単一分子分光による光合成ア ンテナ複合体 の光励起状態 の解明
Single‐ L[Olecule Spectroscopy of PhOtO‐ excited

States Of PhotOsynthetic Antenna Complex

代表研 究者 東京 工業大学 松 下 道雄 TokyO Institute ofTechnO10gy Michio MATSUSHITA

The frst step ofthe photosynthesis is energy transfer from photo―excited pittentS tO the reaction

center where charge separation takes place. This energy transfer process is dittEcult to study onmolecular basis because moLcular prope■ ies are averaged over sttucturally heterogeneous

ensemble of the light― haⅣ esting(LII)pigment― protein complexes.Recent developments of lasersand photo¨ detectors enable spectroscopy of individual molecules, providing direct access tophoto¨ physics of individual complexes. We have built a laser―

scanning confocal fluorescencernicroscope operating at liquid heHum temperature.The sample is kept at l.5 K to flx confollllationof the protcin. In order to invcstigate LII complcxes in natural envirollment, LI‐ I complexes

extracted and pu

fled in the FniCelle of LDAO or OG are transferred into lipid bilayer by dialysis.

LH complex to lipid bilayer ratio of 5:3000 tumed out to produce aggregate of LH complexes.

Photo‐ bleaching of the aggregate indicates energy transfer among complexes.Enlission froln an

aggregate of 4‑5 complexes decay exponentially to tlle level of a single complex,and theremaining emission is bleached in one step.

研 究 目的
光合成過程 で最 も重要な光捕 集機構 の解 明は、光 と物質 の相 互 作用研 究 の 中で も特 に大 きな意味 を持 つ。近年、優れ た レーザ ー と高感度蛍光検 出法 の組み合わせ によ り単 一分子 の分光学的観演1が 可能 にな って きた。本研究は この よ うな最近 の実験手法 を取 り入れて光捕集機
構 の核 心 を明 らかに しよ うとす るもの である。
植 物や光合成細菌 は光合成 にお ける集光効率 を高 めるために、一 個 の光合成反応 中心の周りに 100個 以 上のク ロロフ ィル 色素 を配 置 し、これ らが光捕集 の ためのアンテナ として働 く。
そ して 、ア ンテナ色 素 か ら反応 中心 へ のエ ネル ギー移動 は 90%を 超 える驚異的な効率 で進 む。
このア ンテナ色 素は多数 の色素 とタ ンパ ク質 との複合体 として生体膜 中に二次元組織化 されてい る。 エ ネル ギー移動機構 を理 角季す る第 一 歩 は色素・ タンパ ク複合体 の光励起状態 の解 明である。色素・ タ ンパ ク複合体 は無 数 の立体構造 を持 つの で 、個 々の立体構造 にお ける励起
状態 を明 らかにす ることがエ ネル ギー移動 の解 明に不可欠 である。本研究は この よ うな観 点か ら一 個 一個 の色素 。タ ンパ ク複合体 の分光学的研究 を行 う。
研究経過
我 々 は 14年 度 に新 規研究室 を立ち上 げるに当た り、低温 で単一 分子 か らの発光が検 出できる装置 の製作 か ら開始 した (Fig.1参 照 )。

ｉ降l ll●・⁚¨ ロー尋濡cwttlser

Fig.l Low‐ temperature laser scanning confocal fluorescence IIlicroscope
製作 したのは、液体ヘ リウム クライオ ス タ ッ ト中に試料 を置 き、極低温 での測定 が 可能 な
共焦点 レー ザ ー走査型蛍光顕微鏡 である。光源 は Arイ オ ン レー ザ ー励起 の cwTiSレ ー ザ ー
で、発振波長 は 780〜 920 nmで ある。励起 レーザ ー ビーム は ピンホール に集光 してモー ドを整 えた後、平行 ビーム に してヘ リウム クライオス タ ッ ト中の対物 レンズ に導 いた。対物 レン
ズ には n.a.0.55の 非球面単 レンズ を用 い た。 レンズの焦点距離は 1.45 mmで あ り、液体 ヘ リウムの屈折率が 1.025と 空気 とわずかに異 なるため、液体ヘ リウム 中では焦点距離 が約 50 μm短 くなる。従 つて液 体ヘ リウム 中で試料 に対す る対物 レンズの焦点合 わせ を行わなけれ ばならない。そ のために、lμ mの 精度 で焦点合 わせがで きる試料 ステ ージ を製 作 した。試料 中の単一 分子 か らの発光 は同 じ対物 レンズ で集 め られ 、 ビームス プ リッター を通 して検 出器 へ導かれ る。励起光波長 の迷光 を取 り除 くために、バ ン ドパ スフ ィル ター を 5枚 重ねてアイ ソ レー シ ョン 12 dBを 達成 した。検 出器 には単 一光子検 出 ア ヴァランシェ・ フォ トダイオー ドを用 い た。検 出効率 は 900 nmで 約 30%、 ダー クカ ウン トは約 20 counts/secで ある。
組み上 げた共焦点蛍光顕微鏡 の空間分解能 は 800 nmと 回折限界 に近い性能 を持 ち (Fig.2)、

