日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.）129，337〜342（2007）

遺伝子トラップ法による遺伝子破壊マウス作製技術

特集

山村

研一

要約：ヒトゲノムプロジェクトの進展により種々の生加し，保存と供給の支援を行う FIMRe（Federation of

物のゲノムの塩基配列は明らかとなったが，塩基配列International Mouse Resources）にも創立メンバーとのみでは，遺伝子およびコード領域以外の部分がどのして参加し，また，アジアにおけるミュータジェネシような機能を持っているのか推定すらできないし，まスとリソースセンターの連合体である AMMRA（Asian

た遺伝子自身の機能に関する情報も不十分である．こMouse Mutagenesis and Resource Association） も 立のため全長 cDNA 配列の決定，DNA チップによる発ち上げ，今後の対応も視野にいれた活動を行っている．

現パターンの解析，タンパクの構造解析，タンパクに対する抗体作製等の機能解析系が必要であるといわれ

1. 変異マウス作製法ている．しかし，これらは重要ではあるが，あくまで変異マウスの作成法は，大きく分けて 2 つあり，自機能を同定するための状況証拠を提供するにすぎない

然突然変異と誘発突然変異とがある．自然突然変異は，とみるべきである．具体例を一つあげれば，Cbfa1 は，飼育中に偶然に発見する変異で，古典的ではあるが，リンパ球で発現する遺伝子の転写因子として発見され過去 1000 種類ほどが知られており，この中にはヌーたが，その破壊マウスでは骨形成がみられず，骨形成ドマウスや NOD マウス等があり，貢献度の高いマウのマスター遺伝子であることが分かった．このことは，スも存在する．誘発変異には，放射線や変異原物質に構造や発現パターンからだけでは，必ずしも機能は推よる方法，相同組換え法，遺伝子トラップ法がある．

測できないことを示唆している．そこで，遺伝子改変放射線では，欠失等の大きな変異が生じることが多い

マウスを用いた in vivo の解析の重要性が再認識され，が，ENU（ethylnitroso urea）等の変異原物質では，欧米でノックアウトマウスプロジェクトが始まり，合点突然変異が生じる．ENU を用いたミュータジェネ

計すれば年間約 40 億円に達する金額が投じられるこシスが 1997 年にドイツで始まり，英国，米国，わがととなった．その内容は，遺伝子トラップ法や相同組国でも始められたが，現在ほぼ収束に向かっている．

換え法を用いてほぼ網羅的にノックアウト ES クロー相同組換え法は，別項で述べられるので省略する．遺ンを取るプロジェクトであるが，当面は 129 系統由来

伝子トラップ法は，以下に述べる．の ES 細胞を用い，やがて確立されれば C57BL/6 由来の ES 細胞を用いて行うというものである．筆者ら

2. 遺伝子ノックアウトの歴史は網羅的遺伝子破壊を目指して，可変型遺伝子トラッ歴史を振り返ると，実は古くから方法論が発達してプ法を開発した．この方法により，第 1 段階で完全破きている．相同組換えについては，1981 年の ES 細胞壊が，第 2 段階でトラップベクター内のマーカー遺伝の樹立が始まりで，1984 年に ES 細胞を用いて作製し子を，別の遺伝子で置換，第 3 段階で条件的遺伝子破たキメラマウスから初めて生殖系列への伝達が認めら壊が可能となった．やがて，遺伝子破壊された ES 細れている．1985 年には Smithies らによる培養細胞で胞が全世界に配られ，遺伝子破壊マウスが多量に作製の相同組換えが，1987 年には Capechi らによる ES 細され，保存される時が来る．熊本大学生命資源研究支

胞での相同組換えが報告された．そして，1989 年に援センターでは，世界の主要なリソースセンターが参ES 細胞を用いた遺伝子破壊マウスの誕生が始めて報キーワード：遺伝子トラップ，ノックアウトマウス，ミュータジェネシス，ES 細胞，遺伝子置換
熊本大学 発生医学研究センター（〒860 - 0811 熊本市本荘 2 - 2 - 1）
e - mail: yamamura@gpo.kumamoto - u.ac.jp 原稿受領日 : 2007 年 1 月 29 日，依頼原稿
Title: Production of knockout mouse by gene trapping. Author: Ken - ichi Yamamura

