ラットモノクローナル抗体の樹立と有用性 ―子宮体癌予後予測と悪性中皮腫診断の新規マーカーを例に―
福島県立医科大学教授

医学部
千葉 英樹

2019年11月28日

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CLDN6をバイオマーカーとした子宮体癌患者の予後予測

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従来技術とその問題点がん治療の層別化・個別化に向け、バイオマーカーを用いて「がんの質的診断」を行うニーズが急速に高まっている。
・ 分子標的治療薬の適応を予測
・ 予後不良ながん患者を選別
しかし「有用なバイオマーカーが商品化されていないがん種（子宮体癌など）」も多い。
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乳癌における既存バイオマーカー
HER2: HER2標的薬の適応を予測
トリプルネガティブ乳癌は予後不良
オンコタイプDx及びマンマプリント：
21/70種類の遺伝子発現で再発/転移や予後予測
限られた対象と高額費用がネック
子宮体癌では浸潤・転移・再発能の高い予後不良な症例が少なからず存在するが、有用なバイオマーカーは国内外を問わず開発されていない。
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細胞間接着分子クローディン-6 (CLDN6)は様々な腫瘍で異所性発現を示す
胃腺癌

胚細胞腫瘍

CLDN6

肺腺癌

CLDN6

子宮体癌

CLDN6

卵巣癌

CLDN6
http://www.webpathology.com

Sullivan et al., 2012; Ushiku et al., 2012

生物学的意義は不明
胎生期上皮細胞に発現するが、成体正常組織では発現しない

5ラット足底免疫法によるモノクローナル抗体作製～免疫から10日後～
1. ラットから腸骨リンパ節を採取

2. ポリエチレングリコール(PEG)でB細胞とSP2細胞を融合
3. 限界希釈法でクローニング(96穴プレート×4枚)

Kishiro et al., Cell Struct Funct, 1995

2年で10種類を超える分子に対するモノクローナル抗体 (mAb)作製に成功

6特異性と感度の高い抗ヒトCLDN6
mAbの開発HEK293T

EF1αCLDNs

IRESVenus

IBL Rabbit anti-CLDN6 pAbVehicle

CLDN5

Rat anti-CLDN6 mAbVehicle

CLDN5(kD)250● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●

EGFP
CLDN1
CLDN4
CLDN5
CLDN6
CLDN91005037
CLDN6

CLDN1

CLDN6

HEK293T

CLDN12515250
100

CLDN9

CLDN4

CLDN9

long exposure

CLDN450372515Rab pAb

Rat mAb7CLDN6高発現は子宮体癌の強力な予後不良因子である8CLDN6接着シグナルはSFK/PI3K/AKT経路を介してRARγとERαの活性を制御する
シグナル
起点＝細胞接着
終点＝核内受容体リン酸化

細胞接着-転写因子
シグナル伝達経路を発見

Ser-X

Ser-XX

Sugimoto et al., Proc Natl Acad Sci USA, in revision9

がん細胞はCLDN6-ERα経路を乗っ取ることで子宮体癌の悪性形質を増強する

in vitro/vivoにおける機能獲得・喪失を評価
Sugimoto et al., in preparation

リン酸化Ser-XX-Erαに対するモノクローナル抗体も作製中

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新技術の特徴・従来技術との比較• ラット抗ヒトCLDN6 mAbを開発し、CDRを決定した。
• 本抗体は他のCLDNファミリー分子とは反応せず、既存抗体に比べ高い特異性を示した。
• 本抗体はホルマリン固定・パラフィン包埋標本を用いた病理診断に使用できる。
• 本抗体を用いることで、子宮体癌患者の予後が良好か不良かを予測できる。
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想定される用途• 子宮体癌患者（本邦では年間1万5千人）を対象に、予後・病勢・再発を簡便かつ高精度に予測できるキット（CLDN6免疫染色キット及び血中CLDN6値測定ELISAキット）を開発する。
• 対象が、「CLDN6異所性発現を示す他の悪性腫瘍」にも広がる可能性がある。
• CLDN6はヒト正常組織には発現しない細胞表面分子であり、がんの理想的な分子標的としても有望である 。
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実用化に向けた課題• ELISAによるCLDN6検出については未着手。
• 子宮体癌以外では、CLDN6高発現と予後の関係について未検討。

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企業への期待• 免疫染色キットや血中バイオマーカー測定キットを開発している体外診断薬メーカーとの共同研究を希望。
• 臨床性能試験や薬事申請手続きを希望。

