福岡県保健環境研究所年報第43号，65－69，2016

原著
終末処理場の流入水を利用したポリオウイルス環境水サーベイランス
濱﨑光宏・吉冨秀亮・芦塚由紀・中村麻子・世良暢之・吉田弘*
2012年9月、経口生ポリオワクチン（OPV）に替わり不活化ポリオワクチン（IPV）が我が国の定期予防接種に加えられた。本研究では、OPVからIPVへの移行期において環境中に存在するポリオウイルス（PV）の消長を追跡するため、九州北部に位置する2箇所の終末処理場で採水された流入水を用いてエンテロウイルス特にPVを中心とした環境水サーベイランスを行った。2010年4月から2015年3月までの60か月間で62株のPVが分離された。PVの分離頻度は都市部の終末処理場で高く、農村部の約1.7倍となった。VP1領域の遺伝子配列解析の結果、得られたPVは全てがワクチン株であり、2型が最も多かった。主にPVが分離されたのはOPV中止前であったが、IPV移行後も流域に侵入したPVを分離することが出来た。我々の研究からOPVからIPVへの移行期においてOPVワクチン接種者から排出されるポリオウイルスワクチン株を高感度に分離し、ワクチン由来ポリオウイルスや野生株の出現を監視することの重要性が改めて示唆された。
［キーワード：ポリオウイルス、環境水サーベイランス］
１

日本で確認されたPV野生株は、1980年にポリオ患者から分はじめにポリオウイルス（PV）は、ピコルナウイルス科のエンテ離されたPVが最後であり、以後、患者由来の野生株は確認

ロウイルス属に所属しエンベローブを持たない一本鎖RNAされていない4）。また、ポリオの排除状態を維持するため、ウイルスである1）。PV粒子は、直径約30nmの正二十面体構OPVを約50年間、主に春と秋に定期予防接種を行ってきた。

造であり、抗原決定部位であるVP1を含む4つの異なるカプ

しかし、OPVは生ワクチンのため、ワクチン関連の麻痺性

2）シドタンパクで構成されている 。PVの感染経路は、他の灰白髄炎（VAPP）が希に発生する。この問題を解決するた

エンテロウイルス（NPEVs）と同様に糞便–経口感染であり、めに、2012年9月に不活化ポリオウイルスワクチン（IPV）

ウイルスは腸管で効率的に増殖する2)。感染したPVは、約2が 導 入 さ れ た 。 2012 年 11 月 か ら は 4 種 混 合 ワ ク チ ン3）

ヶ月間糞便に排泄されることが知られている 。PVが感染（DTP-IPV）として定期予防接種（生後3か月から12か月のした人の大部分は不顕性感染であるが、まれに一部の患者間に3回接種、生後12か月から18か月の間に1回接種）に導においてウイルス血症から灰白髄炎（ポリオ）となり、結入されている5)。ワクチン接種率を比較すると2009年から果として後遺性の弛緩性麻痺を呈する場合がある。

2011年春までは83.4%から99.4%の間で推移していたが、1960年代に多くの先進国で経口ポリオワクチン（OPV）OPVからIPVへ切り替わる直前の2012年春のワクチン接種が導入されたため、ポリオの流行は一部の地域を除いて見率は、67.2%とかなり低い水準であった 6)。これは、VAPPられなくなった。1988年、世界保健総会において、ポリオの懸念があったため一時的なワクチン接種控えによるもを世界中から根絶する決議が採択され、「ポリオ撲滅のたのと考えられている7）。

めのグローバルイニシアティブ」が世界保健機関（WHO）、環境水サーベイランスは、下水や河川等の環境水から病国際ロータリー、米国疾病予防管理センター及びユニセフ原体を検出する方法で、顕性、不顕性に関わらずヒト集団により押し進められている。大規模なOPV接種が功を奏し内で流行しているウイルスを検出することが可能である。

ポリオ患者は激減した。2016年現在のポリオ常在国は、パ感染源の特定ができないと言う短所はあるが、不顕性感染キスタンとアフガニスタンである。WHOは、野生株及びワが多いPVの様なエンテロウイルスを検出するのに有効なクチン由来PV（VDPV）の動向について監視を強化している。

