とうもろこしサイレージ中のデオキシニバレノール及びゼアラレノンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による定量法の開発

39

4 とうもろこしサイレージ中のデオキシニバレノール及びゼアラレノンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による定量法の開発
大島 慎司 *，田端 麻里 *，青山 幸二 *Development of Determination Method of Deoxynivalenol and Zearalenone
in Corn Silage by LC-MS/MS
Shinji OSHIMA *, Mari TABATA * and Koji AOYAMA*( * Fertilizer and Feed inspection Department, Food and Agricultural Materials Inspection Center)
We have developed a quantitative determination method of the concentration of deoxynivalenol(DON) and zearalenone (ZEN) in corn silage using a liquid chromatograph-atmospheric pressurechemical ionization-tandem mass spectrometer (LC-APCI-MS/MS).
DON and ZEN were extracted with acetonitrile-water (21:4), and the extracted solution wascentrifuged. The supernatant (1 mL) was then diluted with acetonitrile-water (21:4) to a volumeof 20 mL. The diluted solution was purified with a SPE column (InertSep VRA-3, GL SciencesInc.; Tokyo, Japan), and the purified solution was used for LC-MS/MS determination of ZEN. As
for DON, the purified solution was further purified with graphite carbon to obtain a sample solutionof DON. Sample solutions thus obtained from each process of DON and ZEN were respectively
injected into a LC-MS/MS to determine the concentration of DON and ZEN. LC separation wasthen carried out on an ODS column (InertSustain C18, 3.0 mm i.d. × 50 mm, 2 µm, GL SciencesInc.) with a gradient of 2 mmol/L ammonium acetate solution and 2 mmol/L ammonium acetatemethanol solution for DON, and 2 mmol/L ammonium acetate solution and acetonitrile for ZEN asa mobile phase respectively. In the MS/MS analysis, the negative mode atmospheric pressurechemical ionization (APCI-) was used.
Recovery tests were conducted on corn silages. Corn silage was added with 0.2 and 4 mg/kg of
DON, and 0.02 and 1 mg/kg of ZEN respectively. The resulting mean recoveries ranged from89.3 % to 116 %, and the repeatability in the form of the relative standard deviation (RSDr) was lessthan 8.7 % for DON, while the mean recoveries ranged from 101 % to 112 %, and RSDr was lessthan 12 % for ZEN.
Key words: deoxynivalenol; zearalenone; liquid chromatograph-tandem mass spectrometer (LCMS/MS); atmospheric pressure chemical ionization (APCI); corn silage
キーワード：デオキシニバレノール；ゼアラレノン；液体クロマトグラフタンデム型質量分析計；大気圧化学イオン化法；とうもろこしサイレージ

1

緒

言

飼料自給率の向上は，食糧自給率向上の重要な施策として位置付けられ，とうもろこしサイレー
ジを含む国産粗飼料の増産対策が積極的に行われている．その一方で，国産とうもろこしサイレー
ジからデオキシニバレノール（以下「DON」という．），ゼアラレノン（以下「ZEN」という．）
等のかび毒が検出されており 1) ，農林水産省が委託事業として平成24年度から汚染実態調査事業を実施している．飼料分析基準 2)に収載されている DON 及び ZEN を含むかび毒一斉分析法はとうも*独立行政法人農林水産消費安全技術センター肥飼料安全検査部

40

飼料研究報告 Vol. 45 (2020)

ろこしサイレージへの適用が困難であることが確認されており 3) ，上記の汚染実態調査事業では，事業者が独自に開発した分析法が用いられている．
飼料の有害物質の指導基準及び管理基準 4)において，DON については反すう動物（ほ乳期のものを除く．）に給与される飼料中で4 mg/kg 並びに家畜（反すう動物（ほ乳期のものを除く．）を除く．）及び家きんに給与される飼料中で1 mg/kg，ZEN については家畜及び家きんに給与される飼料中で1 mg/kg の管理基準値が設定されており，将来的に国産粗飼料が管理基準値を遵守していることを確認するための分析法を定めておく必要性があると考えられる．
そこで，汚染実態調査事業において，平成29年度に一般財団法人日本食品検査が用いた分析法 5)（以下「JFIC 法」という．）及び平成30年度に一般社団法人日本海事検定協会が用いた分析法 6)（以下「NKKK 法」という．）を基に，とうもろこしサイレージ中の DON 及び ZEN の液体クロマ
トグラフタンデム型質量分析計（以下「LC-MS/MS」という．）による定量法の飼料分析基準への適用の可否を検討したので，その概要を報告する．
参考に DON 及び ZEN の構造式等を Fig. 1 に示した．

