哺乳類由来の神経毒の⽣物有機化学的研究
Bioorganic Studies on Mammalian Neurotoxins（日本農芸化学会推薦）

代表研究者

名古屋大学

北 将樹

Nagoya University

Masaki KITA

The short-tailed shrew Blarina brevicauda is one of the rare venomous mammals, and produces venom in its
saliva to catch its prey effectively. We have isolated blarina toxin, a kallikrein-like serine protease, as the first lethal
venom from mammalian origin. However, this venom was not active against their major diets, and we re-examined
the identification of neurotoxic substances from the Blarina shrew saliva. Guided by the paralytic activity against
mealworms, we successfully isolated two new neurotoxic peptides with molecular weights of ~5 kDa, and named
blarina paralytic peptides (BPPs) 1 and 2. The amino acid sequences of BPPs were established by MS/MS analysisof the digested peptides. BPP1 and 2 had 48 and 53 amino acids with three disulfide bonds. BLAST search showedthat BPPs were similar to synenkephalin, an enkephalin precursor expressed in human brain, and soricidin, isolated
from the same shrew species. Patch-clamp analysis in the whole-cell configuration showed that BPP2 increased thevoltage-gated Ca2+ channels activity in human neuroblastoma IMR32 cells. This effect was inhibited by w-conotoxin,a specific inhibitor of N-type calcium channel. We also analyzed the saliva venom of Cuban solenodon (Solenodoncubanus), another venomous mammal, and a potent protease activity was detected.

研究目的

どのように関わってきたのか興味が持たれる．

動物由来の天然毒には，フグ毒テトロドトキシン

これまでに研究代表者らはユニークな天然毒の構や下痢性貝毒オカダ酸など，ユニークな構造や切れ造と機能の解明を目指して，哺乳類由来の有毒成分

味鋭い生物活性をもつものが多く知られている．この化学的研究を行ってきた．北米に生息するブラリ

れらの毒はそれぞれイオンチャネルやホスファターナトガリネズミからは致死性プロテアーゼを単離し，ゼの特異的な阻害剤として知られ，薬理学・生理学その構造や機能を明らかにした 1)．さらに，カモノハにおけるツールや医薬リードとして重要である．さ

シの毒が強力な痛みを引き起こす現象に注目して，らに最近，巻貝由来の麻痺性神経毒ペプチド，ω-コ

ヒトでは血圧調整を担うペプチドホルモンが単孔目

ノトキシンの誘導体が疼痛緩和ケアで用いられるな

カモノハシでは脚の付け根の毒腺から分泌され，さど，天然毒の有用性があらためて注目されている．

らに小さいペプチド断片となり炎症や痛みに関わる爬虫類や両生類，魚類，無脊椎動物などの様々なことを見出し 2,3)，このような化学多様性が生物多様動物が自身で生産，もしくは微生物などから獲得し，性を産み，生物進化を漸進させるという仮説を得る毒を保有することが知られている．一方，毒をもつに至った．生物種により化合物の局在や機能が大き哺乳類はとても珍しく，トガリネズミやソレノドン

く異なる場合，ゲノム情報からの網羅的解析だけでなどの食虫類の仲間，およびオーストラリアに生息は「カモノハシにはヒトに類似したタンパク質が存する単項目のカモノハシなど数種しか知られていな在する」ということしか分からないが，実際に発現い．これら有毒な哺乳類は，恐竜が絶滅した太古かしているペプチド断片の構造，活性，局在性などをら原始的な形態を保ってきたとされ，このような珍調べることこそ，天然毒の意外な機能を発見するにしい哺乳類由来の毒が哺乳類の発生や進化の過程には必要と考えられる．