遺伝子改変
マウスの作製法
４

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山村

告された．
一方，遺伝子トラップ法については，1978 年に大腸菌で，転写が活性化されている領域を見つけるエンハンサートラップ方法として開発されたのが最初である（1）．ついで，これが培養細胞に応用されたのが，研一

場合は，クローンとして取れないことがわかったからである．現在は，IRES を挿入することにより，NMDを回避できるベクターが開発されている（7）．

4. 可変型遺伝子トラップ法

1983 年である（2）．このあたりまでは，遺伝子を発見筆者らは，単なる遺伝子機能の解析ではなく，ゲノする方法として使われている．1987 年には，ショウム医学のためのヒト疾患モデルマウスの作製，あるいジョウバエ個体に応用され，遺伝子を発見するとともはゲノム創薬の展開のためのモデル作製も可能な方法に遺伝子を破壊する方法として用いられた（3）．翌

論の開発を行った．このためには，ひとつの遺伝子あ1988 年にはマウス受精卵を用いてエンハンサーを見たり 10 個の異なった変異を導入し，解析する必要がつける方法が報告されたが（4，5），哺乳類ではエンハあると考えられている．そこで，遺伝子をトラップしンサーが必ずしもコード領域の近くにないこと，受精た後に，興味ある遺伝子を挿入し，必要に応じて条件卵を用いたのでは効率が悪く，なかなか遺伝子を発見的に遺伝子破壊ができる方法論の開発が必須である．

できないことから，1989 年には ES 細胞を用いた遺伝

あとで興味ある遺伝子を挿入したとき，トラップした

子トラップ法が開発された（6）．

遺伝子の一部分が発現すると，そこから翻訳されたタ

3.

遺伝子トラップ法

ンパクが何らかの機能，たとえばドミナントネガティ
ブに働くタンパク，を持ってしまうことも予想される．

遺伝子トラップ法には，原理的には 4 種類ある（図そこで，内在性遺伝は完全に破壊する必要が生じる．

1）．第 1 は，エンハンサートラップ法であり，この場そこで，プロモータートラップベクターにすることと合は弱いプロモーターとマーカー遺伝子とポリ A をした．このため，IRES を用いないこと，また，マーもつ構造となる．第 2 は，プロモータートラップ法でカー遺伝子の上流に停止コドンが来るようにした．こあり，プロモーターを持たないが，ポリ A を持つマのようなベクターであれば，もし遺伝子の途中に組みーカー遺伝子を用いる．第 3 は，エクソン／イントロ込まれたとしても，上流からの翻訳は停止コドンで終ントラップで，この場合はスプライスアクセプターを了し，マーカー遺伝子内の薬剤耐性遺伝子であるネオマーカー遺伝子につなぎ，ポリ A もつけておく．第 4も発現しないことになる．つまり，このようなクローは，ポリ A トラップベクターで，弱いプロモーターンが，ネオ選択しても取れてこないことになる．したとマーカー遺伝子だけの構造である．しかし，当初考がって，プロモーター付近にベクターが挿入され，正案されたポリ A トラップベクターでは，機能しないしくネオが発現するクローンのみが単離できることにことが明らかになった．その理由は，マーカー遺伝子なる．さらに，いったん遺伝子を完全破壊したあと，のポリ A が，トラップした遺伝子のポリ A より 50 −

遺伝子置換を行うため，つまり beta - geo 部分を他の60 塩基対より上流にあると，いわゆる nonsense me-遺伝子等に置換するため，上流に lox71 を，下流にdiated DNA decay（NMD）が起こり，mRNA が破壊

loxP - polyA - lox2272 を 挿 入 し た． こ の lox71 やされること，したがって，このポリ A トラップベク

lox2272 は，loxP 配列の反復配列部分またはスペーサ

ターでは，遺伝子の上流にトラップベクターが入ったー領域に変異をもつものである．これを用いた理由は次のとおりである．Cre - loxP システムは，大腸菌内エンハンサートラップ

では切り出しと挿入反応が観察されるが，哺乳類細胞では核の体積が大きいので，いったん Cre により切プロモータートラップり出された断片が，Cre とともにゲノム上の loxP の近傍に存在することは物理的に困難で，そのため挿入エクソントラップ反応は結果として殆ど観察されていない．そこで挿入するための方法として，loxP 配列に変異を挿入し，いったん挿入されれば削除ができなくなるように改変

ポリA トラップすることを試みた．原理は，次のようなものである．
まず，左端の反復配列に変異を導入した lox71 と，右端に変異を導入した lox66 を準備する．lox71 は細胞

