ISSN 1347-4804

January 2019Vol.87 No.1

〔総説〕

「再生研究における細胞単離用抗 CPM 抗体の活用」「動物を用いない高感度な皮膚感作性評価法 "ADRA" の紹介」
「第 34 回 Wako ワークショップ見聞録
【連

山本

裕介、藤田

正晴、笠原

後藤

慎平……… 2

利彦、勝岡

尉浩……… 12岩㟢

広英……… 22

神経科学：基礎から臨床」

載】〈アミノ酸分析 ～新たな潮流～〉「第 3 回

アミノ酸分析の新しい潮流②

キラルに着目したアミノ酸分析」

唐川

幸聖、原田

真志………

5

健太郎………

8〈核酸医薬合成 基礎講座〉 番外編「オリゴヌクレオチドの精製」

佐藤〈エクソソームと生命現象〉「第 4 回

エクソソーム糖鎖プロファイリングのススメ」

松田

厚志……… 10

〔化学大家〕 特別編
「宮沢

賢治」

桜井

弘……… 25〔製品紹介〕
有機合成培

有機 EL 関連製品………………………………………… 20

抗ＣＰＭ，モノクローナル抗体（WK）… …………………

核酸合成用反応補助試薬………………………………… 20

CultureSure 3,3’
,5-トリヨード -L- チロニンナトリウム…… 17分

iCell® 心筋細胞 2.0-01434、

析

養

4

®

7

iCell®ドーパミン神経細胞 -01279… …………………… 18

ＡＤＲＡ キット… …………………………………………… 14

心毒性陽性化合物………………………………………… 19

ポジティブリスト関連標準品… …………………………… 17

細胞生物

機

透明化試薬 SCALEVIEW®-S、SeeDB2、CUBIC… … 16

キラルカラム CROWNPAK CR/ CROWNPAK CR-Ⅰ……

器

３カラーデジタル PCR ナイカシステム…………………… 15

遺セルモーションイメージングシステム SI8000… ………… 19

MagCaptureTM エクソソームアイソレーションキット PS…… 11

伝

子

ScreenF ectTMUP-293…………………………………… 28

1

R

esearch
再生研究における細胞単離用抗 CPM 抗体の活用
京都大学大学院

呼吸器疾患創薬講座

後藤慎平

呼吸器細胞の分化誘導法の開発経緯ずかな健常細胞を得るよりほかは難し

ヒト多能性幹細胞（ES および iPS

肺は一見複雑に見える構造をしていたことから、研究を進めることは容易細胞）が誕生して以来、様々な臓器細るが、規則正しく分岐する精細な気管ではなかった。ヒト多能性幹細胞はこ胞に分化させる技術が確立され、再生支の枝で構成された気道領域と末梢にうした細胞供給の問題を解決できる可

医療もようやく現実的なものになりつ

位置し数億個の肺胞からなる肺胞領域能性が期待されている 8）。また、末梢つある。特にヒト iPS 細胞を用いた網に大きく分けることができる。前者は血があればヒト iPS 細胞の樹立が可能

膜色素変性症の細胞移植治療に加え、異物や病原体の除去、後者はバレーなため、稀少疾患であっても採血さえ重症虚血性心筋症やパーキンソン病にコートの半面分ともされる十分な表面協力を得ることができれば、iPS 細胞

対する臨床研究・治験も始まろうとし積を確保してガス交換の役割を担ってを樹立することができ、そこから肺にており、呼吸器を含むその他の臓器のいる。肺を構成する細胞には上皮細胞分化させ疾患病態を再現できる可能性

再生医療についても期待が高まっていのほかにも線維芽細胞や免疫細胞、血がある。こういった背景のもと、ヒトる。まだ基礎的な研究の域ではある

管内皮細胞などの多種類の細胞が挙げ

多能性幹細胞から呼吸器細胞への分化られるが、外界と接する上皮細胞が、誘導法が期待されてきた 9）。

はじめにが、人工気管の研究

1）や、脱細胞化2）

く、肺胞上皮細胞については未だに長期培養する技術も確立されていなかっは臨

その他の細胞との相互作用を通じて、

床工学的な視点も組み合わせて研究が発生過程や様々な呼吸器疾患の病態に進められており、一定の成果を収めておいて重要な役割を果たすことが示唆きている。これらの研究においては近され、気道および肺胞上皮細胞を用い

次に分化誘導法について述べる。肺い将来、臨床応用に向けてヒト由来のた病態モデリングが期待されてきた。

は発生学的に内胚葉、前方前腸と分化細胞が必要となる。再生医療においてこれまでこういった研究には遺伝子改した後、前方前腸の一部に「腹側化」

細胞の供給方法が重要なことは言うま

変マウスを用いた病態モデルが中心的が起こり、将来の肺を構成する芽となでもないが、特にヒト多能性幹細胞を役割を果たしてきたが、ゲノム背景のる細胞成分が出現したところから発生用いた再生医療では、安全性、機能違いなどから必ずしもヒトの病態を反する。この時に肺の代表的な分化マー性、確実性が求められ、優れた分化誘

映しない可能性も明らかとなってきて

カ ー の １ つ で あ る NKX2.1（TTF1）

導法はこれらすべてに関わる必須技術いる。特に近年は細胞に立体構造を形が発現することが目印となる 10）。培と言える。ヒト多能性幹細胞は培養皿成させて培養する「ミニ臓器」とも表

養皿内でヒト多能性幹細胞から分化

内での分化誘導を基本とするが、多く現されるオルガノイド培養の研究が進誘導した前方前腸をいかに効率よくの臓器細胞において発生学の知見が大み、生体組織から得られるデータとの「腹側化」させるかが重要となり、多いに参考となってきた。肺は内胚葉臓整合性も検討されつつあることから、

くの研究者によって試みられてきた器であるが、ヒト多能性幹細胞から内ヒト由来細胞とオルガノイド培養を組が、筆者らはトレチノイン（ATRA）、胚葉系臓器細胞への分化誘導においてみ合わせた疾患モデリングが期待され

BMP4、CHIR99021 の濃度の組み合わ肺を用いた肺の臓器再生研究7）

分化誘導におけるCPM
抗体の有用性

最初のマイルストーンは、2006 年にるようになっている 。従来の呼吸器せによって「腹側化」の条件を整える

さかのぼり、ヒト ES 細胞から膵臓β

分野では、上述の臓器再生や疾患モデことに成功した 11）。この ABC 三因子細胞への分化誘導について、発生の段リングの検討に使えるヒト由来細胞がによって「腹側化」の条件を最適化す

階を培養皿内で再現することが有効と限られており、がん細胞を由来とするる と 細 胞 株 に よ っ て は 80% 程 度 の報告されたことに始まる 。以降は、細胞株は依然重要なツールではあった

NKX2.1 陽性率を得ることができた。

肝臓 4） や腸管細胞 5） など他の内胚葉

ものの、本来の細胞機能の多くが失わ

しかし、分化効率は細胞株によって一系臓器細胞の分化誘導においても発生れており、本来の細胞機能を再現する定なものではなく、せいぜい 50% 程

学的な段階を再現して分化を促進するには組織から回収できる初代細胞を入度しか NKX2.1 が陽性にならない細胞ことが合理的と報告されたが、肺への手してオルガノイド培養を行なう必要株もあり、その後の分化誘導を安定し分化誘導法の研究成果の報告は遅れ、があった。初代細胞の入手のためにたものにするためには NKX2.1 陽性細2011 年になってようやく内胚葉からは、本邦では倫理的な問題を避けるた胞だけを単離する方法が必要になっ肺に向かう第一歩となる前方前腸へのめ、肺がんのため一定の術式に沿ったた。筆者らは当初、NKX2.1 が陽性に肺切除がやむを得ない場合に、診断になると蛍光を発するレポーター細胞を影響しないレベルで臨床検体から、わ作ろうとしたが、特異的な表面抗原を3）6）

分化誘導法が初めて報告された 。

2

医学研究科

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）

図 A．ヒト多能性幹細胞から呼吸器細胞への段階的分化誘導

見つけた方が細胞株ごとにレポーター

胞に効率よく分化し、繊毛運動が観察ると一定の割合でⅡ型肺胞上皮細胞に細胞を樹立しなくても済むため、方針され主たる機能である粘液繊毛輸送能

分化することが証明できた 13）。

を変えて表面抗原の同定に取りかかっを有することも証明された 12）。次に、た。そこで筆者らはヒト iPS 細胞から肺胞上皮細胞に分化させたい場合は、分化させた前方前腸と効率よく「腹側研究用に市販されている胎児肺由来化」させた後の細胞からそれぞれの線維芽細胞と共培養を行ないなが以上より、NKX2.1 陽性細胞を表面RNA を抽出し、網羅的遺伝子発現解ら、 肺 胞 へ の 分 化 促 進 作 用 が あ る

抗原 CPM で単離することにより、ヒ析で比較し、複数の候補となる表面蛋

Dexamethasone や KGF（FGF7）なト多能性幹細胞から機能的に成熟した

11）

今後の展望

白質を同定した。NKX2.1 陽性細胞にどを含む培地で培養する。 当 初、

気道や肺胞上皮細胞に安定的に効率よおける発現を免疫染色で順番に調べて肺胞の組織幹細胞であるⅡ型肺胞上く分化誘導できる方法が確立できたといったところ、GPI アンカー型蛋白質

皮細胞への分化効率は 10 － 15％と筆者らは考えている。海外からも気道として細胞表面に存在すると報告され

低 か っ た が、「 腹 側 化 」 の あ と、や肺胞上皮細胞を分化誘導できたとすて い た Carboxypeptidase M（CPM）

CHIR99021、FGF10、KGF（FGF7）、

る報告が蓄積されつつあるが、肺に分が、NKX2.1 と よ く 共 発 現 す る こ とNotch シグナル経路を阻害するγセク

化する NKX2.1 陽性細胞を表面抗原をが 分 か り、CPM 抗 体 で 標 識 す れ ば

レターゼ阻害剤 DAPT を含む培地で用いて単離する方法として報告されてNKX2.1 陽性細胞を単離できることを

1 週間培養する段階を加えた 13）。そのきたのは CPM 以外には、最近報告さ見出した。単離した細胞は、細胞外基

後、NKX2.1 陽性細胞を単離し胎児肺れた CD47highCD26low で単離する手質（マトリゲル）のなかで培養すると線維芽細胞との三次元共培養を行なう

法のみである 14）。様々な分化誘導法

三次元構造を形成し、培養条件を変と、Ⅱ型肺胞上皮細胞への分化効率はが報告されてきたが、今後真価が問わえることで気道上皮細胞にも肺胞上50％程度にまで上昇することを見出しれるのはいかに応用が可能かであり、皮細胞にも分化促進できることが分た。また、Ⅱ型肺胞上皮細胞は肺サー

異なる細胞株であっても目的の細胞まかった（図 A）。気道上皮細胞に分化

ファクタントの主成分であるリン脂質で安定的に分化誘導できる表面抗原をさせたい場合は FGF10 や古典的 Wntを細胞外から取り込む機能を持つが、利用した筆者らの分化誘導技術は必ずシグナル経路を刺激する GSK3β阻害

蛍光標識したリン脂質を培地に加える

役立つと確信している。今後展開が予剤である CHIR99021 などを含む培地とⅡ型肺胞上皮細胞のラメラ体に集積想されるのは、これまで実験動物ではで培養し、オルガノイドがある程度することから機能的なⅡ型肺胞上皮細実現の難しかった疾患病態モデルの開育ってから初代細胞用の市販培地に切13）。

発であり、特に稀少な難治性呼吸器疾。すると繊毛細胞だけでさらに NKX2.1 陽性細胞を単離したあ患についてヒト iPS 細胞を用いた研究なく粘液産生細胞、クラブ細胞、基底と、胎児肺線維芽細胞との共培養をしが活発になるであろう。また、ヒト多細胞、神経内分泌細胞など代表的な気な く て も CHIR99021、SB431542 な ど

能性幹細胞を用いた細胞移植、人工気道上皮細胞成分が含まれる気道上皮細の組成を含んだ培地で三次元培養をす

管、脱細胞化肺などの臓器再生の技術

り替える

12）

胞に分化できていることを確認した

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）3

開発、薬剤や喫煙や環境汚染物質への曝露に対する肺毒性試験といった多岐にわたる応用が予想される。

謝辞最後に述べておきたいこととして、
NKX2.1 陽性細胞の表面抗原として筆者らが CPM を同定してまもなく、当時某社で市販され細胞単離に使えていた唯一の抗 CPM モノクローナル抗体
は一斉に販売中止となってしまった。
残っていた抗体でしのぎながら当初独自で CPM 抗体の開発に着手したがな

図 B．CPM 抗体（WK）を用いた呼吸器上皮幹細胞の単離かなかうまくいかず、当時の和光純薬工業株式会社（現 富士フイルム和光
純薬㈱）が細胞単離に使える抗 CPM抗体の開発を快諾していただいたことで、結果的に筆者らの研究は滞りなく前進することができた。筆者らは現在、以前と同等の細胞単離ができるように開発された抗 CPM モノクローナ
ル抗体（WK）を用いて肺の分化誘導研究を続けることができている（図B）。この場を借りて御礼申し上げたい。
〔参考文献〕
１）Sakaguchi, Y. et al . : J. Thorac. Cardiovasc .
Surg ., 156, 1264（2018）.
２）Nichols, J. E. et al . : Sci. Transl. Med ., 10,
eaao3926（2018）.
３）D'Amour, K. A. et al . : Nat. Biotechnol ., 24,1392（2006）.
４）Sullivan, G. J. et al . : Hepatology , 51, 329（2010）.

多能性幹細胞
三胚葉すべての体細胞に分化できる能力があり、ES 細胞や iPS 細胞の総称。
GPI アンカー型蛋白質
翻訳後の蛋白質C末端に糖脂質である
GPI 基の修飾を受けて細胞膜表面に結合した蛋白質。ヒトには150種類程度の
GPI アンカー型蛋白質が存在し、様々な役割を果たしている。

５）Spence, J. R. et al . : Nature , 470, 105（2011）.
６）Green, M. D. et al . : Nat. Biotechnol ., 29, 267（2011）.
７）N ikolić, M. Z. et al . : Development , 145（2018）.
８）Yiangou, L. et al . : Cell Stem Cell , 22, 485（2018）.
９）S omers, A. et al . : Stem Cells , 28, 1728
（2010）.

ES 細胞
胚盤胞の内部細胞塊から樹立される細胞株。1981 年に Evans 博士らによって初めて報告された。
iPS 細胞
体細胞に複数種類の遺伝子を発現させることで分化多能性と自己複製能を獲得した細胞。2006 年に山中博士らによって初めて報告された。

10）Kimura, S. et al . : Genes Dev ., 10, 60（1996）.
11）Gotoh, S. et al . : Stem Cell Reports , 3, 394（2014）.
12）Konishi, S. et al . : Stem Cell Reports , 6, 18（2016）.
13）Yamamoto, Y. et al . : Nat. Methods , 14, 1097
（2017）.
14）Hawkins, F. et al . : J. Clin. Invest ., 127, 2277
（2017）.

