福岡県保健環境研究所年報第40号，94-97, 2013短報
ライノウイルスの分子疫学解析
吉冨秀亮・石橋哲也・中村朋史・世良暢之・松田健太郎*1*2
福岡県におけるライノウイルス(HRV)の詳細な発生動向と臨床症状との関連を明らかにすることを目的に、呼吸器症状を呈する小児279名を対象にHRVを含む呼吸器系ウイルスの網羅的な遺伝子検査を行った。その結果、HRVが94名（33.7%）の小児から検出された。次に検出されたHRVと呼吸器症状との関連を明らかにすることを目的にHRVの分子疫学解析を行った。SRHI1/SRHI2プライマーを用いたPCRにより検出された69検体についてHRVの遺伝子群別を行った結果、A群HRV(HRV-A)が33検体（47.8%）、B群HRV(HRV-B)が1検体（1.4%）、及びC群HRV(HRV-C)が35検体（50.8%）検出された。さらに、HRVの遺伝子群と小児の呼吸器症状の関連を検討した結果、HRV-AとHRV-Cとの間に顕著な差は認められなかった。今回の調査では、HRVの遺伝子群と軽度から中等度までの呼吸器症状との間に関連性はないことが示唆された。
［キーワード：ライノウイルス、分子疫学解析］
１

はじめに

２・２

マルチプレックス PCR 法

ライノウイルス(以下 HRV)はピコルナウイルス科エン16 種類の呼吸器系ウイルスを網羅的に検出するためにテロウイルス属の一本鎖RNAウイルスである。HRVは急性呼当所で開発したマルチプレックス PCR 法を用いた。マルチ吸器疾患の原因ウイルスであり、感冒や気管支炎、肺炎をプレックス PCR 法（4 グループのマルチプレックス PCR）

1)引き起こすことが知られている 。

は鼻汁検体より QIAamp Viral RNA mini Kit (Qiagen)をHRVs は 100 以 上 の 血 清 型 が あ る が 、 遺 伝 子 群 は A 群
2)

用いてウイルス RNA を抽出し、表 1 に示すプライマー及び（HRV-A）、B群（HRV-B）及びC群（HRV-C）に分類される 。

One-Step RT-PCR Kit (Qiagen)によって行った。各グルー

近年、この遺伝子群分類に基づくHRVと臨床症状との関連

プのアニーリング温度はグループ①、②及び④は 55℃、性について検討されてきており、HRV-Cが重症呼吸器症状

グループ③は 58℃とした。PCR 反応後、マイクロチップ電3)

気泳動装置 MultiNA（島津製作所社製）を用いて電気泳動の原因となるという報告もなされた 。
そこで、当所では2009年から2010年にかけて呼吸器症状を呈する小児を対象に検体を採取し、ライノウイルスの分を行った。陽性バンドが確認された検体についてはダイレ
クトシークエンスによりウイルスの同定を行った。

子疫学解析を行った。
２・３２

遺伝子群別はHRVのVP4/VP2領域の塩基配列549bpを系統材料及び方法

２・１

ライノウイルスの遺伝子群別検体解析することにより行った。表1-③に示すSRHI1/SRHI2プ

検体は 2009 年 5 月から 2010 年 10 月に呼吸器症状を呈ライマーを用いてVP4/VP2領域が増幅された69検体についした小児から採取した鼻汁 279 検体を用いた。小児の平均てダイレクトシークエンスにより塩基配列を決定した。遺月齢は 22 ヶ月齢（最小 2 ヶ月齢、最大 179 ヶ月齢）であ

伝子群別のための参照配列はYu Jinらの報告 4) を参考にった。性別は男性 146 名、女性 133 名であった。呼吸器症

DNA Data Bank of Japan (DDBJ) 5)から入手した(例：HRV-A;状の重度別に上気道炎、下気道炎、軽症喘鳴、及び中等度

DQ473507、HRV-B; DQ473486、HRV-C; EF582386)。系統解

喘鳴に分類した。なお、研究対象者へは承諾書により同意

析は塩基配列解析ソフトウェアMolecular Evolutionaryを得た。本研究計画は平成 22 年福岡県保健環境研究所疫Genetics Analysis (MEGA) version5 6)を用いClustalWに学研究倫理審査委員会において審査、承認されている（許より整列後、近隣結合法(Neighbor-Joining, NJ法)により可番号第 21-2 号、平成 22 年 5 月 10 日）。

