GeoMx®プロテオゲノミクス
ワークフローの開発とその性能：
1 枚の FFPE スライドからRNA とタンパク質を同時検出
Shilah A. Bonnett
Giang OngJohn Lyssand
Gary Geiss
Alyssa Rosenbloom
Joseph Beechem

本製品の使用目的は研究用で、診断には使用できません。
NanoString Technologies, Inc., Seattle, WA 98109
MK4240 | Jan 2022

GeoMx®プロテオゲノミクスワークフロー

要旨
DNA

GeoMx®デジタル空間プロファイラー（DSP）は、1 枚のスライド

RNA

タンパク質

でタンパク質または RNA のハイプレックス・ハイスループット
空間プロファイリングと定量化を行うことができる装置です。今
回、組織中の RNA とタンパク質の相互作用を詳細に把握することを目的とし、1 枚のスライドで各関心領域（ROI）における両解析対象物をプロファイリングできる新しい NGS リードアウト用
GeoMx®空間プロテオゲノミクスワークフローを開発しました。
本書では、ハイプレックス GeoMx® Protein Assay および GeoMx®
Human Whole Transcriptome Atlas（GeoMx® Hu WTA）を用いて、細胞ペレットアレイ（CPA）および非小細胞肺癌（NSCLC）や大腸癌（CRC）などの各種組織を解析するプロテオゲノミクスワーク

マルチオミクス

マルチモーダルオミクス

フローの開発とその性能について報告いたします。既知の発現プ
ロファイルを有する細胞株のプロファイリングを行った結果、両

図 1：（A）プロテオームとゲノムまたはトランスクリプトームとの関係を理解するうえでのプロテオゲノミクスの重要性。現在のプロ
テオゲノミクス手法には、（B）個々の「オーム」データセットを統合するマルチオミクス手法と（C）1 つの検体から複数の「オーム」を同時に検出するマルチモーダル手法があります。

解析対象物に対する感度および特異性は、プロテオゲノミクスワ
ークフロー条件下と単一解析対象物ワークフロー条件下で同等であることが確認されました。また、ワークフローの性能は組織検体でも維持されていました。プロテオゲノミクスワークフローと単一解析対象物ワークフローの性能指標に高い相関性が認められたことは、1 つの FFPE 組織検体から RNA 転写産物とタンパク質を適切に検出できたことを示しています。したがって、空間プロ

この手法では、解析対象の体系についてより深く理解することがテオゲノミクスワークフローにより、量が限られている貴重な生可能ですが、データの解析および解釈にあたっては、プラットフ

体検体についてより深い特性解析を行うことが可能です。

ォーム（RNA およびタンパク質）による変動を考慮する必要があり、単独のプラットフォームでも切片間の変動を考慮し、複数のスライド間で関心領域（ROI）を精密にマッチさせなければなりま

緒言せん。より深い知見を得るとともにこれらの変動要因を制御する

空間分解マルチプレックス技術の進歩により、組織の不均一性やために、代替的手法として、1 つの検体から複数の「オーム」を同

腫瘍微小環境、細胞の相互作用、細胞の多様性、治療効果に関す時検出するマルチモーダルオミクスが用いられてきました（7, 8）。

る複雑な生物学的疑問解決のための手法は大きな変革を遂げ、そ空間生物学では、免疫組織化学法（IHC）または免疫蛍光法（IF）の定義も変わりました（1）。GeoMx® デジタル空間プロファイラと in situ ハイブリダイゼーション（ISH）を組み合わせたマルチモー（DSP）を含むこれらの技術では、ホルマリン固定パラフィン包ーダルオミクスワークフローを開発する動きが強まっています

埋（FFPE）検体または新鮮凍結（FF）検体から空間的に分解され（8-16）（図 1C）。しかし、分析対象物の超ハイプレックス同時検たプロテオームデータセットやトランスクリプトームデータセッ

出力を備えたマルチモーダルオミクスワークフローはこれまであトを取得することが可能ですが、多くの空間的解析技術は、プロりませんでした。

テオームまたはトランスクリプトームのいずれかのデータセットに特化しています。一方、RNA とタンパク質の相関関係は弱く、解析対象の遺伝子や組織によってしばしば変化することが報告されています（2）。転写、翻訳、タンパク質の代謝回転や動きを制御する生物学的プロセスを詳細に把握するには、RNA とタンパク質を正確に同時測定できるワークフローが必要です（図 1A）。これらの異なる「オーム間のプロテオゲノミクス的関係を十分に理解するには、様々な技術により得られた個々のデータセットをマ
ルチオミクス的手法により統合しなければなりません（3-6）（図GeoMx® DSP は、FFPE または FF 検体からタンパク質（100 種類以上）および RNA（最大 21,000 種類）を、ハイプレックスにデジタル定量化できる空間解析プロファイラーです（17-20）。この技
術では、タンパク質については独自の親和性試薬抗体、RNA につ
いては ISH プローブに UV 光開裂性オリゴヌクレオチドバーコー
ドを付加した試薬を使用しており、組織検体をこれらの親和性試
薬および蛍光マーカーとともにインキュベートした後、蛍光顕微鏡を用いて画像を取得します。

1B）。

2

Introduction • JAN 12, 2022

本製品の使用目的は研究用で、診断には使用できません。

（2）ROI を設定（1）染色（3）UV 光による開裂、（4）分注
回収

DSP バーコードを付加した抗体（5）バーコード
計数

蛍光抗体
タンパク質

nCounterRNA
DSP バーコードを付加した
RNA プローブ

DSP バーコード

RNA スコーププローブ（または蛍光抗体）

Illumina

図 2：2022 年 3 月時点で市販されている GeoMx® Assay では、nCounter または NGS 定量的リードアウトを用い、別々の組織切片でタンパク質およびRNA ターゲットのハイプレックス空間解析を行うことが可能です。プロテオゲノミクスへの対応予定は 2022 年 6 月以降の予定です。

