細胞膜透過性ペプチドを模倣した
グアニジル化キトサン

鳥取大学

工学部 化学バイオ系学科
准教授 井澤 浩則
令和３年３月２日

1バイオ医薬品の問題点
低分子薬物

×バイオ医薬品
サイズが大きく通れない

細胞膜透過性が低い
腸管吸収性が低い

細胞内に薬物を運びにくい体に吸収されにくい

細胞膜透過性ペプチド（CPP）
RRRRRRRRRGRKKRRQRRRPPQ

HIV-TAT

Oligoarginine (R9)RRWWRRWRR

LLIILRRRIRKQAHAHSK

R6/W3
塩基性 K, R, H
酸性
D, E
非極性 A, V, L, I, M, F, W, P
極性
G, S, T, C, Y, N, Q

pVEC

RQIKIWFQNRRMKWKKPenetratin
MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRVM918
アルギニン（R）リッチCPPでは、アルギニンのグアニジノ基が細胞膜透過性に寄与することが明らかになっている。
T. Takeuchi, S. Futaki, Chem. Pharm. Bull.
,64, 1431-1437, (2016) .
2

キトサン
精製

キチン
アルカリ処理キトサン（CS）

利点
・細胞膜透過性の向上
・生体適合性、生体分解性
・アミノ基の反応性

医薬品用添加剤に開発に有効な素材
3

グアニジル化キトサン (GCS)

GCS
グアニジノ基・細胞膜透過性の向上
・中性域でも正に帯電（pKa = 12.5）→中性域での溶解性・分散性の向上
・リン酸やカルボン酸と強くイオン結合

CSをグアニジル化すれば、CSの細胞膜透過性を強化できる？
4キトサン及びキトオリゴ糖のグアニジル化
キトサンのグアニジル化

APH2O, NEt3 （rt）

CS乳酸塩GCS

H. Izawa, M. Kinai et al., Int. J. Biol. Macromol., 125, 901–905 (2019) .

キトオリゴ糖のグアニジル化
APH2O, NEt3（rt）

キトオリゴ糖（COS）塩酸塩

グアニジル化キトオリゴ糖（GCOS）
H. Izawa, M. Kinai et al., Biomolecules., 9, 259–268 (2019) .

5

グアニジル化PEGグラフトキトサン

ポリエチレングリコール（PEG）
PEG化ユニット・中性の親水性基（分散性・安定性の向上）
・生体内でのステルス効果（RES回避機能）
M. L. Immordino et al., Int. J.
Nanomedicine, 1, 297–315 (2006).

グアニジル化PEGグラフトキトサン（PEG-GCS）

グアニジル化ユニット
・中性域でも正に帯電（pKa = 12.5）→中性域での溶解性・分散性の向上
・リン酸やカルボン酸と強くイオン結合・細胞膜透過性の向上
R. Mogaki et al., Chem. Soc. Rev., 46, 6480–6491 (2017).

発明者：井澤浩則、斎本博之、発明の名称：グアニジル化ポリエチレングリコールグラフトキトサン
及びそれを含む医薬用キャリア、特願2019-084140 (2019/04/25出願).
6本説明会では

１．GCS及びPEG-GCSの合成

7

GCSの報告例
一段階反応

グアニジル化試薬1)

導入率（14%）が低い
シアナミド
1) Xinyun Zhai et al, J. Appl. Polym. Sci., 2011, 121, 3569-35782)

導入率は比較的高い（30%）が、市販されていない。
ホルムアミジンスルホン酸

多段階反応 3)

2) Ying Hu et al, Carbohydr. Polym., 2007, 67, 66-72

多段階でのキトサンの保護・脱保護が必要
高価（5g, 111,000円）

1,3-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-23) Priyanka sahariah et al, Carbohydr. Polym., 2015, 127, 407-417(トリフルオロメタンスルホニル)グアニジン
81-アミジノピラゾール塩酸塩
安価なグアニジル化試薬
25 g, 9400円（東京化成）
1-Amidinopyrazole Hydrochloride (AP)試薬使用例 )

Michael S.Bernatowicz et al, J. Org. Chem. 1992, 57, 2497-2502.
9

APを用いるCSのグアニジル化AP（4.5 eq.）

CS lactate salt

透析

H2O, NEt3（室温, 7日間）

GCS

DDA; 68.8%Mn; 7600 (Mw /Mn=1.47)

1720 cm-1 1590 cm-1
C=N NH2(guanidino group)

Transmittance (a.u.)

