LC Technical Note

ポストカラムHPLCによるビタミンB1の分析

LT010
GL Sciences Inc.

GL-7400高速液体クロマトグラフィーを用いた、ポストカラムHPLCによるビタミンB1の分析をご紹介します。
この分析は、ビタミンB1であるチアミンりん酸エステル類を酵素処理しチアミンを生成させた後、抽出液をカラムクロマトにより精製しHPLCに注入する手法です。
ODSカラムで分離されたチアミンは、アルカリ条件下でフェリシアン化カリウムと反応させることで、蛍光物質のチオクロームが生成され、蛍光検出器を用いて選択的かつ高感度に検出することができます。
また、カラムクロマト精製では、食品衛生検査指針で示されているパームチット法ではなく、参考法として記載されている、固相カートリッジを用いました。固相カートリッジを使うことで、より簡便に前処理が可能になりました。

ビタミンB1の分析( 10μg/L)( 10μg/L)

1. Thiamine
2. Hydroxyethylthiamine (HET) ※1

FLU2010202Time4(min)6標準液のクロマトグラム※1：ヒドロキシエチレンチアミンもB1に含まれます。

分析条件・流路図
Pump

Autosampler

GL-7410GL-7420

Column Oven （40℃）

FL Detector
GL-7450

Inertsil ODS-3
反応コイル

GL-7430
デガッサー内蔵Ex : 375 nm Em : 440 nm

Pump
GL-7410

A：溶離液 B：溶離液

反応液

8000000

HPLC 条件・ カラム

Inertsil ODS-3 (5μm, 150 x 4.6 mm I.D.)

・ 温度
・ 検出器
・ 注入量

20μL

・ 溶離液: A) CH3OH

Thiaminey = 68430x + 16331
R2 = 1.000

40℃

6000000

y = 66977x + 4122

FL Ex 375 nm Em 440 nm

5000000
面積値7000000

B)りん酸緩衝液

R2 = 1.0000

4000000

A/B = 1/9, v/v

3000000

・ 流速: 0.8 mL/min

2000000

・ 反応液: 0.05w/v%フェリシアン化カリウム

1000000+15w/v%NaOH, 0.4mL/min

HET0・ 反応コイル :長さ5m, 内径0.33mm

0りん酸緩衝液 ：0.01M りん酸二水素ナトリウム+0.15M 過塩素酸ナトリウム混液（pH2.2）

2040

6080

100

濃度（μg/L）

検量線

https://www.gls.co.jp/technique/app/app search.html

GL Sciences LC Technical Note

食品中ビタミンB1前処理例

固相抽出
InertSep SlimJ
SCX 500mg

試料－2g

抽出

コンディショニング
－メタノール 5mL－精製水 5mL－酢酸緩衝液 5mL－ 0.1M 塩酸50mL
加熱撹拌（沸騰水浴中30min）
冷却（50℃以下）(4M 酢酸ナトリウム20mL,50%酢酸10mLを精製水で1Lにしたもの)

酵素処理
通液－ 4M 酢酸ナトリウム溶液でｐH4.0-4.5に調整－ タカジアスターゼ溶液 5mL
加温（37℃、一夜）冷却－抽出液 10mL

洗浄

定容

－ 精製水 5mL
－ 70%メタノール水 5mL※2－ 酢酸緩衝液で100mLに定容

溶出－ メタノール：25%KCｌ-0.1M HCｌ（2：8）
混液 10mL－ 25%KCｌ-0.1M HCｌ 8mL

ろ過－ 遠心分離3000rpm,10min※2－ 0.45μｍ クロマトディスク※2

定容－20mLに定容－希釈※2

抽出液

ポストカラムHPLC-FL

固相抽出へ※2：この行程は必要に応じて行って下さい。

チアミンりん酸エステル
下図のクロマトグラムは、酵素処理を行わなかったときの測定例です。
総ビタミンB1を測定する場合には、酵素処理を行って下さい。
1. Thiamine triphosphate
2. Thiamine diphosphate
3. Thiamine monophosphate
4. Thiamine
35. HET( 各100μg/L)

2002450100FLU

1024Time (min)6

固相抽出の効果（うなぎの蒲焼抽出液）
1. Thiamine
2. Hydroxyethylthiamine (HET)

固相抽出を行うことで、夾雑物の除去が可能です。

固相抽出なし固相抽出あり48 10 12 14466FLU

クリーンアップ

1FLU

8 10 12 141220022024Time (min)6024Time (min)6

GL Sciences LC Technical Note

食品中ビタミンB1測定例
豚肉抽出液

60

1. Thiamine
2. Hydroxyethylthiamine (HET)FLU401020202Time4(min)6FLU4060

ほうれん草抽出液020

102Time4(min)6粉ミルク抽出液

020FLU4060

102Time4(min)6チオクローム蛍光化
チオクロームとは、アルカリ性溶液中のチアミンにフェリシアン化カリウムやブロムシアンを作用させると生じる蛍光物質で、この青紫色の蛍光がビタミンB1の定量に用いられます。
CH3CH3N+N

N

CH2CH2OH
CH3N

NH2Thiamine

SN

反 応

CH2CH2OH
CH3NN

S

Thiochrome
Structures are created using Chemistry 4-D Draw which is provided by ChemInnovation Software, Inc.

GL Sciences LC Technical Note

使用装置 ・ 器具
固相カラム：

エンプティーリザーバー：

InertSep SlimJ SCX
500mg 50本入り（包装単位5個）
Cat. No. 5010-65540

12mL フリットなし 20本入り
Cat. No. 5010-60103（写真下はフリットです。フリットなし
タイプには含まれません。
左から4番目のサイズです。）（写真左側）

136542固相抽出マニホールド：
GL-SPE吸引マニホールドシステム
Cat.No. 5010-50001
内容：
1.吸引マニホールドキット
2.ダイアフラム真空ポンプ
3.吸引ろ過ビン
4.減圧ホース
5.ストップコック
6.スピッツ管（2種類）

1

試験管と試験管ラック：1.GL-SPE濃縮管1.0mL&2.0mLメス／20mL 6本入
Cat. No. 5010-51020

22.SPE吸引マニホールド用 20mL濃縮管受けラック＆ロートセット
Cat. No. 5010-50037

3HPLC装置：GL-7400 シリーズ

14分析カラム：
Inertsil ODS-3 5μm, 150 x 4.6 mm I.D.
Cat.No. 5020-01731

番号12345品名
蛍光検出器
ポンプ × 2台
キャリアリザーバー
カラムオーブン
オートサンプラー

型番GL-7453
GL-7410GL-7480
GL-7430
GL-7420252