（2）魚類の体長と重量 （図3）
フナ：4月はB地点で最も大きい29cm、最小で8cmが捕獲され総重量は1235g。7月は10〜31cmで総重量は2770g。10月は6〜17cmで総重量は464gであった。
ボラ：4月はB地点で13〜45cmで、A地点の方が体長が大きいのが多く総重量は12720g。7月はA地点で22〜41cmで総重量は6540g。
10月は12〜37cmで総重量は3420gであった。
コノシロ：体長10〜13cmでほぼ同じ大きさの群れがいる。10月では南部よりも北部B地点の方が多く、南から北へ移動している。
ヒイラギ：個体数が最も多く9月には363尾捕獲された。体長はA地点が5〜7cm、B地点が7〜9cmで北部の方が大きな個体が群れていた。重量は3.5〜7.0gである。
ウグイ：4月、6月に個体数が多く、4月の体長は12〜23cm、重量は23〜50gであった。
ヌマチチブ：体長の変化は5月が3〜6.5cmで7月が5〜7.5cmと大きくなっている。
オイカワ：7月に多く捕獲され重量は2.5gが多かった。

4 その他の生物
佐鳴湖は放水路が2000年7月に通水して以来、塩分が高くなり浜名湖に生物が侵入しているといわれます。冬には、浜名湖に見られるスジアオノリ、リボンアオサが全域に出現し、海の湾奥部に生息するオオヒライソガニやフジツボの付着もあります。フナムツも全域に生息しています。夏、水深2.0mの湖底に籠沈めておくとテナガエビ、ヌマエビなどがどこでも入ります。
5 水質調査（図4）（1）水温
冬の8℃以下から夏の30℃と変動が大きく、表層と底層の差は小さく、水深が約2.0mと浅いため熱が底層までよく伝わると考えられます。
（2）塩分
2.3〜12％で変動し、7月、8月で低いのは降雨の影響と考えられます。南部の底層で高いのは放水路からの塩水の流入のためです。
10％は浜名湖北部と同じ値で、佐鳴湖の塩分が高くなっていることを示しています。

（3）溶存酸素
一年を通し豊富にあり表層は過飽和状態です。6月の底層は表層に比べると少ないが貧酸素水は形成していません。酸素飽和度は最も少ない底層で50％あり、魚類の生存には影響ありません。
（4）クロロフィルa
一年を通し100を越えることが多く、植物プランクトンの増殖が年間を通し活発であることを示します。4月、6月は特に多く、底層でも高く全層で増殖が活発です。植物プ
ランクトンは夏は藍藻が多く、水色は緑色をし、冬は茶褐色で珪藻、ベン毛藻が優先します。11月上旬は17〜45と他の月に比べて小さく、豊富にあった植物プランクトンが沈降したためです。これは植物プランクトンの交替の時期にあたったためと思われます。
（5）透明度
0.4〜0.5mと低くこれは植物プランクトンのためです。11月の透明度が0.78mと最も高くこの程度の値は年間を通してもめったにありません。昭和32年のデータによると湖心で1.0mあり、2003年の11月は当時に近く水の外観になっていたと思われます。

6

まとめ
佐鳴湖は富栄養化が進んでいますが、多種類の海水魚、淡水魚が生息し、魚類の生息に悪影響があるとは考えられません。植物プランクトンや礫に付着する藻類が多いため、それをエサとする魚が多く、酸素不足にはならないので底生魚類の生息が困難になることもありません。佐鳴湖は日本一汚いといわれますが、植物プランクトンが豊富で多くの魚が生息する湖といった方が、佐鳴湖の現状にはあっています。佐鳴湖は汚いというイメージを変えていく必要があると思います。
7 今後の課題（1）魚類の胃の内容物を調べ食性を調べる。
（2）湖内の他地点で同様な調査をする。
8

