2019 年度研究助成事業

成果報告会

要旨集

2020 年 10 月 13 日（火）公益財団法人ニッポンハム食の未来財団

2019年 度 研 究 助 成 事 業 成 果 報 告 会
第一部 個人研究助成 成果報告会 プログラム
報告者：2019年度研究助成事業 個人研究採択者
報告資料のWeb公開：2020年10月9日（金）よりWeb会議：13時45分〜14時45分(報告者がWeb上で質疑応答、情報交換を行う時間)
Web 会議番号課題名

要旨

所属機関・氏名2019_03

HACCP 導入に向けた抗体精密整列化技術
による食物アレルゲンの超高感度検出法の開発
工場内におけるアレルギー感作評価が可
能なペプチドビーズを用いた簡易検査法の開発
血清 microRNA を用いた好酸球性食道炎の
新規バイオマーカーの確立

2019
_04

集頁

東京農業大学 応用生物科学部
食品安全健康学科
准教授 飯嶋益巳

5

甲南大学フロンティアサイエンス
学部 准教授 臼井健二

6

国立病院機構 浜田医療センター
消化器内科 医長 大嶋直樹

7

食物アレルゲン対応食品製造のための新しい高圧噴霧技術の開発

東北大学大学院環境科学研究科
准教授 大田昌樹

8

2019
_05

水溶解メラニンによるアナフィラキシー
応答制御と作用機序の解明

中部大学
准教授 川本善之

9

2019
_06

家塵中の鶏卵抗原と鶏卵アレルギー発症の関連の解明2019_07

3 型自然リンパ球を利用した新規食物ア
レルギー予防法の開発

2019
_08

メイラード反応が甲殻類アレルゲンの消化・吸収性へ及ぼす影響の解明

山梨大学大学院 総合研究部医学域 社会医学講座 助教 小島令嗣
九州大学 生体防御医学研究所
システム免疫学統合研究センター
粘膜防御学分野 教授 澤 新一郎
北海道大学 大学院水産科学研究
院 技術専門職員 清水裕

2019
_09

中部大学応用生物学部食品栄養科学科 講師 田中 守

13神奈川県立こども医療センター
アレルギー科 医長 津曲俊太郎

14

岐阜県保健環境研究所
専門研究員 永井宏幸

15

国立病院機構相模原病院小児科
医師 永倉顕一

16

2019
_13

食物アレルギーに対するカンナデンプンの予防効果
花粉-食物アレルギー症候群に対するシラ
カバ花粉免疫療法の有効性と安全性の検証
LC-MS/MS を用いた特定原材料のアレルゲ
ンおよび品種判別同時分析法に関する研究重症鶏卵アレルギー児に対する経口免疫療法ランダム化比較試験：炒り卵 vs 加
熱卵粉末
低アレルゲン化食品を用いた魚アレルギ
ーに対する新規治療法の開発

藤田医科大学医学部小児科
講師 中島陽一

17

2019
_14

乳児期のビタミン D 投与によるアレルギ
ー予防に関する研究開発

千葉大学医学部附属病院
助教 中野泰至

2019_15

鶏卵アレルゲン除去卵の作出

2019
_16

重症消化管アレルギーの病態解明

2019
_01
2019
_02

2019
_10
2019
_11
2019
_12

小児科

10
11
12

18

北海道大学大学院理学研究院
19
生物科学部門 助教 水島秀成
国立成育医療研究センター研究所
免疫アレルギー・感染研究部
20
室長 森田英明※50 音順・敬称略

1

第二部

2019年 度 研 究 助 成 事 業 成 果 報 告 会
共同研究助成 口頭成果報告会 プログラム

日時：2020年10月13日（火） 15時00分より
場所：AP品川アネックス 1階 A+B ルーム
報告者：2019年度研究助成事業

15:00

共同研究採択者

開会挨拶

15:05〜15:25
食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・22
安達 貴弘
東京医科歯科大学 難治疾患研究所 准教授
15:25〜15:45
重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・31
岡田 直貴
大阪大学大学院 薬学研究科 教授
15:45〜16:05
ソバアレルゲンの特性改変に効果的な手法の探索・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・45
佐藤 里絵
国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 食品研究部門-----（休憩）16：05 から 16：20----16:20〜16:40
ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン 9 分泌を促進させる食品成分との食べ合わせによるアレルギー発症予防・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・51
水野 雅史
神戸大学大学院 農学研究科 教授
16:40〜17:00
食物アレルギー診断技術の開発・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・60
村田 幸久
東京大学大学院 農学生命科学研究科 応用動物科学専攻 准教授
17:00〜17:20
ω -5 グ リ ア ジ ン 欠 損 食 用 小 麦 の 開 発 ： ω -5 グ リ ア ジ ン 感 作 型 小 麦 ア レ ル ギ ー の 根 絶 に 向 けて・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・67
森田 栄伸
島根大学 医学部 皮膚科学講座 教授
17:20

閉会挨拶

17:25

写真撮影

2

評議員・役員・研究助成委員名簿・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・75

当財団案内・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・77

3

公益財団法人ニッポンハム食の未来財団
2019 年度研究助成事業 個人研究助成 成果報告要旨

2019年度研究助成事業

個人研究助成〈Webサイト上での報告〉

要旨※報告書全文は当財団Webサイトに掲載予定

4

公益財団法人ニッポンハム食の未来財団
2019 年度研究助成事業 個人研究助成 成果報告要旨

研究課題名【Web 会議番号 2019_01】
HACCP 導入に向けた抗体精密整列化技術による食物アレルゲンの超高感度検出法
の開発

フリガナ

イイジマ

代表者名

飯嶋

マスミ

益巳

所属機関（機関名）東京農業大学 応用生物科学部 食品安全健康学科（役職名）准教授

本助成金による発
日本農芸化学会 2019 年度大会（2 件）
表論文，学会発表

研究結果要約食品製造現場等において HACCP（Hazard Analysis and Critical Control Point）の導入が義務化され、食物アレルゲンなどの様々な危害因子を、誰でも簡単に、迅速に、感度良く測定できる技術が求められている。特に enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)は広く利用されるが 1)、一般的に抗体は希少で高価なものも多いため、使用量を可能な限り少なくし、無駄なく抗原抗体反応に供して高感度化を図る技術開発が急がれる 2,3)。近年我々は、B 型肝炎ウイルス外皮 L タンパク質の N 末端領域の一部を、protein A 由来 IgG-Fc 結合ドメイン 2 量体に置換した ZZ-L タンパク質とリン脂質二重膜から形成される直径約 30 nm の ZZ タグ提示型バイオナノカプセル(ZZ-BNC)を作製した 2)。そして ZZ-BNC
が、抗体および Fc 融合受容体のクラスター化と精密整列化を同時に達成できる足場分子であり、各種
バイオアッセイの感度を著しく上昇できることを報告した 2-10)。本研究は、ZZ-BNC の特性を用いて極微量の食物アレルゲンをワンステップで超高感度に、安価に検出可能な新規の測定法を開発し、
HACCP の迅速化、低コスト化を目指した。まず、市販の食物アレルゲン検出 ELISA キットに ZZ-BNCを添加するだけで、従来法の高感度化および抗体使用量の低減を可能にした。さらに、固相化食物アレ
ルゲンを検出するイムノスティック法を構築し、ZZ-BNC を使用すると発色強度が増幅し、約 1 時間での簡易検査法として有効なことを示した。今後は、本法を様々な抗原の高感度及び簡易検出技術として展開し、食品分野のブレイクスルーを目指していきたい。

5公益財団法人ニッポンハム食の未来財団
2019 年度研究助成事業 個人研究助成 成果報告要旨

研究課題名【Web 会議番号 2019_02】
工場内におけるアレルギー感作評価が可能なペプチドビーズを用いた簡易検査法の開発

フリガナ

ウスイ

代表者名

臼井

ケンジ
健二

所属機関（機関名）甲南大学フロンティアサイエンス学部（役職名）准教授[学会発表]「官能基指示薬とペプチド固定化マイクロビーズを用いた皮膚感作性検出システムの確立」日本動物実験代替法学会第 32 回大会，つくば市(2019.11.20-22)「A chromophore-immobilized peptide binding assay for assessing skinsensitization in vitro」第 56 回ペプチド討論会，東京(2019.10.23-25)
本 助 成金 によ る 発
他２件
表論文，学会発表[論文発表]"Development of a chromophore-solid phase peptide reaction assay (C-SPRA)
for assessing skin sensitization in vitro", Analyst, 2020, 145, 3211-3216 ※中裏
表紙掲載
他１報投稿中研究結果要約
食の安全が重要視されている現在、工場内における生産機器、容器、食品添加物、食品開発段階の材料などによるアレルギー発症や、アレルギー悪化リスクの防止は、開発・生産において重大課題となる。
開発・生産におけるアレルギー感作試験においては、動物実験に頼らざるを得ないのが現状であるが、倫理的観点、コスト、簡便さなどから動物実験代替法が求められつつある。皮膚感作性試験代替法の一つである、DPRA 法 は食品開発・生産分野においても極めて有効な手法であると考えられる。しかしながら、油性物質などの難水溶性物質を評価できない、操作が煩雑などの問題点も多い。そこで我々はこれまで、分光技術とペプチド工学技術を融合させた様々な物質、物体の簡便な感作性試験法（C-SPRA法）の構築を行ってきた。本助成研究では、未だ基礎的なシーズである本感作性試験法を食品業界に幅広く適用できる汎用性の高い手法へと発展させることを目指した。具体的には、より簡便な方法として
磁性ビーズを用いた本手法の改良法の確立、微量吸光測定によるさらなる高効率手法の検討、本システ
ムの工場内使用へ向けた研究を行うための具体的な計画立案を行った。今後は、企業や他分野研究者と共同し、実際の器材、部品を使った付着物の回収、濃縮、測定手法の確立、ロボットによる自動化を行い、実用化・商品化・適用範囲の拡大をさらに進めていきたい。

6公益財団法人ニッポンハム食の未来財団
2019 年度研究助成事業 個人研究助成 成果報告要旨

研究課題名【Web 会議番号 2019_03】
血清 microRNA を用いた好酸球性食道炎の新規バイオマーカーの確立

フリガナ

オオシマ

代表者名

大嶋

ナオキ

直樹

所属機関（機関名）国立病院機構（役職名）医長

浜田医療センター

消化器内科

2019/06
第 97 回日本消化器内視鏡学会
本 助 成金 によ る 発
ワークショップ 7：消化器内視鏡診療におけるトランスレーショナルリサーチ
表論文，学会発表「microRNA の網羅的解析を用いた好酸球性食道炎のバイオマーカーの探索」
他１報投稿中研究結果要約
好酸球性食道炎（EoE）は遅延型食物アレルギーの一つであり、食道粘膜に多数の好酸球が浸潤し慢性炎症が惹起される病態である。近年、患者数は急激に増加傾向であるが、診断、治療に関しては未だ確立されていない部分が多い。これまでに、我々は食道粘膜局所における microRNA（miRNA）に着目し、内視鏡下に生検した食道粘膜の網羅的解析を行うことによって、欧米との発現プロファイルの相違
やどのように病態形成に関与しているのかを明らかにしてきた。
そこで、本研究では未治療の EoE 患者を対象に、血清 miRNA 発現を網羅的に解析し、非侵襲的なバ
イオマーカーになり得るのかを検討した。その結果、粘膜局所と同様に血清においても EoE 患者とコントロールの間で明確な miRNA 発現パターンの相違を認め、miRNA の発現プロファイルも極めて欧米と類似していることが明らかになった。これは EoE の病態は、本邦と欧米で人種差はなく同一の機序である可能性を示すものであった。加えて、特定の miRNA は EoE の診断や治療における非侵襲的なバイオマーカーの候補となり得るものであった。しかしながら、食道粘膜での miRNA 発現プロファ
イルとの類似性は認めなかった。以上の結果から、本研究により EoE 患者における血清 miRNA 発現の意義を示すことができた。

7

公益財団法人ニッポンハム食の未来財団
2019 年度研究助成事業 個人研究助成 成果報告要旨

研究課題名【Web 会議番号 2019_04】
食物アレルゲン対応食品製造のための新しい高圧噴霧技術の開発

フリガナ

オオタ

代表者名

大田

マサキ
昌樹

所属機関（機関名）東北大学大学院環境科学研究科（役職名）准教授[1] 大田昌樹*，天然物抽出分離のための高圧二酸化炭素の応用，化学工学会東北支部ニュースレター, (2020) 印刷中
本 助 成金 によ る 発 [2] 大田昌樹*，自然環境に順応する化学工学テクノロジーの創製，東北大学大学院
表論文，学会発表 環境科学研究科ニュースレター, 21 (2020).印刷中[3] 大田昌樹*，自然環境に順応する化学工学テクノロジーの創製，東北大学大学院
環境科学研究科アクティビティーレポート 2019, (2020).印刷中

研究結果要約
食物アレルギー対応食品への消費者のニーズは高く、これに応えるべくアレルゲン低減化食品、ひいてはアレルゲン除去食品の開発に期待が高まっている。このようなニーズに応えるべく合目的的な方法論の開拓を目指し、本申請では、高圧流体を用いた噴霧技術によるせん断力を応用した新しい工学的アプローチを採用し、特に液体試料（牛乳）の低アレルゲン化ないしアレルゲン除去に挑戦した。
まず、合目的的な機能を保持する高圧二酸化炭素を用いた噴霧実験装置の開発に着手した。当該装置の構成は、高圧二酸化炭素供給部、牛乳などを想定した液体原料供給部、さらにはこれらの流体を混合する混合部、さらには急減圧を可能とする背圧弁システムとした。このとき、混合流体の温度制御も可能とする仕様とした。トラップは室温で保持し、背圧弁から連続的に吐出される仕組みを採用した。結果として、高圧二酸化炭素噴霧によるせん断場の付与に成功し、25℃にて牛乳中ガゼインを約 10%低減
することができた。さらに低温での噴霧を採用することにより噴霧時の氷結効果が予想され、これによるアレルゲン物質のさらなる低分子断片化効果の獲得が期待できる。

8公益財団法人ニッポンハム食の未来財団
2019 年度研究助成事業 個人研究助成 成果報告要旨

研究課題名【Web 会議番号 2019_05】
水溶解メラニンによるアナフィラキシー応答制御と作用機序の解明

フリガナ

カワモト

代表者名

川本

ヨシユキ

善之

所属機関（機関名）中部大学（役職名）准教授

本助成金による発
現在、国際誌への論文投稿準備中である。
表論文，学会発表

研究結果要約
天然化合物であるメラニンは、あらゆる溶媒に不溶であることが知られているが、申請者は水溶性のメラニン合成法を独自に開発し、これがマスト細胞の脱顆粒反応を強力に抑制することを初めて見出した。メラニンは食材にも使われるイカ墨色素の主成分でもあり、自然界にありふれた色素性物質である。
抗原特異的 IgE 抗体を腹腔内投与して強制的に感作したマウスに対し、水溶解メラニンをゾンデ投与により服用させた後に抗原を腹腔内投与したところ、全身性アナフィラキシー応答が有意に抑制される知見を得た。このように、水溶解メラニンは新規の抗アレルギー剤として利用できる可能性があると考えられた。そこで本研究は、水溶解メラニンによる食物アレルギー応答の重症化軽減およびアレルゲン感
作予防の効果の有無を検証し、そのメカニズムの解析と解明を目的として研究を進めた。
オボアルブミンによる食物アレルギーモデルに対して、水溶解メラニンを１．抗原感作期間のみ
２．抗原負荷期間のみ

３．抗原感作および負荷期間に投与した群を作成し、比較した。その結果、

水溶解メラニンを抗原負荷期間のみに投与した群で有意なアナフィラキシーの抑制効果が見られた。今回の検討で、水溶解メラニンは抗原負荷時における免疫応答を負に制御し、食物アレルギーの重症化抑制に寄与する可能性が示唆された。

9公益財団法人ニッポンハム食の未来財団
2019 年度研究助成事業 個人研究助成 成果報告要旨

研究課題名【Web 会議番号 2019_06】
家塵中の鶏卵抗原と鶏卵アレルギー発症の関連の解明

フリガナ

コジマ

代表者名

小島

レイジ
令嗣

所属機関（機関名）山梨大学大学院（役職名）助教

総合研究部医学域 社会医学講座

本 助 成金 によ る 発
未表論文，学会発表

研究結果要約近年、食物アレルギーの発症に関して二重抗原曝露仮説が発表され、「食物抗原の経皮感作は食物ア
レルギー発症につながる」可能性がある。本研究は家塵中鶏卵抗原量の予測因子を明らかにし、また家塵中鶏卵抗原量が鶏卵アレルギーの発症と関連しているかを明らかにすることを目的とする。山梨県のエコチル調査の 6 歳時詳細調査に参加する児を対象とし、屋内の清掃頻度や鶏卵摂取頻度に関する質問
票調査を実施した。さらに 2 週間の家塵中の鶏卵抗原を ELISA 法で測定し、家塵中の鶏卵抗原量の予測式を作成した。2020 年 4 月現在、102 名から同意が得られ、その内 98 名から家塵の回収し、87 名に対し ELISA 法による鶏卵抗原量測定が完了した。総鶏卵抗原量（μg）の中央値は、1882.1（範囲 10.1
～31294.0）であった。87 名の内、6 歳現在も鶏卵アレルギーがある者は 2 名、過去に鶏卵アレルギーがあった者は 11 名であった。重回帰分析の結果、統計学的有意差はつかなかったものの、総鶏卵抗原量の予測要因として、卵摂取頻度と同居人数が関連している傾向がみられ、卵摂取頻度が多い場合や同居人数が多い場合に、総鶏卵抗原量が多い傾向がみられた。6 歳児の詳細調査の完了（2020 年 10 月）を待って最終的な鶏卵抗原量を予測するモデルを構築し、その予測式を用いて乳幼児期の家塵中の鶏卵抗原量を予測し、それが鶏卵アレルギーの発症と関連しているかを検証する予定である。

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公益財団法人ニッポンハム食の未来財団
2019 年度研究助成事業 個人研究助成 成果報告要旨

研究課題名【Web 会議番号 2019_07】
３型自然リンパ球を利用した新規食物アレルギー予防法の開発

フリガナ

サワ

代表者名

澤

シンイチロウ新一郎

所属機関（機関名）九州大学生体防御医学研究所（役職名）教授

本 助 成金 によ る 発
表論文，学会発表

研究結果要約
腸管制御性 T 細胞（Treg）の維持は腸管免疫寛容の成立と食物アレルギーの予防に極めて重要であるが、腸管 Treg の分化、維持を担う分子基盤は完全には解明されていない。近年、腸管内に同定された
３型自然リンパ球（ILC3）による腸管免疫恒常性維持機構が注目されている。Csf2 遺伝子にコードされたサイトカイン、GM-CSF は腸管において ILC3 や Th17 細胞から分泌され、骨髄球系細胞の分化を介して腸管 Treg の維持に重要な役割を果たすことが報告されている。
本研究では、ILC3 が産生する GM-CSF の役割を解明するために、① ILC3 特異的な GM-CSF 欠損
マウスの作成を試み、②腸管免疫寛容の成立に果たす ILC3 由来 GM-CSF の役割を検討し、③食物ア
レルギーの予防への GM-CSF の利用可能性を計画した。
こ れ ら の 研 究 目 標 を 達 成 す る た め 、 ま ず ゲ ノ ム 編 集 に よ り 作 成 し た Csf2flox マ ウ ス お よ び
KLRp1bCre-P2A-EBFP2/+ノックインマウスを用いて ILC3 特異的に GM-CSF 発現を欠損する
KLRp1b-ΔCsf2 マウスを作成した。若齢の KLRp1b-ΔCsf2 マウスは対象群同様の体重増加が観察されたが、20 週齢以上の加齢マウスにおいては対象群の 25％に相当する体重減少が観察された。一方、8 週
齢の KLRp1b-ΔCsf2 マウスにおいて、Th17 細胞の減少が観察され始め、20 週齢においてより顕著な減少を認めた。一方、予想に反し、大腸、小腸ともに KLRp1b-ΔCsf2 マウスにおける Treg 数の低下は観察されなかった。
現在、GM-CSF 欠損による Th17 細胞の低下が腸管バリア機能を低下させ、腸管 Dysbiosis を引き起こすのではないかとの仮説を立て、加齢 KLRp1b-ΔCsf2 マウスにおける体重減少の原因解明を骨髄球系細胞分化と腸管細菌叢の変容という観点から引き続き解析を行っている。

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公益財団法人ニッポンハム食の未来財団
2019 年度研究助成事業 個人研究助成 成果報告要旨

研究課題名【Web 会議番号 2019_08】
メイラード反応が甲殻類アレルゲンの消化・吸収性へ及ぼす影響の解明

フリガナ

シミズ

代表者名

清水

ユタカ
裕

所属機関（機関名）北海道大学 大学院水産科学研究院（役職名）技術専門職員

本 助 成金 によ る 発 令和２年度日本水産学会春季大会
表論文，学会発表 （ただし、COVID-19 の影響により大会が中止となったため、要旨掲載のみ）

研究結果要約本研究グループでは、水産甲殻類（カニ・エビ）の主要アレルゲンであるトロポミオシン（TM）のア
レルゲン性に及ぼすメイラード反応（タンパク質と還元糖との縮合反応、調理加工中に頻繁に起こる）の影響について、消化・吸収性の観点から検証を進めている。本研究では、メイラード反応が TM の吸収性に及ぼす影響について、マウスを用いた動物実験によって検証した。
まず、精製した TM からグルコースとのメイラード反応物（TM-G）を調製した。次に、TM と TMG をマウスへ経口投与した後、尾部静脈から継時的に採血し、TM と TM-G の血漿中濃度を定量することで、メイラード反応が TM の吸収性に与える影響について検討した。その結果、TM 投与後 15 分で74.8±61.5 ng/ml、30 分で 36.0±20.2 ng/ml（n=6）の TM が検出された。同様に TM-G でも、15 分
で 11.1±14.8 ng/ml、30 分で 4.26±2.77 ng/ml（n=6）が検出された。両者間の有意差は確認できなか
ったが、TM の吸収量が TM-G よりも多くなる傾向が見られた。また、同じ血清をイムノブロットに供したところ、TM 投与個体では未消化の TM が確認されたが、TM-G 投与個体からは未消化の TM-G は確認できなかった。以上の結果から、TM は未消化状態で吸収されるが、その吸収はメイラード反応によって阻害される事が示唆された。

