ADRA 技術講習会-プロトコル・手技説明2023年1月19日
富士フイルム株式会社
山本 裕介© FUJIFILM Holdings Corporation

各種入手可能な手順書等
ADRAキットに同梱・キット用手順書→ 試薬調製～反応停止操作 (HPLC測定前) の手順、キット以外に必要な試薬・器具・装置 等が記載

キット専用Web掲載資料
・96ウェルプレート 配置図・96ウェルプレート 操作用シート

・HPLC条件

・NAC, NAL安定性確認用シート

・データ解析用シート（UV用・FL用）

その他
・SOP (ver. 2.0)
https://www.jacvam.jp/files/list/05/05_07_E1.pdf
・テストガイドライン (OECD TG442C)
https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-442c-in-chemicoskin-sensitisation_9789264229709-en© FUJIFILM Holdings Corporation2

試薬
ADRAキット・NAC Buffer (pH=8.0) プレミックス (300 mL用) × 2本・NAL Buffer (pH=10.2)プレミックス (300 mL用) × 2本・0.01 mol/L EDTA溶液 (1 mL) × 2本・NAC (10 mL用) × 2本・NAL (10 mL用) × 2本

キット以外の試薬 (別途準備が必要)
・水 (蒸留水以上のグレード)
推奨製品：①光製薬 注射用水②大塚製薬 大塚蒸留水（日本薬局方
・アセトニトリル
・アセトン

富士フイルムでの使用品を緑字で記載

注射用水）[富士フイルム和光; Cat#015-08633][富士フイルム和光; Cat#016-00346]

・ジメチルスルホキシド(DMSO)
・トリフルオロ酢酸 (TFA)[富士フイルム和光; Cat#043-07216][富士フイルム和光; Cat#204-02743]

・陽性対照（下記2種のうちどちらか1つあればOK）➀Phenylacetaldehyde, CAS No. 122-78-1 [SIGMA; Cat#107395, Alfa Aesar; Cat# A14263]➁Squaric acid diethyl ester, CAS No. 5231-87-8[東京化成; Cat.#D3253, SIGMA; Cat#310778]© FUJIFILM Holdings Corporation

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器具
試験で使用する器具 (消耗品 ) は、
PPまたはPE製のディスポーザブル品を用い、金属イオンの混入をできるだけ防ぐ
マイクロピペット・マイクロピペット： 2～10、10～100 μL、100～1000 μLの3種類
・12連マルチチャンネルピペット：50～150 μL分取可能なもの

消耗品

富士フイルムでの使用品を緑字で記載

・500 mL程度の容量のある容器 (緩衝液調製用)[サンセイ医療器材; Cat#07-004-01]

・10 mL-100 mLを分取可能なメスピペット (緩衝液、NAC, NAL溶液調製用)[Falcon; Cat#356551(10mL), 356525(25mL), 356550(50mL), 357600(100mL)]

ポリスチレン製
でもOK

・遠沈管：10 mL程度、100 mL程度の容量のあるもの[Falcon; Cat#352196(15mL), Watson; Cat#536-150S(100mL)]・96ウェルプレート (非滅菌のものを推奨 *)[Thermo (NUNC); Cat#267245]

・プレートシール：密封性、耐溶剤性の高いもの[島津ジーエルシー; Cat#370-04030-01]* γ線滅菌や電子線滅菌により、素材に含まれる添加剤（酸化防止剤等）の変化物が生成することが報告されており、それらが試験結果に影響を及ぼす可能性有© FUJIFILM Holdings Corporation4

装置
・電子天秤：0.1 mgまで表示されるもの

・pH計：±0.01 pH単位まで読むことが可能なもの
・試験管ミキサー・プレートシェイカー・プレート遠心機

・インキュベーター：25℃設定が可能なもの
・HPLCシステム：流速0.3 mL/minで96ウェルプレートを測定可能なもの
・UV検出器：281 nmで吸光検出が可能なもの（PDAの方が望ましい）・蛍光検出器（必須ではないが、UVで共溶出がみられるサンプルの測定に必要）・HPLCカラム
推奨品：① Wakopak® Core C18 ADRA Φ3.0 × 150mm[富士フイルム和光純薬, Cat. 233-63991]② CAPCELL CORE C18 column (2.7 μm, 3.0 × 150 mm)[大阪ソーダ, Cat. 51112]③ CORTECS C18 Column (2.7 μm, 3.0 × 150 mm)[Waters, Cat. 186007373]④ Agilent, Poroshell 120 EC-C18 (2.7 μm, 3.0 × 150 mm)[Cat. 693975-302]© FUJIFILM Holdings Corporation5必須ではない器具・装置
必要に応じて使用
・HPLCガードカラム
推奨品：EXP GUARD CARTRIDGE CAPCELL CORE C18 S-2.7 2.1×5 mm[大阪ソーダ、Cat. 3643] (ホルダー)
EXP DIRECT CONNECT HOLDER[大阪ソーダ、Cat. 3640] (カラム)あると便利な器具

