－論文－●細胞膜透過性ペプチドとしてのリムキナーゼ２核小体移行性シグナル─────────────────────────────────────────────────────

先端科学研究所バイオインフォマティックスグループ 小林菜穂子、丹羽 幹夫、吉田 徹彦

リムキナーゼ２(LIMK2)は、LIMドメインを内在するプロテインキナーゼである。LIMK2は、アクチン脱重合因子であるコフィリンをリン酸化することでアクチン重合を制御する機能を有する。また、LIMK2には、内皮細胞において、細胞質と核小体の間を移行するという特性がある。LIMK2に内在する13アミノ酸鎖長の塩基性アミノ酸に富む領域は、核小体移行性シグナル(NoLS)として、細胞質から核、及び核小体への移行において重要な役割を担っていることが報告されている。我々は、新しい細胞膜透過性ペプチド(CPPs)の探索を目的に、LIMK2のNoLSに着目した。CPPsは、タンパク質や核酸、ナノ分子等を細胞外から細胞内へ輸送する働きを有する機能性ペプチドである。LIMK2 NoLSに、神経分化に関与することで知られるVHLタンパク質由来のBC-boxモチーフペプチドや緑
色蛍光タンパク質(GFP)を結合し、それらの細胞膜透過機能を評価した。その結果、LIMK2 NoLSは、細胞の種類や付加する生理活性物質の分子量の大きさに関わらず非常に優れた細胞膜透過機能を有するとともに、血液脳関門(BBB)を透過する特殊な機能を有することを見出した。本研究では、CPPとしてのLIMK2 NoLSの報告を通して、
NoLSをベースとした新しいCPPsを提案する。

１

緒

言

グリカンへの結合に関与しないことからエンドサイトーシス
依存型膜透過ではないという意見もある 12) 。このように、細胞膜透過性ペプチド(Cell penetrating peptides、CPPs)は、

CPPsの細胞膜透過機能のメカニズムは明確に解明されてお細胞外から細胞内へ移行する機能を有する約10～30アミノ酸

らず、現在議論中である。

1)

鎖長の小さなペプチドである 。タンパク質や核酸、ナノ分

LIMK2は、LIMドメインと呼ばれるシステイン残基に富む子をCPPsに結合することで、これらの分子を効率よく細胞

亜鉛結合ドメインを内在するリムキナーゼファミリーに属す。従来用るタンパク質である13)。LIMドメインは、遺伝子発現制御やいられている細胞内への分子導入方法には、エレクトロポレ

細胞構築、細胞接着、細胞運動性、シグナル伝達等に関係すーションやケミカルトランスフェクション、マイクロインジ

る様々なタンパク質に内在することが知られている。LIMK2ェクション等があるが、いずれも細胞へ大きなダメージを与は、コフィリンのリン酸化を介してアクチン細胞骨格の再構えてしまうことが知られている。それに対して、CPPsは、築を制御する機能を有する14)。アクチンフィラメント動態に低毒性で、且つ細胞の種類に関わらず優れた膜透過機能を有

お い て 、 次 の よ う な シ グ ナ ル 伝 達 系 が 作 動 す る 。 Rho-すると考えられていることから、ドラッグデリバリーシステ

associated, coiled coil containing protein kinase(ROCK) が外から細胞内へ導入し機能させることができる

2,3)

ムを始め様々な分野への応用が期待されている

2,4,5)。CPPs

LIMK2のThr-505をリン酸化することにより、LIMK2が賦活が最初に報告されたのは、1989年、HIV-1ウイルスの化する。賦活化したLIMK2はアクチン脱重合因子コフィリン

Transactivating protein(Tat)が細胞膜を透過し細胞質内へ移をリン酸化することにより不活性化する。これによりアクチ。1991年には、ショウジョウ

ン重合が起こるのである15-17)。また、LIMK2には、同じくリバエ(Drosophila melanogaster)の転写制御因子Antennapedia由ムキナーゼファミリーに属するLIMK1には見られない核小体

来のpAntp43-58(Penetratin)が、細胞膜を透過することが報に蓄積するという性質が報告18)されている。このユニークな行するという発見であった

6,7)

8)

告された 。その後、天然に存在するタンパク質の低分子ド性質の要因となっているのが、核小体移行性シグナル

メインやポリアルギニンの様な人工ペプチド等がCPPsとし(Nucleolar localization signal 、 NoLS) で あ る 。 ヒ ト LIMK2て見出されてきた。現在、30種類以上のCPPsが報告されて(hLIMK2)では、塩基性アミノ酸に富む領域(アミノ酸491番

