博士（医学）井坂光宏
学位論文題名
内因性エンドセリン1の心臓虚血再灌流におけるノルエピネフリン放出と不整脈に対する影響：
モルモット摘出心ランゲンドルフ灌流系による検討
学位論文内容の要旨【 背景 】 心 臓虚 血 再 灌流 時 に おい て 、 3種類 の ノ ルエ ピ ネ フリ ン (NE)放 出様 式が存 在する。 比較的 長時間の 虚血（ 10ー40分）に おける 交感神経 終末か らのNE
放出 は、
短 時 間 虚血 （ 10分 以 下 ）と 比 較 し多 量 の NE
放 出 を 誘発す る。しか し、持 続的な虚 血
下 では、過 度のNEは ェキソサ イトーシスよりもむしろ、Na+―H゛交換体によルコントロー ル細胞内 Na+
濃 度に依存 するcarrier−mediated
放 出により 生じる 。また、 以前の報告 で虚血再 灌流時 のNE放出が VF持続時 間と正の 相関性 があるこ とが証 明されて いる。
従 って、過 度のNE放 出の減弱 は再灌 流性不整 脈発生 を防止で きる可能 性があ ると考えら れる。
エ ンド セ リ ン(ET)一 1は、 様々な 生理学的 および 病態生理 学的状 況下で多 種多様の生 理作用を示す血管内皮由来の内因性ペプチドである。このET一1．は狭心症や心筋梗塞に 罹患した 患者や 、動物実 験モデルの虚血再灌流時に増加することが報告されている。
ま た、虚血 再灌流 時には、 E
T―1の結合部位の増加も認められており、ET−1が心筋細胞上 の ET
A受 容 体に 直 接 作用 し再 灌流性不 整脈を増 悪する とも報告 されて いる。こ れらの 報告はET―1が 再灌流性 不整脈 の重要な 調節因子 のーつ であることを示唆している。
本 研究では、心筋虚血再灌流時に内因性ET−1が心臓の交感神経節前線維上のNa+一H
゛交換 体 と 関連 す る E
TAお よび ETB
受 容 体 を 活性 化 し てNE放出を調 節する か否かを 検討した。
【 方法】ハ ートレ イ系雄性 モルモ ットの摘 出心ラ ンゲンド ルフ灌流 装置（ 大動脈圧30mmHg、左 室 拡 張終 期 圧10mmHg)により検 討した 。30分間の 安定化 後、虚血 前値とし て 5分 毎 に 30分 間 、 冠 灌 流 液 を 収集 し 、 20分 間 の常 温 (37℃ ） 虚血 後 45
分問再灌流 を 実 施 し た 。 再 灌 流 開 始後 10分 問は 2分 毎に 冠 灌 流液 を 回 収し 、 そ の後 5分 毎に35分 問冠 灌 流 液を 回 収 した 。回収 した冠灌 流液中 のNEおよび ETー1を各々高 速液体クロ マ 卜 グラ フ イ ー(HPLC)お よび 酵 素 結 合免 疫 測 定法 (ELISA)に て 測 定、 心 電 図に より 再 灌 流後 の 不 整脈 （ 心 室細動 ：VF)を 観察した 。各実 験終了後 、単離 した心臓 を湿重 量として 測定し た。なお 、本研 究で使用 した薬剤 は全て 灌流液に 投与し 、その使用― 477―

濃度は既知の報告に従って決定した。
【 結 果】 20分間 の虚 血後の 45分間の再 灌流時 に放出さ れたNE
放 出量は177. 43
土22.
58 pmol/g（ で あり 、 大 部分 の NE放出 量 は 再灌 流 直 後の 2分 間に 生 じ た。 このNE
放出 は、NE運搬 体阻害 剤である デシピ ラミン(DMI、10 nM)または Na+・H
゛交 換体阻害剤の5‑N‑ethyl−isopropyl−amiloride(EIPA、10ロM）により有意に抑制，（pく0．01）
さ れ たこ と か らCarrier−MediatedのNE放出で あると示 唆され た。ET
変換 酵素阻 害剤
で あ るホ ス フ ォラ ミ ド ン（ 3ロ M） は 再 灌流 問 の NE
放 出 を 約58%抑制 し 、 さら に、再灌流 直後に放 出され たETー1濃度を 著明に減 少させた （pく0．05)。ET受容体非選択的遮 断 薬で あ る P
D142893（1ル M）、 ま た は E
TA受 容体選択 的遮断 薬である B
Q123（10ルM）は顕著 に再灌 流時のNE放 出を抑 制した（ pくO．01） が、ETB受容体 選択的遮断薬であるB
Q788 (300 nM)は再 灌流時 のNE放出を 逆に約 62%（pくO．01）も 増加させ た。対照 群 およ び BQ788の存 在 下 での み 、 V
F出 現 率 は100%
で あ っ た。 20分間 の 虚 血後、 対照群 では再灌 流直後 から40. 11
土7．08秒 （例数＝ 6）持続した。しかし、DMI、EIPA、ホス フォラミ ドン、 P
D142893、BQ123によりVFは 完全に 消失した 。その 一方で、BQ788は 対 照群 と 有 意な 差 を認め なかっ た(
41. 83士36. 34秒，） 。これ らNE放出量 とVF持続時間には正の相関性（′0． 8496，pく0．001）が認められた。虚血直前および再灌流