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2019 年度研究助成事業 個人研究助成 成果報告要旨

研究課題名【Web 会議番号 2019_09】
食物アレルギーに対するカンナデンプンの予防効果

フリガナ

タナカ

代表者名

田中

マモル
守

所属機関（機関名）中部大学応用生物学部食品栄養科学科（役職名）講師

本 助 成金 によ る 発
現時点ではなし。
表論文，学会発表

研究結果要約
これまでに私は食用カンナデンプンの摂取がマウスの消化管においてムチンや IgA を増加させること、盲腸中の乳酸や酪酸、酢酸など短鎖脂肪酸の産生を増加させることを明らかにしてきた。これらの結果は、大腸の制御性 T 細胞の誘導を促す可能性が示唆され、Ⅰ型アレルギーの予防・改善に有効であることが期待される。本研究では、Ⅰ型アレルギーモデルマウスを用いて、食物アレルギーに対するカ
ンナデンプンの予防効果を明らかにすることを目的とした。5 週齢の BALB/c 雌マウスを Control 群、OVA 群、OVA-Canna 群の 3 群に分け、OVA-Canna 群には 10％のカンナデンプンを添加した AIN-93G
を 5 週間摂取させた。また、OVA 群、OVA-Canna 群には OVA を含むアジュバントを腹腔内に投与し、感作マウスを作製した。評価項目としては、アナフィラキシー症状、アレルゲン吸収量、全身性免疫の指標として血清中の抗体産生能、消化管免疫の指標として糞中の IgA およびムチン含量、腸内環境の指標として盲腸内容物中有機酸を評価した。結果、カンナデンプンの継続摂取は、マウスのアナフィラキ
シー症状を抑制することが明らかとなった。アレルゲン吸収量、血清中抗体産生能、盲腸内容物中有機酸に差は認められなかったものの、糞中の抗原特異 IgA やムチン含量の増加が認められた。

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公益財団法人ニッポンハム食の未来財団
2019 年度研究助成事業 個人研究助成 成果報告要旨

研究課題名【Web 会議番号 2019_10】
花粉-食物アレルギー症候群に対するシラカバ花粉免疫療法の有効性と安全性の検
証

フリガナ

ツマガリ

代表者名

津曲

シュンタロウ俊太郎

所属機関（機関名）神奈川県立こども医療センター（役職名）アレルギー科 医長・KAAACI-KAPARD-WPAS-INTERASMA Joint Congress 2019.5.10-11 ソウル「 Evaluation of the dose effect of birch pollen-based subcutaneous
本助成金による発 immunotherapy for apple allergy. 」
表論文，学会発表 ・第 68 回日本アレルギー学会学術大会 2019.6.14-16 東京「花粉-食物アレルギー症候群に対するシラカバ花粉皮下免疫療法におけるアレル
ゲン投与量の検討」

研究結果要約
カバノキ花粉などによって誘発される花粉-食物アレルギー症候群(pollen-food allergy syndrome;
PFAS)では、果物摂取に伴う口腔内症状を呈し、患者数も増加している。花粉抗原を用いたアレルゲン
免疫療法で PFAS の改善も期待できると理論的には考えられるが、治療効果はまだ明らかではない。さらに、治療効果の長期予後も明確でない。我々は先行研究でシラカバ花粉皮下免疫療法の 1 年後における有効性を報告したが、本研究ではその長期的な予後因子を探索し、特にアレルゲン維持投与量と臨床症状の改善および免疫学的パラメータとの関連性について評価することでより適切な治療プロトコー
ルを確立することを目的とした。
本助成研究期間内に 20 名の患者について治療開始 2 年経過時点での評価を行った。アレルゲン投与
量により高用量群(1:200 w/v 0.15ml 以上)8 名と低用量群(1:200 w/v 0.15ml 未満)12 名の 2 群で比較検討した。臨床症状の変化は両群で差は認めなかったが、シラカバ花粉およびリンゴの特異的 IgG4 値は高用量群のほうが高い傾向を示した。このことは、アレルゲン免疫療法において主な IgE 阻害因子として作用すると考えられている特異的 IgG4 抗体が高用量で治療したほうがより有効に産生されることを示唆しており、免疫学的には 1:200 w/v 0.15ml 以上がアレルゲン投与量として適切であると考えられた。

14

公益財団法人ニッポンハム食の未来財団
2019 年度研究助成事業 個人研究助成 成果報告要旨

研究課題名【Web 会議番号 2019_11】
LC-MS/MS を用いた特定原材料のアレルゲンおよび品種判別同時分析法に関する研究

フリガナ

ナガイ

代表者名

永井

ヒロユキ
宏幸

所属機関（機関名）岐阜県保健環境研究所（役職名）専門研究員

第 56 回全国衛生化学技術協議会年会
本 助 成金 によ る 発「安定同位体標識合成ペプチドを活用したアレルギー物質の LC-MS 分析法の開表論文，学会発表
発」

研究結果要約甲殻類アレルゲンについて、甲殻類トロポミオシンに共有して存在する ADTLEQQNK、SLSDEER、
FLAEEADR らをマーカーペプチドとして LC-MS/MS で分析したところ、ほぼ全ての甲殻類でピークを検出することができた。また、食物アレルゲン検査法としての確立を目指して、感度が高く安定して検出される FLAEEADR の合成ペプチドと比較して分析したところ、抽出タンパク質と同じリテンショ
ンタイムにピークが検出され、食物アレルゲンについて合成ペプチドを標準品とした分析法が可能であることが示唆された。また、食物アレルゲンの規制対象にないシャコに特異的なペプチド A、ペプチド
B、食材偽装に使われたクルマエビに特異的なペプチド C を見出し、合成品を標準として、各種甲殻類
抽出液を比較分析したところ、ペプチド A についてはシャコとオキアミ、ペプチド B についてはシャコと同じ配列を有するイセエビのみ、ペプチド C についてはクルマエビおよびシバエビから検出され、オキアミとシバエビ以外はデータベース配列の理論通りに検出できることが分かった。同様の手法でアーモンド、カシューナッツ、ブラジルナッツなど種実類についても特異的ペプチドを見出し、合成ペプ
チドを標準品とした分析手法を作成した。

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公益財団法人ニッポンハム食の未来財団
2019 年度研究助成事業 個人研究助成 成果報告要旨

研究課題名【Web 会議番号 2019_12】
重症鶏卵アレルギー児に対する経口免疫療法ランダム化比較試験：炒り卵 vs 加熱
卵粉末

フリガナ

ナガクラ

代表者名

永倉

ケンイチ

顕一

所属機関（機関名）国立病院機構相模原病院小児科（役職名）医師
当初の計画通りに研究開始 12 ヶ月時までのフォローを実施して評価完了後は、日本アレルギー学会、日本小児アレルギー学会、世界アレルギー学会、ヨーロッパア
本助成金による発
レルギー学会での学会発表、Journal of Allergy and Clinical Immunology: In
表論文，学会発表
Practice、Pediatric Allergy and Immunology、Allergology International への論文投稿を予定している。

研究結果要約＜背景＞
重症鶏卵アレルギー児は耐性獲得しにくく、既存の経口免疫療法(OIT)より安全な OIT の確立が望まれている。
＜目的・方法＞
安全かつ効率的な OIT の確立を目的として「加熱鶏卵粉末を用いた OIT で脱感作へ導入しその後に炒り卵を用いた OIT へ変更すると、より安全かつ効率的に耐性獲得へ誘導できる」と仮説を立てた。対象を炒り卵群 or 鶏卵粉末群に無作為に分け、主要評価項目を 12 ヶ月時の耐性獲得とした。
＜結果＞
2019 年 6 月までに研究体制の整備、倫理委員会の承認、UMIN 登録を終了し、2019 年 7 月から症例登録を開始した。2020 年 4 月時点で 13 例（炒り卵群：6 例、鶏卵粉末群 7 例）を登録しフォロー
中(フォロー期間 0-6 ヶ月)である。研究開始時の年齢(炒り卵群 vs 鶏卵粉末群、以下中央値)は 7.8 歳
vs 8.8 歳、鶏卵アナフィラキシーの既往は 100% vs 71%、卵白/卵黄/オボムコイド特異的 IgE 値は38.9/17.5/21.0 kUA/L vs 12.1/5.4/9.2 kUA/L であった。炒り卵群は全例が炒り卵の初回摂取を無症状で完了した。現時点でフォロー出来ている範囲での自宅での副反応の頻度は、中等症は 1.3% vs 0%、
重症は 0%であった。重篤な有害事象、脱落は両群ともに 0 例であった。
＜今後の予定＞当初の計画通りに研究継続し、目標症例(46 例)に向けて新規登録を継続する。

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公益財団法人ニッポンハム食の未来財団
2019 年度研究助成事業 個人研究助成 成果報告要旨

研究課題名【Web 会議番号 2019_13】
低アレルゲン化食品を用いた魚アレルギーに対する新規治療法の開発

フリガナ

ナカジマ

代表者名

中島

ヨウイチ

陽一

所属機関（機関名） 藤田医科大学医学部小児科学（役職名） 講師

本助成金による発表
未論文，学会発表

研究結果要約
複数の魚に症状をきたす魚アレルギー患者では魚全般の除去を指示される場合もある。魚はビタミン
D の主要な供給源であり、魚アレルギー患者が摂取可能な魚種を増やすことは栄養面で重要と考えられる。魚アレルギーは卵や小麦、乳などと比べて自然耐性を獲得しにくいとされており、多魚種にアレルギーがある重症な患者では治療的介入が必要と考えている。
食物アレルギーの治療である経口免疫療法は、有効であるが安全性の問題が解決されていない。より安全な治療をめざし、世界に先がけて独自の酵素処理で低アレルゲン化した魚肉粉末を開発した。魚アレルギー患者 7 名に使用し安全で有効な結果を得ている。本研究ではこの治療を用いた多施設共同ラン
ダム化プラセボ比較試験を行い、安全で有効な魚アレルギー治療法であることを証明することを目的とした。我々の治療法は、日々の予想外の副反応の危険を恐れながら経口免疫療法を行っている食物アレ
ルギー患者にとって、患者・家族の負担を減らす画期的な方法である。また、アレルゲンの交差性からサケによる治療にて、他の魚の摂取も可能となりうる。
全国の 10 施設で患者登録がされ、治療が開始されたのが 8 例で、2 例が 6 か月のランダム化比較試験を終了した。1 例は味の好みの問題で治療継続を中止したが、ほか 7 例は大きな副反応を起こすことなく治療が継続できている。治療効果については比較試験の途中であるためまだ公表できない。

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公益財団法人ニッポンハム食の未来財団
2019 年度研究助成事業 個人研究助成 成果報告要旨

研究課題名【Web 会議番号 2019_14】
乳児期のビタミン D 投与による食物アレルギー予防に関する研究

フリガナ

ナカノ

代表者名

中野

タイジ
泰至

所属機関（機関名） 千葉大学医学部附属病院小児科（役職名） 助教
Risk factors of pediatric allergic diseases. Insights from birth cohort study in
Chiba, Japan. Taiji Nakano DGAKI-JSA Joint Meeting, November 29 – 30,
2019, Frankfurt, Germany
本助成金による発表
MicroRNA in pediatric allergic diseases. Taiji Nakano Annual Congress of
論文，学会発表
Korean Academy of Pediatric Allergy and Respiratory Disease (KAPARD).
Special Lecture (KAPARD-JSPACI Speaker-Exchange Program) Oct, 25, 2019,
Soul, Korea
研究結果要約
国内外の疫学調査から母体・乳児のビタミン D(VD)欠乏の頻度が多く、VD 低値が食物アレルゲン感
作及び食物アレルギー発症に深く関与する可能性が示唆されている。そこで本研究では出生早期から乳児に VD を経口的に摂取してもらい、VD が感作・アレルギーを予防できるかを検証することを目的として、VD シロップ及びプラセボを用いた無作為ランダム化比較試験を計画した。各グループ 150 名ず
つ合計 300 名を予定としている。2018 年 10 月中旬からリクルートを開始し、2020 年 8 月時点で千葉メディカルセンター125 名、千葉大学医学部附属病院 93 名で合計 218 名のリクルートを完了した。
COVID19 の影響でややリクルート数は減っているが順調にリクルート者数は増えている。6 か月健診、
1 歳健診まで終了したのはそれぞれ 86 名、53 名である。6 か月での血液検査ではコナヒョウヒダニ、
牛乳、卵白、オボムコイドの感作率（クラス１以上を陽性）はそれぞれ 0%、5.8%、18.6%、5.8%だった。1 歳時点での感作率（クラス１以上を陽性）はそれぞれ 5.7%、20.8%、39.6%、17.0%だった。全ての症例が終了するまで VD 群かプラセボ群かオープンできないため、VD の効果について今年度はまだ評価できていない。今後 2020 年度末までに 300 名までリクルート数を集める予定である。

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公益財団法人ニッポンハム食の未来財団
2019 年度研究助成事業 個人研究助成 成果報告要旨

研究課題名【Web 会議番号 2019_15】
鶏卵アレルゲン除去卵の作出

フリガナ

ミズシマ

代表者名

水島

シュウセイ

秀成

所属機関（機関名）北海道大学大学院理学研究院生物科学部門（役職名）助教

学会発表
本 助 成金 によ る 発 The role of inositol-trisphosphate receptors during egg activation in Japanesequail. The 2nd International Conference on Tropical Animal Science and
表論文，学会発表
Production 2019. July 9-12, 2019. Suranaree University of Technology, Thailand.
* Award for the best poster presentation to S. Mizushima.

研究結果要約本研究課題では、鶏卵アレルゲン物質であるオボアルブミン、オボムコイド、オボトランスフェリンを欠損したノックアウトウズラを CRISPR/Cas9 システムを用いて創出することを目的とした。
それぞれの遺伝子の翻訳開始地点近傍に gRNA を設計し、in vitro 転写システムによりそれぞれのgRNA ならびに Cas9 mRNA を合成した。排卵直後のウズラ卵に精子を直接注入（顕微授精）すること
により、または自然交配により卵管から得られた 1 細胞期受精卵に、3 つの遺伝子を標的とした gRNA
および Cas9 mRNA を顕微注入し、卵培養を行った。一部の初期胚から DNA を注入し、塩基配列の編集を確認したところ、同一個体の全ての遺伝子に 1-5 塩基の欠損が確認され、更にはホモでゲノム編集が施されていた。しかしながら、全ての個体が孵化直前で死亡する結果となった。コントロール群と比較して、死亡した胚の重量は約 5 割減少しており、特に頭部および胸筋の形成に異常が生じていた。またコントロール胚の脳および筋肉における mRNA 発現を解析した結果、オボアルブミンとオボトラン
スフェリンが両方に、オボムコイドは脳において発現していることが判明した。本研究から、オボアル
ブミン、オボムコイド、オボトランスフェリンは、脳や筋肉の形成・発達に必要な遺伝子であり、3 つの遺伝子をノックアウトしたウズラ個体は致死になることが分かった。

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公益財団法人ニッポンハム食の未来財団
2019 年度研究助成事業 個人研究助成 成果報告要旨

研究課題名【Web 会議番号 2019_16】
重症消化管アレルギーの病態解明

フリガナ

モリタ

代表者名

森田

ヒデアキ
英明

所属機関（機関名）国立成育医療研究センター研究所（役職名）室長

免疫アレルギー・感染研究部

Orimo K et al, Allergy Asthma Immunol Res. 2020 in press.
本 助 成金 によ る 発
表論文，学会発表 第 48 回日本免疫学会学術集会 シンポジウム,Morita H. Role of innate immunity
in the development of allergic diseases. 浜松 2019 年 12 月

研究結果要約
近年、本邦において新生児・乳児消化管アレルギー（以下、消化管アレルギー）の症例報告が急激に増加している。消化管アレルギーは食物アレルギーの一種であるが、一般的な食物アレルギーとは病態が異なると考えられている。一般的な食物アレルギーとは異なり、消化管アレルギーは IgE 抗体を介さない機序（非 IgE 依存型アレルギー）が想定されている 1)が、その病態の詳細はほとんど明らかになっていない。消化管アレルギーには、複数の亜型が存在することが知られているが、その中でも特に血便や嘔吐を認めない疾患群は、重篤な成長障害を認めることが多いこと、原因抗原の同定が困難な症例が多いことから、病態の解明及び新たな治療法の開発が期待されている。
そこで本研究では、消化管アレルギーの中でも、重篤な成長障害を認めることが多い、血便や嘔吐を伴わない乳児の消化管アレルギーに焦点を絞り、病態に関与する因子の同定を目的とし、胃および S 状
結腸組織での遺伝子発現解析の比較検討を行なった。その結果、消化管アレルギーでは消化管局所で主に免疫細胞遊走に関与する遺伝子群が発現増強していること、これらは臓器毎に異なるパターンを示す
可能性が明らかとなった。

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2019年度研究助成事業

共同研究助成〈口頭成果報告〉

要旨
研究結果要約
研究目的
研究計画及び研究手法
結果と考察
今後の研究活動について
参考文献

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食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明

研究課題名

食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明

フリガナ

アダチ

代表者名

安達

タカヒロ
貴弘

所属機関（機関名）東京医科歯科大学難治疾患研究所（役職名）准教授
氏
共同研究者

名（フリガナ）

戸村道夫（トムラミチオ）
中村公則（ナカムラキミノリ）

所属機関・役職名

役割分担

大阪大谷大学・教授

免疫細胞のプロファイルイン
グ

北海道大学

腸管バリア機能の解析

准教授

食物アレルギー及び自己免疫疾患における IgA の影響
小竹 久仁彦, 安達 貴弘
本 助 成金 によ る 発 日本食品免疫学会設立 15 周年記念学術大会 2019 年 11 月 19 日
表論文，学会発表 IgA deficiency causes spontaneous enteritis
安達貴弘、渡部太郎、永石宇司、渡邉 守、烏山 一、吉川宗一郎
第 48 回日本免疫学会学術集会、浜松 2019 年 12 月 13 日

研究結果要約
食物アレルギーにおける抗原特異的 IgE 産生機序を明らかにすることを目的とした。IgE を過剰に産生する IgE ノックインマウスおよび腸管バリア機能に重要な IgA を欠損したマウスを用いて、食物ア
レルギーモデルを検討し、IgA 欠損マウスにおいて食物アレルギーが C57BL/6 のバックグランドでも起こることを明らかにした。一方、IgE を高産生する IgE ノックインマウスでは一時的なアナフィラキ
シーは見られるが、IgA へのクラススイッチが起こり、トレランスが誘導された。これらの結果は IgAが食物アレルギーの回避に重要なことを強く示唆している。また、その腸内細菌を解析したところ、正常マウスと比べ、変化していることを明らかにした。IgA 欠損マウスでは、野生型マウスに比べ、抗原感作によってより多くの抗原特異的 IgE 産生細胞が誘導されることを見出した。カルシウムバイオセン
サーを発現するマウスより 3 次元培養系エンテロイドを作製し、生体外にて腸管上皮細胞の細胞内カル
シウム動態を可視化できるで再構築系を樹立した。さらに、カルシウムバイオセンサーマウスに食物ア
レルギーを誘導し、その時のパイエル板の B 細胞の活性化の様子を生体イメージングにより経時的に可視化し、経時的変化を明らかにした。以上のように食物アレルギーにおける抗原特異的 IgE 産生を詳細に調べる基盤が確立された。

22

食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明

研究目的

一細胞レベルの解析で明らかにし、食物抗原特異食物アレルギーは食物抗原に一旦感作されて的に免疫記憶をリセットする根本的な治療法開

免疫記憶が成立してしまうと抗原を摂取するた発を目的とする。

びにアレルギー症状が惹起されてしまう。しかし、その治療方法としては、私がコメアレルギーを研研究計画及び研究手法究していた 25 年前から今日に至るまで、アレル

食物アレルギーモデルの構築

ギーの原因となる食物を避けるといった対処療

これまでは Blb/c のバックグランドのマウスが法が、いまだ主流である。少量の抗原を投与する

アレルギーの研究にはよく使われてきたが、減感作療法も行われているが、根本的な解決には

C57BL/6 のバックグランドのマウスでは遺伝子至っていない。食物アレルギーによる死亡事故も改変マウスが多数存在し、詳細な機能解析が可能

毎年のように、数件起きている。先日、厚生労働となるので、まずは、C57BL/6 を使って、食物ア

省がアレルギー疾患に対する戦略を策定し、”革レルギーのモデル系の構築を試みた。食物アレル

新的治療の実現”や”防ぎ得た死をゼロに”を目

ギーの検出系として、IgE を過剰に産生する IgE

標に掲げ、本格的な対策が求められている。通常

ノックインマウス 4)をドイツ・マルブルグ大学 Yu

は、食物抗原により制御性 T 細胞が誘導され 1)、

博士より供与していただき、腸管バリア機能に重経口免疫寛容がされる。しかし、腸管のバリア機

要な IgA を欠損したマウスは CRISPR/Cas9 に能が破綻すると、食物が体内に侵入し、免疫反応

よるゲノム編集法で IgA 重鎖の定状領域を欠失が惹起され、アレルギーを発症すると考えられてしたマウスを独自に樹立した(論文投稿中)。これいる。我々は、免疫細胞の動態のみならず、活性ら 2 系統の遺伝子組換えマウスを用いて、食物ア化、さらには細胞標識までの可視化できる 6D 生

レルギー誘導の実験を行った。IgE ノックインマ

体イメージングを確立し 2,3)、さらに免疫記憶のウスにおいては、さらに鶏オボアルブミン(OVA)成立する機序の一端を解明している（論文投稿中、に特異的な T 細胞受容体を持つ OT-2 マウスと交論文準備中）。これを基盤として、食物アレルギ

配し、OVA による免疫応答を高めたマウスを用ーにおける免疫記憶の機序を詳細に解明できれいた。OVA（50 ㎍）を抗原として水酸化アルミ

ば、そこを標的として食物抗原特異的に免疫記憶

ニウム（alum）アジュバンドでゲル化したものををリセットする根本的な治療法の開発ができる

0.3ml のリン酸バッファーに懸濁して、マウス腹のではないかと考えた。”免疫記憶”という言葉

腔に免疫し、
2 週間後にさらに追加免疫を行った。

は免疫の一つの特徴としてよく知られているが、さらに１週間後に、ゾンデでリン酸化バッファー

実はその実体についてはよくわかっていないこに溶解した OVA（30 ㎍）投与、あるいは５％OVAとも多い。そこで本研究では、食物アレルギーにを含む餌を自由摂取させ、体温の低下、糞便の様おいて免疫記憶が成立および維持される機序を子などを経時的に観察した。

23

食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明

IgE 産生細胞の検出系の確立

パク質の円順列変異体）とその間に存在するカル

食物アレルギー誘導時に、感作された抗原特異モジュリンのカルシム結合部位からなり、カルシ

的な IgE 産生細胞を特定する目的で、IgA 欠損マ

ウムイオンと結合することにより構造変化し、ウスを用いて、OVA/alum で抗原感作を行い、抗CFP のみを励起した場合、カルシウムイオンに原特異的 IgE 産生細胞がどの程度誘導されてい依存して 2 つの蛍光タンパク質が隣接すること

るか、フローサイトメトリーにより IgE 陽性細胞

により、FRET（蛍光共鳴エネルギー移動）によを 、 さ ら に Enzyme-Linked ImmunoSpot

りが起こり、シアンから黄色に、色の変化が起こ（ELISPOT）アッセイにより、抗原特異的 IgEる(図１を参照)。これを利用して細胞内カルシウ

産生プラズマ細胞を調べた。そこで、沢山の抗原

ムイオン濃度変化をモニターできる。Ｂ細胞特異

特異的 IgE 産生細胞を誘導できる IgA 欠損マウ

的にカルシウムバイオセンサーを発現させたスの優位性を生かして、IgE 産生細胞の生体内動CD19-Cre/YC3.60 マウスを用いて、食物アレル態の解明と生体内動態情報に基づく IgE 産生細ギーが起こっているときに、生体内でどのように胞の性状の詳細解析によりアレルギー発症の本

