洛和会病院医学雑誌

原Vol.25：50−53, 2014著

病理診断における蛍光免疫染色の活用
洛和会音羽病院

安井寛・西村洛和会音羽病院

穴吹病理診断科啓介

臨床検査部

昌枝・岩元静香【要旨】
免疫染色蛍光抗体法は、ルーチン業務として施行されている酵素抗体法に比較して、定量性に優れる、明瞭な二重染色が可能、などの利点を有している。腎糸球体病変や皮膚炎症性疾患の診断において、蛍光免疫染色は不可欠な診断ツールとなっているが、その利点を生かすことにより、病理診断のより多様な局面に応用可能である。本稿では、
最近当科において、蛍光抗体法を利用することにより、詳細な病態解析が可能となった2症例について提示する。
Key words：Immunohistochemistry, immunofluorescence, pathological diagnosis.

【緒言】

起と蛍光のスペクトラムの異なる蛍光色素を標識した二次免疫組織化学は、特異的な抗原抗体反応を応用して、目抗体を結合させる。このようにして作成された蛍光染色標的とする抗原物質の局在を組織標本の上で可視化する方法

本に対し、二種類の蛍光フィルターを通して観察するか、である。今日では、病理診断において不可欠な染色法の一それらのシグナル（赤〈red〉・緑〈green〉単色のシグナル）つとなっており、当院の病理検査室でもほぼ毎日施行されを合成したRGB画像として観察することにより、組織や細ている。特に腫瘍の病理診断において、HE染色による形態胞における複数の抗原の局在の違いを比較・検討すること診断とともに、腫瘍特異的な分子（主に蛋白質）の同定が、ができる。

しばしば大きな意味を持つ。また、細胞増殖能や、成長因洛和会音羽病院 病理診断科では、平成25年1月より蛍光子やホルモン受容体などといった癌関連蛋白の動態を、免顕微鏡を導入し、腎生検における蛍光免疫染色を院内で施

疫組織化学を用いて評価することが、遺伝子解析とともに、行するとともに、病理診断の新たな可能性を拡げるために、治療法選択や予後判定の上で、ますます重要になってきて蛍光抗体法の利点を利用した様々な試みを行ってきた。本いる。

稿では、そのような試みを行った症例のうち、特に印象深

免疫組織化学には、大きく分けて蛍光抗体法と酵素抗体い二例を選んで臨床経過・病理診断を含めて提示する。

法があり、それぞれ固有の利点を持つ。蛍光抗体法では、まず第一に、抗原量と蛍光強度との相関が比較的良いと考【症例1】えられる。つまり、蛍光抗体法は定量性に優れている。第一例目は、混合性結合組織病（MCTD）に合併した膜性二に、二重染色の施行とその評価が容易である。まず、同腎症（MN）の64歳女性である。MNが特発性か二次性かの一標本上の異なる抗原に対し、それぞれに対応する一次抗判定に、蛍光免疫染色によるIgGサブクラスの半定量的評価体を結合させる。次いで、それぞれの一時抗体に対し、励が有効であった。

− 50 −

病理診断における蛍光免疫染色の活用

MNは糸球体基底膜の上皮下に免疫複合体が沈着するこ多数見られ、糸球体肥大傾向を呈していた。尿細管・間質とにより糸球体基底膜（GBM）の蛋白質透過性が亢進するや血管系の構造は、近位尿細管に硝子滴変性を認める以外疾患で、成人のネフローゼ症候群の20〜30%を占める1）。特には良く保たれ、間質線維化は極く軽度であった。蛍光抗発性および種々の原因による二次性が存在するが、最近、体法では、係蹄壁と傍メサンギウムにIgG・C3の顆粒状沈特発性MNの原因となる抗原物質が、主として、足細胞の着を認めた。以上より、病型診断は膜性腎症（MN）と考膜表面に局在するphospholipase A2 receptor であることがえられた。病因診断として、背景にMCTDがあり、IgG・判明した2）。これがGBMに接する足細胞の細胞膜表面で、C3の沈着パターンが係蹄壁からメサンギウムに及んでいた

IgG4分画に属するIgG抗体と免疫複合体を形成する。一方、ことから、二次性MNの可能性が考えられた。それを支持二次性MNの場合、GBMに沈着するIgGのなかで、IgG4分する所見を得るために、蛍光免疫染色によるIgGサブクラス画は比較的微量である。これらの知見により、特発性およの半定量的評価を試みた。その結果、蛍光輝度はIgG1が最び二次性MNの鑑別のためにIgGサブクラスの半定量的評も強く、次いでIgG2で、IgG3とIgG4の蛍光強度はいずれも価が重要視される様になってきた。当科においても、現在微弱であった（図1）。対象として、2例の原発性MNにおいこの方法をMNの診断に役立ている。て同様の染色を施行したところ、いずれもIgG4の蛍光強度

