本記事は , 文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム事業 秀でた利用成果について紹介するものです .

文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム平成 28 年度秀でた利用成果

神経変性疾患の発症に関わるタンパク質ミスフォールディング慶應義塾大学理工学部 古川 良明，安齋 樹
自然科学研究機構 分子科学研究所 秋山 修志，向山 厚（左から） 慶應義塾大学理工学部

古川 良明，安齋 樹，分子科学研究所

秋山 修志，向山 厚スであるのに対して，ミスフォールディングは天然構造ではない構造への「発散」と考えることができ，ミスフォー

１．はじめにルド構造はほぼ無限にあるといっても過言ではないから

多 く の タ ン パ ク 質 は， 新 生 ポ リ ペ プ チ ド 鎖 と し てである．例えば，精製タンパク質を非生理的な溶液条件

mRNA から翻訳された後に，天然構造と呼ばれる個々（化学的変性剤の添加や溶液 pH の変化）におくことでミにユニークな立体構造を構築することで，その生理機能スフォールドさせ，その構造・物性についての詳細な評を発揮する．タンパク質が天然構造を獲得するまでの価がなされているが，それらが患者の体内で実際に生じ「フォールディング」と呼ばれるプロセスは，生体内におるミスフォールド構造と同一であるのかは定かでない．

けるタンパク質機能の発現制御を理解する上で非常に重つまり，コンフォメーション病の病理にタンパク質ミス要である．一方で，アミノ酸変異や様々な環境変化が引フォールディングが果たす役割を明らかにするためには，き金となって，タンパク質がその天然構造を構築できず我々の体内で進行しうるミスフォールディングの経路をに異常な立体構造を形成することがある．このプロセス見極める必要があると考えられる．

は「ミスフォールディング」と称され，タンパク質の機私 た ち の 研 究 グ ル ー プ で は，Cu/Zn-superoxide

能喪失や新たな毒性獲得などを通じて，アルツハイマーdismutase（SOD1）というタンパク質に着目し，疾患の病やアミロイドーシスといったコンフォメーション病と発症に関わるミスフォールディングについてタンパク質呼ばれる様々な疾患の発症に関わると考えられている

科学的・病理学的な研究を進めている．SOD1 は筋萎縮性[1]．よって，ミスフォールド型タンパク質の構造・物性側索硬化症（ALS）で最初に同定された責任遺伝子で [2]，を明らかにすることができれば，疾患の発症メカニズム150 種類以上の病因性変異が現在までに報告されているの解明，ひいては，治療・予防法開発へと応用的に展開[3]．ALS は重篤な筋萎縮を主症状とする神経変性疾患で，することが可能となるはずである．

脊髄運動ニューロンが選択的に変性・脱落することが知実際，タンパク質フォールディング・ミスフォールディられているものの，その病理については未だ不明な点がングに関する研究は精力的に進められているものの，発多く，予防・治療法は確立していない．モデル動物を利症に関わるミスフォールド構造については，多くの疾患用した ALS 病理の研究は比較的多く [4]，マウスに変異において不明なままであるのが現状であると私たちは考SOD1 タンパク質を発現させることで ALS 様の症状を再えている．なぜなら，タンパク質のフォールディングは現できるのに対して [5]，SOD1 遺伝子をノックアウトし天然構造と言う単一の構造へと「収斂」していくプロセたマウスは ALS 様の症状を呈さないことが報告されていNanotechJapan Bulletin Vol. 10, No. 3, 2017

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る [6]．よって，変異に伴う SOD1 の生理機能低下が ALS究を開始するに至った．なかでも特に，文部科学省ナノを発症させる要因ではなく，神経毒性につながる新たなテクノロジープラットフォーム事業（分子・物質合成プ物性を SOD1 が変異によって獲得すると考えられている．

