－新技術紹介－
●エクソソームへの(*)およびサポリンの共内包化は癌細胞に対する細胞毒性を増強するCo-encapsulation of EGF and saporin in exosomes enhances cytotoxicity against cancer cells─────────────────────────────────────────────────────

小林 菜穂子、吉田 徹彦Nahoko Kobayashi, Tetsuhiko Yoshida
Keywords : exosome, cancer cells, saporin, EGF (epidermal growth factor)
１ 緒言

される５ 。それ故、(*)内包化リポソームが細胞内に取り込

脂質小胞のエクソソーム（約〜QP）は、生体を構成まれた後、リポソームから(*)を放出し、エキソサイトーシするほとんどの細胞から分泌され、周辺細胞によって取り込スによって細胞から分泌された(*)が細胞膜上の(*)5を活性まれる。エクソソームにはPLUR51$や生理活性タンパク質な化すると考えられる。我々は、エクソソームに内包化されたど細胞機能を制御する分子が内包されており、細胞間コミュ(*)が細胞内へ取り込まれた後エキソサイトーシスによってニケーションにおいて重要な役割を持つ。一方、エクソソー細胞外へ放出され、その後リサイクルされた(*)は(*)5の活

ムの細胞内取り込みにおいて、受容体を介したクラスタリン性化を導くことでマクロピノサイトーシス経路を促進し、そ依存的エンドサイトーシス、およびアクチン細胞骨格依存的れによって細胞によるエクソソーム取り込みが増強されるとに細胞外の栄養素を取り込むマクロピノサイトーシスの関与仮説を立て、検証した。

が報告されているが、詳細な機序に関していまだに解明されまず、エクソソームの細胞内取り込みをトレースするために、*)3（蛍光タンパク質）を融合した&'タンパク質を膜てない。
我々は、先の研究において、マクロピノサイトーシス誘導上に有するエクソソームを安定発現する+H/D細胞（ヒト子宮受容体(*)5（HSLGHUPDOJURZWKIDFWRUUHFHSWRU）をそのリ頚癌）を作製し、*)3融合&'発現エクソソーム（&'*)3

ガンドである(*)（HSLGHUPDOJURZWKIDFWRU）の投与によりH[RVRPHV）を回収した。その後、エレクトロポレーション法

活性化させることで、癌細胞によるエクソソームの取り込みを用いて(*)を&'*)3H[RVRPHVに内包化し、$細胞に対効率が増強されることを見出している。また、マクロピノサする(*)内包化エクソソームの細胞内取り込みを評価した。

イトーシス誘起を利用して、抗癌活性を有するサポリンを内また、同様の方法を用いて、クラスリン介在性のエンドサー包させたエクソソームにより効果的に癌細胞死を誘導するこトーシスを利用し)H（Ⅲ）の細胞内取り込みを誘導すること１で知られるトランスフェリンを&'*)3H[RVRPHVに内包化とに成功している 。
本稿においては、マクロピノサイトーシス誘導受容体を活性化させる(*)を、抗癌活性タンパク質サポリンと共にエクソソーム内に共内包化させて抗癌活性を評価した。その結し、トランスフェリン内包化エクソソームの$細胞に対する細胞内取り込みを比較評価した。
果、驚くべきことに、エクソソームへの(*)とサポリンとの２．１ EGF内包化はエクソソームの細胞内取り込み効力を共内包化は、癌細胞である$細胞（ヒト上皮様細胞癌由向上する来）に対する細胞毒性を顕著に増強することを見出した。

図 １ は 、 (*) を 内 包 化 し た &'*)3 発 現 エ ク ソ ソ ー ム（(*)&'*)3H[RVRPHV）またはトランスフェリンを内包

２ 結果化した&'*)3発現エクソソーム（7UDQVIHUULQ&'*)3

組織や細胞の修復にとって特定の場所への(*)送達は、H[RVRPHV）各々 μg/mLを℃で時間処理した$細胞

様々な細胞機能を制御および作動させる細胞増殖因子療法との共焦点レーザー顕微鏡画像を示している。細胞内に内在す２３。0DUTXH]らは、損傷したる (*)&'*)3H[RVRPHV お よ び 7UDQVIHUULQ&'*)3

ラット歯槽骨の骨治癒過程において(*)を内包化したリポ

H[RVRPHVの最大蛍光強度を、内包化していない&'*)3

して非常に重要な技術であるソームを与えることで損傷からのより迅速な回復がもたらされたことから、(*)送達にリポソームを利用することができると報告した ４ 。(*)はエンドサイトーシスを介して細胞内へ取り込まれた後、エキソサイトーシスによってリサイクル東亞合成株式会社 先端科学研究所
Institute for Advanced Sciences, Toagosei Co., Ltd.

