1-2 耐熱性酵素を用いた高安定性乳酸センサの開発●代表者 斎藤 稔（物理生命システム科学科・教授）●分担者 金子寛生（物理生命システム科学科・教授）
澤田博司（総合文化研究室・教授）
間瀬啓介（物理生命システム科学科・教授）
為我井秀行（化学科・准教授）【研究の目的および概要】
バイオセンサは一般に，酵素の優れた分子認識機能を利用しているが，生体分子を利用しているため物理化学センサに比べて安定性が低いという問題がある。本研究では，乳酸値を測定するバイオセンサ（乳酸センサ）に着目し，このセンサに使用する酵素の耐熱性を高めることにより，高安定性の乳酸センサの開発を目指す。
耐熱性酵素を取得する方法としては，自然界に存在する好熱菌などから耐熱性酵素を抽出する方法や蛋白質工学的手法により目的の酵素を耐熱化する方法が考えられる。本研究では，このような 2 つの方法で耐熱性酵素を取得し，それらを用いて高安定性乳酸センサを開発する。センサの構成としては，臨床面の応用時に患者や被験者への負担を軽減するため，少量の検体での測定を可能とする小型なタイプが望まれる。そのため本研究では，以下の 3つのタイプのセンサを試作する。1 つめのタイプでは信号変換部位（トランスデューサ）として市販のペン型の酸素電極を用いる。2 つめのタイプではトランスデューサとして針型の過酸化水素電極を用いる。このタイプでは極めて少量の検体で測定が可能であり，また将来的に患者や被験者の体内に直接刺して測定できることを目指す。3 つめのタイプではトランスデューサとしてチップ型の過酸化水素電極を用いる。このタイプでは数 mm 角の大きさへの小型化が可能であり，将来的に体内埋込み型への発展が期待される。
【研究の結果】
中温菌 Mycobacterium smegmatis，好熱菌 Thermus thermophilus 由来の LMO およびランダム変異とスクリーニングによって取得した耐熱性変異 LOD を用いて，上記の 3 つのタイプの乳酸センサを試作し，いずれのタイプでも 0.1mM 〜 1 mM の濃度範囲で乳酸値を測定できることを確認した（人間の血液中の乳酸濃度は 0.5 mM 〜 20 mM）。しかしながら，これらのセンサの安定性の評価については，酵素固定化膜からの酵素の流出や酵素固定化膜とトランスデューサとの密着性の低下などの要因により正確な評価ができなかった。そこで，市販のフロー型センサ装置（王子計測（株）製）を用い，センサの安定性の評価を行うことにした。その結果，50℃で耐熱性変異 LOD を用いた場合の安定性評価を行ったところ，wild-type LOD を用いた場合には 60 分で約 70％に出力が低下したのに対し，耐熱性変異 LOD を用いた場合には 90％以上の出力が維持されていた。さらに温度を上げ，60℃および 70℃で耐熱性変異 LOD を用いた場合の安定性評価を行ったところ，60℃では約 30％の出力が維持されていたが，70℃では出力がほぼ見られなくなった（wild-type LOD を用いた場合には 60℃および 70℃とも出力は見られなくなった）。以上のこと
から，耐熱性変異 LOD を用いた場合には wild-type LOD よりも有意な安定性の向上が確認され，上記の 3 つの実用型の乳酸センサでも，耐熱性変異 LOD を用いることにより安定なセンサが実現できることが期待される。しかしながら，その安定性が維持される限界の温度は 60℃程度と考えられる。一方，中温菌および好熱菌由来の LMO を用いた場合には，高純度の酵素の精製法がまだ確立しておらず，これまで正確な安定性評価に至っていない。
上記の通りフロー型センサ装置は主にセンサの安定性評価を目的に使用してきたが，このフロー型センサ装置が生体抽出物中の乳酸濃度測定に有用ではないかというアイデアが生じ，これを用いて脳内乳酸濃度測定を行うことを試みた。実験には成獣雄の ddY マウスを用い，全脳を取り出しホモジナイズした後，濾過して測定試料とした。
この試料中の乳酸濃度をフロー型センサ装置を用いて測定したところ，全脳の乳酸濃度が 3 週齢から 7 週齢にかけ3て一度減少し，その後再び 10 週齢で増加するという新しい知見が得られた。また，部位ごとに測定すると，7 週齢での減少は主に大脳と小脳における減少によるものであり，海馬では大きな減少は見られないことが分かった。
【研究の考察・反省】本研究では，乳酸センサに使用する酵素の耐熱性を高めることにより，高安定性の乳酸センサの開発を目指した。
