Oct. 2014

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

67―5285（ 7 ）BD マックス TM 全自動核酸増幅検査システムを用いたバンコマイシン耐性遺伝子検出坂梨大輔 1）・山岸由佳 1,2）・宮﨑成美 1）・鈴木隆佳 1）・大野智子 1）・
山田敦子 1）・小板 功 1）・宮島節雄 1）・末松寛之 1）・三鴨廣繁 1,2）
1）

愛知医科大学病院感染制御部

2）

愛知医科大学病院感染症科（2014 年 7 月 25 日受付）

BD マックス™ 全自動核酸増幅検査システムを用いたバンコマイシン耐性遺伝子（van 遺伝子）の全自動検出について検討した。同時再現性の検討においては，各 van遺伝子の real-time PCR における Ct 値の変動係数：CV（%）は vanA 2.09%, vanB 1.72%,vanC1 1.41%, vanC2/C3 1.52% と良好な結果が得られた。腸球菌 43 株（vanA 保有菌4 株，vanB 保有菌 14 株，vanB および vanC1 同時保有菌 1 株，vanC1 保有菌 6 株，vanC2/C3 保有菌 4 株，全 van 遺伝子陰性菌 14 株）を用いた従来の conventional PCR 法との比較においては，一致率 100% の結果を得た。本システムは従来法でマニュアル操作が必要であった DNA の抽出，template DNA の分注などの PCR 前検体処理，ゲル電気泳動やエチジウムブロマイド染色などの Amplicon 検出操作がすべて自動化され，業務負担およびコンタミネーションのリスクが大幅に軽減されたうえ測定時間も約半分に短縮されており，検査の迅速化，省力化に大きく貢献できるものと考えられた。

バンコマイシン耐性腸球菌｛vancomycin（VCM）からの検査依頼も受託してきた。しかしながら，

resistant enterococci: VRE｝は院内感染対策上重要

本方法は検査に 4 時間以上要するうえ，各検査行な菌である。1999 年に感染症法上の全数把握疾患

程で多くのマニュアル操作を必要とするため業務1）となって以降，届出数は増加傾向にあり ，医療負担も決して少なくなかった。このような状況のの地域連携が盛んになってきている昨今では施設中，2013 年 7 月にベクトン・ディッキンソン社よ

内のみならず医療・介護施設間の伝播も問題とり BD マックス ™ 全自動核酸増幅検査システム

なっている2,3）。このような背景から，当院では （BD マックス）が上市された。本機器は，核酸の2008 年 4 月から従来の細菌同定・薬剤感受性試験

抽出，増幅，検出の工程をすべて全自動で行う検に加え，VCM の最小発育阻止濃度（MIC; minimum査システムで，専用試薬による迅速検査のほか，inhibitory concentration）値が 4 ȝg/mL 以上を示し

オープン試薬およびオリジナルデザインのプライた腸球菌について conventional PCR を用いた van

マー・プローブを用い独自の測定系を構築できる遺伝子（vanA, vanB, vanC1, vanC2/C3）の検索をことを特徴とする。

ルーチン業務として開始するとともに，近隣施設

今回，われわれは BD マックスを用いた van 遺286（ 8 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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伝子の全自動 real-time PCR について検討し，BD

2. BD マックスによる van 遺伝子の検出

マックス ™ オープン試薬による本邦初の検査系

1）プライマーおよびプローブの調整（Table 2）を確立した。同検査系の基礎的検討を行うとともvanA お よ び vanB の 増 幅・検 出 に は FANG ら 5）に，本システムがもたらした検査の迅速化およびのプライマー・プローブを用い，vanC1 および業務負担の軽減状況について報告する。

vanC2/C3 に つ い て は Primer3 （http://primer3.
sourceforge.net/）を用いて設計したのち，Basic対象と方法

local alignment search tool （http://blast.ncbi.nlm.
nih.gov/Blast.cgi）にて特異性を確認した自製プラ

1. 対象菌株

イマー・プローブを用いた。プライマー・プロー4）

によりブ調整液は 1 サンプルあたり 12.5 ȝL の容量で作VCM 耐性遺伝子（van 遺伝子）の確認がなされた腸成した。各プライマーおよびプローブの終濃度をATCC 株，GTC 株および以前の検討

球菌のうち，vanA 保有 Enterococcus faecium 4 株， 0.5 ȝM とし，BD MAX マスターミックス（PC 入vanB 保有 Enterococcus faecalis 2 株，vanB 保有 E.

