Journal of Environmental Biotechnology（環境バイオテクノロジー学会誌）
Vol. 10, No. 1, 35–38, 2010

原 著 論 文（技術論文）

アルギン酸分解菌の選別とその評価方法
Screening of Alginate Degrading Bacteria and Its Evaluating Method
本郷敦*，米倉秀徳，谷生重晴

ATSUSHI HONGO, HIDENORI YONEKURA and SHIGEHARU TANISHO
横浜国立大学大学院環境情報学府 〒 240–8501 神奈川県横浜市保土ヶ谷区常盤台 79–2
* TEL: 045–339–3996 FAX: 045–339–3996* E-mail: h-atushi@xk9.so-net.ne.jp
Graduate school of Environment and Information Sciences of Yokohama national University, 79–2 Tokiwadai, Hodogaya,Yokohama, Kanagawa 240–850, Japanキーワード：粘度，アルギン酸分解菌，多糖類
Key words: viscosity, alginate degrading bacteria, polysaccharide
（原稿受付

1.

緒

2010 年 2 月 15 日／原稿受付

言

現在世界では，環境問題の意識の高まりをうけ，環境対策や二酸化炭素の削減が大きく掲げられている。その根底にある要素としてエネルギー問題が存在する。
全世界のエネルギーのうち 79.8％が石油，石炭や天然ガスを中心とする化石燃料から生産されており1)，大気中に二酸化炭素を放出するという結果を招いている。さ
らに，この化石燃料には限りがあり，このまま使用し続けると，資源枯渇という結果を引き起こすことは逃れようのない事実である。日本は，全世界で使用されている化石燃料の約 5.1％を使用している2,3)。さらに，化石燃料を他国から輸入しなければならず，輸送時のエネルギーロスと情勢不安定からくるエネルギー供給に関する心配も抱えている。
また，近年の近隣諸国の発展に伴った富栄養化などの海洋汚染の影響で，アオサ等の浮遊海藻の大量発生・漂着が深刻な問題になってきている。この浮遊海藻は各地の湾や海岸に打ち上げられ，例えば横浜市金沢八景海の公 園 は 延 長 約 1 km， 砂 浜 幅 は 干 潮 時 200 m， 満 潮 時60 m の海岸であるが，乾燥重量にして年間 1,000 t 前後のアオサが打ち上げられる4)。アオサに関する調査報告書5) によると日本沿岸に打ち上げられているアオサは年間約 120 万 t とも 200 万 t とも言われる膨大な量になる。
現在これらの有機物は，ほとんどが焼却廃棄されている。
海藻は，日本に存在する貴重な有機資源の一つである。
よって，海藻からエネルギーが生産できれば，海藻から水素を生産し電力エネルギーに変換した場合，海藻 1 t当り 51.2 kWh（処理時のエネルギー消費量 20％を差し引いた値）のエネルギーに変わり，ゴミ問題の解決とエネルギー問題の軽減に寄与することができる。また，浮遊海藻に加え近海において生育のはやい海藻の養殖を行2010 年 7 月 6 日）

い栽培した海藻からエネルギーを生産するということも考えられている。
海藻の固体成分は，主にアルギン酸とマンニトールで構成され，微量成分としてセルロースが含まれている。
例えば褐藻類であるコンブの成分はアルギン酸，マンニトール，セルロース，蛋白質，その他灰分など及び水分がそれぞれ 7％，8％，1％，1％，4％，79％である6)。
マンニトールは分子量 182 の単糖類であり容易に細菌などによる分解が可能である。しかしアルギン酸は，マン
ヌ ロ ン 酸 と グ ル ロ ン 酸 の 結 合 し た， 分 子 量 1,000 〜100,000 以上の難分解性の高粘度物質である。海藻中のアルギン酸を分解，糖化し使用することが出来れば海藻に占める利用可能バイオマスの量は約 15％となる。
本研究では，アルギン酸を糖化する酵素を生成する微生物を選別することとともにアルギン酸の分解における評価方法の確立を目的とした。
2.
2.1

