AJACS MAG (Metagenome-Assembled Genome) を知って・学んで・使う」
2024年7月25日

メタゲノムとMAG解析について
森 宙史, Ph.D.
(Hiroshi Mori)
国立遺伝学研究所
先端ゲノミクス推進センター
hmori@nig.ac.jp1

・ 微生物のゲノム解析
・ 様々な環境のメタゲノム解析
・ Ancient DNA解析
・ これらに関わる情報解析ツール・DBの開発
研究室webページ https://www.genome.id2

微生物について3

微生物は小さい• 単細胞真核生物 (Fungi, protozoa) 4–40 μm• Prokaryotes
0.1–10 μm• Viruses (微生物に含めない場合も多い)
0.03–0.3 μm
この小ささが、phenotype解析やsingle cell解析等様々な解析を困難にしている

微生物を形で判別するのは困難

TogoTV (© 2016 DBCLS TogoTV)4

微生物の実験室での研究は、まず培養して増やすのが基本
培地の例・ LB培地 (Luria-Bertani培地)
・ 化学的に定義された培地

https://togomedium.org/

https://www.jcm.riken.jp/cgi-bin/jcm/jcm_grmd?GRMD=585

数%ぐらいの菌しか培養できない
理由:
単一の環境由来でも多数のニッチが存在し、単一培地ではそれらを再現できない微生物群集、特に細菌群集をどのように解析するか？6

メタゲノム解析概論

7

Metagenomics (since 1998)
Genome analysis against “Microbial community”
to know member compositions and functions““““““““““““““““““““““““TogoTV (© 2016 DBCLS TogoTV)

Microbiota
sampling

DNA extraction
from microbes

DNA sequencing

Bioinformatics
analysis8What’s metagenomics?
• Microflora, microbiota, microbial community: 微生物群集
Total collection of microorganisms within a community• Metagenome: ある群集の遺伝情報の総体
Total genomic potential of a community[Handelsman J. et al. Chem Biol. 1998

• Microbiome: マイクロバイオーム
Micro+biome or Microbio + ome?
Microbiota and metagenome in a microbial community

9

amplicon sequencing analysis(アンプリコン解析, 16S rRNA遺伝子のアンプリコン解析)
Pre-analysis (Remove Primer, Chimera etc.)
Sequence clustering or denoising
DNA extraction

PCR amplification

Taxonomic assignment andComparison between samples

0.0

0.2

0.4

0.60.8

1.0

DNA Sequencing

TestSample2TogoTV (© 2016 DBCLS TogoTV)

SRR061008

SRR061006

SRR061003

SRR061004

SRR095659

SRR094400

SRR090399

Who’s there?

TestSample1

SRR094717

1016S ribosomal RNA (16S rRNA)・ リボソームの核となるRNAの一つ
・ 全ての細菌が所持
・ 配列間の結合によって高次構造を形成 (保存されているサイトと多様なサイトがモザイク状に存在)・ 系統マーカー遺伝子の代表例
・ 170万本以上のほぼ完全長配列がデータベースに登録済み
・ 多くの細菌がゲノム内に複数の遺伝子コピーを所持
・ 全長約1500 base
16S rRNA遺伝子は広範囲の細菌における系統推定を行う上で適した遺伝子
Woese CR. et al. PNAS. 1990

11

Metagenomic sequencing analysis(メタゲノム解析 , ショットガンメタゲノム解析 )(メタトランスクリプトーム解析 )Metagenomic reads
Assemble

MEGAHIT,SPAdes, etc.

Contig sets

DNA extraction / RNA extraction

Gene finding

Reverse transcription

Prodigal,
MetaGeneMark, etc.

Gene sets

DNA Sequencing

TogoTV (© 2016 DBCLS TogoTV)

KEGG,
RefSeq等
Sample1
Metadata
Sample2
Metadata

Comparative
metagenomics

Who’s there?

Sequence similarity
searchBLASTP,DIAMOND,
MMseqs2, etc.

