温度センサーを必要としない新規細胞温度計の開発と応用
Development of a novel sensor-free cell thermometer and its applications（分子科学会推薦）

代表研究者 関西学院大学

重藤 真介

Kwansei Gakuin University

Shinsuke SHIGETO

Temperature is one of the most fundamental physical parameters that affect cellular activities and functions. A
variety of life phenomena including metabolism, immune responses, and tumor formation are closely associated withintracellular temperature. To elucidate the mechanism that enables individual cells to sense and respond to temperature,
accurate measurement of intracellular temperature is required. Different types of “cellular thermometers” have recently
been developed, but virtually all of them use an exogeneous fluorescent temperature sensor and can determine
intracellular temperature only in an indirect manner. In the present study, we develop a novel cellular thermometer that
does not need any temperature sensor to be introduced into the cell. Our method utilizes anti-Stokes/Stokes intensity
ratios in ultralow-frequency Raman spectra to directly evaluate absolute temperature of intracellular molecules with asubmicron spatial resolution. We construct a confocal Raman microspectrometer that is capable of measuring Raman
spectra at as low as ±10 cm−1. For accurate temperature evaluation, intensity calibration of the microspectrometer is ofcritical importance. We propose a practical method for intensity ratio calibration using the Raman spectrum of liquidwater whose temperature can be obtained with a thermocouple. With this method, we can achieve an accuracy oftemperature determination comparable to a thermocouple. A preliminary temperature measurement on a living fission
yeast cell shows that accurate removal of autofluorescence from the cell is just as important as the intensity calibration.

研究目的

温度との相関関係に基づいて温度を求めているため、温度は酸素濃度や pH とともに細胞機能および活絶対温度を直接決定できないという原理的な制約が性に大きな影響を与える重要な環境因子の一つであある。本研究は、温度センサーを導入する必要なしる。温度は、細胞増殖、微生物による発酵、免疫機に生細胞内の分子温度を計測することが可能な新規能の活性化、細胞のがん化など、様々な生命現象と細胞内温度計測技術「ラマン細胞温度計」の開発と深く関わっているが、個々の細胞が環境の温度を感その応用を目的とする。

知し応答するメカニズムの分子レベルでの解明はまプローブを用いることなく細胞内の豊富な分子情だほとんど進んでいない。細胞の温度感知・応答機報（分子の同定、分子構造、微視的環境などに関す構を研究するためには、細胞内の温度を空間分解しる知見）を得ることができる顕微ラマン分光法は、て精密計測する技術が不可欠である。近年、温度に蛍光法に代わる生命科学研究の新たなツールとして依存して蛍光強度あるいは蛍光寿命が変化する種々注目されている。我々は顕微ラマン分光法を用いて、の蛍光ナノ温度プローブが開発され、細胞内温度計

単一生細胞の体細胞分裂過程の化学イメージング測に用いられている[1–4]。しかしこの手法では、蛍[5,6]やバイオフィルムの非破壊解析[7]などの先駆的光色素の退色やプローブ導入により細胞の生理状態な研究を展開し、１細胞解析技術としてのラマン分が変化してしまう可能性がある。また、細胞抽出液光法の有用性を実証してきた。本研究ではこの顕微や緩衝液中で蛍光プローブが示す蛍光強度/寿命とラマン分光法を低振動数ラマン分光法と組み合わせることにより[8]、サブミクロンの空間分解能で温度情報と分子情報を同時に取得できる革新的細胞解析法の創出を目指している。
研究経過
ラマン散乱のアンチストークス対ストークス強度
比 r = I(−ν)/I(ν)はボルツマン因子 exp(−hν/kT)と式(1)で関係づけられる：
r = [(ν0 + ν)/(ν0 − ν)]3 exp(−hν/kT)(1)

ここで、h はプランク定数、ν0 は励起レーザー光の振動数、ν はラマン散乱光の振動数、k はボルツマン定数、T は絶対温度である。したがって、この強度比からラマン散乱を与える分子の絶対温度 T を決定することができる。しかし、ボルツマン因子は振動数すなわちラマンシフトが大きくなるにつれて指数関数的に小さくなり、結果としてアンチストークス散乱光の検出が極めて困難になる。アンチストーク
ス対ストークス強度比から精度良く温度を決めるた
めには、レイリー散乱に近い低振動数ラマンスペク
トルの観測が必須となる。本研究では、非常に狭い
バ ン ド 幅 を 持 つ 体 積 ブ ラ ッ グ 回 折 格 子 （ volumeBragg grating, VBG）型ノッチフィルターと呼ばれる特殊な光学フィルターを用いることにより、±10cm−1 付近まで測定可能な共焦点顕微ラマン分光装置を構築した（Fig. 1）。冷却加熱装置（10021, LinkamScientific）を顕微鏡ステージ上に搭載することにより、試料の温度を−20〜120 ºC の範囲で変化させることができる。この装置のレイリー散乱除去能を評価するため、L-シスチンのラマンスペクトルを測定しFig. 2. (a) Observed low-frequency Raman spectrum

