Journal of Environmental Biotechnology（環境バイオテクノロジー学会誌）
Vol. 10, No. 2, 105–108, 2010

総

説（一般）

嫌気性細菌群によるトリクロロエチレン脱塩素反応中におけるメタン生成細菌の影響
Eﬀect of Methanogenic Activity on Trichloroethene Dechlorination
by Anaerobic Microbial Consortium
伊勢孝太郎*，須藤

孝一，井上

千弘

KOTARO ISE, KOICHI SUTO and CHIHIRO INOUE
東北大学大学院環境科学研究科環境科学専攻 〒 980–8579 仙台市青葉区荒巻字青葉 6–6–20* TEL: 022–795–7404 FAX: 022–795–7404* E-mail: ise@er.kankyo.tohoku.ac.jp
Graduate School of Environmental Studies, Tohoku University, Aoba 6-6-20 Aramaki Aoba-ku 980-8579, Japan
キーワード：トリクロロエチレン，バイオレメディエーション，メタン生成
Key words: trichloroethene, bioremediation, methanogenesis（原稿受付 2010 年 10 月 15 日／原稿受理 2010 年 12 月 6 日）

1.

はじめに

テトラクロロエチレン（PCE）やトリクロロエチレン（TCE）などの塩素化エチレン類による土壌・地下水汚染のバイオレメディエーションの研究，実施が盛んに行われているが，多くのサイトにおいて cis-DCE や VCなどの有害な物質が蓄積してしまうなどの問題がある。
これは PCE から cis-DCE まで脱塩素することが出来る
細菌は多数存在し，比較的容易に増殖させることが出来
るが，cis-DCE からエチレンへと脱塩素することが出来る唯一の細菌である Dehalococcoides sp. はその生理学的特性に不明な部分が多く活性化させることが困難なためであると考えられる。
Dehalococcoides sp. の特徴としては，ゲノム解析 1) や単離株の培養などの研究 2) から，電子供与体として水素のみを利用することや炭素源として酢酸を要求すること，補酵素としてビタミン B12 を要求することなどがわかっている。
水素は嫌気性微生物にとっては重要な物質であり，多くの嫌気性細菌が電子供与体として利用するため，これらの細菌による競合が起こる。特に水素を電子供与体として利用する絶対嫌気性細菌のメタン生成細菌や硫酸還元細菌は生息域が共通であることから直接の競合相手となる。実験室レベルで試験を行う場合には硫酸イオンを除去することが出来ることから，もっぱらメタン生成細菌と脱塩素細菌の競合についての研究がなされてきた。
メタン生成に特異的に作用する阻害剤である 2-Bromoethanesulfonate（BES）をもちいた実験においては，脱塩素反応は阻害されるとの結果 3,4) や阻害は無いが脱塩素経路が変化する 5) などが報告されているのに対して，メタン生成条件において活発な脱塩素の報告がされている 6)。このことから，メタン生成細菌と脱塩素細菌との関係が単純な水素の競合ではないことがわかる。
本 研 究 で は 脱 塩 素 細 菌 の う ち 特 に Dehalococcoides
sp. とメタン生成細菌との関係を研究するため，主にDehalococcoides sp. のみが脱塩素可能とされている cisDCE からの脱塩素実験を行った。嫌気環境に普遍的に存在するメタン生成細菌とクロロエチレン類の無害化に欠かすことの出来ない Dehalococcoides sp. との関係を明確にすることはバイオレメディエーションの最適な設計に非常に重要なことであると考えられる。
2.

