Res. Org. Geochem. 27, 143­148 (2011)〔有機地球化学会 30 周年記念事業 地球・環境有機分子検索マニュアル No.24〕

技術論文

東京湾表層堆積物中のジペプチド分析―ジペプチドの GC/MS による解析― *三田 肇 **（2011 年 1 月 17 日受付，2011 年 5 月 19 日受理）

積物試料中にジペプチドは比較的豊富に含まれ1. はじめにていることが期待される。また，微生物の中にタンパク質は，地球上の全ての生物に普遍的には，栄養源として取り込むために特定のペプチド含まれ，触媒機能や構造形成の役割を担う生命活の細胞膜透過を行うためのシステムを備えたもの

動にとって非常に重要な有機化合物であり，生体中に豊富に存在している。タンパク質は，通常 20が知られており，ジペプチドの選択的透過にはジ種のアミノ酸が，遺伝子（DNA）の情報に従って，リボソーム上で，特定の配列（一次構造）をもって縮合した分子量が概ね 10,000 以上の高分子化

ペプチドパーミアーゼという酵素が関与している（Alves and Payne, 1980; Payne and Smith, 1994;
Smith et al., 1999）。この中で，低温環境である深海堆積物中から単離された Pseudoalteromonas sp. は，合物である。生物体の死後にタンパク質は，タン菌体外にプロテアーゼを分泌し，それにより分解パク質分解酵素による加水分解や化学的な加水分して得られたジペプチドをジペプチドパーミアー

解を受けやすく，堆積物中で比較的速やかに分解ゼを用いて菌体内に取り込むことで，貧栄養環境される。また，糖などとアミノ−カルボニル反応により生成するメラノイジンなどへの変性も起きに適応していることが報告されている（Zhang etal., 2010）。このような事例から，今後，ジペプチドる。一方で，生体中でタンパク質の総量は多くとがバイオマーカーとして展開できる可能性もある。

も，個々のタンパク質分子の物質量は少なく，堆一方，炭素質隕石中にジペプチド（glycylglycine

積物などに含まれている個々のタンパク質分子を分離し分析することは困難である。そこで，タン（Gly-Gly）を検出した報告がある（Shimoyama andOgasawara, 2003）。多くの炭素質隕石の水抽出物

パク質の種類や物質量などを求めるのではなく，を加水分解をすることでアミノ酸が検出されるこ酸加水分解によって得られるアミノ酸を結合態アとに関する報告例は多いが，ぺプチドが前生物的ミノ酸として分析することが一般的である。に生成しうることは，生命の起原を考える上で興タンパク質の加水分解過程には，タンパク質中味深い。今後，多くの炭素質隕石について，分析の任意の位置で加水分解を受ける反応と，タンパが進むことが期待される。
また，20 種類のアミノ酸からなるジペプチドはク質が N-末端より 2 残基ずつ環状中間体（ジケトピペラジン）を経てアミノ酸が 2 個縮合したジペプチドが遊離する反応が知られている（Steinberg
and Bada, 1983; Sepetov et al., 1991）。このため，堆400 種類になり，堆積物試料中で検出されたアミノ酸がすべてジペプチド由来であったとしても，個々のジペプチドが含量はアミノ酸含量の 1/400* Dipeptides in Tokyo Bay sediment –Analyses of dipeptides by GC/MS** 福岡工業大学工学部生命環境科学科，〒 811-0295 福岡県福岡市東区和白東 3-30-1
Hajime Mita, Department of Life, Environment and Materials, Science Faculty of Engineering, Fukuoka Institute ofTechnology 3-30-1, Wajiro-Higashi, Higashi-Ku, Fukuoka, FUKUOKA 811-0295, Japan−143−

三田 肇となる。実際にはジペプチドとして存在するものより，タンパク質などとして存在するアミノ酸のく HPLC 分析（自動アミノ酸分析計）により行った（Spackman et al., 1958）。

