栃木農試研報 No.82 : 29～37（2021）
Bull. Tochigi Agr. Exp. Stn. No.82 : 29～37（2021）

栃木県奨励水稲品種を品種識別する新規 SSR マーカー
データベースの構築
福田理沙・田﨑公久 1)・癸生川真也 2)・若桝睦子・生井潔 3)・中澤佳子
摘要：栃木県では，本県が育成した水稲品種の知的財産の保護および原種の安定生産を目的として，DNA マ
ーカーを用いた品種識別を行っている．これまでの DNA マーカーを用いた品種識別法を見直し，用いるDNA マーカーを更新した．平成 30 年に品種登録出願された夢ささらについても同様に品種識別を行うた
め，夢ささらを識別可能な Simple Sequence Repeat （SSR）マーカーを選定した．マーカー検出は，ポストラベル法による PCR を行い，DNA シーケンサーを用いた．栃木県における奨励 7 品種を含む 13 品種は，5 種類の SSR マーカーで相互に識別可能であった．また， 3 種類の SSR マーカーを追加することで，原種生産における 13 品種内での異品種混入判定が可能となった．さらに，異品種混入検査の検出感度を高めるため，検査方法を変更した．

キーワード：SSR マーカー，水稲，品種識別，ポストラベル法，夢ささら

Construction of new SSR marker database for recommended ricecultivars identification in Tochigi prefecture
Risa FUKUDA, Kimihisa TASAKI, Shinya KEBUKAWA, Mutsuko WAKAMASU, Kiyoshi NAMAI,
Yoshiko NAKAZAWA

Summary:

We use DNA markers to identify varieties for the purpose of protecting the intellectual property ofrice cultivars developed by Tochigi prefecture and ensuring stable production of the original species. The cultivar
identification method using DNA markers has been reviewed and updated the DNA markers used. We also
selected the Simple Sequence Repeat (SSR) marker which can identify Yume-Sasara, the variety registered in
2018. These markers were detected with a DNA sequencer following PCR using post-labeling method. Thirteen
varieties, including 7 varieties recommended in Tochigi prefecture were mutually distinguishable by using 5
types of SSR markers. Additional 3 types of SSR markers enabled the determination of the mixture of different
varieties within the 13 varieties in the original production. In addition, the inspection method was changed inorder to increase the detection sensitivity of the mixture of different varieties.

Key words: cultivar discrimination, post-labeling method, rice, SSR marker, Yume-Sasara

1)現栃木県農政部経営技術課，2)元栃木県職員，3)現栃木県上都賀農業振興事務所（2020.12.9 受理）

29栃木県農業試験場研究報告 第 82 号

Ⅰ緒言ク（本来の検出ピークの前後に生じる副産物）が検出され，識栃木県における水稲は，産出額 714 億円で県内の農業産

別の際に誤認する恐れがあることである．本県で使用されて出額の 24.9%を占め，品目別で 1 位を誇る重要な農産物とないる癸生川ら（2013）の水稲品種識別用 SSR マーカーセットっている．本県が育成した水稲品種は，晴れすがた（大谷ら，は，主に 2 塩基反復モチーフで構成されていたため，改良が1996），なすひかり（伊澤ら，2005），とちぎの星（山崎ら，

望まれていた．スタッターピークの低減は，一般的に 4～6 塩2012），酒造好適米では，とちぎ酒 14（伊澤ら，2007），2018

基反復モチーフからなる SSR マーカーの開発が有効である

年に品種登録出願した新品種夢ささら（山崎ら，2020）がある．

ことが知られており，水稲においては，識別用にスタッターが本県で作付されている水稲の品種構成割合は，コシヒカリが少ない 4 塩基反復モチーフからなる SSR マーカーが開発さ61.5%と半分以上を占め，次にあさひの夢（井澤ら，2001）がれている（岸根，2015）．

21.8%，本県育成品種であるとちぎの星が 10.3%，同じくなす

そこで，新品種夢ささらを含む本県奨励品種の品種識別

ひかりが 4.2%を占めている（令和 2 年度版栃木県農業白書）．

および原種生産における DNA 検査に用いることを目的に，また，本県の水稲奨励品種は，コシヒカリ，なすひかり，とちぎ

4 塩基反復モチーフの SSR マーカーを含む識別マーカーをの星，あさひの夢，きぬはなもち，トヨハタモチ，そして新品種新たに選定し，新規に品種識別用データベースを構築した．