免疫細胞の活性化が起きているか、共焦点レーザ

体に迫るために、IgA 欠損マウスと生体内の臓器

ー顕微鏡にて、可視化解析を行った。アレルギー

連関、免疫細胞移動を可視化して細胞動態を追跡は上記で確立した方法を用いて、OVA/alum で免できる光変換蛍光タンパク質 KikGR マウス 5)を疫後、ゾンデで OVA を投与し、458nm のレーザ掛け合わせて IgA 欠損 KikGR マウスを取得する

ーで励起し、
YFP と CFP の蛍光の画像を取得し、ことにした。また、取得した細胞の詳細解析のた

YFP/CFP の ratio でカルシウムシグナリングをめに、単細胞遺伝子発現解析系の導入確立と、免モニターした。また、取得した画像の解析にはニ疫細胞のプロファイルリングのためにマスサイ

コンの NisElements を用いた。

トメトリーCyTOF 評価系の確立を行った。

食物アレルギーの可視化解析
これまでに独自に樹立した細胞系譜特異的カ
ルシウムバイオセンサーYellow Cameleon 3.60
（YC3.60）発現マウスを用いた５D(x、y、z、時間、カルシウムシグナル)生体イメージングシス
テムを構築しており、腸管のリンパ組織であるパイエル板や腸管上皮での生体イメージングを確立してきた 6)。YC3.60 は一分子内に CFP（シアン蛍光タンパク質）と Venus（YFP:黄色蛍光タン

24

食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明

食物アレルギー発症における腸管ネットワーク

解析するために、野生型マウスおよび IgA 欠損マのニッチとしての解析

ウスより糞便を採取し、便サンプルから細菌由来のゲノム DNA を抽出し、16SrRNA シークエン

申請に先立って、腸管上皮、免疫細胞、の生体
イメージング系はこれまでに構築されていたがスにて腸内細菌叢組成を解析した。

3,6)、腸管神経系については不明な点も多かった。

そこで、まずは腸管の神経細胞について神経細胞

抗原性特異的な記憶細胞の欠失方法の開発を特異的にカルシウムバイオセンサーを発現する

予定していたが、解析手法の確立に本年度はとどNestin-Cre/YC3.60 マウスを作出し、腸管神経叢

まり、免疫記憶をリセットする方法の開発には着であるアウエルバッハ神経叢、マイスナー神経叢、

手できなかった。

さらには腸管上皮近傍の神経終末の可視化を行い、さらにはそれらの生体イメージング系の構築

結果と考察を行ってきた 7)。腸管の知覚神経の細胞体は、脊

食物アレルギーモデルの構築

髄の後根神経節に存在し、また腸管上皮の 1 つでOVA 特異的な T 細胞抗原受容体を持つ OT-2ある腸管内分泌細胞と直接シナプス様結合すると交配した IgE ノックインマウスでは予想に反迷走神経の知覚神経細胞体は下神経節に存在しし、OVA/alum で免疫したにもかかわらず、全くているので、これらの神経細胞を調製して、 in

IgE 抗体価の上昇が見られなかった。このマウス

vitro の細胞培養系の構築を行った 8)。

の系では免疫応答が Th1 優位に傾き、Th2 応答がほとんど起こらなかったためであると考えられる。また、OVA 特異的な T 細胞抗原受容体の腸管オルガノイドを用いた再構築系の確立
食物アレルギーによる神経―免疫―上皮の腸トランスジェニックマウスである OT-2 のバック

管ネットワークの異常を生体外で可視化解析すグランドを持たない IgE ノックインマウスにおるために、腸管オルガノイドを用いた再構築系のいも同様の実験を行い、免疫後、ゾンデで OVA樹立を目指した。まず、カルシウムバイオセンサ

を 1 日おきに継続的に投与したが、体温の低下がーを発現するマウスから小腸を摘出し、オルガノ

見られたのは初回のみで、アナフィラキシー反応

イドを作成後、神経伝達物質であるアセチルコリが見られたが、以後はそのような反応は見られなンのアナログ体であるカルバミルコリン(CCh)くなった。継続的に採取した血清の抗体価を測定

刺激により、腸管上皮細胞内のカルシウム濃度がしたところ、OVA 免疫により OVA 特異的 IgE 抗イメージングにより解析できるかを検討した。

体価の上昇は検出されたが、ゾンデによる経口投
与後、OVA 特異的 IgE 抗体価は低下し、IgA 抗

IgA 欠損マウスにおける腸内細菌叢の解析

体の産生の上昇が見られた。このことは、経口投IgA 欠損マウスが腸内細菌叢に与える影響を

与により OVA 特異的な抗体が IgE クラスから

25

食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明

IgA クラスへクラススイッチすることにより、ト野生型マウスよりも多数検出出来る可能性があ

レランスが誘導されたことを強く示唆している。

る。実際、IgA 欠損マウスでは野生型のマウスと一方、IgA 欠損マウスでは野生型のマウスと比べ、比べ、OVA/alum で免疫後には高い IgE 産生が認

OVA/alum で免疫後、IgE ノックインマウスほどめられた(図)。また、骨髄に移行した IgA 産生細ではないが、IgE クラスの特異抗体が野生型のマ胞が長期の IgA 産生を担うことはよく知られてウスより高く検出された(図 2)。さらに OVA の経

いるが、我々は腸管組織で誘導された IgA 産生細口投与により、体温の低下が見られ、野生型や胞が骨髄に移行することを光変換蛍光タンパク

IgE ノックインマウスと比べ、食物アレルギーが質 KikGR マウスの腸管組織の細胞を赤色にマー

効率よく起きていることを示している。IgA 欠損

キングして追跡することで直接証明し報告してマウスは C57BL/6 バックグランドマウスでも、いる 9)。そこで我々は、IgE 産生細胞も IgA 産生

食物アレルギーのモデル系として高感度に食物細胞と同様骨髄に移行することが、血中 IgE の維アレルギーが検出できることが判明した。

持に貢献している可能性を考えた。そしてその証明を行うために、抗原特異的 IgE 産生細胞が効率的に誘導できる事が期待できる IgA 欠損マウスの優位性を生かし、さらに、IgE 産生細胞の生体内動態の解明と生体内動態情報に基づいて取得
した IgE 産生細胞の性状の詳細解析によりアレルギー発症の本体に迫るために、IgA 欠損マウスと KikGR マウスとの掛け合わせを行い、IgA 欠
損のバックグランドで KikGR を発現するマウスを取得した。そして、IgA 欠損のバックグランド
で KikGR を発現するマウスでの解析を進めるた

IgE 産生細胞の検出系の確立

めに、IgA 欠損マウスに OVA/Alum を 2 回感作

IgE 抗体産生細胞は短命であることや、検出出した後に解析し、腸管、腸間膜リンパ節、脾臓、来る抗原特異的 IgE 産生細胞数が少ないことが、骨髄で IgE 産生形質細胞前駆細胞が誘導される

食物アレルギーを起こす中心的な役割を果たす
IgE 産生細胞の性状解明を困難にしている。上記

ことをフローサイトメトリーにより確認した。まの IgE ノックインマウスによる検討から IgE 産

た、ELISPOT アッセイによる検出により、脾臓
では 107 細胞当たり全 IgE 産生細胞は 400 個、生細胞は持続的な抗原刺激により IgA 産生細胞

OVA 特異的 IgE 産生細胞は 30 個、全 IgG 産生に容易にクラススイッチしてしまう可能性が考

細胞は 2917 個、OVA 特異的 IgG 産生細胞は 248

えられる。翻ると IgA 欠損マウスでは、IgE 産生個検出できた。以上の様に、IgA 欠損バックグラ細胞にクラススイッチできずに IgE 産生細胞が26

食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明

ウンドでの IgE 産生細胞の生体内細胞動態解析のためのマウスの取得し検出系を確立した。
また、取得した細胞の詳細解析のために、単細胞遺伝子発現解析系の導入確立と、マスサイトメ
トリーCyTOF 評価系の確立を行った。添付の図のようにマウスの免疫細胞をプロファイリング
することを可能にした(図 3)。

食物アレルギー発症における腸管ネットワークのニッチとしての解析
腸管神経叢であるアウエルバッハ神経叢、マイスナー神経叢、腸管上皮近傍の神経終末で、神経特異的にカルシウムバイオセンサーを発現する
マウスを用いた生体イメージングを行い、それぞれの部位で、神経細胞の活性化を可視化することに成功した(図 5)。また腸管上皮に多くの神経終末が存在していることが明らかとなり、これらが腸管内容物をセンシングしていることが推測された。

食物アレルギーの可視化解析
ま た B 細 胞 の み を 可 視 化 す る CD19Cre/YC3.60 マウスに OVA を免疫後、OVA を経口投与して食物アレルギーを誘導後、経時的に生体イメージングにより小腸パイエル板の B 細胞を観察したところ、直後ではあまり変化は見られなかったが、投与 2 日後に、細胞内カルシウム濃度が亢進している B 細胞が著しく増加している
ことが明らかになった(図 4)。これは B 細胞が活性化され、IgA へのクラススイッチが効率よく起きているためであると推測された。

27

食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明

エンテロイド培養液中に 10μM を加えたとこ出できるようになった。さらに生体イメージング

ろ、数秒で細胞内カルシウム濃度の上昇を示した。

により、食物アレルギー誘導時の B 細胞の活性

また、カルシウム濃度の上昇に伴い、抗菌ペプチ化の経時的経過も明らかとなった。これらの細胞

ドαディフェンシンを含む顆粒を豊富に持つを指標として、食物アレルギーの詳細な機序解明、Paneth 細胞の顆粒が分泌することを確認した。

および、それらをターゲットにした抑制方法の開この結果は、今後、エンテロイドと腸神経細胞お発が必要である。

よびリンパ球などの免疫細胞との共培養を可能
学会や論文発表等の予定とすることで、神経―免疫―上皮の腸管ネットワ

Taro Watabe, Kunihiko Kotake, Toshihikoークへの食物の関与が分子レベルで解析できる

Kumazawa, Tomomi Aida, Kohichi Tanaka,

可能性を示した。

Ryuichi Ono, Fumitoshi Ishino, Takako Usami,
Takamasa Miura, Hiroko Kawasaki, Naoya

IgA 欠損マウスにおける腸内細菌叢の解析

Tsugawa, Daiki Yamada, Kazuhiro Hirayama,

16SrRNA シークエンス腸内細菌叢組成解析のSoichiro

結果、β多様性において IgA 欠損マウス群は、野Yoshikawa,

HajimeKarasuyama,

Mamoru Watanabe, Richard S. Blumberg,

生型と比較して異なる細菌叢組成を示し、またαTakashi Nagaishi, and Takahiro Adachi.

多 様 性 の 減 少 傾 向 と Parabacteroides 、Immunoglobulin

Ruminococcus 存在率の増加、Helicobacter 存在

A-specificdeficiency

induces spontaneous inflammation specifically率の減少を示した。このことから IgA 欠損マウス

in the ileum.論文投稿中

は腸内細菌叢の破綻（dysbiosis）を誘導することが明らかとなった。これらの結果は、IgA が腸内今後の研究活動について

細菌叢の制御に重要なことを示しており、食物ア

食物アレルギーの発症機序が解明できれば、そ

レルギーにおいても影響を及ぼすことが推測さこを標的として根本的な治療法の開発ができるれた。

のではないかと考え、本研究では、一細胞レベルの時空間的な解析で、食物アレルギーにおいて免今後の課題

疫記憶が成立および維持される機序を明らかに

IgA 欠損マウスを用いることにより食物アレすること、それをもとにした抗原特異的な免疫記

ルギーが効率的に誘導できる系ができ、また IgE

憶およびクラススイッチの制御法の確立を目的

陽性細胞も、フローサイトメーターで検出できるとした研究を行う。2019 年度の研究で、感作さようになり、抗原特異的な IgE 陽性細胞が特定でれた抗原特異的な IgE 産生細胞が検出できるよ

きるようになった。さらには ELISPOT アッセイうになったので、CyTOF による解析、あるいはにより、抗原特異的な IgE 産生細胞も高頻度で検その細胞を単離し、詳細に解析することで、その28

食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明

細胞の特徴を突き止める。IgA 欠損のバックグラ

cytometry and confocal microscopy.

ンドで KikGR を発現するマウスに OVA/Alum を

Biochem Biophys Res Commun. 2008

2 回感作した後に、腸管組織の細胞を赤色にマー

Mar 7;367(2):377-82.
3) Yoshikawa S, Takako Usami T, Kikuta

キングした後、腸間膜リンパ節、脾臓、骨髄で赤J, Ishii M, Sasano T, Sugiyama K,

色にマーキングされた IgE 産生形質細胞前駆細Furukawa T, Nakasho E, Takayanagi H,胞、あるいは IgE 産生形質細胞を検出することでIgE 産生細胞の生体内動態を明らかにする。また、骨髄の細胞を赤色にマーキングすることで、骨髄Tedder TF, Karasuyama H, Miyawaki A,
Adachi T. Intravital imaging of Ca2+
signals in lymphocytes of Ca2+

で長期間生存する細胞を同定する事が可能であbiosensor transgenic mice: indication ofる。この検討により今まで不明であった IgE 産生

autoimmune diseases before the

細胞の生体内動態が明らかになる。さらに、赤色

pathological onset. Sci Rep. 2016; 6:にマーキングされた細胞が検出された組織(骨髄18738.

と脾臓を想定)から分取した赤色の細胞を

4) Lubben W, Turqueti-Neves A,

ELISPOT アッセイし、腸管から移行した抗原特Okhrimenko A, Stoberl C, Schmidt V, et

異的 IgE 産生細胞を同定する。また食物アレルギ

al. IgE knock-in mice suggest a role forーが誘導、あるいはトレランスが誘導されて回避

high levels of IgE in basophil-mediatedされている状況で、生体イメージングにより生理

active systemic anaphylaxis. Eur J
Immunol 2013 43: 1231–1242.

条件下での細胞の活性化を可視化し、クラススイ

5) Futamura K, Sekino M, Hata A,

ッチの時空間的解析により、その機序を明らかに

Ikebuchi R, Nakanishi Y, Egawa G,する。またこれらの知見を基盤に、トレランスを誘導する食品成分、あるいは医薬品の開発を行い、食物アレルギーの予防法、治療法の開発に努める。

Kabashima K, Watanabe T, Furuki M,
Tomura M. Novel full‐spectral flow
cytometry with multiple spectrally‐
adjacent fluorescent proteins and

参考文献

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1) Kim KS, Hong SW, Han D, Yi J, Jung J,

vivo cellular movement. Cytometry A.

Yang BG, Lee JY, Lee M. Surh CD.

2015 Sep; 87(9): 830–842.

Dietary antigens limit mucosal

6) Adachi T, Kakuta S, Aihara Y, Kamiya

immunity by inducing regulatory T cells

T, Watanabe Y, Osakabe N, Hazato N,

in the small intestine. Science 2016 Feb

Miyawaki A, Yoshikawa S, Usami T,

19;351(6275):858-63.

Karasuyama H, Kimoto-Nira H,

2) Adachi T, Tsubata T. FRET-based Ca2+Hirayama K, M.-Tsuj N. Visualization of

measurement in B lymphocyte by flow

probiotic-mediated Ca2+ signaling in

29

食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明

intestinal epithelial cells in vivo. Front

Wang AA, Charabati M, Sun T, Lee

Immunol. 2016; 7: 601.

DSW, Galicia G, Ramaglia V, Ward LA,

7) Aihara Y, Fukuda Y, Osakabe N, Aida T,

Leung LYT, Najafi G, Khaleghi K,

Tanaka K, Yoshikawa S, Karasuyama

Garcillán B, Li A, Besla R, Naouar I,

H, Adachi T. Visualization of mechanical

Cao EY, Chiaranunt P, Burrows K,

stress-mediated Ca2+ signaling in the

Robinson HG, Allanach JR, Yam J, Luck

gut using intravital imaging. Biosci

H, Campbell DJ, Allman D, Brooks DG,

Microbiota Food Health. 2020 in press.

Tomura M, Baumann R, Zamvil SS,8) Nishimura Y, Fukuda Y, Okonogi T,

Bar-Or A, Horwitz MS, Winer DA,

Yoshikawa S, Karasuyama H, Osakabe

Mortha A, Mackay F, Prat A, Osborne

N, Ikegaya Y, Sasaki T, *Adachi T. Dual

LC, Robbins C, Baranzini SE,

real-time in vivo monitoring system of

Gommerman JL. Recirculating

the brain-gut axis. Biochem Biophys Res

Intestinal IgA-Producing Cells Regulate

Commun. 2020 Apr 2;524(2):340-345。

Neuroinflammation via IL-10. Cell.
2019 Apr;177(2):492-493.

9) Rojas OL, Pröbstel AK, Porfilio EA,

30

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

研究課題名

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

フリガナ

オカダ

代表者名

岡田

ナオキ
直貴

所属機関（機関名）大阪大学大学院薬学研究科（役職名）教授氏

名（フリガナ）

所属機関・役職名

役割分担

藤澤隆夫
国立病院機構三重病院・院 経皮免疫療法の治療効果判定（フジサワタカオ）
長マーカーの探索
神山文男
コスメディ製薬株式会社・経皮免疫デバイスの製造・供（カミヤマフミオ）
代表取締役社長
給1. Ito S., et al.: Pharm. Res. 37(3): 35 (2020)
2. Kuwabara Y., et al.: JSA/WAO Joint Congress 2020 [Online Meeting,
September 17-20, 2020]
本助成金による発 3. Kuwabara Y., et al.: EAACI Annual Congress 2020 [Online Meeting, June 610, 2020]
表論文，学会発表
4. 山下 凌ら: 日本薬学会第 140 年会 [誌上開催, 2020 年 3 月 26-28 日]
5. Yamashita R., et al.: 第 48 回日本免疫学会学術総会 [静岡県 (浜松市), 2019年 12 月 11-13 日]
共同研究者

研究結果要約
アレルギー疾患における唯一の根治療法である免疫療法が食物アレルギーに対しても積極的に導入されるようになってきた。しかし、現行の免疫療法はアレルゲンを皮下注射法により頻回投与するものであり、注射針による疼痛があること、長期に定期的な通院が必要なこと、頻度は低いもののアナフィ
ラキシーショックなどの重篤な副作用の危険性があることから患者側、医療側の双方にとって容易に施行できる治療法とは言いがたい。本研究では、皮膚を傷つけることなく微量のアレルゲンを皮膚内に浸透させることのできる親水性ゲルパッチ (HG) を活用し、小児食物アレルギーに対する新規経皮免疫療法 (EPIT) の開発に取り組んだ。マウスモデル実験において、アレルゲン装填 HG を用いた EPIT が特異的 IgG 抗体 (アレルゲン中和抗体) の産生を誘導し、従来の皮下注射免疫と比較して特異的 IgE 抗体(アレルギー誘発抗体) の産生を低減できることを示した。これらの前臨床結果に基づいて、重症牛乳ア
レルギー患児を対象とした探索的臨床研究を実施したところ、牛乳アレルゲン装填 HG を適用した被験者 8 例のうち 4 例で症状誘発閾値が顕著に上昇し、経口免疫療法への移行を可能とした。また、奏効した患児においては血中特異的 IgE 抗体価の減少傾向と血中特異的 IgG4 抗体価の上昇傾向も認められ、HG を応用した EPIT が食物アレルギーに対する簡便な根治療法の確立に貢献できる治療戦略であることを実証した。

31

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

研究目的

拠に基づいて治療を行っているとは言いがたい

食物アレルギーの診断および管理法の進歩に面がある。そこで、EPIT の有効性評価および奏より患者の生活の質 (quality of life; QOL) は改

効機序解析に有用なアレルゲン特異的免疫療法

善しつつあるが未だ十分ではなく、なによりも根モデルの作出に取り組んだ。

治に至る治療法が存在しないことが問題である。

食物アレルギーに対する EPIT は、従来の皮下通常、小児の食物アレルギーは多くが成長と共に注射法 (subcutaneous immunotherapy; SCIT)、寛解するが、最近は寛解困難でアナフィラキシー

舌下法 (sublingual immunotherapy; SLIT)、経のリスクを抱えたまま持続する例が増えている。

口免疫療法 (oral immunotherapy; OIT)、などとそこで本研究では、ニーズの高い牛乳・鶏卵アレ比較して簡便で全身性の症状誘発リスクが低い

ルギーに対する安全で有効性の高い経皮アレル方法として期待されており、特に、OIT や SLIT

(epicutaneousが実施できない重篤な食物アレルギー患児など

ゲ ン 特 異 的 免 疫 療 法

immunotherapy; EPIT) の確立を最終目標とすに選択されるべき治療法と考えられる。本研究は、る。

食物アレルギーに対する新たな治療・予防・診断

将来的な医師主導治験への道筋をつけるため法の創出に繋がるトランスレーショナルリサーに、本研究では EPIT の安全性・有効性に関するチとして、その成果が日本発・世界初の EPIT 用

非臨床・臨床 POC データセットの収集を推進し貼付製剤の上市・臨床応用へと昇華されることをた。また、ここ数年来、免疫学ではアジュバント

目指している。

に関する数多くの分子レベルの知見が蓄積され、その免疫反応における重要性がクローズアップ

研究計画及び研究手法されてきている。アレルギー疾患に対する免疫療A.

アレルゲン装填親水性ゲルパッチ法においてもアレルゲンにアジュバント効果を(hydrophilic gel patch; HG) の作製およびもつ物質を加えることで、より免疫療法の効果を

長期安定性試験
１）HG の作製

上げ、同時にアレルゲン量を減らすことで副反応の危険性を回避できる可能性がある。そこで、

アクリレーツ/ビニルピロリドン共重合体、ヒEPIT に適用可能な経皮アジュバント候補物質のアルロン酸ナトリウム、乳酸オクチルドデシル、探索を行った。さらに、免疫療法はアレルギー治

グリセリンを 100 : 45 : 30 : 0.2 の重量配合比率

療のなかで唯一根治が期待できる治療法である

で酢酸エチル/アセトンに溶解し、ポリエチレンにもかかわらず、その奏効機序はいまだ十分に理

テレフタレート離型フィルムに厚さ 200 m で塗解されていない。その結果、免疫療法を行う際に、工した。塗工シートを室温 30 分間、80C、15 分

アレルゲン量や継続期間の妥当性などを評価す

間静置して有機溶媒を蒸発除去することで HGるようなバイオマーカーがなく、十分な科学的根

を得た。

32

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

２）アレルゲン装填 HG の作製

B.

OVA-HG の安全性試験

無菌条件 (クリーンベンチ内) で低エンドトキ

Hartley モルモットの左右の耳に交互に OVA-シン (< 1 EU/mg) ovalbumin (OVA)、ovomucoid

HG (1 mg OVA/patch) を 2 週間連日貼付し (貼(OVM)、Milk protein concentrate (MPC)、ある付 12 時間/日)、皮膚局所反応を観察した。また経いは AF647 標識 OVA を滅菌蒸留水に溶解し、時的に血清中 OVA 特異的 IgG, IgE 抗体価を測

HG (直径 1 cm の円形) の粘着面に 70 L ずつ滴定した。さらにこれらのモルモットに OVA 溶液

下した。液滴が HG に吸収されるまでクリーンベを 2 mg/kg で静脈内投与し、直腸温測定によりアンチ内に静置し、OVA-HG、OVM-HG、MPC-HG、ナフィラキシー反応を評価した。なお対照群のモあるいは AF647/OVA-HG とした。臨床研究用のルモットには、背部皮膚に OVA 溶液を 100

アレルゲン装填 HG は粘着面をタンパク質低吸g/100 L/head で皮下注射した。

着性離型フィルムで覆ったのち、アルミラミネー
C.

