July 1998

Vol.66 No.3

化学発光法を用いた超高感度イムノブロッティングキット
ImmunoStar Kit
特

長

内

容

コード No.
291-54603
297-54703● 化学発光法を用いているため、発色法に比べ 数十倍から数百倍の感度が得られます。
● 発光は数時間持続しますので、長時間の露出によりさらに微量のタンパク質の検出が可能です。
● 発色法 や他の化学発光検出法に比べ バックグランドが 低減されています。
● 発光後、メンブランの染色も可能です。
● リプロービングが可能です。
● イムノブロッティングに必要なすべての試薬が そろっています。
1） ブロッキング溶液
130mW
2） 抗マウス（またはウサギ）IgG（H+L）, ヤギ，ビオチン結合（100 ×） 1.3mW3） ABC 原液（100 ×）
1.3mW4） 希釈用緩衝原液（10 ×）30mW5） 洗浄原液（20 ×）
2 × 165mW
6） 発光溶液 A
70mW7） 発光溶液 B
70mW8） 発光溶液 C
30mW
品

名

規

格

包

装

希望納入価格（円）ImmunoStar Kit for Mouse

ブロッティング用 1000cm2 用

25,000ImmunoStar Kit for Rabbit

ブロッティング用 1000cm 用

25,0002

キットの性能につきましては、p.9 をご参照下さい。

Wako

目 次
化学大家
「アントン ヘールツ」
芝 哲夫……… 2
総説「重水素標識化ヌクレオシドの構造生物学への利用」
川島 悦子……… 6「Cap Site cDNATM の開発と有用性」
嶋本 顕、古市 泰宏……… 10シリーズ＜ Talking of LAL ＞「第 32 話 エンドトキシンとサイトカイン」
土谷 正和……… 16＜ How to アポトーシス＞「第 3 話 アポトーシスの検出法− DNA 断片化の解析法」
塩川 大介、丸田 英晴、田沼 靖一… 18＜免疫一口メモ＞「インスリン依存型糖尿病における遺伝的背景および液性免疫の意義」
今村 稔、青木 矩彦……… 22
テクニカルレポート「大気中のアルデヒド、ケトンの HPLC 分析」
上森 仁志……… 28
新製品フラッシュ
イムノスターキット……………………… 1,9E-4031、TGF-B（ヒト）、他………………… 5
1
トリス（トリメチルシリル）
シラン-d,99%…… 8㈱ニッポンジーン Cap Site cDNATM…… 13
DNA エキストラクター WB ラピッドキット… 14㈱ニッポンジーン Drop PCR キット、他… 15
リムルス PS シングルテストワコー………… 17
アポトーシスラダー検出キットワコー ………19
抗プレセニリン-1（N- 末端），ヤギ、パラフィ
ン切片染色用 Fas、Fas-L 抗体 …………20
Genzyme 社 アネキシンⅤキット………… 21
幹細胞因子，マウス，組換え体、血球染色試
薬 ……………………………………………23
病理用パラフィン パソプレップ 568、他… 24
水質試験用試薬、
トルエン……………… 25
32 種農薬混合標準液、他………………… 26
ミクロシスチン分解物標準品…………… 27
ダイオキシン類分析用化学修飾シリカゲル … 29
プレセップ -C シリーズ………………… 30
クロマトシート……………………………… 32
お知らせ

STRATEGIC DIAGNOSTICS INC. DIOXIN
RISC TEST 大幅値下げ、スチレンダイマー・ト
リマー近日発売、お客様相談室開設……… 31

1

379

アントン ヘールツ（1843 1883）
大阪大学名誉教授

哲夫

明治初年に来日し、長崎医学校でを迎えようとしたが、ヘールツはこの化学を教授し、京都、横浜司薬場創設

時、長崎病院に入院中であったので、に参画し、日本薬局方草案を作成する

代わりにドイツ人 G. マルチン Martinなど、わが国の化学教育、衛生行政にがその監督となった。ヘールツは病気尽力して、日本を愛し、日本に骨を埋回復後、明治 7 年（1874）に上京して、

めたオランダ人薬学者 A. ヘールツに

長与局長の顧問となって直接わが国ついて紹介する。

の衛生行政にたずさわることとなった。
明治 8 年（1875）、京都司薬場が新Anton Johannes Cornelis Geerts
ヘールツは 1843 年 3 月 24 日にオラン
ダのオウデンデイク Oudendijk に言設されるやヘールツはその監督となっ語学者の子として生まれた。ユトレ

省から内務省に移され、新たに衛生局

ヒト大学薬学科に学び、当時のオランと改称された。京都司薬場はその前にダ化学の中心人物であった G. J. ムル

開設されていた京都舎密局の設備をて赴任した 5）。この時、医務局は文部

1,2）

ダー Mulder に嘱望されて、卒業後ユ借り受けることになったが、その代わりトレヒト陸軍軍医学校の化学教官に就にヘールツは舎密局の生徒に理化学、任した。この学校からは多くの医官が動植物学、鉱物学の講義を行った。そ写真 1. アントン ヘールツの時の講演記録「京都舎密局開業記」

長崎の出島に派遣されていた。それが機縁になってヘールツも日本に深い

幾何、機械学、物理学、解剖学、生理が残されている 6）。同年 7 月には第 1

関心を持つに至った。特に長崎商館医学、病理学とともに化学として、無機回薬舗開業試験が全国に先駆けて京として日本人に化学教育を行ってオラ

化学、有機化学の講義が行われた

2,4）

。

都府において実施された。そのためのンダに帰国した J. K. ファン・デン・ブ

ヘールツは間もなく長崎生まれの十講習会でヘールツは物理学、化学、薬

ルク Van den Broek の日本について歳年下の山口きわと結婚した。来日し剤学、などの教授を行った。わが国薬の講演を聴いて日本行きの夢が掻きて日本人妻と結婚するが、帰国に際し

剤師教育の最初であるといえる 2）。京立てられた。

て別れて帰るお雇外人が多い中で、都時代のヘールツは周辺の鉱物、生ヘールツはその死まできわと添い遂

薬類を収集し、明治 8 年（1875）
の第 4

3）

ヘールツは 1868 年（明治元年）に長崎医学校予科の理化学教師として推げた。

回京都勧業博覧会に多くの鉱物標本薦され、翌年 7 月 1 日に長崎に到達しヘールツは長崎医学校で輸入薬品を出品して銀メダルを贈られた。またた。長崎では幕末に精得館でオランを教材として分析実験を行っていた関

その頃、有馬温泉や平野鉱泉の成分

ダ人教師による医学教育が行われて係で、不良薬品の取締りが急務である

分析も行っている。

いたが、維新に際して、それが明治政1月ことを痛感した。明治 6 年（1873）

ヘールツは京都滞在中に長与衛生

府の下に長崎医学校として再出発すに長崎在住のオランダ人 A. ファン・局長の委嘱を受けて大阪司薬場監督

ることになり、長与専斎校長がオラン

デ・ポルの贋造薬品取締要望書にヘーB.ドワルス Dwars と協力して、わが国

ダ人教師 C. G. ファン・マンスフェルト

ルツは見本のキナ塩の分析を行った

最初の「日本薬局方」の蘭文草案の作

Van Mansvelt と謀って学制改革を計

結果を添えて長崎税関に提出した。こ成を開始した。これは「オランダ薬局

画し、予科の理化学教師に新たにヘーのことが契機となって、同年 9 月に文方」第 1 版をもとにして作られたもので、ルツが迎えられたのである 。医学教

部省から司薬場設置の伺書が出され、ヘールツが横浜司薬場に移った後の育の基礎としての理化学の重要性が翌年には東京司薬場が開設される運明治 10 年（1877）に完成したが、その改めて認められたからである。

びとなった。ヘールツの長崎での具申原稿は原稿紙 588 枚に及ぶ厖大なもがわが国の衛生試験所の発端を開いのであった。明治 14 年（1881）にはたといえる。

ヘールツは日本薬局方制定委員に任

1）

この長崎医学校でヘールツに学んだ京都の小石第二郎の記録によると、

2芝

6 年間の修業年限の中の最初の 2 年間

当時の文部省医務局長であった長ぜられた。しかしオランダ薬局方が改が基礎教育に充てられ、算術、代数、

与専斎はこの東京司薬場にヘールツ

正されたこともあり、その後まもなく

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

ヘールツが急逝したので、その苦心のヘールツには化学、薬学、衛生学の

このほかに、ヘールツの著書として、草稿（写真 2）は遂に公にされることな本業の他に、日本研究や鉱物学研究

成嶋謙吉訳『日本温泉獨案内』明治 12

く、現在も国立医薬品食品衛生研究所の業績がある。前者については明治 2年（1879）、桑田知明訳『日本温泉考』（旧 国立衛生試験所）に保管されてい年（1869）から 6 年（1873）にわたる間

明治 13 年（1880）が知られている。こる 。明治 19 年（1886）に公布されたの日本の政治、教育、貿易などに関すれらは明治 14 年（1881）のフランクフ

最初の日本薬局方はオランダ薬局方

る詳細な調査報告に独自の論評を加ルトにおける万国博覧会に、ヘールツ

第 2 版によって 作 成され たもの で、えて、1 年毎にオランダで発表されたが内務省衛生局から依頼され、日本全ヘールツの草案は結果的には利用さものが和訳されて、『ヘールツ日本年

国の温泉成分分析を行った報告書に

れなかった

報』
として出版されている 。この期間当たるものである 2）。また明治 13 年

明治 9 年（1876）に、京都司薬場はは日本という国が近代化に向けて未（1880）の政府刊行『日本鉱泉誌』もこ

薬物が外国から到着する臨海都市か

曾有の変革を迫られた時で、それに対の時のヘールツの力に負うものであら遠いという理由でわずか開設 1 年半する外国人から見た貴重な観察と意る 8）。なおユトレヒトの陸軍軍医学校時

後に閉鎖されることになった 5）。ヘー

見に満ちている。しかしその底を流れ

7）

1,7）

1）

。

ルツは京都を去り、一時マルチンの任ているものはヘールツの日本に対する期満了で空席となっていた東京司薬

暖かい愛情で、イギリスに対する激し

場の監督代行を勤めたが、明治 10 年

い対抗意識や、キリスト教に対する厳代に Beginselen der quantitatieve
analytische scheikunde ten bruike
bij het hooger en middelbaar onderweijs, 1867 （中等高等教育用定量分（1877）に新設の横浜司薬場の監督としい批判も見受けられる。後者の鉱物

析化学の基礎）の著作がある。

なって赴任した 。横浜司薬場では
ヘールツは分析技術、製薬法の指導学研究に関しては、明治 8 年（1875）から 10 年（1877）
にかけて行われた研分けの伊藤圭介と親交があった。明治に力を注いだ。たとえば、サルサエキ

究結果が和蘭陀教師ア・ヱ・セ・ゲー

15 年（1882）の圭介の 80 歳誕生祝賀

スやヒヨス油浸など 100 種の生薬製

ルツ著『新撰本草綱目』第壱、貮篇会に招かれたヘールツは「日本の植物剤はその純度を判別し難いので薬品学者伊藤圭介の 80 歳誕生祝賀会」として、長浦消毒所や避病院の設立に

礦物之部 明治 11, 16 年として発表された（写真 3）。内容は全文フランス語で書かれた Les Produits de la
Nature Japonaise et Chinois 18781883 である。これは『本草綱目』その奔走し、検疫停船規則や伝染病予防

他の和漢書のうちの鉱物の部分を系

規則の制定に尽力した 1,2）。

統的に調べて解説したものである。

8）として取り扱わないように衛生局に上申してそれが認められた。またコレラの流行に際して、神奈川県当局と折衝

写真 2. ヘールツ
「日本薬局方草案」稿本
国立医薬品食品衛生研究所（旧 国立衛生試験所）蔵

またヘールツは日本の植物学の草題する一文をオランダの学術雑誌に投稿している 2）。ヘールツはまた日本アジア協会副会長を勤めて、同協会の Transaction などに 20 数報の日本に関する報告を発表している 1,2）。
このような日本の深い理解者ヘール

写真 3. ヘールツ著『新撰本草綱目』
内容はフランス語で書かれている

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）3

写真 4. 横浜外人墓地のヘールツと夫人きわの墓碑

ツ は 横 浜 に 在 勤 中 の 明 治 16 年

月 16 日に 81 歳で亡くなり、ヘールツ（1883）腸チフスに罹り、同年 8 月 30
日 忽 然と世を 去った。享 年 40 歳 であった。後には愛妻きわとともに 6 人の墓の傍らに葬られた。最近になって、の幼い娘が残された。日本政府は勲子（きわていこ）のことが日本で知られ四等、旭日小綬章を贈ってその功に報るようになった 9）。この人こそヘールツ

いた。ヘールツに深い信頼を置いていの残した娘の子、つまり孫娘で、横浜た長与専斎はヘールツの娘達を手厚に生れ、17 歳でミラノへ渡り、蝶々夫

く庇護するとともに、横浜の外人墓地

人で欧州オペラ界にデビューしたレに白亜大理石の墓碑（写真 4）を建ててその死を惜しんだ。さらに明治 24 年
（1891）8 月 30 日の没後 8 年目の祥月

クリンゲンであった。喜波貞子は祖母命日に専斎の発起で上野谷中天王寺の薬学の恩人ヘールツの残した余韻

墓地内にヘールツの顕彰碑が建立さであった。

第二次大戦中の欧州でオペラ蝶々夫
人で名声を博したプリマドンナ喜波貞

ティツィア・ジャコバ・ヴィルヘルミナ・
きわを慕ってつけた芸名である。日本

れ、専斎の撰文でヘールツの功績が御教示を賜った向井晃氏と写真撮称えられた。この顕彰碑（写真 5）は現

影の御便宜をおはかり下さった田中彰

在、世田谷用賀の国立医薬品食品衛氏に厚く感謝申し上げます。

生研究所（旧 国立衛生試験所）前庭に移されている 1,8）。
ヘールツ夫人きわは麻布でドレスメーカ−を経営する娘のもとに身を寄せて余生を送り、昭和 9 年（1934）114

写真 5. 国立医薬品食品衛生研究所（旧 国立衛生試験所）
構内にあるヘールツ顕彰碑

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）〔参考文献〕
1）庄司三男訳『ヘールツ日本年報』新異国叢書 第Ⅱ輯 5、雄松堂出版、昭和58 年。
2）庄司三男「A. J. C. ヘールツの生涯とその業績」日蘭学会会誌、9（2）,157（1985）。
3）芝哲夫「河野禎造」和光純薬時報、61（3）, 1（1993）。
4）松田清「小石第二郎とヘールツ」究理堂創設 200 年記念講演、京都、京都医学史研究会 日本医史学会関西支部、
洋学史学会、平成 9 年 5 月 18 日。
5）芝哲夫「明石博高」和光純薬時報、65（3）,1（1997）。
6）向井晃「お雇い外国人 A.J.C. ヘール
ツの「京都舎密局開業記」」東海大学紀要 課 程 資 格 教 育 センター 第 2 号、
25（1971）。
7）江本龍雄「ゲ−ルツの日本薬局方蘭文草案（1877）について」医薬品研究、14（3）,457（1983）。
8）『国立衛生試験所百年史』国立衛生試
験所、昭和 50 年。
9）松永伍一『蝶は還らず−プリマ・ドンナ
喜波貞子を追って』
毎日新聞社、1990。

