飼料用稲中のプロクロラズのガスクロマトグラフ質量分析計による定量法の開発及び共同試験

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1 飼料用稲中のプロクロラズのガスクロマトグラフ質量分析計による定量法の開発及び共同試験
齊木 雅一 *Development and Collaborative Study of Determination Method of Prochloraz
in Rice Straw, Whole-crop Rice Silage and Paddy Rice for Feed by GC-MS
Masakazu SAIKI*( * Sapporo Regional Center, Food and Agricultural Materials Inspection Center)
This paper presents the results of a validation and a collaborative study that I have conducted fordeveloping a quantitative determination method of the concentration of prochloraz in rice straw,
whole-crop rice silage (WCRS) and paddy rice for feed using a gas chromatograph-mass
spectrometer (GC-MS).
Having added water to a sample, prochloraz was extracted with acetone, and the extracted solution
was filtered. The filtrate was then diluted with acetone to a volume of 200 mL. The diluted solution
was purified with Chem Elut (Agilent Technologies Inc.; Santa Clara, CA, USA). Having
decomposed to 2,4,6-trichlorophenol in pyridinium chloride, purified with liquid-liquid partition,
trimethylsilylated, and injected into a GC-MS to determine the concentration of 2,4,6trichlorophenol. The GC separation was then carried out on a fused silica capillary column (DB1MS, 0.32 mm i.d. × 30 m, 0.25 µm film thickness, Agilent Technologies Inc.; Santa Clara, CA,
USA). The mass spectrometer was operated in electron ionization (EI) mode.
Recovery tests were conducted on rice straw, WCRS and paddy rice. Prochloraz was intentionallyadded at the levels of 0.02 and 0.2 mg/kg for rice straw, 0.00889 and 0.0889 mg/kg for WCRS in
original matter, and 0.02 and 2 mg/kg for paddy rice respectively. 2,4,6-trichlorophenol was
intentionally added at the levels of 0.01 and 0.1 mg/kg for rice straw, 0.0044 and 0.044 mg/kg for
WCRS in original matter, and 0.01 and 1 mg/kg for paddy rice respectively. The resulting mean
recoveries ranged from 101 % to 117 % for prochloraz and 99.3 % to 117 % for 2,4,6-trichlorophenol
respectively. The repeatability in the form of the relative standard deviation (RSDr) was less than
15 % for prochloraz and less than 12 % for 2,4,6-trichlorophenol respectively.
A collaborative study was conducted by eleven laboratories using rice straw, WCRS and paddy rice,
all of which were added with prochloraz according to the following specifications: 0.2 mg/kg forrice straw, 0.2 mg/kg for WCRS and 2 mg/kg for paddy rice respectively. The resulting mean
recoveries ranged from 97.6 % to 101 %. The repeatability and reproducibility in the form of
relative standard deviation (RSDr and RSDR) were less than 10 % and less than 18 % respectively.
The HorRat was less than 1.2.
This method was thus validated as useful for inspections of prochloraz in rice straw, WCRS andpaddy rice for feed.
Key words: prochloraz ; 2,4,6-trichlorophenol ; gas chromatograph-mass spectrometer (GC-MS);
rice for feed; rice straw; whole-crop rice silage; paddy rice; collaborative study*

独立行政法人農林水産消費安全技術センター札幌センター

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飼料研究報告 Vol. 45 (2020)

キーワード：プロクロラズ；2,4,6-トリクロロフェノール；ガスクロマトグラフ質量分析計；飼料用稲；稲わら；稲発酵粗飼料；籾米；共同試験

1

緒

言

プロクロラズは，Boots 社が開発したイミダゾール系の殺菌剤である 1) ．エルゴステロール生合成を阻害し，子嚢菌類及び大部分の不完全菌類に対して抗菌活性を示す 1) ．浸透性に優れ，稲のい
もち病，ばか苗病等の防除を主とした種子消毒，その他に小麦，らっきょう，チューリップ等の殺菌防除に使用されている 1)．
飼料中のプロクロラズの管理基準値は，稲わらで0.2 mg/kg，稲発酵粗飼料（以下「WCRS」という．）で0.1 mg/kg2) ，食品，添加物等の規格基準における残留基準値は，米（玄米）で2 ppm，小麦，大麦及びライ麦で0.5 ppm である 3)．プロクロラズは環境中や植物体中で代謝され，イミダゾー
ル環が開裂して尿素骨格をもつ N-ホルミル-N′-1-プロピル-N′-［2-（2,4,6-トリクロロフェノキシ）エチル］尿素及び N-プロピル-N-［2-（2,4,6-トリクロロフェノキシ）エチル］尿素となり，更に加水分解を受けて2,4,6-トリクロロフェノールになることが明らかになっている 4)．
今回，財団法人日本食品分析センターが「平成21年度飼料中の有害物質等分析法開発委託事業」
において開発したガスクロマトグラフ質量分析計（以下「GC-MS」という．）を用いた定量法 5)（以下「JFRL 法」という．）を基に，飼料用稲中のプロクロラズの GC-MS を用いた定量法を開発するとともに，共通試料を用いた共同試験を実施し，飼料分析基準 6) への適用の可否を検討したので，その概要を報告する．
参考にプロクロラズ及びその代謝物の構造式等を Fig. 1に示した．本法は食品の試験法 7) と同様，
プロクロラズ及びその代謝物を2,4,6-トリクロロフェノールに分解して定量するため，これらの物質が共存している場合には定量値は全ての合計量として算出されるが，N-ホルミル-N′-1-プロピルN′-［2-（2,4,6-トリクロロフェノキシ）エチル］尿素及び N-プロピル-N-［2-（2,4,6-トリクロロフェノキシ）エチル］尿素については標準品が入手困難であったため，本検討は2,4,6-トリクロロフ
ェノール及びプロクロラズを用いて実施した．

