令和 2 年度 血液医学分野 一般研究助成 研究成果報告書

腫瘍内シグナルと腫瘍外免疫環境を同時に標的とする難治性悪性リンパ腫の新規治療戦略

遠西大輔
岡山大学病院 ゲノム医療総合推進センター【研究の背景】
難治性悪性リンパ腫は 1 年生存率が 10％以下と予後不良であり、また免疫チェックポイント阻害剤などの免疫療法の治療効果が乏しいことが知られており、その免疫療法抵抗性のメカニズムの解明とその打破は、悪性リンパ腫の個別化医療を進める上で喫緊の課題である。これまで申請者はカナダ・ブリティッシュコロンビア大学（UBC）にて、血液腫瘍のトランスクリプトーム分類と免疫療法抵抗性メカニズムの解明を焦点に、多くの国際研究を主導して来た。特に悪性リンパ腫の正確な患者層別化と新規薬剤開発に関わることで（特許出願番号：PCT/IB2019/058784）、血液腫瘍の個別化医療の推進に貢献してきた（図１：Ennishi D et al. Cancer Discovery 2020）。
その過程で、難治性悪性リンパ腫では、BCR や NF-kB など腫瘍内シグナルの活性化を引き起こす遺伝子（EZH2, TMEM30A）の変異が、同時に細胞外シグナルを抑制し、免疫原性を低下させる事で腫瘍の免疫逃避を引き起こす事を発見した。さらに、これらの遺伝子の阻害剤は、腫瘍細胞自体の増殖抑制効果だけでなく、強力な腫瘍免疫を動員する事で高い抗腫瘍効果をもたらす事を突き止めた（ Ennishi D, Cancer

Discovery 2019; Ennishi D, Nature Med 2020）。最近、このような腫瘍細胞内外シグナルの両者を制御するハイブリッド遺伝子変異の存在は、他の血液がんでも散見されるようになっており（Klughammer J, Nature Med 2018）、ハイブリッド遺伝子変異を標的として腫瘍細胞内外シグナルを同時に攻撃する治療戦略は、次世代の血液腫瘍・治療戦略として非常に注目されている。しかし、これまでハイブリッド遺伝子変異の同定は限られた症例のみで行われており、大規模な検索がなされていない。また、ハイブリッド遺伝子変異の生物学的意義の解明には、腫瘍と免疫環境の複雑なクロストークの解析が必須であるが、従来のゲノミクス技術ではそれらの十分な解析が困難であり、最新のマルチオミクス技術による網羅的解析が必要である（図２）。

【⽬的】

免疫療法抵抗性の機序の解明とその打破は、血液腫瘍患者の個別化医療を進める上で喫緊の課題である。これまで申請者が見出してきた、腫瘍内シグナルと細胞外シグナルを同時に制御するハイブリッド遺伝子変異を標的として、腫瘍内外シグナルを同時に攻撃する治療戦略の開発を目指す。

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先進医薬研究振興財団

2021 年度

研究成果報告集

令和 2 年度 血液医学分野 一般研究助成 研究成果報告書【⽅法】

本研究では、世界最大規模の悪性リンパ腫コホートを用いたマルチオミクス解析により新規ハイブリッド遺伝子変異を同定し、新たな治療戦略、特にエピゲノム阻害剤と免疫チェックポイント阻害剤の新規併用療法の開発を目的として、細胞株、動物モデルを使用した生物学的検証を行う（図３）。
①マルチオミクス解析による新規ハイブリッド遺伝子異常の発見
悪性リンパ腫の臨床検体を使用し、トランスクリプトーム並びにゲノミクス解析を行う。トランスクリプトーム解析では、MHC など腫瘍表面抗原と免疫細胞の定量を行い、ゲノミクス解析と統合解析して、ハイブリッド遺伝子変異の新規同定を行う。これまで B 細胞性リンパ腫 1,500 例の臨床・組織情報を収集し、既に核酸抽出を開始している。
②シングルセルオミクス技術を用いたハイブリッド遺伝子変異の機 能解析と新規 免疫併用 療法の開発
CRISPR-Cas9 などを用いてハイブリッド遺伝子変異を細胞株やマウスモデルに導入し、エピゲノム阻害剤を投与する事で、腫瘍細胞死と腫瘍周囲免疫細胞が再動員される事を評価する。さらに、抗 CD47 抗体や抗 SIRPα抗体など、マクロファージの貪食機能を亢進させる次世代の免疫チェックポイント阻害剤との併用効果を確認する。この際、シングルセルオミクス解析を行い、ハイブリッド遺伝子変異と腫瘍関連免疫細胞のクロストークを詳細に解析する。このように腫瘍自体の増殖抑制効果と、腫瘍免疫の賦活化による腫瘍免疫効果を検証する事で、非臨床 proof of concept の取得を目指す。

【結果】①まず RCHOP 療法を実施した DLBCL 1,200
例に関して、トランスクリプトーム分類を完了した。MHC-I/II 抗原が欠如し免疫微小環境がcold である DHITsig-positive/ind が全症例の約30％に見られ、その予後は 5 年生存率 50％と不良であった（図４）。現在、遺伝子変異解析を実施しており、DHITsig-positive/ind 群に有意に集積が見られる遺伝子変異を同定し、新規ハイブリッド遺伝子変異としての機能解析に進めていく。
②TMEM30A のノックアウトモデルを作成した。これまで高悪性度リンパ腫細胞株を用いて、ハイブリッド遺伝子変異である
TMEM30A を CRISPR/Cas9 にてノックアウトしたところ、”eat me signal”である Phosphatidylserine（PS）の露出が確認され、マクロファージ貪食実験に進んでいる（図５）。同時に、このノックアウト細胞株から RNA を抽出し、シングルセル
RNAseq を実施中であり、TMEM30A が細胞内外シグナルに与える影響を一細胞レベルで評価している。また、動物モデルとしてノックアウト細胞株を導入した xenograft
モデルを作成し、腫瘍増大とマクロファージの貪食機能との関連性を現在評価中であり、マクロファージチェック
図５.TMEM30A-KO細胞株のPS露出

