第 75 回（ 2023年）

日本生物工学会大会
Topics of 2023
特 別要旨 集会期2023 年（令和 5 年）9 月 3 日（日）～ 5 日（火）

会

場

名古屋大学

東山キャンパス

公益社団法人 日本生物工学会

第 75 回（ 2023年）

日本生物工学会大会
Topics of 2023
特 別要旨 集会期2023 年（令和 5 年）9 月 3 日（日）～ 5 日（火）会場名古屋大学 東山キャンパス

公益社団法人 日本生物工学会

第 75 回（2023年）日本生物工学会大会

Topics of 2023

目次

〈トピックス要旨 （一般講演番号 / 一般講演タイトル / 講演者 / 所属）〉
【分類，系統，遺伝学】

1Gp13 G 会場 第 1 日 16:18····························································································· p. 8
中等度酸性条件下での鉱水処理に関わる微生物相の解析○金尾 忠芳 1, 八塚 優衣 1, 上村 一雄 1, 赤堀 文雄 2, 稲谷 博征 2, 公文 翔一 3, 佐藤 王高 3
（1 岡山大院・環境生命 , 2 卯根倉鉱業 , 3DOWA ホールディングス）【酵素学，酵素工学】

1Ap09 A 会場 第 1 日 15:18····························································································· p. 10
Pyrococcus furiosus 由来超耐熱性エンドグルカナーゼの異種発現と糖鎖付加による耐熱化○仙波 弘雅 1, 石川 一彦 2,3, 坪井 宏和 1, 幸田 明生 1
（1 大関総研 , 2 産総研・バイオメディカル , 3 松谷化学工業）

1Bp08 B 会場 第 1 日 15:06 ····························································································· p. 12
Aspergillus syodwii による鰹節だしがらの発酵と可溶性画分の特性解析○竹中 慎治 1, 加藤 将城 1, 織部 恭宏 1, 木村 行宏 1, 田中 伸一 2, 松本 淳一 2, 土居 幹治 2
（1 神戸大院・農 , 2 マルトモ）【タンパク質工学】

1Cp09 C 会場 第 1 日 15:18····························································································· p. 14
機械学習を用いた酵素機能予測モデルによる新規 PETase の発見○水島 良太 1,2, 鈴木 直也 2, 逸見 明央 2, 島田 幸輝 1, 神谷 幸太郎 1, 藤島 皓介 2
（1SyntheticGestalt 株式会社 , 2 東工大）

3Bp12 B 会場 第 3 日 15:36 ····························································································· p. 16
微生物発現と構造安定性を考慮した機械学習支援による抗体断片の親和性成熟○伊藤 智之 1, 河田 早矢 1, 中澤 光 1, 村上 明一 2,3, 梅津 光央 1,4（ 東北大院・工 , 2 徳島大院・医歯薬 , 3RePHAGEN, 4 理研・革新知能）
1【発酵生理学，発酵工学】

2Hp08 H 会場 第 2 日 17:06····························································································· p. 18
Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213 が誘導生産する新規酵素エラグ酸ラクトナーゼの同定と機能解析○片所 杏野 1, 渡邊 寛子 1, 工藤 眞丈 2, 中島 賢則 3, 山本 浩明 3, 小川 順 1, 岸野 重信 1
（1 京大院農 , 2 ダイセル・ヘルスケア SBU, 3 ダイセル・事業創出セ）

3

第 75 回日本生物工学会大会

Topics of 2023

2Ip01 I 会場 第 2 日 15:30 ····························································································· p. 20
酵母 Starmerella bombicola が生産する新規ソホロリピッド誘導体の構造解析○小林 洋介 1, 李 秋実 1, 牛丸 和乗 2, 廣田 真 1, 森田 友岳 2, 福岡 徳馬 2
（1 アライドカーボンソリューションズ , 2 産総研・機能化学）

3Hp01 H 会場 第 3 日 13:00····························································································· p. 22
糠床における複合微生物系代謝コミュニティーのメタゲノム解析○古賀 優梨 1, 篠田 あかり 1, 杉浦 俊作 2, 木村 洋 3, 中山 二郎 1
（1 九大院・生資環 , 2 東海漬物株式会社漬物機能研究所 , 3 北九州小倉・糠床糠炊き研究会）【代謝工学】

1Hp04 H 会場 第 1 日 14:06····························································································· p. 24
放線菌 Streptomyces lividans において糖消費と二次代謝物生産を向上させる
中央代謝経路の遺伝子破壊○中澤 堅太朗 1, 山本 省吾 2, 柘植 陽太 1,3（ 金沢大院・自科 , 2 長瀬産業 , 3 金沢大・新学術）
1

1Hp07 H 会場 第 1 日 14:54····························································································· p. 26
基質としてのグリセリンが大腸菌の組換えタンパク質生産に与える影響の評価○齋藤 肇 1, 尾島 由紘 1, 幸 慎太郎 2, 福永 浩一 2, 坪井 輝道 2, 東 雅之 1
（1 大阪公大院・工 , 2 阪本薬品工業（株））

1Hp16 H 会場 第 1 日 16:54····························································································· p. 28
アセトヒドロキシ酸シンターゼ制御サブユニットの Ala31Thr 置換による清酒酵母のバリンおよびイソブタノール生産性の向上○磯貝 章太 1, 西村 明 1, 村上 直之 2, 堀田 夏紀 2, 小高 敦史 2, 豊川 洋一 1, 石田 博樹 2, 高木 博史 1
（1 奈良先端大・研究推進機構 , 2 月桂冠・総研）

2Ip08 I 会場 第 2 日 17:06 ····························································································· p. 30
油脂酵母 Lipomyces starkeyi における脂肪酸合成酵素遺伝子の改変によるカカオバター様油脂の生産○渡部 凌 1, 佐藤 里佳子 1, 荒 学志 1,2, 荒木 秀雄 2, 山崎 晴丈 1, 高久 洋暁 1
（1 新潟薬大・応生命 , 2 不二製油）【醸造学，醸造工学】

1Fp06 F 会場 第 1 日 14:42 ····························································································· p. 32
酢酸イソブチル高生産酵母の育種と窒素源の影響解析○圍 彰吾 , 浅井 拓也 , 窪寺 隆文 , 明石 貴裕（白鶴酒造）

1Fp07 F 会場 第 1 日 14:54 ····························································································· p. 34
モデル化焼酎醸造系における発酵促進成分の探索○江部 聡 1, 丸岡 生行 2, 髙下 秀春 2, 星田 尚司 3, 赤田 倫治 3
（1 山口大院・創成科学 , 2 三和酒類 , 3 山口大・工）4

2Fp08 F 会場 第 2 日 17:06 ····························································································· p. 36
カナバニンを用いたアルギニンデイミナーゼ破壊株の育種○脇中 琢良 1, 渡部 潤 1,2, 茂木 喜信 1
（1 ヤマサ醤油 , 2 福島大・食農）

2Fp09 F 会場 第 2 日 17:18 ····························································································· p. 38
酢酸低生産性醤油乳酸菌の醸造特性解析○樋口 敬太 1, 額川 裕矢 2, 脇中 琢良 1, 渡部 潤 1,2, 茂木 喜信 1
（1 ヤマサ醤油 , 2 福島大・食農）

3Fp03 F 会場 第 3 日 13:24 ····························································································· p. 40
清酒中に含まれるプリン代謝産物の定量○浅井 良樹 , 根來 宏明 , 石田 博樹（月桂冠・総研）

3Fp04 F 会場 第 3 日 13:36 ····························································································· p. 42
清酒中に含まれるプリン代謝産物の由来と生成経路の解明○根來 宏明 , 浅井 良樹 , 石田 博樹（月桂冠・総研）【食品科学，食品工学】

2Gp08 G 会場 第 2 日 17:06····························································································· p. 44
米発酵食品の乳化性の比較と米素材でつくる新たな乳化食品「米マヨネーズ」の開発○小林 和也 1, 奥原 宏明 1, 羽田 知由 2, 田中 美優 2
（1 新潟県農総研食研セ , 2 山崎醸造）

3Gp08 G 会場 第 3 日 14:36 ····························································································· p. 46
大豆タンパク質由来二次胆汁酸ミセル崩壊ペプチドの同定○清水 翔太 1, 平野 啓太 2, 齋藤 努 2, 秋山 裕和 1, 清水 一憲 1, 本多 裕之 1
（1 名大院・工 , 2 不二製油グループ本社株式会社 未来創造研究所）

3Gp10 G 会場 第 3 日 15:00····························································································· p. 48
L- アンセリンは初代ヒト骨格筋細胞の筋分化および筋収縮力を向上させる○永井 研迅 1,2, 井田 正幸 1, 出雲 貴幸 1, 中井 正晃 1, 本多 裕之 2, 清水 一憲 2
（1 サントリーウエルネス , 2 名大院・工）【環境工学，廃水処理技術】

1Op09 O 会場 第 1 日 15:18····························································································· p. 50
驚異的な油脂分解能力をもつ微生物による超効率的な食用油含有排水処理法の確立と社会実装○小原 優季 1, 蟹江 純一 1, 堀 克敏 1,2（ フレンドマイクローブ , 2 名大院・工）15

第 75 回日本生物工学会大会

Topics of 2023

【バイオマス，資源，エネルギー工学】

1Op15 O 会場 第 1 日 16:42····························································································· p. 52
ケイ酸カルシウム水和物を利用した微細藻類の増殖促進技術の開発○横井 佑果 1, 和賀 健太郎 1, 花田 晶子 2, 春日 友明 2, 明戸 剛 2, 吉野 知子 1, 新垣 篤史 1, 田中 剛 1（1 農工大院・工 , 2 太平洋セメント）

2Np08 N 会場 第 2 日 17:06····························································································· p. 54
麹菌 Aspergillus oryzae による耐熱型 PET 分解酵素の発現○戸所 健彦 1, 伊出 健太郎 1, 佐貫 理佳子 2,3, 河野 恵美 2, 吉田 昭介 2, 石田 博樹 1
（1 月桂冠・総研 , 2 奈良先端大・バイオ , 3 京工繊大・工芸科学）

3Op13 O 会場 第 3 日 15:48····························································································· p. 56
油脂酵母 Lipomyces starkeyi における油脂超高蓄積株 N5-15 株の育種
○三根 健太郎 1,2, 高城 博也 1, 松尾 伸二 1, 吹井 真央 2, 山吉 陵平 2, 佐藤 里佳子 2, 高久 洋暁 2
（1 日清食品ホールディングス株式会社 , 2 新潟薬大・応生命）

3Op14 O 会場 第 3 日 16:00····························································································· p. 58
海洋珪藻 Fistulifera solaris のオープンポンド型屋外培養におけるオイル蓄積機構の解析○福田 晴 1, 熊久保 涼太 1, 村田 智志 1, 西村 恭彦 2, 吉野 知子 1, 田中 剛 1（1 農工大院・工 , 2 電源開発）【生物化学工学】

1Lp05 L 会場 第 1 日 14:18 ····························································································· p. 60
乳製品加工残渣を栄養源とし緑藻を培養した際の細胞応答についての解析と評価○蓬田 美紗樹 1, 堀本 智仁 2, 中西 昭仁 1,3（ 東京工科大院・バイオニクス , 2 明治 , 3 東京工科大・応生）
1

1Lp10 L 会場 第 1 日 15:30 ····························································································· p. 62
光合成細菌の細胞成分による植物成長促進効果○林 修平 1, 岩本 康成 1, 平川 夕貴 1, 森 康一 1, 山田 直樹 2, 牧 孝昭 2, 山本 進二郎 1, 宮坂 均 1（1 崇城大・生物生命 , 2（株）松本微生物研究所）

3Lp01 L 会場 第 3 日 13:00 ····························································································· p. 64
Corynebacterium glutamicum を用いたグルコースからの 2,5- ピリジンジカルボン酸の生産○野中 鏡士朗 , 長村 達也 , 高橋 史員 , 小山 伸吾（ 花王）

3Lp07 L 会場 第 3 日 14:24 ····························································································· p. 66
液体酵素を用いたバイオディーゼル燃料製造における小動力散液デバイスの撹拌効果○濵 真司 1, 松浦 健介 1, 荻野 千秋 3, 向田 忠弘 2, 野田 秀夫 1,2（1Bio-energy, 2 関西化学機械製作 , 3 神戸大院・工）3Mp04 M 会場 第 3 日 13:36···························································································· p. 68
カーボンマテリアルの生物学的な新規利用法の開発○山本 尚毅 1, 的場 直樹 2, 沖野 智也 2, 中西 昭仁 1,3（ 東京工科大院・バイオニクス , 2 関西熱化学 , 3 東京工科大・応生）
16

【培養工学】

1Mp05 M 会場 第 1 日 14:18···························································································· p. 70
高浸透圧下でセリシンを利用した、ハイブリドーマ細胞の抗体生産の増強○竹尾 将俊 1, 藤田 雅也 1, 中尾 匡志 1, 寺田 聡 1, 真杉 遼 2, 梅田 尚希 2, 高橋 潤 2（1 福井大院・工 , 2 セーレン株式会社）

2Lp09 L 会場 第 2 日 17:18 ····························································································· p. 72
低分子抗体生産に向けた枯草菌技術の開発○東條 卓人 , 西口 大貴 , 井上 英俊 , 和田 真由美 , 大浦 智之 , 壺井 雄一 , 川原 彰人 , 小山 伸吾 , 影山 泰 , 瀧村 靖
（花王）

【バイオプロセス】

3Lp05 L 会場 第 3 日 13:48 ····························································································· p. 74
バイオプロセスによるカルノシン生産法の開発

倉本 歩 1,3, 木野 邦器 1,2, 佐藤 謙一郎 3, 岡田 行夫 3
（ 早大・理工総研 , 2 早大院・先進理工・応化 , 3 東海物産）
1【遺伝子工学】

1Jp13 J 会場 第 1 日 16:18 ····························································································· p. 76
糸状菌 Trichoderma reesei における新規誘導プロモーターの探索○一瀬 桜子 , 柴田 望 , 高橋 史員 , 小山 伸吾
（花王）

7

第75
75回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 20232023
第中等度酸性条件下での生物的鉱水処理に関わる微生物相の解析
金尾忠芳 1＊・八塚優衣 1・上村一雄 1・赤堀文雄 2・稲谷博征 2・公文翔一 3・佐藤王高 31

岡山大学大学院環境生命自然科学研究科，2 卯根倉鉱業株式会社，3 DOWA ホールディングス株式会社
1〒700-8530

岡山市北区津島中 1-1-1

Tel: 086-251-8398

岡山大学農学部

Fax: 086-251-8388

pH 3.5で稼働する柵原E-mail:
鉱水処理システムtkanao@okayama-u.ac.jp（試験実施期間：2019/11～12）
脱 ヒ 素鉱水 鉱山廃水

酸化工程

砒素除去工程鉄イオン源
NaOH

pH 3.7870 mgFe/L

苛 性ソー ダ

295 mL/min
NaOH

砒素除去
反応槽

236 mL/min

砒素
除去槽

鉄酸化
細菌
含有槽

ｐ H計
計

シックナー

空気
残留鉄イオンを
中和､除去

酸化槽
51 L
pH 3.5

沈殿槽
pH 調整可能な鉱水処理ミニプラントのフローチャート
340 L
P

中和殿物の成分分析 (w t%)Fe

2 .1 2Ca

1 .5 2L

pH 2.5pH 3.5

鉄殿物

各 pH での酸化槽における鉄酸化処理水の比較
図2

pH 3.82.2 mgFe /L

岡山県美咲町柵原鉱山から流出する酸性鉱山排水（Acid
Mine Drainage; AMD）は，好酸性鉄酸化細菌
Air 6 L/min
2+
HRT=
3.6
を利用して鉱水に溶存する Feを予め酸化することで，中和コストの削減に成功した。しかしながら，P

3+ ウ ム
炭 酸カル
現行施設ではこの酸化処理が pH 2.5 にて行われており，鉄酸化処理後の鉱水にはFeシが溶存している。
今回，生物的鉄酸化処理を現行の pH 2.5 から pH 3.5〜4.0 にて行うことを試みた。これにより Fe3+の中和処理への混入を防ぎ，生物的鉄酸化物として回収することができ，中和殿物の削減が期待できる。
中和殿物

Al

2 0 .2

SO 4 2 -9 .6 2

水 酸化カ
またそのような pH における鉄酸化処理槽において鉄酸化細菌をはじめとした微生物相の解析を行なっ
pH 4
pH 7.2
ルシウム 99%以上の除鉄率を達成し、次世代シーケた。その結果，pH 3.5〜4.0 の鉄酸化処理において鉱水より

Zn

2 .8 9pH 3.5で鉄酸化処理を行うシス新規な鉄酸化細菌である可能性が高い。
テ ムでは 、炭 酸カ ルシウ ム
た。特に Ferritrophicum 属細菌は好酸性菌としての報告はなく，

Mn

0 .2 7

ンスによる菌相解析では Ferritrophicum や Acidimicrobium 属細菌が主要な鉄酸化細菌として検出されに よる中 和工 程で 中和殿 物が ほと んど生 成し ない 。水酸 化
カ ルシウ ムに よる 中和殿 物は 白色 。

はじめに
酸性鉱山排水（Acid Mine Drainage; AMD）は，人間の採掘活動によって空気（酸素）を含んだ地下水が鉱床と反応することによって発生する 1)。多くの場合，強酸性で大量の二価鉄イオン（Fe2+）を含むため，そのまま流出すると環境と生態系に甚大な被害を及ぼす。
したがって AMD では「中和」と「除鉄」という２つの処理を施さなければならない。岡山県美咲町柵原鉱山から流出する AMD は，好酸性鉄酸化細菌を利用して鉱水に溶存する Fe2+ を予め酸化することで，中和コストの大幅な削減に成功している。しかしながら現行施

8２

設ではこの酸化処理が pH 2.5 にて行われており，鉄酸化処理後の鉱水には Fe3+ が溶存している。この Fe3+
は中和処理において沈殿除去できるのだが，中和殿物の容量を増大させ，これを貯留するダムの逼迫が懸念されることからその減量化が求められた。今回，生物的鉄酸化処理を現行の pH 2.5 から Fe3+の溶解度が極端に低くなる pH 3.5〜4.0 にて行うことにより，鉄酸化処理水の溶存 Fe3+ を減少させて中和殿物の生成量の削減を試みた。
従来，好酸性の鉄酸化細菌としては Acidithiobacillus
ferrooxidans や Leptospirillum ferrooxidans など pH 3よりも低い強酸性環境で生育するものがよく利用され，研究されてきた 2)。したがって pH 3.5〜4.0 の環境において十分な鉄酸化処理が行えるのか，その際に鉄酸化槽はどのような微生物相が形成されるのか，またそ
こに生育する鉄酸化細菌の種類や生成する生物的鉄酸化物の特性についても解析することを目的とした。

（２）鉄酸化処理槽における微生物相の解析

ミニプラントにおいて pH3.5 と 4.0 で鉄酸化処理した処理水を採取し、さらに現行施設（pH2.5）の鉄酸化
処理水における微生物相の解析を行なった。
各 pH における微生物相の比較
100%

実験手法

Ferrimicrobium

Acidimicrobiia_uncultured*80%

結果および考察（１）ミニプラントにおける鉄酸化処理

柵原鉱水処理施設において脱ヒ素処理された鉱水を，ミニプラントに NaOH にて pH3.5 または 4.0 に調整し供した。その結果２〜５日で鉄酸化槽にて鉄の酸化が確認できた。鉄酸化が安定化するとその酸化効率は，99%以上となり，鉄酸化処理水からは Fe2+はほとんど検出されなかった。したがって，pH 3.5 および 4.0 においても現行設備（pH 2.5）と同様の効率で，好酸性の鉄酸化細菌を利用した鉄酸化処理が可能であることがわかった。

酸化工程

砒素除去工程

鉱山廃水
鉄イオン源
NaOH

NaOH
砒素除去
反応槽

砒素
除去槽

鉄酸化
細菌
含有槽

60%

Chitinophagaceae_uncultured*

Acidiphilium
50%

Micropepsaceae*
Thiomonas

40%
30%

Ferrovum

③

20%
10%

③

Sulfuricellaceae*
Ferritrophicum④

Acidibacter

②
①

0%

pH 4.0pH 3.5pH 2.5

Candidatus_Ovatusbacter
Metallibacterium
Rhodanobacteraceae
others(1%>)

図 2. 各 pH での鉄酸化槽における微生物相
その結果、pH 4.0 では Ferritrophicum 属細菌 43.8%,
Acidimicrobium 属細菌 19.2%が主な鉄酸化細菌として検出され，比較的多様性を示したのに対し，pH 3.5 では Ferritrophicum 属細菌が 88.8%と大多数を占めて鉄酸化に特化した，より単調な菌相を形成していることが明らかとなった。一方、現行設備の pH 2.5 鉄酸化槽
においては，Ferrovum 属細菌が 45.5%を占め，主要な鉄酸化反応を担っていると推定された。pH 3 を下回る
強い酸性条件下では Acidithiobacillus ferrooxidans や
Leptospirillum ferrooxidans が優勢な鉄酸化細菌として生育することが知られているが，本処理施設ではそれぞれ全体の 0.46%, 0.27%しか検出されなかった。
pH 3.5 の 鉄 酸 化 槽 で 約 ９ 割 に ま で 濃 縮 さ れ た
Ferritrophicum 属細菌は，これまで中性〜pH 4 付近で生育するものしか報告されておらず 3)，新種の可能性が期待できた。本ミニプラントは，本来の目的である鉱水処理だけでなく pH 調整可能な鉄酸化細菌の連続培養装置として，また生物的鉄酸化物の製造装置としても捉えることができる。
したがって、今後は本装置を利用した新規な中等度好酸性の鉄酸化細菌の分離培養装置として，また有用鉄酸化物製造装置として，その利用が期待できる。

