食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明

研究課題名

食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明

フリガナ

アダチ

代表者名

安達タカヒロ貴弘

所属機関（機関名）東京医科歯科大学難治疾患研究所（役職名）准教授
氏
共同研究者

名（フリガナ）

戸村道夫（トムラミチオ）
中村公則（ナカムラキミノリ）

所属機関・役職名

役割分担

大阪大谷大学・教授

免疫細胞のプロファイルイン
グ

北海道大学

腸管バリア機能の解析

准教授

食物アレルギー及び自己免疫疾患における IgA の影響
小竹 久仁彦, 安達 貴弘
本 助 成金 によ る 発 日本食品免疫学会設立 15 周年記念学術大会 2019 年 11 月 19 日
表論文，学会発表 IgA deficiency causes spontaneous enteritis
安達貴弘、渡部太郎、永石宇司、渡邉 守、烏山 一、吉川宗一郎
第 48 回日本免疫学会学術集会、浜松 2019 年 12 月 13 日

研究結果要約
食物アレルギーにおける抗原特異的 IgE 産生機序を明らかにすることを目的とした。IgE を過剰に産生する IgE ノックインマウスおよび腸管バリア機能に重要な IgA を欠損したマウスを用いて、食物アレルギーモデルを検討し、IgA 欠損マウスにおいて食物アレルギーが C57BL/6 のバックグランドでも起こることを明らかにした。一方、IgE を高産生する IgE ノックインマウスでは一時的なアナフィラキシーは見られるが、IgA へのクラススイッチが起こり、トレランスが誘導された。これらの結果は IgAが食物アレルギーの回避に重要なことを強く示唆している。また、その腸内細菌を解析したところ、正常マウスと比べ、変化していることを明らかにした。IgA 欠損マウスでは、野生型マウスに比べ、抗原感作によってより多くの抗原特異的 IgE 産生細胞が誘導されることを見出した。カルシウムバイオセンサーを発現するマウスより 3 次元培養系エンテロイドを作製し、生体外にて腸管上皮細胞の細胞内カルシウム動態を可視化できるで再構築系を樹立した。さらに、カルシウムバイオセンサーマウスに食物アレルギーを誘導し、その時のパイエル板の B 細胞の活性化の様子を生体イメージングにより経時的に可視化し、経時的変化を明らかにした。以上のように食物アレルギーにおける抗原特異的 IgE 産生を詳細に調べる基盤が確立された。

22

食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明

研究目的

一細胞レベルの解析で明らかにし、食物抗原特異食物アレルギーは食物抗原に一旦感作されて的に免疫記憶をリセットする根本的な治療法開

免疫記憶が成立してしまうと抗原を摂取するた発を目的とする。

びにアレルギー症状が惹起されてしまう。しかし、その治療方法としては、私がコメアレルギーを研研究計画及び研究手法究していた 25 年前から今日に至るまで、アレル食物アレルギーモデルの構築

ギーの原因となる食物を避けるといった対処療

これまでは Blb/c のバックグランドのマウスが法が、いまだ主流である。少量の抗原を投与するアレルギーの研究にはよく使われてきたが、減感作療法も行われているが、根本的な解決には

C57BL/6 のバックグランドのマウスでは遺伝子至っていない。食物アレルギーによる死亡事故も改変マウスが多数存在し、詳細な機能解析が可能

毎年のように、数件起きている。先日、厚生労働となるので、まずは、C57BL/6 を使って、食物ア省がアレルギー疾患に対する戦略を策定し、”革レルギーのモデル系の構築を試みた。食物アレル新的治療の実現”や”防ぎ得た死をゼロに”を目ギーの検出系として、IgE を過剰に産生する IgE

標に掲げ、本格的な対策が求められている。通常

ノックインマウス 4)をドイツ・マルブルグ大学 Yu

は、食物抗原により制御性 T 細胞が誘導され 1)、博士より供与していただき、腸管バリア機能に重経口免疫寛容がされる。しかし、腸管のバリア機要な IgA を欠損したマウスは CRISPR/Cas9 に能が破綻すると、食物が体内に侵入し、免疫反応よるゲノム編集法で IgA 重鎖の定状領域を欠失が惹起され、アレルギーを発症すると考えられてしたマウスを独自に樹立した(論文投稿中)。これいる。我々は、免疫細胞の動態のみならず、活性ら 2 系統の遺伝子組換えマウスを用いて、食物ア化、さらには細胞標識までの可視化できる 6D 生レルギー誘導の実験を行った。IgE ノックインマ

