非コード RNA による転写因子結合制御機構の解明
Mechanism of non-coding RNA transcription coupled chromatin remodeling（分子生物学会推薦）

代表研究者 首都大学東京

廣田耕志

Tokyo Metropolitan UniversityKouji HIROTA

協同研究者 首都大学東京

浅田隆大Tokyo Metropolitan University

Ryuta ASADA

首都大学東京千松賢史

Tokyo Metropolitan University

Satoshi SENMATSULong noncoding RNAs (lncRNAs) transcribed across gene promoters have been detected. These regulatetranscription by mechanisms that have not been fully elucidated. We showed that the chromatin configuration isaltered into an accessible state within 290 bp downstream from the initiation site of metabolic-stress-induced
lncRNAs (mlonRNAs) in the promoter of the fission yeast fbp1 gene, whose transcription is massively induced
upon glucose starvation. Chromatin upstream from fbp1 is progressively altered into an open configuration, as acascade of transcription of three overlapping mlonRNA species (-a, -b and -c in order) occurs with transcriptional
initiation sites progressing 5’ to 3’ upstream of the fbp1 promoter. Initiation of the shortest mlonRNA(mlonRNA-c) induces chromatin remodeling around a transcription factor-binding site and subsequent massive
induction of fbp1. We identify the cis-element (mlon-Box) required for mlonRNA-c initiation, and by changing thedistance between mlonRNA-initiation site and the transcription factor-binding site, we showed thatmlonRNA-initiation effectively induces chromatin remodeling in a limited distance within 290 bp. Moreover, weshowed that this element can induce mlonRNA transcription coupled chromatin remodeling in ade6 locus andthereby activates meiotic recombination. These results indicate that mlonRNAs transcription plays roles as ashort-range inducer for local chromatin alterations and suggest that this mechanism plays pivotal roles in theregulation of general genome functions in fission yeast.
研究目的
タンパク質をコードしない転写物（非コード RNA）た。申請者は分裂酵母 fbp1 遺伝子の転写活性化時に働くプロモーター領域上流で発現する長鎖非コードは、ヒトゲノムの広範な領域において転写されていRNA(mlonRNA)を発見し、クロマチン再編成を活性る。非コード RNA の中で遺伝子プロモーター領域化することを通じ、遺伝子本体の制御に不可欠な働において発現する転写物は、プロモーター非コードきをもつことを示した(Hirota et al. 2008)。その後、RNA と呼ばれており、遺伝子制御において機能するこのような非コード RNA は様々な生き物でも発見ことが知られている。このような RNA 転写は酵母されている。これまでに、申請者は mlonRNA 転写からヒトにいたる広範な真核細胞に見られ、その重に沿って転写領域のクロマチン構造が変化する際に、要性が注目されている。これまでのプロモーター非ヒストンアセチル化が誘導されることや、クロマチコード RNA による遺伝子制御の研究では、RNA 分ン再編成因子 Snf22 と Hrp3 が相補的に mlonRNA 転子そのものが足場となってクロマチン制御タンパク写と共役したクロマチン再編成に関わっていること、質の動員を制御する機構が中心的に解析されてきた。

クロマチン再編成因子 Snf22 と Hrp3 とヒストンアセ

一方、非コード領域の RNA ポリメラーゼ通過によ

チル化は相互に依存関係にあることを明らかにしてるクロマチン制御の分子機構は未解明のままであっいる(Adachi et al. 2018)。一方、mlonRNA 転写と共役したクロマチン再編成機構が、生命の普遍的システ

ら、 クロマチン再編成は mlonRNA 転写開始部位かムなのかどうかなど、不明の点が多く残っている。

ら 290 bp の範囲で効果的に引き起こされることが示本研究では、mlonRNA 転写によるクロマチン再編成唆された(Senmatsu et al. 2019)。の分子機構解明とゲノム制御における普遍性の検証のため、転写開始制御と減数分裂期組換え開始制御

