※以下の名称は日本における東ソー株式会社の登録商標です。
“バイオアシスト／BIOASSIST”、“Enviropak／エンバイロパック”、“Enviropak／エンビロパック”、“Lipopropak／リポプロパック”、“トヨパール／TOYOPEARL”、“トヨパールパック／TOYOPEARLPAK”、“マイショリディスク”、“PStQuick”、“TSKgel SuperOligo”、“SuperOligo”、“NPR”

TOYOPEARL® 総合カタログ※以下の名称は日本、米国、欧州共同体、中国等における東ソー株式会社の登録商標です。
“TSKgel”、“BioAssist”、“Lipopropak”、“TSKgel STAT”、“TSKgel SuperMultipore”、“TOYOPEARL”、“TOYOPEARL GigaCap”、“TOYOPEARL MegaCap”、“ToyoScreen”、“TOYOPAK”※“HLC”は日本、中国における東ソー株式会社の登録商標です。
※外観、仕様は予告なく変更することがあります。
※掲載写真と説明文、構成ユニットは異なる場合があります。
※製品の多くは毒性・安全性について検査されていません。
特に警告・注意がなくても、無害・無毒であると保証されている訳ではありません。
※当社製品を使用して得られた分離精製物または精製溶液を、製品及び中間体として使用する場合は、十分にその安全性の確認を行ってご使用ください。
※記載されたデータは当社が取得した参考データで、保証するデータではありません。
お客様の使用環境・条件・判断基準に合わせてご確認もしくはデータの取得をお願い致します。

バイオサイエンス事業部
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バイオサイエンス事業部ホームページ
http://www.separations.asia.tosohbioscience.com■海外でのお求めについて
TSKgel、TOYOPEARLは、海外でもご購入できます。
海外でのお問い合せは下記までお願いいたします。

●Tosoh Bioscience LLC
Address：3604 Horizon Drive Suite 100, King of Prussia, PA 19406, USA
Telephone：+1 800 366 4875 Fax：+1 610 272 3028
●Tosoh Bioscience GmbH
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TSKgel® Bulk Resin

Product Guide

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お問い合せ E-mail●製品全般、カタログに関するお問い合せ●カラム、分離に関するお問い合せ●装置の技術相談に関するお問い合せ

TOYOPEARL® Bulk Resin

hlc@tosoh.co.jp
tskgel@tosoh.co.jp
csc@tosoh.co.jp

5701GX- 品番0994040 D

はじめに
TOYOPEARL充塡剤
TOYOPEARLはラボスケールから生産スケールまでのクロマト

目 次グラフィーに適した親水性ポリマー充塡剤です。機械的強度の高い

安全性データと保証
すべてのバルク充塡剤の安全性データシート（SDS）が常にアップデートされています。

ポリマー骨格を持つため、市販されている多くの充塡剤よりも優れた圧損 /流速特性を示します。高い線速度で溶液を流せることから、

はじめに

製品概要

… ………………………………………………………

… ………………………………………………………

3

4

プロセスの生産性向上とサイクル時間の短縮に大きく寄与します。
TOYOPEARLは pH 2〜 12の範囲で安定であり、更に洗浄の場

医薬品などの製造に TOYOPEARLをご使用いただくため、合ではpH 1〜 13の範囲まで使用することができます。平均粒子径

TOYOPEARLの各種基礎データの充実を図り、GMPやバリデーとして35 μm
（一部30 μm）
、65 μm（一部75 μm）及び100 μション支援を行っています。

mのタイプを用意しておりますので初期精製、中間精製、高分離能分離工程などの目的に合わせてお使いいただけます。また、細孔径の異なる製品が用意されており、サイズ排除、イオン交換、疎水、ア
フィニティークロマトグラフィーなどの各種分離モードに対応可能

サイズ排除クロマトグラフィー
製品の特長
製品一覧

… ………………………………………………………

5… ………………………………………………………

6… ……………………………………………………… 10です。細孔径と表面積を最適化することにより目的成分の分子サイ
TSKgel充塡剤と同じ化学組成で作られており、TSKgelを使用して開発したメソッドをシームレスにスケールアップすることがで
きます。

製品の特長
製品一覧

疎水クロマトグラフィー… ……………………………………………………… 12… ……………………………………………………… 21… ……………………………………………………… 25

製品の特長… ……………………………………………………… 26

製品一覧… ……………………………………………………… 32● 化学物質の審査及び製造等の規制に関する法律（化審法）に関する届出● 少量新規化学物質に関する届出

GMP、バリデーション支援・試験データ● バイオバーデン対応（医薬品等の製造原料の微生物汚染に関する品質保証）● 製品の長期放置安定性試験

TSKgelカラムで使用されている粒子径 20 μm及び 30 μmの… ……………………………………………………… 11

法規制関連

ズによらず高い動的吸着量が得られます。

TSKgel 5PW充塡剤

イオン交換クロマトグラフィー

TOYOPEARLの GMP、バリデーション支援データ、法規制関連資料● 製品溶液中の全有機炭素（TOC）定量試験● 製品中の残留モノマー確認試験

充塡剤が用意されており、生産スケールのイオン交換クロマトグラ● 有機溶媒洗浄における溶出物の定量試験

フィーや疎水クロマトグラフィーにご利用いただけます。これらの● 製品の安全性試験（毒性試験、変異原性試験等）

製品は機械的強度と吸着性に優れ、高い分離性能と理論段数が必要● アルカリ溶液中での長期放置安定性試験とされる分取用やプロセス用の充塡剤としてご利用いただけます。

● アルカリ溶液中での溶出物の同定試験

TSKgelカラムのさらに詳しい情報をご希望のお客様は当社の『TSKgel / TOYOPEARL総合カタログ』をご請求ください。

スクリーニング・プロセス開発用カラム
ToyoScreen®、MiniChrom®、RoboColumn®
ToyoScreenは、各種 TOYOPEARLを充塡した簡易型のスク● アルカリ溶液を用いたCIPにおける耐久性試験● TOYOPEARL CIPマニュアル※ 上記試験データの内容等の詳細につきましては、当社営業までお問い合せください。
※ 上記試験データは、そのグレード、数値を保証するものではありません。
※ TOYOPEARLのバリデーションを含めたインハウスセミナーも行っております。詳細は、当社営業までお問い合せください。

リーニング用カラムです。1 mL、5 mLのカートリッジカラムが用意されており、精製プロセス開発のための充塡剤スクリーニングや分離条件の初期検討が、汎用 LCシステム等に接続して容易に行えます。
MiniChromは、カラムサイズ8 mm I.D. × 10 cm（容量5 mL）で、ToyoScreenカラムでのスクリーニング後、分離条件の至適化や小ミックスモードクロマトグラフィー… ……………………………………………………… 35

製品の特長… ……………………………………………………… 36

製品一覧… ……………………………………………………… 38

アフィニティークロマトグラフィー

RoboColumnは、Tecan社 Freedom EVO®のような全自動分
注システムとの組み合わせで使用するミニカラムでハイスループッ
トでの充塡剤スクリーニングや条件検討が可能です。
※ MiniChrom、RoboColumnはAtoll GmbHの登録商標です。
Freedom EVOはTecan Group Ltd.の登録商標です。

… ……………………………………………………… 39

製品の特長… ……………………………………………………… 40

製品一覧… ……………………………………………………… 48

TOYOPEARLの使用法・充塡法

スケールでの分取精製用に設計されたカラムです。

… ……………………………………………………… 50

3

製品概要

充塡剤

サイズ排除クロマトグラフィー用
イオン交換クロマトグラフィー用TOYOPEARL HWタイプ
陰イオン交換体

TOYOPEARL GigaCap Q-650
TOYOPEARL GigaCap DEAE-650
TOYOPEARL SuperQ-650
TOYOPEARL DEAE-650
TOYOPEARL Q-600 AR
TOYOPEARL QAE-550
TOYOPEARL NH2-750

陽イオン交換体

サイズ排除クロマトグラフィー
（SEC）
粒子径

200 µmTOYOPEARL HW-40EC

75 µm

TOYOPEARL HW-40C
TOYOPEARL HW-50C
TOYOPEARL HW-55C
TOYOPEARL HW-65C

45 µm

TOYOPEARL HW-40F
TOYOPEARL HW-50F
TOYOPEARL HW-55F
TOYOPEARL HW-65F
TOYOPEARL HW-75F

30 µm

TOYOPEARL HW-40S
TOYOPEARL HW-50S
TOYOPEARL HW-55S
TOYOPEARL HW-65S
TOYOPEARL HW-75S

TOYOPEARL GigaCap S-650
TOYOPEARL GigaCap CM-650
TOYOPEARL SP-650
TOYOPEARL CM-650
TOYOPEARL SP-550
TOYOPEARL MegaCapⅡSP-550
TOYOPEARL Sulfate-650

疎水クロマトグラフィー用

650シリーズ

TOYOPEARL Hexyl-650
TOYOPEARL Butyl-650
TOYOPEARL Phenyl-650
TOYOPEARL Ether-650

600シリーズ

TOYOPEARL Phenyl-600
TOYOPEARL Butyl-600
TOYOPEARL PPG-600

充塡カラム

550シリーズ（高吸着タイプ）

TOYOPEARL SuperButyl-550

ミックスモードクロマトグラフィー用

650シリーズ

TOYOPEARL MX-Trp-650M

アフィニティークロマトグラフィー用

群特異的AFC用TOYOPEARL AF-650タイプ

活性化型AFC用TOYOPEARL AF-650タイプ

プロセス開発用カラム

ToyoScreenシリーズ
MiniChromシリーズ
RoboColumnシリーズ

セミ分取用、工業用※詳細やTOYOPEARLの大口径充塡カラムについては、当社営業までお問い合せください。

4

特別注文にてお受けします※

サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）
プロセス精製におけるサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）
の役割

細孔径

表1

TOYOPEARL HWタイプの特性と分子量分画範囲

SEC用のTOYOPEARL HWタイプには5段階の分画範囲に対応

サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）は、水溶液中の分子の大きするグレード、細孔径が用意されています。どのタイプが最適であ

さにより、充塡剤内での浸透性が異なることで分離されます。充塡カ

るかは試料中に含まれる成分の分子量に依存します。たんぱく質、

ラムの中の充塡剤の最大細孔径よりも大きなサイズを持つ分子は充デキストラン、PEGポリマーを対象としたときの選択条件をまと塡剤粒子の細孔内部へ入り込むことができず、充塡剤粒子の間を素めて表1、表2に示します。

試料の分子量（Da）
TOYOPEARL

粒子径
（μm）

細孔径
（nm）

ポリエチレングリコール
及びポリエチレンオキシド

デキストラン

球状たんぱく質（ワクチンなどを含む）

HW-40S

20 ‒ 405100 ‒ 3,000

100 ‒ 7,000

100 ‒ 10,000

12.5

100 ‒ 18,000

500 ‒ 20,000

500 ‒ 80,000

50

100 ‒ 150,000

1,000 ‒ 200,000

1,000 ‒ 700,000

100

500 ‒ 1,000,000

10,000 ‒ 1,000,000

40,000 ‒ 5,000,000＞100

4,000 ‒ 5,000,000

100,000 ‒ 10,000,000

500,000 ‒ 50,000,000

通りして最初に溶出します。より小さな分子は充塡剤粒子内の細孔

HW-40F30 ‒ 60に入り込めるため溶出が遅くなります。従って分子量の大きい順に

HW-40C50 ‒ 100

CH3

HW-50S

20 ‒ 40

C

HW-50F30 ‒ 60

C=O

HW-55S

20 ‒ 40

HW-55F30 ‒ 60

HW-65S

20 ‒ 40

HW-65F30 ‒ 60

HW-75S

20 ‒ 40

HW-75F30 ‒ 60

CH3

溶出します。
SECは、目的とするたんぱく質を凝集体や大幅に分子量の異なる不純物から分離するための最終精製ステップとしても使用され

CH2

C

CH2

C=O

ます。また、精製後のたんぱく質の脱塩処理にも利用されます。
TOYOPEARL HWタイプには種々の粒子径、細孔を有する充塡剤Oがあります（表1参照）。これらのSEC用TOYOPEARL HWシリーズ

R2

R1にイオン交換基や疎水基、アフィニティーリガンドなどを導入して化学的に修飾した充塡剤も用意しています。

O

TOYOPEARLサイズ排除クロマトグラフィー充塡剤は水酸基がの SEC分離に有効に機能します。TOYOPEARLは、官能基を導入

R2

C=O

充塡剤の化学構造導入されたポリマー充塡剤です（図1）。表面の水酸基がたんぱく質

O

CH2

C

CH2

CH3

O

R1 : Aliphatic group
R2 : Hydroxylated
aliphatic group

C=O
C
CH3

したタイプを含めて、クロマトグラフィー用充塡剤の中でも非特異的吸着の低い製品です。例えば血液成分の分離では充塡剤と試料と

図 1 TOYOPEARL SEC充塡剤の化学構造（ヒドロキシアクリル）

表2

TOYOPEARL HWタイプの適用分子量範囲

10

2

10

3

10

4

10

5

10

6

10

7

HW-40

の相互作用が目的物質の回収率低下の原因となることから、この非HW-50

特異的吸着が低いことが特に重要です。

a) 球状たんぱく質

HW-55

また、半硬質ゲルであるため、アガロース系のような軟質充塡剤と比較して優れた圧損/通液特性を有しています。

HW-65
HW-75

● 狭い粒子径分布● 優れた機械的強度・高分離能、より効果的な分離

A
N
R
s
ru
vi
ol

io

分子量スタンダード

P

C

A
C
yt
In TH
R o
su
i
c
α bo h- C n ro lin
hy u mm cle eot a Cry sep
O sino A
va g
H
um
lb en
an A umlγ bu in
-G m
lo in
A bu
ld lin
C ola
at s
a e
Th U lasyr re eog asBlu lob ee
D ulinexHem tra
n
oc
ya
ni
n

12
B
in

・非特異的吸着の低減m● 親水性多孔質ポリマー構造V
ita・高分離能、シャープなピーク

Le● 微細粒子径グレード

uc

in

e

TOYOPEARL HW タイプの特徴及び利点

HW-40

流通特性（流速 / 圧力の関係）の向上

HW-50b) デキストラン

HW-55

・工業用大型カラムでの優れた通液特性（＜0.3 MPa）

HW-65

・溶液の塩濃度が変化しても、カラムベッド容量の変化が少ない● 優れた化学的安定性（pH 2 ‒ 14）

HW-75

・定置洗浄（CIP）における酸、アルカリ、有機溶媒での洗浄が可能
・昇温（4 ‒ 60 ℃）や、121℃でのオートクレーブに対応

HW-40
HW-50

● TSKgel HPLC 充塡剤と同じ特性

・TSKgel HPLC カラムからスケールアップが可能c) ポリエチレングリコール
及びポリエチレンオキシド

HW-55
HW-65
HW-75

6

7

サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）
溶離液の影響TOYOPEARL HWタイプで分画可能な範囲はペプチドからたん
3

溶離液の組成も SECの分離に影響します。図 4に TOYOPEARL

4にTOYOPEARL HWタイプの球状たんぱく質に対する較正曲線を

HW-55F充塡カラムを使用し、塩濃度を変えた場合のたんぱく質

2

示します。
1

HW-75

6

HW-65

5
Log MW (Da)の較正曲線を示します。塩濃度はたんぱく質の流体力学的半径を変Catalase (pl 5.5)化させる能力を持つため、イオン強度の大小によって実効分子サイ

γ-Globulin (pl 6.6)
Yeast ADH (pl 5.4)

ズが増大または減少し、溶出容量が変化します。

7

HW-55

4

HW-50
3

HW-40
2

カラム：
22 mm I.D. × 30 cm

SEC測定において目的物質は充塡剤と相互作用をしないというのが理想ですが、実際には分析種と充塡剤との二次的相互作用を最C-grade

試 料：
標準たんぱく質
溶離液：
0.06 mol/L りん酸塩緩衝液（pH 7.0）＋ 0.06 mol/L KCl
略 号：
Ve = elution volume,
Vc = column volume

3

2

小にするような塩濃度を選択しなければなりません。
4

1

F-grade● 微生物耐性TOYOPEARLは有機合成により作られた材料であり、微生物の作用による劣化に耐性があります。

1
0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80

TOYOPEARL SEC充塡剤の有機溶媒系溶離液中での特性

Ve / Vc較正曲線

粒子径
分離能は粒子径が小さくなるほど向上します（図3）。
TOYOPEARL HWタイプには 3種類の粒子径を有するグレードが用意されています：
Sグレード ： 20〜40 μm（Superfine）
Fグレード ： 30〜60 μm（Fine）

2

2.5

Elution T i me (h)カラム：TOYOPEARL HW-55, 26 mm I.D. × 70 cm
溶離液：33.3 mmol/L りん酸塩緩衝液（pH 7.0）＋ 0.2 mol/L NaCI
流 速：106 mL/h（20 cm/h）
温 度：25 ℃
検 出：UV（280 nm）
試 料：1. チログロブリン（0.3 %）2. γ- グロブリン（0.3 %）3. β- ラクトグロブリン（0.3 %）4. チトクロム C（0.1 %）
注入量：1 mL

Cグレード ： 50〜100 μm（Coarse）

グレードが使用されます。

Thermolysin (pl 5.1)
Chymotrypsinogen A(pl9.5)
Trypsin (pl 10.5)
Lysozyme (pl 11.0)
RNase A (pl 9.5)
Cytochrome C (pl 10.6)

4.0
60

80

100

120

140

160

180

Elution Volume (mL)
カラム：TOYOPEARL HW-55F, 22 mm I.D. × 50 cm
溶離液：25 mmol/Lトリス塩酸塩緩衝液 ＋ 0.5 mol/L NaCl（pH 7.5）（●）
25 mmol/Lトリス塩酸塩緩衝液（pH 7.5）（○）
流 速：1.0 mL/min（16 cm/h）
温 度：5-10 ℃
検 出：UV（280 nm, 420 nm for heme proteins,
200 nm for proteins without aromatic amino acid）

