ISSN 1347-4804

July 2018

Vol.86 No.3
プログルカゴン
グリセンチン（1-69）

GLP-1

GLP-2

オキシントモジュリン

グルカゴン
グリセンチン（1-61）

グルカゴン及びグルカゴン類似ペプチド

ミニ
グルカゴン

〔総

説〕

「サンドイッチ ELISA を用いたグルカゴン再検証の必要性」「医薬品・再生医療等製品向け原材料

北村

忠弘、小林

雅樹……… 2

国産ウシ多血小板血漿由来血清「NeoSERA®」の開発」
濵田

彰子、山原

研一、高田

竜治、須藤

稔太……… 5

〈テクニカルレポート〉「ScreenF ectTMA および ScreenF ectTMA plus による遺伝子導入の特徴」
【連

高木

徹、村上

孝………   8植田

幸嗣……… 10上村

紀仁……… 12伊藤

正人……… 15載】

〈エクソソームと生命現象〉「第 2 回

エクソソームのプロテオーム解析」〈神経変性疾患研究の最前線〉「第 6 回

パーキンソン病（2） αシヌクレイン」〈アミノ酸分析 ～新たな潮流～〉 新連載「第 1 回

アミノ酸分析の歴史とニンヒドリンによるアミノ酸分析法」〈核酸医薬合成 基礎講座〉「第 3 回

オリゴヌクレオチド合成におけるカップリング反応」

佐藤

健太郎……… 18〔化学大家〕
「長井

長義」

渋谷

雅之……… 28

〔製品紹介〕
免

有機合成

疫

高分子アミロイドβオリゴマー ELISA キットワコー… ……… 22

核酸合成用 アクチベーター試薬
Activator-1（4,5-Dicyanoimidazole）他… ………… 19

Tau ELISA キットワコー…………………………………… 23

p 型有機半導体材料 TBBT-C4、TBBT-C10…………… 26

抗りん酸化α- シヌクレイン，モノクローナル抗体（pSyn#64）、

ジスルフィド結合形成試薬 Npys-OMe…………………… 32

抗りん酸化α- シヌクレイン，モノクローナル抗体（pSyn#64），

分

ビオチン結合……………………………………………… 24

析

日立用ニンヒドリン発色溶液キット… ……………………… 17

細胞生物

局方一般試験法用 0.5mol/L 水酸化カリウム・エタノール液…… 27

グルカゴン ELISA キットワコー（サンドイッチ法）… ………

ポジティブリスト関連標準品… …………………………… 27

ハリクロリン………………………………………………… 24

コロイド滴定用 滴定液… ………………………………… 27

遺培ScreenF ectTMA………………………………………… 9, 21

養

NeoSERA®… ……………………………………………

7

伝

4

子

ScreenF ectTMA plus ………………………………………

9

ヘパリンナトリウム，ブタ腸粘膜由来……………………… 25

MagCaptureTM エクソソームアイソレーションキット PS…… 11

機

PS CaptureTM エクソソーム ELISA キット

器

多目的用途ステンレス缶「キミツ」………………………… 25（ストレプトアビジン HRP）
… …………………………… 20

1R

esearch
サンドイッチ ELISA を用いたグルカゴン再検証の必要性
群馬大学 生体調節研究所 代謝シグナル解析分野

はじめに

忠弘、小林

雅樹

プロインスリンからインスリンと C-

グ ル カ ゴ ン 測 定 系（LC-MS/MS） をペプチドの２つしか合成されないのと開発した 5）。誌面の都合上、詳細は省は対照的である。特に、グリセンチン

く が、 質 量 分 析 装 置 に Orbitrap-MS

グルカゴンの主な生理作用は肝臓にとオキシントモジュリンはアミノ酸配を用い、プロテアーゼ処理をせずに全作用した際のグリコーゲン分解や糖原列がグルカゴンと重複しており、抗体

長グルカゴンを直接測定し、さらに操性アミノ酸を基質とした糖新生によるを用いたイムノアッセイでは交叉反応

作過程での回収率を補正する目的で、血糖上昇である。また、グルカゴンはを避けられない。従って、従来から使13

胃腸の蠕動運動を抑制する作用や、中用されてきた多くのグルカゴン測定系

補正することで、グルカゴンのみを特枢に作用した場合の食欲抑制、褐色脂はグルカゴンの C 末断端を認識する

異的に定量解析することが可能となっ肪細胞における熱産生促進作用もあ

特殊抗体が使用されている（グリセンた。しかしながら、今後、全ての検体る。最近では、グルカゴンは糖代謝調

チンやオキシントモジュリンは C 末を LC-MS/MS で測定できるかという節よりもアミノ酸代謝調節に必須であ構造がグルカゴンと異なる）。しかしと、現時点では以下の理由から困難でることも明らかとなっている。従っながら、血中にはグリセンチン（1-61）ある。まず、イムノアッセイと違ってて、グルカゴンを単純にインスリンのの存在が示唆されており、C 末断端認

測定費用が高額になること、さらに、拮抗ホルモンと考えてはいけない。一識抗体でも交叉してしまう。多くの臨

複数検体を同時に測定することがで方、糖尿病における高グルカゴン血症

床研究で血中グルカゴン濃度に関して

きず、測定に時間がかかり過ぎるからの病態生理的意義と、糖尿病治療標的

安定したデータが得られにくかったのである。LC-MS/MS とサンドイッチとしてのグルカゴンにも注目が集まっは、測定系の問題に起因するところがELISA による測定法の長所、短所をている。しかしながら、従来のグルカ大きい。

図１上にまとめてある。従って、機器

C の安定同位体グルカゴンを用いてゴン C 末抗体を用いた競合法 RIA で特異性の問題を克服するには、N 末の技術革新によりコストや測定時間のは交叉反応性の問題から正確にグルカ

断端認識抗体と C 末断端認識抗体の問題をクリアできれば、将来的にはグゴンを測定できなかった。本稿では、両方を用いたサンドイッチ ELISA がルカゴンは LC-MS/MS での測定が標

筆者らが開発した LC-MS/MS による有効である。この系を用いると、理論準になる可能性はあるが、現時点ではグルカゴン測定法とサンドイッチ

上、グリセンチン（1-61）を含め、種々

少なくとも LC-MS/MS の測定値に最

ELISA について紹介し、従来の競合法のプログルカゴン由来のペプチドとのも近いイムノアッセイを採用するべき

RIA との違いについて概説する。

交叉反応を避けられる。最近、Holstと考えた。実際に筆者らが検討したもグルカゴンを正確に測定するには

LC-MS/MS とイムノアッセイ間でのサンドイッチ ELISA が必要であるこ

グルカゴン測定値の相関結果を図１下

1 グルカゴン測定系の問題

2

北村

2）

と を 提 唱 し て お り 、 さ ら に 最 近、に示す。サンドイッチ ELISA と LC-

グルカゴン研究はインスリン研究に

Mercodia 社のサンドイッチ ELISA がMS/MS の値に一致は見られないもの

比べ、低迷してきた。その最大の理由

現時点で最も正確にグルカゴンを測定の、概ね良好な相関は得られている。

はグルカゴン測定の不正確さにある。

できると述べている 3）。しかしながら、それに対し、従来法の競合法 RIA は

そのことは最近 Holst らのグループもMercodia 社 の サ ン ド イ ッ チ ELISA

LC-MS/MS と ほ と ん ど 相 関 し な い。

指摘している 1）。彼らは世界各国で標もグルカゴンに対する特異性が十分

従って、今後はグルカゴンの測定はサ4）

準的に用いられている８種類のグルカでないことが指摘されている 。筆者

ンドイッチ ELISA を用いて行われる

ゴン測定キットを比較検討し、どれ一らも交叉反応試験を行い、グルカゴン

べきであり、これまでのグルカゴンに

つ感度、特異性に優れたものはないと以外の類似ペプチドに交叉反応するこ関するデータもサンドイッチ ELISA

いう結果を報告した。グルカゴンはイとを確認した。即ち、従来法の競合法

で再検証の上、糖尿病におけるグルカ

ンスリンが発見された２年後の 1923

RIA に比べると、グルカゴンに対す

ゴンの新たな病態生理的意義の解明へ

年に発見された古いホルモンであるにる特異性は増したが、サンドイッチとつなげていくべきである。

もかかわらず、なぜインスリンと違っ

ELISA といえども原理はイムノアッて測定が困難なのか？

その理由はプセイであり、抗体による非特異交叉反ログルカゴンからプロセッシングを受

応を 100％除外することはできない。

けてグルカゴンが合成される過程でア

上記の問題を克服すべく、筆者らは

ミノ酸配列が類似した複数のペプチド

イムノアッセイ原理を用いない新たなが合成されてくるからである。これは測定法として、質量分析装置を用いた

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）

健常者における糖負荷
2 と食事負荷後の血中グ
ルカゴン動態
最も基本的なことであるが、健常者

それでは、食後にグルカゴン分泌が促進される生理的意義は何であろうか？

冒頭で記述したようにグルカゴ

ンには肝臓における糖産生促進作用以外に、中枢における食欲抑制、消化管
運動抑制、褐色脂肪での熱産生促進な
どの生理作用があり、これらは全て食後に分泌促進した方が理にかなっている。すなわち、食後に摂食を止めさせる働きや、食事誘導性熱産生（食後には体温上昇や発汗が起こる）にグルカ
ゴンが関わっているという考え方である。しかしながら、最近では、グルカ
ゴンは食後のアミノ酸代謝に必須であ
図１．上：LC-MS/MS とサンドイッチ ELISA によるグルカゴン測定系の長所と短所。
下：LC-MS/MS とサンドイッチ ELISA、または競合法 RIA とのグルカゴン測定値の相関。文献５）から引用改変。

るために分泌が促進されるのではないかと考えられるようになった。即ち、食事中のタンパク質（アミノ酸）が分解 さ れ て 生 じ る NH3（ ア ン モ ニ ア ）では糖負荷や食事負荷をすると、血中の変動パターンを示し、糖負荷でグルは生体に有害であり、これを尿素に変グルカゴン濃度はどのような変動をき

カゴンは有意に低下するが、食事負荷

換して尿として体外に排出する目的

たすのであろうか？

血糖値、血中イでは上昇傾向を示した（その後、検体で、食後にグルカゴン分泌が促進されンスリン濃度の変動と合わせて、３種数を増やすことで有意に上昇することるという考え方である（グルカゴンに類の測定系で血中グルカゴン濃度を評を確認済み）。重要なことに、これらは尿素合成促進作用がある）。実際に、価した結果を図２に示す。血糖値とイの逆パターンは従来の競合法 RIA で筆者らも健常者にタンパク質負荷試験

ンスリンに関しては、糖負荷（75g ブは認められなかった。従って、従来のを行い、血中グルカゴン濃度が速やかドウ糖）と食事負荷（約 50g 炭水化測定法による結果をもとに、食後はイに著しく上昇することを確認している物、約 20g タンパク質、約 10g 脂質）

ンスリン分泌が促進されると同時にグ（未発表データ）。

では、ほぼ類似の変動パターンを示し

ルカゴン分泌は抑制されると考えられた。 そ れ に 対 し、 グ ル カ ゴ ン は LC-てきたが、それは誤りであり、食後はMS/MS とサンドイッチ ELISA の両インスリンもグルカゴンも分泌が促進方において、糖負荷と食事負荷では逆

される。

160

最近、糖尿病に対する薬剤として、

80

70
60

140

60

50

120

40

100

30

40

20

80
60

おわりに

20

10
0 30 60

120 18000 30 60

120

180

0

0

60

120

180 0

60

120

180

0

60

120

180

図２．健常者に対し、糖負荷試験と食事負荷試験を行った際の血糖値、血中インスリン濃度、血中グルカゴン濃度（LC-MS/MS、サンドイッ
チ ELISA、競合法 RIA）の経時的推移。文献 5）から引用改変。

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）3

グルカゴン抑制作用を持つインクレチン関連薬が臨床応用され、グルカゴンが再注目されている。しかしながら、グルカゴンの測定系には交叉反応性の問題があり、正確に評価するには LCMS/MS やサンドイッチ ELISA といった新しい測定系が必要である。今後、新規測定系を用いた糖尿病におけるグルカゴンの病態生理的意義の解明と、種々の糖尿病薬による血中グルカゴン

LC-MS/MS
液体クロマトグラフィ（LC）にて分離した化合物を、質量分析装置（MS）にてイオン化し分析する過程を２段階行い、高精度に化合物を同定する装置。

に Nauck らは、健常人にグルコースを経口投与すると、経静脈投与よりはるかに多いインスリン分泌が認められることを確認し、「インクレチン効果」と名 付 け た。代 表 的 な イ ン ク レ チ ン に
GLP-1 と GIP があり、糖尿病薬である
DPP4 阻害薬と GLP-1 受容体作動薬がインクレチン関連薬と呼ばれる。

インクレチン
消化管由来のインスリン分泌促進因子として 1932 年に提唱された。1986 年

濃度への影響の再検証を行い、将来的にはグルカゴンも視野に入れた糖尿病の病態診断と、それを基にした新たな治療戦略が期待される。
〔参考文献〕
1）Bak, M. J. et al . :“Specificity and sensitivityof commercially available assays for glucagonand oxyntomodulin measurement in humans”,

Eur. J. Endocrinol ., 170, 529（2014）.
2）Holst, J. J. et al . :“Regulation of glucagon
secretion by incretins”,Diabetes Obes. Metab .,13 Suppl 1, 89（2011）.
3）Wewer, Albrechtsen, N. J. et al . :“Hyperglucagonaemia analysed by glucagon sandwich
ELISA : nonspecific interference or truly
elevated levels?”,Diabetologia , 57, 1919（2014）.
4）Matsuo, T. et al . :“Postabsorptive hyperglucagonemia in patients with type 2 diabetes

mellitus analyzed with a novel enzyme-linked
immunosorbent assay”,J. Diabetes Investig .,7, 324（2016）.
5）M iyachi, A. et al . : “Accurate analyticalmethod for human plasma glucagon levels
using liquid chromatography-high resolution
mass spectrometry : comparison with commercially available immunoassays”, Anal.
Bioanal. Chem ., 409, 5911（2017）.

グルカゴン ELISA キットワコー（サンドイッチ法）
本品は、グルカゴンの N 末端認識モノクローナル抗体と C 末端認識モノクローナル抗体を用いたサンド
イッチ ELISA キットです。

基本性能

交差反応性
サンドイッチ法2.2 〜 143.6 pmol/L（7.8 〜 500pg/mL）
0.3pmol/L（1.08pg/mL）
血清（ヒト、ラット、マウス）、血漿（ヒト、ラット、マウス）、培養液
10μL
約 20 時間

必要検体量
測定時間

キット内容
●抗体固相化 96 ウェルプレート●グルカゴン標準品

1 プレート
0 . 287 pmol × 1 本● HRP 標識抗グルカゴン抗体溶液

12 mL × 1 本● TMB 溶液

12 mL × 1 本●反応停止液12 mL × 1 本●緩衝液

12 mL × 1 本●濃縮洗浄液（20 ×）50 mL × 1 本●プレートシール

2枚

交差反応性（%）
0.68
0.96
0.97
0.95
not confirmed
not confirmed
0.64
not detected■他社製品との相関性データ
y =1.6838x − 0.0367
r =0.91(n=78)(pmol/L)

測定対象検体グルカゴン類似ペプチド
Glicentin（1-69）（ヒト）
Glicentin（1-69）（ラット）
Glicentin（1-69）（マウス）
Glicentin（1-61）（ヒト）
Glicentin（1-61）（ラット）
Glicentin（1-61）（マウス）
Oxyntomodulin（ヒト、ラット、マウス）
Mini-glucagon（ヒト、ラット、マウス）〈サンプル条件〉
検体：ヒト血清（n= 78）
測定条件
各キット添付文書に従い実施

A社

測定原理
検量線範囲
感度

Glucagon ELISA kit Wako
(Sandwich method)(pmol/L)

他社同等品と高い相関性がみられた。
コード No.
292-80001

品

名規

Glucagon ELISA Kit Wako（Sandwich method）

格容

糖尿病研究用詳しくは当社 HP をご覧下さい。

量

96 回用

グルカゴン ELISA 和光

希望納入価格（円）95,000検索➡
…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2018 年 7 月時点での情報です。最新情報は、siyaku.com（http://www.siyaku.com/）をご参照下さい。

4

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）

R

esearch

医薬品・再生医療等製品向け原材料 国産ウシ多血小板血漿由来
血清「NeoSERA Ⓡ」の開発
兵庫医科大学

先端医学研究所 医薬開発研究部門
株式会社ジャパン・バイオメディカル

濵田
高田

彰子、山原
竜治、須藤

研一
稔太

あるが、1992 年の 37,316 頭をピーク

増殖因子を豊富に含むことから、ヒトに、発生経路となる飼料の規制強化等

細胞、特に MSC の培養用添加剤としにより発生頭数は大幅に減少し、2016

1）ての使用が多数報告されている 。こ

年には年間 1 頭の発生まで減少してれをヒントに、我々は成牛から多血小下、羊膜 MSC）の製剤化と急性 GVHD

おり（国際獣疫事務局：以下、OIE、板血漿を抽出し、血清化処理を施した（移植片対宿主病）およびクローン病に“Number of reported cases of bovine

NeoSERA Ⓡ の開発に成功した（特許第 6212723 号）。

はじめに
我々はヒト羊膜由来間葉系幹細胞（以対する医師主導治験を実施中である

spongiform encephalopathy（BSE）in（UMIN 試 験 ID UMIN000029945、

farmed cattle worldwide”2016/3/

NeoSERA Ⓡ の 安 全 性 に 関 し て は、

UMIN000029841）。治験向けの羊膜

25）、BSE のリスクは世界的に大幅に獣医による定期的な健康確認を受け、MSC 製剤の製造には、MSC の培養に低下している。2013 年 5 月 OIE によ管理された成牛から採取された血液を汎用される胎児ウシ血清（Fetal Bovine

