1-7 化学科研究活動報告●学科●学科専任教員

化学科
橋本伸哉（教授）
為我井秀行（准教授）【研究の概要および結果】
1. 研究課題の目的および概要
海洋から大気へと放出されるクロロメタンやブロモメタン，ヨードメタンなどのハロゲンを含む揮発性有機化合物（ハロカーボン）は，大気中のハロゲンの主な供給源であり，下部成層圏のオゾン分解や生物が多く生息する対流圏オゾンの濃度決定に関与すると考えられている化合物である。また，その揮発性から海洋，大気，陸上にまたがる物質循環においてハロゲンキャリアーとしての役割を担っている。しかし，生物による生成に関する現在までの報告を基にしても海洋から大気へのフラックスのほとんどが説明できていない。海洋や汽水湖における観測では，植物プランクトンが十分に光合成をすることができない有光層以深にも高濃度のハロカーボンが確認されており，それらハロカーボンの生成にバクテリアが関与している可能性が示されている。しかし，バクテリアによるハロカーボン生成に関する知見は乏しく，バクテリアのハロカーボン生成機構や生成するハロカーボン量の見積りは不確かである。そこで本研究では，ハロカーボンに関して，微生物群集がハロカーボンの生成起源を明らかにする上で重要であると着目して，バクテリア培養液中のハロカーボン測定方法を確立し，バクテリアによるハロカーボン生成を調べた。
2. 実験（1）ヘッドスペースガス濃縮装置によるハロカーボン分析方法の最適化
ガスクロマトグラフ / 質量分析装置（GC/MS;Agilent6890/5975）の試料導入系としては，固体，液体，ゲル状などの様々なサンプルの高感度測定が可能なヘッドスペースガス濃縮装置（DHS;GERSTEL DHS）を用い，ヘッド
スペースガス濃縮 - ガスクロマトグラフ / 質量分析装置によるハロカーボン分析の最適化を行った。バイアル瓶を振とうして気相をパージしながらトラップ管に捕集して，加熱脱着後，ガスクロマトグラフ質量分析装置（GC/MS）へ導入する本法では，気相を濃縮できるので，従来のヘッドスペース法よりも高感度な検出が期待された。
ガスクロマトグラフには高速昇温分析に最適なカラム（DB-624，20m×0.18mm×0.1μm）を用いた。15 種のハロカーボンについて，DHS 法の最適条件を検討するため，標準溶液を振盪時間（min），振盪速度（rpm），パージ流量（ml），パージ流速（ml/min），測定溶液の容量（ml）を変化させて測定し，それぞれの条件でのピーク面積を比較した。また，最適化した条件を用いて標準溶液を測定し，検量線の直線性および測定の検出限界，再現性を明らかにした。また，同一サンプルを DHS 法と従来法である P&T（パージ & トラップ）法で測定し，DHS 法の妥当性を確認した。さらに，本測定法を海水やバクテリアの培地中のハロカーボン測定に適用した。
（2）バクテリア培養サンプルへの適用
ハロカーボン生成バクテリアに関する知見を収集することを目的として，汽水湖である佐鳴湖を対象にハロカーボン生成バクテリアの探索を行った。なお佐鳴湖では，光が届かない湖底付近にブロモホルムやジヨードメタン等の濃度が高くなることがフィールド調査から確認されている。佐鳴湖の湖水試料および底泥試料を採取し，この試料を Marine Broth（MB）の寒天培地に塗抹し，25°C，暗条件で培養した。形成されたコロニーを 1 つC，暗条件で静置培養を行なった。DHSずつ新しい寒天培地に植菌した。その後，MB の液体培地に植菌し，25°GC/MS を用いて培養サンプルの気相中のハロカーボン濃度を測定し，OD600 を用いてサンプルの濁度（細胞数増26加の指標）を測定した。
3. 結果・考察（1）ヘッドスペースガス濃縮装置によるハロカーボン分析方法の最適化
バクテリア培養液等の粘性の高い試料から揮発する微量ガスを高感度に分析するために，ダイナミックヘッドスペース法（DHS 法）によるクロロメタン（沸点；-24.2°C），ブロモメタン（沸点：3.6°C）を含むハロカーボン（15化合物）の分析条件を検討した。パージやトラップ時の条件を変えて測定し，主なハロカーボンのそれぞれの感度を比較した。パージする際のパージ量は，大きいほど高沸点側の化合物の感度が上がり，低沸点側の化合物の感度が下がった。これは，高沸点側の化合物は溶液から揮発するのに時間がかかるため，パージ量を増やすと多くトラップできるようになるが，低沸点側の化合物は逆にパージ量を増やすとトラップに吸着後に再離脱してしまうためであると考えられる。各化合物の標準溶液を DHS-GC/MS で測定した結果，pmol L-1~nmol L-1 の間で直線性がみられ，相対標準偏差は概ね 10% 以下（n = 10）であり，再現性も良好であった。また，同一サンプルをDHS 法と P&T 法とで測定した結果，濃度が一致し DHS 法の妥当性が確認された。さらに，バクテリア用培地を溶媒として検量線を作成したところ，直線性が確認でき，培養液中のハロカーボンの定量が可能であることが明らかになった。
（2）バクテリア培養サンプルへの適用
佐鳴湖の試料から合計 88 株のバクテリアを単離し，培養液中のハロカーボン濃度を測定した。その結果，5 株のバクテリアにおいて，培養液中のハロカーボン濃度がコントロール中のハロカーボン濃度に比べ増加していることが確認され，バクテリアによるクロロメタン，ブロモメタンの生成を初めて明らかにした。ハロカーボン生成がみられた 5 株について培養期間中のハロカーボン濃度の変化を調べたところ，細胞数の増加に伴いハロカーボン濃度が増加し，生成が最も顕著であった株においては培養 10 日目の培養液中のクロロメタン濃度が 130
nmol L-1 であった。株ごとに生成されたハロカーボンの種類や生成比には差があり，それぞれの微生物によるハロカーボン生成に特徴があることが分かった。
［雑誌論文］
1） M.K. Kurihara, M. Kimura, Y. Iwamoto, Y. Narita, A. Ooki, Y. -J. Eum, A. Tsuda, K. Suzuki, Y. Tani, Y. Yokouchi, M.
Uematsu, S. Hashimoto: Distributions of short-lived iodocarbons and biogenic trace gases in the open ocean andatmosphere in the western North Pacific. Marine Chemistry, 2010, 118, 156–170.
［学会発表］
1） T. Fujimori, G. Taniai, M. Kurihara, H. Tamegai, S. Hashimoto: Production of halomethanes and isoprene in theculture of bacteria isolated from brackish water. American Geophysical Union, Fall Meeting 2010，2010 年 12 月 13日，米国サンフランシスコ
2） G. Taniai, H. Oda, M. Kurihara, S. Hashimoto: Optimization of dynamic headspace extraction system formeasurement of halogenated volatile organic compounds in liquid or viscous samples. American GeophysicalUnion, Fall Meeting 2010，2010 年 12 月 15 日，米国サンフランシスコ
3） T. Yamakoshi, M. Kurihara, S. Hashimoto: Production of volatile organic compounds in cultures of cryptophytes
American Geophysical Union, Fall Meeting 2010，2010 年 12 月 15 日，米国サンフランシスコ27