糸状性 ラン色細胞 の分子遺伝学的研究
京派研

都 大
遣 期究 機学
間:富:谷朗 子
2002年 8ノ 月 20日 〜2003年 3月 23日

関 : Division ofMicrobiologyp SChool ofBiOchemistry andMolecular BIolott Universiw ofLeeds
Leeds Ls2 9J■ United Kingdom

研 究 指 導 者 : D■ Dad G.Adnms

成果報告書(整 理番号 2002… 5011)
富谷朗子
研究課題

糸状性ラン色細 菌 の分子遺伝学的研究

派遣者

富谷朗子

所属機関 E身 分

京都大学総合 博物館 特別研究員 PD

派遣研究機関

英国リーズ大学,生 化学 自分子生物学科1

微生物教三 D.G.Adams研 究室
渡航期間

2002年 8月 20日 〜2003年 3月 23日

1.研 究 目的肋 s″ r sp.を 材料 にホルモゴニア形成期におこる同調的細胞分裂を制ffrす る遺伝子の単離と解析を通じて、糸状性ラン色細 菌 の分 子遺伝学的実 験 手法を習得する。

2.1ま じめにラン(藍 )色 細菌はラン藻、シアノバ クテリアとも呼ばれ、酸素発生型光合成を行なう原核生物である。ラン色細菌は地球上に最初に出現した酸素発生型光合成生物であり、その起源は少なくとも27億 年前(Brocks θ′″,1999)に さかのぼると考えられている。ラン色細腐 は現在まで数十億年にわたって、酸素 の発生、有機物の生産によつて地球環境や生態圏に大きな影響を及ぼしてきた。ラン色細菌は形態的な多様性、生理学的な適応力に富み、発生学・生態学的にも興味深い対象である。また、ラン色細菌の中には窒素固定を通じて植物と共生するものがいることから、農学的にも重要である。こうしたラン色細菌のさまざまな特徴を解明するためには、分子遺伝学が強力な実験手法となる。これまで、国内でのラン色細菌の分子遺伝学研究は、主に Synechocystis sp.な どの単細胞性ラン色細菌を用いて行なわれてきた。しかし、これらは、細胞 の分化や植物との共生を行わないため、ラン色細菌の持つ複雑で多様な特徴嗜研究することはできなか

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富谷朗子
つた。
そこで、本派遣では、窒素固定 能をもち、細胞 の分化、共生を行なうラン色細菌で唯 ―の実験 系である 比嘲"sp.の分子遺伝 学的手法 の習得を目指した。此覆″ sp.は 条件的従属栄養性で、栄養細胞が異質細胞 、アキネー ト、ホルモゴニアなどに細胞分化し、植物と共生関係を結ぶことが知られてい る(Oohen θ′″ 1994)。 この実験生物にはトランスポゾンによる変具体 の作成、トランス配列による相補、特定配列をターゲットにした変異 体 の作成 といった実 験技術が利用できる。さらに最近、このラン色細 菌 の全ゲノム配列が 決 定され、新規遺伝子の単離が迅速に行なえるようになつた。

本派遣では、糸状性ラン色細菌のホルモゴニア形成に着目し、それに関与する遺伝子の単離とその解析を通じて、分子遺伝学的実験手法の修得を目指した。ホルモゴニアは、環境条件の変化により誘導される、運動性を持 つ一時的な細胞形態で、植物との共生の開始に大きな役割を果たしている。ホルモゴニア形成は発生学的、生態学的、また農学的にも重要な課題であるが、その分子的背景はよくわかつていなかつた。

