プロテインアッセイ

プロテインアッセイシリーズ（プロテインアッセイ、Quick Start プロテインアッセイ、DC プロテインアッセ
イ、RC DC プロテインアッセイ）
Frequently Asked Questions
FAQ リスト
このリストには、バイオ・ラッド製品に関するよくあるお問い合わせを掲載しております。ここに掲載している製品は研究用途として販売しており、医療・診断目的でのご使用はできません。
#Question

Answer1[プロテインアッセイ 全般] Bradford 法とLowry 法の使い分けは、どのようにしたら良いですか。

サンプルが含まれるバッファー組成に応じて選択します。
Bradforad 法（プロテインアッセイ、Quick Start プロテインアッセイ）は、サンプル溶液中に糖類、ジチオスレイトール(DTT)、β-メルカプトエタノールなどの還元剤が含まれている場合に使用します。
高濃度の界面活性剤やアルカリ試薬が含まれている場合は使用できません。
Lowry 法（DC プロテインアッセイ、RC DC プロテインアッセイ）は、サンプル溶液中に界面活性剤やアルカリ試薬が含まれている場合に使用します。
高濃度の糖類のような還元能のある試薬、ジチオスレイトール(DTT)、β-メルカプトエタノールなどの還元剤が含まれる場合は使用できません。
より詳細な共存試薬リストは、マニュアル内に紹介があります。
また、Bradford 法ではタンパク質の種類によって発色量が大きく変わりますが、Lowry 法ではタンパク質の種類による発色量の違いは少ないことも特徴です。

2[プロテインアッセイ 全般] Bradford 法の原 CBB G-250 の特徴を利用したタンパク質定量方法です。
理はどのようなものですか。
酸性条件下で赤色を呈する CBB G-250 が、タンパク質と結合すると水素イオンが奪われ陰イオン性の青色に呈色反応します。
吸収波長のピークは、465nm から 595nm へと移動します。
CBB G-250 は、主に塩基性アミノ酸（アルギニンなど）に結合すると言われています。
この原理を応用して、595nm での吸光度を測定してタンパク質定量を行います。

3[プロテインアッセイ 全般] Lowry 法の原理 タンパク質溶液をアルカリ性条件下で Cu2+と反応させ、その反応物を Folin 試薬を加えるはどのようなものですか。と、Cu+によってリンモリブデン酸-タングステン酸コンプレックスが還元され青色を呈色します。
発色は、ペプチド結合およびチロシン、トリプトファン、シスチン、システイン、ヒスチジンなどのアミノ酸により起こります。
タンパク質は Folin 試薬の還元を受けて 1、2 または 3 個の酸素原子を喪失し、それによって 750nm で最高、405nm で最低の吸光度を示す特徴的な青色を呈する還元物質が生成されます。

#Question

Answer4[プロテインアッセイ 全般] 同じ Bradford 法 プロテインアッセイと Quick Start プロテインアッセイでは、使用方法と共存許容試薬の濃度でもプロテインアッセイと Quick Start プロテ が異なります。
インアッセイと２種類ありますが、違いはなんですか。
使用方法は、プロテインアッセイは、スタンダードアッセイ法の場合、染色液を５倍希釈し、ろ過して使用します。
Quick Start プロテインアッセイは、染色液を希釈する必要がありません。
共存許容試薬濃度は、プロテインアッセイに比べて Quick Start プロテインアッセイの方が共存可能な試薬の種類が増え、濃度も高くなっているもの（CHAPS や CHAPSO など）が多くありますが、SDS やTris などは許容濃度が低くなっているものもあります。
詳しくは、各製品のマニュアルでご確認ください。

5[プロテインアッセイ 全般] 同じ Lowry 法で 一般的な Lowry 法は、DC プロテインアッセイです。
も DC プロテインアッセイと RC DC プロテインアッセイと２種類ありますが、違いはなん RC DC プロテインアッセイは、RC 試薬（RC I、RC II）でタンパク質を沈殿させ、その後 DCですか。
プロテインアッセイで測定します。
したがって、界面活性剤や還元剤のどちらにもコンパチブルです。
DC プロテインアッセイを持っている場合は、5000119 RC 試薬セット（RC I 試薬、RC II 試薬）を追加で購入すれば、RC DC プロテインアッセイキットとして使用することができます。

