ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品成分との食べ合わせによるアレルギー発症予防研究課題名

ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品成分との食べ合わせによるアレルギー発症予防

フリガナ

ミズノ

代表者名

水野マサシ
雅史

所属機関（機関名）神戸大学大学院農学研究科（役職名）教授
氏
共同研究者名（フリガナ）榊原 啓之(サカキバラ ヒロユキ)

所属機関・役職名
宮崎大学農学部

役割分担
食品中の活性物質の分析と同定

本 助 成金 によ る 発
該当なし
表論文，学会発表

研究結果要約
近年、我が国において花粉症を始めとするⅠ型アレルギーの発症率は、年々増加の一途をたどっている。これまでにマコンブに含まれるフコイダンを経口摂取した時にのみ IgE との親和性が高いガレクチ
ン 9（Gal9）が血中に分泌されⅠ型アレルギーが抑制されることを明らかにした。しかしながら、コンブには健康被害を及ぼすヒ素（乾物重当たり約 53mg）が含まれており、過剰にコンブを摂取することは健康面からすると問題である。そこで本研究では、フコイダンと同時に摂取することでアレルギー抑制効果を増強させる食品を探索し、それに含まれる有効成分をポリフェノール類を中心に同定することでアレルギー予防が期待できるポリフェノールカクテルを選定し、Ⅰ型アレルギー予防に貢献できる食品の食べ合わせを提唱していくことを目的とした。その結果、野菜類ではネギおよびタマネギに、藻類ではノリからの抽出物に増強効果が認められた。そこで活性が認められた野菜とそうでない野菜類中の各ポリフェノール類を比較したところ、ポリフェノールカクテルの候補としてはケルセチンやケンフェロールなどのフラボノール類が見出され、それらを豊富に含んでいる豆苗やオクラが列挙された。一方、ノリ抽出物にも同様の相乗効果を示すことが本研究の一環から見出されたが、フコイダンとは全く違った抑制機構を介することによって抗アレルギー効果を相乗効果に示していることが明らかとなった。

51

ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品成分との食べ合わ
せによるアレルギー発症予防

研究目的

ギー抑制機構を提唱した。さらにフコイダンは感Ⅰ型アレルギーモデルである受動皮膚アナフ作後のマウスに対してもアレルギーを抑制できラキシー（PCA）において、フコイダン経口摂取る事も明らかにし、これまで報告されているが耳介の浮腫を抑制すること、またその作用機序Th1/Th2バランスを調整することでアレルギーはアレルギー発症において重要な働きをしていを抑制する食品因子とは異なった機能を備えたる IgE との親和性が高いガレクチン9（Gal9）が食品因子として意義のある物質であることを明

血中に分泌され、その結果肥満細胞と IgE との結らかにしてきた2)。このようにフコイダンを豊富合が阻害されるためであることを明らかにした1)。に含むコンブを摂取することは、アレルギー発症また、オボアルブミン（OVA）により感作されたの抑制あるいは予防において非常に有意義なこマウスにおいてもフコイダン経口投与によりアとに思われる。しかしながら、コンブには蓄積すレルギーが抑制されることも明らかにしてきた。

ると健康被害を及ぼすヒ素が含まれており、アレ一般に花粉症や食物アレルギーに代表されるⅠ

ルギー予防を目的にコンブ摂取によって十分量型アレルギー発症には、（１）樹状細胞によるアの Gal9分泌促すことは健康の面からすると問題レルゲン認識、（２）ナイーブ T 細胞から2型ヘルが生じる。そこで本研究では、フコイダンと同時パーT 細胞（Th2）への分化誘導、（３）B 細胞のに摂取することでアレルギー抑制効果を増強さ

IgE 産生へのクラススイッチ、（４）IgE と肥満せる食品を探索し、その食品に共通に含まれる成細胞の結合といった一連の反応系、いわゆる感作分を同定することでアレルギー予防が期待でき状態、（５）再度のアレルゲン曝露による脱顆粒るポリフェノールカクテルの構築を目的とした。

