博 士 （ 医 学 ） 小 野 武 紀

学位論文題名Effe
ct ofglycog
ensy
nthasekinase3act
ivi
tyon
dendr
i
ticcellfunctiontoi
nduce
T
hel
per
2
polar
iz
at
ion
（樹状細胞のTh
2細胞誘導能とglycog
ens
ynthasekinase3）

学位論文内容の要旨
IntroductionDendriticcells(DC),the most pot
ent antigen‑
presenting cells, play acritica
l rolein both innateand adaptive immunity by producing chemokines and cytokines as well as presenting antigens to theantigen‑specific T cells. DC polarize naive CD4+ T cells to T helper l (Thl) or Th2 cells. Thl cells,producing interferon (JFN) ‑ y, are crucial in promoting cellular immunity that clear intracellularbacteria and viruses, whereas Th2 cells, releasing interleukin (IL)‑4, IL‑5, 1110, and IL‑13, induce
humoral immune responses against extracellular parasites. However, the mechanism underlying theDC regulation of Thl or Tb2 differentiation is not fully understood. Glycogen synthase kinase 3(GSK3), a serine/threonine kinase, is involved in the Wnt signaling pathway. GSK3 regulates manycellular functions including glycogen metabolism, cell‑cycle control, and proliferation. GSK3 canboth positively and negatively affect a variety of transcription factors that are criticalin regulating
pro‑ and anti‑inflammatory cytokine synthesis. GSK3 is a crucial erizyme for the differentiation andmaintenance of animmature phenotype of human monocyte‑derived DC. However, a role of GSK3
in the DC function for Thl or Th2 differentiation remains unclear. In the present study, the role ofGSK3 activity during the development of DC from murine bone marrow (BM) cells to functional
DC was exami
ned.

Materials and methods
DC were generated by culturing lineage‑marker‑negative BM cells of C57BL/6 mice with
granulocytes‑macrophage colony‑stimulating factor for 6 days in the presence or absence of a
specific inhibitor of GSK3, SB415286, and used as GiDC or control DC. To examine the inhibitory
effects of SB415286 0n GSK3 activity in murine BM cells, the level of phosphorylated glycogensynthase in B6 BM cells lysates treated with or without SB415286 were evaluated byimmunoblotting. Expression of cell surface molecules on each type of DC was analyzed by flow
cytometry. To evaluate the ability to induce Thl or Th2 differentiation, control DC or GiDC weremixed with allogeneic (allo)‑CD4+ T cells of BALB/c mice for 5 days. To determine cellproliferation activity, afier the coculture with each type of DC for 68 hours, the cells were pulsedwith [3H] thymidine for 4 hours and then harvested onto glass fiber. Incorporation of [3H] thymidine
was measured with a liquid scintillation counter. In addition, the CD4+ T cells cultured with eachtype of DC were restimulated with anti‑CD3 monoclonal antibody (mAb) for 24 hours. To assess
CD40‑mediated DC function, control DC or GiDC were stimulated with anti‑CD40 mAb for 24hours. To examine in vivo DC function, control DC or GiDC from B6 mice were injected intoー 323―

