小麦アレルゲンを欠損したパンコムギ系統の実用化に向けた調査

研究課題名

小麦アレルゲンを欠損したパンコムギ系統の実用化に向けた調査

フリガナ

エンドウ タカシ

代表者名

遠藤 隆

所属機関 （機関名） 龍谷大学農学部植物生命科学科（役職名） 教授
氏 名 （フリガナ）
共同研究者

所属機関 ・ 役職名

森田栄新 ( モリタエイシン ) 島根大学医学部
新田康二 ( ニッタコウジ )役割分担
アレルゲン欠損系統の免疫学的および臨床研究

島 根 県 中 山 間 地 域 アレルゲン欠損系統の島根県中研究センター
山間地域での栽培および加工

学会発表
新田 康二 , 帯刀 一美 , 河野 邦江 , 千貫 裕子 , 塩飽 邦憲 , 森田 栄伸 , 竹中 祥
本助成金による発
太郎 , 遠藤 隆 . 「小麦アレルゲンを欠損したパンコムギ系統の実用化に向けた調表論文， 学会発表
査」． 第 242 回日本作物学会講演会（龍谷大学瀬田キャンパス・2016 年 9 月 10 日）( 講演会 優秀発表賞 受賞 )研究結果要約
小麦は， 鶏卵， 牛乳とともに 「食物の 3 大アレルゲン」 の一つである。 小麦アレルギーは， グルテンの成分であるω− 5 グリアジンが主要抗原となっている。 我々は ω − 5 グリアジン遺伝子座を欠失した実験系統を見出し， それに日本のパンコムギ品種ホクシンを 5 回交配して 1BS-18 ホクシン系統を育成した。
本研究では， 1BS-18 系統について， 収穫量や製パン特性を純系品種と比較し， さらに， 免疫学的および臨床研究を行った。 島根県中山間地域研究センターでの露地， 及び瀬田でのハウス内栽培では，
1BS-18 は純系と比較して， 収量はそれぞれ 94％と 67% と低下した。 この主要な原因は， 1BS-18 の葯に不裂開するものが多く不稔性が高くなったためであった。 播種時期を変えた試験栽培は， 播種時期を早めることによって 1BS-18 ホクシンの収量を改善できる可能性を示した。 また， 1BS-18 の製パン性は純系に比べて遜色のないものであった。 1BS-18 のアレルゲン性について， ω-5 グリアジンのエピトープ抗体を用いたウエスタンブロット法および高速液体クロマトグラフィー法， 及び動物実験を用いて評価した。
1BS-18 ホクシン由来のグルテンは患者血清と全く反応せず， 1BS-18 由来のグルテンを摂取したモルモッ
トは， 市販グルテンを摂取したモルモットと比較して， 有意にアレルギースコアが低く， 1BS-18 のアレルゲン性が低いことが示された。

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小麦アレルゲンを欠損したパンコムギ系統の実用化に向けた調査

研究目的

通りの栽培特性と低アレルゲン性を示せば， 日小麦アレルギーの治療法は確立されておら本でも増えている小麦アレルギー患者には， 食ず， 唯一の予防法は原因となるグルテンを含む生活の質の向上をもたらす福音となるであろう食品を摂取しないことである。 いわゆるグルテンし， 乳幼児にとっては， コムギアレルギーの予フリーの食品 ・ メニューが普及しているとはいえ，防になることが期待される。 さらには， 全国的 ・小麦粉はほとんどの食品や料理に含まれている

世界的にアレルゲン欠損パンコムギ品種の普及ので， 小麦アレルギー患者は極めて不便な食が期待される。

生活を余儀なくされている。 小麦アレルギーは，研究計画及び研究手法

グルテンの成分であるグリアジンが主要な抗原と当初の計画と実施した内容は以下の通りであなっており， 各種のグリアジンの中でも， ω− 5る。

グリアジンが小麦アレルギーの主要抗原であ1)る 。 ω− 5 グリアジンをコードする遺伝子は 1B

当初計画染色体の末端に座乗する。 ω− 5 グリアジン遺（1） ホクシンのアレルゲン欠損系統と純系品種伝子座を含む最も小さ欠失を持つ実験系統を，滋賀県瀬田の水田地域 （龍谷大学農学部）