気道・肺胞前駆細胞のマーカー
抗CPM，モノクローナル抗体（WK）
製品概要●組成：り ん 酸 緩 衝 液、50 w/v% グ リ セ ロ ー ル 及 び
0 . 05 w/v% アジ化ナトリウム●用途：フローサイトメトリー（1：100 〜 200）
免疫染色（1：100 〜 1 , 000）

●濃度：1 . 0 mg/mL（初回生産ロット実測値）

ウエスタンブロット（1：1 , 000）

●サブクラス：マウス IgG2 b
コード No.
014-27501

品
名Anti CPM, Monoclonal Antibody
（WK）

規 格
フローサイトメトリー用

容 量
100µL

希望納入価格（円）50,000…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2019 年 1 月時点での情報です。最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

4

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）

アミノ酸分析〜新たな潮流〜

第 3 回 アミノ酸分析の新しい潮流② キラルに着目したアミノ酸分析
味の素株式会社

イノベーション研究所

唐川

幸聖、原田

真志

はキラルでないカラムを用いる。どち

はじめにらの方法も、液体クロマトグラフィー（LC）、ガスクロマトグラフィー（GC）、

生体を構成している化合物の多く、超臨界クロマトグラフィー（SFC）、

例えば糖、核酸、アミノ酸、タンパク

キャピラリー電気泳動（CE）など様々

質など、これらのほとんどは「キラル6）な分離方法が用いられる 。

本稿では、特に食品や生体試料中のな化合物」である。不思議なことに、現存する生命の多くがキラル化合物の

図１．L- および D- アミノ酸の構造

微量な D- アミノ酸を、多量に含まれ一方の立体を選択的に利用しており、る L- アミノ酸や夾雑成分と分けて分

この偏った状態のことを「ホモキラリ

析する方法について、LC を用いた直ティ」と呼んでいる。一対のキラル化合物（エナンチオマー）は、旋光性以キラルなアミノ酸を区別する

接法、間接法それぞれの長所、短所と合わせて紹介したいと思う。

外の物理的、化学的性質が全く同じでこれまで様々な方法でキラルなアミあることが知られているが、「ホモキノ酸を区別することが試みられてきラリティ」の状態である生体中では全た。エナンチオマーの唯一の物理的性

く違う働きをするものが多い。例え

質の違いである「旋光性」を利用した

ば、医薬品サリドマイドの光学異性体

旋光度計、円二色性検出器を用いた検

キラルなアミノ酸をキラルカラムでの一方が催眠作用を持つが、もう一方

出法では光学純度を直接測定すること分離する方法は古くから検討されておの立体は生体内での働きが全く異なができる。また、エナンチオマーを分り、非常に信頼性が高い方法である。

り、その催奇形性が判明したことはと離し個々に検出する方法では、「別のこの方法では、キラルな分子が固定相ても有名な話である。医薬品だけでな

キラル化合物」を用いて「キラルを認に担持されたキラルカラムを用いて、く、より身近な例としてはアミノ酸の識」させることによって、キラル化合

水素結合、静電相互作用、π-π相互

キラリティがある。タンパク質を構成物を区別し、分離している。これは例

作用、疎水性相互作用などにより分析するアミノ酸はアミノ基α位の炭素にえるならば、差し出された手（＝キラ種のキラル化合物を認識し、分離す

キラル中心を持っており、エナンチオ

ル化合物）が右手か左手かを区別するる。キラルセレクターの選び方次第でマ ー は L 体、D 体 と し て 区 別 さ れ る

ときに、こちらが右手を出して正しくは、これらの相互作用がうまく噛みあ（図 1）。タンパク質の構造として用い握手できたら右手、できなければ左手い、非常に良好なキラル分離を達成すられるものも含め、生体中のアミノ酸である、という方法と似ている。分析ることが可能であるため、ある特定のの大部分は L 体であり、マイナーな Dの世界では、認識に用いる「別のキラ化合物をキラル分離する場合には非常体の存在に関しては「意味のないもル化合物」のことを「キラルセレクに便利な方法である。一方で、バラエの」として古くから議論されてこな

ター」と呼んでおり、汎用的分離手法

ティに富んだ構造を有するアミノ酸をかった。しかしながら近年、D- アミ

は、キラルセレクターの使い方によっ

幅広くキラル分離できる固定相は、非ノ酸が細菌のペプチドグリカン構成成て大きく２つに分類される。

常に限られている。さらに、L- アミノ

キラルカラムを用いた D, Lアミノ酸分析

分として産生、利用されていること

一つは、キラルセレクターを固定相

酸やその他の夾雑成分が多量に存在すや、環境応答因子として機能しているに担持（または移動相に添加）するこる食品や生体試料から微量な D- アミ

1）

ことが明らかとなってきた 。また、とにより、カラム中にキラルな環境をノ酸を分析するためには、選択性や感D- アミノ酸は身近な発酵食品や醸造持たせたキラル固定相法（またはキラ度が不足するケースも多い。そのた酒中に多く含まれていることや 2）、アル移動相法）であり、直接法ともいわめ、 プ レ カ ラ ム 誘 導 体 化、 多 次 元

ミノ酸の L 体と D 体で味が異なるこれる。もう一つの方法は、キラルセレ

LC、質量分析計（MS）など、選択性とが知られている 3）。さらには、哺乳クター自体を誘導体化試薬として分析や感度を向上させる工夫をキラルカラ

動物においても D- セリンが脳で記憶種と反応させる方法がある。この方法

ムでの分離と組み合わせる方法が近年や学習に機能していること 4, 5） など、はキラル誘導体化法、もしくは間接法開発されている。

L- アミノ酸とは異なる機能を有すること言われており、性質が同じで分離で代表例として、プレカラム誘導体化とが様々な生物種で明らかとなり、アきないエナンチオマーを、化学的性質と 2 次元 LC を組み合わせることで選

ミノ酸を D 体と L 体に分けて分析すの異なる立体異性体であるジアステレ

択性、感度ともに優れた分析法が報告る重要性が高まってきている。

オマーに変換することができ、分離にされている 7）。本法は、本連載第２回

本シリーズの企画・構成に際し、味の素株式会社 イノベーション研究所 宮野博様にご協力頂きました。
和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）5

でも述べられているアミノ基と選択的せてキラルセレクターとする、という酸の一斉分析はキラル誘導体化法の課に反応する誘導体化試薬、4- フルオのがキラル誘導体化法である。キラル

題であった。

ロ -7- ニトロ -2,1,3- ベンズオキサジア

化合物とキラル化合物を反応させるこ

最近、軸不斉骨格を有する LC-MS/

ゾール（NBD-F）を用いて化合物をとにより、キラルな化合物はジアステ

MS 分析用に設計された新しいキラル誘導体化する。その後、1 次元目の逆レオマーとなり、化学的性質が異なる

誘 導 体 化 試 薬、（R ）-BiAC（ 図 2） が

相カラムで各アミノ酸を分離、オンラ

化合物となる。そのため、キラルな環開発された 11）。この試薬は第一級まイン分取した後、2 次元目のキラルカ

境を有さないカラムでもジアステレオ

たは第二級アミノ基を有する化合物とラムに分取したアミノ酸を順次導入しマーを分離することが可能になる。キ

選択的に反応する。アミノ酸の不斉点ていくことにより、アミノ酸の D, L 体

ラル誘導体化法は、キラルセレクター

付近に軸不斉骨格による良好な不斉場を分離する。本分析法では幅広いアミが固定相側に存在するキラルカラムをが構築されるため、D, L- アミノ酸の立ノ酸を一斉にキラル分析するため、独用いる方法よりも、より空間的に近い体を良好に識別することが可能であ

自に設計、作製されたキラルカラムを場所でキラルを認識することができ、る。その結果、分離度 R s 1.9 以上の高使用している 。このような多次元

誘導体化試薬の選択次第では非常に高い分離度ですべてのタンパク質構成ア

LC を用いた分析法は、１サンプルのい分離度で D, L- アミノ酸を分離する

ミノ酸 19 種類のキラル分離が 11.5 分

分析に数時間から十数時間と長時間かことができる。また、誘導体化試薬のという短時間で可能となった（図 3）。

かるが、非常に選択性が高く、夾雑成

骨格として、「特定の官能基と選択的

この試薬の最大の特徴は、D, L- アミノ

分の多い生体試料の分析では非常に信に反応する反応基」、「検出器に合わせ酸の溶出順であり、すべてのアミノ酸頼性が高く有用な手法である。

て高感度に検出するための検出基」をにおいて D 体→ L 体の溶出順となっ持たせることにより、高選択的かつ高ている。この溶出順は、生体試料中に感度な分析が可能となる。

微量に含まれる D- アミノ酸の検出に

8）

一方、キラルカラムを用いた非誘導体化での網羅的 D, L- アミノ酸分析法も開発されている。キラルなアミノ酸

これまで様々なキラル誘導体化試薬

適 し た 方 法 で あ る と い え る。 ま た、を一斉にキラルカラムにて分離し MSが開発されてきた 10）。多くの試薬のMS での感度を向上させるためのジエに導入することにより、質量（正確にキラル骨格として、アミノ酸や糖とチルアミノ基を有しており、１インは m/z ）の違いによりアミノ酸ごといった天然由来の化合物が利用されてジェクションあたり atto モルレベルの分離、検出を行う。代表例として、

おり、用途に合わせて様々な試薬が使での高い感度が実現できる。本分析法

キラルクラウンエーテルを固定相に有用されている。代表的なものにオルト

では、高い光学純度の誘導体化試薬をするカラム（CROWNPAK CR-I（+），

フタルアルデヒド（OPA）とキラル準備する必要があることや、MS の分ダイセル）を用い、HILIC モードのチオールを用いて D, L- アミノ酸をジ

析に伴うマトリックス効果の補正のた移動相で分析を行うことでプロリンなアステレオマーに誘導体化する方法がめ安定同位体標識された内標準物質を

どの第二級アミノ酸を除く幅広いアミ

知られている 2）。しかしながら、先述

準備する必要があるものの、誘導体化

ノ酸の良好なキラル分離を達成した分の通りアミノ酸は多様な構造と性質を試薬とカラムを準備すれば、汎用の析法が報告されている 9）。本法では、持つため、幅広くアミノ酸を D, L- 分

LC-MS/MS 装置で D, L- アミノ酸の一1 サンプルの分析時間が非常に短時間離することが難しかった。単一の試

斉分析を実施することができるというであり、誘導体化を行わないため、前薬、単一の分離条件での D, L- アミノ

メリットがある。今後、本（R ）-BiAC

処理がより簡便であるという特徴がある。高感度な MS を用いることにより微量な D- アミノ酸を検出できる一方で、マトリックス効果や、複雑な試料の分析では同じ m/z を有する夾雑成分の妨害を受けやすいことに注意する必要がある。

キラル誘導体化試薬を用いた D, L- アミノ酸分析
誘導体化試薬にキラルな構造を持た

6

図２．（R ）-BiAC の構造の特徴とアミノ酸との反応

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）

を用いる分析法は様々なサンプルの D,
L- アミノ酸をはじめとするキラル化合物の分析に応用されていくと期待される。

おわりにこれまでのシリーズで、非常に多様なアミノ酸分析の方法が紹介されてきた。キラルアミノ酸分析はさらに多様であり、測りたいサンプルの種類、アミノ酸の種類、必要な精度や感度などに合わせてこれらの分析法を選択する必要がある。今後のキラルアミノ酸分
析法の発展と、それを用いたさらなるD- アミノ酸の研究成果が、人々の暮図３．(R )-BiAC によるアミノ酸標品 20 種類の抽出マスクロマトグラム

らしに貢献できることを期待し、本稿
4）Nishikawa, T. : J. Chromatogr. B , 879, 3169

を終えたい。

5）Kakegawa, W. et al . : Nat. Neurosci ., 14, 603〔参考文献〕
683（2018）.

（2008）.
11）Harada, M. et al . : 特願 2015-197070（2011）.

1）Aliashkevich, A. et al . : Front Microbiol ., 9,（2017）.
10）Ilisz, I. et al . : J. Pharm. Biomed. Anal ., 47, 1（2011）.

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7）Hamase, K. et al . : Anal. Sci ., 25, 961（2009）.
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3）K awai, M. et al . : Amino Acids , 43, 2349
（2012）.

（2018）.

次回（第４回）は、vol. 87 No. 3 に掲載を予定しています。

9）Nakano, Y. et al . : J. Biosci. Bioeng ., 123, 134

キラルアミノ酸分析に使用する（R ）-BiAC につきましては当社 お客様相談室までお問合せ下さい。
https://labchem.wako-chem.co.jp/question/others/

キラルカラムCROWNPAK CR/ CROWNPAK CR-Ⅰ
コード No.

