宮城教育大学 環境教育研究紀要

第 16 巻 (2014)

ため池水中の溶存態有機物の分画と同定に関する実験法の開発（Ⅱ）1)- 腐植物質の物性評価に関する簡易実験法 三品佳子*・三好直哉**・村松隆***
Development of Experimental Techniques on Fractionation and Identification of Dissolved Organic
Compounds in Natural Ponds(II)-Simple Experimental Methods for the Evaluation of Properties of Humus MaterialsYoshiko MISHINA, Naoya MIYOSHI and Takashi MURAMATSU

要旨 : ため池（岩沼市朝日山公園内荒井堤）の有機汚濁の原因となる溶存態有機物の動態を調べる目的で，約３ヶ月間の生分解実験（簡易法）を行った．定期的に，クロマトグラフィー（吸着法，ゲルろ過法）を用いて溶存態有機物を分画し，成分の分光学的性質，蛍光特性等より難分解性有機物である腐植物質の物性を評価した．
キーワード：ため池，難分解性有機化合物，クロマトグラフィー，生分解実験

1. はじめに要である．

ため池は，自然発生的な池のほかに，農業用水の目一般に，湖沼やため池のような閉鎖性水域の有機物的で人工的に作り出された貯留池，公園池のように多は，図１に示すように，溶存態と懸濁態に区分される．

目的に利用する管理池など，人の暮らしに近接して懸濁態有機物は，池内低層部に沈降し，低層部で生分様々なものがある．ため池は，雨水集積型・湧水停滞解を受けたりヘドロ化して堆積するが，長期に渡って型，流水の一時貯留型など，集水方式の違いによって水中に滞留するものではない．一方，溶存態有機物の幾つかに分類できるが，いずれも，共通して，水量の中で，易分解性有機物は微生物分解により比較的はや少ない閉鎖的な水塊である．

く消失するが，微生物分解を受けにくい難分解性有機多くのため池では，それぞれの環境に応じた動植物物は長期に渡って水中を滞留することになる．これがの生態系がつくられており，その中で生物生産に由来する水の富栄養化が進行している．通常，生物生産による有機汚濁化と生物の捕食吸収（固定化）による水の浄化が同時に進行し，極端な水質悪化は起こらないが，水温の異常上昇や水の嫌気化など，生態を撹乱する外的要因により，池内における食物連鎖の均衡が崩れ，汚濁化が急速に進行することがある．植物プラン
クトンの異常繁殖とアオコ発生は，公園池でもよく見られる現象である．停滞性の水域は，水質の悪化が起こりやすく，環境保全のための継続的な水質監視が必

図１．ため池水中の有機物の分類* 宮城教育大学理科教育講座，** 宮城県立仙台第二高等学校，*** 宮城教育大学附属環境教育実践研究センター－1－ため池水中の溶存態有機物の分画と同定に関する実験法の開発（Ⅱ）

閉鎖的水域の有機汚濁の原因になっている．2)

近年，

２． 溶存態有機物の分析
2-1． 試料

湖沼の中には，生物化学的酸素要求量（BOD）が低値にもかかわらず，化学的酸素要求量（COD）が高分析に用いた試料は，有機汚濁に伴う腐水化が問題値になっている水域も見受けられる．これは，この水視されている雨水集積型富栄養性のため池（岩沼市朝域に生分解されにくいフミン酸やフルボ酸のような腐日山公園内の荒井堤）の水である．荒井堤は，完全停植物質が溶存しているためと考えられている．2,6)

滞性ではなく，雨水のゆっくりとした集積（地下から一般に，湖沼等の閉鎖性水域における全溶存態有機の浸透水と周辺からの流水）で蓄積が進み，過剰分が物に占める腐植物質の割合は，およそ 30％～ 80％に少量ずつ用水路に流れるという停滞性を帯びたため池なることが知られている．2) このことは，腐植物質が，である．荒井堤の年間を通した水質測定結果を表１にため池の有機汚濁の実態を評価し，汚濁化の将来予測示す．表 1 から分かるように，およそ１年間を通してを行う上で有用な指標物質となることを意味している．