細胞内シグナル伝達研究用試薬
細胞内シグナル伝達研究用試薬
K+ Channel Blocker
E-4031

O

H
S N
O

N

生化学用

N

O
・2HCl・2H2O

神経細胞、筋細胞をはじめとする興チャネルブロッカー E-4031 は、筋細奮性細胞の機能を巧妙に調節してい胞の脱分極後の再分極の際、遅延整る多種多様な K チャネルは、電位依流 K 電流の内の rapid な成分 Ikr を選

存性 K チャネル（遅延整流、A 電流）、

択的に抑制します。

＋＋

C21H33Cl2N5O5S=510.48〔規 格〕
含量（HPLC）：98.0% 以上
水 溶 状 ：限度内

内向き整流型、Ca2＋依存性 K ＋チャネ筋に分布する K ＋チャネルのパネリ＋

ル、ATP 感受性 K チャネルなどに大ング、メタンスルホンアニリドをもつ薬

きく分類されます。

剤の開発補助手段のツール 等、K ＋

056-06521

チャネルの持つ様々な機能研究に用052-06523

いられます。

050-06524

抗不整脈薬

群薬の基本骨格の一つメタンスルホンアニリドをもつ K

＋

1mg
10mg
100mg

照

会

照

会

照

会

TGF-β1 【Transforming Growth Factor-β1 】from Human Platelets
生化学用群を加速し、B アミロイドの沈着を促進

TGF-B1 は細胞の増殖と分化の調節、骨形成の促進、コラーゲンとフィブロさせた報告がなされています。この様

ネクチンの産出促進、そして造血過程に TGF-B と そ の 受 容 体、活 性 化になど多くの重要な役割を演じている、

よって起こるシグナル伝達物質との相

分子量約 25kDa の２量体タンパク質関関係が現在も詳しく研究されていまです。TGF-B は細胞膜上の受容体にす。

結合し細胞内のシグナル伝達分子を〔参考文献〕

介する事によりシグナルを細胞核に伝5）Wyss-Coray, T., Masliah, E., Mallory,
M., McConlogue, L., Johnson-Wood,
K., Lin, C. and Mucke, L.: Nature,389, 603（1997）.

202-14231

40,000 円

2Fg1）Takaku, K., Oshima, M., Miyoshi, H.,
Matsui, M., Seldin, M.F. and Taketo,
M.M.: Cell, 92, 645（1998）.
2）竹之下誠一、茂木晃、宮園浩平 : 生体の科学 , 48, 502（1997）.
3）辻 孝、中村敏一 : 実験医学 , 8, 330（1990）.
4）Wakefield, L.M., Lioubin, M.N., Purchio, A. F. and Marquardt, H.: Mol.
Cell. Biol., 8, 4162（1988）.

えます。Smad の様なシグナル伝達分子の異常や細胞周期を制御する遺伝
子に異常があると TGF-B から正確なシグナル伝達が伝わらなくなり、正常細胞のがん化を引き起こす事が指摘されています。また、マウスを用いたモデル実験ではアルツハイマー症候

Poly-L-lysine Hydrobromide
0.1w/v% Poly-L-lysine Solution
生化学用
細胞膜が負に帯電していることから細胞をマトリックス / 支持基材に安定に吸着・保持するのに汎用されています。
特にポリ-L- リシン臭化水素酸塩の水溶液（0. 1%w/v）は調製することなくそのままでスライドガラスに塗布でき、〔参考文献〕
1）河田光博、森本昌史、由利和也、森田
規之 : 第 18 回組織細胞化学講習会 組
織細胞化学 1993, p76（1993）.
2）Tanaka, Y., Meera, P., Song, M., Knaus,
コード No.
160-18641

品

H-G. and Toro, L. : J. Physiol., 502.
3, 545（1997）.
3）病理技術研究会編 :「病理標本の使い方」，p.34,（分光堂）（1992）.

名容

Poly-L-lysine Hydrobromide

M.W. 1,000 〜 4,000

Poly-L-lysine Hydrobromide

M.W. ＞ 300,000

組織切片の固定・免疫組織染色に汎用

166-18643

されます。特に切片をプロテアーゼ処

167-18771

理したり、インキュベーションが長時

163-18773

間に亘るような時に有用な試薬です。

167-18651 0.1w/v% Poly-L-lysine Solution

量

希望納入価格（円）

100mg
500mg
100mg
500mg

10,000

100mW

9,000

35,00010,60038,000

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）5

重水素標識化ヌクレオシドの構造生物学への利用
東京薬科大学 薬学部

DNA およびタンパク質の立体構造併せて紹介する。

分野が 1980 年代末からヨーロッパをび（2'S）-2'- デオキシ [2'-2H] リボヌク

核酸の構造解析- および（2'S）-[2'-2H]を用いて（2'R）

どの様なコンホメーションをとってい核酸の全体構造は、主としてフラるかを解明する手段としては、主としノース環のコンホメーション（糖部パッて X 線解析と NMR 法が中心に用いらカリング）と糖−リン酸バックボーンのDNA 10-mer [d（G *C*A*T*T*A*
A*T*G*C*）] をそれぞ れ 合 成した。
京極先生らによりこの標識化 DNA 10mer の糖部分の詳細な解析が行なわれ た 3）。図 2 に 未 標 識 体（中 央）、
2（2'R）- および（2'S）-[2'- H]DNA10mer の 2' 位の領域の DQF-COSY を[ 2'R）- 体：左、示す （（2'S）- 体：右 ]。この NMR チャートから明らかな様に特れている。NMR 法には安定同位体でねじれ角の幾何構造とあわせて定義

定部位を高立体選択的に重水素化し標識された化合物が有用であるが、安される（図 1）。この際、核酸の NMR ス

たオリゴマーを用いると、NMR のシ

定同位体標識化ヌクレオシドの化学は

ペクトルは、繰り返し存在するフラノー

グナルが劇的に明瞭になった。この結アミノ酸のそれと比して出遅れており、ス部分がかなり複雑なシグナルにな

果この 配 列 で そ れまで 帰 属 でき な

現在のところ DNA 側から得られる構る。特に 2' 位および 5' 位のメチレンプ

かった 2' 位のプロトンのシグナルが帰属でき、さらにパッカリングの決定に中心に発展してきた。遺伝子の発現段

核酸とタンパク質の相互作用、ある階には、RNA を合成する酵素タンパ

いは tRNA やリボザイムの様な核酸同ク質以外にも調節を行うタンパク質が士の相互作用の解明には、その構成種々知られている。このようなタンパク

単位の各ヌクレオチドの構造解析が重質と DNA とが認識している複合体が要な役割を担っている。

造情報はタンパク質側に比して少な

ロトンは重なり合いが激しく、H2' およい。そこでこの安定同位体標識化ヌクび H2" あ る い は、H4'、H5' お よ び

レオシドの効率的合成法を開発し、そH5" の帰属は困難であり、そのため正の合成法で得られた安定同位体標識

確な情報が得難い。このような問題の化オリゴマーを用い、核酸側からの正解決方法として、重水素で標識された確な情報を得ようと NMR 研究者と共オリゴヌクレオチドを用いた構造解析に研究に取り組んだ。今回は安定同位が行われるようになった。

体の中の最も汎用されている重水素に焦点を絞り、オリゴマーの構造解析、更に特定部位を重水素化したヌクレオ

核酸の糖部パッカリングの解析

チドを組み込んだオリゴマーを利用し糖部分の詳細なパッカリングの解析た薬物による DNA 切断機構の解明もとして、まず高立体選択的（2'R）- およ

図 2 d(G＊C＊A＊T＊T＊A＊A＊T＊G＊C＊) の 2' 位の領域の DQF-COSY

6

悦子

レオシド類の合成法を開発 1、2）し、これをもとに生命現象を理解しようとする
構造生物学（structual biology） の川島

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

図１

必要な結合定数が正確に求められ、それらのコンホメーションを決定することができた。

核酸の糖−リン酸バックボーンの構造解析
糖−リン酸バックボーンの NMR による構造解析は 、解析に必要な H4'、H5' および H5" のシグナルが同じ領域に現れ複雑に重なり合うため非常に困難である。 そこで筆者らは（5'R）/（5'S）比に偏りをもたせた 2'- デオキシ

図３[5'-2H] ヌクレオシド類の合成法 4）を開発した。次いで、甲斐荘先生らによりこ

そのラジカルが DNA 鎖を切断したり、定部位の、あるいは高ジアステレオ選の（5'R）/（5'S）比に偏りをもたせた

DNA- タン パク質架橋構造を形成し択的な標識化は有機化学的合成法に[5'- H]DNA 12-mer [d（C*G*C*G*A*A*T*T*C*G*C*G*）] の 解 析 が2D HSQC 法を用いて行われた。その結果、5' 位の全てのプロトンの帰属がたりすることに着目し、この機構を解頼らざるを得ない。

達成され、さらに現在まで小さくて測

オキシ [2'-2H] アデノシンのそれぞれ

現在重水素標識化ヌクレオシド類の定不可能だったリンと 5' 位のプロトンとの J 値（カップリング定数）が求めらを、5- ハロウリジル酸残基の 5' 側に組-2'合成法のうち（2'R）- および（2'S）

み込んだヘキサヌクレオチドを合成し、デオキシ [2'-2H] ヌクレオシドの合成

れた 5）。

それらの光反応を行ない 1' 位および法は、Robins ら 8） 、Chattopadhyaya

2' 位の水素の引き抜き機構を検討しら 9）、および筆者ら 1、2）によりほぼ確立さた。 各々について速度論的同位体効れている。筆者らは、ジアステレオ選果を測定した結果、図 3 に示すように択性を高めるべく、分子運動を抑制さ

2

薬物の DNA 鎖切断機構の解明

明することを試みた。筆者らと共同研
究により、高ジアステレオ選択的に重水素化した（2'R）- および（2'S）-2'- デ

立体選択的重水素標識化ヌクレオシド類の合成：を利用すれば、抗腫瘍性抗生物質や1' 位で水素の引き抜きが起こると共に、 せるため保護基および反応温度、さら2' 位では 2"- 水素が引き抜かれ切断にその温度で作用するラジカル開始
7）
剤を検討し Bu3Sn2H を重水素化試薬が開始されることを明らかにした （図3）。
として、98%de（ジアステレオ過剰率）
このような高次の構造解析、機構解
以上の（2'R）-2'- デオキシ [2'-2H] ヌク

合成 DNA 切断剤による DNA 鎖の切明を可能ならしめたのは特定部位の分子内のある原子を同位体で置換した時、物理的、化学的挙動に差を生じることを同位体効果という。 特定部
位を重水素化しこの種の同位体効果

レオシドを合成する方法を開発した。

断反応の機構が解明され、DNA 鎖切高立体選択的重水素標識化ヌクレオ

ところで近年ラジカル還元剤としてト

断分子の認識機構に関する重要な情シド類の有機化学的合成法を達成しリストリメチルシリルシランの研究が報 が 得られ ることに な る。 抗 癌 剤

た成果による。そこで最後にそれらの報告 10） されている。この試薬と Bu3

bleomycin（BLM）は鉄あるいはコバ
ルトと安定な錯体を形成し DNA を切断すると報告 6）されており、4'- 位に重合成法を記したい。

SnH の 供与水素原子とケイ素原子お水素を導入したチミジンを組み込んだオリゴマーを用いることによりその機構が証明されている。

よびスズ原子との結合エネルギーと重水素標識化ヌクレオシドの合成法

結合距離を比較すると、（Me3Si）3SiHのほうが結合エネルギーは大きく、結合距離は短い。このため（Me3Si）
3SiH

安定同位体標識化合物の合成法はは反応の遷移状態において発生した

杉山先生らはイドクスウリジンの様（a）安定同位体標識微生物から抽出すラジカルに、より接近しなければならな抗腫瘍活性を持つ 5- ハロウリジルる方法（抽出法）（b）微生物発酵法にない。さらに、Bu3SnH の 3 つブチル鎖酸を含む DNA に光照射を行うと、ウリより生産する方法（発酵法）（c）有機はフレキシブルで有るのに対し、（Me3ジル酸部の 5 位にラジカルが形成され、化学的合成法に分類される。しかし特Si）3SiH の 3 つの Me3Si 基は混み合っ

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

7

ているためかなり固定されている。このため（Me3Si）
3SiH は発生したラジカルの周囲の立体障害に大きく影響される。これらの特徴を有する重水素化[ Me3Si）3
トリストリメチルシリルシラン（
Si2H] を重水素化剤とすれば、高立体
選択的重水素化体が得られると予測される。さらに反応温度を− 78℃ という低温にしなくても高い立体選択性が2
得ら れ ると 推 察し、（Me3Si）
3 Si H を

Bu3Sn2H の代わりに用いる検討を行った。 その結果、Bu3Sn2H では− 78℃という低い反応温度で初めて得られる

98%de 以上の高ジアステレオ選択比
2を、（Me3Si）
3Si H では室温で達成できることを見出した 11）。 反応式（Scheme 1）と得られた NMR チャート
（図 4）

Scheme 1を示す。
さらに最近問題になっている環境ホルモンには、船の塗料である有機錫化合物も対象になっている。使用量は少ないといえ Bu3Sn2H は反応後生成す
るヘキサブチルスタノキサンの毒性が強く、しかも反応混合物からの完全

図 4 上：未標識 ,下：室温で (Me3Si)3Si2H で重水素化な分離が困難であるのに対し、（Me3

Si）3 Si2H は無害であり、分離も容易である。このことから、この試薬は今後さらに利用価値が増大すると考えられる。

おわりに重水素化ヌクレオシドの構造生物学への利用の一端を述べた。生命のしくみの研究は今後益々盛んになり解明がなされてゆくことであろう。その中で、NMR 法に有用な安定同位体標識
化合物の効率的合成法がさらに開発されるならば、生命のしくみの詳細な解明に寄与できると期待される。
〔参考文献〕
1）Kawashima, E., Aoyama, Y., Sekine,T., Miyahara, M., Radwan, M. F.,
Nakamura, E., Kainosho, M., Kyogoku,
Y. and Ishido, Y. : J. Org. Chem., 60,
6980-6986（1995）.
2）Kawashima, E., Aoyama, Y., Miya-8

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

hara, M., Sekine, T., Radwan, M. and
Ishido, Y. : Nucleosides & Nucleotides, 14, 333-336（1995）.
3）Kojima, C., Kyogoku, Y., Ishido, Y.,
Kawashima, E., Sekine, T. andKainosho, M. : Nucleic Acides Symp.
Series., 29, 185-186（1993）.
4）a）Kawashima, E., Toyama, K., Ohshima, K., Kainosho, M., Kyogoku, Y.
and Ishido, Y. : Tetrahedron Lett., 36,
6699-6700（1996）.
b）Kawashima, E., Toyama, K., Ohshima, K., Kainosho, M., Kyogoku, Y.
and Ishido, Y. : Chirality, 9, （5/6）,
435-442（1997）.
5）Ono, A., Makita, T., Tate, S., Kawashima, E., Ishido, Y. and Kainosho, M. :Mag. Res. in Chemistry., 34. s40-s46（1996）.
6）Sugiyama, H., Sera, T., Dannoue, Y.
and Saito, I. : J. Am. Chem. Soc. , 113,
2290-2295（1991）.
7）Sugiyama, H., Saito, I., Kawashima,E. and Ishido, Y. : Tetrahedron Lett.,
37, 1805-1808,（1996）.
8）Robins, M. J., Wilson, J. S. and Hansske,

F.: J. Am. Chem. Soc., 105, 4059-4065（1983）.
9）Pathak, T., Bazin, H. and Chattopadhyaya, J. : Tetrahedron, 42, 5427-5441（1986）.
10）a）Kanabus-Kaminska, J. M., Hawarii,
J. A., Griller, D. and Chatgilialoglu,
C. : J. Am. Chem. Soc., 109, 52675268（1987）. b）Giese B., Kopping B.
and Chatgilialoglu, C. : Tetrahedron
Lett., 30, 681-684（1989）.
11）Kawashima, E., Uchida, S., Miyahara,
M. and Ishido, Y. : Tetrahedron Lett.,
38. 7369-7372,（1997）.

