プロバイオティクス乳酸菌由来の新規な耐熱性胆汁酸塩加水分解酵素の発見

産業技術総合研究所 生命工学領域
生物プロセス研究部門 生物資源情報基盤研究グループ
研究員 草田 裕之
研究グループ長 玉木 秀幸

2021年9月9日
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本日の発表内容
 ヒト由来プロバイオティクス乳酸菌が高い胆汁酸耐性能を有することを発見
 乳酸菌は一般的に熱に弱いが、本乳酸菌は高い耐熱性があることを発見
 本乳酸菌から胆汁酸耐性に関わる新規酵素Bile salt
hydrolase (BSH) を単離し、その機能を解明
 既知BSHの中で最も高い耐熱性を有することを発見
 既知BSHの中で最も基質特異性が広いことを発見

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本技術分野の背景１

健常者

ーヒトの健康/疾患と腸内フローラー

患者NGS
解析

高速ゲノム解析技術

 両者の腸内フローラは異なる
 患者群に有意に多い細菌群が存在している
 患者群で乳酸菌が有意に減少している3

本技術分野の背景２

ーヒト健康に関わるプロバイオティクス乳酸菌ー

ピロリ菌の抑制
インフルの感染抑制 免疫細胞の活性化
Fujimura et al., J. Clin. Microbiol, 50:3 (2012), Nakamura et al., Sci Rep, 4:1 (2014), Jounai et al., PloS ONE, 7:4 (2012)よりそれぞれ一部改変転載

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本技術分野の背景３

ー胆汁酸耐性とプロバイオティクス乳酸菌ー
プロバイオティクスとは（Fuller, 1989）

腸内フローラのバランス改善により宿主に保健効果を示す生きた微生物 胃酸や胆汁酸に耐性を持ち消化管内で生存可能
 消化管へ付着・定着し自己増殖が可能
 腸内フローラのバランス調整により便性改善や腐敗物質低下などの有効な効果を発揮
 抗菌物質の生産により病原菌の抑制作用
 臨床試験による有効性・安全性

胆汁酸耐性はプロバイオティクス乳酸菌の選抜指標

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本技術分野の背景４

ー胆汁酸の種類と腸内における役割ー 脂質の消化・吸収の促進に寄与
 腸内では、グリシン/タウリンが抱合 界面活性効果による高殺菌性

コレステロール (0.5-1.0g/day)(-0.5g/day)

グリシン抱合型胆汁酸

CA
Foley et al., PLoS Pathog, 15:3 (2019)より一部改変転載

CDCA

一次胆汁酸

タウリン抱合型胆汁酸

LCA
＜ DCA
毒性 二次胆汁酸6

本技術分野の背景５

ー胆汁酸塩加水分解酵素 (Bile Salt Hydrolase, BSH) ーBSH

BSH

グリシン抱合型胆汁酸

タウリン抱合型胆汁酸

BSHが持つプロバイオティック機能①胆汁酸耐性能（腸内生存・定着に重要）②宿主（ヒト）のコレステロール低下効果③腸内寄生虫によるジアルジア症（下痢）の抑制④C. difficile の生育阻害による下痢/腸炎の抑制

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従来技術の問題点
プロバイオティクス乳酸菌
 胆汁酸耐性はプロバイオティクス乳酸菌の重要な選抜基準であるが、既製品では深く調査されていない
 乳酸菌は一般的に熱に弱いため、製品化する際に加工などがしにくい

Bile salt hydrolase (BSH) 酵素

 腸内には多様な胆汁酸異性体が存在するが、既知酵素では一部の基質にのみ活性が調べられている
 既知酵素では、安定的に高い耐熱性を有するBSHは存在しない
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新技術の特徴１

ー新種の乳酸菌である「パラガセリ菌」とは？ー(Lactobacillus paragasseri sp. nov)

(Lactobacillus gasseri )パラガセリ菌の特徴①ガセリ菌群の主要グループ、②ガセリシン生産、③BSHのコピー数が多い

パラガセリ菌は新たなプロバイオティクス乳酸菌候補として期待
Tada et al., Biosci Microbiota Food Health 36:4 (2017)より一部改変転載, Tanizawa et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol 68:11 (2018)9新技術の特徴２

ー高い胆汁酸耐性を有する乳酸菌の発見ー
胆汁酸なし

Lactobacillus paragasseri

胆汁酸あり

本菌はBSH活性あり（halo, 白色沈殿）
最小生育阻止濃度 (%)

6時間胆汁酸処理後の生存率 (%)

