エラスチンの機能を再現する人工タンパク質の開発
東海国立大学機構 名古屋大学
大学院工学研究科 エネルギー理工学専攻
教授 鳴瀧 彩絵
2019年1月18日

背景：マテリアルの力学特性が細胞挙動に与える影響
 弾性率が細胞分化と相関

 応力緩和するゲル上で細胞が伸展

Chaudfuri et al., Nature Commun. 6, 6364 (2015)

 基材の変形による免疫細胞の遊走Engler et al., Cell 126, 677 (2006)

ほとんどは二次元培養系で実施
コラーゲンコーティング
合成高分子（弾性率可変）力学特性を制御可能な三次元足場の開発が必要

Pakshir et al., Nature Commun. 10, 1850 (2019)

エラスチン
生体組織に弾性・伸縮性を与える細胞外マトリックスタンパク質
エラスチン

皮膚細胞など

コラーゲン

肺動脈
靭帯
乾燥重量 (%) Uitto, Dermatol Clin. 1986, 4, 433.
ファイバー、シート

StretchRelax

Nakashima and Sueishi, Am. J. Pathol. 1992, 140, 959.

高度に化学架橋され、溶媒に不溶

水溶性エラスチン（市販品）
α-エラスチン： 天然エラスチンを熱シュウ酸処理
κ-エラスチン： 天然エラスチンを熱アルコール中でアルカリ処理

性能劣化 材料としてロット差大 扱いづらいエラスチン類似ポリペプチド
D. W. Urry, A. M. Tamburro らVal

Pro(VPGXG)nGly

エントロピー弾性下限臨界共溶温度 (LCST)
水和水X(例．Val)Gly

天然エラスチンにも見られる性質

Tt
ΔG = ΔH-TΔS

Tt は (VPGXG)n の X 残基を変えることで任意に調整可能

50 nm
Janib et al.,Integr. Biol., 2013, 5, 183.

異方的な構造（ファイバー、シートなど）への自己集合は困難
方向性を持たない疎水性相互作用による自己集合我々の技術：人工タンパク質 GPG
MKL-(VGGVG)5-LWLGSG-[(VPGVG)2VPGFG(VPGVG)2]5 -KL-(VGGVG)5-LWLEHHHHHH
β-sheet 形成配列 (G)

温度応答性 (β-turn形成) 配列 (P)β-sheet 形成配列 (G)着想を得て単純化
天然エラスチンのアミノ酸配列
S
Glycine-rich ドメイン

Proline-rich ドメイン

架橋ドメイン

自己集合性ナノファイバー
AFM像

数珠状構造

ファイバー分散液として得られる・基材へのコーティング
・他素材との混合

1 µm

0.5 µm

新規な細胞足場材

D. H. T. Le, R. Hanamura, D.-H. Pham, M. Kato, D. A. Tirrell, T. Okubo, A. Sugawara-Narutaki, Biomacromolecules 2013, 14, 1028.

GPG の自己集合
MKL-(VGGVG)5-LWLGSG-[(VPGVG)2VPGFG(VPGVG)2]5 -KL-(VGGVG)5-LWLEHHHHHH
β-sheet 形成部位

CD

温度応答性 (β-turn形成) 部位

昇温により・すみやかに β-turn 形成・β-sheet の経時的な増加

β-sheet 形成部位

AFM
1 day7 days
0.5 µm(random coil)

水和水

2 µm

2 µm
β-sheetβ-turn昇温

randomcoil

脱水和

疎水性相互作用分子の組織化粒子の連結

β-turn 有機溶媒 (10～30 vol %) の添加によりファイバー形成時間は 1 時間に短縮 (Biopolymers 2015, 103, 175)

GPG 誘導体
遺伝子工学の手法を用い、大腸菌を宿主として発現
GPG

MKL-(VGGVG)5-LWLGSG-(VPGX*G)25-KL-(VGGVG)5-LWLEHHHHHH

付与した機能GPG2 MKL-(VGGVG)5-LWLGSG-(VPGX*G)25-KL-(VGGVG)5-LWLEHHHHHHKAAK

架橋可能配列温度‟非”応答性(Chem. Lett. 2015)

GPG3 MKL-(VGGVG)5-LWLGSG-(VPGX*G)25-KL-(VGGVG)5-LWLEAYSSGAPPMPPFHHHHHH 抗菌性
銀結合配列(Nanomedicine 2013)

GPG4 MKL-(VGGVG)5-LWLGSG-(VPGX*G)25-KL-(VGGVG)5-LWLEHHHHHHKAAKGRGDS

細胞接着性

GPG5 MKL-(VGGVG)5-LWLGSG-(VPGX*G)25-KL-(VGGVG)5-LWLEHHHHHHKAAKGREDV

内皮細胞接着性

細胞接着配列細胞接着配列GPPG MKL-(VGGVG)5-LWLGSG-(VPGX*G)25-KLGSG-(VPGX*G)25-KL-(VGGVG)5-LWLEHHHHHH(J. Biomed. Mater. Res. 2017)(PCT/JP2020/041001)(Int. J. Mol. Sci. 2019)

X* = V (80%) or F (20%)

 すべての誘導体でナノファイバー形成

機能設計が容易GPG ファイバー膜上での細胞培養 (線維芽細胞 NIH/3T3)
細胞増殖性 (Cell Counting Kit-8)
6x104

基板へのコーティング率 (PBS洗浄後）
GPG

GPG-RGD

Fibronectin

92.1

93.6

29.5 [%]

細胞数/well

GPG-RGD (GPG4)

GPG

GPG-RGD
GPG
Fibronectin
polystyrene

4x104

2x10400

細胞初期接着 (24 h)

100 μm

培養日数23

Fibronectin

GPG-RGD

GPG

1100 μm

100 μm

D. H. T. Le, Y. Tsutsui, *A. Sugawara-Narutaki, *H. Yukawa, Y. Baba, T. Ohtsuki, J. Biomed. Mater. Res. A, 2017, 105, 2475.

