機能性自己集合化分子によるがん検出とアミロイド β 凝集阻害効果■ 唐澤 悟昭和薬科大学薬学部 薬品分析化学

唐澤 悟
1999 年 九州大学大学院薬学研究科修了
博士（薬学）取得
同 年 九州大学薬学研究科 助手
2006 年 九州大学大学院薬学研究院助教授
2007 年 九州大学大学院薬学研究院准教授
2014 年− 2018 年
JST さ き が け 研 究 員 兼 任 （ 領域 : 分子技術と新機能創出）2017 年 より昭和薬科大学薬学部
薬品分析化学教室 教授（現職）

Key words : 自己集合化，機能性，がん診断，アミロイド βる。筆者らは，自己集合体と呼ばれる低分子どAbstract

うしで結合し大きな分子量となる集合体を基盤

有機化合物から構成された自己集合化分子
UBD は，水溶液中で弱い分子間相互作用にとして，今までに報告例のない機能性を自己集よって微粒子を形成し，温度を上げることで合体へ付与し，その機能性集合体を医療へ展開

自己集合化が促進される温度応答性の特徴をすることを目的に研究を進めている。今回，自有する。UBD に蛍光団を導入した TFMAQ-

己集合化と機能性をキーワードに，①がんの高UBD を担癌マウスへ投与すると，がん組織温性に感応したがん検出法，②アミロイド β をが正常組織よりも若干高温である性質に感応し，温度応答的に腫瘍へ蓄積できることを蛍光イメージングにより明らかとした。また

自己集合化分子で取り囲むことでのアミロイド
β 凝集阻害効果，について報告する。

UBD に疎水性基を導入することで得られた
UBD-X は，自身の自己集合化能を活かしてア１．自己集合化分子

ミロイド  凝集阻害効果を示すことが明らかとなった。

自己集合化分子とは，分子量 2,000 以下の低分子が，溶液中で自分自身と分子間相互作用によって結合し，大きな分子量の集合体を形成する分子群の事であり，化学の分野では「超分子」

はじめにの一種として分類される。ここで使われる分子間相互作用とは，薬物がタンパク質などと結合様々な疾患を低分子薬剤で治療するアプローするための相互作用や，水分子の沸点が低分子

チは，薬物治療の根幹をなす重要な位置づけにのわりに高い現象を支配している水素結合と同ある。一方近年，低分子薬剤よりも大きな分子類の分子と分子を繋ぐ比較的弱い力である。一や集合体を使っての治療薬が注目を集め，抗般的に知られる高分子ポリマーは，分子の骨格体医薬や核酸医薬などが急速に発展してきていを維持するため強い結合すなわち共有結合からTumor detection and inhibitory effect on Aβ aggregation using the functional self-assembly compounds
Satoru Karasawa，Faculty of Pharmaceutical Sciences, Showa Pharmaceutical University53BIO Clinica 35（6），2020（549）##成るが，自己集合体はポリマーと同様に高分子度に対して鋭敏に反応し，ある特定温度でさらを形成するものの，共有結合よりも弱い結合かに自己集合化して 1 マイクロメートル程度の大ら成るため，身体に入れた後の分解性，すなわきな微粒子へサイズアップする特徴を持つ。こち生分解性が高く速やかに排泄されること，低の相転移温度を下限臨界溶液温度 LCST と呼び，分子であるため容易に様々な機能を付与できるNP の親水性基を変えることで LCST を制御すること，これらが利点としてあげられる。

ことが可能である。一方がんは，微小環境下で正常組織と様々な点で違いがあり，①がんの血２．ウレアベンゼン誘導体

管内皮細胞が粗雑であるために間質に隙間が生②過剰な乳酸発現のため pH が酸性 8），
じること 7），

筆者らは，自己集合化分子を使って，生体内③正常組織より若干温度が高いこと 9），などがの疾患の検出や治療へ応用展開する研究を行っ知られている（図 1）。①の特徴を応用して薬ている。自己集合化分子としては，マルチな分物を隙間へ運ぶドラッグデリバリーシステムは子間相互作用を生み出すことが可能なウレアベ有名であり，この効果を Enhanced Permeability

