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私 にも
！
できた

ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ

P C R 実 戦 技 術 編（1）
技術の多様化にともなって、ライフサイエンス研

その中で、「PCR〜タンパク質発現実験」の中で究に占める研究試薬・キットの役割は日に日々大き使われるDNA関連技術に関して高い関心をもたれくなってきています。その一方において、情報が増ている学生さんや先生方が多い印象を受けました。

えすぎて逆に効果的な研究ができなくなっているとポストゲノム時代と呼ばれると昨今ですが、意外との声も聞かれます。

DNAを扱う実験が多いようです。また、ポストゲノ

本シリーズは、そのような情報を一旦整理し、初心者の方にも分かりやすく効果的にライフサイエン

ム時代になってから、初めて遺伝子実験をされるよ
うな方も多いように感じました。

ス実験を解説できないか、との趣旨から企画されま

そこで、今回から「PCR実戦技術編」と題したシリーズを4回に分けてお届けさせていただくこと

した。
今まで、
研究員の実際の実験ノートなども参考に、
市販のノウハウ本や実施例集ではカバーできなかになりました。本稿が、研究に携われる方の一助になれば幸いです。

ったような『生の事例』を紹介することで、より身近に技術を感じていただけないかと考え、『 PCRを用この前のシリーズでは、まだ駆け出しの新人だっいる遺伝子クローニング編〈Vol.1〉』、『遺伝子発たA子さんは、入社4年目に突入し、ますます張り切

現解析（前・後編）〈Vol.2, 4〉』、及び『ウェスタンっているようです。そんな中、強力なライバルが登ブロッティング・免疫組織染色編〈Vol.3〉』をご紹場したようですが…。

介させていただきました。

今までの
登場人物

研究所近郊でレンゲ草を見つけました

A子さん
N代さん
Sリーダー
冷静沈着なライフ 今年入社4年目 今年入社3年目になる研究員サイエンスグルー になる研究員（A子さんのライバル）
プのリーダー

S本さん
アシスタント本シリーズは、弊社ウェブサイト
（http://www.toyobo.co.jp/bio）の「実験お助けコーナー」でご覧いただけます。

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できた ラ イ フ サ イ エ ン ス 実 験 シ リ ー ズ

1No.90.qx 08.3.21 17:09 ページ 9

進化するKOD DNA polymerase

1

KOD DNA polymeraseは、1997年に報告されて以来様々な方向へ進化を遂げ、実に多くの分子生物学実験に用いられるようになりました。ここでは、そのKOD DNA polymeraseについて、その過去と応用の歴史について解説いたします。

1-1 KODの名前の由来は？

条件での、1秒間の伸長塩基数（Elongation rate）も、Pfuが約

KOD DNA polymerase（以下、KOD）は当時大阪大学のグ25、Taqが約61であるのに対して、KODは約106-138と極めて優れていることが分かっています。

ループによって鹿児島県の小宝

また、2001年にKODの立体構造が明らかとなり2）、その後島の硫気孔より分離された超好熱Archaea：ThermococcusのKODの改良研究は大きく進展しました。KODに特有な配列が立体的にどの部分に配置されているかも明らかとなり、KOD

kodakaraensis KOD1株よりクローニングされました1）。よく、の高い伸長性や効率に対する理解が深まりました。
2）H. Hashimoto, M. Nishioka, S. Fujiwara, M. Takagi, T. Imanaka,
T. Inoue and Y. Kai, , J. Mol. Biol., 306: 469-477（2001）

コダカラ を 子宝 と思われている方がいらっしゃいますが、 小宝 が正解です。しかし、この島に子宝祈願に訪れる方もいらっしゃるとのこと（このポリメラーゼにご利益があるかは不明ですが…）。ともかく、KODの名前は、Kodakara Island に由来します。
このポリメラーゼは、5,013bp（1,671AA）という大変長い
open reading frame（Accession No.D29671）中に見いだされました。KODの分子量は約9万ですので、かなり大きなORFとして発見されたことになります。実は、このORFにはインテインと呼ばれる2つの挿入配列（Intein-1:360AA, Intein-2:
537AA）が含まれていました。現在販売されているKODは、これらの配列を遺伝子工学的に除去したものです。
参考までに、インテイン（Intein）とはタンパク質分子の一部として翻訳され、合成後に自動的に切除されるアミノ酸配列のことを指します。残った部分（Extein）はペプチド結合で再結合されます。このインテインは1980年代後半に報告されて以来、生物界に広く確認されています。インテインの多くはhoming
endonulceaseのドメインを含み、自身の伝播に関わっていると考えられています。この配列は利己的遺伝子要素として太古の昔にKODの遺伝子中に進入してきたものと推察されます。
1）M. Takagai, M. Nishioka, H, Kakihara, M, Kitabayashi, H. Inoue, B. Kawakami,
M. Oka and T. Imanaka, Appl. Environ. Microbiol., 63: 4504-4510（1997）