トパックに入れて密封した (Fig. 1)。

HG を用いた EPIT の免疫応答特性

１）OVM-HG を用いた経皮免疫応答解析
BALB/c マウスの除毛背部皮膚に OVM-HG (1mg/patch) を 24 時間貼付した。対照群には OVM
溶液 (100 g/100 L) を皮下注射した。これらの免疫操作を 1 週間隔で 4 回実施し、経時的に血清
中 OVM 特異的 IgG, IgE 抗体価を測定した。最終免疫 1 週間後に所属リンパ節 (dLN) を摘出し、調製した細胞懸濁液を OVM (1 mg/mL) で再刺激した。48 時間培養後の上清中 IL-2、IL-4、IL３）臨床研究用 OVM-HG および MPC-HG の長10、IL-13、IL-17、IFN-および TNF-を BioPlex マウスサイトカインアッセイを用いて定量

期安定性試験
臨床研究用 OVM-HG および MPC-HG を 4Cした。

で保存し、経時的に HG からの OVM または MPC

２）HG 貼付に伴う抗原提示細胞 (APC) の動態

溶出量を測定した。また、1 年間保存した臨床研

解析

究用 MPC-HG からの溶出液を DBA/2 マウスのBALB/c マウスの除毛背部皮膚に OVA-HG

背部に 100 g/100 L で皮下投与し、用時調製(200 g/patch) あるいは HG を貼付した。対照群

MPC 溶液を同様に投与した場合と血清中 MPCには PBS を皮下注射した。24 時間後にこれらの特異的抗体価を比較することで保存後の MPC のマウスから dLN 細胞を調製し、各種蛍光標識抗免疫原性を確認した。

体で染色した細胞をフローサイトメトリー解析

33

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得した。APC は、ランゲルハンス細胞 (LC; CD11c+,

イトメトリー解析により移入した OT-I 細胞およB220-, CD8-, CD205+, CD207+, CD326+) 、び OT-II 細胞の分裂増殖および活性化を解析し

CD207+ 真 皮 樹 状 細 胞 (dDC; CD11c+, B220-,た。

CD8-, CD205+, CD207+, CD326-)、CD207- dDC
D. 重症牛乳アレルギー患児に対する MPC-HG(CD11c+, B220-, CD8-, CD205+, CD207-) 、CD8α+ DC (CD11c+, B220-, CD8+)、形質細胞様を用いた経皮免疫療法

DC (pDC; CD11c+, B220+)、単球およびマクロフ

本臨床研究は、国立病院機構三重病院倫理審査

ァージを含むその他の CD11c+ 細胞 (CD11c+,

委員会の審査・承認を受けて実施した。

B220-, CD8-, CD205-, CD207-, CD326-) に分画

１）対象
経口負荷試験閾値が牛乳 1 mL 未満の重症牛乳した。

アレルギー患児 8 名 (3 歳～8 歳の男女)

３）HG により皮膚内送達された OVA のプロセ

(組み入れ基準)ッシング経路解析
BALB/c マウスの除毛背部皮膚に AF647/OVA-

・経口負荷試験で確定診断され、寛解傾向のな

HG (200 g/patch) を 貼 付 し た 。 対 照 群 に はい牛乳アレルギー患者
・経口負荷試験による閾値 (総負荷量) が牛乳

AF647/OVA 溶液 (10 g/100 L) を皮下注射し3 mL 以下の患者た。経時的にこれらのマウスから dLN 細胞を調・法的保護者の文書による同意を得られ、かつ製し、各種蛍光標識抗体で染色した細胞をフロー
サイトメトリー解析した。APC を上記 2)と同様

本人の意思確認ができた者(除外基準)に分画し、各種サブセットにおける AF647+ cells

・牛乳摂取状況が直近の 3 ヶ月間に大きく変の細胞数を算出した。
４）OVA-HG 貼付に伴う OVA 特異的 T 細胞へ化している者
・牛乳の経口免疫療法を中止してから 6 ヶ月の抗原提示解析
OVA 特異的 TCR トランスジェニックマウスで以内の者ある OT-I マウスから CD8+ T 細胞 (OT-I 細胞)

・何らかの免疫療法を行っている者

を、OT-II マウスから CD4+ T 細胞 (OT-II 細胞)・心疾患、肝疾患、腎疾患などがあり、現在治をそれぞれ単離し、eFluor 670 にて蛍光標識し療中の者

た後、C57BL/6 マウスに移入した。これらマウス・気管支喘息、アトピー性皮膚炎があり、現在の 除 毛 背 部 皮 膚 に OVA-HG (200 g or 1

コントロール不良の者

mg/patch) を貼付した。対照群には OVA 溶液

２）経皮免疫療法(20 g/100 L) を皮下注射した。3, 4, 5 日後にこ組み入れ基準を満たした患者に、1 mg MPC-

れらのマウスから dLN 細胞を調製し、フローサ

HG を夕刻の入浴後から翌朝起床後までの 12 時

34

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

間、健常皮膚に連日貼付した。貼付スケジュール

OVM-HG 群のほうが PL-HG 群より有意に大きは、1 mg MPC-HG を医師観察下で 1 時間貼付、かった。この試験において保存されていた治療前、副反応がないことを確認後、自宅で貼付継続した。

治療後 12 週、24 週、36 週、48 週における血清

治療期間中は患者が日誌で貼付部位の皮膚状態、検体を用いて、Th2 マーカーである TARC およ

その他の症状を記録するとともに、医師が 8 週毎

び高感度の特異的抗体測定法である DCP チップに貼付部位の状態を観察、二重盲検プラセボ対照法による OVM 特異的 IgE, IgG1, IgG4 抗体を測負荷試験 (DBPCPC)、採血を行った。治療は閾値定した。

レベルの上昇が確認されたときに完了とし、重大F.

な有害事象が発生した場合、牛乳またはカゼイン

経皮アジュバント候補物質のスクリーニンに特異的な IgE の急激な上昇が認められた場合、

グ
１）皮膚細胞における Toll-like receptor (TLR)

あるいは 24〜48 週間以上の治療後に閾値レベルの上昇が達成されなかった場合、は治療を中断しの発現解析た。閾値上昇に成功した被験者は、閾値に従ってマウス除毛背部皮膚と耳介皮膚から酵素処

牛乳の経口摂取を開始した。

理によって表皮細胞懸濁液および真皮細胞懸(主要評価項目)

濁液を調製した。各種蛍光標識抗体で染色した細胞をフローサイトメトリー解析した。

・治療前後における経口負荷試験閾値の変化

２）経皮アジュバント活性の評価

・安全性および有害事象

C57BL/6 および BALB/ｃマウスの除毛背部(副次評価項目)

皮膚に OVA (100 g) と各種アジュバント候補・治療前後における特異的 IgE, IgG, IgG4 抗物質 (Table 1) の混合溶液を装填した HG を 2

体価

週間隔で 3 回貼付した。本実験で用いたアジュ
E.

重症鶏卵アレルギー患者に対する経皮免疫

バント候補物質の用量は、感染症ワクチンやが療法における治療反応性予測マーカーの探んワクチンの基礎研究で用いられている投与索量を参考に設定した。経時的に血清中 OVA 特2017-18 年度に貴財団研究助成を受けて実施

異的 IgG, IgG1, IgG2a, IgG2c, IgE 抗体価を測定した。

した重症鶏卵アレルギー患者に対する経皮免疫療法のランダム化プラセボ対照比較試験 (パイTable 1. TLR ligands as adjuvant candidate applicable for EPIT using HG.

ロット試験) では 22 名が登録され、11 名にTLR ligand

Description

M.W.

Dose

Target TLR

Pam3CSK4

Synthetic mimic of bacterial lipopeptide

1500 Da

20 g

TLR1/2OVM-HG、11 名にプラセボ (PL) HG が割り付

LTA-SA

Lipoteichoic acid from Staphylococcus aureus

4000 – 8000 Da

100 gTLR2Poly I:C

Synthetic analogue of double stranded RNA

1500 – 8000 Da

50 g

TLR3

けられ、24 週間の治療が行われた。その結果、24

Imiquimod

Small molecule agonist

240 Da100 gTLR7

K3

Synthetic CpG-oligodeoxyribonucleotide

6300 Da

20 g

TLR9

週の時点で経口負荷試験閾値の変化量 (上昇) は35

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

G. OVA アレルギーモデルマウスと HG を用い

MAS683、グリセリン、界面活性剤、低分子量た経皮免疫療法治療モデル

ポリビニルピロリドン、を混合均一化し、乾燥後OVA 特異的 IgE トランスジェニック (Tg) マの厚さが 150 m となるよう PET フィルム上にウスの耳介皮膚に、片耳ずつ交互に 3 日間隔で 2塗布して 80C、30 分乾燥させた。

ヶ月間免疫治療した。EPIT 群では OVA 10 g を４）高分子物質および低分子物質の新規 HG 表

装填した HG を 6 時間貼付し、SCIT 群では OVA

面での挙動評価

0.1 g を皮下注射した。経時的に血清中 OVA 特

分子量 10,000 の FD10 (FITC 標識デキストラ

異的 IgG および IgE 抗体価を ELISA にて測定

ン) の水溶液を粘着層表面に滴下し、24 時間後、するとともに、耳介皮膚の局所反応および厚さをHG 断面の蛍光顕微鏡浸透性を評価した。また、評価した。背部皮膚を除毛した BALB/c に免疫治

分子量 829 の食用赤色色素 14 号の水溶液を粘着療後の血清を 10 倍希釈して皮内投与し、1%

層表面に滴下し、24 時間後、HG 断面の光学顕微

Evans Blue と 1 mg OVA の混合溶液を静脈内投鏡観察を行った。

与することで、受動的皮膚アナフィラキシー

５）吸水率測定(PCA) 誘発試験を実施した。また、治療後 OVA-

現行 HG と新規 HG を湿度 100%の環境に 24

IgE Tg マウスに 100 g OVA を静脈内投与する

時間放置した後、重量変化を測定してパッチの吸ことによるアナフィラキシー誘発試験を実施し水性を評価した。

た。
結果と考察
H. 新規 HG の探索・開発

A.

１）基剤の選択

アレルゲン装填 HG の作製および長期安定性試験

親 水 性 ア ク リ ル 粘 着 剤 2 種 (MAS683 とHG は、皮膚を傷つけることなく微量のアレル

MASCOS10) を用いて、グリセリンおよび界面

ゲンを皮膚内に送達し、アレルゲン特異的な免疫活性剤を添加して 2 種の新規 HG を作製した。

応答を誘導できる画期的なパッチ製剤である 1)

MAS683 は親水性モノマーとしてビニルピロリ(Fig. 1)。親水性アクリル系粘着剤をベースに、医ドンを有する。一方 MASCOS10 は親水性モノマ

薬品や化粧品などで使用されている安全性の高ーとしてアクリル酸を有する。

い基剤を混合して作製されており、厚さが約 200

２）添加剤の選択

m と薄く柔軟であるため皮膚表面に密着・追随

粘着物性を損なわない範囲でより水吸収性とすることができる。HG の皮膚粘着面にアレルゲ

水拡散性を向上させるため、各種親水性物質の添ン溶液を滴下すると、水は蒸発あるいはゲル内部加を検討した。

に浸透し、高分子のアレルゲンが HG 表面に濃縮

３）新規 HG の作製される。これを皮膚に貼付するだけで角質層が水36

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

和・膨潤し、アレルゲンが角質層下へと徐々に送(A)
Elution percentage to loaded dose

達される 2)。
EPIT において継続的に使用するアレルゲン装填 HG には長期間保存した際の品質安定性が求められる。臨床研究用 OVM-HG (1 mg あるいは

120
100

0.1 mg OVM/patch) は、保存 1 ヶ月後までは安

80
60

40
20

0

2 weeks

1 month

2 months

3 months

6 months

1 year

3 years

5 years

Storage period

定に OVM を溶出できたが、さらに保存を続ける

MPC-specific IgG antibody titer(Reciprocal log2 titer)(B)と OVM 溶出率が徐々に低下するとともに離型フ
ィルム側への OVM 吸着が認められた (Fig. 2)。
したがって、現状の臨床研究用 OVM-HG は 1 ヶ月以上の保存が難しく、さらなる長期保存を可能

14

12

10

MPC solution prepared at the time of use

8

MPC solution eluted from 1 year-stored MPC-HG

<6
0

1

2

3

4

Weeks after initial immunizationとするには HG 構成基剤あるいは OVM 装填方

Fig. 3. Stability of MPC-containing HG over long-term storage. (A) A dissolution test and protein
quantification was performed for MPC-HG. Dissolution rate was calculated for MPC-loaded in HG as 100%.
Data are expressed as mean  SEM of results from three MPC-HG. (B) Solution eluted from the MPC-HG
stored for 1 year was used to subcutaneously immunize DBA/2 mice at 100 g/100 l. As a control, DBA/2
mice were similarly immunized with MPC solution prepared at the time of use. MPC-specific IgG titer in serum
samples were measured by ELISA. Data are expressed as mean  SEM of results from three mice.

法の最適化が必要と考えられた。

B.

OVA-HG の安全性試験
モルモットは皮膚炎を起こしやすくアレルギ

ー誘発率が高い実験動物として知られている。
Placebo HG を連日貼付したモルモットにおいて臨床研究用 MPC-HG (1 mg MPC/patch) は、は、投与 14 日目まで貼付部位の耳介皮膚に目立保存 1 年後までほぼ 100%の MPC 溶出率を示しった外観所見は認められなかった。一方、OVA-

た (Fig. 3A)。また 1 年保存した MPC-HG から

HG を貼付したモルモットは耳介皮膚を掻き毟

の溶出液は、マウスにおいて用時調製した MPCり、貼付 5 日目から徐々に赤く腫上がり糜爛し溶液と同等の MPC 特異的抗体価を誘導できた

た。OVA-HG 貼付群の 14 日目における血清中(Fig. 3B)。これらの結果から、臨床研究用 MPC-

OVA 特異的 IgG 抗体価は、連日 OVA を皮下投

HG は少なくとも作製から 1 年後までは MPC の与した群と同等の誘導が認められたのに対し、免疫原性を維持したまま安定に保存できる製剤

OVA 特異的 IgE 抗体価は皮下投与群と比較してであることが確認された。

OVA-HG 貼付群では明らかな低値を示した。これらのモルモットに OVA 溶液を静脈内曝露した
ところ直腸温度が速やかに低下し、皮下投与群においては 4 匹中 2 匹が、OVA-HG 貼付群では3 匹中 2 匹が死亡した。これらの結果から、ア37重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

レルゲン装填 HG を同一部位に貼付し続ける、

影響を与えなかったが、皮膚常在性 APC サブセ

あるいは傷害された皮膚に貼付することで、アット (LC、CD207+ dDC、CD207- dDC) のポピ

レルゲンを皮下注射し続けた場合と同様にアレュレーション比を有意に増大させた。これらの現ルギー感作に至ることが示された。したがっ象は、OVA を装填していない HG を貼付したマて、アレルゲン装填 HG を用いた EPIT のヒトウスでも同様に認められた。一方、皮下注射免疫への適用においては、安全性に配慮した貼付部

したマウスにおいてはいずれの APC サブセット

位の選択とスキンケアの併用が重要であると考もポピュレーション比に変動を認めなかった。しえられた。

たがって、HG を用いた EPIT は、SCIT と比較して皮膚常在性 APC サブセットの dLN への遊C.

HG を用いた EPIT の免疫応答特性

走を亢進することが明らかとなった。

OVM-HG を貼付したマウスの血清中 OVM 特AF647/OVA-HG を貼付したマウスの dLN に異的 IgG 抗体価は、皮下注射群と同様に免疫回おいては、6 時間後から 12 時間後にかけて数の増加に伴って上昇した。皮下注射群において

AF647/OVA を捕捉した皮膚常在性 APC サブセ

は免疫 3 回後に OVM 特異的 IgE 抗体価が急激ットである LC、CD207+ dDC、および CD207-に上昇したのに対して、OVM-HG 群では緩やか

dDC の増加が認められた。また、リンパ節常在性な上昇を認めたのみであり、IgG 抗体価に対するAPC サブセットにおいても AF647/OVA 捕捉細IgE 抗体価の比は一定に保たれていた。また、こ胞数の増加が検出された。一方、AF647/OVA をれらのマウスから調製した dLN 細胞を OVM で

皮 内 注 射 し た マ ウ ス で は 、 dLN に お け る

再刺激したところ、皮下注射群では IL-2、IL-10、

AF647/OVA 捕捉 APC サブセットは 2 時間後に

IL-13 といったサイトカイン産生が検出されたのは増加しており、その後減少するプロファイルをに対して、OVM-HG 群においてはいずれも低値示した。皮下注射投与群では dLN におけるいず

あるいは検出限界以下を示した。これらの結果をれの APC サブセットにおいても AF647/OVA 捕まとめると、バリア機能が保たれた皮膚への HG

捉細胞数の顕著な増加は認められなかった。これを用いたアレルゲン投与は、皮下注射法と比較しらの結果から、EPIT に伴う免疫反応においては、てアレルゲン特異的 IgE 抗体や Th2 型サイトカ

dLN においてアレルゲンを捕捉した APC が惹起

インの産生を低く抑えることが可能であり、免疫する免疫イベントの寄与が SCIT による免疫反応

療法における副反応誘発リスクを低減できるとよりも大きいことが示唆された。さらに HG によ考えられた。

って皮膚内送達されたアレルゲンのプロセッシ

OVA-HG による経皮免疫は、dLN におけるリング経路は、① 皮膚組織においてアレルゲンをンパ節常在性 APC サブセット (CD8+ DC, pDC,

捕捉した皮膚常在性 APC サブセットが dLN へ

その他の CD11c+ cells) のポピュレーション比にと遊走し、その後リンパ節常在性 APC サブセッ

38

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

トにアレルゲンを受け渡している可能性、あるい発達する乳幼児期においてカルシウム不足は、骨は② 輸入リンパ管を通って皮膚から dLN に流や歯の成長に影響が大きい 3)。牛乳アレルギー患

れ込んできたアレルゲンを各種 APC サブセット

児を持つ親は、代替食により不足栄養素を補ってが捕捉している可能性、が考えられた。これら二いるものの、時間的・身体的・費用的な問題もあつの可能性のうち寄与の大きな経路を同定する

り親の QOL 低下を招きかねない。
本研究では、ヒトにおける EPIT の安全性・有ため、各 APC サブセットを枯渇できる遺伝子改用性を評価するため、重症牛乳アレルギー患児を変マウスを用いた検討を計画している。
OT-I 細胞を移入したマウスに OVA-HG を貼付対象とした探索的臨床研究を実施した。試験開始

したところ、OT-I 細胞の OVA 特異的分裂増殖は時における患児の臨床的特徴を Table 2 に示した。

OVA 皮下注射群と同様にほとんど認められなか

MPC-HG 貼付に伴い、蕁麻疹や発赤など局所のった。一方、OVA-HG を貼付した OT-II 細胞移皮膚症状は認められたものの、アナフィラキシー

入マウスでは、OVA を皮下注射した群と比較しショックなど重篤な副反応は全例において認めて移入 OT-II 細胞の分裂増殖が亢進しており、なかった。さらに EPIT 実施により、8 例中 4 例

EPIT が SCIT よりも抗原特異的 CD4+ T 細胞へ

においてアレルギー症状誘発閾値が上昇し、牛乳の抗原提示と活性化を促進することが示唆され

3 mL 以上を経口摂取することが可能となった

た。

(Fig. 4)。これは、タンパク量で牛乳 3 mL に相当
するバターを摂取できることを示し、バターの含

D. 重症牛乳アレルギー患児に対する MPC-HG

まれる多くの食品を経口摂取できるようになったことから大幅な QOL 改善につながったと考えを用いた経皮免疫療法
本邦において牛乳アレルギーは、鶏卵に次いでられ、EPIT の有効性が示された。これらの患児罹患者数が 2 番目に多く、乳幼児期に最も発症率においては、OIT に移行し継続的に治療を続けたが高い。牛乳アレルギーは、牛乳タンパク質に含ところ、100 mL 近くの牛乳を飲むことが可能とまれるカゼインが主要アレルゲンであり、これはなった。さらに milk、-lactalbumin (ALA)、-加熱処理をしてもアレルゲン免疫原性は変化し

lactoglobulin (BLG)、casein 特異的 IgE 抗体価ない。チーズやヨーグルトの発酵食品であってもは、EPIT 実施後緩やかに低下傾向を示し、一方、カゼインの免疫原性は変化しないため、牛乳アレ

ALA、BLG、casein 特異的 IgG 抗体価およびブ

ルギー患児は多くの乳製品を摂取することがで

ロック抗体として機能する IgG4 抗体価の上昇傾きない。牛乳アレルギーは、乳幼児期 (0 歳) に向が認められた。したがって EPIT は OIT が困

発症率が高く、その後加齢に伴い自然寛解するケ

難な重症アレルギー患児への導入部分としてもースが多いものの、牛乳アレルギー患児のカルシ

非常に効果的であり、OIT への移行を可能にする

ウム摂取量は健常児の半分以下であり、最も体が手段であると考えられる。

39

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

かに正常状態に戻ることが示された。
これらの探索的臨床研究のデータは、HG を応用した EPIT が簡便な食物アレルギー根治療法として非常に有望であることを示唆するとともに、試験中止につながった副反応を軽減するアプ
ローチを導入することができれば、本療法の恩恵にあずかる食物アレルギー患児を大幅に拡大できる可能性を示唆した。

E. 重症鶏卵アレルギー患者に対する経皮免疫療法における治療反応性予測マーカーの探索
24 週の治療後に負荷試験閾値が卵白 2 g 以上となった 7 例と 2 g を越えなかった 15 例で比較すると、12 週と 24 週の血清 TARC 値は閾値上
昇群で有意に高値であった。TARC の変動と閾値の間では有意な関連はみられなかった。本試験では試験期間中、アトピー性皮膚炎コントロールのためステロイド外用剤のプロアクティブ療法を行い、皮疹がほとんどない状態を維持できていたことより、血清 TARC 高値はアトピー性皮膚炎
残念ながら 32 週目において特異的 IgE 抗体価の状態を示さず、免疫療法による個体の免疫応答に著しい上昇が認められた 2 例 (ID 3, ID 7)、を反映している可能性が考えられた。

MPC-HG 貼付部位の蕁麻疹が頻回となった 1 例

次に、高感度の DCP チップ法で特異的抗体を(ID 6)、閾値の改善効果が得られなかった 1 例

測定したところ、特異的 IgE は有意な変動を示さ(ID 8) において本試験を中止した。milk および

なかったが、特異的 IgG および IgG4 はそれぞれ

casein 特異的 IgE 抗体価が急上昇した症例にお12 週、24 週に有意に上昇した。しかし、治療後いては、試験中止後特異的 IgE 抗体価の速やかなの負荷試験の閾値上昇の程度と IgG1、IgG4 抗体

