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平滑末端クローニング
知っているようで、少し自信がない。本コーナーでは、そのようなプロトコールを詳しく解説いたします。

はじめ に法です。以下に方法をご紹介します。

最近、KOD DNA polymeraseなどの平滑末端を生じる高正確性酵素を用いて増幅を行う機会が増え、平滑末端クローニングを行（1）制限酵素処理

う回数も多くなっているのではないでしょうか？ 今回は、そのよう1〜5μgのベクターを、制限酵素を用いて完全消化します。

な平滑末端を有するDNA断片のクローニング方法および周辺技術

このとき、切れ残りがあると、クローニングの効率が低下しますについて詳しく解説いたします。

ので、電気泳動で切れ残りが確認できなくなるまで念入りに消化します。精製時のロスを考えて少し多めのベクターでスタ今回説明する作業を以下のように図式化しました。ここでは、主にートすることをお薦めします。

このフロー図に沿って説明いたします。

（2）精製
アルカリホスファターゼ処理を確実に行うために精製＊を行います。精製後、DNAを80μlの滅菌水中に溶出（溶解）してください。
＊精製には、磁性ビーズを利用したDNAフラグメント精製キット「MagExtractor TM -PCR & Gel Clean up-（ CodeNo.:NPK-601）」が便利です。

（3）アルカリホスファターゼ処理（脱リン酸化処理）
精製DNA溶液（0.5〜2.5μg）
10×Buffer＊
E. coli Alkaline Phosphatase（0.1〜1U/μl）
Total↓
平滑末端、3'突出末端 → 60℃, 60min
5'突出末端 → 37℃, 60min

80（μl）
1010100μl＊目安として5〜20pmolesの5'末端に対して2Uですが、添加できる最大量（最終液量の10%）を添加することでほとんどの場合、問題なく脱リン酸化できます。

（4）アルカリホスファターゼ処理後のベクターの精製〈この精製は必ず行ってください〉
図1．平滑末端クローニングのフロー

酵素が残留すると以下の実験に大きな影響を及ぼします。
実験書などではフェノール/クロロホルム処理が必要である

方と書かれていますが、MagExtractorTM -PCR & Gel Clean法

up-＊を用いると簡単に精製可能です。

1．
ベクターの脱リン酸化【E. coli Alkaline Phosphatase（Code No.:BAP-111）】＊実験のコツを「私にもできた！ ライフサイエンス実験シリーズ
Vol.1」に紹介しています：弊社ウェブサイトwww.toyobo.co.jp

平滑末端サイトを用いてDNA断片をクローニングする場合、ベ/bioの「実験お助けコーナー」でご覧いただけます。

クターがセルフライゲーションしないようにベクターを脱リン酸化して使用することが一般的です。制限酵素で消化したDNAの

2．
リン酸化PCR産物の調製

5'末端にはリン酸基が残っており、リン酸基を除去することでラ【T4 polynucleotide kinase（Code No.:PNK-111）,rATP（Code No.:ATP-111）】

イゲーションされなくなります。
以下に、E. coli Alkaline Phosphataseを用いるプロトコー
ルを示します。この酵素は耐熱性が高く容易に失活しないため、一般的にPCRに用いられているプライマーの5'末端はリン酸反応後の精製が必要ですが、手間を惜しまなければ最も確実な方化されていません。よって、KOD -Plus-などの平滑末端PCR産686

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物＊は、そのままでは脱リン酸化処理したベクターにはクローニ

高効率ライゲーションキット：Ligation highも含まれており便利ングすることができません。ここでは、プライマーをあらかじめリです。ブランティングのプロトコールは以下のとおりです。

ン酸化しておいてPCRを行う方法と、PCR産物をリン酸化するDNA溶液
10×Blunting Buffer
KOD（2.5U/μl）
滅菌水
Total
↓
72℃、2min

方法をご紹介します。
＊3'-5'エキソヌクレアーゼ活性（校正活性）を有する高正確性
酵素で増幅したDNA断片の末端は平滑化されています。

●リン酸化プライマーを用いる場合（1）50pmole/μl（μM）以上のPrimer溶液を準備します。
（2）以下のように混合、反応させます。

4．
TAクローニング【TArget CloneTM -Plus-（Code No.:TAK-201）】

Primer（50pmole/μl［50μM］）
14（μl）
10×Protruding End Kinase Buffer＊1
210mM rATP＊2
2＊3
T4 Polynucleotide Kinase（5〜20U/μl）
2Total20μl↓
37℃、1h反応↓
95℃、5min（T4 Polynucleotide Kinaseを失活）↓ ← 50μl 滅菌ミリQ水を添加
10pmole/μl［10μM］primer溶液として使用します＊4＊5↓
高正確性酵素を用いてPCRを行います＊1＊2＊3＊4＊5X（μl）
1
18-X10μl

