タンパク質性の熱電変換素子の開発とその利用
Devlopment of protein thermo-electric energy converters
and its application
研究代表者

広島大学大学院生物圏科学研究科

助教授

三本木至宏

Graduate School of Biosphere Science，Hiroshima University，
Assocciate Professor，Yoshihiro Sambongi
現在われわれの生活を支えているエネルギーは，化石燃料や原子力による電気エネルギーが主流である。しかし，環境への負荷という観点から，これら従来の大型・集中型とは異なるエネルギー生産技術体系を構想すべき時期であると考える。本研究では，環境負荷が少ない「生体分子で構成される発電装置」を開発し，それが社会的なエネルギー問題にどのように貢献するかを調査する。科学技術的な側面を中心に研究を展開し，生物学，化学，さらには工学を統合した学際的な立場をとる。具体的には，自然界に存在する多種多様な微生物の電子伝達タンパク質シトクロムｃの立体構造，安定性，および電子伝達反応の関係を明らかにし，その作用機構を多面的に理解する。さらに，これらの知見を基礎として，シトクロムｃを用いて廃熱から電気を生み出すエネルギー変換装置の開発を行い，その社会的な波及効果を考える。

A goal of this project is to gain a detailed insight into biological energy metabolism throughdissecting molecular mechanisms underlying protein stability and redox property of bacterial
cytochrome c.

The cytochrome c molecule will be deeply characterized from a multidisciplinary

standpoint. This project will give a fundamental insight into a practical approach for using
cytochrome c as a biological conductive material, with the aim of developing a molecular device thatcontrols electron flow at nano meter scale.

In the course of this project, we will also construct a

prototype of thermo-electric energy converter cell using the cytochromes c.

The system should

contribute to the establishment of a new technology, leading to an alternate energy generator withexisting ones derived from fossil fuel and nucleic power.
１．研究目的と，②その分子構造に基づき電子伝達機能

本研究の目的は，タンパク質性の熱電変換を解明すること，③シトクロムｃの生産技素子を開発することである。具体的な達成術を確立し，バイオ電池としての利用を図

目標は，①電子伝達タンパク質シトクロムること，である（図表１）。

ｃの構造と安定性の関係を明らかにするこ-1-ると考えているのである。
２．研究経過これまでに，①様々なシトクロムｃの安定性を測定し，②その電子伝達機能の評価として酸化還元電位を測定し，③扱っているシトクロムｃの大量調製法を検討してきている。それぞれの項目での成果を踏まえ，図表 1. 研究の全体像
シトクロムｃの構造，安定性，機能，そして生産様式を調べ，その付加価値を見出したり，人工的に高める。それを発現素子として利用する。

④バイオ電池としての利用に向かいつつある。
２−①．シトクロムｃの安定性

本研究は，熱から電気エネルギーを生みシトクロムｃの安定性の獲得機構を熱力出す生物系素材から成る分子装置を開発す学的な解析により定量化した。様々な温度ることを戦略的なコンセプトとする。この環境に生育する微生物から相同性の高いシような方策を設定する背景には，昨今のエトクロムｃを単離し，それらの安定性と立ネルギー問題に対する懸念がある。地球環体構造を比較した。用いた微生物は，(i)境への負荷という観点から，化石燃料や原子力による電気エネルギーなど従来の大Aquifex aeolicus (最適生育温度：85 ℃)，(ii)型・集中型とは異なるエネルギー生産技術

Hydrogenobacter thermophilus （同 72 ℃），体系を構想すべき時期である。また，申請(iii) Hydrogenophilus thermoluteolus (同 52 ℃)，

者は生物のエネルギー代謝に関する研究実(iv) Pseudomonas aeruginosa （同 37 ℃），お績があり，昨今のエネルギー問題に対してよび (v) Shewanella violocea (同 8 ℃)である。
いずれの微生物も相同なシトクロムｃ（ア自身の強みが活かせると考えて，本研究計

ミノ酸配列はどれも 50 ％以上相同）を持画を提案した。っている。これらのシトクロムｃ遺伝子を具体的な研究目的は，「生体分子で構成さクローニングし，大腸菌でタンパク質を発れる発電装置」を開発することであり，自現することに成功した。さらに，立体構造然界に存在する多種多様な微生物の電子伝
達タンパク質シトクロムｃに焦点を当てる。

を参照にそれぞれのシトクロムｃに対して変異導入実験を行い，安定性に寄与するアシトクロムｃの立体構造，安定性，およびミノ酸残基を同定できた。安定性測定実験

電子伝達反応の関係を明らかにし，その作には，円二色性分散計を用いた。

用機構を多面的に理解する。さらに，これらの知見を基礎として，シトクロムｃを用

２−②．シトクロムｃの電子伝達機構の解いて廃熱から電気を生み出すエネルギー変明換装置の開発を行う。すなわち，生物学，シトクロムｃの生体内反応を試験管内で化学，さらには工学を統合した学際的な立再現し計測する技術を確立し，電子伝達の場から社会的なエネルギー問題に貢献でき-2-機構を明らかにした。２−①に記載したシし②で酸化還元電位を測定したシトクロム

