CUT&Tag-ITTM Assay Kit 说明书目录号 53160（16 次）
版本 B2Active Motif 中国
地址：上海市闵行区万康路 290 号
电话：(86)-21-20926090

目录
概览 ................................................................................................................................................................ 3试剂盒组成及存储条件 ............................................................................................................................... 4
CUT&Tag-ITTM Assay Kit 试剂 ............................................................................................................................ 4额外所需材料 ......................................................................................................................................................... 5
CUT&Tag 检测试剂盒实验方法 ................................................................................................................ 6
Section A. 准备新鲜细胞（30 分钟） ............................................................................................................ 6
Section B. ConA Beads 与细胞结合（30 分钟） ......................................................................................... 6
Section C. 结合一抗（2 小时至过夜）.......................................................................................................... 6
Section D. 结合二抗（60 分钟）..................................................................................................................... 7
Section E. 结合 CUT&Tag-ITTM Assembled pA-Tn5 转座子（60 分钟） ........................................... 7Section F. DNA 片段化（60 分钟）................................................................................................................. 8
Section G. DNA 提取（60 分钟） .................................................................................................................... 8
Section H. PCR 扩增 .............................................................................................................................................. 9Index 引物和测序信息 ...................................................................................................................................... 11
参考文献： .................................................................................................................................................. 11

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豚鼠抗兔二级抗体是根据 Rockland 的许可证提供的© 2016 Active Motif, Inc.，地址：1914 Palomar Oaks Way，Suite 150；Carlsbad, CA 92008。
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概览CUT&Tag 是一种研究组蛋白修饰和一些转录因子的基因组定位的方法，揭示蛋白和 DNA之间的相互作用，也能识别感兴趣的蛋白的 DNA 结合位点。
MNase-Seq 或 ATAC-Seq 靶向开放染色质, 因此依赖于染色质的可及性。CUT&Tag 不同于这两种方法, 利用基于抗体的酶靶向特定的组蛋白修饰或蛋白，以此来揭示这些感兴趣的位点或蛋白的染色质结合信息。
CUT&Tag 基于与 ChIP-Seq 相同的原理，对实验方法做出了一些有利的修改。不同于 ChIPSeq 实验方法中的染色质固定，超声打断及免疫沉淀步骤，在 CUT&Tag 中，新鲜的未固定的细胞与刀豆蛋白 A 磁珠结合，抗体孵育是在细胞自生状态下进行的。结合抗体后，染色质被剪切，NGS 建库所用的接头已经预先装载于 pA-Tn5 转座酶上，一步就能完成建库反应。
CUT&Tag-ITTM 检测试剂盒每个反应可以使用 50,000 至 500,000 个细胞。该试剂盒提供了优化好的试剂和方案，可产生 16 种独特的 illumina®平台测序文库。

产品优势：· 单次实验最少可使用 5,000 个细胞· 测序背景低，测序深度也可降低· 没有甲醛交联造成的假阳性结果产品
TM

CUT&Tag-IT

Assay Kit规格
16 次反应目录号
53160

试剂盒组成及存储条件
试剂盒内包含足够 16 个 CUT&Tag 反应的试剂，其中不同的试剂有不同的储存条件，请参
照下表进行存储。从收到之日起所有试剂保证 6 个月内稳定。

