令和２年３月２５日判決言渡平成３１年（行ケ）第１００１９号
同第１００３０号
口頭弁論終結日

審決取消請求事件（以下「第１事件」という。）

審決取消請求事件（以下「第２事件」という。）
令和２年２月３日
判

決

第

１

事

件

原

告

シージェイジャパン株式 会 社

第

２

事

件

原

告

シージェー チェイルジェダン コーポレーション

上記両名訴訟代理人弁護士

飯

村

末

吉

上記両名訴訟復代理人弁護士

髙

橋

上記両 名訴訟 代理人弁 理士

山

本

鶴

喰

第 １ ・ ２ 事 件 被 告

味

の

素

敏

明
剛

聖

史
修

寿

株

式

孝

会

社

（以下「被告」という。 ）同訴訟代理人弁護 士

森

﨑

博

之

津

城

尚

子

同訴訟代理人弁理 士

白

石

真

琴

同訴訟復代理人弁理士

北

谷

賢

次

主
１

文

原告らの請求をいずれも棄却する。

-1-

２

訴訟費用は原告らの負担とする。

３

第２事件原告について，この判決に対する上告及び上告受理申立てのための付加期間を３０日と定める。
事 実 及 び 理 由

第１

請求

特許庁が無効２０１７－８０００２２号事件について平成３１年１月８日にした審決を取り消す。
第２事案の概要

本件は，特許無効審判請求に対する不成立審決の取消訴訟である。争点は，サポート要件及び実施可能要件違反の有無，進歩性の有無並びに明確性要件違反の有無
である。
１

手続の経緯

(1) 被告は，名称を「Ｌ－グルタミン酸生産菌及びＬ－グルタミン酸の製造方法」とする発明について，平成１７年１２月２８日（以下「本件出願日」という。），特許出願をし（優先権主張：平成１７年９月９日［以下「本件優先日」という。］，優先権主張国：日本国），平成２５年８月２３日，その特許権の設定登録（特許第５３
４３３０３号）を受けた（以下「本件特許」という。）。
(2) 第１事件原告は，平成２９年２月２４日に本件特許の無効審判請求（無効２０１７－８０００２２号）をし，第２事件原告が同審判に参加した。同審判手続において，被告は，平成２９年７月７日付け訂正請求書（甲３９，甲３９の２・３）
で，請求項３を削除することを含む訂正請求（以下「本件訂正」という。）をした。
特許庁は，本件訂正を認めた（以下，訂正後の明細書及び図面を併せて「本件明細書」という。）上，平成３１年１月８日，「特許第５３４３３０３号の請求項１，
２及び４～１２に係る発明についての審判請求は，成り立たない。特許第５３４３
３０３号の請求項３に係る発明についての審判請求を却下する。」との審決（以下「本件審決」という。）をし，本件審決の謄本は，同月１８日に原告らに送達された。

-2-

２

発明の要旨

本件訂正後の本件特許の請求項１，２，４～１２（甲３９の２，以下，請求項の番号に従い「本件発明１」などといい，併せて「本件発明」という。）は，次のとおりのものである。
【請求項１】Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって，変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ－グルタミン
酸生産能が向上したコリネ型細菌であって前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子は，（ｉ），（ｉ’），（ｉ’’）または（ｉｉ）の変異が導入された，コリネ型細菌：（ｉ）配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域の欠失，（ｉ’）配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号
４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域へのインサーションシーケンス又はトランスポゾンの挿入，（ｉ’’）配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異，
または（ｉｉ）配列番号６，６２，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ
酸番号１－２３，８６－１０８，及び１１０－１３２からなる群から選ばれる領域
における１～５個のアミノ酸の置換，欠失，又は挿入。
【請求項２】前記（ｉ’’）の変異は，配列番号６，６２，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列において，４２４位のプロリンをアラニン，グリシン，バリン，
ロイシン，及びイソロイシンからなる群から選ばれる１個のアミノ酸に置換し，及び／または４３７位のプロリンをスレオニン，セリン及びチロシンからなる群から-3-

選ばれる１個のアミノ酸に置換する変異である，請求項１に記載のコリネ型細菌。
【請求項４】Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって，変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ－グルタミン
酸生産能が向上したコリネ型細菌であって，
前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子の変異は，配列番号６，６２，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列において，１００位のアラニンをスレオニンに，及び／または１
１１位のアラニンをスレオニンもしくはバリンに置換する変異である，コリネ型細菌。
【請求項５】Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって，変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ－グルタミン
酸生産能が向上したコリネ型細菌であって，
前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子の変異は，配列番号６，６２，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列において，１４位のロイシンと１５位のトリプトファンの間に１～５アミノ酸を挿入する変異である，コリネ型細菌。
【請求項６】前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子が，下記（ａ）～（ｎ）より選ばれる変異
型ｙｇｇＢ遺伝子である請求項１，２，４及び５のいずれか一項に記載のコリネ型
細菌：（ａ）

配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｂ）

配列番号８のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コ
リネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（ｃ）

配列番号２０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｄ）

配列番号２０のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリ
ネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該-4-コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（ｅ）

配列番号２２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｆ）

配列番号２２のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリ
ネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該
コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（ｇ）

配列番号２４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｈ）

配列番号２４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリ
ネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該
コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（ｉ）

配列番号６４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｊ）

配列番号６４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリ
ネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該
コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（ｋ）

配列番号７０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｌ）

配列番号７０のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリ
ネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該
コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（ｍ）

配列番号７４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｎ）

配列番号７４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリ
ネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該
コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。

-5-

【請求項７】前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子の導入により，Ｌ－グルタミン酸アナログ
耐性が向上したことを特徴とする，請求項１，２及び４～６のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項８】さらに（ｉ）のｓｙｍＡ遺伝子が不活化するように改変された，請求
項１，２及び４～７のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
（ｉ）

配列番号８６の塩基番号５８５～１１２１の塩基配列を含むＤＮＡ。

【請求項９】さらにα－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された，請求項１，２及び４～８のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項１０】コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する，請求
項１，２及び４～９のいずれか一項に記載のコリネ型細菌。
【請求項１１】請求項１，２及び４～１０のいずれか一項に記載のコリネ型細菌を培地で培養し，Ｌ－グルタミン酸を該培地中に生成蓄積させ，該培地からＬ－グルタミン酸を回収することを特徴とするＬ－グルタミン酸の製造法。
【請求項１２】下記（ａ）～（ｎ）より選ばれる変異型ｙｇｇＢ遺伝子：（ａ）

配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｂ）

配列番号８のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コ
リネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（ｃ）

配列番号２０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｄ）

配列番号２０のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリ
ネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該
コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（ｅ）

配列番号２２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｆ）

配列番号２２のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，-6-

欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリ
ネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該
コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（ｇ）

配列番号２４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｈ）

配列番号２４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリ
ネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該
コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（ｉ）

配列番号６４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｊ）

配列番号６４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリ
ネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該
コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（ｋ）

配列番号７０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｌ）

配列番号７０のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリ
ネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該
コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（ｍ）

配列番号７４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｎ）

配列番号７４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリ
ネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該
コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
３

本件審決の理由の要点

以下，無効理由３～６のうち，争点に関する部分についてのみ摘示する。
(1) 無 効 理 由 ３ （ 甲 ８ ［ Susanne RUFFERT,Reinhard Krämer 他 「 Efflux of-7-

compatible solutes in Corynebacterium glutamicum mediated by osmoregulatedchannel activity」European Journal of Biochemistry 247,p572-580,１９９７年］
を主引例とする本件発明１，４，６～７，９，１２の進歩性欠如）について
ア

甲８に記載された発明（以下「甲８発明」という。）

甲８には，「大腸菌のＭｓｃＳとの類似性が示唆される浸透圧調節チャネルを有するコリネバクテリウム・グルタミカム」の発明が記載されている。なお，甲８にコリネバクテリウム・グルタミカムの浸透圧調節チャネルが，Ｌ－グルタミン酸の排出に関わることが記載されているとは認められない。
イ

本件発明１と甲８発明との対比及び相違点についての判断(ｱ) 一致点

浸透圧調節チャネル遺伝子を有するコリネ型細菌である点。
(ｲ) 相違点
本件発明１は，「Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって，変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ－グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって，前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子は，（ｉ）配列
番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域の欠失，（ｉ’）
配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域へのインサー
ションシーケンス又はトランスポゾンの挿入，（ｉ’’）配列番号６，６８，８４
もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９－５３３の領域もしくは配列番
号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異，または（ｉｉ）配列番号６，６２，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号１－２３，８６－１０８，及び１１０－１３２からなる群から選ばれる領域における１～５個のアミノ酸の置換，欠失，又は挿入の変異が導入された，コリネ型細菌である。」のに対し，甲８発明は，そのような特定がされ-8-

ていない点。
(ｳ) 相違点についての判断
甲８に記載の浸透圧調節チャネルの遺伝子が，ｙｇｇＢ遺伝子であることを示す
記載はないし，甲８は，Ｌ－グルタミン酸生産能を向上させるために，変異型ｙｇ
ｇＢ遺伝子を作製し，その変異型ｙｇｇＢ遺伝子をコリネ型細菌に導入することを開示も示唆もしていない。
甲２（国際公開第９５／３４６７２号）,甲１０（Reinhard Krämer 他「Molecularandbiochemical

characterizationofmechanosensitive

channelsinCorynebactreium glutamicum」FEMS Microbiology Letters 218 p305-309,２００３
年），甲１３（Randal B.Bass 他「Crystal Structure of Escherichia coli MscS,
a Voltage-Modulated and Mechanosensitive Channel」Science 298 p1582-1587,
２００２年），甲１４(Samantha Miller 他「Domain organization of the MscS
mechanosensitive channel of Escherichia coli」The EMBO Journal Vol.22 No.1
p36-46,２００３年)，甲１５（Marcos Sotomayor 他「Molecular Dynamics Study ofGating in the Mechanosensitive Channel of Small Conductance MscS」BiophysicalJournal 87 p3050-3065,２００４年）の記載は，コリネバクテリウム・グルタミカ
ムのｙｇｇＢ遺伝子がＬ－グルタミン酸の排出に関与することを示す記載であるとはいえず，また，Ｌ－グルタミン酸生産能を向上させるために，変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製し，その変異型ｙｇｇＢ遺伝子をコリネ型細菌に導入することを示唆する記載であるとはいえない。
周知技術又は技術常識を示す証拠として提出された甲３（特開昭６１－２６８１
８５号公報），甲４（特開昭６２－２０１５８５号公報），甲７（E.H.Muslin 他「Theeffect of proline insertions on the thermostability of a barely α-glucosidase 」 Protein Engineering Vol.15 No.1 p29-33, ２ ０ ０ ２ 年 ） ， 甲 ９（Kuniyuki Okada 他「Functional Design of Bacterial Mechanosensitive Channels」
The JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.277 No.31,p27682-27688,２００２年），-9-

甲１２（Pascale Lapujadae 他「Glutamate Excretion as a Major Kinetic Bottleneck
for the Thermally Triggered Production of Glutamic Acid by Corynebacterium

glutamicum」Metabolic Engineering 1,p255-261,１９９９年），甲１７（特表２０
０２－５０８９２１号公報），甲１８（特開昭６２－１６６８９０号公報），甲１
９（特開昭６３－２１４１８９号公報），甲２０（特開２００４－３１３２０２号
公報），甲２１（M.Marquet 他「Glutamate excretion by Corynebacterium glutamicum :a study of glutamate accumulation during a fermentation course」Appl Microbiol
Biotechnol 25 p220-223,１９８６年），甲２２（Ralf Kelle 他「Reaction Engineering
Analysis of L-Lysine Transport by Corynebacterium glutamicum」Biotechnology
and Bioengineering 51 p40-50, １ ９ ９ ６ 年 ） ， 甲 ２ ３ （ Susanne Morbach 他「 L-Isoleucine Production with Corynebacterium glutamicum:Further Flux
Increase and Limitation of Export」APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY
p4345-4351,１９９６年１２月），甲２４（Dieter J. Reinscheid 他「Stable Expressionof hom-1-thrB in Corynebacterium glutamicum and Its Effect on the Carbon Flux
to Threonine and Related Amino Acids」APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY
p126-132,１９９４年１月），甲２５の１（国際公開第２００３／０４６１２３号），
甲３０（特開昭６３－２１４１８９号公報） ，甲３５（Abdul Haleem Shah 他「 Optimizationof

CultureConditionsfor

L-Lysine

Fermentation

byCorynebacterium glutamicum 」 Online Journal of Biological Science 2(3)p151-156,２００２年）にも，コリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢ遺伝子
がＬ－グルタミン酸の排出に関与することを示す記載はなく，また，Ｌ－グルタミ
ン酸生産能を向上させるために，変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製し，その変異型ｙｇ
ｇＢ遺伝子をコリネ型細菌に導入することの動機付けとなるような記載はない。
したがって，甲２，１０，１３～１５の記載及び本件優先日前の周知技術に基づいても，甲８発明において，浸透圧調節チャネルの遺伝子として，ｙｇｇＢ遺伝子を選択し，さらに，Ｌ－グルタミン酸生産能を向上させるために，変異型ｙｇｇＢ- 10 -

遺伝子を作製し，その変異型ｙｇｇＢ遺伝子をコリネ型細菌に導入することは，当業者が容易に想到し得ることとはいえない。
(ｴ) 本件発明１の効果
本件明細書の実施例２～１３の記載から，本件発明１は，Ｌ－グルタミン酸生産能を向上させたコリネ型細菌を提供することができるという，甲８発明に比べて格別顕著な効果を奏するといえる。
(ｵ) したがって，本件発明１は，甲８，２，１０，１３～１５に記載された発明及び周知技術に基づいて，当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。
ウ

本件発明６，７，９～１１について

本件発明６,７，９～１０は，本件発明１に更なる限定を加えた発明であり，本件発明１１は，本件発明１のコリネ型細菌を使用する方法の発明であるから，本件発明１が，甲８，２，１０，１３～１５に記載された発明及び周知技術に基づいて，当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない以上，本件発明６，
７，９～１１も，甲８，２，１０，１３～１５に記載された発明及び周知技術に基づいて，当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。
エ本件発明４について

本件発明４は，訂正前の請求項１を引用する記載であったものを独立請求項とした発明であり，実質的に本件発明１の（ｉｉ）の「配列番号６，６２，６８，８４
もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号１－２３，８６－１０８，及び１１０－１３２からなる群から選ばれる領域における１～５個のアミノ酸の置換，欠失，又は挿入」の変異の下位概念に該当する「配列番号６，６２，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列において，１００位のアラニンをスレオニンに，及び／または
１１１位のアラニンをスレオニンもしくはバリンに置換する変異」を有する変異型
ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネ型細菌に係る発明であるから，本件発明１が，甲８，２，１０，１３～１５に記載された発明及び周知技術に基づいて，当業者が- 11 -

容易に発明をすることができたものであるとはいえない以上，本件発明４も，甲８，
２，１０，１３～１５に記載された発明及び周知技術に基づいて，当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。
オ

本件発明１２について(ｱ) 甲８発明との一致点
浸透圧調節チャネル遺伝子である点。
(ｲ) 甲８発明との相違点
本件発明１２は，「下記（ａ）～（ｎ）より選ばれる変異型ｙｇｇＢ遺伝子：（ａ）

配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｂ）

配列番号８のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，

挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（ｃ）

配列番号２０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｄ） 配列番号２０のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（ｅ）

配列番号２２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｆ） 配列番号２２のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（ｇ）

配列番号２４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｈ） 配列番号２４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細- 12 -

菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（ｉ）

配列番号６４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｊ） 配列番号６４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（ｋ）

配列番号７０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｌ） 配列番号７０のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。
（ｍ）

配列番号７４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ，（ｎ） 配列番号７４のアミノ酸配列において，１～５個のアミノ酸が置換，欠失，
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌に導入することにより，過剰量のビオチンを含む培地で培養したときの該コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるＤＮＡ。」であるのに対し，甲８発明
は，そのような特定がされていない点。
(ｳ) 相違点についての判断
甲８には，甲８記載の浸透圧調節チャネルの遺伝子が，ｙｇｇＢ遺伝子であることを示す記載はないし，甲８は，Ｌ－グルタミン酸生産能を向上させるために，変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製することを開示も示唆もしていない。
甲２，１０，１３～１５の記載は，コリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇ
Ｂ遺伝子がＬ－グルタミン酸の排出に関与することを示す記載であるとはいえず，
また，Ｌ－グルタミン酸生産能を向上させるために，変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製することを示唆する記載であるとはいえない。また，周知技術又は技術常識を示す- 13 -

証拠として提出された甲３，４，７，９，１２，１７～２４，甲２５の１，甲３０，
３５にも，コリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢ遺伝子がＬ－グルタミン酸の排出に関与することを示す記載はないし，Ｌ－グルタミン酸生産能を向上させるために，変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製することの動機付けとなるような記載はない。したがって，甲２，１０，１３～１５の記載及び本件優先日前の周知技術に基づいても，甲８発明において，浸透圧調節チャネルの遺伝子として，ｙｇｇＢ遺伝子を選択し，さらに，Ｌ－グルタミン酸生産能を向上させるために，変異型ｙｇｇ
Ｂ遺伝子を作製することは，当業者が容易に想到し得ることとはいえない。
(ｴ) 本件発明１２の効果について
本件明細書の実施例２～１３の記載から，本件発明１２は，Ｌ－グルタミン酸生産能を向上させたコリネ型細菌を提供することができるという，甲８発明に比べて格別顕著な効果を奏するといえる。
(ｵ) したがって，本件発明１２は，甲８，２，１０，１３～１５に記載された発明及び周知技術に基づいて，当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。
(2) 無効理由４（実施可能要件）及び無効理由５（サポート要件）について
ア

本件発明の課題

本件発明の課題は，コリネ型細菌を用いたＬ－グルタミン酸の製造において，Ｌ－グルタミン酸生産能力を向上させる新規な技術を提供することである。
イ(ｱ)

本件明細書の実施例８の実験結果について

本件明細書の実施例８の実験結果では，各菌株培養後のグルタミン酸濃度は，野生株が０．５ｇ／Ｌであるのに対し，１９型ｙｇｇＢ変異株は０．７ｇ／Ｌを示しており（表７），１９型ＹｇｇＢ変異の導入によりグルタミン酸生産能が野生型の１．
４倍になったことが明確に記載されていて，発明の詳細な説明は，当業者がＬ－グルタミン酸の生産能力を向上させて発明を実施できる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。

- 14 -

甲２８，３４の実験結果は，「三角フラスコ」を用いた低速での撹拌培養による実験結果であって，そもそも本件明細書には，「三角フラスコ」を用いて培養を行うことは全く記載されておらず，本件明細書に記載されている「坂口フラスコ」を用いて，本件明細書の実施例８の実験条件に沿った実験を行っても，本件明細書の実施
例８の実験結果が再現できなかった証拠は提出されていないので，甲２８，３４の記載事項が，本件発明１１は，「Ｌ－グルタミン酸生産能力を向上させる新規な手段を提供する」という課題が解決できない範囲に及ぶことの根拠になるとはいえない。
(ｲ) コリネ型細菌の培養条件について
本件発明は，課題を解決するための手段として，「ｙｇｇＢ遺伝子がコリネ型細菌のＬ－グルタミン生産に関与していることを明らかにし，ｙｇｇＢ遺伝子を用いてコリネ型細菌を改変することにより，Ｌ－グルタミン酸の生産能が大幅に向上する
ことを見出し」たものであり，コリネ型細菌の培養条件といった好適条件は発明特定事項として課題解決に必要な事項ではない。また，本件明細書の実施例１０は，Ｔｗｅｅｎ４０を添加した条件又はビオチン制限条件というＬ－グルタミン酸生成を誘導できる条件（以下，このようなグルタミン酸の生産を誘導できる条件を「誘導条件」といい，そうでない場合を「非誘導条件」という。）を試験した実験であり，その条件下でのみＬ－グルタミン酸生産量の向上が見られないことを示すものではないし，実施例８の実験結果は，非誘導条件下で１９型ＹｇｇＢ変異体によるコリ
ネ型細菌のグルタミン酸生産能の向上を示したものといえるから，本件発明１１は，「Ｌ－グルタミン酸生産能力を向上させる新規な手段を提供する」という課題が解決できない範囲に及ぶとはいえないし，発明の詳細な説明は，当業者がＴｗｅｅｎ
４０添加又はビオチン制限なしでもＬ－グルタミン酸の生産能力を向上させて発明を実施できる程度に明確かつ十分に記載されていないともいえない。
(ｳ) 以上からすると，本件発明１１は，発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではなく，また，本件発明の詳細な説明は，当業者が本件発明１１の実施をすることができる程度に明確かつ十- 15 -

分に記載されているといえる。
ウ

２Ａ－１型変異（本件発明１の（ｉ）及び（ｉ’）の変異）について

本件明細書の実施例５及び６には，配列番号６のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９から下流部分のＣ末端側にトランスポゾンにより挿入されたＩＳ（インサーションシークエンス）である５個のアミノ酸が挿入された２Ａ－１型変異が開示され，
当該変異を導入したコリネ型細菌のグルタミン酸生産能の向上を確認したことが記載されている。この２Ａ－１型変異は，その変異の態様からすると，実質的にはＹ
ｇｇＢタンパク質のアミノ酸番号４１９以降のＣ末端領域が欠失した変異であるといえるから，当業者は，実施例５及び６の記載から，実施例５及び６の結果は，Ｙ
ｇｇＢタンパク質のアミノ酸番号４１９以降のＣ末端領域の立体構造が改変されることで生じたもので，ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸番号４１９以降のＣ末端領域が欠失した変異について同様の効果が得られることを認識できるから，ＹｇｇＢタ
ンパク質のアミノ酸番号４１９以降のＣ末端領域にＩＳ又はトランスポゾンの挿入を導入したコリネ型細菌について，アミノ酸番号４１９以降のＣ末端領域の立体構
造が改変された場合には，上記実施例に記載の変異と同様の効果が得られることを認識できる。したがって，当業者は，本件明細書の上記実施例の記載及び本件明細書の段落【００６９】～【００７９】の記載から，（ｉ）及び（ｉ’）の変異により，
Ｌ－グルタミン酸の生産能力向上という課題が解決できることを認識でき，また，発明の詳細な説明は，（ｉ）及び（ｉ’）の変異により，Ｌ－グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
エ

６６型変異，２２型変異（本件発明１の（ｉ’’）の変異）について(ｱ) 本件明細書の実施例１２及び１３には，アミノ酸番号４２４のプロリ

ンがロイシンに置換された６６型変異を導入したコリネ型細菌を構築したことが記載され，アミノ酸番号４３７のプロリンがセリンに置換された２２型変異を導入したコリネ型細菌を構築したこと，そのＬ－グルタミン酸生産能が向上したことが記載されている。また，配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９－５３３- 16 -

の領域に存在するプロリンの位置については，本件明細書の段落【００７２】に具体的に記載されているから，当業者が，本件明細書の上記実施例の記載及び本件明細書の段落【００６９】～【００７９】の記載に従って，配列番号６等のアミノ酸
配列のアミノ酸番号４１９－５３３の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異を導入したコリネ型細菌を構築し，その中からＬ－グルタミン酸の生産能が向上したコリネ型細菌を取得することに，当業者に期待し得る程度を超える試
行錯誤や複雑高度な実験を行う必要があると認められない。
(ｲ) 本件明細書には，上記のとおり，配列番号６等のアミノ酸配列のア

ミノ酸番号４１９－５３３の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異を導入したコリネ型細菌がＬ－グルタミン酸の生産能を向上させることができた
実施例が少なくとも一つ存在し，また，本件明細書の段落【００７２】には，ｙｇｇＢ遺伝子のＣ末端側のプロリンは，ＹｇｇＢタンパク質の立体構造維持のために重要な役割を果たしていると考えられることが記載されているから，当業者は，本件明細書の上記実施例１２及び１３の記載，本件明細書の段落【００６９】～【００７９】の記載並びにタンパク質の構造におけるプロリンの役割についての乙１９等の記載から，配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９－５３３の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異を導入したコリネ型細菌について，アミノ酸番号４１９以降のＣ末端領域の立体構造が改変された場合には，本件明細書の上記各実施例に記載の変異と同様の効果が得られることを認識でき，Ｌ－
グルタミン酸生産能の向上という課題が解決できることが認識できるといえる。
(ｳ) したがって，本件発明１の（ｉ’’）の変異について，本件発明１は，発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超える
ものではなく，また，本件発明の詳細な説明は，当業者が本件発明１の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
オ

膜貫通領域の変異（本件発明１の（ｉｉ）の変異）について(ｱ) 本件明細書の実施例７～９及び１１には，配列番号６のアミノ酸配列- 17 -

の１４番目のロイシンと１５番目のトリプトファンの間に３アミノ酸からなるＩＳ（Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ）が挿入されたＡ１型変異を導入したコリネ型細菌を構築し，そのＬ－グルタミン酸生産能が向上したこと（実施例７），配列番号６のアミノ酸配列の１００番目のアラニンがスレオニンに置換された１９型変異を導入した
コリネ型細菌を構築し，そのＬ－グルタミン酸生産能が向上したこと（実施例８），
配列番号６のアミノ酸配列の１１１番目のアラニンがバリンに置換されたＬ３０型
変異を導入したコリネ型細菌を構築し，そのＬ－グルタミン酸生産能が向上したこと（実施例９），配列番号６２のアミノ酸配列の１１１番目のアラニンがスレオニンに置換された８型変異を導入したコリネ型細菌を構築したこと（実施例１１）がそれぞれ記載されている。また，配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸番号１－２
３，８６－１０８，１１０－１３２の領域は，２３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列という限定された領域であり，さらに，本件訂正により，アミノ酸番号１－２
３，８６－１０８，１１０－１３２の領域に導入されるアミノ酸の置換，欠失，又は挿入の個数は１～５個に限定されている。したがって，当業者が，本件明細書の上記実施例の記載及び本件明細書の段落【００６９】～【００７９】の記載に従って，配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸番号１－２３，８６－１０８及び１１
０－１３２からなる群から選ばれる領域において，１～５個のアミノ酸の置換，欠失，又は挿入した変異を導入したコリネ型細菌を構築し，その中からＬ－グルタミン酸の生産能が向上したコリネ型細菌を取得することに，当業者に期待し得る程度を超える試行錯誤や複雑高度な実験を行う必要があると認められない。
(ｲ) 本件明細書には，上記のとおり，配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸番号１－２３，８６－１０８，１１０－１３２の領域における１～５個のアミノ酸の変異を導入したコリネ型細菌がＬ－グルタミン酸の生産能を向上させることができた実施例がそれぞれ少なくとも一つ存在し，また，配列番号６等のアミノ酸
配列のアミノ酸番号１－２３，８６－１０８，１１０－１３２の領域は，２３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列という限定された領域で，かつ，上記実施例の変異- 18 -

の位置の近傍の領域であり，さらに，本件訂正により，アミノ酸番号１－２３，８
６－１０８，１１０－１３２の領域に導入されるアミノ酸の置換，欠失，又は挿入の個数は１～５個に限定されているから，当業者は，本件明細書の上記実施例の記載及び本件明細書段落【００６９】～【００７９】の記載から，配列番号６等のア
ミノ酸配列のアミノ酸番号１－２３，８６－１０８，及び１１０－１３２からなる群から選ばれる領域において，１～５個のアミノ酸の置換，欠失，又は挿入した変異を導入したコリネ型細菌について，Ｌ－グルタミン酸生産能の向上という課題が解決できることが認識できるといえる。
(ｳ) したがって，本件発明１の（ｉｉ）の変異について，本件発明１は，発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超える
ものではなく，また，本件発明の詳細な説明は，当業者が本件発明１の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
カ

配列番号８５のアミノ酸配列について

配列番号８５のアミノ酸配列は，コリネ型細菌に保存されるＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を示したものであり，配列番号６等で示すＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列のうち，アミノ酸置換・欠失が起こっていてもよい箇所をＸａａで示したものである（本明細書の段落【００３５】～【００３６】，【００７８】～【００７９】等）から，配列番号８５のアミノ酸配列についても，他の配列番号のアミノ酸配列と同様にＹｇｇＢタンパク質としての機能を有すると当業者は認識することができる。また，本件発明１の（ｉ），（ｉ’），（ｉ’’）又は（ｉｉ）の変異を導入した場合についても，Ｌ－グルタミン酸の生産能力向上という課題が解決できることを認識することができ，発明の詳細な説明は，Ｌ－グルタミン酸の生産性が向上することが理解できる程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
したがって，配列番号８５のアミノ酸配列について，本件発明１は，発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではな
く，また，本件発明の詳細な説明は，当業者が本件発明１の実施をすることができ- 19 -

る程度に明確かつ十分に記載されているといえる。
(3) 無効理由６（本件発明６～１２の明確性要件違反）について
ア

本件発明６，１２の記載について

本件明細書の段落【００３２】の記載及び出願時の技術常識を考慮すると，「過剰
量のビオチン」という記載の意味内容を理解することができるから，本件発明６，
１２は明確に記載されている。
イ

本件発明７の記載について

本件明細書の段落【００６８】の記載及び出願時の技術常識を考慮すると，「Ｌ－
グルタミン酸アナログ」に包含される具体的な物質を理解することができるから，本件発明７は，明確に記載されている。
ウ

本件発明８の記載について

本件発明８は，「コリネ型細菌」に係る発明であることは明らかであり，また，本件発明８の「（ｉ）のｓｙｍＡ遺伝子」は，訂正後の請求項１の（ｉ）ではなく，訂正後の請求項８の「（ｉ）配列番号８６の塩基番号５８５～１１２１の塩基配列を含むＤＮＡ。」を示すものであることは明らかであるから，本件発明８は，明確に記載されている。
エ本件発明９の記載について

本件明細書の段落【００８３】の記載及び出願時の技術常識を考慮すると，「α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下する」という記載の意味内容を理解することができるから，本件発明９は，明確に記載されている。
オ

本件発明１０，１１の記載について

本件発明１０，１１は，訂正後の請求項６～９を引用するものであるが，上記ア～エで述べたように，本件発明６～９は，明確に記載されているといえる以上，本件発明１０，１１も明確に記載されている。
カ

本件発明６の請求項４，５を引用する部分の記載について

本件明細書の記載及び出願時の技術常識を考慮すると，本件発明６の請求項４を- 20 -

引用する部分については，（ｅ）～（ｊ）の変異型ｙｇｇＢ遺伝子が対応し，また，本件発明６の請求項５を引用する部分については，（ｃ），（ｄ）の変異型ｙｇｇＢ遺伝子が対応することは明らかであるから，本件発明６及び請求項６を引用する本件
発明７～１１は，明確に記載されている。
４

原告ら主張の審決取消事由(1) １９型変異に関する実施可能要件及びサポート要件違反の認定判断の誤り（取消事由１）(2) 進歩性欠如の認定判断の誤り（取消事由２，３）(3) １９型変異以外に関する実施可能要件及びサポート要件違反の認定判断の誤り（取消事由４）(4) 明確性要件違反についての認定判断の誤り（取消事由５）
第３

当事者の主張１ １９型変異に関する実施可能要件及びサポート要件違反の認定判断の誤り（取消事由１）(原告らの主張)(1) 非誘導条件下である実施例８（本件明細書の段落【０１１９】～【０１２１】
及び【表７】）では，Ｌ－グルタミン酸の生産能力向上がみられないこと
ア

