Res. Org. Geochem. 25, 29­38 (2009)論文

微少有機化合物の水素同位体比測定法 *力石嘉人 **（2009 年 4 月 7 日受付，2009 年 8 月 31 日受理）

Abstract
After the development of compound-specific isotope analysis (CSIA) by gas chromatograph/pyrolysis/isotope
ratio mass spectrometer (GC/pyrolysis/IRMS) in the end of the 1990s, stable hydrogen isotopic composition oforganic compounds has been employed for many fields of studies, particularly among the organic geochemicalcommunity as a powerful tool for tracing sources and delivery of organic compounds in geological and geographicalsamples and as a potential proxy for reconstructing paleoclimatic, paleohydrological, and paleosalinity changes.
However, sample amount required for accurate and precise determination of the isotopic composition is generally
10-50 nmol H for each compound, which is much larger than that of stable carbon (0.1-5 nmol C) and nitrogen(1-10 nmol N) on the isotope analysis by gas chromatograph/combustion/isotope ratio mass spectrometer (GC/combustion/IRMS). Here, I demonstrate the performance of GC/pyrolysis/IRMS on the small amount of samples,and suggest a mathematical correction for preventing systematic errors in the measured isotopic composition due todifferent sample amounts. By using this correction, the hydrogen isotopic composition of organic compounds canbe determined with a standard deviation (1σ) of better than 7‰ on the sample amount of 4 nmol H and even 13‰
on the sample amount of 2 nmol H. This correction thus allows us easy access to the hydrogen isotopic compositionof organic compounds containing with small concentration in samples.

揮発性を獲得できる有機化合物）であれば，試料

1. はじめに（溶媒抽出液）中に含まれる一つ一つの有機化合

かつて有機物の分子レベル安定水素同位体比物を単離することなく，個々の化合物の安定水素（D/H）分析は，高度な技術と経験を持つごく一部の科学者だけが扱える特殊な手法であった。しか同位体比を一度の分析で連続的に測定することができる。一般的に，測定に必要な試料量は 1 化合

し近年の技術発展，すなわち，ガスクロマトグ
ラフ / 熱分解 / 同位体比質量分析計（gas chromato-

物あたり水素量で 10 〜 50 nmol であり，1σ で 4 〜
7‰ の精度で測定される（Sessions, 2006）。測定にgraph/pyrolysis/isotope ratio mass spectrometer, GC/

要する時間は 1 試料あたり数十分〜1 時間程度でpyrolysis/IRMS）（Burgoyne and Hayes, 1998; Hilkert
et al., 1999）の開発・普及により，現在では誰にある。GC/pyrolysis/IRMS の登場により，有機化合でも扱える一般的な手法になった。この手法は，爆発的に広がり，今日では有機地球化学をはじめ揮発性の有機化合物（または誘導体化などによりとする様々な研究分野の研究に広く用いられるよ

物の分子レベル安定水素同位体比分析は世界中に*Compound-specific stable hydrogen isotope analysis of small amount of organic compounds** 独立行政法人海洋研究開発機構，海洋・極限環境生物圏領域，〒 237-0061 神奈川県横須賀市夏島町 2-15
Yoshito Chikaraishi: Institute of Biogeosciences, Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology 2-15
Natsushima-cho, Yokosuka, 237-0061, Japane-mail: ychikaraishi@jamstec.go.jp, Tel: 046-867-9778, Fax: 046-867-9775

−29−

力石嘉人

Fig. 1. Schematic of (a) GC/pyrolysis/IRMS used in the present study and (b) its m/z 2 chromatogram of n-alkane standards.

うになった（例えば，力石，2007）。
しかし，この GC/pyrolysis/IRMS による分子レ比については，窒素量で 1 〜 10 nmol あれば 1σ で0.3 〜 1.0‰ の精度で測定される（Sessions, 2006）。

ベル水素同位体比分析法は，ガスクロマトグラ
フ / 燃焼 / 同位体比質量分析計（gas chromatograph/

例えば，著者の研究室では，直鎖脂肪酸（炭素数14 から 34 程度）の同位体比を測定する場合に，炭combustion/isotope ratio mass spectrometer, GC/com-

