iQ-Check Listeria spp. Kit
User Guide
Test for the real-time PCR detection of Listeria spp. in foodand environmental samples
Catalog #3578113

Table of Contents
Section 1

Introduction ............................................................................................................................................. 1

Section 2

iQ-Check Listeria spp. Technology ......................................................................................................... 1

Section 3

Kit Components ...................................................................................................................................... 2

Section 4

Shelf Life and Storage............................................................................................................................. 2

Section 5

Materials Required but Not Supplied ...................................................................................................... 2
Equipment ............................................................................................................................................... 2
Supplies .................................................................................................................................................. 3

Section 6

Safety Precautions and Recommendations for Best Results .................................................................. 4

Section 7

Protocol ................................................................................................................................................... 6
Sample Enrichment ................................................................................................................................. 6
Free DNA Removal Treatment ................................................................................................................ 7
DNA Extraction ....................................................................................................................................... 7
Real-Time PCR ....................................................................................................................................... 8
Data Analysis .......................................................................................................................................... 9

Section 8

Confirmation of Positive Results ........................................................................................................... 10

Section 9

Confirmation of Single Colonies Using the iQ-Check Kit ....................................................................... 11

Section 10

Test Performance and Validations ........................................................................................................ 11

Section 11

Literature ............................................................................................................................................... 12

Section 12

Revision History .................................................................................................................................... 14
Appendix — PCR Mix Calculation Guide .............................................................................................. 15

ii | iQ-Check Listeria spp. Kit

Section 1 Introduction

Section 1
Section 1

Introduction
Conventional bacteriological methods are often long and tedious. In comparison, iQ-Check Listeria spp. isa simple and rapid qualitative test, allowing the detection of specific DNA sequences unique to Listeria spp.
found in environmental samples and food products. Using real-time polymerase chain reaction (PCR),
Listeria spp.–specific DNA sequences are amplified and detected simultaneously by means of fluorescentprobes. Up to 94 samples can be processed, with a minimized risk of contamination and an easy-to-use
procedure. The intended users of this kit are trained laboratory personnel who are performing tests to detect
Listeria spp., including L. monocytogenes, L. fleischmannii, L. grayi, L. innocua, L. ivanovii, L. marthii,
L. rocourtiae, L. seeligeri, L. weihenstephanensis, and L. welshimeri. The use of this test allows results to beobtained within a few hours following enrichment of a sample.

Section 2
Section 2

iQ-Check Listeria spp. Technology
The iQ-Check Listeria spp. Kit is a test based on gene amplification and detection by real-time PCR. The
ready-to-use PCR reagents in the kit contain oligonucleotides (primers and probes) specific for Listeria spp.,
as well as DNA polymerase and nucleotides. Detection and data analysis are optimized for use witha Bio­Rad real-time PCR instrument, such as the CFX96 Touch Deep Well Real-Time PCR Detection System.
PCR is a powerful technique used to generate many copies of target DNA. During the PCR reaction, several
cycles of heating and cooling allow DNA denaturation by heat followed by primers annealing to the target
region. The DNA polymerase then uses these primers and deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) to extend
the DNA, creating copies of the target DNA. These copies are called amplicons.
In real-time PCR, specific probes are used to detect DNA during the amplification step by hybridizing to theamplicons. These probes are linked to a fluorophore that fluoresces only when hybridized to the target
sequence. FAM is the fluorophore linked to the probe hybridizing to the Listeria spp.–specific DNA sequence.
In the absence of target DNA, no fluorescence will be detected. As the amount of amplicons increases witheach round of amplification, fluorescence intensity also increases. The optical module measures thisfluorescence at the annealing step during each PCR cycle while the associated software plots thefluorescence intensity versus number of cycles.
A synthetic DNA internal control is included in the reaction mix to validate any possible negative results.
This control is amplified with a specific probe at the same time as the Listeria spp. target DNA sequence andis detected by a third fluorophore.
This test allows the qualitative detection of Listeria spp.in select foods and environmental samples previously
enriched by culture. It includes the following five main steps:* Please refer to the user guide of the iQ-Check Free DNA Removal Solution (document #10000058391) forthe conditions of use.
iQ-Check Listeria spp. Kit | 1

Section 3 Kit Components

Section 3
Section 3

Kit Components
The iQ-Check Listeria spp. Kit contains sufficient reagents for 96 tests (94 samples).
Reagent ID

Reagent

Quantity Provided, ml

A

Lysis reagent

1 bottle, 20

B

Fluorescent probes

1 tube, 0.55

C

Amplification mix

1 tube, 4.4

D

PCR negative control

1 tube, 0.5

E

PCR positive control

1 tube, 0.25

F

Lysis beads

1 bottle, 17.6 g

Section 4
Section 4

Shelf Life and Storage
Once received, the kit must be stored at 2–8°C. Reagents stored at this temperature can be used until the
expiration date indicated on the tubes. The shelf life of the lysis reagent is 6 months once it is mixed withlysis beads.

Section 5
Section 5

Materials Required but Not Supplied
Equipment■

Lab paddle blender for homogenizing test samples■

Incubator for sample microbiological enrichment■

Specific for extraction in sterile 1.5 ml conical screwcap tubes:–

Benchtop centrifuge (capable of 10,000–12,000 x g)–

Dry heat block at 37 ± 2°C and/or 95–100°C■

Cell disruptor, such as a Disruptor Genie (Scientific Industries, Inc.)■

Specific for extraction in deep well plate:–Heating thermoshaker* capable of maintaining 37 ± 2°C and/or 95–100°C, with a mixing speed ofat least 1,300 rpm■

Vortexer■

Magnetic stir plate■20, 200, and 1,000 μl micropipets

2 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Section 5 Materials Required but Not Supplied■■

Bio-Rad real-time PCR system,* for example, the CFX96 Touch Deep Well System (catalog #3600037)
or CFX Opus Deepwell (catalog # 17007991) Real-Time PCR Systems
Bio-Rad iQ-Check Prep System for automated DNA extraction and PCR plate setup (catalog #3594911)

Note: We recommend using an uninterrupted power supply (UPS) with the thermal cycler and iQ-Check
Prep System.
*

Contact Bio-Rad Technical Support for information about recommended instruments.

Supplies■■

Enrichment medium: Listeria Special Broth (LSB) (catalog #3555703, 225 ml x 6 bottles; 3564703,
dehydrated, 500 g; 3555793, 5 L x 2 bags; 3564753, dehydrated, 5 kg)
Enrichment medium: Listeria Special Broth II (LSB II) (catalog #12017463, 225 ml x 6 bottles;
12017388, dehydrated, 500 g; 12017378, dehydrated, 5 kg)■

iQ-Check Free DNA Removal Solution (catalog #3594970)■

Specific for environmental samples:■–

Environmental sponges–

Environmental swabs–

Neutralizing broth for sponges and swabs, such as Dey-Engley (D/E) or HiCap Neutralizing Broth,or Letheen Broth

Specific for extraction in tubes:
–

■

■

■

■

■

■

1.5 ml conical screwcap tubes, sterile (for example, catalog #2240110XTU)Specific for extraction in a deep well plate:–

96-well deep well plate (catalog #3594900)–

Plastic sealing film (catalog #3590139)–

X-Pierce Sealing Films (catalog #3593977) or Pre-Pierced Plate Sealing Film (catalog #3600040,
North America only)

Specific for Standard II and Easy II extraction protocols:–

iQ-Check Lysis Beads (reagent F) (catalog #3578136)–

200 μl wide-opening pipet tips

Specific for iQ-Check Prep System:–

60 ml dilution container (catalog #3594904)–

Filter tips (catalog #3594902 or 12014486: 50 µl; 3594903 or 12014483: 1,000 µl)–

PCR mix tubes (catalog #12016673, 5 ml x 25)

AL (Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti) Agar (catalog #3563695, 90 mm x 20 dishes;
3564046, dehydrated, 500 g; 3564041, supplement 1; 3564042, supplement 2
RAPID'Listeria spp. Agar* (catalog #3564744, dehydrated, 500 g; 3564745, supplement 1; 3564746,
supplement 2)
RAPID'L.mono Agar* (catalog #3563694, 90 mm x 20 dishes; 3555294, kit for 190 ml agar plus
2 supplements; 3564293, dehydrated, 500 g; 3564294, supplement 1; 3564746, supplement 2)
iQ-Check Listeria spp. Kit | 3

Section 6 Safety Precautions and Recommendations for Best Results■

PCR plates, tubes, sealing tape, and caps■

Sterile filter tips adaptable to 20, 200, and 1,000 μl micropipets■

Tips for Combitip Pipets or equivalent repeat pipettors; sterile, individually packaged■

1 and 10 ml pipets■

2 and 5 ml sterile test tubes■

Powder-free gloves■

Distilled sterile water■

Bleach, 5%■Cleaning agent such as DNA AWAY or RNase AWAY*

Can be used outside of the AOAC-PTM validation.

Section 6
Section 6

Safety Precautions and Recommendations for Best Results
■

■

■

■

■

This test must be performed by trained personnel
Pregnant women, children, the elderly, and immunocompromised individuals should neither perform thismethod nor handle L. monocytogenes due to the high infection and fatality rate associated with thesegroupsSamples and enrichment cultures must be handled as potentially infectious material and discarded
according to local rules and regulations
All potentially infectious material should be autoclaved before disposal
The quality of results depends on strict compliance with Good Laboratory Practices (for example,
the EN ISO 7218 standard), especially concerning PCR:■

Never circulate laboratory equipment (pipets, tubes, etc.) from one workstation to another■

Always use a positive control and a negative control for each series of amplification reactions■–

Do not use reagents after their expiration date–

Vortex reagents from the kit before using them to ensure homogeneity–

Periodically verify the accuracy and precision of pipets, as well as the correct functioning of
the instruments–

Change gloves often, especially if you suspect they are contaminated–Clean work spaces periodically with 5% bleach and other decontaminating agents, such as
DNA AWAY–

Use powder-free gloves and avoid fingerprints and writing on tube caps. Both will interfere withdata acquisition

It is strongly advised to follow the general requirements described in the standard EN ISO 22174:2005(Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection offood-borne pathogens — General requirements and definitions)4 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Section 6 Safety Precautions and Recommendations for Best Results■

iQ-Check Listeria spp. Kit:–■

iQ-Check Prep System:–■

Improper use of the iQ-Check Prep System may cause personal injury or damage to the
instrument.
Some components may pose a risk of personal injury due to excessive heat if improperly handled.
For safe use, the iQ-Check Prep System must be operated only by qualified laboratory personnel
who have been appropriately trained. Servicing of instrument must be performed only by Bio-Rad
field service engineers

CFX96 Touch Deep Well or CFX Opus Deepwell Real-Time PCR Detection Systems:–■

All substances or mixtures in the test kit are classified products, according to the Globally
Harmonized System (GHS). Contact with acids may cause release of toxic gases. No special
precautions are necessary if used correctly. If the product is inhaled, supply fresh air and consulta doctor in case of complaints. After eye contact with the product, rinse opened eye for several
minutes under running water. If the products are swallowed, induce vomiting and call for medical
help

Improper use of the CFX96 Touch Deep Well System or CFX Opus Deepwell System may cause
personal injury or damage to the instrument. Some components may pose a risk of personal injury
due to excessive heat if improperly handled. For safe use, the CFX96 Touch Deep Well System
and CFX Opus Deepwell System must be operated only by qualified laboratory personnel who
have been appropriately trained. Servicing of instrument must be performed only by Bio-Rad Field
Service Engineers

Enrichment:–

The user should read, understand, and follow all safety information in the instructions for theiQ­Check Listeria spp. Kit. Retain the safety instructions for future reference. To reduce the risks
associated with exposure to chemicals and biohazards, perform pathogen testing in a properly
equipped laboratory under the control of trained personnel. Always follow standard laboratory
safety practices, including wearing appropriate protective apparel and eye protection while handling
reagents and contaminated samples. Avoid contact with the contents of the enrichment media andreagent tubes after amplification. Dispose of enriched samples according to current industry
standards–

Listeria is a Biosafety Level 2 organism. Biological samples such as enrichments have the potential
to transmit infectious diseases. Follow all applicable local, state/provincial, and/or national
regulations on disposal of biological waste. Wear appropriate protective equipment, which includes,
but is not limited to, protective eyewear, face shield, clothing/lab coat, and gloves. All work should
be conducted in properly equipped facilities utilizing the appropriate safety equipment (for example,
physical containment devices). Individuals should be trained in accordance with applicableregulatory and company/institution requirements before working with potentially infectious materials–

When testing is complete, all materials and media possibly containing pathogens should be
decontaminated following current industry standards for the disposal of contaminated waste (thatis, autoclave for 20 min at 121°C). Consult the Safety Data Sheet for additional information andlocal regulations for disposal

iQ-Check Listeria spp. Kit | 5

Section 7 Protocol

Section 7
Section 7

Protocol
A. Sample Enrichment
It is strongly recommended to read the entire protocol before starting the test.
Enrichment media must be at the appropriate incubation temperature (ambient or 30°C/37°C when required)
before use.
The use of an enrichment bag with incorporated filter is highly recommended.
Within the scope of the NF VALIDATION, test portions weighing more than 25 g have not been tested.
Incubate, without shaking, for times and at temperatures indicated in the table below. It is also possible tocarry out the iQ-Check test from LSB that has been enriched and then stored at 2–8°C for up to 72 hr.
The following table outlines the different protocols that can be used, depending on the application and thescope of the validation:
Scope (Matrices)
All food products andenvironmental
samples1

NF VALIDATION BRD 7/13-05/07

Sample Preparation
Homogenize n g food in 9 x n ml LSB

Production
environment andsurfaces2

Homogenize n g food in 9 x n ml prewarmed LSB or room
temperature LSB II

Composite food2

Homogenize n g food in 9 x n ml LSB II

Dairy products2

Homogenize n g food in 9 x n ml prewarmed LSB II

Scope (Matrices)2,3
Liver paté, hot dogs,
raw fermented
sausage, sliced deliturkey, sliced deliham, natural cheese(125 g)Sample Preparation
Homogenize n g food in 9 x n ml LSB or LSB II(25 g in 225 ml; 125 g in 1,125 ml)

6 | iQ-Check Listeria spp. Kit

AOAC PTM 090701

Enrichment/DNA Extraction
Standard II extraction
 Incubate 22–24 hr
at 30 ± 1°C
 Tube format
Easy II extraction
 Incubate 24–26 hr
at 30 ± 1°C
 Tube/deep well format
Easy II extraction (LSB)
 Incubate 18–26 hr
at 30 ± 1°C
 Tube/deep well format
Easy II extraction (LSB II)
Incubate 18–26 hr at 37± 1°C
 Tube/deep well format
Easy II extractionIncubate 18-26 hr at 37± 1°C
Deep well format
Easy II extractionIncubate 18-26 hr at 37± 1°C
Deep well format
Enrichment/DNA Extraction
Easy II extraction (LSB)
 Incubate 24–26 hr
at 30 ± 1°C
 Tube/deep well format
Easy II extraction (LSB II)
 Incubate 18-24 hr
at 37 ± 1°C
 Tube/deep well format

Section 7 Protocol

Environmental
surfaces(stainless steel,plastic, ceramic,
sealed concrete)

Environmental samples
 Moisten swabs and sponges with a neutralizing broth that
does not contain aryl sulfonate complex
 For surfaces being analyzed with swabs, sample
a 1 x 1" (2.54 x 2.54 cm) area
 For surfaces being analyzed with sponges, sample
a 4 x 4" (10.16 x 10.16 cm) area
 Add to enough LSB or LSB II to cover the swab (10 ml) or
sponge (60-225 ml)

Easy II extraction (LSB)
 Incubate 18-24 hr
at 30 ± 1°C
 Tube/deep well format
Easy II extraction (LSB II)
 Incubate 16-24 hr
at 37 ± 1°C
 Tube/deep well format

Refer to MFLP-39 for Health Canada approved matrices and protocols
Validation includes “Lis spp Fast” Application Protocol File for a reduced PCR run time. Contact your Bio-Rad representative for more
information.
1

Validation includes the use of the iQ-Check Free DNA Removal Solution and of the “Lis spp Fast” Application Protocol File fora reduced PCR run time. Contact your Bio-Rad representative for more information.

2

3

Validation includes direct streak to RAPID’L. mono, RAPID’Listeria spp., or Agar Listeria plates (excluding natural cheese)

B. Free DNA Removal Treatment
The iQ-Check Free DNA Removal Solution provides an ideal way to remove free DNA. Follow Bio-Rad’s
recommendations in the user guide (document #10000058391).
This protocol is validated:■

By AFNOR Certification on production environmental samples category■

By AOAC Research Institute on a list of matrices indicated on the AOAC-PTM validation certificate

C. DNA Extraction
General recommendations:1.

Turn on the heat block or thermoshaker to preheat before starting the test. Set it to 95–100°C. Keep thelysis reagent in suspension while pipetting by stirring at medium speed on a magnetic stir plate.

2.

In general, avoid shaking the enrichment bag and collecting large fragments of food debris. For foodsamples with a fatty supernatant, collect the sample just below this layer.

3.

Open tubes and wells carefully to avoid any possible cross-contamination.

4.

Cool the deep well plate before pipetting directly through pre-pierced sealing film.

5.

Use the magnetic bar to keep the lysis reagent in suspension. Pipet while it is stirring at medium speed.

6.

Gently shake the lysis reagent by hand first to resuspend the resin. Then pipet while it is stirring at
medium speed with the magnetic bar contained in the bottle, in order to keep it in suspension.

7.

Reconstitute the final lysis reagent as follows:a.

Carefully pour all the contents from reagent F (lysis beads) into reagent A (lysis reagent).

b.

Use consumables with a wide enough tip to allow pipetting of the homogenized lysis reagent.

c.

Lysis reagent mixed with lysis beads (reagents A + F) has a shelf life of 6 months when stored at 4°C.

Standard II Protocol
1.

Collect 1.5 ml of decanted enriched sample into a tube.

2.

Centrifuge the tube at 10,000–12,000 x g for 5 min. Discard the supernatant.
iQ-Check Listeria spp. Kit | 7

Section 7 Protocol3.

Add 250 μl of homogenized lysis reagent (reagents A + F) to the pellet and resuspend the pellet bypipetting the reagent up and down. Close the tube.

Note: Gently shake the lysis reagent by hand first to resuspend the beads.
4.

Place the tube in the thermoshaker or cell disruptor for 3 ± 1 min.

5.

Incubate in the appropriate heat block at 95–100°C for 15–20 min.

6.

Vortex the tube at high speed and centrifuge at 10,000–12,000 x g for 5 min.

This is the recommended stopping point for temporarily stopping the procedure.
The supernatant can be stored for up to 1 year at –20°C. Always allow it to thaw and homogenize, and thencentrifuge at 10,000–12,000 x g for 5 min before reusing.

Easy II Protocol
1.

Aliquot 100 μl of homogenized lysis reagent (reagents A + F) to tubes or the wells of a deep well plate.

Note: Gently shake the lysis reagent by hand first to resuspend the beads.
2.

Add 100 μl of enriched sample.

Note: Shake the suspension to homogenize the culture and then allow any debris to settle before collecting
the sample.
3.

Mix the solution by pipetting up and down until homogenized.

4.

Close the tubes or seal the deep well plate with pre-pierced sealing film.

5.

Place the tubes in the cell disruptor for 3 ± 1 min. Incubate the tubes in the heat block at 95–100°C for
15–20 min.

6.

If using the agitator-incubator for the tube or deep well plate format, incubate the tubes or deep wellplate in the agitator-incubator at 1,300 to 1,600 rpm at 95–100°C for 15–20 min.

7.

Vortex the tubes at high speed, and then centrifuge at 10,000–12,000 x g for at least 2 min.

Centrifugation is not needed for the deep well plate.
This is the recommended stopping point for temporarily stopping the procedure.
The supernatant can be stored for up to 1 year at –20°C. Always allow it to thaw and homogenize, and thencentrifuge at 10,000–12,000 x g for 5 min before reusing.

D. Real-Time PCR
Instrument and Software Setup
For instrument and software setup, follow instructions in the real-time PCR system user guide for iQ-Check Kits.

PCR Mix Preparation1.

Prepare the PCR mix containing the amplification solution (reagent C) and the fluorescent probes(reagent B). The volume of PCR mix needed depends on the number of samples and controls to be

8 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Section 7 Protocol

analyzed. At least one positive and one negative control must be included in each PCR run. Use thepipetting table in Appendix — PCR Mix Calculation Guide to find the correct volumes to use for eachreagent.
Note: Use the PCR mix (reagents B + C) immediately after preparation. It is stable for 1 hr maximum at 2–8°C.
2.

Pipet 45 μl of the PCR mix into each well according to your plate setup.

3.

Add 5 μl of DNA extract, reagent D (negative control), or reagent E (positive control). Do not vortex thesample before pipetting. Hermetically seal the wells of the PCR plate or tube strips. It is important toavoid bubbles at the bottom of the wells by pipetting carefully. As an optional step, centrifuge the sealed
PCR plate or tube strips (quick spin) to eliminate any bubbles.

4.

Place the PCR plate or tube strips in the thermal cycler. Be sure to place the plate correctly, with the A1
well at the upper left corner. Close the reaction module.

Run PCR
To start the PCR run, follow instructions in the real-time PCR system user guide for iQ-Check Kits. The“Lis spp Fast” Application Protocol File has been NF and AOAC validated.

E. Data Analysis
Data can be analyzed directly at the end of the PCR run or at a later time by opening the stored data file.
Follow instructions in the corresponding CFX Manager IDE Software User Manual for opening data files andsetting the data analysis parameters.

Interpreting Results
Once the data analysis parameters have been set, results are interpreted by analyzing the quantification
cycle (Cq) values of each sample (the cycle at which the amplification curve crosses the threshold).
CFX Manager IDE Software allows complete automated analysis for Bio-Rad real-time PCR detection
systems. A verification of the typical characteristics of the amplification curves should be performed prior toreleasing results. Contact your Bio-Rad technical support team if additional support is required.
Controls
Verify the positive and negative controls before interpreting sample results.
For the experiment to be valid, the controls must have the results summarized in the following table.
Otherwise, the PCR reaction must be repeated.
Listeria spp. Detection(FAM Channel)

Internal Control Detection(HEX Channel)

Negative control

Cq = N/A*

28 ≤ Cq ≤ 40

Positive control

26 ≤ Cq ≤ 36

N/A

Control* The software indicates a Cq value (the cycle at which the amplification curve crosses the threshold) of N/A (not applicable) when the fluorescence ofa sample does not rise significantly above the background noise, and hence does not cross the threshold.

If the results of negative and positive controls differ from those in the Controls table (invalid control), repeat
the run and analysis described in D. Real-Time PCR and E. Data Analysis in Section 7 Protocol.

iQ-Check Listeria spp. Kit | 9

Section 8 Confirmation of Positive Results

Samples
A positive iQ-Check Listeria spp. PCR test must show a typical amplification curve and a Cq value ≥10 for
the FAM fluorophore.
■

If the Cq value for both channels is below 10, verify the raw data curve is a regular amplification curve(with a flat baseline followed by a rapid exponential increase of fluorescence and then a flattening out).
If the curve seems correct, it may be considered a positive Listeria spp. test.

If there is no Cq value (Cq = N/A) for FAM, or if the curve is not a typical amplification curve, the internal
control for that sample must then be analyzed:■■■

This sample is considered a negative Listeria spp. sample if there is no Cq value in the FAM channel
and the internal control has a Cq ≥28
Should the internal control also not have a Cq value (Cq = N/A), this probably indicates an inhibition of
the PCR reaction. The sample needs to be diluted (using 10 μl of DNA extract, perform a 1:10 dilution in
distilled sterile water, and then test 5 μl of the dilution) and the PCR repeatedShould the Cq value for the internal control be <28, it is not possible to interpret the result. Verify thatthe threshold was correctly placed or that the curve as raw data is a regular amplification curve. If thecurve does not have a characteristic shape, it will be necessary to repeat the PCR test.

The interpretation of test results is summarized in the following table.
Listeria spp. Detection(FAM)

Internal Control Detection(HEX)

Interpretation

Cq ≥ 10

N/A

Positive

Cq = N/A

Cq ≥ 28

Negative

Cq = N/A

Cq = N/A

Inhibition*

When both target and internal control detection give a Cq value = N/A, the DNA extract must be diluted 1:10 and tested again.

An invalid interpretation can be given when validation criteria are not met. Check the raw data and proceed
as if the sample was inhibited.

Section 8
Section 8

Confirmation of Positive Results
In the context of the NF VALIDATION certified method, all positive iQ-Check results must be confirmed in thefollowing ways:
1.

Using classic tests described in the standardized methods CEN or ISO by going back to the sample.

2.

By isolation of enriched LSB or L:SB II (streaking 100 μl) on RAPID'Listeria spp. or RAPID'L.mono
chomogenic agar and incubation for 24 hr at 37 ± 1°C. The presence of characteristic Listeria spp.
colonies is sufficient to confirm the presence of Listeria spp.

3.

By isolation of enriched LSB or LSB II (streaking 10 μl) on AL or PALCAM agar and incubation for 24–
48 hr at 37 ± 1°C. Typical colonies should be confirmed by the tests described in the ISO method.

4.

Using any other method certified by NF VALIDATION based on a principle different from that used in the iQCheck Listeria spp. PCR test. The validated protocol of this second method must be followed entirely.

10 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Section 9 Confirmation of Single Colonies Using the iQ-Check Kit

In the case of discrepant results between the iQ-Check Listeria spp. Kit and any of the confirmation options
listed above, follow the necessary steps to ensure valid results.
It is possible to store the enriched LSB or LSB II at 2–8°C for 72 hr maximum, following the incubation at
30°C, before carrying out the confirmation.
In the context of AOAC validation, a positive iQ-Check Listeria spp. result should be considered presumptive
positive and confirmed according to an appropriate reference method (for example, USDA MLG, FDA BAM,
ISO, MFHPB, etc.) is recommended. Alternatively, for select matrices, streak 10 μl enriched LSB or LSB II
directly to RAPID’L. mono, RAPID’Listeria spp. or Agar Listeria chromogenic agar and incubate for 24 hr at
37 ± 1°C. The presence of characteristic Listeria spp. colonies should be biochemically confirmed for thepresence of Listeria spp.

Section 9
Section 9

Confirmation of Single Colonies Using the iQ-Check Kit
The iQ-Check Listeria spp. Kit may also be used to confirm single isolated Listeria spp. colonies on agar
plates. This is officially validated by AFNOR Certification on RAPID'L.mono and RAPID'Listeria spp.
chromogenic media.
1.

Pick an isolated colony from a selective or nonselective agar plate with a toothpick, sterile loop, or otheradapted consumable (for example, a pipet tip).

2.

Resuspend the colony in 100 μl tryptone salt or distilled sterile water in a microcentrifuge tube.

Homogenize using a vortexer.
Use 5 μl of the suspension with 45 μl of PCR mix (see D. Real-Time PCR in Section 7 Protocol) and follow
the rest of the iQ-Check Listeria spp. Protocol for the data and results interpretation.

Section 10
Section 10

Test Performance and Validations
The iQ-Check Listeria spp. Kit is specific for the Listeria genus.
NF Validation

BRD 07/13-05/07
ALTERNATIVEANALYSIS
METHODS FORAGRIBUSINESS
http://nf-validation.
afnor.org

The iQ-Check Listeria spp. Kit is certified NF VALIDATION as an alternative method tothe reference method ISO 11290-1:2017, for the detection of Listeria spp. in all products
for human consumption and environmental samples. The validation followed the protocolof ISO 16140-2:2016, and includes the use of the CFX96 Touch Deep Well and CFX
Opus Deepwell Real-Time PCR System. The use of the iQ-Check Free DNA Removal
Solution is validated for composite food, dairy products and production environmental
samples. The associated software is the CFX Manager IDE Software (version 2.2 andlater). The “Lis spp Fast” Application Protocol File is validated. Certificate number: BRD
07/13–05/07. Valid until: Refer to the certificate available on the AFNOR Certification
website.

iQ-Check Listeria spp. Kit | 11

Section 11 Literature

AOAC Validation
The iQ-Check Listeria spp. Kit (Easy Protocol and Easy Protocol with optional Free DNA
Removal Protocol) has been validated by the AOAC Research Institute under the
Performance Tested Method Program for detection of Listeria spp. from stainless steel,plastic, ceramic, sealed concrete, liver paté, hot dogs, raw fermented sausage, sliced deliturkey, sliced deli ham, and natural cheese (125 g). A positive result with iQ-Checkshould be considered presumptive and it is recommended that it be confirmed following
the recommendation in Section 8. LSB, LSB II, the “List spp Fast” APF, the use of theiQ­Check Free DNA Removal Solution, and the use of CFX96 Touch Deep Well and
CFX Opus Deepwell Real-Time PCR Systems are validated for all samples.
The associated software is CFX Manager IDE Software (version 2.2 and later).
Certificate number: 090701.
Health Canada Validation
The iQ-Check Listeria spp. Kit (Easy Protocol) has been validated by Health Canada(MFLP-39) for detection of Listeria spp. from all environmental surfaces and heat­processed
RTE meat and poultry. A positive result with iQ-Check should be considered presumptive
and must be confirmed according to MFHPB-30 (see Section 11).

Section 11
Section 11

Literature
AOAC Official Method 993.12-1996(1999). Listeria monocytogenes in milk and dairy products. Selectiveenrichment and isolation method.
Health Canada (2011). Health Products and Food Branch. MFHPB-30. Isolation of Listeria monocytogenes
and other Listeria spp. from foods and environmental samples. The Compendium of Analytical Methods,
Volume 2, February 2011.
ISO 7218:2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance formicrobiological examinations.
ISO 11290-1:2017. Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of
Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 1: Detection method.
ISO 16140-2:2016. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 2: Protocol for the validationof alternative (proprietary) methods against a reference method.
ISO 22174:2005. Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for thedetection of food-borne pathogens — General requirements and definitions.
United States Department of Agriculture, Food Safety and Inspection Service (2021). Microbiology
Laboratory Guidebook. Chapter 8.13: Isolation and identification of Listeria monocytogenes from red meat,
poultry, ready-to-eat Siluriformes (fish) and egg products, and environmental samples.
https://www.fsis.usda.gov/sites/default/files/media_file/2021-09/MLG-8.13.pdf, accessed February 14, 2020.

12 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Section 11 Literature

United States Food and Drug Administration (2017). Bacteriological Analytical Manual. Chapter 10: Detectionof Listeria monocytogenes in foods and environmental samples, and enumeration of Listeria monocytogenes
in foods. https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-10-detection-listeriamonocytogenes-foods-and-environmental-samples-and-enumeration, accessed February 14, 2020.

iQ-Check Listeria spp. Kit | 13

Section 12 Revision History

Section 12
Section 12

Revision History
Release date
October 2023

Document number
10000167777 Ver A

14 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Change- Document number change – previous version
10000123536 Ver C iQ-Check Listeria spp. User
Guide
- AFNOR Extension: LSB II for composite food,environmental production samples and dairy
products

Appendix — PCR Mix Calculation Guide

Appendix — PCR Mix Calculation Guide
To find the correct volumes for preparing the PCR mix, add the total number of samples and controls to beanalyzed and find the corresponding volumes of reagent B and reagent C in the table.
Total Number ofProbesAmplification Mix Total Number ofProbesAmplification Mix Total Number ofProbesAmplification Mix
Samples and Reagent B, μl Reagent C, μl
Samples and Reagent B, μl Reagent C, μl
Samples and Reagent B, μl Reagent C, μl
Controls
Controls
Controls
1

5

40

33

178

1,400

65

351

2,800

2

11

86

34

184

1,500

66

356

2,900

3

16

130

35

189

1,500

67

362

2,900

4

22

173

36

194

1,600

68

367

2,900

5

27

216

37

200

1,600

69

373

3,000

6

32

259

38

205

1,600

70

378

3,000

7

38

302

39

211

1,700

71

383

3,100

8

43

346

40

216

1,700

72

389

3,100
3,200

9

49

389

41

221

1,800

73

394

10

54

432

42

227

1,800

74

400

3,200

11

59

475

43

232

1,900

75

405

3,200

12

65

518

44

238

1,900

76

410

3,300

13

70

562

45

243

1,900

77

416

3,300

14

76

605

46

248

2,000

78

421

3,400

15

81

648

47

254

2,000

79

427

3,400

16

86

691

48

259

2,100

80

432

3,500

17

92

734

49

265

2,100

81

437

3,500

18

97

778

50

270

2,200

82

443

3,500

19

103

821

51

275

2,200

83

448

3,600

20

108

864

52

281

2,200

84

454

3,600

21

113

907

53

286

2,300

85

459

3,700

22

119

950

54

292

2,300

86

464

3,700

23

124

994

55

297

2,400

87

470

3,800

24

130

1,000

56

302

2,400

88

475

3,800

25

135

1,100

57

308

2,500

89

481

3,800

26

140

1,100

58

313

2,500

90

486

3,900

27

146

1,200

59

319

2,500

91

491

3,900

28

151

1,200

60

324

2,600

92

497

4,000

29

157

1,300

61

329

2,600

93

502

4,000

30

162

1,300

62

335

2,700

94

508

4,100

31

167

1,300

63

340

2,700

95

513

4,100

32

173

1,400

64

346

2,800

96

518

4,100

iQ-Check Listeria spp. Kit | 15

Visit bio-rad.com/iqcheck for more information.
BIO-RAD is a trademark of Bio-Rad Laboratories, Inc.
IQ-CHECK is a trademark of Bio-Rad Europe GmbH in certain jurisdictions.
All trademarks used herein are the property of their respective owner.

10000167777 Ver A US/EG

Sig 0123

iQ-Check Listeria spp. Kit
Guide d’utilisation
Test pour la détection par PCR en temps réel de Listeria spp.
dans les produits alimentaires et les échantillons
environnementaux

Référence — N° 3578113

Sommaire
Section 1

Introduction ............................................................................................................................................. 1

Section 2

Technologie iQ-Check Listeria spp. ........................................................................................................ 1

Section 3

Composants du kit .................................................................................................................................. 2

Section 4

Durée de conservation et stockage ......................................................................................................... 2

Section 5

Matériel requis non fourni........................................................................................................................ 2
Matériel ................................................................................................................................................... 2
Produits ................................................................................................................................................... 3

Section 6

Mesures de sécurité et recommandations pour des résultats optimaux.................................................. 4

Section 7

Protocole ................................................................................................................................................. 6
Enrichissement de l’échantillon ............................................................................................................... 6
Traitement de l’ADN libre ........................................................................................................................ 7
Extraction d’ADN ..................................................................................................................................... 7
PCR en temps réel .................................................................................................................................. 9
Analyse des données .............................................................................................................................. 9

Section 8

Confirmation des résultats positifs ........................................................................................................ 10

Section 9

Confirmation de colonies isolées à l’aide du kit iQ-Check ..................................................................... 11

Section 10

Performance du test et validations ........................................................................................................ 12

Section 11

Bibliographiee ....................................................................................................................................... 13

Section 12

Historique des révisions ........................................................................................................................ 14
Annexe — Guide de calcul du mélange de PCR .................................................................................. 15

ii | iQ-Check Listeria spp. Kit

Section 1

Introduction

Section 1
Section 1

Introduction
Les méthodes bactériologiques traditionnelles sont souvent chronophages et fastidieuses. En comparaison,la méthode iQ-Check Listeria spp. constitue un test qualitatif rapide et simple permettant la détectionde séquences d’ADN spécifiques de Listeria spp. dans les échantillons environnementaux et les produits
alimentaires. Grâce à la technique d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel,
la séquence d’ADN spécifique de Listeria spp. est amplifiée et détectée simultanément au moyen d’une
sonde fluorescente. Il est possible de traiter jusqu’à 94 échantillons avec un risque minimum
de contamination et une procédure d’utilisation
simple. Ce kit est destiné au personnel de laboratoire qualifié, qui réalise des tests de détection
de Listeria spp., including L. monocytogenes, L. fleischmannii, L. grayi, L. innocua, L. ivanovii, L. marthii,
L. rocourtiae, L. seeligeri, L. weihenstephanensis et L. welshimeri. La mise en œuvre de ce test permet
l’obtention de résultats en quelques heures après l’enrichissement d’un échantillon.

