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リポーターアッセイ用新規ルシフェラーゼベクター

Emerald Luc -pELucベクターシリーズ生細胞アッセイに最適なリポーターアッセイ用ルシフェラーゼベクターです。より高感度に測定できます。
Emerald Luc システムは新規に開発されたルシフェラーゼを用いるリポーターアッセイシス
テムです。本システムに採用されているブラジル産ヒカリコメツキムシ由来ルシフェラーゼ
は、従来のホタルルシフェラーゼに比べ、生細胞において安定で、強い発光が観察されます

プロモーター
挿入なし（図1、2）。本ベクターに転写制御配列を挿入していただくことによって、生きた細胞での発光イメージングや非破壊計測によるリポーターアッセイにご利用いただけます。
また、本ルシフェラーゼは破壊系における発光安定性も高く、細胞溶解（in vitro）アッセイ
用のルシフェラーゼ
としても最適です。

Emerald Luc

ホタルルシフェラーゼ
図1．細胞の発光像
NIH-3T3細胞にEmerald Lucおよびホタルルシフェラーゼをトランスフェクションし、セルグラフ（アトー社）で3分間露光しました＊産業技術総合研究所 中島芳浩
先生にご提供いただきました。

図2．生細胞中での発光量比較
同一発現系で2種類のプロモーターを用いて比較

特長1 生細胞における高い発光・ホタルルシフェラーゼと比べ、生細胞において高い発光を示します。細胞培養液にD-ルシフェリンを添加し、生細胞において発光を測定することが可能です。現在注目されている発光イメージングのプローブとして最適です。

特長2 動的な変動解析が可能 Emerald Luc -Short lifeタイプ・時計遺伝子のリズム解析などの動的変動解析用には、ルシフェラーゼのC末端に分解促進シグナル（PEST配列）を付加したEmerald Luc -Short lifeタイプ-を用いることができます。

特長3 高い発光安定性
・Emerald Lucはホタルルシフェラーゼと比べ、破壊系測定において高い発光安定性を示しますので、発光の減衰が少なく、HTSアッセイに最適です。 ＊Emerald Luc専用破壊系（in vitro）測定試薬（リポーターアッセイ用）は近日発売予定です。

一口メモ
Emerald Lucは、ブラジル産ヒカリコメツキムシ Pyrearinus
termitilluminans由来のルシフェラーゼ 2）をもとに、哺乳類細胞で発現しやすいように遺伝子工学的に改変されたルシフェ
ラーゼ遺伝子＊です。本酵素は、最大発光波長538nmの緑色の発光を呈します。この発光スペクトルはpHの影響をほとん
ど受けません。さらに、発光検出に使用される光電子増倍管（PMT）
やCCDカメラではこの領域に高い量子効率を示すものが多く、ハード面からも好適なルシフェラーゼといえます。
＊特許出願中図3．Emerald Lucプロモーター挿入用ベクター
MultiReporter Assay System -Tripluc®-ベクターと同じマルチクローニングサイトを有しています

参考文献

1）バイオテクノロジージャーナル, 3-4, 230-232（2006）
2）Photochemistry and Photobiology, 70: 254-260（1999）1

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実施例1 ホタルルシフェラーゼとの生細胞系における性能比較
pELuc-test、pELuc（PEST）-test、及びホタルルシフェラー
ゼ（fLuc）の各ルシフェラーゼ遺伝子上流にAP1応答エレメント、
HSVtkプロモーターを挿入したコンストラクトを、96ウェルプレートに播種したHeLa S3細胞にトランスフェクションしました。
その後、この細胞を PMAまたはEGF、及び0.2 mM ルシフェリ
ンを含む培養液に置換して5時間インキュベートし、そのままプレートリーダーで発光を計測しました。図3上はシグナル計測値を、下は各コンストラクト毎に誘導比（無添加を1として比率を算出）
をプロットしたものです。Emerald Luc（ELuc）を用いた場合、ホタルルシフェラーゼと比べ、約15倍のシグナルが認められ、誘導の検出もホタルルシフェラーゼ（fLuc）に比べて良好でした。

実施例2 概日時計遺伝子の転写変動解析

図3．生細胞中を用いたリポーターアッセイ結果

pELuc-test、pELuc（PEST）-testのルシフェラーゼ遺伝
子上流に概日変動性の報告されている Bmal1遺伝子プロモーターを挿入したプラスミドを、NIH-3T3細胞へトランスフェ
クションしました。その後、その細胞を100nMデキサメタゾ
ンで処理し、0.2mM ルシフェリンを含む培地に置換した後、培養しながら連続発光測定装置で3日間発光を測定しました。
その結果、Emerald Luc -Short lifeタイプ-の方が良好なリズム変動を示すことが確認できました。これは、細胞内におけるリポータータンパク質の寿命が短縮されたことに起因していると考えられます。
図4．概日時計遺伝子発現の時間変動＊産業技術総合研究所 中島芳浩先生にご協力いただきました。

実施例3 ホタルルシフェラーゼとの破壊系検出における性能比較
SV40プロモーターの下流にELuc、fLucを連結し、HeLa
S3細胞にトランスフェクションし各ルシフェラーゼを強制発現させました。その後、ELuc導入細胞には専用の発光試薬（近日発売予定）を、fLuc導入細胞には他社ホタルルシフェラーゼ検出用試薬AまたはBを、培養液と等量添加しました。10分間放置した後、繰り返し発光を測定し、発光の強度・推移を調べた結果が図5です。上図に発光強度を、下図に相対活性（各測定で最初の計測値を100）を示します。結果、Emerald
Luc は発光強度も高く、発光の持続時間も長いことが分かりました。

図5．破壊系でのルシフェラーゼ安定性

品

名

装＊

保存温度

Code No.

10μg

-20℃

ELV-101￥35,000

10μg

-20℃

ELV-201￥35,000

包

Emerald Lucプロモーター挿入用ベクター

pELuc-test
Emerald Luc -Short lifeタイプ- プロモーター挿入用ベクター

pELuc（PEST）-test

価格＊ 本製品を弊社の検出用試薬（D-luciferin Code No.:MRL-101,102）を用い、研究目的で使用する場合は、ライセンス契約の手続きはございません。弊社以外の検出用試薬を用いる場合や、研究目的以外で使用する場合は、ライセンス契約が必要です。製品にライセンスポリシーが添付されていますので、開封前に必ずご確認ください。ご不明な点は弊社までお問い合わせください。

品

名

包

装＊

20mg
100mg

D-luciferin（カリウム塩）

2

保存温度

Code No.

-20℃

MRL-101
MRL-102価

格¥24,000¥92,000

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発売 ン
ー
キャンペ

部位特異的変異導入キット

KOD -Plus- Mutagenesis Kit

f

30%of

■2006年12月6日〜2007年1月31日の期間中、30％offでご購入いただけます。

KOD-Plus- を用いたInverse PCR法に基づく部位特異的変異導入キットです。幅広い変異導入が可能です。
本製品は、KOD -Plus-の高い正確性を活かした、Inverse PCR法に基づく部位特異的変異導入キットです。Inverse PCR法では、プラスミドを鋳型として、逆向きに設定したプライマーを用いてPCRを行い、プラスミド全周の増幅を行います。その際、導入したい変異や挿入配列を付加したプライマーを用いることにより、様々な変異を導入することができます。本製品には、形質転換までに必要な全ての試薬および詳細なプロトコールが含まれています。

一口メモ¡KOD -Plus-は、KOD DNA Polymeraseに、常温で活性を抑える
2種類の抗体を加えたホットスタート対応型高正確性PCR用酵素です。Taq DNA Polymeraseの約80倍の忠実度（fidelity）
を有し、正確性を要するPCRに最適です。
¡制限酵素Dpn I は、メチル化されたDNAを基質として切断します。通常のメチラーゼを発現している大腸菌（JM109やDH5α）から得られたプラスミドは、Dpn I サイトがメチル化されており、本酵素を用いて選択的に分解することができます。

特長1 幅広い変異導入に対応
・Inverse PCR法の採用により、数bpの置換、挿入、欠失のみでなく、数10bpの挿入（Tagの導入）や数100bpの欠失等にも対応可能です。また、特定部位のアミノ酸を20種類のアミノ酸に置換するなどの Mutant Clone Collectionの作製（Saturation
Mutagenesis）も可能です。

図1．置換、欠失、及び挿入の各変異導入プライマー設計例

特長2 確実な変異導入
・最大95％の変異導入効率が得られます。また、KOD -Plus-の採用、およびPCRサイクル数を最小限に設定するなど条件の最適化
により、PCRエラーによる2nd-site mutation（目的とする変
異以外の変異）が入る可能性を最小限にしています。最長約11kbのプラスミドで変異導入を確認済みです。

特長3 簡単プロトコール＊・本製品では、PCR産物のSelf-ligationを、KinaseとLigaseを同時に反応させて行います。従って、PCR Primerのリン酸化は不要です。また、形質転換まで3ステップの簡単なプロトコール

