2-8 タンパク質分子の機能解明と産業利用のための統合的基盤研究●代表者

茶圓 茂（物理生命システム科学科・教授）●分担者

中里勝芳（物理生命システム科学科・教授）
斎藤 稔（物理生命システム科学科・教授）
金子寛生（物理生命システム科学科・教授）【研究の目的および概要】
生体の中で重要なはたらきを担っているタンパク質を研究対象とし，その機能について原子レベルで解明することを目指す。それに基づき，様々な生命現象の仕組みに関するより深い理解を目指す。また，いくつかのタンパク質については，それらの産業への利用に視野を向けた応用的側面についても可能な限り検討を試みる。1 つの研究対象（生体分子もしくは生命現象）に対して，生化学・生理学・生物物理学・構造生物学・計算機化学などの多角的視野から，診断や創薬などの医療産業分野，食品・化学産業分野あるいはエネルギー産業分野への応用技術の開発を目指していく。
【研究の結果】
2 偏光分岐光学装置は以下のように組み立てた。顕微鏡はオリンパス倒立型顕微鏡 IX71 を用い，その側面ポートから 105mm の位置に一辺が 38mm の立方体の偏光ビームスプリッターを置き，通過する p 偏光とスプリッタと直角に出てくる s 偏光とに分けた。そして通過方向と直角方向にそれぞれ 40mm 離れた位置に焦点距離 40mm の凸レンズを置き，平行光とし，その 2 つの p 偏光と s 偏光の像はふたたびミラーによって，高感度 CCD カメラの撮像面に100mm 凸レンズを用いて投影した。ただし，それぞれの偏光像を導くミラーを調整することにより，CCD 撮像面の左右 2 画面になるようにした。すなわち，左半分は p 偏光の像，右半分は s 偏光の像となるようにした。2 偏光を分岐しているかどうかを確かめるために，顕微鏡試料面に偏光フィルターを回転させて，その回転に応じて，撮像イメージが出力画面上で左右交互に表れることを確認した。

茶圓

フィコキサンチン - クロロフィル a/c- 結合タンパク質（FCP）は珪藻に存在する特殊な光捕集タンパク質である。
4 種類の珪藻，C. gracilis, T. pseudonana, C. meneghiniana, および P. tricornutum に含まれる FCP の会合状態を比較したところ，FCP オリゴマー形成は C.gracilis, T. pseudonana, C. meneghiniana に認められるが，P. tricornutum には認められなかった。

中里

レーザー共焦点顕微鏡を用いたカルシウムイメージング（機能的多ニューロン画像法 functional multineuroncalcium imaging; fMCI 法）により，マウス海馬スライスにおいて，単一細胞レベルの分解能で様々な時空間活動パターンが存在するという通常の蛍光顕微鏡を用いたカルシウムイメージングでは得られなかった知見を得ることができた。例えば，ステロイドホルモンの 1 種であるコルチコステロン（ストレスホルモン）は個々のニューロンの活動を抑制し，さらにそれらの間の同期性にも影響を及ぼすことを見出した。

斎藤

importin αファミリー分子と転写因子のドッキング計算を行い，この計算結果だけに基づき，結合力の違いを予測し，議論できるかを調べた。その結果，ClusPro を用いることにより，importin α2 の NLS 結合部位（正常に核輸送される場合の結合部位）および C 末端部位（核輸送が阻害される場合の結合部位）のそれぞれに，転写因子が結合する複合体構造についておおよそ再現できることを確認した。

金子【研究の考察・反省】
最終目的は蛍光 1 分子の回転をこの装置でイメージングすることである。はじめにその蛍光分子の励起として落射型蛍光励起法で試したが，これでは背景にある蛍光分子を励起して，バックグラウンド蛍光が大きくなり蛍光 132