UV 光を照射して、オリゴヌクレオチドバーコードを各関心領域（ ROI ： Region of Interest ） の UV 照 射 エ リ ア （ AOI ： Area of
Illumination）から正確に分離させた後、回収されて、nCounter®プラットフォームまたは次世代シーケンサー（NGS）を用いて定量化します（図 2）。
GeoMx® DSP は幅広いマルチプレックス能力を備えていますが、GeoMx® Protein Assay および GeoMx® RNA Assay はこれまで、単一分析対象物の検出についてバリデートされてきました。空間プロ
テオゲノミクスプロファイリングには、各分析対象物に 1 枚ずつ、計 2 枚の FFPE 検体または新鮮凍結検体が必要ですが、マルチモーダルオミクス手法を GeoMx®ワークフローに組み込むことにより、量が限られている貴重な生体検体について、より深い特性解析を行うことが可能です。また、1 つの AOI において RNA とタンパク質を同時に評価することにより、2 つの異なるワークフローで各分
析対象物を解析することに伴う技術的な変動を低減することができます。そこで、GeoMx® DSP 技術を土台に、1 枚の FFPE 組織切
片で関心領域（ROI）から RNA とタンパク質双方のプロファイリ
ングを行うことができる新たな NGS リードアウト用同時検出ワー
クフローを開発しました。本書では、ハイプレックス GeoMx®
Protein Assay および GeoMx® Cancer Transcriptome Atlas（GeoMx®
CTA）または GeoMx® Human Whole Transcriptome Atlas（GeoMx® Hu
WTA）を用いて、細胞ペレットアレイ（CPA）および各種組織を分析するプロテオゲノミクスワークフローの技術開発とその性能について報告いたします。

Experimental Design
FFPE 検体
本研究では、厚さ 5 μm のホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）
細胞ペレットアレイ（CPA）および組織切片を使用しました。
GeoMx® Protein Assay
タンパク質のみのコントロールスライドは、GeoMx® NGS Slide3

Preparation User Manual（MAN-10115-05）の Protein FFPE Manual Slide
Preparation Protocol および関連する公表文献（17）に従って手作業で処理しました。
GeoMx® RNA Assay
RNA の み の コ ン ト ロ ー ル ス ラ イ ド は 、 GeoMx® NGS Slide
Preparation User Manual for FFPE（MAN-10115-05）の RNA FFPE
BOND RX Slide Preparation Protocol および関連する公表文献（17,18）に従って処理しました。
GeoMx®空間プロテオゲノミクスワークフローの検体調製
Leica Bond-RX システム（Leica Biosystems、オーストラリア、メルボルン）を用いて、RNA コントロールスライドと同様のワークフ
ローでスライドを処理しました。すなわち、FFPE 切片を載せたス
ライドを熱し、脱パラフィン処理を行い、エタノールで再水和した
後、Leica BOND Wash Solution で洗浄しました。塩基性条件下（TrisEDTA、pH 9.0）で 85℃で 10 分間（細胞ペレット）または 100℃で20 分間（組織）処理してエピトープ回復を行った後、検体を Bond
Wash Solution で洗浄し、0.1 μg/mL プロテイナーゼ（ProK）による消化を 37℃で 5 分間（細胞ペレット）または 15 分間（組織）行いました。スライドを Leica から取り出し、1 回（1X PBS で 5 分間）
洗浄しました。次に、GeoMx® Cancer Transcriptome Atlas（GeoMx®
CTA、NanoString）または GeoMx® Whole Transcriptome Atlas（GeoMx®
WTA、NanoString）オリゴ結合 RNA プローブセットを Buffer R（NanoString）で希釈した液を検体に添加し、HybriSlip Hybridization
Cover（Grace BioLabs）で覆い 37℃で一晩インキュベートしました。
翌日、スライドを厳しい条件下（50％ホルムアミド／2X SSC、37℃）
で 25 分間ずつ 2 回洗浄し、非結合プローブを除去した後、2X SSC（室温、各 5 分間）で 2 回、1X-TBS-T（5 分間）で 1 回洗浄しました。検体を Buffer W（NanoString）で 60 分間室温でブロックした後、閉鎖したモイストチャンバーにて積層した NGS リードアウ
ト用ハイプレックスヒト GeoMx® Protein Assay（オリゴ結合抗体ミックス、NanoString）とともに 4℃で一晩インキュベートしました。

