博 士（ 水産 科学 ）福田覚

学位 論文 題 名
海 産 紅 藻 ス サ ビ ノ り の Elonga
tion factor・ 1ぱ 遺 伝 子 の構造解析とその遺伝子導入における発 現ベ クタ ーと して の応用
学 位論文内容の要旨

アマノリ属は海産の多細胞藻類であるアサクサノリ，スサビノりなどの産業的に重要ないくっかの種を合んでいる．スサピノりの示す諸現象を分子遺伝学的に探求するために形質転換は必須の技術である．しかしながら，スサピノりでは安定した形質転換系が確立していないため，夕グラインやノックアウトを利用した分子遺伝学的研究の報告例はない．本研究では，既存の陸上植物用ベクターを利用することによってバーテイクルガンによる遺伝子導入の基礎的知見を得た．次に発現ベクターの開発のため，スサビノりの配偶体と胞子体の両世代で構成的に発現しているE
longation factor‑la(EF―1ぱ）遺伝子 のcDNAの 塩基 配列 をク ロー ニン グ， 決定 し，mRNAの発現を明らかにした．この情報を 基に EFー la遺 伝子 の上 流領 域を 含む ゲノ ムDNA配列 をク ロー ニン グし ，その構造をcDNA配 列と 比較 し， RT― PCRに よる mRNAの発 現を 明ら かに した ．配 列決 定した上流
領域 を含 むゲ ノム DNA配列を利用し，構築した発現ベクターをバーテイクルガンでスサピノリTU―1株に導入し，一過性発現が見られる細胞数から，一過性発現効率を求めた．
これらの結果について以下に述べる・
陸 上植 物用 pBI221ベ クタ ーを バー テイ クル ガンによってタマネギの表皮細胞とスサピノ リTU−1株ヘ 導入 し， p−glucuronidase遺 伝子の一過性発現におけるGUS活性を組織 化 学 的 ア ッ セ イ に よ る 手 法で 検 出 し た ． 夕 マ ネ ギ の 表 皮 細 胞 の 一 過 性 発 現 効 率〔2．5（土1．1）x10ー4％〕を1とし，スサピノリTU−1株への一過性発現効率を相対的に比較 した ．そ の結 果，一過性発現効率はパーティクルガンの発射口と試料との距離が8cmの 条件 で約 5． 5x10‑3倍 であり ，発 射口 と試 料との距離が9 cmの条件で約1．1x10‑2倍であった・
葉 状の 配偶 体に 由来するcDNAライブラリーからEF−1ぱ遺伝子の候補を単離し，その構造 と発 現を 明ら かにした．塩基配列を決定したcDNAの全長は1，347 bpであり，その配列 中に 推定 449個のアミノ酸に翻訳される読み取り枠が見っかった．インターネット