請求項１１において，製造方法の発明におけるグルタミン酸（以下，Ｌ－グルタミン酸とグルタミン酸を特に区別することなく，単に「グルタミン酸」ということがある。）生成条件は，特定の条件に限定されておらず，実施例８の非誘導条件において，課題が解決できず効果が奏されない場合には，特許請求の範囲の記
載はサポート要件に適合しない。
本件明細書の実施例８では，【表７】のとおり，グルタミン酸生産量は，野生株であるＡＴＣＣ１３８６９では０．５ｇ／Ｌ，１９型ｙｇｇＢ変異株であるＡＴＣＣ
１３８６９－１９では０．７ｇ／Ｌであって，両者の差（０．２ｇ／Ｌ）は，誤差の範囲内にすぎず，ＡＴＣＣ１３８６９－１９によってＬ－グルタミン酸の生産能- 21 -

力が向上したとはいえない。
実施例８と同様の方法によって行われた実施例２における野生株及びブランクの値からすると，実施例８におけるＡＴＣＣ１３８６９とＡＴＣＣ１３８６９－１９とのわずか０．２ｇ／Ｌの差は，誤差の範囲内といえる。
また，実施例８でのＡＴＣＣ１８３６９－１９のグルタミン酸生産量の絶対値（０．
７ｇ／Ｌ）は，実施例３でのブランク値（０．６ｇ／Ｌ）とほぼ一致しており，極めて低いレベルといえ，他の変異株の結果（実施例２，３，５，７，９）と比較しても，ＡＴＣＣ１３８６９－１９のようにブランクとほぼ一致するレベルでは，グ
ルタミン酸生産量が向上しているとはいえない。
イ実施例８の結果を検証するため，一般的な三角フラスコを用い，かつ本件明細書の実施例８が言及する実施例２の条件（段落【００９７】）及び実施例１２の振とう速度（段落【０１４６】）に従うという適切な条件下で再現実験が行われた（甲２８）ところ，非誘導条件下では，ＡＴＣＣ１３８６９及びＡＴＣＣ１３８６
９－１９のいずれについても，グルタミン酸の生成は観測できなかった。
(2) 本件審決の認定判断の誤り及び被告の主張に対する反論
ア

本件審決は，実施例２及び８は全て同一条件で行われたとはいえず，実

施例８の実験結果を誤差の範囲とはいえないと判断したが，実施例８は，「実施例２と同様の方法で」行われたから（本件明細書の段落【０１２０】），両者を比較する
ことができる。
被告は，大豆加水分解物中のグルタミン酸濃度が変動することは技術常識であると主張するが，何ら具体的な証拠を示していない。
本件明細書の実施例３及び実施例８には，「実施例２と同様の方法」（本件明細書の段落【０１００】及び【０１２０】）との記載があり，実施例６には「実施例２記
載の方法」（【０１０９】）との記載があるから，実施例８での大豆分解組成物は，実施例２と同じロットであるか又は同等のもの（Ｌ－グルタミン酸濃度の点でも同等のもの）が使用されたはずである。したがって，実施例２，３及び６での測定値は，- 22 -

実施例８の検討にも参照されるべきである。
イ

また，実施例８では，変異株（ＡＴＣＣ１３８６９－１９）とコントロールである親株（ＡＴＣＣ１３８６９）とのグルタミン酸生産量が比較されているのみで，実施例８におけるブランク値は記載されていない。しかし，ブランク値と変異株及び親株の結果とを対比しないと，実施例の信用性を評価することはできない。仮に，変異株での値がブランク値を下回っていたのであれば，変異株がグルタミン酸を生産したとしても，その量はごく僅かであり，変異株と親株との僅かな違いを議論する意味はないからである。
ウ

本件審決や被告は，実施例８において，１９型変異によりグルタミン酸の生産能が野生型の１．４倍になった（０．７／０．５＝１．４）とするが，０．
２ｇ／Ｌは，上記のとおり，誤差の範囲であり，誤差の多い値同士の割り算を有効
数字２桁まで求めても意味はない。
エ(ｱ)甲３６，乙６は，被告が本件侵害訴訟を提起してから行った実験結果

に関するものであり，本件明細書には，甲３６，乙６のような詳細なデータは記載
されていない。
(ｲ) 本件審決は，追試の結果（甲２８，３４）は「三角フラスコ」を用いた低速での撹拌培養による実験結果に関し，本件明細書の「坂口フラスコ」が使用されていないと認定し，甲２８，３４を排斥したが，本件明細書の実施例２は，フラスコの種類や振とう速度も特定されていない。
坂口フラスコは，本件明細書上，実施例１５で初めて登場する（段落【０１４６】）。
本件明細書に接した当業者は，実施例１４までは，通常使われる三角フラスコのよ
うなフラスコが使用されており，実施例１５において，坂口フラスコという特殊なフラスコが使用されたため，実施例１５にて特にその記載がされたと理解する。
コリネ型細菌によるＬ－グルタミン酸の生産において，坂口フラスコを用い，特定の振とう速度で培養することが周知であることの証拠もない。
坂口フラスコは，国際的には知られておらず，グルタミン酸発酵生産の分野で技- 23 -

術常識ではない（乙１７，１８）。しかも，坂口フラスコによる往復振とうは，アミノ酸の発酵生産のために開発されたものではない。
したがって，本件明細書の実施例２及び８に接した当業者は，合理的には三角フラスコを使用することを想定し，坂口フラスコを用いることは考えない。本件審決は，実施例８では坂口フラスコが使用されていて，その追試でも坂口フラスコが使用されるべきであるとの独自の前提に依拠しており，前提において誤っている。
また，グルタミン酸生産がフラスコの選択に影響を受けるとしたら，第三者は本件明細書の実施例を検証できない。
オ

コリネ型細菌の培養条件について

本件審決は，コリネ型細菌の培養条件といった好適条件は発明特定事項として課
題解決に必ずしも必要な事項ではないとしたが，本件発明１１は，Ｌ－グルタミン酸の製造方法の発明である。Ｌ－グルタミン酸自体は周知の物質であるから，その課題は，生産量を増大させることに尽きる。仮に，新たな菌株を用いても，Ｌ－グ
ルタミン酸の生産量が増大しないのであれば，製造方法の発明としての課題は解決していない。コリネ型細菌の培養条件（Ｔｗｅｅｎ４０を添加した条件又はビオチン制限条件）は，単なる好適条件ではなく，発明特定事項として課題解決に必ず必要な事項であり，本件審決の判断は誤っている。
(被告の主張)(1) 実施例８からＬ－グルタミン酸の生産能力の向上が分かること
実施例２及び３のブランク値が示しているものは，グルタミン酸生産菌を接種しない培養開始時点の培地（以下「初発培地」という。）でのグルタミン酸の濃度であり，菌体の培養のために栄養分として培地に添加した大豆加水分解物（Ｔ－Ｎ）（本
件明細書の段落【００９７】）由来のグルタミン酸の値であるところ，①初発培地に添加物由来のグルタミン酸が含まれていること，②培地に含まれる大豆加水分解物
は，全窒素量を基準に調製されるものである（本件明細書の段落【００５５】）が，天然物由来の原料であり，加水分解の程度によっても，含有されるアミノ酸（グル- 24 -

タミン酸を含む）やタンパク質の量には変動があるため，使用する大豆加水分解物が異なると，ブランク値のグルタミン酸濃度が異なることは，いずれも技術常識である。
本件明細書の実施例８にある「同様の方法」とは，単に実験の手順やその他の条件がほぼ同じであることを意味し，実施例２及び３と大豆加水分解物などの材料が同じロットのもので実験されることまでを意味するものではない。
したがって，原告らが主張するように，実施例８のグルタミン酸生産量を，異なる大豆加水分解物が使用された実施例２及び実施例３のブランク値等と比較することは意味がない。上記のとおり，培地に含まれる大豆加水分解物におけるグルタミ
ン酸濃度が実験ごとに異なるものであることは技術常識であるから，本件明細書においては，各実験において，個別に初発培地によるブランク値の測定をし，対照として野生型の菌体の培養，グルタミン酸濃度の測定を個別に行っているのである。
１９型ｙｇｇＢ変異の導入によりグルタミン酸産生能が野生型の１．４倍になったことが実施例８から確認できるし，実施例８の結果は，被告の実施した非誘導条
件下での再現実験により複数回再現されている（甲３６，乙６）。
(2) 甲２８は，培養条件として当業者が通常選択しない条件を選択しているため，その実験結果は主張の根拠とならないこと
アグルタミン酸は，酸素供給不足下での培養において生産阻害が最も著しいアミノ酸の一つであって，酸素要求充足度が低下するに伴い，グルタミン酸の生成速度も大幅に低下すること（乙１４，１５），コリネ型細菌の培養の際に，培養用容器として坂口フラスコを用いた場合，撹拌速度が約１１５ｒｐｍのときに最大の酸素供給速度が得られるとされている（甲３６，乙６）一方で，三角フラスコを培
養用容器として用いた場合に，坂口フラスコと同等の酸素供給速度を得るためには，
２８０ｒｐｍ以上の回転速度を要するとされていること（乙１６，１７），低速で振とうさせた三角フラスコで培養した場合には，同等の速度で振とうさせた坂口フラ
スコでの培養結果と比較して，菌体の生育が半分程度となること（乙１８）は，い- 25 -

ずれも当業者にとって周知である。
甲２８の実験者は，坂口フラスコを用いて速度１１５ｒｐｍにて振とう培養を行ったことが明記されている本件明細書の実施例１５の条件を確認した上で，敢えて坂口フラスコを用いずに，適正に使用するために倍以上の振とう速度が必要な三角フラスコを用いた上で，坂口フラスコに適した振とう速度で実験を行ったため，甲２８の培養実験では培地への酸素供給が不足する状況となってグルタミン酸生産が著しく低下したと考えられる。
イ

被告がした，培養用容器として，坂口フラスコと三角フラスコを用いた比較実験において，三角フラスコを用いた培養条件下では，大幅なＯＤ６２０値（菌体生育）の低下，培地中の糖消費速度の低下，Ｌ－グルタミン酸蓄積の低下が観察
され，甲２８の表１と同様の結果が観察された（甲３６，乙６）。
また，被告が，坂口フラスコ及び三角フラスコをそれぞれ培養用容器として使用
し，１１５ｒｐｍの回転速度で培養した場合の各培養液中の有機酸の分析を行った
ところ，三角フラスコ使用の培養液では，坂口フラスコ使用時の培養液と比較して，酸素供給が不足する場合に生じるとされる有機酸，特に乳酸，コハク酸の著しく高い蓄積が認められた（甲３６，乙６）。
さらに，甲２８の表１では，各測定時点（培養後１２，１４及び１７時間）のいずれにおいても，グルタミン酸濃度がすべて検出限界（０．１ｇ／Ｌ）未満となっているが，被告が三角フラスコを用いた培養試験の各時点でのグルタミン酸濃度か
ら初発培地含有のグルタミン酸濃度を差し引いたところ，いずれの時点においてもグルタミン酸濃度が０．１ｇ／Ｌ未満となったこと（甲３６，乙６）から，甲２８の表１に示された各時点のグルタミン酸濃度も同様に，初発培地に含まれていたＬ－グルタミン酸濃度との差を表示していることによるものと考えられる。
ウ

以上のとおり，甲２８の培養実験は，当業者が，コリネ型細菌を用いてグルタミン酸の製造を行う際に技術常識として通常用いる培養条件と大きく異なる
条件，特に，坂口フラスコではなく三角フラスコを用いて低速での撹拌培養を行う- 26 -

との条件を採用し，培養を行った上で，ＹｇｇＢ変異体の評価を行った結果，実施
例８に記載の結果を再現できなかったものと考えられる。甲３４の結果も，実施例８に記載の結果を再現できておらず，甲２８と同様，当業者が通常採用しない培養条件で実施された実験である。
２

進歩性欠如の認定判断の誤り（取消事由２，３）（原告らの主張）(1) 甲８発明の認定の誤り（取消事由２）
ア

甲８のＴａｂｌｅ １．には，“ｂｅｆｏｒｅ”の状態から低浸透圧状態（５４０ｍＯｓｍ）へと浸透圧が変化することにより，２０%のグルタミン酸が菌体外に排出されるという事実が，実験データによって示されている。他方，ＡＴＰとの対比からも，グルタミン酸における２０％の減少は有意であり，グルタミン酸は，浸透圧に依存して菌体外に移動することが分かる。
したがって，甲８発明は，「Ｌ－グルタミン酸の排出に関わる，Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）のＭｓｃＳとの類似性が示唆される浸透圧制御チャネルを有する，コリネバ
クテリウム・グルタミカム」と認定されるべきであった。
イ

甲８発明の認定の誤りが結論に影響を及ぼす理由

上記アからすると，本件発明１と甲８発明の相違点は，以下のとおり認定されるべきであった。
（相違点）「本件発明１は，Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって，変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたことにより非改変株と比較してＬ－グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって，前記変異型ｙｇｇＢ遺伝子は，（ｉ）配列番
号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域の欠失，（ｉ’）配列
番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域へのインサーショ- 27 -

ンシーケンス又はトランスポゾンの挿入，（ｉ’’）配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９－５３３の領域もしくは配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する
変異，または（ｉｉ）配列番号６，６２，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号１－２３，８６－１０８，及び１１０－１３２からなる群から選ばれる領域における１～５個のアミノ酸の置換，欠失，又は挿入の変異が導入された，コリネ型細菌であるのに対し，
甲８発明では，コリネバクテリウム・グルタミカムが，Ｌ－グルタミン酸の排出に関わる，Ｅ．ｃｏｌｉのＭｓｃＳとの類似性が示唆される浸透圧制御チャネルを有しているものの，ｙｇｇB 遺伝子が特定されておらず，Ｌ－グルタミン酸の生産能力が特定されていない点。」
上記のように認定できる甲８発明に接した当業者は，後述するようにグルタミン酸の排出がボトルネックであるという技術常識を踏まえ，浸透圧調節チャネルに着目して排出速度を高めようと動機付けられたはずである。本件審決は，引用発明の認定を誤り，それによって相違点の認定及び判断を誤ったから，取り消されるべきである。
ウ

被告は，①１８６０ｍＯｓｍの欄の値からの変化を確認すべきである，②５４０ｍＯｓｍという極端な低浸透圧ショックがかかるまで，グルタミン酸の排
出はほとんどない，③甲８にはグルタミン酸の流出は顕著に制限されていたことが明記されている，④浸透圧調節チャネルと，大腸菌のＭｓｃＳ（後記(2)イａ）との，チャネルからの排出機構が類似性を有することまで示唆しているものではない，⑤コリネバクテリウム・グルタミカムの浸透圧調節チャネルと，大腸菌のＭｓｃＳとは，チャネルからの排出機構が異なるものであろうことが明記されていると主張する。
しかし，甲８のＴａｂｌｅ １.では “ｂｅｆｏｒｅ”の列の０．４６ μｍｏｌ・ｍｇ ｄｍ－１の値が基準とされており，１８６０ｍＯｓｍの値は，その９１%である- 28 -

ことが明示されているから，甲８の実験データの検討に当たっては“ｂｅｆｏｒｅ”の列の値が基準となる。
また，甲８のＴａｂｌｅ １．は，５４０ｍＯｓｍでは，２０%のグルタミン酸が排出されたことを，データに基づいて示している。
甲８のグルタミン酸及びリジンの排出は，かなり限られていたとの記載は，アラ
ニンも，グルタミン酸及びリジンの排出がアラニン等と比較して，相対的に制限されることを記載しているにすぎず，この記載は，グルタミン酸がコリネバクテリウ
ム・グルタミカムから排出されないということを意味しない。甲８は，大腸菌とは異なり，コリネバクテリウム・グルタミカムでは，溶質に応じて排出速度に違いが生じることを説明しているにすぎず，排出速度の溶質依存性に関し，例えば，ＡＴ
Ｐは，大腸菌とは異なり，コリネバクテリウム・グルタミカムでは排出されないが，グルタミン酸については，甲８のＴａｂｌｅ １．の実験において２０％が排出されることが実証されている。
甲８の時点において，担体系（特定の溶質分子を結合して一連の構造変化を行って細胞膜を通過させるタンパク質である担体による排出を指す。）によるコリネバク
テリウム・グルタミカムからのグルタミン酸の排出が提唱されていたが，甲８のＴ
ａｂｌｅ １．は，担体系とは別に，浸透圧調節チャネルという新たな排出経路を実験的に明らかにしたから，甲８に接した当業者は，この浸透圧調節チャネルを排出経路として利用するよう動機付けられたはずである。
甲８には，Ｇｄ３＋の感受性を根拠として，コリネバクテリウム・グルタミカムの浸透圧調節チャネルが大腸菌のＭｓｃＳと類似することが記載されているから，Ｍ
ｓｃＳとしての機能の類似性から，甲８には，大腸菌のＭｓｃＳと同様に，コリネ
バクテリウム・グルタミカムの浸透圧調節チャネルも，浸透圧に応じた開口により，溶質を排出することが示唆されている。
(2) 容易想到性の判断の誤り（取消事由３）
ア

本件発明１１について- 29 -

前記１のとおり，１９型変異は，非誘導条件下では，Ｌ－グルタミン酸の生産能力が向上しないものであるから，Ｌ－グルタミン酸の生産能力の向上の効果は，請求項１１全体に及ぶものではないため，これを相違点の判断において考慮することはできず，相違点は，請求項１１全体にわたってＬ－グルタミン酸の生産量の増大に寄与しているわけではなく，本件発明１１は進歩性を欠く。
イ

本件発明１の容易想到性の判断の誤り

１９型変異は，配列番号６のアミノ酸配列での１００番目のアミノ酸の置換（Ａ１００Ｔ）であるが，これは以下のとおり，当業者が容易に想到し得たものである。
(ｱ) 技術的背景
本件優先日当時，コリネ型細菌がＬ－グルタミン酸生産能を有することは技術常識であり（甲２～４，１８～２０），コリネ型細菌によるアミノ酸の生産能を高めるに当たって，生成したアミノ酸の菌体内での過剰蓄積や菌体外への排出がボトルネックとなっていることも広く知られており，このボトルネックを解消してアミノ酸の生産能を高めるため，アミノ酸を菌体外に効率的に排出することも，周知の課題であった（甲１２，２１～２４，４５，４６）。
(ｲ) コリネバクテリウム・グルタミカムのＹｇｇＢに関する技術常識ａ

大腸菌には，浸透圧の変化に応じて溶質を通過させる機械受容チャネルとして，ＭｓｃＭ，ＭｓｃＳ，ＭｓｃＬの三つがあり（甲１０），ＹｇｇＢは，ＭｓｃＳと同義である（甲１４）。
また，甲１０には，コリネバクテリウム・グルタミカムに，大腸菌のｙｇｇＢ遺伝子のホモログ（相同体）が存在し，ＹｇｇＢタンパク質がメカノセンシティブチ
ャネルとして機能することが記載されている。ｙｇｇＢ遺伝子ホモログのオープン
リーディングフレームはＣｇｌ１２７０として知られ，コリネバクテリウム・グル
タミカムの５３３個のアミノ酸より構成されるタンパク質である（甲１０，１１）
が，このＣｇｌ１２７０のアミノ酸配列は，本件特許の請求項１の配列番号８４及
び８５と一致し（甲１１，１６），配列番号６とも非常に高い相同性（９９％）を有- 30 -

する（甲３３）。そして，甲２５の１にも，Ｃｇｌ１２７０と同一のアミノ酸配列が
配列番号３４０として開示され，当該アミノ酸配列をコードする遺伝子が配列番号３３９として開示されていた（甲２５の１・２）。
したがって，コリネバクテリウム・グルタミカムでも，ＹｇｇＢがメカノセンシ
ティブチャネル（浸透圧制御チャネル）として機能しており，当業者は，甲８発明の浸透圧制御チャネルがＹｇｇＢであることを認識できた。
ｂ

被告は，①甲１０では細胞からの排出能力はベタインのみについて検討されており，グルタミン酸に関する記載は存在しない，②甲１０には，Ｃｇｌ
１２７０のアミノ酸配列の記載はあるものの，その機能は記載されておらず，コリ
ネバクテリウム・グルタミカムにはＹｇｇＢ及びＭｓｃとは異なるチャネルの存在が示唆されている，③甲１４には，大腸菌のＹｇｇＢがＭｓｃＳと同義であるとの記載があるものの，コリネバクテリウム・グルタミカムについての記載はないと主張する。
しかし，仮に，甲１０でベタインのみが詳細に検討されているとしても，コリネ
バクテリウム・グルタミカムにおいて，ＹｇｇＢがメカノセンシティブチャネル（浸透圧制御チャネル）として機能していることに変わりはなく，ＹｇｇＢによるＬ－
グルタミン酸の排出は否定されない。
また，Ｃｇｌ１２７０のアミノ酸配列が大腸菌のＹｇｇＢの配列に対応することから，当業者は，このタンパク質が，大腸菌のＹｇｇＢと同様，浸透圧調節チャネ
ルであることを理解することができる。
そして，コリネバクテリウム・グルタミカムのＹｇｇＢホモログは，大腸菌のＹ
ｇｇＢ（ＭｓｃＳと同義）に対応するから，コリネバクテリウム・グルタミカムについても，大腸菌のＭｓｃＳの知見が適用できる。
(ｳ) 浸透圧制御チャネルがグルタミン酸の排出に関係することが周知であったこと
甲４７（Manfred Schleyer 他「Transient,specific and extremely rapid release of- 31 -

osmolytes from growing cells of Escherichia coli K-12 exposed to hypoosmotic shock」Arch
Microbiol 160 p424-431,１９９３年），甲４８（Piotr Koprowski 他「Glutathione (GSH)
reduces the open probability of mechanosensitive channels in Escherichia coli protoplasts」
Pflügers Arch-Eur J Physiol 438 p361-364,１９９９年），甲４９（Catherine Berrier 他「 Gadolinium ion inhibits loss of metabolites induced by osmotic shock and large
stretch-activated channels in bacteria」Eur.J.Biochem.206 p559-565，１９９２年），甲５０（Dirk Schiller「Osomosensorische Eigenschaften des Glycinbetain-Transporters BetP
aus Corynebacterium glutamicum」Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgradesder Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fankultät der Universität zu Köln,２００４
年）からすると，コリネバクテリウム・グルタミカムも，大腸菌と同様，浸透圧調
節チャネル（メカノセンシティブチャネル）としてＹｇｇＢ（ＭｓｃＳ）を有する
ところ，本件優先日当時，コリネバクテリウム・グルタミカム及び大腸菌において，グルタミン酸が浸透圧に応じて，浸透圧制御チャネルから排出されることは周知であった。
(ｴ) 大腸菌の膜貫通領域の変異を甲８発明に適用して１９型変異の構成を得ることが容易想到であったこと
ａ

大腸菌のＹｇｇＢのうち膜貫通領域のアミノ酸（とりわけ，第３膜貫通領域［ＴＭ３］の１００番目付近のアラニン）に変異を加えると，チャネルが開きやすい状態（ゲイン・オブ・ファンクション［ＧＯＦ］）が実現し，細胞内の溶質が外部へ容易に排出されるという知見は，大腸菌では，以下のとおり，先行文献（甲１３～１５）で繰り返し報告されており，周知であった。
(a)

甲１４には，大腸菌のＹｇｇＢは，２８６個のアミノ酸より構成され，３回膜貫通（ＴＭ１，ＴＭ２，ＴＭ３）タンパク質であることが記載されている上，３種のＧＯＦ変異体があり，同変異体では，細胞内の溶質が容易に外部に排出されることも記載されている。また，甲１４には，当該ＹｇｇＢのペリプラ
ズムループ又は第３膜貫通領域（ＴＭ３）に存在する３種類のアミノ酸置換により，- 32 -

ＧＯＦ変異体を得る発明（以下「甲１４発明」という。）が記載されている。
甲１５には，大腸菌のＹｇｇＢのＴＭ３は，ＴＭ３Ａ及びＴＭ３Ｂで構成されること，ＴＭ３のうちＡ部分（９６－１１３番目のアミノ酸）がチャネルの疎水性ポアを形成し，細胞内の溶質の排出に寄与すること，ＴＭ３のＡ部分はヘリックスを形成しており，少なくとも１０１番目のグリシン，１０２番目のアラニン，１０５
番目のロイシン及び１０６番目のアラニンが，チャネルのポアの遮蔽に関与していることが記載されている。また，甲１５は，甲１４を引用し，アミノ酸置換を行うと，ＹｇｇＢがＧＯＦになること及び９３，１０２及び１０９の残基がポアを内張
りするヘリックスに位置することから，これらがチャネルの伝導特性に影響を与えることは驚くことではないこと（以下「甲１５発明」という。）が記載されている。
甲１３には，大腸菌において，ＹｇｇＢのＴＭ３が溶質の透過経路を形成していること，ＴＭ３中に位置する１０６番目のアラニンは，カリウムに対する超過敏チ
ャネルを形成しており，機能的に重要であることが記載されている。
⒝

大腸菌のＹｇｇＢでは，１０２番目のアラニン（Ａ）をプロリン（Ｐ）で置換された変異体は，強力なＧＯＦを示す。１０２番目のアラニンは，第３膜貫通領域（ＴＭ３）の中で，チャネルのポアの内壁に当たり，溶質の透過経路を形成するＴＭ３Ａに位置するものである。ＴＭ３Ａがポアの中央に向けて変形することによりポアが閉じるが，１０２番目のアラニン及び１０６番目のアラニンは，
その際，ポアの中央に向けて移動する領域に位置する（甲１４，１５）。
また，膜貫通領域のうち，グリシン及びアラニンは，透過状態の間の切替えを促進する可能性があることが知られていた（甲１３）し，メカノセンシティブチャネ
ルであるＭｓｃＳ（ＹｇｇＢ）及びＭｓｃＬに共通して，膜貫通領域のうちポアを狭める箇所に，グリシン及びアラニンが現れることも知られていた（甲４１）。
ｂ

したがって，当業者は，コリネバクテリウム・グルタミカムのＹｇ

ｇＢを改変する場合，ＴＭ３領域内のアラニンに着目することになる。そして，コ
リネバクテリウム・グルタミカムのＹｇｇＢのアミノ酸配列は，本件優先日当時，- 33 -

既に知られていた（甲１０）。したがって，当業者は，コリネバクテリウム・グルタ
ミカムのＹｇｇＢアミノ酸配列のうち，大腸菌のＴＭ３又はＴＭ３Ａの箇所に対応する領域内のアラニンを特定することができた。
ｃ

大腸菌のＴＭ３は，らせんの軸方向で隣接するＣ＝ＯとＮ－Ｈとの間に水素結合が働き，構造を安定化するα－ヘリックス構造を有するところ，アラ
ニンをスレオニンで置換することにより，α－ヘリックスの構造が不安定となり，
ポアの構造にも影響を及ぼす。また，ＭｓｃＬでは，２２番目のグリシンを親水性の残基に置換することにより，チャネルが開きやすくことが知られていた（甲４２）。
したがって，１００番目のアラニンを他のアミノ酸で置換するに際し，当業者は，スレオニンに着目した。
ｄ

また，大腸菌のＭｓｃＬのＴＭ１は，ＹｇｇＢのＴＭ３と類似の機能（メカノセンシティブチャネルの透過経路の形成）と構造（α－ヘリックス構造）を有するものである上，大腸菌のＭｓｃＬの２０－３６番目の残基（ＴＭ１に当たる。）とコリネバクテリウム・グルタミカムのＭｓｃＳの９８－１１４番目の残基（ＴＭ３に当たる。）を比較すると，前者の２２番目の位置は，後者の１００番目の位置に対応する。

甲４３（Christopher D.Pivetti 他「Two Families of Mechanosensitive Channel Proteins」
Microbiology and Molecular Biology Reviews p66-85,２００３年３月）では，ＹｇｇＢのＴＭ３の配列はＭｓｃＬのＴＭ１と類似すること，その類似性がゲーティング・メカニズムにとって必須である可能性があることが指摘されており，ＭｓｃＬのＴ
Ｍ１の配列は，ＹｇｇＢ（ＭｓｃＳ）のＴＭ３の配列と直接に比較され，両者の類似性が示されていた。

- 34 -

ｅ

大腸菌のＭｓｃＬのＴＭ１に当たる２２番目のグリシンをより親水性のアミノ酸に置換することで，チャネルが開きやすい状態（ＧＯＦ）を実現できることは，本件優先日前において，甲４２（Kenjiro Yoshimura 他「Hydrophillicity ofa Single Residue within MscL Correlates with Increased Channel Mechanosensitivity」
Biophysical Journal Volume 77 p1960-1972,１９９９年）に記載されており，しかも，甲４２には，いくつかの生物（コリネバクテリウム・グルタミカムと同じコリネバ
クテリウム亜目に属する黄色ブドウ球菌，シアノバクテリア及び結核菌）では，２２番目のグリシンの代わりにアラニンがこの位置に存在することが記載されていたから，ＭｓｃＬのＴＭ１の２２番目の位置に相当する位置にあるアラニンは，ＧＯ
Ｆのための置換の有力な候補である。
ｆ

コリネバクテリウム・グルタミカムも，大腸菌のＭｓｃＳ（Ｙｇｇ

Ｂ）のホモログを有し，そのＭｓｃＳ（ＹｇｇＢ）が機械受容チャネルとして機能
し，かつ，そのＧＯＦ変異体により，大腸菌と同じ効果が期待できるのであるから，当業者は，大腸菌に関する甲１３～１５の記載から，Ｌ－グルタミン酸生産能を向上させるために，変異型ｙｇｇＢ遺伝子を作製し，その変異型ｙｇｇＢ遺伝子をコ
リネ型細菌に導入することについての示唆を得ることができる。
ｇ

被告は，①甲１４は，大腸菌のＭｓｃＳにおける変異体に関する文献であり，かつ，当該変異体の知見とコリネバクテリウム・グルタミカムにおけるグルタミン酸排出との関連性を示す記載はない上，甲１４によると，Ｌ１０９Ｓ（１
０９番目のロイシンをセリンに置換する変異）及びＡ１０２Ｐ（１０２番目のアラニンをプロリンに置換する変異）は菌の生育に深刻な影響を与えるほどのＧＯＦをもたらす，②甲１５は，大腸菌に関する記載はあるもの，コリネバクテリウム・グ
ルタミカムにおけるＹｇｇＢがメカノセンシティブチャネルとしてグルタミン酸排出に関与することを示す記載はない，③甲１３には，大腸菌のＹｇｇＢのＴＭ３ が溶質の透過経路を形成していること，ＴＭ３中に位置する１０６番目のアラニンがカリウムに対する超過敏チャネルを形成しており，機能的に重要といった記載はな- 35 -