2)を ， 日本のパンコムギ品種ホクシンに戻し交配の圃場とビニールハウス内で， 播種時期を変えして， ω− 5 グリアジン遺伝子座を欠失したホクて栽培する。 稔性と収穫量の調査をして， アレシンのアレルゲン欠損系統 1B-18 を育成した。

ルゲン欠損系統の最適栽培条件を明らかする。

本研究では， この 1BS-18 系統を異なる地域（2） アレルゲン欠損系統と純系品種を， 島根と異なる栽培条件で栽培して， 稔性や収量の調県の中山間地域 （島根県中山間地域センター）査を行い， 最適な栽培条件を明らかにすること，の圃場とビニールハウスで栽培する。 稔性と収収穫した 1BS-18 系統小麦を製粉してパンやう

穫量の調査をして， アレルゲン欠損系統と純系どんに加工して， その特性を既存品種の製パン系統の収穫量の比較を行う。 ビニールハウス内性 ・ 製麺性と比較して 1BS-18 系統栽培特性をでの栽培は， 他品種との自然交雑を極力無くす

明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た。 更 に は，るためで， アレルゲン欠損系統の実用化に当っ1BS-18 系統小麦の免疫学的および臨床研究をて， 加工適正やアレルゲン性の試験のため及行うこと， 具体的には， 1BS-18 のアレルゲン性び生産のための種子を大量に増殖するためでについて， モルモットを用いた動物実験によりある。

評価を行うことを目的とした。

（3） 圃場で栽培するアレルゲン欠損系統と純系

本研究により 1BS-18 系統が， 収量や加工性品種の間の自然交雑率を， 染色体調査およびの観点から， 実用品種になり得るかどうかの判

PCR により調査する。 これにより， 実際の栽培

定， アレルギー反応を低減するなどの生体内にで自然交雑を避けるための， 他品種との安全なおける 1BS-18 のアレルゲン性に関して基礎的隔離距離を明らかにする。

知見の獲得が期待される。 1BS-18 系統が期待（4） 収穫したアレルゲン欠損系統をパンやうど− 13 −

小麦アレルゲンを欠損したパンコムギ系統の実用化に向けた調査

んに加工して， 製パン性と製麺性を調査する。

25 日播種区 ( 以下， ハウス遅い区 ) に播種時これにより， アレルゲン欠損系統が実用的な品期を分けた。 裁植密度は露地と同様のものに設種となり得るかどうかを確認する。

定した。 露地栽培と同様の調査をおこなった。

（5） アレルゲン欠損系統のアレルゲン性を， ω

ただし， DON 及び NIV 分析はハウス早い区，− 5 グリアジン抗体を用いて免疫学的に調査す

ハウス対照区， ハウス遅い区の 3 区を混合してると共に， 実際の患者を対象とした臨床試験を分析した。

行う。

（3） 1BS-18 と純系の間の自然交雑を， 20 個体について染色体観察を行った。 PCR での調実施内容

査のため， 1BS-18 にだけ欠損している PCR マ（1） 水田転換畑 （無施肥） で 1BS-18 と純系ーカー （プライマー :5’ AAGTGAGCAATAGTをそれぞれ 8 反復で栽培した （1 反復 0.25 a，

AAACACAAATCAAAC 3’/5’ CGTTACATTAT

栽植密度 60 cm x 20 cm 3 粒播種）。 ビニールGCTCCATTGACTAACAACGATG 3’） の開ハウス （化成肥料チッソ ・ リン酸 ・ カリ各 6発を行った。 しかし， 計画した 1BS-18 と純系kg/10 a） で 1BS-18 と純系をそれぞれ 6 反復の間の自然交雑率の PCR による大規模調査は2で栽培した （24 個体／ 1 反復 0.5 m ）。

