KOD One®

PCR Master Mix
PCR Master Mix ‒Blue-

実施例集

Contents
製品の概要および特長
基本反応条件……………………………………………………………………… p2………………………………………………………………………………… p3

実施例：基礎データ
実施例 1

高速PCRによる200bp〜10kbのターゲットの増幅 …………………… p4

実施例 2

高速PCRによる17.5〜40kbの長鎖ターゲットの増幅 ………………… p4

実施例 3

GC含量70%以上の領域を含むターゲットの増幅 ……………………… p5

実施例 4

イノシンを含むプライマーを用いた増幅 ………………………………… p5

実施例 5

プラスミドDNA、cDNAをテンプレートとした検出感度の比較 …… p6

実施例 6

逆転写反応液の持ち込み可能量の確認 …………………………………… p6

実施例：クルードサンプルからの増幅
実施例 7

マウステールライセートからの増幅 ……………………………………… p7

実施例 8

植物ライセートからの増幅 ………………………………………………… p7

実施例 9

血液のダイレクトPCR ……………………………………………………… p8

実施例10 フミン酸耐性の確認 ………………………………………………………… p8
実施例11 糸状菌・酵母のダイレクトPCR …………………………………………… p9
実施例12 酵母の遺伝子破壊の確認 ………………………………………………… p10
実施例13 A. fumigatus flbC 欠損株のPCRジェノタイピング ………………… p11
実施例：難配列の増幅実施例14 高GC配列mouse c-Maf cDNA全長配列の増幅 …………………… p12
実施例：PCRによる組み換え実施例15 遺伝子の発現ベクター間の移し替え …………………………………… p13
実施例：PCRによる変異導入
実施例16 相補的なプライマーを用いる変異導入 ………………………………… p14
実施例17 哺乳動物細胞用発現ベクターにクローニングされた遺伝子配列への3塩基変異導入 ………………………………………… p15

保存温度：−20℃＊＊（Dye-free 2×PCR Master Mix）

（Dye-containing 2×PCR Master Mix）

KOD One® PCR Master Mix

Code No.

KOD One® PCR Master Mix -Blue-KMM-101

KMM-101X5

KMM-101X10

KMM-201

KMM-201X5

KMM-201X10

包装

1mL×5本＊（1mL×5本）×5（1mL×5本）×10

1mL×5本＊（1mL×5本）×5（1mL×5本）×10

価

格¥35,000¥140,000¥260,000¥35,000¥140,000¥260,000＊50μL反応系の場合、200回使用できます。
＊＊1ヶ月以内であれば、2〜8℃で冷蔵保存することが可能です。

1

製品の概要および特長
高い正確性・増幅効率をもつ改変型KOD DNA Polymerase（UKOD）に、改良型伸長アクセラレーターを添加することで、高い正確性を維持したまま、高速 PCR を実現しています。
本製品は2×Master Mixで、テンプレート・プライマーを混合するだけでご使用になれます。
また、Loading Dye入りもご用意しております。
従来のPCRをより簡便に、短時間で実施可能です。
Dye-containing 2×PCR Master Mix
KOD One® PCR Master Mix -Blue-

Dye-free 2×PCR Master Mix
KOD One® PCR Master Mix

伸長速度は最速1sec./kbを実現！

PCR時間
（分）

200

Applied Biosystems 9700の場合

150
100
30sec./kbの試薬

0

KOD One®PCR Master Mix
KOD One®PCR Master Mix -Blue-

3kb

増幅長

5kb

10kb

伸長時間

〜1kb
1〜10kb
10kb〜

1sec.
5sec./kb
10sec./kb※ヒトゲノムDNAをテンプレートとして40kbの増幅を確認しています。

50

1kb

増幅長

KODシリーズ最高レベルの正確性！
KOD One®PCR Master Mix
KOD One®PCR Master Mix -BlueKOD -Plus- Neo
A社高速・高正確PCR Master Mix
A社Long PCR酵素
Taq DNA polymerase
0

25

50

75

100

125

150

Mutation Frequency（10−5）100,000塩基あたりのエラー率

クルードサンプルも精製なしで効率よく増幅！

イノシン（dI）・ウラシル（dU）を含むプライマー・テンプレートに対応！

2

こちらからサンプルを請求できます→基本反応条件
１）反応液の調製
反応液を調製する前に試薬を完全に融解し、十分に攪拌してからご使用ください。またすべての試薬を混合後、反応液をボルテックス等で十分に攪拌してサーマルサイクラ―にセットしてください。
試 薬

容量（μL）

終濃度

滅菌蒸留水
KOD One® PCR Master Mix（2×）
Primer（10μM each）
Template＊2

X
25
1.5
Y

1×
0.3μM＊1 each

Total Volume

50＊1：プライマー濃度は、0.3μM（終濃度）を推奨しますが、10kb以上での長鎖を増幅する場合、プライマー濃度を0.15μM（終濃度）に下げることで増幅量が向上することがあります。また検出感度が悪い場合は、プライマー濃度を0.5μMや1.0μM（終濃度）に上げることで検出感度が改善する場合があります。
＊2：テンプレートの添加量は以下を参照してください。

①精製されたテンプレート、cDNAをご使用の場合（PCR反応液：50μL）
テンプレート例
ゲノムDNA
プラスミドDNA
cDNA
λDNA

添加可能範囲真核生物由来DNA
原核生物由来DNA

標準添加量

1〜200ng
0.1〜200ng
1pg〜50ng
1〜750ng（RNA相当量）
10pg〜10ng

50ng
10ng
10ng
50ng（RNA相当量）
1ng②生体組織サンプルなど（PCR反応液：50μL）
サンプルの調製方法は、取扱説明書および本実施例をご確認ください。
テンプレート例

