Res. Org. Geochem. 26, 81­93 (2010)

論文

微量湿式分析による分子レベル同位体比の品質管理と確度向上：
特に天然存在比の正確な評価と Stable Isotope Probing（SIP）法の応用に向けて *高野淑識 **・力石嘉人 **・大河内直彦 **,***,****（2010 年 5 月 28 日受付，2010 年 9 月 29 日受理）

Abstract
Recent advances in the application of molecular approaches have emphasized our potentially underestimate of
microbial diversity in natural environments and have revealed comprehensive biogeochemical processes. One of thebiggest challenges for organic geochemists and/or microbial ecologists is to identify which organisms are carryingout a specific set of metabolic processes. To answer this fundamental question, stable isotope probing (SIP) together
with compound-specific isotope analysis (CSIA) is a useful technique to understand the microbial ecology andits biogeochemical cycles. The method relies on the incorporation of a substrate that is highly enriched in a stable
isotope such as 13C and 15N, and the identification of specific molecular targets through active microorganisms in any
environment. However, we have to pay attention about highly SI-enriched contamination problems and co-elution
problems during pretreatment of chemical analysis and also in chromatographic procedures, which potentiallyprevent us from performing precise CSIA. Here, we point out quality control by wet chemical pre-treatment for
precise compound-specific isotope analysis by isotope-ratio mass spectrometry coupled to gas chromatography andliquid chromatography. Not only in biogeochemical background but also from a scope of common welfare, CSIA
technique is also widely useful tools for validation approaches in food material, anti-doping test, and environmental
assessment. For further precise CSIA, we also discuss representative optimized analytical conditions of some modelcompounds including intact polar lipids (IPLs) with its derivatives, n-alkane, and amino acids.

* Quality control by wet chemical pre-treatment for precise compound-specific isotope analysis** 独立行政法人海洋研究開発機構，海洋・極限環境生物圏領域 〒 237-0037 横須賀市夏島町 2-15
Yoshinori Takano, Yoshito Chikaraishi and Naohiko Ohkouchi: Institute of Biogeosciences, Japan Agency for
Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC)
2-15 Natsushima, Yokosuka, Kanagawa 237-0061, Japan*** 東京工業大学大学院総合理工学研究科化学環境学専攻 〒 226-8502 横浜市緑区長津田 4259
Department of Environmental Science and Technology, Tokyo Institute of Technology
4259 Nagatsuda, Midori-ku, Yokohama, Kanagawa 226-8502, Japan****東京大学大学院理学系研究科地球惑星科学専攻 〒 113-0033 東京都文京区本郷 7-3-1
Department of Earth and Planetary Sciences, University of Tokyo
7-3-1 Hongo, Tokyo 113-0033, Japan
Corresponding author. Yoshinori Takano
e-mail: takano@jamstec.go.jp, Fax: +81-46-867-9775−81−

高野淑識・力石嘉人・大河内直彦の信頼性に大きな影響を与える。例えば，アミノ

1. はじめに微生物群集の構造解析や分子レベルでの生物酸のガスクロマトグラフ法での共溶出に関する事
例では，Nature 誌上で Engel and Macko（1997）と

地球化学的プロセスの解明に向けて，生元素の安定同位体のラベル化による Stable Isotope Prob-

行われている。本稿では，分子レベル同位体比のing（SIP）法が広く用いられるようになった（e.g.,
Boschker et al., 1998: Radajewski et al., 2000: Boschker

る基礎的な留意点についてまとめた。主に，極性脂and Middelburg, 2002: Radajewski et al., 2003: Dumont

質・コア脂質および位置異性体の解析，クロマトグ

and Murrell, 2005: McDonald et al., 2005: Veuger et

ラフ法と共溶出化合物の評価，クロマトグラフ法

al., 2006: Evershed et al., 2006: Nomaki et al., 2008:

および分光法による不純物のスクリーニング，化Pizzarello and Cronin（1998）のような議論・反論が品質管理と確度向上を図るために，湿式分析によBuhring et al., 2009: Webster et al., 2010）。標識され学修飾による共溶出化合物の分離，溶出中の同位た分子の情報を得ることは，クロマトグラフ法を体分別について，いくつかのモデル化合物と分析用いて有機化合物を分離・検出し，その化合物をの具体例を挙げ，その改善方法を考察した。本稿で扱う内容以外でも炭素（13C/12C）・窒素（15N/14N）

同定・定量することが基本となる。低沸点化合物
では，主にガスクロマトグラフ法（GC）およびガスクロマトグラフ / 質量分析法（GC/MS）が必要の分子レベル同位体比の品質管理と正確な評価になる。高沸点化合物では，主に液体クロマトグを目的とした総説（Metges and Petzke, 1999: Hoefs,
2007: Michener and Lajtha, 2007: 力石・大場，2008:

ラフ法（LC）および液体クロマトグラフ質量分析

Ohkouchi et al., 2010）があるので参照されたい。

法（LC/MS）が用いられる。さらに，クロマトグラ
フで分離された化合物は，オフラインまたはオン

2. 試

ラインの同位体質量分析（IRMS）を行なうことで，

料

分子レベルの同位体比を評価することができる。
安定同位体の天然存在比の評価とともに，13C や高分子化合物の試料は，Matreya Biochemicals
LLC お よ び ブ レ ー メ ン 大 学 海 洋 環 境 研 究 セ ン

15

実験の評価には，分子レベル同位体比の品質管理

ターから入手した培養アーキア株（Thermoplasma
acidophilum）の脂質画分を用いた。低分子化合物と確度を向上させる必要がある。では，具体的には，和光純薬から入手した n-アルカンおよびアミは，どのような点に留意すれば良いのだろうか。