図2．KOD -Plus- Mutagenesis Kitによる変異導入フローとなっています（図2）。
＊特許出願中実施例1 種々のサイズのプラスミドをターゲットとした場合の変異導入効率の評価
全長3.3kb〜11.3kbの5種類のヒトcDNAクローン（FLJ cDNA Clone: Code No. FLJ-101）に対して、1塩基置換、3塩
基欠失、6塩基挿入の変異導入をそれぞれ行い、シーケンシングにて変異導入効率の評価を行いました（変異箇所は、ベクター
上の共通領域に設定。
（ベクターサイズ 3.0kb））。その結果、本製品では、plasmidのサイズに特に影響を受けることなく、平均84％の割合で目的の変異体を得ることができました。

3

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Plasmid

Plasmid
サイズ

変異導入の
タイプ

配列確認を試みた
クローン数

目的の変異を有していたクローン数目的とした変異体の割合

FLJ20649

3.3kb

1塩基置換

12

10

83％

3塩基欠失

12

9

75％

6塩基挿入

12

11

92％

1塩基置換

12

10

83％

3塩基欠失

12

12

100％

6塩基挿入

12

9

75％

1塩基置換

12

9

75％

3塩基欠失

12

12

100％

6塩基挿入

12

11

92％

1塩基置換

12

9

75％

3塩基欠失

12

12

100％

6塩基挿入

12

10

83％

1塩基置換

12

8

67％

3塩基欠失

12

11

92％

FLJ11212

5.3kb

FLJ32066

7.3kb

FLJ13783

FLJ43903

9.3kb

11.3kb

6塩基挿入
平

均

12

8

67％

180

151

84％

図3．Inverse PCR後のアガロースゲル
電気泳動結果実施例2 大きな欠失導入およびHis-tag挿入における他社品との性能比較
7.3kbのプラスミドFLJ32066を対象に、本製品とA社non-PCR法キットを用いて90塩基の欠失、および6xHisに対応する18塩基の導入を行いました。その結果、他社のキットが苦手とするこのような変異導入に対しても、本製品では、高い成功率で変異体を取得することができました。
●90ｂｐ 欠失
配列確認を試みた
クローン数

目的の変異を有していたクローン数目的とした変異体の
割合

品

16

14

88％

A社キット

16

7

44％

本

製

●18ｂｐ 挿入
配列確認を試みた
クローン数

目的の変異を有していたクローン数目的とした変異体の
割合

品

16

15

94％

A社キット

16

0

0％

本

製

実施例3 目的外変異（2nd-site mutation ）の挿入頻度の評価
キット付属のコントロールplasmid（4.3kb）を鋳型として変異導入を行い（PCRは8サイクルにて実施）、得られた変異体から24クローンについて各々2000bpの領域のシーケンシングを行いました。その結果、本製品では、実際に解析した合計48,000
塩基の内、目的以外の変異はわずか1塩基でした。これは、A社non-PCR法キットと比較しても、同等以上の結果でした。
変異導入率

シーケンシングした
クローン数

総シーケンシング
塩基数

目的外変異の塩基数

目的外変異の挿入率（×10-5）

品

>80%

24

48000

1

2.08

A社キット

>80%

24

48000

2

4.16

本

製

品

名

包

装

20回用

KOD -Plus- Mutagenesis Kit

保存温度

Code No.

-20℃

SMK-101

価

格￥38,000＊本製品には、以下の試薬が含まれています。KOD -Plus-, 10×Buffer for iPCR, 2mM dNTPs, DpnⅠ, T4 Polynucleotide Kinase,
Ligation high, Control Plasmid, Control Primer #1, Control Primer #2.
※PCR（Polymerase Chain Reaction）は、F. Hoffman-La Roche社が米国特許（特許番号4,683,195および4,683,202）を有しています。PCRの実施に当たっては許可が必要となります。本品はF. Hoffman-La Roche社が有するPCRに関する特許の使用許可を示唆するものではありません。

4

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リアルタイムPCR特集
今回は『リアルタイムPCR』を特集させていただきます。
リアルタイムPCR解析は、今日の遺伝子発現解析にはなくてはならないツールとなった感があります。今号では、各種リアルタイムPCR試薬、および関連試薬に関して特集しております。
是非、研究にお役立てください。

Technical Review『RNA-direct TM Realtime PCR Master Mix』を用いた
1-step Realtime PCRによるプロテインキナーゼ発現定量
東洋紡績（株）敦賀バイオ研究所

川井

淳

はじめに
リアルタイムPCRを用いて目的の遺伝子の発現量を測定する方法には、まずRNA
をcDNAに変換し、それを鋳型としてリアルタイムPCRを行う『2-step反応系』と、RNAを鋳型として逆転写反応とリアルタイムPCRを連続的に行う『1-step反応系』とがあります。1-stepリアルタイムPCRは、試薬の分注操作が1回で済み、ハイス
ループット化に適しています。また、サンプル間のクロスコンタミネーションの危険性も低減します。

RNA-direct TM Realtime PCR Master Mixは、Thermus thermophilus HB8株由来のTth DNA Polymeraseが、2価のマンガンイオン（Mn2＋）存在下において強い逆転写活性を示すことを利用した、1酵素系による1-stepリアルタイムPCR
用2xマスターミックスです。耐熱性DNAポリメラーゼを用いた逆転写反応は、一般の逆転写酵素と比較して、反応を高温で実施できるため、立体構造をとりやすい鋳型
RNAからの増幅や、逆転写反応の特異性を高めるのに適しています。

図1．キット外観
Master Mixと酢酸マンガン溶液がそれぞれ1.5ml
チューブに分注され包装されている。

本キットは、TaqMan®アッセイ・プローブアッセイ用とSYBR® Greenアッセイ
用の2種類から選択いただけます。
本 号 で は 、 R N A - d i r e c t TM S Y B R ®

一口メモ

Green Realtime PCR Master Mixを用Tth DNA polymeraseについて

いてnovel Protein Kinase C（nPKC）
ロファイル解析を実施した例をご紹介いた

Tth DNA polymeraseは好熱細菌：Thermus
thermophilusから分離されたpolI型DNA
polymeraseです。Mn2＋イオン存在下で、逆転
写活性を示すユニークな性質を有しています。

します。

Biochemistry, 30: 7661-7666（1991）のサブタイプごとのヒト各種組織別発現プ※本酵素の基本特許は弊社が有しています。
図2．Tthを用いたRT-PCR原理図

方法
2. プライマー:

1. サンプル:
10種類のヒト由来Total RNA（脳、心臓、腎臓、脾臓、肝PKCδ、PKCε、PKCη、PKCθそれぞれに対して、イン

臓、小腸、筋肉、肺、胃、大腸）を鋳型として用いました。各

トロンを跨ぐ約150〜170bpの領域を増幅するように、それ反応系（20μl）に対し、それぞれ50ngのtotal RNAを添加

ぞれ20mer前後の鎖長を持つプライマーを設計しました。まして解析を行いました。またこれらとは別に、検量線作成用とた、サンプル間のmRNA量を補正するために、β-Actinを内して上記10種のtotal RNAのうち4種（心臓、脾臓、筋肉、肺）部標準として使用しました。プライマー濃度は各0.2μMに設をピックアップして混合したものについて、200ngおよびそ定しました。各プライマーの配列を表1に示します。

の5倍希釈系列を作成し、それぞれ同時に反応を行いました。

5

No.85.qx 06.11.10 20:12 ページ 6

表1

増幅用プライマー
Forward Primer

Reverse Primer

領域長

PKCδ

AGATTGCCGACTTTGGGATGTACAGAAGGACCCCGAAAGA

154bp

PKCε

GGATGTGCAAGGAAGGGATTGCCATCATCTCGTACATCAG

151bp

PKCη

AGGGTCACTGTAAACTGGCA

TCATAGAGCAACACGCCCAT

168bp

PKCθ

TGTTAGGAGATGCCAAGACGTGGAAAGGCGACTGACCAAT

151bp

β-Actin

AGAAAATCTGGCACCACACC

AGAGGCGTACAGGGATAGCA

188bp

3. 反応機器・条件:

一口メモ

Applied Biosystems 7900HTを使用して、以下の条件にnovel Protein Kinase C（nPKC）についてて増幅検出を行いました。

細胞内シグナル伝達システムにおいて重要な役割を果たしている
Protein Kinase C（PKC）
は、現在9種類のサブタイプ（ヒトの場合）が知られていますが、それらは、ホルボールエステル結合部位、カルシウ
ムイオン結合部位を持つconventional PKC（cPKC）、カルシウムイオン結合部位を欠くnovel PKC（nPKC）、更にホルボールエステル結合部位も欠くatypical PKC（aPKC）に大別されます。このうち、nPKCに分類されるものは4種類あり、それぞれδ、ε、η、θと呼ばれています。それぞれのサブタイプは組織別の発現量分布に差があることが知られていますが、機能との関わりは完全には解明されていません。

