― 11 ―養魚場における冷水病菌の定量

静岡水技研研報（55）：11-16, 2022
Bull. Shizuoka Pref. Res. Inst. Fish. Oc.(55): 11-16, 2022

ニジマス養魚場の飼育水中における細菌性冷水病原因菌の定量的モニタリング
中村永介*1
ニジマス養魚場で発生する細菌性冷水病の対策のため，養魚場の飼育水中における原因病原体の増減のモニタリングを目的とした。本研究ではその基礎実験として，湧水，地下水及び河川水を用水とする3 ヶ所のニジマス養魚場をモデルとし，年間を通して定量的リアルタイムPCRによる飼育水中の冷水病原因菌の定量を試みた。既知菌濃度の冷水病原因菌懸濁液を作製し，菌数とqPCRのサイクル数との相関から作成した検量線を用いることで，飼育水の菌濃度の推定が可能であり，簡易的な定量法としてモニタリングに有効であった。また，推定された養魚場の飼育水の菌濃度は平均105 ～ 106 CFU/Lであり，周年検出されたことから，冷水病原因菌の養魚場中での常在が明らかとなった。

キーワード：細菌性冷水病，定量的リアルタイム PCR，環境 DNA，ニジマス養殖，飼育水Flavobacterium psychrophilum(以下冷水病原因菌といことが可能となる。qPCRと環境DNAによる生物検出法6)をう)を原因菌とする細菌性冷水病は，1940年代に北米の組み合わせることで，天然河川における環境水中の冷1)

サケマス孵化場において初めて報告された 。日本で

水病原因菌を定量する7)など，病原体のモニタリングには1987年に養殖アユから本菌が分離されたのち2)，1990も適している。養魚場で感染症が発生した場合には，

3)

年にはギンザケ稚魚からも確認されている 。冷水病

感染した魚体から病原体が排出され，飼育水中には通原因菌はグラム陰性好気性長桿菌で，血清型により大常よりも高濃度の病原体が存在しているため，飼育水中きく3タイプに分けられ，O-1型はギンザケ由来, O-3型における病原体の増減をモニタリングすることで，疾病はニジマス由来に集中し，O-2型はアユ由来のみと報告

発生の動向を捉えることが可能となると考えられる。ブ

＊2されている 。症状は魚種や成長段階によって異なる

リ類養殖においては，魚病の早期発見を目的として環境が，ニジマスでは鰓や肝臓，腎臓の貧血が観察され，DNAからの病原体遺伝子の検出の試みがなされている8)。

体側や尾部に穴あき様の潰瘍を示す場合がある4)。現

本研究ではその基礎実験としてニジマス養魚場を調査

在では全国各地で発生していて，内水面におけるサケ場所とし，qPCRを用いた飼育水中における冷水病原因

科魚類における診断件数では，IHNと並び多くの割合菌の定量とモニタリングを試みた。

5)

被害額も大きいため問題となっている。
を占めており ，対処法としては，抗生物質(水産用医薬品)の投与が有材料及び方法効である。魚病被害の低減には早期の発見と対策が重要であるが，発生初期の兆候を捉えることは難しい。

供試水

定量的リアルタイムPCR(以下qPCRとする)は，PCRに湧水，汲み上げた地下水，湧水を水源とする河川水をよって増幅したDNAの蛍光強度を経時的に測定すること用水としている富士宮市内の3 ヶ所のニジマス養魚場(A，で，サンプル中に含まれる標的DNAを精度良く定量する

B，C)を調査場所とし，用水と飼育水を検体とした。A養2022年2月7日受理
静岡県水産・海洋技術研究所富士養鱒場業績第54号＊1

静岡県水産・海洋技術研究所富士養鱒場＊2

アユ冷水病対策協議会とりまとめ

http://www.maff.go.jp/j/syouan/suisan/suisan_yobo/ayu_reisui/pdf/matome_2008.pdf

― 12 ―

中村永介

魚場の用水は採水せず，B養魚場とC養魚場は取水口かqPCRら採水した。飼育水は各養魚場の最下流に位置する飼qPCRにはPPIC遺伝子領域をターゲットとしたプライ育池の排水部から採水した。採水した検体はチャックマーセットを用いた(表1)9)。検量線の作成にはPCR産物付ポリ袋に入れ，氷冷して実験室に持ち帰った。採水を 用 い た。PCR反 応 液 の 組 成 は，2x Go Taq Masterは上記の5箇所において，2020年1月から2021年4月にMix(Promega)10μL，各プライマー溶液(終濃度200nM)，かけて毎月1回の計16回行い，採水時に飼育水の水温DNA溶 液1μL，滅菌蒸留水で20μLとし，反応条件は，を測定した。