試料 の発光 の検出効率 は約 0.5%、 発光 の検出限界 はお よそ 500 photon/secで パ ワー に してlo‐ 16wの オー ダー である。

23X(μ m)Fig.2 Fluorescence image ofsingle LH complexes

考察
この装置 を用 いて 、光捕集 (Light‐ Harvesingl色 素・ タンパ ク複合体 (LH複 合体 )に ついて 、一個 の LH複 合体 の発光 を観測 できることを確 かめた。複合体 は ミセル として可溶化 し、そ の pM程 度 の薄 い溶液 にポ リマー を加 えて ス ピン コー トす るこ とでポ リマー薄膜 中 に分散させ た。顕微鏡 の焦点である l μm2中 に一個以下 の複合体 しか存在 しない濃度 で一 個 の複合体 か らの発光 を提 えることがで きた。発光観測は液体 ヘ リウム温度 だけでな く、液体窒素温度 で も十分可能であ った。発光体 は一 個 であることは、 クライオ ス タ ッ ト中に酸 素 を導入 して複合体 を光退色 させ た とき、観測 してい る発 光信号 が一段 階 で零 にな った こ とで確認 した(Fig.3)。

︵ｏｏ∽Ｌｏ一∽∽ＦにΦヽＣうｏｏ︶2000
150010005000300400
Time(Sec)Fig.3 Photo‐ bleaching of one light‐ harvesting complex

新 しい現象 として LH複 合体間 の励起 エ ネル ギー移動 を示唆す る光退色 が見つ かつた。LH
複合体 の会合体 の光退色 を液 体窒素温度 で調 べ た ところ、複合体 の数 と同 じ段数 を持 つ 階段状 の退色は見 られず 、複合体 が一 個 になるまで徐 々 に発光 が減少 し、最後 の一個 の複合体 は一段階で退色 した (Fig.4)。

この ことは、複数 の複合体 うちで発光 を担 つてい るの は一個 の複合体 であ り、他 の複合体 は光吸収 体 として振 る舞 って い ると考 える と説 明できる。 一個 の複合体 には 27個 のバ クテ リオ ク ロロフ ィル 色素が含 まれているので、そ の一個 一個 が順番 に
光化学反応 によって光 を吸収 で きな くな つている と解釈 できるか らである。

００８︒
０６→ Ｅ ｏｏｒｂ００４︒
０２︒

つｏｅ ｃｐ ●´ Ｅ Φ200300mme(sec)Fig.4 Photo‐ bleaching of an aggregate oflight‐ harvesting complexes
共焦点顕 微鏡 は試 料 中の一 点 の微弱な発光 を観測す るの に適 してい るが 、試料全体 を知 るには照射 ビーム を試 料 上で走査 しな けれ ばな らない。 そ こで 、試料上 に発 光分子 が どの よ うに分布 してい るかを調 べ るために、100 μm四 方 を照射 して そ の 中の単一発光分子 を観測できる wide field照 射顕微鏡 の光学系を共焦点顕微鏡 に付 け加 えた。現在は顕微鏡 をよ り明るい
もの にす るために、対物 レンズの改良に取 り組 んでいる。現在使用 してい る対物 レンズ は 、1)n.a.が 小 さい,空 気 中で設計 されて い るので液体ヘ リウムの屈折率 1.025の 影響 を受 ける 3)色 収差 がある、 とい う二 つの 問題 を抱 えて い る。 これ らを解消す べ く、n.a.o.65の 非球面単 レンズ、n.a.1.o6の GRINレ ンズ、n.a.o.65の 反射型対物 レンズの三種類 を検討 してい る。
最終的 には天 然 の環境 である脂質 二重膜 中 に一個 一 個孤 立 した LH複 合体 を分光測定す る
こ とが 目標 である。 このため、脂質 二重膜 中で LH複 合体 が会合 しない条件 を探す ために、脂質 に対す る LH複 合体 の濃度や脂質分子 の種類 を変 えた実験 を行 つて い る。

LH2複 合体 の ミセルの試料 は名古屋工業大学応用化学科南後研究室か ら提供 していただいた。
研究発表
口頭発表

1.松 下道雄 ;「 光合成 アンテナ複合体 の単一 分子分光」、日本物理学会 2003年 秋 の分科会 (岡 山、2003)

2.小 井川浩之、星野創 、カロ藤太朗、松下道雄 ;「 単一 分子分光 のための低温共焦点蛍光顕微鏡の製作」、分子構造総合討論会 2003(京 都、2003‐ )3,星 野創、小井川浩之、加藤太朗、松下道雄 ;F単 一分子分光による光合成アンテナ複合体の研究」、日本物理学会 2004年 春の年会 (福 岡、20041
4,加 藤太朗、小井川浩之、星野創、内山大輔、キムチャンマン ;「 単 子分光のため=分の低温共焦点顕微装置の製作」、日本物理学会 2004年 春の年会 (福 岡、2004)