関東森林研究論 文68-1(2017)

ヤクタネゴヨウ、クロマツの針葉・芽切片からのカルス誘導と細胞培養
Callus formation and cell culture from needle and bud segments of Pinus armandii var. amamiana
and P. thunbergii
細井佳久＊1 ・丸山 E. 毅＊１
Yoshihisa HOSOI＊１ and Tsuyoshi MARUYAMA＊１＊１ 国立研究開発法人 森林総合研究所
National Research and Development Agency Forestry and Forest Products research Institute
要旨：ヤクタネゴヨウは絶滅が危惧されている種であるが、大径木となるため、クロマツ同様増殖が可能であれば材利用を期待できる。しかし、両樹種ともスギカミキリが媒介するマツ材線虫病により個体数は減少している。このため、種子胚を利用した増殖法や、組換え技術を利用したザイセンチュウ抵抗性個体の作出研究が進んでいる。しかし、種子胚の細胞は親木とは遺伝的に異なる。そこで針葉や芽の切片を利用した再分化系の開発を目指し、基礎的な実験を行った。両樹種について千代田苗畑（茨城県かすみがうら市）に植栽されている個体から６月に採取した針葉と芽を材料とした。基本培地にオーキシンとして 2,4-D を 0.6μM、サイトカイニンとして BAP やゼアチンを 6μM添加した固形培地上で培養した結果、両樹種ともカルスを形成した。得られたカルスについてプロトプラストを単離し、96 ウェル培養プレート内で液体培地を用い、暗黒下、培養した。その結果、細胞の分裂が観察され、クロマツではコロニーが形成され、ヤクタネゴヨウではその後、カルスを得ることができた。ヤクタネゴヨウの芽切片由来のカルスから液体培養細胞を誘導し、プロトプラストを単離した。
キーワード：プロトプラスト・液体培養細胞・マツ材線虫病
Abstract: Pinus armandii var. amamiana is an endemic species, but becomes a large tree. Therefore, the wood can be used like aJapanese black pine (P. thunbergii). However, the number of these species decreases by damage of pine wilt disease. Therefore thestudies about techniques of propagation and genetic transformation with seed embryo tissues are developed. But the cell of a seedembryo is different from the cell of a stock hereditarily. Basic experiments were made aiming at development of the regeneration
system from segments of needles and buds. Experiment samples were extracted as materials from the individual planted in Chiyoda
nursery (Kasumigaura city, Ibaraki pref.) in June. After culture on basic media containing of 0.6 μM 2,4-D and 6 μM BAP or Zeatin
the tissues of these species were formed calli. Protoplasts isolated from the calli were cultured in liquid media using 96 well plates
in the dark. Protoplasts of P. thunbergii formed colonies and protoplasts of P. armandii var. amamiana formed calli. Suspension
cells were obtained from bud tip-derived calli and protoplasts were isolated from the cells.
Key-word: Protoplast, Suspension cells, Pine wilt disease

Ⅰ はじめにってきた。具体的には、種子胚から胚再生能力を持つ細日本には数種のマツ属樹木が生育しているが、マツ材胞を誘導し、その培養細胞から不定胚を多数形成させて、線虫病による被害が甚大な種が多い。ヤクタネゴヨウも大量増殖法やその保存法に関する研究を進めてきた（４,近年ではクロマツなどと同様にその被害が深刻化してい５, 6, 7, 8, 10 ）。クロマツについても主に育種目的のたる。ヤクタネゴヨウは現在、環境省レッドリストランク

め、種子胚を用いた増殖実験を行っている（２,３,９,11 ）。

で絶滅危惧 IB 類(EN)に指定されており、成育状況の調

しかし、種子胚は生殖器官であり、その組織・細胞は親査や保護活動がなされている。しかし、大径木となるた木のものとは遺伝的に異なる。そのため、種子胚由来のめ、近年までは、丸木舟や建築材として広く利用されて細胞を用いても、育種目的で選抜された個体や、保護のきた。そのため、筆者らは材利用と遺伝資源保全を目的ために現地に残された個体そのものを増殖することにはとし、組織・細胞培養技術を用いた増殖方法の開発を行ならない。そこで今回は、栄養組織である針葉や芽の組－1 －（受理日 2017 年 3 月 24 日）

織・細胞を用いて増殖実験や分化実験を試みた。また、断し、100ml 培養広口フラスコで振とう培養した。培地

ゲノム編集などの遺伝子改変を行う際に、エレクトロポは 10µM 2,4-D を添加した 30ml MS 液体培地を用いた。

ーレーション法や PEG 法などの適用や、遺伝子導入処振とう回転数は、60r.p.m.とした。培養は暗黒下、25℃

理後の細胞をキメラにすることなく取り出すことを想定で行った。プロトプラスト単離の酵素液組成や処理は、し、細胞壁がなく、細胞が単一の状態で存在するプロト前述した方法で行った。