材料及び方法

アルギン酸分解菌の単離および培養方法

アルギン酸を分解する菌の探索を行うため，神奈川県三浦市三崎海岸の表層水，神奈川県真鶴町岩海岸付近の表層水および海底泥を分離源とした。各試料を，上層にSodium Alginate 10 g, Agar 20 g, Ion-Exchange Water
1,000 ml, pH 6.9 で 作 成 し た 培 地（10 ml）， 下 層 にMgSO 47H 2O 0.5 g, FeSO 47H 2O 0.01 g, KH 2PO 4 1 g,
NH4Cl 1 g, Agar 20 g, NaCl 5 g, KCl 0.5 g, Ion-ExchangeWater 1,000 ml, pH 6.9 で作成した培地（10 ml）を持つ
二層寒天平板培地7) で 25°C，3 〜 7 日間培養した8)。ア
ルギン酸分解菌を選別する方法として用いた二層寒天
平板培地は，上層部のアルギン酸寒天から浸透し，下層部の栄養塩寒天にたどりついた菌のみがクリアゾーンを36本郷形成できる9)。さらにクリアゾーンを形成したコロニーを，アルギン酸を含む寒天平板培地10)（Sodium Alginate
5 g, Casamino Asid 5 g, Yeast Extract 1 g, NaCl 5 g, Agar15 g, Ion-Exchange Water 1,000 ml, pH 6.9）を用いて，25°C で 4 日間培養して分解菌の単離を行った。クリアゾーンの存在が確認できた菌体を，2％アルギン酸を含有する半流動培地11)（Sodium Alginate 20 g, (NH4)2SO41 g, KH 2 PO 4 1 g, NaCl 5 g, MaSO 4 7H 2 O 0.2 g,
Ion-Exchange Water 1000 ml, pH 6.9）を 15 ml 分注した
試験管に白金耳で植菌し，37°C で 3 日間培養を行った。
この培地では，アルギン酸分解の割合を粘度の低下によって評価することができる。
2.2粘度計及びゲル濾過クロマトグラフィーを用いた分解菌の選別

2.1 の試験管培養後の培地の粘度を評価するために，
傾 斜 角 30° の 簡 易 粘 度 測 定 器 を 用 い， 培 養 液 1 ml が26 mm 落下する時間を測定した。この定性的な粘度評
価の結果，落下時間が 0.5 sec 以下の 16 検体を選択し，半流動培地培地を分注した 100 ml 容培養器で，37°C，7日間培養した。培養後，1,940 × G 10 min の条件で遠心分離して，菌を取り除いた後，オストワルド粘度計（No.
3）を用いて培養上清の落下時間を測定した。次いで，落下時間 28 sec 以下の粘度が確認されたサンプルについて，ゲル濾過クロマトグラフィー（Sephadex-50Medium［カラム XK26］）を用いてアルギン酸量の測定等を行った。なお，ゲル濾過クロマトグラフィー分析におけるアルギン酸濃度（ピーク高）とオストワルド粘度計によって求まる粘度が比例関係にあることを確認している。さら に， オ ス ト ワ ル ド 粘 度 計 に よ る 測 定 で， 落 下速度
12 sec 以下だった 7 サンプルに対し，前述の半流動培地による培養を行い粘度の変化によるアルギン酸分解速度の比較を行った。37°C で 10 時間から 120 時間にわたり培養し，粘度を測定すると共に，120 時間後のサンプルについてはゲル濾過クロマトグラフィーによる測定も行った。
2.3

16S rRNA 遺伝子の系統解析による分解菌の同定2.2 で選別された菌を同定するために，16S rRNA 遺伝子のシークエンシングを行った。16S rRNA 遺伝子は，他

プライマー 27f および 1525r12) を用いた PCR 法により取得し，シークエンスの決定は株式会社バイオマトリックス研究所に外注した。得られたシークエンスデータをDDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/）にて相同性検索ソフト BLAST で相同性検索を行い，選別された分離株の同定を行った。
2.4