ラットフォーム）として利用が可能である円二色性分光

特に，ALS の病変部位である脊髄運動ニューロンには変装置（CD），及び，X 線小角散乱装置（SAXS）を通じて（図異 SOD1 が異常に蓄積していることからも [7]，変異によ2），ミスフォールド型 SOD1 の溶液構造を明らかにしたる SOD1 のミスフォールディングが毒性の発揮に関与し（詳細な実験内容・結果については，[11] を参照されたい）．ているのではないかと提案されている．

能を発揮する．通常は S-S 結合の形成に関与しない Cys6/

SOD1 はホモ二量体で，各々のサブユニットに銅・亜鉛

Cys111（橙色）についても示した．

イオンが結合し，分子内ジスルフィド（S-S）結合が形成することで，非常に安定な天然構造へとフォールディングするタンパク質である（図 1）．しかし，病因性変異によって，金属イオンとの親和性や分子内 S-S 結合の安定性が低下し [8][9]，SOD1 の構造はミスフォールドすることが提案されている．特に，私たちの研究グループでは，
ALS のモデルマウスが疾患を発症すると，SOD1 が S-S 結合でクロスリンクされた異常なオリゴマー（S-S オリゴマー）が形成することを初めて見いだしている [10]．そこで，タンパク質分子レベルでの ALS 病理を理解するた
めには，S-S オリゴマーの構造や形成メカニズムを明らかにする必要があると考え，タンパク質構造・物性解析のための研究設備が充実している分子科学研究所と共同研

２．実験結果・考察２．１ 示 差 走 査 熱 量 分 析（DSC） に よ る SOD1 の熱変性解析
In vitro/in vivo のいずれの条件においても，ALS 変異の導入に伴って SOD1 と金属イオンとの親和性が低下することが報告されている [8][12][13]．そこで，ALS 変異の一つである G37R 変異を有した SOD1 を作製し，銅・亜鉛イオンを結合していないアポ型タンパク質の示差走
査熱量分析を行うことで，SOD1 の熱変性について評価し

図 1 SOD1 の X 線結晶構造（PDB ID: 1HLA） SOD1 は，銅イオン（青色），及び，亜鉛イオン（赤色）を結合し，サブユニット内にS-S 結合（黄色）を形成することで機能を発揮する．通常は S-S 結合の形成に関与しない Cys6/Cys111（橙色）についても示した．

図 2 （左）円二色性分光装置（CD），（右）X 線小角散乱装置（SAXS）

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た．その際，熱変性によって S-S 結合によるクロスリンクのピークを示す CD スペクトルに変化した（図 3B 赤）．よっが生じないように，SOD1 の S-S 結合に関与する Cys 残基て，変異型 SOD1 が 37℃付近で形成する I 状態においては，（Cys57/Cys146）以外の 2 つの Cys 残基（Cys6/Cys111）

二次構造がほぼ消失していると考えられるものの，DSCを Ser に置換した pSOD1 を使用して実験を行った（図 1）．

により得られるサーモグラムが示すように，溶液の温度既に報告されているように [14]，アポ型 pSOD1 の融点をさらに上昇させることで，いわゆる変性状態（U 状態）（変性中点，T m）は G37R 変異が導入されることで低下し，への転移を示す吸熱過程が観察される（図 3A）．つまり，I 状態は二次構造を消失した状態ではあるものの，U 状態とは異なることが示唆されるが，37℃で優勢に存在する
I 状態とは，いったいどのような構造をしているのだろうか?

タンパク質の熱安定性が低下することが確認されたものの，サーモグラムをより詳細に検討すると，観察される吸熱ピークが左右対称の形状をしておらず（図 3A），ア
ポ型 pSOD1 の熱変性は天然状態（F 状態）と変性状態（U状態）の単純な二状態転移（F ⇔ U ）では説明できなかった．
代わりに，中間的な状態（I 状態）が熱変性過程において存在すると考えることで実験結果をうまく説明することができた（F ⇔ I ⇔ U ）．特に，生理的温度である 37℃付

