Res. Org. Geochem. 22, 43−55 (2007)〔有機地球化学会 30 周年記念事業 地球・環境有機分子検索マニュアル No.13〕

藻類・植物・堆積物に含まれるクロロ色素・フェオ色素のHPLC／MS による解析＊
力石嘉人＊＊・柏山祐一郎＊＊・大河内直彦＊＊（2007 年 1 月 22 日受付，2007 年 8 月 7 日受理）で測定される（e.g. Chikaraishi et al., 2005）。一般的

1. はじめにな分析手順は，（1）試料からの抽出，（2）高速液

クロロフィル・バクテリオクロロフィルなどの体クロマトグラフ（HPLC）による個々の色素分

クロロ色素は，光合成生物のアンテナ色素であ子の分取（単離），（4）EA／IRMS による同位体比

り，また，クロロ色素及びその初期続成生成物での測定で構成される。本報では，藻類・植物葉・あるフェオ色素は，水柱や堆積物などの環境試料堆積物を例に，環境試料中に含まれるクロロ色

中に普遍的に見いだされる。そのためこれらのク素・フェオ色素の分取・同位体比分析を念頭におロロ色素・フェオ色素は，光合成生物の最も確実いた抽出法および高速液体クロマトグラフ／質量なバイオマーカーとして多くの研究で用いられて分析計（HPLC／MS）による分析法（同定法）を紹きた（例えば，Sanger, 1988; Keely et al., 1990; Airs介する。

et al., 2001; Nakajima et al., 2003）。クロロ色素には

2. 試

構造の異なるものが数多く存在し，その構造は光料

合成生物の進化・多様化と密接に関係している

神奈川県湯河原町の相模湾沿岸で採取した褐藻（Table 1，例えば，千原ら，1999; Delwiche, 1999;（シダモク，Sargassum filicinum ）・紅藻（テングTomitani et al., 1999; Blankenship, 2002; Grimm et

サ，Gelidium japonicum），東京都八王子市で採取

al., 2006）。また，クロロ色素の炭素・窒素・水素した陸上植物の葉（メタセコイヤ，Metasequoia

同位体比は，起源となる光合成生物の生育環境のglyptostroboides），群馬県榛名町の榛名湖で採取し情報を良く保存しており（例えば，Bidigare et al.,

た湖底堆積物（30-40 cm）を用いた（試料の詳細

1991; Chikaraishi et al., 2005），とくに窒素同位体

は，Chikaraishi et al., 2004, Chikaraishi and Naraoka,

比に関しては，窒素原子を含む良いバイオマー

2005; Chikaraishi, 2006 などを参照していただきたカーが他にないため，クロロ色素及びその分解生い）。

成物（フェオ色素・アルキルポルフィリン・マレ

3. 分析方法

イミドなど）の窒素同位体比は，過去の海洋・湖
沼の窒素サイクルの復元をするうえで，質の良い

3.1. 分析上の注意情報を提供できるほとんど唯一の指標になる（例
えば，Ohkouchi et al., 2005, 2006）。

生物試料や環境試料に含まれるクロロ色素・フェオ色素は，一般に，アセトンなどの有機溶媒

クロロ色素・フェオ色素の同位体比は，一般的により抽出され，逆相カラムを用いた HPLC またに，元素分析計／同位体比質量分析計（EA／IRMS）

は HPLC／MS で分析される。この分析法は，有機＊HPLC／MS analysis of chloro- and pheo-pigments in algal, plant and sediment samples＊＊独立行政法人海洋研究開発機構

地球内部変動研究センター，〒237-0061 神奈川県横須賀市夏島町 2-15
e-mail: ychikaraishi@jamstec.go.jp, Tel: 046-867-9778, Fax: 046-867-9775
Yoshito Chikaraishi, Yuichiro Kashiyama, Naohiko Ohkouchi: Institute for research on Earth Evolution, Japan Agency
for Marine-Earth Science and Technology 2-15 Natsushima-cho, Yokosuka, 237-0061, Japan−43−