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ただし RC DC プロテインアッセイは、遠心操作を含むため、マイクロプレートでの反応には適していません。
[プロテインスタンダード] タンパク質定量用 ・Bradford 法の場合
スタンダードとして、ウシガンマグロブリンと ウシ血清アルブミンは、ウシガンマグロブリンなど他のタンパク質に比べて発色が強くなりまウシ血清アルブミンのどちらを選べばよいで す。したがって、広範囲のタンパク質の測定にはウシガンマグロブリンの使用をお勧めしますか。
す。また、アルブミン濃度の高いサンプルにはウシ血清アルブミンの使用をお勧めします。
・Lowry 法の場合
ウシ血清アルブミンとウシガンマグロブリンの発色量がほぼ同じになります。どちらを利用しても問題ありません。
いずれの方法においても、スタンダードに選んだタンパク質に換算しての濃度計算になります。なお同じ種類のサンプルを定量する場合は、常に同じスタンダードを使用することが大切です。

789[プロテインスタンダード] 粉末をボトルから秤量して溶解しましたが、濃度の計算値と実測値が一致しません。

プロテインスタンダードの粉末にはバッファー成分が含まれます。秤量してもタンパク質の質量にはなりません。

プロテインスタンダードは 20ml で溶解した時の濃度が 1.40±0.20mg/ml になるように製造されています。ボトルから粉末を分取せず、ボトルに規定量の水を加えて調製するようにしてください。
[DC プロテインアッセイ(Lowry 法)] A 試薬の DC プロテインアッセイの A 試薬が古くなると黒い沈殿物が見られます。
中に黒い沈殿物が見えます。使用すること 試薬に含まれる銅イオンが原因です。
はできますか。
買い換えをお勧めします。
[プロテインアッセイ (Bradford 法)] 共存許
容試薬にリストアップされていないバッファー中に溶解したサンプルの定量を行いたいのですが、そのバッファー成分が測定を妨害するかどうかわかりますか。

以下の方法で検量線を作成して判断します。
1) スタンダードタンパク質を、サンプルを溶解しているバッファーで溶解します。
2) 溶解したスタンダードで希釈系列を作成します。
3) 実際に測定し検量線を作成します。
4) そこで直線性が得られればそのバッファー組成で使用可能です。
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#QuestionAnswer

10[RC DC プロテインアッセイ(Lowry 法)] マイ マイクロプレートによる測定は可能ですが、操作に遠心作業が含まれたり、ピペット誤差なクロプレートを用いた測定を行うことはでき どが生じやすいためお勧めはいたしません。
ますか。
それでもマイクロプレートで反応を行いたい場合は 15,000xg, 3-5 分で遠心分離できるプレート用遠心機が必要です。
遠心機が無い場合には、チューブで反応させて遠心後の上清をマイクロプレートに分取し測定することが可能です。
1) DC reagent S 5uL を DC Reagent A 250uL に加えます。
2) 0.2mg/mL ～1.5mg/mL のタンパク質スタンダードを供与します。
3) マイクロプレート（プレート用遠心機がない場合はマイクロチューブ）に試料 25uL もしくはタンパク質スタンダードを入れます。
4) RC Reagent I 125uL を 3)のチューブに入れます。
5) 懸濁後、室温で 10 分間保温します。
6) さらに RC Reagent II 125uL を加え、15000×g で 3～5 分間遠心します。
7) 上清を完全に取り除きます。
8) 1)で調製した試薬 25uL を加え、沈殿物を溶解し、96 Well plate に移します。
9) Reagent B 200uL を各 Well に加え、ピペッティングをして混ぜます。
10) 室温で 15 分間静置後、750nm で測定します。(1 時間以内に測定すること)

11[Quick Start プロテインアッセイ(Bradford法)] プロテインアッセイ染色液 (Bradford法)との違いは何ですか。

使用方法に関して
プロテインアッセイは、スタンダードアッセイ法の場合、染色液を５倍希釈し、ろ過して使用します。
Quick Start プロテインアッセイは、染色液を希釈する必要がありません。
共存許容試薬濃度に関して
プロテインアッセイに比べて Quick Start プロテインアッセイの方が共存可能な試薬の種類が増え、濃度も高くなっているもの（CHAPS や CHAPSO など）が多くありますが、SDS やTris などは許容濃度が低くなっているものもあります。

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