図1

遺伝子トラップ法に導入しゲノム上に組み込んでおく．挿入したい特集
遺伝子トラップによる遺伝子破壊

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DNA を含むプラスミド上に lox66 を組み込んでおく．

いる遺伝子破壊マウスの数は多くても 1 年間約 1,000

Cre と lox66 を含むプラスミドを，細胞にエレクトロ系統であり，これだと 30 年かかることになる．そこで，

ポレーションすると左端に変異を有する lox71 と右端集中的に大規模に突然変異マウスを「網羅的」に作製に変異を有する lox66 の間で組換えが起こり挿入されする構想が浮上した．つまり，マウス変異体作製がこる．いったん挿入されると，左側には左端および右端れまでの「戦術」から「戦略」目標となったのである．とも変異をもつ lox71/66 が，右側には正常の loxP が現在，世界では 3 つのプロジェクトが始動した．第配 列 す る こ と に な る．Cre は， 両 端 に 変 異 を も つ

1 は，EU の EUCOMM プロジェクトである（11）．遺lox71/66 を認識する効率が悪く，したがって，削除伝子トラップ法と相同組換え法を併用し，20,000 個のの反応の効率が悪くなり挿入されたままとなる．筆者

遺伝子破壊 ES クローンを取る，3 年間で 1300 万ユー

らは ES 細胞に応用し，10% 程度の効率で挿入されたロの計画である．第 2 は，カナダの NorCOMM プロクローンが単離できることを明らかにした．その後，ジェクトで，主に遺伝子トラップ法を用い 4 年間でloxP あるいはスペーサー部分に変異を持つ lox2272 を840 万カナダドルのプロジェクトである．第 3 は，米利用することにより，lox71 と loxP または lox2272 で国の KOMP プロジェクトであり（12），5 年間で 5200はさまれた部分のみを入れ替えることも可能であるこ万ドルで，相同組換え法のみで，約 8000 の遺伝子破とを明らかにした．この変異型 lox を利用したトラッ壊 ES クローンを取る予定である．さらに，中国でもプベクターを作製し pU17 と命名し，それを用いた方3 年間で 1 億中国元でのプロジェクトが始められるこ法を可変型遺伝子トラップ法と命名した（図 2）（8 - 10）．とが決定された．世界中の予算を合計すると，年間約40 億円のプロジェクトとなる．筆者らも，我が国の5. 世界のノックアウトマウスプロジェクトプロジェクトの必要性を叫んでいるが，まだ実現していない．早く始めないと，日本は何の貢献もできない

1）現状
これまで ES 細胞を用いた「個々の」遺伝子破壊マことになる．

ウス作製は大きな威力を発揮し，その機能解析のため

2）ノックアウトプロジェクトの理念と思想の「戦術」として用いられてきた．しかし，個々の研理念は，生命科学の全領域における研究推進であり，究室でこの方法を用いて遺伝子破壊マウスを作製するリサーチのためのリソースの創出であり，個人の利益と，膨大なコストと労力と時間が必要であるという欠ではなく公の利益のためである．したがって，このプ点がある．例えば，1 系統の破壊マウス樹立には最低ロジェクトは大規模で網羅的でなければならず，それ500 万円かかるとしても，3 万個の遺伝子についてはゆえ国家プロジェクトとして実施し，成果は共有する1,500 億円必要である．この方法による律速段階は ESという思想が必要である．また，世界でプロジェクト細胞を用いた相同組換えであり，世界中で作製されてが進行する中で，我が国が影響力を発揮でき，発言権

