23-11

GenNext® Shin-RamDA-seq®
Single Cell Stranded Kit(Code No. RML-101, RML-101T)

取扱説明書
TOYOBO CO., LTD.
Bioproducts Sales and Marketing Department
OSAKA JAPAN

―目次―
[1]
[2]
[3]
[4]

[5]
[6]
[7]
[8]

はじめに・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
製品内容・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
製品のほかに用意するもの・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
使用方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
1. 細胞溶解または RNA 希釈・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
2. 熱変性反応・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
3．ゲノム除去反応・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
4．cDNA 合成および増幅反応(RT-RamDA®反応)・・・・・・・・・・・・・・・・・・
5．2nd 鎖合成反応・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
6．ライブラリー調製・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
7．ライブラリー検証・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
8．シーケンスデータの確認・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
実施例・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
トラブルシューティング・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
関連製品・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
参考文献・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・―ご注意―
本キットに含まれる試薬は、すべて研究用試薬です。診断・臨床用試薬としては決して使用しないでください。本キットの使用にあたっては、実験室での一般の注意事項を厳守し、安全に留意してください。
※RamDA-seq® 、RT-RamDA® 、Shin-RamDA-seq® は 国 立研 究 開発
法人理化学研究所の登録商標です。
※GenNext® は、東洋紡株式会社の登録商標です。
※その他の登録商標または商標は各所有者に帰属します。

RML-101

1

2
3
4
6
6
9
9
10
11
12
16
16
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18
19
19

[1] はじめに
GenNext® Shin-RamDA-seq® Single Cell Stranded Kit は、GenNext® RamDAseq® Single Cell Kit の改良版にあたり、シングルセルや微量の RNA から次世代シーケンス解析(NGS)用のライブラリー調製を行うためのキットです。本キットをご使用
いただくことで、完全長 total RNA-seq のための NGS ライブラリーを調製でき、ストランド解析も可能です。
本キットでは、国立研究開発法人理化学研究所で開発された、Reverse
Transcription with Random Displacement Amplification(RT-RamDA®) 法参考文献(1)を採用しています。RT-RamDA®法は、ランダムプライマーと逆転写酵素の鎖置換活性を利用した新規 cDNA 増幅方法であり、poly(A) RNA に加え、non-poly(A) RNA
由来の cDNA を高感度に検出します。さらに Shin-RamDA-seq®では、rRNA のさらなる低減やストランド解析が実装されており、より高精度な RNA-Seq 解析が可能です。

図 1. 本キットのワークフロー
各ステップの反応時間と反応液の添加量、作業を休止いただく際の作業休止ポイントを示します。本キットには、ワークフロー中の Purification、アダプター付加反応に使用する、磁性
ビーズ、インデックスアダプター試薬を含みません。「[3] 製品のほかに用意するもの」（p.4）
を参照し、ご用意ください。

2

RML-101◆本キットの特長◆
1. シングルセルや微量 RNA から cDNA 調製可能
サンプルとして、1～100 細胞 または 10pg~1ng total RNA に対応
2. 完全長 cDNA を解析可能
10kb 以上のターゲット RNA の全長をリードでカバーできる cDNA を調製可能
3. 様々な種類の RNA を検出可能、従来技術より検出遺伝子数がアップ
Poly(A) RNA の解析以外にも様々な RNA の解析にご利用いただけます。
◇アイソフォームや選択的スプライシングの同定◇poly(A) RNA や non-poly(A) RNA (ヒストン RNA や lncRNA)の検出◇核内 RNA(pre-mRNA や lncRNA)の検出
4. ライブラリー調製まで対応（別途アダプターは必要）
本キットで cDNA 増幅後の Illumina 社 NGS 用ライブラリー調製まで行うことができます（別途 Agencourt AMPure XP 試薬（Beckman Coulter 社）などの精製ビーズ、
TruSeq DNA Single Indexes（Illumina 社）などのアダプターキットが必要です）。
5. ストランド解析が可能
ストランド解析が可能です。

