Oct. 2010

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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337 ( 1 )長時間作用型抗インフルエンザ薬 CS-8958（ラニナミビル
オクタン酸エステル，イナビル ®）のパンデミック(H1N1)2009 インフルエンザウイルスに対するin vitro および in vivo 効果
久保淑・角田正代・山下誠

第一三共株式会社生物医学研究所（2010 年 9 月 1 日受付）

ラニナミビルは新規のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ (NA) 阻害薬で，CS-8958 はそのプロドラッグ体であり，長時間作用の性質を有することが知られている。
2009 年にパンデミックを起したパンデミック (H1N1)2009 インフルエンザウイルスの長崎分離株を使用し，ラニナミビルが NA 活性と培養細胞系でのウイルス増殖に対し強い阻害活性を有すること，さらに NA に対し強い結合力を示すことを明らかにした。さらに，マウス感染モデル系において単回経鼻投与の CS-8958 が優れた肺中のウイルス産生抑制効果を示したことから，パンデミック (H1N1)2009 インフルエンザウイルス感染に対しても CS-8958 は長時間作用型薬剤として有効であることが示唆された。

インフルエンザはインフルエンザウイルスが上

そして 2009 年のブタ由来パンデミック

気道から気管，肺へと拡大感染して起きる，高年(H1N1)2009（以下 pdm(H1N1)2009）インフルエ齢者を中心に時に致死的にもなる呼吸器疾患であンザウイルス 3) によるものを経験した。感染症発り，世界で毎年 350 万人が重篤化し，30 万人から生動向調査によると，2009 年 6 月のパンデミック

1)

50 万人が死に至ると考えられている 。インフル宣言後に日本で患者発生が報告され始めた 2009

エンザウイルスは主に A 型と B 型がヒトで流行を年 28 週から 2010 年 10 週まで pdm(H1N1)2009 ウ

繰返しているが，A 型インフルエンザウイルスはイルス分離率が 99.29% であり 4)，A 型インフルエ

ウイルス粒子表面抗原であるヘマグルチニン (HA)

ンザウイルスは殆ど pdm(H1N1)2009 ウイルスにとノイラミニダーゼ (NA) の抗原性の違いにより置換わったかに見えるが，今シーズン以降の動向

HA は H1 から H16 の 16 種，NA は N1 から N9 の 9に注意を払う必要がある。

種があり，その組合せで多くの亜型が知られてい抗インフルエンザ薬として 2 つのクラスの薬剤る。過去約 100 年において，ヒトは 4 回のパンデ― M2 イオンチャンネル阻害薬と NA 阻害薬―がミック，即ち 1918 年の H1N1 型ウイルスによるスある。M2 イオンチャンネル阻害剤（アマンタジ

ペインかぜ，1957 年の H2N2 型ウイルスによるアン，リマンタジン）はインフルエンザウイルス遺ジアかぜ， 1968 年の H3N2 型による香港かぜ 2)，

伝子の脱殻やウイルスのアセンブリーを阻害する

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が 5)，B 型ウイルスには無効で，また耐性株が容

ステル結合した CS-8958 は単回投与で各種インフ易にできることから，米国においては 2005 年かルエンザウイルスの動物感染系で優れた薬効を示。また， pdm(H1N1)2009

すようになったが 20⬃23)，それは CS-8958 がその経ウイルスも初期の分離株で既に耐性変異を有して鼻投与により呼吸器での長期貯留性を獲得し 24)，いた 9)。NA 阻害薬は産生したインフルエンザウイ

またラニナミビルが NA に強い結合性を有するこルスが感染細胞から遊離する時に必要な NA を阻とで長期作用型の性質を獲得し，単回投与で有効害することで感染の拡大を抑制するものであるが，になったものと考えられた 21)。この長期作用型の

現在，オセルタミビル（タミフル ®，75 mg の 1 日

特長を生かし，インフルエンザ治療が CS-8958 のら使用されていない

6,7)®

2 回 5 日間の経口剤），ザナミビル（リレンザ ， 単回投与で完結することが pdm(H1N1)2009 イン
10 mg の 1 日 2 回 5 日間の吸入剤），ペラミビル®