CUT&Tag-ITTM Assay Kit 试剂试剂

数量存储条件

5% Digitonin

610 μL-20°C

Concanavalin A Beads

320 μL

4°C

CUT&Tag-ITTM Assembled pA-Tn5 Transposomes

16 μL

-20°C

Tagmentation Buffer

2 mL

-20°C

1X Binding Buffer

55 mL

4°C

1X Wash Buffer

40 mL

4°C

Dig-Wash Buffer

50 mL

4°C

Antibody Buffer

800 μL

4°C

Dig-300 Buffer

50 mL

4°CGuinea Pig Anti-Rabbit Antibody

16 μL

-20°C

Protease Inhibitor Cocktail

1.42 mL-20°C

0.5M EDTA

68 μL

RT

10% SDS

20 μL

RT

10 μg/μL Proteinase K

18 μL

-20°C

DNA Purification Columns

16 columns

RT

DNA Purification Binding Buffer

10 mL

RT

DNA Purification Wash Buffer

12 mL

RT

DNA Purification Elution Buffer

5 mL

RT

3M Sodium Acetate

128 μLRT

10 mM dNTPs

16 μL

-20°C

5 X Q5 Buffer

160 μL-20°C

Q5 High Fidelity DNA Polymerase (2U/μL)

8 μL

-20°C

i5 Indexed Primer 1

10 μL

-20°C

i5 Indexed Primer 210 μL-20°C

i5 Indexed Primer 3

10 μL

-20°C

i5 Indexed Primer 410 μL-20°C

i7 Indexed Primer 1

10 μL

-20°C

i7 Indexed Primer 210 μL-20°C

i7 Indexed Primer 3
i7 Indexed Primer 4

10 μL
10 μL

-20°C
-20°C

SPRI Beads

880 μL

4°C

额外所需材料·······

无核酸纯水
100%乙醇
80%乙醇
1.5/2 ml EP 管用磁力架200 μL 八连排 PCR 管用磁力架
旋转摇床
涡旋仪

·······

Thermocycler
Illumina®NextSeq®测序仪
1.5mL 低吸附离心管2mL 低 吸 附 离心管八连排适用的离心机或者 0.2mL 和 1.5mL 离心管适用的离心机
多通道移液器（20-200μL）
滤芯吸头

CUT&Tag 检测试剂盒实验方法
本试剂盒适用于 50,000 至 500,000 细胞
注意： 此方法适用于非贴壁细胞。如果要使用帖壁细胞，避免使用胰蛋白酶或细胞消化液，防止细胞膜蛋白被消化。细胞膜蛋白是实验过程中细胞与刀豆蛋白 A 磁珠链接的关键。请
使用无酶解离的方法收集贴壁细胞。

注:实验过程请使用低吸附的离心管和低吸附枪头Section A. 准备新鲜细胞（30 分钟）
注意：在步骤 3 使用 1x Wash Buffer 之前，
必须在 1x Wash Buffer 中添加 Protease Inhibitor
Cocktail。每 1 mL 1x Wash Buffer 中都要添加 10 μL Protease Inhibitor Cocktail。每个样品
一共需要用 2.5 mL。置于冰上。一旦加入 Protease Inhibitor Cocktail，Wash Buffer 在 4°C
只能存放一周。
1.
2.
3.
4.

室温下收集细胞并计数。将足够量的细胞收集于 1.5 mL 离心管中。
室温 600 x g 离心 3 分钟，弃上清。
室温下用 1 mL 1 x Wash buffer 重悬，再次 600 x g 离心 3 分钟，弃上清。
用 1.5 mL 1 x Wash buffer 重悬后，将细胞转移至 2 mL 离心管中。置于冰上等待后续使
用。

Section B. ConA Beads 与细胞结合（30 分钟）
5. 轻柔重悬足够量的 ConA Beads 悬浊液（每个样品准备 20 µL，每 20 µL beads 可结合500,000 个细胞，之后的实验步骤均假设一个反应使用 500,000 个细胞）。
6. 在 2 mL 离心管中将 20 µL ConA bead 悬浊液加入 1.6 mL 1 × Binding buffer 中并吹打混匀。静置于磁力架上，待液体澄清后，弃上清（30 秒-2 分钟）。
7. 完全弃上清，将离心管从磁力架上移出。加入 1.5 mL 1×Binding buffer，吹打混匀后快速离心。
8. 将离心管置于磁力架上，待液体澄清后，弃上清（30 秒-2 分钟）。20 µL 1 × Binding Buffer重悬 (每 500,000 细胞使用 20 µL)， 室温放置，等待细胞准备好后使用。
9. 将步骤 8 的 ConA Bead 悬浊液缓缓加入装有细胞的离心管中，颠倒离心管以混匀。将离心管置于摇床室温孵育 10 分钟。

