地球環境 Vol.24 No.1

33─42（2019）

非意図的副生物を含む工業製剤の安全性評価：
In vitro レポーター遺伝子アッセイと LC/QTofMS による縮合型リン系難燃剤の影響指向分析
Safety evaluation of technical chemical mixture containing unintentional byproduct:
Effect-based analysis of oligomeric and polymeric phosphorus-containing flame retardants byusing in vitro reporter gene assays and LC/QTofMS
鈴木 剛＊・松神 秀徳
Go SUZUKI and Hidenori MATSUKAMI
国立研究開発法人 国立環境研究所 資源循環・廃棄物研究センター
Center for Material Cycles and Waste Management Research, National Institute for Environmental Studies

摘要工業製剤の安全性評価は，一般的に構成主体を想定して実施される。しかしながら，有機顔料中の PCBs，臭素系難燃剤中の臭素化ダイオキシン類や 2,4,6─トリブロ
モフェノールのように，構成主体よりも高い毒性や環境放散性を有する非意図的副生物が含まれる工業製剤が存在する。その結果，構成主体のみの安全性評価だけでは，含有非意図的副生物のリスク性が見過ごされてしまう場合や，非意図的副生物によるリスク性が評価されないことで構成主体の有用性が損なわれてしまう場合がある。本
研究では，プラスチック樹脂や繊維製品中に汎用される縮合型リン系難燃剤を対象として，当該問題の把握に，in vitro レポーター遺伝子アッセイと先端機器分析による影響指向分析を適用した。本研究によって，縮合型リン系難燃剤は，オリゴマー化やポリマー化といった縮合体化を通じて，環境放散性が低くなるだけでなく，生物利用能も低くなり毒性発現能も低下することが示された。これは，環境負荷低減化や安全性確保の観点から，縮合体化が化成品の適切なデザインとなり得ることを示唆する。
一方で，縮合型リン系難燃剤による影響には，モノマーや水酸基が導入されている関連物質等の非意図的副生物の関与があると推定された。

キーワード：in vitro レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 ア ッ セ イ， 影 響 指 向 分 析，LC/QTofMS，
工業製剤，縮合型リン系難燃剤

keywords：in vitro reporter gene assay, effect-based analysis, LC/QTofMS,
technical chemical mixture, phosphorus-containing flame retardant

1.

はじめに

プラスチック樹脂や繊維製品中に使用される縮合型 リ ン 系 難 燃 剤（Despinasse and Schartel, 2012;
Pawlowski and Schartel, 2007）は，オリゴマー化やポリマー化等縮合して製造され分子量が大きくなる
ことから，モノマー型リン系難燃剤と比較して揮発等を通じた環境放散性が低くなると考えられている。人体への影響の観点においても，縮合型については，分子量が大きくなることで生体内への取り込
みや標的組織での生物利用能が下がり，毒性発現能も低下していることが期待される。したがって縮合体化は，環境上適切な化成品のデザインの在り方と捉えることができる。一方で，有機顔料中の PCBs

（環境省）や臭素系難燃剤（BFR：Brominated Flame
Retardant）中の臭素化ダイオキシン類（酒井・滝上，
2013）や 2,4,6─ ト リ ブ ロ モ フ ェ ノ ー ル（ 鈴 木 ほ か，
2013）を例として，構成主体の化成品よりも高い毒性や環境放散性を有する非意図的副生物が含まれる
工業製剤が存在することがあり，含有非意図的副生物によるリスク性が無視できない場合がある。
縮合型リン系難燃剤は，ストックホルム条約上で残 留 性 有 機 汚 染 物 質（POPs：Persistent Organic
Pollutants）として規制されたヘキサブロモシクロド
デカンやデカブロモジフェニルエーテルといった臭素系難燃剤（POP─BFR）の主要な代替物になると考えられている。縮合型リン系難燃剤は，既に一般家
庭 や オ フ ィ ス な ど の 室 内 環 境（Brandsma et al.,

受付：2019 年 3 月 2 日，受理：2019 年 5 月 14 日＊
〒 305-8506 茨城県つくば市小野川 16-2，E-mail：g-suzuki@nies.go.jp
2019 AIRIES33

鈴木・松神：非意図的副生物を含む工業製剤の安全性評価

2013），廃電気電子機器リサイクル現場周辺の屋外
環境（Matsukami et al., 2015a）等 に 遍 在 し て い る。
製剤含有の非意図的副生物についても，同様に環境中に移行していると推察される。縮合型リン系難燃剤の含有成分としては，重合体とそのモノマー型リン系難燃剤の混合物であるといわれており（Brady
et al., 1995; Bright et al., 1997; 大八化学工業株式会
社，1988, 1996; Gunkel and Barda, 1992; Levchik etal., 2000; Pakalin et al., 2007; Rossi and Heine, 2007;
Syracuse Research Corporation, 2006），我々の既報
研究（Matsukami et al., 2015b）によってモノマー型
リン系難燃剤以外の非意図的副生物の存在も明らかとなった。一方で，非意図的副生物の影響への関与を明らかにする工業製剤の評価はこれまで実施されてこなかった。
本研究では，POP─BFR の代替物と考えられている縮合型リン系難燃剤のうち，国内外で広く販売されている 4 種類の工業製剤を対象として，in vitro
レポーター遺伝子アッセイと液体クロマトグラフ─
四重極飛行時間型質量分析計（LC/QTofMS）による
影響指向分析を行なった。具体的には，in vitro レ
ポーター遺伝子アッセイによる工業製剤の影響評価を実施して，検出された影響の種類や強度に基づいて評価重要度が高いと判断された工業製剤含有成分を対象に，セミミクロ HPLC による分離・分画を行ない，得られた画分について in vitro レポーター
遺伝子アッセイと LC/QTofMS による影響評価／ノンターゲット分析を実施した。得られた結果に基づいて，影響関連物質を推定して縮合型リン系難燃剤の安全性やリスク性を考察した。
2.

