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評価用サンプル有 ® 
高速高速

高正確高正
高正確
確

クルード
クルーード
耐性
耐性

MasterM stte
MaMasMast
terMix
Mix
Mix

さらに「ホットスタート対応」＋「dI, dUを含むプライマー・テンプレート対応」● KODシリーズ最高レベルの正確性！

● 伸長速度は最速１sec./kbを実現！
200

KOD One® PCR Master Mix
KOD One® PCR Master Mix -BlueＰＣＲ
Ｒ 間（分）
Ｒ時

150

KOD -Plus- Neo
100

A社高速社高速・高正確PCR
高 確PCR Mast
高正確
Master
er M
Mixix
50

A社 Long PCR用酵素
01kb

3kb

5kb

10kb

増 幅 長
■ 30sec./kbのPCR酵素 ■ KOD One® PCR Master Mix
KOD One® PCR Master Mix -Blue※Applied Biosystems 9700の場合

増 幅 長

伸長時間〜1kb

1sec.

1〜10kb10kb〜

Taq DNA polymerase
0255075100125-5

Mutation Frequency (10 )100,000塩基あたりのエラー率

5sec./kb
10sec./kb※ヒトゲノムDNAをテンプレートとして40kbの増幅を確認しています。

●クルードサンプルも精製なしで効率よく増幅！

● イノシン(dI)・ウラシル(dU)を含むプライマー・テンプレートに対応！

150

製品概要
高 い 正 確 性・増 幅 効 率 を も つ 改 変 型 KOD DNA
polymerase（UKOD）に、改良型伸長アクセラレーターを添加することで、高い正確性を維持したまま、高速PCRを実現しています。
本製品は2×Master Mixで、テンプレート・プライマーを混合するだけでご使用になれます。
また、Loading Dye入りもご用意しております。
従来のPCRをより簡便に、短時間で実施可能です。

ԎՍԵӷԶՆԵԵӨӼ㕪ԟԍԡӨԚԱՇՈԵՆӨԚԺՌԎՍԵӷԳՃՂՈԱԺՂԺՂԷӨӼ㕪ԟԍԡӨԚԱՇՈԵՆӨԚԺՌԗԞԎӨԞՂԵ٥ӨԟԍԡӨԚԱՇՈԵՆӨԚԺՌԗԞԎӨԞՂԵ٥ ԟԍԡӨԚԱՇՈԵՆӨԚԺՌӨӷԌՀՉԵӷ

実施例1

高速PCRによる200bp〜10kbのターゲットの増幅
ヒトゲノムDNAをテンプレートとして伸長時間の短い高速PCRサイクルで増幅を実施しました。
その結果、本製品では1 kb以下のターゲットは伸長時間1 sec.で、1 〜10 kbのターゲットは、5 sec./kbで明確なバンドを確認することができました。

＜反応液＞
滅菌蒸留水
21µL
KOD One® PCR Master Mix 25µL
10pmol/µL Primer F
1.5µL
10pmol/µL Primer R
1.5µL
10ng/µL ヒトゲノムDNA
1µL
Total Volume

50µL＜PCRサイクル＞
1kb以下のターゲット
98℃10sec.
60℃ 5sec.
30 cycles
68℃ 1sec.

A社高速・高正確PCR Master Mixはメーカーの推奨条件に従って実施しています。

［1kb以下：伸長時間1sec.］［1〜10kb：伸長時間5sec./kb］®

KOD One®
PCR Master Mix

KOD OnePCR Master Mix
M 1 2 3 4 5

1〜10kbのターゲット
98℃10sec.
60℃ 5sec.
30 cycles
68℃ 5sec./kb

8 9 10M 1 2

A社高速・高正確
PCR Master Mix

6 7 M 1 2 3 4 5 6 7

M ： 100bp DNA Ladder 6 ： ERCC4 (550bp) M ： 1kb DNA Ladder
1 ： DDB2 (200bp)
7 ： HRAS (600bp) 1 ： Chrome9 (1kb)
2 ： FANCG (250bp)
8 ： PRF1 (700bp)
2 ： MSH6 (2kb)
3 ： HBG (300bp)
9 ： BRCA1 (800bp) 3 ： FANCE (3kb)
4 ： CDH1 (400bp)
10： CDK4 (1,000bp)
5 ： Chrome9 (500bp)

4 ： RAD51D (4kb)
5 ： KRAS (5kb)
6 ： BRCA1 (7kb)
7 ： DDB2 (10kb)

Template: ヒトゲノムDNA

実施例2

クルードサンプルからの増幅
マウステールライセート（下記アルカリ溶解法）、ヒト全血を用いて、マウス Thy-1 遺伝子、ヒト β-globin遺伝子の増幅を行いました。反応はそれぞれのPCR酵素の推奨条件に従い、伸長時間は5 sec./kbで実施しました。
その結果、KOD One® PCR Master Mixのみ明確なバンドを確認することができました。
12
マウステール（約3mm）＜PCRサイクル＞
98℃10sec.
60℃ 5sec.
68℃ 5sec./kb

