Jpn. J. Protozool. Vol. 41, No. 2. (2008)

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Review

単細胞動物ミドリゾウリムシと緑藻クロレラとの細胞内共生成立
機構
児玉有紀1, 2† ・藤島政博1, ＊1

山口大学大学院理工学研究科, 2日本学術振興会特別研究員 (PD)1〒753-8512 山口県山口市吉田1677-1

Mechanism of establishment of endosymbiosis between the ciliate
Paramecium bursaria and the symbiotic alga Chlorella species
Yuuki KODAMA1, 2† and Masahiro FUJISHIMA1, ＊1
Graduate School of Science and Engeening, Yamaguchi University, Yoshida 1677-1, Yamaguchi
753-8512, Japan
2
Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Research Fellow

1. はじめにミトコンドリアや葉緑体を生み出した細胞内共生は現在でも繰り返して行われ、進化の原動力となっている。その中でも特に原生動物と藻類との細胞内共生 (二次共生) は、動物細胞の植物化を誘導し、植物の多様性の推進力となっている。しかし、その成立機構についてはほとんど明らかにされていない。
太陽虫、ラッパムシ、ツリガネムシ、ミドリゾ
ウリムシやマヨレラなどのように共生クロレラを持つ原生動物は多数報告されている。ミドリゾウ
リムシ (Paramecium bursaria, Fig. 1A) と共生クロレ
ラの細胞内共生は古くから研究が続けられてき*Corresponding author
Tel & Fax: +81-83-933-5712
E-mail: fujishim@yamaguchi-u.ac.jp
Received: 19 September 2008
Note: †現在の所属先: 〒305-8572 茨城県つくば市天王台1-1-1 筑波大学大学院 生命環境科学研究科†

Present address: Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, Tennoudai 1-1-1,
Tsukuba 305-8572, Japanた。ミドリゾウリムシの細胞質内には約700個のクロレラが共生している(Kodama and Fujishima, 2008)。共生 ク ロ レ ラ は 1 細 胞 ず つ が 食 胞 膜 由 来 の Perialagalvacuole (PV) 膜 (Fig. 2) に包まれ、その中で細胞分裂して増殖し、宿主の細胞分裂時には、娘細胞に安定して分配される。PV膜には宿主のリソソームが融合
しない (PV膜の性質の詳細については本総説の「5.
PV膜の性質」を参照)。共生クロレラは宿主のミドリ
ゾウリムシから窒素源や二酸化炭素を供給され(Albers and Wiessner, 1985; Albers et al., 1982; Reisser,
1976, 1980)、共生クロレラの炭素固定は宿主内で促進される (Kamako and Imamura, 2006)。さらに宿主内ではクロレラウイルスの感染から保護される(Kawakami and Kawakami, 1978; Reisser et al., 1988; Van
Etten et al., 1982; Yamada et al., 2006)。一方ミドリゾウ
リムシは、光さえ当てておけば、飢餓やガス交換ができない密閉容器内でも長期間生存可能であり (児玉と藤島、未発表)、酵母菌やバクテリアの感染から保護される (Görtz, 1982)。さらに、共生クロレラから
マルトースや酸素などの光合成産物を供給される(Brown and Nielsen, 1974; Muscatine et al., 1967; Reisser,
1976, 1980, 1986)。共生クロレラを持つミドリゾウリ
ムシの分裂速度は、持たないミドリゾウリムシより速く (Görtz, 1982; Karakashian, 1963, 1975)、共生クロ
レラは宿主を紫外線から保護する働きがあることが118

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Fig. 1 Photomicrographs of algae-bearing P. bursaria
strain OS1g1N (A), algae-free P. bursaria strain Yad1w(B), Chlorella vulgaris isolated from OS1g1N cells (C),strain Yad1w cells during the early infection process (4 hafter mixing with isolated algae) (D). Ma, Macronucleus.
Arrow, single green Chlorella (SGC) which could establish endosymbiosis.

報告されている (Hörtnagl and Sommaruga, 2007)。共生クロレラの光合成産物は宿主の概日リズムの発現に深く関わっており (Miwa et al., 1996; Tanaka andMiwa, 1996, 2000)、宿主と共生クロレラの細胞分裂のタイミングは互いに同調している (Kadono et al.,
2004; Takahashi et al., 2007)。このように、ミドリゾウ
リムシとクロレラは相利共生の関係で、双方の増殖速度の調節機構をも備えているが、両者はまだ単独でも増殖できる能力を維持している。ミドリゾウリ
ム シ を 恒 暗 条 件 下 で 培 養 し た り（Karakashian,1963）、タンパク質合成阻害剤のシクロヘキシミド（Kodama and Fujishima, 2008; Kodama et al., 2007;
Weis, 1984）、光合成阻害剤（Reisser, 1976）、除草剤 (Hosoya et al., 1995)で処理すると容易にクロレラを除去することができる (Fig. 1B)。クロレラ除去細胞
は、共生クロレラを保持した状態と比較すると分裂速度はやや低下するが（Görtz, 1982）、増殖能力は維持している。クロレラ除去細胞を、ミドリゾウリ
ムシのホモジネートから単離した共生クロレラ (Fig.
1C) と混合すると、細胞口から食胞に取り込まれたクロレラの大部分は宿主によって消化されて細胞肛門から排出されるが、一部のクロレラは消化を免れて細胞内共生を再開する (Fig. 1D) (Karakashian, 1975;
Siegel and Karakashian, 1959)。ミドリゾウリムシでは、クロレラとの細胞内共生が不安定な自然突然変異体が得られている (Tonooka and Watanabe, 2002,2007)。さらに、細胞が透明であるため共生成立過程の観察が容易で、マイクロインジェクションも可能
な大きさの細胞である。これらの特徴は、二次共生成立機構解明のモデル材料として、ミドリゾウリム
シと共生クロレラが適切であると考えられる根拠となっていた。しかし、クロレラ除去細胞と共生クロ
レラを混合すると、短時間で多数のクロレラが一気に食胞内に取り込まれるため、その後のクロレラのFig. 2 Transmission electron micrograph of symbiotic
alga near the host cell surface. Chl, symbiotic C. vulgaris. CW, cell wall. PV, perialgal vacuole membrane.
Mt, mitochondrion. Tc, trichocyst. (Kodama andInouye, unpub. data)