素同位体比では 1 化合物あたり 5ng（炭素量で，約0.3 nmol）程度あれば 1σ で 0.3‰ の精度で測定でbustion/IRMS）を用いた分子レベル安定炭素・窒素同位体比分析法（Hayes et al., 1990; Merritt andHayes, 1994）と比較して，測定に必要な試料量が多い（例えば，力石 and 大場，2008）。これはとくに，土壌や堆積物などの地球環境試料や炭素質隕

きるが，水素同位体比では（本稿で述べる補正法
を使わない場合には）1σ で 5‰ 程度の精度を得る
ためには，1 化合物あたり 120ng（水素量で，約 15〜 16 nmol）程度が必要になる。

石などの地球外試料に含まれているごく微量の有

そこで本稿では，GC/pyrolysis/IRMS を用いた水機化合物を分析する上で，非常に大きな障害になる。一般的に GC/combustion/IRMS では，炭素同位素同位体比測定において，微少量の有機化合物を体比については，炭素量で 0.1 〜 5 nmol あれば 1σで 0.1 〜 0.3‰ の精度で測定され，また窒素同位体

分析する際の同位体比の変動を示し，少量の試料でも精度・確度の良い同位体比を得るための補正法を提案する。

−30−

微少有機化合物の水素同位体比測定法

2. 測定機器と試料
2.1. 安定同位体比の定義
安定水素同位体比は，国際標準物質である標準
平 均 海 水（Standard Mean Ocean Water, SMOW, D/
H=0.00015576）のそれに対する千分偏差（δD 値，
単位：‰，パーミル）で定義される（式 1）。
δD 値 = [(R 試料 /RSMOW) − 1]
× 1000（‰, vs SMOW）（式 1）
R は同位体存在比率（D/H）を示し，例えば，D/
H=0.00015732 の試料の場合には，SMOW との D/Hの差（+0.00000156）は，δD=+10‰と表される。試料の δD 値が正であれば，SMOW と比較して重水素（D）に富む（同位体的に重い）ことを示し，負であれば軽水素（H）に富む（同位体的に軽い）こFig. 2. (a) Determined δD values and (b) peak area ofn-alkane standards with respect to varying carriergas flow rate. Dashed lines represent the actual δDvalues.

とを示す。
2.2. GC/pyrolysis/IRMS
GC/pyrolysis/IRMS は，Agilent Technologies 社
製 の 6890N GC に Thermo Fisher Scientific 社 製 のGC-C/TC III interface と DELTAplusXP IRMS が オ

つ正確な同位体比が得られる，0.8ml/ 分の定流量（constant flow）モードに設定した。

ンラインで接続されたもので，GC の導入口にGerstel 社製の PTV（programmed temperature vapor-

2.3. 測定前の準備

ization，温度プログラム気化）導入法を，GC カラ
ム に，Agilent Technologies 社 製 の HP-1MS（ 長 さ30m× 外径 0.32mm× 膜厚 0.1μm）を使用した（概略

試料測定前の準備として，（1）熱分解炉内部へのグラファイト（触媒）コーティングの作製，（2）
標準 H2 ガスを用いて IRMS での検出感度等の調図を Fig. 1a に示す）
。GC オーブンの昇温条件は，50℃で 2 分間保持後 6℃ / 分で 310℃に昇温し 10

整（ピークセンターとオートフォーカス），（3）H3分間保持に，PTV の昇温条件は，60℃で 0.2 分間保持後 600℃ / 分で 350℃に昇温し 10 分間保持に，分解炉に GC の導入口から n- ヘキサンを 1μl ずつ
続けて 3 回導入することで作製した。
（2）は，標熱分解炉（内径 0.5mm，長さ 32cm のセラミック
チューブ）の温度は 1440℃に設定した。

準 H2 ガスを 1.1bar の圧力で GC-C/TC III interface
を通して導入し，PC ソフトウエア（isodat 2.0）にキャリアーガス（He）の流速は，有機化合物のH2 ガスへの熱分解効率に関わる重要ファクター

前の準備時のみに行い，得られた設定値を全てのファクターの測定を行った。（1）は，1440ºC の熱より行った。なお，オートフォーカスはこの測定の一つである（Fig. 2）。流速が速い場合には（例

試料に適用した。一方で，ピークセンターは各試

えば，2.0ml/ 分），有機化合物の熱分解効率が著しく低下し，正確な同位体比が得られない。一料の測定前に毎回行った。
（3）は，標準 H2 ガスの圧力を 0.4 〜 1.2bar（m/z 2 のシグナル強度でお方で，極端に流速を遅くした場合には（例えば，0.5ml/ 分），正確な同位体比が得られても，クロマ

