静電気学会誌，38, 1（2014）28-33

J. Inst. Electrostat. Jpn.

論

文

オンチップエレクトロポレーションを用いた接着細胞核への遺伝子直接送達法の開発
黒澤 修 ，オケヨ・ケネディ・オモンディ ，小穴 英廣 ，
＊＊＊
＊＊＊＊
＊, ＊＊
沖田 圭介 ，小寺 秀俊 ，鷲津 正夫
＊, 1

＊＊

＊＊

（2013年9月10日受付；2013年11月18日受理）

Development of Direct Gene Delivery System into Adherent Cell Nucleus
Using On-Chip Electroporation
＊, 1

＊＊

＊＊

Osamu KUROSAWA , Kennedy O. OKEYO , Hidehiro OANA ,
＊＊＊
＊＊＊＊
＊,＊＊
and Masao WASHIZU
Keisuke OKITA , Hidetoshi KOTERA(Received September 10, 2013; Accepted November 18, 2013)
We developed a novel gene delivery system based on on-chip electroporation for introduction of plasmids directly into the
nucleus of adherent cell by electrophoresis. The orifice sheet with adherent cells was inserted between AgCl electrodes and apulse of 4V-200msec was applied in a DMEM medium containing GFP plasmids. Most cells showed GFP expression within 2hours after pulsation, suggesting that the plasmid was directly introduced into the cell nucleus. Making the orifice pitch nearly
equal to nucleus diameter increased the effect of field constriction at a micro orifice, resulting in higher yield of GFP
expression. We applied this direct gene delivery system to produce iPS cells. After introduction of Yamanaka factors, cells
were cultured on the orifice sheet for three weeks after electroporation, and then reprogramming of nucleus was checked using
Oct4 and Nanog antibodies. Cells which had formed colony stained positive for both antibodies of Oct3/4 and Nanog, showing
successful reprogramming of cell nucleus.

1．はじめにと，導入後の細胞を 1 個レベルで追跡して，望みの応答

近年，iPS 細胞・ES 細胞・抗体産生細胞・骨髄や膵島を示す細胞のみを選別するといった，トレーサブルな細などの移植用細胞をはじめとする，いわゆる高付加価値の細胞の取得・作製・評価が喫緊のニーズになってい胞機能計測法の開発を行う必要がある．
外来物質を種類を問わずに細胞内に導入する方法としる．このためには，細胞内に複数の外来物質を適当な期ては，エレクトロポレーションが挙げられる

間にわたって最適なタイミングと順序で導入する技術

クトロポレーションは，細胞懸濁液にパルス電界を印加

．エレ

1, 2）

して細胞膜に一過的な膜破壊を生じさせ，細胞内に物質キーワード：オンチップエレクトロポレーション，電界集中，遺伝子直接送達，iPS 細胞

東京大学バイオエンジニアリング専攻（〒113-8656 東京都文京区本郷7-3-1）
Dept. Bioengineering, The University of Tokyo, 7-3-1
Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8656, Japan＊＊
東京大学機械工学専攻（〒113-8656 東京都文京区本郷7-3-1）
Dept. Mechanical Engineering, The University of Tokyo,
7-3-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8656, Japan＊＊＊
京都大学 iPS 細胞研究所（〒606-8507 京都市左京区聖護院川原町53）
Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto
University, 53 kawahara-cho, Shogoin Yoshida, Sakyo-ku,
Kyoto 606-8507, Japan＊＊＊＊
京都大学マイクロエンジニアリング専攻（〒606-8501 京都府京都市左京区吉田本町）
Dept. Mechanical Engineering, Kyoto University, Yoshida
Honmachi, Sakyo-ku, Kyoto 606-8501, Japan1
okurosawa@washizu.t.u-tokyo.ac.jp＊を導入する方法である．一過的な膜破壊が生じる条件は，細胞膜に誘起される膜電圧が 1 V 前後の場合と限定されるが，この方法で誘起される膜電圧は，各々の細胞の細胞径・配向に依存し，外部からは制御不能であるため，過大な膜電圧が誘起された細胞は破壊されてしまうな
ど，低収率・低再現性・高侵襲であるという問題を抱えている．しかも，バルクでの作業であるため，目的の物質が導入された細胞を後で選別する必要があり，物質導入時の刺激応答を観測することは非常に困難である．
これらの問題を解決するため，筆者らは，マイクロオ
リフィス上に配置した細胞にパルスを印加する手法（オンチップエレクトロポレーションと命名）の開発を行った（図 1）．本手法を用いれば，電気力線がオリフィスに集中するので，ほとんどの電位降下がオリフィス近傍
で生じ，電極にかけた電圧のほとんどすべてがオリフィスに張られた細胞膜にかかることになる．その結果，細オンチップエレクトロポレーションを用いた接着細胞核への遺伝子直接送達法の開発（黒澤 修ら）

