Journal of Environmental Biotechnology（環境バイオテクノロジー学会誌）
Vol. 12, No. 2, 97–112, 2012

総

説（一般）

環境微生物の新規な代謝機能の探索と開発
Exploration and Development of Novel Metabolic Capabilities of Environmental Bacteria
古

川

謙

介

Kensuke Furukawa
別府大学食物栄養科学部 〒 874–8501 大分県別府市北石垣 82
TEL: 0977–66–9630 FAX: 0977–66–9631
E-mail: kfurukaw@nm.beppu-u.ac.jp
Department of Food and Bioscience, Beppu University, 82 Kitaishigaki, Beppu, Oita, 874-8501, Japan
キーワード：有機水銀，ポリ塩化ビフェニル（PCB），クロロエチレン，ジオキシゲナーセ，進化分子工学
Key words: organomercurials, polychlorinated biphenyls (PCBs), chlorinated ethenes, dioxygenases, evolutionary molecularengineering
（原稿受付

1.

2012 年 9 月 28 日／原稿受理

はじめに

環境バイオテクノロジー学会賞受賞を機に，40 年余りの研究を総括して，本誌に掲載する機会を得た。筆者
が大学を出た 1960 年代，わが国は公害列島の様相を呈していた。陸，海，河川，大気は化学物質で汚れ，水俣病，イタイイタイ病，四日市喘息などの公害病がたて続き発生していた。筆者の研究は微生物による有機水銀の分解に始まり，ついでポリ塩化ビフェニル（PCB），ト
リ ク ロ ロ エ チ レ ン（TCE）， テ ト ラ ク ロ ロ エ チ レ ン（PCE）の微生物分解と続いた。微生物と環境汚染物質のかかわり合いを縦糸に，その分子機構の解明を横糸に研究を行ってきたが，本稿では筆者のこれまでの研究を総括し，研究概要を紹介したい。
2.

微生物による有機水銀化合物の分解

1960 年代はフェニル水銀が いもち病 ，エチル水銀
が種子消毒などの農薬，塩化第二水銀は家庭消毒薬として使用されていた。すなわち，水銀は非選択的な殺菌剤として認識されていた。当時の発酵研究所の外村らは有機，無機水銀に顕著な耐性をもつ Pseudomonas sp. K62
株 を 分 離 し，1968 年，Nature 誌 に 論 文 を 発 表 し た 1)。
筆者は大学を出た 1967 年，外村研に入ったが，このK62 株が何故，水銀に耐性なのか，そのメカニズムについて明らかにするよう言われた。203Hg でラベルしたフェニル水銀を K62 株と一緒に培養すると，K62 のカロチ
ノイド色素により，培養液はきれいなピンク色になり，
203
Hg のほとんどは空気中に揮散してしまう。しかし，培養基の底に鉛色の沈殿が生じていることに気づいた。
これをガンマシンチレーターで測定すると針が瞬時に振り切れた。このことで有機水銀も無機水銀も金属水銀に2012 年 10 月 9 日）

還元分解されることが判明した 2)。ガスクロマトフラ
フィーで分析するとフェニル水銀からはベンゼン，メチル水銀からはメタン，エチル水銀からはエタンが検出された。次に水銀を入れて培養した K62 株の細胞抽出液
から分解に関与する酵素の精製を行った。当時売り出されたばかりのセファデックス G150 でゲル濾過すると，分子量約 6.7 万の画分に塩化第二水銀を金属水銀へ還元する酵素活性が認められた。一方，フェニル水銀の分解には上記画分の他に，分子量約 1 万の画分を同時に入れる必要があった。その後，DEAE セファデックス，CM
セファデックスを用いて酵素を精製した 3–5)。前者のフラビン（FAD）酵素を金属水銀遊離酵素（metallic mercury releasing enzyme），後者はシトクローム C と同じ画分に重なって溶出することから，cytochrome C-I と命名
して論文を発表した 6)。しかし，この命名は間違っていた。その後，手塚や Silver 等により詳細な研究が行われ，metallic mercury releasing enzyme は mercury reductase（MerA），cytochrome C-I は mercurial lyase（MerB）と命名された。すなわち，MerB は有機水銀の C-Hg 結合を切断，炭化水素と二価無機水銀（Hg2+）が生じる
が，MerA が Hg2+ を金属水銀（Hg0）に還元することが判明した。この反応には電子供与体として NADPH とチオグリコール酸のような SH 化合物の添加が必要である。
筆者は水銀の研究で博士号を取得し，1974 年，米国
ウィスコンシン大学へ留学，魚肝での無機水銀のメチル化をしばらく研究した。当時ワシントン大学の Simon
Silver と共同研究者はグラム陰性／陽性の諸種の水銀耐性菌から mer 遺伝子群を明らかにした。MerA 遺伝子，
MerB 遺伝子以外にも水銀化合物の結合（MerP）や運搬（MerT）に関わるさまざまな遺伝子がクラスターを形成して存在することが明らかとなった。K62 株の mer 遺98

古図 1．水俣湾海洋細菌 Pseudoalteromonas haloplanktis M-1 の有機水銀分解機構と遺伝子クラスター

伝子解析は当時摂南大学の清野／芳らにより解明された。K62 株には 6 つのプラスミドが存在するが，28-kb
プラスミド上に mer 遺伝子を含む 2 つのクラスターが存在することを明らかにした 7,8)。我々はその後，水俣
湾の海洋細菌，Pseudoalteromonas haloplanktis M-1 株の mer 遺伝子を明らかにしたが，M-1 株では merA と
merB は染色体の別々の遺伝子クラスター上に存在す
る 9)（図 1）。
3.

