研究・最前線

蛍光光学顕微鏡・走査型電子顕微鏡
ハイブリッド型顕微鏡-「FL-SEM」の開発と観察例 a. 九州大学病院 中央形態分析室、b. 九州大学大学院 システム情報科学府、
c. 九州大学大学院 医学研究院 系統解剖学分野、d. 福岡大学大学院 工学研究科、
e. 九州産業大学 工学部 物質生命化学科、f. 株式会社 アイエスティー、
g. 崇城大学 工学部 ナノサイエンス学科、h.九州保健福祉大学 臨床工学科、
i. 九州大学大学院 医学研究院 眼科学分野、j. 久留米大学 医学部 解剖学講座

金 丸 孝 昭 a,b、平 田 和 穂 c、高 洲 信 一 d、礒 部 信一郎 e,f、水 城 圭 司 g、fhiij
又 賀 駿太郎 、近 藤 照 義 、久 冨 智 朗 、納 富 昭 司 、中 村 桂一郎
1 はじめに鏡を開発した。注目点の蛍光陽性細胞を他細胞と2002 年頃、GFP（Green Fluorescent Protein）

な顕微装置を、「FL-SEM」

区別しながら同試料表面を同軸で高倍観察が可能
3,4）と命名した。

を導入した幹細胞（Stem Cell）を、生後間もない放射線処理したマウスに移植し、移植後のマウス

2.1 構

造1）

現在の「FL-SEM」顕微鏡の装置本体にはを行っていた。この GFP 陽性細胞とそれ以外の細EPMA（Electron Probe Micro Analyzer）を利用

胞は、蛍光光学顕微鏡では区別出来るが、更に高している。EPMA（JXA6800M ： JEOL 製）に倍観察に用いる電子顕微鏡はモノクロ画像の為、は、試料表面の明視野観察用カセグレン型対物レ

GFP でラベルされた細胞とそれ以外の細胞の区別ンズが装着されている。図 1 に示すように、装置がつかないという難点があった。

としては真空中に設置されている対物レンズ以外

体内組織内 GFP 陽性細胞挙動を追跡した実験解決の一つには、GFP 陽性細胞を DAB（標識に、新たにレーザー光源 3 本（405 nm / 488 nm /酵素としてペルオキシダーゼを用いて、ジアミノ532 nm）・可動式フィルター 3 枚・観察用接眼レベンジジンと反応させる）や金コロイド等で標識

ンズ・ C マウント接続装置を備え、光学系をレーし TEM（Transmission Electron Microscope）にザー光源用に適正化して作製後、高感度デジタルて観察する方法もあるが、共に労力と時間を要すカメラを顕微鏡本体へ装着した。また、ソフトにる。そこで蛍光顕微鏡と走査型電子顕微鏡をハイは SEM 画像を A/D コンバーター（semAfor ：ブリッド化した顕微装置を開発した。本装置は、JEOL）で PC へ送り、蛍光顕微鏡像は C マウン2）

GFP だけではなく新規蛍光物質（Fluolid） や市

ト冷却タイプのデジタルモノクロカメラ（D S -販の蛍光物質（Alexa Flour）などで標識した組

Qi1Mc ： Nikon）から同じ PC へ送り、両画像を織・細胞等の試料を高倍で観察出来た。今回、試ソフトにて合成（Photoshop ： Adobe）出来るよ料作製法は新たに工夫し、本装置で撮影した「FL-う付属させた。

SEM 像」を得たので紹介する。

2.2 特

2 FL-SEM とは

徴

STED（Leica）や PAL-M/HR-SIM（Zeiss）・TIRF-SIM/3D-SIM（Nikon）など、超高解像蛍光蛍 光 顕 微 鏡 （ FLM ： Fluorescent Light

顕微鏡がここ数年の間に世界の有名光学顕微鏡メMicroscope） と 走 査 型 電 子 顕 微 鏡 （ SEM ：ーカーから市場に投入されてきた。また、蛍光顕