方法

2.1. 縮合型リン系難燃剤
本研究では，国内外で販売されている 1,3─フェニ
レンビス（ジフェニルホスフェート）（PBDPP），ビス フ ェ ノ ー ル A ビ ス（ジ フ ェ ニ ル ホ スフ ェ ー ト）
（BPA─BDPP），1,3─フェニレンビス［ジ（2,6─ジメチ
ルフェニル）ホスフェート］（PBDMPP），ジエチレ
ングリコールビス［ジ（2─クロロイソプロピル）ホスフェート］（DEG─BDCIPP）の 4 種類の縮合型リン系
難燃剤の工業製剤を使用した（図 1）。
2.2. In vitro バイオアッセイによる工業製剤の
影響評価
2.2.1. 縮合型リン系難燃剤の調製
縮 合 型 リ ン 系 難 燃 剤 を 30 mg 秤 量 後，1 ml のDMSO に定容して製剤原液を調製した。試験時には，製剤原液で影響が確認されたものについて，用量反応データを取得するために段階的な希釈を行なった。本研究では細胞への曝露濃度を 0.1％ DMSO
性状：常温で液状
特性：耐熱性に優れている
用途：各種エンジニアリングプラスチック（耐熱性等特定の機能を強化しているプラスチックの総称）や合成繊維の難燃剤として使用される

1,3─フェニレン ビス（ジフェニルホスフェート）（PBDPP）
性状：常温で液状
特性：耐加水分解性，耐熱性に優れている
用途：各種エンジニアリングプラスチックや合成繊維の難燃剤として使用される

ビスフェノール A ビス（ジフェニルホスフェート）（BPA─BDPP）
性状：常温で粉状特性：耐加水分解性，耐熱性に優れており，粉状で取り扱いが容易である
用途：各種エンジニアリングプラスチック，エポキ
シ樹脂，合成繊維，粘接着剤の難燃剤として使用される（PBDMPP）
1,3─フェニレン ビス［ジ（2,6─ジメチルフェニル）ホスフェート］
性状：常温で液状
特性：耐スコーチ性に優れ，耐加水分解性や構成主体の揮発性が極めて低い
用途：軟質ウレタンフォーム，エラストマー，塗料，成形品ウレタン樹脂全般にわたって難燃剤として使用される（DEG─BDCIPP）
ジエチレングリコール ビス［ジ（2─クロロイソプロピル）ホスフェート］

