2019/7/17

エンテロウイルスD68型（EV-D68）
ー わかっていること・わかっていないこと ー

第18回みちのくウイルス塾 @ 仙台医療センター
国立成育医療研究センター 今村 忠嗣

自己紹介
いま むらただ つぐ

今村忠嗣（32歳）【出身】鹿児島市【略歴】
2007年：東北大学医学部入学
2011年：微生物学分野（博士課程 / MD-PhDコース）
2016年：東北大学医学部卒業
2016年：仙台市立病院（臨床初期研修）
2018年：国立成育医療研究センター（小児科研修）12019/7/17

きっかけ

子供のときのウイルス学者のイメージ
未開の地

ヘリコプターで登場
防護服

軍といっしょに村を封鎖
出血熱
映画 『アウトブレイク』（1995年, 米国）よりきっかけ

学生時代：「学内にすごい先生がいるらしい」→ 「そうだ, 研究室実習で選択しよう」②蚊帳に入れて蚊を集めて…

①フィリピンで水牛を…

押谷 仁 先生④日本脳炎を媒介するイエ蚊を選別③早朝に掃除機で捕獲して…

2

2019/7/17

きっかけ

そんなある日…

ライノウイルスのPCRしてたら変なウイルス捕まえたんだけど解析してみませんか？

………ん？
押谷 仁 先生

はじめに
フィリピンにおける感染症に関する基礎・疫学研究

マニラ

共同研究機関：フィリピン国立熱帯医学研究所

急性呼吸器感染症
急性胃腸炎
狂犬病
フィリピン

人獣共通・節足動物媒介性感染症

32019/7/17

はじめにフィリピンにおける感染症に関する基礎・疫学研究

マニラ
ビリラン
4
共同研究機関：フィリピン国立熱帯医学研究所

パラワン

21

3

急性呼吸器感染症

レイテ

急性胃腸炎
狂犬病
人獣共通・節足動物媒介性感染症

フィリピン

はじめに
フィリピンにおける感染症に関する基礎・疫学研究

マニラ
ビリラン
4
共同研究機関：フィリピン国立熱帯医学研究所

パラワン

2

3

レイテ

1
急性呼吸器感染症
急性胃腸炎
狂犬病

フィリピン

人獣共通・節足動物媒介性感染症

42019/7/17

はじめに
2008年よりレイテ州でウイルス性呼吸器感染症について研究① 小児肺炎研究② 成人肺炎研究2 1
345

Eastern Visayas
Regional Medical Center▷ ３次医療施設▷ 重症呼吸器感染症（SARI）で入院した重症患者が研究対象③～⑤ インフルエンザ様疾患（ILI）研究
レイテ州
Google map

Leyte provincial hospital

Tacloban City Health Center Tanauan Regional Health Unit

▷ 外来医療施設（３箇所）▷ 外来受診しILIと診断された軽症患者が研究対象

はじめにPCR法により複数種類の呼吸器ウイルスを検出研究対象となったウイルス▷ インフルエンザウイルス▷ RSウイルス▷ ヒトメタニューモウイルス▷ ライノウイルス▷ コロナウイルス▷ ボカウイルス▷ WUウイルス▷ KIウイルス

Suzuki A et al, BMC Infect Dis, 2012.

5

2019/7/17

はじめにPCR法により複数種類の呼吸器ウイルスを検出研究対象となったウイルス▷ インフルエンザウイルス▷ RSウイルス▷ ヒトメタニューモウイルス▷ ライノウイルス▷ コロナウイルス▷ ボカウイルス▷ WUウイルス▷ KIウイルス

Suzuki A et al, BMC Infect Dis, 2012.

はじめにライノウイルスを標的とした疫学研究の”思わぬ副産物”
小児肺炎患者から採取した鼻咽頭拭い液（N=816）
ライノウイルス ５‘非翻訳領域（5’UTR）を標的としたPCR
電気泳動

陽性（N=274）陰性（N=542）

シークエンス解析

ライノウイルス（N=245）

EV-D68（N=21）

不明（N=8）
Imamura T et al, EID, 2011.

6

2019/7/17

はじめにエンテロウイルスD68型（EV-D68）• ピコルナウイルス科エンテロウイルス属D種• 急性呼吸器感染症の起因病原体• 1962年米国で小児下気道感染症患者から初分離• 2000年代前半まで希な発生のみ… CDCが米国で行ったEVサーベイランス（1970-2005）で26件のみ報告

はじめにフィリピンの小児肺炎患者 21名＝当時最大のクラスター

なぜライノウイルスを狙ってEV-D68が検出された？

Imamura T et al, EID, 2011.

