23-11

GenNext® RamDA-seq® Single Cell Kit(Code No. RMD-101, RMD-101T)
NSR Primer Set for human(Code No. NSR-101)
NSR Primer Set for mouse(Code No. NSR-102)

取扱説明書
TOYOBO CO., LTD.
Bioproducts Sales and Marketing Department
OSAKA JAPANA6531Ｋ

―目次―
[1]
[2]
[3]
[4]

[5]
[6]
[7]
[8]

はじめに・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
製品内容・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
製品のほかに用意するもの・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
使用方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
1. 細胞溶解または RNA 希釈・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
2. 熱変性反応・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
3．ゲノム除去反応・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
4．cDNA 合成および増幅反応(RT-RamDA®反応)・・・・・・・・・・・・・・・・・
5．2nd 鎖合成反応・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
6．ライブラリー調製・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
7．ライブラリーの検証・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
8．シーケンスデータの確認・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
実施例・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
トラブルシューティング・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
関連製品・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
参考文献・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・―ご注意―
本キットに含まれる試薬は、すべて研究用試薬です。診断・臨床用試薬としては決して使用しないでください。本キットの使用にあたっては、実験室での一般の注意事項を厳守し、安全に留意してください。
※illumina® 、NexteraTM は illumina Inc.の登録商標または商標です。
※MultiNA® は、株式会社島津製作所の登録商標です。
※RamDA-seq® 、RT-RamDA® は国立研究開発法人理化学研究所の登録商標です。
※GenNext® は、東洋紡株式会社の登録商標です。

RMD-101

1

2
3
4
6
6
9
9
10
11
12
16
17
17
18
19
19

[1] はじめに
RamDA-seq® Single Cell Kit は、シングルセルや微量の RNA から次世代シーケ
ンス解析(NGS)用のライブラリー調製を行うための cDNA 合成キットです。本キットをご使用いただくことで、RNA 全長をカバーした解析のための cDNA を調製できます。
本キットでは、国立研究開発法人理化学研究所で開発された、Reverse
Transcription with Random Displacement Amplification(RT-RamDA®) 法参考文献(1)を採用しています。RT-RamDA®法は、ランダムプライマーと逆転写酵素の鎖置換活性を利用した新規 cDNA 増幅方法であり、poly(A) RNA に加え、non-poly(A) RNA
由来の cDNA を高感度に検出します。このため RT-RamDA®法を用いて調製したラ
イブラリは、従来技術に比べ、検出遺伝子数が多いことが特長です。

図 1. 本キットのワークフロー
各ステップの反応時間と反応液の添加量、作業を休止いただく際の作業休止ポイントを示します。本キットには、ワークフロー中の Purification、Nextera 反応に使用する、磁性ビーズ、ライブラリ調製試薬を含みません。「[3] 製品のほかに用意するもの」（p.4）を参照し、ご用意ください。

2

RMD-101◆本キットの特長◆
1. シングルセルや微量 RNA から cDNA 調製可能
サンプルとして、1～100 細胞 または 10pg~1ng total RNA に対応
2. RNA 全長をカバーした解析が可能
10kb 以上のターゲット RNA の全長をリードでカバーできる cDNA を調製可能
3. 様々な種類の RNA を検出可能、従来技術より検出遺伝子数がアップ
Poly(A) RNA の解析以外にも様々な RNA の解析にご利用いただけます。
◇アイソフォームや選択的スプライシングの同定◇poly(A) RNA や non-poly(A) RNA (ヒストン RNA や lncRNA)の検出◇核内 RNA(pre-mRNA や lncRNA)の検出[2] 製品内容
本キットには、以下の試薬が含まれております。試薬は-20℃で保存してください。
RamDA-seq® Single Cell Kit (Code:RMD-101,RMD-101T)
保存
容量(RMD試薬名
101)