[2] 製品内容
本キットには、以下の試薬が含まれております。試薬は-20℃で保存してください。
GenNext® ShinRamDA-seq™ Single Cell Stranded Kit(Code: RML-101, RML-101T)
保存
容量
試薬名
① Lysis Buffer②Lysis Enhancer③RNase Inhibitor④Nuclease free water⑤RT-RamDA® Buffer⑥gDNA Remover⑦rRNA Remover⑧RT-RamDA® Enzyme Mix⑨RT-RamDA® Primer Mix⑩2nd strand synthesis Buffer⑪2nd strand synthesis Enzyme
RML-101

-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
3

(RML-101)

240 μL240 μL22 μL
960 μL240 μL
54 μL
30 μL
54 μL
54 μL
330 μL
55 μL

容量(RML-101T)

60 μL
60 μL
6 μL
240 μL
60 μL
14 μL
8 μL
14 μL
14 μL
83 μL
14 μL

⑫2nd strand synthesis Primer Mix⑬Fragmentase⑭End Repair and A-tailing Buffer⑮End Repair and A-tailing Enzyme⑯Ligation Solution⑰Library Amplification Master Mix⑱Library Amplification Primer Mix

-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃

275 μL120 μL
96 μL
24 μL
480 μL
300 μL120 μL

69 μL
30 μL
24 μL
6 μL
120 μL75 μL
30 μL―注意事項―
本キットに含 まれ る試 薬の 中には、 弊 社よ り販 売 している 別キット、 GenNext®
RamDA-seq® Single Cell Kit (Code: RMD-101)、RT-RamDA® cDNA Synthesis Kit(Code: RMD-201) 、 RamDA® シ リ ー ズ 用 Cell Lysis Kit (Code: RMD-301) 、QuantAccuracy®, RT-RamDA® cDNA Synthesis Kit (Code: RMQ-101)、GenNext®
NGS Library Prep Kit (Code: LPK-101) などと名称が同一の試薬が含まれますが、別
キットによる試薬の代替はできませんのでご注意ください。
本キットでは微量のサンプルから cDNA の増幅、ライブラリー調製を行うため、作業工程中で環境中の DNA などが混入すると、実験結果が著しく損なわれる可能性があります。清浄度の高い部屋で作業を行うなど、コンタミネーション対策には十分注意してください。

[3] 製品のほかに用意するもの
本キットのほかに、以下の機器・試薬類をご用意ください。
・サーマルサイクラー、またはインキュベーター
ご使用にあたっては各装置の取扱説明書に従ってください。

・

磁性ビーズ
Agencourt AMPure XP 試薬（Beckman Coulter、カタログ番号：A63880、A63881 等）を推奨いたします。ご使用にあたっては試薬の取扱説明書に従ってください。

・ 磁気スタンド
磁性ビーズを用いた精製の際に使用します。
磁気スタンドにはマグネットプレート Bit-Mag96(サンプラテック 品番：30550)
がお使いいただけます。
・ 80%エタノール
磁性ビーズを用いた精製の際の洗浄液として使用します。
4

RML-101

・

インデックスアダプター
インデックスを有する TruSeq（Illumina）などのライブラリー作製で一般的に使用されるアダプターが使用できます。
製品名（例）
TruSeq DNA Single Indexes Set A （ 12 Indexes, 24
Samples）
TruSeq DNA CD Indexes (96 Indexes, 96 Samples)
IDT for Illumina – TruSeq DNA UD Indexes v2 (96Indexes, 96 Samples)・

カタログ番号
20015960
20015949
20040870

NSR プライマー
本キットでは、NSR Primer Set for human (Code: NSR-101)または NSR
Primer Set for mouse (Code:NSR-102)を使用することができます。
NSR Primer Set for human (Code: NSR-101)
1st NSR Primer Mix for human-20℃
2nd NSR Primer Mix for human
-20℃

54μL
275μL

NSR Primer Set for mouse (Code: NSR-102)
1st NSR Primer Mix for mouse-20℃
2nd NSR Primer Mix for mouse
-20℃

54μL
275μL

・ 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)
ライブラリー調製時に DNA の溶出に使用します。水での代用はできません。
以下の消耗品は動作確認済みとなります。
チューブ及びキャップ
UC,EU Optical wide area 8-cap strip,
Robust while flexible,with wide indented flat
cap
RP,UC,SFGC,Extra Robust,Fits shell Frame
Grids (0.2 mL)
96 well プレート及びシール
RP,LF,SEMI k,cuttable,96 well plate (0.2mL)
EU Optical wide area 96 cap plate withwide area indented flat caps