センサの構成としては，以下の 3 つのタイプのセンサを試作した：（1）トランスデューサとして市販のペン型の酸素電極を用いたもの，（2）トランスデューサとして針型の過酸化水素電極を用いたもの，（3）トランスデューサとしてチップ型の過酸化水素電極を用いたものである。いずれのタイプでも 0.1 mM 〜 1 mM の濃度範囲で乳酸値を測定できることを確認した（人間の血液中の乳酸濃度は 0.5 mM 〜 20 mM）。これらのセンサの安定性をフロー型センサ装置を用いて評価したところ，耐熱性変異 LOD を用いることにより安定なセンサが実現できる可能性を確認した。一方，中温菌および好熱菌由来の LMO を用いた場合には，これまで正確な安定性評価に至っていない。これは高純度の酵素の精製法がまだ確立しておらず，不純物を含んだ状態でセンサを作製した場合，それが妨害物質として働き，耐熱性酵素の本来の特性を評価できないためである。今後，ベクターの選択，酵素の再構成条件，カラムの選択，透析条件など酵素の精製法の最適化を行う必要がある。
本研究の当初の目的とは異なるが，センサの安定性評価に使用してきたフロー型センサ装置を脳内乳酸濃度測定に応用することを試みた。その結果，マウスの全脳の乳酸濃度が 3 週齢から 7 週齢にかけて一度減少し，その後再び 10 週齢で増加するという新しい知見が得られた。また，部位ごとに測定すると，7 週齢での減少は大脳と小脳における減少によるものであり，海馬では大きな減少は見られないことが分かった。近年，脳の発達時や長期記憶形成時において乳酸が関与しているという報告がある。今後，脳における乳酸の生理的役割を明らかにしていく上で，フロー型センサ装置の有用性が示された。
【研究発表】
耐熱性酵素を用いた乳酸バイオセンサの開発
島崎亮，市川麻衣，山崎薫，斎藤稔
第 22 回バイオ・高分子シンポジウム，2012 年 6 月 25 日〜 26 日，東京
フロー型乳酸バイオセンサの開発とその脳内乳酸測定への応用
山崎薫，市川麻衣，島崎亮，向井秀夫，斎藤稔
第 50 回日本生物物理学会年会，2012 年 9 月 22 日〜 24 日，名古屋
フロー型乳酸バイオセンサの開発とその脳内乳酸測定への応用
市川麻衣，山崎薫，島崎亮，斎藤稔
第 2 回 CSJ 化学フェスタ 2012，2012 年 10 月 14 日〜 17 日，東京
Noggin 蛋白質とヘパリン糖鎖のドッキングシミュレーションから推測された骨形成異常における BMP シグナルの分子病態モデル
難波一徳，金子寛生，増田佐和子，務台英樹，臼井智子，藤井正人，松永達雄
第 85 回日本生化学会大会，2012 年 12 月 14 日〜 16 日，福岡

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カイコ休眠卵の浸酸処理時における卵殻と卵内のカルシウム量の変動
橘田涼，大川真一郎，山本貴之，外川徹，間瀬啓介，澤田博司
日本動物学会第 83 回大会，2012 年 9 月 13 日〜 15 日，大阪
カイコの休眠と休眠阻害の分子機構澤田博司
第 13 回極限環境生物学会年会，2012 年 12 月 1 日〜 2 日，東京
カイコ第 27 連関群に座乗する笹繭原因遺伝子の絞り込み
間瀬啓介，澤田博司，外川徹，平山力，岡田英二，飯塚哲也，門野敬子，生川潤子，山本公子
平成 25 年度蚕糸・昆虫機能利用学術講演会，2013 年 3 月 18 日〜 19 日，つくば
深海脱窒細菌 Pseudomonas sp. strain MT-1 における 2 種の異化型硝酸塩還元酵素遺伝子破壊株の構築と生育
及川勇二，加藤千明，掘越弘毅，川本純，栗原達夫，為我井秀行
第 13 回極限環境生物学会年会，2012 年 12 月 1 日〜 2 日，東京
Bacillus circulans の抗生物質生合成遺伝子 btrC2 の機能解析
板垣詩織，江口正，澤田博司，為我井秀行
第 13 回極限環境生物学会年会，2012 年 12 月 1 日〜 2 日，東京
深海微生物 Shewanella violacea DSS12 におけるシトクロム c4 の生理的意義
羽賀みなみ，加藤千明，三本木至宏，為我井秀行
第 13 回極限環境生物学会年会，2012 年 12 月 1 日〜 2 日，東京
Shewanella livingstonensis Ac10 のシトクロム c4 酸化活性の温度依存性と耐圧性
迫田彩日，栗原達夫，三本木至宏，為我井秀行
第 13 回極限環境生物学会年会，2012 年 12 月 1 日〜 2 日，東京
深海脱窒細菌における 2 種の異化型硝酸塩還元酵素の生理的役割の解明
及川勇二，加藤千明，掘越弘毅，川本純，栗原達夫，為我井秀行
日本農芸化学会 2012 年度大会，2013 年 3 月 24 日〜 27 日，仙台
Shewanella 属のシトクロム c 4 酸化活性の圧力における影響
迫田彩日，羽賀みなみ，加藤千明，栗原達夫，三本木至宏，為我井秀行
日本農芸化学会 2012 年度大会，2013 年 3 月 24 日〜 27 日，仙台

