栃木農試研報No．47：37−46（1998）
Bull

T㏄higi

Agr．Exp．stn

No．47：37−46（1998）

RAPD法を用いた白紋羽病菌系統判別の試み
生井潔・須永哲央・木嶋利男

摘要：白紋羽病は果樹類を中心に多くの植物に病原性を示す難防除病害である．本病は病原学的，遺伝学的解析が遅れているため，防除を難しくしている．そこで本病菌を解析するためRAPD法の可能性について検討した．

1．本菌におけるpolymerase
amplifiedpolymorphic

chain

reaction（PCR）に供試可能な簡易DNA抽出法を確立し，random

DNA（RAPD）法のPCR条件を明らかにした．

2．25菌株を供試し，18種類のプライマーを用いて138個のRAPDマーカーを得た．

3．ナシの同一発病樹から分離した4菌株は全てのマーカーで同じパターンを示したため，同一菌株と思われたが，リンゴの同一発病樹から分離した5菌株は4個のマーカーが異なる2グループに分類された.

4．得られたRAPDマーカーを用いてクラスター解析を行い系統樹を作成したところ，ナシから分離した印一3が他の菌株と遺伝的距離が離れていた．また，各菌株間の遺伝的距離と分離宿主及び分離場所との関連性は認められなかった．そして，同一圃場内の別々の発病樹から分離した3菌株は，比較的遺伝的距離が離れていた．

キーワード：白紋羽病菌，PCR，RAPD，クラスター解析

Classificationof

KiyoshiSummary：The

hard
At

to

white

controL

first，the

DNA

Then

l38RAPD

pear

tree

The

differencesamong

Im−3andof

each

diseased

Key

root

rot

Since

there

extraction

markers

indicated

tree

in

and
the

the

the

words：Roselhnia

Rosellinia

and

it

studies，so

RAPD

analysis

pathologicalmethodof

R．necatrix

and

using

l8primers

among25strainstheisolatedfield

bygenetical

condition

of

of

for

RAPD

tree

were

makers．Also

there

was

plants

or

a

very

examined．
established．

ofanalysis。No

relationship

the

the

isolated

placesfound．Then3isolates

the

same

in2groups．

genetical

cluster

separatedofdiffered

by

was

was

R．necatrix．4isolates
apple

the4RAPD

isanalysis

same

in

the

PCR

of

dendrogram

were

and

trees

pattem，but5isolates

distance

genetical

distanceofdifferent

eachcomparatively．

necatrix，PCR，RAPD，duster＊：現栃木県農務部普及教育課

variousfew

inAnalysis

KIJIMA

been

RAPD

of

RAPD

SuNAGA，Toshio

have

the2groups

same

NAMAI，Tetsuo

bydiseaseidentical

strains

necatrix

importantdetected

betweenotherstrainisRosellinia

analysis（1998．6．30受理）
47

栃木県農業試験場研究報告第47号

な重要形質について明らかにしていくことが必要であり，

1

緒

言

より有効な防除法を確立するためには不可欠と思われる．

n6corrix（不完全世代名：

今後様々な解析を行うにあたり，DNAレベルでの解

xlによって引き起こされる土壌病

明が必要と考えられるため，まず，簡易で応用範囲の広害で，ブドウ，ナシ，リンゴを初めとした多くの果樹や

いRAPD法を用いて収集した白紋羽病菌の解析を行い，樹木を中心として広い寄生性を示し43科83種の植物で報得られたRAPDマーカーによって系統樹を作成すること

告がある3〉．栃木県内では，ナシやブドウで本病の発で若干の知見が得られたので報告する．

白紋羽病はRos81／in
D8η庸o助oron8coro

生が認められ，特にブドウの早期加温ハウス栽培で問題

なお，今回我々が分離し実験に供試した菌株も，現在となっている．最初に認められる地上部での顕著な病徴のところ子のう殻の形成をみていない．そのため，菅・は新梢の生育が悪くなることであるが，この時点では既奈須田の白紋羽病菌選択分離培地上でBavendamm氏反に根部の病徴は進んでおり，根に菌糸束が絡みつき（写応によるBrown真1），その後多くの場合は枯死に至る．防除法につい（写真2）を形成したものを白紋羽病菌とした4）．また，ては，フルアジナムSCの土壌灌注処理による高い防除本稿の一部は平成10年度日本植物病理学会大会で報告し効果が認められるが11・i2），根を堀上げ，罹病組織を除た．

