遺伝子導入実験ハンドブック

−保存版−

目次

◆遺伝子導入実験を始める前に・遺伝子導入の手法と特徴
・主要な遺伝子導入方法の原理
・ベクターとして用いられる主なウイルスの特徴
・ウイルスベクター選択ガイド◆トランスフェクション・エレクトロポレーション◆ウイルスベクター
・レトロウイルスベクター
・レンチウイルスベクター
・アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター
・アデノウイルスベクター◆お役立ち情報関連製品リスト

ウェブサイト http://www.takara-bio.co.jp

遺伝子導入実験を始める前に細胞や生体への遺伝子導入は、遺伝子や遺伝子産物の機能の研究に欠かせない必須の手法です。
このハンドブックでは、遺伝子導入実験を行う皆様が実験目的に最適な遺伝子導入手法を選択し、実験を効率よく進めることができるよう、必要な知識やポイントをわかりやすくまとめました。遺伝子導入実験の手引書としてご活用ください。
遺伝子導入実験の目的と検討ポイント● 遺伝子の機能解析…過剰発現や調節発現による機能解析、発現抑制（RNAi）による機能解析、発現調節領域の解析● タンパク質の発現…変異タンパク質の発現による病態解析、正常タンパク質の発現による機能修復、組換えタンパク質の大量生産

遺伝子の入手発現ベクターの構築

・プロモーターやマーカーの選択・目的遺伝子のクローニング
・変異体作製 ・siRNA設計 など

解析方法の選択

標的の選択

導入方法の選択・mRNAの発現定量
・タンパク質の発現定量

・株化細胞／初代細胞・培養組織片／動物個体・化学的方法・物理的方法・生物学的方法■ 遺伝子導入の手法と特徴
遺伝子導入の方法は、大きく3つ（化学的、物理的、生物学的な導入）に分類できます。目的を達成するために最適な手法を選択しましょう。

分

類

方

法

標

的

長

所

短

所

化学的

トランスフェクション

培養細胞・比較的高効率・簡便・導入サイズに制限なし
・豊富な市販品

・化学毒性・細胞種や状態により導入効率が変動
・特定細胞への選択的導入は困難

物理的エレクトロポレーション
マイクロインジェクション
ソノポレーション
レーザー照射

培養細胞

・シンプルな原理
・適所に導入可能・ベクター不要
・導入サイズに制限なし

・特殊な器具や装置が必要
・核酸が傷つきやすい
・経験が必要

生物学的ウイルスベクター

培養細胞
動物個体

・高効率
・比較的簡便・汚染の危険性・挿入変異・免疫による不活化＊カチオンポリマー＊カチオン脂質＊リン酸カルシウム■ 主要な遺伝子導入方法の原理
トランスフェクションによる遺伝子導入
核酸（DNAまたはRNA）は陰電荷であるため、陽電荷をもつ物
質（リポソームやポリマーなど）に結合し複合体を形成します。
その複合体が陰電荷を帯びた細胞表面に引きつけられ、エンド
サイトーシスにより細胞に取り込まれます。

エレクトロポレーションによる遺伝子導入
核酸と細胞の懸濁液を陽極と陰極ではさみ、電気パルスをかけて細胞膜に小さな穴をあけることにより、細胞外にあった核酸が細胞内へ入り込みます。
エレクトロポレーター
陽極
DNA/RNA

細胞質

細胞質

静電的膜圧縮により、膜が開裂
核

細胞質

核

核へ移行

陰極

ウイルスベクターによる遺伝子導入
ウイルス粒子の表面タンパク質に結合する受容体が細胞膜表面に存在する場合、その細胞にウイルスが感染し、ウイルス粒子内にあった核酸が細胞内へ移行します。
遺伝子導入のためのウイルスベクターとしてよく用いられるものには、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、
アデノウイルスがあります。各ウイルスベクターの特徴、実験目的に最適なウイルスベクターの選択ガイドは2ページをご覧ください。

-1-

遺伝子挿入実験ハンドブック

目的タンパク質の発現

ウイルスが
細胞に感染
逆転写

翻訳

膜融合
転写

レンチ／レトロウイルス
ベクターの場合

宿主染色体へウイルスゲノム挿入

【一過性発現と安定発現について】

目的遺伝子
発現プラスミド

細胞質

目的遺伝子を発現するプラスミドが導入された細胞は、一時的に多量のタンパク質を発現（一過性発現）しますが、細胞分裂と共に発現量は減少していきます。
発現プラスミドの一部は細胞のゲノムに組み込まれるため、予め発現プラスミドに
薬剤耐性遺伝子を載せておき、一過性発現確認後に薬剤選択を行うことで、恒常的に目的タンパク質を発現（安定発現）する細胞だけを選択することができます。

薬剤（Neo, Hyg,
Purなど）

核

トランスフェクション

薬剤選択
一過性発現

安定発現

発現期間： 1週間程度
発現量 ： 多量発現細胞の割合： 細胞株や試薬に依存

発現期間： 恒常的発現量 ： 少〜多量※発現細胞の割合：≒100%※取得クローンに依存遺伝子導入前■ ベクターとして用いられる主なウイルスの特徴
アデノ随伴ウイルス（AAV）

アデノウイルス

レンチウイルス／
レトロウイルス

Parvoviridae

Adenoviridae

Retroviridae

構造

ssDNA

dsDNA

ssRNA

サイズ

約5 kb

約36 kb

8-9 kb

殻の外被（エンベロープ）

−

−

＋

ウイルス粒子直径18-26 nm70-90 nm80-130 nm

宿主染色体へのゲノムの組み込み

−

−

＋

感染した細胞における遺伝子の発現

長期可能（非分裂細胞）

一過性

長期

実験の際に執るべき拡散防止措置レベル ★

P1

P2

P2

分類（Family）

ウイルスゲノム★ 文部科学省の定める省令（「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令」
平成16年文部科学省・環境省令第１号）に記載されています。P2レベルの実験環境の整備について詳細は10ページをご覧ください。

