北大阪地区S MO N患者の細菌血清学的検索

三輪谷

I俊夫（阪大徴研〉

はじめにスモン調査研究協議会の病原涯員として腸内細菌に関 する研究に参加する よう呼びかけられ た私として，

S MO N にみられ る腹部症状から， 細菌特句検索目標に 腸管感染原因菌のうち Sal morr,el la,

Sh i geI 1 a, C 1 ost r id i um ，腸炎ピブリオおよび病原ブドウ球菌を重視した。昭和 4 1 年のことだったと思うが， 大阪府立病院に入院中の S MON 患若の糞便から Sa Im one1 1 a( C またはE1群）が高頻度に分離さ れ， 且つこの 分離棋に対 する患者血清の凝集価が比較的特異的に上昇していると い う私信をえていたため ， 当初は特に S a lmone11 a に重点をおき， 日常検査術式に従って昭和 4 5 年 1 月より横索を開始した。

IT材料および方法
1）患者材料：いずれ も北大阪地区にある吹田市民病院， 新千里病院， 阪大病院， 徴研病院および大手前病院に通院または入院中の SMON患者（確定診断のもののみ〉より採取されたものである。
2 ）糞便の培養倹査法：説明を簡略にするため患者糞便の細菌 培養検査の進め方を表 1 にまとめた。

これ は細菌性食 中毒を含む急性胃腸炎の とき の日常時法1 ）である。 但し ，C lostridiumに関しては ， 食中毒の際には検査材料（増菌 の場合も）を 1 0 0 ℃ 6 0 分 加熱するが，SMON患者 のと きは 6 0 ℃ 6 0 分加 熱することにした。
3)

SMON 患者の 血清学的検索：大阪府立病院にお い て昭和 4 1 年度に SMO N患者の糞便より分離した Sa lmone lla (E 1 群〉のb撚（ 1 0 0 ℃，2 時間）死菌，ホノレマリン（ 0. 5 of, )死菌に 対する SMON 患者血清中味線価を検ベた。術式は Wida 1 反応に準じたが， 小ullの示唆により反応条件は 3 7 ℃ および 5 0 ℃の湯槽中にて 1 5 ～ 1 8 時間反応させてのち肉眼的に判定した。
4) リコール〈髄液）よりの病原細菌お よび M ycopl asma の培養倹査法：病原細菌に関しては
血液寒天，

TG C ブイヨン， T rypticase Soy brot h を用い， Mycop 1 asma に関しては尾形ら

2)’の方法にのっと り次の培地を用いた。

-145 ー

表1

患者糞便の細菌培養検査の進め方
一部凍結保存（ -2 5 ℃ま たは － 9 0 ℃ ）（再検またはウイルス検査にあてる）(4 3℃18-24時間培養）I tff気培養｜サルモネラ周卜・ 一一－一ーハ SS
一一－けトナ
寒天：赤痢菌，サルモネラ糞便約1 r;.を1 omfのセレナイト培地ま片｜( 3 7℃18-24時間培養）
たは Hajna のテトラチオン酸塩培地
DH L 寒天：赤痢菌 ，サルモネラ，
I・ ター，病原大腸菌I ..
( 3 7℃18-24時間培養）：
I
3℃18-24時 間培養）
- -＇＿一ーー一一一一一－－一一JC 1ウ；（ド！

GN (gr am negative）ブイヨン(3 7℃12-1時間培養）
腸炎ピブリ オ用トーーー一一ー一一「 ー →怜BT Bティポール寒 天：腸炎ピブリオ( 3 7℃18-24時間培養）
4必食塩 加ベプトン水また は2�食塩加コリスチンブイョγ」ーー＋ゆ TCB S 寒天：コレラ菌，腸炎ピブリオ(3 7℃18-2 4時間培養）

食塩卵寒天または P P 培地 ：ブドウ球商( 37℃20-40時間培養〉( 3 7℃ 48-72時間培養
斗ウエレ♂ユ菌用卜一ー・・ーーー一ーーー
後60℃60分加熱）：
クックドミート培地またはTG C 培地
（煮沸急冷後材料を接種し， ゴム詮）a）分離用培 地

血液寒天： ブドウ 球菌，腸球菌，未知病原菌，基礎培 地として{PEA アザイドカンテン
各種寒天培地: I 糞便を1 00℃60分煮沸
I

II 嫌気培養｜』＝ヰ＝

L一宇4- cw 卵黄寒天またはL EM (lactoseegg milk ）培地：ウエルシユ菌( 3 7 ℃1 8 -2 4時間培養）( My c o p I a sma 用 ）Difco-PPLO agar

