野兎病  
検査マニュアル  （第 2 版）  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
（平成２７年年４⽉月）      ⽬目次  
  （１）野兎病の概説     

  

  

  

  

  

  

  

3  

  

  

  

  

  

  

5  

  
（２）検査に関する⼀一般的注意     １．検査材料料の採取  ２．検査材料料の輸送  ３．検査の進め⽅方  ４．検査の判定    （３）検査⽅方法        

  

  

  

  

  

  

  

7  

１．細菌学的検査     

  

  

  

  

  

  

  

  

２．⾎血清学的検査     

  

  

  

  

  

  

  

  

３．遺伝⼦子学的検査  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

15  

  

  

  

  

  

  

  

  

17  

（６）執筆者⼀一覧       

  

  

  

  

  

  

  

17  

  

  

  

  

  

  

  

18  

  
（４）参考⽂文献          （５）連絡先         （７）参考図表        表１．野兎病菌の性状  表２．野兎病の臨臨床病型  図１．野兎病の分布  図２．野兎病菌の培地上のコロニーとグラム染⾊色像  図３．微量量凝集反応像  図４．野兎病菌遺伝⼦子増幅産物の確認  2

（１）野兎病の概説    野兎病は野兎病菌 Francisella   tularensis 感染による急性熱性疾患で、感染したノウサギやげっ⻭歯類などとの接触や、ダニ・アブなどの（吸⾎血性）節⾜足動物の刺刺咬により感染する動物由来感染症である。本菌による感染は極めて少ない菌数（10-‐‑‒50 個）でも成⽴立立するとされている。本疾病は国内では東北北および関東地⽅方で多数の感染例例が報告されているが、近年年は極めて稀である。⽶米国、欧州では毎年年発⽣生があり、時に多数の患者が報告されている。感染症法の四類感染症で、全数届け出対象である。また、F.  tularensis は特定病原体（⼆二種）に指定されている。  
  【病原体】グラム陰性の短桿菌（0.2  x  0.3〜～0.7   μm）で多形性で、好気的に増殖する細胞内寄⽣生菌である。
⾮非運動性で芽胞は無い。⾎血清型は 1 種で、⽣生化学的性状、病原性、分布などの相異異から 3 つの亜種  (subspecies)   に分類されている。ヒトへの感染は主に ssp.  tularensis（Type  A）、ssp.  holarctica（Type  B）の２亜種による。Type   A は北北⽶米にのみ分布し、強毒である。近年年のゲノム解析の進展により、さらにA1a、A1b、A2a、A2b などに区別され病原性や⽶米国内の分布が異異なることが明らかになってきた。Type  B
は北北緯 30 度度以北北に広く分布し、⽐比較的病原性が弱い。またエリスロマイシン感受性や分離離地などから⽣生物型(biovar)１、2、japonica に分類される。⽇日本分離離株は biovar  japonica に属す。ssp.  mediasiatica   は中央アジアに分布するが、ヒトへの感染例例はない。他の Francisella   属菌、Francisella   novicida   およびFrancisella  philomiragia は⾮非常にまれにヒトに感染することがある。F.  novicida   は F.  tularensis   の第 4の ssp.として⼀一部の研究者に提唱されているが、国際細菌命名委員会では認定されていない（表 1）。  
  【疫学】野兎病は北北⽶米や北北欧を主とする北北緯 30 度度以北北で多数発⽣生している（図 1）。近年年、その症例例数は過去と⽐比較して少なくなっているが、東欧や中欧などでは、ときおり⼤大きな流流⾏行行が確認されている。⽇日本では戦後から 1960 年年代まで多数の症例例が報告されていた。特に東北北地⽅方各県および千葉葉県で多く、病原体も分離離されている。その他の地域においては数例例の患者が報告されているが、病原体分離離はこれまで確認されていない。近年年では 2008 年年に⻘青森県、福島県、千葉葉県および和歌⼭山県にて 5 例例、2014 年年に兵庫県で 1 例例が報告され、2008 年年および 2009 年年に東北北地⽅方⽣生息ノウサギから病原体が分離離されている。  
  【感染経路路】⽇日本の野兎病患者の約 93％が剥⽪皮や調理理などの野兎との直接接触が原因とさえている。稀にネコ、クマ、リスとの接触、ダニの刺刺咬などによる感染例例もある。海外ではその他に、汚染された飲料料⽔水、河川での⽔水系感染や汚染された塵芥の吸引による呼吸器感染、蚊やアブによる吸⾎血による感染が報告されている。これまでヒトからヒトへの感染報告はない。  
  3