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【研究成果物】
Corticosterone Induces Rapid Spinogenesis via Synaptic Glucocorticoid Receptors and Kinase Networks in Hippocampus,
Yoshimasa Komatsuzaki, Yusuke Hatanaka, Gen Murakami, Hideo Mukai, Yasushi Hojo, Minoru Saito, Tetsuya Kimoto,Suguru Kawato, PLoS One 7（2012）e34124.
A Study on Odor Sensors Using Copper Phthalocyanine, Shinnosuke Asai, Katsutoshi Saeki, Minoru Saito, Yoshifumi
Sekine, Proceedings of International Technical Conference on Circuits/Systems, Computers and Communications,
C-W2-04, CD-ROM.
Various Firing Patterns Found in a Giant Neuron of the Pond Snail Lymnaea stagnalis and Their Dynamics, Minoru Saito,
Yuuta Hamasaki, Makoto Hosoi, Shogo Nakada, Journal of the Physical Society of Japan 82（2013）034801-1-4.
Fluorescence Voltage Imaging Technique for the Measurement of Molluscan Neural Activities, Yuuta Hamasaki, Makoto
Hosoi, Shogo Nakada, Tomoya Shimokawa, Minoru Saito, Open Journal of Biophysics 3（2013）54-58.
Genetic Analysis of the Electrophysiological Response to Salicin, a Bitter Substance, in a Polyphagous Strain of theSilkworm Bombyx mori, T. Iizuka, T. Tamura, H. Sezutsu, K. Mase, E. Okada, K. Asaoka, PLoS One 7（2012）e37549.
Methyl halide production by cultures of marine proteobacteria Erythrobacter and Pseudomonas and isolated bacteria frombrackish water, T. Fujimori, Y. Yoneyama, G. Taniai, M. Kurihara, H. Tamegai, S. Hashimoto, Limnol. Oceanogr. 57（2012）
154-162.
Molecular analysis of the nitrogen cycle in deep-sea microorganisms from the Nankai Trough: genes required for nitrogen
fixation, H. Tamegai, S. Itagaki, C. Kato, J. Jpn. Soc. Extremophiles 11（2012）33-36.
H. Tamegai, S. Nishikawa, M. Haga, D. H. Bartlett, Respiratory system of the piezophile Photobacterium profundum SS9grown under various pressures, Biosci. Biotechnol. Biochem. 76（2012）1506-1510.
Y. Furuhashi, K. Morioka, H. Tamegai, N. Yoshie, Preparation and some properties of stereocomplex-type poly（lacticacid）/layered silicate nanocomposites, J. Appl. Polym. Sci., 127（2013）1615-1622.

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