（ 様 式 ３ ）論文

要旨

Diversification of Escherichia albertii H-antigens andDevelopment of H-Genotyping PCR
新興下痢症病原体 Escherichia albertii における鞭毛 H 抗原遺伝子型の多様性と遺伝子型別法の開発

中江広治【序論及び目的】
Escherichia albertii は、Escherichia 属に属するグラム陰性通性嫌気性桿菌で、Escherichia coli の近縁菌種として 2003 年に新たに命名された新興下痢症病原体の一つである。本菌による複数のアウトブレイクが報告されており、集団感染の探知や疫学情報のサーベイランスのため、型別法の開発は急務である。E. coli では O 抗原と H 抗原による型別法が既に用いられており、我々の研究グループでは、近年 E. albertii の O 抗原コード領域の多様性を明らかにし、その多様性を利用した O 抗原遺伝子型別法 (EAO-genotyping PCR) を開発したが、H 抗原 (鞭毛遺伝子 fliC が規定する) については解析されておらず、型別法も未だ構築されていない。今回、これまでにゲノム配列が決定されている E. albertii
243 株の fliC 遺伝子を既知の E. coli の 53 種の fliC 遺伝子と比較し、fliC 遺伝子の塩基配列の多様性を解明するとともに、243 株の系統関係と fliC 遺伝子型との相関を明らかにした。さらに、multiplex PCRを利用した E. albertii の迅速 H 抗原遺伝子型別法 (EAH-genotyping PCR) の開発を試みた。
【材料及び方法】① fliC 遺伝子の系統解析
材料：公共データベースに登録されている 243 株の E. albertii のゲノム配列と既知の E. coli H 抗原
コード遺伝子 (H1-H56)
方法：E. albertii CB9786 株の fliA と fliD の配列を blastn で検索（E-value の閾値を 0.01）し、243 株の E. albertii の fliC 遺伝子を含む領域を抽出した。同定された各株の fliC 遺伝子の多様性を検討し、さらに同定された fliC 遺伝子配列と E. coli H 抗原遺伝子配列について MEGA6 を用いて系統解析し、Neighbor-joining tree を作成した。
②multiplex EAH-genotyping PCR の開発

材料： E. albertii H-genotype (EAHg)の fliC 遺伝子とアミノ酸配列、Salmonella Typhimurium におけるflagellin（鞭毛タンパク質）のアミノ酸配列および日本国内で分離された E. albertii 92 株
方法：EAHg の代表株と S. Typhimurium の flagellin のアミノ酸配列を clustalW で比較し、機能ドメインの保存性を調べた。さらに EAHg の代表株の塩基配列を clustalW で比較し、得られた結果か
ら EAHg を同定できる multiplex PCR 系を開発した。開発した PCR 系を日本国内で分離された
E. albertii 92 株を用いて検証した。

③EAHg の分布

材料：243 株の E. albertii のゲノム配列と O 抗原遺伝子型 (EAOg)および本研究で同定した EAHg
方法：Prokka で遺伝子配列の注釈付け（アノテーション）を行い、Roary で core gene を同定（cut-off値 90%）し、SNP を抽出した。Core gene の配列が同じ株を除き、Maximum-likelihood (ML) Treeを作成し、EAOg および EAHg をマッピングした。
【結①果】
fliC 遺伝子の系統解析

E. albertii 243 株のうち、231 株で fliC 遺伝子が同定された。同定された 231 株の fliC 遺伝子配列をクラスタリング解析した結果、73 種類に分類され、そのうち 42 種は単一株（singleton）で、31 種は複数株が同一配列だったため cluster 1-31 とした。73 種の fliC 遺伝子と既知の E. coli の H 抗原型の 53
種の fliC 遺伝子について系統解析を行ったところ、E. albertii は E. coli とは別の単系統の枝を形成した。E. albertii の fliC 遺伝子について塩基配列の相同性から 4 つのグループに分け、それぞれ E. albertii
H-genotype1-4 (EAHg1-EAHg4) と命名した。
②

multiplex EAH-genotyping PCR の開発
E. albertii の H 抗原は S. Typhimurium の flagellin と比較しても内部ドメインである D0、D1 ドメインは高度に保存され、表面ドメインである D2、D3 ドメインは多様性があった。EAHg1-EAHg4 の塩基配列レベルでも同様だったため、4 種の EAHg の高度に保存された配列から EAHg 共通プライマーとなる Forward primer、多様性のある配列から各 EAHg 特異的プライマーとなる Reverse primer を設計した。4 種類の EAHg の代表株を用いて設計したプライマーセットの特異性を検証した結果、各遺伝子型で標的とするサイズの PCR 産物が得られ、E. albertii 92 株の分離株はすべて EAHg1-EAHg4 のいずれかに分類できた。対象とした 92 株中 EAHg4（48 株, 43.6%）が最多で、公共データベースに登録されている 243 株の E. albertii においても EAHg4（109 株, 44.9%）が最多であり、E. albertii の fliC
遺伝子は EAHg4 が主流だった。
③ EAHg の分布非常に近縁である株の EAHg は同じであったが、各 EAHg は複数の系統に分布しており、EAHg とEAOg の分布にも相関はなかった。
【結論及び考察】E. albertii においても、E. coli の fliC 遺伝子と同様に flagellin の内部ドメインである D0、D1 ドメインの配列は高度に保存され、表面ドメインである D2、D3 ドメインの配列は多様性があったことから、fliC 遺伝子は宿主における、ある種の免疫学的選択あるいは環境的選択を受けていると考えられる。
また、E. albertii の fliC 遺伝子を解析した結果 H 抗原型は 4 種類しか同定されず、E. coli の H 抗原型が 53 種類あることと比較し、極めて多様性が低いことがわかった。このことは E. albertii が限られた自然宿主や環境においてのみ生息し、鞭毛が生活サイクルの限られた段階で発現、機能している可能性を示唆していると考えられ、E. albertii の鞭毛が低温かつ限られた栄養条件下のみで形成されるという知見からも裏付けられる。本研究によって E. albertii における 4 種類の H 抗原型をもとに構築した EAH-genotyping PCR 系を開発することができた。EAH-genotyping PCR 系は EAO-genotyping PCR 系と組み合わせて使用することにより、E. albertii による感染症の疫学研究に有用なツールになると考えられる。今後さらに解析する株を増やし、EAHg 型の多様性のさらなる解析や新規の EAHg 型の有無を検証する必要がある。
（Frontiers in microbiology Vol.12, No.737979 2021 年 掲載）