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KOD-Plus-/
KOD-Plus- Ver.2

品名包装

Code No.

価格

KOD-Plus-

200U× 1本
200U× 5本
200U×11本

KOD-201
KOD-202
KOD-203￥30,000￥120,000￥230,000

KOD-Plus- Ver.2

200U× 1本

KOD-211￥32,000

高正確性PCR酵素にありがちな「増えない」を解消。広いターゲットに対して確実な増幅をお約束します。

上記特長に加えて

上記特長に加えて

はじめ に
KOD-Plus-は、最高水準のFidelity（正確性・忠実性）を持つ
図1．KOD関連試薬の進化

KOD DNA Polymeraseをベースとして開発された高正確性
PCR用酵素です。本酵素は、Taq DNA Polymeraseの約82倍となります（ホットスタート）。の正確性を有し、クローニングなどの正確性を要する用途に適します。また、本酵素には2種類のモノクローナル中和抗体が混合

KOD-Plus-Ver.2は、KOD-Plus-の反応bufferをさらに改良されており、購入いただいた段階でKOD DNA Polymeraseのすることにより、KOD-Plus-の長所はそのままに、高いリライ

DNA Polymerase活性と3'→5'Exonuclease（Proofreading）アビリティーを付与したDNA polymeraseです。PCRの確実活性は完全に抑えられた状態になっています。これらの抗体は最性・成功率は、KOD-Plus-に比べ確実に向上しており、更に初の変性段階（94℃・2min）で失活し、PCRに影響は及ぼし様々な用途で力を発揮します。

ません。この改善により、非特異反応の主要因である｢PCRの適今回は、本酵素を用いてRT-PCRを実施した実験例をもとに、温に達するまでの副反応｣を大幅に抑えることができ、その結果、本酵素をご使用いただく上でのコツ・注意点をご紹介させていた高い特異性と優れたPCRパフォーマンスを実現することが可能だきます。

方法

RT反応は、HeLa Total RNAの希釈系列（10、50、100、200、300、400、500ng/μl）をサンプルとして、弊社の以下となっていますが、今回は、PCR反応におけるRNAの許容量をみるために50ng〜2.5μgのRNAを使用しました。

1st ストランドcDNA合成キットReverTra Ace -α-®（CodePCR反応については、KOD-Plus-、KOD-Plus- Ver.2を以下No: FSK-101）を用いて、以下のように実施しました。なお、の条件にて使用しました。また、PCR性能の比較のため、他社の本キットの取扱い説明書では、Total RNAの推奨使用量は1μg

High Fidelity PCR酵素を取扱い説明書に従って使用しました。

〈RT反応〉HeLa Total RNAの希釈系列
5（μl）
Oligo（dT）20 primer（10 pmol/μl）
5
RNase Free H2O
2Total12μl↓ 65℃, 5min後、on iceにて急冷↓ （以下の試薬を追加）
4（μl）
5×RT Buffer
210mM dNTPs
1RNase Inhibitor〈逆転写酵素〉 1
ReverTra Ace®（10U/μl）
20μl
Total
↓42℃, 60min → 85℃, 5min →（4℃,∞）↓〈PCR反応〉

KOD-PlusKOD-Plus- Ver.2
D.W.
32（μl）
31（μl）
10×Buffer for KOD-Plus5
10×Buffer for KOD-Plus- Ver.2
52mM dNTPs
5525mM MgSO423
Primer F（10μM）
1.5
1.5Primer R（10μM）
1.5
1.5
逆転写反応溶液22
KOD-Plus-（1.0U/μl）
11Total50μl
50μl（サイクルは、KOD-Plus-、KOD-Plus-Ver.2共通で実施）
94℃, 2min.
98℃, 10sec.
（Tm-5）℃, 30sec. ×25〜35cycles（X：ターゲット鎖長1kbあたり1min.で設定）
68℃, Xmin

15

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結果及び考察Transferrin recepter（3.5kb）

Polymerase ε（6.8kb）

M 1 2 3 4 5 6 7 8

M 1 2 3 4 5 6 7 8

RT反応
HeLa total RNA 50ng〜2500ngをサンプルとして20ulの系で実施↓PCR反応逆転写反応液 2μlを鋳型に50μlの系で実施

KOD-Plus-KOD-PlusVer.2

Lane M : 1kb DNA ラダーマーカー
1 : Negative Control
2 : HeLa total RNA50ng（ 5ng）
3 : HeLa total RNA 250ng（ 25ng）
4 : HeLa total RNA 500ng（ 50ng）
5 : HeLa total RNA 1000ng（100ng）
6 : HeLa total RNA 1500ng（150ng）
7 : HeLa total RNA 2000ng（200ng）
8 : HeLa total RNA 2500ng（250ng）

