相同組換えの正確性を保証するメカニズムの理解
Unraveling the mechanisms that ensure the fidelity of homologous recombination（日本分子生物学会推薦）

代表研究者

九州大学

高橋達郎

Kyushu University

Tatsuro TAKAHASHI

協同研究者

九州大学

河添好孝

Kyushu University

Yoshitaka Kawasoe

The mismatch repair (MMR) system protects genetic information by handling mispairs arising from DNA
replication errors and homology-directed repair between divergent sequences. Replication errors are corrected by theMMR system in a strand-specific manner to restore original genetic information. In contrast, homologous recombination
between divergent sequences is rejected through the unwinding of recombination intermediates. Genetic studies in yeast
have shown that this process, called antirecombination or heteroduplex rejection, depends on the Msh2–Msh6 (MutSα)
mismatch recognition complex and the RecQ homolog DNA helicase Sgs1. However, the mechanistic detail ofantirecombination remains still ambiguous, especially in vertebrates, partly due to the lack of biochemical model systems.
In this study, we set up a single-strand annealing (SSA) model system in Xenopus egg extracts and found thatsequence divergence between two repeating units significantly delays the annealing reaction and reduces the efficiency ofSSA. Immunodepletion experiments showed that this reduction of SSA is mediated by MutSα and the Werner helicase.
MutSα and the Werner helicase were also important for the fidelity of SSA. In addition, we found that the MutLα
endonuclease, which plays a critical role in replication error correction, counteracts the Werner helicase during
antirecombination. These data suggest that MutSα activates the Werner helicase during divergent SSA to improve theselectivity of recombination pairs and a balance between MutLα and the Werner helicase regulates the fidelity of SSA inXenopus egg extracts.

研究目的

能する（Rayssiguier et al., Nature, 1989 など）。興味深

相同組換えは DNA 二重鎖切断損傷を修復する重いことに、MMR システムが DNA 合成の誤りを修復

要な DNA 修復経路であり、その機能は組換え酵素する際にはミスマッチ塩基を削って再合成するのにによる相同鎖探索反応に依存する。一方で、特に動対し、類似配列間の相同組換えを抑制する際には、物や植物のようなゲノムサイズの大きい生物のゲノミスマッチ塩基を含む組換え中間体を削り込むのでムには、多数の類似配列が存在する。類似配列間のはなく引き剥がし、正しい相同鎖の再探索を可能と相同組換えはゲノムの再編、不安定化をもたらすたす る と 考 え ら れ て い る 。 こ の 反 応 は 、 anti-め、生物は類似配列間の相同組換えを抑制するメカ

recombination（抗組換え反応）もしくは heteroduplex

ニズムを進化させてきた。

rejection（ヘテロ二重鎖引き剥がし反応）と呼ばれる類似配列間の相同組換え抑制は、30 年以上前にバが、本稿では抗組換え反応で統一する。その後、真クテリアで発見された（Rayssiguier et al., Nature,

核生物においても、MMR 因子に依存した抗組換え1989）。バクテリアでは DNA 合成の誤りを修復する反応が発見された（Datta et al., Mol Cell Biol, 1996 な

ミスマッチ修復（MMR）因子群（MutS、MutL、UvrD、ど）。真核生物におけるこの分野のパイオニアは、Jim

MutH）の全てが、類似配列間の相同組換え抑制に機Haber（Brandeise Univ）、Eric Alani（Cornel Univ）、SueJinks-Robertson（Duke Univ）、
Richard Kolodner（UCSD）

路に分類することができる。そのうちの一つ、一本らであり、主に 1990 年代後半から 2000 年代前半に鎖アニーリング経路（Single-strand annealing, SSA）は、かけて重要な進展が相次いだ。興味深いことに、彼

タンデムに並んだ相同領域の間に DNA に重鎖切断

らの解析から、真核生物では、DNA 合成に伴うミス損傷（DSB）が生じた際にはたらく経路であり、組換マッチ塩基の修正と抗組換え反応は、大きく異なるえ酵素による相同領域間のアニーリングを経て、相因子群に依存することが分かってきた（Sugawara et

同領域のコピー数が一つ減った産物を生じる。このal., PNAS, 2004 など）。具体的には、真核生物におい反応は、過去にツメガエル卵核質抽出液を用いて試て DNA 合成の誤りを修復する MMR 因子群は験管内再現されている（Yan et al., J Cell Biol, 2005）。

MutSα、MutLα、Exo1、PCNA などであるが、抗組そこで本研究では、SSA 反応をモデル系に、抗組換換え反応には Exo1 や PCNA の寄与はほぼ無く、え反応の試験管内モデル化と、これを用いた分子機

MutLα の寄与は、実験系にも依存するが MutSα よ構の解明を目指した。

りも小さい。また出芽酵母の抗組換え反応は、RecQ

まず我々は、420 bp の相同領域をタンデムに持つファミリーヘリカーゼである Sgs1 ヘリカーゼを必

プラスミド DNA を構築し、これを用いて SSA の再要とするが、この因子は DNA 合成の誤りの修復に現を試みた。制限酵素を用いて相同領域の間を切断は不要である。これらの事実は、真核生物におけるし、これを NPE に加えたところ、40%程度の産物にミスマッチ塩基の修正と抗組換え反応は、それぞれおいて、相同領域が２コピーから１コピーに減少し大きく異なる分子メカニズムによって駆動されるこていた。一方で、相同領域の外側を切断して NPE にとを示唆する。

