食物に対する経消化管感作の機序、特に IL-25 の役割の解明

研究課題名

食物に対する経消化管感作の機序、特に IL-25 の役割の解明

フリガナ

マツモト

代表者名

松本ケンジ

健治

所属機関（機関名）国立成育医療研究センター研究所（役職名）部長
氏
共同研究者

名（フリガナ）

久保 輝文(クボ テルフミ)

免疫アレルギー・感染研究部

所属機関・役職名

役割分担

札幌医科大学医学部
Tuft 細胞の免疫組織学的検討
病理学第一講座 助教

第 48 回日本小児栄養消化器肝臓学会において発表され、
本 助 成金 によ る 発 「好酸球性胃腸炎の病態解明および臨床応用への基盤確立」（松岡 諒，森田 英明，
表論文，学会発表 松本 健治）
2021 年度 日本小児栄養消化器肝臓学会 若手優秀演題賞を獲得した
研究結果要約食物に対する経腸管感作の機序を検討することを目的として基礎的検討を行った。
1. 6 週齢の C57BL/6J マウスの飲水中に Tuft 細胞を活性化して IL-25 を産生誘導することが知られている succinate（100 mM）を混入して 7 日間自由飲水させると、空腸において IL-25 の mRNA が誘導され、組織学的にも Tuft 細胞数の増加が認められた。
2.上記の系で succinate を含む飲水を最大 5 週間行い、2 週目からは胃内に ovalbumin（OVA）を 3 日おきに合計 11 回投与したが、空腸における Th2 cytokine や IL-25 の mRNA 発現、Tuft 細胞数や体重増加を含めた症状について、OVA 追加投与の影響は認められなかった。
3.5 週間投与時点でのマウス血清中の抗 OVA-IgE 抗体価や、腸間膜リンパ節由来単核細胞を in vitroで OVA 刺激した際の培養上清中の IL-5 産生の誘導は認められなかった。
4.さらに、腸管 Tuft 細胞のコハク酸受容体（SUCNR1）以外の味覚受容体の ligand（添加物 A）を飲水中に混入し 3 週間自由飲水させたが、空腸における IL-25 の mRNA 発現、組織学的な Tuft 細胞数や好酸球数には全く影響が認められなかった。
以上から、自然免疫系の活性化（IL-25 の産生誘導を認める）による好酸球性腸管炎症モデルでは、同時に経口的に投与された抗原に対する特異的な IgE 抗体産生や Type 2 免疫応答は誘導されず、経口的に摂取された抗原に対する感作に IL-25 は関与していない可能性が強く示唆された。

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食物に対する経消化管感作の機序、特に IL-25 の役割の解明

TSLP は定常状態では高発現していないことか

研究目的
免疫応答は抗原特異的な獲得免疫応答と、抗ら、もし経腸管感作が誘導されるとしても、経原非特異的な自然免疫応答に分類される。アレ

皮感作とは全く異なる感作機序である可能性がルギー疾患は抗原（アレルゲン）に特異的な強く示唆される。実際に経口的に接種した抗原IgE 抗体の架橋によるマスト細胞の活性化や抗に対する IgE 抗体を産生させる動物モデルとし原特異的な Th2 細胞の活性化を介して症状を発ては Cholera toxin の同時投与 2)と黄色ブドウ球現することから、その病態形成には獲得免疫系菌の再生する Superantigen の同時投与 3)しか知が主として働くと考えられている。一方、自然られて居ない。

免疫応答は、古くは病原微生物に対する免疫応

近年、腸管上皮には IL-25 を産生・貯蔵した答として知られていたが、近年は生体が傷害さTuft 細胞が存在し、味覚受容体やコハク酸受容れた際に放出されるアラーミンによって惹起さ体等を介して寄生虫や原虫を認識し IL-25 を放れる免疫応答も含まれ、特に活性化／障害され出する事が明らかとなった 4)。また、IL-25 はた上皮細胞から放出される IL-25 や IL-33、直接に樹状細胞を活性化する。