BOD が低値に推移し，一方，COD が高値に推移して水中の腐植物質についての分析法は，高度な技術といることが分かる．難分解性有機物（主に腐植物質）

高価な装置・機材を用いたものが多く 2,3,4)，大学講による有機汚濁が起こっていることが予想される．そ義（環境科学実験）や短期的な教師研修で利用するたこで，溶存態有機物を分析するために，ため池の水（原めには，より簡易な実験方法の導入が必要である．

水）をガラスフィルター（ワットマン GF/F）でろ過し，ろ液について，次に述べるような実験を行った．

著者らは，腐植物質の分離・同定のための簡易な手法として，吸着クロマトグラフィーによる酸・アルカリ分画法と，ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子2-2． 溶存態有機物の分画量分画法を開発したが，1)

今回は，これらの手法を（１）吸着クロマトグラフィーによる酸・アルカリ分画用いて，溶存態有機物の生分解実験を行い，難分解性前報１）の方法に従って，内径 10mm，長さ 150mm

有機物である腐植物質の物性を評価するための方法をオムニフィットカラムに非イオン性多孔質交換樹脂検討した．

DAX-8 を充填し，酸とアルカリを溶離液として溶存表１．本研究による荒井堤の水質測定結果（H23.11月～H24.11）－2－

宮城教育大学 環境教育研究紀要

第 16 巻 (2014)

態有機物の分画を行った．この方法では，糖類・タン有機炭素（溶解性有機炭素に相当）を測定し，生分パク質等からなる成分（分画１）と腐植物質（フルボ解の追跡に用いた．

酸・フミン酸）からなる成分（分画２）に分けること②ため池水中の溶存態有機物（図１）のうち，タンができる．それぞれの分画成分は３次元蛍光スペクト

パク質と腐植物質では，蛍光特性が異なるので，5)

ル測定により同定された．

吸着クロマトグラフィー（酸・アルカリ分画）で得た分画成分（分画１と分画２）の３次元蛍光スペク（２）ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量分画 1,7)トルを測定した．蛍光スペクトルにおいて，測定溶

これには，内径 25mm, 長さ 30cm のガラス製カラ液に照射する励起光の波長を EX，光照射により溶ムにゲル樹脂（Sephadex G-15（分画可能な分子量範液から放出される発光（蛍光）の波長を EM とする囲 1500 以下））を充填して分子量分画を行った．標と，EX/EM=280nm/340nm がタンパク質様物質（分準物質としてブルーデキストラン（分子量 2000000），画１），EX/EM=320nm/430nm が腐植物質（分画２）

シアノコバラミン（ビタミン B12, 分子量 1355）を標によるものである．5) この蛍光特性（強度や等高線準物質とし，展開の保持時間と分子量の関係より，腐分布）を同定に用い生分解過程を追跡した．
③紫外・可視吸収スペクトル変化を追跡する方法であ植物質の見かけの分子量を算出した．

る．溶存態有機物は，植物成分（主要成分としてセ2-3. 生分解実験 （簡易法）

ルロース，リグニン）を起源としており，ベンゼン天然水中の有機物を対象とした一般的な生分解実験環を含む複雑な構造をもつ混合物である．4,8) そのでは，水温 20℃，暗所で酸素が充分供給されている

紫外可視吸収スペクトルは，紫外及び近紫外領域（お条件で，100 日間試料水を撹拌し続け，100 日後に残よそ波長範囲：260nm ～ 340nm）にベンゼノイド留した有機物を難分解性有機物と同定するが，6) もっ型の吸収を示す．例えば，溶存態有機物が自然分解と単純に，試料水（微生物を含む湖沼水）を酸素で充などで減少すれば，その効果が紫外・吸収スペクト満したポリ袋（密閉型）に入れ，これを暗所 20℃にル強度の減少として現れる．溶存態有機物の動態を保存し，定期的に溶存物質を分析する方法も知られて追跡するのに利用できる．

