7.3.3 低線量率γ線連続照射マウスの脾臓組織のリンパ球で発現する遺伝子の解析
Gene Expression Analysis of Splenic Lymphocytes from Mice
Irradiated with Low-Dose-Rate Gamma-Rays
杉原 崇, 田中 公夫, 小木曽 洋一
生物影響研究部

Takashi SUGIHARA, Kimio TANAKA, Yoichi OGHISO
Department of Radiobiology
Abstract
Gene expressions of p21 and CyclinG1 were up-regulated by p53 activation in spleens of C3H

miceirradiated with medium-dose-rate (MDR: 400 mGy/22h/day; 18.2 mGy/h) Cs γ-ray, but gene expressionsof p21 and CyclinG1 were not changed in spleen of mice irradiated with low-dose-rate (LDR: 20137

mGy/22h/day; 0.91 mGy/h) γ-ray. T-lymphocytes were separated by magnetic beads from spleens, and gene
expressions of p21, CyclinG1, Bax and Mdm2 were examined by real-time PCR method after irradiation at
20 mGy/22h/day. Gene expressions of p53 targeted genes, Bax, Mdm2 and CyclinG1, were not increased insplenic T-lymphocytes after LDR-irradiation, while p21 alone was up-regulated. No increase in gene
expression of p21 was confirmed in splenic T-lymphocytes of p53-deficient mice after LDR-irradiation,
indicating that gene expression of p21 in T-lymphocytes is regulated by p53 activation in mice irradiated at
LDR, similar to irradiations at MDR and high-dose-rate (HDR).
1. 目的を示すことが知られている p21 遺伝子と CyclinG1 遺

これまで、高線量率 X 線やγ線照射した細胞やマ伝子であった(Sugihara et al. 2004, 2008）。また、このウスへの影響を調べた研究から、高線量率照射に対照射線維芽細胞において発現量の増加が見られたする応答機構は ATM 経路を介した p53 の活性化に

p21 遺伝子と CyclinG1 遺伝子について、1 日から 40

よって説明されてきた(Canman et al. 1998 )。しかし

日間の中線量率(400 mGy/22 h/day)γ線照射したマながら、低・中線量率照射による放射線応答機構がウスの脾臓から抽出した RNA を用いて調べたとこ

高線量率照射で見られる応答機構と同じかどうかはろ、培養線維芽細胞と同様にこれらの遺伝子発現量よくわかっていない。さらに、低線量率から中線量が増加していることがわかった。また、p53 遺伝子率にかけての放射線連続照射では、使用する線量率欠損マウス（C3H/p53 KO）へ中線量率γ線を連続照によって単位時間あたりの DNA 損傷の程度や培養射する実験では、p21 遺伝子と CyclinG1 遺伝子の発細胞の増殖能も異なるため、p53 の活性化と線量率現量の増加が観察されなかったことから、中線量率や照射時間との関与についてもよくわかっていない。

γ線照射された正常マウスの脾臓での p21 遺伝子と平成 19 年度までに行ったマイクロアレイ実験のCyclinG1 遺伝子の発現量増加は、高線量率γ線照射結果、中線量率γ線照射マウス線維芽細胞株と同様に p53 の活性化を介して制御されていること（NIH/PG13Luc 細胞）で発現量が大きく変化する遺がわかった。しかし、この中線量率よりも 20 倍低い

伝子は、放射線照射によって p53 依存的に発現変化低線量率(20 mGy/22 h/day) γ線照射したマウスの脾臓では p21 遺伝子と CyclinG1 遺伝子の有意な発現射による p21 遺伝子の発現が p53 の関与を明らかに量増加は見られなかった。この理由として、脾臓にするために、10 日間低線量率γ線連続照射（集積線は、元来遺伝子発現量の多い細胞や、放射線感受性量 200ｍGy）した p53 遺伝子欠損型マウス（C3H/p53は低いがもともと多量に遺伝子を発現している細胞KO）脾臓の CD4+CD8- T リンパ球の p21 遺伝子の発が複数種混在しているため、全組織の遺伝子発現量現量変化について調べた。その結果、p53 遺伝子欠を調べたときでは、低線量率γ線照射により生じた損型マウス（C3H/p53 KO）脾臓の CD4+CD8- T リン

わずかな遺伝子発現量の変化が検出できなかった可パ球では p21 遺伝子発現量の上昇が全く見られなか能性がある。そこで、脾臓中に存在するリンパ球はった(図 1)。しかし、p53 野生型マウス（C3H/p53 WT）