である夢ささらの 7 品種が選定され，原種生産されている．水また，異品種混入検査についても検出感度向上のためプロト

稲の原種生産は，優良な種子の安定供給のために行われ，コールを変更したので併せて報告する．

他の品種が混ざらないよう厳格な栽培・調整管理が実施され，Ⅱ本県においては，原種出荷の際，DNA 検査を実施し混種の試験方法

危険性を排除している．
水稲の DNA マーカーによる品種識別技術は，他の農産

１．供試材料物と比較してゲノム解析が進んでいたことにより，早い段階か

供試品種は，本県奨励 7 品種を含む 13 品種を用いた．奨ら複数の民間企業による品種識別サービスが行われ，識別

励品種では，粳品種であるコシヒカリ，なすひかり，とちぎのキットも販売されている．これらは，偽装表示抑止や混種防止星，あさひの夢，糯品種であるきぬはなもち（坂ら，2009），トに活用されているが，多くの自治体では，新品種への対応や

ヨハタモチ（金ら，1986），品種登録申請中の酒造好適米で原種生産現場での種子純度の管理などで識別サービスやキある夢ささらを供試した．それ以外では，粳品種である月のットだけでは対応しきれないため，独自に Random Amplified

光（香村ら，1985），糯品種では，モチミノリ（井辺ら，2004），

Polymorphic DNA （RAPD）および Simple Sequence Repeat

ヒメノモチ（平野ら，1973），ゆめのはたもち（根本ら，1999），（SSR）マーカー等による新品種識別技術を開発している（森酒造好適米であるとちぎ酒 14，五百万石（杉谷ら，1957）を供ら，1998；小笠原・高橋，2000；吉田ら，2000；黒柳ら，2006；

試した．いずれも五百万石を除く 12 品種は，本県で過去 10

松古ら，2006；江嶋ら，2007；林ら，2010）．本県においても，年間に奨励品種として原種生産（月の光は原種見合）されて本県と近隣各県の奨励品種を中心とした 20 品種を識別できいることから選定した．

る RAPD マーカーを開発している（小林・吉田，2005）．また，供試組織としては，葉身を用いた．夢ささらを除く 12 品種とちぎの星育成の際には，新たにポストラベル法（Schuelke，は，本場および原種農場（高根沢本場および栃木分場）の保

2000）による 15 品種を識別する SSR マーカーセットを開発し存種子（原種および原々種）をガラスシャーレーに播種・発芽（癸生川ら，2013），原種生産における検査に活用している．

後，128 セルトレー（培土：ニッピ育苗培土 SP200）に植え替え

SSR マーカーは，共優性マーカーであることから，アレルハイポネックスを適宜施肥しながら第 2 から 3 葉期の葉をサ（対立遺伝子）型により識別でき，PCR および電気泳動のみ

ンプリングした．個体数は，各品種 3 個体とした．夢ささらににより容易に解析ができる（赤木，2000）．また，新規 SSR マ

ついては，原種ほ場から 2 系統（各系統 10 個体）の葉をサンーカーの開発についても，現在では公開されているゲノムシ

プリングした．

ーケンスデータから容易に設計でき，水稲では，McCouch etal.（2002）によりゲノム全体に作成された SSR マーカーが公開されている．

２．DNA 抽出DNA 抽出は，DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN）を用いた．

一方，SSR マーカーによる品種識別の欠点としては，2 塩

葉身 100 mg と直径 3 mm のステンレスビーズ 2 粒を 2.0 mL

基反復モチーフの SSR マーカーを使用した場合，その多くチューブに入れ，液体窒素で冷却したのち破砕機 MM300が識別に使用するアレルピーク以外に複数のスタッターピー（Retsch）を用いて 30 回転/秒で 30 秒間振とうした．液体窒素

30栃木県奨励水稲品種を品種識別する新規 SSR マーカーデータベースの構築

による冷却と粉砕を 5 回繰り返し，葉身を粉末状にした．その異品種混入判定用プライマーは，スタッターピークを考慮し，後，抽出キットに添付のプロトコール通りに DNA 抽出を行っ検査品種に比べて混入品種のアレルサイズが大きいことを条た．抽出した DNA は，分光光度計（e-spect, malcom）により件として選定した．ただし，検査品種よりも混入品種のアレル濃度測定し，10 ng/µL に調製し PCR に供試した．

