膜電位感受性⾊素を⽤いた脳神経活動解析法の開発−海⾺神経活動機構の定量網羅解析法の確⽴−

2020 年
冨永洋⼦

⽬次......................................................

1

要旨................................................................

3

序論................................................................

5第1章

海⾺スライス CA1 野における光計測の定量的計測⽅法の確⽴ . . . . . .

91-1 ⽅法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

11

1-2 結果と考察....................................................

20

1-3 結論 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

23

略語・⽤語⼀覧

第2章

海⾺ CA1 錐体細胞の膜電位応答分布と、信号伝播における GABAA 作........

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2-1 ⽅法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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2-2 結果と考察....................................................

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2-3 結論 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

38

動性フィードフォワード抑制の影響の光計測法による解析

第3章

VSD 光計測を⽤いた海⾺ CA1 野からの⻑期増強（LTP）の信号伝播パターンの網羅的解析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

40

3-1 ⽅法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

42

3-2 結果と考察....................................................

42

3-3 結論 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

47................................................................

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図表⼀覧

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54

付録資料

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81................................................................

86

参考⽂献

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88

発表論⽂

............................................................

106

総括

謝辞

略語・⽤語⼀覧

ACSF: artificial cerebrospinal fluid [⼈⼯脳脊髄液]
AD: Alzheimer’s disease [アルツハイマー病]
ASD(s): autism spectrum disorder(s) [⾃閉症スペクトラム障害]
apical dendrite: [尖端樹状突起]
APV, AP5: D-(-)-2-amino-5-phosphonopentanoic acidbasal dendrite: [基底樹状突起]
Bic: bicuculline [ビククリン]
CNQX: cyanquixaline (6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione)
CA1: cornu ammonis 1
CA3: cornu ammonis 3
CCD: charge coupled device
CMOS: complimentary metal oxide semiconducter
DG: dentate gyrus [海⾺⻭状回]
E/I: excitation/inhibition [興奮／抑制]
EPSC: excitatory postsynaptic current [興奮性シナプス後電流]
EPSP: excitatory postsynaptic potential [興奮性シナプス後電位]
fEPSP(s): field excitatory postsynaptic potential(s) [フィールド興奮性シナプス後電位]
FET: Field Effect Transistor
GABA: γ-aminobutyric acid
GEVI(s): genetically encoded voltage indicator(s)HFS: high-frequency stimulation [⾼周波刺激]
IPSP: inhibitory postsynaptic potential [抑制性シナプス後電位]
IPSC: inhibitory postsynaptic current [抑制性シナプス後電流]
LTP: long-term potentiation [⻑期増強]
L-LTP: late phase LTP [後期⻑期増強]
MOS: metal oxide semiconducter1NA: numeric aperture
PITX: picrotoxin [ピクロトキシン]
PR ratio, PRR: stratum pyramidale vs. stratum radiatum optical signal ratio [PR ⽐]
RMS: root mean square [⼆乗平均平⽅根]
SLM, St. lacunosum-moleculare: stratum lacunosum-moleculare [網状分⼦層]
S/N: signal to noise ratio [信号ノイズ⽐]
SO, St. oriens: stratum oriens [上昇層]SO-A, St. oriens-alveus: stratum oriens-alveus [上昇層-⽩板]
SP, St. pyramidale: stratum pyramidale [錐体細胞層]
SR, St. radiatum: stratum radiatum [放射状層]
temporoammonic pathway: [TA 経路]
TBS: theta-burst stimulation [シータバースト刺激]
TTX: tetrodotoxin [テトロドトキシン]
VSD: voltage sensitive dye [膜電位感受性⾊素]2

要旨「記憶・学習」など脳の⾼次機能を理解するには、個々の神経活動の動作とともに、神経回路全体としての動作様式の解明が必要となる。これは脳活動をターゲット
する薬物開発にも重要である。伝統的な神経活動の計測⼿法は、電極を⽤いて個々の神経細胞の膜電位、膜電流変化 (細胞内微⼩電極法、パッチクランプ法等)、あるいは
神経細胞集合フィールド電位 (fEPSP, fIPSP 等) を計測する電気⽣理学的⼿法である。
いくつかの電極を組み合わせた多点電極システム (マルチ電極アレイシステム) も開発されているが、原理的に点計測であり、回路全体としての動作を知ることは困難である。
この問題を解決する⽅法として、膜電位光計測法がある。膜電位光計測法は神経細胞の第⼀義的な情報単位である膜電位に対応した光信号応答を得られるため、神経回路の時空間的な動作様式の解明に最も適している。この⼿法では、細胞への侵襲を抑えて、膜電位変化を直接捉えることが可能で、従来の電気⽣理学的⼿法による膜電位計測法の代替⼿段として⾮常に有⽤である。膜電位光計測法では、適切な計測系を構築することで、⾼い時間分解能を達成できる。また、光学系の選定によって脳神経回路全体という広範囲での計測と、個々の神経細胞構成要素の動態まで知ることが可能な⾼い時空間分解能を満たすことが可能である。
本研究は、膜電位光計測法の１つとして、膜電位感受性⾊素 (Voltage Sensitive Dye;
VSD) を⽤いた光計測法を確⽴するための技術的な課題とその解決を⽰し、本光計測法の有⽤性を⽰した。
「記憶・学習」などの脳の⾼次機能において、海⾺は重要な役割を担っている。その⼀⽅で構造が単純であり、脳スライス標本として電気⽣理及び膜電位光計測実験を⾏うのに適している。本研究では、ラット、マウスの海⾺スライス標本に膜電位感受性⾊素を負荷し、海⾺神経回路における安定した計測を⾏った。また計測データの解析⽅法を確⽴して、海⾺神経活動の機構解析法を確⽴した。

3

第 1 章では、定量的光計測法の確⽴に必要な技術的な課題とその解決について⽰した。第 2 章以降は、第 1 章において確⽴させた計測⽅法を元に光計測データについての検討を⾏い、神経回路全体の動作を検討するのに適した⽅法であることを⽰した。
第 2 章では、ラット海⾺スライス標本の CA1 野から記録された VSD 信号が、神経回路を構成する CA1 錐体細胞の膜電位応答と対応することを⽰した。さらに、信号伝播における GABAA 作動性フィードフォワード抑制の影響を⽰した。
第 3 章では、マウス海⾺スライス標本で⻑時間 (12 時間)を超える計測を可能とし、
海⾺ CA1 野における後期⻑期増強 (L-LTP) を伴う神経信号伝播パターンの網羅的な解析を⽰した。
本研究では、VSD 光計測法による脳神経活動解析法を確⽴し、海⾺神経活動の機構
解析、薬理学的解析の定量解析基盤を築くことができた。本⼿法を駆使することで、精神神経疾患の病態解明、機構解析、治療薬開発、化学物質暴露の影響解明に貢献で
きる。

4

序論

数千億ともいわれる神経細胞からなる脳の神経回路活動を知ることは、脳活動の変調、異常に起因する各種の精神神経疾患の予防、治療などの薬物開発を⾏う上で必須である。⻑寿⾼齢化社会では、⽣涯にわたって脳の活動を健全に保つことは、健康寿
命の延⻑にとっても必須であり、⾼齢化に伴う各種の疾患、アルツハイマー症を代表とする認知症の発症過程の解明や治療薬の開発には、脳の特に記憶に関連する海⾺神
経回路等の機能解析が⽋かせない。また、複雑化する現代社会で重⼤な課題となってきた、発⽣発達期に顕在化する⾃閉症スペクトラム等の脳回路の機能変調を計測する⼿段が必須である。このような機能解析には、従来の点計測である電気⽣理学⼿法に代わるイメージング法の必要性が課題となってきた。それを解決しうる⼿法が、脳の第⼀義的な情報である膜電位を可視化する膜電位光計測法である。その⼀つに膜電位感受性⾊素 (Voltage Sensitive Dye; VSD) による光計測法がある (Grinvald and
Hildesheim, 2004; Homma et al., 2009; Tominaga et al., 2013, 2018)。
光計測法は、最初は膜興奮に伴う膜の光学特性の変化の単⼀点計測から始まった(Hill and Keynes, 1949; Cohen et al., 1968; Cohen et al., 1970)。その後、1970 年代初期、ウッズホール海洋⽣物学研究所 (MBL) の Larry Cohen らの研究グループが、現在の基礎となる技術を開発した(Cohen et al., 1968; Tasaki et al., 1968; Salzberg et al., 1973;

Waggoner et al., 1973 ; Davila et al., 1973; Ross et al.,1974)。これが VSD による計測の始まりである。この技術を⽤いて、1980 年代から脳のリアルタイム回路機能活動を捉える研究が⾏われた (Grinvald et al., 1981, 1982, 1988; Ichikawa et al., 1993a; Tanifuji et al.,
1994; Vranesic et al., 1994; Iijima et al., 1996)。広視野で広範囲を計測可能とする光計測法
は、遺伝⼦改変や薬物投与による病態動物モデルにおいて、その神経回路動態を検証することを可能とした (Tanemura et al., 2002; Mann et al., 2005; Suh et al., 2011; Juliandi etal., 2016)。
膜電位感受性⾊素 (VSD) による光計測法は、上述のように半世紀以上の歴史があるにも関わらず、この⼿法が⼀般に広く使われるようになったのは、2000 年頃からである。これは VSD 光計測法には多くの技術的な課題があったためである。本研究は、こ5のような技術的な課題を解決し、光計測法による脳の⽣理機能の定量的な解析を可能にした。
脳活動計測を⾏うツールとしての VSD 光計測法を確⽴するために、(1) カメラシス
テムの検討、(2) ⾼効率の光学系の確⽴、(3) VSD の選択、(4) 染⾊法の確⽴、(5) 脳ス
ライス標本の作成⼿順の確⽴および⽣理活性の維持 (Tominaga et al., 2002)、を可能とし、これらの⼯夫による⻑時間の安定した計測を可能とした (Tominaga et al., 2018)。光
計測法により取得したデータは膨⼤であり、(6) データ解析のための解析⽤ソフトウエ
アも開発した。本研究では、サブミリ秒の連続データを数千フレームに渡って記録する。実験によっては、１スライスからの１実験データで、データファイルが 100 を超える膨⼤なデータ量（１スライスからの１実験データが合計 2 GB 程度）となり、これを実験群と対照実験群で、それぞれ数枚から 10 数枚のスライスから取得したデータを統計処理し、⽐較解析する必要がある。このような⼤規模なデータを扱うための解析⽤ソフトウエアの開発は必須であり、数値解析⽤プラットフォーム (IgorPro,
WaveMetrics Inc., OR) 上のマクロソフトウエアとして開発した (Tominaga et al.,
2002b)。
神経活動を計測するための光計測システムの要件として、サブミリ秒の膜電位変化が計測できる⾼速時間分解能をもつカメラシステムが必要である。⼀⽅、回路全体のダイナミクスを計測するためには、回路全体が視野に⼊り、かつ⾼空間分解能で計測することも要求される。VSD 信号は⾮常に⼩さいので、その信号の変化 (10-5〜10-3)を計測するためには極めて低ノイズで安定に計測可能な光学系システムを構築する必要がある (Tominaga et al., 2000, 2013)。また、蛍光物質としての VSD そのものの侵襲性（蛍光発⽣に伴うラジカルの発⽣など) の課題 (Schaffer et al., 1994)も解決する必要があった。さらには、測定される光信号の⽣理学的な意味を、正確に解釈することも必要であった (Tominaga et al., 2009)。
本研究では、ラット、マウスの脳スライス標本を使⽤して光計測をおこない、得られたデータを従来の電気⽣理学的⽅法と⽐較して定量的に評価できるようにシステムを較正し、安定して⻑時間計測可能とすることを⽬指した。電気⽣理学的に測定されたパラメーターが、光学記録法ではどのように視覚化され、そのデータをどのように6

捉えるべきかを検討して、光信号の定量化を⽰し、本光計測法の有⽤性を⽰した(Tominaga et al., 2000, 2009, 2018)。
本研究では、海⾺スライス標本を使⽤した。海⾺は、記憶・学習の鍵となる神経回路であり、現在まで最もよくその⽣理機構が調べられてきた組織である。海⾺は層状構造をなしており (Andersen et al., 1969b)、とくに海⾺スライス標本としてよく使われる横断海⾺スライス標本 (transverse hippocampal slice preparation) の CA1 野は、その層構造と錐体細胞の各部位が対応している。海⾺ CA1 野では、計測した各層からの光信
号を CA1 錐体細胞の特定の部位の膜要素に起因する光信号として捉えることを可能とするため (Witter, 1993)、光計測を⽤いた神経回路における神経統合の研究に適している。例えば、海⾺ CA1 野の放射状層 (stratum radiatum; SR) の光信号を尖端樹状突起(apical dendrite) の応答として、錐体細胞層 (stratum pyramidale; SP) の光信号を細胞体の応答として評価し、海⾺ CA1 野の錐体細胞活動の統合評価が可能となる。このような利点を活かして多くの VSD による海⾺光計測研究が⾏われている (Grinvald et al.,
1982; Barish et al., 1996; Tominaga et al., 2000, 2001, 2002b; Inoue et al., 2001; Mochida et al.,
2001; Aihara et al., 2005; Mann et al., 2005; Chang and Jackson, 2006)。
第 1 章での検討の結果、VSD として、Di-4-ANEPPS (分⼦式：C28H36N2O3S, 分⼦
量：480.66) を採⽤した。本⾊素の構造式と動作の模式図を添付 Fig. 1 に⽰す (添付1)。Di-4-ANEPPS は、細胞膜の脂質⼆重層に脂質分⼦と同⽅向に配向する
electrochromic dye (Peterka et al., 2011) と⾔われる⾊素分⼦の⼀つである。この分⼦の発光団からの蛍光量は細胞膜内外の電位差 (膜電位; membrane potential) の変化に応じて変化する。蛍光量の変化は分⼦内の電荷移動に依存するので⾼速の分⼦プローブとして動作し、サブミリ秒 (応答時間はナノ秒オーダー) で膜電位変化を計測することがで
きる(Loew et al., 1985, 1992)。本研究では、すべてこの⾊素を⽤いている。この⾊素は、530 nm の励起光、610 nm の蛍光では、膜の脱分極に対して蛍光量の減少、膜の過分極に対して蛍光量の増⼤を起こす。したがって、本研究で光信号として⽰すときには膜電位変化の極性に合わせて蛍光の減少を正の⽅向の変化として⽰した。蛍光そのものの⼤きさを議論する場合は「蛍光量」として本来の極性で表記した (第２章)。

7

本研究成果で確⽴した評価法を⽤いて、新規開発の認知症治療薬を投与したマウス
海⾺神経回路における神経回路ダイナミクス変化の評価を⾏った (⼩野薬品との共同研
究、結果未公表)。また、この評価法によってアルツハイマー病の原因遺伝⼦による海⾺活動の変化、⾃閉症の原因因⼦の可能性がある化学物質を投与したマウスでの海⾺神経回路の変調、遺伝⼦改変による海⾺回路の活動変化、海⾺周辺回路での可塑的活動変化も明らかになった (Tanemura et al., 2002; Tominaga et al., 2009, 2018; Suh et al.,2011; Juliandi et al., 2016; Kajiwara et al., 2019)。
このように本研究によって、それまで困難であった光計測法による脳神経組織の詳細な機構解析を⾏うことが可能になり、化学物質、脳遺伝⼦変異等各種の要因による脳神経回路の変調機構を定量的に明らかにすることが可能になった。

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第1章

海⾺スライス CA1 野における光計測の定量的計測⽅法の確⽴(本章の内容に関しては、J. Neurosci. Methods 102:11-23 (2000) に発表済み)

神経回路全体としての⽣理学的な動作様式とその改変は、中枢神経系が情報を処理し、⾼度に組織化された⾏動を制御する能⼒において中⼼的な役割を果たしている。
従来の電気⽣理学的⽅法では空間分解能が制限されており、この制限を克服するためにいくつかの光計測法が開発されてきた。神経情報の伝達には膜電位の変化が重要な役割を果たしているため、神経回路を調べるには膜電位の可視化解析が有効な⽅法となる (reviews, Cohen et al., 1978, 1986; Grinvald et al., 1988; Salzberg, 1989; Ichikawa et al.,1993)。この⽅法は、in vitro 脳スライス標本において、たとえば神経機能の連続性(Tanifuji et al., 1994; Iijima et al., 1996) や、単⼀細胞での機能分化 (Zecevic, 1996)、遺伝
⼦改変とノーマル動物の脳における機能ドメインの存在 (Watanabe et al.,1998; Demir etal., 1999) を調べるなど、広く使われてきた。また、海⾺スライス標本における神経信号の伝搬についても、光計測が使われてきた (Grinvald et al., 1982; Barish et al., 1996;
Nakagami et al., 1997; Sekino et al., 1997; Kojima et al., 1999)。海⾺における⾼頻度刺激誘発 LTP について、VSD を⽤いた光計測法で測定した研究も報告されている (Saggau etal., 1986; Bonhoeffer et al., 1989; Momose-Sato et al., 1999)。
しかし、電気⽣理学的⽅法と⽐較した場合、in vitro 標本の光計測は定量的な計測⽅法として確⽴するには⾄っていなかった。このため⾮侵襲的多点同時記録⽅法としての光信号計測には⼤きな可能性があるにもかかわらず、脳スライス標本の神経活動を計測するためのツールとして広く使われることはなかった。この理由は、主に (1) 信号の安定性が低い、(2) VSD 使⽤に伴い発⽣する問題がある、ことである。(1) は計測する信号が微弱であることに起因する。光計測システムに⾼度な技術要件が必要とされる。撮像装置は、神経細胞の活動による⾼速な膜電位変化 (Ca2 +信号がサブ秒オーダ
ーであるのに対し、神経細胞活動による⾼速な膜電位変化はサブミリ秒のオーダーである) を記録するために⾼い時間分解能が要求される。また、信号が微⼩なためより低いノイズの条件でないと計測できない (Ca2 +信号が約 10−2〜10−1 であるのに対し、VSD信号は通常 10−5〜10−3 である)。これらの要件により、光計測システムが不安定で信頼9性が低くなる傾向がある。(2) の問題もいくつかある。VSD を使⽤するための染⾊⼿順
によっては、てんかん様過興奮を誘発させることがある。また、溶液の還流により
VSD が洗い流される問題や、VSD の漂⽩が起こる問題など、膜内の VSD の存在期間が短いことも、光信号の定量的評価を困難にしてきた。蛍光発⽣に伴うラジカルの発⽣(Schaffer et al., 1994)や、VSD によっては、イオンチャネル型 GABAA 受容体に影響を及ぼすことも報告されている(Mennerick et al., 2010)。
本研究では、⽣理学的実験要件を満たし、再現性の⾼い VSD 光計測法の確⽴を⽬指した。そこで、(1) 新規の CCD ベースのデジタル光計測システムの開発、(2) 新規の落
射蛍光光学系の開発、(3) スライス標本作成⼿順の検討・改善、(4) VSD として Di-4ANNEPS の選択と染⾊プロトコルの検討・改善、(5) スライス標本の⽣理活性を維持するための新規チャンバーの設計を⾏い、安定した光計測が可能となった。
次に、ラット海⾺スライス標本を使⽤してシステムを較正し、計測で得られた値が従来の電気⽣理学的⽅法と⽐較して、安定して計測・評価可能であることを検討した。
以上により、膜電位感受性⾊素 (Di-4-ANNEPS) による光計測法は、ラット海⾺スラ
イス標本において、従来の電気⽣理学的⼿法に代わりうる⼿法であることを⽰すこと
ができた。

