栃木農試研報No，46：49−56（1997）
Bull

Tpchigi

Agr，Exp．Stn．No．46：49−56（1997）

オオムギのECL法及びDIG法を用いたRFLPの検出
五月女敏範・小山内英一＊・長村吉晃＊＊
摘要：オオムギのRFLP分析において，非放射性検出法であるECL法及びDIG法の確立を目的に，RFLP検出条件を検討した．DIG法では，始めに，イネDNA及び同プローブを用いてハイブリダイゼーションバッファー，プローブ濃度，発光基質など基礎条件について検討した．結果は，標準バッファーを用いることにより，ほぼ安定してシグナルを検出することができ，プローブ濃度は20ng／mlが適当であった．発光基質のCDP―StarはCSPDより発光開始時間が早く，シグナルも強い発光特性を持つことが確認された。CDP―Starの最適濃度は露光時間を約1時間とした場合に約2000倍希釈と推定された．ECL法及びDIG法によるRFLP検出条件は，オオム
ギ他主作物DNAとイネ及びオオムギプローブを用いて，フィルターの種類とブロッティング法について検討した．結果は，いずれの方法でもアルカリブロッティング法が良く，フィル
ターはECL法ではHybond

Positively

N4が最も良く，Positivelychargedがこれに準じた．DIG法では，chargedが良好で，Hyhondは不適であった．検出感度は，DIG法の方が高く優っていた．また，今回の結果から，ゲノムサイズの大きいオオムギでもECL法やDIG去など非放射性検出法によるRFLP分析が十分可能なことが明らかとなった．
キーワード

オオムギ，ECL法，DIG法，RFLP

Detection

of

RFLP

ECL

and

Toshinori
Summary3The
ECL‑system

detectableandhybridization

DNAandthebufferforreaction

wasprobeofearlier

CSPT．The

suitableone

exposure，

hourcondition

rice．The

andof

theofm㎝brane

DIG‑system

wereBarleythesignals

filterandwerenon−radioactivefbr

nucleicofluminescent

substrate

werewereprobe

wasblotting

stablyanewhminescentmethods

for

using

barleygenomic

DNAandtheprobeofresults

thanSSC−blotting

fbr

the

both

detective

HybondN＋m㎝brane

thedetection

thedetection．And

overtodetection

that．OndetectmostapprophatetheotherhandtheHybondpolymorphic

in

for

DIG‑system，theN＋membrane

RFLP

by

enoughpossibleKeybarley，ECL‑system，DIG‑system，RFLP：

wasbands．DIG‑system

DIG‑system，werewordsof

wasnon−radioactive
even

on

nucleic

barleywith

riceandpositively

useor

RFLP

riceoftheacidlabeling
genomesize

α7，thandilutionfbr

ECL‑system

andECL‑systems，thechargedmembranesuitableforthemethods，suchthanstandard

positively

which

large

the

luminescentmembrane

ECL‑system

togenomic

barley、Alkaline−blotting

inappropriate，insuperiorbysyst㎝s，Inchargcd

methods，substrate，α）P−3

was＊キリンビール（株）ビール醸造研究所，＊＊農林水産省農業生物資源研究所

usingbydetecttng

testedtoexamined

est㎞ate（1approx㎞ately2000t㎞es

showe（1better

nextlabeling

DIG‑system，

was20ng／m1．The

methods

was

acidbarley．In

detected

concentrationstronger，ushlg

CDP‑Staran（1theNAGAMuRA

analysissignals

System，DNA

RFLP

optimumofLabeIing

GenomicOsANAI，Yoshiakj

byluminescentwitch

concentration

NatureRFLP

investigatedconcen甘ation

DIG‑system，in

Non−Radioactive

SoToME，Ei−ichi

DIG‑system，werebuff◎r，probe

by

D，G，onwasbackgromdinaswastoosensitivity．The
ECL‑system

andrice，（1997．81受理）

49

栃木県農業試験場研究報告第46号
DIG法はイネやオオムギでは方法が確立していないため，

1

緒言以下の検出条件の検討を行った．（1〉ハイブリダイゼーション

近年，DNA多型を検出する技術が開発され，それを利バッファー：Boeh吻g87ル血nnhe〃2社推奨の高SDSバッフ用した研究も多岐にわたっている．最近では，犯罪捜査におァーと標準バッファーを改善した方法（第1表）を検討した。

