ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発

研究課題名

ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発

フリガナ

マツモト ケンジ

代表者名

松本 健治

所属機関 （機関名） 国立成育医療研究センター研究所 免疫アレルギー ・ 感染研究部（役職名） 部長氏 名 （フリガナ）

共同研究者

所属機関 ・ 役職名
役割分担
La Jolla Institute for Allergy and研究計画の川上敏明 ( カワカミトシアキ ) Immunology, University of California San
立案と解析
Diego, 教授

本財団からの助成について言及している論文
本助成金による発Kawakami T, Blank U. From IgE to Omalizumab. J Immunol. 2016 Dec
表論文， 学会発表
1;197(11):4187-4192.

研究結果要約
食物アレルギーは、 食物抗原を摂食後、 即時型アレルギー反応を起こすケースが多く、 時に生命の危険を来すアナフィラキシーがおこる。 食物アレルギーにはアレルゲンの除去および減感作以外には確立された治療法はなく、 本研究ではヒスタミン遊離因子 (HRF) の機能を抑制する治療法の開発を目指す。
HRF は、N 末端の 19 アミノ酸と H3 ドメインの 2 箇所で約 30% の IgE 抗体 （IgG 抗体とも） と直接結合でき、２量体として存在する HRF が IgE と結合した複数の IgE 受容体 FcεRI を会合させて、 マスト細胞を活性１）２）化できる 。 この機序により、 標準的なマウスの食物アレルギーモデル では、 HRF がアレルギー症状の誘発期 （感作期ではなく） に炎症増悪を起こすことが明らかになった。 この現象は腸管由来マスト細胞の抗原による試験管内活性化と HRF 阻害剤による抑制でも明らかになった。 さらに、 経口投与した HRF 阻害剤は特異的に小腸のマスト細胞に結合すること食物アレルギーを抑制すると判明した。 急速経口免疫療法を施行後１年後に鶏卵アレルギーを克服できた患児では、 血中 HRF 反応性 IgE が低下することも明らかにした。 同様の結果は２種のマウス免疫寛容モデルでも得られた。 以上の結果に基づいて、 ヒト患者に使用できる HRF 阻害剤候補 3 種のペプチドから最良の予防 ･ 治療効果を示すものを検討中である。

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ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発

研究目的

どれが最大の予防 ･ 治療効果を示すかをマウス

食物アレルギーは、 近年患者数が増え、 社モデルで検討する。 (II) 腸管での HRF の定常会問題になっている。 食物抗原を摂食後、 即状態における機能を解析する。 (III) マウスの食時型アレルギー反応を起こすケースが多く、 時物アレルギー誘発モデルと免疫寛容モデルをに生命の危険を来すアナフィラキシーがおこる。

用いて、 HRF と HRF 反応性抗体の変化を解析

経口免疫療法による免疫寛容の成功例が報告する。 HRF 阻害剤は FcεRI と複数の IgG 受容されつつあるが、 食物アレルギーには確立され体 （FcγRs） に よ る 活 性 化 を 抑 え る こ と か ら、た治療法はなく、 新規の治療法の開発は喫緊

FcεRI による活性化だけを抑える Omalizumabの研究課題である。 IgE 依存性の食物アレルギ（抗 IgE 抗体で食物アレルギーに効果あり） よりーには、 動物モデルの研究により、 IgE とその高い治療効果が期待でき、 かつ安価に製造で受容体 Fc ε RI を介したマスト細胞の活性化がきる。 ペプチド由来の HRF 阻害剤は、 アレル重要であることが知られている。 ヒスタミン遊離ゲンを含む可能性のある食品を摂取する前に服因子 （HRF） は、 N 末端の 19 アミノ酸と H3 ド用することで、 食物アレルギーを未然に防ぐ、 あメインの 2 箇所で約 30% の IgE 抗体 （IgG 抗体

