公共施設及び生活環境の悪臭抑制に用いる
微生物器材の特性とその効果
Nagoya University of Arts and Scieces
School of Nutritional Sciences○岸本 満 1・2 、渡邉 晶次 2・3（ 1 名古屋学芸大院・栄養科学、 2 名古屋学芸大・健康栄養研、 3 朝日メインテナンス工業（株)）目 的

微生物器材中の細菌を分離同定し、器材の細菌分配特性と黄色ブドウ球菌増殖抑制の有無を把握する。
微生物器材

背景

ノロウイルス等消化器系感染症はヒトの糞便およびトイレ環境が感染源になるリスクが高く、清潔な環境を維持することは重要。
バイオプレート（小便器用）
公共施設及び商業施設のトイレについては管理者、利用者ともにその衛生状態に対する関心は高く、特に病院、高齢者施設、保育園、幼稚園、小学校等の免疫弱者が生活する施設では確実な除菌、殺菌、そして悪臭抑制が求められる。
CBS® (クリーンバイオシステム®；ホテイ産業研究所)で用いる微生物器材（商品名：バイオプレート、マーキュ
マーキュリー（ハイタンク
AY509230
Bacillus
psychrosaccharolyticusリーほか)は土壌由来好気性細菌を利用して便器等の汚れ、悪臭除去を行う用具として開発された。本微 AM747813 [Brevibacterium]用）
frigoritolerans
DQ514314 Bacillus simplex
生物器材の増殖抑制そして悪臭抑制に対する効果を検証する。