り日本や米国等が新たに BSE の「無原料として製造することで完全なト

Serum： 以 下、FBS） と 比 べ、 安 全

視できるリスク国」に指定され、2014

レーサビリティを実現し、また、米国

性・安定性・品質を高めた、我々が独年生物由来原料基準の改定（平成 26

USDA 規則 9CFR § 113.420 および欧自に開発した国産ウシ多血小板血漿

年 9 月 26 日厚生労働省告示第 375 号）

州 EMEA 規則 EMEA/CVMP/743/00「NeoSERA 」を使用している。本稿において、反すう動物由来原料等の原に従い、ウイルス不活化を含む滅菌をでは、NeoSERA Ⓡ の開発経緯とその産国を OIE の指定する BSE が「無視目的に 30kGy 以上のγ線照射を実施

特徴、使用上の注意点を中心に概説すできるリスク国」、となったことから、しており、生物由来原料基準の規程をる。

国産のウシ血清が医薬品等の原材料に満たす安全な細胞培養用血清である使用できる状況となっている。

（平成 29 年 4 月 17 日 医薬品医療機器Ⓡ

NeoSERA の開発背景：
医薬品・再生医療等製品
向け国産ウシ血清の復活Ⓡ

現在我が国ではジェイス、ジャッ

総合機構 再生医療等製品材料適格性

ク、テムセル HS 注、ハートシートの確 認 書 取 得 薬 機 審 長 発 第 0417002

４つの再生医療等製品が販売され、い号）。

ずれもウシ血清を使用して培養されてまた、安定性に関しては、単一プロウシ血清の中でも FBS は、ワクチ

い る（ 承 認 資 料 概 要 参 照：http://

トコルにて、少数の成牛からの繰り返ン製造など細胞培養技術を用いて製

www.pmda.go.jp/review-services/

し採血から得られた PRP をプールし造される医薬品等向けを含め、細胞培

drug-reviews/review-information/

た上で分注製造することにより、ロッ

養用添加剤のスタンダードとして汎用

ctp/0002.html）。この理由は、FBS がト間差を最小限にしている。

されている。一方、1980 年代後半英

細胞培養用添加剤のスタンダードであ国の報告から始まった牛海綿状脳症

ることに加え、細胞培養のコストが無（Bovine Spongiform Encephalopathy：

血清培地よりも低額であることも理由

以 下、BSE） の 発 生 は、2001 年 の 我である。しかしながら、FBS は不特が 国 に お け る BSE 発 症 を 契 機 に、

定多数の胎児ウシの血液抽出物である

2003 年医薬品等の安全性を確保することから、① BSE の原因プリオン混

は、platelet-derived growth factor

ため、当該生物由来原料に対して細菌入のリスクがある、②ロット差があ（PDGF）、transforming growth factor

やウイルス等の安全性確保のための基る、③細胞増殖性に劣ることがある、

β（TGF- β）、vascular endothelial

準（「生物由来原料基準」（平成 15 年といった、①安全性、②安定性、③品

growth factor（VEGF）、epidermal

5 月 20 日厚生労働省告示第 210 号））

質における問題点が以前から指摘されgrowth factor（EGF） 等 を 含 む 増 殖が定められることとなった。同基準でている。また、胎児ウシからという、因子が豊富に含まれており 2）、細胞培

は、医薬品等向けの反すう動物に由来

倫理的に大きな問題のある手法により養用添加剤として相応しい組成と考え

す る 原 材 料 に 関 し、 欧 州 の 地 理 的採取されている。

られる。そこで、再生医療分野で広く

NeoSERA Ⓡ の性能
NeoSERA Ⓡ の 主 原 料 で あ る PRP

BSE リスク評価に基づき、原産国がこれらの背景を踏まえ、我々は国産検討されているヒト由来 MSC、ワク規定された。この結果、BSE が発症

成牛の血液を加工することにより、①チン製造に汎用されている細胞株につした我が国は原産国として含まれず、

安全、②安定、③高品質な、医薬品・

いて、NeoSERA Ⓡ の性能に関し FBS

我が国における細胞培養用途のウシ血再生医療等製品向け血清の開発に乗りと比較検討した。

清の製造が途絶えることとなった。
その後の世界における BSE 発生で出した。ヒト血液由来の多血小板血漿（platelet-rich plasma、 以 下 PRP） は

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）5≪ヒト由来 MSC における NeoSERA Ⓡ

胞製剤化におけるメリットである、短2（A）（B）） に お い て、FBS お よ び

による増殖性≫時間で多くの細胞を得ることが期待さ

NeoSERA Ⓡ で培養した細胞の形態に

ヒト骨髄 MSC およびヒト羊膜 MSC

明確な差は認めなかった。増殖曲線れる。

において、NeoSERA Ⓡ および FBS を（グラフ２）および倍加時間（表２）

ぞ れ ぞ れ 10% 添 加 し た αMEM に て≪ワクチン製造用細胞株におけるの結果から、3 ロットの NeoSERA Ⓡ

培養し、増殖曲線より倍加時間を算出

NeoSERA による増殖性≫と FBS との間に増殖性の差を認めなⓇした。培養 7 日目の培養写真を図 1、細胞バンクより入手したアフリカミ増殖曲線をグラフ 1、増殖曲線より算

ドリザル腎臓由来細胞株 Vero 細胞お出した倍加時間を表 1 に示す。

よびヒト胎児肺由来細胞株 MRC-5 細

かった。

NeoSERA Ⓡ 使用上の注意点

ヒ ト 骨 髄 MSC お よ び ヒ ト 羊 膜胞において、NeoSERA Ⓡ（3 ロット）MSC の培養写真（図 1（A）（B））におよび FBS を細胞株のデータシート

おいて、FBS および NeoSERA Ⓡ で培に基づき推奨される基礎培地に添加し基本的に NeoSERA Ⓡ の使用に関し、養した細胞の形態に明確な差は認め培養を行い、増殖曲線より倍加時間を注意すべき点は FBS と大きな差はない。

なかった。増殖曲線（グラフ１）およ算出した。培養４日目あるいは５日目

詳細はジャパン・バイオメディカル社

び倍加時間（表１）の結果から、ヒトの培養写真を図 2、増殖曲線をグラフ

HP（https://www.japan-biomedical.

骨 髄・ 羊 膜 MSC の 培 養 に お い て、2、増殖曲線より算出した倍加時間を

jp/how-to-use-neosera）を参照して欲表 2 に示す。

しいが、最近しばしば受ける問い合Ⓡ

NeoSERA は FBS よりも高い増殖性を有することが示されたことから、細Vero および MRC-5 の培養写真（図わせが、NeoSERA Ⓡ への培地変更の方法である。可能であれば初代培養より NeoSERA Ⓡ の使用が望ましいが、®

他の培養法にて培養していた細胞を
NeoSERA Ⓡ に変更する場合は 3 継代
程度馴化させることをお願いしている。
具体的には、①継代時に NeoSERAⓇ に変更、あるいは②NeoSERA Ⓡ の混合
比率を 3 継代の間に段階的に増やす、といった方法で、細胞の性質により①®

または②の馴化方法を選択することを推奨する。馴化の際、細胞の増殖が速くなった場合であっても継代時の播種密度は大きく変更することなく、細胞をよく観察し、適切な継代のタイミングを決めることをおすすめしたい。

図１．
（A）ヒト骨髄 MSC 培養写真（NeoSERA 、FBS：それぞれ 40 倍）（B）ヒト羊膜 MSC 培養写真（NeoSERA Ⓡ、FBS：それぞれ 40 倍）Ⓡ

NeoSERA Ⓡ の今後
細胞培養技術を用いて製造される
医 薬 品・ 再 生 医 療 等 製 品 に お い て、®

®

表１．ヒト骨髄 MSC、ヒト羊膜 MSC 倍加時間®

®

グラフ１．（A）ヒト骨髄 MSC 増殖曲線（片対数）（B）ヒト羊膜 MSC 増殖曲線（片対数）6

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）

表２．Vero、MRC-5 倍加時間
®

®

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®
®
®

図２．（A）Vero 培養写真（NeoSERA Ⓡ 3 ロット、FBS：それぞれ 40 倍）（B）MRC-5 培養写真（NeoSERA Ⓡ 3 ロット、FBS：それぞれ 40 倍）

現 在、NeoSERA Ⓡ の GMP 製 造 化、更には豪州産の製造に取り組んでおり、近い将来、ジャパン・バイオメディカ
ル社の新しいラインアップとして登場予定である。NeoSERA Ⓡ を FBS の 代替品として幅広い研究者・技術者に使用して頂き、我々にフィードバックを®

®

頂くことで、よりよい製品になるもの

®

®

®

®

と考えており、是非ご協力頂ければ幸いである。
〔参考文献〕

グラフ２．（A）Vero 増殖曲線（片対数）（B）MRC-5 増殖曲線（片対数）1）Rubio-Azpeitia, E. and Andia, I. : Muscles

Ligaments Tendons J ., 4（1）,52（2014）.
2）Anitua, E. et al. : Thromb. Haemost ., 91, 4

NeoSERA Ⓡ を 原 材 料 と す る こ と で、おり、我が国だけでなく世界を視野

製品の安全化、培養期間の短縮によるに、積極的な啓蒙活動を行っていきた

低コスト化を実現できるものと考えてい。

（2004）.

再生医療等製品材料適格性確認書取得済
NeoSERA®
特長●生物由来原料基準の規程を満たす●高い細胞増殖性●γ線照射済（30kGy 以上）●国産ウシ由来
コード No.
632-41645

メーカーコード
JBM001品
NeoSERA®

名

容 量
500mL

希望納入価格（円）
照会

希望納入価格につきましては、当社代理店もしくは担当営業まで、お問合せ下さい。
NeoSERA® は研究用として販売しております。動物由来原料であることによるウイルス及びその他感染性因子による潜在的危険性を認識し、購入者の責任の下で使用して下さい。また、製造元の承認を得ずに本品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の製造及びヒト・動物の医薬品・再生医療用途に使用することは禁止されていますため、ご相談下さい。
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和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）7

echnical Report
ScreenFectTMA および ScreenFectTMA plus による遺伝子導入の特徴
埼玉医科大学 医学部 微生物学教室

はじめに

徹、村上

孝

イトーシスによって、細胞内に取り込せ遺伝子を導入する。組換えウイルス

近年のゲノム科学の発展は生物ゲノ

まれ、核に移行することにより遺伝子を作製する必要があるため、アデノ随

ムの塩基配列や発現解析を格段に飛躍を発現する方法である。特殊な機器や伴ウイルス以外はバイオセーフティー

させた。そこで解析された遺伝子の機技術は必要なく、比較的簡単に行うこ

レベル 2（BSL2）以上の施設が要求能を解析することに欠かせないのが遺とができる。

される。目的に合ったウイルスベク

伝 子 導 入 技 術 で あ る。 プ ラ ス ミ ド

リポフェクション法：陽性電荷脂質

ターを用い、組換えウイルスさえ作製

DNA や siRNA な ど の 核 酸 を 細 胞 になどから成る脂質二重膜小胞（リポできれば、遺伝子導入効率も高い。

導入し、細胞の変化や機能を解析する

ソーム）と導入する DNA との電気的手法は、現在の生物科学でもっとも基な相互作用により複合体を形成し、貪本的な技術の一つになっている。遺伝

食やエンドサイトーシスにより細胞内子工学技術の発展に伴い、現在では多に取り込ませる方法。遺伝子導入効率

ScreenF ectTMA および ScreenF ectTMA
plus （リポフェクション法）を用いた遺伝子導入の例

くの遺伝子導入法や遺伝子導入試薬がが高く、オリゴヌクレオチドや二本鎖

ScreenF ectTMA シ リ ー ズ の 特 記 す登場している。また、遺伝子導入法とRNA の導入も可能であり、特殊な機べきポイントとして、使用面での簡便して、ウイルスベクターを用いた方法

器や技術は必要なく、簡単に行うこと

さと導入効率の高さにある。

もあり、ヒト疾患に応用できる安全なができる。

1）one-step 法の簡便さ

ウイルスベクターも開発され応用され
1）

DEAE デキストラン法：本法によ従来より幅広く利用されているリポて い る 。 さ ら に、CRISPR/Cas9 法

る動物細胞への遺伝子の取り込みや核

フェクション試薬の多くは、遺伝子導の登場により、2 本鎖 DNA を切断し内輸送のメカニズムは、DEAE デキ

入の前日に目的の細胞を調整（播種）て、目的の遺伝子を削除・挿入できるストランと DNA が複合体を形成してしておく必要がある。また、リポソーようになった。この CRISPR/Cas9 法

細胞表面に結合し、エンドサイトーシ

ム と DNA の 複 合 体 形 成 を 妨 げ る たを行う上でも、遺伝子導入法はとてもスにより細胞内へと移行する。リン酸

め、抗生物質フリーや血清フリーの培

重要なものになっている 2）。このようカルシウム法やリポフェクション法に養液を用いて培養しておかなければなに、現在の生物科学実験を行う上で、比べて遺伝子導入効率が低く、細胞毒らない。それに対して ScreenF ectTMA

目的の細胞に遺伝子を導入し、目的の性がある。

シリーズでは、このような操作は必要

タンパク質を発現させることは欠かせエレクトロポレーション法：高電圧ない。さらに目的の細胞を前日から調ないことであり、簡便かつ安定的な発パルスにより一過性に細胞膜の脂質二整しておく必要がなく、遺伝子導入実現が求められる。本稿では筆者の経験

重層の膜構造を不安定化させ、DNA

験の当日に、本試薬を用いて目的の遺を踏まえ、簡易な手順で目的の細胞へを取り込ませる方法。導入効率は電伝子を細胞に導入することができる。

の遺伝子導入が高い効率で実現できる

圧・電気パルスの長さ・温度・細胞や使用する細胞は抗生物質も血清も含ん

ScreenF ectTMA、ScreenF ectTMA plus

DNA 濃度・緩衝液の組成などの条件でいる培地でも遺伝子導入を行えるのの特徴について紹介したい。

により左右される。また、高電圧パル

で、時間的に制約される場合でも細胞スをかけるので、他の方法と比較しての調整や培地交換の必要がなく、非常

バイアビリティーが低い。操作が簡単に簡便にスムーズに遺伝子導入を行う

で遺伝子導入効率は高いが、高価な専ことができる。

遺伝子導入方法の種類と特徴
目的の細胞への遺伝子導入法として
主に、リン酸カルシウム法、リポフェ用機器が必要である。

クション法、DEAE デキストラン法、

マイクロインジェクション法：1 個エレクトロポレーション法、マイクロの細胞に微細ガラス注射針を刺して試ScreenF ectTMA および ScreenF ectTMA

インジェクション法、ウイルスベク料を導入する方法。原理は簡単ながplus を 使 用 し、 ヒ ト 胃 が ん 細 胞 株

ター法があり、それぞれの特徴があら、高度な技術を必要とする。遺伝子

MNK45 細胞とヒト膵がん（肝転移）る 3）。

改変動物（マウスやラットなど）の作細胞株である KMP8 細胞を用いて遺製における常道で、受精卵に遺伝子を

伝 子 導 入 効 率 と 生 存 率 の 例 を 示 す。

注入する。

尚、 導 入 し た 遺 伝 子 は GFP（Green

リン酸カルシウム法：正電荷をもつ
カルシウムイオンを負の電荷をもつ

8高木2）遺伝子導入効率の高さ

DNA に結合させリン酸を加えると、ウイルスベクター法：レトロ（レンFluorescent Protein） を コ ー ド す る

カルシウムイオンとリン酸が結合し沈チ）ウイルス、アデノウイルス、アデ

pCAGGS-EGFP を 使 用 し、 生 存 率 の殿が生じる。このリン酸カルシウム・

ノ随伴ウイルスなど、ウイルス固有の確認には Propidium Iodide（PI）染色DNA 複合体が膜輸送であるエンドサ

生活環を応用し、目的の細胞に感染さを行い、フローサイトメーターを用い

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）

て比較した。

A

Screen ectTMA

MNK45 細胞（図１）では他社製品

Screen ectTMA

他社A

他社B

他社A

他社B

(1:4)

(1:3)

るものの、遺伝子導入効率が非常に高いことが確認された。遺伝子導入効率

Countと比較して、生存率はわずかに低下すは他社と比較して 5 〜 8 倍高い結果とな っ た。KMP8 細 胞（ 図 ２） で も 同様に、生存率はわずかに低下するが、GFP（導入効率）

B

Screen ectTMA

Screen ectTMA
(1:4)

(1:3)

比較して 8 倍以上高い導入効率を示し
た。

Count

遺伝子導入効率が非常に高い。他社とPI（生存率）このように他社製品では非常に導入

図１．MNK45 細胞を用いた遺伝子導入効率の比較
ScreenF ectTMA および ScreenF ectTMA plus は遺伝子導入当日に細胞密度が 80% confluent になるように調整した。一方、他社試薬用では 6 well plate に 2.5 × 105 個ずつ細胞を前日に幡種した。ScreenF ectTMA および ScreenF ectTMA plus は one-step 法、他社製品については two-step法で遺伝子導入を行った。ScreenF ectTMA plus においては、試薬と DNA 量を（1:3）,（1:4）の
2 通りで導入効率の比較を行った。遺伝子導入 24 時間後に、細胞をトリプシン処理し、培養液で 2 回洗った。遺伝子導入効率（GFP 陽性率）の測定と Propidium Iodide（PI : 2μg/ml ; 5 分間）
染色による細胞生存率の測定は FACSCant II フローサイトメーターで行った。

効率が低い細胞でも、ScreenF ect A
TM

シリーズを用いることで確実に目的の遺伝子を効率よく導入することができるうえに、前日からの細胞調整も必要なく、数多く市販されている遺伝子導（A）ScreenF ectTMA, ScreenF ectTMA plus（1:3）,（1:4）, 他社 A, 他社 B について GFP 発現細胞を測定することにより、遺伝子導入効率の確認を行った。（B）ScreenF ectTMA, ScreenF ectTMA plus
（1:3）,（1:4）, 他社 A, 他社 B について PI 陽性細胞を測定することにより、生存率の測定を行った。

入試薬の中で非常に有効な試薬だと考えられる。遺伝子導入試薬（ポリマー）の細胞毒性については、ScreenF ectTMA

A

Screen ectTMA

plus でやや高い様に見える。遺伝子

Screen ectTMA
(1:4)
(1:3)

他社A

他社B

Screen ectTMA
(1:4)
(1:3)

他社A

他社B

分な遺伝子発現が得られる利点の前には大きな障壁になる様には見えない魅Count

導入後の実験評価項目にもよるが、十力がある。

GFP（導入効率）

B1）Cong, L. et al . :“Multiplex genome engineering
using CRISPR/Cas systems”, Science , 339,
819（2013）.
2）C ucchiarini, M. :“Human gene therapy :novel approaches to improve the current
gene delivery systems”, Discov. Med ., 21,495（2016）.
3）村上 孝：「発光・蛍光蛋白質による細胞標識の基本的手技とその応用」，Surgery Frontier ,16, 97（2009）.