体イメージングを確立し 2,3)、さらに免疫記憶のウスにおいては、さらに鶏オボアルブミン(OVA)成立する機序の一端を解明している（論文投稿中、に特異的な T 細胞受容体を持つ OT-2 マウスと交論文準備中）。これを基盤として、食物アレルギ配し、OVA による免疫応答を高めたマウスを用ーにおける免疫記憶の機序を詳細に解明できれいた。OVA（50 ㎍）を抗原として水酸化アルミ

ば、そこを標的として食物抗原特異的に免疫記憶ニウム（alum）アジュバンドでゲル化したものををリセットする根本的な治療法の開発ができる0.3ml のリン酸バッファーに懸濁して、マウス腹のではないかと考えた。”免疫記憶”という言葉

腔に免疫し、2 週間後にさらに追加免疫を行った。

は免疫の一つの特徴としてよく知られているが、さらに１週間後に、ゾンデでリン酸化バッファー

実はその実体についてはよくわかっていないこに溶解した OVA（30 ㎍）投与、あるいは５％OVAとも多い。そこで本研究では、食物アレルギーにを含む餌を自由摂取させ、体温の低下、糞便の様おいて免疫記憶が成立および維持される機序を子などを経時的に観察した。

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食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明

IgE 産生細胞の検出系の確立

パク質の円順列変異体）とその間に存在するカル

食物アレルギー誘導時に、感作された抗原特異モジュリンのカルシム結合部位からなり、カルシ的な IgE 産生細胞を特定する目的で、IgA 欠損マウムイオンと結合することにより構造変化し、ウスを用いて、OVA/alum で抗原感作を行い、抗CFP のみを励起した場合、カルシウムイオンに原特異的 IgE 産生細胞がどの程度誘導されてい依存して 2 つの蛍光タンパク質が隣接することるか、フローサイトメトリーにより IgE 陽性細胞により、FRET（蛍光共鳴エネルギー移動）によを 、 さ ら に Enzyme-Linked ImmunoSpotりが起こり、シアンから黄色に、色の変化が起こ（ELISPOT）アッセイにより、抗原特異的 IgEる(図１を参照)。これを利用して細胞内カルシウ産生プラズマ細胞を調べた。そこで、沢山の抗原ムイオン濃度変化をモニターできる。Ｂ細胞特異特異的 IgE 産生細胞を誘導できる IgA 欠損マウ

的にカルシウムバイオセンサーを発現させたスの優位性を生かして、IgE 産生細胞の生体内動CD19-Cre/YC3.60 マウスを用いて、食物アレル態の解明と生体内動態情報に基づく IgE 産生細ギーが起こっているときに、生体内でどのように胞の性状の詳細解析によりアレルギー発症の本免疫細胞の活性化が起きているか、共焦点レーザ体に迫るために、IgA 欠損マウスと生体内の臓器ー顕微鏡にて、可視化解析を行った。アレルギー連関、免疫細胞移動を可視化して細胞動態を追跡は上記で確立した方法を用いて、OVA/alum で免できる光変換蛍光タンパク質 KikGR マウス 5)を疫後、ゾンデで OVA を投与し、458nm のレーザ掛け合わせて IgA 欠損 KikGR マウスを取得する

ーで励起し、YFP と CFP の蛍光の画像を取得し、ことにした。また、取得した細胞の詳細解析のた

YFP/CFP の ratio でカルシウムシグナリングをめに、単細胞遺伝子発現解析系の導入確立と、免モニターした。また、取得した画像の解析にはニ疫細胞のプロファイルリングのためにマスサイ

コンの NisElements を用いた。

トメトリーCyTOF 評価系の確立を行った。

食物アレルギーの可視化解析
これまでに独自に樹立した細胞系譜特異的カ
ルシウムバイオセンサーYellow Cameleon 3.60（YC3.60）発現マウスを用いた５D(x、y、z、時間、カルシウムシグナル)生体イメージングシス
テムを構築しており、腸管のリンパ組織であるパイエル板や腸管上皮での生体イメージングを確立してきた 6)。YC3.60 は一分子内に CFP（シアン蛍光タンパク質）と Venus（YFP:黄色蛍光タン

24食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明

食物アレルギー発症における腸管ネットワーク解析するために、野生型マウスおよび IgA 欠損マのニッチとしての解析

ウスより糞便を採取し、便サンプルから細菌由来のゲノム DNA を抽出し、16SrRNA シークエン申請に先立って、腸管上皮、免疫細胞、の生体イメージング系はこれまでに構築されていたがスにて腸内細菌叢組成を解析した。