http://www.e-hotei.com/

ミニバイオプレート（小便器用）

バイオボール（小便器内下部用）

AB016270 Bacillus sp.
EF206294 Bacillus butanolivorans
EU647709 Bacillus muralis
EU273353 Bacillus oryzae
DQ400692 Bacillus granadensis
EU652096 Bacillus pichinotyi
AM747042 Bacillus longiquaesitum
EU373401 Bacillus circulans
①実験方法
①実験方法
EU660368 Bacillus nealsonii
AB062696 Bacillus aestuarii
微生物器材マーキュリーを12～24時間水道水に浸漬した「バイオ水」
微生物器材の微生物担体を20℃で16時間、滅菌脱イオン水に浸漬、フィルターろ過し培養、増殖した微生物菌叢を、細AF519469 Bacillus arbutinivorans
を3～6週間使用/不使用して清掃したトイレ床を各１０か所、100㎠ふき
菌はl6SrRNA遺伝子により、真菌は28SrRNA遺伝子によるPCR-DGGE解析を行った。塩基配列をSequencherver､3.1.1で解AF519467 Bacillus djibelorensis
AF519461 Bacillus fucosivorans
取り、黄色ブドウ球菌用測定プレートSTX(3M®）上に増殖したコロニー析BLASTsearchにより、近縁の種の塩基配列を推定し､ClustalWにて系統樹解析、TreeVieWにて系統樹を作成。
AJ542512 Bacillus novalis
X77791 Bacillus pseudomegaterium
数を計測。
EU221375 Bacillus niacini②結果
EU379279 Bacillus drentensis②結果
EF690434 Bacillus senegalensis
細菌のフラグメント1～5はBacillus属菌のグループに系統化された。真菌は１つのフラグメントが得られたが、真菌のフラグ
DQ013307 Bacillus chandigarhensis
バイオ水不使用のトイレ床のブドウ球菌数が有意に多かった。
AJ717382 Bacillus foraminis
メントから塩基配列及び系統樹の解析はできなかった。バイオ水ろ過済みフィルターのうちポテトデキストロース寒天培地
AY672638 Bacillus subterraneus
DQ371431 Bacillus thioparus
で培養したフィルターはコロニー形成の確認が出来なかった。
AF221062 Bacillus jeotgali
4AB262082 Bacillus selenatarsenatis
菌バ
菌バ
カ分EU364818[Bacillus [pallidus]）イP<0.05ー子）イオ
AF071856 Bacillus siralis
オ
量水水
EF451042 Bacillus aeris
マ（（AB441651 Bacillus soliー3細真EF491987 Bacillus infantis
EU569296 Bacillus bataviensis
DQ298115 Bacillus benzoevorans
EU927411 Bacillus cereus
AF526900 Bacillus sp. 83-3C2
Fragment
fragment3
1
fragment2
Fragment
fragment4
2
fragment5
Fragment
fragment1
1
3
Fragment
EU910234 Bacillus pycnus
4EU910249 Bacillus firmus
Fragment
5EU910223 Bacillus oleronius
EU363317 Bacillus idriensis
0EU927414 Bacillus pumilus
DQ465405 Bacillus decisifrondis
バイオ水使用トイレ
バイオ水 不使用トイレ
AB441620 Bacillus macroides
Fragment 6AB363732 Bacillus azotoformans
トイレ床（n=10)拭き取り平均と標準誤差
AB245379 Bacillus ginsenggisoli
AJ781029 Bacillus herbersteinensis
AJ831844 Bacillus aerophilus
DQ415893 Bacillus subtilis
EF433409 Bacillus atrophaeus
AM747812 [Brevibacterium] halotolerans
DQ993671 Bacillus axarquiensis
DQ993673 Bacillus malacitensis
AY820954 Bacillus nematocida①実験方法
EF433404 Bacillus vallismortis①実験方法
EF178464 Bacillus polyfermenticus
1）バイオ水の調整：水道水20Ｌ入りボリタンクにマーキュリーを浮かべ、室温25℃で静置、24時間毎に水を入れ替え。
SCD寒天培地上で生育したコロニー５株を単離し、16SrRNA遺伝子のEF433407 Bacillus velezensis
2）一般生菌、従属栄養細菌、芽胞菌の菌数計測
EU138496 Bacillus inaquosus
増幅、塩基配列を確認した。すなわち、27F及び1492Rを用いてコロ
EU835195 Bacillus amyloliquefaciensAサンプリング ：試験開始からそれぞれ24時間、7日間、14日間、21日間、28日間経過時のポリタンク中の水20ＬをメEU138487 Bacillus tequilensis
ニーダイレクトPCR、電気泳動で増幅産物を確認後、ゲルろ過精製、
EU159468 Bacillus szutsauensis
ンブレンフィルター法（孔径0．45㎛）で水中の細菌を回収。
PCR産物の濃度を測定。BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing
DQ139838 Bacillus olivae
B 培養：＜一般生菌＞ メンブレンフィルターを標準寒天培地にて37℃で48時間培養。
EF433411 Bacillus sonorensis
Kit(Applied Biosystems)によるシーケンス後反応産物を精製、ABI
AJ831843 Bacillus aerius＜従属栄養細菌＞ メンブレンフィルターをＰＧY培地にて37℃で1週間培養。
AJ224962 Bacillus amiliensis
PRISM 3100にて塩基配列を確認、 各塩基配列をSequencher ver.3.1.1
FM199947 Bacillus licheniformis＜芽胞菌＞ 滅菌生理食塩水ｌｍｌでメンブレンフィルター表面を洗浄し、その洗浄液を各耐熱処理条件に従っ
X60615 Bacillus fastidiosus
で解析し、BLAST searchにより最も近い菌種の塩基配列を推定し、同て熱処理、標準寒天培地にて混釈し37℃で48時間培養。
EU372876 Bacillus catenulatus
定した。
EU624419 Bacillus cibi
②結果
EU624425 Bacillus indicus
EU660360 Bacillus endophyticus
１日経過時の放出細菌数に対し、菌数減少は見られるものの２８日経過後においても一般生菌、従属栄養細菌、芽胞②結果
DQ166855 Bacillus cohnii
EU660373 Bacillus niabensis
菌を確認。20L中に放出される菌数は少ないが、長期間細菌を供給、分配する器材である。
AB245380 Bacillus panaciterrae
菌株1（S1)：Bacillus circulans
AY667496 Bacillus koreensis
1日目
7日目
14日目
21日目
28日目
EU884649
Bacillus flexus
日数AJ875426 Bacillus
danangensis ＃1
培養菌種
菌株2（S2)：Paenibacillus lautus
＃1＃2
＃1
＃2
＃2
＃1
＃2
＃1
＃2EU979528 Bacillus megaterium
EU240423 Bacillus
luciferensis
菌株3（S3)：Bacillus abyssalis
72232565
88192014
一般生菌(cfu/20L/1d) 72
DQ374637 Bacillus acidiceler 21EU046267 Bacillus shandongensis
