スモンのワイルス学的検討

永田育也，木村吉延（名大・医・無菌研）

伊藤康彦（名大・医・内科〉

スモンの病因については，感染説，中毒説などの多くの考え方が提討され，その各々の説も内容において次第に変化していると思われる。 しかし現在までのと ころー・ス モ 三と言う一つの疾患が あると仮定するとき，この疾患の全経過を 一 元的に説・明し得る病因論はまだ乏いようである 。

第一 内科祖父江グル ー プは早くから この疾患に注目し多くの観察又は成績を報告しているが，我々もこの疾患について祖父江クソレ ー プの示唆をもととして ，ウイルス学的立場からの検討を試みてきた。
先ず，本疾患がウイノレス性 疾患か否かを検討するため，主として剖検例の材料を中心と し同時に患者糞便，脊髄液からのウイノレス因子の検出を試みた。 一 方井上博士は本英患の糞便及び 脊髄液から高率にー勺のウイルス因子を分離したことを報告したので，この因子（井上因子；の性状を検討する こととした。
以上ウイノレス因子が直接本疾患に関与するか否かを検討 すると共に 最近キノ ホルムが本疾患に 深いかかわりのあることを示唆するような成績 が色々な方面から報告されてνることから，キノホル ムの一般生物学的活性を知る目的で，その既知ウイルスに対する作用，並びにインターフエロンの産生及び 作用に及ぼす影響について検討 した。
本報告の第一 部はウ イノレス因子の検索及び井上因子の検討に関するものであり，第二部はキノホノレムの生物学的活性に関する成績である。

第一 部

スモン患者材料からのウイルス因子分韓の試みと井上因子に関する検討
スモン患者材料からのウイル ス因 子の 検出はすでに各所で行なわれているが，我々も患者糞便乳剤，脊髄液，及び剖検例2例について内部臓器乳剤，腸管内容物から，各種培養細胞によるC P因子の検索を行った。
実験材料及び方法
患者糞便並びに剖検材料はP B S又は 2% 牛血清加イ ー グノレ培地で3 0 分低温遠心上清を接種材料とし た。

0 'le乳剤とし，s. o o o r pm

なお脊髄液についてはそのまを使用し ，棋菌P B Sを用いた-5 8 ー(IF ）の産生及びその作用に及ぽす影響について検討した。

実験材料及び方法
ウイルス：Sindbis ウイノレスは鶏胎児細胞継代株を，ND Vは発育鶏卵継代株を使用した。
鶏胎児細胞培養cc E細胞） : 10日卵より鶏胎児をとり出し頭部，内臓を除去したのち，0. 2 5 %Trypsin 処理し培養液にて細胞＃遊液をつくり，シャ ー レに各41r..£づっ分注し， 3 5 ℃の CO フ ・2ンキに て静置培養した。
培養液：牛血清5%加YL EにPenicillin 200 units/me, Streptomycin z o oµg/me,

Phenol red oo. o s�(lを加えたものを使用した。 維持液としてはキノホルムを各種濃度で含有させた場合は血清濃度として最終的に3. 5 °＂とたるよう不足の牛血清を追加した。 それ以外の場合には2 ～3%牛血清加YL Eを維持液として使用した。
I Fの調製：Sindbi s ウイルスによるI FはC E細胞にウイルス を接種し，3 5 ℃1時間吸着後O<;,c,YL E液で1回洗滞、し ，維持液4meを加え2 4時間後の培養液を38000rpm 2時間超遠心しその上清をP H2. 1のC lark液で4℃2 4時間，再びP H 7. 2 Hanks 液で2 4時間透折し3 0 0 0rpm 1 o分低速遠心した上清をI F材料とした。 N羽r s ウイノLス によるI Fは，1 0日フ化鶏卵の襲尿佐にウイノレス を接種し4 8時間3 5℃で培養した後尿液を24000rpm 1時間超遠心しその上清 をSindhis ウイルスの場合と同じように処理した。

