別添４-２ 調査研究報告書（要旨）

家庭動物を対象としたマルチローカス STR 解析による関する研究を報告している 1-6）。これらは、先身元証明（個体識別）技術に関する研究に述べた事例において有効的な個体識別法として

Dog population data generated from a multiplex STR kit
for forensic DNA profiling日本獣医生命科学大学 獣医学部 獣医保健看護学科 近江 俊徳
Toshinori Omi, Nippon Veterinary and Life science University
キーワード：家庭動物、DNA、個体識別、法科学
Key Words: house animal, DNA, identification, forensic Science

１．目的
動物の飼い主の責任（動物愛護管理法第７条）では、１）動物の種類や習性などに応じて適正に飼い、動物の健康と安全を守るよう努めること。２）動物が人に危害を加えたり迷惑を及ぼすことが無いよう努めること。３）感染症などの病気の知識を持って、予防に注意するよう努めること。４）自分が所有していることを明らかにするために、標識をつけるよう努めること等が定められている。
しかし、現実的には、
１）身元不明動物の遺棄 ２）迷子や地震などの災害、盗難あるいは事故等による飼い主との離別 ３）
ヒトによる家庭動物の殺傷事例 ４）
家庭動物によるヒトへの殺傷事例など（平成 21年度 動物の遺棄虐待事例等調査報告等 環境省）
、ヒトと動物の共生が進む中、動物を取りまく社会的問題も存在する。特に所有者明示における個体識別（身元証明）は重要であり、現在はマイクロチップ装着等が定められているが、マイクロチップの普及率は 0.5％程度と低く（マイクロチップ普及推進モデル事業、自然環境局総務課動物愛護管理室、平成 20 年度）、技術は確立されているものの実用的な個体識別法としては十分とは言い難い。
近年、欧米では法医学者、FBI, 動物遺伝学者などが積極的に家庭動物のＤＮＡ個体識別に注目されてる 1-3）。そこで、本研究では、家庭動物のＤＮＡ個体識別に不可欠な短鎖縦列反復配列（Short tandem repeat；STR）マーカーの遺伝子型頻度からイヌ遺伝子型判定キットの個体識別能を評価することで、DNA 個体識別の実用性を調査した。
２．材料および方法
イヌゲノム DNA は日本獣医生命科学獣医学部獣医学科臨床病理学教室から分与されたGolden Retriever４０検体の血液を用い、常法に抽出した。
次に、身元証明（個体識別）技術に関する調査研究として、が我が国では市販されたばかりのCanineGenotypes
Panel
1.1
Kit(Finnzymes, フィンランド)を選択し、PCR法 に よ り 18 の イ ヌ STR 遺 伝 子 座 位 とAmelogenin 遺伝子座の計19 遺伝子座を同時にマルチプレックス PCR 増幅した。次に、各遺伝 子 座 の 型 判 定 を 行 う た め 、 eneScanTM
500[LIZ]Size Standard(ABI, アメリカ)とともに ABI PRISM 310 Genetic Analyzer （ABI,アメリカ）にてキャピラリー電気泳動を行いPCR 産物を分離後、Gene Mapper v.4.0（ABI,アメリカ）で各アリルの同定を行った。なお、
1

以上の条件は添付の指示書に準じて実施した。
Golden Retriever４０検体の 18STR 座位および Amelogenin 遺伝子座すべての遺伝子型データーをもとに本キットの個体識別能を評価するためヘテロ接合度観察値、ヘテロ接合度期待値、多型情報含有値識別能、総合識別能力、父権否定確率、総合父権否定確率および最もよく見られる確率が高い個体の遺伝子型頻度をMicrosoft Excel（Microsoft Corporation, アメリ カ ） と Cervus ver.3.0.3 ソ フ ト ウ ェ ア（Tristan Marshall）4）を用いて算出した。また、ハーディー・ワインベルグ平衡検定の有意確 率 、 集 団 内 で の 近 交 係 数 は GENEPOPversion 4.0.10. （http://genepop.curtin. edu.
au/ge nepop_op1.html）5）を用いた。さらに
GENEPOP version 4.0.10.を用いて集団内における近交係数を算出した。
３．結果
Golden Retriever 40 検体（♂23 検体、♀17検体）を用いたフラグメント解析の結果、18STR 遺伝子座と Amelogenin 遺伝子座、計 19遺伝子座全てにおいてピークが検出され、遺伝子型判定が可能であった。
表１ Golden Retriever 40 検体で検出された
18 STR 遺伝子座の解析結果

Amelogenin 遺伝子型による性別判定は、雄検体ではヘテロ型[179-215]、雌検体ではホモ型[215-215] を 示 し 、 個 体 情 報 の 性 別 とAmelogenin 遺伝子型判定による性別判定は 40検体全てにおいて一致した。
次 に 、 フ ラ グ メ ン ト 解 析 に よ り Golden
Retriever 40 検体で検出された Amelogenin 遺伝子座を除く 18 STR 遺伝子座の遺伝子型からアリルサイズ範囲、アリル、アリル数、ヘテロ接合体、ホモ接合体、アリル頻度を算出した
その結果、アリルの種類は最少で 3 種類、最多で AHT137 の 10 種類の範囲でアリルに多型が見られ、平均すると 1 遺伝子座につき 5.17のアリルが検出された。また、各遺伝子座のアリルごとに検出されたアリル数からアリル頻度を算出した結果、最もアリル頻度が低かったのは REN54P11 のアリル 226,320、INRA21 のアリル 82,91、AHT137 のアリル 132,142、
2

