令 和 ３ 年 １ １ 月 １ ６ 日
科学技術振興機構（ＪＳＴ）
東京大学

細胞外で複製し進化する人工ゲノムＤＮＡを開発～自律的に増殖し進化する人工細胞の構築に期待～ポイント➢ 生物はゲノムＤＮＡに書かれている情報を使ってＤＮＡを複製し進化することができるが、この能力を持つ人工物はいまだ作られていない。
➢ 本研究では、人工ゲノムＤＮＡと無細胞転写翻訳系を用いることで、細胞外で遺伝子を発現させながら複製するＤＮＡを世界で初めて進化させることに成功した。
➢ この人工ゲノムＤＮＡに遺伝子を追加することにより、将来的には自律的に増殖可能な人工細胞の構築が可能となり、効率的な有用物質生産に貢献すると期待される。
ＪＳＴ 戦略的創造研究推進事業において、東京大学 大学院総合文化研究科 広域科学専攻・附属先進科学研究機構／生物普遍性連携研究機構の市橋 伯一 教授らは、核酸やたんぱく質といった無生物材料のみを用いて、生物の特徴であるＤＮＡからの遺伝子発現と持続的な複製による進化を細胞外で行うことに世界で初めて成功しました。
増えることと進化することは生物の大きな特徴ですが、この特徴を持つ人工物はいまだに作られていませんでした。本研究グループは、ＤＮＡ複製に必要な２つの遺伝子を持つ環状ＤＮＡ（人工ゲノムＤＮＡ）と無細胞転写翻訳系注１）を用いることで、遺伝子がたんぱく質へと翻訳され、その翻訳されたたんぱく質によって元の環状ＤＮＡを複製させることに成功しました。さらにこのＤＮＡ複製サイクルを約６０日間続けることで、複製効率が約１０倍上昇したＤＮＡに進化させることに成功しました。
今回開発した人工ゲノムＤＮＡに転写翻訳に必要な遺伝子を追加していけば、将来的にはアミノ酸や塩基などの低分子化合物を与えるだけで自律的に増殖する人工細胞へと発展させることができます。そのような人工細胞ができれば、現在行われている医薬品開発や食料生産のような生物を使った有用物質生産がより安定で制御しやすいものになると期待できます。
本研究成果は、２０２１年１１月１６日（米国東部時間）に米国科学誌「ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ」のオンライン版で公開されました。
本成果は、以下の事業・研究領域・研究課題によって得られました。
戦略的創造研究推進事業 チーム型研究（ＣＲＥＳＴ）
研 究 領 域 ：「ゲノムスケールのＤＮＡ設計・合成による細胞制御技術の創出」（研究総括：塩見 春彦 慶應義塾大学 医学部 教授）
研究課題名：「自己再生産し進化する人工ゲノム複製・転写・翻訳システムの開発」
研究代表者：市橋 伯一（東京大学 大学院総合文化研究科 教授）
研 究 期 間 ：令和２年１１月～令和８年３月
ＪＳＴはこの領域で、ゲノムの動作原理の解明と細胞利用の基盤技術の創出を目指す。
上記研究課題では、自己再生産しながら複製し進化する人工ゲノムＤＮＡの開発を目指す。
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＜研究の背景と経緯＞
増えることと進化することは生物の大きな特徴です。生物は増える能力を持っているため、食料や医薬品などの安価な生産に利用することができます。さらに進化できるため品種改良も可能です。しかし生物は人間に都合良くはできていないため、生物を使ったもの作りには制御性や安定性に限界があります。もし、増えて進化する能力を持つ人工分子システムを作ることができれば、今まで生物に依存していた有用物質生産をもっと効率的で安定に行うことができると期待されます。
生物の「増えて進化する能力」にとって最も重要な条件は、生物の設計図であるゲノムＤＮＡを長い世代にわたって複製し続けることです。この複製中にゲノムＤＮＡに変異が入り、もしその変異が子孫の数や生存に有利であれば、その変異が集団に広まることで進化が起きます。したがって、増えて進化する人工分子システムの開発には、まずＤＮＡの複製を長期間にわたり起こし続ける必要がありました。さらに生物のように進化を起こすためには、ただＤＮＡが複製すればよいわけではなく、ＤＮＡに書かれている情報（遺伝子）を翻訳してたんぱく質を発現させ、そのたんぱく質によってＤＮＡを複製する必要があります。このようなＤＮＡ複製に必要な遺伝子の発現とそれによるＤＮＡ複製が同時に起こる反応系構築はこれまで達成されていませんでした。これを起こすための大きな障害は、ＤＮＡ複製に必要な遺伝子が多数あり（大腸菌型のＤＮＡ複製では約２０種類、ウイルス型では４種類）、さらにその一部は高濃度なたんぱく質が必要なために、現在の無細胞転写翻訳系ではそのすべてを十分な量で供給するのが難しいことでした。
＜研究の内容＞
そこで本研究グループは、生物が使っているような精巧ではあるものの多数の遺伝子を必要とする複雑なＤＮＡ複製機構ではなく、もっと少ない遺伝子かつ低濃度のたんぱく質で達成可能なＤＮＡ複製の仕組みを人工的に作ることにしました。今回用いたＤＮＡ複製の仕組みでは、わずか２種類の遺伝子（Ｐｈｉ２９ ＤＮＡ複製酵素注２）とＣｒｅ組み換え酵素注３））で環状ＤＮＡ（人工ゲノムＤＮＡと呼びます）を複製することができます（図１）。