本研究では，生態学および進化学的にも興味深い受けないこと，BLTX を獲物に注入してから毒性を希少な哺乳類由来の有毒物質の構造と機能を解明し， 示すまでには数時間以上かかること，およびトガリより高活性な神経毒アナログの創製を目指すこととネズミが主な餌とするミミズや昆虫など無脊椎動物した．食虫動物ブラリナトガリネズミの唾液に含まには効かないことから，顎下腺には BLTX とは異なれる，オピオイド前駆体ペプチド・シンエンケファる未知の麻痺性物質が含まれ，マウスなど脊椎動物リンに類似した麻痺性ペプチド BPP 類や，世界最小に効く遅延性の毒と，昆虫やミミズなど小動物を瞬の哺乳類であるトウキョウトガリネズミおよび絶滅時に捕獲するための毒を使い分けていることが示唆

危惧種キューバソレノドンの唾液由来のユニークなされた．そこで，この動物の唾液成分にはタンパク神経毒成分の解明に挑戦することとした．さらに，毒素とは異なる麻痺活性物質が含まれると予想し，これらユニークな活性物質について，異種の哺乳動顎下腺抽出物の分離を再検討することにした．

物がもつ類似の化合物と構造や機能を比較し，稀少アセトンに浸漬して長期（10 年間以上）保管してな種がもつ麻痺性神経毒の生物学的意義を探ることあったブラリナトガリネズミの顎下腺を生理食塩水を目指して本研究を実施した．

で抽出してミールワームに対する麻痺作用を調べた
結果，1/70 個体分の量で投与後直ちに麻痺，痙攣作研究経過用を引き起こすことを確認した．さらにこの活性は１．トガリネズミ由来の神経毒ペプチド BPP 類セリンプロテアーゼ阻害剤であるアプロチニンではトガリネズミはミミズや昆虫などを主な餌とする阻害されなかったことから，プロテアーゼとは異な小動物であり，唾液の毒で獲物を麻痺させて捕獲し，る水溶性の麻痺成分が含まれることが示唆された．

巣穴に貯蔵する習性がある．また基礎代謝率が高く，

そ こ で 顎 下 腺 抽 出 物 を ワ イ ド ポ ア の 逆 相 HPLC

数時間毎に餌を食べる必要があるとされ，一日に自（Develosil 300C4 HG-5, 10~40% aq. MeCN / 0.1% TFA）

分と同じ体長のミミズを 100 匹以上も食べたというで分離した結果，ミールワームに対する麻痺活性は報告もある．これらのことからトガリネズミは，獲保持時間 26~36min の微量成分のみに確認され，プロ物を効率よく捕らえ，また腐敗を防いで貯蔵するた

テアーゼなど高分子を主に含む保持時間 40~50 min

めに，特異な毒を進化させたと考えられている．トの画分とは１段階で分離することができた．次いでガリネズミは世界で 300 種以上が知られているが，上記の麻痺活性を指標に，ゲルろ過 HPLC（TSKgel

中でも北米に生息するブラリナトガリネズミ

G2000SWXL, 20% aq. MeCN / 0.05% TFA）で分離し，Blarina brevicauda は体長約 7~10 cm，体重約 15~20 g

分子量約 5 kDa の低分子を主に含む活性画分を得た．と小柄ながら，自分よりも大きなネズミや魚を殺す

こ の 画 分 を さ ら に 逆 相 HPLC （ Develosil RP-ほど強い毒を持つ．ヒトが噛まれて死に至った例は

AQUEOUS AR-5，20~50% aq. MeCN / 0.1% HFBA）でないが，その毒成分にはラットやウサギに対する血精製した結果，主成分として新規ペプチド 2 種を単圧降下作用や，平滑筋の弛緩作用などが見出されて離することに成功し，Blarina Paralytic Peptides (BPP)いる．これまでの研究で，マウスに対する致死活性1, 2 と命名した．

を指標に分子量約 35 kDa のタンパク毒ブラリナト

SDS-PAGE 解析において，BPP 類は約 5 kDa の単キシン (BLTX, LD50 1 mg/kg) を単離し，血圧調整に一のバンドとして確認された（Figure 1）．そこで BPP関与する組織性カリクレインに類似したプロテアー類を DTT / iodoacetamide で還元アミノアルキル化し，ゼの一種であり，血管弛緩因子であるキニン類を遊トリプシンもしくは Glu-C で酵素消化した．この溶離させる活性を示すことを見出していた．

