24-01

One-step qPCR Kit

RNA-direct ® Realtime PCR
Master Mix(Code No. QRT-101、QRT-101X5)

取扱説明書
TOYOBO CO., LTD.
Bioproducts Sales and Marketing Department
OSAKA JAPAN

A3586K－ 目 次 －[1] はじめに ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 1[2] 製品内容

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 3[3] 製品のほかに用意するもの[4] 使用方法

・・・・・・・・・・・・・・・・ 4

・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 6[5] 関連プロトコル ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 12[6] トラブルシューティング・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 13[7] 関連商品 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 15

ご注意
本キットに含まれる試薬は、すべて研究用試薬です。診断・臨床用試薬として決して使用しないでください。本キットの使用にあたっては、実験室での一般の注意事項を厳守し、安全に留意してください。

※TaqMan®は、Roche Molecular Systems Inc.の登録商標です。
※SYBRTM は、Molecular Probes Inc.の登録商標です。
※記載している会社名および商品名・ロゴマークなどは、各社の商号、商標または登録商標です。
QRT-101

[1] はじめに
RNA-direct® Realtime PCR Master Mix は、Thermus thermophilus HB8 株由来の組換型耐熱性 DNA ポリメラーゼである rTth DNA Polymerase が、2 価のマンガンイオン(Mn2+)存在下において強い逆転写活性を示すことを利用した、1 酵素系によるワン
ステップリアルタイム PCR 用 2x マスターミックスです。逆転写反応と PCR とを同一の反応系で連続的に行うため、試薬の分注操作が 1 回で済み、ハイスループット化に適しています。また、サンプル間のクロスコンタミネーションの危険性も低減します。
RNA-direct® Realtime PCR Master Mix は、各種プローブやプライマーを組み合
わせて、TaqMan®アッセイ法や FRET プローブアッセイ法など、様々な検出系によるリアルタイム PCR を実施することができます。

-1-

QRT-101◆本製品の特長◆
1. 逆転写反応とリアルタイム PCR を同一の反応系で実施
RNA-direct® Realtime PCR Master Mix は、RNA を鋳型として、逆転写反応と PCRを同一の反応系で連続的に行うため、実験系の迅速化、ハイスループット化に適しています。またサンプル間のクロスコンタミネーションの危険性も低減します。
2. 立体構造を取りやすい RNA 鋳型や、GC-rich な標的配列にも対応
RNA-direct® Realtime PCR Master Mix は、逆転写反応と PCR を単一の耐熱性酵
素 rTth DNA Polymerase で行います。耐熱性酵素を用いた逆転写は、一般の逆転写酵素と比較して、反応を高温で実施できるため、立体構造をとりやすい鋳型 RNA の反応に適しています。また、rTth DNA Polymerase は GC-rich な配列の増幅に有効であることが知られており、リアルタイム PCR においても同様に高い増幅効率を期待することができます。
3. 高速ホットスタート
RNA-direct® Realtime PCR Master Mix は、抗 DNA ポリメラーゼ抗体を用いたホット
スタートシステムを採用しています。抗体を用いたホットスタートは非特異反応の抑制に強力な効果を示し、また、加熱によって速やかに抗体が失活するため、酵素の再活性化も迅速であり、鋳型 RNA や酵素への高温によるダメージを最小限に抑えることができます。
4. 高い汎用性
RNA-direct® Realtime PCR Master Mix は、汎用チューブを用いる LineGene(BioFlux 社)の他、ガラスキャピラリーを用いる LightCyclerTM (Roche Diagnostics 社)、
passive reference 色素を利用する Applied Biosystems 社製 Realtime PCR 装置、さまざまなリアルタイム PCR 装置に幅広く適合しています。

[2] 製品内容
本製品には、以下のパーツが含まれています。

品名および内容®

RNA-direct
Realtime PCR Master Mix
50mM Mn(OAc)2

保存
-20°C

(または 4°C で
2 ヶ月以内)QRT-101(250 回用/20μL 反応)