Gene Function abundance
Pathway abundance
Taxonomic abundance
What are they doing?
12

アンプリコン解析
利点
・安価かつ少量のDNAから系統組成が得られる
・reference配列に依存しない解析も可能
・マシンパワーは少なくて済み、解析ツールも普及（QIIME2・DADA2等）

欠点
・PCRバイアスの存在
・種以下は分解能に問題あり
・個々の系統が持つ機能が不明

メタゲノム解析
利点
・系統組成と遺伝子機能組成が得られる
・実験によるバイアスが少ない
・優占系統のドラフトゲノムの構築（条件が良ければ可能）

欠点
・reference配列に依存した解析・目的依存で解析手法が変化し、マシンパワーも必要

13

アンプリコン解析もメタゲノム解析も、DNA抽出法が極めて重要

DNA extraction

DNA extraction
PCR amplification

DNA Sequencing
DNA Sequencing

TogoTV (© 2016 DBCLS TogoTV)
TogoTV (© 2016 DBCLS TogoTV)

14

アンプリコン解析もメタゲノム解析も、DNA抽出法が極めて重要
Gram+

Gramouter membrane

peptidoglycan
plasma membrane2016 DBCLS TogoTV / CC-BY-4.0• 微生物群集解析用の代表的な DNA抽出法• 酵素法（Lysozyme, Proteinase, RNase等の組み合わせ)• ビーズ破砕法• フェノールクロロホルム法• シリカメンブレン法• スピンカラム法• 短鎖型か長鎖型のシーケンサーを使うかによっても変わる• せっかく長く読めるのに、元のDNAがズタズタだと意味が無い
15• DNA量も重要（長鎖型なら数マイクログラムは欲しい）

微生物の系統間でのDNA抽出バイアスの評価
ATCC Mock

ZymoBIOMICS Gut Mock

ZymoBIOMICS Mock

NBRC Mock

あくまで細胞混合物であり、実際の 16
メタゲノム用サンプルとは異なる

18 species
・18 species even cell-mix
・18 species even DNA-mix

Evolutional distance

18種の細胞を等量混ぜた
Mock communityを作成

Mori H. et al.
DNA Res. 2023
17

Comparison of 10 different DNA extraction methods using 18 species cell-mix
DNA quantity

Mori H. et al.
DNA Res. 2023 18

環境サンプルからのDNA抽出の難しさ
多FFPE

様々な夾雑物の存在
阻害物質の• 酵素反応阻害物質
存在量• フミン酸• DNase, RNase, proteinase
血液• DNAの架橋促進物質

植物組織 糞便

土壌

バイオフィルム
微生物コロニー

DNA抽出の難しさ

難ターゲットの DNAが極少量の場合• Host DNA/RNA• 大量のRibosomal RNA• キットや水、試薬中のコンタミDNA

de Goffau MC. et al. Nature Microbiol. 201819

自分で条件検討をするのは大変なので、先行研究を参考にすべきメタゲノム解析の代表例

20

公共のマイクロバイオームサンプルの内訳(2024年2月時点)
環境区分 プロジェクト数 サンプル数 平均サンプル数
自然環境

69,6282,185,756

31.3

土壌

19,694

772,56839.2

海水7,753

341,94944.1

宿主共生39,368

3,266,106

82.9

ヒト

8,280

1,489,961

179.9

マウス

4,289

275,727

64.2

ショットガンメタゲノムに絞ると上記の約 1/1221

Human microbiome• 消化管・皮膚・鼻腔・性器等に共生微生物が存在• 数百–数千種• 総重量約0.5 kg• 細胞数: ヒトの細胞数の1.5倍以上• 遺伝子の種類数: ヒトの遺伝子の数百倍以上• ヒトの健康に大きく影響 (特に腸内細菌)• 様々な物質の代謝（ビタミン・脂肪酸・二次胆汁酸・アンモニア等）• 薬の代謝• 免疫の発達• 脳腸相関• 100以上の様々な病気と関連（ガン・自己免疫性疾患等）

22

ヒトマイクロバイオームについて、特に詳細にメタデータをキュレーション(2024年2月時点)
全世界
ヒトの体の部位
プロジェクト数 サンプル数
gut (feces)
4,633
847,414oral cavity
1,195
153,980
respiratory system
755
72,700skin
446
92,788
reproductive system
443
95,417others808227,662
othersにはメタデータが無く分類できないものも含む

23

ヒトマイクロバイオームについて、特に詳細にメタデータをキュレーション(2024年2月時点)
日本人のみ
ヒトの体の部位
プロジェクト数 サンプル数
gut (feces)
144
15,294
oral cavity
264,187
respiratory system
5168
skin
101,761
reproductive system2145
others (尿路、血液、眼、bile)9519

197 projects, 22,074 samples (shotgun 2,460 samples)
データサイズ: 約6 TB (shotgun 5.6TB)
世界のヒトマイクロバイオームサンプルの約1.4%
24

Summary of published human genome-microbiome association studies (2016~2022)
Paper

Population

Number of Analysis
samplesmethodGoodrich, J. K. et al. Cell Host Microbe 2016UK1126 pairs