メーカーコード

308-32121

27711

CROWNPAK CR Guard Column

0.4cm×1cm×5μm

1本30,000305-08201

28714

CROWNPAK CR（−）Conventional Analytical Column

0.4cm×15cm×5μm

1本

180,000

301-08203

28734

CROWNPAK CR（−）Semipreparative Column

1cm×15cm×5μm

1本600,000

302-08191

27714

CROWNPAK CR（+）Conventional Analytical Column

0.4cm×15cm×5μm

1本

180,000

308-08193

27734

CROWNPAK CR（+）Semipreparative Column

1cm×15cm×5μm

1本600,000

382-02511＊

385-02501

品

名

内径×長さ×粒子径

容量

希望納入価格（円）54784

CROWNPAK CR-Ⅰ（−）Conventional Analytical Column

0.3cm×15cm×5μm

1本

195,000

53784

CROWNPAK CR-Ⅰ（+）Conventional Analytical Column

0.3cm×15cm×5μm

1本

195,000＊本文中で使用されているカラム…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2019 年 1 月時点での情報です。最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）7核酸医薬合成番外編

基礎講座

サイエンスライター佐藤健太郎

オリゴヌクレオチドの精製
前回までに、主に固相合成法によって、オリゴヌクレオチドを合成する方法について記してきた。固相担体に結びつけたヌ
クレオチド鎖を必要なだけ伸長し、脱保護及び担体からの切り出しを行うことで、合成は完了する。
ただし、こうしてできた合成ヌクレオチド鎖は、さまざまな不純物を含む。合成の途中で徹底的に洗浄を行うとはいえ、各種不純物の残存は完全には避けられない。
不純物の中でも一番厄介なのは、伸長反応や脱保護の失敗によって生じた、目的物よりも短いオリゴヌクレオチド類である。これらは性質が目的物に類似しているため、基本的に分離が難しい。キャッピング反応を各段階であらかじめ行っておくことで、精製困難な不純物の生成をかなり抑えられるが、場合によっては除去に苦労するケースも多い。

図１．オリゴヌクレオチドの脱保護

どの程度こうした不純物の残存を許すかは、使用目的による。

オリゴヌクレオチドが凝集してくる。これを遠心分離によって一般的な PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）のプライマーに用い沈降させ、上澄みを捨てることで、無機塩や保護基由来の低分る場合であれば、神経質に高純度を求める必要はないが、用途

子などをある程度除去することができる。

によっては不完全なヌクレオチド鎖をできる限り除去する必要

順相または逆相シリカを充填した短いカラムを用いた、脱塩が出てくる。人体に投与する核酸医薬では、最高レベルの純度処理も広く行われる。逆相カラムを用いる場合、トリエチルアを求められるのはもちろんのことである。また、ヌクレオチド

ミン−酢酸緩衝液などに合成オリゴヌクレオチドを溶解し、カ

鎖長や修飾状態（蛍光タグなどが組み込まれているか否か）に

ラムにチャージして各種緩衝液などで流し出すことにより、低よっても、精製方法は変わってくる。

分子や無機塩などの不純物を除くことができる。
この操作では、保護基残渣などの低分子は除かれるが、不完

リボヌクレアーゼへの対策

全なオリゴヌクレオチド鎖は除去されず残存してしまう。ただオリゴヌクレオチドの中でも、RNA 合成における特有の問し、用途が PCR のプライマーなどであれば、この程度の精製題として、酵素による分解がある。リボヌクレアーゼ（RNase）

でも十分利用可能である。またこの脱塩工程は、HPLC など他は多くの生物に普遍的に存在し、効率よく RNA を分解してしの精製法の後に、塩類を除去する目的でも行われる。

まう。研究者の手に付着した細菌、空気中に浮遊する各種微生物もこの RNase を持っており、大切な合成 RNA を破壊してしまう。

高速液体クロマトグラフィー（HPLC）
さらに高い純度が求められる場合には、HPLC が用いられる。

これを防ぐため、研究者はラテックスなどの実験用手袋を着用し、使い捨てのプラスチック製容器（RNase フリー）を用い

多くの場合、シリカに C18 の炭化水素鎖を結合させた逆相カラムが利用される。条件の一例として、不純物を含んだオリゴヌて、無菌で操作を行わねばならない。ガラス製容器は 200℃でクレオチド鎖を水溶液としてチャージし、酢酸アンモニウム水

一晩加熱するなどして、滅菌処理を行っておく必要がある。ま

溶液で溶出する。徐々に移動相のアセトニトリル含量を上げてた水なども滅菌済みのものを用い、氷冷状態で取り扱うなどのいくことで、不完全なオリゴヌクレオチド鎖との分離を行う。

配慮が必要となる。

トリチルオンと呼ばれる分離手法もある。固相担体上でオリゴヌクレオチド鎖を必要なだけ延伸し、すぐさまアンモニア水

脱塩処理

処理することで、5’末端保護基の 4, 4’- ジメトキシトリフェニル

オリゴヌクレオチドの精製には、いくつかの方法が知られてメチル（DMTr）基を残したまま切り出すことができる（トリおり、これらを使い分け、あるいは併用することで目的の純度

チルオン）。

の生成物を得ることができる。

この状態のオリゴヌクレオ

前回までに述べたように、固相担体上で合成されたオリゴヌ

チド鎖を逆相カラムにチャー

クレオチドは、アンモニア水で処理することで、側鎖の脱保護

ジすると、脂溶性の高いトリと担体からの切り出しが同時に行われる。この状態では、合成

チル基のために目的のオリに用いた溶媒、保護基の残渣であるイソブチルアミド、ベンズ

ゴ ヌ ク レ オ チ ド は 吸 着 さ れ、

アミドやアクリロニトリル、アンモニウム塩及び、塩基配列にキャッピング処理された不完欠損のあるオリゴヌクレオチドなどが不純物として残存する。

全なオリゴヌクレオチド鎖は真空下で溶媒を留去することで、過剰のアンモニアは除かれ

早く溶出してくる。こうしてる。この水溶液に酢酸ナトリウムなどの塩を加え、リン酸部分

図２．4, 4’- ジメトキシトリフェ 不純物を十分流し出した後で、ニルメチル（DMTr）基 アセトニトリル含量を増やしをナトリウム塩とする。ここにエタノールを加えていくことで、

8

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）

ていくことにより、目的のオリゴヌクレオチドを後から溶出させるというものである。

HPLC 法は、サイズの大きなカラムを用いることで、大規模な精製にも対応できる利点がある。ただし一般に、HPLC によ

DMTr 基は酸処理で容易に切断できるので、これによって効率的な精製が可能となる。ただし、DMTr 基切断の際の酸処理により、アデニンやグアニンの脱アミノ化などの副反応が起きる可能性がある。

る精製は 50 塩基程度が限界であり、それ以上の長いオリゴヌ
クレオチド鎖では分離が困難になるケースが出てくる。

イオン交換クロマトグラフィー
クロマトグラフィーの固定相として、四級アンモニウム塩部
位を持ったゲルを用いる方法である。オリゴヌクレオチドのリン酸基は負に帯電しているため、長いものほど強くゲルと相互作用する。これを利用し、長さの異なるオリゴヌクレオチドを分離できる。ただし、あまりに長いオリゴヌクレオチドでは分離能が低下するため、この方法は 40 塩基程度の長さまでに限られる。

図３．DMTr 基の脱保護

ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE）
オリゴヌクレオチドはリン酸基を持ち、マイナスの電荷を持つ。これを利用し、電気泳動を用いた精製法が可能になる。ポリアクリルアミドゲルは分子ふるい効果が大きく、分子量別に分離するのに適している。

図４．アデニンの脱アミノ化

フレーム内にアクリルアミド、ビスアクリルアミドなどを含HPLC 精製に伴う問題点として、一本鎖オリゴヌクレオチド

んだ溶液を流し込み、重合開始剤を加えて重合させ、ゲルを作が分子内で水素結合を形成し、ヘアピンループなどの高次構造

る。ここに精製したいオリゴヌクレオチド溶液を流し込んで電を作ってしまうケースがある。こうした場合では、ピークがブ

圧をかけると、オリゴヌクレオチドは陽極側に引かれて徐々にロード化するか、2 本に分裂してしまう。アルカリ性溶液を用移動する。鎖長が異なると泳動する距離も変わるため、これをいるか、カラムオーブンでカラムを温めることによって水素結利用して不純物との分離が可能となる。

合を破壊し、これを防ぐことができる。

エチジウムブロマイドなどの蛍光剤は DNA に結合して紫外また、核酸医薬を目指す場合に一般的に用いられる、ホスホ

線照射で光るため、ゲル内のオリゴヌクレオチド検出を容易に

ロチオエートオリゴヌクレオチド（リン酸部分の P=O 結合がする。目的物の分画をスライスして取り出し、これを洗い出す

P=S 結合に変換されたもの）では、HPLC のピークがややブことによって、目的のオリゴヌクレオチド鎖を得る。目的のオロードになることがある。これは、ホスホロチオエートのリンリゴヌクレオチド鎖が長くなると、ゲルの網目からの回収が難原子がキラリティを持つため、微妙に溶出時間が異なるジアス

しくなるが、ゲルをスパーテルなどでよくすりつぶすことで効

テレオマーの混合物となるためである。

率が向上する。
塩基数が 80 を超えると、他の方法での精製は難しいため、
PAGE による精製がほぼ唯一の手段となる。ただし、ゲルからの完全な回収は困難であるため、必ずロスが出てしまうのがこの方法の難点である。
このように、オリゴヌクレオチドの精製法は複数あり、それらの特徴をよく知った上で使い分け、あるいは併用する必要がある。他のジャンルの実験同様、さまざまな方法を自分の手で試し、経験を積んでコツを掴むことが、結局は重要ということ

図５．通常のオリゴヌクレオチド（左）とホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチド（右）になるだろう。

核酸合成関連試薬
当社では、脱保護反応試薬など、核酸合成後の分離・精製に用いる試薬をラインアップしています。
詳しくは、当社 HP をご覧下さい。

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）9

エクソソームと生命現象

第４回

エクソソーム糖鎖プロファイリングのススメ
慶應義塾大学 医学部医化学松田

厚志

細胞が分泌する細胞外小胞の中で多く報告されている。これら技術革新

そのため粒子形状を保ったままエクソも、粒径 100 nm 前後の小胞はエクソによって糖鎖は敷居の高い研究分野かソームを回収することが重要となる。

ソームと呼ばれ、固有のタンパク質やら、誰もが気軽に糖鎖解析を行える時

また、レクチンマイクロアレイは高感

microRNA な ど を 内 包 し て い る。 さ代になった。これまでに著者らは、糖度であるため回収量はそれほどなくてらに、その表層には脂質や糖タンパク

鎖を構造特異的に認識し結合するタンも解析は可能であるが、他の糖タンパ質などが存在することから、血中循環

パク質、レクチンを数十種類固相化しク質が混入するとそれがノイズとな

腫瘍細胞や血中循環 DNA に次ぐ第三たレクチンマイクロアレイシステムをるため正確なエクソソーム糖鎖プロのリキッドバイオプシー標的として注1）
活用し 、各種糖鎖バイオマーカー開ファイリングに支障をきたす。よって

2, 3）

目されており、現在、microRNA、プ発を推し進めてきた。本法最大の精製エクソソームの純度も要求されロテオーム解析を中心に世界的な開発

利点は、質量分析による解析に比べてる。エクソソームの精製は高純度にか競争が展開されている。エクソソーム

感度・スループットの面で秀でている

つ粒子状態を保ったまま回収可能なの最外殻は細胞と同様、糖鎖で覆われことである（図 1）。これまで、本シ

MagCaptureTM Exosome Isolation Kitており、糖鎖はエクソソームマーカー

ステム応用の一環として、様々な生体PS（以後 MagCapture）を使用した。

開発における格好のターゲットにな試料からの解析を可能とするプロトコ

本 Kit の使用は、特に後述する血中エる。臨床上利用されている腫瘍マール開発を実施してきた結果、現在、体クソソーム糖鎖解析の際に抜群の効力

カーは糖鎖構造の違いを認識するもの

液、組織、細胞などレクチンアレイ解を発揮する。

が多く、疾患特異的なエクソソーム上

析の対象は多岐にわたる。粒子状のエ

まず我々は培養細胞をモデルとしての糖鎖変化を捉えることができれば、クソソームは、細胞に比べてその粒径

培養上清からエクソソームを単離・精有用なバイオマーカー開発につながる

こそ小さくはあるが、その表面には無製しレクチンマイクロアレイによるものと期待される。

数の糖タンパク質、糖脂質糖鎖が存在比較糖鎖プロファイリングを試みた。

タンパク質はほとんどが糖鎖をはじする。よって格好のレクチンアレイ解

比較対象として、同一細胞株のペレッめとする様々な翻訳後修飾を受け機能

析対象となる。レクチンアレイ解析はトから細胞膜タンパク質を精製し、そ性タンパク質として働く。ゲノム、タ数十種類のレクチン結合パターンからのタンパク質上糖鎖プロファイルと比ンパク質に次ぐ第三の生命鎖と呼ばれ糖鎖構造を推定し、比較対象と差異の較した（図 2）。3 種の膵臓がん細胞株

る糖鎖は細胞増殖、分化、細胞応答なある糖鎖（レクチン）パターンを見出（Capan-1,-2, HPAF-II）から得られたど様々な生命現象に関与すると考えらす。これを糖鎖プロファイリングと呼レクチンアレイデータから、階層型クれている。また、がん、免疫、感染ぶ。我々が採用するエクソソーム解析

ラスター解析を実施すると、これらプ症、アルツハイマー病など糖鎖が関プロトコルでは、精製したエクソソー

ロファイルは株間ではなく、膜タンパ

わっているとされる疾患は数多く、特ム粒子上タンパク質を蛍光標識する。

ク質・エクソソーム間で見事に分かれにがんでは、がんの転移、浸潤、増殖などでその重要性が明らかにされている。がんの診断・治療法の開発において、糖鎖研究への期待度は高く、糖鎖の分子生物学的意義を明らかにすることは重要課題の一つである。
糖鎖は一筆書きの核酸やアミノ酸配列と比べて、枝分かれや異なる結合様式（α，β- 結合）の多様性が存在し、核酸のように増幅ができず、タンパク質のような有用なプローブ（抗体）が限られていることもその解析をより一層困難なものにさせる。しかし昨今の質量分析、マイクロアレイ基盤技術を中心とした糖鎖解析技術の革新は目覚
ましく、これまでに新たな糖鎖腫瘍
マーカーおよび開発アプローチ例も数

10

図１．レクチンマイクロアレイシステムとエクソソーム糖鎖プロファイリングの流れ

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）エクソソームと生命現象

63

図２．膵臓がん細胞由来エクソソームと細胞膜糖タンパク質の比較糖鎖
プロファイリング（A）階層型クラスター解析によるクラスタリング（B）各細胞株由来細胞膜タンパク質、エクソソーム表層糖鎖のレ
クチンアレイ結合パターン

図３．血清エクソソームの比較糖鎖プロファイリング
（A）各プール血清からの精製エクソソームの銀染色と抗 CD63 抗体ウエスタンブロット（B）レクチンアレイ解析データを用いた主成分解析

た（図 2A）。つまり、たとえ同じ細ンタンパク質をはじめとする血清糖タ

ソームマーカーの開発を試みている。

胞株であっても細胞膜タンパク質上糖

ンパク質のバンドが確認され、比較糖ゲノム・プロテオーム解析を中心にエ鎖と分泌されるエクソソーム上糖鎖は鎖プロファイリングに支障をきたしてクソソームの本質が徐々に明らかにさその構造は異なることを示している。

おり、血清エクソソーム糖鎖解析にはれつつある。近年、革新的な血中エク

また同じエクソソームでもその詳細なエクソソームを高純度に精製可能な

ソソーム測定法の開発により、エクソ

糖鎖プロファイルは異なることから

MagCapture が最適な Kit であること

ソームの定量的計測が可能となりはじ（図 2B）、エクソソームを標的としたが 判 明 し た。 最 終 的 に MagCapture

めている。臨床応用へ向けたイメージ

比較糖鎖プロファイリングが可能であをエクソソーム精製に使用する Kit とも尚一層つくようになった。疾患特異ることが示された。

したプロトコルにより、レクチンアレ

的エクソソーム糖鎖が見出せれば、こ培養上清をモデルとしたエクソソー

イ解析に必要な量として、血清量換算のような革新的エクソソーム定量デバ

ム解析にはある程度目処がたった。血すると数μL に相当するエクソソーム

イスに応用し、より実践的マーカーの清での比較解析を実施する場合、夾雑量があれば検出可能な高感度血中エク開発につながるものと期待される。他する糖タンパク質が多量に含まれるた

ソソーム比較糖鎖解析プロトコルを確のオミクス解析との融合や、見出しためより慎重を期する。つまり、血中エ立した。本 Kit はエクソソームを粒子

特異的糖鎖のバリデーション法など改クソソーム糖鎖解析には高純度にエク状態が保たれたまま回収可能なことも良を重ねる余地は多分にあるが、エクソソームを精製することが重要とな心強い。本プロトコルに従い、実際にソソーム糖鎖マーカー開発へ向けた第る。血清エクソソーム精製法として超健 常 者・ 疾 患 群（A，B，C） プ ー ル

一歩は踏み込めた。

遠心法やポリマー沈殿法、MagCapture

血清中エクソソームの比較糖鎖プロ

を使用した際の糖鎖プロファイリング

ファイリングを実施した。主成分解析

法を比較した。超遠心法やポリマー沈の結果、これら血清エクソソーム表層

殿法で精製した場合、健常者とがん患

糖鎖プロファイルは疾患ごとに異なる

者間で糖鎖プロファイルに差は認めらことが示され（図 3）、エクソソームれなかった。その要因として、本法に糖鎖が新たなエクソソーム診断ターて精製したエクソソーム画分を電気ゲットとなる可能性が示唆された。

〔参考文献〕
１）Kuno, A. et al . : Nat. Methods , 2, 851（2005）.
２）M atsuda, A. et al . : Hepatology , 52, 174（2010）.
３）Matsuda, A. et al . : Anal. Chem ., 87, 7274
（2015）.
４）Yoshioka, Y. et al . : Nat. Commun ., 5, 3591
（2014）.
５）Kabe, Y. et al . : Clin. Chem ., 64, 1463（2018）.