KOD -Plus-やKOD FXなどの高正確性PCR酵素で増幅したDNA断片は、そのままではTAクローニングすることができませんが、TArget CloneTM -Plus-を用いることで、高効率にTAクローニングすることが可能です。原理を図2に示します。抗KODDNA polymerase抗体でKOD DNA polymeraseの3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を抑えておき、Taq DNA polymeraseのTdT活性によってPCR産物にdAを付加して、そのままTベクターに連結することができます。

T4 Polynucleotide kinaseに添付されています。
別途準備する必要があります。
Kinaseは添加できる最大量を添加します（最終液量の10%）。
このままPCR反応に使用します。
凍結して何度でも使用可能です。

●PCR産物をリン酸化する場合（1）高正確性PCR酵素で増幅したPCR産物を精製します。
（2）以下のように混合、反応させます。
精製PCR産物（〜1μg）
10×Blunt End Kinase Buffer＊1
10mM rATP＊2＊3
T4 Polynucleotide Kinase（5〜20U/μl）Total↓37℃、1h反応↓精 製＊435（μl）
55550μl
図2．TArget CloneTM -Plus-を用いたKOD PCR産物のTAクローニング

PCR産物
10×A-attachment Mix＊

＊1 T4 Polynucleotide kinaseに添付されています。
＊2 別途準備する必要があります。
＊3 Kinaseは添加できる最大量を添加します（最終液量の10%）。
＊4 MagExtractorTM -PCR & Gel Clean up-（Code No. NPK601）
を用いることができます。

→ 60℃, 10min＊Taq DNA polymeraseと抗KOD抗体が含まれます。

DW
2×Ligation Buffer
pTA2 Vector
上記反応物
T4 DNA Ligase

3．
DNA断片のブランティング（平滑化）【Blunting high（Code No.:BLK-101）】
Blunting highは高効率なブランティングキットです。本キットに用いられているKOD DNA polymeraseは、3'突出部分を→ 室温, 30min → 形質転換削り、5'突出部分を埋める活性を有しています。このキットには、869（μl）
17（3-X）（μl）
51X
1No.86.qx 07.4.13 14:18 ページ 85．
方向性の確認【Blend Taq®（Code No.BTQ-101）】

D.W.
10×Buffer for Blend Taq®
2mM dNTPs
Forward primer（10pmole/μl）
Reverse primer（10pmole/μl）
Blend Taq®
Total

平滑末端クローニングやTAクローニングを行った場合、DNAが両方向に挿入されるため、方向性の確認が必要です。インサートの確認は通常、ベクター上に設計したプライマーを用いるコロ
ニーダイレクトPCRなどによって確認しますが、その方法ではインサートの有無だけのチェックしかできません。片方をベクター

21.9（μl）
330.90.90.330 μl

上、もう片方をインサート上に設計したプライマーを用いるPCRを行うことによって、インサートの有無と同時に方向性を確認することが可能です。以下に、Blend Taq®を用いるコロニーダイレ
クトPCRの例をお示しします。Blend Taq®はコストパフォーマンスに優れた高性能PCR酵素であり、KOD Dash®とともにコロニーダイレクトPCRに適している酵素です。

図5に、TAクローニング後にコロニーダイレクトPCRによってインサートの方向性を確認した例をご紹介します。F1-R2、およびF1-F2の組み合わせにおいて、インサートの方向性に依存して増幅が認められます（それぞれ相補的な関係になっています）。この方法を用いることで、インサートチェックの段階でクローンを絞り込むことができ、その後の解析をよりスムーズに進めることができます。

図3．PCRによる方向性の確認
ベクター、およびインサート上に設計したプライマーを用いてPCRを行います。aもしくはbの組み合わせで得られる増幅パターンより方向性を確認できます。