加えたものでは、この相同領域が減少した産物は全バクテリアの組換えエラー抑制については近年にく観察されなかった。これらの結果から、本実験系なって試験管内再構成が達成され（Tham et al., Mol

において観察された相同領域のコピー数が減少した

Cell, 2013）、MutS と MutL が組換え中間体に結合し産物は、SSA 経路によって生じた産物であると考えて安定化する、UvrD ヘリカーゼが中間体を解きほぐられた。
以降、この産物を SSA 産物として取り扱う。

すなどのモデルが提示されている。しかし前述のよ

次に我々は、２コピーの相同領域のうち、１コピうにバクテリアと真核生物では関与する因子群が大ーの塩基配列を変え、相同性を 96%および 92%まできく異なっており、反応機構も大きく異なる可能性低下させた基質を作成した。これを相同領域の間でが高い。特に MutLα の寄与は真核生物で小さく、切断して NPE に加えたところ、相同性の低下に伴い、この点でバクテリアのモデルを真核生物に適用するSSA 産物の著しい減少が確認された。さらに、NPEことは難しい。真核生物での唯一の生化学解析は、からミスマッチセンサーである MutSαを免疫除去

精製 MutSα が D-loop 構造中のミスマッチを認識でしたところ、96%および 92%の相同性を持つ基質にきることである（Honda et al., PNAS, 2014）。このよおいても、顕著な SSA 産物を観察した。これらの結うに本分野の生化学的解析は非常に立ち後れている

果は、本研究で構築した SSA 実験系は、相同配列間が、バクテリアの研究（Tham et al., Mol Cell, 2013）の相同性、および MutSαによる制御を受ける事を示が示すように、優れた試験管内系が分子機構理解のす。

ブレークスルーになると予想される。

我々はさらに、類似配列間 SSA の抑制を担う因子

我々の研究室では、ツメガエル卵の核質抽出液を探索した。出芽酵母においては、RecQ ファミリー（NPE）をモデル系に、MMR 反応を含む様々な DNAのヘリカーゼである Sgs1 が抗組換え反応に必須でメタボリズム関連反応を試験管内で再現、解析してある事が示されている（Sugawara et al., PNAS, 2004）。

きた。本研究では、我々が確立した生化学的再現系

脊椎動物においては５種の RecQ ファミリーヘリカを用いて、脊椎動物の抗組換え反応の分子メカニズーゼが知られる。このうちのいくつかについて特異ムを解析したので報告する。

的抗体の作成を試み、NPE から免疫除去を行って抗組換え反応への影響を調べたところ、Werner（Recq3）

研究経過の免疫除去によって、抗組換え活性が著しく減少す真核生物の相同組換え経路は、反応メカニズムやることが分かった。Werner はヘリカーゼの活性に加産物の違いから、いくつかのサブ経路および関連経え、エキソヌクレアーゼの活性も持つ複合酵素である。昆虫細胞 Sf9 を用いて発現、精製した Werner タ必須であることが分かった。他の４種の RecQ ファンパク質は、Werner の免疫除去による抗組換え活性ミリーヘリカーゼの寄与については現在のところ不の低下を相補可能であった。これを用いて抗組換え明であるが、Werner の単独除去によって抗組換え反活性に必要な Werner の生化学的活性を検討したと応が大きく損なわれることから考えて、他の RecQ ヘころ、ヌクレアーゼ欠損 Werner は抗組換え活性を保リカーゼが Werner と協調して抗組換え反応に働く持していたのに対し、ヘリカーゼ欠損 Werner は抗組可能性は十分に残されているものの、それらが単独換え活性を完全に失っていた。これらの結果は、SSAで抗組換え反応に必須である可能性はほぼない。予をモデル系とした抗組換え反応は、MutSαの活性に備的実験からは、もう一つの主要な RecQ ヘリカー加えて Werner のヘリカーゼ活性を必要とすることゼである Bloom については、DSB 末端の削り込みにを示す。これに加え、我々は同様の実験から、DNA必要であることが分かっている。Bloom を除去する合成の誤りを修復する因子である MutLαエンドヌと DSB 削り込みの下流で機能する SSA も阻害されクレアーゼは SSA を基質とした抗組換え反応に不要るため、Bloom が抗組換え反応に果たす役割についであることも見いだした。ては検討できなかった。この点は今後の課題である。

我々はさらに、二種類の DNA 基質を組み合わせ本研究では、さらに複数種類の基質を混合するこることで、正確な SSA と不正確な SSA を共存、競合とで正確な SSA と不正確な SSA を競合させ、SSAさせ、SSA の正確性を見積もる実験系を構築した。の正確性を見積もる実験系を構築した。この実験系