AHTh260 のアリル 240,250,252、FH2848 のアリル 234、AHT121 のアリル 105、AHTh171のアリル 223,234 の 0.0125 で、最もアリル頻度が高かったのは INU005 のアリル 142 の0.7125 であった（表１）。
次に、各 STR の遺伝的多様性や個体識別能力、親子鑑定能力を評価するために、STR 遺伝子座で検出されたヘテロ接合体数、ホモ接合体数、アリル頻度から、ヘテロ接合度観察値（Ho）、ヘテロ接合度期待値（He）、ハーディー・ワイ
ンベルグ平衡検定における有意確率（P-Value）、集団内での近交係数（ Fis ）、多型情報含有値（PIC）、識別能（PD）、父権否定確率（PE）、総合識別能力（APD）および総合父権否定確率（APE）を算出した。
その結果、検出されたヘテロ接合体数から算出されたヘテロ接合度観察値（Ho）は AHT121の 0.4250 から FH2054 の 0.8250 の範囲の値を示し、遺伝子座によって差が見られ。ヘテロ接合 度 観 察 値 （ Ho ） は 、 FH2054, AHT137,
REN169O18,
INU055,REN169D01,
REN162C04, AHTk253, FH2848, INRA21,
INU030, REN247M23, REN54P11, AHTk211,
AHTh171, CXX279, AHTh260, INU005,
AHT121 の順にヘテロ接合度観察値が高い遺伝子座となり、18 遺伝子座のヘテロ接合度観察値の平均値は 0.6236 であった。アリル頻度から算出されたヘテロ接合度期待値（He ）は
INU005 の 0.4706 から AHT137 の 0.8541 の範囲の値を示し、遺伝子座によって差が見られ、AHT137, FH2054, INRA21, REN162C04,
REN169O18, REN169D01, INU055, CXX279,
FH2848, AHTk253, REN54P11, REN247M23,
AHT121, AHTh260, INU030, AHTh171,
AHTk211, INU005 の順でヘテロ接合度期待値が高い遺伝子座となり、18 遺伝子座のヘテロ接合度期待値の平均値は 0.6507 であった。Ho とHe から算出したハーディー・ワインベルグ平衡
検定の有意確率（P-Value）は REN247M23 の0.0332 から AHTk253 の 0.9580 の範囲の値を示し、遺伝子座によって差が見られ、18 遺伝子座のハーディー・ワインベルグ平衡検定の有意確率の平均値は 0.4105 であった。P<0.05 の値を示した遺伝子座は AHT121（ 0.0378）とREN247M23（0.0332）の 2 遺伝子座であった。
集団内での近交係数（ Fis ）は INU030 の－0.1481 から AHT121 の 0.3140 の範囲の値を示