29

胞膜にかかる電圧は細胞の大きさや形状によらず，極めに向かって泳動されるため，プラスミドは必ず核内に入て低い電圧（1～3 V ）で高収率でのエレクトロポレーシ

ることになる。

ョンが可能となる．また，細胞がオリフィスに固定されこのように，細胞核直下にオリフィスを配することで，ているため個々の細胞の経時観察を行うこともできる ．

細胞内に取り込まれたプラスミドを電気泳動効果で核にところで，一般に，ウィルスベクターよりもプラスミ

直接送達するオンチップエレクトロポレーション法を遺3）

ドベクターを用いた方が遺伝子導入の収率が著しく低下

伝子直接送達法と呼ぶこととする．

するといった特徴がある．これは，細胞内への取り込みの不正確さ，核到達の不正確さ，そして細胞質内の核酸3．実験材料および方法

分解酵素や pH の変化によるプラスミドの分解が原因し3.1 細胞および培養ていると考えられる ．従って，プラスミドを核内に直細胞は，ヒト正常二倍体表皮線維芽細胞（ TIG-120）

接送達することができれば，上記の問題がすべて解決さを用いた．培養は，10％ FBS およびペニシリン・スト

4）れ，高収率な遺伝子発現が期待される．
この点に鑑みて，本研究では，接着細胞をあらかじめレプトマイシンを添加した DMEM 培養液で，37°
C・5％
CO2 インキュベータ内で行った．

オリフィスシート上で培養し，接着・伸展させた細胞の3.2 プラスミド

核内にプラスミドを直接送達する手法の開発を行った．

細胞内に導入したプラスミドの発現の有無を可視化す

また，本手法を用いて，ヒト体細胞（表皮細胞）に山中るため，GFP プラスミド（ pmaxGFP ）を使用した．iPS

因子を導入し，細胞の初期化を行うことに成功したので細胞作製用としては，Oct3/4，Sox2，Klf4 および L-Myc（山ここに報告する．

中因子）に，lin28 と p53shRNA の遺伝子を加えたエピソーマルプラスミド（以降，エピソーマル山中ベクター）

2．細胞核へのプラスミド直接送達を使用した ．エレクトロポレーション時の濃度は , 各々

接着細胞をオリフィスシート上で培養すると，細胞は50 μg/ml とした．

6）

シートに接着し扁平な状態に広がる．そして，細胞核は3.3 オリフィスシート

細胞が扁平になる力に押し潰され，シート表面から近い

オリフィス径・ピッチ・シート厚がそれぞれ，約 5位置に配置される．このとき，細胞核がオリフィス上にμm・50 μm・25 μm（カプトンシート：オリフィスシー

あるものは，細胞膜を挟んで核がオリフィスを塞いでいト A），約 3 μm・30 μm・7.5 μm（カプトンシート：オる状態にあるといえる．

リフィスシート B ），約 2 μm・ランダム（空隙率約 6％）
・また，エレクトロポレーションで生じた膜穿孔部から10 μm（ミリポア・アイソポアポリカーボネートフィルのプラスミド移入は，拡散だけではほとんど起こらず，