方法で多くの国で実施されている8～10）。ポリオ排除国において、ポリオ常在国からの野生株の輸入やVDPVの出現を監

福岡県保健環境研究所 （〒818-0135 太宰府市大字向佐野 39）*国立感染症研究所ウイルス第二部（〒208-0011 東京都武蔵村山市学園 4-7-1）

視することは、ポリオ排除状態を維持するためには重要である。WHOポリオ根絶の最終段階戦略とその実施計画において、環境水サーベイランスの強化が推奨されている11)。

-65-また、エンテロウイルス感染症において、患者サーベイラガス存在下でさらに 1 週間観察した。CPE が認められた検ンスと環境水サーベイランスは関連があり、環境水サーベ体は、PV 確認のため L20B 細胞へ接種し 34℃、5%炭酸ガス

イランスで検出されたウイルスが流域で流行しているウ存在下で 1 週間観察した 15）。

イルスを反映していることが知られている12）。本研究では、OPVからIPVへ移行期を含む2010年4月から2015年3月の２・４60ヵ月間において、2カ所の終末処理場の流入水からのPVの分離状況について報告する。

PVの血清型の同定

L20B細胞でCPEが認められた検体のPVの確認と血清型は、中和試験（NT）により決定した。培養上清を分取しウイルス力価を測定し、100 CCID 50に調整した。NTは、ポリオ型

２材料と方法特異的プール血清であるエンテロウイルスNT試薬「生研」

２・１ 検体

混合A、混合B、混合C、混合D（デンカ生研）及びポリオウ

検体は、九州北部にある2カ所の終末処理場（AおよびB）

イルスＮＴ試薬「生研」を用いて行った。NTは、抗血清20Uから流入水を毎月2L入手し検体とした。A終末処理場は都と、100 CCID50のウイルス溶液を等量混合し、2時間中和市部に位置し、高い下水道普及率（80％以上）であるが、反応を行った後、L20B細胞に接種し34℃、5%炭酸ガス存在

B終末処理場は農村部に位置し、低い下水道普及率（30％下で1週間観察した。

13）以下）である 。流域人口は、A終末処理場が約19万人、B終末処理場が約18万人であり二つの終末処理場間でほぼ２・５PVのVP1領域のシーケンス同程度であった。OPVを接種する推奨年齢（0-2歳）の子供

分離されたPVがワクチン株かどうかを決定するためPVの人口は、A終末処理場が7000人、B終末処理場が4200人でのVP1領域を標的にしたPCRを行い、塩基配列を決定した。

あった（表1）。採取した流入水は、濃縮処理するまで4℃

ウイルスRNAをQIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen社）をで保存した。

用いてウイルス培養液から抽出し、UG1 / UC11特異的プライマーセット16）とOne Step RT-PCR Kit（Qiagen社）を用

２・２

検体の濃縮

いてRT-PCRを行った。PCR産物の確認は2%アガロースゲル

検体の濃縮は Nakamura らの方法に従って行った

14）。流電気泳動で行い、増幅が認められたPCR産物は、Illustra

入水 1L を 4℃で 1,500g×30 分遠心分離を行った。塩化マ

ExoStar（GE Healthcare社）で精製した。塩基配列の決定

グネシウムを終濃度 0.05 M になるように上清に添加し、は、BigDyeターミネーターv3.1サイクルシークエンシング

塩酸で pH3.5 に調整した。上清を陰電化フィルター（0.45キット（Applied Biosystems社）を用いてサイクルシーケμm の孔径のフィルター、アドバンテック、東京、日本）

ン ス を 行 い 、 3130 XL ジ ェ ネ テ ィ ッ ク ア ナ ラ イ ザ ーで濾過した。MediFASTH2 ホモジナイザー（オムニ・イン（Applied Biosystems）を用いて塩基配列を決定した。PVターナショナル）を用いて 3％牛肉エキス 10mL でフィルのVP1配列の完全長は、MEGA5ソフトウェア17）を用いて多ターに結合したウイルスを溶出した。16,000g×30 分遠心重整列を行いワクチン株と比較した。 本研究で用いたワ分離を行い破砕したフィルターを除去し、0.22μm の孔径