生成物のIRスペクトル
GCS

4000

CS

3500

3000

2500
2000
Wavenumber (cm-1)

1500

1000

500

10

GCSの1H NMR及び13C スペクトル
cddbaDOHbin D2OaGCSdcbCS
87654
Chemical shift (ppm)

3C3, C4, C5CbaCC1210aC6C2b

Chemical shift (ppm)11

様々な条件下でのGCSの合成
APDialysis

H2O, NEt3 （rt）

GCS

CS lactate salt
Entr
y
1
23
45abCS(g)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0

CS unit(mmol)
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0

Degree of Guanidinylation
AP(mmol)
6.1
6.1
6.1
18.3
18.3

NEt3(mmol)
016.5
16.5
33.0
33.0

Reaction time DGa(day)
(%)
72.3
19.6
725.6112.2742.3

Yieldb(%)
23.7
40.3
49.3
49.055.3

Estimated as follows: (GCS unit determined from elemental (mol)/total units (mol) in CS)x100.
Estimated as follows: (yield of GCS (g)/theoretical yield (g) when CS is perfectly converted to GCS)x100.

（高分子量CSでも同程度のDGのGCSが得られる）

12PEG-GCSの合成
片末端カルボキシル化メトキシPEG（PEG-COOH）

キトサン（CS）

EDC/NHSin 0.1 M MES水溶液

Mn (Mn/Mw) = 7.6 x 103(1.5)
脱アセチル化度68.8％

1-アミジノピラゾール
塩酸塩（AP）
水, トリエチルアミン

PEGグラフトキトサン（PEG-CS）
収率：69.5%
導入率：11.3Mn (Mn/Mw) = 5.6 x 104 (2.2)

グアニジル化-PEGグラフトキトサン（PEG-GCS）
収率：93.8%
導入率：39.0（元素分析）
Mn (Mn/Mw) = 4.5 x 104 (1.6)

13

本説明会では

２．GCS及びPEG-GCSのHeLa細胞への取り込み挙動

14

GCS、PEG-GCSのHeLa細胞への取り込み
HeLa細胞の播種
37℃、CO25 %、24時間培地除去、Hank’s平衡塩溶液（HBSS）で洗浄TM（CS溶液含有）を加え、 2時間静置（37℃、CO2 5 %）Transport Medium（TM）

TMを除去し、リン酸緩衝塩水（PBS） で洗浄TMの添加
CLSM観察グルコース
HEPES
NaHCO3
HBSS(10×)＋CS or GCS or PEG-GCS（ローダミンBでラベル化）
15

CS

GCS

PEG-GCS

0.25 mg/mL

0.125 mg/mL

0.05 mg/mL

16本説明会では３． GCSのBSAとの複合化

17BSAとCS及びGCSの結合定数2.5Acetate buffer (pH 3.6)

y = 1.9952x + 0.9726□2

CS-BSA system (K = 517 M-1)

F0 / F-1○y =GCS-BSA
0.8749x +system
0.9709(K = 875 M )Tris-HCl buffer (pH 7.4)

1.5

y = 0.6161x + 0.991■ CS-BSA system (K = 616 M-1)
●GCS-BSAsystem (K = 1955 M-1)
y = 0.5166x+ 0.9639