1-3 様々な分野への応用
P C R 反 応 溶 液を調製してからPCRが〈ホットスタートPCR〉

開始されるまでの間に、ポリメラーゼとエキソヌクレアーゼ活性が発 現して、プライマーなどを基点とKOD

して様々な副反応が起こる ことが、非 特異増幅の要因の一つとして考えられています。そこで、KODのポリメラーゼ活性と校正活性に対する2種類の中和抗体が作製されました3）。この抗体を酵素に混合しておくことにより、常温下でのポリメラーゼ、及び校正活性を抑制することができます。抗体は最初の変性ステップで変性し、PCRには影響を及ぼしません。
この技術は、『ホットスタートPCR法』と呼ばれ、高正確性PCR酵
素「KOD -Plus-」に最初に取り入れられました。KOD -Plus-は更にバッファーを最適化することで、より高い正確性を達成し、現在、クローニング用酵素のスタンダードとなっています。
3）H. Mizuguchi, M. Nakatsuji, S. Fujiwara, M. Takagi and T.
.
, 126: 762-768（1999）.
Imanaka, J. Biochem（Tokyo）

1-2 KOD DNA polymeraseの特性
Family B（α型）に分類されるKODのようなPCR用酵素が
Taq DNA polymerase （以下、Taq）などの好熱細菌由来のFamily A（PolⅠ型）に属するPCR用酵素と大きく異なる点としては、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性（校正活性）を有する点を挙げることができます。この活性を持つことにより、KODは、Taqに比べ、約50〜80倍という驚異的に高い正確性を示し、遺伝子のクローニングをはじめとする様々な用途に利用されています。
また、KODだけに備わっている性質も明らかにされています。1分子の酵素が一度に伸長できる塩基数

Thumb-2
Thumb-1（Processivity）は同Active centerof polymerase

Exo

じくα型に属するPfu
DNA polymerase（ 以下、Pfu ）が約20であるのに対し、KOD

Fingerは300以上と、飛びぬ
Palm

N-ter

2 ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ

けて優れていることが分かっています。また、酵素を過剰量添加した
私 にも
！
できた

1-4 高成功率という切り口
近年、研究の進展の速度は速まり、様々な分野で分子生物学
領域の技術を使用するニーズも増大しました。その中で、最も必要とされるPCR酵素の特性の一つとして、『PCRの成功率』が挙げられるようになりました。難しい配列を増幅しなくてはならな
い場合や、設計に無理のあるプライマーを使わざるを得ない場合
においても、
迅速に実験を進める必要がでてきたのです。そこで、
KOD -Plus-の正確性をそのまま（Taqの約80倍）に成功率を向上させた「KOD -Plus- Ver.2」と、独自の技術を用いて格段にPCR成功率を向上させた「KOD FX」が成功率をより高く

開発されました（KOD
FXの正確性はTaqのKOD FX
より正確に
KOD -PlusVer.2

約11倍）。KODは、今後さらに新たな境地を

KOD -Plus-

目指して、日々進化を続けています。

KOD
PCR

No.90.qx 08.3.21 17:09 ページ 10

実戦−その1−

2

A子さんはT社バイオ研究所のライフサイエンス試薬開発グループの研究員です。新人だった彼女も入社4年目となり、そろそろ後輩の指導などのような仕事も増えてきています。
また4月からは、Sリーダー指導の下、A子さんを中心に数名の研究員とアシスタントさんでグル ープを作り、『PCRをテーマとした調査・改善活動』を行わなくてはなりません。今回、A子さんのグループには、以下のようなテーマが与えられました。しかし、あまりにも抽象的なテーマに、A子さんは少し戸惑っています。

