称号及び氏名

博士(獣医学)

学位授与の日付

平成２１年２月２０日

論黄色ブドウ球菌におけるエンテロトキシン産生性の解析と

文

名

酒井 史彦

Multiplex PCR を用いたコアグラ－ゼ型別法の構築
論文審査委員

主査
副査
副査

小崎山崎
三宅俊司
伸二
眞実

論文要旨
緒言
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）は自然環境に広く分布するとともに、生息する環境によっては病原性細菌としてヒトや動物に、化膿巣形成、敗血症、院内感染症、および毒素性ショック症候群などの起因菌となる。黄色ブドウ球菌が食品中で増殖するとエンテロトキシン（SE）を産生し、毒素型食中毒であるブドウ球菌食中毒の原因となる。SE は古くから血清学的に SEA、SEB、SEC、SED、SEE（古典的 SE）の5 種類に分類されてきた。一方、最近新たな SE（新型 SE）やブドウ球菌エンテロトキシン様スーパー抗原（SEl）の存在が報告された。特に SEG、SEH、SEI については、これらの毒素遺伝子を保有する黄色ブドウ球菌が食中毒事例を含む様々な環境・検体から検出されること、また、これらの毒素がサルの嘔吐反応を引き起こすことから、食中毒の原因となる可能性が示唆されている。しかし、seg、seh、sei 遺伝子を保有する黄色ブドウ球菌に関して、その毒素産生性や疫学的な特徴ついては不明な点が多い。黄色ブドウ球菌を原因とする食中毒の疫学調査には様々な疫学的マーカーが開発されているが、日本ではコアグラーゼ型別法が最も一般的に用いられている。コアグラーゼ型は、コアグラーゼタンパク質の抗原性の違いにより 10 タイプ（I から X 型）に分類される。
コアグラーゼ型の分布は疾患や動物種により特徴的な分布を示し、例えばブドウ球菌食中毒では VII 型、院内感染で問題となる MRSA では II 型、ウシ乳房炎では VI 型がそれぞれ多く検出される。コアグラーゼ型と古典的 SE の産生との間に関連性は認められていない。一方、新型 SE に関しては、それらを検出するための検査キットが市販されていないため、新型 SE の産生とコアグラーゼ型別との関連性に関する詳細な報告は少ない。また、従来のコアグラーゼ型別法は非常に煩雑かつ熟練した技術を要し、判定結果を得るまでに多くの時間を要するという課題があった。
本 研 究 で は 、 SEG 、 SEH 、 お よ び SEI を 検 出 す る た め の Enzyme Linked
Immunosorbent Assay（ELISA）を構築し、食中毒由来株およびウシ生乳由来株における SEG、SEH、および SEI 産生株の分布とコアグラーゼ型との関連性や、毒素産生性の特性について検討した。また、コアグラーゼ型別を簡便かつ迅速に行うために、
Multiplex PCR を用いた遺伝学的型別法の構築を検討した。