500μL x 5

遮光保存
-20°C

QRT-101X5(250 回用/20μL 反応)×5(QRT-101) x 5

500μL x 1

RNA-direct® Realtime PCR Master Mix
反応バッファー、dNTPs、rTth DNA ポリメラーゼ及び抗 DNA ポリメラーゼ抗体などのPCR 反応組成に加え、passive reference 色素を含んだ 2x 反応溶液です。鋳型 RNA、
プライマー、Mn(OAc)2 溶液を添加し、RNase-free 水で 1x 濃度に調製して使用してください。
-20°C で凍結保存してください。融解後はゆるやかに混和し、溶液を均質化した上でご使用ください。使用後は、-20°C で再度凍結保存してください。ただし、凍結融解の繰り返しは、10 回程度では品質には影響しませんが、なるべく避けてください。一度の使用量が少ない場合は、小分注して保存することをお勧めします。なお、短期間(おおよそ 2ヶ月以内)であれば、4°C で遮光の上、冷蔵保存することもできます。
50mM Mn(OAc)2反応に必要なマンガンイオンの溶液です。通常は反応系に 1/20 volume (終濃度2.5mM)となるように添加しますが、ターゲットとなる RNA の濃度や種類によっては、添加量を増減させることによりパフォーマンスが向上する場合がありますので、適宜調整してご使用ください。
-20°C で保存してください。

-3-

QRT-101[3] 製品のほかに用意するもの
本製品の他に、以下の試薬・機器類をご用意ください。
・リアルタイム PCR 装置
本製品は、LineGene (BioFlux 社)、Applied Biosystems 社製 Realtime PCR 装置、
LightCyclerTM (Roche Diagnostics 社) など、各種リアルタイム PCR 装置にご使用頂けます。ご使用にあたっては各装置の取扱説明書に従ってください。
・プライマーおよびプローブ
目的遺伝子配列に対応したプライマーセットおよびプローブをご用意ください。プライマ
ーおよびプローブの設計は、各アッセイ系それぞれの注意事項に従って実施してください。高感度で定量性のあるデータを得るためには、プライマーおよびプローブの設計が最も重要となります。
以下に、設計時の一般的な注意事項を挙げます。ただし、各アッセイ系により至適条
件が異なる場合がありますので、あくまで参考としてお考えください。
- プライマーの長さは20-30mer、GC含量は40-60%に設定します。
- 増幅領域の長さは200bp以下に設定します。長すぎると増幅効率が低下し、また非特異反応も起こりやすくなるため、検出感度が低下します。
- 増幅領域は可能であればイントロンをはさんだ領域に設定し、プローブはエクソンの境界部位に設定します。これにより、ゲノムDNA由来の増幅を防ぐことができます。
・RNase-free 水フィルター濾過により調製された RNase-free 水の使用をお勧めします。ジエチルピロ
カーボネート(DEPC)処理水を使用する場合は、DEPC の残留により反応が阻害されることがありますので、オートクレーブを十分に行って DEPC を完全に除去してください。
また、リアルタイム PCR に使用する RNase-free 水は、核酸の混入を防ぐため、他の実
験用とは別に保存し、共用しないことをお勧めします。

・Total RNA
本製品では、Total RNA を直接、鋳型として用いることができます。AGPC(Acid
Guanidium - Phenol - Chloroform)法などの標準的な方法により精製された Total RNAには、ゲノム DNA が混入しています。ゲノム DNA の混入は、特に偽遺伝子が多く存在
するターゲットを検出する際等に偽陽性シグナルを発生させる原因となりますので、必要に応じて、DNase I 等を用いてゲノム DNA を除去してください。
組織、培養細胞等から得られた Total RNA には、発現解析の対象となる mRNA が通常 1-2%程度含まれています。
・poly(A)+ RNA (mRNA)poly(A)+ RNA は、oligo(dT)とのハイブリダイゼーションを利用して polyA 末端を有す
る mRNA のみを選択的に分離したものです。精製段階で mRNA を濃縮できるため、
mRNA を高感度で検出したい場合に有用です。ただし、Total RNA に比べてリボヌクレ
アーゼ(RNase)による分解を受けやすいため、取り扱いには注意してください。