N などの同位体標識によるトレース化合物や標識

まず，分子レベル同位体比の評価には，目的とすノ酸標準試料を用いた。陽イオン交換カラムに用いた樹脂は，Bio-Rad 社製 AG50 W-X-8（200-400

る化合物の「正確なベースライン分離あるいは単mesh）を用いた。海洋堆積物試料は，下北半島沖

離」が基本となる。生体試料や堆積物のような多成分系の複雑な組成を持つ試料や夾雑物の多い試で海洋掘削船 ｢ちきゅう｣ の調査航海（CK06-06）
で採取された表層堆積物（sec 1-1，深度 0.5 m）を料を分析する際には，前処理法および分離・単離用いた（Kobayashi et al., 2008）。

の最適化は，常に引き合いに出されている。次に，クロマトグラフ上での「共溶出（co-elute）」の検証

3. 分析方法が必要になることもある。共溶出とは，目的物と同じ保持時間に目的外の化合物が同時溶出すること

3.1. HPLC/ESI-MS および HPLC/APCI-MSを指す。仮に，クロマトグラフによる共溶出がある培養した Thermoplasma acidophilum の Intact polar
lipids（IPLs）画分は，液体クロマトグラフ / 質量分
析計（HPLC/MS, Agilent 1100）を用い，電子スプと，「分子レベルの同位体比」という根拠が成立しないことを意味する。有機化合物の分析では，分下で極性が非常に近い化合物同士がオーバーラッ

レーイオン化法（ESI, positive mode, m/z 200-2000）
で分析した（Sturt et al., 2004）。化合物の分離は，

プするような場合に遭遇することがある。この共LiChrospher Diol（2 × 125 mm, 5 μm; Alltech, Deer-

溶出は，化合物の安定同位体比の評価や分子指標

field, IL, USA）および同ガードカラム（4 ×7.5 mm）

子量や組成式が異なるにも関わらず，同溶出条件−82−

微量湿式分析による分子レベル同位体比の品質管理と確度向上：特に天然存在比の正確な評価と Stable Isotope Probing（SIP）法の応用に向けてで行った。カラムおよびガードカラムは，カラムオーブン（Poralathermo）でプレヒーター 35℃，
オーブン内 30℃に保持した。溶離液は，A: n-ヘ
キサン / 2-プロパノール / ギ酸 / 14.8 mol/L アンモ

i.d.; 膜厚 0.25 μm; Agilent）を用いた。n-アルカン
分析時のオーブン昇温プログラムは，40ºC から
120ºC まで 10ºC min-1 で昇温後，6ºC min-1 で 320ºC
まで昇温し，320ºC で 20 分間保持した。キャリ

ニア水（79:20:0.12:0.04, v/v）の混合溶液，B: 2-プ
ロパノール / 蒸留水 / ギ酸 / 14.8 mol/L アンモニア

アーガスはヘリウムを用い，流速 1.3 mL/min とした。電子イオン化電圧は 70 eV とし，スキャン

水（88:10:0.12:0.04, v/v）の混合溶液を用い，流速0.2 mL/min で，0 分（B 液 : 0%）から 45 分（B 液 :範囲は m/z 40-800 とした。アミノ酸の分析条件
は，Chikaraishi et al.（2009, 2010），力石ら（2009），

65%）のグラジエントで行った。この IPLs は，ホスファチジルグリセロール基（Phosphatidyl glyc-

Takano et al.（2009）を参照されたい。

erol-）およびグリコシル基（Glycosyl-）を極性頭部

4. 結果と考察に持ち，GDGT（glycerol dialkyl glycerol tetraethers）
をコア脂質にしていることから，IPL-GDGTs と呼4.1. 極性脂質と位置異性体（レジオアイソマー）の解析
Figure 1 の培養試料 T. acidophilum 由来の IPL-

ばれる。
次に，ここで用いた IPL-GDGTs に 2 mol/L HCl/
MeOH（1:1, v/v）を用いて，塩酸メタノール分解（acid methanolysis: 110℃，3 時間）を行い，乾燥後，GDGTs のクロマトグラムが示すように，T. acidophilum の膜脂質を構成する IPLs は，多様な構

蒸留水と n-ヘキサン / n-プロパノール（99:1, v/v）の各 1 mL で液 / 液抽出を 3 回行い，有機相の T.

基およびグリコシル基の極性頭部とコア脂質部分

acidophilum 由来のコア脂質（Core Lipids）を精製は複数の組み合わせが可能であり，それらに対応した。この画分を CL-GDGTs と呼ぶ。液体クロマトグラフ / 質量分析計（HPLC/MS, Agilent 1100）

した異性体群（Appendix）のシグナルが出現してを 用 い， 検 出 は 大 気 圧 化 学 イ オ ン 化 法（APCI,
positive mode, m/z 200-2000）で行なった。分離は，ロール基とコア脂質の結合は，グリコシル基とのPrevail Cyano（2.1 ×150 mm, 3 μm; Alltech, Deerfield,

造を保有している。ホスファチジルグリセロール

いることが分かる。また，ホスファチジルグリセ
それに比べて化学的に強く，ESI 法で開裂していIL, USA）および同ガードカラム（4 ×7.5 mm）でないことが分かる。ここで見られる，一連の減少パターン（m/z = 2）は，コア脂質部位のシクロペ行った（Huguet et al., 2006）。カラムおよびガード

ンタン環の数に由来する（Appendix）。

カラムは，カラムオーブン（Poralathermo）でプレ極性頭部を化学的に切断して得られるコア脂

ヒーター 45℃，オーブン内 40℃に保持した。溶
離液は，A: n-ヘキサン，B: n-プロパノールを用質（CL-GDGTs）のクロマトグラムを Figure 2 に示い，流速 0.2 mL/min で，0 分（B 液 : 1%）から 45分（B 液 : 1.8%）のグラジエント後に，55 分まで B