RML-101

5

メーカー
Nippon genetics/BIOplastics

カタログ番号
BPB79701-1/BPB79701-1

Nippon genetics/BIOplastics

BPK69901/
K69901

メーカー
Nippon genetics/BIOplastics
Nippon genetics/BIOplastics

カタログ番号
BPB50651/
B50651
BPB57601/
B57601

マグネットスタンド
Magna Stand for 8-welltube preparation
Bit-Mag96

メーカー
Nippon genetics

カタログ番号
FG-SSMAG2

サンプラテック

30550[4] 使用方法
本キットは、サンプルとして、細胞、または total RNA から、ライブラリー調製のための cDNA を合成することができます。
ご使用になるサンプルに合わせて、下表に示すセクション 1.A～B のいずれかの「細胞溶解／RNA 希釈」を行った後、「熱変性」以降の操作に進んでください。

細胞

サンプル
細胞溶解 / RNA 希釈
FACS による細胞セクション 1．A (p.5)
取得
FACS 以外によるセクション 1．B (p.6)
細胞取得
Total RNA
セクション 1．C (p.7)

熱変性セクション 2 (p.8)

１．細胞溶解／RNA 希釈 （Cell lysis or RNA dilution）
A. FACS を用いて細胞取得を行う場合(1) 細胞溶解に必要な試薬をチューブに作製します。以下を参考に、必要量より余分量をみて調製してください。
細胞溶解液の調製
1 反応(μL)
1
0.95
0.05
1
3

①Lysis Buffer②Lysis Enhancer③RNase Inhibitor④Nuclease free water
Total※余分量を 10%とした場合

20 反応(μL)※ 100 反応(μL)※
22
110
20.9
104.5
1.1
5.5
22
110
66
330

(2) 96well プレートまたは 8 連チューブに、細胞溶解液を 1well あたり 3μL 分注します。分注は氷上で行い、分注後すぐに qPCR 用シールや熱圧着式シールにてシーリングを行ってください。 ソーティングまで、プレートを氷上または 4℃で保管します。
(3) ご使用の FACS の取扱説明書やメーカーが推奨するパラメーターに従い、細胞溶解液を分注したプレートに細胞のソーティングを実施してください。
6

RML-101

(4) ソーティング後、シーリングを行い、遠心を行ってください。
(5) その後、すみやかに次のステップに進むか、－80℃でサンプルを保管してください。
B. FACS 以外で細胞取得を行う場合
1 サンプルあたり、細胞溶解サンプル 3μL を調製します。マニュアルピッキングなどで細胞を分取する際は、細胞溶解液 2.5μL に 0.5μL の細胞サンプルを添加します。細胞溶解が不十分となるため、細胞とともに持ち込まれる PBS などの持込
液量は 0.5μL 以下としてください。細胞サンプルが 0.5μL 未満の場合、細胞溶解液の調製時に Nuclease ｆree water を加え、調整してください。
(1) 細胞溶解に必要な試薬をチューブに作製します。
例) 細胞サンプルの液量が 0.5μL の場合
1 反応(μL)
1
0.95
0.05
2

① Lysis Buffer② Lysis Enhancer③ RNase Inhibitor
Total
細胞サンプルが 0.5μL 未満(xμL)の場合④ Nuclease free water※余分量を 10%とした場合

1-x20 反応(μL) ※ 100 反応(μL) ※
22
110
20.9
104.5
1.1
5.5
44
220

(1-x)X22(1-x)X110(2) 96well プレートまたは 8 連チューブに細胞溶解液を 1well あたり 2.5μL(または(3-x)μL)分注します。分注は氷上にて行い、分注後すぐにシーリングを行い、遠心してください。プレートは、細胞サンプルの添加まで氷上または 4℃にて保管してください。
(3) 細胞サンプルの添加までプレートを氷上または 4℃にて保管を行い、細胞取
得機器のマニュアルに従い、細胞サンプルの添加を行ってください。
(4) 細胞サンプルの添加後、シーリングを行い、遠心を行ってください。
(5) その後、すみやかに次のステップに進むか、-80℃にてサンプルを保管してください。

