ファーマラボEXPO アカデミックフォーラム
2019.7.5 15:15~ ACA-3会場

BCR-ABL PHドメインを標的とした
新規慢性骨髄性白血病治療薬の創製

同志社大学

生命医科学部髙橋美帆慢性骨髄性白血病（Chronic Myeloid Leukemia : CML)
9番染色体 22番染色体✂︎bcr

BCR-ABLタンパク質相互転座
bcr
abl

BCR

PP✂︎

abl

BCR

フィラデルフィア
染色体
BCR領域のCoiled-coilドメインを介して多量体を形成↓
ABLチロシンキナーゼドメインのトランス自己リン酸化が生じ恒常的に活性化、白血球が異常増殖する。

既存の CML 治療薬とその問題点
ABL のチロシンキナーゼドメインを標的とした TKIs (tyrosinekinase inhibitors) が CML 治療の第一選択薬である。
TKIs の問題点(i) TKIs 耐性体が存在する。

(ii) CML 幹細胞に対して治療効果を示さない。

p210 BCR-ABL の他の機能領域を標的とした新たな治療薬の開発が望まれている。

p210 BCR-ABL における他のドメインの病理的機能
p210

CCDHPHSH3

SH2

ABLBCRドメイン

TK

CML における機能

CC

BCR-ABL の多量体化を担い、 BCR-ABL のチロシンキナーゼ活性化に必須。

DH

CML 細胞の運動性を決定。 下流因子の活性化によりCML 細胞の自然免疫回避にも働く。

PH

モノホスホイノシタイドを認識しうるとされているが、その機能は不明。

SH3

本来ならば ABL チロシンキナーゼの自己活性抑制領域として機能するが、CC ドメイン支配的なキナーゼの活性化により十分に機能していない。

SH2

ABL と同様に、BCR-ABL においてもチロシンキナーゼの自己活性化領域として機能する。

FAB

BCR-ABL の F-actin への結合を担う。CML 発症に役割をもつとされている。

FAB

p210BCR-ABL PH ドメインのリガンド特性
脂質小胞濃度依存性の検討10010090
80

Relative binding(arbitrary unit)

80

Relative binding(arbitrary unit)

7060
504060PC
40

PtdIns(3,4)P2PtdIns(4,5)P22030

CL20010PC
PI
PtdIns(3)PPtdIns(4)PPtdIns(5)PPtdIns(3,4)P2PtdIns(4,5)P2PtdIns(3,4,5)P3
PG
PAPS
CL

0HRP

ストレプトアビジン
ビオチン化PE

脂質小胞

リガンドリン脂質
PH ドメイン

plate

0102030
Concentration of ligand phospholipid (µM)

Ligandphospholipid

KD value (µM)

PtdIns(3,4)P2

1.46 ± 0.25

PtdIns(4,5)P2

5.33 ± 0.32

CL15.3 ± 3.1アラニン置換体を用いた p210 BCR-ABL PH ドメインのリガンド認識の結合様式の解明
Consensus motif

2641

BCR-ABL 710 L K D S F M V E L V E G A R K L R H727

***
***

10090807060504030
20100

PtdIns(4,5)P2***** ******

Relative binding(arbitrary unit)

PtdIns(3,4)P2
Relative binding(arbitrary unit)

Relative binding(arbitrary unit)(K/R) X R

H K R G E Y I K T - - - W - R P R Y
L K V K S - - S S - - - W R R E R F

AKT13
PLC1delta 291009080706050403020100XnK

1009080706050403020100CL***** ***(Mean ± SD, n=3; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs WT, Tukey ANOVA)p210BCR-ABL は PH ドメイン依存的に障害ミトコンドリアへと移行する
CCCP(+)

CCCP(-)

Magnified area

WT

R726A

76543210###***##Scale bar ; 10 µm###

100***
**

WT
R726A

013CCCP treatment (h)6Cells with ring-like structure(% of total cell numbers)

