平成 19 年度農林水産省
食品製造工程管理情報高度化促進事業

平成 19 年度

病 原 微 生 物 データ分 析 実 験 作 業
成果報告書「各種環境条件下における腸炎ビブリオの増殖解析と予測」

平成 20 年 2 月
国立大学法人 東京農工大学大学院
藤川 浩教授平成 19 年度

食品製造工程管理情報高度化促進事業

病原微生物データ分析実験報告書
各種環境条件下における腸炎ビブリオの増殖解析と予測

東京農工大学大学院

藤川浩

1. 目的
食品を汚染する有害微生物による食中毒事件および腐敗の発生を減少させる上で、食品をいかに適切な環境条件下で製造し、流通させるかは非常に重要である。その環境要因の中で、最も微生物増殖に大きな影響を与えるものの一つとして温度がある。一方、食品添加物による微生物制御は安全性の面からも消費者は不安感を持っている。したがって、特に生鮮食品ではいかに温度管理、すなわち低温での製造・流通ができているかが微生物増殖に関して大きな課題である。もし、各過程で食品が受けた温度履歴から汚染している有害微生物の増殖を予測できれば、対象食品の微生物学的安全性に対する客観的な判断ができる。これまで国際的にいくつかの増殖モデルが発表され、中でもゴンペルツモデルとバラニーモデルは良く知られている 1, 2）。バラニーモデルは仮説に問題点があり、ゴンペルツモデルは本質的に変動温度に対応できない。最近、私たちは新ロジスティックモデルという新たな増殖モデルを開発した 3）。本モデルは定常および変動温度条件下で大腸菌、ブドウ球菌などの増殖を精確に予測できた 4-8）。
平成 17 年度の本センター食品製造工程管理情報高度化促進事業では、この増殖モデルを使った、微生物増殖予測のための新たなプログラムを開発した 9）(図１)。
このプログラムでは、ユーザーは増殖モデルに関する専門的な知識を必要とせず、菌種・初期菌数を指定し、次に温度データを入力すると瞬時に対象微生物の増殖予測結果がコンピュータ上に表示される。

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図１．新ロジスティックモデルを用いた増殖予測プログラム
数字は操作手順を示す。

平成 18 年度は代表的な食中毒起因菌の一つである腸炎ビブリオの増殖について、温度以外に水分活性（塩分濃度）および水素イオン濃度を加えた環境条件での増殖データを上記のモデルで解析し、その結果を用いて増殖予測を検討した。しかし、
18 年度はまだ全実験データを入手できなかった。そのため、今年度は腸炎ビブリオの全増殖データについて解析を行い、それらを用いてある環境条件下での増殖予測を検討した。さらに、これらの解析結果を基に本菌の増殖予測プログラムの開発を検討した。
2．方法
2.1．増殖予測モデル
増殖モデルは私たちが最近開発した新ロジスティックモデルを用いた。このモデ
ルは生物個体数あるいは人口を表すためにこれまで良く用いられてきたロジスティックモデルを基本にし、それを拡張したものであるため、新ロジスティックモデルと呼ぶ 3-8）。その式を下に示す。

dN
N mN= kN{1 − () }{1 − ( min ) n }
dt
N max
N(1)

ここで N：菌数、t：時間、k：速度定数、Nmax：最大値（定常期菌数）、Nmin：最小値（接種菌数）、m、n：調節パラメータである。ただし、k、m、n はすべて正の値をとる。新ロジスティックモデルは数値解法（ルンゲ‐クッタ法）を用いて解いた 3-8）。

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2.2．増殖データ
腸炎ビブリオの増殖実測データはすべて東京海洋大学藤井・木村先生から譲渡された。今回解析に用いた増殖条件（液体培地）は以下の通りである。
温度：35、30、25、20、15℃
食塩濃度：0.5、4.5、6.5、8.9（%）（水分活性ではそれぞれ 1.0、0.99、0.97、0955 に相当する。）
pH：8.0、7.0、6.0、5.5
なお、ここでは食品の水分活性を用いずに、食塩濃度を環境要因とした。これは食品の製造管理上、食塩濃度の方が実用性で適しているためである。
2.3．新ロジスティックモデルによる増殖解析プログラムの開発
新ロジスティックモデルによる増殖データ解析の迅速化を図るため、モデル中のパラメータ値を瞬時に求めるプログラムを開発した(図２)。このプログラムはMicrosoft Excel 2003 を使って作られ、時間と菌数の値を入力すると、瞬時に最適な増殖曲線を描き、モデル中のパラメータ k、m、n を求めることができる。ここで k は対数増殖期の傾き、m は対数増殖期後期の曲がり方(曲率)、n は対数増殖期の開始時期(ラグタイムの長さ)に関係するパラメータである。
図 2．新ロジスティックモデルを用いた増殖解析プログラム

32.4. 環境要因モデル
各種環境条件下での増殖データに対して得られた新ロジスティックモデルパラメータ値を多項式モデルで解析した。多項式モデルでは各パラメータを次の式のように環境要因である温度、塩分濃度、pH で表す。ここではパラメータ k を 2 次式で表したものを示した。
k = aT 2 + bS 2 + cP 2 + dTS + eSP + fPT + gT + hS + iP + j(2)