運命の観察は困難を極め、共生成立過程の詳細はSiegel and Karakasian (1959) による再共生実験以来の50年もの間不明瞭なままであった。我々は、クロレ
ラ除去細胞に一定数のクロレラを1.5分間だけパルス的に与え、その後チェイスして食胞内に取り込まれたクロレラの運命を計時的に追跡することが可能な最適条件を確立し、この方法を用いてミドリゾウリ
ムシとクロレラとの共生成立過程の全容を明らかにした (Kodama and Fujishima, 2005, 2007, 2008, 2009, 印
刷中; Kodama et al., 2007)。

2. ミドリゾウリムシの食胞の分化
Paramecium属の食胞の分化の研究はハワイ大学のFokらによってP. multimicronucleatum で詳細に行われた (Fok and Allen, 1988)。P. multimicronucleatum の食胞の分化は次の4段階に分類されている。新生の球形の食胞DV-Iに、食胞形成後4-8分にアシドソームが融合して、食胞内のpHを中性付近から3まで下げ、同時に、DV-I膜とアシドソーム膜の膜置換が起こり、収縮したDV-IIと呼ばれる食胞になる。食胞形成後820分に、リソソームがDV-IIに融合し、pHが再び6まで上昇した球形のDV-IIIに分化して食胞内容物は消化される。その後、食胞形成後20分以降には、リソ
ソームの指標酵素の酸性フォスファターゼ (AcPase)
活性の無いDV-IVに分化する。DV-IVは、細胞肛門とJpn. J. Protozool. Vol. 41, No. 2. (2008)
融合し、食胞内の未消化物を細胞外に放出する。
ミドリゾウリムシの食胞の分化に関する報告はこれまでに無く、食胞の分化過程はP. multimicronucleatumと同様であると予測されていた (Meier and Wiessner, 1989)。しかし、パルスラベルとチェイスを行
い、ミドリゾウリムシの食胞の分化過程を観察する

119と、P. multimicronucleatumとはかなり異なることが明らかになった (Kodama and Fujishima, 2005)。Fig. 3に示すように食胞の形態の特徴と食胞内のクロレラの消化の有無を基にミドリゾウリムシの食胞の分化過程を8時期 (DV-I, DV-II, DV-IIIa, DV-IIIb, DV-IIIc, DVIVa, DV-IVb, and DV-IVc) に分類し、各時期の出現時間を明らかにした。クロレラ除去細胞と単離した共生クロレラを混合すると、クロレラは細胞口から取り込まれてDV-Iに包まれる。球形のDV-Iの食胞膜は光学顕微鏡で容易に観察できる。DV-Iはクロレラと混合してから0.5分以内に観察される。0.5–1.0分後には食胞膜が収縮するため、光学顕微鏡では食胞膜が観察困難なDV-IIに分化する。2.0–3.0分後には食胞膜が膨潤して、再び光学顕微鏡で観察可能なDV-IIIに分化する。DV-IIIはその食胞内の全てのクロレラが緑色のDV-IIIa、黄色く退色した消化途中のクロレラと緑色のクロレラとが共存するDV-IIIb、食胞内の全てのクロレラが黄色のDV-IIIcの3つのサブステージに分けられる。そして、20分以降には食胞膜が再び収縮したDV-IVに分化する。DV-IVもDV-IIIと同様に、食胞内の全てのクロレラが緑色のDV-IVa、消化がさらに進み直径が小さく茶色くなったクロレラと緑色のクロレラとが共存するDV-IVb、食胞内の全てのクロレラが茶色のDV-IVcの3つのサブステージに分けられる。ブロモフェノールブルー、ブロムクレ
ゾールグリーン、コンゴーレッドのpH指示薬で細胞壁を標識した酵母菌をクロレラ除去細胞に与え、食胞内に取り込まれた酵母菌の色の変化で食胞内のpHを測定した結果、P. multimicronucleatumと同様に、
DV-IIの時期にアシドソームが食胞に融合して、食胞内のpHは2.4-3.0に低下し、DV-IIIでは食胞内のpHは6.4-7.0に上昇することが分かった (Kodama and Fujishima, 2005)。Gomoriの染色 (Gomori, 1952) で食胞内のAcPase活性の有無を調べると、クロレラの消化が観察されるDV-III以降でAcPase活性が検出されることから、DV-IIIでリソソームの融合が起こることが分かった (Kodama and Fujishima, 2009)。

3. クロレラの再共生過程
Fig. 3 Schematic representation of DV differentiation of
P. bursaria. When isolated living Chlorella sp. and algaefree paramecia were mixed, one or several algae wereingested by the host cytopharynx into a DV-I. pH inside
DV-I is 6.4-7.0. Acidified and condensed DV-II appeared
at 0.5–1.0 min after mixing. pH inside DV-II is 2.4-3.0.
Fusion of lysosomes occurred at 2.0–3.0 min, leading toswollen DV-IIIa to DV-IIIc. The color of the algae fadedby digestion in DV-IIIb and DV-IIIc. pH inside DV-III is
6.4-7.0. Condensed DV-IVa to DV-IVc appeared at 20–
30 min. pH inside DV-IV is 6.4-7.0. The color of thealgae becomes brown by digestion in DV-IVb and DVIVc. Green circle means intact algae. Yellow circle means
digested yellow algae. Brown circle means digested
brown algae. See color figure in on-line publication.

次に、食胞内に取り込まれたクロレラの運命を追跡し、細胞内共生を成立させるクロレラが出現する
食胞とそのタイミングを明らかにした。
ミドリゾウリムシに共生しているクロレラは１つずつがPV膜に包まれて、宿主細胞質に維持されている (Fig. 2)。そこで、単独で存在する緑色のクロレラ
が、どの食胞から、いつ出現するかを明らかにする
ため、クロレラ除去細胞5,000 cells/mlと、ミドリゾウ
リムシから単離した共生クロレラを1:104で混合し、25℃、恒明条件下で1.5分のパルスラベルを行った。
その後、15 μmナイロンメッシュで濾過して、Dryl氏
液で細胞を洗浄して外液のクロレラを除去し、チェ
イスし、0.05, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 6, 9, 24, 48, 72時間後に4% (w/v) パラホルムアルデヒドで固定して、共生初

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Fig. 4 Fates of living and boiled Chlorella sp. during the infection process. Isolated living (A) or boiled (B) Chlorella
sp. and algae-free paramecia were mixed, washed, chased, and fixed at 0.05, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 6, 9, 24, 48, and 72 h
after mixing. The percentages of cells with SGC, single digested Chlorella (SDC), DV-IIIa, DV-IIIb, DV-IVa, and DVIVb were determined. Note that all SGCs that appeared before 0.5 h after mixing were digested by 0.5 h. ▲, cells with
DV-IIIa or DV-IIIb; ●, DV-IVa or DV-IVb; ○, SGC; ■, SDC. For each fixing time interval, 100 to 300 cells were observed. Bar, 90% confidence limit. (From Kodama and Fujishima, 2005.)

