24-06

THUNDERBIRD®
Probe qPCR Mix(Code No. QPS-101, QPS-101T)

取扱説明書
TOYOBO CO., LTD.
Bioproducts Sales and Marketing Department
OSAKA JAPANA4195K－ 目 次 －[1] はじめに・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 1[2] 製品内容

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 2[3] 製品のほかに用意するもの[4] 使用方法

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 3

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 5[5] 関連プロトコル: RNA サンプルからの cDNA 合成 ・・12
[6] トラブルシューティング[7] 関連商品

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・13

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・16

ご注意
本キットに含まれる試薬は、すべて研究用試薬です。診断・臨床用試薬として決して使用しないでください。本キットの使用にあたっては、実験室での一般の注意事項を厳守し、安全に留意してください。

※記載している会社名および商品名・ロゴマークなどは、各社の商号、商標または登録商標です。

QPS-101

[1] はじめにTHUNDERBIRD® Probe qPCR Mix は、TaqMan® probe などの配列特異的蛍光標
識プローブや蛍光標識プライマーなどの各種検出系によるリアルタイム PCR のための2×濃度のプレミックス試薬です。ROX(別添)、プローブ、プライマー以外の成分があらかじめ混合されているため、反応液調製が簡便化できるとともに、サンプル間の蛍光強度のばらつきが最小限に抑えられ、再現性の高い結果を得ることができます。
本製品は、従来品＜Realtime PCR Master Mix (Code No.: QPK-101)＞の組成を更に改良することで、反応特異性と PCR 効率が向上しています。PCR 効率を上げ、非特異反応を抑えることで、幅広い定量可能域(ダイナミックレンジ)を得ることができます。
◆本製品の特長◆
1. 高い特異性 組成最適化により、PCR の特異性が向上しました。非特異反応の低減
により低濃度ターゲットの検出における信頼性が向上しています。
2. 様々なターゲットを均一に検出 新規なエンハンサーを採用。ターゲットごとの PCR
効率のばらつきを最小限に抑えます。
3. 広いレンジで検出可能 高効率、かつ特異的な増幅により、広い測定レンジで解析が可能です。
4. 様々な機器に対応 一般的なブロックタイプの機器のほか、ガラスキャピラリーを用いる高速サイクラーにも対応しています。また、50× ROX reference dye が別添付されているため、パッシブリファレンスを使用する機器 (Applied Biosystems 社製機器、Agilent Technologies 社製機器など) においても、各機種の特性に応じた最適な ROX
濃度でご使用になれます。
5. 高速ホットスタート 抗 Taq ポリメラーゼ抗体を用いるホットスタートシステムを採用しています。抗体は加温により速やかに失活するため、最初の変性時間を短時間に設定できます。
＜蛍光プローブ検出系について＞
TaqMan® probe に代表される蛍光プローブ検出系は、目的の増幅産物に特異的に
ハイブリダイズした際にのみ蛍光を発する(または消光する)特殊なプローブを用いた検出系で、SYBRTM Green I 検出系と比較して、特異性の高いアッセイを行うことが可能です。
非特異増幅産物は検出されませんが、反応の特異性が低い場合、標的配列の増幅反応と非特異増幅反応が競合することで、標的配列の増幅効率が低下する場合があります。
-1-

QPS-101[2] 製品内容
本製品には、以下の試薬が含まれています。
品名および内容
THUNDERBIRD®
Probe qPCR Mix
50×
ROX reference dye

保存
-20°C
(または 2～8°C
で 3 か月以内)

QPS-101(500 回用/20μL 反応)

QPS-101T(100 回用/20μL 反応)1.67mL×3 本

1mL×1 本

250μL

50μL

-20°C
(または 2～8°C)