微生物によるポリ塩化ビフェニル（PCB）の分解と酵素系

ウィスコンシン大学ではハワイ沖で捕獲されたキハダ
マグロの肝臓を空輸してもらい，これをすり潰して無機水銀を加えるとメチル水銀の生成を示す大きなピークがガスクロで検出された 10)。この研究と並行して当時，世界各地で深刻な環境汚染を引き起していた PCB 分解菌の探索分離の研究を行った。最初，PCB を資化する細菌を探したが，一向に生えてこなかった。しかし，塩素のないビフェニルを資化する細菌は複数分離することができた。14C でラベルした 2,5,2'-trichlorobiphenyl を使うと，グラム陰性 Alcaligenes sp. Y42 株からさまざまな中間代謝物が認められた 11,12)（図 2）。すなわち，ビフェニ
ル 資 化 菌 は 多 く の PCB 成 分 を 共 代 謝（cometabolism）
により酸化分解することが分かった 13–16)。PCB はビフェニルに塩素が 1 〜 10 まで置換したものの総称で，209
種類の化合物が存在する。そこで，塩素数の異なる諸種の PCB を購入し，その生分解性を調べた。その結果，以下のことが明らかになった。（1）PCB の分解は置換する塩素の数が多くなるほど分解されにくい，（2）片方のリングのみに塩素の置換した PCB は同じ数，両リングに置換したものより分解されやすい，（3）同じビフェニル環の 2,6-位に塩素が置換した PCB は極めて分解が困難になる 17)（図 3），（4）各種ビフェニル資化菌の間で PCB 分解能力が大きく異なる。
1976 年，千葉の微生物工業研究所（発酵研究所から川

図 2．細菌による 14C-2,5,2’-trichlorobiphenyl の分解と中間代謝物質改称）に帰った。当時，日本電子から売り出されたばかりの GC-MS を購入してもらい，γ 線照射施設を改造した部屋に閉じこもって諸種 PCB の分解経路の研究を行った。ビフェニル資化菌のビフェニル代謝は安息香酸までの酸化分解である 18)（図 4）。PCB の分解も基本的には同じで，主経路は塩素置換の無いあるいは塩素が 1個ついたリングの 2,3- 位への酸素分子の導入に始まり，ジヒドロジオール，フェニルカテコール，環開裂を経て，塩化安息香酸へ分解される。この過程で脱塩素化は生じない。この分解に関与する酵素はビフェニルジオキ
シゲナーゼ，ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ，環開裂ジオキシゲナーゼ，ヒドロラーゼの 4 つの酵素である。しかし，PCB 成分の塩素の置換数と置換位置の違いにより，ジヒドロジオールやジヒドロキシ化合物で反応が止まったり，環開裂黄色物質が蓄積したりする。
また，ビフェニル資化菌の違い，すなわちそれぞれのビフェニル資化菌の酵素の特異性の違いで代謝経路が異なる場合も認められた。例えば，Alcaligenes sp. Y42
株 で は 2,4,6-trichlorobiphenyl を 全 く 分 解 で き な い が，Rhodococcus sp. P6 株は同化合物を速やかにジヒドロキ
シ化合物に変え，さらにトリヒドロキシ化合物を蓄積する。また，後述するが，Pseudomonas pseudoalcaligenes
KF707 株は 2,5,4'-trichlorobiphenyl をメタ開裂黄色化合物に分解するが，Burkholderia xenovorans LB400 株は
同 化 合 物 を 3,4-dihydroxy-2,5,4'-trichlorobiphenyl へ と 変
換し，この化合物が dead end 化合物となる 19)。
4.

ビフェニル／ PCB 分解遺伝子の単離と解析

1980 年，イリノイ大学シカゴ校のチャクラバーティ
研究室に客員准教授として 1 年半，環境微生物の遺伝子工学の研究をする機会を得た。Chakrabarty 教授は 1980
年，遺伝子操作した微生物で初めて特許を取得したチャクラバーティ裁判で有名であるが，これはわが国でも大きなニュースとなった。この研究室では 100-kb を超える巨大分解系プラスミドの抽出に苦労したが，トルエン
資化菌とサリチル酸資化菌をケモスタットで混合培養す環境微生物の新規な機能開発

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図 3．細菌による片方のリングに 2 個塩素置換した PCB の分解

図 4．Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 株のビフェニル代謝経路，酵素及び遺伝子クラスター
BphA1: biphenyl dioxygenase terminal large subunit; BphA2: biphenyl dioxygenase terminal small subunit; BphA3: ferredoxin; BphA4:
ferredoxin reductase; BphB: dihidrodiol dehydrogenase; BphC: 2,3-dihydroxybiphenyl dioxygenase; BphD: 2-hydroxy-6-oxo-phenylhexa2,4-dienoic acid hydrolase; BphX0: glutathione S-transferase; BphX1: 2-hydroxypenta-2,4-dienoate hydratase; BphX2: acetoaldehyde
dehydrogenase; BphX3: 4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase.