Section 2
Section 2

Technologie iQ-Check Listeria spp.
Le test iQ-Check Listeria spp. Kit est fondé sur l’amplification et la détection des gènes par PCR en temps
réel. Les réactifs PCR prêts à l’emploi de ce kit contiennent des oligonucléotides (amorces et sondes)
propres à Listeria spp., ainsi que de l’ADN polymérase et des nucléotides. La détection et l’analyse desdonnées sont optimisées pour l’utilisation avec un instrument de PCR en temps réel Bio-Rad, comme CFX96
Touch Deep Well System.
La PCR (amplification en chaîne par polymérase) est une technique puissante utilisée pour générer de nombreusescopies d’ADN cible. Durant la PCR, la succession de cycles de chauffage et de refroidissement permet une
dénaturation de l’ADN, suivie d’une hybridation des amorces à la région cible, puis un allongement de l’ADN par
action de l’ADN polymérase à partir de ces amorces et des désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP), créantainsi des copies de l’ADN cible. Ces copies sont appelées amplicons.
Au cours de la PCR en temps réel, des sondes spécifiques détectent l’ADN en s’hybridant avec lesamplicons. Ces sondes sont liées à un fluorophore qui produit une fluorescence uniquement lors d’une
hybridation avec la séquence cible. FAM est le fluorophore lié à la sonde qui s’hybride à la séquence d’ADN
propre à Listeria spp. En l’absence d’ADN cible, aucune fluorescence ne sera détectée. Étant donné quele nombre d’amplicons augmente avec chaque cycle d’amplification, l’intensité de la fluorescence augmenteégalement. Le module optique mesure cette fluorescence à l’étape d’hybridation pour chaque cycle de PCR
tandis que le logiciel associé enregistre l’intensité de la fluorescence en fonction du nombre de cycles.
Le mélange réactif comprend un contrôle interne d’ADN synthétique afin de valider tout résultat négatiféventuel. Ce contrôle est amplifié avec une sonde spécifique en même temps que la séquence d’ADN cible
Listeria spp. et est détecté par un troisième fluorophore.
Ce test permet la détection qualitative de Listeria spp. dans les échantillons alimentaires
et environnementaux préalablement enrichis par culture. Il comprend cinq étapes principales :iQ-Check Listeria spp. Kit | 1

Section 3

Composants du kit*Se référer au guide d’utilisation d’iQ-Check Free DNA Removal Solution (n° de référence 10000058391)
pour les conditions d’utilisation.

Section 3
Section 3

Composants du kit
iQ-Check Listeria spp. Kit contient suffisamment de réactifs pour 96 tests (94 échantillons).
ID réactif

Réactif

Quantité fournie, mlA

Réactif de lyse

1 flacon, 20

B

Sondes fluorescentes

1 tube, 0,55

C

Mélange d’amplification

1 tube, 4,4

D

Contrôle négatif PCR

1 tube, 0,5E

Contrôle positif PCR

1 tube, 0,25

F

Billes de lyse

1 flacon, 17,6 g

Section 4
Section 4

Durée de conservation et stockage
Après réception, le kit doit être stocké à 2–8 °C. Les réactifs stockés à cette température peuvent êtreutilisés jusqu’à la date d’expiration indiquée sur les tubes. La durée de conservation du réactif de lyse est de
6 mois après mélange avec les billes.

Section 5
Section 5

Matériel requis non fourni
Matériel■

Stomacher pour homogénéiser les échantillons de test■

Incubateur pour l’enrichissement microbiologique des échantillons■

Matériel spécifique pour extraction en tubes coniques à bouchon fileté 1,5 ml stériles :– Centrifugeuse de paillasse (10 000–12 000 x g)
– Bloc de chauffage à sec à 37 ± 2 °C et/ou 95–100 °C■

Agitateur vibrant, tel que Disruptor Genie (Scientific Industries, Inc.)■

Matériel spécifique pour extraction en plaque Deep Well :– Agitateur-incubateur* capable de maintenir une température de 37 ± 2 °C et/ou 95–100 °C, avec une
vitesse de mélange d’au moins 1 300 rpm

2 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Section 5

Matériel requis non fourni■

Agitateur-mélangeur vortex■

Plaque d’agitation magnétique■

Micropipettes de 20, 200 et 1 000 μl■■

Système de PCR en temps réel de Bio-Rad*, par exemple CFX96 Touch Deep Well System(n° de référence 3600037) ou CFX Opus Deepwell System (n° de référence 17007991)
Bio-Rad iQ-Check Prep System pour l’extraction automatisée d’ADN et la préparation des plaquesde PCR (n° de référence 3594911)

Remarque : nous recommandons d’utiliser une alimentation sans interruption (ASI) avec le thermocycleuret le système de préparation iQ-Check Prep System.
*

Contacter l’assistance technique de Bio-Rad pour de plus amples informations sur les instruments recommandés.

Produits■■

Milieu d’enrichissement : Listeria Special Broth (LSB) (n° de référence 3555703, 225 ml x 6 flacons ;n° de référence 3564703, base déshydratée, 500 g ; n° de référence 3555793, 5 L x 2 poches ;n° de référence 3564753, base déshydratée, 5 kg)
Milieu d’enrichissement : Listeria Special Broth II (LSB II) (n° de référence 12017463, 225 ml x
6 flacons ; 12017388, base déshydratée, 500 g ; n° de référence 12017378, base déshydratée, 5 kg)■

iQ-Check Free DNA Removal Solution (n° de référence 3594970)■

Produits spécifiques pour les échantillons environnementaux :– Éponges d’échantillonnage environnemental– Écouvillons d’échantillonnage environnemental– Bouillon neutralisant pour éponges et écouvillons, tel que Dey-Engley (D/E), HiCap
ou bouillon Letheen■

Spécifique pour extraction en tubes :– Tubes coniques à bouchon fileté 1,5 ml, stériles (par exemple, n° de référence 2240110XTU)■

Matériel spécifique pour extraction en plaque Deep Well :– Plaque Deep Well de 96 puits (n° de référence 3594900)– Film à sceller en plastique (n° de référence 3590139)– X-Pierce Sealing Films (n° de référence 3593977) ou Pre-Pierced Plate Sealing Film(n° de référence 3600040, Amérique du Nord uniquement)■

Matériel spécifique pour les protocoles d’extraction Standard II et Easy II :– iQ-Check Lysis Beads (réactif F) (n° de référence 3578136)– Embouts de pipette à large ouverture 200 µl■

Matériel spécifique pour iQ-Check Prep System :– Récipient de dilution 60 ml (n° de référence 3594904)– Embouts filtrants (n° de référence 3594902 ou 3594902) : 50 µl ; n° de référence 3594903 : 1 000 µl)– Tubes de mélange de PCR (n° de référence 12016673, 5 ml x 25)■

AL (Agar Listeria selon Ottaviani et Agosti) Agar (n° de référence 3563695, 90 mm x 20 boîtes ;n° de référence 3564046, base déshydratée, 500 g ; n° de référence 3564041, Supplement 1 ;n° de référence 3564042, Supplement 2

iQ-Check Listeria spp. Kit | 3

Section 6■■

Mesures de sécurité et recommandations pour des résultats optimaux

RAPID’Listeria spp. Agar* (n° de référence 3564744, base déshydratée, 500 g ; n° de référence
3564745, Supplement 1 ; n° de référence 3564746, Supplement 2)
RAPID’L.mono Agar* (n° de référence 3563694, 90 mm x 20 boîtes ; n° de référence 3555294, kit pourgélose 190 ml plus 2 suppléments ; n° de référence 3564293, base déshydratée, 500 g ;n° de référence 3564294, Supplement 1 ; n° de référence 3564746, Supplement 2)■

Plaques, tubes, ruban à sceller et bouchons pour PCR■

Embouts filtrants stériles adaptables pour micropipettes de 20, 200 et 1 000 μl■

Seringue Combitip ou pipettes à répétition équivalentes ; stériles, emballés individuellement■

Pipettes 1 et 10 ml■

Tubes à essai stériles de 2 et 5 ml■

Gants non poudrés■

Eau distillée stérile

■Eau de Javel, 5 %■Agent nettoyant tel que DNA AWAY ou RNase AWAY*

Utilisable hors validation AOAC-PTM

Section 6
Section 6

Mesures de sécurité et recommandations pour des résultats
optimaux
■

■

■

■

■

Ce test doit être réalisé par du personnel formé.
Les femmes enceintes, enfants, personnes âgées et sujets immunodéprimés doivent éviter tout contact
avec L. monocytogenes en raison du caractère hautement infectieux et létal de la bactérie sur ces
catégories de personnes.
Les échantillons et cultures d’enrichissement doivent être manipulés en tant que substances
potentiellement infectieuses et éliminés conformément aux règles et réglementations locales.
Tous les matériels potentiellement infectieux doivent être soumis à l’autoclave avant élimination.
La qualité des résultats dépend du respect strict des bonnes pratiques de laboratoire (par exemple,
la norme EN ISO 7218), particulièrement en ce qui concerne la PCR :■Ne jamais transférer du matériel de laboratoire (pipettes, tubes, etc.) d’un poste de travail à un autre.

■

Toujours utiliser un contrôle positif et un contrôle négatif pour chaque série de réactions d’amplification.
– Ne pas utiliser les réactifs après leur date d’expiration.
– Vortexer les réactifs du kit avant de les utiliser afin d’assurer leur homogénéité.
– Vérifier périodiquement l’exactitude et la précision des pipettes, ainsi que le fonctionnement correct
des instruments.
– Changer de gants fréquemment, surtout si une contamination est suspectée.
– Nettoyer les postes de travail périodiquement avec de l’eau de Javel à 5 % et d’autres agentsde décontamination tels que DNA AWAY.

4 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Section 6

Mesures de sécurité et recommandations pour des résultats optimaux– Utiliser des gants non poudrés et éviter les empreintes digitales et l’écriture sur les bouchons destubes. En effet, l’acquisition des données peut en être affectée.
■■

Il est fortement recommandé de respecter les exigences générales décrites dans la norme
EN ISO 22174:2005 (Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pourla recherche de micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions).
iQ-Check Listeria spp. Kit :– Tous les mélanges ou substances du kit de test sont des produits classés conformément
au Système général harmonisé de classification et d’étiquetage des produits chimiques (SGH). Tout
contact avec des acides peut entraîner la libération de gaz toxiques. Aucune précaution particulière
n’est nécessaire si le kit est utilisé correctement. Si les produits sont inhalés, apporter de l’air frais
et consulter un médecin en cas de troubles. En cas de contact avec les yeux, rincer l’œil ouvert
pendant plusieurs minutes sous l’eau courante. Si les produits sont ingérés, provoquer
le vomissement et appeler les secours médicaux.

■

iQ-Check Prep System :– Une utilisation incorrecte d’iQ-Check Prep System peut causer des blessures corporelles
ou endommager l’instrument.
En cas de manipulation incorrecte, certains composants peuvent entraîner un risque de blessures
corporelles causées par une chaleur excessive. Pour une utilisation en toute sécurité, iQ-Check Prep
System doit être uniquement manipulé par du personnel de laboratoire qualifié et ayant reçu une
formation adéquate. La maintenance de l’instrument doit être réalisée uniquement par destechniciens de maintenance de Bio-Rad.

■

Système de PCR en temps réel CFX96 Touch Deep Well System ou CFX Opus Deepwell System :– Une utilisation incorrecte du CFX96 Touch Deep Well System ou du CFX Opus Deepwell Systempeut causer des blessures corporelles ou endommager l’instrument. En cas de manipulation
incorrecte, certains composants peuvent entraîner un risque de blessures corporelles causées parune chaleur excessive. Pour une utilisation en toute sécurité, CFX96 Touch Deep Well System
et CFX Opus Deepwell System doivent être uniquement manipulés par du personnel de laboratoire
qualifié et ayant reçu une formation adéquate. La maintenance de l’instrument doit être réalisée
uniquement par des techniciens de maintenance de Bio-Rad.

■

Enrichissement :– L’utilisateur doit lire, comprendre et suivre toutes les informations relatives à la sécurité dans les
instructions de iQ-Check Listeria spp. KIt. Conserver les instructions relatives à la sécurité pourréférence ultérieure. Afin de réduire les risques associés à l’exposition aux produits chimiques
et biologiques, réaliser les analyses d’agents pathogènes dans un laboratoire convenablementéquipé, sous le contrôle d’un personnel qualifié. Toujours suivre les pratiques standard en matière
de sécurité en laboratoire, notamment porter des vêtements et lunettes/masque de protection
appropriés pour manipuler les réactifs et échantillons contaminés. Éviter tout contact avec le contenu
du milieu d’enrichissement et des tubes de réactif après amplification. Éliminer les échantillons
enrichis conformément aux normes actuelles de l’industrie.
– Listeria est un organisme de niveau de biosécurité 2. Les échantillons biologiques tels que lesenrichissements peuvent transmettre des maladies infectieuses. Respecter toutes lesréglementations locales, étatiques/provinciales et/ou nationales applicables à l’élimination desdéchets biologiques. Porter un équipement de protection approprié, ce qui comprend,sans s’y limiter, lunettes ou masque de protection, écran facial, vêtements de protection/blousede laboratoire et gants. Tout travail doit être effectué dans des installations convenablementéquipées, à l’aide des équipements de sécurité appropriés (par exemple, dispositifs de confinement

iQ-Check Listeria spp. Kit | 5

Section 7

Protocole

physique). Le personnel doit être formé conformément aux exigences réglementaires et aux
exigences de l’entreprise/de l’institution avant de travailler avec des substances potentiellement
infectieuses.
– Une fois l’analyse terminée, l’ensemble du matériel et des milieux de culture pouvant contenir desagents pathogènes doit être décontaminé conformément aux normes actuelles de l’industrie pourl’élimination des déchets contaminés (c’est-à-dire, avec un passage à l’autoclave de 20 min
à 121 °C). Consulter la fiche de données de sécurité pour obtenir des informations supplémentaires
ainsi que les réglementations locales relatives à l’élimination.

Section 7
Section 7

ProtocoleA.

Enrichissement de l’échantillon

Il est fortement recommandé de lire le protocole dans son intégralité avant de commencer le test.
Les milieux d’enrichissement doivent être portés à la température d’incubation appropriée (ambiante ou
30 °C/37 °C selon le cas) avant utilisation.
L’utilisation d’une poche d’enrichissement à filtre incorporé est fortement recommandée. Dans le cadre de la marqueNF VALIDATION, les portions d’essai supérieures à 25 g n’ont pas été testées. Incuber, sans agitation, pendant les
temps et aux températures indiqués dans le tableau ci-dessus. Il est également possible de réaliser le test iQ-Checkà partir du bouillon LSB enrichi et conservé à 2–8 °C jusqu’à 72 hr.
Le tableau suivant détaille les différents protocoles utilisables, en fonction de l’application et de l’étendue de lavalidation :NF VALIDATION BRD 7/13-05/07
Domaine (matrices)

Préparation des échantillons

Tous les produits
alimentaireset échantillons
environnementaux1

Homogénéiser n g d’échantillon alimentaire dans
9 x n ml de LSB

Environnement
et surfaces
de production2

Homogénéiser n g d'échantillon alimentaire dans 9 x n
ml de LSB préchauffée ou à température ambiante deLSB II

Enrichissement/Extraction de l’ADN
Extraction Standard II
 Incuber pendant 22–24 hr à 30 ± 1 °C
 Format tube
Extraction Easy II
 Incuber pendant 24–26 hr à 30 ± 1 °C
 Format tube/Deep Well
Extraction Easy II (LSB)

Incuber pendant 18–26 hr à 30 ± 1 °C
Format tube/Deep well

Extraction Easy II (LSB II)
Incuber pendant 18–26 hr à 37 ± 1 °C
Format tube/Deep well
Aliments composés2

Produits laitiers2

Homogénéiser n g d’échantillon alimentaire dans 9x n ml de LSB II

Extraction Easy II (LSB II)

Homogénéiser n g d'échantillon alimentaire dans 9 x n
ml de LSB II préchauffée

Extraction Easy II (LSB II)

AOAC PTM 090701
6 | iQ-Check Listeria spp. Kit







Incuber pendant 18–26 hr à 37 ± 1 °C
Format deep well

Incuber pendant 20–28 hr à 37 ± 1 °C
Format deep well

Section 7

Protocole

Domaine (matrices)2,3

Préparation des échantillons

Pâté de foie, hot-dog,
saucisse sèche crue,
tranche de dinde,tranche de jambon,
fromage naturel(125 g)

Homogénéiser n g d’échantillon alimentaire dans
9 x n ml de LSB ou LSB II (25 g dans 225 ml ;125 g dans 1 125 ml)

Surfaces
environnementales(acier inoxydable,
plastique, céramiqueet béton verni)

Échantillons environnementaux
 Humidifier les écouvillons et éponges avec
un bouillon neutralisant qui ne contient pas
de complexe aryle-sulfonate.
 Pour les surfaces analysées avec un écouvillon,échantillonner une zone de 2,54 x 2,54 cm.
 Pour les surfaces analysées avec une éponge,échantillonner une zone de 10,16 x 10,16 cm.
 Ajouter suffisamment de LSB II pour couvrirl’écouvillon (10 ml) ou l’éponge (60–225 ml)

Enrichissement/Extraction de l’ADN
Protocole d’extraction Easy II (LSB)
 Incuber 24–26 hr à 30 ± 1 °C Format
Tube/Deep Well
Protocole d’extraction Easy II (LSB II)
 Incuber pendant 18–24 hr à 37 ± 1 °C
 Format tube/Deep Well
Protocole d’extraction Easy II (LSB)
 Incuber 18–24 hr à 30 ± 1 °C
 Format Tube/Deep Well
Protocole d’extraction Easy II (LSB II)
 Incuber pendant 16–24 hr à 37 ± 1 °C
 Format tube/Deep Well

Se reporter à MFLP-39 pour les matrices et protocoles validés par Santé Canada
La validation inclut l’utilisation du fichier de protocole d’application « Lis spp Fast » pour un temps d’exécution réduit de la PCR.
Contacter le représentant Bio-Rad pour obtenir davantage d’informations.
1

La validation inclut l’utilisation d’iQ-Check Free DNA Removal Solution et du fichier de protocole d’application « Lis spp Fast » pour
un temps d’exécution réduit de la PCR. Contacter le représentant Bio-Rad pour obtenir davantage d’informations.

2

3

La validation inclut la striation directement sur milieu gélosé RAPID’L. mono, RAPID’Listeria spp. ou Listeria (sauf pour la fromage naturel)B.

Traitement de l’ADN libre

iQ-Check Free DNA Removal Solution est un moyen idéal pour éliminer l’ADN libre. Suivre lesrecommandations de Bio-Rad dans le guide d’utilisation (n° de document 10000058391).
Ce protocole est validé par :
■

■

C.

La certification AFNOR dans la catégorie des échantillons environnementaux de production.
L’organisme AOAC Research Institute pour une liste de matrices indiquées dans le certificat
de validation AOAC-PTM.

Extraction d’ADN

Recommandations générales :1.

Allumer le bloc de chauffage ou l’agitateur thermique afin de préchauffer avant de commencer le test.
Le régler sur 95–100 °C. Garder le réactif de lyse en suspension pendant le pipettage en mélangeantà vitesse moyenne sur une plaque d’agitation magnétique.

2.

De façon générale, éviter d’agiter la poche d’enrichissement et de prélever de gros fragments
d’aliments. Pour les échantillons alimentaires présentant une couche grasse surnageante, préleverjuste en dessous de cette couche.

3.

Ouvrir les tubes et les puits avec précaution pour éviter les risques de contamination croisée.

4.

Refroidir la plaque Deep Well avant de pipetter directement à travers le film préperforé.

5.

Utiliser le barreau magnétique afin de maintenir le réactif de lyse en suspension. Pipetteren mélangeant à vitesse moyenne.

6.

Dans un premier temps, agiter délicatement le réactif de lyse à la main pour remettre la résine
en suspension. Garder le réactif de lyse en suspension pendant le pipettage en mélangeant à vitesse
iQ-Check Listeria spp. Kit | 7

Section 7

Protocolemoyenne avec le barreau magnétique contenu dans le flacon.
7.

Reconstituer le réactif de lyse final de la façon suivante :a. Verser soigneusement tout le contenu du réactif F (billes de lyse) dans le réactif A (réactif de lyse).
b. Utiliser des consommables adaptés, avec un embout à large ouverture, pour permettre le pipettage
du réactif de lyse homogénéisé.
c. Le réactif de lyse mélangé aux billes de lyse (réactifs A + F) présente une durée de conservationde 6 mois pour un stockage à 4 °C.

Protocole Standard II
1.

Prélever 1,5 ml d’échantillon enrichi décanté dans un tube.

2.

Centrifuger le tube à 10 000–12 000 x g pendant 5 min. Éliminer le surnageant.

3.

Ajouter 250 µl du réactif de lyse homogénéisé (réactifs A + F) au culot obtenu et mélanger par
aspiration/refoulement avec la pipette. Fermer le tube.

Remarque : dans un premier temps, agiter doucement à la main le flacon de réactif de lyse afin de remettre
en suspension les billes.
4.

Placer le tube dans le Cell disruptor pendant 3 ± 1 min.

5.

Incuber dans le bloc de chauffage à 95–100 °C pendant 15–20 min.

6. Vortexer le tube à grande vitesse et centrifuger à 10 000–12 000 x g pendant 5 min.
Si vous souhaitez vous arrêter temporairement dans le protocole, cette étape est la plus appropriée.
Le surnageant peut être stocké jusqu’à 1 an à -20 °C. Avant de le réutiliser, toujours laisser décongeler,homogénéiser, puis centrifuger à 10 000–12 000 x g pendant 5 min.

Protocole Easy II
1.

Aliquoter 100 µl du réactif de lyse homogénéisé (réactifs A + F) dans des tubes ou dans les puits d’une
plaque Deep Well.

Remarque : dans un premier temps, agiter doucement à la main le flacon de réactif de lyse afin de remettre
en suspension les billes.
2.

Ajouter 100 µl d’échantillon enrichi.

Remarque : agiter la suspension pour homogénéiser la culture et attendre le dépôt des débris avant
la collecte de l’échantillon.
3.

Mélanger la solution par aspiration/refoulement avec la pipette jusqu’à homogénéisation.

4.

Fermer les tubes ou sceller la plaque Deep Well avec un film préperforé.

5.

Placer le tube dans l’agitateur-incubateur ou le Cell disruptor pendant 3 ± 1 min. Incuber les tubes dansle bloc de chauffage à 95-100°C pendant 15-20 min.

6.

En cas d'utilisation d'un incubateur-agitateur pour tube ou plaque deep well incuber les tubes ou
plaques deep well dans l'incubateur -agitateur entre 1300 et 1600rpm à 95-100°C pendant 15-20 min.

7.

Vortexer les tubes à grande vitesse et centrifuger à 10 000–12 000 x g pendant 2 min au moins.
La centrifugation est inutile pour la plaque Deep Well.

Si vous souhaitez vous arrêter temporairement dans le protocole, cette étape est la plus appropriée.
Le surnageant peut être stocké jusqu’à 1 an à -20 °C. Avant de le réutiliser, toujours laisser décongeler,
8 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Section 7

Protocolehomogénéiser, puis centrifuger à 10 000–12 000 x g pendant 5 min.

D.

PCR en temps réel

Configuration de l’instrument et du logiciel
Pour la configuration de l’instrument et du logiciel, suivre les instructions fournies dans le guide d’utilisation
du système PCR en temps réel pour les kits iQ-Check.

Préparation du mélange de PCR
1.

Préparer le mélange de PCR contenant la solution d’amplification (réactif C) et les sondes fluorescentes(réactif B). Le volume de mélange de PCR nécessaire dépend du nombre d’échantillons et de contrôles
à analyser. Au moins un contrôle positif et un contrôle négatif doivent être inclus dans chaque PCR.
Utiliser le tableau de pipettage de l’annexe (Guide de calcul du mélange de PCR) pour trouver lesvolumes corrects pour chaque réactif.

Remarque : Le mélange de PCR (réactifs B + C) doit être utilisé immédiatement après la préparation. Il est
stable pendant 1 hr maximum à une température de 2–8 °C.
2.

Pipetter 45 µl de ce mélange de PCR dans chaque puits en fonction de la plaque préparée.

3.

Ajouter 5 µl d’extrait d’ADN, de réactif D (contrôle négatif) ou de réactif E (contrôle positif). Ne pas
vortexer l’échantillon avant le pipettage. Sceller hermétiquement les puits de la plaque de PCR ou lesbandes de tubes. Pipetter avec précaution afin d’éviter la formation de bulles au fond des puits. Étape
facultative : centrifuger la plaque de PCR scellée ou les bandes de tubes (rotation rapide) afin d’éliminerles bulles éventuelles.

4.

Placer la plaque PCR ou les bandes de tubes dans le thermocycleur. Veiller à placer la plaquecorrectement, le puits A1 dans le coin supérieur gauche. Fermer le module réactionnel.

Lancement de la PCR
Pour lancer la PCR, suivre les instructions fournies dans le guide d’utilisation du système PCR en temps réelpour les kits iQ-Check. Le fichier de protocole d’application « Lis spp Fast » a été certifié par
NF VALIDATION et AOAC.

E.

Analyse des données

Les données peuvent être analysées directement à la fin de la PCR ou ultérieurement en ouvrant le fichierde données enregistré. Suivre les instructions du manuel d’utilisation CFX Manager IDE correspondant pour
ouvrir les fichiers de données et régler les paramètres d’analyse des données.

Interprétation des résultats
Une fois que les paramètres d’analyse des données ont été définis, les résultats sont interprétés
en analysant les valeurs Cq (cycle de quantification) de chaque échantillon (le cycle auquel la courbe
d’amplification dépasse le seuil).
Le logiciel CFX Manager IDE assure une analyse automatisée complète des systèmes de détection par PCR
en temps réel de Bio-Rad. Une vérification des caractéristiques typiques des courbes d’amplification doit êtreréalisée avant la publication des résultats. Contacter l’équipe d’assistance technique de Bio-Rad en cas
de besoin.
Contrôles
Vérifier les contrôles positif et négatif avant d’interpréter les résultats de l’échantillon.
Pour que l’expérience soit valide, les contrôles doivent présenter les résultats du tableau ci-dessous. Dans

iQ-Check Listeria spp. Kit | 9

Section 8

Confirmation des résultats positifs

le cas contraire, il faut répéter la réaction de PCR.
Détection de Listeria spp.
(canal FAM)

Détection de contrôle interne(canal HEX)

Contrôle négatif

Cq = N/A*

28 ≤ Cq ≤ 40

Contrôle positif

26 ≤ Cq ≤ 36

N/A

Contrôle

* Le logiciel indique une valeur Cq (le cycle auquel la courbe d’amplification dépasse le seuil) N/A (non applicable) lorsque la fluorescence d’unéchantillon ne dépasse pas significativement le bruit de fond, et par conséquent ne croise pas le seuil.

Si les résultats des contrôles négatif et positif diffèrent des résultats indiqués dans le tableau ci-dessus(contrôle non valide), répéter la PCR et l’analyse décrites dans D. PCR en temps réel et E. Analyse desdonnées de la Section 7 Protocole.
Échantillons
Un test PCR iQ-Check Listeria spp. positif doit présenter une courbe d’amplification typique et une valeur
Cq ≥ 10 pour le fluorophore FAM.
■

Si la valeur Cq des deux canaux est inférieure à 10, vérifier que la courbe, en tant que données brutes,
montre un aspect caractéristique d’amplification exponentielle (une ligne de départ plane, avec une
augmentation rapide de la fluorescence, puis une stabilisation). Si la courbe semble correcte, le test
peut être considéré comme positif pour la présence de Listeria spp.

S’il n’y a pas de valeur Cq (Cq = N/A) pour FAM, ou si la courbe n’est pas une courbe d’amplification
typique, le contrôle interne de cet échantillon doit être analysé :■■■Si aucune valeur Cq n’est obtenue pour FAM et si le contrôle interne présente une valeur Cq ≥ 28,l’échantillon est considéré négatif pour Listeria spp.
Un contrôle interne qui n’a pas non plus de valeur Cq (Cq = N/A) indique probablement un phénomène
d’inhibition de la réaction de PCR. Diluer l’échantillon (réaliser une dilution à 1:10 dans de l’eau distillée
stérile avec 10 µl d’extrait d’ADN, utiliser 5 µl de la dilution) et répéter le test de PCR.
Si la valeur Cq pour le contrôle interne est < 28, il n’est pas possible d’interpréter le résultat. Vérifier quele seuil a été placé correctement ou que la courbe de données brutes est une courbe d’amplification
normale. Si la courbe n’a pas de forme caractéristique, répéter le test de PCR.

L’interprétation des résultats de l’échantillon est résumée dans le tableau suivant.
Détection de Listeria spp.
(FAM)

Détection de contrôle interne(HEX)

Interprétation

Cq ≥ 10

N/A

Positif

Cq = N/A

Cq ≥ 28

Négatif

Cq = N/A

Cq = N/A

Inhibition*

Lorsque la détection pour la cible et le contrôle interne donne une valeur Cq = N/A, l’extrait d’ADN doit être dilué au 1:10 et testé à nouveau.

Un non-respect des critères de validation peut entraîner une interprétation non valide. Vérifier les données
brutes et continuer de la même façon que pour un cas d’inhibition de l’échantillon.

Section 8
Section 8

Confirmation des résultats positifs
Dans le contexte de la méthode certifiée NF VALIDATION, tous les résultats iQ-Check positifs doivent êtreconfirmés de l’une des façons suivantes :1.

Mise en œuvre des tests classiques décrits dans les méthodes normalisées CEN ou ISO, à partir

10 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Section 9

Confirmation de colonies isolées à l’aide du kit iQ-Checkde l’échantillon.
2.

Isolement en bouillon LSB ou LSB II enrichi (striation de 100 μl) sur gélose chromogène RAPID’Listeria
spp. ou RAPID’L.mono et incubation pendant 24 hr à 37 ± 1 °C. La présence de colonies
caractéristiques Listeria spp. suffit à confirmer la présence de Listeria spp.

3.

Isolement en bouillon LSB ou LSB II enrichi (striation de 10 μl) sur gélose AL ou PALCAM et incubation
pendant 24–48 hr à 37 ± 1 °C. Les colonies caractéristiques doivent être confirmées avec les tests
décrits dans la méthode ISO.

4.

Utilisation de toute autre méthode certifiée par NF VALIDATION et basée sur un principe différent
de celui utilisé dans le test PCR iQ-Check Listeria spp. Le protocole validé de cette seconde méthodedoit être suivi dans sa totalité.

En cas de résultats discordants entre le kit iQ-Check Listeria spp. et l’une des options de confirmationénumérées ci-dessus, mettre en œuvre les étapes nécessaires pour garantir la validité du résultat.
Avant d’effectuer la confirmation, il est possible de stocker le bouillon LSB ou LSB II enrichi à 2–8 °C
pendant 72 hr maximum, à la suite de l’incubation à 30 °C.
Dans le contexte de la validation AOAC, un résultat iQ-Check Listeria spp. positif est présumé positif, et une
confirmation selon une méthode de référence appropriée (par exemple, USDA MLG, FDA BAM, ISO,MFHPB, etc.) est recommandée. Sinon, pour des matrices sélectionnées, strier 10 μl de LSB ou LSB
II enrichi directement sur la gélose RAPID’L. mono, RAPID’Listeria spp. ou sur la gélose chromogène
Listeria et incuber pendant 24 hr à 37 ± 1 °C. La présence de colonies caractéristiques Listeria spp. doit êtreconfirmée par un test biochimique pour la présence avérée de Listeria spp.

Section 9
Section 9

Confirmation de colonies isolées à l’aide du kit iQ-Check
iQ-Check Listeria spp. Kit peut également être utilisé pour confirmer des colonies isolées de Listeria spp. surmilieux de culture gélosés. Cette méthode est officiellement validée par la certification AFNOR des milieuxde culture chromogènes RAPID’L.mono et RAPID’Listeria spp.
1.

Choisir une colonie isolée sur un milieu de culture gélosé sélectif ou non sélectif, avec un cure-dent,
une anse stérile ou un autre consommable adapté (par exemple, un embout de pipette).

2.

Remettre en suspension la colonie dans 100 μΙ de tryptone-sel ou d’eau distillée stérile dans
un microtube à centrifuger.
Vortexer pour homogénéiser.
Utiliser 5 µl de la suspension avec 45 µl de mélange de PCR (voir D. PCR en temps réel Section 7
Protocole) et suivre le reste du protocole iQ-Check Listeria spp. pour l’interprétation des données
et des résultats.

iQ-Check Listeria spp. Kit | 11

Section 10 Performance du test et validations

Section 10
Section 10

Performance du test et validations
iQ-Check Listeria spp. Kit est spécifiquement destiné à la détection du genre Listeria.
NF VALIDATIONBRD 07/13-05/07
MÉTHODES
D’ANALYSE
ALTERNATIVESPOUR LE SECTEURAGROALIMENTAIRE
http://nf-validation.
afnor.org

iQ-Check Listeria spp. Kit est certifié NF VALIDATION comme méthode alternative
à la méthode de référence ISO 11290-1:2017 pour la détection de Listeria spp. danstous les produits destinés à la consommation humaine et dans les échantillons
environnementaux. La validation respecte le protocole de la norme ISO 16140-2:2016,et inclut l’utilisation des systèmes PCR en temps réel CFX96 Touch Deep Well System
et CFX Opus Deepwell System. L’utilisation de la solution d’élimination de l’ADN libre« iQ-Check Free DNA Removal Solution » est validée pour aliments composés,
produits laitiers et les échantillons environnementaux de production. Le logiciel associé
est CFX Manager IDE (version 2.2 et ultérieure). Le fichier de protocole d’application« Lis spp Fast » est validé. Numéro de certificat : BRD 07/13–05/07. Fin de validité :se reporter au certificat disponible sur le site Web AFNOR Certification.
Validation AOAC
iQ-Check Listeria spp. Kit (protocole Easy et protocole Easy avec protocole facultatif« Free DNA Removal ») a été validé par AOAC Research Institute dans le cadre
du programme « Performance Tested Methods » pour la détection de Listeria spp. surles surfaces en acier inoxydable, en plastique, en céramique, en béton verni et sur les
produits pâté de foie, hot-dogs, saucisse sèche crue, tranche de dinde, tranchede jambon, fromage naturel (125 g). Il convient de considérer un résultat positif avec
iQ-Check comme étant présumé positif et il est recommandé de le confirmer
conformément aux recommandations de la section 8. LSB, LSB II, le fichierde protocole d’application « List spp Fast », l’utilisation d’iQ-Check Free DNA Removal
Solution et des systèmes de PCR en temps réel CFX96 Touch Deep Well System
et CFX Opus Deepwell System sont validés pour tous les échantillons. Le logiciel
associé est CFX Manager IDE (version 2.2 et ultérieure). Numéro de certificat : 090701.
Validation Santé Canada
iQ-Check Listeria spp. Kit (protocole Easy) a été validé par Santé Canada (MFLP-39)
pour la détection de Listeria spp. sur toutes les surfaces environnementales ainsi que
la viande et la volaille prêtes-à-manger traitées thermiquement. Il convient de considérer
un résultat positif avec iQ-Check comme étant présumé positif et il est nécessaire de leconfirmer selon le document MFHPB-30 (voir Section 11).