結果及び考察1. β-ActinおよびPKCの標準曲線作成
今回、相対定量に用いる検量線用のスタンダードとして、nPKCの発現が高いと予想された4つの臓器由来のtotal RNAを混合したものを希釈して用いました（200×5−nng（n=0,1,2…））。まず、それぞれCt値より、β-Actinおよび各PKCサンプルの検量線を作成しました。また同時に、それぞれの組織由来のサンプルを 1反応あたり
50ng、および200ngを用いて同様に増幅しました。
その結果、鋳型量とCt値との相関性は極めて良好であることが示されました。β-Actinの検量線を図3に示します。また、融解曲線解析の結果、プライマーダイマー等の生成は確認されませんでした。
相対定量の場合、プラスミド等にクローニングした遺伝子から転写反応を用いて合成したRNAを定量のスタンダードにする方法もありますが、今回のように単に生体より抽出したRNAを希釈して用いるだけ

図3．β-Actinの検量線でも問題なく検量線を作成できました。
2. PKC各サブタイプの組織毎の発現量算出
β-Actin、およびPKC各サブタイプの検量線を用いて、それぞれの遺伝子の組織別存在量を算出しました。次に、
β-ActinのmRNAの相対量で補正し、各組織における各PKCの相対発現量を算出しました（図4）。
その結果、PKCε、PKCθにおいて、組織別発現量分布が大きく偏っていることが明らかになりました。この結果は既に報告されている情報と良く一致していることが確認できました 1）
2）。また今回、50ngと200ngのtotal RNAを用いてPCR反応を行い、それぞれ相対値を算出しましたが、どちらの濃度のRNAにおいてもほぼ同じ結果を示しました。

図4．PKC各サブタイプの組織別発現量
各グラフの左側のバーが50ng RNA使用時、右側のバーが200ng RNA使用時のデータをそれぞれ示す。縦軸は相対発現量を示す。

6

No.85.qx 06.11.10 20:13 ページ 7

3. 2-step反応系との結果比較:
1-step反応系と2-step反応系（逆転写反応とリアルタイムPCRとを別に実施）の結果に整合性があるかどうかを確認するため、弊社高効率逆転写キットReverTra Ace -α- ®（CodeNo.：FSK-101）と、リアルタイムPCRキット SYBR ®
Green Realtime PCR Master Mix -Plus-（Code No.：
QPK-211）とを用い、核酸増幅リアルタイムモニタリ
ング装置：LineGene（BioFlux社）による2-stepリア
ルタイムPCRを実施した場合との結果の比較を行いました（PKCδのみ実施）。
その結果、図5に示すように、両者の結果はほぼ一致しており、1-step反応系による結果は2-step反応系と同等

図5．1-step反応系と2-step反応系の比較（PKCδ）
グラフの左側と中央のバーは図4のPKCδの解析結果と同じ物（1-step：50ngと200ng）。右側のバーが2-step（Total RNA 10ng相当の逆転社反応液を使用）反応系での結果を示す。縦軸は相対発現量を示す。

の信頼性があり、2-step反応系から1-step反応系への移行も容易であることが示されました。

まとめ
RNA-direct TM Realtime PCR Master Mixを用いた1-step

量の少ないmRNAの解析にも力を発揮するものと思われます。

リアルタイムPCRでは、多数のサンプルの処理をより簡便に行

現在、2-step系の試薬を用いて行っている実験も、1-step系試

うことが可能で、実験系のハイスループット化に適しています。

薬での解析に向いている場合も多々あると推察されます。『RNA-

今回の検討においても、本系の再現性は良好で、かつ2-step反

direct TM Realtime PCR Master Mix』を是非一度お試しくだ

応系とも高い整合性が示されました。また、1-step系では2-さい。

step系に比べ鋳型RNAを多く持ち込める傾向にあるため、発現

参考文献

1）Akita Y. et al., J Biol Chem. 265：354-362（1990）
2）Osada S. et al., Mol Cell Biol. 12：3930-3938 （1992）

品

名

包

One-step qPCR Kit（TaqMan® アッセイ・プローブアッセイ用）

RNA-direct TM Realtime PCR Master Mix
One-step qPCR Kit（SYBR® Greenアッセイ用）

RNA-direct TM SYBR® Green Realtime PCR Master Mix

装＊

格＊＊

保存温度

Code No.

価

40回用（0.5ml×2）
100回用（0.5ml×5）-20℃

QRT-101T
QRT-101￥17,000￥33,000

40回用（0.5ml×2）
100回用（0.5ml×5）-20℃

QRT-201T
QRT-201￥17,000￥33,000＊1反応50μlとした場合の使用回数を記載しています。
※RNA-direct TM Realtime PCR Master Mixおよび RNA-direct TM SYBR® Green Realtime PCR Master Mixには、Passive Reference色
素があらかじめ混合されています。プレートタイプのPCR機器にそのままご使用いただけますが、Passive Reference色素を使用しないPCR機器への影響もありません。
※RNA-direct TM Realtime PCR Master Mixおよび RNA-direct TM SYBR® Green Realtime PCR Master Mixには、必要量の酢酸マンガン溶液が別チューブで添付されます。
※PCR（Polymerase Chain Reaction）は、F. Hoffman-La Roche社が米国特許（特許番号4,683,195および4,683,202）を有しています。PCRの実施に当たっては許可が必要となります。本品はF. Hoffman-La Roche社が有するPCRに関する特許の使用許可を示唆するものではありません。
※LightCyclerTMは、Idaho Technology Inc.並びにRoche Molecular Systems Inc.の商標です。
※SYBR®は、Molecular Probes Inc.の登録商標です。
※TaqMan®は、Roche Molecular Systems Inc.の登録商標です。

今号に関連のある記事をピックアップして詳しくご紹介するコーナーです。

『TArget CloneTM』（本誌p.9掲載）
TArget CloneTMシリーズは、様々なPCRプロダクトを高効率にTAクロ

KOD DNA polymeraseの活性を抑える2種類のモノクローナル抗体とTaqーニングするために開発されたキットです。PCRプロダクトの末端の形状

DNA polymeraseが使われており、PCR後に残存したKOD DNA

によって、2種類のキットを使い分けます。A付加を受けた通常のPCRプロ

polymeraseの活性を抑えつつ、Taq DNA polymeraseの活性により増幅

ダクトのクローニングには、「TArget CloneTM」を用います。一方、高正産物の末端にA付加を行います。

確性酵素であるKOD -Plus- や KOD -Plus- Ver.2で増幅された、末端がブ

ただ、紛らわしいのは、Blend Taq ®やKOD Dash ®のような、2つのTM

PCR酵素を混合したタイプの高性能ポリメラーゼの場合です。弊社のウェ

ラントエンド になっているPCRプロダクトの場合は、「TArget Clone-Plus-」を用います。これらの酵素は、強い3'→5'エキソヌクレアーゼ活性

ブサイト（http://www.toyobo.co.jp/bio）の『PCRコーナー』では、（校正活性）を有するため、増幅産物はその末端が平滑化されてしまい、通PCR酵素別にPCRプロダクトの末端の形状を分かりやすくまとめています。

常の方法ではTAクローニングができません。TArget CloneTM -Plus-には、

是非一度ご参照ください。

7

No.85.qx 06.11.10 20:13 ページ 8

本製品はすでに販売を中止しております。

Products

ヒト正常/病態組織由来cDNA（臨床情報添付）
正常人および各種疾患患者の組織由来のcDNAです。
本製品は、正常人あるいは各種疾患患者の組織から抽出したTotal RNAを鋳型として、合成したcDNAです。本製品を鋳型としてリアルタイムPCRを行うことで、疾患特異的または組織特異的な目的遺伝子の発現解析を行うことが可能です。また、目的遺伝子のクローニング用の鋳型として用いることもできます。

特長1 詳細な臨床情報を添付
・ヒト正常/病態組織由来cDNAには、詳細なドナーの臨床情報を添付しております。臨床情報には、ドナーの身体的特徴だけ
でなく、既往歴、投薬歴等に関する情報が含まれます。それぞれの疾患、組織由来のcDNAについて複数のロットをご用意しております（ロット番号はそれぞれ別のドナーを示します）。〈ご購入前に各ロットの臨床情報をご確認いただけます。弊社テクニカルライン（TEL: 06-6348-3888・FAX: 06-6348-3833・E-mail: techosk@bio.toyobo.co.jp）までご連絡ください〉※倫理面での対応について
本製品の製造に用いたヒト組織由来Total RNAは、
Asterand社（http://www.asterand.com）
から入手しています。ヒト組織については、研究、臨床開発
用途での使用を目的とした試料、関連情報の提供、保有に適用されるすべての法律、規則、ガイドラインに従って入手、提供されています。
1）
すべてのサンプルでインフォームドコンセントが得られています。
2）
すべてのサンプルで2度にわたる非連結匿名化が行われています。

特長2 簡便な操作・リアルタイムPCRおよびPCRの鋳型として、そのまま、もしくは希釈して使用可能です。
・本製品は、高効率逆転写酵素『ReverTra Ace®』を用いて逆転写反応を行った溶液です。逆転写にはオリゴdTプライマーを用いています。製品には、逆転写反応に用いた成分が含まれています。

〈増幅曲線〉〈リアルタイムPCR反応組成〉

ACE: angiotensin converting enzyme
β-actin

D.W.

2.2（μl）

SYBR® Green Realtime PCR Master Mix

5（Code No.: QPK-201）

MCP-1: monocyte chemoattractant protein-1

Primer F（10μM）

0.4

Primer R（10μM）

0.4

ヒト病態組織由来cDNA（糖尿病・腎臓）（200倍希釈） 210（μl）

図1．SYBR® Greenアッセイによる各種遺伝子の増幅例【測定装置：Bioflux社LineGene（Code No.:BFFQD-33A）
】

品

名

装＊

保存温度

Code No.