参考文献

シックナー

残留鉄イオンを中和､除去

図 1. pH 調整可能なミニプラントのフローチャート

Mucilaginibacter

④

空気

鉄殿物

②

Fimbriimonadaceae

70%

検出割合

柵原鉱山鉱水処理施設内に図１のフローチャートで示すようなミニプラントを建設した。このミニプラン
トは，鉱水処理施設において脱ヒ素処理された鉱水を引込み，鉄酸化槽の pH をモニタリングして NaOH による pH 調整が可能な装置である。鉄酸化槽はその底部から空気を供給し，オーバーフローした処理水は，シックナーにて鉄酸化物を沈殿させることができる。
この沈殿には多くの鉄酸化細菌を始めとする微生物が付着しており，これを種菌として鉄酸化槽へ供給することもできる。
菌相解析は鉄酸化槽の処理水（鉄酸化物を含む）を採取後，超音波処理して鉄酸化物に付着した菌体共々
フ ィ ル タ ー に 回 収 。 そ こ か ら DNA を 抽 出 し て
16SrRNA 遺伝子（V4 領域）を PCR 増幅した後，次世
代シーケンサーによって配列を決定。データベースから配列の相同性検索を行い，菌種を同定した。

①

Acidimicrobiia_IMCC26256*

90%

1)

Rambabu K et al., Environ. Sci.
Ecotechnol.,2: 100024 (2020)
2) Rohwerder T et al., Appl. Microbiol.
Biotechnol.,63, 239-248 (2003)
3) Fabisch M et al., Front. Microbiol.,4: 390(2013)
図2

３
9

第75
75回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 20232023
第Pyrococcus furiosus 由来超耐熱性エンドグルカナーゼの異種発現と糖鎖付加による耐熱化
仙波
1

大関株式会社

弘雅 1＊・石川一彦 2, 3・坪井総合研究所，2 産業技術総合研究所〒663-8227

宏和 1・幸田

明生 1

バイオメディカル研究部門，3 松谷化学工業株式会社

兵庫県西宮市今津出在家町 4 番 9 号

Tel: 0798-32-2169

Fax: 0798-34-7475

E-mail: hironori.senba@ozeki.co.jp

要旨
超好熱古細菌 Pyrococcus furiosus 由来超耐熱性エンド 型 セ ル ラ ー ゼ （ エ ン ド グ ル カ ナ ー ゼ ： EGPf) を
Aspergillus niger を宿主として異種発現させた結果、約15 kDa の糖鎖が付加された状態で分泌生産された。糖
鎖付加 EGPf は大腸菌で発現させた糖鎖未付加 EGPfと比較して比活性が約 2 倍に向上した。さらに EGPf
は糖鎖付加により熱安定性が向上し、100℃、5 時間加
熱後も 80%以上の活性を保持していた。また EGPf のイ オ ン 液 体 耐 性 を 評 価 し た と こ ろ 、 10 ～ 30% (v/v)[Bmim]Cl 存在下で比活性の向上が見られ、40%存在下でもイオン液体非存在下と同等の比活性を示した。本
研究で得られた糖鎖付加 EGPf は、高温やイオン液体
共存などの過酷な条件におけるバイオマスの糖化などに有効活用できると期待される。

ース系バイオマスの分解において重要な酵素である。
一般的に反応温度の上昇は酵素反応速度の向上や微生物汚染の低減に繋がるため、酵素の耐熱性は産業利用において必須であり、様々な微生物から耐熱性エンド
グルカナーゼの探索が行われてきた。しかし、水を溶媒とする系での最高温度である 100℃前後の温度で長期間安定なエンドグルカナーゼはこれまでに報告されていない。そこで本研究では基質認識が甘く熱安定性も良好な超好熱古細菌 P. furiosus 由来超耐熱性エンド
グルカナーゼ(EGPf)1)を A. niger を宿主として異種発現させ、糖鎖付加による熱安定性の更なる向上を試みた。
また近年セルロースを比較的温和な条件で溶解させることができるイオン液体がセルロース分解の前処理方法として期待されている。そこで EGPf のイオン液体耐性についても評価した。

結果と 考察はじ めに
エンドグルカナーゼは天然セルロースの非晶質領域をランダムに加水分解する酵素であり、リグノセルロ

10２

A. niger による EGPf の異種発現と特性解析
EGPf (Gene ID: PF0854)を A. niger を宿主として異種発現させた結果、EGPf は培地中に分泌生産され、その一部は約 15 kDa の糖鎖が付加された糖鎖付加 EGPf

(G_EGPf, 約 45 kDa)として分泌されていることが明らかになった（図 1）。そこで EGPf における糖鎖の影響を 評 価 す る た め 、 大 腸 菌 に て 糖 鎖 未 付 加 EGPf(UG_EGPf, 約 30 kDa)を発現させ、それぞれ単一に精製し、特性解析を行った。その結果、大麦由来 β-グルカンを基質とした活性測定にて、UG_EGPf の比活性は173.2 U/mg に対し、G_EGPf の比活性は 353.2 U/mg と約 2 倍に向上していた。

ン液体耐性を有することを示した。今後は本酵素の産業利用に向けた生産性の向上を行うとともに、糖鎖の付加位置を明らかにし、比活性や熱安定性の向上機構を解明する。

図 1. A. niger 発現 EGPf の CBB および PAS 染色
糖鎖 付加 によ る熱 安定 性の 向上
糖鎖が熱安定性に与える影響を評価するため、100℃における安定性試験を実施した。その結果、UG_EGPf
は半減期が約 10 分であったのに対し（図 2B）、G_EGPf
は 300 分加熱後も 80%以上の活性を保持していた（図2A）。G_EGPf の半減期を計算すると推定約 1018 分となり、糖鎖付加により熱安定性が約 100 倍向上した。
EGPf のイオン液体耐性
結晶性セルロース分解の過程で使用されるイオン液体に対する本酵素の耐性を評価するため、1-butyl-3methylimidazolium chloride ([Bmim]Cl)存在下での比活性を評価した（図 3）。その結果 EGPf は 10~30% (v/v)の[Bmim]Cl 存在下で比活性の向上が見られ、40% (v/v)[Bmim]Cl 存在下でも非存在下と同等の比活性を示した。イオン液体は酵素を変性させる効果があるが、活性部位と相互作用することで構造を安定化させる作用も報告されている 1)。一部の超耐熱性セルラーゼでは上述の比活性向上が報告されており、これはこれら酵素の極めて高い安定性故に、イオン液体による活性の向上効果のみを得られたためであると考えられる 2)。
さらに、糖鎖付加による EGPf の比活性の向上効果もイオン液体中において明確に維持されている。

今後の 展望本研究では EGPf を A. niger を宿主として異種発現させることで糖鎖付加により比活性と熱安定性が向上することを明らかにした。また EGPf が極めて高いイオ

図 2. EGPf の 100℃における安定性

図 3. EGPf のイオン液体耐性

参考文 献
1.
2.
3.

Kataoka, M., Kim, H. W. and Ishikawa, K.:
Carbohydr. Res., 522, 108682 (2022).
Shao, Q.: J. Chem. Phys., 139, (2013).
Hebal, H., Hämäläinen, J., Makkonen, L.,
King, A. W. T., Kilpeläinen, I., Bankar, S.,
Boucherba, N. and Turunen, O.: Biotechnol.
Lett., 44, 961–974 (2022).
11
３

第75
回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
7RSLFVRI
第of 2023$VSHUJLOOXVV\GRZLL による鰹節だしがらの発酵と可溶性画分
の特性解析
竹中 慎治 ＊・加藤 将城  ・織部 恭宏  ・木村 行宏 ・田中 伸一 ・松本 淳一 ・土居 幹治  

神戸大学農学研究科， マルトモ株式会社〒神戸市灘区六甲台町  神戸大学農学研究科
7HO)D[
(PDLOVWDNHQDND#SHRSOHNREHXDFMS


かつお
だし
鰹節カビ
の移植

エンド型ペプチダーゼによる分解

鰹節ͬ削り節だしがら
NH2-

だしがら発酵物
加水分解酵素ͬ旨味アミノ酸
ͬ生理活性ペプチド含有

エキソ型ペプチダーゼ-COOH による分解

アミノ酸および生ペプチドの遊離鰹節調整品の生産量増加に伴い、その製造工程で生じる食品残渣“だしがら”についても 6'*V の観点から、従来とは異なる高度な活用法の開発が求められている。同食品残渣は、タンパク質が主体であることから、我々のオリジナルな鰹節カビである $VSHUJLOOXV V\GRZLL 0$ を用いた微生物発酵による加水分解処理を検討した。また、発酵に関わるタンパク質分解酵素の同定および発酵培養物の評価を行った。その結果、鰹節タンパク質の特定部分の分解に特化したタンパク質分解
酵素をはじめ複数の酵素群を見出した。0$ 株の発酵による培養物は、“だしがら”と比較して、味覚が向上しており、種々の生理活性を示すペプチドを含むことが明らかとなった。

背景と目的 年に「和食とその文化」がユネスコの無形文化遺産に登録され、和食の基本である“だし”も世界的に知られるようになった。これに伴い、鰹節等調整品
は、国内消費・輸出量も増加傾向にある 農林水産省輸
出・国際関連情報より 。鰹節からだしをとった後に生じる食品残渣“だしがら”のリサイクルとして、堆肥12

や家畜飼料への転換が挙げられるが、競合する食品廃棄物は多い。よって、6'*V の達成に寄与できる新たな高度利用法の開発も望まれている。我々は、鰹節の発
酵熟成 枯節の製造 に関わる好乾性糸状菌群の特性やそれらが分泌生産する加水分解酵素群の特性を明らかにしてきた   。
“だしがら”は、タンパク質を主成分とする残渣であることから、本研究ではプロテアーゼ
高生産な $VSHUJLOOXV V\GRZLL 0$ を用いた微生物発酵による加水分解処理を検討した。



材料と方法 微生物および培養条件  鰹節の削り節のだしがらを用い、0$ 株を固体培養した  。 発酵物からの菌体外加水分解酵素群および可溶性画分の抽出 既報の方法に従って  、培養物から菌体外酵素を抽出後、緩衝液 S+ および  にて透析し、粗酵素液とした。また、可溶性画分の抽出は、かつおだしの調製法にならった。
 タンパク質分解酵素 の活性評価  粗酵素液および各種クロマトグラフィー  後の画分についてエンド型エキソ型ペプチダーゼ活性を調べた。また、鰹節由
来可溶性タンパク質の加水分解能を 6'63$*( によって評価した。
 可溶性画分の 物理化学的評価 可溶性画分およびそのゲルろ過クロマトグラフィー画分を対象とした。
遊離アミノ酸量および可溶性ペプチド量は、それぞれニンヒドリン法 グリシン換算 および /RZU\ 法 %6$ 換
算 によった。また、サイズ排除クロマトグラフィーにより分子量分布を調べた。
 可溶性画分の生理活性評価  味覚センサーによる特性評価、各種ラジカル消去活性試験、$&( 阻害活性試験、乳酸菌増殖促進試験等を行った。


結果と考察 0$ 株の生産するタンパク質分解酵素  培養
物 か ら DPLQRSHSWLGDVH 3HS 麹 菌 由 来 $SV$LGHQWLW\  ％ 、 WU\SVLQOLNH VHULQH SURWHDVH
3HS3HS 1$ お よ び HODVWLQRO\WLF VHULQH
SURWHDVH 3HS2U\]LQ％ を見出した。鰹節由
来可溶性タンパク質の主成分は、P\RVLQKHDY\FKDLQWDLO 領域 0+&7 領域 であり、見出したタンパク質分解酵素の中で 3HS3HS が高活性であった 図）。
微生物発酵において、これら酵素群が削り節表面に存在する 0+&7 領域を協働しながら加水分解することでアミノ酸や可溶性ペプチドが遊離したと考えられる。
 可溶性画分の 成分組成 培養物から調製した可溶性画分の遊離アミノ酸量および可溶性ペプチド量は、0$ 株を接種しなかった対照と比較してそれぞれ
約  倍および  倍となった 表 。アミノ酸含量
は、順に *OX!/HX!/\V!9DO!$OD であり、これは 0+&7 領
域の構成アミノ酸 *OX!/\V!/HX!$OD!*OQ  と似通っていた。また、可溶性ペプチドの分子量分布は、～N'D であった。
 可溶性画分の生理活性試験  可溶性ペプチド画
分には、$%76 や '33+ ラジカル消去活性、鉄イオン還元能および $&( 阻害活性が見られた（表）。同画分をゲル濾過クロマトグラフィーに供して得られた画分においてこれら生理活性について調べると、$%76 消去活性パターンは他とは異なっていた。さらに、乳酸菌 

種について、056 培地組成を参考にした液体培地に％可溶性ペプチド画分を添加して培養を行い、対照同画分無添加 と比較した。その結果、 /DFWRFRFFXVODFWLV 1%5&  お よ び /DFWREDFLOOXVDFLGRSKLOXV1%5& において増殖促進効果が見られた。
5Pep2/7Pep1(kDa) BM
200
120
90
64
48

0

1

7Pep2

3 24 0 1

3 24

36
28
20
14



図１．精製酵素による鰹節由来可溶性タンパク質の分解
表１．可溶性画分の成分および生理活性評価

対照
培養物
アミノ酸 P0 
0.013±0.001 3.45±0.036
ペプチド PJPO  0.158±0.009 4.66±0.045
$%76＃
0.006±0.003 1.98±0.074
＃'33+ 
0.006±0.001 0.089±0.0001
)5$3＃
0.018±0.006 0.135±0.009
$&(＃
1'

＃$%76$%76UDGLFDOVFDYHQJLQJDFWLYLW\'33+'33+UDGLFDOVFDYHQJLQJDFWLYLW\)5$3)HUULF
LRQUHGXFLQJDQWLR[LGDQWSRZHU いずれも WUROR[ 換算 $&($&(LQKLELWRU\DFWLYLW\ ,&  今後の展望
 微生物発酵を行うことで得られた培養物は、タンパ
ク質分解酵素群を含み、味覚や生理活性も付与されたことから  ）、醸造調味料や健康食品用タンパク質素材へ展開が考えられる。今後、発酵条件のスケールアップとその最適化によって、生産性の向上を目指す。
  文 献 7DNHQDND6HWDO,QW-)RRG0LFURELRO
   7DNHQDND6HWDO,QW-)RRG0LFURELRO     7DNHQDND 6 HW DO 3URF %LRFKHP   

13 

第75
75回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 20232023
第機械学習を用いた酵素機能予測モデルによる新規 PETase の発見
Machine learning-based enzyme function classifier enables
discovery of novel PETases
水島良太 1,2＊・鈴木直也 2・逸見明央 2・島田幸輝 1・神谷幸太郎 1・藤島皓介 2＊
1SyntheticGestalt 株式会社，2 東京工業大学地球生命研究所〒160-0061

東京都新宿区内藤町 1-6 ラ・ケヤキ
Tel: 03-4570-8634

E-mail:r.mizushima@syntheticgestalt.com〒152-8550 東京都目黒区石川台 1 丁目 12-1 1 IE
Tel: 03-5734-3414
E-mail: fuji@elsi.jp

PET リサイクルのための高活性、低コスト、高耐久性の PETase（ポリエチレンテレフタレート（PET）加
水分解酵素）の開発は、持続可能な社会の実現に向けた重要な技術として、近年注目を集めている。このよ
うな PETase を発見・設計するために、我々はアミノ酸
配列情報のみから酵素機能を予測する機械学習（ML）
モデルを構築した。酵素のアミノ酸配列から蛋白質言語モデルを用いて変換したベクトルと酵素機能のクラスラベルから ML モデルを学習した。学習データセッ
トには、PETase に関する研究論文から収集した 42 のPETase 配列が含まれる。このモデルはベクトルを出力し、その成分は酵素機能クラス(EC4 クラス)の予測確

14２率を表している。このモデルを用いて、TrEMBL データ
ベース全体（～2.3 億個の配列）の酵素機能を推論した。PETase の候補は、最大の確率スコアを示すクラス
によって決定された。様々な pH と温度条件下で、複数の基質（BHET、アモルファス PET フィルム、結晶性 PETパウダー）に対する反応生成物（MHET + TPA）を UPLCで定量する酵素活性試験を実施し、PETase 候補の酵素活性を調べた。その結果、既知の PETase と 75%以下の配列相同性を持つ新規 PETase を、従来の方法と比較して少ない実験的負担で複数発見することができた。
PETase はポリエチレンテレフタレート（PET）加水分
解酵素であり、日本のゴミ処理場で採集された微生物

Ideonella sakaiensis から初めて発見された 1)。PET
バイオリサイクルの実用化に適した PETase の開発は、
持続可能な社会に貢献するものであり、近年、注目を集めている 2)。このため、多くの研究者がメタゲノム
スクリーニングから新規 PETase を探索している 3), 4)。
そこで我々は、大規模な遺伝子プールから新規 PETaseを効率的に発見するために、アミノ酸配列情報のみから酵素機能を予測する機械学習（ML）モデルを開発した。この ML モデルは、PETase 探索に限らず、他の酵素の効率的な探索にも用いることができる。
ML モデルの学習には、酵素のアミノ酸配列から蛋白質
言語モデルにより変換したベクトルと EC4 による酵素
機能のクラスラベルを用いた。学習データは学習にふ
さ わ し く な い デ ー タ を 除 外 し た 、レ ビ ュ ー 済 み のSwiss-Prot の配列データに加えて、PETase に関する研究論文を精査して集められた 42 の PETase 配列が含まれる。ML モデルは各入力配列に対してベクトルを出力し、ベクトルの成分は EC4 クラスの予測確率を表す。
また、PETase 予測に特化したモデルとして、以下に述
べる type1/type2-PETase5)を区別して‘Non-PETase’,‘type1-PETase’, ‘type2-PETase’の 3 クラスにEC4 クラスを圧縮した３クラス予測 ML モデルも構築した。このモデルを用いて、機能未知アミノ酸配列のデータベースである TrEMBL の全てのアミノ酸配列の酵
素機能を推論した。約 2.3 億件のデータセットに対する推論を現実的な時間スケールで実現し、ML モデルを
迅速かつ柔軟に開発するために、独自のソフトウェア
で管理された数十台の AWS インスタンスによる並列計
算を採用した。候補となる PETase は、確率スコアが0.95 以上の配列を採用した。最終的な PETase 候補は、由来する生物種や、既知配列との相同性などを考慮して決定した。こうして得た候補について、図 1 に示す
ような、１）リパーゼアッセイ、2)BHET アッセイ、３）PET パウダーアッセイの３段階の酵素活性試験で検証した。リパーゼアッセイは、蛍光で簡便に活性を調べられ、エステラーゼ活性の必要条件と考えられることから、初期スクリーニングとして導入した。PET パウ
ダー試験とあわせて先行研究でも用いられている、ア
モルファスの PET フィルムを基質とする実験も行ったが、type2-PETase で酵素活性が確認できず、type1PETase では確認できたため、異なる基質特異性を持つ
こ と が 確 認 さ れ た 。 一 方 、 PET パ ウ ダ ー で は
type1/type2-PETase の双方で活性が確認できたこと、
PET バイオリサイクルの社会実装プラントにおいてはPET フレークをパウダーに加工した上で PET 分解を行うことが想定されること 6)から、PETase 候補の活性評
価では PET パウダーを基質として用いることにした。

図 1.PETase の酵素活性試験で用いたアッセイ系
様々な pH と温度条件下で結晶性 PET パウダーに対する分解生成物（MHET + TPA）を UPLC で定量する酵素活性試験を実施し、PETase 候補の酵素活性を定量した。
その結果、既知の PETase と 75%以下の相同性を持つ新規 PETase である SG1,SG2,SG3,SG4 を得た（図 2）。

図 2. 発見した新規 PETase の 30℃, pH 9 での PET
パウダーの分解活性の代表的な PETase との比較。

文

献

1) Yoshida S. et al., Science 351, 1196–1199 (2016)
2) Lu H. et al., Nature 604, 662-667 (2022)
3) Christian S. et al., ChemSusChem 15, e202101062(2021)
4) Eiamthong B. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,
61(37), e202203061 (2022)
5) Joo S. et al., Nature Comm., 9(1) (2018)6) Singh A. et al., Joule 5(9), 2479-2503 (2021)

15
３

第75
75回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 20232023
第微生物発現と構造安定性を考慮した機械学習支援による抗体断片の親和性成熟伊藤智之 1・河田1

早矢 1・中澤

光 1・村上明一 2, 3・梅津

光央 1, 4＊東北大学工学研究科，2 徳島大学医歯薬研究部, 3 RePHAGEN, 4 理研
〒980-8579

仙台市青葉区荒巻字青葉 6-6-11
Tel: 022-795-7275

東北大学工学研究科

Fax: 022-795-7276

E-mail: mitsuo@tohoku.ac.jp

標的特異的な結合能を持つ抗体は医薬品や研究試薬として広く用いられているが、標的に対して低親和性であった場合、改めて変異を導入して親和性を向上させる必要がある。しかし親和性は構造
安定性と相反する場合があり、親和性が向上しても構造が不安定化してしまうことがある。本研究では、抗体断片の構造安定性を維持しつつ親和性を向上させることを目的として、複数条件を同時に満たす機械学習を行い、目的分子の取得を試みた。

