令和 5 年度

共同研究報告書

研究区分

一般共同研究研究課題名脳炎発症につながる神経向性フラビウイルスの中枢神経組織侵入の分子機構の解明

新規・継続の別

新規
所属

・

継続

北海道大学・獣医学研究院

研究代表者
職名・氏名

北海道大学・大学院獣医学研究院

職名・氏名

大学院生・Passawat THAMMAHAKIN

所属

北海道大学・大学院獣医学研究院

職名・氏名て下さい）

所属

大学院生・前園

学部学生・藤田

職名・氏名

概要（100～150 字程度）

以下○以下○佳祐〇〇

北海道大学・大学院獣医学研究院

職名・氏名
受け入れ教員

35 歳

進太郎

所属
研究分担者
（適宜行を追加し准教授・小林40 歳

千聖〇

教授・村上正晃
ヒトに重篤な脳炎を引き起こす神経向性フラビウイルスの脳内侵入メカニズムの解明を通じて脳炎病態形成の解明を目指す。ウイルスを感染させたマウスの脳内では、ウイルス抗原が検出される前に、グリア細胞の活性化や炎症性サイトカインの発現上昇が認められ、神経向性フラビウイルスの脳内侵入と炎症の関連が示
唆された。

研究目的
（300 字程度）

ウエストナイルウイルス（WNV）などの神経向性フラビウイル
スは、ヒトに感染すると末梢組織で増殖後、中枢神経組織に侵入し脳炎を起こす。中枢神経組織には血液脳関門が存在し、ウイルスなどの病原体や免疫細胞などを含む様々な物質の組織内への輸送が制限されている。一方、神経向性フラビウイルスは血液脳関門をすり抜けて脳内に侵入するが、その分子機構は不明である。
申請者はこれまでに WNV が脳組織の視床下部の微小血管から侵襲することが示唆される結果を得ており、本研究では WNV を感染させたマウスの視床および視床下部を含む脳幹部の微小血管を中心に組織変化を詳細に解析することで、神経向性フラビウイ
ルスの中枢神経組織への侵入の分子機構の解明を目指す。

研究内容・成果

村上教授の研究室では、免疫細胞及び神経細胞により惹起され（1000 字程度・Web 会議の回数る神経組織周辺の血管における微小炎症が、免疫細胞の神経組織も記載）への進入路(ゲート)の形成を促し、それが免疫細胞の血液脳関門を超えた浸潤の原因となることを解明した。本課題では、フラビウイルスの中枢神経組織への進入においても、脳近傍の血管組織の微小炎症とゲート形成がウイルスの侵入の鍵になるのではない

かと考えた。
感染細胞において蛍光タンパク質を発現する組換え WNV または野生型 WNV を腹腔内接種した C57BL/6 の脳組織を経時的に回収し、免疫組織化学染色によりウイルス感染細胞、ミクログリアについて解析した。ウイルス接種マウスの視床および視床下部において、接種後 5 日目からウイルス抗原が検出された。形態変化を伴う活性化ミクログリアは同部位において接種後 3、4 日目において検出された。続いて、ミクログリアの活性化に関わるケモカインおよび血液脳関門の透過性の亢進に関わる炎症性サイトカインの発現を RT-qPCR により解析した。WNV の抗原が検出される前の脳幹部において Cxcl10 の発現が上昇しており、Cxcl10がミクログリアの活性化に関与することが示唆された。また、

