Photon Factory Activity Report 2018 #36 (2019)

BL-10C/2017G068

免疫グロブリン G の Fc 領域の糖鎖の除去で open 構造は誘起されない: 溶液
小角 X 線散乱による証明
Aglycosylation does not induce the open structure of Fc region of immunoglobulin G
proven by solution small angle X-ray scattering
今村比呂志 1,2, 八桁清樹 1, 渋谷理紗 3, 本田真也 1, 3*
1
産業技術総合研究所バイオメディカル研究部門, 〒305-8566 茨城県つくば市東 1-1-1
2立命館大学生命科学部, 〒525-8577 滋賀県草津市野路東 1-1-1
3
東京大学大学院新領域創成科学研究科, 〒277-8562 千葉県柏市柏の葉 5-1-5
Hiroshi Imamura1,2, Seiki Yageta1, Risa Shibuya3, and Shinya Honda1,3*1
Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology,1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japan2
Department of Applied Chemistry, College of Life Sciences, Ritsumeikan University, 1-1-1
Nojihigashi, Kusatsu, Shiga 525-8577, Japan3
Department of Computational Biology and Medical Sciences, Graduate School of FrontierSciences, The University of Tokyo, 5-1-5 Kashiwanoha, Kashiwa, Chiba 277-8562, Japan
1 はじめに
ヒト免疫グロブリン G1（IgG1）の crystallizablefragment（Fc）領域は、免疫グロブリンフォールドを有する 4 つのドメインをドーナッツ状に配置した構造を有している。さらに CH2 ドメインは N 結合型糖鎖を有しており、この糖鎖はドーナッツの内側の空隙を埋めるように存在する（図 1）。この糖鎖は、Fc 領域の構造安定性と免疫応答に関与しており、糖鎖を除去すると免疫応答に関与する Fc 受容体との結合親和性が消失する。しかし、この現象の分子論的なメカニズムは、未だ完全には明らかにされていな
い。

図１. IgG1 の Fc 領域の結晶構造 (PDB: 1OQX).
これまでに糖鎖除去による結合親和性低下の要因として、いくつかの仮説が提案されている。その一つは、Fc 領域中の CH2 ドメインの空間配置（CH2 ドメイン配向）の変化である。Borrok らの小角 X 線散乱（SAXS）法を用いた解析[1]では、糖鎖を除去した Fc 領域（aglycosylated Fc; aFc）が、糖鎖を有するFc 領域（glycosylated Fc; gFc）よりも大きな回転半径（Rg）を示すことから、aFc の CH2 ドメイン配向はgFc よりも外側に広がっている（=“糖鎖除去によるopen 構造の誘起”）と解釈した。しかし、その後のNMR の残余双極子相互作用を用いた解析[2]では、糖鎖除去による CH2-CH3 ドメイン間における配向に大きな変化は観測されず、先の SAXS 解析の解釈とは矛盾した結論が得られた。
そこで我々は、gFc と aFc を用意し、SAXS 測定を実施し、さらに過去の SAXS 解析では実施されなかった結晶構造を基に算出した SAXS の理論プロファ
イルと測定プロファイルとの比較を行い、溶液中における gFc と aFc の CH2 ドメイン配向の特性を明らかにした[3]。
2 実験
SAXS 測定は BL10C のビームラインで行った。X線の波長は 0.12 nm、カメラ長は 2028 mm とし、ベヘン酸銀の散乱パターンを用いて校正した。X 線散乱は、PILATUS3 2M (DECTRIS Ltd., Switzerland)で検出した。糖鎖を有する IgG1 の Fc 領域（gFc）はパパインによる IgG1 の酵素分解処理で得た。糖鎖を有しない IgG1 の Fc 領域（aFc）は E. coli の発現系で得た[1,2]。精製したサンプルの分子量、糖鎖の不均一性を LC-MS 分析により評価した（詳細は[4]参照）。精製タンパク質溶解液を透析により 20 mMクエン酸-リン酸緩衝液（pH 7.0）に調整し、透析液で 2–5 mg/mL に希釈して測定に供した。測定の温度は、25.0 ± 0.1°C に設定した。1 枚の画像データにつき 2 秒の X 線露光を行い、濃度条件毎に 15 枚のデータを取得した。画像の一次元化には Nika [5]を用いた。

Photon Factory Activity Report 2018 #36 (2019)

3 結果および考察
図 1 に示した gFc と aFc の SAXS 解析より、回転半径（Rg）は糖鎖除去（gFc -> aFc）により増加していることが分かった。この傾向は Borrok らの報告
[1]と一致しているが、距離分布関数と構造モデリン
グの解析（[3]に詳述）により、Borrok らの“糖鎖除去による open 構造の誘起”という解釈が妥当ではないことが分かった。図 1 に模式的に描いたように、タンパク質の形状は変化しなくても、糖鎖が除去されることで、糖鎖に由来する散乱が消失し、Rg の増加が起こる[3]。

図１. gFc と aFc のギニエプロットと Rg. 黒い球はgFc を表す. aFc は gFc と同じ大きさの球だが、糖鎖が除かれた部分（白い部分）が空洞となった中空球で模式化した.
4 まとめ
糖鎖除去（gFc -> aFc）により Rg は増加するが、CH2 ドメイン配向は同等である。溶液中におけるgFc と aFc の距離分布関数と CH2 ドメイン配向のモ
デリング解析の詳細は既報[3]を参照されたい。
謝辞
本研究の一部は、国立研究開発法人日本医療研究開発機構（AMED）の課題番号 JP17ae0101003 の支援を受けた。
参考文献[1] M. J. Borrok et al., ACS Chem Biol. 7, 1596 (2012).
[2] G. Subedi et al., Structure 23, 9 (2015).
[3] S. Yageta et al., mAbs 11, 453 (2019).
[4] S. Yageta et al., Mol. Pharmaceutics 12, 1443 (2015).
[5] J. J. Ilavsky, J. Appl. Crystallogr. 45, 324 (2012).
成果
1. 本成果は Taylor & Francis 出版の mAbs (Volume 11,Issue 3, 2019)のカバーアートに選出された。
2. 小角 X 線散乱データは Small Angle Scattering
Biological Data Bank (SASBDB) に そ れ ぞ れ
SASDDG2, SASDDH2 として登録された。
* s.honda@aist.go.jp