レノイドと 2,3-sn-グリセロールから構成されるカす。GDGTs のうち，五員環を保有しないイソプ

液 10% のバックフラッシュを行った（Takano et al.,ル ド ア ー キ オ ー ル（caldarchaeol）の 他，GDGT1,
GDGT2, GDGT3, GDGT4 およびその位置異性体

2010b）。極性溶媒によるバックフラッシュは，目（regio-isomer: e.g., m/z 1307, 1309）が 含 ま れ る こ

的化合物の溶出後の洗浄を意味しており，カラム
平衡化の前に行われる（e.g., Hopmans et al., 2000）。

とがわかる。三次元クロマトグラムで見ると，
GDGT3 と保持時間がほぼ同一で，質量数が異なる未同定の GDGTs（m/z 1307, 1309）の共溶出が認

3.2. GC/FID および GC/MS
n-アルカンおよびアミノ酸の分析は，ガスクロ

められる。各化合物の同位体組成は，preparative
HPLC により各化合物をベースライン分離で分取

マトグラフ（GC/FID; Agilent Technologies 6890）およびガスクロマトグラフ / 質量分析計（GC/MS;

し，同位体質量分析計を用いて評価が可能となる（e.g., Shah et al., 2008: Takano et al., 2010b）。例

Agilent 6890N/Agilent 5973）を用いた。化合物の分

えば，Figure 2 に示すように，化合物 A（caldarchaeol）や化合物 B（GDGT1）の分子レベル同位体

離は，キャピラリーカラム（HP-5，30 m × 0.25 mm−83−

高野淑識・力石嘉人・大河内直彦

HPLC/ESI-MS (positive) for IPL-GDGTs from Thermoplasma acidophilum
1612
1610

m/z 1456

m/z 1450[M+H]+ = 1618

1616

1614

Intensity[M+H]+ = 1612
1450

1618

1610
1448
1446

1454
4
1456

1700

elution blank
Glyco- and phosphoglycoGDGT isomers

1500
elution blank

m/z

1300

Fig. 1. Representative total ion chromatogram of intact polar lipids (glyco- and phosphoglyco-GDGTs) from Thermoplasma acidphilus by HPLC/ESI-MS on positivemode. Three axis stands for retention time (min), m/z, intensity. See also analyticalcondition in Sturt et al., 2004: Rossel et al., 2008: Schubotz et al., 2009.

Intensity

HPLC/APCI-MS (positive) for CL-GDGTs from Thermoplasma acidophilum

1296
1298

1294

1300
1309
1302

1293, 1291
1307
1296

compound (B)compound (A)1330
GDGT isomers

1300

elution blankcompound (A), (B) …

m/z

1270

elution blankFig. 2. Representative total ion chromatogram of Thermoplasma acidphilus after sugarcleavage treatment by HPLC/APCI-MS on positive mode. Three axis stands forretention time (min), m/z, intensity. Here, compound (A) and (B) indicate caldarchaeol and GDGT 1 (glycerol dialkyl glycerol tetraethers). See also analytical condition (Huguet et al., 2006) and the discussion of elution blank (Takano
et al., 2010b: Ogawa et al., 2010).

−84−

微量湿式分析による分子レベル同位体比の品質管理と確度向上：特に天然存在比の正確な評価と Stable Isotope Probing（SIP）法の応用に向けて出条件のバックグラウンド値の評価，試薬溶媒に比は，この分離条件で評価できる。しかし，このT. acidophilum 試料の場合，GDGT3 や GDGT4 の元来含まれている微量残留添加物のクロスチェッ

保持時間には，高質量側に共溶出する異性体化合物（m/z 1307, 1309）があるため，両者を別の方法

クを必要とする。目的以外の化合物が，混入していないことを示すには，elution blank として目的で再分離しなければ，それぞれの分子レベル同化合物を挟み打ちするように（Figure 2），その保位体比を評価することができない。HT-GC（HighTemperature GC）による分離で，CL-GDGTs を直接

持時間のバックグラウンドを評価すれば反証がでオンラインで同位体質量分析計に導入する方法も検討されている（Pancost et al., 2008）。
実際の環境中には，多種多様な微生物が存在するため，共溶出する IPLs の定性・定量評価は，きる。また，目的化合物を単離した後に，核磁気共鳴スペクトル法（1H-, 13C-NMR）を用いれば，純度決定がより確実になる。有機化合物の NMR 測
定の場合，重溶媒の使用が一般的であり，重水素と極性官能基との間の置換反応は，非常に速やか

SIM（Selected ion monitoring）や後述する MS density map の併用が望ましい（e.g., Rossel et al., 2008:

ンが，重水素と置換され，その部位のプロトンのSchubotz et al., 2009: Lipp and Hinrichs, 2009）。まシグナルが 1H-NMR 上で消失することに留意するに進行してしまう。このため，交換可能なプロト

た，堆積物中では，IPL-GDGTs と CL-GDGTs が必要がある（竹内・西川，2004）。

共存している。それらを正確に識別する一つの方法として，ここで示した HPLC/ESI-MS と HPLC/

ここで，研究対象の目的化合物カルドアーキ
オール（caldarchaeol: C86H172O6）が 1.0 nmol あると

APCI-MS の分析方法を組み合わせることにより，仮定する。真の値 δ13C(1)caldarcheaol = -20‰（vs. PDB）の時，ラベル化された 13C-DIC（dissolved inorganic

各々 IPL-GDGTs と CL-GDGTs の定量評価，Ring
Index 評価等が可能になる。
4.2 クロマトグラフ法と共溶出化合物の評価
4.2.1 同位体ラベルした化合物の共溶出と確度保証
12前後のマスバランスから混入後の見かけ上の値δ13C(2)caldarcheaol は，