1 . はじ め にそこで本研究では、SARS-Cov-2 のレセプター結合ド

抗体は標的特異的な結合能を持つタンパク質で、生メイン(RBD)に対する結合能を有するラクダ由来抗体

体内では免疫機構を担う。産業界では、抗体の分子認

断片 (VHH)を対象として、微生物発現量と構造安定性

識能を利用した医薬品の開発が、世界のバイオ医薬品

を維持しつつ親和性を向上させることを目的とし、複市場拡大の大きな原動力となっている。標的特異的な数条件を同時に満たす答えを導けるように機械学習を

抗体は生体の免疫反応を利用して取得できるが、得ら利用しすることで、相反関係にある 2 つの機能の同時れた抗体がいつも高い親和性を示すとは限らないため、最適化するタンパク質プロセスの開発を試みた。

アミノ酸配列を改変して親和性を向上させる「親和性成熟」が必要になる。しかし抗体の親和性と構造安定

2. 結果 と 考察

性は負の相関関係にあり、親和性成熟の結果、構造が不安定化してしまうことがある [1]。そのため、タンパ
ク質の構造安定性維持と親和性成熟を同時に達成できるタンパク質進化プロセスの開発が必要である。

ラクダ由来抗体断片

変異導入
微量培養

機械学習

- 配列解析
- 結合力測定- 発現量測定

結合力・発現量同時向上

図 1. 機械学習支援による抗体断片の親和性成熟

16１( 1 ) 親和性 成 熟 に 効果 的 な 変 異導 入 残 基の 選 定
抗 RBD VHH の遺伝子断片にエラープローン PCR で変異導入したファージミドベクターを作製し、大腸菌 TG-1
株を形質転換することで、抗 RBD VHH のランダム変異体を提示したファージライブラリーを 109 規模で作製した。同時に、抗 RBD VHH の相補性決定領域(CDR)の一部を 1 残基ずつランダム化した変異体を提示するファージライブラリーも 108 規模で作製した。作製したファージライブラリーを磁性粒子に固定した RBD と混合し、RBD に結合したファージを回収し増幅する生体外選択操作を 4 回行った後、次世代シークエンス解析を行った。その結果、VHH 中の 5 残基(G16, E89, P105,
Y106, S110)に変異をもつ変異体が、生体外選択操作後に多く残存してることがわかった。そこで我々は、この 5 残基が親和性向上に寄与する可能性があると考え、

1.5( 2 ) 学習デ ー タ の 取得 と 機 械 学習
選択した 5 残基を同時にランダム変異させた VHH 変異体遺伝子を持つ発現ベクター群を用いて大腸菌を形質転換した。生じたコロニーから 200 個程度選択し、遺伝子配列を解析すると共に、微量培養した大腸菌の培
地上清を用いて発現量と標的親和性を測定した。発現量はバイオレイヤー干渉法(BLI)を、標的親和性は酵素
固定化免疫吸着法(ELISA)を用いて測定した。その結果、117 種の変異体配列が収集され、そのうち野生型より高い発現量と親和性を示す有望変異体が 20 種あり、全体の 17%であった(図 2 中の白丸)。
機械学習には、アミノ酸配列とその機能値を紐づけしたデータが必要となる[2,3]。我々は、発現量が大きい
変異体は折りたたみ効率が高く構造安定性と正相関すると仮定し、機械学習で高発現量な変異体を予測すれば、構造的に安定な変異体も得られるのではないかと考えた。そこで発現量と結合活性を掛け合わせた数値を機能スコアと定義し、得られたアミノ酸配列―機能紐づけデータを用いてベイズ最適化による機械学習を行い、全変異体(205=3.2x106)の機能スコアを予測した。
予測システムにはベイズ最適化ソフトウェアである
COMBO を使用した[4]。機械学習が提案した機能スコア
予測上位 40 変異体に着目すると、各残基位置で特徴的なアミノ酸が提案されており(図 3)、特に 16 位はア
スパラギン酸のみが提案されていた。

1.2( 3 ) 機械学 習 提 案 変異 体 の 機 能評 価提案された上位 40 変異体遺伝子を持つ発現ベクタ
ーを個別に作製し、学習データ取得時と同様の手法で標的親和性と発現量を評価した。その結果、機械学習が提案した変異体の方が、発現量、親和性共に向上している変異体が多く得られた。
親和性と発現量共に高かった機械学習提案変異体を3 つ選んで再度大腸菌で発現させ、固定化金属アフィ
ニティークロマトグラフィー(IMAC)およびサイズ排除
クロマトグラフィー(SEC)により精製した。その結果、選択した変異体は単量体で発現し、野生型よりも 4～5
倍高い収量が得られた(表 1)。またサーマルシフトア
ッセイを用いて熱変性中点を測定した結果、野生型と同等以上の熱安定性を示した。さらに BLI 法により結合速度定数を求めたところ、野生型より 70 倍近く親和性が向上していた。これらの結果から、一般的には相反する 2 つの機能であっても、本手法を用いること
により、抗体断片の親和性を向上させつつ物性も最適化できる可能性が示唆された。

規格化吸光度 (-)

抗 RBD VHH の 5 残基変異体を作製することにした。

0.9

予測変異体

0.6
学習前変異体

0.3
0.0

野生型

0

5

10

15

20

25

規格化発現量 (µg/mL)

図 2. 学習用変異体(白丸)と機械学習提案変異体(黒丸)の機能評価
学習データ

機械学習予測上位40変異体

16 89 105 106 110

16 89 105 106 110

Position

Position

図 3. 学習データ(左)および機械学習予測上位 40
配列(右)におけるアミノ酸出現頻度
表 1. 機械学習提案変異体の機能値
収量(mg/L-broth) Tm値 (℃)

KD (M)

野生型

565

4.5×10-80

機械学習提案変異体1

23676.4×10-10

機械学習提案変異体2

20668.0×10-10

3. 今後 の 展望
本研究では、相反関係にある 2 つの機能の同時最適化
するタンパク質プロセスの開発を試み、微生物発現量と構造安定性を維持しつつ親和性を向上に成功した。
この手法は抗体以外のタンパク質進化にも応用でき、
食品・環境・医薬品など幅広い分野での活用が期待できると考えている。

文

献[1] Lilia, A., R., et al., Biochem. Eng. J., 137,
365-374 (2018)[2] Saito, Y., et al., ACS Synth., 7, 2014-22 (2018)[3] Saito, Y., et al., ACS Catal., 11, 14615-24 (2021)[4] Ueno, T., et al., Mater. Discov., 4, 18-21 (2016)

２
17

第75
75回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 2023
2023
第Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213 が誘導生産する
新規酵素エラグ酸ラクトナーゼの同定と機能解析〇片所 杏野 1・渡邊 寛子 1・工藤 眞丈 2・中島 賢則 3・
山本 浩明 3・小川 順 1・岸野 重信 1*
1 京都大学大学院農学研究科, 2 ダイセル・ヘルスケア SBU, 3 ダイセル・事業創出センター〒606-8502

京都府京都市左京区北白川追分町

Tel: 075-753-6122

Fax: 075-753-6113

E-mail: kishino.shigenobu.3e@kyoto-u.ac.jp
O
HO

O

HO

ザクロ等

OH

O

OH

O

エラグ酸 (EA)

HO

HO

HO

O

O

HO
O

HO

M5

HO

HO

O

O

HO
OH

OH

E

HO

OH

OH
O

M7

OH
O

isoA
OH

HO

O

HO

エラグ酸代謝の初発反応を触媒する鍵酵素UroHを特定した。

OH

D

O

O

C

OH

O

O

O

HO

M6
OH

HO

HO

OH

HO

OH

OH

O

HO

UroH

OH

HO

O
O

OH

O

O
O

A

O

B

抗酸化・抗炎症作用

M8

要旨
エラグ酸はザクロ等に含まれるポリフェノールの一種であり、腸内細菌の代謝により、抗酸化・抗炎症などの生理機能を有するウロリチン A や B に変換される。このエラグ酸代謝は
ある種の腸内細菌にのみ観察される特異な代謝であり、関連する酵素やその反応機構は未解明であった。本研究では、ヒト糞便由来腸内細菌 Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213
におけるエラグ酸代謝の初発反応を触媒する鍵酵素 UroH の特定に成功した。

1. はじめにエラグ酸はザクロやイチゴ、クルミなどに含まれる
ポリフェノールの一種であり、抗酸化作用や抗炎症作用、がん細胞の増殖抑制などの健康効果が注目されている。近年、エラグ酸が腸内細菌により代謝されウロ
リチン類となり (上図)、中でもウロリチン A、B の生
理活性が高いことが明らかにされてきている 1)。これ
より、ウロリチン類の需要が高まることが予想されている。
一方、ウロリチン類の化学合成では毒性のあるレゾ

18

２

ルシノールが使用されるため、食品素材の生産法としては安全面での課題がある 2)。また、腸内におけるエラグ酸代謝は非常に複雑であり、複数の腸内細菌が関与することが想定されている。近年、各反応を行う菌が明らかになりつつあるが、それらの菌における責任
酵素は明らかになっていない 3) 4)。
ヒ ト 糞 便 由 来 腸 内 細 菌 Gordonibacter
urolithinfaciens DSM 27213 は、エラグ酸の分子内ラクトンの加水分解を初発反応としてエラグ酸をウロリチ
ン M5 へと変換し、さらにウロリチン M5 を M6、M6
を C へと脱水酸化する。しかし、本菌のエラグ酸変換に関わる酵素や反応機構などの詳細な分子メカニズム

は未解明である。そこで本研究では、G. urolithinfaciens
DSM 27213 がもつエラグ酸のウロリチン M5 への変換を触媒する酵素 UroH を特定し、その機能解析を行った。この検討を端緒に、腸内でのエラグ酸代謝を理解するとともに、効率的かつ安全な微生物酵素による
ウロリチン生産系を構築することを目指している。

を培養し、発現誘導を行った後、SDS-PAGE で単一バンドを示す UroH 精製酵素を取得した。
得られた精製酵素を、エラグ酸を基質とする反応に供したところ、エラグ酸からのウロリチン M5 の生成が確認された (図 2)。これより、UroH は、エラグ酸の分子内ラクトンの加水分解を介してウロリチン M5 を誘導する新規ラクトナーゼであることを明らかにした。

2. 方法

UROs concentration [mM]10.8

urolithin C

0.6

urolithin M6

0.4

0urolithin M5

notdetected
non-induced

EA-

induced

EA+

Resting cells

図 1 エラグ酸非添加もしくは添加培地で培養した菌体(EA-もしくは EA+) のエラグ酸変換活性3. 結果と考察
3.1 比較プロテオーム解析
誘導菌体と非誘導菌体から調製したペプチド断片を用いるプロテオーム解析結果を本菌のゲノム情報に帰属させることで、それぞれの菌体で発現しているタン
パク質を選抜した。その結果、エラグ酸を含む培地で培養した誘導菌体に特異的に発現するタンパク質 59
種類を特定した。その中から、加水分解酵素と相同性を示す誘導菌体高発現タンパク質 UroH を見いだした。
3.2 異種タンパク 質発現系の構築
UroH のエラグ酸代謝への関与を調べるために、大腸菌 Escherichia coli Rosetta2 (DE3) を宿主とする
UroH の異種発現系を構築した。得られた形質転換体

Intensity [µV]

本菌を、エラグ酸非添加培地と添加培地にて培養し、得られた休止菌体におけるエラグ酸変換活性を比較した。その結果、エラグ酸添加培地にて培養した菌体(EA+) でのみエラグ酸変換活性を確認した (図 1)。これより、本菌のエラグ酸変換酵素はエラグ酸添加培地で培養することにより誘導される酵素であることが明らかとなった。そこで、プロテオーム解析により誘導
菌体 (EA+) と非誘導菌体 (EA-) で発現しているタン
パク質を比較し、誘導菌体のみで高発現しているタン
パク質に着目することでエラグ酸代謝の初発反応に関与する酵素を特定できると考えた。

0.2

EA

(×104)

M5

14.0
6.0

UroH
Blank

0

2

3

4

5

Retention time [min]図 2 UroH 精製酵素とエラグ酸 (EA) 反応液のHPLC クロマトグラム
3.3 UroH の諸性質の解析
3.2 により得られた精製酵素 UroH を用いて詳細な機能解析を行った。その結果、本酵素が pH 7.0 ~ 9.0,
50 °C にて高い活性を示すこと、本酵素の活性が Ca2+
や Ni2+の添加により上昇することを明らかにした。

4. 今後の展望
本研究では、エラグ酸代謝の初発反応を触媒する酵素 UroH の同定と機能解析を行った。この反応に引き続き起こるウロリチン類の脱水酸化反応を触媒する酵素を同定することにより、エラグ酸の各種ウロリチン類への変換が可能となり、微生物酵素を用いたウロリ
チン類生産系構築への応用が期待できる。今後、ウロ
リチン脱水酸化酵素の同定を行い、ウロリチン代謝の詳細な解明を目指す。

文

献1) Tomás-B, F. A., González-S, A., García-V, R., NúñezS, M. A., Selma, M. V., García-C, M. T., Espín, J. C.:
Mol. Nutr. Food Res ,61 1500901 (2017).
2) Ito, H., Iguchi, A., Hatano, T.: J. Agric. Food Chem.,
56 393-400 (2008).
3) Selma M. V., Beltrán, D., García-V, R., Espín, J. C.,
Tomás-B, F. A.: Food Funct., 5 1779-1784 (2014).
4) Iglesias-A, C. E., García-V, R., Beltrán, D., Frutos-L,
M. D., Espín, J. C., Tomás-B, F. A., Selma M. V.: J.
Agric. Food Chem., 71 4029-4035 (2023).

３
19

第75
75回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 20232023
第酵母 Starmerella bombicola が生産する
新規ソホロリピッド誘導体の構造解析
小林 洋介 1＊・李 秋実 1・牛丸 和乗 2・廣田 真 1・森田 友岳 2・福岡 徳馬 2
1

アライドカーボンソリューションズ株式会社，2 産業技術総合研究所 機能化学研究部門〒410-0873

静岡県沼津市大諏訪 847-1

Tel: 0559-43-7023

Fax: 0559-43-7024

E-mail: y.kobayashi@allied-c-s.co.jp

ソホロリピッド (SL)は二糖のソホロースに脂肪酸が結合した糖脂質であり、酵母 Starmerellabombicola によって発酵生産されている。SL には酸型 (ASL）とラクトン型 (LSL）の 2 種類が知られているが、機能が異なる誘導体であるため、それぞれを正確に分析する手法を確立する必要があった。メタノールを使用した HPLC 分析によって SL を ASL と LSL に分離・定量することができたが、アンスロン硫酸法による全 SL 量の分析値と比較して ASL と LSL の総量が少なく、逆相 TLC の結果からも異なる SL が存在している可能性が考えられた。また、LC/MS 分析で、ASL や LSL の分子量とは異なるピークが存在したことから、これらが SL の新規誘導体である可能性が推察された。これら物質を単離・同定した結果、SL の脂肪酸末端にグリセリンがエステル結合した化合物であり、LSLと ASL の中間的性質を有することが明らかになった。

1. は じ め にバイオサーファクタント (BS）は、植物油脂や糖類などのバイオマスを原料として微生物によって生産される両親媒性脂質であり、SDGs の広まりを背景に、機20

能性バイオ素材としての利用が世界的に広まっている。BS の 1 種であるソホロリピッド (SL)は二糖のソホロースに脂肪酸が結合した糖脂質で、酵母
Starmerella bombicola が生産する 2)。SL には酸型
(ASL）とラクトン型 (LSL）の 2 種類の機能が異なる誘導体が知られており、ASL は水溶性の陰イオン系界面
1)

2. 方 法炭素源として 10% グルコースと 10% 菜種油を含む培地で S. bombicola NBRC10243 を 28℃、1 週間培養し、培養終了後に 60℃で加温して SL を含む沈殿物を回収した。さらに、菌体除去および洗浄、乾燥をしてSL の混合物を回収した。
このサンプルに対して、順相および逆相薄層クロマトグラフィー (TLC）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を行い、混合物中の各成分を詳細に分析した。HPLC は、固定相に ODS カラム、移動相に水/メタ
ノールを使用し、検出は荷電化粒子検出器 (CAD)または質量分析計を使用した。
物質同定のための精製は順相および逆相シリカゲ
ルカラムクロマトグラフィーにより各成分を単離し、NMR によって構造を同定した。また、単離した物質はペンダントドロップ法で表面張力の測定を行った。

また、LC/MS 分析で、ASL や LSL の[M-H]-とは異なる
3 つのピーク群を検出し、それぞれ m/z 1468, m/z 2157,
m/z 1733 を主としていた。これらを単離し、NMR によって構造を同定した。その結果、得られた誘導体は SLの脂肪酸末端にグリセリンがエステル結合した化合物(SL グリセリド)であり、それぞれグリセリンに 2 つのASL が結合した SL グリセリド (化合物 A)、3 つの ASLが結合した SL グリセリド (化合物 B)、2 つの ASL と 1つの脂肪酸が結合した SL グリセリド (化合物 C)であった。
化合物 A、B は水溶性が高く、臨界ミセル濃度 (CMC)とその時の表面張力 (γCMC)も ASL と類似した値を示した (図 2)。一方、化合物 C は水に溶かすと白濁し、表面張力低下能をほとんど示さないなど、同じ SL グ
リセリドの中でも異なる性質を示すことが確認された。
このように SL グリセリドは水溶性であったが、LSL と同様に非イオン界面活性剤に分類されることから、LSLと ASL の中間的性質を有していた。
80

Compound C
Compound B

70

Surface tension (mN/m)

活性剤、LSL は疎水性の非イオン系界面活性剤である
3)。培養液中にはこれらの誘導体が共存しており、その含有率は SL の BS としての性能に大きな影響を与えると考えられる。本発表では SL の分析方法の最適化と、その過程で同定した新規 SL 誘導体について報告する。

3. 結 果 と 考 察

Compound A
CMC1 = 173 mg/L (8.0 x10-5 M)
gCMC1 = 50.8 mN/m

60

CMC2 = 2.99 g/L (1.4 x10-3 M)
gCMC2 = 41.4 mN/m

50
40
CMC = 206 mg/L (1.4 x10-4 M)
gCMC = 43.1 mN/m

30

HPLC 分析によって SL は ASL と LSL に分離することができたが、アンスロン硫酸法による全 SL 量の分析
値と比較して ASL と LSL の総量が少なかった。しかし、逆相 TLC を行った結果、順相 TLC では検出できなかった糖脂質が見出され、異なる SLs が存在している可能性が考えられた (図 1)。

20
0
0.01

0.1

1

10

Concentration (mg/mL)

図 2.

SL グリセリドの表面張力

発酵液中から得られた SL の組成比を定量した結果、
LSL:ASL:SL グリセリド = 49.2:33.5:17.3 であり、SLグリセリドはこれまで未知であったにもかかわらず高
い構成比率を占めた。現在市場に流通している SL は
ASL または LSL のいずれかの性質に活用したものであるが、今後、SL グリセリドのさらなる研究によって、従来にはない SL の用途拡大や市場の活性化が期待さ
れる。

文
図 1.

順相 TLC (a)および逆相 TLC (b)による新規化
合物の検出

献

1) Kitamoto, D. et al.; J. Oleo. Sci. 71, 1-13
(2022).
2) Qazi, M. A. et al.; Bioresour. Technol. 346,
126593 (2022).
3) Hirata, Y. et al.; J. Oleo. Sci. 58, 565-572(2009).

21

第75
75回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 20232023
第糠床における複合微生物系における代謝コミュニティーの
メタゲノム解析古賀 優梨 1＊・篠田 あかり 1・杉浦 俊作 2・木村 洋 3・中山 二郎 1
1

九州大学大学院生物資源環境科学府，2 東海漬物株式会社漬物機能研究所
3
北九州小倉・糠床糠炊き研究会〒819-0395

福岡県福岡市西区元岡 744 ウエスト 5 号館
Tel & Fax: 092-802-4735

E-mail: koga.yuri.152@s.kyushu-u.ac.jp

糠床は,発酵と熟成が進むと菌叢が変化し,それに伴い糠床特有の風味を醸し出す.本研究では,
糠床 6 サンプルのショットガンメタゲノム解析を行い,香気成分であるプロピオン酸の代謝生産経路を推察した。その結果,複数種の乳酸菌が,糠床中の主要発酵産物である乳酸をさらに代謝し,プロピオン酸に変換していることが示された.

1.は じ め に

2.方 法

糠床は,発酵と熟成が進むにつれて菌叢が変わり,それに伴い風味や匂いも変化する.特に,プロピオン酸は
糠床熟成の指標と言われており 1,発酵が進むとその量は変化する.しかし,その代謝メカニズムは未だ明らかになっていない.そこで本研究では、プロピオン酸の代謝経路を明らかにすることを目的とし,糠床 6 サンプ
ルのショットガンメタゲノム解析を行い,プロピオン酸代謝酵素遺伝子とその保有菌の同定を試みた.