サイズが小さい場合でも，検査品種と混入品種とのアレルサ
イズが大きく離れている場合は，スタッターピークの影響を受

３．供試プライマー
21 組（RM5，RM5711，RM8249，RM10000，RM11499，

けにくいため異品種混入判定用マーカーとして用いることとした．

RM12927 ， RM15043 ， RM16604 ， RM17039 ， RM18204 ，
RM18950 ， RM19232 ， RM21367 ， RM21859 ， RM22194 ，６．異品種混入の検出と検査方法

RM24481 ， RM25036 ， RM25416 ， RM26245 ， RM27695 ，

ポストラベル法による PCR 増幅と解析機器における混入異RM28174 ） の プ ラ イ マ ー を 供 試 し た ． RM5 ， RM5711 ，品種の検出限界を調査した．供試品種は夢ささらおよび五百RM8249 は癸生川ら（2013）が供試したプライマー，RM10000

万石を用いた．混合割合は，夢ささらに対して五百万石を以降は岸根（2015）が開発し，農研機構により特許出願され1%相当（夢ささら 95 粒：五百万石 1 粒）および 4%相当（夢さたプライマーである（特許 第 5749466 号）．ただし，シーケン

さら 23 粒：五百万石 1 粒） とした．DNA 抽出は，癸生川ら

サーによって多型検出を行うため，フォワードプライマーは（2013）の TPS 法で行った． 使用プライマーは RM8249 とし，Schuelke （2000）の方法（以下，ポストラベル法）に準じて作

PCR およびマーカーの検出はⅡ-４と同様に行った．

製し，ユニバーサル蛍光標識プライマーがアニーリングされⅢ

るよう M13Rv 配列（5’- CAGGAAACAGCTATGACC）を 5’

結果側に付加した．さらに，癸生川ら（2013）が供試したプライマ
ーのリバースプライマーには岸根（2015）のプライマーと同様

１．4 塩基モチーフ SSR マーカーによる栃木県奨励水稲に pig-tail 配列（5’- GTTTCTT）を 5’側に付加した．

品種の識別プライマーセットの選定
本県奨励品種 7 品種を含む 13 品種を供試し，岸根（2015）

４．PCR 方法および増幅産物の検出が開発した 18 組の SSR プライマーを用いて PCR を行い増PCR 方法および増幅産物の検出は，癸生川ら（2013）の方

幅産物の検出をした結果，RM17039 および RM25416 では

法に準じて行った．ポリメラーゼは，MyTaq DNA Polymerase

す べ て の 品 種 で 同 じ ア レル を 検 出 し ， RM25036 お よ び（Bioline）に変更した．反応液組成は，1×MyTaq Reaction

RM28174 では一部 PCR 増幅が見られない品種があった．供Buffer，0.25 U MyTaq DNA Polymerase（Bioline），0.04 µM

試した 18 組のうち，14 組のプライマーで明瞭な多型が得ら

フォワードプライマー，0.16 µM リバースプライマー，0.08 µM

れた（第 1 表）．13 品種の識別に用いる最小プライマーセット

ユニバーサル蛍光標識プライマー（Dye4_M13Rv）とし，10は，RM12927，RM21367，RM21859，RM24481，RM27695µL の液量で 10 ng/µL に調製した鋳型 DNA 1 µL を加えた．

であった（第 1 表）．新品種夢ささらについては，RM12927

サーマルサイクラーは，Veriti（Applied Biosystems）を用いた．

（a+4，295bp）および RM21859（a-16，213bp）のプライマーを

PCR 産物は 1/10TE で 10 倍希釈し，1 µL の希釈液に 25 µL

用いることで，供試した 13 品種間での品種識別が可能であの ホ ル ム ア ミ ド ， 0.05 µL の DNA Size Standard Kit-400った（第 1 表）．なお，最も多型が認められたプライマーは（ Beckman Coulter ） を 加 え た 後 ， DNA シ ー ケ ン サ ー

RM12927 で 263 bp，283 bp，287 bp，291 bp，295 bp，およびGenomeLab GeXP （Beckman Coulter）を用いてキャピラリー