液内消化で得られた断片ペプチドについて MALDI-

一方，ブラリナトガリネズミの顎下腺抽出物には，TOF MS/MS 解析を詳細に行った結果，BPP 1,2 はそ

上述した腹腔内投与によるマウス致死活性の他にも， れぞれ 48, 53 アミノ酸残基からなり，ともに分子内ミールワームの麻痺作用や，マウス脳室内投与によにジスルフィド結合を 3 つ持つ一本鎖のペプチドとる激しい痙攣作用，皮下投与による炎症惹起作用，決定した．BLAST 検索により，BPP 類はヒトのオピおよび培養ヒト神経芽腫細胞に対する Ca イオン流オイドペプチド前駆体に相当するシンエンケファリ入作用など，多様な活性を示すことを確認した．こンの部分構造（1-42 残基）によく似ていた 4)．また，

れらの活性はいずれもプロテアーゼ阻害剤の影響を同じトガリネズミ種から単離されている 54 アミノ

酸残基からなるペプチド，ソリシジンにも類似しているが 5)，BPP2 とは 3 つのアミノ酸残基が異なっていることが分かった．

Figure 2.

BPP2 increased the voltage-gated Ca2+

channels activity in human neuroblastoma IMR32 cells.
今回用いた IMR-32 細胞では Cav2.1 (P/Q 型)，2.2(N 型)，および 2.3 (R 型) のいずれも発現していたた
Figure 1. SDS-PAGE analysis of BPPs.

め，現在，特定のサブタイプの Ca チャネルを発現させた培養細胞を用いて解析を進めている．また，BPPさらに二次構造に関しては，6 つの Cys 残基の位類の構造と機能を確認するため，固相法によるペプ置が一致していることから，BPP 類はシンエンケフチド合成およびブレビバチルス発現系を用いたリコァリンの部分構造と同様に，3 つのジスルフィド結ンビナントペプチドの合成を検討している．

合を形成していると推定した．このことは，顎下腺から単離した還元アミノアルキル化を行う前の BPP

２．キューバソレノドンの捕獲と唾液の有毒成分類の MALDI-TOF MS 解析で得られた質量が，アミこれまで述べたトガリネズミやカモノハシの他にノ酸配列に基づく予想値よりも 6 mu 少ないことかも，中南米に生息するソレノドン（トガリネズミ目）らも支持された．

や，全身が針毛で覆われているハリネズミ（ハリネ

これまでの研究代表者らの検討において，トガリズミ目）など，数種の陸棲哺乳類が毒を持つとされネズミの顎下腺抽出物，および単孔目カモノハシのるが，その成分はほとんど明らかになっていない．

蹴爪に含まれる毒のいずれについても，Ca チャネル

ソレノドンは，カリブ海に位置するキューバ島の発現細胞における細胞内 Ca イオン濃度の上昇作用

キューバソレノドン Solenodon cubanus とイスパニョを見出している．そこで，この麻痺活性物質が作用ーラ島のハイチソレノドンの２種のみが現生していする標的生体分子を電位依存性イオンチャネルと想る．ともに頭胴長は約 30 cm，体重は 500~750 g にも定し，今回精製した BPP 類の電気生理学的解析を行達し，食虫類の仲間としては世界でも最大級のサイった．ヒト神経芽腫細胞（IMR-32）を BrdU, dbcAMP,ズである．ソレノドンの下顎の切り歯の裏側には発Nu-SERUM 添加 DMEM 培地で培養して Ca チャネ達した溝があり，これはベノム・デリバリー・シスルを発現誘導した．イオンチャネルの発現は蛍光色テム（venom delivery system, VDS）と呼ばれ，噛み付素 Fluo-4 AM を用いた細胞内 Ca 濃度の観測，およびいた獲物に，毒腺から分泌された毒液を唾液とともCa チャネルのサブタイプ特異的な抗体を用いたウに効率よく注入するために使うとされる．興味深いェスタンブロッティングにより確認した．パッチク

