膜透過促進ペプチドによる膜透過促進ペプチドによるバイオ医薬品の細胞内デリバリー
バイオ医薬品の細胞内デリバリー

慶應義塾慶應義塾大学義塾大学 理工学部
生命情報学科教授 土居 信英
1

世界の医薬品売り上げランキング順位

2004年度

2009年度

2014年度1

リピトール（高脂血症）

リピトール（高脂血症）

ヒュミラ（関節リウマチ）

2エポジェン（腎性貧血）

セレタイド（抗喘息薬）

ランタス（インスリン製剤）

3

プラビックス（抗血小板薬）

レミケード（関節リウマチ等）

ソバルディ（C型肝炎）

4

ゾコール（高脂血症）

プラビックス（抗血小板薬）

エビリファイ（統合失調症薬）

5

ノルバスク（降圧剤）

ディオバン（降圧剤）

エンブレル（関節リウマチ等）

6

セレタイド（抗喘息薬）

アバスチン（抗がん剤）

セレタイド（抗喘息薬）

7

タケプロン（抗潰瘍剤）

リツキサン（悪性リンパ腫）

クレストール（高脂血症）

8

ジプレキサ（統合失調症薬）

エンブレル（関節リウマチ等）

レミケード（関節リウマチ等）

9

メバロチン（高脂血症）

ヒュミラ（関節リウマチ）

ネクシアム（抗潰瘍剤）

10

ネクシアム（抗潰瘍剤）

セロクエル（統合失調症薬）

リツキサン（悪性リンパ腫）

バイオ医薬 抗体医薬やタンパク質製剤の売り上げが増えている2

バイオ医薬品の利点と課題（小分子化合物医薬との比較）
利点
抗原結合部位 V
特異性が高いV→ 副作用の恐れが少ない
課題
抗体
生産コストが高い
細胞膜透過性が低い → 疾患標的が限定
H

L

タンパク質の効率的な細胞内デリバリー技術が必要
3

従来技術とその問題点
既に実用化されているものには、膜透過性ペプチドを利用する方法などがあるが、細胞質への送達効率が低い
細胞選択性が低い等の問題があり、広く利用されるまでには至っていない。

4膜透過性ペプチドの利用

細胞透過性ペプチド
例：TAT（ウイルス由来）
ポリアルギニン

膜融合ペプチド
例：GALA
HA2（ウイルス由来）
B18（ウニ由来）
S19（ヒト由来）
5

新技術に至った経緯
宿主細胞と膜融合するウイルスの膜融合ペプチド（FP）だけではなく、細胞同士の膜融合に関与するFPも膜透過促進活性を示すのでは？
eGFP

eGFP

eGFP-TATeGFP-B18-TAT

B18
TAT

エンドソーム核

ウニの受精に関与するタンパク質バインディン由来の膜融合ペプチドB18が、連結した蛍光タンパク質（eGFP）の細胞質送達を促進することを発見
Niikura K. et al. (2015) J. Control. Release 212, 85-93→ ウニ由来なので免疫原性の懸念があった
6

細胞膜融合に関わるヒトタンパク質
178134350 aa

IZUMO11320340 352

392 407440538 aa

シンシチン1

膜融合ペプチド

受精において精子と卵子の細胞融合に関与(Satouh et al., 2012)

胎盤形成において母子由来細胞融合に関与(Lavialle et al., 2013)7ヒト由来膜透過促進ペプチドの探索
178134350 aa

IZUMO11320340 352392 407

440538 aa

シンシチン1

膜融合ペプチド
蛍光タンパク質
eGFP-FP-TATFP TAT

細胞透過性ペプチド

FP TAT NLS

eGFP-FP-TAT-NLS

核移⾏配列

eGFP
FP
TAT

融合タンパク質の発現・精製

ヒト培養細胞に添加

共焦点蛍光顕微鏡による局在観察8ヒト由来膜透過促進ペプチドの探索
IZUMO1SP
1

Ig-like
78

TMD

134

350 aa

eGFP

FP
TAT

Syncytin1
SP
1
Sudo K. et al. (2017) J Control Release 255, 1-11.

CS

FD

NHR

CHR

320 340 352 392 407

440

TMD
538 aa9膜透過促進ペプチド配列の最適化

eGFP

FP
TAT

Sudo K. et al. (2017) J Control Release 255, 1-11.

S19と命名19と命名
10

細胞質に送達された分子数の算出eGFP
核移⾏配列

エンドソームを離脱し細胞質に送達された分子のみが核移行配列により核に運ばれるので、細胞抽出液を核とそれ以外の画分に分け、それぞれに含まれるタンパク質をウェスタンブロットにより定量

FP
TAT

eGFP-FP-TAT-NLS
eGFP-NLS

ーHA2

S19

Hoechst

eGFP

約９０倍

Merge

ヒト由来膜透過促進ペプチドは倍促進した
ヒト由来膜透過促進ペプチドは eGFP-TAT の細胞質送達を約の細胞質送達を約90倍促進した
Sudo K. et al. (2017) J Control Release 255, 1-11.

11ヒト由来膜透過促進ペプチドは単独では細胞膜と強く相互作用しない
単独では細胞膜と強く相互作用しない
eGFP-FP-TATFP−IZUMO157-113

GSSyncytin1320-340

eGFP-FPFP−IZUMO157-113

GSSyncytin1320-340

TATを抗体と置き換えることでTATを抗体と置き換えることで細胞選択的なデリバリーに応用できる可能性がある
細胞選択的なデリバリーに応用できる可能性がある
Sudo K. et al. (2017) J Control Release 255, 1-11.

