからの増幅などにご好評いただいております。
しかし、KOD FXをはじめ従来のPCR酵素は20〜30サイクル以降、増幅0が持続しなくなる〈プラトー現象〉が生じ、PCR機能が完全には発揮できてい1020ませんでした。
「KOD FX Neo」は、KOD FXの技術に、弊社で新たに開発し3040た「伸長エンハンサー」などの技術を応用することで、〈プラトー現象〉を抑え、長いターゲットや難配列ターゲット、クルードサンプルなどからの増幅効率をさ

図1．伸長エンハンサーの効果らに向上させることに成功しました。
＊M. Takagi et al., Appl. Environ. Microbiol., 63：4504-4510（1997）

特長1 優れたPCR性能
・ゲノムDNAを鋳型として最大40kbの増幅が可能。
・30sec./kbの高速サイクルを実現。
（クルードサンプルでは1min./kbをお薦めしております）
・高GCターゲットなどの難配列の増幅に最適。
※正確性はTaq DNA Polymeraseの約11倍

KO D - P l u s KO D - Pl us - Neo
KOD F X
KOD FX Neo
A Long PCR
Taq DNA Po lyme ra s e
020406080

100120140160

Mutation frequency（100,000塩基あたりのエラー数）
図2．各酵素におけるPCRエラー率の比較

実施例1 増幅長の比較
KOD FX Neo及び従来品を用いて、ヒトゲノムDNAを鋳型に長鎖ターゲットの増幅を行いました。
その結果、KOD FX Neoを用いた場合のみ、今まで増幅が困難であった40kbの増幅を確認することができました。また、
KOD FX Neoでは従来品に比べ、伸長時間を半分（30sec./kb）で行うことが可能です＊。そのため、反応時間を大幅に短縮することができました。

＊クルードサンプルでは1min/kbで実施することをお薦めしております。

KOD FX Neo
M

123

A社
Long PCR酵素

KOD FX
M

123M

12【サイクル条件】

3KOD FX Neo

KOD FX

94℃, 2min.

94℃, 2min.

98℃, 10sec.
74℃, 30sec./kb
98℃, 10sec.
72℃, 30sec./kb
98℃, 10sec.
70℃, 30sec./kb〈伸長時間〉

30sec./ kb
M：λ/Hin d Ⅲ Marker
1： tPA 24kb
2： HBg 32kb
3： HBg 40kb

60sec./ kb≦30sec./ kb

98℃, 10sec.
68℃, 30sec./kb

Template：ヒトゲノムDNA 200ng/50μl

35 cycles
5 cycles5 cycles20 cycles

98℃, 10sec.
74℃, 60sec./kb
98℃, 10sec.
72℃, 60sec./kb
98℃, 10sec.
70℃, 60sec./kb
98℃, 10sec.
68℃, 60sec./kb

68℃, 7min.

68℃, 7min.

4℃, Hold

4℃, Hold

5 cycles5 cycles5 cycles20 cyclesNo.97_'11.qx 11.6.7 18:32 ページ 4

実施例2 検出感度の比較
ヒトゲノムDNAを鋳型として検出感度の比較を行いました。

KOD FX Neo

KOD FX【サイクル条件】

M

1KOD FX Neo

12M2

その結果、KOD FX Neoは、従94℃, 2min.

来品に比べ約一桁感度の向上を98℃, 10sec.

8.5kb認めました。

68℃, 4.5min.

40 cycles

4℃, Hold

M： 1kb DNAラダー
1： 0.1ng
2： 0.01ng

KOD FX
94℃, 2min.

Template：ヒトゲノムDNA
Target：Human β-globin 8.5kb

30sec./ kb〈伸長時間〉

98℃, 10sec.
68℃, 9min.