この実験系を用いて MutSα、MutLα、Werner が正は極めて感度に優れており、わずか 2%の相同性の低確な SSA ペアの識別に果たす役割を検討したところ、 下であっても、それによる SSA のバイアスを検出す予想と一致し、MutSα、Werner の免疫除去は SSA のることが可能であった。この系を用いて、我々は、正確性を著しく下げることが分かった。ところが、Werner と MutLαがそれぞれ抗組換え反応の促進、興味深いことに、MutLαの免疫除去は SSA の正確性抑制にはたらくと考えられる事を発見した。MutLαを、わずかではあるが、むしろ向上させた。さらに、はミスマッチ塩基の修正に働くのに対し、抗組換えWerner の組換えタンパク質を NPE に過剰に加える反応はミスマッチ塩基の修正を原則的に必要としなと、SSA の正確性が向上することも分かった。これ

いと予想されている（Sugawara et al., PNAS, 2004）。

らの結果は、MutSαの下流で働くと考えられる二つ

したがって、MutSαの下流でミスマッチ修正反応との因子、MutLαと Werner が、抗組換え反応に対して抗組換え反応が分岐し、それぞれが拮抗的な関係に拮抗する作用を持つこと、および、そのタンパク質あると考えると、観察結果をうまく説明することが濃度のバランスを変えることで、SSA の正確性を操できる。これらの経路の拮抗関係は、体細胞期には作可能であることを示す。

類似配列間の相同組換えが全く許されないのに対し、減数分裂期には相同染色体間でのミスマッチを含む考察組換えが必要とされることと対応するかもしれない。

我々の研究によって、真核生物の抗組換え反応を今後の研究により、相同組換えの正確性と寛容性を再現する生化学的実験系が、世界で初めて確立され支配する制御メカニズムの全貌が明らかになると期た。バクテリアの研究でも試験管内モデル系の確立待される。

によって抗組換え反応の分子メカニズム理解が大きく前進した（Tham et al., Mol Cell, 2013）。本実験系は、参考文献

真核生物、特に脊椎動物における抗組換え反応の分

Datta A, Adjiri A, New L, Crouse GF, Robertson SJ. 1996.

子メカニズム解明に、今後役立つことが期待される。

Mitotic crossovers between diverged sequences are

本研究によって、これまでよくわかっていなかっregulated

bymismatch

repairproteins

in

た、脊椎動物の抗組換え反応の概要が分かってきた。

Saccaromyces cerevisiae. Mol Cell Biol 16: 1085–

ミスマッチセンサーである MutSαは、出芽酵母と同1093.

様に抗組換え反応に必須であった。また、脊椎動物

Honda M, Okuno Y, Hengel SR, Martín-López JV, Cookの５種の RecQ ファミリーヘリカーゼのうち、少な

CP, Amunugama R, Soukup RJ, Subramanyam S,

くとも Werner は SSA を基質とする抗組換え反応に

Fishel R, Spies M. 2014. Mismatch repair protein

hMSH2–hMSH6 recognizes mismatches and forms
sliding clamps within a D-loop recombinationintermediate. Proc National Acad Sci 111: E316–E325.
Rayssiguier C, Thaler DS, Radman M. 1989. The barrier
to recombination between Escherichia coli and研究の発表

口頭発表
1.

Takahashi T, Regulation of the fidelity of homology-

Salmonella typhimurium is disrupted in mismatch-directed repair in Xenopus egg extracts., The 11threpair mutants. Nature 342: 396–401.

quinquennial conference on DNA repair, Egmond aan

Sugawara N, Goldfarb T, Studamire B, Alani E, Haber JE.
2004. Heteroduplex rejection during single-strandZee, The Netherland, 3/28/2022 (Invited)2.

高橋達郎, Regulation of the fidelity of homology-annealing requires Sgs1 helicase and mismatch repairdirected repair in Xenopus egg extracts., 国立遺伝学

proteins Msh2 and Msh6 but not Pms1. Proceedings of研究所・研究集会「染色体安定維持研究会」, 静the National Academy of Sciences of the United States

岡県三島市, 7/4/2022 (Invited)of America 101: 9315–9320.

3.

Takahashi T, The mechanism of a chromatin-Tham K-C, Hermans N, Winterwerp HHK, Cox MM,

remodeling reaction associated with replication error

Wyman C, Kanaar R, Lebbink JHG. 2013. Mismatchcorrection., Chromosome Replication in the New Era

repair inhibits homeologous recombination via- Old and New Questions in Life Science -, Mishima,coordinated directional unwinding of trapped DNA

Shizuoka, Japan, 11/11/2022 (Invited)

structures. Molecular Cell 51: 326–337.

4.

高 橋 達 郎 , The mechanism of a chromatin-Yan H, McCane J, Toczylowski T, Chen C. 2005. Analysis

remodeling reaction associated with replication errorof the Xenopus Werner syndrome protein in DNA

correction., 第 45 回日本分子生物学会年会, 千葉

double-strand break repair. The Journal of Cell Biology

県千葉市, 12/1/2022

171: 217–227.