Tris(trimethylsilyl)silane-d,99%
201-14181

200mg

25,000 円

化学発光法を用いた超高感度イムノブロッティングキット
ImmunoStar Kit
ドットブロッティングやウエスタンブロッティングなどイムノブロッティングでは、通常、標識酵素による発色反応が用いられています。しかし、ますます微量化する試料に対し、濃縮や精製といった煩雑な前処理操作を行うことなく、目的のタンパク質を容易に検出できる高感度検出法が求められるようになりました。
本イムノスターキットは、独自のエンハンサーを用いたルミノール−ペルオキシダーゼ検出システムに基づいております。
ストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（ABC）と増感させた化学発光検出系を組合わせた本キットは、RI法の感度に匹敵する程、高感度に目的のタンパク質を検出することができます。
実用例

0

6

12

18h

サンプル：ウサギ IgG
サンプル：抗 Fas 抗体処理 HepG2 細胞（左より 10,5,2.5,1.25,0.625,0.313,0.156,0.078pg）
一次抗体：抗ウサギ IgG(H+L), ヤギ
露出時間：1 分

一次抗体：抗ヒト活性化 Caspase-3, ウサギ
露出時間：3 時間
操作法

ドットブロッティング
洗浄ウェスタンブロッティング

リプロービング

５分×２

乾燥（風乾）

メンブランの浸潤

ブロット

トランスファー

抗体の除去※
室温、10分間

乾

洗浄

洗浄

燥

５分×２

ブロッキング
洗浄

37℃、１時間

１次抗体反応37℃、１時間５分×３

２次抗体反応洗浄

７M塩酸グアニジン、
50mMグリシン、
0.05mM EDTA・３Na、0.1M塩化カリウム、20mM ２−メルカプトエタノール

※

５分×２

洗浄

10分×２

37℃、20分間
５分×２

ＡＢＣ反応 室温（または37℃）
、20分間
洗浄

５分×３

発光反応

１分間

露出 通常30秒〜１時間

コード No．

品

名

規

格

包

装

希望納入価格（円）2用

25,00025,000291-54603

ImmunoStar Kit for Mouse

ブロッティング用

1,000cm

297-54703

ImmunoStar Kit for Rabbit

ブロッティング用

1,000cm2 用

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

9

Cap Site cDNATM の開発と有用性
エイジーン研究所

嶋本

顕、古市

泰宏

はじめに
cDNA クローニングを行う研究者なら必ず直面するであろう問題の一つに翻訳開始コドン（first ATG）の同定がある。Northern blot 解析などから、たとえ mRNA のサイズがわかっていたとしても、得られたクローンの 5' 末端
まで Open reading frame（ORF）が続いていれば、さらに上流に first ATGが存在する可能性を否定できないであろう。また転写調節領域の解析をするためには、その遺伝子の転写開始点の正確な同定が必須であるが、既存の primer extension や S1 mapping といった方法には実験操作の煩雑さや

図１. Cap Site cDNATM の作製（A）と Cap Site PCR（B）

正確な転写開始塩基の同定ができな
いといった問題がある。さらに近年進れ 2）、この構造が mRNA の安定化や我々は TAP の精製に最大の努力を傾められているゲノム・プロジェクトにお転写・スプライシング、及び翻訳等の注し、満足できる標品を得るに至り、いては遺伝子構造から機能へという研mRNA の機能に重要な役割を果たし

Cap Site cDNATM の 作 製 が 可 能 と究の流れがあり、翻訳開始コドンと終ていることはすでに知られている 3, 4, 5）。

なった。

止コドンを含む 5' 末端から 3' 末端までの情報が重要視されている。これらのmRNA に タ バコ酸 性 ピロホ スファ
ターゼ（TAP）を作用させるとキャップ

た PCR により遺 伝 子の cap site をク

必要性から我々は遺伝子の転写開始

構 造のピロリン 酸 結 合が 水 解され、ローニングすることができる（図 1 − B）。

点 （cap site） を塩基レベルで研究者

キャップ 構 造が 除 去されるとともに後述するように、Cap Site cDNATM にが確信をもって決定できるシ ステム

Cap Site cDNATM を開発した。ここでCap Site cDNATM の特性とその有用

mRNA の 5' 末 端 に はリン 酸 基（5'monophosphate）が残る。このリン酸基を介して rOligo を T4 RNA リガー

ンス・プライマーが用意されているの性について紹介する。

ゼでつなぐことによりオリゴキャップ

当するアンチセンス・プライマーと組
み合わせれば、PCR によって目的遺mRNA の 5' 末端に特定の配列をもつ
RNA oligo（rOligo）
をつなげ、これをRNA を 作り、次 い で random hexamer との逆転写反応により、mRNA の
5' 末端が rOligo に置換した Cap Site
cDNATM が構築される。
以上の反応に供ずる mRNA はあらかじめホスファターゼ（Calf intestine
alkaline phosphatase）で処理している鋳型にして逆転写反応を行って得られため、リボヌクレアーゼ等により部分

る single strand cDNA である。図 1 −

分 解 され た mRNA は Decapping とA にその作製工程を示す。真核生物の mRNA の 5' 末端に m7Gppp からな

rOligo-ligation の系には関与しない。
即ち、Cap Site cDNATM は TAP が高る キャップ 構 造 が 存 在 す ること は純度でヌクレアーゼを含まない限り、1975 年 Furuichi らに よ って 報 告 さキャップ 依 存 的に 作られる。実 際、

Cap Site cDNATMCap Site cDNA は、丸山・菅野のTM

オリゴ キャッピン グ 法

10

1）

をもとに、

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

この Cap Site cDNATM を 鋳 型にしは rOligo 配列に相当する 2 種類のセで、目的の遺伝子の cDNA 配列に相伝子の転写開始塩基を含む 5' 上流部
分をクローニングできる。キャップを除 去した mRNA の 5' 側に 付 加 する

rOligo 配列についても、特異性の高
い PCR が できるよう特 別の 配 慮を払ってデザインされている。

タバコ酸性ピロホスファター
ゼ（TAP）mRNA からキャップ 構造を除く酵
素、TAP は Cap Site cDNATM の作製

において重要な酵素である。この酵素

ワクシ ニアウ イル スの poly （A）+

は 1976 年 Shinshi らによってタバコ培養細胞から精製された 6）。TAP を用
いて mRNA のキャップ構造を除くた
めには、その TAP に RNase 等のコン

RNA を用いて検定した。ワクシニア
ウイルスの mRNA はキャップ構造中のグアニンと、RNA の 5' 末端のグアニン或いはアデニン残基の 2 カ所がメ

10 塩基よりなる任意の 450 種類の配列を設定し、真核生物由来の約 700
万塩基対を対象にホモロジー検索を行いその出現頻度をホモログスコアで表した。そして出現頻度とこのスコ

タミがないことが重要であるが、我々チル化を受けている。そこでこれらのアとの間に相関があるかどうかを調べの目的に適った高純度な酵素は市販

メチ ル 基を 3H で、さらに RNA 鎖をるために、実際に 450 種類の配列を合されていなかった。その理由として、

32

成しヒトゲノム DNA を 鋳 型とし てRNA を分 解 する活 性が 混 入していP で 2 重 標 識し たものを 基 質とし
TAP 精製標品と反応させると、RNA鎖を標識した 32P の TCA 不溶画分はRAPD（Random Amplified Polymorphic DNA） 解析を行った。そのないことを検定する方法がなかったこ

ほとんど変化せず、メチル基を標識し

結果スコアの高い配列は増幅量が多くとが、その理由の一つであった。従った H のレベルは反応後 30 分で 50%（出現頻度が高い）、スコアの低い配列て、我々は、TAP 精製度の 物差し とに達し、その後維持された（図 2 − B）。

は少ない（出現頻度が低い）という相なる高感度検定法の開発により、本法関が見られた（図 3 − A）。即ち、ホモの目的にあった精製度をもった TAP

このことから我々の得た TAP 精製標
品はキャップ構造を除去するが RNA

ログスコアの低い配列は特異性が高を純化することができた。タバコ BY2を分解しないという理想的な品質であいことが証明された。以上の考察から細胞の抽出液を 2 種類のイオン交換カることが確認された。このことは、cap

ラムに通した時点で基質 RNA と反応

site 解析を行う際に求められる高い解

スコアの低い 10mer を組み合わせた
RC2+AA が rOligo として選ばれていさせ、その分解度をゲル上で検定する

析精度を保証する上で非常に重要なる。

方法で RNase のコンタミが認められポイントであることは言うまでもない。

キャップ構造を開裂させ、なおかつ、3たが（図 2 − A：レーン 3、4）、さらに精製を進めゲル濾過の操作を行うことによってこのコンタミを除くことに成功した（図 2 − A：レーン 2）。
さらに、この精製標品が mRNA のキャップ構造を特異的に除去するかをゼによるライゲーション効率を考慮して 3' 末 端に AA をもつこと、そして

rOligo 配列
Cap Site cDNA を鋳型としたCap
Site PCR を特異性の高いものとする
ために、rOligo の配列については、解析 対 象の RNA 中に そのTM配列の出現頻度が低くな
A

この配列の特徴は T4 RNA リガー

くて は ならない。我々は

rOligo の内部に複数のプライマーを設 定し nested PCR が 可 能 な ように
38mer の長さをもつことである。これによって Cap Site PCR に高い特異性を与えるプライマー、1RC 及び 2RC
を rOligo 内部に設定することができた（図 3 − B）。

B

図２． TAP の純度検定

図３． ホモログ・スコアと RAPD パターンの相関（A）と rOligo 配列（B）

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）11ヒト胎盤性ラクトゲン遺伝子（hPL） によるモデル実験
こ の ようにし て 得ら れ た TAP と

rOligo を 用 い てヒト胎 盤 由 来 poly（A）+ RNA から Cap Site cDNA を作製し、すでに転写開始点が報告されているヒト胎盤性ラクトゲン遺伝子 7, 8） をモデルとして、この遺伝子の cap site

図４． hPL 遺伝子の Cap Site PCR（A）と転写開始点マップ（B）の同定を試みた。rOligo の内部に設定したセンス・プライマー、1RC、とヒ
ト胎盤生ラクトゲン cDNA に特異的なアンチセンス・プライマー、ASP2、とを用いてヒト胎盤 Cap Site cDNA を鋳型として PCR を行った。ヒト胎盤ラクトゲン 遺 伝 子 の 転 写 開 始 点 から

ASP2 プライマーまでの長さは約 600
bp であるが、Cap Site PCR の結果はまさにそのサイズに一致した（図 4 −A）。そして、この PCR 産物の塩基配列を解析した結果、報告のあったメ

図 5． WRN 遺伝子の Cap Site PCR

ジャー及びマイナーな転写開始点を同定することができた（図 4 − B）。こ

ンドの増幅が検出されなかったが、こベルで解析できる優れたツールに仕のことから Cap Site cDNAは PCRの反応物を鋳型とする nested PCR を上がっている。実際に我々は Cap Siteを応用することにより、簡便・迅速かつ行うことにより特異的なバンドの増幅

cDNATM を使って何種類もの新規遺正確に転写開始点（cap site）をクローが得られた（図 5 − B）。そこで、このバ伝子の転写開始点の同定に成功してニングする優れた試薬であることが示

ンドを精製・サブクローニングの後、塩おり、プロモーター領域の解析や翻訳された。

基配列を解析したところ図 5 − C に示

開始コドンの確認に威力を発揮していすように複数の転写開始点が同定さる 9, 10, 11, 12）。和光／ニッポンジーンかられ、S1 mapping による WRN 遺伝子

発売された Cap Site cDNATM は PCR

9）の転写開始点のデータと一致した 。

クローニングの経験者全てに翻訳開

我々はヒト遺伝子疾患の一つである

また WRN 遺伝子の Cap Site PCR に

始コドン・転写開始点を容易に同定す

TM

遺伝子クローニングへの応用

ウエルナー症候群の原因遺伝子

よって同定された転写開始点を基にしる機会を与えてくれるものと確信する。

（WRN）の転写調節領域（プロモーてその 5' 上流域を解析したところ、プ

さらにゲノム・サイエンス時代も後半にター）を同定する目的で Cap Site PCR

ロモーター活性を確認することができ

差しかかり、cDNA の 5' 領域の情報のHeLa Poly（A）+ RNA から
を行った。

た 。

必要性が高まるこの時期に、Cap Site

Cap Site cDNA を作製し、これを鋳型として PCR を行った。RC2+AA の

9）

cDNATM の応用範囲はさらに広まるもTM内部に設定されたセンス・プライマー

1RC 及び 2RC とウエルナー遺伝子に特異的なアンチセンスプライマー

ASP1及び ASP2 を用い（図 5 − A）、
まず 1RC と ASP1 で PCR を行い、次にこ の 1st PCR 産 物 を 鋳 型 とし て2RC と ASP2 で 2nd PCR を 行 った。
その結果 1 回目の PCR では DNA バ

12

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

おわりに
Cap Site cDNATM はこれまで 述べてきたように高純度 TAP の精製や特異性の高い rOligo のデザインなどの様々な検討を盛り込んだ mRNA の 5'末端配列を決定する試薬である。従って、このキットはこれまでは煩雑・困難であった転写開始点の同定を塩基レのと思われる。
〔参考文献〕
1）Maruyama, K., & Sugano, S.（1994）. Oligocapping : a simple method to replace thecap structure of eukaryotic mRNAs witholigoribonucleotides. Gene, 138, 171-174.
2）Furuichi, Y., & Miura, K.（1975）. A blocked
structure at the 5' terminus of mRNA fromcytoplasmic polyhedrosis virus. Nature, 253,374-375.
3）Furuichi, Y., LaFiandra, A., & Shatkin, A. J.

