非肥満型高血糖発症
非ヒト哺乳動物の作製方法
日本大学

医学部医学科 小児科学准教授 長野 伸彦
2021年12月21日

発明の背景と概要＜発明の概要＞日本では総出生数は減少しているが低出生体重児は増加しており、その低出生体重児の将来の健康障害を減らすことが医療的・経済的・社会的に求められている。子宮内で低栄養に曝露された胎児は体重が減少するのみならず、その環境に適合するための体質変化が生じる。発達過程（胎児期や生後早期）と出生後の環境との不適合が、成人期のメタボリック症候群や糖尿病の発症に関与するというDOHaDの概念が現在定着している。しかしながら、このDOHaDのメカニズムに関しては未だ十分に解明されていない。我々は、子宮内虚血操作により低出生体重の産仔マウスが出生し、離乳後普通食で、成獣期に低体重にも関わらず高血糖を発症する動物モデルを初めて開発に成功した（特願2020-116354）。DOHaDを証明する適切なモデルマウスは今まで存在せず、我々の子宮内虚血により発症する低出生体重-高血糖発症マウスモデルは、ヒトの実臨床に近い動物モデルと考えている。この低出生体重-高血糖発症モデルマウスを用いて、成獣期までの体重の変化や成獣期の体組成や血糖の解析を行うことで、子宮内で低栄養に曝露されその環境に適合するための体質変化とその後の糖尿病の発症を基礎実験で解析することが可能となる。

＜発明の特徴＞
・本発明の低出生体重-高血糖発症モデルマウスは、ヒトの実臨床に近い動物モデルである。
・子宮内で低栄養に曝露されその環境に適合するための体質変化とその後の糖尿病の発症（DOHaD仮説）を基礎実験で解析することを可能にした。
・本発明の動物モデルを用いれば、低出生体重児-やせ型糖尿病の病態メカニズムを明らかにできる可能性がある。

DOHaD仮説（倹約表現型の胎児プログラミング）
女性のやせ志向

妊娠末期の母体の低栄養生存のための胎児の適応・プログラミング

乳幼児期における蛋白質の過剰摂取が早期の体重のcatch-up(adiposity rebound)を引き起こす。

富栄養環境

インスリン抵抗性の獲得・脂質異常+胎児発育不全・低出生体重児

インスリン抵抗性・脂質異常の持続

メタボリック症候群：
２型糖尿病・肥満・高血圧・高脂血症

出生後の環境とのミスマッチ(DOHaD)

本アニマルモデルと既報の比較
構成

優位点

適用分野

本モデル

既報①

既報②

既報③

マウス妊娠後期
子宮動脈結紮

ラット妊娠後期
子宮動脈結紮

栄養制限型

遺伝子組み換え型

DOHaDの概念に近い。また実臨床に近く、更に成獣期まで観察を行い、成獣期に高血糖を呈することを証明している。

成獣期での高血 母体低栄養糖は確認されて のモデルでいない。インスリ ある。実臨床
ン抵抗性、β細胞 とはかけ離れている。
機能の評価を行っているのみであり、高血糖モデルではない。

遺伝子の機能解析が可能であるが、実臨床とはかけ離れている。

DOHaD研究
糖尿病研究

DOHaD研究
糖尿病研究

糖尿病研究

DOHaD研究
糖尿病研究想定される用途• 低出生体重-糖尿病発症メカニズムの解明• 低出生体重-糖尿病発症の予防・治療研究（例：栄養学的介入研究、投薬介入研究）

実用化に向けた技術的課題と今後の対応計画
実用化に向けた技術的課題
日本特許出願時点での実験数が少なかったため，さらに実験のn数を増やすべく実験を継続中。

今後の対応計画
栄養学的な介入や成長ホルモンの早期投与を行うことで高血糖や体組成に改善効果があるかを調べている。
さらに肝臓や脂肪の高血糖に関連する遺伝子の発現量解析やメタボローム解析を実施
し、高血糖の発症機序の解明を行っている。
これら実用化のための研究を推進し，原出願から進歩性が出た場合には別特許として出願する計画である。
糖尿病は日本のみならずアジア（中国）および欧米においても患者数は多い。
人口及び患者数のいずれも多いアメリカおよび中国への海外特許出願を希望している。
今後アメリカおよび中国においては、アメリカ小児科学会等の国際シンポジウムなどの機会を利用し実施許諾先となる企業の開拓を進める。
2024年頃までに現地国におけるライセンシー開拓を進め，当該ライセンス先企業において実用化を目指す。

企業への期待• 栄養補助食品作成技術を持つ、企業との共同研究を希望する。
• また、糖尿病発症予防食品や医薬品を開発中の企業、DOHaD分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。

低出生体重児に伴う合併症
長期的な問題成長– 低身長、肥満– メタボリックシンドロームの発症• 成人期の高血圧や糖尿病

発達– 精神運動発達遅延– 神経発達症群• 自閉スペクトラム症• 注意欠如/多動症• 限局性学習症
自作低出生体重で出生し、小児期に2型糖尿病を発症した1例
Kuwabara et al. J Diabetes Investig. 2020, doi: 10.1111/jdi.13246.