OH

O
O

HO
O
Deoxynivalenol (DON)

Zearalenone (ZEN)(4S,12E)-15,17-dihydroxy-4-methyl-3-

12,13-epoxy-3α,7α,15-oxabicyclo[12.4.0]octadeca-12,15,17,19-

trihydroxytrichothec-9-en-8-one
C15H20O6

tetraene-2,8-dione

MW: 296.32

C18H22O5

CAS No.: 51481-10-8

Fig. 1CAS No.: 17924-92-4

Chemical structures of DON and ZEN

2
2.1

試

MW: 318.364

実験方法

料

とうもろこしサイレージは 60 °C で 18~24 時間乾燥後，更に室内に静置して風乾した後，目開
き 1 mm のスクリーンを装着した粉砕機で粉砕した．
2.2
1)

試

薬

酢酸アンモニウムは試薬特級，アセトニトリル及びメタノールは LC-MS 用（富士フイルム
和光純薬製），グラファイトカーボンは Supelclean ENVI-Carb SPE Bulk Packing（Sigma-Aldrich製），1 mol/L 酢酸アンモニウム溶液は高速液体クロマトグラフ用（富士フイルム和光純薬製）を用いた．水は Milli-Q Integral 5（Merck Millipore 製）により精製した超純水（JIS K0211 の5218 に定義された超純水）を用いた．

とうもろこしサイレージ中のデオキシニバレノール及びゼアラレノンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による定量法の開発

2)

41

DON 標準液
DON 標準品（富士フイルム和光純薬製，純度 100.0 %）2 mg を正確に量って 20 mL の全量
フラスコに入れ，アセトニトリルを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えて DON 標準原液を調製した（この液 1 mL は，DON として 0.1 mg を含有する．）．
使用に際して，DON 標準原液 1 mL を 50 mL の全量フラスコに正確に入れ，更に標線までア
セトニトリル－水（21+4）を加えて，1 mL 中に DON として 2 µg を含有する標準液を調製した．この標準液の一定量を，水－メタノール－アセトニトリル（18+1+1）で正確に希釈し，1mL 中に DON としてそれぞれ 4，6，8，10，20，40，60，80 及び 100 ng を含有する各標準液を調製した．

3)

ZEN 標準液
ZEN 標準品（富士フイルム和光純薬製，純度 100.0 %）2 mg を正確に量って 20 mL の全量フラスコに入れ，アセトニトリルを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えて ZEN 標準原液を調製した（この液 1 mL は，ZEN として 0.1 mg を含有する．）．
使用に際して，ZEN 標準原液 1 mL を 50 mL の全量フラスコに正確に入れ，更に標線までア
セトニトリル－水（21+4）を加えて，1 mL 中に ZEN として 2 µg を含有する標準液を調製した．この標準液の一定量を，アセトニトリル－水（21+4）で正確に希釈し，1 mL 中に ZEN としてそれぞれ 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1，2，4，6，8，10，20，30，40 及び 50 ng を含有する
各標準液を調製した．

2.3

装置及び器具1)

粉砕機：ZM 200

2)

振とう機：ストロングシェイカーSR-2DW タイテック製（使用時振とう数 300 rpm）

3)

多機能カラム：InertSep VRA-3（リザーバー容量 6 mL）ジーエルサイエンス製

4)

メンブランフィルター：13HP020AN（孔径 0.20 µm，直径 13 mm，ポリテトラフルオロエチ
レン）

5)

東洋濾紙製

LC-MS/MS：LC 部：Nexera X2
MS 部：LCMS-8040

2.4
1)