るいは症状を軽減することが出来ると思われる。

とも） と直接結合でき、 ２量体として存在する

また、 少なくとも、 免疫療法施行時の抗原投与

HRF が IgE と結合した複数の Fc ε RI を会合さによるアナフィラキシーを防ぐことが期待できる。

せて、 マスト細胞を活性化できることが、 これま

また、 HRF 反応性 IgE 抗体価が免疫療法の治でに本申請者らによって明らかになった１）。 標療効果の客観的指標となる可能性がある。

準的なマウスの食物アレルギーモデルを用いて、 HRF は、 アレルギー症状の誘発期 （感作研究計画及び研究手法期ではなく） に炎症増悪作用があることが明ら

I. 食物アレルギー治療に最適な HRF 阻害剤かにした。 さらに、 経口投与した HRF 阻害剤の選択は特異的に小腸のマスト細胞に結合すること、

計画 ： 抗原 ovalbumin （OVA） で腹腔内 （ip）

HRF は腸管で細胞外マトリクスと同じような分布免疫したマウスに、 同じ抗原を複数回経口投与を示すことを明らかにした。 また、 急速経口免して下痢を発症させる。 HRF 阻害剤 （GST-N19

疫療法を施行後１年後に鶏卵アレルギーを克服

または HRF-2CA） を抗原投与の直前に投与すできなかった患児では、 血中 HRF 反応性 IgEると下痢の発症が抑えられることは、 10 回以上が増加すること （HRF 濃度や HRF 反応性 IgGの 実 験 で 確 か め ら れ て い る。 下 痢 発 症 後 には変わらない） も明らかにした。 以上の結果にHRF 阻害剤を投与した場合も、 下痢の発症頻基づいて、 本研究では、 (I) HRF-IgE 間の結合度と重症度を 70% 以上低下させられる。 ヒト患を抑える HRF 阻害剤を、 ヒト患者に使用するこ者に使用できる HRF 阻害剤として、 阻害効果とを最終目標として開発する。 候補として、 阻の強さから HRF の N 末端部分に由来する N19,

害効果の強い 3 種のペプチド由来阻害剤のうち

N25, N32 が考えられる。 これらのペプチドをそ− 32 −

ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発のまま、 または化学修飾 （N 末端のアセチル化

incubate してから SDS-PAGE で解析し、 HRFや PEG 化、 C 末端のアミド化） して安定性と可が抗体をタンパク質分解酵素から守る機能があ溶性を高めて検討する。 下痢症状を呈したマウるか調べる。 ④腸管内細菌と HRF を incubate

スに２回の抗原投与前に HRF 阻害剤を種々のしてから細菌の成長を調べる。

経路で投与し、 下記①～⑥を指標として阻害剤

実施内容 ： 共焦点蛍光顕微鏡により、 凍結しの治療効果とその機序を検討する。 ①下痢のた場合と通常のホルマリン固定を用いた場合で重症度 ・ 直腸温。 ②最終抗原暴露後に腸管組HRF の染まり方が大きく違うことが判明した。 凍織を染色。 炎症度は、 H&E 染色で、 マスト細結切片の場合の方が、 抗 HRF 抗体の特異性胞数は、 chloroacetate esterase 染色で測定。

が高く、 この方法により、 HRF は小腸上皮及び③血中 HRF 濃度 （western blot） および HRF

lamina propria に分布していることが明らかにな反応性抗体価（ELISA）を測定。 ④抗原暴露後、った。 また、 細胞外マトリクスには、 ① HRF 反リンパ節を回収し、 抗原で再刺激後、 各種のサ応性抗体を保持する機能はなく、 ② HRF がイトカイン産生を ELISA 法で測定。 ⑤ RNA-Seq

HRF 反応性 IgE を細胞表面にもつマスト細胞や法で腸管の網羅的な遺伝子発現解析。

好塩基球を遊走させる機能はなく、 ③ HRF が実施内容 ： GST-N19, GST-N25, GST-N32 の抗体をタンパク質分解酵素から守る機能はなく、経口投与のよる下痢発症の阻害効果に差がな④ HRF には細菌の成長に影響を与えないこと

