June 2014

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

67―3

167（ 21 ）臨床分離薬剤耐性緑膿菌に対する抗菌薬 in vitro 併用効果
〜colistin, arbekacin, aztreonam, rifampicin, piperacillin の2 剤組合せを用いた比較検討〜
長岡里枝 1）・猪川和朗 2）・小野寺 一 1）・木場由美子 1）・原 稔典 1）・
城市由美子 1）・横崎典哉 3）・大毛宏喜 4）・森川則文 2）
1）

広島大学病院診療支援部

2）

広島大学大学院医歯薬保健学研究院
3）

広島大学病院検査部

4）

広島大学病院感染症科（2014 年 3 月 6 日受付）

本研究では，薬剤耐性緑膿菌（multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: MDRP）に対する抗菌薬の in vitro 併用効果を検討した。広島大学病院において臨床検体から分離された緑膿菌で MDRP の基準に該当した株，すなわち抗菌薬の minimum inhibitory

concentration（MIC）が meropenem≧16 ȝJP/FLSURÀR[DFLQ≧4 ȝg/mL, amikacin≧32 ȝg/mL のすべてを満たした 40 株を対象とした。
次の 8 通りの抗菌薬組合せについて，独自のチェッカーボードプレートを作成し，＋arbekacin（ABK）, CL＋aztreonam
それぞれの併用効果について検討した：colistin（CL）（AZT）, CL＋rifampicin（RFP）, RFP＋ABK, RFP＋AZT, ABK＋AZT, piperacillin（PIPC）＋ABK, PIPC＋AZT。算出した IUDFWLRQDOLQKLELWRU\FRQFHQWUDWLRQLQGH[ により併用効果（相乗作用，相加作用，不関，拮抗作用）を判定した。最も大きな併用効果が認めら，ii）RFP＋ABK（相れたのは，i）CL＋RFP（相乗作用：80.0%，相加作用：17.5%），iii）RFP＋AZT（相乗作用：5.0%，相加作用：乗作用：7.5%，相加作用：70.0%）

77.5%）であった。これらの組合せにおける各抗菌薬の算術平均 MIC 値はそれぞれ，i） CL （単 剤：1.38 ȝg/mL，併 用：0.26 ȝg/mL）， RFP （単 剤：19.85 ȝg/mL，併 用：1.85 ȝg/mL），ii）RFP（単剤：19.85 ȝg/mL，併用：7.53 ȝg/mL），ABK（単剤：8.87 ȝg/mL，併用：2.79 ȝg/mL），iii）RFP（単剤：19.85 ȝg/mL，併用：10.15 ȝg/mL），AZT（単剤：28.3 ȝg/mL，併用：6.65 ȝg/mL），と有意に低下した。対象 40 株のうち，メタロ-ȕ-ラクタマーゼ産生は 20 株，アミノグリコシド 6ƍ ȃ  アセチル基転移酵素検出は

37 株にそれぞれ認められたが，これらの耐性因子が i〜iii）の併用効果に及ぼす有意な影響は認められなかった。
以上の結果より，MDRP に対しては，RFP に CL, ABK または AZT を併用投与することの有用性が in vitro において示された。ただし今後も，他の組合せについて invitro 併用効果データを集積し比較検討することが重要と考えられた。