Retsch 製（1 mm スクリーン，使用時回転数 14000 rpm）

島津製作所製島津製作所製

定量方法
抽

出

分析試料 25.0 g を量って 500 mL の共栓三角フラスコに入れ，アセトニトリル－水（21+4）
250 mL を加え，60 分間振り混ぜて抽出した．抽出液を 50 mL の共栓遠心沈殿管に入れ，1600×g で 5 分間遠心分離し，上澄み液 1 mL を 20 mL の全量フラスコに正確に入れた．全量フラスコの標線までアセトニトリル－水（21+4）を加え，カラム処理に供する試料溶液とした．
2)

カラム処理
試料溶液を多機能カラムに入れ，初めの流出液 1 mL を捨てた．10 mL の試験管をカラムの下に置き，その後の流出液 1 mL を受け，LC-MS/MS による ZEN の測定に供する試料溶液とした．更に，別の 10 mL の試験管をカラムの下に置き，その後の流出液 3 mL を受け，精製に供する試料溶液とした．

42

飼料研究報告 Vol. 45 (2020)

3)

精

製

試料溶液をあらかじめグラファイトカーボン 200 mg を入れた 15 mL の遠心チューブに入れ，
1 分間振り混ぜた．1600×g で 5 分間遠心分離し，上澄み液 2 mL を 10 mL の試験管に正確に入れ，窒素ガスを送って乾固した．水－メタノール－アセトニトリル（18+1+1）0.5 mL を正確に加えて残留物を溶かし，メンブランフィルターでろ過し，LC-MS/MS による DON の測定に供する試料溶液とした．
4)

LC-MS/MS による測定
試料溶液，各 DON 標準液及び各 ZEN 標準液 5 µL を LC-MS/MS に注入し，選択反応検出（以下「SRM」という．）クロマトグラムを得た．測定条件を Table 1 及び 2 に示した．液体クロマトグラフ部において，DON 及び ZEN の溶離液の条件を変え，Table 1 のとおりそれぞれ
溶離液 1 及び 2 の条件で測定した．
Table 1

Operation conditions of LC-MS/MS

ColumnInertSutain C18 (3.0 mm i.d. × 50 mm, 2 μm), GL Sciences

Mobile phase 1 (DON)

2 mmol/L ammonium acetate-2 mmol/L ammonium acetate methanol solution(19:1) (hold for 1 min) → 9 min → (1:19) (hold for 5.5 min) → 0.1 min→ (19:1) (hold for 4.4 min)

Mobile phase 2 (ZEN)

2 mmol/L ammonium acetate-acetonitrile (7:3) (hold for 1 min) → 4 min→ (1:19) (hold for 7 min) → 0.1 min → (7:3) (hold for 4.9 min)Flow rate

0.2 mL/min

Column temperature

40 °C

Ionization

Atmospheric pressure chemical ionization (APCI)

Mode

Negative

Nebulizer gas

Air (4 L/min)Drying gas

N2 (5 L/min)Interface temperature

350 °C

Heat block temperature

200 °C

Desolvation line temperature

250 °C

Collision gas

Ar (230 kPa)

Target

DON
ZEN

5)

計

Table 2
Precursor
ion(m/z )
295
355
317

MS/MS parameters
Product ion
Quantifier
Qualifier(m/z )(m/z )
265
265
131
175

Collisionenergy
(eV)
10
13
30
22

算

得られた SRM クロマトグラムからピーク面積及び高さを求めて検量線を作成し，試料中のDON 量及び ZEN 量を算出した．

とうもろこしサイレージ中のデオキシニバレノール及びゼアラレノンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による定量法の開発

43

なお，定量法の概要を Scheme 1 に示した．
Sample 25.0 g（500 mL Erlenmeyer flask）
added 250 mL of acetonitrile-water (21:4)
shook for 60 min
centrifuged for 5 min at 1600×g
1 mL of supernatant (20 mL volumetric flask)
filled up to 20 mL with acetonitrile-water (21:4)
InertSep VRA-3
applied sample solution
discarded 0~1 mL fraction
Collected 1~2 mL fraction (ZEN)

Collected 2~5 mL fraction (DON)
Dispersive solid phase extraction (ENVI-Carb 200mg)
shook for 1 min
centrifuged for 5 min at 1600×g
2 mL of supernatant (10 mL test tube)
evaporated to dryness with N2 gas
added 0.5 mL of water-methanol-acetonitrile (18:1:1)
filtrated through a menbrane filter (0.2 µm)