によりアレルギーが発症すると言われている（下図参照）。このような発症経路の中で、OVA 感作研究計画及び研究手法によるフコイダンの抗アレルギー効果について研究計画
フコイダンを経口摂取すると血中に Gal9 が分は、（４）の部分を阻害するという新規のアレル泌され、この Gal9 が IgE と結合することでアレルギーを抑制すること、経口摂取した場合のみアレルギーが抑制されること、アレルゲンに感作された後からフコイダンを摂取してもアレルギーが抑制されることなど、食事から摂取するのに適した機能性素材であることをこれまでに明らかにしてきた。しかしながら、その一方で人体に影響が懸念されるヒ素を含んでいるため大量に摂52

ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品成分との食べ合わせによるアレルギー発症予防取することは好ましくないとされている。そこでたものをポリフェノール分析システム（HPLC-

本研究では，コンブとの食べ合わせにより、抗アPDA）に供し、構築したポリフェノールライブラ

レルギー作用の相乗効果が期待できるポリフェリーから活性物質を想定し、ポリフェノールカクノールカクテルを構築することを目的とした。そテル候補リストを作成する。この時、候補化合物のため以下の①と②の実験を計画した。

が未知成分である場合は、LC-MS/MS、NMR などの分析技術を駆使してその構造を同定する。ま

① PCA 試験を用いてフコイダンによる Gal9た必要に応じて、HPLC を用いた候補化合物の単分泌を促進する食品素材の探索離・精製を行い、十分量の化合物を調整しカクテ

5 週齢、雌の BALB/c マウスに抗アレルギー効ル用試薬として準備する。最後に、実験①から明果を示さない濃度（これまでの経験から 100らかとなったポリフェノールカクテルを理想的μg/ml 以下であることが判明 1））のフコイダンとに含んでいる青果物を見出す。

共に青果物のホモジネートを同時に 4 日間、毎日胃内強制投与した後、抗 DNP-IgE を尾静脈より研究手法投与し、その 30 分後に最初の耳介厚を測定した。

1.

フコイダン画分の抽出

さらに、その直後抗原（Ag）である DNP を耳介

基本的には Tanino ら 1)の方法に従った。具体に塗布し、2 時間後に再び耳介厚を測定した。こ

的には、液体窒素と共に乾燥マコンブをワーニンの刺激前後の耳介厚の差を IgE/Ag による浮腫とグブレンダーを用いて粉砕した後、凍結乾燥機をし、その差の増加度合いで抗アレルギー効果を判用いて凍結乾燥物を得た。次に凍結乾燥物に対し断した。また、血中の Gal9 分泌量については抗て 20 倍量の 0.1M 酢酸緩衝液（pH 4.6）を加えIgE 抗体を用いて免疫沈降法で IgE 画分を調整て、4℃で一昼夜撹拌抽出した。その後遠心分離し、その上で抗 Gal9 抗体を用いたウェスタンブ（3,500 rpm、10 分)により、上清を採取し容量ロット法で検出して、組み合わせによる Gal9 分の半分になるまで減圧濃縮を行った。この濃縮液

泌促進効果を確かめる。これらの結果から、候補に 2 倍量のアルコールを加え再び一昼夜 4℃で保となる青果物を選抜する。共同研究者によって明存した後、遠心分離により残渣を回収しフコイダかとなったポリフェノール類から、一つずつ化合ン画分とした。

物を除いて同様の実験を行い、必要最小限のポリ2.

フェノール類を明らかにする。

各野菜抽出物の調整
野菜中に含まれるポリフェノール類画分を抽出する方法は常法にしたがって抽出した 3)。市販② ポリフェノールカクテルの構築
実験①で効果のあった青果物エキスとなかっされている新鮮な各野菜を包丁で細かく刻み、液53

ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品成分との食べ合わせによるアレルギー発症予防

体窒素で凍らせて乳鉢で粉末状に砕いた。その後、ビノリ多糖画分とした。

凍結乾燥機を用いて乾燥させた。得られた凍結乾燥物に対して、20 倍量の 80％エタノールを加え4.

