博 士 （ 医 学 ） 小 原 雅 人
学 位 論 文 題 名

ヒト成熟B細胞株におけるSDF− 1刺 激 下流で のDOCK2の 役割の検 討
学位論文内容の要旨【背 景と目的】骨髄で産生された未熟B細胞は、骨髄から二次リンパ組織へ、また二次リンパ組織内で移動し分化するが、このときに細胞の遊走およぴ変形を必要とする。低分子量G蛋白の ひとつ であるRacは、 GDPをGTPに置換 される ことで活 性化さ れ、細胞 膜のアクチ ンを重合化することで細胞の遊走および変形に関与するが、今回着目したDO
CK2はマウス 未熟B細胞で のR
acに おける G
DPのGTPへの置 換を担 っている 。すな わち、マ ウス未熟B細胞では、ケモカインであるS
DF−1の刺激により、ケモカインレセプターであるCXCR4を介 してRacが活性 化され、 細胞の遊走・変形が惹起されるが、DOC
K
2ノックアウトマウ
スの B細胞では、アクチンの重合化がほとんど見られなくなり、二次リンパ組織への細胞遊走 が見られず、リンパ濾胞が高度に低形成となる。従って、DO
CK
2ノックアウトマウスを用 いた研究では、リンパ濾胞を経て成熟した記憶B細胞が存在しなくなるため、この細胞に おけるDOC
K2の働きを検討することは困難である。また、ヒトとマウスにおけるシグナル 伝達システムが必ずしも同一ではない。そこで本研究では、ヒト成熟B細胞株である
Raji細胞 を用い て、ヒト 成熟B細胞におけるDO
C
K2の役割を、SDF―1による刺激を中心に検討することを目的とした。
【方 法と結果 】RN
Aiによ ってDO
C
K2m
RN
Aをノックダウンするため、レンチウイルスベクター を用いて DOCK2 siR
NAをR
aji細胞へ 導入し た。標的 配列を2種類決定し、siRNAをコードしたべクターを挿入したレンチウイルスを産生し、Raji細胞への導入を行った（以下DOCK2ノックダウン細胞）。また、陰性対照として、randomoligonucleotideを持っべクターを挿入したウイルスを導入した細胞を用いた（以下Mock細胞）。レンチウイルスにはレポー ター遺伝 子とし て緑色螢 光タンパク質(GFP)を発現させており、siR
NAが導入された細胞 をGFP陽性分画にソーティングすることで純化した。ウエスタンブロット法で確認したと ころ、2種類 のDOCK2ノ ックダ ウン細胞 でのDO
CK2蛋白の発現は、Mock細胞に比して700程度低下していた。フローサイトメトリーで2種類のDOCK
2ノックダウン細胞におけるCXCR4の発現を確認したが、Mock細胞と同等で発現変化を認めなかった。S
DF―1
刺激による細胞形態変化を倒立顕微鏡で観察したところ、Mock細胞では細胞周辺の波打ちが見られたの に対して、DOCK2
ノックダウン細胞では形態変化に乏しかった。トランスウェルマイ
グレーションアッセイは以下に述べる方法で行った。すなわち、24穴プレートにSDF
一1を含むバッファーを投入した後、ケモタキセル245micronを上置し、バッファーに浮遊させたRaji
細胞をケモタキセルヘ投入し静置した後、ケモタキセルを取り除き、プレート中のバッ ファーを 回収し 、ケモタ キセルから遊走した細胞数をFAC
SCaliburで計測した。2種類の D
OCK2
ノックダウン細胞での遊走は、いずれもMock細胞と比較し有意に減少した。また、 CXCR4か らのシグ ナルを阻 害するためpertussistoxin(PTx)を添加したM
ock細胞では、 遊走細胞 の割合 がDOC
K2ノ ックダウン細胞やRac阻害剤を添加した細胞よりも低い傾― 204 ‑向にあった。シュードエンペリオポレーシスアッセイは以下のように行った。すなわち、
マウスストローマ細胞であるM