TSLP は自然リンパ球や炎症細胞を直接活性化

以上のことから、私達は食物に対する経腸管して慢性好酸球性炎症の形成に深く関与するこ感作に Tuft 細胞から産生放出される IL-25 が関とが知られてきている。また、IL-33、TSLP は与しているとの仮説を立てた。本研究ではこの抗原提示細胞を活性化して Naïve T 細胞の分化仮説を検証するため、消化管アレルギー患者由を Th2 にシフトさせることから、自然免疫応答

来組織の網羅的な遺伝子発現解析などを用いては獲得免疫応答の Th1/Th2/Th17/Treg への分化腸管局所の情報を検討すると共に、マウスモデを制御するとされている。

ルを用いて IL-25 が経腸管感作モデルにおいて

IgE 依存性食物アレルギーの約 9 割の小児でどの様な役割を演じているかを検証する。

は湿疹／アトピー性皮膚炎が先行して、湿疹面への食物抗原曝露が IgE 抗体産生を誘導するこ

特に本年度は、Tuft 細胞におけるコハク酸受とが明らかとなっている 1)。一方、残る 1 割の容体以外の味覚受容体に着目し、検討する。

IgE 依存性食物アレルギー患者や、IgE 非依存性食物アレルギー（消化管アレルギー）患者の研究計画及び研究手法

感作経路は経腸管感作が疑われているが、一般① Tuft 細胞の数を制御する遺伝子群の同定に経口摂取した食物抗原に対する免疫応答は寛収集した消化管アレルギー患者／好酸球性消容誘導であり、経腸管感作の機序については全化管疾患患者の腸管生検組織の Tuft 細胞の免疫く不明である。また、小腸や大腸には IL-33、染色を行う。また現在、これらの組織標本と同一

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食物に対する経消化管感作の機序、特に IL-25 の役割の解明

患者の生検組織から total RNA を抽出し、マイク

特に本年度は、Tuft 細胞におけるコハク酸受容ロアレイによる網羅的な遺伝子発現解析を開始

体以外の味覚受容体に注目し、検討した。

する予定である。腸管上皮内の Tuft 細胞の数に③ IL-25 を介した経腸感作モデルの樹立

相関する特異的な遺伝子発現パターン（Tuft 細胞関連遺伝子群）を抽出する。検出された Tuft 細

6 週齢の C57BL/6j マウスの飲水中にコハク酸胞関連遺伝子群の相互関係や上流解析をを添加して 7 日間経口的に投与したところ、体重Ingenuity pathway analysis によって行い、Tuft増加不良と腸管における IL-25 の mRNA の有意細胞の数を制御する遺伝子群や転写因子などのな発現増強が認められた。これらのことから、IL-同定を試みる 5)。

25 を介した経腸炎症モデルが樹立されたと判断できる。今後は、この系に経胃管的に OVA を投② IL-25 の産生放出に関連する遺伝子群の同定与して、OVA に対する感作が成立するかを検討

これまでに知られている Tuft 細胞からの IL-する。具体的には、コハク酸を投与したマウスの25 の放出刺激は Taste receptor type 2（TAS2R）

腸管リンパ節細胞もしくは脾細胞を採取し、OVAやコハク酸受容体(SUCNR1)、TRPM5 などを介刺激を行って、T 細胞の増殖やサイトカイン産生している。これらの遺伝子は family を形成してを評価する。

おり、TAS2 のみで 22 種類、他の type を含める

また、TAS2R 等の受容体の agonist を OVA とと 40 種類以上の分子が存在する。こうした受容共に投与し、OVA に対する IgE 抗体の産生ある体群は、その ligand と結合すると発現が増強すいは消化管アレルギーの発症を検討する。また、る物が多い事から、これらの分子群のうち、どの感作が成立したマウスの腸管を採取し、網羅的な分子が消化管アレルギー患者や好酸球性消化管遺伝子発現解析で Tuft 細胞関連遺伝子群の発現疾患患者の腸管で発現増強しているかを検討し量を検討し、腸管由来 IL-25 が経腸管感作において、患者の病態形成に関与する Tuft 細胞活性化て果たす役割を検討する。

