福岡県保健環境研究所年報第44号，82－85，2017

短報
ムレミカズキモ（Pseudokirchneriella subcapitata）を用いた複合影響試験の検討
古閑豊和・柏原学・志水信弘・石橋融子
ムレミカズキモ（Pseudokirchneriella subcapitata）を用いて塩化亜鉛とドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(DBS)の単独ばく露試験及び複合影響試験を実施した。単独ばく露試験の結果、塩化亜鉛の72h-EC50は0.083 mg/L（亜鉛換算）、DBSの72h-EC50は120 mg/Lとなった。等効果線法による複合影響試験の結果、塩化亜鉛とDBSの混合物は相加効果の可能性が示唆された。しかし、水環境中の亜鉛とDBS濃度は低いため藻類に対して相加的影響をもたらす可能性は低いと考えられる。
［キーワード：Pseudokirchneriella subcapitata、複合影響、全排水毒性］
１

はじめに

２・２

藻類生長阻害試験（単独ばく露試験）

多くの化学物質は人間活動にとってかかせないが、その複合影響試験を実施するにあたり、被験物質のEC50値を全ての化学物質を分析し、リスクを管理することは困難で参考にばく露濃度を決定するため、本研究所の藻類培養条ある。そのため欧米では魚類や甲殻類、藻類による生物応件における被験物質の単独ばく露試験を実施した。

答を活用した指標によって化学物質を含む事業場排水等用いた藻類は国立環境研究所微生物系統保存施設からの規制を行っている。生物応答を活用した指標の利点は、入手したムレミカズキモ（Pseudokirchneriella subcapitata

従来の機器分析では把握できない複数の化学物質による（NIES-35））を用いた。これらをC培地により継代培養し、影響を評価できることである。

試験にはOECD培地に接種してから約3日後の細胞密度が1)

また、生物応答を用いた排水試験法（検討案） による0.5×106 ～1.0×106 cells/mLに達したものを使用した。と藻類試験は試験期間が 72 時間であり、ミジンコ繁殖試

単独ばく露試験の条件は平成15年11月21日薬食発第験（最長 8 日間）や、胚・仔魚期を用いる魚類短期毒性試

11210002 号 、 平 成 15 ･ 11 ･ 13 製 局 第 2 号 、 環 保 企 発 第験（ゼブラフィッシ、8~10 日間）と比較して短い。さら031121002号通知の別添の方法に従い実施した。試験期間に、藻類試験はミジンコ急性遊泳阻害試験（48 時間）やは72時間とした。水温は23±1℃、光強度は100±15 μmol/m2/s

魚類急性毒性試験（96 時間）のような試験期間が短い急（連続照射）の条件下で維持した。培地は市販のOECD培性毒性試験と比較しても、試験生物を維持するコストや労地濃縮液（和光純薬工業製）を超純水で希釈して使用した。

力がかからない利点がある。そのため、本研究では藻類を塩化亜鉛の濃度区はコントロール試験+6濃度区（設定濃用いて複数の化学物質の複合影響について検討した。

度：0.010~0.32 mg/L、公比2）とし、DBSはコントロール試験＋6濃度区（設定濃度：6.3~200 mg/L、公比2）で実施

２

実験方法

２・１

した。対照区は6連、その他濃度区は3連で実施した。

被験物質

生物量は24時間毎に試験液を0.1~1 mL採取し粒子計測モデルとなる被験物質として亜鉛及び直鎖アルキルベ装置（CDA-1000、シスメックス社製）にて細胞数を測定

ンゼンスルホン酸ナトリウム（以下、LAS）を選択した。

した。なお、試験終了時に各試験で試験成立条件9）を満た

この2物質は近年、水生生物保全環境基準項目に設定されしていることを確認した。

2,3）、単独ばく露による毒性試験が報告されており、データの比較が可能である4-8)。ただし、亜鉛は塩化亜鉛（和光純２・３

藻類生長阻害試験（複合影響試験）

薬工業製、純度98％）を使用し、LASについてはドデシル

複合影響試験は千坂ら10)、朴ら11)、鑪迫ら12）の方法を参

ベンゼンスルホン酸ナトリウム（以下、DBS）（関東化学考に等効果線法(Isoblole design)試験で実施した。単独ばく工業製、純度90％）を使用した。

露試験で得られた試験開始後72時間の生長阻害半数影響濃度(以下72h-EC50)を参考に複合影響試験のばく露濃度を設定した。背景物質としてDBSを選択し、主物質として塩福岡県保健環境研究所 （〒818-0135 太宰府市大字向佐野 39）