7 omf

メソプラン・フィルタ ー （ 0.2µ ）. 壇過滅菌ウマ血清20mf

2 5労酵母（ニツテン）加熱抽出液

l ome

0.2労D NA ( t h ym us ) ( N BC )lmf

M-K2HP42mf-"146-Salmon e 11 a,は噴出されなかった。しかし，C lostrid i 田n に関して

Shi ge 11 aは 15 /1 8例に倹出され，しかも1倹体より1～3種類の菌種が認められている。
このように高頻度にC lostridium属菌が検出されたため，非S MO Nの糞慣材料5 0例について表4に示す術式に従ってClostridium属菌の検索を試みたところ，表5に示すよClostridium属菌の培養倹査法

表47

一部費結保存（『90℃）

1グラムずつクッグドミ ー ト培地；
: 一一一ーー一一一 一一一一一I

1時間加熱

60℃，( 3 7℃，48時間）↓（直接加熱）;:Zeissler
gl 底部 e bl叫a伊rILEM

1 二�：.

:；

cw寒天:」一一一.；ー嫌気構

レ プリカ法｜「一：＿オ｜嫌気的」

3 7℃，48時間培養

Clostridium属菌の同定

うに分離培養法によって検出率に多少のずれがみられるが，綜括的にみて4 9/5り例の高頻度でClostridium属菌が検出された。
以上のま口〈菌の検索にあたって今までのところS刈O Nに持有なものは検出していない。

-149 ー

形，豊倉；，によって動物実験で実証された。 その他多くの人々によってキノホルムが SMO N の重）要な原因物質であるらしいという証拠が提出されている。 著者らはニワトリのヒナを用いて， キノホルム投与による SMO N 様症状の発現と腸管感染の関係を追求している。

V結論

北大阪地区にある吹田市民病院， 新千里病院， 阪大病院， 徴研病院および大手前病院より提出さ．

れた S MON 患者（通院または入院中の確定診断がくだされたもののみ）材料について細菌学的および血清勃守検索を行なったo
1）糞便6 5検体について腸管感染症の原因菌の検索を行なったが p C I o s t r i d i um 属菌以外は陰性であった。

C lostridiwn 属菌は 3 5/6 5の検出率であったが， 非 SMO N の糞便からの暁出率は 49 /5りであり， 菌種， および菌量からみて SMO N の場合の方が検出率は低い。
2）大阪府立病院において SMO N 患者の糞便孟り分離された S a I mon e 11 a E 1群株に対する凝集価を SMON 患者血清3 8例について検べたが， 凝集価の特異的な上昇は認められなかった。
3)

リコ ー ル1 3例について病原菌とくに Mycoplasma の検索を試みたが陰性であった。
共同研究者：
倉堀知弘， 竹由美文， 今村邦男， 大川貞二， 上村高明

文献1）三輪谷俊夫：腸管感染症の細菌学的倹索， 臨床倹査，14(12),

139～1 4 6 ' 1 9 7 0·2）小沢敦ぽか： S MON の週辺 一 特に細菌血清学的な立場からー医療， 24(9),23～3 1 ,

昭和4 5年3）吉岡正則， 田村善蔵：S MO N 患者の緑色色素の本態， 医学のあゆみ，

74(7),320～3 22 I

1 9704）椿忠雄ぽか：SMON の原因について，

日本神経学会第3 4団関東地方会発表，
1 9 7 0年9月5日s）井形昭弘， 豊倉康夫：キノホルムによる神経系障害に関する研究ー ー キノホルム静注家兎における末梢神時障害， 医学のあゆみ，

75(6),-152ー

3り9～310,1970

スモン患者の腸内細菌叢とキノホ Fレム
中谷林太郎，中野英 一，山崎恵子，吉田洋子，犬上洋子，扇和子，後藤延 ー （国立公衆衛生院），光岡知足（理化学研究所），井形昭弘（東京大学脳研究所），小沢敦，後藤甚作（国立東京第二病院），大村 一郎（国立呉病 院）

I緒論

腹部症状が ス モンの必発症状の一 つであるこ とから，スモンの病原を探るためには，細菌学的にも十分な検討が行な われなければな らない 。その研究の ー っとし て，われわれはスモン患者の腸内細菌叢が ，健康人 のそれと比較して変化がみられるか否か，もしみられるとす れ ば，いかな る種類の菌群に増加または減少がみられるかを明らかにし，それが， スモンとどのよう必関係にあるかを検討するため研究を行なった。

:rr材料および方法
検査材料：表 1 に示すように，国立 呉 病院入院スモン患者（ 1 9 7 0 年 5 月 2 9 日） 1 0 例と，東大神経内科 の入院および外来患 者を主とする東京地域のス モン患者4 1例（ 1 9 7 0年6月～
1 2 月 ）の新鮮 排唯便を用いた。 これらの患者の病期は単 一 ではなく，摺青後数年のものも新鮮患者も含まれていて，また服部症状も必ずしも一 定
でな く ，と くに検体採取時に下痢を呈していた例は比較的少数であっ た。な お 対象として引用した健康人大使の細菌叢は，すでに光岡（発表予定）