Experimental Design • JAN 12, 2022

本製品の使用目的は研究用で、診断には使用できません。

組織切片の場合は、抗体カクテルミックスとともに蛍光マーカーを添加して一晩インキュベートしました。翌日、スライドを 1X
TBS-T で 10 分間ずつ 3 回洗浄した後、閉鎖したモイストチャンバ
ーにて 4％PFA とともに 30 分間室温でインキュベートしました。
1X TBS-T で 5 分間ずつ 2 回洗浄した後、SYTO 13 で 15 分間室温で対比染色し、下記のとおり GeoMx® DSP 装置プラットフォームに設置しました。
GeoMx® DSP 実験：ROI の設定および収集組織の GeoMx®デジタル空間プロファイリングは、GeoMx® NGS
DSP 装置マニュアル（MAN-10116-05）および Merritt et al.（17）の報告に従って行いました。
細胞ペレットアレイ（CPA）では、各細胞株について 2 つの幾何学的関心領域（ROI）（直径 200 μm）のプロファイリングを行いました。組織切片については、ROI のサブサンプリングとして関心領域（ROI）の設定を容易にするため、蛍光形態マーカーで染色しました。ヒト大腸癌（CRC）および非小細胞肺癌（NSCLC）は抗 CD45
抗体（免疫）および抗 PanCK 抗体（腫瘍）で染色しました。NSCLC
では、各マーカー特異的な関心エリア（AOI）について、直径 100μm の円形の幾何学的 ROI を収集しました。ROI は検討対象の全ての試験スライドでマッチさせました。CRC では高度な ROI 設定法（セグメンテーション）を実施し、セグメンテーション実験では、
DSP オートセグメンテーションツールを用いて、直径 300 μm の円形 ROI をマーカー特異的な関心エリアにセグメント化しました。
次世代シーケンシングおよびデータ解析
GeoMx® NGS Readout Library Prep Manual （ MAN-10117-05 、
NanoString）にわずかな修正を加え、ライブラリを調製しました。
ライブラリのシーケンシングは、Illumina NextSeq2000 または
NovaSeq6000 を用い、それぞれの取扱説明書に従って実施しました。
得られた FASTQ ファイルは、NanoString GeoMx® NGS Pipeline v2.0
または v2.3 を用い、GeoMx® DSP NGS Pipeline User Manual（MAN10118-04、NanoString）に従って、修正後の GeoMx® NGS Pipeline 構
成ファイルとともに処理しました。解析は、社内データ処理スクリ
プトを用いて行いました。

用い、対数変換スケールのカウントで実施しました。組織については異なる細胞集団間の差次的遺伝子解析を rstatix R パッケージの対応のない両側 t 検定を用いて行いました。有意水準は、p 値 0.05未満とし、Benjamini-Hochberg 法により多重比較（または多重仮説検定）の調整を行いました（21）。

結果および考察
空間プロテオゲノミクスワークフローの開発
これまでの GeoMx® DSP による空間分解マルチオミクスプロファ
イリングでは、各分析対象物に 1 枚ずつ計 2 枚の連続 FFPE 組織
切片が必要でした（図 2）。しかし、連続切片に含まれている細胞集団は同一ではなく、遺伝子発現量およびタンパク質量がそれぞ
れどのように制御されているかについて明確かつ直接的に把握することもできません。1 枚の組織切片内の同一の細胞集団からハイプレックストランスクリプトームおよびプロテオームデータを収集することにより、マルチオミクス解析をさらに進化させてマル
チモーダルオミクスリードアウトおよび解析が可能となります。
そこで、1 枚の FFPE 組織切片で関心領域（ROI）内のシングルセル集団からハイプレックストランスクリプトームおよびプロテオームを同時にプロファイリングできる新たな NGS リードアウト用
空間マルチモーダルオミクスワークフローを開発しました。我々はこの空間的解析ワークフローを「プロテオゲノミクス」ワークフ
ローと呼んでいます。
NGS リードアウト用 GeoMx® Protein Assay および GeoMx® RNA
Assay はそれぞれ既存の免疫組織化学法（IHC）または in situ ハイ
ブリダイゼーション法（ISH）を用いています。GeoMx® Protein Assay
では、高圧高温下での酸性熱誘導性エピトープ回復（heat-induced
epitope retrieval : HIER）緩衝剤（pH 6.0）を用いた単一の抗原回復プロセスを行い、GeoMx® RNA Assay では、塩基性 HIER 緩衝剤（pH 9.0）を用いた組織依存性エピトープ回復プロセスの後、タンパク質分解誘発性エピトープ回復（PIER）を行う 2 段階の処理を行います。2 つの分析対象物は、全く異なる抗原回復条件を必要とすることから、まず、両分析対象物に適合するスライド処理条件を検討しました。

定量限界（LoQ）を GeoMean(NegProbes)*GeoSD(NegProbes)2 とし、シグナル対ノイズ比（SNR）が 4 以上であった場合に、遺伝子が検出されたものとみなしました。遺伝子カウントは検出閾値未満の遺伝子を除外したうえで、Q3 正規化により正規化しました。Cancer
Cell Line Encyclopedia RNAseq データセット（CCLE、Broad Institute）
から真の発現遺伝子セット（TPM 1 超）を特定し、それを用いて細胞ペレットにおける WTA の感度および特異性を算出しました。
組織の場合は、遺伝子をフィルタリングし、15％超の AOI において検出閾値を上回っていた遺伝子のみとしました。タンパク質については、シグナルを 3 つの IgG 陰性コントロール（マウス IgG1
およびウサギ IgG アイソタイプコントロール）の幾何平均値で除してシグナル対ノイズ比を算出し、SNR が 3 以上の場合にタンパ
ク質ターゲットが検出されたものとみなしました。
pheatmap R パッケージを用いてクラスターヒートマップを作成しました。クラスタリングは pheatmap の「correlation（相関）」法を4

Experimental Design • JAN 12, 2022

本製品の使用目的は研究用で、診断には使用できません。

染色法の戦略

エピトープ回復条件の影響

ISH 法では、高塩濃度や、高温およびホルムアミドへの長時間の曝露など厳しい条件が必要であり、それらはいずれも FFPE 組織検体
中のタンパク質抗原が検出されにくくなる要因となる可能性があります。ISH 条件がタンパク質抗原の検出にどのような影響を与えるか調べるため、各種染色法を比較しました。

