「花粉関連食物アレルギー症候群」における原因抗原のエピトープ構造解析と低アレルゲン化食品の開発基盤

研究課題名「花粉関連食物アレルギー症候群」における原因抗原のエピトープ構造解析と低アレルゲン化食品の開発基盤

フリガナ

マルヤマ

代表者名

丸山ノブユキ伸之

所属機関（機関名）京都大学大学院農学研究科（役職名）教授
氏
共同研究者

名（フリガナ）

福冨 友馬(フクトミ ユウマ)

所属機関・役職名
国立病院機構相模原病院室長

役割分担
患者血清の収集と臨床評価

1)日本農芸化学会 2021 年度大会 2021 年 3 月 21 日
花粉関連食物アレルギー症候群における gibberellin-regulated protein の交差要因
本 助 成金 によ る 発 の解析 蕭喬丹, Cabanos Cerrone, 福冨友馬, 丸山伸之
表論文、学会発表 2)日本農芸化学会近畿支部第 519 回講演会 2022 年 2 月 5 日
スギ花粉との交差反応に関与するモモ gibberellin-regulated protein のエピトープ
解析 蕭喬丹, 石井翠, Cabanos Cerrone, 福冨友馬, 丸山伸之

研究結果要約
大規模に収集した果物類アレルギー患者の血清から gibberellin-regulated protein(GRP)陽性を示す患者を選抜し、本研究に使用した。スギ及びヒノキ花粉中に GRP に対するウサギ抗血清と反応するタンパク質を検出し、スギおよびヒノキ花粉中に GRP が存在していることを示した。Cry j 7(スギ GRP)と Pru p 7(モモ GRP)の交差反応性を検討するために、組換え型 Pru p 7 および組換え型 Cry j 7 を調製し、競合的に ELISA を行った。Cry j 7 で患者血清に対し前処理を行うことにより、Pru p 7 に対する患者血清中の IgE 抗体結合性が低下したことから、Cry j 7 と Pru p 7 は交差反応する可能性が示唆された。さらに、Cry j 7 と Pru p 7 の交差反応に影響を及ぼすアミノ酸残基を同定するため、Cry j 7 とPru p 7 との間で共通するアミノ酸残基をアラニン残基に置換した変異型 Pru p 7 を作製した。それらの患者血清中の IgE 抗体との結合性を野生型と比較したところ、IgE 結合性が低下した複数の変異体が見出された。また、還元条件下での熱変性処理により、Pru p 7 の血清中の IgE 抗体との結合性が低下した。以上のことから、ヒノキ科花粉と果物類との交差に関わる GRP のアミノ酸残基を特定するとともに、GRP の高次構造がエピトープ形成に影響することを示した。

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「花粉関連食物アレルギー症候群」における原因抗原のエピトープ構造解析と低アレルゲン化食品の開発基盤

本研究では、大規模に収集した果物類アレルギ研究目的「花粉食物アレルギー症候群」は、花粉と食物ー患者血清を対象に GRP に感作されている陽性のアレルゲン間での交差反応によって起こるア検体を選抜する。また、スギ及びヒノキ花粉に含レルギーである。花粉が一次感作源とされており、まれる GRP に対する抗ウサギ血清を作製し、そ生の野菜や果物を摂取した際に症状が出る頻度られの花粉中での存在について検討し、比較する。

が高い。口腔アレルギーを示すことが多いが、全さらに、スギ・ヒノキ花粉と果物類アレルギーで身症状を示すこともある。「花粉食物アレルギーの GRP の交差反応を検証するために、それぞれ症候群」の原因となる代表的なアレルゲンは感染の組換えタンパク質を作製するとともに、選抜す特異的タンパク質-10(pathogenesis-related pro-る GRP 陽性検体を用いて、スギ及びヒノキ花粉

tein: PR-10)やプロフィリンである。PR-10 やプと果物類の GRP の交差反応を解析する。交差反ロフィリンは一次構造の保存性が高いことから応に関与する可能性があるアミノ酸残基への変植物間で立体構造が類似し、交差反応しやすいと異導入や、構造変化による血清との反応性への影されている 1)。最近、GRP が「花粉食物アレルギ響について解析する。

ー症候群」の原因アレルゲンである可能性が指摘

上記により、「花粉食物アレルギー症候群」にされている 2)。GRP は snakin/GASA プロテイン

おける交差反応の原因となる GRP の抗原性の要ファミリーに属する抗菌ペプチドで、植物におい因やエピトープを解明することを目的とする。て病原菌に対する防御などに寄与するとされる3)。GRP は分子量 7-8kDa であり、12 個のシステ研究計画及び研究手法

