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妊娠期の葉酸過剰摂取が仔の耐糖能に及ぼす影響＜平成 27 年度助成＞

妊娠期の葉酸過剰摂取が仔の耐糖能に及ぼす影響金髙有里（十文字学園女子大学人間生活学部食物栄養学科）

緒

言伝子として知られる INS2 の変動を確認し、PCRによる変動の確認および膵臓のインスリン染色に妊娠期の葉酸の摂取により胎児の二分脊椎症なよって母獣の葉酸過剰による仔への影響を見出し

どの神経管閉鎖障害の罹患リスクを減らせるといた。このことから、特に、妊娠期の葉酸過剰が耐う報告から、葉酸摂取の重要性が見直されるよう糖能異常や免疫に及ぼす影響については、生理学になった。世界的に不足が問題となっていた葉酸的変化および機序について早急に検討すべき課題の普及が行われ、米国では 1998 年より葉酸の穀と考えた。

物への添加が義務化され、海外では 58 か国が葉葉酸はエピゲノム変化におけるメチル基供与体酸強化を行っている。日本では、それを受けて厚として働くことが知られている。その葉酸の機能生労働省が発表している「日本人の食事摂取基準」

性を解明すると同時に、とくに胎児期から出生後において妊娠期の葉酸の付加量が設定され、様々に至る組織学的、生理学的、エピジェネティックな機関の呼びかけにより葉酸サプリメントが普及な変化を DNA マイクロアレイおよびメチル化解してきている。

析により得た候補遺伝子に基づいて具体的に解その背景の中、最近のコホート研究によると、明していくことはきわめて重要な課題と考えられ妊娠期の葉酸過剰摂取によって子の喘息、発がる。さらに、DOHaD 説に基づいた胎児期の栄養ん、白血病の罹患リスクの上昇、発達遅延や耐糖環境に着目した研究は、母体の栄養状態が仔の出能異常などの悪影響を生じる可能性が報告され生後にもたらす疾患の原因究明と治療に新たな道た。この報告は、葉酸を過剰に摂った妊婦の子供を開く可能性がある。このことから、本研究では、において、出生後の疾患リスクに影響をもたらす妊娠期の葉酸過剰摂取が仔に及ぼす影響を検討す可能性を示唆している。今後さらに、国内外におることとしてマウスを用いて出生後の仔の耐糖能いて妊娠期の葉酸サプリメントの普及が予測されを検討することとした。

ることから、疫学の検証とメカニズムの解明が重要となってくる。

方法

したがって、妊娠期の人工性葉酸の過剰摂取

飼料の設定は AIN-93G を①基礎飼料：コントによる仔への影響を検討するため、マウスを用いロール食（2 mg/kg : 葉酸含量）（：以下 CN 群）とし、て妊娠期における葉酸摂取の意義について研究②葉酸過剰食（40 mg/kg）（：以下 FA 群）を作製を行ってきた。その中で、母獣の葉酸過剰が胎児した。特殊飼料の作製はオリエンタル酵母（株）にに及ぼす影響について脳・肝臓の組織において、依頼した。

DNA マイクロアレイを用いて網羅的な解析を行っ実験動物には C57/BL6J 系マウスを用いた。6た。肝臓のマイクロアレイの結果、インスリン遺週齢で購入し、2 週間の予備飼育後に雄マウス 1

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浦上財団研究報告書

Vol.24（2017）匹に対し雌マウス 3 匹を同ケージに入れて交配さ

細胞内代謝と細胞の分化に密接に関与する転写せた。膣栓が確認できた日を 0 日とし、各群に組因子である PPARα、PPARγや、グルコースと成の異なる飼料をそれぞれ与えて飼育した。群は脂質代謝の両方に関与する核内転写因子である2 群に分け、それぞれコントロール食、葉酸過剰LXRαの発現パターンを検討した。