期過程で見られる1個で緑色のクロレラ (以後single
green Chlorella, SGCと表す) 、１個で消化途中のクロ
レラ (以後single digested Chlorella, SDCと表す)、DVIIIaまたはDV-IIIb、DV-IVaまたはDV-IVbを持つ細胞の割合を調べた (Fig. 4A)。Fig. 4の横軸はクロレラと混合後の時間、縦軸は各食胞またはSGC、SDCをもつ細胞の割合を示している。DV-IIIaまたはDV-IIIbと、DV-IVaまたはDV-IVbを持つ細胞の割合は時間経
過に伴って減少し、食胞内のクロレラは消化される
ためSDCを持つ細胞の割合が増加する。クロレラと混合してから0.05時間後の12%のSGCは、最初から1つだけ食胞内に取り込まれたクロレラを示している。このようなSGCは0.5時間以内に全て消化される
ため、0.5時間後のSGCを持つ細胞の割合は、0%になる。しかし0.5時間以降は、SGCを持つ細胞の割合が時間経過に伴って増加し、72時間後には34%に達した。0.5時間以降に出現したSGCは、宿主によって消化されることなく、24時間後には細胞分裂によって宿主細胞内で増殖を開始し、細胞内共生を成立させた。これらの結果は、最終的に細胞内共生を行うク
ロレラは最初から少数存在していたSGCではなく、30分以降に緑色のクロレラを含むDV-IVaまたはDVIVbから出現したことを示している (Kodama and Fu-

jishima, 2005)。
10 分間煮沸して殺した共生クロレラを使って、1.5分のパルスラベルとチェイスを行いクロレラの運命を追跡した (Fig. 4B)。その結果、煮沸したクロレラでも生きたクロレラと同様に、SGC を持つ細胞と、DVIIIa を持つ細胞の割合は、0.5 時間後には 0%になるが、生きたクロレラを与えた時とは異なり、その後 SGC が出現することはなかった。また、DV-IVa を持つ細胞の割合も、1 時間後には 0%になり、72 時間後には全てのクロレラが消化または排出された。煮沸したクロレラを与えた時は、生きたクロレラを与えた時とは異なり、消化されたクロレラと、消化を免れた緑色のクロ
レラとが共存する DV-IIIb や DV-IV ｂは出現しないことが分かった。パラホルムアルデヒドなどで固定した共生クロレラでも 100%の消化が誘導された。これらの結果から、DV-III 以降で一部のクロレラが消化を免れる現象は、生きたクロレラを与えた時のみに見られる現象であることが明らかとなった。生きたクロレラ
のみが持つ AcPase 活性に対する抵抗性が何で決まるのかはまだ明らかにされていない (Kodama and Fujishima, 2005; Kodama et al., 2007)。
最終的に細胞内共生を行うクロレラは、DV-IVa と
DV-IVb のどちらの食胞から出現するのだろうか?クJpn. J. Protozool. Vol. 41, No. 2. (2008)

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Fig. 5 Source of SGCs that can establish endosymbiosis. Chlorella sp.-free cells were mixed with isolated algae,
washed, chased, and fixed at 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 6, 9, 24, 48, and 72 h after mixing. (A) Cells fixed at 0.5 h after mixing
were classified into five types according to the stages of their DVs: (a) a cell with no algae, (b) a cell with digested
algae, (c) a cell with DV-IVa, (d) a cell with DV-IVb, (e) a cell with SGC. When a cell had several types of DVs, i.e.,
types b–e are seen together, the cell was classified in the order b＜c＜d＜e. For example, when a cell has DVs with
SDC and SGC, the cell was classified as type e. (B) Summary of DV types found during the infection process. At eachfixing time interval, 100 to 230 cells were observed. Bar, 95% confidence limit. (From Kodama and Fujishima, 2005.)

ロレラによる 1.5 分のパルスラベル後、0.5 時間以降に観察すると、Fig. 5Aa-e に示す 5 種類の細胞（クロレラを持たない細胞、a; 消化途中のクロレラのみを持つ細胞、b; DV-IVa を持つ細胞、c ； DV-IVb を持つ細胞、d; SGC を持つ細胞、e）が見られる。Fig. 5B の横軸はクロレラと混合後の時間を示しており、縦軸は観察した細胞内におけるそれぞれの細胞の割合を示している。同一細胞内に複数のタイプのクロレラを持つ場合
は、より後者(e>d>c>b>a) を持つ細胞としてカウントした。クロレラと混合後 0.5 時間では 0%であった SGCを持つ細胞の割合は時間経過に伴って増加し、それとは対照的に、0.5 時間後では約 50%であった DV-IVb を持つ細胞の割合が減少した。72 時間後には、クロレラを持たない細胞もしくは SGC を持つ細胞の二者のみとなった。混合後、24 時間以降の SGC は細胞分裂によって増殖を開始するので、細胞内共生に成功したと考えることができる。一方、この時宿主は、72 時間後までほとんど細胞分裂を行わなかった。72 時間後のSGC を持つ細胞の割合の約 35%という値は、常に１％以下しか存在しない DV-IVa からの出現のみでは補うことができない。従って、最終的に細胞内共生を行う
クロレラの大部分は、消化されたクロレラと消化を免れたクロレラが共存する DV-IVb から出現したことが明らかになった (Kodama and Fujishima, 2005)。
Fig. 6はクロレラの感染過程におけるDV-I (Figs. 6A
and B)、DV-II (Figs. 6C and D)、DV-IIIb (Figs. 6E andF)、 DV-IVb (Figs. 6G and H) と、食胞から脱出中のクロレラ (Figs. 6I and J)、宿主細胞表層に接着したク
ロレラ(Figs 6K and L) の光学顕微鏡像 (Figs. 6A, C, E,
G, I, and K) と、その時のGomori染色像 (Figs. 6B, D, F,