Screen ectTMA

Count〔参考文献〕

PI（生存率）

図２．KMP8 細胞を用いた遺伝子導入効率の比較
実験条件は図１と同じ。
（A）ScreenF ectTMA, ScreenF ectTMA plus（1:3）,（1:4）, 他社 A, 他社 B について GFP 発現細胞を測定することにより、遺伝子導入効率の確認を行った。（B）ScreenF ectTMA, ScreenF ectTMA plus
（1:3）,（1:4）, 他社 A, 他社 B について PI 陽性細胞を測定することにより、生存率の測定を行った。

トランスフェクション試薬
ScreenFectTMA
ScreenFectTMA plus
コード No.

品

293-73201
299-73203 ScreenFectTMA
297-73204

名

規格

容量

希望納入価格（円）

コード No.

0.2mL
遺伝⼦研究⽤   1mL
1mL×5

8,000
30,000120,000

293-77101
299-77103 ScreenFectTMA plus
297-77104

品

名

規格

容量

希望納入価格（円）0.2mL
遺伝⼦研究⽤   1mL
1mL×5

9,000
35,000140,000

21 ページに実験データをご紹介しています。
また、ScreenF ectTM シリーズの詳細情報を専用 HP（http://screenfect.jp/ja/）にてご紹介しています。
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和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）9

エクソソームと生命現象

第２回

エクソソームのプロテオーム解析
公益財団法人がん研究会

10

植田

幸嗣

微小分泌小胞の一種であるエクソを検出するテストも発表している

PS（以後 MagCapture キット）はエ

ソームは細胞内小胞輸送に由来する産（ExoDx® EGFR T790M）。 同 変 異 はクソソーム膜を構成する脂質の一つで物の一つであり、不要な分子を細胞外EGFR 阻害薬の治療を行った肺がん患

あ る フ ォ ス フ ァ チ ジ ル セ リ ン（PS）に放出したり、内包する分子を遠隔細者の 6 割が獲得する薬剤耐性の原因でを標的としたアフィニティー精製を原胞に輸送、伝達する働きがあるとさ

あ り、 オ シ メ ル チ ニ ブ な ど 同 変 異理としており、他と比べて様々な利点れる。一般的には直径数十〜百ナノ

EGFR にも有効な薬剤への切り替えをを持つ。マグネットビーズに固相化さメートルほどの脂質二重膜構造を持判断するために迅速な耐性獲得診断がれた Tim-4 タンパク質と PS 間の結合

ち、特定のタンパク質群（テトラスパ

重要とされる。210 例の同変異保持肺はカルシウムイオン要求性であり、キ

ニ ン フ ァ ミ リ ー、Rab フ ァ ミ リ ー、

がん患者に対する比較試験によると、レート剤を用いて溶出することによりTsg101、Alix な ど ） や miRNA が 細

すでに承認されている cfDNA を用い

非特異的なビーズ結合タンパク質を溶

胞内構成比率と比して特に多く含まれ®

た 診 断 法（cobas EGFR Mutation

出させることなくエクソソームを特異るものとされる。ただし、粒子径を細Test v2） で は T790M 検 出 の 感 度、的に溶出できるため精製純度が高い。

かく分類してオミクス解析を行うと特特異度が 58％、80％だったのに対し、

また、マグネットビーズによる精製操定の粒子径依存的に分子構成が顕著に

ExoDx® EGFR T790M テストではそ作が支障なく行える範囲であればサン異なるとする研究結果が発表されるな

れぞれ 92％、89％とより良好な診断

プルの容量に制限がないのも希薄な試

ど 1）、いまだエクソソームの分子生物結果が得られたと報告されている 3）。

料を用いる際に有効である。さらに変学的定義は明確に定まっていない。実こうした背景から、基礎生物学研

性溶解を伴わずに溶出を行うため、粒際に、様々な異なるエクソソーム精製

究、臨床応用のいずれにおいてもエク

子数計測、検鏡、細胞投与実験などそ法を用いた機能解析実験に基づいてソソームを高純度に、施設間差なく高の後のアプリケーションを問わず使用（つまり精製純度の異なるエクソソー

い再現性を持って、誰でも簡便に単離できる特徴もある。

ムサンプルを用いて）、がんの転移、精製可能なツールは不可欠なパーツと実際に同一の血清から図 1A に従っ

浸潤、血管新生、免疫細胞制御といっ言える。特に、血清や血漿といったサて エ ク ソ ソ ー ム を 精 製、Orbitrap

た現象への関与が多数報告されていンプルから精製したエクソソームのタ

Fusion Lumos 質 量 分 析 計 に よ り 網る。

ンパク質を対象とした研究においては羅的なプロテオーム解析を行った結

一方で、「病因細胞が持つ分子プロ非常に高いレベルの精製効率が求めら果を示す。総タンパク質同定数は超遠ファイルを末梢血など体液中に放出される。血清・血漿は 60 mg/ml を超え

心 精 製 エ ク ソ ソ ー ム か ら 612 種、れた病因細胞由来エクソソームから読るタンパク質濃度を持ち、リポタンパ

MagCapture キット精製エクソソーム

み取れること」は事実であり、すでにク質など高分子量複合体も多く存在す

から 1,103 種となり、後者の方が約 1.8

診断を目的としたエクソソームの利用

るため、一般的にエクソソーム精製法

倍も多くの同定数を得ることができた

は商業化が進んでいる。例えば、前立として用いられる超遠心沈降法を用い（図 1B）。これは前者において血清中腺がん特異的な RNA 三種 PCA3 non-てもなお多量の血清中のフリータンパに存在する多量のフリータンパク質のcoding RNA、ERG mRNA、SPDEF

ク質（IgM、α2- マクログロブリン、残存が多く、それらが微量なエクソ

mRNA を同時に尿中エクソソームか補体成分など）やリポタンパク質が共ソーム由来シグナルをマスクしてしら検出するテスト（ExoDx® Prostate存する。したがって超遠心沈降法にまった結果である。また、同定タンパ

IntelliScore）が CLIA（Clinical Labo-

よって精製した血清タンパク質をク質を相対定量値と共に俯瞰してみる

ratory Improvement Amendments）

LC/MS による網羅的定量プロテオーと、エクソソームマーカータンパク質ラボのもとで開発されており、LDT

ム解析に供すると、含有量の上位をほとされる分子群の同定数、そして相対（Laboratory Developed Tests : 一 つぼ全て血清中フリータンパク質が占

含 有 量 と も に MagCapture キ ッ ト 精の試験検査施設内で設計・製造・使用

め、エクソソーム由来タンパク質はわ

製エクソソームの方が多いことが分かされる体外診断試験）として国際的な

4）
ずかしか検出されない 。

る（図 2）。このことからも同キット

2）

委託検査発注が可能となっている 。

超遠心法以外にも抗体を用いたアから得られたエクソソームの純度が既

また、同社は血漿からエクソソーム

フィニティー精製法やポリマー沈殿

存の超遠心沈降法に比べて非常に高いと言える。

DNA/RNA、cfDNA（circulating free法、ゲル濾過法、切除組織浸漬液からDNA）をワンステップで単離する技

直接回収する方法 5）、など様々なエク

精製度の高いエクソソームを使用す術を構築し、血液サンプルから非小ソソーム精製法が使用されているが、ることは、エクソソームの機能を解明

細胞肺がんが持つ EGFR-T790M 変異

MagCaptureTM Exosome Isolation Kit

する上でも、診断・治療薬のターゲッ

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）エクソソームと生命現象

トを探索する上でも大変有利で信頼性も高いことは言うまでもない。この点において MagCapture キットは精製
度、汎用性、再現性などの面からあらゆるエクソソーム研究の起点となりうる性能を持っている。ただし、同キットで回収した産物もまた、PS リッチ
な膜成分を持つサイズ非依存的な構造体の集合であって、他の既存研究が指すエクソソームと同等のものかどうか
はこれからのオミクス解析によって慎重に評価、定義していかなければならない。MagCapture キットをはじめとした精製技術、そしてそれらを検出する技術の発展に伴って、エクソソームの本態解明と臨床利用がさらに進展す

図１．エクソソームのプロテオーム解析における精製純度の影響
A）超遠心沈降法と MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS による血清中エクソソームの精製と質量分析
B）同定タンパク質の数と重複〔参考文献〕

タンパク質濃度相対定量値

1）Zhang, H. et al . :“Identification of distinct
nanoparticles and subsets of extracellular
vesicles by asymmetric flow field-flow
fractionation”, Nat. Cell Biol ., 20, 332（2018）.
2）M cKiernan, J. et al . : “A Novel Urine
Exosome Gene Expression Assay to Predict
High-grade Prostate Cancer at Initial
Biopsy”,JAMA. Oncol ., 2, 882（2016）.
3）C astellanos-Rizaldos, E. et al . :“Exosomebased Detection of EGFR T790M in Plasma
from Non-Small Cell Lung Cancer Patients”,
Clin. Cancer Res ., DOI : 10.1158/1078-0432.
CCR-17-3369（2018）.
4）植 田幸嗣：「プロテオーム解析から見たバイオマーカーとしてのエクソソームとその特徴」，細胞工学，32，71（2013）.
5）Jingushi, K. et al . :“Extracellular vesicles
isolated from human renal cell carcinoma
tissues disrupt vascular endothelial cellmorphology via azurocidin”, Int. J. Cancer ,142, 607（2018）.

×

タンパク質濃度相対定量値

ることを期待している。

×
×
×
×
×
×



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

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×
×
×
×

タンパク質同定数

タンパク質同定数

図２．同定エクソソームタンパク質の定量俯瞰図A）MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS、B）超遠心沈降法により精製した血清中エクソ
ソームの定量プロテオーム解析結果。
エクソソームマーカーとして報告のあるタンパク質をピックアップして記載した。

MagCaptureTM エクソソームアイソレーションキット PS
コード No.

299-77603
293-77601

品

名MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS

規格

遺伝子研究用

詳細は当社 HP をご覧下さい。また、20 ページにてエクソソーム ELISA

量

希望納入価格（円）

2回用

20,00010回用

80,000エクソソーム 和光

検索➡

キットもご紹介しています。

容…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
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和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）11

神経変性疾患研究の最前線

第６回

パーキンソン病（2）αシヌクレイン
京都大学大学院医学研究科

はじめに

臨床神経学（神経内科） 上村

存在していると考えられている 8）。生の後、αsyn が、その C 末端配列にて理的にαsyn は安定な四量体（folded

synaptobrevin 2 と 結 合 し、SNARE

helical tetramers）で存在するという複合体の形成を促進すると報告されパーキンソン病（PD）は、黒質緻報告もあるが、これには議論がある 9）。

た 18）。しかし、αsyn の機能として、

密部ドパミン神経細胞脱落と神経細胞

家族性 PD の原因となるミスセンス変

前述したシナプス小胞の放出抑制と内封入体である Lewy 小体の形成を病

異はこの N 末端領域に集中している

SNARE 複合体の形成促進をどのよう

理 学 的 特 徴 と す る。1912 年 に Fritz（ 図 １）。αsyn の 中 央 部 で あ る non-にリンクさせて解釈するかは難しいと

Heinrich Lewy によってこの神経細胞

amyloid-component（NAC） 領 域 は、ころである。

内封入体（後に Lewy 小体と命名）がアルツハイマー病患者脳における老人

記載されてから、長らく PD の病態に斑に存在するペプチド配列として見出

1）

αシヌクレイン凝集と細胞毒性

10）おける意義は不明であった 。しかし、された

1997 年に家族性パーキンソン病の原の凝集に関わっている 11）。C 末端はαsyn は本来的に可溶性の蛋白質で因としてαシヌクレイン（αsyn）の

酸性アミノ酸に富み、Lewy 小体におあるが、シヌクレイノパチーと総称さ

ミスセンス変異が報告され、さらに同

いてリン酸化される Ser129 が存在すれる疾患群において、βシート構造に。同部位は疎水性で、αsyn

12）

年、孤発性 PD における Lewy 小体がる。Lewy 小体を構成するαsyn の富んだアミロイド線維を形成する。シ抗αsyn 抗体で強く染色されることがSer129 は高度にリン酸化されており、ヌクレイノパチーには、PD の他にレ示され、αsyn が PD の病態に深く関

正常脳にはほとんど存在しないことか

ビー小体型認知症（DLB）、多系統萎わっていると考えられるようになっ

ら、病的に凝集したαsyn を検出する縮症（MSA）が含まれる。リコンビ

2, 3）。その後、家族性 PD の原因と目的で同リン酸化αsyn に対する抗体

ナントαsyn も試験管内で線維（フィして SNCA （αsyn 遺伝子）の二重複による免疫組織染色等がしばしば行わブリル）を形成するが、この凝集過程と三重複変異が、また孤発性 PD のリれる。

で可溶性の重合体であるオリゴマーをた

スクとして SNCA の一塩基多型も報

αsyn の生理機能については不明な形成し、一般的にオリゴマーとフィブ

告され、αsyn が PD の病態生理にお点が多い。キンカチョウ（zebra finch）

リルが細胞毒性を発揮すると考えられ

いて中心的役割を果たしていることはにおいては、若く、歌を覚える時期にている（図２）。試験管内では、家族

4, 5）。本稿では、ま一致して、関連する神経核にαsyn の性 PD の原因となる A53T 変異はフィずαsyn の生理機能について述べ、こ発現上昇が認められ、神経可塑性の制ブリル化を促進する一方で、A30P 変れまでに報告されている PD の病態へ御に関わっているのではないかと推測

異 は オ リ ゴ マ ー 化 が 促 進 さ れ る 19）。

疑いの余地が無いの関与について概説する。

αシヌクレインの構造と生理機能

13）。αsyn ノックアウトマウス

生理的にαsyn がテトラマーで存在すの解析では、寿命、生殖機能、脳の形ると主張するグループからは、家族性態に異常は見られなかった 14）。しかPD の原因となるαsyn ミスセンス変された

し、脳スライス標本を用いた電気生理

異はテトラマーを減少させ、不定形のシ ヌ ク レ イ ン は 哺 乳 類 で は 1991

学的解析により、αsyn はシナプス小モノマーを増加させることでαsyn 重

年 に同定され、α、β、γシヌクレ胞の放出に対して抑制的に働くと報告

合と細胞毒性が促進されると報告してインの 3 つのサブタイプが存在する 6）。

されている 14）。αsyn を強制発現したいる 20）。ドパミンの代謝過程では活

αsyn は 140 アミノ酸で構成され、中初代神経培養細胞を用いた研究で性酸素種が産生されるため、ドパミン

枢神経系では主に神経細胞で発現しても、αsyn の同様の機能が示されてい神経細胞は強い酸化ストレスに曝され15）おり、シナプス前終末に豊富に存在す

る。さらに、αsyn が SNARE 複合ている。αsyn は酸化ストレス下におる。 αsyn の N 末 端 に は、 高 度 に 保体を介した脂質膜の融合を抑制するといて、ジチロシン結合を介してオリゴ存された 6 アミノ酸残基から成る 7 回いう報告があり、これは前述の知見をマー化する 21）。また、ドパミンの酸

16）繰り返し配列が存在し、両親媒性のα支持するものと考えられる。一方

化的代謝物であるキノン体も同様に、ヘリックス構造を形成することが予想

で、CSPαはシナプス前終末において

αsyn の C 末端に作用してオリゴマー

される 7）。実際、αsyn モノマーは、

SNARE 複合体形成を促進する働きが化 を 促 進・ 安 定 化 す る 22）。 し か し、

細胞質内において特定の構造を持たなあるが、CSPαノックアウトマウスのオリゴマーと一概に言っても、試験管い形態（unfolded form）と、膜に付シナプス変性や、早期に死亡するとい内での作製法によって、異なる構造と着したαヘリックス構造を取る形態

う異常表現型がαsyn の強制発現にて細胞毒性を持つものが報告され、また（ α-helical form） と で、 平 衡 状 態 で代償されるという報告がある 17）。そin vivo でも性質の異なるオリゴマー

本シリーズの企画・構成に際し、東京大学大学院医学系研究科 岩坪威先生にご助言頂きました。

12

紀仁

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）

神経変性疾患研究の最前線しているかは結論がついていない。

αシヌクレインの細胞間伝播
Lewy 病理が黒質緻密部ドパミン神
経細胞以外にも見られることは以前から知られていたが、Braak らは、剖検
にて Lewy 病理が見つかった非 PD 患者（incidental cases）と、PD 患者に
図１．αシヌクレインの構造
赤：家族性 PD で報告されているミスセンス変異部位。下線：繰り返し配列。
緑：PD において報告されている翻訳後修飾部位。U：ユビキチン化、P：リン酸化、
N：ニトロ化。

