栃 木農試 研報 No66 ： 37 ～ 42 （ 2011 )Bull.Tochigi
Agr.Exp.Stn.No66. ： 37ー遺～ 42伝子（ 2011プ ロアント シア ニジ ンフリant)28 の選 抜に 有効 な DNA マ ーカ ーの 開発 と大 麦育種 への 効率 的な 活用

プロアントシアニジンフリー遺伝子ant28の選抜に有効なDNAマーカーの開発
1)

春山直人・大関美香・五月女敏範・高山敏之・渡邉浩久 ・沖山毅
摘要：大麦種子に含まれるポリフェノールの一種プロアントシアニジン(PA)は，ビールの混濁や麦飯の加熱後褐変の原因物質であることから，その低減は大麦育種上の重要課題である．現在、プロアントシアニジンの産生を抑えるプロアントシアニジンフリー(PAF)遺伝子の育種利用が進められている．従来のPAF品種選抜法では，判定に親由来の組織である種皮を必要とすること，ホモ・ヘテロの判別が不可能なことから非効率的であった．そこで，育種効率の改善のため PAF遺伝子
ant28と 0.4～ 0.9cMで連鎖する DNAマーカーを開発した．本マーカーは，国内の主要な大麦品種で利用することが可能である．また，共優性のCAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)マーカーであるためヘテロの判別が可能であり，戻し交配育種法と組み合わせることで，PAF品種の育種年限を大幅に短縮することが可能となる．

キ－ワ－ド：ant28，大麦, 育種，DNAマーカー，プロアントシアニジンフリー

Development of CAPS marker linked to the Pronanthocyanidin-free gene
ant28 in barley, and efficient usage for breeding PAF cultivars
Naoto HARUYAMA, Mika OOZEKI, Toshinori SOTOME, Toshiyuki TAKAYAMA, Hirohisa WATANABE1)
and Takeshi OKIYAMA
Summary：Proanthocyanidins ( PA), one of the polyphenol group exists in barley grain, cause of thehaize formation of beer and the discoloration of barley foods. The reduction of proanthocyanidins areused to tryed as important subject in barley breeding. Some proanthocyanidin-free ( PAF) genes areready to use for breeding. Since the most of PA exist in the testa layer of grain which belongs toparent tissue, so we require at least F3 grain to select PAF lines with early selection method.
Moreover indistinguishable of homo/hetelo genotype may result to significant loss of breeding,
discarding PAF heterozygous lines that has potentialy good faculties.

We developed the DNA marker

closely linked to PAF gene ant28 by 0.4 to 0.9 cM, and the marker avairable for almost of Japanesebarley cultivars (two-rawed, six-rawed and naked). The marker is codominant CAPS marker, so we
can accerate the backcrossing since no requirement of the generation of fixing phenotype in breeding
process.
Key words：ant28, barley, breeding, DNA marker, proanthocyanidin-free1)現栃木県上都賀農業振興事務所(2010.10.31受理）
37

栃木 県農業 試験 場研 究報 告第66号

DNAマーカーと ant28 間の連鎖解析に用いる PAF品種とⅠ緒

通常型品種の後代として，大系 HL107(とちのいぶき) /言

スカイゴールデン( F2 241個体)， ant28 -494 /スカイゴー
ルデン(F2 189個体)を用いた．

近年，大麦育種では実需者からの高品質化要望に応えるため，様々な新規形質の導入が試みられている．極低２．PAF判定法

ポリフェノール大麦の開発は，現在最も積極的に取り組まれている課題の一つである．特にポリフェノールの一プロアントシアニジンフリーの判定には，現在主要な種であるプロアントシアニジン( PA)は，大麦の種皮にPA定量法である Vanillin-HCl法 11)を簡略化し， PAの有無局在し，タンパク質と結びつくことでビールに混濁を生のみを判定した．すなわち，種子2粒をペンチで粉砕し，じるほか，麦飯の加熱後褐変の原因物質としても知られ試験管中でメタノール500μlを加え攪拌し20分間静置す，育種の中でその低減が図られてきた．