菌株4（S4)：Paenibacillus sp.
4217 EF11332126
28295
1026
23
従属栄養細菌(cfu/20L/1d) 40
Bacillus halmapalus
EU834538 Bacillus litoralis
菌株5（S5)：Paenibacillus sp.
000AY829448 Bacillus
0 alkalitelluris612546
芽胞菌(cfu/20L/1ｄ)
EU841500 Bacillus horikoshii
AJ277983 Bacillus・7日間経過後…80℃、10分間
psychrotolerans*芽胞菌の耐熱処理条件： ・1日間経過後…100℃、10分間
・14、21、28日間経過後 …60℃、10分間
EU723830 Bacillus anthracis
EU760699 Bacillus odysseyi
AM773821 Bacillus cecembensis
EU366378 Bacillus silvestris
DQ399261 Bacillus mangrovensis
EU231621 Bacillus alcalophilus
S.aureus増殖
培養前
培養後培養前後
AB099708 Bacillus vietnamensis
①実験方法
菌株等
EU835731 Bacillus baekryungensisの菌濃度
S.aureus
S.aureus
抑制率EF451043
Bacillus
ferrariarumStaphylococcus.aureus (NBRC14462)と単離同定菌株S1～S5、およびBacillus属等標準株3株をSCD
Log cfu/ml
菌株等
EU835732 Bacillus marisflavi
Log cfu/ml Log cfu/ml（Log/Log)
ブイヨンで増菌培養後、それぞれ黄色ブドウ球菌用測定プレートSTX(3M®）および生菌数測定用
AY667495 Bacillus seohaeanensis
0.00
2.38
7.83---EU240369 Bacillus samanii
測定ACプレート（3M®）で菌数測定。増菌液はSCDブイヨンで段階希釈し、濃度の異なる希釈菌液
Control
DQ148952 Bacillus alkalitolerans
0.00
1.37
7.68---EU862321 Bacillus thuringiensis
各2ｍｌを混合し２４時間３５℃で培養後、増殖したS.aureus数を計測した。
EU924505 Bacillus mycoides
4.48
2.72
7.26
7.3%
Controlと比較してS.aureus増殖菌数が減少した割合を増殖抑制率として対数比で計算した。
AJ244688 Bacillus cf. cereus V4.BE.30
S1：Bacillus circulans
5.48
1.72
5.98
22.2%
EU746686 Bacillus pseudomycoides
EU927415 Bacillus aquimaris
6.81
2.72
6.30
19.5%
EU567689
Bacillus
weihenstephanensis②結果
S2：Paenibacillus lautus EU834274 Bacillus humi
1.72
4.04
47.4%
単離同定株5株のうちS2:Paenibacillus lautusとS4：Paenibacillus spでS.aureus増殖抑制率が高い組EU834241 Bacillus vireti 7.81
AM503357 Bacillus isabelae6.54
2.727.94-1.4%
み合わせがあった。S2株は標準株 Paenibacillus lautus（NBRC15380）と同菌種だが、標準株にはEU231617 Bacillus acidicola
S3：Bacillus abyssalis
7.54
1.72
6.25
18.7%
EU430991 Bacillus sporothermodurans
S.aureus増殖抑制傾向は見られなかった。
AB245378 Bacillus ginsengihumi
5.15
2.72
6.96
11.0%
circulans
NBRC13262
circulansも同様
標準株Bacillus（）も増殖抑制率が高く、同菌種のS1：Bacillus
AJ250318
Bacillus
shackletonii
S4：Paenibacillus sp.
EU652724 Bacillus smithii6.15
1.725.5627.6%に増殖抑制が高い傾向がみられた。
AB362281 Bacillus aeolius
AY605232 Bacillus alveayuensis
6.46
2.72
7.65
2.2%
S5：Paenibacillus sp.
DQ207560 Bacillus carboniphilus
7.46
1.72
6.57
14.4%
AF519462 Bacillus casamancensis
AY055221
Bacillus amyloliquefaciens
FZB42
5.08
2.38
5.22
33.3%
Bacillus circulans
FM207543 Bacillus mojavensis
FM992646 Bacillus safensis
6.08
1.37
5.26
31.5%
NBRC13262
EU924795 Bacillus clausii
1. 本微生物器材で調製した「バイオ水」はブドウ球菌を増殖抑制した。
patagoniensis
7.36AM911024 Bacillus2.38
7.96-1.7%
Paenibacillus lautus AB112729 Bacillus methanolicus
2. PCR-DGGE解析の結果「バイオ水」微生物はBacillus属菌に系統化された。
Z26931 Bacillus thermoalkalophilus
8.36
1.37
7.49
2.5%
NBRC15380
AJ271739
Bacillus
thermoterrestris
3. 5単離株はBacillus属（2株）およびPaenibacillus属（3株）だった。
AJ493665 Bacillus
thermantarcticus 2.38
5.71
7.29
6.8%
Paenibacillus chitinolyticus
AB362282 Bacillus caldovelox
4. 微生物器材は水中で28日間、連続して細菌を供給・分配する機能がある。
EU484355 Bacillus
caldolyticus
6.71
1.37
7.05
8.3%
NBRC15660EU484354
Bacillus caldotenax
5. S2、S4株（paenibacillus属）はS.aureus増殖抑制率高く（-2Log以上）、S1株
AB362707 Bacillus coagulans
DQ860186 Bacillus thermoamylovorans（Bacillus circulans）も高い傾向だった。トイレ悪臭はアンモニア産生菌（ブドD16279 Bacillus racemilacticus
名古屋学芸大学大学院
朝日メインテナンス工業（株）
X77789 Bacillus acidovorans
Z26939 Bacillus thermocloaceae
ウ球菌等）の増殖が原因であることから、本微生物器材の悪臭軽減の背環境衛生学研究室
統轄本部 バリュー推進部
AY288912 Bacillus thermozeamaize
AF039408 Bacillus tipchiralis
景にはブドウ球菌増殖抑制作用があると推測される。
Emil:s.watanabe@asahi-mtn.co.jp
Emil: mkishi@nuas.ac.jp
AF106594
Bacillus vortex

2. 「バイオ水」の微生物の解析

3. 「バイオ水」細菌の同定(Logブドウ球菌数 cfu/100㎠

1. 「バイオ水」のブドウ球菌生育抑制効果

4. 微生物器材からの細菌の分配～「バイオ水」中の菌数変化～

5. 「バイオ水」細菌の黄色ブドウ球菌に対する増殖抑制+

6. まとめ日本防菌防黴学会第42回年次大会_20150901 1Pp-29

EU147167 Bacillus badius
EU147194 Bacillus psychrodurans

EU147196 Bacillus massiliensis
AB042060 Bacillus schlegelii
AY518549 Bacillus solfatarensis

EF636899 Bacillus funiculus