（論文

要様 式 ３ ）旨Regulation of KIF2A by Antitumor miR-451a Inhibits Cancer
Cell Aggressiveness Features in Lung Squamous CellCarcinoma
肺扁平上皮癌において癌抑制型 miR-451a はKIF2A を制御して肺癌細胞の進展を抑制する
内田章文【序論及び目的】
肺癌は世界的にも死亡者数が最も多い癌の 1 つである。肺癌の多くは非小細胞肺癌であり、その大部分を肺腺癌、肺扁平上皮癌が占める。肺腺癌の予後は各種キナーゼ阻害薬や免疫チェックポイント阻害薬の出現により劇的に改善したが、肺扁平上皮癌の治療選択肢は依然として少ない。
近年、様々な癌において、機能性 RNA である microRNA (miRNA) の発現異常が癌の発生・進展・転移に関与することが示されている。我々は、癌抑制型 miRNA である miR-144-5p、miR-144-3p が癌促進遺伝子である NCS1 を標的として肺扁平上皮癌細胞の進展を抑制すること、miR-144-5p、miR-1443p の低発現および NCS1 の高発現が肺扁平上皮癌の予後不良に関与することを報告した。miR-144-5p、miR-144-3p をコードする領域は 17 番染色体長腕に存在し、近傍に miR-451a をコードする領域があり、三者は cluster を形成している。cluster を形成する miRNA は一括に転写され、共通した病態に関与することが報告されている。そこで、肺扁平上皮癌において重要な miR-144-5p、miR-144-3p と cluster を形成している miR-451a に着目した。本研究では、肺扁平上皮癌において miR-451a の腫瘍抑制効果を解析し、miR-451a が制御する腫瘍進展に関わる重要な癌促進遺伝子を同定する。
【材料及び方法】
2010 年から 2013 年に鹿児島大学病院で手術された肺扁平上皮癌 30 検体、非癌部 20 検体より RNAを抽出し、qRT-PCR 法により miR-451a の発現を解析した。細胞株はヒト肺扁平上皮癌細胞株である
EBC-1 細胞、SK-MES-1 細胞を使用した。miR-451a を核酸導入し、miR-451a の腫瘍抑制機能を評価した。機能解析は核酸導入細胞の増殖能、遊走能、浸潤能、apoptosis 誘導能を評価した。miR-451a の標的遺伝子の選出には TargetScanHuman database、GEO database を利用し、ゲノム科学的手法で解析した。臨床 database 解析には TCGA database、cBioPortal、OncoLnc を利用し、統計学的手法にて解析した。標的遺伝子の臨床検体での発現は免疫染色にて評価した。miR-451a による標的遺伝子の抑制効果
は、miR-451a 導入細胞より RNA、蛋白を抽出し、qRT-PCR 法、western blotting で評価した。miR-451aと標的遺伝子内の予測結合配列との直接的な結合はルシフェラーゼレポーターアッセイで評価した。
標的遺伝子の機能評価は、標的遺伝子の siRNA を導入した細胞株を用いて機能解析を行った。標的遺伝子が制御する分子ネットワークの解析には、GEO database、KEGG pathway categories を利用した。
【結果】

〔肺扁平上皮癌手術検体での miR-451a の発現解析および miR-451a 発現による臨床 database 解析〕
qRT-PCR 法による肺扁平上皮癌手術検体での解析で、肺扁平上皮癌部 (n = 30) では、非癌部 (n =20) と比較し、有意に miR-451a の発現低下を認めた (p < 0.001)。
TCGA database を利用した解析で、肺扁平上皮癌における miR-451a の発現低下は予後不良に関連した (5 年生存率: p = 0.035、5 年無病生存率: p = 0.029)。多変量解析で、miR-451a の発現低下は臨床病期や TNM factor とは独立した予後不良因子であった (hazard ratio = 0.667、p = 0.029)。
〔miR-451a の腫瘍抑制機能〕
miR-451a を EBC-1 細胞、SK-MES-1 細胞に核酸導入し、機能解析を行った。miR-451a 導入細胞において、XTT assay では増殖抑制を認め (p < 0.001)、apoptosis の誘導を認めた (p < 0.001)。また woundhealing assay では遊走能の抑制を (p < 0.001)、invasion assay では浸潤能の抑制を認めた (p < 0.001)。
〔miR-451a の標的遺伝子候補の選出〕
TargetScanHuman database を用いて miR-451a と結合する可能性のある 543 遺伝子を抽出した。次に、543 遺伝子から GEO database (accession no. GSE 19188) を利用し、肺癌で発現が亢進している 49 遺伝子を選出した。さらに miR-451a を核酸導入した SK-MES-1 細胞で発現が低下している 15 遺伝子を選出した。15 の候補遺伝子のなかで、TCGA database を利用した解析で、発現高値が予後不良に関連した KIF2A に着目し (5 年生存率: p = 0.043、5 年無病生存率: p = 0.028)、その後の解析を行った。
〔miR-451a 核酸導入による KIF2A の発現抑制〕
EBC-1 細胞、SK-MES-1 細胞への miR-451a 核酸導入により、mRNA (qRT-PCR 法、p < 0.001) および蛋白レベル (western blotting) で KIF2A の発現抑制を認めた。EBC-1 細胞、SK-MES-1 細胞に miR-451aの予測結合配列を含んだ KIF2A の 3’-UTR をクローニングした vector と miR-451a とを遺伝子導入した
ところ、ルシフェラーゼ活性が有意に低下した (p < 0.001)。このことから、miR-451a は KIF2A の 3’UTR における特定の配列に直接作用し、KIF2A の発現を抑制していることが示された。
〔KIF2A の免疫染色および KIF2A 発現による臨床 database 解析〕
肺扁平上皮癌臨床検体における KIF2A の発現を免疫染色で評価し、非癌部と比較し、癌部で高発現していることを確認した。TCGA database を利用した多変量解析で、KIF2A の高発現は臨床病期や TNM
factor とは独立した予後不良因子であった (hazard ratio = 1.493、p = 0.034)。
〔KIF2A の機能解析〕
si-KIF2A を EBC-1 細胞、SK-MES-1 細胞に核酸導入し、機能解析を行った。si-KIF2A 導入細胞において、XTT assay では増殖抑制を認め (p < 0.001)、apoptosis の誘導を認めた (p < 0.001)。また woundhealing assay では遊走能の抑制を (p < 0.001)、invasion assay では浸潤能の抑制を認めた (p < 0.001)。
〔KIF2A が制御する分子経路の探索〕
si-KIF2A を導入した SK-MES-1 細胞で発現が低下した 3621 遺伝子を選出し、そのうち GEO databaseにおいて肺癌で発現が亢進している 92 遺伝子を選出した。KEGG pathway categories での解析で、KIF2Aは cell cycle、p53 signaling pathway、DNA replication の経路を制御していることが判明した。
【結論及び考察】
肺扁平上皮癌において、miR-451a は癌抑制性 miRNA として機能し、KIF2A を直接的に制御する。
KIF2A は癌促進遺伝子で、KIF2A の発現抑制により肺扁平上皮癌細胞の進展が抑制される。癌抑制型
miRNA を起点とした癌関連遺伝子の探索は、肺扁平上皮癌の病因を解明する新しい分子ネットワークの発見につながる可能性がある。
（Cancers. Vol.11, No.2 2019 年 掲載）