す。このホログラフィック蛍光３次元イメージングの応用として生きた細胞や組織の同時３次元イメージングが挙げられます。生きた細胞における分子や構造を蛍光タンパク質により標識し、その動態を蛍光顕微鏡などにより観察することが可能です。
本研究にて構築したシングルショット３次元蛍光観察技術により、これまではレーザースキャン（走査）により比較的長い時間がかかっていた３次元イメージングをシングルショット・スキャンレスで行えるようになります。
次に、図１左側に示すのが、本研究で導入したホログラフィック位相３次元イメージング※４系です。
生きた植物細胞には、細胞核、ミトコンドリア、葉緑体、細胞壁などが存在し、それらの構造を位相（光路長）の違いにより可視化することが可能です。この系では、マッハツェンダー型干渉計を採用することで、平面参照波を用いることができ、簡単でかつ測定物体に応じた最適な干渉縞を得ることができます。
これら蛍光と位相計測の２つを一体化し、ディジタルホログラフィック顕微鏡を構築しました。続いてこの顕微鏡を、生きた植物細胞の可視化に適用しました。今回行なった実験では、空間３次元及び時間軸（１次元）を加えた４次元観察が実現可能であることを実証するために、ヒメツリガネゴケと 10 µm 直径の蛍光ビーズを用いました。図２と図３にヒメツリガネゴケの蛍光と位相の同時３次元イメージング実験結果を示します。図２(b)は従来のフルフィールド型の蛍光顕微鏡による蛍光像で、７つの細胞核を見ることができます。その内、番号 1、2、4 は焦点が合っていますが、その他は奥行き位置が異なるために、ぼけて広がった弱い蛍光像となっています。これに対して本提案手法では、図 2(c)の蛍光ホログラムから蛍光の光波情報を抽出し、この情報を元に計算機内での光伝搬計算により奥行き方向に任意の距離で再生した蛍光像が得られるために、異なる奥行き位置にある複数の蛍光に対して焦点の合った像が記録した 1 枚の画像からスキャンレスに復元されます。３つの面で得られた再生像を図2(d)、 (e)、 (f)に示します。(d)と(e)の間は 10 マイクロメートル、(e)と(f)の間は 15 マイクロメートルです。焦点の合った箇所を黄色の矢印で示していますが、これにより７つの核の蛍光像は３つの面のどれかで焦点が合っていることがわかります。
図３は奥行きの異なる３つの面での定量位相分布を示しています。個々の葉緑体（図 3(b)における細胞の端に多数存在する赤いピーク）などを可視化できています。計測した定量位相値から細胞厚さを計算した結果、約 17 マイクロメートルとなり、他の文献値と近い値を得ることに成功しました。
下記 URL にて、直径 10 マイクロメートルの蛍光ビーズが溶液中を浮かんでいる様子を本手法で記録し、再生した動画をご覧いただけます。ビーズは奥行き方向にも移動しているため、再生距離を変化させて焦点を合わせたままにすることで３次元位置を求めることもできます。
https://www.kobe-u.ac.jp/research_at_kobe/NEWS/news/2020_05_15_01.html（5 月 15 日 18:00 掲載予定）

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図２ ヒメツリガネゴケの蛍光３次元イメージング結果;下段、黄色の矢印が焦点の合った細胞核の蛍光像。