い，④大腸菌のＭｓｃＳとコリネバクテリウム・グルタミカムのＹｇｇＢでは残基の数が異なり，同一性が低く，コリネバクテリウム・グルタミカムのＹｇｇＢにおいてどの残基がチャネルの開閉等の機能に関与するか判断することができないと主張する。
しかし，甲１４について，コリネバクテリウム・グルタミカムは，大腸菌のＹｇ
ｇＢのホモログを有しているから，そのＧＯＦ変異体により，大腸菌と同じ効果が期待できる。また，Ｌ１０９Ｓ及びＡ１０２Ｐの変異は，ＧＯＦ変異体での開口の促進，そしてそれによるグルタミン酸の排出の促進において，大きな効果が期待できるものである。
甲１５について，コリネバクテリウム・グルタミカムも，大腸菌のＭｓｃＳのホモログを有し，そのＭｓｃＳ（ＹｇｇＢ）は，メカノセンシティブチャネル（浸透圧調節チャネル）として機能する。したがって，甲１５の大腸菌のＭｓｃＳに関する記載は，コリネバクテリウム・グルタミカムのＹｇｇＢにも当てはまる。
甲１３には，「ＭｓｃＳにおけるＡｌａ１０６に相当する，ホモログタンパク質Ｋ
ｅｆＡにおける９２２番目の位置での変異は，圧力に対してより感受性であるチャネルを形成し，カリウムに対して超過敏の細胞を形成することが報告されており，チャネルのこの領域の機能的な重要性を強調している」との記載があり。これは，ＫｅｆＡの９２２番目のアミノ酸と同様，ＭｓｃＳの１０６番目のアラニンがカリウムに対する超過敏チャネル形成していることを示している。
当業者は，「ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ」のウェブサイト（甲５１）を使用することにより，コリネバクテリウム・グルタミカムのＹｇｇＢの構造を予測することができ，Ｃ末端側の配列が大腸菌のＭｓｃＳのＣ末端側の配列と高い同一性を有することから，機能を予測することができた。実際，被告も，「ＰｒｅｄｉｃｔＰｒ
ｏｔｅｉｎ」を使用して，大腸菌のＭｓｃＳとコリネバクテリウム・グルタミカムのＹｇｇＢとを対比し，構造の類似性を検証していた（甲５２）。
(ｵ) 小括- 36 -

以上のとおり，コリネ型細菌がＬ－グルタミン酸生産能を有することは技術常識であり，Ｌ－グルタミン酸の生産性を高めるに当たり，菌体内に蓄積したＬ－グル
タミン酸の菌体外へ排出がボトルネックになっていることが周知の課題であったことからすると，同課題の解決に当たり，当業者が，甲８発明におけるＬ－グルタミン酸の排出能を有する浸透圧制御チャネルを標的とし，それによりＬ－グルタミン酸の排出効率を高めようとすることは当然である。
その手段として，甲８発明に対し，浸透圧制御チャネルかつ機械受容チャネルであるＹｇｇＢ（ＭｓｃＳ）のＴＭ３のアラニンに変異を導入する周知技術を適用し，ＧＯＦを実現し，相違点の構成を採用することは，当業者が容易に想到し得た事項である。そして，ＹｇｇＢとして，甲１０のＣｇｌ１２７０（配列番号８４及び８５）のＹｇｇＢを採用することも，当業者が容易に想到し得た事項である。
相違点のうち，Ｌ－グルタミン酸生産能の向上は，Ｌ－グルタミン酸の排出に関わるＹｇｇＢが変異を導入し，ＧＯＦにすることにより当然に達成される効果を説明しているにすぎず，実質的な相違点とはいえない。Ｌ－グルタミン酸生産能の向上は，当業者の目的に沿ったものであり，ＹｇｇＢ（ＭｓｃＳ）のＴＭ３のアラニンに変異を導入する周知技術の適用によって当然に実現する。
したがって，本件発明１は進歩性を欠くものであり，本件審決の認定判断は誤っている。
ウ

本件発明４，６，７及び９～１１の容易想到性

本件発明１について述べた理由により，本件発明４，６，７及び９～１１に関する本件審決の認定判断も誤っている。
エ本件発明１２

本件発明１２は，ｙｇｇＢ遺伝子の発明であり，そのうち，（ｅ）が，１９型変異に関するＤＮＡである。
（ｆ）は，配列番号２２のアミノ酸配列に１～５個のアミノ酸配列の置換，欠失，挿入又は付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡである。
本件審決が認定した本件発明１２と甲８発明との相違点には，上記の（ｅ）及び- 37 -

（ｆ）も含まれるところ，本件発明１について述べたとおり，コリネバクテリウム・
グルタミカムのＹｇｇＢとして配列番号８４及び８５に類似の配列番号６を使用し，さらに１９型変異を導入することは，当業者が容易に想到し得た事項であるから，本件発明１と同様の理由により，本件発明１２に関する本件審決の認定判断も誤っている。
(3) 本件発明の効果の判断の誤り（取消事由３）ア

本件明細書に開示されたコリネ型細菌の変異株のうち，Ｌ－グルタミン酸の生産性が具体的に確認されたのは，ＹｇｇＢについて以下の変異が導入されたもののみである。そのため，特許請求の範囲全体にわたる効果は，本件明細書により裏付けられておらず，進歩性の判断において考慮することができない。
(ｱ) 本件発明１の（ｉ’）の変異に関し，
配列番号６の４１９－５３３番目のアミノ酸が欠失し，Ｃ末端側に５アミノ酸からなるインサーション配列（Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ）が挿入された変異（配列番号８，実施例５～６）(ｲ) 本件発明１の（ｉ’’）に関し，
配列番号５の４３７番目のプロリンがセリンに置換された変異（配列番号７４，
実施例１３）(ｳ) 本件発明１の（ｉｉ）に関し，
配列番号６の１４番目のロイシンと１５番目のトリプトファンの間にＩＳ（Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ）が挿入された変異（配列番号２０，実施例７）
配列番号６の１００番目のアラニンがスレオニンに置換された変異（配列番号２
２，実施例８）
配列番号６の１１１番目のアラニンがバリンに置換された変異（配列番号２４，
実施例９）イ

本件明細書には，Ｌ－グルタミン酸の生産能力を向上させるメカニズムは開示されていない。一般に，タンパク質を構成するアミノ酸は，それぞれ固有の- 38 -

構造及び性質に基づいて，タンパク質の２次構造の形成や３次元構造の安定化に密接に関わり，タンパク質の機能に影響することが知られている（甲６）。しかし，ｙｇｇＢに本件請求項１の（ｉ），（ｉ’），（ｉ’’），（ｉｉ）に包含される変異を導入した場合に共通して起こるメカニズム等については本件明細書には説明されていない。
したがって，請求項１の（ｉ），（ｉ’），（ｉ’’），（ｉｉ）に包含されるｙｇｇＢの変異の全範囲において，当業者はＬ－グルタミン酸の生産能が向上することを理解できない。
また，前記のとおり，１９型変異が導入されたコリネ型細菌のＬ－グルタミン酸の生産能は０．７ｇ／Ｌであり，非改変株のコリネ型細菌の生産性（０．５ｇ／Ｌ）
に対して実質的に差がない。
以上より，本件発明が奏する効果は，その全範囲において，格別顕著なものではない。
（被告の主張）(1) グルタミン酸の排出に関する技術常識
菌体の細胞内で生産されたグルタミン酸が細胞外へ排出されることが，グルタミ
ン酸生産の継続には重要であるが，本件発明の完成時以前は，コリネ型細菌を用いたグルタミン酸生産のメカニズムにおいて，コリネ型細菌の細胞膜からのグルタミン酸排出のメカニズムの詳細は不明であり（本件明細書の段落【０００６】)，また，
コリネ型細菌の保有するｙｇｇＢ遺伝子の役割自体も不明であった。排出メカニズ
ムの探索に当たっても，その主たる対象は，その存在が予測されていた担体であり，その排出に担体ではなく「チャネル」が関与していること自体も明らかにはされていなかった。現に，本件発明の完成まで知られていたコリネ型細菌のアミノ酸排出機構はすべて担体であり，チャネルが関与する例は全く知られていなかった（甲２２，２４，乙１，２）。
担体による溶質の輸送とＹｇｇＢのようなチャネルタンパクによる溶質の輸送は全く異なる機構であり，従来，大腸菌のＭｓｃＳや，コリネ型細菌のＹｇｇＢは，- 39 -

アミノ酸の輸送に関するものとは考えられておらず，コリネ型細菌からのアミノ酸の排出機構は，エネルギーを用いた，担体を介した能動輸送と考えられていた（甲２２，乙３９～４１）。
本件発明は，コリネ型細菌の保有するｙｇｇＢ遺伝子産物であるＹｇｇＢタンパ
ク質が，同細菌の細胞膜上に存在し，グルタミン酸排出において重要な役割を果たしていることを明らかにし，その上，ｙｇｇＢ遺伝子の特定の変異によりｙｇｇＢ
遺伝子産物によるグルタミン酸排出機能が高まり，結果として，そのような変異型
ｙｇｇＢ遺伝子を有するコリネ型細菌がグルタミン酸の高い生産能力を有することを見いだしたもので，産業上の極めて重要かつ画期的な発明であるだけでなく，学術的な観点においても，重要な発見を含むものである。
(2) 甲８発明の認定について
ア

甲８では，グルタミン酸についての浸透圧の変動幅は，正しくは，１８

６０ｍＯｓｍから５４０ｍＯｓｍまでである。また，グルタミン酸について，浸透圧変化による溶質の排出は，「ｂｅｆｏｒｅ」の欄の値（０．４６）ではなく，低浸透圧ショックのかかっていない，１８６０ｍＯｓｍの欄の値（０．４２）からの変化を確認すべきである。
甲８のＴａｂｌｅ １．から明らかなとおり，５４０ｍＯｓｍという極端な低浸透圧ショックがかかるまで，グルタミン酸の排出はほとんどない上，１８６０ｍＯｓ
ｍから５４０ｍＯｓｍに浸透圧を低下させた場合であっても，グルタミン酸の変化
は，０．４２（９１％）→０．３７（８０％）（すなわち，１１％の減少）でしかな
く，これを２０％とする原告らの主張には，誤りがある。
甲８には，グルタミン酸の排出が顕著に制限されていたことが明記されている。
イ

甲８には，コリネバクテリウム・グルタミカムの浸透圧制御チャネルが，Ｌ－グルタミン酸の排出とは無関係であることが複数回記載されている。
ウ

本件審決は，甲８発明について，「大腸菌のＭｓｃＳとの類似性が示唆される」と認定しているが，甲８には，コリネバクテリウム・グルタミカムの浸透圧- 40 -

調節チャネルについて，非特異的チャネル阻害剤であるＧｄ ３＋に対する感受性がないことから，大腸菌のＭｓｃＬチャネルとは異なるとした上で，Ｇｄ ３＋により阻害されない他のタイプであるＭｓｃＳに類似するかもしれないと記載されているにとどまり，コリネバクテリウム・グルタミカムの浸透圧調節チャネルと大腸菌のＭｓ
ｃＳとの，チャネルからの排出機構が類似性を有することまで示唆しているものではない。
むしろ，甲８には，コリネバクテリウム・グルタミカムの浸透圧調節チャネルと，大腸菌のＭｓｃＳとは，チャネルからの排出機構が異なるものであろうことが明記されている。
エ

以上のとおり，甲８には，コリネバクテリウム・グルタミカムには複数の溶質排出のためのチャネルが存在していること，甲８が研究の対象とした浸透圧調節チャネルはグルタミン酸を排出溶質としていないこと，更には，グルタミン酸
排出は浸透圧に依存するのではなく，エネルギー依存性の特定の担体によりされていることが記載されている。
したがって，甲８に開示されている甲８発明は，「Ｌ－グルタミン酸の排出とは無関係であることが明らかな，Ｅ．ｃｏｌｉのＭｓｃＳとの類似性が示唆される浸透圧調節チャネルを有するコリネバクテリウム・グルタミカム。」と認定されるべきであるが，本件審決もＬ－グルタミン酸の排出との関係についてはその認定において触れられていないので，本件審決の認定も間違いではない。
(3) 容易想到性についてア

技術的背景について

原告らは，甲１２，２１～２４の記載に基づき，コリネ型細菌が生成したアミノ酸の菌体内での過剰蓄積や菌体外への排出がボトルネックとなっており，生成したアミノ酸を菌体外に効率的に排出することは周知の課題であったと主張するが，甲１２は，菌体外への排出としては，エネルギー依存的な輸送体の改良等が示唆されているにとどまり，コリネ型細菌からのグルタミン酸排出を改善するための具体的- 41 -

な手段については言及がなく，本件発明に容易に想到し得るような開示や示唆もない。また，甲１２には，コリネバクテリウム・グルタミカムによるグルタミン酸排
出では，排出系が同定されていないため代謝制御解析は不可能であることも記載されており，これは，コリネ型細菌の細胞膜からのグルタミン酸排出のメカニズムの詳細は不明であったという本件優先日前の技術常識の存在を裏付けるものである。
甲２１～２４についても，甲２１には，グルタミン酸生産において，界面活性剤の添加によってアミノ酸の排出を誘導したことが開示されているにすぎないし，甲２２は，リジンの生産，甲２３は，イソロイシンの生産，甲２４は，スレオニンの生産に関する文献であり，これらはいずれもグルタミン酸の生産とは関係のない文献である上，これらの文献に開示されるアミノ酸排出系は，すべてエネルギー依存的な担体である。したがって，原告らの主張するとおり，アミノ酸を菌体外に効率的に排出することが周知の課題であったとしても，その解決方法としては，エネル
ギー依存的な担体によるか又は界面活性剤の添加が示唆されていたにすぎない。
甲４５，４６の原告らが引用する箇所に記載されているのは，本件発明が，解決課題を有する従来技術として指摘している技術（本件明細書の段落【０００３】及び【０００４】）にすぎず，コリネ型細菌からのグルタミン酸排出を改善するための具体的な手段についての言及はなく，動機付けを基礎付けるようなものではない。
イ

コリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢに関する技術常識について(ｱ) 前記(2)のとおり，甲８発明でＬ－グルタミン酸の排出は認められないのであるから，原告らの主張は，その前提において誤っている。
(ｲ) コリネバクテリウム・グルタミカムにおける浸透圧調節チャネルは，浸透圧の突然の低下に際して特定の溶質の排出に関与し，低浸透圧ショック時に，グリシンベタインや，プロリンのような溶質を一気に排出して細胞の破裂を防ぐチ
ャネルである。一方，コリネ型細菌を用いたグルタミン酸発酵において，低浸透圧ショックが継続的に起こることはあり得ず，発酵が進んで生産されたグルタミン酸- 42 -

が蓄積されると，高浸透圧状態になるのであり，このようなグルタミン酸発酵において，低浸透圧ショックで誘導される浸透圧調節チャネルをグルタミン酸の放出に用いることは，たとえ当業者であっても決して容易に想到し得ない。
本件発明の完成前の時点では，コリネ型細菌におけるグルタミン酸排出の機構については，チャネルではなく，特異的な担体が関与していると考えられており，メ
カノセンシティブチャネルも含め，何らかのチャネルをコリネ型細菌のＬ－グルタ
ミン酸産生能の向上のための手段として選択すること自体，当業者には想定し得なかった（乙１，２）。
(ｳ) 原告らの主張に対する反論
ａ

甲１０には，コリネバクテリウム・グルタミカムのｙｇｇＢ遺伝子の機能の検討結果が記載されているところ，細胞からの排出能力の検討対象とする
溶質としてはベタインのみを検討しており，細胞から排出される溶質としてグルタミン酸を検討対象とするような記載は存在しない。
また，甲１０には，コリネバクテリウム・グルタミカムは大腸菌とは異なり，メ
カノセンシティブチャネルとしてＹｇｇＢ，ＭｓｃＬとは異なるチャネルの存在が示されていること，大腸菌のＹｇｇＢとは異なる配列のＹｇｇＢを有していることも記載されており，これらを踏まえると，メカノセンシティブチャネルに関し，大腸菌とコリネバクテリウム・グルタミカムは異なった機構を有していることが認められる。
ｂ

甲１４は，大腸菌のＹｇｇＢについての記載である。また，甲１４には，大腸菌のＭｓｃＳ自体は２８６アミノ酸残基からなり，５３３アミノ酸残基からなるコリネバクテリウム・グルタミカムのＹｇｇＢとは実質的に異なるタンパ
ク質であることが示されている上，甲１４には，Ｌ－グルタミン酸の排出に関する記載もない。
ｃ

甲１０に記載のコリネバクテリウム・グルタミカムのＣｇｌ１２７０のアミノ酸配列やそれをコードする遺伝子が，甲１１や甲２５の１に示され，本- 43 -

件発明１の配列番号８４及び８５と一致する（甲１６）ものの，これらの甲号証に開示されているのは，アミノ酸配列又は塩基配列のみであり，その配列を有するタ
ンパク質がどのような機能を有するかといったことやグルタミン酸排出への関係を示唆する記載はない。
ｄ

甲４７は，大腸菌において，低浸透圧ショック後に，カリウムイオン（Ｋ＋），グルタミン酸及びトレハロースが放出されたことを記載しているが，大腸菌についての文献であり，コリネバクテリウム・グルタミカムについては，「コリ
ネバクテリウム・グルタミカムがグルタミン酸を排出した観察結果（Shiio ら 1962）
は我々の研究と関連している。」との言及があるにすぎず，そこから，コリネバクテ
リウム・グルタミカムの浸透圧制御チャネルがＬ－グルタミン酸の排出能を有していることが基礎付けられるものではない。
ｅ甲４８，４９は，大腸菌に関する文献であり，コリネ型細菌の浸透圧調節チャネルは全く開示も示唆もない。
甲５０も，原告らの主張する内容が記載されているとは認められない。また，甲５０の５頁の図には，コリネバクテリウム・グルタミカムには，ＭｓｃＳとＭｓｃ
Ｌ以外に少なくとも一つの機械受容チャネル（メカノセンシティブチャネル）があることが示されているが，当該第３のチャネルについて，「？」と記載されているとおり，コリネバクテリウム・グルタミカムのメカノセンシティブチャネルについて
は，生化学的な解析がされていないことが示されている。
ウ

原告らは，甲１３～１５の記載からすると，ＹｇｇＢのうち膜貫通領域のアミノ酸（とりわけ，第３膜貫通領域（ＴＭ３）の１００番目付近のアラニン）に変異を加えると，チャネルが開きやすい状態（ＧＯＦ）が実現し，細胞内の溶質が外部へ容易に排出されると主張し，この知見は大腸菌では先行文献に繰り返し報
告されており，周知であったと主張しているが，以下のとおり，当業者が甲１４等に記載の大腸菌のＭｓｃＳに係る知見を，コリネ型細菌に適用することはない。
(ｱ) 甲１４には，大腸菌のＹｇｇＢの名称については，先に電導度が判明- 44 -

していた大腸菌のＭｓｃＳと同じ電導度であったことから，名称を同一のものにする旨の提案がされたといった程度のことが記載されているにすぎない。
甲１４には，大腸菌のＭｓｃＳタンパクは，２８６アミノ酸であることが記載されており，同タンパクは，３３アミノ酸であるコリネバクテリウム・グルタミカムのＹｇｇＢに比べ約半分程度の大きさしかないものであるから，大腸菌のＭｓｃＳとコリネバクテリウム・グルタミカムのＹｇｇＢは実質的には異なるタンパク質であることが甲１４から明らかになっている。現に，大腸菌のＭｓｃＳの２８６アミノ酸残基について，コリネバクテリウム・グルタミカムのＹｇｇＢの５３３アミノ酸残基との配列を比較したとしても，その同一性は部分同士のみの比較でもわずか２９％にすぎないし（甲１０），被告が，大腸菌のＭｓｃＳとコリネバクテリウム・
グルタミカムのＹｇｇＢの全アミノ酸残基（それぞれ，２８６及び５３３アミノ酸残基）を初期設定にて比較したところ，同一性は１８％と算出された（乙３０）。このように低い同一性を有する配列に基づいて，どの残基がチャネルの開閉等の機能に関与するか判断することができないことは，当業者であれば容易に理解できる事項である。
また，甲１４は，あくまで大腸菌のＭｓｃＳにおける変異体に関する文献であり，かつ，当該変異体の知見とコリネバクテリウム・グルタミカムにおけるＬ－グルタ
ミン酸排出との関連性を示す記載はないから，これをコリネ型細菌のＹｇｇＢに適用するための示唆はない。
原告らは，甲１４では，ＴＭ３に存在する３種のアミノ酸置換のいずれかにより，
ＧＯＦ変異体を得る発明が記載されていると主張しているが，上記３種のアミノ酸置換のうち，２種の変異，すなわち，１０９番目のロイシンをセリンへ置換する変異（Ｌ１０９Ｓ）と１０２番目のアラニンをプロリンへ置換する変異（Ａ１０２Ｐ）
は，深刻な菌の生育阻害を引き起こすもので，当業者が極めて高効率な生産を求められるコリネバクテリウム・グルタミカムを用いたグルタミン酸の製造に適用する
ものではなく，大腸菌においても，コリネ型細菌においても，周知技術とはいえな- 45 -

いものである。
(ｲ) ａ 甲１５は大腸菌のＭｓｃＳに関する文献である。甲１５にあるのは，大腸菌に関する記載だけであり，コリネバクテリウム・グルタミカムのＹｇｇＢに関する記載はない。また，甲１５には，コリネバクテリウム・グルタミカムにおけるグルタミン酸排出との関連性を示す記載は一切なく，コリネバクテリウム・グル
タミカムのＹｇｇＢが，グルタミン酸を排出対象となる溶質とするメカノセンシティブチャネルであることを示唆する記載も一切ないから，これをコリネ型細菌のＹｇｇＢに適用するための示唆はない。
ｂ

甲１５の図１の説明に記載されているとおり，ＭｓｃＳは，ホモヘプタマーであり，七つのサブユニットが結合して一つのチャネルを形成しているから，シンプルな単一ユニットからなるタンパク質と比較して，そのアミノ酸配列から構造機能相関を予測することが一般的に困難であり，同一性が非常に低い他のタンパク質に関する知見をＹｇｇＢに適用することは極めて困難である。しかも，甲１５の図６（Ｂ）の説明から明らかなとおり，七つのサブユニットのうち，サブユ
ニットＡ，Ｃ及びＥは，他の四つと異なり顕著なねじれを示しており，更には，Ｍ
ｓｃＳは膜タンパク質であることから膜の脂質との相互作用も非常に重要であり，同一性の低い他のアミノ酸配列に基づく構造機能相関の予測は困難を極める。
ｃ

原告らは，甲１５の図６に示されたＴＭ３Ａに着目し，１０１番目のグリシン等がチャネルのポアの遮蔽に関与していると主張しているが，原告らがコリネ型細菌のＹｇｇＢとして言及している甲１０のＣｇｌ１２７０（配列番号８４及び８５）には，このモチーフが保存されていない。なお，乙３０の比較表の下段のコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のＹｇｇＢの配列は，本件明細書の配列番号６の配列の２９番目から２３０番目(配列番号８４及び８５においても同じ)に一致するものであり，赤枠で囲った部分（１０３番目から１１３番目）の配列が，上段の大腸菌のＭｓｃＳのＧｘｘＧｘｘｘＧｘｘｘｘＧ（ＧＡＡＧＬＡＶＧＬＡＬＱＧ）に相当する部分であるが，その相違が著しく，Ｍ- 46 -

ｓｃＳのＴＭ３Ａにおいて構造変化に重要とされる配列に関する情報を，コリネ型細菌のＹｇｇＢに適用できないことは明らかである。

また，原告らは，ＹｇｇＢ（ＭsｃＳ）のＴＭ３のアラニンに変異を導入する甲１
４発明や甲１５発明のような周知技術を適用することは当業者が容易に想到し得たと主張しているが，「ＹｇｇＢ（ＭsｃＳ）のＴＭ３のアラニン」がコリネ型細菌のＹｇｇＢのアミノ酸配列のどの部分に該当するのかを特定しておらず，どのように適用するかが不明である。
ｄ

甲１５には，１０５番目のロイシンがポアの中央に向けて移動する

際に，１０１番目のグリシン，１０２番目のアラニン，１０６番目のアラニンも一緒に移動すると記載されているにすぎず，その１０５番目のロイシンの役割を知る
ことは，大腸菌のＭｓｃＳにおいてさえ不可能である以上，コリネ型細菌のＹｇｇ
Ｂに適用することは不可能であるし，同引用箇所は１０２番目のアラニンと１０６番目のアラニンに注目するような記載にもなっていない。むしろ，甲１５の３０５５頁にＧｘｘＧｘｘｘＧｘｘｘｘＧというモチーフが記載されている以上，当業者
は，アラニン（Ａ）ではなく，むしろグリシン（Ｇ）に着目する。
(ｳ) 甲１３は大腸菌のＭｓｃＳに関する文献であり，原告らが主張するようなことは甲１３には記載されていない。原告らが指摘する箇所には，メカノセン
シティブチャネルの一種であるＫｅｆＡタンパクでの特定の変異が，圧力に対してより感受性であるチャネルを形成し，カリウムに対して超過敏の細胞を形成することが記載されているが，当該記載は，ＭｓｃＳではなくＫｅｆＡの変異に関し，そのチャネルの排出対象とする溶質も，グルタミン酸ではなくカリウムであることから，チャネル本体及び排出対象のいずれについても，原告らの主張する記載とは異なる。

- 47 -

また，甲１３にも，甲１４と同様に大腸菌のＭｓｃＳタンパク質が２８６アミノ酸であることが記載されており，大腸菌のＭｓｃＳタンパクがコリネバクテリウム・
グルタミカムのＹｇｇＢに比べ約半分程度の大きさしかない，実質的には異なるタ
ンパクであることが示されている。
そして，甲１３の原告らが引用する箇所には，グリシン及びアラニンについて，「クローズ状態とオープン状態の間で，ポア領域において相当なコンフォメーショ
ンの再配列を受けることが示唆される」と記載されているにとどまり，透過状態の切り替えについては記載されていない。
(ｴ) 原告らは，本件訴訟で新たに甲４０～４４に基づく主張をするが，同主張は無効審判においてされておらず，無効審判で提出されていなかった証拠に基づいているから，本件訴訟の審理範囲外であり，排除されるべきものである。
甲４１の右欄３７行目～４６行目には，機能に密接な関係がある孔形成ヘリック
スの配列の特徴として，ＭｓｃＬ及びＭｓｃＳについて，それぞれ，ＡｘＧＸｘｘ
ＧＡＡｘＧ及びＧＡＡＧＸＡｘＧＸＡｘｘＧのパターンが観察されたことが記載されているにとどまる。しかも，このような配列パターンはコリネバクテリウム・グ
ルタミカムには存在しない。したがって，当業者が上記の記載から，コリネバクテ
リウム・グルタミカムのＹｇｇＢの改変に至ることはない。
甲４２についても，ＭｓｃＬの２２番目の残基はグリシンでありアラニンではないし，ＭｓｃＬとＭｓｃＳには配列上の相同性がない。大腸菌のＭｓｃＳの知見を
コリネ型細菌のＹｇｇＢに適用する動機付けもないから，ＭｓｃＬの知見をコリネ型細菌のＹｇｇＢに適用する動機付けは見いだせない。
甲４２のＦｉｇ．１Ｂによると，２２番目のグリシンをスレオニンに置換した場
合，菌体の成長はほぼ完全に停止している。Ｆｉｇ．１Ｃも，同様に，スレオニンに置換した場合，単位時間当たりのＯＤ６５０値が０であることを示しており，ス
レオニンに着目する理由は見いだせない。
なお，甲８には，「コリネバクテリウム・グルタミカムの浸透圧調節チャネルにつ- 48 -

いて，非特異的チャネル阻害剤であるＧｄ ３＋に対する感受性がないことから，Ｅ．
ｃｏｌｉのＭｓｃＬチャネルとは異なる」と記載されており，ここからして当業者
がＭｓｃＬを参照する動機付けはない。
(ｵ) 原告らは，大腸菌のＭｓｃＬのＴＭ１について主張するが，同主張は無効審判においてされておらず，無効審判で提出されていない証拠に基づいているから，本件訴訟の審理範囲外であり，排除されるべきものである。
原告らは，大腸菌のＭｓｃＬの２０－３６番目の残基がＴＭ１に当たり，コリネ
バクテリウム・グルタミカムのＹｇｇＢの９８－１１４番目の残基がＴＭ３に当たるとして，両者の配列を並べ，対比するが，上記コリネバクテリウム・グルタミカ
ムのＹｇｇＢの９８－１１４番目の残基がＴＭ３に当たるとの主張には根拠がなく，しかも，原告らが比較した１７残基のうち，一致しているものは，５残基にしかすぎない。
大腸菌のＭｓｃＬの部分がコリネ型細菌のＹｇｇＢのどの部分に該当するかは不明であり，原告らは後知恵的に両者を対比させているにすぎない。
原告らは，甲４３の図６と図９を参照して，ＭｓｃＬのＴＭ１の配列は，Ｙｇｇ
Ｂ（ＭｓｃＳ）のＴＭ３の配列と直接に比較され，両者の類似性が示されていたとも主張するが，甲４３の図６及び図９は，複数の配列からの保存配列を導き出した結果を示しているにとどまり，コリネ型細菌のＹｇｇＢの配列は全く開示されていない。
(4) 本件発明４，６，７，９～１２の容易想到性について
本件発明１の容易想到性に関する原告らの主張は，理由がないから，本件発明４，
６，７，９～１２の容易想到性に関する原告らの主張も失当である。
(5) 本件発明の効果について
前記２及び後記３のとおり，本件発明は本件明細書記載の各実施例により裏付けがされているから，発明の効果に関する原告らの主張は，理由がない。
３１９型変異以外に関する実施可能要件及びサポート要件違反の認定判断の誤- 49 -

り（取消事由４）（原告らの主張）(1) ２Ａ－１型変異（本件発明１の（ｉ）及び（ｉ’）の変異）について
２Ａ－１型変異に関し，本件明細書には，配列番号６の４１９番目から下流のア
ミノ酸が欠失され，そのＣ末端側に五つのアミノ酸（Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｌ
ｅｕ－Ｐｈｅ）からなるＩＳ（インサーションシークエンス）が挿入された例が記載されている（本件明細書の実施例５及び６）。
しかし，本件発明１の（ｉ）及び（ｉ’）は，４１９－５２９領域の欠失や，実施
例５以外のアミノ酸配列の挿入にも及ぶ。この態様は，本件明細書では裏付けられていない。
実施例で開示されている以外の変異を導入した場合に実施例と同じ効果が得られるのか，当業者であっても予測することはできない。
したがって，本件発明１の（ｉ）及び（ｉ’）に関し，発明の詳細な説明は実施可
能要件に適合せず，特許請求の範囲はサポート要件に適合しない。
(2) ６６型変異，２２型変異（本件発明１の（ｉ’’）の変異）について
ア

本件明細書には，本件発明１の（ｉ’’）に対応する実施例として,実施例

１３（２２型変異，配列番号６のアミノ酸配列の４３７番目のプロリンをセリンに置換する変異）が記載され，実施例１３についてのみ具体的に培養結果（Ｌ－グルタミン酸生産性）が示されている。
しかし，本件発明１の（ｉ’’）は，配列番号６等のアミノ酸配列の４１９－５３
３領域又は配列番号６２の４１９－５２９の領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異全般に及ぶ。４１９－５３３番目のアミノ酸には，多数のプロリンが存在しているから，実施例１３の４３７番目のプロリンの置換のみでは（表１３），その他の箇所のプロリンの置換のサポートや実施可能性を説明することはできず，本件発明１の（ｉ’’）の幅広い態様は，本件明細書には裏付けられていない。
したがって，本件発明１の（ｉ’’）に関し，発明の詳細な説明は実施可能要件に適- 50 -

合しないし，特許請求の範囲はサポート要件に適合しない。
イ

本件審決は，実施例１２及び１３の存在並びにプロリンの位置の特定に関する記載（本件明細書の段落【００７２】）に依拠して，当業者は，各プロリンを置換する変異を導入したコリネ型細菌を構築して生産能を測定すればよいと判断したが，多数のコリネ型細菌の構築及び測定は，過度の試行錯誤というべきである。
大多数のプロリンについて，立体構造の形成への寄与は，検証されていない。また，ある位置のプロリンが立体構造の形成に寄与し，そのプロリンを他のアミノ酸で置換することにより，立体構造に変化が生じるとしても，それによって生じる効
果がグルタミン酸の生産にとって望ましいものであるとは限らない。そうすると，
当業者は，各プロリンについて，逐一，効果が得られるのか否か，実験を繰り返さなければならない。このような負担は，過度というべきである。
ウ