-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃

480μL
108μL
22μL
960μL
240μL
54μL
54μL
54μL
330μL
55μL
275μL

NSR Primer Set for human (Code:NSR-101)
1st NSR Primer Mix for human-20℃
2nd NSR Primer Mix for human
-20℃

54μL
275μL

NSR Primer Set for mouse (Code:NSR-102)
1st NSR Primer Mix for mouse-20℃
2nd NSR Primer Mix for mouse
-20℃

54μL
275μL

①Lysis Buffer②Lysis Enhancer③RNase Inhibitor④Nuclease free water⑤RT-RamDA® Buffer⑥RT-RamDA® Enzyme Mix⑦RT-RamDA® Primer Mix⑧gDNA Remover⑨2nd strand synthesis Buffer⑩2nd strand synthesis Enzyme⑪2nd strand synthesis Primer Mix

RMD-1013

容量(RMD101T)

120μL
27μL
6μL
240μL
60μL
14μL
14μL
14μL
83μL
14μL
69μL

[3] 製品のほかに用意するもの
本キットのほかに、以下の機器・試薬類をご用意ください。
・サーマルサイクラー、またはインキュベーター
ご使用にあたっては各装置の取扱説明書に従ってください。

・

磁性ビーズ
Agencourt AMPure XP 試薬（Beckman Coulter、カタログ番号：A63880、A63881 等）を推奨いたします。ご使用にあたっては試薬の取扱説明書に従ってください。

・ 磁気スタンド
磁性ビーズを用いた精製の際に使用します。
磁気スタンドにはマグネットプレート BiT-Mag96(サンプラテック 品番：30550)
がお使いいただけます。
・ 80%エタノール
磁性ビーズを用いた精製の際の洗浄液として使用します。
・

ライブラリー調製試薬
illumina 社 NexteraTM XT DNA Sample Kit をご使用ください。
製品名
カタログ番号
Nextera XT DNA Library Preparation Kit (24 samples) FC-131-1024
Nextera XT DNA Library Preparation Kit (96 samples) FC-131-1096
また上記キットに対応したインデックス付 PCR プライマーをご使用ください。

・ TE Buffer（10mM Tris 1mM EDTA）pH8.0
ライブラリー調製時に DNA の溶出に使用します。水での代用はできません。

4

RMD-101以下の消耗品は動作確認済みとなります。
チューブ及びキャップ
UC,EU Optical wide area 8-cap strip,
Robust while flexible,with wide indented flat
cap
RP,UC,SFGC,Extra Robust,Fits shell Frame
Grids (0.2 mL)
96 well プレート及びシール
RP,LF,SEMI k,cuttable,96 well plate (0.2mL)
EU Optical wide area 96 cap plate withwide area indented flat caps
マグネットスタンド
Magna Stand for 8-welltube preparation
BiT-Mag96

RMD-101

メーカー
Nippon genetics/BIOplastics

カタログ番号
BPB79701-1/BPB79701-1

Nippon genetics/BIOplastics

BPK69901/
K69901

メーカー
Nippon genetics/BIOplastics
Nippon genetics/BIOplastics

カタログ番号
BPB50651/
B50651
BPB57601/
B57601

メーカー
Nippon genetics

カタログ番号
FG-SSMAG2

サンプラテック

30550

5[4] 使用方法
本キットは、サンプルとして、細胞、または total RNA から、ライブラリ調製のための cDNA を合成することができます。
ご使用になるサンプルに合わせて、下表に示すセクション 1.A～B のいずれかの「細胞溶解／RNA 希釈」を行った後、「熱変性」以降の操作に進んでください。

細胞

サンプル
細胞溶解 / RNA 希釈
FACS による細胞セクション 1．A (p.5)
取得
FACS 以外によるセクション 1．B (p.6)
細胞取得
Total RNA
セクション 1．C (p.7)

熱変性セクション 2 (p.8)