95℃ 10秒間の熱変性後，2ステップサイクル(95℃ 5秒間，60℃ 30秒間)を35サイクル行った。増副産物はMagNA10)

DNA抽出で精製したのち，QuantusTM Fluorometer(Promega)によ

用 水 及 び 飼 育 水 は，1LをGF/F GLASS MICROFIBERりDNA濃度を測定した。DNA濃度と分子量及びアボガド

FILTERS 47mm(cytiva)で吸引濾過したのち，フィルロ定数からコピー数を算出し，10倍の段階で8段階に希ター付着物からDNAを抽出した。DNAの抽出にはDNeasy

釈したものを既知コピー数PPIC遺伝子DNA溶液(以下STD

Blood and Tissue Kit (QIAGEN)を 使 用 し， 付 属 のとする：3.72×100 ～ 3.72×107 copies/μL)とした。
qPCRは以下のとおり実施した。反応液の組成は，2xBuffer AE 100μLに溶出したものをDNA試料とした。

TB Green Ex Taq Master Mix(Takara)5μL，各プライマーコントロール(既知菌数の水抽出DNA溶液)の作製

溶液(終濃度200nM)，DNA溶液1μL，滅菌蒸留水で10μLと用水及び飼育水中の冷水病原因菌数を定量するため，した。qPCRの反応条件はPCRと同様とした。反応は96ウェ

A養魚場で分離された冷水病原因菌を用いて，既知菌数ルプレートで行い，用水及び飼育水から抽出したDNAのの水から抽出したDNA溶液(以下W.STDとする)を作製した。

他，STD及びW.STDを1サンプルにつき2ウェルにアプライ改変サイトファーガ寒天平板培地で16℃，72時間培養しした。qPCR反応はLightCyclerⓇ96 system(Roche)で行い，た概ね対数増殖期にあたる冷水病原因菌を集菌して蒸留解析はLightCyclerⓇ96 Application software(Roche)の水に懸濁し，10倍の段階で希釈した冷水病原因菌懸濁液

絶対定量解析法により実施した。

を8段階作製した。100μLを改変サイトファーガ寒天平板
結果

培 地 に 塗 抹 し て 単 位 水 量 あ た りの 生 菌 数(ColonyForming Unit，以下CFUとする)を求めた。用水及び飼育水と同法でDNAを抽出し， W.STD(4.50×101 ～ 4.50×108

水温採水場所別の水温を図1に示した。湧水を用いるA養CFU/L)を作製した。

表1 プライマー
表1 プライマー
PrimerSequence (5'-3')PPIC-Q-F CCTTCGATGTAGTTTCTGTGCCATA
PPIC-Q-R TTCTAATTCACGAGATTCGTCTGCT

Product sizeAccession No.

131

AB254195

161412水温（℃）

1086A養魚場

4B養魚場

2C養魚場

2020年
採水月
図1

図1 採水場所別の水温変化

採水場所別の水温変化

4月

3月

2月

1月

12月

11月

10月

9月

8月

7月

6月

5月

4月

3月

2月

1月

0
2021年

― 13 ―

養魚場における冷水病菌の定量

魚場の水温は8.6 ～ 11.7℃と低く，地下水を用いるB

qPCRによる養魚場における冷水病原因菌数の推定

養 魚 場 と 河 川 水 を 用 い るC養 魚 場 の 水 温 は13.2 ～qPCRにより推定した月別の養魚場における冷水病原14.8℃であった。いずれも年間を通してほぼ安定して因菌数を図3に示した。用水では，地下水のB養魚場でいた。