被告は，本件明細書の段落【０１１４】に言及するが，当該箇所には，６６型変異をＡＴＣＣ１７９６５株に導入して効果を確認したとの記載があるにすぎず，Ｌ－グルタミン酸の生産性が増強したことは示されていない。まして，いずれの位置のプロリンをいかなるアミノ酸で置換するのかについてすら示されていな
い。
また，被告は，グルタミン酸の生産能が向上しない変異体は，「非改変株と比較してＬ－グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌」という構成要件を充足しないと主張するが，上記の構成要件の下でも，当業者は，グルタミン酸生産能が向上したか否かを検証するため，各プロリンについて実験を行わなければならない。構成
要件として望ましい効果を付加したからといって，発明の詳細な説明の記載が実施可能要件に適合するわけではなく，特許請求の範囲の記載がサポート要件に適合するわけでもない。
さらに，被告は，ＩＳによる置換に関する２Ａ－１型変異（実施例５，６）も引用するが，被告自ら，２Ａ－１型変異は６６型及び２２型変異とは異なるものとして本件明細書に記載しているから，２Ａ－１型変異に基づく主張は失当である。

- 51 -

(3) 膜貫通領域の変異（本件発明１の（ｉｉ）の変異）について
本件発明１の（ｉｉ）に関し，本件明細書には，以下の例しか記載されていない。
アアミノ酸番号１－２３に関し，実施例７（配列番号６に対し，１４番目と１５番目のアミノ酸の間にＣｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕの挿入）
イアミノ酸番号８６－１０８に関し，実施例８（配列番号６に対し，１０

０番目のＡｌａをＴｈｒで置換）
ウ

アミノ酸番号１１１－１３２に関し，実施例９及び１１（配列番号６に対し，１１１番目のＡｌａをＶａｌで置換）
しかし，本件発明１の（ｉｉ）は，配列番号６等のアミノ酸配列の１－２３，８
６－１０８及び１１１－１３２領域の様々な置換，欠失及び挿入に及ぶ。わずか四つの実施例から，本件発明１の（ｉｉ）に包含される全ての態様について，Ｌ－グ
ルタミン酸の生産性が向上することを当業者は認識することはできない。ごく少数の実施例から本件発明１の（ｉｉ）の幅広い態様にまで一般化することはできず，特許請求の範囲が広すぎる。
本件審決は，上記各実施例に依拠して，当業者は，実際に各種の置換，欠失又は挿入の変異を導入したコリネ型細菌を構築して生産能を測定すればよいと判断したが，多数のコリネ型細菌の構築及び測定は，過度の試行錯誤というべきである。
(4) 配列番号８５のアミノ酸配列についてア

野生型ＹｇｇＢタンパク質として具体的に示されているのは，配列番号

６，６８，８４及び６２のみであり，配列番号６のアミノ酸に関して，置換・欠失が起こっていてもよい箇所をＸａａで示している配列番号８５のアミノ酸配列については，任意のアミノ酸への置換又は欠失を行ったことは，具体的に示されていな
い。また，上記の箇所において１～５個のアミノ酸を任意に置換又は欠失させた場
合に共通して起こるメカニズム等については，本件明細書には説明されていない。
タンパク質に変異を導入する場合，同じ変異であっても，導入する位置が異なると結果が異なる。例えば，プロリンは，タンパク質の立体構造の形成に関与する特- 52 -

異なアミノ酸であり，側鎖分子内で環状構造をとり，他のアミノ酸と水素結合できないという特殊な構造を有することが周知である。プロリンの他のアミノ酸への置
換又は欠失，任意のアミノ酸のプロリンへの置換，あるいはプロリンの挿入により，タンパク質の立体構造は著しく変化する。したがって，配列番号６の４５７番目又は５２０番目に存在するプロリンを他の任意のアミノ酸に置換又は欠失した場合，
変異タンパク質の立体構造は著しく変化し，ＹｇｇＢとして機能しない蓋然性が極めて高い。また，配列番号６の４８番目，２７５番目，２９８番目，３４３番目，
３９６番目，４３８番目，４４５番目，４５４番目，４７４番目又は５１７－５１
９番目のアミノ酸をプロリンに置換した場合にも，変異タンパク質の立体構造は著しく変化し，ＹｇｇＢとして機能しない蓋然性が極めて高い。
したがって，配列番号６の複数箇所（４８番目，２７５番目，２９８番目，３４
３番目，３９６番目，４３８番目，４４５番目，４５４番目，４５７番目，４７４
番目及び５１７～５２０番目）において，任意のアミノ酸で置換した場合や欠失させた場合に，ＹｇｇＢタンパク質として機能するのかを当業者は認識することができない。ましてや，そのような置換や欠失が導入されたアミノ酸配列に対して，請求項１の（ｉ），（ｉ’），（ｉ’’），又は（ｉｉ）で規定されるような変異をさらに導入した場合に，Ｌ－グルタミン酸の生産性が向上することを当業者は認識することができない。
イ

被告は，保存性の低い位置のアミノ酸は，置換や欠失が可能であると当業者が理解可能であるとするが，そのような保存性の低い位置のアミノ酸も立体構
造に影響を及ぼし得る。したがって，配列番号８５に含まれる個別具体的な配列について，変異の効果を検証する必要がある。しかも，配列番号８５において，置換や欠失が起こってもよいとされる箇所（Ｘａａで示される箇所）は多数存在し，配列番号８５が採り得るバリエーションは膨大な数となる。当業者は，その膨大なバ
リエーション全てにおいて，変異の効果を検証せざるを得ない。また，アミノ酸が立体構造に及ぼす影響は様々であるから，当業者は，これらのバリエーション全て- 53 -

において，Ｌ－グルタミン酸の生産能力が向上するとは認識できない。
（被告の主張）(1) ２Ａ－１型変異（本件発明１の（ｉ）及び（ｉ’）の変異）について
２Ａ－１型変異は，その変異の態様からすると，本件審決が認定するとおり，実
質的にはＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸番号４１９以降のＣ末端領域が欠損した変異であると考えられる。したがって，当業者は，実施例５及び６の記載から，Ｙｇ
ｇＢタンパク質のアミノ酸番号４１９以降のＣ末端領域が欠損した変異について同様の効果が得られることを認識できる。また，２Ａ－１型変異は５個のアミノ酸が「挿入」されたものであり，アミノ酸番号４１９―５３３のＹｇｇＢタンパク質のＣ末端領域が，５個のアミノ酸に「置換」されたものでもあることから，サポート要件を充足している。
(2) ６６型変異，２２型変異（本件発明１の（ｉ’’）の変異）について
実施例１２は，６６型変異であり，Ｃ．ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ

ＡＴＣＣ１７９６５を用いて効果を確認している（本件明細書の段落【０１１４】）。
配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸番号４１９－５３３の領域に存在するプ
ロリンの位置については，本件明細書の段落【００７２】に具体的に記載されている上，同段落には，ｙｇｇＢ遺伝子のＣ末端側のプロリンは，ＹｇｇＢタンパク質の立体構造維持の為に重要な役割を果たしていると考えられることも記載されている。
また，プロリンが，その側鎖分子内で環状構造をとるため，他のアミノ酸との間で水素結合ができないという他のアミノ酸とは異なる構造上の特徴があり，その結果，タンパク質の立体構造であるα－へリックス構造の破壊や，β－ターン構造のようなタンパク質鎖の折り畳みを促進する主たる構造上の役割を果たすなど，タン
パク質の立体構造形成に関与するといった特異な性質を有するアミノ酸であること
は，従前からの周知の事項であり（乙１９～２２），原告らも，プロリンが，タンパク質の立体構造の形成に関与する特異なアミノ酸であることが知られていることを- 54 -

認めている。このようなプロリンに関する周知事項からも，当業者は，上記領域に存在するプロリンをプロリン以外の他のアミノ酸に置換することにより，当該領域のアミノ酸の立体構造に対する著しい変化が生じ，結果として実施例と同様の効果が得られることを認識できる。
さらに，本件明細書の実施例５及び６として（段落【０１０７】，【０１０８】及び配列８）開示される２Ａ－１変異が，実質的にはＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸
番号４１９以降のＣ末端領域が欠損した変異であることから，当業者は，実施例５，
６，１２及び１３の記載から，ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸番号４１９以降のＣ末端領域に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換することにより，当該領域のア
ミノ酸構造が改変され，これらの実施例と同様の効果が得られることを認識できる。
特に，本件明細書の実施例５及び６として示した２Ａ－１型変異の結果から，当業者は，ＹｇｇＢタンパク質のＣ末端側の領域に含まれるプロリンを他のアミノ酸に置換することで，コリネ型細菌の細胞膜の低い緊張状態でも，高い頻度でＹｇｇＢ
タンパク質のチャネルが開閉するＧＯＦ変異体の状態が引き起こされる可能性が高いことを当然に理解する。
仮に，プロリンの置換を行っても，Ｌ－グルタミン酸の生産能が向上しない変異
体が一部存在したとしても，そもそも，そのような変異体は，「非改変株と比較してＬ－グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって」という本件発明の発明
特定事項を充足しないため，本件発明のクレームの範囲外とされるものである。また，本件明細書には，変異型ｙｇｇＢ遺伝子の効率的な取得，評価方法について，詳細に記載し，かつ，置換の対象となるＹｇｇＢタンパク質のＣ末端側の領域（配列番号６，６８，８若しくは８５のアミノ酸番号４１９－５３３，又は配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域）に含まれるプロリンは，わずか１３個であるため（本件明細書の段落【００３５】，【００７２】），当業者にとって，そのような変異型ｙｇｇＢ遺伝子を取得して評価することに関し，過度な試行錯誤を必要とするものではない。

- 55 -

したがって，本件発明１の（ｉ’’）の変異について，本件訂明１は，発明の課題が解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えるものではな
く，また，本件発明の詳細な説明は，当業者が本件発明１の実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されているものである。
(3) 膜貫通領域の変異（本件発明１の（ｉｉ）の変異）について
本件明細書で，膜貫通領域に対する変異の導入によるアミノ酸産生能向上の効果
として開示されている四つの実施例（実施例７～９及び実施例１１）は，導入される変異の内容及び導入されるアミノ酸配列の箇所がそれぞれ明確に異なっている。
本件明細書には，実施例として，配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸番号１－２３，８６－１０８，１１０－１３２のそれぞれの領域について，１〜５個のアミノ酸の変異を導入したコリネ型細菌が，Ｌ－グルタミン酸の生産能を向上させることができたことが記載されており，また，配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸
番号１－２３，８６－１０８，１１０－１３２の領域は，２３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列という限定された領域で，かつ，上記実施例の変異の位置の近傍の領域であり，さらに，アミノ酸番号１－２３，８６－１０８，１１０－１３２の領域に導入されるアミノ酸の置換，欠失，又は挿入の個数は１〜５個に限定されているから，当業者は，本件明細書の上記実施例の記載及び本件明細書の記載から，配列番号６等のアミノ酸配列のアミノ酸番号１－２３，８６－１０８及び１１０－１
３２からなる群から選ばれる領域において，１〜５個のアミノ酸の置換，欠失，又は挿入した変異を導入したコリネ型細菌について，Ｌ－グルタミン酸生産能の向上という課題が解決できることが認識できる。
また，本件明細書に記載されているような部位特異的変異法（段落【００２１】，【００３６】，【００８０】等）や領域を限定したランダム変異の導入法（段落【００６４】，【０１３１】，【０１３６】等）によって，当業者が，過度の試行錯誤を経ずに容易にそのような変異体を取得することは可能である。
さらに，上記のような膜貫通領域における任意の位置の１～５個のアミノ酸につ- 56 -いて置換，欠失，又は挿入がされた変異型ＹｇｇＢタンパク質を有するコリネ型細菌のＬ－グルタミン酸の生産能の評価は，当業者が，本件明細書に記載の説明に基づき，容易に実施することが可能であり，過度の試行錯誤を必要とするものではない。仮に，一部，膜貫通領域でのアミノ酸変異によっても，Ｌ－グルタミン酸の生産能が向上しない場合が存在するとしても，そのような変異であれば，「非改変株と比較してＬ－グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって」という本件発明の発明特定事項を充足しないため，本件発明の範囲外とされるものである。
(4) 配列番号８５のアミノ酸配列について
配列番号８５のアミノ酸配列は，コリネ型細菌に保存されるＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を示したものであり，タンパク質の機能的制約（一般的に，一定の機能を有するタンパク質について，異なる種間において高度に保存されているアミノ酸は，タンパク質の機能に重要なものであると考えられており，このように進化の過程でタンパク質の保有する固有の機能の保存が，アミノ酸の変化に対し制約を課すとの理論［乙２３］）を把握すると，当業者は，そのような配列について，Ｘａａと表示される箇所が，進化の過程で許容される置換や欠失が可能な部位であることを理解できる（本件明細書の段落【００３５】）。
また，原告らは，プロリンへの置換等によりＹｇｇＢとして機能しない蓋然性が高いと主張しているが，本件明細書に示されたＸａａと表示される箇所について望ましいアミノ酸置換又は欠失について例示された内容（本件明細書の段落【００３５】）及び各アミノ酸番号での保存的置換（一般的にアミノ酸残基の化学構造の比較から，アミノ酸として極めて類似の性質を有していることが知られており，また，
進化の過程や異なる種間で同じ機能を持つタンパク質間で許容される置換として見いだされているアミノ酸間の変換をいう［乙２６の段落【００２６】］。）となるアミノ酸の例示（本件明細書の段落【００３４】，【００７８】）の内容を参照して，本件明細書の各実施例の記載を踏まえ，配列番号８５についても，他の配列番号のＹｇ
ｇＢと同様に，本件発明１の（ｉ），（ｉ’），（ｉ’’）又は（ii）に規定されるような- 57 -

変異を導入した場合に，Ｌ－グルタミン酸の生産性が向上することを認識できる。
さらに，配列番号８５についても，請求項に規定される各変異を導入した変異型
ＹｇｇＢタンパク質を有するコリネ型細菌のＬ－グルタミン酸の生産能の評価は，当業者が，本件明細書に記載の説明に基づき，容易に実施することが可能であるため，過度な試行錯誤を必要とするものではない。仮に，一部，上記のようなアミノ酸変異の導入によっても，Ｌ－グルタミン酸の生産能が向上しない場合が存在するとしても，そのような変異は「非改変株と比較してＬ－グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌であって」という本件発明の発明特定事項を充足しないため，本件発明の範囲外とされるものである。
４

明確性要件違反についての認定判断の誤り（取消事由５）（原告らの主張）(1) 本件発明６，１２の記載について
本件審決は，本件明細書の段落【００３２】及び本件出願日当時の技術常識からすると，本件発明６，１２の「過剰量のビオチン」という記載の意味内容を理解することができるとしたが，本件明細書の段落【００３２】に記載された事項は，本件発明６に記載されていないのであるから，特許請求の範囲に記載された「過剰量のビオチン」における「過剰量」とは，いかなる量をいうのか不明であることに変わりはなく，本件審決の認定は誤りである。
(2) 本件発明７の記載について
本件審決は，本件明細書の段落【００６８】及び本件出願日当時の技術常識からすると，本件発明７の「Ｌ－グルタミン酸アナログ」に包含される具体的な物質を理解することができるとしているが，本件明細書の段落【００６８】には，Ｌ－グルタミン酸アナログに包含される化合物の一部が例示列挙されているにすぎないから，Ｌ－グルタミン酸アナログに包含される化合物の範囲は不明確であって，本件審決の判断は誤りである。また，被告が主張する本件明細書の段落【０１３９】，【００４０】の記載を参照しても，同様に不明確である。

- 58 -

(3) 本件発明８の記載について
本件審決は，本件発明８の「（ｉ）のｓｙｍＡ遺伝子」は，本件発明８の「（ｉ）
配列番号８６の塩基番号５８５～１１２１の塩基配列を含むＤＮＡ」を示すものであることは明らかであると判断しているが，請求項８には，「（ｉ）配列番号８６の塩基番号５８５～１１２１の塩基配列を含むＤＮＡ」とあるから，当該ＤＮＡが
配列番号８６の塩基番号５８５～１１２１の塩基配列以外にどのような配列を含むのか不明である。したがって，本件発明８の記載は不明確であり，本件審決の判断は誤りである。
(4) 本件発明９の記載について
本件審決は，本件明細書の段落【００８３】及び出願時の技術常識を考慮すると，本件発明９の「α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下する」という記載の意味が，「α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して低下していること」であることを理解することができるとしたが，本件審決が認定した上記事項は，請求項９に記載されていない。
「低下」についての比較の対象が，非改変株であるというのであれば，その旨請求項に明確に規定すべきである。したがって，本件発明９の記載は不明確であり，本件審決の判断は誤りである。
(5) 本件発明１０，１１の記載について
上記のとおり，本件発明８及び９はいずれも不明確であるから，これらを引用す
る本件発明１０及び１１についても，同様に不明確である。
(6) 本件発明６の請求項４，５を引用する部分の記載についてア

本件発明４には，配列番号６，６２，６８，８４又は８５の１００位のアラニンをスレオニンに，及び／又は，１１１位のアラニンをスレオニン若しくはバリンに置換する変異を有するコリネ型細菌が記載されている。当該変異は，膜貫通領域の変異（１９型及び／又はＬ３０型）に相当する。したがって，本件発明６の本件発明４に従属する部分については，１９型又はＬ３０型の膜貫通領域の変異- 59 -

を規定する本件発明６の（ｅ）～（ｊ）以外のもの，すなわち，２Ａ－１型変異の（ａ）及び（ｂ），Ａ１型の膜貫通領域の変異の（ｃ）及び（ｄ），並びにプロリン置換の（ｋ）～（ｎ）との関係が不明である。
イ

本件発明５には，配列番号６，６２，６８，８４又は８５の１４位のロ

イシンと１５位のトリプトファンとの間に１～５アミノ酸配列が挿入された変異を有するコリネ型細菌が記載されている。当該変異は，膜貫通領域（Ａ１型）の変異に相当する。したがって，本件発明６の本件発明５に従属する部分については，Ａ１型の膜貫通領域の変異を規定する（ｃ）及び（ｄ）以外のもの，すなわち，２Ａ－１型変異に関する（ａ）及び（ｂ），１９型又はＬ３０型の膜貫通領域の変異に関する（ｅ）～（ｊ）並びにプロリン置換に関する（ｋ）～（ｎ）との関係が不明である。
ウ

以上のとおり，本件発明６の記載は不明確であり，本件審決の判断は誤りである。本件発明６に従属する本件発明７～１１についても，同様の理由により，本件審決の判断は誤っている。
（被告の主張）(1) 本件発明６，１２の記載について
本件明細書の段落【０００３】にも記載のとおり，コリネ型細菌とビオチン制限との関係は，本件優先日前からよく知られており，どのような量のビオチンが，グルタミン酸生産との関係において過剰量となるかは技術常識であり，本件発明６，
１２は明確に記載されている。
(2) 本件発明７の記載について当業者は，本件明細書の段落【００６８】の記載及び出願時の技術常識から，「Ｌ－グルタミン酸アナログ」に包含される具体的な物質を理解することができる。
本件発明７は，「・・・Ｌ－グルタミン酸アナログ耐性が向上したことを特徴とす
る・・・コリネ型細菌。」であり，段落【００６８】においてＬ－グルタミン酸アナ
ログとして記載され，特に使用が推奨されている４－フルオログルタミン酸を用い- 60 -

た実験で，４－フルオログルタミン酸に対する感受性が低下（４－フルオログルタ
ミン酸耐性が向上）していることが確認されていること（本件明細書の実施例１４［段落【０１３９】及び【０１４０】］）からも，当業者は発明の範囲を十分理解できる。
(3) 本件発明８の記載について
本件明細書の段落【００８２】に「Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６
９の sｙｍＡ遺伝子を配列番号８６の塩基番号５８５～１１２１に示す。」と記載されているとおり，配列番号８６の塩基番号５８５～１１２１がｓｙｍＡ遺伝子の塩基配列であるから，本件発明８は明確に記載されている。
(4) 本件発明９の記載について
本件明細書の段落【００８３】の記載及び出願時の技術常識を考慮すると，本件発明８の記載は明確である。
(5) 本件発明１０，１１の記載について
前記(3)及び(4)のとおり，本件発明８，９は明確であるから，これを引用する本
件発明１０，１１も明確である。
(6) 本件発明６の請求項４，５を引用する部分の記載について
本件明細書からすると，請求項６のうち，請求項４に従属する部分については，
本件発明６の（ｅ）～（ｊ）に規定された変異型遺伝子が対応することが，当業者には容易に理解できる。また，請求項５に従属する部分についても，同様に，本件発明６の（ｃ）及びこれに対応する（ｄ）に規定された変異型遺伝子が対応することが，当業者には容易に理解できる。
第４

当裁判所の判断

１

本件発明について(1) 本件明細書の記載（甲１，甲３９の３）ア

技術分野【０００１】- 61 -

本発明は，発酵工業に関し，詳しくは，Ｌ－グルタミン酸の製造法及びそれに用いる細菌に関する。Ｌ－グルタミン酸は調味料原料等として広く用いられる。
イ

背景技術【０００２】
従来，Ｌ－グルタミン酸は，Ｌ－グルタミン酸生産能を有するブレビバクテリウ
ム属やコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産
されている。これらのコリネ型細菌は，生産性を向上させるために，自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。
【０００３】
コリネ型細菌の野生株は，一般的にビオチンが存在している条件ではグルタミン酸を生成しない。したがって，コリネ型細菌によるグルタミン酸生産は，ビオチン
制限，界面活性剤添加，ペニシリン添加等によってグルタミン酸生成を誘導した状態で行われる（非特許文献１）。また，これらの方法を適用しなくてもビオチンが十分存在している条件でＬ－グルタミン酸を生成できる株として，界面活性剤温度感
受性株（特許文献 1），ペニシリン感受性株（特許文献２），セルレニン感受性株（特許文献３）リゾチーム感受性株（特許文献４）等が開発されている。
【０００４】
しかし，これらの手法により開発されたＬ－グルタミン酸生産菌は，脂肪酸合成能の低下や細胞壁合成能の低下を伴っている場合が多く，Ｌ－グルタミン酸生産と引き換えに環境変化への適応力の低下を引き起こしている可能性が高い。したがって，これらの手法を用いてＬ－グルタミン酸を著量蓄積できる菌株を開発するには相当の労力を要していた。
【０００５】
一方，ビオチン十分条件でＬ－グルタミン酸を生成する株は，α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を欠損させることによっても達成される（特許文献５）。しかし，TCA サイクルを途中で遮断する α－ケトグルタル酸デヒドロゲ- 62 -

ナーゼ欠損株は生育が遅いことから菌体量の確保が困難などの課題があった。
【０００６】
コリネ型細菌の yggB 遺伝子は，エシェリヒア・コリの yggB 遺伝子のホモログであり（非特許文献２，３），メカノセンシティブチャンネル(mechanosensitive channel)の一種として解析されているが，（非特許文献４），Ｌ－グルタミン酸に及ぼす影響については知られていなかった。
ウ

発明が解決しようとする課題【０００７】
本発明は，コリネ型細菌を用いたＬ－グルタミン酸の製造において，Ｌ－グルタ
ミン酸生産能力を向上させる新規な技術を提供することを課題とする。
エ

課題を解決するための手段【０００８】
本研究者らは，上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果，ｙｇｇ
Ｂ遺伝子がコリネ型細菌のＬ－グルタミン（判決注：「Ｌ－グルタミン酸」の誤記と認める。）生産に関与していることを明らかにし，ｙｇｇＢ遺伝子を用いてコリネ型細菌を改変することにより，Ｌ－グルタミン酸の生産能が大幅に向上することを見出し，本発明を完成するに至った。
オ

発明の効果

【００１０】
本発明のｙｇｇＢ遺伝子を用いて改変したコリネ型細菌を用いることにより，Ｌ－グルタミン酸を効率よく生産することが出来る。
カ

発明を実施するための形態(ｱ) 本件発明のコリネ型細菌【００１１】
本発明のコリネ型細菌は，Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって，ｙｇｇＢ遺伝子を用いて改変されたことにより，非改変株と比較してＬ－グル- 63 -

タミン酸生産能が向上したコリネ型細菌である。
【００１２】
本発明において，「コリネ型細菌」とは，従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが，現在コリネバクテリウム属に分類された細菌も含み（ Int. J. Syst.
Bacteriol., 41, 255(1991)），またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバ
クテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。・・・【００１５】
本発明において，「Ｌ－グルタミン酸生産能」とは，本発明のコリネ型細菌を培養したときに，培地中または菌体内にＬ－グルタミン酸を蓄積する能力をいう。コリ
ネ型細菌の多くは後述する「Ｌ－グルタミン酸生産条件」でＬ－グルタミン酸を生産することができるため，「Ｌ－グルタミン酸生産能」は，コリネ型細菌の野生株の性質として有するものであってもよい。ただし，育種によって付与または増強された性質であってもよく，さらに後述するようにして，ｙｇｇＢ遺伝子を用いた改変によって，Ｌ－グルタミン酸の生産能が付与されたものでもよい。
「Ｌ－グルタミン酸生産能が向上した」とは，野生株などの非改変株と比較して，
Ｌ－グルタミン酸生産能が上昇したことを意味する。ここで，コリネ型細菌の野生株としては，コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13032 株，13869 株，14067
株，コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965 株などが挙げられる。なお，「非改変株」としては，上記のような野生株と同程度のｙｇｇＢ遺伝子の発現量を示す
ような株，ｙｇｇＢ遺伝子のコード領域内に変異が導入されていない株も含む。
(ｲ) ｙｇｇＢ遺伝子の発現量の増強【００３０】
ｙｇｇＢ遺伝子は，メカノセンシティブチャンネル(mechanosensitive channel)の一種として知られ，mscS とも呼ばれるタンパク質をコードする（FEMS Microbiol
Lett. 2003 Jan 28;218(2):305-9.）。

- 64 -

ｙｇｇＢ遺伝子の発現量を増加させることにより，コリネ型細菌のＬ－グルタミ
ン酸生産能が非改変株に比べて向上する。すなわち，ｙｇｇＢ遺伝子の発現量が増加するように改変されたコリネ型細菌を培養することにより，非改変株に比べて多くの量のＬ－グルタミン酸を培地中に蓄積するか，あるいは，非改変株に比べて速い速度でＬ－グルタミン酸を生産する。例えば，ｙｇｇＢ遺伝子発現増強株は，親株あるいは非改変株と比べて，対糖収率でＬ－グルタミン酸の収率が 2%以上上昇していることが好ましく，4%以上上昇していることがより好ましく，6%以上向上していることが特に好ましい。ｙｇｇＢ遺伝子発現増強株は，非改変株と比べて，除菌体収率が向上していてもよい。除菌体収率とは，対糖収率から菌体生成に用いられた炭素収率を除いたものを意味する。
【００３１】
ｙｇｇＢ遺伝子の発現量が上昇したことの確認は，ｙｇｇＢの m-RNA の量を野生型，あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては，ノーザンハイブリダイゼーション，RT-PCR が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。発現量については，野生株あるいは非改変株と比較して，上昇していればよいが，例えば野生株，非改変株と比べて１．５倍以上，より好ましくは２倍以上，さらに好ましくは３倍以上上昇していることが望ましい。
【００３２】
ｙｇｇＢ遺伝子の発現量が上昇するように改変されたコリネ型細菌は，Ｌ－グルタミン酸生産条件と過剰量のビオチンを含む条件の少なくとも 1 つの条件で，非改変株と比べてＬ－グルタミン酸生産能が向上していればよい。
ここで，「Ｌ－グルタミン酸生産条件」とは炭素源，窒素源，無機塩類，その他必要に応じてアミノ酸，ビタミン等の有機微量栄養素を含有する培地に，Ｌ－グルタ
ミン酸生産を誘導する物質を添加したり，あるいはＬ－グルタミン酸生産を阻害す
る物質の培地中の量を制限した条件を意味し，Ｌ－グルタミン酸生産を誘導するた- 65 -

めに添加する物質には，ペニシリン G や Tween40 等の飽和脂肪酸を含む界面活性剤が挙げられ，Ｌ－グルタミン生産を阻害するために制限する物質とはビオチンが挙げられる（アミノ酸発酵

学会出版センター

1986 年）。Ｌ－グルタミン酸生産条

件でのこれらの物質の培地中の添加濃度は，ビオチンは，15μg/L 未満，好ましくは，10μg/L 未満，さらに好ましくは，5μg/L 未満であり，培地中にビオチンを全く含まなくてもよい。ペニシリンの培地中の添加濃度は，0.1U/ml 以上，好ましくは，0.2U/ml 以上，さらに好ましくは，0.4U/ml 以上であり，界面活性剤の添加濃度
は，0.5g/L 以上，好ましくは，1g/L 以上，さらに好ましくは，2g/L 以上である。
一方，「過剰量のビオチンを含む条件」とは，例えば，培地中にビオチンを 30μg/L
以上，好ましくは 40μg/L，さらに好ましくは 50μg/L 含む条件をいう。
【００３３】
コリネ型細菌のｙｇｇＢ遺伝子としては，例えば，配列番号６，６２，６８，または８４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には，配列番号５の塩基配列 1437-3035 番目の配列を有する遺伝子，配列
番号６１の塩基配列 507-2093 番目の配列を有する遺伝子，配列番号６７の塩基配列
403-2001 番目の配列を有する遺伝子，配列番号８３の塩基配列 501-2099 番目の配列を有する遺伝子などが挙げられる。配列番号５の塩基配列 1437-3035 番目の配列を有する遺伝子は，コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13869 株のｙｇｇＢ遺伝子であり，配列番号６１の塩基配列 507-2093 番目の配列を有する遺伝子は，コリ
ネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・フラバム）ATCC14967 株のｙｇｇＢ遺伝子であり，配列番号６７の塩基配列 403-2001 番目の配列を有する遺伝
子は，コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965 株のｙｇｇＢ遺伝子である。
配列番号８３の塩基配列 501-2099 番目の配列を有する遺伝子は，コリネバクテリウ
ム・グルタミカム ATCC13032 の Genbank Accession No. NC_003450 として登録されているゲノム配列中の塩基番号 1336092-1337693 にコードされており，NCgl 1221
として登録されている（NP_600492. Reports- 66 -

small-conductance...[gi:19552490]）。

また，コリネ型細菌の種や菌株によってｙｇｇＢ遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため，ｙｇｇＢ遺伝子は配列番号５の塩基番号 1437-3035 番目からなる塩基配列のバリアントであってもよい。ｙｇｇＢ遺伝子のバリアントは，配列番号５の塩基番号 1437-3035 番目からなる塩基配列の配列を参考にして，BLAST 等
によって検索出来る（http://（以下略））。また，ｙｇｇＢ遺伝子のバリアントは，
ｙｇｇＢ遺伝子ホモログ，例えばコリネ型細菌の染色体を鋳型にして例えば配列番
号７５，７６の合成オリゴヌクレオチドを用いて PCR で増幅可能な遺伝子を含む。
また，本発明の遺伝子は，コリネ型細菌のｙｇｇＢ遺伝子が望ましいがコリネ型細菌で機能を有する限り，他の微生物由来の遺伝子を用いてもよい。また，後述する
変異型ｙｇｇＢ遺伝子を用いてもよい。
【００３４】
ｙｇｇＢ遺伝子は，コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させるものである限り，配列番号６，６２，６８または８４に示すアミノ酸配列において，１若
しくは数個のアミノ酸の置換，欠失，挿入，または付加を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで，数個とは，例えば，２～２０個，好ましくは２～
１０個，より好ましくは２～５個を意味する。
上記置換は保存的置換が好ましく，保存的置換としては，ala から ser 又は thrへの置換，arg から gln，his 又は lys への置換，asn から glu，gln，lys，his 又はasp への置換，asp から asn，glu 又は gln への置換，cys から ser 又は ala への置換，gln から asn，glu，lys，his，asp 又は arg への置換，glu から gly，asn，gln，
lys 又は asp への置換，gly から pro への置換，his から asn，lys，gln，arg 又はtyr への置換，ile から leu，met，val 又は phe への置換，leu から ile，met，val
又は phe への置換，lys から asn，glu，gln，his 又は arg への置換，met から ile，leu，val 又は phe への置換，phe から trp，tyr，met，ile 又は leu への置換，serから thr 又は ala への置換，thr から ser 又は ala への置換，trp から phe 又は tyrへの置換，tyr から his，phe 又は trp への置換，及び，val から met，ile 又は leu- 67 -