脱塩素細菌に関する既往の研究

塩素化エチレンの嫌気的脱塩素反応では，cis-DCE，塩化ビニル（VC），エチレンへと脱塩素化される。この脱ハロゲン化反応の中間代謝産物のうち VC は TCE より毒性が強く発ガン性物質であるため，TCE の完全脱塩素化が求められている。嫌気的脱塩素化は，ハロゲン呼吸による脱塩素化と連動してエネルギーを獲得する 7)ので，共代謝のように増殖のための余分なエネルギーを獲得するための炭素源がいらないため効率がよく，実用化が期待されている。
嫌気的塩素化エチレンの脱塩素細菌は大きく二つのグ
ル ー プ に 分 け ら れ る。1 つ は 還 元 的 に TCE か ら cisDCE へ脱塩素するグループで，分類学的には Firmicutes
門の Desulfitobacterium sp., Dehalobacter sp. などがある。これら Desulfitobacterium 属で単離されているものには Desulfitobacterium sp.Y51 株 8) や，Desulfitobacterium
sp. PCE-S 株 9) など，また Dehalobacter 属では Dehalobacter restrictus10) などがある。これらの細菌は比較的速く TCE や PCE を cis-DCE へと脱塩素するものの，そ

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伊勢

の先の反応は全く起こらず cis-DCE が蓄積されてしまう。
も う 1 方 は cis-DCE か ら さ ら に 塩 化 ビ ニ ル（VC），
エチレンへの脱塩素化が可能なもので，これらは分類学的 に Chloroflexi 門，Dehalococcoidetes 科 の Dehalococcoides 属細菌である。これら Dehalococcoides 属細菌はTCE のバイオレメディエーションの本命として多くの研究がなされているが，電子供与体としては水素のみを使用するなど条件が非常に限られていることから実験室での培養が難しい。これまで Dehalococcoides ethenogenes 195 株と Dehalococcoides sp. FL2 株 11)，Dehalococcoides sp. BAV1 株 12)，Dehalococcoides sp. CBDB1
株 13)，Dehalococcoides sp. GT 株 14)，Dehalococcoides
sp. MB 株 15) の 6 例のみが報告されるにとどまっている。
これらの細菌について表 1 にまとめる。これらの単離株は論文として報告されてはいるものの，ATCC や DSMZなどの生物資源センターに正式に寄託された株は一つも無く，限られた研究グループにより独占されていることも研究を難しくしている。
また Desulfitobacterium hafniense TCE1 や Dehalospirillum multivorans などの発酵などによっても増殖可能な脱塩素細菌の倍加時間が 2 〜 3 時間なのに対して，D.
ethenogenes 195 や D. restrictus などの脱塩素のみで増殖している細菌の倍加時間が 19 時間となっており増殖速度に大きな違いがあることがわかる 10)。
3.

脱塩素コンソーシアムの生態学的研究

TCE をエチレンまで無害化することが出来る微生物
コンソーシアムとして KB-116) や ANAS17) などが主に研究されている。これらに対する 16S rRNA を対象としたクローンライブラリー解析の結果，これらの微生物コン
ソーシアムの共通する特徴としては，Dehalococcoides
sp. の 存 在 が 確 認 さ れ て い る こ と。Bacteroides sp. や
Clostridium sp. などの発酵性の細菌が大部分を占めて
い る こ と。Desulfitobacterium sp. や Dehalobacter sp.，
Geobacter sp. などの PCE から cis-DCE までの脱塩素反応を行うことが出来る脱塩素細菌が存在していることがあげられる。また，Acetobacterium sp. などのホモ酢酸生成細菌なども検出される。TCE 脱塩素コンソーシア
ムにおける Dehalococcoides sp. などの脱塩素細菌の割合は多いものでは半数近く 16)，少ないものでは 1％以
下 17) となっており，脱塩素速度もバラツキが大きい。
塩素化エチレンのバイオレメディエーションにおいて，添加される有機物はまず，発酵性の細菌により水素