いる．8)
本研究では，簡易な方法として，次のような手順で3. 生分解実験過程における溶存態有機物の動態
3-1. 有機炭素量の推移

生分解実験を試みた．
手順１：滅菌した 2L 広口ガラスびんに試料水（原水

図２は生分解に伴う溶存態の有機物量（溶解性有機をガラスフィルター（GF/F）でろ過したろ液）

炭素量）の変化を示したものである．冬場の試料水

１L を入れる．

（1 月採水）と夏場の試料水（８月採水）を比較しても，手順２：この容器を酸素ガスを満たした滅菌済ポリエ変化に大きな差異は無い．生分解後（90 日）の有機チレン袋に封入し，20℃の恒温槽（暗所）で炭素量はおよそ 5mg/L で 90 日間で全体のおよそ 40％３ヶ月間放置する．定期的にポリエチレン袋の炭素が溶存態から消えたことになる．

内に酸素を供給する．
手順３：毎月１回の割合で試料水 200mL を抜き取り，3-2． 紫外 ・ 可視吸収スペクトル変化

吸着クロマトグラフィーによる酸・アルカリ

図３は生分解に伴う紫外・可視吸収スペクトル変化

分画と，ゲルろ過クロマトグラフィーの分子を示したものである．200nm から 500nm 付近の波長量分画を行った．

範囲）にかけて，なだらかに減少するスペクトルをみせる．

手順３における分画成分の同定は次のように行った．
①生分解期間に定期的に，ろ液（溶存態有機物）の全－3－生分解当初，若干のスペクトル強度の減少が認められたが，その後はほとんど変化しなくなる．溶存態有ため池水中の溶存態有機物の分画と同定に関する実験法の開発（Ⅱ）

機炭素量の推移（図２）を含めて解釈すると，難分解トグラムを図４A に，約 90 日後（生分解実験終了時）性物質（腐植物質）の滞留が予想される．のクロマトグラムを図４B に示す．

図４A に示すように，生分解当初，４種類のピークの存在が確かめられた．それぞれのピークに対応する部分の溶液を分取し測定した３次元蛍光スペクトルを図４（A）a ～ｄ（等高線図）に示す．ピーク１はタンパク質様物質で見かけの分子量が 1500 以上と算出された．
ま た， ピ ー ク ２ と ピ ー ク ３ は， い ず れ も EX/EM=320/430 の蛍光特性を示すことから，いずれも腐植物質と同定され，それぞれの見かけの分子量として1480，1420 が求められた．また，ピーク４の見かけ
図２．生分解に伴う溶存態有機炭素量の変化○：H24.1.19採水、●：H24.8.0２採水

試料：荒井堤水
H24.8採水、ガラスフィルター（GF/F）ろ過水の分子量は 1180 と算出されたが，その成分は蛍光を発せず，非蛍光物質と考えられたが，その起源は不明である．
図４B は，90 日間の生分解実験後に測定したゲルろ液に含まれる全有機炭素を測定ろ過クロマトグラムである．90 日後でも，実験当初に確認された４種類の成分が観測され，クロマトグラ
ムは生分解前とよく似ていた．図２に示すように，溶存態有機炭素量は減少するが，ゲルろ過クロマトグラ
フィーによる成分分析では，含有する有機物の種類はあまり変化しないとうことである．
以上の生分解実験を通して，次のようなことが判明した．
・ 荒井堤の化学的酸素要求量値が生物化学的酸素要求量より高い値になっているのは，水中に難分解性有機物である腐植物質が蓄積されるためである．
・ 荒井堤に溶存する主要な腐植物質は２種類で，それぞれ見かけの分子量が 1480 と 1420 である．これら
図３．生分解過程の紫外・可視吸収スペクトルの腐植物質の由来は，おそらく同一の起源（例えばa:生分解開始日、ｂ：３０日後、c:60日後、d:90日後
試料：荒井堤水
H24.8採水、ガラスフィルター（GF/F）ろ過水