BALB/c mice via the tail vein and five days after the injection, splenic CD4+ T cells were cultured
on anti‑CD3 mAb coated well for 24 hours. To compare the ability for cytokine production in
response to lipopolysaccharide (LPS) between control DC and GiDC, these DC were stimulated with
LPS for 24 hours. The protein levels of cytokines (IL‑4, IL‑6, 11‑10, IL‑12 p40 and IFN‑ y) in theculture supernatants were evaluated by enzyme‑linked immunosorbent assay (ELISA).
Results
Treatment of the BM cells with SB415286 significantly decreased the spontaneous
phosphorylation of glycogen synthase. Thus, SB415286 inhibited GSK3 activity in BM cells. Either
GiDC or control DC exhibited a conventional DC phenotype (CDllb+ B220‑ CD8 ). CD40, CD80,
CD86, and I‑At expression on GiDC was significantly decreased as compared to that on control DC.
The proliferation activity of allo‑CD4+ T cells stimulated with GiDC was lower than that of cells
stimulated with control DC. Level of IFN‑y production in the culture of allo‑CD4+ T cells with GiDC
was significantly higher than that with control DC. On the contrary, IL‑4 and IL‑10 production in theculture with GiDC were markedly reduced as compared to that with control DC. Upon restimulation
with anti‑CD3 mAb, CD4+ T cells primed with GiDC showed decreased IL‑4 and IL‑10 productionand enhanced IFN‑'y production compared to those primed with control DC. In addition, ability ofGiDC to induce Th2 response in vivo was significantly lower than that of control DC. CD40 ligationinduced IL‑6 and IL‑12p40 production by control DC, but failed to induce these cytokine production
by GiDC. Levels of IL‑12p40 and IL‑6 in the culture of allo CD4+ T cell with GiDC weresignificantly lower than those with control DC. The LPS‑induced productions of IL‑6 and IL‑10 byGiDC were more vigorous than those by control DC. In contrast, LPS‑induced IL‑12p40 production
by GiDC was significantly reduced cpmpared to that by control DC.
Discussion
DC induce polarization of naive CD4+ T cell to Thl or Th2 effector cells. In particular, theDC‑derived factors responsible for the initiation of Th2 differentiation are poorly characterizedcompared to those of Thl differentiation. The present findings demonstrate that DC developed underconditions in which GSK3 activity was significantly inhibited (GiDC) showed severely impaired
ability to induce Th2 polarization in responding CD4+ T cell in an allo‑MLR system in vitro and invivo. On the other hand, the GiDC capability to induce Thl differentiation was sustained or ratheraugmented. Thus, GSK3 appeared to play a pivotal role in DC development of the capability toinduce Th2 polarization in the allo‑MLR system. CD28 mediated signals are induced by interaction
with the ligands, CD80 and CD86, expressed on DC during the T cell priming. GiDC was almost
negative for CD86, whereas CD80 expression was substantially sustained on the GiDC compared tothat on control DC. It has been reported that CD28 signals via interaction with CD86 preferentiallypromote Th2 differentiation compared with those via interaction with CD80. Thus, the marked
deficiency of CD86, but not CD80, expression on GiDC may be associated with the impaired
function to induce Th2 polarization. The impaired IL6 production appeared to be attributable to thedeficiency of CD40 expression on GiDC. Furthermore, IL‑6 level in the culture of allo‑MLR withGiDC was significantly reduced compared with that with control DC. From these observations, theimpaired ability of GiDC to promote Th2 differentiation might be attributable to their reduced CD40
expression and the low production of IL‑6 during the antigen presentation, in addition to the alteredinteraction with the CD4+ T cells via CD28. The precise mechanism underlying the impaired
function of GiDC for Th2 polarization remains unclear and should be persued in further studies. And
more, GSK3 activity during the generation of DC appears to be involved in the regulation of the DC
ability to induce cytokine production in response to LPS. The present findings may lead to the― 324 ‑development of clinical applications exploiting the new regulation system of DC via GSK3 for thetreatment of transplantation, cancer, and various immune disorders.

― 325 ‑

学 位論文 審査の要旨
主 査 教 授 笠原 正 典
副 査 教 授 小江 和 則
副 査 教 授 野 野 村 克 也々

学 位 論文題名

Effect of glycogen synthase kinase 3 activity on
dendr
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ontoi
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（ 樹 状 細 胞 の Th2細 胞 誘 導 能 と glycogen synthase kinase3）