力石嘉人・柏山祐一郎・大河内直彦

Table 1. Distribution of chloropigmentsaPurple bacteria
Green sulfur bacteria
Green non−sulfur bacteria
Heliobacteria
Cyanobacteria
Glaucophyta
Rhodophyta (red algae)
Cryptophyta
Heterokontophyta (brown algae)
Haptophyta
Dinophyta
Euglenophyta
Chlorarachniophyta
Chlorophyta (green algae)
Higher plants− : limited abundance

Chlorophyll
b
c

d

a
＋
−
−

Bacteriochlorophyll
b
c
d
e
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋

g

＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋

−

＋
＋
＋
＋
＋

−

−

＋
＋
＋
＋

地球化学における脂質分析でほとんど必須となっ子が色素分子の HPLC 分析で用いるアセトニトているシリカゲルカラムクロマトグラフィーや誘

リル・メタノール・アセトンなどの高極性有機溶

導体化を必要とせず，脂質分析に比べはるかに簡媒では溶出しにくいためである。HPLC への導入易である。しかし，クロロ色素・フェオ色素は光・溶液中に多量に脂質が含まれている場合や分析試

酸素・水に対して非常に不安定な分子であるた

料数が多い場合は，分析カラムが詰まる原因にな

め，全ての分析操作において褐色容器を使用し，る。また，これらの脂質分子の多くは HPLC でのまた抽出後は，酸素・水のできるだけ混入してい光学分析で検出されず，MS でのイオン化もほとない溶媒中で，冷暗所（例えば，−20℃ の冷凍庫）

んど期待できないため，カラム中への脂質分子ので保存するなどの注意が必要である。使用するア

残存量及び溶出液中での存在量を簡単に評価する

セトン，N，N-ジメチルホルムアミド（DMF）など手段がない。そのため，とくに個々の色素分子をの有機溶媒は，予め超音波で脱気処理し，新品，

高純度で分取・単離し，その同位体比を測定する

もしくは水が混入しないように管理したものを用場合などにおいては，導入溶液中の脂質分子の除い，また，個々の色素分子の分取を行う場合は，去（脱脂）が必要になる。

HPLC 分析の溶出溶媒に水溶液を用いることも避褐藻系の藻類に含まれるクロロフィル c，フェ

けなければならない。なお，使用する溶媒中に許オ色素の一種であるフェオフォルバイドなどの色容される含水量や，抽出操作中に許容される暴露

素分子は，他のクロロ色素・フェオ色素に比べ親光量は，同定および同位体比の測定に要する時間

水性が高いなどの理由で，これらの分子を失うこに依存する。本報では，有機溶媒は全て新品を超となく抽出溶液の脱水・脱脂処理を行うことは非音波で脱気処理したものを用い，全ての操作にお常に困難である。そのため，これらの色素分子のいて褐色容器を使用した。抽出から同位体比測定

優れた分取・単離法はこれまでに確立していなまでの期間（約 1 週間）におけるクロロ 色 素・い。そこで本報では，フェオ色素の分解率は，1％ 以下である。

（a）クロロフィル c・フェオフォルバイドの分析を行う場合（同定・定量のみの抽出法：脱水・クロロ色素・フェオ色素を，逆相カラムを用い脱脂処理を行わない）

た HPLC 及 び HPLC ／ MS で 分 析 す る う え で ，HPLC への導入溶液中に脂質が含まれていないこ（b）クロロフィル c・フェオフォルバイドの分析とが望ましい。これは，無極性・微極性の脂質分を行わない場合（分取・同位体比分析を念頭に−44−

藻類・植物・堆積物に含まれるクロロ色素・フェオ色素の HPLC／MS による解析

層を HPLC 分析用のバイアル中に移し，−20℃

おいた抽出法：脱水・脱脂処理を行う）の 2 通りの抽出法を示し（Fig. 1），褐藻についての冷凍庫で保存した。なお，本抽出法では，色素は抽出法（a）を，紅藻・植物葉・堆積物ついてはの抽出後に抽出溶液の脱水が行えるため，予め試抽出法（b）を用いた。

