Ⓒ日本臨床微生物学会 2016

［総説］

MALDI-TOF MS を用いた臨床微生物学的検査の新しい潮流
原理から応用まで
小松方

天理医療大学医療学部臨床検査学科（平成 28 年 2 月 9 日受付）
Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry（MALDI-TOF
MS，マトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型マススペクトロメトリー）を用いた細菌同定法が臨床微生物学分野に登場してから，すでに 10 年が経過しようとしている。わが国においても使用施設が年々増加しており，MALDI-TOF MS 導入による微生物学的検査全般のturn-around time が見直されている。MALDI-TOF MS は分離培養集落があれば，簡便かつ短時間で測定が完了する迅速同定法として注目されている。さらに，集落の前処理法の開発とデー
ターベースの充実が進み，嫌気性菌，Mycobacterium ，Nocardia および真菌の同定精度も向上している。髄液や尿，あるいは血液培養ボトル溶液などの液状検体は，夾雑蛋白質を除去するための 30 分〜1 時間程度の前処理法を施すことで，検体中に存在する細菌を直接的に同定が可能である。新しい β ラクタマーゼ検査法として，抗菌薬の溶液と菌液を混合し，抗菌薬の加水分解による β ラクタム薬の構造変異に伴う分子量の変化を MALDI-TOF MS で検出する方法が考案されている。また基質拡張型 β ラクタマーゼ産生菌，メチシリン耐性黄色ブドウ球菌，ベロ毒素産生大腸菌等の臨床的に重要な耐性菌や毒素産生株のマススペクトルを，ソフトウェアを用いて多変量解析することで，菌群に特有のバイオマーカーの発見や疫学解析にも応用可能な方法として注目されている。
Key words: MALDI-TOF MS，迅速同定検査，バイオマーカー，疫学解析

はじめににおける細菌の迅速同定法として脚光を浴びており，

Matrix-assisted laser desorption ionization-time of

形態学的および生化学的手法を主体とした同定法とはflight mass spectrometry（MALDI-TOF MS，マトリッ

異なり，菌体内タンパク質のマススペクトルをあらかクス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析）は質

じめデーターベース化し，被検株のマススペクトルを量分析法の一種である。本方法は 1988 年に島津製作

これとマッチングさせて同定する方法である。分離培所の田中耕一博士によって考案１）された。MALDI-TOF

養集落さえ確保できれば，最速で 5 分以内に菌名を決

MS は，質量測定の対象物にレーザー照射し，この衝定することが可能である。従来の分離培養・同定検査

撃に対しても対象物を壊すことなく真空管の中を飛行

は 3 日以上の時間を必要としていたが，MALDI-TOF

させ，その飛行時間の違いを以て対象物の質量を測定

MS の導入によって分離培養翌日には，一般的細菌の可能とする方法である。本法は，臨床微生物学の分野

集落同定が可能となる。すなわち，分離培養・同定検査の所要時間は従来法と比較して少なくとも 1 日以上短縮が可能となる２）３）。また従来法と比較して，菌種の著者連絡先：（〒632-0018）奈良県天理市別所町 80-1
天理医療大学小松 方
TEL: 0743-63-7811 内線 546
FAX: 0743-63-6211
E­mail: komatsu@tenriyorozu-u.ac.jp

違いによって分子量が異なるリボゾームタンパク質を主体としてマススペクト ル を と る た め，16S rRNA
シークエンスを用いた同定法に限りなく近い精度も得られる４）。さらに，従来法と比較すると，試薬代や労務費の削減５）６），および早期に同定結果が得られること
日本臨床微生物学雑誌

Vol. 26

No. 2

2016.

1

小松

80

図 1.

方

質量分析の歴史（文献 16, 17 を要約し作図）から抗菌薬適正使用による入院期間の短縮や死亡率のとが研究者らによって明らかにされ，これを陰極線と低下にも貢献する７）〜９）。既に MALDI-TOF MS を用いした。また陰極線が何かに衝突して陽極と反発する方

た集落同定法は年々，国内の臨床検査室へ導入されて向に発する光が見いだされ，これを陽極線とした。イおり，近い将来は本法を用いた同定技術が微生物学的

ギリス

検査の主体となる可能性が高い。MALDI-TOF MS のソン（JJ トムソン，1856―1940）は陰極線と陽極線を技術はさらに，血液培養液１０），尿１１）や髄液１２）などの検それぞれ電子（1899）と正イオン（1912，分子が電子体 中 に 含 ま れ る 細 菌 の 直 接 同 定 や，methicillin-と衝突してプラス荷電したもので，同位体を持つ）で１３）