IF価の測定：常法 のプラック法を用いた ι すなわち，耀持液で倍数稀釈した I F 材料を各稀釈当り3枚の C E細胞に加え， 3sCs時間以上作用させた後，液を除去し約5 0～1 o o P FU/ o. 1r.iCのS indbis ウイルスの0. l mCを接種した。 1時間3 5℃にて吸着後4 m€のover lay mediumを重層した。 7 2時間3 5℃培養後のプラック数が対照の5 0 %減になるI F稀釈倍数をI F値とした。
又キノ，十ノレムによるI F活性の変化をふいる為lこ， c hallenge ウイルスのy i eld を 対照と比較する方法を用い た。
ウイノレス感染価の測定：上記I F測定と同じように常法のブラック法を用いた。
キノホノLムの調製：キノホルム純末1 0 7,tpを牛血清114e Iこ浮避させ， 2000r防n 1 O分遠心を3回くり返えし，その上請をキノホルム1 o o ''o とした。 このキノホルム含有牛血清をY L E液lこ0. 4 4 %から3. 5 �＂までになるよう加えた。 牛血清捜度を3 . 5可に同 一にするため不足の分は正常牛血清をそれぞれ追加した。 本実験におけるキノホノレム溶液はすべてこのように作製した c なお，この濃度のキノホルムによ っては液のP Hには変化なくC E細胞に認むべき細胞変性もきたさt.t.かった。 キノホルムを 分与された予研江頭博士に感謝するむ実 験 結 果1,

既知ウイルスの増殖に対するキノホルムの影響-6 0 ーC E細胞にウイルス液（Sin dbis ウイルス 3 X 1 0 P FU/ 0. 1 me , ND V 1 X 1 0 8 P FU/
0. 1 me ） を 0. 1 me 接種し 3 5 ℃ 1 時間吸着後O%YL E液にて 3 回洗瀞した後各種濃度キノホルム含有維持液を－！ me 加え 3 5 ℃で培養した。 ウイノレス接種後経時的に液中のウ イノレ ス感染価を測定した結果を
Fig1-a, Fig 1-b に示す。 図から明らかなようにS indbis ウイノレス及びNDVの増殖はイルス増殖抑制につい各々キノホルムによって対照に比しおよそ 9 0 %抑制される。 又キノホノレムとウて，特にキノホルム 3.

response が成立しないことがしばしば観察

5 %と1. 7 5 %の聞でdose＼＼／ノ＼、＼〆＼＼〆＼。

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されたが，これについては現在検討中である。

2 448

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chinof oロn on Sindbis virus mu I t i p Ii ca ti o n

CE cellsSindbis virus was inocul ated to CE Ce 11s. Afteradsorption for 1 hour, ce I Is were washed twice and e ach dishpro vided with YLE medium containin g 3.切る C 0-"' 0 ) ' l. 7 5 % C X - -x) '0.-1 4% C口 一一 口〕，－c),ch inoform and no ch inoform（。
respective! y・ Cu 1 tu r e f 1 u i ds were harvested at vario us times
incubation and assayed for virus i n f est iv i t y.

0.88% （どトーム），-61-8－；：：...－：：：，，
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h ours aft er infection
Fig 1-b Et fect of chinoform on NDV multiplication 1n CE
cells
Experiment was done with t h e sam e procedure descrived 1n
Fig 1 a ・ concentration of chin oforrn 3.5% (0--0), 1.75%（× 一一 ×） , 0.8 8%（ムーー ム） , 0.4 4% （口 一 一口）

and no chino form（仔一。）．
2
一既知ウイルス粒子の感染価に及ぽす影響
定の感染価を有 するウイルス液（Sindbi s ウイルス液 3 x 1 O 5 PFlV0.1 m.£, N DV 1 x 1 O 7PFU/ 0.1 m.£ ）にキノホルム含有牛血清を各種濃度で入れ，牛血清濃度を同 一 にするため不足の分は正常牛 血清を加えた。 このウイルス液をシャ ー レに 4 m.£づっ入れ 3 5 ℃で 一 定時間作用させた後ウイ ルス
感染価を測定した。 Fi g 2-a ,Fig2-bに示すように，Sindbis ウイノレスはキノホルム