富士フイルムでの使用品を緑字で記載

・1000-5000 μlを分取可能なマイクロピペット→ 被験物質溶液、陽性対照溶液の調製に便利
・12連ピペット操作用リザーバー [Corning; Cat#4870]→ 6.667 μM NAC, NAL溶液、反応停止液の分注に便利・12連ピペットで作業可能な1.5ml程度の容量のチューブ→ 被験物質、陽性対照、溶媒を12連ピペットでまとめて添加できる
例. サンプルトラック1.4 ml [Thermo, Cat. 4247JP]
セプラシール [Thermo, Cat. 4463] (サンプルトラックのフタ)(96 ディープウェルプレートでも代用可能)
・キャップリムーバー [Thermo; Cat#4469]→ 上記セプラシールを着脱するための道具。1度に最大8個外すことが可能。
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試験の流れ事前作業
緩衝液の調製、HPLC溶離液の調製、被験物質の溶媒チェック

反応（1日目）
1. 4 mM 被験物質溶液、陽性対照溶液の調製
2. 6.667 μM NAC, NAL溶液の調製 *1
3. NAC, NAL標準液（std 1）の調製 *1
4. NAC, NAL溶液と被験物質溶液を混合＆24時間インキュベート*1 事前に調製した物を-80℃で保存することも可能

測定（2日目）
1. 反応停止液（2.5%トリフルオロ酢酸水溶液）の添加
2. NAC, NAL標準液希釈系列の調製 *2
3. HPLCを用いてNAC, NALを定量

データ解析*2 反応時（1日目）に調製してもよい

NAC, NALの減少率 (Depletion)の算出、結果の判定© FUJIFILM Holdings Corporation

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試験の流れ事前作業
緩衝液の調製、HPLC溶離液の調製、被験物質の溶媒チェック

反応（1日目）
1. 4 mM 被験物質溶液、陽性対照溶液の調製
2. 6.667 μM NAC, NAL溶液の調製 *1
3. NAC, NAL標準液（std 1）の調製 *1
4. NAC, NAL溶液と被験物質溶液を混合＆24時間インキュベート*1 事前に調製した物を-80℃で保存することも可能

測定（2日目）
1. 反応停止液（2.5%トリフルオロ酢酸水溶液）の添加
2. NAC, NAL標準液希釈系列の調製 *2
3. HPLCを用いてNAC, NALを定量

データ解析*2 反応時（1日目）に調製してもよい

NAC, NALの減少率 (Depletion)の算出、結果の判定© FUJIFILM Holdings Corporation

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各緩衝液およびHPLC溶離液の調製
各緩衝液(NAC Buffer, NAL Buffer)の調製
1) 500 mL容器に水を270 mL計量する。
2) 上記容器にNAC またはNAL Buffer プレミックスを加え、混合する。
3) プレミックスの容器に水を30 mL加え、プレミックスの容器を洗いこみ、500 mL
容器に移す。
4) プレミックスが溶解した後、0.01 mol/L EDTA溶液を10 μL添加する。*1

5) 調製したBufferの一部を別の容器に移し、pHを確認する。
*1 NAC Bufferの調製時のみ実施

HPLC溶離液の調製（各1L調製する場合）
1) 1000 mL容器に水またはアセトニトリルを1000 mL計量する。
2) トリフルオロ酢酸（TFA）を1mL添加し混和する。

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9被験物質の溶媒選択
ADRAで使用可能な被験物質溶媒①水、②アセトニトリル、③アセトン、④5%DMSO/アセトニトリル
・複数の溶媒に溶解する場合は上記の番号を優先順位とする。
・酸無水物は水中で加水分解してしまうため、水以外の溶媒を用いる。
・その他上記のいずれかの溶媒中で不安定であることが分かっている場合はそれ以外の溶媒を用いる。

調製濃度について下記フローに従って調製濃度（モル濃度 or 重量濃度）を決定する。
被験物質●分子量既知の単一化学物質●既知の混合物および多成分構成物質●分子量不明の単一化学物質●組成不明の混合物および多成分構成物質●ポリマー