■ ウイルスベクター選択ガイド
遺伝子導入の標的（培養細胞、動物個体）、遺伝子発現の仕方（一過性、安定）から、実験目的に最適なウイルスを選択しましょう。

動物個体へ投与
分裂動物細胞へ導入
非分裂動物細胞へ導入
一過性発現 ※

一過性高発現・拡散防止措置レベルP1で取り扱いが可能・血清型の組織指向性を利用して効率よく導入
・低い免疫原性・高力価、高導入効率
・目的遺伝子やsiRNAの一過性高発現に安定発現
・目的遺伝子の安定発現株
作製に・血球細胞や造血幹細胞への高効率導入

・目的遺伝子やsiRNAの安定発現株作製に・血球細胞や造血幹細胞への高効率導入
・Cell Based Assayに※非分裂細胞や動物個体では長期発現が可能

アデノ随伴ウイルス

導入例：マウス脳線条体への導入

アデノウイルス

レンチウイルス

レトロウイルス

mES細胞への導入

神経細胞への導入

iPS細胞の作製
遺伝子挿入実験ハンドブック-2-

トランスフェクション

★ 試薬の無料サンプルご提供中

核酸を哺乳類細胞へ化学的に導入するトランスフェクションは、最も簡便な遺伝子導入方法です。
トランスフェクション試薬TransIT ®シリーズやXfect™シリーズは、細胞毒性が非常に低く、かつ、高効率に核酸の導入が可能な試薬です。下記リスト以外にも多種類の試薬をラインナップしています。詳しくはタカラバイオウェブカタログをご覧ください。
操作方法の概要
核酸

トランスフェクション

24-48 hours
トランスフェクション
試薬を血清フリーの培地で希釈する。

核酸を
添加する。

製

品

混合しインキュベート
する（室温）。

培養細胞に直接
添加する。

名

容

アッセイを行う

24〜48時間培養

製品コード

価格（税別）

TransIT-X2® Dynamic Delivery System

0.3 ml（6 wellプレート使用で40回分）

量

MIR6003¥21,000

Xfect™ Transfection Reagent

50回×2（6 wellプレート使用の場合）

631317¥28,800

エレクトロポレーション★ 試薬の無料サンプルご提供中

化学的なトランスフェクションでは核酸導入が困難な哺乳類細胞、幹細胞、初代細胞に対して、物理的な導入方法であるエレ
クトロポレーションの利用は、高い核酸導入効率を期待できます。Ingenio® Electroporation Kitは、細胞へのダメージを最小限に抑えつつ高効率な導入を実現する試薬です。
操作方法の概要
核酸エレクトロポレーション

12-72 hours
細胞を採取しカウントする。
遠心分離して、 エレクトロ
ポレーション試薬に再懸濁する。

核酸を添加し、核酸と細胞の混合液をキュベット
に移す。

製

品

12〜72時間培養

エレクトロポレーション後、すぐに細胞を培地に移す。

名®

Ingenio Electroporation Kit with 0.2 cm cuvettes®

Ingenio Electroporation Kit with 0.4 cm cuvettes®

Ingenio Electroporation Solution

容

アッセイを行う量

製品コード

価格（税別）

回

MIR50115¥64,000

回

MIR50116¥64,000

回

MIR50114¥40,000※Ingenio Electroporation Kit は、Lonza社（amaxa Nucleofector Device）、Bio-Rad 社（Gene Pulser Xcell Electroporator）、BTX社、
Eppendorf社などが販売するキュベット式エレクトロポレーション装置に適合します。詳細はウェブカタログをご覧ください。

オンラインツール『遺伝子導入試薬

ウェブサイトのタイトル（下記の青字）で検索、もしくは、以下の QR コードを読み取り、アクセスしてください。

選択ガイド（Mirus 社）』

実験目的別に、標的細胞に最適な試薬がぱっとわかる表を掲載！
無料サンプルお申込みフォームともリンクしています。

Search Reagent Agent ®
The Mirus Transfection Datebase『

IT シリーズ 無料サンプルお申込みフォーム』®

小容量サイズを無料でお試しいただけます。
複数の種類のお申込みも可能です。

『遺伝子導入試薬

検索ツール

Reagent Agent』

細胞と導入する核酸の種類を選択して入力すれば、推奨試薬を表示します。
※
IT シリーズの各製品ページからご利用いただけます。

-3-

遺伝子挿入実験ハンドブック

Enter Cell Type:
Select Nucleic Acid:

Show Recommendations※TransIT、IngenioはMirus Bio社の製品です。

安定発現
分裂細胞

レトロウイルスベクターによる遺伝子導入★レトロウイルスベクターの特徴と使用上の留意点

レトロウイルスベクターはモロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）を基に開発されており、遺伝子治療での使用など豊富な実績を有しています。増殖期にある多くの細胞種への遺伝子導入が可能であり、導入遺伝子が染色体に組み込まれるため、長期間、安定に遺伝子の発現が可能です。ウイルスベクターの調製は比較的容易ですが、P2レベルの施設での取扱いが必要です。

Retrovirus

パッケージング
ベクタープラスミド

操作方法の概要

1. 目的遺伝子のクローニング
LTR、パッケージングシグナル（Ψ）および目的遺伝子を搭載したレトロウイルスベクタープラスミドとパッケージングに必要なgag、pol、env遺伝子を搭載したベクタープラスミドを別々に準備し、これらをコトランスフェクション（共導入）することにより、自己複製能を欠く安全性の高い組換えレトロウイルスを得ることができます。
レトロウイルスベクタープラスミドには、標準的なクローニング
方法を用いて目的の遺伝子配列（Gene of Interest：GOI）をマルチク
ローニングサイト（MCS）に挿入します。