去してから処理していることから，県内の栽培体系等をhaloが認められ，洋ナシ型のこぶ状菌糸皿

考慮すると現実的な防除法ではないと考えられる．その材料及び方法ため，枯死した樹を改植することで対応しているのが現1．供試菌株状であるが，改植した樹も3年程度で発病する場合が多供試した白紋羽病菌株は25菌株で，その分離源と分離いことから，簡易で確実な防除対策の確立が望まれてい場所は第1表に示した．ただし，栃木6〜10の5菌株及びる．一方で，特に問題となっている栽培体系が樹に負担

栃木11〜14の4菌株はそれぞれ同一発病樹から分離したをかけやすいことや，同じ栽培体系でも圃場によって発菌株である．また，栃木1〜3は同一圃場の別の発病樹か病程度に差が認められること等から，耕種的な防除によら分離した．

る可能性も示唆される．

2．菌の培養及びDNAの抽出

このように本病は有効な防除対策が確立されていない

供試した白紋羽病菌はポテトデキストロース寒天

難防除病害であるが，それに反して病原菌についての解（PDA）斜面培地で保存した．DNA抽出に供試する菌析は進んでおらず，特に遺伝学的，病原学的に解明され

糸体は，PDA斜面培地から移植し，直径90mmのシャーていない点が多い．白紋羽病菌は菌糸塊を形成して侵入レに分注したポテトデキストロース液体（PDB）培地を座となり，そこから発達する菌糸が組織の細胞縫合部を用いて25℃で静置培養した．培地表面が菌糸体のマット裂開するか直接コルク層を貫通して侵入することからで覆われた後収穫し，純水で洗浄して水分をペーパータ

14），本菌の強力なセルラーゼ活性が2）組織への侵入にオルできる限り除いてから，Lee

関係すると考えられる．また，サイトカラシンE（CE）を産生することが知られており，感染したリンゴ及びナシの根からCEが検出されているが，菌の産生するCEとand

第1表供試菌株
菌株名

分離植物

印一3

ナシ

病原性との関連性については解明されるに至っていない

R−24

クリ

6）．またR．n8cα

岡山3

アスパラガス

rixは子のう菌類に分類され，子のうTaylorの方法8）を分離場所
千葉農試より分譲〃
岡山農試より分譲

岡山1，2，4，6〜10ブドウ〃

殻や分生胞子を形成するが1・7・14〉，人工培地上では子

栃木1〜5

〃

のう殻が形成されず，フスマ培養等で人工接種を行い，栃木6〜10リンゴ

栃木11〜14ナシ，

栃木県岩舟町
栃木県矢板市
栃木県宇都宮市

敷きわら等のマルチを行うことで形成されるため1〉，
現状での遺伝学的な解析は難しい．そこで，培地上での子のう殻形成条件を解明し，交配型や病原性等の遺伝的

48

計

25菌株

注．栃木1〜3は同 一圃場内の異なる発病樹から分離

栃木6〜IO及び11〜14はそれぞれ同一発病樹から分離

RAPD法を用いた白紋羽病菌系統判別の試み

用いてDNAを抽出した．つまり，液体窒素中で菌糸体10000×g，室温で15分間遠心した後，上清を新しいチューを粉砕し，1．5ml遠心チューブ円錐部分の1／2程度を満ブに移し，10μ1の3M酢酸ナトリウム，O．54容量のイソ