ンゼン誘導体（UBD）を基本骨格としている。

Retention（EPR）効果と呼ぶ 10）。②の酸性の特UBD は水素結合，疎水性結合，ベンゼン環の徴を使ったがん検出も多くの研究例が報告されπ-π スタッキングにより自己集合化することがているが，③の温度差を利用した研究例はほと可能で，現在までに UBD を利用して，蛍光物んどない。その理由は正常組織とがん組織の温，MRI 造影剤の候補化合物で度差が 1 から 2℃程度であり，その小さな温度あるガドリニウム製剤を導入した系，金属を含差を認識できる物質が得られなかったことも一まないメタルフリー造影剤を導入した系を構築因と思われる。このような背景の中筆者らは，質を導入した系

1-2），これらを使って生体内の疾患TFMAQ-UBD から成る NP の温度に応答してサの検出を目指している。今回は，UBD に蛍光団イズアップする性質を利用し，がんの温度差をを導入した系による「がん検出」への展開と，認識してがんの隙間に能動的に滞留させるこUBD 中の疎水性基の長さを変えることによってとを試みた（図 1）。すなわち，がんと正常組生じた，「アミロイド β 凝集阻害効果」につい織の違い①と③を組み合わせたアプローチによて概説する。

る展開である。まず，親水性基であるエチレン

してきており3-5）

グリコール鎖の長さ X を変えた三種類の NP-X

３．温度応答性 UBD を用いた蛍光によるがん検出 1）

である，NP-3，NP-4，NP-6 を準備した。それ
ぞれ LCST 値が異なり，1 mM の溶液で NP-3，NP-4，NP-6 は 35，37，40℃を示し，エチレン

筆者らは TFMAQ と呼ぶアミノキノリン骨
6）グリコール鎖が長くなるほど LCST 値は高温と格を有する蛍光団を開発してきた 。TFMAQなった。この理由は，親水性基が長くなるほどは水溶液中でも中程度の蛍光を発することが水溶液中での溶解性が増し，高温にならないとでき，先に述べた UBD と連結させて得られた凝集しないためと理解している。これら三種類

TFMAQ-UBD は，水中で発光する機能を保ちなの NP-X を用いて大腸がんを下肢に移植した担がら自己集合化によって 10 ナノメートル程度

癌マウスへ投与し，ex vivo 蛍光イメージングをのナノ微粒子 NP を形成する。さらに NP は温試みた。マウスには腫瘍の部分を局所的に 45℃

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図１ 正常組織とがん組織の微小環境での違い
がんは，①血管内皮細胞が粗雑であり，特定の大きなのナノ微粒子が隙間に入り込むが，小さいと抜けていく。一方大きな微粒子となると隙間に入り滞留する。この現象を利用したのが EPR 効果であり，多くの DDS でこの効果が利用されている。がんは②乳酸を多く発現するため pH 〜 6.4程度である（正常組織は pH 〜 7.4）。がん組織は③熱量が大きく，1~2℃程度正常組織よりも高温であることが報告されている（がんの大きさや種類で変化する）。

程度で加温した「加温マウス」と温めていな
い「非加温マウス」の二種類を準備した。生理食塩水で希釈した NP-X（200μM）を尾静脈投与し，数時間後腫瘍を取りだして蛍光により観察した結果が図 2 である。左側が「非加温マウス」で右側が「加温マウス」で，上から NP-3，NP-4，NP-6 の結果である。
「加温マウス」では，腫瘍部を LCST 以上に加温しているため全ての NP-X が腫瘍へ集積し滞留したことで強い蛍光を発した。この実験により，温度応答性分子である NP-X は体内の温度変化に感応して自己集合化でサイズアップして，がんの隙間に入り込み滞留することが示唆された。次に「非加温マウス」によって同様の蛍光観察を行った結

図２ NP-X 投与後の担癌マウスの蛍光イメージング「非加温マウス」（左）と「加温マウス」（右）へ
NP-X を尾静脈投与し，腫瘍を取り出し蛍光で観察。
上 か ら NP-3，NP-4，NP-6 の 結 果。
「加温マウス」
では全ての腫瘍に強い蛍光が観察できるが，「非加温マウス」では，NP-3>NP-4>NP-6 の順に蛍光が強くなった。

果，違いが見いだされた。LCST35℃の NP-3 は蛍光強度が強く，LCST37℃の NP-4 はやや弱い
蛍光で，LCST40℃の NP-6 では腫瘍部への蛍光集合化によって腫瘍へ集積するが，腫瘍よりもはほとんど観測されなかった。このことは腫瘍LCST の方が高ければサイズアップしないためへの集積には化合物依存性があり，LCST が低腫瘍への蓄積は観測できないと考えることが出い NP-3 が最も沢山集積し，一番高い NP-6 は来る。言い換えると腫瘍の温度を NP-X で確か集積しないことを示唆する。この理由は，腫瘍めることが出来き，NP-X の蓄積性の差から〜の温度が LCST よりも高ければ温度応答的自己39℃程度であることが推察できる。