るとトルエンにもサリチル酸にも生育してくる株が得られ た。 調 べ て み る と こ の 株 に は TOL プ ラ ス ミ ド（pWW0） の 一 部（57-kb） が SAL プ ラ ス ミ ド（81-kb）に融合した巨大プラスミ（pKF439; 138-kb）が存在した 20)。後に津田らの研究からこれがトルエン代謝遺伝子を含むトランスポゾン Tn4651（56-kb）であることが判明した 21)。シカゴではビフェニル／ PCB 分解遺伝子のクローニングはできなかったが，つくばに帰った 1985
年，P. pseudoalcaligenes KF707 からゲノムのショット
ガンクローニングによって成功した 22)。制限酵素 XhoI
で KF707 株のゲノム DNA を切断，ドイツで開発された広宿主域ベクター pKT230 の XhoI サイトに導入，宿主 と し て 緑 膿 菌（Pseudomonas aeruginosa PAO1161）を用いた。生育した形質転換体にビフェニル蒸気をあてると 1 個だけ黄色になるコロニーが出現した。すなわ
ち，得られた 6.8-kb DNA 上にビフェニルジオキシゲ
ナーゼ，デヒドロゲナーゼ，環開裂ジオキシゲナーゼ遺伝子が存在したわけである。この遺伝子を bph と命名した。その後は遺伝子の解析と全 bph 遺伝子の取得に没頭した。制御遺伝子を含む 13 の遺伝子が一つのクラスターを形成していた 23–31)（図 4）。ビフェニルジオキ
シゲナーゼは多成分酵素で末端ジオキシゲナーゼの大サ
ブユニット（bphA1 によりコード），小サブユニット（bphA2），フェレドキシン（bphA3），フェレドキシン

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図 5．P. pseudoalcaligenes KF707 株の bph 及び sal 遺伝子クラスターの発現調節
sal 遺伝子群はサリチル酸のアセチル CoA とピルビン酸への代謝をコードし，bph 遺伝子群の約 6.6-kb 下流に存在する。HOPD,
2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoate; HMSA, 2-hydroxymuconate semialdehyde.

還元酵素（bphA4）から構成されること，フェレドキシ
ンとフェレドキシン還元酵素は NADH からの電子伝達に関与し，末端ジオキシゲナーゼを還元すること，同酵
素は酸素分子を活性化，ついで基質であるビフェニル／
PCB に酸素が導入される。bphB はジヒドロジオールデ
ヒドロゲナーゼをコードし，bphC は環開裂ジオキシゲ
ナーゼ 33,34) を，bphD はヒドロラーゼをコードすることが 明 ら か と な っ た。KF707 の bph 遺 伝 子 の bphC とbphD の間には bphX0X1X2X3 と名付けた 4 つの遺伝子が存在した。bphX1X2X3 は環開裂化合物が加水分解されてできる安息香酸と 2-hydroxy-2,4-pentadienoic acid の
うち後者をアセチル CoA へ代謝する遺伝子群である。
KF707 株の bph 遺伝子の発現調節は極めて複雑である。本株の bph 遺伝子クラスターの約 6-kb 下流にサリ
チル酸代謝 sal 遺伝子群が存在する。bph と sal 遺伝子
クラスターは相互に関連して制御されている。bphR1
は bphA1 の上流に存在し，bphR2 は sal 遺伝子の上流に存在する。BphR1 タンパク質は GntR ファミリーであるが，BphR2 タンパク質は LysR ファミリーに属し，ナ
フタレン代謝の調節遺伝子である NahR と 81％の相同性を示す。ゲルシフトアッセイとフットプリンティング
解析から図 5 に示す bph 及び sal 遺伝子群の発現調節機構を提案した。ビフェニル及びサリチル酸が存在しな
い時は少量の BphR2 は自身のオペレーターに結合し，bphR2 の転写を抑制する。同時に少量生成した BphR1
は sal オペレーターに結合して，sal 遺伝子の転写を抑制する。この段階で bph 及び sal 遺伝子の転写は極めて低い。ビフェニルが存在すると BphR2 タンパク質は
bphR1 と bphABC のオペレーターに結合して，その転写を促進する。その結果，大量のビフェニル環開裂黄色
物質が生産され，bphR1 の転写が起こり，その産物である BphR1 が bphR1 自身と bphX 及び bphD の転写を活性化する。サリチル酸の存在下では BphR1 は sal 遺伝子群を抑制し続けるが，サリチル酸からの環開裂黄色
物質（HNSA）が生成すると，BphR1 は sal オペレーターから離れ，sal 遺伝子群の抑制が解除されるとともに，
bphR2 の転写が起きる。大量の BphR2 タンパク質はHMSA と会合し sal オペレーターに結合すると sal 遺伝
子群の転写が開始される。極めて複雑な転写機構である
が，詳細は文献を参照願いたい 35–37)。
KF707 株以外に Sphingomonas sp. Q1 から bphC 遺伝子 38)， P s e u d o m o n a s p u t i d a K F 7 1 5 株 か ら
bphRA1A2A3A4BCD 遺 伝 子 を ク ロ ー ン 化 し た が，KF715 株の bph 遺伝子クラスターには bphX 領域の大部分が欠失していた 39)。
5.

