シングルセル・微量RNAからの『RT-RamDA®法』
を用いたcDNA調製キット
次世代シーケンス解析用 cDNA 調製キット

GenNext® RamDA-seq® Single Cell Kit
リアルタイム PCR 解析用 cDNA 調製キット

RT-RamDA® cDNA Synthesis Kit
シングルセルや微量 RNA に対応
1 〜 100 細胞または 10pg 〜 1ng total RNA から cDNA の調製が可能です

完全長 cDNA の調製が可能
Oligo-dT primer のみを用いる既存法では困難であった 10kb 以上のターゲット RNA から cDNAの調製が可能であり、RNA 全長からシーケンスリードが得られます
10kb
5,794kb

5,796kb

5,798kb

5,800kb

5,802kb

RamDA-seq®
A社キット
Malat1(IncRNA)poly(A) RNA に加え、non-poly(A) RNA の検出が可能
Oligo-dT primer に加え、NSR（Not so random primer）または random primer を使用することで、既存法では検出できなかった non-poly(A) RNA の検出も可能です

既存法に比べ検出遺伝子数がアップ
ヒストン RNA、lncRNA、pre-mRNA、circRNA などを含むさまざまな RNA の検出が可能です
Mouse ES RNA 10pg から 2 種類のキット (N=2) で cDNA 調製後、NGS 解析を実施

F'1$ 6\QWKHVLV 0HWKRG
1XPEHU RI WUDQVFULSWV 730!

RamDA-seq®




A社キット



RamDA-seq® とは？

RamDA-seq® の原理
poly(A) RNA

non-poly(A) RNA¶

1. RT primer annealingAA

5DQGRPSULPHURU1RWVRUDQGRPSULPHU

51$¶¶TTTTTT

51DVH+PLQXV
57DVH

3. Random cDNA cleavage
in RNA-DNA hybrid¶

5DQGRPSULPHURU
1RWVRUDQGRPSULPHU

2OLJRG7SULPHU

2. cDNA synthesis
F'1$

A A AAA

AAAA
AAAA
AAA
AA
TT
TTT
TTT

51$
A

'1$
F'1$

51DVH+PLQXV
57DVH

AA
A A AAA
TT
TTT
TTT'1DVH,'1DVH,4. Strand displacement
ampliﬁcationAA
T T A A AAA
TTT
TTT

7JHQHSURWHLQ
TT

TTT7JHQHSURWHLQ

TTT$PSOLILHGF'1$V$PSOLILHGF'1$V

二本鎖合成
次世代シーケンス用ライブラリー調製
次世代シーケンス解析
RamDA-seq®（ラムダセック）は、理化学研究所 生命機能科学研究センター バイオインフォマティクス研究開発チームが開発した1細胞完全長トータルRNAシーケンス法「Random Displacement Ampliﬁcation sequencing」の略です。
既存の1細胞RNA解析法では、Oligo-dT primerのみを用いて逆転写するため、non-poly(A)RNAは合成できず、また途中でcDNA合成が止まった場合、全長の検出が困難でした。一方、RamDA-seq®法では、random primerあるいはNSR primer*を使用するため、poly(A)配列以外からも合成が可能であり、non-poly(A) RNAも検出できます。
また、これらprimerがRNAのさまざまな場所に結合しcDNA合成が開始されるため、RNA全長からシーケンスリードを得ることができます。
さらにRamDA-seq®法は、cDNAが合成と同時に増幅されるため、従来法で実施している増幅用アダプター付加やPCRが必要なく増幅のバイアスを抑えることが可能です。
＊NSR Primerとは、Not so random primerの略で、18S、28S RNA遺伝子に完全にマッチする配列を計算上除外したrandom primerのことです。random primerの代わりにNSR Primerを用いることで、rRNAからのcDNA合成を抑制できます。
※RamDA-seq®とRT-RamDA®は理化学研究所の商標です。

GeneNext® RamDA-seq® Single Cell Kit

RT-RamDA® cDNA Synthesis Kit

1〜100細胞 or 10pg〜1ng total RNA

1〜100細胞 or 10pg〜1ng total RNA

細胞溶解 or RNA希釈(液量3μL)

細胞溶解 or RNA希釈(液量3μL)

1.5min.

熱変性反応

1.5min.

熱変性反応

5min.

ゲノム除去反応(3μL添加)

5min.

ゲノム除去反応(3μL添加)

1hr. 10min.

cDNA合成および増幅反応(3μL添加)

1hr. 25min.