299 bp の 6 アレルが検出された（第 1 表）．

電気泳動を行った．電気泳動により検出されたアレルサイズ
は，コシヒカリを基本サイズ（a）とし，他の供試品種の検出アレ

２．原種生産における異品種混入判定用プライマーセッ

ルをコシヒカリのアレルサイズと比較してプラスマイナスで表

トの選定

示した．

原種の異品種混入判定用プライマーの選定においては，
検査品種と混入品種間でアレルサイズが大きく離れている必５．品種識別および異品種混入判定用 SSR マーカーの選要がある．上記の 5 組の品種識別用プライマー（RM12927，

定

RM21367，RM21859，RM24481，RM27695）における検査
13 品種の品種識別用プライマーは，4 塩基反復モチーフ

品種と混入品種のアレルサイズを比較した結果，なすひかりの 18 組のプライマーから選定した（RM10000～RM28174）．

31

32

備考

◎

a
a
a
a+4
a+8
a-4
a+4
a-8
a-8
a-8
a-28
a
a-8

a
a
a
a
a
a+16
a
a
a+4
a
a+20
a+4
a+4

a
a
a
a
a-4
a-12
a
a
a-4
a-4
a-22
a-4
a+4

RM15043
TCTA
5
242

a
a
a
a
a
a+4
a
a
a
a-8
a+8
a-8
a-4

RM16604
ATAG
5
265

×

a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a

RM17039
ATAC
1
225

a
a
a
a
a
a+4
a
a
a-4
a-4
a+4
a
a-4

RM18204
ATAC
3
272

a
a
a
a
a
a-4
a
a
a
a
a-4
a
a

RM18950
TTAT
2
232

a
a
a
a
a
a
a
a
a
a-4
a
a
a-4

RM19232
ATAC
2
258

◎

a
a+8
a+8
a
a+8
a
a+8
a+8
a+8
a
a
a
a+8

RM21367
ATGT
2
306

◎

a
a
a
a+40
a+40
a+16
a
a+40
a+40
a
a+22
a+40
a+12

RM21859
TATC
5
229

a
a
a
a
a
a+16
a
a
a
a
a+16
a
a

RM22194
CATA
2
285

◎

a
a-24
a-24
a
a
a
a
a
a-24
a-24
a-4
a
a-24

RM24481
ATCT
3
273

×

a
a
a
a-4
a
a-4
a
a+4
a
a

RM25036
TATG
3235

品種識別に用いることはできないものを示す．

注 3．備考欄の◎は 13 品種の識別に用いる最小プライマーセットを示す．×は多型が得られないまたは PCR 増幅しない品種があるため，

注 2．－は PCR 増幅しなかったものを示す．

農研は農業研究センター（現 農研機構)を示す．

注 1．供試品種名横の括弧内は，育成者と種苗法登録年を示す．ただし，東北は東北農業試験場（現 農研機構東北農業研究センター），

栃
木
県
奨
励
品
種

RM12927ATAC
6291

RM11499ATAG
4350

4 塩基モチーフ SSR マーカーによる栃木県奨励品種等の検出アレル

マーカー名
RM10000
SSRモチーフ
TATC
検出アレル数2
基本サイズ（bp)254
コシヒカリ（福井,未登録）a
なすひかり（栃木，2007）aとちぎの星（栃木，2015）a
あさひの夢（愛知，2000）a
きぬはなもち（愛知，2011）a+4
トヨハタモチ（茨城，1986）
a+4
夢ささら（栃木，出願公表）a
月の光（愛知，1986）
a+4
モチミノリ（農研，1991）
a+4
ヒメノモチ（東北，未登録）
a+4
ゆめのはたもち（茨城，2000） a+4とちぎ酒14（栃木，2007）
a+4
五百万石（新潟，未登録）
a

第1表

×

a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a

RM25416
ATCT
1
266

a
a+4
a+4
a+4
a
a+4
a+4
a
a+4
a
a+4
a+4
a+4

RM26245
ATCT
2
269

◎

a
a
a+12
a
a
a+8
a
a
a
a+12
a+12
a+12
a

RM27695
TGTA
3
245

×

a
a
a
a+2
a+2
a+2
a
a
a
a

RM28174
TATG
2
227

栃木県農業試験場研究報告 第 82 号

栃木県奨励水稲品種を品種識別する新規 SSR マーカーデータベースの構築における五百万石，とちぎの星におけるヒメノモチ，きぬはな（RM21859）は 1 組，モチミノリ（RM21859，RM24481），ゆめ