り）（日本ベクトン・ディッキンソン）付属 Primer

faecium 11 株， vanB 保 有 Enterococcus sp. 1 株， and Probe Diluent を 2 ȝL 添加したのち PCR グレー
vanB および vanC1 保有 Enterococcus gallinarum 1

ドの滅菌蒸留水にて 12.5 ȝL にメスアップした。

株，vanC1 保有 E. gallinarum 6 株，vanC2/C3 保有2）試料菌液の調整(QWHURFRFFXVFDVVHOLÀDYXV 4 株，全 van 遺伝子陰性VRE 選択培地またはミュラー・ヒントン寒天培

E. faecalis 14 株，計 43 株を対象とした（Table 1）。 地に発育した腸球菌 1 コロニーを BD MAX DNA
また，菌株 GTC 1754T, v309 および v633 をそれぞ抽出キット -2（日本ベクトン・ディッキンソン）

れ 0.5 マクファーランドに調整し，等量混和した付属 Sample Buffer Tube（SBT）に直接懸濁し試菌液を全 van 遺伝子陽性菌液として検討に用いた。

料とした。

Table 1. Strains used for this study

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67―5287（ 9 ）Table 2. Real-time PCR primers and probes used for analysis3）BD マックスによる核酸抽出および real-timePCR2）で調整した SBT および BD MAX DNA 抽出
キット-2 付属 Unitized Reagent Strips をサンプルラッ

4. 従来の conventional PCR 法との比較検討
従来の conventional PCR 法 4）と BD マックスを比較し，結果一致率，測定時間，操作性等の検討を行った。

クにセットした後，BD MAX DNA 抽出キット-2

結果付 属 DNA extraction reagent お よ び PCR reagent

tubes, BD MAX マスターミックス（PC 入り），プ
ライマー・プローブ調整液を Unitized Reagent Strips

1. 全 van 遺伝子陽性菌液を用いた同時再現性ののそれぞれのストリップにセットした。BD マッ検討

クス本体に BD マックスカートリッジ（日本ベク

各 van 遺伝子とも良好な増幅曲線が観察された

トン・ディッキンソン）およびサンプルラックを （Fig. 1）。また，各 van 遺伝子の Ct 値の CV（%）はセットし，核酸抽出条件「ExKTM DNA-2 モード」， vanA 2.09%, vanB 1.72%, vanC1 1.41%, vanC2/C3

real-time PCR 条件「95°C10 分の後，95°C10 秒（変1.52% と良好な結果が得られた（Table 3）。

性），60°C17.9 秒（アニーリング，伸長，検出）を40 サイクル」の設定で全自動核酸増幅を行った。

2. 従来の conventional PCR 法との比較検討
一 致 率 の 比 較 で は，対 象 全 株 と も 従 来 の

3. 全 van 遺伝子陽性菌液を用いた同時再現性のconventional PCR 法と一致した結果が得られた。

検討

測定時間については，従来法がおよそ 240 分であっ全 van 遺伝子陽性菌液を 10 重測定し vanA, vanB,たのに対し，BD マックスはおよそ 130 分と大幅

vanC1, vanC2/C3 各遺伝子の real-time PCR におけな短縮を認めた（Fig. 2）。また，従来法でマニュる Ct 値の変動係数：CV（%）を求めた。

アル操作が必要であった DNA の抽出，template288（ 10 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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Oct. 2014)LJ $PSOL¿FDWLRQFXUYHVRIUHDOWLPH3&5VLPXOWDQHRXVUHSHDWDELOLW\WHVW

DNA の分注などの PCR 前検体処理，ゲル電気泳動て以降，その報告数は増加傾向にある。VRE 感染やエチジウムブロマイド染色などの Amplicon 検症の感染症法上の扱いに関しては，2013 年 4 月の出操作がすべて自動化されたため，業務負担およ

一部改定を受け届出基準が「分離・同定による腸びコンタミネーションのリスクが大幅に軽減した。

球菌の検出かつ分離菌に対する VCM の MIC 値が16 ȝg/mL 以上」の感染症例に変更となり遺伝子型考察の検索は不要となった。しかし，以前の我々の研究 4）では vanB 保有腸球菌のうち 6.6% が 16 ȝg/mL