2nd鎖合成反応(6μL添加)

1hr. 10min.

cDNA合成および増幅反応(3μL添加)
リアルタイムPCR

Puriﬁcation
1-2 days

Nextera反応
Puriﬁcation ＆ QC
Sequence

本製品の他、磁性ビーズ Agencourt AMPure XP試薬
（Beckman Coulter）およびライブラリー調製試薬
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit（illumina)が必要です。

実施例 1SuperPrep&HOO/\VLV
SuperPrep
&HOO/\VLV 57.LWIRUT3&5 とcDNA増幅率の検証✀䚻䛾 T3&5ヨ⸆䛸⤌䜏ྜ䜟䛫䛻䜘䜛ᛶ⬟ẚ㍑

NIH3T3 total RNA 10pg から、従来の逆転写反応試薬および RT-RamDA® cDNA Synthesis Kit にて、cDNA を調製し、リアルタイム PCR により各遺伝子を測定しました。
その結果、従来の逆転写反応試薬を使用した際の cDNA量に対して、RT-RamDA® cDNA Synthesis Kit では 9 倍以上の cDNA を得ることができました。
増幅率＝10pg と 1nｇの NIH3T3 total RNA を用いて RT-RamDA®
cDNA Synthesis Kit にて cDNA を調製し、リアルタイム
PCR により 8 遺伝子 (N=3 で実施）の Ct 値を比較しました。その結果、10pg インプットと 1ng インプットで高い相関が認められ、微量のインプット量からも cDNA 調製が可能でした。
ϯϭ͘Ϭ

RT-RamDA® 法で得られた cDNA 量ϯϬ͘Ϭ

従来の逆転写反応で得られた cDNA 量
RNA 10pg input

ϯϬ͘Ϭ
Ϯϱ͘Ϭ

増幅率(倍)

SuperPrep&HOO/\VLV
SuperPrep
&HOO/\VLV 57.LWIRUT3&5 とインプット
RNA 量の検証✀䚻䛾 T3&5 ヨ⸆䛸⤌䜏ྜ䜟䛫䛻䜘䜛ᛶ⬟ẚ㍑

実施例 2ϮϬ͘Ϭϭϱ͘ϬϭϬ͘ϬϮϵ͘ϬϮϴ͘ϬϮϳ͘ϬϮϲ͘ϬϮϱ͘Ϭϱ͘ϬϮϰ͘Ϭϭϳ͘ϬϬ͘Ϭ

Actb

実施例 3

Neat1Ppia

Hprt1

B2mTubaϭϴ͘Ϭϭϵ͘ϬGapdhϮϬ͘ϬϮϭ͘ϬϮϮ͘Ϭ

Ϯϯ͘Ϭ

90100

Ϯϰ͘Ϭ

RNA 1ng input

SuperPrep&HOO/\VLV
SuperPrep
&HOO/\VLV 57.LWIRUT3&5 とカバレッジの均一性の確認✀䚻䛾 T3&5 ヨ⸆䛸⤌䜏ྜ䜟䛫䛻䜘䜛ᛶ⬟ẚ㍑
ノーマライズされたカバレッジ

mES total RNA 10pg から GenNext®
RamDA-seq® Single Cell Kit にて、cDNA、二本鎖 DNA を調製し、次世代シーケンス解析を行いました。
解析には illumina MiSeq を使用しました。その結果、調製したライブラリーがおおむね遺伝子全体を均一にカバーしていることが確認できました。

10.80.60.40.2001020304050607080

転写産物長に合わせてノーマライズされた塩基位置 5ʼ→３ʼ (%)
実施例4SuperPrep&HOO/\VLV
SuperPrep
&HOO/\VLV 57.LWIRUT3&5 と長鎖RNAにおけるcDNA 調製の比較
T3&5✀䚻䛾ヨ⸆䛸⤌䜏ྜ䜟䛫䛻䜘䜛ᛶ⬟ẚ㍑

mES total RNA 10pg から GenNext® RamDA-seq® Single Cell Kit および A 社キットにて、cDNA、二本鎖 DNA を調製し、次世代シーケンス解析を行いました。解析には illumina MiSeq を使用しました。その結果、GenNext® RamDA-seq®
Single Cell Kit では、A 社キットではとらえることが難しい Neat1 や Malat1 のような IncRNA も全長にわたって検出することができました。
24kb
5,824kb

5,826bp

5,828bp

5,830bp

5,832bp

5,834bp

5,836bp

5,838bp

5,840bp

5,842bp

RamDA-seq®
A社キット
Neat1(IncRNA)
10kb
5,794kb

5,796kb

5,798kb

5,800kb

RamDA-seq®
A社キット
Malat1(IncRNA)