長期熟成糠床の上部,中部,底部から 2 種類のサイズのビーズ(0.1mm,0.5mm)で DNA を抽出し,150 bp のペアエ
ンドショットガンメタゲノムシーケンスに供し,各サンプル当たり計 6～8 Gb のシーケンスを得た.まず,その配列を用いて菌叢解析プログラムである Kaiju により菌組成を求めた.次に、各配列を Metaspades により
ア ッ セ ン ブ ル し , 得 ら れ た contig を ビ ニ ン グ
し,Metagenome Assemble Genome (MAG)を得た.そして各 MAG 上の遺伝子について,DRAM により機能アノテー
ションを行った(図１).

22図 1.糠床サンプルから菌叢データと遺伝子機能デー
タを得るまでの実験フロー及び,それぞれの解析に用いいた解析プログラム

ラビナン分解酵素遺伝子を有する乳酸菌の存在が示された.一次代謝については,ほぼすべての乳酸菌 MAG に
乳酸と酢酸の代謝経路が確認された.一方,プロピオン
酸生成の代謝については,乳酸から 1,2-Propanediolの代謝を司る Lentilactobacillus buchneri の一連の酵素と,1,2-Propanediol から Propionyl-CoA を経由してプロピオン酸を生成する他の乳酸桿菌の酵素が複数の菌に分かれて見出された.以上,糠床の主要香気成分
であるプロピオン酸が乳酸発酵の主要産物である乳酸を原料とした,複数の乳酸菌による代謝リレーにより生成されていることが示唆された(図 3).

3.結 果 と 考 察
菌叢解析の結果,複数種の乳酸桿菌(Lactbacillus 属)と産膜酵母(Pichia 属）を主体とする菌組成であることが確認された.乳酸菌叢は,熟成糠床に優占的に存在
す る こ と が 知 ら れ て い る Lactobacillus
acetotolerans 2,3,4 を主体とし,加えて 30 種以上の乳酸桿菌で構成されていることが示された(図 2).

図 3.(左)糠床中のプロピオン酸代謝経路の候補酵素(右)糠床サンプルに含まれているプロピオン酸代謝関
連酵素をもつ乳酸菌の候補

文
図 2.糠床６サンプル中の菌叢(左から糠床上層,中層,
下層の,それぞれ DNA 処理する際に用いた 2 種類のビーズサイズによる違いを表している.粒径の大きなビーズで真菌が多くなる傾向が見られている.)

次に,in silico で,ショットガンシーケンスにより得られた DNA 断片を連結させ,各菌のゲノム(MAG)を得た.
各 MAG の糖代謝関連遺伝子解析(CAZY 解析)により,ア

献1) 今井正武,1995,糠みそ床の香気成分の生成に関する
微生物と温度の影響,161-177
2) 阪本直茂,2010,糠床の微生物叢に関する研究,125135
3) 星 子 浩 之 , 2006, 糠 床 中 に お け る 緩 慢 乳 酸 菌
Lactobacillus acetotolerans とその他の乳酸菌の生育挙動と代謝活性4) 小野浩,2014,糠床の発酵過程の微生物叢変化と化学成分に関する研究,123-127

23

第  回日本生物工学会大会 7RSLFVRI
第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023

放線菌 Streptomyces lividans において糖消費と二次代謝物生産を向上させる中央代謝経路の遺伝子破壊中澤堅太朗 ・山本省吾 ・柘植陽太 ＊

金沢大学大学院自然科学研究科，  長瀬産業株式会社，  金沢大学新学術創成研究機構
〒石川県金沢市角間町 金沢大学大学院自然科学研究科生命理工学専攻 
7HO
(PDLO\WVXJH#VWDIINDQD]DZDXDFMS

放線菌 Streptomyces 属は様々な二次代謝物の生産に利用される産業微生物である．我々はStreptomyces lividans における中央代謝経路の改変が一次代謝と二次代謝に与える影響を明らかにすることを目的に，トリカルボン酸（TCA）サイクルの isocitrate dehydrogenase 遺伝子（icd）の欠損が代謝に与える影響を調べた．合成培地を用いたフラスコ培養の結果、icd 欠損株は野生株と比較してグルコース消費量が 44%増加し、二次代謝物の 1 つである undecylprodigiosin の生産量は5.2 倍に増加した．次にジャーファーメンター培養を行った結果、icd 欠損株のグルコース消費量は
野生株の 2.5 倍に増加した．以上の結果から、S. lividans では中央代謝経路の改変が一次代謝と二次代謝物に大きな影響を与えることが明らかになった．特にグルコース消費量の顕著な増加は S.
lividans の一次代謝物の生産宿主としての可能性を開拓するものと期待できる．


1. はじめに放線菌 Streptomyces 属は抗生物質をはじめとする
多様な生物活性物質の生産菌として知られている.放線菌ではこれら二次代謝に関する研究は盛んに行われているが，一次代謝に関する研究は進んでおらず，未解明な部分が多い．二次代謝物は一次代謝物を前駆体として合成されるため，中央代謝経路の改変は広範囲の代謝に影響を与えると考えられる．そこで本研究では放線菌における中央代謝経路の改変が一次代謝、二24２

次代謝に与える影響を明らかにすることを目的とし，Streptomyces lividans において TCA サイクル内の
isocitrate dehydrogenase（IDH）の遺伝子（icd）の欠損が代謝に与える影響を調査した．

2. 実験手法
放線菌の野生株として Streptomyces lividans 1326
株を用いた. icd 欠損株は相同組み換えを用いて作製した．これら 2 株を TSB（1.8 g/L）含有の合成培地を用
いてフラスコで 28℃ 144 h 培養した．グルコース初期濃度は 50 g/L とした. グルコース濃度は高速液体ク
ロマトグラフィー（HPLC）で分析した．
二次代謝物である undecylprodigiosin（Udp）の生産のため、2 株を R2YE 液体培地を用いてフラスコで28℃ 72 h 培養した．Udp 濃度は遠心分離で菌体を回収後，メタノール処理して Udp を菌体外へと溶出させ，上清を 530 nm の吸光度で測定し定量した 1)．
2 L ジャーファーメンターを用いた実験では TSB（1.8 g/L）含有の合成培地を用いて 28℃ 88 h 培養した．通気量は 1 vvm、pH は 7.0 で制御した．グルコー
ス初期濃度は野生株で 50 g/L，Δicd 株で 100 g/L とし，
24 h 後に追添加を行った．

3. 結果と考察
本研究では中央代謝経路の改変が S. lividans の一次代謝、二次代謝に及ぼす影響を調べるため、TCA サイ
クルの icd 遺伝子をターゲットにした（図 1）．はじめに icd 欠損株を作製し、野生株と合わせて Δicd 株をフラスコで培養し、乾燥菌体重量とグルコース濃度を測定・分析した．その結果，乾燥菌体重量は野生株と Δicd
株で差は見られなかったが（図 2A），グルコース消費
量は icd 欠損により 44%増加した（図 2B）．大腸菌やコリネ型細菌では icd 遺伝子の欠損により増殖速度やグルコース消費速度が低下することが報告されており，放線菌は異なる表現型を示した 2)．そこで IDH の比活性を測定したところ，Δicd 株の IDH 比活性は野生株と比較して 88%減少したが，わずかに残存した．S.
lividans は icd 遺伝子を一つしか保持していないため，他の脱水素酵素の中にイソクエン酸を基質として利用するものが存在すると示唆された．


図 フラスコ培養における野生株と Δicd 株の乾燥菌体重量（A）及びグルコース消費量（B）

続いて icd の欠損が二次代謝に与える影響を明らかにするため，S. lividans が生産する二次代謝物の 1 つである Udp の生産量を野生株と Δicd 株で比較した．
2 株を R2YE 培地で培養した結果，Δicd 株におけるUdp 生産量は野生株と比較して 5.2 倍に増加した（図2）．Udp はアセチル CoA を前駆体として合成される．
従って Δicd 株では経路上流のアセチル CoA の蓄積量が増加した可能性が示唆された．

図 2. 野生株と Δicd 株における Udp 生産量
最後にフラスコ培養で観察された野生株と Δicd 株の表現型の差異が，異なる培養スケールでも観察されるかを確認するために，2 L ジャーファーメンターを用いて培養を行った．その結果，乾燥菌体重量はフラスコ培養と同様に野生株と Δicd 株で差は見られなかったが（図 3A），Δicd 株のグルコース消費量は野生株と比較して 2.5 倍に増加し，フラスコ培養よりも顕著な差を示した（図 3B）．このグルコース消費量の増加
は icd 欠損により TCA サイクルへの炭素フラックスが阻害された結果，酸化的リン酸化による ATP 合成量が低下し，それを解糖系における ATP 合成で補うために引き起こされた可能性が考えられた．

図 3. ジャーファーメンター培養における野生株とΔicd 株の乾燥菌体重量（A）及びグルコース消費量（B）
以上により，中央代謝経路の icd 遺伝子の欠損が，S. lividans のグルコース消費量及び二次代謝物の生産量を向上させることが明らかになった．グルコース消費量の顕著な増加は，一次代謝物の生産宿主としての可能性を開拓するものであると考えられた．今後はこの表現型の原因を解明すると共に，icd 以外の中央代
謝経路の改変が代謝系全体に与える影響を調べる予定である．

4. 参考文献
1) Kang, G. et al.,: FEMS Microbiol. Lett., 168, 221–
226 (1998)
2) Kabir, M. et al.,: Appl. Microbiol. Biotech., 65, 84–
96 (2004)

３
25

第75
75回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 20232023
第基質としての グリセリンが大腸菌の組換 えタンパク質 生産に与える 影響の評価
齋藤肇１・尾島由紘１*・幸慎太郎２・福永浩一２・坪井輝道２・東雅之１
1

大阪公立大学大学院工学研究科，2 阪本薬品工業（株）〒558-8585 大阪府大阪市住吉区杉本 3-3-138
Tel: 06-6605-2163

Fax: 06-6605-3092

E-mail: ojima@omu.ac.jp

要旨
大腸菌を用いた組換えタンパク質生産において、グ
ルコースの代替としてグリセリンを基質に用いると、カタボライトリプレッションの解除や中枢代謝の変化によってタンパク質生産量を向上できることが知られている。本研究ではグリセリンを基質として用いた際に、前述のどちらの効果がタンパク質生産に与える影響が大きいのかを評価するため、qRT-PCR を用いた遺伝子発現量の測定やウェスタンブロットによるタンパ
ク質生産量の評価を行った。その結果から、グリセリ
ンによる生産量の向上は、中枢代謝の変化よりも、目的タンパク質の転写におけるカタボライトリプレッシ
ョンの解除に大きく起因していることを明らかにした。
1. はじめに大腸菌の組換えタンパク質生産における基質として、
一般的にはグルコースが用いられるが、代替としてグリセリンを用いた場合には、①カタボライトリプレッ
ションの解除によるタンパク質生産量の向上、②中枢
代謝の変化によるタンパク質生産量の向上、の効果が報告されている。①では、転写制御因子の活性化によって lac プロモーター下流に組み込まれたタンパク質の転写量の低下を回避できる 1)。また、②では、核酸生合成を行うペントースリン酸経路などが低活性化し26増殖が抑制され、TCA 回路などアミノ酸合成経路に関連する代謝経路へ多くの基質が流れると報告されている 2)。本研究では、上記の 2 つの要因の内、どちらの寄与が大きいのかを明らかにすることを目的とし、酵母由来の Gas1 およびヒトのインスリンの前駆体である proinsulin を目的タンパク質として検証を行った。
２．材料と方法
増殖、基質濃度、目的タンパク質量の評価
pET-26b プラスミドの T7 プロモーター下流に Gas1
も し く は proinsulin を ク ロ ー ニ ン グ し 、 大 腸 菌
SHuffle T7 に形質転換した。最小培地に OD660 が約 0.2となるように植菌し、37℃で約 24 h 培養した。最小培
地の基質にはグルコース 0.8%（Glu 培地）、グルコース
0.4%+グリセリン 0.4%（GluGly 培地）、グリセリン 0.8%
（Gly 培地）の 3 パターンを用いた。発現誘導剤である IPTG は、培養開始 2 h 後に終濃度 0.1 mM で添加した。任意の時間で OD 値を測定し、5、10 h 後の培養液中のグルコースとグリセリンの濃度を HPLC で測定した。また、培養終了時に菌体量を合わせたウェスタン
ブロットから目的タンパク質量を比較し、OD 値を乗算することで培養液あたりのタンパク質生産量も算出した。
中枢代謝遺伝子および Gas1 遺伝子の発現量の測定

Gas1 生産培養時の培養 10 h 後の菌体から mRNA を抽出し、rrsA を内部標準として qRT-PCR を行い、中枢代
謝関連遺伝子 glpK、zwf、gapA、ppsA、gltA、pta、acsと目的タンパク質遺伝子 gas1 の発現量を比較した。
３．結果と考察
Gas1 生産培養では、GluGly 培地において最終 OD 値が最も高く、Gly 培地では増殖が遅れた（図 1）。培養
24 h 後の菌体あたりの Gas1 生産量は、GluGly 培地でGlu 培地と比べて約 3 倍に増加したが（図 2）、Gly 培
地では Glu 培地と同程度であった。さらに培養液あたりでは、GluGly 培地の OD 値が最も高かったことから、
約 4.6 倍となった。よって、グルコースとグリセリンを併用すると、Gas1 生産量が最も増加することが明らかとなった。GluGly 培地では、グルコースが 10 h 後に完全に消費され、その後グリセリンが消費されていた（データ省略）。

図 3 Glu 培地を 1 としたときの GluGly 培地での相対発現量(培養 10 h 後)。
は約 1.8 倍に増加した（図 3）。グリセリン添加による増殖の低下は確認されなかった結果を加味すると(図1)、組換えタンパク質の生産向上において、中枢代謝の変化よりもカタボライトリプレッションの解除による目的タンパク質の転写量増加の寄与が大きいことが示唆された。
また、グリセリンの汎用性を確認するため、大腸菌を用いて工業生産されている proinsulin の生産も行った。培養 27 h 後の GluGly 培地の培養液あたりのproinsulin 生産量は、Glu 培地と比べて約 3 倍に増加
し、Gas1 と同様の傾向が確認された（図 4）。

図 1 Gas1 生産培養時の各培地での増殖。

図 4 培養 27 h 後の Glu 培地を 1 としたときの培養液あたりの proinsulin 相対生産量。

図 2 培養 24 h 後の Glu 培地を 1 としたときの Gas1 相対生産量。白：菌体あたりの生産量。黒：培養液あたりの生産量。
遺伝子発現量について、GluGly 培地では Glu 培地と比べて、グリセリン取り込みに関わる glpK や糖新生関連の ppsA、酢酸消費に関わる acs は、グリセリン代
謝に連動するため、大幅な増加を示した。また、ペン
トースリン酸経路に関わる zwf や解糖系に関わる gapAなどの発現量は同程度であった一方で、gas1 の発現量４．今後の展望
本研究では、グリセリン添加による組換えタンパク
質生産の向上について、カタボライトリプレッションの解除の寄与が大きいことを示した。この結果は大腸菌を用いた組換えタンパク質生産におけるグリセリンの有用性を支持するものである。
参考文献
1) Kopp, J., et al., Bioengineering , 5:1 (2018).
2) Terol, L., et al., Microb. Cell Fact., 18:151(2019).

27

第75
75回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 20232023
第アセトヒドロキシ酸シンターゼ制御サブユニットの Ala31Thr 置換による清酒酵母のバリンおよびイソブタノール生産性の向上
磯貝 章太 1*、西村 明 1、村上 直之 2、堀田 夏紀 2、小高 敦史 2、豊川 洋一 1、石田 博樹 2、高木 博史 11

奈良先端科学技術大学院大学・研究推進機構、2 月桂冠株式会社・総合研究所〒630-0192

奈良県生駒市高山町 8916-5

奈良先端科学技術大学院大学研究推進機構発酵科学研究室

Tel: 0743-72-6230
E-mail: s-isogai@bs.naist.ac.jp

バリンの代謝によって生成するイソブタノール・酢酸イソブチルは、酒類や食品の香気性に寄与する。そこで本研究では、付加価値の高い清酒の醸造を目的に、実用清酒酵母株からバリンを高生産する変異株（K7-V7）を育種した。本株を解析した結果、バリン生合成の律速酵素であるアセトヒ
ドロキシ酸シンターゼ（AHAS）の制御サブユニット Ilv6 に導入された Ala31Thr のアミノ酸置換により、AHAS に対するバリンによるフィードバック阻害が部分的に解除され、バリンおよびバリン由来の香気成分の生産性が向上したことを明らかにした。得られた知見は酵母によるバリンやその代
謝産物の高生産に向けた AHAS の改変に応用できると考えられる。さらに、K7-V7 株を用いた清酒の小仕込み試験により、従来の清酒とは異なる香味性を有する清酒が醸造できる可能性が示された。

1.はじめに清酒に対する世界的な関心の高まりに伴い、様々な
呈味性・香味性を有する清酒の需要が増加している。
清 酒 の 醸 造 過 程 に お い て 、 酵 母 Saccharomyces
cerevisiae は、分岐鎖アミノ酸の一種であるバリンから、果実様（梨・バナナ）の香りを示すイソブタノー
ルおよび酢酸イソブチルを生成する[1]。これらの香気
成分は、清酒を含む様々なアルコール飲料の呈味性・香味性に大きく寄与することが知られている[2],[3]。そのため、バリンを高生産する酵母を用いて清酒を醸造し、清酒中のバリンに由来する香気成分を増加させる
ことができれば、高付加価値化に繋がることが期待できる。しかしながら、酵母のバリン生合成では、初発反応を触媒するアセトヒドロキシ酸シンターゼ（AHAS）の酵素活性が最終産物であるバリンによるフィードバ
ック阻害を受けることで生合成量が調節されるため、細胞内にはバリンが過剰に蓄積しない（図 1A）[4]。そ28
１

こで本研究では、実用清酒酵母株を親株にバリンを高生産する株を育種するとともに、育種株のバリン高生産機構について解析した[5]。

2.結果と考察(1) バリン高生産株の育種と高生産に寄与する遺伝子変異の同定
きょうかい 7 号系の実用清酒酵母株に突然変異処理を施し、細胞内バリン含量が親株の 1.7 倍に増加した変異株（K7-V7 株）を取得した（図 1B）。本株の変異点を解析したところ、バリン生合成の律速酵素である
AHAS の制御サブユニットをコードする ILV6 遺伝子にAla31Thr(A31T)のアミノ酸置換を伴う新規変異を同定した。31 番目のアラニン残基は真菌類の AHAS の制御
サブユニットに保存された N 末端領域に位置している。

アセトヒドロキシ酸

15

15

*

4

親株

図 1. 酵母のバリン生合成経路（A）
および育種株の細胞内バリン含量（B）（A）AHAS は触媒サブユニット Ilv2 および制御サブユ
ニット Ilv6 で構成される。Ilv6 にバリンが作用する
ことで活性が制御される。（B）DCW：乾燥菌体重量(2)A31T のアミノ酸置換が AHAS 活性に与える影響
野生型 Ilv2、野生型および A31T 変異型 Ilv6（Ilv6_WT
および Ilv6_A31T）の各組換え酵素を調製し、バリンによるフィードバック阻害に与える影響を解析した。
その結果、野生型 Ilv6 を用いた場合は、0.025 mM のバリン存在下で活性が 29%に低下したのに対し、A31T
変異型 Ilv6 では、57%の活性が残存していた（図 2）。

50

K7-V7 (*, p<0.05)

A31T

WT

5
0

WT

A31T

(*, p<0.05)

図 3. Ala31Thr のアミノ酸置換がバリン（A）
およびイソブタノール（B）生産性に与える影響(4) 清酒小仕込み試験
最後に、K7-V7 株を用いて清酒の小仕込み試験を行ったところ、親株と比較して、清酒中のイソブタノー
ルや酢酸イソブチル含量が 1.5 倍に増加した（図 4）。

A. イソブタノール

B. 酢酸イソブチル

*

160

*

1

120
80

0.5

40

40
比活性 (µmol/min/mg)

0

30

親株

K7-V7

0

親株

K7-V7 (*, p<0.05)

図 4. 清酒中のバリン由来香気成分含量

Ilv2+ Ilv6_A31T

20
10
0

*

10

10

8

0

バリン

*

mg/L

Ilv6

12

mg/L

AHAS Ilv2

B. 細胞外イソブタノールµmol/g-DCW

CO2A. 細胞内バリン

mg/L

2 ×ピルビン酸

B. 細胞内バリンµmol/g-DCW

A. バリン生合成経路

Ilv2+ Ilv6_WT
00.02 0.04 0.06 0.08 0.1

バリン (mM)

図 2. A31T のアミノ酸置換がバリンによるフィードバック阻害感受性に与える影響(3) A31T 変異型 Ilv6 の発現がバリンやその代謝産物の生産性に与える影響
次に、野生型および A31T 変異型の Ilv6 を実験室酵
母で発現させバリン生産性に与える影響を解析した。
その結果、A31T 変異型 Ilv6 発現株（A31T）では、野生型 Ilv6 発現株（WT）と比較して、細胞内バリンが 2倍、細胞外イソブタノールが 2.2 倍に増加した（図 3）。
以上の解析から、A31T のアミノ酸置換に伴って、バリンによるフィードバック阻害が部分的に解除され、バリンおよびバリン由来香気成分の生産性が向上した
ことを明らかにした。また、真菌類の AHAS の制御サブユニットに保存された N 末端領域がバリンによる活性制御に関わることを初めて見出した。