LC-MS/MS

LC-MS/MS

Scheme 12.5
1)Analytical procedure for DON and ZEN in corn silage

多機能カラムからの流出画分の確認方法
ZEN の多機能カラムからの流出画分の確認方法
とうもろこしサイレージ 12.5 g をアセトニトリル－水（21+4）125 mL で抽出し，遠心分離した上澄み液 2.5 mL を 10 mL の全量フラスコに正確に入れ，これに ZEN として 1 mg/kg 相当
量（最終試料溶液中で 50 ng/mL 相当量）を添加した後，全量フラスコの標線までアセトニト
リル－水（21+4）を加え，カラム処理に供する試料溶液を調製した．試料溶液を多機能カラ
ムに入れ，0~1 mL，1~2 mL，2~3 mL，3~4 mL の流出画分を採取し，LC-MS/MS による測定に
供した．

2)

ZEN の多機能カラムからの流出画分における希釈効果の確認方法
とうもろこしサイレージを用いて 2.5 の 1)と同様に抽出，遠心分離した上澄み液 1 mL を 10mL 及び 20 mL の全量フラスコにそれぞれ正確に入れ，これらに ZEN としてそれぞれ 1 mg/kg
相当量（最終試料溶液中で 20 ng/mL 及び 10 ng/mL 相当量）を添加した後，全量フラスコの標線までアセトニトリル－水（21+4）を加え，カラム処理に供する試料溶液を調製した．以降の操作は 2.5 の 1)と同様に行った．

2.6

添加回収試験
DON は，DON 標準品（富士フイルム和光純薬製，純度 100.0 %）9 mg を正確に量って 20 mLの全量フラスコに入れ，アセトニトリルを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えて DON 添
加用標準液を調製した（この液 1 mL は，DON として 0.45 mg を含有する．）．同標準液をアセ
トニトリルで正確に希釈し添加した．

44

飼料研究報告 Vol. 45 (2020)

ZEN は，2.2 の 2)の ZEN 標準原液をアセトニトリルで正確に希釈し添加した．
とうもろこしサイレージについて，DON として，原物換算して 0.2 及び 4 mg/kg 相当量（最終試料溶液中で 8 及び 180 ng/mL），ZEN として，原物換算して 0.02 及び 1 mg/kg 相当量（同 0.2
及び 10 ng/mL）になるようにそれぞれ添加後よく混合し，一夜静置した後に 2.4 に従って定量し，平均回収率及び繰返し精度を求めた．
なお，添加は風乾物試料に対して DON として 0.4 及び 9 mg/kg 相当量，ZEN として 0.04 及び
2 mg/kg 相当量になるよう行い，原物中濃度への換算は，原物中及び風乾物中の水分含有量を60 %及び 10 %と想定して，原物（水分含有量 60 %）中濃度＝風乾物（水分含有量 10 %）中濃度／2.25 の式により行った．

3
3.1

結果及び考察

試料の調製方法
JFIC 法及び NKKK 法における試料の調製方法は，飼料分析基準に規定された方法と異なり，試料を風乾せずに原物のまま 2 mm スクリーンで粗粉砕する方法である．とうもろこしサイレー
ジには子実部分や茎部分が混在しており，粉砕粒度が粗く，かつ，供試する乾物量が少ない原物中の分析では，分析値のばらつきが大きくなることが懸念されたことから，飼料分析基準に規定された試料の調製方法を用いることとした．
3.2

抽出溶媒量の検討
とうもろこしサイレージの風乾物 25.0 g に，JFIC 法及び NKKK 法と同様にアセトニトリル－

水（21+4）100 mL を加えたところ，抽出溶媒を吸収して振り混ぜられない試料があった．最大で 225 mL の抽出溶媒を必要とする試料があったことから，余裕を持たせて抽出溶媒量を 250 mLとした．
なお，検討に用いることのできる分析試料が十分量確保できなかったことから，3.3 以降の検討は試料採取量及び抽出溶媒量を半量にして実施した．
3.3