標準添加量

大腸菌
酵母
糸状菌
培養細胞
血液（EDTA採血管・クエン酸採血管）
爪

チップに付いた少量
チップに付いた少量
チップに付いた少量
101〜105cells
1〜2μL
米粒1/3程度

テンプレート例

標準添加量

髪
植物葉
精米
マウステール
植物組織ライセート＊
動物組織ライセート＊

1〜2cm
2mm角
米粒1/5程度
1mm程度
0.5〜2μL
0.5〜2μL＊動植物ライセートの調製方法は、実施例7、8をご確認ください。

２）サイクル条件
伸長時間は、ターゲット鎖長に応じて以下のように設定してください。

3 ステップサイクル
Denaturation
Annealing
Extension

98℃,（Tm-5）℃,
68℃,

10sec.
5sec.
1〜10sec./kb

25〜45cycles

1kb以下： 1sec.
1〜10kb： 5sec./kb
10kb〜： 10sec./kb

PCR機器によって1sec.の制御ができない場合があります。増幅量が少ない場合は、5sec.に設定してください。
ターゲットのコピー数が少ない場合やクルードサンプルからの増幅の場合などで増幅量が少ない場合は、伸長時間を10〜30sec./kbに伸ばすことで改善する場合があります。
エキストラバンドが認められる場合は、取扱説明書記載の2ステップ、ステップダウンサイ
クルをお試しください。

3◆取扱説明書はこちらからダウンロードできます→

高速PCRによる200bp〜10kbのターゲットの増幅

1

ヒトゲノムDNAをテンプレートとして伸長時間の短い高速PCRサイクルで増幅を実施しました。
その結果、本製品では1 kb以下のターゲットは伸長時間1 sec.で、1〜10 kbのターゲットは、5 sec./ kbで明確なバンドを確認することができました。
反応液組成

Total Volume

結果［1kb以下：伸長時間1sec.］［1〜10kb：伸長時間5sec./kb］

KOD One®
PCR Master Mix
M

1 2

3

4

5

6

7

8

A社高速・高正確
PCR Master Mix

KOD One®
PCR Master Mix
9 10

M 1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5 6 750

PCRサイクル1kb以下のターゲット
98℃,
60℃,
68℃,

10sec.
5sec.
1sec.

30cycles10sec.
5sec.
5sec./kb

実施例

230cycles4： RAD51D（4kb）
5： KRAS（5kb）
6： BRCA1（7kb）
7： DDB2（10kb）

難配列の増幅

98℃,
60℃,
68℃,

M： 1kb DNA Ladder
1： Chrome9（1kb）
2： MSH6（2kb）
3： FANCE（3kb）

実施例

1〜10kbのターゲット

M： 100bp DNA Ladder 6： ERCC4（550bp）
1： DDB2（200bp）
7： HRAS（600bp）
2： FANCG（250bp）
8： PRF1（700bp）
3： HBg（300bp）
9： BRCA（800bp）
4： CDH1（400bp）
10： CDK4（1,000bp）
5： Chrome9（500bp）

実施例 クルードサンプルからの増幅

（μL）
滅菌蒸留水
21
KOD One® PCR Master Mix
25
10pmol /μL Primer F
1.5
10pmol /μL Primer R
1.5
10ng/μL ヒトゲノムDNA
1

基礎データ

実施例

実施例

【実施例】基礎データ

高速PCRによる17.5〜40kbの長鎖ターゲットの増幅

ヒトゲノムDNAをテンプレートとして長鎖ターゲットの増幅を行いました。KOD One® PCR Master Mixを用いた
場合、17.5〜40kbまで増幅が確認できました。

Total Volume

20

PCRサイクル（μL）
Lane 4-8
3.8
10
0.6
0.6
5

98℃,
60℃,
68℃,

10sec.
5sec.
10sec./kb

ＰＣＲによる組み換え（μL）
Lane 1-3
滅菌蒸留水
7.8
KOD One® PCR Master Mix
1010pmol /μL Primer F
0.6
10pmol /μL Primer R
0.6
10ng/μL ヒトゲノムDNA
1

実施例

反応液組成

30cycles※他社PCR酵素は、メーカー推奨の条件にて実施しています。

20

結

プライマー配列M

KOD One®
KOD One®
PCR Master Mix PCR Master Mix -Blue-

他社PCR酵素

1

5

2

3

4

M

1

2

3

4

M

6

7 8

M

ターゲット 32kb Hbg
Forward Primer ：AGACTTCACATGCTGCTCTGTGCATCCGAGTG
Reverse Primer ：ACATGATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGGACTCAGA
ターゲット 40kb Hbg
Forward Primer ：GTTCTCCTCTGCATATCTCCCCACCGCATCTCTTT
Reverse Primer ：CCTTCAGTGCCCATGATGTAGGAAAGTGTGGCATA

4

M：λ/HindⅢ
KOD One ® PCR Master Mix
1： 17.5kb
2： 24kb
3： 32kb
4： 40kb

他社PCR酵素（17.5kb）
5： A社 高速・高正確PCR Master Mix
6： D社 高正確PCR酵素
7： B 社 高正確PCR酵素
8： C 社 高正確PCR酵素

ＰＣＲによる変異導入

ターゲット 24kb tPA
Forward Primer ：CCTTCACTGTCTGCCTAACTCCTTCGTGTGTTCC
Reverse Primer ：TGTCTCCAGCACACAGCATGTTGTCGGTGAC

実施例

ターゲット 17.5kb Hbg
Forward Primer ：TGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTC
Reverse Primer ：ACATGATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGGACTCAGA

果

実施例

【実施例】基礎データ

基礎データ

実施例

3

GC含量70%以上の領域を含むターゲットの増幅

GC含量が多い領域を含む、TGFb、ACE、CASP3、ATCB、BRAFをターゲットとして増幅を行いました。KOD One®
PCR Master Mixでは、いずれのターゲットにおいても増幅が見られましたが、A社 Long PCR酵素では増幅は確認できませんでした。
反応液組成

実施例 クルードサンプルからの増幅

滅菌蒸留水
KOD One® PCR Master Mix
10pmol /μL Primer F
10pmol /μL Primer R
10ng/μL ヒトゲノムDNA