ポイント阻害剤（抗 CD47 抗体）の投与を計画している。

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令和 2 年度 血液医学分野 一般研究助成 研究成果報告書【考察】

これまでの研究結果は概ね既報を再現するものであり、実験系としては機能していると思われる。MHC-I/II 発現が低下す
る DHITsig-pos/ind グループが、本研究の大規模コホートにおいても予後不良であることが明らかとなり、今後の治療介入を積極的に進めていくべき患者群であることが示唆される。また、これらの症例に対して、ハイブリッド阻害剤＋免疫併用療法のストラテジーとして、マクロファージチェックポイント阻害剤による貪食効果の増強を目指して、実験を進めていく。

【臨床的意義・臨床への貢献度】
まず本研究における日本人コホートにおいて、予後不良である DHITsig-pos/ind が 30％存在することが明らかとなり、欧米人のデータを元にした既報とほぼ同様の結果であった。このことから、日本人においても免疫逃避状態にある悪性リンパ腫は予後不良であり、ハイブリッド遺伝子変異の重要性が改めて示されたことになる。また、TMEM30A の遺伝子改変実験では、ハイブリッド遺伝子変異がマクロファージの活性化を制御していることが解明されつつあることから、現在臨床開発が進んでいるマクロファージの貪食機能を増強するマクロファージチェックポイント阻害剤（抗 CD47 抗体）のバイオマーカー、さらには貪食効果をさらに高める免疫併用療法の開発に繋げる。

【参考・引⽤⽂献】

1

Ennishi D, Hsi ED, Steidl C, Scott DW. Toward a New Molecular Taxonomy of Diffuse Large B-cell Lymphoma. CancerDiscovery, 2020.

2

Ennishi D, Healy S, Bashashati A, Saberi SA, Hother C, Mottok A, Chan FC, Chong L, Kridel R, Boyle1 M, Meissner
B, Aoki T, Takata K, Woolcock BW, Viganò E, Abraham L, Gold M, Molday LL, Molday RS, Telenius A, Li MY,Wretham N, Santos ND, Wong M, Viller NN, Uger RA, Duns G, Baticados A, Madero A, Farinha P, Slack GW, Shulha
HP, Chiu DS, Mostafavi S, Gerrie AS, Huang DW, Rushton C, Villa D, Sehn LH, Savage KJ, Mungal AJ, Weng AP,Bally MB, Morin RD, Staudt LM, Connors JM, Marra MA, Shah SP, Gascoyne RD, Scott DW and Steidl C. TMEM30A
loss-of-function mutations drive lymphomagenesis and confer therapeutically exploitable vulnerability in B-cell
lymphoma. Nature Medicine. Apr;26(4):577-588, 2020.

3Ennishi D, Takata K, Béguelin W, Duns G, Mottok A, Farinha P, Bashashati A, Saberi S, Boyle M, Meissner B, BenNeriah S, Telenius A, Lai D, Teater M, Kridel R, Savage KJ, Sehn LH, Morin RD, Marra MA, Shah SP, Connors JM,Gascoyne RD, Scott DW, Melnick AM, Steidl C. Molecular and Genetic Characterization of MHC Deficiency Identifies
EZH2 as Therapeutic Target for Enhancing Immune Recognition. Cancer Discovery. Apr;9(4):546-563, 2019.

4Ennishi D, Jiang A, Boyle M, Collinge B, Grande BM, Ben-Neriah S, Rushton C, Tang J, Thomas N, Slack GW, FarinhaP, Takata K, Miyata-Takata T, Craig J, Mottok A, Meissner B, Saberi S, Bashashati A, Villa D, Savage KJ, Sehn LH,Kridel R, Mungall AJ, Marra MA, Shah SP, Steidl C, Connors JM, Gascoyne RD, Morin RD, Scott DW. Double-Hit
Gene Expression Signature Defines a Distinct Subgroup of Germinal Center B-Cell-Like Diffuse Large B-Cell
Lymphoma. J Clin Oncol. Jan 20;37(3):190-201, 20195Ennishi D, Mottok A, Ben-Neriah S, Shulha HP, Farinha P, Chan FC, Meissner B, Boyle M, Hother C, Kridel R, Lai
D, Saberi S, Bashashati A, Shah SP, Morin RD, Marra MA, Savage KJ, Sehn LH, Steidl C, Connors JM, Gascoyne RD,Scott DW. Genetic profiling of MYC and BCL2 in diffuse large B-cell lymphoma determines cell-of-origin-specificclinical impact. Blood. May 18;129(20):2760-2770, 2017.

6

Boice M, Salloum D, Mourcin F, Sanghvi V, Amin R, Oricchio E, Jiang M, Mottok A, Denis-Lagache N, Ciriello G,Tam W, Teruya-Feldstein J, de Stanchina E, Chan WC, Malek SN, Ennishi D, Brentjens RJ, Gascoyne RD, Cogné M,Tarte K, Wendel HG. Tumor suppression and therapeutic restoration of HVEM (TNFSRF14) in lymphoma. Cell. Oct
6;167(2):405-418, 2016108

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2021 年度

研究成果報告集