方が多いので，個々のジペプチドの存在量はさらに少なく分析が難しいという課題がある。
本報では，タンパク質の初期続成過程におけるジペプチドの存在を明らかにするために，東京湾表層堆積物中に含まれるジペプチド分析の結果について報告する。ペプチド類の分析には HPLC をジペプチド分析
3 mL の 1.5 mol/L HCl-メタノールを加え，室温で 3 h 処理し，メチルエステルとした。ついで，溶媒を留去し，1 mL のトリフルオロ酢酸無水物を加え，室温で 30 min 処理し，トリフルオロア用いることの方が一般的であるが，前述したようセチル化を行った。減圧により反応溶液を除去にジペプチドの種類は非常の多いので，HPLC でし，水と酢酸エチルを加え，ジペプチド誘導体をは十分な分離を期待できなかったため，HPLC に酢酸エチル層より回収した。酢酸エチル層に無水比べ分離能の高いガスクロマトグラフィー質量分

硫酸ナトリウムを加え脱水した後，窒素気流により 50 μL まで濃縮した。濃縮液 1 μL を GC-MS析計（GC/MS）を用いた。GC を用いたジペプチド分析は，GC を用いたアミノ酸分析に準じた。但し，ジペプチドはアミノ酸に比べ，分子量が大きく揮発性が低下するので，アミノ基の誘導化はメチルエステルとし，カルボキシル基はトリフルオ（Shimadzu, GC-MS QP-5000）にスプレットレス法で注入した。GC のカラムには，Chirasil-L-Val キャピラリーカラム（Chrompcak Internationa Inc., 25 m× 0.25 mmID）を用い，キャリアーガスにはヘリ導体化反応は酸存在下に加熱して行うため，誘導ウムを 1 mL/min で流した。カラムオーブンは，50℃から 90℃まで 10℃/min で昇温し，90℃から体化反応中に部分的な加水分解反応も生じる。そ145℃まで 5℃/min で昇温し，20 min 維持した後，こで，加水分解反応が進行せずにかつ効率的に誘導体化させるために室温で 3 時間のエステル化を145℃から 180℃まで 2℃/min で昇温し，180℃か行った（Ogasawara et al., 2000）。

ブタンを反応ガスとした化学イオン化法を（イオン化電圧 200 eV）用いた質量分析計を使用した。

ロアセチル化し，揮発性誘導体とした。また，誘ら 200℃まで 5℃/min で昇温した。検出には，イソデータの取り込みは，トータルイオンクロマトグ
ラフの測定には 1 s ごとに m/z 100-400 を走査し，2. 実験

定量には 0.1 s ごとにサンプリングを行う選択イジペプチ抽出
東 京 湾 表 層 堆 積 物 S8602 に お け る 最 表 層（02.5 cm）の試料を分析に用いた。採取後，凍結乾燥し凍結保存されていた堆積物試料を粉砕し，試料 2 g に 3 mL の水を加えて 60℃で 1 h 抽出する操オンモードで測定した。また，標準物質としては市販のジペプチド 34 種を用いた。また，以上の分
析法の概要を，Fig. 1 に示した。

作を 8 回繰り返した。集めた抽出液を 2 分し，片3. 分析結果

方は，酸加水分解を行いアミノ酸分析を行った。
残りは，0.15 mL の 3 mol/L の HCl 水溶液を加えGC/MS 分析の結果得られた選択イオンクロマト

pH 1.8 とし，Dowex 50W-X8（H ）イオン交換カラグラム（Selective ion chromatogram, SIC）を Fig. 2 にム（10 cm × 1 cmID）に 加 え，25 mL の 純 水 で 金示す。この結果，34 種のジペプチドを検出した。

属イオン，酸性，中性物質を除去した。ついで，
25 mL の 1.2 mol/L ピリジン−酢酸緩衝液（pH 6.5）

それら同定したジペプチドを保持時間と同定に用いた分子イオンなどともに Table 1 に示す。また，で，遊離のアミノ酸とペプチドを溶離した。この溶離液を 2 分し，片方については遊離のアミノ酸代表的なマススペクトルを Fig. 3 に示す。