ついて体系的な病理解析を行った。これによると、最初期 Lewy 病理は延髄
迷走神経背側核と嗅球に起こり、一定のパターンに従って進展する可能性が考えられた 34）。また、病初期から消化管神経叢にも Lewy 病理が認められたことから、消化管の神経叢に起因した Lewy 病理が、遠心性の迷走神経線
維を逆行性に伝播し、中枢神経内において迷走神経背側核に最初期 Lewy 病
理を形成する可能性が示唆された 35）。
このいわゆる Braak 仮説は、Lewy 病
理が伝播しうるという新しい概念の裏

図２．αシヌクレインの凝集
生理的にモノマーとして存在しているか、テトラマーとして存在しているかは議論がある。オリゴマーとフィブリルには、構造の異なるものの存在が示唆されている。

付けが無かったが、その後、PD 治療のため胎児由来ドパミン神経細胞の脳内移植を受けた患者の剖検にて、移植された細胞内にも Lewy 小体が認めらの存在が報告されている

23, 24）。このよ

胞 内 に お い てαsyn 線 維 形 成 が 見 られたことが報告された 36, 37）。さらに、

うに、オリゴマーは多様な分子種を含れ、2 週間の経過でシナプス機能障害

αsyn を in vitro にて精製・フィブリ

30）

んでいると考えられるが、一般にはオと神経細胞脱落が見られる。PD のル化してマウス脳に接種することによ

リゴマーは膜傷害性に働き、ミトコン

病態において、オリゴマー、フィブリ

り、接種されたフィブリルを核としてドリア機能障害や酸化ストレスの惹

ルのいずれが病態に寄与するかは治療

神経細胞内において内因性αsyn が凝起、小胞体−ゴルジ体間の小胞輸送のターゲットを考慮する上でも重要と考集し、これが神経回路に沿って伝播す

障害、シャペロン介在性オートファ

えられる。in vivo においてフィブリることが報告された 38, 39）。また、PD

ジーの障害、シナプス前終末におけるルと比較してオリゴマーが強い毒性を患者由来の Lewy 小体をマウスとサル

31）

SNARE 複合体形成の障害など、様々発揮するとする報告、また PD 患者の脳内に接種することで、神経細胞内な機序で細胞傷害性に働くことが報告

脳では proximity ligation assay（PLA）

αsyn 凝集病変形成され、脳の他部位。一方、αsyn の凝集法を用いることで、通常のαsyn 免疫に も 伝 播 す る こ と が 報 告 さ れ た 40）。

に は NAC 領 域 の 配 列 が 必 要 と さ れ

染色では同定できないオリゴマーが以上の現象はαsyn の prion 様伝播とされている

23-28）

11）、SSNMR に よ る 解 析 で広範に観察されることが報告されても呼ばれ、Braak 仮説を説明しうる可は、アミノ酸 46–54と63–96 が“Greek

いる 32）。一方で、in vivo イメージン能性があり、広く注目されることとkey”の形を取ってフィブリルの核をグによる解析では、αsyn フィブリルなった。治療ターゲットの側面から形 成 し て い る と 報 告 さ れ て い る 29）。

をマウス脳に接種して神経細胞に凝集は、神経細胞間の伝播機序の解明と、

αsyn フィブリルをマウス胎児由来初病変を形成すると、凝集病変を形成し介入による伝播の制御が試みられてい代培養神経細胞に投与すると、神経細た神経細胞が経時的に脱落することがる。報告によって実験系や対象とされ

ているが

33）

胞内に取り込まれたαsyn フィブリル

示されている。オリゴマーとフィるαsyn 分 子 種（ モ ノ マ ー、 オ リ ゴの一部が鋳型となり、経時的に神経細ブリルのどちらが病態により強く寄与

マー、フィブリル）に違いがあるもの

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）13

神経変性疾患研究の最前線の、伝播機序として、直接に細胞膜をらず、宿主側の何らかの要因が必要な

貫 通、 飲 作 用（macropinocytosis）、のかもしれない。

受容体介在性エンドサイトーシス、エキソソーム、ナノチューブを介する等だに分かっていない 41-45）。

αシヌクレイン凝集における
構造多型

おわりに

（2006）.
23）Fusco, G. et al . : Science , 358, 1440（2017）.

Lewy 小体の主要構成成分がαsynであることが発見されてから約 20 年が経過し、様々な実験系で、様々な病態機序と治療ターゲットが報告されているが、今までのところ疾患修飾薬と言える治療法の開発には成功していな

最近、in vitro で作製したαsyn フィい。疾患の病態を完全に再現できる系

ブリルは、作製条件の違いによって生は存在しないが、各々の実験系で病態

化学的性質（凝集構造）や、培養細胞のどの部分を再現しているかを改めてやマウス脳内で惹起する病態（生物見直すことが、真に治療法開発に結び学的活性）が異なることが報告され付く発見に繋がるのではないかと考えた 46, 47）。これらの報告は、凝集αsynる。

には多様性が存在し、ヒト体内においても多様な凝集αsyn が異なる病態を引き起こす可能性を想起させる。PDと DLB は共通して神経細胞内αsyn
凝集病変を特徴とするが、臨床経過と病 理 進 展 パ タ ー ン が 異 な る。 ま たMSA はオリゴデンドロサイト内αsyn
凝 集 病 変 の 形 成 を 特 徴 と し、PD と
DLB とは病理学的に明確に異なる。
同じαsyn という蛋白質が、異なる臨床経過と病理像を示すことは未だに大1）Goedert, M. et al . : Nat. Rev. Neurol ., 9, 13（2013）.
2）Polymeropoulos, M. H. et al . : Science , 276,
2045（1997）.
3）Spillantini, M. G. et al . : Nature , 388, 839（1997）.
4）S ingleton, A. B. et al . : Science , 302, 841（2003）.
5）S atake, W. et al . : Nat. Genet ., 41, 1303
（2009）.
6）Maroteaux, L. and Scheller, R. H. : Brain

Res . Mol. Brain Res. , 11, 335（1991）.
7）Bendor, J. T. et al . : Neuron , 79, 1044（2013）.
8）Pineda, A. and Burre, J. : Proc. Natl. Acad.

αsyn は、PD 脳 由 来αsyn と 比 較 してマウス脳や培養細胞においてαsyn
凝集病変を惹起しやすく、強い毒性を発揮することが報告されている 48, 49）。
では、凝集αsyn の違いのみで病態の違いが説明できるかというと、そうではないようである。MSA 脳由来αsynをマウス脳に接種してもオリゴデンド
ロサイト内αsyn 凝集病変は形成されず、神経細胞内にαsyn 凝集病変が形成された 48, 50）。病態の違いを説明・再現するには、凝集αsyn の違いのみな（2017）.
25）Mazzulli, J. R. et al . : Cell , 146, 37（2011）.
26）Cremades, N. et al . : Cell , 149, 1048（2012）.
27）Martinez-Vicente, M. et al . : J. Clin. Invest .,118, 777（2008）.
28）C hoi, B. K. et al . : Proc. Natl. Acad. Sci.

USA , 110, 4087（2013）.
29）Tuttle, M. D. et al . : Nat. Struct. Mol. Biol .,23, 409（2016）.
30）Volpicelli-Daley, L. A. et al . : Neuron , 72, 57（2011）.
31）W inner, B. et al . : Proc. Natl. Acad. Sci.

USA , 108, 4194（2011）.
32）Roberts, R. F. et al . : Brain , 138, 1642（2015）.
（2015）.

〔参考文献〕

いから、シヌクレイノパチーの病態のいる。例えば、MSA 脳から抽出された

24）Mor, D. E. et al . : Nat. Neurosci ., 20, 1560

33）Osterberg, V. R. et al . : Cell Rep ., 10, 1252

きな謎である。最近、凝集αsyn の違違いを解明しようとする研究が進んで（2000）.
22）Mazzulli, J. R. et al . : J. Neurosci ., 26, 10068の様々な報告があり、いずれが病態において重要な役割を担っているかは未（2015）.
21）Souza, J. M. et al . : J. Bio. Chem ., 275, 18344

Sci. USA , 114, 1223（2017）.
9）Bartels, T. et al . : Nature , 477, 107（2011）.
10）Ueda, K. et al . : Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,90, 11282（1993）.
11）Giasson, B. I. et al . : J . Biol. Chem ., 276, 2380
（2001）.
12）Fujiwara, H. et al . : Nat. Cell Biol ., 4, 160（2002）.
13）George, J. M. et al . : Neuron , 15, 361（1995）.
14）Abeliovich, A. et al . : Neuron , 25, 239（2000）.
15）Nemani, V. M. et al . : Neuron , 65, 66（2010）.
16）DeWitt, D. C. and Rhoades, E. : Biochemistry ,52, 2385（2013）.
17）Chandra, S. et al . : Cell , 123, 383（2005）.

34）Braak, H. et al . : Neurobiol. Aging , 24, 197（2003）.
35）B raak, H. et al . : Neurosci. Lett ., 396, 67（2006）.
36）Li, J. Y. et al . : Nat. Med ., 14, 501（2008）.
37）Kordower, J. H. et al . : Nat. Med ., 14, 504（2008）.
38）Luk, K. C. et al . : Science , 338, 949（2012）.
39）M asuda-Suzukake, M. et al . : Brain , 136,
1128（2013）.
40）Recasens, A. et al . : Ann. Neurol ., 75, 351（2014）.
41）Lee, H. J. et al . : Int. J. Biochem. Cell Biol .,40, 1835（2008）.
42）Hansen, C. et al . : J. Clin. Invest ., 121, 715（2011）.
43）Alvarez-Erviti, L. et al . : Neurobiol. Dis ., 42,360（2011）.
44）Holmes, B. B. et al . : Proc. Natl. Acad. Sci.

USA , 110, E3138（2013）.
45）Abounit, S. et al . : EMBO J ., 35, 2120（2016）.
46）Guo, J. L. et al . : Cell , 154, 103（2013）.
47）Peelaerts, W. et al . : Nature , 522, 340（2015）.
48）Prusiner, S. B. et al . : Proc. Natl. Acad. Sci.

USA , 112, E5308（2015）.
49）Woerman, A. L. et al . : Proc. Natl. Acad. Sci.

USA , 112, E4949（2015）.
50）B ernis, M. E. et al . : Acta Neuropathol.

Commun ., 3, 75（2015）.

18）Burre, J. et al . : Science , 329, 1663（2010）.
19）Conway, K. A. et al . : Proc. Natl. Acad. Sci.

USA , 97, 571（2000）.
20）Dettmer, U. et al . : Nat. Commun ., 6, 7314

次回は、「ALS（筋萎縮性側索硬化症）」［最終回］の予定です。

24 ページにて、当社取り扱いの抗りん酸化α-シヌクレイン抗体をご紹介しています。

14

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）

アミノ酸分析〜新たな潮流〜

第 1 回 アミノ酸分析の歴史とニンヒドリンによるアミノ酸分析法
株式会社日立ハイテクサイエンス

伊藤正人「アミノ酸分析〜新たな潮流〜」シリーズ開始にあたって
味の素株式会社

イノベーション研究所

宮野博

アミノ酸はタンパク質の構成成分であり、代謝物としても重要である。アミノ酸測定技術は、1941 年の分配クロマト
グラフィーに始まるが、現在も進歩し続けており、高感度化、高速化、D- アミノ酸の高感度測定法の開発、正確な定量値を出すための環境整備等が進んでいる。アミノ酸分析技術の進歩は、生化学や栄養学始めさまざまな研究を発展させ、ひいては人々の豊かな暮らしに貢献していくものである。
本連載では、それぞれの技術を実際に牽引する先生に執筆をお願いし、アミノ酸分析の最新情報を提供する。

はじめにり、水溶液中ではイオン化している。

る。ポストカラム法では検出に影響のイオンのままでは分離分析でもっぱら少ない試薬を選ばなければならない。

使用されている逆相クロマトグラ

ポストカラム法にはニンヒドリン法とアミノ酸は、生命の起源を思い描く

フィー（逆相 HPLC）が適用しづらい

OPA 法があり、前者は安定性が高く、にあたり最初にできた複雑な物質と考ため、カラムに導入する前に誘導体化

後者は感度が高いと言える。

えられている。ただ不思議なことに私するプレカラム誘導体化法がいくつか

逆相クロマトグラフィーはイオン交たちの体をつくるタンパク質は L- アミ

考案された。イオン交換クロマトグラ

換クロマトグラフィーよりも高速高分ノ酸だけで構成されている。L- アミノ

フィーを利用すれば、イオン自体をそ離化にむいていると言われており、そ酸は光学異性体の一方であり、生命誕のまま分離することも可能だが、検出の分離方法を応用するプレカラム法が生の初期段階に地球内外のどこかで L-するためには分離後に誘導体化する必

局方に 6 つ収載されている。それぞれアミノ酸が D- アミノ酸より自発的に優要がある。こちらはポストカラム誘導に特色があり、まず PITC 法は Edman

勢になり、以降 L- アミノ酸が増殖し体化法と呼ばれる。

分解に伴う誘導体化法であり、プレカ

たにちがいない。このようなミステリー

表 1 に示す誘導体化法には一長一短

ラム法の原点とも呼べる。AQC 法はを解明すべく例えば地球外から飛来すがある。ポストカラム検出法は、アミ蛍光検出法により高感度化が図られたる生命構成物質が探索されている。なノ酸の各成分をそのままイオン交換クが、システイン（Cys）の検出限界は他にはともあれ生命をつかさどる基本的

ロマトグラフィーにより分離してからの成分に比べあまりよくない。OPA プ

なアミノ酸であるが、タンパク質構成

反応試薬を混合し誘導体化するため希レカラム法は、高感度な蛍光検出法でアミノ酸は 20 成分あり、それらを分析

釈やピーク拡散が生じるが、反応物があるが、プロリン（Pro）など 2 級ア

するにはそれぞれ分子構造が類似して複数種類生成されても反応が途中でミンを検出できない欠点を補うため方いるためまず各成分を分離する必要があっても影響が少ない。このため定量法 7 または 8 と組み合わせて利用されある。また大部分のアミノ酸分子には性、再現性に優れている。一方、プレている。DABS-Cl 法は可視光の吸光光

紫外線の吸収に特異性がないため、ク

カラム誘導体化法は反応生成物が安定度法を応用し、PITC 法に比較して高選ロマトグラフィー分離法の検出手段とで 1 種類であれば、逆相 HPLC が利

択性 ･ 高感度化がなされた。FMOC-Cl

して一般に用いられている紫外吸光光用できるため高速高感度化が図りやす

法は 2 級アミンの高感度分析が可能で度法がそのままでは利用されてこなかっ2）い特徴がある 。また反応試薬の消費あるがヒスチジン（His）誘導体が分た。実際には後述するようないくつか

量は比較的少ないが、反応効率が試料解されやすく安定測定が難しいため、の分離方法と誘導体化検出手段の組合

マトリックスの影響を受ける可能性がOPA プレカラム法と併用される場合

せによる分析方法が考案されている。

ある。試薬ブランクは、プレカラム法がある。最後の NBD-F 法は 2 級アミでは検出されないか分離する必要があンを含めて分析できるため実用的な高アミノ酸分析法

表１．日本薬局方におけるアミノ酸分析法の記載事項

第 17 改正日本薬局方には 8 つのア

方法 1

アミノ酸分析法
分離方法
検出波長
検出限界
直線性 ･ 範囲
ニンヒドリンによるポストカラ イオン交換クロ 吸光 1：570 nm 約 10 pmol
20 ～ 500 pmol
ム検出法
マトグラフィー 吸光 2：440 nm Pro は約 50 pmol
OPA によるポストカラム蛍光検 イオン交換クロ 励起 348 nm
数 10 pmol
数 pmol ～方法 2
出法
マトグラフィー 蛍光 450 nm
Pro は特別処理で検出可能
数 10 nmol
方法 3 PITC プレカラム誘導体化法
逆相 HPLC
吸光 245 nm
ほとんど 1 pmol
20 ～ 500 pmol
励起 250 nm
成分により約 40 ～ 320 fmol
方法 4 AQC プレカラム誘導体化法
逆相 HPLC
2.5 ～ 200 µmol/L
蛍光 395 nm
Cys は約 800 fmol
励起 348 nm
50 fmol、実際は 1 pmol
方法 5 OPA プレカラム誘導体化法
逆相 HPLC－
蛍光 450 nm
Pro は検出できない
2 ～ 5 pmol が定量限界
方法 6 DABS-Cl プレカラム誘導体化法 逆相 HPLC
吸光 436 nm
約 1 pmol
励起 260 nm
数 fmol
方法 7 FMOC-Cl プレカラム誘導体化法 逆相 HPLC
0.1 ～ 50 µmol/L
蛍光 313 nm
His 誘導体は分解していく
励起 480 nm
方法 8 NBD-F プレカラム誘導体化法 逆相 HPLC
約 10 fmol－
蛍光 530 nm
方法

ミノ酸分析法が参考情報として収載されているが 1）、前述の通りアミノ酸分子をそのまま検出する方法はなく何れも誘導体化アミノ酸を検出するものである（表 1）。アミノ酸はアミノ基とカルボキシル基（カルボキシ基）をもつ両性イオン（双性イオン）物質であ

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）15感度法として位置づけられている。
一口にアミノ酸と言っても、Pro、
Cys、His などに対して各分析法にそれぞれの適用性があり、用途に応じて使いこなす必要がある。本稿では標準的な方法として永く利用されているニンヒドリ
ンによるポストカラム検出法にフォーカ
スし、アミノ酸分析の歴史を振り返る。

図２．835 形（1977）

図３．LA8080 AminoSAAYA®
（2017）

ニンヒドリン法の歴史工場に持ち込まれ、当時の最新鋭機に

歴 史 を さ か の ぼ る こ と 3）1948 年、

特徴的なコラーゲンの組成を示したた

Moore と Stein がアミノ酸分析のクロめサメ（フカ）のひれの棘条（きょくマトグラフィーで使用するためのニンじょう）であることが判明し、怪獣のヒドリン光度法を報告した。でん粉ク