いことから、 現在 N19 ペプチドをそのまま、 またがわかった。

は化学修飾してから、 その効果を GST-N19 や
HRF-2CA と比較している。 最終的な結果は、III. 経口免疫寛容モデルにおける HRF 反応性今年度の前半に出る予定である。

抗体の変化の解析
計画 ： Yamashita らの経口免疫寛容モデルを用II. 腸管での定常状態における HRF の機能解析

いる （Allergy, 2012）。 ip 免疫前に OVA を 3

計画 ： 共焦点蛍光顕微鏡により、 HRF は小腸日連続飲ませることで、 上記の食物アレルギーでコラーゲンなどの細胞外マトリクスと同じようなとほぼ同じ OVA 感作と OVA 摂食による下痢の分布を示すことが明らかになった。 可能性があ発症が抑えられる。 経口免疫寛容モデルにおる HRF の機能を以下のように調べる。 ①小腸ける HRF 反応性 IgE の変化が、 鶏卵アレルギの組織を抗 IgG、 抗 IgE、 抗 IgA 抗体で染めてー患児に対する急速免疫療法の効果と相似で共焦点蛍光顕微鏡で観察し、 HRF 反応性抗体あるならば、 HRF 反応性 IgE が低下するはずを保持する役割があるかを調べる。 ② HRF がである。 ip 免疫前に OVA を 3 日連続飲ませた

HRF 反応性 IgE を細胞表面にもつマスト細胞や場合と、 この免疫寛容の操作をしない場合の２好塩基球を遊走させるかを Transwell を用いてつのグループに OVA 感作と OVA 摂食をさせ、調べる。 ③ IgG, IgE, IgA を小腸内のタンパク質

それによって下痢の発症程度や、 他の炎症症

分 解 酵 素 と HRF 存 在 下 な い し 非 存 在 下 で状の変化、 とくに、 血中 HRF 反応性 IgE 抗体− 33 −

ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発価を測定する。

題がなく進捗していると言える。 さらに、 現在こ

実施内容 ： Yamashita らの経口免疫寛容モデれまでの重症度の評価法以上のきめ細かな評

ル３） と免疫療法を受けている患者の状態に近価法を導入しつつある。 この点は、 所期の結果いモデルを用いて、 免疫寛容をマウスに誘導し以上と言える。

た。 これらの操作によって、 両方のモデルにおいて HRF 反応性 IgE 抗体価が低下することが課題 II. 腸管での定常状態における HRF の機明らかとなった。 したがって、 この結果は、 急能解析。

速免疫療法を成功裏に実施した鶏卵アレルギ

凍結切片の場合の方が、 抗 HRF 抗体の特異ー患児と同様の結果である。

性がいいことが抗体を HRF タンパクで吸収する実験で判明した。 それによると、 HRF は小腸上予定外の成果 ： ①食物アレルギーを起こしたマ皮及び lamina propria に分布していることが明らウスから小腸粘膜の細胞群を取り出して、 試験かになった。 したがって、 ホルマリン固定を用管内で抗原刺激をすると、 そこに含まれるマストいた場合では、 非特異的な染色によって間違細胞が活性化されることを示すことができた。 こった結果を導くことを避けられたことは、 幸運だれは、 マウス小腸粘膜で起こっていることを再現ったと言わなければならない。 現在、 この結果できたと解釈される。 さらに、 この試験管内のマを基にして、 各種の細胞の HRF 産性能を検討

スト細胞活性化は HRF 阻害剤で抑制される。 こしている。の現象も、 HRF 阻害剤をマウスに経口投与して起こる現象を反映しているものと思われる。 ②上課題 III. 経口免疫寛容モデルにおける HRF 反述の免疫療法を受けている患者の状態に近い応性抗体の変化の解析。