RML-101

7

C. 精製済みの total RNA を使用する場合
次工程に total RNA を 10pg～1ng (3μL)インプットするため、3.3～333 pg/μL となるように RNA を希釈します。希釈後の RNA 溶液中の RNA 希釈液が 90%以上となるように希釈してください。
(1) 以下を参考に RNA 希釈液を必要量チューブに作製してください。この RNAの希釈液を用いて、3.3～333 pg/μL となるように RNA を希釈してください。
RNA 希釈液の調製①Lysis Buffer②Lysis Enhancer③RNase Inhibitor④Nuclease free water
Total

100 反応(μL)
110
104.5
5.5
110
330

RNA 希釈例)
1ng Input を行う場合（333pg/μL total RNA 溶液）(μL)

RNA 希釈液
終濃度

10ng/μL total RNA
RNA 希釈液

1
29

97%

Total

30

10pg Input を行う場合（3.3pg/μL total RNA 溶液）(μL)

RNA 希釈液
終濃度

333pg/μL total RNA
RNA 希釈液

1
99

99%

Total

100

(2) 96well プレートまたは 8 連チューブに希釈した RNA 溶液を 1well あたり 3μL
分注します。
(3) 分注後、シーリングを行い、遠心を行ってください。
(4) その後、すみやかに次のステップに進むか、-80℃にてサンプルを保管してください。

8

RML-101

2．熱変性反応 （Denature）(1) 細胞溶解サンプルや RNA サンプルの分注されたプレートやチューブを 4℃にて遠心を行い、以下の温度でインキュベートしてください。
凍結サンプルを使用する場合は熱変性反応前に 4℃または氷上にて融解し、遠心した後に熱変性反応に進んでください。
熱変性反応
Step

Temperature

Time

70℃
4℃

1.5min.
hold

Denature

3．ゲノム / rRNA 除去反応 （Digestion of genomic DNA and rRNA）(1) ゲノム除去反応に必要な試薬をチューブに作製します。以下を参考に調製してください。
＊ERCC RNA 等、コントロール RNA を使用する場合は④Nuclease freewater の添加量を調整して下さい。
ゲノム除去反応液の調製⑤RT-RamDA® Buffer⑥gDNA Remover⑦rRNA Remover④Nuclease free water＊
Total※余分量を 10%とした場合

1 反応(μL)
0.3
0.45
0.25
2
3

20 反応(μL) ※ 100 反応(μL) ※
6.6
33
9.9
49.5
5.5
27.5
44
220
66
330

(2) 熱変性反応を行った 96well プレートまたは 8 連チューブに、ゲノム反応液を
1well あたり 3μL 添加し、遠心後、以下の温度でインキュベートしてください。
ゲノム / rRNA 除去反応
Step
Genomic DNA / rRNA digestion

Temperature
30℃
4℃

Time
5min.
hold

(3) ゲノム反応後、すみやかに次のステップに進んでください。

RML-1019

4．cDNA 合成および増幅反応（RT-RamDA®反応）(1) RT-RamDA®反応に必要な試薬をチューブに作製します。以下を参考に調製
してください。
＊NSR Primer を使用する場合は、⑦RT-RamDA® Primer Mix の代わりに
1st NSR Primer Mix for human、または 1st NSR Primer Mix for mouseを使用してください。
RT-RamDA®反応液
1 反応(μL)
1.5
0.45
0.45
0.6
3

⑤RT-RamDA® Buffer⑧RT-RamDA® Enzyme Mix⑨RT-RamDA® Primer Mix＊
④Nuclease free water
Total※余分量を 10%とした場合

20 反応(μL) ※ 100 反応(μL) ※
33
165
9.9
49.5
9.9
49.5
13.2
66
66
330

(2) ゲノム除去反応を行った 96well プレートまたは 8 連チューブに、RTRamDA®反応液を 1well あたり 3μL 添加し、遠心後、以下の温度でインキュベートしてください。
RT-RamDA®反応
Step
Priming 1
Priming 2
Reverse transcription
and amplification
Reverse transcription 2
Inactivation

Temperature

Time

25℃
30℃

10min.
10min.

37℃

30min.