料を乾燥させる必要は無い。また，本法では，クロロフィル c・フェオホルバイドなどの高親水性

3.2. 褐藻に含まれるクロロ色素の抽出（Fig. 1a）

色素は検出できない（3.1 を参照）。

クロロフィル c を失うことなく抽出溶液の脱水を行うことは困難なので，試料は予め完全に乾3.4. HPLC／MS 分析

燥させたもの（粉末）を用いた。乾燥試料（約 0.1

HPLC／MS 分析は，Agilent 1100 シリーズ HPLCg）をまず 10-20 ml のアセトンで超音波抽出（2システム／Agilent 1100 MSD（四重極型）を用い

分，3 回）し，さらに抽出残渣を 10-20 ml のアセた。ガードカラム及び分析カラムは，それぞれトンに浸し，−20℃ の冷凍庫で一晩静置すること

ZORBAX SB-C 18 ガードカラム（12.5 mm 長，4.6で，試料中のクロロ色素を抽出した。抽出溶液（2mm 径，5μm シリカ粒サイズ），ZORBAX SB-C 18

つのアセトン層）をまとめ，0.7 mm の GF／F フィ

分析カラム（250 mm 長，4.6 mm 径，5μm シリカ

ルターで濾過したのち，窒素ガス気流下で乾固し粒サイズ）を使用し，溶出は，流速 1.0 ml／分，室た。乾固したクロロ色素を 0.5-1.0 ml の DMF に温，40 分間で 100％ メタノールから 100％ アセト

再溶解し，HPLC 分析用のバイアル中に移し，ンへのグラジエント溶出を行った。光学検出器はHPLC 分析まで−20℃ の冷凍庫で保存した。な

ダイオードアレイ検出器（PDA, 350-850 nm を検

お，クロロ色素・フェオ色素は DMF 中で比較的出）を，また MS のイオン化法は大気圧化学イオ

安定であり（Suzuki et al., 1993），約 1 ヶ月間の保ン化法（APCI, m ／z 400-1200 を検出），陽イオン存が可能である。

モードを用い，フラグメント電圧は 250 V に設定した。APCI のスプレー条件は，ネブライザー圧

3.3. 紅藻・植物葉・堆積物に含まれるクロロ色
素・フェオ色素の抽出（Fig. 1b）

力：50 pis，気化室温度：500℃，キャピラリー電圧：−4 kV，コロナ放電流：5 mA に設定した。

紅藻・植物葉については未乾燥試料（約 0.1 g）
を，堆積物については乾燥試料（約 1 g）を用い3.5. HPLC／TOF-MS 分析

た。試料をまず 10-20 ml のアセトン（予め−20℃

クロロフィル a , d ,フェオフィチン a についての冷凍庫で冷やしたもの）で超音波抽出（2 分，3は，飛行時間型質量分析計（TOF-MS; Agilent 1100回）し，さらに抽出残渣を 10-20 ml のアセトンにMSD TOF）による精密質量の測定を行った。MS