上 のデ ー タベ ー ス を利 用 した 相 同 性検 索 や モチ ー フ検 索 を 行っ た 結果 ， 他 の生 物 のEF―1ぱ遺伝 子と相同 の領域であることを確認した．ノーザンハイプリダイゼーションにより，本 遺伝子の 発現は葉状 の配偶体 と糸状の 胞子体の両世代で認められ，発生段階によって発 現量の顕 著な変動は 見られな かった．
葉 状 の配 偶 体に 由 来 する ゲノムラ イブラリ ーからEF− la遺伝子の 上流配列 を含むゲノム DNAのク 口 ー ンの 候 補 を単離し， その構造 と発現を 明らかに した．ESTク 口ーンの情報 か ら塩 基 配 列を 決 定 したcDNAの全 長は1，347bpで あり，そ の配列中 に推定449個のアミノ 酸に翻訳 される読み 取り枠が 見っかっ た．ゲノ ムDNAのクロ ーン中に は約1．3kbpの 上 流配 列 が 見っ か っ た． ま た， 本 遺 伝子 は 5 非翻 訳領域 に1個のイ ント口ン を持つこと が明らか となった． インター ネヅト上 のデータベースを利用した相同性検索やモチーフ 検索を行 った結果， 他の生物 のEF−la遺伝 子と相同の領域であることが分かった．RT−PCRに より，本 遺伝子の発 現は葉状 の配偶体 と糸状の 胞子体の 両世代で 認められた．
イントロ ンを含む 約1．3kbpのEF―1ぱ 遺伝子の 上流配列 を利用し てスサビ ノリ用にプロモ一 夕ー領域 を改変した 発現ベク ター，p47GUSと p47GUS−ILを構築 した．こ の2つのべクタ ーをバー テイクルガンによってスサビノリTU−1株ヘ導入し，pーglucuronidase
遺伝 子 の一 過 性 発現 に お けるp−glucuronidaseの 活性を組 織化学的 アヅセイ による手法で検出 した．． pBI221をタマネギの表皮細胞に導入した時の一過性発現効率を1とし，p47GUSをスサピ ノリTU―1株 に導入した 場合の一 過性発現 効率を算 出した結 果，バーテイクルガ ンの発射 口と試料と の距離が 7cmの条件で 約5．5X10‑3倍， 発射口と 試料との距離が8cmの 条件で約 1．7x10・2倍，発 射口と試 料との距離が9cmの条件で約3．3x10‑2倍であっ た．p47GUS−ILに ついては， 発射口と 試料との距離が8cmの条件で約5．5x10‑3倍 で あ り ， 発 射 口 と 試 料 と の 距 離 が 9 cmの 条 件 で 約 5． 5xl0‑3倍 で あ っ た ．
以上の結 果から， p47GUSをスサピノ リTU―1株に 導入した 場合，発 射口と試 料間の距離が9cmの条 件での一 過性発現率 は，pBI221を同 じ距離で 導入した 時の3倍で あった・
また，p47GUS― ILを試料と の距離を9cmと して一過 性発現を 行った時 の効率は ，pBI221を同じ距 離で試料 に遺伝子を 導入した 時の1/2倍で あった． これらの 結果から ，p47GU
Sに用 い られ た イ ン卜 ロ ン を含む約 1.3kbpのEF−1ぱ遺 伝子の上 流配列は ，陸上植 物で開発 さ れた 発 現 ベク タ ー pBI221よりもプ ロモータ ー部分と して機能 している ことが示唆された ．