bph-sal エレメント

P. putida KF715 株を Pseudomonas putida AC30 株と混合培養すると極めて高頻度にビフェニル／サリチル酸
資化性 AC30 株が取得できた。得られた AC30Bph+Sal+
株を供与株，Pseudomonas putida KT2440 株を受容菌として再度，接合伝達すると高頻度に KT2440Bph+Sal+ 株が得られた。これらの株を調べると，染色体には bph/
sal 遺伝子群を含む 90-kb の巨大な DNA 分子が存在した。すなわち，この動く巨大 DNA 分子は接合伝達型ト
ランスポゾンとして機能することが判明した 40)。これをbph-sal エレメントと命名した。bph-sal エレメントはKF715 株の染色体上に存在するが，受容菌との接触により染色体から切り出され環状となり，接合型プラスミドと同様に一本鎖が受容菌に接合伝達する（図 6）。受容菌では二本鎖に複製されインテグラーゼの働きで再度染色体に挿入する。KF715 株の bph-sal エレメントの接合
伝達はしばらく安定に機能したが，繰り返し培養することでその接合頻度は低下し，接合伝達が不能で，ビフェ
ニル，サリチル酸の資化能をも無くした変異株が多数取

環境微生物の新規な機能開発

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図 6．接合トランスポゾン bph-sal エレメントの染色体からの切出しと転移得された。この bph-sal エレメントには少なくとも 3 つの異なる挿入配列（IS），2 種類のグループ II イントロ
ン，P. putida B13 株のクロロカテコール代謝遺伝子をコードする接合型トランスポゾン clc エレメント 41) と高い相同性を示すインテグラーゼ遺伝子など，ゲノムの再編成に関与する数多くの遺伝子が存在した。これがbph-sal エレメントの不安定性に関与しており，その不安定さは大腸菌で作成されたクローンについても観察された。
筆者が先に北九州のビフェニル工場の土壌から分離した諸種のビフェニル資化菌について bph-sal エレメントの有無を検証した。KF715 を含む 12 株の KF シリーズ
株の染色体 DNA をレアカッター制限酵素 Spe I で切断
し，パルスフィールド電気泳動に供した。これらの断片に つ い て サ ザ ン 解 析 を 行 っ た。KF715 株 の bphA1，
salA，int（インテルラーゼ遺伝子）DNA をプローブとして用いると 12 株中の 8 株においてそれぞれの Spe I
断片に上記 3 つの遺伝子と交雑した。このことは bphsal エレメントが 12 株中，8 株のゲノムに存在することを示す。つまり，この接合型トランスポゾンが広く土壌
細菌間で動いていることが判明した。しかし，KF715 株
を除いて 7 株いずれも接合伝達能が認められず，一部はサリチル酸資化能もなかった。現在，（独）製品評価技
術基盤機構（NITE）との共同研究により，これらのビフェニル資化菌についてゲノム解読を行っているが，諸種の菌株の bph-sal エレメントがいかなる再編成を受けているのか，興味深い。
6.

オキシゲナーゼの進化分子工学

ビフェニル資化菌はわが国はもとより，世界各国で分離された。さまざまなグラム陰性菌，グラム陽性菌を含むが，bph 遺伝子は染色体，プラスミド，あるいは上記の接合型トランスポゾンに存在している。これらのビフェニル資化菌はビフェニル代謝酵素により低塩素化
PCB を共代謝して塩化安息香酸へと酸化分解する。P.
pseudoalcaligenes KF707 株は塩素数 1 〜 3 の PCB を良く分解する。しかし，米国 General Electric 社（GE 社）
で分離された Burkholderia xenovorans LB400 株は塩素
数 4 〜 6 の PCB に対しても分解が生起する。調べてみると KF707 株は 4,4'-dichlorobiphenyl（4,4'-CB），2,5,4'-CBに対しては 4'-リングの 2',3'- 位に酸素分子を導入して前者からは 4-塩化安息香酸，後者からは環開裂黄色化合物を蓄積した。しかし，2,5,2',5'-CB をアタックできない。
一 方，LB400 株 は 4,4'-CB を ほ と ん ど 分 解 し な い が，
2,5,4'-CB と 2,5,2',5'-CB からは 2,5- リングの 3,4- 位に酸素分子を導入して 3,4- ジヒドロジオール化合物を生じ，これが dead end 産物となる 19)。このことは両菌株のビフェニルジオキシゲナーゼは上記 3PCB 成分に対して異なる分子認識をしているわけである。これらの結果から
KF707 株と LB400 株の酵素は大きく異なることが予想された。1992 年，我々は KF707 株の bph 遺伝子の塩基配列を J. Bio. Chem. に発表 23)，少し遅れて LB400 株の
bph 遺伝子の塩基配列は J. Bacteriol. に発表された 42)。
驚いたことに両菌株の bph 遺伝子は極めて類似していた（図 6）。すなわち，最も大きな違いは末端ジオキシゲナー
ゼの大サブユニと（BphA1）に認められた。460 アミノ酸のうち，20 アミノ酸が異なっていた（KF707BphA1
は 459 アミノ酸で 1 アミノ酸欠失を含む）。小サブユ
ニット（BphA2）はアミノ酸が一個のみ異なっており，
フェレドキシン（BphA3）およびフェレドキシン還元
酵 素（BphA4）は共に 100％同一であった 31)。すなわ
ち，KF707 株 と KB400 株 の PCB 分 解 能 の 違 い は
BphA1 の 20 のアミノ酸の違いに起因していた 43)。1994
年，Stemmer は DNA シャフリングによる遺伝子の進化
分子工学を Nature 誌に発表した 44)。我々はこの手法を両菌株の bphA1 遺伝子に適用した 45)。
まず，KF707 株と LB400 株のゲノムから bphA1-DNA