1）レトロウイルスベクタープラスミドとパッケージングベクタープラスミドの
コントラスフェクション

2）転写と翻訳
レトロウイルス
ベクタープラスミド

一過性発現
ウイルス
タンパク質

3）ウイルスタンパク質が
Ψ目的遺伝子Ψを認識
RNA
4）ウイルスコアの形成

Gene of Interest
5’ LTRΨ

3’ LTR

MCS

5）感染性ウイルス粒子の出芽

2. ウイルスのパッケージング
293T細胞等に目的遺伝子を搭載したレトロウイルスベクタープラ
スミドとpGP vector（gagおよびpol遺伝子を搭載）、pE vector（VSVG / Ecotropic / Amphotropic等エンベロープをコードするenv遺伝子を搭載）をコトランスフェクションすることで、48時間後には一過性の組換えレトロウイルスを得ることができます。また、パッケー
ジング遺伝子の一部あるいは全てがゲノム中に組み込まれたパッケージング細胞（製品コード 631510等）
を用いる方法もあります。
パッケージング細胞例

gag遺伝子pol 遺伝子

env遺伝子293T細胞−−−

GP2-293細胞＋＋−

PT67細胞

＋

＋

＋

Env

レセプター

5. レトロウイルスベクターによる遺伝子導入

標的細胞

gp70

mCAT1

マウス、ラット

Amphotropic

4070A

rPit-2広範な哺乳類細胞

Dualtropic

10A1

Pit-1 , Pit-2

広範な哺乳類細胞

Pantropic

VSV-G

不要

すべての動物細胞

用

途

製品コード

価格
（税別）

pDON-5 DNA

20 μg

3658

¥57,000

pDON-5 Neo DNA

20 μg

3657

¥57,000

組み合わせてパッケージングに使用し、効率よく組換えウイルスを調製

Retrovirus Packaging Kit Eco ※

10回

6160

¥57,000

レトロウイルス調製細胞 G3T-hi細胞

2×106 cells/vial

6163¥68,000

ウイルス力価の測定

Retrovirus Titer Set (for Real Time PCR)

標的細胞への遺伝子導入促進

RetroNectin®

遺伝子導入効率の向上

Ecotropic Receptor Booster ※レトロウイルスベクタープラスミド

製

品

4. ウイルスベクターの力価測定

レトロウイルスベクターによる遺伝子導入では、一般にウイルス液とプラス荷電の遺伝子導入補助剤の混合液を標的細胞に添加して培養するPolybrene法またはProtamine法が用いられます。遺伝子導入
補助剤によってマイナス荷電の細胞とマイナス荷電のウイルスの結合を容易にし、遺伝子導入効率を上昇させます。
また、RetroNectinを用いることにより、物理的・化学的手法では導入が困難な造血幹細胞等への遺伝子導入が可能となります（10ペー
ジのコラム参照）。
その他、Receptor Boosterを用いることにより標的細胞表面上のウ
イルスレセプター濃度を一過性に高めることで、遺伝子導入効率を改善する方法もあります。

組換えレトロウイルスの感染は、エンベロープによって規定される
ため、pE vectorは標的細胞に応じて選択します。
指向性

3. ウイルス粒子の回収産生された組換えレトロウイルスは培養上清中へ放出されるため、培養上清をフィルターろ過し、ウイルス液とします。

レトロウイルスベクターの力価は、リアルタイムRT-PCRにより測定します。Retrovirus Titer Set (for Real Time PCR)ではほとんど
すべてのMoMLVベースのレトロウイルスベクターのRNAゲノム量を測定し、力価（RNAタイター）を算出することができます。

（＋：細胞のゲノムに組み込み済み、−：プラスミドにて導入）

Ecotropic6）培養上清中のウイルスを回収

名

容

量

100回

6166

¥47,000

0.5 mg（0.5 ml）

T100A¥28,000

20回

631471¥42,200※Amphotropicに対応した製品もラインナップしています。
遺伝子挿入実験ハンドブック

-4-

安定発現
分裂・非分裂細胞

レンチウイルスベクターによる遺伝子導入★レンチウイルスベクターの特徴と使用上の留意点

現在一般的に利用されているレンチ
ウイルスベクターは、HIV-1（ Human

Lentiviral High Titer
Packaging Mix

immunodeficiency virus 1 型）
を基に開Lentivirus

1）ベクタープラスミドとLentiviral High Titer
Packaging Mixのコントラスフェクション

トランスフェクション

発されており、レトロウイルスベクタ

2）転写と翻訳ーでは困難であった造血幹細胞や神経細胞などの非分裂細胞を含めたほぼす

また、レトロウイルスベクター同様、レンチウイルスベクターを用いて導入された目的遺伝子はホスト細胞ゲノムに組み込まれる

一過性発現

pLVSIN
Vector

べての哺乳類細胞への遺伝子導入が可能です。

Lenti-X 293T
Packaging Cell

ため、長期にわたる安定した遺伝子発現が可能です。

3）ウイルスタンパク質が
Ψ目的遺伝子
Ψを認識
RNA

ウイルス
タンパク質

4）ウイルスコアの形成

加えて、安全性を高める工夫として、HIV-1ウイルス由来の修飾・制御遺伝子の機能と構造遺伝子を欠損した増殖力等欠損株に該当するレンチウイルスベクターが広く利用されている他、プロウイ

VSV-G

ルスにおいてLTR（Long Terminal Repeat）のプロモーター活性を喪失するよう改変されたSIN（Self Inactivating）
型レンチウイルスベ

5）感染性ウイルス粒子の出芽

クターについては、国内においてもP2レベルの実験施設にて取り扱いが可能です。

6）培養上清中のウイルスを回収

レンチウイルスベクターの産生フロー

操作方法の概要

1. 目的遺伝子のクローニング

2. ウイルスのパッケージング

目的遺伝子をレンチウイルスベクタープラスミドにクローニングします。その際、以下の変異を導入したSIN型レンチウイルスベク
ターを用いることで、感染力を維持したまま、複製・増殖能を欠いたウイルス粒子を作製でき、安全性の高い遺伝子導入の実現が可能です。

目的遺伝子を挿入したレンチウイルスベクタープラスミドを、パッケージングに必要なgag、pol、tat、revのレンチウイルスタンパク
質、およびエンベロープタンパク質（VSV-Gなど）を発現するプラス
ミドとともにLenti-X 293 Cell Lineなどのパッケージング細胞にコ
トランスフェクションします。
その結果、レンチウイルスベクタープラスミドより転写された組換えウイルスRNAゲノムは、そのパッケージングシグナル（Ψ）によりパッケージングタンパク質に取り込まれ、ウイルスコアが形成されます。次に、このウイルスコアは細胞膜に輸送され、エンベロープタ
ンパク質を含む細胞膜に封入された後、感染性のウイルス粒子として細胞膜から出芽し培地中に放出されます（上図。ウイルス粒子は未成熟粒子で出芽し、体液や培養液中で成熟します）。
レンチウイルスのパッケージングには、必要なコンポーネントを効率良く発現するプラスミドを最適な比率で混合したLentiviral High
Titer Packaging Mixやパッケージングプラスミドとトランスフェ
クション試薬をプレミックスにした簡便操作のLenti-X Packaging
Single Shots（VSV-G）などが利用できます。