次に、空間プロテオゲノミクスワークフローに最適なエピトープ
回復条件を検討しました。標準的な GeoMx® RNA Assay および
GeoMx® Protein Assay は、相反する HIER（塩基性、酸性）について最適化されていますが、単一のプロテオゲノミクスワークフロ
ーでは、1 種類のエピトープ回復条件が必要です。FFPE 細胞ペレットアレイ切片に対し、ヒト GeoMx® Cancer Transcriptome Assay（GeoMx® CTA）の後、6 つの GeoMx® Protein Module からなる 59plex タンパク質パネル（表 1）で染色する逐次染色を行いました。
各細胞株について、複製させた AOI のシグナルの平均値を求め、タンパク質および RNA それぞれのシグナル対ノイズ比（SNR）を算出し、空間プロテオゲノミクスワークフローの性能を単一分析
対象物ワークフローのコントロールスライドと比較しました。

評価したのは、ISH の後 IHC（ISH > IHC）を行う方法とその逆（IHC> ISH）の 2 種類の逐次染色法です。まず IHC 染色を行った後、ISHを行った場合、相関性の低下（R＝0.86）が認められるとともに、検出ターゲット数、すなわち感度が 36％減少しました。一方、まず ISH を行った後 IHC 染色を行った場合には、タンパク質相関性（R＝0.95）および感度（5％減少）に対する影響はわずかでした。
また、抗体（IHC）と RNA（ISH）を同時に染色するという方法も評価しました。ISH 法で使用される高濃度のホルムアミドはタン
パク質ターゲットの検出に悪影響を及ぼすことが知られています。
ホルムアミドを使用することにより、より低い温度でハイブリダ
イゼーションを行うことができるとともに、RNA プローブの非特異的結合を低減させることが可能ですが、抗体と抗原の相互作用が阻害され、その結果、抗体染色の質が低下する可能性があります（8、22）。同時染色法では、タンパク質ターゲット検出率が 45％減少したことから、抗体-抗原結合が阻害されたことがわかりました。したがって、RNA およびタンパク質ターゲット検出のための最適な染色方法は、ISH の後 IHC を行う逐次染色法であると判断しました（データ省略）。

FFPE 細胞株について、RNA（GeoMx® CTA）単一分析対象物コン
トロールワークフローと空間プロテオゲノミクスワークフローを比較したところ、HIER 前処理条件（酸性または塩基性）にかかわらず強い相関関係（R：0.95 超）が認められました。また、HIER 前処理条件（酸性または塩基性）は、空間プロテオゲノミクスワーク
フローと RNAseq CCLE データベースとの相関関係にほとんど影響を与えませんでした（23）。塩基性 HIER 条件下での空間プロテ
オゲノミクスワークフローの擬陽性率（FPR）は 10％未満であったのに対し、酸性 HIER 条件下でのワークフローの FPR は 30％でした。この高い FPR は、エピトープ回復を酸性条件下で行った場
合には非特異的ハイブリダイゼーションが増加したとの既報と一致しています（20）。

1

CTA 対照データと CCLE データベースのPearson 相関係数は 0.86 です。

図 3：各種濃度のプロテイナーゼ K が空間プロテオゲノミクスワークフローの性能に及ぼす影響の評価。エピトープ回復工程において各種濃度のプロテ
イナーゼ K（ProK）で処理した細胞ペレットアレイ（CPA）をプロテオゲノミクスワークフロー条件下で 6 層の GeoMx® NGS Protein Module（59-plex）および GeoMx® Hu WTA で染色しました。
（A）log2 変換 SNR データにおけるプロテオゲノミクスワークフローと単一分析対象物対照ワークフローおよび
CCLE RNAseq データベースとの Pearson 相関。図は、（B）検出可能であったタンパク質ターゲットの数および（C）検出可能であった真陽性 RNA ターゲ
ットの数を示しています。

5

Impact of Epitope Retrieval Conditions • JAN 12, 2022

本製品の使用目的は研究用で、診断には使用できません。

1 日目：RNA

3 日目：DSP

2 日目：タンパク質

4 日目：NGS

図 4：GeoMx®空間プロテオゲノミクスワークフローは、1 枚のスライドでマルチモーダルオミックスプロファイリングを行うことができます。

タンパク質単一分析対象物コントロールワークフローとプロテオ
ゲノミクスワークフローを比較したところ、酸性 HIER 条件下で前処理した FFPE 細胞株は、コントロールとの相関性が R＝0.86 と、
塩基性 HIER 処理の場合（R＝0.77）よりも高値を示しました（データ省略）。
酸性および塩基性 HIER 条件を比較評価した結果、タンパク質検
出は酸性 HIER 条件で、RNA 検出は塩基性条件で最適となり、標準的な GeoMx®単一分析対象物ワークフローと一致しました。一方、
比較的高濃度（1 μg/mL）のプロテイナーゼ K（ProK）を PIER エ
ピトープ回復ステップに使用したときには、タンパク質ターゲッ
ト感度の低下が認められました。そこで次に、塩基性 HIER 条件下
での ProK 濃度が空間プロテオゲノミクスワークフローによるタンパク質および RNA ターゲット検出に及ぼす影響について評価しました。
各種プロテイナーゼ K 濃度が与える影響
各種 ProK 濃度が与える影響を評価するため、FFPE 細胞ペレット
アレイ切片を GeoMx® Human Whole Transcriptome Atlas（GeoMx®
Hu WTA）プローブセットおよび 6 つの GeoMx®Protein Module からなる 59-plex タンパク質パネルで染色し、FFPE 細胞株を塩基性HIER 条件下で評価した後、各種濃度の ProK でタンパク質分解処理（PIER）を行いました。タンパク質単一分析対象物コントロー
ルワークフローと空間プロテオゲノミクスワークフローを比較したところ、比較的強い相関関係が維持されており、ProK 濃度にかかわらず FPR は 10％未満でした（図 3A）。しかし、1 μg/mL を上回る ProK 濃度では、タンパク質ターゲット検出率（SNR 3 以上）に 37％超と有意な減少が認められました。濃度が 0.1 μg/mL の場
合には、空間プロテオゲノミクスワークフローの感度はコントロールと同等でした（図 3B）。
一方、RNA 単一分析対象物コントロールワークフローとプロテオ
ゲノミクスワークフローの相関関係は、ProK 濃度が高いほど強くなり、同様の傾向は、プロテオゲノミクスワークフローで検出された RNA ターゲットと Cancer Cell Line Encyclopedia（CCLE）RNAseq
データベースとの比較でも認められました（図 3A）。さらに、真陽
性数も ProK 濃度が高いほど増加しました（図 3C）。これらの結果から、重要な ProK によるタンパク質分解とのバランスを保つことが最適な RNA 検出のためには必須であること、一方、最低濃度の
ProK でもタンパク質ターゲットの検出にはある程度の悪影響を及6