10

1-1

⽅法

本光計測法を確⽴するために検討した各項⽬について、以下に説明する。尚、電気⽣理学的⼿法については、添付資料 (添付 2) に⽰した。
尚、すべての動物実験は、「徳島⽂理⼤学における動物実験と動物の飼養及び保管等に関する規定」と理化学研究所の「動物実験実施規定」、および⽶国国⽴衛⽣研究所の実験動物の管理と使⽤ガイドによって承認されたプロトコルに従って実施した。
使⽤する動物の数と苦痛を最⼩限に抑えた３R の原則に則り実験を実施した。

1-1-1 脳スライス標本における神経活動の光計測⽤カメラシステムの検討

VSD 光信号を記録するために必要な光信号検出装置の技術要件には、ダイナミック
レンジ、空間分解能、および時間分解能 (撮像速度) が含まれる。特に、より⼤きなシ
グナルを得るために、装置のダイナミックレンジは、神経活動の⽣理学的記録にとって重要である。
光信号検出装置の技術要件について、2000 年の本研究で使⽤した CCD ベースのカ
メラシステムを基に、フォトダイオードアレイ (e.g. Cohen and Lesher,1986; Grinvald etal., 1988)、および MOS ベースのモノリシックアレイ (Ichikawa et al., 1993a) など、他の光計測システムと⽐較して検討した。
撮像装置は、光検出器に投射される光強度の変動を測定する。検出された変動 (∆F)
には、⽣理学的信号 (膜電位) の変化 (dFsignal) および⾮⽣物学的要因によるノイズによって引き起こされる変動が含まれる。dFsignal は光の強度 (F) に⽐例する。
dFsignal ∝ F
Fig. 1-1 は、蛍光強度と光信号 (dFsignal) の関係を⽰している。光検出器での蛍光強度の関数として、光信号が 10−2 から 10−3 の変化を⽰す場合のグラフを実線でプロットした。次のセクションに⽰すように、Di-4-ANEPPS からの光信号は最⼤で 10-3 オーダ
ーの変化である。
11

ノイズの主な原因の 1 つは、光の量⼦的性質による光量⼦ノイズ (photon-shot noise)(dFshot) である。光量⼦ノイズは、光強度の平⽅根に⽐例する。
dFshot ∝ √#Fig. 1-1 の太線は、光量⼦ノイズと光強度の関係を⽰したものである。太線より下では、信号は光量⼦ノイズ (Fig. 1-1 の斜線部分) によって隠されており、信号の定量的評価には使⽤できない。
もう 1 つの主要なノイズは、暗時ノイズ (dark noise)(dFdark) である。暗時ノイズ

は、各光検出器または装置に固有であり、光の強度には依存しない。
dFdark = 定数
既存の機器 (フォトダイオードアレイ、MOS ベースのモノリシックアレイ、CCD ベースの⾼速カメラ、Cooled CCD カメラ) の⼀般的な暗時ノイズレベルを Fig. 1-1 の点線で⽰した。CCD の暗時ノイズレベルは フォトダイオードの熱ノイズのみが原因となる。フォトダイオードの熱ノイズに加えて、フォトダイオードアレイの暗時ノイズには、読み出しアンプ回路固有の熱ノイズが追加され、MOS ベースのモノリシックアレ
イの場合は、FET スイッチングゲートでのリーク電流がノイズとして追加される。各撮像装置のダイナミックレンジの下限は、実際には暗時ノイズと光量⼦ノイズの２つの要素で決定される。 ダイナミックレンジの上限は、フォトンウェルの深さ (CCD お
よび MOS ベースのモノリシックアレイ) または読み出しアンプのダイナミックレンジ(フォトダイオードアレイ) によって決定される。 各装置の⼀般的なダイナミックレンジを Fig. 1-1 に⽰した。
光強度を増加させると、信号 (∆F) は増加する (Fig. 1-1)。 ⼀⽅で、光強度を⾼くすると、標本への光誘起損傷と VSD 漂⽩を起こしやすく、安定した⽣理学的計測を妨げる。実際には、光検出器で⼗分な光を集めることは困難である。 新しい光学系を備えた検出器で 10 µW mm−2 以上の蛍光を⽣成するには、最⼤出⼒で 150 W のハロゲンラン
プや⾼輝度 LED を使⽤する必要がある ( 1-2-2. 参照)。レーザーや Xenon は光源⾃体のノイズが⼤きく、本光計測法での利⽤は難しい。
フォトダイオードと MOS ベースのアレイは、⽐較的⾼い暗時ノイズのレベルを超える必要があり、光強度が⼗分に⾼い場合 (光検出器で約 100〜1000 µW mm−2 ) におい
12

て、ダイナミックレンジ内でより⾼い S/N の光信号を測定できる。対照的に、CCD ベースのシステムは暗時ノイズレベルが低いため、低い光強度 (∼10 µW mm−2) で使⽤可能である。しかしながら、ダイナミックレンジは低く、dFshot の影響を強く受け、S/N
は決して優れているわけではない。ただし、各試⾏中に信号が統計的に同⼀である場
合、加算平均⼿法を⽤いて S/N の低さを改善することが可能となる。Cooled CCD は、
暗時ノイズが最も低いが、光量が低い時は光信号が光量⼦ノイズに隠れ、結果的に通常の CCD の S/N と同程度の信号しかとれず、VSD 信号の測定にはほとんど利点がなかった。そこで、安定した計測を確⽴するという⽬標を達成するために、光検出デバイ
スとして CCD を使⽤することを決定し、CCD ベースの光計測システムを構築した。
本研究では、市販の CCD チップを選択した。市販の CCD チップは、⼤量⽣産により供給が安定し、専⽤チップよりも価格に対して優れた性能を発揮すると考えられる。ほとんどの 1/5〜1/3 インチのインターライン CCD チップが⾼速充電駆動パルス(最⼤ 100 MHz) に追従できることを確認し、その中で ICX076AL (1/5 インチ; Sony Inc.,Tokyo, Japan) を選択した。ICX076AL では量⼦効率 (〜45%) で撮像装置に必要な最適な電荷転送レートが得られた。電気回路の詳細は、以前に (Takashima et al., 1999) によって説明された回路に近く、さらに最新の半導体技術を使⽤してフレームとデータの転送速度を上げた。
このデバイスには、248 × 380 ピクセルで構成される 2 × 3 mm の光検出領域がある。
検出器のダイナミックレンジの上限と撮像速度を上げるために、4 × 4 ピクセルを 1 つのピクセルにビニングした。結果として得られるフォトンウェルの深さは 5 × 105 であり、撮像速度は 0.7 ms / frame に増加した (本システムは MiCAM01 として BrainVisionInc., Tokyo, Japan より市販された)。本システムの空間分解能 (60 × 90 ピクセルの有効な光検出領域) および時間分解能は、他のタイプの光検出システムとほぼ同じであった。 MOS ベースのモノリシックアレイでは、撮像速度が 0.6 ms / frame の 128 × 128 ピ
クセルの解像度が実現された実績がある (Ichikawa et al., 1993; Iijima et al., 1996) が、通常はより良い S/N を得るために 64 × 64 ピクセルが使⽤される。フォトダイオードアレ
イでは、0.5 ms / frame で 34 × 34 ピクセルの解像度が達成されている (Hirota et al.,1995)。これらの仕様は、神経膜の⻑さ定数および神経膜電位イベントの時間スケール
13と⽐較して、脳組織の神経活動を可視化するために必要な要件を満たしている。Fig. 111,12 および第 3 章で使⽤した現⾏システムでは、さらに改良を加えた CMOS カメラ(MiCAM Ultima および MiCAM02, Brainvision Inc., Tokyo, Japan) を使⽤した。
カメラシステムは、PC ベースのコンピューターによって制御した。光信号は、PC
ベースのコンピューターと Macintosh コンピューターで、カスタムメイドのソフトウエ
アまたは Igor Pro (WaveMetrics Inc., OR) を使⽤して、解析⽤のプロシジャおよびプログラムを開発し、オフラインで分析した。

1-1-2 顕微鏡システムの開発

タンデムレンズ構成 (Ratzlaff and Grinvald, 1991 も参照) の⾼開⼝数の落射蛍光光学系を開発した (Fig. 1-2)。本光学系の開発により、⾊素の退⾊や標本の光誘起損傷を避けるための励起光を最⼩限に抑え、かつ⾼ S/N の達成を可能とした。本システムでは、変更を加えた 35 mm カメラレンズ (f = 50 mm, F/1.4, Nikon) を対物レンズとして使⽤し (2000 年当時)、双眼顕微鏡の対物レンズ (f = 55 mm, ×1.0 for Leica MZ-APO, Leica
Microsystems) を投影レンズとして使⽤した。システムの最終倍率は 1.5 倍となった。
適切な集光レンズを備えたライトガイドを⽤いて、ハロゲン光源 (150 W; MHFG150LR, Moritex Corp., Tokyo, Japan) からの光を励起フィルター (λ = 530 ± 10 nm) を通して使⽤した。励起光はダイクロイックミラーで反射し、対物レンズを通して試料を照射する。試料からの蛍光は、ダイクロイックミラーを透過し、吸収フィルター (λ >590 nm) を通って CCD センサーに投影される。明視野照明でスライス標本に電極を配置する必要がある場合は、双眼顕微鏡 (Leica MZ-APO, Leica Microsystems) を使⽤して、光路を回転させてダイクロイックミラーに反射する画像を確認した。尚、このシステムは現在市販されている (THT-01, BrainVision Inc., Tokyo, Japan)。その後の改良により、⽬的に応じて複数のレンズを利⽤可能とした。特に、低倍率の⽔浸対物レンズ(×5, NA 0.60, オリンパス製, f = 20 mm, NA 0.35, Brainvision Inc., Tokyo) は、回路全体の活性を測定しながら、流体の動きによる機械的ノイズの回避を可能とすることで、海⾺ CA1 スライス標本の計測に適したレンズとなった。さらに、低倍率で⾼ NA (開⼝14数) を実現するために、光学系の⼊射瞳を⼤きくとり、2 つの対物レンズと広いダイク
ロイックミラーを組み合わせて、開⼝数の⾼い落射蛍光光学系を実現した。Fig. 1-11,12
および第 3 章で使⽤した現⾏システムでは、上記の光学系の改良と、光源としてフォ
トダイオードフィードバック制御システム (Nishimura et al., 2006) を備えた LED 照明
システム (LEX-2G, Brainvision, Inc., Tokyo) を使⽤することにより、励起光を最⼩限に抑えながら、⾼速光計測に⼗分な量の蛍光を捕捉することを可能とした (最⼤ 10,000
frame / sec)。
現⾏の光学系システムの写真、レンズ群、記録システムの概略図を Fig. 1-3 に⽰し
た。

1-1-3

スライス標本作成の確⽴

光計測法において、光障害などを⽣じない⽣理活性をもった脳スライス標本の作成法を確⽴した。本作成法により、効率的な膜電位感受性⾊素の負荷が可能になり、安定して⻑時間の計測を⾏うことが可能になった。
第 1、2 章ではラット、第３章ではマウスの脳スライス標本を使⽤した。ラットは脳も⼤きく計測法の確⽴のためには有⽤であり、現在でもラットのみで観察される脳機能があると⾔われている。近年、マウスの遺伝⼦改変動物の急速な進歩に合わせて、
ラット海⾺からマウス脳スライス標本へ計測の主体を変更した。ラットでの脳スライス標本の作成法とマウスでの脳スライス標本の作成法は、原則的に同じである。しかし、物理的な⼤きさの変化に合わせて⼿順の改善を⾏った。マウス脳スライス標本作
成は、脳がラットと⽐較して⼩さく虚⾎条件に弱いため、細かい注意が必要となる。
第１、2 章のラット脳スライス標本は Wistar 系の雄ラット (4-5 週令 SLC またはクレア)から作成した。マウス脳スライス標本 (第 1 章 Fig. 1-10-12)、第３章の全ては
C57BL6 系の雄マウス (4-5 週令 SLC またはクレア) から作成した。

15

1-1-3-1 脳スライス標本作成⼿順

海⾺脳スライス標本の作成は以下の⼿順によった。
ラット (マウス) を深⿇酔下で断頭して脳を取り出し、氷冷した⼈⼯脳脊髄液(ACSF; 124 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgSO4, 1.25 mM NaH2PO4, 26 mM
NaHCO3 and 10 mM グルコース, pH 7.4, 95% O2 / 5% CO2 混合ガスでバブリング) で 5分間冷却した。
ラット脳スライス標本作成時は、5 分間の脳の冷却後、⼩脳を切り離し、⼤脳縦裂で左脳と右脳を切り離す。左脳（または右脳）の脳幹をリングピンセットで摘み、精巧なピンセットで硬膜を取り除く。その後、脳幹部を切除し、脳組織の前後（海⾺を含
まない前頭葉部と後頭葉部）を切り落として、直⽅体の寒天ブロックにのせる。この処理で、脳組織をほぼ平らな状態でスライスすることが可能となり、海⾺の形が揃った均質の脳スライス標本を作成することが可能となった。
マウス脳スライス標本作成時は、脳が⼩さいこと、硬膜がラットほど硬くないことなどから、硬膜を取り除く作業は⾏わない。５分間の脳の冷却後、⼩脳と海⾺を含まない前頭葉部を切り離し、⼤脳縦裂で左脳と右脳を切り離してできた脳組織を、寒天ブロックにのせた。Fig. 1-4 に、マウス脳スライス作成時に、脳組織をのせるために使⽤する寒天ブロックと、寒天ブロックを作成するための治具 (テンプレート) のイラス
トと写真を載せた。治具に沿って整形した寒天ブロックの概略図を Fig. 1-5B に⽰した。Fig. 1-5 で⽰したように、この寒天ブロックにマウス脳ブロックをのせてスライス標本を作成することにより、ほぼ歪みのない、常に海⾺の形が揃った均質の脳スライス標本の作成が可能となった。
ラット、マウスとも、脳組織をマウントした寒天ブロックを、スライサーにセットする。海⾺を周囲の⽪質とともに、スライサー (752M Vibroslice, Campden Instruments
Ltd., Lough- borough, UK; 現⾏システムでは Leica VT-1000 または VT-1200s を使⽤) で厚さ 400 µm (ラット脳スライス) 、または 350 µm (マウス脳スライス) のスライス標本を作成した。

16

各スライス標本は、常に 95% O2 /5% CO2 ガスでバブリングした ACSF に浸した状態
で、Fig. 1-5E に⽰したアクリルリング (外径 15 mm、内径 11 mm。直径 13 mm のポリ
テトラフルオロエチレン (PTFE) メンブレンフィルター (オムニポア、JHWP01300、
0.45 µm 孔、Millipore Corp., MA) を貼ったもの)(Tominaga et al., 2000, 2002a, 2002b,

2013) に移動させた。このとき、作成したスライス標本を傷つけないよう、細⼼の注意を払う必要がある。各スライスをアクリルリング上のメンブレンフィルターに移すと、スライス標本は容易にメンブレンフィルターに付着した。すべての処理はアクリ
ルリングを保持して⾏うため、スライス標本は機械的な障害を受けなかった。細かいメッシュのメンブレンフィルターは、酸素と ACSF に対して⼗分な透過性を持っており、⽣理活性を維持することが可能である。アクリルリングに取り付けたメンブレン
フィルターは濡れると半透明になり、明視野照明でスライスを⾒ることが可能となる。電極操作等の電気⽣理学的測定の妨げにはならないように、リングは薄く(1.0mm) 作製した。海⾺スライス標本は膜に付着するため、⽔没型の計測⽤チャンバ
ーにスライスを固定するための押さえや錘も必要なかった。
アクリルリングに置いたスライス標本は、常時 O2/CO2 ガスをバブリングさせた 28℃
モイストチャンバーに移す (Fig. 1-6)。モイストチャンバーで 25 分保った後、室温に移す。染⾊は、全体で１時間保持した後に⾏った。

1-1-4

VSD の検討および染⾊本研究を実施する前に、信号ノイズ⽐ (S/N) と安定性に基づいて市販の VSD をスク
リーニングした。VSD は細胞膜に埋め込まれるため、細胞毒性の可能性がある。また、スライス標本は無酸素状態になると、てんかん様過興奮を容易に誘発することが知られており (Balestrino and Somjen, 1986)、染⾊過程において、無酸素状態を避ける必要もあった。VSD 染⾊による細胞組織損傷を回避するために、⼀定時間の染⾊後に、染⾊液を洗い流す必要がある。また、組織の⽣理活性を保つために、染⾊後の脳スラ
イス標本は、計測時には常に ACSF 還流液下におかれる。親⽔性の VSD (RH155,
RH795 等) は、染めやすい⼀⽅で、⼀般的に洗い流されやすい性質を持つ。膜電位変17化の指標素⼦として、⻑時間、細胞膜にとどまり、適切かつ安定的に光信号を計測できる VSD の選択と、染⾊⼿順の確⽴が必要であった。本研究で⽤いた⾊素 (Di-4ANEPPS; D-1199, Molecular Probes Inc. (現 Thermo Fisher Scientific Inc.) ) は、⽐較的疎⽔性で脂溶性が⾼く、ACSF に溶解しにくいため、脳スライス標本を染⾊するのは容易ではなかった。しかし、本研究で確⽴した適切な⼿順を踏むと、⾊素は⾮常に安定し、膜内に⻑時間とどまることができた。染⾊時における脳スライス標本の無酸素状態を回避するために、脳スライス標本をアクリルリングにのせ、モイストチャンバー (Fig.
1-6) で⼗分な酸素供給と湿度を保った状態でスライス標本を染⾊した。Di-4-ANEPPS
による光誘発毒性 (Schaffer et al., 1994) の兆候は認められなかった (Tominaga et al.,2000, 2018)。

1-1-4-1 VSD 染⾊⼿順

アクリルリングに VSD 染⾊液 [0.1 mM Di-4-ANEPPS (D-1199, Molecular Probes Inc.
OR, USA), 2.7％エタノール, 0.13％ Cremophor EL (Sigma), 50％ウシ胎児⾎清 (Sigma) お
よび 50％ACSF] 100~110 µl を静かにのせて各スライス標本を染⾊し、25 分間 (ラット
脳スライス標本) 、または 20 分間 (マウス脳スライス標本)、モイストチャンバー (Fig.
1-6) 内で、室温で保持する。その後、⼗分にバブリングした ACSF に、アクリルリン
グごとスライス標本を浸してすすいだ後、新しく⽤意した同様のモイストチャンバーに移す。脳スライス標本は、室温で少なくとも１時間保持した後に、実験に供した。