課題：PCR実験を円滑に進めるにはどうすればよいか？

2-1 研究者はPCR実験の何に困っているの？

2-2 高成功率PCR酵素『KOD FX』

今日は、1回目の会合です。A子さん達

次に、A子さん達は対策を打つことにしました。今回挙げられは、早速、「 PCR実験を円滑に進めるにた要因のすべてに対して対策を打つことで、理論上的には、PCR

はどうすればよいか」について話合うこと

実験はスムーズに進むようになるはずです。

にしました。しかし、みんながあまりに話し合いを進める中、「 要因の1．
と2．
を考慮して開発されたのも色々なことを言ったため、結局全く収集

が『KOD FX』ではないの？」、という意見が出されました。KODがつかなくなってしまいました。

FXは、KOD DNA polymeraseをベースに、PCR成功率を考慮

翌週行われた2回目の会合では、Sリー
ダーの指導もあって、まず、「PCR実験がうまくいかない」理由について、思いつくままポストイットに理由を書き付けていきました

して最近開発されたPCR酵素です。様々な改良により今までにないくらいまでPCR成功率が向上しています。
そこで、A子さんたちは、要因の3．
を『KOD FXをどういう時（図1）。みんな、思うところがあったのか、みるみる間に机はポスに使うべきか』、ということに置き換えて、図3に示すような対照

トイットだらけになってしまいました。ざっと眺めると、みんなの表を作成してみました。結局、要因1．
と2．
はKOD FXをうまく用

意見は、幾つかに分類することができそうです。

いることで、解決できそうです。若干正確性が落ちるので、クロー

そこで次に、「 PCR実験がうまくいかない」ことに対する要因

ニング実験に関してはKOD -Plus-にはかないそうもありません

を分類してみました（図2）。すると、要因は、ターゲットのGC含が、従来のTaqベースの酵素と比べるとはるかに良いに違いあ

量が高いなどの「増幅ターゲット」側の要因、変な場所にしかプラりません。

イマーを設計できないなどの「実験上の制限」、「ポリメラーゼの結局、A子さん達は要因1．
〜3．
の対策として、グループで年間選択」、「 実験テクニック」の大きく分けて4つにきれいに分類でを通じて、『KOD FXを用いる成功率向上に関する事例』を作成きることが分かりました。順を追って考えると、きちんとまとまるすることにしました。残った要因4.の『実験テクニック』は、PCR

ことに、みんな少し感動しました。

での増幅そのものではなく、PCRの周辺技術という感じです。これに関しては、Sリーダーに何やら良い考えがあるようです。

KOD FXの特長
・極めて高い増幅
成功率・高い増幅効率・優れた伸長性

図1 ブレインストーミングの結果

GC%

PCR

KOD -Plus（KOD -Plus- Ver.2）
Taq80（<10kb）

Long
KOD FX
Taq
11

設計（>10kb）

PCR
Long PCR
培養細胞やマウステールなどのクルードサンプルからのPCR

図3 PCR酵素の使い分け

図2 要因の解析結果
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3No.90.qx 08.3.21 17:09 ページ 11

KOD FX活 動 報 告 1.

PCR時のスメア、エキストラバンドなどの非特異増幅の軽減について

今回は、10kb以上のターゲットの増幅において度々問題となる、非特異増幅の発生とプライマー長、及び精製グレードの関係について検討を行いました。

【プロトコール＃1】KOD FXの基本反応条件●プライマーの精製グレードの影響の検討

試薬
添加量(μl )2×PCR buffer for KOD FX
25102mM dNTPs
1.5
10pmol/μl Primer #1
1.5
10pmol/μl Primer #2