Scanning Electron Microscope）が融合した顕微

微鏡と SEM が組み合わされた Correlative
Medical Photonics

No.545

研究・最前線

Laser light
473 nmFilter (515 nm)
Specimens

1）レーザー光源部
405 nm 473 nm 532 nm2）吸収フィルター
515 nm 600 nm
3）モノクロ高感度カメラ

図１ FL-SEM の構造

Microscope 5）も発表されている。いずれの装置+0.01 % グルタルアルデヒド潅流

も高分解能ながら試料が大気中にあることが共通

固定あるいは、摘出後の浸漬固定。

しており、大いなる顕微技術の進歩である。

（室温 2 h）

一方「FL-SEM」は、試料を真空中に入れる必②

試料細切：固定液中にて 2 枚のカミソリを交叉し試料細切（5 〜 10 mm 角）要がある。しかし、本装置は、電子顕微鏡用の

浄： PBS（震盪装置 30 min × 4）

様々な試料作製技法と任意の蛍光標識とを組み合③洗わせる事により、数センチ角までの大型試料の高④蛍光染色：蛍光抗体法に準拠（一次抗体 24 h/二次抗体 30 min が目安）解像観察が可能であり、同じ試料から機能情報を含む多角的な画像を取得できる。また、個別に撮⑤脱水：アセトン：蒸留水（50 % - 75 % -影した蛍光顕微鏡像と SEM 像を重ね合わせて 185 % - 95 % - 100 % × 2）各 7つの画像とすることは可能であるが、位置ズレにminより解析を困難にすることをよく経験する。本装⑥乾

燥：t-butyl ア ル コ ー ル に 置 換

置では、試料に対し同じ方向から照射される光子（100% × 2）7 min

線と電子線を用いることにより、二つの画像が正t-butyl アルコール専用凍結乾燥装確に対応する試料表面を観察することができる。

置にて乾燥
⑦

導電処理：Os プラズマコーター等で導電処理（厚さ： 2.5 nm）後、試料観察（観3 各種試料作製法

察時の蛍光輝度を低下させないように薄膜で高い導電性を得られるオス

3.1
①
46

ホールマウント法
固ミウムプラズマコートを行う

定：4 % パ ラ フ ォ ル ム ア ル デ ヒ ドMedical Photonics

No.5（OSMIUM COATER HCP-1S）。
）

蛍光光学顕微鏡・走査型電子顕微鏡ハイブリッド型顕微鏡 -「FL-SEM」の開発と観察例 -3.2*

凍結割断法（DMSO 法）

基本試料作製 ③ までは同じ⑧⑨の操作後③へと進む⑧

凍結：液体窒素（LN2）を割断装置に満50 %DMSO

たし装置を冷却（DMSO ： PBS）をスポイトで装置内に滴下、素早く試料を滴下液中に挿入し 15 min ほど冷却⑨

割断：割断器で試料を割る。（割断器内で冷却したカミソリを用いる）

図2

ホールマウント試料（66 ページ参照）

急激に温度を上げないよう気を付けながら③へ戻る

3.3*

イオンエッチング法（薄切切片）

基本試料作製 ⑤あるいは凍結割断法 ⑨〜③④⑤の後⑩へ進む⑩

包埋：Technovit 8100（応研商事株式会社）を用い指定の通り包埋（8 〜12 h）⑪

切削：ウルトラミクロトームにセットし準超薄切片（2 〜 3 µm）の作製⑫

確認：プレパラート用ガラスに試料を拾図 3 凍結割断バルク試料（66 ページ参照）
Lectin (PNA) 染色・ Floulid-Or 標識 ラット尿細管

い、トルイジンブルー染色後観察⑬

イオンエッチング：下記処理後 ⑦ へ戻る標識した。
6,7）【試料台のイオンエッチング処理】

図 3 は、DMSO 法で凍結割断したラット腎臓で試料は、蛍光剤による二次抗体標識を行っていある。尿細管内腔側にある刷子縁（brush border）

るが、光だけではなく電子も利用するため、電子を同じくアビジン修飾した PNA（Lectin）で染色線により発生する試料搭載板からの自家蛍光を抑後ビオチン化した新規蛍光物質（Fluolid-W Or）制する必要がある。一般標本用ガラスではなく、

9）で標識した 。

Si 板（シリコンウエハーを約 1 cm 角に切り分け

図 4 は、図 3 で作製したバルク試料を樹脂包埋た板）を用いる。セミシン試料を Si 板に搭載し試（Technovit 8100）した後、2?3 µm の準超薄切片料台へ接着後、親水化処理装置を用いイオンエッにして、イオンエッチングした画像である。同じチングする。ハードモード 3 min × 2、ソフトモ