おり、大きく７種類のファミリー(塩基性CPPs、疎水性CPPs、

目から503番目)が核小体への移行機能を担うNoLSとして同

プロリンリッチCPPs、キメラCPPs、β-ペプチド、両親媒性

定されている18,19)。また、hLIMK2 NoLSの核小体移行機能は、ペプチド、及び抗菌ペプチド)に分類できる9)。CPPsの膜透NoLSに内在するThr-494のリン酸化によって阻害されること

過メカニズムには諸説ある。主に、TatやPenetratinがエンドが報告されている 18) 。我々は、NoLSが核小体移行機能ととサイトーシスにより膜透過するという報告11)から、CPPsのもに細胞膜透過機能を有するという仮説を立て 、 LIMK2

膜透過には細胞膜上に存在するレセプターは関与しないと考NoLSに生理活性ペプチドやタンパク質を結合し、それらのえられている

1,10)

細胞膜透過活性を検証した。その結果、LIMK2 NoLSは、最。また、Tatはヘパラン硫酸(HS)プロテオ

東亞合成グループ研究年報

3

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も利用されているCPPであるポリアルギニン(R9)より優れた

NaCl、及び500mM imidazole]でhLIMK2NoLS-GFPを溶出させた。

細胞膜透過機能を有することを見出した。更に、ドラッグデ得られた溶出画分をD-PBSにバッファー置換した後、フィル

リバリーシステムへの応用課題として挙げられる脳内すなわ

ター(0.45μm 膜)滅菌処理を行った。

ち血液脳関門(Blood-brain barrier、BBB)の透過活性について

２.３

もマウス生体内実験により検証したところ、BBBを透過する機能を有することを見出した。

細胞培養

ヒト皮膚線維芽細胞(HNFs、新生児由来、CCD-1079sk、ATCC)は、90％ Eagle’s minimum essential medium(２mM L-

２

実

験

glutamine、Eagle’s BSS、0.1mM non-essential amino acids、及び１mM sodium pyruvate含有)に10％ fetal bovine serumを添

２.１

ペプチド合成加した培地を用い、ゼラチンコートディッシュ上にて37℃、ペプチド合成は、9-fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)固相

５ ％ CO2 環 境 下 で 培 養 し た 。 培 養 し た 細 胞 を 0.05 ％合成法を用いて行った。HOBtとDICを用いた脱水縮合反応

Trypsin/EDTAを用いて剥離し、ゼラチンコート８ウェルチ

によりrink amide MBHA resin(Novabiochem)上にアミノ酸をャンバースライド(BD Falcon)上に密度2.5×104cells/wellと伸長した後、N末端側に6-aminocaproic acid(Acp)リンカーをなるように播種した。

介してfluoresceinisothiocyanate isomer-I(FITC)を結合した。

神経幹細胞(NSCs)は、C57BL/6Nマウス(生後７日)の側脳

その後、reagent K(82.5％ trifluoroacetic acid、５％ water、

室 か ら 単 離 し た 。 Dulbecco’s modified Eagle medium/F12

５％ m-cresol、及び2.5％ 1,2-ethanedithiol)を５時間反応さ(DMEM/F12)(２mM L-glutamine、N2 supplement、50units/50

せ、側鎖の脱保護、及びレジンの切断を行った。その後、冷μg/ml penicillin/streptomycin、20ng/ml bFGF、及び20ng/ml

ジエチルエーテルによりペプチドを沈殿させ、遠心分離

EGF含有)を用いて低接着表面ディッシュ(Iwaki)上にて、(2000rpm、５分)により回収した。HPLCを用いてODSカラ

37℃、５％ CO2環境下で７日から10日間培養し、ニューロ

ムにより純度95％以上に精製した。

スフェア(神経球)を作製した。ピペッティングにより作製したニューロスフェアを単一細胞に分離し、ポリ-D-リシン／

２.２ リコンビナント融合タンパク質の合成

ラミニンコート８ウェルチャンバースライド(BD Falcon)上GFP の N 末 端 に hLIMK2 NoLS を 融 合 し た タ ン パ ク 質に密度2.5×104cells/wellとなるように播種した。