今 回 用 い た T. acidophilum は， 天 然 存 在 比 のC-，14N-栄養基質で培養したものである。13C-基質や 15N-基質を用いて培養した場合は，ラベル基質から二次的に生成した多くの未知 13C-化合物や
15carbon: δ13CDIC = 1000, 2000, 4000, 8000‰） が，0.001-10 nmol（共溶出量 : ZDIC nmol）混入すると，（86 + ZDIC）x δ13C(2)caldarcheaol= 86 x δ13C(1)caldarcheaol + ZDIC x δ13CDICと示される。

N-化合物が混入しているため，「クロマトグラ

Δ13Ccaldarcheaol = δ13C(2)caldarcheaol - δ13C(1)caldarcheaol

ム上には現れない化合物」の存在に留意する必要がある。クロマトグラム上には現れない化合物とは，DAD（Diode Array Detector）の場合，吸収を持であるから，真の δ13C(1)caldarcheaol との差（Δ13Ccaldarcheaol）の理論曲線は，Figure 3 のようになる。同位体質量たない化合物が相当する。MS の場合，検出可能分析計での δ13Ccaldarcheaol の測定誤差を ± 0.5‰とすると，混入した 13C-DIC が 8000‰ の場合，0.1% オー

なレンジ以外の質量範囲の化合物（微少分子量および高分子量）が相当する。このような DAD および MS の弱点を補填できる検出法の一つは，ELSD

ダーの共溶出量でも真の値とのずれは，しだいに顕著になることが分かる。

（Evaporative Light Scattering Detector）である。
また，HPLC のカラムと高親和性で未知の 13C-

4.2.2 エナンチオ過剰率と共溶出の検証化合物が，カラムにトラップされて，連続的ある

4.2.1 で述べた共溶出の検証は，エナンチオ過剰

いは不連続的に溶出するような場合もある。未知の 13C-化合物が前処理で 100% 除去できる保証，率（Enantiomeric Excesses: ee）のように相対比を評価する分析でも重要である。Figure 4 にエナン

ガードカラムに 100% トラップ可能である保証はチオ過剰率のモデル化合物として D-アミノ酸（存無いと考えた方が良い。したがって，preparative
HPLC のように分画後に濃縮が必要な場合は，溶在量比 50.0%），L-アミノ酸（存在量比 50.0%）の例を示す。各存在量比は 50.0% の場合，−85−

高野淑識・力石嘉人・大河内直彦(a) without co-elution
D-Amino acid(50%)

L-Amino acid(50%)

precise conclusion

G13CDIC = 8000‰'13C = 0.0 㫧 0.5 ‰(original G13C in 1V)

Enantiomeric excess(ee: %L - %D)=0%Intensity

'13C
4000‰

base-line resolution(b) with co-elution

L-Amino acid& co-elution compound

2000‰
D-Amino acid

Original

1000‰

misleading conclusion%L > %D'13C = 0.0 㫧 0.5 ‰Co-elution

Retention time (min)Fig. 3. Theoretical diagram between Δ13Ccaldarcheaol (difference between original isotopic composition andco-eluted 13C-DIC) and additional mixing rate of
13C-DIC. Here, original δ13C
caldarcheaol is defined as-20‰ with the amount of 1 nmol.

(c) ' ee % caused by co-elution compound

original ee in 1V (㫧 0.2 %)'eeEnantiomeric Excesses（ee）=（| L – D |）/ L + D |）x 100（|= | L% – %D |'ee

= 0.0 %

D : L = 50.0 : 50.0
(original ee = 0.0 㫧 0.2 %)である。ここで，Figure 4 に示すように L-アミノ酸の検出強度に対して，同じ保持時間に共溶出する化合物の割合を Z % とすると，真の ee と見か
け上の ee の差（Δee）は，
Δ Enantiomeric Excesses（Δee）= （L%|+ Z）–（%D – Z）|=2Z%

Fig. 4. An example of co-eluted unknown compound
overwrapping signal on L-amino acid. (a) separation model of pristine original D-, L-amino acids inbase-line resolution (without co-elution), (b) co-elution with L-amino acid on same retention time, (c)theoretical diagram between Δee (difference of enantiomeric excess) caused by co-elution compound.

となる。したがって，分析の測定誤差を ± 0.2% とすると，共溶出量 0.2% でも真の値とのずれ（Δee）

m/z 207，m/z 281 の未知化合物が高温側でブリーは有意になり，誤った評価が行われてしまう可能性がある（e.g., Engel and Macko, 1997: Pizzarello

ディングしていることが分かる。Figure 5 を二次元の MS density map にすると，Figure 6（b）になる。

and Cronin, 1998）。

Figure 6 には，（a）不純物の無いガスクロマトグ
ラムの分離例，（b）不純物（▼）のあるガスクロマ

4.3. クロマトグラフ法および分光法による不純物

トグラムの分離例を示す。ここで目的とする化合物（●: n-アルカン）の絶対量に対して，目的外化のスクリーニング
n-アルカン（n-C15 – C30）の GC/MS による分離を
Figures 5&6 に示す。ガスクロマトグラフに接続さが多い場合，目的化合物の同位体比の評価は難しれているキャピラリーカラムの劣化や不純物の混くなる。このため，試料に夾雑化合物がある場合，合物（▼ およびブリード化合物）の混入の相対量

入などがあった場合，クロマトグラフを三次元でその前処理・後処理の最適化とともに，その後の可視化すると目的外化合物の判別が容易になる。
Figure 5 では，おそらくカラムブリードに起因する

ガスクロマトグラフ法によるブリーディングの少ない分離条件を最適化する必要がある。

−86−

微量湿式分析による分子レベル同位体比の品質管理と確度向上：特に天然存在比の正確な評価と Stable Isotope Probing（SIP）法の応用に向けて

GC/EI-MS for n-alkane

C16

C22

C15

Intensity

C17

C28

C30

C24
C18
C26
C20

C19

column breed

50
10
20

m/z
500
30

Fig. 5. GC/EI-MS chromatogram of n-alkane (n-C15 to n-C30). Three axis stands for retention
time (min), m/z, intensity. Two column breed signals were observed.

