（論文

要様 式 ３ )旨Type Ⅱ/Ⅲ cell composition and NCAM expression in taste buds
（味蕾におけるⅡ型・Ⅲ型の細胞構成および NCAM の発現）

小栁

江梨子

【序論および目的】
味覚は食行動を調節する情報として重要で､一般に､甘味・うま味・適度な塩味はエネルギーや恒常性維持に必要な栄養素を､苦味・酸味は有害物を意味している。味覚の末梢感覚器である
味蕾は､50～100 個の味細胞で構成され､舌の茸状乳頭(fungiform papillae：FF)・葉状乳頭(foliatepapillae：FL)・有郭乳頭(circumvallate papillae：CV)､および、軟口蓋(soft palate：SP)に分布している｡味細胞は上皮幹細胞から常に新しく生み出され､およそ 10～14 日の周期でターンオーバーしているが､味覚を正常に保つために味蕾の恒常性が維持されなければならない。
味細胞は、電子顕微鏡で観察される形態的特徴に基づいてⅠ型・Ⅱ型・Ⅲ型に分類され､味蕾内に最も多いのはⅠ型で、次いでⅡ型が多く､Ⅲ型は最も少ないとされてきた。その後､甘味／うま味／苦味を受容する細胞がⅡ型､酸味を受容する細胞がⅢ型に含まれていること、また、Ⅱ型とⅢ型の一部は忌避性の高濃度塩味の検出にも関与することが明らかにされた。一方､Ⅰ型の大部分はグリア様細胞であるが､近年、その一部は嗜好性の低濃度塩味を受容することが報告された。また､Ⅲ型細胞はⅡ型細胞からの入力を受けて間接的に甘味／うま味／苦味にも応答すると考えられていたが､Ⅲ型細胞の約半数は、これらの味質に直接応答することが示された。このように、味細胞の多様な機能の解明が進んでおり､その解析に用いる分子マーカーの重要性が高まっている。また､各分子マーカーの発現の重なり／分離のパターンの詳細な解析は､味細胞の分化や細胞系譜の解明に繋がると期待できる。
現在、Ⅲ型細胞マーカーとして様々な分子が用いられている。その中で神経細胞接着因子（neural cell adhesion molecule：NCAM）は、Ⅲ型細胞で特異的に発現することが報告された最初の分子で、現在もⅢ型細胞マーカーとして多用されている。しかし､NCAM の発現パターンの解析は、その殆どが CV の味蕾で行われており､他の領域では十分に調べられていない。さらに､我々の先行研究の結果から、Ⅱ型細胞でもその分化の初期段階に NCAM が一過性に発現することが示唆されていた。そこで本研究では､味蕾のホールマウント免疫染色を行って､FF・CV・SPの味蕾における NCAM の発現を詳細に解析した。
【材料および方法】
C57BL/6J マウス（９～20 週齢）の舌と軟口蓋を摘出後､味蕾をホールマウントで解析するために酵素処理を行って上皮を剥離し､FF・CV・SP 領域を切り出した。これを用いて、まず､Ⅱ型細胞において甘味・うま味・苦味の細胞内情報伝達を担う３型イノシトール三リン酸受容体（inositol triphosphate receptor type 3：IP3R3）と、Ⅲ型細胞において酸の酸味の受容に必須の４型炭酸脱水酵素（carbonic anhydrase type 4：CA4）に対する二重免疫染色を行って、これらの分子の細胞型マーカーとしての信頼性を検証するとともに､各味蕾におけるⅡ型･Ⅲ型の細胞構成を解析した。次に､これらのマーカーに NCAM を加えて三重染色を行い､NCAM を発現する細胞型を解析した。染色後､共焦点レーザー顕微鏡（Leica TCS SP8）で､上皮に含まれる味蕾を１つずつ基底部から味孔方向に Z-stack 撮影した。三次元画像の構築には Imaris 3D Image を用いた。細胞の計数には Fiji/ImageJ の cell counter を用い､染色された細胞の形態と核染を確認しながら行った。統計解析には IBM SPSS Statistics 26 およびフリーソフトウェアＲを用いた。有意差の有無の検定について、パラメトリックデータでは one-way ANOVA および post hoc Bonferronitest を、ノンパラメトリックデータでは Mann-Whitney U test をそれぞれ用いた。統計的に有意なレベルは p < 0.05 とした。