(hLIMK2NoLS-GFP)をコードするように融合遺伝子(人工合成

ヒト人工多能性幹細胞(iPSCs、201B2、京都大学)20)は、ヒDNA)を作製し、昆虫細胞を用いたバキュロウイルス発現シ

ト 胚 性 幹 細 胞 培 地 (DMEM/F12 、 20 ％ knockout serum

ステムによって目的の融合タンパク質を生合成した。

replacement(KSR)、２mM L-glutamine、0.1mM non-essential

制限酵素Bgl-ⅡとXba-Ⅰ(Takara)により人工合成DNAの両

amino acids、0.1mM 2-mercaptoethanol、50 units/50μg/ml

端を切断し、同じ制限酵素で切断したpM15ベクター(片倉工penicillin/streptomycin 、 及 び ４ ng/ml bFGF) を 用 い て 、業)に組み込んでトランスファーベクターを作製した。これ

mitomycin C処理したSNLフィーダー細胞を播種したゼラチンをバキュロウイルスCPd株のゲノムDNA(片倉工業)とBmN細コートディッシュ上にて37℃、５％ CO2環境下で培養した。

胞(片倉工業)へ共感染させ、組み換えウイルスを作製した。

培養したiPSCsをCTK溶液(１mg/ml collagenase IV、2.5％得られた組み換えウイルスをカイコ(Bombyx mori、片倉工

trypsin、0.1M CaCl2、及び20％ KSR含有)処理により回収し、業)に感染させ、蛹になるまで飼育した後、蛹を摩砕用のバ

ピペッティングにより小凝集塊の懸濁液を作製し、

ッ フ ァ ー [20mM Tris-HCl(pH 8.0) 、 150mM NaCl 、 １ mM

mitomycin C処理したSNLフィーダー細胞を播種したゼラチン

EDTA、１mM EGTA、10％ glycerol、10mM benzamidine、１

コート８ウェルチャンバースライド上に播種した。

mM PMSF、及び１mM DTT]中でテフロン加工ホモジナイザ

２.４

ーを用いて破砕した。得られた破砕液にTween20を濃度１％となる様に添加し、４℃で１時間撹拌し可溶化した後、超遠心分離(100000g×１時間、４℃)を行い、hLIMK2NoLS-GFPをFITC-含む可溶性画分を得た。本可溶性画分をPD-10脱塩カラム

合成ペプチド(FITC-VHL-hLIMK2NoLS)とリコンビ
ナント融合タンパク質(hLIMK2NoLS-GFP)の細胞膜透過性評価(in vitro)

VHL-hLIMK2NoLS ストック溶液(１mM)を既定濃度とな(GE-Healthcare)を用いて、吸着バッファー[20mM phosphate

るよう細胞培養液に添加し、37℃、５％CO2環境下で培養し(pH 7.5)、500mM NaCl、１mM DTT、及び５mM imidazole]

た。培養後、冷メタノールを用いて細胞を固定し、DAPI含に置換させた後、HisTrapカラム(GE-Healthcare)に添加して有蛍光褪色防止剤(Invitrogen)を用いて封入した。また、

hLIMK2NoLS-GFPを結合させた。同バッファーにより洗浄し

hLIMK2NoLS-GFPストック溶液(350μg/ml)を既定濃度となる

た後、溶出バッファー[20mM phosphate(pH 7.5)、500mM

よう細胞培養液に添加し、37℃、５％ CO2環境下で培養し東亞合成グループ研究年報

4

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３

た。培養後、冷メタノールを用いて細胞を固定した後、免疫結果染色を行った。細胞を５％ goat serumを用いてブロッキン
グした後、一次抗体にrabbit anti-GFP(1:500、Invitrogen)、

３.１

LIMK2 NoLS結合ペプチド

二 次 抗 体 に Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG (1:800 、

hLIMK2 NoLS(アミノ酸491番目から503番目)のアミノ酸配Invitrogen)を用いて染色を行い、DAPI含有蛍光褪色防止剤を

列は、KKRTLRKNDRKKRである18,19)。げっ歯類のLIMK2タン

用 い て 封 入 し た 。 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 (confocal laser

パク質にはhLIMK2 NoLSと高い相同性のある領域が存在する

scanning microscopy、CLSM、LSM 510 ver 3.2、Carl Zeiss)を(rLIMK2 NoLS: KKRTLRKSDRKKR)。各々のNoLSのC末端に、用いて、各々の封入サンプルにおける蛍光シグナルを検出す