２．３ X 線小角散乱（SAXS）による SOD1 のコンフォ
メーション解析

近では，pSOD1 の大部分が F 状態にあると考えられるのそこで，タンパク質の溶液構造に関する情報を提供すに対して，G37R 変異型 pSOD1 では状態転移を示唆するる SAXS を利用し，I 状態のコンフォメーション（タンパ吸熱が既に始まっており（図 3A），I 状態として存在してク質の形状）の検討を行った．具体的には，G37R 変異いることが示唆された．

型 pSOD1 の散乱曲線を 10℃から 60℃まで溶液温度を変化させて測定し，各々の散乱曲線についてギニエ解析を２．２ 円二色性分光（CD）を利用した SOD1 の二次構造解析行うことで，各温度における慣性半径 R g，ならびに，相対分子質量 M r を算出した．その結果，溶液温度が 40℃
以 下 で 得 ら れ る R g は 20.9Å，SOD1 の 天 然 状 態 の 結 晶

DSC 測定により得られた結果をもとにすると，ALS 変構造から計算される値とほぼ同一であった（図 4A）．ま異が導入されたアポ型 SOD1 は，生体内環境（37℃）にた，M r は お よ そ 32,000 と 計 算 さ れ，SOD1（ 分 子 量：おいて I 状態にミスフォールドしていることが考えられ16,000）の天然状態がホモ二量体として存在することとた．そこで，タンパク質の二次構造情報を得ることがで一致した（図 4B）．一方で，溶液温度が 40℃以上になる

きる CD スペクトルを測定し，G37R 変異型 pSOD1 の Iと，R g は増大し，M r は減少することから，G37R 変異型状態の構造について検討した．比較的低い温度（20℃付pSOD1 が U 状態へ熱変性していることが確認できた（図近）では，210nm 付近に負のピークを示す CD スペクト

4A，B）．つまり，37℃における SOD1 の I 状態は，二次ルが得られ，β- シートに富んだ構造の形成が確認された（図 3B 青）．しかし，溶液の温度を上昇させて 37℃付近構造が消失しているものの，天然構造とほぼ同じ R g を有にすると，β- シートに特徴的な 210nm 付近の CD シグナ
ルは消失し，ランダムコイル構造に見られる 200nm の負とが考えられた．実際，37℃で測定した散乱曲線のクラしたコンパクトな構造で，ホモ二量体として存在するこツキープロットにも極大が確認されることから（図 4C），

図 3 アポ型 pSOD1 の熱変性（A）pSOD1（○），及び，G37R 変異型 pSOD1（●）の DSC 測定により得られたサーモグラム．点線はガウス曲線によるフィットを示す．
（B）G37R 変異型 pSOD1 の CD スペクトルの温度変化．10℃から 60℃まで温度を変化させてスペクトル測定を行った．20℃，及び，37℃で得られた CD スペクトルを，それぞれ青色，赤色で示した．

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I 状態にある G37R 変異型 pSOD1 はコンパクトな構造を有していることが示唆された．ており，シャッフルが生じるような求核攻撃を可能にするような位置関係にはない（図 1）．しかし，変異の導入に伴って，二次構造含量が低下した I 状態へと移行するこ

SOD1 の S-S オリゴマー形成メカニズムとで，S-S 結合のシャッフルが分子内・間で可能となり，生理的な温度条件である 37℃において，ALS 変異を有まり，本研究で見いだした I 状態は SOD1 オリゴマー化の２．
４

S-S オリゴマーが形成するのではないかと推察された．つしたアポ型 SOD1 は I 状態として存在し，天然構造とほ前駆体ではないかと考えられた．

ぼ変わらないコンパクトな全体構造を有していたものの，二次構造含量が大きく低下した状態であることが分かった．そこで，全ての Cys 残基を有した本来の SOD1 を用