けるDNA鑑定や病原性大腸菌レースの同定などで話題と（2）プローブ濃度：5，20，100及び200nglm1の4水準でなっている．植物育種においては，RFLP（Resthction検討した．（3）発光基質：現在C3PDが標準的に使用されてFragm㎝t

いるが，新しい発光基質のCDP乱躍について適正濃度とLengthPolymorphism：制限酵素断片長多型）分析法やRAPD（Randam

AmplinedPolymorphicDNA：任発光特性について検討した．基質濃度は200，400，800

意増幅断片多型DNA）分析法を用いた系統識別・分類や及び1600倍希釈液（メーカー推奨は100倍）に浸漬し露光病害抵抗性遺伝子の選抜が行われている．また，これら分

開始後30分または1時間毎の発光量を調査し，検討した．

析法によるゲノム解析研究の推進により，多くの作物で発光特性は，400倍希釈液に浸漬し露光開始後30分間はRFLPプローブ，PCR（Polymerase

15分間毎，その後は1時間毎に15分間及び45分間の発ChainReaction）プライ

マーをマーカー（以下，DNAマーカー）とする連鎖地図が光量を調査した．（4）リプローブ性：DIG法では，リプローブ作成され，イネやオオムギではこれらのDNAマーカーを用性（フィルターの複数回使用）が劣ることが問題となるので，いたQ皿．（Quantiative

検出の終了したフィルターをストリッピング処理（0．2M

TraitLoci：量的形質遺伝子座）解析による農業上重要な形質の遺伝子地図が作成されていNaOH−0．1％SDSる2）．今後，これらDNAマーカーを用いて有用遺伝子の単ダイズさせ，前回ハイブリダイズさせたプローブの有無を確離やその遺伝子の迅速かつ的確な選抜による育種の効率認した．これらの検討では，サザンハイブリダイゼーション用化が期待されている．のナイロンメンブレンフィルターはPos

しかしながら，RFLP分析法は放射線性同位元素標識を（βoεh73（lmin）した後，異なるプローブをハイブリs〃vめ，oh曜g8dng87ル毎nnh8珈社）を用い，DNAはイネ（品種名：用いてRFLP検出を行っている（以下，田法）が，そのため∬本臓καsαZα孟h）を制限酵素、8α〃2H1，Bg1π，EooR

V，には専用の放射線利用施設や処理施設が無ければ研究が研n4111，オpα1，Z加1，EooR1及びゅn1でそれぞれできないことが問題となっている．放射線を用いない方法とし切断処理し，これら断片を0．6％アガロースゲル電気泳動にて，科学発光系（ペルオキシダーゼ，ジゴキシゲニンなど）をより分離した後，アルカリ法（0．4MNaOH，12hr）でブロッテ利用し非放射性発光物質（ルミノール，C3PDなど）標識をィングし，120℃20minで固定した．プローブは，（1）及び用いる非放射性検出システム（以下，ノンRI法）のECL法（3）の実験ではイネプローブを濃度20ng／m1でハイブリダイズ

やZ）1G法などがあるが，ECL法はゲノムサイズの小さいイネした・発光基質は，（1）及び（2）の実験ではC8PDを200倍希では手法が確立しているものの，ゲノムサイズの大きいオオ釈で用いた．

ムギなどではシグナルが弱く感度が低いため，その適応が難しく実用化されていなかった．オオムギではE（■法で山口

第1表

ρ／α去における検討バッファー

らめの1例だけがある．また，シグナルの強いZ）1G法ではノーザン，コロニーハイブリダイゼイション等で使用されている

バツフアー名（ハイブリ温度）

組成

ものの，サザンハイブリダイゼーションではECL法より検出が不安定なこと，フィルターのリハイブリ性が劣ること，操作が複局SDS雑であることによりほとんど用いられていない．

