Res. Org. Geochem. 25, 91­94 (2009)〔有機地球化学会 30 周年記念事業 地球・環境有機分子検索マニュアル No.22〕

技術論文

現生ハプト藻 Emiliania huxleyi 培養試料中の長鎖アルケンの GC/MS 解析 *,天羽美紀 ** ***・萩野恭子 **・鈴木德行 **・堀口健雄 **・山本正伸 ****
（2009 年 7 月 13 日受付，2009 年 9 月 25 日受理）

2. 試

1. はじめにハプト藻の Emiliania huxleyi は，長鎖アルケノンを作る最も主要な種としてよく知られている。
長鎖アルケノンの不飽和指標は古水温計として，また，その濃度はハプト藻の生産量の指標として利用されている（e.g., Sikes and Volkman, 1993; Amoand Minagawa, 2003; Yamamoto et al., 2005）。これ料

実験には，ベーリング海から単離された NIES1312 株（国立環境研究所）を用いた。電子顕微鏡による円石の形態観察の結果，NIES–1312 株の表現型は Hagino et al.（2005）による B/C と同定された。同株を MNK 培地を用いて 18 ℃，明期 18 時間・暗期 6 時間の光周期で培養した。細胞の増殖までに，E. huxleyi の一部の株では，アルケノンと同じ炭素数 37 や 38 の長鎖アルケンを生合成する

速度をフックスローゼンタル血球計算器（エルマことが報告されている（Conte et al., 1995）。これ（時間に対して指数関数的に細胞数が増加する時

らの長鎖アルケンは，南大洋のように水温の低い海域の堆積物中で検出されている（Sikes and Volk-期）に脂質分析用の試料を採取した。

販売株式会社）を用いてモニターし，対数増殖期

3. 分析方法

man, 1993; Sikes et al., 1997）。
E. huxleyi には炭酸塩の殻である円石の形態にい3.1. 長鎖アルケンの抽出・分離

くつかの表現型があり，その分布は海流系に規制されていることが報告されている。温暖な黒潮海流では，表現型 A が多産し，寒冷な親潮域では表冷凍凍結された培養試料（27 ml）を解凍後，GF/F フィルター（Whatman）で濾過をした。その後，

現型 B や B/C，C が多産する（Hagino et al, 2005）。

フィルター試料をメタノール（HPLC 用）/ ジクロロメタン（HPLC 用）（3:1）20 ml，メタノール / ジ

本報では，寒冷な親潮域で採取された E. huxleyi

クロロメタン（1:1）20 ml，ジクロロメタン 20 mlの培養株について表現型の同定を行い，その中の長鎖アルケンの分析を行った。以下に E. huxleyi

でそれぞれ一回ずつ超音波抽出を行った。抽出物

培養試料の長鎖アルケンの分析方法とマススペク

はロータリーエヴァポレーターを用いて，ウォーターバスを 27℃に設定し乾固した。得られた抽出

トルの解釈について報告する。

物をパスツールピペットに硫酸ナトリウムを詰め* GC/MS analysis of unsaturated long-chain alkenes in culture samples of recent Haptophyte Emiliania huxleyi.
** 北海道大学大学院理学研究院自然史科学部門，〒 060-0810 札幌市北区北 10 条西 8 丁目
Miki Amo, Kyoko Hagino, Noriyuki Suzuki, Takeo Horiguchi: Department of Natural History Sciences, Faculty ofScience, Hokkaido University, N10 W8, Kita-ku, Sapporo 060-0810, Japan.
*** 独立行政法人 石油天然ガス・金属鉱物資源機構 R&D 推進部，〒 261-0025 千葉市美浜区浜田 1-2-2
Technology Research & Development Department, Japan Oil, Gas and Metals National Corporation, 1-2-2, Hamada,Mihama-ku, Chiba 261-0025, Japan.
mail: amo-miki@jogmec.go.jp, Tel: 043-276-4308**** 北海道大学大学院地球環境科学研究院地球圏科学専攻，〒 060-0810 札幌市北区北 10 条西 5 丁目
Masanobu Yamamoto: Division of Earth System Science, Faculty of Earth Environmental Science, Hokkaido
University, N10 W5, Kita-ku, Sapporo 060-0810, Japan.