12 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Section 11 Bibliographiee

Section 11
Section 11

Bibliographiee
AOAC Official Method 993.12-1996(1999). Listeria monocytogenes in milk and dairy products. Selectiveenrichment and isolation method.
Health Canada (2011). Health Products and Food Branch. MFHPB-30. Isolation of Listeria monocytogenes
and other Listeria spp. from foods and environmental samples. The Compendium of Analytical Methods,
Volume 2, February 2011.
ISO 7218:2007. Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations.
ISO 11290-1:2017. Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche
et le dénombrement de Listeria monocytogenes et de Listeria spp. — Partie 1 : Méthode de recherche.
ISO 16140-2:2016. Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 2 : Protocole
pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) par rapport à une méthode de référence.
ISO 22174:2005. Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pourla recherche de micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions.
United States Department of Agriculture, Food Safety and Inspection Service (2021). Microbiology
Laboratory Guidebook. Chapter 8.13: Isolation and identification of Listeria monocytogenes from red meat,
poultry, ready-to-eat Siluriformes (fish) and egg products, and environmental samples.
https://www.fsis.usda.gov/sites/default/files/media_file/2021-09/MLG-8.13.pdf, accessed February 14, 2020.
United States Food and Drug Administration (2017). Bacteriological Analytical Manual. Chapter 10: Detectionof Listeria monocytogenes in foods and environmental samples, and enumeration of Listeria monocytogenes
in foods. https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-10-detection-listeriamonocytogenes-foods-and-environmental-samples-and-enumeration, accessed February 14, 2020.

iQ-Check Listeria spp. Kit | 13

Section 12 Historique des révisions

Section 12
Section 12

Historique des révisions
Date de publication

Numéro de document

Octobre 2023

10000167777 Ver A

14 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Modification- Modification du numéros de document - version
précédente 10000123536 Ver C iQ-Check
Listeria spp.
- Extention de la validation AFNOR : LSB II pourles aliments composés, les échantillon
d'envirronement de production et les produits
laitiers

Section 12 Historique des révisions

Annexe — Guide de calcul du mélange de PCR
Pour trouver les volumes corrects de la préparation du mélange de PCR, additionner le nombre totald’échantillons et de contrôles à analyser et trouver les volumes correspondants de réactif B et de réactif
C dans le tableau.
Nombre totald’échantillons
et de contrôles

Sondesréactif B, μlMélanged’amplification
Réactif C, μl

Nombre totald’échantillons
et de contrôles

Sondesréactif B, μlMélanged’amplification
Réactif C, μl

Nombre totald’échantillons
et de contrôles

Sondesréactif B, μlMélanged’amplification
Réactif C, μl

1

5

40

33

178

1 400

65

351

2 800

2

11

86

34

184

1 500

66

356

2 900

3

16

130

35

189

1 500

67

362

2 900

4

22

173

36

194

1 600

68

367

2 900

5

27

216

37

200

1 600

69

373

3 000

6

32

259

38

205

1 600

70

378

3 000

7

38

302

39

211

1 700

71

383

3 100

8

43

346

40

216

1 700

72

389

3 100

9

49

389

41

221

1 800

73

394

3 200

10

54

432

42

227

1 800

74

400

3 200

11

59

475

43

232

1 900

75

405

3 200

12

65

518

44

238

1 900

76

410

3 300

13

70

562

45

243

1 900

77

416

3 300

14

76

605

46

248

2 000

78

421

3 400

15

81

648

47

254

2 000

79

427

3 400

16

86

691

48

259

2 100

80

432

3 500

17

92

734

49

265

2 100

81

437

3 500

18

97

778

50

270

2 200

82

443

3 500

19

103

821

51

275

2 200

83

448

3 600

20

108

864

52

281

2 200

84

454

3 600

21

113

907

53

286

2 300

85

459

3 700

22

119

950

54

292

2 300

86

464

3 700

23

124

994

55

297

2 400

87

470

3 800

24

130

1 000

56

302

2 400

88

475

3 800

25

135

1 100

57

308

2 500

89

481

3 800

26

140

1 100

58

313

2 500

90

486

3 900

27

146

1 200

59

319

2 500

91

491

3 900

28

151

1 200

60

324

2 600

92

497

4 000

29

157

1 300

61

329

2 600

93

502

4 000

30

162

1 300

62

335

2 700

94

508

4 100

31

167

1 300

63

340

2 700

95

513

4 100

32

173

1 400

64

346

2 800

96

518

4 100

iQ-Check Listeria spp. Kit | 15

Visiter bio-rad.com/iqcheck pour plus d’informations.
BIO-RAD est une marque déposée de Bio-Rad Laboratories, Inc.
IQ-CHECK est une marque déposée de Bio-Rad Europe GmbH dans certaines juridictions. Toutes les marques déposées utilisées dans ce document appartiennent
à leurs propriétaires respectifs.

10000167777 Ver A US/EG

Sig 0123

iQ-Check Listeria spp. Kit
Anwenderhandbuch
Test zum Nachweis von Listeria spp. in Lebensmittel- undUmgebungsproben durch die Real-Time PCR

Katalog-Nr. 3578113

Inhaltsverzeichnis
Abschnitt 1.

Einleitung ................................................................................................................................................ 1

Abschnitt 2. Die iQ-Check Listeria spp.-Technologie .................................................................................................. 1
Abschnitt 3.

Zusammensetzung des Kits .................................................................................................................... 2

Abschnitt 4.

Haltbarkeit und Lagerung ........................................................................................................................ 2

Abschnitt 5.

Zusätzlich benötigtes Material ................................................................................................................. 2
Geräte ..................................................................................................................................................... 2
Zubehör................................................................................................................................................... 3

Abschnitt 6.

Vorsichtsmaßnahmen und Empfehlungen für optimale Ergebnisse ........................................................ 4

Abschnitt 7.

Protokoll .................................................................................................................................................. 6
Probenanreicherung ............................................................................................................................... 6
Behandlung zur Entfernung freier DNA ................................................................................................... 8
DNA-Extraktion ....................................................................................................................................... 8
Real-Time PCR ....................................................................................................................................... 9
Datenanalyse ........................................................................................................................................ 10

Abschnitt 8.

Bestätigung positiver Ergebnisse .......................................................................................................... 12

Abschnitt 9.

Bestätigung von Einzelkolonien mit dem iQ-Check Kit.......................................................................... 12

Abschnitt 10. Testleistung und Testvalidierungen ...................................................................................................... 14
Abschnitt 11. Literatur ................................................................................................................................................. 15
Abschnitt 12. Revisionshistorie ................................................................................................................................... 16
Anhang — Pipettiertabelle für das PCR-Reaktionsgemisch.................................................................. 17

ii | iQ-Check Listeria spp. Kit

Abschnitt 1 Einleitung

Abschnitt 1
Abschnitt 1.

Einleitung
Herkömmliche bakteriologische Methoden sind oft langwierig und aufwändig. Bei iQ-Check Listeria spp.
dagegen handelt es sich um einen einfachen und schnellen qualitativen Test zum Nachweis Listeria spp.
spezifischer DNA-Sequenzen in Umgebungsproben und Nahrungsmittelerzeugnissen. Mithilfe der Real-TimePolymerasekettenreaktion (PCR) werden Listeria spp. spezifische DNA-Sequenzen amplifiziert undgleichzeitig mittels fluoreszierender Sonden nachgewiesen. In einem einfach durchzuführenden Verfahren
können bei minimalem Kontaminationsrisiko bis zu 94 Proben
verarbeitet werden. Dieses Kit ist zur Verwendung durch geschultes Laborpersonal bestimmt, das Tests zum
Nachweis von Listeria spp., einschließlich L. monocytogenes, L. fleischmannii, L. grayi, L. innocua, L. ivanovii,
L. marthii, L. rocourtiae, L. seeligeri, L. weihenstephanensis und L. welshimeri durchführt. Mit diesem Test
können Ergebnisse innerhalb weniger Stunden nach Anreicherung einer Probe erhalten werden.

Abschnitt 2
Abschnitt 2.

Die iQ-Check Listeria spp.-Technologie
iQ-Check Listeria spp. Kit beruht auf der Amplifizierung und dem Nachweis von Genen mittels Real-Time
PCR. Die gebrauchsfertigen PCR-Reagenzien im Kit enthalten Listeria spp. spezifische Oligonukleotide(Primer und Sonden) sowie DNA-Polymerase und Nukleotide. Der Nachweis und die Datenanalyse sind fürdie Verwendung eines Real-Time PCR Gerätes von Bio-Rad, z. B. des CFX96 Touch Deep Well Systems,
optimiert.
Die PCR ist eine leistungsstarke Technik, mit der viele Kopien der Ziel-DNA erzeugt werden können.
Während der PCR-Reaktion wird die DNA in mehreren Erwärmungs- und Abkühlzyklen durch Hitze
denaturiert. Danach binden Primer an die Zielregion. Die DNA-Polymerase verwendet diese Primer und die
Desoxynukleotidtriphosphaten (dNTPs) zur Verlängerung der DNA, wodurch Kopien der Ziel-DNA erzeugt
werden. Diese Kopien werden als Amplikons bezeichnet.
Bei der Real-Time PCR beruht der DNA-Nachweis auf der Hybridisierung spezifischer Sonden an die
Amplikons während der Amplifikation. An diese Sonden ist ein Fluorophor gebunden, der nur fluoresziert,
wenn die Sonde an die Zielsequenz hybridisiert. Bei dem Fluorophor, der an die Sonde gebunden ist, die mit
der Listeria spp. spezifischen DNA-Sequenz hybridisiert, handelt es sich um FAM. Wenn keine Ziel-DNA
vorhanden ist, ist keine Fluoreszenz nachweisbar. Da sich die Zahl der Amplikons mit jeder
Amplifizierungsrunde erhöht, verstärkt sich auch die Fluoreszenzintensität. Beim Annealing-Schritt jedes
PCR-Zyklus misst das optische Modul diese Fluoreszenz, während die zugehörige Software die
Fluoreszenzintensität gegen die Anzahl der Zyklen aufträgt.
Das Reaktionsgemisch enthält eine synthetische interne DNA-Kontrolle, um jedes etwaige negative Ergebnis
zu validieren. Diese Kontrolle wird gleichzeitig wie die Listeria spp. DNA-Zielsequenz mit einer spezifischen
Sonde amplifiziert und durch einen dritten Fluorophor nachgewiesen.

iQ-Check Listeria spp. Kit | 1

Abschnitt 3 Zusammensetzung des Kits

Dieser Test gestattet den qualitativen Nachweis von Listeria spp. in ausgewählten Lebensmittel- undUmgebungsproben, die zuvor durch Kultur angereichert wurden. Er umfasst die folgenden fünf Hauptschritte:*Hinsichtlich der Verwendungsbedingungen ist das Anwenderhandbuch für die iQ-Check Free DNA Removal
Solution (Dokument-Nr. 10000058391) zu beachten.

Abschnitt 3
Abschnitt 3.

Zusammensetzung des Kits
Das iQ-Check Listeria spp. Kit enthält ausreichend Reagenzien für 96 Tests (94 Proben).
Reagenz-ID

Reagenz

Menge

A

Lysereagenz

1 Flasche, 20 ml

B

Fluoreszenzsonden

1 Röhrchen, 0,55 ml

C

Amplifikationsmix

1 Röhrchen, 4,4 ml

D

PCR-Negativkontrolle

1 Röhrchen, 0,5 ml

E

PCR-Positivkontrolle

1 Röhrchen, 0,25 ml

F

Lysis Beads

1 Flasche, 17,6 g

Abschnitt 4
Abschnitt 4.

Haltbarkeit und Lagerung
Nach dem Erhalt muss das Kit bei 2–8 °C aufbewahrt werden. Bei Aufbewahrung bei dieser Temperatur
können die Reagenzien bis zu dem auf den Röhrchen angegebenen Verfallsdaten verwendet werden. Die
Haltbarkeit des Lyse-Reagenzes beträgt 6 Monate, nachdem es mit den Lysis Beads gemischt worden ist.

Abschnitt 5
Abschnitt 5.

Zusätzlich benötigtes Material
Geräte■Labor-Paddel-Blender zum Homogenisieren von Testproben■

Inkubator zur mikrobiologischen Anreicherung der Proben

2 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Abschnitt 5 Zusätzlich benötigtes Material■

Speziell für die Extraktion in sterilen konischen 1,5 ml Röhrchen mit Schraubdeckel:–

Tischzentrifuge (10.000–12.000 x g)–

Heiztrockenblock mit 37 ± 2 °C und/oder 95–100 °C■

Zellaufschlussgerät, z. B. Disruptor Genie (Scientific Industries, Inc.)■

Speziell für die Extraktion in einer Deep Well Platte:–

Thermoshaker mit Heizfunktion*, der eine Temperatur von 37 ± 2 °C und/oder 95–100 °C aufrecht
erhalten kann, mit einer Mischgeschwindigkeit von mindestens 1.300 rpm■

Vortex■Magnetrührer

■Mikropipetten für 20 µl, 200 µl, 1.000 µl■■

Bio-Rad Real-Time PCR System,* zum Beispiel das Real-Time PCR System CFX96 Touch Deep Well
(Katalog-Nr. 3600037) oder CFX Opus Deep Well (Katalog-Nr. 17007991)
iQ-Check Prep System von Bio-Rad für die automatisierte DNA-Extraktion und PCRPlattenvorbereitung (Katalog-Nr. 3594911)

Hinweis: Wir empfehlen die Verwendung einer unterbrechungsfreien Stromversorgung (USV) mit dem
Thermocycler und dem iQ-Check Prep System.
*

Informationen zu empfohlenen Geräten erhalten Sie vom technischen Kundendienst von Bio-Rad.

Zubehör
■■Anreicherungsmedium: Listeria Special Broth (LSB) (Katalog-Nr. 3555703, 6 Flaschen x 225 ml;
Katalog-Nr. 3564703, dehydriert, 500 g; Katalog-Nr. 3555793, 2 Beutel x 5 L; Katalog-Nr. 3564753,
dehydriert, 5 kg)
Anreicherungsmedium: Listeria Special Broth II (LSB II) (Katalog-Nr. 12017463, 6 Flaschen x 225 ml;
Katalog-Nr. 12017388, dehydriert, 500 g; Katalog-Nr. 12017378, dehydriert, 5 kg)■

iQ-Check Free DNA Removal Solution (Lösung zur Entfernung von freier DNA, Katalog-Nr. 3594970)■

Speziell für die Untersuchung von Umgebungsproben:■–

Schwämme zur Gewinnung von Umgebungsproben–

Tupfer zur Gewinnung von Umgebungsproben–

Neutralisierungsmedium für Probennahme-Schwämme und -Tupfer, z. B. Dey-Engley (D/E) oder
HiCap Neutralizing Broth oder Letheen BrothSpeziell für die Extraktion in Röhrchen:–■

Konische, sterile 1,5 ml Röhrchen mit Schraubdeckel (z. B. Katalog-Nr. 2240110XTU)

Speziell für die Extraktion in einer Deep Well Platte:–

Deep Well Platte mit 96 Wells (Katalog-Nr. 3594900)–

Abdichtungsfolie aus Kunststoff (Katalog-Nr. 3590139)–

X-Pierce Sealing Films (Katalog-Nr. 3593977) oder Pre-Pierced Plate Sealing Film
(Katalog-Nr. 3600040, nur in Nordamerika)

iQ-Check Listeria spp. Kit | 3

Abschnitt 6 Vorsichtsmaßnahmen und Empfehlungen für optimale Ergebnisse

■

■

■

■

■

Speziell für die Extraktionsprotokolle Standard II und Easy II:–

iQ-Check Lysis Beads (Reagenz F) (Katalog-Nr. 3578136)–

200 µl Pipettenspitzen mit weiter Öffnung

Speziell für das iQ-Check Prep System:–

60 ml Verdünnungsbehältnis (Katalog-Nr. 3594904)–

Filterspitzen (Katalog-Nr. 3594902 oder 12014486: 50 µl; Katalog-Nr. 3594903 oder 12014483:
1.000 µl)–

PCR-Mix-Röhrchen (Katalog-Nr. 12016673, 25 x 5 ml)

AL (Agar Listeria nach Ottaviani und Agosti) Agar (Katalog-Nr. 3563695, 20 Agarplatten x 90 mm;
Katalog-Nr. 3564046, dehydriert, 500 g; Katalog-Nr. 3564041, Supplement 1; Katalog-Nr. 3564042,
Supplement 2
RAPID'Listeria spp. Agar* (Katalog-Nr. 3564744, dehydriert, 500 g; Katalog-Nr. 3564745,
Supplement 1; Katalog-Nr. 3564746, Supplement 2)
RAPID'L.mono Agar* (Katalog-Nr. 3563694, 20 Agarplatten x 90 mm; Katalog-Nr. 3555294, Kit für
190 ml Agar plus 2
Supplements; Katalog-Nr. 3564293, dehydriert, 500 g; Katalog-Nr. 3564294, Supplement 1; KatalogNr. 3564746, Supplement 2)■

PCR-Platten, -Röhrchen, -Abdichtungsfolie und -Deckel■

Sterile Filterspitzen für 20 µl, 200 µl und 1.000 μl Mikropipetten■

Sterile, einzeln verpackte Spitzen für Combitip-Pipetten oder äquivalente Mehrfachpipetten■

1 ml und 10 ml Pipetten■

Sterile 2 ml und 5 ml Teströhrchen■

Ungepuderte Handschuhe■

Destilliertes steriles Wasser■

5%ige Bleichlösung

■Reinigungsmittel wie DNA AWAY oder RNase AWAY*

Kann außerhalb der AOAC-PTM-Validierung verwendet werden.

Abschnitt 6
Abschnitt 6.

Vorsichtsmaßnahmen und Empfehlungen für optimale
Ergebnisse■■

Dieser Test muss von geschultem Personal durchgeführt werden.
Schwangere, Kinder, ältere Menschen und immungeschwächte Personen sollten diese Methodeaufgrund der mit diesen Gruppen verbundenen hohen Infektions- und Sterberaten weder durchführen
noch mit L. monocytogenes in Kontakt gelangen.

4 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Abschnitt 6 Vorsichtsmaßnahmen und Empfehlungen für optimale Ergebnisse

■

■

■

Proben und Anreicherungskulturen sind bei der Handhabung als potenziell infektiös zu betrachten und
im Einklang mit vor Ort geltenden Verordnungen und Bestimmungen zu entsorgen.
Alle potenziell infektiösen Materialien sollten vor dem Entsorgen autoklaviert werden.
Die Ergebnisqualität hängt von der strikten Einhaltung der guten Laborpraxis ab (zum Beispiel der Norm
EN ISO 7218). In Bezug auf die PCR ist vor allem Folgendes zu beachten:■

Laborgeräte (Pipetten, Röhrchen usw.) nie von einem Arbeitsplatz zu einem anderen bringen.

■

Bei jeder Serie von Amplifikationsreaktionen eine Positivkontrolle und eine Negativkontrolle verwenden.

■

■

–

Die Reagenzien nach Ablauf ihres Verfallsdatums nicht mehr verwenden.

–

Die Reagenzien aus dem Kit vor dem Gebrauch auf dem Vortex mischen, um ihre Homogenität
sicherzustellen.

–

Die Genauigkeit und Präzision der Pipetten sowie die ordnungsgemäße Funktion der Geräteregelmäßig überprüfen.

–Handschuhe häufig wechseln, vor allem dann, wenn vermutet wird, dass sie kontaminiert sein
könnten.

–

Die Arbeitsplätze regelmäßig mit 5%iger Bleichlösung und anderen Dekontaminationsmitteln,z. B. DNA AWAY, reinigen.

–Ungepuderte Handschuhe verwenden, und Fingerabdrücke und Beschriftungen auf
Röhrchendeckeln vermeiden, da dies die Datenerfassung beeinträchtigen würde.

Es wird dringend empfohlen, die in der Norm EN ISO 22174:2005 „Mikrobiologie von Lebensmitteln und
Futtermitteln — Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis von pathogenen Mikroorganismen in
Lebensmitteln — Allgemeine Anforderungen und Begriffe“ beschriebenen Anforderungen einzuhalten.
iQ-Check Listeria spp. Kit:–■

iQ-Check Prep System:–■

Alle Substanzen oder Mischungen in dem Testkit sind klassifizierte Produkte gemäß dem globalenvereinheitlichten System (Global Harmonized System, GHS). Der Kontakt mit Säuren kann zur
Freisetzung giftiger Gase führen. Bei korrekter Anwendung sind keine besonderen
Vorsichtsmaßnahmen erforderlich. Bei Einatmen des Produkts Frischluft zuführen und bei
Beschwerden einen Arzt hinzuziehen. Nach Augenkontakt mit dem Produkt das geöffnete Auge
mehrere Minuten unter fließendem Wasser ausspülen. Wenn die Produkte verschluckt werden,
Erbrechen herbeiführen und ärztliche Hilfe anfordern.
Die unsachgemäße Verwendung des iQ-Check Prep Systems kann zu Personenverletzungen oder
Schäden am Gerät führen.
Einige Komponenten können bei unsachgemäßer Handhabung aufgrund übermäßiger Hitze zu
Personenverletzungen führen. Zur sicheren Verwendung darf das iQ-Check Prep System nur vonqualifiziertem Laborpersonal verwendet werden, das entsprechend geschult wurde. Die Wartungdes Geräts darf nur von Außendiensttechnikern von Bio-Rad durchgeführt werden.

Real-Time PCR Nachweissystem CFX96 Touch Deep Well oder CFX Opus Deep Well:–

Die unsachgemäße Verwendung des CFX96 Touch Deep Well Systems oder des CFX Opus Deep
Well Systems kann zu Personenverletzungen oder Schäden am Gerät führen. Einige
Komponenten können bei unsachgemäßer Handhabung aufgrund übermäßiger Hitze zu
Personenverletzungen führen. Für eine sichere Nutzung darf das CFX96 Touch Deep Well System
und das CFX Opus Deep Well System nur von qualifiziertem Laborpersonal bedient werden, das
iQ-Check Listeria spp. Kit | 5

Abschnitt 7 Protokoll

entsprechend geschult wurde. Die Wartung des Geräts darf nur von Außendiensttechnikern von
Bio-Rad durchgeführt werden.
■

Anreicherung:–

Der Benutzer sollte alle Sicherheitshinweise in den Anweisungen für das iQ-Check Listeria spp. Kit
lesen, verstanden haben und befolgen. Die Sicherheitshinweise zum späteren Nachschlagenaufbewahren. Um die mit der Exposition gegenüber Chemikalien und biologischen Gefahren
verbundenen Risiken zu verringern, sind Pathogentests in einem ordnungsgemäß ausgestatteten
Labor unter der Kontrolle von geschultem Personal durchzuführen. Beim Umgang mit Reagenzienund kontaminierten Proben sind stets die üblichen Laborsicherheitspraktiken einzuhalten,
beispielsweise sind geeignete Schutzkleidung und Schutzbrille zu tragen. Den Kontakt mit dem
Inhalt des Anreicherungsmediums und der Reagenzröhrchen nach der Anreicherung vermeiden.
Angereicherte Proben im Einklang mit den aktuellen Branchenstandards entsorgen.

–

Listeria ist ein Organismus der Biosicherheitsstufe 2. Biologische Proben, z. B. Anreicherungen,können Infektionskrankheiten übertragen. Es sind alle geltenden lokalen, staatlichen/regionalen
und/oder nationalen Vorschriften zur Entsorgung von biologischen Abfällen einzuhalten. Geeignete
Schutzausrüstung tragen, einschließlich unter anderem Schutzbrille, Gesichtsschutz,
Kleidung/Laborkittel und Handschuhe. Alle Arbeiten sollten in ordnungsgemäß ausgestatteten
Einrichtungen unter Verwendung der entsprechenden Sicherheitsausrüstung (z. B. physikalische
Eindämmungsvorrichtungen) durchgeführt werden. Mitarbeiter sollten vor der Arbeit mit potenziell
infektiösen Materialien nach den geltenden Bestimmungen und Anforderungen der Firma/Institution
geschult werden.

–

Nach Abschluss der Tests sind alle Materialien und Medien, die möglicherweise Krankheitserreger
enthalten, im Einklang mit den geltenden Industriestandards für die Entsorgung kontaminierter
Abfälle zu dekontaminieren (d. h. 20 min bei 121 °C autoklavieren). Weitere Informationen und vor
Ort geltende Entsorgungsvorschriften sind im Sicherheitsdatenblatt aufgeführt.

Abschnitt 7
Abschnitt 7.

Protokoll
A. Probenanreicherung
Es wird dringend empfohlen, vor Beginn des Tests das gesamte Protokoll durchzulesen.
Das Anreicherungsmedium muss vor der Verwendung die geeignete Inkubationstemperatur(Umgebungstemperatur oder 30 °C/37 °C, falls erforderlich) aufweisen.
Die Verwendung eines Anreicherungsbeutels mit eingebautem Filter wird dringend empfohlen.
Im Rahmen der NF VALIDATION wurden keine Mengen über 25 g getestet. Ohne Schütteln inkubieren,
wobei die Zeit- und Temperaturangaben in der nachstehenden Tabelle zu beachten sind. Es ist auchmöglich, den iQ-Check Test mit LSB durchzuführen, die angereichert und anschließend bis zu 72 hr bei
2–8 °C gelagert wurde.

6 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Abschnitt 7 Protokoll

In der folgenden Tabelle sind die verschiedenen Protokolle angeführt, die je nach Anwendung und Umfang
der Validierung verwendet werden:
Umfang (Matrices)Alle
Lebensmittelerzeugnisse
und Umgebungsproben1

NF VALIDATION BRD 7/13-05/07

Probenvorbereitungn g Lebensmittel in 9 x n ml LSB homogenisieren.

Anreicherung/DNA-Extraktion
Standard II Extraktion
 Für 22–24 hr bei 30 ±1 °C inkubieren.
 Röhrchenformat
Easy II Extraktion
 Für 24–26 hr bei 30 ±1 °C inkubieren.
 Röhrchen/Deep WellFormat

Produktionsumgebung
und -flächen2

n g Lebensmittel in 9 x n ml vorgewärmtem LSB oder LSB II bei
Raumtemperatur homogenisieren.

Easy II Extraktion (LSB) Für 18–26 hr bei
30 ± 1 °C inkubieren Röhrchen/Deep WellFormat
Easy II Extraktion (LSB II)
 Für 18–26 hr bei
37 ± 1 °C inkubieren Röhrchen/Deep WellFormat

Zusammengesetzte
Lebensmittel2

n g Lebensmittel in 9 x n ml LSB II homogenisieren.

Milchprodukte2

n g Lebensmittel in 9 x n ml vorgewärmtem LSB II homogenisieren.

Easy II Extraktion (LSB II)
 Für 18–26 hr bei
37 ± 1 °C inkubieren Deep Well-Format
Easy II Extraktion (LSB II)
 Für 20–28 hr bei
37 ± 1 °C inkubieren Deep Well-Format

Umfang (Matrices)2,3
Leberwurst, Hotdogs,
rohe fermentierte Wurst,
Truthahnaufschnitt,
Schinkenaufschnitt,Rohmilchkäse (125 g)

Probenvorbereitungn g Lebensmittel in 9 x n ml LSB oder LSB II homogenisieren(25 g in 225 ml; 125 g in 1.125 ml)

AOAC PTM 090701

Anreicherung/DNA-Extraktion
Easy II Extraktion (LSB) Für 24–26 hr bei 30 ±1 °C inkubieren(Röhrchen/Deep WellFormat).
Easy II Extraktion (LSB II)
 Für 18–24 hr bei 37 ±1 °C inkubieren.
 Röhrchen/Deep WellFormat

Umweltoberflächen
(Edelstahl, Kunststoff,
Keramik, versiegelter
Beton)

Umgebungsproben Tupfer und Schwämme mit einer neutralisierenden
Nährlösung befeuchten, die keinen Arylsulfonatkomplex
enthält.
 Bei Verwendung eines Tupfers sollte die Probe von einer
Fläche der Größe 2,54 x 2,54 cm genommen werden.
 Bei Verwendung eines Schwamms sollte die Probe voneiner Fläche der Größe 10,16 x 10,16 cm genommen
werden.
 Ausreichend LSB oder LSB II zugeben, um den Tupferoder den Schwamm zu bedecken (10 ml bzw. 60–225 ml).

Easy II Extraktion (LSB) Für 18–24 hr bei 30 ±1 °C inkubieren(Röhrchen/Deep WellFormat).
Easy II Extraktion (LSB II)
 Für 16–24 hr bei 37 ±1 °C inkubieren.
 Röhrchen/Deep WellFormat

Siehe MFLP-39 bezüglich Matrices und Protokollen mit Freigabe von Health Canada

iQ-Check Listeria spp. Kit | 7

Abschnitt 7 Protokoll

Die Validierung umfasst die Verwendung der Anwendungsprotokolldatei „Lis spp Fast“ für eine kürzere PCR-Laufzeit. Für weitere
Informationen wenden Sie sich bitte an Ihre Bio-Rad-Vertretung.
1

Die Validierung umfasst die Verwendung der iQ-Check Free DNA Removal Solution und der Anwendungsprotokolldatei „Lis spp Fast“
für eine kürzere PCR-Laufzeit. Für weitere Informationen wenden Sie sich bitte an Ihre Bio-Rad-Vertretung.
2

3
Die Validierung umfasst den direkten Ausstrich auf RAPID’L. mono-, RAPID’Listeria spp.- oder Agar Listeria-Platten (ausgenommen
Rohmilchkäse)

B. Behandlung zur Entfernung freier DNA
Die iQ-Check Free DNA Removal Solution ist speziell dafür vorgesehen, freie DNA zu entfernen. Es sind die
Empfehlungen von Bio-Rad im Anwenderhandbuch zu beachten (Dokument-Nr. 10000058391).
Dieses Protokoll ist validiert:■■

Im Rahmen einer AFNOR-Zertifizierung in der Kategorie „Umgebungsproben aus dem Bereich
Produktion“.
Vom AOAC Research Institute auf einer Liste von Matrices, die im AOAC-PTM-Validierungszertifikat
angegeben sind.

C. DNA-Extraktion
Allgemeine Empfehlungen:1.

Den Heizblock oder den Thermoshaker zum Vorheizen einschalten, bevor mit dem Test begonnen wird.
Auf 95–100 °C einstellen. Das Lysereagenz während des Pipettierens durch Rühren bei mittlerer
Geschwindigkeit auf einer Magnetrührplatte in Suspension halten.

2.

Generell sollte vermieden werden, den Anreicherungsbeutel zu schütteln und große
Lebensmittelfragmente in der Probe zu entnehmen. Bei Lebensmittelproben mit fettigem Überstandsollte die Probe knapp unterhalb dieser Schicht entnommen werden.

3.

Beim Öffnen von Röhrchen und Wells vorsichtig vorgehen, um eine mögliche Kreuzkontamination zu
vermeiden.

4.

Die Deep Well Platte kühlen, bevor direkt durch die vorgestanzte Abdichtungsfolie pipettiert wird.

5.

Den Magnetrührer verwenden, um das Lysereagenz in Suspension zu halten. Den Pipettiervorgang
durchführen, während es bei mittlerer Geschwindigkeit gerührt wird.

6.

Das Lysereagenz zuerst vorsichtig per Hand schütteln, um das Harz zu resuspendieren. Das
Lysereagenz pipettieren, während es bei mittlerer Geschwindigkeit gerührt wird (Magnetrührstab
befindet sich in der Flasche), damit es in Suspension bleibt.

7.

Das Lysereagenz wie folgt zur Verwendung rekonstituieren:a.

Den Inhalt von Reagenz F (Lysis Beads) vollständig zu Reagenz A (Lysereagenz) geben.

b.

Zum Pipettieren des homogenisierten Lysereagenzes Pipettenspitzen mit ausreichend großerÖffnung verwenden.

c.

Das mit Lysis Beads gemischte Lysereagenz (Reagenz A + F) ist bei 4 °C für 6 Monate haltbar.

8 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Abschnitt 7 Protokoll

Protokoll Standard II
1.

1,5 ml dekantierte angereicherte Probe in ein Röhrchen überführen.

2.

Das Röhrchen bei 10.000–12.000 x g 5 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.

3.

250 μl homogenisiertes Lysereagenz (Reagenz A + F) zu dem Pellet geben und das Pellet durch Aufund Abpipettieren des Reagenzes resuspendieren. Das Röhrchen verschließen.

Hinweis: Das Lysereagenz zuerst vorsichtig per Hand schütteln, um die Beads zu resuspendieren.
4.

Das Röhrchen für 3 ± 1 min in den Thermoshaker oder das Zellaufschlussgerät geben.

5.

Für 15–20 min in den jeweiligen auf 95–100 °C vorgeheizten Heizblock stellen.

6.

Das Röhrchen bei hoher Geschwindigkeit auf dem Vortex mischen und dann 5 min bei
10.000–12.000 x g zentrifugieren.
Dies ist der empfohlene Zeitpunkt, um die Probenaufbereitungen vorübergehend zu unterbrechen.
Der Überstand kann bis zu 1 Jahr bei -20 °C gelagert werden. Vor der erneuten Verwendung stets auftauen
und homogenisieren und anschließend 5 min bei 10.000–12.000 x g zentrifugieren.

Protokoll Easy II
1.

100 μl homogenisiertes Lysereagenz (Reagenz A + F) in Röhrchen oder die Wells einer Deep Well
Platte aliquotieren.

Hinweis: Das Lysereagenz zuerst vorsichtig per Hand schütteln, um die Beads zu resuspendieren.
2.

100 µl der angereicherten Probe dazugeben.

Hinweis: Die Suspension schütteln, um die Kultur zu homogenisieren, und dann vor der Probenentnahmealle Partikel absetzen lassen.
3.

Die Lösung durch Auf- und Abpipettieren mischen, bis sie homogen ist.

4.

Die Röhrchen verschließen bzw. die Deep Well Platte mit vorgestanzter Abdichtungsfolie verschließen.

5.

Die Röhrchen für 3 ± 1 min in den Thermoshaker oder das Zellaufschlussgerät geben. Inkubieren Sie
die Röhrchen im Heizblock bei 95-100°C für 15-20 min.

6.

Bei Verwendung eines Thermoschüttlers im Röhrchen oder Deep Well Plattenformat werden die
Röhrchen oder Deep Well Patten bei einer Schüttelgeschwindigkeit von 1300 bis 1600 rpm und einer
Temperatur von 95–100°C für 15-20 min inkubiert.

7.

Die Röhrchen bei hoher Geschwindigkeit auf dem Vortex mischen und dann mindestens 2 min bei
10.000–12.000 x g zentrifugieren.

Deep Well Platten brauchen nicht zentrifugiert zu werden.
Dies ist der empfohlene Zeitpunkt, um die Probenaufbereitungen vorübergehend zu unterbrechen.
Der Überstand kann bis zu 1 Jahr bei -20 °C gelagert werden. Vor der erneuten Verwendung stets auftauen
und homogenisieren und anschließend 5 min bei 10.000–12.000 x g zentrifugieren.

D. Real-Time PCR
Konfiguration des Geräts und der Software
iQ-Check Listeria spp. Kit | 9

Abschnitt 7 Protokoll

Zur Konfiguration von Gerät und Software sind die Anleitungen im Anwenderhandbuch des Real-Time PCR
Systems für iQ-Check Kits zu beachten.
Vorbereitung des PCR-Reaktionsgemisches1.

