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自然免疫関連ペプチドを指標とした食品成分の安全性評価法の構築＜平成 22 年度助成＞

自然免疫関連ペプチドを指標とした食品成分の安全性評価法の構築
高橋

夏

子

（北海道大学大学院医学研究科）

緒

するとともに、がん治療における食品機能性成分言の有用性を明らかにすることを目的とする。
1)

がんは日本の死亡原因の第一位を占めており 、分子標的薬を中心としたがん治療法が急速に発展している現在においても完治は難しく、がん患者実験方法
1.

使用細胞の数は今後も増加の一途を辿ることが予想される。

ヒト結腸癌由来 Caco-2 細胞を使用した。理化

一方、がん患者の多くに、手術および抗がん薬学研究所バイオリソースセンターより購入したの副作用による侵襲から腸粘膜の萎縮、さらにはCaco - 2 細胞を継代数 45 – 60 で使用した。Caco - 2

腸管免疫の機能低下が惹起されることが指摘され

細 胞 の 培 養 に は、DMEM に 10 %（v/v）FBS,ている。このような問題を背景に、がん患者の免

0.1 mM NEAA, 2 mM L - グルタミン、100 IU/mL

疫賦活を目的としたサプリメントの市場が拡大しペニシリン- 100 ng/mL ストレプトマイシンを添加ているが、エビデンスに乏しいものが存在するた

した培養液を用いた。培養は 75 cm2 フラスコにめ使用に際しては注意が必要とされる。さらに、培養液 15 mL を加え、37 ℃– 5 % CO 2 下で行った。

近 年 の 医 療 費 の 増 大 や 患 者 の QOL（Quality of2.

細胞生存率の評価法

life）向上に対する意識の変化からも機能性食品の細 胞 生 存 率 の 評 価 は、3（4,5 - Dimethyl - 2 -使用が増加し、健康被害が報告されるようになっthiazolyl）-2, 5 - diphenyl - 2H-tetrazolium bromide

た。がん患者の安全の担保および QOL 向上の観（MTT）assay4) にて行った。細胞懸濁液を 5 × 10 4点から、経口摂取された機能性食品および薬物がcells/mL に調製し、96 穴平底マイクロプレート最初に接触する防御機構、すなわち腸管免疫の食（FALCON ®, Becton Dickinson）に 50μL/well ず– 薬間相互作用の科学的検証が極めて重要な因子つ播種した。37 ℃– 5 % CO 2 インキュベーター内となる。

で 24 時間培養した後、終濃度に合わせて調製し近年、小腸パネート細胞から分泌される抗菌ペた薬液を 50μL/well ずつ添加した。CO 2 インキュプチド、α- defensin が腸管免疫の分野で注目されベーター内にて一定時間薬液を培養細胞と接触さている。このペプチドは、微生物に対する生体防せた。反応終了前に培養液 100μL に対し 0.5 %御機構としてだけではなく、クローン病のようなMTT - PBS ス ト ッ ク 溶 液（ 滅 菌 PBS に MTT を腸管疾患との関連 2) や腸管免疫との関連 3) 等、生溶解して調製）を 10μL/well ずつ添加しインキュ体における重要性が報告されている。

ベーター内で発色させた。反応後、培養液を吸引

本研究では、がん患者における機能性食品と経除 去 し、DMSO を 200μL/well ず つ 添 加 し て 細

口抗がん剤併用による影響をα- defensin を指標と胞を溶解し、マイクロプレートリーダー（Wallacした免疫能の観点から科学的根拠に基づいて提示

1420 ARVOsx, Perkin Elmer）に て 590 nm に お146

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ける吸光度を測定し、生成した MTT formazanqPCR SuperMix UDG を 用 い、95 ºC で 15 分 間 変の吸光度を求めた。細胞生存率は薬物未処理群性させた後、さらに 94 ºC で 30 秒間変性、60 ºC（control）の吸光度に対する薬物処理群の吸光度で 30 秒間アニーリング、72 ºC で 10 分間伸長のの 比（ % of control）を 示 し た。 ま た、inhibitory

条件で 40 サイクル増幅させた。Human defensin

concentration 50 %（IC 50 値）の算出には解析ソフ5（HD - 5）、Human defensin 6（HD - 6）、GAPDH®

ト Origin 8.1J を用いた。
3.