3,6)、腸管神経系については不明な点も多かった。

そこで、まずは腸管の神経細胞について神経細胞抗原性特異的な記憶細胞の欠失方法の開発を特異的にカルシウムバイオセンサーを発現する予定していたが、解析手法の確立に本年度はとどNestin-Cre/YC3.60 マウスを作出し、腸管神経叢まり、免疫記憶をリセットする方法の開発には着であるアウエルバッハ神経叢、マイスナー神経叢、手できなかった。

さらには腸管上皮近傍の神経終末の可視化を行い、さらにはそれらの生体イメージング系の構築結果と考察を行ってきた 7)。腸管の知覚神経の細胞体は、脊食物アレルギーモデルの構築

髄の後根神経節に存在し、また腸管上皮の 1 つでOVA 特異的な T 細胞抗原受容体を持つ OT-2ある腸管内分泌細胞と直接シナプス様結合すると交配した IgE ノックインマウスでは予想に反迷走神経の知覚神経細胞体は下神経節に存在しし、OVA/alum で免疫したにもかかわらず、全くているので、これらの神経細胞を調製して、 inIgE 抗体価の上昇が見られなかった。このマウス

vitro の細胞培養系の構築を行った 8)。の系では免疫応答が Th1 優位に傾き、Th2 応答がほとんど起こらなかったためであると考えられる。また、OVA 特異的な T 細胞抗原受容体の腸管オルガノイドを用いた再構築系の確立
食物アレルギーによる神経―免疫―上皮の腸トランスジェニックマウスである OT-2 のバック管ネットワークの異常を生体外で可視化解析すグランドを持たない IgE ノックインマウスにおるために、腸管オルガノイドを用いた再構築系のいも同様の実験を行い、免疫後、ゾンデで OVA樹立を目指した。まず、カルシウムバイオセンサを 1 日おきに継続的に投与したが、体温の低下がーを発現するマウスから小腸を摘出し、オルガノ見られたのは初回のみで、アナフィラキシー反応

イドを作成後、神経伝達物質であるアセチルコリが見られたが、以後はそのような反応は見られなンのアナログ体であるカルバミルコリン(CCh)くなった。継続的に採取した血清の抗体価を測定刺激により、腸管上皮細胞内のカルシウム濃度がしたところ、OVA 免疫により OVA 特異的 IgE 抗イメージングにより解析できるかを検討した。

体価の上昇は検出されたが、ゾンデによる経口投
与後、OVA 特異的 IgE 抗体価は低下し、IgA 抗IgA 欠損マウスにおける腸内細菌叢の解析体の産生の上昇が見られた。このことは、経口投IgA 欠損マウスが腸内細菌叢に与える影響を与により OVA 特異的な抗体が IgE クラスから25

食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明

IgA クラスへクラススイッチすることにより、ト野生型マウスよりも多数検出出来る可能性があレランスが誘導されたことを強く示唆している。

る。実際、IgA 欠損マウスでは野生型のマウスと一方、IgA 欠損マウスでは野生型のマウスと比べ、比べ、OVA/alum で免疫後には高い IgE 産生が認OVA/alum で免疫後、IgE ノックインマウスほどめられた(図)。また、骨髄に移行した IgA 産生細ではないが、IgE クラスの特異抗体が野生型のマ胞が長期の IgA 産生を担うことはよく知られてウスより高く検出された(図 2)。さらに OVA の経いるが、我々は腸管組織で誘導された IgA 産生細口投与により、体温の低下が見られ、野生型や胞が骨髄に移行することを光変換蛍光タンパク

IgE ノックインマウスと比べ、食物アレルギーが質 KikGR マウスの腸管組織の細胞を赤色にマー効率よく起きていることを示している。IgA 欠損キングして追跡することで直接証明し報告してマウスは C57BL/6 バックグランドマウスでも、いる 9)。そこで我々は、IgE 産生細胞も IgA 産生

食物アレルギーのモデル系として高感度に食物細胞と同様骨髄に移行することが、血中 IgE の維アレルギーが検出できることが判明した。

持に貢献している可能性を考えた。そしてその証明を行うために、抗原特異的 IgE 産生細胞が効率的に誘導できる事が期待できる IgA 欠損マウスの優位性を生かし、さらに、IgE 産生細胞の生体内動態の解明と生体内動態情報に基づいて取得した IgE 産生細胞の性状の詳細解析によりアレルギー発症の本体に迫るために、IgA 欠損マウスと KikGR マウスとの掛け合わせを行い、IgA 欠損のバックグランドで KikGR を発現するマウスを取得した。そして、IgA 欠損のバックグランドで KikGR を発現するマウスでの解析を進めるた