浸し，−20℃ の冷凍庫で一晩静置することで，試のイオン化法は大気圧イオン化法（APCI, m ／z

料中のクロロ色素・フェオ色素を抽出した。それ

400-1200 を検出），陽イオンモードを用い，フラぞれの抽出液をすぐに，5-10 ml のヘキサンと 50-

グメント電圧は 175 V に設定した。

100 ml の蒸留水の入った遠心管へ滴下し，5-10

4. 分析結果

秒程度振り混ぜた後，遠心分離し（1500 回転／分，
2 分），ヘキサン層を分離した。この際，クロロ色

4.1. HPLC／MS 分析

素・フェオ色素はヘキサン層に移動し，同時に脱Fig. 2 に，各試料の分析で得られた HPLC クロ

水が行われた。2 つのヘキサン層をまとめ，0.7

マトグラム（検出波長，660 nm）を，Fig. 3，Table

mm の GF／F フィルターで濾過したのち，0.5-1.0

2 に検出したクロロ色素・フェオ色素の吸収スペ

ml の DMF を加え，数秒間強く振り混ぜた後，−

クトル・マススペクトル，同定レベルを示す（ク20℃ の冷凍庫で 30 分静置した。この際，ヘキサ

ロロ色素・フェオ色素の構造は，Appendix I を参ン層に含まれるクロロ色素・フェオ色素が DMF照）。

層に移動し，脂質がヘキサン層に残ることで，脱褐藻（シダモク，S. filicinum ）からは，クロロ

脂が行われた（Cichelli & Pertesana, 2004）。DMF

フィル a（Fig. 1, No.5），c1（Fig. 1, No.2），c2（Fig.

−45−

力石嘉人・柏山祐一郎・大河内直彦

Fig. 1. Extraction procedure of chloro- and pheo-pigments for (a) brown alga, and (b) red alga, higher plant and lake
sediment.

−46−

藻類・植物・堆積物に含まれるクロロ色素・フェオ色素の HPLC／MS による解析

Fig. 2. HPLC chromatograms (660 nm, DAD) of chloro- and pheo-pigments from (a) brown alga, (b) red alga, (c)higher plant, and (d) lake sediment. Peak numbers correspond to the compound numbers in Figs. 3 and 4.
Table 2. Identification level of chloro− and pheo−pigments
Peak
No.＊

Compound name

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17

Chlorophyll c2
Chlorophyll c1
Chlorophyll d
Chlorophyll b
Chlorophyll a
Bacteriopheophytin a
Pheophytin b
Pheophytin a
Pyropheophytin b
Pyropheophytin a
Pyropheophorbide b 27:1 sterylester
Pyropheophorbide a 27:2 sterylester
Pyropheophorbide a 28:2 sterylester
Pyropheophorbide a 27:1 sterylester
Pyropheophorbide a 29:2 sterylester
Pyropheophorbide a 28:1 sterylester
Pyropheophorbide a 29:1 sterylester

FormulaC35H28MgN4O5
C35H30MgN4O5
C54H70MgN4O6
C55H70MgN4O6
C55H72MgN4O5
C55H76N4O6
C55H72N4O6
C55H74N4O5
C53H70N4O4
C53H72N4O3
C60H76N4O4
C60H76N4O3
C61H78N4O3
C60H78N4O3
C62H80N4O3
C61H80N4O3
C62H82N4O3

Retention Molecular
Detected mass (m／z)
Identification level
time
Weight[M+H]＋ Prominent fragment ions Level＊＊ Reference paper＊＊＊
3.20
608.2
609.2
587.2
3
[2], [4], [6]
3.37
610.2
611.2
589.2
3
[2], [4], [6]
9.75
894.5
895.5
873.6, 617.2, 595.3
2
[8]
10.15
906.5
907.5
885.6, 629.2, 607.3
2
[1]
14.25
892.5
893.5
871.6, 615.2, 593.3
4
19.00
888.6
889.6
611.3
4
21.05
884.5
885.6
607.3
3
[1], [7]
23.45
870.6
871.6
593.3
4
26.39
826.5
827.5
549.2
2
[7], [5]
27.85
812.6
813.6
535.5
4
33.13
916.6
917.6
549.2
3
[3], [5], [7]
34.36
900.6
901.6
535.3
3
[3], [5], [7]
35.40
914.6
915.6
535.3
3
[3], [5], [7]
36.15
902.6
903.6
535.3
3
[3], [5], [7]
36.74
928.6
929.6
535.3
3
[3], [5], [7]
37.04
916.6
917.6
535.3
3
[3], [5], [7]
37.79
930.6
931.6
535.3
3
[3], [5], [7]＊Peak numbers refer to chromatogram in Fig. 2 and spectra in Fig. 3.
1. Interpretation of absorption and mass spectral data.
2. Coincidence in absorption or mass spectral data in references.
3. Coincidence in absorption and mass spectral data in references.
4. Coincidence in absorption, mass spectrum and HPLC retention time with that of authentic standard.
＊＊＊[1] Watanabe et al., 1984; [2] Kraay et al., 1992; [3] Harradine et al., 1996; [4] Harradine and Maxwell, 1998; [5] Talbot et al., 1999; [6]Garrido et al., 2000; [7] Airs et al., 2001; [8] Larkum and Kühl, 2005
＊＊

