2.3 低線量率放射線に対する生理応答影響実験調査（第2期）
2.3.2 低線量率放射線が血管系に及ぼす影響
Analyzing Effects of Low Dose-Rate Radiation on Endothelial Cells Regulating
Hematopoietic Stem Cell Maintenance廣内篤久, 田中 聡, 小村 潤一郎
生物影響研究部

Tokuhisa HIROUCHI, Satoshi TANAKA, Jun-ichiro KOMURA
Department of Radiobiology
Abstract
Hematopoietic stem cells (HSCs) are surrounded by blood vessels in the bone marrow. Endothelial cells
in arteries and sinusoids play an important role in regulating HSC behaviors. Sinusoidal endothelial cells(SECs) anchor HSCs in vascular niches, and arterial endothelial cells (AECs) secrete stem cell factors (SCFs)
and Cxcl12 that promote self-renewal of HSCs. These endothelial cells were sensitive to a lethal dose of highdose-rate radiation, resulting in rupture and hemorrhage. The sensitivity of SECs and AECs to low dose-rate(LDR) radiation is unknown. Previously, we showed that ex vivo HSCs isolated from the bone marrow werehighly sensitive to 20 mGy/day of LDR radiation as compared to in vivo HSCs irradiated in the bone marrow.
Results suggest that the microenvironment surrounding HSCs, such as the SECs and AECs may attenuate theantiproliferative effects of LDR radiation on HSCs. Since the sensitivity of AECs and SECs and their response
to LDR radiation has not been investigated, the object of this study is to clarify roles of AECs and SECs on
maintenance of HSCs during and after irradiation, as well as the possible contribution of the irradiated AECsand SECs towards the transformation of HSCs into leukemic stem cells.
1. 目的

殖が抑制されている可能性が示された。 つまり、低骨髄内の血管は造血幹細胞の周辺環境を構築し、線量率放射線照射中の造血幹細胞周辺環境の形態的造血幹細胞の増殖、休止、分化、移動を制御する。

変化は小さいが、総線量などに応じて造血幹細胞を20 mGy/日の低線量率放射線は、長期照射によりマ維持するために機能していると考えられる。骨髄内ウスの造血幹細胞の増殖を抑制するが、骨髄内血管血管の血管内皮細胞は、造血幹細胞周辺環境の足場への影響は明らかになっていない。一方、亜致死線となる洞様毛細血管内皮細胞（Sinusoidal Endothelial

量及び致死線量の高線量率放射線は骨髄内血管を断Cell: SEC）と造血幹細胞増殖因子を分泌する細動脈裂させ、造血幹細胞の周辺環境を破壊し、造血幹細内皮細胞（Arteriole Endothelial Cell: AEC）があり、胞の減少につながると考えられている。低線量率放造血幹細胞の維持にとって重要である。本研究は、射線については、これまでの調査によって総線量低線量率放射線が骨髄内血管内皮細胞に着目して、8Gyまで血管断裂は見られないが、造血幹細胞を体SECとAECが照射中の造血幹細胞の維持のために果外に出して周辺環境から切り離した環境（Ex vivo環たしている役割を明らかにすることを目標とし、同境）での0.4Gy照射は体内に比べて感受性が高く、前時に造血幹細胞の白血病幹細胞化への寄与を考察す

述の総線量8Gy照射マウスの造血幹細胞の遺伝子発る。

現プロファイルの解析結果は細胞外因子によって増- 40 -

2. 方法起源である血管内皮幹細胞はCD45陰性、TER119陰フローサイトメーターによる骨髄中のAEC、SEC性はAEC、SECと同じだが、CD157陽性、CD200陽性などの細胞数測定を検討した。自家繁殖の158〜160で分離可能できる。フローサイトメーターに用いる

日齢のSPF C3H/He Nrsオスマウスにと殺前にPDPN-

モノクローナル蛍光抗体の多くはC57BLマウスの細PerCP/Cy5.5蛍光抗体3 µgを尾静脈より注射し、10分胞表面抗原との反応を保証しているが、認識部位は間放置した。イソフルラン麻酔による安楽死の後に抗体産生クローンによって異なる。
表1に検討に用い上腕骨と大腿骨を採取し、骨髄の吹き出し、吹き出たモノクローナル蛍光抗体を示す。30-F11クローン

し後サンプルの鉗子、メス、乳鉢による破砕を行っ（CD45）、TER119クローン（TER119）、YN1/1.7.4

た。これにcollagenase IVとdispase IIを同時に処理し、クローン（CD54抗体）由来の抗体はC3Hとの良好なPharm Lyse溶液（BD社）による溶血処理を行った。