まずＰｈｉ２９ ＤＮＡ複製酵素が環状ＤＮＡの中の不特定の場所から２本鎖ＤＮＡを引きはがしながら相補ＤＮＡを合成していきます。鋳型となるＤＮＡは環状ですが、自身が合成したＤＮＡ鎖も引きはがしてさらに合成を続けるため、最終的に数十キロの塩基対におよぶ長い直鎖状１本鎖ＤＮＡを作ることになります。さらにＤＮＡ複製酵素が相補鎖を合成し、長い２本鎖ＤＮＡとなった後、Ｃｒｅ組み換え酵素が働き、ｌｏｘＰと呼ばれる３４塩基対のＤＮＡ配列同士に対して相同組み換えを起こします。元々の環状ＤＮＡにｌｏｘＰ配列が１つ入っているため、その間で相同組み換えが起こると環状ＤＮＡが再生することになります。以上のＤＮＡ複製機構では、わずか２つの遺伝子で再帰的な環状ＤＮＡの複製が可能です。またその２つのたんぱく質も低濃度で十分機能し、現在の無細胞翻訳系で十分量を発現することができると予想されました。
本研究ではまず、この人工ゲノムＤＮＡを持続的に複製できるかを検証しました。人工ゲノムＤＮＡを無細胞転写翻訳系で、図１に示す反応を行わせました。すると１０００倍以上にＤＮＡが複製されました（図２、ラウンド１）。ＤＮＡの持続的な複製を確かめるた
めに、反応液の一部を取って新しい無細胞転写翻訳液で希釈し同じように次のラウンドの転写・翻訳・複製を行わせてみると、次は２倍程度にＤＮＡが増えました（図２、ラウン2ド２）。この調子で何度も希釈と反応を繰り返し継代していくと、徐々にＤＮＡの増えが悪くなり、８回継代後にはＤＮＡが全く増えなくなりました。この理由は複製中に複製エラーにより遺伝子の機能を壊してしまう変異が入り、複製を繰り返していくといつかは遺伝子が壊れてしまうからです。問題は、そうした壊れた遺伝子を持つＤＮＡも、他に正常な遺伝子から発現したたんぱく質によって複製され続けてしまい、最終的には正常な遺伝子がなくなって全体として複製が止まってしまうことです（図３左）。
このような壊れた遺伝子を持つＤＮＡを除く方法の１つは、細胞のように区画構造を導入し、細胞当たりのゲノムＤＮＡの数を少数（できれば１個）に限定することです。こうすれば、壊れた遺伝子を持つＤＮＡは正常なたんぱく質を作れないために複製することができず、そのうち希釈されてなくなるはずです（図３右）。このような区画構造として、直径０．５～０．８マイクロメートル（ｍ）の油中水滴を用いました。油中水滴は鉱油に界面活性剤と反応溶液を加えて激しくかき混ぜることで作ることができます。
このようにして作った水滴中に人工ゲノムＤＮＡと無細胞転写翻訳反応液を封入し、３０度で１６時間、図１に示すＤＮＡ複製反応を行いました。その後、図４Ａに示すように新しい無細胞転写翻訳系を含む水滴で希釈し、次のラウンドの反応を行いました。このよ
うな区画構造中での継代反応を行うと、先の結果とは異なり、８ラウンド経過後も複製が持続しました（図４Ｂ）。そして当初は徐々にＤＮＡ濃度が低下する傾向にありましたが、１８ラウンドになると急によく増えるようになり、６０ラウンド（６０日間、１４０ 世代相当）までＤＮＡ複製を続けることができました。３０ラウンドの時点でＤＮＡを１８個単離してその配列を調べたところ、平均７個の変異が入っており、そのうち５個は過半数のＤＮＡに共通していました。また単離した多くのＤＮＡの複製能力は元のＤＮＡに比べて最大で約１０倍まで上昇していました（図５）。このことは、適応進化が起きたことを示しています。ここで重要なのは、この実験で研究者が特に複製量の高いＤＮＡを意図的に選択したわけではないことです。研究者が行ったのはただ毎日水滴を調整し、希釈し、３０度で温めただけです。操作としては微生物を継代培養することと大差ありません。核酸とたんぱく質などの無生物分子の集まりをただ“培養”するだけでＤＮＡが勝手に進化し始めた点に本研究の新規性があります。
もう１つ興味深い現象として、ＤＮＡ濃度の推移が大きく波打つように上がったり下がったりを繰り返していました（図４Ｂ、２０ラウンドと５０ラウンド前後で極大）。この現象は、おそらく寄生型のＤＮＡが出現したためだと考えています。実際にＤＮＡ濃度が上がった２０ラウンドあたりで増えたＤＮＡを調べてみると、本来の人工ゲノムＤＮＡ以外に、ＤＮＡ複製酵素と組み換え酵素の両方の遺伝子を欠損した１００塩基長程度の繰り返し構造からなるＤＮＡが過剰に増幅していました。このＤＮＡはＤＮＡ複製に必要な遺伝子を持たないため単独では増えることができませんが、同じ区画内に正常なＤＮＡが存在すればそれに寄生して増えることができます。同様な寄生型の複製体の出現と振動するよ
うな濃度推移は、本研究の著者らによるＲＮＡの進化実験注４）でも観察されており（Ｆｕｒｕｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ ｅＬＩＦＥ ２０２０）、同じ現象がＤＮＡの場合にも起きたと考えられます。寄生型の複製体は、ＲＮＡ、ＤＮＡ問わずすぐに出現したことは、寄生種の出現がゲノム複製系にとって一般的な現象であることを示唆しています。