１．細胞溶解／RNA 希釈 （Cell lysis or RNA dilution）
A. FACS を用いて細胞取得を行う場合(1) 細胞溶解に必要な試薬をチューブに作製します。以下を参考に、必要量より余分量をみて調製してください。
細胞溶解液の調製
1 反応(μL)

20 反応(μL)※

100 反応(μL)※①Lysis Buffer②Lysis Enhancer③RNase Inhibitor④Nuclease free water

2
0.45
0.05
0.5

44
9.9
1.1
11

220
49.5
5.5
55

Total
※余分量を 10%とした場合

3

66

330

(2) 96well プレートまたは 8 連チューブに、細胞溶解液を 1well あたり 3μL 分注します。分注は氷上で行い、分注後すぐに qPCR 用シールや熱圧着式シールにてシーリングを行ってください。 ソーティングまで、プレートを氷上または 4℃で保管します。
(3) ご使用の FACS の取扱説明書やメーカーが推奨するパラメーターに従い、細胞溶解液を分注したプレートに細胞のソーティングを実施してください。
(4) ソーティング後、シーリングを行い、遠心を行ってください。
(5) その後、すみやかに次のステップに進むか、－80℃でサンプルを保管してください。
6

RMD-101

B. FACS 以外で細胞取得を行う場合
1 サンプルあたり、細胞溶解サンプル 3μL を調製します。マニュアルピッキングなどで細胞を分取する際は、細胞溶解液 2.5μL に 0.5μL の細胞サンプルを添加します。細胞溶解が不十分となるため、細胞とともに持ち込まれる PBS などの持込
液量は 0.5μL 以下としてください。細胞サンプルが 0.5μL 未満の場合、細胞溶解液の調製時に Nuclease ｆree water を加え、調整してください。
(1) 細胞溶解に必要な試薬をチューブに作製します。
例) 細胞サンプルの液量が 0.5μL の場合
1 反応(μL)
2
0.45
0.05
2.5

① Lysis Buffer② Lysis Enhancer③ RNase Inhibitor
Total
細胞サンプルが 0.5μL 未満(xμL)の場合④ Nuclease free water※余分量を 10%とした場合

0.5-x

20 反応(μL) ※ 100 反応(μL) ※
44
220
9.9
49.5
1.1
5.5
55
275

(0.5-x)X22(0.5-x)X110(2) 96well プレートまたは 8 連チューブに細胞溶解液を 1well あたり 2.5μL(または(3-x)μL)分注します。分注は氷上にて行い、分注後すぐにシーリングを行い、遠心してください。プレートは、細胞サンプルの添加まで氷上または 4℃にて保管してください。
(3) 細胞サンプルの添加までプレートを氷上または 4℃にて保管を行い、細胞取
得機器のマニュアルに従い、細胞サンプルの添加を行ってください。
(4) 細胞サンプルの添加後、シーリングを行い、遠心を行ってください。
(5) その後、すみやかに次のステップに進むか、-80℃にてサンプルを保管してください。

RMD-101

7

C. 精製済みの total RNA を使用する場合
次工程に total RNA を 10pg～1ng (3μL)インプットするため、3.3～333 pg/μL となるように RNA を希釈します。希釈後の RNA 溶液中の RNA 希釈液が 90%以上となるように希釈してください。
(1) 以下を参考に RNA 希釈液を必要量チューブに作製してください。この RNAの希釈液を用いて、3.3～333 pg/μL となるように RNA を希釈してください。
RNA 希釈液の調製①Lysis Buffer②Lysis Enhancer③RNase Inhibitor④Nuclease free water
Total

100 反応(μL)
220
49.5
5.5
55
330

※RNA 希釈例
1ng Input を行う場合（333pg/μL total RNA 溶液）(μL)

RNA 希釈液
終濃度

10ng/μL total RNA
RNA 希釈液

1
29

97%

Total

30

10pg Input を行う場合（3.3pg/μL total RNA 溶液）(μL)