1st steplox71

β- geoloxP

pSP

lox2272

lox511

完全破壊

pA

pA
CAG-Cre2nd step

lox66

Frt

SA gene X

Frt
PKG-p

lox2272

置換

puro

FLP Tg mouse
3rd step

図2

条件的破壊

可変型遺伝子トラップ法

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山村

研一を確保できるリソースを持つ必要がある．

Castaneus は東南アジアに，Musculus は，ロシアか3）必要性

ら 中 国 の 東 北 部 に 分 布 し て い る． 一 方， 日 本 に は

ヒトゲノムプロジェクトにおいて，我が国は 8% のMus Musculus Castaneus と Mus Musculus Musculus

ゲノムの塩基配列を決定した．ゲノムの塩基配列の決の雑種である Molossinus が分布している．これらの定により，多額の研究費を持たず自ら塩基配列の決定

亜種は，約 100 万年前に分離したといわれ，ゲノムのを大規模に行えない研究者にとっても，大きく研究を塩基配列も約 1% 異なっていることがわかった（図 3）．

推進させることができている．遺伝子破壊マウスからヒトとチンパンジーの違いが約 1.23% といわれている

得られる情報は，非常に多大であるが，そのコストがので，この 1% の違いは大きいと考えている．また，高いゆえ，誰でも可能ということではない．多くの研60,000 個の BAC クローンもあり，50 万種類の SNP究者が行いたくてもできない状況にある．したがって，も判明している．幸いなことに，この亜種に属する野個々の研究者にとって，大きな価値がある．ばらばら

生マウスが，1978 年に国立遺伝学研究所の近くで捕に進めれば，同じ遺伝子を複数の研究者が作製すると獲された．森脇たちは，このマウスから近交系化を図いう重複が生じるし，コスト，労力，時間が無駄になり，MSM/Ms と名づけた．現在までにすでに 80 代

る．さらに，研究者は遺伝子破壊マウスを作製することなっている．表現型には，特徴的なものがあり，自とが仕事ではなく，それを解析して新しい発見をする

発運動は活発で，エネルギー代謝も節約型で，がん等ことであるので，遺伝子破壊マウスの作製に時間を取の疾患に対して抵抗性である．つまり，がんが好発すられることがなくなれば，それだけ解析に集中でき，る 実 験 用 マ ウ ス と は か な り 異 な っ て い る． こ の研究が進展する．

MSM/Ms とは異なるが，やはり molossinus 由来の6. わが国のノックアウトマウスプロジェクト

JF1 も樹立されている．筆者らは，これらのマウスからの ES 細胞の樹立に成功し，生殖系列への伝達も確

現在，マウスには少なくとも 4 種類の亜種が存在し認した．我が国としては，独自性のあるプロジェクトている．それらは，Mus Musculus Domesticus, Musが求められており，MSM/Ms 由来の ES 細胞を用いMusculus Castaneus, Mus Musculus Musculus, およびることが必要であると思われる．

Mus Musculus Molossinus で あ る．Domesticus は，欧米に分布し，現在ほとんどの研究者が用いている実験用マウス，たとえば 129, C57BL/6 や BALB/c，の起源は Mus Musculus Domestics という亜種である．

7. 熊本大学生命資源研究・支援センターの活動
1）目標
5 つの目標を掲げている．すなわち，①遺伝子改変

100-200 years

1 M years

Ancestral Mus Musculus species

Domesticus

Castaneus

Molossinus

MSM
Europian Fancy Mouse
East Asian Fancy Mouse
Laboratory Mouse

図3Musculus

マウスの起源と亜種（Moriwaki K. Genetics in Wild Mice. 1994 より改編）

特集
遺伝子トラップによる遺伝子破壊

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マウスの作製，保存，供給の一体化を目指し，かつア

外部からのマウスは，すべてアイソレーターに収容

ジア独自のリソースの確立も目指す，②技術の陳旧化

し，一定期間飼育し感染がない場合にのみ，一般飼育を防ぐため，遺伝子改変マウスの作製，保存，供給に室に移すこととしている．また，遺伝子を注入した受関する技術開発を行う，③マウスのやり取りによる感精卵やキメラ胚を移植した仮親は，アイソレーターに染リスクを低減あるいは撲滅するため，凍結胚およびて飼育し，感染のないことを確認した後，搬出する態

精子による供給体制の確立を目指す，④凍結胚および勢をとっている．

精子による供給体制の確立のため，講習会の実施等に

CARD 搬出時の検査項目は，Mouse hepatitis virus,よる人材育成を行う，⑤マウスリソースの活用のため，Sendai virus, Citrobacter rodentium, Clostridium pili-