3: mlonRNA 転 写 の 転 写 開 始 シ ス エ レ メ ン トについて調べた。

mlon-Box の特定
1 の研究で特定した配列「ATCTTATGTA」のコン研究経過センサスエレメントを同定するために、この 10 bp

1: mlonRNA 転写の転写開始領域の特定を系統的に他の塩基に置換した 30 種の変異細胞を

mlonRNA 転写は、転写領域のクロマチン再編成を作製し、mlonRNA-c の転写誘導について調査した。

誘導することや転写開始領域に明確な TATA box が置換の結果、mlonRNA-c の転写量が不良となった配見当たらないことなど、通常の mRNA 転写と異なる列を排除することで、mlonRNA 転写に必須のコンセことが知られている。このような転写がどのようなンサス配列を決定し、「A/T, A/C, T, T/G, A, T/C/G, G,

転写開始制御を受けているのか解明するにはその転T, A/G」の 9 bp からなる配列であることが判明した。

写開始エレメントを特定する必要性がある。この特定のために３種の mlonRNA のうちの最も短い転写

4: mlon-Box の他の遺伝子座での転写誘導能力の調物であり、転写活性化因子結合部位のクロマチン再査編成に必須の役割を持つ mlonRNA-c の転写開始を3 の研究で mlonRNA 転写の誘導に必要なコンセン含む上流領域 150 bp を 10 bp ごとに配列置換した変サス配列「A/T, A/C, T, T/G, A, T/C/G, G, T, A/G」が特異細胞を作製した。これらの変異細胞から、定できた。この配列の mlonRNA 誘導における普遍mlonRNA-c が完全に不良となる細胞を見つけること性を調べるために、他の遺伝子座に移植する実験をができた。置換された配列は、「ATCTTATGTA」の行った。ade6 遺伝子座において、ナンセンス変異と10 bp であり、この配列が mlonRNA 転写の開始に必して知られている ade6-M26 変異部位下流 200 bp に須であることがわかった。

移植した。ade6-M26 変異は、点変異の結果 Atf1 と呼ばれる転写活性化因子の結合部位が生成し、この2: mlonRNA 転写によるクロマチン再編成の効果領転写因子に依存してストレスや減数分裂期にこの部域の特定位からの新しい転写が引き起こされることが知られ

1 の研究で特定した配列「ATCTTATGTA」を欠損ている(Hirota et al. 2008)。また、この Atf1 に依存しすると、mlonRNA-c の転写が完全に誘導不良となったストレス応答性の転写によってこの領域のヒストた。一方、上流から転写される mlonRNA-a および bンアセチル化やクロマチン再編成が誘導され、減数の転写は正常であった。しかし、この変異細胞では分裂期の組換えが 50 倍ほど上昇することも知られ転写因子結合領域のクロマチン再編成が不良であり、ている(Yamada et al. 2004)。このような状況は fbp1転写因子の結合量が低下し、その結果 fbp1-mRNA の遺伝子に存在する mlonRNA 転写部位の上流に存在誘導が不良となっていた。この事実は、mlonRNA 転する UAS1 転写因子結合領域での Atf1 の働きと酷似写によって誘導できるクロマチン再編成の領域には、するため、この領域への移植を試みた。その結果、転写開始部位から誘導できる範囲があることを示唆

ade6-M26 でも移植した mlon-Box からの新たな転写している。そこで、この効果範囲を特定するために誘導がストレスや減数分裂時に見られることが判明

mlonRNA-b から転写因子結合領域の距離を、190,し、この配列が他の遺伝子座においても機能し得る240, 290, 340, 390, 500 bp と段階的に変化させて、どことがわかった。なお、この誘導には M26 変異が必の程度離れるとクロマチン再編成や転写誘導に影響須であり、Atf1 との共同的作用で転写誘導がなされが出るのか調査した。その結果、190-290 bp 離したることが示唆された。

変異細胞ではクロマチン再編成が正常に誘導されるが、340 bp 以上離すと離した距離に応じてクロマチン再編成が不良化することがわかった。この結果か

5: mlonRNA 転写に必要の転写因子
4 の研究で、mlon-Box は fbp1 遺伝子座以外でも機能し得ることや、Atf1 との共同で転写誘導する実態（Figure 1, 2）。このゲノム情報学的解析により特定が明らかとなった。他の転写因子との連携についてした、天然の mlonBox を有する減数分裂期組換え領も検討するため、移植した mlon-Box 上流の M26 変域の、SPBC24C6.09C では、mlon-Box に依存して減異を変化させて他の転写因子結合部位に変化させる

