脳腫瘍の分子生物
杏林大学医学部付属病院 病理部
小松 京子

第49回日本臨床細胞学会 神戸

【目的】脳腫瘍の迅速診断において細胞診や免疫染色の併用は有効であるが、検体が少量の場合には、組織標本の作製・細胞診の圧座標本作製・免疫染色の併用等の全てを行うことが難しい場合もある。
また、脳脊髄液は、脳腫瘍のうち悪性リンパ腫や転移性腫瘍の診断には最も有効な手段であり、組織検体の採取が難しく、細胞診が唯一の情報源となることも少なくない。我々は脳腫瘍検体や脳脊髄液を有効に活用することを目的として、器具の洗浄による集細胞での免疫染色や遺伝子増幅、を併用し、診断への有用性を検討しているので報告する。

脳脊髄液検体に関する免疫染色と遺伝子解析
2000年から 2005 までの脳脊髄液検体の検体数2000年からと陽性率である。 997 症例中症例中7.7
7.7％が細胞診陽性％が細胞診陽性であった。
Inadequate 4997 in totaｌ
totaｌ

Negative 916Suspicious 25
Positive 52

77 (7.7%)

Categories of Positive Cases
Malignant Lymphoma 22
Leukemia

65％65％

11

Metastatic carcinoma
17
Lung(adenocarcinoma10
Lung(adenocarcinoma10、、small cellcarcinoma 1)1)、、Stomach 3､ Renal cell
ca 1、Breast 2
Brain Tumor

2

Glioblastoma 1､Medulloblastoma 1

Immunocytochemical staining
for meningitisｘ200
B CELL Marker

(L26)

ｘ200

T cell Marker (Uchl-1)

Cytology of ATL

B cell Marker(L26)x400

Papanicolaou
Stain

x1000
x1000

Giemsa Stain

T cell Marker(Uchl-1)

Immunocytochemicalstaining

Metastaticcarcinoma(Lung：adenocarcinoma)
Papanicolaou
Stain

May-Giemsa Stainx200x200

Keratinx200

脳腫瘍において有用な免疫染色と遺伝子解析
脳腫瘍関連における免疫染色は有用であるが、特定の腫瘍型だけに特異的なマーカーは存在せず、推定される鑑別診断として活用し、臨床情報も加味しながら判定することが望ましい。
Astrocytic tumor ：GFAP（分化が低くなると染色性が悪くなる。）,S-100、Oligodendroglioma ：Olig-2（特異性は完全ではない）, GFAP, S-100, etc
Medulloblastoma ：シナプトフィジン,
遺伝子：50％にisochromosome [i（17q）]
Central neurocyma ： シナプトフジン, NeuN, ClassⅢβ-tubulin, NSE
Olfactory neuroblastoma ：シナプトフィジン、NSE、MAP
Atypicalteratoid/rhabdid tumor（AT/RT）：EMA, α-smooth muscleactin, vimentin, hSNFS/INI1遺伝士産物
遺伝子： 22番染色体の欠失ないしモノソミー
Meningioma ： vimentinm, EMA,cytokeratin, etc
遺伝子： 22番染色体の欠失、NF2gene mutation
Hemangioblastoma ： VEGF（Glioma等でも陽性)

DNA変異解析・DNA抽出・PCR法による標的遺伝子の増幅(方法はRNAの場合と同じ)・PCR-SSCP法による変異の検出
泳動装置：AE-6510 ゾルマックス・二連ミニスラブ(ATTO)
ゲル： e-パジェル(12.5%ポリアクリルアミドゲル)(ATTO)
銀染色：2D銀染色試薬・Ⅱ「第一」(第一化学)

・DNAダイレクトシークエンス法にる変異の解析：
ダイターミネータ法による。
システム：ABI PRISM 310(Applied Biosystems Inc.)RNA発現解析○RNA抽出グアニジン系の溶解液を使用○RT-PCR法
抽出したRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成
サーモスクリプト RT-PCRシステム(Gibco BRL)
※ 得られたｃDNAを用いてPCRを行う
プライマー：β―actin mRNA（内部標準）
およびMMP-2、MMP-9 mRNA
※ Taq polymerase：
AmpliTaq GoldTM (Applied Biosystems Inc.)
サーマルサイクラー：PC-808(ASTEC)※ ゲル染色：SYBR GreenⅠ(フナコシ)を用いて染色T cell receptors gene rearrangement andT cell Lymphoma
precursor

VC
Gene diversity

V V V V VV

D

C C C
J

Generearrangement

CClonality
14 V
V primer

5J
J primer

PCR with multiple primer

T celllymphoma
detection

Detection of T cell receptor generearrangement by PCR
Paraffinembedded sectionM 1234Cytology
samples
567

