学位研究紹介

105

学 位 研 究 紹 介

Nested PCR 法を用いて決定された日本人
成人の口腔 Helicobacter pylori 有病率
Current Prevalence of Oral
Helicobacter pylori among Japanese
Adults Determined Using a Nested
Polymerase Chain Reaction Assay
新潟大学大学院医歯学総合研究科う蝕学分野

永田

量子

２．試料採取部位，方法
試料は無刺激唾液，舌苔及び上顎前歯，下顎前歯，上顎右側臼歯，下顎左側臼歯部のデンタルバイオフィルム（DB）を採取した。舌苔は舌ブラシにて，舌表面を 2,3 回擦り，生理食塩水内に撹拌した。DB は滅菌したスプーンエキスカベータにて採取した。各試料は 10000rpm 10 分で遠心分離を行い，DNA 抽出まで -80 にて凍結保存した。
３．DNA 抽出，Nested PCR
陽性対照は H. pylori IID3023 株を，陰性対照は滅菌蒸留水を使用した。各試料から DNA を抽出後（NucleoSpin®

Division of Cariology, Operative Dentistry and Endodontics,

Microbial DNA Kit, TaKaRa Bio），417bp を標的遺伝子

Faculty of Dentistry & Graduate School of Medical and Dentalとした EHC-U（5′-CCCTCACGCCATCAGTCCCAAAASciences, Niigata UniversityA-3′）と EHC-L（5′-AAGAAGTCAAAAACGCCCCAAA

Ryoko Nagata

AC-3′）プライマーにてシングルステップ PCR を，続いて，228bp を標的遺伝子とした ET-５U（5′-GGCAAATCATAAGTCCGCAGAA-3′） と，ET-５L（5′-TGAGACTTTCCT【目的及び背景】

AGAAGCGGTGTT-3′）プライマーを用いて Nested PCRを行った。増幅産物の有無は，1.5% アガロースゲル電

胃がんや慢性胃炎の原因である Helicobacter pylori の気泳動により確認した６）。

感染率は国の衛生状態などの条件により，19~88% と異な

４．DNA シークエンシングる 1）。H. pylori の感染経路は不明確であり，胃のみなら
2）

Nested PCR にて H. pylori が検出された口腔内サンプル

ず口腔内からも検出されている 。しかし，H. pylori はと陽性対照株の増幅産物の 228bp 部をアガロースゲルカッ

口腔では休眠状態で存在するため，培養法では検出困難

ターで切り出し，精製後，DNA シークエンシングによる相3）である 。これまで，口腔 H. pylori の検出には PCR 法が同性解析を行った（Miseq ペアエンド解析 , イルミナ社）。

主体となって使用されてきた。
しかし，その検出率は 0%～さらに，Streptococcus mutans UA159 株と，H. pylori

4）

100% とばらつきがあり，明らかではない 。現在，日本

IID3023 株を段階希釈した混合細菌懸濁液を作製し，そのの衛生環境は改善され H. pylori の感染率は減少したた

PCR 増幅産物より Nested PCR 法の検出限界を解析した。

め，胃がんの発生率も減少すると予想されている 5）。胃と【結果および考察】

口腔の H. pylori 感染について強い関連性がある場合，若年者集団における胃と口腔の H. pylori 感染率の低下は相関すると考えられる。しかし，日本人の口腔 H. pylori 検

DNA シークエンシングの結果，Nested PCR で増幅し出率に関する知見はない。そこで本研究では，Nestedた遺伝子は，H. pylori 標準株の遺伝子と 100% の相同性

PCR 法にて日本人の口腔 H. pylori 検出率を検索し，年齢，が確認された。口腔 H. pylori の陽性率はシングルステッ

性別，サンプリング部及び病歴ごとに相対頻度を分析した。

プ PCR にて 88 人中２人（2.3%），Nested PCR にて 88 人

【方中 32 人（36.4%）であった。男女間での検出率に有意差法】

はなく（男性 29.4%，女性 40.7%），年齢別でも，高齢者（65-91 歳），中高年者（35-64 歳），若年者（24-34 歳）で検出率は各々 38.7,48.3,21.4% であり有意差はなかった（p>１．被験者の選択
本研究は新潟大学倫理審査委員会へ申請承認後，承認0.05, χ2 test）（Table １）。このことは口腔 H. pylori は性ガイドラインに従って行われた（承認番号 2017-0150）。

別や年齢に関係なく存在し，成人の口腔細菌叢の一部で被験者は 2018 年１月から 2020 年４月までに新潟大学医ある可能性が示された。また，H. pylori 罹患歴がある被歯学総合病院歯の診療科を受診し，本研究の趣旨を説明