有機溶媒や有機溶媒と水との混合溶液でも使用することができます。ただし、溶媒によっては、表3及び4に示すとおり、溶媒中の

図 4 NaClの添加の有無におけるたんぱく質のSEC溶出容量の比較

水分含量に応じてゲルベッドが収縮または膨潤を起こすことがあります。オリゴ糖やポリエチレングリコールの SEC分離用として
DMSOの使用も可能です。また、DMFも使用できますので、DMFを溶媒としてポリスチレンのような疎水性物質を SECで分離することもできます。

その他の応用：TOYOPEARL HWタイプはサイズ排除クロマトグラフィーや脱塩用途で用いられますが、それ以外にも次のような用途でも使用されています：

図 3 TOYOPEARL HW-55の異なる粒子径における分離能の比較
高い分離能を必要とする場合は、より粒子径の小さな Sまたは F

Porcine Pepsin (pl〜1.0)
Subtilisin Carlsberg (pl 9.4)
Subtilisin BPN (pl 9.1)

● シャープなクロマトピーク

S-grade図 2 TOYOPEARL HWタイプの球状たんぱく質に対する4.5● 化学的安定性4● 温度安定性

1.5

Apotransferrin (pl 5.5)
Hemoglobin (pl 6.8 - 7.0)

● ゲルベッド容積がほとんど変化しない

3
2

検 出：
UV（280 nm）

1

5.0

TOYOPEARL SEC充塡剤の水系溶離液中での特性● 優れた機械的強度

1

Urease (pl 4.8 - 5.1)

5.5

Log MW

ぱく質まで、分子量として 100〜 50,000,000の範囲です。図 2

・ 生体試料から Triton X-l00等の界面活性剤を疎水的吸着性を除去する

表 3 TOYOPEARL充塡剤の各種溶媒における膨潤収縮
TOYOPEARL

HW-40 HW-50

HW-55 HW-65 HW-75

H 2O

100

100

100

100

100

0.2 mol/L KCl

100

100

100

100

100

CH 3OH

100

100

100

100

105

C2H 5OH

100

100

100

100

110

DMF

110

110

105

105

120

Acetone

80

80

85

90

110

Toluene

65

70

70

75

90

・選択する溶媒系によっては逆相用充塡剤としてカテキンなど低分子化合物の分離も可能

表 4 TOYOPEARL HW-40の各種溶媒における水に対しての膨潤収縮
TOYOPEARL DMSO
HW-40

8

140

Ethyl
CHCl3/
Acetate Benzene CHCl3 CH3OH（1/1）
80

70

105

120

9

サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）
製品一覧表
TOYOPEARL SEC充塡剤
		 品 番品 名							
0007447TOYOPEARL HW-40S

0014681

500

500
1,000

0007968

5,000
TOYOPEARL HW-40C

0014683

20 – 40

4.5 × 104500

30 – 60

4.5 × 104

20 – 40

3.8 × 105

30 – 60

3.8 × 105

20 – 40

2.5 × 106

30 – 60

2.5 × 106

20 – 40

   2 × 10

30 – 60

   2 × 107

TOYOPEARL MegaCapⅡSP-550EC

100 µmTOYOPEARL SuperQ-650C
TOYOPEARL QAE-550C
TOYOPEARL Q-600C AR
TOYOPEARL DEAE-650C

500

75 µm

TOYOPEARL GigaCap Q-650M
TOYOPEARL GigaCap S-650M
TOYOPEARL GigaCap DEAE-650M TOYOPEARL GigaCap CM-650M

65 µm

TOYOPEARL SuperQ-650M
TOYOPEARL DEAE-650M

TOYOPEARL SP-650M
TOYOPEARL CM-650M

45 µm

TOYOPEARL NH2-750F

TOYOPEARL Sulfate-650F

35 µm

TOYOPEARL GigaCap Q-650S
TOYOPEARLSuperQ-650S
TOYOPEARL DEAE-650S

TOYOPEARL GigaCap S-650S
TOYOPEARL SP-650S
TOYOPEARL CM-650S

30 µm

TSKgel SuperQ-5PW（30）TSKgel DEAE-5PW（30）

TSKgel SP-5PW（30）TSKgel SP-3PW（30）20 µm

TSKgel SuperQ-5PW（20）TSKgel DEAE-5PW（20）TSKgel SP-5PW（20）5,000
TOYOPEARL HW-55F

0014687

TOYOPEARL SP-650C
TOYOPEARL SP-550C
TOYOPEARL CM-650C

500
1,000

0008063

5,000
TOYOPEARL HW-65S

0014688500
1,0000008068

5,000
TOYOPEARL HW-65F

5000014689

1,000

0008069

5,000
TOYOPEARL HW-75S

00080710007469

   7 × 103

1,00000080620007468

50 – 100

陽イオン交換体

5,000
TOYOPEARL HW-55S

00146860007465500

陰イオン交換体

200 µm1,000

0008060

0007464

500

粒子径

5,000
TOYOPEARL HW-50F

00146850007457

   7 × 103

イオン交換クロマトグラフィー
（IEC）

1,000

00080590007456

30 – 60

5,000
TOYOPEARL HW-50S

00146840007453

   7 × 103

1,00000079690007452

20 – 40

5,000
TOYOPEARL HW-40F

00146820007449

粒子径		 排除限界（デキストラン）（μm）		
（Da）

1,000

00079670007448

容量		（mL）		

500

7

5,000
TOYOPEARL HW-75F

500

0014691

1,000

0008072

5,000＊ 価格につきましては、「TSKgel / TOYOPEARL総合カタログ」をご覧ください。
＊ TOYOPEARL HW-40にはECグレード（100-300μm）もあります。
＊ 容量1,000 mL、5,000 mLの製品の価格につきましては、当社営業までお問い合せください。

RoboColumn
		 品 番
品 名		
					

10

容量		
（μL）		

粒子径（μm）

0045071

TOYOPEARL HW-40F

200 × 830 – 600045072

TOYOPEARL HW-40F

600 × 830 – 60

イオン交換クロマトグラフィー（IEC）
イオン交換クロマトグラフィー用TOYOPEARL充塡剤

表 4 TOYOPEARL及びTSKgelイオン交換体の細孔径

表 1 各種分離モードにおける吸着量の比較

イオン交換クロマトグラフィー（IEC）は医薬用たんぱく質の精製
分離モード

標準たんぱく質の吸着量（g/L）

製造プロセスでの吸着量（g/L）

選択する理由は、他の分離モードと比較して大きな動的吸着量を持

イオン交換体100 ‒ 200

50 ‒ 100

つことによります（表1）。

疎水充塡剤

40 ‒ 60

10 ‒ 30

アフィニティー充塡剤

40 ‒ 100

20 ‒ 60

逆相充塡剤

60 ‒ 100

30 ‒ 50などで広く使用されている分離モードです。多くの製薬メーカーがクロマトグラフィーによる成分の吸着や濃縮ステップとして IECを充塡剤のイオン交換基

基材

TOYOPEARL HW-65 or TSKgel G5000PWTOYOPEARL HW-60

TOYOPEARL HW-55

細孔径

100 nm

75 nm

50 nm

TOYOPEARL GigaCap S-650

TOYOPEARL Q-600C AR

TOYOPEARL MegaCapⅡSP-550

TOYOPEARL GigaCap Q-650
TOYOPEARL GigaCap DEAE-650

TOYOPEARL QAE-550

TOYOPEARL SuperQ-650

TOYOPEARL及び TSKgelの IEC充塡剤は 6種類の異なるイオ

TOYOPEARL DEAE-650

ン交換基を持つタイプが用意されています（表2参照）。

TOYOPEARL SP-650● 陰イオン交換体3種類：Ｑ（QAE）、DEAE、NH2

Q, SuperQ, QAE pKa = 12.2

● 陽イオン交換体3種類：SP（S）、Sulfate、CM

DEAE pKa = 11.5

これらのイオン交換基のpKa値をまとめて図 1に示します。また
特長と用途をまとめて表2に示します。

基材となる充塡剤の細孔径を幅広い範囲で用意しており、イオン

De

cr

ea

sin

g

TSKgel SP-5PW
TSKgel DEAE-5PW

re

sin

※TOYOPEARL NH2-750F（基材：HW-75、細孔径：>100 nm）

S,SP pKa = 1.2

pK

細孔径の選択吸脱着クロマトグラフィー用*pKa Toyopearl GigaCap CM-650M = 3.6

イオン交換基とpKa値

複数の粒子径でスケールアップまたはダウンが容易
TOYOPEARL HW-65と TSKgel G5000PWシリーズの製品● 目的物質に適した、適切な細孔径の充塡剤を選択します。

は共通の化学的性質と選択性を持っていますので、イオン交換体の●初期精製には、大きな粒子径の充塡剤を、中間精製や最終精

スケールアップまたはスケールダウンが容易です。粒子径を小さく製には、より小さな粒子径の充塡剤を選択します。

イオン交換基と特長、用途
イオン交換基（TSKgel SP-3PW）

TSKgel SuperQ-5PW

CM pKa = 4.7*a

図1

TSKgel SP-5PW

7.0

交換体としては次の 4種類があります：100 nm以上、100 nm、75 nm、50 nm（表4）。

TOYOPEARL CM-650
TOYOPEARL Sulfate-650F

NH2 pKa = 8

Anion
Cation充塡剤の細孔径表2

TOYOPEARL SP-550

TOYOPEARL GigaCap CM-650

すると分離能は向上しますが、試料成分の溶出順序自体は変化しま
せん。

特長、用途

フロースルークロマトグラフィー用

DEAEタイプ

塩濃度が低い試料に適する。吸着が強すぎる試料や、巨大分子量試料に適する。

NH 2 タイプ

塩濃度が高くても吸着しやすい。抗体の凝集体、巨大分子量試料の吸着に適する。

物質を排除するような細孔径の充塡剤を選択することによ

Q（QAE）
タイプ

吸着・保持力が強く、凝集体や DNA、エンドトキシンなどの吸着除去に、フロースルーモードでも利用。
塩濃度が高くても吸着しやすい。

り、効率の良い精製が可能になります（この手法は kinetic

SP（S）
タイプ

DNAや培養液中の色素や pH 指示薬などが吸着されにくい。初期精製に効果的に利用。

され、わずか1 ％の充塡剤表面しか利用されず、吸着、回収

Sulfate タイプ

塩濃度が高くても吸着しやすい。ヘパリンアフィニティーゲルに似た挙動を示す。

CM タイプ

SP（S）
タイプと異なる分離選択性を示す。

● 目的物質の大きさが、不純物成分よりも大きい場合は、目的

exclusionとして知られており、吸着条件で目的物質が排除率のロスが最小限である場合に使用されます）。
高分子量不純物の除去法● 目的物質が、細孔内部に入り込め、かつ不純物は、排除され

表 3 イオン交換体の特長

る細孔径の充塡剤を選択します。

基材

細孔径
(nm)

粒子径
(μm)

交換容量
(eq/L)

吸着量
DBC※ (BSA)(g/L)

TOYOPEARL GigaCap Q-650M

HW-65

100

50 ‒ 1000.10 ‒ 0.20

≧162

TOYOPEARLイオン交換体の全てのグレードで、充塡剤量1 mL

TOYOPEARL GigaCap DEAE-650M

HW-65

100

50 ‒ 1000.15 ‒ 0.25

≧156と 5 mLカラムが用意されています。ToyoScreenは、スクリーニ

TOYOPEARL SuperQ-650M

HW-65

100

40 ‒ 900.20 ‒ 0.30

105 ‒ 155

ング（初期検討）における目的物質の吸着保持と回収率の検討に適

TOYOPEARL DEAE-650M

HW-65

100

40 ‒ 900.08 ‒ 0.12

25 ‒ 35

したカラム製品です。複数のカラムを直列接続することで、更に分TOYOPEARL Q-600C AR

HW-60

75

50 ‒ 150

0.14 ‒ 0.23

≧120

TOYOPEARL QAE-550C

HW-55

50

50 ‒ 150

0.28 ‒ 0.38

60 ‒ 80

TOYOPEARL NH2-750F

HW-75

≧100

30 ‒ 60

0.07 ‒ 0.13≧70（ヒト免疫グロブリン）

基材

細孔径
(nm)

粒子径
(μm)

交換容量
(eq/L)

吸着量
DBC※ (ヒト免疫グロブリン)(g/L)

TOYOPEARL GigaCap S-650M

HW-65

100

50 ‒ 1000.10 ‒ 0.20

136 ‒ 176

TOYOPEARL GigaCap CM-650M

HW-65

100

50 ‒ 1000.17 ‒ 0.28

≧110

TOYOPEARL SP-650C

HW-65

100

50 ‒ 150

0.12 ‒ 0.18

35 ‒ 55（リゾチーム）

TOYOPEARL CM-650C

HW-65

100

50 ‒ 150

0.05 ‒ 0.11

25 ‒ 45（リゾチーム）

TOYOPEARL SP-550C

HW-55

50

50 ‒ 150

0.14 ‒ 0.18

80 ‒ 120（リゾチーム）

TOYOPEARL Sulfate-650F

HW-65

100

30 ‒ 60

≧0.53

≧114

陰イオン交換体

陽イオン交換体

スクリーニング用カラム ToyoScreen

離を検討することも可能です。

※動的吸着量1213イオン交換クロマトグラフィー（IEC）
ペプチドの精製
陽イオン交換クロマトグラフィーは、ペプチド精製に広く使用

小さな充塡剤を用いて、高分離能で分離することが非常に有効でされています。表 5に陽イオン交換基として SPタイプを導入した

す。

TOYOPEARLとTSKgel PWタイプの充塡剤を示します。必要な吸着量と分離能に基づいて適切なSPタイプの充塡剤を選択します。

特長を示します。相対的な吸着量と分離能を、5種類の粒子径の異なる充塡剤について、“＋”記号表示で示します。＋記号が多いほうが、相対的に優れていることを示します。製造プロセスが開発され、イオン交換基の導入法
表 5に示すように、三世代のイオン交換基の導入法があります。

さらに高い分離能が要求される場合は、適宜、粒子径の小さい充塡“伝統”法または、第一世代のイオン交換基の導入法は、基材表面へ剤を選択することになります。

直接イオン交換基をスペーサーとともに導入するものです。第一世同様に、分離能ではなく、高速処理が要求される場合は、大きな粒子径の充塡剤を選択することも可能です。

2500

A (1 mg load)

500

n+1

0

● TOYOPEARL SP-550

量を示します。

● TSKgel SP-5PW

4000● TOYOPEARL CM-650

3500● TOYOPEARL Q-550C

3000● TSKgel DEAE-5PW

リゴヌクレオチドの試料負荷量が、0.2 g/L充塡剤の場合は、粒子● TOYOPEARL MegaCapⅡSP-550EC

径の小さい他社製品のほうが高い分離能を示しますが、試料負荷量が 4 g/L充塡剤になると、他社充塡剤では、分離能が著しく低下し第二世代のイオン交換基導入法（表 5、タイプA）は、基材表面でています。TSKgel SuperQ-5PW（20）は、オリゴヌクレオチドの

イオン交換基とスペーサーをネットワーク化し、吸着表面を増加さ

試料負荷量が多い場合でも、優れた分離能を示します。

せたんぱく質吸着量を増やすものです。以下の 2種類の充塡剤が該

UV 254 nm (mAU)

は SuperQタイプの充塡剤とは少し異なりますが、非常に高い吸着

レ オ チ ド 分 離 の 試 料 負 荷 量 依 存 性 比 較 デ ー タ を 示 し ま す 。オ

800

n-1

600

n+1

400

0
0

● TOYOPEARL DEAE-650

1200
1000

200

代の TOYOPEARL及び TSKgel PWタイプのイオン交換体には以● TOYOPEARL SP-650

図 2にTSKgel SuperQ-5PW（20）と 他 社 製 品 の オ リ ゴ ヌ ク

purified oligo>98 % purity

B (1 mg load)

1400

1000

n-1

IEC resin (15μm) in 0.66 cm I.D. × 15 cm

1600

1500

表5に示すようにTOYOPEARL GigaCap Q-650Mは、選択性

試料負荷量が多い条件下でも高い分離能が維持されます。

1800

purified oligo>98 % purity

2000

下の充塡剤があります。

TSKgel SuperQ-5PWは、他社製品と比べて高い吸着量を示し、TSKgel SuperQ-5PW (20) in 0.66 cm I.D. × 15 cm

10

20

30

40
50
60
70
Elution volume (mL)80

90

TSKgel SuperQ-5PW (20) in 0.66 cm I.D. × 15 cm

C (20 mg load)

4000

purified oligo>94 % purity
peak recovery 60 %and 94 % purity

2500

n-1

n+1

2000
1500
1000

10

20

30

40
50
60
70
Elution volume (mL)

80

90

100

IEC resin (15μm) in 0.66 cm I.D. × 15 cm

D (20 mg load)

3500

500

3000

n-1

2500

purified oligo>90 % purity
peak
recovery 45 %and 90 % purity

2000

n+1

1500
1000
500

0

0
0

当します。

0

100

UV 254 nm (mAU)

表 5に異なる粒子径を持つ SuperQタイプの陰イオン交換体のA社Qタイプイオン交換体（15μm）

TSKgel SuperQ-5PW (20)

UV 254 nm (mAU)

オリゴヌクレオチドとペプチドの精製においては、より粒子径のUV 254 nm (mAU)

オリゴヌクレオチドの精製

10

20

30

40
50
60
70
Elution volume (mL)

80

90

100

0

10

20

30

40
50
60
70
Elution volume (mL)

80

90

100

● TOYOPEARL SuperQ-650● TSKgel SuperQ-5PW
表5

カ ラ ム： 0.66 cm I.D. × 15 cm（5.1 mL）（resin as noted in figure)
試料： DNA based oligonucleotides were loaded as followed: 1 mg/column panels A & B, 20 mg/column panels C & D流
速： 1.43 mL/min（250 cm/h）
溶離液A： 20 mmol/L トリス塩酸塩緩衝液 + 10 mmol/L EDTA（pH 9.0）
溶離液B：20 mmol/L トリス塩酸塩緩衝液 + 10 mmol/L EDTA + 1.0 mol/L NaCl（pH 9.0）
溶離条件：・カラムを溶離液Aで5 CV洗浄・試料注入・カラムを溶離液Aで3 CV洗浄・リニアグラジエント；35-53 %溶離液B, 6 CV. 100 %溶離液B, 5 CV.
検
出： UV（254 nm）
フラクション： 0.5 mLの画分を分取し、TSKgel DNA-NPRで分析