LC-MS/MS 測定条件の検討
とうもろこしサイレージ 12.5 g をアセトニトリル－水（21+4）125 mL で抽出し，以降 JFIC 法に従って調製した試料溶液を，NKKK 法の条件に従って LC-MS/MS で測定し，得られた SRM ク
ロマトグラムを確認した．その結果，DON において定量を妨げるピークが認められたことから，
LC-MS/MS の測定条件の変更を検討した．
DON の定量イオン及び確認イオンをそれぞれ m/z: 295 > 265 及び m/z: 355 > 265 に変更して測定した結果，定量を妨げるピークは認められなかったことから，当該測定条件を用いることとし
た．
3.4

検量線
2.2 の 2)及び 3)により調製した DON 及び ZEN 標準液各 5 µL を LC-MS/MS に注入し，得られた SRM クロマトグラムからピーク面積及び高さを用いて検量線を作成した．
得られた検量線の一例は Fig. 2-1 及び 2-2 のとおりであり，DON は 4~100 ng/mL（注入量として 0.02~0.5 ng 相当量），ZEN は 0.1~50 ng/mL（同 0.0005~0.25 ng 相当量）の範囲で直線性を示した．
なお，当該検量線の濃度範囲は，DON を 0.2~5 mg/kg 及び ZEN を 0.02~10 mg/kg 含有する分析

45

とうもろこしサイレージ中のデオキシニバレノール及びゼアラレノンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による定量法の開発

用試料を本法に従い調製した最終試料溶液中の各かび毒濃度範囲に相当する．

12000

70000
y = 573.79x - 341.98
R² = 0.9995

y = 110x - 11.064
R² = 0.9993

10000
Peak height / arb.units

Peak area / arb.units

60000
50000
40000
30000
20000

8000
6000
4000
2000

10000
0

0
0

20

40

60

80

100

0

20

Concentration of DON / [ng/mL]

Fig. 2-1

y = 8236.9x - 2479.6
R² = 0.9992

100

350000y = 2275.1x - 1031.3
R² = 0.9989

100000Peak height / arb.units

Peak area / arb.units

80

120000400000300000250000200000150000100000

80000
60000
40000
20000

50000

0

0
0

10

20

30

40

0

50

10

Fig. 2-2

20

30

40

50

Concentration of ZEN / [ng/mL]

Concentration of ZEN / [ng/mL]

1)

60

Calibration curves of DON by peak area (left) and peak height (right)

4500003.5

40Concentration of DON / [ng/mL]

Calibration curves of ZEN by peak area (left) and peak height (right)

多機能カラムからの流出画分の確認
ZEN の多機能カラムからの流出画分の確認
2.5 の 1)により ZEN の多機能カラムからの流出画分を確認した．その結果は Table 3 のとおり，0~1 mL の画分で 54.6 %，1 mL 以上の画分ではそれぞれ 143 %以上の流出であった．
Table 3
Mycotoxin
ZEN

Outflow pattern of ZEN from InertSep VRA-3
a)
Concentration
Dilution(%)
ratio(ng/mL)0~1 mL
1~2 mL
2~3 mL
4

50

54.6

143

147

3~4 mL150n=1a) Quantitated concentration in sample solution after column treatment /Concentration in sample solution before column treatment × 100

46

飼料研究報告 Vol. 45 (2020)

2)

ZEN の多機能カラムからの流出画分における希釈効果の確認
1)における結果の原因は，夾雑成分による影響であると推定し，夾雑成分の低減を期待して，
2.5 の 2)によりカラム処理に供する試料溶液の希釈倍率について検討を行った．その結果はTable 4 のとおり，0~1 mL の画分では，10 倍希釈及び 20 倍希釈でそれぞれ 51.3 及び 46.9 %であり，低い値のままであった．1 mL 以上の画分では希釈により 100 %に近づく傾向が認められ，10 倍希釈と比較して 20 倍希釈の方が良好な結果となった．このことから，抽出液を 20 倍希釈した液をカラム処理に供する試料溶液に用いることとした．
Table 4

Dilution effect in outflow pattern of ZEN from InertSep VRA-3

Mycotoxin
ZEN

a)

Dilution
ratio

Concentration(ng/mL)0~1 mL

10

20

51.3

121

117

106

20

10

46.9

113

114

113

(%)
1~2 mL
2~3 mL

3~4 mLn=1a) Quantitated concentration in sample solution after column treatment /Concentration in sample solution before column treatment × 100
3)