計画通りには実施できなかった。

（2） 露地栽培 （化成肥料チッソ ・ リン酸 ・ カリ（4） 製 パ ン 性 試 験 で は ハ ウ ス 内 で 収 穫 し た各 6 kg/10 a） で は， 1BS-18 ホ ク シ ン を H27

1BS-18 ホクシン ( ハウス早い区，ハウス対照区，

年 11 月 4 日播種区 ( 以下， 露地早い区 )， 11

ハウス遅い区を混合 ) を全粒粉にしたものと，

月 17 日播種区 ( 以下， 露地対照区 )， 11 月

純系ホクシンを全粒粉にしたもの， 市販の強力30 日播種区 ( 以下， 露地遅い区 ) に播種時期

粉 ( レ ッ ド キ ュ ー ブ ) の 3 つ に 対 し， 比 容 積を分けた。 また， 対照区と同日に純系ホクシン(cm /g) を測定した。 機器は市販の ZOJIRUSHI( 以下， 純系ホクシン区 ) も播種した。 裁植密BB-KW10 型を用いた。

32度は 8.3 本 /m ( 条間 60cm ×株間 20cm) で 3（5） 実験系統 1BS-18 のアレルゲン性評価を，粒播種とした。 各区ではそれぞれの出穂期，モルモットを実験動物として感作および負荷試

生育 ( 稈長， 穂長， 穂数 )， 収量， 穂の稔性験を行い， 市販グルテンとの比較を行うことによを調査した。 また， 収穫後はホクシンを除く各り 1BS-18 系統の感作能を評価した。 モルモット

区のデオキシニバレノール ( 以下， DON) 及び10 匹を 1 グループとして 2 群準備し， 1 群にはニバレノール ( 以下， NIV) の成分分析をおこな

16 時間絶食後に 1BS-18 系統由来のグルテンった。

感作液 （40 mg/mL, 20 mL/kg） を， もう 1 群

ハウス栽培 （化成肥料チッソ ・ リン酸 ・ カリ各には市販グルテン感作液 （40 mg/mL, 20 mL/6 kg/10 a） で は， 1BS-18 ホ ク シ ン を H27 年kg） を 10 日間連続投与した。 その後， 14 日

12 月 1 日播種区 ( 以下， ハウス早い区 )， 12目まで， あるいは， グループの半数のモルモッ

月 15 日播種区 ( 以下， ハウス対照区 )， 12 月

トがアレルギー症状を呈する （後述するアレル− 14 −小麦アレルゲンを欠損したパンコムギ系統の実用化に向けた調査

ギースコアが 1 以上となる） まで感作液の投与痒行動） および立毛 1 点， 発赤症状および下を継続した （下図 a）。

痢 2 点， 努力性呼吸およびチアノーゼ 3 点，感作に際しては， グルテン感作液投与の 1

死亡 4 点として合計スコアを用いた （下図 b）

時間前に炭酸水素ナトリウム溶液 （7%, 20 mL/3)。 なお， 本検討では， 実際の患者を対象としkg） を投与して胃酸を中和した後， グルテンにた臨床試験を行う前に， 動物実験による基礎的よる感作の効率を高めるためにアスピリンの代謝評価を行った。 当初目的としていた実際の患者産物であるサリチル酸溶液 （10 mg/mL, 0.5% メを対象とした臨床試験については， 島根大学医チルセルロースに溶解 , 20 mL/kg） を前投与しの倫理委員会を通過した段階であり， 今後の課た。 なお， アレルギー症状のスコアリングは既題として行う予定である。

報文献を参考にして，無症状 0 点，鼻こすり （搔図 . 1BS-18 由来のグルテンおよび市販グルテン感作液を用いた感作および負荷試験．

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小麦アレルゲンを欠損したパンコムギ系統の実用化に向けた調査