−91−

天羽美紀・萩野恭子・鈴木德行・堀口健雄・山本正伸

たカラムに通し，水を除去した。抽出物を乾固した後に，シリカゲルカラムクロマトグラフィー（45mm 長，6 mm 内径，5% H2O; 70-230 mesh, Merck）て分析した。オーブン温度は 40℃で 2 分保持し，300℃まで 4℃ / 分で昇温した後，300℃で 20 分間保持した。キャリアガスは高純度ヘリウムを用いによって以下の 4 つのフラクションに分画した。 た。質量分析計によるイオン化は電子衝撃イオン
溶出液の順序はヘキサン（HPLC 用）3 ml（F1 フラ （EI）法であり，全イオンスキャンモード（m/z 50クション），ヘキサン / トルエン（HPLC 用）（3:1） 550）
，イオン化電圧は 70eV で行った。
3 ml（F2 フラクション），トルエン 4 ml（F3 フラク

4. 結ション），トルエン / メタノール（3:1）3 ml（F4 フラクション）である。F1 フラクションをその後の果分析に供した。

長鎖アルケンは，GC/MS で分析を行った。GC/MS のガスクロマトグラム（イオンクロマトグラム）

3.2. ガスクロマトグラフィー・質量分析（GC/MS）

を Fig. 1 に示す。同定された化合物の名称を Table
1 に，質量スペクトルと構造式を Fig. 2 に示す。

F1 フラクションを，Agilent 6890 ガスクロマト

長鎖アルケンは C31, C33, C37, C38 のアルケンが検グラフ・5975 質量検出器計（スプリットレス注入法，CP-Sil5CB（60 m 長，0.25 mm 内 径，0.25 μm出された（Fig. 1 および Table 1 のピーク番号 1, 2, 3,4, 5, 6, 7）。長鎖不飽和アルケンの同定は GC/MS に膜厚）キャピラリーカラム；VARIAN）に導入しよる質量スペクトルを Rieley et al.（1998）と Grossiet al.（2000）と比較して行った。アルケンの分子イオンピークは通常はっきりしているため，すべてのアルケンから分子イオン（M）が得られた。ま

Relative Intensity

た，飽和炭化水素の場合と同じく，直鎖アルケンは 14 単位の間隔でのピーク群で特徴づけられる。
直鎖アルケンの二重結合の位置は，フラグメント

中で容易に移動するので決めにくいが，シス型のRetention Time (min.)

二重結合については，フラグメントイオンから二重結合の位置を推定できる。ピーク 1 は，分子イFig. 1. Total ion chromatogram of long-chain unsaturated
alkenes in Emiliania huxleyi NIES-1312. Compoundnames are given in Table 1.

フラグメントイオン M-126 は Δ22 位に二重結合があることを，さらにフラグメントイオン M-154 は，

4050

オン M=432 から C31:2 アルケンであることを示し，Table 1. Identification of long-chain alkenes.
Peakno.*Compound name

Diagnostic
Identification level**
Formula Molecular fragmentation
weightThis study Reference(m/z)

Reference

12,22-Hentriacontadiene

C31H60432432, 306, 278

21Rieley et al., 1998

23,22-HentriacontadieneC31H60

432432, 306, 264

21

Rieley et al., 1998

3

Tritriacontatetraene

C33H60456456, 332

14

Tritriacontatriene

C33H62458458, 334

15Tritriacontatriene

C33H62458458, 334

16

1,15,22-Heptatriacontatriene

C37H70

514

514

2

1

Rieley et al., 1998; Grossi et al., 2000

71,16,23-Octatriacontatriene

C38H72528528

2

1

Rieley et al., 1998; Grossi et al., 2000

* Peak numbers refer to the chromatogram in Fig. 1.
** Identification level;
1: Interpretation of mass spectrum data.
2: The mass spectrum and GC retention time are identical to those in references.
3: The mass spectrum is identical to that of authentic standard.

−92−

現生ハプト藻 Emiliania huxleyi 培養試料中の長鎖アルケンの GC/MS 解析



306





M-124


 

 m/z2264(M-168)









 
 



6m/z M-124  m/zm/z



7Response m/z

3Response  126

Response

Response306



5126



ResponseResponse

1278(M-154)

 







m/z

Response

4

M-124
























m/z

Fig. 2. Mass spectra of long-chain unsaturated alkenes in peaks #1-#7 in Fig. 1. Compound names are given in Table 1.

Δ2 位に二重結合があることを示している（図 2-1）。

二重結合は，顕著なフラグメントイオンが観察さ

ピーク 2 は，分子イオン M=432 から C31:2 アルケンであることを示し，フラグメントイオン M-126 はれないことからトランス型であると考えられる。
ピーク 4 は，分子イオン M=458 から C33:3 アルケ

Δ22 位に二重結合があることを，さらにフラグメンンであると考えられ，フラグメントイオン M-124
は，シス型の二重結合が Δ24 位にあることを示し

トイオン M-168 は，Δ 位に二重結合があることを示している（図 2-2）
。C31, C33 アルケンは，シス型3ている（図 2-4）。ピーク 3 と同様に，残り 2 つのの二重結合を持つと考えられており（Rieley et al.,1998）
，シス型の二重結合位で開裂が起こっている

二重結合は顕著なフラグメントイオンが観察されないことから，Δ1 位から Δ23 位までの間にトラと考えられる。
ピーク 3 は，分子イオンから C33:4 アルケンであンス型の二重結合があると考えられる。ピーク 5は，分子イオン M=458 から C33:3 アルケンである