1-1-5 計測⽤チャンバーシステム

上記のアクリルリング (Fig. 1-5E) をそのまま使⽤できる計測⽤チャンバーを開発した (Fig. 1-7) (Tominaga et al., 2000, 2002a, 2013)。アクリル製の計測⽤チャンバーは、ア
ルミニウム製の加熱ブロックで囲まれており、ACSF の温度を 31℃に⼀定に保った。バ
ブリングした ACSF は、1 ml/分の流速で還流するようにポンプを設定した。ACSF は、
加熱ブロックに埋め込まれた細いチューブから、気泡トラップチューブを通り、計測18

⽤チャンバーへと流れる。計測⽤チャンバーに流れ込んだ ACSF は、スライス標本をのせたメンブレンフィルター (アクリルリングで保持) の下を流れた後に、細い⽔路を介してスライス標本の上を流れる。この⽔路は閉じているので、確実に、常に酸素を含んだ ACSF の供給を可能とした。アクリルリングは O リングにはめ込んで計測⽤チャンバーに保持しているため、この部分もシーリングされ、ACSF は常にスライス標本の下から上へと⼀⽅向に流れて、最後に ACSF はアウトレットチューブから吸い出される。
この計測⽤チャンバーシステムを開発・製作することで、常に新鮮な酸素を含んだ
ACSF を還流し続け、スライス標本の上下から O2/CO2 ガスとグルコースを持続的に供給することが可能となった。また、⻑時間の⽣理活性の維持と、光計測においてノイズとなる機械的な振動を取り除くことができた。

19

1-2

結果と考察

MiCAM01 カメラシステムを使⽤した代表的計測例を Fig. 1-8 に⽰す。0.75 ms / frameの時間分解能で、各ピクセルの蛍光強度 (∆F) の初期蛍光強度 (F) に対する差分 (∆F)
を測定した (総フレーム数 341)。初期蛍光強度 (F) に対する蛍光強度の差分の変化率(∆F/ F) を使⽤することにより、蛍光強度の変化 (差分) を正規化した。蛍光強度の減
少を正、増加を負の値として扱うことにより、正規化した蛍光強度変化率の向きを膜電位変化の⽅向に⼀致させた (Loew et al., 1992; Haugland, 1996; Yuste et al., 1997)。光計
測時は、少なくとも 1 つのフィールド電極を⽤いて、常時、同時に電気⽣理学的な⼿法で応答を記録し⽐較した。スライス標本の⽣理的条件を確かめるために、刺激強度を変化 (10 µA〜250 µA) させながら同時計測を⾏ない、全ての刺激強度において、光信号および電気⽣理学的信号において、てんかん様過興奮の兆候がないことを確認した。Fig. 1-8 は、5 枚のスライスから得られたデータの代表例を⽰した。
Fig. 1-8 に⽰すように、ベースライン (刺激前 70 ms) の光信号 (∆F / F) の⼆乗平均
平⽅根 (RMS) ノイズ (Fig. 1-8A の⿊塗り記号 (▼,▲,■,●) ) の対数は、蛍光強度 (F)の対数に⽐例した (勾配 = -0.59 ± 0.02, r = 0.94)。画像の光信号 (∆F / F) に対する RMS
ノイズの対数についても同様だった (Fig. 1-8A の○)。これはノイズの振幅が蛍光強度の平⽅根に⽐例することを⽰している。すなわち、光信号のノイズの主な原因は光量⼦
ノイズであるといえる。
S/N を向上させるために、加算平均とソフトウエアフィルターを適⽤した。Fig. 1-8Bに⽰すように、試⾏の数が増加するにつれて、ベースラインの RMS ノイズは減少した(勾配 = -0.51 ± 0.01, r = 0.99)。加算平均は、刺激に対して同じ応答を期待できるときに、ノイズを下げる効果を発揮し、空間分解能と時間分解能には影響を与えない。また、cubic software filter (5 × 5 (イメージプレーン) × 3 (時間) の gausian 3D matrix filter)を作成し、ノイズレベルを約 3×10-3 減少させた。これは検出器における約 10 倍の蛍光に相当する効果である。MOS ベースのモノリシックアレイタイプの光検出器のフォト
ンウェルの深さに近い、106 フォトンウェルの深さに相当する効果となる。隣接ピクセ
ルからの信号を組み合わせて 16 × 16 の光検出器を⽣成した場合にも同様の S/N 効果が20

得られるが (Fig. 1-8C および D を参照)、Fig. 1-8B に⽰すように、cubic software filter の⽅が画像データの空間分解能が⾼い。この結果をもとに、本研究では 8 - 32 の加算平均と cubic software filter を使⽤することとした。
次に、光信号が電気⽣理学的測定で得られた情報と⼀致するかどうかを検討するために、得られた光信号を、同時記録した電気⽣理学的パラメーターを⽤いて定量化した。光信号の定量化を⽰すことができれば、本光計測法がフィールド電位記録で通常⾏われる電気⽣理学的測定の代替⼿段となり得る。さらに、本光計測法により、通常の電気⽣理学的測定で得られる限られた測定部位からの点情報ではなく、広範な領域を網羅した時空間情報を取得可能とすることが可能となる。
Fig. 1-9A は、VSD で染⾊したラット海⾺ CA1 野の蛍光画像 (対物⾯で 2 × 1.3 mm)と刺激電極および電気⽣理学的データを取得するための記録電極の位置を⽰す。図で⽰したように、CA1 野のほぼ全体が、その形態を認識するのに⼗分な解像度で視野に収まった。
Fig. 1-9B では、各フレームの光信号 (∆F / F) の蛍光画像を初期蛍光画像に疑似カラーとして重ねたものである。⾚は膜の脱分極 (光学的)、⻘は膜の過分極 (光学的) を⽰す (Fig. 1-9 左下の⾊補正バーを参照)。刺激電極部位 (Fig. 1-9A の 0.75 ms 画像) で膜の脱分極が始まり (Fig. 1-9A の⾚い点)、CA1 各層に広がり、CA1 の遠位⽅向に向かってシャッファー側枝に沿って広がった (0.75〜8.25 ms 画像)。脱分極の信号は、⼀定の時間後に消失し (9.75〜17.25 ms 画像)、46.5 ms で CA1 の遠位側において初期の⼀過性の脱分極に続いて過分極が発⽣した (Fig. 1-9B 最後の画像)。過分極は、錐体細胞層(SP) と上昇層 (SO) で最も顕著だった。これは、抑制性シナプス後電位 (IPSP) に対応
している可能性があり、数種類の K+チャネルによって引き起こされた後過分極の可能性がある (Schwartzkroin, 1986)。
Fig. 1-10A の上図は、細胞内電極で測定された膜電位変化のトレース (細線) に対応
するピクセルから同時に記録した光信号のトレース (太線) を重ねた図である。重ねて表⽰した光信号は、膜電位変化のトレースと本質的に同じ時間経過をたどっている。
これは、光信号が本質的にシナプス後細胞の膜電位変化を計測していることを⽰唆する。
21

Fig. 1-10A の下図は、細胞外電極で記録したフィールド電位 (fEPSP) のトレース (細線) に光信号を時間微分したトレース (太線) を重ねた図である。fEPSP は、光信号の微分波形に⾮常によく⼀致する。これは、光信号がこの部位のシナプス後膜の膜電位変化を表していることを⽰唆する。
同じ光計測データの他のピクセル位置における代表的なトレースを Fig. 1-10 B に⽰した。それぞれのトレースは、各位置での膜電位の変化に対応していると考えられる。
次に、マウス海⾺スライス標本でも検討した。Fig. 1-11 には現⾏ (2019 年) システ
ムの MiCAM Ultima でのマウス海⾺ CA1 野の光計測データを⽰した。A は１回の試⾏におけるオリジナルデータ、B は 5 × 5 × 5 のキュービックフィルターを２回適⽤した結果である。C はオリジナルデータ A の矩形部分から縦軸に沿って 2 ピクセル( 36µm )間隔でトレースを抽出したグラフである。*で⽰したトレースは錐体細胞層 (SP) のト
レースである。D は B のデータから C と同じ位置のピクセルのトレースを抽出したグラフである。E に C、D のトレースを重ねて⽰した。それぞれの計測システムに改良を加えた結果、現在では１回の試⾏でも S/N の優れた信号が取れるようになった。
マウスとラットの海⾺ CA1 野の光信号を⽐較した (Fig. 1-12)。マウスでは脱分極が伝播したのち、それが消失するのみであるのに対し、ラットでは脱分極性の信号が消失しつつある刺激後 12.0 ms から過分極成分が⼤きく広がっていることが確認できる。
このマウスとラットの海⾺ CA1 野に現れた神経活動現象の差異は、電気⽣理学的⼿法
のみでは⾒逃された可能性のある現象であるが、本光計測法を⽤いることにより、このような計測領域全体における応答の違いを捉えることが可能となった。この差異を起こす機構の違いについては、電気⽣理学的⼿法での検証も加え、今後さらに研究していく必要がある。

22

1-3 結論

本章では、VSD 光計測の技術的な課題と、その克服のための技術開発についてまとめた。特によく使われる脳組織標本である海⾺スライス標本を⽤いて VSD 光計測が安定して定量的に⾏うことができるように各種の開発と検討を⾏った。
VSD 光計測システムを構築するにあたり、以下の技術要件を達成した。(1) 撮像装
置としてより⼤きなダイナミックレンジを持ち、⾼時間空間分解能を持つ CCD ⾼速カ
メラシステムを開発した。(2) 神経回路全体を視野に収め、励起光を最⼩限に抑え、⾼速光計測に⼗分な量の蛍光を捕捉可能な落射蛍光光学系を開発した。(3) ⽣理活性を保った脳スライスを作成する⼿順を確⽴した。(4) 安定した光計測を可能とする VSD として蛍光性の Di-4-ANEPPS を選択した。この⾊素は⽐較的疎⽔性で、染⾊は困難であったが、本研究で確⽴した染⾊⽅法により、⾊素を安定して膜内に維持することが可能となった。また、染⾊した海⾺スライス標本の⽣理活性を保つためのモイストチャ
ンバーを開発し、染⾊⼿順を確⽴した。(5) 計測⽤チャンバーシステムを開発し、⻑時間の⽣理活性の維持と、光計測においてノイズとなる機械的振動を取り除くことを可能とし、安定した計測を可能とした。
Di-4-ANEPPS で染⾊したラット海⾺スライス標本の CA1 野を⽤い、本光計測システ
ムと電気⽣理学的⼿法で得られる神経活動と⽐較検討した。この結果、⽣理学的状態に影響を与えることなく、光信号と電気⽣理学的測定の安定した信頼性の⾼い記録が可能となり、定量的に計測を⾏えたことが確認できた。光信号の時間経過と振幅は、細胞内および細胞外の記録と⼀致し、⻑時間安定した光信号を計測することができた。本研究により、電気⽣理学的⽅法に加えて、光計測が脳スライス標本の神経活動を測定するための代替⼿段となりうることを⽰し、CA1 野全体を網羅できる広範囲において、⾼時間空間分解能を有した多点同時計測可能な優れた⽅法であることを⽰す
ことができた。
上記の技術的検討は、主にラット海⾺スライス標本を⽤いて⾏った (Fig. 1-8, 10,12;
Tominag et. al., 2000) が、同様の⼿法が、マウス海⾺スライス標本における計測 (Fig.
1-11,12) でも有⽤であることも明らかにした。
23

また、この 2000 年に開発した⼿法を基礎にして、実験⼿法にさらに改良を加え、多くの研究者が光計測実験を取り⼊れられるよう、本⼿法をビデオジャーナルとして発表した (Tominaga et al., 2019)。

24

第2章
海⾺ CA1 錐体細胞の膜電位応答分布と、信号伝播における GABAA 作動性フィードフ
ォワード抑制の影響の光計測法による解析(本章の内容に関しては、Neurosci. Res. 64:152–161 (2009) に発表済み)

神経細胞には⾼度に組織化された膜構造があり、⼊⼒情報であるすべての膜電位変化を統合して、情報を出⼒する。神経細胞のこの性質は、膜上の全てのチャネルの特性とその配置に⼤きく依存する。電気⽣理学的⼿法を⽤いて、微細な樹状突起での計測を⾏った研究もあり (Stuart et al., 1993; Davie et al., 2006)、さらに微細な基底樹状突起(Nevian et al., 2007) における計測を⾏った研究もある。しかし、実際の興奮性の程度
や、特に抑制性シナプスからの⼊⼒による神経情報の出⼒に対する影響の程度は明確ではなかった。
海⾺ CA1 回路への主な⼊⼒経路であるシャッファー側枝を刺激することにより誘発される抑制性シナプス後電位 (IPSP) の存在は⻑い間知られていた (Kandel et al., 1961;
Andersen et al., 1963, 1964; Buzsaki, 1984)。この回路は、反回抑制システムと呼ばれる。
順⾏刺激によって活性化されるフィードフォワード抑制も確認されている (Dingledineand Langmoen, 1980; Alger and Nicoll, 1982b)。抑制性シナプス⼊⼒の位置は、局所電気刺激と組み合わせた GABA の局所投与による実験 (Andersen et al., 1980; Alger andNicoll,. 1982a) で、抑制⼊⼒と興奮性⼊⼒は重ね合わされた時間経過トレースとして⽰された (Dingledine and Langmoen, 1980; Brown and Johnston, 1983; Griffith et al., 1986;
Turner 1990; Karnup and Stelzer 1999)。この抑制は、通常、短絡制御に関与するため、膜電位トレースとしてはほとんど検出されない (Turner, 1988; Sayer et al., 1989; Pouille andScanziani, 2004)。したがって、神経細胞の細胞体樹状突起軸に沿って、抑制性⼊⼒がどのように分布して膜電位応答に影響を与えているのかは不明であった。本光計測法
は、海⾺ CA1 回路全体の神経細胞集団の活動を視覚化できることから、海⾺ CA1 錐体細胞の細胞体樹状突起軸に沿った GABAA 受容体介在による抑制制御分布をマッピング
し (Megías et al., 2001)、海⾺ CA1 における信号伝達に対して、抑制部位を決定することが可能になった。
25

本章では、最初に、光信号の性質が、多くの膜要素からの膜電位信号の加算平均となる集合信号 (populational signal) であることを実証し、光計測データが信頼できるものであることを⽰した上で、GABA 作動性フィードフォワード・フィードバック抑制の CA1 錐体細胞への⼊⼒分布を可視化する。
光計測法の問題点は、光信号の振幅が単⼀神経細胞応答から予測される膜電位の絶対値と線形に相関していないように⾒えるということである。このような光信号は適切に解釈されないことが多い。例えば、海⾺スライス標本 CA1 野において、放射状層(SR) に刺激電極を置き、シャッファー側枝に刺激を加えたときの、錐体細胞層 (SP)と SR の光信号の振幅の関係は、錐体細胞における細胞体と尖端樹状突起との膜電位の関係と⼀致しないと解釈されることがある。刺激強度を⾮常に⾼くして飽和状態になるまで⼗分に強度を上げても、SR から測定される光信号 (数 10 mV の興奮性シナプス
後電位に対応) は、SP から測定される光信号 (100 mV の活動電位に対応) よりも光信号の振幅が⼤きい。この⾒かけの不⼀致は、集合信号によるものであるかを明らかにするため、⾼カリウム ACSF 溶液で灌流した時のスライス標本の定常膜電位変化を分析した。さらに、NEURON シミュレータ (Hines and Carnevale, 1997) を使⽤して、光信号測定結果とシミュレーション結果による CA1 錐体細胞集合の膜電位応答の応答分布
図の⽐較検討を⾏った。得られた結果から、光信号データは集合信号であることを⽰し、本光計測データが信頼できるものであるという基盤を築いた。
シャッファー側枝⼊⼒による海⾺ CA1 錐体細胞へのフィードフォワードおよびフィードバック抑制は、海⾺ CA1 野での神経回路演算に重要な役割を果たすと考えられている（Buzsaki, 1984; Lacaille and Schwartzkroin, 1988a,b; Freund and Buzsaki, 1996）。光
計測法の利点を⽣かして、抑制⼊⼒の分布特性評価を⾏い、シナプス後細胞への抑制
⼊⼒の空間的寄与が異なることも発⾒した。

26

2-1

⽅法

光計測システム、ラット海⾺スライス作成および染⾊に関しては 1-1 で既に説明した通りである。本研究にあたって新たに採⽤した光計測⽅法について、以下に⽰す。
電気⽣理学的⼿法および NEURON シミュレータを使⽤した膜電位-光信号シミュレー
ションの詳細については、付録資料（付録 3）に⽰した。

2-1-1 タイムラスプイメージング法の開発

第 1 章で構築した光計測システムは、蛍光の緩やかな変化の評価には適していない
ため、画像取得システムの設定を撮像速度 1ms で 85 フレームを取得するようにした上で、10 秒ごとにこのプロセスが⾛るように⾃動化マクロプログラムを開発した。1 回の計測から得られる 85 フレームの連続画像を平均化して１枚の平均画像を作成した。
これを 10 秒に１枚の蛍光画像とし、実験終了までの 90 分以上にわたる時系列の連続画像データ (タイムラプス画像) を作成した。また、このタイムラプス画像の解析のために IgorPro 上でマクロ⾔語を使ってプログラムを開発した。タイムラプスで計測したデータは、蛍光変化本来の極性 (膜の脱分極に応じて蛍光が減少する) を⽤いた (Fig.
2-2)。

27

2-2

結果と考察

2-2-1 光信号における神経応答の振幅分布

Fig. 2-1B–D に、海⾺ CA1 野のシャッファー側枝に電気刺激 (250 µA を正負⽅向に200 µs) を加えたときの典型的な光信号応答を⽰した (Tominaga et al., 2000, 2002b を参照)。
刺激直後からの時間経過に従って得られた光信号の連続画像を Fig. 2-1B に⽰した。
代表的な 3 点から抽出したトレース (時間に対する光信号の応答) を Fig. 2-1B の下部に⽰した。左端のトレースは、刺激部位で記録された応答を⽰し、刺激アーティファ
クト (電気的な刺激により刺激電極周囲の膜電位が強制的に変化することに対応する信号) の後にシナプス後反応が続いている。CA1 野の中間および遠位部分で記録したトレースをその横に並べて⽰した。それぞれのトレースにおける応答のピークを⽮印で指し⽰した。応答は時間経過にしたがって遠位側に伝播し、それぞれの光信号トレースの応答ピークは、異なる時間に現れている。
刺激電極から約 90 µm 離れた錐体細胞の細胞体樹状突起軸に沿った光信号の時間経
過を、Fig. 2-1C に⽰した。振幅の最⼤値は SR の中央付近にあらわれた。錐体細胞層(SP) では放射状層 (SR) と⽐較してピークが⼩さく、その後、過分極反応が続いた。
各代表ピクセルの光信号トレースを Fig. 2-1D に⽰した。刺激強度の変化 (20, 30, 40,
50, 80, 120, 200, 250 µA) に対応するトレースは、擬似カラーコードで⽰した (Fig. 21D)。全ての刺激強度において、SR での応答が最も⼤きかったのに対し、SP では SR
よりも応答が⼩さく、他の層の応答よりも過分極応答が⼤きかった。
次に、各ピクセルでの最⼤応答振幅値 (Fig. 2-1B のトレースにおいて⽮印で⽰した
ピーク振幅値) の分布を Fig. 2-1E の画像に投影した (最⼤応答投影マップ)。ここか
ら、錐体細胞の細胞体樹状突起軸のピーク振幅を取り出して、応答の振幅を⽐較した。錐体細胞の細胞体樹状突起軸に沿って最⼤応答値を投影した応答分布図を Fig. 21F に⽰す。この図には刺激部位から異なる距離 (90, 180, 360, 540 µm) での応答分布図を⽰している。刺激部位からの距離が異なっても、全ての応答分布図においてピーク28