への置換が挙げられる。
さらに，本発明のｙｇｇＢ遺伝子は，配列番号 6，６２，６８，または８４のアミノ酸配列全体に対して，８０％以上，好ましくは９０％以上，より好ましくは９５％以上，特に好ましくは９７％以上の相同性を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産能を向上させる遺伝子も含む。ここで，ホモロ
ジ ー は，Karlin と Altschul による BLAST (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90,5873(1993)) や Pearson による FASTA (Methods Enzymol., 183, 63 (1990))などによって計算することができる。これらのアルゴリズムによるホモロジー検索プログ
ラム（BLASTN ，BLASTP など）が，NCBI などより入手できる(以下略)。
なお，上記のようなアミノ酸の置換，欠失，挿入，付加，または逆位等には，ｙｇｇＢ遺伝子を保持する微生物の個体差，種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant 又は variant）によって生じるものも含まれる。
【００３５】
特に配列番号６の以下の位置のアミノ酸は置換・欠失していてもよい。コリネ型
細菌に保存されるＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号８５に示し，アミノ酸置換・欠失が起こっていてもよい箇所を Xaa で示す。
４８番目のグルタミン残基（望ましくはアルギニン残基への置換）
２７５番目のアスパラギン残基（望ましくはセリン残基への置換）
２９８番目のグルタミン酸残基（望ましくはアラニン残基への置換）
３４３番目のアラニン残基（望ましくはバリン残基への置換）
３９６番目のフェニルアラニン残基（望ましくはイソロイシン残基への置換）
４３８番目のセリン残基（望ましくはグリシン残基への置換）
４４５番目のバリン残基（望ましくはアラニン残基への置換）
４５４番目のアラニン残基（望ましくはバリン残基への置換）
４５７番目のプロリン残基（望ましくはセリン残基への置換）
４７４番目のセリン残基（望ましくはアスパラギン残基への置換）- 68 -

５１７番目のバリン残基（望ましくは欠失）
５１８番目のグルタミン酸残基（望ましくは欠失）
５１９番目のアラニン残基（望ましくは欠失）
５２０番目のプロリン残基（望ましくは欠失）【００３６】
上記のようなｙｇｇＢ遺伝子ホモログは，例えば，部位特異的変異法によって，コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換，欠失，挿入または付加を含むように配列番号５の塩基配列の 1437-3035 番目の配列を有する遺伝子，配列番号６１の塩基配列の 507-2093 番目の配列を有する遺伝子，配列番号６７の塩基配列の 403-2001 番目の配列を有する遺伝子，または配列番号８３の塩基配列の501-2099 番目の配列を有する遺伝子を改変することによって取得することができる。
また，以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては，配列番号５の塩基配列の 1437-3035 番目の配列を有する遺伝子，配列
番号６１の塩基配列の 507-2093 番目の配列を有する遺伝子，配列番号６７の塩基配列の 403-2001 番目の配列を有する遺伝子，または配列番号８３の塩基配列の501-2099 番目の配列を有する遺伝子を有する遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法，および該遺伝子を保持する微生物，例えばエシェリヒア属細菌を，紫外線または N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエ
チルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。また，上記のようなアミノ酸の置換，欠失，挿入，付加，または逆位等には，ｙｇｇＢ遺伝子を保持する微生物の個体差，種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant 又は variant）によって生じるものも含まれる。これらの遺伝子がコリネ型細菌に導入したときにＬ－グルタミン酸生産能を向上させるか否かは，例えば，これらの遺伝子をコリネ型細菌の野生株に導入し，上述の条件でＬ－グルタミン酸の生産能が向上するかどうかを調べることにより，確かめることができる。

- 69 -

(ｳ) 変異型ｙｇｇＢ遺伝子の導入【００５０】
ｙｇｇＢ遺伝子を用いた改変として，コリネ型細菌への変異型ｙｇｇＢ遺伝子の導入も挙げられる。ここで，「変異型ｙｇｇＢ遺伝子の導入」とは，コリネ型細菌の染色体上のｙｇｇＢ遺伝子への変異の導入であってもよいし，変異型ｙｇｇＢ遺伝子を含むプラスミドのコリネ型細菌への導入であってもよいし，染色体上のｙｇｇ
Ｂ遺伝子の変異型ｙｇｇＢ遺伝子への置換であってもよい。
本発明において，「変異型ｙｇｇＢ遺伝子」とは，ｙｇｇＢ遺伝子のコード領域内の変異であって，コリネ型細菌のビオチンを過剰量含む条件下でのＬ－グルタミン
酸生産能を向上させる機能をｙｇｇＢ遺伝子に付与する変異，を含むｙｇｇＢ遺伝子を意味する。なお，変異型ｙｇｇＢ遺伝子は，コリネ型細菌に導入したときに，ビオチンを過剰量含む条件下だけでなく，上述したようなＬ－グルタミン酸生産条
件でもＬ－グルタミン酸生産能を向上させる遺伝子であってもよい。
「過剰量のビオチンを含む条件下でのＬ－グルタミン酸生産能が向上した」とは，本発明のコリネ型細菌を，非改変株がＬ－グルタミン酸を蓄積できないような濃度のビオチンを含む条件，例えば，30μg/L 以上の濃度のビオチンを含む培地で培養したときに，本発明のコリネ型細菌が，非改変株に比べて多くの量のＬ－グルタミ
ン酸を培地中に蓄積するか，あるいは，非改変株に比べて速い速度でＬ－グルタミ
ン酸を生産することを意味する。
【００５１】
以下，本発明の変異型ｙｇｇＢ遺伝子の取得方法，ｙｇｇＢ遺伝子に変異を導入する方法について記載する。しかしながら，変異型ｙｇｇＢ遺伝子の取得方法，ｙｇｇＢ遺伝子に変異を導入する方法は以下の方法には限定されない。
ａodhA 遺伝子欠損株を利用する方法【００５１】
変異型ｙｇｇＢ遺伝子を取得する方法として，α-ケトグルタル酸デヒドロゲナー- 70 -

ゼの E1o サブユニットをコードしている odhA 遺伝子(sucA 遺伝子)を欠損した株（以下 odhA 破壊株という）が利用出来ることを本発明者は発見した。odhA 破壊株の構築は，上述したような sacB 遺伝子などを用いる方法によって行うことが可能である。
ｂ

転移因子を利用する方法【００５８】
また，変異型ｙｇｇＢ遺伝子を有するコリネ型細菌はコリネ型細菌で機能する転移因子を用いてスクリーニングしてもよい。転移因子とはインサーションシーケン
ス（IS 因子），トランスポゾンを含む。変異型ｙｇｇＢ遺伝子は，野生型のｙｇｇ
Ｂ遺伝子にインサーションシーケンス（IS 因子），トランスポゾンが偶然挿入されることによって取得できるものでもよいし，人工トランスポゾンを用いて，人為的に構築したものでもよい。転移因子が挿入された株は，例えばＬ－グルタミン酸ア
ナログに対する感受性の低下を指標として選択することができる。Ｌ－グルタミン酸のアナログとしては，4－フルオログルタミン酸が利用できる。また，薬剤耐性遺伝子含む人工トランスポゾンを用いて薬剤耐性株をランダムに選択し，耐性株のｙｇｇＢ遺伝子長を PCR で確認することによっても転移因子挿入株を選択できる。
ｃin vitro でｙｇｇＢ遺伝子にランダムに変異を導入する方法【００６４】
また，変異型ｙｇｇＢ遺伝子は，in vitro でランダムに変異を導入し，その中から界面活性剤等の添加なしにＬ－グルタミン酸生産が可能となるクローンから選択することも出来る。スクリーニングに用いる親株としては，ビオチンが過剰量含まれた条件でＬ－グルタミン酸を蓄積することが出来ない株，例えば，C.glutamicum 野
生株である ATCC13869 株，ATCC13032 株，ATCC14067 株，C.melasecola 野生株である ATCC17965 が望ましい。
ｄ

Ｌ－グルタミン酸アナログ耐性株を取得する方法【００６８】
変異型ｙｇｇＢ遺伝子は，野生型のｙｇｇＢ遺伝子を有するコリネ型細菌をＬ－- 71 -

グルタミン酸アナログを含む培地で培養し，同培地で生育可能なＬ－グルタミン酸
アナログ耐性株を取得することによっても取得することができる。スクリーニングに用いる親株としては，上述のコリネ型細菌野生株が好ましいが，野生型のｙｇｇ
Ｂ遺伝子を有するものであれば，いずれでもよい。また野生型のｙｇｇＢ遺伝子を搭載したプラスミドを有するコリネ型細菌でもよい。
Ｌ－グルタミン酸アナログとしては，Ｌ－グルタミン酸－γ－メチルエステル，
α－メチルグルタミン酸，β－ヒドロキシグルタミン酸，メチオニンスルホキシミ
ン，グルタミン酸－γ－モノヒドロキサメ－ト，２－アミノ－４－ホスホノ酪酸，
Ｌ－グルタミン酸－γ－モノエチルエステル，Ｌ－グルタミン酸ジメチルエステル，
Ｌ－グルタミン酸－ジ－ｔ－ブチルエステル，モノフロログルタミン酸，Ｌ－グル
タミン酸ジエチルエステル，Ｄ－グルタミン酸，４－フルオログルタミン酸が挙げられ，特に４－フルオログルタミン酸アナログが使用できる。
Ｌ－グルタミン酸アナログ耐性株は以下のような手法で行う。コリネ型細菌をＬ－グルタミン酸アナログを添加した最小培地に接種し，24 時間～48 時間後にコロニーを形成した株を取得する。培地中に含まれるＬ－グルタミン酸アナログの濃度は，ｙｇｇＢ遺伝子が改変されていないコリネ型細菌が生育できず，ｙｇｇＢ遺伝子に変異が導入されたコリネ型細菌が生育できる濃度が好ましい。より具体的には，４－フルオログルタミン酸を用いる場合は，1.25mM，好ましくは 2.5mM，より好まし
くは 5mM が好ましい。ここで，本発明のＬ－グルタミン酸アナログ耐性とは，最少培地に４－フルオログルタミン酸を添加して一昼夜培養した際に，親株の生菌数（コロニー形成能を有する菌数）を 1/100 まで抑制できるような濃度においても 1/10以上の増殖を示すことを意味する。
取得できたＬ－グルタミン酸アナログ耐性株をビオチンを過剰量含むＬ－グルタ
ミン酸生産液体培地に接種し，しんとう培養したのち，グルタミン酸濃度を定量する。Ｌ－グルタミン酸は野生株では殆ど増加しないが，Ｌ－グルタミン酸アナログ
耐性株では，Ｌ－グルタミン酸を有意に蓄積する株が存在する。そのような株より- 72 -

ｙｇｇＢ遺伝子を PCR によって増幅し，そのｙｇｇＢ遺伝子の塩基配列を決定する
ことで，新規な変異型ｙｇｇＢ遺伝子が取得できる。
(ｴ) 本件発明の変異型ｙｇｇＢ遺伝子【００６９】
以下，変異型ｙｇｇＢ遺伝子の具体例を挙げる。ただし，変異型ｙｇｇＢ遺伝子
は，コリネ型細菌においてビオチンが過剰量存在する条件で，Ｌ－グルタミン酸生産能を向上させうる変異であれば特に制限されない。
ａ

Ｃ末端側変異【００７０】
この変異は，配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ酸番号４１９－５３３の配列，または配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の配列をコードする
領域の塩基配列の一部に導入された変異である。例えば，この領域は，配列番号５の塩基配列においては，塩基番号 2692-3035 番目に相当する。上記領域の塩基配列中の少なくとも一部に変異が導入されていればいずれでもよいが，インサーション
シーケンス（以下 IS という）や，トランスポゾンが挿入されたものが好ましい。変異は，アミノ酸置換を伴うもの（ミスセンス変異）や，上記 IS の挿入によってフレームシフト変異が導入されたもの，ナンセンス変異が導入されたものの何れでもよい。
(a)転移因子の挿入による変異（２Ａ－１型変異）【００７１】
C 末端側変異の一例として，配列番号５の２６９１番目の G の次に IS が挿入された変異が挙げられる。この変異が導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列
番号７に，該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号８に示す。配列番号８においては，配列番号６の 419 位のバリンから下流の領域が短い IS に由来する配列に置換されている。なお，配列番号７にて挿入された
IS は，IS1207(Genbank accession No. X96962) ，IS719: (Genbank accession No- 73 -

E12759)と相同性の高い配列である。
上記変異型ｙｇｇＢ遺伝子を２Ａ－１型変異と呼ぶ。２Ａ－１型変異には，配列
番号６，６２，６８，８４および８５の C 末端側の該領域を欠失または置換する変異が含まれる。
また，上記領域に他の IS が挿入されたもの，例えば上述したような transposase
をコードする IS が挿入されたものも，本発明の範囲に含まれる。transposase が導入される位置は上記領域のいずれの位置でもよいが，それぞれの transposase が認識しやすい箇所や IS が挿入しやすいホットスポットの位置が好ましい。
⒝

プロリン残基を他のアミノ酸に置換する変異（６６型変異，２２型変異）【００７２】
また C 末端側変異の一例として，配列番号６，６８，８４もしくは８５のアミノ
酸番号４１９－５３３の配列，または配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の領域内に存在するプロリンを他のアミノ酸に置換する変異が挙げられる。置換してもよいプロリンは，配列番号６の以下の位置に存在する。
４２４番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の４２４番目）
４３７番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の４３７番目）
４５３番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の４５３番目）
４５７番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の４５７番目）
４６２番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の４６２番目）
４６９番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の４６９番目）
４８４番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の４８４番目）
４８９番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の４８９番目）
４９７番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の４９７番目）
５１５番目のプロリン残基（配列番号６２，６８，８４，８５の５１５番目）
５２９番目のプロリン残基（配列番号６８，８４，８５の５２９番目，配列番号６- 74 -

２番目の５２５番目）
５３３番目のプロリン残基（配列番号６８，８４，８５の５３３番目，配列番号６
２番目の５２９番目）
ｙｇｇＢ遺伝子の C 末端側のプロリン残基は，ＹｇｇＢタンパク質の立体構造維持の為に重要な役割を果たしていると考えられる。
（Protein Eng. 2002 Jan;15(1):29-33，
J Biol Chem. 1991 Dec 25;266(36):24287-94.）
中でも４２４番目と４３７番目のプロリンが他のアミノ酸に置換することが望ましい。
ここで他のアミノ酸とは，プロリン以外のアミノ酸で天然型アミノ酸であればいずれのアミノ酸でもよく，Lys,Glu,Thr,Val,Leu,Ile,Ser,Asp,Asn,Gln,Arg,Cys,Met,
Phe,Trp,Tyr,Gly,Ala,His から選択される残基に置換すればよい。特に，424 番目のプロリンは，疎水性アミノ酸である Ala，Gly，Val，Leu，Ile に置換されることが望ましく，中でも分岐鎖アミノ酸である Leu，Val，Ile が望ましい。（６６型変異）
424 番目のプロリンをロイシンに置換する変異として，例えば，配列番号６７の 1673
位の“C”を“T”に置換する変異が挙げられる。この変異型ｙｇｇＢ遺伝子を配列
番号６９に，該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を
配列番号７０に示す。
また，437 番目のプロリンは，側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸（Thr,Ser,Tyr）に置換することが望ましく，中でも Ser への置換が望ましい。
（２２型変異）437 番
目のプロリンをセリンに置換する変異としては，例えば配列番号５の 2745 位の C
を T に置換する変異が挙げられる。また，本変異は，3060 位の C を T に置換する変異を伴っていてもよい。この変異型ｙｇｇＢ遺伝子を配列番号７３に，該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号７４に示す。
ｂ

膜貫通領域の変異【００７３】
ｙｇｇＢ遺伝子がコードするＹｇｇＢタンパク質は，5 個の膜貫通領域を有して- 75 -

いると推測される。配列番号６，６２，６８，８４，８５の野生型のＹｇｇＢタン
パク質のアミノ酸配列において，膜貫通領域はそれぞれ，アミノ酸番号１～２３（第１膜貫通領域），２５～４７（第２膜貫通領域），６２～８４（第３膜貫通領域），８
６～１０８（第４膜貫通領域），１１０～１３２（第５膜貫通領域）の領域に相当する。これらをコードする DNA は配列番号５の 1437-1505，1509-1577，1620-1688，1692-1760，1764-1832 番目の塩基に該当する。本発明の変異は，この膜貫通領域をコードする DNA 内に変異を有していることが望ましく，変異導入は１若しくは数個のアミノ酸の置換，欠失，付加，挿入又は逆位を含む変異で，フレームシフト変異，
ナンセンス変異を伴わないものが望ましい。従って，ここでアミノ酸配列の置換の場合は，アミノ酸置換を伴うミスセンス変異が好ましく，上記数個の置換，欠失，
付加，挿入又は逆位とは，２～２０個，好ましくは２～１０個，より好ましくは２～５個，さらに好ましくは２～3 個を意味する。またアミノ酸の挿入，欠失変異は，１～数塩基のポイントミューテーションの導入や，フレームシフト変異を伴わない
塩基配列導入，例えば，３，６，９，１２，１５，１８，または２１塩基の挿入または欠失，好ましくは，３，６，または９塩基の欠失または挿入，より好ましくは３塩基の塩基配列の欠失または挿入が望ましい。
【００７４】
例えば，以下のような変異が例として挙げられる。
(a)

第１膜貫通領域の変異（Ａ１型変異）【００７４】
この変異は，配列番号６，６２，６８，８４，８５に示されるアミノ酸配列において，14 番目のロイシン残基，15 番目のトリプトファン残基間に１又は数アミノ酸挿入された変異である。
具体例としては，14 番目のロイシン残基，15 番目のトリプトファン残基間に，３アミノ酸導入されたもの，例えば Cys-Ser-Leu が挿入されたものが挙げられ，この変異の例として，配列番号５の１４８０番目の G の次にＴＴＣＡＴＴＧＴＧが挿入さ- 76 -

れた変異が挙げられる。この変異が導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子の塩基配列を
配列番号１９に，該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２０に示す。
⒝

第４膜貫通領域の変異（１９型変異）【００７５】
この変異は，配列番号６，６２，６８，８４，８５に示されるアミノ酸配列において，１００番目のアラニン残基が，他のアミノ酸残基へ置換した変異である。他のアミノ酸とは，アラニン以外のアミノ酸残基であればいずれでもよく，他のアミノ酸とはアルギニン，アスパラギン酸，アスパラギン，システイン，グルタミン酸，
グルタミン，グリシン，ヒスチジン，イソロイシン，メチオニン，ロイシン，リジン，フェニルアラニン，プロリン，セリン，トリプトファン，チロシン，バリン，
スレオニンを意味するが，中でも側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸（スレオ
ニン，セリン，チロシン）に置換されていることが望ましく，特にスレオニン残基に置換されていることが望ましい。一例として配列番号５の１７３４番目のＧがＡに置換された変異が挙げられる。
この変異が導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号２１に，該遺伝
子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２２に示す。
⒞

第５膜貫通領域の変異（Ｌ３０型変異，８型変異）【００７６】
この変異は，配列番号６，６２，６８，８４，８５に示されるアミノ酸配列において，１１１番目のアラニン残基が，他のアミノ酸残基へ置換した変異である。他のアミノ酸とは，アラニン以外のアミノ酸残基であれば，いずれでもよく，他のア
ミノ酸とはアルギニン，アスパラギン酸，アスパラギン，システイン，グルタミン
酸，グルタミン，グリシン，ヒスチジン，イソロイシン，メチオニン，ロイシン，
リジン，フェニルアラニン，プロリン，セリン，トリプトファン，チロシン，バリン，スレオニンを意味するが，中でも分岐鎖アミノ酸（バリン，イソロイシン，ロ- 77 -イシン），特にバリン残基や，側鎖にヒドロキシル基を有するアミノ酸（スレオニン，
セリン，チロシン），特にスレオニン残基に置換されていることが望ましい。この変異の例として，配列番号５の１７６８番目のＣがＴに置換された変異（L30 型変異）
や，配列番号６１の８３７番目の G が A に置換された変異（8 型変異）が挙げられる。L30 型変異が導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号２３に，該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２４に示す。8 型変異が導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号６３に，該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６４に示す。
【００７８】
変異型ｙｇｇＢ遺伝子がコードするタンパク質としては，同タンパク質の活性がビオチンが過剰量存在する条件においてＬ－グルタミン酸生産能を向上させる機能を有する限り，機能的に均等なタンパク質例えば，配列番号８，２０，２２，２４，
６４，７０，７４から選択されるアミノ酸配列において，上記変異点のアミノ酸以
外にさらに，１若しくは数個のアミノ酸の置換，欠失，挿入，または付加を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで，数個とは，例えば，２～２０個，好ましくは２～１０個，より好ましくは２～５個を意味する。上記置換は保存的置
換（中性変異）が好ましく，保存的置換としては，ala から ser 又は thr への置換，
arg から gln，his 又は lys への置換，asn から glu，gln，lys，his 又は asp への置換，asp から asn，glu 又は gln への置換，cys から ser 又は ala への置換，gln から asn，glu，lys，his，asp 又は arg への置換，glu から gly，asn，gln，lys 又はasp への置換，gly から pro への置換，his から asn，lys，gln，arg 又は tyr への置換，ile から leu，met，val 又は phe への置換，leu から ile，met，val 又は pheへの置換，lys から asn，glu，gln，his 又は arg への置換，met から ile，leu，val
又は phe への置換，phe から trp，tyr，met，ile 又は leu への置換，ser から thr
又は ala への置換，thr から ser 又は ala への置換，trp から phe 又は tyr への置換，- 78 -

tyr から his，phe 又は trp への置換，及び，val から met，ile 又は leu への置換が挙げられる。また，上述したように，配列番号８５の Xaa のアミノ酸が置換されてもよい。さらに，本発明のｙｇｇＢ遺伝子は，配列番号８，２０，２２，２４，６
４，７０，７４のアミノ酸配列全体に対して，８０％以上，好ましくは９０％以上，より好ましくは９５％以上，特に好ましくは９７％以上の相同性を有するタンパク質をコードし，コリネ型細菌で変異型ｙｇｇＢがコードするタンパク質と同等の活性を有するタンパク質をコードするホモログも含む。
(ｵ) 変異型ｙｇｇＢ遺伝子のコリネ型細菌への導入方法【００８０】
上記のような変異を有する変異型ｙｇｇＢ遺伝子は，例えば，部位特異的変異導入法などによって得ることができる。より具体的には，ｙｇｇＢ遺伝子の該当領域に変異を含む配列を有する PCR プライマーを用いて，該当箇所を増幅するオーバー
ラップエクステンション PCR 法などを用いて，変異を含むｙｇｇＢ遺伝子を増幅してクローニングすることができる (Urban, A., Neukirchen, S. and Jaeger, K. E.,
A rapid and efficient method for site-directed mutagenesis using one-stepoverlap extension PCR. Nucleic Acids Res, 25, 2227-8. (1997).)。
得られた変異型ｙｇｇＢ遺伝子をコリネ型細菌に導入することにより本発明のコリネ型細菌を得ることができる。導入の方法としては，変異型ｙｇｇＢ遺伝子で染色体上の野生型のｙｇｇＢ遺伝子を置換する方法が挙げられる。染色体上の野生型のｙｇｇＢ遺伝子を破壊した株に変異型ｙｇｇＢ遺伝子を導入してもよい。なお，
一回組換え株のように，野生型のｙｇｇＢ遺伝子を染色体上に残したまま，変異型
ｙｇｇＢ遺伝子を導入してもよく，野生型遺伝子と，変異型遺伝子が組み込まれる
１コピーずつ染色体上に存在してもよい。染色体上のｙｇｇＢ遺伝子の置換は，例
えば，上述したレバンシュークラーゼをコードする sacB 遺伝子を含む温度感受性プ
ラスミドを用いて行うことができる。
【００８２】- 79 -

さらに上記変異型ｙｇｇＢ遺伝子の機能を抑制する遺伝子が不活化するように改変された細菌を用いてもよい。ここで「ｙｇｇＢ遺伝子の機能を抑制する」とは，その遺伝子の増幅により変異型ｙｇｇＢ遺伝子導入株のグルタミン酸生成を抑制することを意味する。変異型ｙｇｇＢ遺伝子の機能を抑制する遺伝子とは，symA 遺伝
子が挙げられる（supresser of ｙｇｇＢ mutation）。symA 遺伝子は，コリネバク
テリウム・グルタミカム ATCC13032 の Genbank Accession No. NC_003450 として登録されているゲノム配列中の塩基番号 2051306..2051845 にコードされており，NCgl
1867 として登録されている（NP_601149. hypothetical prot...[gi:19553147]）。
C.glutamicum ATCC13869 の symA 遺伝子を配列番号８６の塩基番号 585～1121 に示す。遺伝子の不活化は，遺伝子を破壊するあるいは，発現量を低下するように改変することで達成でき，symA 遺伝子の破壊や発現量を低下させるような変異の導入は，上述の酵素活性の低下と同様の方法で行うことができる。
【００８３】
また，本発明においては，ｙｇｇＢ遺伝子を用いた改変に加えて，さらに α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（以下 α-KGDH と呼ぶ）の活性が低下するように改変された細菌を用いてもよい。
「α‐ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下する」とは，α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して低下していることをいう。α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性は，Shiio らの方法（Isamu Shiio and Kyoko Ujigawa-Takeda, Agric.Biol.Chem.,44(8),1897-1904,1980）に従って測定することができる。α-KGDH 活性は，野生株又は親株等の非改変株に対して低下していればよいが，親株に対して約 1/2 以下，好まし
くは 1/4 以下，さらに好ましくは 1/10 以下に低下していることが望ましく，全く活性を有しなくてもよい。
(ｶ) 本発明のＬ－グルタミン酸の製造方法【００８５】
上記のようにして得られるコリネ型細菌をを培地に培養し，培地中にＬ－グルタ- 80 -

ミン酸を生成蓄積せしめ，Ｌ－グルタミン酸を該培地から採取することにより，Ｌ－グルタミン酸を製造することが出来る。
【００８６】
培養に用いる培地は，炭素源，窒素源，無機塩類，その他必要に応じてアミノ酸，
ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
【００８７】
炭素源としては，グルコース，グリセロール，フラクトース，スクロース，マルトース，マンノース，ガラクトース，澱粉加水分解物，糖蜜等の糖類が使用でき，その他，酢酸，クエン酸等の有機酸，エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては，アンモニア，硫酸ア
ンモニウム，炭酸アンモニウム，塩化アンモニウム，りん酸アンモニウム，酢酸ア
ンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量
栄養素としては，アミノ酸，ビタミン，脂肪酸，核酸，更にこれらのものを含有するペプトン，カザミノ酸，酵母エキス，大豆たん白分解物等が使用でき，生育にア
ミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。無機塩類としてはりん酸塩，マグネシウム塩，カルシウム
塩，鉄塩，マンガン塩等が使用できる。
また，用いるｙｇｇＢ遺伝子改変株の性質にあわせて適当な濃度の界面活性剤，
ペニシリンを加えてもよいし，用いるｙｇｇＢ遺伝子改変株の性質にあわせてビオ
チン濃度も調節すればよい。
【００８８】
培養は，好ましくは，発酵温度２０～４５℃，ｐＨを３～９に制御し，通気培養を行う。培養中にｐＨが下がる場合には，例えば，炭酸カルシウムを加えるか，アンモニアガス等のアルカリで中和する。このような条件下で，好ましくは１０時間- 81 -

～１２０時間程度培養することにより，培養液中に著量のＬ－グルタミン酸が蓄積される。
【００８９】
また，Ｌ－グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて，培地中にＬ－グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ－グルタ
ミン酸が析出する条件としては，例えば，ｐＨ５．０～４．０，好ましくはｐＨ４．
５～４．０，さらに好ましくはｐＨ４．３～４．０，特に好ましくはｐＨ４．０を挙げることができる。（欧州特許出願公開第 1078989 号明細書）【００９０】
培養終了後の培養液からＬ－グルタミン酸を採取する方法は，公知の回収方法に従って行えばよい。例えば，培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法ある
いはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。Ｌ－グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合，培養液中に析出したＬ－グルタミン酸は，遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合，培地中に溶解している
Ｌ－グルタミン酸を晶析した後に，併せて単離してもよい。
キ

実施例(ｱ) 【実施例１】【００９２】＜sacB 搭載遺伝子破壊用ベクターの構築＞（A）pBS3 の構築
sacB 搭 載 遺 伝 子 破 壊 用 ベ ク タ ー の 構 築 は ， 国 際 公 開 WO2005113745 号 ，WO2005113744 号の方法を参照にして行った。sacB 遺伝子（配列番号１１）をバチ
ルス・ズブチリスの染色体 DNA を鋳型として配列番号 13 と 14 をプライマーとして用いて，PCR により取得した。PCR 反応は，LA taq(TaKaRa)を用い，94 ℃で 5 分保温を 1 サイクル行った後，変性 94℃ 30 秒，会合 49℃ 30 秒，伸長 72℃ 2 分からな
るサイクルを 25 回繰り返した。生成した PCR 産物を常法により精製後 BglII と BamHI- 82 -

で消化し，平滑化した。この断片を pHSG299 の AvaII で消化後，平滑化した部位に挿入した。この DNA を用いて，エシェリヒア・コリ JM109 のコンピテントセル（宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い，カナマイシン（以下，Km と略す）25μg/ml
を含む LB 培地に塗布し，一晩培養した。その後，出現したコロニーを釣り上げ，単コロニーを分離し形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し，目的の PCR 産物が挿入されていたものを pBS3 と命名した。pBS3 の構築過程を図 1に示す。
【００９３】（B）pBS4S の構築
pBS3 上に存在するカナマイシン耐性遺伝子配列中の SmaI 部位をアミノ基置換を伴わない塩基置換(SmaI により切断されない変異)によりカナマイシン耐性遺伝子を破壊したプラスミドをクロスオーバーPCR で取得した。まず，pBS3 を鋳型として配列番号 15，16 の合成 DNA をプライマーとして PCR を行い，カナマイシン耐性遺伝
子の N 末端側の増幅産物を得る。一方 Km 耐性遺伝子の C 末端側の増幅産物を得るた
めに pBS3 を鋳型として配列番号 17，18 の合成 DNA を鋳型として PCR を行った。PCR
反応は Pyrobest DNA Polymerase(宝バイオ社製)を用い，98 ℃で 5 分保温を 1 サイクル行った後，変性 98℃ 10 秒，会合 57℃ 30 秒，伸長 72℃ 1 分からなるサイクル
を 25 回繰り返すことにより目的の PCR 産物を得ることができる。配列番号１６と１７は部分的に相補的であり，またこの配列内に存在する SmaI 部位はアミノ酸置換を伴わない塩基置換を施すことにより破壊されている。次に SmaI 部位が破壊された変異型カナマイシン耐性遺伝子断片を得るために，上記カナマイシン耐性遺伝子 N 末端側及び C 末端側の遺伝子産物を，それぞれほぼ等モルとなるように混合し，これを鋳型として配列番号 15，18 の合成 DNA をプライマーとして PCR を行い変異導入された Km 耐性遺伝子増幅産物を得た。PCR 反応は Pyrobest DNA Polymerase(宝バイオ社)を用い，98 ℃で 5 分保温を 1 サイクル行った後，変性 98℃ 10 秒，会合 57℃ 30
秒，伸長 72℃ 1.5 分からなるサイクルを 25 回繰り返すことにより目的の PCR 産物- 83 -

