細胞診検体における遺伝子検索に必要な腫瘍細胞数について─細胞診標本からの適正判断の目安─
厚生連医誌 第31巻 1 号 49〜52 2022

短報

細胞診検体における遺伝子検索に必要な腫瘍細胞数について
─細胞診標本からの適正判断の目安─
長岡中央総合病院、病理部；臨床検査技師1）、細胞検査士2）、認定病理医3）、細胞診指導医4）

大橋珠紀1,2）、小杉 久良1,2）、五十嵐俊彦 3,4）

背景：通常の 1 項目に対する Polymerase Chain Reactin（以下、PCR）遺伝子検索に必要な腫瘍細胞数は
Formalin-ﬁxed paraﬃn-embedded（以下、FFPE とする）ブロックにおいては、一般的に約2000個以上（DNA 量 10 ng）とされているが、細胞診検体において遺伝子検索を実施する場合、腫瘍細胞数の確認が困難な状況にあり、必要数に満たない場合は、「偽陰性」となる可能性があった。そこで、細胞診断用 Papanicolaou（以下、Pap とする）染色標本上に出現する腫瘍細胞数から、遺伝子検索用検体としての適正判断の目安となる基準を考案することとした。
条件：沈査の 1 ／ 2 量を凍結保存（−80℃保管）、 1 ／ 2量を細胞診断用標本作製に使用し、 1 検体あたり 3 〜 4 枚の標本を作製する。遺伝子検索に必
要な腫瘍細胞数は FFPE ブロック検体を参考にし、 1 検体あたり約2000個以上とした。腫瘍細胞が半量ずつ均等に分配されているとして、Pap
染色標本 1 枚あたりに約500枚〜700個以上の腫瘍細胞が確認できれば、凍結保存検体中にも同等の腫瘍細胞が存在し、遺伝子検索の検体として適正と判断することが可能であると考えた。
考察：集細胞法による塗抹面積は、1.4 cm 角が約 2 cm2、長径 0.5 cm の円形では約 0.2 cm2となり、腫瘍細胞を高倍率（対物40倍、 1 視野＝0.345 mm2）で観察する際に出現するおおよその数を算出した。また、腫瘍細胞の出現形態（孤立散在性、集塊）に応じてまとめ、適正判断の目安として、表に示した。その際、集塊の大きさに応じて、標本 1 枚に対する出現集塊数についても記載した。集塊を構成する腫瘍細胞の数を目安として、図に提示した。
結語：鏡検の際に活用することで遺伝子検索検体の適正の判断が得やすくなると思われる図表を提示した。また遺伝子検索の検体適正判断の目安を設けることで、細胞診検体における遺伝子検索結果の「偽陰性」をできる限り回避することができ、精度管理に役立つことと考える。

細胞数は FFPE ブロックにおいては、一般的に約2000個以上（DNA 量 10 ng）とされており、FFPE ブロック（細胞診検査のセルブロックも含む）においては、Hematoxylin Eosin 標本において腫瘍細胞数の確認が可能である（1、2）。
しかし、細胞診検査においては、沈査が少なくセルブロックの作製が困難である場合や良悪性の判断を優先とした細胞診断用の検体では、当院では、沈査の約半量を−80℃の超低温冷凍庫にて保存し、遺伝子検索を実施しており、腫瘍細胞数の確認が困難な状況にあった。そのため、必要な腫瘍細胞数に満たない場合は、遺伝子検索結果が「偽陰性」となる可能性があった。
そこで、凍結保存用検体と同時に作製した細胞診断用 Pap 染色標本上に出現する腫瘍細胞数から、遺伝子検索用検体としての適正判断の目安となる基準を考案することとした。なお、遺伝子検索に必要な腫瘍細胞数は FFPE ブロック検体を参考にし、 1 検体あたり、約2000個以上とする。
条以下の方法で細胞診断用標本を作製することとする。
①沈査中の腫瘍細胞が均等になるように、スポイト等でよく撹拌する。
②沈査の 1 ／ 2 量を凍結保存（−80℃保管）、 1 ／ 2 量を細胞診断用標本作製に使用する。
③細胞診断用の標本は、沈査すべてを使用し、 1 検体あたり 3 〜 4 枚の標本を作製する。
④沈査が少量であるため、直接塗抹法は実施せず、集細胞法にて作製すること。
（塗抹範囲は 1.4 cm 角か長径 0.5 cm の円形となる。
）
以上の方法で標本作製すると、腫瘍細胞を半量ずつ均等に分配しているとして、Pap 染色標本 1 枚あたり、約500枚〜700個以上の腫瘍細胞が確認できれば、凍結保存検体中も同等の腫瘍細胞が存在し、遺伝子検索の検体として、適正とする。

キーワード：遺伝子検索、細胞診検体、腫瘍細胞数、偽陰性
背景

通常の 1 項目に対する PCR 遺伝子検索に必要な腫瘍件

考察

塗抹面積は、1.4 cm 角が約 2 cm2、長径 0.5 cm の円形では、約 0.2 cm2となり、腫瘍細胞を高倍率（対物40倍、 1 視野＝0.345 mm2）で観察する際に出現する数を算出した。

