微生物による有用物質の大量生産を光でコントロールできる技術

日本大学

生物資源科学部 応用生物科学科
准教授 髙野 英晃
2022年12月20日
1

従来技術とその問題点<一般的な微生物タンパク生産系>
大腸菌(メルク)、バチルス属細菌(ドイツMoBiTec)、ロドコッカス(産総研/北海道システムサイエンス)、ブレビバチルス(ヒゲタ醤油)、コリネバクテリウム(味の素)などをホストとする生産系が市販・受託解析に利用されている。
高いタンパク質生産性が報告され、国内外の研究者によって汎用されているが、いずれも低分子インデューサーを必要とする、もしくは増殖阻害を引き起こす構成的発現系である。
大腸菌において青色光をインデューサーとする組換えタンパク質生産に成功した例(J Mol Biol. 416:534(2012))はあるが、バクテリアで広く利用されているタンパク生産系は見つからない。
2

従来型の放線菌の誘導型発現システム
1. tipASシステム (抗生物質チオストレプトン)

1990年代に英国で開発+ チオストレプトン

ter+
P

TipA

ter+
PMCS2. nitRシステム (アミド化合物ε-カプロラクタム)+ ε-カプロラクタム

ter+PMCS

MerRファミリー
アクチベーター

2004年～筑波大小林ら

NitR

ter

AraCファミリー
アクチベーター+P

高いタンパク質生産性が報告され、国内外の研究者によって汎用されているが、いずれも低分子インデューサーを必要とする。

3

オプトジェネティクス、光遺伝学とは？
～光によって細胞機能を制御する技術～
光に応答して何らかの細胞状態や細胞機能を変化させるような生体分子をコードする遺伝子を，特定の細胞に選択的に導入，もしくは発現させ，光操作を行う実験技術.
非侵襲性(物理的接触なし)
可逆的(リバーシブル)

迅速的(すぐにオン)

局所的(ピンポイント)安価(光は安い)
4

光制御システムの特徴
・高価・再利用できない・培地組成を変えてしまう低分子インデューサー(IPTGは生産コストの最大40%を占める)を必要としない安価・非侵襲性に加えて、光遮断によってスイッチオフにもできる可逆性という従来タイプのもたない自由自在にオン・オフ制御できる。
・インデューサーの合成プロセスにおけるCO2 排出・環境破壊を抑制でき、循環型社会構築の一端にも貢献する。
したがって、光誘導システムは既存システムにとって代わる環境にやさしい低コスト生産システムとなりうる。

5組換えタンパク質生産の光制御技術開発
LacI
LacI

PlacUV5

lacO

Light

T7 RNAPori
DE3

pET26b(+)
ベクター
LacI

PcrtY
KmR

litR

litS

ON
EσLitS
LacI
PT7

遺伝子

ON

クローニングサイト

lacO

T7プロモーター

RBS
LacIオペレーター

低分子化合物型

T7ターミ
ネーター

光スイッチ型
6

ストレプトマイシン生産菌
放線菌Streptomyces griseus• 基礎研究で長年使用されてきたため、形態分化と二次代謝制御の主要経路が解明されている

基底菌糸
胞子

• ゲノム解読完了株(微生物ホルモン)

生活環
形態分化

二次代謝

• 容易・安価なDNA導入・遺伝子破壊系が確立されている• プラスミドなどのツールが整備されている• A-ファクターによる形態分化と二次代謝の一括制御

胞子鎖形成
気菌糸形成

抗生物質
ストレプトマイシン生産• 放線菌の中では増殖が速い
7

微生物工場 “放線菌”のエコクリーンな有用物質生産系の開発
Light

LitR-B12
complex

ホスト
Streptomyces griseus NBRC13350

光誘導プロモーター

PcrtE
litR

litS

有用遺伝子

ON
ON
EσLitS

光スイッチ型ベクターpLit19

ベクター
放線菌で広く使用されているpIJ702
LitR
ビタミンB12をクロモフォアに利用する光センサー型DNA結合タンパク質
LitS
RNAポリメラーゼのシグマ因子
PcrtE
LitSによって認識される光刺激誘導型
プロモーター

暗条件におけるLitR-B12複合タンパク質はLitSからの転写開始を抑制しているが、光照射されるとB12の光分解にともなってLitRは不活性化する。その結果、発現したLitSタンパク質がRNAポリメラーゼとともに、crtEプロモーター(PcrtE)からの転写を誘導する。
8

青～緑色光によって発現誘導できる(B) 発現蛋白質の検出(A) XylE活性MBL(kDa)806050405.0∆ABS375/min/mg protein

Dark

4.0

* XylE303.0202.0

151.00.0

N.D

Dark

BL

N.D: Not Detected

Dark Green Dark

RedM : XL-Ladder Broad
BL : Blue light<Culture conditions>S. griseus NBRC 13350/pLit19-XylE
YMPD medium, 2days, shaking culture, BL・Red light:3 µmol·s–1·m–2
Green Light:1 µmol·s–1·m–2

