1-8 総合文化研究室研究活動報告●学科総合文化研究室●学科専任教員

澤田博司（教授）
間瀬啓介（教授）
外川徹（助教）【研究の概要および結果】
研究課題：生物における環境適応に関する研究目的および概要：総合文化研究室所属の 3 名の理系（生命科学系）教員は，生物における環境適応の分子機構の解明を目的として多面的に研究を進めている。以下に当該年度での研究 1 〜 3 についての概要，結果，研究成果等を報告する。
研究 1．昆虫の胚子活性化時における新規一酸化窒素合成酵素スプライシングバリアントの役割
目的および概要：本研究は昆虫の休眠・非休眠機構解明の一環であり，本年度は昆虫（カイコガ）の胚子発生に関与している一酸化窒素合成酵素（NOS）の新規スプライシングバリアント（NovNOS-V）の役割の解明を目的として研究を遂行した。具体的には，NOS と NovNOS-V 遺伝子の発現と構造の解析，胚子発生時の NOS の活性測定を行った。
結果：NOS 遺伝子は，当初 21 のエキソンと 20 のイントロンより構成されていると判断していた。しかし，今回の詳細な解析により 19 エキソンが 2 つに分かれていることが判明し，22 のエキソンと 21 のイントロンに分かれている事が明らかとなった。また，NovNOS-V は，その中の 1 つのエキソンが選択的スプライシングにより除かれていることが判明した。NOS 遺伝子発現解析を RT-PCR により行った結果，休眠卵では産卵後 48 時間の発現が高く，非休眠卵では 24 時間から発現が高くなり 60 時間までその発現が維持されていた。更に，NOS と NovNOS-V 遺伝子は浸酸処理を施した直後に発現が高くなることが明らかとなり，NovNOS-V 遺伝子の発現は浸酸処理卵直後でのみ確認された。NOS の酵素活性を測定したところ，休眠卵では 48 時間での酵素活性が高く，非休眠卵では産卵直後の活性が高くその後減少した。浸酸処理卵では，浸酸処理卵直後に活性が高くなる事が確認できた。
考察・反省：今回解析した NOS 遺伝子の構造は，他の生物種の NOS での報告と一致していた。このような構造は，NOS がヘムや基質であるアルギニン結合部位を含むオキシゲナーゼドメインと NADPH，FAD，FMN 結合部位を含む還元酵素ドメインをもつ事に由来し NOS に特有なものであることが考えられる。また，休眠卵 48 時間での遺伝子発現と酵素活性のみ変動パターンが一致したが，その他は一致しなかった。これは，NOS の活性は主に翻訳後に調節されている可能性が考えられる。しかし，休眠卵 48 時間の酵素の活性化は，転写レベルでの調節が効いているように思われる。また，NOS が休眠卵・非休眠卵・浸酸処理卵でどの様に分布し，細胞内の何処に局在し機能しているのかを明らかにすることが，今後の課題であると思われるので，早急にその準備を進めているところである。
研究 2．カイコガ笹繭発現関連遺伝子の探索目的および概要：絹糸昆虫は繭に色素を分泌することによって周囲の色と同調し，外敵から身を守っている。また，この色素は抗酸化性や紫外線遮蔽効果をもつ有用成分であることが知られている。本研究では，この色素うちフラボノイドの分泌メカニズムを解明するために，カイコガの緑繭系統と白繭系統とを用いた染色体置換系統（CSL）で見出された，最も基本的な笹繭関連遺伝子の詳細な遺伝子座位を決定した。さらに，ゲノムデータベースから，その領域の予測遺伝子に関して RT-PCR を行い，緑繭系統特異的な遺伝子を探索した。
結果：CSL27 の逆交雑集団 1252 個体において，第 27 連関群上の SNPs マーカーによる笹繭発現遺伝子の座位決定を28行ったところ，第 27 連関群の端部付近に座乗することが明らかになった。また，この領域に相当する KAIKO-base
上の物理地図を調べたところ，ギャップをはさむ 2 つのスキャホールドに対応することが分かった。さらに，この領域における予測遺伝子を調べたところ，糖トランスポーターをはじめ幾つかの膜トランスポーター遺伝子などが集積して存在していた。そこでこれら膜タンパク遺伝子の配列情報をもとに特異的プライマーを設計し，緑繭系統と白繭系統の 5 齢期 3 日目にあたる中部絹糸腺から合成した cDNA に対して RT-PCR を行った。その結果，14 遺伝子について解析したところ，一つの General Transporter 遺伝子において緑繭系統でのみ発現が見られた。また，近接する糖トランスポーターでは緑繭系統での発現が際立っていた。しかしながら，これら 2 つの遺伝子において，ゲノム PCR による発現遺伝子領域を調べたところ，欠失や重複等大きなゲノム構造の変異は認められなかった。