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QRT-101

[4] 使用方法
1. LineGene (BioFlux 社) を用いる TaqMan®アッセイ(1)反応液の調製
反応液組成(一例)
Distilled Water (RNase-free grade)
RNA-direct® Realtime PCR Master Mix
50mM Mn(OAc)2
Sense Primer
Antisense Primer
TaqMan Probe
RNA sample

up to 10 μL
5 μL
0.5 μL (終濃度 2.5mM)
3 pmol (終濃度 0.3μM)
3 pmol (終濃度 0.3μM)
2 pmol (終濃度 0.2μM)<500ngTotal volume

10 μL

・Distilled Water は RNase-free グレードのもの(RNase-free 水)をご使用ください。フィルター濾過により調製された RNase-free 水の使用をお勧めします。ジエチルピロカーボネート(DEPC)処理水を使用する場合は、DEPC の残留により反応が阻害されることがありますので、オートクレーブを十分に行って DEPC を完全に除去してください。また、リアルタイム PCR に使用する RNase-free 水は、他の実験用とは別に保存し、共用しないでください。
・プライマーの添加量は各々2-6 pmol (最終濃度 0.2-0.6μM)、TaqMan プローブの添加量は 0.5-3pmol (最終濃度 0.05-0.3μM)を目安にご検討ください。既製品のプライマー・プローブセットを用いる
場合は、各製品の推奨条件をそのまま適用してください。増幅効率がよくない場合、添加量を増やす
ことによりパフォーマンスが向上する場合がありますが、逆に入れすぎると非特異反応の原因となり、検出感度が低下する場合があります。
・Mn(OAc) 2 添加量は最終濃度 2.5mM を基本としていますが、RNA サンプルの濃度や増幅ターゲットの配列によっては Mn(OAc)2 濃度を増減させることにより、より良好な結果を得ることができる場合があります。
・RNA サンプルの添加量は、Total RNA であれば 500ng 以下、poly(A)+ RNA (mRNA)の場合であれ
ば 100ng 以下を目安としてください。過剰量の添加は反応効率低下の原因となり、十分な直線性が得られない場合があります。

(2)PCR の実施
RT-PCR 温度設定(一例)Denature 1
90°C 0:30|
RT
61°C 20:00|
Denature 2
95°C 0:30|
PCR Cycle
95°C 0:15(45 Cycles)
60°C 0:45 (data collection)
・本製品では高速ホットスタートシステム(p.2 参照)を採用していますので、最初の変性ステップ(Denature 1)における酵素の再活性化は 90°C、30 秒間で十分に行うことができます。必要以上の加熱処理は、酵素活性を低下させ、また鋳型 RNA の安定性にも悪影響を及ぼす可能性があります。
・蛍光検出チャンネルは、使用する蛍光色素を確認の上、最適なものを使用してください。

BioFlux LineGene は、高いコストパフォーマンスを実現した 33 フォーマット・パーソナル
タイプのリアルタイム・モニタリング装置です。汎用の 0.2μL PCR 用チューブが使用可
能で、10μL の液量で反応を行うことができ、ランニングコストも安価に抑えることができ
ます。

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QRT-101

2. Applied Biosystems 7900HT を用いる TaqMan®アッセイ(1)反応液の調製
反応液組成(一例)
Distilled Water (RNase-free grade)up to 50 μL®
RNA-direct Realtime PCR Master Mix 25 μL
2.5 μL (終濃度 2.5mM)
50mM Mn(OAc)2
Sense Primer
15 pmol (終濃度 0.3μM)
Antisense Primer
15 pmol (終濃度 0.3μM)
TaqMan Probe
10 pmol (終濃度 0.2μM)
RNA sample<2.5μgTotal volume