他

や酢酸，CO2 などへと分解される。ここで生成された水素が脱塩素細菌やその他の水素資化性細菌により利用される。しかしながら，実際には D. ethenogenes 195 は嫌
気消化槽の汚泥上澄み液などの未知の微量栄養素を要求することから 18)，単純な水素の供給だけでは，反応を進行させることは難しい。このため，その他の細菌からの相互作用の影響が大きいと考えられるが，これらの細 菌 は 脱 塩 素 反 応 の み を 行 う Dehalococcoides sp. やDehalobacter sp. などを除くと嫌気環境中において普遍的に存在している細菌であり，これらの細菌が水素の受給以外にどのような関係を持っているのか不明な点が多い。
メタン生成細菌との関係についての研究もいくつか行
われている。これらの研究では水素資化性メタン生成細菌の活動により水素に対する競合を引き起こすために脱塩素細菌の活動が阻害されるとの報告が大半である。図1 に バ イ オ レ メ デ ィ エ ー シ ョ ン 時 の Dehalococcoides
sp. とメタン生成細菌の関係のイメージを示す。メタン
生成を特異的に阻害するとされている BES を用いた実験では，脱塩素反応を阻害する効果などが報告されている 3,5)。
4.

実験に用いた TCE 脱塩素コンソーシアム

ここでは，我々が実際の TCE 汚染サイトから採取した地下水を用いて作成した TCE 脱塩素コンソーシアム

図 1．バイオレメディエーション時の脱塩素細菌とその他の細菌との水素の競合のイメージ。

表 1．単離された Dehalococcoides 属細菌の代謝可能なクロロエチレン類
Dehalococcoides
sp.strain
195
FL2
BAV1
CBDB1
GT
MB
a

Metabbolic electron accepters

Chloroethenes
cometabolizedGroupaReference

PCE,TCE,cis-DCE,1,1-DCE
TCE,cis-DCE,trans-DCE
cis-DCE,trans-DCE,1,1-DCE,VC

VC
PCE,VC
PCE,TCENot determinedNone
Not determined

Cornell
PinellasPinellasPinellasPinellasCornell

[2]
[11]
[12]
[20]
[14]
[15]

PCE,TCETCE,cis-DCE,1,1-DCE,VC
TCE → trans-DCE

Hendrickson らによる 16S rRNA 遺伝子の配列による分類 19)

嫌気性細菌群によるトリクロロエチレン脱塩素反応中におけるメタン生成細菌の影響を用いた研究を紹介する。この汚染サイトでは，実際に微生物による TCE 分解実験が試みられていた。TCE での継代培養では，無機塩類に酵母抽出物と酢酸ナトリウ
ムを添加した培地を用いて TCE を 0.076（mmol/L）となるように添加した。添加した TCE が全てエチレンへと脱塩素された後に同様な手順により継代培養を行った。添加した TCE は約 2 週間で cis-DCE，VC を経由してエチレンへと無害化された。脱塩素中は活発なメタン生成が見られた。
TCE を無害化することが出来たことから，Dehalococcoides sp. などの脱塩素細菌が存在するのではないかと 考 え，Dehalococcoides sp.，Desulfitobacterium sp.，
Dehalobacter sp. について特異的なプライマーを用いてPCR を行ったところ，Dehalococcoides sp. と Desulfitobacterium sp. の存在が確認された。さらにこの微生物
コンソーシアムに対して，16S rRNA を対象としたクローンライブラリー解析を行ったところ，130 クローンの内のほとんどが Trichococcus sp. や Bacteroides sp. などの発酵性の細菌で構成されていることが確認された。
ま た Desulfitobacterium sp. も 検 出 さ れ た が，Dehalococcoides sp. のクローンは検出されなかった。Real-time
PCR を用いた定量分析の結果からは 1 〜 10％の割合で存在しているものと考えられる。
5.