この実験では、比較的増幅が難しく、また、スメアやエキ ストラ バンド が 出 や す いこと の 知ら れ て い るβglobin遺伝子17.5kbをターゲットとして検討を行いました。テンプレートとしては、50μlの反応あたり、
ヒトゲ
ノムDNAを50ngを用いて行いました。プライマーは、
脱塩、カートリッジ精製、及びHPLC精製の3通りの方法
で精製されたもの(表1のA及びB)を用いました。サイクルは、Long PCRに有効とされている2ステップサイ
クル（30サイクル）とステップダウンサイクル（5→5→
5→20サイクル）で行いました（右図参照）。
その結果、脱塩グレードのプライマーの場合、いずれのサイクル条件においても、スメアが出やすい傾向にあることが分かりました（図4）。一方、カートリッジ精製とHPLC精製グレードのプライマーでは、ステップダウンのサイクル条件で目的バンドのみのキレイな増幅を確認することができました。この結果から、長いターゲット
を 増 幅 する場 合 、カ ートリッジ精 製 以 上 のグレ ード
10kb以上ののプライマーを用いることにより良好な結果が得られることが分かりました（図4）。

X

Template DNA

Y
1
1.0 U / 50μl
50（μl）PCR grade water
KOD FX（1.0U/μl）
Total

3ステップサイクル

2ステップサイクル
×25〜4094℃

×25〜4098℃

94℃

2min. 10sec.

98℃

2min. 10sec.

68℃

1min./kb

68℃
Tm-5℃

4℃

1min./kb

4℃

30sec.

∞∞

ステップダウンサイクル
×5

94℃

×5

98℃

2min. 10sec.

74℃

×5

×15〜25

98℃

98℃

98℃

10sec. 72℃

10sec.

1min./kb

70℃

1min./kb

1min./kb

10sec.

68℃

68℃

1min./kb 7min.

4℃
∞

2ステップ

●プライマー長の影響の検討
次に、18merから40merまで2base刻みで長さを変化させたプライマー（表１のＮｏ．
1〜12、精製は、いずれもカートリッジ精製グレード）を用いて検討を行いました。
その結果、2ステップのサイクル条件では、24〜40
ｍerでターゲットの増幅が認められ、同時に出現したエキストラバンドはプライマーが長い程少ない傾向にある
ことが分かりました（図5）。一方、ステップダウンのサイクル条件では、28〜40merでターゲットの増幅が得られ、エキストラバンドはプライマー長に関わらず出現しませんでした。この結果から、Long PCRでは、通常より長めのプライマーを設計し特異性を上げると共に、アニーリング（及び伸長反応）を比較的高い温度に設定することでより良い結果が得られることが分かりました。
この傾向は、KOD FX以外のPCR酵素においても、ある程度当てはまると推察されます。

終濃度
1×0.4mM each
0.3μM
0.3μM
Genomic DNA : 〜200ng/50μl
Plasmid DNA : 〜50ng/50μl
cDNA: 〜200ng（RNA相当量）/50μl

12

ステップダウン
3

M

1

2

3
1:脱塩
2：カートリッジ精製
3：HPLC精製
M:λ/Hin d Ⅲ digest

17.5kb図4. プライマーの精製度が非特異反応に及ぼす影響
2ステップ

ステップダウンM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

17.5kb

F側Primer（Primer長）
１〜12共通で、
1：hBG17.5F40（40mer） 7：hBG17.5F28（28mer） R側Primerは、を使用。
2：hBG17.5F38（38mer） 8：hBG17.5F26（26mer） hBG17.5R（35mer）
3：hBG17.5F36（36mer） 9：hBG17.5F24（24mer）
4：hBG17.5F34（34mer） 10：hBG17.5F22（22mer）
λ/Hin d Ⅲ digest
5：hBG17.5F32（32mer） 11：hBG17.5F20（20mer） M：
6：hBG17.5F30（30mer） 12：hBG17.5F18（18mer）

図5. プライマー長が非特異反応に及ぼす影響表1. 実験に用いたプライマー配列
No.
A
B

Primer名
hGB17.5F
hGB17.5R

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

hGB17.5F40
hGB17.5F38
hGB17.5F36
hGB17.5F34
hGB17.5F32
hGB17.5F30
hGB17.5F28
hGB17.5F26
hGB17.5F24
hGB17.5F22
hGB17.5F20
hGB17.5F18

4 ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ

Primer配列
TGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCACATGATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGGACTCAGAGACTTTGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCCTTTGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCTTGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCTGATTATGACTATCCCACAGTCATTATGACTATCCCACAGTCTATGACTATCCCACAGTC