DON の多機能カラムからの流出画分の確認
とうもろこしサイレージ 12.5 g を本法 2.4 の 1)により調製したカラム処理に供する試料溶液に DON として 4 mg/kg 相当量（最終試料溶液中で 80 ng/mL 相当量）を添加し，多機能カラムからの流出画分を確認した．流出画分は，操作性を考慮し 2 mL ずつの採取とし，0~6 mL 及び1~7 mL の範囲で確認した．その結果は Table 5 のとおり，JFIC 法で採取している流出液 2~4mL 及び 3~5 mL の画分で 106 %の流出を認めた．
Table 5

Outflow pattern of DON from InertSep VRA-3

Mycotoxin

Dilution
ratio

Concentration(ng/mL)

DON

20

80

a)

a)

0~2 mL(%)
2~4 mL

4~6 mL

97.2

106

99.1

1~3 mL(%)
3~5 mL

5~7 mL

93.0

106

102

n=1
a) Quantitated concentration in sample solution after column treatment / Concentration in sample
solution before column treatment × 100
1)~3)の結果から，多機能カラムからの流出画分については，初めの 1 mL を捨て，1~2 mL の画分を ZEN を測定するための LC-MS/MS に供する試料溶液とし，2~5 mL の画分を JFIC 法と同様に DON を測定するための精製に供する試料溶液とした．
3.6

妨害物質の検討
とうもろこしサイレージ 4 検体を用い，本法により調製した試料溶液を LC-MS/MS に注入し，得られた SRM クロマトグラムを確認した結果，定量を妨げるピークは認められなかった．なお，
DON は一部の試料，ZEN は全ての試料でそれぞれ DON 及び ZEN と同じ保持時間にピークが認められた．これらのピークについて，定量イオンと確認イオンの比を確認したところ，標準液と同等であったことから，DON 及び ZEN であると判断した．

47

とうもろこしサイレージ中のデオキシニバレノール及びゼアラレノンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による定量法の開発

本検討により得られた SRM クロマトグラムの一例を Fig. 3 に示した．

A

B
DON

480

Intensity / arb.units

1150

Intensity / arb.units

ZEN

580

1350

950
750
550
350

380
280
180
80

150
-50

-20
5

5.5

6

6.5

4.5

5

Retention time / min

5.5

6

Retention time / min

C

D
580

DON

1350

480

Intensity / arb.units

1150
Intensity / arb.units

ZEN

950
750
550
350

380
280
180
80

150
-50

-20
5

5.5

6

6.5

4.5

5

Retention time / minFig. 3

5.5

6

Retention time / min

Typical Selected Reaction Monitoring (SRM) chromatograms of DON and ZEN
in standard and blank sample solutions(LC-MS/MS conditions are shown in Tables 1 and 2.

Arrows indicate the retention

times of mycotoxin.)
A: Standard solution (8 ng/mL as DON)
B: Standard solution (0.2 ng/mL as ZEN)
C: Sample solution of DON from corn silage (blank)
D: Sample solution of ZEN from corn silage (blank)
3.7

マトリックス効果の確認
2.4 の 1)~3)により調製したとうもろこしサイレージのブランク試料溶液に DON として 4 mg/kg

相当量（最終試料溶液中で 80 ng/mL 相当量）を添加したマトリックス標準液，2.4 の 1)~2)により調製したとうもろこしサイレージのブランク試料溶液に ZEN として 2 mg/kg 相当量（同 10
ng/mL 相当量）を添加したマトリックス標準液について，2.2 の 2)及び 3)に従って調製した同濃
度の各かび毒標準液に対するピーク面積比を確認したところ，Table 6 のとおりであり，各かび
毒は試料マトリックスによる大きな影響を受けることなく測定可能であった．

48

飼料研究報告 Vol. 45 (2020)

Table 6
Matrix effect study
Concentration of mycotoxins
Mycotoxinsb)Matrix effect (%)a)

in matrix standard
solution (ng/mL)

in sample(mg/kg air-dry matter)

Corn silage 1

Corn silage 2

DON

80

4

102

108

ZEN

10

2

103

105

n=1
a) Converted from the concentration in matrix standard solutionb) Ratio of peak area of mycotoxins in the presence of matrix to that in the absence of
matrix3.8