（42℃）

Buffer

7％SDS

今後，ノンRI法によるRFLP分析がオオムギをはじめ種50％Fomamid々の作物で適用されると考えられるが，現在これら方法でのRFLP検出の可能性や条件設定の研究はあまりされていな

50mM

Sodiumphosphate

標準Buffer

5％SSC

（68℃）

1％Bloking reagent
O．1％Lauroylsarcos血eい．

今回，オオムギのRFLP解析に必要となってくる非放射性5％SSC
2％Bloking reagent
O．1％Lauroylsarcosklebuf琵rO．02％SDS

検出システム（ECL法，五）1G法）を用いた検出条件検討を行ったので，ここに報告する．

2．オオムギのノンRI検出システム

H

試験方法

1．ρ〆6法におけるRFLP検出50

ノンRI法として，ECL法及びD∫G法を用いた。ECL法
はRGP（Rio8Gεno7η8Rθs876hPmgm醒）で行われているオオムギのECL法及びDIG法を用いたRFLPの検出方法4）を，DIG法は前記1．DIG法におけるRFLP検出に3時間位でピークに達するが，α）P謬如7は発光活性化がより改善された方法で試験を行った．各法におけるサザンハ

早く露光開始後の15分後から発光が強くなり，1〜2時間イブリダイゼーションの条件としてフィルターの種類及びブロ後からほぼ最高（平衡状態）に達し今回の調査では約7時ッティング法について検討した。フィルターは，PO傭ガV⑳間後まで発光量は安定していた（第4図）。

ohα喀θ4，1か加n41v（肋ε溜hα吻社）及び1か加n41v＋（同）

これらの結果から，α）P乱俳の最適な濃度は露光時間をを用い，ブロティング法はアルカリ法及びSSC法（0．25N

約1時問とした場合には約2000倍希釈，約30分した場合

HC110min，0．5M

は約1000〜1500倍希釈と推定された．（ユ）P−S如7は（pH7．5＞L5M

NaOH．1．5M

NaC130min，0．5M

NaC115min×2，20×SSC

TrislOmin）を検討

C3PDよりも発光開始が早く，強くかつ長時間にわたる発光

K〜樽母N

K

ミ・ぐN

K

N︑庸〜偽Nミ振K・爆N

KKξ・鳶Nミ魅馬N

粉で，それぞれ植物体の成葉よりCTAB法により抽出した．

ミ勾ぐN（母蒲，κ4so娩h），ダイズ（∠／・兼庄某），コムギ（濃淋61ミ寧Kした．これらの検討に用いたDNAは，オオムギ（働他，イネ

ハイブリダイゼーション用のフィルター作成は、各種DNAを轍轍

制限酵素∫伽4皿，EooR1でそれぞれ切断処理し，これらの断片を0，6％アガロースゲル電気泳動により分離した．
DNAのアプライ量はオオムギ2．0，5．0，8．Ong！well，イネ2．0，ダイズ4．0，コムギ2．0，5．0とした．トランスファーはキャピラリー法，固定は120℃20mtnで行った．プローブは，イネ（CgA），オオムギ（B388）プローブを用い，20ng／m1の鵜濃度でハイブリダイズした．

尚，以上の実験は，1996年1から2月に実施した．

轍鱒

皿結果及び考察1．ρ16法におけるRFLP検出
1）ハイブリダイゼーションバッファー

標準バッファーでは多少バックの濃淡が出る場合もあるもののほぼ安定してシグナルを検出することができた（第1図）．

第1図ρ1θ標準バッファー法におけるRFLP結果

プローブ：イネCgA，ハイブリ条件：20ng／m1，1／200CSPD，露光条件：37℃，3hr，N：厚禰K：んαsα1αfh．

メーカーの推奨する高SDSバッファーでは，バックの上昇が博u鯉﹄．逼榊

辞．獅．㎝

騨

．驚−．・繋嫌．．．．

16

舶屡1

ためにはバックの濃度を下げる種々の検討が必要と思われた．

鱒2）プローブ濃度
プローブ濃度とシグナルの強さ，バックの上昇の度合いを

闘聯⁝灘

蕪一

4﹃﹃

高温でないため操作上は有利であるが，この方法を用いる6 拶ことができなかった．高SDSバッファー法は，ハイブリ温度が5峯蝦奪著しく，洗浄条件を厳しくし篤安定したシグナルを確認する