私 にも
！
できた

PrimerSize（mer） GC% Tm（℃）
精製グレード
77.5
49%
35
脱塩、
カートリッジ、HPLC
76.9
46%
35
脱塩、
カートリッジ、HPLC
40
38
36
34
32
30
28
26
24
22
20
18

48%
47%
47%
50%
47%
47%
46%
42%
42%
41%
40%
44%

78.8
78.0
77.7
75.9
72.3
69.9
67.4
64.0
61.6
57.9
52.7
49.7

カートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジ

No.90.qx 08.3.21 17:09 ページ 12

2-3 強力ライバル出現
A子さんたちの話し合いの中で、PCR実験の問題の一つとして挙げられた「実験テクニッ
ク」に関して、Sリーダーから提案がありました。実験テクニックに関する課題を年間に数回に分けて出して、その課題の解決を通じてそれぞれの手法の裏に潜む注意点・問題点を明らかにするというのです。いつも冷静沈着なSリーダーには、なにやら考えがありそうです。
結局、サークル員の中から代表としてA子さんとN代さんに、それぞれ関連のある課題が出されることになりました。A子さんは、後輩のN代さんに先輩の威厳を示さなくてはと今後の活動方針（対策）

あせっているようです。一方、N代さんは、A子さんとは違って、学生時代から分子生物学分■要因1〜3 a PCR事例を収集

野の研究を行ってきた経歴がありますし、負けん気では一歩も引けをとりません。

a Sリーダーの出す課題に
チャレンジ

■要因4

さて、二人には、次のような課題が出されました（皆さんも是非考えてみてください）。

A子さんへの課題：●平滑末端を有するPCR増幅断片の平滑末端クローニング方法の手順をまとめなさい。
●その手法を用いて、human β-Actin cDNAのC末端欠損変異体を作製しなさい。
条件： ・Accession No.X00351のcDNAクローンを準備するので、そのプラスミドをPCRの鋳型とすること。
・開始コドンの位置にNdeⅠのサイトを導入すること。
・732番目のGCTをTGA（ストップコドン）に変更し、なるべくすぐ後ろにXbaⅠサイトを導入すること。
・作製したクローンを大腸菌DH5αに形質転換した後に、NdeⅠとXbaⅠで切り出して、発現ベクターに組換えること。

N代さんへの課題：●平滑末端を有するPCR増幅断片をTAクローニングする手順をまとめなさい。
●その手法を用いて、human G3PDH cDNAのC末端欠損変異体を作製しなさい。
条件： ・Accession No.M17851のcDNAクローンを準備するので、そのプラスミドをPCRの鋳型とすること。
・開始コドンの位置にNcoⅠサイトを導入すること。
・796番目のTATをTGA（ストップコドン）に変更し、なるべくすぐ後ろにXbaⅠサイトを導入すること。
・作製したクローンを大腸菌DH5αに形質転換した後に、NcoⅠとXbaⅠで切り出して、発現ベクターに組換えること。

2-4 平滑末端クローニング（A子さんのプロトコール）

端も、制限酵素で処理された末端とは異なりリン酸化されていま

KOD DNA polymeraseの優れた正確性を担っているのははリン酸化されていなければならないので、このような場合、リン校正活性とも呼ばれる3'→5'エキソヌクレアーゼ活性です。この酸化されたプライマーを用いてPCRを行うか、PCR産物をリン活性によって、KOD -Plus-やKOD FXなどのPCR酵素によって酸化して用いる必要があります。

せん。DNA断片を連結するには少なくとも片方の断片の5'末端増幅されたPCR産物の末端は平滑化されています。よって、PCR産物は、EcoRVや SmaⅠなどの平滑末端を生じる制限酵
素サイトに直接クローニングすることが可能です。
3'
OH 5'

5' HO
3'

A子さんは、
この課題を与えられた瞬間に過去の失敗を思い出しました（Vol. 1参照）。A子さんは、脱リン酸化処理されたベク
5'

3'

ターにPCR産物を直接連結しようとして失敗したのでした。苦いPP

思い出ですが、今となってはありがたい失敗でもあります。A子さ

3'

5'

3'

OH

5'

HO

5'

3'

5' P
3'

3'

んは、失敗した直後に、平滑末端クローニングのプロトコールを完全にまとめていました。
平滑末端サイトを用いてクローニングする場合、ベクターのセ
ルフライゲーションが問題になります。そこで、ベクターを制限酵