50 μL

・Distilled Water は RNase-free グレードのもの(RNase-free 水)をご使用ください。フィルター濾過により調製された RNase-free 水の使用をお勧めします。ジエチルピロカーボネート(DEPC)処理水を使用する場合は、DEPC の残留により反応が阻害されることがありますので、オートクレーブを十分に行って DEPC を完全に除去してください。また、リアルタイム PCR に使用する RNase-free 水は、他の実験用とは別に保存し、共用しないでください。
・プライマーの添加量は各々10-30 pmol (最終濃度 0.2-0.6μM)、TaqMan プローブの添加量は 2.5-15
pmol (最終濃度 0.05-0.3μM)を目安にご検討ください。既製品のプライマー・プローブセットを用いる
場合は、各製品の推奨条件をそのまま適用してください。増幅効率がよくない場合、添加量を増やす
ことによりパフォーマンスが向上する場合がありますが、逆に入れすぎると非特異反応の原因となり、検出感度が低下する場合があります。
・Mn(OAc)2 添加量は最終濃度 2.5mM を基本としていますが、RNA サンプルの濃度や増幅ターゲットの配列によっては Mn(OAc)2 濃度を増減させることにより、より良好な結果を得ることができる場合があります。
・RNA サンプルの添加量は、Total RNA であれば 2.5μg 以下、poly(A)+ RNA (mRNA)の場合であれ
ば 500ng 以下を目安としてください。過剰量の添加は反応効率低下の原因となり、十分な直線性が得られない場合があります。

(2)PCR の実施
RT-PCR 温度設定(一例)Denature 1
90°C 0:30|
RT
61°C 20:00|
Denature 2
95°C 1:00|
PCR Cycle
95°C 0:15(45 Cycles)
60°C 1:00 (data collection)
・本製品では高速ホットスタートシステム(p.2 参照)を採用していますので、最初の変性ステップ(Denature 1)における酵素の再活性化は 90°C、30 秒間で十分に行うことができます。必要以上の加熱処理は、酵素活性を低下させ、また鋳型 RNA の安定性にも悪影響を及ぼす可能性があります。
・蛍光検出チャンネルは、使用する蛍光色素を確認の上、最適なものを使用してください。
・上記は Applied Biosystems 7900HT における Standard モードでの例です。

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QRT-101

3. LightCyclerTM (Roche Diagnostics 社) 用いる TaqMan®アッセイ(1)反応液の調製
反応液組成(一例)
Distilled Water (RNase-free grade)
RNA-direct® Realtime PCR Master Mix
50mM Mn(OAc)2
Sense Primer
Antisense Primer
TaqMan Probe
RNA sample

up to 20 μL
10 μL
1 μL (終濃度 2.5mM)
6 pmol (終濃度 0.3μM)
6 pmol (終濃度 0.3μM)
4 pmol (終濃度 0.2μM)<1μg

Total volume

20 μL

・Distilled Water は RNase-free グレードのもの(RNase-free 水)をご使用ください。フィルター濾過により調製された RNase-free 水の使用をお勧めします。ジエチルピロカーボネート(DEPC)処理水を使用する場合は、DEPC の残留により反応が阻害されることがありますので、オートクレーブを十分に行って DEPC を完全に除去してください。また、リアルタイム PCR に使用する RNase-free 水は、他の実験用とは別に保存し、共用しないでください。
・プライマーの添加量は各々4-12 pmol (最終濃度 0.2-0.6μM)、TaqMan プローブの添加量は 1-6
pmol (最終濃度 0.05-0.3μM)を目安にご検討ください。既製品のプライマー・プローブセットを用いる
場合は、各製品の推奨条件をそのまま適用してください。増幅効率がよくない場合、添加量を増やす
ことによりパフォーマンスが向上する場合がありますが、逆に入れすぎると非特異反応の原因となり、検出感度が低下する場合があります。
・Mn(OAc)2 添加量は最終濃度 2.5mM を基本としていますが、RNA サンプルの濃度や増幅ターゲットの配列によっては Mn(OAc)2 濃度を増減させることにより、より良好な結果を得ることができる場合があります。
・RNA サンプルの添加量は、Total RNA であれば 1μg 以下、poly(A)+ RNA (mRNA)の場合であれば200ng 以下を目安としてください。過剰量の添加は反応効率低下の原因となり、十分な直線性が得られない場合があります。

(2)PCR の実施
RT-PCR 温度設定(一例)Denature 1
90°C 0:30|
RT
61°C 20:00|
Denature 2
95°C 0:30|
PCR Cycle
95°C 0:00(45 Cycles)
60°C 0:45 (data collection)
・本製品では高速ホットスタートシステム(p.2 参照)を採用していますので、最初の変性ステップ(Denature 1)における酵素の再活性化は 90°C、30 秒間で十分に行うことができます。必要以上の加熱処理は、酵素活性を低下させ、また鋳型 RNA の安定性にも悪影響を及ぼす可能性があります。
・蛍光検出チャンネルは、使用する蛍光色素を確認の上、最適なものを使用してください。
・本製品では全てのステップでランプ速度(Temperature Transition Rate)を最高速の 20°C/sec に設定することが可能です。ただし、増幅効率が思わしくない場合は、アニーリングステップと伸長ステップとの間を 2°C/sec まで減速することで効率が改善される場合があります。