分析を行った。残りを凍結乾燥し，ここでのジペプチド分析に用いた。なお，遊離アミノ酸と酸加した分子イオンが強く現れ，フラグメントイオンとしては分子量より 31 小さい脱メトキシ体のイ

水分解アミノの酸分析は，陽イオン交換法に基づオンが小さく観測された（Fig. 3）。また，glycyl-L-+

マススペクトルでは，いずれもプロトンが付加−144−

東京湾表層堆積物中のジペプチド分析―ジペプチドの GC/MS による解析―([WUDFWLRQIURPSXOYHUL]HGVDPSOH J 
DGGZDWHU P/ 

KHDWLQJDWR&IRUK

Table 1. Concentrations of dipeptides in water extracts ofthe sample at surface ofthe sediment core S8602
of Tokyo Bay[WLPHVFHQWULIXJDWLRQWRUHFRYHUDVXSHUQDWDQW

Compound name1

glycylglycine2430.00

1.6

2glycylalanine

L

257

0.00

3.7

3alanylglycine

L

257

0.00

2.7

4a

alanylalanine

DD

2710.00

0.31

4balanylalanine

DL2710.00

0.19

4c

alanylalanine

LD2710.00

0.12

DF\ODWLRQZLWKWULIOXRURDFHW\ODQK\GULGH P/ 4dalanylalanine

LL

2710.00

4.7

HYDSRUDWHLQYDFXXR

5glycylvaline

L

285

0.00

2.5

H[WUDFWLRQZLWKZDWHUHWK\ODFHWDWH

6valylglycine

L2850.00

3.2

FROOHFWLRQWKHRUJDQLFOD\HU7glycylleucineL2990.00

3.6

GHK\GUDWLRQZLWKVRGLXPVXOIDWH

8leucylglycineL2990.00

1.5

9glycylisoleucineL2990.00

0.53

ZDVKLQJZLWKZDWHU P/ LQRUGHUWRUHPRYHFRQWDPLQDQWVUHFRYHUZLWKPRO/S\ULGLQHDFHWDWHEXIIHU S+  
O\RSKLOL]DWLRQWRGU\QHVVHVWHULILFDWLRQZLWKPRO/+&OPHWKDQRO P/ DW57IRUK

'HULYDWL]DWLRQ

FRQFHQWUDWLRQXQGHU1IORZ*&06DQDO\VLVFig. 1. Schematic diagram of dipeptide analysis in sedimentary rock.

Configuration

m/z*

Retention Concentrationtime/min**/ nmol g-1

No.

3XULILFDWLRQE\FDWLRQH[FKDQJHFROXPQ 'RZH[:; +IRUP FP[FP,' 

10alanylvaline

LL

299

0.00

2.1

11

valylalanine

LL

299

0.00

4.6

12

alanylleucine

LL

313

0.00

4.8

13

leucylalanine

LL

313

0.00

4.1

14

alanylisoleucine

LL

313

0.00

1.3

15

glycylaspartic acid

L

315

0.00

1.7

16

aspartylglycineL315

0.001.217valylvaline

LL

327

0.00

3.018

alanylaspartic acid

LL

329

0.00

5.619

aspartylalanine

LL

329

0.00

3.9

20 glycylphenylalanine

L333

0.00

0.31

21 phenylalanylglycine

L

333

0.00

0.25

22

valylleucine

LL

341

0.00

4.2

23

leucylvaline

LL

341

0.00

1.324

glutamylalanine

LL

343

0.00

0.34

25 alanylphenylalanine

LL

347

0.00

0.74

26 phenylalanylalanine

LL

347

0.00

0.3127

leucylleucine

LL

355

0.00

1.428

valylaspartic acid

LL

357

0.00

4.329

aspartylvaline

LL

357

0.00

1.930valylglutamic acid

LL371

0.00

4.431

leucylaspartic acid

LL3710.00

2.0Fig. 2. Selective ion chromatograms of N-trifluoroacetyl methyl esters of dipeptides in water extractof the sample at 1.3 cm in depth of the sedimentcore S8602 of Tokyo Bay. The m/z ions correspond to (M+1)+, where M stands for a molecularweight of each dipeptide derivative. Peak numbers(1-34) correspond to those of compounds in Table 1.
(Ogasawara et al., 2001)