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まず、塗抹範囲が 1.4 cm 角の場合、腫瘍細胞の出現形態が孤立散在性で単個の時、 1 視野毎に 1 個確認でき、30個程度の腫瘍細胞集塊の時、10視野中に3 個程度確認できれば、適正となる。塗抹範囲が長径 0.5 cm の円形の場合は、腫瘍細胞の出現形態が単個の時、 1 視野毎に10個確認でき、30個程度の腫瘍細胞集塊の時、 1 視野毎に 3 個程度確認できれば、適正となる。また、両者の塗抹範囲共に、30個程度の腫瘍細胞集塊であれば、 1 標本上に集塊数20個以上、100個程度の集塊の時は 1 標本上に集塊数 5 個以上を確認できれば、適正となる。
これらの適正判断の目安を表 1 にまとめた。また、出現形態が集塊である時、腫瘍細胞数の目安を図 1 に示した。
なお、FFPE ブロックでは、炎症性細胞や壊死性物質は避けることが望ましく、サンプリング組織上の腫瘍割合が、一般的に20％以上であることが必要とされているため、細胞診検体においても、これらの背景が伺える場合は、不適となる可能性があると予測される（3）。また、一般的に、がん遺伝子パネル検査に必要なDNA 量は 10〜500 ng とされているが、使用する遺伝子パネルや次世代シークエンシング法機器の種類により異なる（1）。今回の適正判断となる目安はあくまで、1 項目の遺伝子検索に適応するものであり、がん遺伝子パネル検査用では複数項目の遺伝子を検索するため、より多量の DNA 量が必要となる。よって、これらも踏まえて、細胞診検体を使用した遺伝子検索の適正判
断は、必ず、認定病理医等と相談の上、決定することが重要である。
結語

提示した表 1 や図 1 を鏡検の際に活用することで、腫瘍細胞数による遺伝子検索検体の適正の判断が得やすくなると思われる。遺伝子検索の検体適正判断の目安を設けることで、腫瘍細胞数が満たない場合は認定病理医等と相談の上、遺伝子検索を無理に実施せず、細胞診検体における遺伝子検索結果の「偽陰性」をできる限り回避することができるので、精度管理に役立つことと考える。
文献

1 ．日本病理学会ゲノム診療用病理組織検体取扱い規定策定ワーキンググループ作成 . ゲノム診療用病理組織検体取扱い規約．初版．一般社団法人 日本病理学会；2018．8−9頁．
2 ．関根郁夫、村谷匡氏、千葉滋、野口恵美子編．がんゲノム医療 結果報告書の読み方と患者への伝え方． 1 版．医学と看護社；2020．16頁．
3 ．関根郁夫、村谷匡氏、千葉滋、野口恵美子編．がんゲノム医療 結果報告書の読み方と患者への伝え
方． 1 版．医学と看護社：2020．13頁．

英文抄録

Brief report
Number of Tumor Cells Necessary for Gene Search in
Cytology Samples: Guideline for Appropriate Determinationfrom Cytology Specimen
Department of Pathology, Nagaoka Chuo General Hospital;
Clinical laboratory technologist,1）cytotechnologist,2）certiﬁed pathologist,3）and cytology advisor4）
Tamaki Ohashi,1,2）Hisayoshi Kosugi,1,2）
Toshihiko Igarashi3,4）
Background : The number of tumor cells required for thenormal polymerase chain reaction（PCR）gene
search on a single item is generally regarded as
about 2000 cells minimum（DNA level: 10 ng）for
a formalin-ﬁxed paraﬃn-embedded（FFPE）block.
However, there is diﬃculty conﬁrming the numberof tumor cells for gene searches conducted on cytology samples, and there is a possibility of false
negative results being obtained if the number is not
suﬃcient. For this reason, the standard number thatact as the guideline for appropriate determination ofgene search samples was discussed based on thenumber of tumor cells appearing on the cytology
Papanicolaou（Pap）smear specimen.
Conditions : Half the amount of the sediment was storedfrozen（stored at −80℃）and the other half wasused for the preparation of cytology specimen withthree to four specimens prepared from a single
sample. The number of tumor cells required for thegene search was set at about 2000 cells minimumfrom each sample with reference to the FFPE block
samples. Assuming that half the number of tumor
cells is distributed evenly, if the minimum of about
500 to 700 tumor cells are observed in each Pap
smear specimen, the same number of tumor cells
was thought to be present in the frozen stored samples and was considered appropriate for use as agene search sample.
Discussion : The smear area according to the cell concentration was about 2 cm2 for 1.4 cm squares and about
0.2 cm2 for a circle with a major axis of 0.5 cm. The
tumor cells were observed under high magniﬁcation, and（×40 objective, 1 visual field = 0.345 mm2）
the approximate number of cells that appear wascounted. In addition, the tumor cells were summarized by the format of appearance（isolated or scattered, agglomeration）, and the result was shown in
Table as a guideline for appropriate determination.
In this summarization, the number of agglomerations appearing in each specimen was also shown
based on the size of agglomeration. The number oftumor cells constituting the agglomeration was presented as a guideline in Figure.
Conclusion : Utilization of Table and Figure in microscopy
was considered to facilitate the appropriate determi-－ 50 －

細胞診検体における遺伝子検索に必要な腫瘍細胞数について─細胞診標本からの適正判断の目安─nation of gene search samples. Also, the establishment of a guideline for the appropriate determination of gene search samples was thought to help
avoid false negative results in the gene search resultsof cytology samples where possible and is consid-

表1

ered beneﬁcial for precision control.
Key words : Gene search, cytology samples, number oftumor cells, false negative

遺伝子検索に必要な腫瘍細胞数の適正目安
塗抹面積

腫瘍細胞形態

孤立散在性（単個）30個程度の集塊

1.4 cm 角（約 2 平方 cm）

φ 0.5 cm
（約0.2平方 cm）

1 個／毎視野（対物40倍）

10個／毎視野（対物40倍）

3 個／10視野（対物40倍）

3 個／毎視野（対物40倍）

20個／標本 1 枚100個程度の集塊

5 個／標本 1 枚－ 51 －

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第31巻

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図 1 集塊で出現する腫瘍細胞数の目安（上）対物40倍における腫瘍細胞 30個程度の集塊（下）対物20倍における腫瘍細胞 150個程度の集塊－ 52 －