減少を示した。以上のことから、EPIT の実施にの変化には明らかな関連は認められず、治療反応

より局所の皮膚反応やアレルゲン特異的抗体価性のマーカーとしては、さらなる検討が必要と考の上昇などの副反応が生じることも明らかとなえられた。

り、HG の使用を中止することでその症状は速や40

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

F. 経皮アジュバント候補物質のスクリーニン
グ
アレルゲン免疫療法は、治療が長期間に及ぶとともに時にアナフィラキシーショックなど重篤な副反応を誘発するなど、患者負担の大きな治療法であり、アレルゲン用量・投与回数・投与期間の低減と安定した免疫応答の保証が望まれてい

C57BL/6 マウスおよび BALB/c マウスに各種る。これらの問題を解決する方策として、免疫応

アジュバント候補物質を併用した OVA-HG を用

答を増強・修飾できるアジュバントの併用が挙げ

いて経皮投与すると、OVA 特異的 IgG 抗体価はられる。アジュバントを適用した HG 製剤の開発

すべてのアジュバント併用群において OVA 単独には、経皮投与によってアジュバント活性を発揮

群よりも高値を示し、またマウス系統間での差異できる候補物質を新たに探索・同定し、得られたは認められなかった。これら OVA 特異的 IgG 抗候補物質の安全性・有効性評価と活性機序の解明

体のサブクラス解析を行ったところ、OVA 単独を図る必要がある。本研究では経皮アジュバント

群は IgG1 抗体 (Th2 型 IgG サブクラス) のみが候補物質として、自然免疫と獲得免疫のクロスト

検 出 さ れ た の に 対 し て 、 Poly I:C 併 用 群 とークに重要な TLR を標的とするリガンド分子にImiquimod 併用群では BALB/c マウスにおいて着目した 4),5)。

Th1 型 IgG サブクラスの IgG2a が検出され、K3

まず、マウス皮膚細胞における TLR の発現を併用群では両マウス系統において Th1 型 IgG サ

解析したところ、APC として機能する LC およブクラス (IgG2c および IgG2a) の抗体価上昇がび dDC には TLR1 から TLR9 まで全ての TLR認められた。さらに OVA 特異的 IgE 抗体価は、発現が確認された (Fig. 5）。ケラチノサイトにおPam3CSK4 併用群、LTA-SA 併用群、Imiquimod

いては TLR3、7、8、9 の僅かな発現が認められ併用群において OVA 単独群よりも高値を示し、た。皮膚は病原体の侵入を防ぐ物理的バリアを構Poly I:C 併用群および K3 併用群では OVA 単独築しているだけではなく、病原体を排除する免疫群と同レベルであった。以上の結果をまとめると、学的バリアも備えており、皮膚に存在するこれら

Poly I:C (TLR3 ligand) お よ び K3 (TLR9の細胞が TLR を介して病原体の侵入を迅速に察

ligand) は、HG を応用した EPIT におけるアレ

知し、自然免疫の誘導を促していると考えられる。

ルゲン用量・投与回数・投与期間の低減が見込め

したがって、今回発現が認められた TLR に対す

るのみならず、アレルギー患者の Th2 型に傾いるリガンドを HG 製剤に適用することで、経皮アた免疫応答を Th1 型に偏向できる可能性をも有ジュバント効果が発揮されるものと予想された。

するアジュバントとして有望であると考えられた。

41

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

G. OVA アレルギーモデルマウスと HG を用い

H. 新規 HG の探索・開発
現行の HG は親水性アクリル樹脂を主剤とし、た経皮免疫療法治療モデル
OVA-IgE Tg マウスに EPIT および SCIT を実

グリセリンその他の低分子化合物を含むもので施したところ、SCIT 群の OVA-IgE Tg マウスである。アレルゲンの表面濃縮に優れ、食物アレルは血清中 OVA 特異的 IgG 抗体価が 3 週間で上昇

ギーに対する経皮免疫療法用デバイスとして多し始めたのに対し、EPIT 群では 4 週間後から抗くの薬理試験および臨床研究の用途に供されて体価の上昇が認められた。一方、OVA 特異的 IgE

きたが、本経皮免疫療法の臨床試験第 I 相への進

抗体価は両群ともに治療による影響を受けなか展をスムースにサポートするためには以下の課った。また、Th2 サイトカインである血中 IL-4

題に対する解決が望まれる。

濃度は SCIT 群・EPIT 群ともに無治療群と比較(1) 現行の HG ではアレルゲン水溶液を塗布しして低下が認められた。SCIT 群では、頻回のて乾燥させるまでの時間が長く、自動化およOVA 注射投与により耳介皮膚の炎症や肥厚が観び大量生産のためには改良が必要である。

察されたのに対し、EPIT 群では皮膚刺激性・傷(2) 現行の HG の支持体、離型フィルムを含めた害性は認められなかった。以上の結果から、HG

全体仕様は、クリーンブースでの手作業を意

はアレルゲン特異的 IgE 抗体価が高値に維持さ識したものであり、大量生産のためにはよりれた状態でも貼付部位皮膚に重篤な局所反応を

ふさわしい仕様とすることが必要である。

誘発することなく、SCIT と同様にアレルゲン特(3) 組成物として医薬品経皮投与実績を有する異的 IgG 抗体の産生を誘導することが示された。

添加剤のみからなる新しい親水性ゲルとす

免疫治療後の血清を回収して PCA 試験を実施しることにより、近い将来予想される正式の臨たところ、血清 10 倍希釈での Evans Blue 漏出床試験第 I 相への進展をよりスムースにする。

面積は SCIT 群で増加し、EPIT 群では減少が認

そこで今回、これらの条件を具備した臨床試験められた。免疫治療を実施した OVA-IgE Tg マウ

用 HG の大量安定供給を見据えた新たな HG のスに 100 g OVA を静脈内投与すると、無治療群開発に取り組んだ。

および EPIT 群と比較して SCIT 群では直腸温の

親 水 性 ア ク リ ル 粘 着 剤 2 種 (MAS683 とより大きな低下が認められた。これら OVA-IgE

MASCOS10) のいずれを用いた新規 HG も粘着

Tg マウスを活用した免疫治療モデルの結果から、物性は良好であった。HG を水中に浸漬して吸水

HG を用いた EPIT は従来の SCIT と比較して安率を測定したところ MAS683 のほうが優れてい

全性に優れる新規アレルゲン特異的免疫療法とたため、以降の検討で MAS683 を基剤として使して有望であることが示された。今後、本モデル用することとした。また添加剤としては、グリセの最適化検討を進めるとともに、HG を用いた

リンおよび界面活性剤以外に低分子量ポリビニ

EPIT の奏効機序の解析へと展開する予定である。

ルピロリドンを含有する組成がバランスの取れ

42

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得た粘着剤となることを見出し、新規 HG 組成物とて、遺伝子発現変動を RNA-seq 解析により、した。

アレルゲンの動態・局在・捕捉細胞を Flow

新規 HG は、高分子物質である FD10 を粘着

cytometry 解析あるいは蛍光イメージングに層の表面に濃縮することができ、低分子物質であより精査する。また、dLN 中における免疫イベ

る色素は粘着層の表面から全体に浸透させるこ

ントを健常マウスにアレルゲン装填 HG を貼とができた。また、現行 HG とほぼ同等の吸水性付した場合と比較検討する。これらの結果から能を有しており、物性的にも近似していた。今後、EPIT による減感作・脱感作に寄与すると考え薬理的評価を含めてさらに性能評価を行い、臨床られる免疫細胞あるいは免疫機能分子につい試験用の最終製剤へと完成させる予定である。

て、各種遺伝子改変マウスを用いた手法を組み合わせてより詳細な機能解明を進める。
(3) HG を用いた EPIT の大規模臨床研究

今後の研究活動について(1) 食物アレルギーモデルマウスにおける HG

本研究では重症牛乳患児に対するパイロッを用いた EPIT の有効性評価

ト試験において、摂取閾値上昇の効果およびブ

食物アレルギーモデルマウスの作成条件のロッキング抗体とされる特異的 IgG4 抗体の上最適化を継続するとともに、本モデルにおける昇効果を確認できた。また、重症鶏卵アレルギ

アレルゲン装填 HG を用いた EPIT による有ーに対するパイロット試験においても同様の効性を血中 sIgG/sIgE タイター比測定、経口負有効性が認められている。これらの結果は、HG

荷試験におけるアナフィラキシー誘発閾値評を応用した EPIT の大規模臨床試験を実施す

価 (体温変化、糞便観察)、経口負荷後の各種免る妥当性を示しており、今後は臨床研究法に則

疫学的パラメーター解析 (血中ヒスタミン値

った特定臨床研究として多施設でより多数例

変化、血中 TARC 値変化、肥満細胞・好塩基球の実施が望まれる。大規模臨床研究を行うための頻度・活性化状態、制御性 T 細胞の頻度、なには、アレルゲン装填 HG の大量生産体制の確ど) に基づいて検証する。また、EPIT の有効

立や総合賠償責任保険・普通傷害保険などに多性に対するアレルゲン用量ならびに貼付スケ

額の費用を要するため、十分な研究費を獲得す

ジュールについても検討する。ヒト食物アレルる必要がある。

ギーに近いモデルを確立することで前臨床研究をさらに推進し、早期の GLP 試験への展開

参考文献
Ishii Y, Nakae T, Sakamoto F, Matsuo K,を目指す。

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食物アレルギーモデルマウスにアレルゲン

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43

重症食物アレルギーに対する経皮免疫療法の実用化に向けた非臨床・臨床 POC データセットの取得

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SimeoniU,

BriendA.

Nutritional44

ソバアレルゲンの特性改変に効果的な手法の探索

研究課題名

ソバアレルゲンの特性改変に効果的な手法の探索

フリガナ

サトウ

代表者名

佐藤

リエ
里絵

所属機関（機関名）国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 食品研究部門（役職名）上級研究員
氏

共同研究者

名（フリガナ）

近藤康人（コンドウヤスト）
手島玲子（テシマレイコ）

所属機関・役職名

役割分担

学校法人 藤田学園 藤田 ソバアレルギー患者の診断・医 科 大 学 ば ん た ね 病 院 問診、収集した血清の抗体価
小児科 教授の調査
学校法人 加計学園 岡山
ソバアレルゲンコンポーネン
理科大学 獣医学科 食品
トの消化性試験
衛生講座 教授

本 助 成金 によ る 発
国際誌への投稿に向け準備中である。
表論文，学会発表

研究結果要約ソバ（Fagopyrum esculentum Moench）はアミノ酸バランスの良い（アミノ酸スコア 100）タンパ
ク質や、脂質、食物繊維、ビタミン、および抗酸化作用等を持つルチンの豊富な作物である。一方でソバは、ごく微量でアナフィラキシーなど重篤な症状を引き起こすことから、日本では特定原材料として加工食品への表示義務が課されている。ソバは日本だけでなく世界各地で食べられている食品であり、
ソバアレルゲンの低減は重要な課題である。ソバアレルギーの原因物質であるソバアレルゲンはすでに複数同定されている。我々はアナフィラキシーの原因アレルゲンであるとの報告のある Fag e 2 について解析を進めてきており、一部のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換すると消化耐性が低下することを示すとともに、エピトープ配列の同定を行ってきた。本研究では、ソバアレルゲンと、症状およびソバ特異的 IgE 抗体価との関連性を調査し、Fag e 2 と BW10kDa との両方に結合活性を示す患者血清
は、比較的高いソバ特異的 IgE 抗体価および重篤な症状を示すものであることがわかった。また、そば
乾麺を調理した際、調理後のアレルゲンの消化性が変化する可能性を示した。今後、これらのアレルゲ
ンのアレルギー誘発性を明らかにすることで、ソバアレルギーのより正確な診断や低アレルゲン食品の開発、ならびに低アレルゲン品種の作出に貢献したい。

45

ソバアレルゲンの特性改変に効果的な手法の探索

研究目的を持つルチンも豊富な食品である。一方でソバは、

現在、患者が食物アレルギーを引き起こさない

ごく微量でアナフィラキシーなど重篤な症状をようにする方法は、原因食品の摂食を避けること、引き起こすことから、日本では特定原材料としてである。我々が避けるべき原因食品を知るために加工食品への表示義務が課されている。また、ソは、正確な診断が必要とされる。近年、食物アレ

バアレルギーは寛解されにくいことが知られてルギーの原因物質である食物アレルゲンに関し、いる。

1 種類の原因食品には複数のアレルゲンが含まれソバアレルゲンはすでに複数同定されており 1,

ること、患者によって反応するアレルゲンが異な

2)、Fag e 2 はアナフィラキシーの原因アレルゲ

ること、および、どのアレルゲンに反応するかにンであるとの報告がある 3)。我々は Fag e 2 につよって症状に差異が生じることがあること、など

いて解析を進めてきており、一部のアミノ酸残基が明らかになってきた。そこで、個々のアレルゲを他のアミノ酸残基に置換すると消化耐性が低ン（アレルゲンコンポーネント）を同定すること

下することを明らかにするとともに、エピトープと、それぞれがどのような症状の原因アレルゲン

配列の同定を行ってきた 4, 5)。本研究では、①ソであるか関連付けることが、より正確な診断に繋バアレルゲンと症状およびソバ特異的 IgE 抗体

がると期待され、症状と関連付けられたアレルゲ

価との関連性、②調理加工等がソバアレルゲンのンコンポーネントに対する特異的 IgE 抗体価を消化性に及ぼす影響、③Fag e 2 における変異が測定する食物アレルギー検査である Component

消化性・アレルギー誘発性に及ぼす影響、を解明

Resolved Diagnosis (CRD) の確立が進んでいる。

し、ソバアレルゲン改変を目指す。本研究で得ら

実際、小児に症例の多い乳や、重篤な症状で知られる成果は、ソバアレルギーの CRD の確立や低れる小麦や落花生で CRD を実施し、従来の検査

アレルゲン食品の開発、低アレルゲンソバ品種の法のみの場合と比べ、さらに正確な診断を行うこ作出に貢献すると期待される。

とができることが示されてきている。また、CRD
による検査結果を踏まえ、アレルゲンコンポーネ

研究計画及び研究手法

ントを低減できる加工・調理法の確立やテーラー①

ソバアレルゲンと症状との関連性

メイド低アレルゲン食品の開発、またアレルゲン

症状の履歴やソバ特異的 IgE 抗体価の明らかコンポーネントを欠失・低減した作物品種の育成

な血清を用い、ソバアレルゲンの中でも Fag e 2、に対するニーズも高まっている。

BW10kDa、および Fag e 4 に注目し、これらア

ソバ（Fagopyrum esculentum Moench）はタ

レルゲンと症状およびソバ特異的 IgE 抗体価とデ科ソバ属に属する作物で、アミノ酸バランスのの関連を調査する。方法としては、これまでにソ

良い（アミノ酸スコア 100）タンパク質を含み、バアレルギーに関連して我々が収集した血清と、脂質や食物繊維、ビタミン、および抗酸化作用等

ソバから抽出したタンパク質画分とを用いたウ46

ソバアレルゲンの特性改変に効果的な手法の探索ェスタンブロットにより、各患者血清とソバタン

法はヒト FcεRI を発現させたラット培養マスト

パク質画分中のタンパク質との反応性を確認す

細胞株（RS-ATL8）の転写因子（NF-AT）活性化

る。

をルシフェラーゼアッセイにて検出する in vitro試験法で、高感度・高特異性で、より臨床に近い②

調理加工等がソバアレルゲンの消化性に及形で FcεRI の架橋によるマスト細胞活性化を測ぼす影響定できる。本研究では、-80℃で保存可能な患者血

アレルゲンは分子量や含有量、消化性などの性

清中 IgE と、Fag e 2 変異体との反応性を EXiLE

質がそれぞれ異なる。また、消化性は熱や圧によ法で検出し、Fag e 2 のエピトープのどのアミノり変化する場合がある。そこで、ソバアレルゲン

酸残基がアレルギー反応の惹起に影響するか調としてすでに報告されているもののうち、Fag e

査する。

2、BW10kDa、および Fag e 4 に注目し、調理加工等の処理前後で消化性が変化するかどうかを結果と考察調査する。検出は、市販されているそば麺から抽

１）ソバアレルゲンと症状との関連性出したタンパク質画分と、Fag e 2、BW10kDa、

現在、一般に栽培・流通しているソバは、他殖および Fag e 4 の 3 種類のソバアレルゲンに対す性品種である。他殖性品種では、種子１粒ごとにる特異的抗体とを用いたウェスタンブロットに遺伝的背景が異なっている。本研究では、その他て行う。

殖性品種の１つであるキタワセソバ（③

Fagopyrum

esculentum

Moenchcv.

Fag e 2 における変異が消化性・アレルギー

Kitawase-soba）を材料として用いた。キタワセ

誘発性に及ぼす影響

ソバの種子複数粒を粉砕し、得られた粉末に

Fag e 2 は消化耐性を示すアレルゲンである 3)

milli Q で 2 倍希釈した 2×Laemmli Sample

が、Fag e 2 を構成するアミノ酸残基のうち、一

Buffer (BIO-RAD)を加え、Rotator を用いて 4℃部のシステイン残基を他のアミノ酸残基に置換にて転倒撹拌することで、タンパク質を抽出した。

すると、消化耐性が低下（消化性が向上）するこ得られたタンパク質抽出液は遠心し上清を取りとを我々はすでに報告している 4)。また、我々は分け、フィルターを用いてろ過後、ソバタンパク

すでに Fag e 2 のエピトープ配列を同定している質画分とした。得られたタンパク質画分のタンパ

5)。そこで、本研究では、Fag e 2 の IgE エピト

ク 質 濃 度は BCA Protein Assay Kit (Thermoープ配列を他のアミノ酸残基に置換すると消化

Fisher) を用いて測定し決定した。得られたタン性やアレルギー誘発性が変化するかを調査する。

パク質画分は電気泳動にて分離し、分離したタンアレルギー誘発性の調査に用いる EXiLE（IgE

パク質は PVDF 膜に転写した。転写後の膜は我々Crosslinking-induced Luciferase Expression）

が作成した Fag e 2、BW10kDa、あるいは Fag e

47

ソバアレルゲンの特性改変に効果的な手法の探索

4 特異的抗体を用いてウェスタンブロットに供し(ii)商品に記載されている調理法に従い茹でたもた。その結果、Fag e 2、BW10kDa、および Fagの（通常調理）、および、(iii)圧力鍋を用いて茹でe 4 特異的抗体との結合活性を示すバンドが観察たもの（高圧調理）、の 3 種類を準備した。通常されたことから、材料として用いたキタワセソバ

調理および高圧調理のそば麺は、凍結乾燥後、粉から抽出したソバタンパク質画分は、今回の検出

砕し、粉末とした。粉末からのタンパク質画分の対象である Fag e 2、BW10kDa、および Fag e 4

抽出は①と同様に行った。得られたタンパク質画を含んでいることがわかった。次に、この膜と、分は Takagi et al. (2003) 6)の方法に従い、消化試

我々がソバアレルギーに関連して収集した血清験に供した。消化試験後のサンプルは電気泳動にとを用いたウェスタンブロットを行った。その結て分離後、ゲルを coomassie brilliant blue 染色

果、各患者血清とソバタンパク質画分中のタンパ

および銀染色にて可視化するとともに、PVDF 膜

ク質との反応性はそれぞれ異なっていた。Fag eに転写し、Fag e 2、BW10kDa、および Fag e 4

2 および BW10kDa に結合活性を示す患者血清の 3 種類のソバアレルゲン特異的抗体を用いたは複数見られたが、Fag e 4 に結合活性を示す血ウェスタンブロットにて、Fag e 2、BW10kDa、

清は見当たらなかった。Fag e 4 との結合活性をおよび Fag e 4 を検出した。その結果、Fag e 4示す患者血清を見つけることができなかった理については、ほとんど検出できなかった。この原由の１つに、Fag e 4 の分子量が小さく、検出が因として、①の結果と同様、Fag e 4 の分子量がうまくできていない可能性があることが挙げら

小さく、検出がうまくできていない可能性があり、れる。次に、この結合活性と、各患者の症状およ検出系の改善の必要がある。また、Fag e 2 は、びソバ特異的 IgE 抗体価を比較したところ、Fag

乾麺と比べ、通常調理により消化性が高まる傾向

e 2 と BW10kDa との両方に結合活性を示す患者が見られたのに対し、BW10kDa は、通常調理で血清は、比較的高いソバ特異的 IgE 抗体価を示

は消化性が変化しない傾向が見られた。このことし、重篤な症状を示すものである可能性が示唆さは、BW10kDa は比較的消化耐性の高いアレルゲれた。

ンである可能性を示している。

２）調理加工等がソバアレルゲンの消化性に及

３）Fag e 2 における変異が消化性・アレルギー
誘発性に及ぼす影響

ぼす影響
消化耐性についてすでに報告されている Fag e①において、Fag e 2 と結合活性を示すことが2 のほか、消化性などの性質が不明な BW10kDa

わかった患者血清を用い、EXiLE 法にてアレルや Fag e 4 に注目し、調理加工等の処理前後で消ギ ー 誘 発 性 評 価 を 行 っ た 。 EXiLE 法 は化性が変化するかどうかを調査した。材料として、

Nakamura et al. (2010) 7)に従い行った。予備試

市販のそば乾麺を用い、(i)調理する前のそば乾麺、験として、キタワセソバから抽出したタンパク質48

ソバアレルゲンの特性改変に効果的な手法の探索

画分を EXiLE 法に供した。その結果、健常者血析を進めて行きたいと考えている。

清と比較して、ソバアレルギー患者血清の中に、
キタワセソバタンパク質の濃度依存的に反応性

参考文献を示す血清があることがわかった。次に、キタワ

1)近藤康人、宇理須厚雄、和田映子、鶴田光敏、

セソバタンパク質画分の代わりにリコンビナン

矢崎雄彦、山田一恵、増田進、森田豊. そば

ト Fag e 2 野生型を用いて同様の実験を行ったと

主要アレルゲンの Immunoblotting 法によころ、濃度依存的にリコンビナント Fag e 2 野生る検討. アレルギー. 1993; 42(2): 142-148.
2)型と反応性を示す血清は見られなかった。したがUrisu A, Kondo Y, Morita Y, Wada E,
Tsuruta M, Yasaki T, Yamada K, Kuzaya H,って、本研究の目的である、Fag e 2 における変異がアレルギー誘発性に及ぼす影響を評価する

SuzukiM,ことができなかった。

Identification of a major allergen of
buckwheat

Titani
seeds

K,
by

KurosawaK.

immunoblotting

methods. Allergy Clin Immunol News.

今後の研究活動について

1994; 6: 151-155.

Fag e 4 については、はっきりとした検出結果

3)を得ることができなかった。これについては、検Tanaka K, Matsumoto K, Akasawa A,
Nakajima T, Nagasu T, Iikura Y, Saito H.

