博 士 （ 医 学 ） 水 内 一 臣
学位 論文 題名
H2― Dd― mediated regulation of IL― 4production
during natural killer T cell and dendritic cellinteraction(NK
T細胞と樹状細胞との会合におけるH2―Ddを介したIL―4産生調節）

学位論文内容の要旨
Introduction
Natural killer T (NKT) cells are capable of subserving apparently opposite
functions, the interferon (IFN)‑y mediated enhancement of host defens
e andinterleukin(IL)‑4 mediated immune regulation. Dendritic cells (DCs) are the potent professional
antigen‑presenting cells that are primari
ly respons
iblefor initiationand regulationof
immune responses against various antigens. DCs polarize naive CD4+ T cells to Thelper l (ThD or Th2 cells and generate an appropriate acquired immunity.
Extracellular stimuliincluding pathogen associated molecular patterns (PAMPs) suchas Tolllike receptor (TLR) ligands modulate DC ability to induce Thl or Th2
differentiation.Although DCs potently activate NKT cells to produce copious amountsof various cytokines, DC regulation of the IL‑4 versus IFN‑y balance via NKT cell
activation is not well characterized. In the present study, the effec
t ofDC treatmentwith CpG oligodeoxynucleotide (ODN), a TLR9 ligand, on induction of the NKT cellcytokine production was examined.
Materials and methods
CpG‑ODN‑conditioned and a‑galactosylceramide (a‑GalCer)‑loaded myeloid DCs(CpG‑DCs) from BALB/c or C57BL/6 (B6) mice were co‑cultured with nylon
non‑adherent splenocytes or whole thymocytes. Thereafter, amounts of cytokines (IL‑4and IFN‑y) in the culture supernatant were quantitated by enzyme‑linked
immunosorbent assay (ELISA). In some experiments, a‑GalCer‑loaded CpG‑DCs wereincubated with anti‑CD80 mAb, anti‑CD86 mAb, anti‑IL‑12 monoclonal antibody (mAb),
anti‑H2‑Dd mAb, or certain combinations of these mAbs. Then, the DCs wereco‑cultured with nylon non‑adherent splenocytes in the presence of the mAb and thesupernatants were collected and amounts of IL‑4 and IFN‑y were measured. The
intracellular IL‑4 production was also analyzed on CDld‑dimer+ TCRp+ NKT cells by― 325―

flow cytometry. Expression of surface molecules onCpG‑DCs was analyzedbyflow
cytometry.
ResultsCpG‑DCsshowedenhancedabi
litytoin
duceNKTc
ellp
roduc
tionofIL‑4,butnotIFN‑y,comparecltoa‑GalCer‑loadedcontrol(non‑treatedwithCpG‑ODN)DCsinBALB/
cmice.
The CpG‑DCs exhibited significantly higherexpressionofCDld, CD80, CD86,and
H2.DdcomparedtothatoncontrolDCs.Neithersingl
enorcomb
inato
rialtreat
mentofcultures with anti‑CDld, CD80, CD86,orIL‑12 mAbs showedsignificanteffectson
NKTcell‑medi
atedIL‑4produ
ctionindu
cedbyeit
hert
ypeo
fDCs.Blockingoft
heH2‑Ddand Ly49‑receptor interactionduringantigenpresentation completelyabolishedtheenhanced ability of the CpG‑DCs to induce NKT cellproduction of IL‑4.The DCs
stimulated withPam3CSK4 (P3C‑DCs), aTLR2 ligand, alsoshowedhigherabilityto
induceIL‑4productionbyNKTcellsthancontrolDCs.However,theabilit
yofP3C‑DCs
was modest comparedtothat ofCpG‑DCs. The H2‑DdlevelonP3C‑DCswaslower thanthaton CpG‑DCs,whileno differenceswere detectedinCD80 and CD86 expressions
between CpG‑DCs and P3C‑DCs.In contrast, B6 mouse CpG‑DCs, which express noH2‑Dd, failed to induce substantial production ofIL‑4 by syngeneicNKT cells.
Discussion
NKT cells activated by DCsarethought tobetheprimary source ofThl/Th2
cytokines,especiallyinanearlyphaseofimmuneresponses,whichm
ayde
termi
neth
e
subsequenttypeofacquiredimmunity.Thus,DCrecognitionofpathogensviaTLRand
PAMP interaction and the subsequent NKT cell activation appear to be crucial
processesthatleadtoinitiationoftheappropriateacquiredimmunity.Thepresent
findings demonstratethat DCrecognition of CpG motifleads totheenhancedIL‑4productionbyNKTcellsviainteractionoftheaugmentedH2‑DdontheCpG‑DCswith
Ly49receptorsonNKTcells.Furtherinvestigationmaydevelopanapproachtoapply
thisbeneficialeffectsofmanipulationofNKTcellactiva
tioninva
riousauto
immunediseases.