3.今後の展望
本研究で得られた知見は酵母によるバリンやその代
謝産物の高生産に向けた AHAS の改変に応用できると考えられる。さらに、清酒小仕込み試験の結果から、本株を用いることで特徴的な香味性を有する清酒が醸造できる可能性が示された。

謝

辞

本研究は、農研機構生研支援センター「イノベーシ
ョン創出強化研究推進事業」の支援を受けて実施した。

文

献[1] Hazelwood LA et al.: Appl Environ Microbiol 74 ,
2259–66 (2008)[2] Lilly et al.: FEMS Yeast Res, 6, 726–43 (2006)[3] Pires E et al.: Appl Microbiol Biotechnol, 98 ,1937–49 (2014)[4] Pang SS et al.: Biochem J, 357 , 749–57 (2001)[5] Isogai S et al.: FEMS Yeast Res, 23 , foad012(2023)

２29

第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023
第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023

油脂酵母 Lipomyces starkeyi における脂肪酸合成酵素遺伝子の改変によるカカオバター様油脂の生産
渡部

凌 1・佐藤1

里佳子 1・荒学志 1,2・荒木秀雄 2・山崎晴丈 1・高久洋暁 1＊

新潟薬科大学大学院応用生命科学研究科，2 不二製油グループ本社〒956-8603

新潟市秋葉区東島 265-1
Tel: 0250-25-5119

新潟薬科大学大学院応用生命科学研究科
Fax: 0250-25-5021

E-mail: htakaku@nupals.ac.jp

LsELO20%パルミチン酸(16:0)

50%

C16/18 elongase

ステアリン酸(18:0)

改変前 改変後

100%

50%

LsFAD20%∆9desaturase

オレイン酸(18:1n9c)

改変前 改変後

50%∆12desaturase

0%

リノール酸
(18:2n6c)

改変前の遺伝⼦発現量

脂肪酸 (%)

パルミトレイン酸(16:1n9c)

OLE1

0%

改変前 改変後

100%

OLE1

100%

脂肪酸 (%)

50%

改変前 改変後脂肪酸 (%)脂肪酸 (%)

100%

脂肪酸 (%)

100%

改変前 改変後50%

改変後の遺伝⼦発現量

0%

100%

100%

OthersOthers50%10µm

Lipomyces starkeyi

脂肪酸(%)脂肪酸 (%)

C18:2n6c
C18:1n9c
C18:0
C16:1
C16:0
0%

i
ey
ター
rk
オバ
sta
L.
カカ

カカオバター様油脂

C18:2n6c50%

C18:1n9c
C18:0
C16:1
C16:0

0%

様
ター
ター
オバ
オバ 脂 カカカ油
カコロナウイルス感染症、ウクライナ危機の影響による油脂市場の混乱は、油脂自給率が僅か 14%しかない日本に大きな影響を与え、油脂の自給率向上対策は急務課題であることを我々に再認識させた。本研究対象の油脂酵
母 Lipomyces starkeyi は、地域バイオマスから高効率で油脂を生産可能なユニークな酵母である。これまで我々のグループでは、油脂酵母 L. starkeyi によるパーム油代替油脂の発酵生産の研究で、菌株育種により油脂の高生産に成功している。この先行技術を基盤とし、日本で生育が困難な植物の代換油脂の生産が可能になれば、油脂自給率向上に大きく貢献できると考えた。そこで本研究では、L. starkeyi の脂肪酸合成経路を改変すること
により、高温多湿の気候で生育するカカオのカカオバター類似油脂の L. starkeyi 発酵生産系を構築した。

1. はじめに
高温多湿の熱帯で生育するカカオに含まれるカカオ
バターは主にチョコレートの原料として利用されている。しかし、カカオ生産地において、気候変動、害虫や病気、地球温暖化による土地の乾燥化がカカオの生30２

産量に影響を与えると予測されており、将来的に不足する可能性がある 1)。また、油脂自給率の低い日本は、
世界情勢の変化に応答する油脂市場に左右されることから、油脂自給率に対する危機感は高い。日本を含めた油脂低自給率の国々は、自給率向上のための新たな油脂生産技術を必要としている。

この結果を利用し、OLE1 発現強度を低下させるように内在性のプロモーターを改変した。その結果、野生株
ではステアリン酸含量は約 5％、オレイン酸含量が約50％であるのに対し、改変 OLE1 プロモーター株ではステアリン酸含量は約 12％、オレイン酸含量が約 35％に変化した（図 2）。さらに改変 OLE1 プロモーター株
に対し、LsELO2 を高発現させた場合、ステアリン酸含量は約 24％まで向上した（図 2）。この脂肪酸組成はカ
カオバターと比較して非常に類似しており、カカオバ
ターの代替油としての可能性を期待させるものである。
100%

Others
C18:2n6c
C18:1n9c
C18:0
C16:1
C16:0

脂肪酸(%)

OLE1

ステアリン酸(18:0)∆9desaturase

LsFAD2オレイン酸(18:1n9c)∆12desaturase

リノール酸(18:2n6c)

タ
カ
カ
オ
バ

C16/18 elongase

野

LsELO2パルミチン酸(16:0)

⽣

株

0%

ー

50%

プ 改変
ロ
モ OL
ー E
タ 1
ー
株
改
変
Ls OL
EL E
O 1プ
2⾼ ロ
発 モー
現 タ
株 ー

油脂酵母 L. starkeyi は乾燥菌体重量の 70％以上もパーム油類似脂肪酸組成の油脂を細胞内の脂肪球に蓄積できる。また、グルコース以外にもキシロース、マンノース、フルクトース、デンプンなどの様々な糖を炭素源として利用できる 2)。したがって、食品・醸造
残渣などの複数の糖が混在するバイオマス由来の糖化液からの油脂生産が期待できる。
これまで我々のグループでは、L. starkeyi による
パ ー ム 油 代 替 油 脂 の 発 酵 生 産 の実 用 化 へ 向 け 、 L.
starkeyi の油脂生産制御因子の発見と改変により研究を推進してきた 3)。この技術と脂肪酸組成改変技術の活用は、日本で生育が困難な植物の代替油脂生産に繋がり、油脂自給率向上に大きく貢献できると考えた。
L. starkeyi 野生株の生産油脂とカカオバターの脂肪酸組成は、パルミチン酸(C16:0)、ステアリン酸(C18:0)、オレイン酸(C18:1)の含量に違いがある。本
研究では、L. starkeyi によるパルミチン酸からオレイン酸までの変換に関与する酵素遺伝子 LsELO2, OLE1の発現調節によるカカオバター様油脂の発酵生産系の構築を目指した（図 1）。

OLE1
パルミトレイン酸(16:1n9c)

図 1.

改変前

改変後

本研究における脂肪酸合成経路の改変戦略図

2. 材料と方法
本研究では L. starkeyi の野生株と比較して相同組換え効率が格段に向上している L. starkeyiΔlslig4株を宿主として使用した 4)。OLE1 の発現強度を調節するために、OLE1 プロモーター解析を実施した。そのため、β-ガラクトシダーゼをコードする大腸菌由来のLacZ をレポーター遺伝子として様々な長さの OLE1 プ
ロモーターの融合遺伝子断片を作製した。作製した遺伝子断片をエレクトロポレーション法によりΔlslig4
株に導入後、その菌株を培養し、β-ガラクトシダーゼ
活性の測定を実施した。
OLE1 プロモーター解析結果を利用し、OLE1 の発現を弱める改変 OLE1 プロモーターを内在性の OLE1 プロ
モーター領域に、LsELO2 高発現カセットを LsLIG4 領域に導入した。構築した株を培養し、適宜サンプリン
グ及び油脂抽出を行い、GC で脂肪酸組成を分析した。

3. 結果と考察

OLE1 プロモーター解析の結果、プロモーターの長さに応じてβ-ガラクトシダーゼ活性は徐々に低下した。

図 2.

野生株及び改変 OLE1 プロモーター株における脂肪酸組成解析4. 結言
本研究では、L. starkeyi の脂肪酸合成酵素遺伝子の発現を調節した結果、カカオバターと類似した油脂を生産させる酵母の創製に成功した。今後は本研究で構築した菌株に対して、油脂生産制御因子の改変を行うことにより、カカオバター様油脂の高生産化に向けて取り組み、産業利用への応用を目指す。

謝辞
本研究は NEDO の助成事業の支援を受けて実施した。

参考文献
1) Konzock, O. et al., Microbial Cell Factories,
25, 1186 (2022).
2) Oguri, E. et al., Antonie van Leeuwenhoek, 101,
359 (2012).
3) Takaku, H., Appl Microbiol Biotechnol., 107,1269 (2023).
4) Oguro, Y. et al., Current Genetics, 63, 751(2017).

３

31

第75
75回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 20232023
第酢酸イソブチル高生産酵母の育種と窒素源の影響解析
圍

彰吾 1＊・浅井1〒658-0041

拓也 1・窪寺

隆文 1・明石貴裕 1

白鶴酒造（株）研究室

神戸市東灘区住吉南町 4-5-5
Tel: 078-822-8910

白鶴酒造株式会社研究室

Fax: 078-822-8930

E-mail: shogo-kakoi@hakutsuru.co.jp

筆者らは清酒酵母の酢酸イソブチル生産性を向上するために、①酢酸エステル合成酵素 AATase 高活性、②酢酸エステル分解エステラーゼ低活性、③イソブタノール高生産性を有する三重突然変異株
HL430 を取得した。精米歩合 70%の原料米を用いた清酒小仕込み試験において、HL430 のイソブタノール
および酢酸イソブチル生産性は、それぞれ親株の 3.5 倍、2.8 倍に向上した。
一方で精米歩合 50%条件では、HL430 の発酵性や香気生産性が低下したが、硫酸アンモニウムの添加によって改善することが分かった。
本研究で得られたイソブタノール及び酢酸イソブチル高生産株は突然変異株であることから、清酒を含めた食品用途として大変有用であり、その他産業への応用も期待される。

1．はじめに酢酸イソブチルはメロンやバナナ様の香りを呈するエステルであり、一般的な清酒に含まれる濃度は 1ppm未満と低く、著しく生産性を向上した実用株も得られていない。そこで本研究では、酢酸イソブチル高生産性の清酒酵母の育種に取り組んだ。
酢酸イソブチルは、アセチル-CoA とバリン生合成
経路で生成したイソブタノールが、アルコールアセチ
ルトランスフェラーゼ（AATase）によって脱水縮合されて生じる。逆に酢酸イソブチルは、分解エステラー
ゼ Iah1 によって加水分解されてしまう。したがって
清酒中の酢酸イソブチル濃度を飛躍的に向上する方策として、①AATase 活性の亢進、②Iah1 活性の低下、③イソブタノール生産性の向上が挙げられた。
バリン生合成経路は、アセトヒドロキシ酸合成酵素（AHAS）にバリンが結合することでフィードバック阻
害を受けるが、一部のバリンアナログ耐性変異株では、その阻害が解除される 1)。そこで筆者らは、当研究室の先行研究において得られた AATase 高活性かつ Iah1
低活性である清酒酵母 HL295 に対してノルバリン耐性

32１を付与することで、イソブタノール及び酢酸イソブチ
ル生産性を向上した三重突然変異株 HL430 を取得した。
ところが通常の仕込み条件と比べて、より精米された原料米を用いる大吟醸仕込みでは、HL430 の発酵性と香気生産性が低下した。改善策を講じたので報告する。

2 ． 方法（1）ノルバリン耐性株の取得
自社酵母 HL295 の突然変異を誘発し、0.2%ノルバリ
ンを含む SD 寒天培地で生育した株を選抜した。
（2）清酒小仕込み試験
精米歩合 70%の乾燥麹及び α 化米を使用し、品温15℃一定で総米 400g の清酒小仕込み試験を行った。
上槽酒の香気分析を行い、最も酢酸イソブチル濃度の高かった株を HL430 として選抜した。
また、大吟醸条件の清酒小仕込み試験として、精米歩合 50%の乾燥麹及び α 化米、品温 12℃一定の小仕込み試験を実施した。必要に応じて、留添え時に終濃度 2mM または 4mM の硫安を添加した。

（3）生育に必要な成分の探索
SD 培地から単一栄養成分のみを欠乏させた種々の培地に、自社吟醸酵母 HL193 あるいは HL430 の前培養液をそれぞれ OD600 = 0.2 となるよう植え継いだ。その後 20℃で静置培養し、経時的に OD600 を測定した。

3．結果
（1）ノ
ノルバリン耐性株の選抜①精米歩合 70%小仕込み試験
HL295 とそのノルバリン耐性株を用いて精米歩合
70%の清酒小仕込み試験を実施し、イソブタノール及び酢酸イソブチル濃度が、それぞれ親株の 3.5 倍、2.8 倍に向上した HL430 を選抜した。
② 変異点解析
HL430 の Iah1 及び AHAS の調節サブユニットである
Ilv6 について DNA シーケンス解析を行い、K7 酵母と配列比較した。
その結果、Iah1 の活性部位近傍（G10R）と、Ilv6 の制御ドメイン近傍（V162V/M）にそれぞれ新規変異点を見出した。
（2）大吟醸小仕込み試験
対照区に当社吟醸酵母 HL193、試験区に HL430 を使用して、精米歩合 50%、12℃一定の清酒小仕込み試験を実施した。
HL193 よりも HL430 の発酵性は著しく悪く、イソブ
タノール及び酢酸イソブチル濃度も 3.（1）①と比べて低下した。
（3）生育に必要な成分の探索
単一成分欠乏培地における HL193 と HL430 の濁度推移を比較したところ、ほとんどの条件で顕著な差は見られなかったが、硫安欠乏培地では、HL193 と比べて
HL430 において生育阻害が見られた（図 1）。

（4）硫安添加大吟醸小仕込み試験
3.(2)と同様の大吟醸小仕込み試験に硫安を添加した。
HL430 の発酵性は、2mM 硫安添加時に HL193 と同等、4mM 硫安添加時に HL193 を上回り（図 2）、硫安無添加
条件と比較してイソブタノール及び酢酸イソブチル濃度も上昇した。

図 2. 硫安添加大吟醸小仕込み試験の炭酸ガス減量（AS：硫安）4．今後の展望
NCR システムの転写活性化因子である Gln3 の欠損株
では、イソブタノールによる生育阻害が回復し、イソブタノール耐性も向上することが報告されている 2)。
そこで HL430 gln3⊿ を作出し、イソブタノール生産性と窒素源カタボライト抑制（NCR）の関連性解析、イ
ソブタノール生産性の更なる向上に取り組みたいと考
えている。

参考文献
1) Natthaporn, T et al. : Metabolic engineering 46 ,60-67(2018)
2) Kuroda, K et al.: Cell Systems 9, 534-

547(2019)

図 1. 硫安欠乏培地での生育（AS：硫安）

２
33

第75
回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
7RSLFVRI
第of 2023

モデル化焼酎醸造系における発酵促進成分の探索江部 聡 ・丸岡 生行 ・髙下 秀春 ・星田 尚司 ・赤田 倫治 ＊

山口大学創成科学研究科， 三和酒類株式会社， 山口大学工学部
〒宇部市常盤台  山口大学創成科学研究科
7HO)D[(PDLOULQML#\DPDJXFKLXDFMS 焼酎は酵母によるエタノール発酵を利用して製造され て い る ． 焼 酎 製 造 に 用 い ら れ る 酵 母 6+ 株
6DFFKDURP\FHV FHUHYLVLDH  はエタノール発酵が強く，グルコースさえあればエタノールを生産できると考えてしまわれるが，グルコースのみの培地では十分な発酵はできない 図  ．一方で，酵母エキスなどの栄養源を与えれば酵母は増殖するので，増殖の栄養素と発酵にのみ必要な成分を見分けることができない．
そこで，本研究では酵母細胞が増殖しない高濃度の酵
母を初期から与えた条件で発酵量を増加させる成分の特定を行った．
グルコースで酵母菌体量を 2'  とした十分な発酵ができない培地にアミノ酸やビタミンなどを加えて発酵させ，発生した &2 量を測定することで，発酵促進成分を探索した．その結果，グルタミン酸ナト
リウム，または，アスパラギン酸ナトリウムを培地に添加するだけで発酵が促進された．
本研究により，グルタミン酸ナトリウムとアスパラ
ギン酸ナトリウムが発酵を増加させる効果を持つことが分かった．さらに，麹菌の役割を調べるため麹菌$VSHUJLOOXVRU\]DH を加えたところ，これらのアミノ34２酸非存在下でも著しい発酵増強効果を示したので，麹菌由来の発酵促進物質が存在することが示唆された．


図 グルコースのみの培地 〇  と酵母エキスを含む培地 ● での発酵 植菌量 2'  はじ め に 
焼酎製造では，酵母がグルコースを代謝してエタノールに変換する．酵母も，麹造りに必要な麹菌も揮発性成分を生産するが  ，発酵自体についての研究は進んでおらず，麹菌の発酵への影響や発酵促進成分につ
いては知られていない．そこで本研究では，発酵量を増加させる成分の同定を試みた．


それぞれ加えるよりも発酵量へ著しい効果をもたらす
ことが分かった．

結果 と 考察 
密閉容器を用いて グルコース溶液のみに酵母菌
体量を 2'  となるように植菌し，発生した &2 量を測定した．この条件では発酵しなかったが，酵母の栄養となる酵母エキスを加えると発酵した 図  ．しかし，酵母の増殖も観察された．そこで，植菌量を増やすことで増殖しない条件を探索した．様々な培地で発酵 実 験 を 行 っ た 結 果 ，  グ ル コ ー ス で 植 菌 量 を2'  とすると，グルコースだけでも増殖せず発酵する培地を得ることができたが，発酵量が不十分であった 図  ．そこで，この培地に様々な成分を加える
ことで発酵促進成分の探索を行った．アミノ酸をそれぞれ加えてみたところ，グルタミン酸ナトリウムまたはアスパラギン酸ナトリウムを加えた時のみ発酵量が増加した 図  ．グルタミン酸ナトリウムやアスパラ
ギン酸ナトリウムにより発酵量が増加したことから窒素源として働いていることを考え，硫酸アンモニウムを加えて発酵を行ったが，発酵量は増加しなかった図  ．したがって，グルタミン酸ナトリウムとアス
パラギン酸ナトリウムが酵母を増殖させない条件で発酵促進する成分であると考えられた．
焼酎製造でも酵母による発酵が行われている．発酵槽には原料の糖化に利用された麹菌が含まれているが麹菌の発酵に対する役割は知られていない．そこで，麹菌の発酵への影響を調べるため，麹菌を加え グ
ルコースで植菌量を 2'  として発酵を行うと，発酵量が増加した 図  ．この時の発酵量はアスパラギ
ン酸ナトリウムまたはグルタミン酸ナトリウムを加えた時よりも高かった 図  ．この結果から，麹菌はグ
ルタミン酸ナトリウムやアスパラギン酸ナトリウムを図 硫酸アンモニウム ● を グルコースに加えた時の発酵．グルコースのみ 〇  植菌量2'  
図 麹菌  またはグルタミン酸ナトリウム ● を加えた時の発酵．グルコースのみ 〇  グルコース濃度 ，植菌量 2'  今後 の 展望 
今後，発酵促進成分の作用機構を明らかにし，発酵と培地成分の関係性の理解を深めることで，麹菌と発酵の関係性についても明らかにしたい．
参考 文 献 図 グルタミン酸ナトリウム ×  またはアスパラ
ギン酸ナトリウム   を グルコースへ加えた時の発酵．グルコースのみ 〇  植菌量 2'  

 +)XNXGDHWDO-RXUQDORIWKH%UHZLQJ6RFLHW\
RI-DSDQ（）
 +6DNDLGDHWDO1LSSRQ6KRNXKLQ.DJDNX.DLVKL（）  < <RVKL]DNL HW DO -RXUQDO RI ,QVWLWXWH RI
%UHZLQJ（）

35
３

第
第 75
75 回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 2023
2023

カナバニンを用いたアルギニンデイミナーゼ破壊株の育種
脇中1

琢良 1＊・渡部

潤 1,2・茂木喜信 1

ヤマサ醤油株式会社，2 福島大学 農学群食農学類〒288-0056

千葉県銚子市新生町 2-10-1

Tel: 0479-22-0095

ヤマサ醤油株式会社

Fax: 0479-22-9865

E-mail: wakinaka@yamasa.com

Tetragenococcus halophilus は醤油醸造において乳酸発酵を担う乳酸菌であるが，自然界から分離される菌株の多くはアルギニンデイミナーゼ経路を有する．この経路の代謝物であるシトルリン
は，発がん性が指摘されるカルバミン酸エチルの前駆体となることから，醤油醸造用スターターとしてはこの経路を有しない菌株が好まれる．そのため，アルギニンデイミナーゼ破壊株の簡便な育種法が求められていた．本研究において，アルギニンのアナログであるカナバニンを用いた育種法を考案した．アルギニンデイミナーゼ活性を有する菌株がカナバニンの毒性を受けやすい理由は，アミノ酸を大量に消費する経路が存在することで菌体内のアナログ存在比が上昇するためと考えられ，このような経路の破壊は新奇なアミノ酸アナログ耐性機構である可能性があるは じめ に好塩性乳酸菌 Tetragenococcus halophilus は，醤油醸造において乳酸発酵を担う．T. halophilus はアルギニンを分解するアルギニンデイミナーゼ経路を有しており，この経路の代謝物は発がん性が指摘されるカ
ルバミン酸エチルの前駆体となるため，醤油醸造においてアルギニンが分解される反応は好まれない 1)．演
者らは以前に，トランスポゾンの転移を利用してアルギニンデイミナーゼ経路を不活化した変異株を育種できることを報告したが 2)，数千株を個別に培養して活性を確認し変異株を探すという，非常に手間のかかる方法であった．そのため，アルギニン非分解性株の効率的なスクリーニング法を検討することとした．

36

２

方法 と 結 果
カ ナ バ ニ ン を用 い た 育 種法

図 1.