応答は SR の中央 (SP から約 200 µm) に現れた。上昇層 (SO) での最⼤応答は、SR での応答の 70％以下であった。この関係は、刺激強度を変化させても変わらず、全ての刺激強度(20, 30, 40, 50, 80, 120, 200, 250 µA)において、光信号のピーク応答は SR にあらわれた (Fig. 2-1G および H)。
SP における光信号反応は錐体細胞の細胞体における活動電位に対応すると考えられ、活動電位の膜電位変化は 100 mV 以上である。⼀⽅、SR における光信号反応は尖端樹状突起の EPSP に対応すると考えられ、EPSP の膜電位変化は数 10 mV である。
VSD によって測定した応答が膜電位の振幅を反映していると考えると、SR よりも SPの応答が⼤きくなることが予想されるが、光信号計測結果では逆のことが観察されている。すなわち、SR の光信号の⽅が SP の光信号よりも⼤きい。この振幅分布の齟齬が、部位あるいは層依存的な VSD 感度の差に起因していた場合、VSD 信号を使⽤した
脳神経回路全体における膜電位応答の⽐較検討をより慎重に⾏う必要がある。

2-2-2 ⾼カリウム (High K+) 溶液による計測

SP、SR の層または部位における膜電位変化と光信号振幅との間の対応に齟齬が認められる理由として、(1) VSD 感度の部位または層依存性、(2) 光信号集合性による可能性、がある。これらの可能性を検討するため、最初に (1) の VSD 感度に部位または層依存性があるのか検討を⾏った。
海⾺スライス標本外液の [K+]O 濃度を⾼くすると、静⽌膜に対して組織⾮依存に均⼀な持続的脱分極を引き起こすことができる。この時の蛍光変化を計測して (Fig. 22)、評価を⾏った。
灌流液をコントロール ACSF ( [K+]O = 2.5 mM) から High-K+ ACSF 溶液 ( [K+]O = 25mM; 以下 High-K+溶液と記載) に切り替えると、蛍光は全体に減少した。High-K+溶液を洗い流してコントロール ACSF に戻すと、応答は回復し、蛍光レベルがコントロー
ルレベルに戻った (Fig. 2-2A)。脱分極応答時の計測した蛍光データを Fig. 2-2 Ba に⽰した。初期蛍光に対する蛍光の減少の割合 (Fig. 2-2Ba) は、SR では均⼀な変化を⽰す
⼀⽅、SP および SO では蛍光変化が顕著(Fig. 2-2Ba ⽮印)だった。Fig. 2-2Ba の蛍光 3D
29

画像に直交する⻘い平⾯で切り取った断⾯で表される細胞体樹状突起軸の応答分布図
を Fig. 2-2C に⽰した (High-K トレース)。
SP および SO で観察された SR よりも⼤きな蛍光変化が、シナプス後細胞で⽣じる
活動電位によって引き起こされた反応であるか確認するため、電位感受性 Na+チャネル阻害薬 (TTX 5 µM) を High-K+溶液に添加して還流した。TTX を High-K+溶液に加えて還流すると、SP と SO に沿って⾒られた急峻なピーク (Fig. 2-2Ba ⽮印) は消失した(Fig. 2-2Bb ⽮印)。錐体細胞の細胞体樹状突起軸に沿った蛍光変化の応答分布図を Fig.
2-2C にプロットした (High-K+ + TTX)。TTX 存在下では、錐体細胞の細胞体樹状突起
軸に沿った蛍光変化が⼀様になった。Fig. 2-2D に統計処理した応答分布図 (n = 4-9) をプロットしたところ、High-K+溶液 (○) の SP および SO で検出されたピーク応答が、TTX 存在下 (●) では⼤幅に減少した。細胞体樹状突起軸の全⻑に沿った全サンプリン
グポイントで、TTX 存在下と⾮存在下で有意差が認められた (ANOVA 検定, p <0.05)。これは、High-K+溶液における応答分布図の不均⼀は神経細胞の活動電位発⽕によって引き起こされたことを⽰している。
脱分極細胞からの神経伝達物質放出の影響を排除するため、主要な興奮性伝達物質
受容体阻害薬 (NMDA 受容体阻害薬 APV 50 µM、AMPA/Kinate 受容体阻害薬 CNQX 10µM) および抑制性受容体阻害薬 (GABAA 受容体阻害薬ビククリン 20 µM) を含む混合液を加えた High-K+溶液を還流し、計測した(Fig. 2-2D △ HighK+ + Blockers)。この結果
は、放射状層 (SR)、上昇層 (SO)、および網状分⼦層 (SLM) の High-K+脱分極反応を優位に減少させた (Fig. 2-2D 阻害薬混合液存在下 (△ HighK+ + Blockers) と⾮存在下(○
HighK+); ANOVA 検定, p < 0.05)。このことは、細胞周辺の過剰なグルタミン酸およびGABA が、High-K+溶液のスライス標本で観察された脱分極の⼀因となっていることを⽰唆している。SP 付近のピークは、TTX (Fig. 2-2D ▲ HighK+ + Blockers + TTX) の適⽤により消失した。すなわち、蛍光変化の不均⼀な分布は、主にシナプス後細胞である
CA1 錐体細胞の活動電位によって引き起こされたと考えられる。
この結果から、VSD 感度に部位または層依存性がある可能性を排除することができた。

30

2-2-3NEURON シミュレータによる計算データとの⽐較検証

さらに、SP、SR などの部位ごとの膜電位変化と光信号の振幅との間の不⼀致の理由を解明するために、2-2-2 で挙げた光信号データの集合信号としての特性について解析した。
海⾺ CA1 スライス標本のシャッファー側枝へ電気刺激を与えた時に、海⾺ CA1 ス
ライス標本の錐体細胞には、活動電位を発⽕させる細胞と発⽕しない細胞が含まれている可能性がある。活動電位を発⽕させる細胞と発⽕しない細胞の集団組成を実験的にコントロールすることは難しいため、NEURON シミュレータ (Hines and Carnevale,1997) を⽤いて計算的に検証した。このシミュレーションには海⾺ CA1 錐体細胞の現実的なモデル (realistic model; Magee and Johnston, 1995; Migliore et al., 1999; Johnston etal., 2003) を採⽤し、数値モデル (Migliore et al., 2003) より CA1 野の膜電位応答をシミュレートした。Fig. 2-3A に、使⽤した CA1 錐体細胞モデルの幾何学的関係を⽰した。
Fig. 2-3A のトレースは、⽐較的強いシナプス⼊⼒に対して錐体細胞が活動電位を発⽕させた時の、異なる位置 (細胞体から 0, 100, 200, 300 µm) での代表的な膜電位応答を⽰している。モデルの各セグメントの膜電位応答を計算し、それを錐体細胞の細胞体
樹状突起軸に沿った位置に対する応答の分布として再構築した結果から膜電位応答ト
レースを抽出した。
シミュレーションの仮想的な⼊⼒強度の値を少しずつ変えていき、モデル CA1 錐体細胞の応答が活動電位を発⽕させる条件を探索した。これにより、発⽕が起こる直前、すなわち発⽕閾値をわずかに下回った場合 (a)、または発⽕が起こる最⼩の⼊⼒を加えた場合 (b) のシミュレーション結果を得た。この時の両者のモデル CA1 錐体細胞の細胞体樹状突起軸に沿った膜電位応答分布図を計算して３D グラフで⽰した (Fig. 23B)。採⽤した錐体細胞モデルは、細胞体から 200 µm の所にシナプス⼊⼒がある。活動電位を発⽕する⼊⼒を与えた場合 (Fig. 2-3Bb) と活動電位を発⽕しない⼊⼒を与えた場合 (Fig. 2-3Ba) の膜電位応答分布図を計算したところ、どちらも EPSP の振幅はほぼ同じであった。モデル錐体細胞が活動電位を発⽕した場合、SP および SO で⾮常に強い応答 (約 80 mV 変化) が発⽣した (Fig. 2-3Bb)。CA1 錐体細胞単体でのシミュレー
31

ションデータを元に再構築した膜電位応答分布図計算結果からは、発⽕した場合、発⽕しなかった場合のどちらも光計測法によって得られた応答の振幅・分布とは⼀致しなかった。
Fig. 2-4A に、Fig. 2-3Ba,b と対応する膜電位応答の時間経過を⽰した。活動電位⽣成の閾値をわずかに上回る (just-supra threshold) シナプス⼊⼒ (EPSP に続いて活動電位が発⽣する場合。⿊のトレース) と、わずかに下回る (below threshold) シナプス⼊⼒(EPSP のみ発⽣する場合。⻘のトレース) を重ねて⽰した。閾値を超える反応と超えな
い反応は、シナプスウエイトを連続的に変化させた時、閾値をちょうど超えた点での反応と、それ以下の時の反応を⽰しており、EPSP の⼤きさにはほとんど差は認められなかった。これで、ほぼ同じ⼊⼒を受けた時に発⽕する細胞と発⽕しない細胞を代表させることとした。それぞれの⼊⼒を受けた時のモデル錐体細胞の細胞体樹状突起軸に沿ったピーク膜電位応答分布図を Fig. 2-4B に⽰した。EPSP のみ(Fig. 2-4Ba)、活動電位を発⽕させた場合(Fig. 2-4Bb) の 2 つの膜電位応答分布図の形状はまったく異なっていた。活動電位を発⽕した⼊⼒条件では、SP の膜電位振幅と SR の膜電位振幅の⽐(SP 膜電位振幅／SR 膜電位振幅) は 5.13 だったが、活動電位が起こらない⼊⼒条件では、この⽐は 0.63 となった。つまり、膜電位変化は、錐体細胞が活動電位を⽣成した
ときは SP の応答は SR の応答の 513%となり、錐体細胞が EPSP のみを⽣成した場合はSP の応答は SR の応答の 63％になった。
Fig. 2-4C に、⾮発⽕神経細胞 [EPSP のみを⽣成する錐体細胞 (Fig. 2-4Ba) ] と、発⽕神経細胞 [活動電位を⽣成する錐体細胞 (Fig. 2-4Bb) ] の存在の割合を変化させたときの平均膜電位応答分布図を⽰した (Fig. 2-4C)。⾮発⽕神経細胞の割合が⾼い時 (発⽕神経細胞／⾮発⽕神経細胞が 1/60 以下) の膜電位応答分布図の形状は、光信号で捉えた応答分布図の形状と類似している (Fig. 2-1F, G, Fig. 2-5B)。
次に、発⽕のタイミングの違いがこの分布に影響する可能性を検討した。16 ms の範囲内で活動電位発⽕のタイミングをランダムに変化させ、膜電位応答分布図をシミュ
レーションしたが、応答分布図の形状にはほとんど影響しなかった (Fig. 2-4C ⻘線)。
すなわち、Fig. 2-1F, G で⽰した光信号膜応答分布図は、神経細胞集合には発⽕神経細胞と⾮発⽕神経細胞が混在し、EPSP のみを⽣成する⾮発⽕神経細胞の割合が⾼いこと32

が⽰された。光信号は、光の経路に含まれる全ての神経細胞の膜区分の電位情報を光信号に加算平均的に変換しており、この光信号の集合信号としての性質が観察された
光信号膜応答分布図 (Fig. 2-1F, G) となると考えられる。
本シミュレーション条件で、集合電位信号から計算した SP (L = 0 µm) と SR (L =250 µm) の応答⽐ (PR ratio = SP 応答 / SR 応答) を、発⽕神経細胞と⾮発⽕神経細胞の⽐率を変化させて⽰した (Fig. 2-4D)。発⽕神経細胞に対し、⾮発⽕神経細胞の割合を増やすと、PR ratio は低下した。発⽕神経細胞対⾮発⽕神経細胞が 1 : 10 の場合、PR
ratio は 1.35、1 : 200 の場合、0.72 になった。本光計測システムでは 1 ピクセルは対物
⾯で約 25 µm × 25 µm であり、観測される細胞数は細胞の直径が 10 µm、計測可能な光信号の深さが 200 µm と仮定すると、錐体細胞は最⼤でも 200 個程度と推定される(Curtis et al., 1999)。
光計測データから SP (L = 0 mm) と SR の中間部 (L = 250 mm) の光信号の振幅の⽐率として PR ratio を計算すると 0.67 ± 0.07 (mean ± SEM, n = 6 スライス; Fig. 2-5C, ○) となった。これは、シミュレーション結果で得られた発⽕神経細胞と⾮発⽕神経細胞を1 : 200 とした時の PR ratio よりもさらに⼩さい。そこで、シミュレーションで得られた
PR ratio よりも光信号データの PR ratio の⽅が⼩さくなる理由を検討した。

2-2-3 SR 刺激に応答したフィードフォワード／フィードバック抑制⼊⼒影響の光信号に対する影響海⾺ CA1 野の錐体細胞の発⽕は、海⾺ CA1 野に投射する⼊⼒経路と CA1 野の錐体細胞、介在細胞がつくる神経回路内のフィードフォワード抑制⼊⼒とフィードバック
抑制⼊⼒によって制御されていると考えられている (Buzsaki, 1984)。
Fig. 2-5C (○) に、刺激強度に応じた PRratio を⽰した。PR ratio は、刺激強度が強くなるにつれて、最初に⼤きく減少し、その後増加に転じ、最⼤ 0.7 に達した。より低い
刺激強度で⾒られる PR ratio の減少は、光信号で計測した膜電位応答分布図が、刺激により誘発されるフィードフォワード抑制⼊⼒を反映している可能性を⽰唆している(Alger and Nicoll, 1982b; Turner, 1990)。シミュレータでは、この抑制成分を計算してい33

なかったため、シミュレータのデータを元に計算した PR ratio に対して、実測した光信号の PR ratio が⼩さくなった可能性がある。
SR に刺⼊した電極からのシャッファー側枝刺激による錐体細胞の細胞体樹状突起軸に沿った抑制⼊⼒がどのように膜電位変化に影響するかを検討するため、GABAA 受容体阻害剤であるピクロトキシン (PITX) を ACSF 溶液に加えて還流し、海⾺ CA1 野のSP および SR の光信号を計測した (Fig. 2-5)。
PITX 存在下 (⿊) と⾮存在下 (グレー) の SP、SR での光信号の時間変化を Fig. 25A に⽰す。PITX を添加すると、光信号の振幅は⼤きく増加し、⼤きな振幅が⻑く続いた。GABAA 受容体阻害によって引き起こされる応答増⼤の最初のピーク (Fig. 2-5A の⿊⽮印) を、フィードフォワード抑制⼊⼒として定義した。この最初のピーク時点でのPITX による光信号振幅の増加は、シナプス後細胞の活動電位発⽕に先⾏した結果から(Fig. 2-1D も参照)、妥当であった。この時の細胞体樹状突起軸に沿った PITX 存在下(●) と PITX ⾮存在下 (○) の光信号応答分布図は、細胞体近位部位 (±20 µm < L < 0µm ) と尖端樹状突起遠位部位 (L > 360.1 µm) で、ともにコントロールとの有意差が認められた (＊Fig. 2-5B, ANOVA, p < 0.05)。すなわち、細胞体近位部位、尖端樹状突起遠位部位に、GABA フィードフォワード抑制⼊⼒があると考えられる。
尖端樹状突起で発⽣する EPSP に対して、細胞体で活動電位が発⽣する割合 (EPSP活動電位発⽕制御) の指標として、PR ratio を使⽤する。Fig. 2-5C に刺激強度に応じた
PR ratio の変化を、100 µM PITX 存在下 (●)、⾮存在下 (○) に対して計算し、それぞれの値をプロットした。PITX ⾮存在下のコントロール条件では PR ratio は、刺激強度が⼀定の⼤きさ (50 µA) になるまで刺激強度が上昇しても低下し、その後、増⼤して⼀定の値になった (Fig. 2-5C ○)。⼀⽅、PITX 存在下では PR ratio は刺激強度の増⼤に伴って⼀様に増⼤して、PITX ⾮存在下で⾒られたような⼀時的な低下は認められなかった (Fig. 2-5C ●)。すなわち、PITX により、GABAA 受容体が阻害されているため、PR
ratio は単調に増⼤したのち⼀定の飽和値を⽰したことが⽰唆された。
応答初期のフィードフォワード抑制と⽐較するために、応答が⼀過的なピークを過ぎた減少期 (刺激後 30 ms) での光信号応答分布図を Fig. 2-5D に⽰した。PITX ⾮存在
下では、SO、SP および細胞体近位領域から 400 µm の尖端樹状突起で過分極反応が⾒34

られた (Fig. 2-5D ○)。⼀⽅、PITX 存在下では、細胞体樹状突起軸の全体にわたって、脱分極反応が観察された (Fig. 2-5D ●)。 これは主に、錐体細胞全体に対する GABA フィードバック抑制の影響を反映していると考えられる。

2-2-4 刺激部位依存的なフィードフォワード抑制／フィードバック抑制制御の可視化

海⾺ CA1 野の錐体細胞は、CA3 領域からの⼊⼒ (シャッファー側枝) を放射層 (SR)に受ける他、上昇層 (SO) ではシャッファー側枝の分枝のほか、CA1-CA1 樹状突起間連絡がある。網状分⼦層 (SLM) では嗅内⽪質からの TA 経路からシナプス⼊⼒を受けることが知られている。これらの他にも嗅周囲⽪質を含む多くの⼊⼒から投射を受けている。また、SO と SLM にはそれぞれ異なる働きを持つ介在神経が分布していることが⽰唆されている（Freund and Buzsaki, 1996）。これらの⼊⼒経路に対するフィード
フォワード抑制制御の影響を調べるために、SLM および SO 部位に挿⼊した刺激電極
からの電気刺激 (それぞれ SLM 刺激、SO 刺激と略す) に応答した膜電位応答分布図
を、SR への電気刺激 (SR 刺激) と⽐べて評価した (Fig. 2-6)。
SLM 刺激において (Fig. 2-6A-D)、PITX 存在下／⾮存在下の光信号応答分布図を⽐較すると (Fig. 2-6B)、SR 刺激で⾒られたように、SO および細胞体近位部位 (-200 µm< L < 126.2 µm) および尖端樹状突起部位 (L > 381.3 µm) で有意な差が認められた。
SLM 刺激後の PR ratio の変化 (Fig. 2-6C) は、SR 刺激後の PR ⽐の変化 (Fig. 2-5C) とは全く異なった。SLM 刺激では、Fig. 2-6C に⽰すように、刺激強度が増加すると PR
ratio は PITX 存在下の⽅が増⼤し、刺激強度が 120 µA を超えると有意な増⼤を⽰した(P < 0.05)。これは SR 刺激で⾒られたような弱い刺激で活性化するフィードフォワード抑制の効果があまり認められないことを意味している。
SO 刺激 (Fig. 2-6E-H) に対する PITX 存在下/⾮存在下の光信号応答分布図を⽐較す
ると、SO および SP から SR の近位では応答分布図にほとんど影響は認められなかった。⼀⽅、SR 遠位側で PITX 添加により有意な増⼤がみられた (L > 258.8 µm, p <0.05)。Fig. 2-6G に⽰す PR ratio で評価を⾏うと、抑制⼊⼒が SR に⼊っているため
PITX 存在下では SR の EPSP による光信号の振幅が⼤きくなり分⺟が⼤きくなること
35