し遺伝子座によって差が見られ、18 遺伝子座の近交係数の平均値は 0.0399 であった。アリル
頻度から算出した多型情報含有値（PIC）は
INU005 の 0.4361 から AHT137 の 0.8253 の範囲の値を示し、遺伝子座によって差が見られ、AHT137, FH2054, INRA21, REN169D01,
REN169O18, INU055, CXX279, FH2848,
REN54P11,
AHTk253,
REN247M23,AHT121, AHTh260, AHTh171, AHTk211,
REN162C04, INU030, INU005 の順で多型情報含有値が高い遺伝子座となり、18 遺伝子座の多型情報含有値の平均値は 0.5914 であった。
ア リ ル 頻 度 か ら 算 出 し た 識 別 能 （ PD ） はINU005 の 0.6849 から AHT137 の 0.9574 の範囲の値を示し、遺伝子座によって差が見られ、AHT137, FH2054, INRA21, REN162C04,
REN169D01, INU055, REN169O18, CXX279,
FH2848, REN54P11, AHTk253, REN247M23,
AHT121, AHTh260, AHTh171, AHTk211,INU030, INU005 の順で識別能が高い遺伝子座となり、18 遺伝子座の識別能の平均値は0.8116 であった。また、18 遺伝子座の識別能から算出した総合識別能力（APD）
は 1－1.4337-14×10 （=0.999999999999986）となり、この18 STR 遺伝子座の遺伝子型を用いた総合的な識別能力つまり任意の２人が異なる遺伝子型を持つ確率は、99.9999999999986％（1000 兆頭
中 999 兆 9999 億 9999 万 9986 頭が異なる遺伝子型を持ち識別できる確率）となった。また、
父権否定確率（PE）は INU030 の 0.2432 からAHT137 の 0.6900 の範囲の値を示し、遺伝子座によって差が見られ、AHT137, FH2054,
INRA21, REN162C04, REN169D01, INU055,
REN169O18, CXX279, FH2848, REN54P11,
AHTk253, REN247M23, AHT121, AHTh260,
AHTh171, AHTk211, INU005, INU030 の順で父権否定確率が高い遺伝子座となり、18 遺伝子座の父権否定確率の平均値は 0.4021 であった。18 遺伝子座の父権否定確率から算出した
総合父権否定確率（APE）は 0.999934 となり、母子関係が分かっている場合に正しくない父親を検出する確率は 99.9934％（100 万頭の父親候補から 99 万 9934 頭を除外できる確率）となった。
次に、Golden Retriever 40 検体から検出したアリル頻度を用いて最も見られる確率が高い個体の遺伝子型を算出した。各 STR 遺伝子座
3位の遺伝子型頻度は、最もアリル頻度が高かっ常時研究補助をして頂いた本学研究室（獣医保たアリルと 2 番目にアリル頻度が高かったアリ
健看護学基礎部門比較遺伝学研究分野）の学生
ルのヘテロ接合体を遺伝子型頻度とした６）。各に感謝致します。
STR 遺伝子座位で算出した遺伝子型頻度をその結果、18 STR 遺伝子座で最も見られる確率
引用および参考文献が高い遺伝子型を持つ個体の割合は約 5300 億
1. Shutler GG, Gagnon P, Verret G, Kalyn H,
頭に 1 頭という確率となった。
Korkosh S, Johnston E, Halverson J. Removal of a４．考察
PCR inhibitor and resolution of DNA STR types in
国際畜犬連盟の統計によると世界のイヌの）7
mixed human-canine stains from a five year old
頭数は 141,456,939 とされており 、国際畜犬連盟が把握していない頭数も含めると、世界にcase.J Forensic Sci. 1999． 44(3):623-6.
約 4 億頭のイヌがいると推測されている。
また、 2. Brauner P, Reshef A, Gorski A. DNA profilingof trace evidence--mitigating evidence in a dog日本においては 6,880,844 頭のイヌが登録されており、登録されていない頭数を含めると約biting case. J Forensic Sci. 2001． 46(5):1232-4.
3. Zenke P, Egyed B, Zöldág L, Pádár Z.
1200 万頭の犬が飼育されていると推測されてPopulation genetic study in Hungarian canineいる。本調査研究で明らかとなった、総合識別populations using forensically informative STR loci.
能力（APD）：1－1.4337×10-14 および、最も-12一般的な個体の遺伝子型頻度：1.88383×10
Forensic Sci Int Genet. 2011． 5(1):e31-6.
4.
Marshall,T.C., Slate,J., Kruuk,L., and（約 5300 億頭に 1 頭）の結果は、理論的は地Pemberton,J.M.
Statisticalconfidence
for
球上の全部のイヌを検査しても同じ個体は見つ
likelihood-based paternity inference in naturalからないということを意味し、G.R という一品種から導き出された結果ではあるが、本キット
populations. Mlo.Ecol. 1998．7,639-55．
5. Raymond M, Rousset F. GENEPOP(Versionによるイヌ DNA 個体識別は可能であることが
8）1.2):Population Genetics Software for Exact Tests
示唆された。また、多型情報含有値 、親子鑑定能力の指標となる多型情報含有値（PIC）のand Ecumenicism. J.Hered 1995．86:248-9．
6. Entrala C, Lorente M, Lorente JA, Alvarez JC,
平均値は G.R で 0.5914、であった。G.R どちMoretti T, Budowle B, Villanueva E. Fluorescentらにおいても平均して 1 遺伝子座につき 50％
multiplex analysis of nine STR loci: Spanish
以上の確率でアリルの由来を判定できる数値を示したことから、日本国内で飼育されている
population data. Forensic Sci Int 1998．98(3):179-83．
7. Federation Cynologique Internationale For Dogs
G.R において本キットは親子鑑定にも有用であWorldwide.
Statistics(2010)
ることが示唆された。
以上、本調査により我が国におけるイヌ DNA（http://www.fci.be/stats.aspx）
個体識別が技術的に可能であることが示唆され、 8. John M.Butler. 福島弘文・五條掘孝監訳.
身元不明犬の身元証明、動物虐待、遺棄の抑止
DNA 鑑定とタイピング 遺伝学・データベー力など家庭動物の適正飼育管理への応用が期待
ス・計測技術・データ検証・品質管理. 2009 共される。
立出版．
謝辞
本調査研究は、 平成 22 年度
公益社団法人 日本愛玩動物協会 家庭動物の適正飼養管理に関する調査研究助成により実施した。助
成頂いた日本愛玩動物協会関係者の皆様に深謝致します。また、本調査研究で個体識別の検討を主として実施した日本獣医生命科学大学 獣医保健看護学専攻博士課程前期 2 年生 河 上剛氏、血液サンプルを分与頂いた同大学 臨床病理学教室 鷲巣月見教授、
盆子原 誠准教授、
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