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Fig. 6 Differential-interference-contrast (DIC) micrographs of infection process of symbiotic C. vulgaris cells to algaefree P. bursaria cells. Chlorella-free paramecia were mixed with isolated algae and fixed at 0.5 min (A and B), 1 min (Cand D), 10 min (E and F), 30 min (G and H), and 3 h (I-L) after mixing. Cells non-treated with Gomori’s solution ; A, C,
E, G, I, K. Cells treated with Gomori’s solution; B, D, F, H, J, L. Experiments were repeated more than 10 times and theresults were reproducible. DV-I; A and B. DV-II; C and D. DV-IIIb; E and F. DV-IVb; G and H. I and J; an alga is justescaping by budding of the DV-IVb membrane (a red arrowhead). Insets of I and J; enlarged photomicrographs of theescaping alga. K and L; algae attached just beneath the host cell surface (black arrows). Note that DV-I (B) and DV-II(D) are AcPase-negative, and DV-IIIb (F) and DV-IVb (H and J) are AcPase-positive. SGCs that escaped from the hostDVs and translocated just beneath the host cell surface are AcPase-negative (L, black arrows). Bars, 10 µm (L) and 2 µm
(inset in J). Updated from Kodama and Fujishima 2009. See color figure in on-line publication.

H, J, and L) である。クロレラを取り込んだDV-I (Fig.
6A) は、0.5-1分以内にアシドソームが融合したDV-IIに 分 化 す る (Fig. 6C)。DV-I と DV-II の 食 胞 内 に はAcPase活性は検出されない (Figs. 6B and D)。DV-III
以降の食胞内にはAcPase活性が観察される (Figs. 6F,
H, J, and L)。AcPase活性を示すDV-IIIb (Fig. 6F) や、
DV-IVb (Fig. 6H) 内で一部のクロレラが食胞内で一次的にリソソーム耐性を獲得する理由を明らかにするために、クロレラ除去細胞に、クローン化した共生クロレラ (C. vulgaris, strain 1N) やタンパク質合成阻
害剤のシクロヘキシミドで処理したクロレラを与えたところ、それでもDV-IVbは出現した。宿主から単離した共生クロレラに、PV膜が付着していた可能性があるため、ミドリゾウリムシの細胞膜を溶かす濃度の界面活性剤で処理したクロレラを与えたとこ
ろ、それでもDV-IVbは出現した。さらに、消化を免れるクロレラと消化されるクロレラには、その細胞周期や宿主食胞内での位置に違いは見られなかった(Kodama et al., 2007)。クロレラ除去細胞と単離した
共生クロレラを混合し、3時間後に固定して、クロレ
ラを取り込んだ食胞の直径と、食胞内のクロレラの消化との関係を調べた結果、直径が大きい食胞、つまり多数のクロレラを取り込んだ食胞は、直径の小さな食胞と比較して、消化される数が少ないことが分かった (Kodama et al., 2007)。この結果から、直径の大きな食胞には宿主リソソームが融合しない、もしくは、融合しても食胞内にリソソーム酵素が充満していない可能性を考え、Gomori染色で直径の大きな食胞を観察したが、AcPase活性は食胞全体に検出さ れ、こ の 可 能 性 は 排 除 さ れ た (Kodama and Fujishima, 2009)。一部のクロレラだけが一次的にリソ
ソーム耐性を獲得する理由はまだ明らかではない。
クロレラと混合後30分以降では、DV-IVbから食胞膜の出芽によってほぼ全てのクロレラが徐々に１個ずつ食胞膜に包まれて宿主細胞質に脱出する現象が観察される (Fig. 6I、矢じり)。食胞から脱出中のクロ
レラの周りには、AcPase活性が検出された (Fig. 6J、矢じり)。食胞膜の出芽現象は、煮沸して殺したクロ
レラや酵母菌、さらにはDV-IVb内で消化されたクロ
レラでも生じるが、これらは食胞から脱出後に例外無く消化または宿主細胞肛門から排出される。生きている共生クロレラでなくても、食胞から脱出できることが分かった。一方、直径0.81 μmのラテックス
ビーズ、宿主の餌のバクテリア(Klebsiella pneumoniae)、墨汁では食胞膜の出芽による脱出は生じな
かった (Kodama and Fujishima, 2005)。また、食胞からのクロレラの脱出は、宿主とクロレラの両方のタ
ンパク質合成を阻害しても行われた (児玉と藤島, 未発表)。
クロレラと混合後45分以降には、食胞から細胞質に脱出したSGCが宿主の細胞表層直下に接着して安定化する現象が観察される (Fig. 6K、矢印)。このよ
うなSGCは宿主の原形質流動によって細胞質内を移動することはない。このSGC を包む膜の内側には
AcPase活性は検出されなかった (Fig. 6L、矢印)。
従って、PV膜の分化は、DV-IVb膜の出芽による食胞脱出の直後から宿主の細胞表層直下に接着するまでの 約 15 分 間 に 行 わ れ る こ と が 明 ら か に な っ た(Kodama and Fujishima, 2009)。
Fig. 7Bはクロレラと混合してから3分後と30分後の食胞を観察し、観察した全ての食胞に占めるFig. 7AaのようなAcPase活性陰性の食胞 (白い棒グラフ)、
Fig. 7A-bのような食胞の淵のみがAcPase活性陽性の食胞 (灰色の棒グラフ)、Fig. 7A-cの左の食胞のようなAcPase活性陽性の食胞 (黒い棒グラフ) の割合を示し た グ ラ フ で あ る。ク ロ レ ラ と 混 合 後 3 分 で は、
AcPase活性陽性の食胞は約10%存在する。その後、時間経過に伴ってこの割合は増加し、30分後には観察したほぼ全ての食胞がAcPase活性陽性であった。
この時、クロレラと混合してから72時間後に細胞を観察してクロレラの再共生率を調べると約85%であった。再共生率とは、観察した全ての細胞に占める宿主細胞表層に接着したSGCを持つ細胞の割合である。この値は、クロレラと混合してから30分後のAcPase活性陰性の食胞の約4%の食胞からの出現のみ
では補うことが出来ない。つまり、細胞内共生を成立させるクロレラはAcPase活性陽性の食胞から出現したことを示している。これらの結果は、「細胞内共生を成立させるほぼ全てのクロレラは、アシド
ソームとリソソーム融合後のDV-IVbから出現する」という結果 (Kodama and Fujishima, 2005) を、組織化
学的な方法でも、支持するものとなった (Kodama andFujishima, 2009)。
細胞内共生生物が宿主細胞内に侵入して安定して124