Das PCR-Reaktionsgemisch mit der Amplifikationslösung (Reagenz C) und den fluoreszierenden
Sonden (Reagenz B) vorbereiten. Das benötigte Volumen des PCR-Reaktionsgemisches hängt von derAnzahl der zu analysierenden Proben und Kontrollen ab. In jedem PCR-Lauf müssen mindestens eine
Positiv- und eine Negativkontrolle mitgeführt werden. Die korrekten Volumen für jedes Reagenz sind zur
Berechnung des PCR-Reaktionsgemisches in der Pipettiertabelle im Anhang angegeben.

Hinweis: Das PCR-Reaktionsgemisch (Reagenz B + C) sofort nach der Zubereitung verwenden. Es ist bei
2–8 °C maximal 1 hr stabil.
2.
3.

4.

Aus diesem PCR-Reaktionsgemisch dem jeweils verwendeten Platten-Layout entsprechend 45 µl in
jedes Well pipettieren.
5 µl DNA-Extrakt, Reagenz D (Negativkontrolle) oder Reagenz E (Positivkontrolle) zugeben. Die Probevor dem Pipettieren nicht vortexen. Die Wells der PCR-Platte oder der PCR-Röhrchenstreifens
hermetisch abdichten. Es ist wichtig, Luftblasen am Boden der Wells zu vermeiden, indem behutsam
pipettiert wird. Optional kann die verschlossene PCR-Platte bzw. können die verschlossenen PCRRöhrchenstreifen zur Beseitigung etwaiger Luftblasen kurz zentrifugiert werden.
Die PCR-Platte bzw. die PCR-Röhrchenstreifen in den Thermocycler stellen. Auf die korrekte
Ausrichtung der Platte achten, d. h. das Well A1 muss sich oben links befinden. Das Reaktionsmodul
schließen.

Die PCR durchführen
Zum Starten des PCR-Laufs ist die Anleitung im Anwenderhandbuch des Real-Time PCR Systems für die
iQ-Check Kits zu beachten. Die Anwendungsprotokolldatei „Lis spp Fast“ ist NF- und AOAC-validiert.

E. Datenanalyse
Die Datenanalyse kann direkt am Ende des PCR-Laufs oder später durch Öffnen der gespeicherten
Datendatei durchgeführt werden. Für das Öffnen von Datendateien und die Festlegung derDatenanalyseparameter sind die Anweisungen im Benutzerhandbuch der Software CFX Manager IDE
befolgen.

Ergebnisinterpretation
Nach Festlegung der Datenanalyseparameter werden die Ergebnisse durch Analyse derQuantifizierungszyklus-Werte (Cq-Werte) jeder Probe (des Zyklus, in dem die Amplifikationskurve den
Schwellenwert übersteigt) interpretiert.
Die Software CFX Manager IDE ermöglicht eine vollständige automatisierte Analyse bei Verwendung vonReal-Time PCR-Nachweissystemen von Bio-Rad. Vor der Freigabe der Ergebnisse sollten die typischen
Charakteristika der Amplifikationskurven verifiziert werden. Wenn zusätzlicher Support gewünscht wird, ist
der technische Kundendienst von Bio-Rad zu kontaktieren.
Kontrollen
Vor der Interpretation der Probenergebnisse sind die Positiv- und die Negativkontrolle zu verifizieren.
Damit das Experiment gültig ist, müssen für die Kontrollen die in der folgenden Tabelle zusammengefassten
Ergebnisse erhalten werden. Andernfalls muss die PCR-Reaktion wiederholt werden.
10 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Abschnitt 7 Protokoll

Nachweis von Listeria spp.
(FAM-Kanal)

Nachweis der internen Kontrolle(HEX-Kanal)

Negativkontrolle

Cq = N/A*

28 ≤ Cq ≤ 40

Positivkontrolle

26 ≤ Cq ≤ 36

N/A

Kontrolle* Die Software gibt als Cq-Wert (der Zyklus, in dem die Amplifikationskurve den Schwellenwert schneidet) das Ergebnis N/A (Not Applicable; nicht
zutreffend) an, wenn die Fluoreszenz der Probe nicht signifikant höher ist als die des Leerwerts und daher den Schwellenwert nicht übersteigt.

Wenn sich die Ergebnisse der Negativ- und der Positivkontrolle von denen in der Tabelle für die Kontrollen
unterscheiden (ungültige Kontrolle), sind der in „D. Real-Time PCR“ und „E. Datenanalyse“ in Abschnitt 7„Protokoll“ beschriebene Lauf und die Analyse zu wiederholen.
ProbenEin positiver iQ-Check Listeria spp. PCR-Test muss eine typische Amplifikationskurve und für den FAMFluorophor einen Cq-Wert von ≥ 10 ergeben.
■

Liegt der Cq-Wert für beide Kanäle unter 10, muss in den Rohdaten überprüft werden, ob es sich bei
der Kurve um eine normale Amplifikationskurve handelt (d. h. um eine Kurve mit flacher Basislinie,
gefolgt von einem raschen exponentiellen Anstieg der Fluoreszenz und anschließender Abflachung).
Wenn die Kurve korrekt aussieht, kann der Test als positiv auf Listeria spp. betrachtet werden.

Wenn kein Cq-Wert für FAM vorliegt (Cq = N/A) oder es sich bei der Kurve nicht um eine typische
Amplifikationskurve handelt, muss die interne Kontrolle für die entsprechende Probe analysiert werden:■■■

Die Probe gilt als negativ auf Listeria, wenn kein Cq-Wert im FAM-Kanal vorliegt und die interne
Kontrolle einen Cq-Wert ≥ 28 aufweist.
Falls auch für die interne Kontrolle kein Cq-Wert vorliegt (Cq = N/A), bedeutet dies, dass die PCRReaktion vermutlich gehemmt war. Die Probe muss verdünnt (mit 10 μl DNA-Extrakt eine 1:10Verdünnung in destilliertem sterilem Wasser durchführen und dann 5 μl der Verdünnung testen) und die
PCR wiederholt werden.
Falls der Cq-Wert für die interne Kontrolle < 28 liegt, ist keine Interpretation des Ergebnisses möglich.
Es ist zu überprüfen ob der Schwellenwert korrekt platziert wurde oder ob es sich bei der Kurve aus den
Rohdaten um eine normale Amplifikationskurve handelt. Wenn die Kurve keine charakteristische Form
aufweist, muss der PCR-Test wiederholt werden.

Die Interpretation der Testergebnisse ist in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
Nachweis von Listeria spp.
(FAM)

Nachweis der internen Kontrolle(HEX)

AuswertungCq ≥ 10

N/A

Positiv

Cq = N/A

Cq ≥ 28

Negativ

Cq = N/A

Cq = N/A

Hemmung* Wenn sowohl beim Ziel-Nachweis als auch beim Nachweis der internen Kontrolle ein Cq-Wert = N/A erhalten wird, muss der DNA-Extrakt erneut
getestet werden, jedoch im verdünnten Zustand (1:10).

Wenn Validierungskriterien nicht erfüllt sind, wird das Ergebnis unter Umständen als ungültig bezeichnet. Die
Rohdaten überprüfen und wie bei einer inhibierten Probe weiter verfahren.

iQ-Check Listeria spp. Kit | 11

Abschnitt 8 Bestätigung positiver Ergebnisse

Abschnitt 8
Abschnitt 8.

Bestätigung positiver Ergebnisse
Im Kontext der NF VALIDATION-zertifizierten Methode müssen alle positiven iQ-Check Ergebnisse bestätigt
werden. Dazu gibt es folgende Möglichkeiten:
1.

Durchführung klassischer Tests, die in den standardisierten CEN- oder ISO-Methoden beschrieben
sind, unter Verwendung der Ausgangsprobe.

2.

Durch Isolierung von angereichertem LSB oder LSB II (Ausstreichen von 100 μl) auf chromogenem
RAPID'Listeria spp. oder RAPID'L.mono Agar und Inkubation für 24 hr bei 37 ± 1 °C. Das
Vorhandensein charakteristischer Listeria spp.-Kolonien ist ausreichend, um das Vorhandensein vonListeria spp. zu bestätigen.

3.

Durch Isolation von angereichertem LSB oder LSB II (Ausstreichen von 10 μl) auf AL- oder PALCAMAgar und Inkubation für 24–48 hr bei 37 ± 1 °C. Typische Kolonien sollten mit den im ISO-Verfahrenbeschriebenen Tests bestätigt werden.

4.

Verwendung einer anderen von NF VALIDATION zertifizierten Methode, die auf einem anderen Prinzip
als dem des iQ-Check Listeria spp. PCR-Tests beruht. Das validierte Protokoll dieser zweiten Methodemuss vollständig durchgeführt werden.

Bei abweichenden Ergebnissen zwischen dem iQ-Check Listeria spp. Kit und einer der oben aufgeführten
Bestätigungsmethoden sind die erforderlichen Schritte zu befolgen, um gültige Ergebnisse sicherzustellen.
Die angereicherte LSB oder LSB II kann nach der Inkubation bei 30 °C maximal 72 hr bei 2–8 °C aufbewahrt
werden, bevor die Bestätigung durchgeführt wird.
Im Rahmen der AOAC-Validierung gilt ein positives iQ-Check Listeria spp. Ergebnis als vermutlich positiv,
und es wird die Bestätigung mit einer geeigneten Referenzmethode (z. B. USDA MLG, FDA BAM, ISO,MFHPB usw.) empfohlen. Alternativ werden bei bestimmten Matrices 10 μl angereicherte LSB oder LSB II
direkt auf chromogenem RAPID’L. mono-, RAPID’Listeria spp.- oder Agar Listeria-Agar ausgestrichen und
24 hr bei 37 ± 1 °C inkubiert. Bei Vorhandensein charakteristischer Listeria spp.-Kolonien sollte das
Vorhandensein von Listeria spp. biochemisch bestätigt werden.

Abschnitt 9Abschnitt 9.

Bestätigung von Einzelkolonien mit dem iQ-Check Kit
Das iQ-Check Listeria spp. Kit kann auch zum Bestätigen isolierter Listeria spp. Einzelkolonien auf
Agarplatten verwendet werden. Dies wurde im Rahmen der AFNOR-Zertifizierung auf den chromogenen
Medien RAPID'L.mono und RAPID'Listeria spp. offiziell validiert.
1.

Mit einem Zahnstocher, einer sterilen Impföse oder einem anderen geeigneten Verbrauchsartikel(z. B. einer Pipettenspitze) eine isolierte Kolonie aus einer Platte mit selektivem oder nichtselektivem
Agar aufnehmen.

2.

Die Kolonie in 100 µl Tryptonsalz-Medium oder destilliertem, sterilem Wasser in einem
Mikrozentrifugenröhrchen resuspendieren.
Auf dem Vortex homogenisieren.

12 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Abschnitt 9 Bestätigung von Einzelkolonien mit dem iQ-Check Kit

5 μl der Suspension zu 45 μl PCR-Reaktionsgemisch geben (siehe „D. Real-Time PCR“ in Abschnitt 7„Protokoll“) und die übrigen Schritte des Protokolls iQ-Check Listeria spp. zur Daten- undErgebnisinterpretation befolgen.

iQ-Check Listeria spp. Kit | 13

Abschnitt 10 Testleistung und Testvalidierungen

Abschnitt 10
Abschnitt 10.

Testleistung und Testvalidierungen
Das iQ-Check Listeria spp. Kit ist spezifisch für die Gattung Listeria.
NF Validation

BRD 07/13-05/07
ALTERNATIVEANALYSIS
METHODS FORAGRIBUSINESS
http://nf-validation.
afnor.org

Das iQ-Check Listeria spp. Kit ist von NF VALIDATION als alternative Methode zur
Referenzmethode ISO 11290-1:2017 zum Nachweis von Listeria spp. in allen
Erzeugnissen für den menschlichen Verzehr sowie in Umgebungsproben zertifiziert.
Die Validierung erfolgte nach dem Protokoll von ISO 16140-2:2016 und umfasst die
Verwendung der Real-Time PCR Systeme CFX96 Touch Deep Well und CFX Opus
Deep Well. Die Verwendung der Free DNA Removal Solution ist für zusammengesetzte
Lebensmittel, Milchprodukte und Umgebungsproben aus dem Bereich Produktion
validiert. Die zugehörige Software ist die Software CFX Manager IDE (ab Version 2.2).
Die Anwendungsprotokolldatei „Lis spp Fast“ ist validiert. Zertifikatnummer: BRD 07/13–
05/07. Gültig bis: Entsprechend den Angaben auf dem Zertifikat auf der Website von
AFNOR CERTIFICATION.
AOAC-Validierung
Das iQ-Check Listeria spp. Kit (Protokolle Easy Protocol und Easy mit optionalem
Protokoll zur Entfernung freier DNA) wurde vom AOAC Research Institute im Rahmen
des Performance Tested Method-Programms zum Nachweis von Listeria spp. auf/in
Edelstahl, Kunststoff, Keramik, versiegeltem Beton, Leberwurst, Hotdogs, roher
fermentierter Wurst, Truthahnaufschnitt, Schinkenaufschnitt und Rohmilchkäse (125 g)
verwendet. Ein positives Ergebnis mit dem iQ-Check Kit ist als vorläufig positiv zu
betrachten und sollte mit der in Abschnitt 8 empfohlenen Methode bestätigt werden.
LSB, LSB II, die „List spp Fast“ APF, die Verwendung der iQ-Check Free DNA Removal
Solution sowie die Verwendung der Real-Time PCR Systeme CFX96 Touch Deep Wellund CFX Opus Deep Well sind für alle Proben validiert. Die zugehörige Software ist die
CFX Manager Software IDE (ab Version 2.2). Zertifikatnummer: 090701.
Health Canada-Validierung
Das iQ-Check Listeria spp. Kit (Protokoll Easy) wurde von Health Canada (MFLP-39) fürden Nachweis von Listeria spp. auf allen Umweltoberflächen und in hitzebehandeltem
verzehrfertigem Fleisch und Geflügel validiert. Ein positives Ergebnis mit dem iQ-Check
Kit ist als vorläufig positiv zu betrachten und muss gemäß MFHPB-30 bestätigt werden(siehe Abschnitt 11).

14 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Abschnitt 11 Literatur

Abschnitt 11
Abschnitt 11.

Literatur
AOAC Official Method 993.12-1996(1999). Listeria monocytogenes in milk and dairy products. Selectiveenrichment and isolation method.
Health Canada (2011). Health Products and Food Branch. MFHPB-30. Isolation of Listeria monocytogenes
and other Listeria spp. from foods and environmental samples. The Compendium of Analytical Methods,
Volume 2, February 2011.
ISO 7218:2007. Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln – Allgemeine Anforderungen undLeitlinien für mikrobiologische Untersuchungen.
ISO 11290-1:2017. Mikrobiologie der Lebensmittelkette – Horizontales Verfahren für den Nachweis und die
Zählung von Listeria monocytogenes und von Listeria spp. – Teil 1: Nachweisverfahren.
ISO 16140-2:2016. Mikrobiologie der Lebensmittelkette – Verfahrensvalidierung – Teil 2: Arbeitsvorschrift fürdie Validierung von alternativen (urheberrechtlich geschützten) Verfahren anhand eines Referenzverfahrens.
ISO 22174:2005. Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln – Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
zum Nachweis von pathogenen Mikroorganismen in Lebensmitteln – Allgemeine Anforderungen
und Begriffe.
United States Department of Agriculture, Food Safety and Inspection Service (2021). Microbiology
Laboratory Guidebook. Chapter 8.13: Isolation and identification of Listeria monocytogenes from red meat,
poultry, ready-to-eat Siluriformes (fish) and egg products, and environmental samples.
https://www.fsis.usda.gov/sites/default/files/media_file/2021-09/MLG-8.13.pdf, accessed February 14, 2020.
United States Food and Drug Administration (2017). Bacteriological Analytical Manual. Chapter 10: Detectionof Listeria monocytogenes in foods and environmental samples, and enumeration of Listeria monocytogenes
in foods. https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-10-detection-listeriamonocytogenes-foods-and-environmental-samples-and-enumeration, accessed February 14, 2020.

iQ-Check Listeria spp. Kit | 15

Abschnitt 12 Revisionshistorie

Abschnitt 12
Abschnitt 12.

Revisionshistorie
Freigabedatum

Dokumentnummer

Oktober 2023

10000167777 Ver AÄnderungÄnderung der Dokumentnummer - vorherige
Version 10000123536 Ver C iQ-Check Listeria
spp. Benutzerhandbuch- AFNOR-Erweiterung: LSB II fürzusammengesetzte Lebensmittel, Umweltproben
und Milchprodukte

16 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Abschnitt 12 Revisionshistorie

Anhang — Pipettiertabelle für das PCR-Reaktionsgemisch
Die Tabelle gibt Aufschluss über die entsprechenden korrekten Mengen von Reagenz B und C zur
Herstellung des PCR-Reaktionsgemisches je nach der Gesamtzahl der zu analysierenden Proben undKontrollen.
Gesamtzahl an
Proben undKontrollen

SondenAmplifikationsmix
Reagenz B,
Reagenz C,µlµl

Gesamtzahl an
Proben undKontrollen

SondenAmplifikationsmix
Reagenz B,
Reagenz C,µlµl

Gesamtzahl an
Proben undKontrollen

SondenAmplifikationsmix
Reagenz B,
Reagenz C,
µl
µl

1

5

40

33

178

1.400

65

351

2

11

86

34

184

1.500

66

356

2.800
2.900

3

16

130

35

189

1.500

67

362

2.900

4

22

173

36

194

1.600

68

367

2.900

5

27

216

37

200

1.600

69

373

3.000

6

32

259

38

205

1.600

70

378

3.000

7

38

302

39

211

1.700

71

383

3.100

8

43

346

40

216

1.700

72

389

3.100

9

49

389

41

221

1.800

73

394

3.200

10

54

432

42

227

1.800

74

400

3.200

11

59

475

43

232

1.900

75

405

3.200

12

65

518

44

238

1.900

76

410

3.300

13

70

562

45

243

1.900

77

416

3.300

14

76

605

46

248

2.000

78

421

3.400

15

81

648

47

254

2.000

79

427

3.400

16

86

691

48

259

2.100

80

432

3.500

17

92

734

49

265

2.100

81

437

3.500

18

97

778

50

270

2.200

82

443

3.500

19

103

821

51

275

2.200

83

448

3.600

20

108

864

52

281

2.200

84

454

3.600

21

113

907

53

286

2.300

85

459

3.700

22

119

950

54

292

2.300

86

464

3.700

23

124

994

55

297

2.400

87

470

3.800

24

130

1.000

56

302

2.400

88

475

3.800

25

135

1.100

57

308

2.500

89

481

3.800

26

140

1.100

58

313

2.500

90

486

3.900

27

146

1.200

59

319

2.500

91

491

3.900

28

151

1.200

60

324

2.600

92

497

4.000

29

157

1.300

61

329

2.600

93

502

4.000

30

162

1.300

62

335

2.700

94

508

4.100

31

167

1.300

63

340

2.700

95

513

4.100

32

173

1.400

64

346

2.800

96

518

4.100

iQ-Check Listeria spp. Kit | 17

Weitere Informationen finden Sie auf bio-rad.com/iqcheck.
BIO-RAD ist eine Marke der Bio-Rad Laboratories, Inc.
IQ-CHECK ist in bestimmten Ländern eine Marke der Bio-Rad Europe GmbH. Alle hier genannten Marken sind Eigentum der jeweiligen Firmen.

10000167777 Ver A US/EG

Sig 0123

iQ-Check Listeria spp. Kit
Manuale d'uso
Test per la rilevazione mediante PCR real-time di Listeria spp.
in prodotti alimentari e campioni ambientali

N. catalogo 3578113

Indice
Sezione 1

Introduzione ............................................................................................................................................ 1

Sezione 2

Tecnologia iQ-Check Listeria spp. .......................................................................................................... 1

Sezione 3

Componenti del kit .................................................................................................................................. 2

Sezione 4

Validità e conservazione ......................................................................................................................... 2

Sezione 5

Materiali necessari ma non inclusi .......................................................................................................... 2
Apparecchiatura ...................................................................................................................................... 2
Materiali .................................................................................................................................................. 3

Sezione 6

Sicurezza, precauzioni e raccomandazioni per ottenere risultati ottimali ................................................ 4

Sezione 7

Protocollo ................................................................................................................................................ 6
Arricchimento del campione .................................................................................................................... 6
Trattamento per la rimozione del DNA libero .......................................................................................... 7
Estrazione del DNA ................................................................................................................................. 7
PCR real-time ......................................................................................................................................... 9
Analisi dei dati ......................................................................................................................................... 9

Sezione 8

Conferma dei risultati positivi ................................................................................................................ 11

Sezione 9

Conferma di singole colonie tramite il kit iQ-Check ............................................................................... 11

Sezione 10

Esecuzione e convalida del test ............................................................................................................ 12

Sezione 11

Bibliografia ............................................................................................................................................ 13

Sezione 12

Cronologia delle revisioni ...................................................................................................................... 14
Appendice — Guida al calcolo della miscela di PCR ............................................................................ 15

ii | iQ-Check Listeria spp. Kit

Sezione 1

Introduzione

Sezione 1
Sezione 1

Introduzione
I metodi batteriologici convenzionali sono spesso lunghi e noiosi. A confronto, iQ-Check Listeria spp.
è un semplice e rapido test qualitativo che permette la rilevazione di sequenze specifiche di DNA esclusive
di Listeria spp. ritrovate in campioni ambientali e prodotti alimentari. Mediante la reazione a catena dellapolimerasi (PCR) real-time, le sequenze specifiche di DNA di Listeria spp. vengono amplificate e rilevate
simultaneamente tramite sonde fluorescenti. È possibile processare un numero massimo di 94 campioni, con
un rischio di contaminazione minimizzato e una procedura
intuitiva. Questo kit è destinato al personale di laboratorio qualificato, incaricato di eseguire test perla rilevazione di Listeria spp., come L. monocytogenes, L. fleischmannii, L. grayi, L. innocua, L. ivanovii,
L. marthii, L. rocourtiae, L. seeligeri, L. weihenstephanensis e L. welshimeri. I risultati del test si ottengono
entro poche ore dall’arricchimento del campione.

Sezione 2
Sezione 2

Tecnologia iQ-Check Listeria spp.
Il iQ-Check Listeria spp. Kit è un test basato sull’amplificazione e sulla rilevazione genica mediante PCR
real-time. I reagenti pronti all'uso nel kit contengono oligonucleotidi (primer e sonde) specifici per Listeriaspp., nonché DNA polimerasi e nucleotidi. La rilevazione e l'analisi dei dati sono ottimizzati per l'impiego con
uno strumento PCR real-time Bio-Rad, come il sistema di rilevazione tramite PCR real-time CFX96 Touch
Deep Well System.
La PCR è una tecnica di grande efficacia impiegata per generare molteplici copie di DNA target. Durante
la reazione PCR, diversi cicli di riscaldamento e raffreddamento consentono la denaturazione del DNA per
mezzo del calore, con successivo appaiamento dei primer ad una regione target specifica. La DNA
polimerasi si serve di tali primer e deossinucleosidi trifosfati (dNTP) per estendere il DNA, creando copie del
DNA target. Queste copie vengono denominate ampliconi.
Nella PCR real-time, vengono utilizzate specifiche sonde per rilevare il DNA durante la fase di amplificazione
tramite ibridazione degli ampliconi. Queste sonde sono collegate a un fluoroforo che emette fluorescenzasolo se ibridato alla sequenza target. FAM è il fluoroforo collegato alla sonda ibridata alla sequenza specifica
di DNA di Listeria spp. In assenza di DNA target, non verrà rilevata alcuna fluorescenza. Man mano chela quantità di ampliconi aumenta ad ogni ciclo di amplificazione, l’intensità della fluorescenza aumenta a sua
volta. Il modulo ottico misura questa fluorescenza nella fase di appaiamento durante ogni ciclo PCR, mentre
il software associato traccia l’intensità della fluorescenza rispetto al numero di cicli.
Nella miscela di reazione è incluso un DNA sintetico come controllo interno per la convalida degli eventuali
risultati negativi. Il controllo viene amplificato con una sonda specifica contemporaneamente alla sequenza
di DNA target di Listeria spp. e viene rilevato da un secondo fluoroforo.
Questo test consente la rilevazione qualitativa di Listeria spp. in determinati prodotti alimentari e campioni
ambientali precedentemente arricchiti mediante coltura. Prevede le cinque fasi principali seguenti:*Per le condizioni d'uso, fare riferimento al manuale utente di iQ-Check Free DNA Removal Solution(documento 10000058391).
iQ-Check Listeria spp. Kit | 1

Sezione 3

Componenti del kit

Sezione 3
Sezione 3

Componenti del kit
Il iQ-Check Listeria spp. Kit contiene reagenti a sufficienza per l’esecuzione di 96 test (94 campioni).
ID reagente

Reagente

Quantità in ml

A

Reagente di lisi

1 flacone, 20

B

Sonde fluorescenti

1 provetta, 0,55

C

Miscela di amplificazione

1 provetta, 4,4

D

Controllo negativo PCR

1 provetta, 0,5E

Controllo positivo PCR

1 provetta, 0,25

F

Sfere di lisi

1 flacone, 17,6 g

Sezione 4
Sezione 4

Validità e conservazione
Una volta ricevuto, il kit deve essere conservato a 2-8 °C. I reagenti conservati a questa temperatura
possono essere utilizzati fino alla data di scadenza riportata sulle provette. Una volta miscelati con sferedi lisi, i reagenti di lisi hanno una validità pari a 6 mesi.

Sezione 5
Sezione 5

Materiali necessari ma non inclusi
Apparecchiatura■

Omogeneizzatore da laboratorio per i campioni dei test■

Incubatore per l’arricchimento microbiologico dei campioni■

Materiali specifici per l’estrazione in provette da 1,5 ml coniche, sterili e con tappo a vite:– Centrifuga da banco (10.000-12.000 x g)
– Blocco termico a secco a 37 ± 2 °C e/o 95-100 °C■

Dispositivo per il frazionamento cellulare, come Disruptor Genie (Scientific Industries, Inc.)■

Materiali specifici per l’estrazione in una piastra Deep Well:– Termoagitatore* in grado di mantenere 37 ± 2 °C e/o 95-100 °C con una velocità di miscelazione
di almeno 1300 rpm■

Vortex■

Piastra di agitazione magnetica■

Micropipette da 20 μl, 200 μl e 1000 μl

2 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Sezione 5■■

Materiali necessari ma non inclusi

Sistema PCR real-time di Bio-Rad;* ad esempio, il sistema PCR real-time CFX96 Touch Deep Well
System (n. catalogo 3600037) o CFX Opus Deepwell System (n. catalogo 17007991)
Bio-Rad iQ-Check Prep System per l’estrazione automatizzata del DNA e il setup delle piastre PCR(n. catalogo 3594911)

Nota: Si raccomanda l’utilizzo di alimentazione continua (UPS) con il termociclatore e iQ-Check Prep
System.
*Per informazioni sugli strumenti raccomandati, contattare il Supporto Tecnico di Bio-Rad.

Materiali■■

Terreno di arricchimento: Listeria Special Broth (LSB) (n. catalogo 3555703, 225 ml x 6 flaconi;
3564703, in forma disidratata, 500 g; 3555793, 5 L x 2 sacche; 3564753, in forma disidratata, 5 kg)
Terreno di arricchimento: Listeria Special Broth II (LSB II) (n. catalogo 12017463, 225 ml x 6 flaconi;
12017388, in forma disidratata, 500 g; 12017378, in forma disidratata, 5 kg)■

iQ-Check Free DNA Removal Solution (n. catalogo 3594970)■

Specifici per campioni ambientali:–

Spugne ambientali–

Tamponi ambientali–
Brodo neutralizzante per spugne e tamponi come Dey-Engley (D/E), HiCap Neutralizing Broth,o Letheen Broth■–

Specifici per l’estrazione in provetta:
Provette coniche sterili con tappo a vite da 1,5 ml (ad esempio, n. catalogo 2240110XTU)■Specifici per l’estrazione in una piastra Deep Well:–

Piastra da 96 Deep Well (n. catalogo 3594900)–

Pellicola sigillante in plastica (n. catalogo 3590139)–
X-Pierce Sealing Films (n. catalogo 3593977) o Pre-Pierced Plate Sealing Film(n. catalogo 3600040, solo Nord America)■

Specifici per i protocolli di estrazione Standard II e Easy II:–

iQ-Check Lysis Beads (reagent F) (n. catalogo 3578136)–

Puntali per pipette ad ampia apertura da 200 µl■

Specifici per iQ-Check Prep System:–

Contenitore per la diluizione da 60 ml (n. catalogo 3594904)–

Puntali con filtro (n. catalogo 3594902 o 12014486: 50 µl; 3594903 o 12014483: 1000 µl)–

Provette per miscela di PCR (n. catalogo 12016673, 5 ml x 25)

■

■

■

■

AL (Agar Listeria secondo Ottaviani e Agosti) Agar (n. catalogo 3563695, 90 mm x 20 piastre; 3564046,
in forma disidratata, 500 g; 3564041, Supplement 1; 3564042, Supplement 2
RAPID'Listeria spp. Agar* (n. catalogo 3564744, in forma disidratata, 500 g; 3564745, Supplement 1;3564746, Supplement 2)
RAPID'L.mono Agar* (n. catalogo 3563694, 90 mm x 20 piastre; 3555294, kit per 190 ml agar più 2
supplementi; 3564293, in forma disidratata, 500 g; 3564294, Supplement 1; 3564746, Supplement 2)
Piastre PCR, provette, nastro isolante e tappi
iQ-Check Listeria spp. Kit | 3

Sezione 6

Sicurezza, precauzioni e raccomandazioni per ottenere risultati ottimali■

Puntali sterili con filtro adattabili a micropipette da 20, 200 e 1.000 μl■

Puntali per pipette Combitip o pipettatori a ripetizione equivalenti, sterili e confezionati singolarmente■

Pipette da 1 e 10 ml■

Provette sterili per test da 2 e 5 ml■

Guanti senza polvere■

Acqua distillata sterile■

Candeggina, 5%■

Detergenti come DNA AWAY o RNase AWAY*Può essere utilizzato al di fuori della convalida AOAC-PTM.

Sezione 6
Sezione 6

Sicurezza, precauzioni e raccomandazioni per ottenere risultati
ottimali
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■

■

Il presente test deve essere eseguito da personale addestrato
Le donne in gravidanza, i bambini, gli anziani e i soggetti immunodepressi non devono eseguire questo
metodo né manipolare L. monocytogenes per via dell’alto tasso di infezione e mortalità associati a tali
gruppiI campioni e le colture di arricchimento devono essere manipolati come materiali potenzialmente infetti
ed eliminati nel rispetto delle regole e normative locali
Tutti i materiali potenzialmente infetti devono essere collocati in autoclave prima dello smaltimento
La qualità dei risultati si basa sulla rigorosa osservanza delle buone pratiche di laboratorio (ad esempio,
la norma EN ISO 7218), soprattutto in materia di PCR:
Non spostare mai apparecchiature da laboratorio (pipette, provette, ecc.) da una postazione di lavoro
all’altra
Utilizzare sempre un controllo positivo e un controllo negativo per ciascuna serie di reazioni
di amplificazione– Non utilizzare i reagenti dopo la data di scadenza– Per garantire l’omogeneità dei reagenti del kit, miscelarli nel vortex prima di utilizzarli– Verificare periodicamente l’accuratezza e la precisione delle pipette, nonché il corretto
funzionamento degli strumenti– Cambiare i guanti di frequente, in particolare se si sospetta la presenza di contaminazione– Pulire gli spazi di lavoro periodicamente con candeggina al 5% e altri prodotti disinfettanti comeDNA AWAY– Utilizzare guanti senza polvere e non lasciare impronte digitali e scritte sui tappi delle provette.
Entrambi interferiscono con l’acquisizione dei dati■

Si consiglia vivamente di osservare i requisiti generali illustrati nella norma EN ISO 22174:2005(Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the detectionof food-borne pathogens — General requirements and definitions)4 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Sezione 6■

Sicurezza, precauzioni e raccomandazioni per ottenere risultati ottimali

iQ-Check Listeria spp. Kit:
– Tutte le sostanze o miscele contenute nel kit per il test sono classificate come prodotti in conformità
al sistema mondiale armonizzato (GHS). Il contatto con acidi potrebbe causare il rilascio di gas
tossici. Se utilizzato correttamente, non sono necessarie precauzioni particolari. Se il prodotto viene
inalato, portare il soggetto in una zona ben aerata e in caso di disturbi consultare un medico. Se il
prodotto viene a contatto con gli occhi, sciacquarli mantenendoli aperti sotto l’acqua corrente per
diversi minuti. In caso di ingestione del prodotto, indurre il vomito e contattare un medico■

iQ-Check Prep System:– L’utilizzo improprio deliQ-Check Prep System potrebbe causare lesioni personali o danni allo
strumento.

Se manipolati in modo improprio, alcuni componenti potrebbero presentare il rischio di lesioni personali
dovuto al calore eccessivo. Per garantire sicurezza, iQ-Check Prep System deve essere utilizzato
esclusivamente da personale di laboratorio qualificato e opportunamente addestrato. La manutenzione dello
strumento deve essere eseguita solo dai tecnici di assistenza Bio-Rad■

Sistemi di rilevazione tramite PCR real-time CFX96 Touch Deep Well System o CFX Opus
Deepwell System:– L'utilizzo improprio del sistema CFX96 Touch Deep Well System o CFX Opus Deepwell Systempotrebbe causare lesioni personali o danni allo strumento. Se manipolati in modo improprio, alcuni
componenti potrebbero presentare il rischio di lesioni personali dovuto al calore eccessivo. Per
garantire sicurezza, i sistemi CFX96 Touch Deep Well System e CFX Opus Deepwell System devono
essere utilizzati esclusivamente da personale di laboratorio qualificato e opportunamente addestrato.
La manutenzione dello strumento deve essere eseguita solo dai tecnici di assistenza Bio-Rad■

Arricchimento:– L’utente è tenuto a leggere, comprendere e osservare le informazioni relative alla sicurezza contenutenelle istruzioni del iQ-Check Listeria spp. Kit: Conservare le istruzioni di sicurezza per consultazioni
future. Per ridurre i rischi biologici e i rischi legati all’esposizione ai prodotti chimici, eseguire il test dei
patogeni in un laboratorio adeguatamente attrezzato sotto il controllo di personale qualificato. Seguire
sempre le pratiche di laboratorio standard sulla sicurezza, tra cui indossare gli indumenti protettivi e laprotezione per gli occhi durante la manipolazione di reagenti e campioni contaminati. Evitare il contatto
con il contenuto dei terreni di arricchimento e delle provette con i reagenti al terminedell’amplificazione. Smaltire i campioni arricchiti in conformità alle attuali norme industriali– Listeria è un organismo che richiede il livello di biosicurezza 2. I campioni biologici come gli
arricchimenti sono potenzialmente infettivi. Osservare ogni normativa locale, statale/provinciale e/onazionale applicabile in materia di smaltimento di rifiuti biologici. Indossare i dispositivi di protezione
individuale inclusi, senza però ad essi limitarsi, protezioni per gli occhi, visiere per il viso, camiceda laboratorio e guanti. Tutti le operazioni devono essere eseguite in strutture adeguatamente
attrezzate utilizzando gli idonei dispositivi di sicurezza (ad esempio, i dispositivi di contenimento fisico).
Prima di lavorare con materiali potenzialmente infettivi, gli addetti devono ricevere una formazione che
sia conforme alle disposizioni regolamentari in vigore e ai requisiti dell’azienda/ente– Al termine del test, tutti i materiali che potrebbero contenere agenti patogeni devono essere
decontaminati in linea con le attuali norme industriali in materia di smaltimento dei rifiuti contaminati(ovvero, collocarli in autoclave per 20 min a 121 °C). Per maggiori informazioni relative alle normative
locali in materia di smaltimento, consultare la scheda di sicurezza

iQ-Check Listeria spp. Kit | 5

Sezione 7

Protocollo

Sezione 7
Sezione 7

ProtocolloA.