たし（50〜100mg程度），400μ1の溶解緩衝液（50mM

プロパノールを加えて転倒混和し，DNAを析出させる．

Tris−HCl

その後10000×g，室温で2分間遠心して上清を捨て，70

pH7．2，5QmM

EDTA，3％SDS，1％2一メルカ

プトエタノール）を加え，ボルテックスミキサーで良く％エタノールでリンスした後，DNAの沈殿を乾燥し，混合した後65℃で1時間加温する．次にフェノール・ク

100μ1のTE−RNase溶液（10mM

ロロホルム溶液（TE飽和フェノール：クロロホルム：

RNase

イソアミルアルコール＝25：24：1）を加え転倒混和し，てRNase処理したものをDNA試料とした（第1図）．

Tris−HCl，0．1mM

EDTA，

A20μg／ml）に溶解させ，37℃で30分間加温し

液体窒素中で粉砕する

0000

72℃・3分5分↓

72℃・5分
上清

第2図

P

C

R条件

3M酢酸ナトリウム10μ1、

イソフ『ロハノール0．54vo1を加え，軽く転倒混和

10000Xg，2分
第2表

PCR反応溶液組成
容量
1．0μ1

成分

沈殿

70％エタノールでリンス

10000Xg，1分

templateDNA

lO＼PCRヒ）uffer＊
clNTP mb⊂ter（各2．5mM）

2．5μ1

1＼

2．0μ1

0．2nlNlprimer（7．8μM）
Taq DNA polymerase（5U／μ1）l。6μ10．5μNI

O．2μ玉

1LJ

±PW，

．。。鳩申．漸、．．。。、

25μ1

計

乾燥

↓

終濃度
0．5〜2ng程度

注．＊の組成は100mMTris−HCl（pH8．3），

500mMKC1，15mM

MgC12

TE−RNase100μ1に溶解し，37℃30分

第1図
第3表

糸状菌DNAの抽出方法

供試プライマーとアニーリング温度

49

栃木県農業試験場研究報告47号

3．RAPD解析

4）1）

得られたRAPDマーカーにより解析ソフト「Systat」

DNA試料の濃度推定

DNA試料を1μ1とり，Sambrooketalの方法13）によ系統樹の作成を用いてクラスター解析を行い，系統樹を作成した．

りTris−borate−EDTA（TBE）を用いた0．7％アガロース

皿

ゲルで電気泳動し，臭化エチジウム（EtBr）染色した後，結果及び考察

紫外線照射下で写真撮影した．それにより，0．1μg／レー

1．DNA抽出条件の検討

ンの量を泳動したDNAサイズマーカー（λ／Hind皿digest）

白紋羽病菌のDNA抽出に，簡易な抽出法であるLee
andと比較しDNA濃度を推定した．

Taylorの方法8）が適用可能かどうか検討した．でき

2）供試プライマー

る限り水分を除去した生の菌糸体50〜100mg程度を供試フ。ライマーはニッポンジーンの12merのオリゴヌクレ

し，得られたDNAの沈殿は100μ1のTEに溶解させた．

オチドAO2〜AO8，A22，A24，A29，A30，A41，A44のそのうちの1μ1を電気泳動に供試したところ，20Kb以上

13種類及びOperon

Technologiesの10merのオリゴヌクレの大きさのDNAが5〜20ng／μ1程度の濃度で得られていオチドOPA−01，0PA−02，0PA−06，0PA−09，0PA−13，

ると推定された（第3図）．したがって，本法により500

OPD−01〜OPDO3の8種類，計21種類を供試した．

ng〜2μ9のDNAが抽出できることが明らかとなった．

3）

PCR条件及びRAPD解析

またこのDNA試料を10倍希釈して，25μ1のPCRの系に1

PCR反応溶液の組成は矢野の方法16）に従ったが，糸μ1供試することを考えると，1000回のPCRに供試でき状菌はゲノムサイズが小さいことから，鋳型DNAにつることになる．しかしLeeandTaylorによると，得られいてはWhiteらの方法15）を参考にし，抽出したDNA試