夢は発見から 3 か月後水泡に帰してし

ロマトグラフィーを利用し、反応生成

まった。この時に使用された 835 形か物質の吸光度スペクトルやアミノ酸各ら 10 MPa 以上の高圧力をかけて分析

成分のニンヒドリン反応特性が検討さする高速液体クロマトグラフィー

れた。1958 年に Spackman は両博士と（HPLC）としてのアミノ酸分析計のともにアミノ酸のクロマトグラフィー

時代が始まった（図 2）。充てん剤は利用のための自動記録クロマトグラ

粒径 5 µm にまで微粒子化された球形抑えるためには冷蔵保存が有効であフィー装置を発表した 4）。これがちょの樹脂が採用された。内径 4 mm 長る。カラムは、スルホン酸基が導入さうど表１のニンヒドリンによるポスト

さ 150 mm のステンレス鋼カラムをれた強酸性のイオン交換樹脂（粒径 3

カ ラ ム 検 出 法 の さ き が け と な っ た。

用いて酸性から中性、塩基性アミノ酸µm）が充てんされ、ペルチエ方式の1962 年、日立製作所は同様の KLA-2

まで 1 本のカラムで分析可能となっカラム恒温装置により温度コントロー

形アミノ酸分析計 5） を完成した（図た。タンパク質加水分解物のアミノ酸ルされる。ポストカラム誘導体化のた1）。国産初となった KLA-2 形は内径18 成分を約 50 分間で分析できるとこ

め分離カラムから溶出された各アミノ

9 mm、長さ 50 cm と 150 cm のガラ

ろまで高速化された。

酸成分に対し、ポンプ 2 からのニンヒ

ス製カラムを 2 本搭載していた。当時はまだ充てん剤のイオン交換樹脂は破砕 状 で あ り、 粒 径 は 約 300 〜 1,000よりアミノ酸組成分析が試みられた。

図４．ニンヒドリン法の流路図

ドリン反応液を合流・混合する。反応

ニンヒドリン法の現在

装 置 は カ ー ト リ ッ ジ タ イ プ の TDE3
（キューブ）リアクターを 135℃で恒温

2017 年、コンパクトな卓上型高速アする。検出器は、アミノ酸の反応生成

リ ジ ン（Lys） 〜 ア ル ギ ニ ン（Arg）

ミノ酸分析計 LA8080 が公表された

7）

物 で あ る Ruhemann’s purple の 吸 光の塩基性アミノ酸を先に 4 時間で、長（図 3）。ニンヒドリン法の測定原理は度極大である可視光 570 nm で検出すい 方 で ア ス パ ラ ギ ン 酸（Asp） か ら

Moore ら の 報 告4）と 同 じ で あ る が、る 3）。一方、2 級アミンである Pro とフェニルアラニン（Phe）までの酸性・最新の流路図を用いて説明する（図ハイドロキシプロリン（Hypro）から

中性アミノ酸を 15 時間かけて分析し4）。溶離液として、タンパク質加水分

s purple が生成されず、は Ruhemann’

た。試料添加などを含めるとおよそ 1解物であるアミノ酸約 20 成分の分析

440 nm で検出する。この検出波長は日に 1 検体ペースの分析法であった。

法にはクエン酸ナトリウム系の緩衝液

Moore らの装置 4）とまったく同一である。

1977 年 4 月、ニュージーランド沖が、生体液由来の約 40 成分にはクエタンパク質の加水分解は一般に 6で日本のトロール船が謎の動物を捕獲

ン酸リチウム系の緩衝液が用いられて

mol/L 塩酸を用いて 110℃ 24 時間のし、ネス湖のネッシーのようなプレシいる。溶離液はポンプ 1 により送液さ条件下で行われる。Cys やメチオニン

オサウルスではないか、もしかしたられ、アンモニア除去用のフィルタカラ（Met）を正確に定量分析する場合、怪獣を発見したかもしれないとのムを経て、オートサンプラに至る。ア過ギ酸酸化してから塩酸を用いて加水

ニュースが報じられた 。甲板に付着

スパラギン（AspNH2）やグルタミン

分解する方法もある。またトリプト

したひげ状の前びれが日立製作所那珂

（GluNH2）は酸化されやすく、それをファン（Trp）を測定する場合にはアµm もあった。短い方のカラムにより

6）16

図１．KLA-2 形（1962）

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）ルカリで加水分解する方法もある。ニや 3- メチルヒスチジン（3-Mehis）も

夾雑ピークがほとんど出現しない。こンヒドリン法のアプリケーションとし分離が難しい成分である。

のような理由により高い定量再現性がて、タンパク質加水分解物分析法のク

最後に今なお Moore らのポストカ得られ、さらに検出のダイナミックレ

ロマトグラム（標準試料各成分 2 nmol

ラムニンヒドリン法が広く利用されてンジも広く 4 桁以上の直線性が確保で注入、カラム温度 57℃一定）を図 5 にいる理由を述べたい。一つは分離方法

きる。加えてニンヒドリン試薬も冷暗示す。イソロイシン（Ile）とロイシンにある。アミノ基に起因するカチオン所に保管しておけば劣化しづらく安定（Leu）は分子構造が類似しており、クを交換するクロマトグラフィーがベーである。

ロマトグラフィーの分離は難しい。そスであり 8）、基本的にはアミノ酸各成の分離度として 1.2 以上が得られた。さ分の等電点の順番に保持時間が並ぶ。

らに SN 比 2 で Asp の検出限界 2.5 pmol

ただそれだけでは説明できない分離の

おわりに

以下、グリシン（Gly）とヒスチジン

メカニズムが存在する。それは充てん

多くのアミノ酸分析法の中でも特に（His）のピーク面積再現性 RSD1.0％

剤担体であるスチレンとジビニルベン

ポストカラムニンヒドリン法は、分離

以下の結果であった。なお Cys は標

ゼンの共重合体が寄与する疎水性相互法を検討すれば分析時間がかかっても準試料中ではジスルフィド結合をした作用モードである。例えば、フェニル

一定の分離度が確保でき、最終的に高シスチンの状態で存在している。

アラニンとチロシンなど芳香族アミノ

い定量精度が得られることが魅力に

もう一つのアプリケーションとして酸の分離に効果があると考えられる。

なっていると言えよう。冒頭に述べた

生体液分析法もある。その名の通り動分析法開発者は溶離液組成や、ステッ

非対称性研究などのために D- アミノ物試料の血清や尿などを分析するわけ

プワイズ溶離の切り替えタイミング、

酸を L- アミノ酸から分離する分析法

だが、健康サプリメントおよびワイン

カラム温度コントロールなどによりイについては本連載に掲載されることをや醤油などの食品中のタウリンオン交換と疎水性相互作用をたくみに期待して筆を置きたい。

（Tau）、ギャバ（γ -ABA）、オルニチ

操り、目的成分の分離を実現することン（Orn）などアミノ酸類縁物質を含

ができる。

謝

辞

めて約 40 成分も分析できる。温度タ

今一つはニンヒドリンを用いるポ

イムプログラムを駆使する生体液分析

ストカラム誘導体化法に特長がある。

味の素イノベーション研究所 基盤技法（標準試料各成分 2 nmol 注入）も

こ ち ら も ア ミ ノ 基 が 鍵 と な り、術研究所の宮野博所長と小澤真一研究

良好なクロマトグラムが得られた（図Ruhemann’s purple を生成する。ポス

員、ならびに出口喜三郎 元北海道大学

6）。AspNH2 や GluNH2 が分離される

トカラム法は試料中の夾雑成分を分離

特任教授にご指導いただきましたこと

以外に、例えばジペプチドのアンセリすることができるため、夾雑物に妨害心より感謝申し上げます。

ン（Ans）やカルノシン（Car）が検されづらい。このため食品や生物由来

出されている。ハイドロキシリジンの実試料であっても除タンパクとフィ（Hylys）には立体異性体があり、カルタリングだけ確実に前処理しておけ

ラムが良好な時はダブルピークになっば、一定のデータが得られる高い信頼
特異性が高く、かつ可視光域の吸光度

るいは 1- メチルヒスチジン（1-Mehis）

を測定しているためクロマトグラムに

0

0
0

5

10

20
15
時間
［min］

25

30

図５．タンパク質加水分解物分析法
コード No.

299-70501

Arg

3MeHisAns

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100105 110
時間
［min］

図６．生体液分析法
品

Car

Om
Hylys

Lys
1Mehis
His

NH3

b-Ala
b-AiBA

g-ABA
Trp
EOHNH2

Met
Cysthi
Ile
Leu
Tyr
Phe

Asp

Val
Cys
Gly
Ala
Cit
a-ABA

Arg
Trp

20

110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

Thr
Ser
AspNH2Glu
GluNH2
Sar
a-AAA

His

Tyr
Phe

NH3

40

Leu

Gly
Ala

60

Ile

80

Met

Val

Lys

レスポンス
［mV］

Cys

100
Asp
Thr
Ser
Glu

レスポンス
［mV］

120

P-Ser
PEA Tau
Urea

Pro

140

Pro

性がある。Ruhemann’s purple 生成のHyproて見えることがある。また、シトルリ
ン（Cit）とα- アミノ酪酸（α-ABA）、あ

名

Ninhydrin Coloring Solution Kit for HITACHI

規

危

格

〔参考文献〕
1）一般財団法人 医薬品医療機器レギュラトリー
サイエンス財団編：「第十七改正日本薬局方」（じほう）（2016）.
2）中 村 洋監修：「ちょっと詳しい液クロのコツ
前処理編」（丸善）（2006）.
3）小 澤真一、宮野博、伊藤正人：S. I. NEWS ,58, 4968（2015）.
4）Spackman, D. H. et al . : Anal. Chem ., 30, 1190
（1958）.
5）宇 井信生、岩永貞昭、崎山文夫共編：「タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラ
フィー」（化学同人）（1984）.
6）伊藤正人：ぶんせき ，2010，145（2010）.
7）伊藤正人、成松郁子、裴敏怜、森崎敦己、鈴木裕志、福田真人、八木隆、大月繁夫、関一也、豊崎耕作：S. I. NEWS , 61, 5360（2018）.
8）中村 洋監修：「ちょっと詳しい液クロのコツ分離編」（丸善）（2007）.

日立高速アミノ酸分析計用

容

量

2L用

希望納入価格（円）15,000…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2018 年 7 月時点での情報です。最新情報は、siyaku.com（http://www.siyaku.com/）をご参照下さい。

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）17核酸医薬合成

全４回

基礎講座

サイエンスライター佐藤健太郎

第３回 オリゴヌクレオチド合成におけるカップリング反応
DNA 及び RNA は、構成単位である核酸が、リン酸ジエステ

RO

ル結合は、他の低分子化合物ではほとんど見られない結合であ

Base

O

ル結合によって多数結合した構造をとる。このリン酸ジエステ
ROり、独特な合成法が開発されている。

HO

Base

O

O

＋

Base
TPSCl

O
O

核酸合成においては、この結合生成反応を何度も繰り返すこOとになるため、その効率は全体の収率を大きく左右する。今回

Oは、このリン酸ジエステル結合生成反応について解説してゆく。

O

P

O

P

O

OAc

CN

CN

O

Base

iPr

Cl
TPSCl = iPr

カップリング反応の歴史

SO2Cl

OAc

iPr

1950 年代、核酸合成が初めて行われた頃に用いられたのは、

図３．リン酸トリエステル法

1）

ホスホロクロリダートを経由する方法であった 。形式上、酸塩化物とアルコールの反応によるカルボン酸エステル合成の、と総収率は 4.2％にしかならないため、できうる限り収率 100％

リン酸版に当たる。

に近づける必要がある。
RO

RO

HO

Base

O

O

＋

P

O

OBn

が開発された。四配位のリン酸エステル結合よりも、三配位の亜リン酸エステル結合の方が作りやすいという知見に基づく発

Base
O

OBn

P

O
O

そこで 1970 年代に入ってからは、亜リン酸トリエステル法

Base

O

想であった。亜リン酸エステル結合の安定性は高くないので、

O
O

OAc

Base

エステル結合生成後に改めて酸化を行ない、リン酸エステルに変換する必要がある。このため工程数は増えるが、全体としてCl収率向上につながるため、この方法が受け入れられていった

OAc（酸化反応については次回で詳述）。

図１．ホスホロクロリダートを経由する合成法

核酸合成の開祖といわれる H. G. Khorana は、保護されたヌホスホロアミダイト法

クレオチドのリン酸部分と、5’位が保護されたヌクレオシドを、

こうした中、核酸合成におけるカップリング反応の決定版と直接カップリングさせる方法を開発した 2）。縮合剤としては、して登場したのが、ホスホロアミダイト法である 4）。リン原子

N, N ’- ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）または塩化 p -に、ヌクレオシド（またはデオキシヌクレオシド、以下同様）

トルエンルスホニル（TsCl）が用いられた。これは「リン酸ジの 3’位とシアノエトキシ基、ジアルキルアミノ基が結合した図

エステル法」と呼ばれることがある。

4 のような化合物が、一般にホスホロアミダイトと呼ばれる。
RO

HO
RO
O

OH

O

Base

＋

O
O

ジアルキルアミノ基としては、ジイソプロピルアミノ基が最も

Base

O

OH

P

よく用いられる。これより小さければ安定性に欠け、かさ高け
れば反応性が低下するためである。

Base
DCC or
TsCl

O
O

OH

P
O

O

OAc

Base

OAc

図２．Khorana によるリン酸ジエステル法

RO
O

O

iPr

P
N

Base

O

iPr

CN

図４．ホスホロアミダイト

ただしこの方法では、リン酸のヒドロキシ基が両方とも反応18しうるため、ヌクレオシドが 2 つ導入された枝分かれ核酸が副適切に保護されたヌクレオシドに対し、活性化剤となる 1H -生成物として生成してしまう。これを防ぐため、1960 年代にはテトラゾールと共にこのユニットを作用させると、置換反応がR. Letsinger らおよび C. Reese らによって、「リン酸トリエス

起こって両者がカップリングする。活性化剤となるテトラゾー

テル法」が開発された 3）。これは、リン酸のヒドロキシ基のひルは、2 つの役割を演じる。まずテトラゾールからプロトンがとつを 2- シアノエチル基で保護した上で、カップリングを行う

放出され、ホスホロアミダイトの窒素原子に結合して活性化す手法である。シアノエチル基は、オリゴヌクレオチド鎖延長反る。ここからジイソプロピルアミンが脱離し、テトラゾリル基

応終了後に、濃アンモニア水で処理することで、核酸塩基の保と置換したものが活性種となる、これが 5’
位ヒドロキシ基と反護基（前回記事参照）と共に切除される（図３）。

応して、カップリングが成立する。

こうした工夫が重ねられてはきたが、核酸合成においてはこ

活性化剤として 1H - テトラゾールは有効だが、低温では結晶の反応を数十回繰り返す必要があるため、その効率は十分とはが析出してしまうことがある。このため、溶解度の高い 2- エチ

いえなかった。たとえば収率 90％の工程でも、30 回繰り返す

ルチオテトラゾール、2- ベンジルチオテトラゾールなどが用い

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）

られることもあり、1H - テトラゾールよりも反応が早く終了することが多い。また、4, 5- ジシアノイミダゾールなども用いら

RO
RO
O

れる。
ヌクレオチド鎖が結合した固相担体に対し、0.02 〜 0.2M の化剤のアセトニトリル溶液を流し込んで反応させる。ヌクレオチド鎖に対し、モル比でホスホロアミダイトを 5 倍程度、活性化剤を 20 倍程度過剰に用いて、徹底的に反応を進行させる。
RO
O
RO
O

HO

Base

O

＋

Base

N

NH

N

N

iPr

P
N

O

CN

N

＋ iPr

iPr

P
N

O

CN

O

iPr
iPr

P
N

Base

O

CN

iPr

図６．ホスホロアミダイトの合成

なお、2- シアノエチル -N , N , N ’, N’- テトライソプロピルホ
スホロジアミダイトは不安定な化合物なので、使用時に調製すBaseる必要がある 6, 7）。
ヌクレオシドのホスホロアミダイトは、低温、無水の固体状

O

P

O

O
O

Base

OH

ホスホロアミダイトのアセトニトリル溶液、0.2 〜 0.7M の活性

O

iPr

O

iPr

O

CN

態ではほぼ安定に保存できる。溶液中でも、中性ではかなり安Base

定だが、酸性ではほぼ瞬時に分解してしまう。このため、保存Oには気を配る必要がある。できたホスホロアミダイトは、シリ
カゲルカラムで精製を行うことも可能だが、展開溶媒に数％のトリエチルアミンを添加し、弱塩基性を保ちながら溶出させることが望ましい。

図５．ホスホロアミダイト法によるカップリング

なお、ホスホロアミダイトのリン原子は不斉点となるため、立体障害の少ない DNA 合成の場合には数十秒で反応が終了

分子全体としてジアステレオマーとなる。このため、TLC ではするが、RNA 合成の場合には 5 分から 15 分ほどの時間を要す

2 つのスポットが見えることがあり、NMR でも両ジアステレる。またホスホロアミダイトは水分に弱いため、溶媒などはでオマーのピークが観測されるので、注意する必要がある。

きる限り乾燥させたものを用いる。反応終了後はアセトニトリ

次回、酸化反応を含めた合成プロトコルの流れについて解説

ルで担体を徹底的に洗浄し、過剰の試薬を除去する。

する。

ホスホロアミダイトの合成〔参考文献〕

天然の各ヌクレオシドのホスホロアミダイトは市販されているので、通常はこれを反応に用いる。ただし特殊なヌクレオシ
ドなどを用いる場合には、ホスホロアミダイトを自製する必要がある。
適切に保護されたヌクレオシドに対し、2- シアノエチル -N ,N, N ’, N’- テトライソプロピルホスホロジアミダイトを作用させることで、目的とするホスホロアミダイトを得られる 5）。