トクロムｃの野生体およびそれらの変異体ｃすべてについて，電位変化の温度依存性の電子伝達反応をサイクリック・ボルタンを調べた。その結果，温度に対する電位のメトリー（CV）によって，また酸化還元活変化率が大きくなった変異体を見つけるこ

性中心の立体構造を NMR によって測定しとができ，現在その原因を調べているとこた。なお，シトクロムｃの電子伝達機構のろである。

解明のための実験は，筑波大学・化学系・山本泰彦教授所有の設備を使って行った。

３．研究成果上記２−①から，シトクロムｃの安定性

２−③．シトクロムｃの大量調製に寄与するアミノ酸残基を同定することがシトクロムｃタンパク質の大腸菌での生できた。特に，(ii) と(iv)由来のシトクロム産効率を検討した。シトクロムｃは，細胞ｃについては，お互いのアミノ酸残基をス内で翻訳後修飾を受け，ポリペプチド鎖にワップすることでタンパク質の安定性を双ヘムが共有結合する。したがって，シトク方向で変化させることができることを証明

ロムｃの生産量を上げるには，ポリペプチした（図表２）。

ド鎖の合成のみならず，ヘムの結合を効率化する必要がある。本研究では，ヘム結合に焦点を当てた。具体的には，大腸菌でシトクロムｃを発現させる際に，ヘム結合を触媒するタンパク質性因子（Dsb）の寄与を検討した。さらに，大腸菌の培養条件を検討し，シトクロムｃ発現の最適化を図った。
大腸菌で発現したシトクロムｃの精製方法についても検討した。
図表２. 双方向変異解析(ii)HTc552 と(iv)PAc551 にそれぞれ変異を導入して，安定性を測定したところ，一方で下がった安定性は，他方で上がっていた。

２−④．シトクロムｃのバイオ電素子としての利用
２−②でシトクロムｃの CV 実験の際に，２−②からは，アミノ酸変異導入により，温度に対応して酸化還元電位が変化するこ酸化還元電位と安定性に相関性があることとを見出した。用いたシトクロムｃすべてを突き止めた。そのスピンオフとして２−高温より低温側で酸化還元電位が低い傾向④の研究へと発展し，本研究の全体戦略のにあった。この結果は，温度を変化させる目的の達成へと大きく前進した。

ことで起電力を生じさせることを意味し，２−③からは，ヘム結合を触媒する Dsb

電位の変化が大きければ，それだけ付加価の発現制御や培養条件の最適化によって，値が高いといえ，バイオ電池の素子として実験室レベルでは充分な量のシトクロムｃ利用が期待できる。そこで，２−①に記載-3-タンパク質を得られるようになった。実験(2004).

材料作製に大きく貢献した。

(3) Tachiiri, N., Hemmi, H., Takayama, S. J., Mita,H., Hasegawa, J., Sambongi, Y., Yamamoto, Y.

４．今後の課題と発展

Effects of axial methionine coordination on the

上記２−①では，(ii) と(iv)以外のシトク

in-plane asymmetry of the heme electronic

ロムｃについて，タンパク質工学的な研究

structure of cytochrome c. J. Biol. Inorg. Chem.,を展開する。安定性に関わるアミノ酸単独，

9, 733-742 (2004).

あるいはそれらの相互作用の影響を明らか(4) Uchiyama, S., Ohshima, A., Nakamura, S.,にする。

Hasegawa, J., Terui, N., Yamamoto, Y.,

２−②からは，CV 測定装置の購入が課題

Sambongi, Y., Kobayashi, Y. Completeである。実験室ですぐに酸化還元電位が測

thermal-unfolding profiles of oxidized and定できるように設備を整備したい。

reduced cytochromes c. J. Am. Chem. Soc., 126,２−③からは，培養バッチのスケールア

14684-14685 (2004).

ップが課題である。大量にタンパク質を調(5) Oikawa, K., Nakamura, S., Sonoyama, T.,

製したいので，ロスのない精製方法も併せ

Ohshima, A., Kobayashi, Y., Takayama, S. J.,て検討する。

Yamamoto, Y., Uchiyama, S., Hasegawa, J.,

２−④からは，シトクロムｃを用いた発Sambongi, Y.

Five amino acid residues電装置の試作が今後の課題である。試作過responsible for the high stability of

程で問題点を洗い出し，実際に起電力を生Hydrogenobacter thermophilus cytochrome c552:じるかどうか試験する。

RECIPROCAL MUTATION ANALYSIS.

J.

Biol. Chem., 287, 5527-5532 (2005).
５．発表論文リスト(6) Ichiki, S., Nakamura, S., Ohkubo, T., Kobayashi,(1) 三本木至宏. 長い歴史をもつタンパクY., Hasegawa, J., Uchiyama, S., Nishihara, H.,

質の新しい機能：化学と生物学を包括しMizuta, K., Sambongi, Y. Cloning, expression,てわかったシトクロムｃの役割. 化学,

crystallization, and preliminary X-ray59, 61-62 (2004).

characterization of cytochrome c552 from a(2) 山本泰彦，三本木至宏. 疎水性コア構造

moderate thermophilic bacterium,変換による電子伝達タンパク質シトク

Hydrogenophilus thermoluteolus.

ロムｃの機能調節. 機能材料, 24, 31-37

F61, 395-398 (2005).

-4-Acta Crystal.