ヒトVon Hippel-Lindau(VHL)タンパク質のBC-boxモチーフ

ることによりNoLS結合ペプチド及びタンパク質の細胞膜透領域(アミノ酸157番目から171番目)に由来する15アミノ酸残過機能を評価した。

基のぺプチド(VHLペプチド)、及びFITCを結合した。VHL
ペプチドは、既に骨髄間質細胞や皮膚由来前駆細胞から神経

２.５

iPSCsによる合成ペプチドの取り込み量の測定

系細胞への分化誘導に関与する生理活性ペプチドとして報告

ペプチドストック溶液(１mM)を既定濃度となるよう細胞類 の LIMK2 NoLS に FITC を 結 合 し 、 各 々 、 FITC-VHL-

培養液に添加し、37℃、５％ CO2環境下で１時間培養した。

hLIMK2NoLS 、 及 び FITC-VHL-rLIMK2NoLS と 名 付 け た 。 ま た 、されている21,22)。VHLペプチドを結合したヒト、及びげっ歯培養後、細胞を冷メタノールで固定し、DAPI含有蛍光褪色

hLIMK2 NoLSのN末端にGFPを結合し、hLIMK2NoLS-GFPと名防止剤を用いて封入した。細胞内のFITC蛍光強度をCLMS解付けた。比較CPPとしてR9を用い、R9のN末端にVHLペプチ

析により測定した。(アルゴンレーザー励起波長488nm；対ド及びFITCを結合し、FITC-R9-VHLと名付けた(Table 1)。

物レンズPlan-Apochromat 20×/0.75；xyイメージ；1024×

３.２

1024ピクセル；スキャン時間31.46秒；スキャン回数４)ペプ
チドの相対蛍光強度を

FITC-

FITC-

R9-VHL(１μM)の取り込み量を１

HNFsに対する細胞膜透過性(in vitro)

VHL-hLIMK2NoLS を濃度１μMとなるようにHNFs培養として算出した。測定は、独立して３回実施し、その平均値

液中に添加し、１時間及び４時間培養処理を行った。 FITC-

を蛍光強度とした。

VHL-hLIMK2NoLS は、１時間以内に、細胞膜及び核膜を移行することが明らかとなった。また、細胞膜を移行したペプチ

合成ペプチドのBBB透過性評価(in vivo)

２.６

ドは少なくとも4時間までは核や細胞質に蓄積することが明FITC-らかとなった(Fig. 1)。次に、分子量の大きな生理活性物質

VHL-hLIMK2NoLS を腹腔投与した。また、コントロールとしの輸送機能を調べるために、分子量約28kDaのhLIMK2NoLS-て同濃度のFITCを腹腔投与した。腹腔投与16時間後、マウGFPを濃度１μg/ml、３μg/ml、または10μg/mlとなるようスをPBSで灌流し、４％ paraformaldehydeで固定した。その培養液中に添加し、２時間及び14時間培養処理を行った。そ後、脳を取り出し、凍結切片(脳冠状切片、10μm)を作製しの結果、hLIMK2NoLS-GFPの細胞膜透過は２時間以内に起こた。CLSMを用いて凍結切片中のFITC蛍光シグナルを検出することが明らかとなった。しかし、FITC-VHL-hLIMK2NoLSの場

ることによりFITC-VHL-hLIMK2NoLSのBBB透過活性を評価した。

合と異なり、培養２時間の間に、細胞質内において

C57BL/6N(体重20～25g/匹)マウスに、１μmol/kg

hLIMK2NoLS-GFPの分解が開始しており、蛍光シグナルは主に核及び核小体で検出された。更に、hLIMK2NoLS-GFPを異なTable 1

LIMK2 NoLS結合ペプチド、タンパク質、及びR9結合ペプチド
Sequence a

Structure b

Residues

Mw.

TLKERCLQVVRSLVKKKRTLRKNDRKKRFITC-VHL-hLIMK2NoLS

28

3981.9 Da

TLKERCLQVVRSLVKKKRTLRKSDRKKRFITC-VHL-rLIMK2NoLS

283954.9 Da

hLIMK2NoLS-GFP

278

28 kDa

FITC-R9-VHL

243679 DaKKRTLRKNDRKKR-GFP
RRRRRRRRRTLKERCLQVVRSLVKa)

LIMK2 NoLS及びpoly-arginine(R9)は太字標記．FITC-VHL-hLIMK2NoLS、FITC-VHL-rLIMK2NoLS、及びFITC-R9-VHLのC
末端はアミド修飾．GFP：green fluorescent protein．
b)
FITC：Fluorescein isothiocyanate isomer-I；VHL：the BC-box motif of VHL protein(aa157-171)、hLIMK2NoLS：
human LIM kinase 2 nucleolar localization signal peptide、rLIMK2NoLS：げっ歯類のhLIMK2NoLSとの相同領域．

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る濃度で添加し培養した結果、濃度１μg/mlから10μg/mlへ添加し、37℃、５％ CO2環境下で１時間培養処理を行った。

