生理活性反応測定装置(Micro Bioactivity Analyzer)

AMIS-101 データ集

株式会社

バイオエックス

2008 年 10 月

生理活性反応測定装置(Micro Bioactivity Analyzer) AMIS-101 は複雑な発光・発色反応を伴うことなく、酵素反応などの生理活性反応をシンプルに、リアルタイムでの定量測定が可能です。
数マイクロリットルの微量での測定が可能であり、収量の少ないタンパクの代謝機能の解析に威力を発揮します。
当データ集は本測定装置の基本性能を示すために測定例としてまとめたものですが、下記の一覧表に示す通り、幅広い範囲での応用が可能であることがわかります。

基質酵素
グルコース
Glucose Oxidase
グルコース
Glucose Dehydrogenase
Glycerol Kinase +グリセロールGlycerophosphate Oxidase
エタノール
Alcohol Dehydrogenase
ホルムアルデヒド
Formaldehyde Dehydrogenase
アセトアルデヒド
Aldehydel Dehydrogenase
ＡＴＰ
Alkaline Phosphatase
尿素Urease
クレアチニンCreatinine Deiminase
オリーブ油Lipoprotein Lipase
リノール酸コレステロール Cholesterol Esterase
DL-BAPNATripsin

酵素検出感度
補酵素 基質検出感度(20µl中の絶対検出対象
ページ(µM)量)10µg/ml
0.5µg/ml 過酸化水素＋グルコン酸2(55µM)(1ng)
20µg/mlNAD
プロトン
3(111µM)
1.
5µg/mlATP
過酸化水素
4(16µM)
10µg/mlNAD
プロトン
5(217µM)
0.3µg/mlNAD
プロトン＋蟻酸
6(10µM)
5ng/mlNAD
プロトン＋酢酸7(0.1µM)
5µg/ml0.1unit/ml リン酸8(10µM)(0.002unit）
2µg/ml
アンモニア
9(33µM)
1µg/ml1μg/ml アンモニア10(8.8µM)(2ng)
100µg/ml
オレイン酸
11200µg/ml
リノール酸
12(300µM)
60µg/ml
アルギニンカルボン酸
13なお、当データ集に示すプロトコルはすべて精製された試薬ベースのものであり、実際のサンプルでの測定に際しては精製など各サンプルの状態に応じた前処理と試薬の設計が必要となります。具体的なプロトコルの構築に関しましてはご相談下さい。

11.

グルコース（その１）
酵素：Glucoseoxidase
基質：Glucose
Buffer：1mM Tris-HCl pH6.8 50ｍM NaCl
反応機構
Glucoseoxidase

β-D-Glucose + O2 + H2O

δD-Glucono- -lactone + H2O2

方法：①酵素 Glucoseoxidase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した。
②基質 Glucose を Buffer にて所定の濃度に溶解した。
③センサーA、B に①の酵素溶液を 18 マイクロリットル投入した④AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に②の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。

OutputAnalytical Curve (Linear)

100mg/dl
050mg/dl
5010025mg/dl
150

20010mg/dl
2500300

00-0.02-10-0.04

V2040

60

-20-0.06
-0.08

-30

-0.1

-40

-0.12

-50

-0.14mg/dl

Sec.

280

1001202.

グルコース（その２）酵素：Glucosedehydrogenase
補酵素：NAD
基質：Glucose
Buffer：1mM PBS-KOH pH7.0 100ｍM NaCl
反応機構
β-D-Glucose + NAD

Glucose Dehydrogenase+

D-Glucose-δ-lactone + NADH + H+

方法：①酵素 Glucosedehydrogenase を Buffer にて 1.4mg/ml に溶解した②補酵素 NAD を Buffer にて 3.5mg/ml に溶解した③基質 Glucose を Buffer にて所定の濃度に溶解した④センサーA、B に①の酵素溶液を 9 マイクロリットル投入した⑤センサーA、B に②の補酵素溶液を 9 マイクロリットル投入した⑥AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に③の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑦（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。

OutputAnalytical Curve (End Point)

200
0100
5040100150

20100200250

300

0.0-0.2-0.4V-0.6-0.8-1.0

00-100-200-300
Vm-400-500-600-700-800-900

50100150y = -4.0385x + 11.039
2
R = 0.9975
mg/dl

Sec.