食を与えた。自然分娩させ、出生後児数および 4（ III ）DNA マイクロアレイ解析

日目の体重を確認した。FA 群 は出生時に餌をコDNA アレイ解析と RT-PCR 法にて遺伝子発現ントロール食に切り替え、自由摂食とした。摂食（ エピジェネテイックマーカ―）の 解 析 を 行 っ量は毎日測定した。離乳までの栄養環境を統一すた。 信 頼 性 の 高 い Dye-Swap 法 に 従 い、Wholeるために出生 8 日目に雌雄の確認および仔の数をMouse Genome オリゴ DNA マイクロアレイキット揃えた後、以下の実験に用いた。

（G4122F：アジレント社）を用いてそれぞれの群（ I ）血糖値インスリンの評価の 7 週齢における肝臓の遺伝子発現解析を行った。

出生後 22 日目のマウスを用いて 8 時間（ 7：00（ IV ）統計解析～ 15：00 ）の絶食後、空腹時尾静脈採血を行っ統計解析はエクセルを用いて t 検定を行い、FAた。 さ ら に 50 日 目 で 8 時 間（ 7：00 ～ 15：00 ）群と CN 群の比較を行った。有意水準は p < 0.05の絶食後に空腹時血糖値を測定したあと、Oralとした。

Glucose Tolerance Test（ 以 下、OGTT ）を 行 い、0 分 値、15 分 値、30 分 値、60 分 値、120 分 値 の 血結果糖値を尾静脈採血によりラボグルコ（Fora Care

群の数（出生した母獣のうち、仔を 53 日目まで社）を用いて測定した。53 日目は非絶食下で採血飼育できた数）は、CN、FA 群ともに n = 10 匹ずと解剖を行い、組織を取り出した。いずれのポイつとなった。両群の平均出生児数（各 n = 10）はントにおいても血液（血漿）を用いて血糖値とイン

CN 群 で 6.43±1.99 匹、FA 群 で 5.63±1.03 匹 とスリンの測定を行った。

なり、CN 群の方が多い傾向がみられたが、両群（ II ）臓器組織の評価間に有意差は認められなかった。

解剖時に体重、腹部脂肪組織の卵巣・精巣周囲

出生後 50 日までの平均摂食量（各 n = 10）は、脂肪組織、骨格筋（右足腓腹筋）重量を測定し、摘全ての日において CN 群と比較して FA 群で多く出した組織を用いて免疫組織学的検討を行った。

なる傾向が見られた。FA 群の 1 日あたりの平均

免疫組織学的検討は、摘出した膵臓を用いてイン摂食量は CN 群と比較して出生後 2，3，4，6，7，8，スリン染色を行った。肝臓の組織を用いて real-

9，11，12，14，15，24，49 日目において有意に増加していた（Fig. 1）。
time PCR により炭化水素、脂質、タンパク質等のFig.1 Food Intake
8	6	4	* **� *�

*� *�   *� *� *  *��**� ***�2	0	(g)�� 1	2	3	4	5	6	7	8	
9	10	11	12	13	14	15	
16	
17	18	
19	20	
21	22	(PD day)
平均 CN
平均 FA
���

率(%)♂	 

*p<0.05，**p<0.01,***p<0.001 unpaired t-test* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 unpaired t-test	  Fig.2 Rate of change of blood glucose level 	  	  	  	 
400Fig. 1 Food Intake	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	 300

���Fig,3 Selum insulin concentration
4500	
4000	       **            ***              ***�3500		  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	 

200

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妊娠期の葉酸過剰摂取が仔の耐糖能に及ぼす影響

出生後 4 日目の平均体重は、CN 群で雄 2.54±

15 分 後 2 3 2 ％、3 0 分 後 2 3Fig.1
6 ％、6分 後 1 4 8 ％、Food0Intake0.22g、雌 2.35±0.51g、雌 雄 平 均 2.42±0.37g と120 分 後 79 ％ と な り、FA 群 に お い て は 雄 で 0な っ た の に 対 し、FA 群 で は 雄 2.04 ± 0.23g、雌分 93 ％、15 分 後 196*� ％、30 分 後 215 ％、60 分 後

