植物の活性アルデ ヒ ド解毒代謝機構の解明
Detoxiflcation Mechanisms ofReactive Aldchydes in Plants(日 本植 物 生理学会推 薦 )

代表研究者

山口大学

真野 純一

Yarnaguchi Univcrsity

Jun'ichi MANO

協 同研究者

山口大学

松井 健二

Yamaguchi Univcrsity

Kcn」 lUnivcrsitcit Gcnt

Dirk INZE

ゲン ト大学 INZЁ ,Dirk

MATSUI

Antioxidativc dcfensc in cclls is of critical importancc in thc plant protection against
environmental stress.We have rcccntly identified in 24rαbJdOρ sjs′λα′Jα ん
α a novel cnzymc 2‑alkcnal Qβ ―hydrOgcnasc(ALH)that Catalyzes the reduction of theα,β unsaturated bond of2‑alkenals, potcnt cytotoxins produced froln lipid peroxides. In this study, wc ailncd atvcrifving a possiblc involvement of thc lipid peroxidc― dc vcd 2‑alkcnals (rCactivealdehydes)in the environmental stress― induced damages of plants.When A.′ たαJjα んα leaves

were oxidatively stressed,production of crotonddchydc and acrolein was cnhanced.Unlike
thc case for oxidativcly stressed animal cclls,malondialdchydc was not a mttor prOduct.
Thus, thc mctabolism of lipid peroxides differs between plants and animals.Acrolein andcrotonaldchyde inhibited CC)2 fiXation in isolated chloroplasts strongly,but did not affectthc photosynthctic electron transport activity. Thus thc reactive aldchydes speciflcallyinhibit Calvin cyclc activity, causing photoinhibition. Wc constmctcd thrce transgcnic′ακα ALH.The transgenic plants exhibitcd higher
tobacco lines that overproduced thc A.′λα′tolerance to methyl viologen and to intense light,indicating that ALH protected leaf cells
froln oxidative stress. Thcsc rcsults altogether indicate the involvemcnt of the reactive

aldchydes in the photooxidativc ittury and thC significant contribution of ALH to theantioxidative defensc in leaves.

研究 目的植物 の成育 に不可欠な光 は,生 体分子 を励起す ることのできる高 いエネルギーをもつため,潜 在的 に細胞成分を損傷す る危険性をもって いる。乾燥や低温,紫外線 ,オ ゾンな どの 「環境ス トレス」は,と くに強 い太陽光 との組合わせで,葉緑体での活性酸素生成を増大 させ ,細 胞 に酸化的損傷 を与える。活性酸素を消去する細胞 の抗酸化能は環境ス トレス防御 の要であ り,植 物 は多種多様な抗酸化低分子 ,活 性酸素消去酵素を豊富に含んで いる。代表研究者 らは,シ ロイ
ヌナズナ cDNAラ イ ブラリの機能スクリーニ ングか ら新たに見 いだされた抗酸化因子 Plの 生化学機能を追求 し,Plタ ンパク質が,過 酸化脂質か ら生ずる毒性 の強 いα,β 不飽和アルデ ヒド (活 性アルデ ヒド)の α,ル 不飽和結合 を還元 し低毒化する新規酵素 2‑alkenal α,β hydrOgenase(ALH)で ある ことを発見 した。本研
究課題では,植 物の環境ス トレス傷害における活性アルデヒドの関与 と活性アルデヒド消去 のス トレス防御への寄与を検証することを目指 した。
研究経過
1.酸 化的ス トレスによる葉での活性アルデ ヒドの増大

過酸化脂質からは結合の飽和度と炭素鎖長の異なる種々のアルデヒドが生成する。酸化的ス トレス下で葉に蓄積するアルデヒドの分子種 を特定す るため,生葉か らアルデヒドを抽出し,ジ エ トロフェエルヒドラジンによる誘導体化ののちHPLCに よって同定・定量す る方法を確立 した。ス トレスを与えていない
シロイヌナズナ葉では,4‑hcxanal,2‑hcxcnal,3‑hexcnalと いった植物 に典型的な c6ア ルデ ヒドが主要なものであった。葉緑体の活性酸素生成を増大させる
メチルビオローゲン (MV)を 与え酸化的ス トレス処理をおこなったシロイヌ
ナズナ葉では,こ れ らの C6ア ルデヒドはほとんど増大 しないのに対 し,C3および C4活 性アルデ ヒドであるアクロレインとクロ トンアルデヒドの含量が増大した。一方,動 物細胞 において過酸化脂質分解 の主要生成物とされるマロン
ジアルデヒドは Mv処 理葉でもほとんど生成しなかった。すなわち,植 物 と動物では過酸化脂質分解経路は明らかに異なってお り,植 物では酸化的ス トレスによって c3,C4短 鎖活性アルデ ヒドが主に蓄積する ことが明らかになった。
2.活 性アルデ ヒドによる光合成阻害