たDNAを100〜500μ1のTEに溶解し0．1〜10μg／μ1にな

料を10倍希釈した後1μ1を鋳型DNAとして供試した（第るように調製していることから8），我々の少なくとも52表）．Taq

倍以上の収量を得ていることになるため，更に収量を上DNA

Polymeraseは宝酒造，PCR装置はMJ

RESEARCHのPTC−100−96VのHot

Bonnet付きを使用し，げられる可能性がある．

第2図の条件及び第3表のアニーリング温度でPCRを行っ

2．PCR条件の検討

た．その後TBE−L5％アガロースゲル電気泳動してEtBr

PCRに供試する鋳型DNAは來雑物が多い場合には反染色して，紫外線照射下で写真撮影し，その写真からバ応が阻害されるため，DNAが増幅されない．また，RAPD

ンドのサイズを推定してRAPDマーカーとした．

法は反応条件を変えることで結果が異なってしまうこと

M

1

つ

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

23130

9416
6557
4361

2322
2027

第3図

DNA抽出の結果

レーンM：マーカー（λ／Hlnd皿digest）0．1μg
レーン1〜14：栃木1〜14各レーン1μ1

50

13

14

RAPD法を用いた白紋羽病菌系統判別の試みから，得られたDNA試料をPCRに供試して条件検討をであった（第4図）．しかし，その他のプライマーにつ行い，RAPD解析を試みた．

いてはバンドが検出されたため，本PCR条件及びDNA

PCR反応溶液は鋳型DNA量を減少した以外は植物で抽出法は白紋羽病菌においても適用できることが明らか行われている一般的な組成とし，アニーリングの温度にとなった．また今までに本抽出法は，Thraustotheca，

ついてはプライマーのmelting

Dictyuchus，Apodachlya，Aqualinderella，Pythiumdに適

temperature（Tm）を考慮

しlo），ニッポンジーンのプライマーはTmの5℃下，用し，PCRに供試可能であったことから8），多くの糸Operon状菌DNAの抽出に適用できるものと思われる．一方，TechnologiesのプライマーはTmのL5℃下に設定した．その結果，プライマーAO2及びOPA−01を用いたバンドが検出できなかったりスメアーであったプライマー

PCRではバンドが全く現れず，プライマーAO3はスメアー

については，アニーリングの温度を変えることで対応でなパターンを示したため，RAPDマーカーの検索は困難

きると予想されるため，今後検討する必要がある．

（bp）

1353
1078

872
603

第4図

プライマーAO3を用いたPCRの結果

レーンM：マーカー（φX174／Hae皿digest），レーン1：印一3
レーン2：R−24，レーン3〜6：岡山1〜4，レーン7〜11：岡山6〜10

M

l

9

3

4

5

6
RAPDマーカー
（bp）

（bp）

1353

約1600

1078

約1300

872

約750

603

約630
約520

310

ク約350

③約1200

第5図

プライマーAO8によるPCRの結果⑥約550

レーンM：マーカー（φX174／Hae皿digest）

レーン1〜6：栃木9〜1451

栃木県農業試験場研究報告47号

3．RAPD解析

から分離した栃木6〜10のうち，A41をプライマーに用第5，6図のようにバンドのサイズを推定し，多型が認いたPCRの結果では，栃木6，9，10と栃木7，8との間でめられた18種類のプライマーでRAPDマーカーを決定し異なったパターンが認められた（第7図）．栃木6，9，IOていったところ，138個のマーカーが得られた（第4表）．

は約700bpのRAPDマーカー①を有するが，栃木7，8にナシの同一発病個体から分離した栃木ll〜14の4菌株ははマーカー①は存在せず，若干サイズの小さい約670bp

