NADPH産生に着目したペントースリン酸経路の代謝強化による麹菌の脂質生産性の向上
玉野孝一

国立研究開発法人産業技術総合研究所
研究の目的
地球上の化石燃料の需要の増加に伴い、植物成分を原料に生産されるバイオ燃料は、カーボンニュートラルの点で地球環境に及ぼす影響が低いことから、その必要性が高まっている。そこで、物質の分解と合成の能力に優れた麹菌を用いて、グルコースからバイオディーゼル燃料の原料となる脂肪酸などの脂質を大量生産する技術を、遺伝子組換
えにより開発してきた 1)2)。本研究では、脂質生合成に必要な NADPH が、麹菌の通常の代謝では脂質の大量生産に十分な量で産生されていないという実験データに基づき、NADPH を産生するペントースリン酸経路を代謝工学的手法で強化して、NADPH 量を増加させることにより、麹菌の脂質の生産性を高めることを目的とする。

方法
麹菌のペントースリン酸経路を構成する酵素遺伝子の各高発現株は、それらの遺伝子のプロモーターを構成的に発現量が高い tef1 遺伝子のプロモーター（Ptef1）に遺伝子組換えで置き換えることで構築した。この構築に当り、宿主には麹菌 pyrG 欠損型 faaA 破壊株（ΔfaaA_pyrG-）を用いた。
また、プロモーター置換のための DNA 断片は、KOD-PLUS（東洋紡）を用いた fusion PCR により、1kb 長の対象遺伝子の 5’-UTR 断片・pyrG 選択マーカー・1,028 bp 長の Ptef1・1kb 長の対象遺伝子の開始コドンから始まる断片の順に連結した形で、作製した。ΔfaaA_pyrG-株に当該 DNA 断片を導入後、生育した形質転換体を純化した。各高発現株の構築は PCR により確認した。各高発現株は 10%グルコースを含むツァペックドックス最少液体培地 50 ml で 30℃, 200 rpm, 120 時間培養し、生育菌体は回収後に 100 ml のミリ Q 水で 2 回洗浄した。凍結乾燥後、50 mg の乾燥菌体をビーズ破砕機 MS-100（トミー精工）で破砕し、クロロホルムで菌体内遊離脂肪酸を抽出した。クロロホルムを揮発後、遊離脂肪酸の沈殿を 6% トリトン X-100/6%エタノール混合液に溶かし、そのうちの 5 µl を用いて遊離脂肪酸ハーフマイクロテストキット（ロシュ）により菌体内遊離脂肪酸量を測定した。

結果
これまでの麹菌の代謝工学的手法による代謝改変の結果、アシル CoA 合成酵素遺伝
子 faaA の破壊株（ΔfaaA）では遊離脂肪酸生産性が野生株の 9.2 倍に増大することを見出した 2）。そこで、この ΔfaaA でさらに生産性を向上させるために、脂肪酸生合成に必要な NADPH の産生系であるペントースリン酸経路に注目した。麹菌の一般的な代謝における全ゲノムトランスクリプトーム解析の結果、NADPH 合成量は脂質生産を最大化させる上で不十分であることが推察された。そこで、ペントースリン酸経路を強化するために、当経路の各酵素遺伝子を faaA 破壊株で高発現させることを考えた。
麹菌のペントースリン酸経路で働くと考えられる酵素遺伝子は、麹菌ゲノムスケール
代謝モデルに関する論文 3）、および酵母で同定された当経路の酵素遺伝子に対するBLASTP を用いた相同性検索結果を参照して選出した。選出した遺伝子を図 1 内のリストに記した。

