Res. Org. Geochem. 25, 61–70 (2009)〔有機地球化学会 30 周年記念事業 地球・環境有機分子検索マニュアル No.19〕

技術論文

アミノ酸（ピバロイル / イソプロピルエステル誘導体）のGC/MS による解析 *力石嘉人 **・高野淑識 **・大河内直彦 **（2008 年 12 月 12 日受付，2009 年 4 月 6 日受理）化，（3）GC/MS による測定で構成される。アミ1. はじめにノ酸に揮発性を持たせるために様々な誘導体化

アミノ酸はアミノ基（-NH2）とカルボキシル基法が用いられており，tert-ブチルジメチルシリル（-COOH）を持つ有機化合物であり，生物の生合成・代謝・生理機能に深く関わる。生体中で合成化（tBDMS: 例えば，MacKenzie et al., 1987）トリ
フルオロアシル / イソプロピルエステル化（TFA/

される多くのアミノ酸は，α 位の炭素原子に，カiPr: 例えば，Engel et al., 1990），ペンタフルオロルボキシル基，アミノ基，水素，側鎖の４つの異アシル / イソプロピルエステル化（PFA/iPr: 例えば，Pelz et al., 1998），ピバロイル / イソプロピルなる原子（団）が結合した α-アミノ酸であり，D体・L-体の光学異性体が存在する。地球の生物はタンパク質の基本構造として Fig. 1 に挙げた 20
種類の L-α-アミノ酸を用いるが，極少量の D-αアミノ酸や，非タンパク性の β，γ-アミノ酸なども生命活動の維持に欠かせない。さらにアミノ酸は，炭素質隕石などの地球外物質中にも存在し，エステル化（Pv/iPr: 例えば，Metges et al., 1996）,エトキシカルボニル / エチルエステル化（EtOC/
Et: 例えば，Montigon et al., 2001）などが一般的である。
本報では，ピバロイル / イソプロピルエステル誘導体化とその GC/MS 分析法（同定法）を紹介

その存在量や異性体の偏りに関する研究が報告されてきた（例えば，Kvenvolden and Kaplan, 1970;

やフッ素を含まない，（2）誘導体基の炭素数が比Shimoyama et al, 1979; Cronin and Pizzarello, 1997;

較的多い，（3）誘導体化体アミノ酸が比較的安定する。この誘導体化法は，（1）誘導体基にケイ素

Pizzarello and Cronin, 1998）。また，とくにこの数であるという特徴がある。そのため，ガスクロマ

年間においては，生物のアミノ酸（グルタミン酸

トグラフ / 同位体比質量分析計（GC/IRMS）を用やフェニルアラニン）の安定窒素同位体比が，そいた安定窒素同位体比分析において，とても使いの生物の栄養段階や食物連鎖網のベースにある生やすい誘導体化法である。

物（一次生産者）の同位体比を正確に見積ること

2. 試ができる優れたツールであることが見いだされ（力石ら，2007），生物・生態学研究を中心に積極的に使われるようになった。
GC/MS によるアミノ酸の分析手順は , 一般的に，（1）試 料 の 酸 加 水 分 解，
（2）精 製 と 誘 導 体

料

代表試料として，静岡県賀茂郡松崎町の那賀川で採取した緑藻（カワノリ，Prasiola japonica），北海道伊達市の北黄金遺跡で出土した縄文時代前期（約 5500-5700BP）の人骨のコラーゲン，「ち*GC/MS analysis of amino acids as pivaloyl/isopropylesters** 独立行政法人海洋研究開発機構，海洋・極限環境生物圏領域，〒 237-0061 神奈川県横須賀市夏島町 2-15
Yoshito Chikaraishi, Yoshinori Takano and Naohiko Ohkouchi: Institute of Biogeosciences, Japan Agency for MarineEarth Science and Technology 2-15 Natsushima-cho, Yokosuka, 237-0061, Japane-mail: ychikaraishi@jamstec.go.jp, Tel: 046-867-9778, Fax: 046-867-9775−61−(3-aminopropanoic acid)

2-aminobutyric acid*

Sarcosine*

B-Alanine*

Valine3-Aminoisobutyric acid*45678AspThrSerMetGluPhe

LysTyr(2-amino-hexanedioic acid)acid)