ことに，VDS は現生の毒ヘビ，毒トカゲの仲間や，ランプ実験を検討した結果，BPP2 に Ca チャネル開絶滅した初期の哺乳類の化石などにも見られる．

口活性がみられ，かつこの活性は N 型 Ca チャネル

研究代表者らはキューバ共和国の国立公園，科学阻害剤ω-コノトキシンにより阻害されることが分

技術環境庁，およびハバナ大学などと連携して，絶かった（Figure 2）．

滅危惧種のキューバソレノドンの保全を目指した生態調査を行い，その生け捕りと唾液の採取に成功した．唾液の毒性成分の具体的な同定には至っていな
いが，ある種の強いプロテアーゼ活性をこれまでに確認した．一方でごく最近，米国・豪州らの国際チ体にリスクがある．それでもなお，トガリネズミやームがドミニカ共和国でハイチソレノドンを捕獲しカモノハシのような毒を持つ哺乳類が現存するといて，唾液に含まれる主要な酵素としてカリクレイン

うことは，長年の脊椎動物の進化の過程において，を同定し，トガリネズミ毒 BLTX との高い相同性や，環境次第では毒のメリットがデメリットを上回る場

食虫目の進化に関する新しい見解を発表した 6)．プ合があったことを意味する．トガリネズミなど無盲ロテオームや遺伝子解析に関する解析技術が飛躍的

腸類は，系統発生学的には単孔目や有袋目などを除に発展した現在，希少な野生動物由来の毒の研究もく，全ての胎盤を有する哺乳類の始祖とされており，急速に進んでおり，国際的な競争は一層激しくなっ生物進化や生態学にかかわる興味深い事例も見え隠ている．研究代表者らのグループでも現在，キューれする．今後，天然物化学の新たな展開の一つとしバソレノドン毒液に含まれる活性成分の同定や，餌て，ユニークな毒成分のさらなる解明を目指すとととして想定される昆虫類などに対する麻痺作用などもに，その作用機序の理解から生命科学に高いインの評価を進めている．また，共同研究者らによりパクトを与える機能性分子が創出されることを期待DNA サンプルを用いた進化系統解析や 7,8)，糞成分

したい．の分析，超音波域を含む鳴き声の解析なども進められており，キューバソレノドンのユニークな生態が参考文献解明されつつある．

1.

M. Kita, Y. Nakamura, Y. Okumura, S. D. Ohdachi, Y.
Oba, M. Yoshikuni, H. Kido, and D. Uemura, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101, 7542–7547, 2004.

考察

新規神経毒の化学的解明は，薬理学，神経科学，

2.

M. Kita, D. StC. Black, O. Ohno, K. Yamada, H.

精神医学など，広範な生命科学の発展に寄与する．

Kigoshi, and D. Uemura, J. Am. Chem. Soc., 131,

今回，研究代表者らが新たにトガリネズミの唾液か

18038–18039, 2009.

ら発見した BPP 類の構造は，ヒト脳内で発現してい3.

Pure Appl. Chem., 81, 1093–1111, 2009.

る生理活性ペプチドの前駆体と類似していた．このような生理活性ペプチドが，なぜトガリネズミでは

4.

D. R. Liston, J.–J. Vanderhaeghen, and J. Rossier,Nature, 302, 62–65, 1983.

顎下腺で発現し，唾液とともに獲物に注入されて特異な生物活性を発現するのか，生物進化と毒の化学

D. Uemura, M. Kita, H. Arimoto, and M. Kitamura,

5.

C. V. Bowen, D. DeBay, H. S. Ewart, P. Gallant, S.

進化の観点からも非常に興味深い．また，哺乳類由Gormley, T. T. Ilenchuk, U. Iqbal, T. Lutes, M.

来の Ca チャネル作用性分子はこれまで報告例はな

Martina, G. Mealing, N. Merkley, S. Sperker, M. J.

く，本ペプチドの作用機序の解明により，画期的なMoreno, C. Rice, R. T. Syvitski, and J. M. Stewart,

新規麻酔剤や鎮痛剤の創製につながることが期待さ

PLOS One, 8, e58866, 2013.

