福岡県保健環境研究所年報第44号，77－81，2017

短報
飲料中の指定外甘味料ズルチンのHPLCによる定量試験法及びLC-qTOF/MSによる簡便かつ迅速な確認試験法の検討
佐藤環・小木曽俊孝・新谷依子・堀就英・梶原淳睦
赤ワインを試料として、飲料中の指定外甘味料ズルチンの定量及び確認試験法の検討を行った。定量試験法は、イオンペア試薬を用いない、より簡便な分析法を検討し性能評価を行った。その結果、定量下限付近の濃度（0.02 g/kg）における真度及び再現性は、平均回収率が98.6%、相対標準偏差が6.3%であり良好な結果であった。また、LC-qTOF/MSを用いて確認試験法の検討を行ったところ、試料の前処理操作を必要とせず希釈のみで定性が可能であった。以上のことから、本試験法は飲料中のズルチンの定量及び確認試験法として有用であると考えられた。
［キーワード：指定外甘味料、ズルチン、HPLC、LC-qTOF/MS］
１

認試験法は、液体クロマトグラフ質量分析計（LC-MS/MS）

はじめに
食品添加物は保存料、甘味料、着色料、香料など、食品により分析する方法が報告されている3）、5）－7）。しかし、の製造過程や食品の加工・保存の目的で使用される化学物

LC-MS/MSを用いた分析では、試料由来のマトリックスの質である。これらは様々な食品に使用されており、消費者影響により分析が困難な場合がある8）。一方、液体クロマの食品添加物に対する関心は高い。これら化学物質の試験

トグラフ四重極飛行時間型質量分析計（LC-qTOF/MS）は法を簡便で迅速なものに改良することは、検査の効率性向高い分解能を有しており、マトリックスの影響を受けずに上に繋がり、県民の“食の安全性確保”に資するものである。

目的物質の分析が可能になると考えられる。このことから、

また、分析法の簡便・迅速化は健康危機管理の観点から

LC-qTOF/MSを用いた分析法は確認試験法として非常にも重要である。食品による健康被害が生じた場合、拡大防有用であると考えられる。しかし、これまでに、食品中の止のために正確かつ迅速な対応が求められる。地方衛生研

食品添加物についてLC-qTOF/MSを用いて分析した報告

究所においては、既存の機材・施設で対応可能な分析手法はない。の準備と定期的な見直しが推奨されている 1）。そのため当そこで本研究ではまず、イオンペア試薬を用いない、よ所においても、様々な化学物質を健康被害の原因として想り簡便なズルチンの定量試験法を検討し分析法の性能評定し試験法の整備を図っている。

価を行った。さらに、LC-qTOF/MSを用いてズルチンの今回、対象物質として選んだ指定外甘味料ズルチン（図1）は、過去に食中毒事例 2）が報告されている食品添加物

簡便かつ迅速な確認試験法の検討を行った結果について報告する。の一つである。
２

方法

２・１

試料

予めズルチンを含まないことを確認した赤ワインを試料として検討に用いた。

図 1 ズルチンの構造式（分子量：180.21）
ズルチンの一般的な定量試験法3）4）は、試料を透析後、２・２標準物質固相カラム精製を行いHPLCにより分析する方法である

ズルチン標準物質（食品分析用）は関東化学社製を用いが、イオンペア試薬を用いるやや煩雑なものとなっている。

た。
ズルチン標準物質 20 mg を精秤後、メタノールで 20 mL

また、ズルチンを分析対象とした食品中の食品添加物の確に定容し標準原液（1000 µg/mL）とした。この標準原液をメタノール：水（1：1）混液で適宜希釈し、試料への標準福岡県保健環境研究所 （〒818-0135 太宰府市大字向佐野 39）

物質の添加及び検量線の作成に用いた。

-77-

２・３

試薬

２・４・４

添加回収試験

メタノール（LC/MS 用）、蒸留水（LC/MS 用）、アセト採取した試料 20 g に、試料中濃度として 0.02 g/kg となニトリル（LC/MS 用）、りん酸水素二ナトリウム（特級）、るように標準溶液を添加後、上記 2・4・2 に従い試験溶液

