別添４－２ 調査研究報告書（要旨）

ペットショップの子イヌにおけるクリプトスポリジウム感染の実態調査
Molecular detection and characterization of Cryptosporidium species in pet shop puppies
北里大学獣医学部獣医学科
伊藤 直之
Naoyuki Itoh, Kitasato University
キーワード： クリプトスポリジウム、子イヌ、ペットショップ
keywords：Cryptosporidium species, puppy, pet shop

1. はじめにクリプトスポリジウム（ Cryptosporidiumspp.）は、一般的な消化管内寄生原虫であり、世界中に分布してヒトやイヌを含む哺乳類、鳥類など多種の動物に寄生し、宿主に対してしばしば急性ないし慢性の消化器障害を引き起こすことが知られている 1, 2)。クリプトスポリジウ
ムは、少なくとも 20 種、40 以上の遺伝子型に分類され、ヒトに寄生する種はヒトに特異的な
C. hominis と人獣共通感染性の C. parvum であり、イヌに寄生する種はイヌに特異的な C.
canis であることが示されている 3, 4)。一方、少数ではあるが、ヒトの C. canis 感染例やイヌのC. parvum 感染例が報告されていることから 4)、クリプトスポリジウムは人獣共通感染性の原虫として注目されている。ヒトとイヌとの関係が親密になった現在、イヌにおけるクリプトスポリジウム感染状況を明らかにすることは、イヌとヒトの健康維持に重要と考えられる。特に、一般家庭で飼育されているイヌの最大の供給源と考えられるペットショップで飼育されている子イヌは、やがて一般家庭で飼育され、ヒトと親密に関わるようになることを考えれば、これらの子イヌがクリプトスポリジウムを保有している場合、ヒトの感染に対するレゼルボアとして重要な意義を持つことになる。
しかしながら、日本国内に限らず、ペットショップの子イヌにおけるクリプトスポリジウム感染状況は、解明されていないのが現状である。
そこで今回、ペットショップで飼育されている子イヌを対象に、クリプトスポリジウムの感染状況を PCR（polymerase chain reaction）法で調査すると同時に、一部の陽性検体について、その PCR 増幅産物をシーケンス解析することで種を特定し、イヌからヒトへのクリプトスポリジウム伝播について考察した。
２．材料と方法
2.1 糞便材料
2012 年 4 月～12 月の期間に、東日本の 4 カ所のペットショップで飼育されている 3 カ月齢以下の子イヌ 471 頭から採取した新鮮な糞便を調査の材料とした。糞便は、その性状を肉眼的に分類した（固形便と軟便・下痢便）。
2.2 クリプトスポリジウムのオーシスト回収
糞便材料からのクリプトスポリジウムオー
シストの回収は、ショ糖遠心浮遊法 5)を用いて行った。
2.3 クリプトスポリジウム DNA の抽出
クリプトスポリジウムオーシストの懸濁液を、100℃で 5 分間インキュベートした後、4℃で 5 分間冷却する操作を 3 回繰り返し、QIAamp® DNA Mini Kit（Qiagen, Hilden,Germany）を用いて説明書に従いクリプトスポリジウムの DNA を抽出した。DNA 抽出物は、nested PCR に使用するまで－20℃で冷凍保存した。
2.4 クリプトスポリジウム検出の nested
PCR
クリプトスポリジウムの検出は、18S(SSU)rRNA 遺伝子をターゲットとして、特異的なプライマーペアを用いた nested PCR 法で実施した 6)。
2.5 アガロースゲル電気泳動

2nd PCR の増幅産物は、臭化エチジウムを添加した 1.5%アガロースゲル上で電気泳動を行い、目的とする約 500 bp の遺伝子断片が確認できた検体をクリプトスポリジウム陽性と判定した（図 1）。

2.6 シークエンス解析
クリプトスポリジウム陽性検体から無作為に 55 検体を抽出し、外部業者（グライナー・ジャパン（株））にシークエンス解析を依頼した。
解析した各検体のシークエンスデータは、MEGA Version 5.05 を用いて DNA 配列のアラインメント処理と編集を行い、検体の DNA 配列を完成させた。各 DNA 配列は、BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)を使って GenBank データベースに登録されているクリプトスポリジウムの DNA 配列と比較し、種を特定した。
2.7 統計解析
統計学的解析は，カイ二乗検定用いて危険率が 5%以下（P< 0.05）の場合に有意差があると判断した．

2.3 ペットショップ別のクリプトスポリジウ
ム検出率
ペットショップ別の検出率は、ペットショッ
プ A：40.0%（60/150）、B：23.5%（53/226）、C：42.4%（25/59）、D：（11/36）であり、ペットショップ B の検出率は、ペットショップ A お
よび C に比較して有意に低かった（それぞれP< 0.001 および P< 0.01）（表 2）。