5' P
3'

3'
P 5'

素で切断した後に脱リン酸化して使用するのが普通です。ライゲーションが成立するにはDNAの5'末端がリン酸化されていなくてはならず、脱リン酸化されたサイト同士は連結することができ

5' P
3'

P 5'

3'

P 5'

ないからです。
しかし、ここで注意しなくてはならないのが一般的にPCRに用いられるプライマーの5'末端がリン酸化されていないということです。当然、そのプライマーを用いて得られたPCR産物の5'末
図6 平滑末端クローニングのフロー
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5No.90.qx 08.3.21 17:09 ページ 13【プロトコール＃5】MagExtractorTM-PCR & Gel clean upを用いるDNA断片の精製（磁性ビーズ使用）
DNA溶液（〜100μl)
or アガロースゲル（〜0.3g)

ワンポイントメモ ①
・KOD -Plus-やKOD FXのPCR産物は平滑化されています。

吸着液(400μl)＜ゲルは完全に溶解を確認する＞

・通常PCRに用いられるプライマーはリン酸化されていません。

磁性ビーズ(30μl)

軽くスピンダウン

エタノールを完全に除去
蓋を開けて55℃、5min乾燥

2min吸着（ボルテックス）
磁性スタンドによる固液分離（磁気分離）

上清洗浄液 (600μl)【プロトコール＃2】プライマーのリン酸化

10secボルテックス
磁気分離【使用試薬】
・50pmole/μl（μM ）以上のPrimer溶液
・T4 Polynucleotide Kinase（Code No. PNK-111）
・rA TP（Code No. ATP-111）→ 10mMに希釈して使用
Primer（50pmole/μl［50μM］）
10×Protruding End Kinase Buffer
10mM rATP〈Code No.ATP-111を希釈して使用〉＊1
T4 Polynucleotide Kinase（5〜20U/μl）
Total

滅菌水、
ボルテックス（用途により適当な液量で溶出する）
磁気分離
精製DNA溶液

上清
14（μl）
22
2
2075%エタノール（1ml）
×2回
10secボルテックス
磁気分離（デカンテーション）↓
37℃、1h反応↓
95℃、5min（T4 Polynucleotide Kinaseを失活）↓ ← 50μl 滅菌ミリQ水を添加します
10pmole/μl [10μM ] primer溶液として使用します＊2＊3↓
PCRを行います↓
MagExtractor™ -PCR & Gel Clean up-（Code No. NPK-601）
などに
よる精製

上に示した平滑末端クローニングで用いられるプロトコールは便利なので、様々な場合で役に立ちます。また、DNA断片の精製は、ほぼすべての組換え工程の中で使用されますの＊ 1 T4 Polynucleotide Kinaseは添加できる最大量を添加します（最終液量の10% ）。
＊ 2 このままPCR反応に使用します。
＊ 3 凍結して何度でも使用可能です。

で覚えておくと良いと思います（少量の場合は1/2スケールで行うこともできます）。

【プロトコール＃3】PCR産物のリン酸化

ワンポイントメモ ②【使用試薬】
・高正確性PCR酵素の精製PCR産物（平滑末端）・T4 Polynucleotide Kinase（Code No.PNK-111）
・rATP（Code No.ATP-111）→ 10mMに希釈して使用¡プロトコール#5の精製法では約40bp以下のDNA断片は除去されます。

精製PCR産物
10×Blunt End Kinase Buffer
10mM rATP〈Code No.ATP-111を希釈して使用〉＊1
T4 Polynucleotide Kinase（5〜20U/μl）
Total

〜1μg
5
5
5
50（μl）¡ゲルからの切り出しは、UV照射によりDNAが損傷を受けるため効率が低下します。
トランスイルミネーター上で切り出す際は、ア
クリル板などを間にはさみ、短時間で切り出す配慮が必要です。

↓
37℃、1h反応↓
MagExtractor™ -PCR & Gel Clean up-（Code No. NPK-601）
などに
よる精製

2-5 平滑末端PCR産物のTAクローニング（N代さんのプロトコール）＊1

KOD -Plus-やKOD FXのPCR産物の末端は平滑化されていT4 Polynucleotide Kinaseは添加できる最大量を添加します（最終液量の10% ）。