図1

34

本研究で対象とした 4 種類の縮合型リン系難燃剤．

地球環境 Vol.24 No.1

表1

33─42
（2019）

本研究で使用した in vitro レポーター遺伝子アッセイ．

適用手法

対象核内受容体

核内受容体の機能

AR─CALUX アッセイ

ヒト・アンドロゲン受容体（AR）

男性ホルモン作用ERα─CALUX アッセイ

ヒト・エストロゲン受容体α（ERα）

女性ホルモン作用PR─CALUX アッセイ

ヒト・プロゲステロン受容体（PR）

妊娠準備・維持作用

PPARγ2─CALUX アッセイ

ヒト・ペルオキシソーム増殖活性化受容体γ2（PPARγ2） 脂肪細胞の調節，血糖降下作用とするため，最高濃度の 30 mg/ml の製剤原液を曝露する場合は細胞への曝露濃度が 30μg/ml となる。
2.2.2. In vitro レポーター遺伝子アッセイ
本研究では，オランダ・BioDetection Systems b.
v. で開発された表 1 に示す核内受容体結合レポータ
ー遺伝子アッセイを用いて，縮合型リン系難燃剤の各種核内受容体の作動性（アゴニスト活性）及び拮抗性（アンタゴニスト活性）を評価した。影響指標は，生殖毒性や発達神経毒性等に着目して，ヒトのアン
ドロゲン受容体（AR），エストロゲン受容体アルファ（ERα），プロゲステロン受容体（PR）等のアゴニ
スト及びアンタゴニスト活性とした。AR，ERα及び PR のアゴニスト及びアンタゴニスト活性は，
EU で実施された臭素系難燃剤のリスク評価プロジ
ェクト（FIRE：Flame retardants Integrated Risk
assessment for Endocrine effects）に採用された実績を有する（Hamars et al., 2006）。また，既報研究において，当該レポーター遺伝子アッセイで AR アン
タゴニスト及び ERαアゴニストとしてスクリーニ
ングされたモノマー型リン系難燃剤（Suzuki et al.,2013）は，マウス哺乳類毒性試験で生殖や社会性行動に影響を与えることが確認されている（Kamishima et al., 2018; Nakayama et al.,unpublished; Sano et al., unpublished）。これらのマウス哺乳類毒性試験の結果に基づくと，当該レポー
ター遺伝子アッセイは生殖毒性や発達神経毒性のス
クリーニング手法として有用であると考えられる。
影響評価は，外来遺伝子であるホタルのルシフェ
ラーゼ遺伝子を安定的に挿入した組み換えヒト骨肉腫（U2OS）細 胞 を 用 い て 既 報 に 準 じ て 実 施 し た（Suzuki et al., 2013）。概要を以下に示す。U2OS 細胞は，培養用培地を用いて，37℃ 及び 5％ CO2 の条件で培養した。影響評価を行なう際には，培養フラスコ中の U2OS 細胞を，96well マイクロプレー
トに 9,000─12,000 cells/well の濃度で播種して，約24 時間培養した。アゴニスト活性試験では，96well
マイクロプレートの各 well から培地を除去した後，
DMSO に溶解した各種標準物質溶液と製剤原液・希釈液を培養用培地に対して 0.1％ DMSO 濃度になるように添加して調製した培地を各 well に添加
し，U2OS 細胞への曝露を行なった。曝露 24 時間
後，受容体結合に基づいて誘導されたルシフェラー
ゼ活性をルミノメーターで測定した。アゴニスト活性試験では用量反応を示し，アゴニスト標準物質の最高濃度の活性を 100％ とした際の相対活性が 5％（REC5）以上であった場合にアゴニスト活性有りと判断した。アンタゴニスト活性試験では，96well マ
イクロプレートの各 well から培地を除去した後，アゴニスト標準物質溶液と製剤原液・希釈液を培養用培地に対してそれぞれ 0.1％ になるように添加して調製した培地（この場合，0.2％ DMSO）を各 wellに添加して，U2OS 細胞への曝露を行なった。アン
タゴニスト活性試験では，次の 3 種類の試験を順に実施して活性の有無を判断した：試験①最高濃度の活性に対して 50％ を示す濃度（EC50）のアゴニスト
標準物質との共曝露試験を行ない，曝露 24 時間後に活性を測定した。得られた活性が用量反応を示
し，アンタゴニスト標準物質の最高濃度の阻害活性を 100％ とした際の相対阻害活性が 20％（RIC20）以上であった場合に，試験②を実施した。試験②試験①と同様の曝露を行ない，細胞毒性を評価した。試験①で示された相対阻害活性が細胞毒性に因らないことを確認できた場合，試験③を実施した。試験③
EC50 の 100 倍の濃度のアゴニスト標準物質との共曝露試験を行ない，曝露 24 時間後に活性を測定した。試験①で観察された阻害が，過剰量のアゴニス
ト標準物質との共曝露試験（試験③）で回復した（阻害されない）場合に，受容体特異的なアンタゴニス
ト活性と判断した。
2.2.3. データ解析
本研究では，各種試験を少なくとも n＝3 で実施した。アゴニスト活性試験及びアンタゴニスト活性試験で用量反応を示した縮合型リン系難燃剤については，SigmaPlot 13 を用いてシグモイド曲線を描（共曝露したアゴニスト標準物質に
き，EC50 と IC50よる活性を 50％ 阻害する濃度）を算出した。
2.3. 影響関連物質のプロファイリング
縮合型リン系難燃剤には，構成主体のオリゴマー体あるいはポリマー体のリン系難燃剤以外にも，合成未反応物や分解生成物と想定される非意図的副生
物 が 含 ま れ て い る（Brady et al., 1995; Bright et al.,
1997; 大 八 化 学 工 業 株 式 会 社，1988, 1996; Gunkel
and Barda, 1992; Levchik et al., 2000; Matsukami etal., 2015b; Pakalin et al., 2007; Rossi and Heine, 2007;
Syracuse Research Corporation, 2006）。従って影響評価では，これらを含む全ての製剤含有成分による影響を評価している。本研究では，製剤含有成分から主要な影響関連物質を推定するために，製剤含有35鈴木・松神：非意図的副生物を含む工業製剤の安全性評価の影響関連物質のプロファイリングを実施した。テトラヒドロフラン（THF, tetrahydrofuran）に溶解した各種縮合型リン系難燃剤（10 mg/ml）を
セミミクロ HPLC に供して，溶離時間に応じて溶離液を 96 deep well プレートに分取した。分離カラ
ムには，昭和電工株式会社製の KF─402HQ（内径：4.6 mm，長さ：250 mm，ポリスチレンでの排除限界：5,000）を使用した。移動相には，高速液体クロマトグラフ用 THF（安定剤不含）をメンブレンフィ
ルターでろ過したものを要時調製して使用した。分
離カラムの温度は 40℃，移動相の流速は 0.3 ml，サンプルの注入量は 2 μl（20 μg 相当量）とした。分
取した溶離液は，3％ DMSO/ ヘキサン洗浄水を添加後，THF を除去して，影響評価に供して影響を示す溶離液画分を選定した。当該溶離液画分を対象として，LC/QTofMS を用いたノンターゲット分析を実施して製剤含有成分を評価した。
2.4. LC/QTofMS を用いたノンターゲット分析による工業製剤の含有成分評価
2.4.1. 縮合型及びモノマー型リン系難燃剤の調製
縮合型リン系難燃剤を 10 mg 秤量後，10 ml のTHF に定容した 1,000 μg/ml の製剤原液を調製した。製剤原液を THF で 100 倍希釈した 10μg/ml の製剤希釈液を調製した。製剤中不純物と想定されるモノマー型リン系難燃剤のリン酸トリス（2─クロロ
イ ソ プ ロ ピ ル）
（TCIPP），リン酸トリフェニル（TPHP），リン酸トリス
（2,6─ ジ メ チ ル フ ェ ニ ル）
（TDMPP）の同定及び定量には，それぞれ和光純薬工業株式会社製，東京化成工業株式会社製，林純薬工業株式会社製の標準物質を使用した。各標準物質を正確に 10 mg 秤量後，10 ml の THF に定容した
1,000 μg/ml の標準原液を調製した。各標準原液を，5 水準
THF で 20 倍希釈した後（濃度：50 μg/ml）の濃度（0.01，0.05，0.2，1，5 μg/ml）に希釈した標
準希釈液を調製した。
2.4.2. LC/QTofMS
測定装置には，アジレント・テクノロジー株式会
社製の Agilent 6530 Accurate─Mass Q─TOF LC/MS
システム（LC/QTofMS）
を使用した。分離カラムには，
昭和電工株式会社製の KF─402HQ（内径：4.6 mm，
長 さ：250 mm， ポ リ ス チ レ ン で の 排 除 限 界：
5,000）を使用した。移動相には高速液体クロマトグ
ラフ用 THF（安定剤不含）を使用し，分離カラムの温度は 30℃，移動相の流速は 0.3 ml，サンプルの注（APPI）─
入量は 5 μl に設定した。大気圧光イオン化
QTofMS のキャピラリー電圧は 3,500 V，フラグメ
ンターは 150 V，スキマーは 65 V に設定した。乾燥
ガス及び気化ガスの温度は，それぞれ 350℃ 及び300℃ に設定した。ネブライザーガスの圧力は 50
psi（345 kPa）に設定した。コリジョンガスにはアルゴン（＞99.9999％）を使用した。精密質量データの取得及び解析には，アジレント・テクノロジー株式
36