2.3 陽性検体のシーケンス解析
クリプトスポリジウム陽性検体から無作為に抽出した 55 検体のシーケンス解析では、すべ て が C. canis （ GenBank accession No.
JQ413439.1、EU754826、JN543385.1）に 99%～100%一致した（図 2）。

３．成 績
1.1 全体のクリプトスポリジウム検出率
クリプトスポリジウムは、調査した子イヌ
471 頭の 31.6%（149 頭）から検出された。
2.2 糞便性状別のクリプトスポリジウム検出率
糞便性状別のクリプトスポリジウム検出率
は、固形便 31.5%（136/432）、非固形便 33.3%（13/39）であり、糞便性状による差は認められなかった（表 1）。

４．考 察
クリプトスポリジウムの検出方法としては、
ショ糖浮遊法で回収したオーシストを好酸染色や蛍光染色後、光学顕微鏡や蛍光顕微鏡で観察するのが一般的な方法である 2, 7, 8)。しかしながら、クリプトスポリジウムオーシストは微小であり、また、オーシストの糞便への排泄が間欠的であるために、検出が困難な場合がある 2)。
これに対して、PCR 法は少数のオーシストからも高感度に DNA を検出することが可能であり2, 3)、さらに、PCR で得られた増幅産物をシーケンス解析することで、クリプトスポリジウムの種を特定することができることから 9, 10)、人獣共通感染性を考察するための重要なツールでもある。
これまで、日本国内のイヌにおけるクリプトスポリジウムの感染状況に関しては、一般家庭で飼育されているイヌを対象とした PCR 法を用いた調査で、検出率が 3.9%（3/77）であり、すべて C. canis であったことが報告されている11)。また、不要イヌを対象とした PCR 法を用いた調査では、9.3%（13/140）の検出率であり、すべてが C. canis であったと報告されている 12)。
一方、ペットショップは、一般家庭で飼育される子イヌの最大の供給源であると考えられるにもかかわらず、それらの施設で飼育されている子イヌの感染状況や感染しているクリプトスポリジウムの種については、国の内外を問わず明らかにされていない。本研究の成績で、クリプトスポリジウムの検出率は 31.6%（149/471）と高く、ペットショップ内、あるいは、それ以前の繁殖施設でクリプトスポリジウムの感染サイクルが存在し、これらの施設がクリプトスポリジウムの感染源として重要であることが示唆された。
イヌのクリプトスポリジウム検出率は、若齢のイヌや繁殖施設のイヌで高いことが指摘され 2, 4, 13)、免疫学的な未熟さや限られた空間での多頭飼育が関与していると推察されている2)。さらに、クリプトスポリジウムオーシスト
は、消毒薬に耐性であること 14)もペットショップや繁殖施設での蔓延に関与していると考えられる。他方、クリプトスポリジウムの検出率がペットショップ間で差があったことは、各施設における衛生管理の違いによるものと推察される。
クリプトスポリジウム検出と糞便性状には関連性が認められず、従来の報告と一致していた 2, 11, 13)。しかしながら、クリプトスポリジウ
ムの感染に関係したイヌの下痢症も報告され 2)、
また、ヒトでは免疫が低下した状態での易感染性や症状の重篤化が指摘されている 4)。一方で、糞便性状に異常が認められない場合、ペットショップの管理者が子イヌのクリプトスポリジウム感染に気づく可能性は低いと推測され、感染が蔓延する一因であると考えられる。
本研究で、クリプトスポリジウム陽性検体から無作為に抽出してシーケンス解析した 55 検体は、すべてが C. canis に一致した。これまでの報告でも、イヌから分離したクリプトスポリジウムのほとんどが、C. canis である 4, 11, 12)。
ま た 、 ヒ トの 感 染 例は、 C. hominis と C.
parvum がほとんどである 3, 4, 9)。以上のことから、日本国内のペットショップで飼育されている子イヌのクリプトスポリジウム検出率は高いものの、ヒトへの感染源となる可能性は低いと考えられる。ただし、C. canis は HIV に感染した下痢をともなったヒトや、まれには健康なヒトからも検出されていること 4, 9, 15)、そして、C. parvum がイヌからも検出されていることから 4)、C. parvum と C. canis は人獣共通感染性であるとされている。さらに、室内で飼育されるイヌが増加していることやヒト・イヌともに高齢化の加速と腫瘍性疾患の増加によって、免疫低下の個体が多く存在すると推測されることから、今後、イヌからヒトへのクリプトスポリジウムの感染機会は、増大する可能性があると考えられる。したがって、ペットショップの子イヌを中心に、一般家庭で飼育されているイヌにおいても、クリプトスポリジウムの感染を注意深く監視する必要があると考えられる。

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