研究用試薬 PERFORMAgeneTM 使用方法
動物用 DNA 採取キット PG-100
はじめにPERFORMAgene は、動物から DNA の採取および保存のために開発された研究用試薬です。病気の診断や創薬のための使用はできません。取り扱いには十分ご注意頂きますようお願い致します。
※商品に同梱されているすべての添付資料（安全データシート：SDS など)を確認の上、本製品をご利用下さい。
※本書および SDS を常に一緒に保管して下さい。
※SDS ダウンロード用 URL：
https://www.kyodo-inc.co.jp/documents/bio/nucleic_acid/13_SDS_Performagene_PG100.pdf※PERFORMAgene は、採取前、採取後ともに室温(15～30℃)で管理、保存して下さい。

ステップ１ 検体の採取方法
注意：チューブに入っている液体は、DNA の保存溶液となっています。捨てないで下さい。
採取を行う前にチューブからキャップを外さないで下さい。
口腔内から採取を行う場合
・採取を行う 30 分前からは食事を、10 分前からは水を与えないで下さい。
・動物の歯や頬をこすらないようにして下さい。
・動物がスポンジを噛まないように注意して下さい。
1．頬袋や舌の下など、唾液が溜まる場所に 30 秒ほどスポンジを当て唾液を採取して下さい。6 か月齢以上の動物の場合、適度な拘束が必要になる場合があります。

㈱協同インターナショナル〒216-0033

神奈川県川崎市宮前区宮崎 2-10-9

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TEL:044-853-2958

E-mail:kikaku@kyodo-inc.co.jp

FAX:044-854-2958

2．チューブを垂直に持ち、キャップを外します。

3．キャップを逆さにし、スポンジをチューブの中に挿入してキャップを閉じます。液漏れ防止のために、キャップはしっかりと閉めて下さい。

4．チューブを上下逆に 10 回程度よく振り、唾液と保存溶液を完全に混合させます。

鼻腔内から採取を行う場合・鼻腔内がきれいであれば品質のよい DNA が得られますが、土や餌などが多少混入していても問題はありません。
・他の家畜 DNA が混入しないように、採取の際はスポンジの取り扱いに注意してください。
1．鼻腔内に 5 秒間ほどスポンジを当て採取を行います。採取後はスポンジ表面が鼻腔内検体で湿っていることを確認してください。6 か月齢以上の動物の場合、適度な拘束が必要になる場合があります。

2．チューブを垂直に持ち、キャップを外します。

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3．キャップを逆さにし、スポンジをチューブの中に挿入してキャップを閉じます。液漏れ防止のために、キャップはしっかりと閉めて下さい。

4．チューブを上下逆に 10 回程度よく振り、唾液と保存溶液を完全に混合させます。

膣内から採取を行う場合
・膣内がきれいであれば品質のよい DNA が得られますが、糞などが多少混入していても問題はありません。動物が排便した直後での採取は避けることを推奨します。
・採取を行う際には、動物の月齢に関係なく適度な拘束が必要となります。
・他の家畜 DNA が混入しないように、採取の際はスポンジの取り扱いに注意してください。
1．チューブを持った手とは反対の手で動物の尾を抑え、スポンジを 5 回ほど膣内に出し入れして採取を行います。

2．チューブを垂直に持ち、キャップを外します。

3．キャップを逆さにし、スポンジをチューブの中に挿入してキャップを閉じます。液漏れ㈱協同インターナショナル〒216-0033

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防止のために、キャップはしっかりと閉めて下さい。
4．チューブを上下逆に 10 回程度よく振り、唾液と保存溶液を完全に混合させます。

ステップ 2．PERFORMAgene による DNA 保存
採取した検体が PERFORMAgene の保存溶液と混ざり合うと、直ちに DNA は安定した状態になります。
この混合溶液(唾液と保存溶液)は 1 年間、室温(15～30℃)で保管することができます。
下記に示す精製マニュアルによって DNA を得ることができます。
長期的に保存する場合は、-15℃～-20℃での凍結保存が可能です。