現在臨床応用を念頭に糖鎖エクソ

泳動で確認すると、過剰なグロブリ

MagCaptureTM エクソソームアイソレーションキット PS
コード No.

299-77603
293-77601

品

MagCaptureTM

名

Exosome Isolation Kit PS

規格

遺伝子研究用

容

量

2回用
10回用

希望納入価格（円）20,00080,000…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2019 年 1 月時点での情報です。最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）11

R

esearch
動物を用いない高感度な皮膚感作性評価法 "ADRA" の紹介
富士フイルム株式会社

山本

はじめに

環境・品質マネジメント部

裕介、藤田

正晴、笠原

利彦、勝岡

尉浩

可 および 制 限 に 関 す る 規 則 で ある

して、Key event 1 では、Direct Peptide

REACH 規 則においても、2016 年 6 月

Reactivity Assay9）（DPRA）（OECDに REACH 付属書ⅦおよびⅧの改訂がな

TG442C）、Key event 2 では、ARE-Nrf2

動物福祉の観点から世界的に動物実され、年間 10トン以下製造・輸入する

luciferase test method10）（KeratinoSensTM）

験に対する規制が進んでいる。海外では物質は、皮膚腐食性および刺激性、眼（OECD TG442D ; Appendix IA）およ

EU において、1993 年より段階的に化粧

刺激性、皮膚感作性試験について、動（OECD
び ARE-Nrf2 Luciferase LuSens11）

品原料に対する動物実験の規制が実施

物実験代替法を標準の試験法とすること

TG442D ; Appendix IB）、Key event 3

されており、2013 年以降 EU 加盟国にが義務づけられている。

では、h-CLAT4）, U937 Skin Sensitization

おける動物実験を使用した原料を含む化粧品類の販売が全面的に禁止

1）

となっ

た。
このような背景から、動物を使わない安全性試験（動物実験代替法）の開発が喫緊の課題となり、皮膚刺激性、眼刺
激性、皮膚腐食性、皮膚感作性、光毒

本稿では、筆者らが新たに開発した皮Test12）（U-SENS）（OECD TG442E ;膚感作性試験代替法である Amino acid

ANNEXⅡ）および IL-8 Luc assay5）のDerivative Reactivity Assay（ADRA）

計 6 試験が収載されている。
感作性物質は、体内に入った後、タンについて説明する。

皮膚感作のメカニズムと代替法

パク質と結合して複合体を形成し、この複合体を免疫細胞の一つである樹状細胞が取り込むことで抗原（異物）として皮膚感作性とは、皮膚が化学物質に認識される。このタンパク質と感作性物合意された試験方法として経済協力開発

暴 露されることで引き起こされるアレル

質が結合して複合体を形成する過程が機構（OECD）のテストガイドライン（TG）

ギー反応のことである。皮膚感作性は、

Key event 1 であり、2015 年 に TG にに収載されている。国内では 2006 年に体内の免疫系が化学物質を異物として記収載された DPRA と同様に、筆者らが動物愛護管理法が改訂・施行2）され、憶してしまうため、再度化学物質に暴露開発した ADRA もこの過程での反応性を評価する試験法である。

性などの動物実験代替法が、国際的に※以降実験動物における 3Rs の強化がした際に過剰な反応を示し、紅斑（発進められてきた。これを受けて、国内で赤）、浮腫（腫れ）および水疱（水膨も動物実験代替法の開発が盛んに進めれ）のような症状となって現れる。また、られており、 眼 刺 激 性 試 験 代 替 法 の

皮膚感作性は、皮膚刺激性の反応と異Short Time Exposure in vitro test

なり、免疫系の過剰な反応により重篤なタンパク質と感作性物質の結合は、主（STE）（OECD TG491）、皮
method3）症状を引き起こすことがある。さらに、免にタンパク質に含まれるシステインのチオー膚 感 作 性 試 験 代 替 法 の human Cell

疫系を介するため、皮膚が感作性物質

ル基またはリジンのアミノ基との共有結合

Line Activation Test 4）（h-CLAT）に暴露されてから症状が現れるまで複雑によるものであることが知られている 13, 14）。

（OECD TG442E ; ANNEX I）およびな過程がある。OECD では、このステッ

そのため、DPRA ではシステインを含む

Interleukin-8 Reporter Gene Assay5）

プのうち 4 つの Key event（1. タンパクペプチド（システイン含有ペプチド）とリジ（IL-8 Luc assay）（OECD TG442D ;質と感作性物質の結合、2. 角化細胞のンを含むペプチド（リジン含有ペプチド）

Appendix IA）が TGとして収載されて活性化、3. 樹状細胞の活性化、4. T 細の 2 種類を用い、それぞれに対する被験8）

ADRAと DPRAの原理と比較いる。また、代替法に使用される材料の胞の増殖）が定義されている 。現在、物質の反応性からタンパク質との結合性開発も国内において行われており、3 次

最も幅 広く使 用されている in vivo 皮を評価している15）。

元培 養 皮 膚モデルを用いた皮 膚 刺 激

膚感作性試験法としてマウスを使用した

これに対し、ADRA はシステインとリジ性試験代替法の Reconstructed Human

Local Lymph Node Assay（LLNA）

ンの 2 つのアミノ酸に、それぞれナフタレ

Epidermis Test Method 6）（OECDが 知られ て おり、この 試 験 法 は Key

ン環を導入した新規アミノ酸誘導体である

TG439） や 3 次 元 培 養 角 膜モデルを

event 4 に基づいた評価法となっている。

N（2- （1-Naphthyl）acetyl）-L-cysteine

用いた眼刺激性試験代替法の Recon-

動物実験代替法では Key event 4 を除

- （1-Naphthyl）（NAC） および α -N（2-structed Human Cornea-like Epithelium

く3 つの Key event に基づいた試験法と、acetyl）-L-lysine（NAL）を用い（図 1）7）

T e s t M e t h o d （ R h C E ）（ O E C D

OTG492）にジャパン・ティッシュ・エンジニHS

アリング社製の皮膚モデルおよび角膜モ

OH
HN

デルが採用されている。
は EU における化学品の登録・評価・認O

図１．NAC、NAL の構造式

和光純薬時報

O

H2N

OH
HN

上記の化粧品業界に加えて、近年で12

安全性評価センター

Vol.87, No.1（2019）

O

これらと被験物質の反応性からタンパク質との結合性を評価する 14, 15, 16）。
試験手順を次に示す。まず、96 ウェル
プレート上で NAC または NALと被験物質をそれぞれ 1：50 のモル比で混合した反応液を調製し、24 時間 25℃で遮光状態にてインキュベートする。24 時間後、
反 応 停 止 液 であるトリフルオロ酢 酸（TFA）水溶液を添加して反応を停止した後、HPLC にて被験物質と未反応の
NAC、NAL の量を測定することで、被験物質の NAC、NAL に対する反応性を算出する（図 2）。DPRAもADRAと同様、ペプチドと被験物質を 24 時間反応させた後、未反応のペプチドを HPLCで定量して、被験物質の反応性を算出する。この ADRA や DPRA は培 養 細胞や生体由来成分を用いる in vitro 試

図２．ADRA の試験法の流れ
表１．ADRA と DPRA の比較表

験とは異なり、物質の化学反応のみを評

ADRA価する試験法（in chemico 試験）であ

求核試薬

るため、in vitro 試験と比較して、簡便かつ再現性や定量精度の高い試験法であると言える。

試薬

しかし、基本的な原理や試験手順は同
NAC および NALを用いていることにより、
ADRA は DPRA よりも多くの点で優れて
被験物質濃度が 5 〜 20 mMと高いため、反応で定量する必要があるため、被験物質

反応停止

由来のピークと重なり（共溶出）
、正しく

HPLC
測定

評価できないこと等の問題がある。これに対し、NAC および NAL はナフタレン

被験物質必要量（分子量 200 として算出）

10.2
96 ウェルプレート
約 0.3μg/ ウェル

DPRA
Cysteine peptide
Lysine peptide
500μM
なし
不要
①アセトニトリル，②水，③アセトニトリ
ル / 水，④イソプロパノール，⑤アセトン，⑥アセトン / アセトニトリル，⑦アセトニ
トリル /DMSO
5 mM
25 mM
リン酸緩衝液酢酸アンモニウム緩衝液
7.5
10.2
HPLC 用バイアル瓶
約 400μg/ バイアル

0.01 mg ／ウェル

0.2 mg/ バイアル

NAC
5μM

不要

①水，②アセトニトリル，③アセトン，④DMSO/ アセトニトリル
0.25 mM
リン酸緩衝液
8.0

溶液
添加量

反応停止液

NAL

0.2μM EDTA

反応液総量
温度
時間

しばしば被験物質の析出が見られること
や、2 種のペプチドを 220 nm の短波長

溶媒の種類

反応液中濃度
種類
緩衝液
pH
反応容器
求核試薬必要量

じであるものの、 ペプチドの 代わりにいる（表 1）。DPRA では、反応液中の被験物質溶液種類
反応液中濃度
酸化防止剤

検出波長
分析時間

200μL

1 mg/ バイアル

1000μL
25℃
24 時間

TFA 溶液50μL
281 nm
20 分間 / 試料なし
220 nm
20 分間 / 試料

EDTA：エチレンジアミン四酢酸
TFA 溶液：2.5%（v/v）トリフルオロ酢酸水溶液

環を持つため、DPRA よりも約 60 nm 長波長である 281 nm で定量することが可度の低下が認められるが、筆者らはチれに対し、NAC の二量体は析出するこ能である。そのため、被験物質由来のオール基の酸化に金属イオンが関係してとなく、HPLC で定量することが可能であ

ピークと共溶出することがほとんどない。

いることを見出し、ADRA における NAC

るため、万が一 NAC が酸化されても、その 上、HPLC での 検 出 感 度 が 高く、の反応液に極微量の EDTA を添加す

試験系への影響を容易に判断することが反応液における被験物質の濃度は 0.2

ることで NAC の安定性を向上させていできる。以上の点に加え、ADRA では

mM と DPRA のおよそ 1/100 の濃度でる18）。また、DPRA におけるシステイン

反応停止液を添加することにより、HPLCの測定中における反応の進行を抑えられ試験ができるため、被験物質の析出がほ含有ペプチドの二量体は反応液中で析

とんどない。このほかにも DPRA では、出するため、HPLC の測定に対する影ると考えらえるため、DPRAと比較してばシステイン含有ペプチドのチオール基が酸響が懸念される上に、どれくらい二量体

らつきの少ない安定したデータの取得が化されて二量体化することによる定量精化されたかを定量することができない。こ可能であること、HPLC 用バイアル中で

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）13

反 応 液 調 製 を 行う DPRA と異 なり、たが、培養細胞を使用しないため、他のADRA では 96ウェルプレートとマルチチャ

in vitro 代替法試験と比較すると、特別

ンネルピペッターでの操作を基本にするこな施設や設備および無菌操作などの技術とにより、スループット性にも優れているこが不要であること、試験期間が短く安価となど、ADRA は高い試験精度のほかに実施できること、再現性が良いことなど、汎用性や操作性にも優れた試験法である

多くの利点が挙げられる。
EU における化粧品原料に対する動物と言える。

実験禁止の背景から、動物実験代替法

ADRA の感作性評価性能

は化粧品業界におけるニーズが最も高い

動物実験代替法には、動物実験と同料以外の一般化学物質における安全性

等の安全性評価ができることが求められ評価にも動物実験代替法が取り入れられが、REACH 規則の改正など化粧品原る。ADRA においても、動物実験と同様てきているため、今後、化粧品業界に限に化学物質の皮膚感作性評価が可能からず幅広い分野で利用されることを期待確認するため、DPRA の試験法確立にしている。

使用された 82 物質を用いて、LLNA に対〔参考文献〕

する予測精度評価を実施している。その結 果、ADRA の予 測 精 度は 87% と非常に高い値であった 18）。
以上より、ADRA が非常に有用な試験法であることが確認できたため、2016
年から OECD のテストガイドライン収載を目指した取り組みを行っている。2017 年には 4 施設の研究機関参加による試験の再現性と妥当性を評価するバリデーション
試験を実施し、非常に高い施設内再現性と施設間再現性が得られている。現在、この結果に基づきテストガイドライン申請を行っている。

今後の展望
本稿では ADRA が DPRA よりも多くの点において優れていることを説明してき1）EU 化 粧 品 指 令（ 第 7 次 改 正 ）European
Commission “DIRECTIVE:
2003/15/EC OF
THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF
THE COUNCIL of 27 February 2003，
amending Council Directive 76/768/EEC on
the approximation of the laws of theMember States relating to cosmetic
products”, Official J. European Union ,L66/26（2003）.
2）環境省告示，「動物の愛護及び管理に関する施策を総合的に推進するための基本的な指針」，
平成 25 年 8 月 30 日，第 80 号（2013）.
3）O ECD :“Short Time Exposure In Vitro
Test Method for Identifying I）Chemicals
Inducing Serious Eye Damage and II）
Chemicals Not Requiring Classification for
Eye Irritation or Serious Eye Damage”,
OECD Guideline for the Testing ofChemicals 491（2018）.
4）O E C D : “ A N N E X Ⅰ : I n V i t r o S k i n
Sensitisation : Human Cell Line Activation
Test（h-CLAT）”, OECD Guideline for the
Testing of Chemicals 442E（2018）.
5）O E C D : “ A N N E X Ⅲ : I n V i t r o S k i n
Sensitisation : IL-8 Luc assay”, OECD
Guideline for the Testing of Chemicals
442E（2018）.
6）O E C D : “ I n V i t r o S k i n I r r i t a t i o n :「Replacement：動 物 を 使 用※3Rs：
し な い 方 法 へ の 置 換 え」、「Reduction：使用動物数の削減」、「Reﬁnement：実 験 に伴う動物に対する苦痛の削減」の 3 つから成る動物実験における原則。
Reconstructed Human Epidermis Test
Method”, OECD Guideline for the Testingof Chemicals 439（2013）.
7）OECD :“Reconstructed human Cornea-like
Ep it h eliu m （Rh CE） t est m e tho d fo r
identifying chemicals not requiringclassification and labelling for eye irritationor serious eye damage”, OECD Guideline
for the Testing of Chemicals 492（2018）.
8）O ECD : OECD Series on Testing andAssessment , 168, 1（2014）.
9）O ECD :“In Chemico Skin Sensitisation:
Direct Peptide Reactivity Assay（DPRA）”,
OECD Guideline for the Testing ofChemicals 442C（2015）.
10）O ECD :“Appendix IA : In Vitro Skin
Sensitisation : The ARE-Nrf2 Luciferase, OECD
KeratinoSens TM Test Method”
Guideline for the Testing of Chemicals
442D（2018）.
11）O ECD :“Appendix IB : In Vitro Skin
Sensitisation : The ARE-Nrf2 Luciferase
LuSens Test Method”, OECD Guideline for
the Testing of Chemicals 442D（2018）.
12）O E C D : “ A N N E X Ⅱ : I n V i t r o S k i n
Sensitisation : U937 Cell Line Activation”, OECD Guideline for theTest（U-SENSTM）
Testing of Chemicals 442E（2018）.
13）Roberts D. W. et al . : Chem. Res. Toxicol .,20, 1019（2007）.
14）Ahlfors, S. R. et al . : Skin Pharmacol. Appl.
Skin Physiol. , 16, 59（2003）.
15）Gerberick, G. F. et al . : Toxicol. Sci. , 97, 417（2007）.
16）F ujita M. et al . : J. Pharmacol. Toxicol.
Methods , 70, 94（2014）.
17）Yamamoto Y. et al . : J. Appl. Toxicol. , 35,1348（2015）.
18）Fujita M. et al . : J. Appl. Toxicol. , in press,（2018）.