• HIV-1由来の修飾遺伝子（vif, vpr, vpu, nef ）と制御遺伝子（tat, rev）の機能を欠損• 構造遺伝子（gag, pol, env）の固有部分を全て欠損• プロウイルスにおいてLTRのプロモーター活性を持たないよう、
3’LTRのU3領域にあるエンハンサーとプロモーター部分を欠損
タカラバイオのpLVSIN Vectorシリーズは、このようなSIN型のレンチウイルスベクタープラスミドです。本Vectorでは、ウイルス力
価、ベクター機能向上のための各種配列（下図参照）を搭載した上で、なお約4.5 kbまでの目的遺伝子の挿入が可能です。

pLVSIN Vectorの構造

Gene of Interest

5’LTR

Ψ

PCMVIERRE

cPPT/CTS

PPGK

PuroR

WPRE

3’LTR/△U3

MCS・cPPT/CTS：cPPTとCTSは、標的細胞への感染過程においてウイルゲノムの核内への輸送を促進するため、ベクターのゲノムへの組み込みと遺伝子導入効率が向上します。

-5-

・RRE

：スプライシングされていないウイルスゲノムRNAの核外への輸送を促進することで、ウイルス力価を向上させます。

・WPRE：WPREはポリA部位のリードスルーを防ぎ、RNAのプロセッシングと成熟を促進し、RNAの核外への輸送を増大させます。このWPRE
は、パッケージング細胞内のウイルスゲノム転写物に作用してベクターパッケージングを促進しウイルス力価を増大させます。
さらにベクターの内部プロモーターによって産生されるmRNAの成熟を促進するため、遺伝子導入された標的細胞内の目的遺伝子の発現を増強します。

遺伝子挿入実験ハンドブック

3. ウイルス粒子の回収

5. ウイルスベクターの濃縮パッケージング細胞にコトランスフェクションしてから48時間後に培養上清を回収し、0.45 μmフィルターでろ過してウイルス粒子をが得られる培養上清回収
回収します。十分なタイター（5×105 IFU/ml）のタイミングは、Lenti-X GoStixを用いた簡易的な力価測定により確認することができます。Lenti-X GoStixでは、ウイルス上清20 μlとChase BufferをGoStixに加えるだけでTest Bandの有無により最短30秒（〜10分）
で力価測定が可能です。

回収したレンチウイルスベクターの力価が十分でなかった場合や大容量のウイルス上清を回収した場合には、ウイルス上清を濃縮することによって高力価のレンチウイルスベクターを得ることができます。Lenti-X Concentratorを用いれば45分遠心するだけで簡単に約100倍の濃縮が可能です。

C

T

C

S

T

S

C

T

S

T

30秒〜
10分
培養上清20 µlを添加

C

4×Lenti‐X
Concentratorを添加+

4℃で30分〜
一晩
インキュベート＞5×105 IFU/ml

Chase Buﬀer 1を4滴添加

1,500 × g、4℃で45分間遠心分離

ペレットを元の1/10〜1/100
容量に再懸濁Test bandの有無を確認（レンチウイルスp24を検出）

4. ウイルスベクターの力価測定

6. レンチウイルスベクターによる遺伝子導入

最適な多重感染度（MOI）を調べて再現性のある遺伝子導入結果を得るために、回収したウイルスの力価を正確に算出します。レンチウ
イルスベクターの力価測定方法として、リアルタイムRT-PCRや
ELISA法により測定したウイルスのゲノムRNA量やタンパク質量からウイルス粒子数を算出する方法と、蛍光タンパク質や薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子により評価した遺伝子導入効率による方法（生物学的タイター）の大きく2種類が挙げられます。
このうち、遺伝子導入効率に基づいた生物学的タイターでは、細胞にウイルスベクターを感染させて力価測定を行うため、より実際に近い評価結果が得られる一方、その評価には数日〜数週間の時間を要します。これに対して、リアルタイムRT-PCRによるRNAタイ
ター、ELISA法によるウイルス粒子数の測定では、比較的短時間で力価測定が可能です。また、リアルタイムRT-PCRで求められるRNAタイター（IFU/ml）と生物学的タイターとの相関値（copies/IFU）を
あらかじめ求めておけば、短時間で得られるRNAタイターから生物学的タイターを推定して、MOIを決定することも可能です。

レンチウイルスベクターを用いる細胞への高効率な遺伝子導入方法
として以下の方法を推奨します。
・Polybrene法
Polybrene（ポリブレン）法は接着性細胞株（HT-1080、HeLaなど）においてレンチウイルスベクターやレトロウイルスベクターを導入する一般的な方法です。細胞表面とウイルス粒子は通常マイナスに帯電しています。ここにポリブレンを加えるとウイルスとの非特異的な結合に伴って、ポリブレンのプラス電荷がウイルスのマイナス電
荷を中和し、細胞表面と結合しやすくなります。細胞表面がウイル
スのエンベロープと接触しやすくなることで、遺伝子導入効率が著しく上昇します。ポリブレンの一般的な濃度は2〜12 μg/mlであり、過剰に（24時間以上）細胞をポリブレンにさらすと毒性が現れるた
め、培地交換を行ってポリブレンを除去する必要があります。
・RetroNectin法
レンチウイルスベクター／レトロウイルスベクターによる遺伝子導入時にRetroNectinをコートしたプレートやディッシュを用いる手法は、リンパ球等の浮遊細胞や遺伝子導入が困難な造血幹細胞、ポリブレン等の遺伝子導入補助剤では毒性がある細胞への遺伝子導入
効率の向上に最適な方法です（10ページのコラム参照）。

Reverse transcriptase

Envelope(VSV-G or Eco)

ELISA法では
Capsidのp24を定量する

RNA genome
リアルタイムRT-PCR
法ではRNA genomeを定量する

Capsid

概

要

名

容 量

製品コード

SIN型レンチウイルスベクタープラスミド

pLVSIN-CMV Neo Vector ※

20 μg

6181

¥61,000

レンチウイルスパッケージング試薬

Lentiviral High Titer Packaging Mix

60回

6194

¥174,000

Lenti-X™ Packaging Single Shots (VSV-G)

