福岡県保健環境研究所年報第43号，132－135，2016

資料
CHROMagarTM C.perfringens（トライアル品）を用いたエンテロトキシン
遺伝子陽性ウェルシュ菌の糞便検体からの添加回収
世良暢之・前田詠里子・丸田直子・重村洋明・西田雅博・
曽根美紀*・加藤直樹*・小林昭彦*・大西貴弘**
食中毒の病因物質となり得るエンテロトキシン遺伝子陽性ウェルシュ菌が、エンテロトキシン遺伝子陰性ウェルシュ菌やその他のクロストリジウム属菌等の夾雑菌を添加した糞便から効率的に回収できるかどうかについて、3 種類の培地（ECW+培地、CCP 培地及び TSC 培地）を用いて検討した。その結果、夾雑菌を添加した糞便からのウェルシュ菌の回収率は非常に低く、食中毒事例発生時において有症者便からエンテロトキシン遺伝子陽性ウェルシュ菌を分離することは困難を極めると思われた。しかしながら、従来から用いられている ECW+培地に加え、CCP 培地を併用することで、分離できる可能性がわずかながら上昇した。これ
らの結果から、糞便検査において、エンテロトキシン遺伝子陽性ウェルシュ菌を試験検査する際には、従来から用いられている ECW+培地に加え、CCP 培地を併用することが有用であると思われた。
［キーワード：ウェルシュ菌、CHROMagarTM C. perfringens（トライアル品）、添加回収］
１されたウェルシュ菌Clostridium perfringens S7（エンテロはじめにウェルシュ菌による食中毒事例発生時において、病因トキシン遺伝子陰性株）及びC.perfringens S9（エンテロ物質であるエンテロトキシン遺伝子陽性ウェルシュ菌トキシン遺伝子陽性株）、理化学研究所より購入したクを効率良く分離することは迅速な原因究明をする上でロ ス ト リ ジ ウ ム 属 菌 （ C.bifermentans DSM14991 、非常に重要である。ここでは、新しく開発された酵素基

C.sporogenes

質を添加して発育集落の色調により識別を容易にした

C.sordellii JCM3814）の6株を用いた。

CHROMagarTM C. perfringens（CHROMagar 社、トライア(2) 培地JCM1416 、 C.difficile

DSM1296 及 びル品、以下 CCP 培地）が糞便からのエンテロトキシン

培地はECW+培地、CCP培地及びTSC培地を用い、卵遺伝子陽性ウェルシュ菌の分離に有用であるかどうか

黄液は卵黄乳液EX（関東化学）を用いた。対照培地にを検証するため、卵黄反応を釣菌指標とするカナマイシ

はGAM寒天培地（日水製薬、以下GAM培地）を用いた。

ン含有卵黄加 CW 寒天培地（基礎培地：日水製薬、以下(3) 糞便添加回収のための糞便には、ウェルシュ菌が含まれてECW+培地）及び卵黄反応と黒色集落を釣菌指標とする
Trypton sulphite cycloserine 寒天培地（Oxoid 社、以下 TSCいないことを確認した糞便を選定した（表1）。

培地）と比較検討した。

2. 方法(1) 試験菌液の調整

２

試験菌原液は、保存しておいたウェルシュ菌及びクロ研究材料及び方法

1. 材料

ストリジウム属菌を変法チオグリコレート培地（日水製(1) 供試菌株薬）に接種し、アネロパックケンキ（三菱ガス化学）を用いて、35±1℃で22±2時間嫌気培養した培養菌液とした。

供試菌株は、さいたま市健康科学研究センターで分離

試験菌液の希釈は、試験菌原液をYamamoto-Osakiら1)の嫌気性希釈液を用いて10倍から107 倍まで100倍或いは福岡県保健環境研究所 （〒818-0135 太宰府市大字向佐野 39）*
さいたま市健康科学研究センター

10倍段階希釈して用いた。

（〒338-0013 さいたま市中央区鈴谷 7-5-12）(2) 培養培養は、発育菌数の測定ではMiles&Misraら 2) の方法**

国立医薬品食品衛生研究所（以下ミスラ法）を用い、その他の試験においては画線（〒158-0098 東京都世田谷区上用賀 1-18-1）-132-

も、ECW+培地及びCCP培地からは回収が可能であった培養法を用い、アネロパックケンキを用いて、35±1℃で22±2時間、嫌気培養した。

が、TSC培地からは回収されなかった（表3）。

(3) 便への添加回収試験（3）添加回収試験3
ウェルシュ菌（C.perfringens S7及びS9の両方）と夾雑

1) 添加回収試験1（回収率の検討）
生食8.9mlにウェルシュ菌（C.perfringens S7或いはS9菌であるクロストリジウム属菌4種類を同時に共存させ、のいずれか、試験菌原液）0.1mlを添加し、1分間、混釈

