Photon Factory Activity Report 2014 #32(2015) B
BL-20B/2013G649

ゲルを用いた結晶化法による高品質タンパク質結晶の育成
Crystallization of high quality protein crystals using hydrogel methods
丸山美帆子 1,*, 林佑紀 1, 冨永勇佑 1, 山形眞 1, 小泉晴比古 2,橘勝 3, 杉山成 4, 吉村政志 1, 森勇介 1,51
大阪大学大学院工学研究科 〒565-0871 大阪府吹田市山田丘 2-1
2
東北大学金属材料研究所, 〒980-8577 宮城県仙台市青葉区片平 2-1-1
3横浜市立大学大学院生命ナノシステム科学研究科, 〒236-0027 横浜市金沢区瀬戸 22-24大阪大学大学院理学研究科 〒565-0871 大阪府吹田市山田丘 2-1
5
株式会社創晶, 〒565-0871 大阪府吹田市山田丘 2-1
1
Mihoko Maruyama , Yuki Hayashi1, Yusuke Tominaga1, Shin Yamagata1, Haruhiko Koizumi2,Masaru Tachibana3, Shigeru Sugiyama4, Masashi Yoshimura1 and Yusuke Mori1,41
Graduate School of Engineering, Osaka University, 2-1, Suita, Osaka 565-0087, Japan
2
Institute for Materials Research, Tohoku University, 2-1-1, Katahira, Aoba-ku, Sendai 980-8577,
Japan
3
Graduate School of Nanobioscience, Yokohama City University, 22-2 Seto, Kanazawa-ku,
Yokohama, 236-0027, Japan
4
Graduate School of Science, Osaka University, 2-1, Suita, Osaka 565-0087, Japan
5SOSHO Inc., 2-1, Suita, Osaka 565-0871, Japan1 はじめに多種多様なタンパク質個々の機能を理解するために，タンパク質を結晶化し，その結晶を用いて X 線構造解析や中性子線構造解析を行う。一方，構造解析が可能なタンパク質結晶を得るのは極めて難しく，得られたとしてもその後のハンドリング作業がタンパク質結晶にダメージを与えてしまい，これらの過程が構造解析のボトルネックになっている。
高強度ハイドロゲルを用いたタンパク質結晶化技術は，タンパク質の核発生確率を向上させる[1, 2]。更に，得られたタンパク質結晶の機械的・化学的強度は，従来法で得られたタンパク質結晶と比べて高いことが明らかになっており[3, 4]，構造解析に必須のマウント操作などにおいて結晶が損傷しにくく，これが高精度な X 線回折データ取得を実現させる要因となっている。一方
で，ゲル中育成結晶は結晶内部に 3 次元的な構造を持つハイドロゲルを取り込んで成長しているが，ハイドロゲルとタンパク質分子そのものの相互作用，結晶欠陥の変化などについての報告はいくつかあるものの[5]，まだ十分には明らかにはなっていない。
そこで本研究では，ハイドロゲルを用いたタンパク質結晶化技術によって得られたゲル中育成結晶の完全性を X 線トポグラフィで観察し，ハイドロゲル中育成結晶の欠陥キャラクタリゼーションを明確にすることを目的とした。
2 実験方法

3 回再結晶鶏卵白リゾチーム（HEWL），NaCl，NaAc，および粉末アガロースは和光純薬工業から購入した。0.1M NaAc bufferを用いて 2.0~5.0％(w/v)に調整したアガロース溶液，12~15% NaCl in 0.1M NaAc buffer(pH4.5)，および 75~125 mg/ml HEWL in 0.1
M NaAc buffer (pH4.5)それぞれを 45 度に恒温しながら適切な量を混ぜあわせ，結晶化溶液を調整した。最終的な溶液の条件は
HEWL 25 mg/ml ，NaCl 3% ，アガロースゲ
ル濃度 0~2.0%(w/v)であり，バッファーは0.1M NaAc (pH4.5)とした。溶液混合後，結晶化プレートもしくは 1 ml ガラスバイアル

Photon Factory Activity Report 2014 #32 (2015) B(a)
g

(b)




(c)


g

[001]

[110]
図 1．0.25%アガロースゲル溶液中で得られた HEWL 結晶のートポグラフ像．(a)および(b) g = 4 40，(c) g = 004．(a)および(b)で見られた転位線は，(c)において消滅している．

中にタンパク質溶液を分注し，これらを 21±0.5 度のインキュベータ内で保存し，結晶化を行った。得られた結晶を傷つけないように容器から取り出し，プラスチック製のストローに結晶を固定して封入し，観察用サンプルとした。
これらのサンプルを，高エネルギー加速器研究機構 Photon Factory の BL-20B（測定波長 1.2Å，電流値 450mA）において観察し，結晶の X 線トポグラフ像（フィルムおよび CCD）を得た。得られた CCD の画像から，X 線ロッキングカーブの測定も試みた。画像の解析にはプログラム YSU-DTI（Copyright(C)2013 Kei Wako）を用いた。
3 実験結果および考察