２．５

ALS 病 理 に お い て 見 ら れ る S-S オ リ ゴ マ ーいて，アポ型の G37R 変異 SOD1 を 37℃に静置したとこ

さらに私たちは，SOD1 の S-S オリゴマー形成が，試験ろ，S-S 結合でクロスリンクされた S-S オリゴマーを容易管内だけでなく生体内環境においても進行し，ALS の発に形成することが分かった（図 4D）．一方で，溶液温度症に関与するのかについても研究を進めている．特に近を 30℃以下にすることで F 状態を優勢にすると，オリゴ年には，試験管内にて作製した S-S オリゴマーを抗原としマー形成が認められなくなった（図 4D）．私たちのグルーてウサギを免疫することで，S-S オリゴマーを特異的に認プでは，SOD1 のミスフォールディングに伴って，S-S 結識する抗体（S-S オリゴマー抗体）を作製・精製すること

合形成に通常は関与しない 2 つの Cys 残基（Cys6/111）に成功した [16]．私たちの S-S オリゴマー抗体は非常にが， 分 子 内 S-S 結 合 を形成する Cys57/146 を求核 攻 撃

認識特異性が高く，SOD1 のフォールド型はもちろんのこし，S-S 結合がシャッフルするメカニズムを提唱してきと，酸や変性剤で変性させた SOD1，及び，不溶性の凝集た [15]．実際，結晶構造に代表されるような F 状態では，体とは反応せず，可溶性の S-S オリゴマーのみを認識する

Cys6/111 は Cys57-Cys146 の S-S 結合から距離的に離れことが分かった．そこで，S-S オリゴマー抗体を用いて，

図 4 SOD1 コンフォメーションの温度変化（A，B）各温度において得られた pSOD1（黒），及び，G37R 変異型 pSOD1（赤）の散乱曲線に対してギニエ解析を施すことで得られる（A）慣性半径 R g，及び，（B）相対的分子質量 M r を示した．（C）各温度における G37R 変異型 pSOD1 の散乱曲線のクラツキープロットを示した．（D）アポ型の G37R 変異 SOD1 を，ゲル上部に示した温度で 16 時間静置した後に，SDSPAGE による解析を行った．

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ALS モデルマウスや ALS 患者における S-S オリゴマーの免疫化学的検出を試みたところ，病変が限定的である小脳や脊髄後角領域では免疫化学的なシグナルが検出され３．結論なかった一方で，主要な病変部位である脊髄運動ニュー本研究において，ALS 変異型の SOD1 は，金属イオン

ロンには S-S オリゴマーの形成が認められた（図 5）．まとの親和性が低下し，高い構造安定性を失うことで，生た，脊髄に検出される S-S オリゴマー量は病期の進行に伴理的環境では I 状態として存在することが示された．さらい増加したことから（図 5），変異 SOD1 のオリゴマー化に，変異型 SOD1 の I 状態は，天然構造にみられるようなが ALS の発症に関与していることが考えられた．

非常にコンパクトなホモ二量体としての形状を維持して

図 5 生体内における S-S オリゴマーの形成と ALS（A）G93A 変異 SOD1 を発現させた ALS のモデルマウスから，腰髄（赤色），頚髄（緑色），脳幹（青色），及び，小脳（灰色）を取り出してホモジナイズし，S-S オリゴマー抗体を用いたサンドウィッチ ELISA によって S-S オリゴマーの検出を行った．各々の組織において，30 日齢でのデータに対する統計的有意性についても示した（**: P <0.01）．
（B）SOD1 遺伝子に C111Y 変異を有する ALS 患者の腰髄（前角領域）切片を S-S オリゴマー抗体で免疫染色したもの．運動ニューロン内に染色が認められ，S-S オリゴマーの形成が示唆される．

図 6 本研究で提案する SOD1 のミスフォールディング経路
アポ型の変異 SOD1 は，生理的温度（37℃）付近では I 状態として存在し，S-S 結合が分子内・間でシャッフルしやすい状況にあると考えられる．S-S 結合がシャッフルすることで S-S オリゴマーが形成し，ALS の発症や病態の進行に寄与していることが推察される．