1）Michaelson, A. M. and Todd, A. R. : J. Chem. Soc ., 2632（1955）.
2）Gilham, P. T. and Khorana, H. G. : J. Am. Chem. Soc ., 80 , 6212（1958）.
3）Reese, C. B. : Tetahedron , 34 , 3143（1978）.
4）Beaucage, S. L. and Caruthers, M. H. : Tetrahedron Letters , 22 , 1859
（1981）.
5）Nielsen, J. et al . : Nucleic Acids Res ., 14 , 7391（1986）.
6）Nielsen, J. et al . : Nucleic Acids Res ., 15 , 3626（1987）.
7）B eaucage, S. L. : e-EROS （Encyclopedia of Reagents for Organic

Synthesis ）,doi : 10 . 1002 / 047084289 X.rn 00312

オリゴヌクレオチド合成
アクチベーター試薬
コード No.
016-27561
014-27562
019-27551
017-27552
013-19685
011-19681
011-19701
015-20015
013-20011
018-19691

品
名Activator-1（4,5-Dicyanoimidazole）
水分値：300ppm 以下
Activator-4（5-Ethylthio-1H -tetrazole）
危
水分値：300ppm 以下
Activator Solution-1（0.25mol/L 4,5-Dicyanoimidazole,危
Acetonitrile Solution）水分値：30ppm 以下
Activator Soluiton-2（0.45mol/L 1H -Tetrazole, Acetonitrile
危
Solution）水分値：30ppm 以下
Activator Solution-3（0.25mol/L 5-Benzylthio-1H -tetrazole,危
Acetonitrile Solution）水分値：30ppm 以下
Activator Solution-4（0.25mol/L 5-Ethylthio-1H -tetrazole,危
Acetonitrile Solution）水分値：30ppm 以下

規

格

核酸合成用
核酸合成用
核酸合成用

容

量
5g
25g
5g
25g
500mL
3L

核酸合成用

3L

核酸合成用

500mL
3L

核酸合成用

3L

希望納入価格（円）10,00022,00012,00030,000
照 会
照 会
照

会

8,500
照 会
照

会

その他オリゴヌクレオチド合成に使用する商品を取り扱っています。当社 HP をご覧下さい。
https://labchem.wako-chem.co.jp/synthesis/nucleic-acid-synthesis/cat/…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2018 年 7 月時点での情報です。最新情報は、siyaku.com（http://www.siyaku.com/）をご参照下さい。

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）19

ew Products
デ ー タ

体液検体中 細胞外小胞の解析ツール
PS CaptureTM エクソソームELISAキット（ストレプトアビジンHRP）
本キットは、細胞培養上清や体液検体中の細胞外小胞の■ 血液検体の希釈直線性血清（希釈率1：2〜1：16）

EDTA血漿（希釈率1：5〜1：40）

定性解析及び定量解析に利用できる酵素免疫測定試薬です。細胞外小胞表面のホスファチジルセリン（PS）と特異的に結合するタンパク質を固相化したプレートに細胞外小胞を反応させて固定化した後、目的の細胞外小胞表面マー
カータンパク質に対するビオチン標識抗体を一次検出に、キット付属の HRP 標識ストレプトアビジンを二次検出にDilution factor（×）

ヘパリン血漿（希釈率1：2〜1：16）

用いて、目的のマーカータンパク質を表面に有する細胞外小胞を高感度に検出することができます。そして、さまざ
まな動物種のビオチン標識抗体を一次検出に用いることができます。また、二次検出に HRP 標識ストレプトアビジンを採用しており、血液成分への非特異結合が低いため、
血液サンプル中の細胞外小胞を高感度に検出できます。

特長●高 感度（ウエスタンブロットの 50 〜 1,000 倍の感度で検出可能）●細胞培養上清や体液検体中の細胞外小胞を直接定性・定量可能●解析に使用する細胞外小胞量を節約可能（ウエスタンブ
ロットの 10 〜 1,000 分の１以下）

Dilution factor（×）■ ヒ ト正常血液検体中のエクソソームマーカー相対濃度の測定（総反応液量 100μL に対して血清 / ヘパリン血漿量は50μL まで）

測定原理
Serum
（n=10）(Code No. 298-80601)

Anti Mouse IgG POD(Code No. 297-79201)

Extracellular
vesicleExtracellular
vesicle当社キット PS CaptureTM Exosome ELISA Kit（Anti Mouse
IgG POD）（Code No. 297-79201）（図右）では、一次抗体にマウス抗体、二次抗体に抗マウス IgG 抗体を用いていまし
たが、本キット（図左）ではビオチン標識抗体を一次検出、二次検出に HRP 標識ストレプトアビジンを用いています。
そのため、抗体種に依存せずに細胞外小胞を解析できます。

前処理済み（10,000×g、30 分間遠心）の正常ヒト血清、EDTA 血漿、ヘパリン血漿（各 2 検体）をReaction Buﬀerで段階希釈した。段階希釈したサンプルを100μL ずつ
ウェルに添加後、本キットプロトコールに従い、ビオチン標識抗 CD63 抗体（本キット付属品）
にてエクソソームを検出した。

血清、EDTA 血漿及びヘパリン血漿を各 2 検体用意し、CD63 測定における希釈直線性を評価した。
結果、血清とヘパリン血漿の場合、CD63 測定において 2 倍希釈以上で良好な直線性を確認できた。EDTA 血漿の場合、5 倍希釈以上で良好な直線性を確認できた。

●血清及びヘパリン血漿は 2 倍希釈以上で測定可能

Streptavidin HRP

Dilution factor（×）

前処理済み（10,000×g、30分 間 遠 心）の 正 常ヒト血 清（10 検体）、EDTA 血漿（9検体）、ヘパリン血漿（9 検体）
をReaction Buﬀerで希釈後、本キットプロトコールに従い、
Plasma EDTA Plasma Heparin
ビオチン 標 識 抗 CD9 抗 体
（n=9）
（n=9）
、ビオチン標識
Error bar : Standard error（SE） （Novus 社）
抗 CD63 抗体（本キット付属品）及 び ビ オ チ ン 標 識 抗
EpCAM 抗体（MBL 社）にてエクソソームを検 出した。
COLO201 細胞培養上清から精製したエクソソームをスタン
ダードに用いて、CD63 測定
は 10 倍希釈、CD9 測定は50 倍希釈、EpCAM 測定は5 倍希釈で測定した。

正常血液検体としてヒト血清（10 検体）、EDTA 血漿（9 検体）、ヘ
パリン血漿（9 検体）を用意し、エクソソームマーカーの CD63 及び CD9、がん細胞エクソソーム特異的マーカーとして報告されている
EpCAM の測定を行った。
結果、エクソソームマーカーの CD63 及び CD9 は各血液検体で検出されたが、がん細胞エクソソーム表面抗原の EpCAM は極微量である
ことが示された。

…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
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20

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）［次頁に続く］ew Products■C OLO 201由来精製エクソソームの添加回収試験
COLO201由来精製エクソソーム標準曲線

Experimental Data
高性能かつ安価なトランスフェクション試薬
ScreenF ectTMA

本品を用いた HEK293T 細胞への遺伝子導入
結果をご紹介します。
Screen ectTMA

COLO201由来精製エクソソーム濃度（ng/mL）

Actual conc.
of spiked-in
ng/mL
0
1.087
2.245
4.591

Assay value

Recovery value

ng/mL
0.381
1.418
2.377
4.429

ng/mL

%

1.037
1.996
4.048

95
89
88

Actual conc.
of spiked-in
ng/mL
0
1.087
2.245
4.591

Assay value

Recovery value

ng/mL
1.861
2.945
3.898
6.007

ng/mL

%

1.084
2.037
4.146

100
91
90

スケール：24 ウェル

導入効率
89%
細胞生存率 87%
Green Fluorescence

血清（希釈率 1:2）
Recovery rate
Mean（%）

導入遺伝子：GFP
トランスフェクションから検出までの時間：24 時間
遺伝子導入効率：GFP 陽性細胞率をフロー
サイトメーターにより測定# of cells

91

細胞生存率：トリパンブルー染色後、セルカウンターにより測定

EDTA血漿
（希釈率 1:2）
Recovery rate

0 RFU

Mean（%）

94%

Recovery rate
Mean（%）

1.091
2.133
4.286

100
95
93

96

COLO201 細胞培養上清から MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS［コード No. 293-77601］を用いてエクソソームを精製し、各濃度の精製エ
クソソームを前処理済み（10,000 × g、30 分間遠心）のプール正常ヒト血清、
EDTA 血漿、ヘパリン血漿 2 倍希釈液に添加した。添加サンプル中のエクソソームを、本キットプロトコールに従い、ビオチン標識 EpCAM 抗体（MBL社）
にて検出した。
COLO201 細胞由来精製エクソソームを用いて標準曲線を作成し、各サンプ
ルの添加回収率を算出した。

プール血 清、EDTA 血 漿、ヘパリン血 漿の 2 倍 希 釈 液を用 意し、
COLO201 細胞培養上清から精製した 3 濃度の COLO201 由来エク
ソソームを添加し、EpCAM 測定における回収率を求めた。
添加回収率は、EpCAM 測定においては 100% ± 10% 程度に収まっており、良好な回収性能を示した※。
※【血液検体の希釈直線性】を加味し、EDTA 血漿においては、5 倍以上希釈して測定することを推奨します。

298-80601

規格

PS CaptureTM Exosome ELISA
Kit（Streptavidin HRP）

品

名

用途

Fluorescence(RFU)
Sampleﬂuorescence

12288 RFU

RFU threshold :

遺伝子
96回用
研究用

Fluorescence(RFU)

1282 RFU

1486 RFU

Control
ﬂuorescence

培地：High Glucose D-MEM with 10% FBS, 抗生物質含有
使用条件 (DNA 量 (μg) : Transfection reagent(μL))（Screen ectTMA）1:3、（他社品 A）1:0.75、（他社品 B）5:2

ScreenF ectTMA が最も高い遺伝子導入効率を示した。
（データご提供：埼玉医科大学 医学部微生物学 村上教授）

商品情報詳細・サンプル依頼は WEB ページへ
各商品の詳細は WEB ページでご覧頂けます。導入実績
データも公開しています。
検索

ScreenFect
コード No.

20,00080,00058,00030,0009,000
30,00012288 RFU

RFU threshold :58,000

規格 容量 希望納入価格（円）299-77603 MagCaptureTM Exosome
遺伝子    2回用精製研究用 10回用
293-77601 Isolation Kit PS
PS CaptureTM Exosome ELISA 定性 / 定 遺伝子297-79201
96回用
Kit（Anti Mouse IgG POD）
量解析 研究用TM
PS Capture Exosome Flow
遺伝子297-79701
定性解析
300回用
Cytometry Kit
研究用016-27061 Anti CD63, Monoclonal
免疫 20μL
定性解析
化学用 100μL
012-27063 Antibody（3-13）

0 RFU

SampleﬂuorescenceControl
ﬂuorescence

容量 希望納入価格（円）

関連商品
コード No.

0 RFU

➡

近日
発売

名

導入効率
72%
細胞生存率 91%
Green Fluorescence# of cells

ng/mL

他社品B

導入効率
52%
細胞生存率 90%
Green Fluorescence# of cells

Recovery value

ng/mL
0.433
1.524
2.566
4.719

品

1896 RFU

他社品A

Assay value

コード No.

12288 RFU

RFU threshold :Control
ﬂuorescence

ヘパリン血漿
（希釈率 1:2）
Actual conc.
of spiked-in
ng/mL
0
1.087
2.245
4.591

Fluorescence(RFU)
Sampleﬂuorescence

品

名293-73201
TM
299-73203 ScreenF ect A
297-73204

規格

容量 希望納入価格（円）

遺伝子
研究用

0.2mL    8,000
1mL
30,0001mL×5 120,000

関連商品
コード No.

品

名293-77101
TM
299-77103 ScreenF ect A plus
297-77104

規格

容量 希望納入価格（円）

遺伝子
研究用

0.2mL    9,000
1mL
35,0001mL×5 140,000…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2018 年 7 月時点での情報です。最新情報は、siyaku.com（http://www.siyaku.com/）をご参照下さい。

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）21

ew Products
アルツハイマー病研究に性

高分子アミロイドβオリゴマー ELISA キットワコー

検量線範囲
反応する Aβオリゴマー

近年、アミロイドβ（Aβ）オリゴマーはアルツハイマー

測定対象検体※ 2病の原因として注目されています。Aβオリゴマーは、

能

種交差性
必要検体量
測定時間
検出法

Aβモノマーが凝集した可溶性凝集体で、神経細胞のシナプス機能に障害を与えることが知られています。Aβオリ
ゴマーには、分子量の大きさから低分子の Aβオリゴマー

※１
※２
※３

（Low n- オ リ ゴ マ ー な ど ） と 高 分 子 の Aβ オ リ ゴ マ ー（ADDL、Aβ*56、プロトフィブリルなど）があります。
本品は、抗 Aβ抗体（BAN50）を捕捉抗体と検出抗体

0.410 〜 100pmol/L ※ 1≧ 9mer Aβオリゴマー
脳脊髄液
in vitro Aβオリゴマー
ヒト
25μL（4 倍希釈時）
4 時間半
発光系※ 3

標準品である 16 量体 MAP ペプチドの換算値です。
血漿、血清サンプルの測定は推奨しません。
測定には発光プレートリーダーが必要です。

測 定 例の両方に用いた ELISA キットで 9 量体以上の高分子 Aβオリゴマーを特異的に測定可能です。

■ヒト脳脊髄液Aβオリゴマー（pmol/L）

6

?

Aβ
モノマー
Aβ
オリゴマー

4
3
2
1
0

Aβ

フィブリル

AD

CSF 検体Control

非認知症患者（control）、アルツハイマー病患者（AD）の脳脊髄液中の Aβオリゴマーを本 ELISA で測定したところ、非認知症患者（control）とアルツハイマー病患者（AD）間で測定値に差が見られた。

神経毒性

特

5

長

● Aβオリゴマーを定量可能●９量体以上の Aβオリゴマー特異的に検出〔参考文献〕
1）Fukumoto, H. et al . : FASEB J ., 24 , 2716（2010）.

測定原理2）Kasai, T. et al . : Biochem. Biophys. Res. Commun ., 422（3）,375（2012）.

抗 A β抗体（BAN50）を捕捉抗体と検出抗体の両方に用いたサンドイッチ ELISA 系は 1 - 8 量体にはほとんど反応せず、9 量体以上の A βオリゴマーに特異的に反応します

1 , 2）。

コード No.
NEW

品

名

規

格

容量

希望納入価格（円）High Molecular Amyloid β298-80101 Oligomer ELISA Kit Wako 免疫化学用 96回用

98,000標準品には抗 A β抗体（BAN50）の認識配列を 16 本持関連商品

つ 16 量体 MAP ペプチドを使用しています 2）。

コード No.

発光基質

発光○標準品（16 量体 MAP ペプチド）

HRP
HRPストレプトアビジン
ビオチン標識抗 Aβ抗体（BAN50）
Aβオリゴマー

抗 Aβ抗体（BAN50）

抗 Aβ抗体（BAN50）
の認識配列

格

容量

希望納入価格（円）014-26881 Anti Amyloid β, Monoclonal
免疫化学用010-26883 Antibody（BNT77）018-26921 Anti Amyloid β40, Monoclonal
免疫化学用014-26923 Antibody（BA27）

品

名

規

10μL
50μL
10μL
50μL

10,00035,00010,00035,000014-26901 Anti Amyloid β42（43）,
Monoclonal Antibody（BC05） 免疫化学用
010-26903

10μL

10,00050μL

35,000017-26871 Anti Human Amyloid β,
Monoclonal Antibody（BAN50） 免疫化学用
013-26873

10μL

10,00050μL

35,000

詳しくは、 当 社 HP（http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/
product/life/Amyloid_b/index.htm）をご覧下さい。

…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2018 年 7 月時点での情報です。最新情報は、siyaku.com（http://www.siyaku.com/）をご参照下さい。

22

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）ew Products
測 定 例

アルツハイマー病研究に■ ヒト脳脊髄液中の Tau の測定

Tau ELISA キットワコー

Human Tau（pg/mL）

Tau は、微小管結合タンパク質の一つで、主に中枢神経系の神経細胞に発現しており、微小管の安定性を制御しています。アルツハイマー病患者の脳では、りん酸化
Tau が蓄積した神経原線維変化が形成され、その出現の程度が認知症の重症度と相関すると報告されています。そのため、Tau はアルツハイマー病の原因究明や治療薬開発のために研究されています。一方、脳脊髄液中の総Tau とりん酸化 Tau の濃度はアルツハイマー病患者で非りん酸化状態に関わらず、すべての Tau を定量すること

非認知症者（non-dementia）、軽度認知障害患者（MCI）、アルツ
ハイマー病患者（AD）の脳脊髄液を本キットで測定したところ非認知症者（non-dementia）、軽度認知障害患者（MCI）、アルツハイマー
病患者（AD）の間で有意差が見られた。

ができます。

■ 認知機能診断テスト（MMSE スコア）との相関データ

認知症患者よりも上昇すると報告されています。
本品は、Tau を簡便に測定できる ELISA キットです。

特長●少量検体で測定可能
●高感度

性

能

検量線範囲

4.10 〜 1,000pg/mL

測定対象

Total Tau

測定対象検体ヒト脳脊髄液（CSF）

必要検体量10μL 〜

測定時間

3 時間

検出法

発光系

23 点以下：認知症の疑い 24-27 点：軽度認知障害の疑い 28-30 点：正常

本キットで測定した脳脊髄液中の Tau 濃度と脳脊髄液を採取した患者の MMSE スコアの相関性を検討した。
Tau の濃度と MMSE スコアに相関が見られた。

※1

キット内容

※ 1 希釈の正確さを考慮して CSF 検体量は 50μL を推奨しています。

● Antibody-coated Plate

1 プレート● Tau Standard

測定原理

1本

● Buffer

60 mL × 1 本● Biotin-conjugated Antibody Solution

100μL × 1 本● Peroxidase-conjugated Streptavidin Solution 100μL × 1 本● Luminescent Reagent 1