験 者 の陽 性 率は 80.0% で 有 意に 高く（p<0.05, Fisher’s

し同意が得られた 24-91 歳の男女 88 名（女性 54 名，男exact probability test）（Table 1），口腔が H. pylori の潜性 34 名，平均年齢 52 歳）とした。

在的なリザーバーとして機能していることが示唆された。
－ 35 －新潟歯学会誌

106

Table 1. Association between the presence of oral H. pylori andsocio-demographic variables and medical history.
Individuals
Prevalence（Positive/Total） （%）

GenderMale
FemaleGeneration（age）
Young（24 to 34）
Middle-aged（35 to 64）
Elderly（64 to 91）
Medical history
Gastric infection
carrier & Received
eradication therapy
Experience notrequired

10/34
22/5429.440.76/2821.4

14/2948.3

12/3138.751（2）：2021に最適な環境である可能性があり，生息部位は環境依存的であると考えられた。検出限界はシングルステップ
PCR にて 1 × 104CFU であり Nested PCR にて 10 CFUpであった。この結果，DB 中において H. pylori の予想さ0.364

れる存在比率は 0.0001% 未満と考えられる（Figure 1）。

【結0.103論】

口腔 H. pylori は胃への感染の有無にかかわらず口腔に存在している可能性があることが示された。しかし，口腔がH. pylori の感染および再感染の潜在的なリザーバーとして12/15

80.0

20/73

27.4機能しているかは不明である。口腔細菌叢，口腔疾患および胃がんの再発に対する口腔 H. pylori の影響を解明するためには感染機序や感染経路等，更なる研究が必要である。

0.02【引 用 文 献】１）Hooi, J.K.Y. Lai, W.Y. Ng, W.K. Suen, M.M.Y.
Underwood, F.E. Tanyingoh, D. Malfertheiner, P.
Graham, D.Y. Wong, V.W.S. Wu, J.C.Y. et al.
Global prevalence of Helicobactoer pylori
infection: Systematic review and meta-analysis.
Gastroenteology. 153, 420-429, 2017.
２）Yee, J.K.C. Are the view of Helicobacter pylori
colonized in the oral cavity an illusion? Exp.

Figure 1. Detection limits for single-step and nested PCR.
PCR products were prepared from bacterial suspensions
containing various proportions of H. pylori IID3023 and S.
mutans UA159 7）. A: Single-step PCR. B: Nested PCR. Lane
M, 100-bp DNA ladder.

３）Dowsett, S.A. Kowolik, M.J. Oral Helicobacter

Table 2. Frequent sites of oral H. pylori .

４）Adler, I. Muiño, A. Aguas, S. Harada, L. Diaz, M.

7）Supragingival biofilm
Lower incisor
Upper incisor
Lower left molar
Upper right molar
SalivaTongueIndividuals
Prevalence（Positive/Total） （%）
19/88
14/88
3/88
1/88
4/88
2/88

21.6
15.9
3.4
1.1
4.5
2.3

OR

Mol. Med. 49, e397, 2017.
pylori: Can we stomach it? Crit. Rev. Oral Biol.
Med. 14, 226-233, 2003.
Lence, A. Labbrozzi, M. Muiño, J.M. Elsner, B.
Avagnina, A. et al. Helicobacter pylori and oral

24.0
16.5
3.1
1

The number includes overlapping detections among theabove individual sites. OR: Odds ratio

pathology: Relationship with the gastric infection.
World J. Gastroenterol. 20, 9922-9935, 2014.
５）Miyamoto, R. Okuda, M. Lin, Y. Murotani, K.
Okumura, A. Kikuchi, S. Rapidly decreasing
prevalence of Helicobacter pylori amongJapanese children and adolescents. J. Infect.
Chemother. 25, 526-530, 2019.

また，未検査者の 27.4％からも H. pylori が検出された。

６）Song, Q. Spahr, A. Schmid, R.M. Adler, G. Bode,

さらに，罹患歴のある被験者のうち１名は２ヶ月毎に

G. Helicobacter pylori in the oral cavity: High

試料を提供し，H. pylori は６回中３回検出された。これ

prevalence and great DNA diversity. Dig. Dis.

は H. pylori が口腔に存在する時と生息していない時期がSci. 45, 2162-2167, 2000.

あり，検出には複数回のサンプル回収が必要であること

７） Nagata R. Ohsumi T. Takenaka S. Noiri Y.

を示唆している。部位別では，歯肉縁上 DB での検出率

Current Prevalence of Oral Helicobacter pyloriが高く（30.7%），特に前歯部にて多く検出された（p<0.05,

among Japanese Adults Determined Using a

Fisher’s exact probability test）（Table 2）。
このことから，Nested Polymerase Chain Reaction Assay

前歯部の酸素濃度が微好気条件を好む H. pylori の生存

Pathogens. 24; 10（1）:10, 2020.

－ 36 －