被験物質溶液を4 mMで調製

見かけの分子量を計算

被験物質溶液を0.5 mg/mLで調製© FUJIFILM Holdings Corporation10重量濃度による試験について
通常の方法 (4 mM) との違い
・被験物質の溶媒選択、被験物質溶液の調製における濃度が異なるだけ⇒ そのほかの操作は通常の方法と同じ
・以下に従って調製濃度を変更して試験を実施すればよい

通常法 (4 mM)

重量濃度法

20 mM溶液の調製

10 mg/mL溶液の調製

4 mM溶液の調製

0.5 mg/mL溶液の調製© FUJIFILM Holdings Corporation11溶解性確認の流れ
分子量既知の被験物質の場合
溶解
20 mMにおける
溶解性確認(DMSOは80 mM)
不溶

溶解した
溶媒を使用

溶解

溶解した
溶媒を使用

4 mMにおける
溶解性確認(試験不可) *不溶

分子量不明の被験物質の場合
溶解

溶解した
溶媒を使用

10 mg/mLにおける溶解性確認
不溶

溶解

溶解した
溶媒を使用

0.5 mg/mLにおける溶解性確認(試験不可) ** ガイドライン では、さらに低い濃度で実施しても陽性であれば感作性と判定可能と記載。また、上記以外でもNAC、NAL、被験物質の安定性が確認できる他の溶媒があれば使用可能となっている。

不溶© FUJIFILM Holdings Corporation12溶解性確認の手順（分子量既知の被験物質の場合）
1. 20 mM（80 mM）における溶解性確認
1) 15 mLチューブ等に被験物質を秤量する。
2) 秤量値から20 mM溶液（DMSOは80 mM溶液）の調製に必要な溶媒量を計算する。
3) 算出した量の溶媒を添加し、20 mM（80 mM）における溶解性を目視で確認する。
ポイント
・溶媒は水、アセトニトリル、アセトン、DMSO (5%DMSOではない)。
・すぐに溶解しなくても、超音波処理を5分程度行うことによって溶解した場合は、その溶媒を用いてよい。

2. 4 mMにおける溶解性確認 (20 mM（80 mM）で溶解しない場合)
1) 100 mL容量の容器等に被験物質を秤量する。
2) 秤量値から4 mM溶液の調製に必要な溶媒量を計算する。
3) 算出した量の溶媒を添加し、4 mMにおける溶解性を目視で確認する。
ポイント
・溶媒は水、アセトニトリル、アセトン (DMSOは用いない)。
・すぐに溶解しなくても、超音波処理を5分程度行うことによって溶解した場合は、その溶媒を用いてよい。
© FUJIFILM Holdings Corporation13溶解性確認の手順（分子量不明の被験物質の場合）
1. 10 mg/mLにおける溶解性確認
1) 15 mLチューブ等に被験物質を秤量する。
2) 秤量値から10 mg/mL溶液の調製に必要な溶媒量を計算する。
3) 算出した量の溶媒を添加し、10 mg/mLにおける溶解性を目視で確認する。
ポイント
・溶媒は水、アセトニトリル、アセトン、DMSO (5%DMSOではない)。
・すぐに溶解しなくても、超音波処理を5分程度行うことによって溶解した場合は、その溶媒を用いてよい。

2. 0.5 mg/mLにおける溶解性確認 (10 mg/mLで溶解しない場合)
1) 100 mL容量の容器等に被験物質を秤量する。
2) 秤量値から0.5 mg/mL溶液の調製に必要な溶媒量を計算する。
3) 算出した量の溶媒を添加し、 0.5 mg/mLにおける溶解性を目視で確認する。
ポイント
・溶媒は水、アセトニトリル、アセトン (DMSOは用いない)。
・すぐに溶解しなくても、超音波処理を5分程度行うことによって溶解した場合は、その溶媒を用いてよい。
© FUJIFILM Holdings Corporation

14試験の流れ事前作業
緩衝液の調製、HPLC溶離液の調製、被験物質の溶媒チェック

反応（1日目）
1. 4 mM 被験物質溶液、陽性対照溶液の調製
2. 6.667 μM NAC, NAL溶液の調製 *1
3. NAC, NAL標準液（std 1）の調製 *1
4. NAC, NAL溶液と被験物質溶液を混合＆24時間インキュベート*1 事前に調製した物を-80℃で保存することも可能

測定（2日目）
1. 反応停止液（2.5%トリフルオロ酢酸水溶液）の添加
2. NAC, NAL標準液希釈系列の調製 *2
3. HPLCを用いてNAC, NALを定量