よそ 1 〜 4V）まで 0.1bar の間隔で，一定時間（50秒）おきにそれぞれ 20 秒間導入し，PC ソフトウ

トグラム上での有機化合物の分離能の低下や GC/
pyrolysis/IRMS 内部における様々な接続部におけ

エア（isodat 2.0）により計算した。H3 ファクターの測定は試料測定前の準備時と最終試料の測定後る大気の侵入（リーク）の原因になる。本稿では， （11 試料の測定後）に行い，その変動は +0.02（同クロマトグラム上で十分な分離能が得られ，且位体比で約 0.3‰の誤差）であった。これは本研究
−31−

−32−

18
-90
19
-280
20
-94
21
-224
22
-37
23
-245
24
-54
25
-255
26
-64
28
-68
30
-57
32
-218
33
-58
36
-257
Mean on Δ
1σ on ΔCn δDdual inlet

continued.

18
-90
19
-280
20
-94
21
-224
22
-37
23
-245
24
-54
25
-255
26
-64
28
-68
30
-57
32
-218
33
-58
36
-257
Mean on Δ
1σ on ΔCn δDdual inlet

8 nmol (Mean area = 11.3 Vs)
δDref.gas=0‰ δDcorrect-1 Δ δDcorrect-2
175
-84
6
-88
-23
-279
2 -285
175
-84
10
-89
48
-209
15 -215
228
-32
5
-37
12
-244
1 -250
213
-47
7
-51
3
-253
2 -259
199
-60
3
-65
195
-65
3
-69
204
-56
1
-60
44
-213
5 -218
199
-60
-2
-65
12
-244
13 -250
5
5
Δ
2
-5
5
9
0
-5
3
-4
-1
-2
-3
-0
-7
7
-0
5

2 nmol (Mean area = 1.6 Vs)
δDref.gas=0‰ δDcorrect-1 Δ δDcorrect-2 Δ
211
-48
42
-70
20
30
-226
54
-290 -10
187
-72
22
-99
-5
94
-164
60
-213
11
244
-17
20
-32
6
69
-189
57
-243
2
220
-40
14
-60
-6
58
-199
55
-257
-2
215
-45
19
-66
-2
211
-49
19
-71
-3
210
-50
7
-73
-16
72
-185
33
-239 -21
220
-40
18
-60
-2
81
-177
80
-229
28
36
0
22
13

GC/pyrolysis/IRMS
12 nmol (Mean area =16.9 Vs)
16 nmol (Mean area = 23.2 Vs)
δDref.gas=0‰ δDcorrect-1 Δ δDcorrect-2 Δ δDref.gas=0‰ δDcorrect-1 Δ δDcorrect-2
162
-97
-7
-97
-7
167
-92
-2
-92
-31
-286
-6 -286-6-32-287-7 -287
161
-97
-3
-97
-3
160
-99
-5
-99
36
-221
3 -221
3
38-219
5 -219
225
-35
2
-35
2
223
-37
0
-37
10
-246
-1 -246-1
7-249-4 -249
206
-54
0
-54
0
204
-56
-2
-56
-1
-257
-3 -257-3-2-258-3 -258
196
-64
0
-64
0
193
-66
-3
-66
195
-65
3
-65
3
198
-62
6
-62
205
-55
2
-55
2
205
-55
2
-55
43
-214
4 -2144
44-213
5 -213
199
-60
-2
-60
-2
199
-60
-2
-60
7
-249
8 -2498
9-247
10 -247
-0
-0
0
4
4
5

GC/pyrolysis/IRMS
3 nmol (Mean area =3.2 Vs)
4 nmol (Mean area = 4.9 Vs)
δDref.gas=0‰ δDcorrect-1 Δ δDcorrect-2 Δ δDref.gas=0‰ δDcorrect-1 Δ δDcorrect-2
191
-68
22
-90
0
193
-66
24
-75
25
-232
48 -2773-3-259
21 -288
187
-73
21
-95
-1
174
-85
9
-95
78
-180
44 -2177
62-195
29 -217
240
-20
17
-35
2
234
-26
11
-30
59
-198
47 -2387
41-216
29 -240
227
-33
21
-50
4
206
-54
-0
-61
55
-202
53 -24213
32-225
30 -250
213
-46
17
-65
-1
201
-58
5
-66
199
-60
8
-81
-13
194
-65
3
-73
239
-21
36
-36
21
202
-58
-1
-65
65
-192
26 -231-13
65-193
25 -214
201
-59
-0
-79
-21
206
-54
5
-61
34
-222
35 -266-919-237
20 -264
28
-0
15
16
11
12