飼料用稲中のプロクロラズのガスクロマトグラフ質量分析計による定量法の開発及び共同試験

Prochloraz

3

N-formyl-N′-1-propyl-N′-[2-(2,4,6trichlorophenoxy)ethyl]urea

N-propyl-N-[2-(2,4,6-trichlorophenoxy)ethyl]imidazole-1carboxamide
C15H16Cl 3N3O2

MW: 376.7

CAS No.: 67747-09-5

C13H15Cl 3 N2O3

MW: 353.6

Cl
OH

Cl

N-propyl-N-[2-(2,4,6-trichlorophenoxy)ethyl]urea
C12H15Cl 3N2O2

Fig. 1

MW: 325.6

2,4,6-trichlorophenol
C6H3Cl 3O

MW: 197.4

CAS No.: 88-06-2

Chemical structures of prochloraz and the metabolites

2
2.1

Cl

実験方法

分析法開発

2.1.1

試

料

稲わら及び籾米はそれぞれ目開き 1 mm のスクリーンを装着した粉砕機で粉砕した．WCRS は
60 °C で 5 時間乾燥後，更に室内に静置して風乾した後，同様に粉砕した．
2.1.2
1)

試

薬

アセトン，酢酸エチル及びヘキサンは残留農薬・PCB 試験用を用いた．N,O-ビス（トリメチ
ルシリル）トリフルオロアセトアミドはガスクロマトグラフ用（和光純薬工業製）を用いた．
ジエチレングリコール及び塩酸は試薬特級を用いた．塩化ピリジニウムは和光一級（和光純薬工業製）を用いた．水は Milli-Q Advantage（Merck Millipore 製）により精製した超純水（JISK0211 の 5218 に定義された超純水）を用いた．

2)

プロクロラズ標準原液
プロクロラズ標準品（和光純薬工業製，純度 98 %）25 mg を正確に量って 50 mL の全量フラスコに入れ，アセトンを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えてプロクロラズ標準原液を調製した（この液 1 mL は，プロクロラズとして 0.5 mg を含有する．）．

3)

2,4,6-トリクロロフェノール標準液
2,4,6-トリクロロフェノール標準品（和光純薬工業製，純度 99 %）25 mg を正確に量って 50
mL の全量フラスコに入れ，アセトンを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えて 2,4,6-ト
リクロロフェノール標準原液を調製した（この液 1 mL は，2,4,6-トリクロロフェノールとして0.5 mg を含有する．）．

4

飼料研究報告 Vol. 45 (2020)

使用に際して，2,4,6-トリクロロフェノール標準原液の一定量を，ヘキサンで正確に希釈し，1 mL 中に 2,4,6-トリクロロフェノールとしてそれぞれ 0.2，0.4，0.6，0.8，1，2，4，6，8，10，
20，40，60，80 及び 100 ng を含有する各 2,4,6-トリクロロフェノール標準液を調製した．
4)

検量線作成用標準液3)の各 2,4,6-トリクロロフェノール標準液各 1 mL を GC-MS 用バイアルに正確に入れ，これに N,O-ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド 50 μL を加え，ふたをして軽く振り混ぜ，GC-MS による測定に供する各検量線作成用標準液とした．

2.1.3
1)

装置及び器具粉砕機：
粉砕機 1（籾米用）：
ZM-100

Retsch 製（目開き 1 mm スクリーン，使用時回転数 14000 rpm）

粉砕機 2（稲わら及び WCRS 用）：
SM-100

Retsch 製（目開き 1 mm スクリーン，回転数（仕様）1430 rpm）

2)

振とう機：レシプロシェーカーSR-2W タイテック製（使用時振とう数 300 rpm）

3)

多孔性ケイソウ土カラム：Chem Elut（20 mL 保持用）Agilent Technologies 製

4)ドライブロックバス：THB-1

5)

反応管：Vacuum Hydrolysis Tube（19 × 100 mm）

6)

GC-MS：
GC 部：GC-2010

1)

Wilmad-LabGlass 製

島津製作所製MS 部：GCMS-QP2010 Plus
2.1.4

アズワン販売島津製作所製

定量方法
抽

出

分析試料 10.0 g を量って 300 mL の共栓三角フラスコに入れ，水 30 mL（籾米は 20 mL）を加え，30 分間静置した後，更にアセトン 120 mL（籾米は 100 mL）を加え，30 分間振り混ぜて抽出した．200 mL の全量フラスコをブフナー漏斗の下に置き，抽出液をろ紙（5 種 B）で吸引ろ過した後，先の三角フラスコ及び残さを順次アセトン 50 mL で洗浄し，同様に吸引ろ過した．更に全量フラスコの標線までアセトンを加えた．この液 20 mL を 100 mL のなす形フラス
コに正確に入れ，40 °C 以下の水浴で 3 mL 以下まで減圧濃縮し，カラム処理に供する試料溶液
とした．
2)

カラム処理
試料溶液を多孔性ケイソウ土カラムに入れ，10 分間静置した．300 mL のなす形フラスコをカラムの下に置き，試料溶液の入っていたなす形フラスコを酢酸エチル 20 mL ずつで 3 回洗浄し，洗液を順次カラムに加え，液面が充てん剤の上端に達するまで流下してプロクロラズを溶出させた．更に酢酸エチル 100 mL をカラムに加えて同様に溶出させた．溶出液にアセトン－
ジエチレングリコール（49+1）1 mL を加え，40 °C 以下の水浴で約 1 mL まで減圧濃縮し，5mL の全量フラスコに入れた．溶出液の入っていたなす形フラスコを酢酸エチル 1 mL ずつで 3回洗浄し，洗液を順次先の全量フラスコに合わせた．更に全量フラスコの標線まで酢酸エチル
を加え，分解に供する試料溶液とした．

飼料用稲中のプロクロラズのガスクロマトグラフ質量分析計による定量法の開発及び共同試験

3)