（μL）
21
25
1.5
1.5
1

Total Volume

50

PCRサイクル
98℃, 10sec.
60℃,
5sec.
68℃, 50sec.
（5sec./kb）

30cycles※A社Long PCR酵素は、メーカー推奨の条件にて実施しています。

プライマー配列TGFb
Forward Primer ：TCCACCTTGGTCAGTCTCCTATAAC
Reverse Primer ：GCTGTGTGTACTCTGCTTGAACTTG

実施例

ACE
Forward Primer ：CCTCAGGCTCTTCTCCTCTCTACTC
Reverse Primer ：GGTCATATTCCTCCACAAACTTGC結

KOD One®
PCR Master Mix

難配列の増幅CASP3Forward Primer ：CTGGCTTTGTCTCCCTTCTAGGTAC
Reverse Primer ：TGACCTTCTCCACACTCTAGAAACC
ATCB
Forward Primer ：AACACCACACTCTACCTCTCAAGC
Reverse Primer ：TTTAATTACAGGTGGCTCATACGTG

果

M

1

2

3

4

A社Long PCR試薬

5

M

1

2

3

実施例

ＰＣＲによる組み換え

4

5

10kb
M： 1kb DNA Ladder
1： TGFb
2： ACE
3： CASP3
4： ATCB
5： BRAF

BRAF
Forward Primer ：CCTTTACCTGAGAGTAAGCATCAGC
Reverse Primer ：AACAAAACTGGAACGATACTCCTTG

実施例

4

イノシンを含むプライマーを用いた増幅

イノシンを含む縮重プライマーを用いて、従来品との増幅を比較しました。その結果、KOD One® PCR Master Mix（色素なし、入り）でのみ明確なバンドを確認することができました。
反応液組成

実施例

滅菌蒸留水
KOD One® PCR Master Mix/-Blue100pmol /μL Primer F
100pmol /μL Primer R
50ng/μL E. coli ゲノムDNA

（μL）
17
25
1.5＊
1.5＊
5

Total Volume

50

プライマー配列
Forward Primer ：ATGGTICARATHCCICARAAY
Reverse Primer ：RTGIGCYTGRTCCCARTTYTC

結

果
M

1

2

3

ＰＣＲによる変異導入＊縮重プライマーを使用する場合、縮重度が高くなるとプライマー
1種類あたりのモル濃度が少なくなります。縮重度に合わせてプ
ライマー濃度を上げることで感度を向上させることができます。
2.8kb

PCRサイクル
98℃, 10sec.
60℃,
5sec.
68℃, 15sec.
（5sec./kb）

M： 1kb DNA Ladder
1： KOD One ® PCR Master Mix
2： KOD One ® PCR Master Mix -Blue3： KOD -Plus- Neo（従来品）

30cycles55

プラスミドDNA、cDNAをテンプレートとした検出感度の比較

プラスミドDNA、cDNAを用いて、約3.5kbのターゲットを伸長時間5sec./kbで増幅し、検出感度を比較しました。反
応はそれぞれのPCR酵素の推奨条件に従って実施しました。
その結果、 KOD One® PCR Master Mixは他社試薬と比較して、より低コピーの領域まで増幅することができました。
反応液組成

結

Total Volume

果［プラスミドDNA］［cDNA］

Template：プラスミドDNA
Target：Polymerase遺伝子

Template：HeLa細胞 total RNA由来のcDNA
Target：TFR

KOD One®
PCR Master Mix
M

50

1

2

3

4

M

1

2

3

4

PCRサイクル
98℃, 10sec.
60℃,
5sec.
68℃, 18sec.
（5sec./kb）

1

2

3

4

M

1

2

3

4

3.5kb

30cycles
M： 1kb DNA Ladder
1： 25pg
2： 6.3pg
3： 1.6pg
4： 0.4pg

M： 1kb DNA Ladder
1： 25ng（RNA相当量）
2： 5ng（RNA相当量）
3： 1ng（RNA相当量）
4： 0.7ng（RNA相当量）

実施例

難配列の増幅

6M

A社高速・高正確
PCR Master Mix

3.5kb※A社高速・高正確PCR Master Mixは、メーカー推奨条件に従って実施して
います。

実施例

KOD One®
PCR Master Mix

A社高速・高正確
PCR Master Mix

逆転写反応液の持ち込み可能量の確認

Total Volume

結果
KOD One®
KOD One®
PCR Master Mix PCR Master Mix -Blue-

M

1

2

3

4

M 1

2

3

4

KOD -Plus- Neo

M 1

2

3

4

KOD FX Neo
M 1

2

3

4

3.5kb

50

PCRサイクル
30cycles

A社高速・高正確
PCR Master Mix
M

1

2

3

4

A社高正確・高効率
PCR酵素
M 1

2

3

4

B社高正確
PCR酵素
M 1

2

3

C社高正確
PCR酵素
4

M 1

2

3

プライマー配列
Forward Primer ：CCACCATCTCGGTCATCAGGATTGCCT
Reverse Primer ：TACTCCTTAACGAGAAGACATCTCAAGAC

4

3.5kb

M： 1kb DNA Ladder
1： 125ng（RNA相当量）
2： 250ng（RNA相当量）
3： 500ng（RNA相当量）
4： 1,000ng（RNA相当量）

6

Template：HeLa細胞 total RNA由来のcDNA
Target：TFR

ＰＣＲによる変異導入※KOD One® PCR Master Mix以外のPCR酵素は、それぞれの推奨条件に従って実施しています。

実施例

98℃, 10sec.
60℃,
5sec.
68℃, 18sec.
（5sec./kb）

ＰＣＲによる組み換え

（μL）
滅菌蒸留水
17
KOD One® PCR Master Mix/-Blue- 25
10pmol /μL Primer F
1.5
10pmol /μL Primer R
1.5
cDNA
5