誘導遺伝子群の同定を試みる。特に、Tuft 細胞に特徴的に発現している遺伝子として DCLK1 や結果と考察

Pou2F3 の発現に相関する遺伝子群に注目して解① Tuft 細胞の数を制御する遺伝子群の同定析を行う。さらに、刺激受容体が特定された場合既に収集されていた消化管アレルギー患者もには、その分子の agonist や antagonist を用い

しくは好酸球性消化管疾患患者の腸管生検組織て、in vitro もしくはマウスモデルで、その分子の網羅的な遺伝子発現解析を行ったが、IL-25 のの agonist や antagonist による誘導遺伝子を検mRNA の発現増強や Tuft 細胞の増多を示す遺伝索する。

子群の高発現は認められなかった。その理由とし

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食物に対する経消化管感作の機序、特に IL-25 の役割の解明て、マウスモデルでは Succinate 投与によって2. 上記の系で succinate を含む飲水を最大 5 週

IL-25 の mRNA の発現亢進が認められている腸間行い、2 週目からは胃内に 50 mg の ovalbumin

管の部位は空腸であった一方、これまでに収集し（OVA）を 3 日おきに 5 回投与した。3 週目にている消化管アレルギー患者もしくは好酸球性sacrifice し、空腸における Th2 cytokine や IL-消化管疾患患者の腸管生検組織には空腸はほと25 の発現を qPCR にて測定したところ、OVA 追んど含まれて居らず（内視鏡で到達しにくい）、加投与群と succinate 単独群の間に有意な差は認採取部位の差がこの結果に大きく関与している

められなかった。また、Tuft 細胞数や体重増加を可能性が示唆された。そのため、ヒト検体を用い含めた症状についても OVA 追加投与の影響は認た②の解析は中止した。

められなかった。

③ 食物に対する経腸管感作の機序を検討するこ

3. Succinate を含む飲水を 5 週間行い、2 週目かとを目的として、マウスを用いた基礎的検討を行らは胃内に 50 mg の OVA を 3 日おきに 11 回投った。

与した。5 週目に sacrifice し、空腸における Th2

腸管においては、IL-33 や TSLP の定常状態でcytokine や IL-25 の発現を qPCR にて測定したの発現が極めて低いことから、上皮細胞由来サイところ、OVA 追加投与群と succinate 単独群のトカインとして IL-25 が経腸管感作に関与する間に有意な差は認められなかった。また、Tuft 細と仮説を立て、その検証を行った。

胞数や体重増加を含めた症状についても OVA 追加投与の影響は認められなかった。

1. まず、IL-25 の産生誘導が惹起されることが既に報告されている論文（Immunity. 2018;49:33-

4. Succinate を含む飲水を 5 週間行った OVA 追41）に従い、6 週齢の C57BL/6J の飲水中に IL-加投与群の血清中の抗 OVA-IgE 抗体価は対照群

25 を産生誘導することが知られている succinateおよび succinate 単独群との間に差がなかった。

（100 mM）もしくは対照として同 mol となる食さらに、腸間膜リンパ節から単核細胞を分離し、塩（300 mM）を混入して 7 日間自由飲水させ、in vitro で OVA 刺激を行い、72 時間後の上清中腸管における Tuft 細胞関連遺伝子群の発現をの IL-5 濃度を ELISA にて測定したが、SuccinateqPCR にて検討した。

