博 士（ 医学 ）矢 野 俊介
学位論文題名In Vivo Fluorescence Tracking of Bone Marrow
Stromal Cells Transplanted intoaPneumatic Injuryl¥/Iodel of Rat Spinal Cord
（ラット空気圧脊髄損傷モデルに移植した骨髄問質細胞の螢光観察によるmvivoにおける動態追跡評価）

学位論文内 容の要旨

〔 研究 目 的〕近年、脳・脊髄な どの中枢神経系の移植・再 生研究が盛んに行われ、脳梗 塞・脊髄損傷などの動物 モデ ル にES細胞、神経幹細胞 、骨髄問質細胞などの再生 能カを持つ細胞を移植し、障 害された神経症状が改善 した と の報告がある。また、 組織学的にも、細胞を移植 することにより損傷中枢神経 内において神経細胞の増 加を 示 す報告も多い。しかし 、中枢神経再生の機序に関 しては明らかになっておらず 、この神経症状の改善と 組織 学 的事実の間にはまだま だ解明すべき問題が多く残 されている。これまでの研究 は、ある―定の時期に研 究動 物 を殺傷しその時点での 組織学的評価によるもので あり、再生の機序解明には経 時的な移植細胞の動態を評価することが重 要である。
本 研究 で は、再現性のある安定 した脊髄損傷を作製するこ とができるニューマティクイ ンパクトデバイスを用 い た ラ ッ ト 脊 髄 損 傷 モ デ ル を用 いて ， GFP卜 ラ ンス ジェ ニッ クマ ウ スよ り採 取し た骨 髄 問質 細胞 (BMSC)を移 植し 、 移植されたラットを生 存させたまま経時的に移植 細胞を観察して損傷脊髄内で の動態を観察することを 目的 と した 。GFPか らの 発光 を利 用 して 、個 体を 生存 し たま ま経 時的 に損 傷 脊髄内 の移植BMSCを観察したの は本 研 究が始めてである。こ の生体内における移植細胞 の動態の評価は、これまでの 中枢神経再生研究の―元 的な 事 実にっながりを持たせ うるもので、中枢神経再生 の機序解明に大きな意義をも たらすものと考えられる。
〔実験方法〕(GFP‑BMSCの抽 出〕 4‑8週令 の GFPト ラ ンス ジェ ニッ クマ ウ スの 大腿 骨両 端を 切 って、 ヘパリンを含めた培養液 を21ゲ ージ の注 射器 で注 入 し骨 髄を取り出す。コラ―ゲ ンIでコ―ティングしたフラ スコ内の培養液下で継代培養してBMSCを抽 出した(GFP‑BMSC)。培養液交 換は一週3回行った。
〔脊髄損傷の作製〕 Wistar系統ラット9匹（体重 200−250g）に吸入麻酔をかけ、第10‑11胸椎椎弓切除を行った。不完全脊髄損傷を 作製するためニュ―マチック インパクトデバイスの設定を、インパクタ―の速度を2 m/s，
衝 撃 時 の イ ン パ ク タ ― の 硬 膜 か ら の 深 さ を l 1TI111に 固 定 し て 脊 髄 損 傷 を 作 製 し た 。
(GFP‑BMSCの移 植〕 脊 髄損 傷7日目 に、 第9胸椎 の椎 弓切 除 を追 加し 同レ ベル の 脊髄内 に、Hamiltonシリン‑ 159ー