滅菌蒸留水ＹµL
KOD One® PCR Master Mix 25µL
10pmol/µL Primer F
1.5µL
10pmol/µL Primer R
1.5µL
鋳型XµL

マイクロチューブに移す

3Total Volume

50mM NaOH 180µL添加

30 cycles

50µL

A社高速・高正確PCR Master Mixは、メーカーの推奨条件に従って実施しています。

▼ボルテックスにてよく攪拌［マウステールライセートからの増幅］［ヒト全血からの増幅］

KOD One®
A社高速・高正確
PCR Master Mix PCR Master Mix

495℃ 10min.
▼

M 1 2 3 4

1M Tris-HCI(pH8.0) 20µL添加

A社高速・高正確
PCR Master Mix

M 1 2 3 4M 1 2 3 4

1 2 3 4

▼ボルテックスにてよく攪拌▼

12,000rpm, 5min.[optional]

3.6kb

2.6kb

5
上清 2µL▼PCR(50µL)（マウステールは完全には溶解しません。）

M ： 1kb DNA Ladder
1 ： 1 µL 2 ： 2 µL 3 ： 4 µL
Template : マウスゲノムDNA
Target :Thy-1

4 ： 8 µL

M ： 1kb DNA Ladder
1 ： 1 µL 2 ： 2 µL 3 ： 4 µL
Template : ヒトゲノムDNA
Target : ＨＢＢ

4 ： 8 µL

実施例3

プラスミドDNA、cDNAをテンプレートとした検出感度の比較
プラスミドDNA、cDNAを用いて、約3.5kbのターゲットを伸 長 時 間 5 s e c . / k bで 増 幅し、
検 出 感 度 を 比 較しました 。反 応 はそれ ぞ れ のPCR酵素の推奨条件に従って実施しました。
その結果、KOD One® PCR Master Mix は
他社試薬と比較して、より低コピーの領域まで増幅することができました。

［プラスミドDNA］
KOD One
A社高速・高正確
PCR Master Mix PCR Master Mix
M 1 2

滅菌蒸留水
KOD One® PCR Master Mix
10pmol/µL Primer F
10pmol/µL Primer R
鋳型21µL
25µL
1.5µL
1.5µL
1µL

Total Volume

50µL＜PCRサイクル＞
98℃10sec.
60℃ 5sec.
68℃18sec. (5sec./kb)［cDNA］KOD One
A社高速・高正確
PCR Master Mix PCR Master Mix

1 2 3 4

M 1

3.5kb

M 1 2 3 4

3.5kb

30 cycles

A社高速・高正確PCR Master Mixはメーカーの推奨条件に従って実施しています。

M ： 1kb DNA Ladder
1 ： 25 pg
2 ： 6.3 pg
3 ： 1.6 pg4 ： 0.4 pg

M ： 1kb DNA Ladder
1 ： 25 ng（RNA相当量）
5 ng（RNA相当量）
2 ：1 ng（RNA相当量）
3 ：
4 ： 0.2 ng（RNA相当量）

Template: プラスミドDNA
Target: Polymerase 遺伝子

Template: HeLa細胞total RNA由来のcDNA
Target: TFR

実施例4

逆転写反応液の持ち込み可能量の確認
逆転写反応液（cDNA）に含まれるRNAはPCRに対して 阻 害 的 に 働 くた め 、大 量 の c D N A の添加は反応阻害につながります。
そこで、cDNAの持 ち 込 み 可 能 量 を 確 認 する た め 、c D N A の添加量をふり、TFR 遺伝子の検出を行いました。
その結果、KOD One® PCR Master Mixシリー
ズはRNAによる阻害を受けにくく、従来品や他社品では増幅困難な多量のcDNAを添加した条件においても良好な増幅を行うことができました。

滅菌蒸留水
KOD One® PCR Master Mix /-Blue10pmol/µL Primer F
10pmol/µL Primer R
cDNA

17µL
25µL
1.5µL
1.5µL
5µL

Total Volume50µL＜PCRサイクル＞
98℃10sec.
60℃ 5sec.
68℃18sec. (5sec./kb)

KOD One®
KOD One®
PCR Master Mix PCR Master Mix -Blue-

M 13 4

KOD -PlusNeo

KOD FXNeo

M 1 2 3 4M 1 2 3 4

B社高正確
PCR酵素

C社高正確
PCR酵素

M 1 2 3 4M 1 2 3 4

3.5kb

A社高速・高正確
A社高正確・高効率
PCR Master Mix
PCR酵素

M 1 2 3 4M 1 2 3 4

3.5kb30 cycles

KOD One® PCR Master Mix以外のPCR酵素は、それぞれの推奨条件に従って実施しています。

M ： 1kb DNA Ladder
1 ： 125 ng(RNA相当量)
2 ： 250 ng(RNA相当量)

3 ：500 ng(RNA相当量)
4 ： 1,000 ng(RNA相当量)

Template: HeLa細胞total
RNA由来のcDNA
Target: TFR

実施例5

次世代シーケンサー（NGS）のライブラリー増幅

40

60

GC% of 100 base windows

80

10040

2.020
1000204060

GC% of 100 base windows

80

100

Mean base quality30

1.5
1.0Fraction of normalized coverage

0.5402020

Mean base quality

30

1.50Normalized Coverage
Windows at GC%Base Quality at GC%0.0

KOD One PCR Master Mix以外のPCR酵素は、それぞれの推奨条件に従って実施しています。

1014 cycles

Normalized Coverage
Windows at GC%
Base Quality at GC%0®

All Reads Level: All Reads GC Bias Plot

1.050µL

Fraction of normalized coverage

Total Volume＜PCRサイクル＞
98℃10sec.
60℃ 5sec.
68℃ 1sec.