ケンブリッジ大学のジョゼフ・ジョン・トム

resistant Staphylococcus aureus （MRSA） ，基質拡あること証明した。JJ トムソンは陽極線である正イ

張型 β ラクタマーゼ（ESBLs）産生腸内細菌科細菌

オンをパラボラ写真に写しだして測定することを発明や メ タ ロ β ラ ク タ マ ー ゼ 産 生 Pseudomonas aerugi-

し，1906 年にノーベル物理学賞を受賞した。この業

nosa １４）のように臨床的に重要な薬剤耐性菌，並びに
１５）
Shiga-toxin-producing Escherichia coli （STEC）
等の毒素原性菌に特有なバイオマーカーを多変量解析によって区別できる可能性がある。さらに，タンデム型
質量分析計（LC-MS/MS，MALDI-TOF/TOF）を組
み合わせて，抽出したバイオマーカーのアミノ酸配列まで決定する高度なプロテオミクス解析まで発展させることができる。
本項では，MALDI-TOF MS の開発までに至った質
量分析の歴史を振り返り，その原理，臨床微生物学への応用と将来像について解説を行う。

績から，彼は「質量分析学の祖」といわれている。その弟子であるフランシス・アストン（1877―1945）はイオン化した分子のピークを質量の順番に並べたマス
スペクトルの概念を提唱した。そして，現在ある質量分析装置の礎を築いた。この功績から 1922 年にアストンはノーベル化学賞を受賞した。以降，この質量分析装置を使用して分子をイオン化させる方法が数々と報告された。しかし，当時の方法は分子をイオン化する際に発生する熱等によって分解や側鎖が離脱してしまうハードイオン化法であり，実際の分子の分子量を正確には測定できない方法であった。現在タンパク質等の分析に実用されているのは電子イオン化法である

1．質量分析の歴史と原理１６）１７）が，この方法を発展させて，高分子の構造が分解する

質量分析（mass spectrometry，MS，エムエスと呼ことなく質量を測定できる様々なソフトイオン化法が称）の歴史は 18 世紀までさかのぼる（図 1）。真空ガ

開発された。この方法の一つが現在細菌同定に使用さラス管に電流を流すと陰極側からある物質が放出されている方法となる。2002 年のノーベル化学賞はソれ，ガラス管の内側に衝突すると同時に蛍光を放つこ

フトイオン化法を開発した田中耕一博士１）と同じソフ

2

日本臨床微生物学雑誌

Vol. 26

No. 2

2016.

MALDI-TOF MS による臨床微生物検査表 1.

81
菌群別のサンプル調整法

菌属，菌群
一般細菌全般

嫌気性菌

オンプレートギ酸抽出法
or エタノール・ギ酸抽出法

Mycobacterium

95℃，1 時間熱処理↓
ガラスビーズ溶菌↓
エタノールギ酸抽出法

Nocardia, Actinomyces

95℃，10 分熱処理↓
ガラスビーズ溶菌↓
エタノールギ酸抽出法

Yeast

オンプレートギ酸抽出法
or エタノール・ギ酸抽出法

糸状菌

サブローブロスで増菌，
遠心集菌↓
エタノールギ酸抽出法

図 2. MALDI-TOF MSによる細菌同定で使用するマトリックス（CHCA, 右図）とその構造式

トイオン化法であるエレクトロスプレーイオン化法（electrosprayionization：ESI）を発明したバージニ

アのジョン・フェン博士，そして分子の構造を核磁気共鳴分光法（NMR）によって分析する方法を開発したスイス

チューリッヒ工科大学のクルト・ヴュート

リッヒ博士に同時に授与された。高分子タンパク質が分 解 す る こ と な く 質 量 を 測 定 可 能 と し た MALDITOF MS は，後にドイツ

ミュンスター大学のフラ
１８）

ンツ・ヒレンカンプ博士ら がマトリックス（図 2）とサンプル調整法
セルスメア法or オンプレートギ酸抽出法
or エタノール・ギ酸抽出法

文献 19，25，26 から引用，一部改変

してニコチン酸の誘導体を使用し，現在の細菌同定法となっている。
MS とは，重量計量用の天秤では測定できない原子である事が多く，得られた m/z の数値そのものは質や分子等の極微小な重量を測定する方法である。MS量（m）となる。しかし，MALDI のような方法は時の対象物は大きくてもタンパク質の分子レベルであとして 2 価や 3 価のイオンも産出することがあり，1る。これら極微小な物質を計量するために，物質に荷種類の分子が 2〜3 種類の m/z で検出されることがあ

電粒子を付加し，イオン化してから測定を行う。MSる。検出部およびコンピューター解析部は TOF と信は試料導入部，イオン源，分析部，検出部およびコン号強度の違いをそれぞれ横軸と縦軸の二次元上で信号ピューター解析部の順に構成されている。試料導入部化する。この表示をマススペクトルと呼ぶ。細菌同定