ぼすことが明らかとなりました。プロテイナーゼ K 濃度による影響を最も受けたのは、量の少ないタンパク質および RNA ターゲットの検出でした。
GeoMx®空間プロテオゲノミクスワークフロー
最適な GeoMx®空間プロテオゲノミクスワークフローの構築にあたっては、染色法、HIER 条件（酸性、塩基性）および ProK（PIER）
濃度がタンパク質・RNA ターゲット双方の検出感度と特異性に与える影響を考慮しました。その結果、最適な GeoMx®空間プロテオ
ゲノミクスワークフローは、ISH を行った後、塩基性（pH 9.0）HIER
条件および低濃度（0.1 μg/mL）での ProK 消化（PIER）ステップを組み込んだ IHC を行う逐次染色法から構成されるワークフローであると判断しました。GeoMx®空間プロテオゲノミクスワークフローの所要時間は、スライド調製からデータ解析までを含め 4 日間です。GeoMx®空間プロテオゲノミクスワークフローには、RNA プ
ローブセットとして GeoMx® Hu WTA または GeoMx® CTA を使用
していることから、ワークフロー全体が NGS リードアウトのみに対応しています（図 4）。
FFPE 検体のワークフローは以下のとおりです。
1 日目：塩基性条件下での熱誘導性エピトープ回復（HIER）の後、タンパク質分解誘導性エピトープ回復（PIER）（0.1 μg/mL ProK）
を行う 2 段階のエピトープ回復プロセスを実施しました。次に、スライドを GeoMx® Hu WTA または GeoMx® CTA RNA プローブカ
クテルで染色した後、37℃で一晩ハイブリダイゼーションを行いました。
2 日目：検体をホルムアミドを用いた厳しい条件下で洗浄した後、非特異的抗体結合を防ぐためブロッキング液で処理しました。次に GeoMx® Protein Assay による染色を 4℃で一晩行いました。組織
形態を可視化するため、このステップで蛍光結合一次抗体を添加することも可能です。

The overall workflow for FFPE • JAN 12, 2022

本製品の使用目的は研究用で、診断には使用できません。

3 日目：4％PFA で後固定を行い、核マーカー（Syto13）で染色した後、GeoMx®デジタル空間プロファイラーで処理し、実験デザイ
ン の 項 に 示 す と お り Illumina NextSeq2000 ま た は Illumina
NovaSeq6000 でシーケンシングを行いました。
4 日目：実験デザインの項に示すとおり GeoMx® NGS Pipeline を用
いてデータを処理しました。
最適化された GeoMx®空間プロテオゲノミクスワークフローを用いた細胞株のプロファイリング
最適化された GeoMx®空間プロテオゲノミクスワークフローを用いて、GeoMx® Hu WTA および 6 つの GeoMx® Protein Module からなる 59-plex タンパク質パネル（表 1）で染色した FFPE 細胞ペレットアレイ（CPA）切片のプロファイリングを行いました。また、
CPA を 59-plex タンパク質パネルまたは GeoMx® Hu WTA のいずれかで染色し、それぞれタンパク質コントロールおよび RNA コント
ロールとしました。
まず、プロテオゲノミクスワークフローとタンパク質コントロー
ルワークフローで検出されたタンパク質の質を比較評価しました。
全ての細胞株間および全ての検出可能ターゲット間で対相関解析を行ったところ、細胞株間の比較では、検討した細胞株において同細胞株間で一貫して高い相関性が認められました（図 5A）。さらに、プロテオゲノミクスワークフローとタンパク質コントロール
ワークフローで検出された同一タンパク質ターゲット間にも高い相関性が認められました（図 5B）。
次に、プロテオゲノミクスワークフローと RNA コントロールワー
クフローで検出された RNA の質を CCLE RNAseq データセットと比較評価したところ、GeoMx® Hu WTA と CCLE RNAseq データセット間で重複する全てのターゲットについて、プロテオゲノミク
スワークフローおよび RNA コントロールデータの各細胞株は、CCLE データセットの全細胞株（1012 株）と相関していました。
CCLE データセットと重複している各 CPA 細胞株の Pearson R 分
布を図 5C に示します。細胞株ラベルは、各実験および細胞株比較において最も高い相関を示した CCLE 細胞株を示しています。
RNA コントロールワークフローおよびプロテオゲノミクスワーク
フローのいずれにおいても、同細胞株間で比較した時に CCLE
RNAseq データセットとの相関性は最も高くなりました。また、ワークフローのタイプにかかわらず、同一 RNA ターゲット間にも高い相関性が認められました（図 5D）。