16回

631275¥140,000

パッケージング用細胞株

Lenti-X™ 293T Cell Line

1 ml

632180¥65,900

トランスフェクション試薬

TransIT -293 Transfection Reagent

0.4 mlMIR2704¥36,000

簡易力価測定Lenti-X™ GoStix™

20回

631243¥36,100

qRT-PCR法による力価測定

Lenti-X™ qRT-PCR Titration Kit

200回

631235¥108,200

ELISA法による力価測定

Lenti-X™ p24 Rapid Titer Kit

96回

632200¥85,500

レンチウイルスベクターの濃縮

Lenti-X™ Concentrator

100 ml631231¥34,000

標的細胞への遺伝子導入促進

RetroNectin®

0.5 mg（0.5 ml）

T100A¥28,000

ワンショットタイプのレンチウイルス
パッケージング試薬

製

品

®

価格
（税別） 備考＊※ EF1αプロモータータイプ、蛍光タンパク質融合発現タイプなど多数のラインナップがあります。
＊ ご購入前にMTA（Material Transfer Agreement）
をご確認ください。詳細は弊社ウェブカタログでご確認ください。
遺伝子挿入実験ハンドブック

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一過性
（分裂細胞）
長期（非分裂細胞）

アデノ随伴ウイルスベクターによる遺伝子導入★アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターの特徴と使用上の留意点

Adeno-AssociatedVirus

アデノ随伴ウイルス（Adeno-Associated Virus：AAV）
は、アデノウイルスやヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルス存在下で増殖する非エンベロープウイルスです。
AAVベクターはP1レベルの施設で取扱い可能であり、取扱いが容易です。AAVベクターは分裂細胞／
非分裂細胞を問わず遺伝子導入ができ、特に非分裂細胞においては長期間の発現が可能です。また、免疫原性が低く、動物個体への遺伝子導入にも適しています。非常に安定なウイルスであり、精製操
作も簡便に行うことができます。

AAVは血清型（セロタイプ）の違いによって宿主域やウイルスの持つ特徴が異なることが知られています。
標的の細胞・組織に合わせて血清型を選択してください。
※ 遺伝子導入の程度は実験条件によって異なる場合がありますので、文献を参照してください。

血清型と主な標的組織（血清型1、2、5、6の場合） 【参考文献】
血清型

主な標的組織

AAV1

筋肉、肝臓、気道、中枢神経系

AAV2

広範囲の細胞・組織

AAV5

中枢神経系、肝臓、網膜

AAV6

心臓、筋肉、肝臓

Miyake K, Miyake N, Yamazaki Y, Shimada T, Hirai Y.
Serotype-independent method of recombinant adeno-associated virus (AAV)
vector production and purification. : J Nippon Med Sch. 2012;79(6):394-402.
小澤敬也
AAVベクターの開発と遺伝子治療への応用 : 蛋白質核酸酵素Vol.52 No.10 (2007)
1288-1293
Ellis BL, Hirsch ML, Barker JC, Connelly JP, Steininger RJ 3rd, Porteus MH.
A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells andcell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered
adeno-associated virus serotype. : Virol J. 2013 Mar 6;10:74■ AAVpro® Helper Free SystemによるAAVベクターの作製

AAVのゲノム構造
AAVのゲノムは約4.7 kbの1本鎖DNAで、両末端にITR（Inverted
Terminal Repeat）と呼ばれるT字型のヘアピン構造が存在します（下図）。この ITRが複製の開始点となり、プライマーとして機能するほかウイルス粒子へのパッケージングにも寄与します。AAVのゲ
ノムには3つのORFがコードされており、1つ目は複製、転写に関連しているRep、2つ目はウイルス粒子の外殻タンパク質をコードする
Cap、3つ目は非構造タンパク質であり、ウイルス粒子形成に必須の 因 子 で あ る AAPで す 。 Rep領 域 に は 4種 類 の 異 な る タ ン パ ク
質（Rep78、Rep68、Rep52、Rep40）がコードされており、またCap領域には3種類の異なるタンパク質（VP1、VP2、VP3）がコードされています。
ITR

ITR
Rep

操作方法の概要

1. 目的遺伝子のクローニング
AAVベクターの作製に必要なコンポーネントは、以下の3種類のプラスミドです。
・pAAV Vector：
目的遺伝子の発現カセットと2 つのITRを含むベクタープラスミド
・pRC Vector：
AAV2のRep遺伝子と各血清型のCap遺伝子を含むプラスミド
・pHelper Vector：
アデノウイルス由来のE2A、E4、VAを含むプラスミド
ITR

Promoter

GOI

pAAV Vector

Cep

ITR

Rep CeppRC
VectorE2A E4 VA

pHelper
Vector

Rep78
Rep68
Rep52
Rep40
VP1
VP2
VP3

標準的なクローニング方法を用いて、目的の遺伝子配列（Gene ofInterest：GOI）をpAAV Vector のマルチクローニングサイト（MCS）に挿入します。クローニングにはIn-Fusion HD Cloning Kit（製品コード 639648 など）も使用できます。目的遺伝子を含むpAAV Vector
は細胞へのトランスフェクションに適したグレードに精製し、DNA
濃度 1 μg/μl に調整します。
※クローニングする目的遺伝子サイズ： 最大2.5 kbまで

AAP

野生型AAVゲノム構造とコードするタンパク質■ AAV Helper Free Systemとは…
AAVベクターをヘルパーウイルスを使用せずに安全に作製するシステムです。タカラバイオでは各種血清型のAAVベクター作製システ
ム AAVpro Helper Free Systemを販売しています。
このシステムでは、AAVベクターの作製に必要な複数のプラスミド
をHEK293細胞にトランスフェクションすることで、簡便にAAVベクターを作製することができます。

-7-

遺伝子挿入実験ハンドブック

2. ウイルスのパッケージング
HEK293細胞またはHEK293T細胞を直径100 mmの細胞培養用ディッ
シュに2.5〜4.0×106 cells/dishで播種して培養します。細胞播種の翌日、精製pAAV Vector、本キットのpRC VectorおよびpHelper Vector
を細胞へコトランスフェクションします。
トランスフェクション試薬としてTransIT-293 Transfection Reagent
を使用する場合は以下の通りです。
① TransIT-293 Transfection Reagentを室温に戻し、使用前にボルテックスで混合する。