増加するにつれて、核、及び核小体における蛍光シグナル強濃度0.5μMにおいて検出された弱い蛍光シグナルは、１μ度が増加したことから、hLIMK2 NoLSの膜透過機能は濃度依

Mから４μMへと、濃度の上昇に伴い増加したことから、

存 性 を 示 す こ と が 明 ら か と な っ た (Fig. 2A) 。 ま た 、FITC-

hLIMK2NoLS-GFPを濃度10μg/mlで培養処理すると、培養処とが明らかとなった。また、細胞の拡大イメージによると、

理２時間後に強い蛍光シグナルが検出されたが、培養処理14

A

時間後になると蛍光シグナル強度が低下したことから、

DAPI

anti-GFP

Merge

DAPI

anti-GFP

Merge

None

hLIMK2NoLS-GFPは一度、細胞膜及び核膜を移行した後、14

VHL-hLIMK2NoLSの細胞膜透過機能は濃度依存性を示すこ

時間以内に分解されることが確認された(Fig. 2B)。

4h

4h

3 μg/mL1h

10 μg/mL

1h

1 μg/mL

Merge

FITC

Fig. 1 HNFs におけるFITC-VHL-hLIMK2NoLSの局在
FITC(緑)、DAPI(青)、Scale bar＝100μm

10 μg/mL

３.３

B

NSCsに対する細胞膜透過性(in vitro)

異なる濃度の FITC-VHL-hLIMK2NoLS(0.05μM、0.2μM及び１μM)をマウス新生仔由来NSCs培養液中に添加し、37℃、Fig. 2 HNFsにおけるhLIMK2NoLS-GFPの局在
A)培養２時間、B)培養14時間、GFP(赤)、DAPI(青)､Scale bar＝100μm

５％ CO2 環境下で培養処理を行った。 FITC-VHL-hLIMK2NoLS(１μM)の細胞膜及び核膜の移行は培養30分で確認された。
そこで、30分、１時間、２時間、６時間後
30 min

VHL-hLIMK2NoLS は、30分から２時間にかけて徐々に細胞質、核、核小体へと移行し、それ以降は核や核小体への更なる移行が起

1h2h

0.05 μMに 経 過 観 察 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 FITC-

こらなかった。一方、細胞質への移行は少から、FITC-VHL-hLIMK2NoLSの細胞膜移行は
時間依存性を示すことが明らかとなった。

0.2 μM

なくとも６時間継続された。これらのこと

また、濃度0.05μM及び0.2μMの場合で

３.４

iPSCsに対する細胞膜透過性(in vitro)

1 μM

も同様の結果が得られた(Fig. 3)。

異なる濃度のFITC-VHL-hLIMK2NoLS(0.5μM、１μM及び４μM)をiPSCs培養液中に東亞合成グループ研究年報

Fig. 3 NSCsにおけるFITC-VHL-hLIMK2NoLSの局在
FITC(緑)、DAPI(青)、Scale bar＝5μm

6TREND 2012

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6h

るほどの強い蛍光シグナルが検出された。これに対し、

Merge

コントロールとして用いた４μM FITCでは、バックグラウンドレベルの蛍光シグナルしか検出されなかった。従って、FITC-VHL-hLIMK2NoLSは、細胞膜を透過し4 μM

free FITC

FITC

た後、優先的に細胞質ではなく核小体へ移行する機能
FITCを有していることが明らかとなった(Fig. 4)。

Large Magnification

LIMK2 NoLSと人工細胞膜透過性ペプチドとしてよく用いられているR9を比較するために、iPSCsによる

0.5 μM

FITC-

VHL-hLIMK2NoLS 、 FITC-VHL-rLIMK2NoLS 、 及 び FITC-

R9-VHLの取り込み量を定量した。各々のペプチド
５％ CO2 環境下で１時間iPSCsの培養処理を行い、CLSMを用いて細胞内蛍光シグナル強度を定量した。
FITC-

1 μM

FITC-VHL-hLIMK2NoLS(濃度0.5μM、１μM及び４μM)を添加し、37℃、

R9-VHLは、濃度0.5μM及び１μMにおいて、細胞による取り込みが殆ど無いが、４μMになると取り込み量が増加した。これに対し、FITC-VHL-hLIMK2NoLSの取り込み量は、0.5μMではFITC-R9-VHLの12倍、１μMでは7.4倍であった。また、 FITC-VHL-rLIMK2NoLS

4 μMの取り込み量は、0.5μMではFITC-R9-VHLの17倍、１μMでは9.4倍であった。最も高い取り込み量を示したのは、４μM FITC-VHL-hLIMK2NoLSの場合で、同濃度のFITC-R9-VHLに比べると1.7倍であった。以上のことから、iPSCsに対するLIMK2 NoLSの細胞膜透過機能は、