16S rRNAWang, J. et al. Nat. Genet. 2016

German1812

16S rRNA

Turpin, W. et al. Nat. Genet. 2016

Canadian

1561

16S rRNA

Bonder, M. J. et al. Nat. Genet. 2016

Dutch

1514

ShotgunRothschild, D. et al. Nature 2018

Israeli

1046

16S rRNA

Hughes, D. A. et al. Nat. Microbiol. 2020

Belgian, German3890

16S rRNAXu, F. et al. Microbiome 2020

Chinese1475

16S rRNA

Liu, X. et al. Cell Discov. 2020

Chinese1295

ShotgunIshida, S. et al. Commun. Biol. 2020

Japan1068

16S rRNA

Rühlemann, M. C. et al. Nat. Genet. 2021

German8956

16S rRNA

Kurilshikov, A. et al. Nat. Genet. 2021

Many populations

18340

16S rRNA

Qin, Y. et al. Nat. Genet. 2022

Finnish5959

ShotgunLopera-Maya, E. A. et al. Nat. Genet. 2022

Dutch7738

ShotgunBoulund, U. et al. Cell Host Microbe 2022

Many populations

4117

16S rRNA

Sanna S. et al. Nat. Genet. 2022 modified
25

Nature, 2015

Nature, 2015

Candidate Phyla Radiation (CPR)やAsgard clade等、培養を経ずにメタゲノム配列データから機能や進化的な類縁関係が推定された系統が多数存在
26

メタゲノムの情報解析法

27

Metagenomic sequencing analysis(メタゲノム解析 , ショットガンメタゲノム解析 )(メタトランスクリプトーム解析 )Metagenomic reads
Assemble

MEGAHIT,SPAdes, etc.

Contig sets

DNA extraction / RNA extraction

Gene finding

Reverse transcription

Prodigal,
MetaGeneMark, etc.

Gene sets

DNA Sequencing

TogoTV (© 2016 DBCLS TogoTV)

KEGG,
RefSeq等
Sample1
Metadata
Sample2
Metadata

Comparative
metagenomics

Who’s there?

Sequence similarity
searchBLASTP,DIAMOND,
MMseqs2, etc.

Gene Function abundance
Pathway abundance
Taxonomic abundance
What are they doing?
28

Taxonomic assignment strategy?
Coverage ofref.
sequencesSingle
copy ingenomes?

Can analyzeeukaryotes
and virus?

Robustagainst
HGT?

Example oftools

16S rRNA
genes

◯××

◯

VITCOMIC2,MAPseq

Single copy
genes

△

◯×

◯mOTUs3

Unique marker
genes

△

◯×

◯?

MetaPhlAn4

Read mapping△×◯×

BWA-MEM,
Centrifuge

k-mer

△×

◯

×

Kraken2,sourmash29• メタゲノムアセンブル
Read coverageがcontig, scaffold間で異なっていても良い
IDBA-UD, MEGAHIT, MetaVelvet, SPAdes, etc.
• メタゲノム遺伝子予測
コドン使用頻度がcontig, scaffold間で異なっていても良い
Prodigal, MetaGeneMark, MetaGeneAnnotator, etc.
• メタゲノム遺伝子機能推定
Reference配列から遠い場合にも配列類似性を検出する必要がある
DIAMOND, MMseqs2, etc.
30

細菌の場合、基本的に変異は個体間で独立に蓄積していき、個体間で均質化されない少数のクローン個体から開始した実験室環境ならまだしも、群集が形成されてから長い年月が経った自然環境では、種内の多型が大量に存在するはず。

アセンブルの結果できた配列は、あくまで群集の平均値であることに注意すべき。

31

ゲノムアセンブルの二大戦略• Overlap-Layout-Consensus– k-merの共有やローカルアラインメント等でリード間のoverlapを見つけて、短いContigを作成し、さらにContig間をoverlapをもとに結合（layout）。リードのoverlapを領域ごとに集めてマルチプルアラインメント等をしてconsensusをとることでアセンブルする– 例: Celera Assembler, Newbler, Mira, Canu

• de Bruijn Graph– リードをoverlapありのk-merに分割して、多数のリード間のk-merの共有をde Bruijn graphというグラフ構造で表現して、グラフ上で最短経路を見つける問題を解く
32