ProlineAspartic acidThreonine

SerineD-Aminolevulinic acid*

Methionine

Glutamic acidPhenylalanine

2-Aminoadipic acid*

Hydroxyproline*

LysineTyrosine

121314151617181920212223−62−
Hyp

2-AAA

5-ALA

C9H11NO3

C6H14N2O2

C5H9NO3

C6H11NO4

C9H11NO2

C5H9NO4

C5H11NO2S

C5H9NO3C3H7NO3C4H9NO3C4H7NO4C5H9NO2C4H9NO2

C6H13NO2

C6H13NO2

C4H9NO2

C5H11NO2C3H7NO2C3H7NO2C4H9NO2

C5H11NO2

C2H5NO2C3H7NO2

formula181

146

131

161

165

147

149

131

105

119

133

115

131

131

131

103

117

89

89

103

117

75

391

356

325

329

291

315

275

257

315

329

301

241

257

257

257

229

243

215

215

229

243

201

derivative215

Molecular weightunderivative
89

36.9

35.2

29.9

27.0

27.8

27.0

25.4

25.2

25.1

24.6

24.5

22.2

21.1

20.1

19.8

17.4

18.2

18.0

17.9

17.4

16.8

16.5

15.7

Retention
time (min)290, 206, 85, 57

271, 168, 57

282, 239, 152, 85, 68, 57

242, 20, 186, 98, 57

204, 190, 148, 57

228, 186, 174, 84, 57

201, 159, 141, 85, 57

198, 101, 85, 57

126, 85, 57

140, 85, 57

214, 172, 160, 85, 57

154, 85, 70, 57

144, 112, 86, 57

170, 85, 57

170, 85, 57

170, 144, 141, 130, 112, 57

156, 57

156, 130, 128, 98, 57

128, 88, 85, 57

142, 85, 57

156, 57

114, 85, 57

128, 85, 57

Prominent fragment ions (m/z )**: All compounds are identified by coincidence in GC retention time and mass spectra with those of authentic standards*: Non-protein amino acid (IUPAC name in bracket)

Peak numbers refer to chromatogram in Fig. 2 (iVal, Sar, 2-ABA, and 3-AiBA were obtained by authentic standards, but not found in the samples presented in this paper) and spectra in Fig. 3(5-amino-4-oxo-pentanoic acid)Pro

4-aminobutyric acid*

11GABA

Ile

Isoleucine(4-aminopentanoic acid)Leu

Leucine93-AiBAVal

B-AlaSar

10(3-amino-2-methylpropanoic acid)(2-amino-N -methylethanoic acid)

Isovaline*

32-ABAiValGlycine(2-amino-2-methylbutanoic acid)

AlaGlyAlanineAbbreviation

2Compoud1No.

Table 1. Summary of retention time and prominent fragment isons for pivaloyl/amino acid/isopropylesters

4444444444444444-4---44

Level ofidentification**

力石嘉人・高野淑識・大河内直彦

アミノ酸（ピバロイル / イソプロピルエステル誘導体）の GC/MS による解析

Fig. 1. Chemical structures of amino acids: (a-1) essential and (a-2) non-essential protein L-α-amino acids, and (b) typical
non-protein amino acids. Abbreviations refer in Table 1.

きゅう」試験掘削航海（CK-06-06）において下北ソプロピルエステル誘導体化体を得た。なお本手沖海底下から採取したメタンハイドレート層を含む海洋堆積物（コア番号 24-4, 深度 212.9m: Aoike,タミンはそれぞれアスパラギン酸・グルタミン酸

