卵殻を母体とした分取クロマトグラフィー

慶應義塾大学 理工学部 応用化学科
専任講師 蛭田 勇樹

2021年12月16日

2 2背景高速液体クロマトグラフィー(HPLC)
医薬品、食品分野など様々な分野で分離技術として利用

逆相液体クロマトグラフィー(RPLC) 分配平衡による分離 固定相 : 低極性 ・・・ オクタデシルシリカ (ODS) カラム
 移動相 : 高極性・・・ 水 / メタノール or アセトニトリル

ODSカラムRPLCで最も汎用
多孔性シリカゲル粒子にオクタデシル基が修飾

Advantages

高分離能高い再現性

高耐圧性~100MPa

3 3シリカゲルカラムの問題点
HPLCのためのシリカゲルカラムex.) オクタデシルシリカ (ODS) カラム
 汎用されている逆相カラム◎ 高分離効率


多孔性
高耐圧性
シランカップリング剤による修飾

OCH3O Si O Si C18H37
O
CH33 µm

シリカODS 修飾部位

× 低アルカリ耐性
Si-O-Si結合が低アルカリ耐性→ アルカリ性移動相が使えない
中性以下で塩基性化合物が正電荷を持ち低分離効率
pH>pKa

pH<pKaB⊕B

塩基性化合物

疎水性相互作用・テーリング・分離できない

静電相互作用

B

⊕

O⊝

OSi

OSi

シリカ

OSi

高アルカリ耐性の逆相カラムが求められている

クロマトグラフィーの歴史

4 4

カラムクロマトグラフィーは、チョークの粉末
炭酸カルシウムからスタート◾ アルカリ耐性無機材料◾ 無害で安価アルカリ耐性充填剤への応用可能性
チョークのSEM像
J. Phys. Chem. C, 2017 121(26), 14088-14095

高性能RPLC充填剤にするために◾ 多孔性かつ単分散の粒子◾ ODSのように均一に有機官能基を表面修飾

Mikhail Tswett
From Wikipedia

5 5

炭酸カルシウムからなるバイオミネラル
バイオミネラルは階層構造を持つ

人口的に合成したCaCO3

バイオポリマー

親水性高分子Hierarchicalstructure

CaCO3

生物模倣

人口的な多孔質構造

Biomineral

アラゴナイト
真珠層

サンゴ

カルサイト

バテライト

卵殻

3 µm
Y. Oaki et al., Adv. Funct. Mater., 2006, 16, 1633-1639

 高いアルカリ耐性
 多孔質構造 人体に無毒& 安価

H. Imai et al., Cryst. Growth Des. 2012, 12, 876-882◎高アルカリ耐性充填剤として適した材料

6 6

先行研究
高アルカリ耐性逆相充填剤
ベース充填剤
バテライト CaCO3

多孔性マイクロスフェア

表面修飾

逆相HPLC

両親媒性交互ポリマーによる化学吸着
PMAcO : Poly(maleic acid-alt-1 octadecene) 高アルカリ耐性
 20 nmの多孔質構造
 球状の均一な粒子径

 PMAcOの長鎖アルキル部位→ 逆相クロマトグラフィー ポリマー由来の複数の結合サイト→ 高耐久性20nm CaCO3
ナノクリスタルY. Hiruta et al., J. Mater. Chem. B, 2019, 7, 4771-4777, Anal. Chem. Submitted
特許第6733900号

7 7

充填剤の合成CaCO3粒子の合成
PSS

PSSによる結晶成長のコントロール

PSSの除去スルホン酸

1 M CaCl2 aq

5wt% NaClO

stirring

2h 400 °C

CaCO3 -PSS
ポリスチレン microspheren20 nmCaCO3SO3Na
Mn = 70000 ナノクリスタル

16 mM Na2CO3 aq
1 g/dm3 PSS aq

CaCO3-PSS

BareCaCO3

H. Imai et al., Cryst. Growth Des. 2012, 12, 876-882

CaCO3粒子表面へのPMAcO修飾

2 h, 65 °C

BarePMAcO
CaCO3in THF:Toluene (=2:3)

CaCO3PMAcO
J. Zhang et al., Int. J. Green Nanotechnol. Phys. Chem., 2010, 1, 65–71

8 8

CaCO3-PMAcOの評価
SEM images

pH 10.5, 1200 rpm

pH 10.5, 1100 rpm

pH 11.1 500 rpm

PMAcO修飾前
20 µm

20 µm

20 µm

20 µm

20 µm

20 µm

2.9±0.3 µm

4.4±0.9 µm

5.7±0.8 µm

XRD spectra

Vaterite : ICDD #33-268

Abs. [a.u.]IR Spectra

4000-CH2PMAcO
CaCO3 -PMAcO
3000
2000
Wavenumber [cm-1]

Bare-CaCO31000

Intensity [cps]

修飾後

20

Bare-CaCO3
CaCO3-PMAcO
3040502θ [degree]60

9 9カラムパッキング

スラリー カラムパッカーカラムポンプ

Φ2.1 mm×100 mm

パッキング溶媒

スラリー溶媒 : Chloroform
パッキング圧力 : 45 MPa
パッキング溶媒 : MeOH (30 min), Water/MeOH=50/50 (60 min)
HPLCによる評価