る．さらに，8% Vanillin/メタノール溶液と16%HCl/メタ

大麦には，ポリフェノール類の産生量が極度に少ないノール溶液の等量混合液を500μl加え，十分に攪拌した突然変異体が複数見い出されているが，中でも PAを産後に20分程静置し判定した．抽出液に赤味がかった着色

生しないプロアントシアニジンフリー(PAF)遺伝子としのあるものは通常( PA)型( Ant28 /Ant28 , Ant28 /ant28)，てant13,ant17,ant28などが報告されている

呈色しないものはPAF型(ant28/ant28)と判定した．ており

2,14)

2,6)

．これまでの研究から， ant13 や ant17 といった一部の PAF遺伝子を３．DNA抽出法持つ育成系統では，一般的品種と比較してジアスターゼ力や最終発酵度などの麦芽品質が劣ること，それらに比DNA抽出はIkedaら 5)の方法を一部改変して行った．種較して ant28 を持つ系統では麦芽品質のバランスが良好

子では基本5粒からルータードリル(Sunflex社)で削り出であることが明らかとなっている ．また，ant28の導入した胚の粉末20 mg程度を，葉では2 cm×5 mm程度の葉系統においては、麦飯の加熱後褐変特性についても良好片をそれぞれ1.5mlチューブに入れ， SDS抽出バッファ

9)な結果が得られている9,14)ー(100ｍM Tris-HCl( pH 8.0), 50mM EDTA, 500mM．

NaCl, 1.25% SDS)750μlを加え，試料を粉砕・混和し昨今，ビール大麦に先駆け精麦用品種においてPAF遺14,15)た後，65℃処理を1時間行った．5M 酢酸カリウム液 24

しかし，これらPAF品種の育成にあたっては，既存の選0μlを加え氷上に10分間静置し，遠心分離(13500rpm×5抜法では長い時間と大きな手間が必要であった． PAは分)後の上清 500μlを新たなチューブに移した．さらに種子の中でも種皮中に偏在しており，その染色によってイソプロパノール330μ lと混和後，氷上に5分間静置し，選抜が行われてきた．このため，種子が得られるまでは遠心分離(13500rpm×5分)後に上清を捨て，70%エタノ選抜を行うことができず，収穫の手間が必要となる．さール 500μlを加え，再度遠心分離(13500rpm×5分)を行

らには，種皮は親の細胞由来の組織であるため，親の遺い，得られたペレットを室温で30分間乾燥後，RNase(6.

伝子型がヘテロである場合には，胚がPAF遺伝子を持っ7μg/ml)を含むTE緩衝液(10mM Tris-HCl( pHていても判別ができず，次の世代の展開が必要であった．

mM EDTA)50μlで溶解し，65℃で10分処理し，DNA抽伝子ant28を導入した品種が相次いで開発されている．

ビール大麦においても育種の効率化や育種年限の短縮8.0), 1出液とした．の観点から， DNAマーカーが積極的に導入され始めている．本研究では、PAF遺伝子中でも実用的とされる，ant28 を効率的に選抜するために DNAマーカーの開発に取り組んだので，その概要を報告する．

４．DNAマーカーの開発
ant28遺伝子は3H染色体長腕に位置することが報告されている7)．そこで，目的とする領域周辺でDNAマーカーとして利用できる配列多型を得るために， オオムギ

Ⅱ

試験方法の 遺 伝 子 ク ラ ス タ ー デ ー タ ベ ー ス HarvEST( http://harvest.ucr.edu/ ) を 利 用 し た ． 染 色 体 上 に マ ッ

１．材料ピングされた EST ( Expressed sequence tag )地図から，PAF品種として国内で育成された ant28 品種の遺伝子

3 H 染色体長腕上に位置する EST の配列情報を得た.ゲ

導入親である ant28 -494，通常型品種として栃木県育成

ノム構造が近いとされるイネの遺伝子配列を用いて 3 )の主要品種であるサチホゴールデンを用いた．また，オオムギの遺伝子構造を推定するべく， BLAST 1 ) を用いてオオムギ EST とイネゲノムとの相同性検索を行い，

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プ ロア ント シア ニジ ンフリ ー遺 伝子 ant 28 の選 抜に 有効 な DNA マ ーカ ーの 開発 と大 麦育種 への 効率 的な 活用

オ ー ソ ログ の 関 係 に あ る と 推 測 さ れた イ ネ の 遺 伝子Manager QTX 8)を用いた．

配列と比較を行った．オオムギ EST の遺伝子におけるイントロン部を推定したうえで， Primer3 version 0.4.