ク質分解制御と一致していました（24-27）（図 5E）。
組織を用いた GeoMx®空間プロテオゲノミクス
FFPE 細胞株は、新しい空間
プロテオゲノミクスワーク
6 つの NGS 用 GeoMx®
フローの開発に有用な均質
Human Protein Module
な検体であり、組織の連続（59-plex）
切片で認められることの多い変動を低減することが可能です。しかし、複雑な空間的状況に関する生物学的疑問を解決するには組織を用いるしかありません。そこで、各種組織を対象に、空間
プロテオゲノミクスワーク
フローと GeoMx® Hu WTA
または GeoMx® Protein Assay
による単一分析対象物ワー
クフローの比較評価を行いました。連続 FFPE NSCLC
組 織 切 片 を GeoMx® Hu
WTA（RNA コントロール）、
6 つ の GeoMx® Protein
Module からなる 59-plex タ
ンパク質パネル（タンパク質コントロール）または両
表 1 ： 6 つ の GeoMx® Human
者で同時に染色するプロテ
Protein Module には 59 種類の抗オゲノミクスにより染色体-抗原ターゲットが含まれています。
し、マッチする免疫（CD45
濃染色）および腫瘍（PanCK濃染色）領域を比較しました（表 1）。各 CD45+または PanCK+関
心領域（ROI）について直径 100 μm の円形 ROI を収集したところ（図 6A）、タンパク質分析対象物については感度が約 25％低下し（図 6B）、RNA コントロールとの比較では、CD45 および PanCK
濃染色部における SNR 4 以上の遺伝子数がそれぞれ 20％および12％減少しました（図 6C）。感度の低下は過去の観察所見と一致しており、主に影響を受けたのはシグナルが検出閾値付近の少量ターゲットでした。

プロテオゲノミクスワークフローは、2 枚の異なる切片を用いたマ
ルチオミクス解析と比べ、同一の細胞集団から完全なタンパク質
および RNA データが得られるという利点を持っています。均質な細胞株集団内においても、プロテオゲノミクスワークフローは、単一分析対象物ワークフローによるコントロールスライドのマルチオミクス解析と比較し、同様またはより高い相関性を示しました。
また、よく知られているとおり、RNA とタンパク質の間には 1:1の関係はなく、むしろ RNA の安定性や翻訳制御、タンパク質の分解などの重要な細胞プロセスが各時点における RNA およびタンパク質量を決定します。RNA ターゲットと、対応するタンパク質
ターゲットとの間には正（PTPRC/CD45）または負（FN1/フィブロ
ネクチン 1）の相関関係が認められ、既報の翻訳制御およびタンパ

7

GeoMx® Spatial Proteogenomics in Tissue • JAN 12, 2022

本製品の使用目的は研究用で、診断には使用できません。

タンパク質コントロール細胞株とプロテオゲノミクス細胞株の相関関係
細胞株比較

Pearson R

異なる細胞株
同じ細胞株

プロテオゲノミクス

細胞株比較
乳房
中枢神経系
造血およびリンパ組織
大腸
肝臓
肺
卵巣
前立腺
皮膚

タンパク質コントロール細胞株

タンパク質コントロール

度数

WTA と CCLE とのPearson R

WTA データと全 CCLE との Pearson R

WTA 細胞株

Pearson R

マルチオミクス（タンパク質＆RNA 連続スライド）

WTA（log 2 変換 SNR）

WTA 発現量（log 2 変換 SNR）

マルチモーダル（プロテオゲノミクス）

タンパク質発現量（log 2 変換 SNR）

タンパク質（log 2 変換 SNR）

図 5：細胞株における空間プロテオゲノミクスデータと RNA およびタンパク質コントロールデータの品質比較。細胞ペレットアレイ（CPA）を、プロテオゲノミクスおよび標準ワークフロー条件下で 6 層の GeoMx® NGS Protein Module（59-plex）および GeoMx® CTA で染色しました。
（A）タンパク質コントロールデータとプロゲオゲノミクスタンパク質データの細胞株別比較。
SNR 3 以上のタンパク質ターゲットについて、空間プロテオゲノミクススライドの全細胞株とタンパク質コントロールスライドの各細胞株との Pearson R を算出しました。各種組織の細胞株をそれぞれ異なる形のマークで示し、タンパク質コントロール細胞株とマッチする空間プロテオゲノミクスワークフローの細胞株を赤色で表示しています。
（B）タンパク質コントロール
データとプロゲオゲノミクスタンパク質データのターゲット別比較。SNR 3 以上のタンパク質ターゲットについて、空間プロテオゲノミクススライドの全タンパク質ターゲットとタンパク質コントロールスライドの各タンパク質ターゲットとの Pearson R を算出し、ヒートマップを作成しました。（C）RNA コントロールおよびプロテオゲノミクスワークフローの GeoMx® Hu
WTA データと全 CCLE RNAseq データセットの細胞株別比較。CCLE と GeoMx® Hu WTA データ間で重複する全てのターゲットについて、CCLE RNAseq の全細胞株とタンパク質コントロールおよび空間プロテオゲノミクス GeoMx® Hu WTA データとの Pearson R を算出しました。図中の細胞株ラベルは、GeoMx® Hu WTA データとの相関性が最も高かった CCLE 細胞株を示しています。（D）GeoMx® Hu WTA コントロールデータとプロテオゲノミクス GeoMx® Hu WTA データとのターゲット別比較。15％の検体において SNR が 4 以上であった各 RNA ターゲットについて、GeoMx® Hu WTA コントロールの log2 変換 SNR データとプロテオゲノミクス GeoMx® Hu WTA log2 変換 SNR データとの Pearson R を算出し、Pearson R の分布を示すヒストグラ
ムを作成しました。（E）タンパク質ターゲットと各 GeoMx® Hu WTA RNA ターゲットとの比較。SNR 3 以上のタンパク質ターゲットおよび SNR 4 以上の GeoMx® Hu WTA ターゲットについて、プロテオゲノミクスワークフロー（左）およびマルチオミックスワークフロー（右）により検出された各タンパク質および RNA 分析対象物を比較しました。