第１章 食中毒由来黄色ブドウ球菌株における H 型エンテロトキシンの産生性の解析
最近、食中毒の原因となった食材からSEHが検出される事例が報告されている。しかし、黄色ブドウ球菌のSEH産生性や疫学マーカーとの関連性に関する知見は少ない。
そこで、SEHを定量的に検出するためのELISAを構築し、食中毒由来黄色ブドウ球菌株のSEH産生性や疫学マーカーであるコアグラーゼ型との関連性について検討した。
seh遺伝子を保有する黄色ブドウ球菌よりseh遺伝子をクローニングし、大腸菌で発現させた組換え体SEHを精製した。精製した組換え体SEHに対するウサギ抗血清から抗SEH抗体を精製し、ELISAを構築した。SEH検出用ELISAは他の毒素と交差することなくSEHとのみ特異的に反応し、検出限界は 1 ng/mlであった。日本のブドウ球菌食中
毒事例から分離された 144 株の黄色ブドウ球菌株について培地中でのSEA、SEB、SEC、SED、SEE、およびSEHの産生性を調べた結果、SEA産生株が 90 株（63%）と最も多く、次いでSEH産生株が 86 株（60%）であった。SEH産生株のうち 71 株はSEAまたはSEB、もしくはその両者を同時に産生し、残りの 15 株はSEHのみを産生した。これ
ら黄色ブドウ球菌についてコアグラーゼ型と毒素型の関係を解析した結果、SEA産生株
はコアグラーゼ型がII、III、IV、VI、およびVII型に分散しているのに対して、SEH産生株は全てがコアグラーゼVII型であることが明らかとなった。培地中でのSEH産生量はSEAとほぼ同レベルであったが、SEB産生量の約 1/10 のレベルであった。SEHとSEAは対数増殖期の後半から検出されたが、SEBの産生は、そのほとんどが定常期であった。
培地の水分活性(aw)を 1.00 から 0.95 に低下させた場合、SEHとSEAの産生は 50～230％の範囲で変動したが、SEBの産生は 2.2％に大きく低下した。これらの結果から、SEHが食中毒の発症に関与している可能性が示唆された。
第２章 黄色ブドウ球菌による G 型および I 型エンテロトキシンの産生性の解析
SEG 遺伝子（seg）および SEI 遺伝子（sei）を保有する黄色ブドウ球菌は様々な環境から検出され、そのほとんどは両遺伝子を同時に保有している。食中毒由来株やウシ
生乳由来株からも検出されるが、食中毒の発生に関係するのか否かについては不明な点が多い。そこで、食中毒由来株やウシ生乳由来株について、SEG および SEI の産生を調査するとともに、疫学マーカーであるコアグラーゼ型との関係を解析した。まず、分離株から PCR により seg と sei 保有株を検索した結果、食中毒由来株では 16％、生乳由来株では 51％が同遺伝子を保有していた。seg と sei 保有株のコアグラーゼ型は、食中毒由来株が II、III、VII 型および型別不能に広く分布していたが、生乳由来株では67％が VI 型に、残りが II 型に分類された。次に、新たに構築した SEG と SEI を検出するための ELISA を用いて、培地中での SEG と SEI の産生を検討した。食中毒由来株では seg と sei 保有株の全てから SEG と SEI が検出された。一方、生乳由来株では、コアグラーゼ II 型株からは SEG と SEI が検出されたが、VI 型株から両毒素は検出されなかった。SEG および SEI の産生量は、ほとんどの菌株が 0.05 μg/ml 以下であり、SEA、SEB、SEC、SED および SEH の産生量（1～30 μg/ml）に比べて低いレベルであった。また、市販の牛乳や脱脂乳中で培養しても、SEG と SEI は検出されなかった。
以上の結果から、黄色ブドウ球菌による SEG と SEI の産生量は他の SE に比べて低いレベルであり、また、生乳中で主要なコアグラーゼ VI 型株は両毒素をほとんど産生していない可能性が示唆された。
第３章 黄色ブドウ球菌のコアグラーゼ型、および VI 型コアグラーゼのサブタイプを識別するための Multiplex PCR の構築
黄色ブドウ球菌の産生するコアグラーゼは、抗原性の異なる 10 タイプの血清型（I～X 型）に分類されており、黄色ブドウ球菌を識別する有用な疫学マーカーとして使用されている。I から VIII 型については市販の特異抗体を用いた血漿凝固の阻害試験による型別法が実施されているが、その操作は煩雑で迅速性に欠けることから、日本以外での使用実績は低い。本章では、I から VIII 型のコアグラーゼ遺伝子の塩基配列の違いに注目して、Multiplex PCR を用いた型別法の構築を検討した。各型を識別するプライマーは、それぞれの型間で相同性の低い D1 および D2 領域を標的に設計した。しかし、
VI 型検出用のプライマーにおいて、VI 型標準株（stp12）は検出できるがウシ由来 VI型株を検出できない結果が得られた。そこでウシ由来 VI 型株のコアグラーゼ遺伝子塩基配列を解析した結果、stp12 の塩基配列（VIa 型）とは一部が異なる 2 つのタイプの塩基配列（VIb 型および VIc 型）が認められた。これら 3 つの VI 型サブタイプを同時に検出する 1 組のプライマーを新たに設計し、III、IV、VII、VIII 型を検出するためのMultiplex PCR A (M-PCR:A)と、I、II、V、VI 型を検出するための M-PCR:B の 2 組の PCR セットを構築した。155 株の分離株のうち 154 株において、M-PCR 法と従来法により決定されたコアグラーゼ型が一致した。また、VI 型の 3 つのサブタイプをそれぞれ識別するための M-PCR:C を構築し、VI 型株のサブタイピングを実施した。その結果、食中毒由来株は VIa 型に、ウシ由来株は VIb 型と VIc 型に分類された。各サブタイプの se 遺伝子（sea～sei）の保有を調べた結果、VIa 型は sea を保有しており、VIb 型からは sec, sed, seg, および sei のいずれかが検出された。一方、VIc 型からはいずれの se 遺伝子も検出されなかった。これらの結果は、VI 型コアグラーゼ遺伝子のサブタイプと se 遺伝子の保有に関係があることを示唆している。本章で開発した 3 つのMultiplex PCR は、簡便かつ迅速なコアグラーゼ型別法として有用であり、今後黄色ブドウ球菌の疫学的研究の重要なツールと考えられる。
総括
1． 食中毒に由来する黄色ブドウ球菌株の SEH 産生性について検討した結果、食中毒由来株の約 6 割が SEH を産生し、それらは全てコアグラーゼ VII 型に分類された。