症例は64歳女性で、全身浮腫を主訴として来院された。

が際立っており、本症例との染色性の差は歴然としていた。

現病歴として、15歳頃からレイノー症状を、55歳頃からはこれらの所見より、MCTDに基づく二次性膜性腎症と診断

口腔内と眼球の乾燥を自覚していた。入院3カ月前の検尿でした。

蛋白尿を指摘された。入院2週間前から全身浮腫を自覚し、近医を受診したところ尿蛋白と低蛋白・アルブミン血症が認められた。以上の経過よりネフローゼ症候群が疑われ、当院腎臓内科に紹介・入院となった。
入院時、両下腿にpitting edema、手指にソーセージ様腫脹を認めた。検尿では尿蛋白が3+、尿潜血が2+であった。
血算では白血球3,400/µl、赤血球412万/µl、ヘモグロビン
11.4 g/dl、ヘマトクリット37.8%、血小板22.7万/µlと、軽度の貧血以外に著変を認めなかった。血液生化学では総蛋白5.3g/dl、アルブミン1.9g/dl、総コレステロール383mg/dlであった。免疫血清学では、抗SS-A/Ro抗体が142U/ml、抗SS-B/La抗 体 が15.1U/ml、U1RNP抗 体 が500U/ml以 上 と、それぞれ高値を示した。また、サクソンテスト0.5g、シルマー試験2mm/4mmと低値であり、下口唇小唾液腺生検にてリンパ球・形質細胞浸潤と腺房萎縮を認めた。
図1

上記の所見より、シェーグレン症候群、混合性結合組織病（MCTD）およびネフローゼ症候群と診断された。
ネフローゼ症候群の原因精査のため、腎生検が施行された。その病理所見を以下に述べる。皮質・髄質比は10：0と、蛍光免疫染色によるIgGサブクラスの半定量的評価

本症例（左側）では、蛍光輝度はIgG1が最も強く、次いでIgG2で、IgG3とIgG4の蛍光強度はいずれも微弱である。原発性MN症例（右側）では、IgG4の蛍光強度が際立っている。

全て皮質から採取されていた。糸球体は91個含まれ、そのうち2個が全節性硬化に陥っていた。その他の糸球体には、【症例2】

ほぼ全てに軽度のメサンギウム基質増加、足細胞の腫大を認めた。またボウマン嚢径が200〜250μmに及ぶ糸球体が二例目は、蛍光二重染色が病態解析に有効であった節外性濾胞辺縁帯リンパ腫の60歳女性である。

− 51 −

原著

節外性濾胞辺縁帯リンパ腫は、胃をはじめとする消化管素抗体法）を施行したところ、浸潤するリンパ球はCD20がや肺・唾液腺・眼付属腺に好発する、比較的低悪性度のB陽性、CD3・CD5・CD10・cyclin D1が陰性で、MALT リ細胞型リンパ腫である。粘膜関連リンパ組織（MALT）かンパ腫として矛盾しない結果であった。生検の約2カ月後に、。組診断を兼ねた治療法として内視鏡的粘膜下層剥離術（ESD）

織 学 的 に は、centrocyte-like、monocytoid、 ま た は smallが施行された。組織学的に、構造の良く保たれた胃底腺粘lymphocyte-likeと形容される小型Bリンパ球が、リンパ濾膜を背景として、径12mmの比較的境界明瞭なリンパ増殖胞辺縁帯から連続して単調な増殖を示す。複数の腫瘍性リ性病変が認められた（図2A）。病変内には腫大した多数のンパ球が集簇して腺管上皮内に浸潤し、腺管形態の変容をリンパ濾胞が見られ、リンパ濾胞の辺縁帯から周囲に拡が引き起こしてlymphoepithelial lesion（LEL）を形成するのる様に、小型リンパ球が粘膜下層から粘膜に単調な増殖をが特徴とされる。本症例では、胃MALTリンパ腫において、示していた（図2B）。免疫染色（酵素抗体法）では、病変腫瘍性Bリンパ球と腺管上皮細胞が共局在（colocalization）

