1-2 KLF 遺伝子と HES 遺伝子による未分化細胞維持機構の研究●代表者 外川徹（生命科学科・准教授）●分担者 安原徳子（生命科学科・准教授）
栂浩平（生命科学科・助手）

橋本伸哉（化学科・教授）
中尾有利子（地球科学科・助教）【研究の目的および概要】
我々ヒトのような多細胞生物は，多くの非常に様々な種類の細胞から構成される。これらの細胞はすべて単一の受精卵に由来するが，発生の過程で分化することで様々な性質を獲得する。しかしながら，個体を構成するすべての細胞が分化しているわけではなく，ある細胞は未分化な幹細胞として維持され，必要に応じて分化する。このように細胞が未分化状態を維持する機構と，逆に適切なタイミングで適切な細胞へ分化する機構を解明することは，多細胞生物の発生を理解する上でも，また再生医学の発展のためにも極めて重要である。
未分化細胞の維持および分化誘導のメカニズムは，基本的にすべての多細胞生物に存在すると考えられる。チョ
ウやガのような昆虫では成虫になってから翅をもつが，この翅組織は，幼虫期には比較的未分化な組織である翅原基として体内に存在する。幼虫期における翅原基の未分化状態は，セスキテルペノイドである幼若ホルモン（JH）により維持される。JH の細胞内受容体は bHLH-PAS ファミリーの転写因子である Met と Tai のヘテロ二量体であることが知られている。Met/Tai は JH を受容すると，ジンクフィンガー転写因子をコードする Krüppel-homolog 1（Krh1）遺伝子の発現を誘導し，Kr-h1 タンパク質が幼虫形質を維持する。我々は以前，Kr-h1 タンパク質以外の JH シグナル仲介因子を同定する目的で，カイコガ（Bombyx mori）の培養細胞に JH を作用させた際に発現誘導される遺伝子を，DNA マイクロアレイを用いて網羅的に探索した。その結果，bHLH-HES ファミリーの転写因子（HES）をコードする hairy 遺伝子を同定した。hairy 遺伝子はキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）において，表皮細胞から神経細胞への分化を抑制することが知られている。そのため，Hairy タンパク質も Kr-h1 と同様に JH シグナルを仲介することで幼虫期の細胞の未分化状態を維持している可能性がある。
興味深いことに，HES ファミリーの転写因子群は哺乳類にも存在し，昆虫の Hairy と同様に幹細胞の維持や細胞分化の抑制にはたらくことが知られている。さらに，哺乳類では Kr-h1 に相同な転写因子として Krüppel like factor（KLF）転写因子群が知られており，これらも幹細胞や未分化細胞の維持に機能する。これらのことから，KLF 転写因子群と HES 転写因子群を介した未分化細胞維持機構が動物において保存されている可能性がある。そこで本
研究では，HES 転写因子と KLF 転写因子による未分化状態維持機構の解明を目的として，両者の分化過程における変化をカイコガとマウス（Mus musculus）を用いて調べた。
【研究の結果】
JH による hairy 遺伝子の発現誘導の特性を明らかにするために，カイコガ培養細胞を様々な濃度の JH あるいはJH 類似物で処理し，hairy 遺伝子の発現の変化を調べた。JH には官能基が少しずつ異なるいくつかのタイプが知られており，昆虫種によって異なるタイプが主にはたらく。鱗翅目昆虫の主要 JH である JHI と JHII，および他の昆虫で一般的に主要 JH としてはたらく JHIII では生理的濃度以下（10 pM）で十分に発現誘導された。JH 類似物であるメトプレンも JH の生理的濃度（10 nM）で hairy の発現を誘導した。しかしながら，JH 前駆体であるファルネセン酸では発現誘導は認められなかった。また，JH 投与後の時間経過を調べたところ，投与後 1 時間で最大レベルまで発現が誘導された。その後，数時間高いレベルの発現が維持された。これらの特性は JH により発現が誘導されることが知られている Kr-h1 と同様の結果であった。