クチン株の参照配列は、PV1型Sabin1株（AY082688、906PVDF 膜フィルター（ミリポア）で濾過し 100 倍濃縮検体塩基対）、PV2型Sabin2株（AY082679、903塩基対）及びPV3とした。100 倍濃縮検体は、細胞へ接種するまで 4℃で保型Sabin3株（AY082683、900塩基対）を用いた。

存した。
３２・３

ウイルス分離結果
九州北部の2か所の終末処理場から得られた流入水を3

ウイルス分離に使用した細胞は、Vero-E6 細胞、FL 細胞種類の細胞（Vero E6細胞、FL細胞及びRD-18S細胞）に接及び RD-18S 細胞の 3 種類を用いた。Vero-E6 細胞及び FL種した。2010年4月から2013年1月までの検出結果は、細胞は、American Type Culture Collection（ATCC）からNakamuraらの報告14)を引用した。調査期間である2010年4購入し、RD-18S 細胞は愛知県衛生研究所から分与しても月から2015年3月までの60ヵ月間で646検体の陽性検体をらった。細胞は、10%FBS（ウシ胎児血清）添加ダルベッコ

得た。CPE陽性検体をL20B細胞へ再接種した後、L20B細胞5改変イーグル MEM 培地に約 2×10 個/mL の細胞浮遊液としで159検体のCPEを確認した。そのうち、PVは62株、ポリオ24 穴マルチプレートに 1mL ずつ分注した。100 倍濃縮検体

ウイルス以外のエンテロウイルス（NPEV）が97株検出されを各細胞 4 穴に 0.1mL ずつ接種し 34℃、5%炭酸ガス存在た（表1）。検出されたPVの内訳は、PV1型が17株、PV2型下で 1 週間観察した。細胞変性効果（CPE）が認められなが27株、PV3型が18株であった。分離されたPVのVP1領域のかった検体は、新しい細胞浮遊液に接種し、34℃、5%炭酸塩基配列をSabin株と比較した。PV1型及びPV3型は塩基配-66-

表1 採水した2箇所の終末処理場において分離されたポリオウイルス
終末処理場 流域の環境 流域人口AB

都市部農村部

190,000
180,000

2歳以下の 下水道普流域人口 及率
7,000
4,200

合計

80%以上
30%以下

330(171)316(194)

L20B細胞でのCPE
陽性数*
99(51)
60(35)

ポリオウ
イルス分離株数*
3923(2)646(365)

159(86)62*

CPE陽性数*

分離株の血清型

ポリオ1型 ポリオ2型 ポリオ3型
13418
9810(2)172718(2)*：（）内の数は2013年2月から2015年3月までの期間に検出された数。2010年4月から2013年1月までの期間に検出された数はNakamuraらの報告14）を引用した。

図1 採水した2箇所の終末処理場から分離されたポリオウイルスとポリオ以外のエンテロウイルス（NPEV）
2010年4月から2013年1月までの期間に検出された数はNakamuraらの報告14）を引用した。

列の変異率が1%未満、PV2型は0.6%未満をワクチン株とし消失していた。一方、NPEVsは、ほぼ毎月検出されている。
また、2014年10月にB終末処理場からPV3型が分離された。

た。その結果、分離された全てのPVはワクチン株であった。
各終末処理場のPVの分離率を比較すると、A終末処理場か流域の下水道普及率が高いA終末処理場からのPVの分離はら分離されたPVの数はB終末処理場から分離されたPVの約無く、B終末処理場においても11月以降のPVの分離は無か1.7倍多かった。

ったため、分離されたPVは一過性のものであったと考えら

研究期間中に検出されたPVとNPEVの検出数を図1に示す。

れる。PVが県内に流行していないことを確認するため、PVは定期予防接種後、約2か月から3か月間分離されており、2014年4月から10月にかけて感染症発生動向調査で搬入さPVの分離は定期予防接種を反映したものと考えられる。