ヒト正常組織由来cDNA

（すい臓）

20回用

-80℃

DCPN-PC101¥20,000（臨床情報添付）

（腎臓）

20回用

-80℃

DCPN-KD101¥20,000

（筋肉）

20回用

-80℃

DCPN-MS101¥20,000

（冠動脈）

20回用

-80℃

DCPN-HT101¥20,000（大脳皮質）

20回用-80℃

DCPN-CC101¥20,000

（海馬）

20回用

-80℃

DCPN-HC101¥20,000

ヒト病態組織由来cDNA（糖尿病・すい臓）

20回用

-80℃

DCPD-PC101¥20,000（臨床情報添付）（糖尿病・腎臓）

20回用

-80℃

DCPD-KD101¥20,000（糖尿病・筋肉）

20回用

-80℃

DCPD-MS101¥20,000（高血圧・冠動脈）

20回用

-80℃

DCPD-HT101¥20,000（高血圧・腎臓）

20回用

-80℃

DCPD-KD201¥20,000（アルツハイマー病・大脳皮質）

20回用

-80℃

DCPD-CC101¥20,000

包価

格＊原液を1反応に1μl使用した場合の使用回数を示しています。適宜希釈してご使用いただけます。 ※ロット情報については、お問い合わせください。
2ステップ系のリアルタイムPCR試薬をお使いいただけます。詳しくは、本誌p.10〜13「Product Selection Guide（特集）」をご覧ください。

8

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Products
高効率TAクローニングキット

TArget CloneTM/TArget CloneTM -Plus汎用性の高いTAクローニングキットです。リアルタイムのコントロールRNAの調製にも応用可能です。
高効率なTAクローニングキットです。種々のPCRプロダクトに対応することができます。

特長1 迅速・高効率TAクローニング
・ライゲーション反応は最短5分で完了します。PCRプロダクトの精製は必要ありません。

特長2 様々なPCRプロダクトに使用可能
TArget CloneTM

Taqをはじめとする一般的なPCR酵素で増幅したPCRプロダクトを高効率でTAクローニング可能。

TArget CloneTM-Plus-

高正確性酵素：KOD DNA Polymarase, KOD -Plus-,およびKOD -Plus- Ver.2で増幅したプロダクトを高効率でTAクローニング可能。※KOD DNA polymerase（KOD Dash®
除く）で増幅したPCRプロダクトの末端は強い校正活性により平滑化されています。

特長3 リアルタイムPCRのコントロールRNAの調製に使用可能
・pTA1プラスミドのMCSの両端にT7とT3プロモーターがあり、クローニングした配列のRNAを転写反応で作製することもできます（図1参照）。インサートの有無は、青白判定できるようになっています。

図1．pTA2ベクターの
MCSの構造実施例

図2．使用ポリメラーゼによるTAクローニング効率の比較

様々なポリメラーゼのPCR産物を用いたTAクローニング例

高正確性酵素：KOD -Plus-、KOD -Plus- Ver.2、および高性能Taq：Blend Taq®を用いて、human β-globin遺伝子0.5kbを増幅し、精製なしで、TArget CloneTM、およびTArget CloneTM -Plus-を用いて、TAクローニングを行いました。
結果、KOD -Plus-およびKOD -Plus-Ver.2の場合、TArget CloneTM-Plus-を用いることにより、格段にクローニング効率が向上
することが分かりました。一方Blend Taq®では、TArget CloneTMを用いても問題なく高効率にTAクローニングできることが分かりました（図2）。（Blend Taq®はTaq DNA polymeraseに、微量の校正活性（3'→5' エキソヌクレアーゼ活性）を有する酵素が混合されていますが、その末端はかなりA付加されていることが確認されています。）
品 名 お よ び 内 容

装

保存温度

Code No.

(pTA2 Vector, 2×Ligation Buffer, T4 DNA Ligase)

10回用

-20℃

TAK-101￥12,000

TArget CloneTM -Plus- (pTA2 Vector, 2×Ligation Buffer, T4 DNA Ligase, 10×A-attachment Mix)

10回用

-20℃

TAK-201￥16,000

TArget Clone

TM

品 名 お よ び 内 容

包

備

考

包

装

保存温度

Code No.

価

価

格

格

KOD -Plus-

正確性はTaqの約80倍。ホットスタート対応

200U×1本-20℃

KOD-201￥30,000

KOD -Plus- Ver.2

正確性はKOD -Plus-と同等。
リライアビリティーUP

200U×1本-20℃

KOD-211¥32,000

高性能Taqポリメラーゼ（正確性はTaqの約3〜4倍） 250U×1本-20℃

BTQ-101¥19,000

ホットスタート対応で更に特異性UP

250U×1本-20℃

BTQ-201¥21,000

60回用

-20℃

TSK-101¥28,000

Blend Taq®

Blend Taq® -Plus-

ScriptMAX Thermo T7 Transcription Kit 高効率なT7プロモーターからの転写反応に最適®

9

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本製品はすでに販売を中止しております。

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本製品はすでに販売を中止しております。

Products

Real Time PCR Primer/Positive Control Kit・FRET Probe Kit
リアルタイムPCR用プライマーセットとTaqMan®アッセイ用FRETプローブです。
リアルタイムPCR解析に最適なプライマーセット、およびTaqMan®アッセイ用のFRET Probeです。インターカレーターアッセイ、および
TaqMan®アッセイ（FRET Probe使用）にお使いいただけます。弊社のリアルタイムPCRマスターミックス試薬でのアッセイに最適です。

特長1 高い特異性・増幅効率が良く、非特異的増幅が起こらないように設計されたプライマーセットです。

特長2 インターカレーターアッセイ、およびTaqMan®アッセイに最適
・Primer/Positive Control Kitを用いることによりインターカレーターアッセイ、加えてFRET Probe Kitを使用することでTaqMan ®アッセイを簡便に行うことができます。プローブの5 端はFAMで、3 端に非蛍光クエンチャー（Black Hole
Quenchar®）で標識されており、バックグラウンドの低い結果を得ることができます。

特長3 Flexible
・Primer/Positive Control Kitには、PCR用バッファーが含まれており、Taq DNA polymerase（Code No.:TAP-201など）やSYBR® Green Ⅰ等をご準備いただくことにより、そのままリアルタイムPCR用の試薬としてもご使用いただけます。
弊社Realtime PCR Master Mixなどの専用試薬をご使用いただくことで、更に簡便に良好な結果を得ることが可能です（本誌p10〜13に関連記事がございます）。

〈キット内容〉（キットによって若干異なることがございます）【Primer/Positive Control Kit】
Primers（10×）

500μl

Positive Control（DNA）

100μl〈108copies/μl〉
2×Realtime PCR Buffer 1250μl×2
ddH2O（DNase free）

2.0ml【FRET Probe Kit】
図1．SYBR® Greenアッセイ（IL-6）

図2．TaqMan® アッセイ（HHV-6）

FRET Probe（10×）

500μl※Primer/Positive Control Kitの場合、製品名は『Real Time PCR Primer/Positive Control Kit 遺伝子名 』となります。
※FRET Probe Kitの場合、製品名は『Real Time PCR FRET Probe Kit 遺伝子名 』となります。
●Human
遺 伝 子 名包Primer/Positive Control Kit
価格
Code No.

FRET Probe Kit
価Code No.

装

保存温度

Human GAPDH

100回用

-20℃

MBTM60001¥34,000

MBTP10001¥29,000

Human 18S rRNA

100回用

-20℃

MBTM60002¥34,000

MBTP10002¥29,000

Human Bax

100回用

-20℃

MBTM60003¥34,000

MBTP10003¥29,000

Human Bcl-2

100回用

-20℃

MBTM60004¥34,000

MBTP10004¥29,000

Human Bcl-xL

100回用

-20℃

MBTM60006¥34,000

MBTP10006¥29,000

Human β-actin

100回用

-20℃

MBTM60007¥34,000

MBTP10007¥29,000

Human c-Myc

100回用

-20℃

MBTM60008¥34,000

MBTP10008¥29,000

Human Cyclophilin

100回用

-20℃

MBTM60009¥34,000

MBTP10009¥29,000

Human HER-2

100回用

-20℃

MBTM60011¥34,000

MBTP10011¥29,000

Human IFN-γ

100回用

-20℃

MBTM60012¥34,000

MBTP10012¥29,000

Human IL-10

100回用

-20℃

MBTM60013¥34,000

MBTP10013¥29,000

Human IL-1β

100回用

-20℃

MBTM60016¥34,000

MBTP10016¥29,000

Human IL-6

100回用

-20℃

MBTM60020¥34,000

MBTP10020¥29,000

14

格No.85.qx 06.11.10 20:13 ページ 15

遺 伝 子 名包Primer/Positive Control Kit
価格
Code No.

FRET Probe Kit
価Code No.