を得ることができる。
【００９４】PCR 産物を常法により精製後 BanII で消化し，上記の pBS3 の BanII 部位に挿入した。この DNA を用いて，エシェリヒア・コリ JM109 のコンピテントセル（宝バイオ社製宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い，カナマイシン 25μg/ml を含む LB 培
地に塗布し，一晩培養した。その後，出現したコロニーを釣り上げ，単コロニー分
離し，形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し，目的の PCR
産物が挿入されていたものを pBS4S と命名した。pBS4S の構築過程を図 2 に示す。
(ｲ) 【実施例２】【００９５】＜C. glutamicum ATCC13869 由来 odhA 変異株の構築＞

コリネ型細菌の α－ケトグ

ルタル酸デヒドロゲナーゼをコードしている odhA 遺伝子の配列は既に明らかにされている（Microbiology 142, 3347-3354, (1996)，GenBank accession No.D84102）。
公開されている odhA 遺伝子の配列を基に，配列番号１，２に記載のプライマーを設計し ATCC13869 株の染色体 DNA を鋳型として PCR を行い，odhA 遺伝子の内部配列のみを増幅した。増幅した PCR 断片を BamHI で完全分解し，実施例１で構築した pBS4Sの BamHI 部位に挿入したプラスミド pBS4SΔsucAint を構築した（構築図は図３に記
載）。
【００９６】
電気パルス法（特開平 2-207791）にて C.glutamicum

ATCC13869 へ pBS4SΔsucAintを導入し，カナマイシン 25μg/ml を含む CM-Dex 寒天培地（グルコース 5g/l，ポリペプトン 10g/l，酵母エキス 10g/l，KH2PO4 1g/l，MgSO4・7H2O 0.4g/l，FeSO4・7H2O
0.01g/l，MnSO4・4-5H2O 0.01g/l，尿素 3g/l，大豆蛋白加水分解液 1.2g/l，寒天 20g/l，
NaOH を用いて pH7.5 に調整：オートクレーブ 120℃20 分）上に塗布した。31.5℃にて培養後，生育してきた株を，相同組換えによって染色体上に pBS4SΔsucAint が組み込まれた 1 回組換え株であることを PCR にて確認した。なお 1 回組換え株である- 84 -

ことの確認は，候補株の染色体を鋳型にし，pBS4S 上の特異的配列（配列番号 3）と染色体上の配列（配列番号 4）をプライマーにした PCR を行うことによって，容易に確認することが出来る（非組み換え株の染色体上には pBS4S の配列が存在していないため，PCR によって増幅される断片が出現しないことから判別可能となる）。
【００９７】
こうして取得した 1 回組換え株を 2A-1 株と名付けた。野生株 ATCC13869 および
2A-1 株を 20ml のフラスコ培地（グルコース 30g/l,

硫酸アンモニウム 15g/l, KH2PO4

1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4～5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l,
Biotin 300μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOH を用いて pH8.0 に調整：オートクレーブ 115℃10 分）に接種した後，予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを 1g 加え，31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費したのち，培地中のＬ－グル
タミン酸濃度を測定した。結果を表１に示す（OD620 は 101 倍希釈の濁度で菌体量の指標であり，Glu(g/L)はＬ－グルタミン酸の蓄積量を示す）。親株の ATCC13869
ではＬ－グルタミン酸を全く生成しない条件においても 2A-1 株ではＬ－グルタミン
酸生産能を有することが確認された。
【００９８】【表１】(ｳ) 【実施例３】【００９９】＜２A-1 由来 odhA 復帰株の構築＞- 85 -

取得した 2A-1 株は，染色体上の odhA 遺伝子が pBS4SΔＴ￥sucAint によって破壊されている。この株から染色体上のプラスミドを脱落させれば odhA は野生型に復帰する。一方，odhA が欠損した株では，糖を含まない培地での生育が著しく遅いが，odhA が野生型に復帰すれば糖を含まない CM2B(ポリペプトン 10g/l，酵母エキス
10g/l，NaCl 5g/l，Biotin 10μg/L，寒天 20g/l，KOH を用いて pH7.0 に調整)のような培地でも良好に生育すると推測される。そこで，2A-1 株を CM2B プレートに塗布し，生育改善株を誘導した。こうして出現した生育改善株 2A-1R 株を CM2B プレー
トで純化し，そのカナマイシン感受性を調べたところ，すべてカナマイシン感受性であり，スクロース耐性であることが明らかとなった。
【０１００】
pBS4SΔsucAint にはカナマイシン耐性遺伝子とレバンシュークラーゼをコードする sacB 遺伝子が含まれているため，pBS4SΔsucAint を有する株ではカナマイシン
耐性とスクロース感受性を示し，脱落した株ではカナマイシン感受性を示し，またスクロース耐性を示すこととなる。これらの結果から 2A-1R 株では odhA が野生型に復帰していることが示唆された。さらに odhA 遺伝子の配列を確認した結果，odhA遺伝子には変異がないことが確認されたことから，2A-1R 株では odhA は野生型に復帰していると結論した。2A-1R 株のグルタミン酸生産能を実施例２と同様の方法で確認した。結果を表２に示す。
（OD620 は 101 倍希釈の菌体量，Glu(g/L)はＬ－グルタミン酸の蓄積量を示す）2A-1R 株のグルタミン酸蓄積は 2A-1 株には劣るものの野
生株 ATCC13869 よりも遥かに高いことが示された（表２）。また，糖を完全に消費した後も振とうを続けたところ，2A-1R ではグルタミン酸の分解が認められ，odhA が野生型に復帰していることが裏付けられた（図４）。

- 86 -

【０１０１】【表２】(ｴ) 【実施例４】【０１０２】＜2A-1R 株のグルタミン酸生成に関与する遺伝子の単離＞
2A-1R 株は，CM2B プレート培地上においては，野生株 ATCC13869 とほぼ変わらない速度でコロニーを形成できる。しかし，最少培地（グルコース 20g/l,硫酸アンモ
ニウム

2.64g/L, KH2PO4 0.5g/L, K2HPO4 0.5g/L, MgSO4・7H2O 0.25g/L, FeSO4・7H2O

0.01g/L, MnSO4・7H2O 0.01g/L,

CaCl2 0.01g/L, CuSO4 0.02mg/L, MOPS 40g/L, プ

ロトカテク酸 30mg/L, VB1・HCl200μg/L, Biotin 300μg/L, 寒天 20g/L, NaOH を用いて pH6.7 に調整）プレート上では野生株 ATCC13869 に比し著しくコロニー形成速度が低下していることが明らかとなった。そこで，最少培地で 2A-1R 株の生育を回復できる遺伝子の探索をおこなった。
【０１０３】
ATCC13869 株の染色体 DNA を Sau3AI で部分分解し，シャトルベクターpVK9 を BamHIで処理したものとライゲーションし，ライゲーション反応液をエタノール沈殿した
後，E.coli DH5α(タカラバイオ)のエレクトロコンピテントセルを電気パルス法で形質転換した。pVK9 は，pHSG299（タカラバイオ）の AvaII 部位を平滑末端化し，pHK4(特開平 05-007491)に含まれるコリネ型細菌内で自律複製可能な領域を BamHI
および KpnI で切り出し平滑末端化した断片を挿入したシャトルベクターである。形
質転換後の菌体はカナマイシン 25μg/ml を含む LB プレート培地（ポリペプトン 10g/l，- 87 -

酵母エキス 5g/l，NaCl 5g/l，寒天 20g/l，NaOH を用いて pH7.0 に調整）に塗布し，37℃で一晩培養した。翌日出現したコロニーを全てエーゼでかきとり，プラスミドを抽出し ATCC13869 のライブラリーとした。このライブラリーを実施例３で得られた 2A-1R 株に電気パルス法にて形質転換し，カナマイシン 25μg/ml を含む最少培地
プレートに塗布し，コロニー形成速度が向上した株をスクリーニングした。コロニー形成速度が向上した株よりプラスミドを抽出した結果，配列番号５に記す断片がpVK9 の BamHI 部位に挿入されていたことが明らかとなった。このプラスミドを pL5kと命名した。
【０１０４】
pL5k の挿入配列と，既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカム
ATCC13032 のゲノム配列（Acc.No.

NC_003450）を比較した結果，pL5k には完全長の ORF として，配列番号６に示すアミノ酸配列をもつ ORF のみが含まれていることが明らかとなった。ORF が膜タンパク質か否かは，インターネット上で利用可能なプログラム「SOSUI」によって予測可能である（2004/10/07 現在 http://（以下略）にリンクされている）。
「SOSUI」でこの ORF を解析した結果，５回の膜貫通領域が存在していることが示唆された。配列番号６のアミノ酸配列において，膜貫通領域はそれぞれ，アミノ酸番号１～２３，２５～４７，６２～８４，８６～１０８，１１
０～１３２の領域に相当する。これらをコードするＤＮＡ配列は，配列番号５の1437-1505，1509-1577，1620-1688，1692-1760，1764-1832 番目の塩基配列に，膜貫通領域のアミノ酸配列は配列番号２５－２９，表３に示した【０１０５】- 88 -

【表３】(ｵ) 【実施例５】【０１０７】＜2A-1R 株のＹｇｇＢ遺伝子の変異点同定＞
2A-1R 株の最少培地における生育を pL5K が相補したことから，2A-1R 株のｙｇｇ
Ｂ遺伝子には何らかの変異がある可能性が示唆された。そこで，2A-1R 株のｙｇｇ
Ｂ遺伝子の塩基配列を決定した。その結果 2A-1R 株ではＹｇｇＢ遺伝子の C 末端側の領域に IS が挿入されていることが明らかとなった（図 5）。2A-1R 株の変異型ｙｇ
ｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号７に，アミノ酸配列を配列番号８に記した。このことから，2A-1R 株のグルタミン酸生産能は，ｙｇｇＢ遺伝子の変異によって維持されていた可能性が示唆された。なお，この変異は 2A-1R 株のみならず 2A-1 株にも存在していた。odhA 遺伝子に変異を導入した際に，安定してグルタミン酸を細胞外に放出するためのサプレッサー変異として起こった変異であると推測される。ここで，ＩＳが挿入されたこの変異を，2A-1 型変異とした。
(ｶ) 【実施例６】【０１０８】＜2A-1 型ｙｇｇＢ変異株構築とＬ－グルタミン酸生産能評価＞（６－１）

2A-1 型変異の野生株への導入と評価（１回組換え株）

2A-1 株の染色体 DNA を鋳型として，配列番号９と配列番号１０に示す合成 DNA を
プライマーとして PCR を行い，2A-1 型変異を有するｙｇｇＢ遺伝子断片を増幅した。

- 89 -

増幅産物は SacI で処理し，実施例１の pBS3 の SacI 部位に挿入した。2A-1 型変異を有するｙｇｇＢ断片がクローニングされたプラスミドを pBS3yggB2A と名付けた。
電気パルス法にて C.glutamicum

ATCC13869 に pBS3yggB2A を導入し，カナマイシン

25μg/ml を含む CM-Dex 寒天培地上に塗布した。31.5℃にて培養後生育してきた株を，相同組換えによって染色体上に pBS3yggB2A が組み込まれた 1 回組換え株であることを PCR で確認した。得られた一回組換え株を 13869-2A とした。この株では，野生型のｙｇｇＢ遺伝子と変異型のｙｇｇＢ遺伝子の両方が発現していることとなる。
【０１０９】
取得したｙｇｇＢ変異導入株 13869-2A のグルタミン酸生産能を，実施例２記載の方法にて確認した。その結果を表４に示す（OD620 は 101 倍希釈の菌体量，Glu(g/L)
はＬ－グルタミン酸の蓄積量を示す）。13869-2A 株では，ATCC13869 株がＬ－グルタ
ミン酸を生成しない条件でも，明確なグルタミン酸生産能が確認できた。このことから，ＹｇｇＢ遺伝子の変異により，グルタミン酸生産が誘導できることが示された。
【０１１０】【表４】【０１１１】（６－２）2A-1 型変異の野生株への導入と評価（２回組換え株）
変異型遺伝子のみを有する株を構築する為，13869-2A 株を CM-Dex 液体培地で一夜培養した懸濁液を S10 寒天培地（スクロース 100g/l，ポリペプトン 10g/l，酵母
エキス 10g/l，KH2PO4 1g/l，MgSO4・7H2O 0.4g/l，FeSO4・7H2O 0.01g/l，MnSO4・4-5H2O- 90 -

0.01g/l，尿素 3g/l，大豆蛋白加水分解液 1.2g/l，寒天 20g/l，NaOH を用いて pH7.5に調整：オートクレーブ 120℃20 分）上に塗布し 31.5℃で培養した。出現したコロ
ニーのうち，カナマイシン感受性を示す株をｓ2B 寒天培地上で純化した。これらの株より染色体ＤＮＡを調整し，配列番号９と配列番号１０に示す合成 DNA をプライマーとして PCR を行い変異を確認し，ｙｇｇＢ遺伝子にＩＳ様配列が挿入されていた株を 13869-2A-7 とした。
【０１１２】
取得した 13869-2A-7 株のグルタミン酸生産能を，実施例２記載の方法にて確認した。その結果を表５に示す。
（OD620 は 101 倍希釈の菌体量，Glu(g/L)はＬ－グルタ
ミン酸の蓄積量を示す）。13869-2A-7 株では，2A-1R 株と同等以上のグルタミン酸生産能を示したことから，ビオチン過剰量存在下でのＬ－グルタミン酸生産は，ｙｇ
ｇＢ遺伝子の変異によって引き起こされることが確認できた。
【０１１３】【表５】(ｷ) 【実施例７】【０１１４】＜A1 型ＹｇｇＢ変異株の構築と評価＞
上述のＬ－グルタミン酸生産性の odhA 変異株を解析した結果，上述の 2A-1 変異の他にｙｇｇＢ遺伝子上に５種類の変異を見出した。以下，それぞれＡ１型変異，１９型変異，L30 型変異，８型変異，６６型変異とし，前者３つについては ATCC13869の染色体に変異を導入して効果を確認した。８型変異については ATCC14067 の染色- 91 -

体に変異を導入して効果を確認した。６６型変異に関しては， C.melassecola
ATCC17965 の染色体に変異を導入して効果を確認した。
【０１１５】
A1 型変異は，配列番号５の１４８０番目の G の次にＴＴＣＡＴＴＧＴＧが挿入された変異であり，配列番号６のアミノ酸配列の 14 番目のロイシン残基，15 番目のトリプトファン残基間にシステイン，セリン，ロイシン残基が挿入された変異である。この変異が導入された変異型ｙｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号１９に，該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２０に示す。
【０１１６】
A1 型変異遺伝子の取得は次のようにすれば行うことが出来る。配列番号 30 に示す合成 DNA と配列番号 31 に示す合成 DNA をプライマーとして，ATCC１３８６９株の染色体 DNA を鋳型として PCR を行い，N 末端側断片を調製する。同様に配列番号 32と配列番号 33 の合成 DNA をプライマーとして，C 末端側断片を調製する。続いて N
末端側断片と C 末端側断片を等量混合したものを鋳型として，配列番号９と配列番
号 34 の合成 DNA をプライマーとして PCR を行えば A1 型ＹｇｇＢ遺伝子の部分断片を取得できる。得られたＹｇｇＢ断片は SacI で処理して pBS4S の SacI 部位に挿入することにより，変異導入用のプラスミドが構築可能である。このようにして得られた pBS4 YggBA1 を実施例６記載の方法と同様に ATCC13869 株の染色体に挿入した
後，脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のｙｇｇＢ遺伝子の配列を決定し，A1 型に置換されていた株を選択すれば，A1 型変異を有する株を構築することができる。このような変異を持つ A1 型変異株を ATCC13869-A1 株とした。
【０１１７】
ATCC13869-A1 株と親株の ATCC13869 株を実施例２と同様の方法で培養を行った。
培養終了後，培養液中に含まれるＬ－グルタミン酸の量を公知の方法で測定した。
A1 変異を染色体上に導入した，ATCC13869-A1 株は親株の ATCC13869 株と比べてＬ- 92 -

－グルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。
【０１１８】【表６】(ｸ) 【実施例８】【０１１９】＜19 型ＹｇｇＢ変異株の構築と評価＞
１９型変異は，配列番号５の１７３４番目のＧがＡに置換された変異であり，配列番号６のアミノ酸配列の 100 番目のアラニンがスレオニンに置換された変異である。この変異が導入された変異型ＹｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号２１に，該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２２に示す。実施例７と同様の方法にて，１９型変異が導入されたｙｇｇＢ変異株を構築した。具体的には，配列番号 30 に示す合成 DNA と配列番号 35 に示す合成 DNA をプライマーとして，ATCC１３８６９株の染色体 DNA を鋳型として PCR を行い，N 末端
側断片を調製する。同様に配列番号 33 と配列番号 36 の合成 DNA をプライマーとして，C 末端側断片を調製する。続いて N 末端側断片と C 末端側断片を等量混合したものを鋳型として，配列番号 9 と配列番号 34 の合成 DNA をプライマーとして PCRを行えば 19 型ＹｇｇＢ遺伝子の部分断片を取得できる。得られたＹｇｇＢ断片は
SacI で処理して pBS4S の SacI 部位に挿入することにより，変異導入用のプラスミ
ドが構築可能である。このようにして得られた pBS4 YggB19 を実施例６記載の方法と同様に ATCC13869 株の染色体に挿入した後，脱落させる。得られたカナマイシン
感受性株のｙｇｇＢ遺伝子の配列を決定し，19 型に置換されていた株を選択すれば，
19 型変異を有する株を構築することができる。このような変異を持つ 19 型変異株

- 93 -

を ATCC13869-19 株とした。
【０１２０】
ATCC13869-19 株と親株の ATCC13869 株を実施例２と同様の方法で培養を行った。
培養終了後，培養液中に含まれるＬ－グルタミン酸の量を公知の方法で測定した。
19 変異を染色体上に導入した，ATCC13869-19 株は親株の ATCC13869 株と比べてＬ－
グルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。
【０１２１】【表７】(ｹ) 【実施例９】【０１２２】＜Ｌ３０型ＹｇｇＢ変異株の構築＞
Ｌ３０型変異は，配列番号５の１７６８番目のＣがＴに置換された変異であり，
配列番号６の１１１番目のアラニンがバリンに置換された変異である。この変異が導入された変異型ＹｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号２３に，該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２４に示す。
実施例７と同様の方法にて，Ｌ３０型変異が導入されたｙｇｇＢ変異株を構築した。具体的には，配列番号 30 に示す合成 DNA と配列番号 37 に示す合成 DNA をプライマーとして，ATCC１３８６９株の染色体 DNA を鋳型として PCR を行い，N 末端側断片を調製する。同様に配列番号 34 と配列番号 38 の合成 DNA をプライマーとして，
C 末端側断片を調製する。続いて N 末端側断片と C 末端側断片を等量混合したものを鋳型として，配列番号 9 と配列番号 34 の合成 DNA をプライマーとして PCR を行な
いＬ３０型ＹｇｇＢ遺伝子の部分断片を取得する。得られた変異型ＹｇｇＢ断片は- 94 -

SacI で処理して pBS4S の SacI 部位に挿入することにより，変異導入用のプラスミドを構築した。このようにして得られた pBS4 YggB-L を実施例６記載の方法と同様に ATCC13869 株の染色体に挿入した後，脱落させる。得られたカナマイシン感受性株のｙｇｇＢ遺伝子の配列を決定し，L30 型に置換されていた株を選択し，L30 型変異を有する株を構築した。このような変異を持つ L30 型変異株を ATCC13869-L 株とした。
【０１２３】
ATCC13869 株と，ATCC13869-L 株を実施例２と同様の方法で培養を行い，培養終了
後，培養液中に含まれるＬ－グルタミン酸の量を公知の方法で測定した。結果を表８に示す。
（OD620 は 101 倍希釈の菌体量，Glu(g/L)はＬ－グルタミン酸の蓄積量を示す）。Ｌ－３０変異を導入した ATCC13869-L30 株は親株の ATCC13869 株と比べてＬ－グルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。
【０１２４】【表８】(ｺ) 【実施例１０】【０１２５】＜変異型ｙｇｇＢ遺伝子導入株のＬ－グルタミン酸生成条件における培養評価＞
コリネ型細菌は Tween40 等の脂肪酸系界面活性剤の添加や，ビオチン制限によりグルタミン酸生成を誘導できる。そこで，ATCC13869 株と ATCC13869-19 株について，Tween40 添加条件およびビオチン制限条件での培養も行った。シード培養は，20mlのフラスコ培地（グルコース 80g/l,

硫酸アンモニウム 30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・

7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4～5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin- 95 -

60μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOH を用いて pH8.0 に調整：オートクレ
ーブ 115℃10 分）に接種した後，予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを 1g 加え，
31.5℃で振とう培養した。完全に糖を消費した培養液を種培養液とした。Tween40
添加培養においては，種培養液 2ml を 20ml のフラスコ培地（グルコース 80g/l,
酸アンモニウム

硫

30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l,

MnSO4・4～5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物（T-N）
0.48g/l, KOH を用いて pH8.0 に調整：オートクレーブ 115℃10 分）に接種した後，予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを 1g 加え，31.5℃で振とう培養した。培養開始後，OD620(x101)=0.2 に到達した時点で，最終濃度 5g/L となるように Tween40を添加し培養を継続した。ビオチン制限培養においては，種培養液 1ml を 20ml のフラスコ培地（グルコース 80g/l,

硫酸アンモニウム

30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・

7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4～5H2O 0.01g/l, VB1 200μg/l, 大豆
加水分解物（T-N）0.48g/l, KOH を用いて pH8.0 に調整：オートクレーブ 115℃10分）に接種した後，予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを 1g 加え，31.5℃で振とう培養した。この条件ではビオチンの終濃度が約 2.9μg/L となる。
Tween40 添加培養およびビオチン制限培養ともに，培養開始後 40 時間後の培地中のＬ－グルタミン酸濃度を測定した。結果を表９に示す（OD620 は 101 倍希釈の菌
体量，Glu(g/L)はＬ－グルタミン酸の蓄積量を示す）。ATCC13869-19 株では，Ｌ－グルタミン酸生産条件でもＬ－グルタミン酸の蓄積の増大が認められた。

【０１２６】- 96 -

【表９】【０１２７】
ATCC13869 株，ATCC13869-L30，ATCC13869-A1 株，ATCC13869-19 株，プラスミド
によるｙｇｇＢ増幅株についても，Tween40 添加培養を行なった。CM-Dex プレートに一夜培養した菌体を 1/6 プレート分かきとり，20ml のフラスコ培地（グルコース80g/l,

硫酸アンモニウム

30g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4・7H2O 0.4g/l, FeSO4・7H2O 0.01g/l, MnSO4・4～5H2O
0.01g/l, VB1 200μg/l, Biotin 60μg/l, 大豆加水分解物（T-N）0.48g/l, KOH を用いて pH8.0 に調整：オートクレーブ 115℃10 分）に接種した後，予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウムを 1g 加え，31.5℃で振とう培養した。培養開始５時間後にTween40 を終濃度 1g/L となるように添加し，培養開始から 24 時間後の菌体量とＬ－グルタミン酸の収量を分析した。その結果，表１０に示すように，ATCC13869-19,
ATCC13869-L30, ATCC13869-A1 株 ， 野 生 型 の ｙ ｇ ｇ Ｂ 遺 伝 子 増 幅 株（ATCC13869/pL5k-1）ともにＬ－グルタミン酸生産条件でのＬ－グルタミン酸の収量が向上していることが示された。

【０１２８】- 97 -

【表１０】(ｻ) 【実施例１１】【０１２９】＜８型ＹｇｇＢ変異株の構築＞
８型変異は，配列番号６１の 837 位の G が A に置換された変異であり，配列番号
６２の１１１位のアラニンがスレオニンに置換されている。この変異が導入された変異型ＹｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号６３に，該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６４に示す。
実施例７と同様の方法にて，8 型変異が導入されたｙｇｇＢ変異株を構築する。
具体的には，配列番号 30 に示す合成 DNA と配列番号６５に示す合成 DNA をプライマーとして，Brevibacterium flavumATCC14067 株の染色体 DNA を鋳型として PCR を行い，N 末端側断片を調製する。同様に配列番号 34 と配列番号６６の合成 DNA をプライマーとして，C 末端側断片を調製する。続いて N 末端側断片と C 末端側断片を等量混合したものを鋳型として，配列番号 9 と配列番号 34 の合成 DNA をプライマーとして PCR を行い，８型ＹｇｇＢ遺伝子の部分断片を取得する。得られた変異型Ｙｇ
ｇＢ断片は SacI で処理して pBS4S の SacI 部位に挿入することにより，変異導入用のプラスミドを構築する。このようにして得られた pBS4 YggB８を実施例６記載の方法と同様に ATCC14067 株の染色体に挿入した後，脱落させる。得られたカナマイ
シン感受性株のｙｇｇＢ遺伝子の配列を決定し，８型に置換されていた株を選択し，８型変異を有する株を構築する。このような変異を持つ８型変異株を ATCC14067yggB8- 98 -

株とする。
(ｼ) 【実施例１２】【０１３０】＜６６型ＹｇｇＢ変異株の構築＞
６６型変異は，配列番号６７の 1673 番目の C が T に置換された変異であり，配列
番号６８の４２４番目のプロリンがロイシンに置換されている。この変異が導入された変異型ＹｇｇＢ遺伝子の塩基配列を配列番号６９に，該遺伝子にコードされる
変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号７０に示す。
実施例７と同様の方法にて，66 型変異が導入されたｙｇｇＢ変異株を構築する。
具体的には，配列番号 30 に示す合成 DNA と配列番号７１に示す合成 DNA をプライマーとして，C.melassecolaATCC17965 株の染色体 DNA を鋳型として PCR を行い，N 末
端側断片を調製した。同様に配列番号３４と配列番号７２の合成 DNA をプライマー
として，C 末端側断片を調製する。続いて N 末端側断片と C 末端側断片を等量混合したものを鋳型として，配列番号 9 と配列番号 10 の合成 DNA をプライマーとして
PCR を行えば６６型ｙｇｇＢ遺伝子の部分断片を取得できる。得られた変異型Ｙｇ
ｇＢ断片を SacI で処理して pBS4S の SacI 部位に挿入することにより，変異導入用のプラスミドを構築する。このようにして得られた pBS4 YggB６６を実施例６記載の方法と同様に ATCC17965 株の染色体に挿入した後，脱落させる。得られたカナマ
イシン感受性株のｙｇｇＢ遺伝子の配列を決定し，６６型に置換されていた株を選択することで，６６型変異を有する株を構築できる。このような変異を持つ６６型
変異株をｙｇｇＢ66 株とする。
(ｽ) 【実施例１３】【０１３１】＜in vitro 変異による変異型ｙｇｇＢ遺伝子のスクリーニング＞（１３－１）ｙｇｇＢ欠損株の構築
変異型のｙｇｇＢ遺伝子を in vitro でｙｇｇＢに変異をランダムに導入し，その- 99 -

中から界面活性剤等の添加なしにグルタミン酸生産が可能となるクローンを選択することも出来る。変異型遺伝子のスクリーニングを行うため，まずｙｇｇＢ欠損株を構築した。配列番号 39 に示す合成 DNA と配列番号 40 に示す合成 DNA をプライマーとして，ATCC１３８６９株の染色体 DNA を鋳型として PCR を行い，N 末端側断片を調製した。同様に配列番号 41 と配列番号 42 の合成 DNA をプライマーとして，C末端側断片を調製した。配列番号 40 と 41 は互いに相補的である。続いて N 末端側
断片と C 末端側断片を等量混合したものを鋳型として，配列番号 39 と配列番号 42の合成 DNA をプライマーとして PCR を行ないｙｇｇＢ遺伝子の ORF を欠失した断片を取得した。
【０１３２】
得られた PCR 断片は SacI で処理して pBS4S の SacI 部位に挿入することにより，欠損変異導入用のプラスミドを構築した。このようにして得られた pBS4ΔYggB を実施例６記載の方法で ATCC13869 株の染色体に挿入した後，脱落させた。得られたカ
ナマイシン感受性株の染色体 DNA を鋳型として，配列番号 39 と配列番号 42 の合成
DNA をプライマーとして PCR を行い，ｙｇｇＢ遺伝子が欠損していることを確認した。得られたｙｇｇＢ遺伝子欠損株を ATCC13869ΔyggB 株とした。
【０１３３】（1３－2）変異型ｙｇｇＢ遺伝子の in vitro スクリーニング
一方，ｙｇｇＢ遺伝子の変異処理は以下のようにして行った。まず，プラスミド
pL5k はｙｇｇＢ遺伝子以外の領域を若干含んでいるため，pL5k を XhoI と SalI で処
理し，セルフライゲーションすることにより，プラスミド pL5kXS を得た。なお SalI
認識部位は，配列番号 5 の塩基配列上には存在しないが，pBS3 のマルチクローニン
グサイトに存在している。得られた pL5kXS 約 10μg を 500mM リン酸緩衝液，400mM
ヒドロキシルアミン，1mM EDTA (pH6.0)に溶解し，75℃で３０分から９０分処理することにより変異を導入した。変異導入後のプラスミドは，SUPREC-02（タカラバイ
オ）で脱塩した後，実施例６記載の方法で ATCC13869ΔyggB 株に導入し，Km25μg/ml- 100 -

を含む CM2B 培地で形質転換体を選択した。また，対照として変異処理前の pL5kXSについても ATCC13869ΔyggB 株に導入した。出現した形質転換体を，CM2BGU2 培地（実施例３記載の CM2B 培地にグルコース 10g/L と 15g/L の Urea を含む）2ml の液体培地に接種し，31.5℃で５時間しんとう培養したのち，グルタミン酸濃度を定量した。
表１１に，ATCC13869ΔyggB を変異処理した pL5kXS で形質転換した株を CM2BGU2培地にて試験管培養評価した結果を示す。変異処理時間６０分と９０分のプラスミ
ド混合物から得られた形質転換体の中には，1g/L 以上のＬ－グルタミン酸を蓄積するクローンが３クローンが存在していた。なお，培地中にもともと含まれていたグ
ルタミン酸は 0.16g/L であり，ATCC13869ΔyggB/pL5kXS(変異処理なし)のグルタミ
ン酸蓄積量は 0.31g/L であった。
表１２に，ATCC13869ΔyggB を変異処理した pL5kXS で形質転換した株を CM2BGU培地（Urea が 1.5g/L である以外は CM2BGU2 培地と同組成）にて試験管培養評価した結果を示す。変異処理時間９０分のプラスミド混合物から得られた形質転換体の中に，1g/L 以上のＬ－グルタミン酸を蓄積するクローンが１クローン存在していた。
【０１３４】【表１１】【０１３５】- 101 -