ステップ 3．PERFORMAgene からの DNA 精製
以下は精製溶液(PG-AC4)を用いた DNA 精製用のマニュアルです。
下記に示すプロトコルは、500µL の PERFORMAgene サンプルから DNA を精製する方法です。500µL 以下のサンプルを精製する際は、試薬の量をそれに応じて調整して下さい。
【必要な機器/試薬】
・遠心分離器(15,000xg で使用)
・ウォーター/エアーインキュベーター(50℃で使用)
・95～100％エタノール
・TE バッファー
・70％エタノール
・5M NaCl 溶液
唾液サンプル(唾液と保存溶液の混合溶液)500µL からの精製方法
精製手順

備考

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1. サンプルを 5 秒間転倒攪拌させ、液体を混合さ ・粘性の高い検体と保存溶液を十分に混合するたせます。

めです。
・この加熱処理は、DNA を十分に抽出するために行います。ヌクレアーゼを完全に不活化させるために必ず行ってください。
・この加熱処理は、どの段階(唾液採取後、精製直2. サンプルを 50℃にてインキュベートします。 前)でも行うことが可能です。
ウォーターバスでは最低 1 時間、エアーインキ ・サンプルの均一性を保つため、チューブから唾ュベーターでは最低 2 時間インキュベートし 液を分注する前に Oragene のチューブのまま加熱ます。

処理を行ってください。
・この加熱処理は、オーバーナイトで実施することも可能です。
・エアーインキュベーターでは、ウォーターバスよりも熱伝導性が低いため、より長めの加熱処理が必要です。

3. スポンジの先端をチューブ内壁に押し付け、検体をスポンジから絞り出します。

4. PERFORMAgene サンプル 500µL を 1.5mL のマイクロチューブへ移します。

・この作業を行うことにより、より多量のサンプ
ルを得られます。

・残ったサンプルは、室温または凍結（-15℃～20℃）で保存することができます。
・冷蔵（4℃）での保存は行わないでください。

5. マイクロチューブに PG-AC4 を 20µL（サンプ ・不純物や阻害物質が沈殿し、サンプルが混濁すルの 1/25）添加し、数秒よく攪拌させます。

6. 氷上で 10 分間静置します。

ることもあります。
・室温処理も可能ですが、氷上よりも不純物を取り除く効果が多少劣ります。

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・より長い時間(最長 15 分間まで)遠心させること
7. 室温で 5 分間、遠心分離( 15,000 x g)させます。 で、最終的な DNA 溶液の濁度(A320)を下げる可能性があります。
8. マイクロチューブ壁面に生じたペレットを巻き込まないよう、静かに上清液を新しいマイクロチューブに移します。ペレットが付着しているマイクロチューブについては破棄します。

・ペレットは不純物を含んでいます。誤ってペレットを崩してしまった場合は、もう一度遠心分離を行うことを推奨します。

9. 上清 500µL に対し 5M NaCl を 25µL(上清の ・DNA の回収率を上げるために NaCl 添加を行い1/20)加えて混合させます。

ます。
・エタノールを加えることで DNA が沈殿します。

10. 室温の 95～100％エタノール 600µL を上清500µL に加えて静かに混合させます。

サンプル中の DNA 量によっては DNA が沈殿物として確認できます。
・沈殿物が見えない場合も、以降の手順に従いDNA を回収してください。

11. サンプルを室温で 10 分間静置し、DNA を沈殿させます。

・不純物と DNA が混ざり合って沈殿する可能性があるため、低温（-20℃）での静置は避けて下さい。

・チューブのキャップのヒンジ部がローターの中
12. 室温で 2 分間、遠心分離( 15,000 x g)させます。

心に対して逆方向となるよう配置します。遠心分離させた際に DNA 沈殿物がヒンジ部の下に沈殿し、簡単に見つけられます。
・沈殿したペレットには DNA を含んでいます。
ペレットを失うことで、最終的な DNA 収量も減る可能性があります。

