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高正確・高効率・高速PCR酵素『KOD -Plus- Neo』
を用いたPCR増幅例
東洋紡績（株） 敦賀バイオ研究所 小林 哲大
はじめ に『KOD -Plus- Neo』は、『KOD DNA Polymerase』に弊社独自の技術である『伸長エンハンサー』を添加することにより開発されたPCR酵素です。従来の『KOD -Plus-』シリーズの優れた正確性（Taqの約80倍）はそのままに、増幅量や伸長性を格段に向上させています。そのため、『KOD -Plus- Neo』を用いることにより、レアな遺伝子や長いターゲットを正確かつ確実に、増幅することが可能です。また、『KOD -Plus- Neo』では、伸長反応を従来の1min./kbから30sec./kbに短縮することができるため、PCRに要する時間を大幅に短縮することが可能です。

伸長エンハンサーの効果
増幅産物の量KOD-Plus- Neo

サイクル数

伸長エンハンサーの効果

×15 ×20 ×25 ×30 ×35 ×40 ×45 ×50

KOD -Plus- Neo

従来のPCR酵素
プラトー現象

従来品
010203040
Target: Human transferrin receptor（3.5kb）

サイクル数

KOD DNA Polymeraseをはじめ高正確性PCR酵素は、20〜30サイクル以降、増幅が持続しなくなる〈プラトー現象〉が出やすいと言われていました。 KOD -PlusNeoは、伸長エンハンサーの技術を応用することによりプラトー現象を抑えることに成功しています。サイクル後半まで反応を持続させることにより大幅に増幅量が向上します。

今回は、この『KOD -Plus- Neo』を用いて、従来品や他社の高正確性酵素と比較を行いました。以下に、その方法及び結果をご紹介いたします。

方法（1）テンプレート②PCRサイクル

PCRのテンプレートにはHuman genomic DNA、または94℃, 2 min.

HeLa Total RNAから調製したcDNA（弊社のReverTra Ace98℃, 10 sec.

-α-®；Code No. FSK-101を用いて調製）を使用しました。

68℃, 30 sec./kb（2）PCR反応

94℃, 2 min.

PCR反応は、以下の条件にて実施しました。

98℃, 10 sec.

①反応液組成74℃, 9 min.

PCR grade water

32μl

98℃, 10 sec.

10×PCR buffer for KOD -Plus- Neo

5μl

72℃, 9 min.

2 mM dNTPs

5μl

98℃, 10 sec.

25 mM MgSO43μl

70℃, 9 min.

10 pmol /μl Primer ＃1

1.5 μl

98℃, 10 sec.

10 pmol /μl Primer ＃2

1.5 μl

68℃, 9 min.
（実施例150 ng Human Genomic DNA（実施例1）

Total reaction volumeTarget

増幅サイズ

1

Human β-globin

1.3 kb2

Human β-globin

2.7 kb実
施 3 Human β-globin
例1 4 Human β-globin

3.6 kb
8.5 kb5

Human β-globin

17.5 kb1

Human transferrin receptor

3.5 kb

実 2 Human Tuberous scleosis
施
例 3 Human adaptin
24

Human polymeraseε

5.3 kb
5.7 kb
6.8 kb※KOD -Plus- Neoは上記の2ステップサイクルに至適化されています。Tm値が63℃以上の場合は2ステップサイクルを実施してください。

5 cycles5 cycles5 cycles20 cycles

Human β-globin 17.5kbの増幅のみ）μl※長鎖長増幅の場合は、上記のステップダウンのサイクルを行うことで増幅量が増えることがあります。

1μl

他 の高正確性PCR酵素は取扱説明書推奨 の条件にて50μl

PCRを実施し、比較を行いました。

or 0.5 ng（RNA相当量）/μl cDNA（実施例2） 1
KOD -Plus- Neo（1.0 U/μl）

30 cycles（実施例1）or40 cycles（実施例2）

配 列#1：TTAGGCCTTAGCGGGCTTAGAC#2：CCAGGATTTTTGATGGGACACG#1：GCTGCTCTGTGCATCCGAGTGG#2：CCAGGATTTTTGATGGGACACG#1：GGTGTTCCCTTGATGTAGCACA#2：ACATGTATTTGCATGGAAAACAACTC#1：TGATAGGCACTGACTCTCTGTCCCTTGGGCTGTTT#2：ACATGATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGGACTCAGA#1：TGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTC#2：ACATGATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGGACTCAGA#1：CCACCATCTCGGTCATCAGGATTGCCT#2：TACTCCTTAACGAGAAGACATCTCAAGAC#1：GGAGTTTATCATCACCGCGGAAATACTGAGAG#2：TATTTCACTGACAGGCAATACCGTCCAAGG#1：ACCATCTTTGTCCCTGGCAAAGTGG#2：GACGAAGACACAAGGTCAAGCTTCC#1：CACTTCCTCAGTTTCGGCACTCAAGCG#2：CTTCTGCAGCAGCCACTCCAGGGTCTC