Section C. 结合一抗（2 小时或过夜）
注意：在步骤 11 使用 Antibody buffer 之前，
必须添加 Protease Inhibitor Cocktail 和 Digitonin。
每 1 mL buffer 加入 10 µL Protease Inhibitor Cocktail 和 10 µL 5% Digitonin，置于冰上。加入 Protease Inhibitor Cocktail 和 Digitonin 后 Antibody buffer 在 4°C 最多保存 2 天。每个反应需要 50 µL 添加 0.5 µL Protease Inhibitor Cocktail 和 0.5 µL 5% Digitonin 的 Antibodybuffer。
10. 快速离心（<100 × g）后，将离心管置于磁力架上，待液体澄清后，弃上清（30 秒- 2 分钟）。
11. 50 µL 预冷的 Antibody Buffer 重悬细胞，轻柔涡旋。置于冰上。
12. 每个样品中加入 1 µL（或者至少 1 µg）兔一抗，轻柔涡旋或用枪头吹打混匀。
注意：添加兔一抗的时候，我们推荐使用 1:50-1:100 的稀释比例或者使用制造商推荐的应
用于免疫荧光的稀释比例。可以使用 H3K27me3（Cat.No.39157）作为阳性对照。
13. 4°C 孵育 2 小时，请保持液体始终在离心管的底部或壁上。

Section D. 结合二抗（60 分钟）
注意：在步骤 15 使用 Dig-Wash Buffer 之前，必须添加 Protease Inhibitor Cocktail 和Digitonin。每 1 mL buffer 加入 10 µL Protease Inhibitor Cocktail 和 10µL 5% Digitonin。
每个反应需要 3.1 mL buffer，置于冰上。加入 Protease Inhibitor Cocktail 和 Digitonin 后
Dig-Wash Buffer 在 4°C 最多保存 2 天。
14. 快速离心（<100 × g）后，将离心管置于磁力架上，待液体澄清后，弃上清（30 秒-2 分钟）。
15. 将豚鼠抗兔二抗以 1:100 稀释于 Dig-Wash Buffer 中。每个反应需要使用 100 µL 稀释液。将 100 µL 稀释液加入每个样品中，并轻柔涡旋。
16. 将试管放置在水平摇床上，室温孵育 60 分钟。
17. 快速离心后，将离心管置于磁力架上，待液体澄清后，弃上清（30 秒-2 分钟）。
18. 每个离心管中加入 1 mL Dig-Wash Buffer。
轻柔涡旋或用枪头轻轻吹散聚成团的 beads。
19. 重复步骤 17-18，一共需要洗三次。

Section E. 结合 CUT&Tag-ITTM Assembled pA-Tn5 转座子（60分钟）
注意：在步骤 20 使用 Dig-300 Buffer 之前，
必须添加 Protease Inhibitor Cocktail 和 Digitonin。
每 1mL buffer 加入 10 µL Protease Inhibitor Cocktail 和 2 µL 5% Digitonin。每个反应需要3.1 mL buffer，置于冰上。加入 Protease Inhibitor Cocktail 和 Digitonin 后 Dig-300 Buffer 在4°C 最多保存 2 天。
20. 将 CUT&Tag-ITTM Assembled pA-Tn5 转座子以 1:100 稀释于 Dig-300 Buffer 中。
例如，TM
将 1µL CUT&Tag-IT Assembled pA-Tn5 转座子添加于 100 µL Dig-300 Buffer 可应用于 1 个反应。
21. 快速离心（<100 × g）后，将离心管置于磁力架上，待液体澄清后，弃上清（30 秒-2 分钟）。
22. 每个离心管中加入 100 µL 步骤 20 稀释的 CUT&Tag-ITTM Assembled pA-Tn5 转座子，枪头轻柔吹打混匀。
23. 置于摇床，室温下反应 60 分钟。
24. 快速离心（<100 × g）后，将离心管置于磁力架上，待液体澄清后，弃上清（30 秒-2 分钟）。
25. 加入 1 mL Dig-300 Buffer，轻柔涡旋或枪头轻轻吹散聚成团的 beads。
26. 重复步骤 24-25，一共需要洗三次。