Arricchimento del campione

Si raccomanda vivamente di leggere l’intero protocollo prima di iniziare il test.
Prima dell'uso i mezzi di arricchimento devono trovarsi alla giusta temperatura di incubazione (temperatura
ambiente o 30 °C/37 °C ove richiesto).
Si consiglia vivamente di utilizzare un sacco di arricchimento con filtro incorporato.
Nell'ambito della VALIDAZIONE NF, le aliquote di peso superiore a 25 g non sono state testate. Incubare,senza agitare, per il tempo e la temperatura indicati nella tabella riportata di seguito. È inoltre possibile
eseguire il test iQ-Check da LSB precedentemente arricchito e in seguito conservato a 2-8 °C per un tempo
massimo di 72 hr.
La tabella seguente riporta i diversi protocolli utilizzabili, a seconda dell’applicazione e dell’oggetto dellavalidazione:
VALIDAZIONE NF BRD 7/13-05/07

Oggetto (matrici)
Tutti i prodotti
alimentari e campioni
ambientali1

Preparazione dei campioni

Omogeneizzare n g di campione alimentare in 9 x n ml di LSB

Arricchimento/
Estrazione del DNA
Estrazione Standard II
 Incubare per 22-24 hr
a 30 ± 1 °C
 Formato provetta
Estrazione Easy II
 Incubare per 24-26 hr
a 30 ± 1 °C
 Formato provetta/
Deep Well

Ambiente e superfici
di produzione2

Omogeneizzare n g di alimento in 9 x n ml di LSB preriscaldato o di
LSB II a temperatura ambiente

Estrazione Easy II (LSB)
 Incubare per 18-26 hr
a 30 ± 1 °C Formato
provetta/Deep Well
Estrazione Easy II (LSB II)
 Incubare per 18-26 hr
a 37 ± 1 °C
 Formato provetta/Deep
Well

Alimenti preparati2

Omogeneizzare n g di campione alimentare in 9 x n ml di LSB II

Estrazione Easy II (LSB II)Prodotti a base dilatte2Omogeneizzare n g di campione alimentare in 9 x n ml di LSB II
preriscaldato

Estrazione Easy II (LSB II)

Oggetto (matrici)2,3

6 | iQ-Check Listeria spp. Kit

AOAC PTM 090701

Preparazione dei campioni

Incubare per 18-26 hr
a 37 ± 1 °C
Formato Deep Well

Incubare per 20-28 hr
a 37 ± 1°C
Formato Deep Well
Arricchimento/
Estrazione del DNA

Sezione 7

Paté di fegato, hotdog, salsiccia cruda
fermentata, fettedi tacchino, fettedi prosciutto,
formaggio naturale(125 g)Omogeneizzare n g di campione alimentare in 9 x n ml di LSB
o LSB II (25 g in 225 ml; 125 g in 1.125 ml)

Superfici ambientali(acciaio inossidabile,
plastica, ceramica,
cemento sigillato)

Campioni ambientali
 Bagnare leggermente i tamponi e le spugne con un brodo
neutralizzante che non contenga un complesso di arilsolfonato Per le superfici analizzate mediante tamponi, campionare
un’area di 2,54 x 2,54 cm (1 x 1")
 Per le superfici analizzate mediante spugne, campionare
un’area di 10,16 x 10,16 cm (4 x 4")
 Aggiungere a LSB o LSB II sufficiente per ricoprire
il tampone (10 ml) o la spugna (60-225 ml)

Protocollo

Estrazione Easy II (LSB)
 Incubare per 24-26 hr
a 30 ± 1 °C Formato
provetta/Deep Well
Estrazione Easy II (LSB II)
 Incubare per 18-24 hr
a 37 ± 1 °C
 Formato provetta/
Deep Well
Estrazione Easy II (LSB)
 Incubare per 18-24 hr
a 30 ± 1 °C Formato
provetta/Deep Well
Estrazione Easy II (LSB II)
 Incubare per 16-24 hr
a 37 ± 1 °C
Formato provetta/
Deep Well

Fare riferimento a MFLP-39 per le matrici e i protocolli approvati da Health Canada
La validazione comprende il file di protocollo di applicazione "Lis spp Fast" per un tempo di ciclo PCR ridotto. Per ulteriori informazioni
contattare il rappresentante Bio-Rad locale.
1

La validazione comprende l'utilizzo di iQ-Check Free DNA Removal Solution e del file di protocollo di applicazione "Lis spp Fast" perun tempo di ciclo PCR ridotto. Per ulteriori informazioni contattare il rappresentante Bio-Rad locale.

2

3
La validazione include una strisciatura diretta sulle piastre RAPID’L. mono, RAPID’Listeria spp. o Agar Listeria (escluso il formaggio
naturale)B.

Trattamento per la rimozione del DNA libero

iQ-Check Free DNA Removal Solution offre il metodo ideale per rimuovere il DNA libero. Seguirele raccomandazioni di Bio-Rad contenute nel manuale d'uso (documento 10000058391).
Il presente protocollo è validato da:■

Certificato AFNOR per la categoria di campioni prelevati da ambienti di produzione■

AOAC Research Institute per un elenco di matrici indicate sul certificato di validazione AOAC-PTM

C.

Estrazione del DNA

Raccomandazioni generali:1.

Prima di iniziare il test, accendere il blocco termico o il thermoshaker per la funzione
di preriscaldamento. Impostare a 95-100 °C. Durante il pipettaggio, mantenere in sospensione
il reagente di lisi agitando a media velocità su una piastra di agitazione magnetica.

2.

Di norma, evitare l’agitazione del sacco di arricchimento e la raccolta di grossi frammenti di residui
alimentari. Per i campioni alimentari aventi un surnatante grasso, raccogliere il campione appena al disotto di questo strato.

3.

Aprire le provette e i pozzetti con attenzione per evitare eventuali contaminazioni crociate.

4.

Raffreddare la piastra Deep Well prima di effettuare il pipettaggio direttamente nella pellicola sigillante
preforata.

5.

Utilizzare la barra magnetica per mantenere in sospensione il reagente di lisi. Effettuare il pipettaggio
mentre è in atto un’agitazione a media velocità.

iQ-Check Listeria spp. Kit | 7

Sezione 7

Protocollo6.

Per risospendere la resina, per prima cosa agitare delicatamente a mano il reagente di lisi. Al finedi mantenerlo in sospensione, effettuare il pipettaggio mentre è in atto un’agitazione a media velocità
mediante la barra magnetica contenuta nel flacone.

7.

Ricostituire il reagente di lisi finale come segue:a. Versare con attenzione tutto il contenuto del reagente F (sfere di lisi) nel reagente A(reagente di lisi).
b. Utilizzare materiali di consumo con un puntale largo abbastanza da consentire il pipettaggio delreagente di lisi omogeneizzato.
c. Se conservato a 4 °C, il reagente di lisi miscelato con le sfere di lisi (reagente A + F) ha una validità
pari a 6 mesi.

Protocollo Standard II
1.

Aliquotare 1,5 ml di campione decantato arricchito in una provetta.

2.

Centrifugare la provetta a 10.000-12.000 x g per 5 min. Eliminare il surnatante.

3.

Aggiungere 250 µl di reagente di lisi omogeneizzato (reagente A + F) al pellet e risospenderequest’ultimo pipettando il reagente in alto e in basso. Chiudere la provetta.

Nota: prima agitare delicatamente a mano il reagente di lisi per risospendere le sfere.
4.

Posizionare la provetta nel termoagitatore o nel dispositivo per il frazionamento cellulare per 3 ± 1 min.

5.

Incubare le provette nel blocco termico indicato a 95-100 °C per 15-20 min.

6.

Miscelare la provetta nel vortex ad alta velocità e centrifugare a 10.000-12.000 x g per 5 min.
Questo è il momento raccomandato per l’interruzione temporanea della procedura.

Il surnatante può essere conservato per 1 anno a -20 °C. Lasciare sempre il tempo necessario perlo scongelamento e l’omogeneizzazione, in seguito centrifugare a 10.000-12.000 x g per 5 min prima
di utilizzarlo nuovamente.

Protocollo Easy II
1.

Aliquotare 100 µl di reagente di lisi omogeneizzato (reagenti A + F) nelle provette o nei pozzetti di una
piastra Deep Well.

Nota: prima agitare delicatamente a mano il reagente di lisi per risospendere le sfere.
2.

Aggiungere 100 μl di campione arricchito.

Nota: agitare la sospensione per omogeneizzare la coltura, quindi evitare che eventuali residui si depositino
prima di raccogliere il campione.
3.

Miscelare la soluzione pipettando su e giù fino a ottenere l’omogeneizzazione.

4.

Chiudere le provette o sigillare la piastra a pozzetti profondi con la pellicola sigillante preforata.

5.

Posizionare le provette nel termoagitatore o nel dispositivo per il frazionamento cellulare per 3 ± 1 min.
Incubare le provette nel termoblocco a 95-100°C per 15-20 min.

6.

In caso di utilizzo dell'incubatore-agitatore per le provette o le piastre deepwell, incubare le provette o ledeepwell a 1300 o 1600 rpm, 95-100°C per 15-20 min.

7.

Miscelare le provette nel vortex ad alta velocità e centrifugare a 10.000-12.000 x g per almeno 2 min.
La centrifugazione non è necessaria per la piastra Deep Well.

8 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Sezione 7

Protocollo

Questo è il momento raccomandato per l’interruzione temporanea della procedura.
Il surnatante può essere conservato per 1 anno a -20 °C. Lasciare sempre il tempo necessario perlo scongelamento e l’omogeneizzazione, in seguito centrifugare a 10.000-12.000 x g per 5 min prima
di utilizzarlo nuovamente.

D.

PCR real-timeInstallazione strumento e software
Per installare strumento e software, fare riferimento alle istruzioni contenute nel manuale utente del sistema
PCR real-time per i kit iQ-Check.

Preparazione della miscela di PCR
1.

Preparare la miscela di PCR contenente la soluzione di amplificazione (reagente C) e le sonde
fluorescenti (reagente B). Il volume della miscela di PCR necessario dipende dal numero di campionie controlli da analizzare. In ogni ciclo PCR devono essere inclusi almeno un controllo positivo e uncontrollo negativo. Utilizzare la tabella relativa al pipettaggio riportata nell’Appendice — Guida al calcolodella miscela di PCR per verificare i corretti volumi da impiegare per ogni reagente.

Nota: Utilizzare la miscela di PCR (reagenti B + C) immediatamente in seguito alla preparazione. Essa
rimane stabile per massimo 1 hr a 2-8 °C.
2.

Pipettare 45 µl della miscela di PCR in ogni pozzetto secondo lo schema analitico scelto.

3.

Aggiungere 5 µl di estratto di DNA, reagente D (controllo negativo) o reagente E (controllo positivo).
Non miscelare nel vortex il campione prima del pipettaggio. Sigillare ermeticamente i pozzetti dellapiastra PCR o le strip delle provette. Pipettare con attenzione per evitare la formazione di bolle sul
fondo dei pozzetti. Come fase facoltativa, per eliminare eventuali bolle centrifugare la piastra PCR o lestrip delle provette sigillate (centrifuga rapida).

4.

Posizionare la piastra PCR o le strip delle provette nel termociclatore. Accertarsi di posizionarela piastra correttamente, con il pozzetto A1 rivolto all’angolo superiore sinistro. Chiudere il modulo
di reazione.

Eseguire un ciclo PCR
Per avviare un ciclo PCR, seguire le istruzioni contenute nel manuale d'uso del sistema PCR real-time peri kit iQ-Check. Il file di protocollo di applicazione "Lis spp Fast" è stato validato per NF e AOAC.

E.

Analisi dei datiÈ possibile analizzare i dati direttamente al termine del ciclo PCR o in un secondo momento tramite
l’apertura del file di dati memorizzato. Per aprire i file di dati e impostare i parametri dell'analisi, seguire
le istruzioni contenute nel manuale d'uso del software CFX Manager IDE Software.

Interpretazione dei risultati
Dopo aver impostato i parametri dell’analisi dati, i risultati vengono interpretati analizzando i valori del ciclodi quantificazione (Cq) di ogni campione (il ciclo nel quale la curva di amplificazione supera la soglia).
Il software CFX Manager IDE Software consente di completare un’analisi automatizzata per i sistemi
di rilevazione PCR real-time Bio-Rad. È necessario eseguire una verifica delle caratteristiche tipiche dellacurva di amplificazione prima di rilasciare i risultati. Nel caso in cui sia necessario ulteriore supporto,contattare il proprio team di supporto tecnico Bio-Rad.
Controlli
iQ-Check Listeria spp. Kit | 9

Sezione 7

Protocollo

Prima di interpretare i risultati dei campioni, verificare i controlli positivo e negativo.
Al fine di assicurare la validità dell’esperimento, i controlli devono avere i risultati riepilogati nella tabella
seguente. In caso contrario, la reazione PCR deve essere ripetuta.
Rilevazione Listeria spp.
(canale FAM)

Rilevazione controllo interno(canale HEX)

Controllo negativo

Cq = N/A*

28 ≤ Cq ≤ 40

Controllo positivo

26 ≤ Cq ≤ 36

N/A

Controllo* Il software indica un valore Cq (il ciclo in cui la curva di amplificazione supera la soglia) di N/A (non applicabile) quando la fluorescenza di un
campione non aumenta in modo significativo al di sopra del rumore di fondo e di conseguenza non supera la soglia.

Se i risultati dei controlli positivo e negativo differiscono da quelli riportati nella tabella Controlli (controllo nonvalido) ripetere il ciclo e l’analisi descritti nei paragrafi D: PCR real-time ed E: Analisi dei dati nel protocollodella Sezione 7.
Campioni
Un test di PCR positivo iQ-Check Listeria spp. deve mostrare una curva di amplificazione tipica e un valore
Cq ≥ 10 per il fluoroforo FAM.
■

Se il valore Cq è inferiore a 10 per entrambi i canali, verificare che la curva dei dati non elaborati sia
una curva di amplificazione regolare (con linea di base piatta, seguita da un rapido aumento
esponenziale della fluorescenza e infine da un secondo appiattimento). Se la curva sembra corretta,
potrebbe essere considerata come test positivo a Listeria spp.

In assenza di valore Cq (Cq = N/A) per FAM, o se il risultato non è una tipica curva di amplificazione,
il controllo interno per il campione in questione deve essere analizzato:■■■

Questo campione di Listeria spp. viene considerato negativo se non è presente alcun valore Cq nel
canale FAM e il controllo interno ha un Cq ≥28
Se anche il controllo interno non ha un valore Cq (Cq = N/A), ciò probabilmente indica un'inibizionedella reazione PCR. È necessario diluire il campione (utilizzando 10 μl di estratto di DNA, effettuare una
diluizione 1:10 in acqua distillata sterile e quindi analizzare 5 μl di diluizione) e ripetere la PCR
Se il valore Cq per il controllo interno è <28, non è possibile interpretare il risultato. Verificare chela soglia sia posizionata correttamente o che la curva dei dati non elaborati sia una curva
di amplificazione regolare. Se la curva non possiede una forma caratteristica, sarà necessario ripetereil test PCR.

L'interpretazione dei risultati del test viene riepilogata nella tabella seguente:
Rilevazione Listeria spp.
(FAM)

Rilevazione controllo interno(HEX)

Interpretazione

Cq ≥ 10

N/A

Positivo

Cq = N/A

Cq ≥ 28

Negativo

Cq = N/A

Cq = N/A

Inibizione* Qualora la rilevazione produca un valore Cq = N/A sia per il target, sia per il controllo interno, l'estratto di DNA deve essere diluito (1:10) e testato
nuovamente.

Il mancato rispetto dei criteri di convalida può portare a un'interpretazione non valida. Verificare i dati nonelaborati e procedere come se il campione fosse inibito.

10 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Sezione 8

Conferma dei risultati positivi

Sezione 8
Sezione 8

Conferma dei risultati positivi
Nell’ambito del metodo certificato della VALIDAZIONE NF, tutti i risultati iQ-Check positivi devono essere
confermati come segue:
1.

Mediante test classici illustrati nei metodi standardizzati CEN o ISO ritornando al campione.

2.

Tramite isolamento dell'LSB o LSB II arricchito (strisciare 100 μl) su agar cromogenico RAPID'Listeria
spp. o RAPID'L.mono e incubazione per 24 hr a 37 ± 1 °C. La presenza di colonie caratteristichedi Listeria spp. è sufficiente a confermare la presenza di Listeria spp.

3.

Tramite isolamento di LSB o LSB II (strisciare 10 μl) su agar AL o PALCAM e incubazione per 24-48
hr a 37 ± 1 °C. Le colonie tipiche devono essere confermate dai test descritti nel metodo ISO.

4.

Tramite qualunque metodo alternativo certificato dalla VALIDAZIONE NF in base a un principio diverso
da quello impiegato nel test PCR iQ-Check Listeria spp. Il protocollo validato di questo secondo metodo
deve essere seguito interamente.

In caso di risultati discrepanti tra iQ-Check Listeria spp. Kit: e una qualunque delle opzioni di conferma
sopraelencate, seguire le fasi necessarie al fine di garantire risultati validi.
Successivamente all'incubazione a 30 °C, è possibile conservare LSB o LSB II arricchito a 2-8 °C per
un massimo di 72 hr prima di eseguire la conferma.
Nell'ambito della validazione AOAC, il risultato positivo dell'iQ-Check Listeria spp. deve essere considerato
presuntivo positivo e confermato in conformità a un metodo di riferimento opportuno (ad esempio, USDA
MLG, FDA BAM, ISO, MFHPB, ecc.). In alternativa, per matrici selezionate, strisciare 10 μl di LSB o LSB
II arricchito su agar cromogenico RAPID’L. mono, RAPID’Listeria spp. o Agar Listeria e incubare per 24 hr
a 37 ± 1 °C. La presenza di colonie caratteristiche di Listeria spp. deve essere confermata biochimicamente
per la presenza di Listeria spp.

Sezione 9
Sezione 9

Conferma di singole colonie tramite il kit iQ-Check
iQ-Check Listeria spp. Kit può essere utilizzato anche per la conferma di singole colonie isolate di Listeria
spp. su piastre agar. Quanto segue è ufficialmente validato dal certificato AFNOR in materia di terreni
cromogenici RAPID'L.mono e RAPID'Listeria spp.
1.

Scegliere una colonia isolata da una piastra agar selettiva o non selettiva servendosi di uno
stuzzicadenti, un’ansa sterile o altri prodotti di consumo adattati (ad esempio, un puntale per pipetta).

2.

Risospendere la colonia in 100 µl di sale triptone o acqua distillata sterile in una provetta per
microcentrifuga.

Omogeneizzare il tutto mediante un miscelatore vortex.
Utilizzare 5 µl della sospensione con 45 µl di miscela di PCR (vedere il paragrafo D: PCR real-time nel
protocollo della Sezione 7) e seguire il resto del protocollo iQ-Check Listeria spp. per l’interpretazione di dati
e risultati.

iQ-Check Listeria spp. Kit | 11

Sezione 10

Esecuzione e convalida del test

Sezione 10
Sezione 10

Esecuzione e convalida del test
iQ-Check Listeria spp. Kit è specificamente indicato per il gene Listeria.
Validazione NF

BRD 07/13-05/07
METODI DI ANALISI
ALTERNATIVIPER IL SETTOREAGROALIMENTARE
http://nf-validation.
afnor.org

iQ-Check Listeria spp. Kit è certificato ai sensi della VALIDAZIONE NF come metodo
alternativo rispetto a quello di riferimento ISO 11290-1:2017 per la rilevazione di Listeria
spp. in tutti i prodotti destinati al consumo umano e nei campioni ambientali.
La validazione osserva il protocollo ISO 16140-2:2016 e comprende l'utilizzo dei sistemi
PCR Real-Time CFX96 Touch Deep Well System e CFX Opus Deepwell System.
L’utilizzo di iQ-Check Free DNA Removal Solution è validato per alimenti preparati,
prodotti a base di latte e superfici campioni ambientali di produzione. Il software
associato è CFX Manager IDE Software (versione 2.2 e successive). Il file di protocollo
di applicazione "Lis spp Fast" è stato validato. Numero di certificato: BRD 07/13-05/07.
Periodo di validità: Fare riferimento al certificato disponibile sul sito web di AFNOR.
Validazione AOAC
iQ-Check Listeria spp. Kit (Protocollo Easy e Protocollo Easy con protocollo opzionale
di rimozione del DNA libero) ha ottenuto la validazione da parte di AOAC ResearchInstitute in linea con il Performance Tested Method Program (programma metodo
testato per le prestazioni) per la rilevazione di Listeria spp. in acciaio inossidabile,
plastica, ceramica, cemento sigillato, paté di fegato, hot dog, salsiccia cruda
fermentata, fette di tacchino, fette di prosciutto e formaggio naturale (125 g).
Un risultato positivo con iQ-Check deve essere considerato come presunto,
si raccomanda pertanto di effettuare la conferma seguendo le raccomandazioni nella
Sezione 8. LSB, LSB II, l'APF "Lis spp Fast", l'uso dell'iQ-Check Free DNA Removal
Solution e l'uso dei sistemi PCR real-time CFX96 Touch Deep Well System e CFX
Opus Deepwell System sono validati per tutti i campioni. Il software associato è CFXManager IDE Software (versione 2.2 e successive). Numero di certificato: 090701.
Validazione Health Canada
iQ-Check Listeria spp. Kit (protocollo Easy) ha ottenuto la validazione di Health Canada(MFLP-39) per la rilevazione di Listeria spp. in tutte le superfici ambientali e in carnee pollame cotti pronti al consumo (RTE). Un risultato positivo con iQ-Check deve essere
considerato come presunto, si raccomanda pertanto di effettuare la conferma in linea
con MFHPB-30 (vedere Sezione 11).

12 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Sezione 11

Bibliografia

Sezione 11
Sezione 11 Bibliografia
AOAC Official Method 993.12-1996(1999). Listeria monocytogenes in milk and dairy products. Selectiveenrichment and isolation method.
Health Canada (2011). Health Products and Food Branch. MFHPB-30. Isolation of Listeria monocytogenes
and other Listeria spp. from foods and environmental samples. The Compendium of Analytical Methods,
Volume 2, February 2011.
ISO 7218:2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance formicrobiological examinations.
ISO 11290-1:2017. Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumerationof Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 1: Detection method.
ISO 16140-2:2016. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 2: Protocol for the validationof alternative (proprietary) methods against a reference method.
ISO 22174:2005. Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for thedetection of food-borne pathogens — General requirements and definitions.
United States Department of Agriculture, Food Safety and Inspection Service (2021). Microbiology
Laboratory Guidebook. Chapter 8.13: Isolation and identification of Listeria monocytogenes from red meat,
poultry, ready-to-eat Siluriformes (fish) and egg products, and environmental samples.
https://www.fsis.usda.gov/sites/default/files/media_file/2021-09/MLG-8.13.pdf, accessed February 14, 2020.
United States Food and Drug Administration (2017). Bacteriological Analytical Manual. Chapter 10: Detectionof Listeria monocytogenes in foods and environmental samples, and enumeration of Listeria monocytogenes
in foods. https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-10-detection-listeriamonocytogenes-foods-and-environmental-samples-and-enumeration, accessed February 14, 2020.

iQ-Check Listeria spp. Kit | 13

Sezione 12

Cronologia delle revisioni

Sezione 12
Sezione 12

Cronologia delle revisioni
Data di rilascio

Numero di documento

Ottobre 2023

10000167777 Ver A

14 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Modifica- Cambiamento del numero di documento versione precedente Manuale d'uso
10000123536 Ver C iQ-Check Listeria spp.
- Estensione AFNOR: LSB II per gli alimenti
preparati, prodotti a base di latte e superfici
campioni ambientali di produzione

Appendice — Guida al calcolo della miscela di PCR
Al fine di trovare i volumi corretti per la preparazione della miscela di PCR, aggiungere il numero totale
di campioni e controlli da analizzare e trovare i volumi corrispondenti dei reagenti B e C nella tabella.
Numero totale
di campionie controlli

Sonde
Miscelareagente B, di amplificazione
Reagente C, µl
μl

Numero totale
di campionie controlli

Sonde
Miscelareagente B, di amplificazione
Reagente C, µl
μl

Numero totale
di campionie controlli

Sonde
Miscelareagente B, di amplificazione
Reagente C, µl
μl

1

5

40

33

178

1.400

65

351

2.800

2

11

86

34

184

1.500

66

356

2.900

3

16

130

35

189

1.500

67

362

2.900

4

22

173

36

194

1.600

68

367

2.900

5

27

216

37

200

1.600

69

373

3.000

6

32

259

38

205

1.600

70

378

3.000

7

38

302

39

211

1.700

71

383

3.100

8

43

346

40

216

1.700

72

389

3.100

9

49

389

41

221

1.800

73

394

3.200

10

54

432

42

227

1.800

74

400

3.200

11

59

475

43

232

1.900

75

405

3.200

12

65

518

44

238

1.900

76

410

3.300

13

70

562

45

243

1.900

77

416

3.300

14

76

605

46

248

2.000

78

421

3.400

15

81

648

47

254

2.000

79

427

3.400

16

86

691

48

259

2.100

80

432

3.500

17

92

734

49

265

2.100

81

437

3.500

18

97

778

50

270

2.200

82

443

3.500

19

103

821

51

275

2.200

83

448

3.600

20

108

864

52

281

2.200

84

454

3.600

21

113

907

53

286

2.300

85

459

3.700

22

119

950

54

292

2.300

86

464

3.700

23

124

994

55

297

2.400

87

470

3.800

24

130

1.000

56

302

2.400

88

475

3.800

25

135

1.100

57

308

2.500

89

481

3.800

26

140

1.100

58

313

2.500

90

486

3.900

27

146

1.200

59

319

2.500

91

491

3.900

28

151

1.200

60

324

2.600

92

497

4.000

29

157

1.300

61

329

2.600

93

502

4.000

30

162

1.300

62

335

2.700

94

508

4.100

31

167

1.300

63

340

2.700

95

513

4.100

32

173

1.400

64

346

2.800

96

518

4.100

iQ-Check Listeria spp. Kit | 15

Per maggiori informazioni visitare il sito bio-rad.com/iqcheck.
BIO-RAD è un marchio registrato di Bio-Rad Laboratories, Inc.
IQ-CHECK è un marchio registrato di Bio-Rad Europe GmbH in determinate giurisdizioni. Tutti i marchi registrati qui utilizzati sonodi proprietà del rispettivo proprietario.

10000167777 Ver A US/EG

Sig 0123

iQ-Check Listeria spp. Kit
Guia do usuário
Teste para a detecção por PCR em tempo real deListeria spp. em amostras de alimentos e ambientais

N° do catálogo 3578113

Índice
Abschnitt 1

Introdução ............................................................................................................................................... 1

Abschnitt 2

iQ-Check Listeria spp. Tecnologia .......................................................................................................... 1

Abschnitt 3

Componentes do kit ................................................................................................................................ 2

Abschnitt 4

Prazo de validade e armazenamento...................................................................................................... 2

Abschnitt 5Materiaisnecessários, mas não fornecidos ............................................................................................. 2
Equipamento ........................................................................................................................................... 2
Suprimentos ............................................................................................................................................ 3

Abschnitt 6

Precauções e recomendações de segurança para melhores resultados ................................................ 4

Abschnitt 7

Protocolo ................................................................................................................................................. 6
Enriquecimento da amostra .................................................................................................................... 6
Tratamento de remoção de DNA livre ..................................................................................................... 7
Extraçãode DNA ..................................................................................................................................... 8
PCR em Tempo Real .............................................................................................................................. 9
Análise de dados .................................................................................................................................. 10

Abschnitt 8

Confirmação de Resultados Positivos................................................................................................... 11

Abschnitt 9

Confirmação de Colônias Únicas usando o iQ-Check Kit ..................................................................... 12

Abschnitt 10 Desempenho e validação do teste ........................................................................................................ 13
Abschnitt 11 Bibliografia ............................................................................................................................................ 14
Abschnitt 12 Histórico de Revisão ............................................................................................................................. 15Apêndice — Guia de Cálculo da Mistura de PCR ................................................................................. 16

ii | iQ-Check Listeria spp. Kit

Seção 1 Introdução

Seção 1
Abschnitt 1

Introdução
Os métodos bacteriológicos convencionais são, muitas vezes, longos e entediantes. Em comparação,o iQ-Check Listeria spp. é um teste qualitativo simples e rápido, permitindo a detecção de sequências
específicas de DNA exclusivas de Listeria spp. encontrado em amostras ambientais e produtos alimentícios.
Utilizando reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR), as sequências de DNA específicas deListeria spp. são amplificadas e detectadas simultaneamente por meio de sondas fluorescentes. Podem ser
processadas até 94 amostras, com risco minimizado de contaminação e um fácil de usar. Os usuários
pretendidos deste kit são técnicos de laboratório treinados que estão realizando testes para detectar Listeriaspp., incluindo L. monocytogenes, L. fleischmannii, L. grayi, L. innocua, L. ivanovii, L. marthii, L. rocourtiae,
L. seeligeri, L. weihenstephanensis, e L. welshimeri. A utilização deste teste permite que os resultados
sejam obtidos poucas horas após o enriquecimento de uma amostra.

Seção 2Abschnitt 2

iQ-Check Listeria spp. Tecnologia
O iQ-Check Listeria spp. Kit é um teste baseado na amplificação de genes e detecção por PCR em tempo
real. Os reagentes de PCR prontos para uso no kit contêm oligonucleotídeos (iniciadores e sondas)
específicos para Listeria spp., bem como DNA polimerase e nucleotídeos. A detecção e a análise de dadossão otimizadas para uso com um instrumento de PCR em tempo real da Bio-Rad, como o sistema dedetecção de PCR em tempo real CFX96 Touch Deep Well.
A PCR é uma poderosa técnica utilizada para gerar muitas cópias do DNA alvo. Durante a reação de PCR,os vários ciclos de aquecimento e resfriamento permitem a desnaturação do DNA, seguido pelos primers
ligando-se à região-alvo. O DNA polimerase utiliza esses primers e desoxinucleotídeos trifosfatos (dNTPs)
para estender o DNA, criando cópias do DNA-alvo. Essas cópias se chamam amplicons.
Na PCR em tempo real, são utilizadas sondas específicas para detectar o DNA durante a etapa deamplificação, através da hibridização dos amplicons. Estas sondas estão ligadas a um fluoróforo, queapresenta fluorescência apenas quando hibridizado à sequência-alvo. FAM é o fluoróforo ligado às sondas
que estão hibridizando nas sequências de DNA exclusivas da Listeria spp. Na ausência de DNA-alvo, nãoserá observada fluorescência. Como a quantidade de amplicons aumenta em cada rodada de amplificação,a intensidade da fluorescência aumenta também. O módulo óptico mede essa fluorescência em cada ciclode PCR, na fase de hibridação (annealing), e o software associado plota a intensidade da fluorescência emfunção do número de ciclos.
Um controle interno de DNA sintético é incluído na mistura da reação para validar quaisquer possíveis
resultados negativos. Este controle é amplificado com uma sonda específica ao mesmo tempo que
a sequência-alvo de Listeria spp., e é detectado por um terceiro fluoróforo.

iQ-Check Listeria spp. Kit | 1Seção 3 Componentes do kit

Esse teste permite a detecção qualitativa de Listeria spp. em alimentos selecionados e amostras ambientais
previamente enriquecidas por cultura. Inclui as cinco etapas principais a seguir:*Consulte o guia do usuário da iQ-Check Free DNA Removal Solution (nº do documento 10000058391) paraas condições de uso.

Seção 3
Abschnitt 3

Componentes do kit
O iQ-Check Listeria spp. Kit contém reagentes suficientes para 96 testes (94 amostras).

ID do reagente

Reagente

Quantidade fornecida, ml

A

Reagente de lise

1 ampola, 20

B

Sondas fluorescentes

1 tubo, 0,55

C

Mistura de amplificação

1 tubo, 4,4

D

Controle de PCR negativo

1 tubo, 0,5E

Controle de PCR positivo

1 tubo, 0,25

F

Microesferas de lise

1 ampola, 17,6 gSeção 4
Abschnitt 4

Prazo de validade e armazenamento
Uma vez recebido, o kit deve ser armazenado a 2–8°C. Os reagentes armazenados a esta temperatura
podem ser utilizados até o prazo de validade indicado nos tubos. O prazo de validade do reagente de liseé de 6 meses, uma vez misturado com as microesferas de lise.

Seção 5
Abschnitt 5Materiaisnecessários, mas não fornecidos
Equipamento■

Liquidificador de laboratório para homogeneizar amostras de teste■

Incubadora para enriquecimento microbiológico de amostras

2 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Seção 5 Materiaisnecessários, mas não fornecidos■

Específico para extração em tubos estéreis de tampa de rosca cônica de 1,5 ml:– Centrífuga de bancada (capaz de 10.000–12.000 x g)
– Bloco para banho seco a 37 ± 2°C e/ou 95–100°C■

Disruptor celular, como um Disruptor Genie (Scientific Industries, Inc.)■

Específico para extração em placa Deep Well:– Agitador térmico de aquecimento* capaz de manter 37 ± 2°C e/ou 95–100°C, com uma velocidadede mistura de pelo menos 1.300 rpm■

Vortexer■

Placa de agitação magnética

■Micropipetas de 20, 200 e 1.000 µl■■

Sistema de PCR em tempo real da Bio-Rad*; por exemplo, os sistemas de PCR em tempo real CFX96
Touch Deep Well (nº do catálogo 3600037) ou CFX Opus Deepwell (nº do catálogo 17007991)
Bio-Rad iQ-Check Prep System para extração automatizada de DNA e configuração de placas de PCR(nº do catálogo 3594911)

Nota: Recomendamos o uso de uma fonte de alimentação ininterrupta (UPS) com o termocicladore o sistema iQ-Check Prep.
*

Entre em contato com o suporte técnico da Bio-Rad para obter informações sobre os instrumentos recomendados.

