メタボロームデータ解析と活用法：
データベースとオンラインツールの使い方

早川 英介
理化学研究所 環境資源科学研究センター
メタボローム情報研究チーム

1

• 本講義の目的• メタボロミクスデータの解析法を理解し、研究に活用する• 本講義の対象• 質量分析のデータ解析に慣れていない方• 他のオミクス研究者• 講義内容• メタボロミクスデータの簡単な解説• 公共レポジトリ• データ解析ツール2

質量分析によるメタボローム分析

+
試料

液体/ガス
クロマトグラフィー

Mass/charge

質量分析

膨大な質量ピーク情報• 質量電荷比• シグナル強度• 保持時間• ターゲット分析：
あらかじめ測定対象（ターゲット）を決めて分析を行う• ノンターゲット分析：
測定対象を設定せずに分析を行い、検出された質量ピーク全てに関して解析を行う
3

メタボロミクスデータ処理フロー
機器分析(LC/GC-MS)

Rawデータ

試料

MSデータ処理・ピーク検出 ・アライメント
・Feature検出 ・代謝物アノテーション

データ行列(比較定量テーブル)

データ解析

試料A

試料B

試料C

試料D

Metabolite A501009080

Metabolite B

100907560

Metabolite C

306010090

Metabolite D

301008060

多変量解析
エンリッチメント解析
4質量分析におけるRAWデータ

Rawデータ• 生・未加工のLC/GC-MSデータ• 装置のセッティング・質量電荷比・ion count値の配列・クロマトグラム情報• ベンダーが提供しているSDK等で中身へのアクセスは可能

公共フォーマットmzML••••

Open format
XMLベース
ほとんどのMS関連ソフト・ツールで読み込み可
Msconvert（ProteoWizard）でベンダー形式から変換可能
5

RAW データの中身.mzML• 装置• 測定条件• その他の情報• イメージング ：• イオンモビリティ

XY位置情報： Drift bin

MSデータ処理• スペクトル処理• データアライメント••••

Scan number
spectrum type (MS1 or 2)
m/z 配列Intensity 配列• Mass feature検出• データ行列生成

6

メタボロミクスのデータレポジトリ
Metabolights (EMBL-EBI)
メタボロミクス実験と関連情報のレポジトリ (1333studies)
Metabolomics Workbench (UC San Diego)
メタボロミクスデータベース・レポジトリ・解析ツール(2747 studies)
Metabolomic Repository Bordeaux
植物に特化したメタボロミクスレポジトリ(58 projects)
MetaboBank (DDBJ)
メタボロミクスデータレポジトリ。MAGE-TAB formatによるメタデータの記述(104 studies)• Rawデータに加え試料・実験条件などのメタデータを格納• 結果の再現性・データ共有の観点から論文投稿時に強く求められる• 再解析や他のオミクスデータとの連携など利用価値は高い
7

レポジトリデータの活用法・再解析
メタボロミクスレポジトリ
興味ある現象・試料
他オミクス（geno/transcript/proteo）• 実験情報• Rawデータ• データ行列• 代謝物の観点からの知見• オミクスデータ統合
データ解析プラットフォーム• 代謝パスウェイ情報• 代謝物情報• 生物学的解釈• 多変量解析• エンリッチメント解析
8

Metabolights• メタボロミクス研究のためのデータベース/レポジトリ• Rawデータ、実験情報、データ行列（比較定量テーブル）等が登録• Cross-species, cross-technique• 化合物情報など関連情報、外部データベースとの接続性• Studies: プロジェクト単位での各種デー

タのレポジトリ• Compounds: 代謝物構造データベース

https://www.ebi.ac.uk/metabolights/

9

レポジトリ上のデータのブラウジング（Browse Studies）

ヒットしたStudies

分析法
Organism• Metabolights上には多数の”Study”として研究データセットがRawデータ、定量テーブル、各種メタデータと共に格納されている。
（1333 studies 2023Aug）• Studyを• 分析法：Mass spectrometry/NMR• Organism• Organism partで検索して取得することが可能OrganismPart
https://www.ebi.ac.uk/metabolights/

10

各Studyのデータ

https://www.ebi.ac.uk/metabolights/editor/MTBLS3505• Descriptors:
studyの内容を示すkeyword• Protocols:
試料調整・MS分析法・アノテーション法まで含む処理の概要• Samples:
各サンプルの概要• Assays:
各サンプルで行われた一連の処理の詳細• Metabolites:
Studyで検出された代謝物のリスト• Files:
各種ファイル11

ファイル構成• S_MTBLS****.txt ファイル: 各サンプル・Rawデータに関する情報のテーブル• i_investigation.txt: Studyに関する各種メタデータ• maf.tsvファイル：アノテーションされた代謝物のデータ行列12試料の種類・実験条件