系統樹を作成することにより行った。Bootstrap testは福岡県保健環境研究所（〒818-0315 太宰府市大字向佐野 39）)

1000回行った。

*1 松田小児科医院（〒816-0952 大野城市下大利 1-7-18）*2 久留米大学病院（〒830-0011 久留米市旭町 67 番地）-94-

表 1. マルチプレックス PCR 法に用いたプライマー
グループ

呼吸器ウイルスhRSV
Influenza virus A①

Influenza virus B
hMPV
Rhinovirus
Parainfluenza virus type 1
Parainfluenza virus type 2②

Parainfluenza virus type 3
Parainfluenza virus type 4
GAPDH
HCoV 229ERhinovirus③Influenza virus C
HCoV OC43
HCoV NL63
Rhinovirus

C. pneumoniae④Bocavirus

M pneumoniae
Adenovirus

プライマー名GGAACAAGTTGTTGAGGTTTATGAATATGC
TTCTGCTGTCAAGTCTAGTACACTGTAGTCAGAGACTTGAAGATGTCTTTGCTGG
GCTCTGTCCATGTTATTTG
AAAATTACACTGTTGGTTCGGTG
AGCGTTCCTAGTTTTACTTG
CCCTTTGTTTCAGGCCAAGCAGCTTCAACAGTAGCTG
CGGTAATTTTGTACGCCAGTTTGAAACACGGACACCCAAAGTAGT
CCGGTAATTTCTCATACCTATG
CCTTGGAGCGGAGTTGTTAAGAACAATCTGCTGCAGCATTTATGTCAGACAATGGGCAAATCTCGAGGTTGTCAGGATATAG
CTTTGGGAGTTGAACACAGTTCTGAACGGTTGCATTCAGGTTTGCATCAAGAATGAGTCCTTCATCCATGACAACTTTGGTATCGTG
CTCTTCCTCTTGTGCTCTTG
TGGCCCCATTAAAAATGTGT
CCTGAACACCTGAAGCCAATGCATCIGGYARYTTCCACCACCANCCGGGACCAACTACTTTGGGTGTCCGTGTACACTTCCAACCCAATTTGG
CCTGACAGCAACTCCCTCAT
GGCTTATGTGGCCCCTTACTGGCAAATCTGCCCAAGAATAATTAGGAATCAATTCAGCAAGCTGTGGATAACCAGTCGAAGTCACCTAGTTCCTACTTTGGGTGTCCGTGTTGGTAAYTTCCACCACCANCCTGACAACTGTAGAAATACAGC
CGCCTCTCTCCTATAAATGACCTCTGTAAGTACTATTACCTCTGTGTTGACTGAATACAGAAGGACCTGCAAGGGTTCGTCTCTAGCCATTACCTGCTAAGCCGAGAAGGGCGTGCGCAGGTAATGACTTTTGAGGTGGATCCCATGGA

vrsP1
vrsP2
mia1
mia2
mib1
mib2
hmpv1
hmpv2
NCR1
NCR2
PIS1+
PIS1PIP2+PIP2para3.1
para3.2
PIP4+
PIP4GAPDH1GAPDH2
MD1
MD3
SRHI1
SRHI2
CHAA
CHAD
MF1
MF3
N3-PCR2
N5-PCR2
EVP4
OL68-1CP16s1CP16s2188F
542R
MP16s1MP16s2
Adeno P1
Adeno P2

表 2-1. 呼吸器症状を呈する小児におけHRV感染
HRV単独
2種混合感染HRV/AdV
HRV/BoV
HRV/RSV
HRV/hMPV
HRV/Myco
HRV/PIV1
3種混合感染
HRV/BoV/AdV
HRV/PIV1/AdV
HRV/RSV/AdV
HRV以外
RSV
RSV/AdV
PIV1
PIV1/AdVPIV1/Myco
hMPV
AdV
EV68
EV68/AdV
BoV
CoV
Myco
不検出
合計

検出数

94
71
18
9331
115122112
372272
12485
122173
279

%

33.7
25.4
6.5
3.2
1.1
1.1
0.4
0.4
0.4
1.8
0.4
0.7
0.7
40.1
13.3
0.7
9.7
0.7
0.4
8.6
2.9
1.8
0.4
0.7
0.7
0.4
26.2100

参考文献

279

Cane and Pringle (1991)

212

Donofrio et al. (1992)