intensity

(a)

(b)

500

(b)

GC/EI-MS for n-alkane

C30

denoted impurities

m/z

400

300

C15 C16

C17

C18

C19

C20

C24

C22

C26

C28

200
column breed

100
10

15

20

25

30

Retention time (min)Fig. 6. Density map of GC/EI-MS chromatogram of n-alkane (n-C15 to n-C30). Two axis
stands for retention time (min) and m/z with color contour showing intensity. (a)pristine n-alkane separation without any impurities, (b) n-alkane separation with
impurities and bleeding compounds showing also in Figure 5.

−87−高野淑識・力石嘉人・大河内直彦

4.4. 化学修飾による共溶出化合物の分離
極性が非常に良く類似した共溶出化合物の場
合，いずれかの化合物を化学修飾することにより，分離することができる。例えば，前述のアー
キア株 Thermoplasma acidophilum は，ユーリアー
キ オ ー タ 門（Euryarchaeota）で あ る が， ク レ ン

差が生じ，各々の化合物の同位体比を評価できる（Takano et al., 2010b）。
天然界には，このような脂質成分のレジオアイ
ソマー（regio-isomer）の他，D-体と L-体のアミノ酸のようにエナンチオマー（enantiomer）が存在する。D-体と L-体アミノ酸は，極性が同一である

アーキオータ門（Crenarchaeota）の一部には，Appendix に示すような五員環と六員環を分子内にため，通常の分析方法では，シグナルは一つになもつ crenarchaeol（Sinninghe Damsté et al., 2002）や
crenarchaeol regio-isomer を保有するものがいる。

ミノ酸をジアステレオマー化することにより，分特に有光層以深を好む海洋性クレンアーキオー
タ（e.g., Karner et al., 2001）からよく見出され，陸ある固定相のあるキラルカラムで分離することができる。前者の場合，Figure 8 のように（S）- また

水環境から検出されることもある（Pearson et al.,2004）
。この crenarchaeol は，海洋の水柱だけでは（R）- の光学活性試薬を用いれば（例えば，光学
活性アルコールなど），溶出順序を D-体 →L-体まなく堆積物中にも幅広く存在することが知られるようになった（e.g., Ingalls et al., 2006; Turich et al.,2007; Lipp and Hinrichs, 2009）。この化合物は，光合成色素に由来する Pyropheophytin a（P Phe a）と極性が類似しており，順相クロマトグラフ法による。このようなエナンチオマーの場合，双方のア
離することができる。あるいは，立体的配向性のたは L-体 →D-体と意図的にコントロールできる（Takano et al., 2009）。後者の場合，昇温条件とカラムの選定によって溶出順序が D-体 →L-体または L-体 →D-体と変わる場合がある（Levkin et al.,2007）
。これらの光学分割法と同位体質量分析法

る分離の場合，保持時間がオーバーラップすることがある。このような場合，P Phe a に銅をキを組み合わせることで，各々の立体異性体分子レ

レート配位することによって（Figure 7），化合物

新しい分子診断法が確立できる。

ベルでの同位体的均質性・不均質性の評価というの極性を意図的に変え，その結果として保持時間(a) Reaction scheme and structure

Sample: Shimokita sub-surface sediment (CK06-06, core 1-1)

Saturated Cu(CH3COO)2
in acetone

Cu

Ambient, overnight

PPhe a(C53H72N4O3)

CuCu-PPhe a(CuC53H70N4O3)

AbsorbanceAbsorbance(b) UV/Vis spectra

Fig. 7. Intercalation reaction between pyropheophytin a (PPhe a) and its copper derivatives
obtained following treatment with saturated copper acetate dissolved in acetone.
The UV/VIS absorbance is shown before and after the intercalation reaction.

−88−

微量湿式分析による分子レベル同位体比の品質管理と確度向上：特に天然存在比の正確な評価と Stable Isotope Probing（SIP）法の応用に向けて

4.5. クロマトグラフ法における溶出中の同位体分別

ン上で確実に，完全な回収を行なう必要がある。

クロマトグラフ法でベースライン分離ができな

次に，（ii）カラム樹脂と溶質との間で，吸着・い場合，軽元素の同位体組成が真の値と異なる場合がある（e.g., Hare et al., 1991: Filer, 1999: Smit-

脱着の相互作用の際に同位体分別が起きることがtenberg and Sachs, 2007）。主な理由は，（i）目的化

誘導体化の反応阻害になるような夾雑物が多い試ある。例えば，イオン交換クロマトグラフ法は，合物の回収率が低い場合や不十分な分離などによ料（化石試料，岩石試料，堆積物試料）の前処理

り，溶出時間により同位体比が変動するためであとして有効な手法であるが，分子レベルでの同位体分別（Evershed et al., 2007 and the references cited

る。その一例として，アミノ酸の一種グリシンを使った検証例を Figure 9 に示す。グリシンには，アミノ基に窒素が一つ含まれる。その窒素同位体
比は，イオン交換クロマトグラフ法のある溶出条
件下では，最大で 31.1‰（vs. Air）の同位体分別がtherein）を生じる。これと類似した現象は，ガス
クロマトグラフ法の一部のキャピラリーカラムでも知られている（Chikaraishi et al., 2010）。
（i），（ii）の理由から，最も信頼性の高い分子レある（Hare et al., 1991）。同様に，分子内に２つ含まれる炭素は，最大で 1.5‰（vs. PDB）の同位体分