① 回収した細胞ペレットをボルテックスもしくはタッピングにより十分にほぐす。
② 0.5 mlのAAV Extraction Solution Aを添加する。
③ ボルテックスで15 秒間懸濁する。
④ 室温で5分間静置後、さらに15秒間ボルテックスして懸濁する。
⑤ 2,000〜14,000×g 、4℃で10分間遠心する。
⑥ 上清を新しいチューブに回収する。
⑦ 50 μlのAAV Extraction Solution Bを添加してピペッティングにより混合する。
※回収したAAVベクターはー80℃で保存可能② 以下の混合比で無血清のDMEM、プラスミドDNAを加え、穏やかにピペッティングして完全に混合する。

pAAV Vector（1 μg/μl）
pRC Vector（1 μg/μl）
pHelper Vector（1 μg/μl）
無血清DMEM or Opti-MEM

5 μl
5 μl
5 μl
1,500 μl

Total

1,515 μl

③ ②に45 μl のTransIT-293 Transfection Reagent を添加し、穏やかにピペッティングして混合し、15〜30分間、室温で静置する。
④ 前日に播種したHEK293またはHEK293T細胞に③の混合液を滴下し、さらに培養する。
⑤ トランスフェクションから6時間後〜翌日に、新しい2% FBS含有DMEMで培地を全量交換する。

4. ウイルスベクターの精製・濃縮回収したAAVベクター溶液の純度は、特に動物個体へ投与する際に大きく影響します。抽出液から夾雑物を除去するためには、超遠心法など長時間を要する手法が従来から用いられてきましたが、フィルターろ過で簡単かつ短時間で操作できるAAVpro Purification
Kit (All Serotypes)により、同程度の精製が可能です。

3. ウイルス粒子の回収
AAVベクター産生細胞の回収（トランスフェクションから2〜3日後）① 0.5 M EDTA
（pH8.0）を培養液の1/80容量で添加し、よく混合した後、10分間室温で静置して、細胞をディッシュ表面から剥離させる。
② 剥離させた細胞を遠心管に回収し、1,750×gで10分間遠心後、上清を除いて細胞を回収する。

ベクター
抽出液

フィルターろ過

濃縮

遠心

ベクター
濃縮液

5. ウイルスベクターの力価測定
ウイルスベクターの力価測定法には、AAVベクターゲノムをリアル
タイムPCRで定量するベクターゲノム定量法と、力価測定用細胞への感染試験を行う生物学的力価測定法があります。
前者は迅速で定量性のある力価測定法であり、後者は実際の細胞への感染試験を行うことから、より正確で実質的な力価測定法です。

AAVベクター産生細胞からのベクター抽出キット添付のAAV Extraction Solutionの使用により、簡便にAAVベ
クターを抽出することができます。従来行われていた凍結融解法や超音波破砕法のように液体窒素や超音波破砕機を準備する必要がありません。

AAV ベクター作製の実験フローと対応製品
トランスフェクション

転写と翻訳

複製

293T細胞

AAV
ssDNA

目的遺伝子のクローニング

抽出パッケージング

AAVpro® Helper Free System（AAV1 / AAV2 / AAV5 / AAV6）
用

途

精製

抽出

精製・濃縮

AAVpro® Purification Kit（All Serotypes / AAV2）
製

品

標的細胞・
組織へ感染

力価測定

AAVpro® Titration Kit（for Real Time PCR）Ver.2
製品コード

価格
（税別）

血清型2のAAVベクターを調製

AAVpro® Helper Free System (AAV2) ※

名

容

1 Kit

量

6230

¥150,000

様々な血清型のAAVベクター精製に

AAVpro® Purification Kit (All Serotypes)

4回

6666

¥120,000

AAV2ベクターの高純度精製

AAVpro® Purification Kit (AAV2)

2回

6232

¥98,000

AAVベクターの力価測定

AAVpro® Titration Kit (for Real Time PCR) Ver.2

100回

6233

¥75,000【関連製品】
用途

トランスフェクション試薬

血清型2の各種AAVベクターを調製（コントロール用、shRNA発現用）※

AAV産生に最適化した293T細胞

量

製品コード

価格
（税別）

TransIT®-293 Transfection Reagent

製

品

名

容

0.4 mlMIR2704¥36,000

AAVpro® Helper Free System (AAV2-LacZ)

1 Kit

6655

¥150,000

AAVpro® Helper Free System (AAV2-CRE Recombinase)

1 Kit

6652

¥150,000

AAVpro® Helper Free System (AAV2-2xU6)

1 Kit

6661

¥150,000

AAVpro® Helper Free System (AAV2-U6-ZsGreen1) ラ 営

1 Kit

6658

¥150,000

AAVpro® 293T Cell Line NEW

1 ml

632273¥65,900※AAV1 NEW 、AAV5、AAV6に対応した製品もラインナップしています。詳しくはウェブサイトの各製品ページをご覧ください。
ラ ご購入に際してライセンス確認書が必要となります。

営 営利施設の場合、ご購入前にライセンス（有償）を取得する必要があります。
遺伝子挿入実験ハンドブック-8-

一過性高発現
分裂・非分裂細胞アデノウイルスベクターによる遺伝子導入★アデノウイルスベクターの特徴と使用上の留意点

組換えアデノウイルスは、細胞側の受容体CARを介したエンドサイトーシスにより細胞内に侵入し、エピソームとして留まり、ゲノムに組み込まれずに目的遺伝子産物を一過性に大量に発現させることができます。またヒトを含む広範囲の哺乳類細胞に感染する能力をもち、分裂細胞、非分裂細胞を問わず、株化細胞や初代培養細胞、動物個体にも感染させることが可能です。
※CARの発現レベルが低い血球細胞では感染が起こりにくい傾向があります。