ADRAキット
キット内容● NAC… ……………………………………… 10 mL 用× 2 本● NAL Buffer（pH 10 . 2）
（premixed）…… 300 mL 用× 2 本● NAL… ……………………………………… 10 mL 用× 2 本● 0 . 01 mol/L EDTA Solution………………… 1 mL × 2 本● NAC Buffer（pH 8 . 0）
（premixed）… … 300 mL 用× 2 本
コード No.
NEW

296-80901

品

ADRA Kit

名

規

格

容

皮膚感作性評価用量

希望納入価格（円）1キット

75,000

本キットは富士フイルム株式会社よりライセンスを受け製造・販売を⾏っています。
…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2019 年 1 月時点での情報です。最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

14

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）ew Products
デ ー タ

3 カラーデジタル PCR
ナイカシステムμL

フランス Stilla 社の NaicaTM System（ナイカシステム）
は、クリスタルデジタル PCR という次世代技術による新しいデジタル PCR システムです。マイクロ流体技術により、デジタル PCR のプロセスをサファイアチップ 1 つで実現します。

特長μL●3 カラー検出により、コントロールを除いて 2 ターゲッ
トを同時に検出可能

ナイカシステムでのダイナミックレンジと直線性を評価した。
10 倍希釈系列のヒトゲノム DNA サンプルにてアルブミン遺伝子（ALB）の定量を行った。コントロールとして Yakima Yellow を使用した。

●25,000 〜 30,000 ドロップレットを作製し、高感度にターゲットを検出●サファイアチップにサンプル PCR ミクスチャーを入れるだけの簡単操作

Measured Concentration（cp/μL）●2.5 時間（PCR 反応を含む）で結果取得●ユーザーフレンドリーな解析ソフト

ナイカジオード
ドロップレット作製&PCRを行う装置

Measured Concentration（cp/μL）

Expected Concentration（cp/μL）

ナイカプリズム3
ドロップレットの測定（蛍光検出）

Expected Concentration（cp/μL）

サファイアチップ（別売り）

Measured Concentration（cp/μL）

クリスタルマイナー
データ解析ソフト

ナイカシステムは、ナイカジオード・ナイカプリズム 3・クリスタルマイナーのセットです。

製品概要

Expected Concentration（cp/μL）

処理数

12 サンプル / ラン

検出カラー数

3 カラー（Blue、Green、Red）

ドロップレット数

25,000 ～ 30,000

装置専用の消耗品

サファイアチップのみ

EGFR 遺伝子変異である EGFR L858R（A）、EGFR L861Q（B）、
EGFR T790M （C）について 25 〜 0.25 copy/μL のタイトレーションを調製し測定した。コントロールとして野生型 EGFR 遺伝子を用いた。
3 カラー検出により各遺伝子変異量の検出を行った。

測定時間（PCR 含む） 2.5 時間 /12 サンプル
サイズ（W × D × H）

ナイカジオード：35 × 37 × 29 cm
ナイカプリズム 3：44 × 34 × 21 cm

コード No.

品

名556-33061 NaicaTM System
NEW 553-33071
Sapphire Chips（12個入）
NEW

容量

希望納入価格（円）1セット
1箱

19,800,000
72,000…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
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和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）15

ew Products
脳科学を革新する光学的アプローチ

組織深部を高解像 ･ 高輝度解析

SCALEVIEW®-S

SeeDB2

本品は、蛍光タンパク質を含む生体標本を透明化する試

本品は、新しいタイプの組織透明化試薬です。特に蛍光薬です。また、分厚い標本を抗体や蛍光色素で標識する工タンパク質によって標識されたサンプルの 3 次元高解像イ

程においても使用することができます。特に脳組織病理標

メージングに最適です。キット中の SeeDB2G はグリセリ

本の解析ツールとして活躍することが期待されます。

ンの屈折率（1.46）に、SeeDB2S はオイルの屈折率（1.52）に合わせてあり、それぞれグリセリン浸レンズ、油浸レン

使 用 例
■S
 CALEVIEW®-S Trial Kit を用いたマウス脳の透明化

ズを用いた観察において、深部でも球面収差によるボケ（分解能の低下）が生じないように最適化されています。

使 用 例■ SeeDB2 を用いたマウス脳の透明化
PBS
5 mm

SeeDB2G

SeeDB2S

5 mm■ アルツハイマーモデルマウス（17ヶ月齢）脳スライス（2 mm 厚）の AbScale 法による免疫組織染色
Single X-Y plane

X-Z

5 mm

Volume rendered (3D)■ Thy1 -YFP H line マウス脳スライスの共焦点顕微鏡観察
z = 45μm

2 mm➡

120 μm

100 μm緑：ミクログリア（Iba1，RF635 標識抗体［コード No. 013-26471］）、赤：アミ
ロイドβ（アミロイドβ，Alexa Fluor 488 標識抗体）、青：血管（トマトレクチン，
Texas Red 標識）

コード No.

z = 100μm

品

名

SCALEVIEW®-S
299-79901
Trial Kit

規格

容量 希望納入価格（円）

組織透明化用 1キット➡

45,000※ Trial Kit は SCALEVIEW®-S0 〜 S4 及び -SMt にて構成されています。また、deScal e Solution［コード No. 041-34425］
が別途必
要です。
※ SCALEVIEW は、オリンパス株式会社の登録商標です。オリンパス株式会社より使用許諾を受けています。

SeeDB2S、NA 1.4 の油浸レンズを使用。レーザーパワーを変えなくても、
上から下までほぼ一定の輝度が得られる。スケールバーは2μm。

コード No.
NEW

関連商品
コード No.

品

名

規

格

容量 希望納入価格（円）品

名294-80701 SeeDB2 Trial Kit

規格

容量 希望納入価格（円）

組織透明化用 1キット

1 細胞レベルでの解像度で解析可能
CUBIC

041-34425 deScal e Solution

組織透明化用 500mL

12,000193-18455 SCALEVIEW -A2

組織透明化用 500mL

10,000196-18521 SCALEVIEW -S0

組織透明化用 250mL

12,000193-18531 SCALEVIEW®-S1

組織透明化用 250mL

12,000190-18541 SCALEVIEW -S2

組織透明化用 250mL

12,000197-18551 SCALEVIEW®-S3

組織透明化用 250mL

12,000194-18561 SCALEVIEW®-S4

組織透明化用 250mL

12,000

顕微鏡（LSFM）を用いることで、全身の細胞を 1 細胞解191-18571 SCALEVIEW®-SMt

組織透明化用 250mL

15,000

像度で 3 次元イメージとして取得することができます。

®

®

®

CUBIC で使用する組織透明化試薬（Scal eCUBIC 試薬）
は尿素にアミノアルコールを加えた水溶性透明化試薬であり、サンプルを試薬に浸すだけの簡便かつ効果的で再現性の良い手法です。CUBIC は動物の全身・臓器などを丸ごと透明化することが可能です。さらに、シート照明型蛍光…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2019 年 1 月時点での情報です。最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

1655,000

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）［次頁に続く］ew Products
使 用 例

再生医療分野の研究に■C
 UBIC を用いたマウス臓器（丸ごと）の透明化
脳

心臓

肺

腎臓

CultureSure® 3,3',5-トリヨード -L- チロニンナトリウム

肝臓

PBS

本品は、甲状腺ホルモンの一種で T3 とも呼ばれており、

in vitro における間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化誘導の促進や、ヒト iPS 細胞由来の心筋細胞の成熟の促進などがCUBIC報告されています。

特●エンドトキシン試験済み■L SFM を 用 い た CUBIC 処 理（PI 染 色 ） し た CAG-

●マイコプラズマ否定試験済み

EGFP Tg マウスの臓器（丸ごと）の観察
脳●動物由来原料不使用の化学合成品

EGFP 拡大イメージ

Merge

長

製品概要
●含量（HPLC）：98 . 1％

700μm

PI

（初回ロット実績値）
2 mm●外観：白色〜うすい黄褐色

700μm

EGFP 拡大イメージ

Merge

I

I

又はうすい赤褐色、結晶性粉末〜粉末

心臓

O

HO

ONa

NH2

O
I

C15H11I3NNaO4＝672.96
CAS RN® 55-06-1●溶解性：水酸化ナトリウム、DMSO に可溶●マイコプラズマ：陰性

500μm

PI

●エンドトキシン：0 . 1 EU/mg 未満（初回ロット実績値）
2 mm

500μm

コード No.

EGFP 拡大イメージ

Merge

NEW

038-25541

500μm

PI

500μm

コード No.

品

名

規
危

格

容量 希望納入価格（円）

組織透明化用 1キット

CultureSure 3, 3', 5Triiodo-L-thyronine
Sodium Salt

格

容量 希望納入価格（円）

細胞培養用

50mg

15,00045,000

追加品目のお知らせ

コード No.

ポジティブリスト関連標準品品を品揃えしています。下記品目を新たに発売しました。

農薬標準品■イプロジオン代謝産物標準品■ MEP 標準品
■メプロニル標準品■ MPP 標準品
■ナプロパミド標準品■ピリダフェンチオン標準品■トリフロキシストロビン標準品

品

名010-16493 Acetamiprid Standard
NEW
021-07673 Bensulide Standard
NEW 021-16223 Benzofenap Standard
NEW
021-12703 Bifenthrin Standard
NEW
032-16793 Cymoxanil Standard
NEW
037-17723 Cyprodinil Standard
NEW 043-25173 Dimepiperate Standard
NEW
068-03503 Fenpropathrin Standard
NEW 099-02394 Iprodione Metabolite StandardNEW
130-05534 MEP StandardNEW
131-07904 Mepronil StandardNEW
130-06634 MPP StandardNEW
144-05893 Napropamide StandardNEW
169-10914 Pyridaphenthion Standard
NEW 207-15783 Trifloxystrobin StandardNEW

当社では、ポジティブリスト制度の対象となる農薬標準■アセタミプリド標準品■ベンスリド標準品■ベンゾフェナップ標準品■ビフェントリン標準品■シモキサニル標準品■シプロジニル標準品■ジメピペレート標準品■フェンプロパトリン標準品

規CultureSure® 低分子化合物シリーズは、ES・iPS 細胞の分化誘導に使用される低分子化合物にエンドトキシン試験、マイコプラズマ試験などを行っているため、細胞培養に安心してご使用頂けます。
ラインアップは、当社 HP をご覧下さい。

2 mm

290-80801 CUBIC Trial Kit

名®

肝臓（部分）

NEW

品

規 格

容量

残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
危 残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
危 残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg
残留農薬試験用 100mg

希望納入価格（円）12,00011,00026,00018,00020,00020,00020,00010,00015,0008,000
10,0009,000
11,0008,400
22,000…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2019 年 1 月時点での情報です。最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）17

ew Products■ iCell® DopaNeurons 01279

ヒト iPS 細胞由来分化細胞

本品は、ヒト iPS 細胞株から分化誘導したフロアプレー

iCell® 心筋細胞 2.0-01434

ト由来ドーパミン神経細胞です。パーキンソン病などの神

iCell ドーパミン神経細胞 -01279

経変性疾患の研究に最適です。

®

本品は、FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. が開発・製
グや毒性試験など医薬品の安全性評価にご使用頂けます。
本品は、50 誌以上の論文で取り上げられ、有用性が実証されています。

特［Dopamine］ng/mL

造したヒト iPS 細胞由来分化細胞です。創薬スクリーニン

8
6
4
2
0

長

本品

iCell® GABANeurons

コードNo. メーカーコード●ヒト由来細胞

56mmol/L KCl の刺激により、
iCell® DopaNeurons でドーパミンの放出が検出された。

Basal Activity
Stimulated with
56mmol/L KCl

品名

容量 希望納入価格（円）

iCell Cardiomyocytes 01434®

ヒト細胞に似た機能的特徴を示します。
●均質で再現性がある
純度が高いため、生物学的に適切で再現性のある結果が得られます。

2−

C1016 iCell® Cardiomyocytes2 01434 5M Cells＊a1Vial

258,000−

M1001 iCell® Cardiomyocytes Plating Medium

30mL

52,000100mL

20,000−

M1003

iCell Cardiomyocytes MaintenanceMedium®

iCell DopaNeurons 01279●急性及び長期の試験が可能®

＊b

培養液中で長期間生存し純度を保つため、急性及び長期−C1028 iCell® DopaNeurons 01279 5M Cells＊a

1Vial

236,000

反応の両方を評価することが可能です。

−

M1010 iCell® Neural Base Medium 1

100mL

10,000−M1029 iCell Neural Supplement B   2mL

25,000−M1031 iCell® Nervous System Supplement   1mL

29,000●簡単なハンドリング
各細胞専用の培地とともに凍結保存されているため、融解するだけで使用できます。

®

＊ a：保管輸送温度：液体窒素（気相）＊ b：分 化 誘 導 法を開 発した Memorial Sloan Kettering Cancer
Center の Lorenz Studer lab. からライセンスを供与されています。
そのため、ご購入の際には、同意書に署名が必要です。