3200250

3．グリセロール
酵素：Glycerol Kinase, Glycerol Phosphate Oxidase
基質：Glycerol
Buffer：1mM ATP-NaOH pH7.0
反応機構
Glycerol Kinase

Glycerol + ATP

Glycerophosphate Oxidase

Glycerol-3-phosphate +O2

Dihydroxyacetonephosphate+ H2O2

方法：①酵素 Glycerol Kinase (酵素１)を Buffer にて 0.2ｍg/ml g/ml に溶解した②酵素 Glycerophosphate Oxidase（酵素２）を Buffer にて 0.2ｍg/ml に溶解した。
③基質 Glycerol を Buffer にて所定の濃度に溶解した④センサーA、B に①の酵素１溶液を 9 マイクロリットル投入した⑤センサーA、B に②の酵素２溶液を 9 マイクロリットル投入した⑥AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に③の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑦（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。

OutputAnalytical Curve (End Point)

1.6mg
0100

200

3.2mg
300

6.5mg
400

500

600

0.00

0-0.0200.20.4-20-0.04-40V-0.06

Vm -60-80

-0.08
-0.10

-100-0.12-120SEC-140mg/dl

40.60.8

4．エタノール
酵素：Alcohol Dehydrogenase
補酵素：NAD
基質：Ethanol
Buffer：1mM K-PBS pH7.0 NaCl 50mM
反応機構
Alcohol Dehydrogenase
Ethanol + NAD+

Acetoaldehyde + NADH + H+

方法：①酵素 Alcohol Dehydrogenase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した②補酵素 NAD を Buffer にて 1.8mg/ml に溶解した。
③基質 Ethanol を Buffer にて所定の濃度に溶解した④センサーA、B に①の酵素溶液を 9 マイクロリットル投入した⑤センサーA、B に②の補酵素溶液を 9 マイクロリットル投入した⑥AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に③の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑦（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。

Output200

1500V

Analytical Curve (End Point)

100
100

50200

25030000-0.1-100-0.2Vm

50

100

150-200-300-0.3-0.4-400-0.5-500g/l

Sec.

5200

250

５．ホルムアルデヒド
酵素：Formaldehyde Dehydrogenase
補酵素：NAD
基質：Formaldehyde
Buffer：1mM Tris-HCl pH8.5
反応機構
Formaldehyde Dehydrogenase+Formaldehyde + NADFormic Acid + NADH + H+

方法：①酵素 Formaldehide Dehydrogenase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した②補酵素 NAD を Buffer にて 1.8mg/ml に溶解した。
③基質 Formaldehyde を Buffer にて所定の濃度に溶解した④センサーA、B に①の酵素溶液を 9 マイクロリットル投入した⑤センサーA、B に②の補酵素溶液を 9 マイクロリットル投入した⑥AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に③の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑦（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。

Output

0.5mM0-10-20-30
Vm-40-50-60-70-80

Analytical Curve (Linear)

0.2mM
020.1mM
460.05mM8100.01mM
120.0

0.1

0.2

0.3

0.40-2-4-6-8-10-12-14Formaldehyde mM

min60.50.6

6．アセトアルデヒド
酵素：Aldehyde Dehydrogenase
補酵素：NAD
基質：Acetaldehyde
Buffer：1mM K-PBS pH7.0
反応機構
Aldehyde Dehydrogenase
Acetaldehyde + NAD+

Acetic Acid + NADH + H+

方法：①酵素 Aldehide Dehydrogenase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した②補酵素 NAD を Buffer にて 1.8mg/ml に溶解した。
③基質 Acetaldehyde を Buffer にて所定の濃度に溶解した④センサーA、B に①の酵素溶液を 7.5 マイクロリットル投入した⑤センサーA、B に②の補酵素溶液を 7.5 マイクロリットル投入した⑥AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に③の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 5μリットル加えて測定した。
⑦（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。

Output30

Analytical Curve (End Point)2

10.50.3

100200300

40000.1

0-50-100-150
Vm-200-250-300
-350
-400
-450

0.0-0.1

V-0.2
-0.3
-0.4
Sec.

1

2

y = -101.89x + 1.9694
R2 = 0.9952
g/l

734

7．ATP(アデノシン三燐酸)酵素：Alkaline Phosphatase
基質：ATP(Li)
Buffer：10mM Mops-Tris pH7.4 2mM MgCl
反応機構

2

Alkaline Phosphatase
ATPADP,AMP + PiMgCl2

方法：①酵素 Alkaline Phosphatase を Buffer にて 60u/ml に溶解した②基質 ATP Li 塩を Buffer にて所定の濃度に溶解した③センサーA、B に①の酵素溶液を 18 マイクロリットル投入した④AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に②の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。

Output5.2mM

Analytical Curve (Linear)

3mM
52mM

1mM

1mM(2)

0.5mM

0.2mM

10152025

30012

30.00-5-10-15-20
Vm-25-30-35-40-45-50-0.5-1.0-1.5-2.0-2.5-3.0min

8ATP (mM)456８．尿素
酵素：Urease基質：UreaBuffer：1mM Tris-HCl pH8.0 50mM KCl
反応機構
Urease(NH2)2CO + H2O + 2H++2NH4 + CO2