【臨臨床症状】潜伏期間は 3 ⽇日を中⼼心に 7 ⽇日以内が主で、稀に 2 週間におよぶことがある。インフルエンザ
様の全⾝身症状ではじまり、発熱、頭痛、悪寒戦慄慄、筋⾁肉痛、関節痛が認められ、その後、弛緩熱として⻑⾧長期化する。多くの場合、所属リンパ節の腫脹、潰瘍または腫瘍化する。臨臨床的病型は表 2 の様に分類されている。⽇日本では 90％以上がリンパ節腫脹を伴う例例であり、そのうち 60％がリンパ節型、20％が潰瘍リンパ節型で、⽶米国では潰瘍リンパ節型が多い。他の型は稀である。不不顕性感染は本邦で約 2.5％に認められている。  
  【治療療・予防】治療療にはゲンタマイシンやストレプトマイシン、テトラサイクリンが有効で、ペニシリンやセファロスポリン系抗⽣生物質は無効である。旧ソ連の⼀一部や⽶米国においては実験室感染予防のために弱毒⽣生ワクチンが限定的に使⽤用されるが、⼀一般に使⽤用されるワクチンはない。⼀一般的な予防法として、斃死または瀕死状態の野⽣生動物と接触しない、また、それらを扱う場合、マスクおよびゴム⼿手袋を装着することが望まれる。野外活動時にはダニの刺刺咬を避けるため、⻑⾧長ズボンや⻑⾧長袖シャツなど肌を露露出しない服装、防⾍虫剤や忌避剤などを使⽤用する。  
  【法律律上の取り扱い】ヒトの野兎病は感染症法(感染症の予防及び感染症の患者に対する医療療に関する法律律)
で、四類感染症に指定されている。診断した医師は届出基準に基づき、直ちに最寄りの保健所⻑⾧長を経由し都道府県知事に届け出なければならない（法第⼗十⼆二条）。家畜の野兎病は家畜伝染病予防法で届出伝染病に指定されている。対象家畜は⾺馬、めん⽺羊、豚、いのししおよびうさぎである。また、野兎病菌は感染症法及び施⾏行行令令（法第六六条第⼆二⼗十⼀一項政令令第五条）により、特定⼆二種病原体に指定されている。このため本菌の所持・保管は厚⽣生労働⼤大⾂臣へ届出が必要である。病院や検査機関が、業務に伴い⼆二種病原体を滅菌譲渡をするまで所持することになった場合、検出後 1 ⽇日以内に届出し、検出後 3 ⽇日以内に滅菌等を実施する。  

4

（２）検査に関する⼀一般的注意    
野兎病の検査は、細菌学的検査、⾎血清学的検査ならびに遺伝⼦子学的検査により進められる。現在、国内では検査キット等は⼀一般に販売されていない。また、⽇日本では稀な感染症であることから検査法や試薬などは普及しておらず、今後、検査法および試薬、精度度管理理などを整備していく必要がある。検査に必要な試薬等については下記連絡先に問合せされたい。本マニュアルでは病原体の分離離・同定法、微量量凝集反応法よる特異異抗体の検出および PCR 法による野兎病菌特異異的遺伝⼦子の検出法について記述する。野兎病菌は国⽴立立感染症
研究所においてレベル 3 病原体に分類されており、⽣生菌の取り扱いは、Biosafty   Level   3（BSL3）施設で実施することになっている。野兎病が疑われる臨臨床検体の取り扱いは BSL2 内安全キャビネット内で取り扱う。本菌が確認もしくは⾮非常に強く疑われる場合は BSL3 実験室で作業を実施する。  
  １．検査材料料の採取     細菌学的検査および遺伝⼦子学的検査は、摘出リンパ節、リンパ節穿刺刺液、原発病巣部ぬぐい液などが対象となる。採材は適切切な抗⽣生物質投与前が望ましい。⾎血清学的検査には、少なくとも１週以上の間隔で採⾎血した
急性期と回復復期のペア⾎血清が望ましい。感染源として疑われる動物の材料料が得られる場合、⾎血液、肝臓、脾
臓、病変部や、動物体表に付着したダニなどを採取する。  
  ２．検査材料料の輸送     検査材料料は凍結を避け、速やかに冷冷蔵で搬送する。感染性の材料料については郵政省省告⽰示 832 号（平成 12 年年
12 ⽉月 22 ⽇日号外）に基づき梱包郵送する。持参の場合、国⽴立立感染症研究所「感染性材料料（病原体等及び診断⽤用のヒトあるいは動物の検体）の輸送に関するマニュアル（持参の場合）」による（問合せ先：国⽴立立感染症研究所   総務部   業務課）。  
  ３．検査の進め⽅方     問診により得られる情報が重要となる。患者の症状、国内外の野兎病発⽣生地における野外活動歴および動物
接触歴などから野兎病の可能性を考慮し、検査を実施する。確定診断は患者病変部からの野兎病菌分離離であるが、バイオハザードや法律律上の問題等から⼀一般的ではない。野兎病は抗⽣生物質治療療が有効であることから、
ペア⾎血清を⽤用いた⾎血清学的検査は診断の確認として実施することが多い。⽣生物兵器の可能性がある物質や感染源の確認など、早急性や⾼高感度度性を要する場合は遺伝⼦子学的検査が有効である。  
  ４．検査の判定     1）   患者から野兎病菌が分離離同定された場合、確定診断となる。本菌は特定⼆二種病原体であるため、その所5