【症例】 17歳男児
12歳4か月時（中学1年時）の学校検尿で初めて尿糖陽性を指摘され、他院で随時血糖126 mg/dL、HbA1c (NGSP) 6.9%であったため、当院を紹介受診した。

＜出生歴＞
在胎38週1日、体重2,226g（-1.81SD）、身長46.5cm（-0.83SD） SGA＜家族歴＞
母方の祖母と曾祖母に2型糖尿病＜栄養と発育＞
乳幼児期 母乳主体の混合栄養→偏食なし、食事量中等量
3歳時のKaup指数 15.0
学童期 6歳から肥満傾向
小学校高学年～通塾のため夕方に軽食を摂り、さらに21時以降に高脂質の食事を摂るなど食習慣が乱れがちになった
Kuwabara et al. J Diabetes Investig. 2020

【初診時身体所見】
身長 141.5cm (-1.4SD)、体重 46.1kg、 BMI 23.0
腹囲 81.6cm、腹囲身長比 0.58、肥満度 4.5%
血圧 86/42mmHg
高度な肥満ではない
項部に軽度の黒色表皮腫あり
外表奇形なしTanner 3期、精巣容積 8mL

Kuwabara et al. J Diabetes Investig. 2020

【初診時血液検査所見】＜空腹時血液検査＞
HbA1c (%)
6.7
グリコアルブミン (%) 15.7
T-cho (mg/dL)
154
HDL-cho (mg/dL) 42
LDL-cho (mg/dL) 102
TG (mg/dL)
35

AST (IU/L)
ALT (IU/L)
BUN (mg/dL)
Cr (mg/dL)
UA (mg/dL)

30
44
21.4
0.48
5.2

＜75gOGTT＞
前30分 60分 90分
血糖 (mg/dL)
92
117
173
189
IRI (µU/mL)
4.5
10.9
18.9
21.0
HOMA-IR 1.0、HOMA-β 55.9、△IRI/△PG 0.3

120分
204
17.2

Kuwabara et al. J Diabetes Investig. 2020

【初診時画像検査所見】＜臍レベルの腹部単純CT＞
内臓脂肪面積（VAT） 103.0cm2 ≧ 60cm2
皮下脂肪面積（SAT） 135.6cm2
VAT/SAT比 0.76 ≧ 0.3⇒内臓脂肪蓄積あり＜腹部超音波検査＞
脂肪肝あり

Kuwabara et al. J Diabetes Investig. 2020

【経過】ダバグリフロジンは、小児等を対象とした有効性及び安全性を指標とした臨床試験は実施されていない。

ダパグリフロジン
5mg

2型糖尿病と診断
食事療法(2000kcal/日)・運動療法
BMI
35.0

メトホルミン
500mg

HbA1c

1500mg

12.5
11.5

30.0
25.0

10.5

VAT 95.1 cm2

VAT/SAT比 0.56

9.5

20.0
8.5
15.0

VAT 103.0 cm2
VAT/SAT比 0.76

7.5

10.0
5.0

6.5
｜｜｜

｜

｜

12y6m
13y6m
14y6m
12歳
6か月 13y0m
13歳 13歳6か月 14y0m
14歳 14歳6か月 15y0m
15歳

｜｜｜

｜

5.5

15y6m
16y6m
15歳
6か月 16y0m
16歳 16歳6か月 17y0m
17歳
00Kuwabara et al. J Diabetes Investig. 2020

課題
低出生体重で出生後、富栄養の食環境で、肥満を伴って糖尿病を発症するアニマルモデルは存在している。
しかし、低出生体重児は、通常の食環境で、肥満を伴わずに、糖尿病を発症するリスクが高い。
低出生体重児の糖尿病リスクの研究には、低出生体重で出生後、通常の食環境で、肥満を伴わずに糖尿病を発症するアニマルモデルが有用と考えられるが、そのようなアニマルモデルは存在していない。

このような低出生体重で出生し、非肥満で生活習慣病を発症する病態を解明したい！

動物モデルの開発に成功！
名称： 非肥満型高血糖発症非ヒト哺乳動物の作製方法
出願人 ： 学校法人日本大学
発明者 ： 長野伸彦、森岡一朗、清水翔一、片山大地
出願番号 ： 特願2020-116354
出願日 ： 2020年7月6日

低出生体重-非肥満型高血糖発症マウスモデル
DOHaD仮説の概念妊娠20日ごろ出生
妊娠16.5日のマウス
子宮動脈の血流を15分遮断

高脂肪食

低出生体重の産仔マウス
普通食

肥満型糖尿病非肥満型高血糖＝非肥満型糖尿病モデル
新規発明
特許申請技術方法

離乳
母マウス分析

普通食・高脂肪食に分類

●

●

●

●

●

0週齢

4週齢

5週齢

7週齢

8週齢

虚血群とコントロール群

子宮動脈の血流を15分遮断

尿検査

仔マウスの解析仔マウスの飼育
４週

非
虚血群

離乳

高脂
肪
食
普通食
高脂肪
食
普通食

７週

……………………………………………………………..