メタゲノムアセンブルツールの例• IDBA-UD (Peng et al. 2012)– 短いk-merでアセンブルしてContig作成（Contig間のcoverageの差はある程度許容する）。そのContig群を用いて、もう少し長めのk-merでアセンブルしてContig作成。これを繰り返す。最後に、Contig間をまたがるpairリード（paired-endやmate pair)の情報をもとに、scaffoldingする。
– 短いk-merでシーケンスエラー、長いk-merでリピートの問題に対処• MEGAHIT (Li et al. 2015)– Contig作成の方法はIDBA-UDと類似しているが、de Bruijn graphの表現方法が簡素化されているため(https://www.alexbowe.com/succinct-debruijn-graphs/) 、高速で省メモリ。また、coverageが小さいk-merの扱いについて色々と工夫している。scaffoldingはしない。

• SPAdes (Nurk et al. 2017) メタゲノムオプション使用– Contig作成の方法はIDBA-UDと類似しているが、リードデータ中のstrainレベルの配列多様性をContig/Scaffoldにおいてもできるだけ保つために、サイトに多型があるとContigを分岐する傾向が強い。
33

Representative Next Generation Sequencer (NGS) in June 2024

Sequencer Name

Specific
property

Read length Read number / run(base)

ABI 3730xl (not NGS)

Sanger500–1000

illumina iSeq

Bridge PCR 150

4,000,000

MiSeq

Bridge PCR 300

25,000,000

NextSeq 550/2000

Bridge PCR 150

400,000,000

NovaSeq 6000

Bridge PCR 150 or 250~10,000,000,000

PacBio Sequel IIe /RevioSingle
molecule

Average20,000~8,000,000 (Sequel IIe)
~25,000,000 (Revio)

Nanopore
MinION(1), GridION(5), PromethION(48)Singlemolecule

Average
10,00030,000~400,000 (1 flow cell in12 hours)~2,000,000 (1PromethION flow cell)

384

34

2020

Short readsでの補正は必須

35

PacBio HiFi sequencing

https://www.pacb.com/technology/hifi-sequencing/

Short readsでの補正は無くてもOK

36

Metagenome Assembled Genome
(MAG)

37

遺伝子組成解析とMAG解析
Assembly approach

Assembly + Binning approach

Metagenomic reads

Metagenomic reads

Assemble

Assemble

Contig sets

Contig sets

Gene finding

Binning

Gene sets

KEGG,RefSeq等

Comparative
metagenomics

Gene finding

Sequence
similarity search

Gene Function abundance
Taxonomic abundance

Gene sets

KEGG,
RefSeq等
Comparative
metagenomics

Sequence
similarity search

Gene Function abundance
Taxonomic abundance
38バクテリアゲノムのGC含量の多様性

NCBI Datasetsより原核生物18600ゲノムの統計情報をダウンロードして作成
39

k-mer組成やcoverageを用いてメタゲノムContigを分ける(binning)ツールの例
Genome binner using differential
Near complete (>95%) assignment of datasets at some
CONCOCT coverage, tetranucleotide
cost for average genome purity and completeness.
frequencies, paired-end linkage
Genome binner using multi-sample Largest average purity and completeness across entire
abundance range. Recovery of 2nd most genomes with
MaxBin 2.0 coverage, tentranucleotide
frequencies
high purity and completeness.
Genome binner using multi-sample Assignment of a large portion (>88%) of datasets atsome costs for average genome purity and
MetaBAT coverage, tetranucleotide
frequencies, paired-end linkage
completeness.
Recovery of the most genomes with high purity andcompleteness; near complete assignment of datasets
Genome binner using
MetaWatt-3.5
tetranucleotide frequencies
at some cost for average genome purity andcompleteness.
Genome binner using short k-mer
frequencies, multi-sample
Near complete assignment of datasets at some cost
MyCC
for average genome purity and completeness.
coverage, and 40 universal
phylogenetic marker genes

Sczyrba A. et al. Nature Methods. 2017

メタゲノムアセンブル -> Binning -> ゲノムBinごとに系統・機能アノテーション
メタゲノムデータの全体像を議論するのではなく、優占系統のドラフトゲノム配列を抽出して各ゲノムが持つ機能について議論する40

大規模MAG研究の例

2022

41

培養を経ずにメタゲノム配列データから機能や進化的な類縁関係が推定された系統が多数存在
In February 2024

Taxonomicrank
PhylumClass
Order
FamilyGenusSpecies

Cultured and validly Genome-based putative taxa
described taxa
including uncultured taxa
49181
157
548
294
1,772
717
4,772
4,079
20,73924,36385,205

List of prokaryotic names with standing in nomenclature(https://lpsn.dsmz.de/text/numbers)
Genome Taxonomy Database (https://gtdb.ecogenomic.org/stats)42

https://gtdb.ecogenomic.org/

・ Concatenated protein phylogenies
・ 毎年4月更新
・ NCBI Assembly DBからゲノム配列は取得
・ Isolate+MAG