放射線感受性が高いため、リンパ球を分離して遺伝に 10 日間の低線量率γ線照射を行うと、CD4+CD8-T

子発現量を測定すれば、低線量率γ線により誘導さリンパ球の p21 遺伝子の発現量は上昇した(Fig.1)。

れるわずかな遺伝子発現の変化を検出できるのでは中線量率γ線照射では見られた CyclinG1 の遺伝ないかと考え、脾臓から分取した T リンパ球画分の子発現量の増加は低線量率γ線を 104 日間連続照射

遺伝子発現量を解析した。

し た p53 野 生 型 マ ウ ス （ C3H/p53 WT ） 脾 臓 のCD4+CD8- T リンパ球では見られなかったことから、

2. 方法

低線量率と中線量率γ線連続照射では p53 による

C3H/HeN 雌雄 SPF マウス（8 週齢）を低線量率（20137

CyclinG1 に対する転写機構が異なっている可能性がmGy/day） Cs-γ線で約 104 日間（集積線量 2080ある。そこで、高線量率放射線照射後 p53 に依存しmGy）連続照射した。照射群と非照射群それぞれ各て遺伝子発現が上昇することが知られている 2 つの５匹ずつのマウスを用いた。また、低線量率γ線をp53 依存的な遺伝子（Bax,10 日間（集積線量 200 mGy）連続照射した p53 遺伝量率γ線により変化するかについて調べた。その結子欠損型 SPF 雌マウス（C3H/p53 KO）と p53 野生果、CyclinG1 遺伝子の結果と同様に、CD4+CD8- T型 SPF 雌マウス（C3H/p53 WT）各 5 匹を用いた。

リンパ球での Bax 遺伝子、Mdm2 遺伝子の発現量は照射終了後 120 分以内にマウスを解剖し、脾臓を摘変わらなかった（Fig.2)。

出した後、死細胞除去キット（ミルティニー社）にMdm2）の発現量が低線10 日間の低線量率γ線照射による p21 遺伝子発現+量の上昇は p53 遺伝子欠損型マウス（C3H/p53 KO）+（ミルティニー社）、あるいは CD8 細胞抽出キット

では見られないことから、低線量率γ線で見られた（ミルティニー社）を用いて、磁気ビーズによる T

p21 遺伝子の発現は p53 に制御されていると考えらリンパ球画分の分取を行った。細胞を Trizol 試薬でれる。しかし、p53 依存的な Bax 遺伝子,溶解後 RNA を抽出し cDNA 化した後、リアルタイ伝子の発現量が低線量率γ線連続照射によって変わム PCR 法により遺伝子発現量を定量的に解析した。

らなかったことから、低線量率γ線連続照射によっ平成 19 年度までに行ったマイクロアレイ実験の結て活性化された p53 は p53 依存的な 4 つの遺伝子

果（平成 17-19 年度低線量放射線のがん遺伝子影響（p21、CyclinG1、Bax, MDM2）のうち p21 遺伝子実験調査報告書）に基づき、p53 依存的に発現するのみの発現量増加を引き起こす可能性がある。

より死細胞の除去を行った後、CD4 細胞抽出キット

MDM2 遺４個の遺伝子（p21, CyclinG1、Bax、Mdm2）につい引用文献て遺伝子発現量を調べた。

Canman, C.E. et al. (1998) Science 281: 1677-1679.

3. 成果の概要

Sugihara, T. et al. (2004) Radiat Res. 162: 296-307.

低線量率γ線を約 104 日間連続照射（集積線量+-2080mGy）した脾臓の CD4 CD8 T リンパ球では p21遺伝子の発現が増加することから、低線量率γ線照Sugihara, T. et al. (2008) J. Radiat. Res. 49: 231-240.

Relative ratio(p21/Gapdh)

3210
p53WT_C p53W_
p53WT_IR p53KO_C p53Ko_IR

p53KO

p53WTFig. 1 Gene expressions of p21 in CD4+CD8- T-lymphocytes of spleens from wild type and p53-deficient

mice irradiated at LDR (20 mGy/22h/day) for 10 days. p53WT_C: Non-irradiated p53-wild typemice, p53WT_IR: LDR-irradiated p53-wild type mice, p53KO_C: Non-irradiated p53-deficient mice,
p53KO_IR: LDR-irradiated p53-deficient mice.

p21

CyclinG12
Relative ratio（CyclinG1/Gapdh)

Relative ratio(p21/Gapdh)

32100CIRC1CIRFemale

CIR

MaleIRFemale

Mdm220Fig. 2C

Relative ratio（Mdm2/Gapdh)

Relative ratio(Bax/Gapdh)

IRMaleFemale

Bax1CIR

Male210CIRFemale

CIR

Male

Gene expressions of p21,CyclinG1, Bax and Mdm2 in CD4+CD8- T-lymphocytes of spleens fromwild type mice irradiated at LDR (20 mGy/22h/day) for 104 days. C: Non-irradiated mice, IR:LDR-irradiated mice.