ると考えられ，フラグメントイオン M-124 は，シス型の二重結合が Δ24 位にあることを示していると考えられ，フラグメントイオン M-124 は，シス型の二重結合が Δ24 位にあることを示している（図（図 2-3）
。また，残り 3 つの二重結合は Δ1 位から23Δ 位までの間にあることを示している。残りの2-5）。ピーク 3，4 と同様に，残り 2 つの二重結合は顕著なフラグメントイオンが観察されないこと−93−天羽美紀・萩野恭子・鈴木德行・堀口健雄・山本正伸から，Δ1 位から Δ23 位までの間にトランス型の二重結合があると考えられる。Rieley et al.（1998）に

引用文献よる E. huxleyi（VAN 556 株）のアルケン分析の結果，33:2Δ1, 24 と 33:2Δ2, 24 の 2 つの C33 アルケンがAmo M. and Minagawa M. (2003) Sedimentary record

検出されている。これらは，Δ24 位の他には，Δ1位や Δ2 位に二重結合を持っている。このことから，

the Shatsky Rise, western North Pacific, over the lastof marine and terrigenous organic matter delivery to130 kyr. Organic Geochemistry 34, 1299-1312.

本研究で検出された C33 アルケンも Δ1 位や Δ2 位

Conte M. H., Thompson A. and Eglinton, G. (1995)に二重結合を持っている可能性がある。
ピーク 6 は，分子イオン M=514 から C37:3 アル

Lipid biomarker diversity in the coccolithophorid

ケンであり，ピーク 7 も同様に分子イオン M=528から C38:3 アルケンであることが示唆された。C37

lated species Gephyrocapsa oceanica. J. Phycol. 31,triene と C38 triene の二重結合の位置については，

Grossi V., Raphel D., Aubert C. and Rontani, J. -F. (2000)

Rieley et al., 1998 による E. huxleyi（VAN 556 株）のC37 triene と C38 triene の二硫化ジメチル付加物のalkenes composition in the marine coccolithophorid

Emiliania huxleyi (Prymnesiophyceae) and the re272-282.
The effect of growth temperature on the long-chain

NMR とマススペクトル分析から明らかになって

Emiliania huxleyi. Phytochemistry 54, 393-399.

いる。これによると C37 triene は 37:3Δ1, 15, 22 で，C38
triene は 38:3Δ1, 16, 23 であり，二重結合はすべてトラ

Hagino K., Okada H. and Matsuoka, H. (2005) Coc-ンス型であった。また，C37 triene の二重結合の位置については，Grossi et al., 2000 による E. huxleyi

Emiliania huxleyi in the boundary zone between the（CS-57 株）中の C37 triene の二硫化ジメチル付加物の NMR とマススペクトル分析からも同様の結果

colithophore assemblages and morphotypes ofcold Oyashio and warm Kuroshio currents off thecoast of Japan, Marine Micropaleontology 55, 19-47.
Rieley G., Teece M. A., Peakman T. M., Raven A. M.,が得られている。このことから，本研究で得られた C37 triene と C38 triene の二重結合はいずれもトGreene K. J., Clarke T. P., Murray M., Leftley J. W.,Campbell C. N., Harris R. P., Parkes R. J., Maxwell

ランス型で，二重結合の位置も同じであると考えられる。C37 triene と C38 triene の二重結合の位置は，J. R., 1998. Long-chain alkenes of the haptophytes
Isochrysis galbana and Emiliania huxleyi. Lipids 33,

C37 alkadienone と C38 alkadienone と同じであることから，C37, C38 アルケンはアルケノンと同じ生合成経路で作られたことが指摘されている（Rieley et617-625.
Sikes E. L. and Volkman, J. K. (1993) Calibration ofalkenone unsaturation ratios (UK) for paleotemperature estimation in cold polar waters, Geochimica etal., 1998）。
5. 謝

Cosmochimica Acta 57, 1883-1889.

辞Sikes E. L., Volkman J. K., Robertson L. G. and Pichon

本研究の遂行に当たり北海道大学大学院沢田健

J. J. (1997) Alkenones and alkenes in surface waters

講師には貴重なご助言を頂きました。二名の匿名

and sediments of the Southern Ocean: Implications

査読者には本稿の査読を通じて貴重なご意見を頂きました。本研究は文部科学省 21 世紀 COE プロ

Geochimica et Cosmochimica Acta 61, 1495-1505.

グラム新・自然史科学創成（プログラムリーダー

Yamamoto M., Suemune R. and Oba, T. (2005) Equa-岡田尚武）と科学研究費補助金（若手研究（B）：課
題番号 17740354）の助成によって行われました．

torward shift of the subarctic boundary in the記して感謝致します。

Geophysical Research Letters 32, L05609.

for paleotemperature estimation in polar regions,−94−

northwestern Pacific during the last deglaciation.