1-7 総合文化研究室研究活動報告●学科総合文化研究室●学科専任教員

飯野熙彦（教授）
澤田博司（教授）
外川徹（助教）【研究の概要および結果】
研究課題：生物における環境適応に関する研究目的および概要：総合文化研究室所属の 3 名の理系（生命科学系）教員は，生物における環境適応の分子機構の解明を目的として，ほ乳類や昆虫類などを材料に用いてさまざまな実験手法を駆使して，多面的に研究を進めている。
以下に当該年度での研究 1 〜 3 についての概要および結果を報告する。
研究 1．ヒト SPR 欠損患者のプテリジン代謝について目的および概要：従来知られていた BH4 合成系とは異なる新たなヒトでの合成系をすでに明らかにした。新たな合成系では，ヒト Aldo-keto 還元酵素である AKR1C3 と AKR1B1 が関与して BH4 合成が行われる。ヒトの BH4 欠損症や SPR 欠損症と脳内での両酵素による BH4 合成能の関連は，この遺伝病の基礎的理解および治療に対して，重要な情報をもたらすことが期待されるため，両酵素の抗体を用いたヒトでの免疫組織科学的検討による発現部位解析を行い，病態との関連を解明する。
結 果：マウスとヒトの肝臓および脳の Homogenate に対して，抗 AKR1B1, 1C3 抗体を用いた Western blot 解析とImmunohistochemical 解析を行った。マウスの場合肝臓では AKR1C3 の強い発現が見られたが脳では見られなかった。一方 AKR1B1 の発現は脳で顕著であったが肝臓では見られなかった。ヒトの場合，肝臓では AKR1B1, 1C3 の両者の発現が見られたが，脳では，AKR1B1 の発現しか見られなかった。
考 察・反 省：BH4 合成に必須のセピアプテリン還元酵素（SPR）の代替えとして働く AKR1B1, 1C3 は，両者が共同で BH4 を合成することがすでに我々によって見いだされている。SPR 欠損マウスでは，肝臓中にフェニルアラニンの代謝異常が見られるがヒトの SPR 欠損症患者では肝臓中のフェニルアラニンの代謝異常は見られない。この理由は不明であったが，本研究により，AKR1B1,1C3 の発現の違いに寄ることが明らかにされ，ヒト SPR 欠損患者に対する臨床的見地に多くの進展が見られた。
研究 2．昆虫の胚子活性化時における新規一酸化窒素合成酵素スプライシングバリアントの役割
目的および概要：本研究は昆虫の休眠・非休眠機構解明の一環であり，本年度は昆虫（カイコガ）の胚子発生に関与している一酸化窒素合成酵素（NOS）の新規スプライシングバリアント（NovNOS-V）の役割の解明を目的として研究を遂行した。具体的には，NOS と NovNOS-V 遺伝子の発現と構造の解析，胚子発生時の NOS の活性測定を行った。
結 果：