反応が確認された。8.1.1クローン（PDPN抗体）とBP-得られた細胞に含まれる死細胞はFVS780（BD社）で3クローン（CD157抗体）については明確なピークが標識して除外した。これに蛍光抗体を反応させた後、得られなかった。CD31抗体については、MEC13.3クCellotion（Zenoaq社）で洗浄し、FACS Aria Fusion（BDローンと390クローン由来の抗体を検討し、共に弱陽社）で解析した。

性細胞が骨髄と脾臓で観察された。僅かではあるが骨髄内血管内皮細胞と造血幹細胞の共培養系のMEC13.3の方が蛍光強度が高かったので幾分反応性対照実験として、ポリビニルアルコール（polyvinylが良いと考えられる。Sca-1抗体は従来から使用してalcohol: PVA）を用いた造血幹細胞の単独培養を検討いるD7クローン由来のものを使用したが、強陽性細した。140〜190日齢のSPF C3H/He Nrsオスマウスの胞が観察されなかった。AECとSECについては特定上腕骨と大腿骨の骨髄細胞をDMEM培地に吹き出し、が極めて困難であった。一方、血管内皮幹細胞は骨Direct lineage cell depletion kit（Miltenyi社）を用いた髄と脾臓で明確な陽性細胞が認められた。AECと磁気細胞分離（MACS）法により成熟した細胞を除SECを判別についてはCD31抗体、Sca1抗体、CD54抗去し、FVS780標識により死細胞を除去した。これに体、PDPN抗体のクローンを変え、CD62E (E-selectin)

蛍光抗体を反応させ、FACS Aria Fusionを用いて抗体を加えて引き続き検討を行い、B6C3F1マウスにlineage c-kit Sca1 CD34 の造血幹細胞を分取し対する反応性の調査も併せて行う。

neg

posposneg

た。分取した造血幹細胞をポリビニルアルコール

造血幹細胞ニッチ機能解析では造血幹細胞と骨（ polyvinyl alcohol: PVA ） と 0.1% と BIT 9500

髄内血管内皮細胞を可能な限り長期間共培養するこ（STEMCELL Technologies社）を20%含むStemSpanとで造血幹細胞の維持機能を評価することが望まし

SFEM II培地（STEMCELL Technologies社）にhumanい。
同時に各共培養実験の造血幹細胞は非照射の150LDL（STEMCELL Technologies社）、SCF、TPO、Flt-日齢前後のマウスからその都度分取するので、内在3L（R & D社）をそれぞれ25 μg/ml、100 ng/ml、100性コントロール実験を行なって各造血幹細胞単独でng/ml、1 ng/mlの終濃度で添加してCO2インキュベの自己複製能と分化能を実験間で補正する必要があーターで培養した。培地交換は培養開始5日目、それる。造血幹細胞単独の長期培養はPVAとヒトフィブ以降は3日毎に行った。培養後は、Trypan Blue溶液でロネクチンを用いることで約2ヶ月間の培養が可能

死細胞を染色し、血球計算盤で生細胞を計数した。

である。そこで、従来の造血幹細胞Ex vivo培養法にPVAとヒトフィブロネクチンを添加して造血幹細胞

3. 成果の概要単独の長期培養法を検討した。この条件では、造血AECとSECの細胞表面抗原プロファイルは共に幹細胞を培養容器底面に接着させ、3日毎の培地交換

CD45陰性、TER119陰性、CD31陽性だが、SECはSca1時に浮遊細胞を廃棄するので、定期的に分化した細高発現でpodoplanin（PDPN）陽性、CD54（ICAM1）胞が除かれ、自己複製した造血幹細胞だけが残存す

陽性、AECはSca1弱発現でPDPN陰性、ICAM1陰性でる。培養開始3日目から細胞係数を計測したところ、判別可能である。AECとSECを含む血管内皮細胞の17日目において培養開始時の約30倍程度に増加し、- 41 -

20日目で定常状態に達した。今後は増加細胞の細胞分化解析を行うと同時に、各種骨髄内血管内皮細胞と全骨髄細胞との共培養実験の条件検討を行う。

Table 1.

List of monoclonal fluorescent antibodies used for flow cytometry

Cell surface antigen

Endothelial vascular stem cellClone name

AEC

SEC

Sca-1

D7++

+

CD45

30-F11---

TER119

TER119---CD31

MEC13.3, 390+++

YN1/1.7.4-+

PDPN (podoplanin)

8.1.1-+

CD157

BP-3

CD54(ICAM1)+- 42 -