参考文献
原色日本淡水魚類図鑑、原色日本海水魚類図鑑

─ 98 ─

〈〉9

Native-PAGE法による絶滅危惧植物分類の試み

同一の生体内で同じ生体反応の触媒となる異なる酵素が存在することが知られている。そのアイソザイムは種によって固有な分布をしているため、電気泳動で分離することによりアイソザイムを比較することで、植物種の分類ができる。
酵素分子の帯電の様子は溶液のpHによって変わり、酸性側では正、アルカリ性側では負に帯電する。電気泳動においては、酵素分子の立体形、帯電の程度によって酵素分子を固有の速さで移動させるため、泳動する速さの違いによってアイソザイムを分離することができる。泳動の媒質としてはポリアクリルアミド・ゲル（Poly-AcrlamideGel)を用いた。電気泳動（ElectropHoresis)の方法としては、一般に良く用いられている、強く変性させたタンパク質を用いるSDS-PAGE法での検出が容易で精密であり、分子量さえ測定可能である。
しかしながら、この方法をタンパク質混合物に2 研究の目的適用すると、目的の酵素がどのスポットに対応
野外での絶滅危惧植物の調査において、形態的するのか、の確認が難しい。今回の研究ではタ特徴による種の同定方法はもちろん、それに加えンパク質を未変性（Native)のまま分離し、活性て形態の比較以外の方法でも植物の同定を可能に染色法を用いて特定の酵素のみを検出するし、さらにそれらの植物の分類を確定したい。こNative-PAGE法を利用することにした。
れが可能になれば、絶滅危惧植物とわからないた
めに開発の波に呑まれて絶滅に追いやられていく、 （1）実験方法
以下の実験捜査で用いる器具は、使用に際多くの水草を絶滅の危機から救っていくことがでして可能な限り95％エタノールを含ませたペきるようになる。
ーパータオルで拭いてから使用した。また、保存容器の多くは光を避けるため褐色瓶を利3 研究の方法用し、予め水道水・イオン交換水で洗浄した植物種の同定では、一般に DNA分子の塩基配後、オートクレーブで殺菌した。使用した薬列を比較するのがもっとも厳密な方法と考えられ品は、生化学グレード、あるいは電気泳動用
るが、高校に備えられた実験設備、高校生の実験と明記されたものを用いたが、その多くは、技術を考えてみれば、実行することは困難である。
電気泳動実験で多用されているSigma-Aldorich
このため、DNA情報が反映されている様々な形質社の製品である。薬品による被害を避けるたを比較する方法によることにした。ここでは東京めと、試料のタンパク質汚染を防止するため、都環境研の研究者の示唆により、酵素電気泳動法操作するときには必ずポリエチレン製の使いでアイソザイムを分離し、酵素の多型を比較する捨て手袋、またはゴム手袋を着用した。
方法を利用することにした。
ア pHを実験中一定に保つため、電気泳動
酵素の主成分はタンパク質であり、酵素分子の実験でよく用いられている、以下の10数種
科学構造はDNAの情報により決まってしまう。ほ類のトリス塩酸系の緩衝液などをつくり、とんどすべての酵素にはアイソザイムと呼ばれる、

1 はじめに
本校生物部では、絶滅危惧植物の保護を目標に掲げ、絶滅危惧植物の詳しい分布状況や、生育環境の調査を実施してきた。しかし、絶滅危惧種に指定されている植物には分類学的研究が遅れているものが多く、特に水生植物は一般に形態学的変異が陸生植物よりも大きいため、野外で植物調査にあたる時に花が咲く時期を外してしまうと植物種の同定が難しい、ということをいつも感じていた。そうした中で、東京都立環境科学研究所の科学者の方の論文に、形態的特徴以外の方法でも植物、しかも我々が以前から調べてきたミクリ類の分類が可能である、ということが報告されているのを見つけ、この方法に基づいた研究を試み、その可能性を確信できる結果を得たので報告する。