5,802kb

5,844bp

5,846kb実施例5

SuperPrep&HOO/\VLV
SuperPrep
&HOO/\VLV 57.LWIRUT3&5 と検出転写産物数の比較および
RNA 種類別リード数の検証✀䚻䛾 T3&5 ヨ⸆䛸⤌䜏ྜ䜟䛫䛻䜘䜛ᛶ⬟ẚ㍑

mES total RNA 10pg から GenNext® RamDA-seq® Single Cell Kit および A 社キットにて、cDNA、二本鎖 DNA を調製し、次世代シーケンス解析を行いました。GenNext® RamDA-seq® Single Cell Kit ではプライマーとして NSR Primer Set formouse を使用しています。GenNext® RamDA-seq® Single Cell Kit では不要である cDNA 増幅のための PCR を A 社キットでは、18 サイクル実施しました。その後、Nextera XT DNA Sample Preparation Kit を用いてライブラリーを調製し、illumina MiSeq でシーケンスを行いました。その結果、A 社キットに比べて GenNext® RamDA-seq® Single Cell Kit の方が、約 5,000 転写産物をより多く検出することができました。
ϮϬ͕ϬϬϬ
TPM>1ϭϲ͕ϬϬϬ

検出転写産物数

3HUFHQWDJHRIUHDGV 

TPM>0.1ϭϴ͕ϬϬϬ

0DSSHGUHDGVRamDA-seq

A社キットϭϰ͕ϬϬϬ

U51$PLWRFKRQGULDϮϰ͘ϬϮϯ͘Ϭϵ͘Ϭϵ͘ϵϭϮ͕ϬϬϬ&'6Ϯϳ͘ϴϮϲ͘ϯϰϭ͘ϵϰϭ͘ϱ

875ϭϲ͘ϱϭϱ͘ϴϮϭ͘ϵϮϮ͘ϯ

,QWURQVϭϲ͘Ϯϭϰ͘ϴϵ͘ϭϵ͘Ϭϲ͘ϰ
,QWHUJHQLF UHJLRQV
1XPEHURIWUDQVFULSWV
730 !
1XPEHURIWUDQVFULSWV
730 !

ϲ͘Ϯϳ͘ϲϴ͘ϬϭϬ͕ϬϬϬϴ͕ϬϬϬϲ͕ϬϬϬϰ͕ϬϬϬϮ͕ϬϬϬϬϭ
RamDA-seqϮ
A社キット・各試薬について、N=2 で実施・リード数を揃えて解析しています・黄色のセルの数値は % ではなく個数になります*N=2 で実施した平均値です*TPM（Transcripts Per Million ）：各転写産物のリードカウントに対して遺伝子長が 1,000bp となるように補正した後、各サンプルの総リード数をすべて 100 万に揃えた数値。

価格表
包装

保存温度

Code No.

価格

24 回用

-20℃

RMD-101T￥118,000

96 回用

-20℃

RMD-101￥398,000

24 回用

-20℃

RMD-201T￥59,000

96 回用

-20℃

RMD-201￥198,000

1,152 回用

-20℃

RMD-301￥12,000

NSR Primer Set for human*3

96 回用

-20℃

NSR-101￥24,000

NSR Primer Set for mouse*4

96 回用

-20℃

NSR-102￥24,000

品名
次世代シーケンス解析用 cDNA 調製キット

GenNext® RamDA-seq® Single Cell Kit *1・細胞溶解試薬 ・RT-RamDATM 試薬 ・2nd 鎖合成試薬
リアルタイム PCR 解析用 cDNA 調製キット

RT-RamDA® cDNA Synthesis Kit
・細胞溶解試薬 ・RT-RamDATM 試薬

RamDA Cell Lysis Kit *2・細胞溶解試薬＊1：本製品には、ライブラリー調製試薬と磁性ビーズは含まれておりません。また、RT-RamDA® Primer Mix (Oligo-dT primer と Random primer）を含みますが、NSR Primer は含まれておりませんので、別売りの Code No. NSR-101、NSR-102 をご使用ください。 ＊2：Code No. RMD-101, 101T, 201, 201T に含まれる細胞溶解試薬の大包装タイプです。 ＊3：ヒト用の NSR です。 ＊4：マウス用の NSR です。

バイオプロダクト営業部（大阪）〒530-0001 大阪市北区梅田一丁目 13 番 1 号
大阪梅田ツインタワーズ・サウス
TEL 06-6348-3786
FAX 06-6348-3833(E-mail) order̲lifescience@toyobo.jp

バイオプロダクト営業部（東京）〒104-8345 東京都中央区京橋一丁目 17 番 10 号
住友商事京橋ビル
TEL 03-6887-8819
FAX 03-6887-8951(E-mail) order̲lifescience@toyobo.jp

Toyobo テクニカルライン
TEL 06-6348-3888( 9:00 〜 12:00 13:00 〜 17:00 [ 土日祝日、休日を除く ] ）FAX 06-6348-3833(E-mail) tech̲osaka@toyobo.jp
公式 twitter

Toyobo Web Site
[ht t p : / / l i fesci ence. t oy ob o. co. jp / ]㻞㻜㻞㻞㻚㻌㻤㻚㻌㻝㻣