日 環 セ 所 報

No.36.

平成 21 年

55

【研究報告】

異物混入時期特定のための基礎研究－チャバネゴキブリ筋組織の経過時間に伴う変化－
Histological change of cockroach muscle cells with time elapsing after death:
Abasicstudy for specifying time of insect contamination
小泉智子*、矢矧束穂**、長島孝行***

Tomoko KOIZUMI * , Tsukaho YAHAGI ** and Takayuki NAGASHIMA ***【要約】昆虫の組織切片を作成して,死後の時間経過に伴う細胞の変化を組織学的な手法で観察した．

その結果、昆虫の筋肉組織は,死亡した時点から、かなり短時間で変化が生じることが認められた．
また,加熱やエタノール浸漬などの異なる条件の下で供試した場合も同様に変化が認められたが ,その変化の仕方には,相違が見られた．従来法のカタラーゼ反応を利用した方法と比較すると ,本研究で行った昆虫の細胞の変化を組織学的に観察する方法の方が ,製造物に混入した時期の特定をより詳細に推定できるものと考えられた．

キーワード：異物混入，チャバネゴキブリ，筋組織，経時的変化
１．はじめに
本実験では，これまでに様々な検討が行われてき食品等の製造物への混入異物のうち，昆虫類が占た加熱またはエタノール浸漬などの異なる条件下に

1）２），当センターへの混入種

おいて，死後の時間経過に伴う細胞の変化を観察し，の同定，侵入経路，侵入時期の特定依頼も数多く寄

ミクロトームを用いた組織学的な方法で観察するこめる割合はかなり高くせられている

3）．昆虫類の混入の要因を検討する上で，重要視されるのは侵入経路，侵入場所，侵入時とによって，害虫由来の異物混入時期特定手段の一つとしての応用の可能性を検討した．

期などを特定することであり，これまでにカタラー
ゼ活性試験 4）や，円偏光二色性（CD）法 5）など様々２．材料と方法な方法の利用および検討が行われてきた．特に，カタラーゼ活性を利用した判定方法については，様々な検討が行われている

6）7）8）．しかし，昆虫種やその体のサイズ，非加熱であっても試薬に浸漬されていた条件の違いによって活性の反応が異なってくることが知られている．さらに，カビや微生物の発生する条件があれば，一度失活した虫体からも再び活性がみられること，低 pH やエタノール浸漬条件下で

2.1

供試動物

チャバネゴキブリ Blattera

germanica は製造物への混入率も高く,多量の個体の確保が容易であるために供試した．ここでは，（財）日本環境
衛 生 セ ン タ ー に お いて 累代 飼 育 し て い る 渡 田コ
ロニーの雄成虫を用いた.

は，加熱の有無に関係なく失活することなどの問題点が指摘されている 6）7）．

2.2*（財）日本環境衛生センター東日本支局

2.2.1

環境生物部
Dept. of Enviromental Biology, East Branch, Jesc**（財）神奈川科学技術アカデミー試験方法
昆虫死後の細胞および組織の経時的変化

虫体全体を供試した場合，個体間の死亡時間に差異が出ることが懸念されるため，虫体生体から後 脚 腿 節 部 を 切 り 離し た時 点 を 死 亡 時 と み なし

Kanagawa Academy of Science and Technologyて用いた.ジエチルエーテルで麻酔した供試虫の***東京農業大学農学部農学科昆虫機能開発研究室

後脚腿節を解剖用鋏で切断した．切断したサンプ

Tokyo University of Agriculture, Laboratory of

ルはすべて，室温約25℃、湿度0～30％RHに保た

Insect Technology

56

Bulletin of JESC No.36.

れ て い る 室 内 の シ ャー レ上 に 開 放 し た 状 態 で置

3.1

2009
昆虫死後の細胞および組織の経時的変化

き,切断した直後のものを対照として,以降,15，3切断直後（コントロール）のチャバネゴキブリ後0および60分経過時点で，2.0％paraformaldehyde

脚腿節の横断切片では，腱を挟んで次の節を動かす+2.5％glutaraldehydeに投入して一次固定した．
その後0.1M Cacodylate Bufferで数回洗浄後，1.