ジを設置した定位自動注入装置を用いてGFP‑BMSCを移植した（n 3）。移植は脊髄表面から2mmの深度に7ロ1（1．Ox104cells/ハ1）のGF
P‑BM
SC含有溶液を注入した。コントロ―ル群として正常脊髄にGF
P‑BMSCを移植した（n 6）。
〔移植細胞の生体内観察〕移植細胞の観察は、移植日、移植2週間目、移植4週間目に螢光顕微鏡を用いて暗室にて行った。ラットを吸入麻酔下で椎弓切除した範囲 で創を開き、硬膜を露出させて観察を行った。
〔病理組織学的検討)
BMSC
移植28日目、吸入麻酔下に開胸後、23ゲージ針を左心室より上行大動脈に挿入し、ヘパリン入り生理食塩水を約100ml点滴した。次に右心房を切開して脱血した後、40／0フオルマリンを約150ml
点滴し灌流固定を行った。移植郁、脊髄損傷部位を含めて上下に長く脊髄を採取した。採取した脊髄はパラフ
ィン包埋して矢状面で5pmの厚さで切片を作製した。GF
P抗体による螢光免疫染色を行い、GFP陽性の移植したB
MSCの分布を評価した。また、GF
P抗体と、MAP2抗体、NeuN抗体、GF
AP抗体による 螢光二重免疫染色を行い、移植したB
MS
Cの免疫組織学的評価も行った。
〔結果〕移植したG靜IlうMS
CからのGF
P発光は移植時には全例で観察できた。経時的には、正常脊髄にG
FPIBMSCを移 植し たコ ント ロー ル群 では 、移 植2週 後では6例中1例で、移植4週後では6例中3例でGF
Pの発光を観察できた。しかし、いずれもGFPの発光は移植部近傍にのみ観察するにとどまった。一方、脊髄損傷例にGFP‐BMSCを移植した 群では、移植2週後には3匹中1匹が、移植4週後では3匹中全例の3例においてGFPの発光を観察することができた。さらには脊髄損傷群ではGF
Pの発光は、移植部から損傷部に伸びていることが観察された。
組織学的評価では、コントロール群においてはGF
P陽性細胞が移植部近傍の灰白質を中心に認められた。これらのGFP陽性細胞の一部は M
AP2抗体、NeuN抗体、GFAP抗体にも陽性となる細胞も認 められた。―方、脊髄損傷作成群では、GFP陽性細胞が移植部のみならず、脊髄損傷の頭側にも多く認められ、これらは灰白質のみならず背側の白質にも多く存在した。また、脊髄損傷の尾側にも少数ではあるがG
FP陽性細胞が観察され、コントロール群に比べると明らかに広範囲でG
FP陽性細胞が観察された。
〔考察〕損傷中枢神経内において、移植した細胞がいかにして再生に関わるかを解明するために、BM
S
Cを移植したラット脊髄損傷モデルを生存させたまま経時的にその移植細胞の動態を観察する研究を行った。生体内での移植細胞の動態を観察する研究はこれまでにも多く、M
R
亅やSP
E
CT／PE
T、ルシフウラ―ゼを用いたB
iolun
血escenceなどの手法が行われている。しかし、それぞれに利点・欠点があり、例えばMR
亅であれば空間解像度に優れるものの時間解像度、感度にやや劣るなどがある。本研究は若干空間解像度に劣るものであるが、短時間で観察でき、本研究の組織学的結果からも感度は良好であるといえる。また、空間解像度に関してもGF
Pの発 光 強 度 を 上 げ るこ とに より 改善 でき ると 考え られ 、非 常に 有用 な手法 と考 えら れる 。
本研究では、BMSCを移植したラットを生存させたまま移植時、移植2週間後、移植4週間後と、経時的に観察することができた。これは、臨床応用に際し、ヒトに細胞移植した時にもその移植細胞の生体内での観察を可能とするものである。また、正常脊髄にBMSCを移植した群と脊髄損傷に移植した群では生体内でのBM
SCの動態に差が認められた。すなわち、正常脊髄群では移植したBMSCが移植部にとどまり、なおかつGFPの発光を観察できる動物が少なかったのに対して、脊髄損傷群では脊髄損傷部にひかれるようにGFPの発光が観察でき、更にはGFPの発光が多くの動物にて観察できた。このことは、正常脊髄にBMSCを移植した場合に比べー 160 ‑

て、損傷脊髄に移植した場合はBM
SCがその生体内で増殖し、損傷部に向かって遊走していたことを示唆するものである。特に移植2週目より4週目において、多くの動物でGFPの発光を観察できたことは、移植後2〜4週の間に 移植したBMSCが増殖していることを示唆するものである。また、これらの損傷脊髄に移植した
BM
SCの増殖や遊走は病理学的にも実証され、更には組織学的評価により神経細胞やグリア細胞への分化も示唆された。従って、損傷を受けた脊髄内では、移植細胞の増殖や、損傷部に移植細胞を遊走させる因子などが放出されていると考えられる。これらの因子については今後の研究により解明していくべきだが、本研究が、細胞移植による障害された神経症状の改善と、組織学的に神経細胞が移植により増加するというニつの事実の間に存在する中枢神経の移植再生に関する機序解明のブレ―クスル―となりうる意義あるものと考えられた。

― 161ー

学 位論文審査の要旨
主査 教授 佐々木秀直
副 査 教 授 三 浪 明男
副 査 教 授 岩 崎 喜信

学位論文題名In Vivo Fluo
rescence Tracking of Bo
ne Marrow
Strom
alCe
llsT
ransp
lantedintoaPneumati
cInjuryModel ofRatSpinalC
ord（ラット空気圧脊髄損傷モデルに移植した骨髄問質細胞の螢光観察による
mviv
oにおける動態追跡評価）

こ れ ま での 動 物 モ デル を 用いた 中枢神 経系の 移植再 生研究 では、 骨髄問 質細胞 (BMSC)の移植に よる脱 落神経 症状改 善の知 見や、移 植細胞 の生体 内での 生着、増殖、遊走、分化という病理 学的な 知見が ある。 しかし 、これら の知見 の問に は大き なギャップがあり、これを埋めるに は神経 回路網 の再構 築の機 序解明が 必要で ある。 そのた めには経時的な移植細胞の動態を評 価する ことが 重要で 、その 方法とし て′く イオイ メ―ジ ング法が有用と考えられる。
本 研究で は、空 気圧損傷 装置に よるラ ット脊 髄損傷 モデル に，GFP標 識した 骨髄問 質細胞(BMSC‑GFP)を 移 植 し 、GFP螢 光 を 利用 し て ラ ット を 生 存 させ た ま ま 経時 的 に 移 植細 胞 を観 察しJ損 傷脊髄内 での細 胞の挙 動を解 明する ことを 目的と した。