出に用いるタンパク質濃度の改善や、検出系の検Pepsin-resistant 16-kD buckwheat protein

討・改良を行い、追試を行う予定である。また、

is

リコンビナント Fag e 2 を用いた Fag e 2 のアレ

associatedwithimmediatehypersensitivity reaction in patients with

ルギー誘発性評価ができなかった点については、

buckwheat

今回解析に用いた患者血清が Fag e 2 以外のアレ

Immunol. 2002; 129(1): 49-56.
4)ルゲンに結合することによりアレルギー誘発性

allergy.

Int

Arch

Allergy

Satoh R, Koyano S, Takagi K, Nakamura R,に関与している可能性、および、リコンビナント

Teshima R, Sawada J. ImmunologicalFag e 2 が native の Fag e 2 とは異なる立体構造

characterization and mutational analysisof the recombinant protein BWp16, a majorを取っている可能性が考えられ、さらなる検討がallergen in buckwheat. Biol Pharm Bull.

必要である。また、ソバは他殖性作物であり、あ2008; 31(6): 1079-1085.

る１つのソバ品種であっても、その中には複数の5)

遺伝的背景、すなわち変異を含んでいる可能性がSatoh R, Koyano S, Takagi K, Nakamura R,
Teshima R. Identification of an IgE-ある。したがって、今回解析に用いたリコンビナ

binding epitope of a major buckwheat

ント Fag e 2 が、今回解析に用いた患者血清の結allergen, BWp16, by SPOTs assay and

合できる配列を持っているかどうかについても

mimotope screening. Int Arch Allergy

検討し、Fag e 2 のアレルギー誘発性に関する解

Immunol. 2010; 153(2): 133-140.

49

ソバアレルゲンの特性改変に効果的な手法の探索

6)

7)

Takagi K, Teshima R, Okunuki H, Sawada

Nakamura R, Tsuge I, Urisu A, Teshima R.

J.

vitro

A convenient and sensitive allergy test: IgEdigestibility of food proteins and effect ofcrosslinking-induced luciferase expression

preheating on the digestion. Biol Pharmin cultured mast cells. Allergy. 2010;

Bull. 2003; 26(7): 969-973.

65(10): 1266-1273.

Comparative

study

of

in

Nakamura R, Uchida Y, Higuchi M,

50ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品成分との食べ合わ
せによるアレルギー発症予防研究課題名

ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品
成分との食べ合わせによるアレルギー発症予防

フリガナ

ミズノ

代表者名

水野

マサシ
雅史

所属機関（機関名）神戸大学大学院農学研究科（役職名）教授
氏
共同研究者

名（フリガナ）

榊原 啓之(サカキバラ ヒロユキ)

所属機関・役職名
宮崎大学農学部

役割分担
食品中の活性物質の分析と同定

本 助 成金 によ る 発
該当なし
表論文，学会発表

研究結果要約
近年、我が国において花粉症を始めとするⅠ型アレルギーの発症率は、年々増加の一途をたどっている。これまでにマコンブに含まれるフコイダンを経口摂取した時にのみ IgE との親和性が高いガレクチ
ン 9（Gal9）が血中に分泌されⅠ型アレルギーが抑制されることを明らかにした。しかしながら、コン
ブには健康被害を及ぼすヒ素（乾物重当たり約 53mg）が含まれており、過剰にコンブを摂取することは健康面からすると問題である。そこで本研究では、フコイダンと同時に摂取することでアレルギー抑制効果を増強させる食品を探索し、それに含まれる有効成分をポリフェノール類を中心に同定すること
でアレルギー予防が期待できるポリフェノールカクテルを選定し、Ⅰ型アレルギー予防に貢献できる食品の食べ合わせを提唱していくことを目的とした。その結果、野菜類ではネギおよびタマネギに、藻類ではノリからの抽出物に増強効果が認められた。そこで活性が認められた野菜とそうでない野菜類中の各ポリフェノール類を比較したところ、ポリフェノールカクテルの候補としてはケルセチンやケンフェ
ロールなどのフラボノール類が見出され、それらを豊富に含んでいる豆苗やオクラが列挙された。一方、
ノリ抽出物にも同様の相乗効果を示すことが本研究の一環から見出されたが、フコイダンとは全く違った抑制機構を介することによって抗アレルギー効果を相乗効果に示していることが明らかとなった。

51

ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品成分との食べ合わ
せによるアレルギー発症予防

研究目的

ギー抑制機構を提唱した。さらにフコイダンは感Ⅰ型アレルギーモデルである受動皮膚アナフ

作後のマウスに対してもアレルギーを抑制できラキシー（PCA）において、フコイダン経口摂取る事も明らかにし、これまで報告されているが耳介の浮腫を抑制すること、またその作用機序

Th1/Th2バランスを調整することでアレルギーはアレルギー発症において重要な働きをしていを抑制する食品因子とは異なった機能を備えたる IgE との親和性が高いガレクチン9（Gal9）が食品因子として意義のある物質であることを明

血中に分泌され、その結果肥満細胞と IgE との結らかにしてきた2)。このようにフコイダンを豊富合が阻害されるためであることを明らかにした1)。

に含むコンブを摂取することは、アレルギー発症

また、オボアルブミン（OVA）により感作されたの抑制あるいは予防において非常に有意義なこ

マウスにおいてもフコイダン経口投与によりアとに思われる。しかしながら、コンブには蓄積すレルギーが抑制されることも明らかにしてきた。

ると健康被害を及ぼすヒ素が含まれており、アレ

一般に花粉症や食物アレルギーに代表されるⅠ

ルギー予防を目的にコンブ摂取によって十分量

型アレルギー発症には、（１）樹状細胞によるアの Gal9分泌促すことは健康の面からすると問題

レルゲン認識、（２）ナイーブ T 細胞から2型ヘルが生じる。そこで本研究では、フコイダンと同時

パーT 細胞（Th2）への分化誘導、（３）B 細胞のに摂取することでアレルギー抑制効果を増強さ

IgE 産生へのクラススイッチ、（４）IgE と肥満せる食品を探索し、その食品に共通に含まれる成細胞の結合といった一連の反応系、いわゆる感作

分を同定することでアレルギー予防が期待でき状態、（５）再度のアレルゲン曝露による脱顆粒るポリフェノールカクテルの構築を目的とした。

によりアレルギーが発症すると言われている（下図参照）。このような発症経路の中で、OVA 感作

研究計画及び研究手法によるフコイダンの抗アレルギー効果について

研究計画
フコイダンを経口摂取すると血中に Gal9 が分

は、（４）の部分を阻害するという新規のアレル

泌され、この Gal9 が IgE と結合することでアレ
ルギーを抑制すること、経口摂取した場合のみアレルギーが抑制されること、アレルゲンに感作された後からフコイダンを摂取してもアレルギーが抑制されることなど、食事から摂取するのに適した機能性素材であることをこれまでに明らかにしてきた。しかしながら、その一方で人体に影響が懸念されるヒ素を含んでいるため大量に摂52

ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品成分との食べ合わ
せによるアレルギー発症予防

取することは好ましくないとされている。そこでたものをポリフェノール分析システム（HPLC-

本研究では，コンブとの食べ合わせにより、抗ア

PDA）に供し、構築したポリフェノールライブラ

レルギー作用の相乗効果が期待できるポリフェ

リーから活性物質を想定し、ポリフェノールカク

ノールカクテルを構築することを目的とした。そテル候補リストを作成する。この時、候補化合物のため以下の①と②の実験を計画した。

が未知成分である場合は、LC-MS/MS、NMR などの分析技術を駆使してその構造を同定する。ま

① PCA 試験を用いてフコイダンによる Gal9た必要に応じて、HPLC を用いた候補化合物の単分泌を促進する食品素材の探索

離・精製を行い、十分量の化合物を調整しカクテ

5 週齢、雌の BALB/c マウスに抗アレルギー効

ル用試薬として準備する。最後に、実験①から明果を示さない濃度（これまでの経験から 100

らかとなったポリフェノールカクテルを理想的μg/ml 以下であることが判明 1））のフコイダンとに含んでいる青果物を見出す。

共に青果物のホモジネートを同時に 4 日間、毎日胃内強制投与した後、抗 DNP-IgE を尾静脈より研究手法

投与し、その 30 分後に最初の耳介厚を測定した。

1.

フコイダン画分の抽出

さらに、その直後抗原（Ag）である DNP を耳介

基本的には Tanino ら 1)の方法に従った。具体に塗布し、2 時間後に再び耳介厚を測定した。こ

的には、液体窒素と共に乾燥マコンブをワーニンの刺激前後の耳介厚の差を IgE/Ag による浮腫とグブレンダーを用いて粉砕した後、凍結乾燥機をし、その差の増加度合いで抗アレルギー効果を判用いて凍結乾燥物を得た。次に凍結乾燥物に対し断した。また、血中の Gal9 分泌量については抗て 20 倍量の 0.1M 酢酸緩衝液（pH 4.6）を加えIgE 抗体を用いて免疫沈降法で IgE 画分を調整て、4℃で一昼夜撹拌抽出した。その後遠心分離し、その上で抗 Gal9 抗体を用いたウェスタンブ

（3,500 rpm、10 分)により、上清を採取し容量ロット法で検出して、組み合わせによる Gal9 分の半分になるまで減圧濃縮を行った。この濃縮液

泌促進効果を確かめる。これらの結果から、候補に 2 倍量のアルコールを加え再び一昼夜 4℃で保となる青果物を選抜する。共同研究者によって明存した後、遠心分離により残渣を回収しフコイダかとなったポリフェノール類から、一つずつ化合ン画分とした。

物を除いて同様の実験を行い、必要最小限のポリ
2.

フェノール類を明らかにする。

各野菜抽出物の調整
野菜中に含まれるポリフェノール類画分を抽出する方法は常法にしたがって抽出した 3)。市販② ポリフェノールカクテルの構築
実験①で効果のあった青果物エキスとなかっされている新鮮な各野菜を包丁で細かく刻み、液53ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品成分との食べ合わ
せによるアレルギー発症予防

体窒素で凍らせて乳鉢で粉末状に砕いた。その後、

ビノリ多糖画分とした。

凍結乾燥機を用いて乾燥させた。得られた凍結乾燥物に対して、20 倍量の 80％エタノールを加え4.

陰イオン交換クロマトグラフィーて 25℃で一晩振盪した。懸濁液を吸引ろ過して研究手法１で調整した画分を陰イオン交換ク得られたろ液を減圧濃縮してエタノールを完全ロマトグラフィーに供した。交換体としてはに蒸発させ、これを再び凍結乾燥させたものを野Toyopearl-DEAE 650M を用い、溶離液としては

菜抽出物とした。

0.05M Tris-HCl 緩衝液（pH 7.4）に 0.5M およ

また、野菜中に含まれるポリフェノールを同定

び 1.0M NaCl のステップワイズ方で溶出した。

するために、加水分解を実施した。具体的には、それぞれの画分は、フェノール硫酸法によって糖野菜の凍結乾燥物(50mg)を塩酸加水分解した後、含量を測定した。検量線には、フコースを標準物

酢酸エチル抽出した。

質として作成し、フコース当量で算出した。

3.

5.

ノリ多糖画分の抽出

受動的アナフラキシー（PCA）反応

凍結乾燥機を用いて乾燥ナラワスサビノリを

5 週齢、雌の BALB/c マウスに抗アレルギー効

乾燥させた後、ビーズショッカーで粉砕

果を示さない濃度（これまでの経験から（3,000rpm×10 秒）した。この乾燥粉末 1 g に100μg/ml 以下）のフコイダンと共に青果物のホ

対して 25 ml の蒸留水を加え室温で一晩攪拌抽

モジネートを同時に 4 日間、毎日胃内強制投与し出した後、遠心分離（3,500rpm×10 分)して沈殿た後、抗 DNP-IgE を尾静脈より投与し、その 30を回収した。この沈殿物に 1 回目と同量の蒸留水

分後に最初の耳介厚を測定した。さらに、その直を加えて室温で 1 時間攪拌した後、再び同条件で後抗原（Ag）である DNP-BSA を耳介に塗布し、遠心分離して沈殿を回収した。この沈殿を凍結乾2 時間後に再び耳介厚を測定した。この刺激前後燥し、50 倍量の 0.2％酢酸水溶液を加えて 50℃の耳介厚の差を IgE/Ag による浮腫とし、その差で一晩静置し、遠心分離（3,500 rpm、10 分)によの増加度合いで抗アレルギー効果を判断した。

って上清を回収した。回収液は、1M 水酸化ナト

Gal9 あるいは各種サイトカインの中和抗体によリウム水溶液を用いて pH を 7 に調整した後、2る耳介浮腫への影響を確認する際には、抗 DNP-

倍量の 100％エタノールを加えて 4℃で一晩遠攪

IgE を尾静脈から注射する１時間あるいは２時拌した後、遠心分離（3,500 rpm×10 分)した後

間前に、それぞれの中和抗体を１μg あるいは沈殿を回収し、100％エタノールで 2 回洗浄した。

10μg 尾静脈から投与した後、上述と同様に PCA

これを蒸留水に溶解して、室温で一晩透析して脱反応を行った。

塩に供した。この溶液を凍結乾燥し、ナラワスサ

54ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品成分との食べ合わ
せによるアレルギー発症予防6.

HPLC 分析

ルテオリンについては、400 µg の4日連続経口投

上記 2 で調整した野菜抽出物および加水分解

与が PCA 反応においてアレルギー抑制作用を示

物を 0.5％トリフルオロ酢酸含有メタノールに溶すことが分かっている4)。そこでルテオリン単独

解後、メンブレンフィルターろ過したものを次のでは抗アレルギー効果を示さない濃度を検討し条件で HPLC に供した：HPLC システム JASCO

た結果、200 μg 以下であることが分かった。この

system control program （LC-NetII/ADC）、 カ

200 μg は Hostetler ら5)の報告によると、ルテオ

ラム：CAPCEL PAK C18 UG120, S5, 3 μm, 3.0

リンを多く含む赤ピーマンの新鮮重2.33 g 相当

mm I.D.×150 mm（大阪ソーダ）移動相：50 mMだと算出された。そこで、これを基準量として他

リン酸緩衝液（pH 3.3）とメタノールの低圧グラの野菜抽出物についても新鮮物換算で2.33g 相当

ジェント。定量は、加水分解物の測定結果より、の凍結乾燥物を一日の投与量とした。一方フコイ

野菜中に含まれるフラボノイドアグリコンの有ダン投与量は、既報から一日100 μg とした1)。フ

無を確認した。次に、アグリコンの存在を確認でコイダンと野菜抽出物の共投与による耳介浮腫

きた野菜抽出物を HPLC に供し、溶出時間と吸の抑制効果を図1に示した。抗原・抗体反応によ収スペクトルがライブラリ内のデータと一致しって誘導された耳介浮腫は、200 μg フコイダン

た場合は、その標準物質の検量線から含有量を求投与によって有意に抑制されたが、100 μg 投与

めた。溶出位置と吸収スペクトルがライブラリ内では抑制は認められなかった。しかしながら、タのデータと一致しなかったが、そのスペクトル情

マネギあるいはネギ抽出物とフコイダンとの共報から、フラボノイド等のポリフェノール類の種投与によって耳介浮腫は有意に抑制され、その効別できた場合は、類似した骨格を有する標準品の果はほぼ200 μg フコイダン投与と同等の抑制率

検量線を用いて含量を求めた。

を示した。一方、赤ピーマンおよびショウガとの共投与では効果は認められなかった。これ以外の結果と考察

野菜抽出物についても検討したが、有意に抑制を1.

野菜抽出物の共投与でのアレルギー抑制作

示す野菜は認められなかった。これらの結果から、

用

フコイダンとの共投与によって抗アレルギー効

ポリフェノールを多く含む野菜について、その果を増強させる野菜としてタマネギおよびネギ抽出物がフコイダンのアレルギー抑制作用を増が有効であることが明らかとなったが、摂取量に強するかどうか検討した。ポリフェノールである

関してはフコイダン単独の約半分程度であった。

55

ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品成分との食べ合わ
せによるアレルギー発症予防

80

耳介浮腫（ m）

表1．各野菜抽出物中に含まれるポリフェノール類含有量60

フラボノイド類#

4020

抗DNP IgE

フェノール酸類
g/g抽出物

#

#
#

#
タマネギ

0

DNP-BSA
フコイダン (g)

200

野菜抽出物

100

100

100

赤ピーマン

タマネギ

100
ネギ

ネギ

100
ショウガ

図１．PCA反応試験におけるフコイダンと野菜抽出物との共投与における赤ピーマン

耳介浮腫抑制効果

2.

♯： 抗体／抗原反応区と比較して有意差があることを示す（p<0.05）。Tukey-Kramer
test。 平均値±SE。

ショウガ

HPLC 分析によるアレルギー抑制効果を増

ケンフェロールを豊富に含む野菜として、ブロコ強させるポリフェノール類の検討

リー、小ネギ、豆苗、アボガド（皮）、カイワレ、

上記１の試験で効果が見られた抽出物と効果

小松菜（葉）、菜の花、ソラマメ（皮）が、またケが見られなかった抽出物を HPLC に供した結果ルセチンを豊富に含む野菜として、スナップエンを表１に示した。効果が見られた 2 つの野菜（タドウ（皮）、フリルレタス、オクラ、グリーンピー

マネギ、ネギ）と効果が見られなかった 2 つの野ス（皮）を見出した。

菜（赤ピーマン、ショウガ）を比較すると、効果3.

が見られた野菜にはケルセチン（タマネギ）やケ

コイダンとノリ多糖画分との共投与でのアレルギー抑制作用

ンフェロール（ネギ）が豊富に含まれていることがわかった。一方、効果が見られなかった野菜でフコイダンとナラワスサビノリ多糖画分のそは、ルテオリン（赤ピーマン）やフェノール酸（シれぞれ単体ではアレルギー抑制作用を示さないョウガ）が豊富であった。これらの結果から、フ量での共投与によって、アレルギー抑制作用が発コイダンとの共投与によって抗アレルギー効果

揮されるかについて検討した。そのため先ずノリを増強させる成分は、フラボノール類（ケルセチ

多糖類の投与量を検討した結果、図３に示すとおンやケンフェロール）であることが分かった。一りノリ多糖画分 500 µg または 250 µg の経口投方、フラボン類（ルテオリン）やフェノール酸な

与では耳介浮腫の抑制は認められなかった。そこ

どのポリフェノール類の増強効果は弱いこともで既に抗アレルギー効果を示さないことが明ら示された。

かとなっている 100 µg と共投与した場合の耳介

次に、日本人が日常的に摂取する野菜や果物、浮腫に対する効果を検討した。その結果、フコイ

茶類 53 種 88 部位を分析に供し、フラボノール

ダン 100 μg 投与区ではノリ由来多糖画分は類を豊富に含む野菜や果物を探索した。その結果、250μg 以上で耳介浮腫の抑制が認められた。さらにフコイダン 50 μg 投与区ではノリ由来多糖画

56

ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品成分との食べ合わ
せによるアレルギー発症予防

60

#

#

20

耳介浮腫（ m）

耳介浮腫（ m）

60
40

#

#

#

#

a

#

0

DNP-BSA抗DNP IgE

フコイダン (100 g) + ノリ多糖類画分 (250 g)

DNP-BSA
ノリ多糖画分 (g)20

抗DNP IgE

0

フコイダン (g)

40

200
500

250

100

50

100

50

500

500

250

250

抗galectin-9抗体 (1 g)
抗IL-10抗体 (10 g)
抗IgG抗体 (10 g)

図３．PCA反応試験におけるフコイダンとナラワスサビノリ多糖画分との共投与による耳介浮腫抑制効果

図４．フコイダンとナラワスサビノリ多糖画分との共投与による耳介浮腫抑制効果に対する各中和抗体の影響♯： 抗体／抗原反応区と比較して有意差があることを示す（p<0.05）。Tukey-Kramer
test。 平均値±SE。

♯： 抗体／抗原反応区と比較して有意差があることを示す（p<0.05）。Tukey-Kramer
test。 平均値±SE。

分 500 μg 投与で抑制が認められ、フコイダン単構により相乗的に効果を発揮していることが明

独で抑制効果を示す量の 4 分の 1 まで投与量をらかとなった。Liua ら 6)は、紅藻類を経口摂取す削減させることができることが明らかとなった。

ることで血中に IL-10 が分泌されることを報告

ポリフェノール類の結果に比べると、さらに半分している。また、Norton ら 7)は、IL-10 が肥満細量までフコイダンの摂取量を削減できることが胞に発現している IgE に高親和性を示す FcεRI示唆された。

の発現を抑制することを報告している。これらの報告を総合すると、ノリ多糖類の経口投与によっ

4.

フコイダンとノリ多糖画分のアレルギー抑て血中に IL-10 が分泌されることによって肥満制機構の相違細胞上の FcεRI 発現が抑制されるため、IgE の今までに研究でフコイダンの抗アレルギー効

肥満細胞が抑制されるためにアレルギー発症が果は、経口投与した場合のみに認められることと、抑制されたと考えられた。

その作用機序は血中に Gal9 が分泌されることを明らかにしてきた 1)。一方、ノリ多糖画分につい

当初予定していた研究計画の内、フコイダン摂てはその作用機構についてはよく分かっていな

取量を削減できる食品の候補としては、赤ピーマ

いので、サイトカインに着目しそれぞれの中和抗ンとショウガが見出された。またこれらの中に含体を用いて PCA 実験を行った。その結果、Gal9

まれるポリフェノール類と候補に挙げられなか以外に IL-10 中和抗体を抗 DNP-IgE を尾静脈かった食品中のポリフェノールを HPLC 分析で比ら注射する前に尾静脈注射したときに、フコイダ

較すると、ケルセチンやケンフェロール骨格を有ンとノリ多糖画分による耳介浮腫抑制が解消さするフラボノール類が活性を有する候補化合物

れた（図４）。これらのことより、フコイダンとノとして見つかった。また、これらの成分を豊富にリ多糖によるアレルギー抑制機構は異なった機含む野菜としてブロコリー、豆苗、小松菜（葉）57ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品成分との食べ合わ
せによるアレルギー発症予防およびオクラを見出した。今後は、この情報を元

参考文献にフコイダンが有する抗アレルギー効果を増強

1)Tanino Y, Hashimoto T, Ojima T,

できるポリフェノールカクテルの構築を視野にMizuno,

入れた研究が可能になると考えられる。一方、今Saccharina japonica is a novel

回の研究から紅藻類であるナラワスサビノリにinducer of galectin-9 and exhibits

含まれる多糖画分にもフコイダンと共投与する

anti-allergic activity. J Clin Biochem

ことで、抗アレルギー効果画像今日できることをNutr. 2016;59(1):25–30.
2)

見いだせたことは、予定していた研究以外の成果

M.

F-fucoidan

fromMizuno M, Sakaguchi K. Sakane, I.

と判断できる。しかもその抑制機構は、フコイダ

Oral administration of fucoidan can

ン投与による Gal9 分泌増強を促すのではなく、

exert

抗炎症性のサイトカインである IL-10 分泌促進

allergenによることを見いだすことができた。

enhancement of galectin-9 secretionanti-allergic

activityafter

sensitizationinblood.

by

Biomolecules.

2020;10(2):258;

今後の研究活動について

https://doi.org/10.3390/biom1002025

今回得られた結果を基に、当初予定していたフ8.