ための２種類の筋肉（levatormuscle，depressermuscle）が観察された（図１-ａ）．これらの筋肉はいずれも外骨格のクチクラ層に密着し，その内部を0％のOsO 4 に投入して二次固定した．固定は，間満たしていた．筋線維は多数の fibril（筋原繊維）

欠吸引法を用い，その後エタノールで 段階的に5で構成されており，筋線維鞘付辺には核が観察され0％から100％まで脱水し，QY-1に置換後，Epon81た．また，筋線維内部には筋形質が観察された（図2に包埋した．包埋したサンプルは，ウルトラミ２-ａ）。

クロトーム（Reichert OmU3）で，筋線維を横断後脚切断後 15 分経過時点では，それぞれの筋肉のするようにして，0.75μmの切片を作製した．切収縮が始まり、筋線維間に間隙が生じ始め，一部は片をAzur-B溶液で染色後，光学顕微鏡（OLYMPUSAX-70TRF）にて観察を行い，コントロールの横断面と比較した．

外骨格のクチクラ層より剥離していた（図１-ｂ）．
しかし，筋線維の fibril および筋線維鞘付近の核はこの時点でまだ観察することができた（図２-ｂ）．
後脚切断後 30 分経過時点では，筋肉の収縮はさらに進み，筋線維鞘間の間隙がさらに広がった（図１-2.2.2

異なる条件下における細胞および組織の変化ｃ）．また，筋線維付近では明瞭に観察できる核の数が減少し，筋形質はさらに縮小した（図２-ｃ）．

１）および２）の条件における細胞および組織の後脚切断後 60 分経過時点では，筋腺維はさらに収変化を光学顕微鏡で観察した．

縮して外骨格の一方に偏り，筋線維においても核，１）加熱：100℃の水に５，10，20，30 分間浸漬

fibril がほとんど観察されなくなり，筋形質が縮小

２）エタノールに浸漬：25％，50％，80％，100％エしていた（図１-ｄ，２-ｄ）．

タノールに 24 時間浸漬（室温約 25℃）
虫体全体をそれぞれの条件に浸漬すると，虫体が表面に浮いてしまい，設定した条件にさらされていない部分が出てしまうことがある．これによって,条件にさらされた時間に差異が生じる可能性がある

以上のことから，昆虫の組織は切断後，かなり
短 時 間 で 筋 肉 組 織 に形 態的 変 化 が 表 れ る こ とが明らかになった．特に筋形質では，15分後にはすでに縮小が始まっており，核やfibrilにおいてはため，供試虫の処理は試験１と同様として組織切片

切 断 後 15分 後 に は顕 著 な変 化 は 見ら れ なか ったを作成した後,コントロールと比較した．

が,30分後には変化が生じ始め，60分経過後にはそれぞれの処理終了後，試験１と同様の方法で固定した後，Epon812 に包埋し，切片を作製して光学顕微鏡で観察し，コントロールの横断面と比較した．
2.2.3

カタラーゼ活性を用いた方法との比較

2.2.2 と同様の条件下においた供試虫後脚腿節１本を 3.0％過酸化水素水 10ｍL に入れ、時間経過に伴う発泡の有無を観察した。判定は、目視にて行い、発泡が見られた場合には＋、見られなかった場合には－として記録した。その後、同条件で処理した 2.2の細胞や組織の切片と比較した。
３．結果と考察

ほ と ん ど 認 め ら れ なく なる こ と が 明 ら か に なった．

日 環 セ 所 報

TL

平成 21 年

DCａNo.36.

Tb

死 後 15 分 経 過

切断直後

TDC

死 後 30 分 経 過図１d

昆虫死後の筋細胞・組織の経時的変化
L： levator muscle
T： tendon(腱 )NF

死 後 60 分 経 過
s ca l e = 1 0 0 μ m

D： depresser muscle

C： cuticula(外 骨 格 )

切断直後

b

死 後 15 分 経 過F
NF

SP

死 後 30 分 経 過

N： nucleus(核 )FNSP

図２：間隙SPN SPc

D

T

L

DCa

LC

L

c

57

d

死 後 60 分 経 過

昆虫死後の筋細胞・組織の経時的変化２
SP： 筋 形 質

F： fibril(筋 線 維 )s ca l e = 1 0 μ m→ ： sarcolemma( 筋 線 維 鞘 )58Bulletin of JESC No.36.

2009

3.2異なる条件下における細胞および組織の変化

は，その時間が短時間であっても，細胞に著しい変3.2.1化が表れるものと考えられた．また，試験１では，加熱100℃の水に５分間浸漬した場合，筋線維は収縮し筋肉全体が外骨格に付着するように収縮したのに対て筋線維鞘に間隙が生じ，外骨格のクチクラ層よりし，加熱した場合には，筋線維鞘それぞれが収縮し全体的に剥離した（図３-ａ）．また，核は不明瞭なて,外骨格から中心に固まるような状態になることがら観察できたが，fibril および筋形質は全く観察が明らかになった．

することができなかった．また，腱の位置も大きく変化した（図４-ａ）．加熱によって筋肉組織に生じた変化は，試験１で生じた変化と比較すると，筋形質および fibril の著しい収縮が見られた．
100℃の水で 10 分間加熱すると，５分間加熱した場合と同様に筋線維が収縮して筋線維鞘に間隙が生