― 326

学位論文審査の要旨
主 査

教 授

大 野 重 昭副 査

教 授

小 野 江 和 則

副 査

教 授

上 出 利 光学位論文題名H2− Dd− mediated regulation of IL― 4production
duringn
aturalkiller
Tcellanddendriti
ccellinteraction(NKT細 胞 と 樹 状 細 胞 と の 会 合 に お け る H2― Ddを 介し た IL− 4産 生 調節 ）Natural killerT (NKT)細胞は、Thelper typel (Thl)サイトカインであるinterferon‑y(IFNーめとTh2サ イト カインであ るinterleukin‑4 (11ー4）を 迅速かっ大量に産生し、生 体防御反応の増強と 自己 免 疫反 応の 制御 と いう 2つの 機 能を 併せ 持っ 。 樹状 細胞 (dendritic cells、 DC)は、
ナ イ ー ブ T細 胞 や NKT細胞 を活 性化 す るこ との でき る 強カ な抗 原提 示細 胞 であ り、 Toll likereceptor (TLR)は DCに よ る Thl． Th2サ イ ト カ イ ン バ ラ ン ス 調 節 に 重 要 な 役 割 を は た し てい る 。 し か し 、 TLRを 介 し た 細 胞 外 刺 激 が DCに ど の よ う な 影 響 を 与 え 、 そ の 後 の NKT細胞の活性化様式をい かに制御しているかについて は不明な点が多い。
そ こ で 本 研 究 で は 、 TLR9の り ガ ン ド で あ る CpG ODNに よ り 前 処 理 さ れ た DC (CpG‑DC)
で NKT細 胞 を 刺 激 す る こ と に よ り 、 NKT細 胞 か ら の サ イ ト カ イ ン 産 生 の 変 化 と そ の メ カ
ニ ズ ム を 検 討 し た 。 DCを a‑galactosylceramideと CpG ODNで 前 処 理 後 、 マ ウ ス ナ イ ロン 非 付 着 性 脾 細 胞 、 も し く は 胸 腺 細 胞 (NKT細 胞 ソ ー ス ） と 共 培 養 し 、 上 清 中 の IFN‐ nIL‑4産 生 量 を ELISAで 測 定 し た と こ ろ 、 コ ン ト ロ ー ル と 比 較 し 、 CpG‑DCは NKT細 胞 から の IL‑4産 生 の み を 増 強 し 、 IFN‑y産 生 に は 影 響 を 与 え な ぃ こ と が 判 明 した 。 また 、そ れは NKT細 胞 内 の intracellular stainingに よ っ て も 確 か め ら れ た 。 次 に 、そ の メカ ニズ ムを 解 析 す る た め 、 DC上 の 表 面 分 子 を フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー に よ り 調 べ た 。 そ の 結 果 、 DCを CpG ODNで 刺 激 す る こ と に よ り 、 DC上 の CDld、 CD80、 CD86、 そ し て H2‑Ddの 発
現が 増強 さ れる こと が判 明 した 。そ こで 、こ れ らの 分子 に対 する 抗 体を 加え これ ら の共刺激を ブ ロ ッ ク し 、 NKT細 胞 の サ イ ト カ イ ン 産 生 を 解 析 し た と こ ろ 、 こ れ ら の分 子 の発 現増 強は 今 回 の IL‑4産 生 増 強 に は 関 与 し て い な い も の と 考 え ら れ た 。 そ こ で 次に 、NK細胞 やNKT
細 胞 上 に 発 現 し て い る inhibitory receptorで あ る Ly49の り ガ ン ド 、 H2‑Ddに 対 す る 抗 体を 加 え て ブ ロ ッ ク し た と こ ろ 、 CpG‑DCと 共 培 養 し た NKT細 胞 か ら の IL‑4産 生 増 強 が 強く 抑 え ら れ 、 そ れ は intracellular stainingに よっ ても 確か め られ た。 次に 、 TLR2のり ガン ド で あ る Pam3CSK4で 前 処 理 さ れ た DC (P3C‑DC)が NKT細 胞 か ら の IL‑4産 生 に どの よ う な 影 響 を 与 え る か も 調 べ た 。 す る と 、 P3C‑DCは NKT細 胞 か ら の IL‑4産 生 を 増 強し た が 、 そ の 効 果 は CpG‑DCと 比 較 し て 低 か っ た 。 そ こ で CpG‑DCと P3C‑DCの 細 胞 表
面 マ ー カ ー の 発 現 を 比 較 し た と こ ろ 、 CD80、 CD86の 発 現 に は 差 が な か っ た の に 対 し 、P3C‑DCの H2‑Dd発 現 量 は CpG‑DCに 比 べ 有 意 に 低 い こ と が 判 明 し た 。 以 上 よ り 、 CpG
ODNは DCの H2‑Dd発 現 を 増 強 し 、 NKl'細 胞 か ら の IL‑4産 生 を 亢 進 す る こ と が 考 え ら れ 、NKT細 胞 と DCの 相 互 作 用 に よ る サ イ ト カ イ ン バ ラ ン ス の 調 節 に H2‑Ddと そ の り ガ ン ドLy49の反応が関与し ていることが示唆された。
ー 327 ‑