Δ
-2
-7
-5
5
0
-4
-2
-3
-3
6
2
5
-2
10
0
5

Δ
16
-8
-1
7
7
5
-7
5
-2
-6
-8
3
-2
-7
-0
7

40 nmol (Mean area =58.0 Vs)
δDref.gas=0‰ δDcorrect-1 Δ δDcorrect-2
168
-91
-1
-92
-27
-283
-2 -283
163
-96
-2
-97
38
-219
5 -219
225
-35
2
-36
7
-249
-4 -250
207
-52
2
-53
-3
-259
-4 -260
193
-66
-2
-67
197
-63
5
-64
204
-55
2
-56
42
-214
3 -215
201
-59
-0
-60
9
-247
10 -2481
4

6 nmol (Mean area =7.7 Vs)
δDref.gas=0‰ δDcorrect-1 Δ δDcorrect-2
179
-80
10
-89
-14
-270
10 -288
176
-84
10
-92
55
-202
22 -216
229
-31
6
-38
26
-230
15 -246
212
-48
6
-55
19
-238
17 -254
206
-54
10
-61
198
-62
6
-69
208
-52
5
-59
53
-204
14 -219
205
-55
4
-62
18
-239
18 -255
11
6

Δ
-2
-3
-3
4
1
-5
1
-5
-3
4
1
3
-1
9
-0
4

Δ
2
-7
2
8
-1
-1
-1
1
3
-1
-2
-1
-4
2
0
3

Table 1. δD values of n-alkane standards determined by traditional off-line (δDdual inlet) and GC/pyrolysis/IRMS methods (δDref.gas=0‰ , δDcorrect-1, and δDcorrect-2) with respect tovarying sample amounts.

力石嘉人

微少有機化合物の水素同位体比測定法の全期間を通して H3 ファクターの変動が測定値

また，本稿で提案する補正法の検証用の試料に与える影響は，実質的にほとんどないことを意として，同位体比既知（封管燃焼法により決定）の炭素数 16 の直鎖飽和脂肪酸のメチルエステル

味する。本研究では，試料の試料測定前の準備時に得られた H3 ファクターの値（4.12）をすべての化体（n-palmitic acid methylester），炭素数 22 の直試料に適用した。

鎖飽和アルカノールのアセチル化体（n-behenyl
acetate），スティグマステロールのアセチル化体

2.4. 試料と測定（stigmasteryl acetate）を 1 化合物あたりの水素量で2.5, 5, 10 nmol/μl になるように混合した標準溶液

量依存性や補正法を検討する試料として，同位体比既知（封管燃焼法により決定）の炭素数 18 〜
36 の直鎖飽和炭化水素（n-alkane）を 1 化合物あた（n-hexane 溶液）を調製し，上記と同条件で測定を行った。

りの水素量で 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16, 40 nmol/μl になる
ように混合した標準溶液（n-hexane 溶液）を調製した（Table 1）。なおこの標準溶液には，炭素数 172.5. データの取得とキャリブレーションのもの（n-heptadecane）も含まれているが，同位積分値の取得・同位体比の計算は，単位時間あクロマトグラム上での各化合物ピークの検出・体比を決めていないため本研究では評価していなたりのイオン強度の変化率（ピークの始まりと終い。オートサンプラーを用いてそれぞれの溶液を
1 μl ずつ GC/pyrolysis/IRMS に導入した（各試料のわり）をそれぞれ 0.2mV/s，0.4mV/s，最低検出強度を 200mV に指定することで，PC ソフトウエア

測定回数は 1 回）。H2 の標準ガスは PC ソフトウエ
ア（isodat 2.0）のプログラムにより，Fig. 1b のよう（isodat 2.0）の自動処理により行った（なお m/z 2のシグナル強度は，水素量 2 nmol の標準溶液で，に n-alkane のピークの前後に 2 回，3 回，それぞれ 20 秒間ずつ導入した。検出される m/z 2 のシグ