Ⅲ

結果および考察0 1 2 ) を用いて増幅断片長が1500 bp 以内となるようにプライマー対を設計した.

ant28 -494とサチホゴールデ

１．開発したDNAマーカーの特徴

ンの両品種について、設計したプライマーによって得ら設計したプライマー対を用いてサチホゴールデンとれたPCR産物からダイレクトシーケンス法でその塩基配ant28-494間の多型を探索し，検出したSNPsを基に，3種列を決定した．さらに，配列の比較から SNPsを検出し，の CAPSマーカーを開発した．各マーカーの名称，配列

Webcutter 2.0 ( http://users. unimi. it/~camelot/tools/cut2.

情報， PCR条件， CAPS処理に用いる制限酵素，制限酵html)を用いて制限酵素切断部位を特定し，CAPSマーカ

素処理後の断片長，遺伝子クラスターデータベースにおー化した．なお，連鎖解析は開発した各マーカーのほか，

い て 各 ク ラ ス タ ー に 付 与 さ れ て い る Unigene番 号

スカイゴールデンなどが保有し ant28 同様に3 HL染色体(HarvEST assembly 35 様式)を第1表に示した．OPAp1_上に位置する縞萎縮病抵抗性遺伝子 rym5 の連鎖マーカ

1297-AccIは422bpの PCR産物を生じ，制限酵素AccIの処ーSTS-E31/M41 を含めて行った．

理によって ant28 -494では310 bpおよび112 bpの断片が生

10)

一連の塩基配列の解析には BioEDIT を用いた．
3)

じた．OPAp2 _0505-DrdIは1217bpの PCR産物を生じ，制限酵素 DrdIの処理によってサチホゴールデンでは959bp

５．PCRおよび配列多型の確認および258bpの断片が，ant28-494では865bp，258bp，おPCR反応には， DNAポリメラーゼとして TOYOBO社よび94bpの断片が生じた． OPAp2 _1523 -MboIでは478bpのBlend Taq® -Plus-を用いた．反応液組成は滅菌蒸留水の PCR産物を生じ，制限酵素 MboIの処理によってサチ11.2μl，10×Buffer for Blend Taq 1.5μl，2mM dNTPs

ホゴールデンでは466bp，7bpおよび5bpの断片が，ant28

1.5μl，フォワードプライマー，リバースプライマー(1-494では451 bp，15 bp，7 bpおよび5 bpの断片が生じた．

00pmol/μl) 各0.1μl，Blend Taq® -Plus- 0.1μl，鋳型

２．マーカーとant28遺伝子の連鎖地図DNA(50ng/μ l)(0.5μ l)とした．各種プライマーの塩基ant28 の連鎖解析を行うため，ant28品種・系統と通常配列およびPCR反応条件は第１表に示した．サーマルサ型品種による交配から得られた F2 解析集団を養成した

イクラーはMycycler(バイオラッド社)を用いた.

(第2表)．大系 HL107 /スカイゴールデンの241個体のう

PCRおよびCAPS後の反応液は0.5% TBE溶液中で2％

ち，1個体が種皮にPAはあるがCAPSマーカーがant28-49

アガロースゲルを用いて泳動し，エチジウムブロマイド4型を示す組換えが見られた．また，ant28-494/スカイゴ

染色後に紫外線照射下で多型の判定を行った．

ールデンの187個体中，種皮はPAFであるがCAPSマーカーはヘテロ型を示すものが2個体あった．

６． ant28 遺伝子との分離比お よび連鎖の解 析

これらのF2集団を用い，3種のCAPSマーカー，rym5連

開 発 し た DNA マ ー カ ー と ant 28 遺 伝 子 と の 連 鎖 関

鎖マーカー STS-E31 /M41および ant28 遺伝子について3 H係 を 明 ら か に す る た め に ， ant 2 8 - 4 9 4 / ス カ イ ゴ ー ル

染色体にマッピングした連鎖地図を作成した(第1図)．

デ ン ， 大 系 HL 107 / ス カ イ ゴ ー ル デ ン の 2 組 合 せ の F ２

その結果，大系HL107/スカイゴールデンおよびant28-を 用 い て分 離 比 の検 定 を 行 っ た ． ま た 、 マ ー カ ー多494/スカイゴールデンの双方で， OPAp1 _1297-AccIが0.