RNA 希釈液
終濃度

333pg/μL total RNA
RNA 希釈液

1
99

99%

Total

100

(2) 96well プレートまたは 8 連チューブに希釈した RNA 溶液を 1well あたり 3μL
分注します。
(3) 分注後、シーリングを行い、遠心を行ってください。
(4) その後、すみやかに次のステップに進むか、-80℃にてサンプルを保管してください。

8

RMD-101

2．熱変性反応 （Denature）(1) 細胞溶解サンプルや RNA サンプルの分注されたプレートやチューブを 4℃にて遠心を行い、以下の温度でインキュベートしてください。
凍結サンプルを使用する場合は熱変性反応前に 4℃にて融解し、遠心した後に熱変性反応に進んでください。
熱変性反応
Step
Denature

Temperature

Time

70℃
4℃

1.5min.
hold

3．ゲノム除去反応 （Digestion of genomic DNA）
(1) ゲノム除去反応に必要な試薬をチューブに作製します。以下を参考に調製してください。
＊ERCC RNA 等、コントロール RNA を使用する場合は④Nuclease freewater の添加量を調整して下さい。
ゲノム除去反応液の調製⑤RT-RamDA® Buffer⑧gDNA Remover④Nuclease free water＊
Total※余分量を 10%とした場合

1 反応(μL)
0.3
0.45
2.25
3

20 反応(μL) ※ 100 反応(μL) ※
6.6
33
9.9
49.5
49.5
247.5
66
330

(2) 熱変性反応を行った 96well プレートまたは 8 連チューブに、ゲノム反応液を
1well あたり 3μL 添加し、遠心後、以下の温度でインキュベートしてください。
ゲノム除去反応
Step
Genomic DNA digestion

Temperature
30℃
4℃

Time
5min.
hold

(3) ゲノム反応後、すみやかに次のステップに進んでください。

RMD-1019

4．cDNA 合成および増幅反応（RT-RamDA®反応）(1) RT-RamDA®反応に必要な試薬をチューブに作製します。以下を参考に調製
してください。
＊NSR Primer を使用する場合は、⑦RT-RamDA® Primer Mix の代わりに
1st NSR Primer Mix for human、または 1st NSR Primer Mix for mouseを使用してください。
RT-RamDA®反応液
1 反応(μL)
1.5
0.45
0.45
0.6

⑤RT-RamDA® Buffer⑥RT-RamDA® Enzyme Mix⑦RT-RamDA® Primer Mix＊
④Nuclease free water
Total※余分量を 10%とした場合

20 反応(μL) ※ 100 反応(μL) ※
33
165
9.9
49.5
9.9
49.5
13.2
66

3

66

330

(2) ゲノム除去反応を行った 96well プレートまたは 8 連チューブに、RTRamDA®反応液を 1well あたり 3μL 添加し、遠心後、以下の温度でインキュベートしてください。
RT-RamDA®反応
Step
Priming 1
Priming 2
Reverse transcription
and amplification
Reverse transcription 2
Inactivation

Temperature

Time

25℃
30℃

10min.
10min.

37℃

30min.

50℃
98℃
4℃

5min.
5min.
hold

(3) RT-RamDA®反応後、すみやかに次のステップに進むか、-20℃～-30℃にて保管してください。

10

RMD-101

5．2nd 鎖合成反応（2nd strand synthesis）(1) 2nd 鎖合成反応に必要な試薬をチューブに作製します。以下を参考に調製してください。
＊NSR Primer を使用する場合は 2nd strand synthesis Primer Mix の代わりに 2nd NSR Primer Mix for human または 2nd NSR Primer Mix formouse を使用してください。
2nd 鎖合成反応液⑨2nd strand synthesis Buffer⑩2nd strand synthesis Enzyme⑪2nd strand synthesis Primer Mix＊
Total
※余分量を 5%とした場合