活性アルデヒドは強い求電子性 をもち,チ オール基やアミノ基に結合して酵素を阻害す ることがある。また,植 物のミ トコン ドリアに存在するグリシンデカルボキシラーゼなどの活性中心の リポ酸に結合し,活 性を阻害する。葉緑体で光合成反応 に関与す る酵素・タンパ ク質 にも活性アルデ ヒドの潜在的ターゲットと考えられるものがあるが,光 合成に対す る活性アルデ ヒドの影響はほとん

ど研究 されていなかった。ホウレンソウか ら葉緑体を単離 し,ア クロレイ ンまたはクロ トンアルデ ヒドを加え,数 分間イ ンキュベー トしたのち,光 合成活性を測定す ると,炭 酸固定活性が阻害 されて いた。一方チラコイ ド膜 の NADP+光還元活性は これ らのアルデ ヒドによって全 く影響 を受けなかった。すなわち,活性アルデ ヒ ドは葉緑体 のカル ビン回路 を特異的 に阻害 した。葉緑体 を c3〜 C9のアルデ ヒ ド2mMで 8分 問処理 したとき,炭 酸固定 の阻害率 はアクロ レイ ン
では 100%,次 いで Ⅲヾ
E,2‑noncnalで 70%,そ して炭素鎖長 4〜 6の 活性アルデ ヒ ドでは 50%で あつた。同じ炭素鎖長では飽和アルデ ヒドよ り活性アルデヒ ドのほうが明 らかに強 い阻害効果 を示 し,反 応性 の高 い活性アルデ ヒ ドが葉緑体 に対 しても強力な毒物 として作用す ることがわかった。
カル ビン回路 には,酵 素タンパ ク質上のチオール/ジ スルフィ ド変換 を介 して活性制御される酵素が い くつか存在す る。 しか し,ア クロ レインによって葉緑体 のカル ビン回路活性 を完全に失活 させても,チ オール制御酵素であるグリセ
ルアルデ ヒ ド3リ ン酸デ ヒドロゲナーゼ,フ ルク トースビスホスファターゼの失活 は最大 50%で あつた。また,カ ル ビン回路 の鍵酵素であるリブロース 1,5‑ビス リン酸カルボキシラーゼはアクロレイ ンの影響 を受けなかった。カル ビン回路 の停止 を説明できない。活性 アルデ ヒ ドによって失活 しカル ビン回路活性を制限する第一 ターゲッ トの酵素 を究明す る必要がある。

3.ALHに よる光酸素ス トレス防御の証明
シロイヌナズナ ALHは 活性アルデ ヒドのα,β 不飽和結合 を還元するが,ア ルデヒ ド基 とは反応 しないため,反 応生成物 として飽和アルデ ヒドが残る。植物 の抗酸化防御 にとって この酵素反応 は有意義だろうか ?こ れを検証するためにシロイヌナズナ ALH遺 伝子 を過剰発現す るタバ コを作成 した。タバ コに強光またはメチル ビオ ローゲンによって光酸素傷害をあたえると,光 合成活性が不可逆的 に失われる。非組換 え体 に比べ,ALH活 性が 100〜 250倍 高 い ALH過 剰発現
タバヨは, この光合成失活が軽微 であった。すなわち活性アルデ ヒドのα,ル 不飽和結合を還元する ALH活 性は光酸素傷害防御 に寄与 した。 このことか ら,葉の光酸素ス トレスにお いて活性アルデ ヒドが生成 し,そ れが細胞傷害因子 として作用することが示された。シロイ ヌナズナ ALHは 細胞質 に局在す ることが,緑色蛍光タンパ ク質融合 ALHの タバコ細胞 での発現部位解析 か らわかった。