は周年検出限界以下であった。一方，河川水のC養魚場では毎回103 CFU/L以上検出され，高い値を示した

qPCRによる増幅効率と定量性の検討
1

2020年1 ～ 3月及び2021年1月には同養魚場の飼育水と7

STDは3.72×10 ～ 3.72×10 copies/μLの 範 囲 で同程度の約106 CFU/Lであった。飼育水では，2020年1

傾きが-3.5551，Y切片が38.28，相関係数R2値が0.98～ 4月は全ての養魚場で106 CFU/Lを超え，A養魚場でと な る 検 量 線 が 得 ら れ，PPIC遺 伝 子 の コ ピ ー 数 とは1月に，B養魚場とC養魚場では4月に最高値となった。

qPCRのサイクル数との間に強い負の相関が認められその後はA養魚場とB養魚場では7月にも高い数値を示た。

したが，8 ～ 12月にかけて低くなり，最低値となった

qPCRのサイクル数とW.STDとの相関関係を図2に示し10月には全ての養魚場で105 CFU/Lを下回った。期間た。 生 菌 数yと サ イ ク ル 数ctと の 回 帰 式 はy=9.12×

中に検出限界以下となったのはB養魚場における12月

14 -0.7758ct，R2値は0.96となり強い負の相関が認めらの1回のみであった。期間中の平均値は，A養魚場4.232れた。なお，生菌数が4.50×10 CFU/L以下では蛍光×106 CFU/L，B養魚場1.23×106 CFU/L，C養魚場9.55を検出できない場合があったため，検出限界として以×105 CFU/Lとなった。期間全体を通してA養魚場では降の解析結果からは除外した。

他の2養魚場よりも高く，増減は3養魚場でほぼ同じ動向を示した。
1.00E+11
1.00E+101010
1.00E+09910生菌数（CFU/L）

1.00E+08
108
1.00E+07
107
1.00E+06

y = 9.12×1014e-0.7758ct
R2 = 0.96

106

1.00E+05

105
1.00E+04
104
1.00E+03
1.00E+02
103
1.00E+01

0101520253035

qPCRサイクル数（ct）
図2qPCRサイクル数とW.STDの生菌数との相関
図2 qPCRサイクル数とW.STDの生菌数との相関

1.0E+08108
1.0E+07107
1.0E+06106

冷水病菌数（CFU/L）

10 e105
1.0E+05104
1.0E+04103
1.0E+03

A養魚場飼育水

102
1.0E+02

B養魚場飼育水

101
1.0E+01

C養魚場飼育水
C養魚場用水100
1.0E+00
1月 2月 3月 4月 5月 6月 7月 8月 9月 10月11月12月 1月 2月 3月 4月
2020年

2021年
採水月

図３qPCRにより推定した月ごとの養魚場ごとの環境水中の冷水病菌数
qPCR により推定した月ごとの養魚場ごとの環境水中の冷水病菌数
図３※※B 養魚場飼育水
12 月は検出限界以下
B養魚場飼育水12月は検出限界以下（C 養魚用水の 2021 年 3、4 月は欠測）（C養魚用水の2021年3、 4月は欠測）

― 14 ―中村永介

考察は水量を調査項目としていないため因果関係は不明であるが，飼育水の菌濃度の高かった7月には，当該地域ニジマス養魚場における用水及び飼育水中の冷水病

では記録的な大雨があり，湧水量と河川水量が大幅に増加していた18)。冷水病原因菌は淡水中で10年以上も生原因菌数
富士山麓の地下水には病原体を含む微生物が極めて少存するという報告19)もあることから，増水により水底にないとされ11)，本研究においても，汲み上げた地下水を沈んでいた冷水病原因菌が流されて一時的に菌濃度が用いているB養魚場の用水ではPPIC遺伝子は通年検出限高くなっていた可能性もある。水量も調査項目のひとつ界以下であった。その地下水が湧水となっているA養魚とし冷水病原因菌の総量を捉えることも飼育魚のモニタ場の用水中においても冷水病原因菌は存在していないとリングには必要であることが示唆された。

考えられる。しかし，A養魚場とB養魚場の飼育水からはPPIC遺伝子がほぼ通年検出され，冷水病原因菌が養魚場内に常在していることが示唆された。また，河川水を用水及び飼育水抽出物のqPCRによる冷水病原因菌数の定量性用水とするC養魚場においても飼育水は常に用水よりもqPCRには絶対定量法と相対定量法があり，細菌数やウ高い数値となっていることから，今回実施した3ケ所の養イルス量の定量には一般的に絶対定量法が用いられ，既魚場内で冷水病原因菌が増殖していると考えられる。魚知濃度のコントロールで検量線を作成して定量する20)。

種は異なるものの，アユで冷水病が発生している河川水

今回，qPCRの増幅効率の確認にSTDを，用水及び飼育水

35からは10 ～ 10 copies/LのPPIC遺伝子が検出されたと7)