もちにおけるあさひの夢が混入検査不可（-8bp 以内）であっのはたもち（RM5711，RM8249）および五百万石（RM5711，

た（第 1 表）．多型が認められた 14 組から上記の 5 組を除い

RM27695）は 2 組，なすひかり（RM5，RM24481，RM27695），

たプライマーセットおよび癸生川ら（2013）のプライマーセットと ち ぎ の 星 （ RM5 ， RM24481 ， RM27695 ） ， き ぬ は な も ちの中から，効率的に異品種混入判定に用いることができるも（ RM8249 ， RM21859 ， RM27695 ） ， 夢 さ さ ら （ RM8249 ，のを検討した．その結果，癸生川ら（2013）が設計し，増幅がRM21859，RM27695） ， ヒ メ ノ モ チ （ RM5711 ， RM8249 ，

安定していた RM5，RM5711，RM8249 を異品種混入判定用

RM27695 ） お よ び と ち ぎ 酒 14 （ RM21859 ， RM24481 ，

プライマーとして選定した．合計 8 組のプライマーを用いるこ

RM27695 ） は 3 組 ， コ シ ヒ カ リ （ RM8249 ， RM21859 ，とにより，供試した 13 品種内での異品種混入判定が可能とな

RM24481，RM27695），あさひの夢（ RM8249，RM21367 ，った（第 1 表および第 2 表）．

RM21859 ， RM24481 ） ， 月 の 光 （ RM8249 ， RM12927 ，

新品種である夢ささらついては，原種生産における異品種

RM21859，RM24481）は 4 組必要であった．

混 入 判 定 の た め の 最 小 プ ラ イ マ ー セ ッ ト は ， RM8249 ，RM21859，RM27695 であった（第 2 表）． RM8249 では夢さ

３．異品種混入の検出と検査方法

さらは 181 bp（a-16）を示し，197 bp（a）を示すコシヒカリ，なす

本供試プライマーおよび解析機器における異品種混入検ひかり，とちぎの星，きぬはなもち，ヒメノモチ，とちぎ酒 14，

出限界を調査した．夢ささらの DNA に，同じく酒造好適米で五百万石との混入判定が可能であった（第 2 表）．RM21859

ある五百万石を 1％と 4％の割合で混入させたところ，混入のでは夢ささらは 229 bp（a）を示し，269 bp（a+40）を示すあさひ

割合が 1％よりも 4％の方が五百万石を示すアレルを明確にの夢，きぬはなもち，月の光，モチミノリ，とちぎ酒 14，245 bp

確認できた（第 1 図）．

（a+16）を示すトヨハタモチとの識別が可能であった（第 2 表）．

本結果をもとに新たに原種における異品種混入検査方法

RM27695 では夢ささらは 245 bp（a）を示し，257 bp（a+12）をを変更した（第 2 図）．最初に，定性検査は，水稲研究室にお示すとちぎの星，ヒメノモチ，ゆめのはたもち，とちぎ酒 14，

いて目視で確認された各サンプルから 96 粒を無作為に選抜

253 bp（a+8）を示すトヨハタモチとの識別が可能であった（第し，2 mL96 ディープウェルプレート（AXYGEN）（1 ウェルに 3

2 表）．

mm ステンレスビーズ 1 個）に 1 ウェルに 1 粒ずつ加えた．

第 3 表に各検査品種における異品種混入判定用プライマ

TPS buffer（1M KCl，50 mM Tris-HCl pH 8.0，10mM EDTA

ー組合せを示した．異品種混入検査に必要なプライマー組

pH 8.0）50 µL を添加後，96 ディープウェルプレート用マット

合せは，各検査品種によって異なっており， トヨハタモチ

第2表

供
試
品
種
の
ア
レ
ル
サ
イ
ズ

SSR マーカーによる水稲 13 品種の多型検出結果

マーカー名
RM5
SSRモチーフGA
検出アレル数3
基本サイズ（bp）133
コシヒカリ
a
なすひかり
a
とちぎの星
a
あさひの夢
a
きぬはなもちa
トヨハタモチ
a+11
夢ささら
a+6
月の光
a
モチミノリ
a+6
ヒメノモチ
a+6
ゆめのはたもち a+6とちぎ酒14
a+6
五百万石
a+6