C.perfringens S9（エンテロトキシン遺伝子陽性株）が回した。上記に便1ｇを添加して、さらに1分間、混釈した。

収できるかどうかについて検討した結果、試験菌原液の混釈液を、嫌気性希釈液で、10倍段階希釈した後、3種エンテロトキシン遺伝子陽性ウェルシュ菌を添加した類の培地各2枚に、ミスラ法で滴下し、嫌気培養した。

際には、ECW+培地及びCCP培地においてのみ、回収が可能であった（表4）。

2) 添加回収試験2（ウェルシュ菌の検出）
生食8.5mlにウェルシュ菌（C. perfringens S7或いはS9のいずれか、試験菌原液、100倍段階希釈）0.1ml、クロ４考察

ス ト リ ジ ウ ム 属 菌 （ C.bifermentans 、 C.sporogenes 、ウェルシュ菌分離用に新しく開発されたCCP培地が、C.difficile及びC.sordellii）各0.1mlを添加し、1分間、混釈

エンテロトキシン遺伝子陽性ウェルシュ菌を糞便からした。上記に便1ｇを添加して、さらに1分間、混釈した。

効率的に分離できるどうか検証するため、従来から用い3種類の培地各2枚に、画線し、嫌気培養した。

られている2種類の培地（ECW+培地及びTSC培地）と比3)

添加回収試験3（エンテロトキシン遺伝子陽性ウ較検討した。その結果、エンテロトキシン遺伝子陽性ウェルシュ菌の検出）

ェルシュ菌を、エンテロトキシン遺伝子陰性株及びその生食8.4mlにウェルシュ菌（C.perfringens S7及びS9の両夾雑菌であるクロストリジウム属菌を同時に添加した

方、試験菌原液、10倍段階希釈）各0.1ml、クロストリ糞便から回収することは非常に難しいことが分かった。

ジウム属菌（C.bifermentans、C.sporogenes、C.difficile及

特に抗生物質を投与されている有症者便からの回収はびC.sordellii）各0.1mlを添加し、1分間、混釈した。上記

非常に困難であり、抗生物質投与前の糞便を確保するこに便1ｇを添加して、さらに1分間、混釈した。3種類のとが食中毒発生時の原因究明には非常に大事であると培地各2枚に、画線し、嫌気培養した。3種類の培地2枚思われた。今回の試験で、食中毒事例発生時等においてから、培地の種類毎に10集落を釣菌し、PCRで、エンテ有症者便等からエンテロトキシン遺伝子陽性のウェルロトキシン遺伝子を確認した。

シュ菌を分離する際には困難が予想されるものの、従来(4) エンテロトキシン遺伝子の確認から用いられているECW+培地に加え、新しく開発されたCCP培地を併用することが有用であると思われた。

ウェルシュ菌のDNAは、分離した単一コロニーの中心部から滅菌チップなどで菌体を釣菌、100㎕の滅菌蒸留水に懸濁し、95℃で5分間加熱後、遠心分離により菌体文献の残渣を除いた上清液を使用した。PCRはタカラバイオ1 ） Takako Yamamoto-Osaki, Shigeru Kamiya, SadaakiのCPE-1&2（S020）に従い、20㎕系で実施した。

Sawamura, Masanori Kai and Atsushi Ozawa: Growth
inhibition of Clostridium difficile by intestinal flora of infant

３

結果

faces in continuous flow culture., J. Med. Microbioli., 40,（1）添加回収試験1

179－187, (1994).
2）坂崎利一, 新

ウェルシュ菌のみ（C.perfringens S7或いはS9のいずれ

細菌培地学講座・上, 200－211, 近代出版, (1978).

か）を3種類の糞便へ添加し、3種類の培地を用いて回収試験を実施した結果、抗生物質投与済みの便からは全く回収されなかった。それ以外の便からの回収率も低く、数％～20数％程度で、培地による差は認められなかった

謝辞
本研究は、平成27年度厚生労働科学研究費補助金「食（表2）。

品中の食中毒菌等の遺伝特性及び制御に関する研究（2）添加回収試験2（H25-食品-一般-014）」により行った。本研究を進める

ウェルシュ菌（C.perfringens S7或いはS9のいずれか）にあたり、CHROMagarTM C.perfringens（トライアル品）に夾雑菌であるクロストリジウム属菌4種類を同時に共を提供いただきました関東化学株式会社の関係各位、当存させた際の添加回収について検討した結果、試験菌原所の香月進所長、岡元冬樹氏、さいたま市健康科学研究液のウェルシュ菌を添加した際には、夾雑菌が存在してセンターの宮﨑元伸所長に深謝いたします。

