低品質iPS細胞を「検出」し、光で「除去」する技術
産業技術総合研究所 生命工学領域
細胞分子工学研究部門 多細胞システム制御研究グループ
研究員 渡邊 朋子
2021年9月9日
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技術分野の背景 (1): 人工多能性幹細胞 (iPS細胞)
体細胞

iPS細胞
山中４因子
(Oct3/4, Sox2,Klf4, c-Myc)

様々な細胞種に分化する能力（多能性）

自分と同じ細胞を作る能力（自己複製能）iPS細胞は再生医療に用いる細胞源として期待されている

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技術分野の背景 (2): iPS細胞を用いた再生医療

網膜色素上皮細胞（2014年・理研）
加齢黄斑変性

ドーパミン神経前駆細胞（2018年・京都大）
パーキンソン病

角膜上皮細胞（2019年・大阪大）
角膜上皮幹細胞疲弊症

神経幹細胞（2019年・慶応大）
脊髄損傷

血小板（2020年・京都大）
血小板減少症

心筋細胞（2020年・大阪大）
虚血性心筋症

iPS細胞を用いた再生医療の実現に向けて研究が進んでいる

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技術分野の背景 (3): iPS細胞の移植までの流れ
iPS細胞の樹立

iPS細胞の培養

分化誘導

iPS細胞の拡大培養

移植

iPS細胞の品質管理技術の開発が求められている

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従来技術の課題: 品質低下を招く逸脱細胞
・iPS細胞を長期間培養していると扁平でサイズが大きい、多能性を失った「逸脱細胞」 が発生することがある
・逸脱細胞はiPS細胞の品質低下を招くと考えられている

逸脱細胞（課題）逸脱細胞を非破壊検出・除去する技術がなかった5

本日ご紹介する技術

1. 逸脱細胞の非破壊「検出」技術の開発:
培養上清を用いた逸脱細胞の非破壊検出技術(Watanabe et al., Biochem Biophys. Res. Commun, 2020)

2. 逸脱細胞の選択的「除去」技術の開発
iPS細胞集団に混入した逸脱細胞の除去技術(Watanabe et al., Biochem Biophys. Res. Commun, 2021)

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本日ご紹介する技術

1. 逸脱細胞の非破壊「検出」技術の開発:
培養上清を用いた逸脱細胞の非破壊検出技術(Watanabe et al., Biochem Biophys. Res. Commun, 2020)

2. 逸脱細胞の選択的「除去」技術の開発
iPS細胞集団に混入した逸脱細胞の除去技術(Watanabe et al., Biochem Biophys. Res. Commun, 2021)

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新技術の特徴: 逸脱細胞の定量評価技術の開発
1. 逸脱細胞は初期分化マーカー
SSEA-1 (LeX糖鎖) を発現する
逸脱細胞(Thomson et al., Science 1998)

2. 培養上清中のSSEA-1陽性糖タンパク質を同定
逸脱細胞

青：核
緑：SSEA-1

SSEA-1のキャリアタンパク質は同定されていない

SSEA-1陽性
分泌 糖タンパク質

3. サンドイッチELISAの構築
SSEA-1抗体
キャリアタンパク質抗体

逸脱細胞から分泌されるSSEA-1陽性糖タンパク質を測定し、逸脱細胞を検出する技術の開発を目指した

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技術開発(1): SSEA-1抗体陽性タンパク質の探索
細胞の培養上清から糖タンパク質をレクチン濃縮してSSEA-1抗体でブロット2501501007550

逸脱細胞

(kDa)

iPS細胞

Blot:
SSEA-1抗体

LC-MS/ MS解析
The number ofunique peptide
hiPSC Deviated cell
700Protein name

MolecularWeight（×10‒3）

Fibronectin263

Tenascin
Latent-transforming
growth factor betabinding protein 22410519502

Vimentin

5421Hornerin

282

31

Serum albumin

69

81

Dermcidin

1115537

SSEA-1陽性タンパク質候補としてフィブロネクチンが検出

9技術開発(2): SSEA-1抗体陽性タンパク質の同定
IP: フィブロネクチン抗体

(kDa)

iPS細胞

逸脱細胞

Blot: SSEA-1抗体

逸脱細胞

iPS細胞

Blot: フィブロネクチン抗体(kDa)250250150

1501001007575

フィブロネクチン

フィブロネクチンはSSEA-1のキャリアタンパク質である

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技術開発(3): フィブロネクチンの発現解析
iPS細胞

スケールバー：100 μm

逸脱細胞

青：核
赤：フィブロネクチン

フィブロネクチンはiPS細胞には発現せず、逸脱細胞に発現11

技術開発(4): 逸脱細胞の定量的検出法の開発
SSEA-1陽性フィブロネクチンを検出するサンドイッチELISA「FN-SSEA-1 test」を構築
FN-SSEA-1 test

