「細胞をハイジャックするウイルス」スライド説明
東北大学医学系研究科

微生物学分野D3 三村敬司（スライド１）タイトル（スライド２）治療に応用されている 2 次元の画像の 1 例で、CT による肺炎像を示します。
（スライド３）そのほかに、臨床医学でよく用いられる画像で３次元画像の例を示します。
これは肝細胞癌の 3DCT 像です。
（スライド４）4 次元の画像の例だと、胎児（17 週）の動画が例として挙げられます。これらのような画像が最近は臨床応用されているのです。
（スライド５）最近のインフルエンザでは、このような診断方法が治療に応用されているのです。ここからは、感染増殖しているインフルエンザウイルスをどのような画像で観察できるのかを追及したいと思います。
（スライド６）もともとは直接観察したいという探究心でした。
（スライド７）どのようにしたら感染の過程を観察できるかについてですが、まずこれまで行われてきた方法をご説明します。
（スライド８）大きくは 3 つの手法があり、①ウイルスのラベル・②ウイルスゲノム/mRNAの標識・③蛍光標識抗体の細胞内への導入です。
（スライド９）ここで紹介するのはその基礎となる蛍光タンパク質についてです。オワンクラゲの蛍光タンパク質をクローニングしたところが発端です。
（スライド１０）このタンパク質を発現させることによりさまざまな現象の観察が可能になりました。その発見と応用で 3 名の科学者がノーベル化学賞を受賞しています。
（スライド１１）研究に応用されている代表的な蛍光タンパク質をスライドに示します（スライド１２）予断ですが、いま小田急新江ノ島水族館ではオワンクラゲの展示をしていますので、興味がある方はご来場ください。
（スライド１３）感染過程の観察にどうやってこの蛍光タンパク質を応用するかですが、ウイルスのタンパク質と融合させて発光させられないかと考えました。
（スライド１４）インフルエンザウイルスの RNA 分節では M１タンパク質が多いことがわかっています。ここに焦点を絞ってみます。
（スライド１５）M1 タンパク質はそもそもウイルス膜を裏打ちするタンパク質です。感染が成立した細胞では核内のゲノム複製やウイルスゲノムの核外輸送、出芽に関与します。
（スライド１６）ただ、GFP を M1 タンパクの N 末端と C 末端につけた場合では蛍光の仕方が違います。ごらんのように、N 末端につけないと細胞がうまく見えないということが判りました。
（スライド１７）ここでは動画で核内の M1 タンパクやウイルス発芽をライブイメージングによりお見せします。
（スライド１８）しかし、これまで抗 M1 抗体を用いた染色でさえ核内の集積が観察されなかったことはどうしてでしょうか。
（スライド１９）観察法の違いを検証してみます。今回の蛍光タンパクを用いた観察ではパラホルムアルデヒドで固定後に細胞膜に Triton X100 で細胞膜に穴を開けています。
（スライド２０）従来の抗 GFP および抗 M1 抗体による免疫染色では核内顆粒が見えない。
ひょっとすると抗体が核内にたどり着いてないのかも知れないと疑いました。
（スライド２１）メタノール固定とパラホルムアルデヒド固定で比較してみると、従来のパラホルムアルデヒドでは見えなかった顆粒がメタノール固定では見えるようになります。
（スライド２２）メタノール固定であれば従来の観察法でも核内に M1 タンパクを観察でしました。
（スライド２３）しかしこの解析には問題点があります。M1 に GFP をくっつけると分子量が倍になり、その挙動は元の M1 と同じではないだろうと考えられるからです。また、
M1 タンパク自体は後期タンパク質なのですが、この観察法では最初からタンパクとして存在することとなり、本来の姿を観察しているとは言いにくいからです。
（スライド２４）しかし M1 単独発現細胞でも M1 タンパクは同様に核内に認められます。
（スライド２５）EGFP/M1 を発現させると、抗 M1 抗体で蛍光のある部分以外にも発現があるため、どうやら見ているものが違うようです。
（スライド２６）GFP に代わる生細胞観察方法を探ることが必要になりました。
（スライド２７）ここで Tetra-Cystein

タグ（TC タグと略）を用いた観察法を紹介します。
（スライド２８）TC タグの検出原理とその利点です。あとで FIAsH 試薬を加えることにより蛍光が観察できるというものですが、TC 部分そのものが低分子量であり、FIAsH 試薬が生細胞の膜を通過できるため、パルスーチェース実験ができるという利点を持ちます。