結果と考察

アレルギー症状の出現はなく， 15 日目に小麦ホクシン 1BS-18 をホクシン純系と比較した

運動負荷を行うも症状出現に至らなかったが，結果（島根・露地と瀬田・ハウス）

グルテン感作液の腹腔内投与によりアレルギ・ 稈 長は統計的に有意な差はなく， 穂長， 穂ー症状が出現した （アレルギースコア＝ 0.4,表参照）。

数に有意な差があった。 この差は， 1BS-18染色体の末端欠失の 1 効果もあるが， 実験・ 市 販グルテン感作群は 13 日目に全例がスコ系統の遺伝的背景がホクシンに完全に置き換

ア 1 以上のアレルギー症状を呈し， 14 日目

わっていなことも影響していると思われる。に行った小麦運動負荷によりアレルギー症状・ 稔 性 は， 島 根 ・ 露 地 で 8.0% 低 下 し （P =がみられたが， 運動によるアレルギー症状の0.105964） ，瀬田・ハウスで 16.2% 低下した （P増強は見られなかった （アレルギースコア＝= 0.000066） 。 ホクシン 1BS-18 を人為交配

1.4， 表参照）。 また， グルテン感作液の腹腔するとほぼ 100% の着粒であることから， 稔性内投与によりアレルギー症状が増強した （アの低下は葯の高頻度の不裂開が原因と考えらレルギースコア＝ 4.4， 表参照）。
・ 感 作期間中に市販グルテン感作グループでれる。
・ 収 量は， 島根 ・ 露地で 9 kg/10a 低下し （Pは 10 匹の実験動物のうち 5 匹が実験開始後= 0.63） ， 瀬田 ・ ハウスで 195 kg/10a 低下し5 日以内に瀕死状態となり， 1BS-18 系統グルた （P = 0.005871）。 稔性の低下が 収量の低テン感作グループでは 2 匹が 12 日以内に瀕下に反映したと考えられる。

死状態となったために安楽死処分を行った。
解剖の結果これらモルモットでは消化管の障

ホクシン 1BS-18 の収量を播種時期により比害が見られ， サリチル酸の前投与による消化較した結果（島根・露地／ハウス）管障害に加えて， 感作時に投与したグルテン・ 島 根 ・ 露地での 11 月 4 日播種は， 11 月 30の量が多量であった事が体調不良の原因と考えられた。

日播種に比べて 89 kg/10a （85%） 多かった （P= 0.000015）。 これは， 冬季までの生育期間と・ モルモットにおいて， 1BS-18 系統由来グルテ全体の生育期間の長期化が， 穂長， 穂数，ン感作群は市販グルテン感作群よりアレルギ千粒重の増加に寄与したためと考えられる。

ースコアが有意に低く， 1BS-18 系統の感作・ 島 根 ・ ハウスでの 12 月 1 日 播種 は， 12 月能が低いことが示された。 モルモットの IgE 抗25 日播種にくらべて収量に差はなかった （P体に対する特異抗体試薬が存在しないため，= 0.465715）。 これは， 12 月 1 日が既に低温

本検討では感作成立の指標となる小麦関連になっており早く播種した効果が無かったため

項目 （小麦， グルテン， ω -5 gliadin） 特異と考えられる。

的 IgE の上昇は確認し得なかった。

実験系統 1BS-18 のアレルゲン性評価・ し かし， 市販グルテンおよび 1BS-18 系統由来グルテンの腹腔内投与によりアレルギー症

・ 1BS-18 由来グルテン感作群は， 14 日目まで

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小麦アレルゲンを欠損したパンコムギ系統の実用化に向けた調査状の出現が確認されたことは， 感作成立の一化コムギの実用品種として有望であるという， 所つの指標と考えられる。 また， 感作過程にお期の結果は得られた。

いて， 市販グルテン投与群は， 1BS-18 系統
助成期間後に残された課題由来のグルテン投与群に比して体調不良個体が多かったことからも， 1BS-18 系統由来のグ

