称号及び氏名

博士（獣医学）

学位授与の日付

平成２６年３月３１日

論Genetic and biological analyses of Cryptosporidium andersoni novel

文名古屋敷 早希（長野 早希）

type（Cryptosporidium andersoni novel type の遺伝子解析および生物学的性状解析)）

論文審査委員

主査

笹井和美

副査

三宅 眞実

副査

山崎 伸二

論文要旨
緒言
Cryptosporidium はアピコンプレックス門に属する原虫で、様々な脊椎動物に胃腸炎を引き起こす医学・獣医学領域において重要な寄生虫である。ヒトでは 1976 年に初めて、免疫不全患者に Cryptosporidium parvum の感染が認められ、人獣共通感染症の病原体として認識された。当初は免疫不全患者のみに感染すると考えられていたが、後に健常者にも急性下痢を引き起こすことが分かり、1990 年代にはイギリスとアメリカで大規模な水系由来集団感染を起こしたことから、現在、水系感染症の病原体として重要視されている。Cryptosporidium 感染の症状は主に水様性下痢で、重症度は無症状～致死的に至るまで様々である。特効薬がないため、回復には宿主の免疫状態が重要で、免疫不全患者では慢性的な下痢による体重減少と脱水で、死に至る恐れがある。
Cryptosporidium には現在 30 の種と、70 のゲノタイプが報告されているが、種の分類は現在も更新されており、ゲノタイプと同定されたものが種として分類されたり、新しい宿主から新種が毎年のように報告されている。現在のところ、牛に感染する種は C.
parvum、C. bovis、C. ryanae、C. suis、及び C. andersoni の 5 種である。これらはオーシストの大きさと感染部位によって大きく 2 つのグループに分かれ、小型のオーシストを形成する C. parvum、C. bovis、C. ryanae、及び C. suis は小腸に感染し、大型のオーシストを形成する C. andersoni は第４胃に感染する。C. andersoni は、第４胃に感染して消化吸収不良を引き起こし、体重増加率や泌乳量の低下といった産業的損害を与えるとされる。また、HIV 陽性患者や子どもにも感染することが報告されている。
C. andersoni はマウスには感染しないことが報告されているが、近年日本において、
18S rRNA 遺伝子配列が C. andersoni と一致するにも関わらず、マウスに感染する株が検出され、C. andersoni novel type と名付けられた。しかし、その分布や感染性などの詳細はまだ明らかにされていない。
そこで、本研究では C. andersoni novel type の性状を明らかにするために、1）COWP(Cryptosporidium oocyst wall protein)遺伝子と 18S rRNA 遺伝子を用いた C. andersoni
novel type の更なる遺伝子解析、2) C. andersoni novel type の疫学調査、3) C. andersoni
novel type のマウスへの感染性の調査、の 3 点について検討した。

第１章

佐賀で検出された C. andersoni novel type の遺伝的・生物学的性状解析

本研究までに、C. andersoni novel type は北海道と宮城県で検出されていた。今回、佐賀県で Cryptosporidium が検出され、それが C. andersoni novel type である可能性が高いと思われたため、遺伝子解析とマウスへの感染性を調べた。
検出された株は、佐賀県で飼育された 2 歳齢の去勢牛の便から得られ、大阪市食肉衛生検査所で採取された。ショ糖浮遊法による顕微鏡検査を行ったところ、7×5μm の大型
Cryptosporidium オーシストが認められた。検体のオーシストを再度ショ糖浮遊法で精製し、COWP 遺伝子と 18S rRNA 遺伝子の両遺伝子の遺伝子解析と、マウスへの感染実験を行った。感染実験では、SCID (severe combined immune deficiency)マウス（C.B-17/Icr-SCID Jcl、雌、５週齢）３匹に 1×106 個のオーシストを胃内接種し、一日分の糞便を採取してショ糖浮遊法による糞便検査を行い、OPD（oocyst per day）を計測した。
感染実験では、全てのマウスでオーシストの排出が認められ、OPD は 1×106 個に達し、持続的な排出が認められた。遺伝子解析では、COWP 遺伝子は牛由来オーシスト及びSCID マウス排出オーシストの全てで既報の C. andersoni と 100%一致した。18S rRNA遺伝子において、Forward および Reverse シークエンスの両方において同一箇所を起点とするシークエンス波形の乱れが認められ、２つのゲノタイプのオーシストの混合感染の可能性が考えられた。
混合感染の有無を明らかにするために、単離オーシストの遺伝子解析を行った。オーシスト１個の COWP 遺伝子と 18S rRNA 遺伝子を同時に増幅できるように、既存の PCR条件を調整して Modified multiplex PCR を設計した。全 20 検体の単離オーシストのうち8 検体で遺伝子の増幅に成功し、全ての検体の COWP 遺伝子は既報の C. andersoni のものと一致した。18S rRNA 遺伝子は、既報の配列（Type A）と、それにチミンが挿入した配列（Type B）の 2 種類が得られ、２つのゲノタイプのオーシストが混合感染していたことが判明した。全 8 検体のうち、Type A と Type B はそれぞれ 4 検体ずつ得られた。
以上の結果から、佐賀県で検出された Cryptosporidium は C. andersoni novel type であり、18S rRNA 遺伝子において既報の配列と、1 塩基変異した配列の 2 種類のゲノタイプのオーシストが混合感染していることが判明した。