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いるにもかかわらず，二次構造含量が大幅に低下しており，システイン残基の間で S-S 結合がシャッフルし，S-S

362 (1993) 59-62.
[3] O. Abel, J.F. Powell, P.M. Andersen, A. Al-Chalabi,オリゴマーが容易に形成しうる状態にあることが示唆さ

ALSoD: A user-friendly online bioinformatics tool for

れた（図 6）．また，ALS の病期が進むにつれて，S-S オ

amyotrophic lateral sclerosis genetics, Hum Mutat,リゴマーが病変部位である脊髄運動ニューロンに蓄積し33 (2012) 1345-1351.ていくことから，S-S オリゴマーの形成は ALS 病態に関

[4] B.J. Turner, K. Talbot, Transgenics, toxicity and

連した SOD1 のミスフォールディング経路であることがtherapeutics in rodent models of mutant SOD1-考えられた．現在は，これらの知見をもとにして，変異

mediated familial ALS, Prog Neurobiol, 85 (2008) 94-

SOD1 における F から I への状態転移，ならびに，S-S オ

134.

リゴマーの形成過程をターゲットとすることで，疾患に[5] M.E. Gurney, H. Pu, A.Y. Chiu, M.C. Dal Canto, C.Y.

関連したミスフォールディング経路を抑制できる薬剤のPolchow, D.D. Alexander, J. Caliendo, A. Hentati, Y.W.

開発を進めている [17]．

Kwon, H.X. Deng, et al., Motor neuron degenerationin mice that express a human Cu,Zn superoxide
dismutase mutation, Science, 264 (1994) 17721775.

謝辞[6] A.G. Reaume, J.L. Elliott, E.K. Hoffman, N.W. Kowall,

本研究において中心的な役割を果たした実験手法であR.J. Ferrante, D.F. Siwek, H.M. Wilcox, D.G. Flood, M.F.

る CD，及び，SAXS の測定については，文部科学省ナノBeal, R.H. Brown, Jr., R.W. Scott, W.D. Snider, Motor

テクノロジープラットフォーム事業（分子科学研究所

neurons in Cu/Zn superoxide dismutase-deficient

分子・物質合成プラットフォーム）からの支援を受けて

mice develop normally but exhibit enhanced cell

実施された．また，DSC を用いた熱変性の評価についても，

death after axonal injury, Nat Genet, 13 (1996) 43-

分子科学研究所の共同利用を通じて得られた成果である．

47.

実施機関（分子科学研究所）の担当者である秋山 修志教[7] L.I. Bruijn, M.K. Houseweart, S. Kato, K.L. Anderson,

授，及び，向山 厚助教には，装置の扱い方や測定手法はS.D. Anderson, E. Ohama, A.G. Reaume, R.W. Scott,

もちろんのこと，サンプル調製に関する指導から，具体

D.W. Cleveland, Aggregation and motor neuron的なデータ解析に至るまで，手取り足取りのお世話になっtoxicity of an ALS-linked SOD1 mutant independent

た．特に，SAXS については，単なる装置利用に留まらず，from wild-type SOD1, Science, 281 (1998) 1851-

有効的かつ友好的な共同研究として大いに勉強させて頂1854.

いた．また，モデルマウスのサンプルは，名古屋大学環[8] L.J. Hayward, J.A. Rodriguez, J.W. Kim, A. Tiwari,

境医学研究所の山中 宏二教授，慶應義塾大学薬学部の三J.J. Goto, D.E. Cabelli, J.S. Valentine, R.H. Brown,

澤 日出巳教授に，ALS 患者のサンプルについては，まつJr., Decreased metallation and activity in subsets

もと医療センター神経内科の大原 慎司副院長に提供してof mutant superoxide dismutases associated with頂いた．この場を借りて深謝する次第である．

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（慶應義塾大学理工学部古川 良明）【お問い合わせ】
分子・物質合成プラットフォーム
自然科学研究機構 分子科学研究所☎ 0564-55-7345
E-mailyokoyama@ims.ac.jp

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