−47−

力石嘉人・柏山祐一郎・大河内直彦

Fig. 3. DAD absorption and APCI mass spectra of chloro- and pheo-pigments. Compound numbers correspond to thepeak numbers in Fig. 2.

−48−

藻類・植物・堆積物に含まれるクロロ色素・フェオ色素の HPLC／MS による解析

Fig. 3. (continued)−49−力石嘉人・柏山祐一郎・大河内直彦

Fig. 3. (continued)−50−

藻類・植物・堆積物に含まれるクロロ色素・フェオ色素の HPLC／MS による解析

Fig. 3. (continued)−51−力石嘉人・柏山祐一郎・大河内直彦

Fig. 3. (continued)

1, No.1）が，紅藻（テングサ，G. japonicum）から

チン b（Fig. 3, No. 9），ピロフェオフォルバイド b

は，クロロフィル a（Fig. 1, No.5），d（Fig. 1,

ステリルエステル（Fig. 3, No. 11）のものとは明白

No . 3 ）が ， 植 物 葉（ メ タ セ コ イ ヤ ， M .

に異なる。

glyptostroboides）からは，クロロフィル a（Fig. 1,＋
クロロ色素のマススペクトルは，［M＋H］のNo.5），b（Fig. 1, No.4）が検出された。紅藻から親イオンに加え，中心金属のマグネシウムの脱離検出されたクロロフィル d は，紅藻に共生してい＋した［M＋H-Mg］，及び，173 位のフィチル側鎖るシアノバクテリアに由来すると考えられる（例＋＋の脱離した［M＋H-phytyl］
・［M＋H-phytyl-Mg］

えば，Hegazi et al., 1998; Larkum and Kuhl, 2005）。

に対応したイオンフラグメントを示す。例えば，榛名湖堆積物からは，クロロフィル a（Fig. 1,＋
クロロフィル a のマススペクトルは，［M＋H］

No.5），
b（Fig. 1, No.4），
バクテリオフェオフィチン＋
が m ／z 893.5 であり，［M＋ H-Mg ］，［ M ＋ H-a（Fig. 1, No.6），フェオフィチン a（Fig. 1, No.8），＋＋
phytyl ］，［ M ＋ H-phytyl-Mg ］に対応する m ／zb（Fig. 1, No.7），ピロフェオフィチン a（Fig. 1,

871.6，m ／z 615.2，m ／z 593.3 を持つ（Fig. 3, No.

No.10），b（Fig. 1, No.9），及び複数のピロフェオ

5）。クロロフィル c1, c2 は，
173 位にフィチル側鎖をフォルバイドステリルエステル（別名，ステリル＋＋
持たないため，［M＋H］，［ M＋H-Mg］に対応しクロリンエステル，Fig. 1, No.11-17）が検出されたイオンフラグメント（それぞれ，m／z 611.2，m

た。

／z 589.2，m／z 609.2，m／z 587.2）のみが検出されクロロ色素の吸収スペクトルは，構造の違いをる（Fig. 3, No. 1, 2）。

良く反映し，
クロロフィル a, b, c, d ではっきりとフェオ色素のマススペクトルは，クロロ色素と異なる（Fig. 3, No. 1-5）
。一方，クロロフィル c1, c2

＋
同様に，
［M＋H］
の親イオンに加え，173 位のフィのスペクトルは非常に類似している（Fig. 3, No.