各IEC充塡剤の特性

オリゴヌクレオチド精製用IEC充塡剤（Q-タイプ）
平均粒子径
(µm)

吸着量

分離能

イオン交換基
導入法

TSKgel SuperQ-5PW (20)
TSKgel SuperQ-5PW (30)
TOYOPEARL SuperQ-650S
TOYOPEARL SuperQ-650M
TOYOPEARL SuperQ-650C

20
30
35
65
100

++
++
++++
++++
++++

+++++
++++
+++
++
+

タイプA
タイプA
タイプA
タイプA
タイプA

TOYOPEARL GigaCap Q-650M
TOYOPEARL GigaCap Q-650S

75
35

+++++
+++++

++
+++

タイプB
タイプB

図2

TSKgel SuperQ-5PW（20）を用いたオリゴヌクレオチドの分離（高試料負荷量でも高分離能を維持）

第三世代のイオン交換基導入法（表 5、タイプB）は、イオン交換
基の吸着場（部位）を向上させたものです。このタイプは、大きな細ペプチド精製用IEC充塡剤（S、SP-タイプ）

孔径の内部で、たんぱく質が吸着できる空間にイオン交換基を立体

平均粒子径
(µm)

吸着量

分離能

イオン交換基
導入法

TSKgel SP-5PW (20)
TSKgel SP-5PW (30)
TSKgel SP-3PW (30)
TOYOPEARL SP-650S
TOYOPEARL SP-650M
TOYOPEARL SP-650C

20
30
30
35
65
100

++
++
+++
++++
++++
++++

+++++
++++
++++
+++
++
+

伝統法
伝統法
伝統法
伝統法
伝統法
伝統法

TOYOPEARL GigaCap S-650M
TOYOPEARL GigaCap S-650S

75
35

+++++
+++++

++
+++

タイプB
タイプB

的に化学結合させたものです。この構造により、吸着量が著しく増加し、かつ細孔内部での物質移動も向上しました。物質移動を向上させることで、目的物質の溶出容量を減少することができます（図8）。全ての TOYOPEARL GigaCapシリーズはこのタイプ Bのイ
オン交換基導入法に相当します。
● TOYOPEARL GigaCap S-650● TOYOPEARL GigaCap CM-650● TOYOPEARL Sulfate-650F● TOYOPEARL GigaCap Q-650● TOYOPEARL GigaCap DEAE-650● TOYOPEARL Q-600C AR● TOYOPEARL NH2-750F

1415イオン交換クロマトグラフィー（IEC）

70
380

3

1

3
1

TSKgel DEAE-5PW（20）280

TSKgel DEAE-5PW（30）

590

230
TSKgel SP-5PW（20）mVmV

TSKgel DEAE-650S
TSKgel SuperQ-5PW（20）

390

60

2

330

790

190
30

TOYOPEARL GigaCap S-650S/M

TOYOPEARL GigaCap Q-650S

0

10

20

30

40

50

カ ラ ム： 7.5 mm I.D. × 7.5 cm
溶離液 A： 50 mmol/L トリス塩酸塩緩衝液（pH 8.5）
溶離液 B： 50 mmol/L トリス塩酸塩緩衝液＋1.0 mol/L NaCl（pH 8.5）
グラジエント：溶離液A→B 120 min リニアグラジエント
流
速： 1.0 mL/min
検
出： UV（280 nm）
試
料： 1. トランスフェリン（2.9 g/L）
2. オブアルブミン（6.5 g/L）
3. トリプシンインヒビター（10.0 g/L）
注 入 量：100μL

10

20

30

2

160

カ ラ ム： 7.5 mm I.D. × 7.5 cm
溶離液 A： 20 mmol/L りん酸塩緩衝液（pH 7.0）
溶離液 B： 20 mmol/L りん酸塩緩衝液＋1.0 mol/L NaCl（pH 7.0）
グラジエント：溶離液A→B 60 min リニアグラジエント
流
速： 1.0 mL/min
検
出： UV（280 nm）
試
料： 1. リボヌクレアーゼ A（9.8 g/L）
2. チトクロム C（3.6 g/L）
3. リゾチーム（6.4 g/L）
注 入 量：20μL

TOYOPEARL GigaCap Q-650M

80

カ ラ ム： 7.5 mm I.D. × 7.5 cm
溶離液Ａ：50 mmol/L トリス塩酸塩緩衝液（pH 8.5）
溶離液Ｂ：50 mmol/L トリス塩酸塩緩衝液＋1.0 mol/L NaCl（pH 8.5）
グラジエント：A → B 120 min リニアグラジエント
流
速： 1.0 mL/min
検
出： UV（280 nm）
注 入 量：25μL
試料： トランスフェリン（2.9 g/L）
オブアルブミン（6.5 g/L）
トリプシンインヒビター（10.0 g/L）

分離選択性の比較

TOYOPEARL SuperQ-650Mでは、イオン交換基導入方法の違いにより、有効な細孔容積が減少したため、巨大たんぱく質の吸着量は減少しています。このようなタイプ Aの充塡剤では、スペー
サーとイオン交換基のネットワーク構造により、充塡剤の細孔容積が減少します。

図 6 ネイティブたんぱく質とPEG化たんぱく質の分離選択性比較
表6

たんぱく質の大きさと動的吸着量（DBC）の関係

充塡剤

細孔径
(nm)

BSA
66 kDa

吸着量(g/L)human IgG
160 kDa

Thyroglobulin
660 kDa

103

ー

145

13

3

TOYOPEARL Q-600C AR

75

108

90

26

Q-600ARTOYOPEARL QAE-550C

50

29

32

6

GigaCap Q-650M

TOYOPEARL DEAE-650M

100

25

31

3

SuperQ-650M
DEAE-650M
0

10

20

30

40

50

60

min

溶出溶離液：吸着溶離液 + 1.0 mol/L NaCl
カ ラ ム： 6 mm I.D. × 4 cm
流
速： 1.0 mL/min（212 cm/h）
試 料 濃 度：1 g/L
検
出： UV（280 nm）
吸着溶離液：
BSA
0.05 mol/L トリス塩酸塩緩衝液（pH 8.5）
Human IgG
0.05 mol/L トリス塩酸塩緩衝液（pH 8.7）+ 0.015 mol/L NaCl
Thyroglobulin 0.05 mol/L トリス塩酸塩緩衝液（pH 8.7）+ 0.15 mol/L NaCl

カ ラ ム： 5 mm I.D. × 5 cm
溶離液A：20 mmol/L トリス塩酸塩緩衝液（pH 8.0）
溶離液B：溶離液A + 2.0 mol/L NaCl（pH 8.0）
グラジエント：溶離液A→B 120 min リニアグラジエント
流
速： 1.0 mL/min
検
出： UV（280 nm）
試
料： BSA 1 mg

図5

各種イオン交換体におけるBSAの分離挙動

50

40

30

20

0

図7

カ ラ ム： 5 mm I.D. × 5 cm
溶離液A： 20 mmol/L トリス塩酸塩緩衝液 (pH 8.0)
溶離液B：溶離液A + 1 mol/L NaCl
グラジエント：溶離液A→B 60 min リニアグラジエント
流
速： 1.0 mL/min
検
出： UV（280 nm）
試
料： Mab（IgG1, 0.5 mg）

Fraction 1（モノマー）

Fraction 2の凝集体はほとんどが2量体。
Fraction 2
（凝集体）

10

16

り、最も高い吸着量を示しています。

170

0

min

カ ラ ム： 6 mm I.D. × 4 cm
溶離液A： 50 mmol/L りん酸塩緩衝液（pH 7.0）
溶離液B： 50 mmol/L りん酸塩緩衝液（pH 7.0）
, 0.5 mol/L NaCl
グラジエント：TOYOPEARL GigaCap S-650M TOYOPEARL GigaCap CM-650M
10minute 100 % 溶離液 A
10minute 100 % 溶離液 A
60minutes 0 %B-100 %B
60minutes 0 %B to 50 %B流
速： 1 mL/min
試料： ネイティブリゾチーム 5 g/L,
mono-PEG化リゾチーム 5 g/L

100

0
50

GigaCap Q-650Mが、細孔径とイオン交換基導入法の効果によ

100

20

40

0
min

TOYOPEARL SuperQ-650M

10

30

40

TOYOPEARL GigaCap DEAE-650M

4020る分子量のたんぱく質の動的吸着量を示します。TOYOPEARL

50

20

10

表 6に、6種類の TOYOPEARL充塡剤における 3種類の異な

10

71

60

-20

20

細孔径とイオン交換基導入方法の動的吸着量への影響

20

104

30

3

30

173

40

100

40

20

の分離を示します。

100

NH2-750F

TOYOPEARL DEAE-650M

1

GigaCap S-650Mを用いた天然型及び mono-PEG化リゾチーム

TOYOPEARL GigaCap Q-650M

A社 DEAE充塡剤

120

70

60
TOYOPEARL GigaCap DEAE-650M

140

図4

min

微粒子イオン交換体の分離選択性の比較

180

mV

-20
0

min

TOYOPEARL GigaCap S, PEG-lysozyme0

市販SPタイプ充塡剤

市販Qタイプ充塡剤す。図6に、TOYOPEARL GigaCap CM-650MとTOYOPEARL50

UV 280 nm (mAU)

市販Qタイプ充塡剤

80
60

30

イオン交換体は、PEG化たんぱく質の精製にも、よく使用されま

90

0

市販SPタイプ充塡剤

80

TOYOPEARL GigaCap S, native lysozyme

40

TOYOPEARL SP-650S

TOYOPEARL SuperQ-650S

図3

50

130
TSKgel SuperQ-5PW（30）-10TOYOPEARL GigaCap CM, PEG-lysozyme

10

180

PEG化たんぱく質

100
TOYOPEARL GigaCap CM, native lysozyme

Gradient %B

2

UV 280nm (mAU)

990

0

5

10

15

20

25

min

TOYOPEARL NH2-750Fによるモノクローナル抗体（IgG1）の凝集体の分離

17イオン交換クロマトグラフィー（IEC）
図 8に TOYOPEARL GigaCap Q-650Mと他社同等品のブ
1200
TOYOPEARL GigaCap Q-650M
A社Qタイプイオン交換体

800
600
400

レークスルーカーブの比較図を示します。図は、10 ％のブレー

TOYOPEARL NH2-750Fは、TOYOPEARL HW-75に第 1級

クスルーまでの吸着と、溶出のクロマトグラムを示しています。

アミノ基を導入した陰イオン交換体で、以下のようなユニークな特TOYOPEARL GigaCap充塡剤では、他社品に比べ、溶出画分の容性を示します。

量が著しく少なく、高濃度での回収が可能となります。

塩耐性（salt tolerant）

At 5 % breakthrough value:
GigaCap Q-650M = 13 CVs
A社ゲル = 48 CVs

試料溶液や吸着溶離液の塩濃度が高い状態でも吸着分離が可能な塩耐性を示します。例えば、0.15 mol/L NaClを含んだ試料に対2000

してpHに関わらず、高い吸着量が維持されます（表8）。
塩濃度が高い試料溶液でも、希釈、脱塩といった操作を行うことな
0

50

100

150

min

く、そのまま負荷することが可能です。

カ ラ ム： 6 mm I.D. × 4 cm
試料： polyclonal human IgG（1 g/L）
吸着溶離液：15 mmol/L トリス塩酸塩緩衝液（pH 8.7）
溶出溶離液：15 mmol/L トリス塩酸塩緩衝液（pH 8.7）+ 1.0 mol/L NaCl
流
速： 1.0 mL/min（212 cm/h）
検
出： UV（280 nm）

表8

BSAの動的吸着量（g/L）
吸着溶離液

図 8 TOYOPEARL GigaCap Q-650Mと他社イオン交換体との吸着物（抗体）の溶出容量比較
表 7 TOYOPEARL GigaCapシリーズのアルカリ耐久性
保存溶液

試 料

吸着量測定法

開始時吸着量

1週間後

2週間後

3週間後

TOYOPEARL GigaCap S-650M

1.0 mol/L NaOH

hlgG

Dynamic

143 (g/L)

144

140

135

TOYOPEARL GigaCap CM-650M

0.5 mol/L NaOH

hlgG

Dynamic

99 (g/L)

88

90

91

TOYOPEARL GigaCap Q-650M

0.5 mol/L NaOH

BSA

Static166 (g/L)

NA

153＊

136

充塡剤

動的吸着量の比較＊12 日

TOYOPEARL
Q-600C AR

TOYOPEARL
NH2-750F※

20mmol/L トリス塩酸塩緩衝液（pH 8.0）9065

20mmol/L トリス塩酸塩緩衝液（pH 8.0）＋ 0.15 mol/L NaCl

27

46

20mmol/L トリス塩酸塩緩衝液（pH 7.5）＋ 0.15 mol/L NaCl

16

42

20mmol/L トリス塩酸塩緩衝液（pH 6.0）＋ 0.15 mol/L NaCl

1138

＊滞留時間：1分※吸着溶離液のNaCl濃度が0.15 mol/L以下の場合は、BSAの吸着量が減ることがあります。

強い保持力

優れた凝集体分離

通常の陰イオン交換体に比較して、選択性が異なり、極めて強い

抗体等たんぱく質の凝集体分離に優れます（図11）。バイオ医薬品

保持力を示します（図 10）。従来の陰イオン交換体では保持、分離の精製工程において凝集体の除去は重要です。例えば抗体医薬品精できなかった試料を効率良く精製できます。

TOYOPEARL Q-600C AR

Dynamic binding capacity (g/L)

180

高吸着量タイプの充塡剤は、目的物質だけでなく不純物や異60

性体も、より多く吸着します。場合によっては、0.5 mol/Lや、

50

160

1.0 mol/L NaOH等のアルカリ溶液による充塡剤の洗浄・再生が必140

要となります。したがって、充塡剤には、高いアルカリ耐久性が要求されます。

120

プに使用することで、凝集体を効率的に除去することが可能です。
mAU（280 nm）

200

Q-600 AR30

TOYOPEARL Q-600C AR

80

TOYOPEARL Q-600C ARは、高いアルカリ安定性を示しま60

Super Q-650M

す。また TOYOPEARL GigaCap Q-650Mよりは、やや小さい40

細孔径を持ち、BSAの吸着量は 100 g/Lです。図9に示すように、

20

1 mol/L NaOH溶液で 100日間保存しても、動的吸着量は変化し
0

20

40

60

80

100

120

1mol/L NaOH exposure period (days)

ません。

DEAE-650M
0

10

20

30

40

50

60

カ ラ ム ： 5 mm I.D. × 5 cm（1 mL）
溶離液A ： 20 mmol/L トリス塩酸塩緩衝液（pH 8.0）
溶離液B ： 20 mmol/L トリス塩酸塩緩衝液＋ 2.0 mol/L NaCl（pH 8.0）
グラジエント ： 溶離液A→B 120 min リニアグラジエント流
速 ： 1.0 mL/min
検
出 ： UV（280 nm）
試
料 ： オブアルブミン（1 mg）

図 9 TOYOPEARL Q-600C ARのアルカリ耐久性と動的吸着量
図 10

たんぱく質の溶出挙動

min

30

20
凝集体

10

0

0

5

10

15

20

25

min

カ ラ ム ： 5 mm I.D. × 5 cm（1 mL）
溶離液A ： 20 mmol/L トリス塩酸塩緩衝液（pH 8.0）
溶離液B ： 20 mmol/L トリス塩酸塩緩衝液＋ 1.0 mol/L NaCl（pH8.0）
グラジエント ： 溶離液A→B 60 min リニアグラジエント流
速 ： 1.0 mL/min
検
出 ： UV（280 nm）
試
料 ： モノクローナル抗体（IgG 1, 0.5 mg）

図 11

18

モノマー

40

Giga Cap Q-650M

20

0

50

NH2-750F

40

10

100

0

製であれば、TOYOPEARL NH2-750FをプロテインAの後ステッ

アルカリ耐久性mAU（280 nm）

UV 280 nm (mAU)

1000

TOYOPEARL NH2-750F

モノクローナル抗体の凝集体の分離

19イオン交換クロマトグラフィー（IEC）
TOYOPEARL Sulfate-650F

製品一覧表

TOYOPEARL Sulfate-650Fは、硫酸エステル基を持つ高吸陰イオン交換体
TOYOPEARL IEC充塡剤

着量型の陽イオン交換体です。抗体凝集体の分離能に優れ、プロテ
イン Aの後ステップとしても有効です（図 12）。さらにヘパリンア
フィニティー充塡剤に似た挙動を示し、血液凝固因子等への適用が

		品 番
品 名		
					

可能です。図 13はアンチトロンビンⅢ保持挙動の比較を示したも0022882のです。測定を行った条件では、通常の陽イオン交換体では全く保0022883

持されないのに対し、TOYOPEARL Sulfate-650Fでは保持するこ0022884とが確認されています。

0021855

TOYOPEARL GigaCap Q-650S

monomer

600022866
50
TOYOPEARL Sulfate-650F
300
C社 SO3型
200

B社 SO3型
A社 SO3型

100

0

10

20

30

40

50

30
TOYOPEARL AF-Heparin HC-650M

20

0

min

カ ラ ム ：7.5 mm I.D.×7.5 cm
溶 離 液 A ：54 mmol/L 酢酸塩緩衝液（pH 5.5）
溶 離 液 B ：54 mmol/L 酢酸塩緩衝液＋1.0 mol/L NaCl（pH 5.5）
グラジエント ：溶離液A→B 60 min リニアグラジエント流
速 ：1.0 mL/min
注 入 量 ：90 µL
試料 ：加熱処理したモノクローナルヒト化IgG（約3 g/L）

