琵琶湖における微生物群集の増殖解析

京都大学大学院工学研究科
都市環境工学専攻
平成31年3月22日（金）大阪・ドーンセンター

平成30年度公益財団法人琵琶湖・淀川水質保全機構
水質保全研究助成 成果報告会

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研究背景 ～湖沼の水質問題の特性～研究分野：流域水環境管理のための水質指標に関する調査研究

琵琶湖における微生物群集の増殖解析

環境省（2011）

 湖沼は閉鎖性が高いために滞留時間が長く、富栄養化や汚濁・汚染が京都大学大学院 工学研究科

いったん進行してしまうと、その影響が長期間にわたって継続する。

日下部 武敏 湖沼の水質改善・浄化には多大な時間とコストが必要となる。
 琵琶湖のような大きくて深い湖の水質形成メカニズムは複雑で不明な点が多い。

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微生物ループ と 微生物炭素ポンプ

細菌群集の計数 と 増殖活性評価

CO2 呼吸CO2 光合成（炭素固定）

 細菌細胞数・濃度の計数／定量法（無機化）• 核酸染色法（AO、DAPI、SYBR Green II/SYBR Gold 等） w/ EfM、CLSM、FCM• 濁度法、乾燥菌体重量法、平板培養法、MPN法、RT-PCR、NAD測定
等々

古典的食物連鎖（生食連鎖）

植プラ

動プラ

高次生物（一次生産者）

溶存有機物（DOM）

 細胞増殖活性の評価法【 微生物ループ 】

原生動物

細 菌4

• 上記方法による菌体量／濃度の時間変化から比増殖速度（d-1）を求める。

DOMを起点として、→ 必要細胞量が多い。
→ 培養時間を要する。
→ 菌体の洗浄、乾燥などの操作が煩雑である。
→ そもそも培養できない微生物（VBNC）は評価が難しい。

生元素・エネルギーが細菌群集の数・活性・種の評価が欠かせない。

高次へ伝達される経路（Azam et al., 1983）

水環境中における細菌群集の増殖活性を評価する手法が必要である。

【 微生物炭素ポンプ 】
ウイルス分流微生物群集（細菌、古細菌）によって難分解性溶存有機物（R-DOM）

R-DOMが生産されているという概念（Jiao & Zheng, 2011）4-1

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京都大学大学院工学研究科
都市環境工学専攻5

新規DNA合成を指標とする増殖活性評価

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研究目的

 [3H]-チミジン（TdR）取り込み法（チミジン法） （Fuhrman & Azam, 1982）••••

DNA合成前駆物質 TdR を増殖時にDNAに取り込ませる。
検出のために放射性同位元素で標識した3H-TdRを使用する。
シンチレーションカウンターなどの設備が必要となる。
毒性のあるシンチレーションカクテルを取り扱う。

BrdU代替としてEdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）を用いた微生物の群集レベルおよび細胞レベルでの増殖解析手法の開発
••
•
•

TdR

 BrdU法 （Porstmann et al., 1985）
••
•
•
•
•

TdRの代替として非放射性BrdU（5-bromo-2’-deoxyuridine）を使用する。
抗BrdU抗体で検出する（→透過処理）。
チミジン法と高い相関がある。 （Steward & Azam, 1999）
細胞（single cell）レベルでの検出が可能である。 （Pernthaler et al., 2002）
抗体での反応には加熱、塩酸などによるDNA変性処理が必要である。
多重染色には適さない（他のターゲットとの組合せに不適）。

BrdU同様、チミジン・アナログとして、DNA合成時に取り込まれる。
Click chemistry（蛍光色素の特異標識）による検出が可能である。
シンプルなプロトコールで高解像度のデータを取得することが期待できる。
透過処理が穏やかで、DNA変性処理が不要なため、多重染色が可能である。

増殖活性を有する細菌の群集構造の解析には、DNA変性処理が不要で、TdR

BrdU

EdU多重染色（他の手法との組合せ）できることが望ましい。

Click反応を利用した新規DNA合成の検出

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BrdU法 と EdU法の違い

 銅（Cu+）触媒存在下におけるアジド-アルキン環付加反応（CuAAC）

BrdU法

強い透過処理EdU法

抗BrdU抗体+

蛍光色素（Alexa Fluor 488 等）

••
•
•

EdU
抗BrdU抗体での検出にはDNase、熱、酸などによるDNA変性処理が必要アジドやアルキンが生体内には存在しない（bioorthogonal）官能基である。
室温においても水中で反応が進行し、生体内でもほとんど阻害を受けない。
Cu+触媒存在下で不安定な成分を含む反応との互換性がない。
触媒のCu+が細胞に毒性を示すことがある。