データ解析*2 反応時（1日目）に調製してもよい

NAC, NALの減少率 (Depletion)の算出、結果の判定© FUJIFILM Holdings Corporation

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被験物質溶液（分子量既知物質）、陽性対照溶液の調製
陽性対照、20 mM溶液（80 mM）が調製可能な物質
1) 15 mLチューブ等に被験物質、陽性対照を秤量する。
2) 秤量値から20 mM溶液の調製に必要な溶媒量を計算する。
3) 算出した量の溶媒を添加し20 mM溶液を調製する。
4) 上記の20 mM溶液の一部を各溶媒で5倍希釈し、4 mMに調製する。
ポイント
・溶媒が5%DMSO/アセトニトリルの場合は、DMSOで80 mMに調製後、アセトニトリルで20倍希釈する。
・4 mM溶液はサンプルトラック [Thermo Cat. 4247JP] や96ディープウェルプレート等に調製し、マルチチャンネルピペットで操作できるようにすると良い。

20 mM（80mM）に必要な溶媒量を算出＆添加

被験物質 又は陽性対照溶液の一部を20倍希釈

20 mM（80mM）溶液

4 mM溶液© FUJIFILM Holdings Corporation

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被験物質溶液の調製（分子量既知物質）
20 mM（80 mM）で溶解しない被験物質
1) 100 mL容量の容器等に被験物質を秤量する。
2) 秤量値から4 mM溶液の調製に必要な溶媒量を計算する。
3) 算出した量の溶媒を添加し4 mM溶液を調製する。
ポイント
・溶媒は水、アセトニトリル、アセトンの3種類が使用可能 (DMSOは不可) 。
・調製した4 mM溶液はサンプルトラック [Thermo Cat. 4247JP] や96 well ディープウェル
プレート等に分注し、マルチチャンネルピペットで操作できるようにすると良い。

4 mMに必要な溶媒量を算出＆添加

被験物質 又は陽性対照

4 mM溶液© FUJIFILM Holdings Corporation

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被験物質溶液（分子量不明物質）の調製
10 mg/mL溶液が調製可能な物質
1) 15 mLチューブ等に被験物質、陽性対照を秤量する。
2) 秤量値から10 mg/mL溶液の調製に必要な溶媒量を計算する。
3) 算出した量の溶媒を添加し10 mg/mL溶液を調製する。
4) 上記の10 mg/mL溶液の一部を各溶媒で20倍希釈し、0.5 mg/mLに調製する。
ポイント
・溶媒が5%DMSO/アセトニトリルの場合は、DMSOで10 mg/mLに調製後、アセトニトリルで20倍希釈する。
・0.5 mg/mL溶液はサンプルトラック [Thermo Cat. 4247JP] や96ディープウェルプレート等に調製し、マルチチャンネルピペットで操作できるようにすると良い。

10 mg/mLに必要な溶媒量を算出＆添加

被験物質 又は陽性対照溶液の一部を20倍希釈

10 mg/mL溶液

0.5 mg/mL
溶液© FUJIFILM Holdings Corporation

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被験物質溶液の調製（分子量既知物質）
10 mg/mLで溶解しない被験物質
1) 100 mL容量の容器等に被験物質を秤量する。
2) 秤量値から0.5 mg/mL溶液の調製に必要な溶媒量を計算する。
3) 算出した量の溶媒を添加し0.5 mg/mL溶液を調製する。
ポイント
・溶媒は水、アセトニトリル、アセトンの3種類が使用可能 (DMSOは不可) 。
・調製した0.5 mg/mL溶液はサンプルトラック [Thermo Cat. 4247JP] や96 well ディープ
ウェルプレート等に分注し、マルチチャンネルピペットで操作できるようにすると良い。

0.5 mg/mLに必要な溶媒量を算出＆添加

被験物質 又は陽性対照

0.5 mg/mL溶液© FUJIFILM Holdings Corporation

19NAC, NAL溶液、標準液の調製
6.667 μM NAC, NAL溶液の調製
あらかじめ調製しておいた緩衝液 (pH=8.0 for NAC, pH=10.2 for NAL)をそれぞれ
10 mLずつNACまたはNALの容器に直接添加し、溶解する。
ポイント
・激しく混和するとNACが酸化してしまう可能性があるため、穏やかに攪拌する。
・6.667 μM溶液の状態でも-75℃以下であれば1年程度保存可能 (テストガイドラインに記載) 。
⇒ ただし、キットにおいては用時調製を推奨