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Profiling of Cell Lines • JAN 12, 2022

本製品の使用目的は研究用で、診断には使用できません。

GeoMx®空間プロテオゲノミクスワークフローと GeoMx® Protein
Assay による単一分析対象物ワークフローのマッチする ROI について教師なし階層的クラスタリングを行ったところ、プロテオゲ
ノミクスワークフローと単一分析対象物タンパク質コントロール
ワークフローのマッチする ROI 間に高い一致性が認められ、また、
CD45 濃染色 ROI 間および PanCK 濃染色 ROI 間にも高い相関性が認められました（図 6D）。次に、GeoMx®空間プロテオゲノミクス
ワークフローと GeoMx® Hu WTA による単一分析対象物ワークフ
ローのマッチする ROI について教師なし階層的クラスタリングを行ったところ、2 つのワークフローによるタンパク質検出と同様に、プロテオゲノミクスワークフローと単一分析対象物コントロール
ワークフローのマッチする ROI 間に高い一致性が認められ、また、
CD45 濃染色 ROI 間および PanCK 濃染色 ROI 間にも高い相関性が認められました（図 6E）。
NSCLC 連続切片では、GeoMx®空間プロテオゲノミクスワークフ
ローと標準的な GeoMx®単一分析対象物ワークフローによるターゲット検出力は同等でしたが、特に少量又は低発現量のターゲッ
トでは感度にわずかな低下が認められました。また、連続切片のマッチする ROI 間で高い一致性が認められるとともに、免疫または腫瘍濃染色 ROI 内でも高い相関性が認められました。そこで、次に、プロテオゲノミクスワークフローの GeoMx®セグメンテーショ
ン機能（光学的解剖）および 2 倍以上向上したハイプレックスタ
ンパク質解析能力を評価しました。
空間プロテオゲノミクスワークフローによるセグメンテーション
組織を光学的に解析する機能は、明確な空間コンテキストと特定の細胞亜集団のプロファイリングを結びつけることができます。
そこで、GeoMx® DSP プラットフォームの組織セグメンテーショ
ン機能を利用し、ヒト大腸癌を対象に空間プロテオゲノミクスワ
ークフローを評価しました。確立された空間プロテオゲノミクス
ワークフローにおいて、組織切片を GeoMx® Hu WTA（RNA ター
ゲット数：18,000）および 15 つの GeoMx® Protein Module からなる
147-plex タンパク質パネルで染色するとともに、CD45 および
PanCK に対する蛍光結合一次抗体で染色することにより免疫および腫瘍細胞亜集団を特定し（表 2）、直径 300 μm の ROI を CD45 濃
染色免疫細胞亜集団および PanCK 濃染色腫瘍細胞亜集団にセグメ
ント化しました。ROI は、免疫細胞の多い領域または免疫細胞の少ない領域に近接する腫瘍領域を含め、組織切片内の様々な腫瘍領域について設定しました（図 7A）。検出された RNA ターゲット（SNR 4 以上）およびタンパク質ターゲット（SNR 3 以上）について教師なし階層的クラスタリングを行ったところ、予想されたとおり、免疫セグメントおよび腫瘍セグメント内に明確なクラスタ
リングが認められました（データ省略）。腫瘍および免疫セグメン
ト間でタンパク質および RNA ターゲット双方の差次的発現解析を行った結果、各セグメントタイプ内の両分析対象物に対する堅牢な同時検出力および特異性が確認されました（図 7B）。

915 層の NGS 用 GeoMx® Human Protein
Module（147-plex）

表 2：15 つの GeoMx® Human Protein Module には 147 種類の抗体-抗原ター
ゲットが含まれています。

免疫または腫瘍セグメントに関連する重要な RNA／タンパク質ターゲットペアの発現量を調べたところ、明確な免疫または腫瘍
AOI（UV 照射領域）において一部のターゲットに変動が認められました（図 7C）。免疫または腫瘍セグメント AOI において検出可能であった全てのタンパク質ターゲットと RNA ターゲットの相関関係を検討すると、明確な相関（赤）および反相関（青）パター
ンが認められました。例えば、IGHG1-4 RNA ターゲットは CD44、
IDO1、CD8 などの免疫タンパク質ターゲットと強く相関していましたが（赤矢印）、Epcam、CD56 などの細胞接着タンパク質ターゲ
ットおよび腫瘍ターゲット B7-H3 とは反相関していました（青矢印）（図 7D）。腫瘍セグメントでは、杯細胞の粘液産生に関連する
MUC5AC の RNA ターゲットとタンパク質ターゲット PanCK（腫瘍細胞マーカー）との間に反相関（青矢印）が認められました（28）。
逆に MUC5AC RNA ターゲットと自食作用に関連するタンパク質
ターゲットである ATG5、ATG12、Lamp2a および Bag3 の間には正の相関関係（赤矢印）が認められました。一般的に、正常な粘液産生制御には、ムチンの制御および分泌のための自食作用が関与しています（29）。また、悪性大腸癌細胞では MUC5AC の異常発現が認められることが多いことも報告されています（28）（図 7E）。
以上のとおり、GeoMx® DSP を用いた新規 GeoMx®空間プロテオゲ
ノミクスワークフローを適用することより、空間解析された個々の CRC 細胞亜集団から明確な腫瘍または免疫関連 RNA およびタ
ンパク質ターゲットを同時にハイプレックスで検出することが可能であることが確認されました。