法では，加水分解の過程で，アスパラギン・グルに変換される。また，アルギニン・システイン・2007）の分析結果を示す。

ヒスチジン・トリプトファンなどのアミノ酸も検出されない。Table 1 に示すアミノ酸については，

3. 分析方法
3.1. アミノ酸の抽出と誘導体化
アミノ酸の抽出・ピバロイル / イソプロピルエステル誘導体化の分析手順を Fig. 2 に示す。まず乾燥試料（緑藻・人骨コラーゲンは 1mg，海洋堆積物は 120mg）を，12 規定（12mol/l）塩酸で酸加水分解し（100℃ , 12 〜 24 時間），試料に含まれるタンパク質をアミノ酸へ分解した。加水分解溶おおむね 90% 以上の回収率で得られるが，プロリンの回収率は 10% 以下である。
3.2. GC/MS 分析
GC/MS 分析は，Agilent HP 6890 ガスクロマト
グラフ /HP MSD 5973N 質量分析計を用いた。導入 法 は PTV 法 を 用 い，50 ℃ で 0.2 分 間 保 持 し，液を有機溶媒（ジクロロメタン /n-ヘキサン）での液 -液抽出により脱脂した後，メタノールを加え，350℃まで 600℃ / 分で昇温した後，350℃で 10 分窒素ガス気流下で乾固した。塩化チオニル / イソプロパノール（110ºC, 2 時間）でイソプロピルエ

長，0.25mm 径，0.15μm 膜厚）を使用し，40℃で4 分間保持し，90℃まで 10℃ / 分で昇温し，90℃ステル化し，続いて，塩化ピバロイル / ジクロロメタン（110ºC, 2 時間）でピバロイル化し，最後から 220℃まで 5℃ / 分で昇温した後，220℃で 10に水 -有機溶媒（ジクロロメタン /n-ヘキサン）での液 -液抽出により，アミノ酸のピバロイル / イ分の定流速（constant flow）モードで使用した。

間保持した。分析カラムは，J&W HP-5MS（30m分間保持した。キャリアーガスの流速は，1.4ml/−63−力石嘉人・高野淑識・大河内直彦

Samples

4. 分析結果* Deca䌲bonated (2mol/l HCl) & dried up by N2 stream (with methanol at 100ºC)
HCl hydrolyzed (1ml of 12mol/l HCl at 100ºC for 12-24h䋩

Fig. 3 に，各試料の分析で得られた TIC クロマ* Filtrated (removed solid matter)

トグラムを，Table 1 同定レベルを示す。 アミノ酸のピバロイル / イソプロピルエステル誘導体のDefatted (dichloromethane/n-hexane 6:5, v/v, 3mls3䋩
Added 3ml of methanol
Dried up by N2 stream (100ºC)

基本的なマススペクトルは，親イオン [M] に加え，プロピル基が脱離した [M–43]，プロピルエ* Removed impurities (cation-exchange column chromatography)
Amino acids

ステル基が脱離した [M–59]，カルボニル基が脱離した [M–87]，及び，ピバロイル基 [85]，tert-ブ

Esterified(1ml of thionylchloride/isopropanol, 1:4, v/v, at 110ºC for 2h)
Dried up by N2 stream

チル基 [57] に対応したイオンフラグメントを示す（Fig. 4）。なお，これらの基本的なもの以外で，

Added 0.5ml of dichloromethane & dried up by N2 stream (s2)Amino acid/isopropylesters

個々のアミノ酸に特異的なフラグメントがある場Acylated(1ml of pivaloyl chloride/dichloromethane, 1:4, v/v, at 110ºC for 2h)合は，Fig.4 の構造式に特記した。

Dried up by N2 gentle stream

例えば，アラニンのマススペクトルは，[M]+が m/z 215 で あ り，[M–43]+，[M–59]+，[M–87]+

Added 0.5ml of dichloromethane & dried up by N2 gentle stream (s2)Added 1ml of water & extracted with dichloromethane/n-hexane(6:5, v/v, 3mls3)に対応する m/z 172，m/z 156，m/z 128，ピバロイ
ル基と tert-ブチル基に対応する m/z 85，m/z 57 をPivaloyl/amino acid/isopropylesters持つ（Fig. 4, No. 1）。イソロイシンのマススペク
トルは，[M]+ が m/z 257 であり，[M–43]+，[M–59]+，

GC/MS & GC/IRMS

Fig. 2. Extraction and derivatization procedures of aminoacids. Asterisks indicates optional processes.