7

2019/7/17

遺伝子構造
エンテロウイルス：一本鎖プラス鎖RNAウイルス

保存領域

可変領域

スクリーニングを目的としたPCRの標的領域

血清型・遺伝子型の決定を目的としたPCRの標的領域

遺伝子学的相同性
5’UTRで他エンテロウイルス・ライノウイルスと高い相同性
HEV-D種ライノウイルス(%)
Oberste MS et al, JGV, 2002.

8

2019/7/17

遺伝子学的相同性
5’UTRで他エンテロウイルス・ライノウイルスと高い相同性
HEV-D種ライノウイルス

65％前後

50％前後

(%)
Oberste MS et al, JGV, 2002.

ちなみに
EV-D68のライノウイルス（HRV）に類似した生物学的性質
酸抵抗性
至適増殖温度EV-D68HRV

エンテロウイルス一般なし
33℃

なし
33℃

あり
37℃

EV-D68およびHRV↳気道親和性気道(33℃)
胃(pH1.0)

エンテロウイルス一般↳腸管親和性腸管(37℃)
Oberste MS et al, JGV, 2002.

9

2019/7/17

疫学
2000年代後半以降 EV-D68検出数が世界規模で増加

疫学
2008年以降にEV-D68検出が報告されている国々

2014年9月～2015年1月に49州から計1,153例の報告（死亡例14例/1%）

1-20 cases
21-40 cases

41-60 cases
61-80 cases

81-100 cases
101- cases

102019/7/17

疫学
米国アウトブレイク（2014年）：EV-D68感染者の患者背景
重症化因子：気管支喘息・喘鳴性疾患の既往
EV-D68陽性者 (n=611)
1歳未満
51 (8%)
・EV-D68陽性者と陰性者の比較：
1～4歳
209 (34%)
5～11歳
年齢
251 (41%)- 喘息or反復性喘鳴の既往が有意に多い
12～17歳
251 (41%)- 心疾患, 未熟児は統計学的有意差なし
Shuster JE et al, JCV, 2015.
18歳以上
39 (6%)・ICU入室/人工呼吸器管理となったEV-D68陽性者：
性別（女子）
250 (41%)
喘息・喘鳴性疾患
322 (52%)- 喘息・喘鳴性疾患の既往が有意に多い
未熟児
39 (6%)- 未熟児は統計学的有意差なし

基礎疾患

心疾患
免疫抑制状態

15 (2%)
10 (2%)

Midgley CM et al, Lancet Respir, 2015.

Midgley CM et al, Lancet Respir, 2015.

疫学
気管支喘息や反応性気道疾患*のある児への注意勧告* 乳幼児期にウイルス感染や環境因子などにより喘鳴を繰り返す病態(日本小児アレルギー学会喘息治療・管理ガイドライン委員会)

112019/7/17

疫学
米国アウトブレイク（2014年）：EV-D68感染者の症状・転帰
EV-D68陽性者 (n=611)
発熱
294 (48%)
喘鳴
427 (70%)
症状
多呼吸296 (48%)
重症例と軽症例のどちらが多い？
陥没呼吸
261 (43%)
成人患者は本当に少ない？
酸素投与
436 (80%)
NPPV
118 (23%)
治療*挿管/人工呼吸
145 (28%)
ECMO
8 (2%)
集中治療管理338 (59%)
転帰
死亡
5 (1%)* NPPV; non-invasive positive pressure ventilation,
ECMO; extracorporeal membrane oxygenation

Midgley CM et al, Lancet Respir, 2015.

はじめに
2008年よりレイテ州でウイルス性呼吸器感染症について研究① 小児肺炎研究② 成人肺炎研究2 1
345

Eastern Visayas
Regional Medical Center▷ ３次医療施設▷ 重症呼吸器感染症（SARI）で入院した重症患者が研究対象③～⑤ インフルエンザ様疾患（ILI）研究
レイテ州
Google map

Leyte provincial hospital

Tacloban City Health Center Tanauan Regional Health Unit

▷ 外来医療施設（３箇所）▷ 外来受診しILIと診断された軽症患者が研究対象

122019/7/17

臨床像
レイテ州での研究（2008-2011年）：小児では重症例が多い
肺炎（小児）
n=1187

肺炎（成人）
n=456インフルエンザ様疾患
n=3597

EV-D68陽性者数 →n=9210.44% 0.028%

0.76%* p<0.0001 (Fisher’s exact test)*Imamura T et al, PLOS One, 2013.