-133-

表1
表 1 添加回収に使用した糞便検体の情報
添加回収に使用した糞便検体の情報
検体番号

便１有症者

喫食場所 潜伏時間

24歳、男

飲食店

約30時間

症状
水様性下痢
嘔吐

抗生物質

5回／日
2回／日

検査結果
細菌・寄生虫ウイルス

備考

クラリシッド錠200mg

陰性

ノロウイルスGII.17－無し

ブドウ球菌検出

実施せず

ヒラメからクドア検出

無し

陰性

実施せず

ヒラメからクドア検出

嘔気

便２

31歳、男

飲食店

約6時間

水様性下痢

5～6回／日

嘔吐
嘔気

10回／日

発熱

37.9℃

頭痛
悪寒
倦怠感
水様性下痢
嘔吐

2～3回／日5回／日嘔気
便３

30歳、女性

飲食店

約9時間

発熱

37.5℃

頭痛
悪寒
倦怠感

表2表 ウェルシュ菌のみを糞便に添加した際の3種類の培地からの回収試験結果
2 ウェルシュ菌のみを糞便に添加した際の 3 種類の培地からの回収試験結果
供試菌株
ウェルシュ菌
添加菌量（cfu/g）

C.perfringens
S7

C.perfringensS9添加材料

比較検討した培地（cfu/g）
ECW
CCP
TSC

875,000

便１0(0%)

1(0%)

2(0%)

875,000

便２

39,167(4.48%)

64,500(7.37%)

132,500(15.1%)

875,000

便３433(0.05%)

8,000(0.91%)

67,500(7.71%)

125,000

便１0(0%)

1(0%)

0(0%)

125,000

便２

7,000(5.60%)

30,500(24.4%)

6,000(4.80%)

125,000

便３8(0.01%)

1,850(1.48%)

1,625(1.30%)-134-表 3 ウェルシュ菌に夾雑菌としてその他のクロストリジウム属菌を同時に添加した際の回収試験結果
表3 ウェルシュ菌に夾雑菌としてその他のクロストリジウム属菌を同時に添加した際の回収試験結果

ウェルシュ菌供試菌株
添加菌量（cfu/g）

添加材料

875,000
8750便１88875,000

C.perfrinens

8750

S7

便２88875,000
8750

便３88125,0001250

便１13125,000

C.perfrinens
1250

S9

便２13125,000
1250

便３13

添加した夾雑菌（cfu/g）
クロストリウム属菌

ECW

ウェルシュ菌の回収
CCP
TSC

C. bifermentans , 8.1x105
4.3x105
C. sporogenes ,9.9x101
C. difficile ,1.3x105
C. sordellii ,---------

C. bifermentans , 8.1x105
C. sporogenes ,4.3x105
9.9x101
C. difficile ,C. sordellii ,1.3x105++-------

C. bifermentans , 8.1x105
4.3x105
C. sporogenes ,9.9x101
C. difficile ,1.3x105
C. sordellii ,-+-------

C. bifermentans , 8.1x105
4.3x105
C. sporogenes ,9.9x101
C. difficile ,1.3x105
C. sordellii ,---------

C. bifermentans , 8.1x105
C. sporogenes ,4.3x105
9.9x101
C. difficile ,1.3x105
C. sordellii ,-+-------

C. bifermentans , 8.1x105
4.3x105
C. sporogenes ,C. difficile ,9.9x101
C. sordellii ,1.3x105-+-------（＋、回収可能、－、回収不可）

表 4 エンテロトキシン遺伝子陽性ウェルシュ菌に、エンテロトキシン遺伝子陰性ウェルシュ菌及び
表4 エンテロトキシン遺伝子陽性ウェルシュ菌に、エンテロトキシン遺伝子陰性ウェルシュ菌及びその他のクロストリジウム属菌を同時に添加した際の回収試験結果
その他のクロストリジウム属菌を同時に添加した際の回収試験結果
供試菌株
添加菌量
ウェルシュ菌（cfu/g）

C.perfrinens
S9C.perfrinens
S9C.perfrinens
S9125,000
12,500
1,250
125
13

125,000
12,5001,250
125
13125,000
12,500
1,250
125
13

添加材料

添加したウェルシュ菌及び夾雑菌（cfu/g）
ウェルシュ菌クロストリジウム属菌
S7

エンテロトキシン遺伝子陽性
ウェルシュ菌の集落数
ECWCCPTSC

便１875,000
87,5008,75087588

C. bifermentan s, 8.1x105
C. sporogenes ,4.3x105
C. difficile ,9.9x101
C. sordellii ,1.3x105

000000000000000

便２875,000
87,500
8,750
875
88

C. bifermentans , 8.1x105
C. sporogenes ,4.3x105
C. difficile ,9.9x101
C. sordellii ,1.3x105

100
00

20000

0000
0

便３875,000
87,500
8,750
875
88

C. bifermentans , 8.1x105
C. sporogenes ,4.3x105
C. difficile ,9.9x101
C. sordellii ,1.3x105

000002000000000-135-