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Fig. 7. A, Three kinds of DVs classified according to the localization of their AcPase-activity. AcPase-negative DV (a);DV with partially AcPase-positive area near DV membrane (b); entirely AcPase-positive black DV (left DV in c). Bar,
10 μm. B, Timing of appearance of Gomori’s staining-positive DVs. White bars mean AcPase-negative DV. Gray bars
mean DV with partially AcPase-positive area near DV membrane. Black bars mean entirely AcPase-positive black DV.
Algae-free P. bursaria strain, Yad1w cells, were mixed with symbiotic C. vulgaris strain, 1N cells, for 1.5 min at 5,000
paramecia/ml and 5×107 algae/ml, washed, chased and fixed at 3 and 30 min after mixing. The cells were stained byGomori’s staining to detect AcPase activity in DVs ingesting the algae. Results obtained from three separate experiments
were summarized as mean % ± SD. For each time point, 472–512 DVs from 233–236 paramecia were observed. At 3
min, only 6.3% of the DVs were entirely AcPase-positive. On the other hand, at 30 min, ratios of such DVs were increased to 95.6%. Thus, it shows that the majority of the DVs become AcPase-positive until 30 min. Updated Kodama
and Fujishima, 2009. See color figure in on-line publication.

維持されるためには、第一に宿主細胞のリソソーム
酵素の攻撃を回避しなければならない。これには、
Listeria属とHolospora属細菌のように食胞膜を貫通して細胞質に脱出してリソソーム酵素の攻撃を回避す
る 例、Salmonella 属 細 菌・結 核 菌・Legionella 属 細菌・Brucella属細菌のように食胞とリソソームとの融合を阻止する例が知られている (Iwatani et al., 2005;
山本と高谷, 2006)。過去の研究では、最終的に細胞内共生に成功するクロレラは、食胞にリソソームが融合する前にDV-IIから細胞質に脱出すると考えられていた (Meier and Wiesssner, 1989)が、我々の結果はそれが間違いであることを示した。最終的に細胞内共生に成功するクロレラは、アシドソームとリソソームが融合した食胞内で一次的にリソソーム酵素
耐性能を獲得し、次に食胞膜の出芽で食胞膜に包まれて細胞質に脱出し、この膜がリソソーム融合阻止能力を有するPV膜に分化して、宿主細胞表層に接着して増殖を開始することが明らかになった (Kodama
and Fujishima, 2005, 2009, 印刷中)。共生クロレラによる３段階の宿主リソソーム攻撃からのエスケープ機
構 (一次的なリソソーム酵素耐性能の獲得、食胞からの脱出、PV膜への分化）は、これまでに報告された
どの寄生性や共生性生物とも異なる新規で複雑なエスケープ機構である (Fig. 8)。

4. クロレラ除去細胞に取り込まれた共生可能なクロ
レラ種と共生不可能なクロレラ種の運命
ミドリゾウリムシと共生可能なクロレラと共生不可能なクロレラを宿主食胞に取り込ませた時の運命の違いを調べるため、9種15株の自由生活クロレラ(C. vulgaris strain C-27, C. sorokiniana strains C-212 andC-43, Parachlorella kessleri strains C-208 and C-531, C.
ellipsoidea strains C-87 and C-542, C. saccharophila
strains C-183 and C-169, C. fusca var.vacuolata strains C104 and C-28, C. zofingiensis strain C-111, C. protothecoides strains C-150 and C-206, カイメンの共生藻であるChlorella sp., strain C-201) をクロレラ除去細胞に一定条件でパルス的に与え、食胞内に取り込まれたク
ロレラの運命を追跡した。その結果、ミドリゾウリ
ムシに共生可能な自由生活クロレラのC. vulgaris, C.
sorokiniana, P. kessleriは、宿主食胞に取り込まれるJpn. J. Protozool. Vol. 41, No. 2. (2008)

125

Fig. 8 Schematic representation of timing of PV membrane differentiation from DV membrane in early infection processof symbiotic C. vulgaris to algae-free P. bursaria cells. (A) Spherical DV-I vacuole containing green algae. (B) Differentiation of condensed DV-II vacuole by fusion of acidosomes and acidification. (C) Differentiation of swollen DV-III
vacuole by fusion of primary lysosomes. AcPase-activity positive area by Gomori’s staining are shown by a gray area inthe DV. In the DV-III vacuole, some of the algae exhibit resistance to the lysosomal enzymes and can maintain green
color and original morphology. Remaining algae are partially digested and show yellow colors in the same DV. Internal
pH of the DV-III vacuole increased. DV-III is further classified into three substages: DV-IIIa contains green algae only;
DV-IIIb contains both discolored by partial digestion and green algae; and DV-IIIc contains exclusively discolored algae.
(D) Differentiation of condensed DV-IV vacuole. DV-IV is classified into three substages: DV-IVa contains green algae
only; DV-IVb contains both green and digested brown algae; DV-IVc contains digested brown algae only. (E) Appearance of a SGC and a SDC through DV-IVb vacuole membrane budding. This phenomenon occurs notwithstanding thefact that alga is intact or partially digested. Note that alga in the buds were still covered by a gray thin layer by Gomori’s
staining. (F) Translocation of the SGCs just beneath the host cell surface, anchor there at about 10 μm interval and initiation of algal cell division to establish endosymbiosis. Note that algae attached beneath the cell surface has no AcPase
activity, suggesting that the vacuole membrane wrapping the algae differentiate to PV membrane (red circle) immediately after budding from the DV membrane. Afterward, the distance between each alga is shorter. SGCs of infectionincapable and SDCs of infection-capable Chlorella species cannot translocate beneath the host cell surface and eventually failed to establish endosymbiosis. Green circle means intact algae. Yellow circle means digested yellow algae.
Brown circle means digested brown algae. Updated from Kodama and Fujishima, 2009. See color figure in on-line publication.

