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MultiReporter Assay System -Tripluc®- ベクターシリーズ 多色ルシフェラーゼベクター

SLO/SLR TA Cloning Kitを用いたプロモーター解析方法のご紹介
東洋紡績（株） 敦賀バイオ研究所 浅井 友実
はじめ にTA Cloning Kitは、解析の効率性をさらに向上させるものと期待しております。

TAクローニングは特別なプライマーを用いることなく、制限酵素等の処理も必要としませんので、PCR産物を効率的にクローニン

本稿では、複数の遺伝子プロモーター候補をDBTSS公開配列をグする方法として広く普及しております。弊社では、このTAクロー

もとにMultiReporter Assay System -Tripluc®- SLR TA

ニ ン グ 技 術 を プ ロ モ ー タ ー 解 析 に も ご 利 用 い た だくべ く、Cloning Kit for KODを用いてクローニングし、培養細胞で転写活

MultiReporter Assay System -Tripluc®- SLO/SLR TA性を確認した例をご紹介いたします。

Cloning Kitとしてご提供しております。さらに、MultiReporter

方Assay System -Tripluc®- SLO/SLR TA Cloning Kit for
KODは、高フィデリティ酵素としての特性上平滑末端産物を生じや法

1. プロモーター候補配列の検索およびクローニング

すく、TAクローニングを苦手とするKODシリーズにおいても、高フ

今回は、表1に示すハウスキーピング遺伝子として知られる10ィデリティ性を活かし、さらにTAクローニングを可能にするように工個の遺伝子について、DBTSSの情報より、RefSeqの5'末端を夫されたキットです。

基点に−1400bp〜＋100bpおよび−500bp〜＋100bpの一方、プロモーター領域の単離や解析には、従来、S1マッピング領域をプロモーター候補配列として抽出し、その5'末端、3'末端法、5'-RACE法によるmRNAの5'-UTR域（転写開始点近傍）の同に相補的なプライマーを設計しました（図１）。

定、さらにはこの配列をプローブとしたゲノムDNAライブラリーのPCRは、Jurkat細胞より抽出したGenomic DNAを鋳型としスクリーニングといった手法が用いられてきました。これらの手法て、High fidelity hot start PCR酵素KOD -Plus-を用いては煩雑な作業が必要で、多種類の遺伝子プロモーターを解析するに行いました。PCR増幅の成否結果は表1に記載します。

は非常な労力を要します。

続 い て 、P C R 増 幅 が 認 め ら れ た サ ン プ ル に つ い て 、

近年、
ヒトゲノムプロジェクトにより決定されたヒトゲノム配列、おMultiReporter Assay System -Tripluc®- SLR TA Cloning

よびNEDOの主導下で行われた「完全長cDNA構造解析計画」にKit for KODのプロトコールに従い、精製処理を行わずにA-より蓄積された転写開始点に相当する5'末端情報をもとに、mRNAattachment Mixを用いて3'末端にdAを付加し、pSLR-Tとラ転 写 開 始 点データベ ースD B T S S（ h t t p : / / d b t s s . h g c . j p /イゲーション反応を行いました。その反応液を用いてコンピテン

index.html）が公開されています。今後、転写制御やシグナル伝達

トセルDH5αへ導入し、翌日、コロニーダイレクトPCRを行い、目などのプロセスを解析していく上で、このようなデータベースの公的産物が挿入されたポジティブクローンを単離しました。これら

開配列をプロモーター領域候補として利用していくことは効果的なポジティブクローンを培養し、プラスミドを精製しました。

手法のひとつとなるものと考えられます。このような手法を進めて

2. 培養細胞へのトランスフェクションおよびルシフェラーゼ活性の測定いく上で、MultiReporter Assay System -Tripluc®- SLO/SLR

接着細胞であるHeLa S3細胞は前日、24ウェルプレートに0.75×105cells播種しました。浮遊細胞であ表1．プロモータークローニングを実施した遺伝子とプライマー
Gene Nam eβ -actin

glyceraldehyde3-phosphate
dehydrogenase

α -tubulin

ubiquitin C

ribosomal
protein S9

ribosomal
protein L13

aminolevulinate,delta , synthase 1

Symbol
ACTB

GAPD

cDNA
TargetRefSeq. No. length

RPS9

RPL13

0.6 kb

ACTCCATGC
ACTC
CATGCCC
CCTCCAAGAGC
TCCAAGAGCTCYWHAZ NM̲003406

SV40

SV40
negative○○るJurkat細胞はトランスフェクションの前に、24ウェルプレートに5×105cells（0.5ml/1ウェル）ずつ播種しました。被験配列を挿入した
S L R ベ クタ ー 0 . 4 7 5μg 、p S L G - S V 4 0

GGTCAGGGACTGG
GGTCAGG
ACTGGAGTCCTGTGAGTCCTGTGGGT
GGT
ACCGC
CGCAGAGCGCCTCGCTCGAGGAG
AGGAGAAG
AG○control（Code No. MRV-201）0.025μgを