α- defensin mRNA の測定1） Caco-2 細胞からの total RNAの抽出のプライマーは以下のものを用いた。
HD - 5 forward : 5’
- cgccatccttgctgccattct - 3 ’,
HD - 5 reverse : 5’- aacggccggttcggcaatagc - 3 ’,

Caco - 2 細胞 1 × 10 5 cells/mL 懸濁液を調製後、HD - 6 forward : 5’- gtggggcaaatgaccaggact - 3 ’,

6 well プ レ ー ト（coster）に 2 mL/well ず つ 播 種

HD - 6 reverse : 5’- tccctcagaggcagcagaatc - 3 ’,

し、37 ℃– 5 % CO 2 インキュベーター内でコンフGAPDH forward : 5’- atgggaagctggtcatcaac - 3 ’,

ルエントとなるまで培養を行った。その後、抗GAPDH reverse: 5’-gtggttcacacccatcacaa-3’。

がん薬としてテガフールおよび機能性食品とし

ま た、反 応 お よ び 検 出 に は、Mx3000 TM Real -て Epigallocatechin gallate（EGCg）を添加し、規Time PCR System（STRATAGENE）を使用し定の時間細胞に接触させた。テガフールおよびた。実 験 の 結 果 は HD - 5 お よ び HD - 6 の 結 果 をEGCg 処理後、培養液を吸引し氷冷した PBS をGAPDH で割り、コントロールの値を 100 %に換加えた。セルスクレーパーにより細胞をかきと算したときの相対値を示した。

り、遠心分離（1,500 × g, 5 min, 4 ºC）により細胞4） 統計処理を回収した。回収した細胞を氷冷した PBS で洗データは平均±標準偏差で表示した。多群間の浄後、ISOGEN ® 0.5 mL に溶解させた。ISOGEN

比較には one way ANOVA および Duncan test を行

溶 液 に chloroform 0.2 mL を 加 え、15 秒 間 激 しい解析した。危険率 5 %未満を統計学的有意とした。

く転倒混和し、室温で 3 分間静置した。遠心分離（12,000 × g, 15 min, 4 ºC）により得られた上清に2 - propanol 0.5 mL を加え、室温で約 5 分間静置した。その後、遠心分離（12,000 × g, 10 min, 4ºC）により沈殿を回収し、70 % ethanol 1 mL を加え結果と考察
1. Caco - 2 細胞におけるα- defensin mRNA 量に対するテガフールおよび Epigallocatechingallate (EGCg) の影響た。遠心分離（7,500 × g, 10 min, 4ºC）を行い、沈機能性食品の安全性評価法の構築に必要な基礎

殿 し た total RNA を 乾 燥 後、RNase free water

的知見を得るため、テガフールおよび EGCg の（DEPC-treated water）に溶解させた。

曝露時間を変動させα- defensin mRNA量を評価

2） 逆転写反応

した。

逆転写反応は、ReverTra Ace を用い、得られ予備培養後、テガフールおよび EGCg を 3、6、た total RNA 5 μg に つ い て 逆 転 写 反 応 を 行 い

12、24、48 時 間 曝 露 し Caco - 2 細 胞 を 培 養 し た。

cDNA を 合 成 し、Real - time PCR の テ ン プ レ ー

各設定時間曝露後、Caco - 2 細胞より RNA を抽出

ト DNA と し て 用 い た。 な お、 逆 転 写 反 応 に はし cDNA を 合 成、Real - time PCR に 用 い た。 そTMiCycler （BIO-RAD）を使用した。の結果、HD - 5 mRNA 量は 3 時間で顕著な減少を

3） Real - time PCR

示し、12 時間まで時間依存的に回復し、48 時間

Real - time PCR は、Platinum ® SYBR ® Green。また、HD - 6 でにかけて再び減少した（ 図 1 - a）

自然免疫関連ペプチドを指標とした食品成分の安全性評価法の構築

図1

図2147

テガフール曝露が HD-5/6 mRNA 量に及ぼす影響

EGCg 曝露が HD-5/6 mRNA 量に及ぼす影響

は 3 時間曝露において有意な減少が確認され、12かった。

時間にかけて回復後は大きな変動を示さなかった

2.