持・保管は厚⽣生労働省省への届出が必要となる。
近年年、⾃自動細菌同定機器による誤判定が散⾒見見されている。
対象菌の基本性状を精査したうえで菌種の判定を進めることが望まれる。  
2）   ⾎血清学的検査では急性期から回復復期にかけての 4 倍以上の抗体価上昇を認めた場合を陽性とする。単⼀一⾎血清では抗体価 80 倍以上の場合、陽性を疑う。ブルセラ属菌やエルシニア属菌などとの交差反応があることが知られている。  
3）   遺伝⼦子学的検査は、迅速な遺伝⼦子検出、分離離菌同定の指標として有効である。コンタミネーションの可能性に注意する必要がある。  
4)      鑑別診断を要する疾患には、ツツガムシ病、⽇日本紅斑熱、猫ひっかき病、ブルセラ症、結核、ペストなどがある。  

6

（３）検査⽅方法    １．細菌学的検査  病変部からの野兎病菌分離離を⽬目的とする。⼀一般的に抗⽣生物質投与された患者からの分離離は困難である。分離離にはグルコース、システインおよび鉄分を含む寒天培地が⽤用いられる。Eugon 寒天培地は容易易に調製できる有効な培地である。市販の平板寒天培地としてはチョコレート(II)寒天培地（Becton,   Dickinson   and  Company）が有効である。雑菌の混⼊入が懸念念される場合、ペニシリンを添加し培養する。  
  １）検体の採取および培養までの保存  検体は野兎病菌に有効な抗⽣生物質の投与前に無菌的に採取し、直ちに培地に塗抹、培養が望ましい。野兎病
菌は増殖が遅く、雑菌の混⼊入は本菌のコロニー形成を著しく阻害するため、採材後の即時の培養が困難な場
合は⼀一時的に検体を 4℃に保存し、速やかに培養の準備をする。  
  ２）Eugon(⾎血液またはチョコレート）寒天培地の作製  ①試薬および器具  ・  Eugon  agar（Difco  cat.  No  258910）  ・  緬⽺羊脱繊⾎血（⽇日本バイオテストなど）  ・  蒸留留⽔水  ・  オートクレーブ  ・  恒温槽  ・  三⾓角コルベン（500  ml）  ・  メスシリンダー     ・  計量量天秤  ・  ピペット  ・  シャーレ  ②作製⽅方法（シャーレ 10 枚分）  ・  三⾓角フラスコ内にて 200ml の蒸留留⽔水に Eugon  agar  9.08  g を加温溶解させ、オートクレーブにて 121℃
15 分間滅菌する。  
・  50℃程度度まで冷冷却後、保温した脱繊⾎血 16  ml を無菌的に混合し、緩やかに攪拌する。チョコレート寒天作製の場合、培地をチョコレート⾊色を呈すまで 60℃程度度に 30 分程保温する。  
・  シャーレに 20ml ずつ⼊入れ、固まるまで放置する。  
・  使⽤用まで 4℃に保存する。  