イン残基から成る 6 個のジスルフィド結合をも項目 1. 果物類アレルギー患者の原因抗原の解析つ 2)。これらのジスルフィド結合によって GRP

100 名以上の果物類アレルギーの確定診断がは熱や消化酵素に対する耐性を持つ 2)。モモ(Pru

なされた患者の血清を保存している。これらの患p 7)、ウメ(Pru m 7)、オレンジ(Cit s 7)、ザクロ

者血清について、GRP 感作を示す果物類アレル(Pun g 7)の GRP が果物類のアレルゲンと報告さギー患者を選抜する。測定には、酵素標識したヒれている。これらの GRP 間におけるアミノ酸配ト IgE 抗体に対するモノクローナル抗体と蛍光列同一性は非常に高く、Pru p 7 は Pru m 7 と同基質を用いた酵素結合免疫吸着法を用いる。

一のアミノ酸配列をもつ 4)。さらに、スギ花粉においても Cry j 7 が報告され 5)、アミノ酸配列の項目 2. スギ及びヒノキ花粉 GRP の解析

類似性から、ヒノキ科花粉と果物の GRP 間で交Cry j 7 をウサギに免疫して、Cry j 7 に対する差反応し「花粉食物アレルギー症候群」を引き起抗血清を調製している。スギ及びヒノキ花粉よりこす可能性が考えられている 6)。

タンパク質を抽出し、等量の抽出液に対して57

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GRP に対するウサギ抗血清を用いてウェスタンアミノ酸残基を指標にして、IgE 抗体との結合おブロットを行い、スギ及びヒノキ花粉中の GRPよび交差反応に関わる GRP のアミノ酸残基を同量を検証する。

定する。類似タンパク質の立体構造データに基づ
いて GRP のホモロジーモデルを作製し、交差反

また、GRP に対するウサギ抗血清との反応性を指標に花粉からの粗抽出液についてカラムク応に寄与するエピトープの構造を特定する。

ロマトグラフィーを行い、GRP を精製する。精製物に対して質量分析を行い、花粉中の GRP で項目 5. 交差エピトープ構造を破壊するための加あることを確認する。

工・調理条件に関する基盤解析
果物類は、未加熱で食するとともに、加熱処理

項目 3. 果物類 GRP 陽性患者における果物及びや酸処理などを行うことも多い。果物類 GRP の花粉 GRP の交差反応の解析

加熱処理において、果物類 GRP が構造変化を起Cry j 7 と Pru p 7 の交差反応性を検証するた

こす条件を明確にする。さらに、その条件下で構めに精製した Cry j 7 と Pru p 7 を用いて競合造変化と果物類アレルギーの患者血清中の IgEELISA 試験を行う。そのため、Cry j 7 と Pru p抗体との結合能について解析することにより、抗7 をメタノール資化性酵母により発現させ、クロ原性と加工・調理との関係について基礎的知見をマトグラフィーにより精製する。Pru p 7 陽性患得る。

者血清に対し Cry j 7 を用いて前処理した血清と未処理の血清について ELISA 法により特異的結果と考察

IgE 抗体価測定を行い、Pru p 7 に対する IgE 結

項目 1. 果物類アレルギー患者の原因抗原の解析
100 名以上の果物アレルギー患者血清を用い合性の違いを比較する。て GRP に対する特異的 IgE 抗体を測定し、20項目 4.「花粉食物アレルギー症候群」における30 名の患者に特異的 IgE 抗体を検出した。これ

GRP の交差エピトープ構造解析

らの血清を本研究に使用した。

交差反応には、果物類 GRP とスギ・ヒノキ花
粉 GRP 間で共通性の高いエピトープが存在する

項目 2. スギ及びヒノキ花粉 GRP の解析必要がある。両 GRP についてアライメント上でヒノキ花粉およびスギ花粉より陽イオン交換一致するアミノ酸残基を置換した様々な組換えカラムを用いて GRP を部分精製し、ウサギ抗タンパク質(変異体)を調製し、それらに対してGRP 血清を用いたウェスタンブロッティングにGRP 陽性患者血清中の特異的 IgE 抗体量を測定

おいてスギ及びヒノキ花粉の分画物からウサギする。結合量が減少する変異体において置換した抗血清と反応するバンドを検出した。さらに、陽58

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イオン交換カラムからの溶出分画をゲル濾過カ性が低下していた。このことは、Cry j 7 が患者

ラムによって精製した。溶出画分に対してウェス血清中の GRP 特異的 IgE 抗体と結合することにタンブロッティングを行い、GRP と予想されるより、Pru p 7 の血清中の IgE 抗体への結合が阻

SDS-PAGE でのバンドについて質量分析を行っ害されたことを示している。以上のことから、たところ、ヒノキ科花粉の GRP である Cup s 7

Cry j 7 と Pru p 7 は血清学的に交差反応する可および Jun a 7 に含まれる配列を同定した。また、能性が考えられた。

Cry j 7 にも類似した配列が含まれていた。このことは、ヒノキ花粉にも他のヒノキ科 GRP と類

項目 4.「花粉食物アレルギー症候群」における似した一次構造をもつ GRP が含まれていること

GRP の交差エピトープ構造解析
Cry j 7 と Pru p 7 の交差反応に影響を及ぼすを示している。

アミノ酸残基を調べるために、Cry j 7 と Pru p 7
項目 3. 果物類 GRP 陽性患者における果物類及の共通アミノ酸残基を一残基ずつアラニン残基

びスギ花粉 GRP の交差反応の解析に置換した変異型 Pru p 7 を約 20 種類設計した。

組換え型 Cry j 7 及び Pru p 7 をメタノール資

それらについて野生型と同様の方法により組換化性酵母により発現させた。発現タンパク質はイえタンパク質を発現及び精製した。精製した全てオン交換カラム及びゲル濾過カラムを用いて精の変異型は SDS-PAGE において野生型とほぼ同製した。精製タンパク質について質量分析によりじ位置にバンドを示し、ウェスタンブロッティンCry j 7 と Pru p 7 であることを確認した。精製