臨床像
EV-D68による呼吸器感染症の重症度：全体像は不明

医療機関受診を要した患者（肺炎, ILI …）

医療機関受診に至らない軽症患者

132019/7/17

中枢神経疾患米国（2014年9～12月）：計120例の急性弛緩性脊髄炎（AFM*）* AFM; acute flaccid myelitis

Sejvar JJ et al, Clin Inf Dis, 2015.

中枢神経疾患
MRI検査において脳幹および脊髄に病変部位が散在

橋被蓋頚髄
腹側
Case5
FLAIR

Case2
FLAIR

歯状核（小脳）

Case5
T2WI

Case1
T2WI

脊髄前根（脊髄円錐）

脊髄前角

脊髄灰白質（頚髄）
Case1
T2WI

Case1
T1WI

Case6
T2WI（頚髄）

Messacar K et al, Lancet, 2014.

142019/7/17

中枢神経疾患
これらAFM患者の属性 （ ≠ 注 EV-D68によるAFM ）AFM患者 (n=120)
年齢0.4～20.8歳（中央値：7.1歳）
EV-D68の検出：24/120（20%）のみ
性別（女子）（すべて呼吸器検体）49 (41%)

先行する発熱/呼吸器症状
四肢症状

脳神経症状

脱力

105 (90%)
29 (24%)

EV-D68が起因病原体？！
疼痛61 (51%)
顔面神経麻痺

17 (14%)

嚥下障害

14 (12%)

複視10 (9%)
Sejvar JJ et al, Clin Inf Dis, 2015.

中枢神経疾患EV-D68の流行と同時期に急性弛緩性麻痺の患者が増加

Messacar K et al, Lancet Inf Dis, 2018.

15

2019/7/17

中枢神経疾患EV-D68が検出された中枢神経疾患の患者は少数*
年

検出地

患者数

診断

2008

米国11髄膜脊髄脳炎

2012-13

米国22AFP2014

米国34脳神経障害, AFP

2014

フランス41AFP

2014

ノルウェー5EV-D68検出

CSF

血液便

01NANA

NANANANA

40NA

NA

10(現在) EV-D68と中枢神経疾患の関係性
2AFP
20NA

100

2010-14

米国60002012-14

米国7011

2012-15

米国80NA

NA2015

日本92015-16

英国102016

ヨーロッパ115脳神経障害, AFP

呼吸器

5多13 ：疫学情報からの示唆
AFP, 脳炎
139AFM

111急性脳症

10NA

12AFP, GBS

1NANA

229AFM

272NA8少 ：患者からの病原体同定* AFP; 急性弛緩性麻痺, AFM; 急性弛緩性脊髄炎, GBS; ギランバレー症候群, NA; 報告なし.
1 Kreuter JD et al, Arch Pathol Lab 2011.

5 Pfeiffer HC et al, Euro Surveillance 2015.

9 Nakata K et al, Frontier Pediatrics, 2015.

2 Roux A et al, Neurology 2014.

6 Greninger AL et al, Lancet, 2015.

10 Williams CJ et al, Euro Surveillance, 2016.

3 Maloney JA et al, AJNR Am J Neuroradiol 2015.

7 Messacar K et al, Lancet, 2015.

11 Knoester M et al, Ped Inf Dis J, 2018.

4 Lang M et al, Euro Surveillance, 2014.

8 Sejvar JJ et al, CID, 2015.

中枢神経疾患
中枢神経疾患発症に関与するアミノ酸変異の有無は不明**** ; CladeDark red ; 脳炎患者
Red ; AFP患者
Blue ; 呼吸器症状のみ

Greninger AL et al, Lancet, 2014.

16

2019/7/17

国内状況
日本国内でも2010年以降に検出報告数が増加（検出件数）（年）
国立感染症研究所 病原微生物検出情報（Infectious Agents Surveillance Report; IASR）

国内状況

17

2019/7/17

国内状況
EV-D68陽性患者の診断名（2005-2015年）：呼吸器疾患が主体

・・・

・・・

脊髄炎
脳炎
脳症

陽性患者割合（%）
75532321・・・

発熱
下気道炎
上気道炎
喘鳴/喘息

陽性者数 (n=538)
402
285
122113

死亡例からの検出報告は少数2（症例15/2010年） 4歳児, 胃腸炎症状3（症例23/2013年） 0歳児, 発熱症状

11

国立感染症研究所 病原微生物検出情報（Infectious Agents Surveillance Report; IASR）国内状況
EV-D68流行期にAFM患者数が増加（その一部からEV-D68が検出）

Chong PF et al, Clinical Inf Dis, 2017.

