インフラマソームのアダプター分子による炎症スイッチ機構の解明
Study of molecular switch mechanism of inflammasome adaptor protein（日本免疫学会推薦）

代表研究者 慶應義塾大学

原英樹

協同研究者 ミシガン大学

ガブリエル ニュネツ

Keio UniversityHideki HARA

University of Michigan

Gabriel NUNEZ

The inflammasome, an innate immune system, is a protein complex composed of intracellular receptors, the adaptor
ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD), and the proteolytic enzyme caspase-1. Activation ofinflammasome is induced after sensing of abnormal metabolites, alarmins, and microbial components by intracellularpattern-recognition receptors, resulting in the induction of the inflammatory cytokine production including IL-1β(interleukin-1β) and IL-18 and the gasdermin D-mediated pyroptosis, an inflammatory programmed cell death.
Inflammasome activation has been reported to be involved in the pathogenesis and severity of various inflammatory
diseases and autoimmune diseases such as stroke, Alzheimer's disease, atherosclerosis, diabetes, rheumatoid arthritis,
infectious diseases including COVID-19, cancers, and inflammatory bowel disease, but the molecular mechanisms
triggering inflammasome activation under diseases remains poorly understood. In this study, we investigated a regulatory
mechanism of inflammasome activation focusing on the adaptor protein ASC. As results, we found that modifications ofASC by kinases and protein-protein interaction are required for full activation of inflammasome. These results reveal a
previously unrecognized regulatory systems of inflammasome activation in macrophages.

研究目的

じて、脳や血管、関節、肺、心臓、膵臓、腸といった自然免疫機構であるインフラマソームは細胞内であらゆる臓器でインフラマソームは活性化しうるた形成されるタンパク複合体であり、細胞内受容体、め、脳梗塞やアルツハイマー病、動脈硬化、心筋梗アダプターASC (apoptosis-associated speck-like protein

塞、関節リウマチ、糖尿病、肺がん、大腸がんなど多containing a CARD)、タンパク分解酵素カスパーゼ 1様な炎症性疾患や自己免疫疾患の発症および重症化前駆体から構成される (参考論文 1)。細胞内パターに関与することが報告されている (参考論文 2)。そン認識受容体が異常代謝産物やアラーミンなどの内れに加えて、黄色ブドウ球菌などいくつかの感染症因性異物、および微生物成分などの外因性異物を感においてもインフラマソーム応答が病態を悪化させ知することでインフラマソーム複合体を形成する。

ることをわれわれのグループは世界に先駆けて報告

インフラマソーム複合体が形成されるとカスパーゼしている (参考論文 3)。インフラマソーム応答の上1 前駆体が活性型となり、基質である炎症性サイト流に位置する細胞内受容体として、NLRP3 (NLR

カイン IL-1β (interleukin-1β)前駆体や IL-18 前駆体をfamily pyrin domain-containing protein 3)や NLRP6、切断することで生物活性を有するアクティブフォー

AIM2 (absent in melanoma 2)など 7 種類の分子がこれムへと変換させる。また、カスパーゼ 1 は膜傷害タまで同定されており、それぞれ異なるリガンドを認ンパク質ガスダーミン D も活性型へと変換させるこ

識することで多様な異物に対応していることが明らとで膜傷害を伴うプログラム細胞死パイロトーシス

かとなっている (参考論文 4)。一方で、細胞内受容を誘導する。異物が発生もしくは侵入した部位に応体より下流のシグナル経路を制御する分子機構はいまだ不明な点が多い。ASC やカスパーゼ 1 を含む下

上記の結果を踏まえて、特に影響の大きかったリ流の分子は細胞内受容体の種類によらずインフラマン酸化部位である ASC の 144 番目チロシンに競合ソーム応答に共通するため、特に感染症など複数の拮抗するようなペプチドを作製した。Lipofectamine

インフラマソームを活性化しうる疾患においては効を用いてこのペプチドをマクロファージに導入した果的な治療標的になると考えられる。そこで本研究

のちに LPS でプライミングを行い Nigericin で刺激では、インフラマソーム応答に共通するアダブターした。その結果、インフラマソーム非依存的な TNFα分子 ASC に着目した制御機構の探索を行った。インの産生には影響がなかったが、インフラマソーム依フラマソームの制御機構を解明することで、病的な存的な IL-1β 産生はペプチド濃度依存的に抑制されインフラマソーム活性だけを特異的に抑制することた。このことから、マクロファージにおけるインフが可能となり、上述した疾患の治療および理解に繋ラマソームの活性化に ASC のリン酸化は必須であがることが期待される。