ここで、T :温度、S :食塩濃度、P :pH。a, b, …, j は係数である。k に対して式(2)について実測値と推測値の誤差が最小となるような各係数の最適値を最小２乗法によって求めた。ここでは、Microsoft Excel 2003 中の Solver を用いた。誤差をさらに小さくするため、多項式の次数を 3 次、4 次に上げて解析した。k を 3 次式で表したものを下に示す。
k = aT 3 + bS 3 + cP 3 + dT 2 S + eS 2 P + fP 2T + gT 2 P + hS 2T + iP 2 S + jTSP+ kT 2 + lS 2 + mP 2 + nTS + oSP + pPT + qT + rS + sP + t(3)

さらに、実測値の無い条件に対して、異常な値を推定しないかを検討した。
パラメータ n についても同様な解析を行なった。
2.5．増殖予測プログラムの作成
増殖モデル（新ロジスティックモデル）を基に、そこで用いるパラメータ値を多項式モデルを使って求め、増殖予測プログラムの作成を行なった。
すなわち、本予測プログラムでは、ユーザーが入力した条件（温度、塩分濃度、pH）に適合するパラメータ k および n の値を多項式モデルを使って求め、その値を新ロジスティックモデルに代入して増殖曲線を予測した。パラメータ m は増殖曲線へ与える影響が少ないため、その値を 1 に固定した。プログラム作成は Microsoft
Excel 2003 を使って検討した。

4最適値が得られた。
以上の解析結果を用いて腸炎ビブリオの増殖予測を行なった結果、実測値との良い一致が認められた。（図 6）
図 6．制限条件領域における増殖予測●：実測値、曲線は新ロジスティックモデルによって描かれた。
B．温度 30℃、食塩 4.5%、pH 7

101088log N (CFU)

log N (CFU)

A. 温度 15℃、食塩 6.5%、pH 7642642020406080
T I M E (h)1001200481216T I M E (h)20244．増殖予測プログラムの作成
以上のような解析過程を経て、腸炎ビブリオ増殖予測プログラムを作成した（図7）。入力項目としては、腸炎ビブリオの環境要因（温度、食塩濃度、pH）、初期菌数および保存時間である。各環境要因にはその適用範囲を明示した。出力としては、入力条件に応じた増殖予測曲線が描かれ、印刷ができる。さらに保存中の任意の時間における予測菌数（対数）、設定菌数（対数）までの予測到達時間も出力できる。
図 7．腸炎ビブリオ増殖予測プログラム（画面）74．まとめ今回、各種環境条件下での腸炎ビブリオ増殖データを、新ロジスティックモデルを用いて解析した。ほとんどのデータは本モデルで精確に表すことができた。得られたモデルの各パラメータ値は 3 次の多項式モデルで一部の環境条件を除いてほぼ予測できた。さらに環境条件領域を制限することで、高い精度のパラメータ値が予測できた。得られたパラメータ値を新ロジスティックモデルに代入し、精度の高い増殖曲線が予測できた。以上の解析結果を基に一般ユーザー向けの腸炎ビブリオ増殖予測プログラムが作成された。

参考文献
1. Gibson, A. M., Bratchell, N., Roberts, T. A. 1987. The effect of sodium
chloride and temperature on the rate and extent of growth of Clostridium

botulinum type A in pasteurized pork slurry. J. Appl. Bacteriol., 62, 479-490.
2. Baranyi, J., Roberts, T. A., McClure, P. 1993. A non-autonomous differential
equation to model bacterial growth. Food Microbiol. 10, 43-59.
3. H. Fujikawa, A. Kai, and S. Morozumi. 2003. A New Logistic Model for
Bacterial Growth. Journal of the Food Hygienic Society of Japan. 44:155-160.
4. H. Fujikawa, A. Kai, and S. Morozumi. 2004. A New Logistic Model for

Escherichia coli Growth at Constant and Dynamic Temperatures. Food
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5. H. Fujikawa and S. Morozumi. 2005. Modeling Surface Growth ofEscherichia coli on Agar Plates. Applied and Environmental Microbiology
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6. H. Fujikawa and S. Morozumi. 2006. Modeling Staphylococcus aureus
growth and enterotoxin production in milk. Food Microbiology. 23:260-267.
7. H. Fujikawa, K. Yano, and S. Morozumi. 2006. Characteristics and modelingof Escherichia coli growth in pouched food. Journal of the Food Hygienic
Society of Japan. 47:95-98.
8. H. Fujikawa, K. Yano, and S. Morozumi. 2006. Model comparison for

Escherichia coli growth in pouched food. Journal of the Food Hygienic
Society of Japan. 47:115-118.
9. 藤川浩、矢野一好、諸角聖、木村凡、藤井建夫．2006. 各種温度条件下における微生物増殖予測プログラムの開発．47:288-292.
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