を含む飲水を行った群においても、OVA 抗原特

その結果、空腸において IL-25 の mRNA が誘異的な IL-5 の誘導は認められなかった。

導され、組織的にも Tuft 細胞数の増加が認めら
5. 6 週齢の C57B6N および C57B6J マウスに対れた。

して、腸管 Tuft 細胞のコハク酸受容体（SUCNR1）53食物に対する経消化管感作の機序、特に IL-25 の役割の解明

以外の味覚受容体の ligand である添加物 A（10,ど不明であった経腸感作の誘導経路と仮説を立

20 30 mM）を飲水中に混入し 3 週間自由飲水さてた IL-25 に関して今回行った一連の実験の結せ、胃体部および噴門部における T2 サイトカイ

果は、IL-25 が腸管感作には全く関与していないンである IL-13 や IL-25 の mRNA 発現や組織学事を強く示唆しており、これ以外の免疫応答を介的な検討を行った。その結果、添加物 A の投与はしている可能性が示唆される。

IL-13 や、IL-25 など Tuft 細胞関連遺伝子群のその一方で、味覚受容体は 40 種類以上が同定

mRNA 発現、好酸球数には全く影響が認められされており、それらの発現分布などについては不なかった。

明な点が多く残されている。今回は特に小腸に分布する Tuft 細胞を標的とした検討を行ったが、それ以外の消化管部位の Tuft 細胞についての検以上から、自然免疫系の活性化（IL-25 の産生誘導を認める）による好酸球性腸管炎症モデルで討を加えてゆく予定である。

は、同時に経口的に投与された抗原に対する特異的な IgE 抗体産生や Type 2 免疫応答は誘導され

参考文献

ず、経口的に摂取された抗原に対する感作に IL-

1) Matsumoto K, Saito H. Epicutaneous im-25 は関与していない可能性が強く示唆された。

munity and onset of allergic diseases - per"eczema"tous sensitization drives the allergy

なお、本研究の前半部分は、第 48 回日本小児march. Allergol Int. 2013;62(3):291-6
2) Tamura S, Shoji Y, Hasiguchi K, Aizawa C,

栄養消化器肝臓学会において発表され、「好酸球性胃腸炎の病態解明および臨床応用へ

Kurata T. Effects of cholera toxin adjuvant onの基盤確立」（松岡 諒，森田 英明，松本 健治）

IgE antibody response to orally or nasally ad-2021 年度

ministered日本小児栄養消化器肝臓学会 若手

ovalbumin.

Vaccine.

1994;12(13):1238-40

優秀演題賞を獲得した。

3) Yang PC, Wang CS, An ZY. A murine modelof ulcerative colitis: induced with sinusitis-

今後の研究活動について

derived superantigen and food allergen. BMC

これまでにアレルギー感作が成立するためには、自然免疫系の活性化による IL-33 や TSLP のGastroenterol. 2005;5:6

産生放出が抗原提示細胞である樹状細胞を活性

4) Nadjsombati MS, McGinty JW, Lyons-Cohen

化して、Naïve T 細胞に抗原提示する際に Th2 細MR, Jaffe JB, DiPeso L, Schneider C, Miller胞への分化を誘導する経路が最も重要であると

CN, Pollack JL, Nagana Gowda GA, Fontana

されて来た。一方、これまで全くと言って良いほMF, Erle DJ, Anderson MS, Locksley RM,54

食物に対する経消化管感作の機序、特に IL-25 の役割の解明

Raftery D, von Moltke J. Detection of Succin-Kamemura N, Kido H, Takahashi T, Ohya Y,

ate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2

Saito H, Matsumoto K. Antigen-specific T-Innatecell responses in patients with non-IgE-medi-Immune

Circuit.

Immunity.

2018;49(1):33-41

ated gastrointestinal food allergy are pre-5) Morita H, Nomura I, Orihara K, Yoshida K,

dominantly skewed to T(H)2. J Allergy ClinAkasawa A, Tachimoto H, Ohtsuka Y, Namai

Immunol. 2013;131(2):590-2

Y, Futamura M, Shoda T, Matsuda A,55