り、なかでも 144 番目チロシンのリン酸化部位を阻害することでインフラマソームの活性化を抑制でき研究経過ることがわかった。

インフラマソーム活性化時に ASC がどのようなこれまでの研究から、ASC などのインフラマソー分子と会合しているのか調べるために、NLRP3 インム構成因子を欠損したマウスに黄色ブドウ球菌やリフラマソームを活性化する Nigericin で野生型マクロステリアを感染させると野生型マウスと比較して臓ファージを刺激後、ASC の免疫沈降を行った。その器内菌数が低下し、マウスの生存率が改善すること

結果、プロテイン Y が ASC と会合していることをを突き止めている (参考論文 3)。このメカニズムを見出した。そこで、CRISPR/Cas9 ゲノム編集技術を解明するために、カスパーゼ 1 の基質となる IL-1β用いてプロテイン Y を欠損するマクロファージを作および IL-18 の関与を各欠損マウスを用いて検討し製した。その結果、NLRP3 インフラマソームを活性た。その結果、リステリアを感染した IL-1β 欠損マ化する ATP や AIM2 インフラマソームを活性化する

ウスでは野生型マウスと同程度の臓器内菌数が検出

poly(dA:dT)などに対する応答性が野生型マクロファされたのに対して、IL-18 欠損マウスでは他のインフージと比較して減弱することを見出した。このこと

ラマソーム構成因子欠損マウスと同様に臓器内菌数から、プロテイン Y は細胞内受容体の下流で ASC との減少が観察された。一方で、黄色ブドウ球菌感染会合することにより ASC 依存的なインフラマソー

でも検討を行ったところ、リステリア感染で得られム応答を制御していることが明らかとなった。今後、た結果とは異なり、IL-1β 欠損マウスと IL-18 欠損マ

プロテイン Y による ASC の機能制御機構についてウスの両者で臓器内菌数の低下が観察された。以上詳細な検討を進める計画である。の結果から、インフラマソームの活性化は病原菌の次に ASC の翻訳後修飾がインフラマソーム応答生体内増殖を加速させ病状を悪化させるが、どのサに与える影響を検討した。ASC のリン酸化候補部位

イトカインが関与するのかは病原体に依存することを絞り込むために各アミノ酸に変異を加えたところ、が判明した。

特に 144 番目のチロシンをフェニルアラニンに置換

最後に自己免疫疾患として多発性硬化症のモデルした ASC (Y144F)を発現するマクロファージにおいでて、Nigericin や poly(dA:dT)に対する応答性が顕著にencephalomyelitis)におけるインフラマソーム応答の減少した。あわせて感染症における ASC リン酸化の影響を検討した。これまで NLRP3 インフラマソーム影響を検討したところ、144 番目のチロシン以外にを介した IL-1β 産生が EAE の病態形成に関与するとも 92 番目のセリンに変異を加えることで黄色ブド考えられてきた (参考論文 6)。そこで、他のインフウ球菌感染におけるインフラマソーム応答が減少しラマソームの関与を検討するために、AIM2 欠損マた。これらのアミノ酸以外にも ASC のリン酸化標的

ウスにおける EAE の病態スコアを野生型マウスとは報告されていることから (参考論文 5)、インフラ比較した。その結果、野生型マウスと比較して特にマソームの活性化には ASC の複数のアミノ酸のリ後期における病態スコアが野生型マウスより低下しン酸化が関与しており、その組み合わせによって炎た。また IL-1β だけでなく、IL-18 欠損マウスにおい症応答が制御されていることが示唆された。ても EAE の病態スコアが減弱したことから、インフあるEAE(Experimentalautoimmuneラマソーム活性化後、IL-1β と IL-18 が産生されるこ

ラマソーム依存的に産生される IL-1β および IL-18 がとで協調的に EAE の炎症病態を形成していると考協調的に炎症病態の形成に関わることが本研究からえられる。

示された。本研究で検討した疾患モデルだけでなく、脳神経系疾患や老年性疾患、悪性腫瘍など幅広い疾考察

病の発症および重症化にインフラマソームが関与すインフラマソームは、炎症性サイトカインの産生ることが報告されていることから、本研究で得られや炎症誘導性細胞死パイロトーシスを誘導することた知見などをもとに、インフラマソーム阻害薬の開で多様な炎症応答を制御している。インフラマソー

発をすすめることで、幅広い疾患の治療に応用できムの細胞内受容体はそれぞれ特有のリガンドを認識ることが期待される。

することでカスパーゼ 1 を活性化させるが、1 種類のインフラマソームしか活性化しない疾患は稀であ

参考論文

り、多くの場合、複数のインフラマソームが活性化

1. Tschopp J, Martinon F, Burns K. NALPs: a novelする。そこで本研究では、特にインフラマソームのprotein family involved in inflammation. Nat. Rev.