Suprimentos■■

Meio de enriquecimento: Listeria Special Broth (LSB) (nº do catálogo 3555703, 225 ml x 6 frascos;
3564703, desidratado 500 g; 3555793, 5 L x 2 sacos; 3564753 desidratado, 5 kg)
Meio de enriquecimento: Listeria Special Broth II (LSB II) (nº do catálogo 12017463, 225 ml x 6 frascos;
12017388, desidratado, 500 g; 12017378, desidratado, 5 kg)■

iQ-Check Free DNA Removal Solution (n° do catálogo 3594970)■

Específico para amostras ambientais:– Esponjas ambientais– Esfregaços ambientais– Caldo neutralizante para esponjas e cotonetes, como Dey-Engley (D/E) ou HiCap Neutralizing Brothou Letheen Broth■Específico para extração em tubos:– Tubos com tampa cônica de rosca de 1,5 ml, estéreis (por exemplo, nº do catálogo 2240110XTU)■

Específico para extração em placa Deep Well:– Placa Deep Well de 96 poços (n° do catálogo 3594900)– Filme plástico de vedação (nº do catálogo 3590139)– X-Pierce Sealing Films (nº do catálogo 3593977) ou Pre-Pierced Plate Sealing Film (nº do catálogo
3600040, apenas América do Norte)

iQ-Check Listeria spp. Kit | 3Seção 6 Precauções e recomendações de segurança para melhores resultados■

Específico para os protocolos de extração Standard II e Easy II:– iQ-Check Lysis Beads (reagente F) (nº do catálogo 3578136)– Pontas de pipete com abertura ampla, 200 μl■

Específico para o iQ-Check Prep System:– Recipiente de diluição de 60 ml (nº do catálogo 3594904)– Pontas de filtro (nº do catálogo 3594902 ou 12014486: 50 µl; 3594903 ou 12014483: 1.000 µl)– Tubos de mistura de PCR (nº do catálogo 12016673, 5 ml x 25)

■

■

■

AL (Ágar Listeria de acordo com Ottaviani e Agosti) Agar (nº do catálogo 3563695, 90 mm x 20 placas;3564046, desidratado, 500 g; 3564041, suplemento 1; 3564042, suplemento 2
RAPID'Listeria spp. Agar* (nº do catálogo 3564744, desidratado, 500 g; 3564745, suplemento 1;
3564746, suplemento 2)
RAPID'L.mono Agar (nº do catálogo 3563694, 90 mm x 20 placas; 3555294, kit para 190 ml de ágarmais 2 suplementos; 3564293, desidratado, 500 g; 3564294, suplemento 1; 3564746, suplemento 2)■

Placas de PCR, tubos, fitas e tampas de vedação

■Pontas de filtro estéreis adaptáveis a micropipetas de 20, 200 e 1.000 µl■

Ponteiras para pipetas Combitip ou pipetadores de repetição equivalentes, estéreis, embalados
individualmente■

Pipetas de 1 e 10 ml■

Tubos de ensaio estéreis de 2 e 5 ml■

Luvas sem talco■Água estéril destilada■

Alvejante, 5%■Agente de limpeza, como o DNA AWAY ou o RNase AWAY*

Pode ser usado fora da validação AOAC-PTM.

Seção 6
Abschnitt 6

Precauções e recomendações de segurança para melhores
resultados
■

■

■

■

Este teste deve ser realizado por pessoal treinado
Gestantes, crianças, idosos e indivíduos imunocomprometidos não devem realizar esse método nem
lidar com L. monocytogenes devido à alta taxa de infecção e fatalidade associada a esses grupos
Amostras e culturas de enriquecimento devem ser manuseadas como material potencialmente
infeccioso e descartadas de acordo com as regras e regulamentos locais
Todos os materiais potencialmente infecciosos devem passar por autoclavagem antes do descarte

4 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Seção 6 Precauções e recomendações de segurança para melhores resultados■

A qualidade dos resultados depende do estrito cumprimento das Boas Práticas de Laboratório (porexemplo, a norma EN ISO 7218), especialmente em relação ao PCR:■

Nunca circule equipamentos de laboratório (pipetas, tubos etc.) de uma estação de trabalho para outra■

Sempre use um controle positivo e um controle negativo para cada série de reações de amplificação
– Não utilize reagentes após a expiração de suas datas de validade– Agite os reagentes do kit antes de utilizá-los, de modo a garantir a homogeneidade– Verifique periodicamente a exatidão e precisão das pipetas, bem como o correto funcionamento dos
instrumentos– Troque frequentemente de luvas, especialmente se suspeitar que estão contaminadas– Limpe os espaços de trabalho periodicamente com alvejante a 5% e outros agentes
descontaminantes, como o DNA AWAY
– Utilize luvas sem talco e evite escrever ou deixar impressões digitais nas tampas dos tubos. Ambos
interferem na aquisição de dados■■

Recomenda-se fortemente seguir os requisitos gerais descritos na norma EN ISO 22174:2005(Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection offood-borne pathogens — General requirements and definitions)
iQ-Check Listeria spp. Kit:
– Todas as substâncias ou misturas no kit de teste são produtos classificados, de acordo com
o Sistema Globalmente Harmonizado (GHS). O contato com ácidos pode causar a liberação degases tóxicos. Nenhuma precaução especial é necessária, se usado corretamente. Se o produto for
inalado, forneça ar fresco e consulte um médico em caso de queixas. Após o contato dos olhos com
o produto, enxágue os olhos abertos por vários minutos em água corrente. Se os produtos forem
ingeridos, provoque vômito e procure ajuda médica

■–iQ-Check Prep System:
O uso inadequado do iQ-Check Prep System pode causar ferimentos ou danos ao instrumento.
– Alguns componentes podem representar um risco de ferimentos pessoais devido ao calor
excessivo, se manuseados incorretamente. Para uso seguro, o iQ-Check Prep System deve ser
operado somente por pessoal qualificado do laboratório que tenha sido treinado adequadamente.
A manutenção do instrumento deve ser realizada apenas pelos engenheiros de serviço de campo
da Bio-Rad■

Sistemas de detecção de PCR em tempo real CFX96 Touch Deep Well ou CFX Opus Deepwell:– O uso inadequado do Sistema CFX96 Touch Deep Well ou CFX Opus Deepwell System podecausar ferimentos ou danos ao instrumento. Alguns componentes podem representar um risco deferimentos pessoais devido ao calor excessivo, se manuseados incorretamente. Para uso seguro,o Sistema CFX96 Touch Deep Well e CFX Opus Deepwell deve ser operado somente por pessoal
qualificado do laboratório que tenha sido treinado adequadamente. A manutenção do instrumento
deve ser realizada apenas pelos engenheiros de serviço de campo da Bio-Rad■

Enriquecimento:– O usuário deve ler, entender e seguir todas as informações de segurança nas instruções do iQCheck Listeria spp. Kit. Guarde as instruções de segurança para referência futura. Para reduzir os
riscos associados à exposição a produtos químicos e riscos biológicos, realize testes de patógenos
em um laboratório devidamente equipado, sob o controle de pessoal treinado. Sempre siga as
iQ-Check Listeria spp. Kit | 5Seção 7 Protocolo

práticas padrão de segurança do laboratório, incluindo o uso de vestuário de proteção e proteção
ocular adequados ao manusear reagentes e amostras contaminadas. Evite o contato com
o conteúdo do meio de enriquecimento e dos tubos de reagentes após a amplificação. Descarte
amostras enriquecidas de acordo com as normas atuais do setor– A Listeria é um organismo de nível 2 de biossegurança. Amostras biológicas, como
enriquecimentos, têm o potencial de transmitir doenças infecciosas. Siga todos os regulamentos
locais, estaduais/provinciais e/ou nacionais aplicáveis sobre o descarte de resíduos biológicos. Use
equipamento de proteção adequado, que inclua, entre outros, óculos de proteção, proteção facial,roupas/jaleco e luvas. Todo o trabalho deve ser realizado em instalações adequadamente
equipadas, utilizando o equipamento de segurança apropriado (por exemplo, dispositivos decontenção física). Os indivíduos devem ser treinados de acordo com os requisitos regulamentares
e da empresa/instituição aplicáveis antes de trabalhar com materiais potencialmente infecciosos– Quando o teste estiver concluído, todos os materiais e meios possivelmente contendo patógenos
devem ser descontaminados, seguindo as normas atuais da indústria para o descarte de resíduos
contaminados (ou seja, autoclave por 20 min a 121°C). Consulte a folha de dados de segurança
para obter informações adicionais e regulamentos locais para descarteSeção 7
Abschnitt 7

ProtocoloA.

Enriquecimento da amostra

É altamente recomendável ler o protocolo inteiro antes de iniciar o teste.
Os meios de enriquecimento deve estar na temperatura de incubação adequada (ambiente ou 30°C/37°C ,quando necessário) antes do uso.
O uso de um saco de enriquecimento com filtro incorporado é altamente recomendado.
No escopo da NF VALIDATION, porções de teste pesando mais de 25 g não têm sido testadas. Incubar,
sem mexer, várias vezes e nas temperaturas indicadas na tabela abaixo. Também é possível realizar o teste
iQ-Check a partir do LSB que foi enriquecido e armazenado a 2–8°C por até 72 hr.
A tabela a seguir descreve os diferentes protocolos que podem ser usados, dependendo do aplicativo e do
escopo da validação:6 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Seção 7 Protocolo

NF VALIDATION BRD 7/13-05/07
Escopo (Matrizes)

Preparação da amostra

Todos os produtos
alimentares
e amostras
ambientais1

Homogeneíze n g de alimento em 9 x n ml de LSB

Ambiente
e superfícies deprodução2

Homogeneíze n g de alimento em 9 x n ml de LSB préaquecido ou LSB II em temperatura ambiente

Enriquecimento/Extração de DNA
Extração Standard IIIncubar por 22–24 hr a 30 ± 1°C
Formato do tubo
Extração Easy IIIncubar por 24–26 hr a 30 ± 1°C
Formato do tubo/Deep Well
Extração Easy II (LSB)
 Incubar porL18–26 hr a 30 ± 1°C
 Formato do tubo/Deep Well
Extração Easy II (LSB II)
Incubar por 18–26 hr a 37 ± 1°C
Formato do tubo/Deep Well

Alimentos
compostos2

Homogeneíze n g de alimento em 9 x n ml de LSB II

Extração Easy II (LSB II)
Incubar por 18–26 hr a 37 ± 1°C
Formato do deep well

Laticínios2

Homogeneíze n g de alimento em 9 x n ml de LSB II préaquecido

Extração Easy II (LSB II)
Incubar por 20–28 hr a 37 ± 1°C
Formato do deep well

AOAC PTM 090701
Escopo (Matrizes)

2,3Preparação da amostraPatê de fígado,cachorro-quente,salsicha fermentada
crua, peru em fatias,
presunto em fatias,
queijo natural (125 g)

Homogeneíze n g de alimento em 9 x n ml de LSB ou LSB II(25 g em 225 ml; 125 g em 1.125 ml)

Superfícies
ambientais (aço inox,
plástico, cerâmica
e concreto selado)

Amostras ambientais

Umedeça os cotonetes e esponjas com um caldo
neutralizante que não contenha complexo aril sulfonatoPara superfícies sendo analisadas com swabs, faça
a amostragem de uma área de 1 x 1" (2,54 x 2,54 cm)
Para superfícies sendo analisadas com esponjas, faça
a amostragem de uma área de 4 x 4" (10,16 x 10,16 cm)
Adicionar LSB ou LSB II suficiente para cobrir o swab
(10 ml) ou a esponja (60–225 ml)

Enriquecimento/Extração de DNA
Extração Easy II (LSB)
Incubar por 24–26 hr a 30 ± 1°C
Formato do tubo/Deep Well
Extração Easy II (LSB II)
Incubar por 18–24 hr a 37 ± 1°C
Formato do tubo/Deep Well
Extração Easy II (LSB)
Incubar 18–24 hr a 30 ± 1°C
Formato do tubo/Deep Well
Extração Easy II (LSB II)
Incubar por 16–24 hr a 37 ± 1°C
Formato do tubo/Deep Well

Consulte o MFLP-39 para matrizes e protocolos aprovados pela Health Canada
A validação também inclui o uso do arquivo de protocolo de aplicação “Lis Fast” para um tempo de execução de PCR reduzido. Entreem contato com seu representante da Bio-Rad para obter mais informações.
1

A validação também inclui o uso do iQ-Check Free DNA Removal Solution e do arquivo de protocolo de aplicação “Lmono Fast” paraum tempo de execução de PCR reduzido. Entre em contato com seu representante da Bio-Rad para obter mais informações.
2

3

A validação inclui estriar direto placas de RAPID’L. mono, RAPID’Listeria spp., ou Ágar Listeria (excluindo queijo natural)

B.

Tratamento de remoção de DNA livre

A iQ-Check Free DNA Removal Solution fornece uma maneira ideal de remover DNA livre. Siga asrecomendações da Bio-Rad no guia do usuário (documento nº10000058391).
iQ-Check Listeria spp. Kit | 7Seção 7 Protocolo

Este protocolo é validado:
■

■

C.

Por AFNOR Certificação na categoria de amostras ambientais de produção
Pelo AOAC Research Institute em uma lista de matrizes indicadas no certificado de validaçãoAOAC-PTM

Extraçãode DNA

Recomendações gerais:
1.

Ligue o bloco de calor ou o agitador térmico para pré-aquecer antes de iniciar o teste. Defina para
95–100°C. Mantenha o reagente de lise em suspensão enquanto pipeta, agitando em velocidade média
em uma placa de agitação magnética.

2.

Em geral, evite agitar o saco de enriquecimento e coletar fragmentos de grande dimensão de resíduos
alimentares. Para amostras alimentares com um sobrenadante gorduroso, colete a amostra logo abaixo
desta camada.

3.

Abra os tubos e os poços com cuidado para evitar possíveis contaminações cruzadas.

4.

Resfrie a placa Deep Well antes de pipetar diretamente através do filme de vedação pré-perfurado.

5.

Use a barra magnética para manter o reagente de lise em suspensão. Pipete enquanto estiver
mexendo em velocidade média.

6.

Agite suavemente o reagente de lise manualmente primeiro para ressuspender a resina. Pipeteenquanto estiver mexendo em velocidade média com a barra magnética contida na ampola, paramantê-lo em suspensão.

7.

Reconstitua o reagente final de lise da seguinte maneira:a. Despeje cuidadosamente todo o conteúdo do reagente F (microesferas de lise) no reagente A(reagente de lise).
b. Use consumíveis com uma ponta larga o suficiente para permitir a pipetagem do reagente de lise
homogeneizado.
c. O reagente de lise misturado com as microesferas de lise (reagentes A + F) tem um prazo devalidade de 6 meses quando armazenado a 4°C.

Protocolo Standard II
1.

Colete 1,5 ml de amostra enriquecida decantada em um tubo.

2.

Centrifugue o tubo a 10.000–12.000 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante.

3.

Adicione 250 µl de reagente de lise homogeneizado (reagentes A + F) ao sedimento e ressuspenda
o sedimento pipetando o reagente para cima e para baixo. Feche o tubo.

Nota: Agite suavemente o reagente de lise manualmente com a mão para ressuspender as microesferas.
4.

Coloque o tubo no agitador térmico ou disruptor celular por 3 ± 1 min.

5.

Incube no bloco de calor apropriado a 95–100°C por 15–20 min.

6. Agite no vortex o tubo em alta velocidade e centrifugue a 10.000–12.000 x g por 5 min.
Este é o ponto de parada recomendado para interromper temporariamente o procedimento.

8 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Seção 7 Protocolo

O sobrenadante pode ser armazenado por até 1 ano a –20°C. Sempre deixe descongelar e homogeneizar
e depois centrifugue a 10.000–12.000 x g por 5 min antes de reutilizar.

Protocolo Easy II
1.

Alíquota de 100 µl de reagente de lise homogeneizado (reagentes A + F) para tubos ou poços de uma
placa Deep Well.

Nota: Agite suavemente o reagente de lise manualmente com a mão para ressuspender as microesferas.
2.

Adicione 100 µl de amostra enriquecida.

Nota: Agite a suspensão para homogeneizar a cultura e, em seguida, permita que os detritos se depositem
antes de coletar a amostra.
3.

Misture a solução pipetando para cima e para baixo até homogeneizar.

4.

Feche os tubos ou sele a placa Deep Well com filme de vedação pré-perfurado.

5.

Coloque os tubos no agitador térmico ou no disruptor celular por 3 ± 1 min. Encubar os tubos em bloco
térmico a 95-100ºC por 15-20 min.

6.

Se estiver usando um agitador térmico para tubos ou placas de poço profundo, encubar os tubos ou
placas de poço profundo no agitador térmico a 1.300 a 1.600 rpm a 95-100ºC por 15-20 min.

7. Agite no vortex os tubos em alta velocidade e em seguida centrifugue a 10.000–12.000 x g por 2 min.
A centrifugação não é necessária para a placa Deep Well.
Este é o ponto de parada recomendado para interromper temporariamente o procedimento.
O sobrenadante pode ser armazenado por até 1 ano a –20°C. Sempre deixe descongelar e homogeneizar
e depois centrifugue a 10.000–12.000 x g por 5 min antes de reutilizar.

D.

PCR em Tempo Real

Configuração do instrumento e do software
Para a configuração do instrumento e do software, siga as instruções do guia do usuário do sistema PCR
em tempo real para iQ-Check kits.

Preparação da mistura de PCR
1.

Prepare a mistura de PCR contendo a solução de amplificação (reagente C) e as sondas fluorescentes(reagente B). O volume de mistura de PCR necessário depende do número de amostras e controles
a serem analisados. Devem ser incluídos pelo menos um controle positivo e um controle negativo emcada execução da PCR. Use a tabela de pipetagem no Apêndice — Guia de cálculo da mistura de PCRpara encontrar os volumes corretos a serem usados para cada reagente.

Nota: Use a mistura de PCR (reagentes B + C) imediatamente após a preparação. Ela é estável por 1 hr nomáximo a 2–8°C.
2.

Pipete 45 μl da mistura de PCR para cada poço, de acordo com a configuração da placa.

3.

Adicione 5 µl de extrato de DNA, reagente D (controle negativo) ou reagente E (controle positivo). Nãoagite a amostra em vortex antes da pipetagem. Vede hermeticamente os poços da placa de PCR ou
tiras de tubo. É importante evitar a formação de bolhas no fundo dos poços, o que é conseguido
fazendo a pipetagem cuidadosamente. Como uma etapa opcional, centrifugue a placa de PCR selada
ou as tiras de tubo (rotação rápida) para eliminar quaisquer bolhas.
iQ-Check Listeria spp. Kit | 9Seção 7 Protocolo4.

Coloque a placa de PCR ou as tiras de tubo no termociclador. Certifique-se de colocar a placa
corretamente, com o poço A1 no canto superior esquerdo. Feche o módulo de reação.

Execute o PCRPara iniciar a execução do PCR, siga as instruções do guia do usuário do sistema PCR em tempo real para
os iQ-Check kits. O arquivo de protocolo de aplicação “Lis spp Fast” foi validado pela NF apenas na
categoria de amostras ambientais de produção.

E.

Análise de dados

Os dados podem ser analisados diretamente no final da execução da PCR ou posteriormente, abrindoo arquivo de dados armazenados. Siga as instruções no manual do usuário do software CFX Manager IDE
correspondente para abrir arquivos de dados e definir os parâmetros de análise de dados.

Interpretação de resultados
Depois que os parâmetros de análise de dados forem definidos, os resultados serão interpretados através
da análise dos valores do ciclo de quantificação (Cq) de cada amostra (o ciclo no qual a curva deamplificação cruza o limite).
O software CFX Manager IDE permite análises automatizadas completas para sistemas de detecção de
PCR em tempo real da Bio-Rad. Uma verificação das características típicas das curvas de amplificação
deve ser realizada antes da liberação dos resultados. Entre em contato com a equipe de suporte técnico da
Bio-Rad se for necessário suporte adicional.
Controles
Verifique os controles positivo e negativo antes de interpretar os resultados da amostra.
Para que a experiência seja válida, os controles devem ter os resultados resumidos na tabela a seguir. Caso
contrário, a reação de PCR deve ser repetida.
Detecção da Listeria spp.
(Canal FAM)

Detecção de controle interno(Canal HEX)

Controle negativo

Cq = N/A*

28 ≤ Cq ≤ 40

Controle positivo

26 ≤ Cq ≤ 36

N/A

Controle* O software indica um valor de Cq (o ciclo no qual a curva de amplificação ultrapassa o limite) de N/A (não aplicável) quando a fluorescência de uma
amostra não aumenta significativamente acima do ruído de fundo e, portanto, não ultrapassa o limite.

Se os resultados dos controles negativos e positivos diferirem dos da tabela Controles (controle inválido),
repita a execução e a análise descritas em D. PCR em tempo real e E. Análise de dados na Seção 7
Protocolo.
Amostras
Um teste de PCR positivo Q-Check Listeria spp. deve mostrar uma curva de amplificação típica e um valor
de Cq ≥10 para o fluoróforo FAM.
■

Se o valor de Cq para ambos os canais estiver abaixo de 10, verifique se a curva de dados brutos
é uma curva de amplificação regular (com uma linha de base plana, seguida de um rápido aumento
exponencial da fluorescência e depois de um achatamento). Se a curva parecer correta, considere
estar diante de uma amostra positiva para Listeria spp.

Caso não haja valor Cq (Cq = N/A) para a FAM, ou caso a curva não seja uma curva de amplificação típica,deve-se analisar o controle interno dessa amostra:
10 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Seção 8 Confirmação de Resultados Positivos

■

■

■

Essa amostra é considerada negativa para Listeria spp. se não houver valor Cq no canal FAM
e o controle interno tiver um valor Cq ≥ 28
Caso o controle interno também não tenha um valor Cq (Cq = N/A), provavelmente isso indica
a inibição da reação de PCR. A amostra precisa ser diluída (usando 10 μl de extrato de DNA, realizar
uma diluição de 1:10 em água estéril destilada e depois testar 5 μl da diluição) e a PCR repetida
Se o valor Cq para o controle interno for <28, não será possível interpretar o resultado. Confirme seo limite foi corretamente colocado, ou se a curva, como dados brutos, é uma curva regular deamplificação. Caso a curva não apresente uma forma característica, será necessário repetir o testede PCR.

A interpretação dos resultados do teste é resumida na tabela a seguir.
Detecção da Listeria spp.
(FAM)

Detecção de controle interno(HEX)

Interpretação

Cq ≥ 10

N/A

Positivo

Cq = N/A

Cq ≥ 28

Negativo

Cq = N/A

Cq = N/A

Inibição

*Quando a detecção do alvo e do controle interno fornecer um valor Cq = N/A, o extrato de DNA deve ser diluído em 1:10 e testado novamente.

Uma interpretação inválida pode ser fornecida quando os critérios de validação não são atendidos. Verifiqueos dados brutos e proceda como se a amostra estivesse inibida.

Seção 8Abschnitt 8

Confirmação de Resultados Positivos
No contexto do método certificado pela NF VALIDATION, todos os resultados positivos do iQ-Check devem
ser confirmados das seguintes maneiras:
1.

Utilizando testes clássicos descritos nos métodos padronizados CEN ou ISO, retornando à amostra.

2.

Por isolamento de LSB ou LSB II enriquecido (faixa de 100 μl) em RAPID'Listeriaspp. ou ágarcromogênico RAPID'L.mono e incubação por 24 hr a 37 ± 1°C. A presença de colônias características
no Listeria spp. é suficiente para confirmar a presença de Listeria spp.

3.

Por isolamento de LSB ou LSB II enriquecido (estriamento 10 μl) em ágar AL ou PALCAM e incubação
por
24–48 hr a 37 ± 1°C. Colônias típicas devem ser confirmadas pelos testes descritos no método ISO.

4.

Utilizando qualquer outro método certificado pela NF VALIDATION, com base em um princípio diferentedaquele usado no Teste de PCR iQ-Check Listeria spp. O protocolo validado deste segundo método
deve ser seguido inteiramente.

No caso de resultados discrepantes entre o iQ-Check Listeria spp. Kit e qualquer uma das opções deconfirmação listadas acima, siga as etapas necessárias para garantir resultados válidos.
É possível armazenar o LSB ou LSB II enriquecido a 2–8°C por 72 hr no máximo, após a incubação a 30°C,
antes de realizar a confirmação.
No contexto da validação da AOAC, presume-se que um resultado positivo para iQ-Check Listeria spp. seja
positivo e recomenda-se a confirmação de acordo com um método de referência apropriado (por exemplo,
USDA MLG, FDA BAM, ISO, MFHPB etc.). Como alternativa, para matrizes seletas, estriar 10 μl
iQ-Check Listeria spp. Kit | 11Seção 9 Confirmação de Colônias Únicas usando o iQ-Check Kit

enriquecido LSB ou LSB II diretamente para RAPID’L. mono, RAPID’Listeria spp. ou Ágar Listeria ágarcromogênico e incubar por 24 hr a 37 ± 1°C. A presença da característica de colônias Listeria spp. deve serbioquimicamente confirmada para a presença de Listeria spp.

Seção 9Abschnitt 9

Confirmação de Colônias Únicas usando o iQ-Check Kit
O iQ-Check Listeria spp. Kit também pode ser usado para confirmar colônias isoladas de Listeria spp. em
meios de cultura de ágar. Isso é validado oficialmente pela certificação AFNOR no RAPID'L.mono
e RAPID'Listeria spp. meio cromogênico.
1.

Escolha uma colônia isolada de uma placa de cultura de ágar seletivo ou não seletivo com um palito dedente, alça estéril ou outro consumível adaptado (por exemplo, uma ponta de pipeta).

2.

Ressuspenda a colônia em 100 µl de sal de triptona ou água estéril destilada em um tubo demicrocentrífuga.
Homogeneíze usando um vortexer.

Use 5 µl da suspensão com 45 µl de mistura de PCR (consulte D. PCR em tempo real na Seção 7
Protocolo) e siga o restante do iQ-Check Listeria spp. Protocolo para interpretação de dados e resultados.

12 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Seção 10 Desempenho e validação do testeSeção 10Abschnitt 10

Desempenho e validação do teste
O iQ-Check Listeria spp. Kit é específico para o gênero Listeria.
NF Validation

BRD 07/13-05/07
MÉTODOS DEANÁLISEALTERNATIVA PARAO AGRONEGÓCIO
http://nf-validation.
afnor.org

O iQ-Check Listeria spp. Kit é certificado pela NF VALIDATION como um método
alternativo ao método de referência ISO 11290-1:2017, para a detecção de Listeria
spp. em todos os produtos para consumo humano e amostras ambientais. A validação
seguiu o protocolo da ISO 16140-2:2016 e inclui o uso dos sistemas de PCR em tempo
real CFX96 Touch Deep Well e CFX Opus Deepwell. O uso da iQ-Check Free DNA
Removal Solution é validado para alimentos compostos, laticínios e amostras
ambientais de produção. O software associado é o CFX Manager IDE Software (versão
2.2 e posterior). Arquivo de Protocolo de Aplicação “Lis spp Fast” é validado. Número
do certificado:
BRD 07/13-05/07. Válido até: Consulte o certificado disponível no site de certificação
da AFNOR.
Validação AOAC
O Q-Check Listeria spp. Kit (protocolo Easy e protocolo Easy com Remoção de DNA
Livre opcional) foi validado pelo AOAC Research Institute no âmbito do Programa deMétodo de Testes de Desempenho para detecção de Listeria spp. de aço inoxidável,plástico, cerâmica, concreto selado, patê de fígado, cachorro-quente, salsicha
fermentada crua, peru em fatias, presunto em fatias e queijo natural (125g). Um
resultado positivo com o iQ-Check deve ser considerado como presumido erecomenda-se que seja confirmado seguindo os métodos de referência na Seção 8.
LSB, LSB II, the “Lista spp Fast” APF, o uso da iQ-Check Free DNA Removal Solution
e dos sistemas de PCR em tempo real CFX96 Touch Deep Well e CFX Opus Deepwell.
O software associado é o CFX Manager IDE Software (versão 2.2 e posterior).Número
do certificado: 090701.
Validação do Health Canada
O iQ-Check Listeria spp. Kit (protocolo Easy) foi validado pela Health Canada (MFLP-39)
para a detecção de Listeria spp. de todas as superfícies ambientais e carne e aves RTE
processadas termicamente. Um resultado positivo com o iQ-Check deve ser considerado
presumido e deve ser confirmado de acordo com o MFHPB-30 (consulte a Seção 11).

iQ-Check Listeria spp. Kit | 13Seção 11 BibliografiaSeção 11
Abschnitt 11

Bibliografia
AOAC Official Method 993.12-1996(1999). Listeria monocytogenes in milk and dairy products. Selectiveenrichment and isolation method.
Health Canada (2011). Health Products and Food Branch. MFHPB-30. Isolation of Listeria monocytogenes
and other Listeria spp. from foods and environmental samples. The Compendium of Analytical Methods,
Volume 2, February 2011.
ISO 7218:2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance formicrobiological examinations.
ISO 11290-1:2017. Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of
Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 1: Detection method.
ISO 16140-2:2016. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 2: Protocol for the validationof alternative (proprietary) methods against a reference method.
ISO 22174:2005. Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for thedetection of food-borne pathogens — General requirements and definitions.
United States Department of Agriculture, Food Safety and Inspection Service (2021). Microbiology
Laboratory Guidebook. Chapter 8.13: Isolation and identification of Listeria monocytogenes from red meat,
poultry, ready-to-eat Siluriformes (fish) and egg products, and environmental samples.
https://www.fsis.usda.gov/sites/default/files/media_file/2021-09/MLG-8.13.pdf, accessed February 14, 2020.
United States Food and Drug Administration (2017). Bacteriological Analytical Manual. Chapter 10: Detectionof Listeria monocytogenes in foods and environmental samples, and enumeration of Listeria monocytogenes
in foods. https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-10-detection-listeriamonocytogenes-foods-and-environmental-samples-and-enumeration, accessed February 14, 2020.

14 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Seção 12 Histórico de Revisão

Seção 12
Abschnitt 12Histórico de Revisão
Data de lançamento

Número do documento

Outubro de 2023

10000167777 Ver A

Alteração
- Alteração do número do documento - versão
anterior Guia do Usuário 10000123536 Ver C
iQ-Check Listeria spp.
- Extensão AFNOR: LSB II alimentos compostos,amostras de ambientes de produção elaticínios

iQ-Check Listeria spp. Kit | 15Seção 12 Histórico de Revisão

Apêndice — Guia de Cálculo da Mistura de PCR
Para encontrar os volumes corretos para a preparação da mistura de PCR, adicione o número total deamostras e de controles a serem analisados e encontre os volumes correspondentes de reagente B
e de reagente C na tabela.
Número Totalde Amostras
e Controles

Reagente deMistura desondas B,
amplificação
Reagente C, µl
μl

Número Totalde Amostras
e Controles

Reagente deMistura desondas B,
amplificação
Reagente C, µl
μl

Número Totalde Amostras
e Controles

Reagente deMistura desondas B,
amplificação
Reagente C, µl
μl

1

5

40

33

178

1.400

65

351

2

11

86

34

184

1.500

66

356

2.800
2.900

3

16

130

35

189

1.500

67

362

2.900

4

22

173

36

194

1.600

68

367

2.900

5

27

216

37

200

1.600

69

373

3.000

6

32

259

38

205

1.600

70

378

3.000

7

38

302

39

211

1.700

71

383

3.100

8

43

346

40

216

1.700

72

389

3.100

9

49

389

41

221

1.800

73

394

3.200

10

54

432

42

227

1.800

74

400

3.200

11

59

475

43

232

1.900

75

405

3.200

12

65

518

44

238

1.900

76

410

3.300

13

70

562

45

243

1.900

77

416

3.300

14

76

605

46

248

2.000

78

421

3.400

15

81

648

47

254

2.000

79

427

3.400

16

86

691

48

259

2.100

80

432

3.500

17

92

734

49

265

2.100

81

437

3.500

18

97

778

50

270

2.200

82

443

3.500

19

103

821

51

275

2.200

83

448

3.600

20

108

864

52

281

2.200

84

454

3.600

21

113

907

53

286

2.300

85

459

3.700

22

119

950

54

292

2.300

86

464

3.700

23

124

994

55

297

2.400

87

470

3.800

24

130

1.000

56

302

2.400

88

475

3.800

25

135

1.100

57

308

2.500

89

481

3.800

26

140

1.100

58

313

2.500

90

486

3.900

27

146

1.200

59

319

2.500

91

491

3.900

28

151

1.200

60

324

2.600

92

497

4.000

29

157

1.300

61

329

2.600

93

502

4.000

30

162

1.300

62

335

2.700

94

508

4.100

31

167

1.300

63

340

2.700

95

513

4.100

32

173

1.400

64

346

2.800

96

518

4.100

16 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Histórico de Revisão

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10000167777 Ver A US/EG

Sig 0123

iQ-Check Listeria spp. Kit
Manual de usuario
Análisis para la detección por PCR en tiempo real de Listeria
spp. en muestras de alimentarias y ambientales

Referencia #3578113

Tabla de Contenidos
Apartado 1

Introducción ............................................................................................................................................ 1

Apartado 2

Tecnología de iQ-Check Listeria spp. ..................................................................................................... 1

Apartado 3

Componentes del kit ............................................................................................................................... 2

Apartado 4

Vida útil y conservación .......................................................................................................................... 2

Apartado 5

Materiales necesarios, no suministrados ................................................................................................ 2
Equipos ................................................................................................................................................... 2
Consumibles ........................................................................................................................................... 3

Apartado 6

Seguridad, precauciones y recomendaciones para la obtención de resultados óptimos ........................ 4

Apartado 7

Protocolo ................................................................................................................................................. 6
Enriquecimiento de la muestra ................................................................................................................ 6
Tratamiento de eliminación de ADN libre ................................................................................................ 8
Extracción de ADN .................................................................................................................................. 8
PCR en tiempo real ................................................................................................................................. 9
Análisis de datos ................................................................................................................................... 11

Apartado 8

Confirmación de resultados positivos.................................................................................................... 12

Apartado 9

Confirmación de colonias aisladas mediante el kit iQ-Check ................................................................ 13

Apartado 10 Aplicación del análisis y validaciones.................................................................................................... 13
Apartado 11 Referencias ........................................................................................................................................... 14
Apartado 12 Historial de revisiones ........................................................................................................................... 15
Apéndice — Tabla de cálculo de la mix de PCR ................................................................................... 14

ii | iQ-Check Listeria spp. Kit

Apartado 1

Introducción

Apartado 1
Apartado 1

Introducción
Los métodos bacteriológicos convencionales suelen ser largos y tediosos. En comparación, iQ-Check
Listeria spp. es un ensayo cualitativo simple y rápido, que permite la detección de secuencias específicas de
ADN exclusivas de Listeria spp. que se encuentran en muestras ambientales y productos alimenticios.
Mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, las secuencias de ADN específicas
de Listeria spp. se amplifican y se detectan simultáneamente por medio de sondas fluorescentes. Se
pueden procesar hasta 94 muestras, con un riesgo mínimo de contaminación y un procedimiento fácil deusar. Los usuarios previstos de este kit de detección son personal de laboratorio capacitado que está
realizando ensayos para detectar Listeria spp., incluyendo L. monocytogenes, L. fleischmannii, L. grayi,
L. innocua, L. ivanovii, L. marthii, L. rocourtiae, L. seeligeri, L. weihenstephanensis y L. welshimeri. El uso deeste ensayo permite obtener resultados pocas horas después del enriquecimiento de una muestra.

Apartado 2
Apartado 2

Tecnología de iQ-Check Listeria spp.
iQ-Check Listeria spp. Kit es un ensayo que se basa en la amplificación del gen y la detección por PCR entiempo real. Los reactivos de PCR listos para su uso en el kit contienen oligonucleótidos (cebadoresy sondas) específicos para Listeria spp., así como ADN polimerasa y nucleótidos. La detección y el análisis
de datos están optimizados para su uso con un instrumento de PCR en tiempo real de Bio-Rad, como elsistema de detección en tiempo real CFX96 Touch Deep Well System.
La PCR es una técnica potente que se utiliza para generar múltiples copias del ADN diana. Durante lareacción de PCR, varios ciclos de calentamiento y enfriamiento permiten la desnaturalización del ADN por
calor, seguida de la hibridación de los cebadores en la región objetivo. La ADN polimerasa utiliza estos
cebadores y desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) para extender el ADN, creando copias del ADN diana.
Estas copias se llaman amplicones.
En la PCR en tiempo real, se utilizan sondas específicas para detectar el ADN durante la fase deamplificación, mediante la hibridación de los amplicones. Estas sondas están unidas a un fluoróforo que
sólo se vuelve fluorescente cuando se hibrida con la secuencia diana. FAM es el fluoróforo unido a la sondaque hibrida con la secuencia de ADN específica de Listeria spp. En ausencia de ADN diana, no se detectará
ninguna fluorescencia. A medida que la cantidad de amplicones aumenta con cada ciclo de amplificación, laintensidad de la fluorescencia también aumenta. El módulo óptico mide esta fluorescencia en la fase delectura durante cada ciclo de PCR mientras que el software correspondiente traza la intensidad de lafluorescencia en función del número de ciclos.
En la mix de reacción se incluye un control interno de ADN sintético para validad cualquier posible resultado
negativo. Este control se amplifica con una sonda específica al mismo tiempo que la secuencia de ADN
diana de Listeria spp., y se detecta por un tercer fluoróforo.
Este ensayo permite la detección cualitativa de Listeria spp., en muestras de alimentos y ambientales
seleccionadas previamente enriquecidas por cultivo. Consta de los siguientes cinco pasos principales:

iQ-Check Listeria spp. Kit | 1

Apartado 3

Componentes del kit*Por favor, consulte el manual del usuario del producto iQ-Check Free DNA Removal Solution(documento #10000058391), para conocer las condiciones de uso.