32valine（Gly-L-Val）と L-valylglycine（L-Val-Gly）の今回調べたグリシンを含むジペプチド 5 種につように同じアミノ酸からなるジペプチドで配列順

いては，いずれもグリシンが N-末端に存在するジの異なるものも同じ形状のマススペクトルを示した（Fig. 3c, d）。

ペプチドが C-末端にあるものより保持時間が遅い

valylphenylalanine

LL

3750.000.69

33 leucylphenylalanine

LL

3890.000.64

34 phenylalanylleucine

LL

389

0.00

0.52

Total80* Mass numbers used for identification of dipeptides on
massfragmentograms.
** All compounds were identified by coincidence in mass spectra andretention times with those of authentic compounds.

傾向が見られた。一方，alanylvaline（Ala-Val）と−145−三田 肇

valylalanine（Val-Ala）では Ala-Val が先に溶出し，alanylleucine（Ala-Lue） と luecylalanine（Lue-Ala）の加水分解により，実際に存在するジペプチドをでは Lue-Ala が先に溶出した。このことから，N-末端側と C-末端側のアミノ酸分子の大小などによっ正しく測定できない可能性がある。既報の誘導体化条件（Islam and Darbre, 1972; Knapp, 1979）をて溶出順を推定することは困難であることを示している。よって，標準物質との溶出時間の一致を参考にポリグリシン（平均分子量 6800）やヘキサグリシンのエステル化を 80℃，1 h で行ったとこ確認しなければ配列を同定することはできない。

ろ，実際にジペプチドが検出された。しかし，本

このため，本研究では，標準試料となるジペプチドの用意ができた 34 種について，同定を行った。

分析条件では，これらのモデルペプチドからジペジペプチドの誘導体化過程において，タンパク質や大きなポリペプチドの加水分解によるジペプチドの生成や，存在するジペプチドのアミノ酸へプチドの生成は認められていない（<0.02-0.04%）（Ogasawara et al., 2000）。一方，80℃，1 h のエステル化を行ったところグリシンや L-バリンの生成が確認された L-Val-Gly を，本分析条件でエステル化したところ，グリシンや L-バリンの生成も認められなかった（< 0.2%）。よって，本分析条件
は，穏やかな反応であり，より大きなタンパク質やポリペプチドからのジペプチドへの分解と，存在するジペプチドの分解が抑制されている。
また，光学活性なカラムを用いることで，通常の カ ラ ム で は（L-alanyl-L-alanine（L-Ala-L-Ala），
D-Ala-D-Ala） と（D-Ala-L-Ala，L-Ala-D-Ala） の2 つのジアステレオマーにしか分けることができないが，4 つのジアステレオマーの全てを区別して検出することができた（Fig. 4）。このことにより，ジペプチドの起源についての情報を得ることができる。Ala-Ala の 4 つのジアステレオマーでは，L-Ala-L-Ala が最も多く，ついで D-Ala-D-Ala，D-Ala-L-Ala，L-Ala-D-Ala の順で検出された。LAla-L-Ala からのエピ化では，まず D-Ala-L-Ala あ
るいは L-Ala-D-Ala が多く生成することになり，D-Ala-D-Ala が最も少なくなるはずである。しかし，D-Ala-D-Ala の方が，D-Ala-L-Ala や L-Ala-DAla より多く検出されたことは，D-Ala を含むジペプチドが，L-Ala-L-Ala からのエピ化から生じたものではないことを示している。おそらく，グラム陽性菌の細胞壁のペプチドグリカンに由来すると考えられる。Gly-Val では，Gly-L-Val のみが検出され，Gly-D-Val が検出されなかったことからも，エピ化が進行していないことが裏付けられる（Ogasawara et al., 2000）。なお，この分析条件でglycyl-L-aspartic acid（Gly-L-Asp）と L-Ala-L-Ala を