チル側鎖もしくはステリル側鎖の脱離した［M＋1, 2）。フェオ色素の吸収スペクトルは，由来する＋＋
H-phytyl］
または［M＋H-steryl］に対応したイオ

クロロ色素により異なり，同一のクロロ色素に由

ンフラグメントを示す。例えば，フェオフィチン

来するフェオ色素の吸収スペクトルは非常に類似＋
a のマススペクトルは，［M＋H］
が m／z 871.6 でしている（Fig. 3, No. 6-17）。例えば，
クロロフィル＋あり，［M＋H-phytyl］に対応する m／z 593.3 を持a に由来するフェオフィチン a（Fig. 3, No. 8），ピつ（Fig. 3, No. 8）。また，ピロフェオフォルバイド

ロフェオフィチン a（Fig. 3, No. 10），ピロフェオ

a 27:1 ステリルエステルのマススペクトルは，

フォルバイド a ステリルエステル（Fig. 3, No. 12-＋［M＋H］
が m ／ z 903.6 で あ り ，［ M ＋ H-27 : 1

17）は，
ほとんど同一の吸収スペクトルを持ち，こ＋steryl］に対応する m ／z 535.3 を持つ（Fig. 3, No.

れらのスペクトルは，クロロフィル b に由来する

14）。なお，ピロフェオフォルバイドステリルエス

フェオフィチン b（Fig. 3, No. 7），ピロフェオフィ

テルのマススペクトルからは，ステリル側鎖の詳−52−

藻類・植物・堆積物に含まれるクロロ色素・フェオ色素の HPLC／MS による解析

Fig. 4. Mass spectra of chlorophylls a , d and pheophytin a on HPLC ／ TOF-MS analysis . Compound numbers
correspond to the peak numbers in Fig. 2.

しい構造（骨格構造・二重結合の位置など）を決O:15.99494，Mg:23.985 を用いた。このように，定することはできない。

HPLC／MS 分析に加えて HPLC／TOF-MS による精このように，クロロ色素・フェオ色素は，そのマススペクトル・吸収スペクトルにより，容易に密質量の測定を行うことで，さらに正確な同定が可能である。

同定することができる。HPLC の溶媒系，カラム

謝

温度を固定してリテンションタイムの情報もあわせて比較すれば，より正確な同定が可能である。

辞

HPLC／TOF-MS 分析は，横河アナリティカルシ
ステムズ譁の内田秀明氏にお世話になりました。

4.2. HPLC／TOF-MS 分析

深く感謝いたします。本稿の内容は，日本学術振Fig. 4 に，クロロフィル a, d ，フェオフィチン a＋のマススペクトル（［M＋H］イオンに対応する部

興会特別研究員奨励費及び CREST により実施した研究成果の一部を取り纏めたものである。

分を拡大して表示）を示す。検出されたクロロ

引用文献＋
フィル a, d ，フェオフィチン a の［M＋H］
は，そ

れぞれ m／z 893.5415, m／z 895.5171, m ／z 871.5709

Airs R. L., Atkinson J. E. and Keely B. J. (2001 )であり，±3 ppm の相対誤差（式 1）以内で，構造Development and application of a high resolution

式から計算される理論質量（それぞれ 893.5409,

liquid chromatographic method for the analysis of

598.5171, 871.5715）と一致した。

complex pigment distributions. J. Chromatogr. A
917, 167-177.

相対誤差＝（検出 m／z／理論質量）／理論質量

Bidigare R. R., Kennicutt II M. C., Keeney-Kennicutt（式 1）

W . L . and Macko S . A . ( 1991 ) Isolation andpurification of chlorophylls a and b for the

なお各元素の質量は，H:1.0078，C:12.0，N:14.003，−53−

determination of stable carbon and nitrogen isotope

力石嘉人・柏山祐一郎・大河内直彦

reversed-phase high-performance liquid chromato-

compositions. Anal. Chem. 63, 130-133.

graphy. J. Chromatgr. A 829, 153-159.

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Keely B. J., Prowse W. G. and Maxwell J. R. (1990)

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Hydrogen isotopic fractionations during desatu-

Separation of chlorophylls c1, c2 and c3 of marine

ration and elongation associated with polyunsatu-

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