海藻組織分解試験によるアルギン酸の分解の評価
実験

アルギン酸は海藻の細胞間に存在しているので，充填材としてのアルギン酸が分解されることによって，各細胞，細胞間組織が浮遊し不溶性部分と可溶性部分に分離することが知られている13)。アルギン酸分解菌の分解能を検証するためにわかめ粉末の分解試験を実施した。分
解実験に使う海藻粉末は，ワカメ粉末「浜みどり」（理研ビタミン株式会社）を 900 g/L の濃度で用いた。37°Cで 7 日間培養後，目視により可溶性部分と不溶性部分の状態を観察及び簡易粘度計による計測を行った。
3.
3.1

結果と考察

アルギン酸分解菌の選別

簡易粘度測定で落下速度が 0.5 sec 以下となった 16 サンプルを選別し，さらにオストワルド粘度計を用いた粘度の測定を行い，落下時間 28 sec の 9 サンプルについてゲル濾過クロマトグラフィー測定を行った。特徴的なパターンを示した 3 つのサンプル ok04，tms01，ki19 のクロマトグラムを図 1 に示す。アルギン酸ピークと（a）の無機塩類のピークの間に現れている（b）（c）のピー
クは，分子量 1,500 Da–30,000 Da まで低分子化されたアルギン酸であると考えられる。図 1 右のサンプル ki19においてはアルギン酸のピークが非常に小さくなり，無機塩類とのピークが高くなっているため，3 種のサンプ
ルのうち，最もアルギン酸ポリマーの分解が進んでいると考えられる。このようにアルギン酸ピークがほぼなくなっていたものを，アルギン酸分解菌と判断し，同じよう な ク ロ マ ト グ ラ ム が 得 ら れ た m04，ms08，tms02，ki11，ki19，kinashi01，kinashi03 の 7 サンプルを選抜した。
これらの分離株のオストワルド粘度計による落下時間はいずれも 12 sec 以下であった。

図 1．アルギン酸分解菌の培養液のゲル濾過クロマトグラム
左からそれぞれ ok04，tms01，ki19 の各サンプル。
▼：アルギン酸ピーク

アルギン酸分解菌の選別とその評価方法

3.2

3.3

アルギン酸分解速度の比較3.1 で選抜された 7 サンプルの分解速度の比較を行った結果を図 2 に示す。10 時間後では m04 もっとも分解が早く，40 時間後では kinashi03，kinashi01，m04 の順で粘度低下が進んでいた。120 時間後では m04（30.85 sec）
以外の分離株では 11.13 〜 15.12 sec の粘度を示した。
120 時間後のゲル濾過クロマトグラフィー分析の結果では，kinashi03，ms08，ki11，tms02，kinashi01，ki19 の 6サンプルの分離株において，アルギン酸のピークがなくなっていることが確認された。
分離株 kinashi03 は，いずれの測定時間においても最も粘度が低下していることが観察されたため，本株が最もアルギン酸分解に有効であると考えた。

16S rRNA 遺伝子の系統解析

分 離 株 kinashi03 と Pseudomonas aeruginosa の16S rRNA 遺伝子塩配列が 99％の相同性が認められ，
ま た 分離株 m04ではCitrobacter farmeriとCitrobacteramalonaticus に対し 98％の相同性が示された。これら 2つの菌体の 16SrRNA 遺伝子配列の一部を DDBJ に登録
し，kinashi03 と m04 の accession number は，それぞれ
AB545811，AB545812 である。
3.4

海藻組織分解試験によるアルギン酸分解の評価

表 1 に簡易粘度計による落下時間及び目視での評価結果を示した。表 1 の上段に，培地中のワカメのアルギン酸が分解され目視で可溶性部分と不溶性部分の二層に分

図 2．分離株によるアルギン酸分解速度の比較
表 1．ワカメ粉末の分解試験
サンプル

二層分離粘度（sec）

m04
kinashi3tms02
kinashi1ms08
ki11
ki19+++++++

0.20
0.23
0.25
0.48
0.49
0.53
0.58

tm03
tm04
m03
mh03
m01
tms09
ki15
ok05
ki23
w01
tm07
ki12

–––––––––––
–

1.44
5.47
6.36
9.74
27.31
30.50
40.58
50.20
60.30
72.07
85.76
102.28+：二層分離が確認されたサンプル