装

保存温度

Human p21

100回用

-20℃

MBTM60022¥34,000

MBTP10022¥29,000

Human p27

100回用

-20℃

MBTM60023¥34,000

MBTP10023¥29,000

Human p53

100回用

-20℃

MBTM60024¥34,000

MBTP10024¥29,000

Human TERT

100回用

-20℃

MBTM60025¥34,000

MBTP10025¥29,000

Human TNF-α

100回用

-20℃

MBTM60026¥34,000

MBTP10026¥29,000

Human IL-4

100回用

-20℃

MBTM60028¥34,000

MBTP10028¥29,000

Human IL-8

100回用

-20℃

MBTM60030¥34,000

MBTP10030¥29,000

Human IL-18

100回用

-20℃

MBTM60031¥34,000

MBTP10031¥29,000

Human sFLT1

100回用

-20℃

MBTM60044¥34,000

MBTP10044¥29,000

Human Caspase-1

100回用

-20℃

MBTM60049¥34,000

MBTP10049¥29,000

Human Caspase-3

100回用

-20℃

MBTM60050¥34,000

MBTP10050¥29,000

Human FAS

100回用

-20℃

MBTM60051¥34,000

MBTP10051¥29,000

Human FAS Ligand

100回用

-20℃

MBTM60052¥34,000

MBTP10052¥29,000

Human MMP-3

100回用

-20℃

MBTM60053¥34,000

MBTP10053¥29,000

Human IBP-3

100回用

-20℃

MBTM60054¥34,000

MBTP10054¥29,000

包

装

保存温度

Mouse FLK

100回用

-20℃

MBTM60005¥34,000

MBTP10005¥29,000

Mouse APE

100回用

-20℃

MBTM60014¥34,000

MBTP10014¥29,000

Mouse CD61

100回用

-20℃

MBTM60015¥34,000

MBTP10015¥29,000

Mouse CTA

100回用

-20℃

MBTM60017¥34,000

MBTP10017¥29,000

Mouse FNE

100回用

-20℃

MBTM60018¥34,000

MBTP10018¥29,000

Mouse MGP

100回用

-20℃

MBTM60019¥34,000

MBTP10019¥29,000

Mouse PGFR

100回用

-20℃

MBTM60021¥34,000

MBTP10021¥29,000

Mouse β-Actin

100回用

-20℃

MBTM60032¥34,000

MBTP10032¥29,000

Mouse 18S

100回用

-20℃

MBTM60033¥34,000

MBTP10033¥29,000

Mouse Bcl-2

100回用

-20℃

MBTM60035¥34,000

MBTP10035¥29,000

Mouse GAPDH

100回用

-20℃

MBTM60036¥34,000

MBTP10036¥29,000

Mouse IL-12p40

100回用

-20℃

MBTM60037¥34,000

MBTP10037¥29,000

Mouse IL-18

100回用

-20℃

MBTM60038¥34,000

MBTP10038¥29,000

Mouse IL-1β

100回用

-20℃

MBTM60039¥34,000

MBTP10039¥29,000

Mouse IL-2

100回用

-20℃

MBTM60040¥34,000

MBTP10040¥29,000

Mouse IL-3

100回用

-20℃

MBTM60041¥34,000

MBTP10041¥29,000

Mouse IL-6

100回用

-20℃

MBTM60042¥34,000

MBTP10042¥29,000

Mouse TNF-α

100回用

-20℃

MBTM60043¥34,000

MBTP10043¥29,000

Mouse sFLT1

100回用

-20℃

MBTM60045¥34,000

MBTP10045¥29,000

包

装

保存温度

100回用

-20℃

MBTM60027¥34,000

MBTP10027¥29,000

CMV, Major immediately early gene 100回用-20℃

MBTM60034¥34,000

格●Mouse
遺 伝 子 名Primer/Positive Control Kit
価格
Code No.

FRET Probe Kit
価Code No.

格●Virus/Bacteria
遺 伝 子 名HHV6

Primer/Positive Control Kit
価格
Code No.

FRET Probe Kit
価Code No.

格

MBTP10034¥29,000＊

HBV+Internal Control

100回用

-20℃

MBTM60046I¥49,000

MBTP10046I¥53,000＊＊

HCV+Internal Control

100回用

-20℃

MBTM60047I¥49,000＊

MBTP10047I¥53,000＊＊

CTR

100回用

-20℃

MBTM60048¥34,000

MBTP10048¥29,000

CTR+Internal Control

100回用

-20℃

MBTM60048I¥49,000＊

MBTP10048I¥53,000＊＊＊インターナルコントロールが添付が添付されています。
＊＊ROX標識したインターナルコントロール特異的TaqMan®プローブが添付されています。2波長で励起可能な検出機が必要です。
※詳しくは、MBIのホームページ（http://www.maximbio.com/）をご覧ください。
※SYBR®は、Molecular Probes Incの登録商標です。TaqMan®はRoche Molecular Systems Inc.の登録商標です。
※Black Hole Quenchar®は Biosearch Technologies, Inc.の登録商標です。

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Products

本製品はすでに販売を中止しております。

核酸増幅リアルタイムモニタリング装置

LineGene

核酸の増幅過程をリアルタイムモニタリング。コストパフォーマンスに自信あり。
LineGeneは、核酸の増幅過程をリアルタイムにモニタリングする装置です。33フォーマットのパーソナル設計で、再現性と精度に優れています。機器本体価格、およびランニングコストについて高パフォーマンスを実現しています。

特長1 優れたコストパフォーマンス

特長3 多様な系に対応・対応試薬は、SYBR® GreenⅠ、TaqMan® Probes（レポーター分・測定に専用チューブやキャピラリーは不要で、汎用0.2ml
PCR用チューブを使用できます。

子：FAM、クエンチャー分子：TAMRA）、Hybridization Probes、
Molecular Beaconなど、多様な系に対応します。

・少ない反応ボリューム（10μl〜）で安定した結果を実現します。

励起波長：470nm

・試薬ランニングコストを低減※します。

検出波長：530nm 、640nm 、710nm※反応ボリューム10μlで…37円/チューブ（弊社キットSYBR ®

特長4 ソフトウェア

Green Realtime PCR Master Mixを用いた場合）・増幅曲線のリアルタイム表示により、反応の進行状況を確認

特長2 高感度オプティカルユニット

可能です。また、ランニング中にグラフのスケールを拡大し・励起用光源は、発熱性が低く安定かつ長寿命のBlue LED

反応初期の微小な蛍光をモニタリングすることも可能です。

を採用しています。

・増幅の程度に合わせ、反応中にサイクルを追加、削除する

・検出器は、検出限界が高く高速応答低ノイズのPMTを採用ことも可能です。

しています。

・定量解析および融解曲線解析（SYBR® GreenⅠアプリケ

・この光学系により、蛍光シグナル信号を高感度かつ高速にーション）のどちらも可能です。

読み取り可能です。

性・測定の生データをダウンロード可能。

能■テンプレート濃度2倍差の検出
初期の鋳型濃度が2倍差のサンプル
を、はっきりと区別して検出できます。
■ウェル間均一性
全ウェルにわたり同等の解析が可
能です。

主な仕様

■ダイナミックレンジ（図上・右）
広範囲かつ正確に未知試料を定量できます。
10コピー程度の低濃度での検出も可能です。

サンプル容量：0.2ml×33本
励起波長：

470nm

検出波長：

530nm

温度精度（設定温度）：≦±0.5℃（95℃）≦±0.3℃（72℃）≦±0.2℃（55℃）

640nm

710nm

励起用光源： Blue LED

温度均一性（設定温度）：≦±1.0℃（95℃）≦±0.5℃（72℃）≦±0.3℃（55℃）

蛍光検出器： フォトマルチプライヤーチューブ
（PMT）

電源：

100V

50/60Hz

最大消費電力： 1000W

温度制御範囲： 30℃〜99℃

外形寸法：

W514×D456×H292（mm）

温度変化率： 最大4℃/sec

重量：

23㎏

（2ステップ，45サイクルの反応=約90分）

品 名 及 び 内 容

包

核酸増幅リアルタイムモニタリング装置

装1式

LineGene（本体 + ソフトウェア）※製品の性能および仕様、
外観は改良のため予告なく変更することがある。

Code No.
BFFQD-33A

価¥1,890,000®

※SYBR は、Molecular Probes社の登録商標です。
※TaqMan®は、Roche Molecular Systems社の登録商標です。
※Hybridization ProbesはHoffman La Roche社の実施許諾が必要です。

●訪問デモを行っております
ご依頼は、弊社ウェブサイト（http://www.toyobo.co.jp/bio）の『お問い合わせ・ご請求』のコーナーから行うことができます。お気軽にお問い合わせください。

16

格No.85.qx 06.11.10 20:13 ページ 17

Products
高正確性PCR用酵素

KOD -Plus- / KOD -Plus- Ver.2
リアルタイムPCR用のコントロール遺伝子のクローニングにも力を発揮します。
本酵素は、KOD DNA polymeraseをベースに開発された高正確性PCR用酵素です。ホットスタート対応 で、特性の高いPCRを実現しています（2種類の抗KOD Pol.抗体を混合）。KOD -Plus- Ver.2は、バッファーの改良により、正確性を保ちつつPCRリライア
ビリティー（成功率）を向上させています。

特長

高い正確性

・3'→5' エキソヌクレアーゼ活性によって非常に高い正確性を示します（Taq pol.の約80倍）。増幅したPCRプロダクトの末端は平滑化されますが、TArget CloneTM -Plus-（Code No.: TAK-201：本誌P9に掲載）を用いることによってTAクローニングすることも可能です。

実施例
100
90

正確性（対KOD -Plus-）

80
70
60

KOD -Plus-

50

A社High Fidelity酵素

40

B社High Fidelity酵素［A］

30

C社High Fidelity酵素

20

B社High Fidelity酵素［B］

10

Blend Taq -Plus-R

D社Long PCR用酵素0

図1．
他社酵素との増幅比較

品

名

図2．
他社酵素との正確性比較

保存温度

Code No.