荒井堤の水生植物）によるものと思われる．
・ 溶存する有機物炭素量（溶解性有機炭素量）の測定から，荒井堤の溶存態有機物の約４０％が，易分解性有機物と解釈される．荒井堤の生態を支える食糧

3-3. ゲルろ過クロマトグラフィーによる追跡になるものである．

荒井堤の原水（８月２日採水）を，ガラスフィルター・ 荒井堤の腐植物質の分子構造を特定することは困難（GF/F）でろ過し，ろ液のゲルろ過クロマトグラフィーである．しかし，その起源は，植物セルロースや木により追跡（λ =260nm の吸光度測定）した．生分解質リグニン等の高分子に由来したものと考えられ当初の試料溶液について観測されたゲルろ過クロマ

る．1480 と 1420 の見かけの分子量をもつ物質構造－4－宮城教育大学 環境教育研究紀要

第 16 巻 (2014)

図４. 生分解前後における試料水のゲルろ過クロマトグラフと各成分の３次元蛍光スペクトル（A）：生分解当初日
試料：荒井堤水（B）：生分解実験90日後

H24.8採水、ガラスフィルター（GF/F）ろ過水をどのように考えるかは推測の域を出ないが，例え興味深い．本研究で確かめられた腐植物質（およそば，図５はおよそ分子量が 3000 程度の比較的小さ２種類）は，リグニンの生分解過程もしくは自然分なサイズのリグニンの分子構造を示したものである．

解過程において，官能基の一部がヒドロキシル基ちょうどこの構造を 2 等分すると，およそ 1500 程やカルボキシル基に変化し，水中で疎水性塩基性や度の分子サイズをもったリグニンとなり，本研究で疎水性酸性等示すようになったものと予想できる．

観測された腐植物質の分子量に近い値になることは難分解性有機物の腐植物質の性質を理解する上で，－5－

ため池水中の溶存態有機物の分画と同定に関する実験法の開発（Ⅱ）4) 日本腐植物質学会，2008, 環境中の腐植物質その特図５に示すようなリグニンモデルはよい教材になる

徴と研究法（三共出版）.と思われる．

5) 福島武彦・中島俊之・今井章雄・松重一夫・尾崎則篤，2001, EEMS による水中溶存有機物の特性解析，
水環境学会誌，24(10), pp686-692.
6) 山田悦・青木眞一・布施泰朗，2010, 湖沼など閉鎖性水域における難分解性有機物増加の原因解明に関する研究Ⅱ，植物プランクトン Microcystis
aeruginosa 由来の溶存有機分の特性評価，京都工芸
繊維大学環境科学センター報「環境」，2010-04,pp43-54.
7) 山本弘・森忠繁，1997, ゲルクロマトグラフィーによる鹿児島湖流域における E260 発現成分の挙動評
価，水環境学会，20(2),pp117-121.

図5. リグニンの分子構造（一例）

8) 福島武彦・今井章雄・松重一夫・井上隆信・小澤秀（de Leewe and Largeau, 1993）

明，1997, 湖水溶存有機物の紫外部吸光度：DOC 比

参考文献の特性とそれの水質管理への利用，水環境学会誌，

1) 三好直哉・三品佳子・村松隆 , 2013, ため池水中の20(6), pp397-403.
9) de Leeuw J.W.and L argeau C. A, 1993, review of

溶存態有機物の分画と同定に関する実験法の開発，

macromolecular organics compounds that comprise

宮城教育大学環境教育研究紀要 ,15,pp49-55.
2) 国立環境研究所，2004, 湖沼における有機炭素の物

living organisms and their role in kerogen, coal, ad

質収支および機能・影響の評価い関する研究，国立petroleum formation. In:Engel, M.H. & Macko,S.

環境研究所特別研究報告 SR-62-2004.

A.(Editors), Organic Geochemistry, pp 23-72, Plenum3) 仲川直子・金澤良昭・宮原一隆・上村育代・梅本諭，2011, 珪藻類を対象とした植物プランクトン由来の難分解性有機物に関する特性評価，兵庫県環境研究センター紀要，2,pp.1-7.

－6－Press,NewYork.