（1977）. 5'-Terminal structure and mRNAstability. Nature, 266, 235-239.
4）Lewis, J. D., & Izaurralde, E.（1997）. The
role of the cap structure in RNA processing
and nuclear export. Eur J Biochem, 247,
461-469.
5）McCracken, S., Fong, N., Rosonina, E.,
Yankulov, K., Brothers, G., Siderovski, D.,
Hessel, A., Foster, S., Shuman, S., & Bentley, D. L.（1997）. 5'-Capping enzymes aretargeted to pre-mRNA by binding to thephosphorylated carboxyterminal domain of
RNA polymerase II. Genes Dev, 11, 33063318.
6）Shinshi, H., Miwa, M., Kato, K., Noguchi,M., Matsushima, T. & Sugimura, T.（1976）.
A novel phosphodiesterase from cultured
tobacco cells. Biochemistry, 15, 2185-2190.
7）Chen, E. Y., Liao, Y-C., Smith, D. H.,
Barrera-Saldane, H. A., Celinas, R. E. andSeeburg, P. H.（1989）. The human growth
hormone locus : Nucleotide sequence,
biology, and evolution : Genomics, 4（4）,479-497.
8) Tanaka, M., Masuda, N., Watahiki, M.,
Yamakawa, M., Shimizu, K., Nagai, J. andNakashima, K.（1988）. cDNA Cloning of
human chorionic somatomammotropin-1
mRNA whose transcription was intiated at
the 5' region of TATA box. Biochem. Int.,
16（2）287-292.
9）Yamabe et al.
（1998）. Mol. Cell. Biol., submitted.
10）Shimamoto, A., Kitao, S., Ichikawa, K.,
Suzuki, N., Yamabe, Y., Imamura, O.,
Tokutake, Y., Satoh, M., Matsumoto, T.,
Kuromitsu, J., Kataoka, H., Sugawara, K.,
Sugawara, M., Sugimoto, M., Goto, M. &Furuichi, Y. A unique human gene thatspans over 230 kb in the human chromosome

8p11-12 and codes multiple family proteinssharing RNA-binding motifs.（1996）. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA., 93, 10913-10917.
11) Yamabe, Y., Ichikawa, K., Sugawara, K.,
Imamura, O., Shimamoto, A., Suzuki, N.,
Tokutake, Y., Goto, M., Sugawara, M., &Furuichi, Y.（1997）. Cloning and characterization of Rep-8 （D8S2298E）in the humanchromosome 8p11.2-p12. Genomics, 39,
198-204.
12) Chang, A.C.M., Jeffrey, K.J., Tokutake, Y.,
Shimamoto, A., Neumann, A. A., Dunham,
M.A., Cha, J., Sugawara, M., Furuichi, Y.,& Reddel, R. R.（1998）. Human stanniocalcin（STC）: genomic structure, chromosomal
localization, and the presence of CAG
trinucleotide repeats. Genomics, 47, 393398.

〔特 長〕■ 調製済の cDNA なので、面倒な mRNA の精製や酵素反応等が不要です。
■ CapSiteTM Hunting により、発現遺伝子の転写開始点が迅速、高感度しかも正確に決定できます。
■あらかじめ cDNA として合成した Cap Site のライブラリーなので、複数の遺伝子が同時に解析できます。
■ キャップ構造をターゲットとした方法で調製しました。

〔内 容〕
10FW
● Cap Site cDNATM
100FW● 1RC Primer（10FM）
100FW● 2RC Primer（10FM）● Control Primer1（10FM） 10FW
● Control Primer2（10FM） 10FW
● 製品マニュアル（株）ニッポンジーン
Cap Site cDNATM〔保存〕 − 20℃

NEW

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〔参考文献〕 Maruyama, K. and Sugano, S. : Gene, 138, 171-174（1994）.
Code No.
311-03581
312-03631
319-03641
313-03661
318-03591
310-03431
310-03671
317-03441
317-03681
314-03691
315-03741
317-03701
311-03601
314-03451
318-03611
315-03621
314-03571
311-03461
316-03651
314-03711
312-03751
319-03761
316-03771
310-03791
313-03801
310-03811
317-03821
314-03831
311-03721
311-03841
313-03781
318-03731
318-03471
315-03481

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製品
名Human Brain
Human Heart
Human Hippocampus
Human Kidney
Human Liver
Human Placenta
Human Spleen
Human Testis
Human Thymus
Mouse Brain
Mouse Embryo(16days)
Mouse Heart
Mouse Intestine
Mouse Kidney
Mouse Liver
Mouse Lung
Mouse Spleen
Mouse Testis
Mouse Thymus
Rat Brain
Rat Embryo (18days)
Rat Kidney
Rat Liver
Rat Lung
Rat Ovary
Rat Pancreas
Rat Skeletal Muscle
Rat Small Intestine
Rat Spleen
Rat Stomach
Rat Testis
Rat Thymus
Rice Shoot(L16D8 ＊1)
Rice Shoot(Dark ＊2)

容

量

1set
1set
1set
1set
1set
1set
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1set
1set

希望納入価格（円）90,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,00090,000＊ 1 L16D8 : for 7days in 16hr. light and 8hr. darkness per day＊ 2 Dark : for 7days in complete darkness

本製品は、株式会社エイジーン研究所が開発し、株式会社ニッポンジーンが製造したものです。

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）13

３０分で全血中の DNA が抽出可能！
！
DNA Extractor WB-Rapid Kit
現在 PCR 反応をはじめとする各種の検出法が開発され、ヒトゲノム DNA を用いた研究や診断が特別な技術や経験を必要とせずに一般に行えるようになってきました。このような状況の中で、ヒトゲノム DNA を抽出する頻度が増し、簡便かつ短時間でゲノム DNA を抽出できるキットが要望されています。

DNA エキストラクター WB- ラピッドキットは、全血液からのゲノム DNA 抽出を短時間（30 分）にかつ、高回収率で抽出でき、少量多検体処理に有効です。
特１. 簡便な操作（１本の反応容器）により 30 分でゲノム DNA を抽出することができます。
２. EDTA 血及び、使用する鋳型 DNA 量の調節によりヘパリン血でも PCR 反応を阻害しない DNA サ
ンプルが抽出できます。
３. 凍結保存血からも DNA が回収できます。
４. 少量多検体処理に有効です。
５. フェノール、クロロホルムなどの有害な有機溶剤を使用しません。

長

実用例（ゲノム DNA の確認）

( k b)

M 1

23. 1
9. 4
6. 6
4. 4
2. 3
2. 0

（ヘパリンの影響）
ヒ ト 全 血 100FW か ら 操 作 法 に従ってゲノム DNA を抽出後、1.0% アガロースゲル電気泳動
を行った。

M

1

2

操作法に従って抽出したゲノム

DNA の全血 5 〜 10FW に相当す
る量をテンプテートとして

PCR 反応を行った。

分子量マーカー 23.1kb のバン
ドよりも大きい位置に 1 バンドとして高分子量ゲノム DNA が検出された。

全血 5FW、10FW 分の DNA を鋳型に用いた PCR 反応で、ヒト
β-Globin 領域の 262bp の増幅を確認した。

M : E Hind Ⅲ分子量マーカー
1 : ゲノム DNA

M : H ×174Hae Ⅲ分子量マーカー
1 : 全血 5FW に相当する DNA
2 : 全血 10FW に相当する DNA（他社との比較）

サンプル 1
サンプル 2

Kit

DNA 収量WB-Rapid

4.92 Fg

A社

1.27 Fg

WB-Rapid

2.73 Fg

A社

0.26 Fg

A/WB-Rapid
25.5%

9.6%

サンプル 1：EDTA 処理し 4℃ で 10 日保存した血液サンプル 2：ヘパリン処理し 4℃ で 10 日保存した血液〔参考文献〕Lu, W., Hirayasu, K., Ishizawa, M. and Kobayashi, Y. : Nucleic Acids Res., 22, 1774(1994).

コード No.
297-54801
293-54803

14

品

名

DNA エキストラクター WB- ラピッド キット

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

規格

全血中 DNA 抽出用

容量

希望納入価格（円）

20 回用

9,500

200 回用

20,000（株）
ニッポンジーン
Drop PCR Kit for Human Blood
血液中には、多くの PCR 阻害物質が含まれています。血液中の DNA を解析するためには、従来は DNA をあらかじめ精製
しなければなりませんでした。

Drop PCR Kit for Human Blood には、これらの阻害物質の作用を効果的に抑制する物質を含む Buffer が添付されており、各種抗凝固剤処理血、凝固血及び血痕を直接 PCR 反応液に添加するだけで PCR を行うことができます。
また、Gene Taq、dNTP Mixture が添付されていますので、血液試料及びプライマーを用意するだけで目的の遺伝子の増幅が可能です。なお、Gene Taq は、本品の性能を最大限に発揮させることのできる Taq DNA Polymerase です。
〔特

長〕

〔内

容〕

● 血液を直接 PCR 反応液に添加するだけで PCR を行えます。

Drop A

600FW● 各種抗凝固剤処理血、凝固血及び血痕試料に使用できます。

Drop B

600FW● 1kbp 以下の DNA の増幅に適しています。

Gene Taq

150units● DNA 精製を行う必要がないので、dNTP Mixture

240FW

・短時間で解析できます。

Control Primer

15FW

・操作が簡便であり、一度に多数のサンプルを処理することができます。

（forward and reverse, 20pmol/FW each）

・精製過程におけるクロスコンタミネーションの可能性が少なくなります。

Loading Buffer（-SDS）

300FW

・ウイルス感染血などを扱う際の危険性が少なくなります。
● 詳細なマニュアルが添付されています。
コード No.

品

318-03851〔保
名容存〕 − 20℃

量

希望納入価格（円）60 回分

Drop PCR Kit for Human Blood

55,000Drop PCR Kit for Human Blood は株式会社島津製作所との技術提携で製品化しました。

Protein Molecular Weight Markers, Low-Range(M.W. 3,500 〜 31,000)

Hyaluronic Acid Potassium
Salt from Human umbilical
cords

電気泳動用

SDS、還 元 剤、グリセ

Protein

ロールを含むローディング

Carbonic anhydrase

緩衝液に溶解されていま

Soybean trypsin inhibitor

すので直ちに使用できまHorse heart myoglobin

す。

M.W.

ヒトへ その緒から分離した B-D-N-

31,000アセチルグルコサミンと B-D- グルク

20,400/19,700

ロン酸が交互に結合してできた直鎖

16,900状の高分子多糖です。ヒアルロニダー

Lysozyme

14,400ゼの基質としてヒアルロニダーゼの生

Aprotinin

6,100

理活性その他異化代謝の研究に有用

Insulin, B chain

3,500

です。

各濃度 0.5mg/mW

549-00203

9,000 円100mg

性 状：62.55mmol/W Tris-HCl (pH 6.8) 、
2% SDS、10mmol/W DTT、20%
Glycerol、0.0125% Bromophenol
Blue
SDS-PAGE の Gel 濃度：
16%（32:1 Acrylamide : Bis）

COOH
O

〔関連商品〕
Protein Molecular Weight Markers,
Mid-Range （M.W. 97,400~14,400）

電気泳動用
163-18511

1mW

27,000 円

CH2OHO

169-16911

1mW

O
O

OH

O

HO
OH

NH
O = CCH3n21,000 円

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

15和光純薬工業（株）大阪研究所

土谷正和

第 32 話 エンドトキシンとサイトカインす 2）。その他多くの生物活性も実はサが、実は悪液質誘発因子として発見さ示します。これらの活性は、細胞へのイトカインの作用によって起こっていれたカケクチンと同一の物質であった

直接作用及びその結果産生される液

ることがわかってきています。

例からもわかるように、制御されない

エンドトキシンは種々の生物活性を性 因子によって起こると考えられま

この中で、エンドトキシンが単球や状態のサイトカインは、生体にとってす 。エンドトキシンによって産生され顆粒球を活性化する機序については、

非常に危険な作用を及ぼす可能性が1）

る液性因子としては、インターロイキ

最近の 10 年間で非常に研究が進んだあります。エンドトキシンの悪玉として-1、IL-6、IL-8、腫瘍壊死因子
ン（IL）

分野の一つといえるでしょう。この研の作用の発現において、エンドトキシ（TNF）、インターフェロン（IFN）など究の進歩に大きく貢献したのが、急性

ンがマクロファージ、好中球、血管内のサイトカイン や血小板活性化因子

期蛋白である LPS 結合蛋白（LBP）の皮細胞等に作用し、生体のサイトカイ（PAF）、アラキドン酸カスケード因子

発見です 。この 60kDa の糖蛋白の血

ンネットワークをかき乱すことがかななどのケミカルメディエーター組織因

清中の濃度は、正常人では 0.5Fg/mW

り重要と考えられます。また、逆の観子（TF）などが挙げられます。今回は、

以 下 で すが、炎 症の急 性 期には 30

点から、腸内細菌のエンドトキシンやこの中から、炎症性のサイトカインにペプチドグリカンが生体内ではホルモ

発熱性は、エンドトキシンの代表的

Fg/mW 以上になるといわれています。
LBP はエンドトキシンのリピド A の部分に結合し、LBP 存在下におけるマク
ロファージの TNF 産生は、非存在下な生物活性です。その機構は、エンド

でのエンドトキシン濃度以下で起こる

トキシンの作用により各種細胞より産ことが報告されています。さらに、マク

すし、生体への作用機序も非常に複雑生された IL-1、IL-6、TNF、IFN など

ロファージの分化抗原の一つであるです。さらに、これまでのシリーズで考が視床下部に作用してプロスタグラン

えてきたように、エンドトキシンの活考えられています。人に対するエンド

CD14 が LPS-LBP 複 合 体のレ セプ
ターであることが明らかにされ 5）、LBP
がエンドトキシンの CD14 との結合をともエンドトキシンの生体作用を複雑

トキシン（E. coli O113 : H10 : K- 株

大幅に促進することが示されました。

にしていると思われます。いずれにしLPS 2 ng/kg）の投与実験では、投与後 1.5 時間で TNF の、2 時間で IL-6

マクロファージに対するエンドトキシても、エンドトキシンの生体作用にとっンの作用はこの LBP・CD14 を介したてサイトカインは最も重要な因子の一ついてエンドトキシンとの関係を考えてみたいと思います。

ジン E2 を産生させて発熱を起こすと3）ンのような作用をしているという考えもあり1）、非常に興味深いところです。
ともあれ、エンドトキシンに結合する
血漿中の蛋白は多数報告されていま性自体が変化しやすいもので、このこのピークが認められ、体温は徐々に上系が中心と思われますが、エンドトキ

つと考えられますが、その全貌は依然昇し、投与後 3 時間目あたりをピーク

シン が 直 接 CD14 に 結 合 する系 やとして明らかにはなっていません。

とした発熱がサイトカインが下がった

CD14 をも介さない系があるといわれ後も続くという結果が報告されていまています。ともあれ、マクロファージに結合したエンドトキシンがTNF をはじめとするサイト
カインの誘導の引き金となるわけですが、その結合様式には種々のパターンがあるようです。
サイトカインは、もともと生体によって制御されており、生体にとって必要〔参考文献〕
1）遠藤重厚、稲田捷也：「エンドトキシンと 病 体」， p.41-74, （へ る す 出 版）
（1995）.
2）Van Deventer, S. J. et al. : Blood, 76,
2520-2526（1990）.
3）Tobias, P. S. et al. : J. Biol. Chem.,
263, 13479-13481（1988）.
4）Mathison. J. C. et al. : J. Immunol.,149, 200-206（1992）.
5）Wright, S. D. : Science, 249, 14311432（1990）.