櫛◎

瀞晦

酪燭P
灘螂

20ng／ml

5ng／m1

調査した結果は，シグナルの強さはプローブ濃度が増すにつれて強くなったが、濃度に比例しなかった．バックは20ng／m1では低く像は鮮明であったが，100ng／ml以上ではかなり高くなった（第2図）．これらの結果から，プローブ濃度

墨は20ng／ml前後が適当と考えられた。

3）発光基質CDP−S孟躍の各濃度での露光は，濃度が濃くなるに従いバック，シグナル共に高くなった．今回の結果では，1600倍希釈液でも露光開始直後の30分間で十分な発光量が得られ，それより濃い濃度ではバックも著しく高くなった（第3図）。発光特性は、C3PDは露光開始後2時間より発光が活性化し100n

第2図

gml

200ng

m1

ρ／（霧去におけるプローブ濃度

ハイブリ条件は，プローブ濃度以外は第1図と同じ．

51

栃木県農業試験場研究報告第46号

1／

400

1／

800

1！

1600
猿

0100・0：30

0：30・1：00（0．5hr）（0，5hr）

第3図

、：．瑛

．蟹』．，

2；00昌3100

LOO・2：00

3：00属4100

（1hr）

（1hr）

4100−5：00

（lhr）

（1hr）

00ρ一5fθ〆の濃度とシグナルの変化時間は露光開始後からの経過時問（hr：min），（）は累積露光時間．11200はバックの上昇が著しくシグナルを検出することができなかった．
プローブ：イネR2672，ハイブリ条件：発光基質，露光時間以外は第1図と同じ．

蝕殉・…甲．貯樽櫛膚曽ズ 4獅m獄螂徽周煉 り琳

・解蜘

＾、w

鱒一、衛．
諭

薗

り1噂15min鰯
0：30・0：45

0：00・0：15m血4：30−4：45

3：30・3：45

2：30■2：45

1：30・1：45♂一携．．穂一鎌脳懸難，響嚇簸．、懲・一霧
藍（0：15・0：30）

第4図

0：45・1：30

1：45・2：30

謙き，＿，

2：45・3：30

3：45・4：30

4：45・5：30

00ρ一5f甜の発光特性1シグナルの経時的変化

下段数字は露光開始後からの経過時間（hr二min），左数字は累積露光時間．
αン県36ar1！400，プローブ：イネR2672．ハイブリ条件：発光基質，露光時間以外は第1図と同じ．