サンプル

S_MTBLS****.txt
Sample nameCharacteristic 1

Characteristic 2

Characteristic 3

C1

Mouse

KidneyControl

C2

Mouse

KidneyControl

N1

Mouse

KidneyDrug Treated

N2MouseKidneyDrug Treated

サンプル

代謝物

maf.tsv

Database ID

inchi

Metabolite name

C1C2

N1

N2

CHEBI:17263

InChI=…

Estrone1.69E+08

7.0E+08

5.7E+08

7.2E+08

CHEBI:80658

InChI=…

Dihydrocortisol

1.52E+09

1.2E+09

3.6E+09

1.4E+09

CHEBI:732

InChI=…

Adipate semialdehyde

3.26E+09

1.9E+09

3.2E+09

1.4E+09

CHEBI:2490

InChI=…

3-Aminopentanedioate

1.69E+08

7.0E+08

3.2E+09

3.6E+06

CHEBI:28791

InChI=…

N-[(2S)-2-Amino-2-c…

1.69E+08

1.4E+09

7.1E+08

3.6E+09• サンプル情報テーブル（S_MTBLS***.txt）と比較定量テーブル(maf.tsv)にメタボローム解析に必要な主要データが含まれている。
13• 両ファイルを組み合わせることで容易に再解析が可能になるメタボロミクスデータ解析• メタボロミクスでは膨大な代謝物データが得られるため、データを要約する解析が重要• 多変量解析が良く用いられる• 主成分分析 (Principle component analysis)• 部分的最小二乗法 (Partial least squares)• 生物学的な解釈のためのエンリッチメント解析

データ行列（比較定量テーブル）

多変量解析• データの傾向・要約• 重要な代謝物の選択

エンリッチメント解析• 代謝パスウェイ特定• 生物学的な解釈
14

メタボロミクスデータ解析ツール
MSデータ処理• MS-DIAL: 多様な装置の形式に対応したMSデータ解析ツール。
ピーク検出・デコンボリューションやアノテーションで活躍。
MSデータ処理• MZmine: マススペクトロメトリデータの解析のためのソフトウェア。ピーク検出、アライメント、データの視覚化、および多変量解析のサポートを含む。
解析・解釈• Metabolomics workbench:レポジトリ・データベースに加えさまざまなメタボロミクス解析ツールを提供するウェブベースのプラットフォーム。多変量解析のサポートも含む。
解析・解釈• MetaboAnalyst: ウェブベースのツールで、多変量解析・エンリッチメント解析を含む多数のデータ解析機能を提供する。
APIやR言語での利用も可能
15

MetaboAnalyst• カナダのアルバータ大学のDavid Wishartと マギル大学のJianguo Xiaの研究グループにより運営されているフリーのWebサービス
http://www.metaboanalyst.ca/••

Xia, J., Wishart, D.S. (2011), “Web-based inference of biological patterns,
functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst”, NatureProtocols., 6, 743-760.
Pang, Z., Chong, J., Zhou, G., Morais D., Chang, L., Barrette, M., Gauthier, C.,
Jacques, PE., Li, S., and Xia, J. (2021) MetaboAnalyst 5.0: narrowing the gap
between raw spectra and functional insights Nucl. Acids Res. (doi:10.1093/nar/gkab382)• メタボロミクスデータの解析と解釈を支援するための包括的なウェブベースのツールであり、様々な統計的な解析手法を統合して、研究者がメタボロミクスデータを解釈するのを助ける。
16

Metaboanalystデータ解析メニュー

①
②
③
④
多変量解析

https://www.metaboanalyst.ca/①Raw spectra: ピーク処理前のRawデータ②MS peaks: ピーク検出後の質量電荷比・シグナル強度情報のリスト③Annotated Features: アノテートされた化合物のリスト④Generic Format: csv, tsvフォーマットの様々なデータ

17

データの準備（Metabolightsから）

サンプル

S_MTBLS****.txt

Sample nameCharacteristic 1

Characteristic 2

Characteristic 3

C1

Mouse

KidneyControl

C2

Mouse

KidneyControl

N1

Mouse

KidneyDrug Treated

N2

Mouse

KidneyDrug Treated

群A
群B

サンプル名

代謝物

maf.tsv

Database ID

inchi

Metabolite name

C1

C2

N1

N2

CHEBI:17263

InChI=…

Estrone1.69E+08

7.0E+08

5.7E+08

7.2E+08

CHEBI:80658

InChI=…

Dihydrocortisol

1.52E+09

1.2E+09

3.6E+09

1.4E+09

CHEBI:732

InChI=…

Adipate semialdehyde

3.26E+09

1.9E+09

3.2E+09

1.4E+09

CHEBI:2490

InChI=…

3-Aminopentanedioate

1.69E+08

7.0E+08

3.2E+09

3.6E+06

…

…

…

…

…

...

…

C1C2

N1N2

サンプル名

Metabolite name

群A

群A

群B

群B

群名

Estrone1.69E+08

7.0E+08

5.7E+08

7.2E+08

Dihydrocortisol

1.52E+09

1.2E+09

3.6E+09

1.4E+09

Adipate semialdehyde

3.26E+09

1.9E+09

3.2E+09

1.4E+09

3-Aminopentanedioate

1.69E+08

7.0E+08

3.2E+09

3.6E+06

…

…

…

...