と、その一部が食胞膜の出芽で細胞質に脱出し、さらに宿主の細胞表層直下に接着できた (Fig. 9A、矢印)。一方、共生不可能な他種のクロレラ （C. ellipsoidea, C. saccharophila, C. fusca var. vacuolata, C. zofingiensis, C. protothecoides）の場合は、食胞から細胞質への脱出まではできるが、共生可能なクロレラのように宿主の細胞表層直下に接着することができず、最終的には宿主細胞肛門から排出された (Fig.
9B) (Kodama and Fujishima, 2007)。これらの結果は、宿主細胞表層直下への接着が二次共生の成立の可否を決定する最終段階として必須な現象であることを示している。さらに、共生可能であると報告されているC. vulgaris, C. sorokiniana, P. kessleriの3種のクロレラであればどの株でも共生できるわけではなく、同じ種でも共生能力は株に依存することが分かった(Table 1)。Takedaらは我々が用いたクロレラ除去株(P. bursaria, strains OS1w and Yad1w) とは異なる株(P. bursaria, strain T316w) を用い、この株には感染可能な3種のクロレラの全ての株が共生したと報告している (Takeda et al., 1998)。これらの結果は、クロレ
ラ株だけの問題ではなく、宿主株とクロレラ株の組
み合わせも影響する可能性を示唆している。
一方、過去の研究では、クロレラの細胞壁をアルカリ溶液で処理して残る不溶性画分（rigid wall）の糖組成が、共生可能なクロレラ種ではグルコサミン型であり、共生不可能な種ではグルコースとマン126

原生動物学雑誌 第 41 巻 第 2 号

Fig. 9. Photomicrographs of P. bursaria OS1w cells pulse-labeled with symbiotic Chlorella sp. cells isolated fromP. bursaria OS1g cells (A) and with C. saccharophila
strain C-169 cells (B). Paramecia were observed 3 h after
mixing. Note that the symbiotic Chlorella sp. cells are
localized close to the host cell surface (arrows), whereas
C. saccharophila C-169 cells are not. Ma, Macronucleus.
From Kodama and Fujishima, 2007. See color figure in
on-line publication.

2008 年されていた(Nishihara et al., 1996; Reisser et al., 1982;
Weis, 1980)。今回、我々が調べたクロレラのうち、Con A結合能とクロレラ除去細胞への再共生能を持つ
株 は 無 か っ た が、C. sorokiniana, strain C-212 に はWGAが結合し、クロレラ除去細胞に再共生することができた (Table 1)。そこで、WGAでC-212株の細胞壁をマスクした後、クロレラ除去細胞と混合し、再共生率への影響を調べたところ、コントロールの未処理のクロレラと比較して再共生率に有意差は見られなかった。これらの結果は、クロレラの細胞内共生能力は細胞壁の糖組成とは無関係であり、食胞から脱出後に宿主細胞表層直下に接着する能力の有無で決定されることを強く示している (Kodama andFujishima, 2007)。洲崎らはクロレラ除去細胞に3種の酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae, Rhodutorula rubra,
Yarrowia lipolytica)を与え、食胞に取り込まれた酵母菌がその後、宿主細胞表層に定着するか、宿主細胞内で分裂増殖できるか、宿主細胞質に維持される
か、細胞内共生を成立させるかを調べた。その結果、R. rubraとY. lipolyticaは宿主の細胞表層に定着して増殖し、再び共生クロレラが与えられるまでは、安定した細胞内共生を確立させた。一方S. cerevisiae
は細胞表層には定着せず、１週間から10日後に自然に消失したと報告している (Suzaki et al., 2003)。これ
らの結果は、クロレラ以外でも宿主細胞表層に接着する能力があれば、ミドリゾウリムシに共生可能であることを示している。

5. PV膜の性質
ノ ー ス 型 で あ る と 報 告 さ れ て い た (Takeda et al.,1988)。そこで、アルカリ溶液処理を行った各種クロ
レラの細胞壁と未処理のクロレラの細胞壁に対するAlexa flour 488で標識した3種のレクチン (Con A; マン
ノースと結合、GS-IIとWGA; Nアセチルグルコサミ
ンと結合) の結合性を調べ、rigid wallの糖組成とミド
リゾウリムシとの共生能の有無との相関を調べた。
その結果、アルカリ溶液処理の有無に関わらず、ク
ロレラのレクチン結合性とミドリゾウリムシとの共生能の有無には相関は見られなかった (Table 1)。
山田 (1994) は、クロレラウイルスのクロレラへの感染能と、クロレラの共生能の関係について考察している。クロレラウイルスは、日本各地の淡水湖沼
河川に頻繁に存在しているウイルスで、ミドリゾウ
リムシやヒドラなどと細胞内共生を営んでいたクロ
レラにしか感染しない。ウイルスの宿主となるクロ
レラは細胞表面に特徴があり (クロレラウイルスによって認識されるレセプターの存在や酵素による分解性)、これがミドリゾウリムシやヒドラとの共生関係の樹立にも重要な因子となると考察している。ク
ロレラのミドリゾウリムシへの共生能の有無が、クロレラウイルスの感染能の有無とも関係があるのかどうかは大変興味深い。
一方、過去の研究では、クロレラの細胞壁をCon A
でマスクすると、再共生率が低下するという報告が共生クロレラを包むPV膜は宿主の食胞膜由来であるが、両者の性質は大きく異なる。1. 食胞膜には1つ以上のクロレラが包まれているが、PV膜にはクロレ
ラが1つだけ包まれている。2. 食胞膜の直径は食胞内のクロレラの数によって変化する (2.1-12.9 μm) が、PV膜の直径はクロレラの細胞分裂時以外はほとんど変化しない (2.5-4.5 μm)。3. 食胞膜には宿主の原形質流動に伴う移動が見られるが、PV膜には見られない。4. 食胞膜には分化に伴う膜構造の変化が見られるが、PV膜には見られない。5. 食胞膜には宿主のリソソームが融合するためAcPase活性が検出されるが、PV膜にはリソソームが融合しないためAcPase活性が検出されない (Reisser, 1992)。なぜPV膜がリソ
ソーム融合を阻止できるか、どのようにPV膜を通じて宿主と共生クロレラ間の物質交換がなされているかは未だに明らかになっていない。PV膜の性質に関しては多くの点が不明瞭なままである。
我々は、ミドリゾウリムシを恒明条件下でタンパ
ク質合成阻害剤のシクロヘキシミドで処理すると、24時間以内にPV膜が同調して膨潤し (我々はこの現象をsynchronous PV-swelling, 略してSPVSと呼んでいる)、SPVSが誘導されると8割以上のクロレラが消化されることを明らかにした (Fig. 10B, Kodama andFujishima, 2008)。シクロヘキシミド処理後48時間たJpn. J. Protozool. Vol. 41, No. 2. (2008)