E社 PCR 試薬

All Reads Level: All Reads GC Bias Plot

0.514µL
25µL
5µL
5µL
1µL

KOD One® PCR Master Mix

0.0

＜反応液＞
滅菌蒸留水
KOD One® PCR Master Mix
10pmol/µL Primer F
10pmol/µL Primer R
1ng/µL NGS library

2.0NGSライブラリーの増幅においては、配列による増幅バイアスがないことが重要となります。GC率70%のThermus thermophilus 由来のライブラリーを増幅し、シーケンス後のデータを比較しました。
シーケンスには イルミナ社 MiSeq®を使用しました。
®
その結果、KOD One PCR Master Mixで増幅したライブラリーはGC率が高くてもノーマライズされたカバレッジが1に近く、バイアスが少ない結果となりました。KOD One ® PCR Master Mixは長鎖ターゲットの増幅にも強みがあり、Shortリードのライブラリーだけでなく、Longリードのライブラリー増幅にも応用が期待できます。

実施例6

相補的なプライマーを用いる変異導入（Site-Directed Mutagenesis）
相補的なプライマーを用いた変異導入法による、約5 kbのプラスミドへの変異導入（3塩基置換、3塩基欠損、3塩基挿入）を実施しました。KOD One® PCRMaster Mixを使用することで、5 kbのプラスミドでも伸長時間25 sec.の高速サイクルで変異導入ができました。得られたコロニーのほとんどで変異導入が確認され、目的外変異（2nd- site mutation）は確認されませんでした。
KOD One® PCR Master Mixを用いることで、迅速かつ正確に変異導入が可能です。

滅菌蒸留水
KOD One® PCR Master Mix
10pmol/µL Primer F
10pmol/µL Primer R
50ng/µL プラスミド

21µL
25µL
1.5µL
1.5µL
1µL

Total Volume

50µL＜変異導入サイクル＞
10sec.
60℃
5sec.
68℃ 25sec.(5sec./kb)

15 cycles

上記反応液↓ ← Dpn I [10U/µL ; Code No. DPN-101]
37℃, 1hr.
↓
JM109 [Code No. DNA-900Ｆ] を形質転換

2µL○変異導入サイクル後の電気泳動確認
M 1235kb

M ： 1kb DNA Ladder
1 ： 3塩基置換
2 ： 3塩基欠損
3 ： 3塩基挿入○各8クローンの変異導入率および、目的外変異数
変異導入率

品

名
サンプル

KOD One PCR Master Mix®

サンプル(Dye-containing 2×PCR Master Mix)

KOD One PCR Master Mix -Blue®

サンプル

無償の本製品を使用した評価用サンプルを多数の実施例をご用意しています。

ご紹介しています。

サンプル請求8/ 8クローン

0個

3塩基欠損

8/ 8クローン

0個

3塩基挿入

7/ 8クローン0個

包価

Code No.

(Dye-free 2×PCR Master Mix)

実施例集

目的外変異数

3塩基置換

装格(税別)

KMM-101
KMM-101X5
KMM-101X10

1mL × 5本*(1mL× 5本)× 5(1mL× 5本)×10¥35,000¥140,000¥260,000

KMM-201
KMM-201X5
KMM-201X10

1mL × 5本*(1mL× 5本)× 5(1mL× 5本)×10¥35,000¥140,000¥260,000*50μLで反応を行った場合、200回用としてご使用になれます。

保存温度 -20℃

１ヶ月以内を目安として２〜８℃で冷蔵保存することができます。
※本資料に記載している会社名および商品名・ロゴマークなどは、各社の商号、商標または登録商標です。

バイオプロダクト営業部(E-mail) order̲lifescience@toyobo.jp（ 大 阪 ）〒530-0001

大阪府大阪市北区梅田一丁目13番1号
大阪梅田ツインタワーズ・サウス
TEL 06-6348-3786 FAX 06-6348-3833（ 東 京 ）〒104-8345

東京都中央区京橋一丁目 17 番 10 号
住友商事京橋ビル
TEL 03-6887-8819 FAX 03-6887-8951

テクニカルライン( E-m ai l ) te ch̲o s aka@to y o b o .jp
TEL 06-6348-3888 FAX 06-6348-3833( 9:00 〜 12:00 13:00 〜 17:00 [ 土日祝日、休日を除く ] ）toyobo 公式 X

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