放射線照射による蛋白質への影響	
藤井 紀子	

京都大学原子炉実験所	

放射線生命科学研究部門	

1	

*自然界の放射線	

科学技術庁が決めた
年間許容量は50mSv	

2	(「放射線化学のすすめ」学会出版センターより）

3	放射線による生物影響	

身体的影響
急性症状 ： 皮膚の紅斑、脱毛など
晩発症状：

白血病、ガン、白内障など

遺伝的影響
代謝異常 軟骨異常など。  	

急性症状は  0.25Sv  以下では臨床上現れないが、3Sv  以上になると皮膚の紅班、脱毛が起こり、  7Sv  を越すと大多数の人が死亡する。
4	放射線量別の人体への影響	
高線量放射線		
致 死 的	
１００ Sv 	
即死			～１００ Sv がんの放射線治療を行うときの局所的な照射			
５０ Sv 	
（局部照射）壊死			
１０ Sv 	
（全身照射）１～２週間でほとんど死亡、（局部照射）紅斑		重症	５ Sv	白内障 			４ Sv	吐き気、半数が死亡する				
軽症	
３ Sv	
発熱・感染・出血・脱毛・子宮が不妊になる			
２ Sv	
倦怠・疲労感、白血球数低下、睾丸が不妊になる 			
1 Sv(1,000mSv) 吐き気などの「放射線病」（死亡率は低い）低線量放射線			
250 mSv	
胎児の奇形発生（妊娠 14 日～18 日）			
～ 200 mSv
（これ以下の被ばくでは放射線障害の臨床的知見、無）		
50 mSv 	
原子力施設で働く人たちへの基準（年間） 			
10 mSv 	
ガラバリ（ブラジル）の人が年間に受ける自然の放射線量		
0.6 mSv 	
1 回の胃の X 線診断で受ける量 			
自然放射線		4.4 mSv 	
（医療機関も含めて）日本人が 1 年間に受ける平均の放射線量			
2.4 mSv 	
1 年間に自然から受ける平均の放射線量 			
1.0 mSv 	
原子力施設の公衆への基準（年間）			
0.2 mSv 	
成田･ニューヨーク間の国際線航空機片道飛行で宇宙線からあびる量		(１Sv = 1,000ｍSv)（出典：https://www.atomin.go.jp/reference/radiation/body/index05.html#introduction5	宇宙ステーションでの被曝予想�
�

宇宙放射線の量は、地表からの高度とともに大気層が無くなること、荷電粒子を散乱させる地磁気が弱くなるため、急激に増加する。�
�

国際宇宙ステーションは、高度約400km、軌道傾斜角51.6度で飛行：�
�

被曝：低LET放射線（γ線や高エネルギー陽子など）�
��� 高LET放射線（α線、重粒子線、中性子線など）�
�

国際宇宙ステーションの内部の被曝量は、1日�あたり約1mSvと概算されている（地表の約1,000倍）�
��（放射線作業従事者の被曝限度：年間50mSv以下）�
6	

眼の水晶体は、放射線感受性が最も高い組織の一つで、検出可能な水晶体変化は、0.2～0.5Gyで認められる。	 

調査対象

白内障のタイプ しきい線量 信頼区間

原爆被ばく者 皮質白内障
0.6Sv
90%：0～1.2Sv(急性被ばく) 後嚢下白内障             0.7Sv
90%：0～2.8Sv    (急性被ばく)  チェルノブイリ 病期Ⅰ-Ⅴ                  0.50Gy   95%：0.17～0.65Gy
事故処理作業員 病期Ⅰ   0.34Gy   95%：0.19～0.68Gy(分割照射/放射線誘発以外         0.50Gy     95%：0.17～0.69Gy  長期被ばく)   の病期Ⅰの白内障      病期Ⅰ表面皮質白内障      0.34Gy    95%：0.18～0.51Gy  病期Ⅰの後嚢下白内障      0.35Gy   95%：0.19～0.66Gy
7	