─ 99 ─

冷蔵庫内で4℃程度に保って保管する。以下、体積モル濃度（mol/l)の単位をMと略記することにして、主な水溶液を紹介する。
①［すり潰し用緩衝液］②4倍濃度の濃縮［stacking］ゲルb u f f e r (5 0 ml)③［アクリルアミド・ゲル調整用の保存溶液］
A 1M HC148ml
Trizmabase
36.6g
TEMED
0.23ml
イオン交換水を加えて100mlにする。
B 1M HC148ml
Trizmabase
5.98g
イオン交換水を加えて100mlにする。
C アクリルアミド
29.2g
BIS0.8g
イオン交換水を加えて100mlにする。
F 電極槽緩衝液
Trizmabase
6.0g
グリシン
28.8g
イオン交換水を加えて1000mlにする。
（pH8.3となっているはずである）
G 過硫酸アンモニウム
0.14g
イオン交換水を加えて100mlにする。
（使用直前に調製することが望ましい）
G' 10％過硫酸アンモニウム水溶液過硫酸アンモニウム１gにイオン交換水9mlを加える。使用直前に調製することが望ましい。
④電極バッファー（1000ml)
貯液槽［reservoir］bufferともいう⑤［アミノペプチダーゼ緩衝溶液 pH4.3］⑥［リン酸緩衝液（0.2M P H o s p H a t e
b u f f e r p H 7 .5 ) ］⑦［0.1M Tris-HCI pH8.0］⑧［0.2M Tris-HCI pH8.0］⑨［0.1M Tris-HCI pH7.0］⑩［0.2M L-アスパラギン酸L-Asparticacid］⑪［2M KOH］⑫［4.0％ L-Ieucyl-B-napHthylamide水溶液］⑬［1M DL-リンゴ酸水溶液］⑭［2M NaOH］⑮［1.0％塩化マグネシウム Magnesium
chloride 6水和物］⑯［0.1％マーカー色素（BPB)液］⑰［0.2M Tris-0.2M Maleate,pH3.8］⑱［NAD混液］
褐色ビンに入れ、冷蔵保存する⑲［NADP混液］
褐色ビンに入れ、冷蔵保存する
イ 可能な限り若くて新鮮な芽を採集し、すり潰し緩衝液を加えて氷冷状態ですり潰す。
［実験で使用した植物］①ミクリ科植物・ミクリ（準絶滅危惧）・オオミクリ（準絶滅危惧）・ナガエミクリ（準絶滅危惧）
・ヤマトミクリ（絶滅危惧種Ⅱ類）②ゴマノハグサ科植物・カワヂシャ（準絶滅危惧）・オオカワヂシャ
・イヌノフグリ（絶滅危惧Ⅱ類）
・タチイヌノフグリ
・フラサバソウ③ガマ科植物・ガマ・コガマ・ヒメガマ④ミズアオイ科植物・ミズアオイ・コナギ⑤ミズワラビ科植物
・ミズワラビ
試料のホモジェネートにはタンパク質を分解する酵素、プロテアーゼが含まれているため、実験中は氷冷するか、冷蔵庫に入れるなどして5℃以下に保つ。−20℃以下（急速冷凍）に保たないと、翌日以降の実験では酵素の活性が極端に低下する。
ウ すり潰した試料を冷蔵庫で冷却しながら遠心分離する。分離された試料のうわずみ
液15〜30μlを電気泳動に用い、残りは氷冷保存する。
エ ポリアクリルアミド・ゲルを作製する。
① 専用のゲル作製器を２台組み立てる。
② 分離ゲルを注入する。
空気に触れていると凝固しないので、ゲル上部に静かにイオン交換水を入れる。

─ 100 ─

凝固するまで１時間以上待つ。凝固が完了したら、上層の水を捨てる。
③ 濃縮ゲルを注入する。
注入したら試料を入れる溝を作るための櫛を挿入する。濃縮ゲルはすぐに凝固するので、櫛を入れる操作は速やかに行う。再び１時間待ってゲルが完全に凝固した後、櫛を注意深く外し、電解槽バッ
ファーで２〜３回溝を濯ぐ。その後染料マーカーと試料をマイクロピペットで注入する。ウェルと呼ばれる溝に注入したばかりの試料にはまだ１cm程度の幅があり、このままでは明瞭なバンドの分離ができない。そこで、二層になっているゲルのうち上部にある濃縮（stacking)ゲルは、下部にある分離ゲルに入る直前までに試料を細いバンド状に圧縮して、分離が鮮やかになるようにする。タンパク質は常にマイナスに帯電しているので、正極である下部に引き寄せられるようにして、それぞれの酵素固有の速度で下方に移動する。
オ ポリアクリルミド・ゲルを電気泳動槽へ入れる。電気泳動槽にゲル２枚をセットした後、泳動槽用緩衝液を注入し、冷蔵庫に入れて冷やしながら通電を開始する。濃縮
ゲル中では１枚あたり定電流10mAで約１時間30分、分離ゲル中では20mAで約１時間電気泳動を行い、泳動の先端が下端近くまで来たら泳動を終了する。
カ 泳動槽からゲル板を取り出す。ゲルを活性染色液に入れ、適度に発色するまで恒温槽中で揺り動かす。温度は恒温槽の中で37℃に保つ。光で分解してしまう色素が多いため、なるべく暗くして染色する。発色してバンドが現れたら、停止液と定着液に浸け、記録した後保存する。
（2）同定に利用した酵素群と活性染色液
ア GOT（グルタミン酸オキサロ酢酸アミノ基転移酵素）
イ LAP（ロイシンアミノペプチダーゼ）
ウ SKDH（シキミ酸デヒドロゲナーゼ）
エ ADH（アルコール脱水素酵素）
オ LDH（乳酸脱水素酵素）
カ MDH（リンゴ酸脱水素酵素）