方法：①酵素 Urease を Buffer にて 0.075mg/ml に溶解した②基質 Urea を Buffer にて所定の濃度に溶解した③センサーA、B に①の酵素溶液を 15 マイクロリットル投入した④AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に②の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 5μリットル加えて測定した。
⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。

Output10mg/dl

Analytical Curve (End Point)

8mg/dl

5mg/dl

3mg/dl

2mg/dl
500
450
400
350
300
Vm250
200
150
100
5000.50.40.3

V 0.20.10-0.1050100150

y = 42.613x + 7.5385
R2 = 0.9981

0Sec.

9246mg/dl

81012９．クレアチニン
酵素：Creatinine Deiminase
基質：Creatinine
Buffer：1mM Tris-HCl pH7.5 50mM NaCl
反応機構
Creatinine Deiminase++Creatinine + H2O + H

N-Methylhydrantoin + NH4

方法：①酵素 Creatinine Deiminase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した②基質 Creatinine を Buffer にて所定の濃度に溶解した③センサーA、B に①の酵素溶液を 18 マイクロリットル投入した⑤AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に②の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。

Output0.12

Analytical Curve (End Point)

10mg/dl7mg/dl

5mg/dl

3mg/dl

1mg/dl500.10400.0830V 0.06

200.04y = 4.2517x - 0.0238
R2 = 0.9977

100.0200.00
0100

200300Sec.

1002

46mg/dl

8101210．オリーブ油
酵素：Lipoprotein Lipase
基質：Olive Oil
Buffer：5mM K-PBS pH7.0
反応機構
Lipoprotein Lipase によるオリーブ油の加水分解の結果生じるオレイン酸を検出
方法：①酵素 Lipprotein Lipase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した②基質オリーブ油を Buffer にて所定の濃度に溶解し、超音波処理を行った。
③センサーA、B に①の酵素溶液を 18 マイクロリットル投入した④AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に②の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。

OutputAnalytical Curve (Linear)

10mg/ml
0.5mg/ml
05mg/ml
0.1mg/ml
1001mg/ml
200

00204060

0-0.005-2-0.01-0.02

50 -4-E
X -6-0.025-8

V -0.015

-0.03

-10

sec.

11mg/ml80

10012011．リノール酸コレステロール
酵素：Cholesterol Esterase
基質：Cholestryl Linoreate
Buffer：1mM Tris-HCl pH7.5
反応機構
Cholesterol Esterase による Cholestryl Linoreate 分解反応の結果生じるリノール酸を検出
方法：①酵素 Cholesterol Esterase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した②基質 Cholestryl Linoreate を IPA に溶解し Buffer にて所定の濃度に希釈し、過熱して IPA を蒸発させた後超音波処理を行った。
③センサーA、B に①の酵素溶液を 18 マイクロリットル投入した④AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に②の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。

Output300mg/dl
0.00
-0.01
-0.02
-0.03
-0.04
V
-0.05
-0.06
-0.07
-0.08
-0.09

0

Analytical Curve (Linear)

200mg/dl
50100mg/dl
100

15050mg/dl
20010mg/dl

250

300

0100

200

0.00
-10.00-20.00-30.00y = -0.0914x - 0.1788
2
R = 0.9765-40.00

Sec.

mg/dl

12300

400

12．DL-BAPNA（合成基質）
酵素：Tripsin
基質：Nα-Benzoyl, L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride DL-BAPNA
Buffer：2.5mM Tris-HCl pH8.3
反応機構（酵素 Tripsin）

による 基質 Nα-Benzoyl, L-arginine 4-nitroanilide hydrochlorideをアルギニンカルボン酸を検出
方法：①酵素 Tripsin を Buffer にて 1mg/ml に溶解した。
②基質 DL-BAPNA を Buffer にて所定の濃度に溶解した。
③センサーA、B に②の DL-BAPNA 溶液を 18 マイクロリットル投入した④AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に①の酵素溶液を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。
⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。
（DL-BAPNA）の分解反応の結果生じる

OutputAnalytical Curve (End Point)

0.5
050

0.25
1000.125
1502000.0625250300

00350

00.00

-0.1

-0.10

-0.2

-0.20

V-0.3

V-0.30

-0.4

-0.40

-0.5

-0.50

0.1

0.2

0.3

-0.60

-0.6

mg/ml

SEC

130.4

0.5

0.6

14株式会社バイオエックス〒610-0121
京都府城陽市寺田今堀 121-17
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