型 と ant 28 遺 伝 子 型 の 連 鎖 解 析 に は 解 析 ソ フ ト Map

4cMおよび0.9cMで連鎖しておりant28と最も近かった．

第1表 ant28連鎖マーカーの検出条件と判定型

注．特定の遺伝子クラスターに対応する番号であるUnigeneは，HarvESTのassembly 35 に準拠した．

39

栃木 県農業 試験 場研 究報 告第66号

第2表 二条大麦を用いたant28解析F2集団におけるPAおよびCAPSマーカーOPAp1_1297-AccIの分離比

注． 種皮PAに関するχ2検定の結果は，大系HL107/スカイゴールデン: χ2(3:1)=1.008, 0.30<P<0.50, ant28-494/スカイゴールデン: χ2(3:1)=2.44,0.10<P<0.20. CAPSマーカーOPAp1_1297-AccIに関するχ2検定の結果は，大系HL107/スカイゴールデン: χ2(1:2:1)=2.037, 0.30<P<0.50, ant28-494/ス
カイゴールデン: χ2(1:2:1)=7.203, 0.02<P<0.05. 各交配組合せにおける組換価はそれぞれ 0.41±0.41% および1.07±0.75%.

ことは，大系 HL107が ant28 原品種の ant28 -494に対して日本のビール大麦の背景を持つ栃系216と栃系253を交配して育成されたこと9),さらに大系HL107とスカイゴール
デンは共に rym5 を持つことから，大系 HL107では3 H染色体上の ant28 から rym5 にかかる領域が日本のビール大麦品種型に置き換わっているものと推測された．
３．CAPSマーカーが利用可能な品種作成されたマーカーのうち，最も ant28 と密接に連鎖しているOPAp1_1297-AccIについて，国内の大麦品種での育種利用を想定し，マーカー多型の調査を行った．
その結果，二条，六条，裸の主要な大麦品種について，ant28遺伝子の導入親であるant28-494との間でCAPSマーカーの多型が得られることが明らかとなった．このことは，国内の主要品種を交配相手とした ant28 遺伝子の導入において，本マーカーが活用できることを示す．
第1図 ant28とDNAマーカーの連鎖地図および泳動像
注．泳動像は通常型8品種，PAF8系統，Ant28/ant28のF1による

さらに， ant28 の他の導入親として， ant28 -484およびant28-2131についても多型の確認を行ったが，いずれもant28-494と同様の CAPSパターンを示し，本マーカーは一方， ant28 -494 /スカイゴールデンでは rym5 連鎖マーカ

ant28-484およびant28-2131からのant28遺伝子導入にも有ー EM31 /41が19.7 cMと ant28から最も遠かった．なお，効であることが明らかとなった．なお， Alexisおよび大系HL107/スカイゴールデンでは両親の間にOPAp1 _12Triumphといった，いくつかの外国品種では， ant28-494

97 -AccI以外のマーカー多型は検出されなかった．このとの間に多型が確認できなかった．そのため，近い祖先

第3表 大麦主要品種・系統におけるant28選抜マーカーOPAp1_1297-AccIのCAPS多型

注. ant28を持つPAF品種・系統は太字 斜体.で表記した．また，マーカー多型はant28-494型だがPAを産生する品種は下線で示した．

40

プ ロア ント シア ニジ ンフリ ー遺 伝子 ant 28 の選 抜に 有効 な DNA マ ーカ ーの 開発 と大 麦育種 への 効率 的な 活用に外国品種が含まれる品種・系統を親に用いる交配組合
せで本マーカーを利用する際には，事前に親の間で多型が得られるか確認する必要がある．