RM5711AAT
5176

RM8249GA
2197

RM12927ATAC
6291

RM21367
ATGT
2306

RM21859
TATC
4229

RM24481ATCT
3273

RM27695
TGTA
3
245

a
a
a-6
a-6
a-6
a-9
a-6
a-6
a-6
a-12
a-15
a-6
a-12

a
a
a
a-16
a
a-16
a-16
a-16
a-16
a
a-16
a
a

a
a
a
a+4
a+8
a-4
a+4
a-8
a-8
a-8
a-28
a
a-8

a
a+8
a+8
a
a+8
a
a+8
a+8
a+8
a
a
a
a+8

a
a
a
a+40
a+40
a+16
a
a+40
a+40
a
a+4
a+40
a+4

a
a-24
a-24
a
a
a
a
a
a-24
a-24
a-4
a
a-24

a
a
a+12
a
a
a+8
a
a
a
a+12
a+12
a+12
a

注 1．RM12927，RM21367，RM21859，RM24481，RM27695 は岸根（2015）が開発したマーカー．
注 2．供試品種のアレルサイズは，コシヒカリのアレルサイズを基本（a）としプラスマイナスで示した．

33

栃木県農業試験場研究報告 第 82 号

第3表

栃木県水稲原種品種識別用プライマー組合せ

ーで混合後，2 mL チューブに移し，等量のイソプロパノール

他12品種との混種識別に用いるプライマー

で転倒混和した（96 粒：24 粒×4 本）．15000 rpm で 10 分間

コシヒカリ
RM8249 ・ RM21859 ・ RM24481 ・ RM27695
なすひかり
RM5
・ RM24481 ・ RM27695
とちぎの星
RM5
・ RM24481 ・ RM27695
あさひの夢
RM8249 ・ RM21367 ・ RM21859 ・ RM24481
きぬはなもち RM8249 ・ RM21859 ・ RM27695
トヨハタモチ RM21859
夢ささら
RM8249 ・ RM21859 ・ RM27695
月の光RM8249 ・ RM12927 ・ RM21859 ・ RM24481
モチミノリ
RM21859 ・ RM24481
ヒメノモチ
RM5711 ・ RM8249 ・ RM27695
ゆめのはたもち RM5711 ・ RM8249とちぎ酒１４ RM21859 ・ RM24481 ・ RM27695
五百万石
RM5711 ・ RM27695

注．RM12927，RM21367，RM21859，RM24481，RM27695 は岸根（2015）が開発したマーカー．

遠心分離後，上清を除去し，エバポレーターで 15 分間乾燥
させ，TE-RNase（20 µg/mL）500 µL 加え，37℃で 30 分間イ
ンキュベートした．以降の PCR および増幅産物の検出はⅡ４，供試プライマーは第 3 表に示した．
24 バルク法で混入品種アレル検出の疑いがあった場合，1粒ごとのマーカー検出を行うこととする．混入品種アレル検出の疑いがあった 24 粒の抽出液を 1 ウェルあたり 50 µL ずつ
PCR プレートにそれぞれ移し，等量のイソプロパノールを加えボルテックスにより混和する．4800 rpm で 15 分遠心分離し，
エバポレーターで 15 分乾燥させ，TE-RNase（20 µg/mL）20µL 加え，DNA を溶解後，再検定を行う．

（BM6018D）で蓋をし，MM300（Retsch）により粉砕した（25S・混入品種アレルが確認された場合は，さらに定量検査に

90 秒×2 回）．TPS buffer 450 µL を添加後，ボルテックスによ移行し，無作為に新たに 192 粒を抽出し，1 粒ごとにアレルり混合し，4800 rpm で 15 分間遠心分離した．1 粒あたり上清