遮光保存※QPS-101X5 は、QPS-101 の 5 セット組です。

THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix
反応バッファー、dNTPs、Mg2+、rTaq DNA ポリメラーゼ及び抗 DNA ポリメラーゼ抗体などを含む 2×プレミックス溶液です。鋳型 DNA (cDNA、genomic DNA、virus DNA、
plasmid DNA など)とプライマー・プローブ溶液を添加し、滅菌水で 1×濃度に調製して使用してください。ROX (passive reference dye)は含まれておりません。
製品到着後は、-20°C で凍結保存してください。使用時は、融解後、ボルテックスミキ
サーなどでよく混和し溶液を完全に均質化した上でご使用ください。その後は、3 ヶ月以
内を目安として、2～8°C で冷蔵保存することができます。長期間使用しない場合は、20°C で再度凍結保存してください。凍結融解の繰り返しは、10 回程度では品質に影響がないことが確認されています。
50× ROX reference dye
Applied Biosystems 社製機器など、ウェル間の蛍光強度および分注誤差補正のため、パッシブリファレンスを用いる機器での反応の際に添加してください。最適な添加量
は機種により異なります。主な機器の添加量については、[4] 使用方法の項目をご覧ください。また、パッシブリファレンスによる補正を行わない機器では添加する必要はありません。
-20°C または 2～8°C で遮光保存してください。長期間使用しない場合は、-20°C で凍結保存してください。
※ROX reference dye を同一濃度で定常的にご使用される場合、50× ROX reference dye をあらか
じめ THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix へ混合して保存することもできます。混合後はゆるやかに
転倒混和し、上記の THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix の保存条件に従って保存してください(ROX の蛍光減衰を防ぐため、混合後は遮光保存してください)。混合比率は以下の通りです。ROX
濃度については、[4] 使用方法の項目をご覧ください。
ROX を 1×濃度で使用する場合
qPCR Mix : 50× ROX = 1.67mL : 66.8μL (QPS-101) 又は 1mL : 40μL (QPS-101T)
ROX を 0.1×濃度で使用する場合
qPCR Mix : 50× ROX = 1.67mL : 6.7μL (QPS-101) 又は 1mL : 4μL (QPS-101T)
QPS-101-2-

[3] 製品のほかに用意するもの
本製品の他に、以下の試薬・機器類をご用意ください。
(1) リアルタイム PCR 装置
本製品は、一般的なブロックタイプ、高速タイプ、ガラスキャピラリータイプなど、各種
リアルタイム PCR 装置にご使用になれます。ご使用にあたっては各装置の取扱説明書に従ってください。
(2) プライマー
目的遺伝子配列に対応したプライマーセットをご用意ください。高感度で定量性のあるデータを得るためには、プライマーの設計が重要となります。以下に、設計時の一般的な注意事項を挙げます。
- 長さは20～30mer、GC含量は40～60%に設定します。
- 増幅領域の長さは200bp以下、可能であれば80～150bp程度に設定してください。長すぎると増幅効率が低下しやすくなります。
- cDNAを検出する場合、増幅領域は可能であればイントロンをはさんだ領域に設定します。これにより、ゲノムDNA由来の増幅を防ぐことができます。
- プライマーの融解温度(melting temperature: Tm)は、60～65°C程度に設定してください。ただし、融解温度は、計算方法により値が異なりますので、あくまで目安としてお考えください。
また、プライマーの精製純度は、反応特異性に大きな影響を与えます。一般的に精製純度が低いプライマーでは品質のばらつきが大きくなり、非特異反応が発生しやすくなることがあります。可能であればHPLC精製、少なくともカートリッジ(OPC)精製以上の精製グレードのプライマーをご使用ください。
(3) 蛍光プローブ
目的遺伝子配列に対応した蛍光プローブをご用意ください。プローブの配列設計については、各種プローブの設計のガイドラインに従ってください。
また、プローブの精製純度が十分で無い場合、残存した未結合の蛍光色素が増幅の検出に対して阻害的に作用することがあります。可能であればHPLC精製以上の精製グレードのプローブをご使用ください。