1 反応(μL)
3
0.5
2.5
6

20 反応(μL) ※ 100 反応(μL) ※
63
315
10.5
52.5
52.5
262.5
126
630

(2) RT-RamDA®反応を行った 96well プレートまたは 8 連チューブに、2nd 鎖合成反応液を 1well あたり 6μL 添加し、遠心後、以下の温度でインキュベートしてください。
2nd 鎖合成反応
Step
Second-strand synthesis
Inactivation

Temperature

Time

16℃
70℃
4℃

60min.
10min.
hold(3) 2nd 鎖合成反応後、すみやかに次のステップに進むか、-20℃～-30℃にて保管してください。

RMD-101

11

6．ライブラリー調製
本キットのライブラリー調製プロトコルは、illumina 社「NexteraTM XT DNA ライブ
ラリー調製ガイド」で推奨されている反応容量に対し、4 分の 1 で実施するプロトコ
ルを記載しています。以下のプロトコルに含まれる変更は、本キットのみに適応されることに留意してください。
ライブラリー調製の詳細な手順については、illumina 社「NexteraTM XT DNA ライ
ブラリー調製ガイド」をご確認ください。
本キットには、NexteraTM XT DNA Sample Kit や Agencourt AMPure XP beads
を含みません。「[3] 製品のほかに用意するもの」（p.4）を参照し、ご用意ください。
A. 二本鎖 cDNA の精製(1) 精製を始める前に、4 分の 1 希釈した AMPure XP beads を作製してください。希釈液は、AMPure XP beads を遠心し、その上清を希釈液として使用してください。
例) 8 サンプル分の 4 分の 1 希釈 AMPure XP beads の作製方法
a. 1×AMPure XP beads 220μL をマグネットスタンドに静置し、磁性ビーズが完全に吸着した後、上清を回収します。
b. a で回収した上清 180μL と 1×AMPure XP beads 60μL を良く混合し、4 分の 1
希釈 AMPure XP beads として使用してください。

(2) 5.(3)の 2nd 鎖合成反応後の二本鎖 cDNA 溶液 15μL に対して、4 分の 1
希釈 AMPure XP beads を 27μL 添加してください。その後、遠心を行い、25℃、2,000rpm にて 2 分間撹拌し、5 分間静置してください。
(3) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置き、溶液が透明になるまで静置します。その後、上清を除去します。
(4) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置いたまま、80%エタノールを150μL 加え、室温で 30 秒間インキュベートします。
(5) エタノールを除去します。
(6) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置いたまま、80%エタノールを150μL 加え、室温で 30 秒間インキュベートします。
(7) ピペットを用いて、エタノールを完全に除去します。
エタノールが残存している場合は、シングルピペットマンを用いてエタノールを除去してください。
12

RMD-101

(8) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置いたまま、25℃で 5 分間、または室温にて 5 分～10 分ドライアップします＊。
＊エタノールが残存していると反応がうまくいかない可能性があります。磁性ビ
ーズがひび割れはじめるまでドライアップしてください。室温や湿度により、ドライアップの時間を調整してください。
(9) ドライアップの間に溶出に必要な試薬をチューブに作製します。以下を参考に調製してください。
溶出液
1 反応(μL)
Tagment DNA Buffer(NexteraTM XT DNA Sample prep kit)
④Nuclease free water
Total※余分量を 8%とした場合100 反応(μL) ※

2.5

270

1.25
3.75

135
405

(10) 96well プレートまたは 8 連チューブに、溶出液を 1well あたり 3.75μL 添加
し、遠心します。
(11) ビーズが完全に分散するまで Vortex を行い、25℃で 5 分間インキュベートします。
(12) 遠心後、チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置き、溶液が透明になるまで 5 分間静置します。
(13) 透明な上清 3.75μL を新しいチューブあるいはプレートに移し、次のステップに進んでください。
B. タグメンテーション(NexteraTM XT DNA ライブラリー調製)(1) 精製した二本鎖 cDNA に対して Amplicon Tagment Mix を 1well あたり
1.25μL 添加し、遠心後、以下の温度でインキュベートしてください。
タグメンテーション反応
Step
Tagmentation