Fig. 4 iPSCsにおけるFITC-VHL-hLIMK2NoLSの局在
FITC(緑)、DAPI(青)、Scale bar＝100μm

Relative Intensity [FITC-R9-VHL (1μM)=1]

20

ポリアルギニンに比べて優れていることが明らかとなった。また、その性能の差は、特に低濃度において顕著に示された(Fig. 5)。４μMという高濃度では、iPSCsによ

0.5 μM
1 μM

る取り込みは、飽和レベルに達している可能性があり大きな

4 μM差が出なかったと考える。

15

LIMK2 NoLSに分子量の大きな生理活性物質をiPSCs内へ輸送する機能があるかどうかを検証するために、異なる濃度の
hLIMK2NoLS-GFP(１μg/ml、３μg/ml及び10μg/ml)をiPSCs

10

培養液中に添加し、37℃、５％ CO2環境下で１時間培養処理を行った。蛍光シグナルは、主に、核及び核小体で検出さ5れた。また、添加タンパク質濃度の上昇に伴って、蛍光シグ
ナル強度が増加した。一方、コントロールとして用いた10μ0g/ml GFPによる培養処理では、バックグラウンド程度の蛍
FITC-R9-VHL

FITC-VHL-hLIMK2No

光シグナルしか検出されなかった。以上のことから、

FITC-VHL-rLIMK2NohLIMK2NoLS-GFPのiPSCs内への移行は、 FITC-VHL-hLIMK2NoLS

Fig. 5 iPSCsによるLIMK2 NoLS結合ペプチドとR9結合ペプチドの取り込み量の場合と同様に濃度依存性を示すことが明らかとなった(Fig.
6)。

FITC-

評価した３段階の濃度いずれにおいても、

VHL-hLIMK2NoLS
FITC-

VHL-hLIMK2NoLSのBBB透過性(in vivo)は核小体に蓄積していることが確認された。低濃度(0.5μ３.５M)の場合、主に核小体で蛍光シグナルが検出されたが、１

LIMK2 NoLSがBBBを透過し、脳組織へVHLペプチドを輸

μMの場合には、核小体、核及び細胞質においてより強い蛍送する機能を有するかどうかを検証するために、C57BL/6N

光シグナルが検出された。更に、４μMの場合には、核小体、マウスにFITC-VHL-hLIMK2NoLSを腹腔内投与(１μmol/kg)した。

核及び細胞質においてiPSCsの輪郭がはっきりと浮かび上がまた、コントロールとして同濃度のFITCを腹腔内投与した。

東亞合成グループ研究年報

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ーチにより非常に優れたCPPを発見した。LIMK2に内在する

Merge

anti-GFP

塩基性アミノ酸リッチなモチーフ領域(491番目から503番目

10 μg/mL

GFPのアミノ酸配列)は、核膜を透過し核小体へ移行する役割を担うNoLSとして同定されていたが、このモチーフ領域の細胞膜透過機能については全く知られていなかった。実際に、
LIMK2 NoLSの発見者が、LIMK2 NoLSの核移行における活性部位の特定にエレクトロポレーションによるトランジェント
トランスフェクションを用いた 18) ように、NoLSには細胞膜透過機能がないと考えられてきた。LIMK2は、アクチン重合
1 μg/mLを制御する機能を有する核小体移行性タンパク質であり、分泌タンパク質や膜タンパク質の様な細胞外で機能するタンパ
ク質ではないこと、またウイルス由来のタンパク質ではないこと等から、LIMK2と細胞膜透過機能が結びつかなかったこことで知られる核移行性シグナル(Nuclear localization signal、NLS)に細胞膜透過機能が見出されていることから、我々は、

3 μg/mLhLIMK2NoLS-GFPとが理由と考える。近年、細胞質から核への移行を制御する

NoLSには核小体移行機能だけでなく細胞膜透過機能が内在するという仮説をたて、様々な種類の細胞(HNFs、NSCs及びiPSCs)を用いてLIMK2 NoLSの細胞膜透過機能評価を行った。その結果、LIMK2 NoLSに、CPPとしての有用性がある

10 μg/mL

ことを見出した。
DIC

free FITC

FITC

Fig. 6 iPSCsにおけるhLIMK2NoLS-GFPの局在GFP(赤)、DAPI(青)、Scale bar＝100μm
腹腔内投与16時間後に解剖し、作製した脳冠状切片をCLSM