は，試料を液状化（liquid chromatography：LC）あは菌体成分（主にリボゾームタンパク質）を菌種ごとるいはガス状化（gas chromatography：GC）しながにマススペクトルをとり，これをデーターベースにら，試料の特性（疎水性，イオン性，分子量等）の違し，被検株のマススペクトルと比較して菌名を決定す

いにより分離しながらイオン源へ移動する。イオン源

る方法である。なお，後述する耐性因子検出のためのは水素イオン等を付加あるいは除去し試料を帯電させ抗菌薬のマススペクトルや，バイオマーカー探索，未る部位であり，現在汎用されている原理に MALDI や

知タンパク質の同定等については，スペクトルひとつESI 等がある。次に分析部はイオン化したそれぞれのずつを細かく読み取る必要があるため，上述したマス

分子を真空の中に投じ，質量（m）と荷電（z）の質

スペクトルの発生の原理や分子のイオン化の特性につ量荷電比（m/z：エム・オーバー・ジーと呼称）の違

いてはさらに詳しい知識を得る必要がある。

いで，真空内を移動する時間の違いをもって分離する。MALDI であれば真空内をイオン化した分子が飛2．細菌同定検査装置としての MALDI-TOF MS

行する時間（time of flight：TOF）を計測する。試料

MALDI-TOF MS は複数の機種が存在し性能も様々

導入部―イオン源―分析部の組み合わせの違いで，である。国内の臨床検査目的で販売されている質量分

LC-ESI MS，MALDI-TOF MS 等と表記して分析方法

析装置は VITEK-MS（シスメックス・ビオメリュー

を区別する。通常，分子の荷電（z）は 1 価のイオン

株式会社）と MALDI バイオタイパー（ブルカー・
日本臨床微生物学雑誌

Vol. 26

No. 2

2016.

3

小松

82

図 3.

方

MALDI-TOF MS を用いた尿中細菌の直接同定法
サンプル調整のためのフローチャート

ダルトニクス株式会社）である。これらの装置は，国や S. pneumoniae のような臨床的意義が高い菌種の内で販売されている既存の細菌同定・薬剤感受性自動

MALDI-TOF MS を用いた同定検査だけでは十分では分析装置，血液培養装置等の細菌学的検査装置一式となく，生化学的性状試験や血清型別等を追加する必要

総合システムを以て連動できる。MALDI-TOF MS のがある。

同定性能は本学会総会や PubMed 上でも多く報告さ

次に，培養集落の測定までの調整方法について解説

れており，普通寒天培地，血液寒天培地等の一般培地

する（表 1）。この操作が綺麗なマススペクトルを描に発育する細菌は高い確率で同定ができる事が証明さ

かせ，結果的に高い精度で同定結果を得ることが出来

１９）れている。菌群ごとの同定性能は Clark ら の総説をる最も重要なステップである。MALDI-TOF MS では参照されたい。ただし，16S rRNA の 相 同 性 が 高 いターゲットプレート上にサンプルを塗布し，乾燥後にStreptococcus mitis グループ（Streptococcus pneumoniae ，S. oralis 等）が誤同定されるが２０），データーベースの再構築で鑑別可能とする報告２１）もある。また，Escherichia coli と Shigella ，あるいは Salmonella enterica の血清型群である Enteritidis，Paratyphi A，Typhi 等は通常の操作では鑑別ができない。これら
は，属レベルあるいは菌群（complex）レベルまでの同定であり，種レベルでの鑑別が困難な菌種はシステ
ム上アラートが出現する仕組みがある。S. Typhi やShigella は特定のバイオマーカーピーク解析によってnon-Typhi 群や E. coli との識別が可能であるが２２）２３），
別途解析技術が必要である。現状は，法的手続きが必
要な感染症原因細菌（Shigella ，Salmonella Typhi）
4

日本臨床微生物学雑誌

Vol. 26

No. 2

2016.

マトリックスである α―シアノ―4―ヒドロキシ桂皮酸（ニコチン酸の誘導体，図 2，CHCA または HCCA と呼称）を重層する。サンプルの塗布は一般的に新鮮な培養集落をエーゼで釣菌し，そのままターゲットプ
レートに塗布する方法（セルスメア法あるいはダイレ
クトスメア法と呼称）が最も簡便な操作法である。しかし，粘度が高い集落，嫌気性菌，Mycobacterium ，Nocardia ，真菌などはセルスメア法ではきれいなマ
ススペクトルが得られず同定ができないことがある。
この場合，集落をエタノールで処理（脂質類の除去）
しギ酸（formic acid）による菌体内タンパク質の抽出を行う。さらに，Mycobacterium ，Nocardia 等は溶菌促進や術者の感染防止上，菌体の活性の不活化を促

MALDI-TOF MS による臨床微生物検査83

図 4. 好中球由来蛋白質の大量混入による同定結果への影響
Escherichia coli（Sample No. THU13）を含む尿の前処理後（低遠心法，メンブランフィルター法）および分離株のエタノー
ル・ギ酸抽出後のマススペクトルの比較．3 種類の α- ディフェンシンの強いスペクトルの影響で菌体タンパク質のイオン化が抑制されている．