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図 7．P. pseudoalcaligenes KF707 株と Burkholderia xenovorans LB400 株の bph 遺伝子クラスターの比較とビフェニルジオキシゲナー
ゼ大サブユニットにおけるアミノ酸配列の比較

を PCR で増幅した。次いでそれぞれの bphA1-DNA を
DNaseI でランダムに切断，ポリアクリルアミド電気泳動を行った。20 〜 50-bp 付近の DNA をそれぞれゲルより切出し，精製した後混合した。この DNA 混合物に対してプライマーレス PCR を行った。この過程で KF707bphA1-DNA と LB400-bphA1-DNA の間で相互にプライ
ミングし，キメラ bphA1-DNA 断片が生成した。次いで，bphA1-DNA の 5 および 3 末端のプライマーを用いて再度 PCR を行うことで，1.4-kb のキメラ bphA1DNA が取得できた。これらの bphA1-DNA を bphA2bphA3-bphA4-bphB-bphC の上流に挿入し，Escherichia
coli で発現させ，ビフェニルから黄色化合物をつくる E.
coli 形質転換体を得た 46)。次に野生株のビフェニルジオ
キシゲナーゼを凌駕する進化した酵素を生産する形質転換体を選抜した。KF707 株の BphABC 酵素はジフェニ
ルメタンに作用し，環開裂黄色化合物を蓄積するが，LB400 株酵素は同化合物を全く分解できない。一方，
LB400BphABC 酵素はジベンゾフランから黄色化合物を蓄積するが，KF707 株の酵素は本化合物にアタックできない。そこでジフェニルメタンとジベンゾフランの両化合物から環開裂黄色化合物を蓄積する形質転換コロニーを探した。結果，100 を超える進化酵素発現株が得られた 45,47–49)（図 8）。両野生株のビフェニルジオキシゲナー
ゼはインドールからインジゴを生成できないが，上記選抜株にはインジゴを生成する株が存在していた。進化株について両菌株の BphA1 で異なる 20 のアミノ酸について調べた結果，全ての進化株では KF707 株とLB400 株の BphA1 間で異なる 20 アミノ酸がランダムに相互に置換していた（図 9）。図 10 に代表的な 8 進化株についてビフェニル（BP），4-chlorobiphenyl（4-CB），
4-methylbiphenyl（4-MB），diphenylmethane（DM），
dibenzofuran（DF），2,2'-dichlorobiphenyl（2,2'-CB），
2,5,4'-trichlorobiphenyl（2,5,4'-CB），4,4'-dichlorobiphenyl（4,4'-CB）の分解特性について調べた。まず，KF707 株

図 8．DNA シャフリングにより進化ビフェニルジオキシゲナー
ゼのスクリーニング■：KF707 株ビフェニルジオキシゲナーゼ，ジフェニルメ
タンのみに活性；▲：LB400 株ビフェニルジオキシゲナー
ゼ，ジベンゾフランのみに活性；●：進化ジオキシゲナー
ゼ：両化合物に活性；●：インドールよりインジゴ生成と LB400 株のビフェニルジオキシゲナーゼはビフェニ
ルを除く 7 化合物に対して異なる分解特性を示す。一方，進化ビフェニルジオキシゲナーゼを発現する E. coli
株中には親株酵素を凌駕する高い分解能を示すもの，広い 基 質 特 異 性 を 示 す も の が 認 め ら れ た。 ま た，
pSHF1075 を保有する株は 2,2'-CB のみに高い活性を示環境微生物の新規な機能開発

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図 9．進化オキシゲナーゼ大サブユニットのアミノ酸配列
KF707-BphA1 と LB400-BphA1 で異なる 20 アミノ酸のシャフリングを示す。

図 10．進化オキシゲナーゼによるビフェニル関連化合物の分解特性
進化 BphA1-BphA2A3A4-BphB-BphC を発現する E. coli 株による環開裂黄色化合物の生成を測定。

した 45)。
進化分子工学手法には DNA シャフリング以外にもランダムな配列をもつプライマーを用いて目的遺伝子に変異を導入する方法があるが，この手法で得られた BphA1
は KF707-BphA1 の Thr-376 を Val に 変 え る こ と で， 親株酵素がアタックできないダイオキシン（塩素 0）に対。KF707 株の BphA1 はする分解能が出現した 50)（図 11）
未だ X 線解析ができていないが，ナフタレンジオキシ
ゲナーゼをベースにホモロジーモデリングを行った 51)。
この情報を基に基質結合部位に関与すると考えられるア
ミノ酸を部位特異的に変えることで，2,5,4'-CB の 2,5- リ
ングの 3,4- 位に OH を導入する変異酵素，Ile335Phe 及

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図 11．ランダムプライミング組換え手法によって得られた T376V 変異ジオキシゲナーゼによるダイオキシンの代謝
T376V 以外の変異はこの代謝に影響しなかった。

図 12．進化 bphA1 遺伝子を KF707 株染色体野生型 bphA1 と入れ替えた進化株による諸種芳香族化合物の資化特性●：P. pseudoalcaligenes KF707；■：B. xenovorans LB400；○：KF707-DC1045；□：KF707-DC1046；△：KF707-DC1049；◇：
KF707-DC1072