コイダンとの共摂取により抗アレルギー効果を3)高めるポリフェノールカクテルの構築を目指し

Sakakibara H, Honda Y, Nakagawaていくのが、直近のやるべきことと考えている。

S,

そのためには、我々の研究室で開発した腸上皮細Simultaneous determination of all

胞である Caco-2 と肥満細胞である RBL-2H3 とpolyphenols in vegetables, fruits, andの共培養系を用いて、適切な組み合わせを選抜しteas.

てから PCA 反応へと展開するのも一案かと考え

2003;51:571–581.
4)ている。また、ノリ由来多糖画分による抗アレル

AshidaJ

Yamashita

H,

Agric

S,

Kanazawa

Food

K.

Chem.

YokoyamaY,

ギー効果がフコイダンの場合とは異なることか

Hashimoto T, Mizuno, M. A novel in

ら、血中 IL-10 分泌を促進する食品を選抜するこ

vitro co-culture model comprised ofとで、新たなアレルギー抑制を視野に入れた食品

Coco-2/RBL-2H3 cells to evaluateの探索に利用できないかを模索しているところ

anti-allergic effects of food factorsである。

through the intestine. J Immunol
Meth. 2016;435:1–6.
5)

58

Hostetler GL, Ralston RA, Schwartz

ヒ素摂取量低減を目的としたフコイダンの血中ガレクチン９分泌を促進させる食品成分との食べ合わ
せによるアレルギー発症予防

SJ.

Flavones:

bioavailability,

6)

Food

sources,

metabolism,

Polym. 2017;165:189–196.

and

7)

Norton SK, Barnstein B, Brenzovich

bioactivity. Adv Nutr. 2017;8:423–

J, Bailey DP, Kashyap M, Speiran K,

435.

Ford J, Conrad D, Watowich S,

Liua QM, Xu SS, Li L, Pan TM, Shi

Moralle MR, Kepley CL, Murray PJ,

CL, Liu H, Cao MJ, Su WJ, Liu GM.

Ryan JJ. IL-10 suppresses mast cell

In

IgE

vitro

and

immunomodulatory
sulfatedinvivo

activityofpolysaccharide

receptor

expression

andsignaling in vitro and in vivo. J

fromImmunol., 2008;180: 2848–2854.

Porphyra haitanensis, Carbohydr

59食物アレルギー診断技術の開発

研究課題名

食物アレルギー診断技術の開発

フリガナ

ムラタ

代表者名

村田

タカヒサ
幸久

所属機関（機関名）東京大学（役職名）准教授
氏

大学院農学生命科学研究科

名（フリガナ）

応用動物科学専攻

所属機関・役職名

役割分担

共同研究者

大矢 幸弘
国立成育医療研究センター・
患者の診断と採尿を行う。
（オオヤユキヒロ）
アレルギーセンター長
発表論文
・ Epithelial cell-derived prostaglandin D2 inhibits chronic allergic lunginflammation in mice. Maehara T, Nakamura T, Maeda S, Aritake K,
Nakamura M, *Murata T. FASEB J. fj201802817R. 2019.
・ Comparison of urine and blood as a convenient and practical sample for
本 助 成金 によ る 発
estimating the contamination level of live cattle with radioactive cesium.
Sato I, Sasaki J, Satoh H, Natsuhori M, Murata T, Okada K. Animal Science
表論文，学会発表
Journal. 90(8):1090-1095. 2019.
・ L-PGDS-derived PGD2 attenuates acute lung injury by enhancing
endothelial barrier formation. #Horikami D, #Toya N, Kobayashi K, Omori
K, Nagata N, *Murata T. J Pathol. 248(3):280-290. 2019.
次ページへ続く
研究結果要約
食物アレルギーを診断するためには、医師が患者に抗原を食べさせて症状の有無を評価する「経口抗原負荷試験」行うが、この方法は大変な手間がかかる。治療法として知られる免疫療法では、症状が出ない少量の抗原を毎日食べることで、食べられる量を増やしていく。この方法も、大変な手間がかかり、治るまでに数年を要す。また途中で症状が出てしまうケースもある。安全かつ適切な食物アレルギーの診断や治療を実現するには、症状を常にモニタリングできる病態マーカーを見つける必要がある。申請者は子供からでも採取が簡単な尿の中に、アレルギー反応をおこす細胞として知られる肥満細胞が産生した PGD2 の代謝産物 PGDM が排泄されることを発見した。このマーカーを用いれば、血液を採取す
ることなく、小さな子供でも安全かつ的確に、食物アレルギーの診断が可能となる。しかし、PGDM の濃度測定には質量分析装置を用いる必要があり、高い費用と時間がかかる、また、症状が認められても、尿中 PGDM 濃度が上昇していない偽陰性が少数ある、などの、解決すべき課題も見えてきた。本提案
では、①尿中 PGDM の抽出や測定方法の、高速化と最適化を行い、安く、早く、適切に PGDM 濃度測定が行えるように研究開発を行った。また、②症状がでていても PGDM が反応しない偽陰性が出る原因を明らかにするとともに、偽陰性の場合に応用できる、代替診断マーカーの探索も行った。

60

食物アレルギー診断技術の開発

本助成金による発表論文，学会発表の続き
・Therapeutic potential of D prostanoid receptor 1 signal enhancement in a murine model of foodallergy. #Nakamura T and #Hirai R, Tachibana Y, Masuko S, Nagata N, *Murata T. J Allergy

Clin Immunol. 143(6):2290-2293. 2019.
・ Hematopoietic prostaglandin D synthase-derived prostaglandin D2 ameliorates adjuvantinduced joint inflammation in mice. Tsubosaka Y, Maehara T, Imai D, Nakamura T, Kobayashi
K, Nagata N, Fujii W, *Murata T. FASEB J. fj201802153R. 2019.
・Urinary PGDM, a prostaglandin D2 metabolite, is a novel biomarker for objectively detecting
allergic reactions of food allergy. Inagaki S, Maeda S, Narita M, Nakamura T, Shimosawa T,*Murata T and *Ohya Y. J Allergy Clin Immunol. S0091-6749(18)30995-3.2018.
・5,6-DiHETE attenuates vascular hyperpermeability by inhibiting Ca2+ elevation in endothelial
cells. Hamabata T, Nakamura T, Tachibana Y, Horikami D, *Murata T. J Lipid Res. 59(10). 18641870. 2018.
学会発表
・質量分析を用いたアレルギー診断マーカーの探索 、村田幸久、日本化学会第 100 回春季大会
2020/3/22
・The role of Prostaglandin D2 synthase in retinal angiogenesis、堰八英里香、大森啓介、小林幸
司、永田奈々恵、中村達朗、倉田薫里、植村明嘉、村田幸久、第 93 回日本薬理学会年会 2020/3/16
・プロスタグランジン D2 を毒仮説から考える、中村達朗、藤原祐樹、木田美聖、村田幸久、第 2 回
比較薬理学・毒性学会春季研究会 2020/1/25
・疾患における生理活性脂質の役割の解明と応用、大森啓介、前原都有子、藤原祐樹、宮崎悠介、藤井省太、堀上大貴, 山崎愛理沙、今井大貴、橘侑里、益子櫻、林亜佳音、濱崎雄太、木田美聖、小林唯、宮田佳奈、山本晃子、竹ノ内晋也、原口大雅、芦名功平、小林幸司、中村達朗、永田奈々恵、
村田幸久、第 2 回比較薬理学・毒性学会春季研究会 020/1/25
・アトピー性皮膚炎モデルマウス及び患者における尿中脂質プロファイルの解析、永田奈々恵、濵﨑
雄大、稲垣真一郎、中村達朗、堀上大貴、山本貴和子、犬塚祐介、下澤達雄、橘侑里、成田雅美、
大矢幸弘、村田幸久、第 2 回比較薬理学・毒性学会春季研究会 2020/1/25
・PGDM as a Specific Maker of Food Allergy, Takahisa Murata, Food Allergy Gordon Research
Conference 2020/1/7
・The profiling of lipid metabolites in the nasal lavage fluid of a murine model of allergic rhinitis,
Yuri Tachibana, Tatsuro Nakamura. Takahisa Murata, World Allergy Congress 2019,61

食物アレルギー診断技術の開発

2019/12/14
・The role of prostaglandin D2 in food allergy, Takahisa Murata,The 1st ToBEST symposium,
2019/11/15
・DBPCFC with N of 1 RCT and PGDM improve diagnostic accuracy of food allergies in a 9-yearold boy. Yusuke Inuzuka, Kiwako Yamamoto-Hanada, Motoko iwama, Kenji Toyokuni, Koji
Nishimura, Makoto Irahara, Fumi Ishikawa, Makiko Miyata, Miori Sato, Yumiko Miyaji,
Mayako Saito, Tatsuki Fukuie, Masami Narita, Ichiro Nomura, Tatsuro Nakamura, Tatsuo
Shimosawa, Takahisa Murata, Yukihiro Ohya, Pediatric Allergy and Asthma Meeting (PAAM)
2019, 2019/10/17
・アレルギー性鼻炎モデルマウスの鼻汁における脂質メディエーターの産生量の変化、橘侑里、中村
達朗 、荒井美乃、曽根正好 、村田幸久、第 162 回日本獣医学会学術集会、2019/9/10
・Mediator Lipidomics: Towards Comprehensive Metabolic Profiling of Eicosanoids and Related
Fatty Acids, Atsuhiko Toyama, Tatsuro Nakamura, Takahisa Murata,.The Omics Rebolution:
Beyond Genomics, 2019/9/8
Lipid profiling in nasal lavage fluid of a murine model of allergic rhinitis, Tatsuro Nakamura,
Yuri Tachibana, Takahisa Murata, The 68th Annual Meeting of Japanese Society of Allergology,
2019/6/15

62食物アレルギー診断技術の開発

研究目的

研究計画及び研究手法

食物アレルギーを確定診断するには、医師が患①

尿中 PGDM の高速・安価測定法の確立

者に抗原を食べさせて症状の有無を評価する「経１．尿の精製における、固相抽出カラムの素材の口抗原負荷試験」行う必要があり、手間がかかる。

開発と、充填容器の選択、吸着・洗浄・再溶

唯一の治療法と言える免疫療法では、確定診断に出過程を最適化する。可能な限り、特殊な機より決定された可食量以下の抗原を、毎日食する器（大型遠心機や減圧器）を要することなくことでその量を増やしていく。この方法も医師の精製できるキット形態をデザインする。

経験と勘によるところが大きく、寛解に数年を要

２．質量分析装置の測定メソッドの最適化とアす。また途中症状を誘発するリスクも伴う。安全

プリケーション作製を同時に行う。

かつ適切な食物アレルギーの診断や治療を実現するには、指標となる病態マーカーの存在が必須②

偽陰性となる根拠の解明である。

１．成育医療研究センターにて経口抗原負荷試
験を行い、診断と尿中 PGDM 度測定を行う。

申請者は、小さな子供からでも採取が簡単な尿２．負荷開始と発症のタイミング、発現部位と強の中に、肥満細胞が多く産生する PGD2 の代謝産度に分けて詳細に評価して、回帰分析を行う。

物 PGDM が食物アレルギーに特異的かつ症状のこれにより、尿中 PGDM 濃度がどの臨床症程度に比例して排泄されることをマウスモデル

状を大きく反映し、どの症状を反映しないか、を用いて発見した 1)。さらにこのマーカーがヒトを明らかにし、偽陰性がでる根拠を明らかにの経口抗原負荷試験の有用な診断指標になるこする。

とも証明した 2)。しかし、①現在行っている質量３．他のアレルギー疾患患者の尿中 PGDM 濃度分析装置を用いた PGDM の濃度測定には、高いを測定し、特異性を改めて評価する。

費用と時間がかかる、また、②臨床症状が認められても、尿中 PGDM 濃度が上昇していない偽陰③性が少数ある（約 9％）、など本検査の実用化に向１．尿以外の他の体液中の PGD2 代謝産物濃度

代替診断法の開発を測定する。採取した標本の採取方法やタイ

けて、解決すべき課題も見えてきた。

ミング、 測定対象物質を再探索し、4 時間後の尿中 PGDM 濃度が反映できない臨床症状

本提案では、食物アレルギーの診断法の標準化と実用化を目標に掲げ、①尿中 PGDM の高速・を検出できる診断法を探す。

安価測定法の確立、②偽陰性となる根拠の解明、を目的として研究を行った。

63

食物アレルギー診断技術の開発

結果と考察

度を測定できるようにした。

本助成研究の結果①

３．上記方法の validation を行った。具体的には

尿中 PGDM の高速・安価測定法の確立

１．尿中 PGDM 測定に特化したカラム素材の選

尿への PGDM 添加回収試験を行い。測定の択と容器の選択を行い、抽出条件の最適化を

日差変動、日内変動を計算した。また PGDM進めた。具体的には、尿の希釈率、希釈溶媒、の尿中保存安定性評価を行い、-20℃もしく

内部標準物質選択と添加量調整、pH 整、溶は 4℃条件下であらば、1 週間再現性高く、出液の選択、カラム充填剤の選択、容量決定、尿を保存して PGDM の測定に供することがなどを行った。

できることを明らかにした。さらに、PGDM
濃度測定に干渉する可能性がある尿中に排既存の市販品を用いた場合、前抽出に約 3 時

泄される主要脂質の濃度測定も行った。

間を要し、PGDM の回収率は 1.4％と低かった。新たに開発した方法では、尿 20 標本を②

3 ステップ、15 分で質量分析装置へアプライ

１．国立成育医療研究センターにて、経口抗原負できる。また、PGDM 回収率は 80％に大幅

荷試験を行い診断と採尿を行い、東京大学にに改善することができた。また、回収率の向て、質量分析装置を用いた PGDM 度測定を上に伴い、測定に必要となる尿量も 0.1 ml で行った。その結果従来得られていた、測定レ可能となった。これらの成果により、将来実

ンジ 1.14～17.7 ng/mg Cre とカットオフ値

用化できるキット構成を決定することがで

2.25 ng/mg Cre を再確認した。

偽陰性となる根拠の解明きた。
２．各患者の症状とタイミング等を勘案しなが２．抽出工程に加えて、測定に感度向上と高速化

ら、尿中 PGDM 濃度との回帰分析を行った。

を進めた。質量分析内のラインと測定プロト

その結果、尿中 PGDM 濃度に反映されやす

コルをすべて見直し、洗浄工程を含めて、１い症状の順として、消化器（係数 6.9）、呼吸標本約 5 分で測定できるプロトコルを確立

器（係数 6.0）、皮膚（係数 4.8）が挙げられした。また、測定から結果、解析までを自動た。これらに比べて口腔症状の係数が小さかで行えるプログラム（マクロ）を作成した。

った。口腔のみに症状がでる患者に対して、
尿中 PGDM が偽陰性となる可能性が考えら

上記方法の改善やアプリケーションの確立れた。本計算の重相関係数は 0.51、自由度調により、測定条件の決定や、対象脂質の抽出、整済決定係数は 0.24 であった。

測定、解析に知識と技術を要する質量分析装置を用いて、誰でも容易に尿中の PGDM 濃

３．偽陰性となった患者（症状あり、尿中 PGDM

64

食物アレルギー診断技術の開発

濃度が 2 ng/mg 以下）の患者の尿を用いて、に成功した。唾液を用いた脂質の検出に関しては、

偽陰性の原因を探るべく、他脂質の網羅的な

引き続き検討を行っていく必要がある。

濃度測定を行った（158 種類）。その結果、一学会や論文発表等の予定部の患者では、PGD2 やその代謝産物以外のアトピー性皮膚炎の尿中 PGDM 濃度の推移に

脂質濃度の上昇が観察された。現在その理由関しては、現在論文を投稿中である。またさらなを解析中である。

る脂質探索に関しても、論文投稿準備を進めてい４．尿中 PGDM の食物アレルギー特異性を評価る。

する目的で、アトピー性皮膚炎患者の診断と採尿を行い、尿中 PGDM 濃度を測定した。

③

今後の研究活動について

その 結 果、アト ピ ー性皮 膚炎 の患者 で は今後も、尿中 PGDM を用いた食物アレルギーPGDM 濃度の上昇は怒らないことを確認で検査技術の実用化を目指して研究を進めていく。

きた。

今後の課題として以下を挙げる。

代替診断法の開発〇PGDM の検査項目としての validation

１．上記結果で、口内症状のみが出た患者では、・

これまでは自立排尿が可能な子供を対象と尿中 PGDM 濃度の上昇が確認されないケー

して診断と採尿を行ってきたが、乳幼児や大スが多かったため、唾液中の脂質濃度測定を人の経口抗原負荷試験の尿中 PGDM データ

試みた。まず、唾液からの脂質抽出条件を改を集める必要がある。

めて検討した。その後、20 名の患者の唾液を・

動物モデルや一部疾患の患者の尿を用いた、対象に、質量分析装置を用いた網羅的な脂質特異性評価は進めてきた。今後もこれを継続濃度測定を行った。その結果、唾液中に排泄する必要がある。

される複数の脂質濃度の上昇を確認するこ・また、経口抗原負荷試験のみならず、免疫療とができた。今後再現性の確認を急ぐととも

法中の尿中 PGDM 濃度測定を行いたい。症に、引き続き、標本採取方法や抽出方法、測状が出ない抗原の負荷量で、PGDM 濃度上定条件の検討、標的となる脂質の選択を進め昇を確認することができれは、非常に有用なていく。

指標になると期待している。

所期の結果は得られたか。また残された課題〇測定キットの開発

提案した実験は、ほぼ予定通りに行うことがで・本研究において、尿の前処理や質量分析装置

きた。尿中 PGDM を用いた食物アレルギー診断を用いた測定の最適化や高速化に成功した。

技術の実用化に向けたデータの取得や技術革新

しかしより広く検査を広げるために、抗体を65

食物アレルギー診断技術の開発

・用いた検査キットの開発が必要である、Tachibana Y, Aritake K, Shimosawa T, Yatomi Y,

また、上記の様に乳幼児から尿を採取して検*Murata T. Scientific Reports. 7(1):17687.2017.

査に用いるために、オムツからの PGDM 抽Urinary PGDM, a prostaglandin D2 metabolite, isa novel biomarker for objectively detecting

出キットの作製も進める。

allergic reactions of food allergy. Inagaki S,
Maeda S, Narita M, Nakamura T, Shimosawa T,

参考文献*Murata T and *Ohya Y. J Allergy Clin Immunol.

Prostaglandin D2 metabolite in urine is an index

S0091-6749(18)30995-3.2018.

of food allergy. Maeda S, Nakamura T, Harada H,66

ω-5 グリアジン欠損食用小麦の開発：ω-5 グリアジン感作型小麦アレルギーの根絶に向けて研究課題名

ω-5 グリアジン欠損食用小麦の開発：ω-5 グリアジン感作型小麦アレルギーの根絶
に向けて

フリガナ

モリタ

エイシン

代表者名

森田

栄伸

所属機関（機関名）島根大学医学部皮膚科学講座（役職名）教授

共同研究

氏 名（フリガナ）
所属機関・役職名
役割分担遠藤 隆
ω-5 グリアジン欠損小麦新品
龍谷大学農学部教授(エンドウタカシ)
種の開発松尾裕彰
ω-5 グリアジン欠損小麦の動広島大学薬学部教授(マツオヒロアキ)
物モデルによる評価
籠橋有紀子
ω-5 グリアジン欠損小麦の食
島根県立大学准教授(カゴハシユキコ)
品開発松本正人
ω-5 グリアジン欠損小麦の実
株式会社メディカル工笑(マツモトマサト)
用化栽培および食品加工
1. Yamada Y, Yokooji T, Ninomiya N, Taogoshi T, Morita E, Matsuo H. Evaluation of theallergenicity of ω5-gliadin-deficient Hokushin wheat (1BS-18) in a wheat allergy rat
model. Biochem Biophys Rep. 2019 Nov 1;20:100702.

本助成金による発表論文，学会発表 2.

河野邦江，塩飽邦憲：低アレルゲン化小麦 1BS-18 を用いたω-5 グリアジン感
作型小麦アレルギー対策．第 68 回日本農村医学会学術総会．北海道，2019 年
10 月 18 日

研究結果要約
食物アレルギーの対策は感作予防と感作後の治療である。本共同研究では、小麦アレルギーの主要抗原である ω-5 グリアジンの遺伝子座を欠損した 1BS-18 小麦系統を活用して、小麦アレルギーの感作予
防と感作後の治療の 2 つの観点から、根本的な小麦アレルギー対策を講じることを試みた。1BS-18 食用小麦系統（1BS-18 ホクシン）の感作予防効果をアレルギーモデルラットを用いて評価し、感作予防法の確立に資するエビデンスを得た。また、1BS-18 系統小麦の社会実装を視野に入れ、継続的に 1BS18 系統小麦を市場流通させるために、顕微鏡下戻し交配技術（特許出願中）を用いて様々な栽培特性を有する数種の新規 1BS-18 食用小麦系統の育成を行った。そして、島根県西部にて新規 1BS-18 系統小麦の栽培実験を行うとともに、収穫した小麦の加工特性を継続的に評価した。さらに、既存小麦品種との差別化を行うため、「小麦アレルギーの主要抗原であるω-5 グリアジンを遺伝子的に含まない」という 1BS-18 小麦系統の付加価値を前面に押し出し、「しまね夢こむぎ」と命名し登録商標を申請、６次産業化に向けたブランド戦略を構築した。治療法の確立に関しては、小麦アレルギー患者を対象とした「低アレルゲン化小麦 1BS-18 ホクシンの臨床応用に関する多施設共同第 II 相臨床試験」を実施した（UMIN: UMIN000024951）。

67ω-5 グリアジン欠損食用小麦の開発：ω-5 グリアジン感作型小麦アレルギーの根絶に向けて研究目的

レルギー患者の数が激減すると考えられる。

小麦は世界各国で主食とされ、本邦でも多くの目的１．感作予防

市場流通食品に含まれる。小麦アレルギー患者は、

本研究は、アレルギーモデルラットを用いて日常の食事に常に気を配る必要があるため QOL

1BS-18 ホクシンの感作能を評価する事を目的とが低下する。新生児から乳幼児期に発症する小麦した。また、市場流通を前提として実用品種に戻アレルギーの多くは学童期までに治癒するが、成し交配することにより、様々な栽培・加工特性を

人の小麦アレルギーは比較的治癒しにくい 1）。成有する ω-5 グリアジン欠損食用小麦系統を確立

人期以降の小麦アレルギーは、摂食に加えて運動することを目的とした。

や薬剤、アルコール、ストレス等の二次的要因が目的２．治療法の確立（医師主導の臨床研究）

組み合わさることで症状をきたす、食物依存性運

ω-5 グリアジン感作型成人小麦アレルギー患者

動誘発アナフィラキシーとして発症する。申請者に対して、ω-5 グリアジン欠損小麦系統 1BS-18

らはこれまで、成人小麦アレルギー患者の約

ホクシンから作製したパン（1BS-18 ホクシンパ

95％は主として小麦 ω-5 グリアジンに感作されン）の摂取可能量を確認すること、1BS-18 ホクており、ω-5 グリアジン感作型小麦アレルギーの

シンパンの継続摂取による減感作療法の有効性

有病率は国内成人で約 0.2%であることを明らかを確認することを目的とした。

にしてきた 2,3)。国内では数万人の小麦アレルギー患者が存在すると推定される。また、小麦 1B

研究計画及び研究手法

染色体上の ω-5 グリアジン遺伝子座を部分欠損

本共同研究は、成人小麦アレルギーの病態解析、した 1BS-18 小麦系統を見出し、モルモットアレ

疫学調査、予防法・治療法の確立を目的としてルギーモデルで経口摂取による感作が成立しに2007 年に発足し、島根大学を中心とした共同研

くいことを証明してきた 4)。このことは、1BS-18

究により小麦アレルギーに関する多くの研究成

小麦系統を普及させることにより、小麦アレルギ果を発表して現在に至っている。2019 年度は、ーの発症予防が可能であることを示唆している。

医学・薬学（島根大学、広島大学）、農学（龍谷大さらに、1BS-18 小麦系統を食用小麦系統ホクシ学）、食品科学（島根県立大学）、産業（メディカンと戻し交配して 1BS-18 食用小麦系統（1BS-18

ル工笑）が共同連携してω-5 グリアジン欠損食用ホクシン）を樹立した。1BS-18 ホクシンは、ω-

小麦系統の特性の検証と６次化産業化を行い、本5 グリアジンを含有しない事から、小麦アレルギ

小麦系統を広く流通させることで小麦アレルギ

ー患者でも摂取できる可能性がある。また、小麦ーの根絶化を目指すものである。

アレルギー患者が 1BS-18 ホクシンを継続摂取す島根大学

ることで、減感作が成立する可能性もある。さら研究統括機関として研究会の開催、研究進捗のに 1BS-18 小麦系統が市場に流通すれば、小麦ア

管理、共同研究機関および連携機関との連絡調整

68

ω-5 グリアジン欠損食用小麦の開発：ω-5 グリアジン感作型小麦アレルギーの根絶に向けてを行った。具体的には、2019 年度は年 3 回の研おけるω-5 グリアジン欠損小麦の摂取可能量の究会の開催を予定し、研究目的の共有と意見交換

判定、治療可能性を明らかにするために次に示すの場の提供を通して共同研究が円滑に推進され臨床研究を継続した（表 1）。なお、本研究では臨るよう努めた。「しまね夢こむぎ」の継続的な市

床研究に用いる小麦の確保が最優先課題であり、場流通を通じて、自治体や地域事業者らの目標に

小規模環境での製粉方法・製パン性の検討、1BS-

沿った仕組みづくりを行い、尚且つ、持続可能な18 ホクシンパンを継続的に提供できる体制準備

開発目標（SDGs）の実現が可能となるよう社会も併せて行った。島根大学地域未来協創本部との貢献を行うことを目指した。具体的には、地域事連携により、ω-5 グリアジン欠損小麦シリーズを業者や食品改善推進員等に対して「しまね夢こむ「しまね夢こむぎ」と命名して商標登録手続きをぎ」の試食会や食物アレルギーの勉強会を行い、行い、実用化に向けたブランド戦略により付加価

本取り組みの認知度を高める試みを行った。さら値の明確化と価値の創出を図った。

に、ω-5 グリアジン感作型小麦アレルギー患者に表 1.低アレルゲン化小麦 1BS-18 ホクシンの臨床応用に関する多施設共同第 II 相臨床試験の概要
研究対象：ω-5 グリアジン感作型の成人小麦アレルギー患者 20 名
研究形態：多施設共同研究（研究代表機関：島根大学、共同研究機関：国立病院機構福岡病院、広島大学、神戸大学、大阪大学等）
島根大学医の倫理委員会承認番号：20160823-3
UMIN 登録番号：UMIN000024951
本研究で明らかにすること
1.