実施例

逆転写反応液（cDNA）に含まれるRNAはPCRに対して阻害的に働くため、大量のcDNAの添加は反応阻害につながります。そこで、cDNAの持ち込み可能量を確認するためcDNAの添加量をふり、TFR遺伝子の検出を行いました。
その結果、KOD One® PCR Master MixはRNAによる阻害を受けにくく、従来品や他社品では増幅困難な多量のcDNAを添加した条件においても良好な増幅を行うことができました。
反応液組成

実施例 クルードサンプルからの増幅

（μL）
滅菌蒸留水
21
KOD One® PCR Master Mix 25
10pmol /μL Primer F
1.5
10pmol /μL Primer R
1.5
Template（プラスミド DNA、cDNA） 1

基礎データ

実施例

実施例

【実施例】基礎データ

実施例【実施例】クルードサンプルからの増幅

基礎データ

実施例

7

マウステールライセートからの増幅

アルカリ溶解法にて調製したマウステールライセートを用いて、マウスThy-1遺伝子の増幅を行いました。反応はそれぞれのPCR酵素の推奨条件に従って5sec./kbの伸長時間で実施しました。その結果、KOD One® PCR Master Mixのみ明確なバンドを確認することができました。
■アルカリ溶解法

反応液組成

実施例 クルードサンプルからの増幅

マウス
テール（約3mm）

マイクロ
チューブ
に移す

1

2

50mM NaOH 180μL添加
Vortexにて良く攪拌

3Vortexにて良く攪拌

12,000rpm, 5min.［optional］ 4

実施例

難配列の増幅8

Total Volume

結

50

果
KOD One®
PCR Master Mix

M

98℃, 10sec.
60℃,
5sec.
68℃, 13sec.
（5sec./kb）

1M Tris-HCl（pH8.0） 20μL添加

実施例

Forward Primer：
CCACAGAATCCAAGTCGGAACTCTTG
Reverse Primer：
GTAGCAGTGGTGGTATTATACATGGTG

PCRサイクル

95℃・10min.

50μL反応系に上清1〜8μL添加（マウステールは完全には溶解しません）

プライマー配列

（μL）
滅菌蒸留水
Y
KOD One® PCR Master Mix 25
10pmol /μL Primer F
1.5
10pmol /μL Primer R
1.5
ライセート
X

1

2

3

4

A社高速・高正確
PCR Master Mix
M

1

2

3

4

30cycles
2.6kb※A社高速・高正確PCR Master Mixは、
その推奨条件に従って実施しています。

5

M： 1kb DNA Ladder
1： ライセート1μL
2： ライセート2μL

3： ライセート4μL
4： ライセート8μL

植物ライセートからの増幅実施例

ワンステップ法にて調製したタバコ葉ライセートを用いて、KOD One® PCR Master Mix（色素なし、入り）および従来品でrbcL遺伝子の増幅比較を行いました。KOD One® PCR Master Mixでは良好な増幅が得られました。KOD FX Neo
では、同様の増幅が見られましたが、KOD -Plus- Neoは、ライセート1μLの場合は増幅が見られず、植物成分による阻害がかかったものと思われます。
■ワンステップ法

反応液組成

ＰＣＲによる組み換え葉（3mm角）

マイクロ
チューブ
に移す

1

2

Buﬀer ABuﬀer A:
100μL添加 100mM Tris-HCl（pH9.5）
Vortexにて良く攪拌

1M KCl10mM EDTA

3

Total Volume

98℃, 10sec.
60℃,
5sec.
68℃,
7sec.
（5sec./kb）

30cycles※従来品PCR酵素は、それぞれの推奨の条件にて実施しています。

20

プライマー配列
Forward Primer ： ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC
Reverse Primer ：AAGCAGCAGCTAGTTCCGGGCTCCA

95℃・10min.

実施例

Vortexにて良く攪拌

PCRサイクル

（μL）
滅菌蒸留水
Y
KOD One® PCR Master Mix/-Blue- 10
10pmol /μL Primer F
0.6
10pmol /μL Primer R
0.6
ライセート
X

4

ＰＣＲによる変異導入

結果

KOD One®
KOD One®
PCR Master Mix PCR Master Mix -Blue- KOD FX Neo

20μL反応系に0.5〜2μL添加

5

M 1

2

3

M 1

2

3

M 1

2

3

KOD -Plus- Neo
M 1

2

3

【参考文献】
Bio Techniques, 19: 394（1995）

1.3kb

M： 1kb DNA Ladder
1： ライセート0.25μL
2： ライセート0.5μL
3： ライセート1.0μL

7

血液のダイレクトPCR

9

血液を精製せずにそのまま用いて、ヒトβ-globin遺伝子の増幅を行いました。反応はそれぞれのPCR酵素の推奨条件に従って5sec./kbの伸長時間で実施しました。その結果、KOD One® PCR Master Mixのみ明確なバンドを確認することができました。
反応液組成

Total Volume

50

結PCRサイクル
98℃, 10sec.
60℃,
5sec.
68℃, 18sec.
（5sec./kb）

果
A社高速・高正確
KOD One®
PCR Master Mix PCR Master Mix

30cycles
M

1

2

3

4

1

2

3

4

※A社高速・高正確PCR Master Mixは、
その推奨条件に従って実施しています。

3.6kb

プライマー配列
Forward Primer ：GGTGTTCCCTTGATGTAGCACA
Reverse Primer ：ACATGTATTTGCATGGAAAACAACTC

フミン酸耐性の確認

難配列の増幅10

3： 血液4μL
4： 血液8μL

実施例

実施例

M： 1kb DNA Ladder
1： 血液1μL
2： 血液2μL

フミン酸（humic acid）とは、腐植土や土壌などに存在する赤褐色または黒褐色の有機物であり、PCRを阻害することが知られています。通常行われるDNAの精製ではこのフミン酸は除くことはできません。そのため、環境・生態系サンプ
ルを鋳型としたPCRはとても難しいとされています。そこでKOD One® PCR Master Mixおよび各種PCR酵素を用い、フミン酸含有下でヒトゲノムからHBg遺伝子の増幅確認を行いました。
KOD One® PCR Master Mixを用いた場合は、フミン酸の量にかかわらず増幅が見られ、高速PCR条件下においても高いフミン酸耐性を示す結果となりました。