168（ 22 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

67―3June 2014

薬剤耐性緑膿菌（multidrug-resistant Pseudomonas

材料と方法

aeruginosa：MDRP）は，感染症法上，広域 ȕ-ラクタム系，アミノ配糖体系，フルオロキノロン系の 3 系統の薬剤に対して耐性を示す緑膿菌であ

1. 対象

り，検査室での判断基準は，MIC 値が imipenem≧

2004 年から 2010 年までに，広島大学病院で臨床16 ȝJP/FLSURÀR[DFLQ≧4 ȝg/mL, amikacin≧32 ȝg/

検体から分離された緑膿菌のうち，薬剤感受性試験mL のすべてを満たす場合とされる。Imipenem 以によって MDRP と判定された 40 株を対象とした。

外のカルバペネム系薬剤，FLSURÀR[DFLQ 以外のフルMDRP の判定は感染症法における MDRP の基準にオロキノロン系薬剤で耐性の結果が得られた場合従い，MIC が meropenem≧16 ȝJP/FLSURÀR[DFLQ≧にも MDRP の基準を満たすものとされる（http://4 ȝg/mL, amikacin≧32 ȝg/mL のすべてを満たす緑w w w. m h l w. g o . j p / b u n y a / k e n k o u / k e k k a k u -膿菌とした。なお，同一患者由来の菌株は初回分1）

kansenshou11/01-05-42-01.html） 。MDRP に よ る離株のみ採用し，表現型の特徴から判断して同じ感染症は五類感染症に指定され，届け出が必要で起源と考えられる菌株は除外した。

あり，重要な耐性菌の一つとなっている。健康成人で感染症を発症することは少ないが，免疫不全患者や重篤な基礎疾患を有する患者では，敗血症

2. 薬剤感受性試験
Colistin（ CL ），arbekacin（ ABK ），aztreonamなどの重症感染症を発症するおそれがあり，患者 （AZT），rifampicin（RFP），piperacillin（PIPC）のの予後を左右するため，適切な治療が求められ組合せについて独自の薬剤併用感受性チェッカーる。抗菌療法としては，現在日本で承認されていボードプレートを作成し，Clinical Laboratory andる抗菌薬では単剤投与で効果が期待できない場合

Standards Institute に準じた微量液体希釈法にてもあり，抗菌薬の併用効果が期待されている。

MIC を測定した6）。培養は 35°C，20 時間とし，接抗菌薬の併用効果の検査方法には，checkerboard種菌量は約 5×104 CFU で行った。検討した 8 通り法 2,3），spectrophotometer 法，殺菌曲線法，ディスクの組合せとその希釈系列は次のとおりであった。

拡散法，E-test 配置組換え法などがある。TATEDACL（0.25〜8 ȝg/mL）＋ABK（2〜32 ȝg/mL）， CL4）

ら が考案した break-point checkerboard（BC）法 （0.25〜8 ȝg/mL）＋AZT（2〜32 ȝg/mL），CL（0.25〜にもとづく BC プレート 栄研 は，1 枚のプレー8 ȝg/mL）＋RFP（1〜16 ȝg/mL）， RFP（1〜16 ȝg/トで複数の抗菌薬の組合せによる併用効果が判定mL）＋ABK（1〜4 ȝg/mL），RFP（1〜16 ȝg/mL）＋でき，スクリーニング法として有用であると報告

AZT （0.5〜16 ȝg/mL）， ABK （1〜4 ȝg/mL）＋AZTされている5）。

（1〜16 ȝg/mL），PIPC（1〜4 ȝg/mL）＋ABK（1〜4 ȝg/しかし，MDRP に対する抗菌薬の in vitro 併用mL），PIPC（1〜4 ȝg/mL）＋AZT（1〜16 ȝg/mL）。

効果は詳細に検討されていない。そこで本研究では，独自のチェッカーボードプレートを作成し， 3. 併用効果の判定

2 剤の組合せについて比較検討した。

測 定 し た MIC を 用 い て， fractional inhibitory

concentration（FIC）LQGH[ を算出し7），得られた),&LQGH[ の最小値を ),&LQGH[ として採用した。
≦0.5 を相乗作用，0.5＜〜≦1.0 を相加作用，1.0＜〜≦2 を不関，＞2 を拮抗作用とした。さらに，

June 2014

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

67―3169（ 23 ）相乗作用＋相加作用を「併用効果あり」と判定し用投与における MIC 値を Table 1 に示す。各抗菌た。

薬の併用投与における算術平均 MIC 値は，ほとん併用投与での MIC 併用投与での MIC),&LQGH[＝＋単剤投与での MIC 単剤投与での MIC

どの組合せで，単剤投与よりも有意に低下した。
特に，CL＋RFP で CL（単剤：1.38 ȝg/mL，併用：0.26 ȝg/mL）， RFP （単 剤：19.85 ȝg/mL，併 用：4. メタロ- ȕ - ラクタマーゼ産生および耐性遺伝

