茨城県工業技術センター研究報告 第 36 号

県産農産品の機能性成分の調査研究
フクレミカンの機能性成分探索
坂井祥平*

宇津野典彦*

武田文宣**

中川力夫*

１．はじめにカンキツ類のもつ生体調節機能（機能性）については，疫学研究を含めて既に多数の研究報告がある(1)。
その中でも近年，カンキツ類の成分であるβ－クリプ
トキサンチン，ノビレチンやオーラプテンに発ガン抑制効果があることが明らかにされたことにより，カンキツが身近な機能性食品として認知されてきた。βクリプトキサンチンは温州みかん，ノビレチンはシーク
ワシャー，ポンカン，オーラプテンはカラタチなど，それぞれ既に経済栽培されている品種に比較的多く含まれていることが報告されており，機能性食品素材としてのカンキツに注目が集まっている(2)。
本県で昔から親しまれてきたカンキツにフクレミカン（福来みかん）がある。熟すと果皮が実と分離して，果皮が“ふくれ”て見えることからその名がついたといわれるこのカンキツは，古くは食用として，現在では，果皮を乾燥させて七味唐辛子の原料とするために一部地域で栽培されている。
地元では有名なフクレミカンも，多くのカンキツ中では地方品種の１つにすぎず，その機能性成分等についてこれまで詳細に検討されたことはなかった。そこ
で，フクレミカンの機能性食品素材としての可能性に着目し，フクレミカンに含まれているフラボノイド類を定量し，また ORAC 法により抗酸化性を評価したので報告する。
試料および実験方法
試薬類 ナリンジン（NRG），エリオシトリン（ECR），ネオエリオシトリン（NER），ポンシリン（PON），ノビレチン（NOB），タンゲレチン（TNG），ジオスミン（DSM），ヘスペレチン（HPT），ルテオリン（LTN）の HPLC スタンダード及びフルオロセインナト
リウム塩，Trolox は Sigma-Aldrich 製を用いた。ナリルチン（NRT），ネオジオスミン（NDM），シネンセチン（SNT），イソロイフォリン（IRF），ロイフォリン（RFN）の HPLC スタンダードは Extrasynthese，ヘスペリジン（HSP）の HPLC スタンダード，HPLC 用メ
タノール及び 2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオンアミジン)ニ塩酸塩（ＡＡＰＨ）は和光純薬工業製を用いた。その他，記載のないものは全て特級試薬を用いた。
供試試料 フクレミカンの果実は，平成 19 年 11 月
13 日に桜川市で採集した。いずれの日程も同一の果*地場食品部門**食品バイオ部門

樹園の異なる 3 本以上の木からそれぞれ 3 個以上，合で４kg になるよう採取した。それぞれの果実は，収穫当日または貯蔵が終了した時点でナイフで粗く切って凍結乾燥（以下，FD）した。
FD 試料は果皮，じょうのう，じょうのう膜，種子に分別し，使用時まで－80℃で保存した。
貯蔵試験 貯蔵試験は貯蔵温度・日数を因子とし，採集日から 13 日間行った。すなわち，収穫した果実を 5℃，20℃に保った恒温器の中でそれぞれ２５個程度，重ならないようにして貯蔵し，３日ごとに６個または７個の果実を取り出して（3，6，9，13 日），HPLC 分析に供した。
抽出方法 フラボノイド定量用試料は，乳鉢で粉砕した FD 粉末 0.1g に対して，4mL の抽出溶媒を加えて12 時間室温で回転振とうして抽出した。抽出溶媒の組成はメタノール：ジメチルスルホキシド＝1：1（体積比）である。抽出後は遠心分離して上清を回収し，孔径 0.45μm のメンブレンフィルタでろ過して分析まで－80℃で保存した。
親水性 ORAC 測定用の試料は FD 粉末 0.1g に対してAWA を 4mL 加えて 12 時間回転振とうした。AWA はアセトン：蒸留水：酢酸＝70：29.5：0.5（体積比）である。抽出後は遠心分離して上清を回収して分析まで－80℃で保存した。
HPLC 分析条件 フラボノイドの定量は野方の方法(3)により行った。すなわち，Agilent 1100HPLC システ
ムを用い，フォトダイオードアレイで 200-450nm の吸収スペクトルを検出した。分離カラムはメルク製 LiC
hrospher100 RP-18(250mm×4.0mm)及びガードカラムを用いた。カラムオーブン温度は 40℃とし，流速は0.6ml/min，サンプルは 10μL 注入した。分離は 0.01M リン酸，メタノールの２液の３ステップによるグラジエントで，0.01M リン酸を(1)0-55 分 70-55% (2) 55-95 分 55-0% (3)95-100 分 0%とそれぞれ線形的に変化させた。また１測定終了後は測定開始時の移動相組成で 15 分間流し，安定させる操作を行った。この115 分を１サイクルとして，１水準について２回測定を行った。
各スタンダードは0.4mg/mLとなるように抽出溶媒に溶解し，0.1mg/mL，0.05mg/mL及び0.025mg/mLとなるように移動相によって希釈した。

