Fund amental Lectur e

光学系構築（実践編）
全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）による 1 分子イメージング

Construction of an optical system (Practical):Single-molecule imaging using a total internalreflection fluorescence microscope (TIRFM)
飯野 亮太
Ryota IINO
大学共同利用機関法人自然科学研究機構 分子科学研究所
Institute for Molecular Science, National Institutes of Natural Sciences〒 444-8787 岡崎市明大寺町字東山 5-1
5-1 Higashiyama, Myodaijicho, Okazaki 444-8787
e-mail: iino@ims.ac.jp
分類番号 : 9.4, 7.10

本稿では，全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を用いた蛍光色素の 1 分子イメージングについて解説します．顕微鏡の空間分解能と位置決定精度の違い，実際の観察，データ解析についての具体例と留意点を述べます．また，関連の発展形として，全反射暗視野顕微鏡と金ナノ粒子を用いた高速・高位置決定精度 1 分子イメージングについても紹介します．

1. まえがき：1 分子蛍光イメージング小史

基礎講座1) で述べたとおり，最近はプリズム型ではなく対物レ

1)

前回の基礎講座 で解説した全反射蛍光顕微鏡（Total

ンズ型がより多く用いられていますが，1 分子蛍光イメージン

Internal Reflection Fluorescence Microscope: TIRFM）を用グの手法として現在は世界中で利用されています．なお，

いると，水溶液中の蛍光色素 1 分子のリアルタイムイメージン

Kinosita らは，従来の落射蛍光顕微鏡でも背景光の要因をグを行うことが可能です．1 分子が観察できるのは，励起光丁寧に取り除けば 1 分子蛍光イメージングが可能であることをの全反射で形成されるエバネッセント場によりガラスと水の界ほぼ同時期に示しています3)．このように，1 分子蛍光イメー面近傍の蛍光色素のみを選択的に励起し，水中の深い位置ジングの実現には日本の研究者が大きく貢献しました．に存在する蛍光色素からの背景光を大幅に低減できるためで2.

す．1 分子蛍光イメージングが容易になったほかの要因として

TIRFM の空間分解能は，EM-CCD カメラ（浜 松 ホトニクス (株) や 英 国 Andor

TIRFM の横方向の空間分解能は，通常の光学顕微鏡と同Technology 社から購入可能）を代表とする検出器の高感度程度です．このため，1 分子蛍光イメージングを行うには，観化が挙げられます．

察視野に存在する蛍光色素の密度を低くする必要があります．

Yanagida らは 1990 年代初頭に，結像光学系の透過効率密度が高いと視野一面が光ってしまい，個々の分子を識別すや検出器の感度などに基づいた計算から，1 分子の蛍光色るのは困難になります．顕微鏡の空間分解能は，観察対象と素は十分検出可能な数の光子を発生しているとすでに指摘しなる 2 つの微小な物体（分子）がどのくらい近づくと区別がていました．昼間に星が見えないのと同じ理屈で，問題は感できなくなるかの指標であり，回折限界によって対象の像（点度でなく，むしろ背景光の高さでした．Yanagida らは背景光像分布関数）が本来の大きさよりも広がってしまうことに起因の低減にプリズム型 TIRFM を利用し世界で初めて，水中・します．レイリーの定義では，点像分布関数の広がり r（エア2)

常温での 1 分子蛍光イメージングに成功しました ．前回のリーディスク：像のプロファイルをベッセル関数でフィットした際光学系構築（実践編） TIRFMによる 1 分子イメージング（飯野）／ 基礎講座

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F u n da m e n t a l L e c t u r e（a）に強度がはじめにゼロになる中心からの距離）と空間分解能0s（ｂ）

120

退色r =0.61λ/nsin θ=0.61λ/NA5s(1)ここで，λ は観察に用いる光の波長，nsin θ(=NA)は対物10 s

レンズの開口数です．例えば，開口数 1.49 の対物レンズを蛍光強度（AU)は同一であり式(1)で表されます．
800

用いた TIRFM で，蛍光波長 500 nm の色素を観察する場

1分子の蛍光強度

4001020時間（s）

合，空間分解能は 205 nm となります．よって，ガラス基板上30の分子の密度は 1 分子/μm2 以下に抑える必要があり，密度図1が低ければ低いほど，個々の分子の識別は容易になります．

ICCD カメラを用い励起波長 532 nm，励起強度 1 µW/µm2，時間分解能

蛍光色素の 1 分子観察．(a)Cy3 の観察画像例（30 µm×30 µm）．

33 ミリ秒で撮影．(b)Cy3 の蛍光強度の時間変化の例．15 秒付近（矢印）3.