3. 5 ヲもの場合， 2 2 時間で対照に比し 9 7 ヲも感染価が低下するのに ，NDVではキノホルムによる感染価の低下はほとんど認められない。 叉，キノホ ノレム 3. 5 %によって 9 7 %感染価が低下したSindbis
ウイ／レスを 1 o Omµのフイノレターで伊過した場合 ，その前後で 感染価が 3 3. 4 %低下するが，これは対照実験でも炉過により 3 4. 3 %低下することから，キノホノレムによってウイルスが凝集したためではないと考えられる。
-6 2 ーincubation t i口1es
100(hours)
24、尽く、48＼＼ト ＼＼＼＼ ＼ ー＼ ＼＼＼＼、＼＼＼＼＼＼、＼、＼＼＼、＼｛、 、し＼ ＼＼ょ＼＼、、＼＼＼、、、、
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Fig 2-aInac tivation of Sindb i s virus b y chinoform

Sindhi s virus
chinoform.

After incubation at 35 。C,virus infec t ivi ty

was assayed.
1.7 5%

as mixed w ith YLE medium contain ing

羽，concentr ation of chinoform 3.5% (0 一－ 0)'（×一一×），

0.8 89ら（ムーーム），chinoform (o--o-6 3 ー

0.4 4%（口一 一口） and no7（ 切O【 ）

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Effect of chi no fo rm on Sindbis virus mu 1 tip I ication

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CE ce 11 s.

Virus titer of the culture fluids atSindbis virus

inoculation.

-66-

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ω－M－』 ω〔【65「the yield of Sindbis

IF pretreated Ce 1 1 s.

CE Ce l l S were pretreated with-7 0 ー

IF for8hours- AfterキノホルムはI F活性に対する抑制作用を有する。 その作用はI F分子を直接的に不活化するものではなく ， I F によるいわゆる An t i v i v a I

Pr o t e i n合成以後 lこも，その I F 活性抑制が認められた。

-7 2-

間観察したが何ら発症 はなかった。 そして．“lと同じ方法でエマホルムのみを与えて分離材料を与えていない伝3の犬は，

1 3 0日（エマホルム2 3 ＜／－ 投与）で後枝の麻揮がみられ， この状態は

1 7 9白（エマホルム8 3 I;-投与）ま で続き， 症状はそれ以上に強〈進行することはなかった。
4'n. 4の犬は， SMO N患者音便（0 -DM株とは異なる患者〉そのものを経口的に投与し， そわ後 3 日して排出した下痢便を， 更にもう 一 度 2 代目の犬すなわちAo. 4 の犬に 投与し， 前 3 者の犬と同様にエマホルムを与えたものである。 これは1 '.! 6日〈エマホルム1 5. 5 (j-投与）で後腹に麻寄がきたが， 3日間拷いただけでこの麻霊は回復し， その後31日間

マ ホル ムの投与を続けながらエ智察したが何ら症状はみられなかった。 ここで守雄材料0-DM株の経口接種を開始したところ，2m fづっ1 1日間与えた時点で後肢の麻寄が表われ，1 4日で前肢にも麻嘩がみられるように なり， 歩行間警となった の 尚目下観察継続中である。

IV

総括ならひに考案
昭和4 3年秋以来， 岡山県下に多発したSMO N思者から病原依の分離実績を試みてきた。 すな

わち分離用材料として用いたものは， 患者の者便， 原， 血液， 脳， 背鰭液および舌苔である。 とれらの材料を各種三望者緒。物と各種培養細胞に種々の方法で接粛し 長時間観察を行ったのであるが，すべて信作堵要のムで病原らしきものを分侍することは出来なかった。
しかし， 無血清窮地による培莞細胞を月いることにより，ウ イ；！.スとマイコプ号スマを混合守護することが出来た 。 ウイルスは地代が至って困難であり， 叡代にして消失し， しかも患者血清と の：聞の中予1J試誌は陽侍であるとはいえなかった n そしてマイコプラズマと号、者血清との問の関連性については尚尚討中で不明でふる。 このようにウイルスもマイコプラズマも現状では， S l\l[O Nの病問として認めるわけにはゆかないが， ともにS MO N患者に由来して分保されたものであることに間違いは々く， S MO Nと何らかの関係があるのではないかと考えるわけである。
そとで，員近キノボルムヵ：S Nl:O Nに聞係ありとする報告が多くなってきたので s者支細胞で増唱えE代しているマイコフヲズ

マ

イコプラズマのλを与えた犬は発症せず，

エマ ホ ;L.