S―5を播種したプレートヘ液体培地に浮遊させたR
aji細胞を添加し、表面を洗浄することでM
S―5下層へ潜り込まなかった細胞を取り除いた後に細胞を回収し 、MS−5下層へ潜り込んだR
aji細胞の数をFACSCaliburで計測した。M
ock細胞と比較して 、2種 類のDOCK
2ノックダウン細胞ではいずれも潜り込みが有意に低下した。次に、SDF−1刺激によるRac活性化を確認するためGTPase
アッセイを行った。すなわち、Raji細胞をS
D
F−1で刺激しlysisbu
fferで溶解して得た蛋白抽出液を、アガロースビーズと接合させたP
AK1−RBD
融合蛋白と混和させた後、アガロースビーズと結合したRacーGTPを沈降させ、得 られたRac
一GT
P蛋白をウエスタンブロット法にて検討した。2
種類のDO
CK
2
ノッ
クダウン細胞でのRac活性化は、Mock細胞と比較し減弱していた。最後に、SDF―1刺激下でのAktならぴに E
RK
リ ン酸化の 検討を 、Raji細胞を S
DF−1で刺 激した 後lysisbu
fferで溶解し、得られた蛋白抽出液のウエスタンブロット法で行った。M
ock細胞、およびDOCK
2
ノックダウン細胞2
種類のいずれにおぃ、てもERKおよぴAkt
のりン酸化のタイミングおよび程度に差を認めなかった。
【考察】 今回の検 討で、ヒト成熟B細胞株において、DO
CK2がS
DF−1/CXC
R4刺激による細胞遊走に おいて重 要な役割を果たしていることが示された。SDF―1によって刺激された
Raji細胞の変形および組織への侵入、細胞遊走、さらにはSD
F―1分泌細胞下層への潜り込み現象においてDOCK2が重要である事が、それぞれ位相差顕微鏡による観察、トランスウ
エルマイグレーションアッセイ、およぴシュードエンペリオポレーシスアッセイで確認された。ま た、DO
CK
2ノックダウン細胞ではRacの活性化が低下していることが確認され、さらにRac阻害剤 を添加したM
ock細胞とDOC
K
2ノックダウン細胞との遊走能低下はほば同程度であ ったこと から、DO
CK
2ノックダウン細胞で見られた現象はR
ac活性化の低下を介している ことが示 された。さらにDOCK2
ノックダウン細胞では、PTx添加Mock細胞と比較して遊走能が残存し、SDF一1での刺激による細胞遊走にDOCK2を介さない系が存在する可能性が考えられた。SDF−1による刺激は、血液細胞の遊走のみならず、生存、増殖、分化、および接着に関与するとされ、これらのシグナルを介する経路が報告されているが、ヒト
成熟B細胞にお いて、 D
OCK2はSDF‑1での 刺激によるPI
3K/Akt、ならびにM
APK/ERKの活性化に関与しない事が示された。成熟B細胞の腫瘍化によって発症する悪性リンパ腫の組織浸潤は、正常B細胞同様、SDF−1が働いている事が示されており、また骨髄や二次リンパ組織では、腫瘍細胞が周囲の細胞からの支持によって、化学療法や免疫療法に対して耐性を獲得する事が知られているが、DO
C
K2の阻害で組織への腫瘍細胞の潜り込みを抑制する
事が造血器悪性腫瘍治療ヘ応用される事が期待される。今回の研究では、検討が細胞株に限られて おり、健 常人由来成熟B細胞におけるDOCK2の機能解析、ならぴに正常細胞と腫瘍細胞との間でのDO
CK2活性の差などが今後の検討課題である。
【結語】1，ヒト成熟B細胞においてDOCK2がSDF―1による遊走に関与する事を示した。2．
ヒト成熟 B細胞 におい てD
OCK2がRacの 活性化を 制御する事が確認された。3．ヒト成熟B
細 胞 に お い て Aktな ら ぴ に ERKの 活 性 化 に DOCK2が 関 与 し な い 事 が 示 さ れ た 。