Adenovirus

操作方法の概要

1. 目的遺伝子のクローニング

4. 高力価ウイルスベクターの産生と回収

アデノウイルスベクターへの目的遺伝子のクローニングは、従来制限酵素によって行われていましたが、アデノウイルスベクターは36 kbの直鎖状二本鎖DNAウイルスであるため、通常のクローニン
グ法では目的遺伝子の効率の良いクローニングは困難でした。
そこで、Adeno-X Adenoviral System 3ではIn-Fusionクローニン
グ法を用いて線状化済みのpAdenoX Vectorと目的遺伝子を連結し、簡便かつ迅速な高効率クローニングを可能にしました。クローニン
グ後、目的遺伝子を含む精製済みアデノウイルスベクタープラスミ
ドは制限酵素（Pac I）などで線状化します。

シードウイルスの段階では遺伝子導入できるほどの力価は得られな
いため、シードウイルスを細胞に導入し自己複製させることで高タイターのウイルスを得ます。シードウイルスは自己複製に必要なE1Aを欠損させているため、E1Aが常時発現しているAdeno-X 293
Cell Lineなどに感染させ、3〜4日間培養し、50%程度細胞が浮いている状態で培地と細胞を回収します。このときAdeno-X GoStixを用いれば、簡易的に培養上清の力価チェックが可能です。回収した細胞および培養上清から凍結融解法や超音波破砕法によって高力価ウ
イルスベクターを回収します。

primerYour
gene

Adeno-X
293 cells

primerAdeno-X
293 cells

ITR
pUC Ori
Ampr
ITR

ITR
（Pac l） Your gene

アデノウイルスベクターに目的遺伝子（~6.4 kb）を
In-Fusion CloningC

ITR（Pac l）

プラスミドを精製後,
Pac Iで制限酵素処理
して線状化

シードウイ ルスの感染
ウイルスのパッケージング

TS

簡易タイター測定

回収

5. ウイルスベクターの精製回収したウイルス液中には多くの夾雑物が含まれているため、実験目的によってはウイルスの精製が必要になります。Adeno-X Maxi
Purification Kitを用いれば、アデノウイルスベクターをフィルター
吸着させ簡便に精製できるため、わずか2時間足らずで高純度な精製アデノウイルスベクターを得ることができます。

2. ウイルスのパッケージング
線状化したアデノウイルスベクターはE1Aを発現するAdeno-X 293
Cell Lineなどのパッケージング細胞へ導入します（E1A欠損型であるため）。ウイルスの構造タンパク質は細胞質で翻訳後、核内に移行しウイルス粒子を構成し、ウイルスゲノムのパッケージングシグナル（Ψ）を認識してゲノムをパッケージングします。

6. ウイルスベクターの力価測定
精製後のアデノウイルスベクターの力価（IFU=infection units）を
Adeno-X Rapid Titer Kitを用いて抗体染色法にて求めます。

3. シードウイルス粒子の回収
アデノウイルスは細胞を壊死させながら増殖するため、パッケージ
ング後、細胞の壊死（CPE=cytopathic effect）の状態を観察できます。
遺伝子導入効率によりますが1週間程度培養し続けることで細胞のCPEの割合が多くなっていくので、Late CPEまで培養後、培地と細胞を回収し、凍結融解法または超音波破砕によってシードウイルス
粒子を取り出します（下図）。

48時間培養ウイルスストックを希釈し細胞に感染

1.細胞を固定
2.抗ヘキソン抗体反応
3.HRP標識二次抗体を添加
4.DABで染色感染したHEK293細胞はヘキソンタンパク質を発現染色された陽性細胞数
より感染力価を求める

7. アデノウイルスベクターによる遺伝子導入

Early CPE

Late CPE

用

-9-

途

アデノウイルスベクターの感染条件はMOI=10〜100（1個の細胞に対して10〜100のウイルス感染単位を加える）が適当です。アデノウイ
ルスは細胞毒性があるため、過剰なMOIで感染すると細胞にダメー
ジを与えます。

凍結融解法
超音波破砕法量

製品コード

価格（税別）

アデノウイルス調製システム

Adeno-X™ Adenoviral System 3 (CMV)

1 Set

632269¥177,200

パッケージング用細胞株

Adeno-X™ 293 Cell Line

1 ml

632271¥65,900

簡易力価測定Adeno-X™ GoStix™

20回

632270¥43,300

アデノウイルスベクター精製

Adeno-X™ Maxi Purification Kit

2回

631532¥88,600

免疫測定法による力価測定

Adeno-X™ Rapid Titer Kit

120回

632250¥103,000qRT-PCR法による力価測定

Adeno-X™ qPCR Titration Kit

200回

632252¥81,400

遺伝子挿入実験ハンドブック

製

品

名

容

お役立ち情報■ ウイルスベクターを使用する場合の実験環境整備についてウイルスベクターを取り扱う際には、ウイルスの環境への拡散防止のため、使用する実験施設がそのウイルスの取扱いに適した閉鎖系になっているかに注意する必要があります。
文部科学省の定める省令（「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令」平成16年文部科学省・環境省令第1号）に記載されているP2レベルの施設とは、大腸菌の組換え体などを取扱い可能な
P1レベルの実験施設に加え、実験室内に安全キャビネットがあること、実験室のある建物内にオートクレーブがあること、実験室入り口に「P2」レベルの施設であることを明記した表示（入室制限）があることが必要です。

P2レベル実験施設（右図）
P1実験施設に加え必要になるもの● 安全キャビネット
● オートクレーブ● 入口に「P2レベル実験中」と表示

安全キャビネット
HEPA

入室制限
P2レベル
実験中

実験台

オートクレーブ

実験操作は安全キャビネットの中で行います。
<エアロゾルを発生する可能性のある実験>
内向きの気流の流れを維持し、キャビネット外への微生物等の漏洩を防止します。
排気は、HEPAフィルターを通して外部に排出することにより、外部への病原体等の漏洩を防止します。

手洗い器など＜実験操作の注意点＞①エアロゾル発生（ウイルス粒子が微小な水滴に含まれた状態で空中を浮遊する状態）を防ぐ
・容器は蓋をし、必要な時だけ蓋をあける。
・ピペット中の試料液を滴下する際は、ピペットの先を容器に接するようにする。
・試験管やチューブを撹拌するときは注意する。
・使用したチップを放置しない⇒残存する液からエアロゾルが発生する。
②廃液処理を適切に行う
ウイルスベクター作製時、培地には活性のあるウイルスが含まれています。廃棄時にオートクレー
ブ処理で不活化してください。
注：ウイルスベクター製品を改変した組換えウイルスを利用される場合、改変内容によっては、実験分類がクラス3以上に分類される場合があります。こうした遺伝子組換え実験を行う場合は、事前に文部科学大臣による拡散防止措置の確認（承認）が必要となりますのでご注意ください。