1.90±0.09g、雌雄平均 2.10±0.24g となり CN 群と比較して FA 群が小さい傾向を示したが有意な差ではなかった。
出 生 後 8 日 目 の 平 均 体 重 は、CN 群 で 雄 4.28±0.69g、雌 3.72±0.50g、雌 雄 平 均 4.14 ± 0.42g*� *�   *� *� *  * **� ***�
* **�
6	
�
167 ％、120 分 後 95 ％、雌 で 0 分 123 ％、15 分 後�
4	8	245 ％、30 分 後 245 ％、60 分 後 170 ％、120 分 後2	106％となった。CN 群と FA 群の比較では、雌の0	�� CN
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21	22	120 分値で群と比較して FA群で有意に高値(g)(PD*p<0.05，**p<0.01,***p<0.001
unpaired t-testを示した（Fig.
2）。
���	  Fig.2 Rate of change of blood glucose level

3.7±0.73g、雌雄平均 3.74±0.48g となり雄ではCN 群と比較して、FA 群の体重が有意に減少していた。
出生後 22 日目の平均体重は、CN 群で雄 8.28±	  変化率(%)♂	 となったのに対し、FA 群では雄 3.81±0.45g、雌7.37±1.02g、雌雄平均 7.76±1.53g となり、出生後より、週数を重ねることにより FA 群の体重がCN 群と逆転し、大きくなる傾向がみられた。
出生後 22 日目の空腹時血糖値は、CN 群では雄で146.5±36.7 となり、雌では 145.4 ± 25.7、雌雄平均が 146.0±31.9 に対し、FA 群では、雄で 132.64±21.6 と な り、雌 で は 130.47±20.17、雌 雄 平 均
131.5±20.5 となった。両群間に差は認められなかった。

300

3500		  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	 100 	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	 3000	
2500	
負荷前	 0153060120（分） 2000	

1500	

300

1000	

200500	1000	0
負荷前	 015CN30FA60120（分）22��**p<0.01,**＊p<0.05，atby unpaired
unpairedt-test
t-test* p<0.05，at each
each time
time point by
Fig.4 Insulin Immunostaining
Fig. 2 Rate of change of blood glucose levelCN

出生後 22 日、50 日、53 日目の血清インスリン値
は、CN 群では 22 日目雄 3318.9±122.5、雌 3633.5

出生後 50 日目における糖負荷前における平均±73.5、50 日目雄 3802.2±117.0、雌 3743.2±120.9、

空 腹 時 血 糖 値 は、CN 群 で は 雄 で 217.6 ± 33.0、53 日 目 雄 3880.6 ± 141.9、 雌 3790.0 ± 298.5 と雌 で 163.4 ± 36.7、雌 雄 平 均 値 は 195.0 ± 43.5 となった。FA 群では、22 日目雄 2965.0±94.7、雌なった。FA 群 では、雄では 155.1±37.3、雌では	  	  	  	  	 日目雄 2618.8±142.1、雌 2702.2
2744.4±186.6、50165.8±46.9、雌雄平均値は 161.0±42.5 となった。

±365.7、53 日目雄 2855.0±386.0、雌 2674.1±239.7

CN 群と比較して、FA 群では雄の平均値、雌雄のとなった。CN 群と比較して、22 日、50 日、53 日い平均値ともに有意に低値を示した。

ずれの値においても、雌雄共に FA 群の血清イン

出生後 50 日目に行った糖負荷試験の結果は、4000	       **    200400変化率(%)♀	 な っ た の に 対 し、FA 群 で は 雄 8.16±1.80g、雌Fig,3 Selum
4500		  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	 00.77g、雌 7.20 ± 1.04g、雌雄平均 7.74±1.05g と	  	  	  	 400

���

スリン値は低値を示した（Fig. 3）。

糖負荷前の血糖値を 100 ％として負荷後 0 分、15

組織学的な検討においては、上述したインスリ分後、30 分後、60 分後、120 分後の値を変化率でン値の違いを検討するため、摘出した膵臓を用い

示 し た。OGTT で は、CN 群 の 雄 に お い て 0 分てインスリン染色を行った。その結果、53 日目の

1 0 4 ％、15 分 後 2 1 8 ％、3 0 分 後 2 4 9 ％、6 0 分 後膵臓では CN 群と比較して FA 群で抗インスリン167％、120 分後 91％、雌においては 0 分 110％、抗体陽性細胞の面積が増加していた（Fig. 4）。