会社製の MassHunter ソフトウェアを使用した。
2.4.3. モノマー型リン系難燃剤の同定及び定量
製剤希釈液と標準希釈液を対象として，m/z 100～3,200 の質量範囲で MS 測定を行い，製剤含有のモノマー型リン系難燃剤を同定した。具体的には，製剤含有成分のうち，標準物質で検出された分子量
関連イオンの精密質量と保持時間が一致する成分を確認した。標準物質の分子量関連イオンをプリカー
サーイオンに設定して m/z 50～1,500 の質量範囲でMSMS 測定を行い，標準物質で確認されたプロダ
クトイオンが一致することを確認した。製剤中モノ
マー型リン系難燃剤は次の手順で定量した。測定用
標準溶液及び測定用製剤溶液について MS 測定で得られた質量データの中からモノマーの標準物質で確認された分子量関連イオンの抽出イオンクロマトグ
ラム（EIC）を±20 ppm の質量範囲で作成した。モノ
マー型リン系難燃剤のピーク面積を求め，測定用標
準溶液の濃度比から絶対検量線法に基づき定量値を求めた。当該測定法では，0.01～5 μg/ml の範囲で作成した標準物質の検量線の相関係数が 0.99 以上であり良好な直線性が確認された。製剤含有成分のカラム分離，イオン化，飛行時間型質量分析計（Time─
of─flight Mass Spectrometer：TofMS）の精密質量分離により，モノマー型リン系難燃剤の正確な定量を干渉するオリゴマー型リン系難燃剤や不純物等は確認されなかった。3 回繰り返し測定で得られた定量
値の変動係数（C. V.）は，0.9～6.6％ の範囲であり，安定した定量分析が可能であった。分析工程における汚染は検出下限以下であることが確認された。
2.4.4. その他製剤含有成分の推定
製剤希釈液を対象として，m/z 100～3,200 の質
量範囲で MS 測定を行い，製剤含有成分の分子量関
連イオンの精密質量に基づいて元素組成を決定した。各成分の分子量関連イオンをプリカーサーイオ
ンに設定して m/z 50～1,500 の質量範囲で MSMS
測定を行った。MSMS 測定時に設定したコリジョ
ン電圧値は各成分の開裂に適した値を検討した。各
成分のプロダクトイオンの精密質量から開裂経路を解析し，化学構造に基づいて構成成分を推定した。
3.