50℃
98℃
4℃

5min.
5min.
hold

(3) RT-RamDA®反応後、すみやかに次のステップに進むか、-20℃～-30℃にて保管してください。

10

RML-101

5．2nd 鎖合成反応（2nd strand synthesis）(1) 2nd 鎖合成反応に必要な試薬をチューブに作製します。以下を参考に調製してください。
＊NSR Primer を使用する場合は 2nd strand synthesis Primer Mix の代わりに 2nd NSR Primer Mix for human または 2nd NSR Primer Mix formouse を使用してください。
2nd 鎖合成反応液⑩2nd strand synthesis Buffer⑪2nd strand synthesis Enzyme⑫2nd strand synthesis Primer Mix＊
Total
※余分量を 5%とした場合

1 反応(μL) 20 反応(μL) ※ 100 反応(μL) ※
3
63
315
0.5
10.5
52.5
2.5
52.5
262.5
6
126
630

(2) RT-RamDA®反応を行った 96well プレートまたは 8 連チューブに、2nd 鎖合成反応液を 1well あたり 6μL 添加し、遠心後、以下の温度でインキュベートしてください。
2nd 鎖合成反応
Step
Second-strand synthesis
Inactivation

Temperature

Time

16℃
80℃
4℃

60min.
15min.
hold(3) 2nd 鎖合成反応後、すみやかに次のステップに進むか、-20℃～-30℃にて保管してください。

RML-101

11

6．ライブラリー調製
本キットには、TruSeq DNA Single Indexes（illumina 社）や Agencourt AMPure
XP beads（Beckman Coulter 社）を含みません。「[3] 製品のほかに用意するもの」（p.4）を参照し、ご用意ください。
A. 二本鎖 cDNA の精製(1) 精製を始める前に、4 分の 1 希釈した AMPure XP beads（本製品には含まれません）を作製してください。希釈液は、AMPure XP beads を遠心し、その上清を希釈液として使用してください。
例) 8 サンプル分の 4 分の 1 希釈 AMPure XP beads の作製方法
a. 1×AMPure XP beads 220μL をマグネットスタンドに静置し、磁性ビーズが完全に吸着した後、上清を回収します。
b. a で回収した上清 180μL と 1×AMPure XP beads 60μL を良く混合し、4 分の 1
希釈 AMPure XP beads として使用してください。

(2) 5.(3)の 2nd 鎖合成反応後の二本鎖 cDNA 溶液 15μL に対して、4 分の 1
希釈 AMPure XP beads を 27μL 添加してください。その後、遠心を行い、25℃、2,000rpm にて 2 分間撹拌し、5 分間静置してください。
(3) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置き、溶液が透明になるまで静置します。その後、上清を除去します。
(4) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置いたまま、80%エタノールを150μL 加え、室温で 30 秒間インキュベートします。
(5) エタノールを除去します。
(6) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置いたまま、80%エタノールを150μL 加え、室温で 30 秒間インキュベートします。
(7) ピペットを用いて、エタノールを完全に除去します。
エタノールが残存している場合は、マイクロピペットを用いてエタノールを除去
してください。
(8) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置いたまま、25℃または室温で 5 分間、ドライアップします＊。

12

RML-101

＊エタノールが残存していると反応がうまくいかない可能性があります。磁性ビ
ーズがひび割れはじめるまでドライアップしてください。室温や湿度により、ドライアップの時間を調整してください。
(9) 96well プレートまたは 8 連チューブに、10 mM Tris-HCl (pH 8.0) を 1well あたり 4.5μL 添加し、遠心します。
(10) ビーズが完全に分散するまでボルテックスまたはピペッティングを行い、25℃
または室温で 5 分間インキュベートします。
(11) 遠心後、チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置き、溶液が透明になるまで 5 分間静置します。
(12) 透明な上清 4 μL を新しいチューブあるいはプレートに移し、次のステップに進むか、-20℃～-30℃にて保管してください。
B. 断片化・末端修飾・アデニン付加反応(1) 断片化・末端修飾・アデニン付加反応に必要な試薬をチューブに作製します。
以下を参考に調製してください。
断片化・末端修飾・アデニン付加反応液
1 反応(μL)⑬Fragmentase
1⑭ER+AT Buffer
0.8⑮ER+AT Enzyme
0.2
Total
2
※余分量を 10%とした場合

20 反応(μL) ※ 100 反応(μL) ※
22
110
17.6
88
4.4
22
44
220

(2) 精製した DNA 溶液 4μL に対し、断片化・末端修飾・アデニン付加反応液を
2μL 添加し、遠心後、以下の温度でインキュベートしてください。
断片化・末端修飾・アデニン付加反応
Step
Temperature
Fragmentation+ER+AT
Inactivation

