博 士（ 地球 環 境科 学） 安 田俊 平

学位論文題名MolecularPhylogeogr
aphyoftheJ
apaneseDor
mouse，
Gli
7'ztlusjap07zicus（ ニ ホ ン ヤマ ネ の 分子 系 統 地理 ）学位論文内容の要旨
ニホンヤマネ(
Glirulusjaponicus)
は属として日本固有であり、日本列島の生物相の固有性 ・多様性を代表する種である。本州・四国・九州・隠岐島後の4島に棲息し、冬眠
お よび日 内休眠を 行なう ことで知 られて いる。1975
年 に国の 天然記念 物に指 定され、また、日本の哺乳類のレッドリストでは危急種に指定されており、保全の対象でもある。
ここ20年 余りの研 究から 、毛色・ 頭骨形態・染色体・遺伝子などに地理的な変異が存在することが確認されてきたが、系統地理学的な観点からの十分な研究が未だなされておらず、EvolutionarilySignificantUnit(ESU)のように、遺伝的特性を重視した保全学的単位の樹立も緊急の課題となっている。そこで、本研究では、ミトコンドリアのcytochromeろ
遺 伝子 、 Y染色 体 の S
RY遺 伝子 、 常染色 体のりボ ソームRNA (rDNA）遺 伝子を 用いて系統地理学的解析を行なうとともに、マイクロサテライトマーカーを今回新たに本種において開発し、遺伝的構造の解明をめざした。さらにこれらの遺伝的分化の指標に基づぃた保全単位の樹立も試みた。最後に、マイクロサテライトマーカーを用い、行動学的観点からの調査も行なった。
ニ ホ ン ヤマ ネ の 試料 を 分 布域 か ら 広く 収 集 し、 48地 点63
個 体につい て母系 遺伝をするミトコンドリアDNAの塩基配列の解析を行なった。その結果、日本列島には東北（I）・関東（II）．岐阜十和歌山（m）．山陰（IV）・四国（V）．九州十西中国（VI）・石川県白山（VII）．静 岡県静 岡市北部 （VI）の地域に8つの系統が存在することが確認された。
こ の中 で 、 系統 VIIと系統V
mは 1個体 の み であ る が 、 他の 系統 は複数個 体から 成立しており、それぞれ分布域が重ならない地域特異性を示した。また、分岐年代を推定した結果 、 系 統 VIが 約 500万 年 前 に 分 岐 し 、残 り の 多く の 系 統 は約 340
万 年 前 に分 岐 し たも のと推 定された 。ただ し、系統 IIと系統 V
IHの分 岐は、 約130万 年前と推 定され た。
この結果はニホンヤマネの遺伝的構造の構築は第三紀後期に遡ることを示唆し、これは他の日本産哺乳類の中でも際立った特性であると思われた。特に東北集団のこの長い歴史性は、これまでの他の生物の研究では確認されておらず、ニホンヤマネの氷期待避所が第四紀を通して東北地方に存在した可能性が示唆する証拠が示され意義深いものであった。次に 、父 系 遺 伝を す る Y
染 色 体 の賦 y
遺伝 子の塩 基配列の 変異に ついて、 メス1匹の試 料
し かない 系統VI
Iを除き 解析を行 なった 。その結 果、系統 mと 系統VIで同 一のタ イプが発見されたこと以外は、ミトコンドリアの結果を支持する結果となり、地域集団に固有の系統の存在が改めて示された。したがって、メスだけでなく、メスより行動圏の広いオスの地域 集団間の移動も妨げられている可能性が示唆された。しかし、鍛yの進化速度が推定できないため、この結果の解釈には慎重になる必要がある。また、分断化の要因については、山脈の影響があると考えられる場所を除いて不明であり、今後の調査が必要である。
― 1309 ‑核rDNA
遺 伝 子 制限 酵 素 断片 長 多 型 はDNA試料 の 十 分な 系 統I〜V
Iについ て解析を 行なった。そ の結果 、分布域 の両端 である系 統Iと 系統VIを 代表する個体で高い遺伝的独自性が確 認され た。一方 、地理的 に近い 場所に位 置する 系統m．系統IV．系統Vを代表 する個体の間では独自の変異がほとんど確認されず、本マーカーの解像カの弱さが要因かあるい は 実際 に 遺伝 的 な分 化 が進 ん でいな ぃのかは判 別がっかな かった。
集団遺伝 学的解 析を進め るため に、本種においてマイクロサテライトマーカーの開発を行 っ た 。ス ク リ ーニ ン グ の結 果、GTタン デムリ ピートを 含む配列 を108配列入手 できた。さ らに、 30のクロー ンにつ いて塩基 配列の 解析を行 なった結果、6つのマイクロサテライ ト座位 を解析用 のマー カーとして樹立するに至った。この6つの座位を用い、38地点 から集 められた 46個体に ついての 解析を行 なった 結果、上記のミトコンドリア系統の系統 I
I．系統 III間と 系統IV． 系統VI間で 遺伝的 交流が断たれていることが確認された。両境界線とも、他の哺乳類でも確認される事があり、前者においては日本アルプスが地理的障壁となり分断の原因となったと考えられるが、後者については要因ははっきり分かって いない 。ここま での研 究から、 ESUの基 準を厳 密に満たすのは九州十西中国集団のみと言うことになるが、ミトコンドリア系統の古さから考えて、現状ではそれぞれのミト コ ンド リ ア 系統 を 最 小の 保 全単 位 と する の が妥 当 で ある と 考えられた 。
さらに、 個体問 関係を調 査する ため、ハヶ岳の麓にある山梨県北杜市清里の森（標高約 140 0m)に て 捕 獲 さ れ た 45個 体 か ら DNAを 抽 出 し 、 マ イ ク ロ サ テ ラ イ ト と 母 系遺伝する ミトコンドリアのcontrolregionを解析した。その際、DNAは、個体識別用に切った耳サ ンプルを用いて抽出した。その結果、2家族（母子）の調査の結果、それぞれの家族の子供は全て父親を共有していることが判明した。飼育下の観察事例によると、メスは繁殖期 に1晩のうちに複数のオスと交尾をする事例が確認されているが、今回の調査結果はその事例に反するものであった。サンプル数が少なく、今後調査を続ける必要があるが、ニホンヤマネでは過去に交尾栓が発見されており、その交尾栓が有効に機能している可能性もある。
また、ニ ホンヤ マネは、 複数個 体が寄り集まって日内休眠や冬眠を行なう事例がいくっか確認されているが、今回、日内休眠時に巣箱を共有していた個体間の関係も調査した。
巣箱を共 有して いた5グループ のうち、1グループは兄弟であった。しかし、明確な血縁関係が確認できないグループも複数存在し、性成熟した血縁関係のないオス同士が巣箱を共有している事例も確認された。これは、ニホンヤマネの他個体への寛容さを示す事例であると同時に、生誕地からの拡散についても今後なんらかの示唆を与えるものであると考えられる。これにより、これまで多くの謎に包まれていたニホンヤマネの繁殖行動の解明にむけた研究の端緒が開かれ、ニホンヤマネに対して、遺伝学的および生態学的視点も加え統 合的 な保全に関 する枠組 みづくり の研究が 展開され るものと 期待される 。