結果と考察

3.1. 縮合型リン系難燃剤の含有成分
縮合型リン系難燃剤の含有成分の詳細分析評価
は，我々の既報（Matsukami et al., 2015b）で詳述した。含有成分の構成については，本研究でも重要な情報であるため，要約して以下に記述する。
縮合型リン系難燃剤の含有成分は，分子サイズで分 離 後，APPI 条 件 下 で 水 素 付 加 イ オ ン と な り，
TofMS で精密質量分離され，ポジティブイオンモードで検出された。分子量関連イオンの精密質量につい て EIC を 作 成 し た 結 果，PBDPP で は 6 成 分，

地球環境 Vol.24 No.1

BPA─BDPP で は 6 成 分，PBDMPP で は 4 成 分，
DEG─BDCIPP では 9 成分が，各製剤の含有成分と推定された。PBDPP 及び BPA─BDPP では，構成成分の 1 成分が TPHP 標準物質の分子量関連イオンの精密質量及び保持時間と一致した。PBDMPP では，
1 成 分 が TDMPP の 標 準 物 質 と 一 致 し た。DEG─
BDCIPP では，TCIPP の標準物質と一致した。さらに，製剤中 TPHP，TDMPP，TCIPP と各標準物質のプロダクトイオンが一致することも確認された。
標準希釈液及び製剤希釈液の MS 測定データから作成した EIC を用いて，製剤中のモノマー型リン系難燃剤（TPHP，TDMPP，TCIPP）のピーク面積を求めて絶対検量線法に基づき定量値を求めた（表 2）。
PBDPP 及び BPA─BDPP 中 TPHP の含有量はそれ
ぞれ 2.0％ 及び 1.2％，PBDMPP 中 TDMPP の含有
量 は 2.8％ で あ っ た。PBDPP，BPA─BDPP 及 び
PBDMPP は，オキシ塩化リンと二価のフェノール
系化合物及びフェノール（またはアルキルフェノー
ル）との反応によって製造され（Daihachi Chemical
Industry, 1988; Gunkel and Barda, 1992; Brady et al.,
1995）
，PBDPP には 5％ 未満の TPHP，BPA─BDPPには 3％ 未満の TPHP が含まれると報告されている（Bright et al., 1997; Levchik et al., 2000; Pakalin etal., 2007; Rossi and Heine, 2007; Syracuse Research
Corporation, 2006）。DEG─BDCIPP 中 TCIPP の 含
有量は 5.7％ であった。DEG─BDCIPP は，触媒の存在下で，アルキレンオキサイドとオキシ塩化リンとの反応によって製造され，6％ 未満の TCIPP を含有することが報告されている（Daihachi Chemical
Industry, 1996）。我々の結果は，既報と同程度であった。PBDMPP 中 TDMPP の含有量は，我々が初めて報告した。
MS 測定で検出された PBDPP の 6 成分，BPA─
BDPP の 6 成 分，PBDMPP の 4 成 分，DEG─
BDCIPP の 9 成分を対象に MSMS 測定を実施した。
各成分のプロダクトイオンの精密質量から元素組成を決定し，開裂経路を解明して化学構造の候補を探索した。PBDPP では，TPHP とダイマーからペンタマーまでのオリゴマー，リン酸［（3─ヒドロキシフェニル）ジフェニル］（HP─DPHP）が含有成分と推定
表2

33─42
（2019）された。BPA─BDPP では，TPHP とダイマーからテトラマーまでのオリゴマー，リン酸［（4─［2─（4─ヒ
ドロキシフェニル）プロパン─2─イル］フェニル）ジフェニル］（BPA─DPHP）などの BPA─BDPP の類縁物
質 が 含 有 成 分 と 推 定 さ れ た。PBDMPP で は，
TDMPP とダイマーとトリマーのオリゴマー，リン酸［（3─ヒドロキシフェニル）ジ（2,6─ジメチルフェニ
ル）］（HP─2,6─DDMPP）が 含 有 成 分 と 推 定 さ れ た。
DEG─BDCIPP では，TCIPP とダイマーからペンタマーまでのオリゴマー，TCIPP 及び DEG─BDCIPPの類縁物質が含有成分と推定された。
3.2. 縮合型リン系難燃剤の影響評価
縮合型リン系難燃剤の影響を評価した結果，ERα
アゴニスト活性，AR アンタゴニスト活性及び PR
アンタゴニスト活性が検出された。PBDPP 及び
DEG─BDCIPP では ERαアゴニスト活性と AR アン
タゴニスト活性及び PR アンタゴニスト活性が，
BPA─BDPP 及び PBDMPP では ERαアゴニスト活性と PR アンタゴニスト活性が検出されている。縮合型リン系難燃剤の ERαアゴニスト活性，AR アン
タゴニスト活性及び PR アンタゴニスト活性の用量
反応を図 2～図 4 に示す。各用量反応から算出した
REC5，EC50 及び RIC20 を表 3 に示す。
縮合型リン系難燃剤の ERαアゴニスト活性については，REC5 に基づく影響強度の順位が PBDMPP＞PBDPP＞BPA─BDPP＞DEG─BDCIPP となっており，ポリマー体の DEG─BDCIPP で最も活性が低かった。評価濃度範囲で得られた用量反応に基づくと，PBDPP と PBDMPP は，17β─ エストラジオー
ル（E2: ERαアゴニスト標準物質）と類似の用量反応性を示す ERαアゴニスト活性であると考えられた。
RIC20 に基づく影響強度の順位は，AR アンタゴニ
スト活性で PBDPP＞DEG─BDCIPP，PR アンタゴ
ニ ス ト 活 性 で PBDPP＞PBDMPP＝DEG─BDCIPP＞BPA─BDPP であった。評価濃度範囲で得られた
用量反応に基づくと，PBDPP はフルタミド（AR ア
ンタゴニスト標準物質）あるいは RU486（PR アンタ
ゴニスト標準物質）と類似の用量反応性を示す AR
アンタゴニストあるいは PR アンタゴニストであると考えられた。