Total Volume

結20

PCRサイクル
98℃, 10sec.
60℃,
5sec.
68℃,
7sec.
（5sec./kb）

プライマー配列
30cyclesForward Primer ：TTAGGCCTTAGCGGGCTTAGAC
Reverse Primer：
CCAGGATTTTTGATGGGACACG

ＰＣＲによる組み換え

滅菌蒸留水
KOD One® PCR Master Mix
10pmol /μL Primer F
10pmol /μL Primer R
OD280＝1 フミン酸
4ng /μL ヒトゲノム DNA

（μL）
Y
10
0.6
0.6
X
1

実施例

反応液組成

※KOD One ® PCR Master Mix以外のPCR酵素は、それぞれ推奨の条件にて実施しています。

果
KOD One®
PCR Master Mix

KOD FX Neo

A社高速・高正確
PCR Master Mix

KOD -Plus- Neo

A社高正確・高効率
PCR酵素

A社高成功率
PCR酵素

実施例

M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 78

M： 1kb DNA Ladder
5：4μL
6：5μL
7：6μL
8：7μL

8

ＰＣＲによる変異導入

1.3kb

フミン酸添加量（X） 1：0μL
2：1μL
3：2μL
4：3μL

実施例 クルードサンプルからの増幅

（μL）
滅菌蒸留水
Y
KOD One® PCR Master Mix 25
10pmol /μL Primer F
1.5
10pmol /μL Primer R
1.5
血液
X

基礎データ

実施例

実施例

【実施例】クルードサンプルからの増幅実施例【実施例】クルードサンプルからの増幅

基礎データ

実施例

糸状菌・酵母のダイレクトPCR

11
実験の目的

糸状菌・酵母の菌体から抽出、精製なしでDNAを増幅する。

実験方法
サンプルの種類
実施例 クルードサンプルからの増幅

Aspergillus oryzae および Saccharomyces cerevisiae 菌体
サンプルの調製方法
糸状菌・酵母を生育させたプレートから、爪楊枝で菌体を取り、以下をテンプレートとして用いました。
1. 50μLの滅菌水に懸濁したうちの5μL
2. 20μLの滅菌水に懸濁したうちの5μL
3. そのままターゲット遺伝子名と長さ
18S rRNA内 ITS1領域

実施例

Aspergillus oryzae : 約180bp
Saccharomyces cerevisiae : 約450bp

難配列の増幅

プライマー配列

回収したAspergillus oryzae の菌体

ITS1 Forward Primer ：GTAACAAGGTYTCCGT
ITS1 Reverse Primer ： CGTTCTTCATCGATG※ターゲット領域が短いため、この実験では推奨の長さ（22〜35mer）よりも短いPrimerを用いました。

反応液組成

PCRサイクル

実施例

（μL）
滅菌蒸留水
3.8 または 8.8
KOD One® PCR Master Mix
10
10μM Primer F
0.6
10μM Primer R
0.6
菌体懸濁液または菌体
5 または 0

ＰＣＲによる組み換え

Total Volume

98℃,
45℃,
68℃,

10sec.
5sec.
10sec.

30cycles20

結果・考察
Saccharomyces cerevisiaeでは、サンプル調製法による増幅量の差はそれほど見られませんでしたが、Aspergillus
oryzaeでは、菌体をPCR反応液に直接懸濁した方がよく増幅しました。また、KOD One® PCR Master MixとKOD One®
PCR Master Mix -Blue-では、結果に差はありませんでした。
KOD One®
PCR Master Mix
M 1

2

3

4

5

6

KOD One®
PCR Master Mix -BlueM 1

2

3

4

5

M： 100bp DNA Ladder

Aspergillus oryzae

6

実施例

1： 菌体を50μL滅菌水に懸濁 5μL使用
2： 菌体を20μL滅菌水に懸濁 5μL使用
3： 菌体をdirect

Saccharomyces cerevisiae

ＰＣＲによる変異導入

4： 菌体を50μL滅菌水に懸濁 5μL使用
5： 菌体を20μL滅菌水に懸濁 5μL使用
6： 菌体をdirect

450bp
180bp

※菌体からのダイレクトPCRは、菌体量が多いと阻害がかかり増幅がうまくいかない場合がありますが、一方でカビなどは細胞が固いため、ある程度の量を入れないと増幅できないこともあります。あらかじめ、菌体量の検討をお勧めします。

菌体量を検討してうまく増幅できない場合は、伸長時間を10sec./kbに設定することで増幅できることがあります。
また、KOD One® PCR Master Mixは、推奨のPCRサイクルに初期変性のステップがないため、サンプル調製を行う際に、滅菌水に懸濁後、95℃, 5min.程度の熱処理を行うことで、菌種よってはPCR効率が改善される場合があります。

9

12

酵母の遺伝子破壊の確認
データご提供 大阪大学大学院 歯学研究科 口腔科学フロンティアセンター 先端口腔生物学教室

荒木 保弘 先生

実験の目的

基礎データ

実施例

実施例

【実施例】クルードサンプルからの増幅

染色体上の標的遺伝子をマーカー遺伝子により破壊できたことを確認する。

実験方法
サンプルの種類

サンプルの調製方法
イエローチップの先にマッチの頭ほどのコロニーをかき取り、0.02M NaOH 50µLへPCRチューブ内で懸濁した。
酵母懸濁液をPCRで95度10分熱処理した。
ターゲット遺伝子名と長さ
PIB2/ 2,345bp pib2::natNT2/ 1,783bp
GTR1/ 1,128bp gtr1::kanMX4/ 1,679bp

実施例

プライマー配列

難配列の増幅PIB2Forward Primer ：CGGATGCTATGTCACGTTG
Reverse Primer ： TCTTTACTGCTGTTGTGTCC
GTR1Forward Primer ：ACCCTAAATTGTGATTATGG
Reverse Primer ： TTCTTCCTCTTATGTTTCTC

反応液組成

98℃,
53℃,
68℃,

10sec.
5sec.
10sec.