で、PITX 存在下の PR ratio が PITX ⾮存在下と⽐べて⼩さくなっている。刺激強度に対する PR ratio の変化を Fig. 2-6G に⽰した。これは SO 刺激が主に錐体細胞の直接刺激と、介在細胞の直接刺激に相当すると考えられた。
刺激後 30 ms での光信号応答分布図を PITX 存在下／⾮存在下で⽐較すると、PITX
⾮存在下の光信号応答分布図は過分極状態であるのに対し、PITX 適⽤時は細胞体樹状
突起軸全体に沿って、脱分極が誘発されていることが観察できた。フィードバック抑制による制御 (SLM 刺激時: Fig. 2-6D; SO 刺激時: Fig. 2-6H) は細胞体樹状突起軸に沿って、全体にわたって影響していた。

2-2-5. 電気⽣理学的記録

CA1 錐体細胞を電位固定した状態で、SR、SLM および SO に対して、2 つの異なる
刺激強度 (250 µA および 40 µA) の⼊⼒を⾏った結果を、Fig. 2-7 に⽰す。固定電位を-80 mV から -20 mV の間で変化させ、膜電流応答を計測したトレースを⽰した (Fig. 27)。
膜電流応答は、興奮性シナプス後電流 (EPSC) と抑制性シナプス後電流 (IPSC) の重ね合わせで⽰される。Fig. 2-7A の⼀番右側のトレース (左側 (250 µA)、中央部 (40µA) の２種類の刺激強度に対する固定電位-70 mV と-30 mV の時の応答を拡⼤表⽰したもの) で⽰したように、脱分極電位である-30 mV で電位固定した場合、弱い刺激 (40µA) により、⼀瞬の⼩さな内向き EPSC に引き続き、すぐに早いフィードフォワード
IPSC が引き起こされた。刺激強度を 250 µA に増加させると、さらに遅いフィードバッ
ク IPSC (Glickfeld and Scanziani, 2006) が加算的に動員されるのが観察された。SLM 刺激でも同様であった (Fig. 2-7C)。これは、SO 刺激ではあまり明確ではなかった (Fig.
2-7B)。これらの IPSC は-70 mV での電位固定ではトレース上に明確には検出されなかった。塩素イオンの反転電位 (ECl) は約-73 mV と計算されるので、これらの IPSC は塩素イオンによるものと考えられる。実験したすべての細胞 (n = 6) で同様の傾向が観察
された。

36

これは、SR 刺激 (シャッファー側枝刺激) では、特に閾値の低いフィードフォワー
ド抑制成分が動員されるのに対して、刺激強度が⼤きくなると、閾値が⾼くより⼤きな電流を起こすフィードバック抑制成分が加算的に動員されることを⽰唆している。
これは、光計測結果から⾒られる応答分布 (Fig. 2-5B) と同様であり、SLM 刺激においても同様である。⼀⽅、SO 刺激 ではこのようなフィードフォワード抑制成分は動員されず、光計測による応答分布と符合した。以上の結果から、これまで困難であった
抑制シナプスの動員の空間分布を明らかにすることができた。

37

2-3. 結論

海⾺ CA1 野での光計測を⾏った時に、数 10 mV のシナプス電位に対応する SR の計
測値が⼤きく、100 mV に及ぶ活動電位を反映すると思われる SP の計測値がそれよりも⼩さいことは、いままで⼗分に説明できていなかった。
細胞の静⽌電位は細胞外液のカリウム濃度に⼤きく依存している。本研究では、最初に海⾺スライス標本の外液のカリウム濃度を⾼めて化学的な電位固定をした状態を作り出して光計測を⾏なった。外液を⾼カリウム ACSF 溶液に置換すると、SP および
SO では⼤きな光信号が現れたが、SR での光信号は⼀様になった。この⾼カリウム
ACSF 溶液に電位感受性 Na+チャネル阻害薬 TTX を加えて活動電位の発⽕を抑えると、SP および SO を含む全ての層において⼀様な光信号が計測された。この結果は、VSD 感度には層の違いに依存性はなく、どの層の膜においても膜電位変化と光信号の間には⼀定の⽐例関係があると考えて良いことを⽰した。
次に、シャッファー側枝への電気刺激で引き起こされる光信号伝播において、SP の光信号が SR の光信号よりも⼩さい理由について、NEURON シミュレータを⽤いて検討した。このシミュレーションプログラムで、個々の膜の各成分で現実的な膜電位応答を計算し、光信号の集合電位としての性質を加味して錐体細胞に沿った応答分布を算出した。実際の光信号の応答分布と⽐較することで、光信号での応答分布は錐体細胞の活動電位発⽕率を考慮すると説明できることが明らかとなった。このシミュレー
ションでは、発⽕する細胞は 100 個に 1 個くらいと推計された。以上の研究より、光計測における集合信号としての光信号の応答分布の特性は実際の細胞の膜電位応答強度分布を反映していることを⽰した。
さらに、ACSF に GABAA 受容体拮抗薬である PITX を加えた時のスライス標本の膜電位分布から、抑制性シナプスの膜電位応答に対する関与の程度を検証した。刺激応
答特性と、時空間パターンから興奮性膜電位の最初のピークの PITX による変化は、フィードフォワード抑制に起因し、後の応答 (刺激後 30 ms に現れる) はフィードバック抑制に起因していることを明らかにした。

38

SR 刺激によるフィードフォワード抑制の空間分布は、細胞体近位および遠位の尖端
樹状突起領域で観察された。最も⼤きなフィードフォワード抑制が⾒られたのは細胞体近位であった。
刺激強度によるフィードフォワード抑制⼊⼒の影響の違いについても可視化した。
SR 刺激において、低い刺激強度 (20 – 80 uA) では PR ratio (Fig. 2-5C) が減少したのに対し、PITX 存在下では PR ratio の増加が認められた。この結果は、低い刺激強度の順
⾏刺激が IPSP (Andersen et al., 1969a; Turner, 1988, 1990)と IPSC (Fig. 2-7A 右端参照) を誘発するという結果と⼀致した。また、光計測データでの PR ratio が、シミュレーショ
ンモデルでの PR ratio よりも低い要因は、低い刺激強度の SR 刺激が誘発するフィード
フォワード抑制⼊⼒による発⽕制御が⼀因と考えられた。
SLM 刺激および SO 刺激におけるコントロール光信号応答は SR 刺激と⽐較すると微弱である。SLM 刺激における PITX 存在下／⾮存在下で解析したフィードフォワー
ド抑制は、細胞体近位および尖端樹状突起領域で観察され、特に細胞体近位において、⽐較的広い範囲で⼤きなフィードフォワード抑制が観察された。刺激強度に対するフィードフォワード影響は、PR ratio による評価では、刺激強度が 120 µA を超える
⾼い強度の刺激で認められた。
⼀⽅、SO 刺激における PITX 存在下／⾮存在下で解析したフィードフォワード抑制
は、遠位尖端樹状突起領域のみで認められた。刺激強度によるフィードフォワードの影響は、PR ratio による評価では、刺激強度が 40 µA または 80µA 以上で有意差が認められ、SR, SO 刺激と異なり、PITX 存在下での PR ratio は反転して、PITX ⾮存在下よりも⼩さい値となった。これは遠位尖端樹状突起領域に⼊⼒しているフィードフォワ
ード⼊⼒が PITX により遮断され、SR における光信号応答が⼤きくなったためと考えられる。
本研究により、光計測データは信号集合であることを明らかにした上で、GABA 作
動性フィードフォワード・フィードバック抑制の CA1 錐体細胞への⼊⼒分布と刺激強度に対する影響を可視化することができた。

39

第3章

VSD 光計測を⽤いた海⾺ CA1 野からの⻑期増強 (LTP) の信号伝播パターンの網羅的解析(本章の内容に関しては、Front. Cell. Neurosci. 12:389 (2019) に発表済み)

学習および記憶機能など脳機能は、脳神経回路の⼊出⼒ (I/O) 活動に応じた変化が重要な役割を担っていると考えられる。脳神経回路の動態を理解することは、健常な脳と病気の脳の⽣理学と病理学に取り組むために不可⽋である。神経回路の機構的な理解は、検査や治療の客観的な指標としても重要である。
近年、神経回路において興奮／抑制 (E/I) バランスが重要であるという認識が⾼まり (Isaacson and Scanziani, 2011)、神経回路活動を直接解明することの重要性が認知されてきている。E/I バランスの崩れや不均衡は、様々な回路要素間の制御と同期に影響し、⾃閉症スペクトラム障害 (ASDs)(Persico and Bourgeron, 2006; Connor et al.,2016)、統合失調症 (Canitano and Pallagrosi, 2017)、アルツハイマー病 (AD) (Busche andKonnerth, 2016) など、精神障害発症に関与していることが報告されている。脳の機能不全の神経回路メカニズムを理解するためには、脳神経回路を広範囲に、さらにその
時空間的動態を評価することが重要である (Uhlhaas and Singer, 2012; Anticevic and
Murray, 2017)。
フィールド電位記録、細胞内記録、パッチクランプなどの従来の電気⽣理学的⼿法
は、回路内の個々の神経細胞活動や要素間のシナプス接続の研究には有効な⼿段である。⼀⽅で、点計測であるため、脳神経回路全体の動態研究には適さない。
光計測法では、回路内の樹状突起、軸索、細胞体などの神経細胞における全ての構
成要素で膜電位をプローブすることを可能とし、脳神経回路全体の時空間における機能動態の理解を可能とする。本研究で開発した光計測法は、脳の局所神経回路の I/O 関
係を測定することで、回路の E/I バランスを時空間動態の差として定量的に⽰す重要なツールとなる。
脳神経回路全体の時空間応答動態の変化を評価するためには、定量的かつ安定した⻑期連続測定が必要となる。ここでは、VSD 光計測法を使⽤して、海⾺ CA1 野におけ40

るシータバースト刺激 (TBS) による⻑期増強 (LTP) に関連する回路動態変化を計測した。本研究で開発してきた⾼速光計測システムにより、海⾺ CA1 野全体から、神経活動に対応する光信号を最⼤フレーム速度 0.1 ms / frame で 60 秒ごとに 12 時間以上測定することができた。
光信号データの評価に当たっては、スライス標本による形態の違いに依存せず、光信号データを統計処理して評価する必要がある。このために、新たな座標系を定義して導⼊し、スライス標本間の幾何学的な不整合の問題を解決した。光信号データをこの座標系に座標変換して投射することにより、全ての海⾺ CA1 野からの光信号データが同等に評価可能となり、さらにこの座標系で光信号を正規化して評価することにより、回路活動の変化を評価可能となった。本研究では、多くの脳神経疾患病態モデル(Monday and Castillo, 2017; Monday et al., 2018) において脳機能の重要な指標である「海⾺ CA1 野での LTP」 (Bliss and Gardner-Medwin, 1973; Bliss and Collingridge, 1993) の画像解析に、この新たな座標・評価系を導⼊することができた。

41

3-1 ⽅法

光計測システム、スライス標本作成および染⾊に関しては 1-1 で既に説明した。第３章での計測ではマウス海⾺標本を⽤いている。これは脳科学の分野において、1990
年代以降ノックアウトマウスなどの遺伝⼦⼯学の⼿法を⽤いた（その当時）マウスでしかできない研究が主流となってきたことに対応するものである。マウスとラットのスライス作成⼿法の差は第 1 章の⽅法にまとめた。尚、電気⽣理学的⼿法について
は、付録資料 (付録 2) に⽰した。

3-2 結果と考察

3-2-1

L-LTP 計測

Fig. 3-1A に、光信号記録のセットアップの模式図を⽰した。励起光 (LEX-2G,
Brainvision, Inc., Tokyo, Japan) には、フィードバック安定化コントローラーを装備した
LED 照明 (Nishimura et al., 2006) を⽤いた。この照明により、計測の障害となるドリフ
トの問題を防ぐことができ、励起光を最⼩限に抑えることができた。第 1 章の⽅法で既に述べたように、現⾏システムではスライス標本の保持・染⾊⽤モイストチャンバ
ー、計測⽤チャンバーシステム、光学系のシステムを改良することにより、シータバースト刺激 (TBS; 100 Hz で 4 パルスを 200 ms 間隔で 10 回) によって誘発した後期
LTP (L-LTP, Fig. 3-1B-D) の⻑期にわたる安定した光信号記録を達成した。
計測は、プログラム開発プラットフォーム (IgorPro, WaveMetrics Inc., OR) 上で独⾃に開発したプログラムにより⾃動制御で⾏った。コントロールと LTP 誘導後の神経興奮応答を調べるために、100µA（200µsec 双極）刺激で応答を計測した。
Fig. 3-1B は、左側にフィールド電極で記録したフィールド興奮性シナプス後電位(fEPSP) の代表的なトレース、右側にフィールド電極の先端のピクセル (Fig. 3-1A 右図の⾚い点) で得られた光信号トレースを⽰した。TBS 刺激⼊⼒前のコントロール(⿊)、TBS 刺激⼊⼒後、２時間 (緑)、4 時間 (シアン)、そして 6 時間 (⻘) のトレース
42

をそれぞれ重ねて⽰した。Fig. 3-1C は TBS 刺激により L-LTP を誘発させたときの、刺激前から刺激後 5 時間以上にわたるフィールド電極での記録 (fEPSP 勾配 (⿊) ) と電極の先端に対応するピクセルでの光信号 (⻘) をプロットした時間経過のトレースである。Fig. 3-1D は、各時点 (コントロール、2、4、6 時間) で海⾺ CA1 野に沿った神経興奮の伝播を⽰す⼀連の光信号画像 (10,000 frame / sec で記録した光信号像を 9 フレーム間隔) を⽰した。コントロール画像と⽐較して、TBS 後の興奮伝播パターン (Fig. 3-1D2, 4 and 6 hrs) では TBS 刺激前の興奮伝播パターン (Fig. 3-1D control) に⽐べ⼤きな脱分極信号が記録された。この TBS 刺激後の活性化パターンの振幅と時間経過は、2 時
間後、４時間後、６時間後においても安定していた。この実験結果は、本光計測シス
テムが⽣理学的活動の変化を⻑期間追跡できることを⽰している。

3-2-2 海⾺ CA1 野の光信号の評価法；形態に対応した座標系の導⼊と信号の正規化

本研究では、光信号の解析にあたり、海⾺ CA1 スライス標本における個々の標本の形態的な違いがデータ評価に影響を及ぼすことのないよう、新たな座標系を導⼊した。海⾺ CA1 野の 2 次元光信号画像データ (XY 座標) を、細胞体樹状突起軸に沿ったSP からの距離 (D) と CA1-CA2 境界付近の刺激部位からの距離 (L) に対応する D-L 座
標に変換した。 海⾺ CA1 野の錐体細胞は、円弧上に放射状に存在するという仮定のもとで、以下の関数に沿って、光信号画像平⾯を D-L 座標に変換した (Fig. 3-2A)。

r2 = (x − x0)2 + (y − y0)2(1)

l = (xs − x0) cos (L / r) − (ys − y0) sin (L / r) + x0

(2)

d = (ys − y0) cos (L / r) − (xs − x0) sin (L / r) + y0(3)

ここで、xs, ys は、刺激部位の (x, y) 座標を⽰す。
画像内の SP の線を円弧に合わせると、円弧の中⼼ (x0, y0) と半径 (r; r は (x0, y0) から SP までの距離) のパラメーターが決定できる。これらのパラメーターを決定後、上記の変換式を⽤いて、海⾺ CA1 野画像を Fig. 3-2A の右下の模式図に⽰す⻑⽅形画像に43

変換した。Fig. 3-2B に、海⾺ CA1 野の蛍光画像 (Fig. 3-1A) を D-L 座標に変換した蛍光画像を⽰した。Fig. 3-2C には、光信号画像を D-L 座標変換したときの神経活動の伝播パターンを⽰した。興奮は D 軸の約 150 µm で始まり、L 軸の遠位側に向かって伝搬していく。
D-L 変換により、異なるスライス標本からの光信号画像データを効率的に統計処理し、評価可能となった。Fig. 3-2C に、4 つの異なる時点 (コントロール、2、4、6 時間)での神経活動の伝播パターンを⽰した。この図で、D-L 変換により、シャッファー側枝に沿った伝搬パターンを、L 軸に沿った直線に変換できたことを⽰した。Fig. 3-2D
は、D-L 座標の各ピクセルでの光学応答のピーク値を⽰し、Fig. 3-2E は D-L 座標上の異なるピクセルでの 10 時間の応答の時間変化を⽰した。LTP がどの部位にどのくらいおこったのか、それは D-L 座標位置によって異なる。Fig. 3-2F は LTP 誘導後の経過時間に対する LTP 誘導率の分布を、D-L 座標平⾯に擬似カラーコードで⽰したものである。D-L 光信号画像平⾯上の全ピクセルに対して、LTP 誘導率 (TBS 後の光信号最⼤振
幅／TBS 前の光信号最⼤振幅) を計算して、D-L 座標平⾯上の空間的な位置に再マッピングした。LTP 後の神経興奮増⼤率の空間的な差異分布を⽰す画像となる。Fig. 3-2Gは、Fig. 3-2D の光信号最⼤振幅画像データより、D = -75 µm (SO, ⻘) および D = 150µm (SR, ⿊) における L 軸に沿った振幅のライン応答分布図 (コントロール (⽩抜記号) 、TBS から 2、4、6 時間後 (中塗り記号) ) である。Fig. 3-2H には、LTP 誘導率のライン応答分布図を⽰した。これは Fig. 3-2G と同様に、D = -75 µm (SO, ⻘) および D= 150 µm (SR, ⿊) における L 軸に沿った LTP 誘導率を、Fig. 3-2F より抽出してプロットした。SO では CA1 野遠位部で LTP 誘導率増加が認められ、L = 775 µm で LTP 誘導率のピークが認められた。SR では刺激の付近を除いて LTP 誘導率の増加はほぼ⼀様だ
った。Fig. 3-2I では、SO (D = -75 µm) および SR (D = 150 µm) での光信号の時間経過トレースを L = 500 µm および L = 775 µm の位置それぞれに対して⽰した。SR での信号は、主に EPSP を反映し、SO の信号は活動電位の発⽣を反映すると考えられる。これ
らの結果により、LTP 誘導は EPSP 興奮への影響は CA1 領域全般 (刺激付近を除く) に
おいてほぼ⼀様であることを⽰すとともに、遠位 CA1 野においては EPSP 興奮に対する細胞体発⽕確⽴が⾼くなることを⽰すことができた。また、本実験の結果は、LTP
44