30℃
65℃
4℃

Time
30min.
5min
hold(3) 断片化・末端修飾・アデニン付加反応後、すみやかに次のステップに進んでください。

RML-10113

C. アダプターライゲーション(1) アダプター（本製品には含まれません）を 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)を用いて50 nM に希釈します。
尚、以下表中の製品を使用する場合、原液を 300 倍希釈してください。
製品名
カタログ番号
TruSeq DNA Single Indexes Set A （ 12 Indexes, 24 20015960
Samples）
TruSeq DNA CD Indexes (96 Indexes, 96 Samples)
20015949
IDT for Illumina – TruSeq DNA UD Indexes v2 (96 20040870
Indexes, 96 Samples)(2) 断片化・末端修飾・アデニン付加反応を行った各サンプルに、⑯Ligation
Solution を 4 μL ずつ添加します。
(3) 各サンプルに 50 nM に希釈したアダプター溶液を 1 μL ずつ添加します。このとき、各サンプルの index はそれぞれ異なるようにすることに注意してください。
(4) タッピングまたは軽くボルテックスすることによって混和し、遠心後、以下の温度でインキュベートしてください。
アダプターライゲーション
Step

Temperature

Time

20℃
4℃

15min.
hold

アダプターライゲーション

D. DNA の精製（サイズセレクション）(1) アダプターライゲーション後の反応液 11μL に対して、1×AMPure XP
beads を 8.8μL 添加してください。その後、遠心を行い、25℃、2,000rpm にて 2 分間撹拌し、5 分間静置してください。
(2) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置き、溶液が透明になるまで静置します。その後、上清を除去します。
(3) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置いたまま、80%エタノールを150μL 加え、室温で 30 秒間インキュベートします。
(4) エタノールを除去します。
14

RML-101

(5) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置いたまま、80%エタノールを150μL 加え、室温で 30 秒間インキュベートします。
(6) ピペットを用いて、エタノールを完全に除去します。エタノールが残存している
場合は、マイクロピペットを用いてエタノールを除去してください。
(7) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置いたまま、25℃または室温で 5 分間、ドライアップします＊。
＊エタノールが残存していると反応がうまくいかない可能性があります。磁性
ビーズがひび割れはじめるまでドライアップしてください。室温や湿度により、
ドライアップの時間を調整してください。
(8) 96well プレートまたは 8 連チューブに、10 mM Tris-HCl (pH 8.0) を 1well あたり 7μL 添加し、遠心します。
(9) ビーズが完全に分散するまでボルテックスまたはピペッティングを行い、25℃
または室温で 5 分間インキュベートします。
(10) 遠心後、チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置き、溶液が透明になるまで 5 分間静置します。
(11) 透明な上清 6.5 μL を新しいチューブあるいはプレートに移し、次のステップに進むか、-20℃～-30℃にて保管してください。
E. PCR（ライブラリーエンリッチメント）(1) PCR（ライブラリーエンリッチメント）反応に必要な試薬をチューブに作製します。以下を参考に調製してください。
PCR 反応液
1 反応(μL)⑰Library Amplification
Master Mix⑱Library Amplification
Primer Mix
Total※余分量を 10%とした場合

RML-1011520 反応(μL) ※100 反応(μL) ※

2.5

55

275

1

22

110

3.5

77

385

(2) 精製した DNA 溶液 6.5 μL に対して PCR 反応液を 3.5μL ずつ添加し、遠心後、以下のサイクルで PCR を行ってください。
ライブラリーエンリッチメント反応
Step
Temperature
Denature
94℃
PCR
98℃
60℃
68℃
4℃

Time
30sec.
10sec.
10sec.
15sec.