陰イオン交換クロマトグラフィーて 25℃で一晩振盪した。懸濁液を吸引ろ過して研究手法１で調整した画分を陰イオン交換ク得られたろ液を減圧濃縮してエタノールを完全ロマトグラフィーに供した。交換体としてはに蒸発させ、これを再び凍結乾燥させたものを野Toyopearl-DEAE 650M を用い、溶離液としては菜抽出物とした。

0.05M Tris-HCl 緩衝液（pH 7.4）に 0.5M およ

また、野菜中に含まれるポリフェノールを同定

び 1.0M NaCl のステップワイズ方で溶出した。

するために、加水分解を実施した。具体的には、それぞれの画分は、フェノール硫酸法によって糖野菜の凍結乾燥物(50mg)を塩酸加水分解した後、含量を測定した。検量線には、フコースを標準物酢酸エチル抽出した。

質として作成し、フコース当量で算出した。

3.

5.

ノリ多糖画分の抽出

受動的アナフラキシー（PCA）反応

凍結乾燥機を用いて乾燥ナラワスサビノリを5 週齢、雌の BALB/c マウスに抗アレルギー効乾燥させた後、ビーズショッカーで粉砕果を示さない濃度（これまでの経験から（3,000rpm×10 秒）した。この乾燥粉末 1 g に100μg/ml 以下）のフコイダンと共に青果物のホ対して 25 ml の蒸留水を加え室温で一晩攪拌抽

モジネートを同時に 4 日間、毎日胃内強制投与し出した後、遠心分離（3,500rpm×10 分)して沈殿た後、抗 DNP-IgE を尾静脈より投与し、その 30を回収した。この沈殿物に 1 回目と同量の蒸留水分後に最初の耳介厚を測定した。さらに、その直を加えて室温で 1 時間攪拌した後、再び同条件で後抗原（Ag）である DNP-BSA を耳介に塗布し、遠心分離して沈殿を回収した。この沈殿を凍結乾2 時間後に再び耳介厚を測定した。この刺激前後燥し、50 倍量の 0.2％酢酸水溶液を加えて 50℃の耳介厚の差を IgE/Ag による浮腫とし、その差で一晩静置し、遠心分離（3,500 rpm、10 分)によの増加度合いで抗アレルギー効果を判断した。って上清を回収した。回収液は、1M 水酸化ナト

Gal9 あるいは各種サイトカインの中和抗体によリウム水溶液を用いて pH を 7 に調整した後、2る耳介浮腫への影響を確認する際には、抗 DNP-倍量の 100％エタノールを加えて 4℃で一晩遠攪

IgE を尾静脈から注射する１時間あるいは２時拌した後、遠心分離（3,500 rpm×10 分)した後間前に、それぞれの中和抗体を１μg あるいは沈殿を回収し、100％エタノールで 2 回洗浄した。

10μg 尾静脈から投与した後、上述と同様に PCAこれを蒸留水に溶解して、室温で一晩透析して脱反応を行った。

塩に供した。この溶液を凍結乾燥し、ナラワスサ

54ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品成分との食べ合わせによるアレルギー発症予防6.

HPLC 分析

ルテオリンについては、400 µg の4日連続経口投

上記 2 で調整した野菜抽出物および加水分解

与が PCA 反応においてアレルギー抑制作用を示

物を 0.5％トリフルオロ酢酸含有メタノールに溶すことが分かっている4)。そこでルテオリン単独解後、メンブレンフィルターろ過したものを次のでは抗アレルギー効果を示さない濃度を検討し条件で HPLC に供した：HPLC システム JASCO