キG6PDH（グルコース―6―リン酸 デヒドロゲナーゼ）
ク FDH（ギ酸デヒドロゲナーゼ）
ケ GDH（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）

4 結果と考察
電気泳動に用いた試料の濃さの違いなどによって、発色の程度や分離の度合いが異なるゲルが得られた。昨年度に実施した予備的な電気泳動実験の結果（2002夏）をも加味して、以下各酵素ごとに結果を示し、考察を加えていく。
染色されたバンドの分析は、通常泳動比（Rm値）でなされる。
Rm＝（基線からあるスポットまでの距離）／（基線から泳動フロントまでの距離）（1）GOT 今回の実験で得られたGOT染色されたゲルを、写真.１に示す。ここで、今回得られた泳動ゲルのレーン番号と用いた試料との対応は、図．A〜図．Cの通りであるが、このレ−ン番号については、以下に示す写真でも全て共通である。

図．A 2002年夏実験のレ−ン番号と植物対応

図．B 2003年春実験のレ−ン番号と植物対応

図．C 2003年夏実験のレーン番号と植物対応

─ 101 ─ミクリ類のGOTスポットについて、易動度に変換して示したものが図．Dである、この図において、ミクリGOTIのf(＝fast)バンド

冷蔵庫内で4℃程度に保って保管する。以下、体積モル濃度（mol/l)の単位をMと略記することにして、主な水溶液を紹介する。
①［すり潰し用緩衝液］②4倍濃度の濃縮［stacking］ゲルb u f f e r (5 0 ml)③［アクリルアミド・ゲル調整用の保存溶液］
A 1M HC148ml
Trizmabase
36.6g
TEMED
0.23ml
イオン交換水を加えて100mlにする。
B 1M HC148ml
Trizmabase
5.98g
イオン交換水を加えて100mlにする。
C アクリルアミド
29.2g
BIS0.8g
イオン交換水を加えて100mlにする。
F 電極槽緩衝液
Trizmabase
6.0g
グリシン
28.8g
イオン交換水を加えて1000mlにする。
（pH8.3となっているはずである）
G 過硫酸アンモニウム
0.14g
イオン交換水を加えて100mlにする。
（使用直前に調製することが望ましい）
G' 10％過硫酸アンモニウム水溶液過硫酸アンモニウム１gにイオン交換水9mlを加える。使用直前に調製することが望ましい。
④電極バッファー（1000ml)
貯液槽［reservoir］bufferともいう⑤［アミノペプチダーゼ緩衝溶液 pH4.3］⑥［リン酸緩衝液（0.2M P H o s p H a t eb u f f e r p H 7 .5 ) ］⑦［0.1M Tris-HCI pH8.0］⑧［0.2M Tris-HCI pH8.0］⑨［0.1M Tris-HCI pH7.0］⑩［0.2M L-アスパラギン酸L-Asparticacid］⑪［2M KOH］⑫［4.0％ L-Ieucyl-B-napHthylamide水溶液］⑬［1M DL-リンゴ酸水溶液］⑭［2M NaOH］⑮［1.0％塩化マグネシウム Magnesium
chloride 6水和物］⑯［0.1％マーカー色素（BPB)液］⑰［0.2M Tris-0.2M Maleate,pH3.8］⑱［NAD混液］
褐色ビンに入れ、冷蔵保存する⑲［NADP混液］
褐色ビンに入れ、冷蔵保存する
イ 可能な限り若くて新鮮な芽を採集し、すり潰し緩衝液を加えて氷冷状態ですり潰す。
［実験で使用した植物］①ミクリ科植物・ミクリ（準絶滅危惧）・オオミクリ（準絶滅危惧）・ナガエミクリ（準絶滅危惧）
・ヤマトミクリ（絶滅危惧種Ⅱ類）②ゴマノハグサ科植物・カワヂシャ（準絶滅危惧）・オオカワヂシャ
・イヌノフグリ（絶滅危惧Ⅱ類）
・タチイヌノフグリ
・フラサバソウ③ガマ科植物
・ガマ
・コガマ
・ヒメガマ
④ミズアオイ科植物・ミズアオイ・コナギ⑤ミズワラビ科植物
・ミズワラビ
試料のホモジェネートにはタンパク質を分解する酵素、プロテアーゼが含まれているため、実験中は氷冷するか、冷蔵庫に入れるなどして5℃以下に保つ。−20℃以下（急速冷凍）に保たないと、翌日以降の実験では酵素の活性が極端に低下する。
ウ すり潰した試料を冷蔵庫で冷却しながら遠心分離する。分離された試料のうわずみ液15〜30μlを電気泳動に用い、残りは氷冷保存する。
エ ポリアクリルアミド・ゲルを作製する。
① 専用のゲル作製器を２台組み立てる。
② 分離ゲルを注入する。
空気に触れていると凝固しないので、ゲル上部に静かにイオン交換水を入れる。