図１(a) ~ (c)に，アガロースゲル 0.25%のリゾチーム溶液から得られた正方晶 HEWL
結晶の X 線トポグラフ像を示す。図 1 (a)おーよび(b)の回折ベクトルは g = 440，(c)の回折ベクトルは g = 004 である。(a)および(b)には，複数本の転位線と見られる黒いコントラストが観察された。多くのものは，２本の線が隣り合うような形で観察されている。同じ結晶の 004 反射において， 440 反射で見られた黒い線（(a)および(b)に矢印①〜③で示したもの）が消滅することが確認された。転位の消滅則 g・b = 0 (b:転位のバーガースベクトル)より，今回観察された転図２．0.25%アガロースゲル溶液中で得られた HEWL 結晶の XRC半値幅マッピング像．
ー位線は b が<110>であり，転位線の方向と並行であることかららせん転位であることが確認された。なお，(c)において消滅したそれぞれの転位線の周辺にやや黒いコントラストが残留しているのは，転位線周辺に残留する歪の影響であると考えている。全ての転位線の長さの総和を結晶の体積で除したものを転位密度として定義し計算した
ところ，本結晶の転位密度は 2.55×102cm-2であった。図２に，同じ結晶の CCD トポグラフ像から計算した XRC 半値幅のマッピング像を示す。画像の処理により，図１と左右が反転している。半値幅マッピング
像は，斜めのコントラストを呈した。結晶の中央付近で転位線と重複しない範囲を選び，30 ピクセルほどの範囲で XRC の半値幅を測定したところ，3.8×10-3 deg.程度の値であった。
今回得られたトポグラフ像，得られた転位密度および XRC 半値幅を過去の溶液中育成結晶のものと比較を試みた。
Mukobayashi らによって報告された NiCl2 濃度勾配法で溶液中育成した結晶は，転位密度が 102 ~ 103 cm-2 のオーダーであり，XRC半値幅の分布は 1.5×10-3 ~ 3.0×10-3 deg.程度であった[6]。本研究で得られた値は，この溶液中育成結晶と比較して同程度の転位密度および XRC 半値幅を呈している。結晶内部にアガロースゲルという異物を混入

Photon Factory Activity Report 2014 #32 (2015) B
しながらも，結晶の欠陥（らせん転位）は溶液中結晶とほとんど変わらない振る舞いをすることが初めて明らかにされた。

4.

4 まとめ

5.	  0.25 ~ 2.0%(w/v)アガロース溶液中で結晶化した HEWL の結晶について，X 線トポグ
ラフィ観察を行った。今回，0.25%(w/v)アガロース条件で育成した結晶に関して良好なトポグラフ像が得られ，結晶内部に b = <6.

ー110>のらせん転位が複数存在することが確認された。見積もられた転位密度およびXRC 半値幅の値は，これまでに報告されている溶液中リゾチーム結晶と同等程度であり，結晶内部に含有されるアガロースゲルの繊維によって結晶の完全性が大幅には乱されないことが明らかになった。
今回の報告では，解析の都合上 0.25%アガロースゲル中で得られた結晶のみを示した。得られたデータの解析が進行し次第，再度の報告を予定している。
謝辞	  本研究を遂行するにあたり，現場での作業をサポートいただいた横浜市立大学の岸健晴氏，鈴木凌氏に感謝いたします。また，データの解析プログラムをご提供くださった横浜創英大学の若生啓博士に感謝いたします。

参考文献
1.
Vidal, O., M.C. Robert, and F. Boué,
Gel growth of lysozyme crystals studied
by small angle neutron scattering: caseof agarose gel, a nucleation promotor.
Journal of Crystal Growth, 1998. 192(12): p. 257-270.
2.
Tanabe, K., et al., Promotion of Crystal
Nucleation of Protein by Semi-SolidAgarose Gel. Applied Physics Express,2009. 2(12): p. 125501.
3.
Gavira, J.A. and J.M. Garcia-Ruiz,
Agarose as crystallisation media forproteins II: Trapping of gel fibres into
the crystals. Acta Crystallographica
Section D, 2002. 58(10 Part 1): p. 16531656.

Sugiyama, S., et al., Growth of Protein
Crystals in Hydrogels Prevents OsmoticShock. Journal of the American
Chemical Society, 2012. 134(13): p.
5786-5789.
Robert, M.C., et al., Influence ofimpurities on protein crystal perfection.
Journal of Crystal Growth, 2001. 232(1–4): p. 489-497.
Mukobayashi, Y., et al., Observation ofdislocations in hen egg-white lysozyme
crystals by synchrotron monochromaticbeam X-ray topography. Phys. Status
Solidi A, 2009. 206(8): p. 4.

* maruyama@cryst.eei.eng.osaka-u.ac.jp