価

KOD -Plus-

200U× 1本
200U× 5本
200U×11本

包

装

-20℃

KOD-201
KOD-202
KOD-203￥30,000￥120,000￥230,000格

KOD -Plus- Ver.2

200U× 1本

-20℃

KOD-211￥32,000※PCR（Polymerase Chain Reaction）は、F. Hoffman-La Roche社が米国特許（特許番号4,683,195および4,683,202）を有しています。PCRの実施に当たっては許可が必要となります。本品はF. Hoffman-La Roche社が有するPCRに関する特許の使用許可を示唆するものではありません。

実験川柳特集
今回は日々の実験の一コマをユニークに切り取った実験川柳を特集いたします。沢山のご投句ありがとうございました。
●詠み人 匿名希望 OHさん

●詠み人 匿名希望 さすらいのサーファーさん【句評】なかなか良いセンスですね。バンドが得られない場合は、是非、Can
Get Signal ®をお使いくださいませ。

【句評】かなり字余りですが、リアルな句ですね…。換気の悪い部屋での火気の取り扱いにはお気をつけて！
●詠み人 匿名希望 リクロマトの達人さん【句評】あまり遭遇したくない状況ですね。何の実験だったのでしょうか？
【句評】あまりなりたくない達人ですね…。ぎりぎりの心理状態がよく詠めています。その蛋白質、きちんと活性があるといいですね。

受付は終了
募集要項が同封のアンケートの裏面にございます。奮ってご応募ください。しております【句評】日常の光景が良く詠めていると思います。少なくとも一度といわず遭
遇する体験ですよね。
＜OHさん、沢山ご投句ありがとうございました。またお待ちしております！＞

17

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プロテインキナーゼ･ホスファターゼ
基質ペプチド■2006年12月6日〜2007年2月26日の期間中、プロテインキナーゼ・ホスファターゼ基質
ペプチドを20%OFFでご購入いただけます。

本製品はすでに販売を中止して
おります。
ーン
ペ
ン
キャ

f

20%of

プロテインキナーゼ・ホスファターゼの活性測定に最適な高純度ペプチドです。

AnaSpec社は、様々なペプチド関連試薬を扱っている米国

一口メモのペプチドカンパニーです。今回、プロテインキナーゼ・ホ

プロテインキナーゼ・ホスファターゼ
活性の測定には、N末端をビオチンや蛍光物質で標識したものも使用されます。また、非特異反応を軽減するためにC末端のカルボキシル基をアミド化して使用する場合もあります。
有名なペプチド基質には、名前が付いているものも多く存在します。

スファターゼの基質ペプチドを対象に20%OFFでお届けします。ここに掲載した以外にも、アミド化、ビオチン化、蛍光化ペプチド(FAM、TAMRA化等)なども含め、100以上のペプチドを対象といたします。詳しくは、弊社ホームペー
ジ(http://www.toyobo.co.jp/bio）『キャンペーン』コー
ナーをご覧ください。一覧表をご参照いただけます。

保存温度：-20℃
品名及び内容価格

キャンペーン
価 格

参考文献

包装

Code No.

CREBtide [KRREILSRRPSYR]

1mg

AS60510-1 ¥19,000¥15,200

Kemptide [LRRASLG]

5mg

AS22594¥12,000¥9,600

PKA; PKC; MAPKAP-K1 Substrate [RRRLSSLRA-NH2]

1mg

AS29983-1 ¥18,000¥14,400

PKCμ Substrate [AALVRQMSVAFFFK]

1mg

AS29924-1 ¥18,000¥14,400

PKC Substrate [RRGRTGRGRRGIFR]

1mg

AS60542-1 ¥19,000¥15,200

J. B. C. 381, 19-27 (2000); J. B. C. 274, 30722-8 (1999).

AS60560-1 ¥19,000¥15,200

J. B. C. 277, 41850 (2002); J. B. C. 270, 6156 (1995);
J. B. C. 266, 14390 (1991).

AS27183¥16,800

PKCδ Substrate [RFAVRDMRQTVAVGVIKAVDKK]

1mg

Protein Kinase Cε Peptide Substrate [ERMRPRKRQGSVRRRV] 1mg¥21,000

Nucleic Acids Res. 20, 6106 (1992).
Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 505 (2002);
Eur. J. Biochem. 252, 245 (1998).
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83, 5968 (1986);
FEBS Lett. 175, 219 (1984); J. Biochemistry 42, 849 (2003).
J. B. C. 278, 319 (2003); J. B. C. 277, 45451 (2002);
J. B. C. 272, 952 (1997).

J. B. C. 265, 7301 (1990); FEBS Lett. 243, 351 (1989).

MARCKS Protein (154-165) [KKRFSFKKSFKL]

1mg

AS27165¥12,000¥9,600Glycogen Synthase 1-8 [PLSRTLSVAAKK-NH2]

1mg

AS23013¥12,000¥9,600

Pharmacol. Ther. 93, 271 (2002); J. B. C. 272, 4072 (1997);
J. B. C. 268, 1501(1993).
Biochem. J. 268, 303 (1990); J. B. C. 262, 772 (1987);
J. B. C. 260, 14471 (1985).

Neurogranin 28-43 [AAKIQASFRGHMARKK]

1mg

AS27173¥20,000¥16,000

Biophys. J. 72, 554 (1997); Biochemistry 32, 1032 (1993).

Protein Kinase G Substrate [QKRPRRKDTP]

1mg

AS27185¥18,000¥14,400

Cell 112, 77 (2003); J. B. C. 274, 3485 (1999).

PKG Substrate [RKRSRAE]

1mg

AS60298-1 ¥14,000¥11,200

J. B. C. 274, 3485-95 (1999); J. B. C. 221, 581-93 (1994).

BPDEtide [RKISASEFDRPLR]

1mg

AS60506-1 ¥19,000¥15,200

Autocamtide-2 [KKALRRQETVDAL]

1mg

AS60249-1 ¥13,000¥10,400

J. Pharmacol. Exp. Ther 283, 885 (1997);
J. B. C. 258, 11391 (1983).
Brain Res. 962, 41 (2003); Brain Res. 851, 54 (1999);
Am. J. Physiol. 274, E708 (1998).

Autocamtide-3 [KKALHRQETVDAL]

1mg

AS29973-1 ¥17,000¥13,600

J. Appl. Physiol. 88, 352 (2000); J. B. C. 274, 26199 (1999).
Neurosci. Lett. 336, 121-5 (2003); B. B. R. C. 215, 861-7 (1995);
Arch. Biochem. Biophys. 252, 418-25 (1987).

Syntide-2 [PLARTLSVAGLPGKK]

1mg

AS22551¥12,000¥9,600Glycogen Synthase 1-10 [PLSRTLSVSS-NH2]

1mg

AS60514-1 ¥19,000¥15,200

Brain Res. 962, 41 (2003); J. B. C. 265, 17613 (1990).
Neurosci. Lett. 336, 121 ( 2003);
J. B. C. 266, 15391 (1991).

1mg

AS29954-1 ¥14,000¥11,200

AKT/PKB/Rac-Protein Kinase Substrate [ARKRERTYSFGHHA] 1mg

AS29944-1 ¥17,000¥13,600

CaM Kinase II Substrate 281-291 [MHRQETVDCLK-NH2]

J. B. C. 275, 36108 (2000); Annu. Rev. Biochem. 68, 965 (1999).

Crosstide [GRPRTSSFAEG]

1mg

AS60209-1 ¥12,000¥9,600B. B. R. C. 293, 1191 (2002); J. B. C. 272, 30491 (1997);
Annu. Rev. Biochem. 68, 965 (1999).

CDK1 Substrate [HATPPKKKRK]

1mg

AS60522-1 ¥19,000¥15,200

J. Biochemistry 42, 849-56 (2003); Cell 112, 243-56 (2003).

CDK5 Substrate [PKTPKKAKKL]

1mg

AS60026-1 ¥16,000¥12,800

J. Biochemistry 42, 849-56 (2003); J. B. C. 274, 9600-6 (1999).
J. B. C. 278, 5062 (2003);
J. Cell. Biochem. 45, 391 (1991).
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 2365-9 (1992);
Ann. N. Y. Acad. Sci. 973, 265-7 (2002)
Int. J. Impot. Res. 14, 217; J. B. C. 268, 7646 (1993);
J. B. C. 266, 15277 (1991).
B. B. R. C. 198, 898 (1994);
Cell Mol. Biol. Res. 40, 383 (1994).
J. B. C. 278, 4474 (2003); Arch. Biochem. Biophys. 325, 289(1994); B. B. R. C. 198, 898 (1994).
J. Cell Physiol. 194, 13 (2003); Clin. Cancer Res. 9, 516S (2003);
Int. J. Pept. Protein Res. 45, 587 (1995).
J. Cell Physiol. 194, 13 (2003); Clin. Cancer Res. 9, 516S (2003);
Int. J. Pept. Protein Res. 45, 587 (1995).
Int. J. Pept. Protein Res. 45, 587-92 (1995);
Harvey Lect. 94, 81-119 (1998).