エマホルムととを犬に与口的に与えてム たのであろう：， その結果マム円ムを与えた犬は常枝に持軍事がみられ， 両者を与えた犬l土荷徒吃の麻 3草と失明をきたし歩行不言きになって，

S 1v10 Nを患わせるような症状を示しfこ。
培もマイコプラスマのム或いはキノホルムのムの投与 で；z， 発症は，三いかぶは胃、窪行，Aをまわすが， 両者をあわせ与tるこ とにより症状はS1v10 Nに1以三ようなものに主るとの司君主を与える。 Lがしこれな，あくまでも予備的に行なったもので， 例数は少なく， 罵理誼詰僚は， いまだ後査途上で t あり， 人のS J\10 Iイに:i:i,tる病理苛見との比較が問題となることは'JJ論でS1"10 Nによく似た管状が犬にAられた現象があった というにすぎない。 再．向討を要する奏験であると考える。

-7 6 ー

この研究はスモン調査研究協議会の研究費によるものである。最後に，実験について種々お世話になっている甲野会長，本間教授その他多くの方々に対し心から感謝の意を表する次第である。

｝.）甲野礼作：スモン病因論

議

文ー

感染説の立場から。最新医学， 24, 2403ー240 6,

1 96 92）新宮正久： SMO N 流行地と非流行地における住民の E CHO 2 1型ウ イルスに対する抗体保有状況，スモン調査 研究協議会。第 3田病原班会議抄録，

19703 ）井上幸重，西笥鶴子，中村良子：スモン患者糞便より高率に分離された新しいウイ／レス。医学のあゆみ，

72 ,1 9 703 2 1～3 2 2 ,井上幸重西部…良 子 一一一一イス（第 2レ1 97 0報）。医学のあゆム， 73 , 68～68,
5） 武内忠男，桜間信義，富尾延江：のあゆみ， 7 3 ,6 5～ 68,

SMO N の特異な腸病変とそれより検出されたウイルス．医学

1 970

6）東昇：スモン病原体の電子顕徴鏡的研究 . SMON 調査研究協議会，第 3回病原班会議抄録，

1 9 707 ）太田善介，大藤真，

74

600～602

SMO N 患 者より分離された ウイルスの電顕像 n 医学のあゆみ，
19708）俵寿太郎，金政泰51.，林英生，赤塚和也，市川主宰，坂本鈴江：培養細胞によるS MO N 病原体分離の試み．医学 のあゆム， 7 5 ,66～68,

19709）本間遜，帖佐治，複本美枝子，渡辺接，富山哲雄，青山友三，甲野礼作，斉藤守，スモン患者の舌苔よりの菌のをた索。 SMON 調査研究協議会，第 3 回病原班 会議抄録， 1 9 7 U10）富山哲雄： SMO N 患者由来マイコプラズマと患者血清の血清反応. SMO N 調 査研究協議会，
第 3 回病原涯会議抄録 s197 011 ）甲野礼作，赤尾額幸， j志賀定同：スモン患者咽頭および糞便からのマイコプラズマ分離の試み．

SMO N 調査研究協議会，第3回病原涯会議抄録，-7 7

1 97 0得られた結果
1.

用いたすべての動物種の各神経組織からグリア細胞とせんい芽細胞の旺盛な増殖が3日頃より認められ，

5 ～ 6 日でmon o I a ye rを形成した。 ただし 3 週間の観察に於ても髄鞘形成 を認めるまでに到らなかった 。

2. すべての神経組織につい てトリプシン消化後 tube culture を試み， 細胞培養に成功したが， 細胞の種類は多岐にわたり， 神経細胞とグリア細胞の細 胞種を生化学的に判断するまでに到らなかった。

3Tube cul ture の神衛担胞維持は一般に困難で用いた培養液の水質， pH などに敏感に反応し死滅する。

4.

Herpes simplex Virus( HE F 1株）感染の経過追跡

マウスの 脳細胞 のmonolayer に m. o. i. = 4で HEF 1株を感染させると， Astrocyte様細胞とせんい芽細胞に感染し， C p E は明らかでないがWatkins 現象（感作赤血球の吸着反応）が陽性となる。 O I igodendrocyt e 様細胞には Watkin s 現象が証明されなかった。

8 2一