。一方、EGCg 曝露においては、HD - 5（ 図 1 - b）
および HD - 6 mRNA 量共に早い段階での増加がテガフールおよび Epigallocatechin gallate(EGCg) 曝露による Caco - 2 細胞に対する障害性。
見られ、12 時間後減少傾向を示した（図 2 - a , b）

1 の検討で得られたα- defensin の変動が細胞障

この理由については、EGCg の分解物による影響害性に起因するものであるか確認するため、テガが考えられるが、現在のところ不明である。また、

フールおよび EGCg の曝露濃度、時間を変動させテガフールおよび EGCg の曝露濃度の違いがαMTT assay にて評価した。

- defensin に与える影響については、実際の投与をテガフールの曝露濃度の違いによる細胞障害性想定し、腸管に曝露されうる 1 から 100μM の濃の検討では、1、10、100μM において細胞障害度範囲で検討を行った。設定時間は、自然免疫系。また、EGCg 曝性は確認されなかった（ 図 3 - a）の発動が早期であること、またテガフール曝露に露においても、1 から 100μM において細胞障害よる HD - 5 および HD - 6 mRNA 量減少が顕著で。テガフールの曝性は確認されなかった（図 3 - b）

あった 3 時間とした。テガフール曝露においては、露時間の違いが細胞生存率に与える影響では、241、10 μM 曝露で HD - 5 および HD - 6 mRNA 量に時間目まで顕著な変動は確認されなかったが、48変化は見られなかったが、100μM において、両時間曝露において細胞生存率の低下が見られた

mRNA 量の低下が確認された（data not shown）。

。ま た、EGCg 曝 露 に お い て は、3 時 間（ 図 4 - a）

また、EGCg 曝露においては、濃度の違いによるから 48 時間まで細胞障害性は確認されなかった

HD - 5 および HD - 6 mRNA 量の変動は観察されな。以上の結果より、各条件における検討（ 図 4 - b）

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浦上財団研究報告書

図3

テガフールおよび EGCg の曝露による細胞障害性（濃度）

図4

テガフールおよび EGCg の曝露による細胞障害性（時間）は適切であると判断し、以下の検討を行った。
3.

Vol.19（2012）

評価した。
EGCg 曝露濃度依存的に、テガフールによるテガフールによるα-defensin mRNA 量の減少に対する EGCg の影響

HD - 5 および HD - 6 mRNA 量減少を抑制する傾EGCg 併用がテガフールの HD - 5 および HD - 6

向が見られた。特に、HD - 5 における抑制効果は、mRNA 量低下に及ぼす影響を評価した。
テガフールおよび EGCg の曝露時間は、自然免

HD-6 と比較しより低濃度で効果があることが明。
らかとなった（表 1 ）疫系の働きが早期であることを考慮し 3 時間に設以上の結果より、EGCg は腸管において、テガ定した。また、テガフールの濃度は、1 の検討よ

フールによるα- defensin mRNA 量減少を抑制するり変動が見られた 100μM とし、1、10、100μMことが示され、抗がん薬治療による免疫低下を改の各濃度の EGCg を同時に曝露した時の影響を善できる食品素材となり得る可能性が示唆された。