6 mL × 1 本● Luminescent Reagent 2

6 mL × 1 本● Wash Solution（10 ×）

100 mL × 1 本● Sample Buffer 1

0 . 6 mL × 1 本● Sample Buffer 2

30 mL × 1 本● Plate Seal
コード No.
NEW

3枚
品

名

296-80401 Tau ELISA Kit Wako

規格

容量 希望納入価格（円）

免疫化学用 96回用 98,000

抗 Tau, モノクローナル抗体も取揃えています。当社
HP にてデータをご紹介しています。
Tau 抗体和光

検索➡
…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
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和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）23

ew Products
パーキンソン病の研究に

VCAM-1 産生阻害作用物質

抗りん酸化α- シヌクレイン，モノクローナル抗体（pSyn#64）

ハリクロリン

抗りん酸化α- シヌクレイン，モノクローナル抗体（pSyn#64），ビオチン結合

ハリクロリンは、クロイソカイメン由来のアルカロイ
ド で す 1）。VCAM-1 産 生 阻 害 作 用 を 示 し ま す 2）。 ま た、

パーキンソン病、レビー小体型認知症（DLB）などの

NF-κB 活性化の阻害を介し、内皮への単球接着を減少さ神経細胞に特異的に出現するレビー小体は、セリン 129 残

せる 3）、血管平滑筋細胞において L- 型 Ca2+ チャネルを阻基が特異的にりん酸化を受けたα- シヌクレインタンパク

害する 4）と報告されています。

質を含んでいます。本品は、正常なα- シヌクレインとは反VCAM-1 は、IL-4、TNF などの刺激により血管内皮細

応せず、蓄積したりん酸化α- シヌクレインのみを認識す胞に発現し白血球と強力に接着する細胞接着分子で、炎るため、レビー小体関連病変の研究にご利用頂けます。

症、がん、移植臓器拒否反応などに深く関わると考えられ

製品概要ており、ハリクロリンは、抗炎症、抗がん、免疫抑制のリード化合物となる可能性があります。

抗りん酸化α - シヌクレイン， 抗りん酸化α - シヌクレイン，
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体（pSyn#64）（pSyn#64）, ビオチン結合
標識体
クローンNo.
サブクラス
抗 原
種交差性
組 成
実用希釈
倍率

未標識

製品概要

ビオチン

●外観：白色の固体

pSyn#64
マウスIgG
セリン129がりん酸化されたヒトα-シヌクレインの124-134残基
ヒト、マウス、ラット
血清含有培地上清，PBS, 0.05% アジ化ナトリウム
0.05% アジ化ナトリウム
免疫組織染色免疫細胞染色（1:1,000 ～ 10,000）（1：200〜5,000）
ウエスタンブロット
免疫組織染色（1:1,000 ～ 10,000）（1：200〜5,000）●メタノール溶状：試験適合●含量（HPLC）：94 . 9 %（初回生産ロット実測値）

H

N

O
O

使 用 例

H3 C
Cl

本品を用いたレビー小体型認知症の脳切片免疫組織染色像。病変部位である
レビー小体が特異的に染色されている。

C23H32ClNO3＝405.96
CAS RN® 178176-75-5

OH〔参考文献〕
1）Kuramoto, M. et al . : Tetrahedron Lett ., 37（22）,3867（1996）.
2）Kuramoto, M. et al . : Mar. Drugs , 2 , 39（2004）.
3）Tsubosaka, Y. et al . : J. Pharmacol. Sci ., 113 , 208（2010）.

（データご提供：東京大学大学院医学系研究科 岩坪威先生）
コード No.

品

名Anti Phosphorylated α-Synuclein,015-25191 Monoclonal Antibody（pSyn#64）

4）Tsubosaka, Y. et al . : Eur. J. Pharmacol ., 628 , 128（2010）.

規格 容量 希望納入価格（円）

免疫
50μL
化学用

30,000Anti Phosphorylated α-Synuclein,
免疫010-26481 Monoclonal Antibody（pSyn#64）,
100μL
化学用
Biotin-conjugated

45,000

当社では、その他、Aβやタウ関連試薬を取扱っています。22 ページにて高分子アミロイドβオリゴマー ELISA
キット、23 ページにて Tau ELISA キットをご紹介しています。また、当社 HP で上記抗体の染色画像などのデータを掲載していますので、是非、ご覧下さい。
和光 シヌクレイン

コード No.
NEW

品

名089-10441 Halichlorine

規

格

容量

希望納入価格（円）

生化学用

100μg

55,000

当社では、海洋天然物由来毒性成分を多数取扱っています。下記当社 HP にてご紹介しています。
http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/product/life/
Marintoxin/index.htm

検索和光

海洋天然物由来毒性成分➡

➡
…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
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24

和光純薬時報検索Vol.86, No.3（2018）ew Products
用

耐高真空性能 多目的ステンレス缶！

途

半導体その他電子部品・フィルム・ディスク・紙製品・

キミツ

医薬品・化粧品・香料・化学品・インク・塗料・セラミッ

本品は、極めて優れた耐高真空性能をもつフルオープン

ク・新素材・生鮮食品・乳肉・バイオ試料・分析用試料・タイプのステンレス缶です。独特な構造の二重パッキンが缶内の真空度の上昇に従って缶とフタの間にくい込むため強力に密閉します。

飲料水・文化財などの保存・輸送など。
〈ご注意〉
本品は、耐加圧性がないため、ガス置換を行う際は、先に減圧を行うなど、容器内部が加圧状態にならないようにご注意下さい。

リングクランプ

コード No.

二重パッキン

フタ
（天板）

品名

容量

重量

637-41651 010-SS
10L 8.3kg
634-41661 020-SS
20L 9.3kg
631-41671 030-SS
30L 11.1kg
キミツ
638-41681 050-SS
50L 13.9kg
635-41691 100-SS
100L 18.0kg
638-41701 200-SS
200L 27.5kg

フタ

カプラプラグメーカー
コード

シリコンパッキン缶
缶

寸法（ｍｍ）
希望納入
外高 板厚 内径 価格（円）

205
280
400
580
488
920

104,000
108,000
Φ 390
112,000
116,000
174,000
Φ 567
186,000

1.5

高純度品
ヘパリンナトリウム，ブタ腸粘膜由来
特長

ヘパリンは、マスト細胞において作られるムコ多糖で、脾臓、肺、筋肉をはじめ種々の臓器や血中に存在し、血液●独自構造のステンレス缶（SUS-304 製）

凝固阻止作用があります。ムコ多糖の中では最も多く硫酸・板 厚 1.5mm ながら、缶の胴体はリブで補強し、フタ基を含み、硫酸基が負に帯電しているため、種々の生理活と底は内側へ湾曲成型してあるため、約− 0.1Mpa の性物質と相互作用を示します。また、bFGF と結合するこ

真空下でも座屈しない。

とで、液体中における bFGF の安定性が増すという報告

・ガ スバリア性が極めて高く、湿気除去や遮光性が高もされています。さらに、ラクトフェリンなどの血清タンい。

パク質、エンドヌクレアーゼなどの DNA 結合タンパク質●超広口のフルオープンタイプ

やアンチトロンビンⅢなどの凝固因子とも結合性を持つた・胴 体の溶接面のラップや底部の隙間がなく簡単に洗め、それらタンパク質の精製にも使用できます。

浄・スチーム殺菌が可能。

本品は、高純度なヘパリンナトリウムです。特に不純物・パ ッキンはシリコンゴム製で、簡単に取り外して洗である亜硝酸分解抵抗性物質を製造工程において除去して浄・スチーム殺菌が可能。

います。

・缶とフタはリングクランプを締めるだけで固定できるため、作業能率が向上。

特・缶内にラックやトレーを⼊れることで、細かいもので

長

●高純度

も⽴体的に収納可能。

●亜硝酸分解抵抗性物質除去済み●ワンタッチ方式のカプラを採用
・真空ポンプやガスボンベと配管することで、簡単に真製品概要

空引きや不活性ガス置換、ガス燻蒸などが可能。

●活性：130units/mg 以上（初回ロット実測値：208units/mg）

・真空圧ゲージや正負圧ゲージを取り付けて缶内圧をモ●不純物（亜硝酸分解抵抗性物質）：0.20% 以下

ニターすることができる。

●エンドトキシン試験済み・バリアカットや三方バルブを取り付け、缶内圧を外気圧に戻すことにより、簡単にフタを開けることができる。
●特注仕様の相談

コード No.

・覗き窓付フタや吸引ろ過缶など、お客様のご要望に応じた仕様での製作や加工が可能。

品

名088-10391
Heparin Sodium, from Porcine
NEW084-10393
Intestinal Mucosa
NEW082-10394
NEW

規格

容量

250mg
細胞
1g
培養用
5g

希望納入価格（円）7,000
18,00060,000…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2018 年 7 月時点での情報です。最新情報は、siyaku.com（http://www.siyaku.com/）をご参照下さい。

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）25

ew Products
p 型有機半導体材料
TBBT-C4TBBT-C10
有機電界効果トランジスタ（OFET）は、機械的に柔軟かつ軽量であるメリットに加え、低コスト・低環境負荷の塗布プロセスによって作製可能な有機半導体材料を活性層に用いているため、プリンテッド・フレキシブルデバイスなど次世代エレクトロニクスへの応用が期待されています。

〈TBBT-C10〉

この度、高いホール移動度を有し、溶解性の高い p 型

C10H21

有機半導体材料のラインアップを追加しました。本品は東京大学竹谷教授、岡本准教授と富士フイルム（株）の共S同研究によって開発された新規材料です。

特C10H21SS

C36H48S3＝576.96
CAS RN® 1810008-48-0

長●高いホール移動度

Au

5cm2/Vs を超えるホール移動度〈塗布膜作成条件〉

100μm

Au

F4-TCNQ

F4-TCNQTBBT-C10●高耐熱性

β-PTS

OSC パターニングに必要な温度履歴を経ても特性が

アニソール

濃度

0.05 wt%

溶かした温度 70℃

SiO（200nm）
2
Si

劣化しない

溶媒

Hot plate 温度 40℃●高溶解性トルエン溶解度：0.5wt％●高い再現性

基板

SiO2 200nm

SAM

β-PTS

滴下量

1滴

乾燥

減圧下 70℃，24h

パイクリスタル社によるトランジスタ特性評価で良好な再現性を確認●昇華精製品
純度 99% 以上を保証

デ ー タ■エッジキャスト法による結晶膜作製・トランジスタ特性評価〈TBBT-C4〉
C4H9

C4H9
S

〔参考文献〕S

1）Okamoto, T. et al . : Adv. Mater ., 25 , 6392（2013）.
2）Mitsui, C. et al . : J. Mater. Chem. C. , 5 , 1903（2017）.
3）岡本敏宏：和光純薬時報 , 86 , 10（2018）.

S

C24H24S3＝408.64
CAS RN® 1810008-49-1

Au

100μm

F4-TCNQ〈塗布膜作成条件〉
Au
F4-TCNQTBBT-C4β-PTS
SiO（200nm）
2
Si

溶媒

トルエン

濃度

0.05wt%

コード No.

Hot plate 温度 50℃
SiO2 200nm

SAM

β-PTS

滴下量

1滴

乾燥

減圧下 50℃，8h

名

規

格

容量

機能性有機材料用 100mg
機能性有機材料用 100mg

和光純薬時報75,00075,000

関連商品
有機半導体ビルディングブロック
コード No.

品

201-20811 TBBT-Br2
近日
発売 204-20801 TBBT-H2
近日
発売

名

規

格

容量

機能性有機材料用 250mg
機能性有機材料用 250mg…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
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26

希望納入価格（円）本品は東京大学、富士フイルム ( 株 ) のライセンスを受けて製品化しました。

溶かした温度 60℃
基板

品

208-20821 TBBT-C4
NEW
205-20831 TBBT-C10
NEW

Vol.86, No.3（2018）

希望納入価格（円）

照
照

会
会

ew Products
リニューアル！

無アルデヒドエタノールを使用して調製

コロイド滴定用 滴定液

局方一般試験法用 0.5mol/L 水酸化カリウム・エタノール液

ご愛顧頂いていますコロイド滴定用試薬の値付けを国際

本品は、日本薬局方に準じた無アルデヒドエタノールを用単位系（SI）にトレーサブルな評価方法にリニューアルしいて調製した 0.5mol/L 水酸化カリウム・エタノール液です。

ました。

当社の局方一般試験法用 容量分析用標準液は、日本薬局方に準じた調製及び標定を行い、濃度を保証しています。

値付方法概略特SI 単位●無アルデヒド処理済みのエタノールを用いて調製

フタル酸水素カリウム（CRM：認証標準物質）●ファクターは小数点以下３桁

産業技術総合研究所より頒布

コード No.

（滴定）

テトラフェニルほう酸ナトリウム［コードNo.195-16891］
（滴定）

品

名

規

0.5mol/L PotassiumNEW
169-28425 Hydroxide-Ethanol Solution

産業技術総合研究所で危格

希望納入価格（円）

容量

局方一般
500mL
試験法用

4,800

qNMR、LC-MS/MSに関連商品

よる値付け済み

CPC［コードNo.080-06681］

コード No.

（滴定）
製品試験
（滴定）

長

品

名

規

0.1mol/L Potassium
NEW 164-27995
Hydroxide-Ethanol Solution

PVSK 原末

危格

希望納入価格（円）

容量

局方一般
500mL
試験法用

4,800

調液

追加品目のお知らせ

PVSK 滴定液（滴定）

Gch滴定液 MGch 滴定液 DADMAC 滴定液

ポジティブリスト関連標準品

関連商品への値付け

当社では、ポジティブリスト制度の対象となる農薬標準品、動物用医薬品標準品をラインアップしています。
下記品目を新たに発売しました。

【略語説明】
CPC：ヘキサデシルピリジニウムクロリド
PVSK：ポリビニル硫酸カリウム
Gch：グリコールキトサン
MGch：メチルグリコールキトサン
DADMAC：ポリ（塩化ジアリルジメチルアンモニウム）

農薬標準品■ジクロベニル代謝産物 E 標準品■エトフメセート代謝産物 M2 標準品■ピカルブトラゾクス標準品■ピカルブトラゾクス代謝産物 B 標準品■キザロホップ標準品

今回のリニューアル商品を用いてこれまでと同様の試験を行った場合、試験結果が変わる可能性があります。
詳細は当社 HP をご覧下さい。

コード No.

https://labchem.wako-chem.co.jp/info/docs/PVSKhenkou
180305.pdf
コード No.

名

名

規格 容量 希望納入価格（円）

NEW

コロイド
500mL 照滴定用

160-28391 Picarbutrazox Standard会NEW

163-28401

コロイド
500mL 照
滴定用

会

NEW

178-00791 Quizalofop Standard

近日発売

N/400 DADMAC Solution
コロイド
042-34455 【N/400 Poly（diallyldimethylammonium
500mL 照滴定用
Chloride）Solution】

会

近日
発売

N/400 PVSK Solution
167-28105 【N/400 Potassium Polyvinyl Sulfate
Solution】

会

近日
発売

品

品

N/200 Gch Solution
077-06715【N/200 Glycol Chitosan Solution】

N/200 MeGch Solution
近日
発売 139-18875 【N/200 Methyl Glycol Chitosan
Solution】

危

Picarbutrazox Metabolite B
危Standard

残留農薬
試験用
残留農薬
試験用
残留農薬
試験用
残留農薬
試験用
残留農薬
試験用

容量

希望納入価格（円）

100mg

6,000

100mg

30,000100mg

25,000100mg

30,000100mg

35,000

随時、当社 HP のリストに発売品目を追加・更新しています。詳細は、当社 HP をご覧下さい。
当社試薬 HP →分析→食品分析「ポジティブリスト」
和光 ポジティブリスト

検索

➡

コロイド
500mL 照滴定用

規格

Dichlobenil Metabolite E
NEW 045-34401
Standard
Ethofumesate MetaboliteNEW053-09211
M2 Standard…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
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和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）27

化学大家 443
長井長義（1845 . 7 . 24 . ～ 1929 . 2 . 10）
徳島大学名誉教授

渋谷雅之

長井長義（写真 1）の事跡について

藤吉郎、田原良純、高橋三郎などの逸は、過去に多くの著作 1-6）などで紹介さ材は大学南校でドイツ語を習得し、専れているが、ここでは薬学の創始や発門に進んで理化学を学ぼうとしていた展に関連して長井が果たした役割を中が、鉱山学に転向するわけにもゆかず心に、その生涯をたどってみたい。

途方にくれていた 8）。明治 6 年、大学
東校（医学校）内に製薬学科が設けら生い立ちと長崎留学7）れたことにより、ドイツ語教育が続い長井長義は弘化 2 年（1845）阿波蜂ていた大学東校に、これらの逸材が集

須賀藩の医官を務める長井琳章の長男

団で移動し、現代薬学の“ご先祖”にとして現在の徳島市中常三島町に生まなるという、信じられない経緯をたどれ た。15 歳 で 元 服 し て 直 安 と 称 し、る。一方、前述のように理化学の可能慶応 2 年（1866）22 歳のときに他の 6性をもった南校への転校が長井の意識名とともに長崎留学の藩命を受けた。

に姿を見せても不思議はなかったので

長井が藩庁から命ぜられた長崎留学のある。こうした大混乱の中から日本の名目は「洋学修行」という漠然とした薬学は誕生した。

ものだったが、父・琳章は阿波藩の御殿医だったことから嫡子の長井に医学

父 ･ 琳章と徳島藩庁の執拗な束縛に
写真 1．壮年期の長井長義

修行を期待したのは当然のことだった

ぎはなかった。そして化学を社会に活長井は慶応 4 年 3 月に帰藩する。翌明

かす分野として、長井が薬学を意識し一方、長井は、当時阿波藩に仕えて

治 2 年正月、京都の伊東玄伯（方成）

はじめるのは、ベルリンにおける長与いた関寛斎から化学を学び、興味を抱に入門し、同年 3 月の東京遷都によ専斎との出会い（後述）がきっかけできはじめており、当人の留学意図は最り、伊東と共に東京に移り大学東校