7＊

   抗⽣生物質添加培地作製の場合、培地の温度度が冷冷め、シャーレに分注する直前にペニシリンを添加する。  

  ３）検体の接種および培養  ①接種  摘出リンパ節などの場合、割⾯面を直接培地に塗布、または⽣生理理⾷食塩⽔水にて 10％乳剤を作製し、静置後の乳剤上清を塗布する。穿刺刺液やぬぐい液の場合は直接培地に塗布する。雑菌の増殖抑制のためにはペニシリン
を 500U/ml 程に添加する。  
②培養  33〜～37℃で好気的に培養する。バイオハザードを考慮し培地を密閉容器に⼊入れる場合はパッキンを半分程緩めた状態で培養する。  
＊  コロニーは通常培養 4 ⽇日以内で観察されるが 7 ⽇日⽬目まで観察する事が望ましい。抗⽣生物質を使⽤用した場
合は増殖が遅延する事がある。CO2 濃度度は本菌の増殖に関与しないとされている。  

  ４）判定  
①コロニー性状  
使⽤用培地や菌株で若若⼲干異異なるが、多くは、⽩白⾊色から灰⽩白⾊色の 1 から 3mm 径（図 2A）のコロニーを形成する。コロニーは露露滴状、湿潤性、光沢があり、粘稠性が⾼高い。疑わしいコロニーについては以下の検査の結果を菌同定の判断材料料とする。  
②染⾊色像  グラム染⾊色により薄いピンク⾊色に観察される（図 2B）。⼩小桿菌だが、⻑⾧長時間の培養にて球菌状、⻑⾧長桿菌状など多形性を⽰示す。また蒸留留⽔水への懸濁により球形を呈す。芽胞は形成せず、鞭⽑毛は保有しない。  
③⽣生化学的試験  カタラーゼ弱陽性、オキシダーゼ陰性である。糖分解能、エリスロマイシン感受性が ssp.や biovar 間で異異なる（表 1）。しかしこれらの試験は煩雑であるため推奨されない。近年年は野兎病菌遺伝⼦子の ISFtu2 領領域
および RD1 領領域の解析により簡易易的に ssp.や biovar を判別している。詳細は国⽴立立感染症研究所獣医科学部に問い合わせされたい。  
④⾎血清学的試験  スライドグラス上にて菌懸濁液と野兎病菌抗⾎血清を混合し、その凝集像から判定するスライド凝集反応が簡便便である。3 分以内に混合液が凝集した場合、分離離菌が野兎病菌である事を疑う。使⽤用培地によっては培養菌が⾃自家凝集しやすくなることがあるため、供試前に菌を PBS や⽣生理理⾷食塩⽔水などで洗浄する。  
⑤免疫学的試験  抗野兎病菌特異異的抗体による蛍光抗体法が⼀一般的である。蛍光標識識抗体と蛍光顕微鏡が要すが、⽐比較的短時

8間で結果が得られる。本試験は採材検体のスタンプ標本からの菌体検出にも適⽤用可能である。  
⑥遺伝⼦子学的試験  PCR 法にて野兎病菌特異異遺伝⼦子を検出する。
⾼高感度度のため⽇日常的に野兎病菌扱う場所ではコンタミネーションに注意する。詳細は後述する。  
  

  

9

２．⾎血清学的検査  野兎病菌に対する抗体価は発症後 1〜～2 週後から上昇し、⻑⾧長期にわたり維持される。抗体価の測定は操作が簡便便な凝集反応（試験管法または微量量凝集反応法）が⼀一般的である。他に間接⾚赤⾎血球凝集反応、ラッテクス
凝集反応、ELISA、ウェスタンブロット法でも検査可能である。本マニュアルでは凝集反応のうち感度度が良良
く、少量量の⾎血清および抗原が試験可能な微量量凝集反応（マイクロプレート法）について記載する。  
  １）検体  
急性期（発症直後）および回復復期（発症 2 週⽬目以降降）のペア⾎血清の同時測定が望ましい。ペア⾎血清は少なく
とも 1 週間以上間隔をあけて採⾎血する。  
  ２）微量量凝集反応法  ①試薬および器具  ・  ホルマリン不不活化菌液（②参照）  ・  ⽣生理理⾷食塩⽔水  ・  0.5%ホルマリン加⽣生理理⾷食塩⽔水  ・  サフラニン溶液 1)  ・  U 底 96 ⽳穴プレート 2)  ・  インキュベーター  ・  プレート振盪機  ・  陽性（強および弱）3)ならびに陰性対照⽤用⾎血清  ・  マイクロチューブ、ピペット類  1)     国⽴立立感染症研究所では⽇日⽔水製薬株式会社「フェイバーG」を使⽤用している。凝集像の⽬目視確認を容易易にするための菌の着⾊色が⽬目的であるため、1％Tetrazolium-‐‑‒blue や 0.1％クリスタルバイオレットでも可。  