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＜今後の展開＞
現在の人工ゲノムＤＮＡにはＤＮＡ複製に必要な２遺伝子だけが載っていますが、他の遺伝子を導入することで人工ゲノムＤＮＡの持つ機能を拡張していくことができます。例
えば、現在は無細胞翻訳系中に入っているＲＮＡやたんぱく質もゲノムＤＮＡから発現させることができるため、今後、転写翻訳に必要な遺伝子をすべて載せれば、アミノ酸や塩基などの低分子化合物を与えるだけで自律的に増殖をする人工分子システムへと発展させることができます。膜合成遺伝子を導入すれば、細胞膜を作り出せる可能性があります。
また、翻訳したたんぱく質の機能が十分でなければ、進化させることでその機能を向上させることもできます。本研究で開発した人工ゲノムＤＮＡをコアにすれば、自律的に増殖する人工細胞の構築につながることが期待されます。
このような自律的に増殖する人工分子システムができれば、現在、生物に頼っている医薬品開発や食料生産などをこのシステムに置き換えることができると考えられます。生物は丈夫で安定ですが、人間に都合良くはできていません。また生物の動作原理にはまだブラックボックスが多く残されています。そのため生物を使ったもの作りには常に制限が付きまといます。一方で人工的に構築した分子システムであれば、必要な要素しか入っておらず、すべて既知の物質で作ることができるため設計や制御が容易になります。将来は、このような人工システムを使うことで、生物を使っている現状の有用物質の生産をより安定して制御できることが期待されます。

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＜参考図＞

図１ 人工的に設計したＤＮＡ複製の仕組み
ＤＮＡから２種類のたんぱく質が発現し、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡ複製酵素によって環状ＤＮＡから２本鎖の長い直鎖状ＤＮＡが合成される。その後、Ｃｒｅ組み換え酵素により分子内で相同組み換えが起こり、環状ＤＮＡが再生される。このときできる環状ＤＮＡの大きさはもとより２倍、３倍大きい可能性もある。また環状ＤＮＡにならず長い直鎖状ＤＮＡのまま複製する経路も存在する。このようなＤＮＡ複製の仕組みは２００６年に海外のグループにより提案されていたが、Ｃｒｅ組み換え酵素がＤＮＡ複製酵素の機能を強く阻害してしまうために長年実現されていなかった（Ｆｏｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ ２００６ Ｍｏｌ Ｓｙｓ Ｂｉｏｌ）。本研究グループの先行研究で阻害効果が少ないＤＮＡ複製酵素変異体が取得され（Ｓａｋａｔａｎｉ ｅｔ ａｌ ２０１８ Ｓｃｉ Ｒｅｐ）、本研究が可能となった。