かつ高回収率であることが第一の必須条件と言え別がある。このため，目的化合物であるグリシン

る。ただし，高回収率であれば同位体比が真のの真の同位体比は，溶出したピークをベースライ

値と整合的である保証はなく，各分析ラインでの確度検証（e.g., Chikaraishi et al., 2010）が必要であ

ベル同位体比を得るためには，ベースライン分離

る。Figure 10 に，タンパク性および非タンパク(a) D-, L-amino acids with S-(+)-2-butanol

性アミノ酸を陽イオン交換クロマトグラフ法（樹脂：Bio-rad AG50 W-X-8, 200-400 mesh）で処理し(e.g., D-, L-alanine)

L-Ala

た際の各分子レベル安定同位体比を示す。GC/
FID で求めたこの前処理法によるアミノ酸の回収率は，94.3 ± 11.4%（mean, n=3）であり，カラムを通す前後の δ15Namino acids を比較する理想直線（1:1）

D-Ala
Intensityとの誤差（Δ15N）は，最大で 0.3‰（mean = 0.02‰）
である（Takano et al., 2010a）。この方法により，化(b) D-, L-amino acids with R-(-)-2-butanol
Glycine (50 mg)

Absorbance (210 nm)

3

D-Ala

0

4

2

G15N (‰ Air)

L-Ala

5

-5
-10
-15

'G15N = 31.1 ‰

-20
-25

1

6

Retention time (min)G13C (‰ PDB)

1
7

Fig. 8. Derivatization of amino acid diastereomers by
optically active (S)-(+)-2-butanol or (R)-(–)-2butanol with pivaloyl chloride to produce N-pivaloyl-(R, S)-2-butyl esters (NP/2Bu). Representative schemes: (a) D-alanine is first elution when
we use (S)-(+)-2-butanol, and (b) L-alanine is firstelution when we use (R)-(-)-2-butanol (Takano etal., 2009). Here, the molar fraction was D-alanine :L-alanine = 5 : 95.

96

120
mL

2

3

4

5

6

7

8

'G13C = 1.5 ‰

-28
-29
-30

1

2

3

4

5

6

7

8

Sampling position

Fig. 9. Carbon and nitrogen isotopic fractionation during
the separation of glycine from an ion exchange column. A 50mg quantity of glycine was loaded onto
the ion exchange column chromatograph. Fractions
were collected across the peak. Modified from Hareet al., 1991.

−89−

高野淑識・力石嘉人・大河内直彦

石，堆積物，岩石などの硬組織に保存されてい引用文献

る生物起源アミノ酸を分画・精製が可能になり，

Boschker H., Nold S., Wellsbury P., Bos D., De Graaf

様々な生物地球化学試料へ応用できる。

W., Pel R., Parkes R., Cappenberg T. (1998) Direct
謝linking of microbial populations to specific biogeo-

辞chemical processes by 13C-labelling of biomarkers.
Nature, 392, 801-805.

培養アーキア株（Thermoplasma acidophilum）試料の一部は，ブレーメン大学 Yu-Shih Lin 博士からBoschker H., Middelburg J. (2002) Stable isotopes and提供された。ブレーメン大学の Kai-Uwe Hinrichs

biomarkers in microbial ecology. FEMS Microbiol-

博士，海洋研究開発機構の小川奈々子博士，筑波

ogy Ecology, 40, 85-95.

大学の野本信也博士には，分析上のアドバイスを

Buhring S.I., Smittenberg R.H., Saches D., Lipp J.S.,

頂いた。著者らは，ゲスト編集委員の大場康弘

Golubic S., Sachs J.P., Hinrichs K.-U., Summons

博士（北海道大学）から執筆の機会を与えて頂い

R.E. (2009) A hypersaline microbial mat from theた。本稿は，山本正伸博士（北海道大学）および一Pacific Atoll Kiritimati: insights into composition

人の匿名者から査読を受けた。本研究の一部は，科学研究費補助金（Y.T., Y.C., N.O., 19GS0211）にand carbon fixation using biomarker analyses and a
13

C-labeling approach. Geobiology, 7, 308-323.

力石嘉人，大場康弘（2008）ガスクロマトグラフ /よって行われた。

同位体比質量分析計による分子レベル安定同位体比分析法．Researches in Organic Geochemistry,

Bio-rad AG50 W-X-8 (200-400 mesh)23/24, 99-122.
Chikaraishi Y., Ogawa O.N., Kashiyama Y., Takano
Y., Suga H., Tomitani A., Miyashita H., Kitazato H.,

Non-protein amino acids

Ohkouchi N. (2009) Amino acid trophic level (ATL):

3-AiBA
Val
Hyp

Ile

Phe

elucidation of aquatic food web structure based on

Gly
Leu
Met
Ala
Asp+Thr

Sar+E-Ala
2-AAAcompound-specific nitrogen isotopic composition of

SerProamino acids. Limnology and Oceanography: Meth-Gluods, 7, 740-750.
力石嘉人，高野淑識，大河内直彦（2009）アミノ酸（ピバロイル / イソプロピルエステル誘導体）の2-ABA

Protein amino acids

GC/MS による解 析．Researches in Organic Geochemistry, 25, 61-70.
Chikaraishi Y., Takano Y., Ogawa N.O., Ohkouchi N.

Fig. 10. Verification of data consistency prior to (without)and following cation-exchange chromatography forcompound-specific nitrogen isotope ratios (δ15N,‰ vs. air). The resin we used was Bio-rad AG50
W-X8 (200-400 mesh). Standard AA mixtures
including protein (lower plot line) and non-protein(upper plot line) were used. Gly, glycine; Leu,
leucine; Ile, isoleucine; Met, methionine; Sar;
sarcosine; β-Ala, beta-alanine; Ala, alanine; Asp,
aspartic acid; Thr, threonine; Pro, proline; 2-AAA,
2-aminoadipic acid; Ser; serine; Glu, glutamic acid;
Val, valine; Phe, phenylalanine; 3-AiBA, 3-aminoisobutyric acid; Ile, isoleucine; Hyp, hydroxyproline; 2-ABA, 2-aminobutyric acid. Modified
from Takano et al., 2010a.