─ 100 ─

凝固するまで１時間以上待つ。凝固が完了したら、上層の水を捨てる。
③ 濃縮ゲルを注入する。
注入したら試料を入れる溝を作るための櫛を挿入する。濃縮ゲルはすぐに凝固するので、櫛を入れる操作は速やかに行う。再び１時間待ってゲルが完全に凝固した後、櫛を注意深く外し、電解槽バッファーで２〜３回溝を濯ぐ。その後染料マーカーと試料をマイクロピペットで注入する。ウェルと呼ばれる溝に注入したばかりの試料にはまだ１cm程度の幅があり、このままでは明瞭なバンドの分離ができない。そこで、二層になっているゲルのうち上部にある濃縮（stacking)ゲルは、下部にある分離ゲルに入る直前までに試料を細いバンド状に圧縮して、分離が鮮やかになるようにする。タンパク質は常にマイナスに帯電しているので、正極である下部に引き寄せられるようにして、それぞれの酵素固有の速度で下方に移動する。
オ ポリアクリルミド・ゲルを電気泳動槽へ入れる。電気泳動槽にゲル２枚をセットした後、泳動槽用緩衝液を注入し、冷蔵庫に入れて冷やしながら通電を開始する。濃縮
ゲル中では１枚あたり定電流10mAで約１時間30分、分離ゲル中では20mAで約１時間電気泳動を行い、泳動の先端が下端近くまで来たら泳動を終了する。
カ 泳動槽からゲル板を取り出す。ゲルを活性染色液に入れ、適度に発色するまで恒温槽中で揺り動かす。温度は恒温槽の中で37℃に保つ。光で分解してしまう色素が多いため、なるべく暗くして染色する。発色してバンドが現れたら、停止液と定着液に浸け、記録した後保存する。
（2）同定に利用した酵素群と活性染色液
ア GOT（グルタミン酸オキサロ酢酸アミノ基転移酵素）
イ LAP（ロイシンアミノペプチダーゼ）
ウ SKDH（シキミ酸デヒドロゲナーゼ）
エ ADH（アルコール脱水素酵素）
オ LDH（乳酸脱水素酵素）
カ MDH（リンゴ酸脱水素酵素）

キG6PDH（グルコース―6―リン酸 デヒドロゲナーゼ）
ク FDH（ギ酸デヒドロゲナーゼ）
ケ GDH（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）