た結果、200 μg 以下であることが分かった。この

system control program （LC-NetII/ADC）、 カ

200 μg は Hostetler ら5)の報告によると、ルテオ

ラム：CAPCEL PAK C18 UG120, S5, 3 μm, 3.0

リンを多く含む赤ピーマンの新鮮重2.33 g 相当

mm I.D.×150 mm（大阪ソーダ）移動相：50 mMだと算出された。そこで、これを基準量として他リン酸緩衝液（pH 3.3）とメタノールの低圧グラの野菜抽出物についても新鮮物換算で2.33g 相当

ジェント。定量は、加水分解物の測定結果より、の凍結乾燥物を一日の投与量とした。一方フコイ

野菜中に含まれるフラボノイドアグリコンの有ダン投与量は、既報から一日100 μg とした1)。フ無を確認した。次に、アグリコンの存在を確認でコイダンと野菜抽出物の共投与による耳介浮腫

きた野菜抽出物を HPLC に供し、溶出時間と吸の抑制効果を図1に示した。抗原・抗体反応によ収スペクトルがライブラリ内のデータと一致しって誘導された耳介浮腫は、200 μg フコイダンた場合は、その標準物質の検量線から含有量を求投与によって有意に抑制されたが、100 μg 投与めた。溶出位置と吸収スペクトルがライブラリ内では抑制は認められなかった。しかしながら、タのデータと一致しなかったが、そのスペクトル情

マネギあるいはネギ抽出物とフコイダンとの共報から、フラボノイド等のポリフェノール類の種投与によって耳介浮腫は有意に抑制され、その効別できた場合は、類似した骨格を有する標準品の果はほぼ200 μg フコイダン投与と同等の抑制率検量線を用いて含量を求めた。

を示した。一方、赤ピーマンおよびショウガとの共投与では効果は認められなかった。これ以外の結果と考察野菜抽出物についても検討したが、有意に抑制を1.

野菜抽出物の共投与でのアレルギー抑制作示す野菜は認められなかった。これらの結果から、

用

フコイダンとの共投与によって抗アレルギー効ポリフェノールを多く含む野菜について、その果を増強させる野菜としてタマネギおよびネギ抽出物がフコイダンのアレルギー抑制作用を増が有効であることが明らかとなったが、摂取量に強するかどうか検討した。ポリフェノールである関してはフコイダン単独の約半分程度であった。

55

ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品成分との食べ合わせによるアレルギー発症予防

80

耳介浮腫（ m）

表1．各野菜抽出物中に含まれるポリフェノール類含有量60

フラボノイド類#

4020

抗DNP IgE

フェノール酸類
g/g抽出物

#

#
#

#
タマネギ

0DNP-BSA
フコイダン (g)

200

野菜抽出物

100

100

100

赤ピーマン

タマネギ

100
ネギ

ネギ

100
ショウガ

図１．PCA反応試験におけるフコイダンと野菜抽出物との共投与における赤ピーマン

耳介浮腫抑制効果

2.

♯： 抗体／抗原反応区と比較して有意差があることを示す（p<0.05）。Tukey-Kramer
test。 平均値±SE。

ショウガ

HPLC 分析によるアレルギー抑制効果を増

ケンフェロールを豊富に含む野菜として、ブロコ強させるポリフェノール類の検討

リー、小ネギ、豆苗、アボガド（皮）、カイワレ、

上記１の試験で効果が見られた抽出物と効果

小松菜（葉）、菜の花、ソラマメ（皮）が、またケが見られなかった抽出物を HPLC に供した結果ルセチンを豊富に含む野菜として、スナップエンを表１に示した。効果が見られた 2 つの野菜（タドウ（皮）、フリルレタス、オクラ、グリーンピー

マネギ、ネギ）と効果が見られなかった 2 つの野ス（皮）を見出した。

菜（赤ピーマン、ショウガ）を比較すると、効果3.