表1.埼査 対 象
例数対スモン患者｜建康人｜

呉1 0
※東 京

4 1

東京

3 5fコh 号ロ ・ヰ

5 13 5※ 東大，三楽．中島，関東 中央 ，東京

医科歯科大の各病院

が 2 3 才～ 8 5 才の成人について検査した 3 5 例の成績である。厳密な意味での対照としては，各スモン例に適切に対応する非スモン例をとるべきであったが，現在の段階で大まかな目安をつけるという意味では，これを対照と して比較することで十分な意味があると考えたの検体の処理：腸内細菌壌のパランスは，排便後きわめて急速に変化しやすいので，検体は華鮮排
出便を用 い，輸送する場合には，嫌気的に保存した o.o s% L-cystein HCL 0H20,0.1 %aga r 加B r a i n h e a r t i n f US i n O b r O t h ( Di f C O )9

me に約 1 9-の検体をとりこれを氷冷し，極力菌叢の変化を防ぐ借置をとった，検査は排便後できるだけ短時間内に守ない，長くとも2 4時間以内には培地へ の接種が終わるようにした。
-153-

た。
Lac t obacillu sは菌数としては健康人で大便中の総菌数の0. l O"'＂ 足らずを占めるにすぎない菌群であるが常に検出されるのに対し ， スモン患者では検出率7 8 0-0 に低下し ，また検出例における 菌肢も減少していることが認められた。
一方S treptoc occu sやEntero bac t e riac ea e の菌群は ，両群とも全例に検出されてはいるが，菌数を比較すると ． ス モン患音詳の方がやや多い傾向にあることが観察された。
Veillonella に関しては ，両鮮問に検出率の差はなかったが，検出例における菌設は， スモン患者群の方がかなり高かった。
Staphyloc occu sはスモン患者詳での後出率が著明に低下してい た反面，険出例の菌数は逆にスモン患者群において増加していることがうかがわれた。
Clos tr id iu mおよびYea s tも， 体出率はスモン患者群では低かったが， 菌数には差がみられなかった， その他の荷群に関しては， 両群とも筒出例が少ないので比較は困難である。
ia cea eに属する菌群中 で， 通常は優勢を示す乳糖発特性大腸菌のなお， Enter o ba cter
菌数が比較的少々い例が多く， それに代って乳頭非発弾性胃（Prot eus,Citrobac te r等〉ゃKlebsiell 生などが多く認められる場合が少なからずあった。
表3
種

健康人とスモン患者の腸内細荷叢 の比較
l 3 5伊lj J
健康人大使
ーす 均 a
情出率
精出範屈b( 1 og/9)（係〉

平l(og／れ検出範担b

同出率
（労）

スモン患者った便
均 a.

( 5 1例〉

Bacte roidac田 e

1 0.2

8.1～11 ヨ97

9.2

6.2～1o. 8

96

Catenabacterium.
97

7.3～1 0. 991

8. 7

3.8～10.575

Bificb凶cterium

9.9

8.3～1 0. 7

94

8.8

5. 7～10. t

82

Peptostreptococcus

8. 7

3.0～1 0.4

34

8.3

6.4、ー10 白 O

33

L actobaci 1lus

7.4

3.7～

9 8

10 0

6.5

3.0～ 9 .1

78

S treotococcus

8.ヨ5. 3～10.6

100

8. 7

4.5～1 0.6

10 0Enterobacteri aceae 1

8.:2

4.1～1 0. 5

10U

8.4

4.7～1 0.3

1UU

C lostri di um

6.:2

3.2～ 9.0

6 7

5. 9

2.5～ 9.1

49

Veillmella-1.5

2 司 、ー

93

6 7

6. 9

2.3～ 9 365

Sta凶ylococcus

3.9

2.3～ 7.3

94

5.2

2.2～10. 1

6 1

Bacillus

3.1

2.6～

3.5

6..!