全てのRAPDマーカーで同じ結果となり，同一菌株であのマーカー②を持つ．また，栃木6，9，10は約580bpのると考えられた．しかし，同じくリンゴの同一発病個体

マーカー③を有するのに対し，栃木7，8は若干小さい約

つ﹈

M

1

3

5

4

6

8

7

（bp）

1353
1078

RAPDマーカー
（bp）

872
①約700

603

③約600

310

②約670

第6図

プライマーOPD−02によるPCRの結果

レーンM：マーカー（φX174／Hae皿d．igest）

レーン1〜3：栃木9〜11，レーン4：栃木13，レーン5：栃木14
レーン6：印一3，レーン7：R−24，レーン8：岡山3

第4表得られたRAPDマーカー
AO4
AO5

AO6

AO7

．へ08

A22
．A24

A29
A30
A41
、へ44

0P、ヘー020PA−060PA−090P、ヘー130PD−OlOPD−020PD−03

計

52

マーカー数

77453
9221
21
01
842・8
14
115941
1

供試プライマー

3

M

l

つ

3

4

5

6

（bp）

1353

BAPDマーカー
（bp）

1078

872

①約700

603

（3）約580310

第7図

プライマーAO4によるPCRの結果

レーンM：マーカー（φXl74／Hae皿digest）

レーン1：栃木2，レーン2〜6：栃木6〜10

②約670
④約550

RAPD法を用いた白紋羽病菌系統判別の試み

550bpのマーカー④と差異が認められるが，マーカー④

鎖したマーカーを得られる可能性もある．いずれにしてはバンドが太いことから約550bpと約580bpの2つのバンも，多くの菌株の収集及び子のう殻形成条件の解明が重ドが重なっている可能性も考えられる．これらの結果及要な課題である。

び他のマーカーについては全く同じパターンを示すとい

4．白紋羽病菌系統分類の試み

うことから，これらの菌株はもとは同じ系統であったが，得られたRAPDマーカー138個を用いて解析ソフト

何らかの変異によって異なるパターンを示すようになっ「Systat」によりクラスター解析を行い，系統樹を作成たと考えられる．また，栃木6，9，10の3菌株と栃木7，したところ，第8図の結果となった．まず，印一3が1菌株

8の2菌株に分類されることから，培養中に変異が起こっだけ遺伝的に離れた位置にあることが目立つ．この結果たとは考え難く，感染した植物体上で変異したと思われはリボソームRNA遺伝子（rDNA）in麓mah㎜scribed

spac−

る．その他に何らかの形質等に関連する情報を得るため

ers（ITS）領域のPCR−RFLP（Restriction

Length

解析を行ったが，供試した菌株数が少ないことや分離源

Polymorphism）結果と一致する．つまり，印一3，R−24，が限られていること及びブドウから分離した菌以外の菌

岡山卜4及び岡山5〜IOのll菌株を供試してrDNA

株数が少ないこと等もあり，明らかな傾向は認められな域のPCR−RFLPを行った結果，PCR産物は印一3のみ約620

かった．今後はこれらの菌株を接種試験に供試し，病原bpと推定され，他菌株の約600bpと比較し若干大きく，性等の形質を明らかにしたうえでのRAPD解析や，様々

Haem，Hhaな植物からの分離菌株を得て解析を行うことが必要と思より印一3菌株のみ他菌株と異なるパターンを示した（未われる．また，子のう殻形成条件が明らかとなり，菌株発表）．また，他菌株と比較して培地上での生育が遅い間の交配が可能になれば，病原性等の何らかの形質に連こと，兼松らによると国内各地から分離された白紋羽病

I，Hinfl，MspFragment

ITS領

Iの4種の制限酵素切断に

1．0

遺伝的距離
岡山0
1

岡山8

岡山6

岡山1

・岡山3

縁

類

・岡山9係
関

■岡山4

伝

的

−岡山7

る

よ

に

一

栃木−o遺

・栃木9

栃木6

栃木8

マ

﹁

D

︐栃木7カ

■岡山2

栃木4却

ら

得

図

Ω︾

R
−R別 た
れ

■栃木5

・栃木3

4

1

・栃木ト第
1

︐栃木1

3

−栃木2

−印

0

53

栃木県農業試験場研究報告47号

菌48菌株のrDNA

ITS領域のPCR−RFLPパーターンは，

引用文献

分離宿主に関わらず全て同じであったこと5）から印一3

1．荒木隆男（1995）作物病原菌研究技法の基礎一分離・は非常にユニークな菌株と思われる．

全体的には岡山の分離菌株は遺伝的に比較的まとまりを見せる，栃木の分離菌株はばらつきがあるが，分離場

培養・接種一：309−31L

日本植物防疫協会

2．荒木隆男・鈴木直治（1959）白紋羽病菌及び紫紋羽病所による明確な分類には至らない．また分離宿主につい菌のセルローズ分解酵素．日植病報24：19ては，ブドウが栃木1〜5及び岡山1，2，4，6〜10の13菌