NovNOS-V と NOS のプローブを用いたゲノムサザンブロット解析を用いた予備実験により，NovNOS-V とNOS をコードする遺伝子（ゲノム DNA）は共通で，しかもゲノム（この場合，全染色体を意味する）中でシングルコピーであることが明らかとなった。そこで，NOSとNovNOS-VのcDNAの塩基配列を基にしてカイコのゲノムデータベース使って解析を行った。その結果，NOS 遺伝子は 21 のエキソンと 20 のイントロンに分かれていた（この知見はカイコでは初である）。また，NovNOS-V は，その中の 1 つのエキソンが選択的スプライシングにより除かれて合成されることが判明した。一方，NovNOS-V と NOS 遺伝子発現解析を RT-PCR により行った結果，NovNOS-V 遺伝子は休眠卵を人為的に発生を進める処理（浸酸）を施した直後に特異的に発現されることが明らかとなった。更に，
22NOS の酵素活性を測定したところ，浸酸処理後に酵素活性が高くなる事が確認できた。
考 察・反 省：NOS 遺伝子の構造は，21 のエキソンと 20 のイントロンに分かれていたが，このようにエキソンが多くのイントロンにより分断されていることは，ショウジョウバエやヒトの NOS での報告と一致していたので，このような構造は NOS 遺伝子に特有なものであることが考えられる。また，NovNOS-V 遺伝子の浸酸処理直後の特異的な発現は，NovNOS-V がカイコの初期発生において細胞を G2 期でストップ（休眠）させないように何らかの重要な役割を担っている可能性が考察される。NovNOS-V と NOS の発現解析において，更に多くの発生ステージにおいて解析を行う必要があると思われた。また，NOS の活性測定においては，NOS が可溶性画分か不溶性画分のどちらに存在するかを検討して詳細に NOS 活性の検討を行わなければならないことが，今後の課題であると思われる。
研究 3．JH 誘導性 bHLH 転写因子群の機能解析
目的および概要：昆虫の変態は体の構造や生理機能が短期間に劇的に変化する現象であり，このメカニズムの解明は生物学的に非常に重要である。変態現象は主に脱皮ホルモン（エクダイソン）と幼若ホルモン（JH）により制御されている。エクダイソンのシグナル伝達における分子基盤については多くの知見が蓄積しつつあるが，それに対し JH の分子作用機構はほとんど解明されていない。本研究は，この JH シグナル伝達経路の全貌解明を目標とした研究の一部である。
JH シグナル伝達におけるメディエイター分子を同定する目的で，カイコ培養細胞において JH により誘導される遺伝子群を，DNA マイクロアレイにより網羅的に探索した。その結果，3 種の bHLH ファミリー転写因子（BmH,BmCwo, BmMnt）を同定した。本年度は，これらの転写因子の JH による誘導における基礎的データの取得を行った。
結 果：カイコ培養細胞 aff3 を JH で処理した後の，BmH, BmCwo, BmMnt の発現の経時変化を real-time RT-PCR で解析した。BmH は JH 処理後 1 時間後には最大の発現量に達し，その後減少した。それに対し，BmCwo と BmMnt の発現は JH 処理後 4 時間で最大になった。また，これらの転写因子の JH による誘導における用量−反応関係を解析したところ，3 つの転写因子とも非常に低濃度の JH で誘導され，ED50 は 10-10 M ほどであることが明らかになった。
次に，これらの転写因子の組織特異性を知るために，4齢幼虫2日目の組織（脳，アラタ体，前胸腺，だ液腺，脂肪体，中腸，マルピーギ管，表皮）における発現を DNA マイクロアレイを用いて解析した。BmH の発現は非常に低レベルであったが，解析した組織では脂肪体で比較的高い発現が見られた。BmCwo と BmMnt は解析した全ての組織で発現が認められたが，その中でも BmCwo は前胸腺で，BmMnt は中腸とマルピーギ管で特に強い発現が見られた。
考 察・反 省：BmH と BmCwo/BmMnt では JH により誘導されるタイミングが異なった。おそらく BmH は JH の一次応答遺伝子，BmCwo と BmMnt は二次応答遺伝子として機能しているのではないかと推測される。また，これらの遺伝子のJHに対するED50 は10-10 Mであった。これはピーク時のJHの体液濃度である34nMより十分低い。そのため，これらの遺伝子は生理濃度の JH で十分発現誘導され得ると言える。組織分布を解析したところ，3 つの遺伝子はそれぞれに異なる特徴を示した。このことから，これらの遺伝子が JH シグナルの異なる局面で機能している可能性が考えられる。次に，各組織での JH に対する応答を明確にするために，各組織における経時変化を詳細に解析する必要がある。
〈研究発表・研究成果物〉
BH4 合成に関与する Aldo-keto 還元酵素の発現解析。
JPC・JNCP 第 5 回合同研究発表会

2009 年 8 月 29 日（東京）カイコの初期発生における一酸化窒素合成酵素（NOS）について。
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日本動物学会第 80 回大会 2009 年 9 月 19 日（静岡）カイコ胚子発生初期におけるグリコーゲンシンターゼキナーゼ 3βの機能解析。
日本動物学会第 80 回大会 2009 年 9 月 19 日（静岡）Why so many cuticular protein genes? Insight from expression analysis of CPR genes in Anopheles
The 57th Annual Meeting of the Entomological Society of America, Program Symposia; Insect Molecular Physiology:
Basic Science to Applications．2009 年 12 月 15 日（アメリカ合衆国インディアナポリス）
ゲノミクスから見えてきたクチクラタンパク質の遺伝子構成と発現パターン
昆虫ワークショップ 09 福．2009 年 10 月 29 日（福津）Expression analysis of the aldo-keto reductases involved in the novel biosynthetic pathway of tetrahydrobiopterin inhuman and mouse tissues.
The Journal of Biochemistry 146, 51-60, 2009.

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