学 位論文審査の要旨
主査教
授嵯峨直恆
授荒井克俊
副査教
教授都靖
副査教
木彰
授安副査助
井肇

学位論文題名海産紅藻スサビノりのE
longationfactor‑lぱ遺伝子の構造 解析とその遺伝子導入における発現 ベク夕，としての応用アマノリ属は海産の多細胞藻類であるアサクサノリ，スサピノりなどの産業的に重要ないくっかの種を含んでいる．スサピノりの示す諸現象を分子遺伝学的に探求するために形質転換は必須の技術である．しかしながら，スサピノりでは安定した形質転換系が確立していないため，夕グラインやノックアウトを利用した分子遺伝学的研究の報告例はない，
本 論文は，6つの章より構成され，第1章では，全体における緒言を示し，第2章において，既存の陸上植物用ベクターを利用したバーテイクルガンによる遺伝子導入法の基礎的知見を得るとともに，発現ベクター開発の重要性について論じた．第3章では，EF―1ぱ 遺伝子の クロー ニング法 を示し，得られたcDN
Aの構造とmR
N
Aの発現の特徴について論 じた．第4章では，EF−1ぱ遺伝子のプロモーター領域を含むゲノムDNA配列のクローニ ング法を示し，cD
N
A配列との構造比較とR
T−PCRによるmRNA発現の特徴について論じた ．第5章では ，第4章で決定 したプ ロモ一夕 ー領域 を含むゲ丿ムDN
A配列を利用した
発 現ベク夕一の開発を行い，それらを用いた遺伝子導入を試みた．第6章では，研究の総括を行い，形質転換系の確立における今後の課題ならぴに研究方針について論じた・
第2章において，陸上植物用pB
1221
ベクターをバーテイクルガンによってタマネギの表皮細胞とスサピノリTU―1株ヘ導入し，p−glucuronidase
遺伝子の一過性発現におけるGUS活性を組織化学的アッセイによる手法で検出した．夕マネギの表皮細胞の一過性発現効率〔2．5（士1．1）x
10・4％〕を1とし，スサピノリTU−1株への一過性発現効率を相対的に比較した．その結果，一過性発現効率はバーテイクルガンの発射口と試料との距離が8cmの条 件で約 5．5x10・3倍 であり， 発射口 と試料と の距離が9cmの条件で約1．1x10，2倍であった．
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第3章 に おい て ， 葉状 の 配 偶体に由 来するcDN
Aライプラ リーか らE
F−la
遺伝 子の候補 を単離 し，その 構造と発 現を明 らかにし た．塩 基配列を 決定し たc
DN
Aの全長 は1，644bpであ り，その 配列中 に推定449個の アミノ酸 に翻訳さ れる読 み取り枠 が見っか った． インター ネット上 のデータベースを利用した相同性検索やモチーフ検索を行っ た結果 ，他の生 物のEF−la遺伝子と 相同の 領域であ ることを 確認し た．丿ー ザンハ イプリ ダイゼー ションに より，本遺伝子の発現は葉状の配偶体と糸状の胞子体の両 世 代 で 認 め ら れ ， 発 生 段 階 に よ って 発 現 畳の 顕 著 な変 動 は 見ら れ な かっ た ．
第4章 に おい て ， 葉状 の 配 偶体に由 来するゲ ノムラ イブラリ ーから E
F−la遺伝子の上 流配列 を含むゲ ノムDN
Aのクロ ーンの候 補を単 離し，その構造と発現を明らかにし た ．ゲ ノ ム D
NAの クロ ー ン 中 には 約 1．3kbpの 上 流 配列が 見っか った．ま た，本遺伝 子は5 非翻 訳領域に 1個 のイント ロンを持 つこと が明らか となっ た．イン ター
ネッ ト上の データベ ースを利 用した相同性検索やモチーフ検索を行った結果，他の生物の E
F−la
遺伝 子と相同 の領域 であるこ とが分 かった． RT−PCRにより，本遺伝子の発現 は葉状 の配偶体 と糸状の 胞子体 の両世代 で認め られた，第5章 に おい て ， イン ト ロ ンを含む 約1． 3kbpのEF−la遺伝 子の上流 配列を利 用
して スサビ ノリ用に プロモー ター領域を改変した発現ベクター，p47
GUSとp47GUS−ILを構 築した ．この2つのべ クター をバーテ イクル ガンによ ってスサピ丿1JTU−1株ヘ導入 し，p―glucuronidase遺伝子 の一過性 発現に おけるp−glucuronid
aseの活 性を組織 化学的 アヅセイ による手 法で検 出した． この結 果から， p47
GU
Sに用い られたイント ロンを 合む約1．3kbpのEFー1a
遺 伝子の 上流配列 は，陸上 植物で 開発され た発現ベ クター pBI221よりもプ ロモー ター部分 として 機能して いるこ とが示唆 された．
主 論文 は 平 成15年 1
月 29日 16時 か ら17時 まで 第 二 研究 棟 特 別講 義 室 にお い て ，審 査 員お よ ぴ 関連 教 官 9
名 お よぴ一 般聴講20
名 出席の もと発表 された ．一般聴 講におい ては， 目的の遺 伝子を含 むゲノ ムクロー ンの取 得方法，5 非翻訳領域に含まれるイ ントロ ンの特徴 ，金属粒 子のサイズと導入する強さとの関係について質疑・応答がな された ．また， 審査員お よぴ関連教官においては，スサピ丿りにおける形質転換系の 確立後 の展望， 発現ベク ターのターゲットとする細胞ステージや細胞内における発現 部分に ついて質 疑・応答 がなされた．本論文で開発したスサビノリ固有の遺伝子の上 流配列 を利用し た発現ベ クターは，大型藻類の形質転換の研究に貢献すると判断し ， 博 士 （ 水 産 科 学 ） の 学 位 を 授 与 さ れ る 資 格 の あ るも の と 判定 し た．

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