約 250mV である）。

ナル強度は，低炭素数のもので高く高炭素数のもので低くなる傾向があるが，その積分値（ピークエリア）は炭素数に関係なくほとんど一定であった（ばらつきは 5% 以内である）。

試料の同位体比は，標準 H2 ガスの同位体比を0‰ として得られた測定値（δDref.gas=0‰）と，封管燃焼法で得られている同位体比（δDdual inlet）との相関直線（Fig. 3）から計算した。水素量が 12 nmolの標準溶液を測定したときに得られた相関直線か

Fig. 3. Correlation between δD values determined by Dual inlet (vs. SMOW) and GC/pyrolysis/IRMS (vs. Ref. gas=0‰)with respect to varying sample amounts.

−33−

力石嘉人

Fig. 4. δDcorrect-1 values of typical n-alkane standards with respect to varying sample amounts. The marked
area indicates an error of ±7‰.

ら計算したものを δDcorrect-1 値（式 2）とし，それぞれの濃度で別々に得られた相関直線を用いて計算したものを δDcorrect-2 値（式 3）とした。各試料

れぞれ，10, 21, 48, 54‰ と顕著に大きくなる（Fig.
4）。このように，δDcorrect-1 値を用いた場合には，一般的な測定精度（1σ で 7‰ 以内）で測定できるにおける δDref.gas=0‰値，δDcorrect-1 値，δDcorrect-2 値
を Table 1 にまとめた。

最低試料量は，化合物あたり水素量で 8 nmol である。そして，2 nmol では δDdual inlet 値との差は平均

δDcorrect = 0.982 × δDref.gas=0‰ − 256（式 2）
δDcorrect = Slope × δDref.gas=0‰ + Intercept（式 3）で 36‰ にもなり，そのばらつきも 1σ で 22‰ になる（Table 1）。
3.2. δDcorrect-2 値
一方で上記（3-1 章）の問題は，それぞれの濃3. 結果と考察

度で別々に得られた相関直線を用いて計算した
δDcorrect-2 値にはほとんど見られない（Table 1）。例

3.1. δDcorrect-1 値
δDcorrect-1 値は，ある一つの濃度の標準試料で得られた相関直線を様々な濃度の試料にそのまま適

えば，炭素数 19 の飽和炭化水素（n-nonadecane）
で は，2 〜 40 nmol の す べ て の 濃 度 に お い て用して得られた値であり，すなわち少量の試料をδDcorrect-2 値と δDdual inlet 値の差は ±10‰ 以内である

分析する際の同位体比の変動を無視したキャリブ（Fig. 5）。他の炭素数の n-alkane についても，水素量が 8 nmol 未満になっても，δDcorrect-2 値と δDdual

レーション法で計算された値である。このような場合には，δDcorrect-1 値と δDdual inlet 値の差は，水素量が 8 nmol 以上の場合には一般的な測定誤差

inlet 値の差は，常に平均で 0‰ であり，そのばら以内（1σ で 7‰）であるが，8 nmol 未満の場合には，有意に（10‰ 以上）大きくなる（Table 1）。例

あっても 1σ で 13‰ である。このように δDcorrect-2
値を用いれば，一般的な測定精度（1σ で 7‰ 以内）

えば，炭素数 19 の飽和炭化水素（n-nonadecane）
では，水素量が 8 nmol 以上の場合には δDdual inlet 値で測定できる最低試料量は，化合物あたり水素量で 4 nmol になり，これは δDcorrect-1 値を用いた場との差は ±7‰ 以内であるが，水素量が，6, 4, 3, 2
nmol と小さくなるにつれ，δDdual inlet 値との差はそ合の約半分である。

つきは 4 nmol 以上では 1σ で 7‰，また 2 nmol で−34−

微少有機化合物の水素同位体比測定法

Fig. 5. δDcorrect-2 values of typical n-alkane standards with respect to varying sample amounts. The marked
area indicates an error of ±7‰.