縮合型リン系難燃剤含有のモノマー型リン系難燃剤の含有量（Matsukami et al., 2015b）
．
TPHP

対象製剤

濃度（mg/g）

TDMPP
重量％

濃度（mg/g）

TCIPP
重量％

濃度（mg/g）

重量％

平均

標準偏差

平均

平均

標準偏差

平均

平均

標準偏差

平均

PBDPP

20

0.55

2.0

─

─

─

─

─

─

BPA─BDPP

12

0.11

1.2

─

─

─

─

─

─

PBDMPP

─

─

─

28

0.88

2.8

─

─

─

DEG─BDCIPP

─

─

─

─

─

─

57

3.8

5.7

─：測定していない37

鈴木・松神：非意図的副生物を含む工業製剤の安全性評価

図2 7β─ エストラジオール
1（E2：アゴニスト標準物
質）と縮合型リン系難燃剤の ERαアゴニスト活性の用量反応．

図3 フ
 ルタミド（アンタゴニスト標準物質）と縮合型
リン系難燃剤の AR アンタゴニスト活性の用量反
応．

38

図4

 U486R（ アンタゴニスト標準物質）と縮合型リン系難燃剤の PR アンタゴニスト活性の用量反応．

縮合型リン系難燃剤の構造から推測されるように，PBDPP と BPA─BDPP に は TPHP が，
PBDMPP に は TDMPP が，DEG─BDCIPP に は
TCIPP が，それぞれ不純物として数％ 程度含まれている（表 2）。縮合型リン系難燃剤の影響強度を評価するために，各縮合型製剤に関連のあるモノマー型リン系難燃剤が示す影響と比較考察を行なった。
モノマー型リン系難燃剤については，既報において検出される影響の種類や強度を明らかにしている（Suzuki et al., 2013）。既報で明らかにした TPHP，
TDMPP 及び TCIPP の REC5 あるいは RIC20 をモルベースから重量ベースに換えると，ERαアゴニスト
活 性 の REC5 は TPHP で 0.33 mg/l，TDMPP で0.0041 mg/l，TCIPP で＞3.3 mg/l，AR アンタゴニ
ス ト 活 性 の RIC20 は TPHP で 0.98 mg/l，TDMPP
で 0.41 mg/l，TCIPP で 3.3 mg/l，PR アンタゴニス
ト 活 性 の RIC20 は TPHP で 0.33 mg/l，TDMPP で0.41 mg/l，TCIPP で 0.98 mg/l となる。これらの影
響 濃 度 を 縮 合 型 リ ン 系 難 燃 剤 の REC5 あ る い は
RIC20 と比較すると，いずれも関連するモノマー型
リン系難燃剤よりも影響濃度が高くなっており，影響の強度が低くなっていることが示された（図 1 と表 3 参照：PBDPP と TPHP，BPA─BDPP と TPHP，
PBDMPP と TDMPP，DEG─BDCIPP と TCIPP）。

地球環境 Vol.24 No.1

表3

33─42
（2019）

縮合型リン系難燃剤のアゴニスト活性（REC5）とアンタゴニスト活性（RIC20）．
アゴニスト（mg/l）

試験物質

E2
Flutamide

アンタゴニスト（mg/l）

ERα

AR

PR

REC5

EC50

RIC20

IC50

8.2×10－8

9.7×10－7

─

─

─

─

2.8×10－2

1.8×10

－1

RIC20

IC50

─

─

─

─
－6

4.1×10－5

RU486

─

─

─

─

4.3×10

PBDPP

1.0

1.1

3.0

3.6

1.0

2.2

NC

NE

NC

3.0×10NC

BPA─BDPP

1.0×10－1

PBDMPP

3.0×10

1.3

NE

NC

3.0

NC

DEG─BDCIPP

3.0×10NC

3.0×10NC

3.0

1.4×10で活性なし，NC：計算できない
─：試験を実施していない，NE：最高濃度（30 mg/l）

さらに表 2 に示す各製剤に関連するモノマー型
リン系難燃剤の含有濃度に基づいて，各種活性への寄与を算出し，上記の縮合型リン系難燃剤の結果と比 較 し た。 既 報（Suzuki et al., 2013）に よ る と，
TPHP と TMDPP が ERαアゴニスト活性と AR アン
タゴニスト活性及び PR アンタゴニスト活性を，
TCIPP が AR アンタゴニスト活性及び PR アンタゴ
ニスト活性を有しており，縮合型リン系難燃剤で検出されるハザードは，各縮合型リン系難燃剤含有のモノマー型リン系難燃剤で検出される影響の種類と概ねよく一致している。一方で，実験的に評価された縮合型リン系難燃剤の影響強度は，含有モノマー型リン系難燃剤の濃度から想定される影響強度に比べて高い傾向にあり，モノマー型リン系難燃剤以外の含有成分の影響への関与が想定された。中でもPBDPP は，すべての影響で想定よりも 15 倍以上強い活性が示された。その他の縮合型リン系難燃剤についても，検出される影響の強度が想定と異なっていた。モノマー型リン系難燃剤以外の含有成分についても，先述の通り LC/QTofMS で物質数や構造を推定しており，これら含有成分の影響への関与が想定された。
3.3. 影響関連物質のプロファイリング
上記のように縮合型リン系難燃剤に含有されるモ
ノマー型リン系難燃剤以外の含有成分の各種影響への関与が想定されたが，それらは化学物質標準品が存在しないため，工業製剤中の濃度を正確に定量することはできない。そこで本研究では，セミミクロ
HPLC による製剤含有成分の溶離時間に応じた分離を行ない，in vitro レポーター遺伝子アッセイと
LC/QTofMS による影響評価／ノンターゲット分析を実施して，影響関連物質を推定した。
縮合型リン系難燃剤で検出された ERαアゴニス
ト活性，AR アンタゴニスト活性及び PR アゴニス
ト活性については，既報においても難燃剤やハウスダストで共通して検出されており（Suzuki et al.,2013）
，相互に関連性のあるエンドポイントである