362

Donofrio et al. (1992)

416

S. Bellau-Pujol et al. (2005)

501

Andeweg AC et al. (1999)

317

Echevarria et al. (1998)

507

Echevarria et al. (1998)

189

Karron et al. (1994)

451

Aguilar et al. (2000)

564

Gueudin et al. (2003)

573

Vabret et al. (2001)

549

Savolainen et al. (2002)

485

Zhang and Evans (1991)

335

Vabret et al. (2001)

255

Astrid Vabret et al. (2005)

530

Shimizu H. et al. (1999)

463

Gaydos et al (1994)

354

Allander T et al. (2005)

277

F. J. M. van Kuppeveld et al. (1992)

134

Hierholzer JC et al. (1993)

表 2-2. 呼吸器症状の重度別にみた HRV 検出状況

る呼吸器系ウイルスの検出状況
検出されたウイルス

PCR産物
(bp)

配列 (5'→3')

検出された
ウイルス
HRV単独
HRV/AdV
HRV/BoV
HRV/RSV
HRV/hMPV
HRV/Myco
HRV/PIV1
HRV/BoV/AdV
HRV/PIV1/AdV
HRV/RSV/AdV
小計
HRV以外の呼吸器ウイルス
不検出
合計

呼吸器症状
上気道炎

下気道炎

軽症喘鳴

中等度喘鳴

714314452316117120

11216041680

12920104648
1886257

表 2-1 及び表 2-2 の略語説明：
HRV: Rhinovirus, PIV1: Parainfluenzavirus 1, hMPV: human Metapneumovirus,
AdV: Adenovirus, BoV: Bocavirus, Myco: Mycoplasma pneumoniae,
RSV: RSvirus, EV68: Enterovirus68, CoV: Coronavirus
混合感染について：
HRV/AdV は HRV と AdV の 2 種混合感染を示す。
HRV/BoV/AdV は HRV と BoV と AdV の 3 種混合感染を示す。

-95-

（47.8%）がHRV-Aに、1検体（1.4%）がHRV-Bに、35検体（50.8%）がHRV-Cに分類された。経時的にみると、HRVは調査期間において夏季にやや少なくなる傾向はあったものの毎月検出されており、HRV-AとHRV-Cの経時的な検出状況について差は認められなかった(図1)。呼吸器症状の重度別にHRV遺伝子群を分類した結果、HRV-A及びHRV-Cは症状が重度になるにつれ検出数が多い傾向にあったが、遺伝子群間の傾向の差は認められなかった(表3,図2)。今後、HRV感染が臨床症状に及ぼす影響を長期的な観察研究によ図 1. HRV-A,B,C 群の経時的検出状況り明らかにしたい。

表 3. HRV 遺伝子群別と呼吸器症状の分類
HRV遺伝子群
HRV-A
HRV-B
HRV-C
計

呼吸器症状
上気道炎

下気道炎

015690817

軽症喘鳴 中等度喘鳴

22018402046４計

まとめHRVは呼吸器症状を呈する小児279名中69名（33.7%）か3313569ら検出された。また、HRVは約25%の割合で他の呼吸器系ウイルスと混合感染しており、混合感染は軽度の呼吸器症状を引き起こす原因となるが、中等度以上の重症化の原因とはならないことが示唆された。さらに、遺伝子群別を行っ３た結果、HRV-Aは47.8%、HRV-Bは1.4%、HRV-Cは50.8%であ結果及び考察
マルチプレックスPCR法を用いて呼吸器症状を呈する小児の呼吸器系ウイルスの検出を行った結果を表2-1に示す。
HRVは94検体（33.7%）から検出され、そのうち71検体(75.5%)はHRV単独感染、18検体（19.1%）は2種混合感染、5検体（5.3%）は3種混合感染であった。HRV以外の呼吸器ウイルスは112検体(40.1%)から検出された。ウイルス別にみると、RSウイルスの検出数が最も多く37検体(13.3%)、次いでパラインフルエンザウイルス1型が27検体(9.7%)、ヒトメタニューモウイルスが24検体(8.6%)検出された。
HRVの検出状況を呼吸器症状の重度別に示す(表2-2)。
HRVは上気道炎を呈する小児20名中7名(35%)、下気道炎を呈する小児46名中20名(43%)、軽症喘鳴の小児188名中60名(32%)、中等度喘鳴の小児25名中7名(28%)から検出された。HRVの検出率は下気道炎を呈する小児において43%と最も高かったが、呼吸器症状の重度による大きな差は認められなかった。HRVと他の呼吸器ウイルスとの混合感染は、上気道炎を呈する小児は認められず、下気道炎を呈する小児20名中6名(30%)、軽症喘鳴の小児60名中16名(27%)、中等度喘鳴の小児7名中1名(14%)で認められた。また、HRVと他の呼吸器系ウイルスとの3種混合感染は軽症喘鳴の小児60名中4名（6.7%）にのみ検出された。混合感染の組み合わせは、HRVとアデノウイルスが同時に検出された検体が多かったが、アデノウイルスは年間通して検出されており、重症化との関連は今回の調査においては明らかにできなかった。
HRVが検出された69検体について、HRVのVP4/VP2領域の系統解析を行った結果を図2に示す。その結果、33検体ったが、遺伝子群と臨床症状との関連性は明らかにならなかった。
文献
1)