タ ー： オ リ フ ィ ス シ ー ト C ）， 約 2 μm・15 μm・2 μm

電気泳動を利用するのが効果的である ．

（ SU-8 シート：オリフィスシート D ），以上 4 種類のシ

5）

従って，図 1 に示すような配置で，接着・伸展した細ートを用いた．

胞に対して，オリフィス部以外の膜にも穿孔を起こすの

3.4 免疫染色用抗体に十分な持続長を有する矩形波パルスを印加すると，膜細胞の初期化の確認を，免疫染色法を用いて，未分化穿孔により細胞内に電流が流れることとなり，プラスミ細胞のマーカータンパク質である，Oct-3/4 と Nanog のドは電気力線に沿って正極に向かって電気泳動される．

発現の有無を調べることで行った．1 次抗体として，さらに，細胞内に導入されたプラスミドはオリフィス部

Oct3/4 抗体（ sc-5279：santa cruz ），Nanog 抗体（ ab21624：
abcam ）
，2 次 抗 体 と し て，Alexa-488 Anti-Mouse IgG（ A11001：Invitrogen ），Alexa-546 Anti-Rabbit IgG（ A11010：Invitrogen ）を用いた．

3.5 細胞播種
細胞を約 300 個 /mm でオリフィスシート上に播種し，
2

CO2 インキュベータ内で 1 日培養した．

3.6 パルス印加
シリコンゴムシートをスペーサーとし，電極ギャップ
図 1 細胞核へのプラスミド直接送達
Fig. 1 Direct introduction of plasmid into cell nucleus

が 1 mm あるいは 800 μm となるように，銀塩化銀電極
でオリフィスシートを挟み，細胞およびプラスミドが存

30

静電気学会誌 第38巻 第 1 号（2014）

在する側のチャンバーを負極側，オリフィスを介して反を図 2 に示す．図 2-a 中の点線で囲った細長い形状は，対 側 の チ ャ ン バ ー を 正 極 側 と し， 矩 形 波 パ ル ス

オリフィスの直上に細胞核がある細胞の輪郭で，この輪

4V-200msec を 1 回だけ印加した．

郭内でさらに点線で囲まれた円形部分は細胞核を示して3.7 iPS細胞の作製

いる．オリフィスは各図の中央部分に 15 μm ピッチでオリフィスシート D を用いて，エピソーマル山中ベ

13 個配置されている（図-a 中では白い輝点）．図中の点

クターと pmaxGFP を導入した後，直ちに，オリフィス

線で囲った細胞は，パルス印加から 30 分後に，わずかシートをシャーレ内の DMEM 培養液に沈め，CO2 イン

ではあるが GFP を発現し，60 分後には緑の蛍光（図中キュベータ内で培養した．6 日目までには DMEM で，7白色）がはっきりと確認できるまでに発現する様子が確

日 目 か ら は，iPS 細 胞 の 培 養 に 使 用 さ れ る mTeSR-1

認された．パルス印加から観察開始までにおいて細胞分（ STEMCELL ）で培養した．その後約 3 週間にわたり，裂は生じていなかったことより，この結果は，プラスミ

1 日ごとに細胞の経過を観察し，最後に，免疫染色によドが核内に直接送達されたことを反映しているといえり核の初期化の有無を調べた．

る．また，他の細胞の観察結果から，GFP の発現が見られた細胞は，2 時間以内には発現を開始し，5 時間で発4．実験結果現量がほぼ飽和に達する様子が確認された．

4.1 導入プラスミド発現のタイムラプス

4.2 遺伝子直接送達におけるオリフィスパターン依
存性

細胞内に導入されたプラスミドが遺伝子を発現するた
めには，核内に入って遺伝情報を読み出す（転写）必要

本遺伝子直接送達法は，遺伝子（プラスミド）が核内がある．しかし，プラスミドは，核膜孔（開口部直径約を直撃することが本質であることより，オリフィスシー

10 nm ）を通過できないため，細胞質内のプラスミドがト上に播種した細胞へのプラスミドの導入収率は，オリ核内に入るためには，核膜が消失する細胞分裂を経験しフィスと核の位置関係に大きく依存すると予想される．