報告がされている が，本研究で調査したC養魚場の用水
9の菌濃度の定量にW.STDと，2種類のコントロールを用いた。既知コピー数のDNAとしては，組換えプラスミドを用から検出されたPPIC遺伝子は最大で2.86×10 copies/L

いる方法7)も報告されているが，作製が容易なPCR産物をとなることから，相当量の冷水病原因菌が存在しているSTDとして用いることで簡略化が可能であった。また，今ことになる。冷水病原因菌は血清型の他，遺伝型による回の解析では既知菌数の水からDNAを抽出したW.STDによ12，13)，由来する魚種により病原性も異り菌数の推定も試みた。本研究で用いたW.STDは対数増。本研究では調査場所である養魚場内に存在す殖期の生菌数を基に作製しているためCFU/Lを単位としる魚類はニジマスを中心としたサケ科魚類のみであるたて用いている。W.STDの生菌数とPCRサイクル数の間にはめ，血清型及び遺伝型については検討していないが，ア有意な相関があり，簡易的な定量法として有効であった。

区別もされており
14，15)

なる

14)

ユ由来株がニジマスに高い病原性を示す事例 も報告さ

ただし，用水及び飼育水中に多くの死菌が含まれていたれているため，調査の必要性も伺われる。今回推定され場合，死菌DNA由来のPPIC遺伝子を検出してしまうことで，

5

6た3 ヶ所の養魚場の飼育水中の菌濃度の平均は10 ～ 10

生菌数を過大評価している可能性が考えられる。RNAをCFU/Lであったが，ニジマスへの冷水病原因菌による人鋳型とする手法の報告もあり21)，より正確に解析が必要

為的な攻撃試験では106CFU/L以上の菌濃度での浸漬が有な場合にはこれを用いることも検討すべきである。

16)

効とされている 。死菌検出等による過大評価の可能性

本研究ではW.STDを用いたqPCRの検出限界を4.50×102はあるものの，上記の飼育水を用水として再利用する場

CFU/L以下としたが，ニジマス養魚場の飼育水のモニタ合には感染源となり，新たな感染を起こすリスクが高い。

リングとして冷水病原因菌の定量が可能であった。しか冷水病の根絶には，清浄な用水の確保だけではなく，受し，用水では検出限界値近い場合もあり，清浄性調査

17)

精卵の吸水前消毒 のように感染源を持ち込まない防疫等の用途では感度の向上が必要である。qPCRを阻害す対策に加え，施設内の清浄化による下流域への病原体のる要因のひとつとして，環境水中からDNAを抽出する際排出抑制が必要になると考えられる。に混入するPCR阻害物質があげられる22)。そのため，DNA

今回，調査月により飼育水の菌濃度は異なったが，水抽出にQIAmp DNA Mini kit(QUIAGEN)を用いる方法23)や，温との関連性はみられなかった。後の聞き取り調査の結DNA標準物質を環境水中に加えることで正確に定量する

果，A，B，C，いずれの養鱒場においても冷水病が周年

方法24)等が報告されているが，いずれの手法も手順が煩発生しており，飼育水の菌濃度と発生との明確な関連雑になる。今回の調査場所は清浄な用水が求められる性は見いだせなかった。これには養魚場単位ではなくニジマス養魚場であり供試水中にも懸濁物質等は非常

飼育池を単位とし，死亡率や被害量など発生状況を加に少ないこと，病原体の増減を捉えるための飼育水のえた詳細な調査と解析が必要と考えられる。また，今回モニタリングでは必然的に検体数が多くなることを考慮

― 15 ―

養魚場における冷水病菌の定量すると，本手法のように簡易な手法を用いて解析数を増やした検討を行うのが効果的になると考えられる。

11) 加藤憲二・永翁一代 (2015): 水循環における微生物DNAインディケーター . River Front, 81, 6 ～ 10.
12) 吉 浦 康 寿・釜 石 隆・中 易 千 早・乙 竹 充 (2006):

謝辞

Peptidyl–prolyl cis-trans isomerase C遺 伝子を標的としたPCRによるFlavobacterium psychrophilum

用水及び飼育水のサンプリング及びDNAの抽出につの判別と遺伝子型. 魚病研究, 41(2), 67 ～ 71.