（スライド２９）TC/M1 ウイルスを実際に作成するとなると、ウイルスの産生量は 102 ほど減るのがスライドに示したグラフからお分かりになると思います。これは実験には支障のない範囲なので、問題なしと考えました（スライド３０）TC/M1 ウイルス感染細胞を実際に蛍光染色したスライドを示します。
（スライド３１）蛍光染色の経時変化を動画で示します。感染後 4 時間程度は合成された
M1 タンパクが核内に認められます。一部は細胞質にも存在しているようにも見えます。
（スライド３２）そこで、細胞質内に存在する M1 タンパクを染色して、CT のように横断面を観察してみました。
（スライド３３）切片像を示します。細胞質内というよりも細胞表面に見えるような印象を持ちます。
（スライド３４）抗 HA 抗体で染めたものと比較してみると細胞表面の HA と M1 タンパクが同じように染まって見えます。
（スライド３５）先ほどと同様に CT のようなスライスで比較して見ます。
（スライド３６）パラホルムアルデヒド固定した場合は HA と M1 が細胞表面で共存しているようには見えなかったものの、今回は共存して見えます。
（スライド３７）つまり、TC タグを用いるとさまざまな応用が可能だといえます。
（スライド３８）ウイルス粒子の FIAsH ラベルの画像です。
（スライド３９）これは細胞をホモジェナイズして電気泳動したゲルの写真です。M1/TCのウエスタンブロットでは M1 タンパクの 1 部しか染色できませんでした。
（スライド４０）TC タグの応用につき説明していきます。
（スライド４１）TC/M1 以外の組み換えウイルスを検証してみました。TC/NP は核内から蛍光が出ることがありません。TC/M2 と TC/HA はきれいに染色できませんでした。
（スライド４２）では、今まで見てきた核内顆粒はなんだろうと考察してみます。
（スライド４３）細胞の核内構造を示します。
（スライド４４）先ほどのスライドに示した構造物で、GFP/M1 細胞に見られた核内顆粒は PML とは一致しているように見えます。しかしどうも SC35 とは違うようです。
（スライド４５）TC/M1 ウイルスでも核内顆粒は PML と一致しました。
（スライド４６）では、なぜ PML と一致するのでしょう？
（スライド４７）PML ボディーは老化、発ガン、アポトーシスに関与し、刺激を受けると内部のタンパク質などの構成成分が変化していくことが知られています。
（スライド４８）また、PML はインフルエンザウイルスの増殖を抑えることが知られています。
（スライド４９）そして PML には多くのバリアントが存在しています。
（スライド５０）そのバリアントごとで、インフルエンザウイルスの活性抑制は異なっていることも知られています。
（スライド５１）ここで生細胞での PML のウイルス活性抑制効果を FRAP 解析してみます。FRAP 解析とはレーザーを定点に照射することでその動きを解析する手法です。
（スライド５２）結果を示します。M1 タンパクの発現で PML の動きが抑制されることが判ります。
（スライド５３）つまり、M1 タンパクが PML に集積して PML の抗ウイルス効果を抑制していると考えられます。
（スライド５４）まとめです。GFP や TC タグにより M1 タンパクを生細胞で観察できました。その過程で核内の PML ボディーに M1 タンパクが集積することを新規に発見しました。このことにより、M1 タンパクは PML ボディーをハイジャックすることで PML の抗ウイルス効果を抑制している可能性が示唆されたと考えます。
質疑応答
質問 1 O 先生「HA と M1 の同居は、核の高さで同様に認められるのは、細胞表面に出て行く前に何か細胞内で interaction があると考えられないか？」
回答「局在しているのは細胞表面であり、細胞内に見えているだけのこと。それはないと考えます。」
質問 2 N 先生「M1 をラベルできたのはゲノムに余裕があったからで、ほかのタンパクは余裕がなかったからラベルできなかったのか？」
回答「そのとおりです。
」
質問 3 Ｎ先生「ほかのタンパクには TC タグをつけられなかったのか？」
回答「M2、HA、NA につけることはできたが、増やしても染色できませんでした。」
N 先生「TC タグだけが抜け落ちて元のタンパクのみ発現しているのではないか？」
回答「検証していないので良くわかりません。」
N 先生「T 大学医科学研究所では、TC タグだけ抜け落ちていることを確認している。追求してみたらよいのではないでしょうか？」
質問 4 NI 先生「PML の阻害については、動きを見ただけですか？」
回答「PML だけを抜き出して検証するのはとても困難です。成功したのはこの検証だけでした。」
NI 先生「では PML のほかの観察方法はないのか？」
回答「今模索しています。
」