Reaction

Gene ID

Annotation①

AO090005001427

Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase②

AO090005000789

6-phosphogluconolactonase③

AO090003000121

6-phosphogluconate dehydrogenase③

AO090001000547

6-phosphogluconate dehydrogenase④

AO090023000209

Ribose 5-phosphate isomerase⑤

AO090012000303

D-ribulose-5-phosphate 3-epimerase⑥

AO090012000526

Transketolase⑥

AO090023000345

Transketolase⑥

AO090001000322

Transketolase⑦

AO090020000520

Transaldolase

number

図 1 細胞質における NADPH 産生の代謝イラスト（左）、ペントースリン酸経路で働くと予測された麹菌の酵素遺伝子リスト（右）これらの選出酵素遺伝子の各高発現株を、ΔfaaA_pyrG-を親株に用いて構築した。その結果、トランスケトラーゼをコードすると予測された AO090023000345 を高発現させると、遊離脂肪酸生産性が ΔfaaA の 1.4 倍に増大することが認められた（図 2A）。また、培養後の全菌体の乾燥菌体重量で菌体収量を比較した。その結果、この AO090023000345
高発現 faaA 破壊株（ΔfaaA_tktOE）は、ΔfaaA に比べて菌体収量が 1.2 倍に増大していることが確認された。したがって、単位培養液量当たりの遊離脂肪酸の生産量は、両増大比の積算値に当たる 1.7 倍に増大した（図 2B）。

A

B
Relative FFA production yield

Relative FFA productivity

1.6
1.41.210.80.60.40.20ΔfaaA
図2ΔfaaA_tktOE

2.221.81.61.41.210.80.60.40.20ΔfaaA

ΔfaaA_tktOE

AO090023000345 高発現化による遊離脂肪酸の生産性（A）
および単位培養液量当りの生産量（B）の変化

興味深いことに、ΔfaaA は液体培養で菌糸の凝集体を形成するのに対し、ΔfaaA_tktOE
は凝集体を形成せずに菌糸が分散した状態となった（図 3）。
図 3 麹菌 faaA 破壊株（左）とAO090023000345 高発現 faaA 破壊株（右）の液体培養菌体の写真

一方、ペントースリン酸経路の他の酵素をコードすると予測された遺伝子の高発現化は、いずれも遊離脂肪酸生産性を増大させなかった。加えて、AO090023000345 以外にも麹菌でトランスケトラーゼをコードすると予測された遺伝子は 2 個あったが、それらの高発現化も遊離脂肪酸生産性を増大させなかった。
ペントースリン酸経路と共に、TCA 回路から発生するリンゴ酸をピルビン酸に変換するリンゴ酸酵素反応も NADPH を生成する。このリンゴ酸酵素をコードすると考えられる 2 遺伝子（AO090011000876, AO090038000621）の各高発現株を、ΔfaaA_pyrG-を親株として構築した。しかし、遊離脂肪酸生産性は ΔfaaA から向上しなかった。

結論
麹菌 faaA 破壊株において、ペントースリン酸経路のトランスケトラーゼをコードすると予測された AO090023000345 の高発現化が、遊離脂肪酸生産性を 1.4 倍に増大させた。さらに、生産性だけでなく、菌体収量も 1.2 倍に増大した。その結果、単位培養液量当たりの遊離脂肪酸生産量は 1.7 倍に増大した。一方で、NADPH 産生に直接関与する、グルコース 6 リン酸脱水素酵素、6 ホスホグルコン酸脱水素酵素、およびリンゴ酸酵素の各予測遺伝子の高発現化は faaA 破壊株において遊離脂肪酸生産性の増大に寄与しなかった。

文献1) Tamano, K. et al. (2013) Increased production of fatty acids and triglycerides in Aspergillus
oryzae by enhancing expressions of fatty acid synthesis-related genes. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 97: 269-281.
2) Tamano, K. et al. (2015) Increased production of free fatty acids in Aspergillus oryzae by
disruption of a predicted acyl-CoA synthetase gene. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99:3103-3113.
3) Vongsangnak, W., Olsen, P., Hansen, K., Krogsgaard, S., and Nielsen, J. (2008) Improved
annotation through genome-scale metabolic modeling of Aspergillus oryzae. BMC Genomics
23: 245.