すため，加熱処理を行い，次いで溶菌目的としてガラたコスト計算について MALDI-TOF MS と従来法にスビーズ処理を追加する。これらの菌群はデーター

よる比較を行なった。年間のコスト削減が試薬コスト

ベースが追加されていく中で，当初同定が困難であっのみで＄69,108.61（約 800 万円；＄1.0=117 円計算のた菌種も同定精度の向上が認められている２４）２５）。糸状場合），検査技師の人件費，機器メンテナンス費を含菌も菌体タンパク質の抽出法の問題によって同定が困めたトータルコストは従来法で＄142,532.69（約 1,660

難なケースが存在したが，抽出法の改良やデーター

万円），MALDI-TOF MS で＄68,886.51（約 800 万円）

ベースの集積によって，同定精度の向上が見られていと大きく差を認めた。MALDI-TOF MS 機器購入の初る２６）。

期投資費用の減価償却は約 3 年で回収できたとした。
次に，感染症診断・治療上における MALDI-TOF

3．MALDI-TOF MS を導入することによる効果

MS 導入の効果について，同定結果が従来法よりも 1

MALDI-TOF MS 導入による臨床的効果に関する研日以上短縮して臨床医に報告されるため，適切な抗菌究が行われている。装置購入のための初期費用は高額

薬選択までの時間および stewardship team 介入までであるものの，同定のためのランニングコストおよびの時間が短縮される。Huang ら７）は 501 名の菌血症ま

操作時間短縮による人件費の低額化が見込まれ，従来

たはカンジダ血症の患者群を使用し，MALDI-TOF

法よりコスト削減が可能である。Tran ら５）は米国ノーMS による同定群（n=245）と VITEK2 による同定群

スカロライナ・ヘルスケア大学の事例を用いて必要経（n=256）の 2 群 に 分 け て，MALDI-TOF MS 導 入 効

費 の 削 減 に つ い て 詳 細 に 分 析 し て い る。1 年 間 に果について詳細に分析している。MALDI-TOF MS 導

21,930 株（1 日平均 60 株，解析に一般細菌と抗酸菌

入によって短縮あるいは減少した項目は，集落同定時を含み，嫌気性菌と糸状菌は含まない）の同定に要し

間が 84.0 時間から 55.9 時間（p＜0.001），効果的な抗
日本臨床微生物学雑誌

Vol. 26

No. 2

2016.

5

小松

84

図 5.

方

カルバペネマーゼによるメロペネムの構造の変化（文献 35 を改変）

菌薬治療（effective therapy）への変更が 30.1 時間か低遠心法で前処理を実施し，MALDI-TOF MS で分析

ら 20.4 時間（p=0.021），最適な抗菌薬治療（optimal

したところ，種レベルの同定確率を示したのが 91.8%

therapy）へ の 変 更 が 90.3 時 間 か ら 47.3 時 間（p＜（202 検体），属レベル以上では 92.7%（204 検体）で0.001），ICU 滞在期間が 14.9 日から 8.3 日（p=0.014），あった。ただし，本研究の母集団の 79％（173 検体）

菌血症の再燃が 5.9% から 2.0% としている。

は E. coli の分離例であり，他の菌種の実施は多くない。Ferreira の検討でグラム陽性球菌群（Staphylococ-

4．臨床材料（尿，髄液）および血液培養ボトル中の細菌の同定尿１１）および髄液１２）中に存在する細菌を MALDI-TOF
MS を用いて直接同定する例がいくつか報告されている。Ferreira ら１１）は 尿 を 2,000×g，30 秒 間 の 低 遠 心により，細菌分画と生体内細胞分画を比重の違いで分離し，上清に残存した細菌分画を回収後，夾雑蛋白質を洗浄によって除去し，エタノール・ギ酸抽出法で細菌のタンパク抽出を行い MALDI-TOF MS で同定した。105 CFU/mL 以上を含む細菌尿 220 検体について
6

日本臨床微生物学雑誌

Vol. 26

No. 2

2016.

cus ，Enterococcus ，Streptococcus ）は 15 検体使用されていたが，そのうち同定できたのは 10 検体（67%）に留まった。数例の報告を比較すると，検出感度はお
よそ 104〜6 CFU/mL である１１）２７）〜２９）。著者ら２８）は孔径 5.0
μm のメンブランフィルターで生体内細胞を除去し，パスフラクション中に移動した細菌分画を MALDITOF MS で分析する方法を検討した。同時に，Ferreiraの方法を検証したが，著者らも Ferreila らの方法もグラム陽性球菌が混入している一部の尿において，連鎖やクラスター形成の著しい細菌は，比重やサイズが

MALDI-TOF MS による臨床微生物検査

図 6.