2)     国⽴立立感染症研究所にて IWAKI  3870-‐‑‒096、FALCON  351177、NunclonTM  MPC  treatment、WATSON  4846-‐‑‒96US の 4 種のプレートで適⽤用性を確認している。  

3)     弱陽性は強陽性を陰性対照⽤用⾎血清で 8 倍希釈して調整する。  

②ホルマリン不不活化菌液の調整  ・  新鮮培養菌 4)を 0.5%ホルマリン加⽣生理理⾷食塩⽔水に懸濁し、37℃に⼀一晩保温する。  
・  菌の不不活化を確認する。5)  ・  ⽣生理理⾷食塩⽔水にて 2 回以上（3,500rpm  20 分）洗浄する。  
・  調製した菌が⾃自家凝集しない事をアクリフラビン反応 6)にて確認する。  
・  0.5%ホルマリン加⽣生理理⾷食塩⽔水に再浮遊させ、4℃に保存する。  

10・  ⽣生理理⾷食塩⽔水にて OD560 値を 1.0 に調整する。  
・  菌液にサフラニン溶液を加え、最終濃度度 0.005％にする。  
4)     ⾃自家凝集しない菌株を使⽤用する。国⽴立立感染症研究所では 3 ⽇日培養の Yama 株を使⽤用している。  

5)     菌の不不活化は菌液の⼀一部を 5,000  rpm  10 分遠⼼心後、再浮遊した沈沈殿を 7 ⽇日培養し、コロニー形成が無いことを確認する。  

6)     0.1%アクリフラビン⽔水溶液と菌液を１滴ずつ混和し、3 分後に凝集しないことを確認する。  

③反応⼿手順  ・  ⾎血清を 56℃30 分間にて⾮非働化処理理する。  
・  陽性（強および弱）ならびに陰性対照⾎血清とともに被験⾎血清を 2 列列ずつ⽣生理理⾷食塩⽔水にて 5 から 640 倍まで 2 倍段階で希釈する。  
・  ⾎血清希釈液は U 底 96 ⽳穴プレートの 1 ウェルあたり 25μl とする。  
・  抗原液を 25μl ずつ分注する。  
・  プレートを 20 秒程振盪し、反応液を混和する。  
・  プレートをビニールフィルム等で包み乾燥しないよう、37℃にて 16 時間以上感作させる。  
④判定  ・  菌体が沈沈殿したものを陰性像、分散したものを陽性像とする。トレース台上で観察すると判定しやすい。  
(図 3)  ・  凝集⼒力力価は、陽性凝集像を⽰示す⾎血清の最⾼高希釈倍数で表す。（⾎血清と抗原液を等量量混合しているので 10倍からとなる）  ・  陽性対照の強と弱の凝集⼒力力価に 8 倍の差があることを確認する。  
・  回復復期⾎血清の凝集価が急性期⾎血清の凝集価から 4 倍以上上昇した場合を陽性とする。単⼀一⾎血清では凝集
抗体価 80 倍以上の場合、陽性を疑う。  
＊     ブルセラ属菌との交差反応が知られているため、必要に応じて（特に⽝犬との関連がある検体）ブルセラ
属菌に対する抗体測定を⾏行行う（検査マニュアル「ブルセラ症」参照）  

  

  