5

分解
試料溶液 1 mL を反応管に正確に入れ，40 °C 以下で加温しながら窒素ガスを送って乾固させた．残留物に塩化ピリジニウム 1 g を加え，真空ポンプで吸引して反応管内を減圧した後密封した．これをドライブロックバスを用いて 200 °C で 3 時間加熱した後放冷し，ヘキサン転溶
に供した．

4)

ヘキサン転溶反応管を開封し，塩酸（1+50）5 mL を加えて内容物を溶かし，内容物を 50 mL の共栓遠心
沈殿管に入れた．反応管を塩酸（1+50）5 mL ずつで 3 回洗浄し，洗液を順次共栓遠心沈殿管に加えた．ヘキサン 4 mL を共栓遠心沈殿管に正確に加え，5 分間振り混ぜた．1000×g で 5 分
間遠心分離し，更にヘキサン層の一部を 5000×g で 5 分間遠心分離した．上澄み液 1 mL を GCMS 用バイアルに正確に入れた．これに N,O-ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトア
ミド 50 μL を加え，ふたをして軽く振り混ぜ，GC-MS による測定に供する試料溶液とした．

5)

GC-MS による測定
試料溶液及び各検量線作成用標準液各 2 µL を GC-MS に注入し，選択イオン検出（以下「SIM」という．）クロマトグラムを得た．測定条件を Table 1 に示した．
Table 1

Operation conditions of GC-MS

ColumnDB-1MS (0.32 mm i.d. × 30 m, 0.25 μm film thickness), Agilent Technologies

Column temperature

50 °C (hold for 1 min) → ramp 20 °C/min → 280 °C (hold for 10 min)Injection mode

Splitless (60 s)

Injection port temperature

250 °C

Carrier gas

He 1.5 mL/min

Transferline temperature

250 °CIon source temperature

230 °C

Ionization

Electron ionization

Ionization energy

70 eV

Monitor ion

m /z 253 (for quantification) , 217 (for confirmation)

6)

計

算

得られた SIM クロマトグラムからピーク面積及び高さを求めて検量線を作成し，試料中の2,4,6-トリクロロフェノール量を算出し，これに 1.91 を乗じて試料中のプロクロラズ量を算出した．
なお，定量法の概要を Scheme 1 に示した．

6

飼料研究報告 Vol. 45 (2020)

Sample 10.0 g (300 mL Erlenmeyer flask)
added 30 mL of water (paddy rice: 20 mL) and allowed to stand for 30 min
added 120 mL of acetone (paddy rice: 100 mL) and shook for 30 min
filtrated through No. 5B under reduced pressure
washed with 50 mL of acetone
filled up to 200 mL with acetone
transferred 20 mL of sample solution to eggplant flask
evaporated to the volume of 3 mL under 40 °C
Chem Elut
applied sample solution to Chem Elut and allowed to stand for 10 min
washed the eggplant flask with 20 mL of ethyl acetate and eluted (three times)
eluted with 100 mL of ethyl acetate
added 1 mL of acetone – diethylene glycol (49:1)
evaporated to the volume of 1 mL under 40 °C
transferred to 5 mL volumetric flask
washed with 1 mL of ethyl acetate (three times)
filled up to 5 mL with ethyl acetate
Decomposition
1 mL of sample solution
dried with nitrogen
added 1 g of pyridinium chloride and vacuumed
heated to 200 °C for 3 hours
dissolved in 5 mL of hydrochloric acid (1:50) and transferred to 50 mL centrifuge tube
washed with 5 mL of hydrochloric acid (1:50) (three times)
added 4 mL of hexane and shook for 5 min
centrifuged at 1000×g and transferred hexane layer to tube
centrifuged at 5000×g and transferred 1 mL of supernatant to GC-MS vial
added 50 μL of N ,O -bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide
GC-MS

Scheme 1

Analytical procedure for prochloraz in rice straw, whole-crop rice silage (WCRS)
and paddy rice for feed

2.1.5

窒素乾固における損失の防止の検討
2,4,6-トリクロロフェノール標準原液の一定量を酢酸エチルで正確に希釈し，1 mL 中に 2,4,6-

トリクロロフェノールとして 5 ng を含有する標準液を調製した．標準液 2 mL ずつを 50 mL のな
す形フラスコに正確に入れ，窒素ガスを吹き付け乾固させた後，更にそれぞれ窒素ガスを 0 秒間，
30 秒間及び 60 秒間吹き付けたものを調製した．同様に標準液 2 mL ずつを 50 mL のなす形フラスコに正確に入れ，アセトン－ジエチレングリコール（49+1）0.1 mL を加え窒素ガスを吹き付け乾固させた後，更にそれぞれ窒素ガスを 0 秒間，30 秒間及び 60 秒間吹き付けたものを調製した．ヘキサン 2 mL を正確に加えて残留物を溶かし，その 1 mL を GC-MS 用バイアルに正確に入れた．N,O-ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド 50 μL を加え，ふたをして軽く振り混ぜ，GC-MS による測定に供する試料溶液とした．
2.1.6