審 査にあた っては、 副査上 出利光教 授から (1) D
Cのcell lin
eの成熟DCのTL
R9とTL
R2の発現量に差があるかどうか、その発現量の差によりその後のsignalingに差が出てきた可能性 の有無 について 質問があり、その可能性は否定できないと思われるが、今回はTL
Rの発現 量をみ ていなぃ ため、今後の検討が必要であると回答した。(2)
ひとっのDCがH
2．Ddを介してIF
N．y、IL．4両方に働きかけると考えるかについては、その可能性は高く、今回もH2‐DdとLy49の相 互作用 をブロッ クする ことによ りN
KT細胞から のIFN‐Yの産生量が増加 したこ とから、 本来DCに はN
KT
細 胞から のI
FN．Y
産生 を増強 するカが あるものの、普 段 は H2． Ddに よ り そ れ が 抑 制 さ れ て い る こ と が 考 え ら れ る と 回 答 し た 。
一方、副査小野江和則教授からは（1）Cp
Gは何のバクテリア由来の成分かについての質問が あり、 TLR
2のりガ ンド、Pam3は歯周病菌のりポ蛋白であるが、Cp
Gは特定のバクテリアで はなく 、バクテ リア全般と考えられると回答した。（2）TLR
9とTLR
2は細胞のどこに発現しているのかについては、TL
R2は細胞表面上に発現しているが、TL
R
9は細胞質endosome
内にあるため、その作用発現には抗原の内包化が必要であると回答した。（3）バクテリアのCpGがメ チル化さ れてい るのかに ついて は、バクテリアのCpG配列はメチル化されていないと回答した。
ま た、主査 大野重昭 教授からは（1）invivoの実験結果について質問があり、BALB/c、
B6マウスを用いて様々な実験を行ったが、vivoの場合様々な細胞が関与していることが考えられ、また、マウスの系によっても結果が異なり、今回のvitroのデータのようなクリアカットな結果は得られず、今後の検討課題と考えられると回答した。（2）ヒトの疾患とCpGと の 関 連 に つ いて は 、 ヒト で は B
細 胞 、 NK細 胞 、 単球 、 plasmacytoidDC
な ど で TL
R9が 発 現し て お り、 最近の報 告では T
LR9の遺伝子 のpolymorphi8mと べーチェ ット病の 感受性とは関連がないとの報告があり、また、活動性のへルペス角膜炎患者の角膜や、アデノウイ ルスに 感染した ヒト角 膜内皮細 胞のTLR9の 発現量が増加しているとの報告があると回答した。（3）今後T
h2優位の疾患への応用の可能性については、サイトカイン産生調節を介 してTh
1屈h2
バラ ンスを コントロ ールす ることによりその可能性はあり、実際にT
h2優位 の疾患 である喘 息がCpGの投与で抑制されたとの報告もあるが、今回の実験結果はinv
itroのマウスの結果であるので、実際の臨床応用に至るまでは多くのハードルを越える必要があると回答した。
この 論 文 は 、NKT細胞 と DCの 相 互 作用 に よるサ イトカ インバラ ンスの 調節にH2‐DdとそのりガンドLy49の反応が関与していることを初めて報告した点で高く評価され、今後の さ ら な る 研 究 に よ り 、 様 々 な 自 己 免 疫 疾 患 への 応 用が 期 待さ れ る。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ 申 請者 が 博 士 （医 学 ） の学 位 を 受け る の に充 分 な 資格 を 有 する も のと 判定した 。

― 328一