で退色が起きている．EM-CCD カメラを用いて励起波長 532 nm，励起強度

観察例と注意点：蛍光色素は退色する

0.5 µW/µm2，時間分解能 100 ミリ秒で撮影．

対物レンズ型 TIRFM による蛍光色素 Cy3 の観察例を示します（図 1(a)）．励起光レーザーの試料面での強度を 0.1〜
1 μW/μm2 程度に設定すれば十分に観察できます．個々の輝とは異なる概念です．なお，詳細は省きますが，2014 年ノー点が 1 分子の Cy3 に相当します．時間とともに輝点の数が減

ベル化学賞の対象となった超解像蛍光顕微鏡法である PALMるのは分子がなくなったのではなく退色しているからです．退（Photo-Activated

色は励起状態の蛍光色素が活性酸素などのラジカル種と反応（STochastic Optical Reconstruction Microscopy)8) は 1 分子して蛍光を発しない化学構造に不可逆的に変化することで起蛍光イメージングに基づいており，位置決定精度が空間分解

4)

Microscopy)7) や STORM

Localization

こります ．退色は確率的に起こり，水溶液中の酸素を除去能よりもはるかに小さな値を達成できることを巧みに利用してすることで退色までの時間を長くすることも可能です．図 1(b)回折限界を超える解像度を達成しています．には Cy3 の蛍光強度の時間変化を示します．矢印の点で突

1 分子イメージングにおける位置決定精度 σ は，理想的に然，蛍光強度が背景光のレベルまで落ちています．このようは分子の像の広がり s（エアリーディスクとは定義が若干異なな不可逆的な 1 段階での退色が 1 分子の蛍光色素の特徴でり，ガウス関数で像の強度プロファイルをフィットした際の標準あり，1 分子が観察できていることの簡便な指標としてよく用偏差）と，1 画像で得られるフォトン数 N で決まります（式(2))9)．

いられます．1 分子蛍光イメージングに以前から用いられていσ=る Cy3 やテトラメチルローダミンといった蛍光色素は，退色すs N(2)

るまでに 107〜108 個程度の光子を放出します5)．顕微鏡シス

s はエアリーディスクの大きさ r より小さく120 nm 程度であり，テム全体の光子の検出効率は 1 % 程度なので，退色までに1 nm の位置決定精度を達成するには 1.4 万個のフォトンを得

56

放出される 10 〜10 個程度の光子を用いて観察を行うことにればよい計算になります．しかし実際の計測では，画像のピクなります．励起光の強度を上げると，励起される頻度が高くな

セルサイズ a が有限で背景光の揺らぎ（標準偏差 b）がある

り単位時間当たりに放出される光子の数が増加してシグナルとことから，位置決定精度は理想的条件よりも劣ります（式(3))9)．

位置決定精度（後述）は改善しますが，観察可能時間は短くなります．分子吸光係数と量子収率がともに高い蛍光色素の観察可能時間は数十秒から長くて数分程度，達成可能な時間分解能は最高で 1ミリ秒程度となります．

σ=a/12 8πsbs++  NNaN

(3)

位置決定精度の測定例を以下に示します（図 2）．本測定
では蛍光色素 Cy3 で標識したタンパク質をガラス基板に非特異的に結合させています．励起波長は 532 nm，励起光強度4.