85

カルバペネマーゼ産生株とメロペネム溶液の反応後のマススペクトル（文献 35 を改変）

大きくなるため低遠心法でもフィルター法でも細菌分要な菌量は 106 CFU/mL 以上必要としている。血液画を回収できない現象を発見した。この現象を改善す

培養ボトル中の細菌を直接同定する方法は，血液培養

るため，著者ら３０）は前処理前に超音波発生装置を使用抽出キットである MALDI セプシタイパー血液培養抽して尿中細菌のクラスターや連鎖形成を散在化させる出キット（ブルカー・ダルトニクス株式会社）等の前処理を加え，同定精度上げる事に成功した（図 3）。

処理キットを併用すれば約 30 分以内に同定が可能と

その他，同定精度を下げる要因として，ヒト好中球由なる。血液培養ボトル内の迅速同定は従来法と比較す

来タンパク質である α―ディフェンシン（3371，3440，

れば 1 日以上早く菌名を得ることができることから，

２９）３１）3486 Da.）の混入がある（図 4）。このタンパク質菌血症やカンジダ血症の診断と治療薬の決定が早期にはイオン化しやすく，本来検出すべき細菌タンパク質可能となり，第 3 項で解説したように臨床的なインパのイオン化が抑制され同定ができないケースが認めら

クトは極めて高い７）１９）３４）。

３２）れる。この現象を解消するため，Sánchez-Juanes ら

は低遠心法に加え SDS を加えた処理を実施すること

5．MALDI-TOF MS を用いた抗菌薬耐性の検出で，同定スコアーが＜2.0 を示した検体の 46.5% が同

MALDI-TOF MS を用いた抗菌薬耐性の検出は 2 通

定確率の向上を認めたとしている。尿中細菌の検出にりの考え方がある３５）。1 つは β ラクタマーゼによる β

関しては感染症診断や治療や選定に関して極めて有用

ラクタム系抗菌薬の加水分解，rRNA メチラーゼのよ性が高いと考えるが，さらに同定精度を高めるために

うにアミノグリコシド，クリンダマイシン等に側鎖をは，夾雑タンパク質を如何に取り除く前処理を開発す

修飾する酵素の保有を，あらかじめ準備した抗菌薬溶るかが今後の課題となろう。

液と分離株を混合し反応させ，抗菌薬構造の分子量の血液培養ボトル内の細菌の同定性能についてもより変化を MALDI-TOF MS で測定する方法である。特多くの報告がある。Christner ら３３）は MALDI-TOF MSにカルバペネマーゼ産生菌について，メロペネムの加で血液培養ボトル内の細菌を確実に同定するために必

水分解産物を MALDI-TOF MS で検出する方法はす
日本臨床微生物学雑誌

Vol. 26

No. 2

2016.

7

小松

86

方

でに海外の検査室で導入されている。方法は分離株とが大きく見直され進展するのは間違いない。これに伴メロペネム溶液を 2 時間反応させ，すぐさま MALDI-

い感染症診断や治療に関する情報提供や antimicro-

TOF MS で分解産物を検出できるため，短時間にカbial stewardship team の介入もより迅速となる。まルバペネマーゼの産生性を決定できる（図 5，6）。もた，集落の迅速同定だけではなく，臨床材料から直接う 1 つの検出方法は耐性因子あるいは関連バイオマー

同定する方法，抗菌薬耐性因子や毒素因子，また疫学

カ ー を MALDI-TOF MS で 直 接 検 出 す る 方 法 で あ解析にまで応用できる可能性が秘められている。今る。集落のエタノール・ギ酸抽出物を使用し，sinapic

後，検査を実施する当事者たちがプロテオミクス解析

acid（シナピン酸）や dihydroxybenzoic acid（DHB）の技術と知識をさらに習得すれば，MALDI-TOF MS等の細菌同定用とは異なるマトリックスを使用して βを操作する日常検査の質がより向上するのは勿論のラクタマーゼ（約 29 kDa）を直接検出する試みや３６），事，臨床微生物学の発展にも大きく寄与できると確信

１３）

MSSA と MRSA ，バンコマイシン感性と耐性腸球している。

菌の区別３７）３８）を特異的なピークを捉えることで識別す

文る方法が報告されている。

献1）Tanaka, K., H. Waki, Y. Ido, et al. 1988. Protein and

6．MALDI-TOF MS を用いた他の応用例

polymer analysis up to m/z 100000 by laser ionization

MALDI-TOF MS で菌種を同定すると数百のピーク

time-of flight mass spectrometry. Rapid Communが出現する。これらのピークをクラスタリング解析す

Mass Spectrom 2: 151-153.