５．今後の課題
前述のように，本試験で開発した CAPSマーカーは連鎖マーカーであるため， ant28 遺伝子とマーカーとの間で組み換えが生じることで，連鎖が切れてしまう可能性

４．CAPSマーカーの連続戻し交配育種への利用がある．一度連鎖が切れた場合には，その後の系統を用

近年， ant28 遺伝子を導入した品種が各地で開発されいた交配組合せでは，当マーカーを利用することはできているが， ant28 の導入親である ant28 -494は外国品種ない．現在，オオムギゲノム情報の解析が急ピッチで進Catrin由来の突然変異であり，日本においては栽培性でめられており，遠からず3H染色体上の ant28遺伝子が座も品質面でも大きく劣っている．そのため，国内の優良上する領域についても，配列情報が明らかにされると考品種・系統を複数回交配することで， ant28 -494由来のえられる．今後， ant28 遺伝子本体の特定とその働きの劣悪形質を排除し，国内品種の優良形質を導入する必要究明によって，PAFとなる原理の解明や，突然変異部位がある．最も現実的な手段として，背景となる品種の特からのマーカー開発が可能となることが期待される．

性を活かすことのできる戻し交配があり，共優性マーカ

さらに， ant28 の持つ欠点として，穂発芽に劣ることーと組み合わせることによって，交配後の世代で直ちにが挙げられる． ant28 以外の多くの PAF遺伝子について連続戻し交配が可能となる(第2図)．特にビール大麦でも耐穂発芽に劣ることが知られており13)，休眠性の付与

は栽培性や収量性に加え，14を数える品質検定項目全て等による穂発芽性の改善が今後の課題である．こうしたにおいて優れていなければ品種とならない．縞萎縮病抵場面において，耐穂発芽性に優れた品種・系統を背景と抗性遺伝子 rym5 の導入には20年以上の期間を要しておして，本マーカーによる連続戻し交配を活用することで，

16)

り ，目的とする形質のみを効果的に導入できる戻し交配育種は，早期育成の手法として非常に有効である．

一定の改善が可能と考えられる．
なお，麦芽製造に適した揃いの良い発芽特性と，強い従来の戻し交配では，2度の交配の後に自殖を行い，穂発芽耐性をもたらす休眠性とは，二律背反的な関係に目的遺伝子を持つ個体を選抜してから再度交配を行う．

あると考えられている．麦芽製造を必要とするビール大ant28 のような PAF遺伝子の場合， PAが親由来の組織で麦の育種では，双方のバランスを保った品種の開発が課

ある種皮に存在するため，自殖時にはF2に実るF3種子ま題である．今後， ant28 を含め PAF遺伝子と休眠性の関でPAF個体の選抜および交配が行えない．DNAマーカー係が解明されることによって，ビール大麦におけるPAFを利用した連続戻し交配を行うことで，約半分の期間で遺伝子のより効果的な活用が可能となることを期待したのPAF品種・系統の育成が可能となる．

い．

第2図 ant28の戻し交配育種における従来の選抜法とマーカー選抜法の比較モデル
注．破線枠は作業における最小の反復単位を示す．

41

栃木 県農業 試験 場研 究報 告謝第66号

Ordon, F. and Graner, A. (2005)

辞本研究の一部は農林水産省指定試験事業，プロジェク

High-resolution mapping of the Rym4 /Rym5 locus

ト研究「低コストで質のよい加工・業務用農産物の安定conferring resistance to the barley yellow mosaic

供給技術の開発」および農林水産研究高度化事業「極低virus complex BaMMV, BaYMV, BaYMV-2) in

ポリフェノール大麦を利用した機能性食材の新規用途開

barley. Theor. Appl. Genet. 110:283-293.

発」により実施した．研究材料の養成，分析には大塚孝，田中良張，荒川秀樹の諸氏にご協力いただいた．ここに11. 栃木分場（1998）

品質検定法｢品種改良のためのビール麦（第3版）｣

12. Rozen, S. and Skaletsky H. J. (2000) Primer3

記して感謝の意を表する．

on the WWW for general users and for biologist

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