127

Table. 1 Lectin-binding activity of the NaOH-treated and untreated cell walls of Chlorella species and their infectivity for algae-free P. bursaria

Species

Infectivity

Strain(alternative name)

Con A

WGA

GS-II

Con A

−

−

−

−

+

+

+

+

+

−

−

±

+

±

−

+

−

−

+

+

+

+

−

−

−

−

−

±

−

+

+

−

−

−

−

±

−

−

−

−

−

+

−

+

+

−

−

−

−

+

−

+

+

C-183b

−

−

+

+

−

+

+

b

−

−

−

+

−

−

+

−

−

−

+

−

−

+

−

−

−

+

−

−

−

−

−

−

+

−

−

+

−

−

−

+

−

−

+

C-206b

−

−

−

+

−

−

+

b

C-201

−

−

−

+

−

+

+

b

+

−

−

−

+

+

+

Dd1gb

+

−

−

−

+

+

+

KM2gb

+

−

−

−

+

+

+

+

±

−

±

+

+

+

+

−

−

−

+

+

+

C. sorokiniana

C-212(211-8k)c+

C-43b
Parachlorella kessleri

C-208(formerly called as
C. kessleri)(211-11g)c
C-531(211-11h)c
C-87(211-1a)c
C-542(211-1a)c

C. saccharophila

C-169
C. fusca var. vacuolata

C-104(211-8b)b
C-28b

C. zofingiensis

C-111(211-14)b

C. protothecoides

C-150(211-11a)b

Symbiotic Chlorella sp.

OS1g

Bwk-16(C+)b
1Nba

NaOH-treared cells

GS-II

C-27b

C. ellipsoidea

Non-treated cells
WGA

C. vulgaris

T316w OS1w

Lectin labeling of:aAlgal cells were labeled with Alexa Fluor 488-conjugated Con A, WGA or GS-II. +, 100% of cells with FITC fluorescence; ±, less than 100 %; -, 0%. For each experiment, more than 100 algal cells were observed.
b
Strain used only in this study.
cStrain used in this study and by Takeda et al. (1998).
Updated from Kodama and Fujishima, 2007.

128

原生動物学雑誌 第 41 巻 第 2 号

2008 年

Fig. 10. Photomicrographs of algae-bearing OS1g1N cells suspended in fresh culture medium containing 10 µg/ml of
cycloheximide at 5×103 paramecia/ml at 25 ± 1°C under the LL condition: (A) before treatment; (B) 1 day after mixing
with cycloheximide. All PVs containing green algae swelled synchronously. Furthermore, digested algae appeared in thecytoplasm (arrow). (C) 2 days after mixing with cycloheximide, the green algae were numerically reduced. (D) 3 days
after mixing. (E) 5 days after mixing. (F) 7 days after mixing. All algal cells disappeared from the host cytoplasm. The
paramecium cells became small. Ma, macronucleus. Bar = 10 µm. From Kodama and Fujishima, 2008. See color figure
in on-line publication.

つと再びPV膜は収縮する (Fig. 10C)。その後、共生クロレラの数は徐々に減少し (Figs. 10D and E)、シクロヘキシミド処理後7日では観察した全ての細胞からクロレラが消失した (Fig. 10F)。シクロヘキシミド
は1-100 μg/mlではクロレラのタンパク質合成のみを阻害し、宿主のタンパク質合成は阻害しない (Ayala
and Weis, 1987) ことから、ミドリゾウリムシから共生クロレラを除去する方法として用いられてきた(Weis, 1984)。しかし、どのようにクロレラが除去されるかについては調べられていなかった。シクロヘ
キシミドによるSPVSは、Schüßler and Schnepf (1992)
が報告したモネンシンによるPV膜膨張の現象と同様に、恒暗条件下や光合成阻害剤のDCMU存在下では誘導されない。さらにクロレラの除去も誘導されない (Fig. 11) (Kodama and Fujsihima, 2008)。この結果は、光合成活性存在下で同時に合成されるクロレラのタンパク質が、共生クロレラを包むPV膜への宿主
リソソーム融合阻止能力と深く関わっている可能性を示唆している。Reisser (1992) はクロレラ細胞壁とPV膜が密着していることが物質の流動性を低下させ、結果としてリソソーム融合を阻止している可能性を示唆しているが、モネンシンではシクロヘキシミドで誘導されたようなSPVSに引き続く消化の誘導は起きなかったことから、PV膜とクロレラ細胞壁間の距離がリソソーム融合阻止能力の原因ではないことが明らかになった。さらに我々はGomori染色を用いて、恒明条件下でのシクロヘキシミド処理によって消化されたクロレラには宿主のリソソームが融合Jpn. J. Protozool. Vol. 41, No. 2. (2008)

129

し、恒暗条件下や光合成阻害剤のDCMU存在下でのシクロヘキシミド処理ではPV膜にリソソームは融合
しないことを確認した (Fig. 12) (Kodama and Fujishima, 2008)。恒明条件下におけるシクロヘキシミ
ドによるSPVSと消化の誘導について、Fig. 13のような仮説を立てた (Kodama and Fujishima, 2008)。恒明
条件下のみでSPVSが誘導される理由や、PV膜とクロレラ細胞壁の間を満たしている物質については不明
であるが、これまで情報が希薄だったPV膜の性質について新たな見解が得られた。今後は、光合成活性存在下で同時に合成されるクロレラのタンパク質の検出と機能を解明したいと考えている。

6. まとめと今後の展開
我々の研究は、これまでの細胞内共生に関する多くの研究とは異なり真核細胞の進化のルーツを探るのではなく、二次共生の成立に必要とされる諸現象の分子機構を明らかにすることを目的にしている。
この研究が進めば、任意の細胞の組み合わせで細胞内共生を人為的に誘導して有用な細胞をつくり出す

Fig. 11. Effects of cycloheximide on the mean number ofgreen algae per host cell under LL and DD conditions.
Paramecium cells were suspended in culture media with
(open circle) or without (closed circle) 10 µg/ml of cycloheximide at 5×103 cells/ml at 25 ± 1 °C, under an LL(A) and a DD (B) conditions. The vertical bars represent
standard errors of the mean quantities of green algal cells
per host cell. At each time, 20-30 Paramecium cells wereobserved. The vertical bars, respectively, represent standard errors of the mean for three samples. Updated from
Kodama and Fujishima, 2008.