樹 状 細 胞(DC)は 生 体 内で も っ とも 強 カ な抗 原 提 示 細胞 で 、 自然 免 疫 、獲 得 免 疫の両 方に お い て重 要 な 役割 を 果 たし て い る。 ま た 、 Glycogensynthasekinase3(GSK3)
は 糖代 謝 、 細胞 周 期 、細 胞 増 殖と いっ た多く の細胞機 能を制 御するこ とが知 られている 。 本 研 究 は、 DCを分 化 誘 導し て く る際 の GS
K3活 性 の役 割 を 検討 し た もの で あ る。
DCを GSK3活 性 抑 制 下 に 誘 導 し た DC (GiDC)は 、 機 能 的 に よ り 未 熟 で 、 LPSに よ る
ILー 12p40
産 生が減 弱してい た。AlloーMLRを用 いた検 討では、 GiDCはCD4゛T
細 胞のTh2への分 化を有意 に抑制 し、Thlへの分 化を誘導 してい た。また 、invivoの系でも、GiDCはC
D4゛ T細胞のT
h2へ の分 化 を 有意 に 抑 制 して い た 。本 研 究 により 、DC分化 時における GSK3活性 が 、 allo−MLRの系 に お いて DCの C
D4゛ T
細 胞 の 分化 誘 導 、と く に T
h2へ の分化の 確立に必 要なも のである ことが 示された 。
質 疑 応 答に お い て、 笠 原 正典 教 授 より 、 GS
K3に は 2つ の isozymeが 存 在す る が 、マウ ス細 胞 に おい て ど ちら も 発 現す る の か、 今 回 用 いた inhibitor
はど ちらも 抑制するの か、 DCで重 要 な もの は ど ちら か につ いての質 問があっ た。こ の質問に 対し、 マウスを 含 め 哺 乳 類で は 機 能の 相 補 性は な ぃ もの の 、 2
つ の isozyme
が と も に存 在 し てい る
こ と 。 今 回 用 い た inhibitorの SB41
5286は2つ の isozymeを とも に 抑 制す る こ と。 そし て、 DCに 韜いてど ちらの isozyme
が 重要かは 現在まで のとこ ろ検証さ れてい ないが、GSK3pのknockout
マ ウ ス では TNFaが 強発現 すること で肝細 胞のapoptosisが誘導 され、重 度の 肝 変 性に よ り 胎生 致 死 に至 るこ とが報 告されて おり、 GSK3が細胞形 成にお いてcriticalな 酵素 で あ ると 回 答 した 。 また、GSK3
は 糖産生 制御酵素 だが他 の基質へ の影
響につ いての質 問があ った。こ の質問 に対し、．糖代謝のみならず、W
rlt/pーcateninに代 表さ れ る 様カ な pa
thwa
yに お いて も り ン 酸化 を お こす と 回 答した 。その 中で、GiDCのT
h2分 化抑 制 の 機序 と し て、 Wnt/pー cateninが 特 に関 与 す るか質 問され たが、本 研
究 で は 検 討 して お ら ず、 今 後 検討 し て いき た い と述 べ た 。 また 、 DCに 関 し てGSK3を着 目し た 経 緯に っ い ての 質 問 があ っ た 。こ の 質 問 に対 し 、 Huma
nmonocyteで のTLR
刺激 によ る ILー 10産生 上 昇 のメ カ ニ ズム が 報 告 され て お り、 移 植での tolerance
誘 導に
IL− 10を 強 カ に 産 生 す る DCを 誘 導 で き な い か 考 え た 。 DCで も GSK
3活 性 抑制 に よ り
IL― 10の産 生 上 昇は 認 め たが toleranceを 誘 導し う る もの で はな かった と回答し た。
− 326ーついで， 小野江和 則教授 より、DC―CD4゛T
細胞 問での 抗原提示 量が少ない場合にTh2への偏向が 誘導され る報告 があるが 、この 検討を行っているかについての質問があった。
この質問 に対し、 allo―ML
Rにおけ るD
C、CD4゛T
細 胞の比 をふって 検討したが、アロ抗原提 示 量は GiD
CでのTh
2分化抑 制に影響 を与え なかった と回答 した。ま た、ultr
apureL
PSを 用い た 場 合の GiD
Cの IL― 10産生 っいて の質問が あった 。この質 問に対 し、TL
R2
ligand成 分 を除 去 し てあ る ultrap
ureL
PSの 使用によ るIL―10産 生量へ の影響は 、今後の 検 討 課題 で あ ると 回 答 した 。 さら に、野 々村克也 教授よ り、inhibitorの臨床 応用に つ いて の質問が あった 。この質 問に対 し、SB415286の ヒトヘの 使用例は なぃが 、oncogene
で あるB一cateninの上昇と それに よる発癌 性が危 惧される ので、 axinとの重合に 関 与し なぃGSK3i
nhib
itorの 開発が 望まれる と回答 した。ま た、問質 性膀胱 炎におけ る 具体 的な投与 方法を 含めての 臨床応 用につい ての質問 があっ た。この 質問に 対し、 問 質 性膀 胱 炎 はsyst
emic
な ア レル ギー疾 患と捉え られる ものであ り、Th2抑制目
的に GSK3活性を 介する 治療は検 討しても よいが 、局所投 与にお ける治療 効果は 不明であり 、 全 身投 与 と して は Al
zhei
mer病で使 用されて いる間 接的GS
K3
活性 抑制能 を有す
るりチウ ムを用い る方法 が考えら れると 回答した 。
こ の 論文 は 、 I
mmunologyで 高 く評 価 さ れ 、今 後 の G
SK3活性 を介 する新 たなDCの制御機構の 開発に結 びっく ものと期 待され る。
審 査 員一同 は、これ らの成 果を高く 評価し 、大学院 課程に おける研 鑽や取得 単位なども 併 せ申 請者が博 士（医 学）の学 位を受 けるのに 十分な資 格を有 するもの と判定 した。

― 327ー