(2010) Instrumental optimization for compoundspecific nitrogen isotope analysis of amino acids bygas chromatography/combustion/isotope ratio mass
spectrometry. Earth, Life and Isotopes (edited by N.
Ohkouchi, I. Tayasu, K. Koba), Kyoto Univ Press.
pp. 365-386.
Dumont M., Murrell J. (2005) Stable isotope probinglinking microbial identity to function. Nature
Reviews Microbiology, 3, 499-504.
Engel M.H., Macko S.A. (1997) Isotopic evidence for−90−

extraterrestrial non-racemic amino acids in the Mur-

微量湿式分析による分子レベル同位体比の品質管理と確度向上：特に天然存在比の正確な評価と Stable Isotope Probing（SIP）法の応用に向けて

suura T., Miura T., Takaki Y., Morono Y., Nunoura T.,

chison meteorite. Nature, 389, 265-268.
Evershed R., Crossman Z., Bull I., Mottram H., Dun-

Imachi H. (2008) Phylogenetic and enzymatic diver-gait J., Maxfield P., Brennand E. (2006) 13C-labellingsity of deep subseafloor aerobic microorganisms inof lipids to investigate microbial communities in theorganics-and methane-rich sediments off Shimokita

environment. Current opinion in biotechnology, 17,Peninsula. Extremophiles, 12, 519-527.
Levkin P.A., Levkina A., Czesla H., Schurig V. (2007)

72-82.
Evershed R. P., Bull I. D., Corr L. T., Crossman M. Z.,

Temperature-induced inversion of the elution order

Van Dongen B. E., Evans C. J., Jim S., Mottram H. R.,of enantiomers in gas chromatography: N-ethoxy-

Mukherjee A. J., Pancost R. D. (2007) Stable isotopes

carbonyl propylamides and N-trifluoroacetyl ethyl

in ecology and environmental science (edited by R.

esters of alpha-amino acids on Chirasil-Val-C-11 andMichener & K. Lajtha), Blackwell Publishing, p. 508.

Chirasil-Dex stationary phases. Analytical Chemistry, 79, 4401-4409.

Filer, C. (1999) Isotopic fractionation of organic compounds in chromatography. Journal of labelled com-

Lipp J.S., Hinrichs K-U. (2009) Structural diversity
and fate of intact polar lipids in marine sediments.

pounds & radiopharmaceuticals, 42, 169-197.
Hare P, Fogel M, Stafford T, Mitchell A., Hoering

Geochimica et Cosmochimica Acta, 73, 6816-6833.

T. (1991) The isotopic composition of carbon and

McDonald I.R., Radajewski S., Murrell J.C. (2005)

nitrogen in individual amino acids isolated from

Stable isotope probing of nucleic acids in methano-modern and fossil proteins. Journal of Archaeologicaltrophs and methylotrophs: A review. Stable isotope

Science, 18, 277-292.

applications in methane cycle studies. Organic

Hopmans E.C., Schouten S., Pancost R.D., van derGeochemistry, 36, 779-787.

Meer M.T.J., Sinninghe Damsté J.S. (2000) Analysis

Metges C.C., Petzke J.K. (1999) The use of GC-C-

of intact tetraether lipids in archaeal cell material

IRMS for the analysis of stable isotope enrichment

and sediments by high performance liquid chroma-in nitrogenous compounds. In Methods for investi-

tography/atmospheric pressure chemical ionization

gation of amino acid and protein metabolism. CRC

mass spectrometry. Rapid Communications in Masspress LCC, Florida, USA., 121-132.

Spectrometry, 14, 585-589.

Michener R., Lajtha K. (2007) Stable isotopes in ecology

Huguet C., Hopmans E.C., Febo-Ayala W., Thompson

and environmental science. Blackwell Publishing.

D.H., Sinninghe Damsté J.S., Schouten S. (2006) An

Nomaki H., Ogawa N.O., Ohkouchi N., Suga H., Toyo-

improved method to determine the absolute abun-

fuku T., Shimanaga M., Nakatsuka T., Kitazato H.

dance of glycerol dibiphytanyl glycerol tetraether(2008) Benthic foraminifera as trophic links between

lipids. Organic Geochemistry, 37, 1036-1041.

phytodetritus and benthic metazoans: carbon and

Hoefs J. (2007) Stable Isotope Geochemistry, Springer.

nitrogen isotopic evidence. Marine Ecology-Progress Series, 357, 153-164.

翻訳本は，J. ヘフス著（和田秀樹・服部陽子 訳）
同位体地球化学の基礎．Springer Japan.

Ogawa O.N., Nagata T., Kitazato H. & Ohkouchi N.

Ingalls A., Shah S., Hansman R., Aluwihare L., San-(2010) Ultra sensitive elemental analyzer/isotope

tos G., Druffel E., Pearson A. (2006) Quantifying

ratio mass spectrometer for stable nitrogen andarchaeal community autotrophy in the mesopelagic

carbon isotope analyses. Earth, Life, and Isotopes

ocean using natural radiocarbon. Proceedings of the(edited by N. Ohkouchi, I. Tayasu, and K. Koba),

National Academy of Sciences, 103, 6442-6447.

Kyoto University Press. 339-353.