【表１２】【０１３６】
表１１において，６０分の変異処理時間を行うことで 1g/L 以上のＬ－グルタミン酸を蓄積する生産能を獲得したプラスミドを pL5kXSm-22, 表１２において，９０分の変異処理時間を行うことで 0.9g/L 以上のＬ－グルタミン酸生産能を獲得したプラ
スミドを pL5kXSm-27 とした。ATCC13869ΔyggB/pL5kXS 株，ATCC13869ΔyggB/pL5kX
Sm-27 株，ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-22 株を，実施例２記載の条件で培養し，４時間後の菌体量とＬ－グルタミン酸蓄積を分析した。表１３に，独立した３回の実験による平均値を示した。ATCC13869ΔyggB/pL5kXSm-27 株，ATCC13869ΔyggB/pL5kXS
m-22 株では有意にＬ－グルタミン酸蓄積が上昇していることが確認でき，in vitro
でのランダムな変異導入によってもＬ－グルタミン酸に有利な変異型遺伝子が構築可能であることが示された。なお，pL5kXSm-22 が含む yggB 遺伝子の配列は，配列
番号７３に示した。（２２型変異）
22 型変異は，437 番目のプロリンをセリンに置換する変異であり，例えば配列番号
５の 2745 位の C を T に置換する変異である。また，本変異は，3060 位の C を T に置換する変異を伴っている。この変異型 yggB 遺伝子を配列番号７３に，該遺伝子にコードされる変異型ＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号７４に示す。

【０１３７】- 102 -

【表１３】【０１３８】（１３－３）変異型遺伝子のコリネ型細菌への導入とＬ－グルタミン酸生産確認（１３－２）で得られた新規変異型ｙｇｇＢ遺伝子をコリネ型細菌に導入する。
導入方法は，実施例 6 に記載された方法で pBS4S に変異型遺伝子を導入し，ATCC13869の染色体上の野生型のｙｇｇＢ遺伝子と置換した。この新規変異型遺伝子を導入した株と親株の ATCC13869 株を実施例２と同様の方法で培養を行う。培養終了後，培養液中に含まれるＬ－グルタミン酸の量を公知の方法で測定し，変異導入株がＬ－
グルタミン酸の蓄積が向上していることを確認する。このような方法でＬ－グルタ
ミン酸生産能の向上したｙｇｇＢ変異株を取得することが出来る。
(ｾ) 【実施例１４】【０１３９】＜変異型ｙｇｇＢ遺伝子保持株のグルタミン酸アナログ感受性＞(１４－１)固体培地における４-フルオログルタミン酸感受性
ｙｇｇＢ変異によってＬ－グルタミン酸の生産能が向上している株では，Ｌ－グルタミン酸アナログ感受性が低下していることが予測された。そこで，ｙｇｇＢ変異によるＬ－グルタミン酸のアナログとして，4-フルオログルタミン酸に対する感
受性の変化を検討した。実施例４記載の最少培地に，NaOH で pH6.7 に調整しフィル
ター滅菌した４－フルオログルタミン酸を終濃度 7.5mM となるように添加した。
ATCC13869 株，ATCC13869-L30 株，ATCC13869-A1 株を CM-Dex 培地に塗布して一夜培養した後集菌し，滅菌した 0.85%の NaCl 溶液で洗浄し，図６上部に記載の菌濃度となるように希釈してプレートにスポットした。プレートは 31.5℃で培養し，その経- 103 -

時変化を図６に示した。4-フルオログルタミン酸を無添加の条件では，ATCC13869
株が最も生育が速いのに対し，4-フルオログルタミン酸添加条件では ATCC13869 株の生育が抑えられ，ATCC13869-L 株および ATCC13869-A1 株の方が生育が良好である
ことが示された。
【０１４０】（１４－２）液体培地における４-フルオログルタミン酸感受性
実施例４記載の最少培地（ただし寒天を含まない）に，NaOH で pH6.7 に調整しフィルター滅菌した４－フルオログルタミン酸を終濃度 1.25mM, 2.5mM, 5mM, 10mM,
20mM となるように添加した。ATCC13869 株，ATCC13869ΔyggB 株，ATCC13869-L30
株，ATCC13869-A1 株を CM-Dex 培地に塗布して 31.5℃で一夜培養した後集菌し，滅菌した 0.85%の NaCl 溶液で洗浄し，液体培地に接種し 31.5℃にて振とう培養した。
各菌株において，４-フルオログルタミン酸を無添加の培地での OD660 の値が１に到達した時点で培養を終了し，培養液を適当に希釈して CM-Dex プレートに塗布した。
翌日出現したコロニー数を計測し，液体培養終了時の生菌数とした。４－フルオログルタミン酸無添加区の生菌数を１として，４－フルオログルタミン酸添加による相対生菌数の変化を図７に示した。ATCC13869-A1 株および ATCC13869-L30 株では，
４－フルオログルタミン酸に対する感受性が低下（４フルオログルタミン酸耐性が向上）していることが明らかとなった。
これらの結果から，４-フルオログルタミン酸等，グルタミン酸の構造類縁体の感受性を指標としたスクリーニングによっても本発明のｙｇｇＢ変異株が取得できることが示された。
(ｿ) 【実施例１５】【０１４１】＜odhA 弱化株での変異型 yggB 遺伝子導入株の作成と評価＞【０１４２】
上記実施例９で構築した ATCC13869-L30 株を用いて yggB odhA 二重変異株を構築- 104 -

し，変異型 odhA 遺伝子の評価を行った。
まず，ATCC13869-L 株の odhA 遺伝子に表１４に示す変異を導入した株を構築した。
なお，表１４では，配列番号４３の塩基番号２５２８～２５６２に相当する領域の配列を示した。また，表１５では配列番号４４のアミノ酸番号６９６～７０７に相当する領域の配列を示した。
配列番号４５の塩基配列を有する変異型 odhA 遺伝子が導入された L30sucA8 株を構築するには以下のようにすればよい。まず配列番号５３と配列番号５４に示す合成 DNA をプライマーとして PCR を行い，odhA 断片を調整する。得られた odhA 断片
を BamHI 処理して，タカラバイオ製 Mutan-Super Express Km に付属のプラスミド
pKF19m の BamHI 部位にクローニングした後，5'末端がリン酸化された配列番号５５の合成 DNA と Mutan-Super Express Km に添付されているセレクションプライマーを用いて PCR を行い，得られた PCR 産物で sup0 の E.coli 例えば MV1184 株を形質転換することで変異型 odhA 断片を含むプラスミドを構築する。次にこの断片を BamHI
で切り出し，pBS4S の BamHI 部位に挿入することで変異導入用プラスミドが構築できる。このプラスミドを用いて実施例１記載の方法と同様にして ATCC13869-L 株を形質転換し，染色体に変異導入用プラスミドが挿入された株を取得する。次に，これらの染色体にプラスミドが挿入された株から，スクロースに耐性を示し，かつカ
ナマイシンに感受性を示す株を分離する。さらに odhA 遺伝子の配列を確認し，目的
フレームシフトが導入された株を選択することにより odhA 遺伝子が欠損した
L30sucA8(odhA8)株が構築できる。
【０１４３】
また，以下の方法で yggB 変異株を用いて，他の odhA 変異株を得ることができる。
配列番号４７の塩基配列を有する変異型 odhA 遺伝子が導入された L30sucA801 株の取得には，5'末端がリン酸化された配列番号５５の合成 DNA の代わりに 5'末端がリン酸化された配列番号５６の合成 DNA を用いて上記方法を適用すればよい。
配列番号４９の塩基配列を有する変異型 odhA 遺伝子が導入された L30sucA805 株- 105 -

の取得には，5'末端がリン酸化された配列番号５５の合成 DNA の代わりに 5'末端がリン酸化された配列番号５７の合成 DNA を用いて上記方法を適用すればよい。
配列番号５１の塩基配列を有する変異型 odhA 遺伝子が導入された L30sucA77 株の取得には，5'末端がリン酸化された配列番号５５の合成 DNA の代わりに 5'末端がリン酸化された配列番号５８の合成 DNA を用いて上記方法を適用すればよい。
L30sucA8 株の odhA 遺伝子はフレームシフト変異であるために，αKGDH 活性を有さない。しかし，L30sucA801 株，L30sucA805 株，L30sucA77 株は odhA 遺伝子に欠失があるものの，フレームシフトが起こらない変異となっており，αKGDH 活性を有しているが活性は非改変株より低下している。（データは示さず）【０１４４】【表１４】【０１４５】【表１５】【０１４６】＜odhA 改変株のグルタミン酸生産培養＞
これらの odhA 改変株のＬ－グルタミン酸生産能を，坂口フラスコを用いた培養を- 106 -

行うことにより検証した。表１４に示した株を CM-Dex 寒天培地で 31.5℃で一昼夜培養を行い，フラスコ培地（グルコース 60g/l，硫安 22.5g/l，KH2PO4
7H2O

0.4g/l，FeSO4・7H2O

0.01g/l，MnSO4・4-5H2O

1g/l，MgSO4・0.01g/l，ビタミン B1

200μg/l，

大豆蛋白加水分解液 0.48g/l，ビオチン 300μg/l，KOH を用いて pH8.0 に調整）20mlに 1/6 プレート分の菌体を接種し，予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウム 1g を添加した後，31.5℃，速度 115rpm で振とう培養を行った。培養開始 19 時間目のＬ－
グルタミン酸蓄積を表１６に示した。odhA 改変株の中には，ATCC13869-L 株とほぼ同等のＬ－グルタミン酸蓄積のものも含まれていたが，sucA801, sucA805,sucA77
株は sucA8 株よりも高いグルタミン酸蓄積を示した。これらの結果から，yggB 遺伝
子の変異と共に odhA 遺伝子に変異を導入することによって，さらにＬ－グルタミン
酸収率が向上することを見出した。
(ﾀ) 【実施例１６】【０１４８】＜ATCC14067 株および ATCC14067yggB8 からの odhA 弱化株の構築＞
８型変異を有する yggB 変異株より odhA 欠損株を構築し，odhA 欠損のみを有する株と比較培養を行なった。まず，odhA を完全欠損するためのプラスミドを構築した。
ATCC14067 株の染色体 DNA を鋳型として，配列番号７７と配列番号７８の合成 DNA
を用いて PCR を行い，sucA 遺伝子の上流側断片を調製した。続けて，ATCC14067 株の染色体 DNA を鋳型として，配列番号７９と配列番号８０の合成 DNA を用いて PCRを行い，sucA 遺伝子の下流側断片を調製した。次に，上流側断片と下流側断片を等モルとなるように混合し，これを鋳型として配列番号８１と配列番号８２の合成 DNA
を用いて PCR を行い，odhA を欠失した遺伝子断片を調製した。得られた PCR 断片を
BamHI で処理した後，実施例１で構築した pBS4S にクローニングした。こうして得られるプラスミドを pBSΔsucA47 とした。
pBSΔsucA47 を実施例６記載の方法と同様に ATCC14067 株または ATCC14067yggB8株の染色体に挿入した後，脱落させた。得られたカナマイシン感受性株より染色体- 107 -

DNA を調製し，これを鋳型として配列番号７７および配列番号８０の合成 DNA を用いて PCR を行い，odhA 領域が欠損している株を選択した。こうして構築した odhA
欠損株をそれぞれ ATCC14067ΔodhA 株および ATCC14067ΔodhA yggB８株とした。
構築した ATCC14067ΔodhA 株および ATCC14067ΔodhA yggB８株を実施例３記載の方法で培養した結果を表１７に示した。yggB8 変異によって odhA 変異株の L-グルタ
ミン酸収量を向上できることが明らかとなった。
【０１４９】【表１７】(ﾁ) 【実施例１７】【０１５０】＜2A-1R 株からの symA 欠損株の構築＞
実 施 例 ３ で 構 築 し た ， ｙ ｇ ｇ Ｂ に IS 挿 入 変 異 を 有 す る ２ A-1R 株 よ り ，symA(suppressor of ygg mutation A)遺伝子を欠損した株を構築し，2A-1R 株と比較培養を行なった。ATCC13869 株の NCgl1867 遺伝子の核酸配列およびアミノ酸配列
はそれぞれ配列番号８６および８７に記した。まず，symA 遺伝子を完全欠損するためのプラスミドを構築した。ATCC13869 株の染色体 DNA を鋳型として，配列番号８８と配列番号８９の合成 DNA を用いて PCR を行い，symA 遺伝子の上流側断片を調製した。続けて，ATCC13869 株の染色体 DNA を鋳型として，配列番号９０と配列番号- 108 -

９１の合成 DNA を用いて PCR を行い，symA 遺伝子の下流側断片を調製した。次に，上流側断片と下流側断片を等モルとなるように混合し，これを鋳型として配列番号
８８と配列番号９１の合成 DNA を用いて PCR を行い，symA 遺伝子を欠失した遺伝子断片を調製した。得られた PCR 断片を BglII で処理した後，実施例１で構築した pBS4Sにクローニングした。こうして得られるプラスミドを pBSΔsymA とした。
pBSΔsymA を実施例６記載の方法と同様に 2A-1R 株の染色体に挿入した後，脱落させた。得られたカナマイシン感受性株より染色体 DNA を調製し，これを鋳型として配列番号８８および配列番号９１の合成 DNA を用いて PCR を行い，symA 領域が欠損している株を選択した。こうして構築した symA 欠損株を 2A-1RΔsymA 株とした。
構築した 2A-1RΔsymA 株および親株の 2A-1R 株を実施例３記載の方法で培養した結果を表１８に示した。symA 遺伝子の欠損によって，変異型ｙｇｇＢ遺伝子を有する株のグルタミン酸生産能を向上できることが明らかとなった。
【０１５１】
【表１８】

ク

図面

- 109 -

【図１】

【図２】

【図３】

- 110 -

【図４】

【図５】

【図６】

- 111 -

【図７】(2) 本件発明の概要
前記⑴によると，本件発明の概要は，以下のとおりである。
ア

技術分野・背景技術

本件発明は，発酵工業に関し，調味原料等として広く用いられるＬ－グルタミン酸の製造法及びそれに用いる細菌に関するものである（段落【０００１】）。
従来から，Ｌ－グルタミン酸は，Ｌ－グルタミン酸生産能を有するブレビバクテ
リウム属やコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されていた（段落【０００２】）。
コリネ型細菌によるＬ－グルタミン酸生産は，ビオチン制限，界面活性剤添加，- 112 -

ペニシリン添加等による誘導条件下で行われており，これらの方法を適用しなくてもビオチンが十分存在している非誘導条件下でＬ－グルタミン酸を生成できる株として，界面活性剤温度感受性株，ペニシリン感受性株，セルレニン感受性株，リゾ
チーム感受性株等が開発されていたものの，これらの株は，Ｌ－グルタミン酸生産と引き換えに環境変化への適応力の低下を引き起こしている可能性が高く，Ｌ－グ
ルタミン酸を著量蓄積できる菌株を開発するには相当の労力を要していた（段落【０００３】，【０００４】）。
ビオチン十分条件でＬ－グルタミン酸を生成する株は，α－ケトグルタル酸デヒ
ドロゲナーゼをコードする遺伝子を欠損させることによっても達成されるが，ＴＣ
Ａサイクルを途中で遮断する α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損株は生育が遅いことから菌体量の確保が困難などの課題があった（段落【０００５】）。
コリネ型細菌のｙｇｇＢ遺伝子は，エシェリヒア・コリ（大腸菌）のｙｇｇＢ遺伝子のホモログであり，メカノセンシティブチャンネル(mechanosensitive channel)の一種として解析されているが，Ｌ－グルタミン酸に及ぼす影響については知られていなかった（段落【０００６】）。
イ

本件発明の課題

本件発明は，コリネ型細菌を用いたＬ－グルタミン酸の製造において，Ｌ－グルタミン酸生産能力を向上させる新規な技術を提供することを課題とする（段落【０００７】）。
ウ

課題を解決するための手段等

ｙｇｇＢ遺伝子がコリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産に関与していることを明らかにし，ｙｇｇＢ遺伝子を用いてコリネ型細菌を改変することにより，Ｌ－グルタミン酸の生産能が大幅に向上することを見いだし，本件発明を完成するに至った（段落【０００８】）。
本件発明のコリネ型細菌は，Ｌ－グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌であって，ｙｇｇＢ遺伝子に変異を導入して改変されたことにより，非改変株と比較し- 113 -

てＬ－グルタミン酸生産能が向上したコリネ型細菌である（段落【００１１】）。変異型ｙｇｇＢ遺伝子は，コリネ型細菌においてビオチンが過剰量存在する条件で，Ｌ－グルタミン酸生産能を向上させ得る変異であれば特に制限されない（段落【００６９】）。
(ｱ) 本件発明でｙｇｇＢ遺伝子に導入される変異の一形態は，ｙｇｇＢ遺伝子のＣ末端領域に変異を導入するＣ末端側変異であり，この変異は，配列番号６，
６８，８４，８５のアミノ酸番号４１９－５３３の配列，又は配列番号６２のアミノ酸番号４１９－５２９の配列をコードする領域の塩基配列の一部に導入された変異である（段落【００７０】）。Ｃ末端側変異の一例としては，①転移因子の挿入による変異（２Ａ－１型変異）と②プロリンを他のアミノ酸に置換する変異（６６型
変異，２２型変異）がある（【請求項１】，段落【００７０】～【００７２】，【実施例２】～【実施例６】，【実施例１２】，【実施例１３】，【実施例１７】）。
(ｲ) 本件発明でｙｇｇＢ遺伝子に導入される変異のもう一つの形態は，ｙｇｇＢ遺伝子がコードするＹｇｇＢタンパク質が有すると推測される５個の膜貫通領域（配列番号６，６２，６８，８４，８５の野生型のＹｇｇＢタンパク質のアミノ酸配列において，膜貫通領域はそれぞれ，アミノ酸番号１～２３［第１膜貫通領域］，２５～４７［第２膜貫通領域］，６２～８４［第３膜貫通領域］，８６～１０８［第４膜貫通領域］，１１０～１３２［第５膜貫通領域］）をコードする部分に変異を導入するものであり，①第１膜貫通領域の変異（Ａ１型変異），②第４膜貫通領域の変異（１９型変異），③第５膜貫通領域の変異（Ｌ３０型変異，８型変異）が例として挙げられている（【請求項１】，段落【００７３】～【００７６】，【実施例７】～【実施例１１】，【実施例１５】，【実施例１６】）。
エ

本件発明の効果

本件発明のｙｇｇＢ遺伝子を用いて改変したコリネ型細菌を用いることにより，Ｌ－グルタミン酸を効率よく生産することができる（段落【００１０】）。
２ １９型変異に関する実施可能要件及びサポート要件違反の認定判断の誤り（取- 114 -

消事由１）について(1) コリネ型細菌を用いた発酵法によるグルタミン酸生産についての本件優先日及び本件出願日当時の技術常識
ア

コリネ型細菌を用いた発酵法によるグルタミン酸の工業的生産は，１９６０年代頃から行われていた（乙２，２４，弁論の全趣旨）。
イ

発酵法によるグルタミン酸の生産は，炭素源や窒素源となる各種原料やその他の物質を加えてグルタミン酸生産性コリネ型細菌を培養し，生成されたＬ－
グルタミン酸を培養物から分離するというものであるところ，ビオチンが十分に存在している条件であってもグルタミン酸を生成できる株が開発されるまでは，培地中のビオチン量を制限するか，界面活性剤やペニシリンなどを添加するといった誘導条件下でグルタミン酸の生産が行われることが一般的であった（甲１，１９～２
１，乙２，２４，弁論の全趣旨）。
(2) １９型変異に関する本件発明１１のサポート要件適合性について
ア

特許請求の範囲の記載が，明細書のサポート要件に適合するか否かは，特許請求の範囲の記載と発明の詳細な説明の記載とを対比し，特許請求の範囲に記載された発明が，発明の詳細な説明に記載された発明で，発明の詳細な説明の記載
により当業者が当該発明の課題を解決できると認識できる範囲のものであるか否か，また，その記載や示唆がなくとも当業者が出願時の技術常識に照らし当該発明の課題を解決できると認識できる範囲のものであるか否かを検討して判断すべきもので
ある。
イ(ｱ)

本件発明の課題は，「コリネ型細菌を用いたＬ－グルタミン酸の製造において，Ｌ－グルタミン酸生産能力を向上させる新規な技術を提供すること」であり，本件発明１１の中には，誘導条件下のみならず，非誘導条件下においても生産能力の向上を図るものが含まれているところ，誘導条件下において，１９型変異を導入した株であるＡＴＣＣ１３８６９－１９株の生産能力が野生株に比して向上
していることは，本件明細書の実施例１０（段落【０１２５】～【０１２８】，【表- 115 -

９】，【表１０】）に開示されているといえるから，当業者は，１９型変異について，誘導条件下でグルタミン酸の生産能力向上がみられるものであることを認識できるといえる。
(ｲ) 次に，非誘導条件下における１９型変異の生産能力の向上について検討するに，本件明細書の実施例８の培養は，実施例２と同様の方法で実施されたとされていて，その培地には，請求項６などにいう「過剰量のビオチン」に該当する
３００μｇ／ｌのビオチンが存在していた上，界面活性剤等は添加されていなかったと認められるから，実施例８は，非誘導条件下での１９型変異株の生産能力向上についてした実験である（本件明細書の段落【０１２０】，【００９７】，【００３２】）。
そして，実施例８の【表７】には，以下のとおり，１９型変異株であるＡＴＣＣ
１３８６９－１９株が，野生株に比して０．２ｇ／Ｌ多くのＬ－グルタミン酸を生産したことが示されている。そして，それを受けて本件明細書の段落【０１２０】には，「ＡＴＣＣ１３８６９－１９株は親株のＡＴＣＣ１３８６９株と比べてＬ－グ
ルタミン酸蓄積が大幅に向上していた。」と記載されているから，それらの記載から，当業者は，１９型変異について，非誘導条件下でも本件発明の課題を解決できるものであることを認識するといえる。

ウ

原告らは，実施例８に関して，①実施例２における野生株のグルタミン

酸生産量の値及びブランク値，実施例３におけるブランク値並びに実施例２，３，
５，７，９の値からみて，実施例８における野生株と１９型変異株のグルタミン酸
生産量の違いは誤差の範囲内にすぎず，当業者は，実施例８からグルタミン酸の生産能力が向上したとは認識できない，②ブランク値と変異株及び親株の結果とを対比しないと，実施例８の信用性を評価することはできない，③甲２８の実験や甲３- 116 -

４の実験の結果からも１９型変異株が非誘導条件下でグルタミン酸を生成しないことが裏付けられていると主張する。
(ｱ) 上記①について
本件明細書上，実施例３，６～９は，いずれも実施例２記載の方法又は同様の方法で，培地中に３００μｇ／ｌのビオチンが存在するなどの非誘導条件下で実施されたものである（本件明細書の段落【００９７】，【０１００】，【０１０９】，【０１１２】，【０１１７】，【０１２０】，【０１２３】）。そして，実施例２，３，６の【表１】，【表２】，【表４】，【表５】に記載されているブランク値について，本件明細書に明示的な説明はされていないものの，菌体量を示すＯＤ６２０値がいずれも０．
００２と極めて低い値になっていることからすると，被告が主張するとおり，グルタミン酸生産菌を接種しない培養開始時の培地（初発培地）でのグルタミン酸の濃度を表すものであると認められる。また，甲３６，乙６によると，非誘導条件下での野生株（ＡＴＣＣ１３８６９）のグルタミン酸生産量の値は，培養が進むにつれてグルタミン酸が分解された後の値であると認められる。
上記四つのブランク値が，それぞれ異なっていること（【表１】が０．４ｇ／Ｌ，【表２】と【表４】が０．６ｇ／Ｌ，【表５】が０．７ｇ／Ｌ）からすると，実施例
３，６～９について，実施例２記載の方法又は同様の方法で実施されたと記載されているものの，初発培地におけるグルタミン酸の濃度などの培養条件は実施例又は各培養ごとに異なるものであったと認められる。本件明細書の段落【００９７】の記載及び甲３６，乙６の記載からすると，上記のような各実施例におけるブランク
値の違いは，天然物を起源とする大豆加水分解物に由来するものであると認められる。
そもそも，本件明細書のブランク値及び野生株のグルタミン酸生産量の値は，上記認定のとおりのものであって，これらの値を根拠に，これらの値とは異なる実施
例８における野生株と１９型変異株とのグルタミン酸生産量の違いが誤差に基づくものということはできない。その上，上記認定のとおり，培養条件は，実施例又は- 117 -

各培養ごとに異なるから，なおさら，実施例２や実施例３に表れた数値を根拠に，実施例８における野生株と１９型変異株におけるグルタミン生産量の０．２ｇ／Ｌの違いが誤差に基づくものであるということはできない。
さらに，実施例２，３，５，７，９のその他の数値からみても，実施例８の野生株と１９型変異株のグルタミン酸生産量の０．２ｇ／Ｌの違いが誤差に基づくものということはできない。
以上からすると，上記①は，前記イの判断を左右するものとはいえない。
(ｲ) 上記②について
本件発明の課題は，「コリネ型細菌を用いたＬ－グルタミン酸の製造において，Ｌ－グルタミン酸生産能力を向上させる新規な技術を提供すること」であるところ，
ここでいう「生産能力の向上」とは，「野生株などの非改変株と比較して，Ｌ－グルタミン酸生産能が上昇したこと」を意味する（【請求項１】，【請求項４】，【請求項５】
及び本件明細書の段落【００１５】，【００３１】）から，実施例８において，１９型変異株が，野生株に比してより多くのグルタミン酸を生産することが示されている
以上，ブランク値が記載されていないとしても，実施例８の結果が信用できないものということはできない。
(ｳ) 上記③についてａ

甲１９（特開昭６３－２１４１８９号公報）に，「このようにして得られた本発明の多重強化株を用いてグルタミン酸発酵を行なってＬ−グルタミン酸を製造する方法は，公知の従来のグルタミン酸生産菌を使用する場合とほとんど同じである。
・・・培養を行う装置としては試験管やフラスコ，ジャーファーメンター等が使用可能であり工業化スケールで運転することも当然可能である。
・・・培養の方法としては好気的であればよく，振盪培養でも通気攪拌振培養でもよい。」（５０３頁右上欄下から４行～右下欄１２行）と記載され，甲２０（特開２００４－３１３２０２号公報）にも「発酵は，振とう培養や通気攪拌培養等による好気条件下にて・・・
行うのがよい。」（段落【００２０】）と記載されていることに，本件出願日前に刊行- 118 -

された発酵法に関する文献（乙１４，１５）の記載及び弁論の全趣旨を総合すると，発酵法の実施に当たっては各種の容器や装置が使用可能であり，用いる容器に応じた適宜の方法により十分な酸素を供給する必要があることは，本件出願日当時において，技術常識になっていたと認められる。
ｂ

甲２８の実験では，三角フラスコを用いながら，振とう速度については，本件明細書の段落【０１４６】の記載を根拠に坂口フラスコの振とう速度を採用している上，どのような振とう方式を採用したかも甲２８からは明らかではない。上記本件出願日当時の技術常識からすると，当業者は，本件明細書の段落【０１４６】に明示されている容器が坂口フラスコであるとしても，それにとらわれずに自己が培養に用いる容器や装置に応じた適切な酸素供給方法を選択して発酵法を行うはずであるのに，甲２８の実験では，坂口フラスコの振とう速度として記載されたものを三角フラスコでの培養に当たって機械的に適用しており，その振とう方式も不明であることからすると，甲２８の実験が適切な方法で行われたものとは認められず，甲２８の実験結果は，前記イの判断を左右するものとはいえない。
なお，この点に関連して，原告らは坂口フラスコが国際的には知られておらず，
本件明細書に接した当業者は三角フラスコのような通常のフラスコが用いられたと理解するとも主張するが，上記のとおり，本件出願日当時，当業者は，各種の容器や装置を用いてグルタミン酸の生産に必要な好気条件を適宜設定できたと認められるから，本件明細書において，段落【０１４６】以外に培養容器の記載がないとしても，それが三角フラスコによるものと理解するとはいえず，ましてや三角フラス
コを用いて同段落の振とう速度を適用したものと理解するということはできない。
甲３４の実験についても，「当業者が用いる通常の好気的培養条件であるｂａｆｆ
ｌｅｄ ｆｌａｓｋを活用した３１．５度，２００ｒｐｍ条件」で培養を行ったことが記載されているものの，その他の培養条件の詳細は明らかでなく，また，グルタ
ミン酸の生産量をどのように測定したのかなども明らかではないから，直ちに信用することができず，やはり，前記イの認定を左右するものではない。

- 119 -

(3) 実施可能要件充足性についてア

本件発明１１は方法の発明であるところ，方法の発明における発明の実

施とは，その方法の使用をする行為をいう（特許法２条３項２号）から，方法の発明について実施可能要件を充足するか否かについては，当業者が明細書の記載及び出願当時の技術常識に基づいて，過度の試行錯誤を要することなく，その方法の使用をすることができる程度の記載が明細書の発明の詳細な説明にあるか否かによるというべきである。
イ

前記１(1)の本件明細書の記載内容，前記(1),(2)で検討したところからすると，当業者は，１９型変異について，本件明細書に開示されたところと本件出願日当時の発酵法に関する技術常識から，過度の試行錯誤をすることなく，本件発明１１を実施できるといえる。
(4) 小括以上からすると，１９型変異に関して，本件発明１１にサポート要件違反や実施可能要件違反があるとはいえないから，原告らが主張する取消事由１は理由がない。
３

進歩性欠如の認定判断の誤り（取消事由２，３）について(1) 本件優先日当時のコリネ型細菌におけるグルタミン酸排出に関する知見についてア(ｱ)

コリネ型細菌を用いた発酵法によるグルタミン酸の工業的生産は早くから実用化されていたものの，細菌がどのようなメカニズムでグルタミン酸を菌体外へ排出するのかは長らく解明されていなかった（甲１２，乙１，２，３３）。
(ｲ) 発酵法において，発酵が進んでグルタミン酸の排出が進むと，菌体外の方が，浸透圧が高い状態となるが，そのような状態になった後もグルタミン酸の排出が進行することが本件優先日以前に知られていたが，これは菌体外が低浸透圧の状態になった場合に，浸透圧調節チャネルからグルタミン酸が排出されることだ
けでは説明することができない現象である（乙２８，３９，弁論の全趣旨）。
(ｳ) 本件優先日以前，Reinhard Krämer 博士（以下「クラマー博士」とい- 120 -う。）らは，コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて，Ｌ－リジン，Ｌ－スレオ
ニン，Ｌ－イソロイシンなどのアミノ酸を輸送する担体を発見するとともに，グルタミン酸についても担体によって排出されるものであることを主張する乙３９(Reinhard Krämer 他「Carrier-mediated glutamate secretion by Corynebacterium

glutamicum under biotin limitation」Biochimica et Biophysica Acta 1112 p115-123,
１９９２年）と乙４０（Reinhard Krämer「Secretion of amino acids by bacteria:
Physiology and mechanism」FEMS Microbiology Reviews 13 p75-94,１９９４年）の二つの論文を発表していた（甲２２，乙１，２，３９～４１）。
１９９７年（平成９年）に執筆された甲８の共同執筆者の一人は，クラマー博士
であるところ，甲８は，上記乙３９，４０を引用し，後述のとおり，甲８の実験で観察されたグルタミン酸の排出が担体によるものであるとの結論を導いている（甲８，乙３９，４０，４２）。
イ