変異株のトランスポゾン転移位置

アルギニンのアナログであるカナバニンを含む培地で T. halophilus NBRC 12172 株を培養したところ，アルギニン非分解性の変異株が優先的に生育することを見出した．その後，YA163 株，YA197 株においても同様の現象が観察された．このようにして取得した変異株
は，従来の方法で取得した変異株と同様に，アルギニ
ンデイミナーゼオペロンにトランスポゾンが転移していることが確認された（図 1）．
生 育 へ の カ ナバ ニ ン の 影響
NBRC 12172 株から取得した変異株と親株を，様々なアルギニン，カナバニン濃度の培地で培養し生育を比較した（図 2）．

図 3.

アルギニン，カナバニンの取り込み

考察
図 2.

培地組成の違いによる生育比較

親株，変異株ともアルギニン非存在下では生育しなかった．NBRC 12172 株のゲノム情報からも，アルギニンの生合成経路を有しないことが予想される．
アルギニンが十分量存在すれば，親株・変異株とも
カナバニンが存在しても生育し，カナバニンの影響は認められなかった．
アルギニンが微量存在する場合に，親株・変異株ともカナバニンによる生育阻害を受けたが，その影響は変異株に対するより親株に対する方が大きかった．
この生育阻害効果の違いによって，カナバニン存在
下ではアルギニンデイミナーゼ破壊株が優先的に生育したのだと考えられる．
カ ナ バ ニ ン 取り 込 み 量 の評価
NBRC 12172 株の親株と変異株の菌体を，アルギニンとカナバニンを含む食塩水に入れ，24 時間静置後に分析してアルギニンとカナバニンの取り込み量を評価した（図 3）．親株では食塩水中にアルギニンが検出できなくなるまでアルギニンを取り込んだ一方，変異株のアルギニン取り込みは確認できなかった．そして，カナバニンの取り込みは，親株でも変異株でも確認できなかった．
つまり，アルギニンデイミナーゼオペロンにコードされたアルギニン-オルニチン交換輸送体（ArcD）は，
アルギニンに対する選択的な取り込み能力を有していることが示された．

NBRC 12172 株はアルギニンの生合成経路を有しない．
アルギニンの取り込み経路として，ArcD があるが，ArcD を破壊してもアルギニンを取り込んで生育することから，ArcD とは別の経路も存在する．アルギニン
が十分量存在すればカナバニンが毒性を発揮しないことから，いずれの経路でも，カナバニンに対しアルギ
ニンが選択的に取り込まれる．しかし，アルギニンが微量だとカナバニンが毒性を発揮することから，いずれの経路でも，わずかながらカナバニンは取り込まれると考えられる．
カナバニンは，アルギニンの代わりにタンパク質合成に用いられることで，タンパク質が機能阻害を受けて毒性を発揮する．アルギニンデイミナーゼの有無にかかわらず，カナバニンは一定量菌体内に取り込まれるが，アルギニンデイミナーゼを有する菌株は，アルギニンを大量に消費することにより菌体内でカナバニンの存在比が高まり，カナバニンの毒性をより強く受けると推測された．
このように，アミノ酸を大量に消費する経路が破壊されることで，菌体内のアナログ存在比が低下してアナログ耐性が向上するという機構は，従来知られていなかった新奇なアナログ耐性機構である可能性がある．

文献1) Matsudo, T. et al.: J. Agric. Food Chem., 41,352-356 (1993).
2) Wakinaka, T. and Watanabe, J.: Appl. Environ.
Microbiol., 85, e00208-19 (2019).

37
３

第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023
第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023

酢酸低生産性醤油乳酸菌の醸造特性解析
樋口敬太 1＊・額川1

裕矢 2・脇中琢良１・渡部

潤 1，2・茂木喜信 1

ヤマサ醤油株式会社，2 福島大学 農学群食農学類〒288-0056

千葉県銚子市新生町 2-10-1

Tel: 0479-22-0095

ヤマサ醤油株式会社

Fax: 0479-22-9865

E-mail: higuchik@yamasa.com

醤油乳酸菌 Tetragenococcus halophilus は，醤油諸味において乳酸を産生することで醤油に爽
やかな酸味をもたらすと共に，諸味の pH を下げることで醤油酵母によるアルコール発酵に好適な環境を提供する役割を担っている．その一方，T. halophilus の生産する酢酸は，醤油酵母の主要な生育阻害物質であることも知られていた．最近，演者らのグループは T. halophilus の任意の遺伝子に変異が生じた株をスクリーニングする手法（TIMING 法）を開発した．本研究では，この手法を用いて酢酸低生産性変異株を取得し，変異株の発酵スターターとしての醤油醸造特性を親株と比較検討した．その結果，酢酸低生産性の T. halophilus を用いることで，エタノール濃度が高く，酸臭が穏やかな醤油を製造できることが明らかになった．

はじめに
醤油乳酸菌 Tetragenococcus halophilus は醤油醸造において，熟成初期の諸味中で増殖し，乳酸を生産することで醤油に爽やかな酸味をもたらす．また，乳酸発酵に伴って諸味の pH を下げることで，乳酸発酵に続く醤油酵母によるアルコール発酵に好適な環境を提供する役割も担っており，醤油の香味形成に欠かせない
重要な細菌である．T. halophilus は諸味中で乳酸と共に酢酸を生産し，酢酸の多くはクエン酸を代謝する際に生じることが報告されている 1)．この酢酸は酵母の主要な生育阻害物質であり，乳酸発酵が過剰に進んだ諸味ではしばしば酵母によるアルコール発酵は微弱となる．T. halophilus の生産する酢酸を低減するこ38２とができれば，醤油酵母によるアルコール発酵がより旺盛に進み，官能面で特徴的な醤油が製造できると考えられた．
これまで T. halophilus では実用的な形質転換系が確立されておらず，遺伝子機能解析が困難であった．
しかし最近，演者らが T. halophilus の任意遺伝子に内在性のインサーションシーケンス（IS）が挿入された変異株を効率的にスクリーニングする手法（TIMING法）を開発 2)したことにより，T. halophilus の逆遺伝学的解析が可能となった．
そこで本研究では，TIMING 法を用いて T. halophilusのクエン酸代謝酵素をコードするシトレートオペロンに変異が生じた株を取得し，酢酸生産量の解析と，発酵スターターとして用いた際の醤油醸造特性を親株と比較検討することとした．

方法 と 結 果
T I MI NG 法 に よ る シ ト レ ー ト オ ペ ロ ン 変 異 株 の 取 得
TIMING 法では，変異株ライブラリーの中から任意の遺伝子に IS が挿入された変異株を，遺伝子型を指標に単離する．T. halophilus NBRC 12172 株の変異株ライ
ブラリーに対して PCR による選別を行った結果，クエン酸代謝に必要な citC 遺伝子に IS が挿入した変異株が得られた（図 1）．

図 1.

シトレートオペロン変異株の IS 挿入位置

図 3. 香り（A）と味（B）の官能評価結果*：p < 0.05
香りについて，Sour（酸臭）の項目で試験品の強度が弱いという結果が得られた（図 3A）．味についても,
Sourness（酸味）の項目で試験品の強度が弱い傾向がみられた（図 3B）．

考察 と 総 括得られた citC 変異株と親株をクエン酸を含む培地で培養し，クエン酸濃度と酢酸濃度を測定した結果，
citC 変異株はクエン酸資化能を失い，酢酸生産量が低下していることが確認された．
酢 酸 低 生 産 性株 の 醤 油 醸造特 性 の 評 価
citC 変異株（＝酢酸低生産性変異株）と親株を発酵
スターターとして醤油の試醸を実施した．乳酸菌は仕込みと同時に添加し，4 ヶ月間熟成後，諸味をろ紙でろ過して清澄な生醤油を得た．以下 citC 変異株を接種した醤油を試験品，親株を接種した醤油を対照品と表記する．pH，全窒素濃度，食塩濃度については試験品と対照品の間に差はなかった．酢酸濃度は試験品の方が約 40%低く，酢酸/乳酸比についても対照品よりも小さかった（図 2A）．試験品ではクエン酸の残存も確認された．エタノール濃度は試験品の方が高く，対照品と比較して約 80%増加していた（図 2B）．

本研究では T. halophilus の酢酸生産に着目し，TIMING 法で取得した酢酸低生産性の変異株を発酵ス
ターターとした際の醤油醸造特性を親株と比較検討した．醤油諸味を酢酸低生産性変異株で発酵させること
で醤油中の酢酸が減少し，エタノールが増加することが示された．また官能的にも酸臭が低減していることが確認された．以上の結果から，酢酸低生産性醤油乳
酸菌を醤油醸造に用いることでエタノール濃度が高く，酸臭が穏やかな醤油を製造できることが実証された．
醤油醸造では醤油中のエタノールが不足した場合，防黴のために製品に醸造アルコールを添加する必要が生じる場合がある．そのため諸味でエタノールを多く作ることができるということはコスト面で産業上のメリットとなる．醤油乳酸菌のクエン酸資化能を欠損させることで酢酸生産量は低下したものの，酢酸を全く生産しなくなるわけではない．これは解糖系由来のピルビン酸からも酢酸が生成されるためと考えられる．ピ
ルビン酸からの酢酸生成経路も欠損させることができれば，更に酢酸生産量が低減し，一層醤油中のエタノール量を増加させられる可能性がある．TIMING 法は T.
halophilus の内在性の IS を利用するため，遺伝子組換えには該当しない．本研究で，TIMING 法が産業上有
効な醤油乳酸菌の育種ツールであることが示された．

文
図 2. 試験品と対照品の成分値比較（A）各種有機酸濃度，（B）エタノール濃度
得られた生醤油の官能評価によって香りと味を評価した．

献1) Kanbe, C., and Uchida, K.: Appl. Environ.

Microbiol., 53, 1257-62 (1987).
2) Nukagawa, Y., Wakinaka, T., Mogi, Y., and
Watanabe, J.: Appl. Environ. Microbiol., 89,e02005-22 (2023).

３
39

第75
75回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 20232023
第清酒中に含まれるプリン代謝産物の定量
浅井〒612-8385

良樹＊・根來

宏明・石田

月桂冠株式会社

総合研究所

京都市伏見区下鳥羽小柳町 101
Tel: 075-623-2130

博樹

月桂冠株式会社

総合研究所

Fax: 075-623-2132

E-mail: yo_asai@gekkeikan.co.jp

アデニン化合物

キサンチン化合物
ヒポキサンチン化合物

グアニン化合物
ＧＴＰ

ＡＴＰ
ヌクレオチド

ＧＤＰ

ＡＤＰ
アデニル酸

イノシン酸

NH2

OH

イノシン

塩基

O

HN

N
H

N

アデニン

N

HN

N

N
H

OH
O

H2N

N

N

キサントシン

OH OH

グアノシン

O

N

HN

N
H

O

ヒポキサンチン

O
N

N

HN
N
H

OH
O

OH OH

O

N
N

OH
O

OH OH

NH2
N

O
N

HN

N

N

O
OH OH

アデノシン

グアニル酸

O

N

HN

N

N

ヌクレオシドO
N

N

キサンチル酸

N
H

キサンチン

H2N

N

N
H

グアニン

代表的なプリン体化合物

要旨
清酒中にはプリンを部分構造として持つ複数種類の代謝産物（以下、総称してプリン体）が含まれる。清酒醸造におけるプリン体の動態は、過去にいくつかの報告があるものの詳細は不明であった。我々は清酒中のプリン体の組成とその生成機構について解析を進めている。本研究では、清酒中に含まれるプリン代謝産物の組成について詳細な解析を試みた。その結果、清酒中には様々な種類のプリン体化合物が含まれており、ビール中の組成とは大きく異なることが分かった。各種プリン体化合物は発酵が進むにつれていずれも増加
する傾向にあり、酵母や麹菌の酵素による代謝の影響を受けていると考えられた。

1. はじ め に
過去の報告 1)では清酒中のプリン体を塩基まで加水分解して定量しているが、実際にはプリン塩基そのものやヌクレオシド、ヌクレオチドなどの多様な化合物として存在している。そこで各種プリン体化合物を個別に定量する方法を検討し、清酒中とビール中との組

40
２

清酒とビールにおけるプリン体組成の比較

成と比較することで清酒の特性を明らかにした。また
同定できなかった清酒中のプリン体化合物はメタボローム解析による評価を試みた。さらにプリン体の起源を解析するため、醪におけるプリン体組成の推移を調べた。

2. 材料 と 方 法
アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチンの各塩基を部分構造として含むプリン体を測定対象とした。プリン体を塩基ごとの総量として定量する際には、試料に過塩素酸を添加して加熱することで塩基まで分解させ、LCMSMS により測定した。また化合物を個別に定量する際には、試料を適当に希釈したものを直接 LCMSMS で測定した。このとき「塩基ごとの総量」と「個別に定量した総量」の差を、「未同定のプリン体化合物」とした(図 1)。
メタボローム解析はヒューマン・メタボローム・テ
クノロジーズ社の Basic Scan を用いて、水溶性・イオ
ン性代謝物質を測定した。試料には限外ろ過チューブ（5 kDa）により遠心ろ過したものを用いた。
清酒醸造は麹歩合 20%、汲水歩合 160%として仕込みを行った。温度は 15℃とし、15 日間発酵させた。

3 - 3. 醪 に お け る プ リ ン 体 推 移
清酒中に含まれるプリン体の起源を解析するため、
醪におけるプリン体組成の推移を調べた。その結果、各種プリン体化合物は発酵が進むにつれて増加していたものの、増加の程度は化合物によって若干異なって
おり、酵母や麹菌の酵素による代謝の影響を受けていると考えられた。

図 1. プリン体化合物の定量法

3. 結果 と 考 察
3 - 1. プ リ ン 体 化 合 物 の 個 別 定 量
LCMSMS を用いたプリン体の測定条件を検討し、プリン体ヌクレオチド、ヌクレオシド、プリン塩基等について、絶対検量線法により個別に定量できることを確認した。これを用いて清酒中に含まれるプリン体を測定したところ、キサンチンやヒポキサンチンなどのプ
リン塩基と、アデニン骨格を含む化合物（以下、アデニン化合物）やグアニン骨格を含む化合物（以下、グアニン化合物）から主に構成されることが分かった。
これらアデニン化合物やグアニン化合物には、個別に測定対象とした化合物だけでなく、未同定の化合物が含まれていた。またビール中においてはアデノシンやグアノシンが多い一方でプリン塩基そのものはほとん
ど含まれておらず、清酒中における組成とは大きく異なっていた（表 1）。

表 1. 清酒とビールにおけるプリン体組成の比較
清酒

アデニン化合物

グアニン化合物

ヒポキサンチン化合物

キサンチン化合物

アデニン
アデノシン
2'-デオキシアデノシン
アデニル酸
未同定アデニン化合物
グアニン
グアノシン
2'-デオキシグアノシン
グアニル酸
未同定グアニン化合物
ヒポキサンチン
イノシン
イノシン酸
未同定ヒポキサンチン化合物
キサンチン
キサントシン
未同定キサンチン化合物

未同定アデニン化合物の一部は S-アデノシルメチオ
ニンであることが示唆された。またその他にも複数のプリン体化合物が検出されたものの、いずれも微量で未同定化合物の全てを説明することはできなかった。
清酒中には本解析では測定対象外の化合物も含まれていると推定された。

4. 緒言 と 今 後の 展 望
清酒中にはキサンチンやヒポキサンチンなどのプリン塩基、S-アデノシルメチオニン、その他未同定のアデニン化合物やグアニン化合物が多く含まれており、ビール中とは異なるユニークな組成を示した。またこ
れら化合物は、酵母や麹菌の酵素により発酵中に代謝されていると考えられた。
今回得られた知見は、プリン体測定による清酒の品
質の評価や、清酒に含まれるプリン体含有量の制御などへの応用が期待される。

参考 文 献1) Kaneko, K. et al.: Biomed. Chromatogr., 23, 858864 (2009)

ビール
1
32
0
0
35
18
0
0
0
61
67
0
0
18
103
1
40

2
67
48
10
17
4
418
29
2
0
3
41
0
0
39
11
2
（μM）

3 - 2. 未 同 定 化 合 物 の 評 価
LCMSMS では同定できなかったプリン体化合物を評価するため、メタボローム解析を試みた。その結果、

41
３

第75
75回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 20232023
第清酒中に含まれるプリン代謝産物の由来と生成経路の解明
根來〒612-8385

宏明＊・浅井良樹・石田

月桂冠株式会社

総合研究所

京都市伏見区下鳥羽小柳町 101
Tel: 075-623-2130

博樹

月桂冠株式会社

総合研究所

Fax: 075-623-2132

E-mail: negoro@gekkeikan.co.jp

蒸米
アデニン化合物

グアニン化合物
溶出

米こうじ

アデニン化合物

麹酵素

変
換

酵母

変 麹酵素
換

取込
ヒポキサンチン

ヒポキサンチン

発酵初期

米こうじ
溶
出
グアニン化合物
キサンチン

発酵中期～後半

清酒醸造におけるプリン体生成機構の概要
プレスや専門家外の方々が酵母細胞に含まれるプリン体化合物の組成を測定した。
研究の概要を把握できるような
要旨
2:プリン体を基質として米こうじ粗酵素が触媒する反Graphical Abstract を 1 枚，原稿の最初にご作成ください．
応を調べた。3:発酵工程における各プリン体化合物の清酒中にはプリンを部分構造として持つ複数種類の（縦横比・サイズの微調整は原稿量に合わせてご調整ください）
消長を評価した。
代謝産物（以下、総称してプリン体）が含まれる。清酒醸造におけるプリン体の動態は、過去にいくつかの報告があるものの詳細は不明であった 1)。我々は清酒
2. 材料 と 方法
中のプリン体を化合物ごとに定量しその組成を明らかにした 2)。本研究では原料からの供給と微生物によるプリン体の定量は前報告に従って行った 2)。すなわ
代謝に焦点を当てて生成機構に関する検証を行った。
ち、塩基ごとの総量として定量する際には、過塩素酸
その結果、発酵前半では原料から溶出したプリン体を存在下で熱分解することで生成した塩基を LCMSMS に酵母が取り込み、発酵後半では酵母からプリン体が再より測定した（例えば、アデニン構造を含む化合物を溶出すると同時に麹菌の酵素により変換されていると全てアデニンまで分解した）。化合物を個別に定量する推察した。
際には、試料を直接 LCMSMS で測定した。
原料からのプリン体抽出液は、粉砕した米および米
こうじに水あるいは 10%過塩素酸を加え、4℃、24 時間
静置して得た 3)。酵母細胞は、遠心で得られた酒粕か
1. はじ め にら酵母の層を回収することで得た。米こうじの粗酵素
清酒中には様々な種類のプリン体化合物が含まれ液は、国税庁所定分析法に従って米こうじから酢酸バており、その組成はビールとは異なっていたこと、さッファーにより抽出した後、PD-10 ゲル濾過カラムでらに発酵中に組成が変化したことから、清酒中のプリ精製して調製した。
ン体化合物は清酒に特有の原料や発酵工程に応じて生清酒醸造は麹歩合 20%、汲水歩合 160%として仕込み成したものであると推察した。そこで清酒中のプリンを行った。温度 15℃とし、15 日間発酵させた。
体がどのように生成するのか全体像を把握するため、次の 3 点について検証した。1:白米と米こうじおよび

42

２

3. 結果 と 考察

3 - 2. 米 こ う じ の 酵 素 に よ る 変 換
麹酵素がプリン体の変換能を持つと推察されたため、各種標準液に粗酵素液を作用させて変化を調べた。その結果、アデノシンおよびイノシンはヒポキサンチンへ変換され、グアノシンはグアニンへ変換された。これより、米こうじの粗酵素液にはプリンヌクレオシド
ホスホリラーゼとアデノシンデアミナーゼが含まれていると考えられた。さらに、清酒に粗酵素液を作用さえると、ヒポキサンチンが増加したが他の測定対象とするプリン体の変化が見られなかったことから、未同
定アデニン化合物からの変換が示唆された（図 1）。

アデニン化合物

グアニン化合物

ヒポキサンチン化合物

キサンチン化合物

12

米麹の
持ち込み

10
8

μM

3 - 1. 原 料 に 含 ま れ る プ リ ン 体
白米を水に浸漬してもプリン体はほとんど検出されず、10%過塩素酸では抽出された。多くは測定対象としていない、アデニン骨格を含む化合物（以下、アデニン化合物）とグアニン骨格を含む化合物（以下、グアニン化合物）であった。米こうじのプリン体は水で抽出され、主にグアニン化合物やヒポキサンチンで構成
されていた。しかし、米こうじに直接熱過塩素酸を加えて処理した場合とは組成が異なっていたことから、水抽出中に麹酵素による変換を受けていると推察した。
酒粕中の酵母細胞は主に未同定アデニン化合物と未同
定グアニン化合物を含んでおり、ＹＰＤ培養の細胞でも同様の組成を示した。

酵母の
取り込み

米麹から
溶出
麹酵素に
よる変換

6

酵母から
溶出

4
2
0
0

4

8

12

16

発酵日数

図 2. 清酒醸造中のプリン体推移

4. 結言 と 今後 の 展 望
清酒もろみの液相に含まれるプリン体は、原料からの溶出、酵母の取り込みと排出、酵素による反応が複雑に絡み合って生成していると考えられた。発酵初期に米こうじあるいは蒸米からアデニン化合物、グアニ
ン化合物あるいはキサンチンが供給され、酵母は発酵
初期にこれらの一部のプリン体を取り込んで代謝するが発酵後半では生存率の低下とともに溶出し、溶出したプリン体は麹菌の酵素によりヒポキサンチンやグアニンへ変換される、という生成機構を推察した。
今回得られた知見は、例えばプリン体を低減した清酒や、旨味成分である核酸を増強した清酒の製造への応用が期待される。

参考 文 献1) Kaneko, K. et al.: Biomed. Chromatogr., 23, 858864 (2009)2) 浅井良樹ら: 第 75 回日本生物工学会大会（2023）
3) 毛利威徳, 橋田度: 東洋食品工業短大･東洋食品研
究所 研究報告書, 266-280 (1967)

図 1.