位置決定精度：空間分解能とは異なる概念

は 0.28 μW/μm2，時間分解能は 1.0 秒です．1 分子の画像

観察視野中の密度が低く，近傍にほかの分子が存在しないのシークエンス（動画）を取得し（図 2(a)），それぞれの画ことが 1 分子蛍光イメージングに必要だと述べました．他方，像における分子の中心位置を 2 次元ガウス関数でフィットして密度が低く個々の分子が識別できる場合には，分子の位置を求め，その分布をプロットします（図 2(b)）．2 次元ガウス関6)

ナノメートルレベルの精度で決定することが可能です ．この

数 のフィットは 例 えば，フリー の 画 像 解 析ソフトウェア「位置決定精度」は，リアルタイムイメージングで分子の動きImageJ10) のプラグイン Particle Track and Analysis（新井由を正確に計測するうえで重要なパラメータであり，空間分解能之博士開発11)）などが利用できます．なお，フォトン数 N

応用物理532

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Fund amental Lectur e（a）（b）15（c）302(a)の個々の画像から求めた式(3)のパラメータは5200

頻度(nm)

間時

10−5それぞれ，sX=120±4 nm，10sY=115±4nm，a=67.7nm，σ

N=1039±279，b=0.5±0.1−10−15−15−10 −5 0 5(nm)0−15−10 −5 0 5(nm)10 1510 15であり，これらの値を用いて式(3)から得られる位置
決 定 精 度の理 論 値は σX

図2位置決定精度の測定例．(a)ガラス基板に固定した Cy3 標識タンパク質の 1 分子蛍光像のシークエンス．励起波

長 532 nm，励起光強度 0.28 µW/µm2，時間分解能 1.0 秒で撮影．(b)各フレームで求めた中心位置の 2 次元プ=3.9±0.7 nm，σY =3.8ロット．(c)X 軸方向の中心位置の分布．ガウス関数でフィットし，位置決定精度 σ（標準偏差に相当）を測定．この例±0.7 nm となります．実では，位置決定精度は 6.0 nm である．

測値が理論値よりも低下している理由には，試料ステージの振動やドリフトな（d） 80

セルラーゼ

（a）

40

運動速度定数解離速度定数結合速度定数tron

結晶性セルロース

時間分解能：200ミリ秒
308−1−1 −1on: 7.6×10 M μm s2550=17001×109 2×109 3×109 4×109on(M−1μm−1s−1)040506070時間 (s)

fast

off

600−120

数十ミリ秒に上げると，位0510
結合持続時間 (s)80: 8.8 nm/s

: 34.9 nm/s

fast

tr

低下します．

5. 応用例：セルラーゼの 1 分子計測

15ある種のセルラーゼは，10結晶性セルロースを水溶

51540(nm)

slow

tr

20=7570

置 決 定 精 度 が 得られます．時間分解能を 100〜

25: 1.1 s−1 (70 %)20−408040

ジングでは，秒オーダの置決定精度は数十 nm に

: 0.10−1 (30 %)offのように 1 分子蛍光イメー

時間分解能で数 nm の位−160−40slow

80
頻度

頻度10

時間分解能
200ミリ秒40100201580どが考えられます．この例−80

結合持続時間頻度6.6 μm

蛍光強度 (AU)セルラーゼ（c） 120

tr: 11.4 nm/s0(nm)off（b）

時間分解能：2.0秒

0=180020 40 60 80 100 120
tr (nm/s)

性の 2 糖に連続的に分解しながら直進運動するリニア分子モータであることが知られています．1 分 子

図3Cy3 標識セルラーゼの 1 分子計測．(a)セルラーゼの化学反応と運動の速度定数．kon: 結合速度定数．ktr: 運動速度定数．koff: 解離速度定数．(b)kon の計測．▼はセルロースに結合したセルラーゼ．下は kon の分布．最小のピー
クが 1 本のセルロース繊維状結晶への kon に相当．時間分解能 200 ミリ秒で撮影．(c)koff の計測．結合の持続時間を計測．下は koff の分布．結合した結晶面の違いに対応する 2 成分の指数関数減衰でフィットしている．時間分解能 200ミリ秒で撮影．(d)ktr の計測．各フレーム中心位置の座標変化から運動速度を計算．下は ktr の分布．遅い成分は分解を伴う直進運動，速い成分は分解を伴わない拡散運動に対応．時間分解能 2.0 秒で撮影．

蛍光イメージングでカビ由来セルラーゼの化学反応と運動の素過程を 1 分子計測した例を示します12)．
セルロースの繊維状結晶をガラス基板上に固定し，（シグナル）が十分に大きい場合には，2 次元ガウス関数