0

10

20

min

抗体凝集体分離図 13

アンチトロンビンⅢ保持特性

0.20 – 0.30

105 – 155

40 – 900.20 – 0.30

105 – 155

50 – 150

0.20 – 0.30

105 – 155

20 – 500.08 – 0.12

25 – 35

40 – 900.08 – 0.12

25 – 35

50 – 150

0.05 – 0.11

25 – 35

50 – 150

0.14 – 0.23

≧ 120

50 – 150

0.28 – 0.38

60 – 80

30 – 60

0.07-0.13≧70（ヒト免疫グロブリンG）

250

250

250

250
1,000

0007974

5,000
TOYOPEARL DEAE-650C

250
1,000

0007989

5,000
TOYOPEARL Q-600C AR

0021987250
1,000

0021988

5,000
TOYOPEARL QAE-550C

0014704250
1,000

00140270023439

20 – 50250

5,000
TOYOPEARL DEAE-650M

00146930014026

≧156

1,000

000797300219860.15 – 0.25

5,000
TOYOPEARL DEAE-650S

0014694

図 12

50 – 100

250

1,000

0014692

0007988

≧ 162

5,000
TOYOPEARL SuperQ-650C

0017233

0007473

0.10 – 0.20

1,0000017232
0007472

50 – 100

250

5,000
TOYOPEARL SuperQ-650M

0017229

カ ラ ム ：7.5 mm I.D.×7.5 cm
溶 離 液 A ：20 mmol/L りん酸塩緩衝液（pH 7.5）
溶 離 液 B ：20 mmol/L りん酸塩酸緩衝液＋2.0 mol/L NaCl（pH 7.5）
グラジエント ：溶離液A→B 30 min リニアグラジエント流
速 ：1.0 mL/min
注 入 量 ：50 µL
試料 ：アンチトロンビンⅢ（約3 g/L）

≧ 170

1,000

001722800172310.14 – 0.24

5,000
TOYOPEARL SuperQ-650S

00172250017227

20 – 50

1,000

0017224

10

TOYOPEARL GigaCap S-650M
00017223TOYOPEARL Sulfate-650F

250

5,000
TOYOPEARL GigaCap DEAE-650M

002286840

たんぱく質吸着量（BSA, g/L）

1,000

0022867

aggregates
UV 280 nm（mV）

UV 280 nm（mV）

400

イオン交換容量（eq/L）

5,000
TOYOPEARL GigaCap Q-650M

0021857

TOYOPEARL GigaCap S-650M

粒子径
（μm）

1,000

0021856
500

容量
（mL）

5,000
TOYOPEARL NH2-750F

2500023440

1,000

00234415,000

陰イオン交換体
TSKgel IEC充塡剤					
		品 番
品 名		
					
0043383

TSKgel SuperQ-5PW（20）

粒子径
（μm）

イオン交換容量（eq/L）

たんぱく質吸着量（BSA, g/L）

25

15 – 25

0.12 – 0.18

52 – 88

20 – 400.12 – 0.18

52 – 88

15 – 25

0.05 – 0.11

25 – 45

20 – 400.05 – 0.11

20 – 400018535250

0018546

1,000

00185470043283

5,000
TSKgel SuperQ-5PW（30）250018536250

0018548

1,000

001854900433815,000
TSKgel DEAE-5PW（20）2500147102500014711

1,000

00184360043281

20

容量
（mL）

5,000
TSKgel DEAE-5PW（30）250014712250

0014713

1,0000018370

5,000

21イオン交換クロマトグラフィー（IEC）
製品一覧表

製品一覧表

ToyoScreen IECカラム（プロセス開発用、スクリーニング用）

陽イオン交換体					TOYOPEARL IEC充塡剤					
		品 番
品 名		
					
0022876

TOYOPEARL GigaCap S-650S

粒子径
（μm）

イオン交換容量（eq/L）

たんぱく質吸着量（リゾチーム, g/L）

250

20 – 50

0.15 – 0.25

≧150（ヒト免疫グロブリン）

0022877

1,000

0022878

5,000

0021834TOYOPEARL GigaCap S-650M

250

0021835

1,000

0021836

5,000

0021947TOYOPEARL GigaCap CM-650M

250

0021948

1,000

0021949

5,000

0008437

TOYOPEARL SP-650S

0014698250

2500014699

1,000

0007998

5,000

0007994

TOYOPEARL SP-650C

250

0014700

1,000

0007995

5,000

0007474

TOYOPEARL CM-650S

250

0014695

1,000

0007971

5,000

0007475

TOYOPEARL CM-650M

250

0014696

1,000

0007972

5,000

0007991

TOYOPEARL CM-650C

250

0014697

1,000

0007992

5,000

0014028

TOYOPEARL SP-550C

250

0014705

1,000

00140295,000

0021805

TOYOPEARL MegaCapⅡSP-550EC

250

0021806

1,000

0021807

5,000

0023468

50 – 1000.10 – 0.20

136 – 176（ヒト免疫グロブリン）

TOYOPEARL Sulfate-650F

2500023469

1,000

0023470

5,000

品 名

00228720021362

50 – 1000.17 – 0.28

≧110（ヒト免疫グロブリン）

GigaCap Q-650M 1 mLタイプ6 本

ToyoScreen GigaCap DEAE-650M

GigaCap DEAE-650M 1 mL タイプ6 本

GigaCap Q-650M 5 mLタイプ6 本
GigaCap DEAE-650M 5 mL タイプ6 本
ToyoScreen SuperQ-650M

0021363

20 – 50

0.13 – 0.17

40 – 60

40 – 900.13 – 0.17

40 – 60

Q-600C AR 5 mLタイプ6 本
QAE-550C 1 mLタイプ6 本

ToyoScreen NH2-750F

NH2-750F 1 mLタイプ6 本

QAE-550C 5 mLタイプ6 本
NH2-750F 5 mLタイプ6 本

00234440021868

ToyoScreen GigaCap S-650M

GigaCap S-650M 1 mLタイプ6 本

ToyoScreen GigaCap CM-650M

GigaCap CM-650M 1 mLタイプ6 本

0021869
50 – 150

0.12 – 0.18

35 – 550021951

20 – 500.08 – 0.12

30 – 50

GigaCap S-650M 5 mLタイプ6 本

00219520021368

GigaCap CM-650M 5 mLタイプ6 本
ToyoScreen SP-650M

00213690021366

40 – 900.08 – 0.12

30 – 50

50 – 150

0.05 – 0.11

24 – 450.14 – 0.18

80 – 1200021396

100 – 300

0.10 – 0.20     100 – 155（インスリン）

0021397

30 – 60≧0.53≧114（ヒト免疫グロブリン）

0021392

ToyoScreen IEC

		品 番
品 名		
					
0043382

TSKgel SP-5PW（20）

容量
（mL）

粒子径
（μm）

イオン交換容量（eq/L）

たんぱく質吸着量（リゾチーム, g/L）

25

15 – 25

0.06 – 0.12

20 – 400014714250

0014715

1,000

0018435

5,000

0043282

TSKgel SP-5PW（30）250014716250

0014717

1,0000018384

5,000

00219760021977

TSKgel SP-3PW（30）25

GigaCap Q-650M、GigaCap S-650M、
GigaCap CM-650M、SuperQ-650M、
Q-600C AR、SP-550C 1 mLタイプ各1本
GigaCap Q-650M、GigaCap S-650M、
GigaCap CM-650M、SuperQ-650M、
Q-600C AR、SP-550C 5 mLタイプ各1本

ToyoScreen A-IEC

GigaCap Q-650M、DEAE-650M、
SuperQ-650M、Q-600C AR、QAE-550C
1 mLタイプ各1本
GigaCap Q-650M、DEAE-650M
SuperQ-650M、Q-600C AR、QAE-550C
5 mLタイプ各1本

陽イオン交換体					0021394

Sulfate-650F 1 mLタイプ6 本
Sulfate-650F 5 mLタイプ6 本

0021393

TSKgel IEC充塡剤					MegaCapⅡSP-550EC 1 mLタイプ 6本
MegaCapⅡSP-550EC 5 mLタイプ 6本

ToyoScreen Sulfate-650F

0023473
50 – 150

SP-550C 1 mLタイプ6 本
SP-550C 5 mLタイプ6 本

ToyoScreen MegaCapⅡSP-550EC

00218710023472

CM-650M 1 mLタイプ6 本
CM-650M 5 mLタイプ6 本

ToyoScreen SP-550C

00213710021870

SP-650M 1 mLタイプ6 本
SP-650M 5 mLタイプ6 本

ToyoScreen CM-650M

00213670021370

Q-600C AR 1 mLタイプ6 本

ToyoScreen QAE-550C

00213650023443

DEAE-650M 1 mLタイプ6 本
DEAE-650M 5 mLタイプ6 本

ToyoScreen Q-600C AR

00219930021364

SuperQ-650M 1 mLタイプ6 本
SuperQ-650M 5 mLタイプ6 本

ToyoScreen DEAE-650M

00213610021992

内 容

ToyoScreen GigaCap Q-650M

0021860

0021360

5,000
TOYOPEARL SP-650M

00218590022873

1,000

0008438
0007997

		品 番

容量
（mL）

ToyoScreen C-IEC

GigaCap S-650M、GigaCap CM-650M、
CM-650M、SP-650M、SP-550C
1 mLタイプ各1本
GigaCap S-650M、GigaCap CM-650M、
CM-650M、SP-650M、SP-550C
5 mLタイプ各1本

0021395＊ToyoScreenをご使用の際には、品番0021400 ToyoScreen Holderが必要になります。
20 – 400.06 – 0.12

20 – 40

ToyoScreenカラムホルダ、コネクタ
		品 番
20 – 400.07 – 0.22

≧ 65（インスリン）

品 名

内 容

0021400

ToyoScreen Holder

1 mL、5 mLカラム共通

0020028

T-Fユニオン

FPLC ® 用コネクタ

2500021978

1,000

0021979

5,000＊「FPLC」はGEヘルスケア・ジャパン社の登録商標です。

＊ 価格につきましては、「TSKgel / TOYOPEARL総合カタログ」をご覧ください。
＊ 容量が1,000 mL、5,000 mLの製品の価格につきましては、当社営業までお問い合せください。

22

23

イオン交換クロマトグラフィー（IEC）
製品一覧表
MiniChrom
		品 番
品 名		
					

カラム容量
（mL）

粒子径
（μm）

0045101

TOYOPEARL GigaCap S-650M

5

50 – 1000045102

TOYOPEARL GigaCap S-650S

5

20 – 500045103

TOYOPEARL GigaCap CM-650M

5

50 – 1000045104

TOYOPEARL GigaCap Q-650M

5

50 – 1000045105

TOYOPEARL GigaCap Q-650S

5

20 – 500045106

TOYOPEARL GigaCap DEAE-650M

5

50 – 1000045107

TSKgel SuperQ-5PW (20)5

15 – 250045108

TOYOPEARL NH2 -750F

530 – 60

0045117TOYOPEARL Sulfate-650F

530 – 60

容量
（μL）

粒子径
（μm）

疎水クロマトグラフィー
（HIC）
粒子径

HIC充塡剤（疎水ゲル）

100 µmTOYOPEARL SuperButyl-550C
TOYOPEARL Hexyl-650C
TOYOPEARL Butyl-650C
TOYOPEARL Phenyl-650C

65 µm

TOYOPEARL Butyl-600M
TOYOPEARL Phenyl-600M
TOYOPEARL PPG-600M

RoboColumn
		品 番
品 名		
					
0045001

TOYOPEARL GigaCap S-650M

200 × 850 – 1000045002

TOYOPEARL GigaCap S-650M

600 × 850 – 1000045003

TOYOPEARL GigaCap Q-650M

200 × 850 – 1000045004

TOYOPEARL GigaCap Q-650M

600 × 850 – 1000045005

TOYOPEARL GigaCap CM-650M

200 × 850 – 1000045006

TOYOPEARL GigaCap CM-650M

600 × 850 – 1000045007

TOYOPEARL GigaCap DEAE-650M

200 × 850 – 1000045008

TOYOPEARL GigaCap DEAE-650M

600 × 850 – 1000045011TOYOPEARL Q-600C AR

200 × 850 – 150

0045012TOYOPEARL Q-600C AR

600 × 850 – 150

0045021TOYOPEARL NH2-750F

200 × 830 – 600045022TOYOPEARL NH2-750F

600 × 830 – 600045027

TOYOPEARL Sulfate-650F

200 × 830 – 600045028

TOYOPEARL Sulfate-650F

600 × 830 – 60

TOYOPEARL Butyl-650M
TOYOPEARL Phenyl-650M
TOYOPEARL Ether-650M
35 µm

TOYOPEARL Butyl-650S
TOYOPEARL Phenyl-650S
TOYOPEARL Ether-650S

30 µm

TSKgel Phenyl-5PW (30)
TSKgel Ether-5PW (30)20 µmTSKgel Phenyl-5PW (20)
TSKgel Ether-5PW (20)＊MiniChrom、RoboColumnの他グレード製品につきましては、当社営業までお問い合せください。

24

疎水クロマトグラフィー（HIC）
塩の種類が及ぼす影響

HIC充塡剤にはそれぞれが程度の異なる疎水性と選択性を示す 5

HIC分離の選択性は、リガンドの疎水性に加え、溶離液に用いる

有効な分離モードです。このモードはたんぱく質表面に存在する疎種類のリガンドがあります。TOYOPEARL HIC充塡剤では次の順

塩の種類によっても影響を受けます。異なるたんぱく質の分離能に水性領域と、弱い疎水性を持つ充塡剤固定相との相互作用を利用しに疎水性が高くなります：Ether＜ PPG（ポリプロピレングリコー

及ぼす塩の影響を図4に示します。

ます。HICはイオン交換とサイズ排除クロマトグラフィーを補完すル）＜Phenyl＜Butyl＜Hexyl（図2参照）。

二塩混合溶液での動的吸着量
疎水クロマトグラフィーにおける吸着溶液において用いられる塩n

ゲルの動的吸着量を改善することが可能です（表3）。 疎水クロマト

OH

グラフィーの塩として一般的に用いられている硫酸アンモニウム（硫PPG

HICにおけるたんぱく質の充塡剤への結合は塩濃度の高い水溶液

Hexyl中で起こります。塩析効果により疎水性リガンドへのたんぱく質がHydrophobic

結合します。したがって、HICでは塩濃度を下げることでたんぱく
質の溶出が起こります。目的とするバイオ医薬品は低塩濃度または

OCH2CH2CH2CH2CH2CH3

TOYOPEARL HIC 充塡剤

逆相クロマトグラフィー（RPC）と HICの溶出法を比較すると、たんぱく質の回収率

Phenyl
-650M

Butyl
-650M

84

62

76＊

示します。この 2つの分離モードの相対的な結合エネルギーを比較目的とするバイオ医薬品の疎水性と充塡剤の疎水性とを適合さするものとして、分離における吸着条件と溶出条件の表面張力を測せることが、高い精製効率を得るために非常に重要です。たんぱ

α-Chymotrypsinogen A

96

88

90

定する手段があります。HICとRPCの溶出における表面張力を比較

く質に対して疎水性の強すぎる充塡剤を使用するとたんぱく質がCytochrome c

─

81＊

87＊

した例を図 1に示します。HICは（表面張力の変化が小さく）温和な

不可逆的に充塡剤に結合したり、酵素活性を失う原因になります。

IgG

91

─

─

溶離条件で分離を行うため、ほとんどの場合、試料の生理活性も保TOYOPEARL HIC充塡剤の標準的な質量回収率と生理活性回収率

持されます。

を表1と表2に示します。

α-Lactalbumin

90

─

─

Lysozyme

94

92

85

Ovalbumin

83

88

73

Ribonuclease A

─

72＊

82＊

HIC工程を最適化するためには、高い動的吸着量と適切な分離選
択性、良好な質量回収率と生理活性回収率のバランスをうまくとる(NH4)2SO4 Concentration (mol/L)

Surface Tension (erg/cm2)

0

1

2

3

Desorb protein

804Bind protein

ことが重要です。
TOYOPEARL Hexyl-650及び Butyl-650/550は強い吸着力を持つことから、親水性の高いたんぱく質の分離に使用されます。
この 2種類の充塡剤は、塩濃度の低い条件での分離にも使用するこ(NH4)2SO4とができます。

Bovine serum albumin＊

Procedure: A 200 mL sample containing 200 mg of protein was
loaded onto a 7.5 mm I.D. × 7.5 cm column and eluted with a 60
minute gradient of 1.8 mol/L（ ＊1.5 mol/L）to 0.0 mol/L ammonium
sulfate in 0.1 mol/L sodium phosphate（pH 7.0）. The mass recovery
was determined spectrophotometrically at UV 280 nm and 25 ℃.

