特集

学生の研究活動報告−国内学会大会・国際会議参加記 242012 ; Doi et al. 2015）が多いコイ（Cyprinus car-

第 63 回日本生態学会大会に参加して垣見pio L.）とした．実験では供試魚 3 個体を試験用水槽（60×30×36 cm：約 57 L, 7-19 時 の 12 時 間 明希期）で 5 日間馴化した．温度依存性を検証するため

Naoki KAKIMI

直に水温は 20℃（n＝4）と 30℃（n＝3）の条件下で環境ソリューション工学専攻修士課程2年実験をおこなった．
馴化後各水槽から飼育水を 4 L を採水し，採水後1．はじめにに飼育水と同様の温度でインキュベートした．試料

私は 2016 年 3 月 20 日から 24 日に仙台国際セン

水は採水直後および 3, 6, 12, 24 時間経過ごとにターで開催された，第 63 回日本生態学会大会に参RNA 用サンプルとして 300 mL, DNA 用サンプルと加し，「魚類からの環境 RNA 放出速度と温度依存

し て 150 mL を GF/F フ ィ ル タ ー（1825-047, GE性」という題目でポスター発表をおこなった．

Healthcare, Buckinghamshire, UK）で濾過した．
濾過後のフィルターは RNAlater（AM 7021, Am-2．研究内容
2.1

bion, Foster City, CA, USA）で RNA 用サンプルを抽出まで保存し，NucleoSpin RNA Plus（740984.50,

背景近年，環境水中に含まれる生物由来の DNA 断片

Macherey-Nagel, Düren, German）で RNA を 抽 出，（環境 DNA）を分析することで水棲生物の在／不在精製をおこなった．そ の 後 PrimeScriptTM RT re-の判定（Ficetola et al. 2008 ; Miya et al. 2015）やagent Kit（Perfect Real Time）（RR 047 A，タカラバ

生物量を推定（Takahara et al. 2012 ; Thomsen et al.

イオ（株），大津市，日本）を用いて相補 的 DNA2012）する環境 DNA 分析の開発が進んでいる．し（cDNA）を合成した．

かし，環境 DNA では資源管理における重要な指標

DNA 用 サ ン プ ル は−20℃ で 保 存 し，DNeasyとなる代謝や産卵，ストレスなどの生物の状態を推Blood & tissue kit（cat. no.69504, Qiagen, Hilden,定することは不可能である．ここで，本研究ではGermany）で DNA を抽出，精製をおこなった．

RNA に着目した．RNA は生物の活動によって発現定量 PCR は，多種が混在する環境水中から対象量が変化する（Murakami et al. 1994）ことから，環生物の mRNA のみを特定するために，種特異的な境水中に含まれる生物由来の RNA（環境 RNA）を配列をもつミトコンドリアのチトクロム b 領域を環境 DNA と同様に環境水中から回収することで，対象としておこなった．

環境 DNA 分析では困難であった生物の状態を推定

遺伝子発現の解析では一般的に代謝やストレスなで き る 情 報 が 得 ら れ る と 考 え ら れ る．し か し，どで発現量が変化しないハウスキーピング遺伝子をRNA は分解速度が速いため環境水中からの回収は基準に解析をおこなうが，飼育水中からハウスキー困難であると考えられており，環境 RNA の温度依ピング遺伝子を回収することができないため，水温存性や環境水中での放出や減少といった基礎的知見

で 濃 度 が 変 化 し な い 環 境 DNA（Takahara et al.

がない．このことから，本研究では環境 RNA の温2012）をハウスキーピング遺伝子の代わりとして環度依存性と放出速度を解明することを目的として実境 RNA を cDNA 濃度／環境 DNA 濃度の環境核酸験をおこなった．

比で示した．温度依存性を検証するために水温間の環境核酸比を比較した．また，放出直後と 3, 6, 12,2.2

24 時間後の環境核酸比を比較し，環境 RNA の分方法

対象種は環境 DNA の先行研究（Takahara et al.

解速度から放出速度の推定を試みた．

― ３９ ―

2.3

謝いたします．

結果および考察

20℃ と 30℃ の間で採水直後の環境核酸比に差は見られなかった（Wilcoxon rank sum test, p＞0.05, n.

引用文献s.）．今後は水温によって発現量が変化する遺伝子

Doi, H, Uchii, K, Takahara T, Matsuhashi, S., Yamanaka, H.,

配列を選択することで，水温の影響を評価することが可能になると考えられる．また，塩基配列情報のデータベースが充実することで，環境 RNA による

Minamoto, T., 2015. Use of Droplet Digital PCR for Estimation of Fish Abundance and Biomass in Environmental
DNA Surveys, PLoS ONE, 10 : e0122763
Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P., 2008.
Species detection using environmental DNA from water

状態の推定が可能になると考えられる．
採水直後と各経過時間の間で環境核酸比に変化が見られなかった（Steel-Dwass test, p＞0.05, n.s.）たsamples. Biol Lett 4 : 423-425.
Miya, M., Sato, Y., Fukunaga, T., Sado, T., Poulsen, J. Y.,
Sato, K., Kondoh, M., 2015. MiFish, a set of universal PCRめ，分解速度や放出速度の解析には至らなかった．

primers for metabarcoding environmental DNA from fishes :しかし，分解速度が速いと考えられていた環境

detection of more than 230 subtropical marine species. RRNA が長時間環境水中に存在していることが明らかになった．放出後に比較的長い時間が経過しても環境 RNA は検出できたため，水試料のみから生物の生理的状態を推定できる可能性が高まったといえ

Soc Open Sci, 2（7）, 150088.
Murakami, T., Shimomura, Y., Fujitsuka, N., Nakai, N., Sugiyama, S., Ozawa, T., Suzuki, M., 1994. Enzymatic and genetic adaptation of soleus muscle mitochondria to physicaltraining in rats. Am J Physiol, 30（3）, E 388.
Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kaw-る．

abata, Z., 2012. Estimation of fish biomass using environ-3．おわりにmental DNA. PLoS ONE 7, e35868.
Thomsen, P. F., Kielgast, J., Iversen, L. L., Møller, P. R., Ras-

学会では発表を通して様々な意見を頂くことがでmussen, M., Willerslev, E., 2012. Detection of a diverse

きました．また，来年も発表できるようにさらに研

marine fish fauna using environmental DNA from seawater

究に励みたいと思います．最後に，研究や学会発表

samples. PLoS ONE, 7（8）, e41732.

に関して指導いただきました山中裕樹講師に深く感― ４０ ―