国内および国際的なネットワーク形成を行う，である．

forme, Corynebacterium kutscheri, Helicobacter hepat-2）遺伝子改変マウスの作製について

icus, Mycoplasma spp., Pasteurella pneumotropica, Sal-①独自リソースの開発

monella spp., Aspiculuris tetraptera, Giardia muris,

可変型遺伝子トラップ法を用いて，トラップ ES

Syphacia spp., Spironucleus muris, Trichomonas spp.,

クローンの収集とトラップマウスの樹立を行っていEctoparasite である．

る．マウスまで樹立できたものについて，すでに立6）講習会

ち 上 げ た EGTC（exchageable gene trap clone） デ

毎年 2 回の生殖工学技術講習会を行い，技術の普及ータベースに，順次組み入れている．また，アジアを行っている．

独自のリソースの開発のため，MSM/Ms 由来の7）データベース

ES 細胞の樹立を行い，これを用いた遺伝子導入お① CARD R - BASEよび破壊マウスの作製を行いつつある．
②受託による遺伝子改変マウスの作製研究者からの依頼を受け，毎年平均 70 件程度の国立遺伝学研究所の山崎博士，浜松医科大学の加藤博士の協力の下，CARD R - BASE を立ち上げ，凍結保存しているマウス系統に関する情報を公開して遺伝子改変マウスの作製を行っている．また，ESいる．FIMRE 参加機関等のデータベースを統合し細胞の講習会も行っているが，最近は希望のある講

た IMSR（international Mouse Strain Resources）が習内容が多様化しており，個別に対応することにし構 築 さ れ た（http://www.informatics.jax.org/imsr/ている．

index.jsp）．

3）凍結保存と関連した研究開発② EGTC データベース① C57BL/6 マウスの精子は，従来の方法では凍結に可変型遺伝子トラップ法を用いて作製した ES トより受精率が 20% と低かった．そこで，高い受精ラップクローンについて，EGTC を作成し公開して率が得られる新規凍結保存液を開発した．これによい る．International Gene Trap Consortium の 参 加

り受精率が約 60% と各段に向上したので，企業を機関で，統合データベースが構築された（http://通し FERTIUP という商品名で発売を開始した．
②マウス胚や配偶子の凍結保存法はルーチン化しているが，輸送において液体窒素とそのタンクが必要でwww.igtc.ca/FAQ.html）（13）．
8）国際活動① Federation of International Mouse Resources（14）あり，小型化したとはいえ，輸送の準備，輸送元かこの設立に参加し，国際間でのマウスリソースのら輸送先へタンクを送るコストのみならず，輸送先保存供給のネットワークの形成を行いつつあるから輸送元へタンクを送り返すコストがかかる．そ（http://www.informatics.jax.org/imsr/fimre.html）．

こで，ドライアイス詰めにした発泡スチロールでの② AMMRAマウス精子の輸送法，さらに，凍結乾燥精子による保存法の開発を行っている．

アジアでのマウスリソースの開発と保存供給のネットワーク形成のための活動を行い，2006 年 11 月

③生殖工学の技術を解説した生殖工学マニュアルの

22 日― 24 日に中国上海において，北京大学生命科

CD 版（日本語，英語，中国版）を作成し，販売し学学院，協和医科大学・中国医学科学院，上海生命ている．

科学院上海実験動物センター，上海模式生物研究セ4）受託による凍結保存，供給，クリーニング
毎年 100 件を超える系統収集と凍結保存を行ってい

ンター，南京大学模式動物研究センター，台湾実験動物センター，韓国生物科学・バイオテクノロジー

る．

研究所，シンガポールリソースセンターとの間で連5）微生物学的統御合体を形成した．

342

山村

文

献

1）Casadaban MJ, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1979;76:45304533.
2）Fried M, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1983;80:2117-2121.
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2006;17:363-364.

著者プロフィール

山村 研一（やまむらけんいち）

熊本大学 発生医学研究センター・臓器形成分野，教授，医学博士．
◇ 1973 年 3 月信州大学医学部卒業，’78 年 3 月大阪大学大学院医学研究科博士過程修了（医学博士），同年 4 月富山医科薬科大学和漢薬研究所助手（病態生化学部門），同年 10 月米国 Yale 大学 Department of Biology 研究員，’80 年
10 月富山医科薬科大学和漢薬研究所助手（復職），’81 年 4 月大阪大学医学部助手（老年病医学講座），’84 年 7 月同上講師，’86 年 4 月熊本大学医学部 教授，’00 年 4 月熊本大学発生医学研究センター 教授（改組に伴う配置替）．
◇研究テーマ：哺乳類の発生と疾患発症における遺伝と環境の相互作用．◇趣味：シュノーケリング．◇主な著書：
1.

山村研一．考える遺伝学．南山堂；1997 年 2 月 pp1-180．

2.

森脇和郎，山村研一，米川博通編集．モデル動物の作製と維持．Life-Science Information Center；2004 年 7 月．