が見られた野菜にはケルセチン（タマネギ）やケ

コイダンとノリ多糖画分との共投与でのアレルギー抑制作用ンフェロール（ネギ）が豊富に含まれていることがわかった。一方、効果が見られなかった野菜でフコイダンとナラワスサビノリ多糖画分のそは、ルテオリン（赤ピーマン）やフェノール酸（シれぞれ単体ではアレルギー抑制作用を示さないョウガ）が豊富であった。これらの結果から、フ量での共投与によって、アレルギー抑制作用が発コイダンとの共投与によって抗アレルギー効果揮されるかについて検討した。そのため先ずノリを増強させる成分は、フラボノール類（ケルセチ多糖類の投与量を検討した結果、図３に示すとおンやケンフェロール）であることが分かった。一りノリ多糖画分 500 µg または 250 µg の経口投方、フラボン類（ルテオリン）やフェノール酸な与では耳介浮腫の抑制は認められなかった。そこ

どのポリフェノール類の増強効果は弱いこともで既に抗アレルギー効果を示さないことが明ら示された。

かとなっている 100 µg と共投与した場合の耳介次に、日本人が日常的に摂取する野菜や果物、浮腫に対する効果を検討した。その結果、フコイ茶類 53 種 88 部位を分析に供し、フラボノール

ダン 100 μg 投与区ではノリ由来多糖画分は類を豊富に含む野菜や果物を探索した。その結果、250μg 以上で耳介浮腫の抑制が認められた。さらにフコイダン 50 μg 投与区ではノリ由来多糖画56

ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品成分との食べ合わ
せによるアレルギー発症予防

60#

#

20

耳介浮腫（ m）

耳介浮腫（ m）

60
40#

#

##a#

0

DNP-BSA抗DNP IgE

フコイダン (100 g) + ノリ多糖類画分 (250 g)

DNP-BSA
ノリ多糖画分 (g)20

抗DNP IgE

0

フコイダン (g)40200500

250

1005010050500500

250250

抗galectin-9抗体 (1 g)
抗IL-10抗体 (10 g)
抗IgG抗体 (10 g)

図３．PCA反応試験におけるフコイダンとナラワスサビノリ多糖画分との共投与による耳介浮腫抑制効果

図４．フコイダンとナラワスサビノリ多糖画分との共投与による耳介浮腫抑制効果に対する各中和抗体の影響♯： 抗体／抗原反応区と比較して有意差があることを示す（p<0.05）。Tukey-Kramer
test。 平均値±SE。

♯： 抗体／抗原反応区と比較して有意差があることを示す（p<0.05）。Tukey-Kramer
test。 平均値±SE。

分 500 μg 投与で抑制が認められ、フコイダン単構により相乗的に効果を発揮していることが明

独で抑制効果を示す量の 4 分の 1 まで投与量をらかとなった。Liua ら 6)は、紅藻類を経口摂取す削減させることができることが明らかとなった。

ることで血中に IL-10 が分泌されることを報告

ポリフェノール類の結果に比べると、さらに半分している。また、Norton ら 7)は、IL-10 が肥満細量までフコイダンの摂取量を削減できることが胞に発現している IgE に高親和性を示す FcεRI示唆された。の発現を抑制することを報告している。これらの報告を総合すると、ノリ多糖類の経口投与によっ4.

フコイダンとノリ多糖画分のアレルギー抑て血中に IL-10 が分泌されることによって肥満制機構の相違細胞上の FcεRI 発現が抑制されるため、IgE の今までに研究でフコイダンの抗アレルギー効肥満細胞が抑制されるためにアレルギー発症が果は、経口投与した場合のみに認められることと、抑制されたと考えられた。

その作用機序は血中に Gal9 が分泌されることを明らかにしてきた 1)。一方、ノリ多糖画分につい当初予定していた研究計画の内、フコイダン摂てはその作用機構についてはよく分かっていな取量を削減できる食品の候補としては、赤ピーマ

いので、サイトカインに着目しそれぞれの中和抗ンとショウガが見出された。またこれらの中に含体を用いて PCA 実験を行った。その結果、Gal9まれるポリフェノール類と候補に挙げられなか以外に IL-10 中和抗体を抗 DNP-IgE を尾静脈かった食品中のポリフェノールを HPLC 分析で比ら注射する前に尾静脈注射したときに、フコイダ