まず、 安定し たラット

脊髄損 傷モデ ルの作 成のた め、空 気圧損傷 装置に よるモ デルの 確立を行った。モデルの確立
後、バ イオイ メージ ングを 行った 。方法と して、 ウィス タ―ラ ットに吸入麻酔下で空気圧損
傷 装置 を 用 い てThl0レ ペ ル に 脊髄 損 傷 を 作成 し た 。 脊髄 損 傷 7日 目 に GFP卜 ラン スジェ ニッ クマ ウ ス の 大腿 骨 よ り 抽出し たBMSC‑GFPを 定位自 動注入 装置を 用いて 損傷部頭 側に移 植した（ n 3）。 コント ロ―ル 群とし て正常 脊髄にBMSC‑GFPを移植した（舮6）。移植細胞の観察 は、 移 植 日 、移 植 2週 間 目 、移 植 4週 間 目 に螢 光 実 体顕微 鏡を用 いて暗 室にて行 った。 4週 日の 観 察 後 、モ デ ル を 灌流固 定し、 7pimの脊 髄矢状断 切片を 作成し て、GFP抗 体、MAP2
抗体 な ど によ る 螢光 免 疫 染色 で 移 植細 胞 の分 布 や 分化 の 様子 を 評 価し た 。
バ イ オ イメ ― ジ ン グの 結 果 、 コン ト ロ ― ル群 で は 、 移植 2週日 で 1例 、 移 植4週目 では3例 でGFP螢光 を観察 できた 。しかし 、いず れも移 植部近 傍に観 察する にとど まった 。―方、脊 髄 損 傷 群 で は 、 移 植 2週 日 で は 3匹 中 1匹で 、 移 植 4週 目で は 3匹 全 例 でGFP螢 光 を 観 察―162―

するこ とができ た。さ らには 脊髄損 傷群で はGFP蛍光 は、移 植部か ら損傷 部に伸 びていることが観 察された 。
病理学 的評価 では、 コントロ ―ル群 では少 数のGFP陽 性細胞 が移植 部近傍 に認められた。
一方、 脊髄損傷 群では 、GFP陽 性細胞が 移植部 と損傷 部の間 に多く 認めら れ、主 に脊髄背側に存在 した。ま た、脊 髄損傷 の尾側 にも少 数では あるが GFP陽性細 胞が観 察され た。これらの GFP陽性 細 胞 の 一部 は MAP2抗 体 、 NeuN抗 体、 GFAP抗 体 に も陽 性 を 示 し、 神 経 細 胞や グリア細 胞への分 化も示 唆され た。
こ れ ら の結 果 は 、 正常 脊 髄 群 と比 べ 、 損 傷脊 髄 に BMSCを 移植 し た場合 はBMSCは生 体内で増殖 し、損傷 部に向 かって 主に脊 髄背側 を遊走 し、一 部の細胞は損傷部を越えて損傷部尾側ま で 遊 走 して いた ことを 示唆する もので ある。 特に移 植2週目 より4週 目にお いて、 多くの動物 でGFP螢光 を観察 できた ことから 、この 時期に BMSCが増 殖、遊走 したと 考えられる。
更には 増殖、遊 走しな がら神 経細胞 やグル ァ細胞 への分 化も示唆された。従って、損傷を受けた脊 髄内では 、移植 細胞の 増殖や 、損傷 部に移 植細胞 を遊走させる因子などが放出されていると 考えられ る。
本 研 究 では 、 ラット を生存 させた まま経 時的に移 植した BMSCを観 察する 方法論を 確立した。こ れにより 、損傷 中枢神 経内に おける 移植細 胞の動 態を適時観察でき、これまでの一元的な知 見にっな がりを 持たせ うるも ので、 中枢神 経再生 の機序解明に大きな意義をもたらすものと 考えられ る。更 に、移 植再生 治療が 臨床応 用され た際にも、移植細胞のヒト生体内での観察 を可能と するも のであ り、そ の安全 性の評 価や治 療計画に役立っものと考えている。

口頭 発表に 当たり 、副査 の岩崎 教授か ら、細胞 移植に よる神 経症状 の経過 、損傷7日目に細胞 を移植 した論 拠に関 しての質 問があ った。 同じく 副査の三浪教授から、細胞遊走を来たす因 子の証 拠、移 植細胞 の長期的 な観察 可能期 間、移 植細胞とホス卜の神経細胞との関わりなど につい ての質 問があ った。ま た主査 の佐々 木教授 より、正常脊髄と損傷脊髄における分化の 差異、 神経細 胞分化 の展望、 神経、 グリア 細胞以 外の分化の有無などに関する質問があった 。最後 にフロ アから 、GFP細胞 の分裂 による 螢光維持 、観察 可能な 深達度 についての質問 があった 。これら の質問に 対して申 請者はお おむね適切 な回答を 行った。
この 論文は 、モデ ルを生 存させ たまま 移植細胞 の動態 を経時的に観察することを可能とした点 で優れ ており 、中枢 神経再生 の機序 解明に っなが る大変意義のあるものと考えられた。
審査 員―同は、これらの成果を高く評価し、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資 格を有 するも のと判 定した。

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