43

MAG construction test using a metagenomic
sequence data from an 18 species DNA even-mix sample
NovaSeq 6000 & MetaBAT2 & Gene content analysis

Evolutional distance3–5 / 18 species’ MAGs are very high quality

Mori H. et al. DNA Res. 2023

Short readでは群集を構成する全ての微生物のMAGが得られるわけでは無い
44

Short or Long reads?
Cost

必要なDNA量InDelerror

Construct
good ref.

geneneighbor

Short reads

lowlowlow◯△Long reads

highhighhigh◎◯

高分子DNAが数μgオーダーで必要になる点は課題だが、Long readを用いてメタゲノムからの完全ゲノム構築が可能になりつつある

Nanopore
GridION

Nanopore
PromethION

PacBio Sequel IIe

PacBio Revio
45

MAG解析ワークフローの例
Short/Longread sequence
Assemble(MEGAHIT/hifiasm-meta)

sourmash toGTDB

contigs

Species/Genuscomposition

Binning(MetaBAT2 + CheckM2)
GTDB-Tk2
MAGs
DFAST
Proteinsequences
DIAMOND/KofamScan

KEGG
Protein /
KOfam

KEGG
Orthology
composition

基本的にShort readとlong readではアセンブルツールが異なる
Long read専用の高精度なMAG構築binningツールは現状存在しない 46

Short read MAG構築の結果の例 (CheckM2の結果)

・一般的にはCompleteness 90%以上、Contamination 10%以下が高精度なMAG・各MAGのContig数は数十Contigs
47

パスウェイデータベース
メタゲノムでは、KEGG Orthologyを遺伝子機能の単位として使うことが多い
https://www.genome.jp/kegg/ko.html

ただし、KEGGのアミノ酸配列データとKO IDとの対応関係を
48
手軽に取得するためのKEGG FTPサイトへのアクセスは有料

https://www.genome.jp/tools/kofamkoala/
各機能タンパク質群 (KOfam)について、マルチプルアライメントから構築した配列保存プロファイルに対して隠れマルコフモデルを用いてプロファイル検索する
KEGG FTPサイトを使うKOのアミノ酸配列そのものを使うと有料だが、KOの配列保存プロファイ
ルは無料でダウンロード可能。
配列類似性検索ツールや検索速度はアミノ酸配列そのものと配列保存プロファイルでは異なる。

49

ある程度遠縁なアミノ酸配列も探せる配列類似性検索ツール

Nature Methods. 2021

Nature Biotech.502017

BLAST
1. 完全マッチのseed探索 (BLASTPならsize 6)
2. gap無しでseed延伸
3. gapありのSmith-Watermanアルゴリズムでアラインメント

51

DIAMOND ver. 2.x (BLASTPの1000倍以上高速)
1. クエリとリファレンスを11圧縮アミノ酸に変換
2. クエリとリファレンス配列両方に対して、シードと場所のペアのテーブルを作成。
（実際はリファレンス側は事前に作成してファイルに保存済みなので、クエリのみ）
シードは、spaced seed
fast mode = weight 10 のspaced seedで2 shapes
sensitive mode = weight 8で16 shapes
very-sensitive mode = weight 7で14 shapes
ultra-sensitive mode = weight 7で64 shapes
3. クエリ-リファレンス間でseedがマッチしたら、seedを中心に48 AAのwindowでペアのhamming distanceを計算。一定以下なら4に進む
4. gap無しでseedを前後に伸ばしていき、scoreが一定以上になったら5に進む
5. クエリごとに全リファレンス配列中で4を突破したgap無しアライメント群をscoreでソート
6. score高い順に400ペアを一単位 (chunk)としてgapありSmith-Watermanアルゴリズムでアラインメント。400ペア全てで一定のスコアを突破するアラインメントが無かったら、そのqueryについては以降のchunkは全部捨てる。
52

遺伝子組成解析とMAG解析
Assembly approach

Assembly + Binning approach

Metagenomic reads

Metagenomic reads

Assemble

Assemble

Contig sets

Contig setsGene finding

Binning

Gene sets

KEGG,
RefSeq等

Comparative
metagenomics

Gene finding

Sequence
similarity search

Gene Function abundance
Taxonomic abundance

Gene sets

KEGG,
RefSeq等
Comparative
metagenomics

Sequence
similarity search

Gene Function abundance
Taxonomic abundance
53