図5．コロニーダイレクトPCRの一例0.5kbのPCRプロダクトをTAクローニングした後、図3に示した様々なプライマーの組み合わせを用いてコロニーダイレクトPCRを行いました。
（R1はベクター上に設計したリバースプライマー）
M：100bpラダーマーカー
1〜5：各コロニー

おわりに今回は両方が平滑末端のDNA断片のクローニング方法を中心に解説しましたが、片方が平滑末端で、もう一方が付着末端の場合の便利なクローニング方法を「私にもできた！ ライフサイエンス実
験シリーズVol.1 」に詳しく紹介しています（ 弊社ウェブサイト
［www.toyobo.co.jp/bio］の「実験お助けコーナー」でご覧いただけます）。この方法で連結した場合、どこにNickができるかなども一度頭の中でシュミレーションしてみてはいかがでしょうか。このシリーズでは、日常の実験に役立つ様々なプロトコールを紹介させていただく予定です。

図4．コロニーダイレクト PCRの操作フロー886

No.86.qx 07.4.13 14:18 ページ 9より長く、

Flexib
品名包保存温度Code No.

100U×1本-20℃

BAP-111￥15,000

200回用

室温

NPK-601￥25,000

1個

室温

MGS-101￥38,000

1,500U×1本-20℃

PNK-111￥15,000

50μmoles/0.5ml-20℃

ATP-111￥15,000

20回用

-20℃

BLK-101￥25,000

10回用

-20℃

TAK-201￥16,000

375μl×2本-20℃

LGK-101￥20,000

750μl×1本-20℃

LGK-201￥22,000

250U×1本-20℃

BTQ-101￥19,000

250U×1本-20℃

LDP-101￥25,000

100回用

-20℃

PIK-151￥29,000

100回用

-20℃

PIK-251￥31,000

200U×1本-20℃

KOD-201￥30,000

200U×1本-20℃

KOD-211￥32,000-20℃

KFX-101￥35,000

脱リン酸化酵素

E. coli Alkaline Phosphatase
高効率DNA断片精製キット

MagExtractorTM -PCR & Gel Clean up磁性スタンド

Magical Trapper
リン酸化酵素T4 Polynucleotide Kinase
rATP
高効率平滑化＋Ligation

Blunting high
KOD PCRプロダクトのTAクローニング

TArget CloneTM -Plus高効率ライゲーションキット

Ligation highTAクローニング効率をさらにアップ。-20℃で凍結しません。

Ligation high Ver.2（本誌p.5）高性能Taqポリメラーゼ

Blend Taq®
高効率ポリメラーゼ

KOD Dash®
高効率コロニーダイレクトPCR試薬

InsertCheck -Ready-（プライマーフリー）
高効率コロニーダイレクトPCR試薬（色素混合タイプ）

InsertCheck -Ready- Blue（プライマーフリー）

装価格

平滑末端を生じる代表的な高正確性ポリメラーゼ
KOD -PlusKOD -Plus- Ver.2
KOD FX（本誌p.10）

200U×1本

過去に紹介した記事で、今号に関連のある記事をピックアップしてご紹介するコーナーです。

『ACP & MCP-tag』（本誌p.17-18掲載）
ACP/MCP-tagは、ACP/SFP synthase存在下、蛍光標識されたCoA誘膜タンパク質といえば、最近、膜タンパク質間での相互作用解析の研究が盛ん導体に共有結合するユニークな約8kDaのタグです。膜タンパク質の細胞外ドです。Dualsystems社（http://www.dualsystems.com/）では、スプリッメインなどとの融合タンパク質として発現させることにより、膜タンパク質を特トユビキチンシステムを用いた、膜タンパク質間相互作用を検出できるユニー異的に蛍光パルスラベルすることができます。

クなYeast two-hybrid systemを販売しています（『DUALmembranesystem』）。

このタグを開発したCovalys社（http://www.covalys.com/）は、この他にも様々な性質を有するユニークなタグを開発しています。
『SNAP-tagTM』
は約20kDaのタグであり、ベンジルグアニン誘導体を基質として共有結合する

興味のある方は、弊社のwebサイト（http://www.toyobo.co.jp/bio）のサ性質を有しています。ACP-tagに比べサイズは若干大きいですが、タグ自身がイト内検索に、「 SNAP」「DUALmembrane」と入力してみてください。詳細

酵素活性を有するため、様々な用途に使用可能です。

情報をご確認いただけます。

TOYOBO高正確、高効率
PCRで応用可能
高正をし

高効
PCR

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