れた無菌性髄膜炎、感染性胃腸炎、手足口病及びヘルパンIPVへ移行する前（2012年9月以前）、A終末処理場ではギーナ患者由来の検体についてL20B細胞へ接種しPVの分

2012年5月、B終末処理場では2011年11月までPVは分離され離を試みたが、全て陰性であった。なお、感染症流行予測た。2012年9月以降、IPVの予防接種は全国で行われている。

調査術式に従いウイルス分離を行った結果、PV3型は6株分

PVは、OPVからIPVに移行する前に終末処理場の流入水から離され全てワクチン株であることが確認された。

-67-

４へ移行した後もPVは、感染した場合、ほとんどが不顕性感

考察
環境水サーベイランスは、腸管に感染するウイルスを顕染でありヒトの腸管内で増殖中に変異を起こしVDPVが出性、不顕性に関係なく検出できるため、不顕性感染が多い

現することが懸念される25）。環境水サーベイランスは流行

PV感染症のサーベイランスには適している。特に世界的な地域から野生型PVの侵入だけでなく、ポリオ根絶の最終段

ポリオ根絶のためには、PVが排除された地域において、PV階であるOPVからIPVへの世界的な移行前のVDPV出現を監の環境サーベイランスは患者サーベイランスと並んで重視するために重要な役割を果たすと考えられる。

要である。我々はOPVからIPVへ移行する際、環境中でのPVの動向を調査するため、九州北部にある都市部と農村部に文献位置する2つの終末処理場の流入水を用いて60カ月間、環境水サーベイランスを実施した。分離された62株のPVは、全てワクチン株であった。2つの終末処理場の流入水から分離されたPVの分離株数の差は、下水道普及率と2歳児以下の流域人口数の違いを反映したものと考えられる。また、
IPVに移行後、流域内に侵入したPVを検出することが出来た。依然として近隣諸国ではOPVを使用しており、観光客が持ち込んだものと推測されるが侵入経路は不明である。
日本では、使い捨ておむつの使用頻度が高い（約80%以上）ことが知られている18）。OPVを接種した子供の糞便を

1) Committee on Enteroviruses. : Virology., 16,501-504, 1962.
2) M. Pallansch & R. Roos : Fields Virology 5thedition., 840-893, 2007.
3) Alexander JP Jr, Gary HE Jr & Pallansch MA. : J.

Infect. Dis., 175, 176-182, 1997.
4) Hara M et al.: Microbiol. Immunol., 31, 327-336,
1987.
5) K. Okada et al.: J. Infect. Dis., 208, 275-283,
2013.

含む使い捨ておむつが適切に処理され、廃棄されている場

6) 厚生労働省：平成24年度春 急性灰白髄炎（ポリオ）合、流入水からのPV分離率はかなり低くなると考えられる。

予 防 接 種 率 の 調 査 結 果 ま と め ,しかし、今回の我々の研究結果から、定期接種時期とほぼ

http://www.mhlw.go.jp/bunya/kenkou/polio/dl/12

重なる時期にPVが検出されている。このことは、OPVを接1102-1.pdf （2016/06/22アクセス）

種した子供達の便、又は、OPVを接種した子供から感染し

7) M. Hosoda et al.: Lancet., 379, 520, 2012.

たヒトの便が下水に流入していることを示している。実際

8) HG. van der Avoort et al.: Epidemiol. Infect., 114,に、OPVを接種した子供からの家族内感染事例が報告され19）ている 。家族内感染以外では、幼稚園などの学校施設での感染も考えられるが20）、NPEVは家族内感染を広く引き起21）こすことが報告されており 、PVに関しても同様に主に家族内感染が起こっていると考えられる。また、今回我々の研究からPVが分離される時期はOPVの定期接種時期と関連があることを示している。Huangらの報告

22）481-491, 1995.
9) H. Yoshida et al.: J. Gen. Virol., 83, 1107-1111,
2002.
10) L. El Bassioni et al.: Am. J. Epidemiol., 158,807-815, 2003.
11) World

HealthOrganization.