た。~10 cm−1 のラマンバンドを、ストークス・アン

of liquid water at 24.0 ºC. (b) Calibration of the

チストークス両方の領域で明瞭に観測することがで

intensity ratio r. Thin line, experimental curve; dashedきた。

thin line, theoretical curve obtained with Eq. (1); thick

実測の低振動数ラマンスペクトルからアンチストline, the ratio between the experimental and theoreticalークス対ストークス強度比を正確に求めるためには、

curves. (c) Fitted result (thick gray line) of thecalibrated experimental intensity ratio (thin line).
分光装置の感度校正を厳密に行い、分光器中の回折格子の回折効率や検出器の応答に起因する感度の波長依存性を解消する必要がある。本研究ではまず、相対放射強度が既知の標準光源（Intellical, PrincetonInstruments）を用いる校正方法を検討した。この方Fig. 1. Schematic diagram of the constructed confocal
Raman microscope, which is capable of measuring
Raman spectra at as low as ±10 cm−1.

法では、ラマン散乱光が発せられる点と同じ位置で標準光源を点灯させる必要があるが、Fig. 1 のような顕微鏡システムではそれが容易ではなく、正しい感度校正が困難であることがわかった。一方、ラマン

ストークス対ストークス強度比から種々の水の温度スペクトルそのものを使う感度校正法では、上記のを求めた結果の比較を Fig. 3 に示す。我々の方法で

問 題 点 を 回 避 す る こ と が で き る 。 Okajima と求めた水の温度の誤差は 0.3〜1.7 K で、使用した熱Hamaguchi は N2 ガスの純回転ラマンスペクトルを強電対の精度（1.5 K）を考慮すると、非常に正確な温度標準として用いることにより、顕微ラマン分光装度計測を達成できたと結論することができる。他の置の感度校正を行い、アンチストークス対ストーク

2 つの方法では~10 K 以上の大きな系統誤差が生じス強度比から精度良く水の温度を決定している[9]。ており、とくに標準光源による校正は確度が低かっ

しかし、この方法では N2 の純回転ラマンスペクトルた。さらに、水溶液（例えばグリセロール水溶液なの測定に非常に長い時間（>10 h）を要するだけでなど）に対しても、同様の精度および確度で温度測定く、細胞内局所の計測には必須となる高倍対物レンを行えることを確認した。

ズでの測定が難しいという難点がある。

構築した超低振動数顕微ラマン分光装置を用いて、そこで我々は、より簡便で、かつ細胞計測への実生きた分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）細胞内装が容易な校正法として、細胞の主要構成成分であの 空 間 分 解 ラ マ ン ス ペ クト ル の 測 定 を 行 っ た 。

る水の低振動数ラマンスペクトルを用いて、各ラマ

Figure 4 からわかるように、細胞のラマンスペクト

ンシフト|ν|におけるアンチストークス対ストークス

ルは主に細胞内物質の自家蛍光に起因するバックグ強度比 r の補正を行う方法を考案した。熱電対（Kラウンドを示した。このバックグラウンドを正しくタイプ）で温度を正確に測定した水（室温に近い 24.0除去し、純粋なストークスおよびアンチストークスºC とした）の低振動数ラマンスペクトル（Fig. 2a）

ラマン強度を求めなければ、強度比の校正を行ったから計算した r の実測値 rexpt で式(1)から予想されるとしても妥当な温度が得られないことが明らかとな

r の理論値 rtheory を割ることにより、低振動数領域のった。

各ラマンシフトにおける「強度比補正係数」を求めることができる（Fig. 2b）。得られた補正係数はそのまま他の温度の水の強度比補正に適用可能で、補正後の強度比から、式(1)に従って絶対温度 T をフィッティングにより決定することができる（Fig. 2c）。3通りの方法（すなわち、標準光源、本研究で考案した強度比校正法、感度校正なし）を用いて、アンチ

Fig. 4. Representative Raman spectra at three different
locations within a living single S. pombe cell. The
inset displays the optical micrograph of an S. pombecell. These spectra exhibit different backgroundpatterns

arising

mainlyfrom

intracellularautofluorescent molecules.