化亜鉛を選択した。ばく露濃度については表1に示すように試験No.1～6まで設定した。試験の設定上、試験No.1と-82-表１

No.6は塩化亜鉛とDBSの単独ばく露試験となっている。

複合影響試験のばく露濃度設定表

なお、ばく露条件等は上記の２・２単独ばく露試験と同様に実施した。
２・４

被験物質分析方法

単独ばく露試験及び複合影響試験の被験物質濃度を試
験前及び試験終了後に測定した。塩化亜鉛は亜鉛としてJISK 0102、53･4、ICP質量分析法にて測定した。DBSは平成15年厚生労働省告示第261号の陰イオン界面活性剤、別表第28号に定める方法にて測定した。各被験物質の試験開始前と試験終了後の測定濃度を幾何平均値として算出し、実測濃度として結果の解析を実施した。
２・５

統計解析方法各試験のエンドポイント（成長速度）について最大無影
響濃度NOEC(No observed effect concentration)及びx％阻害濃度ICx(x% inhibition concentration)を統計解析ソフトR13）を用いて算出した。統計処理の手法に関しては生物応答を用いた排水試験法（検討案）1)に従った。Rの計算に用いる関数等は渡部ら14)の方法を参考にした。
３

結果及び考察３・１

単独ばく露試験結果

塩化亜鉛とDBSの単独ばく露試験における細胞密度の経時変化と生長阻害率をそれぞれ図1と図2に示す。また各試験から求めた72h-EC50、 72h-EC10 、 72h-EC5、 NOECを表2に示す。塩化亜鉛（亜鉛換算）の72h-EC50は0.087 mg/L、DBSの72h-EC50は130 mg/Lであった。DBSのNOECについて今回、最低試験濃度でも対照区と比較して有意差(p>0.05%)がついたため算出しなかった。
単独ばく露試験で得られた72h-EC50を文献 4-8) から得られた値と比較すると、塩化亜鉛（亜鉛換算）の72h-EC50は0.061-0.11 mg/Lであり、今回の結果はその範囲内であった。
また、DBSの72h-EC50は83-103 mg/Lの範囲であり、今回の図 1 細胞密度の経時変化（単独ばく露試験）

結果は文献値よりも高い値であったが、大きく値を外れておらず、結果に問題はないものと考えた。これら単独ばく露試験で得られた72h-EC50を基に複合影響試験を実施した。

表２

単独ばく露試験結果-83-図 3 塩化亜鉛と DBS の等効果線法試験結果

Antagonistic effectAdditive effect

Synergistic effect
図 2 生長阻害率（単独ばく露試験）

表 3 複合影響試験結果（TU）
図 4 等効果線法試験による相互作用の概念図

３・２

複合影響試験結果

また、主物質である塩化亜鉛のTUは（式２）から求めら試験①～⑥で得られた結果はToxic Unit (TU)に変換した。

れ る 。試 験 No.1～ 5にお ける 塩 化亜 鉛（ 亜鉛 換算 ）の背景物質であるDBSのTUは（式１）から求められる。試72h-EC50を（式２）の【1】に代入し、試験①で得られた

験①～⑤におけるDBS濃度を（式１）の【1】に代入し、単独ばく露試験の72h-EC50を（式２）の【2】に代入する。

試験⑥で得られた単独ばく露試験の72h-EC50を式１の【2】に代入する。

なお（式１）と（式２）における【2】に用いるEC50は単独ばくろ試験として設定した試験No.1及びNo.6の値を-84-用いるため試験No.1及びNo.6のZnとDBSのTU値は0もし文献

くは１となる。

1)

各試験のTU値及び等効果線法試験結果をそれぞれ表310)11)と図3に示す。千坂ら 、朴ら 、鑪迫ら

12）の報告を元に会：生物応答を用いた排水試験法（検討案），2014.
2)

等効果線法試験結果における拮抗作用、相加作用、相乗作用の概念図を図4に示す。
図3と図4を比較すると相加作用を示す直線とほぼ同じ

また、環境水中の亜鉛とDBS濃度が藻類に与える複合影

環境省，環境省通知環水企発031105001号・環水管発031105001号，2003.