なものと考えられます。しかし、腫瘍を壊死させる因子として発見された TNF

16

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

次回は「第 33 話 エンドトキシンの測定条件」の予定です。

☆パイロセップを用いた濃縮により 試料中の微量エンドトキシンを特異的に測定☆脂溶性中の微量エンドトキシンの測定も可能

Limulus PS Single Test wako
エンドトキシンに特異的な LAL ES 試薬と、エンドトキシン吸着剤である Pyrosep（パイロセップ）から成るキットです。
試料中のエンドトキシンをパイロセップに吸着・濃縮させた後エンドトキシンに特異的な LAL ES 試薬と反応させ、比濁時間分析法により試料中のエンドトキシンを定量します。通常のリムルステストでは検出不可能な、ごく微量のエンド
トキシンや脂溶性物質中のエンドトキシンの検出に有効です。

特長● パイロセップにより試料中のエンドトキシンを吸着させ濃縮しますので、共存物質の影響を受けずに微量のエンドトキシンを特異的に測定することが可能です。
● エンドトキシンはエタノール中でもパイロセップに吸着するため、通常のリムルステストでは不可能な
脂溶性試料でもエタノールで溶解できればエンドトキシンの測定が可能です。
● 測定に必要な数だけ LAL 試薬を使用できますので無駄がありません。

測定原理
パイロセップ（水溶性担体にスペーサーを介してヒスチジンを結合させたアフィニティー吸着体で、エンドトキシンを特異的に吸着させる（田辺製薬（株）開発））を充てんしたキャピラリーカラムに、試料中のエンドトキシンを吸着させます。
試料を洗い流した後、吸着したエンドトキシンを LAL 試薬と反応させることによって、試料中のエンドトキシンの定量を行います。測定はトキシノメーターで行います。
測定原理

パイロセップの模式図

吸 着

O

分 離

パイロセップスペーサー

トキシノメーター
LAL

OH

試 料

ヒスチジン

アガロース
エンドトキシン
吸着条件：pH３〜８、μ ≦ ０.１
吸着容量：０.３1mg (E. coli UKT-B, LPS) /g（湿重量）
吸着体-１３
解離定数 (Kd)：７.３×１
０ .M (E. coli UKT-B, LPS)

阻害あるいは活性化物質
偽陽性物質

内 容
（１）LAL ES 試薬 米国カブトガニ（Limulus polyphemus）血球抽出物の凍結乾燥品（トリス塩酸緩衝液、B-1,3- グルカン誘導体を含む）（２）パイロセップ懸濁液（りん酸緩衝液に懸濁）（３）LAL 溶解液（４）洗浄液（５）検体希釈用緩衝液（６）キャピラリー（シリコンチューブ付き）

コード No.
299-54501

品

名Limulus PS Single Test wako規

格

エンドトキシン検出用

20 バイアル（0.3mW 用）
20 バイアル（0.77mW）
１バイアル（7mW）
４バイアル（11mW）
４バイアル（10mW）
２０本

容

量

20 回用

希望納入価格（円）98,000

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

17東京理科大学 薬学部

塩川

大介、丸田

英晴、田沼

靖一

第３話 アポトーシスの検出法ー DNA 断片化の解析法
1972 年、Kerr、Wyllie、Currie らによりそれまで一般的であった受動的な細胞死、ネクローシスとはことなる細胞死の様式として能動的な細胞死、アポトーシスが提唱された 1）。彼らの定義によるとアポトーシスは細胞表面微絨毛の消失、細胞体積の縮小、クロマ
チン DNA の核膜周辺への凝縮、核の断片化といった形態学的変化、及びク
ロマチン DNA のヌクレオソーム単位での断片化といった生化学的変化を伴う細胞死であるとされている。ここ
数年のあいだにアポトーシスに関する
研究は爆発的に進み、分子レベルにおけるアポトーシスのメカニズムの解析が世界中で行われている。研究の進展に伴い、poly(ADP-ribose) polymerase(PARP) の分解などの新たなアポトーシスマーカーが用いられる様になってきたが、現在でも DNA 断片化の解析はアポトーシス研究におけるはじめの一歩であるとともに、その細胞死が真にアポトーシスによるものであるかを判定する上で重要な位置を占めている。しかし DNA 断片化を迅
速かつ定量的に観察する手法は細胞、組織により異なり、一部の接着細胞、ガン組織などにおいてはきれいなラダー像を得ることが困難である場合も
少 なくない。また、アポトーシ スのDNA 切断にはラダー状の DNA 断片
化とは別に数十〜数百キロ塩基対といった 大きな DNA 切 断、い わゆる
ラージフラグメンテーションが存在することが報告されており、このラージフ
ラグメンテーションをアポトーシスの指標に用いる論文もみられる様になってきた。さらに DNA 切断を触媒する
エンドヌクレアーゼとして DNase I 型（3'-OH/5'-P）
ま たDNase II 型
（3'-P/5'
OH）の切断様式を持つ酵素の関与が示唆されており2-5）、それぞれの系においてどの様なエンドヌクレアーゼが働いているかを調べるには断片化 DNAの切断様式を決定する必要があるな
ど、しだいにアポトーシス細胞の DNA
解析においても様々なテクニックが要18

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

求されるようになりつつある。

1．アポトーシスにおける DNA 切断
真核生物のゲノム DNA はクロマチンと呼ばれる形態をとっており、ヒスト
ン八量体に DNA が約 1 と 3/4 回巻ついたコアとそれを結ぶリンカー部位に
ヒストン H1 が結合したヌクレオソームを基本的な単位構造としている（図1A）。アポトーシスにおいてはこのリンカー部位に切断が起こるため、アポトーシスを起こした細胞から DNA を抽出しアガロースゲル電気泳動法を用いて解析するとその泳動像は図 1Bに示すような約 180 塩基対の整数倍の DNA ラダーが観察される。これが現在アポトーシスを判定する指標としてもちいられている DNA 断片化である。さて実際にはどの様にこの DNA
ラダーを観察すればよいのだろうか。

2．アガロースゲルを用いた DNA
切断解析法
アガロースゲル電気泳動法によりDNA ラダーを観察する行程は、1、粗DNA 溶液の調整、2、DNA の抽出、
3、アガロースゲル電気泳動、の 3 つのステップに分けることができる。HL60 や Jurkat、L929 などの培養細胞やラット胸腺細胞など、多くの細胞についてステップ 2 を省略し良好な結果を得ている。しかし一部の上皮系培養細胞や組織細胞においては DNA の抽出を行わないときれいな泳動像が得られないこともある。私達は抽出過程における DNA の損失がなく、その後の定量化においてより信頼性が高まること、また、より簡便、迅速であることから通常 1、3 の組み合わせにより実験を行っている。実際に実験を行うときは
まず 1、3 の組み合わせをためし、うまくいかない場合は 1、2、3 の組み合わせを行うのが良いであろう。
粗 DNA 溶液の調整は以下のように行う。培養細胞の場合、約 1 × 106 個の細 胞 を 20FW の lysis buffer（50mM

Tris-HCl pH7.8, 10mM EDTA,
0.5% w/v sodium-N-lauroylsarcosinate）に懸 濁し た 後、RNase A、及びProteinase K 処理を行う。また、ガン組織などの場合はガラス板などの上で細かく切り刻み、その一部（1FW 程度
でよい、概ね数 Fg の DNA がとれる）に 20FW の lysis buffer を 加 え、Proteinase K、RNase A の順で処理を行うことで良い結果が得られる。
このようにして得られた DNA をア
ガロースゲル電気泳動法を用いて解析するのだが、ミューピッドシステム
を用いる場合、ウエルには最大 30FWのサンプ ルがアプライできるので、
DNA 溶液の全量をのせることができる。しかし、ここで得られた DNA サン
プルは粘度が高く、通常の方法でゲルに ア プ ラ イし ても す べ て 泳 動 バッ
ファー中に浮き出してしまう。そこで
私たちはまずサンプルをゲルにアプライしてから泳動バッファーをゲルの上端ぎりぎりまで満たし泳動を開始し、マーカー色素が 1mm ほどゲルに入っ

図１．アポトーシスの DNA 断片化

たらゲルを沈め、さらに泳動を行うという方法を行っている。DNA ラダーを観察する場合は 2％のゲルを用い図1B のような泳動像が得られる。きれいな泳動像が得られない場合はステッ
プ 2 の DNA の抽出を行なった後に泳動を行なうが、この場合は加える lysis
buffer を 100 〜 500FW にスケールアッ
プして DNA 溶液を調整し、フェノー
ル / クロロフォルム抽出、及びエタノー
ル沈殿を行った後、TE バッファーにとかせば良い。なお、加える Proteinase
K の量、処理時間を増やすことでもかなり改善できる。最近、より少ない細胞数（1 × 104 個程度）
を用いて簡便にラダーを検出できるキットが和光より発売されているので、初めてラダーを観察する場合、また従来法の検出感度に不満がある場合には試してみると良いであろう。
このように行ったアガロースゲルのポラロイド写真をもとに、DNA 断片化率を定量することもできる。まず写真を イメージ スキャナで 取り込みコン
ピュータを用いて画像解析を行うのだ
が、DNA 量を OD で表し総 DNA 量に対するある大きさ以下（5kbp を基準としている）の DNA 量の比をもってDNA 断片化率としているので、デンシトメータ機能のあるものであれば利用可能である。
ラージフラグメンテーションを観察する場合にはパルスフィールド電気泳動法を用いれば良い。私達は電場の向きを 180 ゜交互に変換させる FIGE
（field inversion gel electrophoresis）
を行っている、結果の一例を図 1C に示した。

3．DNA 切断様式の解析法
酵素的な切断をうけた DNA の末端は 3'-OH/5'-P、または 3'-P/5'OH であることが考えられる。よって、さまざまな細胞のアポトーシスにおいて断片化された DNA フラグメントの切断様式
関連商品

図２．末端標識法を用いたアポトーシス細胞における DNA 切断様式の解析を調べることは、それぞれの細胞においてどのようなエンドヌクレアーゼがDNA 断片化に関与しているのかを知る上で重要である。私達は、基質とな
る DNA の末端が OH の場合にのみ働くという酵素の特性を利用した切断様式決定法を行っている。
DNA ラダ ーの検出法で述べたス
テップ 1、及び 2 を用いて（DNA 抽出を行って）DNA サンプルを調製する。
4 サンプル分用意し、うち 2 サンプル
を CIAP（仔ウシ小腸由来アルカリホ
スファターゼ）処理により末端リン酸基をはずし、3' および 5' 末端標識反応におけるポジティブコントロールとして用いる。
まず、CIAP 処理、未処理のサンプルをペアとし、3' 末端をターミナルヌ
クレ オ チ ジ ルトラン スフェラ ー ゼ（TdT）と [A 32P]dCTP、5' 末端を T4 ポ
リヌクレ オ チド キ ナ ー ゼ と [C 32P]
dATP を用い、それぞれ標識を行う。
フェノール / クロロフォルム抽出、クロ
ロフォルム抽出後、エタノール沈殿により DNA を回収し、アガロースゲル
電 気 泳 動を 行う。ここで はトラン ス
ファーの効率を考慮し、1.5％の TAEゲルを用いている。DNA をナイロン膜にトランスファーした後オートラジ
オグラフィーを行うと図 2 に示す様な結果が 得られる。そのラベリング パ
ターンより、ここで調べたアポトーシス

細 胞の DNA 切 断 様 式 は す べ て 3'OH/5'-P 型であることがわかる。
アポトーシスに関する研究が進むにつれ、さまざまな刺激に応答して細胞がアポトーシスを起こすことが明らかとなってきた。しかし、形態学的変化
や DNA 断片化を観察せずに アポ
トーシスである と結論している論文もあり、それらのすべてがアポトーシスによる細胞死であるとは言い切れないように思われる。将来、細胞死の研究がさらに進み、生理的な細胞死がさらに細かく分類される日が来るであろう。
そういった意味でも基本に立ち返り、
形態学的変化、そして DNA 断片化をきちんと観察してゆくことがアポトー
シス研究に求められているのではないか。
〔参考文献〕
1）Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H. andCurrie, A. R.（1972）Br. J Cancer 26,
239-257
2）Barry, A. and Eastman, A. （1993）
Arch. Biochem. Biophys. 300, 440-4503）Peitsch, M. C., Polzar, B., Stepham,
H., Crompton, T., MacDonald, H. R.,
Mannherz, H. G. and Tshopp, J.
（1993）EMBO J. 12, 371-377
4）Shiokawa, D., Ohyama, H., Yamada,T., Takahashi, K. and Tanuma, S.
（1994）Eur. J. Biochem. 226, 23-30
5）Shiokawa, D., Ohyama, H., Yamada,T. and Tanuma, S.（1997）Biochem. J.
326, 675-681.