あったかもしれない。

初から化学修行にあった。長井は関寛（東京大学の淵源）に入学する（写真斎から、オランダ人化学者・ハラタマ2）。大学東校は、新政府により我が国

および写真師の上野彦馬に宛てた紹介に創設された医学教育機関だったが、状を得て長崎に旅立つ。長崎に着いた

ここで医学を修めようとする意図が長

長井は、ハラタマが入れ違いに江戸に井にあったと推測するのは難しい。長

去ったことを知る。そこで当時の日本

井が伊東玄伯に師事したのは、父 ･ 琳

では数少ない職業写真館を開いていた章に対する親孝行ととらえるのが自然

上野彦馬に師事することになった。彦であろう。一方、大学本校（昌平学

馬は化学者としても著名である。上野校）の南にあった大学南校（旧・開成彦馬の写真術は当時の最先端科学の雰

学校）には法、理、文の 3 科がおかれ囲気を持っていたであろう。

た。南校の中に理化学教育の創始がであろう。

長井は精得館（幕府が創設した医学あったため、長井が東校から南校に転校）に通い、医学修行らしい記録を残校しようとして発覚し、御目玉を喰う

すが、その期間は最初の 1 ヶ月のみといったこともあったらしい 8）。

で、その後は精得館を無視して写真用大学創設当初の初年次教育はドイツ

薬品の製造、砂糖の精製、電気メッ

語で行われていたが、時の趨勢から、

キ、ライフル銃、大砲の発射管、等々

大学南校の教育システムが突如英語にの研究に明け暮れる。父の跡を継いで切り替えられる。文部省は英語教育の医師になることを運命づけられていた徹底に努める一方、ドイツ語から転向

長井は、その運命の糸を自ら断ち切っすることが困難な上級学生のために臨た。

時に「鉱山学科」を設けて収容し、学大学東校に学んだ長井は、明治政府

生の卒業後は廃止するといった荒技をにより第 1 回欧州派遣留学生に選ばれ使う 9）。のちに我が国の薬学を担うこた。明治 4 年、長井は太平洋航路のアとになる下山順一郎、丹波敬三、丹羽

メリカ丸で米国に渡り、さらに大西洋

大学東校
鳥羽伏見戦争の情報を長崎で聞いた

28

もかかわらず、長井の化学志向に揺る

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）

写真 2．大学東校時代の長井長義

ベルリン留学 10）

を渡ってベルリンに到る。長井の渡米に遅れること 9 ヶ月、特命全権大使・岩倉具視の率いる使節団が、同じアメリカ丸に乗って米欧回覧の旅に出た。
ベルリン大学で有機化学の大家・ホフマンに学び、数々の学術的業績をあげた長井は、のちにホフマンに請われて私設助手となり、さらにベルリン大学助手に就任し、ドイツ化学会における将来を嘱望されるようになる。
長井は結局ベルリンに 13 年間滞在するのだが、この時期、日本では教育システムの確立や科学産業の育成に関して次々と課題が生まれ、急速に新しい制度や組織が作られつつあった。長井とともにベルリンに留学し、明治 7年に帰国していた柴田承桂（東京医学校初代製薬学科教授）や、衛生局長・長与専斎は東京大学医学部における化

写真 3．明治 21 年 5 月 7 日、勅令第 13 号により日本最初の博士学位が授与された。

学部門や、製薬会社の技術指導者としに随行してベルリンに到った長与専斎て長井を嘱望し、約 10 年にわたり長井の帰国要請運動を展開する。かくして明治 17 年、長井は帰国し、活動の場を日本に移した。

医薬分業（写真 4）は我が国の医療制度の基本

長井は帰国直後の明治 18 年、日本を定める使命を帯びていた。ベルリン

薬学会の前身である東京薬学会で演説

で長井と再会した長与専斎は、その意

し、ベルリンでの経験を元にして、薬学

位

剤師養成と医薬分業の重要性を次のよ

長井はドイツ留学中、ベルリン大学

うに説いた。「日本では医学と薬学がか ら Dr. der Philosophie の 学 位 を 得

密着して離れない。民間では薬の代価ていたが、帰国後の日本にはまだ学位と診察料の違いを理解できず、薬の代制度がなかった。明治 21 年、勅令第価が診察への謝礼そのものの性質を13 号によってわが国初の博士 25 人が持っていると誤解している。ヨーロッ誕生した。理学、工学、医学、文学、

パでは薬学は一大専門学である。その法学の各 5 人に文部大臣・森有礼からため、薬の専門家でない医師がそれを学位記が授与され、長井は理学博士の理解できないのは当然であり、国民も学位を受領する。写真 3 は関東大震災

そのことを認めている。薬学そのものと太平洋戦争における東京空襲から奇の進歩のために努力すると同時に、こ跡的に守られ、現在は徳島大学が所蔵のような困った習慣を正すのは、我々している貴重な学位記である。

薬学者の義務である」

当初薬学はまだ主要な学術分野と認

長井の医薬分業に関する見識はベルめられていなかった。薬学博士の誕生

リン留学中に長与専斎との交わりの中までには 10 年あまりを要し、その間で形成されたものである。

医学博士の授与を打診された薬学者は長井と長与の交友の芽生えは幕末の受領を辞退した。明治 32 年、勅令第長崎にあった。長井が長崎で化学を学

344 号により学位に薬学が加えられ、び始めた時期、長与專斎は精得館の若長井は田原良純、下山順一郎、丹波敬

いリーダーとして医学生の衆望を集め三とともに薬学博士第 1 号となる。

ていた。それから 4 年後、岩倉使節団

和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）

写真 4．長 与専斎（明治 5 年 11 月 20 日に長与がホフマンに呈したことを示す裏書きがある。ホフマンの旧蔵アルバムに加えられていたと伝わる。参考文献 11 より引用）

29

見や、新生ドイツの医療制度を参考に下したが、未知の化学構造を解明するしつつ「医制」76 箇條の草案を練る。

という、胸躍らせる学門の経験を積ん

そしてベルリンにおける長与と長井のだ若者たちは、やがて合成化学や生命

出会いは 2 人が日本の医薬分業を考え

化学の分野に進出して、その中核となはじめる発端となる。

るに至るのである。

明治 7 年、医制の 54 条から 76 条で

長井自身による研究は、ホフマン教

薬舗と売薬に関して規定され、医薬分授の指導のもとにベルリンで開始され業が明文化されたが、「医師が必要とた。長井は、ワニリンやオイゲノール

するときは医師自ら調剤できる」といといった、芳香を発する植物成分の構う例外規定が盛り込まれ、この例外規造に関する研究の成果をまとめて定が、以後 140 年にわたり医薬分業のPh.D. の学位を得たほか、ホフマンに成熟を阻む要因の一つとなった。

協力して、窒素を含む天然物の化学合

長与専斎はドイツから帰国後、日本

成など、優れた研究をおこなった。

で最初の近代的薬学教育機関である東日本に帰国した後、長井は東京大学

京医学校製薬学科の設立を急ぎ、明治

および衛生試験所において漢方薬の成6 年に実現した。当時西洋医薬品を輸分を究明する研究にとりかかる。牡丹入する業者には悪質なものが多く、不良医薬品が日本中にはびこりつつあり、しかも医薬関係者に、それを見破る力はなかった。そのため、長与は日

写真 5．昭 和 3 年 11 月 10 日、大日本製薬（株）に発売が許可された「エフェドリンナガヰ」

がその対象となった。これらの中で成分の化学構造の解明にまでこぎ着けた
ものは、前述のエフェドリンの他、ベ本独自の薬品を製造する必要性を痛感き、その分野の学問に対する貢献を自ンゼン環やナフタレン環を基本骨格としていたのだった。

らの使命と位置づけた。その後、長井する低分子化合物である。このようなは医科大学内科教授・三浦謹之助らと比較的単純な化学構造を持つ化合物の共同研究により開発したいくつかのは、化学の黎明期には好んで取り上げエフェドリンの発見と産学官連携
帰国後の長井は、東京大学教授、衛

医薬品を大日本製薬（株）に技術移転られた研究対象だった。元素分析にし生局東京試験所長、中央衛生会委員、するなど、産学官連携の草分け的な業ても大量のサンプルを用いて、七輪と大日本製薬会社製薬長などの要職を兼績を残す。長井が開発したミドリアチ

炭火の火力で分析するといった時代で務し、教育、研究、社会貢献を実践しン（瞳孔拡散剤）、アロカイン（局所ある。少し複雑な分子に行き当たった

た。これらが近年の日本で大学の 3 大麻酔剤）などは、日本人が独自に開発

場合は、たちまち研究が暗礁に乗り上使命として定着した状況を思えば、長した医薬品として、以後の時代をリーげるのは普通のことだった。一例とし

井の先見性に学ぶものは多い。

ドすることになる。

て、苦参の塩基成分でありマトリンと

明治 18 年 7 月、長井は大日本製薬

長井は明治 20 年に日本薬学会初代

名 付 け ら れ た 中 枢 神 経 毒（ 図 1） が会社の一室で、衛生局の試験研究員・会頭に就任し、その逝去まで、実にあった。この化合物は 15 個の炭素を山科元忠から黒褐色のエキスを示され42 年にわたり薬学会を指導した。

持つ四環性の物質であり、当時の知識た。山科が野生植物の麻黄から抽出したものであり、そのエキスの中に、肉30

皮、苦参、蒼朮、百部根、白屈菜などと技術では手も足も出ない対象だっ天然物有機化学た。長井による基礎研究を引き継いだ眼で認められる結晶性の物質が混在し天然物有機化学は長井がその創始にているのが発見された。山科は不幸にかかわり、戦前戦後を通じて日本が世も間もなく死亡したが、この時発見さ界をリードした学問分野である。天然れたエフェドリン（写真 5）に関する物の構造研究に関しては、戦後核磁気研究は、長井をリーダーとして引き継共鳴スペクトル（ＮＭＲ）や、Ｘ線結

がれ、43 年にわたって続けられた。

晶解析などの手法が開発され、天然有

長井は前述の東京薬学会における演機化合物の研究は飛躍的な進歩を遂説（明治 18 年）の後半で、自然界かげ、化学の初心者でも複雑な化学構造

ら有効成分を発見し、人工合成によりの謎を解くことができるようになっ

医薬品を生み出すことの重要性を説た。そのため学術としての重要性は低和光純薬時報Vol.86, No.3（2018）のは、丹羽藤吉郎、田原良純ら、その図 1．マトリンの立体構造

後の日本を代表する天然物有機化学者

げて教育研究組織の創設を国に働きかである。以後、長井の後を継いで東京けた。その結果、大正 12 年に現在の帝国大学医学部薬学科薬化学講座の継徳島大学薬学部の淵源となる徳島高等承者となった近藤平三郎、および三代

工業学校応用化学科製薬科学部が誕生目となった落合英二に引き継がれ、最した。このような経緯で創設された薬終的には昭和 32 年、落合の後輩であ学部は全国唯一のものであり、その特る津田恭助により化学合成などで構造

色は脈々と受け継がれたが、近年、薬が決定された。余談ながら近藤、落剤師養成のための全国的な組織替えに合、津田は、いずれも文化勲章を受章より、その伝統に終止符が打たれた。

している。

長井は他に、富山薬専や熊本薬専の創長井の研究姿勢は、その後日本の天立、発展にも尽力している。

然物有機化学の分野に伝統的に引き継一方、長井は晩年、日本女子大学校

がれ、基礎薬学の研究と教育に大きなの「香雪化学館」の創設に協力し、創役割を果たした。そして日本の薬学が設後は化学教授として女子化学者の育薬剤師養成という目標に向かって進み成に努めた。長井が育てた黒田チカ

始めた近年、ようやくその基礎薬学的（お茶の水女子大学教授）、丹下ウメ

な役割を終えようとしている。長井が（日本初の女性農学博士）、鈴木ひでる

蒔いた天然物有機化学の種は近年下村（日本初の女性薬学博士）らは、わが脩 氏（2008・ 化 学 賞 ） や 大 村 智 氏

国の女子教育の発展に大きく貢献す（2015・生理学医学賞）のノーベル賞

る。

〔参考文献〕

受賞によって、ようやく花開いたよう

長井の研究・教育者としての姿勢はにみえる。一方それは、長井が残した

上野彦馬とホフマンの教えを実践した

伝統により日本の薬学が輝いた遠い過実験第一主義によって貫かれ、学生に去の時代への鎮魂歌のようでもある。

対しては常に自主的な問題解決能力を長井は生涯天然物有機化学に取り組

晩

このことと深い関係を持っているようてドイツ旅行を行う。ベルリンではドにみえる。そして長井の研究発表におイツ化学会、薬学会合同歓迎会に出席けるこのような淡泊な態度は、競争相し、「日本の化学はドイツと同様に薬手の少なかった時代のせいばかりでは学をもって始まり薬学をもって進んないように思える。

だ」と感動的な講演を行う。その席上で、長井はホフマンの肖像を鋳したプ
ラケッテ（写真 6）を贈られ、ドイツ

長井の残した業績の中で、学校創設

薬学会名誉会員に推挙された。同年ベに関する貢献は忘れてはならないもの

ルリンにおいてヒンデンブルグ大統領

である。

に謁見し、独逸国赤十字第一等名誉章を贈られた。

３）金 尾清造：「長井長義傳」（社団法人日本薬５）今村壽明：化学大家359

長井長義，和光

純薬時報，60（1），2（1992）．
６）渋 谷雅之：「阿波の偉人伝

長井長義」（株式会社阿波銀行）（2016）．
７）徳島大学薬学部長井長義史料委員会編：「長井長義長崎日記：原本解読版」（徳島大学薬学部長井長義資料委員会）（2006）．
８）緒 方章：「一粒の麦：老薬学者の手記」（廣川書店）（1960）．
９）小 澤健志：「お雇い独逸人科学教師」（青史
出版）（2015）．
10）徳島大学薬学部長井長義史料委員会編：「長井長義ベルリン通信」（徳島大学薬学部長井長義資料委員会）（2005）．
11）石 黒敬章：「幕末明治の肖像写真」（角川学芸出版）（2009）．

は高知と松山に高等学校が設置された

昭和 4 年、長井は咽頭癌のため 84

が、長井の郷里徳島では専門学校を設

年の生涯を終える。逝去後、ローマ法

置しようとする動きがあった。徳島は王庁より「聖セブルクロ勲一等大十字

海を隔てて京阪神に隣接しているにも章」が伝達された。これらは主としてかかわらず産業が不振だったことを背

第一次世界大戦におけるドイツ化学会

景としている。長井は製薬産業に貢献への人道的支援活動に対する感謝によできる人材を養成するという目標を掲るものである。

和光純薬時報長井長義先生の巻 第 133 回～第 215 回」（日薬新聞）（1955）．

クリエイティブ）（2008）．

年
昭和 2 年、83 歳の長井は老躯を駆っ大正年間の学制改革の中で、四国で（1943）．
２）根本曽代子：「草楽太平記

４）の原博武：「この人長井長義」（ヒューマン・

それらを発表した論文数の少なさは、学校創設と人材育成

１）橋 爪檳榔子：「医科学の三巨人」（潮文閣）学会）（1960）．

求めた。

んだが、正確には楽しんだと言うべきであろう。長井の研究の量に比して、

写真 6．昭 和 2 年 10 月 17 日、長井はベルリンで講演を行い、ドイツ化学会からホフマン像を鋳したプラ
ケッテを贈られた。

Vol.86, No.3（2018）31

ジスルフィド結合形成試薬
Npys-OMe
SH 基を複数有する化合物と反応し、ジスルフィド結合形成により選択的な分子内環化反応が進行します。有機合成、
特に、ペプチド合成に効果的な試薬です。創薬研究にご検討下さい。

特長● SH 基を複数有する化合物と反応してジスルフィド結合を形成

O2N●選択的な分子内環化反応が可能

H3CO●空気酸化と比較して高濃度かつ迅速に反応●よう素酸化と比較して穏和な条件下で反応

S

N

C6H6N2O3S＝186.19
CAS RN® 68118-08-1

基本反応〈「Npys-OMe」
を用いた分子内環化の基本反応〉
O2N
SH
H

Cys

SH
Cys

H3CO

S

N

S

H

Cys

OH

S

OH
Cys

O2N
S

N
H

MeOH

反 応 例

コード No.
NEW

148-09791

品

名Npys-OMe【2（Methoxythio）-3-nitropyridine】

規格

ペプチド合成用

容

量

100mg

…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。
…特定毒物
…毒物
…劇物
…毒薬
…劇薬 危 …危険物
…向精神薬
…特定麻薬向精神薬原料特定…化審法 第一種特定化学物質…化審法 第二種特定化学物質…化学兵器禁止法 第一種指定物質…化学兵器禁止法 第二種指定物質
毒素等 …国民保護法
覚 …覚せい剤取締法
掲載内容は、2018 年 7 月時点での情報です。上記以外の法律及び最新情報は、siyaku.com（http://www.siyaku.com/）をご参照下さい。

希望納入価格（円）22,000…カルタヘナ法収載されている試薬は、試験・研究の目的にのみ使用されるものであり、「医薬品」、「食品」、「家庭用品」などとしては使用できません。
記載希望納入価格は本体価格であり消費税などが含まれておりません。

和光純薬時報 Vol. 86 No. 3
2018 年７月 15 日 発行
発行責任者
編集責任者
発 行 所

印

32

刷

所

糸 博之
鎌田裕子
富士フイルム和光純薬株式会社〒 540-8605 大阪市中央区道修町三丁目 1 番 2 号
TEL.06-6203-3741（代表）URL http://ffwk.fujifilm.co.jp/
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European Office（Neuss, Germany）：Tel +49 2131 311 0 / Fax +49 2131 311 100

Vol.86 No.3

本品は、東京薬科大学の林良雄教授の研究グループが開発したジスルフィド形成試薬です。