FA	  変	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	 1000	100 	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	 3000	

001 unpaired t-test

ucose level	  	  	  	 

0015

負荷前	 
120300	

3500		  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	 0 	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	 	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	 3000	
2500	
601202000	

CN

30

FA

60120

CN	
FA	

500	

4000	       **            ***              ***�
100
0

2500	
15CN
CN
1000	

200

負荷前	 

060
2000	
Vol.24（2017）＊p<0.05，at each time point by unpaired t-test
1500	
Fig.4 Insulin
Immunostaining

浦上財団研究報告書

Fig,3 Selum
300 insulin concentration
4500		  	  	  	  	  	  	  	 変化率(%)♀	 1	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21	
22	 0(PD day)負荷前	 ������
44400

15CN

30

FA

60

120

22��� 50��� 53���

**p<0.01,***p<0.001unpaired t-test＊p<0.05，at each timeCN	
point by unpaired t-test
Fig.4 Insulin ImmunostainingFA	CN	  	  	  	  	 

1500	

FA
FA

1000	
500	
0	FA

60

120

npaired t-test

22��� 50��� 53���** p<0.01,*** p<0.001 unpaired t-test**p<0.01,***p<0.001unpaired
t-test	  	  	  	  	 Fig. 3 Selum insulin concentration

Fig. 4 Insulin Immunostaininging

DNA マイクロアレイについては仔の肝臓を用いFAて行ったが、現在その結果について解析を進めて生期の葉酸がインスリンの分泌へ及ぼすメカニズムについて検討する必要性を見出した。

いる。
考察とまとめ今後は日本の現状に即し、葉酸過剰摂取が耐糖能や糖代謝にどのような影響を及ぼすかについて、さらなる検討を進めていく必要がある。

母獣の妊娠期の葉酸過剰摂取により、仔の出生後における過食、糖負荷後の血糖値低下抑制、イ謝

辞ンスリン分泌能低下が起こる可能性が示された。

本研究の遂行にあたり、研究助成を賜りました

しかし、インスリン染色により、インスリン陽性

公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団並びに細胞の減弱が見られなかったことから、インスリ関係者の皆様に篤く御礼申し上げます。

ンの産生は保たれている可能性がある。今後、胎22�

**p<0.01,*

FAEffect of high maternal folic acid supplementation on glucose metabolism in mouse offspring

Effect of high maternal folic acid supplementation on
glucose metabolism in mouse offspring
Yuri KintakaDepartment of Food and Nutrition, Faculty of Human Life
Jumonji University
Maternal supplementation of folic acid lowers the risk of birth defects in offspring;hence, many countries encourage periconceptional folic acid supplementation in theprenatal period. Excessive supplementation of folic acid is becoming a worldwide problem.
Our previous investigation on the effect of high maternal folic acid supplementation on
mouse offspring showed that exposure to excessive folic acid in the prenatal period down
regulated the Ins2 gene in the liver and attenuated the number of insulin-staining positive
cells. Therefore, excessive supplementation of pteroyl-monoglutamic acid in the prenatal
period may affect the glucose tolerance of pups. To investigate this, mated C57/BL mice
were divided into two dietary groups and fed the AIN93G diet containing 4 [control group(CN)] and 40 mg folic acid/kg of diet [folic acid group (FA)] in the maternal period. On
postnatal day (PD) 22 and PD 50, fasting blood glucose was compared among the offspringof both groups. The oral glucose tolerance test on PD 50 for the female FA group showeda significantly higher blood glucose rate of change at 120 min post loading. Furthermore,
folic acid had reduced fasting serum insulin concentrations at PD 22, PD 50 (after 8 h offasting), and PD 53 (no fasting). On the otherhand, the difference was not observed in thenumber of insulin-staining positive cells of both groups. In conclusion, our results suggestthat excessive maternal supplementation of folic acid exacerbates the detrimental effect on
insulin secretion and glucose intolerance.

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