茨城県工業技術センター研究報告 第 36 号

溶出成分はリテンションタイム及び紫外可視吸収ス
ペクトルをスタンダードと比較し同定した。定量は絶対検量線法により行った。
親水性ORAC法 親水性ORAC測定はグレーティングマ
イクロプレートリーダーSH-8000Labで行った。恒温器は37℃に設定し，一般的なORAC法の条件で測定を行った。すなわち，AAPHをペルオキシラジカル発生源としTroloxをスタンダードとするものである。
Trolox は 75mM リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）で溶解し，50，25，12.5，6.25μＭの各濃度となるよう用時調製した。分析試料もリン酸カリウム緩衝液で段階的に希釈した。また，フルオロセインナトリウム塩，AAPH は 75mM リン酸カリウム緩衝液で溶解し，それぞれ 81.6nM，200mM となるよう用時調製した。
96 ウェルマイクロプレートの各ウェルに 25μＬのサンプルまたは Trolox 溶液またはブランク（リン酸カリウム緩衝液）を分注し，150μＬのフルオロセインナトリウム塩溶液を加えた。
各ウェルに 25μL の AAPH を加えて撹拌したのち，直ちに蛍光強度を測定した。その後は各ウェル６０秒ごとに蛍光強度を記録して，その減衰を観察した。
プレートリーダーのパラメーターは次のとおりである：測定法，カイネティック；励起波長，485nm；蛍光波長，528nm；半値幅，12nm；測定回数，40 回；測定間隔，60 秒；撹拌時間，9 秒間（初回のみ，直線）；分注間隔，1 秒
親水性 ORAC 値は試料濃度に対する蛍光強度の減衰曲線下面積（netAUC）の回帰直線を用いて計算した。
値はスタンダードとして用いる Trolox 相当量として得られ，その単位はμmolTE/g（TE：Trolox 相当量）である。netAUC は Trolox または試料の曲線下面積 AUC（Area Under the Curve）からブランクの AUC を減じて得た。

NOB はシークヮシャーやポンカンの果皮に大量に含まれていて，その機能性についても研究がすすんでいる。細胞試験や動物試験で優れた抗がん作用が示唆されており，利用が期待されているカンキツ機能性成分の一つである(2)。フクレミカン果皮にも NOB が多く含まれていることが明らかになったことで，今後は機能性食品素材として加工利用法を検討していく。
また，カンキツのフラボノイド類は果実の成熟過程において変化することが既に知られ，フラボノイド類が多く含まれる未成熟のカンキツ果実を加工原料として利用することが検討されている(4)。図 1,2 で示した貯蔵試験の結果が示すとおり，貯蔵条件によりフラボノイド組成や量に大きな変化がなかったのは，試験に既に成熟した果実を使用したためだと思われる。今後は，未成熟の時期も含めて収穫時期と成分の関係を検討する必要がある。
表１ フクレミカンの部位ごとのフラボノイド組成
ECRNERNRTHSPSNTNOB
TNG