添加回収試験
2.1.2 の 2) のプロクロラズ標準原液及び 3)の 2,4,6-トリクロロフェノール標準原液をアセトン

飼料用稲中のプロクロラズのガスクロマトグラフ質量分析計による定量法の開発及び共同試験

7

で正確に希釈し添加に用いた．
プロクロラズとして，稲わらに 0.02 及び 0.2 mg/kg 相当量（最終試料溶液中で 2,4,6-トリクロ
ロフェノールとして 0.524 及び 5.24 ng/mL），WCRS に原物換算して 0.00889 及び 0.0889 mg/kg
相当量（同 0.524 及び 5.24 ng/mL），籾米に 0.02 及び 2 mg/kg 相当量（同 0.524 及び 52.4 ng/mL），
2,4,6-トリクロロフェノールとして，稲わらに 0.01 及び 0.1 mg/kg 相当量（最終試料溶液中で 0.5
及び 5 ng/mL），WCRS に原物換算して 0.00444 及び 0.0444 mg/kg 相当量（同 0.5 及び 5 ng/mL），
籾米に 0.01 及び 1 mg/kg 相当量（同 0.5 及び 50 ng/mL）になるようにそれぞれ添加後よく混合し，一夜静置した後に本法に従って定量し，平均回収率及び繰返し精度を求めた．
なお，本法はプロクロラズを 2,4,6-トリクロロフェノールに分解して定量するため，添加回収試験はプロクロラズ及び 2,4,6-トリクロロフェノールをそれぞれ単独で添加して実施した．
また，WCRS において，添加は風乾物試料に対してプロクロラズとして 0.02 及び 0.2 mg/kg，
2,4,6-トリクロロフェノールとして 0.01 及び 0.1 mg/kg 相当量になるよう行い，原物中濃度への換
算は，原物中及び風乾物中の水分含有量を 60 %及び 10 %と想定して，原物（水分含有量 60 %）中濃度＝風乾物（水分含有量 10 %）中濃度／2.25 の式により行った．
2.2
2.2.1

共同試験
試

料

プロクロラズ（代謝物を含む）を含有しないことを確認した稲わら及び籾米を，目開き 1 mmのスクリーンを装着した粉砕機で粉砕した．また，WCRS を 60 °C 以下で 5 時間乾燥し，更に室内に静置して風乾した後，同様に粉砕した．これらについて，約 12 g ずつ小分けしたもの（試料名は非明示）各 2 袋を試験用試料として計 6 袋を各試験室に配付した．
2.2.2
1)

試

薬

アセトン，酢酸エチル及びヘキサンは残留農薬・PCB 試験用又はこれ以上のものを用いた．
N,O-ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドはガスクロマトグラフ用（和光純薬工業製）を用いた．ジエチレングリコール及び塩酸は試薬特級又はこれ以上の純度のものを用いた．塩化ピリジニウムは試薬一級又はこれ以上の純度のものを用いた．水は超純水（JISK0211 の 5218 に定義された超純水）又は市販の液体クロマトグラフ用又はこれ以上のものを
用いた．

2)

プロクロラズ標準原液
2.1.2 の 2)と同様にプロクロラズ標準原液を調製した．

3)

2,4,6-トリクロロフェノール標準原液
2.1.2 の 3)と同様に 2,4,6-トリクロロフェノール標準原液を調製した．

4)

検量線作成用標準原液3)で調製した 2,4,6-トリクロロフェノール標準原液 2.5 mL を 250 mL の全量フラスコに入れ，更に標線までアセトンを加えて，1 mL 中に 2,4,6-トリクロロフェノールとして 5 µg を含有す
る検量線作成用標準原液を調製した．

5)

稲わら及び WCRS 添加用標準液2)で調製したプロクロラズ標準原液 2 mL を 500 mL の全量フラスコに入れ，更に標線までア
セトンを加え，1 mL 中にプロクロラズとして 2 µg を含有する稲わら及び WCRS 添加用標準液

8

飼料研究報告 Vol. 45 (2020)を調製した．
6)

籾米添加用標準液2)で調製したプロクロラズ標準原液 10 mL を 250 mL の全量フラスコに入れ，更に標線までアセトンを加え，1 mL 中にプロクロラズとしてそれぞれ 20 µg を含有する籾米添加用標準液を調製した．
1)の N,O-ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド並びに濃度を非表示にした 4)の

1 本，5)の 4 本及び 6)の 2 本を，2.2.1 の試験用試料と併せて各試験室に配付した．
2.2.3

分析試料
非明示の 2 点反復で，2.2.1 の試験用試料を用いた．分析試料としては，プロクロラズとして

稲わら及び WCRS にそれぞれ 0.2 mg/kg 相当量（試験用試料 10 g に対して稲わら及び WCRS 添
加用標準液 1 mL 添加）を，籾米にそれぞれ 2 mg/kg 相当量（試験用試料 10 g に対して籾米添加用標準液 1 mL 添加）を，各試験室にて分析開始の前日に添加して調製した試料を用いた．
2.2.4

定量方法
2.1.4 によった．

2.2.5

報告方法
2.2.3 の分析試料 6 点の分析値は，分析試料中濃度（mg/kg）で表し，4 桁目を四捨五入して有効桁数 3 桁まで報告させることとした．
2.2.6

分析実施期間平成 28 年 12 月 14 日から平成 29 年 2 月 3 日まで

2.2.7

解析方法
結果の解析については，国際的にハーモナイズされた共同試験に関する手順 8), 9) を参考に，

Cochran 検定，single Grubbs 検定及び paired Grubbs 検定を行い，外れ値の有無を確認した上で平均回収率，繰返し精度（RSDr）及び室間再現精度（RSDR）を算出し，得られた RSDR から，修正 Horwitz 式 10)を用いて HorRat を求めた．
2.2.8

参加試験室
一般財団法人東京顕微鏡院

食と環境の科学センター，一般財団法人日本穀物検定協会

研究所，一般財団法人日本食品分析センター
品質安全部

中央

多摩研究所，JA 東日本くみあい飼料株式会社

分析・開発センター，一般財団法人マイコトキシン検査協会，独立行政法人農林水産消費安全技術センター肥飼料安全検査部，同札幌センター，同仙台センター，同名古屋センタ
ー，同神戸センター及び同福岡センター（計 11 試験室）

3
3.1

分析法開発

3.1.1

検量線

結果及び考察2.1.2 の 4)に従って調製した 2,4,6-トリクロロフェノール標準液の各検量線作成用標準液各 2 µL
を GC-MS に注入し，得られた SIM クロマトグラムからピーク面積及び高さを用いて検量線を作成した．得られた検量線の一例は，Fig. 2 のとおりであり，2,4,6-トリクロロフェノールは 0.2~10
ng/mL（注入量として 0.04~20 pg 相当量）及び 10~100 ng/mL（注入量として 20~200 pg 相当量）の範囲で直線性を示した．