なければならない．すなわち，通常の方法で GFP プラ

そこで，オリフィス径とオリフィスピッチの異なるオリ

スミドを導入した場合，すべての導入細胞が GFP を発

フィスシート（オリフィスシート A，B，C ）を用いて，現するのは，細胞周期分経過した約 24 時間後となる ．

プラスミド導入収率のオリフィスパターン依存性を検証

7）

一方，本研究で提案する遺伝子直接送達法を用いれば，
プラスミドは核内に直接送達されるため，導入から数時間以内に発現が生じるはずである．

した．
本研究で使用した細胞がシート上に接着・伸展した際の細胞と核のおおよその大きさは，細胞が 30 μm × 100

エレクトロポレーション後，キーエンスのオールイン

μm，核の径は 15～20 μm 程度である（図 2-a 参照）．従ワン蛍光顕微鏡（ BZ-9000）を用いて，15 分間隔で蛍光って，細胞が十分な接着状態にある場合，各シートにお画像を取得し，GFP 発現の時間経過を調べた結果の一部

ける細胞核とオリフィスの配置は以下となる．シート A（図 3a-1）では，細胞の直下にオリフィスはあるが核の直下にオリフィスがあるとは限らない．シート B（図3b-1）の場合，細胞核の直下にほぼ 1 個のオリフィスが存在している．シート C（図 3c-1）の場合，核の直下に確実に複数個のオリフィスが存在するが，オリフィス部
での電界集中が必ずしも保証されない．
以上より，高収率な遺伝子発現を安定して得られるのは，シート B と予想される．
パルス印加から 5 時間経過した各オリフィスシート上における GFP 発現細胞の結果を図 3a，b，c-2 に示す．
予想どおり，シート B を用いた場合に最も多くの GFP
発現細胞が得られた（図 3b-2）．シート C を用いた場合も比較的高収率な GFP 発現細胞を得られているが（図図 2 パルス印加による GFP プラスミド導入から GFP 発現の経過観察
Fig. 2 Time-lapse observation of GFP expression after pulsation

3c-2），オリフィスが密集している個所などは電界集中が不十分となり，実際，再現性に問題があった．
以上の結果より，電界集中を保証したうえで，オリフオンチップエレクトロポレーションを用いた接着細胞核への遺伝子直接送達法の開発（黒澤 修ら）

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クターが用いられていた．しかし，この方法は，導入した外来遺伝子が iPS 細胞のゲノムの中に組み込まれ，細胞の癌化を引き起こすなど，安全面で問題があった．そこで，遺伝子挿入のない iPS 細胞を作製する方法の一つとして，遺伝子発現が一過的であるプラスミドをエレクトロポレー
ションで導入する方法が開発された ．この方法は，細胞9）内で自己複製可能なエピソーマルプラスミドを用い，通常の山中因子に lin28，p53shRNA を加えることで，初期化効率（ iPS 細胞のコロニー数 / 使用した総細胞数）を0.03％程度までに改善することに成功している ．しか6）

し，この効率は，ウイルスベクターを用いた場合の 10
分の 1 で，さらなる高率化が求められている．
そこで，遺伝子直接送達法を用いて，エピソーマル山
中ベクターを細胞核に直接導入することで，iPS 細胞作
製効率を向上できるかを検討した．
エピソーマル山中ベクターおよび pmaxGFP 導入後オンチップ培養した細胞の経過観察結果を図 4 に示す．図4a-2 は，パルス印加から 5 時間後の GFP 発現状況で，約 20％程度の細胞が GFP を発現しており，エレクトロ
ポレーション自体は上手くいっていることが分かる．6日目の結果（図 4b ）から，分裂して増殖した細胞が寄り集まって集合しやすい傾向がみられた．このような細胞の集合は，山中因子を導入していない細胞では見られ
図 3 GFP 発現収率のオリフィスサイズおよびピッチ依存性
Fig. 3 GFP expression on three types of orifice sheets 5 hours
after pulsation

ない現象である．7 日目以降から使用した mTeSR-1 培養ィスピッチを狭めることができれば，発現収率をより高えており，山中因子が導入された細胞が分裂・増殖してめることができる．筆者らの解析結果によると，電界集いるといえる．図 4d-1 に見られるような細胞のコロニ中を保証するためには，オリフィス径を a，ピッチを p，ーは，15 日目ぐらいにコロニーの出来始めがみられ，