NAC, NAL標準液 (Std 1) 、標準液希釈Bufferの調製
以下の分量に従って、各溶液を混合し、冷蔵または-75℃以下で保存する。

NAC, NAL標準液 (Std 1)・6.667 μM NAC溶液
または NAL溶液
・水・TFA
・アセトニトリル

標準液希釈Buffer
300 μL
20 μL
2 μL
78 μL

・NAC Buffer (pH 8.0)
または NAL Buffer (pH 10.2)
・水・TFA
・アセトニトリル

900 μL
60 μL
6 μL
234 μL© FUJIFILM Holdings Corporation

20NAC, NALの安定性確認
6.667 μM溶液におけるNAC, NALの安定性を確認するために、
6.667 μM溶液調製時には必ず以下の操作を実施する。
1) 6.667 μM NAC, NAL溶液を2枚のプレートに各150 μL、n=3ずつ分注する。
2) 上記のNAC, NAL溶液にアセトニトリルを50 μLずつ添加する。

3) 2枚のプレートのうち、1枚において反応停止液を50 μLずつ添加する。
4) それぞれプレートにプレートシールを貼り、攪拌・スピンダウンする。
5) 反応停止液を添加したプレートをHPLCで測定する。
6) もう一方のプレートは、25℃で24時間インキュベート後に反応停止液を添加し、HPLCで測定する。

ポイント
・反応液の組成はRC-A, RC-Bおよびアセトニトリル溶媒のRC-Cと同じ。
・あらかじめ6.667 μM NAC, NAL溶液を調製して-75℃以下で保存する場合は、調製したタイミングで必ず安定性確認を行う（以後解凍して使用する際は確認不要）。
・用時調製 (被験物質との反応と同時) の場合は、24時間後測定分の反応液 (n=3) を、被験物質等の反応液と同じプレートに調製してもよい。
・安定性確認ではNACの二量体も定量する必要があり、NAC二量体は蛍光検出では定量できないため、必ずUV検出で測定する。

© FUJIFILM Holdings Corporation

21NAC, NALの安定性確認
安定性におけるクオリティ
・0時間、24時間それぞれにおけるNAC総量 (単体+二量体) に対するNAC単体の割合 ≧ 90%
・0時間におけるNALに対する24時間におけるNALの割合 ≧ 90%

ポイント
・クオリティはADRAキットWebページの「NAC, NAL安定性確認用シート」にHPLCにおける各ピーク面積を入力することで確認することが可能。
・安定性のクオリティを満たさなかった場合、再度安定性確認試験を行い、再試験においてもクオリティを満たさなかった場合緩衝液から新たに再調製する。
→ 緩衝液調製に使用した水や器具が原因の可能性があるため。

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22NAC, NALと被験物質の反応反応から測定までの流れ

NAC, NAL

被験物質

反応液中濃度
被験物質： 1 mM または
0.125 mg/mL
NACまたはNAL： 5 μM

被験物質溶液（50 μL）
96ウェルプレート上で、
NAC, NALと被験物質を混合

NACまたはNAL溶液（150 μL）

定量波長
UV： 281 nm
FL： 284nm (Ex)、333nm (Em)

24時間反応(25℃)

反応停止液(2.5% TFA)
50 μL

反応停止液を添加後、HPLCでNAC, NALの残存量を測定© FUJIFILM Holdings Corporation23

各反応液の調製
以下の表の分量に従い、①6.667 μM NACおよびNAL溶液、NACおよびNAL Buffer、➁被験物
質溶液、陽性対照溶液、各溶媒、の順に96ウェルプレートに添加する。
ポイント
ピペット操作において、NAC, NAL溶液およびBufferはフォワードピペッティング (1段階吸って出し切る操作)、被験物質、陽性対照および各溶媒はリバースピペッティング (2段階分吸って1段階分出す操作) で分注すると良い。

6.667 μM
NAC, NAL溶液

RC-A

RC-B

RC-C

陽性対照

被験物質 *1

150 μL150 μL150 μL150 μL150 μLNAC Buffer (pH 8.0)
NAL Buffer (pH 10.2)
アセトニトリルCC

150 μL
50 μL

50 μL

被験物質溶媒4 mM 陽性対照溶液

50 μL *2
50 μL

4 mM 被験物質溶液

50 μL

50 μL

RC：参照コントロール、CC：共溶出コントロール*1 以降、被験物質とNAC, NALの反応液を「被験物質」と表現する*2 陽性対照がアセトニトリル溶媒のため、アセトニトリルRC-Cは必ず用意する© FUJIFILM Holdings Corporation