型確認を行い，混入割合を算出することとした．

40 µL をリザーバーに移し，24 粒分 合計 960 µL をピペッタ

第 1 図 「夢ささら」に「五百万石」を混入させたときの検出例
A；4％混入の図，B；1％混入の図，C；4％混入時の五百万石を示すアレルピークの拡大図，D；1％混入時の五百万石を示すアレルピークの拡大図．C，D は A，B の 197 bp 付近を拡大した図である．4％混入の図（A，C）では，五百万石を示す 197 bp 付近のアレルピークが 3000 程度であるのに対し，1％混入の図（B，D）では，500 以下となっている．

34

栃木県奨励水稲品種を品種識別する新規 SSR マーカーデータベースの構築

第2図

Ⅴ

考

改良した 24 バルク法による異品種混入検査の流れ察できなかった．一般的に反復モチーフ数が大きくなると多型が得られにくいことが知られていることから，大きなアレルサイ

栃木県では，栃木県と近隣各県の奨励品種を中心としたズの差が得られなかったと考えられる．今後，水稲において20 品種について，RAPD マーカーを用いて識別する技術

は，ゲノム全体に設定された SSR マーカーが公開されている（小林・吉田，2005）や，SSR マーカーを用いて識別する技術ことから（McCouch et al.，2002），それらの情報を用いてさら（癸生川ら，2013）を開発している．しかし，2018 年に新品種に 4 塩基反復モチーフの SSR プライマーを選定し，スクリー

である夢ささら（山﨑ら，2020）が出願公表されたことから，再ニングすることにより解消できると考えられる．

度品種識別マーカーを選定する必要性が高まってきた．また，本県の酒造用玄米の生産量は 1315 トンであり，品種別生癸生川ら（2013）が開発した SSR マーカーは，2～3 塩基反復

産量および構成割合は，山田錦（池上ら，2005）：770 トン

モチーフであり，スタッターピークが発生することがあるため，（58.5％），五百万石：320 トン（24.3％），夢ささら：107 トン

混入判定の観点から，岸根（2015）の 4 塩基反復モチーフの（8.2％），ひとごこち（近藤ら，1999）：72 トン（5.5％），とちぎ酒

SSR マーカーの有効性を確認した．

14：27 トン（2.1％），美山錦：19 トン（1.4％）である（平成 30 年

本県奨励水稲 7 品種を含む供試 13 品種は，岸根（2015）

度米の農産物検査，農林水産省）．

の 4 塩基反復モチーフの SSR マーカーのうち 5 マーカー

今回，栃木県における奨励品種の品種識別および原種生（RM12927，RM21367，RM21859，RM24481，RM27695）で産における異品種混入判定マーカーの開発を目的としたた品種識別が可能であった．岸根（2015）は，水稲主要 48 品種

め，本県で生産されている酒造好適米の品種識別についてのアレル型を決定しており，本試験のコシヒカリ，あさひの夢，

はとちぎ酒 14，五百万石および新品種である夢ささらのみ調なすひかり，ヒメノモチ，五百万石の 5 品種についてはすでに査した．

アレル型が決定していたが，新たにその他 8 品種（とちぎの生産量の上位を占める山田錦および美山錦のアレル型に星，きぬはなもち，トヨハタモチ，月の光，モチミノリ，ゆめのは

ついては，岸根（2015）の水稲主要 48 品種のアレル型デー

たもち，とちぎ酒 14，夢ささら）についてアレル型を決定する

タで既に報告されている．そのため，岸根（2015）の山田錦おことができた．このことから，今回供試した 4 塩基反復モチー

よび美山錦のアレル型と本試験における夢ささらのアレル型

フ SSR マーカーの汎用性は高いと考えられる．

を比較した結果，山田錦に関しては 3 マーカー（RM12927，

一方，異品種混入判定用マーカーについては，供試した

RM21367 ， RM27695 ） ， 美 山 錦 に 関 し て は 4 マ ー カ ー

18 組の 4 塩基反復モチーフの SSR プライマーだけでは選定（RM12927，RM21367，RM24481，RM27695）で識別が可能
35

栃木県農業試験場研究報告 第 82 号

であり，特に RM12927 については他の 12 品種に関してもア

林猛・小林麻子・鮑根良・富田桂 (2010) 福井県の水稲奨

レル型が異なっていた．今後，本県の検出手法により山田錦励品種を識別する SSR マーカーセット開発. 北陸作

および美山錦のアレル型を決定し，品種識別データベース

物学会報 44:11-14.