び Phe377Leu な ど が 得 ら れ た 51)。 上 記 進 化 bphA1 を
KF707 株 野 生 株 の bphA1 と 置 換 し た 進 化 株 を 作 成 した 52)。このため，進化 bphA1 を bphR と bphA2A3A4 遺伝子に挟み込み自殺ベクターにつないで KF707 株に導入した。相同組換えによって得られた進化株の生育特性を図 12 に示す。その中には 1072 株のように親株が資化できないトルエンやエチルベンゼンに生育できる進化

株，1049 株のようにイソプロピルベンゼン，エチルベン
ゼン及びブチルベンゼンに高い生育を示すものなどが得られた。
上記の bphA1 遺伝子を対象とした進化工学によるビ
フェニルジオキシゲナーゼの進化に先だって，サブユ
ニットを交換したハイブリッドジオキシゲナーゼを作成した。本研究では上記 KF707 株のビフェニルジオキシ

環境微生物の新規な機能開発

105

図 13．P. pseudoalcaigenes KF707 株のビフェニル代謝 bph 遺伝子群と P. putida F1 株のトルエン代謝 tod 遺伝子群
それぞれの遺伝子産物のアミノ酸配列の類似性が比較されている。

図 14．ビフェニルジオキシゲナーゼとトルエンジオキシゲナーゼのサブユニット間相互置換によるハイブリッドジオキシゲナーゼの構築
E. coli（todC1-bphA2-bphA3-bphA4）発現株はトリクロロエチレンを効率よく分解した。

ゲ ナ ー ゼ の bpA1-bphA2-bphA3-bphA4 遺 伝 子 ク ラ ス
ターとトルエン資化菌 Pseudomonas putida F1 株のトル
エンジオキシゲナーゼの todC1-todC2-todB-todA 遺伝子
クラスター（図 13）の各遺伝子を相互に交換したハイ
ブリッドジオキシゲナーゼを構築し，E. coli で発現させた 53–55)（図 14）。これらのサブユニット遺伝子を相互置換した酵素のうち，TodC1-BphA2-BphA3-BphA4 を発現する E. coli はトルエンとビフェニルに酸素添加活性を示す外，土壌，地下水汚染で深刻な環境汚染を引き起しているトリクロロエチレン（TCE）を極めて効率よく分解することが判明した 56,57)。そこで todC1 遺伝子を
bphR と bphA2A3A4 に 挟 み 込 ん で， こ れ を 自 殺 ベ ク
ターに入れ，KF707 株に導入した。その結果，相同組換えにより KF707 株の染色体に存在する bphA1 が todC1

106と置換したダブルクロスオーバー株が得られた。このハ
イブリッド株は親株 KF707 株と F1 株を凌駕する TCE
分解能が認められた 58–63)（図 15）。

古

川

7.

進化ジオキシゲナーゼを利用した複素環とベンゼン環を分子内にもつ諸種化合物の変換

上述した進化ジオキシゲナーゼのうち，広い基質
特 異性を有する BphDox-1072 を発現する E. coli を用

図 15．TodC1-BphA2-BphA3-BphA4 ハイブリッドジオキシゲナーゼを発現する KF707 進化株によるトリクロロエチレン（TCE）の分
解
todC1 遺伝子を KF707 株染色体 bphA1 と置換したハイブリッド株 KF707-D2 株はトルエン，コハク酸，ビフェニルにそれぞれ生育させた。KF707（wt）: ビフェニル資化菌 P. pseudomonas KF707 野生株，F1（wt）：トルエン資化菌 P. putida F1 野生株

図 16．進化ジオキシゲナーゼ（進化 BphA1-BphA2-BphA3-BphA4）を発現する E. coli 株による諸種芳香族化合物からのジヒドロジオールの生成107

環境微生物の新規な機能開発

いてさまざまな芳香族化合物に対して水酸基の導入を行 っ た 45,47)。BphDox-1072 の大サブユニットの活性中
心周辺基質結合領域の体積を測定した。結果，野生株
707-BphA1 の体積 82.27 Å3 に比べて 1072-BphA1 では
101.25 Å3 と計算され，BphDox-1072 酵素ではかさ高い
芳香族化合物と結合して分子状酸素を導入できることが推測された。事実，本進化酵素を発現する E. coli
（BphDox-1072）株 は 複 素 環 を 含 む 多 く の 芳 香 族 化 合物に分子状酸素を導入した 64–69)（図 16）。すなわち，E.
coli（BphA1-[1072]-BphA2-BphA3-BpA4） を 用 い る と
1-phenylpyrrole，3-methyl-1-phenylpyrazole，4-phenylpyrimidine，
2-phenylindole，2-phenylbenzoxazole，3-phenyl-1-indanone，2-phenylquinoline などから極めて効率よくジヒドロジオー
ル化合物が得られた。効率は落ちるが，2-phenylpyridine
や 2-phenylbenzothiazole からもジヒドロジオール化合物が得られた 70–72)。また，1-phenylpyrazole からはピラゾー
ル環に水酸基が一個ついた化合物が得られた。次いで E.
coli（BphA1-[1072]-BphA2-BphA3-BpA4-BphB） を 用 い
ると上記，ジヒドロジオール化合物はジオール化合物に変換した。また，flavone，6-hydroxyflavone，flavonone，7-hydroxyisoflavone，(trans-)chalcone などのフラボン類
からもジオール体が生成した。さらに E. coli（BphA1[1072]-BphA2-BphA3-BpA4-BphB-BphC）を用いるとビフェニルは環開裂黄色化合物が生成するが，この反応にアンモニアを過剰添加すると，興味深いことに窒素原子を取込んで環が閉環し，ピコリン酸が生成した。この系を用いてさまざまなピコリン酸が得られた 73)（図 17）。
水酸基の導入は通常の有機化学合成では困難な場合が多く，進化したジオキシゲナーゼを利用することで，これまでに数多くの新規な化合物をつくることに成功した。これらの化合物にはラットの脳ホモジェネートに対して抗酸化作用を示すものが存在し，フリーラジカルによる脂質過酸化抑制効果が認められた 71)。また，上記の多くの化合物が創薬の中間体としての利用が期待できる。

8.