れる．

6.

116, 25745–25755, 2019.

今後の展開として，神経毒リガンドが結合する受容体の種類や結合様式を決定するケミカルバイオロ

N. R. Casewell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,7.

J. J. Sato, S. D. Ohdachi, L. M. Echenique–Diaz, R.

ジー研究を目指していきたいと考えている．この目

Borroto–Páez, G. Begué–Quiala, J. L. Delgado–的のため，光親和性反応基と検出基を生物活性リガ

Labañino, J. Gámez–Díez, J. Alvarez–Lemus, S. T.

ンドに効率的に導入したケミカルプローブの合成法

Nguyen, N. Yamaguchi, and M. Kita, Sci. Rep., 6,や，質量分析法やアフィニティー精製に利用できる

31173, 2016.

独自の蛍光タグの開発なども合わせて進めている（誌上発表 1,2）．

8.

J. J. Sato, T. M. Bradford, K. N. Armstrong, S. C.
Donnellan, L. M. Echenique-Diaz, G. Begué-Quiala,

動物由来の毒は，複雑で多様性に満ちた構造や機J. Gámez-Díez, N. Yamaguchi, S. T. Nguyen, M. Kita,

能を備えており，潜在的な可能性に満ちている．毒

and S. D. Ohdachi, Mol. Phylogent. Evol. 141,をもつことは，獲物の捕獲や防御の手段としてのメ106655, 2019.

リットがある半面，毒の生産に余分なエネルギーを割かなければならず，また体内に溜めておくこと自研究の発表

口頭発表

ポスター発表1.

1.

2.

北将樹: 切れ味の良い分子を自然界にもとめて、

4.

5.

ChemicalCommunicationontheMammalian Venom. 新学術領域研究「化学コミュ

北将樹: 哺乳類由来の神経毒の化学生物学研究、ニケーションのフロンティア」第 1 回国際シン第 42 回日本分子生物学会年会・シンポジウム『トポジウム（ISCC2019） 2019 年 1 月．
2.

北将樹: 哺乳動物毒における化学コミュニケー

北将樹: 哺乳類由来の神経毒の化学生物学研究、ションの解明、新学術領域研究「化学コミュニケ

宇都宮大学バイオサイエンス教育センター・C-ーションのフロンティア」第 6 回公開シンポジ

Bio セミナー、2020 年 2 月.

ウム, 2019 年 12 月.

森田真布, 武仲敏子, 別所学, Maturana D. Andres,
木越英夫, 大舘智志, 上村大輔, 北将樹: 食虫動

誌上発表

物トガリネズミ由来の麻痺性神経毒ペプチドの1.

A. Arai, R. Watanabe, A. Hattori, K. Iio, Y. Hu, K.

構造と生物活性. 日本農芸化学会 2020 年度大会、Yoneda,2020 年 3 月.

Dimethylaminopyrene as a fluorescent affinity mass

矢野佑介，Maturana, Andres D., 森田真布，北将

tag for ligand-binding mode analysis. Sci. Rep., 10,

樹: ブラリナトガリネズミ由来の神経毒ペプチ

7311, 2020.

ド BPP 類の合成研究、日本農芸化学会 2021 年度
6.

Kita:

第３回函館セミナー、2019 年 9 月.

キシン』の織りなす多元的世界、2019 年 12 月.
3.

M.

2.

H.

Kigoshi,andM.

Kita:N,N-M. Kita and H. Kigoshi: Discovery and use of natural

大会、2021 年 3 月.

products and derivatives as chemical probes. in The

北将樹、矢野佑介、鈴木麻佑子、森田真布、大舘Discovery and Utility of Chemical Probes in Target

智志：食虫性哺乳類における化学コミュニケー

Discovery, Ed. P. Brennan (The Royal Society ofション、日本化学会第 101 春季年会・中長期シChemistry), pp. 124–149, 2020.

ンポジウム、2021 年 3 月.