cis-DCE の脱塩素挙動

Dehalococcoides sp. とメタン生成細菌との関係を調べるため，cis-DCE を添加して，脱塩素挙動を調べた。
cis-DCE の脱塩素実験において，発酵により生成した水素は速やかに消費されて，そのほとんどがメタン生成に利用された。またメタン生成が起こった後に VC の生成がゆっくりと始まっている。このことから，メタン生成
により多量の水素が消費されたことによって cis-DCEの脱塩素速度を著しく遅くさせていることが示唆された。そこで，メタン生成活性を抑えるために，メタン生成に特異的な阻害剤である BES を添加して，脱塩素反応への影響を調べた。
BES を 2.0 mM 添加して脱塩素実験を行ったところ培養後 1000 時間を超えた時点においてもメタン生成は完全に抑制された。しかしながら，VC の生成は見られず
cis-DCE の脱塩素反応も完全に阻害されてしまった。一
方，BES の添加量を 0.2 mM に減らして同様の実験を行ったところ，初期のメタン生成は抑制されたが，200
時間以降，メタン生成が進行した後に VC の生成が見られ，cis-DCE の脱塩素反応が確認された。これらのことから，Dehalococcoides sp. による cis-DCE の脱塩素反応が起こる前にはメタン生成反応が起こる必要があることが示唆された。
6.

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必須の栄養とされているビタミン B12 によるものかを評価するため，ビタミン B12 についても脱塩素反応への影響を調べた。図 2 は cis-DCE の脱塩素実験を行った際の培養後 123 日後のエチレン生成量を示している。（A）
は 通 常 の 培 養 条 件 で，（B） は 通 常 の 培 養 条 件 に M.
mazei の懸濁液を添加したもの，（C）は通常の培養条件（D）は M. mazei の懸にビタミン B12 を添加したもの，
濁液とビタミン B12 を添加したものである。M. mazei の懸濁液を添加した場合には明らかに脱塩素活性が上昇
し，エチレンの生成量が増加している。またビタミン
B12 を添加した場合には通常の培養条件における結果と比較して，大きな違いは見られなかった。このことから，
M. mazei の菌体の存在が Dehalococcoides sp. による脱塩素反応に影響を示していることがわかった。また，ビ
タミン B12 を添加した場合においても，脱塩素速度には影響が見られなかったことから，M. mazei の脱塩素反応への影響がビタミン B12 の供給のみではないことが示
唆された。
7.

おわりに

これまでメタン生成細菌と Dehalococcoides sp. との関係では，メタン生成細菌による水素の消費の問題から，メタン生成細菌の活動を抑えることで脱塩素反応を促進させる試みがされてきた。ところが本研究ではメタン生成反応が起こった後に脱塩素反応が進んでおり，メタン
生成細菌と Dehalococcoides sp. との間に水素の競合以外の関係があることが示唆された。この効果に関しては，
まだ検討の余地があるがメタン生成細菌の大半を占める
Methanosarcina sp. の存在が大きく影響しているものと考えられる。Methanosarcina sp. はビタミン B12 を比較的高濃度に蓄積するものとして知られていることから，
Dehalococcoides sp. へのビタミン B12 の供給源となっているとも考えられる。しかしながら，Methanosarcina
sp. の懸濁液を用いた実験の結果からはビタミン B12 のみの影響ではないことが示唆された。既存の単離株である Dehalococcoides ethenogenes 195 株では合成培地に嫌気消化槽の汚泥上澄み液を添加することにより飛躍的に

Methanosarcina mazei（DSM No. 2053）の菌体懸濁液を用いた実験

メタン生成細菌の活動が脱塩素反応に影響を与えていることが示唆されたことから，脱塩素コンソーシアム中のメタン生成細菌の優占種である M. mazei の菌体懸濁液を用いて，また，この効果が Dehalococcoides sp. に

図 2．培養後 123 日後のエチレン生成量。
（A）通常の培養条件（B）Methanosarcina 懸濁液を添加した 系（C） ビ タ ミ ン B12（0.5 mg/L） を 添 加 し た 系（D）
Methanosarcina 懸濁液とビタミン B12 を共に添加したもの

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伊勢

図 3．想定される Dehalococcoides sp. と Methanosarcina sp. との関係。

増殖速度が向上することが確認されていることから 2)，
Methanosarcina sp. から Dehalococcoides sp. に必須の栄養成分が供給されていると考えられる。これらのことか
ら図 3 のような Dehalococcoides sp. と Methanosarcina
sp. との関係が考えられる。しかしながら，どのような物質が供給されているかは，さらに研究を進めるなかで特定していく必要がある。
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