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各コントロールの定義
参照コントロールA (RC-A)
HPLC装置の適格性を確認するためのコントロール。被験物質溶液の代わりにアセトニト
リルをNACまたはNAL溶液に添加した溶液について、標準液検量線から算出したNAC,
NAL濃度が適切な値になるかを確認する。

参照コントロールB (RC-B)
分析時間中の反応液の安定性を確認するためのコントロール。被験物質溶液の代わりに
アセトニトリルをNACまたはNAL溶液に添加した溶液について、分析開始時と終了時にn=3ずつ測定し、値のバラつきを確認する。

参照コントロールC (RC-C)
NACおよびNALの減少率 (Depletion) を算出するためのコントロール。被験物質溶液の代わりに被験物質の溶媒を添加する。被験物質によって溶媒が異なる場合はそれぞれの溶媒に対するコントロールを調製する。

共溶出コントロール(CC)
被験物質がNACまたはNALと共溶出していないか確認するためのコントロール。被験物
質が281 nmで吸収があるかどうか、また溶出時間がNACまたはNALと同じではないか(共溶出する可能性はないか)を確認する。
© FUJIFILM Holdings Corporation

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96ウェルプレート 配置例
ポイント・各列ごとにサンプル、陽性対照、溶媒を揃えて配置するとマルチチャンネルピペットを用いた操作がしやすい。
・陽性対照がアセトニトリル溶媒のため、アセトニトリルのRC-Cは必ず配置する。

1枚目 (12サンプル実施時)
A
B
C
D
E
F
G
H

1
サン
プル
No.1
CC-1
サン
プル
No.1
CC-1

2
サン
プル
No.2
CC-2
サン
プル
No.2
CC-2

3
サン
プル
No.3
CC-3
サン
プル
No.3
CC-3

4
サン
プル
No.4
CC-4
サン
プル
No.4
CC-4

5
サン
プル
No.5
CC-5
サン
プル
No.5
CC-5

6
サン
プル
No.6
CC-6
サン
プル
No.6
CC-6

7
サン
プル
No.7
CC-7
サン
プル
No.7
CC-7

8
サン
プル
No.8
CC-8
サン
プル
No.8
CC-8

9
サン
プル
No.9
CC-9
サン
プル
No.9
CC-9

10
サン
プル
No.10
CC-10
サン
プル
No.10
CC-10

11
サン
プル
No.11
CC-11
サン
プル
No.11
CC-11

12
サン
プル
No.12
CC-12
サン
プル
No.12
CC-12

9

10

11
Std 1
Std 2
Std 3
Std 4
Std 1
Std 2
Std 3
Std 4

12
Std 5
Std 6
Std 7

2枚目 (2種の溶媒 (水、アセトニトリル) 使用時)
1

2

3

A
RC-A RC-B RC-B
B
C
DE
RC-A RC-B RC-B
F
G
H
AN：アセトニトリル

4

5

6

RC-C
(水)

RC-C
(AN)

陽性
対照

RC-C
(水)

RC-C
(AN)

陽性
対照

7

8

6.667 μM NAC溶液に被験物質、陽性対照
または溶媒を添加

NAC Buffer (pH 8.0)に被験物質を添加6.667 μM NAL溶液に被験物質、陽性対照
または溶媒を添加

Blank

Std 5
Std 6
Std 7

NAL Buffer (pH 10.2) に被験物質を添加Blank© FUJIFILM Holdings Corporation

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反応液調製後～インキュベート
操作
1) 各溶液をすべて添加後、プレートシールでふたをする。
2) プレートシェーカーで攪拌後、遠心機でスピンダウンする。

3) インキュベーターにプレートを入れ25℃で24時間静置する。
ポイント・プレートシールは粘着性、耐溶剤性が高いものを用いる。
推奨品：TORAST ™ 96well Seal E Type [島津ジーエルシー, Cat. 370-04030-01]
・プレートシールを張る際は隙間がないよう注意する。
→隙間があるとインキュベート中に揮発したサンプルや溶媒が他のウェルに コンタミする可能性がある。
→また、溶媒等が揮発することにより、NACおよびNALの濃度が高くなり、値がばらつく可能性がある。
・シェーカーでの攪拌は600~700rpmで30秒程度でよい。

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試験の流れ事前作業
緩衝液の調製、HPLC溶離液の調製、被験物質の溶媒チェック