ー 1310―学位論文審査の要旨
主査

助教授

鈴木仁

副査教授

木村 正人

副査教授

東正剛

学位論文題名MolecularPhylogeogra
phyoftheJapaneseDormouse，Glirulusjap07zicus（ニホンヤマネの分子系統地理）
ニホ ンヤ マネ (Glirulus japonicus)は属レベルで日本固有であり、日本列島の生物相の固 有性 ・多 様性 を代 表す る種 である 。本 州・ 四国 ・九 州・隠岐島後の4島に棲息し、冬眠
お よ び 日 内 休 眠 を 行 う こ と で 知 ら れ て い る 。1975年 に 国 の天 然記念 物に 指定 され 、また 、日 本の 哺乳 類の レッ ドリストでは準絶滅危惧種に指定されて韜り、保全の対象でもある 。こ こ20年余 りの 研究 から 、毛色 ・頭 骨形 態・ 染色 体・ 遺伝 子な どに 地理 的な 変異が存 在す るこ とが 確認 され てきたが、系統地理学的な観点からの十分な研究が未だなされておらず、Evolutionarily Significant Unit (ESU)のような、遺伝的特性を重視した保全学的単位の樹立も緊急の課題となっている。そこで、本研究では、ミトコンドリアのcytochrome
6遺 伝 子 、 Y染 色 体 の SRY.常 染 色 体 の り ボ ソ ー ム RNA遺 伝 子 (rDNA)を 用 い て 系 統 地
理 学的 解析 を行 なう とと もに、マイクロサテライトマーカーを今回新たに本種において開発 し、 遺伝 的構 造の 解明 と保全単位の樹立を試みた。また、マイクロサテライトマーカーを用い、行動学的観点からの調査も行なった。
第 1章 で は 、 ニホ ン ヤ マ ネ の 試 料 を 分 布 域 か ら 広 く 収 集 し 、 48地 点 63個体 に つ い て
母 系 遺 伝 を す る ミ ト コ ン ド リ ア DNAの cytochrome6遺 伝 子 の塩 基配列 解析 を行 った 。その 結果 、日 本列 島に は東 北（ I）・ 関東 (II)・岐 阜十 和歌山（m）・山陰(IV)．四国(V)．
九 州 十 西 中 国 (VI)． 石 川 県 白 山 (VII)． 静 岡 県 静 岡 市 北 部 (vIn)の 地 域 に 8っ の 系 統が 存 在 す る こ と が 確 認 さ れた 。こ の中で 、系 統vnと系 統VIIIは 1個体 のみ であ るが 、他の 系統 は複 数個 体か ら成 立しており、それぞれ分布域が重ならない地域特異性を示した。
ま た 、 分 岐 年 代 を 推 定 し た 結 果 、 系 統 VIが 約500万 年 前 に 分 岐 し 、 残 り の多 く の 系 統
は 約 340万 年 前 に 分 岐 し た も の と 推 定 さ れ た 。 た だ し 、 系 統 IIと 系 統 vniの 分 岐 は 、
約 130万 年 前 と 推定 さ れ た 。こ の結 果は 、ニ ホン ヤマ ネの 遺伝 的構造 の構 築が 第三 紀後期 に遡 るこ とを 示唆 した 。特に東北集団のこの長い歴史性は、ニホンヤマネの氷期の待避所 が第 四紀 を通 して 東北 地方に存在したことを示唆する意義深いものであった。父系遺伝