飼料用稲中のプロクロラズのガスクロマトグラフ質量分析計による定量法の開発及び共同試験

9

なお，当該検量線の濃度範囲は，プロクロラズを 0.0076~0.38 mg/kg 及び 0.38~3.8 mg/kg 又は
2,4,6-トリクロロフェノールを 0.004~0.2 mg/kg 及び 0.2~2 mg/kg 含有する分析用試料を本法に従い調製した最終試料溶液中の 2,4,6-トリクロロフェノール濃度範囲に相当する．
200000y = 2233171x - 4194.014
R² = 0.9997

20000015000010000050000

Peak height / arb. units

Peak area/ arb. units

250000150000100000
50000

0

0
0

20
40
60
80
100
Concentration of 2,4,6-trichlorophenol / [ng/mL]

0

20
40
60
80
100
Concentration of 2,4,6-trichlorophenol / [ng/mL]

20000
y = 1964807x - 69.86214
R² = 0.9996

20000
15000
10000
5000

Peak height / arb. units

25000
Peak area/ arb. units

y = 1778329x - 2557.167
R² = 0.9953

y = 1568232x + 7.533981
R² = 0.9999

15000
10000
5000

0

0
0

2
4
6
8
10
Concentration of 2,4,6-trichlorophenol / [ng/mL]

Fig. 2

0

2
4
6
8
10
Concentration of 2,4,6-trichlorophenol / [ng/mL]

Calibration curves of 2,4,6-trichlorophenol derivative

Peak area (left), peak height (right), 10~100 ng/mL (upper), 0.2~10 ng/mL (lower)
3.1.2

多孔性ケイソウ土カラムによる精製の適用の検討
2.1.4 の 1)により調製した試料溶液を JFRL 法に従い 500 mL の分液漏斗を用いて液液分配に供したところ，稲わら及び WCRS でエマルジョンが発生した．エマルジョンは静置しておけば消滅するものであったが，消滅するのに 15 分以上かかるものもあり，液液分配の操作に長時間を要した．そこで，多孔性ケイソウ土カラムの使用を検討した．
2.1.4 の 1)により調製したカラム処理に供する試料溶液にプロクロラズとして 200 ng（最終試料溶液中で 2,4,6-トリクロロフェノールとして 5.24 ng/mL 相当量）及び 2,4,6-トリクロロフェノールとして 100 ng（最終試料溶液中で 5 ng/mL 相当量）をそれぞれ添加し，多孔性ケイソウ土カラムからの溶出画分を確認した．その結果は Table 2 のとおりであり，プロクロラズ及び 2,4,6-ト
リクロロフェノールは酢酸エチル 160 mL で全て溶出した．このことから，JFRL 法の液液分配の代わりに多孔性ケイソウ土カラムによる精製を行うこととし，溶出溶媒は酢酸エチル 160 mL と
した．

10

飼料研究報告 Vol. 45 (2020)

Table 2Elution pattern of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol from Chem Eluta)

Feed types

Rice Straw
WCRS
Paddy rice

Recovery (%)
Ethyl acetate (mL)

Spiked components

Total

0~100

100~120120~140140~160

160~180180~200

Prochloraz

94

3

3

1

0

0

101

2,4,6-Trichlorophenol

98

7

2

0

0

0

107

Prochloraz

91

1

1

0

0

0

93

2,4,6-Trichlorophenol

87

1

0

0

0

0

88

Prochloraz

86

12

6

3

0

0

107

2,4,6-Trichlorophenol

101

0

0

0

0

0

101

a) Mean (n = 2)
3.1.3

分解に供する試料溶液の調製方法の変更

JFRL 法では酢酸エチル転溶後に減圧濃縮，窒素乾固，アセトン 2 mL で溶解し，その 1 mL を分解に供している．しかし，稲わら及び WCRS では，窒素乾固時に約 0.5 mL 程度の残留物が生じ，多孔性ケイソウ土カラムを用いた方法でも同程度の残留物が生じた．これをアセトン 2 mLで溶解し，その 1 mL を分解に供することは，定量操作において不正確であることから，カラム
処理後の溶出液を 40 °C 以下の水浴で約 1 mL まで減圧濃縮した試料液を，5 mL の全量フラスコで定容し，その 1 mL を分解に供することとした．
3.1.4

窒素乾固における損失の防止
窒素気流による乾固操作における分析対象成分の損失の有無を確認するため，プロクロラズ標

準液及び 2,4,6-トリクロロフェノール標準液をそれぞれ反応管に入れ窒素乾固し分解したところ，
プロクロラズの回収率はほぼ 100 %であったが，2,4,6-トリクロロフェノールは 0 %に近い低回収率であった．
そこで，2.1.5 に従い検討を行ったところ，Table 3 のとおり，アセトン－ジエチレングリコー
ル（49+1）を加えることにより，2,4,6-トリクロロフェノールの損失を防止することができた．
そこで，カラム処理後の溶出液にアセトン－ジエチレングリコール（49+1）1 mL を加えることとした．
Table 3

Loss of 2,4,6-trichlorophenol due to drynessa)Acetone – diethylene glycol (49:1)

Recovery (%)
Duration of N2 gas spray after drying up
0s

Spiked114

Not spiked

22.6

30 s
105
6.3

60 s
94
0.0

a) Mean (n = 2)
3.1.5

妨害物質の検討稲わら 2 検体，WCRS 2 検体及び籾米 2 検体を試料として，2.1.4 により調製した試料溶液をGC-MS に注入し，得られた SIM クロマトグラムを確認したところ，WCRS 1 検体において妨害
ピーク（風乾物試料に対して 0.001 mg/kg）が認められた．他の試料については定量を妨げるピ