-3-

QPS-101

(4) 鋳型 DNA
本製品では、鋳型 DNA として、cDNA、genomic DNA、plasmid DNA、virus DNA な
ど、各種 DNA を用いることができます。
(a) cDNA
一般的な逆転写反応用試薬などを用いて合成した cDNA 液を、精製せずに滅菌水などで適宜希釈して、そのままリアルタイム PCR 反応液に添加してご使用いただくことができます。
添加量は反応液量の 10%を上限の目安としてください。高濃度の添加は、PCR 反
応バッファーの組成を大きく変化させ、定量性低下の原因となります。また、リアルタイ
ム PCR での使用が考慮されていない一部の逆転写反応用試薬では、添加可能量は10%よりも少なくなる場合があります。
※弊社のリアルタイム PCR 用逆転写キット ReverTra Ace® qPCR RT Kit (Code No.:
FSQ-101)は、リアルタイム PCR での反応阻害を低減させる組成を採用しており、反応液中に 20%量まで添加が可能です。
(b) genomic DNA、virus DNA
genomic DNA、virus DNA を鋳型として使用することもできます。添加量は、50μL
反応あたり 200ng を上限の目安としてください。
(c) plasmid DNA
plasmid DNA を鋳型として使用することもできます。ただし、環状のまま使用すると、増幅効率が低下し、正しいコピー数を反映しない場合がありますので、制限酵素で切断し、直鎖状にしたものをご使用ください。
また、精製された plasmid DNA 溶液を鋳型として使用する場合、全 DNA 量に対する標的配列のコピー数が極めて高くなるため、反応液への添加量は少なくする必要があります。その際、溶液中の DNA 濃度が極めて低くなることで、DNA が容器への吸着などによって失われやすくなり、リアルタイム PCR 実施の際に、低濃度域での直線性や再現性が大きく低下する原因となります。希釈の際には、反応と関与しない核酸(yeast RNA など)をキャリアとして希釈液に混合することで、低濃度域の直線性が改善される場合があります。
plasmid DNA のコピー数は、以下の式で簡易的に算出することができます。
1μg あたりの plasmid DNA のコピー数 = 9.1 x 1011 / plasmid DNA のサイズ(kb)QPS-101-4-[4] 使用方法(1) 反応液の調製
以下に、TaqMan® Probe を用いた 50 μL および 20 μL 反応時の調製例を示します。
用いるサーマルサイクラーの特性に合わせ、適宜反応液量を増減させてください。
その他の蛍光プローブを用いる場合には、販売元からの情報をご確認ください。
試薬

50μL 反応20μL 反応

滅菌水

X μL

X μL

THUNDERBIRD®
Probe qPCR Mix

25 μL

10 μL

1×

Forward Primer
Reverse Primer

15 pmol
15 pmol

6 pmol6 pmol

0.3 μM*1
0.3 μM*1

TaqMan® Probe

10 pmol

4 pmol

0.2 μM*1

50× ROX reference dye

1 / 0.1 μL

0.4 / 0.04μL 1× / 0.1×*2

DNA 溶液

Y μL

Y μL

合計液量

50 μL

20 μL

最終濃度

*1: プライマー・プローブの発売元から、添加濃度が指定されている場合は、発売元の指定条件に従ってください。増幅効率が不十分な場合は、プライマー濃度を増やすことで、また非特異反応が発生する場合(低濃度の鋳型での反応で増幅曲線の立ち上がりが悪くなる場合)は、プライマー濃度を減らすことで、反応結果が改善することがあります。プライマー濃度は、最終濃度 0.2～0.6 μM
を目安にご検討ください。
*2: 50× ROX reference dye は、Applied Biosystems 社製機器など、ウェル間の蛍光強度および分
注誤差補正のためにパッシブリファレンスを用いる機器での反応の際に添加してください。最適な添加量は機種により異なります。主な機器の添加量は以下の通りです。また、補正を行わない機
器では添加する必要はありません。
表 1: 主な機器の最適な ROX reference dye 濃度
機器
Applied Biosystems 7000、7300、7700、7900HT、StepOne™、
StepOnePlus™ など
Applied Biosystems 7500、7500Fast、
Agilent Technologies 社製機器(オプション)など
Roche 社製機器、Bio-Rad 社製機器、BioFlux Line Gene など

最終濃度 (添加量)
1× (1/50 量)0.1× (1/500 量)不要※弊社従来品＜Realtime PCR Master Mix (Code No.: QPK-101)に含まれている ROX は、上記の 1×濃度に相当します。
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QPS-101