1.5 kbTGTATGCAAATTTGGATTTTG
TGT
ATGCAAATTTGGATTTTGAATC
AATC○

混合し、市販の試薬を用いてトランスフェクショ

0.6 kb

CACTGCCTTTAAAGG
CACTGCCTTT
AAAGGAACTG
AACTGAGAG○

ンし、37℃、24時間インキュベートしました。

1.5 kbTTTTTCAGTTGGTAGCCTCTTTTTC○GCCTTCAGGCCGTCCCTAGCCTCCC

AAAGCAGCCGGGAGCCGCACGGCTT×CGAAAGCCCCGGCCAGCCCAGCAGC

翌 日 、ル シ フェラ ー ゼ 活 性 を 検 出 試 薬

0.6 kbGTCAGGAGGGAGGGTCAGGAGGGGGGAGG
GGAGGGAGAC○1.5 kb

CGAGCTGTGCG
AGCTGTGGAGACAGCAGACCATCGC
CCATCGC○「MultiReporter Assay System -Tripluc®-

0.6 kbAAGGTTCTCCCTGGTTCTCCCTACTTCTTCTCAGG
TCAGG○Detection Reagents」と色分離機能付チュ

1.5 kb

CATGCGCCACCACGCCCAGCTTTTT

×ーブ測定用ルミノメーター「カラフルックアナラ

0.6 kbCCACAAATGTTCTAAATGGATG
CCACAAATGTTCTAAATG
ATG○1.5 kb

ACTCTGTCTCAAACAAACAAACACTCTGTCTCAAACAAACA
AAC○ATTTCTCGAAGGGTCTCCGCGGGGTCCGCGTTGGCTGAAGCGCCAGGCCG

ALAS1 NM̲199166

tyrosine
3/tryptophan 5 monooxygenase

PCR(1)

1.5 kbNM̲000977

PEX19

Reverse Primer

0.6 kbNM̲001013

peroxisomal
biogenesis
factor 19(1) ○、× はPCR増幅の有増幅の有 無を示します。

GAGCCGCCTGCCCCGGTCGGCTGGC

NM̲021009

endoG

80

ACACCT
CTACTAACTACGCGCGCTGCCGCTGCAAAG
AGAGC
AGC

NM̲002046

Endonuclease G,
precursor

negative

1.5 kbNM̲001101

KALPHA-1 NM̲006082

UBC

Forward Primer○細胞であるHeLa S3細胞は培地を除去後その×ままLysis Solutionを添加することによって細○胞を溶解しましたが、浮遊細胞であるJurkat細○胞については培養液をマイクロチューブに移GTCCAAACGAAACGCTCGTTGC
0.6 kbGCTGAGTG
GCTG
AGTGTCCCGCTTCTTCCG
CCGCTTCTTCCG

1.5 kbCTTATTTTCCTTAAAGGAAAAAAAAACTTATTTTCCTTAAAGGAAAAAA
AAA
TGC

0.6 kbGGCGCATGCCTGT
GGCGCATGCCTGTAATAATCCCAG
CCCAGC

1.5 kb

TTAGCTTTAGCTACCTT
ACCTTACAGCAGCAGCAGGGG
GGGG

NM̲004435

NM ̲002857

CCCTTCCACTCACAAACACTGC

CTATGGGCTCTTACTTTCCAG
0.6 kbTTGAACCCGGGAGGCCAAGGCTG
TTG
AACCCGGGAGGCCAAGGCTG1.5 kb

TTTCTTTCTGCTACTG
TTTCTTTCTGCTCTGAAG
AGTTTCC
TTTCC○○
AGGTTTGAGGGACGTCGTAGTC

0.6 kb○AAACCCACTAAACCCACTAAAATATAACTGGTCAAATATAACTGGTC

イザーTM」を用いて測定しました。この際、接着し、3,000rpmで5分間遠心した後、上清を除去し、Lysis Solutionを添加することによって細胞を溶解しました。

pSLR-SV40 control
未挿入プラスミド（pSLR-T
未挿入プラスミド（pSLR-T）

13

No.80 05.9.15 7:19 PM ページ 14

RefSeq 5'末端末端（転写開始点？）

ゲノムDNA-1400-500

0ます。この他、GAPDについては1.5kb、0.6kbに被験配列いずれも同等の活性が認められるのに対し、HeLa S3細胞では1.5kbにcDNA(RefSeq)

より強い活性が認められますので、HeLa S3細胞中に存在する転+100写因子に関係するエレメントが上流域に存在する可能性が考えらます。K-ALPHA-1については今回選択した領域にはプロモーター活被験配列とした領域性がありませんでしたので、評価領域を広げる必要があります。あ図1．被験配列の抽出

るいは今回の検討ではRefSeqを基点としておりますので、オリゴキャップ法で得られたcDNAの5'末端を基点にすることでプロモー結果及び考察ター活性を有する領域を取得できるかもしれません。KCIPについ