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図３ ヒメツリガネゴケの位相３次元イメージング結果; 異なる再生面での位相再生像。右側は立体マップ。今後の展開本技術では、蛍光及び位相同時３次元計測を実現するシングルショットマルチモーダルディジタルホログラフィック顕微鏡を提案しました。これにより定量位相と蛍光イメージングを同時に実現できるため、生きた細胞群や生体組織における生命現象の可視化に新しい基盤技術を提供すると考えられます。
特に、本顕微鏡が複雑な植物細胞にも適用可能であることが示されたため、動物細胞よりも再生しやすい植物細胞の幹細胞化プロセスを多角的に解明することに役立ちます。将来的には、本顕微鏡による幹細胞化の可視化をもとに、光刺激による幹細胞化操作を実現し、植物の効率的増殖や成長促進による食料増産につなげるシステムなどへの応用展開が見込めます。
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今後の課題としては、光利用効率の更なる向上が挙げられます。ディジタルホログラフィーでは２つの光波の干渉を利用するため、光波を空間的に広げた後、２つの光波に分割し、再び重ね合わせる必要があります。そのため、イメージセンサーで観測するには蛍光エネルギーを大きくする必要があります。
その結果、細胞に照射する光エネルギーを大きくする必要があり、生きた細胞にダメージを与える光毒性が大きな問題となります。光毒性を避けるための光利用効率の更なる向上を目指す手段としては、体積型ホログラムの利用などが考えられます。また別の課題として、再生された３次元分布において、光の伝搬方向（物体の奥行き方向）に分布が伸び、精度を低下させる問題があります。この伸びを抑えて再生画像の画質を向上させるために、深層学習を用いる方法やフィルタ処理などに取り組んで参ります。

用語解説※1. ディジタルホログラフィー光は電磁波の仲間であり、光電場は振幅と位相で記述されます。この振幅と位相を記録する技術がホログラフィーです。光波の記録には、物体を通過または反射した物体光と基準となる参照光との干渉を用いて、光強度分布を光感光性フィルムやイメージセンサーで記録します。再生時には記録時に用いた参照光を光感光性フィルムに照射することで元の物体光が再生されます。干渉強度分布をイメージセンサーで記録して、光波の伝搬計算により元の物体光を計算機で復元・再生する方法はディジタルホログラフィーと呼ばれ、３次元計測分野に用いられています。
※2. ホログラフィック蛍光３次元イメージング蛍光はレーザー光とは異なり、空間的、時間的な干渉性が低い光です。ホログラフィーでは２つの光波の干渉が必要なため、光波を分割するビームスプリッタや回折格子などを用いて蛍光自身の光から複数の光波に分割することで干渉を得て、物体の３次元情報を取得する技術です。
※3. 空間光変調素子光波を空間的に制御する装置のことで、光の強さ（振幅）や光波の速度（位相）を画素ごとに制御することができます。
※4. ホログラフィック位相３次元イメージング干渉計測では２つの光波の位相差を干渉強度として計測します。参照光に平面波と呼ばれる一様な位相分布をもつ光波を用いると、物体光のもつ位相分布を抽出することができます。また、光波の振幅の２乗が強度となるため、物体光の振幅分布と位相分布の両方を求めることができます。これを用いて、元の物体面までフレネル伝搬計算や角スペクトル伝搬計算などの光伝搬計算法を用いることで、元の物体光の強度分布や位相分布を計算機内で再現することができます。位相分布を定量的に求めることができるため、細胞厚さ分布や屈折率分布などの計測にも利用できます。

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謝辞本研究は、科学研究費補助金基盤研究(A)「非線形ホログラフィック並列細胞操作技術を備えた４次元マルチモーダル顕微鏡」、科学技術振興機構(JST) 戦略的創造研究推進事業（CREST）研究領域「光の特性を活用した生命機能の時空間制御技術の開発と応用」（研究総括: 影山龍一郎）における研究開発課題「ホログラム光刺激による神経回路再編の人為的創出」（研究代表者：名古屋大学 和氣弘明）、神戸大学先端融合研究環極みプロジェクト「ホログラフィック技術による生命現象の４次元計測・操作の実現とその臨床利用」の支援を受けて行なったものです。

論文情報・タイトル“Digital Holographic Multimodal Cross-Sectional Fluorescence and Quantitative Phase ImagingSystem”DOI：10.1038/s41598-020-64028-x・著者Manoj Kumar, Xiangyu Quan, Yasuhiro Awatsuji, Yosuke Tamada, and Osamu Matoba・掲載誌Scientific Reports

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E-mail：matoba@kobe-u.ac.jp

京都工芸繊維大学電気電子工学系教授 粟辻 安浩（あわつじ やすひろ）TEL：075-724-7444

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