数分裂期に転写が誘導されていることや、mlon-Box実験を行った。その結果、Atf1 以外の Rst2 や Php5を変異により不活性化すると、減数分裂期 DNA２重などの転写因子が結合する配列でも同様に鎖切断が導入されなくなることが判明した(Figure 3)。

mlon-Box からの転写がストレス依存的に起こるここれらの事実から、mlonRNA 転写によるクロマチンとがわかった。

再編成機構は、分裂酵母ゲノムの転写や組換えといった、ゲノム機能の調節に重要な働きを持つことが6: mlonRNA 転写に共役したクロマチン再編成の減示唆された。

数分裂期組換え誘導での機能
mlonRNA 転写によるクロマチン再編成制御を介して、fbp1 遺伝子座では転写制御がなされていることが知られている(Hirota et al. 2008)。それでは、転写制御以外のゲノム機能の調節にも関与するのだろうか？4, 5 の研究で mlon-Box は ade6 遺伝子座でも機能し、Atf1 などの転写因子との共同で転写誘導する実態が明らかとなった。ade6-M26 は減数分裂期の組換え部位となることが知られている。そこで、
mlon-Box の移植による組換えへの影響について調査した。その結果、mlon-Box 挿入細胞では変異して機能しない mlon-Box を挿入した細胞（対照細胞）と比べ、有意に高い組換え価を示すことが明らかとなった。減数分裂の誘導において、初期に組換え領域

Figure1 The histogram showing relationship between mlon-Box andを決定する重要なイベントは、染色体 DNA への２TSS (Transcription start site). Distance from TSS was indicated in

重鎖切断の誘導である。この誘導は Spo11（分裂酵X-axis (bp), while number of mlon-Box was indicated in Y-axis.

母では Rec12）と呼ばれる蛋白質による DNA の切断反応によるものである。mlon-Box の挿入部位近傍に対照細胞に比べ有意に高いレベルの DNA２重鎖切断がされているとともに、高いレベルの Spo11 の結合 が 見 ら れ る こ と が わ かっ た 。 こ の 事 実 か ら 、mlonRNA 転写に共役したクロマチン再編成は転写のみならず、減数分裂期組み換えの制御にも関わり得ることが示唆され、広範なゲノム機能の調節に重要な働きを持つ可能性が浮上した。
7: 天然の mlon-Box の転写や減数分裂期組換えの制御での機能の可能性のゲノム情報学的解析
6 の研究で、mlonRNA 転写に共役したクロマチン再編成は広範なゲノム機能の調節に重要な働きを持つことが示唆された。そこで、分裂酵母ゲノムに天然に存在する mlon-Box を調査した。その結果、

Figure2 The dot-plot showing relationship between mlon-Box andmlon-Box は転写開始部位や減数分裂期組換え部位

Rec-12-flagment (meiotic recombination site). Distance from mlon-Boxと、有意にオーバーラップしていることが判明した

was indicated in X-axis (bp), while number of rec12-flagment wasindicated in Y-axis.

で、高等生物にまで本研究成果を展開できることが期待できる。
引用文献（参考文献）
1.

Yamada T, Mizuno K, Hirota K, Kon N, Wahls WP,Hartsuiker E, Murofushi H, Shibata T, Ohta K
Roles of histone acetylation and chromatin
remodeling factor in a meiotic recombination
hotspot. EMBO J 23: 1792-803 (2004)

2.

Hirota K, Mizuno K, Shibata T, Ohta K Distinct
chromatin modulators regulate the formation ofaccessible and repressive chromatin at the fission
yeast recombination hotspot ade6-M26. Mol Biol
Cell 19: 1162-73 (2008)

3.

Hirota K, Miyoshi T, Kugou K, Hoffman CS,Shibata T, Ohta K Stepwise chromatin remodelling

Figure3 DNA double strand breaks are induced meiotically aroundby a cascade of transcription initiation ofmlon-Box.

non-coding RNAs. Nature 456: 130-4 (2008)
考察

4.