く刷子縁が蛍光標識されていることがよく判る。

ード 3 min × 1（Ion Bombarder PIB-10）

図 5 は、多重蛍光染色例である。マウス眼底に新生血管を作製後、ホールマウントの状態で蛍光染色後、網膜を剥離し観察した。赤色が新生血管

4 FL-SEM 画像の例

（CNV ： choroidal neovascularization）、緑色が

図 2 は、「FL-SEM」初期にホールマウント法で8）マクロファージである。各々、一次抗体には CD-である。ラット脊髄のア

31 と Iba-1 に対する抗体を用い二次抗体の蛍光物

ストロサイトをアビジン修飾した抗 GFAP 抗体と質には、Alexa Fluor 532 と Alexa Fluor 488 を用ビオチン化した新規蛍光物質（Fluolid-W Or）でいた。これまで新生血管の研究は、光学顕微鏡で作製した FL-SEM 画像

Medical Photonics

No.5

47

研究・最前線とができる。
現在、九州大学システム情報科学府 集積電子システム学講座にて光学系 XYZ 分解能向上実験に取り組み、先ずはエバネッセント光研究により Z 軸方向の高分解能化研究を行っている。光学系の高分解能化という大きな課題を達成することにより、抗体や GFP など様々な蛍光色素プローブを用いた分子やオルガネラレベルの機能・構造研究を可能にする装置作製を目指している。
図 4 イオンエッチング切片像（66 ページ参照）

将来、本装置が生命科学研究をはじめ食品や歯・骨の分析研究

12）など多彩な領域で活用できる新型顕微鏡装置として活躍できるし、様々な科学・産業分野での活用が期待される。

6 謝 辞
本研究を遂行するに当たり実験協力を頂いた、
都合 亜記暢 氏（久留米大学）、本研究への助言を頂いた星元紀 博士ならびに伊藤 明夫 博士（放送大学）、石川 文彦 博士（横浜理研）、また日本電図5新生血管とマクロファージの多重蛍光染色像（66 ページ参照）

子 株式会社、株式会社 久留米リサーチパーク、財団法人 福岡県産業・科学技術振興財団の関係者に感謝致します。の観察10,11）が主だったが、本装置を使用することで細胞を蛍光での特定だけではなく、細胞の超微形態を伴った観察が可能になったことにより、より詳細な観察研究に寄与出来た。

5 まとめ
これまで光学特性が異なる、光学顕微と電子顕微鏡から得られた画像の位置調整は必ずしも容易ではなく、微小領域の重ね合わせは不正確なことも経験する。蛍光標識法にて染色された細胞・組織試料の蛍光画像と SEM 画像とを合成した「FLSEM 画像」（同軸カラー蛍光 SEM 画像）は、こ
れらの不都合を解決し注目細胞を詳細に観察することが可能となった。
改善点として、光学系と電顕系画像周辺歪みのマッチング、光学系画像の分解能向上、あるいは画像合成技術の高精度化ならびに迅速化などが挙げられる。これらは、今後既存技術で対応するこ48

Medical Photonics

No.5

参考文献
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26, 33?38 （2005）

平田 和穂（ひらた かずほ）
九州大学大学院 医学研究院 系統解剖学分野
高洲 信一（たかす しんいち）
福岡大学大学院 工学研究科
礒部 信一郎（いそべ しんいちろう）
九州産業大学 工学部 物質生命化学科、株式会社 アイエスティー
水城 圭司（みずき けいじ）
崇城大学 工学部 ナノサイエンス学科
又賀 駿太郎（またか しゅんたろう）
株式会社 アイエスティ
近藤 照義（こんどう てるよし）
九州保健福祉大学 臨床工学科

金丸 孝昭（かねまる・たかあき）
九州大学病院 中央形態分析室、九州大学大学院 システム情報科学府

久冨 智朗（ひさとみ としお）九州大学大学院 医学研究院 眼科学分野
納富 昭司（のうとみ しょうじ）
九州大学大学院 医学研究院 眼科学分野
中村 桂一郎（なかむら・けいいちろう）
久留米大学 医学部 解剖学講座

Medical Photonics

No.549