¥22,000¥17,600

Tyrosine Hydroxylase 24-33 [KQAEAVTSPR]

1mg

AS60294-1 ¥15,000¥12,000

EGF Receptor 661-681 [KRELVEPLTPSGEAPNQALLR-NH2]

Protein Kinase p34 (cd2) Substrate [ADAQHATPPKKKRKVEDPKDF] 1mg

AS22579

1mg

AS29969-1 ¥34,000¥27,200

Casein Kinase I Substrate [RRKDLHDDEEDEAMSITA] 1mg

AS60547-1 ¥19,000¥15,200

Casein Kinase II Substrate [RRADDSDDDDD]

1mg

AS60537-1 ¥19,000¥15,200

Tyrosine Kinase Peptide 1 [KVEKIGEGTYGVVYK]

1mg

AS60551-1 ¥19,000¥15,200

Tyrosine Kinase Peptide 3 [RRLIEDAEYAARG]

1mg

AS22581¥12,000¥9,600p60c-src Substrate I [YIYGSFK]

1mg

AS27197¥12,000¥9,600※詳細に関しましては、http://www.anaspec.com/をご参照ください。

18

No.85.qx 06.11.10 20:13 ページ 19

QTL LightSpeed® Assay Kitを用いた

本製品はすでに販売を中止しております。

プロテインキナーゼの活性測定-One product for biochemical and cell-based assaysFrauke Rininsland and Casey Stankewicz（QTL Biosystems： URL: http://www.qtlbio.com/）
はじめ に
ゲノムプロジェクトによって明らかとなった500を超える一群究に不可欠であるといえます。また、プロテインキナーゼの細胞のプロテインキナーゼは、今日、ゲノム創薬に適したターゲット

ベースアッセイは、医薬品開発の初期のステージにおける、毒性の有力候補の一つであると考えられています。既に幾つかのプロや代謝の検討などにおいても有用であると考えられています。

テインキナーゼは、主だったシグナル経路の重要な構成要素とししかし、「生化学的アッセイ」と細胞抽出液を用いる「細胞ベて研究が進む一方、様々な疾病（ガン、炎症、神経疾患、心臓血ースアッセイ」の両方に対応可能な活性測定試薬は思ったほど一管病、および代謝疾患など）との関係が報告されています。

般化してないのが現状です。スーパークエンチング法をベースに今後、プロテインキナーゼ経路の理解と新規医薬品開発のため

弊社で開発した『QTL LightSpeed®シリーズ』は「生化学的アには、精製酵素を用いる「生化学的アッセイ」、および細胞粗抽ッセイ」、および「細胞ベースアッセイ」に適したアッセイ試薬

出液を用いる「細胞ベースアッセイ（cell-based assay）」の両の一つです 1）。今回、srcキナーゼのアッセイを例として、ご紹方に対応できる活性測定法が必要であると考えられています。生

介いたします。

化学的アッセイ法は、反応キネティクスの研究や、阻害物質のス【QTL LightSpeed® シリーズの特長】

クリーニングなどに有用です。一方、細胞ベースアッセイは、生理的条件下での酵素活性の検討や、機能スクリーニングなどの研

1. スーパークエンチング法を採用
市販の蛍光リーダーを用いて高感度で測定可能です。
また、抗体を使用しないため、様々なアッセイに応用できます。洗浄工程は不要です。
2. HTSや細胞ベースアッセイに最適
3. 様々な用途に対応● Universal assay Development Kit⇒TAMRA標識ペプチドを合成いただくことで任意のプロテインキナーゼのアッセイ系の構築が可能● Kinase Activity Assay for Protein substrate Kit⇒タンパク質基質を用いた活性測定3）が可能

図1．スーパークエンチング法の原理
リン酸化を受けたペプチドが、リン酸結合担体へ結合することにより、クエンチャ
ーがQTLセンサー（蛍光ポリマーを結合した微小ビーズ）に接近し、ポリマー単位
での消光（スパークエンチング）が生じます。また、この消光とは反対に、クエン
チャーに起因する蛍光は増大するので（enhanced emission）、2波長の比を求めることによって、化合物に起因する蛍光ノイズを低減したよりクリアなデータを得ることもできます2）。

● PI3K Activity Assay Kit⇒PI3Kのような非ペプチド基質をターゲットする
キナーゼの活性測定が可能2）

方 法 お よ び 結 果 （生化学的アッセイ）
図2は、リコンビナント法で発現させ精製したserキナーゼの濃度依存的な活性検出曲線を示しています。また、図3は阻害剤の一種であるStaurosporineの濃度依存的な阻害効果を示しています。アッセイには、QTL
LightSpeed® src Kinase
Activity assayを使用しました。この様に本試薬は、通常の生化学アッセイ系を用いたHTSなどの用途に適している試薬といえます。

図2．QTL Lightspeed® Kitによるsrc活性測定
serキナーゼを段階希釈し、490 nmの減少（スーパークエンチング）を指標として測定した結果を示します（基質:1μM、ATP:100μM）。中のグラフは基質ペプ
チドのリン酸化率を示しています。

19

図3．srcの阻害アッセイ
様々な濃度のStaurosporine存在下でのserキナーゼの活性を示しています（基質:1μM, ATP 6μM）。その結果、StaurosporineのIC50は40 nMと算出されました。

No.85.qx 06.11.10 20:13 ページ 20

細胞ベースアッセイ
細胞ベースアッセイは、ヒト扁平上皮癌細胞株A431細胞の内在性のsrc

図4．細胞抽出液を用いたアッセイ例
A431細胞を96-well white plateで培養した後、20μLのLysis Bufferを添加し、細胞を溶解しました。その後、基質（キット添付）を最終1μMになるように添加し、ATPを添加することによって反応を開始しました（ATP終濃度 100μM）。反応
をpostreaction buffer（キット添付）を加えて停止させ、等量の1×Sensor（ キット添付）を添加した
後、450nmで励起し、490nmと600nmを測定した後、490nm/600nmの比を活性としてプロットしました。

タンパク質をターゲットとして、同試薬を用いて解析を行いました。今回のプロトコール4）を用いると、細胞培養、細胞の溶解、およびキナーゼアッセイ
を全て96穴プレートのウェル内で行うことが可能です。
図4にアッセイの結果を示しました。
値が低いほど活性が強いことを示しています。図5は、細胞ベースアッセイ
時にser特異的阻害剤を添加したときの阻害カーブを示しています。こちら
は、値が高いほど阻害活性が強いこと

図5．細胞抽出液を用いた阻害剤実験
細胞を溶解した後、serの特異的阻害剤である
PP2を段階希釈して各ウェルに添加しました。その他の工程は図4と同じ方法を用いて検出を行いました。

を示しています。両実験ともに良好な結果を得ることができました。

今日、多くのペプチド基質は、一つ以上のプロテインキナーゼを測定します。図6、7は、この方法を用いて測定したそれぞれによってリン酸化を受けることが知られています。そこで、細胞の酵素濃度依存的な反応曲線、および阻害剤（Staurosporine）

抽出液中の特定のプロテインキナーゼの活性を測定する方法とし

濃度依存的な阻害曲線を示しています。

て、目的のキナーゼに対する抗体を用いてアフィニティー精製を

この方法は、従来の煩雑な免疫沈降試薬を用いる方法に比べ簡4）行った後に活性を測定する次のような方法を考案いたしました 。

便で、96穴プレートを用いることができるため、迅速アッセイ

まず、protein A/Gコートされた96穴プレートに抗キナーゼに向く方法といえます。ここでは、srcキナーゼについて紹介し抗体を結合させたプレートに、細胞抽出液を加えます。十分結合ましたが、他のプロテインキナーゼへ応用することも可能です。

を行わせた後、洗浄を行い、非特異的に吸着したタンパク質類を今回、本システムがHTSなどの生化学的アッセイから、細胞除去します。その後、各ウェルに基質溶液を加え反応を行い、上ベースアッセイまで幅広くご使用いただけることをお示ししまし

清を蛍光測定用の白色プレートに移し、前述の方法に従って活性た。是非一度本システムをお試しください。

図6．プレート精製したsrcの濃度依存的反応曲線
段階希釈したA431細胞抽出液を100ngの抗-vSrc抗体を結合したprotein A/Gプレートを用いて精製した後、基質：0.5μM、ATP:75μMを含む反応液で反応を行いました。中のグラフは、算出したリン酸化率を示しています。