1

Stern-Volmer plot

0.5
00.5
1
1.5
CS unit + GCS unit ( mM )F0F= K・［CS unit +GCS unit］ + 1

Stern-Volmer plots of the CS-BSA and GCS-BSA systems in
0.1 acetate buffer (pH 3.6) (○ and □, respectively) or 0.1
Tris-HCl buffer (pH 7.4) (● or ■, respectively)18

結合の強さと電荷の関係
Tris-HCl buffer
pH 7.4

Acetate buffer
pH 3.6酸性塩基性＋pKa = 12.5

pKa = 6.5

ーpI = 4.719

本説明会では

４． GCS及びPEG-GCSのオリゴDNAとの複合化
20水中でのdA21との複合体形成
一本鎖オリゴDNA（デオキシアデノシン一リン酸の21量体：dA21）を用いて複合体形成挙動を観察した。
CS, GCS, PEG-CS, 及びPEG-GCS（Sample 1）とdA21を超純水中で混合し、得られた水溶液の写真

PEG-CS/dA21

平均粒径： 90.6 nm

PEG-GCS/dA21

CS/dA21

GCS/dA21 PEG-CS/dA21 PEG-GCS/dA21（CS主鎖の総ユニット数/dA21の総ユニット数 = 1）

平均粒径： 80.7 nm

CSとGCSでは白濁する→過凝集したマクロな複合体が析出する
PEG-CS及びPEG-GCSでは透明なまま→PEGによって過凝集が抑制されている

21

酸性条件でのPEG-GCSとdA21との複合体形成
0.1 M 酢酸緩衝液（pH 5.5）中での複合体の粒径分布をDLSにて測定した。
ユニット比

PEG-CS/dA21

平均粒径（nm）

PEG-GCS/dA21

平均粒径（nm）

1312.4199.93223.3

188.25220.8190.8

ユニット比= CS主鎖の総ユニット数（mol）/dA21の総ユニット数 （mol）22

中性条件でのPEG-GCSとdA21との複合体形成
トリス緩衝塩水（pH 7.4, 25 mmol/L-Tris, 0.137 mmol/L-NaCl, 2.68 mmol/LKCl）中での複合体の粒径分布を測定した。
ユニット比

PEG-CS/dA21

平均粒径（nm）

PEG-GCS/dA21

平均粒径（nm）

1232.2152.0

3321.3102.6

5331.6105.923

従来技術とその問題点
キトサンの問題点
・通常のキトサンは酸性条件にしか溶解しない。
・未修飾のキトサンでは機能が不十分
・化学修飾で上記問題点は解決可能であるが、生産性・コストの面で実用的なものは無い。

24

新技術の特徴・従来技術との比較• キトサンよりも中性域で溶解しやすい• 大量合成が可能（10 g程度のサンプル提供の実績があります。）• GCSは、細胞の核に移行しやすい• GCSは、タンパク質との結合定数が３倍高い• 用途に応じて置換基の導入も可能• PEG-GCSは中性域でのオリゴDNAとのナノ複合体形成に効果的25想定される用途• バイオ医薬品（中、高分子量医薬品）の吸収促進を目的とした医薬品添加剤• その他、DDS用素材• 遺伝子デリバリー用人工ベクター• 生体接着剤用素材• バイオマテリアル用素材

26実用化に向けた課題• グアニジル化の反応時間が長い。
• 応用展開に向けた機能検証が実施できていない。

27

企業への期待• 応用展開に向けた明確なビジョンと技術を持つ、企業との共同研究を希望。
• また、遺伝子デリバリーを開発中の企業、経口製剤分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。

28

本技術に関する知的財産権• 発明の名称： グアニジル化ポリエチレン
グリコールグラフトキトサン
及びそれを含む医薬用キャリア• 出願番号： 特願2019-84140• 出願人：
国立大学法人鳥取大学• 発明者：
井澤 浩則、斎本 博之
29

お問い合わせ先
国立大学法人鳥取大学 研究推進機構TEL: 0857-31-5703
FAX: 0857-31-5571
e-mail: sangakucd@ml.cjrd.tottori-u.ac.jp30