(a) Green alga (Prasiola japonica)[M–87]+ に 対 応 す る m/z 214，m/z 198，m/z 170，

13

18

14
19

915

12
1 2

22

10

723

1721(b) Collagen (Jomon human)

18

Intensity

12

21

13

2

14

19

15

91

22
107(c) Marine sediment(Shimokita offshore)

1

1723

18

97

2

10
12

6

19

14
13 15

14

16

18

20

22

20

23

21

1122

24

26

28

30

32

34

36

38

Retention time (min)Fig. 3. TIC chromatograms of amino acids from (a) green alga, (b) human collagen, and (c) marine sediment. Peak numbers
correspond to the compound numbers in Table 1 and Fig. 4.

−64−アミノ酸（ピバロイル / イソプロピルエステル誘導体）の GC/MS による解析

Fig. 4. (1/51/5)
Mí5

Common fragment ions forpivaloyl/isopropylester

Mí87
85
Mí
57

No.1, AlaMí5

5Mí5

M

Mí4

MW=215
MW=21No.2, GlyIntensity

5

5

Mí
M

Mí5

MW=20
MW=201

No., i9al5Mí

5MW=24
MW=24
Mí5

M

No.4, 2-ABA5

Mí

5Mí5

Mí4M

MW=22
MW=22

m/z
Fig. 4. Mass spectra of amino acids as pivaloyl/isopropylester derivatives. Compound numbers correspond to the compoundnumbers in Table 1 and the peak numbers in Fig. 3.

−65−

力石嘉人・高野淑識・大河内直彦

Fig. 4. (2/52/5)
No.5, Sar5

5

Mí
Mí5

M

MW=21
MW=215

No.6, B-Ala
130

Mí

5
130

Mí5
M

Mí4

5

MW=215

No., 9al

IntensityMí
55MW=24
MW=24
Mí5

M

No., -AiBA
5

144
Mí5
5M

144
Mí4

MW=22

No., /eXMí

5

5
Mí5

Mí4

m/z−66−M

MW=25
MW=25

アミノ酸（ピバロイル / イソプロピルエステル誘導体）の GC/MS による解析

Fig. 4. (3/53/5)
No.10, IleMí55Mí5

M

Mí4

MW=25
MW=2

No.11, GABA
5

144144
5Mí5

MW=22M

Mí4No.12, ProMí

Intensity55Mí5

MW=241
MW=M
Mí4

No.1, AspMí55Mí5Mí4M

MW=01

M

MW=2

No.14, Thr
55Mí Mí5m/z−67−

力石嘉人・高野淑識・大河内直彦

Fig. 4. (4/54/5)
No.15, Ser5

230
5Mí 230 Mí5M

MW=15No.16, 5-A/A5

5Mí5
Mí

MW=25

M

No.1, MetIntensity

5

190
5190

MW=25M

No.1, GlX
Mí

5

5Mí5
Mí4

M

Mí4

M

MW=15No.1, Phe5

Mí5Mí5

m/z

−68−

MW=21

アミノ酸（ピバロイル / イソプロピルエステル誘導体）の GC/MS による解析

Fig. 4. (5/55/5)
No.20, 2-AAA5

Mí

5Mí5Mí4M

MW=2

No.21, Hyp5

5Intensity

Mí4
M

Mí5

MW=25

No.22, /ys5
271271
5MW=56

Mí

Mí5

Mí4

M

No.2, Tyr5

5290Mí
Mí5

m/z−69−290
Mí4MMW1MW=1

MW=15力石嘉人・高野淑識・大河内直彦

ピバロイル基と tert-ブチル基に対応する m/z 85，m/z 57 を持つ（Fig. 4, No. 10）。グルタミン酸のマ

report, CDEX-JAMSTEC, pp. 1-73.
Engel M. H., Macko S. A., and Silfer J. A. (1990) Carbon

ススペクトルは，[M]+ が m/z 315 であり，[M–43]+，[M–59]+，[M–87]+ に 対 応 す る m/z 272，m/z 256，isotope composition of individual amino acids in them/z 228，ピバロイル基と tert-ブチル基に対応す

力石嘉人・柏山祐一郎・小川奈々子・大河内直る m/z 85，m/z 57 を持つ（Fig. 4, No. 18）。フェニルアラニンのマススペクトルは，[M]+ が m/z 291

彦（2007）生 態 学 指 標 と し て の 安 定 同 位 体：

Murchison meteorite. Nature 348, 47-49

アミノ酸の窒素同位体比分析による新展開
Radioisotopes 56, 436-477.