(2)PCR サイクル条件設定
以下に、推奨条件(p.3 (2)参照)に基づいて設計されたプライマーを用いて TaqMan®
Probe によるアッセイを行う場合の標準的な PCR 温度条件を示します。この条件で、ほとんどの標的配列に対応することが可能です。
また本試薬は、多くの場合、既に他の試薬で実施しているサイクル条件をそのまま適用していただくこともできます。
その他の蛍光プローブを用いる場合には、販売元からの情報をご確認ください。
ステップ

温度

時間

昇降速度

初期変性

95°C

20～60 秒*1

最大95°C
60°C*31～15 秒*2
30～60 秒*4

最大
最大

PCR
(40 cycles)

変性
伸長(Data Collection は伸長ステップに設定します)*1: 本製品では高速ホットスタートシステムを採用しており、極めて短い初期変性時間で酵素が再活性化されます。ただし、鋳型 DNA の変性を完全に行うために、各機器の特性に応じた十分な初期変性時間を設定してください。最適時間がわからない場合は、60 秒に設定してください (初期変性時間の延長は反応効率にはほとんど影響しません)。
表 2: 主な機器における最適な初期変性時間の目安
機器
Applied Biosystems 社製の高速サイクラー(Applied Biosystems 7500Fast 等)
キャピラリータイプの高速サイクラー(Roche LightCyclerTM 1.x、2.0)
一般的なブロックタイプのサイクラー(Applied Biosystems 7700、7500、7900HT(通常ブロック)、
StepOne™、StepOnePlus™、Agilent Technologies 社製機器、BioFlux Line Gene 等)

QPS-101-6-

初期変性時間
20 秒
30 秒

60 秒

*2: PCR サイクル中の変性時間は、各機器の特性に応じて、以下の時間に設定してください。不十分な変性時間は、PCR 効率低下の原因となりますのでご注意ください。最適時間がわからない場合
は、15 秒に設定してください (変性時間の延長は反応効率にはほとんど影響しません)。
表 3: 主な機器における最適な PCR サイクル中の変性時間の目安
機器
PCR サイクル中の変性時間
Applied Biosystems 社製の高速サイクラー
3秒(Applied Biosystems 7500Fast 等)
キャピラリータイプの高速サイクラー
5秒(Roche LightCyclerTM 1.x、2.0)
一般的なブロックタイプのサイクラー(Applied Biosystems 7700、7500、7900HT(通常ブロック)、
15 秒
StepOne™、StepOnePlus™、Agilent Technologies 社製機器、BioFlux Line Gene 等)*3: 十分な増幅効率が得られない場合は温度を低めに、非特異的反応が発生する場合(鋳型濃度が低いサンプルで、増幅曲線の形状がゆがむ場合)は温度を高めに設定することで、反応が改善されることがあります。56～64°C の範囲を目安にご検討ください。
*4: 伸長時間は、標的配列が 300bp 以下の場合は 30 秒で十分に反応が進行しますが、一部の機器
では、安定した蛍光測定に 30 秒より長い時間を必要とする場合があります。増幅曲線のがたつきや、ウェル間の変動が大きい場合には、長めの時間(45～60 秒)を設定してください。また、機器や制御用ソフトウェアの仕様上、30 秒に設定できない場合もありますので、取扱説明書をご確認の上、設定可能な時間を適宜設定してください(例: Applied Biosystems 7000/7300 では 31 秒以上、
7500 では 35 秒以上)。

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QPS-101(2)-1 Applied Biosystems 7900HT におけるサイクル条件設定例(通常ブロックタイプ、ソフトウェアバージョン 2.2.2)
以下に、本試薬を用いた TaqMan® Probe アッセイを Applied Biosystems 7900HT
において実施する場合のサイクル条件設定例を示します。
1. ソフトウェアを起動し、Instrument タブ中の Thermal Profile タブを開き、以下のように温度条件を設定します。
※ Sample Volume (μL)の欄は、必ず正しい反応液量を入力してください。
※ 伸長時間を 45 秒以下に短縮すると、機器特性の影響により、増幅曲線形状にがたつきが見られる場合があります。