GCA

TCA

GDCA

TDCA

GCATCA

GDCA

TDCA>0.75>0.75

0.25>0.75

93.6

97.2

63.977.3

本株はTCA, TDCA, GCAに耐性あり（腸内の平均胆汁酸濃度は0.3%）

Kusada et al., Microbial Biotechnol (under revision) 10

新技術の特徴３-１

ー高い耐熱性を有する乳酸菌の発見ー
食品衛生法に基づく加熱殺菌実験

加熱殺菌後も本菌は生存し、BSH活性も保持している
Kusada et al., in preparation

11新技術の特徴３-２

ープロバイオティクス乳酸菌の耐熱性を発見ー
既知プロバイオティクス乳酸菌との耐熱性の比較

L. paragasseri

L. gasseri

L. helveticus
Kusada et al., in preparation

12新技術の特徴４

ー基質特異性が極めて広い新規BSH酵素の発見ー

BSH酵素で最も基質特異性が広い
Kusada et al., in preparation

13新技術の特徴５

ー新規BSH酵素の高い耐熱性を発見ー

 高温 (50-90℃) の反応条件でも至適条件の>80%の活性 酵素を予め高温処理 (55-85℃・2時間) しても至適条件の>80%の活性Kusada et al., in preparation 14

新技術の特徴６

ーBSHが抗生物質耐性にも寄与することを発見ー
胆汁酸耐性

BSH

胆汁酸（消化液の成分）(Bile salt hydrolase)

両機能性酵素
ペニシリン（抗生物質）

抗生物質耐性PVA(Penicillin acylase)
最小生育阻止濃度 (μg/mL)
Penicillins
Cephems
PENG AMP AMO CEPC CEF CEFD
0.050.10.1>402010

本株はCephem系に耐性あり（乳酸菌ではレア）

Kusada et al., in preparation

15新技術の特徴・従来技術との比較
LapBSH (this study)

LgBSH (Rani et al, 2017)

LjBSHC (Chae et al, 2013)

相同性 (%)-99.39

62.81

基質特異性

GC/TC

GC

GC

分解可能な基質

GCA, GCDCA, GDCA,GUDCA, GLCA, GHDCA,TCA, TCDCA, TDCA,TUDCA, TLCA, THDCA

GCA, GDCA, TCA, TDCA

GCA, GCDCA, GDCA,TCA, TDCA, TCDCA,TUDCA, THDCA

PVA活性Yes

Yes

ND

至適温度

37℃

52℃

70℃

耐熱性

相対活性 87.6% (70℃)
相対活性 82.5% (90℃)

相対活性 約10% (70℃)

相対活性 20%以下 (90℃)

至適pH

6.0

5.5

5.0

BSH阻害剤(>70%阻害)

CuCl2/CuSO4/MnCl2/MnSO4 CuCl2/CuSO4/ZnCl2/ZnSO4

ND
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新技術の特徴・従来技術との比較
 従来の乳酸菌研究で課題であった、高い胆汁酸耐性と高い耐熱性を併せ持つプロバイオティクス乳酸菌を発見した
 従来のBSH研究では存在しなかった、基質特性が広くかつ耐熱性が最も高いBSHを発見した
 BSHや乳酸菌を高温下で処理することで、①反応液の粘度低下②基質の溶解度の向上③コンタミネーションリスクの低下により製品の生産効率が向上することが期待される

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想定される用途
プロバイオティクス乳酸菌

プロバイオティクス食品
プロバイオティクスサプリメント
プロバイオティクス製剤
Bile salt hydrolase (BSH) 酵素

酵素製剤・サプリメント（家畜/ペット飼料）
分子生物学実験のツール（学術研究用）
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実用化に向けた課題 取得したBSH酵素や乳酸菌のin vivoにおける有効性（胆汁酸耐性・耐熱性・腸内定着性など）を確認する必要がある
 実用化に向けて、取得したBSH酵素や乳酸菌の安全性を確保する必要がある 今後、取得したBSH酵素や乳酸菌の更なるプロバイオティクス効果を探索し、付加価値をつけることで既製品との差別化をはかる（例：コレステロール低下作用やジアルジア症予防など）

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企業への期待乳酸菌の安全性評価や有効性評価の技術やノウハウを有する企業、また乳酸菌/酵素を活きたまま腸内に届ける「カプセル技術」を有する企業との共同研究を希望致しますプロバイオティクス関連の食品・サプリメ
ント・製剤分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われます
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本技術に関する知的財産権• 発明の名称：耐熱性胆汁酸塩加水分解酵素および経口組成物• 出願番号 ：特願2020-143314• 出願人：国立研究開発法人産業技術総合研究所、大学共同利用機関法人情報・システム研究機構• 発明者：草田 裕之、玉木 秀幸、有田 正規

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お問い合わせ先
産業技術総合研究所
知的財産部 技術移転室
ＴＥＬ 029－862－6158
ＦＡＸ 029－862－6159
e-mail aist-tlo-ml@aist.go.jp
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