11

３．遺伝⼦子学的検査     野兎病菌の培養による検出は⽇日数を要し困難な場合が多い。野兎病菌特異異的遺伝⼦子断⽚片を PCR 法にて増幅し検出する⽅方法は迅速な病原体検出法、分離離菌の同定の指標として有⽤用である。ここでは野兎病菌の 16S   リ
ボソーム RNA 遺伝⼦子（16S  rRNA）、2 種の外膜蛋⽩白質遺伝⼦子   [Outer  Membrane  Protein  （fopA）および Major  Membrane  Protein（tul4）]を標的とした PCR 法について記載する。  
菌が分離離または遺伝⼦子が検出された場合、さらに菌の亜種や由来地域を推定するため、野兎病菌遺伝⼦子のISFtu2 領領域および RD1 領領域を解析する。その詳細については国⽴立立感染症研究所獣医科学部に問い合わせされたい。  
  1）必要な試薬・器具・機材     ・  DNA 抽出キット；SepaGene  (#SG0010;   エーディア)など  ・  DEPC-‐‑‒H2O  ・  TE  buffer  （pH  8.0）（10  mM  Tris  (pH  8.0),  1  mM  EDTA）     ・  増幅⽤用プライマーセット     標的遺伝⼦子  16S  rRNA  fopA  

tul4  

プライマー名   配列列  参照  F5         5ʼ’-‐‑‒CCTTTTTgAgTTTCgCTCC-‐‑‒3ʼ’  F11         5ʼ’-‐‑‒TACCAgTTggAAACgACTgT-‐‑‒3ʼ’  MS1         5ʼ’-‐‑‒CAgCTACTACACAAAgCAgTgg-‐‑‒3ʼ’  MAI         5ʼ’-‐‑‒CACCATTTACTgTATAgCACgC-‐‑‒3ʼ’  TUL4-‐‑‒435      5ʼ’-‐‑‒gCTgTATCATCATTTAATAAACTgCTg-‐‑‒3ʼ’  TUL4-‐‑‒863         5ʼ’-‐‑‒TTgggAAgCTTgTATCATggCACT-‐‑‒3ʼ’  

12  

13  

14  

  
  
  
  
  
  
  
  
  

・  PCR キット   (TOYOBO  Blend  Taq  #BTQ-‐‑‒101 など)     ・  サーマルサイクラー  ・  エチジウムブロマイド     ・  アガロース     ・  TAE  buffer    ・  電気泳動装置  ・  UV トランスイルミネター  ・  撮影装置     ・  その他ピペット、チップ、チューブ類     12  2）DNA の抽出  ・  ⾎血液や⽣生検材料料や、分離離培養した菌コロニーから直接市販の DNA 抽出キット等を⽤用いてプロトコールに従い抽出精製し、DEPC-‐‑‒H2O あるいは TE  buffer（pH  8.0）に溶解する。  
・  菌コロニーの場合は、マイクロチューブ（スクリューキャップ付）に⼊入れた 0.1  ml の TE  buffer に菌を浮遊させ 95℃10 分間加熱後の遠⼼心上清が供試可能である。  
  3）PCR 反応  ①   反応溶液組成     TOYOBO  Blend  Taq  Taq  (2.5  unit/μl)  0.25   μl     10x  Ex  Taq  Buffer      2.5   μl     dNTPs  (2  mM  each)         2   μl     Sample  DNA         2.5   μl     Sense  Primer（10   μM）       1   μl  Antisense  Primer（10   μM）       1   μl  DEPC-‐‑‒H2O     

  

  

  

15.75   μl       総量量     

  

  

  

25   μl     

  

  

  
②   PCR 反応条件  94℃   5  min     
-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒  94℃   30  sec     58℃   30  sec         35  cycles     72℃   30  sec     
-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒-‐‑‒  72℃   7  min     4℃に冷冷却     ③   操作⼿手順     ・   PCR ⽤用反応マイクロチューブに①の組成の反応液を加える。  
・   サーマルサイクラーにセットし、②の条件で反応させる。     ・   PCR サンプルの 5   μl を 1.3%アガロースゲル（1x  TAE  buffer）で電気泳動する。  
・  エチジウムブロマイド染⾊色     

13・  バンドを UV トランスイルミネーターにて観察する。     ④   野兎病菌遺伝⼦子増幅産物の確認（図 4）     ・  16S  rRNA：全ての Francisella 属菌で 1,142  bp の遺伝⼦子断⽚片が増幅される。  
・  fopA：F.  tularensis および F.  novicida で 707  bp の遺伝⼦子断⽚片が増幅され、F.  phiromiragia   では増幅されない。  
・  tul4：F.  tularensis および F.  novicida で 407  bp の遺伝⼦子断⽚片が増幅され、F.  phiromiragia では増幅されない。      14