QPS-101-8-

2. Data Collection タブをクリックし、以下の位置のデータ取得をアクティブにします。

3. 正しい位置にプレートをセットし、プログラムをスタートします。

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QPS-101(2)-2 Roche LightCyclerTM 1.1 におけるサイクル条件設定例(ソフトウェアバージョン 3.5)
以下に、本試薬を用いた TaqMan® Probe アッセイを Roche LightCycler TM 1.1 において実施する場合のサイクル条件設定例を示します。
1. ソフトウェアを起動し、各ステージごとに温度条件を入力します。最初の初期変性ス
テップでは、Analysis Mode は None を選択し、温度および時間は以下のように入力してください。

2. 続く PCR ステップでは、Analysis Mode は Quantification を選択し、温度および時間を以下のように入力して ください 。伸長反応(60°C)の Acquisition Mode は
SINGLE に設定します。

QPS-101- 10 -

3. 反応終了後にチャンバー内を冷却するため、冷却ステップを追加します。Analysis
Mode は None を選択し、温度および時間は以下のように入力してください。

4. カローセルにキャピラリーをセットし、プログラムをスタートします。

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QPS-101[5] 関連プロトコル: RNA サンプルからの cDNA 合成
本試薬は、さまざまな逆転写反応用試薬を用いて合成した cDNA を鋳型として用いることが可能ですが、リアルタイム PCR 用に設計された逆転写反応用試薬を用いること
で、より感度の高い反応を行うことが可能となります。
弊社の ReverTra Ace® qPCR RT Kit (Code: FSQ-101)はリアルタイム PCR での使用を考慮して設計された、高効率 cDNA 合成キットです。ここでは、ReverTra Ace®
qPCR RT Kit を用いたリアルタイム PCR 用 cDNA 合成法について記載します (詳細はキットに添付の取扱説明書をご参照ください)。
(1)RNA の変性
鋳型として用いる RNA 液を使用量分取し、65°C で 5 分間インキュベートした後、氷上で急冷します。
・この処理はスキップすることも可能ですが、この処理を行うことで、高次構造を取りやすい RNA に対する逆転写効率が向上する場合があります。
・この処理を行う際は、5×RT Buffer や酵素液は添加しないでください。RNA の分解や酵素活性の低下の原因となります。

(2)反応液の調製
反応液組成
Nuclease-free Water
5× RT Buffer
RT Enzyme Mix
Primer Mix
RNA

X μL
2 μL
0.5 μL0.5 μL
0.5pg～1μg

Total volume

10 μL(3)逆転写反応
37°C で 15 分間インキュベートし、逆転写反応を行います。
↓
98°C で 5 分間インキュベートし、酵素失活反応を行います。
↓
反応終了後、4°C または-20°C で保存します。リアルタイム PCR 実施の際は、鋳型として反応液に直接または希釈して添加してください。
・この温度条件は本キットの組成に最適化された条件となっており、温度条件の変更は、酵素活性以
外にも、プライマーのアニーリング効率や、RNA 除去効率、逆転写反応後の酵素失活効率などに大きく影響を与えます。条件の検討を行う際も、必ずこの条件を基本として実施してください。
QPS-101- 12 -

[6] トラブルシューティング
現象
高濃度サンプルの反応で直線性が乱れる

原因
サンプル溶液中の不純物による反応阻害対策
サンプルの純度が低い場合、不純物によってPCR が阻害されることがあります。また、リアルタ
イム PCR 用に設計されていない逆転写反応用試
薬により合成した cDNA をご使用の場合、逆転写
反応液に含まれる物質によって、反応が阻害されることがあります。サンプル濃度を下げて反応を行うか、サンプルの精製を行ってください。また、逆転写反応にはリアルタイム PCR 用に設計された試薬を用いてください。
低濃度サンプルの反 標的 DNA のコピー数
反応液中に標的 DNA が数コピーから数十コピー
応で直線性が乱れが少なすぎるしか含まれない場合、確率的にコピー数のばらつ
る、または増幅曲線
きが大きくなり、直線性が乱れやすくなります。サ
の蛍光強度が低くな
ンプル濃度を上げて反応を行ってください。
る
DNA の反応チューブへ 用いたサンプルの DNA 量が少ない場合、またはの吸着
サンプルを希釈して長時間放置した場合、DNAが反応チューブへ吸着するなどの原因で実質的な鋳型量が減少することがあります。サンプル濃度を上げて反応を行ってください。また、サンプルを希釈して反応を行う場合は、希釈は反応直前に行ってください。
プライマーダイマーとの 一般的に、蛍光プローブを用いたアッセイでは、標競合
的以外の増幅産物に由来するシグナルは検出されませんが、標的配列の増幅と、プライマーダイ
マーの増幅とが同時に発生した場合、競合によって標的配列の増幅反応が弱くなることがあります。反応条件の再検討を行い、非特異反応の発生を回避してください。改善されない場合は、プライマー配列の変更を検討してください。
希釈系列サンプルの 非特異反応との競合
一般的に、蛍光プローブを用いたアッセイでは、標増幅曲線の間隔が揃
的以外の増幅産物に由来するシグナルは検出さ
わない、または形状れませんが、プライマー配列の特異性が十分でなが不揃いい場合、標的以外の増幅反応が同時発生することで、競合によって標的配列の増幅反応が弱くなることがあります。反応条件の再検討を行い、非特異反応の発生を回避してください。改善されない場合は、プライマー配列の変更を検討してください。