添加回収試験
2.6 により添加回収試験を実施した．その結果は Table 7 のとおり，DON については平均回収率 89.3~116 %，その繰返し精度は相対標準偏差（RSDr）として 8.7 %以下，ZEN については平均
回収率 101~112 %，RSDr は 12 %以下の成績が得られ，飼料分析基準別表 3 の試験法の妥当性確認法ガイドライン（以下「妥当性確認法ガイドライン」という．）に定められた 1)及び 2)の真度及び併行精度の目標値を満たす良好な結果であった．
1)

真度：70 %以上 120 %以下

2)

併行精度：22 %以下（添加濃度 0.02 mg/kg），20 %以下（同 0.2 mg/kg），16 %以下（同 1
mg/kg），13 %以下（同 4 mg/kg）
なお，得られた SRM クロマトグラムの一例を Fig. 4 に示した．
Table 7

Mycotoxin

Spiked level(mg/kg as feda)basis)
DON

Mycotoxin

Recoveries for DON and ZEN

Corn silage 1

Corn silage 2Corn silage 3

b)

b)

b)

Recovery
(%)

c)
RSDr

(%)

Recovery
(%)

c)
RSDr

(%)

Corn silage 4

Recovery
(%)

c)
RSDr

(%)

b)

c)

Recovery
(%)

RSDr
(%)

4

89.3

5.9

89.4

8.7

－

－

－

－

0.2

－

－

－

－

114

7.9

116

6.0

Spiked level(mg/kg as fed

Corn silage 1b)Corn silage 2
c)

b)

RSDr
(%)

Recovery(%)

Corn silage 3
c)

RSDr
(%)

b)

Corn silage 5c)Recovery
(%)

RSDr
(%)

b)

c)

basis)
1

101

4.0

106

4.2

－

－

－

－

0.02

－

－

－

－

110

8.7

112

12

ZEN

Recovery
(%)

RSDr
(%)

Recovery(%)a)－: Not testeda) The mycotoxins were spiked to air-dried corn silage samples one night prior to extraction.

The

spiked levels were 0.4 and 9 mg/kg as air-dry basis for DON, and 0.04 and 2 mg/kg as air-dry basis
for ZEN respectively.

The levels of mycotoxins as fed basis were calculated with following

equation on the assumption that the moisture content of corn silage samples was 60 % as fed basis
and 10 % as air-dry basis.
The levels of mycotoxins as fed basis (moisture 60 %)= the levels of mycotoxins as air-dry basis (moisture 10 %) / 2.25b) Mean (n = 5)c) Relative standard deviation of repeatability

49

とうもろこしサイレージ中のデオキシニバレノール及びゼアラレノンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による定量法の開発

A

B
DON

8500
7500

24000

6500

Intensity / arb.units

Intensity / arb.units

ZEN

29000

5500
4500
3500
2500
1500

19000
14000
9000
4000

500
-500

-1000
5

5.5

6

6.5

4.5

5

C

D
29000
24000

6500

Intensity / arb.units

Intensity / arb.units

7500

5500
4500
3500
2500
1500

19000
14000
9000
4000

500
-500

-1000
5

5.5

6

6.5

4.5

Retention time / minFig. 4

6

ZEN

DON

8500

5.5

Retention time / min

Retention time / min

5

5.5

6

Retention time / min

Typical SRM chromatograms of DON and ZEN in standard and spiked sample solutions(LC-MS/MS conditions are shown in Tables 1 and 2.

Arrows indicate the peaks of mycotoxin.)

A: Standard solution (60 ng/mL of DON (0.3 ng as injection amount))
B: Standard solution (10 ng/mL of ZEN (0.05 ng as injection amount))
C: Sample solution of corn silage (spiked at 1.3 mg/kg original matter of DON (0.3 ng as injection
amount))
D: Sample solution of corn silage (spiked at 1 mg/kg original matter of ZEN (0.05 ng as injection
amount))3.9