SEH の産生性は SEA の産生性に似た特性を有しており、SEB とは大きく異なった。
SEH は、SEA と同様に食中毒の発症に関与している可能性が示唆された。
2． 食中毒由来およびウシ生乳由来黄色ブドウ球菌株の SEG および SEI の産生量は、他の SE に比べて非常に少ないことが判明した。また、コアグラーゼ VI 型株からSEG および SEI の産生は認められず、コアグラーゼ型間で SEG および SEI の産生は異なることが示唆された。
3． コアグラーゼ I から VIII 型と、VI 型コアグラーゼ遺伝子の 3 つのサブタイプを識別するための Multiplex PCR を構築した。さらに、VI 型コアグラーゼ遺伝子に 3つのサブタイプが存在することを見出し、それらを識別する Multiplex PCR を構築した。Multiplex PCR を用いた型別法は、簡便かつ迅速であり、疫学的研究の有用なツールと考えられる。

審査結果の要旨

黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）は病原性細菌としてヒトや動物に敗血症、院内感染症などの起因菌となる。本菌が食品中で増殖するとエンテロトキシン（SE）を産生し、ブドウ球菌食中毒の原因となる。SE は古くから 5 つの血清型（A〜E 型）に分類されてきたが、最近新たな SE（新型 SE）の存在が報告され、特に SEG、SEH、SEI については毒素遺伝子を保有する黄色ブドウ球菌が食中毒事例を含む様々な環境・検体から検出されることから、食中毒の原因となる可能性が示唆されている。一方、食中毒の疫学調査にコアグラーゼ型別法（I〜X 型）が最も一般的に用いられ、型別の分布は疾患や動物種により異なるが、SE の産生とコアグラーゼ型別との関連性に関する詳細な報告は少ない。本研究では、新型 SE の検出法を構築し、食中毒由来株およびウシ生乳由来株における新型 SE 産生株の分布とコアグラーゼ型との関連性や、毒素産生性の特性について検討した。また、コアグラーゼ型別を簡便かつ迅速に行うために、
Multiplex PCR を用いた遺伝学的型別法の構築を検討した。
SEH を定量的に検出するための ELISA を構築し、食中毒由来黄色ブドウ球菌株のSEH 産生性や疫学マーカーであるコアグラーゼ型との関連性について検討した。精製した組換え体 SEH に対するウサギ抗血清から抗 SEH 抗体を精製し、ELISA を構築した。SEH 検出用 ELISA は SEH とのみ特異的に反応し、検出限界は 1 ng/ml であった。