4 結果と考察
電気泳動に用いた試料の濃さの違いなどによって、発色の程度や分離の度合いが異なるゲルが得られた。昨年度に実施した予備的な電気泳動実験の結果（2002夏）をも加味して、以下各酵素ごとに結果を示し、考察を加えていく。
染色されたバンドの分析は、通常泳動比（Rm値）でなされる。
Rm＝（基線からあるスポットまでの距離）／（基線から泳動フロントまでの距離）（1）GOT 今回の実験で得られたGOT染色されたゲルを、写真.１に示す。ここで、今回得られた泳動ゲルのレーン番号と用いた試料との対応は、図．A〜図．Cの通りであるが、このレ−ン番号については、以下に示す写真でも全て共通である。

図．A 2002年夏実験のレ−ン番号と植物対応

図．B 2003年春実験のレ−ン番号と植物対応

図．C 2003年夏実験のレーン番号と植物対応

─ 101 ─ミクリ類のGOTスポットについて、易動度に変換して示したものが図．Dである、この図において、ミクリGOTIのf(＝fast)バンドが再現性良く染色できるので、アイソザイムバンドの基準（e易動度100）とした。また、GOT２はこれらの植物では１種しか確認できないが、ここでもミクリのGOT２を基準とした。
GOT１やGOT２の分子は植物の種によって少しずつ異なり、形態的に良く似ているミク
リとオオミクリ、あるいはナガエミクリとヤマトミクリのアイソザイム分布は、互いによく似ているが、この２グループ間、あるいはこの２グループと形態的にも遠く隔たった他の植物との間には、分布の差が大きく表れる。

（2）ADH
ADHについては、数回染色を試みたが、きれいな泳動スポットを得られたのは１回のみであった。
今回の実験で得られたADH染色されたゲルを写真．
２に示す。

slow−S型バンドの2種類が確認されたが、ADH2についてはアロザイムの存在は確認できなかった。

LAPにいては、染色時にゲルのバックグラ
ンドが強く、活性染色が難しかったが、2003
年夏実験では、少しずつスポットが現れ始めた。

写真．3 今夏のMDH（3）MDH
MDHについては、常に染色に成功してきた。
MDHは複雑なバンド構造を持つゲルが何枚も得られている。これらのゲルを写真・3に示す。
種により、かなりバンドパターンに差が認められる。今回の植物については、MDHバンド構造が複雑すぎて、GOTほどはっきりとバンドが分析できなたが、染色には成功しており、分離できる可能性がかなり高いので、実験方法を改善して分離ができるようにしていきたい。
（4）SKDHSKDHについては、１種類、アロザイムにF型とＳ型が存在しているようである。
（写真．
4）易動度の解析例を図．Fに示す。

写真．2 今春のADH
これらの泳動スポットを移動度で表したもの
が図．Eである。
ADH1に関しては、ミ図．E ミクリ類などのADH分布
クリ・オオ
ミクリのような移動度の大きいfast−F型バンドと、ヤマトミクリ・ナガエミクリのような移動の遅い（5）GDH
GDH2は、泳動距離が短いため十分に分離できなか
図.F ミクリ類のSkDHったが、１種類のみしか確認できない。GDH1も不十分ではあるが２種類以上確認できた。
（6）LAP─ 102 ─（4）形態的特徴の比較、核型分析、アイソザイム分析などを総合して、絶滅危惧植物の同定・分類を確実にできるようにする。

（7）G６PDH、FDH、LDH
G６PDH、FDH、LDHではなかなか染色がうまくいかなかった。これらの酵素については、まず、確実に染色できるように実験条件を工夫していきたい。
（8）結果のまとめ
アイソザイムはNative−PAGE法で分離でき、その変異は形態的に差があればあるほど大きいということが明らかになった。また、酵素の種類によりアイソザイム変異の程度が異なるため、いくつかの酵素を総合して比較を行えば、より確実に分類や同定ができることも確認できた。

5 実験の感想と今後の課題
進んだ内容の実験であり、生物の授業で学んだ実験方法を実際に行って確認することができた。
実験では危険な薬品も使用していて、常に手袋を着用しながら慎重に行わなければならなかった。
使用した酵素は実験条件にきわめて繊細な影響を受けるため、少しのことで実験結果に差がでてしまうこともあった。また、一回の実験に長い時間がかかり途中で止めることができず、長期休暇中にしかできないため、少ししか実験ができなかった。この実験では、生命科学の研究でよく用いられる実験手段を用いており、今後生物を学んでいく上で発展性が見込める実験、という印象を受けた。
これからの課題として、以下のようなものが挙げられる。
（1）実験方法に習熟し、活性染色法を改良することにより、精度の高い検出法を見つける。
（2）今回の実験では分離が難しかったMDHやGDHのバンドがうまく分離できる実験条件の検討。
（3）うまく分離できて、危惧種をはっきりと分類できる酵素を選別する。