Apartado 3
Apartado 3

Componentes del kit
iQ-Check Listeria spp. Kit contiene suficientes reactivos para 96 ensayos (94 muestras).

ID de reactivo

Reactivo

Cantidad proporcionada, ml

A

Reactivo de lisis

1 frasco, 20

B

Sondas de fluorescencia

1 tubo, 0,55

C

Mix de amplificación

1 tubo, 4,4

D

Control negativo PCR

1 tubo, 0,5E

Control positivo PCR

1 tubo, 0,25

F

Perlas de lisis

1 frasco, 17,6 g

Apartado 4
Apartado 4

Vida útil y conservación
Una vez recibido, el kit debe ser almacenado a 2-8 °C. Los reactivos almacenados a esta temperatura
pueden usarse hasta la fecha de caducidad indicada en los tubos. La vida útil del reactivo de lisis es de
6 meses una vez que se mezcla con las perlas de lisis.

Apartado 5
Apartado 5

Materiales necesarios, no suministrados
Equipos■

Mezcladora de paletas de laboratorio para homogeneizar las muestras de ensayo■

Incubadora para el enriquecimiento microbiológico de muestras■

Materiales específicos para la extracción en tubos estériles de tapón de rosca cónico de 1,5 ml:– Centrifuga de sobremesa (capacidad de 10.000-12.000 x g)
– Calentador de bloque seco a 37 ± 2 °C y/o 95-100 °C

2 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Apartado 5■

Disruptor celular, como el Disruptor Genie (Scientific Industries, Inc.)■

Materiales específicos para la extracción en la placa Deep Well:

Materiales necesarios, no suministrados– Calefactor térmico con agitación* con capacidad para mantener 37 ± 2 °C y/o 95-100 °C, con una
velocidad de agitación de al menos 1.300 rpm■

Agitador vórtex

■Placa agitadora magnética

■Micropipetas de 20, 200 y 1.000 µl■■

Sistema de PCR en tiempo real de Bio-Rad*, por ejemplo, los sistemas de PCR en tiempo real CFX96
Touch Deep Well System (referencia #3600037) o CFX Opus Deepwell System (referencia #17007991)
iQ-Check Prep System de Bio-Rad para el procedimiento de extracción automático de ADN
y configuración de la placa PCR (referencia #3594911)

Nota: Recomendamos usar una fuente de alimentación ininterrumpida (SAI) con el termociclador y el
iQ-Check Prep System.
*

Contacte con el Servicio Técnico de Bio-Rad para obtener información sobre los instrumentos recomendados.

Consumibles■■

Caldo de enriquecimiento: Listeria Special Broth (LSB) (referencia #3555703, 225 ml x 6 frascos;
3564703, deshidratado, 500 g; 3555793, 5 L x 2 bolsas; 3564753, deshidratado, 5 kg)
Caldo de enriquecimiento: Listeria Special Broth II (LSB II) (referencia #12017463, 225 ml x 6 frascos;
12017388, deshidratado, 500 g; 12017378, deshidratado, 5 kg)■

iQ-Check Free DNA Removal Solution (referencia #3594970)■

Materiales específicos para muestras ambientales:– Esponjas ambientales– Hisopos ambientales– Caldo neutralizante para esponjas e hisopos, como el caldo neutralizante Dey-Engley (D/E) o HiCap
Neutralizing Broth o Letheen Broth■Materiales específicos para la extracción en tubos– Tubos cónicos estériles con tapón de rosca de 1,5 ml (por ejemplo, referencia #2240110XTU)■

Materiales específicos para la extracción en placa Deep Well:– Placa Deep Well de 96 pocillos (referencia #3594900)– Película de sellado de plástico (referencia #3590139)– X-Pierce Sealing Films (referencia #3593977) o Pre-Pierced Plate Sealing Film
(referencia #3600040, sólo en América del Norte)■

Materiales específicos para protocolos de extracción Standard II y Easy II:– iQ-Check Lysis Beads (reactivo F) (referencia #3578136)– Puntas de pipeta de 200 µl con apertura ancha■

Materiales específicos para el iQ-Check Prep System:
iQ-Check Listeria spp. Kit | 3

Apartado 6

Seguridad, precauciones y recomendaciones para la obtención de resultados óptimos– Recipiente de 60 ml para dilución (referencia #3594904)– Puntas con filtro (referencia #3594902 o 12014486: 50 µl; 3594903 o 12014483: 1.000 µl)– Tubos de mix de PCR (referencia #12016673, 5 ml x 25)■■

AL (Agar Listeria de acuerdo a Ottaviani y Agosti) Agar (referencia #3563695, 90 mm x 20 placas;3564046, deshidratado, 500 g; 3564041, suplemento 1; 3564042, suplemento 2
RAPID'Listeria spp. Agar* (referencia #3564744, deshidratado, 500 g; 3564745, suplemento 1;
3564746, suplemento 2)■

RAPID'L.mono Agar* (referencia #3563694, 90 mm x 20 placas; 3555294, kit para 190 ml agar plus 2■

Suplementos; 3564293, deshidratado, 500 g; 3564294, suplemento 1; 3564746, suplemento 2)■

Placas PCR, tubos, film adhesivo y tapas■

Puntas estériles con filtro adaptables a micropipetas de 20, 200 y 1.000 µl■

Puntas de pipetas Combitip o pipetadores de repetición equivalente; estériles, empaquetadas
individualmente■

Pipetas de 1 y 10 ml■

Tubos de ensayo estériles de 2 y 5 ml■

Guantes sin talco■

Agua destilada estéril■

Lejía, 5 %■*Agente descontaminante, como DNA AWAY o RNase AWAY
Puede utilizarse fuera de la validación de AOAC-PTM.

Apartado 6
Apartado 6

Seguridad, precauciones y recomendaciones para la obtención
de resultados óptimos
■

■

■

■

■

■

Este análisis debe ser realizado por personal capacitado
Las mujeres embarazadas, los niños, los ancianos y los individuos inmunocomprometidos no deben
realizar este método ni manipular L. monocytogenes debido a la alta tasa de infección y mortalidad
asociada con estos grupos
Las muestras y los cultivos enriquecidos deben manipularse como material potencialmente infeccioso
y desecharse de acuerdo con las normas y reglamentos locales
Todo el material potencialmente infeccioso debe ser esterilizado en autoclave antes de su eliminación
La calidad de los resultados depende del estricto cumplimiento de las buenas prácticas de laboratorio(por ejemplo, la norma EN ISO 7218), especialmente en lo que respecta a la PCR:
Nunca haga circular el material de laboratorio (pipetas, tubos, etc.) de una estación de trabajo a otra

4 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Apartado 6■

Seguridad, precauciones y recomendaciones para la obtención de resultados óptimos

Utilice siempre un control positivo y un control negativo para cada serie de reacciones de amplificación– No utilice los reactivos después de su fecha de caducidad– Agite (mediante vórtex) los reactivos del kit antes de usarlos para asegurar su homogeneidad– Verificar periódicamente la exactitud y la precisión de las pipetas, así como el correcto
funcionamiento de los instrumentos– Cámbiese los guantes a menudo, especialmente si sospecha que están contaminados– Limpie los espacios de trabajo periódicamente con un 5 % de lejía y otros agentes
descontaminantes, como DNA AWAY
– Use guantes sin talco y evite las huellas dactilares y escribir en los tapones de los tubos. Ello podríainterferir en la correcta adquisición de datos■■

Se recomienda encarecidamente seguir los requisitos generales descritos en la norma
EN ISO 22174:2005 (Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction(PCR) for the detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions)
iQ-Check Listeria spp. Kit:
– Todas las sustancias o mezclas del equipo de ensayo son productos clasificados, según el Sistema
Globalmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos (GHS en inglés por
el acrónimo de Globally Harmonized System). El contacto con ácidos puede causar la liberación degases tóxicos. No es necesario tomar precauciones especiales si se utiliza correctamente. Si se
inhala el producto, suministre aire fresco y consulte a un médico en caso de presentar molestias.
En caso de contacto del producto con los ojos, enjuague el ojo abierto durante varios minutos con
agua corriente. En caso de ingestión de los productos, induzca el vómito y solicite ayuda médica.

■

iQ-Check Prep System:– El uso inadecuado del sistema de preparación iQ-Check Prep System puede causar lesiones
personales o daños en el instrumento.
Algunos componentes pueden suponer un riesgo de lesiones personales debido al calor excesivo si
se manejan de forma inadecuada. Para un uso seguro, el iQ-Check Prep System debe ser
manipulado y utilizado sólo por personal de laboratorio calificado que haya sido instruido para tal fin.
El mantenimiento del instrumento debe ser realizado sólo por los ingenieros del servicio de campode Bio-Rad.

■

Sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch Deep Well System o CFX Opus
Deepwell System:– El uso inadecuado del sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch Deep Well
System o CFX Opus Deepwell System puede causar lesiones personales o daños en el instrumento.
Algunos componentes pueden suponer un riesgo de lesiones personales debido al calor excesivo si
se manejan de forma inadecuada. Para un uso seguro, el sistema de detección de PCR en tiempo
real CFX96 Touch Deep Well System y CFX Opus Deepwell System deben ser manipulados yutilizados sólo por personal de laboratorio cualificado y que haya sido instruido para tal fin. El
mantenimiento del instrumento debe ser realizado sólo por los ingenieros del servicio de técnicode Bio-Rad.

■

Enriquecimiento– El usuario debe leer, comprender y seguir toda la información de seguridad en las instrucciones deliQ-Check Listeria spp Kit. Conserve las instrucciones de seguridad para futuras consultas. Para
iQ-Check Listeria spp. Kit | 5

Apartado 7

Protocolo

reducir los riesgos asociados a la exposición a productos químicos y a riesgos biológicos, losanálisis de patógenos deben ser realizados en un laboratorio debidamente equipado y bajo elcontrol de personal capacitado. Siga siempre las prácticas normalizadas de seguridad de loslaboratorios, incluido el uso de vestimenta protectora adecuada y protección ocular al manipular
reactivos y muestras contaminadas. Evite el contacto con el contenido de los medios deenriquecimiento y los tubos de reactivos después de la amplificación. Deseche las muestras
enriquecidas de acuerdo con las normas vigentes aplicables a la industria.
– La Listeria es un organismo de bioseguridad de nivel 2. Las muestras biológicas como losenriquecimientos tienen un potencial de transmitir enfermedades infecciosas. Siga todos losreglamentos locales, estatales/provinciales y/o nacionales aplicables para la eliminación dedesechos biológicos. Use el equipo de protección apropiado, que incluya, pero no se limite a, gafas
protectoras, protector facial, ropa/bata de laboratorio y guantes. Todos los trabajos deben realizarse
en instalaciones debidamente equipadas, utilizando el equipo de seguridad adecuado (por ejemplo,
dispositivos de contención física). Las personas deben ser instruidas y estar capacitadas de acuerdo
con los requisitos reglamentarios y de la empresa/institución aplicables antes de trabajar con
materiales potencialmente infecciosos.
– Una vez finalizados los análisis, todos los materiales y medios que puedan contener patógenos
deberán descontaminarse siguiendo las normas actuales de la industria para la eliminación dedesechos contaminados (es decir, en autoclave durante 20 min a 121 °C). Consulte la Ficha de Datos
de Seguridad para obtener información adicional y los reglamentos locales para la eliminación.

Apartado 7
Apartado 7

Protocolo
A. Enriquecimiento de la muestra
Altamente recomendable leer completa y detenidamente el protocolo antes de iniciar el ensayo.
El medio de enriquecimiento debe encontrarse a la temperatura de incubación apropiada(ambiente o 30 °C/37 °C cuando sea necesario) antes de su uso.
Se recomienda encarecidamente el uso de una bolsa de enriquecimiento con filtro incorporado.
En el ámbito de la VALIDACIÓN NF, las porciones que pesan más de 25 g no han sido probadas. Incube, sinagitar, durante los tiempos y a las temperaturas indicados en la tabla siguiente. También es posible llevar a cabo
el ensayo iQ-Check a partir de LSB que haya sido enriquecido y luego almacenado a 2-8 °C durante 72 hr.
En el cuadro que figura a continuación se esbozan los diferentes protocolos que pueden utilizarse, según laaplicación y el alcance de la validación:

6 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Apartado 7

Alcance(matrices)
Todos los
productos
alimentarios
y las muestras
ambientales1

Entorno ysuperficies deproducción2

NF VALIDACIÓN BRD 7/13-05/07

Preparación de las muestras

Homogeneizar n g de alimento en 9 x n ml de LSB

Protocolo

Enriquecimiento/Extracción de ADN
Extracción Standard II
 Incubar durante 22-24 hr
a 30 ± 1 °C
 Formato de tubo
Extracción Easy II
 Incubar durante 24-26 hr
a 30 ± 1 °C
 Formato de tubo/Deep Well

Homogeneizar n g de alimento en 9 x n ml de LSB precalentado o
LSB II a temperatura ambiente

Extracción Easy II (LSB)
Incubar durante 18-26 hr a 30
± 1 °C
Formato de tubo/Deep Well
Extracción Easy II (LSB II)
Incubar durante 18-26 hr a 37
± 1 °C Formato de tubo/Deep Well

Alimentos
compuestos2

Homogeneizar n g de alimento en 9 x n ml de LSB II

Productos
lácteos2

Homogeneizar n g de alimento en 9 x n ml de LSB II precalentado

Alcance(matrices)2,3
Paté de hígado,
perritos calientes,
salchichas crudas
fermentadas,lonchas de pavo,lonchas dejamón, queso
natural (125 g)
Superficies
ambientales(Acero inoxidable,
plástico,cerámica,
hormigón sellado)

AOAC PTM 090701

Preparación de las muestras

Homogeneizar n g de alimento en 9 x n ml de LSB o LSB II (25 g
225 ml; 125 g en 1.125 ml)

Muestras ambientales
 Humedecer los hisopos y las esponjas con un caldo
neutralizante que no contenga complejo de sulfonato de arilo.
 Para las superficies que se analizan con hisopos, tome una
muestra de una superficie de 1 x 1" (2,54 x 2,54 cm).
 Para las superficies que se analizan con esponjas, tome una
muestra de una superficie de 4 x 4" (10,16 x 10,16 cm).
 Añadir una cantidad suficiente de LSB o LSB II para cubrir elhisopo (10 ml) o la esponja (60-225 ml)

Extracción Easy II (LSB II)
Incubar durante 18-26 hr a 37
± 1 °C
Formato de Deep Well
Extracción Easy II (LSB II)
Incubar durante 20-28 hr a 37
± 1 °C
Formato de Deep Well
Enriquecimiento/Extracción de ADN
Extracción Easy II (LSB)
 Incubar durante 24-26 hr
a 30 ± 1 °C formato detubo/Deep Well
Extracción Easy II (LSB II)
 Incubar durante 18-24 hr
a 37 ± 1 °C
 Formato de tubo/Deep Well
Extracción Easy II (LSB)
 Incubar durante 18-24 hr
a 30 ± 1 °C formato detubo/Deep Well
Extracción Easy II (LSB II)
 Incubar durante 16-24 hr
a 37 ± 1 °C
 Formato de tubo/Deep Well

Consulte MFLP-39 para conocer las matrices y protocolos aprobados por el Ministerio de Sanidad de Canadá
La validación también incluye el uso del archivo de aplicación de protocolo “Lis spp Fast” para un tiempo de ejecución de PCR
reducido. Póngase en contacto con su representante de Bio-Rad para más información.
1

La validación también incluye el uso de iQ-Check Free DNA Removal Solution y el archivo de aplicación del protocolo “Lis spp Fast”
para un tiempo de ejecución de PCR reducido. Póngase en contacto con su representante de Bio-Rad para más información.

2

3

La validación incluye la siembra directa a RAPID’L. Mono, RAPID’Listeria spp., o placas de agar Listeria (excluido el queso natural)
iQ-Check Listeria spp. Kit | 7

Apartado 7

B.

Protocolo

Tratamiento de eliminación de ADN libre

iQ-Check Free DNA Removal Solution es la mejor forma de eliminar el ADN libre. Siga las recomendaciones
de Bio-Rad descritas en el manual del usuario (documento #10000058391).
Este protocolo está validado:
■

■

C.

Por la certificación AFNOR en la categoría de muestras ambientales de producción
Por el Instituto de Investigación de la AOAC en una lista de matrices indicadas en el certificado devalidación AOAC-PTM

Extracción de ADN

Recomendaciones generales:
1.

Precaliente el bloque calefactor o mezclador térmico antes de iniciar el ensayo. Póngalo a 95-100 °C.
Mantenga el reactivo de lisis en suspensión mientras pipetea agitando a velocidad media en una placa
agitadora magnética.

2.

En general, evite agitar la bolsa de enriquecimiento y recoger grandes fragmentos de restos demuestra. Para muestras de alimentos con un sobrenadante graso, recoja la muestra justo debajo deesta capa.

3.

Abra los tubos y pocillos con cuidado para evitar cualquier posible contaminación cruzada.

4.

Enfríe la placa Deep Well antes de pipetear directamente a través de la película para sellado
preperforada.

5.

Utilice la barra magnética para mantener el reactivo de lisis en suspensión. Pipetee mientras agita
a velocidad media.

6.

En primer lugar, agite el reactivo de lisis manualmente para resuspender la resina. Seguidamente,
pipetee mientras se agita a media velocidad con la barra magnética contenida en la botella, paramantener el reactivo en suspensión.

7.

Reconstituya el reactivo de lisis final de las siguientes maneras:a. Vierta cuidadosamente todo el contenido del reactivo F (perlas de lisis) en el reactivo A (reactivode lisis).
b. Utilice puntas con apertura suficientemente ancha para permitir el pipeteo homogeneizado delreactivo de lisis.
c. Los reactivos de lisis mezclados con perlas de lisis (reactivos A + F) tienen una vida útil de 6 meses
almacenados a una temperatura de 4 °C.

Protocolo Standard II
1.

Recoja 1,5 ml de muestra enriquecida decantada en un tubo.

2.

Centrifugue el tubo a 10.000-12.000 x g durante 5 min. Descarte el sobrenadante.

3.

Añada 250 μl de reactivo de lisis homogeneizado (reactivos A + F) al decantado o pellet y resuspéndalo
pipeteando el reactivo hacia arriba y hacia abajo. Cierre el tubo.

Nota: en primer lugar, agite el reactivo de lisis manualmente para resuspender las perlas.
8 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Apartado 7

4.

Coloque el tubo en el disruptor celular durante 3 ± 1 min.

5.

Incube en el bloque calefactor apropiado a 95-100 °C durante 15-20 min.

Protocolo

6. Agite (agitador vórtex) el tubo a alta velocidad y centrifugue a 10.000-12.000 x g durante 5 min.
Este es el punto de parada recomendado para detener temporalmente el procedimiento.
El sobrenadante puede ser almacenado hasta 1 año a –20 °C. Antes de volver a utilizarlo, déjelo
descongelar, homogenícelo y a continuación centrifúguelo a 10.000-12.000 x g durante 5 min.

Protocolo Easy II
1.

Introduzca una alícuota de 100 µl de reactivo de lisis homogeneizado (reactivos A + F) en los tubos
o pocillos de una placa Deep Well.

Nota: en primer lugar, agite el reactivo de lisis manualmente para resuspender las perlas.
2.

Añada 100 µl de muestra enriquecida.

Nota: agite la suspensión para homogeneizar el cultivo y seguidamente deje que los restos se asienten
antes de recoger la muestra.
3.

Homogeneice la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta que se homogeneice.

4.

Cierre los tubos o selle la placa Deep Well mediante la película pre-perforada de sellado.

5.

Coloque el tubo en el disruptor celular durante 3 ± 1 min. Incubar los tubos en el bloque térmico a 95–
100°C durante 15–20 min.

6.

Si se emplea un termoagitador para tubos o placa de pocillo profundo (placa deep well), incubar lostubos o la placa a 95-100ºC programando una agitación de 1,300 a 1,600 rpm durante 15–20 min.

7.

Agite (agitador vórtex) el tubo a alta velocidad y centrifugue a 10.000-12.000 x g durante 2 min.

La centrifugación no es necesaria para la placa Deep Well.
Este es el punto de parada recomendado para detener temporalmente el procedimiento.
El sobrenadante puede ser almacenado hasta 1 año a –20 °C. Antes de volver a utilizarlo, déjelo
descongelar, homogenícelo y a continuación centrifúguelo a 10.000-12.000 x g durante 5 min.

D. PCR en tiempo real
Configuración del software e instrumento
Para la configuración del instrumento y del software, siga las instrucciones del manual del usuario delsistema de PCR en tiempo real para los kits iQ-Check.

Preparación de la mix de PCR
1.

Prepare la mix de PCR que contiene la solución de amplificación (reactivo C) y las sondas
fluorescentes (reactivo B). El volumen de mix de PCR necesario depende del número de muestras
y controles a analizar. Se debe incluir al menos un control positivo y uno negativo en cada ejecución de
PCR. Utilice la tabla de pipeteo del Apéndice-Guía de cálculo de la mix de PCR para encontrar losvolúmenes correctos a utilizar para cada reactivo.

iQ-Check Listeria spp. Kit | 9

Apartado 7

Protocolo

Nota: Utilice la mix de PCR (reactivos B + C) inmediatamente después de su preparación. La mix
permanecerá estable durante 1 hr como máximo a 2-8 °C.
2.
3.

4.

Pipetee 45 µl de mix de PCR en cada pocillo según la configuración de su placa.
Añada 5 µl de extracto de ADN, reactivo D (control negativo) o reactivo E (control positivo). No agite
con vórtex la muestra antes del pipeteo. Selle herméticamente los pocillos de la placa de PCR o lastiras de tubos. Es importante evitar las burbujas en el fondo de los pocillos pipeteando con cuidado.
Como paso opcional, centrifugue la placa sellada de PCR o las tiras de tubos (quick spin) para eliminar
cualquier burbuja.
Coloque la placa de PCR o las tiras de tubos en el termociclador. Asegúrese de colocar la placa
correctamente, con el pocillo A1 en la esquina superior izquierda. Cierre el módulo de reacción.

Ejecución de la PCR
Para iniciar la ejecución de la PCR, siga las instrucciones del manual del usuario del sistema de PCR entiempo real del kit iQ-Check. El archivo de aplicación del protocolo "Lis spp Fast" ha sido validado por NF
y AOAC.

10 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Apartado 7

Protocolo

E. Análisis de datos
Los datos pueden ser analizados directamente al final de la ejecución de PCR o en un momento posteriorabriendo el archivo de datos almacenados. Siga las instrucciones del correspondiente manual de usuariodel software CFX Manager IDE para abrir los archivos de datos y configurar los parámetros de análisis dedatos.

Interpretación de los resultados
Una vez establecidos los parámetros de análisis de los datos, los resultados se interpretan analizando losvalores del ciclo de cuantificación (Cq) de cada muestra (el ciclo en el que la curva de amplificación cruza elumbral).
El software CFX Manager IDE permite un análisis completamente automatizado para los sistemas dedetección de PCR en tiempo real de Bio-Rad. Antes de publicar los resultados, debe realizarse una
verificación de las características típicas de las curvas de amplificación. Póngase en contacto con el equipo
de asistencia técnica de Bio-Rad si necesita ayuda adicional.
Controles
Verifique los controles positivos y negativos antes de interpretar los resultados de las muestras.
Para poder validar el experimento, los controles deben tener los resultados que se resumen en el siguiente
cuadro. De lo contrario, deberá repetirse la reacción.
Detección de Listeria spp.
(Canal FAM)

Detección de control interno(Canal HEX)

Control negativo

Cq = N/A*

28 ≤ Cq ≤ 40

Control positivo

26 ≤ Cq ≤ 36

N/A

Control* El programa informático indica un valor Cq (el ciclo en el que la curva de amplificación cruza el umbral) de N/A (no aplicable) cuando la fluorescencia
de una muestra no se eleva significativamente por encima del ruido de fondo, y por lo tanto no cruza el umbral.

Si los resultados de los controles negativos y positivos difieren de los de la tabla de controles (control
inválido), repita la ejecución y el análisis descritos en D. PCR en tiempo real y E. Análisis de datos en elapartado 7 Protocolo.
Muestras
Un resultado positivo de PCR iQ-Check Listeria spp. debe mostrar una curva de amplificación típica y unvalor Cq ≥10 para el fluoróforo FAM.
■

Si el valor Cq de ambos canales está por debajo de 10, verifique que la curva presente una
amplificación normal (con una línea de base plana, seguida de un rápido aumento exponencial de lafluorescencia, y luego un aplanamiento o fase meseta). Si la curva parece correcta, puede considerarse
une muestra positiva para el ensayo Listeria spp.

Si no hay un valor Cq (Cq = N/A) para FAM, o si la curva no es una curva de amplificación típica, debe
analizarse el control interno de esa muestra:■

Si no hay un valor Cq para el canal FAM y el control interno tiene un valor Cq ≥ 28, esta muestra seconsidera como una muestra negativa de Listeria spp.

iQ-Check Listeria spp. Kit | 11

Apartado 8■■

Confirmación de resultados positivos

Si el control interno tampoco tiene un valor Cq (Cq = N/A), esto probablemente indica la inhibición de lareacción de PCR. Diluya la muestra (realice una dilución 1:10 en agua destilada estéril utilizando 10 µlde extracto de ADN y a continuación analice 5 μl de la dilución) y repita la PCR.
Si el valor Cq del control interno es <28, no es posible interpretar el resultado. Verifique elposicionamiento correcto del umbral, y que la curva presente una amplificación típica. Si la curva notiene una forma característica, será necesario repetir el ensayo de PCR.

La interpretación de los resultados de las muestras se resume en el siguiente tabla.
Detección de Listeria spp.
(FAM)

Detección de control interno(HEX)

Interpretación

Cq ≥ 10

N/A

Positivo

Cq = N/A

Cq ≥ 28

Negativo

Cq = N/A

Cq = N/A

Inhibición*

Si tanto la detección de la diana como del control interno dan un valor Cq = N/A, el extracto de ADN debe diluirse 1:10 y analizarse de nuevo.

Se puede dar una interpretación inválida cuando no se cumplen los criterios de validación. Compruebe losdatos en bruto y proceda como si la muestra se hubiera inhibido.

Apartado 8
Apartado 8

Confirmación de resultados positivos
En el contexto del método certificado de validación NF, todos los resultados positivos del iQ-Check deben
confirmarse de la siguiente manera:
1.

Utilizando los ensayos clásicos descritos en los métodos estandarizados CEN o ISO volviendo a lamuestra.

2.

Mediante aislamiento de LSB o LSB II enriquecido (por siembra de 100 μl) en RAPID'Listeria spp.
O RAPID'L.mono chomogenic agar e incubación durante 24 hr a 37 ± 1 °C. La presencia de colonias
características de Listeria spp., es suficiente para confirmar la presencia de Listeria spp.

3.

Mediante aislamiento de LSB o LSB II enriquecido (por siembra de 10 μl) en AL o PALCAM agar e
incubación durante 24-48 hr a 37 ± 1 °C. Las colonias típicas deben confirmarse mediante los ensayos
descritos en el método ISO.

4.

Utilizando cualquier otro método certificado por la validación NF basado en un principio diferente alutilizado en el ensayo de PCR iQ-Check Listeria spp. El protocolo validado de este segundo método
debe ser seguido en su totalidad.

En caso de resultados discrepantes entre el iQ-Check Listeria spp. Kit y cualquiera de las opciones deconfirmación enumeradas anteriormente, siga los pasos necesarios para asegurar resultados válidos.
Antes de llevar a cabo la confirmación, es posible almacenar el LSB o LSB II enriquecido a 2-8 °C durante
72 hr como máximo, después de la incubación a 30 °C.
En el contexto de la validación AOAC, un resultado positivo de iQ-Check Listeria spp., es presuntivo de serpositivo y se recomienda su confirmación según un método de referencia apropiado (por ejemplo, USDA
MLG, FDA BAM, ISO, MFHPB, etc.). Como alternativa, para matrices seleccionadas, siembre 10 μl de LSB
o LSB II enriquecido directamente en agar cromogenico RAPID’L. mono, RAPID’Listeria spp. o Listeria
chromogenic agar e incube durante 24 hr a 37 ± 1 °C. La presencia de colonias características de Listeria
spp. Debe confirmarse químicamente para detectar la presencia de Listeria spp.
12 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Apartado 9

Confirmación de colonias aisladas mediante el kit iQ-Check

Apartado 9
Apartado 9

Confirmación de colonias aisladas mediante el kit iQ-Check
iQ-Check Listeria spp. Kit puede utilizarse también para confirmar colonias Listeria spp. individuales aisladas
en las placas de agar. Esto está validado oficialmente bajo certificación AFNOR para el medio cromogénico
RAPID'L. mono y RAPID'Listeria spp.
1.

Recoja una colonia aislada en una placa de agar selectivo o no selectivo con un palillo, un lazo estéril
u otro consumible adaptado (por ejemplo, una punta de pipeta).

2.

Resuspenda la colonia en 100 µl de sal triptona o agua destilada estéril en un tubo de microcentrífuga.

Homogenice con vórtex.
Analice 5 µl de la suspensión con 45 µl de mix de PCR (véase D. PCR en tiempo real en el apartado 7
Protocolo) y siga el resto del protocolo iQ-Check Cronobacter spp. para la interpretación de los datos y losresultados.

Apartado 10
Apartado 10

Aplicación del análisis y validaciones
iQ-Check Listeria spp. Kit es específico para la detección del género Listeria.
NF Validation

BRD 07/13-05/07
MÉTODOS DEANÁLISIS
ALTERNATIVOSPARA LAAGROINDUSTRIA
http://nf-validation.
afnor.org

iQ-Check Listeria spp. Kit, está validado por NF como método alternativo al método dereferencia ISO 11290-1:2017 para la detección de Listeria spp. en todos los productospara el consumo humano y muestras ambientales. La validación siguió el protocolo de lanorma ISO 16140-2:2016 e incluye el uso del sistema de PCR en tiempo real CFX96
Touch Deep Well y CFX Opus Deepwell. El uso de iQ-Check Free DNA Removal
Solution está validado para alimentos compuestos, productos lácteos y muestras
ambientales de producción. El software asociado es el CFX Manager IDE (versión 2.2 yposterior). El archivo de aplicación del protocolo "Lis spp Fast” ha sido validado. Número
de certificado: BRD 07/13-05/07. Válido hasta: consulte el certificado disponible en elsitio web de AFNOR Certification.
AOAC Validation
iQ-Check Listeria spp. Kit (protocolo Easy y protocolo Easy con el protocolo opcional deextracción de ADN libre) ha sido validado por el Instituto de Investigación de la AOAC enel marco del Programa de Métodos de Desempeño Probado para la detección deListeria spp. en acero inoxidable, plástico, cerámica, hormigón sellado, paté de hígado,
perritos calientes, salchichas crudas fermentadas, pavo en lonchas, jamón en lonchas yqueso natural (125 g). Un resultado positivo con iQ-Check debe considerarse como no
definitivo y se recomienda que se confirme siguiendo las recomendaciones del apartado
8. LSB, LSB II, el “List spp Fast” APF, el uso de la solución iQ-Check Free DNA Removal
Solution y el uso de los sistemas de PCR en tiempo real CFX96 Touch Deep Well
System y CFX Opus Deepwell System están validados en todas las muestras.
iQ-Check Listeria spp. Kit | 13

Apartado 11 Referencias

El software asociado es el CFX Manager IDE (versión 2.2 y posterior).
Número de certificado: 090701.
Validación del departamento Health Canada
iQ-Check Listeria spp. Kit (protocolo Easy) ha sido validado por el departamento Health
Canada del Ministerio de Salud de Canadá (MFLP-39) para la detección de Listeria spp.
en todas las superficies ambientales y en las carnes y aves listas para su consumo (RTE)
procesadas térmicamente. Un resultado positivo con iQ-Check debe considerarse comono definitivo y se recomienda que se confirme mediante el método MFHPB-30 (véase elapartado 11).

Apartado 11
Apartado 11

Referencias
AOAC Official Method 993.12-1996(1999). Listeria monocytogenes in milk and dairy products. Selectiveenrichment and isolation method.
Health Canada (2011). Health Products and Food Branch. MFHPB-30. Isolation of Listeria monocytogenes
and other Listeria spp. from foods and environmental samples. The Compendium of Analytical Methods,
Volume 2, February 2011.
ISO 7218:2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance formicrobiological examinations.
ISO 11290-1:2017. Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of
Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 1: Detection Method.
ISO 16140-2:2016. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 2: Protocol for the validationof alternative (proprietary) methods against a reference method.
ISO 22174:2005. Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for thedetection of food-borne pathogens — General requirements and definitions.
United States Department of Agriculture, Food Safety and Inspection Service (2021). Microbiology
Laboratory Guidebook. Chapter 8.13: Isolation and identification of Listeria monocytogenes from red meat,
poultry, ready-to-eat Siluriformes (fish) and egg products, and environmental samples.
https://www.fsis.usda.gov/sites/default/files/media_file/2021-09/MLG-8.13.pdf, accessed February 14, 2020.
United States Food and Drug Administration (2017). Bacteriological Analytical Manual. Chapter 10: Detectionof Listeria monocytogenes in foods and environmental samples, and enumeration of Listeria monocytogenes
in foods. https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-10-detection-listeriamonocytogenes-foods-and-environmental-samples-and-enumeration, accessed February 14, 2020.