ことが考えられる。中でも ERαアゴニスト活性は，
ハ ウ ス ダ ス ト（Suzuki et al., 2013）， 室 内 空 気（Kennedy et al., 2009）， 表 層 水（Murk et al., 2002;
van der Linden et al., 2008），環境水中粒子状物質（Murk et al., 2002; Legler et al., 2003），下水処理水（Murk et al., 2002; van der Linden et al., 2008），堆積物（Legler et al., 2003; Grung et al., 2011; Houtman etal., 2006），環境大気中粒子状物質（Houtman et al.,2006）等の様々な媒体で検出されており，評価重要度の高い影響と考えられる。そこで検出された影響のうち，ERαアゴニスト活性を対象として，影響関
連物質のプロファイリングを行なった。はじめに，
セミミクロ HPLC を用いて縮合型リン系難燃剤の含有成分を分子サイズに応じて分離して分取した画分について ERαアゴニスト活性を評価した。得られた結果を図 5 に示す。DEG─BDCIPP を除く 3 種の縮合型リン系難燃剤で ERαアゴニスト活性が示された。表 3 に示している通り，DEG─BDCIPP に
ついては，ERαアゴニスト活性が評価対象製剤で最も低いため，影響関連物質を分離することで得られる活性プロファイルが取得できなかったと考えられた。縮合型リン系難燃剤の ERαアゴニスト活性プ
ロファイルをみると，PBDPP では溶離時間 7 分から 7.5 分にかけて二つのピークが，BPA─BDPP では 7 分に一つのピークが，PBDMPP では 7 分から
8 分にかけて二つのピークが，それぞれ示されている。実線で示される示差屈折率は，溶離溶媒と分離された含有成分を含む溶液との屈折率の差を示しており，製剤含有成分の相対的含有量の目安となると考えられる。従って，各製剤でみられる最も大きなピークは，構成比の高い縮合型リン系難燃剤の主要構成成分であるダイマーやトリマー由来と考えられた。活性プロファイルと示差屈折率の結果から，
PBDPP については示差屈折率の最も大きい縮合型
リン系難燃剤のピークで ERαアゴニスト活性が示されるものの，いずれの製剤についても縮合型リン系難燃剤の主要構成成分である重合体が主要な影響
39

鈴木・松神：非意図的副生物を含む工業製剤の安全性評価

図5

 合型リン系難燃剤の ERαアゴニスト活性
縮プロファイル．─：示差屈折率，■：ERαアゴニスト
活性関連物質ではないと考えられた。リン系難燃剤については，オリゴマー体やポリマー体といった縮合型にすることによって，環境放散性が低くなることが良く知られている。これに加えて，本研究の結果か
ら，リン系難燃剤の縮合型化は，分子量が上がることで分子サイズが大きくなり，生物利用能や毒性発現能を低下させると考えられた。
縮合型とモノマー型リン系難燃剤以外の構成成分（非意図的副生物）の影響への関与を推定するため，
ERαアゴニスト活性を示す画分と，活性を示さない
前後の画分について，LC/QTofMS による MS 測定を行い，分子量関連イオンの精密質量に基づいて元素組成を決定して画分含有成分を推定すると共に，そのピーク面積を求めた。各画分含有成分のピーク
面積と相対活性の関係性から，影響関連物質を推定した。PBDPP では，対象画分に TPHP のダイマー（PBDPP）と ト リ マ ー，HP─DPHP が 検 出 さ れ，
40