*
白内障

前房
硝子体
水晶体
角膜
網膜

水晶体の特徴•無色透明でレンズの働き（網膜への結像•タンパク質の塊（ α、β-, γ-crystallin)•代謝されずに核部（中心）に集積する水晶体混濁の増加の原因
水晶体内の蛋白質の変性に伴う不溶性蛋白質の増加

リスクファクター
加齢、放射線、紫外線、薬物
80歳の罹患率ほぼ100％→ 失明	From: Cosmic Radiation Increases the Risk of Nuclear Cataract in Airline Pilots: A Population-Based CaseControl Study"
Arch Ophthalmol. 2005;123(8):1102-1105. doi:10.1001/archopht.123.8.1102"

パイロット（71名）は一般人(374名）よりも3倍以上、核白内障を発生しやすい。	

Data From Logistic Regression of Nuclear Cataract Risk Among Cases and Controls According to Employment as a Commercial
Airline Pilot, Age, Smoking Status, and Sunbathing Habits""
Date of download: 2/1/2014"

Copyright © 2014 American Medical Association.
All rights reserved."

宇宙飛行士と白内障	
1） 21 人の宇宙飛行士の眼の混濁度を 395 人の一般者と比較したところ、不透明度の値がわずかに強く、後部皮質（posteriorcortex）や水晶体後襄（posterior capsule）で増加する。
Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 240, 543–547, 2002

2） 247名の宇宙飛行士または軍飛行士の対照群との水晶体皮質部白内障の変動性及び中央値が、対照群と比較して有意に高い（p=0.015）とした。また、ベースラインの所見で、宇宙放射線と、後嚢下領域（p=0.015）及び病巣中心（p=0.056）の増加とに正の相関が見られるとして、後嚢下白内障の大きさと被ばく線量の相関が宇宙飛行士の集団で認められるとした。一方で、核性白内障は被ばくと関連していないとし、皮質及び後嚢下混濁に対する白内障のリスクは低線量で増加する。	
Radiat. Res. 172, 10–20, 2009

*白内障の危険因子• 加齢�
• 性別（女性）�
• 喫煙�
• 放射線	• 紫外線�
• 近視�

• 薬物�
– ステロイド�• 全身疾患�– 糖尿病�
– アトピー性皮膚炎�

11	*
水晶体混濁の増加の原因
水晶体内の蛋白質の変性に伴う不溶性蛋白質の増加

水晶体蛋白質の化学変化
12	

*

αB
Crystallin
細胞骨格蛋白質	
無機質 1%	

水 65%	

蛋白質 34%	

αA
α-"β	γ	

安定な会合体形成、透明性維持				α-crystallin

β-crystallin

γ-crystallin�

  αA , αB	 			20 kDa 	
会合状態 	
30〜40量体
主要2次構造�β-sheet
生体内局在� 多分布		

βA1-βA4	

βB1-βB3	23-35 kDa 		
二量体/複合体
�β-sheet�	
水晶体固有 �γA-γFγS		20 kDa		
単量体	
�β-sheet	�水晶体固有	Subunit

13放射線、紫外線、加齢による水晶体内放射線、ほう蛋白質の変化
放射線

酸化
脱アミド化

どうやって、蛋白構成アミノ酸の	一残基ごとの変化を迅速、簡便、微量で検出するか？→質量分析	

*蛋白質化学からみる白内障発症のメカニズム
800 kDa	γ	

水晶体を構成している蛋白質の約90%がクリスタリン（α-,  β-,  γ-クリスタリン)     安定な会合体酸化
アスパラギン酸糖化（Asp）の異性化
異常な会合体
リン酸化20kDa"

B A

αβ	20-60 kDa	

脱アミド化
異性化

水晶体の透明性を維持

白内障	

生体内のアミノ酸、ペプチド、蛋白質はすべてＬ-アミノ酸で構成されている。
体内ではD-アミノ酸.
変化しないと信じられていた。
L-アミノ酸

加齢、放射線によってアスパラギン酸が生体内でD-体に変化する
16

蛋白質中にＤ−アスパラギン酸が生成されると？	

隣接残基の側鎖が	同じ向きに配置	される。	
ポリペプチド鎖が乱れる	進化	
片手構造の維持	
老化	

正常な生命活動	放射線照射による蛋白質への影響			

凝集、ラセミ化、酸化	γ線照射によるαB-crystallinの

αB-crystallin

凝集	V0669 k

吸光強度(uV )