フルエンザウイルスによるパンデミック前までに（ラピアクタ ， 300 mg の単回点滴静注剤）があ

行 わ れ た 臨 床 試 験 で 証 明 さ れ て い る 25,26)。

り，オセルタミビルが最も広く使用されている。

CS-8958 はインフルエンザ治療が 1 回で完結する

しかしながら，既にインフルエンザ患者から何種吸入剤イナビル ® として，2010 年 9 月に製造販売

類かのオセルタミビル耐性ウイルスが分離されてが承認された。

9,10)。特にオセルタミビル耐性の H274Y 変異

本論文では 2009 年に国内で分離された株（ 274 位のヒスチジンがチロシンに変異の意，

pdm(H1N1)2009 インフルエンザウイルスを使用

N2 ナンバリング）の野生株からの置換わりは極

し，NA 阻害活性，培養細胞でのウイルス増殖阻

めて急であった。即ち，まず 2006⬃2007 年の北害活性，NA への結合力，マウス感染モデル系で

いる

11)

，国内では

の薬効評価を行った結果， pdm(H1N1)2009 イン

翌 2007⬃2008 年シーズンに 2.6% の分離率に過ぎフルエンザウイルス感染症に対する CS-8958 の単なかったものの 12)，2008⬃2009 年シーズンには国回投与での有効性を示唆したことを報告する。

欧地域での高い分離頻度が報告され

内では 99.7% となり 13)，世界的にも殆どが H274Y
耐性変異に 14,15) わずか 1 年で置換わった。この

材料と方法

H274Y 変異株は高病原性 H5N1 トリインフルエン
ザウイルス 16) や pdm(H1N1)2009 ウイルスでも分

1. ウイルス，細胞，動物

離されており，pdm(H1N1)2009 ウイルスでは既にpdm(H1N1)2009 インフルエンザウイルス A/Na-

17)

WHO により 300 例近くが ，国内において 1.13%

gasaki/I01/2009v27)， INF007， INF010， INF020，の分離率が報告されている 18)。pdm(H1N1)2009 ウ

INF023， INF034， INF095， INF126， INF138，

イルスの H274Y 変異株に対し，オセルタミビル

INF139， INF189， INF223， INF324， INF331，

活性体とペラミビルはほぼ同等の耐性度上昇とのINF407， INF442， INF444 株は 2009 年 7 月より

報告がなされた

19)。

12 月にインフルエンザ患者より長崎県で分離さ我々はラニナミビルは高病原性トリ H5N1 型イ

れ ， Madin-Darby Canine Kidney Cells（ MDCK

ンフルエンザウイルスを含む各種インフルエンザ

細胞，ATCC CCL-34）で 1 回増殖させたものを長ウイルス NA に強い阻害活性をもつ新規 NA 阻害

崎大学熱帯医学研究所より入手した。入手したウ薬として見出し，H274Y 変異ウイルスを含む各種

イルスは MDCK 細胞で 1 回増殖させ，培養上清

オセルタミビル耐性ウイルスにも有効であることを分注して ⫺80°C で保存し，適宜溶解し実験にを報告した 20,21)。ラニナミビルにオクタン酸をエ供 し た 。 MDCK 細 胞 は American Type CultureOct. 2010

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339 ( 3 )Collection より入手した。 BALB/c マウス（ 5 週の代わりに非感染細胞培養液上清を用いた。残存

令，メス，SPF）は日本チャールス・リバー株式

酵素活性は次式により求めた。
残存酵素活性 (%)⫽{(A⫺B)/(C⫺B) 平均値}

会社より購入した。

⫻100
2. 被験化合物

ここで，A ：蛍光値，B ：バックグラウンド平均

CS-8958（ラニナミビルオクタン酸エステル）， 値，C ：薬剤非添加の蛍光値である。
ラニナミビル，ザナミビル，ペラミビルは第一三残存酵素活性が 10⬃90% を与える連続した濃度