Karner M.B., DeLong E.F., Karl D.M. (2001) Archaeal

Ohkouchi N., Tayasu I., Koba K. (2010) Earth, Life,dominance in the mesopelagic zone of the Pacific
Ocean. Nature, 409, 507-510.

and Isotopes. Kyoto University Press.
Pancost R.D., Coleman J.M., Love G.D., Chatzi

Kobayashi T., Koide O., Mori K., Shimamura S., Mat−91−

A., Bouloubassi I., Snape C.E. (2008) Kerogen-高野淑識・力石嘉人・大河内直彦

bound glycerol dialkyl tetraether lipids released byrichs K-U. (2004) Intact polar membrane lipids inhydropyrolysis of marine sediments: A bias againstprokaryotes and sediments deciphered by high-incorporation of sedimentary organisms? Organic

performance liquid chromatography/electrospray

Geochemistry, 39, 1359-1371.

ionization multistage mass spectrometry - new biomarkers for biogeochemistry and microbial ecology.

Pearson A., Huang Z., Ingalls A.E., Romanek C.S.,
Wiegel J., Freeman K.H., Smittenberg R.H., Zhang

Rapid Communications in Mass Spectrometry, 18,

C.L. (2004) Nonmarine crenarchaeol in Nevada hot

617-628.

springs. Applied and Environmental Microbiology,

Takano Y., Chikaraishi Y., Ogawa O.N., Kitazato H.,
Ohkouchi N. (2009) Compound-specific nitrogen70, 5229-5237.
Pizzarello S., Cronin J.R. (1998) Alanine enantiomers

isotope analysis of D-, L-alanine and valine: applica-in the Murchison meteorite. Nature, 394, 236-236.

tion of diastereomer separation to δ15N and microbial

Radajewski S., Ineson P., Parekh N., Murrell J. (2000)

peptidoglycan studies. Analytical Chemistry, 81,

Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology.
Nature, 403, 646-649.

394-399.
Takano Y., Kashiyama Y., Ogawa O.N., Chikaraishi Y.,

Radajewski S., McDonald I., Murrell J. (2003) Stable-

Ohkouchi N. (2010a) Isolation and desalting withisotope probing of nucleic acids: a window to the

cation-exchange chromatography for compound-function of uncultured microorganisms. Current

specific nitrogen isotope analysis of amino acids.

opinion in biotechnology, 14, 296-302.

Rapid Communications in Mass Spectrometry, 24,

Rossel P.E., Lipp J.S., Fredricks H.F., Arnds J., Boetius

2317-2323.

A., Elvert M., Hinrichs K-U. (2008) Intact polar lip-Takano Y., Chikaraishi Y., Ogawa O.N., Nomaki H.,

ids of anaerobic methanotrophic archaea and associ-Morono Y., Inagaki F., Kitazato H., Hinrichs K-U.,

ated bacteria. Organic Geochemistry, 39, 992-999.

Ohkouchi N. (2010b) Sedimentary membrane lipids

Schubotz F., Wakeham G. S., Lipp J.S., Fredricks H.F.,

recycled by deep-sea benthic archaea. Nature Geo-

Hinrichs K-U. (2009) Detection of microbial biomass by intact polar membrane lipid analysis in thescience, 3, 858-861.

water column and surface sediments of the Black竹内敬人，西川実希（2004）有機化学のための高分解能 NMRテクニック．講談社サイエンティフィック．

Sea. Environmental Microbiology, 11, 2720-2734.

Turich C., Freeman K.H., Bruns M.A., Conte M.,

Shah S.R., Mollenhauer G., Ohkouchi N., Eglinton T.I.,

Jones A.D., Wakeham S.G. (2007) Lipids of marine

Pearson A. (2008) Origins of archaeal tetraether lip-

Archaea: Patterns and provenance in the water-col-ids in sediments: Insights from radiocarbon analysis.

umn and sediments. Geochimica et Cosmochimica

Geochimica et Cosmochimica Acta, 72, 4577-4594.

Acta, 71, 3272-3291.

Sinninghe Damsté J.S., Schouten S., Hopmans E.C.,

Veuger B., van Oevelen D., Boschker H.T.S., Middel-

van Duin A.C.T., Geenevasen J.A.J. (2002) Crenar-

burg J.J. (2006) Fate of peptidoglycan in an intertidal

chaeol: the characteristic core glycerol dibiphytanyl

sediment: An in situ 13C-labeling study. Limnology

glycerol tetraether membrane lipid of cosmopolitan
pelagic crenarchaeota. Journal of Lipid Research,and Oceanography, 51, 1572-1580.
Webster G., Rinna J., Roussel E., Fry J., Weightman A.,

43, 1641-1651.

Parkes R. (2010) Prokaryotic functional diversity in

Smittenberg R., Sachs J. (2007) Purification of dinos-

different biogeochemical depth zones in tidal sedi-

terol for hydrogen isotopic analysis using high-per-ments of the Severn Estuary, UK revealed by stable-

formance liquid chromatography-mass spectrometry.

isotope probing. FEMS microbiology ecology, 72,

Journal of Chromatography A, 1169, 70-76.

179-197.

Sturt H.F., Summons R.E., Smith K., Elvert M., Hin-−92−

微量湿式分析による分子レベル同位体比の品質管理と確度向上：特に天然存在比の正確な評価と Stable Isotope Probing（SIP）法の応用に向けて

GTGT (0)GDGT (3)GDGT (0): caldarchaeol, where X, X’=H

GDGT (4)GDGT (1)

GDGT (5): crenarchaeol, where X, X’=H
GDGT (2)GDGT (5)’: crenarchaeol regio-isomer,
where X, X’=H

X, X’: -H (CL-GDGTs) or -polar head group (IPL-GDGTs)

IPL-GDGT
e.g., phosphoglycolipid-GDGT (3)glycosyl-

phosphatidyl glycerol-

Appendix. Representative structures of archaeal tetraethers detected in marine environment. Their regioisomers are not shown (e.g., crenarchaeol regio-isomer). X, X’ denote polar head group.

−93−