11

飼料用稲中のプロクロラズのガスクロマトグラフ質量分析計による定量法の開発及び共同試験

ークは認められなかった．
そこで検出したピークの定量イオンと確認イオンの強度比を確認したところ，プロクロラズ（2,4,6-トリクロロフェノール）ではなく，妨害ピークと判断した．しかし，その面積は 3.1.8 で確認された定量下限に相当するピーク面積の 1/10 未満であり，飼料分析基準別表 3 の試験法の妥当性確認法ガイドライン（以下「妥当性確認法ガイドライン」という．）に定める選択性の許容範囲であることから，試験に支障のないものと判断した．
なお，得られた SIM クロマトグラムの一例を Fig. 3 に示した．
2000

A

B

1500

Intensity/arb. units

Intensity/arb. units

2000

1000

500

1500

1000

500

0
7.2

7.4

7.6

7.8

8

8.2

0

Retention time / min

7.2

7.4

7.6

7.8

8

8.2

Retention time / min
2000

C

1500

Intensity/arb. units

Intensity/arb. units

2000

1000

500

0

D

1500

1000

500

0

7.2

7.4

7.6

7.8

8

8.2

7.2

7.4

Retention time / minFig. 3

7.6

7.8

8

8.2

Retention time / min

Typical Selected Ion Monitoring (SIM) chromatograms of 2,4,6-trichlorophenol derivativein standard and blank sample solutions(GC-MS conditions are shown in Table 1.

Arrows indicate the retention time of 2,4,6-

trichlorophenol derivative.)
A: Standard solution (0.2 ng/mL)
B: Blank sample solution (rice straw)
C: Blank sample solution (WCRS)
D: Blank sample solution (paddy rice)
3.1.6

マトリックス効果の確認
2.1.4 の 1) から 4)により調製した稲わら，WCRS 及び籾米の N,O-ビス（トリメチルシリル）ト

リフルオロアセトアミドを加える前のブランク試料溶液 1 mL に，2,4,6-トリクロロフェノールとして 0.1 mg/kg 相当量（プロクロラズとして 0.191 mg/kg 相当量，最終試料溶液中で 5 ng/mL）及び N,O-ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド 50 μL をそれぞれ添加した各マトリックス標準液について，ヘキサン 1 mL に 2,4,6-トリクロロフェノールとして 0.1 mg/kg 相当量（同 0.191 mg/kg 相当量，同 5 ng/mL）及び N,O-ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセト
アミド 50 μL をそれぞれ添加した標準液に対するピーク面積比を確認したところ，Table 4 のとお12

飼料研究報告 Vol. 45 (2020)

りであり，2,4,6-トリクロロフェノールは試料マトリックスによる大きな影響を受けることなく測定可能であった．
Table 4
Matrix effect study
Concentration of 2,4,6-trichlorophenol
Samplesin matrix standard
solution (ng/mL)

Rice strawa)in sample asprochloraz (mg/kg)b)

Matrix effect
(%)

5

0.191

109

WCRS

5

c)

110

Paddy rice

5

0.191
0.191

115

n=1
a) Converted from the concentration in matrix standard solutionb) Ratio of peak area of 2,4,6-trichlorophenol in the presence of matrix to that in theabsence of matrixc) mg/kg air-dry matter
3.1.7

添加回収試験
2.1.6 により添加回収試験を実施した．その結果は Table 5 のとおり，プロクロラズについては

平均回収率 101~117 %，その繰返し精度は相対標準偏差（RSDr）として 15 %以下，2,4,6-トリク
ロロフェノールについては平均回収率 99.3~117 %，RSDr として 12 %以下の成績が得られ，妥当性確認法ガイドラインに定められた真度及び併行精度の目標値（真度：70 %以上 120 %以下，精度：0.01，0.02 及び 0.1 mg/kg では 22 %以下，0.2 mg/kg では 20 %以下，1 mg/kg では 16 %以下，
2 mg/kg では 14 %以下）を満たしていた．
なお，得られた SIM クロマトグラムの一例を Fig. 4 に示した．

13

飼料用稲中のプロクロラズのガスクロマトグラフ質量分析計による定量法の開発及び共同試験

Table 5
Spiked components

Prochloraz

2,4,6-Trichlorophenol

Recoveries for prochloraz and 2,4,6-trichlorophenolc)

Rice Straw

WCRS

Spiked level(mg/kg as fed
basis)

Recovery(%)

0.00889
0.02
0.08890.2
20.00444

－
114
－
109
－
－

－
12
－
11
－
－

108

13

－
117
－
－
117

0.01

109

4.3

0.0444

－

0.1

99.3

1

－

－

a)

b)
RSDr

a)

b)
RSDr

Paddy ricea)b)

Recovery
(%)

RSDr
(%)

－
4.8
－
－
6.4

－
102
－
－
101
－

－
15
－
－
5.5
－

－

－

117

6.4

－

110

12

－

－

3.0

－

－

－

－

－

－

114

7.6

(%)

Recovery(%)(%)－: Not testeda) Mean (n = 5)b) Relative standard deviation of repeatabilityc) Prochloraz and 2,4,6-trichlorophenolwere spiked to air-dried WCRS samples one night prior to extraction.
The spiked levels were 0.02 and 0.2 mg/kg as air-dry basis for prochloraz, and 0.01 and 0.1 mg/kg as airdry basis for 2,4,6-trichlorophenolrespectively.

The levels of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenolin as

fed basis were calculated with following equation on the assumption that the moisture content of WCRS
samples was 60 % as fed basis and 10 % as air-dry basis.
The levels of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol as fed basis (moisture 60 %)= the levels of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol as air-dry basis (moisture 10 %) / 2.25

14

飼料研究報告 Vol. 45 (2020)
4000

4000

A

B
3000

Intensity/arb. units

Intensity/arb. units

3000

2000

1000

2000

1000

0
7.2

7.4

7.6

7.8

8

0

8.2

7.2

Retention time / min

7.6

7.8

8

8.2

Retention time / min
4000

C

3000

Intensity/arb. units

Intensity/arb. units

4000

7.4

2000

1000

0

D

3000

2000

1000

0
7.2

7.4

7.6

7.8

8

8.2

Retention time / minFig. 4

7.2

7.4

7.6

7.8

8

8.2

Retention time / min

Typical SIM chromatograms of 2,4,6-trichlorophenol derivativein standard and spiked sample solutions(GC-MS conditions are shown in Table 1.