1.85 ȝg/mL），RFP＋ABK で RFP（単剤：19.85 ȝg/子の検出

mL，併 用：7.53 ȝg/mL）， ABK （単 剤：8.87 ȝg/メタロ- ȕ - ラクタマーゼ産生は，ディスク拡散法

mL，併用：2.79 ȝg/mL），RFP＋AZT では RFP（単（SMA，栄研化学株式会社）を用いたスクリーニン剤：19.85 ȝg/mL，併用：10.15 ȝg/mL），AZT（単グにより検出した。耐性因子に関しては，KITAO ら剤：28.3 ȝg/mL，併用：6.65 ȝg/mL）へと大きく低8）の方法 と同様に免疫イムノクロマト法により，ク下した。

イック チェイサー I ae・IMP-1（株式会社ミズ

しかし，PIPC 併用投与における ABK およびホメディー）を用いて，IMP 型メタロ -ȕ-ラクタ

AZT の 算 術 平 均 MIC 値，ABK 併 用 投 与 お よ び

マーゼ，アミノグリコシド 6ƍ ȃ  アセチル基転移酵

AZT 併用投与における PIPC の算術平均 MIC 値（6ƍ）-Iae）を検出した。blaVIM-2 遺伝子に素（AACは，低下傾向を示したものの有意ではなかった。

ついては，SHIBATA らの方法 と同様に polymerase9）

chain reaction 法を用いて検出した。

3. 各種抗菌薬の併用効果),&LQGH[ を指標とした併用効果を Table 2 に示

5. 統計処理す。最も大きい相乗作用＋相加作用が認められた

統計ソフトウェア 6WDW)OH[9HU（株式会社アーの は， CL＋RFP （80.0%＋17.5%）， RFP＋ABKテック）を用いて，有意差検定（Mann-Whitney） （7.5%＋70.0%）， RFP＋AZT （5.0%＋77.5%）のを行った。有意水準は 5% とした。

結果組合せであった。

4. メタロ- ȕ - ラクタマーゼ産生および耐性遺伝子の検出

1. MDRP が分離された患者の背景
対象菌株である 40 株のうち，性別（男性：女

対象 40 株のうちメタロ-ȕ-ラクタマーゼ産生株
は 20 株（50%）で，そのうち IMP 型は 17 株，blaVIM-2-Iae 検出は，40 株性）は 31 : 9，算術平均年齢は 66.0 歳（4〜81 歳） 保有は 3 株であった。AAC（6ƍ）
であった。入院・外来別では，入院では 38 株，外中 37 株（92.5%）に認められた。

来では 2 株であり，入院が 95.0% を占めた。臨床

Table 3 に示すとおり，メタロ-ȕ-ラクタマーゼ，便 7 株（17.5%），痰 6
材料は，尿 17 株（42.5%）

産生株とメタロ-ȕ-ラクタマーゼ非産生株で各抗株（15.0%），血液 3 株（7.5%），膿 2 株（5.0%），胆菌薬の MIC 値を比較した結果，両群間に有意な違，その他 3 株（7.5%）であった。
汁 2 株（5.0%）

いは認められなかった。ȕ-ラクタム系薬の AZT は
メタロ-ȕ-ラクタマーゼ産生株においても低い算

2. 薬剤耐性緑膿菌 40 株における各種抗菌薬の薬術平均 MIC 値を示し，併用効果が比較的高い傾向

剤感受性-Iae 検出の有無で，アにあった。また，AAC（6ƍ）

CL, ABK, AZT, RFP, PIPC の単剤投与および併

ミノ配糖体系薬剤 ABK をはじめ各抗菌薬の MIC

170（ 24 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

67―3

June 2014

Table 1. Minimum inhibitory concentration（MIC）values for combinations of colistin（CL）,arbekacin（ABK）, aztreonam（AZT）, rifampicin（RFP）and piperacillin（PIPC）against
multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates（n＝40）