IgE 産生細胞の検出系の確立

めに、IgA 欠損マウスに OVA/Alum を 2 回感作

IgE 抗体産生細胞は短命であることや、検出出した後に解析し、腸管、腸間膜リンパ節、脾臓、来る抗原特異的 IgE 産生細胞数が少ないことが、骨髄で IgE 産生形質細胞前駆細胞が誘導される

食物アレルギーを起こす中心的な役割を果たす
IgE 産生細胞の性状解明を困難にしている。上記

ことをフローサイトメトリーにより確認した。まの IgE ノックインマウスによる検討から IgE 産た、ELISPOT アッセイによる検出により、脾臓
では 107 細胞当たり全 IgE 産生細胞は 400 個、生細胞は持続的な抗原刺激により IgA 産生細胞

OVA 特異的 IgE 産生細胞は 30 個、全 IgG 産生に容易にクラススイッチしてしまう可能性が考細胞は 2917 個、OVA 特異的 IgG 産生細胞は 248えられる。翻ると IgA 欠損マウスでは、IgE 産生個検出できた。以上の様に、IgA 欠損バックグラ細胞にクラススイッチできずに IgE 産生細胞が26

食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明

ウンドでの IgE 産生細胞の生体内細胞動態解析のためのマウスの取得し検出系を確立した。
また、取得した細胞の詳細解析のために、単細胞遺伝子発現解析系の導入確立と、マスサイトメ
トリーCyTOF 評価系の確立を行った。添付の図のようにマウスの免疫細胞をプロファイリングすることを可能にした(図 3)。

食物アレルギー発症における腸管ネットワークのニッチとしての解析
腸管神経叢であるアウエルバッハ神経叢、マイスナー神経叢、腸管上皮近傍の神経終末で、神経特異的にカルシウムバイオセンサーを発現するマウスを用いた生体イメージングを行い、それぞれの部位で、神経細胞の活性化を可視化することに成功した(図 5)。また腸管上皮に多くの神経終末が存在していることが明らかとなり、これらが腸管内容物をセンシングしていることが推測された。

食物アレルギーの可視化解析
ま た B 細 胞 の み を 可 視 化 す る CD19Cre/YC3.60 マウスに OVA を免疫後、OVA を経口投与して食物アレルギーを誘導後、経時的に生体イメージングにより小腸パイエル板の B 細胞を観察したところ、直後ではあまり変化は見られなかったが、投与 2 日後に、細胞内カルシウム濃度が亢進している B 細胞が著しく増加していることが明らかになった(図 4)。これは B 細胞が活性化され、IgA へのクラススイッチが効率よく起きているためであると推測された。

27

食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明

エンテロイド培養液中に 10μM を加えたとこ出できるようになった。さらに生体イメージング

ろ、数秒で細胞内カルシウム濃度の上昇を示した。

により、食物アレルギー誘導時の B 細胞の活性

また、カルシウム濃度の上昇に伴い、抗菌ペプチ化の経時的経過も明らかとなった。これらの細胞

ドαディフェンシンを含む顆粒を豊富に持つを指標として、食物アレルギーの詳細な機序解明、Paneth 細胞の顆粒が分泌することを確認した。

および、それらをターゲットにした抑制方法の開この結果は、今後、エンテロイドと腸神経細胞お発が必要である。

よびリンパ球などの免疫細胞との共培養を可能
学会や論文発表等の予定とすることで、神経―免疫―上皮の腸管ネットワ

Taro Watabe, Kunihiko Kotake, Toshihikoークへの食物の関与が分子レベルで解析できる

Kumazawa, Tomomi Aida, Kohichi Tanaka,

可能性を示した。

Ryuichi Ono, Fumitoshi Ishino, Takako Usami,Takamasa Miura, Hiroko Kawasaki, Naoya

IgA 欠損マウスにおける腸内細菌叢の解析

Tsugawa, Daiki Yamada, Kazuhiro Hirayama,

16SrRNA シークエンス腸内細菌叢組成解析のSoichiro

結果、β多様性において IgA 欠損マウス群は、野Yoshikawa,

HajimeKarasuyama,

Mamoru Watanabe, Richard S. Blumberg,

生型と比較して異なる細菌叢組成を示し、またαTakashi Nagaishi, and Takahiro Adachi.