Arrows indicate the retention time of 2,4,6-

trichlorophenol derivative.)
A: Standard solution (The concentration is 0.6 ng/mL as 2,4,6-trichlorophenol.)
B: Sample solution of rice straw spiked at 0.02 mg/kg of prochloraz (The concentration in
the sample solution is about 0.5 ng/mL as 2,4,6-trichlorophenol.)
C: Sample solution of WCRS spiked at 0.02 mg/kg of prochloraz (The concentration in
the sample solution is about 0.5 ng/mL as 2,4,6-trichlorophenol.)
D: Sample solution of paddy rice spiked at 0.02 mg/kg of prochloraz (The concentrationin the sample solution is about 0.5 ng/mL as 2,4,6-trichlorophenol.)
3.1.8

定量下限及び検出下限
2,4,6-トリクロロフェノールの検量線が直線性を示した範囲，2,4,6-トリクロロフェノールとして 0.2~100 ng/mL の下端付近となる濃度（稲わら，WCRS 風乾物及び籾米にプロクロラズとして
0.02 mg/kg 相当量（最終試料溶液中で 2,4,6-トリクロロフェノールとして 0.5 ng/mL 相当量））の添加回収試験の結果，得られたピークの SN 比が 10 以上であったため，プロクロラズの定量下限
は稲わら，WCRS 風乾物及び籾米で 0.02 mg/kg とした．この濃度は、プロクロラズの稲わらの管理基準値及び WCRS の管理基準値の風乾物中換算値（それぞれ 0.2 及び 0.225 mg/kg）に対してそれぞれ 1/10 及び 1/11 であり，妥当性確認法ガイドラインに定められた目標値（1/5 以下）を満たしていた．なお、Table 5 に示したとおり，当該定量下限濃度における添加回収試験結果は良好であった．
本法の検出下限を確認するため，添加回収試験により得られたピークの SN 比が 3 となる濃度を求めた．その結果，検出下限は稲わら，WCRS 風乾物及び籾米でプロクロラズとして 0.006

15

飼料用稲中のプロクロラズのガスクロマトグラフ質量分析計による定量法の開発及び共同試験mg/kg であり，同様に妥当性確認法ガイドラインに定められた目標値（1/10 以下）を満たしてい
た．
3.2

共同試験
開発した分析法の室間再現精度を確認するため，2.2 により共同試験を実施した．
結果は Table 6 のとおりであった．稲わら，WCRS 及び籾米についてそれぞれ，平均回収率は99.1，101 及び 97.6 %，RSDr は 10，4.3 及び 4.6 %，RSDR は 14，18 及び 18 %，HorRat は 0.68，
0.91 及び 1.2 であり，妥当性確認法ガイドラインに定められた室間再現精度の目標値（稲わら及び WCRS については 41 %以下，籾米については 29 %以下）を満たしていた．
参考のため，各試験室で使用した LC-MS/MS の機種等を Table 7 に示した．
Table 6
Lab. No.

WCRS

Paddy rice(mg/kg)(mg/kg)(mg/kg)

1

0.166

2

0.218

3

Collaborative study for prochloraz

Rice straw
0.206
0.225
b)

0.183

1.79

1.99

0.225

0.206

2.12

2.27

0.277

0.296

2.62

2.68

0.213

0.192

1.92

1.78

4

0.296
0.241

5

0.193

0.188

0.186

0.182

1.80

1.86

6

0.206

0.209

0.203

0.197

1.90

1.88

7

0.152

0.155

0.150

0.154

1.31

1.30

8

0.178

0.183

0.212

0.202

2.11

2.02

9

0.224

0.224

0.219

0.214

1.97

2.12

10

0.198

0.172

0.162

11

0.170

0.310
0.213

b)

0.196

0.243

0.162
a)

0.2
10

10

10

No. outliers
Mean value (mg/kg)

1

1

1

Mean recovery (%)

99.1

RSDr (%)

e)

10

4.3

4.6

f)

14

18

18

g)

20
0.68

20
0.91

14
1.2

No. labsc)d)

RSDR (%)
PRSDR (%)
HorRat

0.198

0.202
101

1.71

1.70
a)

0.187
0.2

Spiked level (mg/kg)

0.252

1.90
a)

2.45

a)

2

1.95
97.6

a) Data excluded by Cochran test.
b) Data excluded by single Grubbs test.
c) Number of laboratories retained after eliminating outliersd) Number of outlier laboratories removed in parenthesese) Relative standard deviation of repeatability within laboratoryf) Relative standard deviation of reproducibility between laboratoriesg) Predicted relative standard deviation of reproducibility between laboratories calculated from themodified Horwitz equation

16

飼料研究報告 Vol. 45 (2020)

Table 7

Lab.
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

Instruments used in the collaborative study
GC column
GC-MS(i.d. × length, film thickness)
GCMS-QP2010 Plus, Shimadzu
DB-1MS, Agilent Technologies(0.32 mm × 30 m, 0.25 µm)
GC: 7890A, Agilent Technologies
DB-1MS, Agilent Technologies
MS: 5975C, Agilent Technologies(0.25 mm × 30 m, 0.25 µm)
GC: 6890N, Agilent Technologies
DB-1MS, Agilent Technologies
MS: 597 inertMSD, Agilent Technologies(0.32 mm × 30 m, 0.25 µm)
GCMS-QP2010 Plus, Shimadzu
DB-1MS, Agilent Technologies(0.32 mm × 30 m, 0.25 µm)
GCMS-QP2010 Plus, Shimadzu
DB-1MS, Agilent Technologies(0.32 mm × 30 m, 0.25 µm)
GC: 6890, Agilent Technologies
HP-5MS, Agilent Technologies
MS: 5973, Agilent Technologies(0.25 mm × 30 m, 0.25 µm)
GC: 7890A, Agilent Technologies
Rxi-1MS, Restek
MS: 5975C Inert XL MSD, Agilent Technologies(0.25 mm × 30 m, 0.25 µm)
GCMS-QP2010 Plus, Shimadzu
DB-1MS, Agilent Technologies(0.32 mm × 30 m, 0.25 µm)
GC: 7890A, Agilent Technologies
HP-1MS, Agilent Technologies
MS: 5975C, Agilent Technologies(0.25 mm × 30 m, 0.25 µm)
GCMS-QP2010, Shimadzu
DB-1MS, Agilent Technologies(0.32 mm × 30 m, 0.25 µm)
GC: 7890A, Agilent Technologies
DB-1MS, Agilent Technologies
MS: 5975C, Agilent Technologies(0.32 mm × 30 m, 0.25 µm)