蛍光法による高感度アポ蛍光法による高感度アポトーシス
トーシス DNADNA ラダー簡易検出キッ
ラダー簡易検出キット

24 レーン用

包装追加しました

主要な試薬をキット化していますのでプロトコールに従って使用するだけでアポトーシスが検出できます。
コード No.
NEW

291-53204
297-53201

品

名

Apoptosis Ladder Detection Kit Wako

規格

アポトーシス研究用容

量24 レーン用96 レーン用

希望納入価格（円）33,00058,000

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

19

アルツハイマー病研究用
Anti Presenilin-1(N-terminus), Goat
免疫化学用
早期発症型家族性アルツハイマー

免疫原 ：プレセニリン-1 のアミノ酸病の原因遺伝子として発見されたプレ

14- 33 に相当する合成ペプ

セニリン-1 及び-2 は、その変異により

チド
形 状 ：PBS 凍結品
特異性 ：プレセニリン-1 の N 末端残基 14-33 に特異的に反応する

B アミロイド（A B）1-42/43 の産生を亢進することが分かってきました。アル
ツハイマー病の発症メカニズムの研究にご利用下さい。

実用希釈倍数：

ELISA

1:5,000

免疫組織染色パラフィン切片
凍結切片

1: 100
1:1,000

013-17321

1mg

50,000 円

パラフィ
パラフィン切片染色用
ン切片染色用〜 Fas、Fas-L 抗体〜
本品は、従来良好な結果が得られなかったパラフィン包埋切片での免疫組織染色に優れております。既に販売しております
抗ヒト Fas 抗体とともに組織レベルでの Fas 及び Fas リガンドの発現、局在の研究にご利用下さい。

Anti Mouse Fas, Rabbit
免疫化学用
免疫原 ：マウス Fas のアミノ酸 292306 に相当する合成ペプチ
ド-MAP
形 状 ：全血清
特異性 ：マウス肝臓の肝細胞細胞膜及び卵巣の顆粒層細胞、卵細胞に発現している Fas と反応する

実用希釈倍数：パラフィン切片

1:100-1:500

抗マウス Fas, ウサギによるマウス肝臓の免疫
組織染色

Anti Rat Fas Ligand, Rabbit
免疫化学用
免疫原 ：ラット Fas リガンドのアミノ酸 42-56 に相当する合成
ペプチド-MAP
特異性 ：マウス角膜の角膜上皮及び精巣の間質細胞に発現している Fas リガンドと反応する

実用希釈倍数：パラフィン切片

1:100-1:1,000

抗ラット Fas, リガンド，ウサギによるマウス角膜の免疫組織染色

コード No.

品

015-17261

Anti Mouse Fas, Rabbit

名

容

100FW

量

希望納入価格（円）30,000012-17271

Anti Rat Fas Ligand, Rabbit

100FW

30,000〔関連商品〕

20

コード No.

品

019-16181

Anti Human Fas, Rabbit

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

名

容

量

100FW

希望納入価格（円）35,000初期アポ
初期アポトーシスの検出に
トーシスの検出に ！
アネキシン V キット−フローサイトメトリーにより 初期アポトーシスを検出−
細胞膜りん脂質のホスファチジルセ
リンは、正常細胞では細胞質側にのみ存在しますが、アポトーシスの初期段階でこの非対称性が崩れ、ホスファチ
ジルセリンが細胞表面に露出します。
この変化は DNA 断片化に先立って現れるため、初期のアポトーシスの指標となります。アネキシン V はカルシウ
ムイオン存在下でホスファチジルセリ
ンと特異的に結合し、初期アポトーシ
ス細胞を検出します。

特長・3 ステップのシンプルなキットです。

・フローサイトメトリーにより初期アポトーシスを検出しま

検出方法：

す。
・蛍光顕微鏡による in situ apoptosis 検出もできます。

細胞の採取、洗浄・よう化プロピジウムとの多重染色により初期アポトーシス↓

細胞、後期アポトーシス細胞またはネクローシス細胞、生細胞の判別が可能です。

アネキシン V、よう化プロピジウムとのインキュベーション

染色結果↓
フローサイトメトリーによる測定

キット内容

アネキシン V

よう化プロピジウム

初期アポトーシス細胞＋−

後期アポトーシス細胞
またはネクローシス細胞

＋

＋

生細胞

−

−

・アネキシン V- FITC または Biotin 溶液（50Fg/mW）
・10 × Binding Buffer・よう化プロピジウム溶液（50Fg/mW）
名

100FW
5mW
1mW

コード No.

メーカーコード品

容量

希望納入価格 ( 円 )532-68111

80-4618-00

Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit

100 回用

41,000539-68121

80-4619-00

Annexin V-Biotin Apoptosis Detection Kit

100 回用

41,000

関連商品

DNA 断片化の検出に ！
コード No.
536-68131

メーカーコード
80-4630-00

品
TACS

TM

名

Apoptotic DNA Laddering Kit-Etidium Bromide容量20 サンプル用

希望納入価格（円）27,000関連試薬もございます。お問合わせ下さい。

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）21

18
免疫一口メモ◯インスリン依存型糖尿病における遺伝的背景および液性免疫の意義
近畿大学 医学部 第 2 内科

今村

稔、青木

矩彦

前回は、IDDM（インスリン依存型糖尿病）のモデル動物の NOD マウス

IDDM（18 例）の HLA typing と自己抗体陽性率の糖尿病発症における細胞性免疫とりわけ サ イトカインの 関 与を 述 べ た。

年齢 16 − 35 歳（平均 27.5 ± 5.1 歳）

NOD マウスは生後 4 週頃より膵島炎が生じ、その後自己免疫機序によりラ

発症年齢 10 − 27 歳（平均 20.0 ± 5.1 歳）氏島の破壊が生じ、15 週頃より自然発
症的に IDDM が認められるようになる。

罹病期間 1 カ月− 18 年（平均 7.3 ± 4.7 年）

その発症の遺伝的背景として、少なく
とも 10 個の遺伝子が関与するとされ

HLA typing

る。その一つは、主要組織適合抗原

major histocompatibility（ MHC、マウスでは H-2, ヒトでは HLA ）クラス
II 分子に関連したものである 1）。マウ
スのクラ ス II 分 子に は I-A（ヒトのHLA-DQ に相当）と I-E（ヒトの HLADR に相当）があり、NOD マウスにおいては、ユニークな I-A の存在（β鎖57 番目のアミノ酸がセリンでありアスパラギン酸でないこと、また、56 番目
がヒスチジンであることを指す）と I-E

HLA DR4 9/13（69.2％）
HLA DR9 4/13（30.8％）
自己抗体陽性率

GAD 抗体陽性率 10/18（55.6％）
ICA 陽性率 2/8（25％）の 欠 如の 両 方 が、膵 島 炎 ならびには、その発症予防に関しても重要な意の 中にも 緩 や かに 進 行 する IDDM

IDDM 発症に関与しているとされる。
一方、ヒトの IDDM の遺伝的背景に義を有するものと考えられる。

（slowly progress IDDM）と考えられ

つい て は、一 卵 性 双 生 児に お け る

IDDM の一致率が約 40% であること

IDDM で は、抗ラ氏島抗体（ICA、ICSA）や GAD 抗体等のラ氏島に対であり、その後インスリン依存性の状から、遺伝関与が示唆されている。関する自己抗体が検出され、液性免疫も態になるので、IDDM の診断・予知

与する遺伝子として、NOD マウスと臨床あるいは病態上で重要な役割をマーカーとして有用である。さらに、同様に、MHC クラス II 分子の重要性はたす 。現在もっとも臨床的に有用

現在、遺伝的背景や自己抗体の検出

る 症 例 が 存 在 す る。こ れら患 者 は

3）

NIDDM の時期でも GAD 抗体が陽性が指摘されている。われわれも一部症であるのは、GAD 抗体で保険適応もを考慮して IDDM の危険性が高い例

例 に つ い て クラ ス II 分 子 の HLAされている。発症早期 IDDM の 60-（ハイリスク者）をとりあげて IDDM のtyping を検討したが、DR4 が 13 名中80％に検出され、さらに、IDDM の発予防的治療も試みられているので 3）、
9 名、DR9 は 13 名中 4 名に認められ、 症前より検出されるという特徴がある。 今後、免疫遺伝学ならびに自己抗体の当科では、GAD 抗体を IDDM と疑わ
重要性は拡大すると考えられる。
以前の報告と一致して、
日本人 IDDMれるものに測定し診断の一助としていにおいて DR4 と DR9 が高頻度に認める。実際に、GAD 抗体は IDDM と診られた（表）。また、DQ に関しては、〔参考文献〕
1）Todd J. et al: Nature, 351, 542（1991）
IDDM と DQA1*03、DQB1*0303、 断した患者の 55. 8% で検出された。
2）Awata T, Kanazawa Y: Diab Res Clin
DQB1*0401 と関連があるとされる 2）。 一方、ICA は、25％の陽性率であった
Pract, 24（supple）, S83（1996）
これら IDDM の疾患感受性遺伝子あ（表）。また、インスリン非依存型糖尿3）Slover RH, Eisenbarth GS: Endcrine病（NIDDM）として治療している患者
るいは免疫応答遺伝子を検討すること
Reviwes, 18, 241（1997）22

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

Stem Cell Factor, Mouse, recombinant
生化学用

Stem Cell Factor は、幹細胞のみなされました。
他のサイトカイン（IL-1, -3, -6）や造な血因子（GM-CSF や G-CSF、EPO）
どと相乗的に増殖作用を示すことが知られていますが、単独での作用は明らかと言えず、ごく幼若な造血幹細胞にらず血球細胞系、肥満細胞、生殖細胞、
メラノサイト等の増殖・発達促進作用を有する多機能因子として知られており、遺伝的造血障害マウスの研究により c-kit のリガンドとしてクローニング

作用していると予想されています。
〔形 状〕 凍結乾燥品（安定剤不含）〔分子量〕 18.3kDa
198-11521

39,000 円

10Fg

血球染色試薬●ギムザ染色液〔染色法〕
固 定：メタノール数滴……………………………… 約 30 秒
染色液希釈：水 1mW に対し 1 〜 1.5 滴ギムザ染色液を添加する。
（標本 1 枚あたり 2 〜 3mW の希釈染色液が必要）
＊注意＊

染
洗
乾

色：希釈した染色液を塗抹面にのせる。…… 15 〜 30 分
浄：水洗………………………………………… 15 〜 30 秒
燥

ギムザ染色液は一旦希釈すると時間の経過に伴いアズール B とエオジン Y が結合し、染色性が悪くなるので、用時希釈して下さい。

●メイグリュンワルド染色液〔細胞診染色法〕
前処理： 1. メイグリュンワルド染色液を塗抹標本上に載せる
2. 蒸留水またはりん酸緩衝液（pH 6.4 〜 6.8 1/15
mol/W）をさらに加える
洗 浄：流水……………………………………… 30 秒〜 1 分
染 色：ギムザ希釈液…………………………… 15 分〜 20 分

〔血球染色法〕
固定・染色：メイグリュンワルド染色液を約 10 滴加える…………………………………………… 2 〜 3 分
染 色：りん酸緩衝液（pH 6.4 〜 6.8 1/15mol/W）を約 10 滴加
える…………………………………………… 2 〜 3 分
洗 浄：ギムザ希釈液で洗浄………………………… 2 〜 3 秒
染 色：ギムザ希釈液……………………………… 10 〜 15 分
洗 浄：流水………………………………………… 15 〜 30 秒
乾 燥

洗 浄：水洗………………………………………………… 数秒
後処理：水を塗抹面に盛る（青色の液が浮き出る）…………………… 30 秒〜 1 分
乾 燥
透 徹
封 入

●ライト染色液〔染色法 1（ライト染色）〕〔染色法 2（ライト・ギムザ染色）〕
固定・染色：ライト染色液を約 10 滴加える……… 2 〜 3 分
染 色：りん酸緩衝液（pH 6.4 〜 6.8 1/15mol/W）を約 10 滴加
える…………………………………………… 2 〜 3 分
洗 浄：ギムザ希釈液を上から流す………………… 2 〜 3 秒
染 色：ギムザ希釈液……………………………… 10 〜 15 分

固定・染色：ライト染色液 10 〜 15 滴加える……… 2 〜 3 分
染 色：りん酸緩衝液（pH 6.4 〜 6.8 1/15mol/W）10 〜 15 滴を の上に滴下し混和する………………… 4 〜 7 分
洗 浄：流水………………………………………… 15 〜 30 秒
乾 燥

洗
乾

＊備考： 本染色性の特長として、顆粒は鮮明に染色されるが、核

浄：流水燥

はあまり鮮明に染色されない。
コード No.

品

名

規

格

容

量

希望納入価格（円）079-04391

ギムザ染色液病理細胞診研究用

250mW

2,200

131-12811

メイグリュンワルド染色液

病理細胞診研究用

250mW

1,200

238-01541

ライト染色液病理細胞診研究用

250mW

1,300

〔関連商品〕
コード No.

品

名

組成（1 包中）Na2HPO（無水）4

KH2PO 4

規

格

容

量

希望納入価格（円）166-14461

りん酸緩衝剤粉末 1/15mol/W, pH 6.4

2.5g

6.7g

生化学用

1W 用× 20 包3,700

163-14471

りん酸緩衝剤粉末 1/15mol/W, pH 6.8

4.7g

4.5g

生化学用

1W 用× 20 包3,700

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）23

病理組織包埋用パラフィン
Pathoprep 568
パソプレップ 568 はロット間の品質のバラツキをなくし、均一な炭素分布を持つ精製パラフィンに安全かつ安定な高分子化合物を添加した病理用包埋剤です。下記の特長と安全性を備えています。
①ペレットタイプで取扱いやすい②組織への優れた浸透性③薄切性に優れている
・1 〜 2Fm の超薄切切片が切れる
・連続切片が安定に得られる・ミクロトームでの切れ具合は適度に堅く、腰が強い・できた薄切切片はミクロトームへの巻き付きが少なく、取扱いやすい④切片の伸展性良好
・湯浴中での伸展性は良好
・伸展器（40 〜 50℃）で伸展させても、組織とパラフィンの剥離、ひび割れ、収縮膨張は無い⑤脱パラフィンはスムーズに行われ、染色性に問題は無い⑥安全性テスト合格品
・FDA 法に準じた食品に対する適合合 格性テスト
・日本薬局方パラフィン試験適合性
合 格■ HE 染色■ ABC 染色骨脱灰
コード No.
162-18961

ヒトリンパ節組織 pan B 2Fm （× 200）2Fm （× 100）品

名規

パソプレップ 568

格・マウスに対する経口急性毒性試験[LD50] 16.0g/kg 以上
・70℃、長時間熔融しても有害な揮
発成分は認められない⑦使いやすい包装形態
・片手で持って注ぎ やすいコンパク
トサイズの容器設計
・パラフィンを容器に入れたまま熔融
可能（70℃ 約 1 週間が限度）
・便利な使い捨て容器の上、一般ゴ
ミとして焼却処理できる環境にやさしい包材を使用
融点：56 〜 58℃
保存条件：冷所保存（30℃ 以下）
容

病理組織包埋用量

希望納入価格（円）500g × 1 ダース

13,000

細胞診染色『パパニコロウ染色』染色液 3 種
パパニコロウ染色は組織検査の HE染色に相当する汎用の染色法であり、がんの診断のための検査法としても重要なものです。
染色操作法
95％エタノール

.
.