りん酸二水素ナトリウム（特級）は関東化学社製を用いた。

を調製し定量を行った。試験溶液の調製は 5 併行で実施し

1 mol/L 塩酸、塩化ナトリウム（特級）、1 mol/L ぎ酸アンた。

モニウム溶液（高速液体クロマトグラフ用）は和光純薬社製を用いた。Sep-Pak C18（充填量 1 g）固相カートリッジ

２・４・５

試料マトリックスの測定値への影響の確認

カラムは Waters 社製、透析膜（分画分子量 12000～14000）採取した試料 20 g に、試料中濃度として 0.025 g/kg とな

は Thermo Fisher Scientific 社製、フィルター（孔径 0.45 µm）るように標準溶液を添加後、上記 2・4・2 に従い試験溶液付きバイアルは GE ヘルスケア社製を用いた。

を調製し定量を行った。試験溶液の調製は 3 併行で実施した。続いて、0.5－10 µg/mL の範囲でマトリックス標準溶

２・４液を調製し、マトリックス検量線による定量を行った。得

HPLC による定量試験法
装置及び分析条件

られた定量結果を溶媒検量線による定量結果と比較した。

HPLC 条件は表 1 に示した。

マトリックス標準溶液は以下に示す方法により調製した。

２・４・１

表1HPLC 条件

まず、濃度 50、100、200、500 及び 1000 µg/mL のズルチン標準溶液をメタノールで調製した。続いて、標準品未添

LC装置 ： LC-10ADvp (SHIMADZU)UV検出器 ： SPD-10AV (SHIMADZU)

加の赤ワインから調製した試験溶液 1mL ずつを 5 本の試

分析カラム ： Inertsil ODS-2 (GL Sciences、4.6×250 mm,5 µm）
カラム温度 ： 40℃

験管に分取し、各濃度の標準溶液を 10 µL ずつ添加して0.5、1、2、5 及び 10 µg/mL のマトリックス標準溶液とし移動相 ： 25%メタノール（アイソクラティック）
移動相流量 ： 1.0 mL/min

た。

注入量 ： 10 µL
検出波長 ： 230 nm

２・５LC-qTOF/MS による確認試験法

２・５・１
２・４・２装置及び分析条件

LC-qTOF/MS 条件は表 2 に示した。

試験溶液の調製

試料 20 g を量り取り、約 20 mL の透析内液（10%塩化ナトリウム含有 0.01 mol/L 塩酸）とともに透析膜に充てん

２・５・２

試験溶液の調製した。これを 200 mL のメスシリンダーに入れ、透析外液

試料 10 mL（10 g）に、試料中濃度として 0.02 g/kg とな（0.01 mol/L 塩酸）で全量を 200 mL とし、ときどき揺りるように標準溶液を添加した。この試料をメタノール：水動かしながら室温で約 18－20 時間透析した。透析外液 10（1：1）混液で 200 倍に希釈したものを試験溶液とした。

mL を分取し、0.1 mol/L リン酸緩衝液（pH5.0）で 20 mLに定容した。よく混和した後、C18（1 g）固相カートリッ

２・５・３

定性

ジカラムに 10 mL を負荷し、流出液は捨てた。
蒸留水 30 mL、同位体分布計算ツールソフトウェア（Agilent 解析ソフ

メタノール：水（1：9）混液 5 mL で順次洗浄した後、メトウェア Mass Hunter）を用いて、ズルチンの［M＋H］＋タノール：水（1：1）混液 10 mL で溶出し、10 mL に定容の精密質量を計算しプレカーサ―イオン（m/z 181.0972）した。溶出液を 0.45 µm のフィルターでろ過したものをを決定した。m/z 181.0972 のプロダクトイオンスキャンにHPLC 試験溶液とした。

より得られた試験溶液のマススペクトルを標準溶液（0.1µg/mL）のマススペクトルと比較した。

２・４・３

定量

HPLC の検量線用標準溶液は、メタノール：水（1：1）

３

結果及び考察混液を用いて、0.5－10 µg/mL の範囲で調製した。標準溶３・１

液濃度及びピーク面積から検量線を作成し、絶対検量線法

３・１・１

イオンペア試薬の使用について衛生試験法・注解 20153）のズルチンの試験法はイオンにより定量を行った。定量下限は、検量線の最低濃度を試料中濃度に換算した 0.01 g/kg とした。