2.6～

2U

lVIo1d2.5

2. 3 ～

3り

1 4

3.2

3.2

Yeast

3.8

2. 3～

6.9

74

4.2

2.3～Total

1 0. 79 9～l 1.2a同出された例のみの平均値

qb5.710.0

全く快出されない例を除く
-155-

8.3

2.087

5.9～ 11059E考察

これらの結果より投与薬剤を調べると，キノ ホルム（ 1日2 g ）とフマル酸第一教を服用していることがわか った。 正常人尿に0. 25%キノホルムのメタノ ー ル溶液を滴下しでも縁色は生じなかった。
さらに 第二鉄塩を加えたところ緑 色となった。 したがって吸収されたキノホル ムと同じく服用 していた鉄剤 と反応して尿カ緑色を呈したと思われる。
以上，述べた様にS MO N患者の尿中には キ ノホルムが抱合体としてではなく，鉄キレ ー トあるいは遊離のかたらで多量に（投与量のi O吾程度）排世されていたが，この事実はSMONの病因解明に大きな手懸りとなるだろう。

N要ヒ＝，s

SMON患者の緑尿，緑便に含まれる緑色物質はキノホルムの鉄（阻）キレ ー トであったo
なお，こ の繰尿中には多量の遊離キノホルムが排池されていた。

文献1）井形，高須，豊倉：医学のあゆみ，72,539,1970，同，72,637 ,1970
2 ）井形，長谷部，辻：日本軍事新報，瓜2421 ,P25,197 03）吉岡，田村：医学のあゆみ，74, 320 ,197 0-161 ー’

Iのカラムでキノホ／レムに一致するピークを認めた。〈図1参照）。 またピリジン 抽出後の残濫を酢酸エチルと無水トリフ f レオロ酢酸によってT FA化しながら抽出するとさらに多量のキノホルムが検出され ，2%0V-l 7 , 2%XF- l 1 0 5のカラムによっても検出された a 従って緑色舌苔にキノホノレムが含まれることは確実である。

"'

コ t;•' (1＼二 l. l 戸n·c.;iF-1. 15, 1·\cliinofoτ111 ・ TFA

図1E考,hi,o'rmT�l； 素炎イオン化検出器）
緑色舌苔からのキノホルムの検出（検出禁： 水察

さきに科学警察研究所の孤塚氏らによってSMONの録色舌苔中に異常に多量のヨウ素が含まれていることが発見され，L）これがキノホ／レムであると推定されていたが ・上記の実裳事実からキノホルムの＋存在が確認された r 従って舌苔中の縁色物質も緑尿や緑便と同様にキノホルムの Fg キレ ー トであることが確実となった。2 )つ＋

キノ ホルムおよびF； キレ ー トがS :MON患者の舌苔に蓄積される慨は今後解明すべき問題であろOF内ノ要U日IV

SMON患者の緑色舌苔にもキノホノレムが含まれていることが判明したc文献1 ）孤塚寛，f也：医学のあゆみ ， 75 ,372 ,19 7 02 ）今成，田村：医学のあゆみ， 75 ,547 . 1970-163-E急性中毒とし，薬量レベ ル はI O O O mg/kg; ,4 5 0 mg/kg群 は2日間隔で計4回，I 50mg/kg, 5 0 mg/kg 群は連日1 0閉経口投与した。
3）組織からの抽出および査光比色
クロロホルム抽出も可能であるが，ガスクロマトグラフ用試料と兼用の場合不都合であるので，ベ ンゼンを採用したo対照群の組織も相当程度の盲蛍光を呈するので，対照群の数匹からのそれぞれの組織を混合平均し，これにキノホルム標晶 一 定量を添加して内部標準を毎回作製し，蛍光比色の基準としたの抽出の操作を図式で示した（表1 ）。蛍光比色は八木式徴量蛍光光度計（UM-S型）を使用し，励起光選択フィ ル タ ー U v-v 1 ，励起光遮断フィ ル タ ーUV-01 ，蛍光遇尺フ ィ ルタ－FL-B！！を選んだDl

表

試料（約4 0 0～7 0 0 mg)*
冷ヘキサンて粗にホモジナイズ｜
軽く 遠 沈

対沈痘

回群

上、
対実験群

．
5 µg/me ベンゼン ベンセ ン ベンゼン
キノホ／レム 1.0 r.ze 3.0 me 3.0 me＋ベンゼン2. 0 尻t

群

邑

実験群

5µ広角t
キノホ ルムベンゼン ベンゼン ベンゼン
1. 0 mt 3.0 me 3. 0 沼d＋｜｜Ii

ベンゼン2.0 me
握置振充分にホモジナイズ

ア七トン0.5me

遠沈3000rpm
3 0分以上ちタノー／レ2溶液0.5 me

mtvr 1zt

振レメ！

ノタ

接＋ m
A9r、JiZ U 1 2

清J山液－溶上／沈撞／照清重ヤ上＼

遠沈3000rpm
3ci

上清沈撞

蛍光比色＊

対照群試料は，数匹分の試料を磨砕し，これより検体担当重量をとり，平均された対照として使用する。但し通常内部標準法をとるから対照群は 2倍畳を使用する。
噌且rF
Dβd