考察・反省：新規に見出した笹繭関連遺伝子に対して，SNPs マーカーによる座位決定と RT-PCR による候補遺伝子を絞り込んだ。過去において，笹繭発現には中部絹糸腺におけるフラボノイド透過性が関係していること報告されており，今回の候補遺伝子との矛盾はない。しかしながら，それらには大きなゲノム構造の変異は見られなかったので，塩基置換レベルでの解析や発現調節領域について調べる必要があると思われる。また，他の遺伝子についても確認する必要があるので，今後より詳細な座位決定およびギャップ領域の充填，ならびに予測遺伝子の発現解析を継続する予定である。
研究 3．JH 誘導性 bHLH 転写因子 hairy の発現解析
目的および概要：昆虫の変態は体の構造や生理機能が短期間に劇的に変化する現象であり，このメカニズムの解明は生物学的に非常に重要である。変態現象は主に脱皮ホルモン（エクダイソン）と幼若ホルモン（JH）により制御されている。エクダイソンのシグナル伝達における分子基盤については多くの知見が蓄積しつつあるが，それに対し JH の分子作用機構はほとんど解明されていない。本研究は，この JH シグナル伝達経路の全貌解明を目標とした研究の一部である。
カイコの bHLH ファミリー転写因子をコードする BmH 遺伝子は，培養細胞において JH により発現誘導される。そのため BmH タンパク質が JH シグナルを仲介している可能性が高い。本遺伝子と JH シグナルとの関連を明らかにするためには，まず遺伝子発現パターンを解析し，体内の JH 濃度変化と比較することが肝要である。本年度は，変態に伴う変化が顕著な器官である表皮について BmH 遺伝子の発現パターンを解析した。
結果：カイコ表皮を発育段階をおってサンプリングし，real-time RT-PCR 法により BmH mRNA 量を解析した。その結果，3 齢幼虫から 4 齢幼虫においては，体内 JH 濃度変化に呼応するような発現パターンが観察された。しかしながら，終齢である5齢幼虫から蛹期におけるBmH遺伝子の発現は，体内のJH濃度変化と一致していなかった。また，ピーク時の発現量を比較すると，5 齢幼虫から蛹期の方が 3 齢から 4 齢幼虫の器官より 2 倍から 3 倍高かった。
考察・反省：BmH 遺伝子の表皮における発現変動の結果から，本遺伝子は若齢幼虫では JH シグナル経路で機能しているかもしれないが，終齢幼虫期から蛹期の表皮では JH シグナル経路とは異なる経路で主に機能している可能性が高い。しかしながら，JH は変態制御以外にも性成熟などにも関与しており，この生理活性における標的器官は脂肪体もしくは生殖巣であると考えられる。マイクロアレイを用いた解析から，BmH は表皮よりむしろ脂肪体での発現が高いことが判明した。このことから，BmH は脂肪体や生殖巣において JH シグナル伝達に関わっている可能性があり，これらの器官における BmH 遺伝子の発現変動を詳細に解析する必要がある。

29【研究成果】（学会発表）
ジメチルスルホオキシド（DMSO）による休眠打破効果
日本蚕糸学会第 80 回記念大会 2010 年 4 月 3，4 日（上田）
染色体置換系統作出過程に見られた緑繭関連遺伝子について
日本蚕糸学会第 80 回記念大会 2010 年 4 月 3，4 日（上田）ジメチルスルホキシドによるカイコ卵休眠の打破
日本動物学会第 81 回大会 2010 年 9 月 23-25 日（東京）
耐熱性乳酸酵素のバイオセンサへの応用
第 48 回日本生物物理学会 2010 年 9 月 20-22 日（仙台）カイコ初期発生における一酸化窒素合成酵素と GTP シクロヒドロラーゼ I について
日本蚕糸学会第 81 回大会 2011 年 3 月 20，21 日（東京）
染色体置換系統作出過程で見出した笹繭遺伝子の座位決定
日本蚕糸学会第 81 回大会 2011 年 3 月 20，21 日（東京）姫日油（ohi）とアレルな新規致死油蚕変異体の遺伝学的解析
日本蚕糸学会第 81 回大会 2011 年 3 月 20，21 日（東京）（学術論文）
Role of 20 kDa protein associated with a carbocycle-forming enzyme involved in aminoglycoside biosyhthesis inprimary and secondary metabolism.
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 74, 1215-1219, 2010.
（特許）「ジメチルスルホキシド（DMSO）によるカイコ休眠卵の人工孵化方法および卵内への化学物質導入方法」
特願 2010-188018，出願日 2010 年 8 月 25 日30