P N

M

LＢＣを用いた場合の細胞形態学的な変化と免疫染色への影響

Cytic CorporationのThinPrepを用いた細胞診標本作製法
検体の採取
固定液

PreservCyt液中で洗う

検体

ThinPrepで標本作製

CytoLyt液あるいは残りの検体で遺伝子解析を行う

固定・染色・封入脳腫瘍(G2)

圧座標本

ThinPrepMetastatic carcinoma

圧座標本

ThinPrepMeningioma
ThinPrep

圧座標本脳腫瘍における液状処理は、①集細胞の手段として有用である。 。
②神経線維は明瞭であるが、血管との関係は圧座標本が優れている。
③転移性の癌に有用である。
④検体が微量であることが多いので、特にｂｉｏｐｓｙには効果的な手段となる可能性が示唆された。

LBCを使用した遺伝子の抽出と解析

方法
脳腫瘍標本作製後の残りLBCの保存液中でピンセットやガーゼ等を洗い、圧座標本との形態学的な比較検討ならびに免疫染色を行った後の検体から遺伝子抽出を行い、Matrix metalloprotenases-2(MMP-2)とMatrix metalloprotenases-9(MMP-９)のmRNAの定量ならびにその有用性を検討した。また、これらの抗体を使用した免疫染色の検討も行った。

MMPs(matrix metalloprotenases)
MMPs(matrix metalloprotenases) は 、 間 質
マトリックスの代謝に関与する一群の酵素群であり、ドメイン構造と基質特異性から5群に分類される。MMP-2と9は、ゼラチンやIV型コラーゲンを分解するゼラチナ－ゼ群で、癌の浸潤や転移に関与していると言われている。我々は脳腫瘍において、MMP-2、9の過剰発現及びp53遺伝子変異の有無を検索し、組織型・生物学的悪性度等との関連性を検討している。

Anti MMP-2 : mono, x10,Daiichi Fine Chemical

Histology

Glioblastoma症例

LBC

Anti MMP-9 : mono,x100, Daiichi Fine
Chemical
Anaplastic oligodendroglioma

Histology

Cytology

LBC

Real-time PCR
Gene expression is determined quantity relatively or absolutely
by real-time PCR method.
96 well plate total 25μ l
Master Mix
Forward primer
Reverse primer
TaqMan prbe
Water
Template DNA

ABI 7000 (Applied Biosystems)
95℃ 5 min
95℃ 30 sec
60℃ 1 min40-50 cycles

Data is analyzed
automatically bycomputer software.
Total time： 2.5 hrs

Primers used for RT-PCR of MMP-2and MMP-9Sequence
MMP-2
MMP-9Forward

5´－TTGACGGTAAGGACGGACTReverse

5´－CTTGCAGTACTCCCCATCG

Forward5´－TTGACAGCGACAAGAAGTGG

Reverse5´－CCCTCAGTGAAGCGGTACATLength(bp)153148

Standard samples for real time quantitative PCR
Sample: PCR products of GAPDH and MMP-2,9Quantity = Concentration of PCR products/Molecular weight of target sequences

They were diluted from 106 to 103 copies/μl.

No difference among
the data byconventional PCR
methodWell correlation between the starting quantityof the target fragment and the cycle timeachieve the same fluorescent intensity.

Quantitative analysis for
MMP--2、9mRNA
MMP
Samplediagnos
isControl

MMP-2

MMP-9Quantity(copies/μｌ)
組織1

GBM

24221.4

0.10

1.26

細胞1

GBM

118.7

0.06

0.93

組織2

G3

199398.6

0.370.87

細胞2

G3420.1

0.68

2.70

組織3

G33831.2

0.15

1.38

細胞3

G34044.2

0.121.02

【結果】我々の組織学的なデータでは、MMP9は定量値と組織型とに相関が見られ(p<0.05)、MMP-2の定量値と広汎な浸潤広汎な浸潤・播種・再発が認められた症例との間に相関が認められている(p<0.05)。
細胞診検体でのmRNA定量データは組織でのデータと相関していた。
遺伝子抽出は腫瘍細胞十数個単位でも遺伝子の抽出は可能であり、冷蔵保存1年後でも可能であった。

結論
MMP-2の過剰発現は広汎な浸潤・播種・再発と相関し、MMP-9の過剰発現は組織型と相関した。
中枢神経組織では、astrocyteなどの胞体や突起などで充満しておりマトリックスは一定で20nmであるといわれている。細胞外マトリックスは脳浮腫により、発達する。
MMPの細胞内に存在する量MMPがmRNAから前駆体（pro）型のタンパク質として合成され細胞外に分泌され、活性型のプロテアーゼになる。細胞質内のMMPの量と活性化とは異なる。
MMP-9は血管との関連がみられ、blood brain burrierやサイトカインとの関連が示唆される。

MMP-2、9の免疫染色による局在の観察とRT-PCRによるmRNAの発現解析と定量化、p53遺伝子変異解析などは、形態学的検索とともに再発・浸潤に関する有用な情報を提供すると考えられる。