米こうじ粗酵素による推定反応

3 - 3. 発 酵 中 の プ リ ン 体 推 移
清酒もろみ中のプリン体を経時的に測定した。液相中の多くのプリン体化合物は、発酵開始直後と比較して数日後に減少していたことから、米こうじから溶出したプリン体を酵母が取り込んだと推察した。発酵後
半では、いずれのプリン体も増加傾向にあった。この
うちヒポキサンチンとアデニン化合物の増加は酵母の活性を示すメチレンブルー染色率と相関があり、酵母からの溶出が要因であると考えられた。また、麹酵素の活性が高いほどこれらの増加量が大きい傾向にあり、麹酵素による変換も関与していた。キサンチンの増加
は米こうじからの溶出であると推定した（図 2）。

３43

第 75 回日本生物工学会大会

44

Topics of 2023

60
50
40
30
20
10
0

62.5%

65%

67.5%

70%

72.5%

60
A Koji amazake(saccharification at 60 for 1 h)
B Salt koji
C Miso-like seasoning
D Miso-like seasoning (tamari)
E Sweet miso
F Rice-koji miso
G Sake lees
H Soy milk

50
40
30
20
10
0

A

B

C

D

E

F

G

H

45

第75
75回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 20232023
第大豆タンパク質由来二次胆汁酸ミセル崩壊ペプチドの同定
翔太 1・平野清水1

啓太 2・齋藤努 2・秋山裕和 1・清水一憲 1・本多裕之 1＊

名古屋大学工学研究科，2 不二製油グループ本社株式会社 未来創造研究所〒464-8603

名古屋市千種区不老町

名古屋大学工学研究科

Tel: 052-789-3215

生命分子工学専攻

Fax: 052-789-3214

E-mail: honda@chembio.nagoya-u.ac.jp

コレステロールの異化・代謝産物であるデオキシコール酸（DCA）の増加は、大腸がんのリスクファクターと言われており、DCA 排出を促す機能性食品の開発が期待される。本研究では、大豆タンパク質由来のペプチドの網羅的分析に基づき、DCA 排出効果が期待できる 10 種のペプチド同定に成功した。大豆タンパク質由来のペプチドを利用した機能性食品開発に繋がる可能性があ
る。

1. 緒言
生体内では、高脂肪食を摂取した場合に、肝臓では主にコレステロールの生合成や一次胆汁酸への異化が促進し、胆汁として分泌された腸管において腸内細菌叢によって一部が二次胆汁酸へと代謝される。腸管で二次胆汁酸が増加することで、大腸粘膜の損傷や炎症、
酸化ストレスを介した DNA 損傷などの影響から大腸がんが誘発されると考えられている 1)。このため二次胆汁酸は大腸がんのリスクファクターであり、体内からの排出が必要である。
胆汁酸は、通常、腸内において、コレステロールを含む脂質分子を内包したミセルの状態で存在しており、脂質と共に毛細血管から吸収される。生理活性ペプチドの一つである胆汁酸結合ペプチドは、胆汁酸と結合
するとミセルの形成阻害やミセル崩壊が起こり、腸管吸収を抑えてそのまま体外へ排泄されると考えられている。本研究室では、ペプチドアレイを用いた一次胆汁酸結合ペプチドの探索に成功している 2)。また、Park
らは、大豆のペプシン加水分解物が DCA に対して結合活性を示すことを報告した 3)。
これらのことから本研究では、大豆タンパク質配列に基づく網羅的分析を行い、二次胆汁酸ミセル崩壊ペプチドの同定を試みた。

2. 方法( 1 ) DC A 結 合 ア ッ セ イ
8 種の大豆タンパク質配列について、3 残基ずらしの 6 残基配列を選択し、計 1391 配列のペプチドライ

46

２

ブラリーを作製した。Fmoc 固相合成法で、この配列のペプチドアレイを合成した。
作製したペプチドアレイに対して、DCA、一次抗体、蛍光標識二次抗体の順に結合させ、蛍光測定を行った。
一次抗体無しで実験したデータと蛍光値を差し引きした値を DCA 結合強度 I として用いた。
( 2 ) 胆汁酸 ミ セ ル 崩壊 試 験
コレステロール、フォスファチジルコリン、オレイ
ン酸、モノオレインで構成されるコレステロール溶液と DCA、PBS (リン酸緩衝生理食塩水) を合わせて超音波処理し、コレステロール包含胆汁酸ミセル溶液を作製した。少量の胆汁酸を溶解させた PBS を用いてペプチドを終濃度 6 mg/ml で溶解させた。胆汁酸ミセル溶
液とペプチド溶液を 1:1 で混合し、37 ℃、140 rpm で
2 時間インキュベートした後、遠心して得られる上清のコレステロール量を、コレステロールキットを用いて吸光度測定した。
( 3 ) 大 豆 ペ プ シ ン 加 水 分 解 物 ( S PH ) の 作 製
ペプシンを用いて pH 2.0 で大豆タンパク質を 5 時
間加水分解処理し、凍結乾燥することで大豆ペプシン
加水分解物 (SPH) を得た。

3. 結果 お よび 考 察( 1 ) DC A 高 結 合 配 列 の ス ク リ ー ニ ン グ
8 種の大豆タンパク質配列から作製した 1391 配列のペプチドライブラリーに対する DCA 結合アッセイを行

DCA binding intensity [×106 -]̅ 標準偏差𝜎𝜎を使った。全配列の DCA 結合強度平均値𝐼𝐼 と̅
って、𝐼𝐼 + 2𝜎𝜎 以上の結合活性を示した 42 配列を高結合配列として選択した。図 1 に 8 種のうちの 1 つの大豆タンパク質である 11S_A1aB1b (P04776) の DCA 結合
アッセイの結果を示す。

胆汁酸の違いによって活性が変化することに着目して、配列機能解析を試み、DCA 結合とミセル崩壊活性の特徴を見出す。さらに、SPH の分離濃縮法を検討することにより、DCA 高結合ペプチドの選択的濃縮を試みる
予定である。

6

4

2

0

-2
0

20

図 1.

40 60 80 100 120 140 160
Peptide Fragment No.

11S_A1aB1b の DCA 結合アッセイ●は DCA 高結合配列を示す
図 2.

( 2 ) 胆汁酸 ミ セ ル 崩壊 試 験 に よる 検 証
DCA 高結合配列の 42 配列を実際に固相合成し、DCA
ミセル崩壊試験で活性を評価した。各ペプチドは DCA
だけでなくコール酸 (CA)、タウロデオキシコール酸(TDCA)、タウロコール酸 (TCA) についても同様に調べた。結果をカラーバーとして図 2 に示す。41 配列は50％以上の活性が得られた。また、結果をクラスタリ
ング解析したところ、5 つのクラスターに分類できた。
( 3 ) DC A 高 結 合 断 片 を 含 む S P H 配 列 の 検 証
SPH を作製し、LC-MS/MS による解析を行ったところ、1354 ペプチドが同定された。この中で、DCA 高結合な
42 配列が含まれる最小残基のペプチド 10 配列をピックアップし、胆汁酸ミセル崩壊試験を行った (図 3)。
どの配列も 50％以上の崩壊活性を示しており、元配列から活性が保持されていることがわかった。このことから、SPH 配列から DCA 排出効果が期待できる 10 種のペプチド配列同定に成功したと判断した。

4. 今後 の 展望
SPH の LC-MS/MS 解析では、今回合成した 10 配列の残基伸長配列も確認された。このため、残基伸長によってどこまで活性が保持されるのか検討する。また、

DCA 高結合配列の胆汁酸ミセル崩壊試験とクラスタリング解析

図 3.

SPH 配列の DCA ミセル崩壊活性

参考 文 献1) Li L., et al., Food and Function, Vol. 9, 55885597, 20182) Ito M, et al., J Biosci Bioeng., Vol. 127 (3),366-371,2019.
3) V. V. Pak, et al., Chemistry of Natural
Compounds, Vol. 41 (6), 710-714, 2005

47
３

第75
75回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 20232023
第L-アンセリンは初代ヒト骨格筋細胞の筋分化および筋収縮力を向上させる
永井 研迅 1,2・井田 正幸 1・出雲 貴幸 1・中井 正晃 1・本多 裕之 2・清水 一憲 2＊
1

サントリーウエルネス株式会社 生命科学研究所，2 名古屋大学大学院 工学研究科〒464-8603

愛知県名古屋市千種区不老町

Tel: 052-789-3213

Fax: 052-789-3214

E-mail: shimizu@chembio.nagoya-u.ac.jp

超高齢社会である日本では、サルコペニアや廃用性筋萎縮に伴う筋力低下が問題になっている。こうした背景から筋力低下を予防する食品成分が求められている。我々は、回遊魚や鳥類に多く含まれており、様々な食品から摂取されている成分かつ、多様な生理活性が報告されている L-アンセリンに着目した。本研究では、L-アンセリンがヒト由来
骨格筋細胞の筋分化を促進し、筋収縮力を増大させることを 2 次元培養および独自デバイスを用いた 3 次元培養で明らかにした。

1. はじめに
超高齢社会に伴い、健康寿命延伸や生活の質（QOL）の向上が課題となっている。健康寿命や QOL 低下の要因として、認知症と並び運動器の老化が挙げられる。
加齢とともに筋力や筋量が低下し、その結果として持久力や歩行速度の低下など、運動機能障害により要介
護や要支援のリスクが高まると考えられている 1)。こうした背景から、筋力低下を予防、あるいは筋力を増強させる食品成分が求められている。
L-アンセリン（β-アラニル-1-メチル-l-ヒスチジン）
は、カルノシンやバレニンと同じイミダゾールペプチ
ドで、1929 年にガチョウから初めて同定された。L-ア
ンセリンは回遊魚や鳥類に多く含まれており、様々な食品から摂取されている成分である 2)。L-アンセリン
は認知機能改善、血糖値調節、血清尿酸値低下作用など様々な生理活性が報告されており、ヒトの健康に寄与する成分であると考えられている。特に骨格筋においては、L-アンセリンが運動誘発性筋損傷を改善する
ことが報告されており、また、イミダゾールペプチド

48

２を含む鶏肉エキスが脚の筋力を増強することが報告されている。一方で L-アンセリンの筋分化や筋収縮力に対する作用は報告されていないため、これらを検討することを目的とした。

2. 方法と結果
2-1 平面培養における筋短径および遺伝子発現の検討
初代ヒト骨格筋筋芽細胞を平面培養で播種後、分化誘導を行った。分化誘導 4 日目に L-アンセリン（0, 0.1,
1 μM）を添加し、96 時間培養した。その後、Myosin
Heavy Chain（MF-20）の免疫染色を行い、筋短径を測定した。また、培養後に total RNA を回収し、qPCR にて筋分化マーカーの遺伝子発現を測定した。
1 μM の L-アンセリン添加により、control 群と比較して有意に筋短径の肥大が見られた（図 1）。さらに、
Myogenin および Myh1, Myh2, Myh7 mRNA の発現が有意に増加した。

加作用が消失した。一方で、H2R および H3R antagonist
は L-アンセリンの効果に影響を与えなかった（図 3）。

図 1 L-アンセリンの筋短径への影響
Mean ± SD (n = 6). Dunnett’s test, *p < 0.05
2-2 三次元培養における形態および筋張力の検討
ヒト培養筋組織を作製し、独自のマイクロデバイス
上で三次元培養を行った。分化誘導 4 日目に L-アンセ
リンおよびその構成アミノ酸である β-アラニンまたは1-メチルヒスチジンを添加し、96 時間後に筋収縮力を測定した。その結果、1 μM の L-アンセリン添加により、筋収縮力が有意に増加した。一方で、β-アラニン
または 1-メチルヒスチジンおよびこれらの混合物は筋収縮力に影響が見られなかった。また、α-Actinin の免
疫染色を行った結果、サルコメア構造を有する筋線維の割合が増加した（図 2）。

図 3 H1R antagonist による筋収縮力への影響
Mean ± SD (n = 3-4). Dunnett’s test, *p < 0.05

3. 考察と結論
1 μM の L-アンセリン添加により筋短径が有意に増加し、Myogenin および Myosin heavy chain の遺伝子発現が増加したことから、L-アンセリンは筋分化を促進することが示唆された。三次元培養における筋収縮力評価の結果、L-アンセリン添加により有意に筋収縮力が増加した。一方で、構成アミノ酸は効果が見られなかったため、ジペプチド構造が重要であることが示唆された。L-アンセリンの筋収縮力の増加作用は、H1R
antagonist 共添加によって消失したため、この効果は
H1R を介すことが示唆された。L-アンセリンは HR を介して血圧を調整すること 3)や、C2C12 は HR が発現していること 4)、ヒスタミンは mdx マウスにおいて筋力を改善させること 5)から、L-アンセリンの筋張力亢
進作用は H1R を介したメカニズムが考えられる。
本検討により L-アンセリンは筋分化を促進し、筋収縮力を増加させる可能性が示された。また、独自のマ
イクロデバイスはサルコペニアを予防する食品成分評価に応用できる可能性が示された 6)。

4. 文献
図 2 ヒト培養筋組織における L-アンセリンの効果(A) ヒト培養筋組織、(B) 筋収縮力への影響 Mean ±SD (n = 4-5). Dunnett’s test, *p < 0.05、(C) サルコメア
構造への影響 Mean ± SD (n = 8). unpaired Student’s ttest, *p < 0.05
2-3 ヒスタミン受容体 antagonist を用いた検討
三次元培養において、分化誘導 4 日目に L-アンセリ
ンおよびヒスタミン受容体（HR） antagonist を共添加
し、96 時間後に筋収縮力を評価した。その結果、H1R
antagonist との共添加により L-アンセリンの筋張力増

1) Kitamura, A et al., J. Cachexia Sarcopenia Muscle., 12,
30– 38(2021)
2) Boldyrev, A. A et al., Physiol. Rev., 93, 1803– 1845
(2013)
3) Tanida, M et al., Physiol. Res., 59, 177– 185 (2010)
4) Chen, Y et al., Mol. Med. Rep., 11, 2624– 2630 (2015)
5) Gurel, V et al., Dose Response, 13, 155932581561635(2015)
6) Nagai, A et al., J. Agric. Food Chem., 71, 23, 8952–
8958 (2023)

49
３

第75
75回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 20232023
第驚異的な油脂分解能力をもつ微生物による超効率的な食用油含有排水処理法の確立と社会実装
小原1

優季 1・蟹江純一 1・堀克敏 1,2＊

株式会社フレンドマイクローブ，2 名古屋大学工学研究科〒464-8603

名古屋市千種区不老町

名古屋大学大学院工学研究科

Tel: 052-789-3339

工学部 1 号館 710 号室

Fax:052-789-3218

E-mail:khor@chembio.nagoya-u.ac.jp

要旨

背景

高濃度動植物油脂含有排水は、油を物理的に分離することで処理されてきた。しかし、悪臭や害虫の発生、産廃処理コストなどが大きな課題であった。名古屋大学の堀が開発した超高活性油脂分解微生物によるバイオ処理法は、全ての動植物油脂に適応可能で、従来品の 10 倍以上の分解速度を発揮し、高濃度油脂にも対応でき、上述の課題を解決する。当該水処理システム
は「Mibiocon（マイビオコン）」として名古屋大学発ベンチャー（株）フレンドマイクローブから販売されており、大手食品工場にも導入され始めた。今後、本システムは既存技術を刷新する油脂含有排水処理技術となっていくだろう。本年 5 月には事業会社と投資会
社から 2 億 3 千万円の資金調達に成功し、産業界から、廃棄物削減による SDGs 推進への期待が寄せられる。

食品工場や外食産業施設からは、日々、動植物油脂を多量に含んだ排水が排出されており、下水管の詰まりや河川の汚染を引き起こすため、排水基準がノルマル
ヘキサン抽出物質(n-Hex)値として定められている。
油脂含有排水の一般的な処理法は、グリーストラップ
や加圧浮上装置を用いた物理的分離除去である。しかし、蓄積した油による悪臭や害虫の発生、分離油の産廃処理コストなどの問題があった。また、水中に含まれる油をバイオディーゼルに変換することも、現状では困難である。よって、現場で排水中から油そのものを消滅させてしまうような技術が切望されてきた。オ
ゾン分解や微生物分解が検討されてきたが、前者は安全性の問題が、後者は微生物の能力上の問題があり、従来の物理的除去を代替するには至っていない。

50２

技術の 詳細
名古屋大学の堀によって単離された 2 種の微生物、
Burkholderia arbolis KH-1 と Yarrowia lypolitica KH-2 は、あらゆる動植物油脂を高速に分解して資化する 1)。この２種の微生物を含む製剤の特徴は以下の通りである。
① 圧倒 的に 速い 分解 速度
図 1 は、本微生物製剤と市場に出回っている油脂分解
微生物製剤の実廃水中の分解速度を比較したものである。我々の微生物製剤による分解速度は圧倒的に早く
他より 10 倍以上の速度で分解した。一般的な工場排水では、24 時間以内に分解できないと、排水の滞留
時間内に処理することができないため、適用は難しい。
なお、本微生物製剤はこの数 10 倍以上高い濃度の油
脂も、24 時間以内に分解可能である。

図 2 . 様 々な 工場 排水 に含 まれ る油 脂も 本微 生物製 剤 で 2 4 時間 以内 に分 解可 能.