50000
40000
30000
20000
10000
05791113時間	 (m in)

15

1719ー0 Gy, ー0.5 kGy, ー1.0 kGy, ー1.5kGy, ー2.0 kGy	

M: M.W. marker	

a: 0 Gy	b: 0.25 kGy	c: 0.5 kGy	d: 1.0 kGy	e: 1.5 kGy	f: 2.0 kGy	

*Risk factors

Catarac D/L ratio of Asp Growttin lenshproteinsRate

60 days after 15 Gy(mouse)1)+++

0.04 →0.06

50%

18 months after 5 Gy
18 months (0Gy) (mouse) 1)++++

0.05 →0.09
0.05 →0.06

44%
20%

1) Fujii N. et al. J Rad. Res. 27, 183-190 (1986) 	

*
Risk factors

Cataract

D/L ratio of Asp
in lens proteins

GrowthRate

60 days after 15 Gy (mouse)1)+++

0.04 →0.06

50%

18 months after 5 Gy
18 months (0Gy) (mouse) 1)++++

0.05 →0.09
0.05 →0.06

44%
20%

UVB (5J/cm2) after 72 hours(6 week–old rat) 2)+++

0.02 →0.20(Asp 151 of αA)

900%1) Fujii N. et al. J Rad. Res. 27, 183-190 (1986), 2) Fujii N. etal. Exp.
Eye Res. 65, 99-104 (1997)	

Risk factors

Cataract

D/L ratio of Asp
in lens proteins

GrowthRate

60 days after 15 Gy (mouse)1)+++

0.04 →0.06

50%

18 months after 5 Gy
18 months (0Gy) (mouse) 1)++++

0.05 →0.09
0.05 →0.06

44%
20%

UVB (5J/cm2) after 72 hours(6 week–old rat) 2)+++

0.02 →0.20(Asp 151 of αA)

900%

80 Y human αA-crystallin3)
80 Y human αB-crystallin3)+++

0.02 →0.20
0.02 →0.10

900%
400%

1) Fujii N. et al. J Rad. Res. 27, 183-190 (1986), 2) Fujii N. etal. Exp. Eye Res. 65,99-104 (1997)	
3) Fujii N. et al. Biochim. Biophys. Acta 999, 239-242 (1989) 	

放射線白内障と加齢性白内障に共通していること	1.      水晶体蛋白質の凝集促進と機能低下
1 Year
S20,W＊＊R (Å) (37℃）
g＊Chaperon Act.
＊80 Year

17S
60
100％	

30-80S
70-80
40％

αB
αB
αA

αA

Aging,

α-crystallin"LD

α-crystallin"

αA- D- β -Asp：Asp58, Asp151"
αB- D- β Asp： Asp36, Asp62"

白内障のクリスタリンは会合の度合いが大きく、シャペロン機能も低下	

放射線白内障と加齢性白内障に共通していること	2.      水晶体蛋白質のラセミ化が促進							Masters et al. Proc.Natl. Acad.Sci . 1204
(1978)	

0.6
0.50.40.3
0.20.100 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	

年齢�水晶体蛋白質のうちの、どの蛋白質のどのアミノ酸がラセミ化しているのか？
これを化学的に、定量的に簡便に決定する。

微量D-アミノ酸の迅速、精度の良い	分析法を確立		
タンパク中のＤ−アミノ酸の検出は	藁の中に落ちている針を見つけるようなもの	2725

* 蛋⽩白質中でのAsp/Asn残基異異性化の機構	 易さ：この反応の起こりイミド形成のしやすさ,隣接残基のアミノ酸の側鎖が小さいとき  反応中間体		--L α-Asp

D α-AspL-succinimide-L β-Asp

D-succinimide-L α-Asn-

D β-Asp

Asp残基は4つの異異性体を有する	

sampleUltra sonication & Homogenized in 2mM 2mercaptoethanol 35mM Tris-HCl buffer (pH7.4)