■ iCell® Cardiomyocytes2 01434
本品は、凍結からのリカバリーが早く、播種後 4 日目から使用でき、薬理安全性評価、薬効評価などに最適です。
ま た、 ヒ ト iPS 細 胞 応 用 安 全 性 評 価 コ ン ソ ー シ ア ム（CSAHi）において、多点電極アレイ（MEA）システム

初めてお使い頂く方のために、お試し頂きやすい小包装
サイズもラインアップしました。詳細は、当社 HP をご覧下さい。

iCell FFWK

検索➡

を用いた催不整脈作用を検出するための試験細胞として採用されています。
〈お知らせ〉

この度、当社は、セルラー・ダイナミクス・インター

デ ー タナショナル・ジャパン株式会社より本品の輸入販売業
務を事業譲受しました。すべての製品を単品販売へ変Baseline

3000

2500

2000
RFU

RFU

2500
1500
1000

0

10

20 30 40
Time (sec)50

60

単品でご購入頂くことができます。細胞・培地・サプ
内容となります。

1500
500

更しましたので、培地・サプリメントと同様に細胞をリメントを組合せ頂くと、従来のキット品と同じ構成

2000
1000

500
0

10μmol/L Isoproterenol

3000

お問合せ先
0

10

20 30 40
Time (sec)50

60

製品のご購入：当社代理店、または当社営業担当者
テクニカルサポート：富士フイルム和光純薬株式会社
培養試薬開発部

β作動薬であるイソプロテレノール（10μmol/L）で処理した結果、カルシウム電流の増加が確認された。

TEL：03-3270-6320（ダイヤルイン）…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2019 年 1 月時点での情報です。最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

18

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）ew Products
薬剤の毒性評価コントロール化合物

次世代のライブセルイメージングシステム

心毒性陽性化合物

セルモーションイメージングシステム SI8000

本品は、心室性不整脈（torsade de points：TdP）誘発

本品は、細胞の動きを非染色・非侵襲で定量評価する、

リスクを持つ化合物です。

独自の画像解析技術を応用した新しいコンセプトの細胞分

新規医薬品候補化合物の中には、開発の過程で QT 間隔

析用ソリューションシステムです。

を延長させ、致死性の TdP を誘発するものがあり、これが原因で開発を断念した化合物が数多くあります。そのため、開発初期段階から TdP 誘発リスクを予測することが重要となっており、リスク因子である hERG チャネルの抑制作用や QT 間隔延長作用で検証されています。これらの化合物は近年、ヒト iPS 細胞由来心筋細胞による、ヒトにおける TdP 誘発リスクを精度よく評価できるツールとして期待されています。
ま た、 当 社 で は ヒ ト iPS 細 胞 由 来 心 筋 系 細 胞 iCell®
Cardiomyocytes（FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc 社 ）特も取扱っています。併せてご使用下さい。

長●⽣理的環境下での⾼解像度細胞撮影●ノンラベルで細胞の形態、動きを定量化・可視化
コード No.

NEW

NEW

品

名

030-25501 Cisapride037-25491
059-08451

Chromanol 293B

E-4031 n -Hydrate

055-08453
Mexiletine
132-17581
HydrochlorideNEW

162-28471

Pilsicainide
Hydrochloride

222-00781 Verapamil

作 用

規

格

hERG
チャネル
（Ikr）阻害

細胞
培養用

10mg

40,000

KCNQ
チャネル（Iks）阻害

細胞
培養用

10mg

40,000hERG
チャネル（Ikr）阻害10mg 30,000
細胞
生物学用 50mg 120,000
1g   7,800

Naチャネル
阻害10mg25,0001g   4,500

10g

24,200細胞
培養用●⾼速撮影による細胞の速い運動の解析（筋細胞など）●⾃動細胞認識による複数 ROI＊の一括設定と解析●Dynamic ROI 機能による、形態トラッキング解析＊ROI（region of interest）

Naチャネル及びhERG
生化学用チャネル（Ikr）阻害Caチャネル
生化学用阻害228-00783 Hydrochloride

容量 希望納入価格（円）■ 心筋細胞の拍動・伝播解析

製品ページはこちら■ その他さまざまなアプリケーション・機能が充実

関連商品
コード メーカー
No.
コード

品

名

作 用

メーカー

容量 希望納入価格（円）

512D525700 Dofetilide
45291

Kチャネル
阻害

TorontoResearch 10mg
Chemicals

14,4005573948/50 Terfenadine
29321

hERG
チャネル
（Ikr）阻害

Tocris

14,00050mg

細胞内小器官の動き

神経細胞の動き主要モデル

自動認識機能なども

希望納入価格（円）Basic model

6,000,000 〜

All-in-one model

14,000,000 〜…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
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和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）19

ew Products■ホスト材料

高純度発光材料⑦

有機 EL 関連製品⑧
N

有機 EL（OLED : Organic Light-Emitting Diode）は発光層が有機化合物から構成される発光ダイオードで、電子Nと正孔の再結合によって生じた励起子によって発光しま
す。これまで発光層には蛍光材料やりん光材料が使用され

C40H30＝510.67
CAS RN® 142289-08-5ていましたが、蛍光材料は電気エネルギーの最大 25%しか使用する事ができず、一方、りん光材料は希少な貴金属

コード
No.

を含むためコスト、資源の両面から課題が残ります。最新

No.

の研究では第三の発光材料として熱活性化遅延蛍光材料

蛍光青色ドーパント（TADF：Thermally Activated Delayed Fluorescence）
が報告され、新規材料の研究が盛んに行われています。
この度、高純度な蛍光材料とホスト材料をラインアップ
しました。

容量

希望納入
価格（円）

200TBPe【2,5,8,11-Tetra-t -butylperylene】
20881

機能性有
250mg 照 会
機材料用

近日
発売

②

200TPPy【1,3,6,8-Tetraphenylpyrene】
20901

機能性有
250mg 照 会
機材料用

蛍光緑色ドーパントNEW③

Coumarin 545T【10-（2-Benzothiazolyl）037- 2,3,6,7-tetrahydro-1,1,7,7-tetramethyl25511 1H ,5H ,11H -[1]benzopyrano[6,7,8-ij]
quinolizin-11-one】

機能性有250mg 15,000
機材料用

近日
発売

④

039- Coumarin 481【7-（Diethylamino）-425571 （trifluoromethyl）coumarin】

機能性有250mg 照 会
機材料用

←アノード
←ガラス基板

蛍光赤色ドーパント

有機 EL の概略図

■蛍光青色ドーパント
①

規格

①

←電子注入層（ETL）←ホール輸送層
（HTL）

名

近日
発売

←カソード

発光層
・青色ドーパント→・緑色ドーパント・赤色ドーパント・ホスト材料品

C30H20N2＝408.49
CAS RN® 550378-78-4

NEW⑤

203- TBADN【2-t -Butyl-9,10-di（naphth-2-yl）
20871 anthracene】

機能性有250mg 25,000
機材料用

NEW

⑥

DCJTB【2-t -Butyl-4-（dicyanomethylene）0476-[2-（1,1,7,7-tetramethyljulolidin-9-yl）
34461
vinyl]-4H -pyran】

機能性有250mg 20,000
機材料用

②

ホスト材料

C36H44＝476.73
CAS RN® 80663-92-9

C40H26＝506.63
CAS RN® 13638-82-9■蛍光緑色ドーパント
③
O

F

F

N

N

N

O

機能性有
500mg 照 会
機材料用

近日
発売

⑧

131mCP【1,3-Bis（N -carbazolyl）benzene】
18891

機能性有
機材料用

1g

照会

核酸の合成手法であるホスホロアミダイト法に使用する

O

C14H14F3NO2＝285.26
CAS RN® 41934-47-8■蛍光赤色ドーパント⑤

041- DPVBi【4,4'-Bis（2,2-diphenylvinyl）
34481 biphenyl】

核酸合成用反応補助試薬

F

S

C26H26N2O2S＝430.56
CAS RN® 155306-71-1⑦

使い切りに便利な 100mL 包装追加

④
O

近日
発売

反応補助試薬シリーズに、この度、少・中量合成機での合成に便利な 100mL 包装を追加しました。開封後の品質劣化を避けるため 1 回で使い切りたい場合に便利です。また、水分値を保証しているため、低水分が求められる核酸⑥の合成に最適です。
N

CN

O

CN

特

長

●ホスホロアミダイト法で使用する反応補助試薬をフルラ
インアップ

C38H30＝486.64
CAS RN® 274905-73-6

C30H35N3O＝453.62
CAS RN® 200052-70-6●低水分保証 （一部製品除外）●試薬の取り違いを防ぐため、種類別にラベルを色分け…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
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20

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）［次頁に続く］ew Products■ オリゴヌクレオチドの合成

コード No.

品

名

水分値

規格

容量 希望納入価格（円）

アセトニトリル溶媒
Cap A Solution
037核酸
NEW
[1-Methylimidazole-Acetonitrile ≦100ppm
100mL
25393
合成用
危
（2:8）]Cap B1 Solution
核酸
030NEW－
100mL[Acetic Anhydride-Acetonitrile
合成用
25383
危
（4:6）]Cap B2 Solution
核酸
033NEW≦100ppm
100mL[2,6-Lutidine-Acetonitrile
合成用
25373
危
（6:4）]Cap B Solution
核酸
030NEW－
100mL[Acetic Anhydride-2,6-Lutidine合成用
25403
危
Acetonitrile（2:3:5）]

6,000

6,000

7,000

8,000

関連商品
DNA/RNA合成機＊に直結可能
ボトルキャップ
当社の核酸合成用補助試薬に採用している 100mL ガラ
ス瓶・3L ガロン瓶専用のボトルキャップです。
日本テクノサービス社製の DNA/RNA 合成機と直結できる仕様になっています。試薬とセットでご使用下さい。
＊日本テクノサービス社製の DNA/RNA 合成機専用です。

デブロッキング試薬
コード No.

品

名

ガス・試薬ラインのセット

水分値

規格

容量 希望納入価格（円）

ジクロロメタン溶媒
Deblocking Solution-1
046核酸
NEW
（3w/v% Trichloroacetic Acid, ≦40ppm
100mL
28924
合成用
Dichloromethane Solution）
トルエン溶媒
Deblocking Solution
049核酸
NEW
[Dichloroacetic Acid-Toluene ≦40ppm
100mL
34443
合成用
危
（3:97）]

アウター

4,000

インナー

6,000

コード No.

品

名

水分値

規格

容量 希望納入価格（円）Activator Solution-3
017- （0.25mol/L 5-Benzylthio-1H 核酸
NEW≦30ppm
100mL
20014 tetrazole, Acetonitrile
合成用
危
Solution）

7,500

Activator Solution-4（0.25mol/L
5-Ethylthio-1H 核酸
014NEW≦30ppm100mL
合成用
19693 tetrazole, Acetonitrile
危
Solution）

6,000

品

名

水分値

規格

容量 希望納入価格（円）

THF溶媒Cap A Solution-2[Tetrahydrofuran/Acetic
036核酸
NEW
≦100ppm
100mL
19013 Anhydride/Pyridine（8:1:1）
合成用
危
Solution]
Cap B Solution-2
核酸033NEW≦100ppm
100mL（10vol% 1-Methylimidazole/
合成用
19023
Tetrahydrofuran Solution） 危

対応容器

100mL

品

名

容量 希望納入価格（円）

F-Wako Bottle Cap Set for
Reaction Reagent
1セット（アウター、インナー、O-リング、
ガス・試薬ラインのセット）
F-Wako Bottle Cap（Inner Side）
1個
638-44501 M2P-RCFIN
for Reaction Reagent
F-Wako Bottle Cap（Outer Side）
1個
635-44511 M2P-RCFOUT
for Reaction Reagent
F-Wako Bottle Oring for Reaction
1個
635-44491 M2P-RCF-OL
Reagent
対応容器 3L
Bottle Cap（Inner Side）for
1個
630-44561 M2P-RCGIN
3L-4L Gallon Bottle
F-Wako Bottle Cap（Outer Side）
1個
637-44571 M2P-RGFOUT
for 3L Gallon Bottle
Oring for 3L-4L Gallon Bottle
1個
633-44551 M2P-RCG-OL（Long Life）
1個
636-44541 M2P-RCG-O Oring for 3L-4L Gallon Bottle
対応容器 100mL・3L
Portline Set for Reaction Reagent
639-44531 M2P-RPLSET
1セット（試薬、ガスラインのセット）
632-44521 M2P-RCFSET

キャッピング試薬
コード No.

反応試薬用ボトルキャップセット（100mL 用）（右）を容器に装着した状態（左）（瓶はボトルキャップセットに付属していません。）
コード No. メーカーコード

アクチベーター試薬

5,000

5,000

O-リング

32,00012,0007,000
3,500
20,000
7,500
9,800
1,300
10,000

インナー・アウターの材質は PEEK
（ポリエーテルエーテルケトン樹脂）です。

…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。その他の略号は、巻末をご参照下さい。
掲載内容は、2019 年 1 月時点での情報です。最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）

21

第34回

見聞録

Wako ワークショップ
神経科学：基礎から臨床群馬大学大学院 医学系研究科

岩﨑

広英

第 34 回 Wako ワークショップ「神分解酵素であるカテプシン D のノックて」というタイトルで、生後早期に見経科学：基礎から臨床」が 2018 年 11

アウトマウスや、カテプシン B と L のられるシナプス形成・除去過程とシナ

月 14 日に東京・秋葉原にある秋葉原

ダブルノックアウトマウスにおいて、プスの安定化のメカニズム、および興コンベンションホールにおいて開催さ脳内にセロイドリポフスチン顆粒の蓄

奮性シナプスの形成の場であるスパイれました。開催に先立ち、本ワーク

積が認められることを示されました。

ンの形態解析に関して講演されまし

ショップを企画された順天堂大学の内

また、谷田先生が新たに作製されたた。ヒトの脳は２歳頃までに急速に発

山安男先生が、ワークショップの主旨

PK（pHluorin-mKate2 tandemfluorescent

達し、この間に樹状突起上のスパインについてお話になりました。内山先生

protein）-LC3 で は、 従 来 観 察 で き な

数は増大します。その後、思春期に向は、免疫やがんなどの分野において、かった脳や腎臓でのオートファジーのけて漸減し、成人期に入るとシナプス

近年、基礎医学の研究者が治療を目指

可視化が可能となることを示されまし

数は安定になります。こうしたシナプ

した研究に積極的に関わっていることた。最後にオートファジーの可視化に

ス数の変化は、自閉症、統合失調症、に言及され、神経科学においてもその関連して、光学顕微鏡と電子顕微鏡でアルツハイマー病といった様々な精

ような基礎と臨床を結ぶ研究が必要との同一試料の観察を可能とするよう

神神経疾患・発達障害の発症時期となりつつあることを強調されました。

な、いわゆる「光−電子相関顕微鏡法

密接に関連していると考えられます

実際、今回講演された先生方のどのご（CLEM）」に関する新しい手法につ（Penzes et al ., 2011）。安定に維持さ講演も基礎と臨床を結ぶようなお話とい て 紹 介 さ れ ま し た。 谷 田 先 生 はれるシナプスは長期的な記憶の維持に