4-2

Click chemistryにより蛍光色素を直接結合させることが可能！
(変性処理が不要)

琵琶湖における微生物群集の増殖解析

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都市環境工学専攻

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EdU法のプロトコール（概要）AF488（B励起）

サンプリング10

琵琶湖細菌群集の増殖解析における仮定① 琵琶湖の細菌群集は対数増殖をしている。

DAPI（U励起）==GF/C前ろ過（1.2 m）

×（＝ 一定）

② DNA合成速度は一定で、全ゲノム長が2倍になったときに細胞分裂する。
=

DAPI 対比染色③ 増殖速度の温度依存性は、Q10 値を用いて説明できる。

蛍光顕微鏡 観察（or ﾌﾛｰｻｲﾄﾒｰﾀｰ）

固定＆透過条件 Click-iT Plus EdU Kit（濃度、温度、時間） （銅触媒濃度が低い）=④ 琵琶湖細菌のゲノム長を4.1 Mbp、GC含量を50.5%とする1)。

画像解析

880660GC%

マウント 褪色防止

EdU濃度
取込時間

2ゲノム長（Mbp）

Click-iT反応（蛍光標識）

化学固定
透過処理

EdU 取り込み

42402000(13,178個の中央値を採用)

1) National Center for Biotechnology Information, US11

大腸菌株を用いたEdU蛍光係数の決定
 E.coli K-12株 （NBRC3301）: 全ゲノム長 4.6 Mbp, AT含量 49.2%1)
4103

EdU添加

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比増殖速度 1.8 hr−10

蛍光量（ ×10-4）

EdU法

ln (OD/OD0)

培養法-112EdU法による琵琶湖細菌群集の増殖解析 採水

2018年1月（冬季）・8月（夏季）、琵琶湖今津沖中央（17B）、水深 0.5 m

 EdU取り込み条件• 現場水温（冬季 8.6℃, 夏季 27.1℃）• 取り込み培養6時間

86DAPI（核酸対比染色）AF488（EdU取り込み活性）4200.00.51.01.52.02.53.00

Time (hr)
倍加時間Td = 23 min➡ 15分間に新規合成されるAT対T は、

51015Time (min)

20
活性あり

15分間に取り込まれたEdUの蛍光量F は、7.4×10-4

1.46 Mbp= .

活性あり×1) NCBI RefSeq: NC_000913.34-3

琵琶湖における微生物群集の増殖解析

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 ImageJを用いてAF488画像を16-bitグレースケールに変換した後、蛍光量F を数値化
を用いて、新規AT対合成量T に変換（琵琶湖細菌群集：ゲノム長 4.1 Mbp、GC含量 50.5%）

Q10 = 1.1415105Dec.

Nov.

Oct.

Sep.

Aug.

Jul.

Jun.

Jan.

May.

0

・全菌数（DAPI法）
・細胞容積（TEM法）
・細菌炭素密度（Nagata, 1986）
・水温データ（滋賀県）

Apr.

hr

3.2×10−2 （夏季）
=2.5×10−2 （冬季）年間細菌二次生産量
80.9 (µgC/L/year)Mar.

= 5.07 × 1020
細菌二次生産量 (ugC/L/month)

 換算式

14

細菌二次生産量の推定結果

Feb.

琵琶湖細菌群集の増殖活性の評価

細菌二次生産量の推定

まとめ

15謝 辞

 BrdU代替としてEdUを用いた増殖解析手法の開発

16 平成30年度 公益財団法人琵琶湖・淀川水質保全機構「水質保全研究助成」のご支援を賜りました。

 チミジンアナログとしてEdUを用いることで、DNA変性処理が不要
 琵琶湖北湖における細菌群集の増殖活性（）を評価

 琵琶湖での採水調査を遂行するにあたり、滋賀県琵琶湖環境科学研究センターのご協力を賜りました。

 年間細菌二次生産量を 80.9 ugC/L/year と推定

 本研究の実施に際して、京都大学・流域圏総合環境質研究センターのB4・𠮷野魁人君、D2・沈尚君のご協力を賜りました。

 今後の計画
 TSA増感法などによる感度向上
 EdU増殖解析法に、セルソーティングおよび菌叢解析を組み合

ここに記して、深く感謝の意を表します。

わせることにより、増殖活性の高い細菌種の探索・同定

4-4琵琶湖における微生物群集の増殖解析

ご清聴ありがとうございました。

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