19-20 cycles＊

hold＊次頁記載の表を参考に PCR サイクルを変更してください。
下記記載の表を参考に PCR サイクルを変更してください。
Estimated amount of total RNA per Typical Number of PCR Cycles
cell / total RNA amount>10pg
19
5-10pg
19-20＊RNA 量が 5pg より少ない場合は PCR サイクルを増やしてください。
＊得られるライブラリー収量が多い場合、PCR サイクルを減らしていただくことも可能です。
F. ライブラリーの精製(1) PCR 溶液 10μL に対して 1×AMPure XP beads を 10μL 添加してください。その後、遠心を行い、25℃、2,000rpm にて 2 分間撹拌し、5 分間静置してください。
(2) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置き、溶液が透明になるまで静置します。その後、上清を除去します。
(3) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置いたまま、80%エタノールを150μL 加え、室温で 30 秒間インキュベートします。
(4) エタノールを除去します。
(5) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置いたまま、80%エタノールを150μL 加え、室温で 30 秒間インキュベートします。
(6) ピペットを用いて、エタノールを完全に除去します。
(7) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置いたまま、25℃または室温で 5 分間、ドライアップします＊。
16

RML-101

＊エタノールが残存していると反応がうまくいかない可能性があります。磁性
ビーズがひび割れはじめるまでドライアップしてください。室温や湿度により、
ドライアップの時間を調整してください。
(8) 96well プレートまたは 8 連チューブに 10 mM Tris-HCl (pH8.0)（または TE
Buffer (pH8.0)）を 1well あたり 20μL 添加し、遠心します。
(9) ビーズが完全に分散するまでボルテックスまたはピペッティングを行い、25℃
または室温で 5 分間インキュベートを行い、遠心します。
(10) チューブあるいはプレートを磁気スタンドの上に置き、溶液が透明になるまで
2 分間静置します。
(11) 透明な上清 20μL を新しいチューブあるいはプレートに移し、QC のステップに進むか、-20℃にて保管してください。
7.ライブラリーの検証(1)

ライブラリーの定量
GenNext® NGS Library Quantification Kit(Code: NLQ-101) 、あるいは同等の市販品を用いて、qPCR で定量することを推奨いたします。GenNext® NGS Library
Quantification Kit(Code: NLQ-101) は illumina 次世代シーケンサー用のライブラリ
ー定量キットで、illumina 社が採用している P5、P7 アダプター配列に対応しており、
フローセル上に結合できるライブラリーのみを特異的、かつ正確に定量します。

(2)

ライブラリーサイズ分布の確認
ライブラリーの分布を確認する場合は、Bioanalyzer（アジレント・テクノロジー株式会社）、MultiNA（株式会社島津製作所）等の電気泳動で確認することをお勧め致します。分布例は続く［5］実施例の 実施例 1. 細胞からのライブラリー調製、NGS 解析 などをご参考ください。

RML-10117

[5] 実施例
実施例１ 細胞からのライブラリー調製、NGS 解析＜方法＞
本製品を用いて、平均化したマウス由来 NIH3T3 細胞 1 細胞分からライブラリー調製を行い、Agilent 4200 TapeStation システム（アジレント・テクノロジー株式会社）によるライブラリーサイズ分布の確認、Miseq（イルミナ株式会社）による NGS 解析を行いました（n = 4）。
尚、逆転写反応時および 2nd 鎖合成反応時のプライマーとして本製品付属のプライマー（⑨RT-RamDA® Primer Mix、⑫2nd strand synthesis Primer Mix）または NSR プ
ライマー（NSR Primer Set for mouse、NSR-102）を用いました。インデックスアダプタ
ーとしては TruSeq DNA Single Indexes Set A（12 Indexes, 24 Samples）を用い、ライ
ブラリーエンリッチメント反応時の PCR サイクル数は 20 サイクルで実施しました。
＜結果＞
まずライブラリーサイズ分布はランダムプライマーであっても大きな変化はなく、300
bp 前後、10～60 nM 程度のライブラリーが得られました（図 1、2）。

図 1. ランダムプライマーでのライブラリーサイズ分布

図 2. NSR プライマーでのライブラリーサイズ分布18

RML-101

また NGS 解析で得られたシーケンスデータを BaseSpace Sequence Hub（イルミナ
株式会社）上の RNA-Seq Alignment Version 2.0.2（イルミナ株式会社）にて Mus
musculus/mm10 (RefSeq) をリファレンスとして解析したところ、表 1 および図 3 のような結果が得られました。マッピング率やストランド解析率が高く、アバンダントな遺伝子である rRNA 率を抑えての解析が可能であり、遺伝子の全長性（カバレッジ）にも優れてい
ることがわかります。
表 1. NGS 解析の基礎データ

