統合データ解析トライアル中間激励会 2013 11/29 @JST東京本部

データを用いたメタゲノム解析Webアプリケーションの開発
森 宙史
Hiroshi Mori
東京工業大学
大学院生命理工学研究科
生命情報専攻 黒川・山田研 助教
1© 2013森 宙史（東京工業大学大学院）licensed under CC表示2.1日本

Metagenome

This Figure is obtained from
National Research Council (USA)2

16S rRNA gene amplicon sequencing analysis(メタ16S解析)
Pre-analysis (Remove Primer, Chimera etc.)
Multiple sequence alignmentor sequence clustering

DNA extraction

Distance calculationor similarity search

PCR amplification

DNA Sequencing

Who’s there?

Ley R. et al., PNAS 2007

3

Metagenomic sequencing analysis(メタゲノム解析)
Metagenomic reads
Assemble

SOAPdenovo2, Velvet,
IDBA-UD etc.

Contig sets

DNA extraction

Gene finding

MGA, MetaGeneMark

Gene sets

DNA Sequencing

BLASTP

Sample1
Metadata
Comparative
Sample2 metagenomics
Metadata

Who’s there?

Gene Function abundance
Pathway abundance
Pathway reconstruction
Taxonomic abundance
What are they doing?4

・ メタゲノム解析データから、簡便に系統組成と遺伝子機能組成の情報を抽出したい
・ 組成情報を既存のメタゲノム解析サンプルと比較したい

その環境の細菌群集は他のサンプルと比較するとどのような共通性・違いがあるか？
その環境のメタデータと自分のサンプルのメタデータを比べて、何が異なるのか？

5integrates lots of data related to microbes.
Especially, we integrates the microbial data that can be linked to genomes.

http://microbedb.jp/

Gene
Ortholog: MBGD

Taxon

Environment
Taxonomy:
NCBI Taxonomy

Genome: GTPS/RefSeq
Annotation:
TogoAnnotation

Culture Collection:
NBRC/JCM

Metadata:
INSDC SRA

Metagenome:
INSDC SRA
6

Red color indicates our collaborators.

既存のメタゲノム・メタ16Sデータの整理・統合
微生物の情報とその生息環境の情報を結びつける
1. 公共DB(SRA)からメタ16S・メタゲノム配列データとメタデータを取得
2. 配列データから系統組成・遺伝子機能組成情報を計算
3. メタ16S・メタゲノム論文から微生物の生息環境についてのメタデータを抽出
4. 生息環境を記述するために同義語、語彙間の関連性を記述した
オントロジーMEOを構築
5. MEOとメタ16S・メタゲノムのメタデータの対応付け
サンプルの種類

サンプル数

環境メタ16S
ヒトメタ16S

290411289環境メタゲノム
ヒトメタゲノム

約1100
約4900

7

公共塩基配列DB(INSDC SRA)
メタゲノム配列データを取得

本研究開発で開発する解析ツール

DDBJスーパーコンピューター

大規模計算実行解析
パイプライン

既存のメタゲノムの解析済み
データを取得

解析
Web
比較
パイプ
解析 アプリケーション
ライン

メタゲノムDB
アップロード
メタゲノム
配列データ

MicrobeDB.jp中の既存メタゲノムデータとの比較解析結果

ユーザ

系統組成

遺伝子機能組成

ユーザのメタゲノム解析データを受け取り、系統組成と遺伝子機能組成を解析し、既存メタゲノムデータと比較解析した結果を返す

8

研究開発スケジュールと現在の進捗

現時点で、項目１については、ほぼ完了
項目２については、基本的な比較解析機能は実装済み
9

テストデータ
畑の土壌

Mori H. et al., 2013, DNA Res.の2種類のメタ16Sデータを使用

DNA extraction

PCR amplification by
the 338F-533R primer set

PCR amplification by
the 342F-806R primer setDNA Sequencing
by the Roche 454
Test
Sample1

Test
Sample2

100%
80%
60%
40%

リード数はそれぞれ約29,000本と約15,000本

20%
0%
TestSample1

10

TestSample2

配列の前処理 (目的: メタゲノムとメタ16Sデータの区別 & 高精度配列データの抽出)
ユーザがメタ16S or メタゲノムの情報を入力
FASTQ ファイル
Nを含む配列除去
配列長でフィルタリング
配列長のMedianを計算し、±25 % までの長さのリードを採用
Qualityでフィルタリング
Quality Average > 20

高精度
メタゲノム配列デー
タ

高精度メタ16S
配列データ

11

メタ16S解析パイプライン

高精度メタ16S
配列データ

UCLUST
Identity > 97%, cov > 90%

OTU代表配列

Reference 16S rRNA
gene database

UCHIME Reference mode
でキメラを検出

UCHIME De novo mode
でキメラを検出

両modeでキメラとされたOTUをキメラと判定、そのOTUを構成する全リードを除去

キメラ除去済みOTURDP Classifierを用いてbootstrap cutoff >= 50%
で各OTUの代表配列を系統アサインメント

Genus-Phylumレベルの系統組成12

MicrobeDB.jp中の既存サンプルとの比較解析
Test Sample1, 2のGenus組成

メタゲノムDB
既存メタ16SサンプルのGenus組成
距離行列計算ユークリッド距離
1-Pearson相関係数
etc.

階層的クラスタリング

Complete Linkage法

解析対象のサンプルと組成が類似したサンプルのみ抽出
組成の可視化

上記の各ステップはRで実行 13

Genus組成によるサンプル間階層的クラスタリングの結果
全体像 約3000ノード

Test Sample1, 2の付近のみ拡大

14

Genus組成の可視化

MicrobeDB.jp中の既存サンプルの環境メタデータやそのGenusの情報をどう整理して提供する？
15

来月と再来月の課題

1. ユーザが入力した環境メタデータを利用した解析
2. 比較解析機能の充実
3. サーバ上でWebアプリケーションを構築
4. ユーザが持つ巨大な配列データをどう扱うか

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