反応（1日目）
1. 4 mM 被験物質溶液、陽性対照溶液の調製
2. 6.667 μM NAC, NAL溶液の調製 *1
3. NAC, NAL標準液（std 1）の調製 *1
4. NAC, NAL溶液と被験物質溶液を混合＆24時間インキュベート*1 事前に調製した物を-80℃で保存することも可能

測定（2日目）
1. 反応停止液（2.5%トリフルオロ酢酸水溶液）の添加
2. NAC, NAL標準液希釈系列の調製 *2
3. HPLCを用いてNAC, NALを定量

データ解析*2 反応時（1日目）に調製してもよい

NAC, NALの減少率 (Depletion)の算出、結果の判定© FUJIFILM Holdings Corporation28

反応停止、標準液希釈系列の調製
反応停止操作
1) プレートをインキュベーターから取り出し、遠心機でスピンダウンする。
2) 各反応液に反応停止液 (2.5%トリフルオロ酢酸水溶液)を50 μL添加する。
ポイント
万が一析出が観察された場合、HPLC配管やカラムに詰まる可能性が考えられるので、低速（100-400g）で遠心分離し、上清を100 μL程度別のプレートに移して測定してもよい。
遠心で析出が沈殿しない場合はフィルター処理 [Merck Millipore; Cat#MSRLN0410等] に
よって析出を除くこともできる（ガイドラインに記載はないがSOPに記載有）。

標準液希釈系列の調製
事前に調製した標準液希釈Bufferを用いて、下記表に従ってNAC, NAL標準液 (Std1) を希釈していき、6段階の希釈系列を調製する。
Std 1

Std 2

Std 3

Std 4

Std 5

Std 6

Std 7

NAC, NAL濃度5 μM

2.5 μM

1.25 μM

0.63 μM

0.31 μM

0.16 μM

0 μM

NAC 標準液
NAL 標準液150 μL(Std 1)150 μL(Std 1)150 μL(Std 2)150 μL(Std 3)150 μL(Std 4)150 μL(Std 5)－－150 μL150 μL150 μL150 μL150 μL150 μLNAC 希釈 Buffer
NAL 希釈 Buffer© FUJIFILM Holdings Corporation

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HPLC測定HPLC条件
カラム温度

40℃
25℃

サンプル温度検出器

サンプル冷却機能のあるオートサンプラーがある場合、4℃にすることでサンプルを測定時までより安定な状態で保存できる。
フォトダイオードアレイ検出器または吸光度検出器（281nm）
蛍光検出器

注入量

10～20 μl (HPLC装置によって変わる。ピークがブロードならば、注入量を減らす。)

測定時間

20分

ポイント
・各移動相を混合するミキサーの容量が適切でないと、溶出条件通りのグラジエントが得られない
場合があるため、あらかじめ確認・調節しておく。
(島津prominenceでは0.5 mlのミキサー容量が適切)
・カラムから検出器までの配管の内径や長さによりピークがブロードになる場合があるため、配管の内径0.18 mmφ以下、カラムから検出器までの距離50 cm以下にする。
・蛍光検出器は必須ではないが、UV検出で共溶出がみられた場合必要。UV検出器と直列でつないで測定することで、一度にUVと蛍光の両方のデータを採取することができる。
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HPLC測定
グラジエント条件
NACグラジエント条件

NALグラジエント条件

時間

流速

%A

%B

時間

流速

%A

%B

0分
9.5分
10分
13分
13.5分
20分

0.3ml/min
0.3ml/min
0.3ml/min
0.3ml/min
0.3ml/min
終了

70
45
0
0
70

30
55
100
100
30

0分
9.5分
10分
13分
13.5分
20分

0.3ml/min
0.3ml/min
0.3ml/min
0.3ml/min
0.3ml/min
終了

80
55
0
0
80

20
45
100
100
20

ポイント
13.5分～20分における6.5分間の再平衡化時間は、装置の違いや装置の混合容積によって長くなったり、短くなったりする可能性がある。NAC、NALの溶出時間が安定すれば、より短い平衡
化時間することも可能。

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HPLC測定
分析シーケンス
以下の順番で各反応液を測定していく。
① NAC 標準液希釈系列② NAC RC-A
③ (NAC CC)④ NAC RC-B (n=3)⑤ NAC サンプル、陽性対照、RC-Cの n=1⑥ NAC サンプル、陽性対照、RC-Cの n=2⑦ NAC サンプル、陽性対照、RC-Cの n=3⑧ NAC RC-B (残りのn=3)
以下、NALもNACと同様の順番