18

2019/7/17

まとめ①
EV-D68の疫学や臨床像についての報告から…

わかっていることわかっていないこと- 世界各地で2010年台以降に検出数が増加- 2010年台に流行拡大を起こしたのはなぜ？

- 小児患者の報告数が多く, 重症例も含まれる- 複数システム（呼吸器/中枢神経）の疾患を起こすのはなぜ？

- 呼吸器疾患に加えて中枢神経疾患も起こす
(かも)

まとめ①
EV-D68の疫学や臨床像についての報告から…

わかっていることわかっていないこと- 世界各地で2010年台以降に検出数が増加- 2010年台に流行拡大を起こしたのはなぜ？

- 小児患者の報告数が多く, 重症例も含まれる- 複数システム（呼吸器/中枢神経）の疾患を起こすのはなぜ？

- 呼吸器疾患に加えて中枢神経疾患も起こす
(かも)

19

2019/7/17

分子疫学
近年の流行は遺伝子学的3系統のウイルスで構成(Clade C)(Clade B1/D)(Clade B)(Clade A)

VP1 (capsid) 546nt,
Neighbor joining method x 500

Imamura T et al, Rev Med Virol, 2015.

分子疫学
遺伝子型交代と流行拡大の関係性は不明

台風ハイアン

医学のあゆみ253巻1号

202019/7/17

抗原性Lineage 1-3を分けるアミノ酸変異はVP1:BC・DE-loopに集積↓BC-loopP
123

異なる抗原性の遺伝子型の出現が↓ DE-loop
近年の流行拡大の原因では？
VP1蛋白：loop構造が抗原性に関与（”epitope”）

P
123

P

VP1

P : Prototype
1 : Lineage 12 : Lineage 23 : Lineage3βストランド

123

Mateu MG, Virus research 1995より改変

ループ
Imamura T et al, JVI, 2014.

抗原性

抗原性比較研究のデザイン
Lineage 1

Lineage 2

Lineage 3（2010年山形）（2010年山形）（2010年山形）

YY Y

YY Y

EV-D68腹腔内投与

YY Y抗血清ハートレー系
モルモット（生後6週メス）

中和試験
HI試験

21

2019/7/17

抗原性初代分離株と近年流行株で異なる抗原性

Log2(中和抗体価/10)

1210
86420
抗Lineage 1 Y
モルモット血清近年流行株,初代分離株,

抗Lineage 2 Y
モルモット血清EV71

抗Lineage 3 Y
モルモット血清Imamura T et al, JVI, 2014.

抗原性Log2(HI価 / 10, 100)

近年流行株も遺伝子型間で異なる抗原性

多様な抗原性の遺伝子型の出現が近年の流行拡大に関与した可能性- ヒトで再感染を起こしうるレベルの違いか不明- その他ウイルス学的性質の違いは未検討

抗Lineage 1 Y
Yモルモット血清抗Lineage 2 YYモルモット血清

抗Lineage 3 YYモルモット血清* P<0.05 by Wilcoxon rank sum test

222019/7/17

まとめ①
EV-D68の疫学や臨床像についての報告から…

わかっていることわかっていないこと- 世界各地で2010年台以降に検出数が増加✔
- 2010年台に流行拡大- 小児患者の報告数が多く, 重症例も含まれる- 複数システム（呼吸器/中枢神経）の疾患を起こすのはなぜ？

- 呼吸器疾患に加えて中枢神経疾患も起こすを起こしたのはなぜ？

(かも)受容体結合性EV-D68は赤血球凝集性あり

血球種類何に結合してるの？
モルモット

七面鳥

赤血球凝集性
[1]

羊ニワトリ

[2]

××
[1,2]

[2]

[1] Schieble JH et al, J Epidemiol, 1967.
[2] Imamura T et al, Rev Med Virol, 2015.

EV-D68はシアル酸を介して細胞培地表面に接着し増殖[3] Uncapher CR et al, Virology, 1991.

23

2019/7/17

受容体結合性シアル酸：いろいろ種類がある（特に重要なのは2種類）

α2-6結合型シアル酸

α2-3結合型シアル酸

Kumlin U et al, Influenza Other Resp Viruses, 2008.