共株式会社で合成した。オセルタミビルはタミフを選択し，その対数値と残存酵素活性値から直線®

ル より抽出し，オセルタミビル活性体はオセル

回帰により IC50 と 95% 信頼区間を SAS System

タミビルよりいずれも第一三共株式会社で調製しRelease 8.2 (SAS Institute Inc.) を用いて求めた。

た。

5. 50% ウイルス増殖有効濃度 (EC50) の算出
3. 試薬

ウイルスを 6 穴プレートの MDCK 細胞に 1 時間

4-Methylumbelliferyl-N-Acetyl-a -D-Neuraminic

接触させ PBS で洗浄した後，0.21% ウシ血清アル

Acid, Ammonium Salt (MU-NANA) はナカライテ

ブミン，25 mM HEPES 緩衝液，0.01% DEAE デスク株式会社，Distilled Water (DW)，リン酸緩衝

キストラン，1.0 m g/mL トリプシン，0.001% フェ

生 理 食 塩 水 (PBS)， Modiﬁed Eagle Medium

ノールレッド，1⫻PS，0.5 m g/mL ファンギゾン，(MoEM)，HEPES 緩衝液，500 U/mL ペニシリン/

0.6% アガーを含む MoEM（MoEM/BA 寒天培地）

500 m g/mL ストレプトマイシン (100⫻PS)，ファに種々濃度の被験化合物を加え，添加した。

ンギゾンは Life Technologies Corporation， 2-(N-37°C，5% 炭酸ガスインキュベータで 42⬃44 時間

Morpholino)ethanesulfonic Acid (MES)，トリプシ培養を行った後，クリスタルバイオレットで生細ン (Type IX-S, From Porcine Pancreas)，ウシ血清胞を染色しプラークを計数した。プラーク形成率

アルブミン (35%) Fraction V (BA)，DEAE デキス

は次式で算出した。

トラン，アガー，クリスタルバイオレット，フェプラーク形成率 (%)⫽(M/M100)⫻100

ノールレッドは Sigma-Aldrich Corporation よりそ

ここで， M ：被験化合物添加ウェルのプラーク

れぞれ購入した。

数，M100 ：被験化合物非添加ウェルのプラーク数である。プラーク形成率と対数濃度から次式のシ

4. 50% 酵素阻害濃度 (IC50) の算出
32.5 mM MES-4 mM CaCl2 溶 液

グモイド Emax モデルにより SAS System Release(pH 6.5)(NAB) 中で，10⬃100 pmol/min の酵素活性を与え8.2 を用いて EC50 を算出した。
n]
プラーク形成率 (%)⫽[100⫻（濃度）/[(EC50)n⫹（濃度）n]るよう希釈したウイルス液と各種被験化合物を混合し， 室温で 10 分間静置した。 MU-NANA を(n: sigmoidicity factor)

100 m M となるよう添加し，室温で 30 分反応後，蛍光プレートリーダー CytoFluor Series 4000（ア6. NA 解離測定

プライドバイオシステムズジャパン株式会社）でNAB 中で，0.4% BA と 1⫻PS 含有の PBS (PBS-

励起波長 360 nm，蛍光波長 460 nm での蛍光強度

BA/PS) に懸濁した INF139 と各被験化合物を終濃を測定した。バックグラウンドとして，ウイルス度で 100 nM になるように添加し，37°C で 60 分イ

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ンキュベートした。被験化合物無しには DW を，

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結果

ウイルス無しには PBS-BA/PS を添加し同様にインキュベートした。インキュベート後，バイオス

1. ノイラミニダーゼ阻害活性

ピンカラム 6（ゲルろ過担体バイオゲル P-6，バイ

ノイラミニダーゼ活性を 50% に阻害する濃度

オラッド）にアプライし， 1000⫻g， 4 分間遠心

（ IC50 値）を表 1 に示した。ラニナミビルは他のし，NA 阻害薬とウイルス酵素の複合体からなる

NA 阻害薬と同様に強い阻害活性を有し，17 株に溶出液を回収し，遊離の被験化合物を除去した。

対する IC50 値の中央値は 1.50 nM（最小値 1.21

直ちにその複合体に NAB 中で終濃度 100 m M とな

nM⬃最大値 2.11 nM）であった。他 2 剤について，

るように MU-NANA を添加し，蛍光プレートリー

IC50 値を同様に記すと， ザナミビルは 1.32 nM

ダーで励起波長 360 nm/蛍光波長 460 nm で基質添

(1.04 nM⬃1.97 nM)， オセルタミビル活性体は加直後から 15 分間隔で 6 時間後まで蛍光を測定し0.655 nM (0.468 nM⬃0.831 nM) であった。