蛍光色素 Cy3 で標識したセルラーゼの結合，解離，運動をフィットではなく画像の重心解析で中心位置を正確に求めるこ計測しています（図 3(a)）．図 3(b)は，セルロースへのセルとも可能です．図 2(c)は X 方向（水平方向）の中心位置のラーゼの結合頻度を計測し，セルラーゼ濃度と繊維の長さで分布です（5 分子のデータをまとめたもの）．この分布をガウ規格化することで結合速度定数を見積もった例です．図 3(c)ス関数でフィットして得られる標準偏差が X 方向の位置決定

は，セルロースに結合してから解離するまでの時間を測定す

精度の実測値 σX となります．この例では，位置決定精度のることで解離速度定数を計測しています．さらに図 3(d)では，実測値は σX=6.0±0.3 nm，σY=5.5±0.9 nm です．また，図セルロースに結合したセルラーゼ分子の動きを計測することで光学系構築（実践編） TIRFMによる 1 分子イメージング（飯野）／ 基礎講座

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F u n da m e n t a l L e c t u r e

2040FD

Ni-NTA glass

散乱像

7His-tags

エバネッセント場
対物レンズ

L1L220 40 60（nm）

40 mM

高速CMOSカメラ累積回転数

100 μM

20406042BE

100.0020 40 60（nm）

ポーズ

3FSND

図4605+ =M1

散乱光4020 40 60（nm）

6
後焦点面

1=

穴あきミラー

2060

A B A

（nm）

V1-ATPase（b）（nm）

Streptavidin

Gold colloid（40 nm）

（nm）

（a）

ステップ
10 μM
0.050.10

レーザー

0.15 0.20
時間（s）

0.250.30

全反射暗視野顕微鏡．(a)光学系の模式図．対物レンズ型 TIRFM のダイクロイックミラーとバリヤフィルタの代わりに穴あきミラーを用いることで金ナノ粒子の散乱像を観察．検出器には高速 CMOS カメラを使用．ほかの詳細は前回の基礎講座1) の図 3(a)を参照されたい．上部は，タンパク質分子モータ V1-ATPase の回転運動を観察する実験系の模式図．固定子リングをガラス基板に固定し，回転子サブユニットに粒径 40 nm の金ナノ粒子を結合．(b)V1-ATPase の回転運動の軌跡の例．運動素過程であるポーズとステップが観察されている．ATP 濃度の増加に伴いポーズの持続時間が短くなり回転速度が増加する．時間分解能 100 マイクロ秒で撮影．

運動速度定数を見積もっています．なお，個々の分子は確率的に振る舞うので，1 分子計測では多数のデータを集めて統計的に解析する必要がある点に注意してください．

します．
我々が開発した全反射暗視野顕微鏡は非常にシンプルで，TIRFM のダイクロイックミラーとバリヤフィルタを，中心に穴があいたミラーに交換しただけです（図 4(a)）．金ナノ粒子で6.

蛍光以外への発展例：全反射暗視野顕微鏡と金ナ散乱された光を，この穴を通して検出器（高速 CMOS カメ

ノ粒子を用いた 1 分子イメージングラ）に結像させます．穴を通ることで対物レンズの実効開口

エバネッセント場は蛍光色素の励起以外にも用いることがで数が若干低下し，金ナノ粒子の像の広がり s は大きくなります

きます．我々は，対物レンズ型 TIRFM を改変した新しい暗が，フォトン数 N が圧倒的に大きいので高い位置決定精度が視野顕微鏡を開発し，タンパク質分子モータの 1 分子イメー得られます．図 4(b)は粒径 40 nm の金ナノ粒子をプローブと13)ジングに利用しています（図 4)．暗視野法は蛍光ではなくして用い，回転分子モータ V1-ATPase の回転運動を 100 マイ散乱光を観察する方法であり，粒径が数十 nm の金ナノ粒子クロ秒の時間分解能で観察した例です14)．1 秒間に 100 回を高いシグナル／ノイズ比で観察することができます．金ナノ転以上の高速回転中のステップとポーズが明確に観察されて粒子の散乱では蛍光色素より圧倒的に高いフォトン数 N が得おり，V1 -ATPase がステッピングモータであることがわかりまられるため，マイクロ秒の時間分解能で 1 nm 以下の位置決す．本手法はまた，リニア分子モータであるキネシンの直進運定精度を達成することができます．我々は現在，100 マイクロ動の詳細な解析にも適用されています15)．さらに金ナノ粒子