ALHは 細胞質で活性アルデ ヒドを解毒 し,細 胞 を光酸素傷害か ら防御 した と考え られる。
考察
従来 ,植 物 の光酸素傷害 の主 因は活性酸素種であるとされてきたが,本 研究 の結果 か ら,活 性アルデ ヒ ドもまた潜在的な光酸素傷害要因であること,そ の消去能が植物 の環境 ス トレス防御機構の重要な構成要素であることが示された。
動物細胞 の研究か ら,過 酸化脂質分解では主にマロンジアルデ ヒドが生ずると従来考えられて いた。本研究 では酸化ス トレスを与えた植物にでは主にクロ ト
ンアルデ ヒ ド,ア ク ロレイ ンが蓄積す るとい う予想外 の結果が得 られた。さらにこれ らの短鎖活性アルデ ヒ ドは葉緑体 のカル ビン回路を特異的 に阻害す ることを発見 した。植物研究 においては過酸化脂質分解産物 の細胞毒性はほとんど認知 されていなかったが,葉 へ の酸化的ス トレスによって生ずる過酸化脂質由来 のアルデ ヒドが細胞機能を障害す ることが これ らの結果か ら明確 に示 された。
環境 ス トレス条件下で葉緑体内で活性アルデ ヒド濃度が上昇すれ ば,co2固 定能力が失われ ,ス トロマは過還元状態 とな り,光 化学系 I末 端でのスーパ オキ
シ ド生成・光化学反応 中心での一重項酸素生成が促進され,光 阻害がもた らされる ことになる。 どのような環境条件で,ど のよ うなアルデ ヒド分子種が増大するか,そ の生成機構 とあわせて今後詳 しく究明す る必要がある。

ALH過 剰発現タバコでは,野 生株に比べ 100倍 以上もの ALH活 性が発現 していたにも拘わ らず,光 酸素傷害 に対 し部分的な防御効果 しか得 られなかった。
この理 由としては,活 性アルデ ヒ ドだけでな く活性酸素種の直接作用 も傷害 の原因であった こと,活 性アル デ ヒドがおそ らく葉緑体で生成 したのに対 して細胞質 に局在す る ALHは 間接的な消去効果 しか発揮できかったことなどが考え られる。また,活 性アルデ ヒ ドが ALHに よって還元 されて も飽和アルデ ヒドが残るため,そ の毒性 によって細胞 に傷害が もた らされた可能性 もある。実際,飽
和アルデ ヒ ドをカルボン酸 に酸化 し解毒す るアルデ ヒドデ ヒドロゲナーゼ(ALDH)が 植物 には存在 し,ALDHを 過剰発現 させた植物は種 々の酸化的ス
トレス処理に対 して耐性 を示す と報告 されている。興 味深 いことにシロイヌナ
ズナ ALDHは 鋭β不飽和結合をもつ活性アルデ ヒドを基質 としない。 したがって植物細胞内では,活 性アルデ ヒドは ALHに よって飽和アルデ ヒドに還元され,これが ALDHに よってカルボン酸へ と酸化 されるとい う活性アルデヒ ド解毒代
謝経路が機能 しているか もしれな い。動物細胞での研究結果 によれば,こ れ らの酵素の他 にもアルデ ヒ ドを消去する酵素や低分子が存在する。植物細胞 のア
ルデ ヒ ド消去成分を洗 い出し,そ れぞれの組織分布 ,細 胞内局在性 ,ス トレス誘導性などを解析する ことで植物 の活性アルデ ヒ ド解毒機構 の全体像を明 らかにしていきたい。
機能未知 の抗酸化遺伝子 Plに 端 を発 した研究か ら,植 物 の環境 ス トレス下での傷害要因 となる活性アルデ ヒ ドの発見 にいたった。強い光合成阻害作用をもつ活性アルデ ヒ ドが植物 のス トレス因子 として これまで認知 されていなかったのは,植 物 の活性アルデ ヒ ド消去 システムが きわめて効率よくはた らいて いるためだ とも考え られる。今後 も植物ゲノムの探索か ら,植 物 の環境ス トレス防

御1齢 の新たな側面が￨つ ぎつぎと明らかにさ￨れ るに違いない。
研究発表
回頭発表

1.真 野純■t鳥居義光,滝 本晃‐,Dirkllnze,浅 田浩二 :「 活性アルデ ヒドを消去する新規酵 素アルケナールαβヒドロゲナーゼによる酸化的ス トレス耐性」日本植物生理学会 2003年 度年会 (東 大阪,2003)
2,真 野純‐下 ;.「 活性アルデヒド解毒酵素アルケナールαβヒ ドロゲナーゼの過剰発現による強光耐性」,日 本植物生理学会 2004年 度年会 (八 王子,2004・ )3=真野純一 ;「活性アルデヒド消去酵素 :植 物のもうひ.と つ―の抗酸化防御系」
かずさ DNA研 究所セミナー (木 更津,2004・ 〉とス トレス耐性」
4.真 野純一 :「 不良環境耐性作物の開発 ― 植‐
物の抗酸イ
ヒ防御‐,,

山 口大学研究推進体公開シンポジウム「植物の潜在機能の開拓と新￨た な食料生産技術への応用」 (山 口,2005‐)