CLEM-Red と命名された蛍光タンパク

とって重要と考えられますが、一方で最初の演者である順天堂大学の谷田質がオスミウム酸固定で消光するもの

シナプスは外界からの変化に応じて以誠先生は「脳・神経細胞におけるの、その後 TUK solution で処理する

可塑性を示す必要があります。今回はオートファジーを視る」というタイトことで蛍光が回復し、電子顕微鏡用試

特に、シナプス不安定化因子としてルで講演されました。まずオートファ料作製処理を施しても蛍光が残存する

最近同定された BMP4 について中心

ジー・リソソーム分解系に関して概説

ことを示されました。CLEM-Red おにお話されました。EGFP で標識した

された後、神経変性との関連に焦点をよび TUK solution は近日中に富士フ

BMP4 を海馬神経細胞に発現させると当て、オートファゴソーム形成に関わ

イルム和光純薬株式会社から発売さ

EGFP-BMP4 は 速 い 軸 索 輸 送 で 運 ばる Atg7 や Atg9 の脳神経系特異的なれるそうですので、発売されたらぜ

れ、神経活動を上げると輸送が止まる

ノックアウトマウスではアストロサイ

ひ試してみたいと思います。CLEM-

こと、軸索から放出された BMP4 はトの増加やプルキンエ細胞の脱落、ユRed は赤色の蛍光タンパク質ですが、シナプス前部付近に係留されること、ビキチン陽性凝集体の増加が認められ今後は緑色でも同様の性質を持つ蛍光細胞膜上の BMP4 のクラスターがシること、神経突起進展に異常が認めら

タンパク質の開発が望まれます。

ナプスを不安定化することを示されまなっていたことが印象的でした。

れることを示されました。また、リソ

次に講演された東京大学の岡部繁男

した。また、二光子顕微鏡を用いたソーム機能と神経変性疾患との関連に先生は「かたちを見て機能と病態を探

in vivo イメージングでは生きたままついて、リソソームの主要タンパク質る―新しいシナプス形態学を目指しの動物を用いてスパインの動態を経時

オーガナイザーの内山安男先生

22

機能形態学分野

講演風景

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）

Wako

ワークショップ

見聞録
的に観察することが可能ですが、生後早期のスパイン動態を３種類の自閉症
モデルマウスで解析したところ、３種類すべてに共通してスパインの形成・除去が亢進していることを示されました。こうしたスパイン動態の亢進が安定な神経回路の形成を阻害し、自閉症の病態を誘起している可能性が考えられます。最後に、超解像顕微鏡を用いたマウス海馬分散系におけるスパイン

谷田 以誠 先生

岡部

繁男 先生

大塚

稔久 先生

伊佐

服部

信孝 先生

笠井

清登 先生

形態の解析について示されました。超解像顕微鏡の一種である構造化照明法（SIM）で撮影したスパインの画像を用いて主成分分析や機械学習によりスパイン形態を分類し、スパイン形態と可塑的変化との関係について示されました。
３番目の演者である山梨大学の大塚稔 久 先 生 は、「 神 経 シ ナ プ ス・ ア ク
ティブゾーン：分子構造から脳病態の理解へ」というタイトルでお話されま

正 先生した。アクティブゾーンはシナプス前話でした。まず京都大学の伊佐正先生

しないものの、一旦治癒してしまうと部にある電子密度の高い部位であり、は、「機能回復を促す脳の働き」とい

脊髄固有ニューロンを阻害しても効果

シナプス小胞の開口放出との関連が示うタイトルで、脊髄損傷により手指のが無いことが明らかとなりました。ま唆されています。大塚先生はラット脳精密把持運動が障害され、餌を取るこた、PET を 用 い た 脳 機 能 解 析 か ら、からアクティブゾーンに局在する分子とが困難となったマカクザルの機能回

脊髄損傷後は大脳皮質運動野や運動前として CAST と ELKS を同定されま復について講演されました。一般に手野が活性化されることや、動機づけなし た。 さ ら に 神 経 終 末 に 局 在 す る

指の巧緻運動は皮質脊髄路による制御

どの中枢として機能する側坐核などのSAD キナーゼが CAST を直接リン酸が知られていますが、この経路に障害辺縁系が活性化されることが明らかに化し、このリン酸化のオン・オフがシが生じた場合には、脳幹を介した間接されました。興味深いことに、一旦手ナプスの短期可塑性を制御することを経路や脊髄固有ニューロンを介した間指の把持機能が回復したと思われるサ

示 さ れ ま し た。 ま た、CAST/ELKS

接経路などが代償的に働くことで機能

ルでも、側坐核にムシモルを注入しては網膜のシナプスや脳幹の Calyx of

回復することを示されました。実際、機能低下させると再び手指の麻痺が生Held シ ナ プ ス に お い て カ ル シ ウ ム

脊髄を損傷したサルの餌を取る行動

じ、把持運動が正確に行えなくなる様チャネルの局在を調節し、シナプス小が、数週間ほどで回復していく様子を子を動画で示されました。筆者には、胞の放出を制御していることを明らか

動画で示され、大変印象的でした。さ

脊髄損傷により失われた機能が全く別にされました。病態との関連について

らに脊髄損傷の手法として従来の外科の脳部位によって代償されるという現は、ELKS が自閉症患者ゲノムにおい手術的なアプローチよりも精密に脊髄象が興味深く思われたのですが、脳梗てレア変異として見出されているこ損傷を行うことが可能な分子生物学的

塞・脳出血等でリハビリに励む患者さと、CAST のノックアウトマウスで手法について示されました。具体的にん達にとって、こうした機能回復のメは母親マウスの養育行動に異常が見らは逆行性のウイルスベクターと順行性

カニズムの解明は切実な問題であり、れ、ネグレクトとの関連が示唆されるのウイルスベクター２種類を用い、二その臨床的応用の早期の実現が強く望ことについて示されました。

重感染した細胞でのみ経路が遮断されまれることと思われます。

前半の３つのご講演は分子・細胞レるという系を開発されました。この系

次に順天堂大学の服部信孝先生は、ベルからのアプローチを主体としたおを用いて脊髄固有ニューロンの特異的「パーキンソン病の発症機序：遺伝性話でしたが、後半の３演題は個体・行遮断を行った結果、脊髄固有ニューロ

パーキンソン病からヒントを得て」と動レベルからのアプローチに関するおンを阻害すると手指の巧緻運動は回復いうタイトルで講演されました。まず

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）

23

Wako

ワークショップ

見聞録

パーキンソン病研究の歴史について概ン病の罹患率はますます増大すること

模メタ解析の結果、統合失調症の患者説された後、最新の研究成果や治療法が懸念されます。パーキンソン病の発では左淡蒼球増大が認められたことをなどについて紹介されました。特に症メカニズムを解明し、発症メカニズ

お示しになりました。これらの特徴はパーキンソン病と酸化ストレスとの相ムに基づいた治療法を確立することでヒト以外の動物でも計測・評価可能で関について言及され、これまでにパー「国を医す」のだという、服部先生のあることから、異種間でトランスレー

キンソン病の原因遺伝子として同定さ強いご意思が感じられました。

ション可能な（＝トランスレータブル）

れ て い る 遺 伝 子 の う ち、parkin や

最後にご講演された東京大学の笠井指標を確立し、精神神経疾患の客観的pink1 は 不 良 ミ ト コ ン ド リ ア の 除 去清登先生は「精神疾患のリバーストラ

な評価・診断に役立てることの有用性（mitophagy）に関わることを示されンスレーショナルリサーチ」というタについて強調されました。最後に精ました。これと関連して、カフェイン

イトルで、特に統合失調症の病態関連

神疾患と遺伝子変異との関連として、が酸化ストレスの除去に効果的であ

神経回路の同定に関してお話になりま

22q11.2 欠失症候群について紹介されり、パーキンソン病のリスク軽減因子

した。まず統合失調症についての簡単ました。22q11.2 症候群は 22 番染色体であることを紹介されました。このなご説明の後、統合失調症患者に見の微細欠失により生じる遺伝性の疾患

他、臨床医学の研究室でありながら、られる大脳皮質上側頭回の灰白質体であり、幼少期にはファロー四徴症をショウジョウバエを用いた研究も展開

積の減少や、この部位を発生源とする

はじめとする心疾患を合併し、思春期以されており、例えば Park14 をノック

聴覚ミスマッチ陰性電位（mismatch

降において統合失調症様の精神病症状アウトしたショウジョウバエではリン

negativity, MMN）の進行性振幅減衰

を高率で発症することを示されました。

脂質の代謝に異常が見られることを示

について示されました。さらに、MMN

本ワークショップでは、各分野におされました。時折ユーモアを交えてのの発生にグルタミン酸受容体の一種でける第一線の先生方が、50 分間といご講演は門外漢の私にとってわかりや

ある NMDA 受容体が関与しているこう比較的長い時間に亘ってお話くだ

すく、興味深く拝聴しました。ご講演となど、血中グルタミン酸濃度と統合さったことで、それぞれの分野の歴史の 中 で 引 用 さ れ た、「 上 医 は 国 を 医失調症との関連について示されまし的経緯や背景についても充分理解する（いや）し、中医は人を医し、下医はた。また統合失調症患者脳では、GABA

ことができ、大変勉強になりました。

病を医す」（陳延之『小品方』）という神経伝達系が関与すると考えられてい今回のワークショップを企画された内言葉は特に印象に残りました。2007

る auditory steady state gamma-band

山先生、演者の諸先生方、ならびに年生まれの子供の 50％は 107 歳まで

oscillatory responses（40Hz ASSR）

ワークショップを運営された富士フイ

生きると推定されているそうです。こに異常が認められることについてもおルム和光純薬株式会社の皆様に厚く御のように長寿化が進めば、パーキンソ

示しになりました。さらに MRI 大規

礼申し上げます。

日時：2018 年 11 月 14 日（水）会
場：秋葉原コンベンションホール
オーガナイザー：内山 安男 順天堂大学大学院医学研究科
主催：富士フイルム和光純薬株式会社

神経疾患病態構造学〈講演プログラム〉●脳・神経細胞におけるオートファジーを視る
順天堂大学医学部 神経生物学・形態学講座●かたちを見て機能と病態を探る―新しいシナプス形態学を目指して 東京大学大学院医学系研究科 神経細胞生物学●神経シナプス・アクティブゾーン：分子構造から脳病態の理解へ
山梨大学大学院総合研究部医学域 生化学講座第一教室●機能回復を促す脳の働き
京都大学大学院医学研究科 高次脳科学講座 神経生物学分野●パーキンソン病の発症機序：遺伝性パーキンソン病からヒントを得て 順天堂大学医学部附属順天堂医院 脳神経内科●精神疾患のリバーストランスレーショナルリサーチ24

和光純薬時報東京大学医学部附属病院

Vol.87, No.1（2019）

精神神経科

谷田
岡部

以誠
繁男

大塚
伊佐

稔久
正

服部
笠井

信孝
清登

化学大家 445
宮沢−特別 編 −

賢治（1896 . 8 . 27 〜 1933 . 9 . 21）
京都薬科大学名誉教授

桜井弘『春と修羅』や『銀河鉄道の夜』な本で鉱物を学び、詩や童話を書くため

ど不思議なそして素晴らしい作品を著の強いインスピレーションを得て、鉱した宮沢賢治（写真 1）は詩人、童話

物や岩石を多数の作品に取り入れまし作家として広く知られています。作品

た。研究科修了後、東京への家出、妹群をよく読んでみると、宇宙、4 次元の死、そして農学校での教師生活を空間、星座、星、山野、植物、動物、きっかけに『春と修羅』と『注文の多鉱物、分子、元素、物理化学的現象やい料理店』を自費出版し、『銀河鉄道

実験器具などの言葉がいたるところにの夜』、『風の又三郎』など多数の童話

現れ、科学（化学）が底流にあることや 小 説 を 怒 涛 の よ う に 書 き ま し た。

を感じます。さらに、賢治は自らをサ『楢ノ木大学士の野宿』、『十力の金剛

イエンティストととらえていたこと

石』や『気のいい火山弾』などには、も、手紙から知ることができます。宮

多くの鉱物や宝石類がキラキラと顔を沢賢治の作品群から、サイエンティス

出します。

ト宮沢賢治を紹介しましょう。

鉱物の化学組成シールには、必ず元
素記号が書かれています。たとえば、

宮沢賢治の生涯
賢治は、1896 年 8 月 27 日に岩手県
花巻で生まれました。生まれる約 2 ヵ

写真 1．宮沢賢治［1896（明治 28）年− 1933（昭和 8）年］（資料提供：林風舎）

緑柱石の化学組成は Be2Al2Si6O18 と記されています。賢治は多数の標本を見て、それらの化学組成、つまり元素に

月前に明治三陸地震（1896 年 6 月 15

やめてしまいます。病が回復して東北関心を示したと思われます。高等農林

日、マグニチュード 8.2-8.5、死者・行砕石工場の技師となりますが、再び病学校の関教授の教えを受けて学んだ片方不明者約 22,000 人）が、そして亡に倒れ療養生活を余儀なくされまし

山正夫著の『化學本論』（1915 年）
（写

くなる 1933 年 9 月 21 日の 6 ヵ月前にた。この時期に『雨ニモマケズ』を手真 2）は、賢治の座右の書のひとつでは 昭 和 三 陸 地 震（1933 年 3 月 3 日、帳 に 書 き 残 し ま し た。1933 年 9 月、した。この本には 72 種類の元素を含

マグニチュード 8.1、死者・行方不明

病態が悪化し、21 日に亡くなりまし

む短周期型の「週期系の表」が掲載さ者約 3,000 人）が起きています。賢治

た（写真 1）。

れています。しかし、賢治は高等農林

は、この二つの大震災の間の 37 年間を生きました。川口尋常小学校、続い学校へ入る前から、短歌の中に多くの
宮沢賢治の化学知識

元素を使っています。なぜ、中学生時て盛岡中学校で学び、鉱物・植物採集

図１に、宮沢賢治の生涯を簡単にま

代に元素名を知っていたのでしょう？

や山登りに熱中しました。家業の質

とめています。賢治は幼少のころから調べてみると、賢治が中学へ入学した屋・古着商の継承を勧める父との葛藤石を集めるのが好きで「石っこ賢さ

1909 年に近藤清次郎著『中等化學本のなか盛岡高等農林学校へ進学し、島ん」とよばれていました。この石採集論講義』が出版されていることがわか

地大等編の「漢和対照 妙法蓮華経」

が、賢治の生涯をつらぬく原点となりりました。ここには、80 種類の元素かを読み感銘を受けました。高等農林学ました。高等農林学校では、ドイツのらなる長周期型の「元素週期表」（図校では、関豊太郎教授の指導を受け、クランツ社などから多数の鉱物や岩石