グにおいても野生型と同様に発色した。会合状態した Cry j 7 及び Pru p 7 についてゲル濾過クロの確認のために変異型 Pru p 7 についてゲル濾過マトグラフィーでの溶出時間を比較したところ、クロマトグラフィーを行い、野生型との比較を行共に分子量より予想される時間に溶出され、単量った。3 種類の変異型は野生型とほぼ同じ時間に体として溶液中に存在していることが示唆され溶出されたが、その他の多くの変異型は野生型よた。Cry j 7 と Pru p 7 の交差反応性を検証するりも少し早く溶出された。変異型 Pru p 7 の二次ために精製した競合 ELISA 試験を行った。Pru構造を比較するために円偏向 2 色性測定を行っ

p 7 陽性を示す果物アレルギー患者血清に Cry jた。8 種類の変異型は野生型とほぼ同じスペクト7 を加えて 4℃で一晩インキュベートした。処理ルを示したが、それ以外の変異型は野生型とは異した血清および未処理血清(コントロール)を用いなるスペクトルを示した。変異型 Pru p 7 について ELISA 試験を行い、Pru p 7 に対する血清中て果物アレルギー患者血清を用いた ELISA 測定の IgE 抗体の結合性の比較を行った。その結果、を行い、野生型と比較した。いくつかの変異型は前処理した血清では未処理血清よりも IgE 結合野生型と比べて IgE 抗体結合性が著しく低下し59

「花粉関連食物アレルギー症候群」における原因抗原のエピトープ構造解析と低アレルゲン化食品の開発基盤ていた。IgE 抗体結合性が低下した変異型は患者た。還元条件下で熱処理した Pru p 7 では未処理によって異なっており、IgE 抗体結合に寄与する

Pru p 7 と比較して血清中の IgE 抗体への結合性アミノ酸残基が患者間で異なっていることが示が著しく低下した。このことから、Pru p 7 の IgE唆された。野生型と比較した変異型の平均 IgE 抗抗体結合性には高次構造形成が大きく影響して体結合率を算出した。野生型と比較して IgE 抗体おり、加熱などの加工などの条件によっては結合率が約 60-80%を示す変異型、IgE 抗体結合GRP の抗原性を低下できる可能性が示唆された。

率が大きく低下した変異型が複数見出された。これらの変異型のアミノ酸残基は Cry j 7 と Pru p

上記の GRP のエピトープの解析結果について、7 について交差反応に寄与すると考えられる。ま必要に応じて変異体を追加して専門誌への論文た、これらのアミノ酸残基は Pru m 7、Pun g 7、投稿を検討している。

Cit s 7 にも保存されていたことから、GRP の抗原性に重要な残基であることが示唆された。特定今後の研究活動についてされたアミノ酸残基は Cry j 7 と Pru p 7 だけで本研究により、スギ・ヒノキ花粉と果物 GRPなく、ヒノキ科花粉 GRP と果物 GRP の交差反間の交差反応に関わるエピトープに寄与するア応に寄与するエピトープである可能性が示唆さミノ酸残基を概ね同定できたため、所期の成果はれた。

達成したと考えている。
今後の課題の一つとして、GRP の関与する「花項目 5. 交差エピトープ構造を破壊するための加粉関連食物アレルギー症候群」について明らかに工・調理条件に関する解析するために、一次感作に関するスギ・ヒノキ花粉

加工や調理によりタンパク質は変性し、構造がに対する抗原解析が必要があると考えている。ま変化すると考えられる。変性によりアレルゲンのた、加工・調理の条件と GRP の抗原性について抗原性が変化する可能性があるため、Pru p 7 がも重要な課題であり、さらに解析が必要であると変性することにより IgE 結合性にどのような影考えている。加工による GRP の変性・巻き戻り響を及ぼすのかを検討した。Pru p 7 には多くのの分子機構やジスルフィド結合の寄与などを解ジスルフィド結合が存在することから、ジスルフ析することにより、GRP の抗原性を失活させる

ィド結合を還元するメルカプトエタノール存在

調理や加工条件を精密に制御することが可能に下において 90℃で 30 分間熱処理した。その後、なると考えている。

熱処理した Pru p 7 と未処理 Pru p 7(コントロー

以上のように、本課題は引き続き必要性の高いル)を用いて、Pru p 7 陽性を示す果物アレルギー重要な研究課題であると考えている。

患者血清中の IgE 抗体に対する結合性を比較し60

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