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図２ 区画構造がない条件で継代した場合のＤＮＡ濃度推移
区画構造のない普通の反応液で図１に示す反応を行い、毎日、新しい無細胞転写翻訳反応液で希釈し反応させ、ＤＮＡ濃度を測定した。ＤＮＡ複製が起こるとＤＮＡ濃度が上昇し、継代の際に希釈されるので濃度が下がっている。８，９ラウンドではＤＮＡ複製が起きなくなった。６ラウンド（黒矢じり）では、ＤＮＡ濃度が検出感度以下になったため、一度ＤＮＡを取り出して人為的に増幅したのち、再び区画内に戻している。

図３ 細胞のような区画構造の効果
左）区画構造がないときは、たとえ遺伝子が壊れたＤＮＡでも他の正常なＤＮＡと同様に複製されてしまい除かれない。右）区画構造があり区画当たりのＤＮＡが１分子であれば、遺伝子が壊れたＤＮＡは複製されないためそのうち希釈されていなくなってしまい除かれる。

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図４ 区画構造がある条件で継代したときのＤＮＡ濃度推移
Ａ）油中水滴の中で図１に示す反応を行い、次のラウンドでは新しい無細胞転写翻訳反応液を含む油中水滴で希釈し、かき混ぜることで水滴の中身を混ぜて反応させた。Ｂ）各
ラウンドでＤＮＡ濃度を測定した。独立に２系列の実験があり、上ではその１例を示す。
どちらも複製は最後まで持続した。黒矢じりで示すラウンドでは、ＤＮＡ濃度が検出感度以下になったため、一度ＤＮＡを取り出して人為的に増幅したのち、再び区画内に戻している。

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図５ 単離されたＤＮＡの複製能力の比較
ラウンド３０で単離した複数のＤＮＡについて図１に示す転写・翻訳・複製反応を行い、環状、線形ＤＮＡを含む総ＤＮＡ複製量を比較した。

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＜用語解説＞
注１）無細胞転写翻訳系
細胞外でＤＮＡにコードされた遺伝子からＲＮＡを転写し、たんぱく質へ翻訳することに必要なすべての因子を含む反応液。本研究では特に、東京大学の上田 卓也 研究室で清水 義宏（現 理化学研究所 生命機能科学研究センター 無細胞タンパク質合成研究チームチームリーダー）らによって開発された、すべて精製された既知のたんぱく質とＲＮＡから構成されている再構成型のもの（ＰＵＲＥ ＳＹＳＴＥＭ，Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ Ｎ
ａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００１）を用いているため、不明要素のないシステムになっている。
注２）Ｐｈｉ２９ ＤＮＡ複製酵素
枯草菌のバクテリオファージｐｈｉ２９が持つＤＮＡ複製酵素。この酵素はＤＮＡやＲＮＡをプライマーとしてＤＮＡ鎖を合成できる。鎖置換活性があるため、２本鎖を分離しながらＤＮＡ合成を続けることができる。本研究では転写酵素によって作られたＲＮＡ断片をプライマーとして複製を行っていると予想される。
注３）Ｃｒｅ組み換え酵素
大腸菌のバクテリオファージＰ１が持つＤＮＡ組み換え酵素。ｌｏｘＰと呼ばれる３４塩基長の配列同士を組み替えることができる。本研究で用いる人工ゲノムＤＮＡは１つのｌｏｘＰを持つ。
注４）ＲＮＡの進化実験本研究で開発したような持続的に複製し進化するシステムは、過去に本グループのメンバーによりＤＮＡではなくＲＮＡで達成されていた（Ｉｃｈｉｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１３）。しかし、ＲＮＡゲノムの場合は持続的複製可能なＲＮＡの長さに制限があり、遺伝子を追加することが難しく発展性に欠けるという問題があった。
これに対し今回開発したＤＮＡゲノムには今のところそのような制限はなく、複数の遺伝子の追加が可能でありさまざまな応用が期待される。
＜論文タイトル＞“Continuous cell-free replication and evolution of artificial genomic DNA in acompartmentalized gene expression system”（区画化された無細胞遺伝子発現システム中における人工ゲノムＤＮＡの持続的な複製と進化）
ＤＯＩ：10.1021/acssynbio.1c00430＜お問い合わせ先＞＜研究に関すること＞
市橋 伯一（イチハシ ノリカズ）
東京大学 大学院総合文化研究科教授

9〒153-8505

東京都目黒区駒場４－６－１ Ｔ棟 ３０３E-mail：ichihashi[at]bio.c.u-tokyo.ac.jp＜ＪＳＴ事業に関すること＞
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