上原記念生命科学財団研究報告集, 33 (2019)

上原記念生命科学財団研究報告集, 33（2019）139. 腸管上皮細胞における糖鎖修飾機構の解析奥村 龍
大阪大学 大学院医学系研究科 免疫制御学
Key words：腸内細菌叢，腸管上皮細胞，糖鎖修飾，粘膜バリア緒 言
内なる外といわれる腸管には他の臓器と異なり、食物由来の外来異物や病原性細菌を含む多数の腸内微生物が存在する。そのため、共生する腸内微生物から腸管組織守り、またそれらに対する過剰な免疫応答を回避するために、腸管上皮細胞によって構築される多種多様な生体防御機構（粘膜バリア）が存在する。腸管上皮によって形成される粘膜バリアは化学的バリアと物理的バリアの二つに大別される。化学的バリアには、ディフェンシンファミリー分子などの抗菌分子が含まれる。一方で物理的バリアには、上皮細胞を覆う粘液層、上皮細胞表面の糖衣、細胞間接着装置である密着結合と接着結合が含まれる。特に夥しい数の腸内細菌が存在する大腸においては、物理的バリアの一つである分厚い粘液層が大腸上皮を覆い、腸内細菌と大腸上皮を分け隔てている。粘液層や糖衣などの物理的バリアの機能に不可欠とされるのが、ムチン分子などの腸管上皮細胞に発現する糖タンパク質に付着する大量の糖鎖である。我々はこれまで大腸粘膜バリアに関連する新規分子として、Ly6／Plaur domain containing 8（Lypd8）という GPI アンカー型タンパク質を同定し、この分子が腸内細菌の中で特に大腸菌などの有べん毛細菌の腸管上皮への侵入を抑制し、腸管炎症を防止していることを明らかにした［1］。さらにこの分子は、高度に N 型糖鎖修飾される糖タンパク質であり、この分子機能に糖鎖が重要であることを明らかにしているが、どういった糖鎖構造が重要であるかについてはこれまで明らかになっていない。
糖タンパク質の糖鎖構造を決定する最重要因子が糖鎖をタンパク質に付加する糖転移酵素である。糖転移酵素の発現は、細胞各々によって異なり、同じアミノ酸配列でも発現する細胞によって糖タンパク質の糖鎖構造は異なるとされている。近年後藤、清野らはマウス小腸上部では腸管上皮細胞の膜タンパク質のフコース付加（フコシル化）が見られないのに対し、小腸下部では糖転移酵素の一つである Fucosyltransferase 2（Fut2）の発現とともに、腸管上皮膜タンパク質のフコシル化が見られることを報告している［2］。さらに同報告では、小腸上皮における Fut2 の発現が、ある種の腸内細菌依存的であり、腸内細菌によって誘導される膜タンパク質のフコシル化が生体防御に重要であることを明らかにしている。このように、腸内細菌が腸管上皮の糖鎖発現に影響を与え、その結果として粘膜バリア機能に影響を与えることが少しずつ明らかとなっているが、その詳細なメカニズムは依然として不明である。以上のことを明らかにする足掛かりとして、本研究では腸内細菌によって腸管上皮細胞で誘導される糖転移酵素の発現を解析した。