3.3. 実試料の測定比おける補正法

積分値，δDref.gas=0‰値，Fig. 3 の相関直線の傾きとFig. 3 に示すように，標準 H2 ガスの同位体比を0‰ として得られた測定値（δDref.gas=0‰）と封管燃切片を用いた補正法を提案する。
Fig. 6a に示すように，化合物の水素量と GC/

焼法で得られている同位体比（δDdual inlet）の間に

pyrolysis/IRMS での測定で得られた積分値の間には，正の相関関係がある。そして相関係数（R ）は，試料量が 4 nmol 以上では 0.994 以上であり，は，明確な正の相関関係（R2=0.999）がある。そして，その積分値と Fig. 3 の相関直線の傾きと切2, 3 nmol であっても，それぞれ 0.987, 0.981 と，非2

常に強い相関関係を示す。しかし，相関直線の傾片の間には，それぞれ Fig. 6b, 6c に示すような関係がある。積分値が 16.9Vs（m/z 2 の強度で，約きは，40 〜 12 nmol では 0.981 〜 0.982 とほぼ一定であるのに対し，8, 6, 4, 3, 2 nmol と試料量が少2.5V）以上では，傾きも切片も一定であるので，同位体比のキャリブレーションは，12 nmol の試

なくなると 0.990 から 1.210 へと増加する。またその切片は，40 〜 12 nmol では −257‰ 〜 −256‰ と料で得られた値（傾き =0.982, 切片 =−256‰）を用いる（式 2）。一方で，積分値が 1.6Vs 以上 16.9Vs

ほぼ一定であるのに対し，8, 6, 4, 3, 2 nmol と試料量が少なくなると −262‰ から −326‰ へと減少す

未満では，式 3 に Fig. 6b, 6c の近似式（それぞれ，
式 4, 5）より得られた傾き（Slope）と切片（Inter-る。なぜこのような変化が観察されるのかについての明確な原因は，残念ながら現在のところ不明

cept）を用いる。
Slope = −5.81 × 10−8 × Area5 + 7.13 × 10−6であり，メモリー効果（5 章参照）や熱分解効率の変化，m/z 2 の強度が 1V 以下での H3 ファクター

× Area4 − 3.13 × 10−4 × Area3+ 6.65 × 10−3 × Area2 − 7.19 × 10−2の変動，GC クロマトグラムのバックグラウンド

× Area + 1.305（式 4）Intercept = −2.34 × 10−6 × Area6 + 2.99 × 10−4の影響の増大などの可能性が考えられる。
GC/pyrolysis/IRMS による分子レベル安定水素
同位体比分析では，一般的に試料に含まれる有機× Area5 − 1.39 × 10−2 × Area4+ 3.19 × 10−1 × Area3 − 4.03 × Area2化合物の量が化合物ごとに異なることが多く，実際の測定では，化合物ごとに積分値（area, 単位 :なお，これらの近似式は，表計算・グラフ PC

Vs）や δDref.gas=0‰値が得られる。そこで本稿では，

ソフトウエア（Hulinks 社製，カレイダグラフ）に+ 29.5 × Area − 364.8

−35−

（式 5）

力石嘉人

Fig. 6. (a) Hydrogen amount injected into GC, (b) slope and (c) intercept on the correlation line of the δDref.
gas=0‰ and δDdual inlet values, and (d) standard deviation on the δDcorrect-2 value, with respect to varying
m/z 2 mean area on the chromatogram.

より求めた（5 次式まで与えて補正を行う重要性があるかどうかには疑問が残るが，近年の PC の発達により非常に簡易に多次元の近似式が得られるので，本稿ではその近似式をそのまま用いた）。
このキャリブレーション法を用いると，一般的な測定精度（1σ で 7‰ 以内）が得られる最低試料量は，化合物あたり水素量で 4 nmol であり，また 2nmol であっても 1σ で 13‰ の精度である。

により傾きと切片を求め，式 3 を用いて同位体比（δDcorrect-2 値）を求めた。
Table 2 に示すように，δDref.gas=0‰値は化合物の導入量により大きく異なる。例えば，n-palmitic
acid methylester では，2.5, 5, 10 nmol のときに，それぞれ 88, 54, 42‰ である。しかし，式 3, 4, 5 を用いて得られた δDcorrect-2 値は，2.5 nmol では，δDdual
inlet 値との差が± 9‰以内，5, 10 nmol ではその差が± 4‰以内と，3 種の化合物・3 種の導入量すべてで δDdual inlet 値と良い一致を示した。このよう

3.4. 検証
n-palmitic acid methylester, n-behenyl acetate, stig-に，式 3, 4, 5 を用いたキャリブレーションは，少masteryl acetate の標準溶液を測定し，得られた積量の有機化合物の水素同位体比を精度・確度よく分値，δDref.gas=0‰ 値を Table 2 に示す。得られた積分値は 2.5 〜 14.1Vs の範囲にあるので，式 4, 5