VRE 感染症は 1999 年に施行された感染症新法に満たない VCM の MIC 値であったことなどかにより 5 類感染症として全例報告が義務付けられら，依然 van 遺伝子の検索は感染対策上重要な検Oct. 2014

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67―5289（ 11 ）Fig. 1. Continued

Table 3. Ct value analyses of real-time PCR simultaneous repeatability test

査であると考えられる。van 遺伝子の分子生物学

核酸の抽出，増幅，検出の工程をすべて全自動で的 検 索 法 と し て は DUTKA-MALEN ら の Multiplex

行う。機器の特性上 Nested PCR, アンプリコンの6）PCR が汎用されているが，本法を当院の日常検シーケンシング，電気泳動によるアンプリコンサ査の中で実施するにあたっては検査時間や操作性イズ確認など PCR 増幅産物の 2 次的利用は不可の問題が少なからず存在し，業務負担の一因とな能であるが，既存の様々な real-time PCR 技術をる実情があった。

導入可能で高い拡張性をもつ。BD マックスを用

そこでわれわれは BD マックスを用いた全自動

いたオリジナルの Multiplex real-time PCR についMultiplex real-time PCR による van 遺伝子の検出ては SYBR Green によるインターカレーションとを検討し，検査法を確立させた。BD マックスはMelt curve analysis による検出法 7），蛍光プロー

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Fig. 2. Comparison of BD MAXTM system and conventional PCR method with assay time

ブ・ハイブリダイゼーション法による検出法 8）がオープン試薬による全自動 real-time PCR 検査系

報告されているが，今回われわれは高い特異度を確立の報告となった。

得るために蛍光プローブによる検出を試みた。本

今回の結果は培地上に発育したコロニーから得法の基礎的性能の検討では，全 van 遺伝子陽性菌液られたものであるが，院内感染防止を目的としたを用いた同時再現性試験で得られた各 van 遺伝子アクティブサーベイランスに寄与する臨床検体かの Ct 値の CV（%）は vanA 2.09%, vanB 1.72%, vanC1らの直接検出へと繋がる成果であると考える。

1.41%, vanC2/C3 1.52%，腸球菌 43 株を用いた従来の conventional PCR 法との比較では一致率 100%

文献とそれぞれ良好な結果が得られた。また，操作

1）国立感染症研究所ホームページ：http://www.
nih.go.jp/niid/ja/idwr/2085-ydata/1615-reportja.html
2）SHIRANO, M.; S. TAKAKURA, M. YAMAMOTO, etal.: Regional spread of vanA- or vanB-positive
Enterococcus gallinarum in hospitals and longterm care facilities in Kyoto prefecture, Japan.
Epidemiol. Infect. 139: 430〜436, 20113）MATSUSHIMA, A.; S. TAKAKURA, M. YAMAMOTO, etal.: Regional spread and control of vancomycinresistant Enterococcus faecium and Enterococcus
faecalis in Kyoto, Japan. J. Clin. Microbiol.
Infect. Dis. 31: 1095〜1100, 20124）坂梨大輔，山岸由佳，鈴木隆佳，他：愛知県で 分 離 さ れ た 腸 球 菌 の 疫 学 解 析。 Jpn. J.
Antibiotics 67: 123〜132, 20145）FANG, H.; A. K. OHLSSON, G. X. JIANG, et al.:Screening for vancomycin-resistant enterococci:
DQHI¿FLHQWDQGHFRQRPLFDOODERUDWRU\GHYHORSHG
test. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31: 261〜性・迅速性の観点においては，本法は被検菌コロ
ニーを Sample Buffer Tube に懸濁し，あらかじめ調整したプライマー・プローブ調整液等とともにサンプルラックに設置するのみで van 遺伝子検出が可能となり，操作が極めて容易になった。また，

real-time PCR を測定原理としていることから，従来のゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染
色などの検出行程を省略でき，検査時間の大幅な短縮が実現された。

BD マックス上市以降，関連する文献報告が増え続けているが，そのほとんどはメーカーが提供する専用試薬の性能評価 9〜12）であり，2014 年 6 月
現在，BD マックス™オープン試薬を用いた全自動 real-time PCR の 報 告 は 前 述 の DALPKE ら のPneumocystis jirovecii 検出系 8）のみである。すなわち，本法は 2 例目，そして本邦初の BD マックス™