上記アに関連し，原告らは，証拠（甲４７～５０）からすると，本件優先日当時，コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて，グルタミン酸が，浸透圧に応じて浸透圧調節チャネルから排出されることが周知となっていたと主張する。
しかし，甲４７には，「特別な条件下で，大腸菌がトレハロースを排出した観察結果（ＳｔｙｒｖｏｌｄとＳｔｒｅｍ

１９９１）およびコリネバクテリウム・グル

タミカムがグルタミン酸を排出した観察結果（Ｓｈｉｉｏら

１９６２）は我々の研究と関連している。」との記載があるにすぎず，これだけで，原告らが主張するような技術常識があったと認めるには足りない。
また，甲４８，４９はいずれも大腸菌に関する文献であって，そこからコリネバ
クテリウム・グルタミカムをはじめとするコリネ型細菌におけるグルタミン酸排出の技術常識の存在を認めることはできない。
甲５０には，その５頁の図に関して，コリネバクテリウム・グルタミカムの低浸透圧における相溶性溶質の排出が，少なくとも３種類の機械受容チャネル（浸透圧調節チャネル）を通じて起こる旨の記載がある。しかし，後述する甲８の記載から- 121 -

すると，浸透圧調節チャネルを通じた排出は全ての溶質について等しく行われるものではなく，特定の溶質について選択的に行われるのであると認められるから，上記排出されるべき「相溶性の溶質」の中にグルタミン酸が含まれるのかは，上記図だけからでは必ずしも明らかになっているとはいえず，甲５０から原告らの主張する技術常識の存在を認めることはできない。
以上からすると，原告らの上記主張を認めるに足りる証拠はない。
(2) 甲８発明の認定の誤りについて（取消事由２）
前記(1)の事実関係を踏まえて，甲８において，原告らが主張するように，グルタミン酸が浸透圧調節チャネルから排出されたと認定できるかについて検討する。
ア

甲８の記載事項（甲８，乙３１，乙３１の２）(ｱ) Ａｂｓｔｒａｃｔａ５７２頁１行～６行「細菌は，低浸透圧ストレスに対して，低分子量の溶質を遊離し，一定の膨脹圧を維持することによって応答する。我々は，コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて，浸透圧の突然の低下による様々な溶質の排出に関わる，浸透圧調節チャネ
ルの機能を研究している。当該チャネルは，グリシンベタイン及びプロリンのような相溶性の溶質の排出を優先的に媒介する。同じような大きさの分子，例えば，グルタミン酸又はリジンの遊離は，制限され，ＡＴＰは，厳しい浸透圧ショックの後であっても，完全に維持された。」
ｂ

５７２頁１３行～１４行「これらの結果は，大腸菌のメカノセンシティブチャネルに類似の浸透圧調節チャネルが，Ｃ．グルタミカムに存在することを示唆する。」(ｲ) Ｒｅｓｕｌｔｓ- 122 -

ａ５７５頁のＴａｂｌｅ１．

ｂ５７５頁右欄１９行～５７６頁１行「表１のデータは，Ｃ．グルタミカムにおいて浸透圧により引き起こされる溶質の排出は，特定の溶質について明確な選択性があることを示す。
・・・表１のデータ
は，浸透圧により引き起こされる排出において，グリシンベタインがエクトインよりも選択的であることを実証する。
・・・アラニンの放出の度合いは，エクトインと類似していたが，一方，グルタミン酸とリジンの流出は顕著に制限されていた。」
ｃ

５７６頁左欄４３行～５２行「化学的または放射化学的方法による本研究における排出の測定において，すべての主要な排出溶質が考慮されたことを確認するため，低浸透圧ショック後の細胞外の培地を１ＨＮＭＲによって分析した・・・。得られたスペクトルから，対応する実験において細胞により放出された主要な化合物は，グリシンベタイン，プロリ
ン及びエクトインであることが証明された。わずかな乳酸塩以外の化合物は，これらの実験において，顕著な量で検出されることはなかった。」(ｳ) Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎａ５７８頁左欄５０行～６０行「低分子質量化合物の流出は，原理的には，膜漏出によって，タンパク質性チャネルによって，又は流出担体によって，媒介されることができる。三つの全ての可能性の例が既報である。この流出は，特定の基質に対して顕著な優先傾向を示すこ- 123 -

とが見出されたため，Ｃ.グルタミカムについては，単純な膜漏出の可能性は排除された。担体の関与は，複数の実験結果から非常に可能性が低いことが示された。こ
の排出速度は非常に速く，すなわち，Ｃ.グルタミカムについてこれまでに既報の全ての担体（最速のものは，完全に誘導されたベタイン取り込み担体（（ＢｅｔＰ）の
１１０µｍｏｌ・ｍｉｎ－１・ｇｄｍ－１（Ｆａｒｗｉｃｋら，１９９５）である）よ
りもずっと速い。」
ｂ５７８頁右欄２６行～４０行「このシステムの興味深い特性は，特定の溶質に対するその選択性である。Ｅ．
ｃｏｌｉにおいては，激しい浸透圧ショックのもとでは，多かれ少なかれ，全ての低分子量化合物は放出された。Ｃ．グルタミカムでは，そのようなことは起こらず，
補償溶質が主に排出された。グリシンベタインやプロリンと大きさが類似している
分子，例えば，グルタミン酸も，あるいはより小さい無機イオン（Ｎａ ＋，Ｋ＋）でさえも，明らかにこのチャネルをグリシンベタインやプロリンと同じ程度には使用していない。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて，激しい低浸透圧ショック後にやはり放出されるＡＴＰのような分子は（Ｂｅｒｒｉｅｒら，１９９２），Ｃ．グルタミカムにおいては完全に保持されていた。結果として，このチャネルの特性は，Ｅ．ｃｏｌｉシ
ステムとは異なるに違いない。Ｃ．グルタミカムのチャネルの分子としての正体（アイデンティティ）は判明していないが，観察されたＣ．グルタミカムのチャネルを介した透過性の順序については，異なる特異性を有する複数のチャネルが存在する
ことにより説明可能である。」
ｃ５７８頁右欄４６行～５５行「非特異的チャネル阻害剤Ｇｄ３＋に対するこのチャネルの感受性の欠如は（Ｂｅｒｒｉｅｒら，１９９２；Ｓｃｈｌｅｖｅｒら，１９９３；Ｈａｓｅら，１９９５），Ｅ．ｃｏｌｉにおいて記載されクローン化されたＧｄ３＋感受性ＭｓｃＬチャネルとは異なるものとして，それをさらに定義する（Ｓｕｋｈａｒｅｖら，１９９４）。しかしながら，この非特異的遮蔽剤が作用しないその他の例も存在する（Ｂｅｒｒｉ- 124 -

ｅｒら，１９９６）。したがって，Ｃ．グルタミカムのチャネルは，電気生理学的技
術を用いることにより大腸菌において同定されたその他のタイプ，即ち，ＭｓｃＳと類似するかもしれない（Ｍａｒｔｉｎａｃら，１９８７，１９９０；Ｚｏｒａｔ
ｔｉとＰｅｔｒｏｎｉｌｌｉ，１９８８；Ｂｅｒｒｉｅｒら，，１９９６）。」ｄ５７９頁左欄３９行～４６行「最後に，ここで強調されるべきは，ここで述べた排出チャネルは，よく知られた
特定の代謝条件下で観察されるＣ．グルタミカムのグルタミン酸排出とは関係がな
いことである。継続的なグルタミン酸生産の条件下でのグルタミン酸排出は，その活性に関し浸透圧変化に応答しているようにも見えるが（ランバートら，１９９５年），その排出は，以前から示されているエネルギーに依存する特定の担体系によりなされるものである（グートマンら，１９９２年，クラマー，１９９４年）。」
イ

検討

甲８のＴａｂｌｅ １．には，上記のとおり，低浸透圧の状態になった際にグルタミン酸が排出されていることが記載されているが，ｂｅｆｏｒｅの値を基準にその排出量を検討すべきとする原告らの主張を前提としても，グルタミン酸は，浸透圧が５４０ｍＯｓｍになるまでほとんど排出されず，５４０ｍＯｓｍになって２０％が排出されているにすぎないところ，これは，全部で１１種類検討されている溶質の中でＡＴＰに次いで小さな値である。そして，上記のようなＴａｂｌｅ

１．の結果を受けて，クラマー博士をはじめとする甲８の執筆者らは，グリシンベタインなど多くが排出されている溶質については浸透圧調節チャネルから排出されたとしつつ，グルタミン酸の排出については，浸透圧調節チャネルではなく，担体による排出であるとの結論を導いている。
Ｔａｂｌｅ

１.でグルタミン酸に次いで排出が制限されていることが観察されたリジンについては，前記(1)アで認定したとおり，本件優先日当時までに，その輸送を担う担体がクラマー博士らによって発見されており，グルタミン酸の排出についてもリジンなどと同様に担体によるものであるとの説がクラマー博士らによって- 125 -

提唱されていた。そのクラマー博士が，自ら実験をした上でＴａｂｌｅ

１.の結果を分析し，甲８の共同執筆者の一人として上記のような結論を導いていることからすると，甲８に接した当業者が，それと異なる結論を敢えて着想するとは通常は考え難いところである。
以上からすると，原告らが主張するように，当業者が，Ｔａｂｌｅ

１.の結果を受けて，甲８に記載された浸透圧調節チャネルをグルタミン酸の排出と関連付けて認識すると認めることはできないというべきである。
そして，上記アで認定した甲８の記載内容からすると，本件審決の甲８発明の認定に誤りはなく，原告ら主張の取消事由２は理由がない。
(3) 容易想到性判断の誤りについて（取消事由３）
本件発明１と甲８発明との間には，本件審決が認定した前記第２の３(1)イの一致
点及び相違点があることが認められる。
上記相違点の容易想到性について検討するに，前記(1)，(2)で検討したとおり，
本件優先日当時に，コリネバクテリウム・グルタミカムをはじめとするコリネ型細菌において，浸透圧調節チャネルがグルタミン酸の排出に関与しているということが当業者において周知になっていたとは認められないし，甲８に浸透圧調節チャネ
ルがグルタミン酸の排出に関与していることが記載されているとも認められない。
原告らは，甲８発明に，甲１０，１３～１５及び周知技術・技術常識を適用する
ことで，１９型変異の構成を得ることができると主張するが，甲１０，１３～１５に，コリネ型細菌において，浸透圧調節チャネルからグルタミン酸が排出されることを示唆する記載はなく，他に,そのような周知技術・技術常識が存したとも認められない。
そうすると，当業者が，甲８発明に甲１０，１３～１５及び周知技術・技術常識を適用して，コリネ型細菌において浸透圧調節チャネルをコードするｙｇｇＢ遺伝子に着目し，それにグルタミン酸の排出を促すような変異を導入することを動機付られることはないというべきである。

- 126 -

その他，この点に関する原告らの主張は，上記認定を何ら左右するものではない。
したがって，上記相違点を容易想到ではないとした本件審決の判断に誤りはない。
(4) 本件発明４の容易想到性について
本件発明４は，本件発明１の（ｉｉ）の「配列番号６，６２，６８，８４もしく
は８５のアミノ酸配列のアミノ酸番号１－２３，８６－１０８，及び１１０－１３２からなる群から選ばれる領域における１～５個のアミノ酸の置換，欠失，又は挿入」の変異の下位概念である「配列番号６，６２，６８，８４もしくは８５のアミノ酸配列において，１００位のアラニンをスレオニンに，及び／または１１１位のアラニンをスレオニンもしくはバリンに置換する変異」を有する変異型ｙｇｇＢ遺伝子が導入されたコリネ型細菌の発明であるから，本件発明１が，甲８や甲１０，
１３～１５及び周知技術・技術常識から当業者が容易に想到することができたものとはいえない以上，容易想到とはいえない。
(5) 本件発明６，７，９～１１の容易想到性について
本件発明６，７，９～１１は，本件発明１に更なる限定を加えた発明であるから，
前記(3)のとおり，本件発明１が，甲８や甲１０，１３～１５及び周知技術・技術常識から当業者が容易に想到することができたものとはいえない以上，いずれも容易
想到とはいえない。
なお，原告らは，本件発明１１について，１９型変異が非誘導条件下ではグルタミン酸を生産能力が向上しないものであるから，本件発明１１が進歩性を欠くとも主張しているが，前記２のとおり，１９型変異は非誘導条件下でもグルタミン酸を非改変株より多く生産するものであるから，その主張は採用することができない。
(6) 本件発明１２の容易想到性について
前記(2)で検討したとおり，甲８にグルタミン酸が浸透圧調節チャネルから排出されていることが記載されていると認められないことからすると，本件審決の前記第２の３(1)エ記載の本件発明１２と甲８発明の相違点の認定に誤りはない。
また，前記(3)のとおり，当業者が，甲８発明に甲１０，１３～１５及び周知技術・- 127 -

技術常識を適用して，コリネ型細菌において浸透圧調節チャネルをコードするｙｇｇＢ遺伝子に着目し，それにグルタミン酸の排出を促すような変異を導入することを動機付られることはない。
したがって，本件発明１２が甲８発明に甲１０，１３～１５及び周知技術・技術
常識を適用して容易に想到することができたものとはいえない。
(7) 小括以上からすると，その余の点について判断するまでもなく，原告らの主張する取消事由２，３はいずれも理由がない。
４１９型変異以外に関する実施可能要件及びサポート要件違反の認定判断の誤り（取消事由４）について(1) ２Ａ－１型変異（本件発明１の（ｉ）及び（ｉ’））について
ア

前記１，３で検討したところに照らすと，本件発明は，コリネ型細菌において，ｙｇｇＢ遺伝子によりコードされる浸透圧調節チャネルであるＹｇｇＢタ
ンパク質が，Ｌ－グルタミン生産の排出に関与しているという知見に基づき，ｙｇ
ｇＢ遺伝子に変異を導入してＹｇｇＢタンパク質を改変し，よりグルタミン酸を排出しやすい菌株を作成することをその技術思想とするものといえる。
そして，本件発明１では，ｙｇｇＢ遺伝子に導入すべき変異として，遺伝子の領域と膜貫通の観点から大別し，①ｙｇｇＢ遺伝子のうち，Ｃ末端領域をコードする
部分に変異を導入するもの（２Ａ－１型変異［本件発明１の（ｉ）及び（ｉ’）］，６
６型変異，２２型変異［本件発明１の（ｉ’’）］。Ｃ末端側変異）と②ｙｇｇＢ遺伝子のうち，第１，第４，第５の膜貫通領域をコードする部分に変異を導入するもの（本件発明１の（ｉｉ）。膜貫通領域の変異）の二種類を示している。
イ

本件明細書には，ｙｇｇＢ遺伝子に導入すべき変異のうち，段落【００７０】にＣ末端側変異一般についての説明があるほか，段落【００７１】に２Ａ－
１型変異について，Ｃ末端領域において４１９位より下流の領域が五つのアミノ酸に置換されたもののほか，配列番号６，６２，６８，８４及び８５のＣ末端領域を- 128 -

欠失又は置換する変異が含まれると記載され，さらに，本件明細書の実施例５，６には，Ｃ末端領域において４１９位より下流の領域が五つのアミノ酸に置換された
２Ａ－１型変異において，グルタミン酸の生産能力が向上したことが確認されたことが記載されている（段落【０１０７】～【０１１３】）。
上記アのような基本となる技術思想を踏まえつつ，本件明細書の上記記載に接した当業者は，２Ａ－１型変異（本件発明１の（ｉ）及び（ｉ’））においては，Ｃ末端領域に欠失や置換等の変異が導入されることで，Ｃ末端領域の立体構造が改変されてグルタミン酸が排出されやすくなり，その生産能力の向上が図られるものと認
識すると認められるし，本件明細書の記載を手掛かりに過度の試行錯誤をすることなく，２Ａ－１型変異に係る本件発明１の（ｉ）及び（ｉ’）の変異を実施することができるといえる。
ウ

原告らは，２Ａ－１型変異（本件発明１の（ｉ）及び（ｉ’）の変異）は，欠失や本件明細書に記載された五つのアミノ酸への置換以外の変異の態様を含むが，それらについて同じ効果が得られるのかは予測不可能であるし，欠失の実施例は存在しないと主張する。
しかし，上記のとおり，２Ａ－１型について，当業者は，本件明細書の記載から，
Ｃ末端領域の立体構造の変化によって，グルタミン酸生産能力の向上が図られるという，その基本的な原理を認識できるといえる。
また，本件明細書の実施例５，６では，上記のとおり，Ｃ末端領域において４１
９位より下流の領域が五つのアミノ酸からなる短いアミノ酸残基に置換されたタイプの２Ａ－１型変異について生産能力が向上したことが開示されているから，その変異の態様からすると，当業者は，生産能力の向上は，Ｃ末端領域の立体構造が改変されたことによるものと認識でき，Ｃ末端領域が欠失した場合でも，同様に，Ｃ末端領域の立体構造が改変されることを認識し，グルタミン酸生産能力が向上すると予測することができるといえる。
上記に加えて，変異を導入する領域についても一定の限定が付されていることも- 129 -

考え併せると，本件明細書で開示されていない他の態様についてもサポート要件及び実施可能要件が欠けるとはいえず，原告らの上記主張は採用することができない。。
(2) ６６型変異，２２型変異（本件発明１の（ｉ’’）の変異）について
ア

本件明細書の段落【００７２】には，置換可能なｙｇｇＢ遺伝子のＣ末端側のプロリンが１２個開示されるとともに，同プロリンがＹｇｇＢタンパク質の立体構造維持のために重要な役割を果たしていると考えられることが記載されている。また，本件明細書の実施例１２，１３では，４２４番目のプロリンをロイシンに（６６型変異），４３７番目のプロリンをセリンに（２２型変異）それぞれ置換した変異株を作成したことが記載され，実施例１３の２２型変異株については，実際にグルタミン酸の生産能力が向上したことが記載されている（段落【０１３０】～【０１３８】）。
以上の本件明細書の記載に加えて，証拠（乙１９～２２）及び弁論の全趣旨によると，一般にプロリンが，タンパク質の立体構造形成に関与する特異な性質を有す
るアミノ酸であることは当業者に周知であり，これが上記本件明細書の段落【００７２】の記載と整合的であることからすると，当業者は，前記(1)の本件発明の基本的な技術思想も踏まえ，Ｃ末端領域のプロリンを他のアミノ酸に置換することでＣ末端領域の立体構造が改変されて，ＹｇｇＢタンパク質からグルタミン酸が排出されやすくなって本件発明の課題が解決できると認識するといえるし，上記明細書の記載及び技術常識から，過誤の試行錯誤をすることなく，本件発明１の（ｉ’’）の変異を実施することができるものと認められる。
イ

原告らは，大多数のプロリンについて立体構造形成への寄与は検証されていないことなどから，当業者は，各プロリンの置換がグルタミン酸生産能力の向上をもたらすのかについて，これを逐一確認する必要があると主張する。
しかし，上記のとおり，基本的な原理は明らかにされている上，置換可能なプロリンの数が限定されていることからすると，原告らが主張するような点をもって，過度な試行錯誤であるということはできない。

- 130 -

(3) 膜貫通領域の変異（本件発明１の（ｉｉ）の変異）について
ア

ｙｇｇＢ遺伝子に導入すべき変異のうち，本件発明１における膜貫通領域の変異は，アミノ酸配列の１－２３（第１膜貫通領域），８６－１０８（第４膜貫通領域），１１０－１３２（第５膜貫通領域）の各領域において１～５個のアミノ酸を置換，欠失又は挿入するというものである。
本件明細書においては，変異の実施例が，それぞれの膜貫通領域に対応して一つ又は二つ記載されており（段落【００７４】～【００７６】），第１膜貫通領域の変異の例としてＡ１型変異（配列番号６のアミノ酸配列の１４番目のロイシン，１５番目のトリプトファン間にシステイン，セリン，ロイシンが挿入された変異）が，第４膜貫通領域の変異の例として１９型変異（配列番号６のアミノ酸配列の１００
番目のアラニンがスレオニンに置換された変異）が，第５膜貫通領域の変異の例としてＬ３０型変異（配列番号６のアミノ酸配列の１１１番目のアラニンがバリンに置換された変異）及び８型変異（配列番号６２のアミノ酸配列の１１１位のアラニ
ンがスレオニンに置換された変異）がそれぞれ記載されている。
さらに，本件明細書では，実施例７として，Ａ１型変異株の作成方法と同株でグ
ルタミン酸の生産能力が向上していること（段落【０１１４】～【０１１８】），実
施例８として，１９型変異株の作成方法と同株でグルタミン酸の生産能力が向上していること（段落【０１１９】～【０１２１】），実施例９として，Ｌ３０型変異株の作成方法と同株でグルタミン酸の生産能力が向上していること（段落【０１２２】～【０１２４】）及び実施例１１として，８型変異の作成方法（段落【０１２９】）が，それぞれ記載されている。
前記(1)のとおり，本件発明の基本的な技術思想は，ｙｇｇＢ遺伝子に変異を導入することで，浸透圧調節チャネルを形成するＹｇｇＢタンパク質に改変を加えて，グルタミン酸を排出しやすくするというものであり，本件発明１の（ｉｉ）は，膜貫通領域に改変を加え，膜貫通領域の立体構造を改変するというものである。このように課題を解決するための基本的な原理が明らかにされていることに加え，グル- 131 -

タミン酸の生産能力の向上がみられた実施例が，上記のように三つの膜貫通領域に対して一つ又は二つ記載されていること，変異を導入する領域が限定されていて，置換，欠失又は挿入するアミノ酸の数も１～５個と限定されたものであることからすると，当業者は，本件発明１の（ｉｉ）について，本件発明１の課題を解決できるものであると認識すると認められるし，本件明細書の上記各記載を手掛かりに，過度の試行錯誤をすることなく，本件発明１の(ｉｉ）の変異を実施することができるものと認められる。
イ

原告らは，多数のコリネ型細菌を構築して生産能を測定すればよいというのは過度の試行錯誤であると主張する。
しかし，上記アのとおり，基本的な原理は明らかにされている上，かつ変異を導入する領域や置換等するアミノ酸の個数が限定されていることからすると，原告らが主張するような点をもって，過度な試行錯誤であるということはできない。
(4) 配列番号８５のアミノ酸配列についてア

本件明細書の段落【００３５】は，配列番号８５のアミノ酸配列について，置換又は欠失してよい箇所をＸａａで示している。証拠（乙２３，２６）によると，タンパク質の活性中心や機能上重要な部位では進化の過程の中でアミノ酸置換が起きない（タンパク質の機能的制約）一方で，それ以外の部位ではタンパク質の立体構造を保存するような，大きさや極性のよく似たアミノ酸同士による置換（保存的置換）が観察されるとされており，これは当業者にとって周知であったと認められる。これに加えて，本件明細書の段落【００３４】，【００７８】に「上記置換は保存的置換が好ましく」などとして，保存的置換の具体例が開示されていることを考え併せると，当業者は，配列番号８５のＸａａで示された箇所は，上記のようなタンパク質にとって機能上重要ではなく，置換・欠失が許容されている部位であり，どのような置換をすることが許容されるかについても，上記の保存的置換の意
義を踏まえ，一定の範囲のものを認識することができるといえる。
そうすると，本件明細書には，ｙｇｇＢ遺伝子に導入すべき変異として，他の配- 132 -

列と同列で配列番号８５のアミノ酸配列のＣ末端側変異と膜貫通領域変異について記載され，前記(1)～(3)のとおり，他の配列の実施例があることを考え併せると，本件発明１の配列番号８５のアミノ酸配列について，本件明細書に実施例がなくても，当業者は，配列番号８５のＸａａで示された箇所は，置換・欠失が許容されている部位であるとして，保存的置換の意義を踏まえ，一定の範囲のものを認識し，本件発明１の（ｉ），（ｉ’），（ｉ’’）（ｉｉ）の変異を導入した場合に本件発明１の課題を解決できると認識するし，過度の試行錯誤をすることなく本件発明１を実施することができるものと認められる。
イ

原告らは，タンパク質の立体構造の形成に関与するプロリンを置換，欠失，挿入したりすると，タンパク質の立体構造が著しく変化し，浸透圧調節チャネ
ルとして機能しなくなる可能性がある上，配列番号８５が採り得るバリエーション
は膨大な数となると主張する。
しかし，当業者は，上記アの保存的置換に関する知見から，無制限に置換可能ではなく，浸透圧調節チャネルとしての機能を喪失させるようなものについては，本件発明１の範囲に含まれるものではないと認識するものと認められるし，バリエー
ションの数についても，上記アのとおり，一定範囲のものに限られると認められるから，原告らの主張は採用することができず，上記アの認定は左右されない，(5) 小括以上からすると，本件訴訟で原告らが主張する事由に基づいて，本件発明が，サポート要件及び実施可能要件に違反するとはいえず，原告らが主張する取消事由４
は理由がない。
５

明確性要件違反についての認定判断の誤り（取消事由５）について(1) 本件発明６，１２の記載について
ア

特許を受けようとする発明が明確であるか否かは，特許請求の範囲の記載のみならず，明細書の記載及び図面を考慮し，また，当業者の出願時における技
術常識を基礎として，特許請求の範囲の記載が，第三者に不測の不利益を及ぼすほ- 133 -

どに不明確であるか否かという観点から判断されるべきである。
本件明細書の段落【００３２】には，「『過剰量のビオチンを含む条件』とは，例
えば，培地中にビオチンを３０μｇ／Ｌ以上，好ましくは４０μｇ／Ｌ，さらに好ましくは５０μｇ／Ｌ含む条件をいう。」と記載されている。
また，前記２(1)で認定したとおり，発酵法を用いたグルタミン酸の工業的生産は
１９６０年代頃から行われており，ビオチンが十分に存在する条件下でもグルタミン酸を生産できる株が開発されるまでは，誘導条件の一つとして，ビオチンを制限
してグルタミン酸を生産することが広く行われていたと認められる。このことに前記１(1)の本件明細書の記載を総合すると，本件発明６，１２は，非誘導条件下でも生産能力の向上を図ることができる発明であると認められる。
したがって，当業者は，本件発明６，１２にいう「過剰量のビオチン」とは，本件明細書の段落【００３２】にあるような誘導条件に当たらないような量のビオチンを指すものであると理解できるものと認められる。
以上からすると，本件発明６，１２が明確性要件を欠くとはいえない。
イ

原告らは，本件明細書の段落【００３２】に記載された事項が【請求項６】に記載されていないから不明確であると主張するが，上記アのとおり，特許請
求の範囲が不明確か否か判断するに当たって，明細書の記載や技術常識を参酌することが許されないということはないから，その主張は採用することができない。
(2) 本件発明７の記載についてア

本件発明７にいう「Ｌ－グルタミン酸アナログ」について，本件明細書の段落【００６８】には，「Ｌ－グルタミン酸アナログ」に該当する具体的な物質が１３種類列挙されている上，段落【０１３９】，【０１４０】には，列挙された物質の一つである４－フルオログルタミン酸に対する耐性が向上している菌株についての実施例が記載されている。したがって，当業者は本件発明７にいう「Ｌ－グルタ
ミン酸アナログ」にどのような物質が含まれるかを理解することができるといえ，本件発明７が明確性要件を欠くとはいえない。

- 134 -

イ

原告らは，本件明細書の段落【００６８】，【０１３９】，【０１４０】には「Ｌ－グルタミン酸アナログ」に包含される物質の一部しか列挙されていないか
ら不明確であると主張するが，明確性の要件に違反するかは，第三者に不測の不利益を及ぼすほどに不明確であるか否かという観点から検討されるべきものであり，
本件では，上記アのように具体的な物質が数多く列挙されているから，当業者は，どのような物質が「Ｌ－グルタミン酸アナログ」に含まれるのかを認識できるものということができる。
したがって，原告らの上記主張は採用することができない。
(3) 本件発明８の記載についてア

本件明細書の段落【００８２】には，請求項８にあるｓｙｍＡ遺伝子について，「変異型ｙｇｇＢ遺伝子の機能を抑制する遺伝子とは，ｓｙｍＡ遺伝子が挙げられる（supresser of yggB mutation）。ｓｙｍＡ遺伝子は，コリネバクテリウム・
グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の Genbank Accession No. NC_003450 として登録されているゲノム配列中の塩基番号 2051306..2051845 にコードされており，ＮＣｇ
ｌ１８６７として登録されている（NP_601149. hypothetical prot...[gi:19553147]）。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ

ＡＴＣＣ１３８６９のｓｙｍＡ遺伝子を配列番号８６の塩基番号 585～1121 に示す。」と記載され，さらに，段落【０１５０】では，ｓｙｍＡ欠損株の作成方法が具体的に記載されている。当業者は，これらの記載から請求項８の記載内容を明確に理解することができると認められるから，本件発明８が明確性要件を欠くとはいえない。
イ

原告らは，請求項８には，「（ｉ）配列番号８６の塩基番号５８５～１１２１の塩基配列を含むＤＮＡ」との記載があるから，当該ＤＮＡが配列番号８６の
塩基番号５８５～１１２１の塩基配列以外にどのような配列を含むのか不明であるから，本件発明８の記載は不明確であると主張するが，上記のとおり，「ｓｙｍＡ遺伝子」の意味は明確であるから，本件発明８が明確性要件を欠くということはできない。

- 135 -

(4) 本件発明９の記載について
ア

請求項９にいう「α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下する」

について，本件明細書の段落【００８３】に「『α－ケトグルタル酸デヒドロゲナー
ゼ活性が低下する』とは，α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して低下していることをいう。」と記載されているから，当業者はその意味を理解することができるといえる。
したがって，本件発明９が明確性要件を欠くとはいえない。
イ

原告らは，「低下」についての比較の対象が，非改変株であるというのであれば，その旨請求項に明確に規定すべきであると主張するが，前記(1)アのとおり，特許請求の範囲の記載が不明確か否かを判断するに当たって，明細書の記載を考慮することが許されないということはないから，その主張を採用することができない。
(5) 本件発明１０，１１の記載について
前記(3)，(4)のとおり，本件発明８，９はいずれも明確であるから，本件発明８，９を引用する本件発明１０，１１についても明確性要件を欠くとはいえない。
(6) 本件発明６の請求項４，５を引用する部分の記載について
請求項４は，本件明細書の段落【００７５】，【００７６】に記載された１９型変異，Ｌ３０型変異及び８型変異を特定したものであるから，当業者は，本件発明６の請求項４を引用する部分には，（ｅ）～（ｊ）の変異型ｙｇｇＢ遺伝子が対応し，同引用部分とその他の（ａ）～（ｄ），（ｋ）～（ｎ）とは関係がないことを理解できる。
同様に，請求項５は，本件明細書の段落【００７４】に記載されたＡ１型変異を特定したものであるから，当業者は，本件発明６の請求項５を引用する部分には，（ｃ），（ｄ）の変異型ｙｇｇＢ遺伝子が対応し，同引用部分と（ａ），（ｂ），（ｅ）～（ｎ）とは関係がないことを理解できる。
以上からすると，本件発明６の請求項４，５を引用する部分の記載及び請求項６を引用する本件発明７～１１が明確性要件を欠くとはいえない。

- 136 -

(7) 小括以上のとおり，本件発明６～１２はいずれも明確性要件を欠くものとはいえず，原告らが主張する取消事由５は理由がない。
第５結論

よって，原告らの請求にはいずれも理由がないからこれを棄却することとして，主文のとおり判決する。

知的財産高等裁判所第２部

裁判長裁判官
森

義

之

裁判官
眞

鍋

美

熊

谷

大

穂

子

裁判官

- 137 -

輔