妊娠
マ
ウス

………………………………………………………………

虚血群

５週

尿検査

８週
解剖
（血糖値、体組成等の測定）

雌-体重推移（食事変更前）
＊＊

＜1週齢＞

6.71±0.23(ｇ)

雌-体重推移（食事変更前）

Body Weight(g)5.02±0.154035302520151050

＜5週齢＞
非虚血群

虚血群

12345
週齢（weeks)(ｇ)n=1231.54±0.66＊

n=1434.64±0.82

虚血群では低出生体重で出生し、５週齢でも低体重であった。
n=12n=14

mean ±SE、 ＊P<0.05, ＊ ＊ P<0.01 for 虚血群 vs 非虚血群

雌-体重推移（食事変更後）
雌-体重推移（食事変更後）
＜8週齢＞
＊(ｇ)

60

＊＊

52.52±1.60

50Body Weight(g)＊＊42.80±3.18
40.02±0.93
34.96±1.094030201005678
週齢(weeks)

虚血群-普通食群

非虚血-普通食群

虚血-高脂肪食群

非虚血群-高脂肪食群

n=5n=7n=5n=9mean±SE、*P<0.05、**P<0.01

成獣期に普通食で痩せ型を、高脂肪食では肥満を呈した。

血糖値＊＊＊(mｇ/dL)

212.6±24.29＊＊

165.57±12.79＊＊

140.8±12.29

79.33±5.02n=5n=7n=5n=9mean ±SE、**P<0.01

・虚血-普通食群は低出生体重で出生後、成獣期に痩せ型で高血糖を呈する。
・虚血-高脂肪食群は低出生体重で出生後、成獣期に肥満を伴う高血糖を呈する。

体組成計（Impedi VET）
体組成計の原理●BIA法は生体組織の電気抵抗値（生体インピーダンス）を測定することで、体脂肪率などの体組成を推定する方法です。
●生体組織において、脂肪組織はほとんど電気を通しませんが、筋肉などの電解質を多く含む組織は電気を通しやすい性質があります。電気抵抗をはかることで脂肪とそれ以外の組織の割合を推測しています。
ImpediVET測定項目• Body Mass Index (BMI) BMI指数、体重(kg)÷（身長(m)の2乗）• Total Body Water (TBW) 体内総水分量• Intra-Cellular Fluid (ICF)細胞内液量• Extra-Cellular Fluid (ECF)細胞外液量• Fat Free Mass 除脂肪量
• Fat Mass 脂肪量

脂肪重量、除脂肪重量<除脂肪重量><脂肪重量>
＊＊

＊＊

n.s.

n.s.
n.s.

（g）

＊＊

n.s.

（g）

＊＊

＊＊
＊＊

22.3±2.235.4±3.2

16.9±4.5 17.2±2.7 15.7±2.8

29.6±2.818.2±3.1

17.8±3.5

n=5

n=7

n=5

n=9

n=5n=7n=5n=9mean ±SE、*P<0.05、**P<0.01

高脂肪食群は普通食群と比較して、脂肪重量が多かった。
8週齢でコントロール群が有意に除脂肪重量が多かった。

普通食群のみでの解析（体重推移）
＊

＊＊

＊

非虚血群

＊＊

Body weight (ｇ)

虚血群
＊＊＊
＊＊

＊＊＊
＊＊

012345Age（weeks)

678mean±SE、*P<0.05、**P<0.01 ***P<0.001

血糖、IRI、HOMA-R＜血糖＞**

Blood glucose (mg/dl)

250200150
100500Control

Ischemia＜IRI＞*52.52HOMA-R

4IRI (μU/ml）＜HOMA-R＞**

321.5
110.500ControlIschemia

ControlIschemia

mean ±SE、*P<0.05、**P<0.01

脂肪重量、除脂肪重量<脂肪重量><除脂肪重量>n.s.
2018161412108642020

Free fat mass (g)Fat mass (g)＊2515105Control

Ischemia

0ControlIschemiamean ±SE、*P<0.05

8週齢でコントロール群が虚血群と比較し、有意に除脂肪重量が多かった。

低出生体重-非肥満型高血糖発症マウスモデルの開発
出生体重(g)

虚血n=12
コントロールn=141.51.8

栄養

成獣期体重 血糖値(g)(mg/dl)

普通食
n=735.0189

高脂肪食
n=552.5213

普通食n=940.076

高脂肪食
n=542.8141

子宮内虚血操作を行うと出生体重は小さく出生する。その後、普通食で飼育すると成獣期の体重は小さいが、高血糖を呈する。

まとめ• 子宮内虚血による低出生体重-高血糖発症モデル
マウスは、ヒトの実臨床に近い動物モデルである。
• 子宮内で低栄養に曝露されその環境に適合するための体質変化とその後の糖尿病の発症（DOHaD仮説）を基礎実験で解析することを可能にした。
• 本発明の動物モデルを用いれば、低出生体重児非肥満型糖尿病の病態メカニズムを明らかにできる可能性がある。

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日本大学産官学連携知財センター
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