10 10

分離能評価
Van Deemter plot
H = A + B/u + C・u
HETP (µm)

A : 他流路拡散
B : カラム軸方向の拡散
C : 物質移動の項
H (HETP): Height of Equivalent to a TheoreticalPlate, u : linear velocity (mm/sec)

9080706050403020
100

3.0 µm C18 silica gel column
3.0 µm C8 silica gel column
2.9 µm CaCO3-PMAcO column
4.4 µm CaCO3-PMAcO column
5.7 µm CaCO3-PMAcO column

0.00.51.0
1.5
2.0
Linear velocity (mm/s)

Particle size (µm)

ABC

2.9

14.5

2.04

4.83

4.4

20.0

1.81

8.70  市販のカラムに匹敵する分離能

5.7

39.6

0.995

8.97

C18 カラム (3μm)

2.59

12.7

1.59

C8 カラム (3μm)

2.21

12.6

1.67

11 11

疎水性および平面性化合物の分離
Chromatograms

Acetonitrile/Water gradient, flow rate: 0.3 mL/min, 25℃

 Hydrophobicity

C0 C1Sample
CnH2n+1C2C3n = 0~9

 Planarity
102C6C7C8C4 C5C910Time (min)2063Naphthalene Acenaphthylene Acenaphthene

54Fluorene

756Phenanthrene

81Anthracene

0Fluoranthene

2Pyrene548
Acetonitrile/Water gradient,flow rate: 0.3 mL/min, 25℃

7310Time (min)15

12 12

アルカリ条件下での塩基性化合物の分離
三環系抗うつ薬

Acetonitrile/pH 12 NaOHaq gradient,flow rate: 0.3 mL/min, 25℃
N

N

1HN

N

NH

1. Desipramine 2. Nortriptyline 3. Imipramine(10.2)(9.7)(9.7)
N23 45ClN
N

4. Amitriptyline 5. Clomipramine
(9.4)
(9.4)

024Time (min)6安定にアルカリ移動相での塩基性医薬品の分離を達成

8

13 13

高アルカリ性逆相分析カラム
アルカリ条件

塩基性薬物の分離分析

pH 10.8 アルカリ移動相

2種の塩基性薬物(向精神薬)
N

CaCO3-PMAcO 102%
columnODS columnClN

 開発したカラムは高アルカリ耐性
0.3ml/min, 5mM Na2B4O7 buffer (pH 10.8) /MeOH=50/50
Sample : Naphthalene

N

CaCO3–PMAcO カラム
アルカリ性条件

分離できず
①①+②

Injection
Level
ng

②

十分な
分離効率
01020
Time (min)

血清全血ODS カラム （中性条件）←血液成分劣化67%N①imipramine ②clomipramine
pKa =9.5
pKa = 9.3

Normalized Int. (-)

Change of retention time ofNaphthalene (%)

安定①30②5.0

Recovery%, n=397.6±0.796.4±0.2

 塩基性薬物の分離分析に有効

0.3ml/min, ODS : water/MeOH = 20/80,
高アルカリ耐性充填剤の開発に成功
CaCO3-PMAcO : 5mM Na B O buffer (pH 10.8) /MeOH=40/60
2 4 7

14 14

バイオミネラルを充填剤に
バイオミネラルは階層構造を持つ

人口的に合成したCaCO3

バイオポリマー

親水性高分子Hierarchicalstructure

CaCO3

人口的な多孔質構造

Biomineral

アラゴナイト
真珠層

サンゴ

カルサイト

バテライト

卵殻

3 µm
Y. Oaki et al., Adv. Funct. Mater., 2006, 16, 1633-1639

 高いアルカリ耐性
 多孔質構造 人体に無毒& 安価

H. Imai et al., Cryst. Growth Des. 2012, 12, 876-882◎高アルカリ耐性充填剤として適した材料

15 15

本技術
安価な原料を利用した高アルカリ耐性逆相充填剤
分取カラム用充填剤
× シリカゲルベースの充填剤はアルカリ耐性が低い
× 分析カラムに比べて、大量充填剤が必要→×高価
× 人口的に多孔性粒子を合成することは3 µm

コストとスケールアップの面で課題あり

コンセプトPMAcO

卵殻を充填剤のベースに応用
5%biopolymer,moisture◎ 高アルカリ耐性

逆相HPLCによる表面修飾

95%
CaCO3◎ 安価+ ◎ 大量に入手可能→◎ 食品廃棄物のリサイクル

特願2020-84901, PCT/JP2021/018442

エコフレンドリー16 16

卵殻表面処理と修飾
手順

EDTA aq.

卵殻(10 μm粉末)

NaClO aq.