今回、PCR増幅を試みた20個のターゲットのうち、17個においてはHeLa S3細胞においては転写活性が検出できませんでしたて増幅が認められました。PCR増幅が認められなかったターゲットが、Jurkat細胞では比較的大きな活性が認められましたので、については、プライマー配列の問題、ゲノムDNA中の繰り返し配列Jurkat細胞に存在する転写因子に関係するエレメントが存在するや相同性の高い配列の存在等の影響などが考えられますので、プラ可能性が考えらます。

イマー設計部位を変更して再度PCR増幅を試みる必要があります。
実際に2種類の細胞系を用いた各被験配列のプロモーター活性

本稿では、MultiReporter Assay System -Tripluc ® -の評価結果について、ルシフェラーゼ活性を測定し色分離算出されSLO/SLR TA Cloning Kitをご利用いただくことによって、複数たデータを図2、3に示します。ここでは、各サンプルにおいて内部の遺伝子プロモーターの転写制御を効率的に比較できることが示

標準として添加したSLG値に対するSLR値の割合を算出し、プロッされました。
ご関心あるファミリーに属する複数の遺伝子の転写制御を解析しトしています。
個々のプロモーターの様子を見てみますと、例えば、Jurkat細胞たい場合、あるいは一つの遺伝子について複数の被験配列長あるではACTBプロモーターの転写活性が強く認められることが分かりいは異なる配列部位の転写活性を比較評価したい場合など、本キットを用いることによって効率的に実験を進め

HeLa S3

Jurkatていただくことができ

4.00

25.00

3.50

20.00

るのではないでしょう3.00
2.50

15.00

か 。 是 非 、一 度

2.00

10.00

MultiReporter

1.50
1.00

5.00

Assay System -0.50
0.00

Tripluc ®- SLO/SLRACTAC B 1
T .5k
G B0
AP .6k
K- G D 1
AL AP .5k
K- PH D 0
AL A- .6
PH 1 1 k
A- .5k1
U 0.6
BC k
RPS 1.5k
R 91
PS .5
R 90 kPL .
1 6k
AL 3 0AS .5kAL 1
A .5
en S 0 kd.5
PE oG kX 1.5
PE 19 kX1 1.5YW 9 kH 0.6
YW AZ k
H 1.5
AZ k
0.
6
S k
ne V40gativeACTAC B 1
T .5k
G B0
AP .6k
K- G D 1
AL AP .5
D k
K- PH 0.
A6AL kPH 1 1A- .5k
1U 0.6BC k
RPS 1.5k
R 91
PS .5
R 90 kPL .
1 6k
AL 3 0AS .5kAL 1.
A 5k
en S 0d.5
PE oG kX1 1.5
PE 9 1 k.5
X
YW 19 kH 0.6
YW AZ k
H 1.5
AZ k
0.
6
S k
ne V40ga
tive0.00

図2．Jurkat細胞における各被験配列の転写活性TA Cloning Kitシリーズをお試しください。

図3．HeLa S3細胞における各被験配列の転写活性品 名 及 び 内 容

装保存温度Code No.

価20回用-20℃

MRT-201¥69,000

20回用-20℃

MRT-202¥69,000

20回用-20℃

MRT-101¥65,000

20回用

-20℃

MRT-102¥65,000-80℃

MRA-101¥30,000-CLX-101¥1,350,000

包格MultiReporter Assay System -Tripluc®-

SLO TA cloning kit for KOD
2×Ligation Buffer
pSLO-T
10×A-attachment Mix
T4 DNA Ligase
MultiReporter Assay System -Tripluc®-

SLR TA cloning kit for KOD
pSLR-T
2×Ligation Buffer
T4 DNA Ligase
10×A-attachment Mix
MultiReporter Assay System -Tripluc®-

SLO TA cloning kit
pSLO-T
T4 DNA Ligase

2×Ligation BufferMultiReporter Assay System -Tripluc®-

SLR TA cloning kitpSLR-T
T4 DNA Ligase

2×Ligation Buffer

MultiReporter Assay System -Tripluc®- in vitro アッセイ用試薬

Detection Reagents
細胞溶解剤（Lysis Solution）
発光基質（Assay Reagent）

100回用

色分離機能付チューブ測定用ルミノメーター

1式

カラフルックアナライザーTM

品 名 及 び 内 容
高正確性PCR用酵素

KOD -PlusMultiReporter Assay System -Tripluc®- in vivo アッセイ用試薬
D-luciferin（カリウム塩）＊

包装格

２００４〜２００５
総合カタログ

保存温度

Code No.

価200U×1本＊-20℃

KOD-201￥30,000

1-1020mg＊-20℃

MRL-101￥24,000-＊：この印のついた製品には、上記以外に他の容量でも販売しております。詳しくは、弊社までお問い合わせください。

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