た。

2. 培養細胞系でのウイルス増殖抑制活性
7. ウイルス感染マウスでの薬効評価

pdm(H1N1)2009 ウイルス 3 種の MDCK 細胞で100 プラーク形成単位 (pfu) の A/Nagasaki/I01/の増殖における各種薬剤のウイルス産生抑制効果

2009v をイソフルラン麻酔したマウスに経鼻感染をプラーク減少法で検討し，プラーク数を 50% にした。オセルタミビル投与群は感染 2 時間後からする濃度 (EC50) を表 2 に示した。 EC50 値はラニ

40 および 100 mg/kg のオセルタミビルを 1 日 2 回

ナミビルが 1.5⬃9.4 nM，ザナミビルは 12⬃17 nM，経口投与， 2 時間後に生理食塩水を 1 回経鼻投与

オセルタミビル活性体は 4.3⬃14 nM であった。

した。 CS-8958 投与群は感染 2 時間後に 0.080 お
よび 0.24 mg/kg の CS-8958 を 1 回経鼻投与， 2 時

3. ノイラミニダーゼへの結合力の比較

間後から生理食塩水を 1 日 2 回経口投与した。コ

pdm(H1N1)2009 イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル スントロール群は薬剤投与群に合わせて生理食塩水

INF139 株のノイラミニダーゼ結合からの解離をを経鼻投与，経口投与した。経鼻投与はイソフル

調べ，図 1 に示した。オセルタミビル活性体は薬

ラン麻酔下で行った。感染 39， 63， 87 時間後に剤非添加よりやや遅れるもののほぼ同じ傾きで酵マウス肺を摘出し，PBS-BA/PS でホモジナイズし素活性が観察された。ザナミビルが次ぎに解離がた。時点毎に 3 匹のマウスを使用した。ホモジナ

遅く，ペラミビルとラニナミビルの解離は非常に

イズ液は 10 倍希釈系列を調製し，6 穴プレートで遅いものの，ラニナミビルの方がややペラミビル

増殖させた MDCK 細胞に 37°C， 1 時間接触させより遅い解離を示した。

た。細胞は PBS で洗った後，MoEM/BA 寒天培地を加え，37°C 下，5% CO2 インキュベーターで約

42 時間培養した。プラーク数を基に肺中のウイル

4. マウス感染モデル系でのウイルス産生抑制
効果

ス力価を算出した。統計解析は SAS System Re-

pdm(H1N1)2009 インフルエンザウイルス A/

lease 8.2 を用いて 2 元配置分散分析で行い， p 値

Nagasaki/I01/2009v の 100 pfu をマウスに感染さは， *: p⬍0.05， **: p⬍0.01， ***: p⬍0.001 としせ，薬剤を投与した時の肺中ウイルス力価の推移て記載した。

を図 2 に示した。ウイルスを感染させると薬剤非投与の時，ウイルス力価は 3 日後にピークを迎え，

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341 ( 5 )表 1．パンデミック (H1N1)2009 インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼに対する各種のイラミニダーゼ阻害薬の阻害活性

4 日後に若干の減少が見られるウイルス増殖パ

ミビル 100 mg/kg 反復投与に比べ，有意なウイル

ターンを示し，最大で肺当たり約 106 pfu まで増殖

ス減少効果を示した。

した。いずれの薬剤とも使用した投与量，投与回数で有意なウイルス減少効果を示し，感染 3 日後

考察のピーク時において，オセルタミビルの 40 mg/kg，100 mg/kg 反復投与はおおむね 0.5 log の， CS-

NGUYEN らは，基質として本報告と同じ MU-

8958 の 0.080 mg/kg， 0.24 mg/kg の単回投与は， NANA を用いた方法で， pdm(H1N1)2009 インフそれぞれ 0.75 log，1 log のウイルス減少が観察さルエンザウイルスのニューヨーク，ワシントン，れた。CS-8958 単回投与は両投与量ともオセルタ