誘導における回路依存性および層依存性の変化における神経活動のダイナミクスの安定性も⽰すことができた。

3-2-3 TBS 誘発 LTP データ

Fig. 3-3 は、4 匹のマウスから作成した 12 スライス標本 (N = 4, n = 12) からの D-L
座標における TBS 誘発 LTP を⽰したものである。Fig. 3-3A に⽰すように、LTP は、
SR よりも SO および SP でより⼤きく計測された。Fig. 3-3C, D は、この現象をより明確に⽰している。LTP は空間的に不均⼀に誘導されており、L 軸に沿った位置に応じて、時間経過にも不均⼀性が現れる。LTP は L が⼩さい L = 225 µm では明確には観察できないのに対し、L = 775 µm ではより⼤きな変化として計測された。CA1 錐体細胞の⼊出⼒ (I/O) 関係の変化を判断するために、SP と SR のピーク値の⽐率 (PR ratio;
Tominaga et al., 2009 及び第 2 章を参照) を Fig. 3-3F に⽰した。図から明らかなように、TBS がシャッファー側枝に与られた時点を境に PR ratio は L 軸に沿って CA1 野全体で変化した。
LTP 誘導刺激パターンの違いによる LTP 誘導と維持メカニズムの違いについては、
すでに複数の論⽂で報告されている (Larson and Lynch, 1986; Larson et al., 1986; Huertaand Lisman, 1995; Larson and Munkácsy, 2015)。⾼周波刺激 (HFS；100 Hz, 1 sec) は、いわゆるテタヌス刺激として知られ、最も⼀般的な LTP 誘導刺激の 1 つである。LTP の維持段階はさまざまなメカニズムに依存する (Korte et al., 1995, 1998; Kang and human,
1996; Smith et al., 2009; Edelmann et al., 2015)。LTP 誘導刺激のもう⼀つの代表的な刺激パターンである TBS は活動電位の発⽕⽣成を増強し、HFS は GABAA 依存メカニズム
によりスパイクを減少させる (Tominaga et al., 2000, 2002a, 2013)。そこで、CA1 野での
LTP の違いを⽐較、検討した (TBS; Fig. 3-3, HFS; Fig. 3-4)。
LTP 誘導刺激後の数分にわたる⼀過性の短期増強 (STP) は、L 軸⽅向全体にわたって HFS 誘発 LTP でより⼤きく計測され、TBS 誘発 LTP では短期増強が明確に観察されなかった (Fig. 3-3A, Fig. 3-4A を⽐較)。TBS 誘導 LTP と HFS 誘導 LTP を⽐較すると、LTP の不均⼀な分布は同様の傾向が⽰された (Fig. 3-3B, C と Fig. 3-4B, C を⽐較)。
45

TBS 誘発刺激でも HFS 誘発刺激でも、LTP の⼤きさは SR よりも SO の⽅が⼤きかっ
た。HFS 誘発 LTP での PR ratio (PRR; Fig. 3-4F) は、遠位 (L = 775 µm) 領域で⼀時的な増加を⽰した。これは、TBS 誘発 LTP のときの PR ratio 変化とは異なっていた (Fig. 33F)。TBS 誘発 LTP では PR ratio は⼀様に変化した。
以上の結果は、LTP を誘導する刺激の種類によって、LTP 誘導後の時空間変化に違いがあることを明らかにした。

3-2-4 TBS 誘発 LTP 時の刺激応答関係の解析

LTP 誘導の空間的不均⼀性は、各神経細胞要素の I/O 関係に関係している可能性がある。ここでは、刺激強度を変化させて (10, 25, 40, 60 V, Fig. 3-5) によって TBS 誘発
LTP による刺激応答の変化を測定した。Fig. 3-5A に、D-L 座標中央の代表点での光信号での応答を⽰した。20 秒ごとに刺激強度を変化させ、TBS 刺激前約 10 分から刺激後
約 10 分までの光信号応答の変化の時間経過を Fig. 3-5A に⽰した。Fig. 3-5B は、D-L 座
標の異なる位置での光信号記録の時間経過を⽰した。Fig. 3-5A,B より、TBS (刺激強度25 V) が、I/O 関係の変化を引き起こしたことがわかる。LTP 誘発後、より⼩さな刺激強度に対する応答は、⼤きく増⼤したが、より強い刺激強度に対する応答は、増⼤の割合が⼩さかった。Fig. 3-5C は光信号応答のピーク値を 2D 画像に投影したものである。Fig. 3-5D に、経過時間と刺激強度に対する LTP 誘導率の解析画像を⽰した。刺激強度が強い (60 V) 場合、LTP 誘導は明確でなかったが、刺激強度が弱い時 (40 V (２⾏⽬)、25 V (３⾏⽬)) は、LTP による明確な増⼤が検出された。どちらの場合とも、
SR よりも SO において、より LTP 誘導率が上昇し、その変化は刺激部位の近くよりも遠位領域で LTP がより顕著となった。PR ratio の変化は、中程度 (25 V, 40 V) の刺激強度では TBS の前後で⼤きく変化したが、最も弱い刺激強度 (10 V) と最も強い刺激強度 (60 V) では明確な変化が現れなかった (Fig. 3-5E)。

46

3-3

結論

神経回路の⼊出⼒ (I/O) 関係における活動依存的な変化は、脳の学習および記憶機
能の中⼼的課題である。回路全体の調整を理解するには、回路内の樹状突起、軸索、細胞体などの神経細胞のすべての要素で膜電位を計測する光計測技術が不可⽋である。回路全体の活動動態の変化を評価するためには、定量的な⻑期連続測定が重要となる。本章では、VSD 光計測法で LTP の⻑期連続測定が可能になったことを⽰した。
さらに、CA1 野のシナプス強度の LTP 誘発刺激による LTP に関連する回路活動の変化を網羅的に記録できることを明らかにした。
光学系と⾼速光計測システム、計測制御ソフトウエアの改良、開発により、CA1 野
全体からの 60 秒ごとに 0.1 ms / frame の最⼤フレーム速度で 12 時間以上測定することができた。また、CA1 野の回路活性の変化を、異なる海⾺スライス標本間で形態の差を超えて、網羅的に評価する⽅法を開発した。これらの⼿法を駆使して、⻑期間のLTP 計測における 2 種類の空間的不均⼀性を明確にすることができた。最初の不均⼀性は、刺激部位からの距離に依存して LTP 誘導率が増加する。 2 番⽬の不均⼀性は、LTP が SR よりも SP、SO 領域で⾼いことである。また、TBS と HFS の LTP 誘導プロ
トコルの違いにより、LTP 誘導パターンが不均⼀に変化することも明らかにした。その不均⼀性は、回路要素の I/O 応答に依存することを実証した。通常の電気⽣理学的な計測法では、このような空間的不均⼀性は、単に実験条件の誤差と解釈されてしまう可能性が⾼いが、光計測で回路全体の LTP 誘導状態が可視化することにより正確に評価することができ、薬物の影響などをより詳細に検討することが可能となる。

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4. 総括

「記憶・学習」など、脳の⾼次機能を理解するには個々の神経活動の動作とともに
神経回路全体としての時空間的な機能の解明が必要となる。従来から広く⽤いられている電気⽣理学的な計測⼿法は電極を⽤いて個々の神経細胞の膜電位変化、あるいは⼀部の神経細胞集合の電位変化 (集合電位等) を計測するものであり、回路全体としての時空間動態を知ることは困難である。膜電位感受性⾊素 (Voltage Sensitive Dye: VSD)を⽤いた計測⽅法では、VSD が細胞膜に組み込まれ、個々の VSD が膜電位変化に応じた蛍光量の変化を⽰すことを利⽤する。これにより細胞の各膜区分の電位変化を蛍光量変化という光の信号に置き換えて計測することが可能となる。本研究では、ラット
およびマウスから作成した海⾺スライス標本を VSD (Di-4-ANEPPS) で染⾊した測定系(bulk staining measurement) において、安定した計測を⾏う新規な⼿法を開発し、また計
測データの解析⽅法を確⽴することを⽬標とした。
本論⽂において、第 1 章では光計測の定量的計測⽅法を確⽴した。神経回路活動を計測するための光計測システムを確⽴するためには様々な技術要件を満たす必要がある。(1) ダイナミックレンジが広く、⾼い時間空間分解能を満たすカメラシステムの開発、(2) 低倍率で⾼い開⼝数を実現し、できるだけ蛍光量を⼤きく捕捉する顕微鏡システムの開発、(3) ⻑時間⽣理活性を保って安定して計測を⾏うためのスライス標本作成の確⽴、(4) VSD の検討及び染⾊⼿順の確⽴、(5) 計測⽤チャンバーシステムの開発など、多くの課題を乗り越えて、安定して⻑時間計測可能なシステムを構築、開発した。この⽅法を駆使して、⽣理学的状態に影響を与えることなく、安定した信頼性の⾼い定量的な計測を⾏うことが可能となった。その光信号の時間経過と振幅は、電気⽣理学的⼿法による細胞内および細胞外の記録と⼀致した⻑時間の安定した計測することができた。
第 2 章では、第 1 章において確⽴させた計測⽅法を元に光計測データについての検討を⾏った。海⾺ CA1 野での光計測では、数 10 mV のシナプス電位に対応する放射状層 (SO) の計測値が⼤きく、100 mV に及ぶ活動電位を反映すると思われる錐体細胞層.
(SP) の計測値がそれよりも⼩さいことは、それまで⼗分に説明されていなかった。最48

初に、VSD の感度に組織依存性・層依存性がないことを⽰すために、海⾺スライス標
本を⾼カリウム溶液を⽤いて組織⾮依存的に電位固定し、活動電位も起こさないように電位感受性ナトリウムチャネル阻害薬 (TTX) を加えた状態で計測すると、海⾺ CA1
野全体においてほぼ⼀様な光信号が検出できることを⽰した。この結果より、VSD 感
度には部位または層依存性はなく、どの部位・層の膜においても、光信号は膜電位の⼤きさに応じた振幅で検出されることが明らかとなった。
次に、シャッファー側枝への電気刺激で錐体細胞層 (SP) の光信号が放射状層 (SO)の光信号に⽐べて⼩さい理由を解明するために、NEURON シミュレータによる膜区分毎の膜電位応答を算出した。これを集合信号 (population signal) として考えた場合に予想できる応答分布を計算し、それぞれの錐体細胞の活動電位発⽕の発⽕率が1/100、すなわち 100 個に 1 個くらいの発⽕率であると考えれば光信号の応答分布が説明できることを⽰した。すなわち、放射状層 (SO) の光信号の振幅の⽅が錐体細胞層(SP) の光信号の振幅よりも⼤きい理由は、光信号が集合信号であることが要因であることを明らかにした。
この結果を⽤いることにより、本計測法から得られる錐体細胞に沿った応答分布への GABAA 受容体阻害剤 (PITX) の作⽤を調べることにより、フィードフォワード抑制とフィードバック抑制の⼊⼒部位とその影響の⼤きさを可視化して⽰すことができた。
第３章では、第 1 章および第２章で⽰した VSD 光計測法の改良、信号の検証を基礎として、マウス海⾺スライス標本の CA1 野における LTP 誘導に伴う変化を測定した。
これまでの VSD 光計測法の開発により、0.1 ms / frame で 400 ms の記録を達成するために必要な励起光を反復して露光しても CA1 野の神経活動の変化を⻑時間 (12 時間) にわたって定量的に追跡できた。すなわち、海⾺スライス標本の L-LTP (後期⻑期増強：
Huang et al., 1996; Kandel, 2001) も計測できることを明らかにした。さらに、CA1 野の形態学的な差異を空間的に校正する⽅法を開発することで異なるスライス標本のデー
タを同じ座標軸で評価した。この⼿法により、TBS と HFS による LTP 誘導の違いを⽰すことが可能となった。また、LTP が刺激応答関係に及ぼす時空間的影響を明らかにした。
49

海⾺ LTP は、アルツハイマー型認知症 (AD) や⾃閉症スペクトラム症候群 (ASD)を含む精神神経疾患動物モデルの神経機能を評価するための重要な指標の 1 つである
(Monday and Castillo, 2017; Monday et al., 2018)。本研究で開発した光計測法を⽤いた
LTP 測定は、精神神経疾患の発症機構やそれに関与する分⼦、薬物の影響を詳細に検討できることが期待される。従来の電気⽣理学的な点計測では、LTP の時空間的な違いは計測できないため誤った結論を導く可能性があるが、本光計測法を⽤いて、LTPの正確な時空間パターンを検出し、正しい評価を⾏うことができる。
LTP の時空間的差異は、回路の E / I バランスを反映し、AD、ASD などの精神神経疾患は、E / I バランスと密接に関係している (Gogolla et al., 2009; Takesian and Hensch,
2013; Murray et al., 2014)。したがって、LTP 誘導中の時空間パターンの変化 (Jackson,
2013; Stepan et al., 2015) は、これらの脳精神神経疾患の病態を検討するための重要なターゲットになる可能性があり、本計測法は⼤変有⽤である。
ASD を含め、脳の発⽣発達への外来化学物質の影響が注⽬されている。特に、環境物質としての化学物質暴露や、治療薬（抗てんかん薬等）としての化学物質投与の発⽣初期に影響を与えると考えられている。このような外来化学物質の早期暴露による神経回路動作の変調・改変のターゲットは、未だ解明されておらず、回路全体を調べる技術として、本研究で開発された技法はとても重要である。現在、本計測法を⽤いて、抗てんかん薬であるバルプロ酸を安全基準にのっとった摂取量で妊婦へ投与したときの仔への影響について評価や、環境ホルモンといわれるビスフェノールや農薬 (ネオニコチノイド) などの妊娠期の摂取における仔への影響などの評価も⾏うことができる。さらに、アルツハイマー病等の認知症治療薬としての新薬の効果についても (⼩野薬品株式会社との共同研究)、遂⾏中である。本光計測法を⽤いた評価法は、脳神経回路、とくに海⾺における環境ホルモンや薬剤投与などの影響の有⼒な機構解析法とな
りうる。

50

【海⾺での光計測について】

哺乳類の脳組織に VSD イメージングを適⽤する先駆的な試み (Grinvald et al., 1982)
以来、海⾺スライス標本は頻繁に⽤いられてきた。海⾺の層構造のおかげで、海⾺ス
ライス標本を使うことで 光信号を細胞体および樹状突起の特定の膜要素に簡単に割り当てることができる (Witter, 1993)。光計測の⽐較的初期には吸光⾊素 (RH-155, RH482 など) が、しばしばシナプスの薬理学的性質の検証に使われてきた (Ratzlaff and
Grinvald, 1991; Barish et al., 1996; Nakagami et al., 1997; Sekino et al., 1997; Kojima et al.,
1999; Jin et al., 2002)。また 2000 年以降は蛍光⾊素が多く⽤いられるようになった(Tominaga et al., 2000, 2002b, 2013; Mann et al., 2005; Suh et al., 2011; Juliandi et al., 2016;
Tominaga and Tominaga, 2016)。⻑期記録に関しては、 吸光⾊素 (主に Momose-Sato etal., 1999; Mochida et al., 2001; Jin et al., 2002; Chang and Jackson, 2006; Chang et al., 2007;
Wright and Jackson, 2014) および蛍光⾊素 (Tominaga et al., 2000) で試されている。
第 1 章、第 2 章でも紹介したようにいくつかの試験の結果、我々は Di-4-ANNEPS(Fluhler et al., 1985; Loew et al., 1992) の使⽤を推奨している。この⾊素は、⽔溶液よりも脂質に⾮常に溶けやすく、⾊素が膜内により⻑く残ることができる。この特性は、
特に⽣理的溶液を脳スライスに継続的に灌流し、⾊素の「脱染⾊ (wash out) 」を引き起こす in vitro 標本の場合、⻑期の記録を達成するのに必須である。スライス標本の脱染⾊と不均等な染⾊は、⽣理学的活動によるものではない信号の⼤きさの変化を引き起こす可能性がある。蛍光⾊素は、吸光⾊素に⽐べ信号が初期光量で校正でき、これらの問題を避ける上で有利である。また、Di-4-ANEPPS で得られた光信号の時間経過が、吸光⾊素で記録された時間経過と異なることも注⽬に値する (Grinvald et al., 1982
(RH-155) および Momose-Sato et al., 1999

(NK3630／RH482) )。吸光⾊素記録、特にRH-155 はジヒドロカイネート (DHK、グリアグルタミン酸トランスポーターGLT-1 の阻害剤) の適⽤に敏感な光学成分を持っているため、グリア性の信号が含まれると考えられる (Kojima et al., 1999)。Di-4-ANEPPS を使⽤した光信号には、このような成分はみとめられなかった (Tominaga et al., 2002b)。⼀⽅、吸光⾊素はその性質により光毒性が少ない可能性がある。そのため、測定の⽬的と結果に応じて、実験に適した⾊素の51

種類を選択する必要がある。計測システムが重⼤な光毒性を引き起こさないように注
意深く設計できている場合は、グリア性信号およびその他の固有の光学信号の混⼊が少ないため、蛍光⾊素の⽅が優れていると考えられる。

【LTP の空間分布の不均⼀性】

第 3 章に⽰したように LTP の程度には少なくとも 2 つの空間的な違いがあった。1
つ⽬は、SO-SP と SR の違いである。つまり、SO-SP は常に SR よりも⾼い LTP を⽰した。SO-SP 光信号は、細胞体の膜電位イベントを主に反映し (Tominaga et al., 2009)、これは活動電位発⽕特性を反映するため、刺激と反応の関係は, 樹状突起部のシナプス電位を反映する SR での信号よりもより急な勾配を持つ (Tominaga et al., 2000) ことを反映している。
他の空間的な違いは L 軸である。つまり、遠位部位の LTP は近位部位よりも⼤きかった。このような刺激部位からの距離に応じた LTP の増加は、回路活動における介在神経細胞の関与の増加を反映している可能性がある。遠⽅の細胞は、近位の細胞よりも多くの阻害を受けると考えられるためである。この可能性は、今後の研究でさらなる検討が必要である。

【シータバースト刺激とテタヌス刺激 (⾼頻度刺激) 】

海⾺の LTP は、学習と記憶のシナプスモデルであると考えられている (Bliss andGardner-Medwin, 1973; Bliss and Collingridge, 1993)。テタヌス (⾼頻度刺激：HFS) は、
海⾺回路で LTP を誘発するために使⽤された最初の刺激パラダイムである。しかし、永らくこの刺激パターンは⼈⼯的なものであるという議論がある。なぜなら、そのよ
うな活動は⽣体脳内では発⽣しないからである。⼀⽅、 げっ⻭類は、新規物、新規空間を探索しながらシータ活動を⽰すが、場所細胞 (Place cell) はこのシータ振動に伴って形成されることが知られている (O’Keefe and Dostrovsky, 1971; Larson and Munkácsy,2015)。このシータ活動を模倣する刺激パラダイム、すなわちシータバースト刺激
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(TBS) は、CA3-CA1 シナプスで LTP を正常に誘導する (Larson and Lynch, 1986; Larson
et al., 1986)。TBS はさまざまなタイプの LTP を誘発すると考えられている (Larson andMunkácsy, 2015)。
LTP の誘導期中、TBS はより多くの活動電位を誘発するが、HFS は刺激中に活動電位を抑制することを報告した(Tominaga et al., 2002)。両⽅の応答には、GABAA 受容体の活性化を介した GABA 作動系が関与している (Tominaga and Tominaga、2010、2016)。
HFS は、主に⻑時間持続する脱分極性 GABAA 電位 (depolarizing GABAA receptor
potential)を誘導し (Kaila et al., 1997, 2014; Voipio and Kaila, 2000)、コンダクタンスの増加は短絡による活動電位発⽕を抑制する (Tominaga and Tominaga, 2010)。