表1

FT による HD-5 および HD-6 mRNA 量低下に EGCg が及ぼす影響

自然免疫関連ペプチドを指標とした食品成分の安全性評価法の構築

まとめ
がん治療においては、治療費が高額になること149実証されていないものも数多く存在し、機能性食品と医薬品の併用による健康被害が問題となっている。

や奏効率の低さから、がん患者が補完代替医療と本研究において確立された評価法は、機能性食してサプリメントを併用するケースが増えている。

品の安全性評価における新たな基準となり、がん

しかしながら、サプリメントの使用は恩恵をもた患者のみならず、生活習慣病を予防する食品の探らすばかりではなく、それ自体もしくは薬剤との索等、健常人の健康維持・増進にも役立つことを併用による健康被害を被る可能性があり、利用す大いに期待する。

る際には注意が必要とされる。本研究では、がん患者に汎用され、且つ日常的にも摂取される機能謝 辞

性食品成分の一つである茶ポリフェノールに着目

本研究を遂行するにあたり、多大な研究助成をし、腸管免疫への影響から安全性評価を試みた。

賜りました財団法人浦上食品・食文化振興財団な腸管上皮細胞が産生する抗菌性ペプチドであるらびに関係者各位に心より感謝を申し上げますと

α- defensin の発現に対する経口抗がん薬と機能性ともに、貴財団の将来にわたる益々のご発展をお食品成分の影響を検討した。腸管モデル細胞であ祈り申し上げます。

る Caco - 2 を用い、テガフール曝露による HD - 5

本研究助成による成果は、第 21 回 日本医療薬

mRNA 量 へ の 影 響 を 確 認 し た と こ ろ、HD - 5

学会年会
（神戸）
において演題名：「EpigallocatechinmRNA 発現量は減少し、短時間の曝露で最も減少gallate が経口抗がん薬由来の腸管免疫低下に与えすることが明かとなった。さらに、機能性食品成る影響」で発表した。

分である EGCg を同時添加したところ、テガフールによる HD - 5 および HD - 6 mRNA の減少を抑文制する効果が認められた。

1) 「平成 22 年人口動態統計の概況」厚生労働省 大臣官房
統計情報部, 2010.

近年、健康の保持、病気の予防・治療などを目的とした多くの機能性食品が市場に出回り、国民の 8 割以上が利用経験を有し、日常生活に欠くことのできないものとなりつつある。一方で、わが国で販売されている機能性食品は科学的に機能が献

2) Tanabe H. et al. BBRC, 2007.
3) Masuda K. et al. Adv Otorhinolaryngol, 2011.
4) Mosmann T., J. Immunol. Methods., 65, 55-63 1983.

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浦上財団研究報告書

Vol.19（2012）

Establishment of a safety evaluation system for functional foodby innate immune peptide α-defensin
Natsuko Takahashi
Graduate School of Medicine, Hokkaido University
Supplements are being used by many cancer patients to alleviate side effects ofchemotherapy and therapy-related symptoms such as immune compromise. Somenutraceuticals have been approved as dietary foods for special medical purposes for cancer
patients. However, the most pressing problems associated with these products are presenceof incorrect assumption and absence of regulatory oversight. In addition, interactions
between supplements and anticancer drugs may increase or decrease the pharmacologial or
toxicological actions.
The effect of epigallocatechin gallate (EGCg) on suppression of the immune system bytegafur, an oral 5-FU prodrug, was investigated. We focused on α-defensins and examinedthe effect of EGCg on the expression of α-defensins in intestinal epithelial Caco-2 cells inthis study. α-Defensins (HD-5: human defensin 5, HD-6: human defensin 6) are abundantconstituents of mouse and human paneth cells and play a role in the innate immune systemin the intestine. We detected HD-5 and HD-6 mRNA in Caco-2 cells by real-time PCR
analysis and evaluated the effects of an anticancer drugs and functional foods on HD-5 andHD-6 mRNA levels. HD-5 and HD-6 mRNA levels were decreased by exposure of tegafur.
On the other hand, EGCg increased HD-5 and HD-6 mRNA levels. The tegafur-induced
decrease in HD-5 and HD-6 mRNA levels was almost completely suppressed by EGCg.
These results indicate that EGCg suppressed the expression of α-defensins induced by FT
at the transcriptional level in Caco-2 cells, suggesting that EGCg can be used an adjunctive
therapy in chemotherapy.