2）が掲載されています。賢治は、こ得業論文「腐植質中ノ無機成分ノ植物標本が購入されていました。新しい標の本を用いて講義をした先生から化学

ニ対スル価値」を著し、その後 2 年間研究を続けました。研究科修了後、日蓮宗（法華経）の国柱会に入会し、家出しました。法華経を広めるために詩や童話（法華文学）を書きはじめたと伝えられています。25 歳のときに花巻農学校の教諭に採用されますが、その翌年に妹のトシが亡くなります。４
年後に農学校を依願退職し、農民とともに生きる決意をして「羅須地人協会」を設立しますが、病に倒れ活動を

図 1．宮沢賢治の生涯

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）

写真 2．片山正夫著『化學本論』（大阪市立科学館所蔵）

25

と元素を学んだのではと推定されます。
45 種類の元素を使って作品を書く
賢治が元素名を用いて著した作品をいくつか紹介しましょう。
・検温器の 青びかりの水銀 はてもなくのぼり行くとき 目をつむれり われ

病の折に水銀体温計で体温をはかると、目盛がどんどん上昇していきます。
思わず目を閉じます。青光りする水銀に蒼ざめた感情をぶつけているのです。
・あをあをと なやめる室にただひとり
加里のほのほの白み燃えたる・コバルトのなやみよどめる その底に加里の火 ひとつ 白み燃えたる

賢治は、炎色反応が好きだったようです。カリウムの炎色反応で見られる
赤紫色のまばゆい光や 2 価コバルトの青色で、将来への情熱や悩みを表現しています。
賢治は、作品、手紙あるいは手帳に
45 種類もの元素名を使いました。短

見つめて、賢治は悲しさや怒りを表現えていたと、当時の生徒が思い出を編『イーハトーボ農学校の春』では、しました。また、『銀河鉄道の夜』では、語っています。

リチウム、ラジウム、水銀、リンの 4

10 種類の元素を登場させています。

種類の元素名が使われています。太陽オリンピックでは 1、2、3 位はそれ

コロナの光をリチウムの炎色反応で、ぞれ金、銀、銅メダルが与えられるこ

宮沢賢治の化学実験室
賢治は、実験室風景、化学反応、物

満ちあふれる太陽の光をラジウムで、と を 賢 治 は 知 っ て い た で し ょ う が、

理化学現象なども描いています。

光をうけて青く輝く麦を水銀で、そし『注文の多い料理店』の「かしわばや・こ んなやみよののはらのなかをゆくて噴出する樹液の輝きをリン光で表ししの夜」では賢治特有の感性からユー

ときは 客車のまどはみんな水族館のています。『春と修羅』の「永訣の朝」

モラスに 1 位は白金、2 位は金、3 位

窓になる

からです。

は水銀の賞品が決められます。

（乾いたでんしんばしらの列が せわ研究科に進んだころ、岩手県の蛇紋

しく遷ってゐるらしい きしやは銀河

よぴちよ沈んでくる岩からイリジウムとオスミウムを発見

系の玲瓏レンズ 巨きな水素のりんご

ああとし子 死ぬといふいまごろにした喜びを父に手紙で伝えています。

のなかをかけてゐる）りんごのなかをなって わたくしをいつしょうあかる

この成果は、後に賢治の業績のひとつ

はしっているくするためにとして認定されました。そして、『春『春と修羅』“オホーツク挽歌”「青森挽歌」

・蒼鉛いろの暗い雲から みぞれはぴち

こんなさつぱりした雪のひとわんをと修羅

おまへはわたしにたのんだのだ（イリジウムとオスミウムの合金）をありがたうわたしのけなげないもう使って詩を書きました。

とよ わたしもまつすぐにすすんでい26

図 2．近藤清次郎著『中等化學本論講義』（明治 42（1909）年、東京高岡書店）の巻末に掲載されている長周期型周期表「元素週期系」（当時は、「周期表」を「週期表」と記載していた）第 2 集』に、イリドスミン

この詩からどんなイメージを描かれますか？

賢治が気体発生装置キップ

元素は、研究の動機になっただけでの装置（写真 3）を使っていたことをくからなく、賢治の心象を表すには、欠くこ

示しています。玲瓏（れいろう）は、（あめゆじとてきてけんじや）とのできない道具のひとつとなりまし

透き通っていることです。キップの装

蒼鉛は、ビスマスのことです。黒っぽた。これは賢治の発明といえるかもし

置で水素ガスを発生させると、まん中

い自然蒼鉛には、白や黄色の鉱物がまれません。

の液体がたまる部分には白い泡の塊がじり、あたかも賢治の心を表すのにふ

農学校の教諭時代には、「元素周期

モクモクとでき、まるで水素でできた

さわしい鉱物です。この鉱物をじっと表」を自らつくり元素や化学反応を教

リンゴのように見えます。下の丸いガ

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）

ラスの部分は溶液で満たされレンズのように透明で、まるで水族館の窓のよ
うに見えます。小説『三人兄弟の医師と北守り将軍』では、キップの装置が発砲装置としてユーモアたっぷりに使われています。
・ソックスレット 光る加里球 並んでかかるリービッヒ管

ソックスレイ抽出器やリービッヒ冷却器は今でも使われていますが、カリ球
Kalli Kugel（写真 4）は、あまり見か

写真 3．キップの装置

けることはありません。ドイツのユス

写真 4．カリ球（大阪市立科学館蔵所蔵）とアメリカ化学会（ACS）のシンボルマーク

タス・リービッヒ（1803 − 1873）がは、帰国した翌年 1925 年 7 月に賢治

元素分析に用い、後にアメリカ化学会

を同人誌「銅羅」に誘いました。賢治のシンボルマークになりましたので、は 9 月に返信し、その中でご存知の方も多いでしょう。

「私は詩人としては自信がありませ・ひばり ひばり 銀の微塵（みじん）のんけれども、一個のサイエンティス

ちらばるそらへ たったいまのぼった

トとしてだけは認めていただきたい

ひばりなのだと思います。」

くろくてすばやくきんいろだ そらでと書きました。多少のためらいと自負

やる Brownian movement

が重なっているような自己表現です。

図３．
『思索メモ』“科学より信仰への小さな橋梁”（1927 − 1931 ？）硝酸銀溶液に銅片を加えてしばらくし詩はあまり上手くはないが、せめてサ

忘れてはならないと、現代の私たちにて棒でかき混ぜると、キラキラしたダ

イエンティストとして認めて欲しいと呼びかけているように思われます。

イヤモンドのようなうずができる様子

訴えています。さらに 12 月には、岩をひばりにたとえて美しい詩を読みま波書店の社長岩波茂雄に手紙を送り、した。これは、イオン化傾向：H ＞「わたくしは岩手県の教師をしておCu ＞ Hg ＞ Ag ＞ Pt ＞ Au により、りますが、（中略）あとで勉強する

２Ａｇ+＋Ｃｕ→２Ａｇ＋Ｃｕ2+

ときの仕度にと、それぞれの心もちをそのとほり科学的に記載しておきで示される反応が進み、無色の溶液がました。」

銅イオンの生成で青くなり、同時に析

と『春と修羅』の“心象スケッチ”は出する銀粒子が動き回ってブラウン運

科学的に描いていると科学を相当意識動をしている様子をうたっています。

した表現をとっています。

宮沢賢治は、化学の知識のみならず

このような状況を見ると、賢治は自物理学、とくに相対性理論や 4 次元世らをサイエンティストとしてとらえて界にも関心を持ち、自らの自然観を築いたことは間違いなさそうです。賢治

きました。現代の私たちに、自然を愛は先端的な科学者（化学者）ではあり

し、広い展望と深い思考を持つようにませんでしたが、常日頃、物事を科学とメッセージを送っているようです。

（化学）的に考えて、自然の美や自らの心を誠実に描こうとしていたと想像

サイエンティスト宮沢賢治

できます。科学（化学）と文学を融合

花巻農学校の教諭をしていたころ、させました。さらに、次のような『思賢治は 1924 年 4 月に詩集『春と修羅』

索メモ』“科学より信仰への小さな橋を、12 月に『注文の多い料理店』を梁”（1927 − 1931 ？）（図 3）からも、出版しました。中国で詩集を読んで感宇宙や自然界を階層構造としてとら動 し た 詩 人 の 草 野 心 平（1903-1988）

え、人間は原子的な存在であることを

和光純薬時報Vol.87, No.1（2019）〔参考文献〕
１）宮澤賢治：「新校本 宮澤賢治全集 全 16 巻 別巻１」（筑摩書房）（1995-2009）．
「校本 宮澤賢治全集 全 14 巻」
２）宮 澤賢治：（筑摩書房）（1973 − 1977）．
「宮沢賢治全集 全 10 巻、ちくま
３）宮 沢賢治：文庫」（筑摩書房）（1986-1995）．
「宮澤賢治地学用語辞典」（愛智出４）加 藤碵一：版）（2011）．
「宮澤賢治研究」（筑摩書房）
５）草 野 心 平 編：
（1958）．
；草野心平：「宮沢賢治覚書」（講談社）（1991）．
「年譜 宮沢賢治伝」（中公文庫）
６）堀 尾青史：（1991）．
「新装版 宮沢賢治物語」（学習研究７）関 登久也：社）（1995）．
「化學本論」（内田老鶴圃）（1915）．
８）片山正夫：「中等化學本論講義」（東京高岡９）近 藤清次郎：
書店）（1909）．
10）板 谷 英 紀：「 宮 沢 賢 治 と 化 学 」（ 裳 華 房 ）（1988）．； 板 谷 栄 城：「 宮 沢 賢 治 の 宝 石 箱 」（朝日文庫）（1991）．
11）斉 藤文一：
「科学者としての宮沢賢治」（平凡社）（2010）．
「賢治と鉱物」（工作舎）
12）加藤碵一、青木正博：（2011）．
「元素 118 の新知識」ブルーバッ13）桜井 弘編：
クス（講談社）（2017）．
「宮沢賢治の元素
14）桜井 弘著、豊 遥秋写真：図鑑」（化学同人）（2018）．

27

組換えタンパク質大量発現システム用遺伝子導入試薬
ScreenF ectTMUP-293

Booster が細胞のタンパク質発現量を大きく高めます。

特

長

デ ー タ
■ ルシフェラーゼ発現量の比較●安価●組換えタンパク質を高発現●トランスフェクション試薬を変えるだけ

FreeStyle293-F細胞

1,200,000
1,000,000

40,00030,000

RLU

RLU

800,000

キット内容

600,000
400,000

構成試薬100mL 用ScreenF ect UP-293
Transfection Reagent

200μL×1 本

1mL×2 本ScreenF ectTMUP-293 Dilution
Buffer

6.7mL×1 本

67mL×1 本

ScreenF ectTMUP-293 Booster

500μL×1 本

5mL×1 本TM

本品はトランスフェクション試薬のみで構成されており、細胞及び培地は含まれません。

0

20,00010,000200,000

1L 用

Expi293F細胞

50,000他社品A

0Screen ectTMUP-293

培地：FreeStyle293 Expression
Medium

他社品B

Screen ectTMUP-293

培地：Expi293 Expression
MediumFreeStyle293-F細胞及びExpi293F細胞へ分泌型Luc発現ベク
ターを各種トランスフェクション試薬を用いて導入した。
培養スケールは30mLで実施し、96時間後に培養上清を回収後、ルシフェラーゼアッセイによって発光強度を測定した。
FreeStyle293-F 細胞 ：他社品 A よりも高いルシフェラーゼ発現量を示した。
Expi293F 細胞：他社品 B と同等のルシフェラーゼ発現量を示した。

［別途必要な試薬］

サンプル提供中

FreeStyle293 Expression System

サンプル（100mL スケール培養用）をご希望の方は、細胞FreeStyle293-F Cells

培地

FreeStyle293 Expression Medium

み」よりご依頼下さい。

希釈バッファー

Opti-MEMⅠ Reduced Serum Medium

https://screenfect.jp/ja

下記 ScreenF ectTM 専用 HP の「サンプルお申し込

Expi293 Expression System
細胞

Expi293F Cells培地

Expi293 Expression Medium

希釈バッファー

＊不要＊ ScreenF ect UP-293 付属の Dilution Buffer で希釈します。
TM

コード No.
NEWNEW294-80201
290-80203

品

名ScreenF ectTMUP-293

規格

危

遺伝子
研究用

容量

希望納入価格（円）100mL用7,500

1L用63,000Expi293、FreeStyle、Expi293F、Opti-MEMは、Thermo
Fisher Scientific 社の商標または登録商標です。

…2 〜 10℃保存…− 20℃保存…− 80℃保存
150 …− 150℃保存 表示がない場合は室温保存です。
…特定毒物
  
…毒物
…劇物
…毒薬
…劇薬 危 …危険物
…向精神薬
…特定麻薬向精神薬原料特定    
…化審法 第一種特定化学物質…化審法 第二種特定化学物質…化学兵器禁止法 第一種指定物質…化学兵器禁止法 第二種指定物質
毒素等 …国民保護法
覚 …覚せい剤取締法
掲載内容は、2019 年 1 月時点での情報です。上記以外の法律及び最新情報は、当社 HP をご参照下さい。

…カルタヘナ法収載されている試薬は、試験・研究の目的にのみ使用されるものであり、「医薬品」、「食品」、「家庭用品」などとしては使用できません。
記載希望納入価格は本体価格であり消費税などが含まれておりません。

和光純薬時報 Vol. 87 No. 1
2019 年 1 月 15 日 発行
発行責任者
編集責任者
発 行 所

印

28

刷

所

糸 博之
鎌田裕子
富士フイルム和光純薬株式会社〒 540-8605 大阪市中央区道修町三丁目 1 番 2 号
TEL.06-6203-3741（代表）URL http://ffwk.fujifilm.co.jp
共進社印刷株式会社●和光純薬時報に対するご意見・ご感想はこちらまでお寄せ下さい。
E-mail ffwk-jiho@fujifilm.com●製品に対するお問合せはこちらまでお寄せ下さい。

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■富士フイルム和光純薬株式会社（Japan）
試薬 URL https://labchem.wako-chem.co.jp
フリーダイヤル（日本のみ）0120-052-099
フリーファックス（日本のみ）0120-052-806
E-mail ffwk-labchem-tec@fujifilm.com■Wako Overseas Offices :・FUJIFILM Wako Chemicals U.S.A. Corporation http://www.wakousa.com
Toll-Free（U.S. only）+1 877 714 1920

Tel +1 804 714 1920 / Fax +1 804 271 7791

・FUJIFILM Wako Chemicals Europe GmbH http://www.wako-chemicals.de
European Office（Neuss, Germany）：Tel +49 2131 311 271 / Fax +49 2131 311 100

Vol.87 No.1

本品は、FreeStyle293 Expression System 及び Expi293 Expression System 用のトランスフェクション試薬です。
組換え抗体やタンパク質の大量発現に適しています。トランスフェクション後に添加する ScreenF ectTMUP-293