35cycles10

ＰＣＲによる組み換え

Total Volume

PCRサイクル

実施例

（μL）
滅菌蒸留水
3.9
KOD One® PCR Master Mix -Blue5
10μM Primer F
0.3
10μM Primer R
0.3
酵母懸濁液
0.5

実施例 クルードサンプルからの増幅

酵母から抽出したゲノムDNA

PCR反応液の半量(5μL)を用いて、電気泳動を行った。

サイクラー機種
Applied Biosystems GeneAmp® PCR System 9700

結果・考察

実施例

・PCRの時間が大幅に短縮された。
・目的遺伝子の増幅効率が改善された。
・All in oneなのでPCR反応液の調製が容易になった。

普段から大量のPCRをやる機会が多く、負担となっていました。しかし、KOD One®を使うようになってから、この負担が大きく軽減しました。以前は御社のKOD製品を目的別に数種類使っていましたが、反応速度、正確性を鑑みて現在はKOD One®のみを用いており、経済的な観点からも助かっています。

10

ＰＣＲによる変異導入

感想・ご意見等

実施例【実施例】クルードサンプルからの増幅

基礎データ

実施例

13

A. fumigatus flbC 欠損株のPCRジェノタイピング
データご提供 東北医科薬科大学 薬学科 感染生体防御学教室

田中 大 様実験の目的
PCR法を用いてA. fumigatus flbC 遺伝子組換体を選別する。

実験方法◉KOD One® PCR Master Mix

サンプルの種類
実施例 クルードサンプルからの増幅

Aspergillus fumigatus 胞子実施例

プライマー配列

反応液組成

サンプルの調製方法
極微量（チップの先に付いたか付かないくらい）のAspergillus
fumigatus 胞子をTE buﬀer 100μLに懸濁し、電子レンジ処理（500W、2分）して上清を得た。

滅菌蒸留水
KOD One® PCR Master Mix
10μM Forward / Reverse Primer
電子レンジ処理 胞子懸濁液
Total Volume

（μL）
8.8
10
各 0.1
1
20

PCRサイクルターゲット遺伝子名と長さ

98℃,
68℃,

flbC（Afu2g13770） 1,500bp
ptrA
2,600bp

10sec.
20sec.

40cycles◉KOD FX Neo
反応液組成

難配列の増幅Forward Primer ： TCTCATCTGCTCCCTTCATCT
Reverse Primer ：ATTGTACAAGGGACGAGAGCC

滅菌蒸留水
2×PCR Buﬀer
10μM Forward / Reverse Primer
KOD FX Neo
電子レンジ処理 胞子懸濁液

サイクラー機種
T100 サーマルサイクラー（Bio-Rad）Total Volume

（μL）
7.4
10
各 0.1
0.4
1
20

PCRサイクル
98℃,
68℃,

10sec.
240sec.

40cycles

実施例

結果・考察

ＰＣＲによる組み換え実施例

ＰＣＲによる変異導入

Aspergillus fumigatus A1159株を親株とし、flbC 遺伝子のコード領域上流・下流にそれぞれ相同な配列、及びピリチ
アミン耐性遺伝子ptrAの配列を含むDNA断片を挿入した組換体（flbC 遺伝子欠損株 #1〜3）を取得した。
これら組換体および親株の胞子を電子レンジ処理して得られた溶液を
KOD One®
KOD FX Neo
鋳型とし、KOD One®とKOD FX Neoをそれぞれ用いてコロニーPCRを組換体組換体行った。その後、アガロース電気泳動法にて遺伝子組換えの成否および両野生株 ＃1 ＃2 ＃3
野生株 ＃1 ＃2 ＃3
酵素の性能比較を行った。
その結果、いずれの酵素を用いた場合でも、遺伝子組換体・親株のどちらでも問題なくPCR生成物が得られた。すなわち、どちらの酵素も、コロ
ニーPCR法による遺伝子組換えの成否観察に用いることができた。一方、
2,600bp
PCRに要した時間は、KOD One®はおよそ55分、KOD FX Neoは200分 1,500bpであった。
これらのことから、KOD One®はクルードサンプルに強い酵素でありな
がら、コロニーPCRに要する時間を短縮できる「使える酵素」であることが分かった。
マーカー：1kb DNA Ladder

感想・ご意見等

同僚に「カビ胞子のコロニーPCRにはKOD FX Neoを使うといいよ」と教わって以来、遺伝子組換えカビのジェノタイピ
ングにはKOD FX Neoばかり使ってきました。しかしこのKOD One®は、伸長に要する時間が大幅に短縮されているにも関わらず、KOD FX Neo並みにクルードサンプルに強いということで驚かされました。今後もKOD One®を使い続けると
思います。

11

14

高GC配列mouse c-Maf cDNA全長配列の増幅
データご提供 福島県立医科大学 医学部 放射性同位元素研究施設

関亦 正幸 先生

実験の目的

基礎データ

実施例

実施例

【実施例】難配列の増幅

動物細胞発現ベクター構築のための mouse c-Maf cDNA全長配列を増幅する。

実験方法
サンプルの種類

サンプルの調製方法
ISOGEN（ニッポンジーン）によりtotal RNAを調製し、その後PrimeScript RT Master mix（Perfect Real Time）（タカ
ラバイオ）にてcDNA合成したものを鋳型に用いた。
ターゲット遺伝子名と長さ
mouse c-Maf cDNA / 1.2 kb
プライマー配列

実施例

Forward Primer ： GGGATCCGATGGCTTCAGAACTGGCAA
長さ：27mer
Tm：65.1℃
Reverse Primer ：GGTCGACCATGAAAAATTCGGGAGAGG
長さ：27mer
Tm：63.5℃

難配列の増幅◉KOD One® PCR Master Mix -Blue-、A社高速・高正確 PCR Master Mix 共通
反応液組成
各 PCR Master Mix
10μM Primer F
10μM Primer R
cDNA
Total Volume

（μL）
3
1
1
1
6

PCRサイクル
94℃,
98℃,
55℃,
68℃,

2min.
10sec.
5sec.
15sec.