測定するうえで有効な手法である。

−36−

微少有機化合物の水素同位体比測定法

Table 2. δD values of typical lipid standards (n-palmitic acid methylester, n-behenyl acetate, and stigmasterol)
determined by traditional off-line (δDdual inlet) and GC/pyrolysis/IRMS method (δDcorrect-2) withrespect to varying sample amounts.
Compounds
2.5 nmoln-Palmitic acid methylester
n-Behenyl acetate
Stigmasterol acetate
5 nmoln-Palmitic acid methylester
n-Behenyl acetate
Stigmasterol acetate
10 nmoln-Palmitic acid methylester
n-Behenyl acetate
Stigmasterol acetate

δDdual inlet

GC/pyrolysis/IRMS
Area (Vs) δDref.gas=0‰ (‰) Slope Intercept (‰) δDcorrect-2 (‰ )

Δ (‰)

-218
-295
-245

2.5
2.5
2.5

88
22
52

1.17
1.17
1.17

-312
-312
-312

-210
-287
-251

8
9
-6

-218
-295
-245

6.5
6.3
6.6

54
-13
35

1.05
1.05
1.05

-277
-278
-277

-220
-292
-240

-2
4
4

-218
-295
-245

14.0
13.8
14.1

42
-38
11

0.99
0.99
0.99

-257
-257
-257

-216
-295
-246

2
0
-1

比を精度・確度良く確実に測定するには，必ず同

4. ま と めGC/pyrolysis/IRMS による分子レベル水素同位体比分析法は，測定に必要な試料量が 1 化合物あたり水素量で 10 〜 50 nmol と比較的多く，これは位体比既知の標準試料を用いて，δDref.gas=0‰値とδDdual inlet 値の相関直線の傾き・切片や，式 2 〜 5の各項を個々の装置や測定シークエンスごとに調整し，また，数試料毎に様々な濃度の標準有機化試料に含まれているごく微量の有機化合物を分析

合物を測定し，装置の状態が一定に保たれている

する上で大きな障害になっている。そこで本稿でのかを常にモニターする必要がある。

は，GC/pyrolysis/IRMS による分子レベル水素同

5. コメント位体分析法における試料量と得られる同位体比の関係を示し，また少量の試料でも精度・確度の良5.1. メモリー効果について

い同位体比を得るための補正法を提案した。本補正法を用いると，一般的な測定精度（1σ で 7‰ 以2008 年 の 終 わ り に，Wang and Sessions は GC/
pyrolysis/IRMS を用いた分子レベル同位体比測定内）で測定できる最低試料量は，化合物あたり水法におけるメモリー効果についての論文を発表した（Wang and Sessions, 2008）。メモリー効果とは，素量で 4 nmol になり，また 2 nmol であっても 1σ
で 13‰ の精度で測定することができる。

クロマトグラム上で前に検出される有機化合物のなお，GC/pyrolysis/IRMS による分子レベル安同位体比が，後に検出される有機化合物の同位体

定水素同位体比測定では，試料導入量と得られるに干渉することであり，彼らの報告によれば，2積分値の関係は，装置の様々な条件や測定対象の有機化合物の種類で左右される（力石 and 大場，つの有機化合物のピークがクロマトグラム上で約100 秒離れていても，後に検出される有機化合物

2008）。著者の経験では，一つの装置を同条件で使っている場合には，30 〜 40 試料の連続分析（1おおむね 2 〜 4％の影響を受ける。そしてこのメは，前に検出される有機化合物の同位体比から，

試料 1 時間の分析で，約 2 日）の中では，H3 ファ

モリー効果は，2 つの化合物ピークの間隔が狭く

クターも含めこれらの項はほとんど変化しない

なり，後に検出される有機化合物のピークエリア

が，イオンソースのフォーカスを再設定したり，が小さくなり，熱分解炉の累積測定数が多くなる

測定待機時に熱分解の温度を一時的に下げたり，熱分解炉や GC カラムを交換した場合には，これと，顕著（5% 程度）になる。
本稿で用いた n-alkane 標準溶液は，同位体比のらの項は大きく変化することが多い。また，クロ