東亞合成グループ研究年報 2 TREND
75(1'2022第25号
第号
東亞合成グループ研究年報

aCD63-GFP-exosomes

Mergeb
1200

EGF

800
600
4002000
EGF
Transferrin

Transferrin

812

1000

CD63-GFP-exosomes

Relative cellular uptake ofControl

188
100-+-+Encapsulation in exosomes
図１ エクソソームの EGF 内包化はエクソソームの細胞内取り込みを増強（D）(*) またはトランスフェリンを内包化した &'*)3エクソソーム（ μJP/）を ℃で  時間処理した $ 細胞の共焦点顕微鏡画像。緑：&'(*)エクソソーム、青：+RHFKVW による核染色、スケール
バーμP。
（E）&'*)3エクソソーム（内包化なし）に対する (*) 内包化 &'*)3エクソソーム、トラン
スフェリン内包化&'*)3エクソソーム、および &'*)3エクソソームの細胞内取り込み。
（D）と同様の条件下で培養し、フローサイトメーターを用いて細胞内取り込み量の評価を行なった。データは３回の実験結果の平均値（±6'）を示す。 S。
H[RVRPHV（コントロール）と比較観察した（図図 １ D ）。その(*)内包化の技術を応用し、エクソソームを介して抗癌活結果、(*)&'*)3H[RVRPHVおよび7UDQVIHUULQ&'*)3

性タンパク質サポリンの細胞内送達を行い、癌細胞に与える

H[RVRPHVはコントロールに比べて優位に細胞内へ取り込まれ影響を解析した。その結果を図図２に示している。(*)存在下ており、(*)&'*)3H[RVRPHVは細胞内において特に高いまたは非存在下でエレクトロポレーションを行い、サポリン蛍光シグナルが見られた。更に、フローサイトメーターを用

お よ び (*) を 共 内 包 す る エ ク ソ ソ ー ム （ VDSRULQ(*)

いて各エクソソームの細胞内取り込み量を評価したところ、H[RVRPHV ）、 お よ び サ ポ リ ン の み 内 包 す る エ ク ソ ソ ー ム(*)&'*)3H[RVRPHVで処理した細胞はコントロールに対VDSRULQH[RVRPHV ） を 作 製 し た 。 図 ２ D は 、 VDSRULQ

して約８倍の細胞内取り込み量であることが示された。一方

H[RVRPHまたはVDSRULQ(*)H[RVRPHV（、４、 μg/m/）

で、トランスフェリン内包化はエクソソームの細胞内取り込を )%6含有培地に添加し℃で時間処理した$細胞みを僅かに増加させた（図図１E ）。以上の結果により、(*)内の顕微鏡画像を示している。驚くべきことに、VDSRULQ(*)

包化がエクソソームの細胞内取り込みを増強することが明ら

H[RVRPHVは、低濃度（JP/）で有意なレベルの細胞死をかとなった。(*)内包化はエクソームの細胞内取り込みに著もたらした（図図１D）。一方、VDSRULQH[RVRPHVはμg/m/しく高い影響を与えることから、このシンプルな技術はターおよびμg/m/において、$細胞の形態学変化を誘導するゲットとする細胞によるエクソソーム取り込みを活性化することなく、高濃度（ μg/m/）において$細胞の細胞増ために大変有効であることが示唆された。

殖を抑制した（図図１D ）。また、同様の培養条件で:67アッセイを行い、細胞生存率を評価した。その結果、VDSRULQ

２．２ エクソソームへの EGFとサポリンの 共内包化は 、サ(*)H[RVRPHVは、低濃度（μg/m/）において$細胞のポリンの細胞毒性を増強する生存率を抑制したことから、(*)およびサポリンの共内包化