3.2.2

エタノール浸漬

各濃度のエタノールに 24 時間浸漬した場合も，試
験１，２と同様に筋線維鞘の収縮が観察され，筋線維鞘間に間隙が生じ，全体的に外骨格から剥離していた（図５）．

じた（図３-ｂ）．核はかなり不明瞭となり，観察で25％，50％，80％エタノールに 24 時間浸漬した場

きる数は少なくなり，fibril および筋形質は観察さ

合は加熱した場合と異なり，核,筋形質およびれなかった（図４-ｂ）． 20 分および 30 分加熱した

fibril を観察することができた（図６）．しかし，場合も，５および 10 分間加熱した場合と同様に，筋筋腺維の場合は,浸漬したエタノールの濃度が上が腺維が収縮し，外骨格から剥離していた（図３-ｃ,るにつれて収縮が進み，100％エタノールの場合は,ｄ）．また，核が不明瞭ながらも観察できたのは加熱

他の濃度に浸漬した場合と比べると,収縮がかなり後 20 分までであった（図４-ｃ）．

激しかった．このような収縮は，エタノールの脱水以上のことから，100℃の水で加熱した場合には，筋線維の収縮により，外骨格から全体的に剥離し，作用によるもので，それに伴って筋線維鞘間に間隙が生じたものと考えられた．

筋線維鞘間に間隙が見られた．また，核は加熱時間以上のことから，エタノールに浸漬した場合も，に伴って明瞭に観察されなくなり，筋形質および試験１および試験２-１）と同様に筋線維の収縮が観fibril は全く確認できなくなるものと考えられた。

察されたが，その収縮の仕方には違いがあることがすなわち,核以外は加熱時間の長短による変化はわかった．

ほとんど無かったことから，高温で加熱された場合

LT

D

LCa

100℃ 熱 湯 に ５ 分 間 浸 漬

LTbCc

DC1 0 0 ℃ 熱 湯 に 1 0 分 間 浸 漬

LDTT

D

C100℃ 熱 湯 に 20 分 間 浸 漬
図３d100℃ 熱 湯 に 30 分 間 浸 漬

加 熱 条件下での筋細胞・組織の変化 s c a l e =1 0 0 μ mL： levator muscle

D： depresser muscle T： tendon (腱 )C： cuticula（ 外 骨 格 ）：間隙

日 環 セ 所 報

No.36.

平成 21 年

59N

N

Na100℃ 熱 湯 に ５ 分 間 浸 漬

b100℃ 熱 湯 に 10 分 間 浸 漬

Nc

100℃ 熱 湯 に 20 分 間 浸 漬
図４TD

Ｌ

T

D

C

25％ エ タ ノ ー ル に 24 時 間 浸 漬

Ｌ

T

b

50％ エ タ ノ ー ル に 24 時 間 浸 漬

ＬDCcs c a l e= 1 0 μ m→ ： sarcolemma( 筋 線 維 鞘 )Ca100℃ 熱 湯 に 30 分 間 浸 漬

加 熱 条件下での筋細胞・組織の変化

N： nucleus(核 )

ＬdT

D

C

80％ エ タ ノ ー ル に 24 時 間 浸 漬
図５d

100％ エ タ ノ ー ル に 24 時 間 浸 漬

エ タ ノ ー ル 浸 漬 条 件 下 での筋細胞・組織の変化

L： levator muscle
T： tendon(腱 )D： depresser muscle
C： cuticula(外 骨 格 )：間隙scale=100μ m

60Bulletin of JESC No.36.

2009

NFFSPNSPa

25％ エ タ ノ ー ル に 24 時 間 浸 漬

b50％ エ タ ノ ー ル に 24 時 間 浸 漬

NFSPSP

Nc80％ エ タ ノ ー ル に 24 時 間 浸 漬
図６d

F

100％ エ タ ノ ー ル に 24 時 間 浸 漬エ タ ノ ー ル 浸 漬 条 件 下 での筋細胞・組織の変化

scale=10μ m

Ｎ ： n u c l e u s （ 核 ） Ｓ Ｐ ： sarcoplasm（ 筋 形 質 ）Ｆ ： f i b r i l （ 筋 線 維 ） → ： sarcolemma（ 筋 線 維 鞘 ）3.3

カタラーゼ反応との比較

また，エタノールに浸漬した場合でも反応は全てプ

3.2 と同じ条件に供試したサンプルについて，カタラーゼ活性を調べた結果を，表１に示した．すなラス（＋）で，供した条件の違いによる差違は認められなかった．

わち，加熱処理をしたものの反応は全てマイナス（－）
で，加熱時間の長短による変化は認められなかった．
表-１

各条件下におけるカタラーゼ反応結果－：カタラーゼ反応なし＋：カタラーゼ反応あり

日 環 セ 所 報

No.36.