4

Kr-h1 は JH によって発現誘導されるため，体内の各組織では体液中の JH 濃度変化に呼応した発現パターンを示す。そこで，カイコガの幼虫脂肪体における hairy の発生段階に沿った発現パターンを調べた。終前齢である 4 齢幼虫においては比較的高い発現を維持し，終齢である 5 齢幼虫への脱皮後に発現が減少した。その後，5 齢幼虫後半から蛹脱皮にかけて徐々に発現が上昇することが明らかになった。この発現変動は概して JH の体内濃度変動と一致していると言える。また，5 齢 2 日目の幼虫に 1 μg のメトプレンを投与したところ，溶媒であるアセトンを投与したコントロール個体に比べて，hairy の発現が数倍に上昇した。同様に Kr-h1 についても解析したところ，メトプレン投与によって数十倍の発現上昇が認められた。これらのことから，脂肪体において hairy は JH によって発現が誘導され，おそらく合成された Hairy タンパク質が JH の生理作用を仲介していることが示された。皮膚と翅原基においても 4 齢から 5 齢幼虫における hairy の発現パターンを解析した。しかしながら，これらの組織においては脂肪体とは異なり，JH 濃度変化に呼応する発現変動は認められなかった。Kr-h1 遺伝子は皮膚において JH によって発現が誘導され，幼虫形質の維持に重要な役割を果たしていることが知られている。これらのことから hairy 遺伝子は Kr-h1 遺伝子同様 JH によって発現誘導されるが，その誘導は Kr-h1 とは異なり組織依存的であり，おそらく組織特異的な JH の生理作用に関わることが示唆された。
転写因子はその機能を果たす際に，その遺伝子が発現するだけではなく，合成された転写因子が核内に輸送されることが必要である。そこで，KLF ファミリー転写因子である KLF5 の細胞分化過程における細胞内局在変化を，マウス ES 細胞を用いて解析した。GFP 融合 KLF5 発現プラスミドを導入した ES 細胞を PBS で洗浄すると，KLF5 は核内から核外へ輸送された。その後，分化培地に交換すると KLF5 は細胞質に留まったが，未分化培地に交換すると核内へ輸送されることが明らかになった。このことから，KLF5 がなんらかのメカニズムで分化刺激や環境変化を認識し，細胞内局在を変化させ，そのことが細胞の分化あるいは未分化状態の維持に重要な役割をもつことが示唆された。
【研究の考察・反省】
昆虫では，幼虫期に未分化状態で維持されていた成虫組織が，変態の過程で分化する。そのため，変態を調節するメカニズムは細胞分化調節にも重要な役割を果たすと考えられる。変態を抑制する JH の生理作用は，転写因子 Kr-h1 によって仲介されることが知られている。本研究では，Kr-h1 に加えて HES ファミリーの転写因子であるHairy の遺伝子も JH によって発現が誘導され，おそらく JH の生理作用を仲介することが示された。Kr-h1 のホモログである KLF 転写因子群と，Hairy が属する HES 転写因子群は様々な動物において未分化維持に機能するため，これらの因子は動物に広く保存された未分化維持機構に関わると考えられる。しかし本研究では，Kr-h1 遺伝子とhairy 遺伝子の JH による誘導性が，組織によって異なることを示した。そのため今後は，それぞれの転写因子が担う JH の生理作用，また細胞の未分化維持における機能の違いを明らかにする必要があると思われる。また，マウス ES 細胞を用いた実験では，細胞の分化過程で KLF5 の細胞内局在が変化することが示された。昆虫の Kr-h1 やHairy が変態過程で細胞内局在を変化させるかどうか知ることは，大変興味深い。昆虫と哺乳類，そして他の動物群を用いて，KLF 転写因子群と HES 転写因子群のはたらきをさらに解析することで，動物に保存された細胞の未分化維持および分化の分子機構が明らかになっていくと考えられる。
【研究発表】
外川徹，下段詩絵理，成瀬佳奈，粥川琢巳，鈴木大己，内田康介，栂浩平，篠田徹郎
bHLH 転写因子遺伝子 hairy の幼若ホルモンによる組織依存的な発現誘導第 63 回日本応用動物昆虫学会大会（つくば，2019 年 3 月 27 日）