Number of ring-likestructure per cell

FLAG p210 BCR-ABL COX IV

80******##******

#***
***

60

WT
R726A

402000136
CCCP treatment (h)p210 BCR-ABL は PH ドメイン依存的にマイトファジーを抑制する①CCCP(-)

R726A

WT

p210(-)

(+)

(-)

(+)

(-)

(+)

Lyso
Dye

Mtphagy
Dye

Overlay

Mitophagy-positive cells(% of total cell numbers)

Scale bar ; 5 µm

50454035302520151050

##

##

**

**

p210(-)
WT
R726A

(-)

CCCP

(+)

p210 BCR-ABL は PH ドメイン依存的にマイトファジーを抑制する ②
R726A

WT

CCCP (h)ミトコンドリアタンパク質

COX IVオートファゴソーム形成のマーカータンパク質061224061224(kDa)
17LC3 II 17β-actin

4835245

FLAG-BCR-ABL 180

#**

0.6**

*WT

0.4***

0.200612

CCCP treatment (h)24R726A

ns5
4.5
4
3.5
32.5
2
1.5
10.50nsns

WT
R726A

061224CCCP treatment (h)Relative amount of BCR-ABL(normalized ratio)

1

Relative amount of LC3-II(normalized ratio)

Relative amount of COX IV(normalized ratio)

1.2

0.8

FLAG-BCR-ABL

LC3 II

COX IVns

1.2ns1* **0.8ns*****

0.6

WT

0.4

R726A

0.20061224

CCCP treatment (h)(Mean ± SD, n=3; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs time 0, #p<0.05, ns means not significant, Tukey ANOVA)p210 BCR-ABL は PH ドメイン依存的にマイトファジーを抑制する ③
WTBafilomycin はオートファゴソー
ムとリソソームの融合阻害に働く。

CCCP Bafilomycin COX IV(kDa)
17LC3 II17β-actin++-+

1
*
**

***

0.4
0.2
0WT+-+

35

6R726A

Relative amount of LC3-II(normalized ratio)

Relative amount of COX IV(normalized ratio)#0.6+LC3 II##0.8-48

COX IV
1.2R726A**5*43210WTR726A(Mean ± SD, n=3; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs time 0, #p<0.05, ##p<0.01, Tukey ANOVA)p210 BCR-ABL は PH ドメインを介して CCCP により誘導される ROS 産生を増強する###Relative MFI (arbitrary unit)

##
2.5
***
2p210(-)

***

WT

1.5

R726A

***

10.50(-)(+)

CCCP treatment(Mean ±SD, n=3; ***p<0.001 vs CCCP(-), ##p<0.01, ###p<0.001, Tukey ANOVA)p210 BCR-ABL PHドメインの病理的機能に関するモデル

Shimasaki K, Watanabe-Takahashi M, et.al.,Genes Cells 23(1):22-34, 2018

p210 BCR-ABL PH ドメイン制御分子の取得
X : Cys を除く 19 種アミノ酸の mixturep210 BCR-ABL PH ドメイン制御分子の取得

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

WT

R726A

Z; システインを除く19のアミノ酸
X: システインを除く19のアミノ酸の混合A
B
C
DE
F

A
B
CDEF

p210 BCR-ABL PH ドメイン制御分子の取得
1st library

2nd
3rd
4th
5th
6th
7th

(特願2018-210822)

各候補ペプチドのp210 BCR-ABL PHドメインに対する結合活性(特願2018-210822)

WDD-tetはp210 BCR-ABL PHドメインとCLとの結合に対して競合的に働く

HRP
ストレプトアビジン
ビオチン化PE
脂質小胞

CL

リガンドリン脂質
PH ドメインplate

WDD-R4-tetはミトコンドリア障害に伴うp210 BCR-ABL
PHドメインのミトコンドリアへの移行を阻害する
CCCP
WDD-R4-tet--+++-+WT

R726A

Scale bar ; 10 mm

WDD-R4-tet:
膜透過性を付与するためにC末端にArg4個付加したWDD-tet

まとめ