実施例 クルードサンプルからの増幅

マウスT細胞から抽出したtotal RNA

30cycles※A社 高速・高正確 PCR Master Mixの条件でPCRを行っています。

実施例

サイクラー機種

結果・考察
KOD One はGC含量の多いc-Maf cDNAの1.2 kbを増幅することができた。A社高速・高正確PCR Master Mixは増幅できるがGC含量の多い領域を欠失した産物ができる。

MK

1

2

®

感想・ご意見等

mouse c-Maf cDNA
（1.2kb）

ＰＣＲによる変異導入

12

実施例

エキストラバンド
増幅配列はGC含量が70%と高く、局所的に94%を超えてGCが連続す
る配列が存在している。そのため、通常のTaqポリメラーゼでは増幅できないか、できたとしても高連続GC配列を欠失した短鎖として増幅されてしまう。DMSOを添加することでPCR反応が改善されることはあるが、常MK： 100bp DNA Ladderに安定した結果が得られるかは不明である。
1： KOD One ® PCR Master Mix -Blue比較のA社高速・高正確PCR Master Mixも、その中においては増幅能
2： A社高速・高正確PCR Master Mix
力の高い正確性の高い酵素であるが、図（レーン2）にあるように高連続
GC配列を欠失した短鎖として増幅されている。これに対して、KOD One® PCR Master Mix -Blue-（レーン1）では、全長の1.2kbの増幅がメインのバンドとして検出されている。このメインバンドをクローニングし、シークエンスしたところ
塩基配列が正しいことが確認できた。
このことから、KOD One® PCR Master Mix -Blue-は、高連続GC配列の正確な増幅にも適していることが判明した。

ＰＣＲによる組み換え

Bioer Technology LifeECO ver 2.0

実施例 基礎データ【実施例】PCRによる組み換え実施例

遺伝子の発現ベクター間の移し替え

15

データご提供 慶應義塾大学 理工学部 生命分子工学研究室

藤原 慶 様

実験の目的別々にクローン化した遺伝子を、別の発現ベクターに移し替える。

実験方法
実施例 クルードサンプルからの増幅

サンプルの種類

サンプルの調製方法

プラスミドDNA

キットで精製したDNA

iVEC法

ターゲット遺伝子名と長さ
ベクターA（pET15由来）
大腸菌遺伝子A-H

6,050bp1,000〜2,000bp

プライマー配列

実施例

ベクター用 Forward Primer ：長さ : 20nt
Reverse Primer ：長さ : 18nt

Tm : 55.4℃
Tm : 56.9℃

遺伝子用

Tm : 58.8℃
Tm : 53.8℃

Forward Primer ：長さ : 23nt
Reverse Primer ：長さ : 21nt

PCR後、反応液5μL に対しDpnⅠ（NEB）を0.1μL添加↓
37℃ 40分（この間に電気泳動）
1 M 2 3 4 5 6 7 8

9

難配列の増幅

相同領域
Forward側 ：81nt
Reverse側 ：117nt※今回の実験では、移し替えるplasmid
自体に相同配列があるため、相同領域にプライマー配列が含まれます。

反応液組成

実施例

滅菌蒸留水
KOD One® PCR Master Mix
3μM Primer F
3μM Primer R
50ng/μL Template
Total Volume1：vector（約6kbp）
M：1kbpラダーマーカー
2〜9： insert（8種類の大腸菌
遺伝子、1kbp〜2kbp）
1μLを泳動

（μL）
1.4
2.5
0.5
0.5
0.1

ＰＣＲによる組み換え↓
Vector1.5μL、遺伝子1μLを混合し、12μLの i VEC3株のコ
ンピテントセルと混合（資源研より供与された株を凍結保存プロトコールによりコ
ンピテントセル化したものを使用）↓
On ice 20分↓
LB培地400μLを添加し、37℃で60分静置↓
遠心（12,000xg 30秒）により菌体を回収し、上清を捨てる↓
10μLの10mM Tris-HCl（pH8.0）で懸濁し、即座にプレー
トへまく↓
翌日、生えたコロニーに対するコロニーPCRもKOD One®で行った（1サンプルあたり合計3μLの系）

5.0

PCRサイクル
98℃,
96℃,
55℃,
72℃,

1min.
10sec.
10sec.
10-35sec.

25cycles

測定機器
ChemiDoc MP（Bio-Rad）

実施例

結果・考察

ＰＣＲによる変異導入

各遺伝子につき1コロニーをつついたところ、8コロニー中7コロニーが当たり。

感想・ご意見等
他社の高速PCR酵素から切り替えたところ、ベクターの増幅効率が倍以上になり、なおかつベクターPCRの失敗がほとんどなくなりました。また、iVEC3法での形質転換を活用することで、PCRからプレーティングまで2時間で終えることができるようになりました。

13

実施例

実施例

【実施例】PCRによる変異導入

基礎データ

相補的なプライマーを用いる変異導入

16
実験の目的

相補的なプライマーを用いた変異導入法による、約5kbのプラスミドへ変異導入（3塩基置換、3塩基欠損、3塩基挿入）を行う。

実験方法
サンプルの調製方法

プラスミドDNA

組換え大腸菌からミニプレップにて精製しました。

プライマー設計実施例 クルードサンプルからの増幅

サンプルの種類＊Forward : Fwd、Reverse : Rev①導入したい変異、位置を決定する。
プラスミド配列
5 -ATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGC-3
導入したい変異↓置換例 ATG→TGC
5 -ATGCATGCATGCATGCATGCATGCTGCCATGCATGCATGCATGCATGCATGC-3
欠損例 ATGを除去
5 -ATGCATGCATGCATGCATGCATGC……CATGCATGCATGCATGCATGCATGC-3
挿入例 ATGの前にAAA 5 -ATGCATGCATGCATGCATGCATGCAAAATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGC-3②Fwdプライマーの設計
変異部位を中心に5 側、3 側それぞれに12〜20bpのプラスミドにハイブリダイズする領域をつける。