Segmentation with Spatial Proteogenomic Workflow • JAN 12, 2022

本製品の使用目的は研究用で、診断には使用できません。

図 6：非小細胞肺癌（NSCLC）における空間プロテオゲノミク
スデータと RNA およびタンパク質コントロールデータの品質比較。NSCLC の FFPE 切片を 6 つのヒト GeoMx® NGS Protein
Module（59-plex）、GeoMx® Hu WTA、抗 PanCK 抗体（青緑色）および抗 CD45 抗体（赤紫色）で染色し、直径 100 μm の ROI を
全てのスライド条件および組織切片についてマッチさせました。
（A）空間プロテオゲノミクスワークフローでプロファイリ
ングした NSCLC の代表的画像。免疫細胞（CD45、赤紫色）および腫瘍細胞（PanCK、青緑色）が強く濃染色されている 2 つの ROI も併記しています。単一分析対象物コントロールワーク
フローまたはプロテオゲノミクスワークフローによりプロファイリングした各領域における、検出閾値を上回るタンパク質
ターゲット数（B）および遺伝子ターゲット数（C）の平均値。
検出閾値はタンパク質では SNR 3 以上、GeoMx® Hu WTA では
15％の検体において SNR が 4 以上の場合としています。（D）
タンパク質データの ROI 別比較。プロテオゲノミクススライドの全ての ROI とタンパク質コントロールスライドの各 ROI のlog2 変換 SNR データの Pearson R を算出し、R 値について教師なし階層的クラスタリングを行いました。
（E）GeoMx® Hu WTA
データの ROI 別比較。プロテオゲノミクススライドの全てのROI と RNA コントロールスライドの各 ROI の log2 変換 SNR データの Pearson R を算出し、R 値について教師なし階層的クラスタリングを行いました。

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Spatial Proteogenomic Data Qualit • JAN 12, 2022

本製品の使用目的は研究用で、診断には使用できません。

図 7：セグメンテーションによる高度 ROI 設定。CRC 検体について、直径 300 μm の円形 ROI を免疫領域および腫瘍領域にセグメント化し、タンパク質および RNA のマルチプレックス特性解析を実施しました。タンパク質および RNA カウントは SNR に変換し、SNR が 3 以上のタンパク質ターゲッ
トおよび SNR が 4 以上の WTA RNA ターゲットを解析対象としました。
（A）プロテオゲノミクスアッセイでプロファイリングした大腸癌検体。FFPE
切片を 15 の GeoMx® Protein Module（147-plex）、GeoMx® Hu WTA、抗 PanCK 抗体（腫瘍、緑色）および抗 CD45 抗体（免疫、赤紫色）で染色しました。
腫瘍および免疫セグメントはそれぞれ PanCK および CD45 免疫蛍光染色により作製しました。
（B）タンパク質発現量と RNA 発現量を併記した火山プ
ロット。背景を上回るタンパク質および RNA ターゲットについて、全ての免疫セグメントと全ての腫瘍セグメントを比較しました。差次的発現遺伝子のサブセットは、それらの分析対象物にマッチする色で表示しています。
（C）マッチするタンパク質ターゲットと RNA ターゲットの一致度。SNR が3 以上のタンパク質ターゲットと SNR が 4 以上の対応する RNA ターゲットについて、対散布図を作成し、各分析対象物間の一致度を視覚化しました。
各図に Pearson R 算出値を示しています。免疫セグメント（D）および腫瘍セグメント（E）における、背景を上回るプロテオゲノミクス RNA ターゲッ
トとタンパク質ターゲットとの一致度。免疫および腫瘍セグメントの双方について、検出された全 RNA ターゲット（SNR 4 以上）と検出された各タン
パク質ターゲット（SNR 3 以上）の Pearson R を算出しました。

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Advance ROI selection using segmentation • JAN 12, 2022

本製品の使用目的は研究用で、診断には使用できません。

結論

謝辞

本ホワイトペーパーでは、1 枚の組織切片スライドから RNA およびタンパク質ターゲットを同時検出するハイプレックス空間プロ
テオゲノミクスワークフローの開発について報告いたしました。
また、複数の細胞株や組織への使用事例を紹介し、このワークフローを活用して同一検体内での RNA およびタンパク質の変化を正確に測定する方法も考察しました。このワークフローにより、
GeoMx® DSP の適用範囲が拡大し、複数の分析対象物を調べる際に貴重な検体の使用量を最小限に抑えることができます。今後さらに GeoMx® DSP を用いたプロテオゲノミクスの適用範囲を拡大するため、新鮮凍結（FF）検体や手作業での前処理、マウス特異的な試薬を用いたときの本ワークフローの性能についても評価する予定です。GeoMx® DSP を用いた同一スライド空間プロテオゲノ
ミ ク ス 解 析 の 詳 細 に つ い て は 、 www.nanostring.com/spatialproteogenomics をご覧ください。

知 見 と 助 言 を 提 供 し て く だ さ っ た NanoString Technologies 社
Bridget Kulasekara、Karen Nguyen、Daniel R. Zollinger、Michelle Kriner、Michael Rhodes、Margaret Hoang 各氏、編集作業にご協力いただいた Aric Rininger 氏、NGS を支援してくださった NanoString 社 Corey
Williams 氏に感謝申し上げます。

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Conclusions • JAN 12, 2022

本製品の使用目的は研究用で、診断には使用できません。

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JAN 2022 MK4240