灘鶏盟

雛1畷醐繍轍頗唖》

雛轍鱒撚鷺撒釦醐購‡鱒嚇 噸1 織鷺齢欝r甲締轍．．

︐輔零饗
獅撒講欝
畿一縣鱗鱒撚 縣糠溺甲 鵜﹃一甲難鱒鱒椴漁嫌欄

鱒−『鱗ゆ榊難．﹄

罵

鱒

縣樽

鮮獺剛騰

澱・離轍轍騨
竸灘轍淵晦徽轍轍轍轍

ゐか瑚き榊（C9A→）C9A

第5図∫（C9A→）R2510

0姶法におけるリプローブ結果

各フィルターとも前回または前々回C9Aをハイブリダイズし，0．2M

52（C9A→C9A→）R2672

NaOH・0．1％SDSでストリッピング処理．

オオムギのECL法及びDIG法を用いたRFLPの検出

鑓1灘驚

標準Buffer

一標準Buffer3−5m1，68℃，1hr以上

5XSSC
1％Bloking reagent
O．1％Lauroylsarcos血e《一一一陶…一・……・一……一・…・繋ローダ（20g／m1）

0．02％SDS（100℃，5min）

灘羅麟獺魏練㈱（オートクレープ）

標準buffer3−10ml，68℃，ovemight

O，IMMaleicacid
O．15MNaCl
H20

撒灘灘
洗浄液

蹴室温，5min×2，振猛

2XSSC
O．1％SDS辮蒙雛灘
洗浄液 65℃，10min×3，振猛鐙鍵擁漁

Washing

Washinbuffer室温，2min×2，振猛buffer

BufOer1
0，3％（wlv）Tween−20

励G懇β￠麟σ闘Buffer2

蒲Buffer2−

室温，30min，振猛Bufferl
1％Bloking棲￠撫巖1㈱驚Anti−DIG−AP液

reagent

Ant卜DIG−AP液
室温，3（lmin，浸漬BufOer2
1／100000Anti−DIG−AP

洗藻
Washing

buffer室温，15min×2，振猛覆G難雛…o麟3
Buffer3

Buffer3

室温，5min，浸漬（フィルター滅菌）

一0．1MTris（pH9．5）

0，1MNaC150mMMgClz
HzO

騨撫麟1㈱護〇〇ρ一5ご∂〆液

室温，3−10sec，浸漬

00ρ一5飴〆液
一Buffer3

1／2000CDP−S訪α7臨鱒so370C，

1−2hr

ストリッピング液

0．2MNaOH
O．1％SDS

第6図0／θ法を用いたRFLP検出プロトコールフロー図
53栃木県農業試験場研究報告第46号

繊鰍M12345678910111213141516M
鰯・鎌

難

搬毒

灘 轍雑アルカリ法

嚢M12345678910111213141516M

欝朋難

Ml2345678910111213141516M

噸醗鋤雛鱗嚇

麟．

SSC法

羅

猫−甲轍縫鯛駈徽轍嚇撒轍藤︐鵜アルカリ法欝構椰籍鞭翻鰯轍撤鱒繊鷺欝

滞

煽SSC法

魑照『懸Po謡ルθノ70加r8θゴ

第7図E功oηゴN∬oηゴノVチ

ε0乙法におけるフィルターの種類及びブロッティング法の検討結果
DNA：1，2，9，10．イネ（2nglwell），3，11，ダイズ（4），4，12．オオムギ（2），5，13．同（5），6，14．同（8），7，15．コムギ（2），8，16．同（5），M．λ1伍力副ダイジェストマーカー， 酵素処理：1−8．研力躍，
9・16．忍oo㊧1・ プローブ：イネC9A（点線上），オオムギB388（点線下），20ng！m1． 4hr．expose．
Po51

ルθケ・h群8θゴ・アルカリ法ブロッティングフィルターは，電気泳動ゲルにエチジウムブロマイドが入っていたためにややスマイリングを起こしている．

54

附オオムギのECL法及びDIG法を用いたRFLPの検出

M12345678910111213141516M

M12345678910111213141516M

M123456789101U213141516M

㈱・

アルカリ法

鱗蜘一撒・鋤

SSC法
織アルカリ法
蔓鰹・

SSC法
ψoηdN

∬．

∬．

Po5i診ルθケ6加r8θぜゆoηゴノVチ

第8図 ρ1θ法におけるフィルターの種類及びブロッティング法の検討結果
標準buf艶r，1／200CSPD，37℃3hr．expose．

各種条件は第7図と同じ、特性を持っているため，露光時間の長短によりシグナルコン

ムサイズが大きくシグナルの弱い植物でもRFLP検出が有トロールが容易であり，また短時間露光による実験時間の能効と思われた。

率化を図ることも可能と考えられた．さらに，オオムギなどゲノ4）リプローブ性55栃木県農業試験場研究報告第46号
リプロービングの結果では，異なったプローブをハイブリダ

また，今回の結果より，ゲノムサイズの大きいオオムギでもイズした場合，前回のゴーストバンドが極めてわずかながらECZ，法やDIG法などのノンRI法によりRFLP分析が十分検出されたが，実用上は問題ないと考えられた（第5図）．

可能なことが明らかになった。

今回の実験では3回までの使用が確認されたが，フィルター3．50乙法と餌G法の検出感度の違いの耐用回数がどれ位なのか，また，使用を重ねた場合にこのオオムギのノンRI検出システムにおいて，ECL法と加Gゴーストバンドシグナルの強さがどの様になるかは不明であ法の結果で，Pos∫〃veかo加εgε4，砺加n4Nフィルターでった．のシグナルの検出感度を比較した場合，ECL法ではややス以上の結果から、DIG法を用いたRFLP検出法のプロト