人工血管材料としての適正評価①血小板低粘着性（抗血栓性） ②血管内皮細胞増殖性（速やかな内皮化）

低活性（偽足０本）

中活性（偽足１～２本）

高活性

ヒト内皮細胞増殖性
内皮細胞数 [103 cells/cm2]

血小板数 [103 cells/cm2]

ヒト血小板粘着性 (1 h)（偽足３本～）GPG GPG GPG コラー ガラス-RGD -REDV ゲン （細胞培養基材）

内皮細胞接着配列 REDV を付加した GPG は
人工血管素材として適正な生物学的特性(特願 2019-200444, PCT/JP2020/041001)

小口径 (内径 4 mm 以下) 人工血管の作製へナノファイバー分散液／ハイドロゲルの動的粘弾性G'

高アスペクト比 ( > 400) のナノファイバー

G"

TEM像

G'G"0.5 wt%

0.03 wt%

1 μm

0.03 wt% の極低濃度でも G' （貯蔵弾性率）＞ G" （損失弾性率）
ナノファイバーが液中でネットワーク構造を形成
Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 6262.

参考）セルロースナノファイバー分散液の動的粘弾性
0.03 wt% で G‘ （貯蔵弾性率）＜ G“ （損失弾性率）[粘性的]0.03 wt%

Frequency [Hz]Geng et al, Macromolecules 2018, 51, 1498.

ハイドロゲルの形成
0.1

0.2

0.3

0.4 (wt%)
ゲル形成

粘調な液体

力学特性と生物学的特性を独立に制御可能

配列

濃度1) (IPAVG)168(VPGXG)140(IPAVG)168 10 wt%2) (XPAVG)50
15 wt%1) E. L. Chaikof et al., Biomaterials 30, 409 (2009)2) B. D. Olsen et al., Biomacromolecules 16, 3762 (2015)

細胞接着性配列

GPG-RGD
104
貯蔵弾性率 G' [Pa]ペプチド濃度1wt%未満での物理ゲル形成は世界初

GPG

103

GPG
G' ~ C1.53

102
101
1000.01

Int. J. Mol. Sci., 22, 4104 (2021).

GPG-RGD
G' ~ C1.65
0.11ペプチド濃度 [wt%]10ハイドロゲルのチクソトロピー性（自己修復特性）
GPGハイドロゲルの自己修復性
静置

104
ゲル

G', G" [Pa]

ゲル

振 ゾル
とう

ひずみ γ = L / h

ひずみ100%103

L

ひずみ 0.5%

h

102
G'G"

101
1000500 1000 1500
Time [s]2000

Int. J. Mol. Sci., 2021

簡便な細胞三次元培養と回収

細胞の分光学的評価の簡便化液状化

移植等の二次利用

従来技術とその問題点（１） 生物（ウシ、ブタ、ウマ等）から抽出したエラスチン
・不溶性（水にも有機溶媒にも溶けない）のため加工が困難
・可溶化処理（化学処理）により品質低下、ロット差大・生体利用においては、不純物に由来する問題点あり（石灰化等）（２） 人工エラスチン（エラスチン由来ポリペプチド）・弾性繊維を形成しない
・成形加工が困難（化学架橋が必要）
・物理ゲルの形成に１０wt%以上必要

新技術の特徴・従来技術との比較• 本人工エラスチンGPGは、３７℃への加温により、水中でナノファイバーを形成 [沈殿形成なし, 透明なファイバー分散液]• タンパク質濃度1wt%未満で物理ゲルを形成• 物理ゲルの力学特性と生物学的特性を独立に制御可能• 物理ゲルは自己修復性を示し、細胞の包埋と回収が可能• ファイバー形成能を保持したまま機能化が可能• 抗血栓性と内皮細胞接着性を両立できる

想定される用途• 表面改質用コーティング剤• 細胞三次元培養基材• 人工血管用素材

実用化に向けた課題と企業への期待• 大量生産技術の開発• 多様な細胞の三次元培養によるデータ取得（未分化能維持等、細胞品質管理）

本技術に関する知的財産権• 発明の名称• 出願番号• 出願人• 発明者：ポリペプチド：特願2019-200444：名古屋大学：鳴瀧彩絵, 大槻主税, 中村仁,佐藤和秀, 夏目和宜

お問い合わせ先
名古屋大学大学
学術研究・産学官連携推進本部

柴田裕介

ＴＥＬ ０５２－７８８－６０５５e-mail y_shibata＠aip.nagoya-u.ac.jp