値を比較した結果，両群間に有意な違いは認めら

内承認されておらず，既存の抗菌薬での治療に制れなかった。

限されている。単剤での治療は難しく，併用療法による治療が求められている。現在までに国内では，考察

MDRP に対する 2 剤の併用効果が in vitro2〜5,7,10,11）や臨床 12〜15）でも有用であると多く報告されてい

MDRP による感染症の治療法に関して，CL は国る。さらに耐性化が高度になってきている昨今，

June 2014

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

67―3171（ 25 ）Table 2. Effects of double antibacterial drugs based on fractional inhibitory concentration（FIC）values for combinations of colistin（CL）, arbekacin（ABK）, aztreonam（AZT）,rifampicin（ RFP ）and piperacillin（ PIPC ）against multidrug-resistant Pseudomonas
aeruginosa isolates（n＝40）

抗菌薬の併用療法は今まで以上に考慮すべき方法が認められており，CL が重篤な MDRP による感だと考えられる。また，単剤で有効であるとされ染症に対する併用療法のための有用な選択肢である CL が使用可能であっても併用療法を検討すべることを示唆している。また，今回の結果，CL 以き場合がある。すなわち，CL を用いても無効な例

外では RFP＋AZT, RFP＋ABK が特に，相乗作用は存在するため，重症感染例では特に併用による＋相加作用が高かった。これらの RFP を用いた組治療を考慮する必要がある。さらに，近年，CL に合せは，MDRP による感染症に対する治療法の候対する耐性菌の出現も問題となっており，CL 耐補と考えられ，その併用効果や有用性について今性株を誘導しないための併用療法が推奨されてい後検討していくことが重要と考えられる。

る16）。

メタロ- ȕ - ラクタマーゼ産生の有無による各抗本研究における結果，最も大きい in vitro 併用菌薬 MIC 値の比較結果（Table 3）に関して，ȕ-ラ効果を示したのは CL＋RFP であった（Table 2）。 クタム系薬の AZT はメタロ-ȕ-ラクタマーゼ産生
西尾らの報告でも，高度の相乗作用を認めた抗菌株において算術平均 MIC 値 20.6 ȝg/mL を示し，他薬の組合せは CL と RFP で，同様な成績であったの薬剤と併用した際でも相加作用が比較的強い傾5）。AOKI らは，肺炎マウスモデルでの in vivo 併用向にあった。これまでの報告でもメタロ-ȕ-ラクタ療法においても CL＋RFP に効果を認めたと報告

マーゼ産生株において AZT で併用効果が認めら。さらに併用効果だけでなく，炎症性れており，同様の結果となっている 2,10）。これはサイトカインの産生およびリポ多糖体活性の減少

AZT がメタロ-ȕ-ラクタマーゼに対して比較的安している17）

172（ 26 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

67―3June 2014

Table 3. Minimum inhibitory concentration（MIC）values for combinations of colistin（CL）,arbekacin（ABK）, aztreonam（AZT）, rifampicin（RFP）and piperacillin（PIPC）against
metallo-beta-lactamase-producing（n＝20）and non-metallo-beta-lactamase-producing（n＝20）multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates

定していることが原因として考えられる。メタた。 AAC（6ƍ）-Iae 検 出 に つ い て も 40 株 中 37 株

ロ-ȕ-ラクタマーゼ産生株 20 株のうち，IMP 型は （92.5%）に認められたが，アミノ配糖体系薬剤

17 株，blaVIM-2 遺伝子は 3 株でそれぞれ検出されABK をはじめ各抗菌薬において，有意な傾向をたが，有意な傾向を見いだすことはできなかっ

見 い だ す こ と は で き な か っ た。こ れ は， AAC

June 2014

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS（6ƍ）-Iae 検出の有無の割合が偏ったことも原因であるため，今後の課題と考えられた。
以 上，本 研 究 で は MDRP に 対 す る 抗 菌 薬 invitro 併用効果を CL, ABK, AZT, RFP, PIPC の 2 剤を用いて比較した。その結果，CL＋RFP, RFP＋ABK, RFP＋AZT，が大きい相乗作用＋相加作用を示したことから，MDRP に対しては，RFP にCL, ABK または AZT を併用投与することの有用性が in vitro において示された。ただし今後，他の組合せについても，地域・施設の間での薬剤感受性の違いを含めて，in vitro 併用効果データを集積して比較検討することが重要と考えられた。
利益相反自己申告：利益相反はない。