Fig. 12. AcPase activity around the symbiotic algae of
Paramecium bursaria cells, strain OS1g, treated with 10µg/ml cycloheximide for 24 h at 5×103 cells/ml at 25 ±1°C, under the LL condition (A), DD condition (B), and
LL condition in the presence of 10-7 M of DCMU. Only
under the LL condition, many symbiotic algae were digested (some are labeled by white arrowheads) andshowed AcPase activity around them. In contrast, under
the DD condition (B) or the LL condition in the presenceof DCMU (C), algal digestion and AcPase activity in thePVs were not induced. AcPase activities appearing in B
and C are those in DVs containing food bacteria. An asterisk denotes DV containing many digested algae; Ma, macronucleus. Bar, 10 µm. From Kodama and Fujishima,2008. See color figure in on-line publication.

130

原生動物学雑誌 第 41 巻 第 2 号

2008 年

Fig. 13. Schematic drawing illustrating some hypotheses related to the induction of SPVS and digestion of symbiotic
alga after treatment of alga-bearing Paramecium bursaria cells with 10 mg/ml cycloheximide under LL or DD conditions. As molecules responsible for functions of the PV membrane, two proteins that are synthesized by the algae, excreted outside the algae and localized on the PV membrane, are postulated. One is a hypothetical maltose transporterrelated protein (squares on PV membrane) (Willenbrink, 1987), which is synthesized by the alga during photosynthesis
and transports maltose from inside the PV membrane to the outside. Loss of this protein in the LL condition induces
accumulation of photosynthesized carbohydrates, mainly maltose. Another one is a hypothetical lysosomal fusion blocking protein (circles on PV membrane) that is synthesized by the algae and which has abilities to block lysosomal fusion
to the PV membrane and also to attach to unknown structures immediately beneath the host surface, so that loss of thisprotein induces detachment of the PV from the host cell surface and induces fusion with the host lysosomes. The maltose
transporter-related protein disappears rapidly from the PV membrane when the algal protein synthesis is inhibited bycycloheximide. On the other hand, the lysosomal fusion blocking protein has a longer turnover time than that of the former; for this reason, this protein remains for some time on the PV membrane when the algal protein synthesis is inhibitedby cycloheximide. Under the LL condition (A), the symbiotic alga synthesizes mainly maltose by photosynthesis in thehost cell (Muscatine et al., 1967) and excretes it into a lumen between the cell wall of the algae and the PV membrane.
The maltose is then transferred outside of the PV membrane through the maltose transporter-related protein on the PV
membrane. The maltose transporter-related proteins disappear from the PV membrane (B-2) when the algal protein synthesis is inhibited by treatment with cycloheximide under the LL condition (B). Ayala and Weis (1987) reported that, bytreatment with 100 mg/ml cycloheximide, the rate of carbohydrate secretion by symbiotic algae under LL showed nosignificant difference between the treated and untreated groups. Consequently, the concentration of the carbohydrates
including maltose increases inside the PV membrane, and outside water flows into the PV and induces the SPVS (B-3).
Later, the lysosomal fusion blocking protein disappears from the swollen PV membrane (B-4). Therefore, the vacuole
containing an alga detaches from the host surface; then the host acidosomes fuse to the swollen vacuole and the vacuole
contracts by membrane replacement between the acidosomal membrane and the swollen vacuole (Fok and Allen, 1988;
Kodama and Fujishima, 2005). Thereafter, lysosomal fusion occurs to the contracted vacuole and the alga is digested (B5). As shown in Fig. 10C, the PVs that are able to avoid the lysosomal fusion in the presence of cycloheximide recontracted PV. Such vacuoles might be produced by evasion of lysosomal fusion after acidosomal fusion. Under the DD
condition (C-1), cycloheximide treatment induces loss of the maltose transporter-related protein from the PV membrane(C-2), but no morphological change is induced. Later, the lysosomal fusion blocking protein disappears from the PV
membrane (C-3). The vacuole detaches from the host cell surface and fuses with acidosomes and lysosomes; then thealgae are digested (C-4). Under the DD condition, the fate of the PV is the same as that of C, irrespective of the presenceor the absence of cycloheximide. CH, cycloheximide. From Kodama and Fujishima, 2008. See color figure in on-line
publication.

Jpn. J. Protozool. Vol. 41, No. 2. (2008)
技術の開発が期待される。たとえば、動物細胞に光合成能力を獲得させる技術開発が可能になるであろう。また、ゾウリムシとその核内共生細菌ホロスポ
ラの細胞内共生の研究は、共生によって宿主細胞が各種のストレス耐性を獲得し、生息域を拡大できる
ことを明らかにした (Fujishima et al., 2005; Hori andFujishima, 2003)。細胞内共生の人為的誘導技術の開発は、究極の省エネ対策としての食料不足の解決
や、二酸化炭素濃度の減少と酸素濃度の増加、さらに生存に不適な各種ストレス環境下でも生育できる生物の作成等に貢献できることが期待される。動物と藻類との細胞内共生は地球環境のいたるところに存在するので、ミドリゾウリムシとクロレラの細胞内共生成立機構の研究で得られた成果は、藻類を細胞内共生生物とする他の様々な共生系と生態系の維持及び修復に役立つことが期待される。

7. 謝辞
本研究は、児玉への日本学術振興会特別研究員奨
励費と、藤島への科学研究費補助金基盤研究(B)海外(No. 17405020)の支援で行われた。

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