福岡県保健環境研究所年報第45号，76－79，2018

短報
福岡県で2015年に検出されたノロウイルスGI.3の系統樹解析
吉冨秀亮・中村麻子・小林孝行・芦塚由紀
福岡県で2015年3月から7月に感染性胃腸炎及び食中毒疑い事例の糞便検体からノロウイルスGI.3が検出された。従来、ノロウイルスの検出はN/S領域約350bpの塩基配列に基づく解析結果であり、ノロウイルスGI.3の詳細な性状解析は未実施であった。そこで本研究では、ノロウイルスGI.3の遺伝子学的特徴を明らかにすることを目的に、ポリメラーゼ領域及びカプシドVP1領域の配列を決定し系統樹解析を行ったので報告する。検体は感染性胃腸炎及び食中毒疑い事例由来の糞便10検体を用いた。
ポリメラーゼ領域及びカプシドVP1領域は、独自に設計したプライマーを用いて遺伝子増幅し、それぞれの領域について最尤法を用いて系統樹解析を行った。この結果、ノロウイルスGI.3の2539bpを決定し、遺伝子型はすべてGI.P3_GI.3bに分類された。また、2015年に福岡県で検出されたノロウイル
スGI.P3_GI.3bは、同時期に中国において検出された0304-19株が最も近縁であることが示唆された。
［キーワード：ノロウイルスGI.3、2015年、系統樹解析］
１

はじめに

２

ノロウイルスは感染性胃腸炎の主要な原因である。ノロウイルスはカリシウイルス科ノロウイルス属に属し、7つ

方法
検体は2015年3月から7月にかけて、ノロウイルスGI.3が検出された糞便検体10検体を用いた（表1）。の遺伝子群（GI～GVII）に分類される。そのうち、特にヒ検体処理及びRNA抽出は常法4)に従い行った。ORF1及び

トに感染し胃腸炎を引き起こす遺伝子群はGI及びGIIであORF2を増幅するプライマーは独自に設計した（表2）。1st

り、それぞれ9種（GI.1～GI.9）及び22種（GII.1～GII.22）

PCR反応はPrimeScript II High Fidelity One Step RT-PCR1)の遺伝子型に分類される 。ノロウイルスは約7500bpの塩Kit (タカラバイオ)を用い、45℃15分逆転写反応後、94℃基からなる一本鎖RNAを遺伝子として持ち、3つの蛋白質コ2分初期変性を行い、98℃10秒変性、60℃15秒アニーリンード領域（open reading frame; ORF）が存在し、ORF1；

グ、68℃2分伸長を40サイクル繰り返した後、68℃7分伸長

非構造蛋白質、ORF2；構造蛋白質（カプシド蛋白質；VP1）、反応を行った。2nd PCR反応はPrimeSTAR GXL DNA Polymerase

ORF3；構造蛋白質（VP2）をコードしている。現在、ORF1(Takara Bio)を用い、98℃10秒変性、60℃15秒アニーリンがコードするポリメラーゼ領域とORF2がコードするカプ

グ、68℃2分伸長を40サイクル繰り返した後、68℃7分伸長

シドVP1領域の塩基配列に基づく遺伝子型分類が推奨され反応を行った。明瞭な陽性バンドが確認されたPCR産物にている2)。

ついて、ダイレクトシークエンスにより塩基配列を決定し福岡県において、2015年3月から7月にかけてノロウイルた。決定した塩基配列はGenBankデータベ－スに登録し、スGI.3が感染症発生動向調査事業及び食中毒事例から複アクセッション番号を取得した（LC378984-LC378993）。

数検出された。従来、ノロウイルスの検出法はN/S領域約

系統樹解析はMEGAソフトウェアver.7を用いて最適なモ350bpの塩基配列に基づく解析結果であり、詳細な解析はデルを算出し、ポリメラーゼ領域、カプシドVP1領域とも3)未実施であった。J.Vinjeら によると、ノロウイルスGI.3にKimura 2-parameter model（+I）を用いて最尤法によりは さ ら に 4 つ の ポ リ メ ラ ー ゼ （ GI.P3, GI.P4, GI.P5,

系統樹を作成した。得られた分子系統樹評価のため、ブーGI.P6）と4つのカプシドVP1（GI.3a, GI. 3b, GI.3c, GI.3d）

トストラップは1000回実施した。のサブタイプの組み合わせに分類される。そこで、本研究では、2015年に福岡県において検出されたノロウイルス３結果及び考察GI.3の遺伝子学的な特徴を明らかにすることを目的に、ポ2015 年 3 月から 7 月に検出されたノロウイルス GI.3 陽リメラーゼ領域及びカプシドVP1領域の塩基配列を決定し、性 10 検体について ORF1/ORF2 領域の増幅を行った結果、2539bp を決定した。10 検体の塩基配列を比較した結果、系統樹解析を行ったので報告する。