じょうのう じょうのう膜
種－－－4.5－－48－－65
320
10－－－－－－－－－（単位 mg/100g－乾燥重量）

表２ 県産カンキツのフラボノイド含有量
フクレミカン
ECR
NER
NRT
HSP
SNT
NOB
TNG

貯蔵日数（日）３．実験結果および考察
フラボノイド組成について HPLC によるフクレミカンのフラボノイドの定量結果を表１に示した。ピークが小さく定量することが不適当であったものを除くと全部で７種類のフラボノイド類を同定することができた。
４つの部位ともに最も多く含まれているのは HSP であった。HSP はカンキツ類に含まれる代表的なフラバノンであり，表 2 に示した他の県産カンキツにも多く含まれている。
その他には果皮やじょうのう膜にフラバノンの NRTの含有量が比較的多かった。
そのなかでも，特徴的なのは果皮に含まれるポリメトキシフラボンの NOB，TNG で，これは他の県産カンキツと比べてもフクレミカンの果皮のみに特徴的に含まれている成分であることが明らかになった。
貯蔵による果汁中のフラボノイド含有量の変化について図 1，2 に示した。5℃，20℃ともに貯蔵により顕著な組成や量の変化は見られなかった。

果皮
8.0
3.35.04004.85656

温州ミカン
ユズ（宮川早生）
2.91.4－1.03.3－6.65928170210401.4－－
171.8－
17－－（単位 mg/100g－新鮮重量）

03NER
HSP
NOBTNG

6913050100150
フラボノイド含量(mg/100ml)

200

図１ 20℃で貯蔵した果実の果汁中のフラボノイド量の変化

貯蔵日数（日）茨城県工業技術センター研究報告 第 36 号

03NER
HSP
NOB
TNG

6913050100150
フラボノイド含量(mg/100ml)200

図２ 5℃で貯蔵した果実の果汁中のフラボノイド量の変化
フクレミカンの抗酸化性について 親水性 ORAC 法によるフクレミカンの分析結果は 30.5μmolTE/g－新鮮重量であった。部位ごとの測定結果を表３に示した。
乾燥重量あたりでは ORAC 値は果皮で最も高く，次いでじょうのう膜で高かった。
表３ フクレミカンの親水性 ORAC 値
部位
果皮
じょうのうじょうのう膜
種ORAC 値
320 ± 40
60.4 ± 20
170 ± 3.0
84.0 ± 17（単位 μmolTE/g-乾燥重量）

一般のカンキツ類の抗酸化性については，文献によると，ネーブルオレンジの親水性 ORAC 値は 17.85，タンジェリンは 16.13，グレープフルーツは 15.13μmolTE/g－新鮮重量と報告されており(5)，これらと比較してもフクレミカンの親水性 ORAC 値はカンキツ類として高い部類に入るといえる。これはフクレミカン
は果実が小さいことにより，単位重量当たりの果皮の占める割合が多く，結果として親水性 ORAC 値も高くなったためであると考えられる。
フクレミカンの果皮は現在でも陳皮に加工され，七味唐辛子の材料として用いられているが，今回の実験結果から果皮には有用なフラボノイド類が多く含まれ，また抗酸化性が高いことが明らかになったので，機能性食品素材として加工食品への新たな応用が期待できるものである。
謝辞 ORAC 法についてご教授くださいました食品機能性評価支援センターの皆様に感謝申し上げます。

参考文献(1) 食品の機能性分析.㈱流通システム研究センター
編.2005.144-151(2) 矢野昌充.カンキツによるガン予防.日食工誌.
2002.49.139-144(3) 野方洋一.カンキツ果実の機能性成分の検索とその有効利用に関する研究.近中四農研報.
2005.5.19-84(4) 公開特許公報.ヘスペリジン高含有食品及びその製造方法.特開 2005-27864(5) Xianli,Wu.;Gray,R.B.;Joanne,M.H.;David,B.H.;
Suzan, E.G.;Ronald,L.P.Lipophilic andhydrophilic antioxidant capacities of common
foods in United States.J.Agric. Food.Chem.
2004, 52, 4026-4037