RMD-101

Temperature

Time

55℃
10℃

5min.
hold

13

C. 中和反応(NexteraTM XT DNA ライブラリー調製)(1) タグメンテーションした二本鎖 cDNA に対し、Neutralization Buffer を 1well
あたり 1.25μL 添加します。その後、遠心を行い、25℃、2000rpm にて 1 分間
撹拌し、5 分間静置してください。
D. ライブラリーエンリッチメント(NexteraTM XT DNA ライブラリー調製)(1) 中和した 2 本鎖 cDNA に対し NPM PCR Master Mix を 1well あたり
3.75μL 添加し、遠心します。その後、各 well に Index primer(S5XX)と Index
primer(N7XX)をそれぞれ 1.25μL ずつ添加し、遠心します。
(2) 遠心後、以下のサイクルで PCR を行ってください。
ライブラリーエンリッチメント反応
Step
Temperature
72℃
Denature
PCR

Time
3min.
30sec.
10sec.
30sec.
30sec.

95℃
95℃
55℃
72℃
72℃
4℃

14 cycles＊

5min.
hold

＊下記記載の表を参考に PCR サイクルを変更してください。
Estimated amount of total RNA per
cell / total RNA amount>10pg
5-10pgTypical Number of PCR Cycles
14
14-15

＊RNA 量が 5pg より少ない場合は PCR サイクルを増やしてください。
＊得られるライブラリー収量が多い場合、PCR サイクルを減らしていただくことも可能です。
E. ライブラリーの精製(1) PCR 溶液 12.5μL に対して 1×AMPure XP beads を 15μL 添加してください。その後、遠心を行い、25℃、2,000rpm にて 2 分間撹拌し、5 分間静置してください。
(2) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置き、溶液が透明になるまで静置します。その後、上清を除去します。
14

RMD-101

(3) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置いたまま、80%エタノールを150μL 加え、室温で 30 秒間インキュベートします。
(4) エタノールを除去します。
(5) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置いたまま、80%エタノールを150μL 加え、室温で 30 秒間インキュベートします。
(6) ピペットを用いて、エタノールを完全に除去します。
(7) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置いたまま、25℃で 5 分間、または室温にて 5 分～10 分ドライアップします＊。
＊エタノールが残存していると反応がうまくいかない可能性があります。磁性
ビーズがひび割れはじめるまでドライアップしてください。室温や湿度により、
ドライアップの時間を調整してください。
(8) 96well プレートまたは 8 連チューブに TE Buffer を 1well あたり 24μL 添加
し、遠心します。
(9) ビーズが完全に分散するまで Vortex を行い、25℃で 2 分間インキュベートを行い、遠心します。
(10) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置き、溶液が透明になるまで
2 分間静置します。
(11) 透明な上清 24μL を新しいチューブあるいはプレートに移し、QC のステップに進むか、-20℃にて保管してください。

RMD-10115

7.ライブラリーの検証(1)

ライブラリーの定量
GenNext® NGS Library Quantification Kit(Code: NLQ-101) 、あるいは同等の市販品を用いて、qPCR で定量することを推奨いたします。GenNext® NGS Library
Quantification Kit(Code: NLQ-101) は illumina 次世代シーケンサー用のライブラ
リー定量キットで、illumina 社が採用している P5、P7 アダプター配列に対応しており、フローセル上に結合できるライブラリーのみを特異的、かつ正確に定量します。