ポイント
・NACとNALでグラジエント条件が異なるため、NACについてすべて測定を行ってからNALについての測定を行うようにする。
・CCはどのタイミングで測定してもよい。
・サンプル、陽性対照、RC-Cは合わせてn=1ずつ測定する。
・分析は反応停止後 72時間以内に測定が終了するようにする。

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試験の流れ事前作業
緩衝液の調製、HPLC溶離液の調製、被験物質の溶媒チェック

反応（1日目）
1. 4 mM 被験物質溶液、陽性対照溶液の調製
2. 6.667 μM NAC, NAL溶液の調製 *1
3. NAC, NAL標準液（std 1）の調製 *1
4. NAC, NAL溶液と被験物質溶液を混合＆24時間インキュベート*1 事前に調製した物を-80℃で保存することも可能

測定（2日目）
1. 反応停止液（2.5%トリフルオロ酢酸水溶液）の添加
2. NAC, NAL標準液希釈系列の調製 *2
3. HPLCを用いてNAC, NALを定量

データ解析*2 反応時（1日目）に調製してもよい

NAC, NALの減少率 (Depletion)の算出、結果の判定© FUJIFILM Holdings Corporation

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試験結果の判定
減少率 (Depletion) の算出
被験物質との反応液におけるNAC, NALのピーク面積と、被験物質と同じ溶媒の
RC-CにおけるNAC, NALのピーク面積から以下の式に従い、NAC, NALそれぞれのDepletionを算出する。

Depletion
(%)

=

1 －

サンプルにおけるNAC, NAL
ピーク面積の平均値

RC-CにおけるNAC, NAL
ピーク面積の平均値

×

100

ポイント
UV検出と蛍光検出を同時に行った場合、UV検出において特に共溶出が見られない場合
はUV検出のピーク面積をDepletion算出に用い、共溶出が見られた場合は蛍光検出のピーク面積をDepletion算出に用いる。

結果の判定基準
上記で算出したNACとNALのDepletionから平均値を算出し、以下の表に従って陰性、陽性を判定する。

Depletion 平均値

判定

4.9% ≦

陽性< 4.9%

陰性© FUJIFILM Holdings Corporation

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試験結果の判定
NAC単独予測モデル
NALにおいて共溶出がみられ、正しくDepletionを算出できない場合は以下の表に従い、NACのDepletonのみを用いて判定することが出来る。

NAC Depletion

判定

5.6% ≦

陽性< 5.6%

陰性

ポイント
共溶出していても明らかにRC-Cと比較してNAC, NALのピークが減少している場合は正確なDepletionは算出できないが、陽性と判定してよい。

確認試験の必要性
以下の場合には、確認試験を実施して判定結果の再現性を確認する。
1回目と2回目の判定結果が異なった場合は、さらに確認試験を実施し、3回の判定
結果の多数決により判定を決める。
NAC/NAL予測モデル：3.0% ≤ 平均スコア ≤ 10.0%
NAC単独予測モデル：4.0% ≤ NACの減少率 ≤ 11.0%© FUJIFILM Holdings Corporation35

試験成立条件
標準液希釈系列の各濃度とピーク面積から検量線を作成し、各コントロール、
陽性対照、サンプルにおけるNAC, NALの濃度を算出する。
上記の値に対して次の条件を満たしているか確認する。

装置の適合性・検量線の直線性 r2 ＞ 0.990
・参照コントロールAのNACまたはNAL濃度の平均値=3.2～4.4 μM

分析中の安定性
RC-B (n=6) とアセトニトリル溶媒のRC-C (n=3) の合計n=9におけるNAC, NAL
ピーク面積のCV ＜ 10%

RC-Cの安定性
・各溶媒のRC-C (n=3) におけるNAC, NALピーク面積のCV ＜ 10%・参照コントロールCのNACまたはNAL濃度の平均値=3.2～4.4 μM© FUJIFILM Holdings Corporation36

試験成立条件
サンプルのバラつき
NACおよびNALのDepletionにおけるSD ＜ 10%

陽性対照・NACおよびNALのDepletionにおけるSD ＜ 10%
・NACおよびNALのDepletionが下記表の範囲内（PhenylacetaldehydeおよびSquaric acid diethyl esterのどちらも同じ範囲）

NAC Depletion (%)

NAL Depletion (%)

下限値

上限値

下限値

上限値

30

80

70

100

ポイント
Depletion等の各値や判定、試験成立条件の合否はADRAキットWebページの「データ解析用シート」にHPLCにおける各ピーク面積を入力することで確認することが可能。

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