Cxcl10 を発現する細胞を特定するために、Cxcl10 に対する in situ
hybridization を実施した結果、WNV 感染マウスの脳幹部の血管を構成する細胞で Cxcl10 の陽性像が認められた。これらの結果
は WNV が脳内に侵入する前に、ミクログリアの活性化と Cxcl10の発現上昇を伴う微小な炎症が生じていることを示唆している。
今後は申請者がこれまでに明らかにしてきた脳炎病態の形成に関わるアミノ酸に変異を導入したフラビウイルスを用いて、微小炎症の誘導に関わるウイルス因子や宿主因子について解析することで、ウイルス感染によってゲートが形成される仕組みを明らかにする。
さらに研究代表者らは今年度内に、WNV を接種したマウスの脳内で多様なサブタイプのミクログリアが活性化されることを見出し、その中で disease-associated microglia と呼ばれるサブタイプがウイルス感染神経細胞の近傍に局在することを明らかにした。また WNV の NS5 タンパク質は感染細胞内にユビキチン化タンパク質の蓄積を誘導することでウイルスの増殖を亢進させることならびに、WNV の E タンパク質が Rab27a によってリソソームに輸送され分解されることを明らかにした。
村上教授との共同研究に関する面談
直接面談：0 回、Web 会議：0 回
遺伝子組換え実験：有（2022-051）・動物実験：有（23-0128）
成果【学会報告】
参加者名、講演タイトル、学会名、開催場所、開催日時入力のこと
河合 星来、福田 幸音、前園 佳祐、Thammahakin Passawat、
苅和 宏明、小林 進太郎、ウエストナイルウイルス感染時のRab27a の役割の解明、第 166 回日本獣医学会学術集会、東京農工大学、2023/09/05
梶山 実紗、福田 幸音、佐々木 道仁、Thammahkin Passawat、
前園 佳祐、長谷部 理絵、村上 正晃、苅和 宏明、小林 進太郎、ウエストナイルウイルスの脳内侵入機構解明のための脳組織の病
理組織学的解析、第 166 回日本獣医学会学術集会、東京農工大学、
2023/09/05
江口 悠人、前園 佳祐、THAMMAHAKIN Passawat、石橋 和大、好井 健太朗、苅和 宏明、小林 進太郎、ウエストナイルウイルス
感染で形成される複製複合体内に局在する二本鎖 RNA を標的とした抗ウイルス効果の検討、第 166 回日本獣医学会学術集会、東京農工大学、2023/09/05
前園 佳祐、Passawat THAMMAHAKIN、好井 健太朗、苅和 宏
明、小林 進太郎、核膜孔複合体の機能障害に着目したウエストナ
イルウイルス感染による宿主タンパク質の核-細胞質間輸送の障害と病態形成との関連の解明、第 166 回日本獣医学会学術集会、
東京農工大学、2023/09/05
梶山 実紗、福田 幸音、佐々木 道仁、Thammahkin Passawat、
前園 佳祐、長谷部 理絵、村上 正晃、苅和 宏明、小林 進太郎、ウエストナイルウイルスの脳内侵入機構の解明につながる脳組織の病理組織学的解析、第 29 回トガ・フラビ・ペスチウイルス研究会、仙台国際センター、2023/09/25、国内、口頭
江口 悠人、前園 佳祐、THAMMAHAKIN Passawat、石橋 和大、好井 健太朗、苅和 宏明、小林 進太郎、ウエストナイルウイルス
感染で形成される複製複合体内に局在する 二本鎖 RNA を標的とした抗ウイルス効果の検討、第 29 回トガ・フラビ・ペスチウイル
ス研究会、仙台国際センター、2023/09/25
前園 佳祐、Passawat Thammahakin、好井 健太朗、苅和 宏明、
小林 進太郎、ウエストナイルウイルス感染による核膜の構造的異常を伴う TDP-43 の細胞質内への 異所性局在と病態形成との関連、第 29 回トガ・フラビ・ペスチウイルス研究会、仙台国際センター、2023/09/25