メア状にシグナルが検出されているのに対し，1）1G法ではクコールフロー図を第6図の通り作成した．

リアことなどから，DIG法の方が特異性が上がる条件にもか2．オオムギのノンRl検出システム

かわらず，検出されるバンドの数及びシグナルの強さはDIC

1）EC乙法法の方が上回っていた．このことから，検出感度は加G法のDNAの吸着は，フィルターでは劫ソ加n4N＋＞Posi漉eか方が高いと考えられ，また，D灯法においては洗浄等の条

oh醐g躍＞＞珈わon41Vの順で，ブロティング法では，件によって特異性の強弱を変えることによりシグナルコントロ

砺加n41〉＋を除いて，アルカリ法＞SSC法の順であった．

ールもできると推定された．

RFLPバンドのシャープさではアルカリ法＞＞SSC法であっ謝辞た．（第7図）．

ECZ法におけるオオムギのRFLP検出結果では，今回用本研究は，（社）農林水産先端技術産業センター農林水

いたオオムギ及びイネプローブではシグナルを十分確認す

産先端技術研究所にて実験を行ったが，実験遂行にあたり，ることができた．

技術的指導を頂いたRGP．の諸氏に心より感謝の意を表す

2）P1σ法る．

今回の結果では，劫ノ加n4ノ〉＋はいずれのブロッティング

引用文献

法でもバックの上昇が著しくシグナルの検出は困難であった（第8図）．バックの上昇の程度はPosihvely

chargedではや1。Kuぼata，N．，YNagamura，K．Yamamoto，Y．Halushima，

や高く，砺加n41vはほとんどバックの上昇が見られなかっ

N．Sue，」．Wu，B，A．Antonio，A．Shomura，T．Shimizu，た．DNAの吸着，バンドのシャープさはECL法と同様で，

S．Y．Lin，

フィルターではPos∫〃vθかoh醐g84＞＞∫かわoπ4N，ブロティ

T．Toyama，Y．Myamoto，T．k姓ihara，K．Hayasaka，AMiyao，

ング法ではアルカリ法＞＞SSC法の順であった（第8図）．

L．Moma，H．S、Zhong，Y．Tamura，Z．X．W㎝g，T．Mo㎜a，各条件におけるストリッピング状況はいずれも良好であり，リY．Umehara，M、Yano，T．Sasaki

プローブは可能と考えられた．

300kilobase

DIG法でのオオムギのRFLP検出結果は良好で，特にオオムギプローブをハイブリダイズした場合にはECL法に比べてシグナルも強く，検出バンド数も多かった．

以上の結果から，1必L法においてはフィルターはめわon4

expressed

T．lnoue，A．Fukuda，intervalsequence．

g㎝eticNature

T．Sh㎞ano，andmap

Y．Minobe（1994）A

of

rice

including883

Genehcs8：365−372、

2・Hayes，P．M、，B．H．Liu，S．J・KnapP，ECh㎝，BJones，T，Blake，」、Franckowiak，D．Rasmusson，M，Sorrells，S。EUlhich，D、Wesenberg

andA．Kleinho蕊（1993）

N＋でアルカリブロティング法が最も良く，Pos鵡veかQuantitativeohα喀ε4でアルカリブロッティング法が準じた．同様に那Ginteractin法ではポジティブチャージでアルカリ法が良いと考えられた．

plasm．Theor

さらに，RFLP分析をECL法と．DIG法で行うなう場合には，3。山口修，矢野昌裕，佐々木卓治（1996）

Poぶif∫v81y

大麦系統間のRFLP検出頻度

6h俳ge4を用いてアルカリ法でブロティングし，サY．Kuboki，

hin

aitalocus

sampleApplofeffects

Northan（1American

environmen惚1barleyg㎝nG㎝et87：392−401．

日本のビール育雑．46（別1）：98

ザンハイブリダイゼーション用フィルターを作成すれば，1っ4．分子マーカーを利用した有用形質の遺伝解析方法農のフィルターで両方法により検出ができると考えられた．

林水産先端技術振興センター

56