分子のイメージングには適さないことが判明し，エバネッセンス光照明法を組み込んだ，スライドグラス表面近くにある蛍光分子のみを励起することのできる全反射顕微鏡システム装置を組み立てた。ただし通常の全反射顕微鏡システムでは 1 方向の偏光の励起ビームになるので，輪帯照明光学系と呼ばれる，レーザー光の照射を 1 点から円にすることにより蛍光物質を全角度から励起できる装置を新たに組み立てた。これにより背景光が抑えられ，蛍光1 分子の回転がイメージングできることが期待できる。

茶圓

P. tricornutum を除く 3 種の珪藻には FCP オリゴマー形成に中心的に働く共通のサブユニットの存在が示唆された。また，FCP トリマーは全ての珪藻に見られたが，タンパク質組成はまったく異なっていた。これらの結果に基づき，4 種の珪藻における FCP のオリゴマー形成とトリマー形成の役割について考察した。

中里

コルチコステロンが海馬の活動を抑制することは，通常のカルシウムイメージングによっても明らかにされていたが，f ＭＣＩ法を用いることによりコルチコステロンがニューロン間の活動の同期性にも影響を及ぼしているという新しい知見を得た。今後は海馬が異なった活動状態にあった場合に，コルチコステロンがどのような影響を及ぼすかを調べる予定である。

斎藤

ドッキング計算により求められた構造を詳細に観察すると，結晶構造を正確に再現していない部分も見られた。
また，結合に関する自由エネルギーの差は，わずかであり，確実に有意というには，条件を変えて多くのテストをする必要がある。
原因として，剛体ドッキングによる計算の限界が考えられ，受容体̶リガンド両者フレキシブルなドッキングによる最適化や分子動力学計算などのより詳細な計算が今後必要となるであろう。

金子【研究発表】
Maruta, T., Miyazaki, S., Kobatake, T., Chaen, S. Nucleotide turnover rates of bipolar myosin filament during actin
filament sliding. 第 51 回日本生物物理学会 , 2013. 10.30. 京都
Koyama, T., Maruta, T., Shibata, K., Mochizuki, A., Umeki, E., Iwai, S., Chaen, S. Effect of mutation in the SH1 helix
region of Dictyosterium myosin II on the motile characteristics. 第 51 回日本生物物理学会 , 2013. 10.30. 京都
Various spatiotemporal activity patterns of mouse hippocampal slices and the nonlinear analysis
Yuuta Hamasaki, Hiromi Osanai, Akiyoshi Suzuki, Minoru Saito
Neuro 2013, June 20-23, 2013, Kyoto
Spatiotemporal patterns of neural activities in the olfactory center of the land slug and the nonlinear analysis（II）
Kohei Ishida, Tomoya Shimokawa, Yuuta Hamasaki, Minoru Saito
Neuro 2013, June 20-23, 2013, Kyoto
SAW センサを用いた室内環境測定システムに対する一検討
杉山克俊，佐伯勝敏，斎藤稔，関根好文

平成 25 年電気学会電子・情報・システム部門大会，2013 年 9 月 4 日〜 7 日，北見マウス海馬スライスの CA1 領域における様々な時空間活動パターンのレーザー共焦点イメージング（II）
市川麻衣，小山内裕美，浜崎雄太，斎藤稔

第 51 回日本生物物理学会年会，2013 年 10 月 28 日〜 30 日，京都
マウス海馬スライスに見られる時空間活動パターンに対する解析法の提案
和泉翔大，浜崎雄太，小山内裕美，斎藤稔

第 51 回日本生物物理学会年会，2013 年 10 月 28 日〜 30 日，京都33

チャコウラナメクジ嗅覚中枢における時空間神経活動パターンの膜電位イメージング
下川智也，石田康平，浜崎雄太，小松崎良将，斎藤稔

第 51 回日本生物物理学会年会，2013 年 10 月 28 日〜 30 日，京都
チャコウラナメクジの脳嗅覚中枢における自発振動活動の長時間相関解析
田中裕一，江藤多門，芳賀祥平，斎藤稔，小松崎良将

第 51 回日本生物物理学会年会，2013 年 10 月 28 日〜 30 日，京都
ヨーロッパモノアラガイの中枢神経系における神経活動の膜電位イメージング（II）
相川裕貴，仲田正吾，細井誠，小松崎良将，斎藤稔