方 法
日本クレア株式会社より購入した C57BL/6N 系統の SPF マウスと無菌（GF）マウスの雄、雌各 1 匹ずつより小腸、大腸を剖出。小腸は中央で切離し、口側を小腸上部、肛門側を小腸下部とした。それぞれの小腸上部、小腸下部、大腸の内容物をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄した後、37℃の EDTA（5mM）を含むハンクス緩衝塩溶液（HBSS）中で振盪させ、遊離した上皮細胞を含む上清を回収した。上清中に含まれる上皮細胞を遠心分離にて沈降させた後、PBSで再度細胞を洗浄し、再び細胞を沈降させ、得られた腸管上皮細胞を TRI reagent®（Sigma-aldrich）で溶解し、totalRNA を抽出した。Illumina hiseq 2500、Illumina Casava1.8.2 software を用いて、抽出した RNA のシークエンシン
グを行い、得られたシークエンスをソフトウェア TopHat、Bowtie2、SAMtools で解析し、各遺伝子の発現量を The
fragments per kilobase of exon per million mapped fragments（FPKMs）として数値化した。
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結 果
1．SPF マウスと無菌マウスの糖転移酵素遺伝子の発現量比較
全遺伝子の中で発現量が FPKM0.1 以上の遺伝子を解析対象とし、その中で計 134 の糖転移酵素遺伝子について発現量を解析した。
まず大腸上皮における糖転移酵素の発現を調べたところ、SPF マウスと GF マウスで 2 倍以上の発現変化を認める糖転移酵素遺伝子は認められず、大腸においては腸内細菌により発現が誘導される糖転移酵素は同定できなかった。
一方で小腸においては、SPF／GF で雄、雌の平均が 2 倍以上の発現上昇を認める糖転移酵素が存在し、特に小腸下部においては、これまで腸内細菌によって発現誘導されることが報告されている Fut2 （SPF／GF fold change：20.22）、B3gnt5（SPF／GF fold以外にも、B3galt5（SPF／GF fold change：34.35)、B3gnt7（SPF／GF fold change：3.84）change：3.04）など、小腸下部にて腸内細菌によって 2 倍以上発現が亢進する糖転移酵素遺伝子が計 10 個同定された。
2．SPF マウスにおける大腸と小腸下部の糖転移酵素遺伝子の発現量比較
大腸と小腸における糖転移酵素遺伝子の発現を比較すると、上述した小腸下部で腸内細菌による誘導される糖転移酵素遺伝子の多くが、小腸に比べ大腸上皮において発現が高く（Fut2：6.25 倍、B3galt5：14.20 倍、B3gnt7：10.17 倍（大腸／小腸下部））、特に St6galnac6 は大腸で著しく発現が高いことが明らかとなった。
表．小腸下部において腸内細菌によって誘導される糖転移酵素遺伝子

小腸下部におけるSPFマウスとGFマウスの発現比が2倍以上であった糖転移酵素遺伝子とその発現比（SPF vs GF、大腸 vs 小腸下部）ならびにFPKM値（小腸下部、大腸）を示す。

考 察
SPF マウスと GF マウスの小腸および大腸の上皮細胞の遺伝子発現を RNA-seq により網羅的に解析することで、特に小腸において腸内細菌によって発現が誘導される糖転移酵素が新たに同定された。一方で、計画時に予測していた大腸における腸内細菌による糖転移酵素の発現誘導は認められなかった。しかしながら、粘膜バリア機能に重要とされる

Fut2 も大腸で発現が高いものの、大腸では腸内細菌によって発現が誘導されておらず、今回新たに同定した糖転移酵素もまた Fut2 と同様に、小腸では腸内細菌で発現が誘導され、大腸ではさらに高い発現が認められることから粘膜バ（IL）
リアに重要である可能性があると考える。
特に B3galt5 は腸管上皮の抗菌分子の発現を誘導するインターロイキン-22 により発現が誘導されることが報告されており［3］、粘膜バリア機能に関係していることが考えらえる。今回新たに腸内細菌によって発現誘導されることが明らかとなった糖転移酵素のほとんどは、in vitro において酵素活性は同定されているものの、生体内での機能は不明である。今後は CRISPR/Cas9 システムを用いてそれぞれの糖転移酵素の欠損マウスを作製し、その表現型を解析することで、特に腸管におけるそれらの機能を明らかにしていく予定である。
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共同研究者・謝辞
本研究の共同研究者は、大阪大学微生物病研究所遺伝情報実験センターの奥崎大介氏である。

文 献
1） Okumura R. et al. Lypd8 promotes the segregation of flagellated microbiota and colonic epithelia. Nature. 2016
Apr 7;532(7597):117-21. doi：10.1038/nature17406. Epub 2016 Mar 30.
2） Goto Y. et al. Innate lymphoid cells regulate intestinal epithelial cell glycosylation. Science. 2014 Sep
12;345(6202):1254009. doi：10.1126/science.1254009. Epub 2014 Aug 21.
3） Muñoz M. et al. Interleukin-22 induces interleukin-18 expression from epithelial cells during intestinal
infection. Immunity. 2015 Feb 17;42(2):321-331. doi：10.1016/j.immuni.2015.01.011. Epub 2015 Feb 10.

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