脱ハロゲン呼吸細菌によるクロロエテン類の脱塩素化

半導体の脱脂洗浄などに使用されたトリクロロエチレン（TCE）やドライクリーニングの洗浄剤などに使用されたテトラクロロエチレン（PCE）など塩素系有機溶媒による土壌，地下水汚染は世界的な広がりをみせ，深刻な環境汚染物質となって久しい。PCE や TCE から脱塩素化した cis- ジクロロエチレン（cis-DCE）あるいは
trans-DCE，さらにビニルクロライド（VC）も広く環境を汚染している。このうち，VC は発がん性物質として知られている。また，PCE は好気性微生物による酸化分解は困難でその研究例はほとんど報告されていない。
これらの塩素系有機溶媒を最終電子受容体として脱塩素化する偏性嫌気性細菌はこの 20 数年にわたり，広く分離され精力的に研究されてきた。このような脱ハロゲン呼吸細菌は Chloroflexi および Firmicutes 門，ε- および γproteobacteria な ど に 広 く 分 布 し て い る。PCE お よ び
TCE を脱塩素化する菌として，Dehalobacter，Dehalobiun，Dehalococcoides，Desulfitobacterium，Desulfuromonas，Geobacter，Sulfurospirillum が報告されている が，DCE や VC を 脱 塩 素 化 で き る の は Dehalococcoides のみである 74,75)。
九大発酵化学研究室では PCE 汚染土壌から Desulfitobacterium hafniense Y51 株を分離し，その遺伝性化学的研究を行った 76)。本細菌は PCE を cis-DCE に脱塩素化呼吸により増殖するほか，フマール酸，チオ硫酸，亜硫酸，硝酸，亜硝酸，ジメチルスルフォキシド，Fe(III)などを最終電子伝達体として呼吸し増殖できる極めて多彩な能力を示す。我々はまず，Y51 株から PCE デハロ
ゲナーゼの精製を行った。本酵素は極めて酸素感受性で空気中に 10 数時間さらすとほとんど失活するため，その精製は困難を極めたが，0.2％の収率で分子量 58-kDaのタンパク質を精製することができた。この N 末端アミノ酸配列から PCE デハロゲナーゼ遺伝子（pceA）のクローニングに成功した 77,78)。pceA 遺伝子の下流には膜貫通型の小タンパク質遺伝子（pceB）が存在した。

図 17．進化ジオキシゲナーゼ，ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼおよび環開裂ジオキシゲナーゼ（進化 BphA1-BphA2-BphA3BphA4-BphB-BphC）を発現する E. coli 株による諸種芳香族化合物からのピコリン酸の生成

108

古

pceB の下流には機能不明な pceC，および pceT が存在した。これらの pceABCT 遺伝子クラスターの上流と下流には 2 つの相同な IS が存在し，従ってこの pce 遺伝
子クラスターはトランスポゾンとして機能することが判明した 79)（図 18）。PCE デハロゲンーゼお構造は N 末
端に 39 アミノ酸からなる Tat（twin arginine translocation）シグナル配列と 2 つの Fe-S 結合部位が認められた。また，コリノイドを含むことが明らかになった。
PceA の未成熟タンパク質はシャペロンタンパク質 PceT
により，フォールディングされ，ついで Tat システムに
より細胞膜を貫通しペリプラズムに運ばれ，細胞質膜に存在する PceB と結合して存在する 80)。
Y51 株を繰返し培養すると PCE の脱塩素化能を無くした株が高頻度に出現することが判明した 79)。これらの株には pce 遺伝子を保持するが，脱塩素化能を無くした SD 株と pce 遺伝子を全て無くした LD 株の二種類が存在した。調べてみると SD 株は pceA の上流に存在する IS が欠失していた（図 19）。この IS 中に pceABC のプロモータが存在し転写が生起しないこと，LD 株ではpceA 上流の IS と pceT 下流に存在する相同な IS の間で相同組換えが生起し，pceABCT が完全に欠失していた（図 20）。興味あることに Y51 野生株では 0.1 μM の
極低濃度のクロロフォルム（三塩化炭素）によってその川生育が完全に阻害されるが，SD 株と LD 株では生育阻害が全く認められない 81)。この阻害は四塩化炭素でも同様に認められるが，二塩化炭素では全く阻害されない。
この現象が如何にして生起するのかは未だ不明であるが，少なくとも PceA，PceB，PceC，あるいは PceT のタンパク質のいずれかとクロロフォルム（および四塩化炭素）が相互作用して生育を阻害していることが想定され，現在検討中である。
Y51 株のゲノムは地球環境産業技術研究機構（RITE）と の 共 同 研 究 で 明 ら か と な っ た 82)。 全 塩 基 数 は5,727,534 bp で，GC 含 量 は 47.4 ％， 推 定 遺 伝 子 数 は5060，極めて多彩なエネルギー獲得系（脱ハロゲン呼吸の他にフマール酸呼吸，チオ硫酸呼吸，亜硫酸呼吸，
硝酸呼吸，亜硝酸呼吸，ジメチルスルフォキシド呼吸，および Fe(III)）呼吸）を持っている。これらの性質はDehalococcoides mccartyi 195 株とは対照的である。195
株は PCE をエチレンまで完全に脱塩素化するが，ゲノ
ム サ イ ズ は 1,469,720 bp と 小 さ く， 推 定 遺 伝 子 数 は1,580，この中に 19 のデハロゲナーゼ遺伝子が存在する。またこの株は脱ハロゲン呼吸のみでエネルギーを獲得しており，この点でも Y51 株とは対照的である。