ますので、そのままではTAクローニングすることはできません。
このような場合、KOD専用のTAクローニングキット「TArget
CloneTM -Plus-（Code No.TAK-201）」を用いると便利です。

【プロトコール＃4】ベクターの脱リン酸化【使用試薬】E. coli Alkaline Phosphatase（Code No.BAP-111）
精製ベクター溶液（制限酵素処理後精製したもの）
10×Buffer＊
E. coli Alkaline Phosphatase（0.1〜1U/μl）
Total

0.5〜2.5μg
1010100（μl）＊目安として5〜20pmolesの5'末端に対して2Uですが、添加できる最大量（最終液量の10% ）を添加することでほとんどの場合、問題なく脱リン酸化できます。

↓
平滑末端、3 突出末端 ⇒ 60℃、60min
5 突出末端 ⇒ 37℃、60min↓
MagExtractor™ -PCR & Gel Clean up-（Code No. NPK -601）
などに
よる精製

原理は、増幅産物にTaqを混合して末端にdAを付加するという単純なものです。しかし、KODは熱安定性に優れ、PCR後の反応液の中でも活性を保っているため、せっかくdA付加が起きてもKODの校正活性でまた削られてしまいます。よって、このキットには、KODの校正活性に対する中和抗体が使用されています。
つまり、この抗体でKODの校正活性を抑えている間に、Taqを用
いてdA付加反応を行うわけです（図7）。そして、そのままTベク
ターにライゲーションします。この方法は、PCR産物を精製せずにそのままベクターにクローニングすることができるので、とても便利です。

6 ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ

私 にも
！
できた

No.90.qx 08.3.21 17:09 ページ 14

結局、TGA（ストップコドン）から3塩基も下流にXbaⅠサイトを導入

ワンポイントメモ ③

しなければなりませんでした。G3PDH-Rプライマーは多くのミスマ

KOD -Plus-やKOD FXのPCR産物は平滑化されていますが、TArget CloneTM -Plus（Code No. TAK-201）を用いることで、簡単にTAクローニングすることが可能です。

ッチを含みますが、特異的な部分を延ばしたので問題ないはずです。
また、上流側のAの連続が気になったので、下流側を少し長めに設計しました。N代さんは、このプライマーを用いてKOD -Plus-で増幅し【プロトコール＃6】KOD産物のTAクローニング
試薬
PCR産物 from KOD
10x A-attachment Mix
60℃、10min

添加量
9μl
1

たPCR産物をTArget CloneTM -Plus-（Code No. TAK-201）を用いて直接TAクローニングするつもりです。
二人とも、何とか夕方にはプライマーの注文を終わらせることができました。念のため、2人は自分の設計したプライマーのデザイン案をSリーダーのところに持ち寄りました。Sリーダーの机の上に広げられ

試薬
添加量
DW
（3ーX）
μl
2x Ligation Buffer5pTA2 Vector（50ng/μl）
1
上記反応物
X
T4 DNA Ligase1
室温（15〜25℃）、30min
形質転換た解答をしばらく眺めていたA子さんとN代さんは、それぞれ内心 にVector：PCR産物は1:3以上に設定します。

たアシスタントのS本さんは見逃し

やり としました。
ちょうどその時、Sリーダーのメ
ガネのレンズが夕日に反射して一瞬 キラリ と輝いたのを、横にいませんでした。

図7 KOD PCR産物のTAクローニングの原理

2-6 二人の解答
今日は朝から、A子さんとN代さんは、Sリーダーから出されたC末端欠損変異体作製の課題に一心不乱に取り組んでいます。何やら張り合っているようです。
A子さんは、鋳型はプラスミドなので、少し強引な設計のプライマー