（４）参考⽂文献    概説  1.      Ellis  J,  Oyston  PCF,  Green  M  and  Titball  RW  (2002)  Tularemia.  Clinical  Microbiology  Reviews  15:631-‐‑‒646.     2.      藤⽥田博⼰己   (2002)   野兎病菌．「細菌学」⽵竹⽥田美⽂文、林林英夫編：245-‐‑‒250   朝倉書店．     3.      ⼤大原義朗   (2003)   野兎病．「動物由来感染症その診断と対策」神⼭山恒夫、⼭山⽥田章雄編：209－213   真
興交易易．     4.      Petersen  JM  and  Molins  CR  (2010)  Subpopulations  of  Francisella  tularensis  ssp.  tularensis  and  holarctica:identification  and  associated  epidemiology.  Future  Microbiol.  5:649-‐‑‒661.  
5.      WHO  Guidelines  on  Tularemia  (WHO  2007)  6.      棚林林清   (2004)   野兎病.「感染症の事典」国⽴立立感染症研究所   学友会編：249-‐‑‒250   朝倉書店.       細菌学的検査  7.      佐藤   佶、藤⽥田博⼰己、渡辺百合⼦子、⼤大原義朗、本間守男   (1992)   ⼤大原研究所における野兎病の検査法．
⼤大原年年報 35:  1-‐‑‒10.     8.      Chu  MC  and  Weyant  RS  (2003)  Francisella  and  Brucella.   “Mannual  of  Clinical  Microbiology”  8th  ed.,  P.  R.  Murray  Ed.:  pp.  789-‐‑‒808.  ASM  Press,  Washington  D.  C.     9.      ⼤大原甞⼀一郎郎、桜井信夫（1987）野兎病菌．「微⽣生物検査必携、細菌･真菌検査第 3 版」I 各論論 6 ⼈人畜共通感染症：pp.  I  28-‐‑‒I  39 ⽇日本公衆衛⽣生協会．       ⾎血清学的検査  10.   Sato  T,  Fujita  H,  Ohara  Y  and  Homma  M  (1990)  Microagglutination  test  for  early  and  specific  serodiagnosis  of  Tularemia.  J.  Clin.  Microbiol.  28:2372-‐‑‒2374.     11.   Sharma   N,   Hotta   A,   Yamamoto   Y,   Fujita   O,   Uda   A,   Morikawa   S,   Yamada   A,   Tanabayashi  K.(2013)  Detection  of  Francisella  tularensis-‐‑‒Specific  Antibodies  in  Patients  with  Tularemia  by  a  Novel  Competitive  Enzyme-‐‑‒Linked  Immunosorbent  Assay.  Clin.  Vaccine  Immunol.  20:9-‐‑‒16.  
  遺伝⼦子学的検査  12.   Forsman  M,  Sandström  G  and  Sjöstedt  A  (1994)  Analysis  of  16S  ribosomal  DNA  sequences  of  Francisella  tularensis  strains  and  utilization  for  determination  of  the  phylogeny  of  the  genus  and  for  identification  of  strains  by  PCR.  Int.  J.  Syst.  Bacteriol.  44:38-‐‑‒46.     

1513.   Higgins   JA,   Hubalek   Z,   Halouzka   J,   Elkins   KL,   Sjöstedt   A,   Shipley   M   and   Ibrahim   S   (2000)  Detection   of   Francisella   tularensis   in   infected   mammals   and   vectors   using   a   probe-‐‑‒based  polymerase  chain  reaction.  Am.  J.  Trop.  Med.  Hyg.  62:310-‐‑‒318.     14.   Sjöstedt  A,  Eriksson  U,  Berglund  L  and  Tärnvik  A  (1997)  Detection  of  Francisella  tularensis  in  ulcers  of  patients  with  tularemia  by  PCR.  J.  Clin.  Microbiol.  35:1045-‐‑‒1048.  
  16

（５）連絡先    国⽴立立感染症研究所   獣医科学部  森川   茂  電話：03-‐‑‒5285-‐‑‒1111     ファックス：03-‐‑‒5285-‐‑‒1179    （６）執筆者⼀一覧    堀⽥田明豊：国⽴立立感染症研究所   獣医科学部  藤⽥田   修：国⽴立立感染症研究所   獣医科学部    17

（７）参考図表  

  
  

  
  

  

18

  
  
  
  

  

19

  

20

  

21