─ 103 ─が再現性良く染色できるので、アイソザイムバンドの基準（e易動度100）とした。また、GOT
２はこれらの植物では１種しか確認できないが、ここでもミクリのGOT２を基準とした。
GOT１やGOT２の分子は植物の種によって少しずつ異なり、形態的に良く似ているミク
リとオオミクリ、あるいはナガエミクリとヤマトミクリのアイソザイム分布は、互いによく似ているが、この２グループ間、あるいはこの２グループと形態的にも遠く隔たった他の植物との間には、分布の差が大きく表れる。

（2）ADH
ADHについては、数回染色を試みたが、きれいな泳動スポットを得られたのは１回のみであった。
今回の実験
で得られた
ADH染色されたゲルを写真．
２に示す。

slow−S型バンドの2種類が確認されたが、ADH2についてはアロザイムの存在は確認できなかった。

LAPにいては、染色時にゲルのバックグランドが強く、活性染色が難しかったが、2003
年夏実験では、少しずつスポットが現れ始めた。

写真．3 今夏のMDH（3）MDH
MDHについては、常に染色に成功してきた。
MDHは複雑なバンド構造を持つゲルが何枚も得られている。これらのゲルを写真・3に示す。
種により、かなりバンドパターンに差が認められる。今回の植物については、MDHバンド構造が複雑すぎて、GOTほどはっきりとバンドが分析できなたが、染色には成功しており、分離できる可能性がかなり高いので、実験方法を改善して分離ができるようにしていきたい。
（4）SKDHSKDHについては、１種類、アロザイムにF型とＳ型が存在しているようである。
（写真．
4）易動度の解析例を図．Fに示す。

写真．2 今春のADH
これらの泳動スポットを移動度で表したものが図．Eである。
ADH1に関しては、ミ図．E ミクリ類などのADH分布
クリ・オオミクリのような移動度の大きいfast−F型バンドと、ヤマトミクリ・ナガエミクリのような移動の遅い（5）GDH
GDH2は、泳動距離が短いため十分に分離できなか
図.F ミクリ類のSkDHったが、１種類のみしか確認できない。GDH1も不十分ではあるが２種類以上確認できた。
（6）LAP─ 102 ─（4）形態的特徴の比較、核型分析、アイソザイム分析などを総合して、絶滅危惧植物の同定・分類を確実にできるようにする。

（7）G６PDH、FDH、LDH
G６PDH、FDH、LDHではなかなか染色がうまくいかなかった。これらの酵素については、まず、確実に染色できるように実験条件を工夫していきたい。
（8）結果のまとめ
アイソザイムはNative−PAGE法で分離でき、その変異は形態的に差があればあるほど大きいということが明らかになった。また、酵素の種類によりアイソザイム変異の程度が異なるため、いくつかの酵素を総合して比較を行えば、より確実に分類や同定ができることも確認できた。

5 実験の感想と今後の課題進んだ内容の実験であり、生物の授業で学んだ実験方法を実際に行って確認することができた。
実験では危険な薬品も使用していて、常に手袋を着用しながら慎重に行わなければならなかった。
使用した酵素は実験条件にきわめて繊細な影響を受けるため、少しのことで実験結果に差がでてしまうこともあった。また、一回の実験に長い時間がかかり途中で止めることができず、長期休暇中にしかできないため、少ししか実験ができなかった。この実験では、生命科学の研究でよく用いられる実験手段を用いており、今後生物を学んでいく上で発展性が見込める実験、という印象を受けた。
これからの課題として、以下のようなものが挙げられる。
（1）実験方法に習熟し、活性染色法を改良することにより、精度の高い検出法を見つける。
（2）今回の実験では分離が難しかったMDHやGDHのバンドがうまく分離できる実験条件の検討。
（3）うまく分離できて、危惧種をはっきりと分類できる酵素を選別する。

─ 103 ─