文献1）厚生労働省：感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律第 12 条第 1 項及び第 14 条第 2 項に基づく届出の基準等の一部改正について。平成 23 年 1 月 14 日健感発第114001 号，20112）岡 陽子：多剤耐性緑膿菌に対する抗菌薬の併用効果。日本化学療法学会雑誌 53：476〜482, 2005
3）前﨑繁文，山口敏行，橋北義一，他：臨床分
離薬剤耐性緑膿菌における各種抗菌薬の併用効果の検討。Jpn. J. Antibiotics 59: 11〜20, 2006
4）TATEDA, K.; Y. ISHII, T. MATSUMOTO, et al.:ʻBreak-point Checkerboard Plateʼ for screeningof appropriate antibiotic combinations against
multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa.
Scand. J. Infect. Dis. 38: 268〜272, 20065）西尾久明，小松 方，末吉範行，他：多剤耐性 Pseudomonas aeruginosa に対する併用薬ス
クリーニングのためのブレイクポイント・チェッカーボード法の有用性。日本化学療法
学会雑誌 59: 29〜33, 20116）Clinical Laboratory and Standards Institute:
Performance standards for antimicrobial
susceptibility testing; nineteenth informational
supplement. M100-S19, 20097）YAJKO, D. M.; J. KIRIHARA, C. SANDERS, et al.:

67―3173（ 27 ）Antimicrobial synergism against Mycobacterium
avium FRPSOH[ VWUDLQV LVRODWHG IURP SDWLHQWVZLWK DFTXLUHG LPPXQH GH¿FLHQF\ V\QGURPH
Antimicrob. Agents Chemother. 32: 1392〜1395,19888）KITAO, T.; T. TADA, M. TANAKA, et al.: Emergenceof a novel multidrug-resistant Pseudomonas
aeruginosa strain producing IMP-type metalloȕ-lactamases and AAC（6ƍ）-Iae in Japan. Int. J.
Antimicrob. Agents 39: 518〜521, 20129）SHIBATA, N.; Y. DOI, K. YAMANE, et al.: PCR
typing of genetic determinants for metallo-betalactamases and integrases carried by Gramnegative bacteria isolated in Japan, with focus
on the class 3 integron. J. Clin. Microbiol. 41:5407〜5413, 200310）宮本仁志，村上 忍，村瀬光春，他：多剤耐性緑膿菌の検出状況と併用効果。日本臨床微生物学雑誌 19: 157〜162, 200911） 福島奈央，棚町千代子，橋本好司，他：久留米大学病院で検出された多剤耐性緑膿菌に対する抗菌薬の併用効果。日本臨床微生物学雑誌 16: 127〜133, 200612）荒岡秀樹，馬場 勝，米山彰子：Checkerboard
plate を用いた多剤耐性緑膿菌に対する aztreonamとアミノグリコシド系抗菌薬の併用効果の検討。
感染症学雑誌 83: 133〜135, 200913）荒岡秀樹，馬場 勝，辰島啓太，他：好中球減少患者の多剤耐性緑膿菌敗血症に対し薬剤併用療法が奏功した 1 例。感染症学雑誌 82:466〜470, 200814）樽本憲人，阿部良伸，山口敏行，他：多剤耐性 緑 膿 菌 に よ る 尿 路 感 染 症 に Aztreonam とArbekacin の併用療法が奏功した一例。日本環境感染学会誌 24：279〜282, 200915）河添 仁，滝口祥令，井上達也，他：同種造血幹細胞移植患者における多剤耐性緑膿菌による感染症治療。薬学雑誌 128: 657〜661, 200816）コリスチンの適正使用に関する指針作成委員
会：コリスチンの適正使用に関する指針。日本化学療法学会雑誌 60: 446〜468, 201217）AOKI, N.; K. TATEDA , Y. KIKUCHI, et al.(I¿FDF\of colistin combination therapy in a mousemodel of pneumonia caused by multidrugresistant Pseudomonas aeruginosa. J.
Antimicrob. Chemother. 63: 534〜542, 2009