範囲が −37‰ 〜 −280‰ であり，クロマトグラム上で隣接するピークの間隔は狭いところで 80 秒程度

マトグラム上の前の化合物ピークの同位体的な干渉，いわゆる メモリー効果 （5-1 章参照）の影響も懸念されるため，有機化合物の安定水素同位体である。メモリー効果を 2 〜 4％と仮定すると，得られる同位体比は 5 〜 13‰ 程度の誤差を生じるこ

−37−

力石嘉人

とになる。実際に Table 1 の δDcorrect-1 値の Δ 値を注意深く見ると，前に検出される n-alkane の同位体比が低い場合は小さい値に，高い場合は大きい値になる傾向がある。しかしこの n-alkane 標準溶液で得られた補正式（式 2 〜 5）を，n-palmitic acidmethylester，n-behenyl acetate，stigmasteryl acetate の標準溶液の測定に用いても（クロマトグラム上でのこれらの有機化合物ピークの間隔は 300 秒以上である），得られた δDcorrect-2 値は，3 種の化合物・3 種の導入量すべてで δDdual inlet 値と良い一致を示していることから，間接的証拠ではあるが，本測定におけるメモリー効果は測定誤差以内と考えられる。メモリー効果の評価には本原稿で議論する量依存性を考慮する必要もあり，また，装置の様々な条件や測定対象の有機化合物の種類で左右される

謝辞

著者が分子レベル安定同位体比分析法を習得するにあたり，奈良岡浩教授（九州大学）
・SimonR. Poulson 助教授（ネバダ州立大学）・大河内直彦
博士（海洋研究開発機構）には，非常に熱心なご指導をいただきました。心より厚く御礼申し上げます。本稿の執筆において，サーモフィッシャー
サイエンティフィック株式会社の大堀基己氏にはメーカーエンジニアとしての立場から，当研究室研究生の山口保彦氏（東京大学・修士課程学生）にはユーザーとしての立場から，様々なアドバイス・助言を頂きました。また，奈良岡浩教授（九州大学），大場康弘博士（北海道大学）には，本稿の査読を通じて，大変貴重なアドバイス・コメン
トを頂きました。記して厚く感謝致します。

と考えられる。Wang and Sessions（2008）の結果がすべての測定機，測定条件，すべての有機化合物

引用文献に当てはまる事象であるのか，またその影響が有Burgoyne T. W. and Hayes J. M. (1998) Quantitative
production of H2 by pyrolysis of gas chromatographic effluents. Anal. Chem. 70, 5136-5141.

意であるのかは，今後注意深く調べる必要がある。
5.2. 化合物の種類と同位体比一般的に，GC/pyrolysis/IRMS や GC/combustion/
IRMS を用いた有機化合物の分子レベル安定同位体比測定法では，同位体比既知の標準有機化合物には，できるだけ測定対象の化合物と同じものを用いることが望ましい（力石 and 大場，2008）。これは，GC カラムや熱分解炉などの測定装置内部
での同位体分別が否定できないため，試料有機化
合物と構造が大きく異なるものを標準有機化合物として用いる場合には，両者の同位体分別の程度（大きさ）が大きく異なる可能性があるためである（力石 and 大場，2008）。
本稿では，補正式を直鎖飽和炭化水素の測定で作製し，その検証を n-palmitic acid methylester，nbehenyl acetate，stigmasteryl acetate で行ったが，力石 and 大場（2008）で指摘されるような懸念は見られなかった。しかし，実際に GC/pyrolysis/IRMS
を用いて水素同位体比を測定する場合には，標準有機化合物としてどのような有機化合物が適切であるか（どのくらい構造が異なった有機化合物でも使用できるのか）を，それぞれの測定機，測定条件について必ず検討して頂きたい。

力石嘉人（2007）脂質・色素分子の安定水素同位体
組成 Res. Org. Geochem. 21, 1-18.
力石 and 大場（2008）ガスクロマトグラフ / 同位体
比質量分析計による分子レベル安定同位体比分析法 Res. Org. geochem. 23/24, 99-122.
Hayes J. M., Freeman K. H., Popp B. N., and Hoham
C. H. (1990) Compound-specific isotopic analyses: A
novel tool reconstruction of ancient biogeochemical
processes. Org. Geochem. 16, 115-1128.
Hilkert A. W., Doutitt C.B., Schlüter H. J., and Brand
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in compound-specific D/H analysis by gas chromatography/pyrolysis/isotope-ratio mass spectrometry.
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−38−