24

↓
95％エタノール↓
80％エタノール↓
70％エタノール↓
50％エタノール↓
水 洗↓Pap. ヘマトキシリン染色液↓
水 洗↓
0.5％塩酸水

30 分
10 回
10 回
10 回
10 回
かるく

3分
かるく
適当に

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

コード No.

品

名

規

格

容

量

希望納入価格（円）168-18941

パパニコロウ・ヘマトキシリン染色液

病理細胞診研究用

250mW

2,200

161-18931

パパニコロウ OG100 染色液

病理細胞診研究用

250mW

2,200

164-18921

パパニコロウ EA100 染色液

病理細胞診研究用

250mW

2,500

↓
水 洗
↓
50％エタノール↓
70％エタノール↓
80％エタノール↓
95％エタノール↓
Pap.OG100 染色液↓
95％エタノール↓
95％エタノール↓
Pap.EA100 染色液

↓

5分
10 回
10 回
10 回
10 回
1分
10 回
10 回
2分

95％エタノール↓
95％エタノール↓
100％エタノール↓
100％エタノール↓
100％エタノール
↓
キシレン
↓
キシレン
↓
キシレン
↓
封 入

10 回
10 回
10 回
10 回
10 回
10 回
10 回
10 回

水質試験用試薬品目追加 ！

上水試験法に収載されている、消毒副生成物の標準品（液）を商品化しました。既存品と併せてご利用下さい。

PFBOA 誘導化分枝アルデヒド類標準品
水質試験用
分枝アルデヒド類を PFBOA（ペン

コード No.

R

容量

希望納入価格（円）タフルオロベンジルヒドロキシルアミ

163-19111

PFBOA-Isobutyraldehyde Std.

CH(CH3)2

100mg

15,000ン）で誘導体化した商品です。（E）-,

160-19121

PFBOA-Isovaleraldehyde Std.

CH2CH(CH3)2

100mg

15,000（Z）- 体の混合物です。

167-19131

PFBOA-2-Methylbutanal Std.

CH(CH3)C2H5

100mg

15,000164-19141

PFBOA-Pivalaldehyde Std.

C(CH3)3

100mg

15,000R

容量

希望納入価格（円）H

15,700品

名〔関連商品〕
直鎖アルデヒド類 PFBOA 誘導体化標準品

F

F
CH2ON = CHRFFF

コード No.

品

161-18311

PFBOA-Formaldehyde Std.

168-18321

PFBOA-Acetaldehyde Std.

CH3

100mg
100mg

165-18331

PFBOA-Propionaldehyde Std.

CH2CH3100mg

15,000162-18341

PFBOA-n-Butyraldehyde Std.

(CH2)2CH3

100mg

15,700169-18351

PFBOA-n-Valeraldehyde Std.

(CH2)3CH3

100mg

15,700166-18361

PFBOA-n-Hexanal Std.

(CH2)4CH3

100mg

15,000163-18371

PFBOA-n-Heptanal Std.

(CH2)5CH3

100mg

15,000160-18381

PFBOA-n-Octanal Std.

(CH2)6CH3

100mg

15,000品

規格

容量

希望納入価格（円）

水質試験用

1g

14,000

コード No.
165-16751

名名

O-(2,3,4,5,6-Pentafluorobenzyl)hydroxylamine Hydrochloride

ハロ酢酸類・ハロアセトニトリル類標準液

Toluene

水質試験用

大気汚染物質測定用

上水試験法収載のハロ酢酸類・ハロアセトニトリル類の標準液を追加しました。
コード No.

品

名

容 量

希望納入価格（円）024-13251

Bromoacetic Acid Std. Soln. (1mg/mW TBME)

2mW × 10A

9,000

038-16871

Chloroacetic Acid Std. Soln. (1mg/mW TBME)

2mW × 10A

9,000

209-14001

Trichloroacetonitrile Std. Soln. (1mg/mW TBME)
Haloacetic Acid Mixed Std. Soln.
(ea. 1mg/mW TBME)
内 容 : Bromoacetic Acid, Chloroacetic Acid,
Dichloroacetic Acid,Trichloroacetic Acid

2mW × 10A

9,000

2mW × 10A

12,000086-07261〔関連商品〕
コード No.

容 量

希望納入価格（円）041-24471

Dichloroacetic Acid Std. Soln. (1mg/mW TBME)

品

名2mW × 10A

9,400

201-12861

Trichloroacetic Acid Std. Soln. (1mg/mW TBME)

2mW × 10A

9,400

048-24481

Dichloroacetonitrile Std. Soln.(1mg/m W AcCN)

2mW × 10A

8,400

＊ 関連商品は水道法・監視項目に該当します。

15,000

大気中の揮発性有機ハロゲン化合物等の測定の際、捕集管（活性炭チューブ等）に捕集した試料の脱着溶媒として使用されます。
本品は、GC/ECD 及び GC/MS において、有機ハロゲン化合物がほとん
ど含まれないことを確認しています。
〔規 格〕
含 量（cGC）：99.7％以上
GC（ECD）分析適合性：試験適合
GC（MS）分析適合性 ：試験適合
500mW
208-14135
6,000 円〔関連商品〕
Fluorobenzene Standard
大気汚染物質測定用
1g
068-03721
5,000 円Toluene-d8 Standard
大気汚染物質測定用
1g
204-14311
照 会

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

25

ゴルフ場農薬試験 (GC/MS) 用
32 種農薬混合標準液
ゴルフ場使用農薬目標基準値が設定されている農薬のうち、GC/MS 法により測定される 32 農薬の混合標準液です。
〔内容〕

1. アセフェート
2. メタミドホス
3. ベンスリド（SAP）
4. ベスロジン（ベンフルラリン）
5. ブタミホス
6. キャプタン
7. CAT（シマジン）
8. クロロネブ
9. クロルピリホス

10. DEP（トリクロルホン）
11. ダイアジノン
12. ジチオピル
13. エクロメゾール（エトリジア

18. イソキサチオン
19. MBPMC（テルブカルブ）
20. MEP（フェニトロチオン）
21. メプロニル
22. メタラキシル
23. メチルダイムロン
24. ナプロパミド
25. ペンシクロン
26. ペンディメタリン

ゾール）

14. フルトラニル
15. イプロジオン
16. イソフェンホス
17. イソプロチオラン〔保存条件〕 − 20℃・遮光保存〔ご使用上の注意〕① 2 〜 10℃ 保存下では徐々に分解します

27. プロピザミド
28. ピリブチカルブ
29. ピリダフェンチオン
30. トルクロホスメチル
31. TPN（クロロタロニル）
32. トリクロピルブトキシエチル
各 10Fg/mW アセトン溶液

GC/MS（TIC）
による標準クロマトグラム

ので、必ず上記保存条件にて保存して6+16+23下さい。
② 希 釈 後の 溶 液 は 2 〜 10℃ 保 存 下 で徐々に分解しますので、希釈後はできるだけ速やかにご使用下さい。
（本品を

32

8

27+31

アセトンで 20 倍希釈した場合、DEP は

11

直ちに分解します。
）

30 9

4

③ 試料気化室のガラスインサートは不活

19

22
12
20

13

性化処理したものをご 使用下さい。不活性化処理をしていないインサートをPhase : HP-5 Trace Analysis, 0.1μm
Column : 30m×0.25m I.D.
Injection : 50-270℃
Interface : 270℃
Column temp. : 50-270℃
Carrier gas : He 1.7mℓ/min.
Injection mode : Splitless

5+24 17
14

21

26

28
15

29

7

用いて分析を行った場合、DEP 及びメ
チルダイムロンが分解するおそれがあ

25

1
10

2

18

ります。
3

④ 希釈に用いる溶媒は、高純度の分析用グレードをご使用下さい。

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

⑤ アンプル中には 約 1.2mW 入っています。

コード No.
162-19201

品 名
32 種農薬混合標準液

規 格

容 量

希望納入価格（円）

残留農薬試験用

1mW × 5A

45,000不活性化（シラン）処理用
5w/v％ジメチルジクロロシラン トルエン溶液
ガスクロマトグラフィーにおける、試料気化室のガラスインサートや石英
ウールの不活性化処理（シラン処理）にご使用下さい。
〔方 法〕① 清浄な試験管を用意する。
② インサートを 水洗浄、希塩酸（1％）
洗浄後、乾燥する。

26⑦ 乾燥後は蓋のある容器に入れ、暗③ 試験管に本品（5％ジメチルジクロ
ロシラン トルエン溶液）を入れ、イ所に保存する。
※
上記操作時、インサートを直接手で触れ
ンサート全体が浸るようにする。
ないようにして下さい。
（ピンセット等でお④ 試験管に栓をし、ドラフト内等換気取扱い下さい。）のよいところに約 10 時間放置する。
※ 同様な操作で石英ウールも不活性化処理⑤ 試験管から取り出し、メタノールで
できます。
洗浄する。
（ドラフト内 約 2〔保存条件〕⑥ 室温にて乾燥する。
時間）
不活性ガス封入・2 〜 10℃・遮光保存

コード No.

品

045-26375

5w/v％ジメチルジクロロシラントルエン溶液

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

名

規

格

ガスクロマトグラフ用

容

量

500mW

希望納入価格（円）10,000関連商品
水質 ･ 環境試験（HPLC）用

水質試験（GC/MS）用

水質 ･ 環境試験（GC/MS）用

8 種農薬混合標準液

4 種農薬混合標準液

13 種農薬混合標準液

残留農薬試験用

残留農薬試験用

残留農薬試験用

〔内

〔内

〔内

容〕

容〕

容〕

アシュラム、ベンスリド（SAP）、イプロジオン、

ダイアジノンオキソン、EPN オキソン、イソキサ

MCPP（メコプロプ）、ペンシクロン、チウラム、TPN（クロロタロニル）、シデュロン
各 100Fg/mW アセトニトリル溶液

チオンオキソン、MEP オキソン（フェニトロチオ

ノブカルブ）、CAT（シマジン）、CNP（クロルニンオキソン）

トロフェン）、DDVP（ジクロルボス）、ダイアジノ

各 100Fg/mW アセトン溶液

ン、EPN 、IBP（イプロベンホス）、イソプロチオ

160-18401

167-18411

1mW × 5A

25,000 円

1mW × 5A

オキシン銅標準液

有機りん農薬混合標準液

残留農薬試験用

残留農薬試験用〔内〔内

164-18421

1mW × 5A

25,000 円

容〕

EPN、メチルジメトン、メチルパラチオン、パラ

50Fg/mW メタノール溶液

1mW × 5A

プロピザミド、TPN（クロロタロニル）
各 10Fg/mW アセトン溶液

下水道試験用

159-01961

ラン、イソキサチオン、MEP（フェニトロチオン）、

20,000 円

水質 ･ 環境試験（HPLC）用
容〕

ベンチオカーブ（チオベンカルブ）、BPMC（フェ10,000 円

チオン
各 1mg/mWトルエン溶液※「毒物劇物取締法」に基づく「特定毒物研究者指定証」が必要です。

153-01481

1mW × 5A

15,000 円ミ
ミク
クロシスチン測定用
用
ミクロシスチン分解物標準品（MMPB）
水質試験用
富栄養化の進んだ湖沼ではアオコによる水質汚染の影響が問題となっています。アオコを形成している藍藻類がつくる代表的な毒素『ミクロシスチン』は、現在 60 種類ぐらいの誘導体が知られています。ミクロシスチンの分析は、従来より HPLC 法による各成分の分析が行われておりますが、試料の調製が煩雑であるなど種々の問題があります。
最近、新しい測定法としてミクロシスチンの毒性発現に重要な Adda 構造に着目したミクロシスチン分解物 (MMPB)
測定法が開発されました 1)。この方法はミクロシスチンの Adda 構造の二重結合を切断し、遊離する 2-Methyl-3-methoxy4-phenylbutyric Acid (MMPB) を測定することにより、全ミクロシスチン量の定量が可能となります。
本品は、ミクロシスチン分解物測定法に使用される MMPB 標準品と GC-MS 分析に必須な MMPB-d3 標準品です。
〔規 格〕
含量 (HPLC)…………… 97.0％ 以上

１）
〔反応式〕

ミクロシスチン類

MMPB

COOH OO〔参考文献〕

X N
H
CH3

HN

1) Sano, T., Nohara, K., Shiraishi, F. andKaya, K. : Intern. J. Environ. Anal.
Chem., 49, 163 (1992).

R3HC

O

R1

O

Z
HN

H H3C

O

H
CH3

KMnO4 + NaIO4

NH

N

CH3

CH3
HOOC

H3CO

OCH3

Adda

COOH

R2

Adda : 3-Amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6-dienoic Acid

コード No.

品

名

容

量

希望納入価格（円）130-12881

erythro-2-Methyl-3-(methoxy-d3)-4-phenylbutyric Acid Sodium Salt Standard (MMPB-d3 Sodium Salt)

1mg

45,000133-12871

erythro-2-Methyl-3-methoxy-4-phenylbutyric Acid Sodium Salt Standard (MMPB Sodium Salt)

1mg

40,000＊本品は erythro 体の為、(2R,3S) 体と (2S,3R) 体の混合物です。

関連商品

コード No.
300-05191

品

名

常盤化学工業（株）ミクロシスチン ELISA キット
名

容 量

希望納入価格（円）96 回用

75,000

コード No.