20,000g 60min

ppt (WI)

Trypsin,	37°C 20h 	Sup(WS)	

α, β, γ-crystallin

LC-MS	1) Identify the tryptic peptides .
2) Analyze D/L ratio and β/α ratios of individual Asp
��residues in all crystallins

*c:\users\norihiko\desktop\ws_64

2011/07/08 11:22:25

RT: 0.00 - 120.01 SM: 11G100

WI:沈殿画分

80

Relative AbundanceNL:
3.87E5m/z=85.00-2000.00 F:
ITMS + c NSI Fullms[350.00-2000.00]
MS wi_64

6040200100

NL:
1.49E5m/z=85.00-2000.00 F:
ITMS + c NSI Fullms[350.00-2000.00]
MS ws_64

WS:上清画分

80
60
40
200102030

Relative Abundance

NL:
4.41E4m/z=588.00-589.00 F:
ITMS + c NSI
Full ms[350.00-2000.00]
MS WI_64

WI80

40

Mass range	

588-589.5	60
40200100NL:
3.33E4m/z=588.00-589.00 F:
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Full ms[350.00-2000.00]
MS ws_64

WS805060Time (min)

7080

90

Mass range	

748.5-750	110120
NL:
1.57E4m/z=748.50-750.00 F:
ITMS + c NSI
Full ms[350.00-2000.00]
MS WI_64

WI806040
20010080

αB 57-69	

αA 55-65	

TVLDSGISEVR	 APSWFDTGLSEMR	

[M+2]2+=588.3	 [M+2]2+=748.8	

60

100

RT: 50.00 - 80.00 SM: 11G
100

Relative Abundance0

RT: 20.00 - 50.00 SM: 11G100

NL:
1.97E4m/z=748.50-750.00 F:
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Full ms[350.00-2000.00]
MS ws_64

WS60
4040

20200020253035
Time (min)40455050556065
Time (min)7075

Fujii N. et al. J. Biol. Chem. 287,39992-40002, (2012) 	

80

αA-,  αB-クリスタリン中のAsp残基の異性体含有率

Fujii N. et al. J. Biol. Chem. 287,39992-40002, (2012) 	

1. 隣のアミノ酸残基がGly,  Ala,  Serのような小さいアミノ酸のとき
2. Asp残基周辺の構造がflexibleなとき
βB2-クリスタリン	
ウシαA-クリスタリンの立体構造

Asp151	

Asp4	

Laganowsky  A.  et  al.  Protein  Sci.,  19:1031  -  1043,  2010

Smith MA et al. PROTEIN SCI. 16, 615-625, 2007,	放射線、紫外線、加齢による蛋白質の変化
放射線、ほう放射線

酸化脱アミド化

Fujii N. et al. J. Biol. Chem. 287, 39992-40002 (2012).	

*
1. 白内障（蛋白質の異常凝集）はAsp  残基の異性化によって惹起する。  Asp  残基の異性化すべての残基に生じるのではなく、部位特異的に生じることが明らかとなった。
2. LC-MSを用いて蛋白質の同定と異性体部位の同時決定する方法を確立した。多種多様の異性体一斉分析が可能となった。
•

白内障の防御の一助となりえる。

*
慶応大：
竹鼻 真
金沢医大：   佐々木 洋
筑波大：  加治優一            藤田保健衛生大：山本直樹
旭テクノグラス：下岡正志            防衛医大皮膚科：多島新吾
阪大：後藤祐児
京大：三木邦夫、喜田昭子

京大原子炉：藤井智彦、高田匠、久下勝規、新名芳有、
中村徹、倉林咲枝、石田匠、清水健一、森雄平、安岐健三、川口剛広、元家亮太、坂上弘明、
貴田将司、美濃岡智洋,蔡  思敏、金仁求、前田裕貴、木野内忠稔、齊藤毅、杉山正明
Oregon Health Science Univ. : Kirsten

Lampi
33

Ｗｅｌｃｏｍｅ ｔｏ D-amino  acid ｗｏｒｌｄ* ご清聴ありがとうございました

鏡の国のアリス	34