【今後の光計測法の課題】

遺伝的にコード化された膜電位インジケーター (GEVI) を使⽤すると、細胞タイ
プ固有の発現を通じてこの分野が⼤幅に進歩する可能性がある (Vranesic et al., 1994;
Knöpfel, 2008, 2012; Knöpfel and Song 2019)。これを含めた膜電位の可視化解析の重要性
はますます⼤きくなってきており、今後もさらなる技術⾰新が求められている。脳神経回路全体の挙動を捉える必要がある⼀⽅で、個々の神経細胞活動を把握することも必要である。これまでで確⽴してきた光計測法および解析法を利⽤しつつ、遺伝的にコード化された膜電位インジケーター (GEVI) を使⽤し、細胞タイプ固有の発現を通じて、脳神経回路全体の挙動とともに、個々の神経細胞挙動も同時に計測できるシステムを確⽴し、研究を進めていきたい。

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図表⼀覧

Fig. 1-1. 光強度の関数としての 2 つの異なる感度 (10-2 および 10-3 の変化) とフォトンショットノイズ(dFshot) の電位感受性⾊素によって引き起こされる光検出器での光強度の変化を⽰す概略図。 各イメー
ジングデバイス (フォトダイオードアレイ、MOS ベースのモノリシックアレイ、CCD ベースのカメラ、Cooled CCD) に固有のダークノイズレベルをそれぞれ点線で⽰した。 各デバイスのダイナミックレンジ
は、プロットの上部に⽰してある。 下側にある単位⾯積あたりのエネルギーの光強度のスケールは、光の波⻑が 720 nm のときに有効な光検出器⾯積が 3 × 10−5 mm−2 であると仮定して近似した。 (T.
Tominaga, Y. Tominaga, et al., J Neurosci. Methods 2000)

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Fig. 1-2. ⾼開⼝数の落射蛍光光学系、カメラシステム、セットアップの概略図。変更を加えた 35 mm カ
メラレンズ (f = 50 mm, F / 1.4, Nikon) を対物レンズとして使⽤し、双眼顕微鏡の対物レンズ (f = 55 mm,
×1.0 for Leica MZ-APO, Leica Microsystems) を投影レンズとして使⽤した。システムの最終倍率は 1.5倍。ハロゲン光源 (150 W; MHF-G150LR, Moritex Corp.,) 使⽤。⼊⼒光は励起フィルター (λ = 530 ± 10nm) を通した後、ダイクロイックミラーで反射され対物レンズを通ってスライスに到達。VSD からの蛍
光はダイクロイックミラーを透過して吸収フィルター (λ > 590 nm) を通って CCD センサーに投影される。 (T. Tominaga, Y. Tominaga, et al., J Neurosci. Methods 2000)

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Fig. 1-3. スライス標本からの光信号記録システム。 (A) 現⾏システムの顕微鏡部分の写真。 光学系
は、対物レンズ (x5 NA 0.60)、ダイクロイックフィルター⽤ミラーボックス (580 nm) 、および投影 (チューブ) レンズ (PLAN APO x1.0) で構成。⾼速カメラは、C マウントで投影レンズの上部に取り付けてある。励起光は、光ファイバーを使⽤して投射される。 (B) ミラーボックスと互換性のあるレンズ群。
(C) 記録システムの概略図。イメージングシステムおよび電気⽣理記録システムとも、PC で制御している。現在は光源として、フォトダイオードフィードバック制御システムを備えた LED 照明システムを使⽤。 (Y Tominaga, et al., J Vis Exp., 2019)56

Fig. 1-4. マウス脳スライス作成時の脳組織をマウントするために使⽤する寒天ブロックとブロックを作成するための治具 (テンプレート) 。(A) 脳ブロックを 4％寒天ブロック (B) にのせた時の概略図。
(C、D) 寒天ブロックを作成するための治具。アクリルプレート (厚さ 5 mm) の治具を研究室で作成し、この治具にそって寒天ブロックを作成する。その寒天ブロック上に脳ブロックを置いてスライスを作成することにより、どの実験でも常に同質のスライスが作れるように⼯夫した。 (E) 寒天ブロックを
トリミングして、 (A),(B) の形に成形する。 (Y Tominaga, et al., J Vis Exp., 2019)57

Fig. 1-5. マウス脳からの海⾺スライス標本作成。(A) マウスの脳を取り出し、破線 (a), (b) で切断する。
最後に、線 (c) に沿って切断する。底に対して垂直に切断すること。(B) 脳ブロックを寒天ブロックにマウントする。(C) Rostal(吻) 側が寒天⾯につくように脳ブロックを寒天ブロックにのせ、寒天ブロッ

ク全体をリングピンセットでつかんで、Ventral (腹) 側が下 (グルーにつく) ようにし、脳ブロックがブレード側になるようにセットする。(D) スライサーでスライスしたもの。 余分な組織がついているので、破線で切断する。(E) アクリルホルダー (外径 15 mm、内径 11 mm。直径 13 mm のポリテトラフル
オロエチレン (PTFE) メンブレンフィルター (ポアサイズ 0.45 µm) を貼ったもの) にスライスをのせる。計測しやすいよう、メンブレンフィルターの中央に配置する。メンブレンフィルターは ACSF に浸すと半透明になり、明視野照明でスライスを確認できる。リングは薄く作ってあるため、電気⽣理測定が可能である。スライスはメンブレンフィルターに⾃然に付着するため、⽔没型の記録チャンバーにスライスを固定するための特別な仕組みは必要ない。(Y Tominaga, et al., J Vis Exp., 2019)58

Fig. 1-6. スライスの⽣理機能を維持するためのチャンバー。 (A) システムの全体図。
内部。

(B) チャンバー(C) モイストチャンバーの模式図。 90 mm および 60 mm のペトリ⽫に ACSF を満たし、その上にろ紙を敷く。ろ紙は ACSF で⼗分に湿るので、その上にスライスを置く。ペトリ⽫と ACSF バブリン
グ⽤コンテナは、アクリルプレートで固定する。 O2 (95%) / CO2 (5%) は、バブリングボトルを通して⼗分加湿した後に、チャンバー内に供給する。 (Y Tominaga, et al., J Vis Exp., 2019)59

Fig. 1-7. 計測⽤チャンバーシステム。 (A) チャンバーの側⾯図。アクリル製のチャンバーを、アルミニウム製の温度調節⽤加熱ブロック (⿊) で囲んでいる。ACSF は試料の下を流れた後、接続チャネルを通って試料の上を流れる。スライスをのせたアクリルリングは O リングでチャンバーに密着させるた
め、ACSF は常に⼀定⽅向に流れ、ガスとグルコースの⼗分な供給が可能となる。その後、ACSF はアウ
トレットチューブで吸い出す。

(B) チャンバーシステムの上⾯図。⽮印は、ACSF の流れを表す。

(C) 実験記録システムの写真。 (Y Tominaga, et al., Front. Cell. Neurosci., 2018)60

Fig. 1-8. 光信号のノイズ。 (A) 光信号 (ΔF / F) の⼆乗平均平⽅根 (RMS) ノイズと蛍光強度 (F) の関係。⽩抜き記号は、各光強度に対する画像の RMS ノイズ (記録領域の中央にある 10 × 10 ピクセル領域)を⽰している。⿊塗り記号 (▼,▲,■,●) は、記録領域の中⼼でのベースライン光信号の RMS ノイズである (刺激の 70 msec 前)。各⿊塗り記号は、ベースラインの絶対光強度に対してプロットした。これは、それぞれの部位での組織学的差異によって異なる。⿊塗り記号の回帰直線を⽰した：傾き = -0.59 ±0.02, r = 0.94, n = 60 (n は各ピクセルでの測定値の数)。 (B) 刺激後 11 ms のフレーム画像に対して、最上⾏がオリジナル画像データ、中間⾏は最⼤ 16 × 16 ピクセルにビニングした画像データ、最下⾏はキュー

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ビックソフトウェアフィルターでフィルタリングした画像データである。それぞれに対し、異なる試⾏
回数 (1〜256) の平均化 (加算平均) を⾏った画像データを並べた。右に⾏くにつれて加算平均回数が増えている。 (C) 各トレースは、最左列がオリジナル画像データ、中間列が 16 x 16 ビニング画像デー
タ、最右列がキュービックフィルターでフィルタリングした画像データから記録領域の中⼼ (放射状層)での光信号の時間経過を抽出したものである。下に⾏くにつれて、それぞれ加算平均回数が増加した時のトレースを⽰す。 (D) 加算平均⼿法を⽤いて平均化した試⾏回数に対する各データセットのベースラ
インの RMS ノイズの関係をプロットした。○：オリジナルデータのベースライン RMS ノイズ。●：キュービックフィルター処理したデータの RMS ノイズ。□：ビニングしたデータの RMS ノイズ。直線は回帰直線である。勾配は、オリジナルデータでは-0.51 ± 0.01, r = 0.99、キュービックフィルター処理したデータでは-0.51 ± 0.01, r = 0.99、ビニングしたデータでは-0.48 ± 0.01, r = 0.99 であった。 (T. Tominaga,
Y. Tominaga, et al., J Neurosci. Methods 2000)

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Fig. 1-9. VSD 染⾊したラット海⾺ CA1 領域の蛍光画像 (対物⾯で 2 x 1.3mm) と光信号で捉えた海⾺神経
活動が時間経過。 (A) 光計測システムで得られた蛍光画像を、海⾺の横断⾯の概略図に重ねた。 ⾊付
きのドットは、電極先端の位置を⽰しています。⾚: 刺激電極、 緑: 細胞内電極、 ⻘: 細胞外電極。
(B) シャーファー側路に単発の電気刺激を⼊⼒した時の応答を ΔF/F で蛍光強度の変化を⽰した連続画像。ラット海⾺スライス CA1 各層に沿って応答が広がっていくことがわかる。画像上の数字は、刺激後の時間 (msec) を⽰す。 左下のスケールバーに表⽰した擬似カラーは、信号の振幅の変化を表す。 (T.
Tominaga, Y. Tominaga, et al., J Neurosci. Methods 2000)

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Fig. 1-10. VSD シグナルで捉えた海⾺ CA1 の各部位における時間経過のトレースと細胞内記録のデータ
およびフィールド電位記録のデータとの⽐較。 (A) 細胞内電極 (細線、上部のトレース) および細胞外電極 (細線、下部のトレース) で記録した電気信号と光信号 (上下それぞれの図に重ねた太線トレース)の⽐較。 (B) CA1 の縦軸に沿った 3 つの異なる位置 (i、ii、および iii) 上の画像の点 (a-e) で⽰した部位の代表的なトレース (光信号)。 (T. Tominaga, Y. Tominaga, et al., J Neurosci. Methods 2000)

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Fig. 1-11. 1 回の試⾏におけるマウス海⾺ CA1 領域の代表的な光信号。 (A) フィルターをかけていない
光計測データ。フレームレート 0.1 ms / frame。連続画像は 0.2 ms ごとに表⽰した。 (B) フィルターとして 5 × 5 × 5 のキュービックフィルター (3 次元ガウシアンカーネル) を 2 回適⽤した後の同じデータ。
(C、D) 代表的なピクセルの光信号のトレース。*は錐体細胞層 (SP)。CA1 中央の縦軸 (錐体細胞の細胞体樹状軸) に沿って 2 ピクセル (36 µm) 間隔のトレースを表⽰ ( (A) の矩形部)。 (E) C の上に D のトレースを重ね合わせて⽰す。C,D のトレースはきれいに重なり合うことが確認できる。 (Y Tominaga, et al.,J Vis Exp., 2019)65

Fig. 1-12. マウスとラットの海⾺スライスにおける光信号の⽐較。 マウス (A) およびラット (B) 海⾺ス
ライスにおいて CA3 / CA1 境界付近のシャファー側枝へ電気刺激を与えた時の代表的な連続画像。錐体細胞層 (SP) および放射状層 (SR) での CA1 中央の光信号のトレース (時間変化の様⼦) を、図の右側に⽰す。 (Y Tominaga, et al., J Vis Exp., 2019)

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Fig. 2-1. ラット海⾺スライス標本の CA1 領域におけるシャファー側枝での光信号の振幅分布。 (A) 記
録領域の蛍光画像にラット海⾺スライスの模式図を重ねた。画像システムのサンプル領域は約 1.8 mm ×
1.8 mm。Stim., 刺激電極; SO-A, 上層層-⽩板; SP, 錐体細胞層; SR, 放射状層; SLM, 網状分⼦層; DG: 海
⾺⻭状回 (B) 刺激から開始して、0.2 ms ごとに取得した光信号を⽰す連続画像。１⾏⽬の左から右へ向
かって、時間経過が進み、続いて２⾏⽬の左から右へ、さらに３⾏⽬の左から右へと時間経過が進んでいる。下のトレースは、視野内のピクセルで得られた代表的なトレースである。 (C) 刺激電極から約 90µm 離れた位置で (B) のデータを錐体細胞の軸に沿ってスリット状に切り出し、信号の時間変化を 3D で表した。 (D) パネル C に⽰した a〜g から記録した光信号の代表的なトレース。a〜g の⾊別トレース
は、異なる刺激強度 (20, 30, 40, 50, 80, 120, 200, 250 µA) に対応している。 (E) 各ピクセルでの最⼤応答の投影の擬似カラー画像。 (F) C (太いトレース) および刺激電極からの距離が遠くなった時 (90, 180,
360, 540 µm) の錐体細胞の軸に沿ったスリットでのスライス画像の最⼤応答プロファイル。 (G) 異なる
刺激強度に対する刺激電極から 90 µm での応答プロファイル。⾊は、パネル D に⽰されている応答に対応。 (H) SR (○、細胞体から 200 µm) および SP (●) から記録された刺激と反応の関係 (n = 6,エラーバ
ーは SEM)。 データは、10 kHz フレームレートで取得した (MicamUltima, ブレインビジョン社)。 (YTominaga et al., Neurosci Res., 2009)

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Fig. 2-2. CA1 領域の SR の中央で測定された VSD 蛍光の変化。 (A) 相対蛍光強度 (∆F / F) を測定し、時間に対してプロットした。各点は、1 ms /フレームのレートで 10 秒間隔で取得した 85 フレームの蛍光画像の平均。計測開始時は通常の ACSF ( [K+] O = 2.5 mM) を還流し、その後、⾼濃度 K+ (High-K+) のACSF 溶液 ( [K+] O = 25 mM) を 30 分間還流した。絶対蛍光強度を右軸に⽰す。 a および b の⽮印は、Bの画像に使⽤した代表的なフレームを⽰す。 (B) ⾼濃度 K+溶液による刺激に応答した蛍光変化の分布に対する TTX の影響。 TTX の⾮存在下 (a) および存在下 (b) での⾼濃度 K+溶液に対する応答の振幅を⽰す 3 次元グラフ。 TTX は応答の振幅を減少させた (蛍光が減少した)。特に、⽮印で⽰した SP / SO 層に対応する部位の応答において、 (a) では⻩⾊い擬似カラーで表されるように応答振幅が⼤きかった
が、 (b) ではその応答がほとんど消失した。 (C) TTX の⾮存在下 (High-K+) および存在下 (High-K+ +TTX) での錐体細胞の体細胞樹状軸に沿った蛍光変化のプロファイル。 (D) High-K+ (○) および High-K++ TTX (●) 条件下での蛍光変化データ。さらに High-K+溶液に APV、CNQX、ビククリンを加えた時のTTX ⾮存在下 (△) と TTX 存在下 (▲) のデータも⽰した。データは平均 ± SEM (n = 4–9 スライス)。
(Y Tominaga et al., Neurosci Res., 2009)70

Fig. 2-3.

(A) 海⾺ CA1 錐体細胞の現実的なマルチコンパートメントモデル。各セグメントごとに電気⽣理学的特性が割り当てられている (Migliore, 2003)。グラフは、細胞体から異なる距離に位置する異なるセグメントの膜電位応答を⽰す。膜電位応答は、NEURON シミュレータプログラム(Hines andCarnevale,1997)を使⽤してモデルから計算した。(B) CA1 錐体細胞の細胞体樹状突起軸に沿った膜電位変化の代表的なプロファイルの時間経過。細胞体で活動電位を⽣じさせない弱いシナプス⼊⼒ (a) と細胞体で活動電位を引き起こす⼊⼒ (b) があった時の計算結果の 3D グラフ。これらのプロファイルは、ニューロンモデルの各コンパートメントから測定された膜電位応答を平均することによって計算した。各
3D グラフには、膜電位の時間変化 (左) とピーク膜電位プロファイル (右) を⽰す線形プロットも⽰した。 (Y Tominaga et al., Neurosci Res., 2009)71

Fig. 2-4. シミュレートで得られたシナプス⼊⼒に対する膜電位応答のプロファイル。(A) NEURON を使⽤してシミュレートした、細胞体での膜電位の変化を表すトレース。⿊いトレースは、閾値をわずかに超えたシナプス⼊⼒に対する応答を、⻘いトレースは、閾値をわずかに下回る⼊⼒に対する応答を⽰す。(B) 閾値以下の⼊⼒ (a) および閾値以上の⼊⼒ (b) を受け取ったときの錐体細胞モデルの細胞体樹状突起軸に沿った膜電位プロファイル。(C) ⿊いトレースは、発⽕細胞と⾮発⽕細胞、すなわち、活動電位を発⽕させるニューロン (Bb) と活動電位を発⽕させないニューロン (Ba) を異なる⽐率で含んだ場
合の錐体細胞モデル集合の平均膜電位プロファイルを⽰した (1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 60, 1 : 80, 1 : 100, 1 :200)。⻘⾊のトレースは、活動電位発⽕が 16 ミリ秒の範囲内でランダムに発⽕を⽰す場合の膜電位プロ
ファイルである。(D) 発⽕した細胞と発⽕しなかった細胞の割合を変化させた時の PR ⽐ (SP (L = 0 µm)と SR (L = 250 µm) の膜電位応答の⽐)。発⽕した神経細胞の割合を減らしていくと光計測で得られた膜電位プロファイルに似た形を⽰した。 (Y Tominaga et al., Neurosci Res., 2009)72

Fig. 2-5.

(A) ACSF を還流した海⾺ CA1 スライス標本と、ACSF に PITX を加えた時の標本で記録された

光信号の時間経過。弱い刺激に対する応答 (50 µA) (a) と強い刺激に対する応答 (250 µA) (b) を⽰す。
ACSF 還流下（灰⾊のトレース）と PITX 存在下 (⿊いトレース)。SP : 錐体細胞層 (SP) に対応するピクセルで取得されたトレース。 SR：放射状層 (SR) の中央のピクセルで得られたトレース。 (B) 光計測
データから得られた膜電位プロファイル。刺激部位から 90 µm 離れた位置での細胞体樹状突起軸に沿った信号をプロットした。○: ACSF (コントロール) ; ●: ACSF + 100 µM PITX (C) 刺激強度の関数としての光信号の PR ratio の変化 (n = 6 スライス, error bar = SEM)。○: ACSF (コントロール) ; ●: ACSF + 100 µM
PITX。⽮印 (a および b) は、A のトレースに対応する刺激強度を⽰す。 (D) SR 刺激後 25〜30 ms の膜電位プロファイル。○: ACSF (コントロール) ; ●: ACSF + 100 µM PITX。トレース上の＊ (B, C, D) は、コ
ントロールプロファイルと PITX 存在下での有意差を⽰す (ANOVA、P < 0.05)。 (Y Tominaga et al.,Neurosci Res., 2009)73

Fig. 2-6.