3.実 験材料 口方法
職 tiformθ AttCC29133株 の単離株を使用した。培ラン色細菌 北所aθ ●地は BGllを 用い、必要に応じて培地を 1.5%の精製寒天で日化した。野生株および突然変具体の培養は、30℃ 、自色蛍光灯の継続的照射下で行つた。液体培地を用いた際には、120 rev/minで 振動培養した。
まず、滋断″ のホルモゴニア形成を誘導する環境条件を特定するために、脆所aθ A丁 0029133株 の培養条件を変化させた際の形態 の変化を、光学顕微鏡を用いて経時的に観察した。ras″ ′29133株のホルモゴニアは、顕著な運動性を示さないために、栄養細胞からなる糸状体との見分けがつきにくいこと、またホルモゴニアを誘導する安定 した実験手法が確立していないことから、本予備成果報告家 整理番号 2002‐ 5011)
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調査が不可欠であった。調べた条件は、培地中の糖および硝酸体の有無、照射する光の光質、培地の硬度、共生宿主である植物の影響、などである。対照として、培地中の糖の除去により安定してホルモゴニアが誘導される 滋刷物 sp.LBG
l株 を用いた
続いて、プロモータ欠損 に、A鑓 伝子をコードする丁n5由 来の pRL1063aをプラスミドとして持つ大腸菌 HB101株 と /ras″ σsp.と の接合によって変具体を′″,1991)。 変異体は抗生物質ネオマイシンで選択した。
作成した(Wdk θ
得られたトランスポゾン変具体からホルモゴニア形成に異常を示す変異体を選別するために、ホルモゴニア誘導によって導入された遺伝子によって蛍光シグナルを発する個体を、CCDカ メラを用いて検出を試みた。一方で、ホルモゴニ形成が誘導された後は暗所下でも同調的に細胞分裂を続けることを利用し、細胞分裂時に細胞壁形成を阻害する薬剤、ペニシリンを用いて、ホルモゴニア形成に異常を示す変異体を選別することを試みた。ベニシリンを使用するに当たり、加えるペニシリンの濃度、およびホルモゴニア誘導後ペニシリンを培地に加える時期と変具体の選別を行なう時期を最適化するための予備実験を行なつた。

4.結 果
北親″ LB01株 が培地中の糖 の除去のほか、培地 の硬 度の変化によっても安定してホルモゴニアが誘導されるのに対し、詢 s■0● 29133株 は糖および硝酸体の有無、培地の硬度の変化では、ホルモゴニアは誘導されなかつた。一方で、赤色光および植物培養液によつてホルモゴニアを形成することが確かめられた。
sの 培養液を用いた場合は、誘導開始後少なくとも4時 間後からは特にズ屁加´ θ

ホルモゴニア形成が 開始し、18時 間後までには栄養 組胞はホルモゴニアに分化していることがわかつた。したがつて、以後の実験では、4/瀞の培養液によつてホルモゴニアを誘導することとした。
接合を行つてから、約3週 間で薬剤耐性遺伝子を持 つ変具体 のみが培地上に確認された。約4週 間後、各コロニーが十分な大きさに育つたところで、変成果報告書(整 理番号 2002‐ 5011)
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具体を回収 した。8回 の 変異体生成実験により合計約 300個 の独立な変異体を用意した。
得られた変異体 群 からホル モゴニア形成に異常を示す変具体を選 別するために、植 物培養液 の投与 によって蛍光シグナルを発する個体を検 出する予定であつたが 、CCDカ メラ用 の解析ソフトを動作するコンピュー タの故障により、この方法で変具体を単離することはできなかつた。
一 方 で、ペ ニ シリンを用 いた 予 備 実 験 か らは、ras″θ 29133株 は100‑200u‖ tsの ペニシリンを投与後、16時 間未満でホル モゴニアの細胞分 裂に伴う細胞壁形成が完全に阻害される(死 滅する)一方、ペニシリン処理した栄養細胞は 16時 間後でも細胞は生存していることが わかつた。この条件で変異 体群から目的の変異 体が選 Ellで きる可能性が示されたので、同様 の条件を用い、用意した /1/as′ θσsp.の 突然変異体約 300個 体 からホル モゴニア形成に異 常を示す個体の単離を試みた。しかし、時間の制 約 のため単離を完 了するところまでは及ばなかつた。

5,今 後 の課題
本派遣により、糸状性ラン色細菌 屁所"29133株のトランスポゾン突然変異体の作成法、および 目的の変異 体個体を選別する方法の基 礎を習得することができた。特 に、蛍光シグナルを高感度カメラを用いた実験方法は、さまざまな環境条 件 の変化によつて引き起こされる現象の分 子的な背景を明らかにするのに役立 つ。これは、派遣者 の 目標とする、光合成生物の進化と環境条件の変遷の解 明を進めていく上で非常に強力な手法となると考えられ、今後の研究に大いに活用したい。また、実験を通じて、ラン色細 菌 の形 態 形成や生理学的反応、植物 との 共生関係といつた様 々な特徴を扱うことができ、ラン色細 菌 の進化を広い視 点から見 直す契機になると考える。
今回の滞 在 では、時間の制 約 上 、ホル モゴニア形成に関与する遺伝子を単離するところまで実験を終えることができなかったが、引き続き実験を進めて

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おり、研究を完成させる予定である。そして将来的には、本派遣で習得した手法や知識を利用し、ラン色細菌の形態的・生理的な多様性を支える分子的機構を手がかりに、進化の問題や地史学的な環境変動との対応の解明に取り組んで行きたい。

6ビ

参考文献

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