シンガポール分離株を用いた成績を発表した 19)。

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表 2．パンデミック (H1N1)2009 インフルエンザウイルスの培養細胞系での増殖に対する各種のイラミニダーゼ阻害薬の阻害効果

図 1．パンデミック (H1N1)2009 インフルエンザウイルスノイラミニダーゼへのラニナミビルの結合安定性

pdm(H1N1)2009 インフルエンザウイルス INF139 を過剰量の各種 NA 阻害薬，オセルタミビル活性体 (䊏)，ザナミビル (䊐)，ペラミビル (䊊)，ラニナミビル (䊉)，あるいは蒸留水 (䉭) と混合した後，遊離の NA 阻害薬をバイオス
ピンカラムで除去し，ウイルス NA と NA 阻害薬複合体を調製した。そこに NA の基質である MU-NANA を添加
し，NA 反応を 360 分まで追跡し，NA 阻害薬の NA からの解離を比較した。オセルタミビル活性体，ザナミビ
ル，ペラミビル，ラニナミビルの順に解離し，ラニナミビルの解離が最も遅く，強い結合を示した。

その 3 株の平均 IC50 値は，ラニナミビルは 0.74

体は 1.90 nM，ペラミビルは 0.22 nM であった。まnM，ザナミビルは 1.20 nM，オセルタミビル活性

た， ITOH らは pdm(H1N1)2009 インフルエンザウ

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343 ( 7 )図 2．パンデミック (H1N1)2009 インフルエンザウイルス感染マウスでの CS-8958 の薬効pdm(H1N1)2009 インフルエンザウイルス A/Nagasaki/I01/2009v を 100 プラーク形成単位，マウスに経鼻感染し，
その 2 時間後からオセルタミビルを 40 mg/kg (䊐) および 100 mg/kg (䊊) を 1 日 2 回経口投与，あるいは 2 時間後に
CS-8958 を 0.080 mg/kg (䊏) および 0.24 mg/kg (䊉) を 1 回経鼻投与，あるいは生理食塩水 (䉱) を投与した。感染39，63，87 時間後にマウス肺を摘出し（各時点 n⫽3），肺中のウイルス力価をプラーク法で測定した。

イルスのカリフォルニア（初期分離株），大阪分

に対する平均 IC50 値が，ラニナミビルが 1.14 nM，離株を用い，ラニナミビルは 0.41⬃0.44 nM，ザナ

ザナミビルが 1.04 nM，オセルタミビル活性体がミビルは 0.32⬃0.43 nM，オセルタミビル活性体は1146 nM，ペラミビルが 124 nM と報告した 19)。こ0.96⬃1.6 nM と報告した 23)。長崎県で分離されたの数値は本報告と同じ MU-NANA を基質としてpdm(H1N1)2009 インフルエンザウイルス NA の NA測定した値から計算した。この IC50 値は野生株

阻害薬 3 剤に対する感受性は，他国や国内他地域

IC50 値のそれぞれ，1.5 倍，0.87 倍，603 倍，564の分離株とほぼ同等であった。また，長崎地域で倍の活性低下であり， pdm(H1N1)2009 ウイルス2009 年の 7 月から 12 月の 6 ヶ月の間，NA 阻害薬の H274Y 変異に対し，ラニナミビルとザナミビ

3 剤に対し分離ウイルスは非常に安定した感受性

ルはほぼ阻害活性を維持しているが，オセルタミを維持していた。これらのことは pdm(H1N1)2009

ビル活性体とペラミビルは共に 600 倍程度の阻害

ウイルスの NA は初めて分離された 2009 年 4 月以活性低下があることを意味している。季節性

降から比較的安定に維持されていることを示唆し

H1N1 型インフルエンザウイルスの H274Y 変異をている。

有するオセルタミビル耐性ウイルスはわずか

さらに，NGUYEN らは大阪，ワシントン，香港，

1 年でそれまでの感受性株に置換わった 12⬃15)。

シンガポールで分離された H274Y 変異をもつ 4 種

pdm(H1N1)2009 インフルエンザウイルスにおいての pdm(H1N1)2009 インフルエンザウイルスの NAも，既に H274Y 変異を持つオセルタミビル耐性