12

新技術の特徴・従来技術との比較• 従来技術の問題点であった、タンパク質などの生体高分子の細胞質送達（エンドソーム離脱）効率を数十倍向上することに成功した。
• 従来とは異なり、ヒト由来の膜融合ペプチドを用いるので、医薬品に適用する場合、免疫原性の恐れが少ない。
• 本技術の膜透過促進ペプチドは、単独では細胞膜と強く相互作用しないため、TATを別のリガンドと置き換えることで細胞選択性の付与が期待される。
13

汎用性の評価①
子宮細胞由来

表皮細胞由来

肝臓細胞由来神経細胞由来ヒト由来膜透過促進ペプチド
ヒト由来膜透過促進ペプチドは
由来膜透過促進ペプチドは様々なヒト培養細胞において々なヒト培養細胞において蛍光タンパク質（）の細胞内取り込み蛍光タンパク質（eGFP）の細胞内取り込みを促進
内取り込みを促進
Sudo K. et al. (2017) J Control Release 255, 1-11.

14汎用性の評価②
β-ガラクトシダーゼ（116 kDa x 4量体） 酵素活性により蛍光を発する基質
β-Gal-TAT

β-Gal-S19-TAT

C12-FDG+
Hoechst
20 µm

蛍光色素

SNAP-TATBG-DY505+
Hoechst

SNAP-S19-TAT

SNAPタグ（20 kDa）
20 µm

ベンジルグアニン（BG）と共有結合

ヒト由来膜透過促進ペプチドは様々なタンパク質
タンパク質の細胞
ヒト由来膜透過促進ペプチドは様々なタンパク質の細胞内取り込みをの細胞内取り込みを促進内取り込みを促進
Sudo K. et al. (2017) J Control Release 255, 1-11.

15安全性の評価
WST-1アッセイにより細胞増殖および生存への影響を検証
8 hr

12 hr

24 hr

細胞生存率の相対値
Relative Cell Viability

4 hr

Noprotein−IZUMO178-134 IZUMO1116-134

GSSyncytin1320-340

S19FP

eGFP-FP -TAT

ヒト由来膜透過促進ペプチド
ヒト由来膜透過促進ペプチドは膜透過促進ペプチドは細胞の増殖や生存に影響を及ぼさない細胞の増殖や生存に影響を及ぼさない
Sudo K. et al. (2017) J Control Release 255, 1-11.

16

日本経済新聞2016.12.26

新聞記事

化学工業日報2017.4.10

日経産業新聞2017.4.14
17

抗体を利用した細胞選択的デリバリーへの応用
VH
VL

膜抗原に対する完全抗体

ヒト由来の膜透過促進ペプチド
バイオ医薬（ペプチド／細胞内抗体）

薬物（小分子化合物）

抗体薬物複合体（ADC）＜従来技術＞

膜抗原に対する一本鎖抗体

VL
VH＜新技術の応用＞18

想定される用途• 本技術の特徴を生かすためには、バイオ医薬品のデリバリーに適用することで、細胞質送達効率アップによるコスト削減のメリットが大きいと考えられる。
• 上記以外に、細胞選択性の付与による副作用低減の効果が得られることも期待される。
• また、より早い実用化が期待できる用途として、分子細胞生物学の基礎研究におけるタンパク質（細胞内抗体、転写因子など）や核酸（プラスミドDNA、siRNAなど）の細胞質送達用担体や膜透過促進剤に応用することも可能と思われる。
19

実用化に向けた課題• 現在、S19-TATを連結した蛍光タンパク質やいくつかの酵素について in vitro で効率的な細胞質送達が可能なところまで実証済み。
• 今後、 S19-TATを連結したバイオ医薬品について in vitro および in vivo で実験データを取得する必要がある。
• また、細胞選択性の付与に向けて、TATの代わりに抗体やリガンドを用いた技術を確立する必要もある。
20

企業への期待• 細胞透過性ペプチド TAT を利用したバイオ医薬品や細胞内導入試薬を開発中の企業には、本技術 S19-TAT の利用が有効と思われる。このとき、S19-TAT を連続したままS19 のN末側に積荷を連結することが重要。
• また、特定の細胞内疾患標的に対する細胞選択的なDDSの開発を企図している企業との共同研究を希望。
21

本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：融合タンパク質又は複合タン
パク質、細胞内送達用担体、部分ペプチド、細胞膜透過促進剤、ＤＮＡ、及びベクター• 出願番号 ：PCT/JP2016/066455• 出願人：学校法人慶應義塾• 発明者：須藤慧、新倉啓介、土居信英
JST 知財基盤強化支援（権利化支援）事業に採択
知財基盤強化支援（権利化支援）事業に採択
22

本技術に関する文献
本技術に関する文献
Sudo, K., Niikura, K., Iwaki, K., Kohyama, S., Fujiwara, K., Doi, N.
Human-derived fusogenic peptides for the intracellular delivery of proteins.
J. Control. Release 255,255 1-11 (2017)
土居信英：タンパク質の細胞質送達を促進するヒト由来膜融合ペプチド．
「医療・診断をささえるペプチド科学 - 再生医療・DDS・診断への応用 -」シーエムシー出版 pp.232-238 (2017)
土居信英：ヒト由来膜融合ペプチドによるバイオ医薬のDDS．
細胞 49,49 602-605 (2017)
土居信英：新規の膜透過促進ペプチドを利用した抗体医薬の細胞選択的DDSに向けて．「ドラッグデリバリーシステム - バイオ医薬品創成に向けた組織、細胞内、核内送達技術の開発 -」 シーエムシー出版（印刷中）23お問い合わせ慶應義塾大学
研究連携推進本部
https://wwwdc01.adst.keio.ac.jp/kj://wwwdc01.adst.keio.ac.jp/kj/
https://wwwdc01.adst.keio.ac.jp/kj/
rcp/contact/index.html
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ＴＥＬ
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