であり，[M–43] ，[M–59] ，[M–87] に対応する
m/z 248，m/z 232，m/z 204，ピバロイル基と tert-Cronin J. R. and Pizzarello S. (1997) Enantiomeric ex-

ブチル基に対応する m/z 85，m/z 57 を持つ（Fig. 4,No. 19）。

MacKenzie S. L., Tenaschuk D., and Fortier G. (1987)+++cesses in meteoric amino acids. Science 275, 951-955.

また，ヒドロキシル基（セリン : Fig. 4, No. 15）や硫黄原子（メチオニン : Fig. 4, No. 17），末端にAnalysis of amino acids by gas–liquid chromatogra-

アミノ基を持つアミノ酸（β-アラニン : Fig. 4, No.
6，アミノ酪酸 : Fig. 4, No. 11）などは，ピバロイ

tion of derivatives in a single reaction. J. Chromatogr.

ル基が脱離した [M–85]+ を特徴的に示す（それぞれ，m/z 230，m/z 275，m/z 130，m/z 144）。

Metges C. C., Petzke K.-J., and Hennig U. (1996) Gas

しかし，これらのマススペクトルには，同定がtrometric comparison of N-acetyl- and N-pivaloyl

難しいイオンフラグメントも多い。例えば，セリン（Fig. 4, No. 15）の m/z 128 やメチオニン（Fig. 4,amino acids esters to measure 15N isotopic abundanc-

phy as tert.-butyldimethylsilyl derivatives : PreparaA 387, 241-253.
chromatography/combustion/isotope ratio mass spec-

es in physiological samples: A pilot study on amino

No. 17）の m/z 141，ヒドロキシプロリン（Fig. 4,No. 21）の m/z 152 などである。また，ロイシン

acids synthesis in the upper gastro-intestinal tract of（Fig. 4, No. 9）とイソロイシン（Fig. 4, No. 10）のMontigon F., Boza J. J., and Fay B. (2001) Determina-

ように，構造異性体のフラグメントパターンは非tion of 13C- and 15N-enrichment of glutamine by gas

常に類似していることが多い。そのため，アミノ酸のピバロイル / イソプロピルエステル誘導体のchromatography/mass spectrometry and gas chroma-

同定は，標準物質の保持時間の情報をあわせて比after N (O, S)-ethoxycarbonyl ethyl ester derivatisa-minipigs. J. Mass. Spectrom. 31, 367-376.

tography/combustion/isotope ratio mass spectrometrytion. Rapid Commun. Mass. Spectrom. 15, 116-123.

較する必要がある。
謝Kvenvolden K. and Kaplan I. R. (1970) Evidence for辞extraterrestrial amino-acids and hydrocarbons in theMurchison meteorite. Nature 228, 923-926.

本稿で用いたカワノリは，鈴木利明氏（無所属）・馬場美和 氏（永楽堂）から，人骨コラーゲン

Pelz O., Cifuentes L. A., Hammer B.T., Kelley C. A.,は，米田穣准教授・内藤裕一氏（東京大学新領域and Coffi n R.B. (1998) Tracing the assimilation of創成科学研究科）から，下北沖の海洋堆積物は，

organic compounds using δ13C analysis of unique

稲垣史生博士（JAMSTEC 高知コアセンター）からamino acids in the bacterial peptidoglycan cell wall.

提供されたものである。深く感謝いたします。本

FEMS Microbiol. Ecol. 25, 229-240.

稿の内容は，科学研究費（力石・高野）により実Pizzarello S. and Cronin J. R. (1998) Alanine enantio-施した研究成果の一部を取り纏めたものである。

mers in the Murchison meteorite. Nature 394, 236.
Shimoyama A., Ponnamperuma C., and Yanai K. (1979)

引用文献

Amino acid in the Yamato carbonaceous chondrite

Aoike K. (2007) CK06-06 D/V Chikyu shakedown
cruise offshore Shimokita. Laboratory operation−70−

from Antarctica. Nature 282, 394-396.