る事でパルスフィールド電気泳動（PFGE）のような

2）Wieser, A., L. Schneider, J. Jung, et al. 2012. MALDI-

疫学解析を実施できるツールがある。性能は未だ明ら

TOF MS in microbiological diagnostics-identification

かにされていないが，PFGE レベルの識別能力あるいof microorganisms and beyond (mini review). Applはそれより劣るが MRSA 分離株の相同性を簡 便 に確認する一次スクリーニングとしての利用価値がある３９）４０）。さらに，ClinProTools（ブルカー・ダル ト ニクス株式会社）などのソフトウェアで解析すること
で，ある耐性因子保有株と非保有株，あるいはある毒素因子保有株と非保有株を識別できる特異ピーク（バイオマーカー）を見いだす方法がある４１）４２）。Nakamura
ら４２）は世界流行株である E. coli ST131 と他の ST タイ
プを識別可能な特異ピーク（YahO）を ClinProTools

Microbiol Biotechnol 93: 965-974.
3）Seng, P., J.M. Rolain, P.E. Fournier, et al. 2010.
MALDI-TOF-mass spectrometry applications in clinical microbiology. Future Microbiol 5: 1733-1754.
4）Mellmann, A., J. Cloud, T. Maier, et al. 2008. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionizationtime-of-flight mass spectrometry in comparison to
16S rRNA gene sequencing for species identificationof nonfermenting bacteria. J Clin Microbiol 46: 19461954.

で 発 見 し て い る。ま た Christner ら１５）は 2011 年 に 北5）Tran, A., K. Alby, A. Kerr, et al. 2015. Cost savings re-

ドイツで流行した E. coli O104：H4（STEC 株）と非alized by implementation of routine microbiological

流行 STEC 株を識別可能な特異ピーク（YdgA と un-

identification by matrix-assisted laser desorption

known protein）を見出している。いずれの報告も，

ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Mi-

MS 機能を有する機器を 2 台接続したタンデム質量分

crobiol 53: 2473-2479.

析 計（MALDI-TOF/TOF や LC-MS/MS）を 組 み 合6）Tan, K.E., B.C. Ellis, R. Lee, et al. 2012. Prospective

わせ，検出した特異ピークのアミノ酸シークエンスも

evaluation of a matrix-assisted laser desorption

同定している。今後，このような特異ピークが多く発

ionization-time of flight mass spectrometry system in

見されれば，MALDI-TOF MS を用いて抗菌薬耐性菌

a hospital clinical microbiology laboratory for identifi-

や毒素産生菌の迅速同定が可能となるかもしれない。

cation of bacteria and yeasts: a bench-by-bench study
for assessing the impact on time to identification andcost-effectiveness. J Clin Microbiol 50: 3301-3308.

おわりに
MALDI-TOF MS を用いた細菌同定法がわが国で導入されてより数年が経過しており，大学病院をはじめとして徐々に臨床微生物検査室へ導入されている。本検査法は従来法で要していた検査所要時間を日単位で短縮可能な方法であり，既存の微生物学的検査フロー8

日本臨床微生物学雑誌

Vol. 26

No. 2

2016.

7）Huang, A.M., D. Newton, A. Kunapuli, et al. 2013. Impact of rapid organism identification via matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flightcombined with antimicrobial stewardship team intervention in adult patients with bacteremia and can-

MALDI-TOF MS による臨床微生物検査
didemia. Clin Infect Dis 57: 1237-1245.

8718）Hillenkamp, F., M. Karas, R.C. Beavis, et al. 1991.

8）Wenzler, E., D.A. Goff, J.E. Mangino, et al. 2016. Im-

Matrix-assisted laser desorption/ionization masspact of rapid identification of Acinetobacter bauman-

spectrometry of biopolymers. Anal Chem 63: 1193A-

nii via matrix-assisted laser desorption ionization

1203A.

time-of-flight mass spectrometry combined with an-19）Clark, A.E., E.J. Kaleta, A. Arora, et al. 2013. Matrix-

timicrobial stewardship in patients with pneumonia

assisted laser desorption ionization-time of flightand/or bacteremia. Diagn Microbiol Infect Dis 84: 63-

mass spectrometry: a fundamental shift in the rou-

68.

tine practice of clinical microbiology. Clin Microbiol9）Nagel, J.L., A.M. Huang, A. Kunapuli, et al. 2014. Im-

Rev 26: 547-603.

pact of antimicrobial stewardship intervention on20）Kaleta, E.J., A.E. Clark, A. Cherkaoui, et al. 2011. Com-

coagulase-negative Staphylococcus blood cultures inparative analysis of PCR-electrospray ionization/

conjunction with rapid diagnostic testing. J Clin Mi-

mass spectrometry (MS) and MALDI-TOF/MS forcrobiol 52: 2849-2854.

the identification of bacteria and yeast from positive10）Stevenson, L.G., S.K. Drake, P.R. Murray. 2010. Rapid

blood culture bottles. Clin Chem 57: 1057-1067.