知ってて良かった！この逸品
標的細胞

RetroNectin®（製品コード T100A/B）

VLA-5（α5β1）

VLA-4（α4β1）

レセプター

レトロウイルス／レンチウイルスベクターを用いて遺伝子導入している
血球系細胞や間葉系幹細胞など導入が難しい細胞が標的である
こんな場面で遺伝子導入効率をあげたい方にお勧めです！
細胞培養プレートにコーティングして使用します。

【幹細胞への遺伝子導入例】
ヒト造血幹細胞（hCD34 + ）、ヒ
ト間葉系幹細胞（hMSC）、および
ヒト脂肪由来細胞（hADSC）へ のレトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入効率を、RetroNectin
法 、Polybrene法 、Protamine
法 で測定した。
RetroNectin法では他の方法に比べて高効率で遺伝子導入がで
きた。

CS-1

（％）
80

遺伝子導入効率【使用方法】

細胞接着ドメイン（C-Domain：RGDS） ヘパリン結合ドメイン（H-Domain）

60

40

20

0

hCD34+

hMSC

hADSC

RetroNectinはインテグリンVLA-4、VLA-5を発現している哺乳類細胞に対してレトロウイルスベク
ターおよびレンチウイルスベクターを介した遺伝
子導入を行う際に有用です。
VLA-4を発現している細胞はCS-1部位と、またVLA-5を発現している細胞は細胞接着ドメインと接着し、一方、ウイルスベクターはヘパリン結合
ドメインに結合することによってRetroNectin上に共配置されます。これにより、局所的に両者の濃度が高められ、遺伝子導入が促進されると考えられています。

★ RetroNectinの製品情報については次ページをご覧ください。
遺伝子挿入実験ハンドブック- 10 -

【遺伝子導入】 その他の関連製品
製

品

名

概

要

容

量

製品コード

価格
（税別）

備考

トランスフェクション試薬
Xfect™ mESC Transfection Reagent

マウスES細胞に最適化

50回×2

631320¥36,100

CalPhos™ Mammalian Transfection Kit

哺乳類細胞用（リン酸カルシウム法）

1 Set

631312¥48,400

TransIT-PRO® Transfection Kit

浮遊系HEK細胞またはCHO細胞に最適化。
タンパク質高発現用

1 ml

MIR5700¥61,000

Retro-X™ Universal Packaging System

標的細胞に適したエンベロープタンパク質を選択可能なレトロウイルス作製システム

1 Set

631530¥165,800

Retro-X™ Tet-One™ Inducible
Expression System

レトロウイルスベクター型Tetシステム

1 Kit

634304¥288,400

ラ 営

Knockout™ Tet RNAi System H

レトロウイルスベクター型Tet誘導性shRNA
発現システム

1 Kit

630925¥183,300

ラ 営

Retro-X™ Concentrator

レトロウイルスベクターの濃縮

100 ml

631455¥34,000

Retro-X™ qRT-PCR Titration Kit

レトロウイルスベクターのRNAタイターを測定

200回

631453¥108,200

pMEI-5 DNA

レトロウイルスベクタープラスミド
（高発現）

20 µg

3656

¥57,000

Retrovirus Constructive System Eco

ウイルス調製から遺伝子導入までトータルにサポートするシステム

1 Set

6164

¥136,000

0.5 mg（0.5 ml）

T100A¥28,000

レトロウイルスベクター関連

レトロネクチン
RetroNectin®
(Recombinant Human Fibronectin
Fragment)

溶液品（ろ過滅菌処理済）

2.5 mg（2.5 ml）

T100B¥113,000

RetroNectin® Dish

あらかじめRetroNectinがコートされた培養用
35 mmディッシュ

10 dishes

T110A¥57,000

レンチウイルスベクター関連
Lenti-X™ HTX Ecotropic Packaging
System

エコトロピック（gp70）のレンチウイルスベクター
作製システム

20回

631251¥150,400

Lenti-X™ Maxi Purification Kit

培養上清からレンチウイルスベクターを精製

2回

631233¥44,300

Ecotropic Receptor Booster

細胞表面に一過的にmCAT-1受容体を導入しエコトロピックウイルスの形質導入を可能に

20回

631471¥42,200

アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター関連
AAVpro® CRISPR/Cas9 Helper Free
AAVベクター型のCRISPR/Cas9システム
System (AAV2)
AAVpro® Tet-One™ Inducible
AAVベクター型のTetシステム
Expression System (AAV2)

1 Kit

632608¥150,000

1 Kit

634310¥160,000

ラ 営

pAAV-ZsGreen1 Vector

蛍光タンパク質発現AAVベクター作製に

20 μg

6231

¥105,000ラ 営

アデノウイルスベクター関連
Adeno-X™ Adenoviral System 3(Universal)

任意プロモーターおよびpolyAシグナルの使用に適したアデノウイルスベクターシステム

1 Set

632266¥177,200

In-Fusion® HD Cloning Kit

簡単・便利なディレクショナルクローニング

10回

639648¥23,000

DNA Ligation Kit ＜Mighty Mix＞

高いライゲーション効率を実現する1液タイプのライゲーションキット

1 Kit

6023

¥27,000

PrimeSTAR® Max DNA Polymerase

非常に高い正確性と良好な反応性を両立する
PCR酵素（ヒトゲノムを鋳型に〜6 kbを増幅）

100回

R045A

¥31,500＊

クローニング用試薬とPCR酵素

ラ ご購入に際してライセンス確認書が必要となります。

営 営利施設の場合、ご購入前にライセンス（有償）を取得する必要があります。

＊ ご購入前にMTA（Material Transfer Agreement）をご確認ください。

詳細は弊社ウェブカタログでご確認ください。

・本パンフレットで紹介した製品はすべて研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
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・ライセンス情報については弊社ウェブサイトにてご確認ください。
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