HPLC による定量試験法の検討

ペア試薬として、HPLC 測定時は水酸化テトラ-n-プロピルアンモニウムを、C18 固相カラム精製時は臭化テトラ-nブチルアンモニウムを用いている。イオンペア試薬は、カラムに保持しにくい解離性の物質を分析する際に非常に-78-有効である。一方で、カラムの平衡化に時間を要する、機a)

8000

器を汚染しやすいといった欠点もある。そこで、イオンペ

7000

ア試薬を用いずにズルチン分析が可能であるか検討した。

6000
5000

Intensity

HPLC 測定においてイオンペア試薬を含まない移動相（25%メタノール）を用いて、標準溶液（0.5 µg/mL）を 5

4000
3000
2000

回繰り返し測定したところ、ピーク面積の相対標準偏差1000（RSD）は 4.0%であり、良好な再現性が得られた。また、

0C18 固相カラム精製において、イオンペア試薬を用いた場-1000
50101520253035253035R.Time（min）

合と用いない場合を比較したところ、測定値に差が見られb)なかったことから、イオンペア試薬を用いずに分析可能で8000あると考えられた。そこで、以下の検討ではイオンペア試

7000
6000

薬を用いないこととした。
３・１・２

Intensity

5000

クロマトグラム及び検量線

4000
3000
2000

ズルチン標準溶液（5 µg/mL）及びマトリックス標準溶

1000液（5 µg/mL）を HPLC で測定した際のズルチンのクロマ

0-1000トグラムを図 2 に示した。保持時間はほぼ一致しており、

05101520R.Time（min）

試料マトリックス共存下においても測定が十分に可能であった。

図 2 ズルチンの HPLC クロマトグラム

また、検量線は図 3 に示したように 0.5－10 µg/mL の範a）標準溶液（5 µg/mL）

囲で良好な直線性が得られた。

b）マトリックス標準溶液（5 µg/mL）
)

３・１・３

添加回収試験結果

分析法の真度及び再現性を評価するため、5 併行で添加

３・１・４

試料マトリックスの測定値への影響

回収試験を実施した結果、ズルチンの平均回収率は試験溶液中の試料マトリックスが、測定値に影響してい98.6±6.2%（RSD＝6.3%）であり、目標値である 70%－るかを確認するため同じ試験溶液について、溶媒検量線及120%9）を満足した。精度は Horwitz の修正式から算出したびマトリックス検量線を用いて定量し測定値を比較した。

併行精度の許容範囲

10）

その結果、溶媒検量線における試料中濃度の平均値は内（RSD＜6.7％）であった。

表2

LC-qTOF/MS 条件

LC装置 ： LC1290 Infinity(Agilent Technologies)
qTOF/MS装置 ： 6540 UHD Accurate-Mass-Q-TOF LC/MS(Agilent Technologies)
分析カラム ： Atlantis T3 (Waters、2.1×75 mm,3 µm)
カラム温度 ： 40℃
A液(10 mM ギ酸アンモニウム溶液(pH3))
移動相 ：B液(アセトニトリル)
グラジエント条件 ： A/B 95/5(2.5min)－17.5min－0/100(2.5min)
移動相流量 ： 0.2 mL/min
注入量 ： 1 µL
イオン化法 ： ESI法（ポジティブモード）
乾燥ガス温度 ： 300℃
乾燥ガス流量 ： 12 L/min
ネブライザガス圧 ： 50 psig
シースガス温度 ： 400℃
キャピラリー電圧 ： 4000 V
コリジョン電圧 ： 20 eV
プレカーサ－イオン ： m/z 181.0972
測定モード ： プロダクトイオンスキャン-79-a) x103 +ESI Product Ion (8.545 min) Frag=120.0V CID@20.0 (181.0972[z=1] -> **)4.5

400000108.0447
4y = 34242 x + 2658
R² = 0.999

3500003.5Peak Area

3000003250000

2.5

2000002138.0905

65.0385

1.581.0328

1500001181.0970

1000000.5

50000

164.0663

55.0530

030

4050

60

70

80

00

2468101290 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)b) x103 +ESI Product Ion (8.528 min) Frag=120.0V CID@20.0 (181.0972[z=1] -> **)Standard concn (µg/mL)5