前園 佳祐、 Passawat Thammahakin、 好井 健太朗、 苅和 宏
明、 小林 進太郎、核膜孔複合体の機能障害に着目したウエスト
ナイルウイルス感染による宿主タンパク質の核-細胞質間輸送の障害機構の解析、第 70 回日本ウイルス学会学術集会、仙台国際センター、2023/09/27河合 星来、福田 幸音、前園 佳祐、Thammahakin Passawat、
苅和 宏明、小林 進太郎、ウエストナイルウイルス感染におけるRab27a の役割の解明、第 70 回日本ウイルス学会学術集会、仙台国際センター、2023/09/27
小林 進太郎、前園 佳祐、Passawat Thammahakin、好井 健太朗、苅和 宏明核内膜タンパク質の小胞体局在によるウエストナイ
ルウイルスの増殖との関連、、第 70 回日本ウイルス学会学術集会、
仙台国際センター、2023/09/27
江口 悠人、前園 佳祐、THAMMAHAKIN Passawat、石橋 和大、
好井 健太朗、苅和 宏明、小林 進太郎、ウエストナイルウイルス
感染で形成される複製複合体内に局在する二本鎖 RNA を標的とした抗ウイルス効果の検討、第 70 回日本ウイルス学会学術集会、
仙台国際センター、2023/09/27
小林 進太郎、前園 佳祐、タマハキン パサワット、好井 健太朗、澤 洋文、苅和 宏明、核内膜タンパク質の小胞体局在によるウエストナイルウイルスの増殖への影響、第 46 回日本分子生物学会年会、神戸ポートアイランド、2023/12/06
前園 佳祐、Passawat Thammahakin、好井 健太朗、苅和 宏明、
小林 進太郎、ウエストナイルウイルス感染による核膜の構造的異常を伴う TDP-43 の細胞質内への異所性局在と病態形成との関連、第 46 回日本分子生物学会年会、神戸ポートアイランド、
2023/12/07
江口 悠人、前園 佳祐、THAMMAHAKIN Passawat、石橋 和大、
好井 健太朗、苅和 宏明、小林 進太郎、ウエストナイルウイルスの感染で認められる TDP-43 の細胞質内蓄積による脳炎病態形成への影響の解析、第 46 回日本分子生物学会年会、神戸ポートアイ
ランド、2023/12/07

Shintaro Kobayashi, West Nile virus Capsid protein induces
nuclear membrane loss and promotes viral replication. Viral
Diseases Panel Meeting, U.S.-Japan Cooperative Medical
Sciences Program, Grand Hyatt Incheon, March 8, 2024
【論文発表】
著者、論文名、掲載誌名、号・年・ページ等、IF 入力のこと
Kobayashi S, Kawai S, Fukuda Y, Eguchi H, Maezono K,Thammahakin P, Sawa H, Kariwa H, Rab27a Promotes
Degradation of West Nile Virus E Protein in the Lysosome.
iScience, 27, 2024, 109539, IF: 5.8
Kobayashi S, Kawakami R, Takeda C, Maezono K,
Thammahakin P, Eguch H, Hang'ombe BM, Orba Y, Sawa H,Yoshii K, Kariwa H, Ubiquitin accumulation induced by thefinger and palm sub-domains of NS5 modulates the replicationof West nile virus. Virology, 588, 2023, 109902, IF: 3.7
Tabata K, Itakura Y, Ariizumi T, Igarashi M, Kobayashi H,
Intaruck K, Kishimoto M, Kobayashi S, Hall WW, Sasaki M,Sawa H, Orba Y, Development of flavivirus subviral particles
with low cross-reactivity by mutations of a distinct antigenic
domain. Applied Microbiology and Biotechnology, 107, 2023,7515-7529, IF: 5.0
Thammahakin P, Maezono K, Maekawa N, Kariwa H,Kobayashi S, Detection of disease-associated microglia among
various microglia phenotypes induced by West Nile virus
infection in mice. Journal of Neurovirology, 29, 2023, 367-375,
IF: 3.2
Kobayashi S, Fukuda Y, Yoshii K, Thammahakin P, Maezono K,Eyer L, Růžek D, Kariwa H, Development of recombinant West
Nile virus expressing mCherry reporter protein. Journal ofVirological Methods, 317, 2023, 114744, IF: 3.1
Itakura Y, Tabata K, Saito T, Intaruck K, Kawaguchi N,Kishimoto M, Torii S, Itakura Y, Tabata K, Saito T, Intaruck K,Kawaguchi N, Kishimoto M, Torii S, Kobayashi S, Ito N,Harada M, Inoue S, Maeda K, Takada A, Hall WW, Orba Y,

Sawa H, Sasaki M. Morphogenesis of Bullet-Shaped Rabies
Virus Particles Regulated by TSG101. Journal of Virology, 12,2023, e0043823, IF: 5.4【新聞報道】