TOYOPEARL PPG-600、Butyl-600、Phenyl-600は特に抗体の分離に適し、高い吸着量を示します。また中程度の疎水性を示

HIC
RPC

Bind protein

60

40

すたんぱく質分離用充塡剤です。

TOYOPEARL
HIC 充塡剤

たんぱく質

や膜たんぱく質のような目的物質を精製するために使用されます。

Phenyl-650

Phytochrome

Desorb protein

TOYOPEARL HICの全てのグレードで、充塡剤量1 mLと5 mLの

CH3CN

カラムが用意されています。目的物質の吸着・選択性と回収に適した

20
0

20

40

60

80

% Acetonitrile

C. Horvath et. al., Separation Processes in Biotechnology,(J. Asenjo, Ed.) 9, 447 (1990) Marcel Dekker

図 1 HICとRPCに用いられる水溶性溶離液の表面張力

100

表 2 たんぱく質の酵素活性回収率

TOYOPEARL Ether-650充塡剤は、非常に疎水性の高い抗体スクリーニング用カラムToyoScreen

26

Ether
-650M

充塡剤をスクリーニングするために簡便にご使用いただけるカラムです。複数のカラムを直列接続することにより更に複雑な分離を行うこ

活性回収率
（％）
79

10

20

40

50 min

図 3 TOYOPEARL HIC充塡剤のスクリーニング（標準たんぱく質の分離）100

Conalbumin/β-Glucosidase

Cytochrome c/Conalbumin

500

カ ラ ム： TOYOPEARL Butyl-650 4.1 mm I.D. × 4 cm
溶離液A： 20 mmol/L りん酸塩緩衝液 + 1 mmol/Lの上記各塩（pH 7.0）
溶離液B： 20 mmol/L りん酸塩緩衝液（pH 7.0）
グラジエント： 溶離液A → B 20 min リニアグラジエント
流
速：1 mL/min
検出：UV（280 nm）
J. Fausnaugh, L. Kennedy and F. Regnier, J. Chromatography 317, 141 (1984)

Butyl-650

Halophilic protease85

Butyl-650

Poly（3-hydroxybutyrate）depolymerase

88

Butyl-650

Aculeacin-A acylase82

表 3 二塩混合溶液でのモノクローナル抗体の動的

Butyl-650

Opine dehydrogenase81

		 吸着量の比較

図 4 分離能における塩の種類の影響

吸着溶液

とも可能です。

動的吸着量（IgG1, g/L）
Ether650M

PPG600M

Phenyl600M

Butyl600M

1 mol/L（NH4）2SO4（135 mS/cm）

0.9

23.1

20.9

10.2

1.3 mol/L NaCl + 0.4 mol/L
クエン酸ナトリウム（118 mS/cm）

0

22.9

16.7

11.1

1.2 mol/L Glycine + 0.6 mmol/L
Na2SO（4 65 mS/cm）

0

18.9

19.8

16

1.7 mol/L NaCl + 0.7 mol/L（NH4）2SO（
4 185 mS/cm）

0

29.2

25.1

15.3

1.4 mol/L Glycine + 0.8 mol/L（NH4）2SO（
4 100 mS/cm）

0

26.2

19.1

16.6

ToyoScreenを使用して標準たんぱく質のTOYOPEARL HIC充塡剤に対する吸着特性と選択性を調べた結果を図3に示します。

30

カ ラ ム： ToyoScreen（1 mL）
溶離液A：0.1 mol/L りん酸塩緩衝液+ 1.8 mol/L Na 2SO4（pH 7.0）
溶離液B： 0.1 mol/L りん酸塩緩衝液（pH 7.0）
グラジエント：溶離液A → B 30 min リニアグラジエント
流
速：1 mL/min
検出：UV（280 nm）
試
料：1.リボヌクレアーゼA、2.リゾチーム、
3.α-キモトリプシノーゲンA, 1 g/L
注 入 量： 50 µL

表 1 たんぱく質の回収率（％）

図 2 HICリガンドの構造

塩を含まない緩衝液で溶出することになります。
HIC分離の吸着エネルギーの方が RPC分離のそれよりも低い値を0＊）A. M. Senczuk et al., Hydrophobic Interaction Chromatography inDual Salt System Increases Protein Binding Capacity , Biotechnology
and Bioengineering, 103(2009)930

Na 2 SO4

Butyl0

Na 3 Citrate

疎水性表面を持つたんぱく質やその他の分子は、HIC充塡剤の疎Hexyl-650C

20 %ないし50 % 改善できる場合があります＊）。

NH4SCNOCH2CH2CH2CH3

水性領域に吸着されます。

50

ム、 グリシンなどを混合することにより、 疎水ゲルの動的吸着量をPhenyl

HICはどのように作用するか？

SuperButyl-550C安）のほかにも塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウ
O

NaCl

えられます。

Butyl-650M

100

NH4SCNO

Phenyl-650M

250

NaCl

Ether

離した後にHICを用いて疎水性の違いで分離するといった方法も考を1種類から2種類の異なる性質の塩を混合することにより、 疎水

PPG-600M

200(NH4) 2 SO4を持つたんぱく質を、アフィニティークロマトグラフィーにより分(OCH2CH2)nOH

3Ether-650M

Na 2 SO4

Hydrophilic

2

250

Na 3 Citrate

中の不純物が、類似の等電点や類似の分子量を持つ場合などの分離に効果を発揮します。アフィニティーリガンドと類似の結合サイト

1(NH4) 2 SO4

る優れた方法で、特にたんぱく質の異性体が存在する場合や粗試料

300

UV 280 nm (mAU)

異なる5種類の疎水性リガンドが示す選択性

疎水クロマトグラフィー（HIC）は生体分子を分離精製するためのResolution Factor (Rs)

疎水クロマトグラフィー用TOYOPEARL充塡剤

27

疎水クロマトグラフィー（HIC）
図 5に示すホフマイスター系列は、各種アニオンとカチオンを疎粒子径の最適化

水的吸着を促進する能力の順に並べたものです。系列の左側に属するイオンはリオトロピック性（lyotropic）と呼ばれ、系列の右側の

機械的強度

TOYOPEARL HIC充塡剤は、次に示す各種粒子径が用意されて
います：

0.15

TOYOPEARLとTSKgel 5PWのHIC充塡剤は、高い流速で使用できます。TOYOPEARL Phenyl-650の各粒子径が示す圧損 /流100 μmTOYOPEARL C

キャプチャー（初期精製）速の関係を図 8に示します。粒子径の大きな Cグレードでは、圧力

ピックの塩は、塩濃度が高くなると疎水性相互作用を高める性質が65 μm

TOYOPEARL M

中間精製が低く、より高流速で使用可能なことがわかります。

あるため、たんぱく質を沈殿、塩析させ、カオトロピックの塩は、塩35 μm

TOYOPEARL S

中間精製/最終精製

濃度が高くなるとたんぱく質の変性を促進させます。図 4及び表 3

30、20 μm

TSKgel 5PW

高分離能/最終精製に示すように塩の種類により充塡剤の吸脱着の性質が変化します。

工業スケールで HICを応用するために使用できる各種リガンドと粒子径をまとめて図 7に示します。この図では、各粒子サイズの充PPG-600M

SO42- > HPO 42-> CH3COO - > halide > NO3- > CIO4- > SCN -精製、最終精製）のどの工程で用いられているのかも示しています。

化学的安定性

細孔径(nm)(CH3)4 N + >NH4+ >K+ >Na+ >Cs + >Li + >Mg 2+ > Ca 2+ > Ba 2+硫酸アンモニウム及び硫酸ナトリウムがHICに最もよく使用される塩です。

これらの製品はいずれも広い範囲の pHとイオン強度に耐える化

0.05

細孔径の最適化0012.5 40‒50

75

100

>100 >170

内に浸透しにくくなり、有効な表面積は減少します。このため、たTOYOPEARL HW: 40

5

50

60

65

75

んぱく質のサイズに応じて、有効な表面積が最大となる最適細孔径

TSKgel PW:

G2000 G4000

55

（80）

G5000 G6000

表面積の増加図 6 HIC充塡剤に使用される基材の特徴比較充塡剤のバイオ医薬品の動的吸着量（DBC）も大きくなります。上記の観点から、より大きな動的吸着量を持つことを目的とした 3種の細孔径のHIC充塡剤が開発されました。

DBC was calculated at 10 % of breakthrough.

図 9 各種 HIC充塡剤におけるポリクローナル抗体のブレークスが適しています。製品としては TOYOPEARL PPG-600M、

中間精製

35μm

ルーカーブ

と比較したデータを図 9に示します。図 10に、HIC充塡剤 600シ

Phenyl-650S
3

TOYOPEARL Butyl-650M
TOYOPEARL Phenyl-650M
TOYOPEARL Ether-650M

2.5

TSKgel Phenyl-5PW（30）TSKgel Ether-5PW（30）20μm

TSKgel Phenyl-5PW（20）TSKgel Ether-5PW（20）

最終精製

Phenyl-650M

Butyl-600M

Phenyl-650C
0
0

2

10

20

30

40

50

60

70

Elution volume (mL)カ ラ ム： 7.5 mm I.D. × 7.5 cm
試料： 1. リボヌクレアーゼA、2. リゾチーム、
3. α-キモトリプシノーゲンA
注 入 量：100 µL（1 g/L）
溶 離 液A：1.8 mol/L (NH4)2SO4 + 0.1 mol/L
りん酸塩緩衝液（pH 7.0）
溶離液B：0.1 mol/L りん酸塩緩衝液（pH 7.0）
グラジエント：溶離液A → B 60 min リニアグラジエント
流
速：1.0 mL/min（136 cm/h）
温度：25 ℃
検
出：UV（280 nm）

0
0

200

400

600

800

Flow (cm/h)

図 8 TOYOPEARL Phenyl-650の流速と圧力損失の関係
TSKgel Phenyl-5PW
TSKgel Ether-5PW

Phenyl-600M

50

カラム：TOYOPEARL Phenyl-650C, M and S, 25 mm I.D. × 25 cm
溶離液：2 mol/L（NH4）2SO4

10μm

1

100

1.5

30μm

3

150

TOYOPEARL Butyl-600M
TOYOPEARL Phenyl-600M
TOYOPEARL PPG-600M

TOYOPEARL Butyl-650S
TOYOPEARL Phenyl-650S
TOYOPEARL Ether-650S

2

PPG-600M

リーズの分離選択性の比較を示します。
UV 280 nm (mAU)

TOYOPEARL SuperButyl-550C
TOYOPEARL Hexyl-650C
TOYOPEARL Butyl-650C
TOYOPEARL Phenyl-650C

Pressure (bar)65μm

分離選択性の同じ HPLC カラム

50

これらの製品の動的吸着量（DBC）を TOYOPEARL Phenyl-650

100μm

精製物

40

Butyl-600Mと Phenyl-600Mの 3タイプが用意されています。

Feedstock

初期精製

30

カ ラ ム： 7.8 mm I.D. × 20 cm
試料： polyclonal human IgG
吸着溶離液：1 g/L IgG in 0.8 mol/L (NH4)2SO4 + 0.1 mol/L
りん酸塩緩衝液（pH 7.0）
流速：2.4 mL/min（300 cm/h）
温度：25 ℃
検
出：UV（280 nm）

が存在することになります。吸着可能な表面積が増加すると、目的

モノクロナール抗体への応用には細孔径約 75 nmの充塡剤
粒子径20IgG loaded (g/L)

高い動的吸着量を持つTOYOPEARL
精製工程

10

なります。一方、細孔径が小さすぎると、大きなたんぱく質は細孔

図 5 ホフマイスター系列

28

Phenyl-600M

学構造を有しています。

多孔質充塡剤の絶対表面積は平均細孔径が小さくなるほど大きく

For cations

図7

Butyl-600M

0.1

塡剤が、クロマトグラフィーの一連の製造工程（キャプチャー、中間For anions

QC

他社フェニルタイプゲル

Phenyl-650M

C/C 0

イオンはカオトロピック性（chaotropic）と呼ばれます。リオトロ

図10

TOYOPEARL HIC充塡剤600シリーズの分離選択性比較

各種精製プロセスにおける疎水クロマトグラフィー用充塡剤29

疎水クロマトグラフィー（HIC）

C/C 0

0.1

100

0.05

50
アガロースタイプ フェニル

0

20

40

60

80

Lysozyme loaded (g/L)

0
0

10

20
30
40
50
Elution volume (mL)60

70

Binding capacity (g/L)(10 % Breakthrough)Phenyl-600M
Phenyl-650M

カ ラ ム： 7.5 mm I.D. × 7.5 cm
試料： 1. リボヌクレアーゼA、 2. リゾチーム、
3. α-キモトリプシノーゲンA
注 入 量：100 µL（1 g/L）
溶離液A：1.8 mol/L (NH4)2SO4 + 0.1 mol/L
りん酸塩緩衝液（pH 7.0）
溶離液B：0.1 mol/L りん酸塩緩衝液（pH 7.0）
グラジエント：溶離液A → B 60 min リニアグラジエント
流
速：1.0 mL/min（136 cm/h）
温度：25 ℃
検
出：UV（280 nm）

58
27

カ ラ ム： 7.8 mm I.D. × 20 cm
試料： 1 g/L リゾチームを含む 0.1 mol/L りん酸塩緩衝液（pH 7.0）+ 1.8 mol/L (NH4)2SO4
流
速：2.4 mL/min（300 cm/h）
検
出： UV（280 nm）

50
40
30
20
10
0

ゾチーム）

Phenyl-650M及びアガロース系充塡剤の分離比較を示します。

Hexyl-650C

PPG-600M

うな低分子たんぱく質には、TOYOPEARL SuperButyl-550C（細孔径 50 nmの TOYOPEARL HW-55から誘導体化）が適して

Phenyl-650M
Ether-650M

います。

0.02

TOYOPEARL Phenyl-600Mは、分子量の小さいたんぱく質リゾチームに対しても、高いDBCを示します（図13）。

0.01は、分子量 20万を超えるたんぱく質と凝集体を対象とした研究においてHICが凝集体除去に有効であることを明らかにしました。

糖たんぱく質を起こしますが、TOYOPEARL HIC充塡剤を使用すれば精製が可能です。TOYOPEARL Butyl-650S充塡剤を使用して巨大糖たん
ぱく質を精製した例を図16に示します。

0

20

40

60

80

Lysozyme loaded (g/L)

Ether-650M
Phenyl-650M
Butyl-650M
Hexyl-650C
PPG-600M
SuperButyl-550C

6,953,686）。Hexyl-650Cはエンドトキシン除去用としてもHIC充塡剤の中で最も高い効果を持つことが示されており、その吸着除去量は2百万 EU/mL充塡剤です。RNAと混入たんぱく質も効
果的に除去されました。またTOYOPEARL Hexyl-650Cは、スー

経済性（Process economics）に劇的な変化をもたらします。

パーコイル状及び開環環状型（open circular forms）のプラスミ
ドDNAの分離でも有効でした。

ミスフォールドたんぱく質の除去

51種類の異なるマウス IgGを TSKgel Phenyl-5PWで測定（溶離ミスフォールドたんぱく質は一般に、本来のたんぱく質よりも時間を疎水性の指標として代用）したものです。mAbは非常に多様高い疎水性を示しますので、ミスフォールドたんぱく質除去にはな疎水性を示すことが分かります。何種類かの IgGは他の IgGより

TOYOPEARL Butyl-650M充塡剤が利用されます。多くの場合、ミ

12.5
27.5
32.2
33.2
44.2
54.3

も2〜3倍も溶出が遅く、より強い疎水性を持つことが分かります。

スフォールドたんぱく質を吸着し、目的物質がカラムを通過するよ疎水性の強い mAb（マウスの抗ニワトリ 14kDaレクチン抗体な

うな溶離条件（フロースルー）でのクロマトグラフィーを用います。

ど）に対しては、より疎水性の弱い（親水性が強い）TOYOPEARL

詳細な応用例については、弊社のウェブサイトを参照ください。

図12 各種HIC充塡剤を用いたリゾチーム分離のブレークスルー

15

min

30

カ ラ ム： A. TSKgel Ether-5PW, 7.5 mm I.D. × 7.5 cm
B. TOYOPEARL Ether-650M,7.5 mm I.D. × 7.5 cm
試料： マウス腹水A. 1.5 mg in 100μL ; B. 0.76 mg in 50μL
溶離液A： 0.1 mol/L りん酸塩緩衝液 + 1.5 mol/L (NH4)2SO4（pH 7.0）
溶離液B： 0.1 mol/L りん酸塩緩衝液（pH 7.0）
グラジエント： 溶離液 A → B 60 min リニアグラジエント
流
速： 1.0 mL/min（136 cm/h）
検
出： UV（280 nm）

図15 マウス腹水からのモノクローナル抗体の分離（TOYOPEARLとTSKgelの比較）

Cambrex, Baltimore, MDは、プラスミド DNAの精製にBinding capacity (g/L)(10 % Breakthrough)カ ラ ム： 7.8 mm I.D. × 20 cm
試料： 1 g/L リゾチームを含む 0.1 mol/L りん酸塩緩衝液+ 1.8 mol/L (NH4)2SO4（pH 7.0）
流速： 0.8 mL/min（100 cm/h）
検
出： UV（280 nm）

0

TOYOPEARL Hexyl-650C充塡剤を使用しました（US patent

600と 550シリーズの HIC充塡剤はあるたんぱく質に対し高い

HICはモノクロナール抗体（mAb）の精製に有用です。図 14は

mAb

DNAプラスミドの精製とエンドトキシン除去

モノクロナール抗体0

B. 65 μmTOYOPEARL Ether-650M

大きな細孔径を持つ TOYOPEARL Butyl-650と Phenyl-650
はたんぱく質凝集体の分離、除去に非常に有効です。Kargerら＊）

動的吸着量を示し、細孔径とリガンドの違いにより製造プロセスのSuperButyl-550C

min

30

たんぱく質凝集体の除去の DBCの比較を示します。リゾチーム（分子量 12,000 Da）のよ
Butyl-650M

15

図14 HIC分離におけるマウスモノクローナル抗体の多様性（溶出時間）

糖たんぱく質は糖を基材とする充塡剤ではしばしば不可逆的結合
図11にフェニル基を持つ充塡剤TOYOPEARL Phenyl-600M、
図 12に TOYOPEARL SuperButyl-550Cとその他 HIC充塡剤

0.03

0

カ ラ ム：TSKgel Phenyl-5PW, 7.5 mm I.D. × 7.5 cm
7.0）
溶離液A：0.1 mol/L りん酸塩緩衝液 ＋ 1.8 mol/L (NH4)2SO（pH4
溶離液B：0.1 mol/L りん酸塩緩衝液（pH 7.0）
グラジエント：（B）0 %（0 min）→ 0 %（5 min）→ 100 %（65 min）linear流
速：1 mL/min
検出：UV（280 nm）
試
料：マウスモノクローナル抗体51種

図13 TOYOPEARL Phenyl-600Mのブレークスルーカーブ（リ

図11 フェニルタイプのHIC充塡剤の分離選択性比較

UV 280 nm(AU)mAb

Antibody

Phenyl-650M

0

70
60

Ether-650Mが適しています。腹水からの mAbの精製（図 15）では TSKgel Ether-5PW（10 μm）を使用し、スケールアップでは

www.separations.asia.tosohbioscience.com

同じ選択性を持つ TOYOPEARL Ether-650M（粒子径 65 μm）

www.separations.us.tosohbioscience.com

を使用することができます。
＊）Grinberg, N. Blanco, R. Yarmush, D. Karger, B. L. Protein
Aggregation in High Performance Liquid Chromatography:
Hydrophobic Interaction Chromatography of β-Lactoglobin , Anal.
Chem. 1989, 61, 514-520

100

2.0

50

1.0

A.

0

C.

B.