13. ピペットで上清を取り除きます。沈殿したペレ ・ペレットをチューブ内壁に残すように、ピペッット状の DNA に触れないよう注意してくだ トで上清のみを取り除いてください。
さい。

・上清には不純物が含まれている可能性があります。可能な限り全て取り除いてください。
・ペレットの過度な乾燥は、以降の手順においてDNA の溶解を阻害します。

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14. ペレットに 70%エタノール 250µL を静かに添加し、室温で 1 分間静置します。その後ペレットを乱さないように、エタノールを完全に除去します。

・ペレットを乱さないように注意して下さい・ペレットが崩れてしまった場合は、15,000 x g で5 分間遠心分離させてください。
・このステップはサンプル内に存在する阻害物質を除去するために行います。

15. さらに 6 秒間遠心分離を行い、ピペットでエタ ・残留したエタノールが、その後のアプリケーシノールを可能な限り取り除きます。

ョンに影響を及ぼす可能性があります。

16. TE buffer100µL(または類似の低塩 Buffer)を添加し、ペレットを溶解させます。最低 5 秒間ボルテックスミキサーで撹拌します。
室温で一晩放置することで DNA が完全に再水和されます。定量を行った後、アプリケーションへの使用が可能になります。

・高分子 DNA は buffer に溶解するまでに時間がかかる場合があります。
・水和が不十分な DNA は正確な定量が行えなえず、その後の PCR などのアッセイにおける失敗を招きます。

17. ★オプション
DNA を完全に再水和するためには以下のいずれかの手順を追加して下さい。

・高分子の DNA 必要とする場合には c)を推奨しa)ボルテックスミキサーによる攪拌b)時々ボルテックスミキサーにて攪拌を行います。

ながら、50℃にてインキュベートする。
c)室温にて 1～2 日インキュベートする。
18. 完全に再水和された DNA についての保存方法は以下のいずれかになります。

・長期的な保存は-20℃での凍結を推奨します。

a)TE Buffer に溶解した状態で-20℃にて一定 ・TE Buffer に溶解した DNA を凍結すると DNA
期間保存は沈殿します。解凍する際は、ステップ 17 以降かb)TE Buffer に溶解した状態で 4℃にて 2 ヶ月 らプロトコルに従って処理してください。
間保存

DNA の定量化
DNA サンプル中の二本鎖 DNA(dsDNA)の定量は、260nm での吸光度測定よりも蛍光色素㈱協同インターナショナル〒216-0033

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を使用した測定の方が正確です。RNA のコンタミが少ない為、Picogreen や Sybrgreen な
どの蛍光色素を使用し二本鎖 DNA を定量することを推奨します。Sybrgreen を使用した安価なプロトコルは下記 DNAgenotek 社のウェブサイトより入手可能です。
https://www.dnagenotek.com/ROW/pdf/PD-PR-075.pdf
他にも市販されている Invitrogen 社 QuantiT Pico Green dsDNA Assay Kit Cat. No. Q33130 も使用できます。どちらのプロトコルにおいても精製した DNA を TE で 1:50 で希釈し、5ul を定量分析に使用することを推奨します。
吸光度測定におけるアドバイス
DNA を吸光度で定量する場合は、まず RNase で処理し、RNA を分解しエタノール沈殿でRNA の破片を除外することを推奨します。詳細プロトコルは下記 DNAgenotek 社のウェブサイトをご参照下さい。
https://www.dnagenotek.com/ROW/pdf/PD-PR-040.pdf
PERFORMAgene の DNA サンプルは血液サンプルに比較すると RNA が多く含まれている点をご注意下さい。必ずアルコール沈殿後の DNA が完全に水和してから吸光度を測定するようにして下さい。

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