4まとめ

飼料用稲に残留するプロクロラズについて，JFRL 法を基に，GC-MS を用いた定量法を開発するとともに，共同試験を実施し，飼料分析基準への適用の可否について検討したところ，①液液分配をケイソウ土カラムによる精製に変更，②酢酸エチル転溶後のアセトン 2 mL 添加を 5 mL の全量
フラスコを用いた定容に変更，③カラム処理後の溶液にアセトン－ジエチレングリコール（49+1）
0.1 mL を加えることで，以下の結果が得られ，適用が可能であると考えられた．
1)

検量線は，0.2~10 ng/mL（注入量として 0.4~20 pg 相当量）及び 10~100 ng/mL（注入量として20~200 pg 相当量）の範囲で直線性を示した．
なお，当該検量線の濃度範囲は，プロクロラズを 0.0076~0.38 mg/kg 及び 0.38~3.8 mg/kg 又は
2,4,6-トリクロロフェノール 0.004~0.2 mg/kgg 及び 0.2~2 mg/kg 含有する分析用試料を本法に従い調製した最終試料溶液中の 2,4,6-トリクロロフェノール濃度範囲に相当する．

2)

稲わら，WCRS 及び籾米について，本法に従って得られたクロマトグラムには，定量を妨げる
ピークは認められなかった．

3)

本法に従い得られる試料溶液についてマトリックス効果を確認した結果，2,4,6-トリクロロフ
ェノールは試料マトリックスによる大きな影響を受けることなく測定可能であった．

飼料用稲中のプロクロラズのガスクロマトグラフ質量分析計による定量法の開発及び共同試験

4)17

プロクロラズとして，稲わらに 0.02 及び 0.2 mg/kg 相当量，WCRS に原物換算して 0.00889 及
び 0.0889 mg/kg 相当量，籾米に 0.02 及び 2 mg/kg 相当量，2,4,6-トリクロロフェノールとして稲わらに 0.01 及び 0.1 mg/kg 相当量，WCRS に原物換算して 0.00444 及び 0.0444 mg/kg 相当量，籾
米に 0.01 及び 1 mg/kg 相当量を添加し，本法に従って 5 点併行分析を実施し，回収率及び繰返し
精度を求めたところ，妥当性確認法ガイドラインに定められた真度及び併行精度の目標値を満たす良好な結果が得られた．

5)

本法のプロクロラズの定量下限は試料中で 0.02 mg/kg，検出下限は 0.006 mg/kg であった．設定
した定量下限及び検出下限は，妥当性確認法ガイドラインに定められた目標値を満たしていた．

6)

稲わら，WCRS 及び籾米にプロクロラズとしてそれぞれ 0.2，0.2 及び 2 mg/kg 相当量を添加した試料を用いて 11 試験室において本法に従い共同試験を実施したところ，妥当性確認法ガイド
ラインに定められた室間再現精度の目標値を満たす良好な結果が得られた．

謝

辞共同試験に参加していただいた一般財団法人東京顕微鏡院
法人日本穀物検定協会
本くみあい飼料株式会社

食と環境の科学センター，一般財団

中央研究所，一般財団法人日本食品分析センター
品質安全部

多摩研究所，JA 東日分析・開発センター，一般財団法人マイコトキシン検査協会における関係者各位に感謝の意を表します．

文
1)

献

一般社団法人日本植物防疫協会：農薬ハンドブック 2016 年版（改訂新版），420-421，東京，
日本植物防疫協会，(2016) (ISBN: 978-4-88926-146-2).

2)農林水産省畜産局長通知：飼料の有害物質の指導基準及び管理基準について，昭和 63 年 10 月
14 日，63 畜 B 第 2050 号 (1988).

3)

厚生省告示：食品，添加物等の規格基準，昭和 34 年 12 月 28 日，厚生省告示第 370 号 (1959).

4)

布施 淳一，金森 久幸，井手吉 範久：GC による野菜・果実中のプロクロラズの分析法，食品
衛生学雑誌，41，61-65 (2000).

5)

財団法人日本食品分析センター：平成 21 年度飼料中の有害物質等分析法開発委託事業（飼料中の有害物質等の分析法の開発）(2010).

6)

農林水産省消費・安全局長通知：飼料分析基準の制定について，平成 20 年 4 月 1 日，19 消安
第 14729 号 (2008).

7)

厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知：食品に残留する農薬，飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法について，平成 17 年 1 月 24 日，食安発第 0124001 号 (2005).

8)

William Horwitz: Protocol for design, conduct and interpretation of method-performance studies, Pure &Appl. Chem., 67(2), 331-343 (1995).

9)George W. Latimer, Jr.: Official methods of analysis of AOAC INTERNATIONAL 20th edition,
Appendix D, Guidelines for collaborative study procedures to validate characteristics of a method ofanalysis. Gaithersburg, MD, USA (2016) (ISBN: 978-0-935584-87-5).

10)Michael Thompson: Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations inrelation to fitness for purpose criteria proficiency testing, Analyst, 125, 385-386 (2000).