2539bp の相同性は 97.5%～100%、ポリメラーゼ領域 904bp

福岡県保健環境研究所 （〒818-0135 太宰府市大字向佐野 39）

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表 1 検体一覧

は GenBank に登録されていなかった。本研究では、抗原性の変化を検討していないため、2015 年に GI.P3_GI.3b が複数検出された要因は不明である。今後、カプシド VP1 領域の塩基配列及びアミノ酸配列の変化について解析し、抗原性の変化について解析を行う。
４まとめ
2015年3月から7月に福岡県において検出されたノロウイルスGI.3はすべてGI.P3_GI.3bに分類された。また、同

表 2 ノロウイルス GI.3 解析プライマー一覧

時期に中国において検出された0304-19株が最も近縁であることが示唆された。
文献
1. Kroneman, A. et al., Proposal for a unified
norovirus nomenclature and genotyping. Arch Virol,
158, 10, 2013
2. 病原微生物検出情報, ノーウォークウイルス（ノロウイルス）の遺伝子型（2015年改訂版）, 2015年9月
3. Vinjé, J., Advances in laboratory methods for
detection and typing of norovirus. Journal ofclinical microbiology, 2015, 53.2: 373-381.
4. 厚生労働省通知法（平成１９年５月１４日付け食安監発第0514004号）の相同性は 97.3%～100%、カプシド VP1 領域 1635bp の相同性は 97.7%～100%であった。10 検体のアミノ酸配列を比較した結果、ポリメラーゼ領域の相同性は 99.3%～100%、カプシド VP1 領域の相同性は 98.7%～100%であった。
次に、最尤法を用いてサブタイプ分類が可能な参照株を含めて系統樹解析を行った。ポリメラーゼ領域の比較可能な 267bp を用いて系統樹解析を行った結果、すべて GI.P3に分類された（図 1）。同様に、カプシド VP1 領域の比較可能な 1635bp について系統樹解析を行った結果、すべてGI.3b に分類された（図 2）。これらの結果から、2015 年に 福 岡 県 で 検 出 さ れ た ノ ロ ウ イ ル ス GI.3 は す べ て
GI.P3_GI.3b に分類されることが明らかとなった。
GenBank データベース検索の結果、2015 年に福岡県で検出された株と最も近縁な株は、2015 年 3 月に中国で検出された 0304-19 株（Accession No. KY934262）であった。
これらの株の塩基配列を比較した結果、ポリメラーゼ領域の相同性は 96.2%-97.6%、カプシド VP1 領域の相同性は95.7%-96.3%であった。同時期に日本国内で検出された株77 －－－77－

図 1 ノロウイルス GI.3 のポリメラーゼ領域の系統樹解析結果
系統樹はポリメラーゼ領域 267bp において最尤法で作成した。ブートストラップ値は、クラスターを支持する枝にそれぞれ数字で示した。●は 2015 年に福岡県で検出された株を示す。

図 2 ノロウイルス GI.3 のカプシド VP1 領域の系統樹解析結果
系統樹はカプシド VP1 領域 1635bp において最尤法で作成した。ブートストラップ値は、クラスターを支持する枝にそれぞれ数字で示した。●は 2015 年に福岡県で検出された株を示す。

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Phylogenetic analysis of norovirus GI.3 detected in 2015 in Fukuoka
Hideaki YOSHITOMI, Asako NAKAMURA, Takayuki KOBAYASHI,
and Yuki ASHIZUKA
Fukuoka Institute of Health and Environmental Sciences,
Mukaizano 39, Dazaifu, Fukuoka 818-0135, Japan

From March to July 2015, Norovirus GI.3 was detected from fecal specimens of infectious gastroenteritis and foodborne suspected
outbreaks in Fukuoka. The present study determined the entire polymerase genes and capsid genes of ten norovirus GI.3 isolates
from these fecal specimens. In addition, a phylogenetic analysis of each gene region was conducted using the maximum likelihood
method to classify the sub-genotypes of the norovirus GI.3 isolates. The 2,539-bp PCR product covering the entire polymeraseand capsid-encoding region sequences of norovirus GI.3 was amplified using original designed primers. Based on the results, allten norovirus GI.3 strains were classified as GI.P3_GI.3. Unfortunately, norovirus strains from the same season in Japan could not
be compared with the isolates from this study because they were not registered in the GenBank database; however, it was clear thatthe norovirus strains detected in 2015 in Fukuoka were closely related to the 0304-19 strain detected in China in March 2015.
Therefore, the norovirus GI.P3_GI.3b detected in 2015 in Fukuoka was likely widely prevalent in Asia.
[Key words; norovirus GI.3, 2015, phylogenetic analysis]

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