共通アダプター分子である ASC に注目してその制Mol. Cell Biol. 2003, 4, 95-104.

御機構の解析を行った。その結果、インフラマソー

2. Martinon F, Tschopp J. Inflammatory caspases: linking

ムの活性化には ASC とプロテイン Y との相互作用

anintracellular

innateimmunesystemtoが重要であり、さらに ASC に 144 番目チロシンを含autoinflammatory diseases. Cell 2004, 117, 561-74.

む複数のアミノ酸がリン酸化される必要があること

3. Hara H, Seregin SS, Yang D, Fukase K, Chamaillard M,

が明らかとなってきた。今後、ASC のリン酸化に関Alnemri ES, Inohara N, Chen GY, Núñez G. The

わるシグナル経路やプロテイン Y との相互作用機序

NLRP6 Inflammasome Recognizes Lipoteichoic Acidを明らかにすることで、新たなインフラマソーム阻and Regulates Gram-Positive Pathogen Infection. Cell

害薬の開発に結びつく可能性が期待される。

2018, 175, 1651-1664.

また、インフラマソーム応答によって誘発される

4. Xue Y, Enosi Tuipulotu D, Tan WH, Kay C, Man SM.

免疫応答のうち、どれが病原微生物の生体内増殖にEmerging Activators and Regulators of Inflammasomes

影響を及ぼしているのか検討を行った。その結果、and Pyroptosis. Trends Immunol. 2019, 40, 1035-1052.

黄色ブドウ球菌とリステリアなどのグラム陽性菌同

5. Song N, Li T. Regulation of NLRP3 Inflammasome by

士でも IL-1β と IL-18 の役割が異なることが判明しPhosphorylation. Front. Immunol. 2018, 9, 2305.

た。
これらの下流ではさらに IL-6 や IFN-γ (interferon-6. Gris D, Ye Z, Iocca HA, Wen H, Craven RR, Gris P,γ)など多岐にわたるサイトカインの産生が制御を受

Huang M, Schneider M, Miller SD, Ting JP. NLRP3

けていることから、サイトカインをターゲットにしplays a critical role in the development of experimental

た中和や競合阻害は一定の効果は認められるが感染

autoimmune encephalomyelitis by mediating Th1 and症によっては複数のサイトカインを標的としなけれTh17 responses. J. Immunol. 2010, 185, 974-81.

ばならないことが明らかとなった。現在、薬剤耐性菌や新型コロナウイルスが世界的に蔓延しており、研究の発表効果的な治療法の開発が危急の課題となっている。

口頭発表

これらの難治性感染症において、インフラマソーム

1.

Tanishita Y, Sekiya H, Nunez G, Yoshimura A, Haraが活性化すると病態が重症化することが最近の研究

H.

から明らかとなりつつある。今回の研究成果をもとinflammasomeに、インフラマソーム応答を効果的に制御できる分

exacerbate infection. 第 95 回日本細菌学会総会.

子標的を特定し特異的な阻害剤を開発することで、2022 年 3 月 29 日、オンライン治療が困難な薬剤耐性菌や新型コロナウイルスに対

2.

LLO

promotes

phosphorylation

adaptor ASC

throughof

theLyntoHara H, Nunez G, Yoshimura A. Lyn kinase signaling

する新たな対抗手段を得ることができる可能性を秘

promotes inflammasome activation in macrophages

めている。

infected with Listeria monocytogenes. 第 50 回 日

感染症に加えて、自己免疫疾患においてもインフ

本免疫学会総会. 2021 年 12 月 8 日、奈良3.

Hara H, Tanishita Y, Sekiya H, Nunez G, Yoshimura

Hara H. Analysis of the mechanism by which Gram-

A. Molecular mechanism of inflammasome activation

positive bacteria activates NLRP6 inflammasome．第induced by Gram-positive bacteria infection. 第 4494 回細菌学会総会．2021 年 3 月 26 日、岡山回 日本分子生物学会年会. 2021 年 12 月 1 日、横4.

5.

6.

Hara H, Nunez G, Yoshimura A. Gram-positive

浜pathogens

Hara H, Nunez G, Yoshimura A. Recognition ofbacterial survival in infected mice. 第 93 回日本細Gram-positive bacteria infection in macrophages

菌学会総会. 2020 年 3 月 25 日、愛知

throughNLRP6inflammasome.

The

27th

international symposium on molecular cell biology of

誌上発表

macrophages. 2021 年 6 月 15 日、大阪

該当なし

activate

inflammasome

topromote