PBDPP（ 図 5 Compound A）と HP─DPHP（ 図 5
Compound B）が ERαア ゴ ニ ス ト と 推 定 さ れ た。
BPA─BDPP では，対象画分に BPA─BDPP と BPA─DPHP が 検 出 さ れ，BPA─DPHP（ 図 5 Compound
C）が ERαアゴニストと推定された。PBDMPP では，HP─2,6─DDMPP，TDMPP，TDMPP のダイマー（PBDMPP：PBDMPP の構成主体）が検出され，と TDMPP（図HP─2,6─DDMPP（図 5 Compound D）
5 Compound E）が ERαアゴニストと推定された。
影響関連物質については，合成等によって化学物質
標準品を入手して物質同定を行い，製剤含有濃度や影響の強度を調査することでそのリスク性を評価することが可能となる。
3.4. 縮合型リン系難燃剤が示す影響に関する見解
本研究では，縮合型リン系難燃剤が構成主体として含まれる工業製剤で，ERαアゴニスト活性，AR
アンタゴニスト活性及び PR アンタゴニスト活性を検出した。その影響の強度は，関連性のあるモノマー型リン系難燃剤と比較して低いと考えられた。縮合型リン系難燃剤については，縮合型にすることによって，環境放散性が低くなるだけでなく，生物利用能も低くなり毒性発現能も低下することが推察された。これは，オリゴマー体やポリマー体といった縮合体化が環境負荷低減化や安全性確保の観点か
ら，化成品の適切なデザインとなり得ることを示唆する。一方で，縮合型リン系難燃剤含有の非意図的
副生物の影響への関与が示された。本研究では，水酸基が導入された非意図的副生物の影響への関与が想定されており，気相経由だけでなく水相経由の環
境放出とそれに伴う毒性等リスク性を考えていく必要がある。縮合体化という化成品デザインについて
は，構成主体ではなく，その製造プロセスで生じる
未反応モノマーや水酸化体等の非意図的副生物のリスク性に着目する必要があるかもしれない。縮合型
リン系難燃剤については，今後使用量が増えていく
可能性が高く，含有製品の製造や使用，廃棄物処理，リサイクルといったライフサイクルにおける非意図的副生物の挙動把握と必要に応じたリスク管理が重要な課題と考えられる。
4.

結論

本研究では，市販されている縮合型リン系難燃剤の 4 製剤を対象として，in vitro レポーター遺伝子
アッセイと LC/QTofMS による影響指向分析を行なった。縮合型リン系難燃剤の含有成分を評価したと
ころ，未反応モノマーと考えられるモノマー型リン系難燃剤が数％ オーダーで検出され，PBDPP 及び
BPA─BDPP に は TPHP が 2.0％ 及 び 1.2％，
PBDMPP には TDMPP が 2.8％，DEG─BDCIPP には TCIPP が 5.7％，それぞれ含まれていた。また，
化学物質標準品がないため定量はできていないが，

地球環境 Vol.24 No.1

モノマー型リン系難燃剤以外にも，PBDPP では 5
成分，BPA─BDPP では 5 成分，PBDMPP では 3 成
分，DEG─BDCIPP では 8 成分の含有成分の存在が明らかとなった。非意図的副生物を含む縮合型リン系難燃剤の影響を評価した結果，ERαアゴニスト活性，AR アンタゴニスト活性及び PR アンタゴニス
ト活性が検出された。縮合型リン系難燃剤で検出される影響の種類は，含有モノマー型リン系難燃剤で検出されるものと概ねよく一致していた。一方で，実験的に評価された縮合型リン系難燃剤の影響強度
は，含有モノマー型リン系難燃剤の濃度から想定される影響強度に比べて高い傾向にあり，モノマー型
リン系難燃剤以外の含有成分の影響への関与が想定された。セミミクロ HPLC による製剤含有成分の溶離時間に応じた分離を行ない，得られた画分につい て in vitro レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 ア ッ セ イ ／ LC/
QTofMS による影響評価／ノンターゲット分析を実施して，ERαアゴニスト活性を対象とした影響関連物質の推定を実施した。本研究で対象とした 4 製剤については，縮合型リン系難燃剤そのものが主要なハザード寄与物質ではないと考えられた。本研究の結果から，リン系難燃剤の縮合型化は，分子量が上がることで，生物利用能や毒性発現能を低下させ，結果として影響の強度を低くすることが示唆された。一方で，縮合型リン系難燃剤の ERαアゴニス
ト活性には，モノマー型リン系難燃剤だけではな
く，水酸基が導入されている関連物質の関与があると推定された。本研究の結果は，縮合体化の化成品
デザインとしての有用性と共に，含有される非意図的副生物の環境放出や毒性等リスク性の評価の必要性を示した。
謝辞

本研究は，環境研究総合推進費（3K133001）及びJSPS 科研費（17K00641）の助成を受けた。研究遂行に関しては，国立研究開発法人国立環境研究所の道中智恵子氏，米岡恭子氏，高木博夫氏の協力を得た。研究の構想については，滝上英孝氏の助言を得た。
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鈴木剛／Go Suzuki

国立環境研究所主任研究員。1977 年 9月広島県呉市生まれ。2005 年 3 月岩手大学大学院連合農学研究科修了，博士（農学）。国立環境研究所 NIES ポスドク
フェロー，愛媛大学沿岸環境科学研究センター日本学術振興会特別研究員（SPD），アムステルダム自由大学環境研究所客員研究員，
国立環境研究所任期付研究員を経て，2015 年 4 月より現職。
哺乳類細胞を用いるレポーター遺伝子アッセイ法や模擬消化液を用いる溶出試験法等の生化学的手法と機器分析手法を統合して，製品ライフサイクルを通じて排出される化学物質の排出実態把握・曝露影響評価・リスク管理に従事。

松神秀徳／Hidenori Matsukami
国立環境研究所任期付研究員。1977 年 3月北海道札幌市生まれ。2016 年 3 月東京大学大学院新領域創成科学研究科修了，博士（環境学）。株式会社島津テクノ
リサーチ，日本ウォーターズ株式会社，
国立環境研究所准特別研究員及び特別研究員を経て，2018 年 4 月より現職。廃棄物の処理・資源化施設における短鎖塩素化パラフィン類やリン系難燃剤等の製品含有化学物質の排出実態調査に従事。