第２章

C. andersoni novel type の全国的な疫学調査

第１章から、C. andersoni novel type は北海道・宮城県以外に佐賀県でも検出されたことがわかった。今まで、日本において Cryptosporidium の疫学調査は行われてきたが、遺伝子解析を実施した報告はなく C. andersoni novel type が他の地域に存在するのかは不明である。そこで、全国的な分子疫学調査を行った。調査の目的として、1) C. andersoni
novel type が全国的に分布しているのかどうか、2) 日本の他の C. andersoni novel type の株に Type A と Type B の混在はあるのかどうか、3) 日本の牛における Cryptosporidiumの罹患率はどの程度か、の 3 点を挙げた。
糞便検体として、日本の 1 道 20 県を産地とする牛から得られた全 205 検体で、大阪市食肉衛生検査所に搬入されたものを用いた。品種は和牛 70 頭、交雑種牛 112 頭、乳牛 23 頭で、採取した牛の月齢は 17.1-37.4 ヶ月齢であった。糞便はショ糖浮遊法にて顕微鏡検査を行い、陽性であったものは COWP 遺伝子と 18S rRNA 遺伝子の遺伝子解析を行った。また、精製して 1×106 個以上のオーシストが得られた株は SCID マウスへの感染実験を行った。
Cryptosporidium は、全 205 検体のうち 12 検体（罹患率 5.9%）で検出され、その産地は北海道、静岡、愛知、山口、香川、佐賀、及び熊本の 1 道 6 県であった。オーシストは大型で、COWP 遺伝子の配列は既報の C. andersoni のものと 100%一致した。また、
18S rRNA 遺伝子においては第１章の佐賀株で見られたような 2 種のシークエンス波形が見られた。また、マウスへの感染実験を行った全ての株（5 株）で感染が認められた。
Type A と Type B の混在を確かめるために、マウスへの感染実験をおこなった 5 株で単離オーシストの遺伝子解析を行った。第１章と同じ方法で、Modified multiplex PCRを使用し、1 株につき 10 個のオーシストの遺伝子解析を行った。結果、全てのオーシストの COWP 遺伝子は既報の C. andersoni の配列と一致し、18S rRNA 遺伝子は Type Aと Type B のいずれかと一致した。
以上の結果から、C. andersoni novel type は Type A と Type B が混在して全国的に分布しており、調査した地域で、罹患率は 5.9%であったことがわかった。

第３章

C. andersoni novel type の少数投与での感染実験

C. andersoni novel type の詳細な生物学的性状解析を目的として、マウスを使用した
C. andersoni novel type の少数オーシスト投与での感染実験を行った。Cryptosporidium の特徴として、免疫不全患者に感染しやすく重症化しやすいという性質があるため、まず、成熟した免疫正常マウスと SCID マウスでの感染実験を行った。また、C. parvum での感染実験では哺乳マウスで易感染性が見られるため、哺乳マウスの免疫正常マウスとSCID マウスの感染実験も行った。
成熟マウスには 1×103 及び 104 を各 5 匹のグループに胃内接種し、哺乳マウス及び免疫正常マウスには 1×10、102、103、104、及び 105 個を、SCID マウスには 1×102、103、104、及び 105 を胃内接種した。成熟マウス群は接種後 4 日目から糞便を採取し、哺乳マウス群及び免疫正常マウスは接種後 2 ないし 5 週目に、SCID マウスは 2 ないし 10 週目に糞便を採取し、ショ糖浮遊法にて糞便中のオーシストを検査した。また陰性の確認には 18S rRNA 遺伝子の PCR を使用した。
結果、C. andersoni novel type の感染オーシスト数は 103 個（成熟正常マウス・哺乳 SCIDマウス）および 104 個（成熟 SCID マウス・哺乳正常マウス）であり、免疫能および成熟期と哺乳期の間で感染に必要なオーシスト数に大きな差異は認められなかった。

総括
・佐賀県で検出された Cryptosporidium は C. andersoni novel type であり、18S rRNA 遺伝子において、1 塩基の異なる２つのゲノタイプが混在していた。
・C. andersoni novel type は全国的に広く分布しており、佐賀株で確認されたゲノタイプの混在が認められた。
・C. andersoni novel type の感染成立オーシスト数は、1×103 ないし 104 個で、成熟マウスと哺乳マウス、免疫正常マウスと SCID マウスの間に大きな差はなかった。