12〜20bp

12〜20bp

12〜20bp

12〜20bp

12〜20bp

5 - TGCATGCATGCATGCAAAATGCATGCATGCATG -3

難配列の増幅12〜20bp

5 - TGCATGCATGCATGC……CATGCATGCATGCAT -3

実施例

プラスミド配列
5 -ATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGC-3↓
5 - TGCATGCATGCATGCTGCCATGCATGCATGCAT -3
置換用Fwd Primer
欠損用Fwd Primer
挿入用Fwd Primer③Revプライマーの設計
上記で設計したFwdプライマーと逆相補鎖のプライマーを設計する

5 - TGCATGCATGCATGC……CATGCATGCATGCAT -3
3 - ACGTACGTACGTACG……GTACGTACGTACGTA -5

欠損用Rev Primer

5 - TGCATGCATGCATGC AAAATGCATGCATGCATG -3
3 - ACGTACGTACGTACGTTT TACGTACGTACGTAC -5

挿入用Rev Primer

反応液組成

（μL）
滅菌蒸留水
21
KOD One® PCR Master Mix
25
10pmol /μL Primer F
1.5
10pmol /μL Primer R
1.5
50ng/μL プラスミドDNA
1
Total Volume

PCRサイクル
98℃, 10sec.
60℃,
5sec.
68℃, 25sec.
（5sec./kb）［変異導入サイクル後の電気泳動確認］
M

1

2

3

15cycles
5kb

ＰＣＲによる組み換え

置換用Rev Primer

実施例

5 - TGCATGCATGCATGCTGCCATGCATGCATGCAT -3
3 - ACGTACGTACGTACGACGGTACGTACGTACGTA -550
M： 1kb DNA Ladder
1： 3塩基置換
2： 3塩基欠損
3： 3塩基挿入

3塩基置換
3塩基欠損
3塩基挿入

結果・考察

変異導入率
8/8クローン
8/8クローン
7/8クローン

目的外変異数0個
0個
0個

KOD One® PCR Master Mixを使用することで、5kbのプラスミドでも伸長時間25sec.の高速サイクルで変異導入ができました。得られたコロニーのほとんどで変異導入が確認され、目的外変異（2nd-site mutation）は確認されませんでした。
KOD One® PCR Master Mixを用いることで、迅速かつ正確に変異導入が可能です。

14

ＰＣＲによる変異導入［各8クローンの変異導入率および、目的外変異数］

実施例

PCR反応液↓ ← DpnⅠ（10U/μL）2μL↓ ［Code No. DPN-101］
37℃, 1hr.
↓
JM109［Code No. DNA-900］を形質転換実施例 基礎データ【実施例】PCRによる変異導入
実施例

哺乳動物細胞用発現ベクターにクローニングされた遺伝子配列への3塩基変異導入

17

データご提供 広島大学大学院 医歯薬保健学研究院 産科婦人科教室 助教

杉本 潤 様

実験の目的
哺乳動物細胞用発現ベクターにクローニングされた遺伝子Aに対しアミノ酸置換を誘発する3塩基の変異導入を行う。

実験方法
サンプルの種類

サンプルの調製方法

反応液組成

Qiagen midi kit で抽出、精製したプラスミド
DNA
ターゲット遺伝子名と長さ遺伝子A : 1.8kb、ベクター : 7.1kb

（μL）
滅菌蒸留水
10.5
KOD One® PCR Master Mix
12.5
10μM Primer F
0.5
10μM Primer R
0.5
50pg/μLプラスミドDNA
1
Total Volume

プライマー配列

測定機器

実施例

変異導入用プライマーForward（31base）
変異導入用プライマーReverse（31base）

GeneAmp PCR system 9700

難配列の増幅実施例 クルードサンプルからの増幅

プラスミド：哺乳動物細胞用発現ベクター（約7.1kb）に遺伝子A（約1.8kb）をクローニングしたプラスミド

結果・考察
M1

1

2 M2

A社高速・高正確
PCR Master Mix使用Kit
23,130bp

PCRサイクル
98℃,
55℃,
72℃,

10sec.
15sec.
40sec.

30cycles25

KOD One®

9,416bp

2,322bp

1,500bp
500bp

PCR-product（5μL）を0.8％アガロースゲル
で電気泳動

100bp

実施例

1： A社高速・高正確Master Mix使用Kit
2： KOD One ®
M1： 100bp DNA Ladder
M2： λHin dⅢ

PCR-product 2μLを直接大腸菌DH5αに形質転換後のLBプレート像

ＰＣＲによる組み換え

感想・ご意見等
当研究室で使用している哺乳動物細胞用発現ベクターは、その大きさと特徴的な配列により、クローニングされた遺伝子配列への直接的な変異導入が困難であった。このことから、違うベクター（pGEM-Tなど）にクローニングした遺伝子配列へ変異を導入後、この変異を含むDNA断片を切り出し、哺乳動物細胞用発現ベクターに再クローニングする必要があった。
しかし、KOD One®を用いることにより直接変異を導入することが可能となり、時間、労力の短縮につながった。
また、変異の導入効率は調べた数クローン中100%であり、近傍の配列にPCRエラーは確認されなかった。

実施例

東洋紡株式会社

ライフサイエンス事業部（大阪）

ＰＣＲによる変異導入〒530-8230 大阪市北区堂島浜二丁目2番8号
TEL.06-6348-3786 FAX.06-6348-3833（E-mail）order̲lifescience@toyobo.jp

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A5876K/2019/07