参考文献

図7．プレート精製したsrcを用いた阻害剤アッセイ
段階希釈したA431細胞抽出液を100ngの抗-vSrc抗体を結合した
protein A/Gプレートを用いて精製した後、基質：0.5μM、ATP:10
μM、希釈した阻害剤（Staurosporine）を含む反応液で反応を行った。
その結果、StaurosporineのIC50は40 nMと算出されました。

1）Rininsland F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(43): 15295-15300 (2004)2）Stankewicz C. and Rininsland F. J. Biomol. Screen. 11(4): 413-422 (2006)
3）Rininsland F. et al., BMC Biotechnol., 5: 16 (2005)
4）http://www.qtlbio.com/06/pdf/GAdyepepcell.pdf

この度、センサービーズの製法を改良することにより、安価で安定な供給ができるようになりました。是非、この機会にお試しください。また、技術導入相談等もお受けいたします。相談がございましたら、東洋紡テクニカ
ルライン（TEL: 06-6348-3888、E-mail: techosk@bio.toyobo.co.jp）までお気軽にお問い合わせください。

20

No.85.qx 06.11.10 20:13 ページ 21

QTLセンサービーズのみのバルク供給を開始いたします。お問い合わせください。
400 data point¥50/well
800 data point¥25/well【30μlアッセイ系】
3,000〜6,000 data point¥20/well> 6,000 data point

アッセイには、QTLセンサービーズの他に、以下の試薬が必要です。
詳細につきましては、お問い合わせください。
・TAMRA標識基質ペプチド（自家調製可能）
・アッセイバッファー（自家調製可能）（必要に応じて）・TAMRA標識キャリブレーション用ペプチド（リン酸化ペプチド）
・Postreaction buffer¥10/well※キットのバルク見積りお受けいたします。 ※TAMRA標識ペプチドの合成お受けいたします。お問い合わせください。
品 名 及 び 内 容

危

包

装

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® Abl Kinase Activity Assay

400回用(30μl/well)

危

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® Akt1/PKBα Kinase Activity Assay

400回用(30μl/well)

危

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® Aurora A Kinase Activity Assay

400回用(30μl/well)

危

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® Erk1/Erk2 Kinase Activity Assay

400回用(30μl/well)

危

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® Fyn Kinase Activity Assay

400回用(30μl/well)

危

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® IRAK4 Kinase Activity Assay

400回用(30μl/well)

危

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® Jnk3 Kinase Activity Assay

400回用(30μl/well)

危

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® Lyn Kinase Activity Assay

400回用(30μl/well)

危

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® Msk Kinase Activity Assay

400回用(30μl/well)

危

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® p38α Kinase Activity Assay

400回用(30μl/well)

危

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® p70S6 Kinase Activity Assay

400回用(30μl/well)

危

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® PKA Kinase Activity Assay

400回用(30μl/well)

危

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® PKCα Kinase Activity Assay

400回用(30μl/well)

危

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® PKCβI/II Kinase Activity Assay

400回用(30μl/well)

危

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® PKCεKinase Activity Assay

400回用(30μl/well)

危

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® PKCζKinase Activity Assay

400回用(30μl/well)

危

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® Rsk-2 Kinase Activity Assay

400回用(30μl/well)

危

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® Sgk Kinase Activity Assay

400回用(30μl/well)

危

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® Src Kinase Activity Assay

400回用(30μl/well)

危

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® Yes Kinase Activity Assay

400回用(30μl/well)危危

QTL LightSpeed ® Class IA Phosphoinositide 3- Kinase(PI3Kα,PI3Kβ、PI3Kδ、PI3Kγ）Activity Assay

100回用(60μl/well)

QTL LightSpeed ® Universal Assay Development Kit***

400回用(30μl/well)

400回用(30μl/well)
800回用(30μl/well)

保存温度
4℃
4℃
4℃・-20℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃・-20℃
4℃・-20℃
4℃・-20℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃・-20℃
4℃・-20℃

4℃

8000回用(30μl/well)危

QTL LightSpeed ® Kinase Activity Assay For Protein Substrates***

100回用(60μl/well)
400回用(30μl/well)危
危

Code No.

価

価格改定
しました

格

QTK017K100¥49,000

QTK017K400¥88,000

QTK002K100¥49,000

QTK002K400¥88,000

QTK014K100¥49,000

QTK014K400¥88,000

QTK016K100¥49,000

QTK016K400¥88,000

QTK015K100¥49,000

QTK015K400¥88,000

QTK024K100¥49,000

QTK024K400¥88,000

QTK021K100¥49,000

QTK021K400¥88,000

QTK012K100¥49,000

QTK012K400¥88,000

QTK020K100¥49,000

QTK020K400¥88,000

QTK004K100¥49,000

QTK004K400¥88,000

QTK008K100¥49,000

QTK008K400¥88,000

QTK001K100¥49,000

QTK001K400¥88,000

QTK003K100¥49,000

QTK003K400¥88,000

QTK011K100¥49,000

QTK011K400¥88,000

QTK010K100¥49,000

QTK010K400¥88,000

QTK009K100¥49,000

QTK009K400¥88,000

QTK006K100¥49,000

QTK006K400¥88,000

QTK007K100¥49,000

QTK007K400¥88,000

QTK005K100¥49,000

QTK005K400¥88,000

QTK018K100¥49,000

QTK018K400¥88,000

QTK023K100¥49,000

QTK023K400¥88,000

QTK025K004¥78,000

QTK025K008 ¥118,000
QTK025K080 ¥898,000

4℃・-20℃

QTK022K100¥49,000

QTK022K400¥88,000

QTL LightSpeed ® PP2A Phosphatase Activity Assay

100回用(60μl/well)

4℃

QTP002K100¥49,000

QTL LightSpeed ® PTP-1B Phosphatase Activity Assay

100回用(60μl/well)

4℃

QTP001K100¥49,000

50μmoles-20℃

ATP-111¥15,000

ｒATP*

危 本キットのパーツには、消防法における第4類第3石油類（等級Ⅲ）であるジメチルスルホキシド（DMSO）が含まれます。ご注意ください。
＊それぞれのキットにはATP濃度を検討いただく場合を想定してATPが添付されておりません。別途添加してご使用いただく必要があります。
＊＊100回用は96ウェルプレート（60μl）、400回用は384プレート（30μl）での使用を前提としたキット構成になっていますが、どちらでも使用可能です。
＊＊＊基質が含まれておりません。別途ご購入いただく必要があります。詳細は、弊社テクニカルラインまでお問い合わせください。

21

●ヒト正常細胞用培地半額キャンペーン

〜2006年12月27日（ご注文分）

Cell Applications社（CAI）ヒト正常細胞1本とヒト正常細胞用培地1本を一括でご注文いただいたお客様に、培地を半額でご提供させていただきます。詳しくは弊社ウェブサイト・キャンペーンコーナーでご案内しております。
※CAI社の製品を価格改定し、さらにお求め安くなっております。是非この機会にお試しください。

●各種カタログ・ライフサイエンス実験シリーズ発刊
・TOYOBO細胞カタログ
・バイオ機器カタログ（2006年秋号）
・私にもできた！ライフサイエンス実験シリーズ Vol.4「遺伝子発現解析編（後編）」−リアルタイムPCRに挑戦−《弊社ウェブサイトから資料請求いただけます》●カルナバイオサイエンス社のプロテインキナーゼのラインアップが増えました。
本製品はすでに販売を中止してご好評いただいておりますカルナバイオサイエンス社のプロテインキナーゼに19品目が追加されました。
おります。
保存：-80℃、容量：5μg/Vial

品 名
BUBR1

Code No.
価 格
CB05-105 ￥40,000

品 名
MLK2

Code No.
価 格
CB09-116 ￥40,000

品 名
skMLCK

Code No.
価 格
CB02-150 ￥38,000

CDC7/ASK

CB05-109 ￥40,000

MNK1

CB02-145 ￥40,000

TAOK2

CB07-133 ￥40,000

CDK9/CycT1 CB04-110 ￥40,000

MNK2

CB02-146 ￥38,000

TSSK2

CB02-165 ￥40,000

CK2α1

CB05-310 ￥40,000

P70s6kb

CB01-155 ￥38,000

WNK2

CB05-180 ￥40,000

CK2α2

CB05-183 ￥38,000

PAK2

CB07-124 ￥38,000

WNK3

CB05-181 ￥38,000

DLK

CB09-111 ￥40,000

PCTAIRE1

CB04-115 ￥38,000

WNK4

CB05-182 ￥38,000

MAP4K2

CB07-111 ￥40,000●Thermus thermophilus Ribonuclease H（Tth RNase H）販売中止
長らくご愛用いただきましたTth RNase H（Code No.:RNH-201）の販売を終了させていただきました。

●本ページ掲載の試薬類は全て一般研究用の目的にのみ販売しており、医薬品、診断用医薬品、化粧品、食品用等には使用できませんので、十分ご注意ください。誤用による事故については、当社は一切の責任を負いません。
●本ページ掲載商品にには消費税は含まれておりません。実際のご購入価格については弊社代理店へお問い合わせください。
●本ページ中の略号：毒 印は毒物および劇物取締法に基づく医薬用外毒物です。
劇 印は毒物および劇物取締法に基づく医薬用外劇物です。
危 印は消防法に基づく危険物です。

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