モデルとは、 最初にマウスに食物アレルギーを２種の経口免疫寛容モデルにおいて、 HRF起こし、 その後、 OVA を 3 日連続飲ませて免反応性 IgE 抗体価が低下した。 これは、 急速疫寛容を導入したものである。 その際に HRF免疫療法を成功裏に実施した鶏卵アレルギー反応性 IgE 抗体価が低下することから、 鶏卵ア患児と同様の結果であり、 HRF 反応性 IgE 抗レルギー患者に急速免疫療法を成功させた場

体価が免疫療法の成否の客観的な指標となるこ合に相似している。とを示している。

結果と考察

残された課題 ： 課題 I の早期の終了と各種の課題 I. 食物アレルギー治療に最適な HRF 阻細胞の HRF 産性能を検討することが現在の喫害剤の選択。

緊の問題である。

GST-N19, GST-N25, GST-N32 の解析と論文

学会や論文発表等 ： 主論文は、 ２月以内に投作成のための実験に予想よりすこし時間がかか稿予定である。

った。 しかし、 ほぼ半年遅れながら、 大きな問

Kawakami, T. and Blank, U. From IgE to− 34 −

ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発

omalizumab. J. Immunol. 197:4187-4192,

今後の研究活動について

2016.

HRF が食物アレルギーの増悪に寄与していることは、 疑う余地がないほどデータが蓄積してきた。 また、 HRF 阻害剤がヒトに応用できる可能以下の学会で発表済みないし発表予定である。
stSymposium of the Collegium

性はまだ直接の証拠がないものの大分高まったInternationale Allergologicum, April 3-8,と 思 わ れ る。 今 後、 現 在 の 候 補 か ら 最 適 な2016, Charleston, South Carolina, USA.

HRF 阻害剤を決定して、 なるべく早く臨床試験

02 N
 IAID Workshop entitled “IgE Regulation inに進むことを第一に考えている。 しかし、 さらにAllergic Diseases” , April 19-20, 2016,

薬物製剤法の改良 （たとえばコートする） や抗Rockville, MD, USA.

体の開発などの第二世代の HRF 阻害剤の開発

01 T he 31

03 T he 65th Annual Meeting of Japaneseにも注力したい。

Society of Allergology, Special Lecture, June
参考文献

17-19, 2016, Tokyo, Japan.
04 FOCiS (Federation of Clinical Immunology1) K ashiwakura J, Ando T, Matsumoto K,Societies) 2016, June 22-25, 2016, Boston,Kimura M, Kitaura J, Matho MH, Zajonc DM,MA, USA.

Ozeki T, Ra C, Macdonald SM, Siraganian

05 F ASEB Conference entitled “IgE andRP, Broide DH, Kawakami Y, Kawakami T.

Allergy, 50 Years & Onward” ,Histamine-releasing factor has aCo-Organizer and Speaker, July 24-29,

proinflammatory role in mouse models of2016, West Palm Beach, FL, USA.

asthma and allergy. J. Clin. Invest. 201206 2 016 Sylvia & Thomas Bodamer Symposia inJan;122(1):218-228.

Allergy & Immunology, August 30, 2016, San2) B randt EB, Strait RT, Hershko D, Wang Q,Diego, CA, USA.

Muntel EE, Scribner TA, Zimmermann N,

07 The 45th Annual Meeting of the Japanese

Finkelman FD, Rothenberg ME. Mast cells

Society for Immunology, December 5-7,

are required for experimental oral allergen-2016, Okinawa, Japan.

induced diarrhea. J. Clin. Invest. 2003

08 B iomarker Summit 2017, March 20-22,Dec;112(1):1666-1677.

2017, San Diego, CA, USA.

3) Y amashita H, Takahashi K, Tanaka H, Nagai

09 T he 8th EMBRN International Mast Cell andH, Inagaki N. Overcoming food allergy

Basophil Meeting, May 25-27, 2017, Prague,through acquired tolerance conferred byCzech Republic.

transfer of Tregs in a murine model. Allergy

10 J ohns Hopkins University Symposium,2012 Feb; 67(2):201-209.

November 17, 2017, Baltimore, MD, USA− 35 −