37–：分離しなかったサンプル

右写真：代表的な培養後の様子

38

本郷

離したサンプル，下段には二層に分かれていなかったサンプルの結果を示した。なお，3.1 で簡易粘度測定で落下時間 0.5sec 以下の結果が得られた 16 サンプル全てにおいて二層に分離することが確認された。これは，海藻細胞間の充填剤の役割を果たしているアルギン酸が分解されたことを示しており，二層分離は顕微鏡観察でも確認することができた（データ示さず）。海藻粉末を基質とした培養試験による目視の評価により，アルギン酸分解確認の指標として利用が可能であると考えられる。
4.

結言

アルギン酸濃度低下が著しかった株として kinashi03が分離された。基質として用いたアルギン酸ナトリウムのもともとの動粘度は 600 〜 800（cP）あったが，この分離株の 7 日間培養後の培地の粘度は，オストワルド粘度計による動粘度で示すと 1.0（cP）まで減少していた。
また，市販されているアルギン酸リアーゼを用いて，同様の方法でアルギン酸消化実験を行って動粘度を比較した場合，1 日目において急激に減少し 10（cP）以下になったが 3 日目以降でも 5.0（cP）という結果であった。これは分離株 kinashi03 がアルギン酸をより細かく分解する酵素を持っていると考えられる。
海藻粉末によるアルギン酸分解菌のスクリーニングにおいては，粘度計やゲル濾過クロマトグラフィー測定のような機材が必要なく簡単な方法で多くのサンプルの選抜作業が可能であることが確認された。

他文献

1) 経済産業省．2008．エネルギー白書．
2) IEA（国際エネルギー機関）．2009．Energy indicators andenergy balance sheets. pp. II88–91, Energy Balance of OECDCountries.
3) 矢野恒太記念会．2006．世界国政図解．pp. 183–186.
4) 横浜海の公園管理事務所．2008．横浜海の公園管理事務所
統計データ．
5) 三河湾環境チャレンジ委員会，蒲郡アオサバイオマス研究会．2004．アオサに関する調査報告書．
6) Yoshiaki Sanbonsuga. 1984. Studies of the growth of forced
Laminaria, Bull. Hokkaido Reg. Fish Res. Lab, pp. 12.
7) 小林良正．2001．5．アルギン酸の生分解性，pp. 55–56．
生分解性プラスチックの実際技術，シーエムシー出版．
8) Selman A. Waksman, Rneria L.Carey and Melvin C. Allen.
1934. Bacteria decomposing alginic acid. J. Bacteriol. 28: 215–218.
9) 木村喬久．1961．アルギン酸分解菌の簡易鑑別法について．
北海道大學水産學部研究彙報．42.
10) Tang J.-C., H. Taniguchi, H. Chu, Q. Zhou and S. Nagata.
2008. Isolation and characterization of alginate-degrading
bacteria for disposal of seaweed wastes. Lett. Appl. Microbiol.
48: 38–43.
11) 坂崎利一．1981．有機化合物の炭素源としての利用性試験，
pp. 371–374．新・細菌培地学講座・上．近代出版．
12) 平 石 明．2001． リ ボ ソ ー ム RNA 遺 伝 子 の 塩 基 配 列，
pp. 48–64．微生物の分類・同定実験法，シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社．
13) 尾島孝男，井上 晶，鈴木賢一，山本紗代，大塚周二，水田浩之，嵯峨直瓦．2005．食藻性軟体動物の消化酵素を用いた海藻プロトプラストの調製（http://www2.fish.hokudai.
ac.jp/21coe/Seminars-Symposia/gif/20050426d.pdf）．