:2013

PolioやMuellerら

Eradication and Endgame Strategic Plan 2013–2018,の報告23）では、OPVからIPVへ移行する際、OPV接種中止後

http://www.polioeradication.org/resourcelibrar

2～3か月以内に下水からPV分離数が急速に減少すること

y/strategyandwork.aspx （2016/06/22アクセス）を示している。今回の我々の報告では、OPVからIPVに移行

12) Pathogen

surveillancesysteminJapan

andする前に下水からPVが消失していた。2012年5月に政府がInfectious Agents Surveillance Report. :IASR., 31,

OPVからIPVへの移行を発表して以降、VAPPの懸念からOPV

69-70, 2010.の接種率が減少したことに起因していると考えられる7）。

13) 国土交通省九州地方整備局：下水道処理人口普及率,

今後、OPVからIPVへ移行後のVAPP症例について注視していhttp://www.qsr.mlit.go.jp/n-park/city/index_e024）

2_a.html （2016/06/22アクセス）

く必要がある 。
環境水サーベイランスは高感度にPVを検出できる方法であり、我々は定期予防接種でOPVを接種した集団からPV

14) T. Nakamura et al.: Appl. Environ. Microbiol., 81,1859-1864, 2015.

を検出することが出来た。また、IPV移行後も侵入経路は

15) DJ. Wood, B. Hull: J Med Virol., 58, 188-192, 1999.

不明であるが、流域地域内に侵入してきたPVを検出するこ16) S. Guillot et al.: J. Virol., 74, 8434-8443, 2000.とが出来た。OPVからIPVへの移行は、PVの世界的な根絶に

17) K. Tamura et al.: Mol. Biol. Evol., 28, 2731-2739,

向けての必要不可欠な過程であるが、その際、OPVの接種率を高く保ったままIPVへ移行することが重要である。IPV-68-2011.
18) 竹下友子，甲斐今日子、乳幼児のおむつ使用の実態

と今日的課題：佐賀大学文化教育学部研究論文集, 15,22) QS. Huang et al.: Lancet., 366, 394-396, 2005.

237-247, 2011.

23) JE. Mueller et al.: Appl. Environ. Microbiol., 75,19) M. Sugieda et al.: Jpn. J. Infect. Dis., 59,1395-1401, 2009.
24) LN. Alexander et al.: JAMA., 292, 1696-1701, 2004.

277-278, 2006.
20) M. Benyesh-Melnick et al.: Am. J. Epidemiol., 86,25) E. Anis et al.: Euro Surveill., 18, 20586, 2013.

112–136, 1967.
21) M. Iwai et al.: Clin. Vaccine Immunol., 17,764-770, 2010.

（英文要旨）

Environmental Surveillance of Poliovirus in Sewage
Mitsuhiro HAMASAKI, Hideaki YOSHITOMI, Yuki ASHIZUKA, Asako NAKAMURA, Nobuyuki SERA,
and Hiromu YOSHIDA*Fukuoka Institute of Health and Environmental Sciences,
Mukaizano 39, Dazaifu, Fukuoka 818-0135, Japan* Department of Virology II, National Institute of Infectious Diseases,
4-7-1 Gakuen, Musashimurayama-shi, Tokyo 208-0011, JapanTo trace polioviruses (PVs) within communities, environmental surveillance was conducted at two independent sewage plants inurban and rural areas in the northern prefectures of Kyushu, Japan. Over 60 months from April 2010 to March 2015, 62 PVs wereisolated. The frequency of PV isolation at the urban plant was 1.7-times that at the rural plant. Molecular sequence analysis of theviral VP1 gene identified all three serotypes, and the most prevalent serotype was type 2. Nearly all PV isolates exhibited morethan one mutation from the Sabin vaccine strains. During this study, inactivated poliovirus vaccine (IPV) was introduced forroutine immunization on September 1, 2012, replacing the live oral poliovirus vaccine (OPV). Much of the PV was isolated fromthe sewage before OPV cessation. However, some of the PV that entered the basin was isolated after the transition from OPV toIPV. Our study highlights the importance of environmental surveillance during the OPV to IPV transition period to detect theexcretion of PVs in an OPV-immunized population.
[Key words ; poliovirus , environmental surveillance]-69-