2022/09/01“菌体外”にスペルミジンを排出する乳酸菌株

京都工芸繊維大学 応用生物学系教授 鈴木 秀之

1

なぜスペルミジンなのか
ポリアミンとは?
生物界に広く存在する生理活性アミン
DNAの構造安定化
RNAと相互作用して、タンパク質の合成を促進
プトレッシン
スペルミジン
スペルミン
カダベリン（アグマチン）2

なぜスペルミジンなのか
ポリアミン、特にスペルミジンのヒトの健康維持への効果•

スペルミジンによるオートファジーの誘発

Nat. Cell Biol. 11:1305 (2009)

が⾧寿を促進•肝臓、腎臓の保護

Exp. Gerontol. 44:727 (2009)

•

炎症抑制

PLOS One 8:e23652 (2011)•

認知機能の改善Nat. Neurosci. 16:1453 (2013)•

健康寿命の伸⾧Sci. Rep. 4:4548 (2014)•

心不全の進行の抑制

Nat. Med. 22:1428 (2016)•

スペルミジンの健康への効果についての総説

Science 359:eaan2788 (2018)

ポリアミン（特にスペルミジン）

炎症

抗酸化物質 ポリフェノール（イソフラボン、カテキン）
コエンザイムQ10

酸化物質

動脈硬化

生活習慣病
3

生合成したスペルミジンを菌体外に排出することの意義

ヒトのポリアミン（スペルミジン）源
アルギナーゼグルタミン酸食事として摂取する
ヒトの体が生合成する

オルニチン脱炭酸酵素

加齢に伴って作られにくくなる
J. Biochem. 139: 81 (2006)

腸内細菌が生合成する

スペルミジン
合成酵素

オルニチン

アルギニン

プトレッシン

スペルミジン
スペルミン
合成酵素

プトレッシンは小腸のジアミンオキシダーゼで分解される

スペルミン

スペルミジン、スペルミンを多く含む食品の摂取することが重要

4

新技術の概要
京野菜、京漬物のポリアミン含量を調べた
松ヶ崎に伝わる菜の花漬のスペルミジン含量が高い

松ヶ崎に伝わる菜の花漬～乳酸発酵を伴う

ポリアミン
含量増加

プトレッシン
カダベリン
スペルミジン
アグマチン
スペルミン
5

新技術の概要
菜の花漬から単離した乳酸菌の特徴:
1. YF1株の16S rDNA解析 → Bacillus coagulansと同定
グラム染色 陽性

MRS培地 + CaCO3

YF1

B. coagulans
基準株 DSM 16

新技術の概要
菜の花漬から単離した乳酸菌の特徴:
2. 胃酸に耐えて腸に届く芽胞を形成する
芽胞染色

人工胃液処理後の生存率(%)
芽胞
栄養細胞

胃酸に耐える芽胞形成

人工胃液処理 /0.2% NaCl処理
栄養細胞

6.45×10-4

芽胞

24.6

人工胃液
0.2%NaCl
0.157N HCl37℃, 3h,120rpm振盪

7

新技術の概要
菜の花漬から単離した乳酸菌の特徴:
3. 嫌気条件下で培養すると、乳酸を菌体外に排出

MRS培地、上清
1000

mV900

乳酸

嫌気条件

800700

酢酸600
500
400
300
200
10000.01000

5.010.015.020.025.030.0

35.040.0min

mV

900

好気条件

800
700

乳酸600

酢酸

500
400
300
200
10000.05.0

10.0

培養後

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

min

MRS培地のみ

Aminex HPX87-H (300×7.8 mm) カラム（BIO-RAD）を用いたHPLC分析

8

新技術の概要
菜の花漬から単離した乳酸菌YF1株の特徴:
嫌気条件、45℃
YF1

B. coagulans
基準株 DSM 1

YF1B. coagulans
基準株 DSM 1ポリアミンフリー培地A

ポリアミンフリー培地B

グルタミン酸、セリン、ロイシン、アルギニン、アラニン、アデニン、及びウラシルを含まないポリアミン非含有培地

Aに0.5 mg/mLの グルタミン酸1Na・1H2Oを添加した

9

新技術の概要
Ser, Leu, Arg, Ala, adenine, uracilを含まない
ポリアミンフリー培地で嫌気培養した場合の菌体外スペルミジン濃度
Spermidine

前培養 MRS、45℃で好気培養、M9で１度洗菌
本培養 ポリアミンフリー培地（Ser, Leu, Arg, Ala,adenine, uracilを含まない）
初発OD600=0.1、45℃、24時間、200 rpmで撹拌して培養（24時間後のOD600 YF1 1.22, DSM1 0.52)

YF1

DSM110新技術の概要
ArgT HisMPQ

Glutamate
ArgA

×

S-Adenosylmethionine

ArtPMQJI

Arginine
Ornithine
SpeA, AdiA
SpeC, SpeF
Agmatine××
SpeB ×Putrescine× PuuA ×
PatA×
SpeE