長さ22 mer
22 mer
22 mer
22 mer
22 mer
26 mer35 mer35 mer35 mer35 mer
27 mer29 mer32 mer30 mer
25 mer
25 mer
27 mer
27 mer

Tm（℃）
66.2
69.2
73.5
69.2
65.9
65.5
79.6
76.9
77.5
76.9
77.2
65.6
74.2
74.2
73.2
69.8
76.2
77.6

GC%
54.5
50.0
63.6
50.0
50.0
34.6
51.4
45.7
48.6
45.7
55.6
41.4
46.9
46.7
52.0
52.0
55.6
63.0

※ プライマーは22〜35mer（Tm値＞63℃）で設計してください。長めのプライマーを用いることで特異性があがり、PCR成功率が向上することがあります。

20105

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結果及び考察実施例1

様々なサイズの遺伝子を増幅した増幅量・伸長性の評価

KOD -Plus- Neo KOD -Plus- Ver.2
M 123451234

A社 高正確性酵素

5 1234B社 高正確性酵素

5123451：Human β-globin 1.3kb
2：Human β-globin 2.7kb
3：Human β-globin 3.6kb
4：Human β-globin 8.5kb
5：Human β-globin 17.5kb
M：1kb DNA Ladder〈伸長時間〉30sec./ kb

1min./ kb

1min./ kb

30sec./ kb

Human β-globin遺伝子をターゲットとし、様々なサイズの増幅を試みました。PCR産物を、1％アガロースゲルに5μlアプライして解析を行った結果、KOD -Plus- Neoのみ、17.5 kbまでの明瞭な増幅を確認することができました。
また、17.5kb以下の増幅においても、他の高正確性酵素を上回る収量が確認され、KOD -Plus- Neoが増幅量・伸長性共に最も優れていることが示されました。 KOD -Plus- Neoを用いれば、正確にかつ他の高正確性酵素では伸長できない長いターゲットの増幅が可能になると考えられます。

実施例2

微量テンプレートを鋳型とした増幅効率の評価

KOD -Plus- NeoM123

KOD -Plus- Ver. 24123

A社 高正確性酵素

B社 高正確性酵素

114234234

1：Human transferrin receptor（3.5kb）
2：Human Tuberous scleosis（5.3kb）
3：Human adaptin（5.7kb）
4：Human polymeraseε（6.8 kb）
M：1kb DNA Ladder〈伸長時間〉30sec./ kb

1min./ kb

1min./ kb

30sec./ kbcDNA 0.5ng（RNA相当分）を用いて4種類の遺伝子を増幅し、増幅効率を比較しました。PCR条件は40サイクルにて増幅を行
い、PCR産物を、1％アガロースゲルに5μlアプライして解析を行いました。その結果、KOD -Plus- Neoのみ4種類の遺伝子すべてについて、微量テンプレートから効果的な増幅を確認でき、5kb以上の長鎖ターゲットにおいても優れた増幅効率を持つことが示されました。
KOD -Plus- Neoは通常より多めのサイクル数をかけることが可能であるため、他の高正確性酵素では不可能だったレア遺伝子等の微量のテンプレートからの増幅に利用することができます。

まとめ
KOD -Plus- Neoは、他の高正確性酵素に比べ、増幅量が多く、伸長性も大幅に向上しています。クローニングをはじめ高い正確性が必要な場面で、増幅が見られない、増幅が少ないといった問題解決にはぜひ、KOD -Plus- Neoを一度お試しください。

品名および内容

保存温度

Code No.

価200U×1本［200回用＊］-20℃

KOD-401￥30,000（200U×1本）
×5［1,000回用＊］-20℃

KOD-401X5￥120,000

包装格

高正確・高効率・高速PCR酵素

KOD -Plus- Neo
KOD -Plus- Neo（1U/μl）
10×Buffer for KOD -Plus- Neo
2mM dNTP
25mM MgSO4＊50μl反応を行ったときの反応回数で表示しています。

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