Section F. DNA 片段化（60 分钟）
注意：在使用 Tagmentation Buffer 之前，
必须添加 Protease Inhibitor Cocktail 和 Digitonin。
每 1 mL buffer 加入 10 µL Protease Inhibitor Cocktail 和 2 µL 5% Digitonin。
27. 快速离心（<100 × g）后，将离心管置于磁力架上，待液体澄清后，弃上清（30 秒-2 分钟）。
28. 每个离心管中加入 125 µL Tagmentation Buffer，轻柔涡旋或用枪头吹打混匀。
29. 37°C 孵育 60 分钟。

Section G. DNA 提取（60 分钟）30. 将下列试剂添加进每个离心管中以停止片段化反应：
4.2 µL 0.5M EDTA
1.25 µL 10% SDS
1.1 µL Proteinase K（10mg/mL）
31. 最大速涡旋 2 秒，55°C 孵育 60 分钟以消化。
注意：由于 DNA 的粘弹性，在与蛋白酶 K 和 SDS 的孵育过程中，beads 通常会聚成一团。
但是对于大量的全基因组表位来说，基因组的大规模片段化通常会导致结块减少，beads 悬
浮于 buffer 中，相较于阴性对照而言液体呈褐色。
32. 快速离心（<100 × g）后，将离心管置于磁力架上，待液体澄清后（30 秒-2 分钟），将上清转移至新的 1.5mL 离心管中。
33. 每个离心管中加入 625 µL DNA Purification Binding Buffer，并用枪头吹打混匀。如果颜
色指示变为紫色或者橙色，请加入 8 µL 3M 醋酸钠。
34. 将对应标记每个样本的 DNA 纯化柱放入收集管中。
35. 将样品转移至对应的标记好的 DNA 纯化柱中，17,000 × g（约 14,000 rpm）室温离心
1 分钟。
36. 弃废液，将纯化柱放回收集管中。

注意：在第一次使用之前需要在 DNA Purification Wash Buffer 中加入无水乙醇，使终浓度为 80%（向装有 DNA Purification Wash Buffer 的瓶中添加 40mL 无水乙醇）
37. 纯化柱中加入 750 µL DNA Purification Wash Buffer（添加好无水乙醇的），17,000 x g（约 14,000 rpm）室温离心 1 分钟。
38. 弃废液，将纯化柱放回收集管中。
17,000 x g 空离 2 分钟以弃尽 DNA Purification WashBuffer。
39. 将 DNA 纯化柱转移至新的离心管中，在柱中心加入 35 µL DNA Purification Elution Buffer，室温孵育 1 分钟。
40. 17,000 x g（约 14,000 rpm）室温离心 1 分钟，移除纯化柱。纯化后的 DNA 可以保存
于-20°C 或者直接进行下一步 PCR 扩增。

Section H. PCR 扩增
41. 请按照下面的表格来进行 PCR 反应。如果建库样品较多，请保证每个样品的 i5 和 i7 端index 都是唯一的。
PCR 反应中每个样品都需要 1 个 i7 端 index 引物和 i5 端 index 引物。我们的试剂盒中
提供了 4 x 4=16 种不同组合的 i7/i5 引物，可以用于 16 个样品。这些引物都是基于
Illumina 的测序平台接头。

PCR 反应前：使用 1 个 i7 端 index 引物
i7 Indexed Primer 1 = i7 N701
i7 Indexed Primer 2 = i7 N702
i7 Indexed Primer 3 = i7 N703
i7 Indexed Primer 4 = i7 N704