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QRT-101[5] 関連プロトコル●Total RNA の DNase I 処理
AGPC(Acid Guanidium-Phenol-Chloroform)法などの標準的な方法により精製された
Total RNA にはゲノム DNA が混入しています。必要に応じて、下記の方法によりゲノム
DNA を除去してください。
(1)反応液調製
反応液組成(一例)
Distilled Water (RNase-free grade)
Total RNA
10x DNase I Buffer
RNase-free DNase I (10U/μL)

up to 10 μL
X μg
1 μL
0.5 μL

Total volume

10 μL(2)反応と精製
上記反応組成液を調製し、氷上で 10 分から 30 分間静置して反応させます。
↓
反応液に 100μL の Distilled Water、100μL の TE 飽和フェノールを添加し、ボルテック
ス等で混合した後、氷上で 5 分間静置します。
↓
12,000rpm、5 分間の遠心分離を行い、上清を回収します。
↓
100μL のクロロホルムを添加し、混合します。
↓
12,000rpm、5 分間の遠心分離を行い、上清を回収します。
↓
5μL の 20mg/ml グリコーゲン(共沈剤)、100μL の 5M 酢酸アンモニウム、200μL のイソ
プロパノールを添加し、混合した後、-20°C で 30 分間静置します。
↓
12,000rpm、5 分間の遠心分離を行い、上清を廃棄します。
↓
沈殿に 70%エタノールを加えます。
↓
12,000rpm、5 分間の遠心分離を行い、上清を廃棄します。
↓
沈殿に適量の Distilled Water を加え、溶解します。

[6] トラブルシューティング
1. 増幅がみられない、乱れる
原因
対策
検出機器の設定などが蛍光色 標識に用いられている蛍光色素の種類によって、検素に適合していない
出機器の設定を変更する必要があります。設定を適正化して再解析してください。
data collection の設定が不適 蛍光標識プローブや、蛍光標識プライマーを用いた
切
各種アッセイでは、アッセイ法により data collectionの推奨設定位置が異なります。設定を確認し、適正化して再実験してください。
サンプル位置の設定ミス
入力したサンプル番号と、機器にセットしたサンプルの位置が合っているか確認し、適正なサンプル位置を設定して再解析、あるいは再実験してください。
その他装置の故障・不具合
各装置の取扱説明書に従い、点検してください。
PCR 反応条件・プライマーの濃 プライマー濃度や PCR 反応条件の変更をご検討くだ
度・配列などが不適切
さい。増幅が悪い場合は、一般的にアニーリング温
度を下げる、アニーリング時間を長くするか、プライ
マー濃度を上げてみます。まれに、逆にアニーリング
温度を上げることや、伸長時間の延長などで向上す
ることもあります。ランプ速度を遅くすることで感度が改善される場合があります。また、GC 含量の高いターゲットでは、変性時間を延長することで、改善することもあります。それでも不良の場合は、プライマー
再設計をおすすめします。
サンプルの純度が悪い
RNase の作用により鋳型 RNA が分解されている可能性があります。ピペット等の器具類は RNA 取扱専用のものを使用し、RNA を再調製してください。
2. 定量値がばらつく
原因
装置の故障・不具合

サンプルの純度が悪い対策
装置の不具合により、温度管理や検出にばらつきが生じている場合があります。各装置の取扱説明書に従い、点検してください。
純度が悪いサンプルは、ばらつきの原因となります。
均質なサンプルをご使用ください。また、サンプル中のゲノム DNA の残留により、ゲノム DNA 由来の増幅産物が検出されることがあります。DNase I 処理
によりゲノム DNA の除去を行ってください。
- 13 -