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QPS-101

現象
PCR 効率が 90%を下回る
(slope < -3.6)

対策
標的配列によっては、標準の反応条件で十分な
PCR 効率が得られない場合があります。[4] 使用
方法 (2) PCR サイクル条件設定に従って、PCR
反応条件の再検討を行ってください。
プライマーの劣化
プライマーの劣化により、PCR 効率が大きく低下することがあります。プライマーの原液からの再希釈、またはプライマーの再合成を行ってください。
PCR 効率算出時に、直 直線から外れた Ct 値を PCR 効率算出に利用し線から外れた Ct 値を含 た場合、算出値の誤差が増大します。直線から外めた
れた Ct 値を算出対象から外し、再計算を行ってください。
PCR 効率が 110%を PCR 効率算出時に、直 直線から外れた Ct 値を PCR 効率算出に利用し上回る
線から外れた Ct 値を含 た場合、算出値の誤差が増大します。直線から外(slope > -3.1)
めた
れた Ct 値を算出対象から外し、再計算を行ってください。
再現性が良くない
サンプルの純度が低い サンプルの純度が低いと、PCR への阻害が発生し、再現性が低下することがあります。サンプル濃度を下げて反応を行うか、サンプルの精製を行ってください。
希釈後、長時間放置し 濃度が薄い DNA 溶液は、容器への吸着によってたサンプルを使用
実効濃度が低下することがあります。原液から再希釈を行ってください。また、希釈系列による標準
サンプルは、希釈後の保存は避け、毎回反応時に原液から都度作製してください。
鋳型に精製プラスミド
精製プラスミド DNA 溶液や PCR 増幅産物を鋳DNA や PCR 増幅産物 型として使用する場合、全 DNA 量に対する標的を使用
配列のコピー数が極めて高くなるため、反応液への添加量は少なくする必要があります。その際、溶液中の DNA 濃度が極めて低くなることで、DNA が容器への吸着などによって失われやすくなり、特に低濃度域の直線性や再現性が大きく低下する原因となります。希釈の際には、反応と関与しない核酸(Yeast RNA など)を希釈液に混合することで、低濃度域の直線性が改善される場合があります。
反応条件の不適合
反応条件が至適からずれている場合、反応の再現性が低下することがあります。[4] 使用方法
(2) PCR サイクル条件設定に従って、PCR 反応
条件の再検討を行ってください。
プライマー・プローブの 同一の配列を持つプライマーやプローブでも、合品質差
成時毎に品質差が発生することがあります。新規に合成を行った際は、従来用いていたものと比較実験を行って、品質差の確認を行ってください。