174（ 28 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

67―3June 2014

In vitro combined effects of double antibacterial drugs against
multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates:
comparison among combinations of colistin, arbekacin,aztreonam, rifampicin and piperacillin
RIE NAGAOKA1）, KAZURO IKAWA2）, MAKOTO ONODERA1）, YUMIKO KOBA1）,TOSHINORI HARA1）, YUMIKO JOICHI1）, MICHIYA YOKOZAKI3）,
HIROKI OHGE4）and NORIFUMI MORIKAWA2）
1）

Department of Clinical Support, Hiroshima University Hospital
Department of Clinical Pharmacotherapy, Hiroshima University
3）
Division of Clinical Laboratory Medicine, Hiroshima University Hospital
4）
Department of Infectious Diseases, Hiroshima University Hospital2）This in vitro VWXG\ H[DPLQHG WKH FRPELQHG HIIHFWV RI GRXEOH DQWLEDFWHULDO GUXJV DJDLQVW
multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa（ MDRP ）. The tested clinical isolates fromHiroshima University Hospital were 40 strains which met the criteria for MDRP, that is, theminimum inhibitory concentration（ MIC ）was 侒16 ȝg/mL of meropenem, 侒4 ȝg/mL of
FLSURÀR[DFLQ DQG 侒32 ȝg/mL of amikacin. Using the original checkerboard plates for colistin（CL）, arbekacin（ABK）, aztreonam（AZT）, rifampicin（RFP）and piperacillin（PIPC）, MIC
values were determined for single and double combinations. Based on the MIC values, fractional
LQKLELWRU\FRQFHQWUDWLRQLQGH[YDOXHVZHUHFDOFXODWHGDQGWKHFRPELQHGHIIHFWV（synergy action
or additive action）were evaluated. The three strongest drugs among the tested combinations
were i）CL＋RFP（synergy, 80.0%; additive, 17.5%）, ii）RFP＋ABK（synergy, 7.5%; additive,70.0%）and iii）RFP＋AZT（synergy, 5.0%; additive, 77.5%）. In these cases, the arithmetic
mean MIC value of each drug significantly decreased as follows: i）1.38 ȝg/mL（alone）and0.26 ȝg/mL（with RFP）for CL, 19.85 ȝg/mL（alone）and 1.85 ȝg/mL（with CL）for RFP; ii）
19.85 ȝg/mL（alone）and 7.53 ȝg/mL（with ABK）for RFP, 8.87 ȝg/mL（alone）and 2.79 ȝg/mL（with RFP）for ABK; iii）19.85 ȝg/mL（alone）and 10.15 ȝg/mL（with AZT）for RFP, 28.3 ȝg/mL（alone）and 6.65 ȝg/mL（with RFP）for AZT. Of 40 strains, metallo-beta-lactamase andaminoglycoside 6ƍ-N-acetyltransferase were found in 20 and 37 strains, respectively; however, no
VLJQL¿FDQWLQÀXHQFHRIWKHVHIDFWRUVZDVREVHUYHGRQWKHFRPELQHGHIIHFWVRIL）, ii）and iii）. The
results of this study provide an in vitro rationale for RFP plus CL, ABK or AZT as an effective
FRPELQDWLRQWKHUDS\IRU0'53LQIHFWLRQVDOWKRXJKWKHUHVXOWVVKRXOGEHYHUL¿HGDQGFRPSDUHG
with other antibacterial drugs in further studies.