多 様 性 の 減 少 傾 向 と Parabacteroides 、Immunoglobulin

Ruminococcus 存在率の増加、Helicobacter 存在

A-specificdeficiency

induces spontaneous inflammation specifically率の減少を示した。このことから IgA 欠損マウス

in the ileum.論文投稿中は腸内細菌叢の破綻（dysbiosis）を誘導することが明らかとなった。これらの結果は、IgA が腸内今後の研究活動について細菌叢の制御に重要なことを示しており、食物ア食物アレルギーの発症機序が解明できれば、そレルギーにおいても影響を及ぼすことが推測さこを標的として根本的な治療法の開発ができるれた。のではないかと考え、本研究では、一細胞レベルの時空間的な解析で、食物アレルギーにおいて免今後の課題疫記憶が成立および維持される機序を明らかに

IgA 欠損マウスを用いることにより食物アレすること、それをもとにした抗原特異的な免疫記ルギーが効率的に誘導できる系ができ、また IgE憶およびクラススイッチの制御法の確立を目的陽性細胞も、フローサイトメーターで検出できるとした研究を行う。2019 年度の研究で、感作さようになり、抗原特異的な IgE 陽性細胞が特定でれた抗原特異的な IgE 産生細胞が検出できるよきるようになった。さらには ELISPOT アッセイうになったので、CyTOF による解析、あるいはにより、抗原特異的な IgE 産生細胞も高頻度で検その細胞を単離し、詳細に解析することで、その28

食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明細胞の特徴を突き止める。IgA 欠損のバックグラ

cytometry and confocal microscopy.

ンドで KikGR を発現するマウスに OVA/Alum を

Biochem Biophys Res Commun. 2008

2 回感作した後に、腸管組織の細胞を赤色にマー

Mar 7;367(2):377-82.
3) Yoshikawa S, Takako Usami T, Kikuta

キングした後、腸間膜リンパ節、脾臓、骨髄で赤J, Ishii M, Sasano T, Sugiyama K,

色にマーキングされた IgE 産生形質細胞前駆細Furukawa T, Nakasho E, Takayanagi H,胞、あるいは IgE 産生形質細胞を検出することでIgE 産生細胞の生体内動態を明らかにする。また、骨髄の細胞を赤色にマーキングすることで、骨髄Tedder TF, Karasuyama H, Miyawaki A,
Adachi T. Intravital imaging of Ca2+
signals in lymphocytes of Ca2+

で長期間生存する細胞を同定する事が可能であbiosensor transgenic mice: indication ofる。この検討により今まで不明であった IgE 産生

autoimmune diseases before the細胞の生体内動態が明らかになる。さらに、赤色

pathological onset. Sci Rep. 2016; 6:にマーキングされた細胞が検出された組織(骨髄18738.と脾臓を想定)から分取した赤色の細胞を4) Lubben W, Turqueti-Neves A,

ELISPOT アッセイし、腸管から移行した抗原特Okhrimenko A, Stoberl C, Schmidt V, et

異的 IgE 産生細胞を同定する。また食物アレルギal. IgE knock-in mice suggest a role forーが誘導、あるいはトレランスが誘導されて回避

high levels of IgE in basophil-mediatedされている状況で、生体イメージングにより生理

active systemic anaphylaxis. Eur JImmunol 2013 43: 1231–1242.

条件下での細胞の活性化を可視化し、クラススイ

5) Futamura K, Sekino M, Hata A,ッチの時空間的解析により、その機序を明らかに

Ikebuchi R, Nakanishi Y, Egawa G,する。またこれらの知見を基盤に、トレランスを誘導する食品成分、あるいは医薬品の開発を行い、食物アレルギーの予防法、治療法の開発に努める。

Kabashima K, Watanabe T, Furuki M,
Tomura M. Novel full‐spectral flow
cytometry with multiple spectrally‐adjacent fluorescent proteins and

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食物アレルギーにおける免疫記憶の機序解明

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DSW, Galicia G, Ramaglia V, Ward LA,7) Aihara Y, Fukuda Y, Osakabe N, Aida T,

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Tomura M, Baumann R, Zamvil SS,8) Nishimura Y, Fukuda Y, Okonogi T,

Bar-Or A, Horwitz MS, Winer DA,

Yoshikawa S, Karasuyama H, Osakabe

Mortha A, Mackay F, Prat A, Osborne

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9) Rojas OL, Pröbstel AK, Porfilio EA,30