電極ギャップを L とすると，aL/p が 10 より十分小さいコロニーとしてはっきりと認識できる程度になったのは

2

液は，ヒト iPS 細胞用に調製されており，体細胞はほとんど増殖できない．図 4c をみると，細胞が全体的に増18 日目であった．通常，iPS 細胞のコロニー形成においことが条件となる．
ここで，接着状態での細胞核のサイズが 15〜20 μm 程ては，山中因子導入後の細胞をフィーダー細胞上に再播度であることを考慮すると，オリフィスピッチを 15 μm

種して培養を行うが，その場合，2〜3 週間でコロニーにすれば，核の直下にオリフィス 1 個以上をほぼ確保でができ始めて大きな塊となる ．すなわち，オンチップ

きる．この条件のもとで，オリフィス径を 2 μm，電極培養でコロニー形成に要した期間は，フィーダー細胞をギャップを 800 μm 以下とすれば，aL/p は 7 以下となり，用いる従来の方法とほぼ等しいといえる．これはおそら

電界集中を保証できる．

く，山中因子が導入されなかった細胞が，オンチップ上2以上より，以降の実験においては，オリフィス径 2
μm，ピッチ 15 μm のオリフィスシート D を用い，電極6）でフィーダー細胞様の働きをしたためと予想される．
図 5 は，20 日経過後の細胞を Oct3/4 抗体と Nanog 抗ギャップ 800 μm で行うこととした．

体で免疫染色した結果である．図 5a〜d は，オンチップ

iPS細胞作製への応用

上の細胞の全体像で，図 5a は明視野像，図 5b は細胞の4.3

iPS 細 胞 とは，体 細 胞 に 4 つ の 遺 伝 子（ 山 中 因 子：

核を染めた DAPI 染色像，図 5c は Oct3/4 抗体による免Oct3/4，Sox2，Klf4 および c-Myc ）を導入することで核を疫染色像，図 5d は Nanog 抗体による免疫染色像である．

初期化し，分化万能性を再獲得させた細胞のことである ．

また，各図内で示した四角点線で囲った領域の拡大図を，

遺伝子を導入する方法としては，当初，レトロウイルスベ

図 5-e（領域 A ），図 5-f（領域 B ）に示す．四角点線内

8）静電気学会誌 第38巻 第 1 号（2014）32

図 4 山中因子導入からコロニー形成の過程
Fig. 4 Time course of colony formation from the introduction of
Yamanaka factors.

のコロニー状の細胞の核が Oct3/4 と Nanog 抗体で染色されていることより，Oct3/4 と Nanog を発現しているのがわかる．
Oct3/4 は，山中因子にも含まれるが，エピソーマルプ

図 5 免疫染色による初期化細胞の確認
Fig. 5 Micrographs are the results of immunostain for Oct3/4 andNanog.

ラスミドを用いた場合でも，3 週間後の残存率は 5％程度であることより ，図 5e-2 に見られるようにコロニーコロニーであり，これを 30 日間培養したとすると，領内の全細胞に発現している Oct3/4 は，染色体由来のも域 A 内と領域 B 内の各コロニーはひとかたまりとなるのといえる．

ことが予想され，その場合の効率は 0.05％で，従来法と6）以上の結果より，形成されたコロニーは初期化された細胞の集合体であるといえる．

ほぼ同程度ということになる．従って，今回の方法では，効率を大きく改善できたとは言い難い．その原因の一つ

さて，iPS 細胞の効率は，播種した細胞数（本実験でとして，従来法と同じく，エピソーマル山中ベクターをは約 4000 個）当たり形成したコロニー数で表わされる．

1 回のみしか導入しなかったことが挙げられる．効率改

図 5 の領域 A および B には，
大小いくつかのコロニー（ α，

善のためには，細胞内で生じる初期化のプロセスをコン

β，γ，δ，ε ）が存在しているが，図中 α，β，γ，δ，ε でトロールすることが重要であるので，本手法を用いて，示したコロニーをすべて独立したコロニーとみなすと，初期化に関わる因子を，各因子の導入量および導入タイ