Rueckert, In Fields Virology, 609-654, 1996

2)

Palmenberg AC et al., Science, 324, 55-59, 2009

3)

J.Bizzintino et al., Eur Respir., 37, 1037-1042, 2011

4)

Yu Jin et al., J. Clin. Microbiol. 47, 2895-2900, 20095)

DNA Data Bank of Japan, http://www.ddbj.nig.ac.jp/

6)

Molecular

EvolutionaryGenetics

Analysis,

http://www.megasoftware.net/
7)

Cane and Pringle, J. Gen. Virol. 72, 349–357, 1991

8)

Donofrio et al., PCR Methods Appl.,1, 263–268, 1992

9)

Bellau-Pujol et al., J. Virol. Methods., 126, 53–63, 2005

10) Andeweg AC et al., J. Clin. Microbiol. 37, 524-530, 1999
11) Echevarria et al., J. Clin. Microbiol., 36, 1388–139, 1998
12) Karron et al., J. Clin. Microbiol., 32, 484–488, 1994
13) Aguilar et al., J. Clin. Microbiol., 38, 1191–1195, 2000
14) Gueudin et al., J. Virol. Methods, 109, 39–45, 2003
15) Savolainen et al., Respir. Rev., 4, 91–98, 2002
16) Zhang and Evans, J. Virol. Methods.,1991
17) Astrid et al., Emerg Infect Dis., 11, 1225–1229, 200518) Shimizu H. et al., Jpn.J.Infect.Dis., 52, 12-15,1999
19) Gaydos et al., J. Clin. Microbiol., 32, 903-905, 199420) Allander T et al., Proc Natl Acad Sci USA, 102,12891-12896, 200521) Kuppeveld et al., App. Env. Micro., 2606-2615,1992
22) Hierholzer et al., J Clin Microbiol, 3, 1886–1891, 1993-96-図 2. HRV の系統樹解析結果＊サンプルは呼吸器症状の重度別に、○:上気道炎、●:下気道炎、△:軽症喘鳴、▲:中等度喘鳴をサンプル名の前に付記する。記号のない配列は参照株を示す（例：EF582386）。

（英文要旨）

Molecular Epidemiologic Analysis of the Rhinovirus in Fukuoka
Hideaki YOSHITOMI，Tetsuya ISHIBASHI, Tomofumi NAKAMURA, Nobuyuki SERA, andKentarou MATSUDA*1
Fukuoka Institute of Health and Environmental Sciences,
Mukaizano 39, Dazaifu, Fukuoka 818-0135, Japan*1 Matsuda Children’s Hospital, Shimoori 1-7-18, Onojyou, Fukuoka 816-0952, Japan*1 Kurume University Hospital, asahi-machi 67,Kurume, Fukuoka 830-0011, Japan
To investigate prevalence of rhinovirus, we carried out an exhaustive search of the respiratory virus. Among 279 children withrespiratory symptoms, HRV was detected from 94 samples (33.7%) and had coinfected with other respiratory virus at a rate ofapproximately 25 %. In addition, as a result of phylogenic analysis of 69 samples, 33 samples (47.8%) were classified as HRV-A,
1 sample (1.4%) was classified as HRV-B, and 35 samples (50.8%) were classified as HRV-C. However, there was no significant
relationship between detected HRV-genogroup and the clinical symptom of the patient.
[Key words ; Rhinovirus , Molecular evolutionary analysis]-97-