A社 High-Fidelity
PCR Enzyme（）内はPCR反応への持込量

図2．RT-PCRにおけるRNAサンプル量の検討

今回、3.5kbと6.8kbの2種類の遺伝子をターゲットとしてが有効な対策であると考えられます。また、発現量の少ない遺伝

RT-PCRを試みました。その結果、KOD-Plus-、及びKOD-子をターゲットとする場合や、cDNAライブラリーの調製等で、Plus- Ver.2のいずれにおいても、エキストラバンドのない明瞭やむを得ず大量のRNAを使用しなければならない場合には、なバンドを得ることができました。特に、KOD-Plus- Ver.2でTotal RNAではなくpoly（A）＋RNAを使用する、もしくはRT反は、より広いRNAの濃度幅で増幅が得られており、PCRが応後に過剰の鋳型RNAをアルカリ加水分解等により除去する、かことが有効であると思われます。

かる 範囲が確実に広がっていることが確認できました（図2）。
一方、本結果から、過剰のRNAを用いて合成したcDNA溶液

また、RNAによるPCR阻害は、図3の例のように、DNA鋳型を鋳型とした場合、増幅産物が得られにくくなることも明らかとに大量のRNAが混入している場合にも起こり得ますので、ゲノなりました。ターゲットにより若干の差はありますが、KOD-ムDNAを鋳型とする場合においても、同様の注意が必要です。

Plus-では〜100ng、KOD-Plus- Ver.2では〜150ng相当以下

クローニング用のRT-PCRも、コツさえつかめばそれほど難しのRNAから得られたcDNA溶液を鋳型にした場合にのみ良好ない実験ではありません。これを機に、一度プロトコールを見直さ増幅が得られました。この原因としては、PCR反応に持ち越されてみてはいかがでしょうか？

れた過剰のRNAによるPCR反応の阻害が疑われました（逆転写反応が阻害されていないことは別途確認済みで

KOD-Plus- Ver.2

KOD-Plus-す）。

1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8

図3は、ヒトゲノムDNAを鋳型としたPCRにおいて様々な濃度のTotal RNAを添加した場合の影響を示しています。この結果から、cDNA合成溶液に含まれる過剰のターゲット:
ヒトゲノムDNA上のMyosin h.c.
（5.2kb）

RNAはPCR効率に明らかに影響することが示唆されます。
過剰なRNAによるPCR阻害の原因としては、RNAがLane M : 1kb DNA ラダーマーカー
1 : ヒトゲノムDNA0ng + HeLa Total RNA0ng
2 : ヒトゲノムDNA0ng + HeLa Total RNA 50ng
3 : ヒトゲノムDNA 50ng + HeLa Total RNA0ng
4 : ヒトゲノムDNA 50ng + HeLa Total RNA 50ng
5 : ヒトゲノムDNA 50ng + HeLa Total RNA 100ng
6 : ヒトゲノムDNA 50ng + HeLa Total RNA 150ng
7 : ヒトゲノムDNA 50ng + HeLa Total RNA 200ng
8 : ヒトゲノムDNA 50ng + HeLa Total RNA 250ng

PCR反応に必要なMg2+をキレートするためと考えられま2+す（RT反応は比較的高濃度のMg を含むbufferが使用されるため阻害は受けません）。
RT-PCR時に増幅が見られないことは良く見かけるトラブルの一つです。今回の結果から、そのような場合には、RNA濃度やcDNA溶液の持ち込み量を増やすより、むし

図3．ヒトゲノムDNAを鋳型としたPCRにおけるコンタミRNAの影響

ろ、RT反応液の添加量を減らすか、Mg濃度を上げること

品

名

逆転写酵素

ReverTra Ace®（100U/μl）
1stストランドcDNA合成キット

ReverTra Ace -α-®
High‐Fidelity RT-PCRキット

ReverTra -Plus-TM
KOD/KOD-Plus-用TAクローニングキット

TArget CloneTM -Plus-

包装

保存温度

Code No.

価10,000U
50,000U-20℃

TRT-101
TRT-102￥15,000￥60,000

100回用

-20℃

FSK-101￥53,000

20回用
100回用

-20℃

PCR-501T
PCR-501￥19,000￥70,000

10回用

-20℃

TAK-201￥16,000

16格