後 45分 時 点 での 冠 灌 流速度、 心拍数 およびLeft Ve
ntricular Developed Pre
ssureにお い て 、 BQ123群 の み 全 て の パ ラ メ ー タ ー で 有 意 な 改 善 が 認 め ら れ た 。
【考 察】これ らの結 果から、 心臓虚 血再灌流 の状況 下で内因 性ET―1がETA受容体を活 性 化す る こ とに よ り 心臓 の 交 感神 経 終 末に お けるcarrier−mediat
ed N
E放出 および 再 灌流 性 不 整脈 を 増悪し 、反対 にE
TB
受 容体を 活性化す ることに よりNE
放 出および再 灌 流性 不 整 脈を 抑 制する ことを 証明した 。また 、ET変換酵 素阻害 剤による E
T一1
産生の 抑制がNE
放 出およ び再灌流 性不整 脈を減弱 するこ とを証明 した。こ れらから、局所的 な．ET
−1産生 が心筋虚 血再灌 流時にお けるNE放 出を調節し、再灌流性不整脈に関与することが考えられた。
【結 論】心筋 虚血の 際、交感 神経終 末から放 出され るNEは、冠 血管を 収縮させ、また 心 筋内 の Ca
濃 度 を 上昇 さ せ 、致 死 的 不整 脈 を 惹起する 。本研究 により 、将来的 にETA
受 容 体 遮断 薬 ま たは ETB
受 容 体 作用 薬 は 致 死的な 再灌流性 不整脈 の防止に 役立つ可能性が示唆された。

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 安 田 慶 秀
副 査 教 授 筒 井 裕 之
副 査 教 授 三 輪 聡 一

学 位 論 文 題 名

内因性エンドセリン1の心臓虚血再灌流におけるノルエピネフリン放出と不整脈に対する影響：
モルモット摘出心ランゲンドルフ灌流系による検討
本研 究の 目的 は， 心 臓虚 血再 灌流 時に 内因 性′ ET− 1が心 臓の 交感 神経 節前線維上のE
T受容体を活性化してCarrier一mediatedNE
放出を調節するか否かを検討することである．
モルモットの摘出心ランゲンドルフ灌流装置により検討した．30分間の安定化後，虚血前値として5分毎に30分間，冠灌流液を収集し ，20分間の常温(37℃）虚血 後45分間再灌流を実施した．冠 灌流液中のNEおよびET−1を 各々高速液体クロマトグラフイー(HPLC)および酵素結合免疫 測定法(ELISA)にて測定，心電図により再灌流後の不整脈（心室細動：VF)を観察した．な お，本研究で使用した薬剤は全て灌流液に投与し，その使用濃度は既知の報告に従って決定した．20分 間の 虚血 後の 45分 間の 再灌 流時 に放 出さ れ たNE放出 量は N
E
運搬体阻害剤であるデシピラミン(DMIまたはNa゛−H
゛交換体阻害剤の5‑N‑ethyl―isopropyl‑amiloride(EIPA，10 p,M)により有意に抑制されたことからCarrier‑MediatedのNE放出であると示唆 された．E
T変換酵素阻害剤であるホスフォラミドン（3HM)はNE放出を約58Y0抑制し，さ らに再灌流直後に放出されたET―1濃度を著明に減少させた．ET
受容体非選択的 遮 断 薬 で あ る PD142893（ 1弘 M)， ま た は ETA受 容体 選択 的遮 断薬 であ るBQ12
3は 顕
著 に NE放 出 を 抑 制 し た が ， ETB受 容 体 選 択 的 遮 断 薬 で あ る BQ788は NE放 出 を 逆に 約62%も増加させた．対照群およびBQ788の存在下でのみ，VF出現率はlOOYoであった．同様に VF
持 続時 間に 関し てもBQ
788存在下でのみ対照群と比較し有意 差を認めなかった，虚血直前およ ぴ再灌流後45分時点での冠灌流量，心拍数およびLe
ftVentricularDevelopedPressureにおいて，BQ123群のみ全てのパラメーターで有意な改善が認められた．以上により，心臓虚 血再灌流の状況下で内因性E
T−1がE
TA受容体を活性化することにより心臓の交感 神経 終末 にお ける carrier‑mediated NE
放出および再灌流性不 整脈を増悪し，反対にETB受容体を活性化することによりNE放 出および再灌流性不整脈を抑制することが示唆された，このことから，内因性ET―1がNE放出に関与することが示唆された。E
T―1が心筋虚血―479−

再灌流性不整脈を誘起することがこれまでの研究で解っている。本研究のE
T
各種薬物によるNE
放出の変化は ，ETー1が交感神経に作用しNE放出を調節していることを示唆していると考えられる。しかしながら，本研究では内因性ET―1のNE放出調節機序を明らかにすることが出来なかった．このことをより明らかにするためには，心筋の条片を使用し，細胞内情報伝達機構を解明すること，二重免疫染色により交感神経上のET受容体を検討することが必要と考えられ，今後の検討課題である。
公 開 発 表 で は ， 副 査 の 筒 井 教 授 か ら ， ET1に よ る NE放 出 が PKC依 存 性 か 否 か ，三輪教授から，外 因性工ンドセリン‐1の使用した時のNE放出量，主査の安田教授から，心筋保護に関して 臨床応用に必要な実験に関して等の質問がなされた．申請者は自らの実 験結 果， この 分野 に関 する 文献 な どを もと に， 誠実 かつ 妥当 な回 答を 成し えた．
、 本研 究は ，心 臓虚 血再 灌流 性不 整 脈に 対す るETA受容体 遮断薬の臨床応用，機序解明の―端を担い， 再灌流性不整脈予防および心筋保護の今後の展開に重要な寄与を要するものと評価される．
審査員一同は， 申請者の学識に合わせて，この研究が関連領域研究とその臨床応用への可能性を評価し，大学院課程における研鑚や単位取得なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した．

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