3)

環境省：環境省通知環水大水1303272号，2013.

4)

Pascal Radix et al.: Ecotox. Environ. Safe.，47，186-194

場所に結果がプロットでき、塩化亜鉛（亜鉛）とDBS（LAS）の混合物は相加作用を持つ可能性が考えられた。

排水（環境水）管理のバイオアッセイ技術検討分科

2000.
5)

Michael A. Lewis: Wat. Res.，25，101-113，1991.

6)

Natasha M. Franklin: Environ. Sci. Technol. ， 41 ，響を比較するため、平成27年度の福岡県内の河川水（類型8484-8490，2007.

指定河川）の亜鉛濃度とDBS（LASとして）濃度を文献調

7)

浦野紘平ら：水環境学会誌，39，121-125，2016.

査した15）。その結果、亜鉛の平均値は0.001~0.005 mg/L、

8)

環境省，化学物質の環境リスク評価，

LASの平均値は<0.0006～0.0008 mg/Lであった。今回の研https://www.env.go.jp/chemi/report/h19-03/pdf/chpt1/1-2-

究で得られた亜鉛及びDBSのNOECや72h-EC50は、環境水3-01.pdf中濃度より高い。そのため、福岡県内河川水中において藻9)厚生労働省・経済産業省・環境省，薬食発第11210002

類に対して相加的影響により生長阻害をもたらす可能性号、平成15･11･13製局第2号、環保企発第031121002

は低いと考えられる。

号，2003.
10) 千坂英雄：雑草研究，31，91-95，1986.

４

11) 朴

まとめ
ムレミカズキモを利用した単独ばく露試験及び複合影

明玉ら：環境毒性学会誌，3，23-32，2000.

12) 鑪迫典久：平成25年度化学物質の複合影響評価に関す響試験を検討した。単独ばく露試験で得られた72h-EC50をるシンポジウム資料，2014.

基にばく露濃度を決定した結果、塩化亜鉛とDBSは相加作

13) R development core team: R:Language and Environment

用を持つことが示唆された。また、水環境中の亜鉛とDBS

for Statistical Computing. R Foundation for Statistical（LASとして）濃度は低いため藻類に対して相加的影響をComputing，http://www.R–projec t .org

もたらす可能性は低いと考えられる。

14) 渡部春奈ら：環境化学，25，43-55，2015.
15) 環 境 省 ， 平 成 27 年 度 公 共 用 水 域 水 質 測 定 結 果 ，
http://www.env.go.jp/press/files/jp/104390.pdf（英文要旨）

Interaction of Chemicals in Pseudokirchneriella subcapitata
Toyokazu KOGA, Manabu KASHIWABARA, Nobuhiro SHIMIZU and Yuko ISHIBASHI
Fukuoka Institute of Health and Environmental Sciences,
Mukaizano 39, Dazaifu, Fukuoka 818-0135, Japan
We investigated exposure of Pseudokirchneriella subcapitata to zinc chloride and sodium dodecylbenzenesulfonate (DBS), bothin single exposure tests and with exposure to both chemicals at the same time. In the single exposure tests, the half maximal
effective concentration of zinc chloride at 72h was 0.083 mg/L (as Zn) and that of DBS was 120 mg/L. The results of the isobole
method suggested that a mixture of zinc and DBS had an additive effect. However, based on the low concentrations of Zn(0.001-0.005 mg/L) and LAS (<0.0006-0.0008 mg/L) in river water in Fukuoka Prefecture in 2015. There is no possibility of amixture of zinc and DBS having this additive effect on algae in the environment.
[Key words ; Pseudokirchneriella subcapitata, Interactive effect, whole effluent toxicity]-85-