5本間悠里，浅野美和，栂浩平，篠田徹郎，外川徹
カイコガにおける PTEN-like phosphatase（Plip）の in vivo 機能解析
第 63 回日本応用動物昆虫学会大会（つくば，2019 年 3 月 26 日）
地引和也，前原一満，平田早季，仙波雄一郎，野上順平，柴崎典子，木村宏，大川恭行，安原徳子
核輸送因子 importin αファミリーのクロマチン結合解析
文部科学省科学研究費補助金新学術領域研究「オルガネラ・ゾーン」平成 30 年度若手の会（徳島，2019 年 1 月）
Homma, Y., Uchibori-Asano, M., Toga, T., H., Shinoda, T., and Togawa, T.
Knockout of 37(1OLNHSKRVSKDWDVH 3OLS  a selectively-expressed gene in corpora allata in Bombyx mori2018 ESA, ESC and ESBC Joint Annual Meeting（Entomology 2018）（Vancouver, British Columbia, Canada; Nov, 2018）
地引和也，前原一満，平田早季，仙波雄一郎，野上順平，堀越直樹，田口裕之，米田悦啓，斉藤典子，木村宏，胡桃坂仁志，大川恭行，安原徳子
Nuclear transport receptor importin α regulates gene expression via interaction with chromatin in ES cells
第 41 回日本分子生物学会年会（横浜，2018 年 11 月）
安原徳子，地引和也，浅野僚二，前原一満，仙波雄一郎，胡桃坂仁志，大川恭行，木村宏
核輸送因子 importin αファミリーによる細胞運命決定機構
第 41 回日本分子生物学会年会（横浜，2018 年 11 月）
地引和也，前原一満，平田早季，仙波雄一郎，野上順平，堀越直樹，田口裕之，米田悦啓，斉藤典子，木村宏，胡桃坂仁志，大川恭行，安原徳子
Nuclear transport receptor importin α2 plays role in differential regulation of ES cells by two functions, nuclear transportand interaction with chromatin
第 91 回日本生化学会大会（京都，2018 年 9 月）
浅野僚二，安原徳子The function of importin α in the cell proliferation
第 91 回日本生化学会大会（京都，2018 年 9 月）
安原徳子
核輸送受容体 importin αによる遺伝子発現制御機構
大阪大学蛋白質研究所セミナー「細胞核とクロマチン構造が操る高次生命現象」（吹田，2018 年 8 月）
地引和也，前原一満，平田早季，仙波雄一郎，野上順平，堀越直樹，田口裕之，米田悦啓，斉藤典子，木村宏，胡桃坂仁志，大川恭行，安原徳子
Nuclear transport receptor importin α2 affects maintenance of undifferentiated state by two functions, nuclear transport
and interaction with genomic DNA in mouse ES cells.

6

第 70 回日本細胞生物学会 第 51 回日本発生生物学会 合同大会（東京，2018 年 6 月）
浅野僚二，安原徳子
Nuclear transport and cell proliferation.
第 70 回日本細胞生物学会 第 51 回日本発生生物学会 合同大会（東京，2018 年 6 月）
本間悠里，栂浩平，篠田徹郎，外川徹
幼若ホルモン生合成に関連する新規酵素遺伝子 PTEN-like phosphatase（Plip ）の機能解析
第 62 回日本応用動物昆虫学会大会（鹿児島，2018 年 3 月 26 日）
下段詩絵理，粥川琢巳，小山みど梨，石野遥菜，鈴木大己，内田康介，栂浩平，篠田徹郎，外川徹
bHLH 転写因子 hairy は幼若ホルモンによって組織特異的に誘導される
日本蚕糸学会第 88 回大会（名古屋，2018 年 3 月 20 日）
浅野僚二，安原徳子，柴崎典子，地引和也，石畑雄太郎，海江田愛奈美
細胞増殖における核輸送因子の働き
2017 年度生命科学系学会合同年次大会（ConBio2017）（神戸，2017 年 12 月）
地引和也，山本達郎，中尾光善，斉藤典子，安原徳子
ER 陽性乳がん細胞における核輸送受容体 importinα の働き2017 年度生命科学系学会合同年次大会（ConBio2017）（神戸，2017 年 12 月）
Togawa, T., Kayukawa, T., Oyama, M., Ishino, H., Uchida, K., Toga, K., Shinoda, T.
A bHLH-HES family gene, KDLU\ is induced by juvenile hormone in tissue-dependent manner in Bombyx moriThe 3rd International Insect Hormone（the 21st Ecdysone）Workshop 2017（Nasu, Tochigi, Japan; Jul 13, 2017）
Homma, Y., Toga, K., Shinoda, T., and Togawa, T.
PTEN-like phosphatase（Plip）, a novel enzyme involved in juvenile hormone biosynthesis
The 3rd International Insect Hormone（the 21st Ecdysone）Workshop 2017（Nasu, Tochigi, Japan; Jul 10, 2017）
安原徳子
核輸送因子による遺伝子発現調節機構
日本大学文理学部生命科学セミナー・細胞核機能の発現と制御（東京，2017 年 6 月）
【研究成果物】
なし

7