QPS-101

原因
反応条件の不適合- 14 -

現象
no-template control(NTC)で増幅が見られる

原因
コンタミネーションの発
生対策
再試時も再現する場合には、試薬類や滅菌水へのコンタミネーションが発生している可能性がありますので、試薬類や滅菌水の更新を行ってください。
蛍光測定の設定の誤り 複数種の蛍光プローブを用いた multiplex PCR(multiplex PCR 実施時 において、蛍光測定の設定が正しく行われていななど)
い場合、異なる色素のクロストークによるシグナルを誤って検出してしまう場合があります。反応系に含まれる全ての蛍光色素に対して、機器の設定を再確認してください。
増幅曲線の蛍光シグ 50× ROX reference パッシブリファレンスを使用する機器において、50ナルが弱い、またはdye の添加量が過剰
× ROX reference dye の添加量が過剰である
増幅曲線の形状がギ場合、蛍光量補正時に蛍光値が低く見積もられるザギザになることがあります。[4] 使用方法 (1) 反応液の調製に従い、50× ROX reference dye の添加量を確認してください。
蛍光測定の設定の誤り 蛍光色素の設定に誤りがあると、正しい検出が行われませんので、機器の取扱説明書をご参照の上、設定を再確認してください。
蛍光プローブの純度が 蛍光プローブの純度が十分でない場合、合成時に低い残存した未結合の蛍光色素が、ベースライン上昇の原因となり、増幅産物由来の蛍光値が低く見積もられる場合があります。HPLC 精製グレード以上のプローブを用いてください。
クエンチャー色素の蛍
TAMRA などの蛍光を発するクエンチャーを用い光強度が過剰ている場合、クエンチャーが発する蛍光によってベースラインが上昇し、増幅産物由来の蛍光値が低く見積もられる場合があります。non-fluorescentquencher を用いたプローブを使用することで改善される場合があります。
プローブの劣化
プローブ溶液の保存上の問題により、プローブが分解し、ベースラインが上昇することがあります。
また、一部の蛍光色素は、EDTA により劣化する性質を持つものがあります。プローブの合成元推奨の保存条件をご確認ください。
蛍光測定時間が短い
一部の機器では、PCR の伸長時間が短すぎる場
合、蛍光測定が十分に完了しない場合があります。増幅曲線のがたつきが目立つ場合には、伸長
時間を長め(45～60 秒)に設定することで、改善される場合があります。
反応液量が少ない
機器の標準条件よりも少ない液量で反応を行った
場合、蛍光測定値の誤差が増大する傾向があります。液量を増やして反応を行ってください。

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QPS-101

[7] 関連商品
SYBRTM Green I 検出系用リアルタイム PCR 試薬
品名

容量1mL x 1SYBRTM Green I 検出系用リアルタイム PCR 試薬(100 回用/20μL 反応)

THUNDERBIRD® SYBRTM qPCR Mix

1.67mL x 3

Code No.
QPS-201T(500 回用
QPS-201/20μL 反応)®
TM
※THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix では、50× ROX reference dye が別容器で添付されます。
※2,500 回用の QPS-201X5 (QPS-201 の 5 セット組) もご用意しています。

cDNA 合成試薬
品名
リアルタイム PCR 用 cDNA 合成キット
ReverTra Ace® qPCR RT Kit
リアルタイム PCR 用 cDNA 合成試薬 プレミックスタイプ

ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix
リアルタイム PCR 用 cDNA 合成試薬 プレミックスタイプ（ゲノム DNA 除去試薬付き）

ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix
with gDNA Remover
1 ステップ・リアルタイム PCR 関連試薬
品名
各種蛍光プローブ・蛍光プライマー検出系用
1 ステップ・リアルタイム PCR 用試薬®

RNA-direct Realtime PCR Master Mix
SYBRTM Green I 検出系用
1 ステップ・リアルタイム PCR 用試薬

容量

Code No.

200 回用FSQ-101

200 回用

FSQ-201

200 回用FSQ-301

容量0.5mL x 5

Code No.

(250 回用/20μL 反応)0.5mL x 5(250 回用/20μL 反応)

RNA-direct® SYBRTM Green
Realtime PCR Master Mix

QRT-101

QRT-201※RNA-direct®シリーズでは、50mM Mn(OAc)2 が別容器で添付されます。
※1,250 回用の QRT-101X5、QRT-201X5 (QRT-101 または QRT-201 の 5 セット組) もご用意しています。

より詳細な情報は、弊社ウェブサイトをご覧ください

https://lifescience.toyobo.co.jp/

QPS-101- 16 -

【製造・販売元】－価格・在庫に関するお問い合わせ－
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