identification of bacteria in positive blood culture21）Werno, A.M., M. Christner, T.P. Anderson, et al. 2012.

broths by matrix-assisted laser desorption ionization-

Differentiation of Streptococcus pneumoniae fromtime of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 48:

nonpneumococcal streptococci of the Streptococcus

444-447.
11）Ferreira, L., F. Sánchez-Juanes, M. González-Avila, etal. 2010. Direct identification of urinary tract patho-

mitis group by matrix-assisted laser desorption
ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 50: 2863-2867.

gens from urine samples by matrix-assisted laser22）Kuhns, M., A.E. Zautner, W. Rabsch, et al. 2012. Rapid

desorption ionization-time of flight mass spectrome-

discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi

try. J Clin Microbiol 48: 2110-2115.

from other serovars by MALDI-TOF mass spec-12）Segawa, S., S. Sawai, S. Murata, et al. 2014. Direct application of MALDI-TOF mass spectrometry to cere-trometry. PLoS One 7 (6): e40004.
23）Paauw, A., D. Jonker, G. Roeselers, et al. 2015. Rapid

brospinal fluid for rapid pathogen identification in aand reliable discrimination between Shigella species

patient with bacterial meningitis. Clin Chim Acta 435:

and Escherichia coli using MALDI-TOF mass spec-

59-61.

trometry. Int J Med Microbiol 305: 446-452.

13）Edwards-Jones, V., M.A. Claydon, D.J. Evason, et al.

24）Rodríguez-Sánchez, B., M.J. Ruiz-Serrano, A. Ruiz, et2000. Rapid discrimination between methicillin-

al. 2016. Evaluation of MALDI Biotyper Mycobacte-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus

ria library v3.0 for the identification of non-aureus by intact cell mass spectrometry. J Med Mi-

tuberculous Mycobacteria. J Clin Microbiol. acceptedcrobiol 49: 295-300.

manuscript.

14）Schaumann, R., N. Knoop, G.H. Genzel, et al. 2012. A

25）Toyokawa, M., K. Kimura, I. Nishi, et al. 2013. Reliable

step towards the discrimination of beta-lactamase-and reproducible method for rapid identification of

producing clinical isolates of Enterobacteriaceae andNocardia species by matrix-assisted laser desorp-

Pseudomonas aeruginosa by MALDI-TOF masstion/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rin-

spectrometry. Med Sci Monit 18: MT71-77.

sho Biseibutshu Jinsoku Shindan Kenkyukai Shi 24: 1-

15）Christner, M., M. Trusch, H. Rohde, et al. 2014. Rapid

8.

MALDI-TOF mass spectrometry strain typing dur-26）Lau, A.F., S.K. Drake, L.B. Calhoun, et al. 2013. Devel-

ing a large outbreak of shiga-toxigenic Escherichia

opment of a clinically comprehensive database and acoli . PLoS One 9 (7): e101924.

simple procedure for identification of molds from16）高山光男，和田芳直．2013．質量分析学の発展史．

solid media by matrix-assisted laser desorption

p. 11-22，現代質量分析学（高山光男編），化学同人，

ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Mi-

京都.

crobiol 51: 828-834.

17）荒川隆一，高山光男．2013．イオン化法②ソフトイ

27）Kim, Y., K.G. Park, K. Lee, et al. 2015. Direct identifi-

オン化法．p. 39-62，現代質量分析学（高山光男編），

cation of urinary tract pathogens from urine samples

化学同人，京都.

using the Vitek MS system based on matrix-assisted

日本臨床微生物学雑誌

Vol. 26

No. 2

2016.

9

小松

88

laser desorption ionization-time of flight mass spec-

方diagnosis. Clin Microbiol Rev 26: 103-114.
36）Camara, J.E., F.A. Hays. 2007. Discrimination be-trometry. Ann Lab Med 35: 416-422.
28）Komatsu, M., A. Kondo, S. Matsuo. 2013. Rapid andtween wild-type and ampicillin-resistant Escherichia

simple method for direct identification of bacteria incoli by matrix-assisted laser desorption/ionization

urine samples with matrix-assisted laser desorption/

time-of-flight mass spectrometry. Anal Bioanal Chem

ionization time-of-flight mass spectrometry. 23rd
European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Berlin, Germany.

389: 1633-1638.
37）Griffin, P.M., G.R. Price, J.M. Schooneveldt, et al. 2012.
Use of matrix-assisted laser desorption ionization-29）Veron, L., S. Mailler, V. Girard, et al. 2015. Rapid urine

time of flight mass spectrometry to

identify

preparation prior to identification of uropathogens by

vancomycin-resistant enterococci and investigate the

MALDI-TOF MS. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 34:

epidermiology of an outbreak. J Clin Microbiol 50:

1787-1795.
30）小松

2918-2931.