9非常に弱い光によって誘導できる(細胞のストレスにならない光強度)
35.0∆ABS375/min/mg protein

30.0

25.0

20.0

15.010.0

5.00.0Dark BLempty

Dark

BLXylE
2.5Dark BLDark

empty
5.0BLDark BLXylE

empty

Dark

BLXylE
10.0µmol·s–1·m–2<Culture conditions>S. griseus NBRC 13350/pLit19, pLit19-XylE
YMPD medium, 2 days, shaking culture

10培養培地の種類に依存しない高いタンパク生産性
pLit19(empty)

24 hrspLit19-XylE

48 hrspLit19(empty)

pLit19-XylE

M
[kDa]

100
8060
5040

* XylE

3020

M : XL-Ladder Broad
Shaking culture (135rpm), Blue light : 3 µmol·s–1·m–211各種細胞内タンパク質の大量生産M

empty XylEGUSMSGRempty
5412
mCheery
EGFP(kDa)(kDa)8080*605060504040*30302020
M : XL-Ladder Broad***<Culture conditions>S. griseus NBRC 13350/pLit19-GOI
YMPD medium, 2days, shaking culture, BL:3 µmol·s–1·m–212

各種細胞外酵素の大量発現 (50倍濃縮)
実験方法
100mL TSB培地に前培養液1 mL添加

kDaM

empty

SLAC

EpoA

S. coelicolor

AGR
T-94株

TGase
No.201株

XylA

S. moba S. netro-raensis-psis

S. griseus

S. aver-metilis

XlnC

PhoD1 AbfA

AGR
S. avermetilis
T-94株

S.coelicolor

8028℃,Light条件で2days
遠心6,000 rpm 10 min 4℃
上清 15mLをファルコンチューブに分注

60*5040+30 mL 99.5%EtOH-80℃ O/N*30******

遠心10,000 rpm 10 min 4℃

上清を除去

20300 mL 1×TE（pH7.0）で懸濁10 mLをSDS-PAGEに使用

M:XL-Ladder Broad(5μLアプライ)

光強度：3 µmol/m2 sec

13

青～緑色光によるラッカーゼSLCAの発現誘導(50倍濃縮)
Blue

pLit19pLit19pLit19-SLAC

Green

pLit19-SLAC

pLit19M

M

Red

pLit19-SLAC

M

[kDa]
100
80605040*30*20

Ｍ：XL-Ladder Broad
24時間培養, Blue light：3 µmol/m2 sec
SDS-PAGE濃縮ゲル：12.5%14市販簡易LEDライトの利用 （販売価格2000円程度）
24 hrs
Dark

Light(kDa)

8060504030200万円
従来型

*XylE

2015

タイッテク BR-180LF

液体振とう培養

10YMP-glucose + 20γ tsr
1日間連続白色＋電球色光照射(8.2 mmol·s–1·m–2)

15

Normal

遮光性バッフル付フラスコの利用
48 hrs

24 hrsBL
NormalBL

Dark
Shading

NormalNormalDark
Shading

Normal(kDa)

(kDa)

80
60508060
5040403030

20201515Shading

pLit19-XylE
YMP-glucose + 20γ tsr, 1~2日間連続青色光照射 (2.75 µmol·s–1·m–2)

16新技術の特徴・従来技術との比較• 従来技術では、低分子化合物を誘導剤に用いるため、遺伝子発現をオフにすることは困難であった。本技術ではオフ制御も可能である可能性が高い。
• 従来技術では、低分子化合物を誘導剤に用いるため、 環境負荷が高い、その低分子化合物の販売が終了する可能性などの問題点があった。
• LED光源を用いるため、長年繰り返し使用でき、環境負荷が低く、安価である。
17

想定される用途• 本技術では、オンオフ制御が光によってできるため、複雑な発酵制御が可能である。
• 放線菌を用いるため二次代謝産物の生産に適している。
• 放線菌を用いるため組換え(食品)酵素生産も可能である。
• 弱い光で制御可能であるため、細胞のストレスにならない。

18

実用化に向けた課題• 組 換 え ( 食 品 ) 酵 素 で 実 績 の あ る 放 線 菌 Streptomyces
lividansでは本系は機能しないため、プラスミド型から染色体組込み型に変更して、現在検討中である。
• 放線菌の組換えタンパク質系のキット化に向けて、DNA導入系・培養培地を検討して、簡便・安価にする。

19

企業への期待• 微生物による有用物質生産の技術を持つ、また新規参入を検討している企業との共同研究・ライセンス移転を希望。
• 環境にやさしい・複雑・厳密な微生物生産制御系を開発中の企業には本技術の導入が有効と思われる。
• 現在求められている低環境負荷な生産系であり、企業ブランドイメージアップに貢献できる。
• 放線菌Streptomycesの組換えタンパク質発現キットは市販されていない。
20

本技術に関する知的財産権• 発明の名称• 出願番号• 出願人• 発明者：プラスミドベクター、組換え放線菌、及び標的タンパク質の生産方法：特願2022-031597：学校法人日本大学：髙野 英晃21

お問い合わせ先
日本大学産官学連携知財センター
ＴＥＬ ０３－５２７５－８１３９
ＦＡＸ ０３－５２７５－８３２８e-mail nubic＠nihon-u.ac.jp22