(A、E) SLM 刺激時 (A) および SO 刺激時 (E) の海⾺ CA1 スライス標本における光信号の時間経過。ACSF 還流下（灰⾊のトレース）と PITX 存在下 (⿊いトレース)。SP: SP に対応するピクセルで取得されたトレース。 SR: SR の中央のピクセルで得られたトレース。(B, F) SLM 刺激 (B) および SO
刺激 (F) 時の光計測データから得られた膜電位プロファイル。刺激部位から 90 µm 離れた位置での細胞体樹状突起軸に沿った信号をプロットした。○は ACSF 還流時(コントロール) ; ●は ACSF + 100 µM
PITX。 (C, G) 刺激強度の関数としての SLM 刺激 (C) および SO 刺激 (G) 後の PR ratio の変化 (n = 7
スライス、error bar = SEM)。○: ACSF (コントロール) ; ●: ACSF + 100 µM PITX。 (D, H) SLM 刺激 (D) お
よび SO 刺激 (H) 後 25〜30 ms の膜電位プロファイル。○: ACSF (コントロール) ; ●: ACSF + 100 µM
PITX。これらのプロファイルは、光計測データから取得した。トレースの＊ (B, C, D, F, G, H) は、コントロールと P PITX 存在下での有意差を⽰す (ANOVA、P < 0.05)。 (Y Tominaga et al., Neurosci Res.,
2009)

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Fig. 2-7. 2 つの異なる刺激強度 (250 µA;左列) および (40 µA;中央) での SR 刺激 (A) 、SO 刺激 (B) お
よび SLM 刺激 (C) に応答した錐体細胞からのボルテージクランプ記録。 -80, -75, -70, -65, -60, -55, -50, 45, -40, -35, -30 および-20 mV の異なる保持電位で計測した。⼀番右の列の拡⼤したトレースは、強い刺激 (250 µA;⾚) と弱い刺激 (40 µA;⻘) での脱分極状態 (-30 mV) および静⽌膜電位 (-70 mV) 付近の電流応答を⽰す。刺激した錐体細胞から約 90 µm の錐体細胞をホールセルクランプ条件で計測した。スケールバー横軸はそれぞれ 20 ms, 5ms。(Y Tominaga et al., Neurosci Res., 2009)75

Fig. 3-1. 電圧感受性⾊素 (VSD) 光計測で、シータバースト刺激 (TBS) によって引き起こされる海⾺ス
ライスの⻑期的な回路活動の変化。(A) 光計測システムの模式図。電極の構成 (Stim.: 刺激電極、f.p.:フィールドポテンシャル記録電極)。略語 SO: stratum oriens-alveus, SP: stratum pyramidale, SR: stratum
radiatum, SLM: stratum lacunosum-moleculare (B) TBS 誘発⻑期増強 (LTP) 時のフィールド電極で記録されたフィールド興奮性シナプス後電位 (fEPSP) のトレースと、電極の先端に対応するピクセルでの光信号のトレース。(C) フィールド電極での記録 (fEPSP 勾配 (⿊) ) と電極の先端に対応するピクセルでの光信号 (⻘) をプロットした LTP 後の時間経過のトレース。(D) コントロール、2 時間、4 時間、6 時間後の光計測で得られた画像を表⽰した。フレームレートは 0.1 ms / frame、60 秒ごとに光信号を記録した。
(Y Tominaga, et al., Front. Cell. Neurosci., 2018)76

Fig. 3-2. 正規化による海⾺スライスの CA1 領域の光信号の評価。(A) 海⾺ CA1 領域を CA1 の始点からの距離 (L) と細胞層 (D) 平⾯からの距離 (B) に変換した図。(C) 制御記録および TBS から 2、4、6 時間に⾏われた記録の各時間フレームで D-L プレーンに変換された CA1 エリアに沿って広がる光信号の代表的な伝搬パターン。 (D) D-L 平⾯内の各ピクセルのピーク値。(E) 10 時間の D-L 平⾯のピクセルにおける正規化された光信号の時間経過。 (F) 各時点で D-L 平⾯にマッピングされた LTP の正規化された次数の振幅。(G) 各時点での D = -75 µm (SO, ⻘) および D = 150 µm (SR, ⿊) のラインに沿った光信号のラインプロファイル (コントロール, 2, 4, 6 時間)。(H) 同じラインに沿った LTP 誘発率のラインプロファ
イル。 (I) 各時点での SO (D = -75 µm) および SR (D = 150 µm) の各ラインの代表点 (それぞれ L = 500
および 775 µm) での光信号の時間経過。 (Y Tominaga, et al., Front. Cell. Neurosci., 2018)77

Fig. 3-3. TBS 誘発 LTP の分析。 (A) 3 つの異なる L 位置 [L = 225 (シアン) , 500 (紫) , 775 (⿊) µm] および
4 つの異なる D 位置 (D = −75, 0, 75, 150 µm)。 (B) D-L 座標にマッピングされたピーク値。 (C) D-L 座
標の LTP ⽐。 (D) 各時点での異なる L 位置 [225 (シアン), 500 (紫), 775 (⿊) µm] での C のラインプロ
ファイル。 (E）コントロールの記録と TBS ⼊⼒後、0, 10, 20, および 30 分の L 軸に沿ったラインプロ
ファイル (F) SO (D = −75) 対 SR (D = 150)、PRratio でのラインプロファイルの⽐率の L 軸に沿った時間変化。 N = 4, n = 12, (A、D、E) のバーは SEM を⽰す。 (Y Tominaga, et al., Front. Cell. Neurosci.,
2018)

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Fig. 3-4. ⾼周波刺激 (HFS) 誘発 LTP の分析。 LTP 誘導プロトコルは 100 Hz で 100 パルス (HFS) ⼊⼒
している。

(A) 3 つの異なる L 位置 [L = 225 (シアン), 500 (紫), 775 (⿊) µm] および 4 つの異なる D 位

置の代表点での光信号の正規化したピーク振幅の時間変化 (D = -75, 0, 75, 150 µm)。 (B) D-L 座標にマッピングされたピーク値。 (C) D-L 座標の LTP ⽐。 (D) 各時点での異なる L 位置 [225 (シアン), 500(紫), 775 (⿊) µm] での C のラインプロファイル。 (E) コントロールおよび TBS から 0 分、10 分、20
分、30 分の L 軸に沿ったラインプロファイル。 (F) SO (D = −75µm) 対 SR (D = 150 µm) ⽐。L 軸に沿った PR ratio でのラインプロファイルの⽐率の時間変化。 N = 2, n = 7, (A、D、E) のバーは SEM を⽰す。
(Y Tominaga, et al., Front. Cell. Neurosci., 2018)79

Fig. 3-5. TBS によって引き起こされた刺激反応関係の変化。 (A) 代表点での LTP の誘導を含む時間経過の記録。 (B) 刺激強度を変化させながら、D-L 座標の代表点での光信号の時間経過。刺激強度 [10 (⻘),
25 (緑), 40 (⻩⾊), および 60 V (⾚) ] に対応。 (C) 異なる刺激強度と異なる時間で D-L 座標に投射された光信号のピーク値。 (D) 刺激強度に対応する D-L 座標平⾯の LTP の割合。 (E) 各刺激強度に対する
PRRatio の時間変化。 N = 2, n = 10, (A、B) のバーは SEM を⽰す。 (Y Tominaga, et al., Front. Cell.
Neurosci., 2018)

80

付録資料

【付録 1

Di-4-ANEPPS】

Di-4-ANEPPS の化学構造を以下に⽰す。
分⼦式：C28H36N2O3S、分⼦量：480.66

CAS 番号: Pyridinium, 4-(2-(6-(dibutylamino)-2-naphthalenyl)ethenyl)-1-(3-sulfopropyl)-,hydroxide, inner salt 90134-00-2
AB

付録 Fig. 1 脳海⾺スライス標本における VSD による計測の概念図。A. VSD 構造式。B. VSD のはたらき⽅を⽰す模式図。VSD の蛍光は膜内の電界強度に依存して変化する(Tominaga and Tominaga, ⽣物物理2011)。

81

【付録 2 電気⽣理学的記録】

単極刺激電極およびフィールド電位記録⽤の記録電極としてガラス微⼩電極（開⼝径 5 µm, 電極内液: ACSF, 電気抵抗約 1 MΩ）を⽤いた。細胞内電位記録には、4 M 酢酸カリウムを電極内液とした先端の細いガラス微⼩電極（電気抵抗約 100 MΩ）を使⽤した。これらのガラス電極は主に Flaming–Brown ピペットプーラー（Sutter Instruments,
Novato, CA）を⽤いて作成した。アンプには Axoclamp-2B、200B、700B アンプ（Axon
Instruments, Forster City, CA）または Model 3100(A-M systems, WA)を使⽤した。電気⽣
理学的記録システムは、Igor Pro（WaveMetrics Inc., OR）で開発したマクロプログラムで制御した。プログラムの⼀部は PULSE XOPS（Herrington et al., 1995）を使⽤して開発している。
ほとんどの実験において、シャファー側枝に 0.017 - 0.05 Hz で刺激を与え、常にフィールド電位を記録した。IgroPro 上で開発したマクロプログラムにより、ITC-18（Instrutech, Longmont, CO, USA）または ESTM-8（Brainvision Inc., Tokyo, Japan）を制御して刺激パターンを⼊⼒した。刺激装置は双⽅とも D / A, A / D コンバーターを内蔵している。ITC-18 は、線形アイソレーター (A395, WPI Inc., Sarasota, FL, USA; 0 – 250µA, 正負⽅向に 200 µs) と組み合わせて使⽤した。ESTM-8 は線形アイソレーターを内蔵しており、プログラムで刺激パルス (0 - 60 V を正負⽅向に 300µs) を⽣成するように制御した。
第 2 章におけるホールセルモードパッチクランプ記録⽤電極は P-97 Flaming–Brown
ピペットプーラー（Sutter Instruments, Novato, CA）を使⽤してガラス微⼩電極（3〜5MΩ）を作成した。電極内液は、130 mM Cs-MeSO3, 10 mM Hepes, 4 mM MgCl2, 4 mM
NaATP, 0.4 mM NaGTP, 10 mM Na-Phosphocreatine, 10 mM EGTA, PH 7.2 に調整した。5mM QX-314 を必要に応じて加えている。ホールセル記録は、ローパスフィルターを 3
kHz に設定し、10 kHz でデジタル化した。データはデジタイザー（ITC-18, Instrutech
Inc., NY）でデジタル化し、独⾃に開発した IgorPro ソフトウェア（WaveMetrics Inc.,
OR, USA）でオフラインで分析した。電気刺激は、SO、SR、および SLM に配置したガラス電極で定電流刺激装置（A395、WPI）で加えた。正⽴顕微鏡（BX-51WI、オリン82

パス東京、⽇本）に取り付けた CMOS カメラ（SKDCE-2EX、Sigma Koki Co., Tokyo）
に対して、斜光照明によってコントラスト強調して、神経細胞を視覚化した。ボルテージクランプモードでは、電気刺激の前に常に試験膜電位ステップ（-10 mV）を実施
し、直列抵抗（Rs）が 20 MΩ より低いデータのみ採⽤した。

【付録 3

NEURON シミュレータ】

数値シミュレーションは、Macintosh コンピューター（Mac OSX）で NEURON（ver.
5.7）(Hines and Carnevale, 1997)を使⽤した。モデルとして CA1 錐体細胞の現実的な形
態学的・電気⽣理学的な多区画モデルを採⽤した（Migliore et al., 1999; Migliore,
2003）。このモデルは、ニューロンの軸索、細胞体、樹状突起を表す 202 の区画で構成されている。アクティブコンダクタンス（gNa、gKDR、gKA および gh）の分布と動態の詳細、およびモデルに埋め込まれたコンポーネント、シナプス接続の受動的電気特性については、Neuron Model DB(http://senselab.med.yale.edu/modeldb/ShowModel.asp?model=19696）を参照のこと。各コンパートメントで膜電位応答をシミュレート・分析し、IgorPro ソフトウェア上で本研究⽤に開発したマクロプログラムを使⽤して膜電位プロファイルを計算し、描画した。
シミュレーションにあたって、2 つの異なる膜電位プロファイルをもつ神経細胞モ
デルを⽤意した。どちらの神経細胞モデルもほぼ同じ振幅の EPSP を起こすが、⼀⽅は閾値をわずかに超えて活動電位を発⽣させ、もう⼀⽅は閾値にわずかに到達しないた
め活動電位を発⽣しない。この 2 つの異なる膜電位プロファイルを持つモデルを作成するために、モデルの重みを変更して神経細胞モデルの発⽕の閾値を求めた。それぞれの神経細胞モデル興奮時の時間経過は Fig.2-4A に⽰した。また、そのときの膜電位
プロファイルを Fig.2-4Ba（閾値以下。ウエイト 1.231e-2）, Fig. 2-4Bb（閾値以上。ウエ
イト 1.24e-2）に⽰した。
細胞集団の膜電位プロファイル（Fig. 2-4C）は、細胞体からの距離（L）と興奮した細胞に対する⾮興奮細胞の数の割合 （p）の関数としての膜電位の平均（Vmavg）として以下の式で計算した。
83ここで、Vmepsp（L）と VmAP（L）は、それぞれ Fig.2-4Ba（閾値以下）と Bb（閾値以上）で⽰した膜電位プロファイルに対応する膜電位である。
Fig. 2-4D の PR ⽐は、⽐率（p）の関数として、SP（L = 0 mm）の応答と SR（L =250 µm）の応答の⽐率として計算した。

光信号の PR ⽐は L = 0 µm での光信号の振幅と L = 250 µm での光信号の振幅である。

84

【本論⽂に掲載の図について】

本論⽂の図はそれぞれ図、および付録図の説明に付記した論⽂からの転載であり、Elsevier 社(J. Neuroscience Method, Neuroscience Research)、Frontires.org, Journal of Visual
Experiments, ⽇本⽣物物理学会「⽣物物理」編集室の許可を得ている。

85

謝辞

本研究は、理化学研究所、徳島⽂理⼤学を通して、現在、神経科学研究所教授の冨永貴志の指導の元に⾏ったものです。
今回、博⼠論⽂としてまとめるにあたり、お忙しい中、快く主査をお引き受けくださった⾹川薬学部薬物治療学講座教授の伊藤康⼀先⽣、紹介教員および副査をお引く
受けくださった徳島⽂理⼤学⾹川薬学部分⼦⽣物学講座教授の宮澤宏先⽣、同じく副査をお引き受けくださった⽣命物理化学講座教授の岸本泰司先⽣にも⼼より深く御礼
申し上げます。理化学研究所時代からお世話になっている東北⼤学⼤学院農学研究科
動物⽣殖科学分野教授の種村健太郎先⽣には、遠⽅にも関わらず、快く副査をお引き受けくださり、深く感謝申し上げます。
本研究を進めるにあたり、徳島⽂理⼤学神経科学研究所で研究補助として共に働き、研究にご協⼒いただいた⽵歳⿇紀⼦さん、前⽥直⼦さん（現在、森永製菓株式会
社研究所勤務）、⾕⼝愛さん、１年半研究員として所属されていた Pooja Gusain さん、
また研究室メンバーの皆様にも御礼申し上げます。
本研究は、理化学研究所脳科学総合研究センター脳型デバイス・ブレインウエイ研
究グループ脳創成デバイスチームでテクニカルスタッフとして研究に携わったときに遡ります。光計測法の研究に迎え⼊れてくださり、ご指導くださった、当時のグルー
プリーダー故松本元先⽣、チームリーダー市川道教先⽣（現在、ブレインビジョン株
式会社代表取締役）、研究員

⼭⽥整先⽣（現在、トヨタ⾃動⾞株式会社

センター T-フロンティア部センター統括室

未来創成

第２基盤研究グループ主幹）を始め、共に同じグループ・チームで研究を進め、あるいはサポートしてくださった皆様、またグループを越えて交流し、お世話になった皆様に感謝いたします。
博⼠論⽂着⼿にあたり、⼼を砕いてくださった産業技術総合研究所⼈間情報研究部
⾨

⾼島⼀郎先⽣、明治⼤学理⼯学研究科准教授

梶原利⼀先⽣にも感謝申し上げます。
また、徳島⽂理⼤学の先⽣⽅、動物舎の皆様、事務の皆様にもいつも暖かくサポー
トいただきました。この場を借りて、御礼申し上げます。
86私は筑波⼤学第⼆学群⽣物学類を卒業し、富⼠通株式会社で 8 年間勤務したのちに、⽶国ハワイ州⽴⼤学マノア校情報学科 SEAL 研究室（当時）にリサーチアシスタ
ントとして約２年間所属させていただきました。⼤学・研究室における学究活動や会社での実務において、数多くの先⽣⽅、先輩後輩⽅、友⼈、上司や同僚の皆様、本当にたくさんの⽅々から教えていただき、育てていただきました。ここに感謝申し上げます。
MBL（ウッズホール海洋⽣物学研究所）での光計測研究会への参加を快く迎え⼊れてくださったイエール⼤学教授 Lawrence B. Cohen 先⽣、遺伝的にコード化された膜電位インジケーター（GEVI）の導⼊についてご教授くださった Imperial College London
教授の Thomas Knöpfel 先⽣、新規の Fast lntrinsic Optical Signal (FIOS)を⽤いた脳活動計測法の開発研究でお世話になった MBL Associate Scientist の⾕
究開発法⼈産業技術総合研究所

⽣命⼯学領域

知⼰先⽣（現主任研究員）、⾕

国⽴研

真紀先⽣（現関⻄⼤学 国際共同研究担当）にも⼼より深く御礼申し上げます。
本研究で培ってきた技術をもとに、VSD を使⽤しない無染⾊スライス標本からの新規の光信号計測、『新規の Fast lntrinsic Optical Signal (FIOS)を⽤いた脳活動計測法の開発』研究を開始し、科学研究費補助⾦として 2019 年奨励研究に採択いただきました。
ここに感謝申し上げ、今後、さらに研究を発展させていきたいと考えております。
個別にお名前をあげさせていただいておりませんが、共同研究、学会や会議等、その他いろいろな場⾯で、ご助⾔やご意⾒をくださった先⽣⽅、お世話になった数多くの皆様にも⼼から御礼申し上げます。
論⽂博⼠という⾼いハードルを乗り越えることに怖気付いていた私の背中を押して応援してくれた家族にも感謝します。夫であり、徳島⽂理⼤学神経科学研究所の教授でもある冨永貴志には、研究上の指導やアドバイスをもらうだけでなく、家事分担など、家庭内でのサポートもしてもらいました。娘の冨永結理果も、くじけそうになる
私をいつも応援してくれました。ここに、感謝の意を表し、謝辞とさせていただきま
す。

87

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