3．家城洋之（1995）植物病理学事典：629．養賢堂

株であるが，間にリンゴの栃木7〜10，ナシの栃木ll〜14，

4．菅正道・奈須田和彦（1975）植物残渣ろ過法による白アスパラガスの岡山3が入っており，分離宿主による分紋羽病菌の土壌検診法．福井農試報12：61−91

類も難しい．このことは，宿主範囲の広さを支持する結5．兼松聡子・小林雅文・大津善弘（1998）白紋羽病菌の果と考えられる．しかし，R々∫zoc

rDNA

oniαsolonのように多犯性の病原菌であるが，菌糸融合群と宿主範囲が密接

ITS領域の解析及び検出用プライマーの設計．

日植病報64：342に関連している菌もあり，白紋羽病菌についても検討す6．Kanematu，S．，Hayashi，T．and

る必要がある．また，RAPDマーカーの不足や前述した

ofRosellinia

necatrix

ように菌株の不足も考えられるため，更に解析を進めるE

Production

and

ためのデータを蓄積することが重要と思われる．

Soc．Jpn．63：425−431

栃木1〜3は同一圃場内の異なるブドウの発病樹から分離した菌株であるが，比較的遺伝的距離が離れた結果とIts

Mutants

Kudo，A．（1997）Isolation
with

Impaired

Cyt㏄halasln

Pathogenicity。Ann．Phytopatho1．

7．北島博（1989）果樹病害各論：544−55L養賢堂
8．Lee，S．B．and

Taylor，J．W．（1991）菌糸体および単なった．松本は白紋羽病のhypovirusによる防除の可能性

一胞子からのDNA分離．PCR実験マニュアル：245−

について指摘しており9），そのためには圃場内のvegetative

249．HBJ出版局

compatibility

9．松本直幸（1997）病原菌のpopulationgroup（VCG）の多様性が低いことが重要

biologyを利用しとなるため，遺伝的距離とVCGの関係について興味がた生物防除の可能性．バイオコントロール研究会レポー

持たれる．

ト．5：70−74．日本植物病理学会

本報告ではRAPD法を用いて系統間の多型を検出し，10．中山広樹（1996）細胞工学別冊目で見る実験ノート

解析を加えてきたが，本法による白紋羽病菌の解析は十シリーズバイオ実験イラストレイテット・本当に増分な可能性を持つと考えられる．しかし，現状では菌株

えるPCR：25−27．秀潤社

が少ないことや収集した菌の形質についての調査が済ん

11．那須英男・金谷元・伊達寛敬（1996）ブドウ白紋羽病

でいないこと等から，より多くのデータを収集して多方に対するフルアジナムSC，プロクロラズ乳剤の土壌面からの解析を進めることが必要と思わπる．

灌注処理の効果．日植病報62：318
12．那須英男・金谷元・伊達寛敬（1997）ブドウ白紋羽病

謝辞

に対するフルアジナムSCの土壌灌注処理の効果．日

本研究を行うにあたり，岡山県農業試験場の那須英夫

植病報63：222氏，金谷元氏，千葉県農業試験場の梅本清作氏には貴重13．Sambrook，J．，Fristsch，E．F．and

な菌株を分譲していただいた．栃木県市貝農業改良普及

Molecular

センターの山崎周一郎氏には白紋羽病について有益な示

Edition．Cold

唆をいただいた．当場企画経営部の天谷正行氏にはPCRについてご指導いただいた．栃木県栃木農業改良普及セ
ンターの鈴木裕章氏には菌株を収集するにあたりご協力いただいた。ここに記して心から感謝の意を表する．

54

Cloning，ASpringLabor飢ory
HarborManiatis（1989）

Manual，Second

Laborato理Pressl4．鈴井孝仁（1984）新版土壌病害の手引：141−144．日

本植物防疫協会
15．軸ite，T．J．，Bnms，T．，L㏄，S．and

Taylor，J．

（1991）

系統発生研究のための真菌リボソームRNA遺伝子の

RAPD

tl tp

rL

/‑ir ; . PCR

/ t

V

7 *7)

t..‑

C ]

f.

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275 281ljW} f L4 ld

HB J dli H Z; 5

16.

: PI :(1995)RAPDi Ii ; Q"

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124‑128.

IJ H]H :1+ f' *::i'*' ‑';i**: " <*=**==="!'"++i' '* = ;f'/''i:':'": ' i ""# x '*=*== "(='='!=
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