を す る Y染 色 体 の SRYの 塩基 配 列も cytochromeろ遺 伝 子と ほ ば 同様 の 結果 を 示 した 。 また 、分断化 の要因にっいては、山脈の影響があると考えられる場所を除いて不明であった。
核 rDNAス ペ ー サ ー 領 域 の制 限 酵素 断 片 長多 型 はDNA試 料 の十 分 な系 統 I‑‑‑VIにつ い て
解 析 を 行な っ た。 そ の 結果 、 分 布域 の 両端 で あ る系 統 Iと 系統 VIを代 表 する個 体で高い
遺 伝 的 独自 性 が確認 された。 一方、地 理的に近 い場所に 位置する 系統III．系統 IV・系統
Vを代 表 す る個 体の間 では独自 の変異が あまり確 認されな かったが 、本マーカ ーの解像 カの 弱さによ るのか、 実際に遺 伝的な分 化が進んで いないた めである のかは判別がっかなかっ た。
第 2章 では 、 集団遺伝 学的解析 を進める ために、 本種にお いてマイ クロサテラ イトマー
カ ー の 開発 を 行った 。その結 果、6っの マイクロ サテライ ト座位を 解析用のマ ーカーと して 樹 立 す る に 至 り 、 さ ら に 、 こ の 6っ の 座 位 を 用 い38地 点か ら 集め ら れ た46個 体に つい て の 解析 を 行っ た 結 果、 上 記 の系 統 IVと それ以 外のグル ープの間 で遺伝的分 化が進んで いること が確認さ れた。こ の分化は 、歴史的な 分断化の 結果であ ると考えられるので、ESUの 定 義で あ る「ミト コンドリ アの単系 統性」と 「核の遺 伝子交流 の制限」を 満たすと考 え ら れる 。 ただ し 、 ミト コ ン ドリ ア 系統 の 古 さや 、 他の 核 DNAマー カ ーの結 果から考え て、現状 ではそれ ぞれのミ トコンド リア系統を 最小の保 全単位と するのが妥当であると考 えられた 。
第 3章 では 、 さらに、 今回開発 したマイ クロサテ ライトを 用いて生 態学的研究 への応用を 試 み た。 手 始めに 2家族（母 子）の血 縁関係を 調査した ところ、 それぞれの 家族の子 供は 全て父親 を共有し ているこ とが判明 するなど、 生態学的 情報を得 るとともに、用いたマイ クロサテ ライトマ ーカーの 有効性が 確認された 。さらに 、ニホン ヤマネは、日内休眠や冬 眠の際の 同巣個体 の血縁度 にっいて 解析を試み たところ 、血縁性 とは関係なく個体が集合 すること が確認さ れた。こ れは、ニ ホンヤマネ の他個体 への寛容 さと個体拡散に関する有 益情報を 与えるも のと考え られた。
審 査委員一 同は、こ れらの成 果を高く 評価し、ま た研究者 として誠 実かつ熱心であり、大 学院博士 課程にお ける研鑽 や習得単 位などもあ わせ、申 請者は、 博士（地球環境科学）の 学位を受 けるのに 充分な資 格を有す るものと判 定された 。