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図３ UBD 誘導体のネガティブ染色で得られた TEM 画像
スケールバーは 50 nm を表す。（図は昭和薬科大学紀要より使用許諾を得て引用）

ドとが結合したことを意味し，アミロイド凝集

４．アミロイド β 凝集阻害 11）体が沢山生成している。一方弱ければ UBD-Xの阻害効果によってアミロイド凝集体の生成が先の報告より UBD は水溶液中自己集合化し，抑制されていることを示す。コントロールとしその程度は化合物の極性や温度刺激などに依存て調整した Aβ42 ペプチドのみで UBD-X を含ますることが示された。そこで，UBD が自己集合ない溶液では，時間経過に伴いアミロイド凝集化して微粒子を形成する際に，アミロイド β を取体が形成し ThT と結合したことを蛍光強度増加

り込みことができれば，アミロイド β 凝集阻害薬から確認した（図 4 濃いグレー）。UBD-1 共存として展開できるのではないかと考え，疎水性下では 122 時間後において僅かに蛍光強度が減置換基の長さを変えた三種類の UBD-X である，少し，若干の凝集体形成阻害効果が示唆された

UBD-1（炭素 6 個から成るヘキシル鎖），UBD-2（図 4a）。UBD-2 共存下では 122 時間後におい（炭素 7 個から成るヘプチル鎖），UBD-3（炭素て明らかな蛍光強度減少が観測され，阻害効果8 個から成るオクチル鎖）をそれぞれ準備した。

が強いことが示唆された（図 4b）。一方 UBD-3アミロイド β は疎水性の高い物質と分子間相互共存下では，122 時間以上インキュベーション作用することが知られており，最も疎水性の高してもコントロールとほとんど差がなく，阻害

い UBD-3 が高い凝集阻害効果を示すことを期効果が弱いことが示唆された（図 4c）。

待した。全ての UBD-X は先に述べた NP と同以上の結果より，凝集阻害効果が現れるに様に水溶液中自己集合化し，〜 50 ナノメートル

は 122 時間程度が必要であり，化合物に依存す程度の球状ナノ微粒子を形成した（図 3）。またることも明らかになった。凝集阻害効果が最もLCST は 1 mM の溶液で，UBD-1，UBD-2，UBD-3

強いのは，疎水性が最も高い UBD-3 ではなくがそれぞれ 71℃，29℃，23℃を示し，疎水性が高UBD-2 であったのは新しい知見であり，凝集阻いほど低温で凝集が始まることが分かった。

害のためには疎水性の強さだけではない他の重Aβ1-42 ペプチドの凝集体形成に対する阻害効果要因子の存在が示唆された。この点については，を評価するため，UBD-X と Aβ1-42 ペプチドを混今後様々な誘導体を合成することで明らかにし合し，凝集の程度を化合物依存性と時間経過のて行きたい観点から見積もった。この際，疎水性が非常に高い蛍光性チオフラビン T（ThT）を共存させた。

おわりに

ThT は水溶液中単分子での蛍光強度が弱いため，ThT 由来の蛍光が強ければ ThT と Aβ1-42 ペプチ

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今回，自己集合化と機能性をキーワードにが図４ UBD-X による Aβ 凝集体形成阻害評価（a）UBD-1 共存下，（b）UBD-2 共存下，（c）UBD-3 共存下における各時間のチオフラビン T 蛍光強度比較。（図は昭和薬科大学紀要より使用許諾を得て引用）

んへの蓄積性とアミロイド β 凝集阻害について述べた。がん検出については，微小環境下，正常組織よりも若干高温のがん組織へ UBD が集積蓄積することが明らかとなり，今後は蛍光よりも身体の深部透過性の高い電磁波を利用する
MRI などで検出できる UBD 構築を目指していく。また UBD に制がん剤を導入した分子も共同研究先と進めており，がんの治療と診断が可能となるセラノスティック剤の開発へ展開させたい。一方アミロイド β 凝集阻害については，まだまだ明らかになっていないことが多いが，今回得られた結果から，UBD がある程度凝集抑制効果を持つことが明らかになり道筋は見えたと考えている。今後様々な誘導体を合成することにより，画期的な抑制効果を示す阻害剤開発を目指したい。
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BIO Clinica 35（6），2020（553）##