FITC-VHL-hLIMK2NoLSを用いて解析したところ、FITC-VHL-hLIMK2NoLSを投与したマウスの大脳皮質において、強い蛍光シグナルが検出された。
一方、FITCを腹腔内投与したマウスの大脳皮質には、バックグラウンド程度の蛍光シグナルしか検出されなかった。以上のことから、LIMK2 NoLSは、BBB透過機能を有し、更にその機能は、通常BBBを透過できる限界サイズ(分子量500Daを超える分子サイズ)を遥かに超える分子を輸送できることが実証された(Fig. 7)。
Fig. 7

４

考

察

FITC-

VHL-hLIMK2NoLSのマウス脳組織への輸送
FITC(緑)、DIC(微分干渉)、Scale bar＝200μm

NoLSは、HIV-1 TatやHVS ORF57のようにNLSと同じモチ
現在、様々な生理活性物質を輸送するための新しい技術とーフを共有する場合もあり、NLSと共に議論されることが多してペプチドを基にしたベクターが注目されている。最初のい。しかし、NLSは核膜孔複合体(Nuclear pore complexes、

CPPであるHIV-1 Tatが発見されて以来、約二十年間に亘りNPCs)に依存して核と細胞質の間を移行することや、更にそ様々なタンパク質に由来する新しいCPPsの探索、並びに、の移行はβ-Karyopherin(Kap)に仲介されることが明らかと

CPPsのメカニズムの解明研究が盛んに行われてきた。本研なっている 23) 一方、NoLSがどのようなメカニズムで核小体究において、我々は、NoLSに着目するという新しいアプロに移行しているのかは明らかになっていない。現在のところ、東亞合成グループ研究年報

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NoLSの移行機構としては、NLSの様に核膜に存在する認識

Ruoslahti, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 106, 16157 (2009).

モチーフを標的にしているのではなく、核小体に存在するタ

３) G. P. Dietz, E. Kilic, and M. Bähr, Mol. Cell. Neurosci., 21,

ンパク質や核酸と高親和性を示し相互作用するために起こる

29 (2002).

18)４) G. P. Dietz and M. Bähr, Mol. Cell Neurosci., 27, 85 (2004).

と考えられている 。
FITC-５) U. Langel, Handbook of Cell-penetrating peptides, 2nd Ed.,

VHL-hLIMK2NoLSは、HNFs、NSCs及びiPSCsにおいて、濃度依存的に、細胞膜を透過した後、核膜を透過し、そして

CRC/Taylor & Francis, Boca Raton, FL (2007).

核小体へ移行した。分子量の大きなLIMK2NoLS-GFPも同様に、

６) A. D. Frankel and C. O. Pabo, Cell, 55, 1189 (1988).

濃度依存的にHNFsやiPSCsの細胞膜を透過した。また、げっ

７) M. Green and P. M. Loewenstein, Cell, 55, 1179 (1988).

歯類のLIMK2に存在するヒトLIMK2 NoLSとの相同領域を評

８) A. Joliot, C. Pernelle, H. Deagostini-Bazin, and A.
Prochiantz, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88, 1864 (1991).

価したところ、ヒトLIMK2 NoLSと同様に細胞膜を透過した。
更に、LIMK2 NoLSの細胞膜透過活性は、現在最も有効な

９) R. Fischer, M. Fotin-Mleczek, H. Hufnagel, and R. Brock,

Chembiochem, 6, 2126 (2005).

CPPとして用いられるR9より優れていることが明らかとなった。

10) J. P. Richard, K. Melikov, E. Vives, C. Ramos, B. Verbeure,
M. J. Gait, L. V. Chernomordik, and B. Lebleu, J. Biol.

更に、マウスを用いた生体内評価実験において、腹腔内投
与した

FITC-

Chem., 278, 585 (2003).

VHL-hLIMK2NoLSが脳組織で検出されたことから、

LIMK2 NoLSは、BBBを透過し、生理活性物質を脳組織へ輸

11) U. Koppelhus, S. K. Awasthi, V. Zachar, H. U. Holst, P.

送する機能を有することが明らかとなった。BBBは毛細血管

Ebbesen, and P. E. Nielsen, Antisense Nucleic Acid Drug

内皮細胞によって形成されており、血中から中枢神経系へのDev., 12, 51 (2002).

基質の透過を制御している。分子量が約500Da以下の小分子

12) M. Silhol, M. Tyagi, M. Giacca, B. Lebleu, and E. Vivès,Eur. J. Biochem., 269, 494 (2002).