本研究では、申請者が独自に分裂酵母 fbp1 遺伝子

Adachi A, Senmatsu S, Asada R, Abe T, Hoffman
CS, Ohta K, Hirota K Interplay between chromatin座において発見したプロモーター非コード RNA で

modulators and histone acetylation regulates theある mlonRNA のクロマチン再編成誘導での分子機

formation of accessible chromatin in the upstream

構の一端と、fbp1 遺伝子座以外での普遍的な機能について解明した。本研究により、mlonRNA 転写によregulatory region of fission yeast fbp1. Genes

るクロマチン再編成が、転写開始部位からの限られGenet Syst 92: 267-276 (2018)た領域のみで起こることがわかった。このことから、

5.

Senmatsu S, Asada R, Abe T, Hoffman CS, Ohta K,

転写開始複合体がプロモーターから乖離して転写開Hirota K lncRNA transcriptional initiation induces

始するクリアランス過程において、クロマチン再編

chromatin remodeling within a limited range in the成が誘導されている可能性が考えられる。mlon-Boxfission yeast fbp1 promoter. Sci Rep 9: 299 (2019)

は TATA ボックスとは異なる配列を有するとともに、このように通常の mRNA 転写開始とは異なりクロマチン再編成を誘導することから、mlonRNA 合成開研究の発表ポスター発表

始複合体は既知の転写ユニットとは異なる複合体からなることが予想される。mlon-Box と相互作用する

1.

浅田隆大, 廣田耕志, 局所的ゲノム高次構造を介した転写因子の標的配列結合タイミング制御因子の系統的解析を今後行うことで、mlonRNA 転写と共役したクロマチン再編成機構の詳細を明らかに機構の解析, クロマチン動構造ワークショップしたい。

(北海道 2017 6 月)

本研究では、mlonRNA 転写によるクロマチン再編

2.

成現象が分裂酵母ゲノムの調節機能において普遍的千松賢史, 廣田耕志, 長鎖 non-coding RNA 転写による クロマチン構造制御メカニズムの解に機能することが示唆された。上記の mlonRNA 転明, クロマチン動構造ワークショップ (北海道写開始複合体の系統的な解析で制御因子が特定でき2017 6 月)

れば、動物細胞における相同因子の解析を行うこと
3.

千松賢史, 廣田耕志, metabolic stress-induced4.

lncRNA(mlonRNA) 転写によるクロマチン再編

mediated by local higher-order genome structure.,

成は、転写と減数分裂期組換えを活性化する, 染The 9th International Fission Yeast Meeting (カナ色体ワークショップ (愛知 2017 11 月)

ダ 2017 5 月)

Satoshi Senmatsu, Ryuta Asada, Arisa Oda, Charles
S. Hoffman, Kunihiro Ohta and Kouji Hirota The

誌上発表

novel cis-acting element for metabolic stress-induced

1.

lncRNA (mlonRNA) and meiotic recombination inHirota K lncRNA transcriptional initiation induces

fission yeast. 3R&3C Symposium (Kanazawa, Japan

chromatin remodeling within a limited range in theNovember, 2018)

fission yeast fbp1 promoter. Sci Rep 9: 299 (2019)
2.

2.

3.

Adachi A, Senmatsu S, Asada R, Abe T, Hoffman CS,
Ohta K, Hirota K Interplay between chromatin

口頭発表
1.

Senmatsu S, Asada R, Abe T, Hoffman CS, Ohta K,

廣田耕志, 非コード RNA の転写開始によってmodulators and histone acetylation regulates the

誘導されるクロマチン再編成の転写や組換え

formation of accessible chromatin in the upstream

における役割, 遺伝研研究会 (静岡 2017 10 月

regulatory region of fission yeast fbp1. Genes Genet

2 日)

Syst 92: 267-276 (2018)

千松賢史,廣田耕志, metabolic stress-induced

3.

Umeda M, Tsunekawa C, Senmatsu S, Asada R, AbelncRNA(mlonRNA)転写はクロマチン再編成をT,誘導し、転写と減数分裂期組換えを活性化させHistone-chaperone

る, 分子生物学会 (神戸 2017 12 月 7 日)

establishment

Ryuta Asada and Kouji Hirota, Transcriptional

Schizosaccharomyces pombe fbp1 gene repression.

activation via “catch-and-release” translocation of

Mol Cell Biol (2018)transcription factor Rst2 between activation sites isOhta

K,

HoffmanCS,

Asf1

requiredofis

repressive

HirotaKforthechromatinin