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 小 池 隆 夫
副 査 教 授 藤 田 博 美
副 査 教 授 今 村 雅 寛

学 位 論 文 題 名

ヒト成熟B細胞株におけるSDF− 1刺 激 下流 でのDOCK2の役割 の検討
低分子量 G蛋 白のひと つである R
acは 、GDPをG
TPに 置換され ること で活性化 され、細胞膜のア クチン を重合化 すること で細胞の遊走および変形に関与するが、今回着目した
DOCK2はマ ウス未 熟B細 胞でのRacにお けるGDPのGTPへの置換 を担っ ている。 しかし、 B細胞にお けるDO
CK2の機能 解析は 、マウス 未熟B細胞の みで行われており、ヒト成熟B細胞ではな されていない。そこで本研究では、ヒト成熟B細胞株であるRaji細胞を用いて、ヒト成熟 B細胞 におけ るD
OCK2の 役割を、骨髄やりンパ節で分泌されるケモカインである
SDF―1による刺激を中心に検討することとした。
研究には 、レン チウイル スベク ターを用いてDOC
K2siR
NAを導入し、DOCK2蛋白の産生をノック ダウンしたRaji細胞を用いた。ウエスタンブロット法で確認したところ、DO
CK2
ノックダ ウン細 胞でのDOCK2蛋白 の発現は、Mock細胞に比して70%程度低下していた。次に、SDF―1刺激による細胞形態変化を観察した。コントロール細胞ではS
D
F一1刺激に伴い細胞周辺の波打ちが見られ、またアクチンの重合化・局在化がファロイジン染色で確認されたのに対して、DOC
K
2ノックダウン細胞では形態変化に乏しかった。次に、SD
F‑1
ならぴにボイデンチャンバーを用いたトランスウェルマイグレーションアッセイでケモカイン濃度勾配に 従う細胞の遊走能を観察したところ、DOC
K2ノックダウン細胞での遊走は、コントロール 細胞と 比較し有 意に減少 した。また、SD
F‑1の受容体であるCXC
R4からのシグナルを阻害 するた めに百日 咳毒素を 添加し たコント ロール 細胞では 、遊走 細胞の割 合がD
OCK2ノッ クダウ ン細胞や R
ac阻 害剤を添加した細胞よりも低下していた。次に、Raji細胞の骨髄ストローマ細胞下層への潜り込みを観察する目的でシュードエンペリオポレーシ
スアッセ イを行ったところ、コントロール細胞と比較して、DOCK
2ノックダウン細胞ではストローマ細胞下層への潜り込みが有意に低下した。次に、GTPase
アッセイでS
DF‑1
朿｜J
激によるRac活性 化をウエ スタンブ ロット法にて検討したところ、DOCK
2ノックダウン細胞でのRac活性化 は、Mock細胞 と比較し減弱していた。最後に、SDF―1
刺激下でのAktならびにERKリン酸 化をウエ スタンブ ロット法で検討したところ、DOCK2ノックダウン細胞でのERK
お よぴAktのりン 酸化のタ イミングおよび程度はコントロール細胞との間に差を認めなかっ た。以 上より、 今回の検 討で、ヒト成熟B細胞株において、SDF‑1/CX
CR4
刺激による細胞遊走、すなわち細胞の変形、組織への侵入、細胞遊走、SD
F−1分泌下層への潜り込み現象において、DOCK2が重要である事が確認され、また、DOC
K
2
ノックダウン細胞では― 206ー

Racの活性 化が低下 していることが示された。さらにヒト成熟B細胞株において、SDF−1で の 刺 激 に よ る 細 胞 遊 走 に DOCK2を 介 さ な い系 が 存 在す る 可 能性 が 考 えら れ た 。
成熟B細胞の腫瘍化によって発症する悪性リンパ腫の組織浸潤は、正常B細胞同様、SDF一1が働いている事が示されており、また骨髄や二次リンパ組織では、腫瘍細胞が周囲の細胞からの支持によって治療耐性を獲得する事が知られているが、今回の研究から、DOC
K2の阻害によって腫瘍細胞の浸潤を抑制する事が造血器悪性腫瘍治療へ応用される事が期待される。
質疑応答では、副査の藤田博美教授からR
ac阻害剤の有効性、阻害剤を添加した細胞のトランスウェルマイグレーションアッセイの結果に対する考察、ならびに今回の知見を悪性腫瘍治療ヘ応用する際の方法論についての質問があった。次いで副査の今村雅寛教授から血液細胞におけるDOC
K2の特異性、DO
CK
2とセレクチンの活性との関係、B細胞の分化段階におけるDOC
K2発現の変化、ならぴに支持組織からのSDFー1分泌亢進の機序についての質問があった。さらに、主査の小池隆夫教授より、今回の検討をB細胞で行った理由、DOC
K2の細胞生存への関与、今回の知見を悪性腫瘍治療へ応用する際の具体的な戦略についての質問があった。いずれの質問に対しても、申請者は過去の文献報告や未発表であった実験結果などを引用し、概ね適切に回答した。
この 論文は ，マウス 未熟B細胞で のみ検討 されていたDOCK2の機能をヒト成熟B細胞で解析 した事 が高く評価され，今後のB細胞の運動・成熟の解析、ならびにB細胞性悪性腫瘍への治療応用が期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ 申請者 が博士（ 医学） の学位を 受けるの に充分 な資格を 有する ものと判定した。

ー 207ー