方，中村彰宏，阿部教行，他．2014．MALDI38）Nakano, S., Y. Matsumura, K. Kato, et al. 2014. Differ-

バイオタイパーを用いた尿路感染症原因細菌の迅速

entiation of vanA -positive Enterococcus faecium

同定法の改良．第 25 回日本臨床微生物学会総会，名from vanA -negative E. faecium by matrix-assisted

古屋市.

laser desorption/ionisation time-of-flight mass spec-

31）Köhling, H.L., A.A. Bittner, K.D. Müller, et al. 2012. Di-

trometry. Int J Antimicrob Agents 44: 256-259.

rect identification of bacteria in urine samples by39）Ueda, O., S. Tanaka, Z. Nagasawa, et al. 2015. Devel-

matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-

opment of a novel matrix-assisted laser desorption/

flight mass spectrometry and relevance of defensins

ionization time-of-flight mass spectrum (MALDI-

as interfering factors. J Med Microbiol 61: 339-344.

TOF-MS)-based typing method to identify meticillin-

32）Sánchez-Juanes, F., M. Siller Ruiz, F. Moreno Ob-

resistant Staphylococcus aureus clones. J Hosp Infectregón, et al. 2014. Pretreatment of urine samples with
SDS improves direct identification of urinary tract

90: 147-155.
40）Østergaard, C., S.G. Hansen, J.K. Møller. 2015. Rapid

pathogens with matrix-assisted laser desorption

first-line

ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Mi-

Staphylococcus aureus strains using MALDI-TOF

crobiol 52: 335-338.

discriminationofmethicillin

resistant

MS. Int J Med Microbiol 305: 838-847.

33）Christner, M., H. Rohde, M. Wolters, et al. 2010. Rapid

41）Matsumura, Y., M. Yamamoto, M. Nagao, et al.

identification of bacteria from positive blood culture

2014. Detection of extended-spectrum-β-lactamase-bottles by use of matrix-assisted laser desorption-

producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal

ionization time of flight mass spectrometry finger-

groups by matrix-assisted laser desorption ionization-

printing. J Clin Microbiol 48: 1584-1591.

time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 52:34）Morgenthaler, N.G., M. Kostrzewa. 2015. Rapid identi-

1034-1040.

fication of pathogens in positive blood culture of pa-42）Nakamura, A., M. Komatsu, A. Kondo, et al. 2015.

tients with sepsis: review and meta-analysis of the

Rapid detection of B2-ST131 clonal group of

performance of the sepsityper kit. Int J Microbiol

extended-spectrum

827416.

richia coliβ-lactamase-producing

Esche-

by matrix-assisted laser desorption35）Hrabák, J., E. Chudácková, R. Walková. 2013. Matrix-

ionization-time-of-flight mass spectrometry: discov-

assisted laser desorption ionization-time of flightery of a peculiar amino acid substitution in B2-ST131(maldi-tof) mass spectrometry for detection of antibi-clonal group. Diagn Microbiol Infect Dis 83: 237-244.

otic resistance mechanisms: from research to routine10

日本臨床微生物学雑誌

Vol. 26

No. 2

2016.

MALDI-TOF MS による臨床微生物検査89

A new trend in clinical microbial studies using MALDI-TOF MS
From principle to application
Masaru Komatsu
Department of Clinical Laboratory Science, Faculty of Health Care, Tenri Health Care University
Almost 10 years have passed since the method of identifying bacteria using matrix-assisted laser desorption
ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) first appeared in the field of clinical microbiology.
In Japan, more and more institutions are using this method every year, and the turn-around time of microbial
studies in general is being reviewed. MALDI-TOF MS is drawing attention as a rapid method of identification because if there are isolated colonies, about 10 minutes are needed to complete the measurement using simple procedures. Furthermore, developments in the method of preprocessing colonies and enhancements of the database
have contributed to the improved accuracy of identification of anaerobic bacteria, Mycobacterium , Nocardia andfungi. Bacteria that exist in fluid specimens such as spinal fluid, urine or blood culture fluid can be directly identified by using a 30 to 60-minute preprocessing method to remove contaminating proteins. A new β-lactamase examination method has been invented in which after mixing a solution of antibacterial agent with the bacterial culture, variations in molecular weight that are associated with the structural mutation of a β-lactam agent via hydrolysis are detected by MALDI-TOF MS. Also, multivariate analysis conducted with software of the mass spectra of clinically important resistant bacteria or toxin-producing strains such as extended-spectrum β-lactamaseproducing bacteria, methicillin-resistant Staphylococcus aureus and verotoxin-producing Escherichia coli has received attention as an applicable method for the discovery and epidemiological analysis of biomarkers unique tobacteria.

日本臨床微生物学雑誌

Vol. 26

No. 2

2016.

11