図 18．脱ハロゲン呼吸細菌 Desulfitobacterium hafniense Y51 株の pce 遺伝子クラスター
pceA：PCE デハロゲナーゼをコード；pceB：膜アンカータンパク質をコード；pceC：未知遺伝子；pceT：シャペロン遺伝子；
tnpA：トランスポザーゼ遺伝子；IS：挿入配列；Tn：トランスポゾン

図 19．脱ハロゲン欠損 SD 株の欠失領域
pce 遺伝子クラスターを挟む 2 つの相同 IS のうち上流が欠失，この中にプロモーターのマイナス 35 領域が含まれ，pceABC の転写が生起しない。
TSP： 転写開始点

環境微生物の新規な機能開発

109

図 20．脱ハロゲン欠損 LD 株の欠失領域と欠失メカニズム
pce 遺伝子クラスターを挟む 2 つの相同な IS 間で相同組換えが生起，pce 遺伝子クラスターが欠失。
tnpAab：tnpAa と tnpAb のハイブリッド遺伝子9.

化学的脱塩素化と微生物分解を組合せた
有機ハロゲン化合物の分解

平成 14 年度即効型地域コンソーシアムプロジェクト
で我々は樫原宏博士との共同研究で「常温常圧脱ハロゲ
ン化反応を活用した有害物質処理システムの開発」を実施した。これは化学反応による脱ハロゲン化と微生物を組合わせた諸種の有機塩素化合物の高効率分解システムの開発である。対象物質として PCB，ダイオキシン，
フロン，有機塩素系農薬について検討した。これらの塩
素化合物をテトラヒドロフラン（THF）に溶解し，これに水素化リチウムアルミニウム（LiAlH4）を添加し，水中で超音波処理をすることで，極めて短時間でほとん
どの塩素がとれることが判明した。すなわち，超音波処理により LiAlH4 から水素ラジカルが発生し，これが有機塩素化合物の塩素と置換する機構が考えられた。脱塩
素化した化合物は炭化水素となり，容易に微生物により分解された。この装置を設計し，上記有機塩素化合物の全てを常温常圧で短時間で容易に分解することができた。PCB 分解の一例を図 21 に示す。KC400（四塩化物が中心の PCB 混合物）を常温常圧で一分間超音波処理することで，多くの PCB 成分がビフェニルと 1 〜 2 塩
化物塩に脱塩素化された。脱塩素化された塩素数 1 〜 2の PCB は P. pseudoalcaligenes KF707 により容易に酸化分解された。塩素数 4 〜 10 のダイオキシンも 99％以
上が脱塩素化され，フロンからはフッ素と塩素のとれた炭化水素が得られた。また，有機塩素農薬である DDTやドリン系農薬も全て効率よく脱塩素化された。
10.

おわりに

現在 10 万種類を超える化学物質が製造され，その一部は環境に流出し，今なお環境を汚染している。わが国図 21．水素化リチウムアルミニウム / 超音波処理による PCB（KC400）からの脱塩素化
KC400，20000 ppm をテトラヒドロフランに溶解し，室温で一分間超音波処理したガスクロマトグラフを示す。
ほとんどの高塩化 PCB はビフェニル，一塩化物，二塩化物に脱塩素化した。

では 1960 年代に大きな公害問題に直面した。現在，中国，インドをはじめ東南アジアを中心に多くの発展途上国が日本の後を追っている。世界は局所的な公害問題に留まらず，地球規模での深刻な環境問題に直面している。勿論，汚染物質を環境に出さないのが基本である
が，一端環境に放出された化学物質は薄く広く環境を汚染し，食物連鎖を経て我々の人体にも蓄積する。このう
ち，有機塩素化合物は微生物による分解が困難であるば
かりでなく，脂溶性で長期間体内に蓄積する。環境の局

110

古

部を汚染した物質は微生物などを用いたバイオレメディ
エーションが可能であるが，広く薄く汚染した物質は土着菌による分解に頼らざるを得ない。環境中で汚染物質がどのような微生物で如何に分解されていくのか，これまでも大きな課題であったが，これからの地球での産業活動を考える時，益々その重要性は高まるはずである。
本稿では筆者の 40 年間にわたる環境バイオテクノロ
ジー関連の研究を総括する形でその概略を記載したが，今にして思えば 少年老い易く学なりがたし の心境である。本誌に環境バイオの一研究者の記録を掲載していただいたことに感謝したい。
本研究は昭和 42 年〜平成元年，工業技術院微生物工業研究所，平成元年〜平成 19 年，九州大学，平成 19
年〜平成 24 年。別府大学で行った研究をとりまとめたものである。この研究に関係した多くの共同研究者，学生諸君に感謝したい。
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