図8 A子さんの解答
β-actin［Accession No.X00351］のC末端欠損変異体の作製方法

を用いてもきちんと増幅されるはずと考えています。まず、A子さん
は、指定どおりNdeⅠサイトを含んだフォワードプライマー（BACT-F）
を設計しました（図8）。次に、リバース側のプライマーの設計ですが、
まず、指定のあった732番目のGCTをTGAに変更しました。次に、その直後の配列がXbaⅠサイトとホモロジーの高い配列であったこともあり、そのまま続けて直近にXbaⅠサイトを導入し、BACT-Rプライマーを設計しました（図8）。A子さんは、このプライマーを用いてKOD Plus-で増幅したPCR産物を、先程の平滑末端クローニングの方法に従って、クローニングするつもりです。この程度の増幅ならば、KOD
FXを使うまでもありません。慎重なA子さんは、最後に、組換えた後のプラスミドの制限酵素マップをシュミレーションすることも怠りませんでした。A子さんは、気になるのか、余った時間でN代さんの配列も何やらコンピューターで解析しているようです。
N代さんも、フォワードプライマーはさっさと設計してしまいました

図9 N代さんの解答
G3PDH［Accession No.M17851］のC末端欠損変異体の作製方法（G3PDH-F：図9）。次に、リバースプライマーの設計ですが、N代さん
は、ストップコドンの種類が TGA に限定されていることと、続けてみなさんも2人の解答が正しいかどうかを、吟味してみてくだ

XbaⅠサイト（TCTAGA）を導入するということから、すぐに、
「これは

さい。
【注意：2人の解答には間違いが含まれている可能性がDamメチラーゼの問題だ！ 確か、Damメチラーゼの認識配列は・・・・
GATCのはず…」と ピンッ ときました。彼女は、学生時代、このミスありますので、上の図を実験の参考にはしないでください。
】

で大切な1ヶ月間を無駄にしてしまった苦い経験がありました。N代さ2人の解答の解説は、次号「PCR実戦技術編（2）」でお届けする予定です。

んは、Sリーダーによって巧妙に仕掛けられたトラップをかいくぐるよ
うに、
注意深くリバースプライマー（G3PDH-R）
を設計しました
（図9）。
私 にも
！
できた ラ イ フ サ イ エ ン ス 実 験 シ リ ー ズ

7

No.90.qx 08.3.21 17:09 ページ 15

KOD -Plus- Ver.2とKOD FXはどのように使い分ければいいですか？

高成功率という言葉の意味が良く分からないのですが…

KOD -Plus- Ver.2はKOD -Plus-の正確性を落とさずに〈Taqの約80倍〉、PCR成功率を向上させています。
よって、難しい配列などを、正確性を落とさずに増幅したいような場合に用います。

GC含量の高いターゲットなどの増幅を行うときに、一回のチャレンジで成功する確率が向上しているようなイメー
ジです。クルードなサンプルにおいても同様なことが言えます。今までどの酵素を用いても成功しなかったような
PCRもKOD FXを用いることで増幅できる可能性がありますので、冷蔵庫で眠っているプライマーを掘り起こしてきて、一度チャレンジしてみると良いかも知れません。

KOD FXは、KOD -Plus- Ver.2以上にPCR成功率にこだわって改良を加えたポリメラーゼです。GCが高く、どの酵素を用いても増幅が困難なターゲットの増幅や、10〜
20kb以上程度の比較的大きなターゲットの効果的な増幅、プライマーの設計に制限があり適切な位置にプライマーが設計できなかった場合の増幅などに有効です。しかし、KOD -Plus-に比べて正確性が若干低下している〈Taqの約11倍：PCRエラーは144,535塩基中、19塩基程度〉ので、それを考慮して実験する必要があります。よって、正確性を優先するPCRは、
まずはKOD -Plus- もしくはKOD -Plus- Ver.2を用いることを薦めます。

KOD FXの末端も完全に平滑化されているのですか？
KOD FXは、KOD -Plus-に比べて正確性は若干低下していますが、末端を平滑化するのに十分な校正活性を有しています。
よって、KOD FXで増幅されたDNA断片は、KOD -PlusのPCR産物と全く同じ方法を用いて、クローニングすることができます。

KOD FXはクルードなサンプルの増幅にも有効ですか？
KOD FXは細胞などを含むクルード溶液からのPCRにも有効です。実際の増幅では、細胞懸濁液の液量を反応液50μlに対して2μl以下にすると効果的に増幅できます。ヒトの細胞ならば、1反応に2×104cells程度あれば十分です。
ヒト細胞株（Jurkat細胞）の培養液を用いて、2×104cellsから8.5kbの増幅の成功例があります。また、KOD FXはマウステールなどからのPCRにおいても有効です。

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8 ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ

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できた

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