…

化合物名
多変量解析用テーブル

18メタボロミクスにおける代表的な多変量解析手法• 主成分分析 (Principle component analysis)• 大量の代謝物（変数）を説明する主成分を軸として次元を削減• サンプル群の代謝物プロファイルの傾向を可視化

https://genap.metaboanalyst.ca

19

メタボロミクスにおける代表的な多変量解析手法• 部分的最小二乗法 (Partial least squares)• 目的変数（サンプル情報等）と予測変数（代謝物群）の関係を潜在変数を介してモデリングを行う。
• 目的変数への寄与が高い代謝物を選択

https://genap.metaboanalyst.ca

20

操作手順（多変量解析）

ファイルアップロード
入力データの確認

Normalization/scaling
PCA

絵

解析結果のメニュー21

エンリッチメント解析
Metabolite set enrichment analysis (MSEA)• メタボロームデータと代謝パスウェイを関連づける手法• t-検定などの統計的仮説検定は個々の代謝物について有意なものを選ぶが、エンリッチメント解析では代謝経路ごとに計算を行う。
• 「群間で変動している代謝物」と「代謝パスウェイ（metaboliteset）」をマッチングし、特定の代謝パスウェイが統計的に有意に変動しているかを検証。
代謝経路X変動した物質数

変動しない物質数

合計

代謝経路Xの物質数10515

代謝経路X以外の物質数

107585

合計

2080100• （統計的に厳密な解釈には注意が必要）

22

MetaboAnaystでのエンリッチメント解析
エンリッチメント解析
ID変換ツール• （変動・有意差のあった）代謝物リストをテキストボックスに入力• 入力名はcompound name (HMDB)や各種ID が利用可能• ID変換はID conversion toolが利用可能

23

入力情報の確認・標準化（Name/ID Standardization）

https://www.metaboanalyst.ca/• ユーザーの入力した代謝物情報の確認• マッチしない（認識されない）代謝物は黄色でハイライトされるのでviewリンクから正しい名前を確認

24

解析で用いる代謝経路の分類指定（Parameter Setting）

https://www.metaboanalyst.ca/• 目的に合った代謝経路の分類を選択する。
• 一般的なメタボロミクスの場合はPathway-associated metabolite sets(SMPDB)を選択• 他のオミクス解析でKEGG、SNPs、組織等の情報と連携させる場合は該当の物を選択• 自分で作成した代謝経路の分類・代謝物のセットを利用することも可能
25

エンリッチメント解析結果①

https://www.metaboanalyst.ca/

代謝パスウェイ/代謝物セット

Enrichment ratio• Enrichment ratio: 特定の代謝パスウェイ(代謝物セット)内の代謝物の頻度と、全体のデータセット内のその頻度との比率。
26

エンリッチメント解析結果②

https://www.metaboanalyst.ca/

エンリッチメント解析結果のP-valueとEnrichment Ratioを可視化
27解析結果の詳細https://www.metaboanalyst.ca/• Holm P : Holm法による多重比較補正を行ったp-value• FDR:

想定される偽陽性の割合• Viewリンクから代謝パスウェイ/代謝物セットの詳細が確認できる
28

マルチオミクス（マルチセット）のデータ解析• マルチセットPLS• 教師有マルチセットPLS-ROG(Yamamoto, H., Journal of Chemometrics, 31(3) (2017) e2883)• Joint Pathway Analysis (MetaboAnalyst)• マルチセット多変量解析の結果で統計的に優位な遺伝子・タンパク質・代謝物に対してエンリッチメント解析を行う。

from MetaboAnalyst tutorial page(https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/docs/Tutorials.xhtml)
29

MetaboanalystにおけるJoint Pathway Analysis• Menu• データ入力
Organism

Genes/proteins• 結果

Metabolites• 詳細30解析結果のダウンロード①②①エンリッチメント解析結果②使用した代謝物リスト・マッチ結果③④③各種画像ファイル④Rコード31

Summary• メタボロミクスデータ解析の流れ• Rawデータ→MSデータ処理 → データ行列 →解析• 公共データレポジトリ• Rawデータに加え各種ファイルを取得可能• 構造化されたデータファイルから効率的に再解析を行う• データ解析ツール• 多変量解析でデータの傾向と重要な代謝物を知る• エンリッチメント解析で代謝パスウェイと生物学的な解釈へ

32

質量分析インフォマティクス• 質量分析インフォマティクス研究会（http://ms-bio.info/)• 「質量分析法を用いた研究分野（特にオミクス研究）のデータ解析」の研究者の交流の場• ハッカソン（国内版バイオハッカソンと共同開催）・ソフトウェア講
習会・ミートアップ（テーマごとのディスカッション・情報交換）• メタボロミクス実践ガイド （書籍）
• 試料調整、機器分析、データ解析まで網羅
https://www.yodosha.co.jp/yodobook/book/9784758122511/• 質量分析インフォマティクス入門• 質量分析インフォマティクスに関する各種情報を紹介
https://mass-spec-info.github.io/metaboguide/（google検索：”質量分析インフォマティクス” & “github”）

33