Fig. 3. Mass spectra of N-trifluoroacetyl methyl esters ofa) L-ala-L-ala, b) gly-gly, c) L-val-gly, and d) glyL-val standards obtained bynthe chemical ionization
mode. (Ogasawara et al., 2000)

誘導体化したところ，エピ化した Gly-D-Asp や，
D-Ala-L-ala，L-Ala-D-Ala，D-Ala-D-ala のピークは検出されていない（< 0.1%）。このように，誘導体−146−

東京湾表層堆積物中のジペプチド分析―ジペプチドの GC/MS による解析―さによって決まることになる。しかし，ジケトピペラジンの開環反応から予測されるジペプチド の 存 在 比（Smith and Baum, 1987; Steinberg andBada, 1983）と，検出されたジペプチドの存在比（Ogasawara et al., 2001）が大きく異なることや，ペプチドグリカンを構成するペプチドの C-末端に存在するジペプチドである D-ala-D-ala が検出されていること（Ogasawara et al., 2000）から，ここで検出されたジぺプチドはジケトピペラジンを介して生成したものではない。
Fig. 4. Selective ion chromatograms of N-trifluoroacetyl
methyl esters of ala-ala diastereomers (m/z 271)
and gly-val diasteromers (m/z 285) in water extractof the sample at 1.3 cm in depth of the sedimentcore S8602 of Tokyo Bay. (Ogasawara et al., 2000)このようにジペプチドは比較的多く検出されながら，その生成経路については不明である。微生物の中には，菌体外にプロテアーゼを分泌し，分解して生じたジペプチドなどを栄養源として取り込むものが知られていること（Zhang et al., 2010）から，ジペプチドの生成には生分解の寄与が大きい化中のエピ化は無視することができることが確かことが考えられる。また，ジペプチドの分析がアミめられている。

ノ酸分析では困難であったバイオマーカーとして活用できる可能性がある。現状では，堆積物中のジペプチドの分析例は少ないが，今後，分析例が4. 今後の展開集まることで大きく発展することが期待される。

検出されたジペプチドの量は，4-0.1 nmol/g であり，加水分解アミノ酸と遊離アミノ酸の量は 860-

謝

38 nmol/g と 13-1.3 nmol/g で あ っ た（Ogasawara et辞al., 2001）。例えば，Gly を含むジペプチドは，39使用した東京湾堆積物試料は，東京都立大学石種類存在するがそのうち 12 種が同定され，その総量は 23 nmol/g であり，加水分解により検出され渡良志名誉教授のご好意により提供を受けました Gly の約 2.7% を占めており，遊離態の Gly より名誉教授のご指導を頂きました。また，筑波大学も多い。一部のタンパク質やポリペプチドが分析

大学院化学研究科小笠原亮博士（現アジレントテ中に加水分解した可能性もあるが，ここでの分析クノロジーズ）には分析データを提供いただきました。また，力石嘉人博士と 1 名の匿名の査読者

条件ではポリグリシンやヘキサグリシンからジペた。本研究の遂行に当たり筑波大学化学系下山晃

プチドの生成が生じないことが確かめられている（Ogasawara et al., 2000）。このことから，ジペプチの方には査読を通して貴重のご意見をいただきま

ドが比較的安定（Hill, 1965）であり，堆積物中に構環境科学研究所研究員研究費（H20 年度）によかなり多く存在しているものと考えられる。

り実施しました。ここに記して感謝いたします。

した。本研究の一部は，福岡工業大学総合研究機

一方，これまでにタンパク質・ポリペプチドの堆積環境における化学分解過程におけるジペプチドの生成反応として，N-末端より 2 残基ずつ環状

引用文献中間体（ジケトピペラジン）を経る反応が提案さAlves R.A. and Payne J.W. (1980) The number and na-れている（Steinberg and Bada, 1983; Sepetov et al.,1991）。この場合，生じるジペプチドはもともと

ture of the peptide transport systems of E. coli: char-のタンパク質・ポリペプチドの配列情報を保持せSoc. Trans. 8, 704-705.

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−148−