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ウイルスが世界的に出現している 17⬃19)。A 型イン与で治療が完結する吸入剤と医療現場における薬フルエンザウイルスの変異スピードは極めて速く，剤の選択肢が広がることになる。耐性ウイルスのかつ One Lineage 進化をすることが知られてい出現状況，患者の年令や重篤度，服薬コンプライる28)ことから，H274Y 変異をもつ pdm(H1N1)2009

インフルエンザウイルスが再び一気に蔓延する危アンスなど，医療現場での多様な状況に最適な薬剤選択ができるようになることが期待される。

険性を示唆している。
培養細胞系での pdm(H1N1)2009 インフルエン

謝辞

ザウイルスの増殖をラニナミビルは EC50⫽1.5⬃9.4

nM で強く阻害し，この値はザナミビルやオセル

pdm(H1N1)2009 インフルエンザウイルスをご恵

タミビル活性体の EC50 値より強いものであった

与下さいました長崎大学熱帯医学研究所

森田公（表 2）。 NA 阻害活性はラニナミビルがザナミビ

一博士および久保ルやオセルタミビル活性体より同等ないしやや弱

爆諫早病院，この逆転現象は図 1 のい値を示しており（表 1）す。動物実験は第一三共株式会社生物医学研究所

結果から説明可能と考えている。即ち，ラニナミ

友澤尚徳氏に担当して頂きました。感謝致しま

ビルはオセルタミビル活性体やザナミビルより NAす。

亨博士，日本赤十字社長崎原

福島喜代康博士に感謝申し上げまに対し強い結合を示した。酵素阻害は 30 分の反応であるのに対し，ウイルス増殖阻害は 2 日の反引用文献

応であり，解離速度の遅いラニナミビルは長い反

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応を観察するウイルス増殖阻害では，他剤より阻害活性が強く出たと考えられる。この強い結合性
は季節性 H1N1 ウイルス， H3N2 ウイルス， B 型
ウイルスに対しても観察されることを我々は報告している 21)。
マウス感染モデル系において CS-8958 は 0.080

mg/kg， 0.24 mg/kg の単回経鼻投与で有意なウイ
ルス産生抑制効果を示した。この投与量は小児，成人を対照に行われた臨床吸入投与量 (20 mg，40 mg) よりやや低い用量である。CS-8958 はオセ
ルタミビルの 100 mg/kg の反復経口投与より有意に強くウイルス産生を抑制したが，オセルタミビ
ルの投与量は臨床投与量 75 mg/body/shot（成人，
体重 37.5 kg 以上の小児）， 2 mg/kg（小児）よりかなり高い。この理由は不明であるが，薬物動態的側面を含めた検討が必要であると思われる。

NA 阻害作用による抗インフルエンザ薬は既存の 3 剤に CS-8958 が加わると，反復投与が必要な
経口剤と吸入剤， 1 回投与の点滴静注剤， 1 回投Oct. 2010

7)

8)

9)

10)

11)

12)
13)
14)
15)
16)

17)
18)
19)

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In vitro and in vivo effects of a long-acting anti-inﬂuenza agent
CS-8958 (laninamivir octanoate, Inavir®) against pandemic(H1N1) 2009 inﬂuenza viruses
SHUKU KUBO, MASAYO KAKUTA and MAKOTO YAMASHITA
Daiichi Sankyo Co. Ltd., Biological Research Laboratories
Laninamivir is a novel neuraminidase inhibitor of inﬂuenza viruses and it has been reported
that its prodrug, CS-8958 shows a long-lasting characteristics. Using viruses isolated in Nagasaki ofpandemic (H1N1) 2009 inﬂuenza virus which cause pandemic in 2009, it was shown that laninamivir has a strong inhibitory activities against their neuraminidases and virus replication in cultured cells, and strong binding stability to the virus NA. Furthermore, a single intranasal administration of CS-8958 showed a superior reduction of virus load in lungs in mouse infection model. Thesesuggest that CS-8958 will work as a long-acting neuraminidase inhibitor to an infection with pandemic (H1N1) 2009 inﬂuenza viruses as well.