動画『DNA 型鑑定の実際』の解説＊本動画は、押田茂實・岡部保男編著『Q&A 見てわかる DNA 型鑑定』
（現代人文社、2010 年４月刊行）の付録 DVD を再収録したものである。

DVD の構成（収録時間 32 分 04 秒）
1 鑑定試料の血液採取
2─1 フェノール・クロロフォルム法による血液からの DNA 抽出
2─2 QIAamp ® DNA Micro Kit による血液からの DNA
3 PCR（Polymerase Chain Reaction）法
4 STR 多型の検出
参考 精液斑の鑑定＊本 DVD では、①採血した血液について、②DNA 抽出、③PCR 法、④STR 多型の検出を行っています。一般に性的犯罪に関連する下着の精液斑からの精液の証明とDNA 型鑑定例が多いので、参考までにその検査法の一部を最後に収録してあります。
企画：押田茂實（日本大学医学部社会医学系法医学分野）
撮影協力：鉄 堅（日本大学医学部社会医学系法医学分野）
岩上悦子（日本大学医学部社会医学系法医学分野）
い さ はい飯酒盃勇（日本大学医学部社会医学系法医学分野）

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動画『 DNA 型鑑定の実際』の解説

岡部健一（弁護士）
・贄田健二郎（弁護士）
制作：株式会社ビデオ・パック・ニッポン
撮影場所：日本大学医学部法医学教室
撮影日時：2009 年 12 月 17 日・24 日
著作権者：押田茂實＋現代人文社

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鑑定試料の血液採取

服装チェック、帽子･マスク・手袋諸注意（使用するマイクロピペット・遠心分離機など）
氏名、記名のチェック（取り違えの防止）
鑑定試料の血液採取

鑑定試料の血液採諸注意（使用するマイクロピペットの諸注意（使用するマイクロピペットの扱いなど）

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②溶液Ⅰ0.5ml と NP-40 20μl を入れ、よく混合する。

⑥上、中層を新しいチューブに入れる。
下層：赤→黄上層：白2―1

フェノール・クロロフォルム法による血液からの DNA 抽出（約 1 時間位）

① 全血 0.5 ml（抗凝固剤：EDTA3Na 約 3 mg/ml）を 1.5 ml チューブに入れる。
② 溶液Ⅰ0.5 ml と NP-40 20μl を入れ、よく混合して 8,000 回転、 4 ℃で 10 分間遠心分離する。
（細胞膜を溶かす）③ デカンテーション法で上清を捨てる。
（沈査を捨てないよう、ゆっくりと上清を捨てる）④ 溶液Ⅱを 300μl 入れ、チップ先端を切ったものでよく混ぜ合わせる。
⑤ 飽和フェノール 300μl を入れ、よく混合して、12,000 回転、 4 ℃で 2 分間遠心する。（核膜を溶かす）⑥ 上、中層を新しいチューブに入れる。

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下層：赤→黄 上層：白

動画『 DNA 型鑑定の実際』の解説⑤と⑥を 3 回繰り返し⑦ Phenol：Chloroform：Isoamyl alcohol（25：24： 1 ） 液 300μl を 加 え、 よく混ぜ合わせてから 12,000 回転、 4 ℃で 2 分間遠心する。
⑧ 中間層、上層を取って、Chloroform : Isoamyl alcohol（24： 1 ）液 300μl を加え、混ぜ合わせて 12,000 回転、 4 ℃で 2 分間遠心する。
⑨ 上層だけ取り、約 2.5 倍量である 100％エタノール 500μl を加え、よく混和する。
（純粋の DNA を集める、DNA が肉眼で見える）⑩ 12,000 回転、 4 ℃で 10 分間遠心する。
⑪ デカンテーション法で上清を捨てる。
⑫ 70％冷エタノール 500μl を加え、沈殿した DNA を洗浄し、12,000 回転、 4℃で 10 分間遠心する。
⑬ 上層のエタノールを捨てて、残っている DNA を乾燥させる。
⑭ TE buffer（緩衝液）または滅菌水 25〜50μl を入れる。
⑮ 65℃で 5 〜10 分間加温して、DNA を溶かす。
DNA 抽出終了⑯ DNA 濃度を測定する。測定器械（NanoDrop® Spectrophotometer、ND-100）⑯DNA 濃度を測定する。
測定器 械（Nano Drop® Spectrophoto meter、ND-100）

42─2

QIAamp ® DNA Micro Kit(50) による血液からのDNA 抽出

DNA 抽出キット

QIAamp® DNA Mico Kit プロトコール：少量の血液からのゲノム DNA 分離
EDTA、クエン酸、へパリンなどの抗凝固剤で処理した 1 〜100μl の全血からDNA を分離するためのプロトコール。
準備 服装チェック・サンプルを室温に戻す（15〜25℃）。
・溶出用 Buffer AE あるいは蒸留水を室温に戻す。
・インキュベーターを 56℃にセットする。
・Buffer AW1 および AW2 を調製する。
・Buffer AL あるいは Buffer ATL が沈殿物を形成している場合には 70℃に温めて静かに撹拌し、沈殿物を溶かす。