1BS-18 ホクシン系統の真の実用化には， 大ルテンはよりアレルゲン性が低いことが示唆さ

規模栽培 （ヘクタール単位） をして工場製粉にれた。

よる上質小麦粉を使った品質試験をする必要が・ 動物実験により， in vitro のみならず in vivoある。 また， 1BS-18 のアレルゲン原性の評価の検討においても， 1BS-18 のアレルゲン性については， 実際の患者を対象とした臨床試験が低いという基礎的知見が示された。

を行う必要がある。

本助成研究で，所期の結果は得られた学会や論文発表等

1BS-18 ホクシン系統は， 栽培試験の結果若これまでの途中結果はすでに学会発表してい干の不稔性による収量低下があるものの栽培方る。 時間がかかるかも知れないが， 更なる結果法により不稔性は改善できそうであること， 動物が得られれば， 学会や論文で発表する。 また，を用いた試験ではアレルゲン原性が低下してい市民講演会のような場では積極的に発表した

ることが示されたので， 1BS-18 が低アレルゲンい。

表 . 感作時および負荷試験時のモルモットのアレルギースコア
感作時のスコア
負荷試験時のスコア （点数）
動物番号
（点数および日数）
グルテン + トレッドミル
腹腔内投与
市販グルテンを感作したグループ
1
1 (1 on day 13)
1 (1)4 (1+3)5
1 (1 on day 13)
1 (1)4 (1+3)7
3 (1+2 on day 13)
3 (1+2)6 (1+2+3)8
1 (1 on day 13)
1 (1)4 (1+3)91 (1 on day 13)
1 (1)4 (1+3)平均±偏差
1.4 ± 0.9
1.4 ± 0.9
4.4 ± 0.9
1BS-18 由来のグルテンを感作したグループ
30 (day 14)00
40 (day 14)
01 (1)
50 (day 14)00
60 (day 14)
01 (1)
70 (day 14)
01 (1)
80 (day 14)00
90 (day 14)00
100 (day 14)00
平均±偏差
0 ± 0.0
0 ± 0.0
0.4 ± 0.5Note) アレルギースコアは， 感作時および負荷試験時ともに 1BS-18 由来のグルテンを感作したグループ
で有意に低い値を示した （P < 0.05）．

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小麦アレルゲンを欠損したパンコムギ系統の実用化に向けた調査

今後の研究活動について患者を対象とした臨床試験については， 島根

本助成研究の結果，さらに進める必要のある大学医の倫理委員会を通過した段階であり， 今研究後の課題として行う予定である。

1BS-18 ホクシン系統が実用品種になり得る結果が得られたので， いろいろな地域での栽培と参考文献

いろいろな用途に対応するため， 栽培方法の

1) M orita E, Matsuo H, Mihara S, Morimoto K,

改良と 1BS-18 染色体を異なる品種 （パン用，Savage AWJ, Tatham AS. Fast ω-gliadin is

春播き等） に導入する研究が必要である。

a major allergen in wheat-dependent
exercise-induced anaphylaxis. J Dermatol

動物実験により， in vitro のみならず in vivo

Sci. 2003 Nov;33(2):99-104.の検討においても， 1BS-18 のアレルゲン性が低いという基礎的知見が示されたので， 実際の

2) E ndo TR, Gill BS. The deletion lines of患者を対象とした臨床試験を行う研究が必要で

c o m m o n w h e a t . J . H e r e d i t y . 1996

ある。

July;87(4):295-307.
3) C u e t o - S o l a M , B a i l o n E , U t r i l l a P ,今後の研究活動

Rodríguez-Ruiz J, Garrido-Mesa N, Zarzuelo

低アレルゲン化コムギ品種を日本とヨーロッパ

A, Xaus J, Gálvez J, Comalada M. Activeの春播きコムギ品種で育成するために， 1BS-18

colitis exacerbates immune response to

染色体導入のための交配と選抜を継続していinternalized food antigens in mice. Int Archる。

Allergy Immunol. 2013;162(3):214-24.

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