や脂質溶解性の小さなタンパク質はBBBを透過できるが、分

13) K. Nagata, K. Ohashi, N. Yang, and K. Mizuno, Biochem. J.,

子量の大きなタンパク質はBBBを透過できないか、或いは中枢神経系に移行するための受容体介在性トランスサイトーシスが必要となる

24,25)

343, 99 (1999).
14) J. L. Kadrmas and M. C. Beckerle, Nat. Rev. Mol. Cell

。BBBは、毒性のある生体異物の侵入かBiol., 5, 920 (2004).

ら脳を保護するために重要な役割を担っているのである。し15) T. Sumi, K. Matsumoto, and T. Nakamura, J. Biol. Chem.,

かしながら、神経変性疾患治療の新しいアプローチとして、治療を目的としたタンパク質等を脳内の神経細胞やグリア細276, 670 (2001).

胞へ安全かつ効率よく輸送することが求められている今日、

16) S. T. Po'uha, M. S. Shum, A. Goebel, O. Bernard, and M.
Kavallaris, Oncogene, 29, 597 (2010).

BBBのtight junction(脳毛細血管で内皮細胞同士が密着結合した部位)が障壁となっている。我々は、LIMK2 NoLSのマウス

17) T. Amano, K. Tanabe, T. Eto, S. Narumiya, and K. Mizuno,,

Biochem. J., 354, 149 (2001).

BBB透過性評価を行い、LIMK2 NoLSが分子量500Daを超える

18) P. Goyal, D. Pandey, and W. Siess, J. Biol. Chem., 281,

大きなタンパク質を脳組織内へ輸送できるという非常に優れたBBB透過機能を有することを見出した。BBBを透過する

25223 (2006).
19) E. Emmott and J. A. Hiscox, EMBO Rep., 10, 231 (2009).

CPPの報告は、1999年、HIV-1 Tatがβ-ガラクトシダーゼを
26)

マウス脳内へ輸送できるという発見から始まった 。続いて、

20) K. Takahashi, K. Tanabe, M. Ohnuki, M. Narita, T.
Ichisaka, K. Tomoda, and S. Yamanaka, Cell, 131, 861

ショウジョウバエに由来するPenetratinやSynBベクターに由来するSynB1にBBB透過機能が発見された

4,27,28)(2007).

。現在、脳腫瘍などの治療を目的とした脳内への薬剤デリバリーが上述し21) Y. Yamazaki, H. Kanno, K. Maeda, T. Yoshida, N.

た３つのCPPsを中心に議論されている。LIMK2 NoLSを基に

Kobayashi, A. Kubo, Y. Yamaguchi, and T. Saito,

したCPPは、初めてのヒトタンパク質に由来するBBB透過性

Neuroreport, 21, 287 (2010).

29,30)CPP22) A. Kubo, T. Yoshida, N. Kobayashi, T. Yokoyama, T.

であり、ペプチドをベースとしたドラッグデリバリ

Mimura, T. Nishiguchi, T. Higashida, I. Yamamoto, and H.

ーシステムにおいて、新しい候補となり得ると考える。

Kanno, Stem Cells Dev., 18, 1523 (2009).

引用文献23) M. P. Rout, J. D. Aitchison, M. O. Magnasco, and B. T.
Chait, Trends Cell Biol., 13, 622 (2003).

１) V. Sebbage, Bioscience Horizons, 2, 64 (2009).

24) E. Kilic, U. Kilic, and D. M. Hermann, CNS Drug Rev., 11,２) T. Teesalu, K. N. Sugahara, V. R. Kotamraju, and E.

東亞合成グループ研究年報

369 (2005).

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25) B. J. Spencer and I. M. Verma, Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
104, 7594 (2007).
26) S. R. Schwarze, A. Ho, A. Vocero-Akbani, and S. F. Dowdy,

Science, 285, 1569 (1999).
27) S. V. Sarantseva1, O. I. Bolshakova1, S. I. Timoshenko, A.
A. Kolobov, M. P. Vitek, and S. A. L. chwarzman1,

Biochemistry (Moscow) Supplemental Series B: Biomedical
Chemistry, 3, 149 (2009).
28) C. Rousselle, P. Clair, J. M. Lefauconnier, M. Kaczorek, J.
M. Scherrmann, and J. Temsamani, Mol. Pharmacol., 57,
679 (2000).
29) N. Kobayashi, M. Niwa, H. Yang, and T. Yoshida, Protein

Pept Lett., 17, 1480 (2010).
30) 東亞合成株式会社．人工ペプチド及びその利用．国際公開WO 2009／093692号公報．2009-07-30．

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