秒の時間分解能で 3 Å の位置決定精度を達成していますの散乱像と色素 1 分子の蛍光像を同時に取得することも可能（未発表データ）．さらに金ナノ粒子は蛍光色素と異なり退色しであり，分子モータの運動と化学反応（蛍光性 ATP の結ないので，長時間の観察が可能になります．金ナノ粒子はタ合・解離）の同時計測にも適用が可能です．

ンパク質よりも大きいので，その機能を阻害する可能性もありますが，結合させる場所を適切に選べば大概は問題なく機能

応用物理

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Fund amental Lectur e

7. むすび9）R.E. Thompson, D.R. Larson, and W.W. Webb: Biophys. J. 82, 2775
だい ごみ(2002).
10）https://imagej.net/Welcome

TIRFM に限らず顕微鏡を使った研究の醍醐味は，世界でまだ誰も見たことのない映像を初めて目の当たりにする機会に

11）http: //www. sanken. osaka-u. ac. jp/labs/bse/ImageJcontents/frameImageJ.
html

巡り合えることだと思います．本稿により，皆さんがこの喜び

12）A. Nakamura, T. Tasaki, D. Ishiwata, M. Yamamoto, Y. Okuni, A.
Visootsat, M. Maximilien, H. Noji, T. Uchiyama, M. Samejima, K.
Igarashi, and R. Iino: J. Biol. Chem. 291, 22404 (2016).
13）H. Ueno, S. Nishikawa, R. Iino, K.V. Tabata, S. Sakakihara, T. Yanagida,and H. Noji: Biophys. J. 98, 2014 (2010).
14）Y. Minagawa, H. Ueno, M. Hara, Y. Ishizuka-Katsura, N. Ohsawa, T.
Terada, M. Shirouzu, S. Yokoyama, I. Yamato, E. Muneyuki, H. Noji, T.
Murata, and R. Iino: J. Biol. Chem. 288, 32700 (2013).
15）H. Isojima, R. Iino, Y. Niitani, H. Noji, and M. Tomishige: Nat. Chem.
Biol. 12, 290 (2016).
(2018 年 2 月 26 日 受理)を体験する一助になれば幸いです．

謝辞

本稿を作成するうえで中村彰彦博士，安藤潤博士（ともに(共)自然科学研究機構分子科学研究所）に協力，助言をいただきました．この場を借りて感謝いたします．

文献1）飯野亮太：応用物理 87, 442 (2018).
2）T. Funatsu, Y. Harada, M. Tokunaga, K. Saito, and T. Yanagida: Nature374, 555 (1995).
3）I. Sase, H. Miyata, J.E. Corrie, J.S. Craik, and K. Kinosita Jr.: Biophys. J.
69, 323 (1995).
4）T. Ha and P. Tinnefeld: Annu. Rev. Phys. Chem. 63, 595 (2012).
5）X.S. Xie and J.K. Trautman: Annu. Rev. Phys. Chem. 49, 441 (1998).
6）A. Yildiz, J.N. Forkey, S.A. McKinney, T. Ha, Y.E. Goldman, and P.R.
Selvin: Science 300, 2061 (2003).
7）E. Betzig, G.H. Patterson, R. Sougrat, O.W. Lindwasser, S. Olenych, J.S.
Bonifacino, M.W. Davidson, J. Lippincott-Schwartz, and H.F. Hess:Science 313, 1642 (2006).
8）M.J. Rust, M. Bates, and X. Zhuang: Nat. Methods 3, 793 (2006).

飯野亮 太（いいの りょうた）2000 年名古屋大学大学院理学研究科単位取得退学．03 年
博 士（理 学）取 得．国 立 研 究 開 発 法 人 科 学 技 術 振 興 機 構（JST）ERATO 研究員，大阪大学産業科学研究所特任助手，助手，助教，東京大学工学系研究科講師，准教授を経て，14年 6 月より大学共同利用機関法人自然科学研究機構分子科学研究所・岡崎総合バイオサイエンスセンター教授．総合研究大学院大学教授兼任．

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