較すると、ケルセチンやケンフェロール骨格を有ンとノリ多糖画分による耳介浮腫抑制が解消さするフラボノール類が活性を有する候補化合物れた（図４）。これらのことより、フコイダンとノとして見つかった。また、これらの成分を豊富にリ多糖によるアレルギー抑制機構は異なった機含む野菜としてブロコリー、豆苗、小松菜（葉）57ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品成分との食べ合わせによるアレルギー発症予防およびオクラを見出した。今後は、この情報を元

参考文献にフコイダンが有する抗アレルギー効果を増強

1)Tanino Y, Hashimoto T, Ojima T,できるポリフェノールカクテルの構築を視野にMizuno,入れた研究が可能になると考えられる。一方、今Saccharina japonica is a novel

回の研究から紅藻類であるナラワスサビノリにinducer of galectin-9 and exhibits

含まれる多糖画分にもフコイダンと共投与する

anti-allergic activity. J Clin Biochem

ことで、抗アレルギー効果画像今日できることをNutr. 2016;59(1):25–30.
2)

見いだせたことは、予定していた研究以外の成果

M.

F-fucoidan

fromMizuno M, Sakaguchi K. Sakane, I.と判断できる。しかもその抑制機構は、フコイダ

Oral administration of fucoidan can

ン投与による Gal9 分泌増強を促すのではなく、

exert

抗炎症性のサイトカインである IL-10 分泌促進

allergenによることを見いだすことができた。

enhancement of galectin-9 secretionanti-allergicactivity

aftersensitization

inblood.

byBiomolecules.

2020;10(2):258;

今後の研究活動について

https://doi.org/10.3390/biom1002025

今回得られた結果を基に、当初予定していたフ8.

コイダンとの共摂取により抗アレルギー効果を3)高めるポリフェノールカクテルの構築を目指し

Sakakibara H, Honda Y, Nakagawaていくのが、直近のやるべきことと考えている。

S,

そのためには、我々の研究室で開発した腸上皮細Simultaneous determination of all

胞である Caco-2 と肥満細胞である RBL-2H3 とpolyphenols in vegetables, fruits, andの共培養系を用いて、適切な組み合わせを選抜しteas.てから PCA 反応へと展開するのも一案かと考え

2003;51:571–581.
4)ている。また、ノリ由来多糖画分による抗アレル

AshidaJ

Yamashita

H,

AgricS,

Kanazawa

FoodK.

Chem.

YokoyamaY,

ギー効果がフコイダンの場合とは異なることか

Hashimoto T, Mizuno, M. A novel in

ら、血中 IL-10 分泌を促進する食品を選抜するこvitro co-culture model comprised ofとで、新たなアレルギー抑制を視野に入れた食品

Coco-2/RBL-2H3 cells to evaluateの探索に利用できないかを模索しているところ

anti-allergic effects of food factorsである。

through the intestine. J Immunol
Meth. 2016;435:1–6.
5)

58

Hostetler GL, Ralston RA, Schwartz

ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品成分との食べ合わ
せによるアレルギー発症予防

SJ.

Flavones:bioavailability,6)

Foodsources,

metabolism,Polym. 2017;165:189–196.

and7)

Norton SK, Barnstein B, Brenzovich

bioactivity. Adv Nutr. 2017;8:423–

J, Bailey DP, Kashyap M, Speiran K,

435.

Ford J, Conrad D, Watowich S,Liua QM, Xu SS, Li L, Pan TM, Shi

Moralle MR, Kepley CL, Murray PJ,CL, Liu H, Cao MJ, Su WJ, Liu GM.

Ryan JJ. IL-10 suppresses mast cell

InIgE

vitro

and

immunomodulatory
sulfated

invivoactivityofpolysaccharide

receptor

expression

andsignaling in vitro and in vivo. Jfrom

Immunol., 2008;180: 2848–2854.

Porphyra haitanensis, Carbohydr59