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3 TREND

0.4 μg/mL

a4 μg/mL

20 μg/mL

Saporinencapsulated
exosomes

Saporin-EGFencapsulated
exosomes

140
Cell viability (% control)b120

Saporin-exosomes

1008060

****

$$$$
###
****

40
200####***

Saporin-EGF-exosomes
05

1015

2025Concentration (μg/mL)
図２ サポリン-EGF 内包化エクソソームの細胞毒性の効果（D）サポリン内包化、又はサポリン(*) 内包化エクソソーム（、４、 μJP/）を  )%6 含有培地に添加し、℃で  時間処理した $ 細胞の顕微鏡画像。
（E）:67 アッセイによる細胞生存率の評価。サポリン内包化
エクソソーム（青）、サポリン(*) 内包化エクソソーム（赤）（μJP/）。
（D）と同様の条件下で培養し、データは４回の実験結果の平均値（±6'）を示す。 S  S   対サポリン内包化エクソソーム。
S 対 μJP/ サポリン内包化エクソソーム、 SS 対 μJPO サポリン(*)

内包化エクソソーム。
は、内包化したサポリンの細胞毒性を効果的に増強すること

養には、熱非働化ウシ胎児血清（)HWDOERYLQHVHUXPが示された（図図２E ）。以上の結果は、図図１で示した(*)内包)%6；*LEFR/LIH7HFKQRORJLHV、*UDQG,VODQG1<86$）

化がエクソソームの細胞内取り込みを促進するという知見を含有minimum essential mediumα（αMEM; Gibco、/LIH

サポートするものである。また、このシンプルな技術は、標7HFKQRORJLHV）を、$細胞の培養には、)%6含有的細胞内へ生体機能分子などの治療用分子を送達するために、

PLQLPXPHVVHQWLDOPHGLXP（0(0*LEFR、/LIH

非常に有効な方法であると考えられる。

7HFKQRORJLHV）を用いた。各々の細胞は、PPディッ
シュ上で℃、５&2環境下で培養した。

３ 実験方法３．１ 細胞培養

３．２ 緑色蛍光タンパク質（Green fluorescent protein,

ヒト子宮頚癌由来+H/D細胞は理化学研究所バイオリソース研究センター（7VXNXED、,EDUDNL）、ヒト上皮様細胞癌由来

GFP）融合CD63を安定発現するHeLa細胞の作製
7HWUDVSDQLQ&'は膜貫通タンパク質の一つであり、エク$細胞は$PHULFD7\SH&XOWXUH&ROOHFWLRQ（$7&&、

ソソーム膜のマーカータンパク質として知られている。エク0DQDVVDV、9$、86$）から入手した。培地は、+H/D細胞の培

ソソームの局在をトレースすることを目的に、&'*)3を有東亞合成グループ研究年報 4 TREND75(1'2022第25号第号
東亞合成グループ研究年報
するエクソソーム（&'*)3H[RVRPHV）を得るため、*)3融（μ/）上で混合し、1(3$7\SH,,（1(3$JHQHV、合&'タンパク質を安定発現する+H/D細胞を作製した。+H/D

7RN\R）を用いてエレクトロポレーション（１FPエレクトロ

細胞（× FHOOV）を穴プレート（,ZDNL、$*&、ポレーションキュベット、室温、3RULQJSXOVHWZLFH

7RN\R）に播種し、１日培養した。その後、)%6含有

SXOVH（５秒間）、WUDQIHUSXOVHILYHSXOVH 9秒αMEM培地（μ/）にて、リポフェクタミン/7;試薬間 ）を行い、エクソソームにサポリン（VDSRULQIURP（μ/）および3/86試薬（１μ/,QYLWURJHQ/LIH

6DSRQDULDRIILFLQDOLVVHHGV、6LJQD$OGULFK）を導入し

7HFKQRORJLHV）を用いて、&'*)3プラスミド（S&7&'

た。内包されなかったタンパク質は、$PLFRQ8OWUD遠心フィ*)3、S&09、&\WR7UDFHU、6\VWHP%LRVFLHFHV、0RXQWDLQ

ルターによる遠心および洗浄（.GHYLFH、0HUFN

9LHZ、&$、86$；QJ）をトランスフェクションした。細

0LOOLSRUHμ/3%6、×J、４℃、分間、３胞は、ピューロマイシン（３μg/m//.7/DERUDWRULHV、回）をすることで除去した。サポリンおよびヒト(*)を内包