【結 果】
IP3R3 と CA4 の発現が､解析した全ての味蕾（SP：233 個､FF：123 個､CV：281 個）で重ならず完全に分離することから､IP3R3 と CA4 はそれぞれⅡ型およびⅢ型細胞の特異的マーカーであると確認された。味蕾１個あたりの IP3R3(+)細胞数の平均（±標準偏差）は多い順に SP (22.5± 7.3)＞FF (12.5 ± 3.6)＞CV (10.0 ± 3.6)､CA4(+)細胞数は CV (5.9 ± 2.3)＞SP (3.6 ± 1.8)＞FF(1.7 ± 1.1)で､それぞれ FF・CV・SP の間で有意に異なっていた。個々の味蕾に含まれるⅡ型とⅢ型の細胞数の間には、CV で中程度の相関(Pearson の相関係数 r = 0.442)があったが､SP では相関は低く(0.279)､FF では有意な相関は見られなかった(−0.011)。
次に､三重免疫染色によって IP3R3・CA4 およびⅢ型細胞マーカーとされている NCAM の発現を比較解析した。CA4(+)細胞は全て NCAM(+)であった。一方、NCAM(+)細胞の大部分はCA4(+)で、CA4(−)の割合はそれぞれ CV 11.4% (90/791)､SP 22.2% (76/333)､FF 8.5% (9/106)であった。NCAM(+)CA4(−)細胞は、それぞれ CV 53.3% (65/122)､SP 60.0% (42/70)､FF 13.8%(8/58)の味蕾に存在し、味蕾１個当たりには CV 1〜3 個､SP 1〜4 個､FF 1〜2 個含まれていた。
また、それぞれの部位で、小さな味蕾から大きな味蕾に、偏りなく検出された。NCAM(+)CA4(−)
細胞は､CV において全て IP3R3(−)であったが､SP と FF では IP3R3(+)の細胞､すなわちⅢ型細胞マーカーとされている NCAM とⅡ型細胞マーカーである IP3R3 を共発現する細胞が検出された。この NCAM(+)IP3R3(+)細胞は､SP と FF の NCAM(+)CA4(−)細胞のそれぞれ 83% (63/76)､67% (6/9)を占めていた。
こ の 様 に NCAM(+)CA4( − ) 細 胞 の 中 に は 、 Ⅲ 型 と Ⅱ 型 の マ ー カ ー を 同 時 に 発 現 す る
NCAM(+)IP3R3(+)細胞が存在した。そのため､NCAM(+)CA4(−)細胞を含む味蕾は、含まない味蕾と比較して､Ⅲ型あるいはⅡ型マーカーをそれぞれ単独で発現する細胞の数が少ないなど､細胞構成が異なる可能性がある。そこで､NCAM(+)CA4(−)細胞を含まない味蕾群（TB#1）と含む 味 蕾 群 （ TB#2 ） に 分 け て ､ 個 々 の 味 蕾 の CA4(+) 細 胞 ､ NCAM(+) 細 胞 ､ IP3R3(+) 細 胞 ､IP3R3(+)NCAM(−)細胞､そして IP3R3・CA4・NCAM で検出された細胞の総数を比較した。その結果､Ⅱ型マーカーを単独で発現する IP3R3(+)NCAM(−)細胞と、Ⅲ型マーカーを単独で発現す る CA4(+) 細 胞 の 数 に は 、 TB#1 お よ び TB#2 の 間 で 差 が 検 出 さ れ な か っ た 。 一 方 ､NCAM(+)CA4(−)細胞を含む残りの細胞群[NCAM(+)細胞､IP3R3(+)細胞､マーカーで検出された 細 胞 の 総 数 ] で は 、 TB#1 よ り も TB#2 で 多 い 傾 向 が み ら れ た 。 こ れ は 、 味 蕾 内 でNCAM(+)CA4(−)細胞の存在は、付加的であり、Ⅱ型・Ⅲ型の細胞構成を変化させないことを示している。
【結論および考察】
個々の味蕾に含まれるⅡ型およびⅢ型細胞の割合は､FF・CV・SP 各部位に特有の値をとると考えられてきた。しかし本研究で､Ⅱ型細胞とⅢ型細胞の数は味蕾ごとに大きくばらついており､特に FF や SP では両者の相関が極めて低いことが明らかになった。Ⅱ型細胞とⅢ型細胞の割合の多様性は､味蕾の幹細胞・前駆細胞の性質を反映していると考えられる。また、味蕾が、味細胞のターンオーバーによって細胞を更新する過程で、それぞれ一定の構造を保っているのではなく､その大きさと細胞構成をダイナミックに変化させている可能性を示しており、味覚機能の恒常性はその総和として維持されていると推測される。
一方､SP と FF における NCAM(+)IP3R3(+)細胞の存在が明らかになり､NCAM はⅢ型細胞のマーカーとして適切でないことが示された。我々の先行研究で得られた｢CV の味蕾Ⅱ型細胞は、Mash1（mammalian achaete-scute homolog 1）と NCAM を一過性に発現した細胞に由来する｣という結果に基づけば､SP と FF に存在する NCAM(+)IP3R3(+)細胞は後にⅡ型へ成熟分化すると推測される。しかし、機能的に成熟した細胞である可能性も否定できず､その性質を明らかにするには更なる研究が必要である。
( Cell and Tissue Research, 2021, ⅠN PRESS )