使用 1 个 i5 端 index 引物
i5 Indexed Primer 1 = i5 N501
i5 Indexed Primer 2 = i5 N502
i5 Indexed Primer 3 = i5 N503
i5 Indexed Primer 4 = i5 N504

每个 CUT&Tag 样品所需要的试剂

体积（50µL）

片段化的 DNA30 µL

i7 端引物

2.5 µL

i5 端引物

2.5 µLdNTPs（10 mM）

1.0 µL5x Q5 Reaction buffer灭菌蒸馏水

10 µL

Q5 Polymerase0.5 µL

3.5 µL

42. 在 PCR 仪中进行如下反应：
72 °C

5 min

98 °C

30 sec98 °C

10 sec

63 °C

10 sec

72 °C

1 min

10 °C

Hold

循环 13 次43. 使用 SPRI 磁珠进行回收，每个样品需要 55 µL SPRI 磁珠（1.1 倍体积），最后使用 20 µL
DNA Purification Elution Buffer 洗脱，每个样品还需要准备 400µL 80%新鲜配置的乙醇。
a. 每个样品加入 55 µL SPRI 磁珠（提前放置于室温）。
b. 涡旋混匀，室温下孵育 5 分钟。
c. 将样品管置于磁力架上分离磁珠和液体。
d. 溶液澄清后，小心移除上清。
e. 保持样品管始终在磁力架上，加入 180 µL 80%乙醇进行漂洗。
f. 室温孵育 30 秒。
g. 小心移除上清。
h. 重复漂洗步骤，总计漂洗 2 次。
i. 将样品管置于室温干燥（2-5 分钟）。
j. 干燥后，将样品管取下，加入 20 µL DNA Purification Elution Buffer 洗脱。
k. 盖上管盖后涡旋混匀。
l. 室温下孵育 5 分钟。
m. 将样品管置于磁力架上分离磁珠和液体。
n. 溶液澄清后，小心吸取上清转移至新的 EP 管中。
44. 回收完的 DNA 可用于定量或测序。

Index 引物和测序信息Index 1 (i7) Primers
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTCTCGTGGGCTCGG
Index 2 (i5) Primers
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]TCGTCGGCAGCGTC

i7 Indexi7 Sequence

测序信息N701

TCGCCTTATAAGGCGA

N702

CTAGTACGCGTACTAG

N703

TTCTGCCTAGGCAGAA

N704GCTCAGGATCCTGAGC

i5 Indexi5 Sequence测序信息（NovaSeq，MiSeq，HiSeq2000/2500）

N501

TAGATCGCTAGATCGC

N502

CTCTCTATCTCTCTAT

N503

TATCCTCTTATCCTCT

N504

AGAGTAGAAGAGTAGA

i5 Indexi5 Sequence

N501

TAGATCGC

N502

CTCTCTAT

N503

TATCCTCT

N504

AGAGTAGA

测序信息（NovaSeq v1.5
Reagent Kits, iSeq，MiniSeq，NextSeq，HiSeq3000/4000）
GCGATCTAATAGAGAG
AGAGGATATCTACTCT

Read1 和 Read2 测序接头序列：CTGTCTCTTATACACATCT。
注意：推荐测序 2-10 兆 reads，根据我们的质控测试，10 兆 reads 可产生 20,000 peak。

参考文献：
1. Kaya-Okur, H.S. et al. (2019) Nature comm. 10:1930 (1).

常见问题指南问题文库检测峰值低建议在 CUT&Tag 实验中，这种情况比较常见，特别是研究转录因子的时候。几乎看不见的文库仍然可以很好的获得测序结果。库丰度
的 qPCR 分析（如 KAPA LibraryQuantification）可以帮助测量库的量。如果你的实验阳性对照有效，这些低量的文库仍然值得测序。如果您的阳性对照不起作用，
您可能在试验过程中丢失了细胞。如果是这种情况，请在 B 部分末尾对与珠子结合的细胞进行计数，以确保细胞不会丢失。