食中毒事例から分離された 144 株について SE の産生性を調べた結果、SEA 産生株が90 株（63%）と最も多く、次いで SEH 産生株が 86 株（60%）であった。SEH 産生株のうち 71 株は SEA または SEB、もしくはその両者を同時に産生し、残りの 15 株はSEH のみを産生した。コアグラーゼ型と毒素型の関係を解析した結果、SEA 産生株はコアグラーゼ型が II、III、IV、VI、および VII 型に分散しているのに対して、SEH 産生株は全てがコアグラーゼ VII 型であった。
食中毒由来株やウシ生乳由来株について、SEG および SEI の産生を調査するとともに、コアグラーゼ型との関係を解析した。分離株から PCR により seg と sei 保有株を検索した結果、食中毒由来株では 16％、生乳由来株では 51％が同遺伝子を保有していた。コアグラーゼ型は、食中毒由来株が II、III、VII 型に広く分布していたが、生乳由来株では 67％が VI 型に、残りが II 型に分類された。SEG と SEI の検出を ELISA で試みたところ、食中毒由来株は seg と sei 保有株の全てから SEG と SEI が産生することを確認したが、SE の産生量は少なかった。また、市販の牛乳や脱脂乳中で培養しても、SEG と SEI の産生は認められなかった。
コアグラーゼ遺伝子の塩基配列の違いに注目して、Multiplex PCR を用いた型別法の構築を検討した。ウシ由来 VI 型株のコアグラーゼ遺伝子の塩基配列を解析した結果、stp12 の塩基配列（VIa 型）とは一部が異なる 2 つのタイプの塩基配列（VIb 型およびVIc 型）が認められた。これら 3 つの VI 型サブタイプを同時に検出する 1 組のプライマーを新たに設計し、III、IV、VII、VIII 型を検出するための Multiplex PCR A(M-PCR:A)と、I、II、V、VI 型を検出するための M-PCR:B の 2 組の PCR セットを構築した。155 株の分離株のうち 154 株において、M-PCR 法と従来法により決定されたコアグラーゼ型が一致した。また、VI 型の 3 つのサブタイプをそれぞれ識別するための M-PCR:C を構築し、VI 型株のサブタイピングを実施した。その結果、食中毒由来株は VIa 型に、ウシ由来株は VIb 型と VIc 型に分類された。各サブタイプの se 遺伝子（sea〜sei）の保有を調べた結果、VIa 型は sea を保有しており、VIb 型からは sec, sed,seg, および sei のいずれかが検出された。一方、VIc 型からはいずれの se 遺伝子も検出されなかった。これらの結果は、VI 型コアグラーゼ遺伝子のサブタイプと se 遺伝子の保有に関係があることを示唆している。開発した 3 つの Multiplex PCR は、簡便かつ迅速なコアグラーゼ型別法として有用な方法になると考えられた。
以上、本研究は、 新規 SE の中で SEH は食中毒の発症に関与しているが、SEG お
よび SEI 産生菌の毒素産生性が低いことを明らかにした。また、新規に構築したコアグラーゼ型を識別する Multiplex PCR は簡便かつ迅速な疫学的研究の有用なツールとなることを示した。これらの成果は、応用獣医学、特に感染制御学、食品衛生学の領域で新たな知見を提供するものであり、学力確認の結果と併せて博士（獣医学）の学位を授与することを適当と認める。