60sec./ kb

40 cycles

4℃, Hold

特長2 クルードサンプルからの増幅性能アップ
・グラム陽性菌や酵母・カビなどの微生物、髪の毛・爪などの動物組織、哺乳類培養細胞や血液などからの直接PCRが可能です。
・従来品よりもPCR阻害物質に強く、土壌や食品などのよりクルードなサンプルからの増幅が可能です。
・植物ライセートやマウステールなどからの増幅効率が向上。

実施例3 マウステールの直接PCR
マウステールを直接PCR反応液に添加し、様々なPCR酵素で増幅を比較しました。その結果、KOD FX Neoを用いた場合のみ増幅を確認することができました。
このように、KOD FX Neoではサンプル
Mを直接PCRに持ち込むことが可能であり、煩KOD FX
Neo

A社クルードサンプル B社クルードサンプル
対応PCR酵素
対応PCR酵素

1M

23123

M

123M

雑な精製を省略することが可能です。

【サイクル条件】
94℃, 2min.

マウステール1mm

98℃, 10sec.
直接68℃, 1min./kb

電気泳動解析

4℃,

PCR

30 cycles

Hold

KOD FX Neo＊マウステールなど動物組織を直接増幅した場合、PCR産がアガロースゲル電気泳動のウェルに残ることがあります。
泳動する際は、PCR産物50μlに対し、20mg/ml Proteinase K10μlを添加してから泳動することをお薦めします。

M： 200 bp DNAラダー
1： Mouse TATA box binding protein (TBP) 0.5 kb
2： Mouse transferrin receptor (Tfr) 1.5 kb
3： Mouse membrane glycoprotein (Thy-1) 2.6 kb

実施例4 フミン酸添加実験
フミン酸（humic acid）とは、腐植土や土壌などに存在する赤褐色または黒褐色の有機物であり、PCRを阻害することが知られています。
通常行われるDNAの精製ではこのフミン酸は除くことはできません。そのため、環境・生態系サンプルを鋳型としたPCRはとても難しいとされています。ここでは、例としてヒトゲノムDNAにフミン酸を混合し、PCRの阻害に関する評価を行いました。その結果、KOD FX Neoが最もフミン酸の阻害に強い傾向を示しました。KOD FX Neoを用いれば環境・生態系のサンプルからでもPCRが可能であると考えられます。

KOD FX Neo KOD FX
M

123M

123（関連記事がp5にございます）

A社クルードサンプル B社クルードサンプル
対応PCR酵素
対応PCR酵素M

123M

123

【サイクル条件】
M： 1kb DNAラダー
1：フミン酸添加量＊ 0μl
2：フミン酸添加量＊ 2μl
3：フミン酸添加量＊ 4μl

94℃, 2min.
98℃, 10sec.

Template：10ngヒトゲノムDNA
Target：Human β-globin 3.6kb

68℃, 4min.
4℃,

30 cycles

Hold＊フミン酸：OD280＝1の溶液を使用

品名および内容高効率・高成功率PCR酵素

包装

保存温度
＊KOD FX Neo
KOD FX Neo（1.0U/μl）
2×PCR Buffer for KOD FX Neo
2mM dNTP

Code No.

価格-20℃KFX-201￥35,000＊（200U×1本）
×5［1,000回用］-20℃

KFX-201X5￥140,000＊（200U×1本）
×10［2,000回用］-20℃

KFX-201X10￥260,000

200U×1本［200回用］＊50μl反応を行ったときの反応回数で表示しています。
品名

高効率TAクローニングキット（KOD用）

TArget Clone™ -Plus-

装保存温度

Code No.

10回用-20℃

TAK-201

包価格￥16,000

KOD FX Neoによって増幅されたDNAの末端は平滑化されていますので、末端を制限酵素処理するか、平滑末端クローニングの手法を用いてクローニングを行う必要があります。また専用のTAクローニングキット「TArget CloneTM -Plus-（Code No. TAK-201）」を用いることで増幅産物に直接Aを付加し、そのまま容易にTAクローニングを行うことができます。

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