PMAcO

Eggshell-PMAcO(10 μm粉末)

acetone

SEM像
未処理

NaClO

EDTA +NaClO
100〜500 nm
マクロポア

5 µm

5 µm

5 µm

水銀圧入法による細孔容積評価
Total pore volume[mL/g]

Total pore area
[m2/g]EDTA未処理0.56

2.0

EDTA処理後

0.73

2.2

修飾前

修飾後

17 17

粒径分布
未処理

EDTA処理Particle size[µm]

RSD [%]

No treatment

3.20

109

EDTA

8.76

59

EDTA処理により粒径分布が均一に

18 18

カラムパッキングスラリー カラムパッカー
カラムポンプΦ2.1 mm×100 mm

パッキング溶媒

スラリー溶媒 : Chloroform
パッキング圧力 : 30 MPa
パッキング溶媒 : MeOH (60 min), Water/MeOH=50/50 (30 min)
HPLCによる評価

19 19

分離能評価
Van Deemter plot: H = A + B/v + Cv
H=L/N

(H: Height equivalent to a theoretical plate, L: Column length, N: Theoretical plate)AB

CNotreatment

166.4

6.4

13.5

EDTA

77.8

3.5

38.8

n=3

EDTA処理によりHETPが改善

20 20アルキルベンゼンとステロイドの分離 10種類のアルキルベンゼン

CnH2n+1n = 1~10C7C4 C6C8C3C5C1 C2C9C10

Stationary phase: Eggshell-PMAcO column
Mobile phase: H2O/MeOH (gradient)
Injection: 10 mg/mL, 100 µL
Column temperature: 25 ℃

213

 5種類のアルキルベンゼン
2 1 4354

50 min~6 min: H2O/MeOH = 80/20 constant
6 min~10 min: H2O/MeOH = 80/20 → 70/30 gradient
10 min~: H2O/MeOH = 70/30 constant
3 mL/min, T=25 ℃, Injection: 10 mg/mL steroids, 50 µL

21 21アルカロイドの全合成への応用
Dehydrostemonineおよびepi-dehydrostemonineの合成

T. Sato et al., J. Am. Chem. Soc., 2017, 39, 18386
1

1. epi-dehydrostemonine 2. Dehydrostemonine
Stationary phase: Eggshell-PMAcO column
Mobile phase: H2O/MeOH (= 99/1, v/v), 3 mL/min, 25 ℃
Injection: 4 mg/mL, 10 µL2

22 22塩基性医薬品の保持容量3種類の三環系抗うつ薬の分離
Imi AmiClomiN

0 min~20 min: 0.1% TEA in H2O/0.1% TEA in
MeOH = 65/35 constant
20 min~35 min: 0.1% TEA in H2O/0.1% TEAin MeOH = 65/35 → 50/50 gradient
35 min~: 0.1% TEA in H2O/0.1% TEA in
MeOH = 70/30 constant
3 mL/min, T=25 ℃, Injection: 10 mg/mL basicdrugs, 30 µL

ClN

Clomipramine
pKa =7.8Log P = 5.19

保持容量Imi

Clomi

Mobile phase: 0.1% TEA in H2O/0.1 % TEA in MeOH = 60/40,3 mL/min, T=25 ℃, Injection: 200 mg/mL basic drugs

Injection

RS

6.0 mg each

1.46

5.0 mg each

1.60

4.0 mg each

1.97

3.0 mg each

1.99

2.0 mg each

2.60

1.0 mg each

2.82

0.5 mg each

2.970.1 mg each

3.62

NAmitriptyline
pKa =9.4
Log P = 4.92
NNImipramine
pKa = 9.5
Log P = 4.80

23 23アルカリ耐性テスト
NNNImiClMobile phase: 0.1% TEA in H2O/0.1 % TEA in MeOH = 50/50,
T=25 ℃, Injection: 10 mg/mL basic drugs, 10 µL

N

H2O/MeOH = 50/50

Clo3L

3L

Column3 mL/min×2000 min=6L

0.1% TEA 0.1% TEAin MeOH
in H2Ot [min]HETP [µm]

Imi

Clomi

Imi

Clomi

RS0 min

5.20

8.64

348

418

2.43

2000 min

5.46

9.07

3243772.55

RSD [%]

1.9

1.8

3.1

5.8

2.0

結論・課題・企業への期待

24 24

結論
卵の殻という安価な材料を用いて分取カラム用充填剤の開発に成功
様々な化合物の分離・分取へ応用できた
シリカベースでは、達成できていない高アルカリ耐性を実現

課題
シリカベースに比べると分離能や保持容量の改善が必要カラムパッキングや分級に課題あり

共同研究を希望する企業
粉体の分級技術を持つ企業
高速液体および中圧分取クロマトグラフィー用カラム開発企業
現在、分離精製にお困りの企業

本技術に関する知的財産権

••
•
•

25 25

発明の名称 ：液体クロマトグラフィー用カラム充填剤及びその製造方法
出願番号 ：特願2020-84901, PCT/JP2021/018442
出願人：学校法人慶應義塾
発明者：蛭田勇樹、持田麻衣、今井宏明、吉井智夏

お問い合わせ先慶應義塾大学
研究連携推進本部 知的資産担当

ＴＥＬ03-5427-1439

ＦＡＸe-mail03-5440-0558
toiawasesaki-ipc@adst.keio.ac.jp

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