0
10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Antibacterial activity (%-Inhibition)

1

80

Absorbance, 280 nm

150
UV 280 nm (mAU)

Phenyl-600M

3

Phenyl-600M

A. 10 μm TSKgel Ether-5PW

90

No.1
No.3
No.5
No.7
No.9
No.11
No.13
No.15
No.17
No.19
No.21
No.23
No.25
No.27
No.29
No.31
No.33
No.35
No.37
No.39
No.41
No.43
No.45
No.47
No.49
No.51

Phenyl-650M

Elution time of each antibody
on TSKgel phenyl-5PW(min)

0.15

2

Fraction Number (8 mL/fraction)

カ ラ ム： TOYOPEARL Butyl-650S, 22 mm I.D. × 26 cm
試料： アメフラシ由来粗たんぱく質
溶 離 液： 50 mmol/L りん酸塩緩衝液 + (NH4)2SO4（pH 7.0）
A. 40 %飽和 (NH4)2SO4
B. 20 %飽和 (NH4)2SO4
C. (NH4)2SO4 不含グラジエント： ステップ（図内に表示）
検出： UV（280 nm）

図16 TOYOPEARL Butyl-650Sを用いた高分子量糖たんぱく
質の分離

カーブと動的吸着量3031

疎水クロマトグラフィー（HIC）
製品一覧表

製品一覧表

TOYOPEARL HIC充塡剤
		 品 番品 名							
0016172100

0016174			

1,0000016176			

5,000

0016173

TOYOPEARL Ether-650M100

粒子径		たんぱく質吸着量（参考値）（μm）		 （リゾチーム, g/L）
20 – 50		

40 – 90		

10 – 30

10 – 30

		 品 番品 名							
0043276

容量		（mL）		

TSKgel Ether-5PW（20）		25

粒子径		
たんぱく質吸着量（μm）		 （リゾチーム, g/L）
15 – 25		

0016052		

250		

0016053		

1,000		

0018437		

5,000		

0016175			

1,000		

00431760016177			

5,000		

0016050		

250		

0021302

TOYOPEARL PPG-600M

20 – 40		

0016051		

1,000		

0018439		

5,000		

0021304			

5,000		

0043277100

40 – 90		 20 – 35（γ-globulin）

25

1,000		TOYOPEARL Phenyl-600M

100

TSKgel Ether-5PW（30）0021303			
0021888

40 – 90		

45 – 65

TSKgel Phenyl-5PW（20）25

15 – 25		

0014718		

250		

0021889			

1,000		

0014719		

1,000		

0021890			

5,000		

0018438		

5,000		

0014477

TOYOPEARL Phenyl-650S

100

20 – 50		

0014784			

1,000		

0014935			

5,000		

0014478

TOYOPEARL Phenyl-650M

100

40 – 90		

0014783			

1,000		

0014943			

5,000		

0014479

TOYOPEARL Phenyl-650C

100

50 – 150		

0014785			

1,000		

0014944			

5,000		

0007476

TOYOPEARL Butyl-650S

100

20 – 50		

0014701			

1,000		

0007975			

5,000		

0007477

TOYOPEARL Butyl-650M

100

40 – 90		

0014702			

1,000		

0007976			

5,000		

0007478

TOYOPEARL Butyl-650C

100

50 – 150		

0014703			

1,000		

0007977			

5,000		

0021449

TOYOPEARL Butyl-600M

100

1,000		

0021451			

5,000		TOYOPEARL SuperButyl-550C

100

50 – 150		

0019957			

1,000		

0019958			

5,000		

0019026

TOYOPEARL Hexyl-650C

100

30 – 50

30 – 500043177

TSKgel Phenyl-5PW（30）25

20 – 40		

0014720		

250		

0014721		

1,000		

0017210		

5,000		

10 – 30

10 – 30

15 – 35

10 – 30＊ 価格につきましては、「TSKgel / TOYOPEARL総合カタログ」をご覧ください。
30 – 50＊ 容量が1,000 mL、5,000 mLの製品の価格につきましては、当社営業までお問い合せください。

30 – 50

30 – 50

30 – 50

40 – 90		 40 – 60（γ-globulin）

0021450			
0019956

32

TOYOPEARL Ether-650S

TSKgel HIC充塡剤
容量		
（mL）

50 – 150		

0019027			

1,000		

0019028			

5,000		

52 – 70

30 – 5033

疎水クロマトグラフィー（HIC）
製品一覧表
ToyoScreen HICカラム（プロセス開発、スクリーニング用）
		 品 番
0021372

品 名

内 容

ToyoScreen Ether-650M

Ether-650M 1 mLタイプ6 本

0021373		

Ether-650M 5 mLタイプ6 本

0021380

PPG-600M 1 mLタイプ6 本

ToyoScreen PPG-600M

0021381		

PPG-600M 5 mLタイプ6 本

0021374

Phenyl-650M 1 mLタイプ6 本

粒子径

MXC充塡剤（ミックスモード充塡剤）

0021375		

Phenyl-650M 5 mLタイプ6 本

0021892

Phenyl-600M 1 mLタイプ6 本

65 µm

TOYOPEARL MX-Trp-650M

ToyoScreen Phenyl-650M
ToyoScreen Phenyl-600M

0021893		

Phenyl-600M 5 mLタイプ6 本

0021376

Butyl-650M 1 mLタイプ6 本

ToyoScreen Butyl-650M

0021377		

Butyl-650M 5 mLタイプ6 本

0021494

Butyl-600M 1 mLタイプ6 本

ToyoScreen Butyl-600M

0021495		

Butyl-600M 5 mLタイプ6 本

0021382

SuperButyl-550C 1 mLタイプ6 本

ToyoScreen SuperButyl-550C

0021383		

SuperButyl-550C 5 mLタイプ6 本

0021378

Hexyl-650C 1 mLタイプ6 本

ToyoScreen Hexyl-650C

0021379		

Hexyl-650C 5 mLタイプ6 本			
0021398
ToyoScreen HIC
			

Phenyl-600M、PPG-600M、Phenyl-650M、
Hexyl-650C、Butyl-600M、Butyl-650M
1 mLタイプ各1本

			0021399					

Phenyl-600M、PPG-600M、Phenyl-650M、
Hexyl-650C、Butyl-600M、Butyl-650M
5 mLタイプ各1本＊ToyoScreenをご使用の際には、品番0021400 ToyoScreen Holderが必要になります。

ToyoScreenカラムホルダ、コネクタ
		 品 番

品 名

内 容

0021400

ToyoScreen Holder

1 mL、5 mLカラム共通

0020028

T-Fユニオン

FPLC® 用コネクタ

MiniChrom
		品 番
品 名		
					

カラム容量
（mL）

粒子径
（μm）

0045121TOYOPEARL Phenyl-650M

5

40 – 900045122TOYOPEARL Phenyl-650S

5

20 – 500045123TOYOPEARL Phenyl-600M

540 – 900045124TOYOPEARL PPG-600M

540 – 900045125

TOYOPEARL Butyl-650M

5

40 – 900045126

TOYOPEARL Butyl-650S

5

20 – 500045127

TOYOPEARL Butyl-600M

540 – 90

容量
（μL）

粒子径
（μm）

RoboColumn
		品 番
品 名		
					
0045031TOYOPEARL Phenyl-600M

200 × 840 – 900045032

TOYOPEARL Phenyl-600M

600 × 840 – 900045033

TOYOPEARL Butyl-600M

200 × 840 – 900045034TOYOPEARL Butyl-600M

600 × 840 – 900045035TOYOPEARL PPG-600M

200 × 840 – 900045036

TOYOPEARL PPG-600M

600 × 840 – 900045037

TOYOPEARL Phenyl-650M

200 × 840 – 900045038TOYOPEARL Phenyl-650M

600 × 840 – 90＊MiniChrom、RoboColumnの他グレード製品につきましては、当社営業までお問い合せください。

34

ミックスモードクロマトグラフィー（MXC）

ミックスモードクロマトグラフィー（MXC）
ミックスモードクロマトグラフィー用TOYOPEARL充塡剤

TOYOPEARL MX-Trp-650M

MXC及びIECにおける塩存在下での動的吸着量の比較

抗体の分離精製

ミックスモードクロマトグラフィー (MXC)は、異なる複数の相TOYOPEARL MX-Trp-650Mには、アミノ酸であるトリプト

MXCでは、一般のイオン交換体と比べ、試料中に塩が含まれ細胞培養液には、イオン強度として 0.1-0.15 mol/Lの NaClに互作用（イオン交換、疎水結合、アフィニティー結合など）を持つ官ファンが固定化されています（図 1）。トリプトファン分子には、イていても、高い吸着量を維持することができます。図 2は、0.15相当する塩が含まれており、この条件で吸着分離できるMXCは、モ能基を導入した充塡剤を用いる分離モードです。したがって、目的

ンドール環による疎水性相互作用と、カルボキシ基による陽イオン

mol/L NaClを含む試料中の IgG吸着量を各 pHで比較したものでノクローナル抗体の分離精製に適用可能です（図4）。

物質の分離において、複合的な相互作用と分離選択性により、一段交換作用があります。

す。高い吸着量を得るため、通常のイオン交換体では pHを下げる

また、2種類の塩を組み合わせた溶離液において、塩とpHの両方必要がありますが、MXCでは中性に近い pHでも高い吸着量が維のグラジエントを用いることによって、良好な抗体フラグメントの持されています。

分離が行えます（図5）。

階で不純物を除去し、高純度精製が可能となります。また、イオン

また、抗体の吸着量が高く、試料中や、試料溶液中の塩濃度が高

交換クロマトグラフィーに較べて、試料や溶離液中の塩濃度が高い

い場合でも、分析種を十分吸着できる能力（塩耐性）を有していま場合でも、試料が吸着しやすいため（塩耐性クロマトグラフィー）、

す。表 1に、市販ミックスモード充塡剤との抗体の吸着量の比較を

初期精製や、中間精製において有利になります。

示します。

MXCでの動的吸着量と塩濃度及びpHの影響

一方、複雑な相互作用のため、分離条件の最適化が必要となりま

イオン交換基と疎水基の両方が、吸着に寄与するため、吸着条件、

MXCにおける動的吸着量は、吸着溶離液における塩濃度とpHのす。実験計画（DoE）などにより、溶離液の塩濃度、pHなどの検討

溶出条件、洗浄条件の検討が重要です。一般的な分離条件を表 2に影響が大きく、pHが低い場合、より高い塩濃度でも、高い吸着量がが、MXCの利用におけるポイントとなります。

示します。

得られます（図3）。

TOYOPEARL

CH2

N
H

図1

COONa 弱陽イオン交換

疎水性

TOYOPEARL MX-Trp-650Mにおける一般的な分離条件●イオン交換基と疎水基の両方が、 試料の吸着に寄与するため、吸着条件、溶出条件、洗浄条件の検討が重要です。
●陽イオン交換体に近い分離条件になります。
●吸着溶離液のpH及び塩濃度で、吸着量が大きく変動します。
吸着条件

緩衝液：pH 4.0 – 5.5
塩濃度：0.1 mol/L NaCl 以下が望ましい
試料に塩（0.15 mol/L 以下）が含まれていても吸着にはあまり問題はありません。

TOYOPEARL MX-Trp-650Mの構造120＊不純物が多い場合には、吸着条件で洗浄の後、塩濃 度 が 0.1 mol/L 以 下の 緩 衝 液（pH 5.0 – 7.0）で洗浄することも効果的です。

溶出条件

緩衝液：pH 7.0 – 8.0 前後
塩濃度：0.15 mol/L NaCl 以上

洗浄条件

塩濃度：0.5 – 1.0 mol/L NaCl
アルカリ溶液：0.1 – 0.5 mol/L NaOHTOYOPEARL MX-Trp-650M
TOYOPEARL GigaCap CM-650M
TOYOPEARL GigaCap S-650M
市販ミックスモード充塡剤100

IgG DBC (g/L)

O =OCH2CNH

表2
H
C

mAb DBC ＝ 93 g/L
Yield 96 ％

80

0

60

40

20

0

図2

4

4.3

4.7

pH

ミックスモード充塡剤及び陽イオン交換体におけるIgGの動

20

40

60

80

100

120

140 minカ ラ ム： TOYOPEARL MX-Trp-650M（6 mm I.D. × 4 cm）
吸着溶離液：50 mmol/L 酢酸塩緩衝液（pH 4.7）＋ 0.1 mol/L NaCl
溶出溶離液：0.1 mol/L トリス塩酸塩緩衝液（pH 8.5）＋ 0.3 mol/L NaCl
流速（吸着）：1.0 mL/min（212 cm/h）
流速（溶出）：2.0 mL/min、124分
検出：UV（280 nm）
試
料：CHO 細胞培養液（モノクローナル抗体）
試料は、抗体濃度が1g/Lとなるように、吸着溶離液で希釈的吸着量の比較（0.15 mol/L NaCl 存在下、各種pH）
図4

細胞培養液からのモノクローナル抗体の精製

動的吸着量
（IgG）

回収率

動的吸着量
（IgG）

回収率

TOYOPEARL MX-Trp-650M

50 – 100

0.12

95 g/L97 %48 g/L96 %市販ミックスモード充塡剤

平均

0.07

14 g/L86 %11 g/L85 %75

流 速：212 cm/h
DBC：10 %ブレークスルーカーブ

40
20
0
3.5

吸着溶離液：0.05 mol/L 酢酸塩緩衝液（pH 4.7）＋ 0.1 mol/L or 0.15 mol/L NaCl

10

60

8
0.00 mol/L NaCl
0.10 mol/L NaCl
0.15 mol/L NaCl
0.20 mol/L NaCl
4

4.5

6

80

40

Fc

30

60
40

20
10

20
0

0
5

5.5

6

6.5

4

35
30
25
20
15

0

50

100

150

200

250

min

Loading buffer pH

カ ラ ム： 6 mm I.D. × 4 cm
吸着溶離液：0.05 mol/L 酢酸塩緩衝液（pH 4.0 ‒ 6.0）+
0 ‒ 0.2 mol/L NaCl
溶出溶離液：0.1 mol/L トリス塩酸塩緩衝液（pH 8.5）+
0.3 mol/L NaCl
流
速：1.0 mL/min（212 cm/h）
検
出：UV（280 nm）
試
料：ヒトポリクローナルIgG（1 g/L）
動的吸着量は、ブレークスルーカーブ（10 ％高さ）より算出した。

図3

36

40

%B

0.15 mol/L（17 mS/cm）

45

F（ab ）
2

0.10 mol/L（12 mS/cm）

12

80

50

100

mAb

吸着溶離液（pH 4.7）中のNaCl濃度

UV［mAU］

イオン交換容量
（μL）

pH

粒子径
（μm）

120

50

60

100

CIP

14

抗体の吸着量の比較
Human IgG DBC (g/L)

表1

conductivity［mS/cm］

120

カ ラ ム： 6.6 mm I.D. × 2 cm
吸着溶離液：0.1 mol/L 酢酸塩緩衝液 ＋ 0.2 mol/L NaCl（pH 4.3）
溶出溶離液：0.1 mol/L 酢酸塩緩衝液 ＋ 0.4 mol/L NaCl（pH 5.6）
リニアグラジエント（80分）
流
速：0.86 mL/min（150 cm/h）
検
出：UV（280 nm）
試
料：モノクローナル抗体（凝集体含む）, 1 g/L

図5 TOYOPEARL MX-Trp-650Mによる抗体フラグメントの分離

動的吸着量における吸着緩衝液のpH及び塩濃度の影響

37

ミックスモードクロマトグラフィー（MXC）
製品一覧表
TOYOPEARL MXC充塡剤
		 品 番品 名							
0022817TOYOPEARL MX-Trp-650M

容量		（mL）		

粒子径		（μm）		

たんぱく質吸着量（γ-globulin, g/L）25		50 – 100		

≧75

0022818			

1000022819			

1,0000022820			

5,000＊ 価格につきましては、「TSKgel / TOYOPEARL総合カタログ」をご覧ください。

アフィニティークロマトグラフィー
(AFC）
粒子径

抗体特異的AFC充塡剤

45 µm

TOYOPEARL AF-rProtein A-650F
TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F
TOYOPEARL AF-rProtein L-650F＊ 容量が1,000 mL、5,000 mLの製品の価格につきましては、当社営業までお問い合せください。
※ 使用時に、酸化剤の使用や、強い直射日光、UV光への暴露は避けてください。
※ 遮光保存してください。

ToyoScreen カラム（プロセス開発、スクリーニング用）
		 品 番

品 名

規 格

内 容

0022824

ToyoScreen MX-Trp-650M

1 mL × 6 本

MX-Trp-650M 1 mL タイプ6 本

0022825

ToyoScreen MX-Trp-650M

5 mL × 6 本

MX-Trp-650M 5 mL タイプ6 本

群特異的AFC充塡剤

65 µm＊ToyoScreenをご使用の際には、品番0021400 ToyoScreen Holderが必要になります。

TOYOPEARL AF-Chelate-650M
TOYOPEARL AF-Red-650ML
TOYOPEARL AF-Heparin HC-650M

ToyoScreenカラムホルダ、コネクタ
		 品 番

品 名

内 容

0021400

ToyoScreen Holder

1 mL, 5 mLカラム共通

0020028

T-Fユニオン

FPLC®用コネクタ

活性化型AFC充塡剤

65 µm

TOYOPEARL AF-Tresyl-650M
TOYOPEARL AF-Epoxy-650M

MiniChrom
		品 番
品 名		
					
0045151TOYOPEARL MX-Trp-650M

カラム容量
（mL）

粒子径
（μm）

5

50 – 100

容量
（μL）

粒子径
（μm）

200 × 850 – 100

600 × 850 – 100

RoboColumn
		品 番
品 名		
					
0045051TOYOPEARL MX-Trp-650M

0045052		

38

活性化型AFC充塡剤（添加剤必要）

65 µm

TOYOPEARL AF-Formyl-650M
TOYOPEARL AF-Amino-650M
TOYOPEARL AF-Carboxy-650M

アフィニティークロマトグラフィー（AFC）
プロテインAアフィニティークロマトグラフィー

プロテインA充塡剤の通液特性

モノクローナル抗体はバイオ医薬品や診断検査試薬として需要が

初期工程

中間工程

最終工程

高く、大量精製、高純度精製が必須となっています。そのためダウ

プロテインA

陽イオン交換体

陰イオン交換体

0.40

ンストリームでのクロマトグラフィーによる精製が、ますます重要になっています。

プロテインA

陰イオン交換体

陽イオン交換体

表1に各種クロマトグラフィー分離モードの特長を、図1に、抗体

0.30

プロテインA

ミックスモード充塡剤＊アパタイトゲルを含む

テインA充塡剤は、抗体の精製純度が非常に高く、初期精製に最もよく使用されています。

陰イオン交換体

プロテインA

疎水充塡剤

陰イオン交換体

初期工程にプロテイン A充塡剤を用いるプロセスでは、以降のプロセスで、不純物（ホストセルたんぱく質、核酸、抗体凝集体、プロ

図 1 プロテインA充塡剤を用いる抗体精製プロセス例

Pressure（MPa）

精製のクロマトグラフィープロセス例を示します。現在では、プロ

ドで、不純物の除去分離を行います。

適しています。TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650Fは、高濃度の抗体試料液に対しても非常に高い吸着量を示します。また、短い滞留時間でも高い吸着量が維持されます。TOYOPEARL
AF-rProtein A-650Fは、機械的強度に優れており、カラム高さを20 cmないし 30 cmにすることで、高流速条件（線速を 500 cm/