に加える必要性があると考えられる．一方，ひとごこちに関し平野哲也・進藤幸悦・赤間芳 洋・内山田博士・松本顕ては，4 塩基反復 SSR マーカーのアレル型の報告はない．ま(1973) 水稲新品種「ヒメノモチ」の育成について. 東た，夢ささらの交配親は，山田錦×T 酒 25（愛知 93 号（あさ

北農試研報 45:17-31.

ひの夢×山田錦）×山田錦）F5×ひとごこち）であることから，

井辺時雄・赤間芳洋・中根晃・羽田丈夫・伊勢一男・安東

品種識別においてひとごこちのアレル型を決定することは重郁男・内山田博士・中川宣興・古舘宏・堀末登・能登要であると考えられる． なお，RM21859 における夢ささらの

正 司 (2004) 水 稲糯 品種「モチ ミ ノリ」 . 作 物研 報

アレル型（a-16，213bp）は，あさひの夢のアレル型（a+40，

5:19-33.

269bp）および岸根（2015）の山田錦のアレル型（a+4，233bp）と異なることから，ひとごこち由来と推定される．
品種の偽装や異品種混入を判定する目的で DNA 鑑定を行う場合，正確性と緊急性が求められる．簡便な DNA 抽出

池上勝・三好昭宏・世古晴美・渋谷幾夫・西田清数 (2005)
酒米品種「山田錦」の育成経過と母本品種「山田穂」，「短稈渡船」の来歴. 兵庫農技総セ研報(農業) 53:3750.

の方法として，玄米と葉身から TPS 法によって約 1 時間で抽井澤敏彦・朱宮昭男・工藤悟・加藤恭宏・藤井潔・坂紀邦・

出でき，抽出した DNA は PCR に利用可能な品質であったこ

遠山孝通・伊藤俊雄・杉浦直樹・小島元・中嶋泰則とから，識別のための標準的な DNA 抽出法とされている（江(2001) 水稲新品種「あさひの夢」の育成. 愛知農総嶋ら，2007；癸生川ら，2013）．そのため，今回の原種検査方

試研報 33:1-10.

法においても採用している．また，異品種の検査を行う際は，

伊澤由行・湯澤正明・藤井真弓・五月女恭子・大谷和彦・

混入品種の割合が 4%相当となる 24 バルク法を採用すること

小林俊一・大久保堯司・小島隆・山口正篤・伊藤浩・

により混入品種のピーク判断が容易となった．今後，原種生

倉井耕一・出口美里・栃木喜八郎・五月女敏範・池田産における DNA 検査においては，今回使用した 4 塩基反復

二朗 (2005) 水稲新品種「なすひかり」の育成. 栃木

モチーフ SSR マーカーと本検出方法により，効率的に検査

農試研報 55:1-14.

が行えると考えられる．

伊澤由行・山口正篤・小林俊一・倉井耕一・五月女恭子・
出口美里・藤井真弓・大谷和彦・大久保堯司・池田二謝辞朗 (2007) とちぎ酒 14 品種登録番号 15391.

本研究を実施するにあたり，供試材料を提供していただい癸生川真也・中澤佳子・天谷正行・生井潔 (2013) ポスト

た栃木県農業試験場研究開発部水稲研究室長木村守氏，

ラベル法を用いた栃木県水稲奨励品種を識別する

栃木県農業試験場原種農場長（現那須農業振興事務所経SSR マーカーセットの開発. 栃木農試研報 71:55-61.

営普及部長）福島敏和氏に厚くお礼申し上げる．4 塩基反復

岸根雅宏 (2015) イネまたはそれに由来する組織，あるい

モチーフの SSR マーカーについて御教授していただいた国はそれらの加工品の品種鑑定法. 特許第 5749466 号.

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優良品種の品種識別. 日作紀 74:207-211.

博士に深く感謝申し上げる．原種農場高根沢農場および栃近藤武晴・久保田基成・手塚光明・新井利直・前島秀和

木農場の職員の皆様には、快くサンプリングにご協力してい(1999) 水稲新品種「ひとごこち」の育成. 北陸作報

ただいた．また，生物工学研究室の皆様には，貴重なご助言，

34:10-11.

ご協力をいただいた．ここに記して心から感謝の意を表する．

金忠男・奥津喜章・須賀立夫・平沢秀雄・根本博雄 (1986)
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