部にはCD20陽性のBリンパ球が密在し、CD3陽性のTリンしてLELを形成する像を、蛍光二重染色を用いて明瞭に示

パ球は比較的疎に散在性に分布していた（図2C、D）。また、すことが出来た。

サイトケラチン（上皮マーカー）の免疫染色（酵素抗体法）

ら 発 生 す る 事 か らMALTリ ン パ 腫 と も 称 さ れ る3）4）

症例は60歳女性で、人間ドック受診を目的に来院された。

により、病変部粘膜深層において、変形してLELを形成す

上部消化管内視鏡検査を施行したところ、胃体部後壁に、る腺管上皮が明瞭に描出された。以上の所見はMALTリン

径14×14mmの隆起性病変を認めた。周囲との境界ほぼ明

パ腫に特徴的であったが、これだけで反応性リンパ過形成

瞭で、中心部に陥凹を伴い、辺縁にやや不整が見られた。

を確実に除外するのは困難と考えられた。診断確定のため生検では、小型リンパ球の密な浸潤を伴う胃底腺粘膜が採には、増殖するBリンパ球が同一のクローン由来（モノク取され、リンパ球の侵入を伴って変形した腺管、即ちLELローナル）であることを遺伝学的に証明する必要がある。

が認められた。MALTリンパ腫を念頭において免疫染色（酵しかし、本例ではフローサイトメトリーや遺伝子診断用の図2

症例2の胃リンパ増殖性病変

ルーペ像では比較的境界明瞭な隆起性病変が認められる（A）。病変内には腫大した多数のリンパ濾胞が見られ、リンパ濾胞の辺縁帯から周囲に拡がる様に、小型リンパ球が粘膜下層から粘膜に単調な増殖を示す（B）。免疫染色（酵素抗体法）
では、病変部にはCD20陽性のBリンパ球が密在（C）、CD3陽性のTリンパ球は比較的疎に散在性に分布する（D）。

− 52 −

病理診断における蛍光免疫染色の活用

検体が採取されなかったため、厳密な診断確定は困難で【考察・結語】あった。そこで、病理組織学的手法の範囲内で、可能な限本稿では、病理診断における蛍光抗体法の、ルーチン以り確定診断に近づける事を試みた。その一つが、LELの形外での活用法を提示した。即ち、優れた定量性、二重染色成に与るリンパ球が単一の免疫形質を示すことの証明であの容易さといった、基本的な利点を生かして、様々な局面る。LEL病巣において、赤色蛍光を呈する腺管上皮の内部において従来法より精度の高い病理診断が可能になる。に、緑色蛍光を呈するBリンパ球の集簇が明瞭に認められ緒言で述べた様に、免疫組織化学は、特異的な抗原抗た（図3A）。一方、Tリンパ球を同様の方法で観察したとこ

体反応を利用して、組織標本の上で目的とする抗原の局ろ、LEL病巣の外部にのみ散在性に見出された（図3B）。即在を可視化する方法であるが、核酸の特異的結合、即ちち、励起・吸収スペクトラムの異なる蛍光色素で標識した

hybridizationを 用 い て、 ウ イ ル ス や ヒ ト の ゲ ノ ムDNA

二種類の二次抗体を用いた染色（蛍光抗体二重染色法）ににおける特異的配列の局在を可視化する方法は、in situ

より、LEL内部のリンパ球の全てがBリンパ球であることをhybridization（ISH）と呼ばれ、そのなかで、蛍光色素をはっきりと示す事が出来た。

用いたものはFISHと呼ばれる。病理診断用の検体を用いた
FISHは、癌の遺伝子異常、特に染色体レベルの異常を鋭敏に検出する方法として重用される5）。今後は蛍光抗体法にFISHも含めた活用を視野にいれ、病理診断の更なる向上と深化を目指している。
【文献】

1）Distribution of glomerular IgG subclass deposits inpatients with membranous nephropathy and anti-U1
ribonucleoprotein antibody. Omokawa A et al., Nephrol
Dial Transplant, 27：1937–1941, 2012.
2）M-Type Phospholipase A2 Receptor as Target Antigen
in Idiopathic Membranous Nephropathy. Laurence HBet al, N Engl J Med 361：11-21, 2009.
3）Gastrointestinal malignant lymphoma：a pathologic
study of 37 cases in a single Japanese institution.
Terada T. Am J Blood Res 2（3）：194-200, 2012.
4）Gastrointestinal lymphomas：Morphology, immunophenotypeand molecular features. Bautista-Quach1 MA et al., J

図3 症例の胃リンパ増殖性病変におけるLEL病巣の蛍光染色赤色蛍光を呈する腺管上皮の内部に、緑色蛍光を呈するBリンパ球の集簇が明瞭に認められた（A）。一方、Tリンパ球はLEL病巣の外部にのみ散在性に見出された（B）。

Gastrointest Oncol 3（3）：209-225, 2012.
5）Multitarget FISH Analysis in the Diagnosis of Lung
Cancer. Bubendorf L et al.,  Am J Clin Pathol 123：516523, 2005.

− 53 −