(2) ライブラリーサイズ分布の確認
ライブラリーの分布を確認する場合は、Bioanalyzer（アジレント・テクノロジー株式会社）、MultiNA®（株式会社島津製作所）等の電気泳動で確認することをお勧め致します。
ライブラリー分布例
本キットと NexteraTM XT DNA ライブラリー調製キット(14cycle)を用いてマウス
ES 細胞 1 細胞からライブラリーを調製した場合、下図にように約 100～600bpにライブラリー分布が確認され、収量としては約 10~20nM(TE 24μL 溶出)得られます。

※100～150 bp 付近のアダプターダイマー量が多い場合は、サンプル液量に対して 0.8 倍量の AMPureXP beads を用いて、再度ライブラリーの精製を実施することでダイマーの割合を低減することができます。本工程はサンプルを等濃度にプールした後でも実施可能です。

16

RMD-101

8.シーケンスデータの確認
シーケンスデータを解析する前に、カバレッジの均一性を確認することをお勧めします。本キットでは下図のような均一なカバレッジを得ることが可能です。

[5] 実施例
1.検出転写産物数の比較および各領域へのアライメント割合の比較＜方法＞
Mouse ES 細胞から抽出した Total RNA 10pg を用いて、GenNext® RamDA-seq® Single Cell Kit(Code: RMD-101)と A 社キット用いて調製した cDNA について、NGS による比較解析を行いました。
GenNext® RamDA-seq® Single Cell Kit では、プライマーとして NSR Primer Set for mouse(NSR-102)
を使用しました。A 社キットでは、cDNA 増幅のため、18 サイクルの PCR を実施しました（GenNext®
RamDA-seq® Single Cell Kit では PCR は行いません）。cDNA 調製後、Nextera XT DNA Library
Preparation Kit を用いてライブラリーを作製し、illumina Miseq でシーケンスを行いました。

＜結果＞

GenNext® RamDA-seq® Single Cell Kit は、A 社キットに比べて、転写産物を約 5,000 多く検出することができました。

RMD-101172.長鎖 RNA における全長性の比較＜方法＞
実施例 1 の方法にて得られたシーケンスデータについて、個別の遺伝子のリードについて、比較を行いました。

＜結果＞

GenNext® RamDA-seq® Single Cell Kit では、A 社キットでは捉えることの難しかった Neat1 やMalat1 遺伝子のような lncRNA についても全長にわたって検出することが可能です。

[6] トラブルシューティング
原因
対策
現象
得られる cDNA 量 RNA が分解して ・RNA が分解していないか確認してくださ
が少ない
いる
い。
・チップやチューブなどに RNase がコンタミしていないか確認してください。
・細胞溶解や RNA 希釈のステップは氷上にて行ってください。
ライブラリー収量が 精製時のエタノー ・磁性ビーズをエタノールで洗浄した際にエ少ない
ルが残存している タノールが残存していると後反応を阻害す
ることがあります。磁性ビーズが乾燥しているか確認してください。
・作業部屋の湿度が高いとビーズの乾燥がされにくい場合があります。作業部屋の湿度を 55%以下にすることをお勧めします。

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RMD-101

[7] 関連製品
RT-RamDA® cDNA synthesis Kit

内容
96 回用
24 回用

Code No.
RMD-201
RMD-201T

RamDA Cell Lysis Kit

1,152 回用

RMD-301

NSR Primer Set for human

96 回用

NSR-101

NSR Primer Set for mouse

96 回用

NSR-102

内容
500 回用
/20μL 反応

Code No.

内容

Code No.

96 回用

RML-101

24 回用

RML-101T

品名リアルタイム PCR 解析用 cDNA 調製キット

品名
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GenNext® NGS Library Quantification Kit

品名RT-RamDA®法による NGS 解析用ライブラリー調製キット

GenNext® Shin-RamDA-seq®
Single Cell Stranded Kit

NLQ-101[8] 参考文献(1) Hayashi .T et al.Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive
splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9：619（2018)より詳細な情報は、弊社ウェブサイトをご覧ください
https://lifescience.toyobo.co.jp/

RMD-10119

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