プラストの単離・培養を試みた。
Ⅲ 結果と考察Ⅱ 方法

１．実験材料の殺菌 それぞれの切片についての殺菌１．実験材料の組織培養 茨城県かすみがうら市の千効果を表－１に示した。
針葉切片の場合、両樹種とも３％

代田苗畑に植栽されているヤクタネゴヨウとクロマツか代のコンタミ率であった。しかし、芽切片では殺菌剤のら、2015 年６月に採取した針葉と芽を使用した。針葉は濃度を上げたり処理時間を延長したりしたが、コンタミ約 1.5cm に、芽は先端部を約２cm に切断した切片を殺率は上昇した。芽の部分は鱗片で覆われていることと、菌して培養した。殺菌は、針葉切片の場合２%の次亜塩材料採取時期が６月と梅雨時であったためと思われる。

素酸ナトリウム水溶液でヤクタネゴヨウは 20 分、クロ２．カルス形成 ヤクタネゴヨウ、クロマツとも針葉

マツは 30 分、芽切片の場合ヤクタネゴヨウは２%、クロ切片、芽切片で同様にカルスの形成がみられた（図－１）。

マツで３％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液で 50 分、それぞれ撹拌して行った。
培養は、16 時間蛍光灯照明、25℃の環境下、90mm シャーレ内で、基本培地として硝酸アンモニウム濃度を１/２に下げた MS と DCR（１）培地を用い、2,4-D を 0.6µM、BAP あるいは Zeatin を６µM、１cm

ショ糖を２％、寒天を 0.7%添加した固形培地で行った。
２．誘導したカルスからのプロトプラストの単離・培
養① ヤクタネゴヨウ 針葉切片由来カルスをメスで細断したものを、酵素液として１％セルラーゼ̏オノズカ˝

１cm

RS、0.25%ペクトリアーゼ Y-23、0.6M マンニトールを40ml 入れた 100ml 広口培養フラスコ内で、約６時間静図－１．ヤクタネゴヨウのカルス形成の例置処理した。処理後、62µm のナイロンメッシュでろ過（上：針葉切片 下：芽切片）したものを 80×ｇで遠心し、沈殿したプロトプラストを

Fig.1 An example of callus formation from a segment

回収して 0.6M マンニトールで洗浄・精製した。プロト

of P. armandii var. amamiana

プラストの培養は、96 ウェル培養プレートを用い、暗黒(Above: A needle tip Below: A bud tip)

下 25℃で静置培養した。培地には、0.6M マンニトールいずれのカルスも同様の形態をしており、誘導時と同を含み、オーキシンとして 2,4-D を１, 10, 30µM と、サじ培地で増殖し、継代培養することができた。
しかし、イトカイニンとして BAP あるいは Zeatin を０,１, 10µM多芽などの器官分化はみられなかった。筆者らは、ヒの濃度で組合わせて添加した液体培地を用いた。培養密

ノキやサワラの葉条切片の培養において、今回用いた度は２×103 プロトプラスト / ml とした。芽切片由来カ改変 MS 培地で培養し、多芽体を得ている。また、DCRルスについても同様に酵素処理し、単離したプロトプラ

培地はサトウマツ( Pinus lambertiana )の茎葉の分化ストを培養した。培養は 2,4-D と BAP とを組合せた培促進に効果があると報告されている（１）。しかし、今地条件についてのみ行った。

回の実験では器官分化に対して効果は認められなかっ② クロマツ 針葉切片由来カルスについて、酵素処た。基本培地のほか、用いるオーキシンやサイトカイ理はヤクタネゴヨウと同様に行った。培養は、0.6M マン

ニンの種類や濃度についてもさらに調べる必要がある

ニトールと 10µM 2,4-D を含む DCR 液体培地を用い、かもしれない。

２×104 プロトプラスト / ml の密度で培養した。
３．ヤクタネゴヨウ芽切片由来カルスからの液体培養細胞の誘導・プロトプラストの単離 カルスをメスで細－３．プロトプラストの単離・培養①ヤクタネゴヨウ 針葉、芽切片由来カルスから単離

2 －関東森林研究68-1(2017)

したプロトプラストの直径は、どちらの場合も約 40 かさせることができたが、茎葉などの器官分化には至ってら 60µm であり、生存率は約 80%であった（図－２）。

いない。プロトプラストからのコロニー形成率の向上を培養３週間後のコロニー形成率について表－２、３に示図るとともに、分化に適した培地条件を調べる必要があした。針葉由来カルスから単離したプロトプラストにつる。

50µm100µm

図－２．針葉切片由来カルスから単離したプロトプラス
トFig.2 Protoplasts isolated from needle tip-derived calli

図－４．針葉カルス由来プロトプラストから形成されたコロニー

いて、2,4-D を 10µM 添加した培地で培養した場合に、Fig.4 Colony formation from protoplasts of needle tip-

コロニー形成率が 14.5%となり最高値を示した。他の材

derived calli

料や培地条件も含め、2,4-D については 10µM 以上の添加がコロニー形成に対して効果的であった。５週間後、コロニーを 0.2M マンニトール、10µM 2,4-D を添加した
DCR 液体培地に移植した。培養には 24 ウェル培養プレートを用いて暗黒下培養した。１ヶ月細胞を増殖させた
後、0.6µ M 2,4-D と 6µM BAP、0.7%寒天を添加した
DCR 固形培地で 16 時間蛍光灯照明下、25℃で培養した。