14 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Apartado 12 Historial de revisiones

Apartado 12
Apartado 12

Historial de revisiones
Fecha delanzamiento

Número dedocumento

Octubre de 2023

10000167777 Ver A

Modificación-

Cambio de número de documento - versión anterior
10000123536 Ver C iQ-Check Listeria spp. manual deusuario
Extensión AFNOR: LSB II para alimentos compuestos,
muestras de ambientes de producción y productos lácteos

iQ-Check Listeria spp. Kit | 15

Apéndice — Tabla de cálculo de la mix de PCR

Apéndice — Tabla de cálculo de la mix de PCR
Para encontrar los volúmenes correctos para preparar la mix de PCR, sume el número total de muestras
y controles a analizar y encuentre los volúmenes correspondientes del reactivo B y del reactivo C enla tabla.
Número total
de muestras
y controles

Sondasreactivo B,µl

Mix deamplificación
Reactivo C,µl

Número total
de muestras
y controles

Sondasreactivo B,µl

Mix deamplificación
Reactivo C,µl

Número total
de muestras
y controles

Sondasreactivo B,µl

Mix deamplificación
Reactivo C,
µl
2.800

1

5

40

33

178

1.400

65

351

2

11

86

34

184

1.500

66

356

2.900

3

16

130

35

189

1.500

67

362

2.900

4

22

173

36

194

1.600

68

367

2.900

5

27

216

37

200

1.600

69

373

3.000

6

32

259

38

205

1.600

70

378

3.000

7

38

302

39

211

1.700

71

383

3.100

8

43

346

40

216

1.700

72

389

3.100

9

49

389

41

221

1.800

73

394

3.200

10

54

432

42

227

1.800

74

400

3.200

11

59

475

43

232

1.900

75

405

3.200

12

65

518

44

238

1.900

76

410

3.300

13

70

562

45

243

1.900

77

416

3.300

14

76

605

46

248

2.000

78

421

3.400

15

81

648

47

254

2.000

79

427

3.400

16

86

691

48

259

2.100

80

432

3.500

17

92

734

49

265

2.100

81

437

3.500

18

97

778

50

270

2.200

82

443

3.500

19

103

821

51

275

2.200

83

448

3.600

20

108

864

52

281

2.200

84

454

3.600

21

113

907

53

286

2.300

85

459

3.700

22

119

950

54

292

2.300

86

464

3.700

23

124

994

55

297

2.400

87

470

3.800

24

130

1.000

56

302

2.400

88

475

3.800

25

135

1.100

57

308

2.500

89

481

3.800

26

140

1.100

58

313

2.500

90

486

3.900

27

146

1.200

59

319

2.500

91

491

3.900

28

151

1.200

60

324

2.600

92

497

4.000

29

157

1.300

61

329

2.600

93

502

4.000

30

162

1.300

62

335

2.700

94

508

4.100

31

167

1.300

63

340

2.700

95

513

4.100

32

173

1.400

64

346

2.800

96

518

4.100

14 | iQ-Check Listeria spp. Kit

Visite bio-rad.com/iqcheck para más información.
BIO-RAD es una marca registrada de Bio-Rad Laboratories, Inc.
IQ-CHECK es una marca registrada de Bio-Rad Europe GmbH en diversos países. Todas las marcas comerciales aquí indicadas son
propiedad de sus respectivos propietarios.

10000167777 Ver A US/EG

Sig 0123

iQ-Check Listeria spp. Kit
用户指南可用于食物和环境样本中李斯特菌属的实时荧光定量 PCR 检测目录号 3578113

目录
第 1 部分简介 .....................................................................................................................................................................1

第 2 部分

成分列表..............................................................................................................................................................2

第 3 部分保质期及储存条件 ..............................................................................................................................................2

第 4 部分其他仪器、试剂与耗材.......................................................................................................................................2
仪器 .....................................................................................................................................................................2试剂和耗材 ..........................................................................................................................................................3

第 5 部分最佳实验结果的安全预防措施及建议 ...............................................................................................................4

第 6 部分

操作流程..............................................................................................................................................................6
样本增菌..............................................................................................................................................................6
去除游离 DNA 处理 ...........................................................................................................................................8DNA 提取 ............................................................................................................................................................8
实时荧光定量 PCR .............................................................................................................................................9
数据分析........................................................................................................................................................... 10

第 7 部分

阳性结果的确认 ............................................................................................................................................... 11

第 8 部分

使用 iQ-Check Kit 确认单菌落 ...................................................................................................................... 12

第 9 部分测试性能和验证 ............................................................................................................................................... 12

第 10 部分

参考资料 e ....................................................................................................................................................... 13

第 11 部分修订记录........................................................................................................................................................... 14
附录 — PCR 混合物计算指南 ........................................................................................................................ 15

ii| iQ-Check Listeria spp. Kit

第 1 部分 简介

第 1 部分
第 1 部分简介传统的细菌学方法往往耗时较长且复杂繁琐。相比之下，iQ-Check Listeria spp. 是一种简单且快速的定性检
测方法，可以检测在环境样本和食物产品中发现的李斯特菌属特有的特异性 DNA 序列。利用实时聚合酶链反应 (PCR)，使用荧光探针可以同时扩增和检测李斯特菌属的特异性 DNA 序列。可以处理多达 94 个样本，污染风险极低，流程简单方便。该试剂盒的预期使用者是负责检测李斯特菌属（单核细胞增生李斯特菌、弗

氏李斯特菌, 格氏李斯特菌、英诺克李斯特菌、伊氏李斯特菌、默氏李斯特菌、罗氏李斯特菌,斯氏李斯特菌、韦氏李斯特菌, 以及威氏李斯特菌）的训练有素的实验室人员。采用这种检测方法在样本增菌后数小时内
即可获得结果。

第 2 部分
iQ-Check Listeria spp. 技术
iQ-Check Listeria spp. Kit 是一种基于实时 PCR 的基因扩增和检测的测试。该 PCR 试剂盒包含针对李斯特菌
属的 DNA 引物和探针，DNA 聚合酶和核苷酸。我们将检测过程和数据分析进行了优化，可与 Bio-Rad 的 实时荧光定量 PCR 仪器（如 CFX96 Touch Deep Well 实时 PCR 检测系统）配合使用。
PCR 是分子生物学中使用最广泛的技术，它能在短时间内大量扩增目标 DNA。在 PCR 反应过程中，经过多次加热和冷却，可使 DNA 受热变性，然后退火，引物与目标 DNA 互补区结合，DNA 聚合酶使用这些引物和三磷酸脱氧核苷酸 (dNTP) 来扩增 DNA，从而生成目标 DNA 的扩增产物，也称“扩增子”。
在实时 PCR 中，特异性探针用于在扩增过程中与扩增子杂交，从而检测目标 DNA。这些探针与荧光基团相连，仅在与目标序列杂交时才会发出荧光。探针可与李斯特菌属特异性 DNA 序列杂交，与该探针连接的荧光基团为
FAM。当不存在目标 DNA 时，无法检测到荧光。随着每轮扩增后扩增量的增加，荧光强度也随之增强。光模块可以在每个 PCR 周期的退火步骤中测量荧光基团，而相关的软件可以绘制荧光强度与周期数的关系图。
反应混合物中包含合成的 DNA 内部质控，可验证任何可能的阴性结果。当李斯特菌属的对照在与李斯特菌属
目标 DNA 序列同时使用特定探针扩增，并由第三种荧光基团检测。
该检测方法可对培养增菌后的选定食品和环境样本中的李斯特菌属进行定性检测。其中主要包括以下五个步骤：增菌条件可选步骤：游
离 DNA 去除*DNA 提取实时荧光定量数据分析与结

PCR

果解释

*使用条件请参阅 iQ-Check Free DNA Removal Solution（文件编号 10000058391）的用户指南。

iQ-Check Listeria spp. Kit | 1

第 3 部分 成分列表

第 3 部分
第 2 部分成分列表
iQ-Check Listeria spp. Kit 包含足够进行 96 项检测（94 份样本）的试剂。
试剂编号

试剂

数量，ml

A

裂解液

1 瓶，20B荧光探针

1 管，0.55

C扩增混合液

1 管，4.4

D

PCR 阴性对照

1 管，0.5

E

PCR 阳性对照

1 管，0.25

F

裂解珠

1 瓶，17.6 g

第 4 部分
第 3 部分保质期及储存条件请将该试剂盒置于 2–8°C 条件下储存。在该条件下储存的试剂在有效期内均可使用。裂解液与裂解珠混合后
的保质期为 6 个月。

第 5 部分
第 4 部分其他仪器、试剂与耗材仪器■实验室专用拍打式无菌均质器：用于检测样本的混匀处理■

恒温箱：用于微生物增菌■

专用于在无菌 1.5 ml 锥形螺帽管中提取：– 台式离心机（可调至 10000–12000 x g）
– 干式恒温器（可调至 37 ± 2°C 和/或 95-100°C）■细胞破碎器，如 Disruptor Genie (Scientific Industries, Inc.)■

提取专用 Deep Well 板：– 加热振荡混合仪（可维持 37 ± 2°C 和/或 95-100°C 恒温，混合速度至少为 1300 rpm）

■

涡旋振荡器

2 | iQ-Check Listeria spp. Kit

第 5 部分 其他仪器、试剂与耗材

■

磁力搅拌板

■

微量移液枪 (20 µl，200 µl，1000 µl)■

Bio-Rad 实时 PCR 系统，* 例如 CFX96 Touch Deep Well（目录号 3600037）或 CFX Opus Deepwell（目录号 17007991）实时 PCR 系统

■Bio-Rad iQ-Check Prep System：用于全自动 DNA 提取和 PCR 板设置（目录号 3594911）

注意：推荐使用不间断电源 (UPS)、热循环仪和 iQ-Check Prep System。
*

请联系 Bio-Rad 技术支持中心获取推荐仪器的信息。

试剂和耗材
■

培养基：Listeria Special Broth（李斯特氏菌特制肉汤）(LSB)（产品目录号 3555703，225 ml x 6 瓶；
3564703，干粉，500 g，3555793，5 L x 2 袋；3564753，干粉，5 kg）■

培养基：Listeria Special Broth（李斯特氏菌特制肉汤）(LSB II)（产品目录号 12017463，225 ml x
6 瓶；12017388，干粉，500 g；12017378，干粉，5 kg）■

iQ-Check Free DNA Removal Solution（目录号 3594970）■

专用于环境样本：– 采样海绵
– 采样棉签
– 用于海绵和拭子的中和肉汤，例如 Dey-Engley (D/E) 或 HiCap Neutralizing Broth，或 Letheen
Broth

■

专用于管中提取：– 1.5 ml 锥形螺旋盖管，无菌（例如产品目录号 2240110XTU 的产品）■专用于在 Deep Well 板内提取：– 96-well deep well plate（产品目录号 3594900）– Plastic sealing film（产品目录号 3590139）– X-Pierce Sealing Films（产品目录号 3593977）或 Pre-Pierced Plate Sealing Film（产品目录号
3600040，仅限北美地区）■

专用于 Standard II 和 Easy II 提取流程：– iQ-Check Lysis Beads（试剂 F）（产品目录号 3578136）– 200 μl 宽口移液器吸头

■专用于 iQ-Check Prep System：– 60 ml 稀释容器（目录号 3594904）– 移液器滤芯枪头（产品目录号 3594902 或 12014486：50 µl；3594903 或 12014483：1000 µl）– PCR 混合管（产品目录号 12016673，5 ml x 25）

iQ-Check Listeria spp. Kit | 3

第 6 部分 最佳实验结果的安全预防措施及建议■

AL (Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti) 培养基（产品目录号 3563695，90 mm x 20 碟；
3564046，干粉，500 g；3564041，添加剂 1；3564042，添加剂 2■

RAPID'Listeria spp. Agar*（产品目录号 3564744，干粉，500 g；3564745，添加剂 1；3564746，
添加剂 2）■RAPID'L.mono Agar*（产品目录号 3563694，90 mm x 20 个；3555294，190 ml 琼脂加 2 份■添加剂；3564293，干粉，500 g；3564294，Supplement 1；3564746，Supplement 2）■

PCR 板、管子、密封胶带和盖子■适用于 20、200 和 1000 μl 微量移液管的无菌带滤芯移液器枪头

■Combitip 移液器或等效重复移液器的吸头；无菌，独立包装■

1 ml 和 10 ml 移液器■

2 ml 和 5 ml 无菌试管

■

无粉手套

■

蒸馏无菌水

■

漂白剂，5%■DNA AWAY 或 RNase AWAY 等清洁剂*

可用于 AOAC-PTM 验证以外的用途。

第 6 部分
第 5 部分最佳实验结果的安全预防措施及建议■此测试必须由经过专门培训的人员操作■孕妇、儿童、老人和免疫功能受损人群的李斯特菌感染几率和死亡率较高，不建议操作此方法和处理单核

细胞增生李斯特菌。
■

样品和增菌培养物必须作为潜在传染性材料处理，并根据当地法规和规定进行废弃物处理■所有具有潜在传染性的材料在处置前都应进行高压灭菌■

最后的实验结果取决于严格遵守良好实验室规范（例如，EN ISO 7218 标准），尤其是 PCR 操作：■

切勿将实验室设备（移液管、试管等）从一个工作站重复使用到另一个工作站■对于每个系列的扩增反应，始终使用阳性对照及阴性对照– 试剂过期后请勿使用– 使用前涡旋试剂盒中的试剂以确保均匀– 定期验证移液器的准确度和精密度，以及仪器的正常功能– 经常更换手套，尤其是当您怀疑它们被污染时

4 | iQ-Check Listeria spp. Kit

第 6 部分 最佳实验结果的安全预防措施及建议– 使用 5% 的漂白剂和其他去污剂（例如 DNA AWAY）定期清洁工作空间– 使用无粉手套并避免在管帽上留下指纹和墨迹。两者都会干扰数据采集■强烈建议遵守标准 EN ISO 22174:2005（Microbiology of food and animal feeding stuffs —Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens — General
requirements and definitions, 食品和动物饲料微生物学 — 用于检测食源性病原体的聚合酶链反应(PCR) — 一般要求和定义）中描述的一般要求■

iQ-Check Listeria spp. Kit：
– 根据全球化学品统一分类和标签制度 (GHS)，测试试剂盒中的所有物质或混合物均属于分类产品。与酸接触可能会释放有毒气体。如果使用得当，则不需要特别的预防措施。如果产品被吸入，请马上吸入新鲜空气并在出现投诉时咨询医生。眼睛接触产品后，用流水冲洗睁开的眼睛几分钟。如果吞下产
品，请催吐并寻求医疗帮助。

■

iQ-Check Prep System：– iQ-Check Prep System 的不当使用可能会导致身体伤害或仪器损坏。
如果处理不当，某些组件可能会有因过热而造成人身伤害的风险。为安全使用，iQ-Check Prep
System 只能由经过适当培训的合格实验室人员操作。只能由 Bio-Rad 现场服务工程师执行仪器维修■

CFX96 Touch Deep Well 或 CFX Opus Deepwell 实时 PCR 检测系统：– CFX96 Touch Deep Well 系统或 CFX Opus Deepwell 系统使用不当可能会导致人身伤害或仪器损坏。如果处理不当，某些组件可能会有因过热而造成人身伤害的风险。为安全使用，CFX96 Touch
Deep Well 系统或 CFX Opus Deepwell 系统只能由经过适当培训的合格实验室人员操作。只能由
Bio-Rad 现场服务工程师执行仪器维修

■

增菌条件：
– 用户应阅读、理解并遵守 iQ-Check Listeria spp. Kit 说明中的所有安全信息。保留安全说明以备将来
参考。为降低与接触化学品和生物危害相关的风险，请在经过培训的人员控制下，在配备适当的实验室进行病原体检测。始终遵循标准的实验室安全规范，包括在处理试剂和受污染的样品时穿戴适当的防护服和护目镜。扩增后避免接触增菌培养液和试剂管。根据当前行业标准处理增菌样品。
– 李斯特菌属于生物安全 2 级微生物。增菌生物样本具有传播传染病的潜力。遵守所有适用的地方、州/
省和/或国家有关生物废物处置的法规。穿戴合适的防护设备，包括但不限于：防护眼镜、面罩、衣服/实验服和手套。所有工作都应在配备适当安全设备（例如隔离装置）的设施中进行。在处理潜在传染性材料之前，个人应根据适用的法规和公司/机构要求接受培训– 测试完成后，所有可能含有病原体的材料和介质都应按照当前处理污染废弃物的行业标准进行净化（即在 121°C 下高压灭菌 20 min）。有关更多信息和当地处理法规，请参阅安全数据表

iQ-Check Listeria spp. Kit | 5

第 7 部分 操作流程第 7 部分
第 6 部分

操作流程
A.

样本增菌

强烈建议您在阅读完全部操作流程后才开始进行检测。
使用前请将增菌液根据需求放置于适当的孵育温度下（室温或 30°C/37°C）。
强烈建议使用带有过滤功能的增菌袋。
在 NF 验证范围内，尚未对重量超过 25 g 的样本进行过测试。按照下表所示的时间和温度进行培养，无需晃动。也可以对增菌后在 2–8°C 条件下存放长达 72 hr 的 LSB 进行 iQ-Check 检测。
下表概述了可供使用的不同方案，具体取决于应用和验证范围：

NF 验证 BRD 7/13-05/07
范围（食品基质）
所有食物产品和环境

增菌/DNA 提取样本制备
在 9 x n ml LSB 中均匀混合 n g 食品

Standard II 提取
在 30±1°C 下培养 22 - 24



样本 1

hr

管



Easy II 提取
在 30±1°C 下培养 24 - 26hr

管/Deep Well生产环境和表面2

将 n g 食物放入 9 x n ml 预热的 LSB 增菌液或室温的 LSB II 增菌液中

Easy II 提取 (LSB)均质化

在 30±1°C 下培养 18 –



26 hr
管/Deep Well

Easy II 提取 (LSB II)


合成食物

2

在 9 x n ml LSB II 肉汤中 中均匀混合 n g 食品

Easy II 提取 (LSB II)



乳制品 2

在 9 x n ml 预热的 LSB II 肉汤中 中均匀混合 n g 食品

范围（食品基质）2,3

6 | iQ-Check Listeria spp. Kit样本制备

在 37±1°C 下培养 18 –26 hr
Deep Well

Easy II 提取 (LSB II)AOAC PTM 090701

在 37±1°C 下培养 18 –26 hr
管/Deep Well



在 37±1°C 下培养 20 –28 hr
Deep Well
增菌/DNA 提取第 7 部分 操作流程肝酱饼、热狗、原料

在 9 x n ml LSB 或 LSB II 中均匀混合 n g 食品（225 ml 中混合 25 g；发酵香肠、熟食火鸡

1125 ml 中混合 125 g）

肉片、熟食火腿片、天然奶酪 (125 g)

Easy II 提取 (LSB)

在 30±1°C 下培养 24 - 26hr

管/Deep Well

Easy II 提取 (LSB II)

在 37±1°C 下培养 18 - 24hr

管/Deep Well

iQ-Check Listeria spp. Kit | 7

第 7 部分 操作流程境表面

Easy II 提取 (LSB)环境样本（不锈钢、塑料、陶

用不含芳基磺酸盐复合物的中和肉汤润湿棉签和海绵瓷、密封混凝土）对于用棉签分析的表面，取样面积为 1 x 1 英寸 (2.54 x 2.54 cm)对于用棉签分析的表面，取样面积为 4 x 4 英寸 (10.16 x 10.16cm)

加入足够 LSB 或 LSB II 覆盖拭子 (10 ml) 或海绵 (60-225 ml)

在 30±1°C 下培养 18 - 24hr

管/Deep Well

Easy II 提取 (LSB II)

在 37±1°C 下培养 16 - 24hr

管/Deep Well

有关加拿大卫生部批准的基质和方案，请参考 MFLP-39
1

验证中需使用“Lis spp Fast” Application Protocol File，以缩短 PCR 扩增时间。可联系您的 Bio-Rad 销售代表获取更多信息。

2

验证时也需用到 iQ-Check Free DNA Removal Solution 和“Lis spp Fast”Application Protocol File 以缩短 PCR 扩增时间。可联系您的

Bio-Rad 销售代表获取更多信息。
3

验证包括直接划线至 RAPID'L. mono、RAPID'Listeria spp.，或琼脂李斯特菌培养皿（不包括天然奶酪）B.

去除游离 DNA 处理iQ-Check Free DNA Removal Solution 是去除游离 DNA 的最佳选择。使用过程中请遵守 Bio-Rad 用户指南（文件编号 10000058391）中的建议。
该操作流程已通过以下验证：■AFNOR Certification 针对生产环境样本类别的验证■

AOAC 研究机构针对 AOAC-PTM 验证证书所在系列培养基的验证C.

DNA 提取以下是我们的建议：1.

检测开始前，预热恒温器或加热振荡混合仪。将其设置为 95–100°C。移液时将裂解液置于磁力搅拌板上以中等速度搅拌，使其保持悬浮状态。

2.

避免晃动增菌袋和采集大块食品碎屑。若食品样本中含有脂肪上清液，只需收集脂肪层以下的样本。

3.

小心打开离心管和孔板，避免交叉污染。

4.

在直接移液到预穿孔密封膜前，冷却 Deep Well 板。

5.

使用磁力搅拌棒使裂解剂保持悬浮状态。以中等速度搅拌时进行移液。

6.

使用裂解液时，首先用手轻轻晃动裂解液。然后，瓶中磁力搅拌棒以中速搅拌液体时移液，使液体保持呈
悬浮状态。

7.

按照以下步骤重组最终裂解液：a.

小心将 F 试剂（裂解珠）中的所有内含物倒入 A 试剂（裂解液）中。

b.

使用带有足够宽吸头的耗材，以便对均质后的裂解液进行移液。

c.

裂解液与裂解珠混合后（试剂 A + F）在 4℃ 条件下保存可有 6 个月保质期。

8 | iQ-Check Listeria spp. Kit

第 7 部分 操作流程Standard II 流程1.

将 1.5 ml 倒出的增菌样本收集到试管中。

2.

以 10000–12000 x g 的标准对试管进行离心操作 5 min。弃置上层清液。

3.

向试剂丸中加入 250 μl 均质后的裂解液（试剂 A + F），对试剂进行上下移液，使试剂丸重新悬浮。
盖上试管盖。

注意：首先用手轻轻晃动裂解剂，使珠子悬浮。
4.

将试管置于热振动器或细胞破碎器中 3±1 min。

5.

在 95–100°C 的适当恒温器中培养 15–20 min。

6.

以较高的速度对试管进行涡流操作，并以 10000–12000 x g 的标准离心操作 5 min。

如需暂时停止检测，推荐在此步骤暂停。
上清液可在 -20°C 条件下保存长达 1 年。再次使用前，将其解冻、混匀，然后离心 10000–12000 x g 5min。

Easy II 流程1.

向试管或 Deep Well 板中加入 100 μl 均质后的裂解液（试剂 A + F）。

注意：首先用手轻轻晃动裂解剂，使珠子悬浮。
2.

加入 100 μl 增菌后的样品。

注意：晃动悬浮液使培养物混匀，然后等碎片沉淀后再采集样本。
3.

用移液枪上下吹打溶液，直至安全混合均匀。

4.

盖上离心管盖，或用预穿孔密封膜将 Deep Well 板密封。

5.

将试管置于热振动器或细胞破碎器中 3±1 min。将试管放在加热块中于 95–100°C 下孵育 15–20 分钟。

6.

如果使用试管或深孔板形式的搅拌培养箱，请先将试管或深孔板放在搅拌培养箱中以 1,300 至 1,600
rpm,95–100°C 孵育 15–20 分钟。

7.

以较高的速度对试管进行涡流操作，然后以 10000-12000 x g 的标准离心操作至少 2 min。

Deep Well 板不需要进行离心。
如需暂时停止检测，推荐在此步骤暂停。
上清液可在 -20°C 条件下保存长达 1 年。再次使用前，将其解冻、混匀，然后离心 10000–12000 x g 5
min。

D.

实时荧光定量 PCR仪器和软件设置
请参阅 iQ-Check Kits 的实时荧光定量 PCR 系统用户指南中的说明进行仪器和软件设置。

iQ-Check Listeria spp. Kit | 9

第 7 部分 操作流程PCR 混合物的准备制备 PCR 混合物需用到扩增液（C 试剂）和荧光探针（B 试剂）。所需 PCR 混合物的体积取决于待分

1.

析的样本和对照的数目。每次运行的 PCR 中必须至少包含阳性对照和阴性对照各一个。利用“附录 —PCR 混合物计算指南”中的移液概览表，即可确定每种试剂的所需体积。
注意：PCR 混合物（B 试剂 + C 试剂）准备完后，应立即使用。在 2–8°C 条件下最多可稳定保存 1 hr。
2.

根据您的实验设计方案，向每孔中加入 45 μl PCR 混合物。

3.

加入 5 μl DNA 提取物，或试剂 D（阴性对照）或试剂 E（阳性对照）。移液前不要涡旋振荡样品。将PCR 板或联管上的孔密封。请小心移液，避免孔底部产生气泡。可选步骤：对密封后的 PCR 板或联管进行离心操作（快速旋转），以消除气泡。
将 PCR 板或联管放入热循环仪中。确保正确放置板，即 A1 孔位于左上角。最后关上 PCR 仪器盖。

4.

运行 PCR
要开始运行 PCR，请参阅 iQ-Check Kits 的实时荧光定量 PCR 系统用户指南中的说明。“Lis spp Fast”
Application Protocol File 已通过 NF 和 AOAC 验证。

数据分析

E.

可在 PCR 运行结束后直接进行数据分析，或稍后打开存储的数据文件进行分析。请参阅 CFX Manager IDE软件用户手册中的说明，来打开数据文件并设置数据分析参数。

结果解释
设置数据分析参数后，可通过分析每个样本的量化周期 (Cq) 值（扩增曲线与阈值相交的循环）来解读检测结果。
CFX Manager IDE 软件可对 Bio-Rad 实时荧光定量 PCR 检测系统进行完整的自动化分析。在发布结果之前，应验证扩增曲线的典型特征。 如果需要额外支持，请联系您的 Bio-Rad 技术支持团队。
对照
在解释样本结果之前，需核实阳性和阴性对照。
对照必须获得下表所示结果，才能表示实验有效。否则必须重新进行 PCR 反应。
李斯特菌属检测

内部对照检测

（FAM 通道）（HEX 通道）

阴性对照

Cq = N/A*

28 ≤ Cq ≤ 40

阳性对照26 ≤ Cq ≤ 36

N/A

对照

*

当样本的荧光信号并未显著高于背景干扰，并因此没有跨越阈值时，软件会显示 Cq 值为 N/A（不适用）。

如果阴性和阳性对照的结果与对照表中的结果不同（无效对照），则重复第 7 部分“操作流程”中的“D. 实时
PCR”和“E. 数据分析”中描述的操作和分析。

10 | iQ-Check Listeria spp. Kit

第 8 部分 阳性结果的确认样本阳性 iQ-Check Listeria spp. PCR 检测必须显示典型的扩增曲线，并且 FAM 荧光团的 Cq 值 ≥ 10。
■

如果两个通道的 Cq 值均小于 10，请核实原始数据曲线是否是正常的扩增曲线（具有平坦的基线，
随后荧光发射呈指数快速增加，最后趋于平坦）。如果曲线正常，则可视为李斯特菌属阳性检测。

如果没有 FAM Cq 值 （Cq = N/A），或曲线不是典型扩增曲线，则必须分析该样本的内部质控：■如果无 FAM Cq 值但内部对照 Cq 值 ≥ 28，则可将样本视为阴性李斯特菌属样本。

■

如果内部对照也无 Cq 值 （Cq = N/A），说明 PCR 反应未正常进行。需将样本进行稀释（将 10 μl DNA 提取物用无菌蒸馏水 1:10 稀释后，取 5 μl 稀释液进行检测）并重新进行 PCR。

■

如果内部对照 Cq 值 <28，则无法解释结果。需核实阈值是否设置正确，或原始数据曲线是否为正常扩增曲线。如果曲线不具有典型形状，则需重新进行 PCR 检测。

检测结果解释如下表所示。
李斯特菌属检测

内部对照检测

结果解释

(FAM)

(HEX)

Cq ≥ 10N/A阳性Cq = N/A

Cq ≥ 28

阴性Cq = N/A

Cq = N/A培养*

当目标检测和内部对照检测均为 Cq 值 = N/A 时，必须将 DNA 提取物按 1:10 稀释并再次进行检测。

当不满足验证标准时，可视为无效结果。如果样本的反应被抑制，需检查原始数据并重新进行检测。

第 8 部分
第 7 部分

阳性结果的确认
在 NF 验证认证方法的情况下，所有 iQ-Check 阳性检测结果必须通过下列方法证实：1.

使用 CEN 或 ISO 标准化方法中描述的经典检测方法从样本开始进行证实。

2.

对在 RAPID'Listeria spp. 或 RAPID'L.mono 显色培养基中增菌后的 LSB 或 LSB II 进行分离（划线分离
100 μl），并在 37 ± 1°C 条件下培养 24 hr。出现特有的李斯特菌属菌落，足以证实李斯特菌属的存在。

3.

对在 AL 或 PALCAM 平板中增菌后的 LSB 或 LSB II 进行分离（划线分离 10 μl），并在 37 ± 1°C 条件
下培养24-48 hr。典型菌落应当通过 ISO 方法中描述的检测方法进行证实。

4.

使用经 NF 验证认证的不同于 iQ-Check Listeria spp. PCR 检测原理的其他方法。必须完全遵循第二种方法的验证方案。

iQ-Check Listeria spp. Kit | 11

第 9 部分 使用 iQ-Check Kit 确认单菌落

如果 iQ-Check Listeria spp. Kit 和上面列出的任何确认选项之间的结果不一致，则遵循必要的步骤以确保有效的结果。
在进行确认之前，在 30°C 条件下培养之后，增菌后的 LSB 或 LSB II 可以在 2–8°C 条件下最多存放 72 hr。
如果是 AOAC 验证，iQ-Check 李斯特菌属阳性结果应视为假定阳性，并建议按照适当的参考方法（例如USDA MLG、FDA BAM、ISO、MFHPB 等方法）进行确认。或者，对于选择培养基，将 10 μl 增菌后的
LSB 或 LSB II 直接划线到 RAPID'L. mono、RAPID'Listeria spp.，或琼脂李斯特菌显色平板上，并在 37 ±1°C 条件下培养 24 hr。特有的李斯特菌属菌落的存在应通过生化方法来证实李斯特菌属是否存在。

第 9 部分
第 8 部分

使用 iQ-Check Kit 确认单菌落
iQ-Check Listeria spp. Kit 也可用于确认平板培养基上的李斯特菌属菌落。该方法已获得 AFNOR 对RAPID'L.mono 和 RAPID'Listeria spp. 显色培养基的正式确认。
1.

用牙签、无菌环或其他合适耗材（如移液枪枪头）从选择性或非选择性琼脂培养基上挑取一个单菌落。

2.

用 100 μl 胰蛋白胨盐或无菌蒸馏水在微量离心管中重悬菌落， 并使用涡旋振荡器混匀。

取 5 μl 悬浮液，加入 45 μl PCR 混合物（请参见第 7 部分“操作流程”中的 D.“实时荧光定量 PCR”），
参照 iQ-Check Listeria spp. 操作流程进行后续操作，获取数据并进行结果分析。

第 10 部分
第 9 部分测试性能和验证
iQ-Check Listeria spp. Kit 仅适用于李斯特菌属。
NF 验证iQ-Check Listeria spp. Kit 已通过 NF 验证认证，作为参考方法 ISO 11290-1:2017 的 替代
方法，用于所有人类消费产品和环境样本中李斯特菌属的检测。验证遵循 ISO 16140BRD 07/13-05/07

2:2016 中的操作流程，并且使用了 CFX96 Touch Deep Well 和 CFX Opus Deepwell 实时农业企业的替代分析方法 PCR 系统。iQ-Check Free DNA Removal Solution 的使用针对生产环境样本进行了验证,
http://nfvalidation.afnor.org

合成食物, 乳制品。相关软件是 CFX Manager IDE 软件（版本 2.2 及更高版本）。“Lis
spp Fast”Application Protocol File 已通过验证。证书编号：BRD 07/13-05/07。有效期至：请参见 AFNOR 认证网站上提供的证书。

12 | iQ-Check Listeria spp. Kit

第 11 部分 参考资料 e

AOAC 验证
iQ-Check Listeria spp. Kit（Easy 流程以及 Easy 流程加可选的游离 DNA 去除流程）已由
AOAC 研究所根据性能测试法程序进行了验证，用于不锈钢、塑料、陶瓷、密封混凝土、肝酱饼、热狗、原料发酵香肠、熟食火鸡肉片、熟食火腿片和天然奶酪 (125 g) 中李斯特

菌属的检测。iQ-Check 阳性检测结果应视为推定结果，建议按照第 8 部分中的建议进行确认。LSB、LSB II、“List spp Fast” APF、iQ-Check Free DNA Removal Solution 的使用
以及 CFX96 Touch Deep Well 和 CFX Opus Deepwell 实时 PCR 系统的使用针对所有样本进行了验证。相关软件是 CFX Manager IDE 软件（版本 2.2 及更高版本）。
证书编号：090701.
加拿大卫生部验证
iQ-Check Listeria spp. Kit（Easy 流程）已通过加拿大卫生部 (MFLP-39) 验证，作为所有环境表面及热加工即食肉类和禽类中李斯特菌属的检测方法。iQ-Check 阳性检测结果应视为推定结果，必须按照 MFHPB-30（请参见第 11 部分）进行确认。

第 11 部分
第 10 部分

参考资料 eAOAC Official Method 993.12-1996(1999). Listeria monocytogenes in milk and dairy products. Selectiveenrichment and isolation method.
Health Canada (2011). Health Products and Food Branch. MFHPB-30. Isolation of Listeria monocytogenes
and other Listeria spp. from foods and environmental samples. The Compendium of Analytical Methods,
Volume 2, February 2011.
ISO 7218:2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance formicrobiological examinations.
ISO 11290-1:2017. Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of
Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 1: Detection method.
ISO 16140-2:2016. Microbiology of the food chain — Method validation — Part 2: Protocol for the validationof alternative (proprietary) methods against a reference method.
ISO 22174:2005. Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for thedetection of food-borne pathogens — General requirements and definitions.
United States Department of Agriculture, Food Safety and Inspection Service (2021). Microbiology
Laboratory Guidebook. Chapter 8.13: Isolation and identification of Listeria monocytogenes from red meat,
poultry, ready-to-eat Siluriformes (fish) and egg products, and environmental samples.
https://www.fsis.usda.gov/sites/default/files/media_file/2021-09/MLG-8.13.pdf, accessed February 14, 2020.
United States Food and Drug Administration (2017). Bacteriological Analytical Manual. Chapter 10: Detectionof Listeria monocytogenes in foods and environmental samples, and enumeration of Listeria monocytogenes
in foods. https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-10-detection-listeriamonocytogenes-foods-and-environmental-samples-and-enumeration, accessed February 14, 2020.

iQ-Check Listeria spp. Kit | 13

第 12 部分 修订记录第 12 部分
第 11 部分

修订记录
发布日期

文件编号

变更

2023 年 10 月

10000167777 Ver A-

文件编号变更 – 之前版本 10000123536 Ver C
iQ-Check Listeria spp. 用户指南-

AFNOR 扩展：LSB II 增菌液适用于合成食物,环
境生产样品及乳制品

14 | iQ-Check Listeria spp. Kit

附录 — PCR 混合物计算指南附录 — PCR 混合物计算指南
添加待分析的样本和对照总数并在表中找到相应 B 试剂和 C 试剂的体积，即可确定准备 PCR 混合物所需的正确体积。
样本和对照物总数

探针试剂
B, µl

扩增混合液试剂 样本和对照物总数C, µl

探针试剂 B,

扩增混合液试

µl剂 C, µl数样本和对照物总 探针试剂 B, 扩增混合液试剂
µl

C, µl

1

5

40

33

178

1400

65

351

2800

2

11

86

34

184

1500

66

356

2900

3

16

130

35

189

1500

67

362

2900
2900

4

22

173

36

194

1600

68

367

5

27

216

37

200

1600

69

373

3000

6

32

259

38

205

1600

70

378

3000

7

38

302

39

211

1700

71

383

3100

8

43

346

40

216

1700

72

389

3100

9

49

389

41

221

1800

73

394

3200
3200

10

54

432

42

227

1800

74

400

11

59

475

43

232

1900

75

405

3200

12

65

518

44

238

1900

76

410

3300

13

70

562

45

243

1900

77

416

3300

14

76

605

46

248

2000

78

421

3400

15

81

648

47

254

2000

79

427

3400
3500

16

86

691

48

259

2100

80

432

17

92

734

49

265

2100

81

437

3500

18

97

778

50

270

2200

82

443

3500

19

103

821

51

275

2200

83

448

3600

20

108

864

52

281

2200

84

454

3600

21

113

907

53

286

2300

85

459

3700
3700

22

119

950

54

292

2300

86

464

23

124

994

55

297

2400

87

470

3800

24

130

1000

56

302

2400

88

475

3800

25

135

1100

57

308

2500

89

481

3800

26

140

1100

58

313

2500

90

486

3900

27

146

1200

59

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