HRP
フィブロネクチン抗体

ビオチン

アビジンコートプレート

逸脱細胞

0.25

SSEA-1抗体
OD450/620 nm

SSEA-1陽性
フィブロネクチン

0.3

y = 8E-05x + 0.0012

0.2

R² = 0.9994

0.15
0.1
0.05
0-0.05

iPS細胞
01000

2000

3000

細胞数(cells/mL)

FN-SSEA-1 testは細胞数依存的に逸脱細胞を検出

12回収/算出細胞数 (cells/mL)

応用例: FN-SSEA-1 testによる逸脱細胞数計測
16000

逸脱細胞数（実測値）
算出逸脱細胞数

12000

検出下限値
100 cells/mL（約 0.1%）8000
4000
025000

12500

6250

播種細胞数 (cells/mL)

0

FN-SSEA-1 testを用いて逸脱細胞の高感度計測が可能

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本日ご紹介する技術

1. 逸脱細胞の非破壊「検出」技術の開発:
培養上清を用いた逸脱細胞の非破壊検出技術(Watanabe et al., Biochem Biophys. Res. Commun, 2020)

2. 逸脱細胞の選択的「除去」技術の開発
iPS細胞集団に混入した逸脱細胞の除去技術(Watanabe et al., Biochem Biophys. Res. Commun, 2021)

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新技術の特徴: 逸脱細胞を除去する技術を開発
IR700標識フィブロネクチン抗体（αFN）の作製
αFN抗体
IR700

逸脱細胞に反応逸脱細胞

近赤外線照射による細胞破壊
近赤外線

H2O

αFN抗体と近赤外光線照射法を用いて逸脱細胞を除去する技術の開発を目指した

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技術開発(1): IR700標識αFNの結合能の検証

無処理

抗体反応 1時間

抗体反応 6時間

赤：IR700-FN抗体

αFN抗体を培養上清に添加して１時間後には逸脱細胞表面に結合し、6時間後も細胞表面に局在

16技術開発(2): αFN/近赤外線処理による細胞破壊

近赤外線照射αFN/近赤外線照射

死細胞(EthD-1)生細胞(Calcein-AM)

IR700-αFN

100 μm

IR700-αFN/近赤外線処理は逸脱細胞の細胞死を誘導

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技術開発(3): IR700-αFNの濃度依存性の検討
IR700-αFNを培養上清に添加して１時間後に近赤外線照射し、24時間後に細胞生存率を定量評価
細胞生存率 (%)

100806040

逸脱細胞
iPS細胞

200012345678910

IR700-αFN (ng/mL)

IR700-αFNにより逸脱細胞を選択的に殺傷可能18応用例: iPS細胞共培養での逸脱細胞除去(1)

死細胞(EthD-1)

生細胞(Calcein-AM)

IR700-αFN
逸脱細胞
iPS細胞

近赤外線照射iPS細胞

αFN/近赤外線照射

iPS細胞

逸脱細胞

100 μmiPS細胞コロニーは維持され、ほぼ全ての逸脱細胞が死滅

19応用例: iPS細胞共培養での逸脱細胞除去(2)緑蛍光染色をした逸脱細胞と未染色のiPS細胞を共培養し、抗体/ 近赤外線照射後に、フローサイトメトリーで除去効率を解析

Normalized To Mode

IR700-αFN
100

近赤外線照射
100

iPS細胞

80

逸脱細胞

60

33.8%

IR700-αFN/近赤外線照射
100

iPS細胞

80

逸脱細胞

6034.2%80

40402020201000101102103104105

100

逸脱細胞

60400

iPS細胞

1.8%

0101102103104105100101102103104105

CMFDA蛍光強度iPS細胞集団に混入した逸脱細胞の選択的な除去が可能

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想定される用途• 再生医療に用いるヒトiPS細胞の品質管理
ヒトiPS細胞に混入した逸脱細胞の検出が可能• 高純度なヒトiPS細胞の作製
逸脱細胞を除き高純度なiPS細胞の調製が可能• 高効率なヒトiPS細胞の分化誘導の実現
高純度iPS細胞から高効率な分化誘導が期待
21実用化に向けた課題• 現段階では201B7細胞株のみでの検証実験→ 今後は他の細胞株での追加検証を検討• 製品化に向けた詳細なプロトコルの作製→ あらゆる実験環境での再現性の実証• 抗体・近赤外線照射の細胞への影響→ 処理の影響を長期培養で検証する必要性
22

企業への期待• 逸脱細胞の検出・除去技術のキット化（ライセンシング契約および共同研究開発可能）• 再生医療に用いるヒトiPS細胞の品質管理への適用性の検証

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本技術に関する知的財産権• 発明の名称：培養液を用いたヒト多能性幹細胞の品質管理技術• 出願番号 ：PCT/JP2021/023128• 出願人：国立研究開発法人産業技術総合研究所• 発明者：渡邊 朋子、舘野 浩章、回渕 修治、原本 悦和

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お問い合わせ先
産業技術総合研究所
知的財産部 技術移転室
ＴＥＬ 029－862－6158
ＦＡＸ 029－862－6159
e-mail aist-tlo-ml@aist.go.jp
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