100µm

その結果、緑色のカルスを形成した（図－３）。

図－５．茎葉切片由来カルスから誘導した液体培養細胞
Fig.5 Suspension cells obtained from bud tip-derived
calli

1cm
図－３．プロトプラストから得られたカルス
Fig. 3 Calli derived from protoplasts②クロマツ プロトプラストのサイズ、生存率ともヤクタネゴヨウとほぼ同じであった。培養２，３週間後には少数だが分裂し、コロニーが形成された（図－４）。現在増殖用培地に移植し、観察中である。

50µm

４．液体培養細胞の誘導とプロトプラストの単離 １週間程度で細胞が遊離し、増殖した。増殖細胞は、２週間ごとに誘導時と同じ培地で継代培養可能であった（図図－６．液体培養細胞から単離したプロトプラスト－５）。また、カルスからの単離と同様な方法でプロトプ

Fig.6 Protoplasts isolated from suspension cells

ラストの単離が可能であった（図－６）。
Ⅳ さいごに
今回、栄養組織である針葉や芽切片からカルスを形成－

3 －表－１．殺菌後のコンタミ率

謝辞：なお、本研究の一部は、JSPS 科研費 JP16K14949

Table 1 Contamination rate after sterilizationの助成を受けた。
引用文献

ヤクタネゴヨウ ( P. armandii var. amamiana )（１）GUPTA, P. K., DURZAN, D. J. (1985) Shoot

コンタミ切片／コンタミ

multiplication from mature trees of Douglas-fir

全培養切片率 [%](Pseudotsuga menziesii) and sugar pine (Pinus

針葉切片

5/146

3.4lambertiana). Plant Cell Reports 4：177-179

芽切片

11/86

12.7

（２）細井佳久・丸山 E. 毅 （2015）国産マツの不定胚形成による再分化と器官培養による分化の試み. 関東森林研究 66(2)：111-114

クロマツ ( P. thunbergii )コンタミ切片／コンタミ

全培養切片

率 [%]

針葉切片

14/396

3.5

芽切片

127/23753.6（３）細井佳久・丸山毅（2011）クロマツのプロトプラ
スト培養による不定胚の形成とその発芽. 関東森林研
究 62：147-150（４）細井佳久・石井克明（2007）ヤクタネゴヨウのコピーをつくり危急に備える. 屋久島の森のすがた「生命の島」の森林生態学（文一総合出版）123-131

表－２．針葉切片由来カルスから単離したプロトプラス（５）細井佳久・丸山エミリオ・石井克明（2005）ヤクトのコロニー形成率

タネゴヨウ自生個体の未熟種子からの不定胚形成と茎葉

Table 2 Colony formation rate of protoplasts isolated

分化. 日本森林学会関東支部大会発表論文集 56：113-

from needle tip derived-calli

114
2,4-D[μM]（６）細井佳久・丸山エミリオ・石井克明（2003）絶滅BAP[μM]131030

危惧種ヤクタネゴヨウの不定胚形成細胞の誘導と分化.

00014.58.5

日本森林学会関東支部大会発表論文集 54：171-172

1013.59（７）HOSOI, Y., ISHII, K.（2001）Somatic

100045.5

embryogenesis and plantlet regeneration in Pinus

armandii var. amamiana. In: Morohoshi, N.,
Komamine, A. (eds.) Molecular Breeding of Woody

2,4-D[μM]
Zeatin[μM]131030Plants, Elsevier Science：313-3180005.58（８）ISHII, K., Hosoi, Y., MARUYAMA, T.,

100.5

1.55.5KANETANI, S. (2011) Preservation of an in vitro

10000.53＊数値は２ウェルの平均
表－３．芽切片由来カルスから単離したプロトプラストのコロニー形成率
Table 3 Colony formation rate of protoplasts isolated
from bud tip derived-calli

propagated endangered species Pinus armandii var.

amamiana (Koidz.) Hatusima. Propagation ofOrnamental Plants 11(4) : 210-212（９）丸山 E. 毅・細井佳久（2015）ポリエチレング
リコール又は高濃度ゲランガムを添加した培地上で成熟したクロマツ不定胚からの植物体再生. 関東森林研究66(1)：69-72（10）MARUYAMA, E., HOSOI, Y., ISHII, K. (2007) Somatic

2,4-D[μM]
BAP[μM]

13103001.25

1.75

43.5

120.5

2.5

1.75

100.5

0.25

4.25

1.75

＊数値は４ウェルの平均

embryogenesis and plant regeneration in yakutanegoyou, Pinus
armandii Franch. var. amamiana (Koidz.) Hatusima, an
endangered species in Japan. In Vitro Cellular Developmental
Biollogy-Plant 43(1)：23-34（ 11 ） MARUYAMA, E., HOSOI, Y., ISHII, K. (2005)
Somatic embryogenesis and plant regeneration of JapaneseBlack pine. Journal of Forest Research 10(5) : 403-407－4 －