品

含量 (HPLC)

規

格

容 量

希望納入価格（円）136-12241

Microcystin LR

95.0% 以上

生化学用

250Fg

15,000133-12251

Microcystin RR

95.0% 以上

生化学用

250Fg

15,000132-12841

Microcystin YR

95.0% 以上

生化学用

100Fg

15,000

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）27大気中のアルデヒド、ケトンの HPLC 分析
和光純薬工業（株） 大阪研究所

アルデヒドは有害大気汚染物質とし対象になっている。

て、国内では大気汚染防止法（2 成分）、

今回、当社の ODS シリカを用いた悪臭防止法（6 成分）により、また米国

場合の分離の最適化検討（定量性、検では、EPA 等により 15 成分の測定法

出限界、妨害物の影響、分析時間等）

が示され、2,4- ジニトロフェニルヒドラを実施した結果、Wakosil-II 5C18RS

ゾン（DNPH）誘導体として GC または充填剤を用いた時に最適分離

HPLC により分析され ている。ODS（C18）
シリカを用いる HPLC 分析法は、
GC 法で必要となる未反応の 2,4- ジ

結果が得られた。DNPH 誘導
体化標準液の分析は、市販のニトロフェニルヒドラジンの除去やアニトリルに溶解し標準液とし、セトニトリルから酢酸エチル溶液への

屋外大気サンプルの分析は、転溶操作が不要等の理由から広範に

DNPH 誘導体標準品をアセト

上森

時の相関係数ｒ =0.9999 が得られた。
また各成分の検出限界を表 1 にまとめて示した。

Table1. Limit of detection(as aldehyde and ketone)
Formaldehyde

12.3pgAcetaldehyde

18.5pg

屋外大気を DNPH 含浸シリカ

Acetone32.6pg

利用されている。大気汚染防止法によ

カートリッジカラムで誘導体化

Propionaldehyde

35.8pgれば、ホルムアルデヒドおよびアセト

後 ア セトニトリル で 溶 出し、Isobutyraldehyde

82.0pgアルデヒドの２成分が優先取組物質にButyraldehyde

82.0pg指定され、また悪臭防止法においてもHPLC にて分析した。この時の分離の状況を図 1 に示した。

Isovaleraldehyde

89.0pg

アセトアルデヒド、プロピオンアルデ

実検体の分析においても妨害

Valeraldehyde

ヒド、n- ブチルアルデヒド、イソブチ物の影響を受けず、検量線は、108.2pg

ルアルデヒド、n- バレルアルデヒド、イ

0 〜 50ng の範囲で原点を通る

ソバレルアルデヒドの 6 成分が規制の良好な直線関係を示し、その標準品の分析

仁志

屋外大気試料の分析
HPLC Conditions
Column : Wakosil-

5C18RS

Column size : 4.6mmH × 250mm
HPLC system : Shimadzu LC-6A
Eluent : CH3CN/H2O=60/40(v/v)
Flow rate : 1.0mW/min at 40℃
Detector : UV 360nm, 0.04Aufs
Inj. Vol. : 10FW each

0.75Fg/mW(as aldehyde, ketone)
Sample : -2,4-DNPH/ 1.Formaldehyde,
2. Acetaldehyde, 3. Acetone,
4. Propionaldehyde, 5. Iso butyraldehyde, 6. n-Butyraldehyde, 7. Isovaleraldehyde
8. n-Valeraldehyde（注）ODS カラムを用いた場合には DNPHn- ブチルアルデヒド、 DNPH- イソブ
チルアルデヒドが重複している。

図１ DNPH- アルデヒド類の分析例

28

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

わ！
わず
ずらわしい調製が不
不要
要に
に！
！
！
ダイオキシン類分析用化学修飾シリカゲル
分析方法

排ガス、土壌中などのダイオキシン類を分析する際、試料のクリーンアップに多層シリカゲルカラムクロ
マトグラフィーが用いられます。本品は多層シリカゲルカラムの作製時に使用する化学修飾シリカゲルであり、それぞれ水酸化カリウム、硝酸銀、硫酸の濃度を 2％、10％、44％、22％になるよう調製した製品です。

※ 多層シリカゲルカラム
試料（粗抽出液）
一部分取

硫酸ナトリウム

内標準添加
濃10% 硝酸銀シリカゲル

縮ワコーゲル S-1 など

多層シリカゲルカラムクロマトグラフィー

硫酸処理

22% 硫酸シリカゲル

シリカゲルカラムクロマトグラフィー
濃44% 硫酸シリカゲル

縮ワコーゲル S-1 など
２% 水酸化カリウムシリカゲル

アルミナカラムクロマトグラフィー
ワコーゲル S-1 など

活性炭埋蔵シリカゲルクロマトグラフィー
濃縮／転溶
シリンジスパイク
GC-MS

クリーンアップ性能

GC/MS (TIC) クロマトグラム

操作方法
アバンダンス

試 料 10 mℓ（土壌加熱還流抽出試料）
アントラセン 50μg 添加
γ-クロルデン 10μg 添加
多層シリカゲルカラム処理
ヘキサン100 mℓ溶出KD 濃縮１mℓ

GC/MS (TIC)※試料には分析時の爽雑物質の指標としてアントラセンを、分析対象物の指標として C- クロ

Time

ルデンをそれぞれ添加しています。

Propyzamide
Anthracene
N,N-Bis(1-methyl)-benzamide
γ-Chlordane
LenacilBis(2-ethylhexyl)Phthalate
Terpenes

アバンダンス②

6800000
6600000
6400000
6200000
6000000
5800000
5600000
5400000
5200000
5000000
4800000
4600000
4400000
4200000
4000000
3800000
3600000
3400000
3200000
3000000
2800000
2600000
2400000
2200000
2000000
1800000
1600000
1400000
1200000
1000000
8000006000004000002000007000000
6500000
6000000
5500000
5000000

（処理前）

（処理後）

4500000
4000000
3500000
3000000①

2500000⑤

2000000⑦⑥③

1500000④

1000000④
500000
0

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

45.00

50.00

Time

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

40.00

45.00

50.00

※カラムクロマト管に充てん後、ダイオキシン類分析用 n- ヘキサンなどの溶媒で洗浄を行って下さい。

〔参考資料〕

１）厚生省生活衛生局水道環境部環境整備課：廃棄物処理におけるダイオキシン類標準測定分析マニュアル
２）環境庁大気保全局大気規制課：有害大気汚染物質測定方法マニュアル

コード No

品

名

規

格

容

量

希望納入価格（円）167-19251

2% Potassium Hydroxide-impregnated Silica Gel

ダイオキシン類分析用

100g

197-11611

10% Silver Nitrate-impregnated Silica Gel

ダイオキシン類分析用

100g

17,00017,000191-11631

44% Sulfuric Acid-impregnated Silica Gel

ダイオキシン類分析用

100g

17,000194-11621

22% Sulfuric Acid-impregnated Silica Gel

ダイオキシン類分析用

100g

17,000〔関連商品〕
コード No

品

名

規

格

容

量

希望納入価格（円）203-14141
209-14143

Tolueneダイオキシン類分析用

083-07391

Hexane (n-〃)ダイオキシン類分析用

048-26321
044-26323

Dichloromethane

ダイオキシン類分析用

019-11941

Active Carbon-impregnated Silicagel

ダイオキシン分析用

1W
3W
1W
1W
3W
10g

197-07485

Sodium Sulfate

PCB・フタル酸エステル試験用

500g

3,400

230-00261

Wakogel

カラムクロマトグラフ用

250g

10,500S-1(for determination of PCB)

4,000
9,000
3,500
4,500
11,50016,800

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

29

試
（
試料
料前処理用 固相抽
抽出
出カ
カラ
ラム
ム
（カ
カー
ート
トリ
リッジタイプ ）プレセップ -C シリーズ
複雑な組成の試料から目的の物質のみを抽出する方法として、液−液抽出法が汎用されてきましたが、近年、環境への配慮などからさまざまな手法、技術が開発され応用されるようになりました。

HPLC，GC 分析などの試料の前処理として用いられる固相抽出法は、簡便で溶媒使用量も少ないなどの利点から、従来の液−液溶媒抽出法に代わって多く使用されるようになりました。環境分析、食品分析に関する公定法でも多く採用されるようになり、この方法を用いる技術が発展すると思われます。
前述のように固相抽出法は、簡便、使用溶媒量が少ないだけでなく次のような利点があります。
１． 多検体を同時に短時間で処理できる
２． 再現性が良く、また回収率も高い
３． 高濃縮倍率が得られる

0.773
8.785

使用カラム：プレセップ - Ｃ シリカゲル
試 験 方 法：本品を HPLC に接続し下記条件で分析、ピーク形状から充てん状態を確認
Eluent： n-Hexane/CH3CN=９９/１
Flow Rate ： 2.0mW/min．at 35℃
Detection ： UV254nm， 0.08AUFS
Sample ： 1)Toluene2)Dimethyl Phthalate
1)/ 2)/n-Hexane=1/1/48(V/V/V)
Injection Volume ：20FW

0

１． 固 相 抽 出 時 に 加 圧 及 び 減 圧
いずれの方式でも使用可能
２． 充てん剤種、量等目的に応じ数個連結可能〔基本性能試験例〕

10

現在用いられている固相抽出用カラムには、両端密閉型のカートリッジタイプと一端が開放型のシリンジタイプとがあり、また充てん剤もさ
まざまな種類があります。
このたび当社では両端密閉型カー
トリッジカラムプレセップ −Ｃシ
リーズを商品化いたしました。カー
トリッジタイプの特長としては、

左記条件にてのクロマトグラム

すでに多くの方にご利用いただいております当社の充てん剤を充てんし、10〔製品の主な試験項目〕
１． 乾燥減量
２． 基本性能試験
３． 回収率試験〔回収率試験例〕
使用カラム：プレセップ - Ｃ シリカゲル
試 験 方 法：本品を HPLC に接続し下記条件で分析、ピーク面積値
から回収率を測定
Eluent：n-Hexane/CH3CN=９９/１
Flow Rate ： 2.0mW/min．at 35℃
Detection ： UV254nm， 0.08AUFS
Sample ： Dimethyl Phthalate/n-Hexane=1/49(V/V)
Injection Volume ：20FW

0

よう厳重に品質管理をしております。

8.629

左記条件にてのクロマトグラム

再現性良く安心してご利用いただける〔次項へ続く〕30

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

サンプル包装を用意しておりますのでご請求下さい。
コード No．

規 格

包 装

希望納入価格（円）294-31851

Presep -C Silica Gel

品

名

試料前処理用

10 個×５25,000290-31951

Presep -C Florisil

試料前処理用

10 個×５25,000292-32251

Presep -C C18 (ODS)

試料前処理用

10 個×５25,000296-32151

Presep -C Na2SO4

試料前処理用

10 個×５25,000規 格

包 装

希望納入価格（円）

残留農薬試験用

50 個

38,000〔関連商品〕

シリンジタイプ用固相抽出カラム
コード No．
291-26851

品

名Presep -Agri※ポリマーゲル（スチレンジビニルベンゼン- メタクリレート系ポリマー）を吸着素材に用いて、残留農薬を迅速かつ簡便に前処理するシリンジタイプの固相抽出用カラムです。

大大幅
幅値下げしました !！
!！
ダイオキシン測定用キット
STRATEGIC DIAGNOSTICS INC.
DIOXIN RISC TESTDIOXIN RISC TEST は エン ザ イ
ム イムノアッセ イ（EIA）法により、 〔キット構成〕
2,3,7,8-TCDD を定量〜半定量的に・ 抗ダイオキシン抗体コーティング
測定するキットです。
10 本
チューブ
1.5m
・ ダイオキシン結合酵素〔特長〕
W用
1. n g / W 〜 pg / W の 濃 度 の 2,3,7,8 5mW × 1
・ 試料希釈緩衝液
TC DD を測定する事ができます。
50mW × 1
・ 10 倍濃縮洗浄液
2. キットには 毒 性の高い 2,3,7,8-T
5mW × 1・ 基質 A
CDD が含まれていません。
B
5mW × 1・ 基質
3. EIA法により簡易な測定が可能で5mW × 1・ 反応停止液
200FW × 1
す。
・ TriCDD 標準液

旧価格

300,000 円 /10 テスト用↓

180,000 円 /10 テスト用
532-48211

10 テスト用 180,000 円

近日発売
近日発売！
スチレンダイマー・トリマー標準品
環境分析用

和光純薬ではこの度お客様相談室を開設いたしました。
試薬の製品内容、使用方法等はこちらにお願いいたします。

環境ホルモンの疑いのある物質の一つに、ポリスチレン容器中に残存しているスチレンダイマー・トリマーが上げられておりその実態解明が進められ（フリーダイヤルの受け付け時間は平日の９：30 〜 17：00 です。お問合わせは受け付け時間内にています。

お願いいたします。）

詳しくは資料をご請求下さい。

E-mail アドレス
ホームページアドレス

labchem-tec @ wako-chem.co.jp（西日本）
labchem-tect @ wako-chem.co.jp（東日本）
http://www.wako-chem.co.jp

和光純薬時報 Vol.66, No.3（1998）

31

和
光
純
薬
時
報
第
六
十
六
巻

紙の使い易さとシリカゲルの分離性が合体
Chromato Sheet
薄層クロマトグラフ用
クロマトシートは 紙 の利点を最大限に生かした「軽量で使いやすい」「廃棄の問題もない」環境にやさしい製品です。従来

第三号の薄層クロマトプレート（TLC プレート ) と異なり、特殊な技術でシリカゲルと蛍光剤 F254 を 紙 の繊維に固定したもので、「紙の使いやすさ」と「シリカゲルの分離性（吸着、分配モード）」が得られます。TLC 分離、ブロッティング等、種々の用途にご利用
下さい。
特

長

クロマトシート仕様

・ TLC プレート同様、分離性・再現性に優れる
・ はさみで容易に、任意の大きさに切断できる・ かさばらず保管しやすく、そのままファイルもできる
・ クロマトシート上に鉛筆等での記入ができる
・ 粉落ちしない・ ブロッティング可能・ 紫外線検出 (254nm）可能

クロマトシートとシリカゲル 70F254 プレートワコーの比較
サンプル ：ワコーゲルＢテスター（バタ−エロ−、ズダンレッドＧ、インドフェノ−ル）
展開溶媒： クロロホルム

大きさ： 20cm × 20cm

厚重

： 約 0.3mm： 約 7g/ 枚ささ

包 装 ： 25 枚入り
使用シリカゲル：粒径５〜 20Fm 破砕状、F254 蛍光剤入り（紙の特性のため全体が青みがかって見えます）

クロマトシートの紫外線（254nm）による検出例
サンプル ： ブルシン、オキシプロピルテオフィリン、カフェイン
展開溶媒： クロロホルム９＋メタノール１

サンプル包装を用意しておりますのでご請求下さい。
コード No.

品

036-17151

Chromato Sheet (20cm × 20cm)

名

規

格

薄層クロマトグラフ用

容量

希望納入価格（円）

25 枚

10,000

収載されている試薬は、試験・研究の目的にのみ使用されるものであり、家庭用、医療用等他の用途には用いられません。

希望納入価格には消費税等が含まれておりません。

発行所

32

和光純薬工業株式会社〒 540-8605
大阪市中央区道修町三丁目 1 番 2 号
TEL.
（代）
和光純薬時報 Vol.66, 06-203-3741
No.3（1998）

発 行 日
発行責任者
編集責任者
印 刷 所

1998 年 7 月 15 日
岸 井 松 司大 西 礼 子
共進社印刷（株）

32