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265, 20126）DUTKA-MALEN, S.; S. EVERS & P. COURVALIN:
Detection of glycopeptide resistance genotypes
DQGLGHQWL¿FDWLRQWRWKHVSHFLHVOHYHORIFOLQLFDOO\relevant enterococci by PCR. J. Clin. Microbiol.
33: 24〜27, 1995
7）HOFKO, M.; A. MISCHNIK, M. KAASE, et al.:Detection of carbapenemases by real-time PCR
and melt curve analysis on the BD Max system.
J. Clin. Microbiol. 52: 1701〜1704, 2014
8）DALPKE, A. H.; M. HOFKO & S. ZIMMERMANN:Development and evaluation of a real-time PCR
assay for detection of Pneumocystis jirovecii on
the fully automated BD MAX platform. J. Clin.
Microbiol. 51: 2337〜2343, 20139）LE GUERN, R.; S. HERWEGH, B. GRANDBASTIEN, etal.: Evaluation of a new molecular test, the BD
Max Cdiff, for detection of toxigenic Clostridium
GLI¿FLOH in fecal samples. J. Clin. Microbiol. 50:3089〜3090, 2012

67―5291（ 13 ）10）SCHWARTZ, J.; B. ROBINSON-DUNN, J. MAKIN, etal.: Evaluation of the BD MAX GBS assay todetect Streptococcus group B in LIM broth–enriched antepartum vaginal–rectal specimens.
Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73: 97〜98, 201211） ANDERSON, N. W.; B. W. BUCHAN & N. A.
LEDEBOER: Comparison of the BD MAX entericbacterial panel to routine culture methods for
detection of Campylobacter, enterohemorrhagic
Escherichia coli （O157）, Salmonella, andShigella isolates in preserved stool specimens. J.
Clin. Microbiol. 52: 1222〜1224, 2014
12）DALPKE, A. H.; M. HOFKO & S. ZIMMERMANN:
Comparison of the BD Max methicillin-resistant
Staphylococcus aureus（MRSA）assay and theBD GeneOhm MRSA achromopeptidase assay
with direct-and enriched-culture techniques using
clinical specimens for detection of MRSA. J.
Clin. Microbiol. 50: 3365〜3367, 2012

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'HYHORSPHQWRIDVLPSOL¿HGDVVD\IRUGHWHFWLRQRIvan gene harbored enterococci using the automated BD MAXTM platform
DAISUKE SAKANASHI1）, YUKA YAMAGISHI1,2）, NARIMI MIYAZAKI1）, TAKAYOSHI SUZUKI1）,TOMOKO OHNO1）, ATSUKO YAMADA1）, ISAO KOITA1）, SETSUO MIYAJIMA1）,
HIROYUKI SUEMATSU1）and HIROSHIGE MIKAMO1,2）
1）

Department of Infection Control and Prevention,
Aichi Medical University Hospital2）

Department of Clinical Infectious Diseases,
Aichi Medical University Hospital

We developed and evaluated of multiplex real-time PCR assay for detection of vancomycinresistant genes（vanA, vanB, vanC1 and vanC2/C3）using the new, fully automated BD MAX
platform. Ct value analyses of real-time PCR simultaneous repeatability test have showed theXVHIXOQHVVFRHI¿FLHQWRIYDULDWLRQ&9（%）were determined 2.09%, 1.72%, 1.41% and 1.52%
with vanA, vanB, vanC1 and vanC2/C3, respectively. We also evaluated with 43 strains ofenterococci were characterized by conventional PCR method; 4/4 for vanA-positive, 14/14 forvanB-positive, 1/1 for vanB plus vanC1-positive, 6/6 for vanC1-positive, 4/4 for vanC2/C3positive and 14/14 for all-van gene-negative strains were identified correctly. This assay was
automatically performing before and after PCR operations previously done manually by operator,
such as DNA extraction, sample dispensing and gel electrophoresis or the ethidium bromidedyeing. As a result, work burden and the risk of the contamination were largely reduced and wereshortened to about half for measurement time. We conclude that this assay could greatly
FRQWULEXWHWRHI¿FLHQWDQGUDSLGGHWHFWLRQRIYDQFRP\FLQUHVLVWDQWJHQHV