効率は 0.125％で，従来法での 0.03％に比べ効率が改善

ミングを制御して細胞内導入すれば，効果的であると期されたといえる．しかし，通常，コロニーのカウントは，待される．

30 日間培養した後に行われる．図 5 は 20 日間培養後の以上，本手法を用いれば，フィーダーフリーで iPS 細オンチップエレクトロポレーションを用いた接着細胞核への遺伝子直接送達法の開発（黒澤 修ら）

33

胞を作製できることが判明した．iPS 細胞を再生医療に参考文献応用するためには，異種成分を含まない培養系の確立が

1） C. Chen, A S.W. Smye, A M.P. Robinson, J.A. Evans：

求められることより，自己細胞をフィーダー様細胞としMembrane electroporation theories: a review. Med Biol Engている本手法は，有効な方法になりうると期待される．

Comput, 44（2006）5-14
2） J. Gehl：Electroporation: theory and methods, perspectives

5．結論

for drug delivery, gene therapy and research. Acra

オンチップ上で培養した細胞の核にプラスミドを直接Physiologica Scandinavica, 177, Issue 4（2003）438-443

導入する遺伝子直接送達法を開発し，以下の結果を得た．

3） O. Kurosawa, H. oana, S. matsuoka, A. Noma, H. Kotera and1．パルス印加から数時間以内には十分量の遺伝子発現

M. Washizu：Electroporation through a micro-fabricatedが生じることが実験的に示された．この結果は，細orifice and its application to the measurement of cell response

胞周期に依存することなしに遺伝子発現のタイミングを制御できることを示している．
2．山中因子導入から初期化細胞コロニー形成までをオ

to external stimuli. Meas. Sci. Technol., 17（2006）3127-3133
4） D. Luo & W. M. Saltzman：Synthetic DNA delivery systems.
Nature Biotechnology, 18（2000）33 - 37

ンチップ上で行うことができた．フィーダー細胞上5） S. I. Sukharev, V. A. Klenchin, S. M. Serov, L. V.

への再播種等の作業が省略され，自己細胞をフィー

Chernomordik, and Yu. A. Chizmadzhev,：Electroporation

ダー様細胞とする安全で簡便な iPS 細胞作製法といand electrophoretic DNA transfer into cells The effect of DNA

える．

interaction with electropores. Biophys. J., 63（1992）1320-

3．遺伝子直接送達法を用いて iPS 細胞を作製できることを実証した．作製効率は，従来法の同等以上では

1327
6） K. Okita, Y. Matsumura, Y. Sato, A. Okada, A. Morizane, S.

あるが，大幅な改善には至らなかった．

Okamoto, H. Hong, M. Nakagawa, K. Tanabe, K. Tezuka, T.

本手法の利用は，iPS 細胞の作製のみならず，細胞分Shibata, T. Kunisada, M. Takahashi, J. Takahashi, H. Saji, and裂を行わない神経細胞やプライマリー細胞へのプラスミ

S. Yamanaka, ＂A more efficient method to generate

ド導入と遺伝子発現等に応用が期待される．

integration-free human iPS cells＂, Nature methods, online 3
april（2011）

謝辞

7） K. Hakamada, S. Fujita, and J. Miyake：Onset timing of

本 研 究 の 一 部 は， 科 学 研 究 費 補 助 金（ 課 題 番 号：

transient gene expression depends on cell division.Journal of23241041，23246045）および㈱アークレイの助成を受け

Bioscience and Bioengineering, 109, Issue 1（2010）62-66て行われたものです。ここに謝意を表します。

8） K. Takahashi, S. Yamanaka：Induction of pluripotent stem
cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures bydefined factors.Cell, 126, Issue 4（2006）663-676
9） K. Okita, M. Nakagawa, H. Hyenjong, T. Ichisaka, S.
Yamanaka：Generation of Mouse Induced Pluripotent StemCells without Viral Vectors. SCIENCE, 322（2008）949-953