図 3 ズルチンの検量線

108.0442
4.543.50.023 g/kg、マトリックス検量線における試料中濃度の平3

均値は 0.024 g/kg であり、ほぼ同等の結果であった。この

2.5138.0918

65.03812

ことから、試料マトリックスは測定値に影響しないと考え81.0338

1.5られた。

1181.0972
164.0683

53.03970.5
0３・２30LC-qTOF/MS による確認試験法の検討

健康被害発生時においては、原因物質の損失を防ぐため

405060708090 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)

図 4 ズルチンのマススペクトル

試料の前処理を行わない分析法が望ましい。そこで、試料

a) 標準溶液（0.1 µg/mL）の希釈のみでズルチンを分析可能であるか検討した。

b) 試験溶液

プロダクトイオンスキャンによるズルチンの標準溶液及び試験溶液中のマススペクトルを図 4 に示した。試験

文献

溶液中のプロダクトイオン同士の強度比は標準溶液と比

1）厚生労働省：地域における健康危機管理について～地較してほぼ同等であり、マススペクトルの一致度は高かっ域 健 康 危 機 管 理 ガ イ ド ラ イ ン ～ ，た。本試験法は試料の前処理操作を必要とせず、希釈のみ

http://www.mhlw.go.jp/general/seido/kousei/kenkou/guideline/iで定量下限付近のズルチンの定性が可能であった。

ndex.html，平成 29 年 4 月 3 日
2）斎藤孝一：食品衛生学雑誌，10（2），112-113，1969４3）衛生試験法・注解 2015，（日本薬学会），p.375，2015

まとめ
飲料中の食品添加物の正確、簡便かつ迅速な試験法の整（金原出版、東京）備を目的とし、赤ワインをモデル試料として飲料中のズル

4）小林千種ら：食品衛生学雑誌，40（2），166-171,1999

チンの定量及び確認試験法の検討を行った。イオンペア試

5）小山政道ら：食品衛生学雑誌，46（3），72-78，2005

薬を用いない、より簡便な定量試験法を検討し分析法の性

6）松本ひろ子ら：東京都健康安全研究センター年報，59，

能評価を行った。定量下限の 2 倍濃度（0.02 g/kg）におけ

129-135，2008

る真度及び再現性は、平均回収率が 98.6%、RSD が 6.3%

7）鶴田小百合ら：食品衛生学雑誌，54（3），204-212，であり良好な結果であった。また、LC-qTOF/MS を用いて2013

ズルチンの確認試験法の検討を行ったところ、試料の前処

8）望月直樹：YAKUGAKU ZASSHI，131（7），1019-1025，

理操作を必要とせず、希釈のみで定性が可能であった。

2011

以上のことから、今回検討した試験法は飲料中のズルチ

9）厚生省生活衛生局食品保健課長通知：衛食第 117 号，ンの定量及び確認試験法として有用であると考えられた。

平成 9 年 4 月 1 日，1997

今後は、赤ワイン以外の飲料及びズルチン以外の食品添加10 ） Codex Alimentarius Commission ： CODEX STAN

物について検討し、適用範囲を確認する必要がある。

(193-1995)，1995-80-

（英文要旨）Development of a Quantitative HPLC Method and a Simple and Rapid Qualitative Method
Using LC-qTOF/MS for Dulcin in Beverages
Tamaki SATO, Toshitaka KOGISO, Yoriko SHINTANI, Tsuguhide HORI and Jumboku KAJIWARA
Fukuoka Institute of Health and Environmental Sciences,
Mukaizano 39, Dazaifu, Fukuoka 818-0135, Japan
We studied quantitative and qualitative analytical methods for dulcin, an unspecified sweetener that previously caused
food-poisoning case, in beverages using red wine as a representative sample. A simple quantitative method without ion-pairreagents at the purification and measurement was developed and evaluated. The recovery rate with a dulcin concentration of 0.02g/kg was 98.6% with satisfactory repeatability. We also developed a qualitative method using LC-qTOF/MS. As a result, the only
sample preparation step required was dilution in this method. The methods developed in this study will be useful for quantitativeand qualitative analysis of dulcin in beverages.
[Key words ; unspecified sweeteners, dulcin, HPLC, LC-qTOF/MS]-81-