図 3. NGS 解析における全遺伝子の平均カバレッジ

横軸はマッピングされた全遺伝子における 5’末端（横軸における 0）から 3’末端（横軸における 100）の平均カバレッジを示しており、縦軸は平均が 1 になるように正規化されたカバレッジの高さを示しています。

RML-10119

実施例 2 個々の遺伝子におけるカバレッジ解析、ストランド解析＜方法＞
本製品を用いて、平均化したヒト白血病細胞株 K562 細胞 1 細胞分からライブラリー
調製を行い、実施例 1 と同様に Miseq（イルミナ株式会社）による NGS 解析を行いました（n = 4）。
尚、逆転写反応時および 2nd 鎖合成反応時のプライマーとして本製品付属のプライ
マーNSR プライマー（NSR Primer Set for mouse、NSR-102）を用いました。インデック
スアダプターとしては TruSeq DNA Single Indexes Set A（12 Indexes, 24 Samples）を用い、ライブラリーエンリッチメント反応時の PCR サイクル数は 20 サイクルで実施しました。
＜結果＞
NGS 解析で得られたシーケンスデータをシングルセル RNA-Seq 用のカバレッジ解析
ツールである Millefy 参考文献(2)（https://github.com/yuifu/millefy）を用いて解析しました。
長鎖ノンコーディング RNA である NEAT1 遺伝子（3.7 kb 程度の NEAT1_1 と 23 kb 程
度の NEAT1_2 の 2 種類）および、逆向きに転写され、かつ隣接する遺伝子である
RBM18 遺伝子と MRRF 遺伝子について解析したところ、図 4 および図 5 のような結果が得られました。長鎖ノンコーディング RNA における全長性や、逆向きに転写されるRNA のストランド解析においても高い性能を発揮していることがわかります。

図 4. NEAT1 遺伝子のカバレッジ解析の結果

図 5. MRRF 遺伝子および RBM18 遺伝子のカバレッジ解析の結果
20

RML-101

[6] トラブルシューティング
原因
対策
現象
得られる cDNA 量 RNA が分解して ・RNA が分解していないか確認してくださ
が少ない
いる
い。
・チップやチューブなどに RNase がコンタミしていないか確認してください。
・細胞溶解や RNA 希釈のステップは氷上にて行ってください。
ライブラリー収量が 精製時のエタノー ・磁性ビーズをエタノールで洗浄した際にエ少ない
ルが残存している タノールが残存していると後反応を阻害す
ることがあります。磁性ビーズが乾燥しているか確認してください。
・作業部屋の湿度が高いとビーズの乾燥がされにくい場合があります。作業部屋の湿度を 55%以下にすることをお勧めします。

RML-10121

[7] 関連製品
品名

内容

Code No.

NSR Primer Set for human

96 回用

NSR-101

NSR Primer Set for mouse

96 回用

NSR-102

内容
500 回用
/20μL 反応

Code No.

96 回用

RMD-101

品名
イルミナ社次世代シーケンサー用ライブラリー定量キット

GenNext® NGS Library Quantification Kit
NGS 解析用 cDNA 調製キット

GenNext® RamDA-seq® Single Cell Kit

NLQ-101[8] 参考文献(1) Hayashi T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics ofrecursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9：619 (2018)(2) Ozaki H., et al. Millefy: visualizing cell-to-cell heterogeneity in read coverage of single-cell
RNA sequencing datasets. BMC Genomics 21:177 (2020)

より詳細な情報は、弊社ウェブサイトをご覧ください
https://lifescience.toyobo.co.jp/

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【製造・販売元】－価格・在庫に関するお問い合わせ－
東洋紡株式会社 バイオプロダクト営業部 (大阪)〒530-0001 大阪府大阪市北区梅田一丁目１３番１号
大阪梅田ツインタワーズ・サウス
TEL 06-6348-3786 FAX 06-6348-3833
E-mail : order_lifescience@toyobo.jp
東洋紡株式会社 バイオプロダクト営業部 (東京)〒104-8345 東京都中央区京橋一丁目１７番１０号 住友商事京橋ビル
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東洋紡株式会社 バイオプロダクト営業部 テクニカルライン
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開設時間 9:00～12:00 , 13:00～17:00 (土日祝日、休日を除く)
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