定量下限及び検出下限の検討
検量線が直線性を示した範囲，DON においては 4~100 ng/mL の下端付近となる濃度（とうもろこしサイレージ風乾物中で 0.4 mg/kg 相当量（最終試料液中濃度 8 ng/mL 相当量）），ZEN においては 0.1~50 ng/mL の下端付近となる濃度（とうもろこしサイレージ風乾物中で 0.04 mg/kg 相
当量（最終試料液中濃度 0.2 ng/mL 相当量））の添加回収試験の結果，得られたピークの SN 比が 10 以上であったため，DON 及び ZEN の定量下限の濃度はとうもろこしサイレージの風乾物
中でそれぞれ 0.4 及び 0.04 mg/kg とした．この濃度は，DON 及び ZEN のとうもろこしサイレー
ジ中の管理基準値（DON については最も低い値）の風乾物中換算値（2 mg/kg）に対してそれぞれ 1/5 及び 1/50 であり，妥当性確認法ガイドラインに定められた目標値（1/5 以下）を満たして

50

飼料研究報告 Vol. 45 (2020)

いた．
本法の検出下限を確認するため，添加回収試験により得られたピークの SN 比が 3 となる濃度を求めた．その結果，検出下限は風乾物中で DON 0.1 mg/kg ，ZEN 0.01 mg/kg であり，同様に妥
当性確認法ガイドラインに定められた目標値（1/10 以下）を満たしていた．
なお，Table 7 に示したとおり，当該定量下限濃度における添加回収試験結果は良好であった．

4

まとめ

とうもろこしサイレージ中の DON 及び ZEN について，JFIC 法及び NKKK 法を基に，LC-MS/MSを用いた定量法の飼料分析基準への適用の可否について検討したところ，抽出溶媒量，カラム処理に供する試料溶液の希釈倍率及び多機能カラム処理における採取する流出画分を変更することで，以下の結果が得られた．
1)

検量線は，DON は 4~100 ng/mL（注入量として 0.02~0.5 ng 相当量），ZEN は 0.1~50 ng/mL（注入量として 0.0005~0.25 ng 相当量）の範囲で直線性を示した．
なお，当該検量線の濃度範囲は，ZEN を 0.02~10 mg/kg 及び DON を 0.2~5 mg/kg 含有する分析用試料を本法に従い調製した最終試料溶液中の各かび毒濃度範囲に相当する．

2)

本検討で用いたとうもろこしサイレージについて，本法に従って得られたクロマトグラムには，定量を妨げるピークは認められなかった．

3)

本法に従い得られた試料溶液についてマトリックス効果を確認した結果，DON 及び ZEN は試料マトリックスによる大きな影響を受けることなく測定可能であった．

4)

とうもろこしサイレージに，DON として原物換算して 0.2 及び 4 mg/kg 相当量，ZEN として原物換算して 0.02 及び 1 mg/kg 相当量を添加し，本法に従って 5 点併行分析を実施し，回収率及び繰返し精度を求めたところ，妥当性確認法ガイドラインに定められた真度及び併行精度の目標値を満たす良好な結果が得られた．

5)

本法の DON の定量下限は風乾物中で 0.4 mg/kg，検出下限は 0.1 mg/kg，ZEN の定量下限は風乾物中で 0.04 mg/kg，検出下限は 0.01 mg/kg であった．設定した定量下限及び検出下限は，妥当性確認法ガイドラインに定められた目標値を満たしていた．

文

献

1)

平岡久明：飼料中のマイコトキシン汚染状況，臨床獣医，25(6)，10-17 (2007).

2)

農林水産省消費・安全局長通知：飼料分析基準の制定について，平成 20 年 4 月 1 日，19 消安
第 14729 号 (2008).

3)

伊藤 千晶，佐藤 憲大：とうもろこしサイレージ中のかび毒定量法に関する検討～アフラトキシン B1，ゼアラレノン及びデオキシニバレノール～，飼料研究報告，42，87-100 (2017).

4)

農林水産省畜産局長通知：飼料の有害物質の指導基準及び管理基準について，昭和 63 年 10 月
14 日，63 畜 B 第 2050 号 (1988).

5)

一般財団法人日本食品検査：平成 29 年度生産資材安全確保対策事業（国産飼料中のかび毒含
有実態調査）報告書，平成 30 年 1 月 (2018).

6)

一般社団法人日本海事検定協会：平成 30 年度生産資材安全確保対策事業（国産飼料中のかび
毒含有実態調査）成果報告書，平成 31 年 1 月 (2019).