【THUNDERBIRD® Next Probe qPCR Mix トラブルシューティング】
現象
高濃度サンプルの反応で直線性が乱れる

原因
サンプル溶液中の不純物による反応阻害対策
サンプルの純度が低い場合、不純物によってPCR が阻害されることがあります。また、リアルタ
イム PCR 用に設計されていない逆転写反応用試
薬により合成した cDNA をご使用の場合、逆転写反応液に含まれる物質によって、反応が阻害されることがあります。サンプル濃度を下げて反応を行うか、サンプルの精製を行ってください。また、逆転写反応にはリアルタイム PCR 用に設計された試薬を用いてください。
低濃度サンプルの反 標的 DNA のコピー数
反応液中に標的 DNA が数コピーから数十コピー応で直線性が乱れが少なすぎるしか含まれない場合、確率的にコピー数のばらつる、または増幅曲線
きが大きくなり、直線性が乱れやすくなります。サの蛍光強度が低くなンプル濃度を上げて反応を行ってください。
る
DNA の反応チューブへ 用いたサンプルの DNA 量が少ない場合、またはの吸着サンプルを希釈して長時間放置した場合、DNAが反応チューブへ吸着するなどの原因で実質的な鋳型量が減少することがあります。サンプル濃度を上げて反応を行ってください。また、サンプルを希釈して反応を行う場合は、希釈は反応直前に行ってください。
プライマーダイマーとの 一般的に、蛍光プローブを用いたアッセイでは、標競合的以外の増幅産物に由来するシグナルは検出されませんが、標的配列の増幅と、プライマーダイマーの増幅とが同時に発生した場合、競合によって標的配列の増幅反応が弱くなることがあります。反応条件の再検討を行い、非特異反応の発生を回避してください。改善されない場合は、プライマー配列の変更を検討してください。
希釈系列サンプルの 非特異反応との競合
一般的に、蛍光プローブを用いたアッセイでは、標増幅曲線の間隔が揃的以外の増幅産物に由来するシグナルは検出さわない、または形状れませんが、プライマー配列の特異性が十分でなが不揃いい場合、標的以外の増幅反応が同時発生することで、競合によって標的配列の増幅反応が弱くなることがあります。反応条件の再検討を行い、非特異反応の発生を回避してください。改善されない場合は、プライマー配列の変更を検討してください。

QPX-101

現象
PCR 効率が 90%を下回る(slope < -3.6)

対策
標的配列によっては、標準の反応条件で十分なPCR 効率が得られない場合があります。[4] 使用方法 (2) PCR サイクル条件設定に従って、PCR反応条件の再検討を行ってください。
プライマーの劣化
プライマーの劣化により、PCR 効率が大きく低下することがあります。プライマーの原液からの再希釈、またはプライマーの再合成を行ってください。
PCR 効率算出時に、直 直線から外れた Ct 値を PCR 効率算出に利用し線から外れた Ct 値を含 た場合、算出値の誤差が増大します。直線から外めたれた Ct 値を算出対象から外し、再計算を行ってください。
PCR 効率が 110%を PCR 効率算出時に、直 直線から外れた Ct 値を PCR 効率算出に利用し上回る線から外れた Ct 値を含 た場合、算出値の誤差が増大します。直線から外(slope > -3.1)
めた
れた Ct 値を算出対象から外し、再計算を行ってください。
再現性が良くない
サンプルの純度が低い サンプルの純度が低いと、PCR への阻害が発生し、再現性が低下することがあります。サンプル濃度を下げて反応を行うか、サンプルの精製を行ってください。
希釈後、長時間放置し 濃度が薄い DNA 溶液は、容器への吸着によってたサンプルを使用実効濃度が低下することがあります。原液から再希釈を行ってください。また、希釈系列による標準サンプルは、希釈後の保存は避け、毎回反応時に原液から都度作製してください。
鋳型に精製プラスミド
精製プラスミド DNA 溶液や PCR 増幅産物を鋳DNA や PCR 増幅産物 型として使用する場合、全 DNA 量に対する標的を使用
配列のコピー数が極めて高くなるため、反応液への添加量は少なくする必要があります。その際、溶液中の DNA 濃度が極めて低くなることで、DNA が容器への吸着などによって失われやすくなり、特に低濃度域の直線性や再現性が大きく低下する原因となります。希釈の際には、反応と関与しない核酸(Yeast RNA など)を希釈液に混合することで、低濃度域の直線性が改善される場合があります。
反応条件の不適合反応条件が至適からずれている場合、反応の再現性が低下することがあります。[4] 使用方法
(2) PCR サイクル条件設定に従って、PCR 反応条件の再検討を行ってください。
プライマー・プローブの 同一の配列を持つプライマーやプローブでも、合品質差成時毎に品質差が発生することがあります。新規に合成を行った際は、従来用いていたものと比較実験を行って、品質差の確認を行ってください。

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原因
反応条件の不適合現象
no-template control(NTC)で増幅が見られる

原因
コンタミネーションの発生対策
再試時も再現する場合には、試薬類や滅菌水へのコンタミネーションが発生している可能性がありますので、試薬類や滅菌水の更新を行ってください。
蛍光測定の設定の誤り 複数種の蛍光プローブを用いた multiplex PCR(multiplex PCR 実施時 において、蛍光測定の設定が正しく行われていななど)
い場合、異なる色素のクロストークによるシグナルを誤って検出してしまう場合があります。反応系に含まれる全ての蛍光色素に対して、機器の設定を再確認してください。
増幅曲線の蛍光シグ 50×ROX reference
パッシブリファレンスを使用する機器において、50ナルが弱い、または dye の添加量が過剰
×ROX reference dye の添加量が過剰である場増幅曲線の形状がギ合、蛍光量補正時に蛍光値が低く見積もられるこザギザになるとがあります。[4] 使用方法 (1) 反応液の調製に従い、50×ROX reference dye の添加量を確認してください。
蛍光測定の設定の誤り 蛍光色素の設定に誤りがあると、正しい検出が行われませんので、機器の取扱説明書をご参照の上、設定を再確認してください。
蛍光プローブの純度が 蛍光プローブの純度が十分でない場合、合成時に低い残存した未結合の蛍光色素が、ベースライン上昇の原因となり、増幅産物由来の蛍光値が低く見積もられる場合があります。HPLC 精製グレード以上のプローブを用いてください。
クエンチャー色素の蛍TAMRA などの蛍光を発するクエンチャーを用い光強度が過剰ている場合、クエンチャーが発する蛍光によってベースラインが上昇し、増幅産物由来の蛍光値が低く見積もられる場合があります。non-fluorescentquencher を用いたプローブを使用することで改善される場合があります。
プローブの劣化
プローブ溶液の保存上の問題により、プローブが分解し、ベースラインが上昇することがあります。
また、一部の蛍光色素は、EDTA により劣化する性質を持つものがあります。プローブの合成元推奨の保存条件をご確認ください。
蛍光測定時間が短い
一部の機器では、PCR の伸長時間が短すぎる場
合、蛍光測定が十分に完了しない場合があります。増幅曲線のがたつきが目立つ場合には、伸長時間を長め(45～60 秒)に設定することで、改善される場合があります。
反応液量が少ない
機器の標準条件よりも少ない液量で反応を行った場合、蛍光測定値の誤差が増大する傾向があります。液量を増やして反応を行ってください。

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