SpeD

Decarboxy-S-adenosylmethionine
5’-S-Methyl-5’-thiomethyladenosine

Arginine

-Glu-putrescinePatD
GABA

×CadA, LdcC

Cadaverine

Agmatine×Putrescine

PuuP

-Aminobutyraldehyde

Spermidine

LysineAdiC

Putrescine utilization
pathwayNAminotransferase
pathway

Succinate

SH1994 :F- Δggt-2 ΔspeAB ΔspeC ΔcadA
ΔldcC ΔspeF Δpuu(PA-DR)::tetR
ΔpatA ΔspeE ΔadiA::kanR-FRTSH2179 :SH1994 but argA::camR

TCA cycle11新技術の概要(B) Ornithine

Intencity (mV)

(A) Arginine
SH2238

SH2238

SH2238

SH2179 :F- Δggt-2 ΔspeAB ΔspeC ΔcadA ΔldcC
ΔspeF Δpuu(PA-DR)::tetR ΔpatA ΔspeE
ΔadiA::kanR-FRT ΔargA::camR

Intencity (mV)Intencity (mV)空ベクターを導入
SH2236

SH2236

SH2236

Agm

Agm

Agm

SH2235

SH2235

SH2235

Put

Put

Citrulline

Ornithine

Put
Agm

Agm
Retention time (min)Arginine
SpeA(C) Citrulline

Retention time (min)Agm

pYF43 (SpeAYF1)を導入

pYF42(SpeAYF1-SpeBYF1)を導入

Retention time (min)Glutamate
ArgA

Agmatine
SpeB
Putrescine
Aspartate b-semialdehyde
Carboxyspermidine
Spermidine
12新技術の概要

Intencity (mV)Intencity (mV)

培地にプトレッシンを添加
(A)

Put

空ベクターを導入

potential intermediate(B)YF1)を導入
pYF46(SpeI(SpeIYF1
pYF46)を導入

Arginine

Citrulline

Ornithine

Intencity (mV)

Agmatine(C)YF1)を導入
pYF47 (SpeIJ(SpeIJYF1
pYF47)を導入

Putrescine

Spd

SpeI

Glutamate
ArgA
SH1994 :F- Δggt-2 ΔspeAB ΔspeC ΔcadA
ΔldcC ΔspeF Δpuu(PA-DR)::tetR
ΔpatA ΔspeE ΔadiA::kanR-FRT

Potential intermediate
SpeJ
Retention time (min)Spermidine

13新技術の特徴・従来技術との比較

・植物性の食品から単離した乳酸菌である。
・乳酸菌の中でも例外的に芽胞を形成する乳酸菌である。
Bacillus coagulans のプロバイオティクスとしての応用例があるが、スペルミジンに関する情報はなかった

・嫌気条件下で、自ら生合成したスペルミジンを菌体外に排出する。
何種かの微生物でスペルミジンエキスポーターの報告はいくつかあるが、自ら生合成したスペルミジンを菌体外に排出したという報告例はない

14

想定される用途

・プロバイオティクスとして利用できる乳酸菌の中でも例外的に芽胞を形成するため、胃酸に耐えて生きたまま腸に届く乳酸菌としての利用
・直接スペルミジンを菌体外（＝大腸内）に生産するプロバイオティクスとしての利用
・細菌によるスペルミジンの発酵生産（化学合成ではない生物生産法）
・精製したスペルミジンの化粧品などへの添加15実用化に向けた課題

・経口摂取する場合は、芽胞の状態で胃を通過させなければならないので、栄養分や水分活性が高い食品への直接添加は難しい。
（芽胞が発芽して、栄養細胞に戻ってはいけない）
そのような食品への添加は、添加後すぐに食べるという用法を考える必
要がある。

16

どのような企業に使って頂きたいか・この乳酸菌をプロバイオティクスとして利用したいと考える企業。
・この乳酸菌が培地中に生産したスペルミジンをそのまま、あるいは濃縮して、さらには精製して、化粧品素材や化成品中間体などとして利用したいと考える企業。
・食品素材あるいは食品中でこの乳酸菌を生育させ、生成したスペルミジンが含まれた食品として一緒に摂ることに利用したいと考える企業。

17

まとめ単離Glu

菜の花漬

YF1株の特徴

Bacillus coagulans
・芽胞を形成する乳酸菌→ 胃酸に耐えて、生きたまま腸に届く

Arg

Spermidine

Spermidine
・アルギニン経由でスペルミジンを合成し、菌体外に排出・漬物から単離した乳酸菌である・芽胞を形成する乳酸菌である → 芽胞は胃酸に耐性である
・アルギニンを培地に添加することなくスペルミジンを生合成する
・生合成したスペルミジンを菌体外に排出する・アルギニン→アグマチン→プトレッシン→未同定の中間体→スペルミジンの順に合成される
18

本技術に関する知的財産権

発明の名称: スペルミジンを菌体外に生産する乳酸菌• 出願番号: 特願2021-114048, PCT/JP2022/004877• 出願人: 国立大学法人京都工芸繊維大学• 発明者: 鈴木秀之

19

お問い合わせ先

京都工芸繊維大学
産学公連携推進センター

知的財産戦略室（研究推進・産学連携課 知的財産係）
tel. 075-724-7039 / fax. 075-724-7030
e-mail chizai@kit.ac.jp
https://www.liaison.kit.ac.jp/index.php

20