による繰り返しCIPでも、吸着量の減少が抑えられています。

100

300

400

500

600

700

55
50
45

0.08

40

A社アガロース系プロテインA充塡剤
0

5

10

15

20

25

min

カ ラ ム： 5.0 mm I.D. × 5 cm for TP AF-rProtein A-650F
A社アガロース系プロテインA充塡剤 1 mL流
速：1.0 mL/min
溶離液A：20 mmol/L トリス塩酸塩緩衝液（pH 8.5）
溶離液B：25 mmol/L クエン酸緩塩衝液（pH 2.8）
0 to 100 % B 30分リニアグラジエント
試料：mouse IgM in 20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.5）ca.
8 g/L 100μL
検

出：UV（280 nm）

0.07

35
0

1

2

3
5
4
Residence Time

6min

カ ラ ム：TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F
TOYOPEARL AF-rProtein A-650F
A社アガロース系高吸着型・耐アルカリ型プロテインA充塡剤
カラムサイズ：5 mm I.D. × 5 cm
溶 離 液：0.02 mol/L りん酸塩緩衝液 ＋ 0.15 mol/L NaCl（pH 7.0）
試料：ヒトポリクローナル IgG（1 g /L）

0.06

図 7 IgMの分離例

0.05
0.04
0.03
0.02

TOYOPEARL AF-Protein A-650F(45 um) in water (L=8.4 cm)

0.01
0

0

100

200

300

400

500

600

Flow [cm/h]

カラムサイズ：40 cm I.D. × 8.4 cm（10.6 L）
カラム圧力は、線速500 cm/hでも、0.1 MPa以下

図 5 高速型TOYOPEARL AF-rProtein A-650Fの通液特性

＋＋＋

＋＋

＋

80

＋＋

＋＋＋

＋＋＋

70

3000

疎水充塡剤

＋＋

＋＋

＋＋＋

＋＋

60

2500

ミックスモード充
塡剤

＋＋

＋＋

＋＋

＋＋

mAU（280 nm）＋＋＋＋＋

DBC for IgG (g/L-gel)

プロテインA充塡剤

50
1 g/L
5 g/L
10 g/L

40
30
20

2000
1500
1000

CIP
（0.1 mol/L NaOH）

充塡剤
のコスト

図 2 滞留時間と動的吸着量の関係

陽イオン交換体＋＋＋ ； 特に優れている＋＋； 優れている＋； 改善が望まれる

200

溶出溶離液

充塡剤
の洗浄

0

図 4 高吸着型TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650Fの通液特性

60

滞留時間3分以上で60 g/L以上の高い動的吸着量が得られます。

抗体
精製純度

-200

Flow Rate（cm/h）

表 1 各種クロマトグラフィー分離モードの特長
抗体
吸着量

0
-100

65

30

hないし 1,000 cm/h）でも、比較的高い吸着量を維持でき、抗体

IgM、Fabなどに対しても強い親和性を示します。またアルカリ洗浄

200

0.05

Pressure [MPa]

DBC for IgG（g/L-gel）

初期工程では、大量の培養上清を迅速に精製することが要求さ材に多点で結合しており、一般的に吸着が弱かったマウス IgG1や、

300

100

TOYOPEARL AF-rProtein A-650F
A 社アガロース系高吸着型・耐アルカリ型プロテイン A 充塡剤
TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F

70

AF-rProtein A-650F

400

0.15

高吸着型プロテインＡ充塡剤れるため、高吸着量で、高速処理が可能なプロテイン A充塡剤がは、アルカリ耐久性のあるプロテイン Aを親水性ビニルポリマー基

500

0.10

耐アルカリ・高吸着型及び高速型プロテインA充塡剤

TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F及びAF-rProtein A-650F

600

0.20

0.00

精製における生産効率を向上させることが可能です。

700

0.25

テイン Aリガンドなど）を除去していく方法です。陰イオン交換体（陰イオン交換膜クロマトグラフィーも含む）は、フロースルーモー800
1.0 cm ID
2.1 cm ID
9.0 cm ID
10.0 cm ID

0.35

500

10
0
0
2

3.3

5

Residence time

Resin: rProtein A HC-650F
Column size: 5 mm I.D. × 5 cm（resin volume 1 mL）

図 3 TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650Fにおける IgG濃度と動的吸着量

0

50

100

150

200

250

min

min

カ ラ ム：TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F（5 mm I.D. × 5 cm）
吸着溶離液：0.02 mol/L りん酸塩緩衝液＋ 0.15 mol/L NaCl（pH 7.0）
溶出溶離液：0.1 mol/L クエン酸塩緩衝液（pH 3.0）
流速：0.2 mL/min
検出：UV（280 nm）
試
料：細胞培養液 40 mL（ヒト化IgG1：1 g/L）
＊精製画分は、TSKgel G3000SWXLによる純度チェックにより、純度95 %と確認されました。

図640

モノクローナル抗体（IgG1）の精製例

41

アフィニティークロマトグラフィー（AFC）
プロテインA充塡剤からのリガンド漏出量

プロテインLアフィニティークロマトグラフィー

耐アルカリ型プロテインA充塡剤は、0.1mol/L NaOHによるCIPTOYOPEARL AF-rProtein A HC-650Fは、プロテインAリガ

Fab、scFv、Diabodyといったフラグメント抗体は、一般的にでは、200サイクルまで、吸着量の減少は10 ％程度です（図8）。まンドが基材に化学的に多点結合されているため、リガンドが充塡剤

製造コストが安いメリットがあり、また組織への浸透性等、優れたた、その際のプロテインA充塡剤の精製能力として、CIP200サイク

から漏出する量が非常に少なくなっています（図10）。

特性を有することから次世代の抗体医薬品として開発が進められル後でも、ホストたんぱく質の除去効率は、低下しません
（図9）
。

ています。
通常の抗体（フルボディ）精製のアフィニティー精製には、抗体

ProteinA leaching［ng/mL］

6100

Capacity(%)

80
60
40
20
0

の Fc領域に親和性を有するプロテイン A充塡剤が広く使用されていますが、フラグメント抗体は Fc領域を有さないため、適用でき

5

20

40

60

80

80
70
60
AF-rProtein L-650F（lot.A）
AF-rProtein L-650F（lot.B）
他社品

すが、精製にはイオン交換クロマトグラフィーや疎水クロマトグ

400ラフィーといった従来型の分離モードが使用されています。

2

2

TOYOPEARL AF-rProtein L-650Fは、κ軽鎖に親和性のある

1

遺伝子組み換えプロテインLを固定化したフラグメント抗体精製用
0

20

40

60

CIP cycles

80 100 120 140 160 180 200

Number of CIP cycles

468
Exposure time（hour）

図13

耐アルカリ性表3種、抗体クラスによる親和性の確認た遺伝子組み換えプロテインLは、既存市販品に比較して、吸着量、

種

クラス

親和性

ヒト

IgG1

＋

IgG2

＋

IgG3

＋

IgG4

＋

IgG1

＋

IgG2a

＋

IgG2b

＋

IgA

＋

IgM

＋

λ軽鎖

−

IgG1

＋

IgG2a

＋

IgG2b

＋

IgG2c

＋

IgA

＋

IgM

＋

プロテイン L充塡剤では IgAや IgMにも親和性があります。プロ

λ軽鎖−

テイン A充塡剤で吸着しない抗体の精製においての補完的な役割※個別の抗体により親和性が異なることがあります。

レードと同様に機械的強度にも優れ、大型プロセスでも実用的に

DBCは20CIP毎に10 %ブレークスルーにより測定

インAで、化学的、物理的に安定な構造を持ち、高温や、高濃度の有TOYOPEARL AF-rProtein L-650Fは、新規リガンドの使用に

機溶媒、変性剤などの処理においても、吸着量の変化が少なくなっ

加えて基材の特性を最適に設計することにより、他社品（アガローています（図11、図12）。

スベース）に比較して、高いFab動的吸着量を示します（表2）。

使用可能です。

プロテインA充塡剤の温度安定性、溶媒安定性
プロテイン A充塡剤のリガンドは、遺伝子組み換えによるプロテプロテインL充塡剤の吸着量
マウス

性（CIP）

プロテインL充塡剤の耐アルカリ性

100
80
60
40

50

スベース）に比較して、優れた耐アルカリ性を示します。
90%以上の吸着量が維持できる時間は 2倍以上長くなっています30（図13）。

20

プロテインL充塡剤の親和性

10

Ref

40

0
0

20

40

60

80 100 120 140 160 180 200

Number of CIP cycles

CIPは0.2 mol/L NaOH（接触時間15分）で実施した。
200CIPサイクルでもゲルは安定

50

60

70

80

90

100 Autoclave

Temperature (degreeC)

加温時間：30分
溶媒：イオン交換水
オートクレーブ：120度、1.2気圧、15分も果たします。

1000

表2

Fab動的吸着量の比較

Fab動的吸着量（g/L）
図11 温度安定性

滞留時間
3.4 分

滞留時間
4.0 分

TOYOPEARL AF-rProtein L-650F

33

50

他社品

19

26

図 9 CIPにおけるホストセルたんぱく質の除去効率
Static binding capacity（g/L-gel）

60
50

30
20
10

Ref

20% EtOH 40 % EtOH 60 % EtOH 80 % EtOH 100% EtOH
Concentration of ethanol

接触時間：16時間

図12 エタノール溶媒安定性

Fab fraction800

カラムサイズ ：4.6 mm I.D. × 5 cm
吸 着 液 ：0.1 mol/L りん酸ナトリウム緩衝液（pH 7.5）
試料 ：2 g/L Fab（ポリクローナルヒト免疫グロブリンG由来）
吸着量は10 %ブレークスルーより算出

40

0

42

ラット

例として、0.1 mol/L NaOH水溶液に浸漬した場合、初期から

40

0

20

TOYOPEARL AF-rProtein L-650Fは、既存他社品（アガロー

UV280 nm（mV）

Static binding capacity (g/L-gel)

CHOP content（compared to start value）［％］

60

120

12

耐アルカリ性が大幅に向上しています。また他のTOYOPEARLグ

図10 CIPにおけるプロテインAリガンドの漏出量

140

10

アフィニティークロマトグラフィー用充塡剤です。新規に開発しカ ラ ム：TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F（5.0 mm I.D. × 5 cm）
CIPサイクル：10 CV吸着溶離液, 5 CV溶出溶離液,
7 CV吸着溶離液 3 CV 0.1 N NaOH
（接触時間：15分）, 5 CV吸着溶離液

図 8 TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650Fのアルカリ耐久

9050

これまでに数種類のフラグメント抗体医薬品が承認されていま

3

100 120 140 160 180 200

100

ません。

4

0
0

110

Binding capacity（%）

プロテインA充塡剤のアルカリ耐久性

600

400

200

0
0

10

20

30
40
Time（min.）50

60

カラムサイズ ：5 mm I.D. × 5 cm
吸 着 液 ：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）
溶 出 液 ：50 mmol/L クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 2.5）
流
速 ：0.25 mL/min
検
出 ：UV（280 nm）
注 入 量 ：1.2 mL
試
料 ：ヒト化モノクローナル抗体のパパイン消化物

図14

ヒト化モノクローナル抗体パパイン消化物からのFab精製

43

アフィニティークロマトグラフィー（AFC）
アフィニティークロマトグラフィー用TOYOPEARL充塡剤
TOYOPEARLアフィニティークロマトグラフィー（AFC）充塡剤には活性化型充塡剤や、群特異的リガンドを導入した充塡剤が用

TOYOPEARLアフィニティー充塡剤の共通の特性

活性化型充塡剤 - リガンドを直接固定化● 膨潤収縮が少なく、優れた圧損 /流通特性を備えた親水性充塡剤● 巨大たんぱく質にも対応できる大きい細孔径（100 nm）

直接結合させることが可能です。固定化反応についてはカルボジイ● ラボと生産スケール両方の AFC分離に適した Mグレード（40〜90 μm）

HW- -O-R-O-CH CH OSO CH CF + H N - Ligand
2
2
2
2
3
2
65

TOYOPEARL AF-Tresyl-650M

対して強い反応性を示す活性化型充塡剤です。

意されています。活性化型充塡剤はたんぱく質その他のリガンドを
ミドカップリングまたは還元アミノ化処理を施して共有結合を形成

TOYOPEARL AF-Tresyl-650Mはアミノ基及びチオール基にこの充塡剤は乾燥状態で提供され、たんぱく質その他のリガン

pH: 7.5-8
25 ℃

ドを含む緩衝液で反応します。固定化反応は中性から弱アルカリ性

HW- -O-R-O-CH CH -NH-Ligand + CF CH SO H
2
2
3
2
3
65

（pH7〜8）の溶液で行います（図18）。

させるタイプもあります。

Stable secondary amine linkage

このような条件下では不安定なたんぱく質でも固定化させること

TOYOPEARLの活性化型充塡剤の構造を図 16に、リガンド固定化のための活性化型充塡剤の選択
たんぱく質のカップリング用として TOYOPEARL AF-Tresyl-ができます。この固定化反応によって非常に安定性の高い二級アミ

表 3 タイプ別AFC充塡剤

TOYOPEARLの群特異的リガンドを図17に示します。

活性化型

ンまたはチオエーテル結合が作られます。トレシル（tresyl-）基密群特異的度は至適化（膨潤ウェット状態で約 20 mmol/L）してあり、多点結

AF-Tresyl

AF-Amino

AF-Red合によるたんぱく質リガンドの不活化を防ぎながら、固定化が可能

AF-Epoxy

AF-Carboxy

AF-Chelateです。代表的データを表4にまとめてあります。

AF-Formyl

AF-Heparin HC

650Mまたは TOYOPEARL AF-Formyl-650Mを推奨しますが、分子量の小さいリガンドのカップリング用としては TOYOPEARL

も使用できます。

TOYOPEARL AF-Tresyl-650M
pH: 7.5-8
25 ℃

HW-O-R-O-CH2CH2-S-Ligand + CF3CH2SO3H
65

粒子径 10 μmの TSKgel Tresyl-5PWにつきましては、

Stable sulfide linkage「TSKgel / TOYOPEARL総合カタログ」をご覧ください。

AF-Epoxy-650Mが適しています。TOYOPEARL AF-Amino650M及び TOYOPEARL AF-Carboxy-650Mはどちらの目的に

HW-O-R-O-CH2CH2OSO2CH2CF3 + HS-Ligand
65

R = hydrophilic polymer

TOYOPEARL AF-Epoxy-650Mは高密度のエポキシ基（約TOYOPEARL AF-Red-650ML

800 μmol/g）を持つ活性型充塡剤であり、乾燥状態で提供されま

図18 活性化型AFC充塡剤を用いた固定化方法

す。低分子量リガンドを高密度で固定化する場合に特に効果を発揮

TOYOPEARLアフィニティー充塡剤の固相合成への応用

NaO3S

各種の有機溶媒及び過酷な pH値に対して優れた安定性を示す
TOYOPEARL AFC充塡剤は、ペプチドやオリゴヌクレオチドのコ
ンビナトリアルケミストリーや固相合成用としても使用することが

SO3Na
N

NaO3S

リシンは100 mmol/Lを超える密度で固定化されます。

N

N

できます。

します（図 19）。たとえば、膨潤状態の充塡剤にグルタチオンとグ

N
OH

SO3Na

O
HW- -O-R-O-CH -CH-CH + H N-Ligand
2
2
2
65

活性化型充塡剤 - リガンド固定化に添加剤を利用

TOYOPEARL AF-Epoxy

TOYOPEARL AF-Formyl-650Mを使用すれば、温和な条件下

HO

pH: 9-11
40 ℃

で第一級アミンを有するリガンドを固定化することができます。

活性型TOYOPEARL

NaO3S

NH
N

TOYOPEARL AF-Tresyl-650M
HW65

N

NH

N

HW65

O-R-O-SO2-CH2-CF3

NH

N
N

NH
N

リガンドは充塡剤のホルミル基（アルデヒド基）と安定な二級ア
SO3Na

OH

多種多様な工業用酵素がアルデヒド基を含む担体を用いて固定化

HW65

O-R-O

CH2COO NaTOYOPEARL AF-Carboxy-650M
HW65

O-R-O-CH2COOH

Ligand Density: 100 meq/L
R = hydrophilic polymer

図16 活性化型AFC充塡剤の構造

Stable sulfide linkage

R = hydrophilic polymer

図19 活性化型AFC充塡剤を用いた固定化方法

TOYOPEARL AF-Heparin HC-650M

HW65

O-R-O

OH

O

O

OSO3NaOH

Ligand Density: 100 meq/L

HW- -O-R-O-CH -CHOH-CH -S-Ligand22
65

Ligand Density: 20 mmol/L

COONa
O-R-O-CH2-CH-CH2-NH2

pH: 7-8
25 ℃

CH2-N

Ligand Density: 60 mmol/L

HW65

CH2OSO3NaOOOHHNOSO3Na

表 4 活性化型AFC充塡剤を用いたたんぱく質の固定化
nApproximate Ligand Density: 5 g/L
R = hydrophilic polymer