いては，元静岡県水産・海洋技術研究所富士養鱒場の13) 井上僚・高瀬智洋 (2019): リアルタイムPCRを用いた木南竜平氏にマニュアルの整備等で協力を頂いた。こ

細菌性冷水病菌原因菌Flavobacterium psychrophilum

こに記して感謝します。のA,B遺伝子型迅速判別法の開発. 魚病研究, 54(3),58 ～ 60.

文献14) 中居祐(2001): アユ及びニジマス由来冷水病原因菌のニジマスに対する病原性. 岐淡水研報, 46,

1) Davis H.S.(1946): Care and disease of trout. US
department o f the Interior Research Report No.12,US

15) 久下敏宏・新井肇・鈴木究真・泉庄太郎 (2006):

Government Printing Office, Washington,DC.98pp.

ヤマメとニジマスから分離された冷水病菌のアユ

2) Wakabayashi H., Toyama T., Iida T.(1994): A study on
serotyping of Cytophaga psychrophila isolated fromfishes in Japan. Fish Phathology, 29(2), 101 ～ 104.
3) 若林久嗣・堀内三津幸・文谷俊雄(1991): 日本で発生したギンザケ稚魚の冷水病. 魚病研究, 26(4),211 ～ 212.
4) Izumi S., Wakabayashi H.(1999): Further study
on serotyping of Flavobacterium psychrophilum.
Fish Phathology, 34(2), 89 ～ 90.
5) 熊谷明 (2016): 細菌性冷水病. 魚病研究, 51(4),6)8)に対する病原性. 群馬水試研報, 12, 28 ～ 29.
16) 大島俊一郎・近藤基樹・川合研兒 (2004): 魚類
冷水病ワクチン. 特開2004-210769
17) 熊谷明 (2008): サケ科魚類の細菌性冷水病の垂直感染の防除. 宮城水産研報, 8, 49-56.
18) 静岡地方気象台 (2020): 静岡県の気象概要2020
年年報. 18pp.
19) 中居祐・原徹 (2016): 淡水中におけるアユ由来冷水病原因菌の生存性. 岐水研研報, 61, 17 ～ 20.
20) 青木仁孝・荒木信夫・珠坪一晃・山口隆司(2011):

153 ～ 157.

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ける環境DNA法を用いた生物モニタリング. 里山
7)17 ～ 21.

21) Fey A., Eicher S., Flavier S., Christen R., Höfle

学研究センター年次報告, 188 ～ 191.

M. G., Guzmán C. A. (2004): Establishment of a

今城雅之・山﨑憲一・山下はづき・門野真弥・片real-time PCR-based approach for accurate

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一・吉浦康寿(2009): リアルタイムPCRを用いたアユ

QIAamp DNA mini kit for removing of inhibitors

冷水病魚におけるFlavobacterium psychrophilumの定in detection of Cryptosporidium parvum oocysts

量性の検討. 日本水産学会誌, 75(2), 258 ～ 260.

in water samples by a nested–PCR assay. Int. J.

10) Rohland N., Reich D. (2012): Cost-effective,Environ. Sci. Tech., 4(2): 241-246.

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ニタリング. 日本水産学会誌, 73(2), 306-309.

― 16 ―

中村永介

Quantitative monitoring of Flavobacterium psychrophilum (Bacterial Cold-water
Disease-causing bacteria) in aquatic environments of Rainbow trout farms
Eisuke Nakamura
Abstract The purpose of this study was to monitor the increase and decrease in the number of causative
pathogens in aquaculture water to prevent the outbreak of bacterial cold-water disease (BCWD) in rainbow
trout farms. In this study, as a basic experiment, we attempted to quantify Flavobacterium psychrophilum,
the causative agent of BCWD, in rearing water by quantitative real-time PCR (qPCR). The experiments wascarried out throughout the year in three rainbow trout farms with water from springs, groundwater, and rivers
as models. We prepared suspensions of known concentration was made with the cultured F. psychrophilum ,and used a calibration curve generated from the correlation between the number of bacteria and the numberof qPCR cycles to estimate the concentration of the bacteria in the rearing water. The estimated mean
concentrations of bacteria in the aquaculture water of trout farms were 105—106 CFU/L. The bacteria weredetected throughout the year, indicating that the F. psychrophilum were endemic to trout farms.
Key words: Bacterial Cold-water Disease, Quantitative PCR, Environmental DNA, Rainbow trout farming,
Aquaculture water