Fig. 3. Water temperature calculated using the考察

anti-Stokes/Stokes intensity ratio vs. temperature

本研究で考案した水の低振動数ラマンスペクトル

measured with a thermocouple. Circles, our approach

を用いるアンチストークス対ストークス強度比の校

using the water Raman spectrum; squares, without any

正法は、確度の点で標準光源を用いる校正法より優calibration; triangles, with a standard light source.

れていた。また、N2 の純回転ラマンスペクトルに基づいた方法と比較すると、本手法は 20 分程度で行え9.

ることから、測定時間の点で遥かに有利であると言H. Okajima, H. Hamaguchi, J. Raman Spectrosc. 46,1140 (2015).

える。波長ごとの感度校正は不可能であるが、アンチストークス対ストークス強度比から温度を求める研究の発表という目的を達成するうえでは十分である。

口頭発表

分裂酵母生細胞を用いた予備的実験から、自家蛍

1.

Shinsuke Shigeto, “Utilizing Ultralow-Frequency

光によるバックグラウンドが細胞内温度計測の成否

Raman Spectra To Reveal Biomolecular Structureに大きな影響を及ぼすことがわかった。Figure 4 にand Intracellular Environment”, 26th International示す分裂酵母細胞のラマンスペクトルは自家蛍光のConference on Raman Spectroscopy (ICORS 2018),少ない最小培地中で測定したものであるが、NADH

Jeju, Korea (August 2018).

やフラビンといった細胞内に存在する生体分子からの自家蛍光を抑えることは原理的に困難である。バ

ポスター発表ックグラウンドの多項式フィットのような後処理、

1.

島端要典，安田充，重藤真介，「超低振動数顕微

もしくはわずかに異なる 2 つの励起波長を用いた測ラマン分光法を用いた細胞内分子温度計測の試定を行うなどの工夫が必要であり、現在これらの方み」，第 11 回分子科学討論会，仙台（2017 年 9法の検討を進めている。

月）
2.

Yosuke Shimabata, Mitsuru Yasuda, Shinsuke

参考文献

Shigeto, “Development of an Ultralow-Frequency

1.

J.-M. Yang, H. Yang, L. Lin, ACS Nano, 5, 5067

Raman Microscope for Measurement of Intracellular(2011).

Temperature”, 日本化学会第 98 春季年会，船橋

K. Okabe, N. Inada, C. Gota, Y. Harada, T. Funatsu,（2018 年 3 月）

2.

S. Uchiyama, Nat. Commun. 3, 705 (2012).
3.

4.

5.

7.
8.

吉川友貴，島端要典，安田充，重藤真介，「超低K. Oyama, M. Takabayashi, Y. Takei, S. Arai, S.

振動数顕微ラマン分光法を用いたバイオフィル

Takeoka, S. Ishiwata, M. Suzuki, Lab Chip, 12, 1591

ム内の温度および分子クラウディングの評価」，(2012).

第 12 回分子科学討論会，福岡（2018 年 9 月）

G. Kucsko, P. C. Maurer, N. Y. Yao, M. Kubo, H. J.

4.

吉川友貴，重藤真介，「超低振動数ラマンイメー

Noh, P. K. Lo, H. Park, M. D. Lukin, Nature, 500, 54

ジングによる生細胞内の分子クラウディングの(2013).

評価と可視化」，2019 年度日本分光学会年次講演

C.-K. Huang, M. Ando, H. Hamaguchi, S. Shigeto,会，宇治（2019 年 5 月）．

Anal. Chem. 84, 5661 (2012).
6.

3.

5.

Yuki Yoshikawa, Mitsuru Yasuda, Shinsuke Shigeto,J.-F. Hsu, P.-Y. Hsieh, H.-Y. Hsu, S. Shigeto, Sci.

“Evaluation of molecular temperature and molecularRep. 5, 17541 (2015).

crowding

Y.-T. Zheng, M. Toyofuku, N. Nomura, S. Shigeto,microspectroscopy and its applications to living

Anal. Chem. 85, 7295 (2013).

cells”, 10th International Conference on Advanced

C.-F. Chang, H. Okajima, H. Hamaguchi, S. Shigeto,

Vibrational Spectroscopy (ICAVS 10), Auckland,

Chem. Commun. 50, 12973 (2014).

New Zealand (July 2019). 発表予定

using

ultralow-frequency

Raman