受容体結合性
α2-6/2-3結合型シアル酸：立体構造が違う
α2-6結合型シアル酸

α2-3結合型シアル酸“アンブレラ（傘）”“コーン（円錐）”
Viswanathan K et al, Glucoconju J, 2010.

24

2019/7/17

受容体結合性
α2-6/2-3結合型シアル酸：体内分布が違う→疾患が違う
α2-6結合型シアル酸
鼻腔
咽喉頭
気管

結膜
気管支
細気管支
肺胞

α2-3結合型シアル酸
EK Miller et al, JCV, 2013より改変.
Mastrosovich M et al, Top Curr Chem, 2015.
Kumlin U et al, Influenza Other Resp Viruses, 2008.

受容体結合性グリカンアレイ法：6種類のシアル酸糖鎖への結合性を調査
α2-6結合型シアル酸

α2-3結合型シアル酸

25

2019/7/17

受容体結合性EV-D68はα2-6結合型シアル酸に親和性あり
α2-6結合型シアル酸

α2-3結合型シアル酸

Imamura T et al, JVI, 2014.

受容体結合性細胞培地での増殖にもα2-6結合型シアル酸が関与

コントロールα2-3 SA (-)α2-6 SA (-)α2-6 SA (-)α2-3 SA (-)

Baggen J et al, PNAS, 2015.より改変.

26

2019/7/17

受容体結合性EV-D68表面の”canyon”がシアル酸結合部位と推定

Baggen J et al, PNAS, 2015.

受容体結合性
α2-6/2-3結合型シアル酸：体内分布も違う→疾患が違う
α2-6結合型シアル酸
鼻腔

どうやって中枢神経細胞に感染しているの？
（別の受容体があるのでは…？）
咽喉頭
気管

結膜
気管支
細気管支

肺胞

α2-3結合型シアル酸
EK Miller et al, JCV, 2013より改変.
Mastrosovich M et al, Top Curr Chem, 2015.
Kumlin U et al, Influenza Other Resp Viruses, 2008.

27

2019/7/17

受容体結合性
神経特異的なICAM5（intercellular adhesion molecule 5）も受容体

Wei W et al, Cell, 2016.より改変.

（予想される）病態まとめ

呼吸器感染 → ウイルス血症？ → 中枢神経播種（神経行性？*）

ICAM-5
EV-D68α2-6 SAEK Miller et al, JCV, 2013より改変.
* Hixon AM et al, JVI, 2019.

28

2019/7/17まとめ②
EV-D68に関する近年の基礎研究により…

わかっていること- 近年流行株は多様な抗原性の株で構成わかっていないこと- 動物モデルでは？

（近年の流行拡大の一因？）- α2-6 SAとICAM-5を受容体として利用して複数システムに感染

動物モデル
近年報告されたEV-D68の動物モデル
マウス

呼吸器疾患

中枢神経疾患- Balb/c- 経鼻投与- 肺内ウイルス増殖- 気道病理変化- 血中サイトカイン値上昇- Swiss, C57BL, AG129- 経鼻, 筋中, 脳, 腹腔内投与- 神経内ウイルス増殖- 麻痺発現- 神経病理変化(Rajput C et al, JCI Insight, 2018)

コットンラット(Rajput C et al, JCI Insight, 2018
Hixon AM et al, JID, 2017,
Morrey JD et al, Viruses, 2018)- 経鼻投与- 鼻腔, 肺内増殖
- 気道病理変化- 血中サイトカイン上昇(Patel M et al, PLOS ONE, 2016)

フェレット- 経鼻投与
- 肺内増殖- 血中サイトカイン値上昇(Zheng HW et al, Viruses, 2017)29

2019/7/17

動物モデル
呼吸器・中枢神経疾患を同時に発症するBalb/c mice
間質性肺炎

神経細胞損傷Sun S et al, Antivir Res, 2018.より改変.

全体まとめ
以上の全てをまとめると…

わかっていること- 近年世界的に流行（多様な抗原性の株の出現）- 複数システムの疾患（複数種類の受容体）

わかっていないこと- 流行予測は可能？
（周期性, 流行間の感染維持）- 真の臨床像は？
（成人, 軽症患者も含めて）- 小児重症例報告多数- ワクチン, 治療薬は？

- 動物モデル開発中

さらなる研究が必要！

30

2019/7/17

ご清聴ありがとうございました

国立成育医療研究センター 今村忠嗣
E-mail：imamura-t@ncchd.go.jp

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