審査結果の要旨
Cryptosporidium はアピコンプレックス門に属する原虫で、様々な脊椎動物に胃腸炎を引き起こす医学・獣医学領域において重要な寄生虫である。発見当初は免疫不全患者のみに感染すると考えられていたが、後に健常者にも急性下痢を引き起こすことが分かり、1990 年代にはイギリスとアメリカで大規模な水系由来集団感染を起こしたことから、現在、水系感染症の病原体として重要視されている。特効薬がないため、回復には宿主の免疫状態が重要で、免疫不全患者では慢性的な下痢による体重減少と脱水で、死に至る恐れがある。
Cryptosporidium には現在 30 の種と、70 のゲノタイプが報告されているが、種の分類は現在も更新されており、ゲノタイプとされていたものが種として分類される場合や新しい宿主から新種が毎年のように報告されている。現在のところ、牛に感染する種は 5種である。これらはオーシストの大きさと感染部位によって大きく 2 つのグループに分かれ、小型のオーシストを形成する C. parvum、C. bovis、C. ryanae、及び C. suis は小腸に感染し、大型のオーシストを形成する C. andersoni は第４胃に感染する。
C. andersoni
は、第４胃に感染して消化吸収不良を引き起こし、体重増加率や泌乳量の低下といった産業的損害を与えるとされる。また、HIV 陽性患者や子どもにも感染することが報告されている。
C. andersoni はマウスには感染しないことが報告されているが、近年日本において、
18S rRNA 遺伝子配列が C. andersoni と一致するにも関わらず、マウスに感染する株が検出され、C. andersoni novel type と名付けられた。しかし、その国内分布や感染性などの詳細はまだ明らかにされていない。
そこで、本研究では C. andersoni novel type の性状を明らかにするために、1）COWP(Cryptosporidium oocyst wall protein)遺伝子と 18S rRNA 遺伝子を用いた C. andersoni
novel type の更なる遺伝子解析、2) C. andersoni novel type の疫学調査、3) C. andersoni
novel type のマウスへの感染性の調査、の 3 点について検討した。
第 1 章では、佐賀県で検出された Cryptosporidium の大型のオーシストの遺伝学的及び生物学的性状の解析を実施した。遺伝学的解析は、Cryptosporidium の同定で解析される COWP 遺伝子と 18S rRNA 遺伝子を対象とした。生物学的解析として、マウスへの感染実験を実施した。分離株はマウスに感染性を有する過去に国内では北海道と宮城県でのみ検出された C. andersoni novel type であり、COWP 遺伝子は既報の塩基配列と 100%一致した。18S rRNA 遺伝子は、既報の塩基配列と 100%一致するオーシストと 1 塩基が異なるオーシストの２つのゲノタイプを有するオーシストが混合感染していることが判明した。
第１章から、C. andersoni novel type は北海道・宮城県以外に佐賀県でも検出されたことがわかった。第 2 章では、今まで、日本において Cryptosporidium の疫学調査は行われてきたが、遺伝子解析を実施した報告はなく C. andersoni novel type が他の地域に存在するのかは不明である。そこで、1 道 20 県を産地とする牛から得られた全 205 検体を用いた遺伝学的及び生物学的解析を実施した。Cryptosporidium は、全 205 検体のうち12 検体（罹患率 5.9%）で検出され、その産地は北海道、静岡、愛知、山口、香川、佐賀、及び熊本の 1 道 6 県であった。検出されたオーシストは大型で、COWP 遺伝子の配列は既報の C. andersoni のものと 100%一致した。また、18S rRNA 遺伝子においては第１章の佐賀株で見られたような 2 種のシークエンス波形が見られた。また、マウスへの感染実験を行った全ての株（5 株）で感染が認められた。
第 3 章では、C. andersoni novel type の詳細な生物学的性状解析を目的として、マウスを使用した少数オーシスト投与での感染実験を行った。Cryptosporidium の特徴として、免疫不全患者に感染しやすく重症化しやすいという性質があるため、まず、成熟した免疫正常マウスと SCID マウスでの感染実験を行った。また、C. parvum での感染実験では哺乳マウスで易感染性が見られるため、哺乳マウスの免疫正常マウスと SCID マウスの感染実験も行った。C. andersoni novel type の感染オーシスト数は 103 個（成熟正常マウス・哺乳 SCID マウス）および 104 個（成熟 SCID マウス・哺乳正常マウス）であり、初回感染時においては、宿主の免疫能および成熟期と哺乳期の間で感染に必要なオーシスト数に大きな差異は認められなかった
本研究は、マウスに感染性を有する C. andersoni novel type が国内に蔓延しており、分離株は 18S rRNA 遺伝子の塩基配列が既報と 100%一致するオーシストと 1 塩基が異なるものの２つのゲノタイプを有するオーシストが混合感染していることを明らかにした。さらに、マウスへの初回感染においては、宿主の年齢及び免疫能による影響がないことを明らかにした。本研究で実施した国内での疫学調査やその生化学性状に関する重要な知見は、子供や免疫機能が正常でない人での感染が報告されている C. andersoni の防疫等に寄与することが予想される。これらの成績は獣医学ならびに医学に大きく貢献するものと評価できる。本論文の審査および最終試験の結果と併せて博士（獣医学）の学位を授与することを適当と認める。