平成 21 年

3.2.2 で述べたように筋肉細胞の変化をミクロト

61引用文献ーム法で観察した場合には，それぞれの反応時間および条件によって，変化がみられたのに対して，カ1）大柿好春（1984）：食品・薬品の混入異物対策．

タラーゼ反応では，加熱またはエタノール浸漬にお「食品・薬品の混入異物対策」（緒方一喜・光楽昭

ける反応は各々一律の，マイナス（－）ないしプラ雄編），9-10，思潮社，東京

ス（＋）であり反応時間や濃度条件によっての差違は認められなかった．
すなわち，従来法では判別することができなかっ2）小曽根惠子，金山彰宏（2002）：横浜市における食品の異物混入－昆虫類を中心に－（1993～2001年度）．ペストロジー，17（2）：87‐92た加熱の有無やエタノール浸漬などの様々な条件の3）武藤敦彦（2006）：第６回害虫由来異物混入対策

違いにおいても，ここで行った組織学的な観察では，講習会テキスト，5-16．財団法人日本環境衛生セ差違を見出すことができた．

ンター，神奈川

このことから，現在最も多くの検討が行われてい4）沼本敬直，望月敬夫，鈴木敏孝，溝口善則，大沢るカタラーゼ活性を利用した判定方法において指摘

貞夫（1978）：不良食品（昆虫，毛髪等）の原因追されているネガティブな諸問題を解決する有効な方求に対するカタラーゼ試験の応用について．食品法と考えられた．

衛生研究，28：50－53

なお，今回の実験では，供試虫の後脚腿節のみを

5）石橋美幸，堀妃佐子，諏訪芳秀，佐脇徹也，増田試料として限られた条件で供しており，昆虫種や個正裕，岩田修二，峯孝則（2002）：昆虫の被加熱履

体差イ，供試部位，虫体全体を供試する場合などの歴鑑定技術の開発．日本食品化学学会誌，９(１)：違いによっても，変化のパターンが異なることが予30‐34

想される．また，異物混入においては，今回実施し6）望月香織，渡部泰弘，辻英明（2000）：昆虫死

た加熱やアルコールへの浸漬以外にも様々な条件が体のカタラーゼ活性簡易チェック法の基礎検討．

考えられるので，冷蔵，冷凍，酸や糖への浸漬など

ペストロジー学会誌，15：86‐89の条件についても検討する必要があると考えられた。
また，今回試験１では，死後 60 分後までしか観察を行っておらず、異物混入の相談では、混入してか

7）望月香織，辻英明（2001）：昆虫死体のカタラーゼ活性簡易チェック法の基礎検討－その２－．
ペストロジー学会誌，16：41－45

らクレームが発生するまでの期間が長期に渡ること

8）田中伸久，山口安宣（2003）：各種溶液が昆虫カもあるので、死後長期間経過した細胞がどのようにタラーゼ活性に及ぼす影響．ペストロジー学会誌，変化していくかも明らかにしておく必要がある。

18：109－111

異物混入発覚時の侵入経路の特定には迅速性が強く求められる．本方法は細胞や組織の詳細な情報が多Summary数得られる反面，その手順は複雑で観察までに少な
くとも１週間程度の時間を要する上に、特殊な技術

As an attempt for specifying the time of insectや機器も必要である．したがって，比較的短時間でcontamination, the histological changes of

観察を行うことができる凍結切片法による検討も必cockroach muscle cell and tissue with time

要と考えられた．また，ここでの供試条件では，従elapsing after death were investigated. Effects来法に比べて組織学的な観察の方が，より明確な差of various treatments such as hot water and違を見出すことができた．したがって，本方法で従

alcohol soaking were also examined. By a light

来法を補完して，総合的な判定を行うなど，さらにmicroscope,信頼度の高い方法の確立が必要と考えられた．

changes were observed in the muscle cells andslightbutclearhistologicaltissue even within 15 minutes after death.
５．謝辞

Especially, muscle fibers shrunk, and nuclei
and sarcoplasm were gradually difficult to

本研究は，当センター研究奨励金制度（平成 16detect within 60 minutes after death. Hot年度）の助成を受けて実施されたものである．ここ

water and alcohol soaking treatments alsoに関連各位に謝意を表します．

brought about prominent histological changes,

62

Bulletin of JESC No.36.

which were significantly different from thenon-treated control. These results suggest that
histological examination of invaded insects
may be one effective procedure to estimate thetime of insect contamination. Furthermore,comparison

withconventional

reaction was carried out.

catalase2009