図17 群特異的AFC充塡剤の構造

TOYOPEARL 充塡剤
たんぱく質固定化量（g/L）

AF-Tresyl-650M

AF-Formyl-650M

AF-Amino-650M

AF-Carboxy-650M

Soybean trypsin inhibitor
Protein A
Concanavalin A
α1-Antitrypsin
α-Chymotrypsin
Myoglobin
Ovalbumin
Bovine serum albumin
Human IgG
Cytochrome C
Lysozyme

16
1.9
13
12.3
12.5
12.4
─
12.4
10.0
─
60

3.5
─
─
─
─
─
2.5
14
15
5.8
20

5.8
─
─
─
─
─
6.7
19.2
6.7
3.3
5.8

15
─
─
─
─
─
0.8
3.3
11.7
7.5
17.5

not required

NaCNBH3NaCNBH3 or
Carbodiimide

Carbodiimide

7.0 ‒ 9.0

6.9 ‒ 9.0

4.5 ‒ 6.0

4.5 ‒ 6.0

Coupling agent
Optimal pH

44

TOYOPEARL AF-Epoxy

担体です。

CH2COO NaTOYOPEARL AF-Formyl-650M

TOYOPEARL AF-Amino-650M

HW65 -O-R-O-CH2-CH-CH2 + HS-Ligandに優れた多孔性充塡剤に、そのまま使用可能なアルデヒド基を持つ

O-R-O-CH2-CH-CH2
O
Ligand Density: 800μmol/g (dry)O-R-O-CH2-CHO

O

されています。TOYOPEARL AF-Formyl-650Mは、機械的強度

TOYOPEARL AF-Chelate-650M

HW65

HW65

Stable secondary amine linkage

代表的な固定化例を表4に示します。

Ligand Density: 80μmol/g (dry)

TOYOPEARL AF-Epoxy-650M

HW- -O-R-O-CH -CHOH-CH -NH-Ligand2265

ミン結合により充塡剤に結合します（図20）。

45

アフィニティークロマトグラフィー（AFC）

HW- -O-R-O-CH -CHO + H N-Ligand
2
2
65

TOYOPEARL AF-Formyl-650M

pH:7
25 ℃
HW- -O-R-O-CH -CH = N-Ligand
2
65

Schiff s Base Intermediate(Unstable)
NaCNBH3

HW- -O-R-O-CH -CH -NH-Ligand
2
2
65

Stable secondary amine linkage

R=hydrophilic polymer

TOYOPEARL AF-Amino-650Mはカルボン酸（ペプチド結合）

TOYOPEARL AF-Red-650MLには Reactive Red 120ます（図21）。カルボキシ基を持つリガンドを、カルボジイミドを（Procion Red HE-3B）が導入されています（図17）。この充塡

カップリング剤として使用し、リガンドと担体間にアミド結合を生剤はヌクレオチド依存性酵素、リポたんぱく質、プラスミノーゲ

成し固定化することが可能です。

ン、ペプチド、ホルモン、サイトトキシンなどの精製に有効です。

アルデヒド基を持つリガンドとしては、還元糖を有する炭水化物
や糖たんぱく質か、あるいは温和な過ヨウ素酸酸化反応で糖鎖のジオール基をアルデヒド基に開裂した化合物が利用可能です。

TOYOPEARL AF-Heparin HC-650M
ヘパリンは抗血液凝固作用を持つ高度に硫酸化された直鎖グル

TOYOPEARL AF-Amino-650Mは官能基の導入密度が至適化

コサミノグリカンです。このポリアニオン特性により、ヘパリンは（100 mmol/L）されていますので、たんぱく質や低分子量リガン

血漿成分やリポたんぱく質、リパーゼ、コラゲナーゼ、DNAポリメ

ドの固定化に適しています。たとえば、ラクトースは還元アミノ化

ラーゼなど幅広い生体分子と相互作用します。

反応を用いて 30 mmol/L充塡剤で固定化することができます。各図20 活性化型AFC充塡剤を用いた固定化方法

TOYOPEARL AF-Red-650ML

またはアルデヒド基（還元アミノ化）を介してリガンドを固定化し種たんぱく質の固定化例を表4に示します。

TOYOPEARL AF-Heparin-HC-650Mは高い吸着量と優れた
化学的安定性を持つアフィニティ充塡剤です（図17）。

またTOYOPEARL AF-Carboxy-650Mは、温和な方法でたんぱく質のアミノ基または低分子量リガンドの固定化に使用できまHW- -O-R-O-CH -CHOH-CH NH + HOCO-Ligand
2
2
2
65

TOYOPEARL AF-Amino-650M

carbodiimide
pH: 4-625 ℃

HW- -O-R-O-CH -CHOH-CH NH-CO-Ligand2265

Peptide bond linkage
HW-O-R-O-CH2-CHOH-CH2NH2 + OCH-Ligand
65

TOYOPEARL AF-Amino-650M
pH:7
25 ℃

HW-O-R-O-CH2-CHOH-CH2-N = CH-Ligand
65

Schiff s Base Intermediate

NaCNBH3

スクリーニング用カラムToyoScreen

す。カルボジイミドをカップリング剤とする固定化反応で、リガン

充塡剤量として1mLと5 mLのタイプがあり、TOYOPEARL AF-

ドと担体間にアミド結合を生成します（図22）。代表的な固定化例

rProtein A HC-650F、TOYOPEARL AF-rProtein A-650F、を表4に示します。

TOYOPEARL AF-rProtein L-650F、TOYOPEARL AFChelate 650M、TOYOPEARL AF-Heparin HC-650M及び群特異性リガンドを導入したTOYOPEARLTOYOPEARL AF-Chelate -650M
この充塡剤はリガンド密度約 35 mmol/Lのイミノジ酢酸（IDA）
を導入したものです（図 17）。応用例としては、金属イオン（Ca2+、TOYOPEARL AF-Red-650MLが用意されています。
ToyoScreenはプロセス開発の初期段階で目的物質の吸着と回収率に適した充塡剤をスクリーニングする目的で簡便にご使用いただける製品です。

Ni2+、Zn2+、Co2+など）を安定な三座キレート配位により担体に結合させます。得られた金属イオン配位充塡剤は、His-Tagたんぱく
質などアミノ酸配列にヒスチジンや遊離システインを含むたんぱく
質やペプチドを選択的に結合、保持します。金属キレートアフィニ
ティークロマトグラフィー（IMAC）は組み換え型ヒト成長因子や組織プラスミノーゲン活性化因子、グリコホリン、細胞そのものなどの精製に使用されています。

HW-O-R-O-CH2-CHOH-CH2-NH-CH2-Ligand
65

Stable secondary amine linkage

R = hydrophilic polymer

図21 活性化型AFC充塡剤を用いた固定化方法

HW- -O-R-O-CH2COOH + HN-Ligand
65

TOYOPEARL AF-Carboxy-650M
carbodiimide
pH: 4-625 ℃

HW- -O-R-O-CH -COO-NH-Ligand
265

Peptide bond linkage

R = hydrophilic polymer

図22 活性化型AFC充塡剤を用いた固定化方法

46

47

アフィニティークロマトグラフィー（AFC）
製品一覧表

製品一覧表

TOYOPEARL AFC充塡剤
品 番
品 名
			

ToyoScreen AFCカラム（プロセス開発、スクリーニング用）
容量
（mL）

粒子径
リガンド濃度（μm）		

たんぱく質吸着量（参考値）

抗体的AFC充塡剤
0022803

TOYOPEARL AF-rProtein A-650F

002280410
1000022806

1,000

0022807

5,000
TOYOPEARL AF-rProtein A HC -650F

100023426

250023427

100

0023428

1,000

0023429

5,000

0023486─

≧45 g/L（免疫グロブリンG）

250022805

0023425

30 – 60

TOYOPEARL AF-rProtein L-650F

002348710
1000023489

1,000

0023490

5,000

0022809

品 名

内 容

ToyoScreen AF-rProtein A-650F

AF-rProtein A-650F 1 mLタイプ5 本

0022810

AF-rProtein A-650F 5 mLタイプ1 本

00228110023430

AF-rProtein A-650F 5 mLタイプ5 本
ToyoScreen AF-rProtein A HC-650F

0023431

30 – 60

─≧68 g/L（免疫グロブリンG）

0023494

AF-rProtein A HC-650F 5 mL タイプ5 本
ToyoScreen AF-rProtein L-650F

0023495

AF-rProtein L-650F 5 mLタイプ5 本
ToyoScreen AF-Chelate-650M

0021385
30 – 60

─≧64 g/L（免疫グロブリンG）

0021388

AF-Chelate-650M 1 mLタイプ 6 本
AF-Chelate-650M 5 mLタイプ6 本

ToyoScreen AF-Red-650M

AF-Red-650M 1 mLタイプ6 本

ToyoScreen AF-Heparin HC-650M

AF-Heparin HC-650M 1 mLタイプ6 本

00213890021390

AF-rProtein L-650F 1 mLタイプ5 本
AF-rProtein L-650F 5 mLタイプ1 本

00234960021384

AF-rProtein A HC-650F 1 mL タイプ5 本
AF-rProtein A HC-650F 5 mL タイプ1 本

0023432

250023488

		 品 番AF-Red-650M 5 mLタイプ6 本

0021391

AF-Heparin HC-650M 5 mLタイプ6 本＊ToyoScreenをご使用の際には、品番0021400 ToyoScreen Holderが必要になります。

群特異的AFC充塡剤
0014475

TOYOPEARL AF-Chelate-650M

25

40 – 90

2.5 – 45 meq/L─

ToyoScreen カラムホルダ、コネクタ

0019800

100

品 名

規 格

0014476250

0021400

ToyoScreen Holder

1 mL、5 mLカラム共通

00149071,000

0020028

T-Fユニオン

FPLC® 用コネクタ

0008651TOYOPEARL AF-Red-650ML

0019801

40 – 90─

2.5 – 4.5 g/L（HSA）

40 – 90─

≧5 g/L（AT Ⅲ）＊「FPLC」はGEヘルスケア・ジャパン社の登録商標です。

10000087060020030

25

		 品 番500
TOYOPEARL AF-Heparin HC-650M

100020031100

0020032

1,000

0020033

5,000

MiniChrom
		品 番
品 名		
					

カラム容量
（mL）

粒子径
（μm）

0045161

TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F

530 – 60

0045162

TOYOPEARL AF-rProtein L-650F

530 – 60

容量
（μL）

粒子径
（μm）

200 × 830 – 60

活性型AFC充塡剤
0014471

TOYOPEARL AF-Tresyl-650M

5 g＊0014472

100 g＊

0014906

1,000 g＊0008000

TOYOPEARL AF-Epoxy-650M

10 g＊

0008038

100 g＊

0018315

1,000 g＊0008004

TOYOPEARL AF-Formyl-650M

250008040

1000017396

1,000

00173975,000

0008002

TOYOPEARL AF-Amino-650M

250008039100

0018074

1,000

00183160008006

40 – 90─

40 – 90 600 – 1,000 μeq/L≧ 60 g/L（STI）

─

RoboColumn
		品 番
品 名		
					
0045061

TOYOPEARL AF-rProtein A-650F

0045062
40 – 90

40 – 70 meq/L─00450630045066
70 – 130 meq/L─

40 – 90

80 – 120 meq/L─

30 – 60

TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F

200 × 830 – 60

600 × 830 – 60

TOYOPEARL AF-rProtein L-650F

200 × 830 – 60

600 × 830 – 6000450640045065

40 – 90600 × 85,000
TOYOPEARL AF-Carboxy-650M

250008041100

0018827

1,000

0018828

5,000＊ プロテインA、プロテインLリガンド漏出率キット（ELISAキット）につきましては、当社営業までお問い合せください。
＊ ドライゲル1 gは水溶液中で約3.5 mLに膨潤します。
＊ 価格につきましては、「TSKgel / TOYOPEARL総合カタログ」をご覧ください。
＊ 容量が1,000 mL、5,000 mLの製品の価格につきましては、当社営業までお問い合せください。

48

49

TOYOPEARLの使用法・充塡法MEMO
無加圧でも、ポンプまたは落差圧で圧力をかけた加圧状態でも充塡できます。
但し、粒子径が小さいので、無加圧充塡では大きなカラムでは流速が非常に遅くなります。
このような場合には、溶出液槽の位置をたとえば1 m程度高くし落差をつけるか、またはポンプ使用により加圧します。
詳細は「TOYOPEARL、TSKgel PW充塡及び使用法ガイド」を参照ください。

スラリーの調整
1．微粒子の除去
微粒子の混在はフィルタの目づまりの原因となり流速の低下につながります。次の要領で微粒子を除きます。
●除去方法の一例
─TOYOPEARL DEAE-650S 250 mLの場合─
❶ 懸濁液250 mLを2 Lのビーカーに取り出し水を約750 mL 入れて合計1 Lとする。
❷ 次に2〜3分よく攪拌する。
❸ 1.5時間静置後上澄の浮遊微粒子含有部約500〜600 mLを捨てる。
❹ 以上の操作を3〜4回くり返す。
最も粒子径の小さいSuper Fineの例であり、粒子径の大きいMediumでは、静置時間を短くします。
2．必要充塡剤量
充塡法により異なります。加圧しないで充塡する方法は、カラム体積よりいくらか多めに取ります。
加圧して充塡する場合には、カラム体積のおおよそ20 %増程度が必要となります。
3．洗浄
ほとんどのTOYOPEARLは20 %エタノール水溶液に懸濁して出荷されますので、使用に先だってグラスフィルター上で、充塡剤の3倍量以上の水で洗浄する必要があります。
4．濃度の調製❶ デカンテーションで微粒子を除去した充塡剤を、充塡剤容積の3倍量の充塡溶媒で2〜3回洗浄します。
❷ 洗浄後、カラム容積の1.2倍量の充塡剤をメスシリンダーで計量します。
❸ スラリー濃度が30〜50 %になるように充塡溶媒を加えてスラリー化します。充塡には、分離に使用する溶液のうち最も塩濃度の高い溶液（例えばIECの場合、0.5 mol/L NaCl溶液等）を用います。

カラムへの充塡
各種充塡法の比較

充塡法
以下にTOYOPEARL HWタイプの充塡を行うに当たっての注意点を示します。
❶ TOYOPEARLの充塡は、緩和な加圧条件（50〜数100 kPa）でおこなうのが最項

目

適です。この観点からペリスタリックポンプ（HPLC用ポンプも使用可能）を使用する充塡法が好ましいものといえます。HPLC用充塡剤の場合のように高圧下で特の充塡は、お勧めできません。
❷ 簡便法である自然落差充塡法においては、できるだけ水圧を大きく取っていただ

使用流速
徴

く方が性能の良いカラムが得られます。また充塡溶媒を加温し粘性を下げるなどして、充塡流速を大きくすることも良い効果をもたらします。
が起こります。デカンテーションにより浮遊物を取り除いてください。

各種HW充塡剤の充塡流速
品名HW-40F

HW-55F
HW-50F

HW-65F
HW-75F

自然落差による充塡法
3.リザーバ使用法◎速い
×遅い（1よりも速い）

4.簡易法
（加温）
×遅い
（3よりも速い）○ 大 きいと ◎ 大 きいと ×使 用 流 速 ×使 用 流 速
が制限さ
が制限さ
ころまで
ころまで
れる
れる
可能
可能

充塡に
おける再現性

○良い

◎非常に
良い

○良い

○良い

ポンプ

×必要

×必要

×必要

○不要

リザーバー

×必要

×必要

×必要

○不要

圧力計

△ 使 用する ×必要
方が良い

○不要

○不要

（○長所、× 短所）

各種充塡剤の充塡流速及び使用流速
流 速
mL/min11.0 〜 11.4
12.4 〜 13.0
14.0 〜 15.0
10.0 〜 14.0
  2.0 〜 13.0
  6.0 〜 19.0
  1.0 〜 16.0
  6.0 〜 18.0
  4.0 〜 16.0
  3.0 〜 15.0
  2.4 〜 13.0
  2.5 〜 10.0
  2.5 〜 10.0

＊使用流速は充塡流速の半分以下に設定してください。

50

○速い

＊ HPLC 用ポンプも使用可能

定流速充塡法における充塡流速
カラムサイズmm I.D. × cm
10 × 60
16 × 60
22 × 60
44 × 60
16 × 60
32 × 60
44 × 60
22 × 30
22 × 45
22 × 60
22 × 90
22 × 60
22 × 60

必要な器具❸ 懸濁液中に浮遊微粒子が存在すると、フィルターが目づまりし、圧力上昇、流速低下

充塡流速

ペリスタリックポンプ
による充塡法1. 定流速法 2.半定圧法

線

速 度
cm/h
70 〜 11070 〜 190
60 〜 180
40 〜 160
60 〜 185
45 〜 165
45 〜 165
95 〜 130
65 〜 190
50 〜 170
35 〜 155
40 〜 150
40 〜 150

品

名カラムサイズグレード（mm I.D. × cm）

HW-40

22 × 60

HW-50、HW-55

22 × 60

HW-65、HW-75

22 × 60

IEC

22 × 20HIC

22 × 20

AF-650 タイプ

22 × 10

S
F
C
S
F
C
S
F
C
S
M、C
S
M、C
M

充塡流速 充塡線速度 使用線速度
mL/mincm/hcm/h
2.0 〜  2.5   30〜  40 10 〜  25
4.0 〜  5.0   60〜  80 25 〜  50
8.0 〜 10.0 120〜160 50 〜 100
1.5 〜  2.0   25〜  35 10 〜  20
3.0 〜  5.0   50〜  70 25 〜  35
6.0 〜  8.0   90〜130 35 〜  70
1.5 〜  5.0   20〜  75 10 〜  15
2.5 〜 10.0   40〜150 15 〜  30
5.0 〜 20.0   30〜300 30 〜  65＜35＜550
45 〜  65
＜65
＜1000
80 〜 240＜35＜550
45 〜  65
＜65
＜1000
80 〜 240＜65＜1000
30 〜 130