6W3DXO、01、86$）処理により&'*)3を安定発現する化する際には、エレクトロポレーションの前にサポリンおよ+H/D細胞株を選抜した。

び&'*)3H[RVRPHVへ(*)（μg）を添加した。

３．３ 共焦点レーザー顕微鏡

３．６ 細胞生存率（WST-1アッセイ）

細胞（× FHOOV、２P/）をPPガラスベース

> LRGRSKHQ\O  QLWURSKHQ\O +

ディッシュ（,ZDNL）へ播種し、℃および５&2環境下でWHWUD]ROLR@EHQ]HQHGLVXOIRQDWH（:67）アッセイ６時間培養した。細胞が底面へ接着した後増殖培地で洗浄を用いて細胞生存率を評価した。細胞（１×FHOOV、（１P/、３回）し、ヒト(*)（6LJPD$OGULFKμ/）を穴プレート上で℃および５&2環境下でμ/ZHOO）の存在下または非存在下においてエクソソー

時間培養した後、エクソソーム試料（μ/）で処理した。

ム試料で処理した。細胞は、+RHFKVW（,QYLWURJHQ

その後、各穴に:67試薬（μ/）を添加し、℃で分

５μg/m/）を℃で分処理し、洗浄した。細胞を新鮮な間インキュベートし、QP（$）およびQP（$）に増殖培地にて洗浄（１P/、３回）し、細胞を固定化するこおける吸光度を測定し、$の測定値から$の測定値を差しとなく9共焦点レーザー顕微鏡（2O\PSXV、7RN\R）を用引いて生存細胞数を算出した。

いて×対物レンズにて観察した。

４ おわりに３．４ フローサイトメトリー

我々の方法は、エクソソーム膜を人工的に改変することな細胞（×FHOOV、P/）を穴プレート（,ZDNL）

く、(*)を共内包化させたエクソソームを用いて、細胞内へへ播種し、℃および５&2環境下で時間培養した。細

治療用分子を効率よく送達することを可能にした。エクソ胞が底面へ接着した後、増殖培地で洗浄（１P/、３回）

ソーム膜タンパク質および脂質の共有結合修飾（例えば、化し、エクソソーム試料で処理した。その後、3%6で洗浄学リンカーとの結合など）はそれらの生物学的機能に影響を（μ/、３回）し、トリプシン（J/）与える可能性がある。そのためエクソソームへの(*)内包化

HWK\OHQHGLDPLQHWHWUDDFHWLFDFLG（('7$PPRO/

技術は、エクソソーム膜環境を維持するためにも有益な方法

1DFDODL7HVTXHμ/ZHOO）で℃、分間処理し、と考える。(*)とサポリンのエクソソームへの共内包化は、3%6（μL）を加えて細胞を回収し、USP$細胞に対する細胞毒性の顕著な増強を示した。エクソ（×J）、４℃で３分間遠心した。上清を取り除き、細胞ソームに生体機能分子などの治療用分子と共に(*)を共内包を3%6（μ/）で洗浄した後、USP（×J）、化させる本方法は、エクソソームの積極的な癌細胞取り込み

４℃で３分間遠心した。この洗浄作業を再度繰り返した後、経路を利用した薬物送達応用など、疾病診断や治療技術開発

細胞を3%6（μ/）に懸濁し、*XDYD(DV\&\WH（0HUFN

への貢献が期待される。

0LOOLSRUH、%LOOHULFD0$、86$）フローサイトメーター（QPODVHUH[FLWDWLRQ、QPHPLVVLRQILOWHU）を

５ 謝辞

用いて、)RUZDUGVFDWWHUおよび6LGHVFDWWHUを基に生存細本研究は、大阪府立大学大学院理学研究科中瀬生彦教授、胞（FHOOVVDPSOH）を検出し、解析した。

武庫川女子大学薬学部中瀬朋夏教授との共同研究である。ここに感謝の意を表します。

３．５ エクソソームへのタンパク質内包化&'*)3H[RVRPHV（μg）とサポリン（μg）を3%6

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5 TREND

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