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本技術に関する知的財産権• 発明の名称：子宮体癌患者の予後予測
マーカー• 出願番号：PCT/JP2019/012503• 出願人：福島県立医科大学• 発明者：千葉英樹、杉本幸太郎

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CLDN15は悪性中皮腫の新規診断マーカーとなる

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中皮 Mesothelium• 漿膜 serosaとほぼ同義• 胸膜, 腹膜, 心膜, 精巣鞘膜
• 単層の中皮細胞と結合織の二層から構成

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悪性中皮腫 Malignant Mesothelioma• 中皮細胞由来の悪性腫瘍で、予後は極めて不良• 胸膜 (80-85%)>腹膜 (10-15%)>心膜, 精巣鞘膜(1%)• アスベスト (石綿)との関連が深い：潜伏期間30-40年• アスベストの中皮への到達経路や詳細な発生機序は不明• 世界的に増加傾向にある

・Wagner et al., Br J Ind Med, 17: 260-271, 1960
・Robinson and Lake, New Engl J Med, 17: 1591-1603, 2005
・Robinson et al, Lancet, 366: 397-408, 2005
・Bianchi and Bianchi, Ind Health, 45: 379-387, 2007
・Yap et al., Nat Rev Cancer, 17: 475-488, 2017
・厚生労働省人口動態統計中皮腫による死亡数の年次推移（平成7年～平成27年）
・全がん協生存率調査（2018年2月集計）18

悪性中皮腫の組織型• 上皮型悪性中皮腫 (70%)：立方状の腫瘍細胞が腺管様・偽乳頭状・シート状構造を示す• 二相型悪性中皮腫 (20%)：上皮型と肉腫型が混在し、minor componentが10%以上ある• 肉腫型悪性中皮腫 (10%)：紡錐形の腫瘍細胞が膠原線維の増生を伴って増生• 組織型が多彩で、種々の悪性腫瘍との鑑別が困難
上皮型

肉腫型

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従来技術とその問題点組織型が多彩で、種々の悪性腫瘍との鑑別が困難。
特異的な中皮マーカーがなく、確定診断には「少なくとも2種類の陽性マーカーが陽性で、少なくとも2種類の陰性マーカーが陰性」であることを確認。

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CLDN6遺伝子は上皮型悪性胸膜中皮腫で高発現している
1) Gordon et al., Am J Pathol, 166: 1827-1840, 2005
2) Blueno et al., Nat Genet, 48: 407-416, 2016
3) Rouka et al., Front Physiol, 8: 156, 20174) Blum et al., Nat Commun, 10: 1333, 2019

悪性中皮腫におけるCLDN15タンパク質の発現は不明
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特異性と感度の高い抗ヒトCLDN15mAbの開発

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抗ヒトCLDN15 mAbのエピトープ

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CLDN15は悪性中皮腫の陽性マーカーとなる
HE

CLDN15

Calretinin24新技術の特徴・従来技術との比較• 特異性の高いラット抗ヒトCLDN15 mAbを開発した。
• 本抗体のエピトープとCDRを決定した。
• 本抗体はホルマリン固定・パラフィン包埋標本を用いた病理診断に使用できる。
• CLDN15タンパク質は悪性中皮腫の新規陽性マーカーとして有用である• 本抗体と抗カルレチニン抗体を併用することで、極めて高い感度で悪性胸膜中皮腫を鑑別できる。
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想定される用途• 世界的に増加している悪性中皮腫患者を対象に、CLDN15免疫染色キットを開発する。
• 免疫染色による悪性中皮腫の鑑別診断は、本邦でルーチン化している。
• ヒト正常組織では、CLDN15は中皮細胞と腸上皮細胞のみで発現することが示唆される細胞表面分子である。よって、極めて高い致死性を示す悪性中皮腫の分子標的となる可能性がある。

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実用化に向けた課題• ヒト正常組織におけるCLDN15の発現については検討中。
• 様々な悪性腫瘍におけるCLDN15の発現については検討中。

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企業への期待• 免疫染色キットを開発している体外診断薬メーカーとの共同研究を希望。
• 臨床性能試験や薬事申請手続きを希望。

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本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：悪性中皮腫鑑別方法, 及び悪性中皮腫鑑別用抗CLDN15抗体• 出願番号：特願2019-162576• 出願人：福島県立医科大学• 発明者：千葉英樹、東智仁29

お問い合わせ先
福島県立医科大学
医療研究推進センター
増井 誠一郎ＴＥＬ 024－547－1791e-mail semasui＠fmu.ac.jp30