QRT-1012. 定量値がばらつく(つづき)
原因
対策
PCR 反応条件・プライマーの濃 PCR の増幅効率が悪い場合は、ばらつきも大きくな
度・配列などが不適切る傾向があります。プライマー濃度や PCR 反応条件の変更をご検討ください。増幅が悪い場合は、一般
的にアニーリング温度を下げる、アニーリング時間を長くするか、プライマー濃度を上げてみます。伸長時間の延長などでも向上することがあります。また、
GC 含量の高いターゲットでは、変性時間を長くすることで、改善されることがあります。それでも、ばらつきが大きい場合は、プライマーおよびプローブの再設計をおすすめします。
計量のばらつき多くのリアルタイム PCR 装置では、推奨反応スケー
ルよりも少量の液量で検出が可能ですが、検出感度や正確性が低下する場合があります。反応スケールを上げて推奨液量で再実験してください。
3. ブランクサンプルにシグナルがみられる。
原因
対策
陽性サンプルや PCR 産物のコ まずは、ブランクに用いたサンプル(水)を更新してく
ンタミネーション
ださい。それでも発生する場合は、使用する蒸留水やプライマー、試薬などを更新して再検討してください。

[7] 関連商品
簡便なインターカレータアッセイによる One-step Realtime PCR 用試薬
品名

内容500μL×5 本(250 回用/20μL 反応)(500μL×5 本)×5(250 回用/20μL 反応)
×5

One-step Realtime PCR 用マスターミックス(SYBRTM Green アッセイ用)

RNA-direct® SYBRTM Green
Realtime PCR Master Mix

Code No.
QRT-201
QRT-201×5

RNA 調製関連試薬
品名
磁性ビーズを用いる簡便な Total RNA 精製キット

MagExtractorTM -RNA-

磁性ビーズによる精製を簡単に行う専用磁性スタンド

Magical Trapper

内容

Code No.

100 回用NPK-201F

1個

MGS-101

内容

Code No.

1ml×5 本
(1ml×5 本)×5

QPK-101
QPK-101X5

1ml×5 本
(1ml×5 本)×5

QPK-201
QPK-201X5

1ml×5 本
(1ml×5 本)×5

QPK-212
QPK-212X5

1ml×1 本1.67ml×3 本(1.67ml×3 本)×5
1ml×1 本1.67ml×3 本(1.67ml×3 本)×5

QPS-101T
QPS-101
QPS-101X5

200 回用FSQ-101

200 回用

FSQ-201

200 回用FSQ-301

10,000U×1 本(10,000U×1 本)×5
(10,000U×1 本)×10
2,500U×1 本（2,500U×1 本）×5

TRT-101
TRT-101X5
TRT-101X10

リアルタイム PCR 関連試薬
品名
リアルタイム PCR 用マスターミックス(プローブアッセイ用)

Realtime PCR Master Mix

リアルタイム PCR 用マスターミックス(SYBRTM Green アッセイ用)SYBRTM Green Realtime PCR Master Mix

信頼性がさらに向上したリアルタイム PCR 用マスターミックス(SYBRTM Green アッセイ用)SYBRTM Green Realtime PCR Master Mix -Plus各種蛍光プローブ・蛍光プライマー検出系用
リアルタイム PCR 試薬

THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix

SYBRTM Green I 検出系用リアルタイム PCR 試薬

THUNDERBIRD® SYBRTM qPCR Mix
リアルタイム PCR 用 cDNA 合成キット

ReverTra Ace® qPCR RT Kit

リアルタイム PCR 用 cDNA 合成マスターミックス

ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix

ゲノム DNA 除去試薬をプラスしたリアルタイム PCR 用 cDNA
合成試薬

ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix
with gDNA Remover

高伸長性・高反応効率の改良型逆転写酵素

ReverTra Ace®

ゲノム DNA の混入を抑えた組換型 RNase 阻害剤

RNase Inhibitor, Recombinant- 15 -

QPS-201T
QPS-201
QPS-201X5

SIN-201
SIN-201X5
QRT-101

【製造・販売元】－価格・在庫に関するお問い合わせ－
東洋紡株式会社 バイオプロダクト営業部 (大阪)〒530-0001 大阪府大阪市北区梅田一丁目１３番１号
大阪梅田ツインタワーズ・サウス
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TEL 06-6348-3888 FAX 06-6348-3833
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