1BS-18 ホクシンパンの摂取可能量

2.

2. 1BS-18 ホクシンパンを継続摂取することにより減感作療法が成立するか否か

3.

3. 治療前後の、通常のパン小麦および 1BS-18 ホクシン由来のグルテンに対する患者由来 の末梢血好塩基球の反応性

研究方法：ω-5 グリアジン感作型の小麦アレルギー患者に対して 1BS-18 ホクシンパンの摂取の安全性
および継続摂取による減感作療法の有用性を確認する臨床研究を実施する。ステップ１ では、摂取可能量を評価するために 1BS-18 ホクシンパンの段階的摂取（1BS-18 ホクシンパ
ンの摂取を 10 グラムより開始し、段階的に 60 グラムまで摂取）を行い、アレルギー 症状の有無にて評価する。ステップ２では、ステップ１の摂取可能量の評価に基づいて安全な摂取量を定め、3 カ月継続して摂取し、開始前後の好塩基球活性化試験により判定する。

69

ω-5 グリアジン欠損食用小麦の開発：ω-5 グリアジン感作型小麦アレルギーの根絶に向けて

18 ホクシンを用いた食品の開発を産学連携によ龍谷大学
1BS-18 ホクシンに日本の春まき小麦 4 品種り試みた。開発した食品については、アンケート（ミナミノカオリ、ハルユタカ、はるきらり、春を用いて、風味・甘味・硬さ・舌ざわり・外観・よ恋）を交配して得た F1 雑種を制御植物培養室

総合点について評価をまとめるとともに、嗜好意

で世代促進栽培し、それぞれの品種について１回

欲尺度にて試食品の評価を行い、開発者に対するの戻し交配と自家受精 1 回を行った。各交配の自フィードバックを行った。さらに、島根県内の食家受精子孫から 1BS-18 がホモ接合になった個体

品改善推進員を対象とした勉強および試食会にを選抜・栽培し、出穂が早く、稔性の良い系統をおいて、1BS-18 ホクシン小麦粉の活用方法に関

2～4 個体選び、それらの自家受精子孫合計 14 系

する提案を行うとともに、試食会にて全粒粉うど

統（ミナミノカオリ 1BS-18 ：2 系統、春よ恋 1BS-

んの新たな魅力について評価を行った。

18 ：4 系統、はるきらり 1BS-18 ：4 系統、ハル

メディカル工笑

ユタカ 1BS-18 ：4 系統）を 12 個体ずつ圃場で2018 年 11 月に播種した 1BS-18 ホクシンおよ

栽培し形質調査を行った。さらに、これら 14 系

びを 2019 年 7 月に収穫し、脱穀・乾燥・異物除統から最も優良な個体を 1 個体ずつ選び、それぞ去を行い専用の保冷庫に保存して実用化検討にれの自家受精子孫 160 個体ずつを圃場に栽培し向けて準備を行った。製粉は用事調製とした。

た。2020 年夏にこれらの系統の収量調査を行う

2019 年 6 月には、2018 年度産の 1BS-18 ホクシ

予定である。

ンを用いた全粒粉うどんの試作および試食会を広島大学担当した。2019 年度産の 1BS-18 ホクシンにつ

1BS-18 ホクシンの小麦タンパク質に対する感

いては、地域事業者と連携して、食パンおよびサ

作予防効果を経口免疫寛容の点から評価する動

ンドイッチの試作を行った。2019 年 11 月に 1BS-

物モデルの作製を目的に、通常小麦グルテンを用18 ホクシンおよび新たに 1BS-18 ミナミノカオ

いた経口免疫寛容モデルラットを作製した。経口

リを播種し、試験栽培を開始した。その際、積極

免疫寛容モデルは、あらかじめ溶媒または通常小的に地元企業と連携して「しまね夢こむぎ」の付

麦グルテン（東京化成）を 5 日間経口摂取させた加価値を高めるため、中山間地域の棚田を活用す

4 週齢の Brown Norway ラットに、同グルテンることを発案した。

を単回皮下感作することで作製した。経口免疫寛容の誘導は、血清中のグルテンおよびグリアジン

結果と考察

特異 IgE 抗体価やグルテンを静脈内投与した際

島根大学
2019 年度は、2019 年 6 月 21 日（島根県出雲の直腸温の低下を指標として評価した。

市＠島根大学）、2019 年 12 月 6 日（島根県出雲中山間地域研究センター

市＠島根大学）に 2 回の低アレルゲン化小麦研究2018 年度および 2019 年度に収穫された 1BS-

70

ω-5 グリアジン欠損食用小麦の開発：ω-5 グリアジン感作型小麦アレルギーの根絶に向けて会を開催し、2020 年 3 月 14 日（島根県出雲市＠は保持しており、減感作療法に有用な小麦系統で島根大学）に小麦アレルギー研究会を開催してあると考えている（2019 年 10 月 17 日、第 68 回

1BS-18 ホクシンに関する多施設共同臨床研究に

農村医学会にて発表、日本農業新聞一面記事、資関する討議を行った。また、低アレルゲン化小麦料 2）。

の事業化を念頭に、島根県西部の浜田市役所三隅

1BS-18 ホクシンパンについては、パンのふく

支所長および益田市長と意見交換を行ったらみに影響するグルテンの性質が気候条件の影（2019 年 2 月 10 日及び 2 月 11 日）。さらに、

響を受けて年度ごとに異なるものの、安定的な膨低アレルゲン化小麦事業の地域への浸透を目的

らみは維持されている。また、各年度におけるグとして食品改善推進員を対象とした勉強会兼試

ルテンの抗原性についてもウエスタンブロット

食会を主催した［2019 年 6 月 28 日＠益田市（山法を用いて確認し、変化が無いことを証明してい陰中央新報掲載、資料 1）、2020 年 1 月 10 日＠る。一方で、気候条件によりグルテンの粘弾性が雲南市］。

変化したり、梅雨時期の穂発芽の影響により澱粉

臨床研究は、全体で成人患者 20 例の登録を予

質の変化が生じたりすることが課題であるが、龍定した中で、2020 年 3 月 1 日時点で 14 例が臨谷大学での出穂期と収穫期がより早期で稔性の床研究に登録して試験を実施しており、概ね所期

良い系統の育成により対処する予定である。

の計画通り実施出来ている。課題として、本臨床研究の評価は、20 症例全員の試験が終了した後に、1BS-18 ホクシンパンの摂取可能量、臨床的なアレルギー症状、好塩基球活性化試験の結果を総合的に解釈して行う予定である。本研究に使用する 1BS-18 ホクシンは、小麦アレルギーの主要抗原であるω-5 グリアジンを遺伝的に欠損するという特徴を持つ。由来は、1BS-18 (ナショナル
バイオリソースプロジェクト KOMUGI が保有する約 12,000 種類の小麦系統より選抜した研究
用小麦品種チャイニーズスプリングの染色体部分欠損系統)3) とホクシン (一般流通小麦品種)の交配によるものである。1BS-18 ホクシンは、
ω-5 グリアジン遺伝子を欠損したことでアレルギー症状発症に強く寄与する主要抗原が除去されたが、その類似タンパク質が残存するため抗原性71

ω-5 グリアジン欠損食用小麦の開発：ω-5 グリアジン感作型小麦アレルギーの根絶に向けて龍谷大学（新規 1BS-18 品種の開発）

ンを用いた経口免疫寛容モデルラットの作製を

1BS-18 ホクシンと春まき小麦 4 品種（ミナミ

試みた。グルテンの感作のみを行った群では感作

ノカオリ、ハルユタカ、はるきらり、春よ恋）と開始 2 週間後よりグルテンおよびグリアジン特の交配および戻し交配子孫を 3 回の自家受精子

異 IgE 抗体価の上昇が確認された。一方、あらかと選抜で 14 系統を得た。現在これら 14 系統をじめグルテンを連日経口投与した群の両抗体価

160 個体ずつ（合計 2240 個体）を収量調査のたは、4 週目で感作のみを行った群よりも有意に低め圃場で栽培している（写真 1）。これらの系統のい値を示した。さらに各群にグルテンを負荷した

中から農業形質が純系品種と同等に近い 1BS-18

際のアナフィラキシー症状の惹起を確認するた品種が育成されることを確信している。

め、感作開始 5 週目のラットにグルテンを静脈内負荷して直腸温度の変化を測定した。その結果、グルテン感作群ではグルテン負荷により体温が有意に低下したが、感作前にグルテンを経口投与した群においてはグルテン負荷を行っても体温の変化が認められなかった。以上の結果から小麦グルテンを感作前に連日経口投与することにより免疫寛容が誘導できた。これらの結果は、本手法にて小麦の免疫寛容を評価することが可能で広島大学（ω-5 グリアジン感作型小麦アレルギーあることを示すものであり、今後、同手法にての感作と症状惹起予防に対する 1BS-18 の有用性

1BS-18 ホクシンによる経口免疫寛容モデルラッの検討）

トを作製し、1BS-18 ホクシンの免疫寛容におけ

昨年度までの解析により、1BS-18 ホクシンはる有用性を評価することを予定している。

通常のホクシンよりも ω-5 グリアジンに対する感作能やアレルギー症状の惹起能が低いことを明らにした（Yamada Y et al, Biochem Biophys
Rep. 2019、図 1）。これらの結果から、1BS-18 ホ
クシンは通常小麦よりも安全に ω-5 グリアジン
感作型小麦アレルギーの発症予防と減感作の誘導に利用できる可能性が示唆された。
島根県立大学（商品化検討）

本年度は、1BS-18 ホクシンの小麦タンパク質に対する感作予防効果を経口免疫寛容の点から2018 年度および 2019 年度に収穫された 1BS-

評価する動物モデルの作製を目的に、小麦グルテ

18 ホクシンを用いた食品の開発を試みた。県内
企業プチレストランクルトン等との共同開発に

72

ω-5 グリアジン欠損食用小麦の開発：ω-5 グリアジン感作型小麦アレルギーの根絶に向けて

より、シフォンケーキ、パンおよびクッキー5 種可能であり、また、クリームパン等の菓子パンの類を作成し、1BS-18 ホクシン小麦粉の活用にお製造も可能であった（写真 3）。しかし、費用の面いて、その可能性を検討した（写真 2）。また、

でネックが残り、打開策として栽培面積を増やす

1BS-18 ホクシンの生産量が十分ではないことや、こと、ブランド戦略により低アレルゲン化による販売商品の価格帯の検討の一環で、酒米の精米時

付加価値ついて認知度を十分に高めることなど、にでて廃棄されることの多い未利用素材（酒米粉）

ビジネスを行う上での工夫が求められる。2019を活用したクッキーの作成を行った。米粉の配合

年 9 月より、新たな打開策として、地域事業者や割合により、様々な食感の展開が可能となること

行政と協力して棚田を活用した小麦栽培の検討が示唆された。メディカル工笑より、評価依頼をを行っている（写真 4）。近年、棚田における稲作

受けた試作クッキーについて、食味試験による評

は、収入の低迷により後継者が不足し、年々耕作価を行い、結果に関するフィードバックを行った。

放棄地が増している。島根県中山間地域では、全

今後は、商品化に向けた試作品の官能評価および国第一位の面積を誇る室谷の棚田（島根県浜田市）

物性評価を予定している。

が存在したが、現在そのほとんどが耕作放棄地となっているのが現状である。本事業では、こうした地域の課題解決を率先して行いたいと考える
地元事業者と連携し、行政を巻き込みながら、「しまね夢こむぎ」栽培から６次産業化までを視野に入れた地産地消低アレルゲン化小麦ビジネスモ
デル考案の試みを続けている。

メディカル工笑（島根県西部におけるホクシン
1BS-18 の栽培適性の検討と６次化アイテムの開発）
2019 年 7 月に収穫した 2019 年度産 1BS-18 ホ
クシン（浜田市）は、2 か所合計 13.5a の畑より
約 200kg 収量が得られた。昨年度課題であった、
野鳥被害対策として、耕作農地を変更することにより被害の軽減を試みた。2019 年度には、収穫時期に気候条件に恵まれてグルテンの粘弾性が高く、製パン性に優れた 1BS-18 ホクシンが収穫今後の研究活動についてされた。地域事業者（益田市）と連携して試作し申請者らの研究グループは 2007 年に共同研究

た食パンは膨らみも良くサンドイッチにも加工体制を確立して、低アレルゲン化小麦の研究事業

73ω-5 グリアジン欠損食用小麦の開発：ω-5 グリアジン感作型小麦アレルギーの根絶に向けてを推進してきた。2017 年度、研究の節目を迎え、地方大学の試みとして、多くの購買層、特に小麦本研究の将来的なアウトカムを研究成果の社会

アレルギー患者および関心を持つ層の目に留ま実装（事業化）に定めた。2018 年度はこれに加るよう努力していきたい。

え、島根県中山間地域の活性化に資する仕組みづ
くりに関する基礎的検討を開始した。2019 年度

参考文献

は、引き続き小麦アレルギー治療法の確立のため、

1)

Hamada Y, Chinuki Y, Fukutomi Y, Nakatani E,
Yagami A, Matsunaga K, Oda Y, Fukunaga A,「低アレルゲン化小麦 1BS-18 ホクシンの臨床応

Adachi A, Hiragun M, Hide M, Morita E. Long-

用に関する多施設共同第 II 相臨床試験」を実施

term dynamics of omega-5 gliadin-specific IgE

し、小麦アレルギー患者の低アレルゲン化小麦

levels in patients with adult-onset wheat allergy. J

1BS-18 ホクシンパンの摂取量の確認および継続

Allergy Clin Immunol Pract. 2020; 8(3): 1149-

摂取による減感作療法の確立の可能性を評価し1151.

ている段階にある。今後は、治療法の確立のため、

2)Morita E, Matsuo H, Chinuki Y, Takahashi H,

大規模臨床試験も必要と考えている。また、小麦Dahlström J, Tanaka A. Food-dependent exercise-

アレルギー予防法の確立のため、アレルギーモデ

induced anaphylaxis-Importance of omega-5

ルラットを用いて経口免疫寛容の評価系を完成

gliadin and HMW-glutenin as causative antigens
forさせた。今後は、予防法について得られた評価系

wheat-dependent

exercise-induced

anaphylaxis- Allergol Int. 2009 ; 58(4): 493-498.

を活用して詳細な検討を進めたいと考えている。

3)

低アレルゲン化小麦 1BS-18 系統小麦の普及に

Morita E, Chinuki Y, Takahashi H, Nabika T,
Yamasaki M, Shiwaku K. Prevalence of wheat

より新たな小麦アレルギー患者の発症が抑制さ

allergy in Japanese adults. Allergol Int. 2012;

れる可能性が高いことから、1BS-18 系統小麦製

61(1): 101-105.
4)

品販売の実現準備、製粉、保管施設の設立が必要

Kohno K, Takahashi H, Endo T, Matsuo H,と考え、準備を進めている。今年度は、島根県益Shiwaku K, Morita E. Characterization of a

田市および浜田市において、新たに地域事業者か

hypoallergenic wheat line lacking ω-5 gliadin.

らの協力と行政の参画が得られつつある。今後は、さらにこの体制を柔軟に促進させ、キラリと光る

74

Allergol Int. 2016; 65(4): 400–405.

役員・評議員・研究助成審査委員名簿（ 2020年 9月 30日 現 在 ）

1.役員
理事長

山田良司

常勤

元 日本ハム（株）中央研究所

副理事長

岩間

非常勤

日本ハム（株）中央研究所

専務理事

沖浦智紀

常勤

日本ハム（株）中央研究所より出向

一色賢司

非常勤

（一財）日本食品分析センター
北海道大学名誉教授

伊藤節子

非常勤

同志社女子大学

清

所長

所長

生活科学部

学術顧問、
特任教授

宇理須厚雄 非常勤

藤田医科大学

医学部

客員教授

大社啓二

非常勤

日本ハム（株)

相談役

畑江敬子

非常勤

お茶の水女子大学名誉教授

村田容常

非常勤

お茶の水女子大学

久木田 勝

非常勤

日本ハム（株）経理財務部

大谷敏郎

非常勤

(公財)日本植物調節剤研究協会 理事長

菊田行紘

非常勤

TMI 総合法律事務所

河野陽一

非常勤

（独）労働者健康安全機構 千葉労災病院 名誉院長
千葉大学名誉教授

西藤久三

非常勤

（一財）食品産業センター

清水 誠

非常勤

東京大学名誉教授
東京農業大学客員教授

畑 佳秀

非常勤

日本ハム（株）代表取締役社長

前田文男

非常勤

日本ハム(株)取締役 常務執行役員 経営企画本部長、中央研究所担当

理事

監事

基幹研究院自然科学系

教授

次長

2.評議員

評議員

75

弁護士

顧問

3.研究助成審査委員
委員長

委員

一色賢司

(一財）日本食品分析センター
北海道大学名誉教授

穐山

国立医薬品食品衛生研究所

浩

食品部

部長

五十部誠一郎日本大学

伊藤浩明

あいち小児保健医療総合センター

川村

香川大学

農学部

教授

楠 隆

龍谷大学

農学部

教授

倉園久生

徳島大学 副理事(研究支援担当)・教授
研究支援・産官学連携センター 副センター長

駒井三千夫

東北大学

下条直樹

千葉大学予防医学センター

特任教授

立花宏文

九州大学大学院農学研究院

主幹教授

柘植郁哉

藤田医科大学医学部

鍋谷浩志

東京家政大学 短期大学部栄養科 教授

松本健治

国立成育医療研究センター研究所

三橋富子

元日本大学短期大学部

森山達哉

近畿大学

好田 正

東京農工大学大学院農学研究院 教授

理

生産工学部

顧問

教授
センター長

名誉教授

農学部

客員教授

部長

教授

教授

2019年 度 事 業 の 審 査 は 以 下 の 委 員 に も ご 担 当 い た だ き ま し た 。

新井克彦

東京農工大学農学部付属硬蛋白質利用研究施設

76

教授

公益財団法人ニッポンハム食の未来財団
１．目

案内

的

食物アレルギーや食品分野における研究、研究支援及び啓発活動を行い、もって世界の人々においしさの感動と健康の喜びを提供することを目的とする。

２．事業内容本法人は、前条の目的を達成するため、次の事業を行います。
(1) 食物アレルギーや食品分野に関する講演会等の開催(2) 食物アレルギーや食品分野に関する印刷物の刊行及び広報活動(3) 食物アレルギーや食品分野に関する試験研究及び調査(4) 食物アレルギーや食品分野に関する研究を行う者に対する助成(5) 食物アレルギーや食品分野に関する指導者の育成及び啓発活動への支援(6) 食物アレルギーや食品分野に関する研究及び啓発活動に関し功績のある者の表彰(7) その他この法人の目的を達成するために必要な事業

３．沿革2015 年 1 月 27 日に日本ハム株式会社により「一般財団法人ニッポンハム食の未来財団」として設立されました。
内閣総理大臣より公益認定を受け、2017 年 4 月 1 日より「公益財団法人ニッポンハム食の未来財団」
として活動しています。

４．情報公開等
Web サイト： https://www.miraizaidan.or.jp/
Facebook： https://www.facebook.com/miraizaidan

Twitter： https://twitter.com/syokunomirai/

５．2020 年度主な事業活動
・2020 度研究助成の実施、2021 年度研究助成の公募 及び 2019 年度研究助成の成果報告会の実施
・第 6 回食物アレルギー対応食 料理コンテストの実施
・主催セミナーの実施
・2020 年度団体活動支援助成の公募及び実施
・当財団 Web サイトからの情報発信
以上77公益財団法人ニッポンハム食の未来財団
2020 年 9 月 30 日発行〒305-0047 茨城県つくば市千現 2-1-6
つくば研究支援センターA-24
電話
029-893-4466
FAX
029-893-4360
URL
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E-mailinfo@miraizaidan.or.jp
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