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動画『 DNA 型鑑定の実際』の解説

操作手順① 1.5ml のマイクロ遠心チューブに 1〜100μl の全血をピペットで入れる。
② Buffer ATL を加えて最終容量を 100μl にする。
③ 10μl の Proteinase K を添加する。
④ 100μl の Buffer AL を添加後、ふたを閉めボルテックスで 15 秒間混ぜる。
⑤ 56℃で 10 分間インキュベートする。
⑥ 1.5ml チューブを数秒間遠心してふたの内側に付いたサンプルを集める。
⑦ 50μl のエタノール（96〜100％）をサンプルに添加し、ふたを閉め、15 秒間ボルテックスで完全に混和する。室温で 3 分間インキュベートする。
⑧ 1.5ml チューブを数秒間遠心してふたの内側に付いたサンプルを集める。
⑨ QIAamp MinElute Column にいれてふたを閉め、8,000 回転で 1 分間遠心する。
QIAamp MinElute Column を新しい 2 ml のコレクションチューブにセットし、ろ過液を含むコレクションチューブを捨てる。
⑩ QIAamp MinElute Column を静かに開き、500μl の Buffer AW1 を添加する。
8,000 回転で 1 分間遠心する。QIAamp MinElute Column を新しい 2 ml のコレクションチューブにセットし、ろ過液を含むコレクションチューブを捨てる。
⑪ QIAamp MinElute Column を静かに開き、カラムの縁を濡らさないように 500μl の Buffer AW2 を添加する。ふたを閉めて 6000×g（8000rpm）で 1 分間遠心操作する。QIAamp MinElute Column を新しい 2 ml のコレクションチューブにセットし、ろ過液を含むコレクションチューブを捨てる。
⑫ メンブレンを完全に乾燥させるために、14,000 回転で 3 分間遠心する。
⑬ QIAamp MinElute Column を新しい 1.5ml のマイクロ遠心チューブにセットし、ろ過液を含むコレクションチューブを捨てる。QIAamp MinElute Column のふたを静かに開き、20〜100μl の Buffer AE（あるいは蒸留水）をメンブレンの中央に添加する。
⑭ ふたを閉めて室温（15〜25℃）で 1 分間インキュベートする。14,000 回転で 1 分間遠心する。
DNA 抽出終了

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3PCR（Polymerase Chain Reaction）法①前処理②PCR 装置にセット③PCR 装置の作動

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動画『 DNA 型鑑定の実際』の解説

器械（手順、必要時間）
自動的に PCR 増幅
AmpFℓSTR® Identifiler™PCR Amplification Kit（Applied Biosystems 社 ） を 用 いて
User’s Manual に従って、D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO（Human c-fms protooncogene for CSF-1 receptor gene ）、 D3S1358 、 TH01 （ Human tyrosinehydroxylase gene）、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、vWA（Human vonWillebrand factor gene）、TPOX（Human thyroid peroxidase gene）、D18S51、 D5S818、FGA （ Human alfa fibrinogen） の 15 座 位 の 常 染 色 体 STR 多 型 と 性 染 色 体 のAmelogenin 座位の PCR 増幅を行い、STR 多型の解析には、ABI PRISM® 310 ジェネ
ティックアナライザを用い、キャピラリー電気泳動を行い、GeneMapper ID v3.2 ソフト基づいて、それぞれの型判定を実施した。

①クリーンベンチでの前処理

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4STR 多型の検出
STR の検査法として 2 種類があり、一つは従来のポリアクリルアミドゲル電気泳動法で、もう一つはキャピラリー電気泳動法である。前者は手作業で銀染色法を用い、一回におおよそ 1 〜 3 ローカスを検出できる。後者のキャピラリー電気泳動法は機械の検出器により結果を記録し、一回に 9 箇所以上のローカスを検出でき、現在多用されている。
・キャピラリー電気泳動法
機 械 の 進 歩 が 著 し い（ABI PRIZM ®310 ジ ェ ネ テ ィ ッ ク ア ナ ラ イ ザ、AppliedBiosystems 3130 ジェネティックアナライザ）①サンプルの前処理（陽性対照・陰性対照・検体）②入力、生データの表示（35〜40 分／ 1 サンプル）③結果の出力・印刷④エレクトロフェログラム（チャート）のチェック

STR 多型検出器（左奥）とコンピュータ（中央）9動画『 DNA 型鑑定の実際』の解説

Applied Biosystems 3130 ジェネティックアナライザ

STR 多型検出後、コンピュータを操作してエレクトロフェログラム（チャート）を出力する

画面上のエレクトロフェログラム

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参考 精液斑の鑑定

1 鑑定試料の観察と試料採取
下着の精液斑、ガーゼの精液斑①全景・部分（拡大）写真撮影（下にメジャーを入れて撮影する）②試料採取部位の写真撮影③試料の採取（検体と陰性対照）④試料採取後の部位写真撮影（検体と陰性対照）⑤採取試料の写真撮影（検体と陰性対照）
2 予備試験
①紫外線照射②SM テスト
酸性ホスファターゼに関する定性試験。
【試薬】1 液 α-Naphthylphosphoric acid
2 液 Diazonium o-dianisidine0.2M 酢酸緩衝液（pH 5）

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動画『 DNA 型鑑定の実際』の解説【方法】① 1 液と 2 液を等量混合し、酢酸緩衝液で 8 倍に希釈する。
②希釈液を検体に滴下する。
③判定（陽性ではアゾ色素生成により鮮やかな紫色を呈する）。
3 確認試験（精子の証明）〜顕微鏡検査・写真撮影（400 倍）精子の写真（オピッツ法〔Oppits〕による発色、400 倍）

4 DNA 型検査
①血液からの DNA 型検査と異なり、被害者（女性）と加害者（精液）の混合斑痕の場合には両方の型が精液斑などから検出されます。精液のみの DNA 型を検出する方法も施行されています。
②犯人逮捕前に試料から犯人の精液の型が検査されて判明しているか。
（犯人の精液を誤って混入される可能性のないことの証明）（了）

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