第 51 回日本生物物理学会年会，2013 年 10 月 28 日〜 30 日，京都
フロー型乳酸バイオセンサを用いたマウスの脳内乳酸測定
山崎薫，市川麻衣，島崎亮，斎藤稔

第 51 回日本生物物理学会年会，2013 年 10 月 28 日〜 30 日，京都
匂い刺激時におけるナメクジ嗅覚中枢・前脳葉の神経活動解析
江藤多門，芳賀祥平，斎藤稔，小松崎良将

第 3 回生物物理学会関東支部研究会，2014 年 3 月 6 日〜 7 日，東京
奥山隆英，山岸良介，安原徳子，米田悦啓，金子寛生，“核内輸送因子による転写因子の認識および核輸送制御機構の解明” 第 86 回日本生化学会大会 （2013）
Kazunori Namba, Sawako Masuda, Hideki Mutai, Hiroki Kaneko, Tatsuo Matsunaga,“Novel pathological model of SYM-1 and conductive hearing loss revealed by docking simulation of Noggin and heparin”
36th MidWinter Meeting of the Association for Research in Otolaryngology: Baltimore Marriott Waterfront HotelBaltimore, Maryland, USA February 16-20, 2013
Kazunori Namba, Hiroki Kaneko, Sawako Masuda, Hideki Mutai, Satoko Usui, Tatsuo Matsunaga,“Novel pathological model of Proximal symphalangism and conductive hearing loss revealed by docking simulationof Noggin and heparin” 9th Molecular Biology of Hearing & Deafness Conference: Conference Center at Li Ka Shing
Center, Stanford School of Medicine Stanford, CA, USA June 22 – 25, 2013
【研究成果物】
Haruo Sugi, Takahiro Abe, Takakazu Kobayashi, Shigeru Chaen, Yoshiki Ohnuki, Yasutake Saeki, Seiryo Sugiura,
Enhancement of Force Generated by Individual Myosin Heads in Skinned Rabbit Psoas Muscle Fibers at Low IonicStrength” , PLoS One. 2013 May 15: 8（5）: e63658
Ryo Nagao, Shuji Takahashi, Takehiro Suzuki, Naoshi Dohmae, Katsuyoshi Nakazato, Tatsuya Tomo, Comparison ofoligomeric state and polypeptide compositions of fucoxanthin chlorophyll a/c-binding protein complexes among various
diatom species. Photosynth. Res.（2013）117, 281-288.
Coherency Evaluation of Spatiotemporal Neural Activities in the Molluscan Olfactory Center Applying ExtracellularRecording with Wavelet Analysis, Yuuta Hamasaki, Tomoya Shimokawa, Kohei Ishida, Yoshimasa Komatsuzaki, Satoshi
Watanabe, Minoru Saito, Open Journal of Biophysics 3（2013）291-297.
Oscillatory Pattern Generation of the Olfactory Center Hardware Model of the Land Slug, Hidefumi Masumoto, Yuuta
Hamasaki, Tomoya Shimokawa, Ken Saito, Minoru Saito, Information 17（2014）637-648.

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フロー型乳酸バイオセンサの開発とマウスの脳内乳酸測定への応用，山崎
斎藤薫，島崎亮，市川麻衣，小山内裕美，稔，日本大学文理学部自然科学研究所紀要 No.49，pp.299-303，2014.

Noriko Yasuhara, Ryosuke Yamagishi, Yoshiyuki Arai, Rashid Mehmood, Chihiro Kimoto, Toshiharu Fujita, Kenichi Touma,Azumi Kaneko, Yasunao Kamikawa, Tetsuji Moriyama, Toshio Yanagida, Hiroki Kaneko and Yoshihiro Yoneda, “Importin
Alpha Subtypes Determine Differential Transcription Factor Localization in Embryonic Stem Cells Maintenance”
Developmental Cell 26, 123–135（2013）35