社会実 装の 現状

図 1 . 実工 場 排水 中の 油脂 の分 解能 力比 較.
② 高濃 度油 脂の 分解 が可 能
本微生物製剤は、30 g/L の油脂まで分解可能である。
食品工場排水の多くは、n-Hex として数 100～数 1000
mg/L の範囲内にあるので、本微生物製剤は十分に適用可能である。これまでの微生物は、せいぜい数 100
mg/L 程度の濃度が限界であるものがほとんどある。
本微生物製剤は、排水のみならず、はるかに油分濃度が高い油性汚泥の処理にも適用可能である。
③ すべ ての 動植 物油 脂を 分解 可能
KH-1 株と KH-2 株は、マーガリンやショートニングなどに多く含まれるトランス脂肪酸を分解できることが認められた唯一の微生物である 2)。そのため、様々なタイプの食品工場排水に適用可能である（図 2）。
④ 強力 な油 脂分 解酵 素リ パー ゼの 分泌これらの高い油脂分解活性はリパーゼの能力と微生物の脂肪酸分解能力に由来する。KH-1 が分泌する新規リパーゼについて着目し、機能解析を行ったところ、トランス脂肪酸含有油脂を含む様々な油脂に対する高い加水分解活性が認められた 3)。

本微生物製剤を用いた油脂含有排水処理システムは、「Mibiocon® (マイビオコン)」として、名古屋大学発ベンチャー（株）フレンドマイクローブから販売されている。同システムは既に大手食品会社の工場へも導入されており、悪臭の低減や処理水の発泡低減等の有効性が確認されている。その実力が認められ、水処理エンジニアリング複数社との業務提携を締結した他、本年 5 月にはハウス食品グループ、豊田合成、住友商事と投資会社ジェネシア・ベンチャーズから、総額 2億 3000 万円の資金調達を行った。今後、本システム
は既存の油水分離処理システムに成り代わる新たなス
タンダード技術となっていくだろう。

今後の 展望上述の新規リパーゼにより、油脂含有水にメタノールを添加することで、効率的にバイオディーゼルとなる
メチルエステルに変換できることもわかった 3)。将来は排水からバイオ燃料を得られるようになるかもしれない。また、動植物油脂よりも廃棄量の多い鉱物油・機械油の分解技術の開発にも着手しており、将来は、全ての油に対応できる処理技術を提供していく計画だ。

文献
1) Matsuoka, H.,Miura, A., Hori, K.: J. Biosci.
Bioeng., 107, 401-408 (2009)2) 特願 2020-158725
3) 特許第 7084656 号

51
３

第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023
第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023

ケイ酸カルシウム水和物を利用した
微細藻類の増殖促進技術の開発
佑果 1・和賀 健太郎 1、花田 晶子 2、春日 友明 2、明戸 剛 2、横井

吉野 知子 1、新垣 篤史 1、田中 剛 1*
1

東京農工大学大学院 工学府 生命工学専攻，2 太平洋セメント株式会社〒184-8588

小金井市中町

Tel: 81-42-388-7021

2-24-16

Fax: 81-42-385-7713

E-mail: tsuyo@cc.tuat.ac.jp

微細藻類は CO2 固定能が高く、大気中の CO2 の直接回収 (Direct Air capture: DAC)への利用が期待されている。
しかし、微細藻類の DAC においては、培地への CO2 溶解速度が炭素固定の律速となっており、CO2 溶解促進技術が求められている。本研究では、ケイ酸カルシウム水和物 (CSH)を培地へ CO2 溶解を促進する資材として利用
し、微細藻類培養における増殖促進効果の評価を行った。大気条件下の円石藻及び珪藻培養において CSH による増殖促進が確認され、今後の微細藻類を用いた CO2 回収における CSH の利用が期待される。
これまで、培地中への CO2 溶解を促進する目的で、
1. はじ め に
重炭酸塩や炭酸脱水酵素を用いた微細藻類培養が行われている 5,6)。しかしながら、資材のコストや藻類への化石燃料の使用量の増加に伴い大気中への CO2 の排出量が増加しており、大気中の CO2 を直接回収する技
毒性の影響が懸念されている 6,7)。よって、微細藻類を術、DAC 技術の開発が進められている。DAC 技術は用いた CO2 回収技術の実用化に向けては、低コストかつ細胞毒性のない効率的な CO2 溶解促進法が求められ
CO2 のマイナスの排出を目指す、ネガティブエミッシ
ョンを可能にする技術である 1,2)。パリ協定で定められる。
我々は無機化合物資材であるケイ酸カルシウム水和
た、気温上昇を 1.5°C 以下に抑えるという目標達成に
物 (calcium silicate hydrate: CSH)に着目した。CSH はコ
は、ネガティブエミッション技術が必要とされている
3)
ンクリート等に含まれる物質であり、資源量が豊富な。その主な手法として、アルカリ性水溶液等を用いた石灰石や珪石を主原料に水和や水熱反応により比較的化学吸収が用いられている。ただし、大気中の CO2 濃
安価に製造が可能である。また、培地に添加すること
度が薄く回収のエネルギーコストが高いことから 4)、で培地 pH を弱アルカリ性に保持する性質を持つ 8)。
光合成を利用した生物学的な DAC の利用が注目されている 3)。そのなかで、微細藻類は、陸上植物と比較
よって、CSH の培地への添加により、培地中の CO2 溶
して 10 倍以上の高い CO2 固定能を示すことから、炭解量が増加し、微細藻類の増殖が促進されることが期待される。本研究では、種々の微細藻類において CSH
素貯留のための生物ホストとしての利用が期待されて添加による細胞増殖の評価を行い、微細藻類の増殖促いる。しかし、微細藻類を用いた大気中 CO2 の回収は、進技術の確立を目指した。
培地中への CO2 溶解が律速となっている 4)。

52

微細藻類として、円石藻、海洋珪藻及び多糖高生産
株して分離された緑藻 9)の 3 種類を用いた。培地はそれぞれ ESM 培地、f/2 培地及び IMK 培地を用いた。顆
粒状の CSH (図 1)を 1 g/l
添加した培地を用い、通気条件下で各藻類の培養を行った。温度及び光量
子束密度は、各藻類に至適な条件で行った。藻類
存在下と非存在下の培地において pH 及び炭酸濃度を測定し、CSH の CO2
溶解促進効果を評価した。また、細胞濃度及びバイオマス濃度を測定
図 1 ケイ酸カルシウ
し、CSH の増殖促進効果
ム水和物(CSH)。
を評価した。

ては、CSH 添加によって最終藻体濃度は無添加条件と比較して 1.8 倍の増加が示された。また、緑藻培養においては、富栄養条件では、約 2 倍に増殖促進効果が示されたが、大気通気及び貧栄養条件下での培養においては、明確な効果は確認できなかった。このことから、CSH による増殖促進効果は藻類の炭酸要求性の違いにより異なることが示唆された。以上の結果から、
CSH を利用した培地中への CO2 溶解促進により、多様な微細藻類の増殖促進へ応用できることを確認できた。
0.7
Biomass concentration (g/l)

2 . 材料 ・ 方法

0.4
0.3
0.2
0.1
0

CSH を添加した ESM 培地、f/2 培地及び IMK 培地
において、それぞれ pH の増加が確認された。また、
CSH を添加した各培地の炭酸濃度をモニタリングしたところ、通気下で 4～6 日目以降に飽和に達した。さらに、CSH を添加した培地中の炭酸濃度は、非添加培地と比較して、ESM 培地で約 1.3 倍 (図 2)、f/2 培地で約 1.5 倍、IMK 培地で 1.7 倍に増加した。以上のことから、CSH の培地への炭酸濃縮効果が確認され、微細藻類培養の生育向上への利用性が示唆された。

Carbonic acid (mg/l)

0.5

03 . 結果 と 考察

200

-CSH
+CSH

0.6

-CSH
+CSH

150

2

4 6 8 10 12Time (days)

図 3 通気条件下の円石藻培養における CSH の効果。

4.今後 の 展 望
本研究では、培地へ CO2 溶解を促進するケイ酸カル
シウム水和物 (CSH)を微細藻類培養へ応用すること
で、DAC へ応用可能な増殖促進技術を確立した。本研
究は、CO2 の培地への低い溶解性による微細藻類の炭素固定の制限に対する、新たな解決手法を提供するものである。今後、CSH 添加量や培養条件の検討により
CO2 供給量の最適化を行い、細胞増殖促進効果を最大化することで、さらなる CO2 固定量の向上が期待され
る。

文献

100
50
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Time (days)

図 2 通気条件下の ESM 培地における炭酸濃度の推移。
続いて、CSH を添加した培地を用いて、微細藻類の培養試験を行った。その結果、通気下での ESM 培地を用いた円石藻培養において、培養 13 日目における藻体濃度は 0.58 g/L に到達し、CSH 非添加培地と比較して、1.7 倍の向上が確認された (図 3)。珪藻培養におい[1] Kato, E., Kurosawa, A.: Sustain. Sci., 16, 463-475(2021)[2] Yang, D., et al.: Int. J. Greenhouse. Gas. Control., 111,
103473 (2021)[3] Zhou, W., et al.:Renew. Sustain. Energy. Rev., 76, 11631175 (2017)[4] Christian, B., et al.:Cell., 3, 2053–2065 (2019)[5] Zhu, C., et al.: J. CO2. Util., 37, 320-327 (2020)[6] Xu, X,. et al.: ACS. Sustain. Chem. Eng., 9, 9698-9706(2021)[7] Costa, J.A.V., De Morais, M.G.: Bioresour. Technol.
102, 2-9 (2011)[8] 花田ら:太平洋セメント研究報告第 173 号 (2017)[9] Aketo, T., et al.: J. Biosci. Bioeng., 129, 687-692 (2020)53

第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023
第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023

麹菌 Aspergillus oryzae による耐熱型 PET 分解酵素の発現

戸所 健彦 1＊, 伊出 健太郎 1, 佐貫 理佳子 2,3, 河野 恵美 2, 吉田 昭介 2, 石田 博樹 1
1

月桂冠 総合研究所，2 京都工芸繊維大学・工芸化学, 3 奈良先端大学院大学・バイオ〒612-8385

京都市伏見区下鳥羽小柳町 101
Tel: 075-623-2130

月桂冠株式会社

総合研究所

Fax: 075-623-2132

E-mail: todokoro@gekkeikan.co.jp

Polyethylene terephthalate（PET）は石油を原料に製造され、ペットボトルや衣類などに汎用されている合成樹脂である。PET 廃棄物は環境汚染の原因となることから、より効率的なリサイク
ル方法の開発が望まれる。近年、PET を分解資化する細菌 Ideonella sakaiensis が単離され、産生する PET 分解酵素 PETase について精力的に研究がすすめられている。中でも FAST-PETase は
PETase の耐熱性・反応性を機械学習により向上させたもので、実用化に向け期待が持たれる。
我々は近年、日本酒・味噌・醤油などの伝統的な発酵食品づくりに古くより用いられてきた麹菌（Aspergillus oryzae）が高い酵素生産能力を有することに着目し、麹菌を用いて PET 分解関連
酵素を生産させることに成功している。本研究では我々は麹菌により FAST-PETase を生産させる
ことに初めて成功し、その PET 分解能力を検証した。生産された麹菌 FAST-PETase は期待どおり
もともとの PETase より高い耐熱性・反応性を有しており、試験に用いた PET フィルムをほぼ完全に分解できることを確認した。本研究は麹菌の酵素生産能力の高さを改めて示しており、PET 分解などの環境問題対策に関する各種分野での今後の応用が期待される。

54
２

第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023

【背景・目的】Polyethylene terephthalate（PET）は石油を原料に製造され、ペットボトルや衣類などに汎用されている合成樹脂である。PET 廃棄物は環境汚染の原因となることから、より効率的なリサイクル方法の開発が望まれる 。 近 年 、 PET を 分 解 資 化 す る 細 菌 Ideonella
sakaiensis が単離され 1)、産生する菌体外 PET 分解酵
素 PETase について精力的に研究がすすめられている。
中でも FAST-PETase はこれまでに研究がすすめられた各種の改良 PETase の構造をもとに機械学習により設計されたものである。FAS-PETase は native な PETaseとの違いはわずか 4 アミノ酸置換であるものの、耐熱性・反応性が大きく向上すると報告されており、実用化 に 向 け て 期 待 が 持 た れ る 2) 。 麹 菌 Aspergillus
oryzae は日本酒・焼酎・醤油・味噌など伝統的発酵産業に用いられる糸状菌であり、古くから今日まで利用されてきた理由はその安全性と高い酵素生産・分泌能力である。また、麹菌は現在では各種の産業用酵素の生産にも用いられている。我々はこれまでに麹菌 A.
oryzae をホストに I. sakaiensis の native な PETaseについて、活性型酵素の発現に成功している。しかしながら、native な PETase は PET 分解反応時の耐熱性・反応性において産業面での実用化に課題があった。そこで本研究では PETase の改良型である FAST-PETaseを異種発現させ、麹菌の PET 分解への活用の可能性を検討した。

【方法・結果】
まず麹菌において FAST-PETase を発現させるためのコドン最適化を実施した。麹菌は高い酵素生産能力を有するものの、他生物種由来の酵素を生産させる場合にはコドンを最適化させなければうまく高生産しないことが知られている。我々は麹菌において酵素を高生産させるためのコドン自動生成・採点アルゴリズムを
これまでに構築しており 3)、今回も同手法により FASTPETase のコドンを最適化した。さらにこの配列の N 末端に菌体外排出シグナルを結合したものを sodM プロ
モ ー タ ー 下 で 恒 常 発 現 す る コ ン ス ト ラ ク ト を A.
oryzae OSI1013leu-株へ導入し、FAST-PETase の菌体外分泌を確認した。また、麹菌による酵素発現では糖鎖付加が生じ酵素活性に悪影響する可能性があること
か ら 、 Hypocrea jecorina 由 来 endo- β -Nacetylglucosaminidase 4) も 共 発 現 す る こ と で FASTPETase の糖鎖を減少させた。分泌された酵素は、PETを分解する高い酵素活性をもつことが確認された。現在、分泌された酵素の安定性や最適な反応温度についての詳細についても確認を行っている。

文

献1) Yoshida et al., Science, 351, 1196-1199, 2016
2) Lu et al., Nature, 604, 662-667, 2022
3) 伊出ら, 2022 年 度 日 本 生 物 工 学 会 大 会 要 旨 集 , 91,
20224) Li et al., Journal of bioscience and bioengineering, 129,573-580, 2020

55

２

第75
75回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 20232023
第油脂酵母 Lipomyces starkeyi における油脂超高蓄積株 N5-15 株の育種
三根
・吹井
1

健太郎 1,2・高城

真緒 2・山吉博也 1・松尾陵平 2・佐藤伸二 1

里佳子 2・高久洋暁 2＊

日清食品ホールディングス株式会社，2 新潟薬科大学応用生命科学部〒956-8603

新潟市秋葉区東島 265-1
Tel: 0250-25-5119

新潟薬科大学応用生命科学部

Fax: 0250-25-5021

E-mail: htakaku@nupals.ac.jp

日本の油脂自給率はカロリーベースで 3 % と他の先進国と比較しても非常に低い。自給率の向上に効率的な手段として油糧植物からの油脂供給が挙げられるが、生産効率が高い油糧植物アブラヤシは熱帯性の植物かつ栽培に広大な耕作面積を必要とするため、日本での栽培は困難である。そこで我々は様々な糖を油脂に変換し細胞内に油脂を高蓄積する油脂酵母 Lipomyces starkeyi に着目した。本酵母由来の油脂（以降、酵母油）の脂肪酸組成
は、アブラヤシから採れるパーム油の脂肪酸組成と非常に類似しており、代替パーム油としての適性が高いと考えられる。我々はこれまでに酵母油の食品適性や食品残さ培地への適応性の高さを確認してきた。しかし、酵母油を産業化するためには、油脂生産速度や油脂変換効率などの課題を解決する必要がある。そこで本研究では、
L.starkeyi に対して突然変異を誘発することで、油脂高蓄積株を取得することを目指した。L. starkeyi 野生株
CBS 1807 に UV を照射し、変異を誘発させ、油脂生産量が 2 倍に向上した油脂高蓄積変異株 N5 を取得した。さらにこの N5 株を親株として、再度変異誘発を行い、油脂生産量が野生株の 2.7 倍に向上した新規油脂超高蓄積
変異株である N5-15 株の取得に成功した。

1. はじめに即席麺の揚げ油にも利用されているパーム油は世界で最も多く使用されている植物油である。安価で利用性が高いことから、食品から日用品まで広く用いられている。日本では年間 64 万トンのパーム油が使用

56２

されているが、その 100%を輸入に依存しているため、今後の持続的な油脂供給手段が求められている。パー
ム油は油糧作物であるアブラヤシから採取されるが、アブラヤシは熱帯性の食物であり、栽培に広大な耕作面積を必要とするため、日本での栽培は困難である。
そこで、我々は様々な糖を油脂に変換し細胞内に油脂を高蓄積する油脂酵母 Lipomyces starkeyi に着目した。本酵母由来の油脂（以降、酵母油）の脂肪酸組
成は、アブラヤシから採れるパーム油の脂肪酸組成と非常に類似しており、代替パーム油としての適性が高いと考えられる 1)。これまで我々は酵母油でフライした即席麺の食品適性や食品残さ培地への適応性を検討しており、酵母油を活用した食品の実現性が高いことを確認してきた（図１）2)。
酵母油を産業化するためには、生産コストの削減が必須となるため、油脂酵母における油脂生産速度や油脂変換効率などの課題を解決する必要がある。そこで、本研究では L.starkeyi に対して UV を用いた突然変異を誘発することで、油脂蓄積量が向上した油脂高蓄積
変異株を取得することを目指した。

図 1. 油脂酵母 Lipomyces starkeyi とこれまでの歩み

図 2. Percoll 密度勾配遠心分離法による油脂高蓄積
株の育種濃縮した変異株群からコロニー単離した複数の油
脂高蓄積変異候補株を得た。それらの培養評価スクリーニングを行うことで、油脂高蓄積株 N5 株を獲得した。野生株と比較して、N5 株における培地あたりの油脂量は 2 倍、細胞あたりの油脂量は 2.5 倍となった（培養 4 日目）。
続いて、取得した N5 株を親株として、上記と同様に再度変異誘発および濃縮・スクリーニングを実施した
結果、新規油脂超高蓄積変異株である N5-15 株の取得に成功した。野生株と比較して、N5-15 株における培地あたりの油脂量は 2.7 倍、細胞あたりの油脂量は 4.5倍となった（培養 4 日目）（図 3）。
今後は、さらなる油脂高蓄積株の育種および産業化を目指したコストダウン・スケールアップ検討に加え、N5-15 株の油脂高蓄積原因遺伝子の同定・活用を進める。

2. 材料と方法
本研究では、L. starkeyi CBS 1807 （野生株）に UVを照射し、変異誘導を行った。また、Percoll 密度勾
配遠心分離法を利用して、油脂高蓄積細胞（低密度）と油脂低蓄積細胞（高密度）を分離した。取得した変異株を培養し、適宜サンプリングし、細胞濃度、糖濃度、油脂量の定量及び GC で脂肪酸組成を分析した。

3. 結果と考察

L. starkeyi 野生株に UV を照射し、変異誘発を行った変異株群を Percoll 密度勾配遠心分離法を用いて分離した。上層には油脂を高蓄積した（=低密度画分）細胞があることから、その画分を分取し、培養後、Percoll 密度勾配遠心による分離を繰り返すことで、
低密度画分の濃縮を行った（図 2）。

図 3. 新規な油脂超高蓄積株である N5-15 株

参考文献
1) 高久洋暁, 化学と生物, 57, 609-615 (2019).
2) 三根健太郎ら, 日本農芸化学会 2022 年度大会講演要旨集, 216 (2022).

３

57

第  回日本生物工学会大会 7RSLFVRI
第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023

海洋珪藻 Fistulifera solaris のオープンポンド型屋外培養
におけるオイル蓄積機構の解析
福田 晴 ・熊久保 涼太 ・村田 智志 ・西村 恭彦 ・吉野 知子 ・田中 剛 ＊

東京農工大学大学院 工学府 生命工学専攻， 電源開発株式会社〒小金井市中町 
7HO)D[

(PDLOWVX\R#FFWXDWDFMS







海洋珪藻 Fistulifera solaris JPCC DA0580 株は高い増殖能及びオイル蓄積能からバイオジェット燃料
生産ホストとして期待されており、屋外での大規模培養技術が確立されている。しかし、屋外培養では、混入微生物や多くの環境パラメータが変動するため、生育やオイル蓄積が不安定であることが課題となっている。近年、混入微生物に依存した微細藻類のオイル生産性の変化が報告されている。しかし、F. solaris 屋外培養における混入微生物の菌叢及びそれに伴う細胞内オイル代謝の変動は明らかとなっていない。そこで本研究では、屋外培養における微生物叢解析及びトランスクリプト―ム解析を行い、安定した屋外培養のための生物学的な指標獲得を目指した。

 はじ め に  
カーボンニュートラルの実現に向けて、持続可能な
航空燃料 (SAF)の利用が世界的に注目を集めている。
微細藻類は高い CO2 固定能を有し、細胞内にトリアシ
ルグリセロール (TAG)を主成分としたオイルを蓄積することから、SAF 生産の生物ホストとして期待されている。中でも、海洋珪藻 Fistulifera solaris は高い増殖能及びオイル蓄積能 (65%)を有しており、有用なSAF 生産ホスト候補の 1 つである 1)。我々は、F. solarisを用いた SAF 生産の実用化に向けて、屋外での大規模培養技術の検討を行ってきた。これまでに、福岡県北九州市において、オープンポンド型培養装置を用いた
F. solaris の大規模培養技術を確立している (図 1)。さらに、F. solaris 及び冬季に屋外での培養が可能な好冷性のオイル高蓄積珪藻を併用することで、年間を通し58

た屋外でのオイル生産に成功している 2)。しかし、屋外培養では混入微生物や天候など多くの環境パラメー
タが変動するため、安定的なバイオマス生産及びオイル生産が実用化に向けた課題である。近年、混入微生物に依存した微細藻類の生育やオイル生産性の変化が報告されている。混入微生物はその種類によって、共生関係を築き培養プロセスの強靭化に寄与する場合や、捕食関係により培養した藻類細胞の壊滅を招く場合がある 3, 4)。よって、屋外培養の安定化に向けて混入微生物の菌叢の把握は重要となっている。しかし、F. solarisの屋外培養において、混入微生物の菌叢及びそれに伴うオイル蓄積の変動は明らかとなっていない。そこで本研究では、屋外培養における微生物叢解析及び遺伝
子発現解析を行い、屋外培養の安定化に向けた指標の獲得を目指した。

600 kL6.2 kL図. 1 大規模オープンポンド型培養装置を用いた
F. solaris の屋外大量培養。

2. 材料・方法
東京農工大学小金井キャンパス内にオープンポン
ド 型 屋 外 培 養 シ ス テ ム を 設 置 し 、 F. solaris JPCC
DA0580 株 (提供：電源開発株式会社)の 6,200 L での屋外培養を実施した。培養期間中、定期的に CO2 を培養液に通気し、培地 pH が一定となるように制御した。
各培養段階における細胞濃度及びオイル含有率を測定した。F. solaris 屋外培養における混入微生物菌叢解析に向けて、各培養段階の培養液から DNA を抽出し、16S/18SrDNA を対象としたアンプリコンシーケンス解析を実施した。培養期間中のオイル蓄積関連遺伝子の発現変動を解析するため、各培養段階で回収した藻体から total RNA を抽出し、RNA-seq 解析を行った。

 結果 ・ 考察 

認されなかった。原核生物の菌叢は、培養期間中で大きく変化しなかった (図 3)。以上より、本研究で行った屋外培養において微生物混入が限定的であったことが、バイオマス生産を安定的に行うことができた要因の一つとして考えられた。さらに、原核生物の中で、γ-プロテオバクテリア綱ビブリオ目の存在比が培養期間を通して最も高かった。Euglena gracilis とビブリオ目に属する細菌の共培養により、バイオマス生産性が増加することが報告されており、IAA 生産能や窒素固定能が関与していると考えられている 3, 5)。このことか
ら本研究で明らかとした屋外培養槽中の菌叢は、F.
solaris の安定的な生育に寄与している可能性が考えられた。

図. 3 F. solaris 屋外培養における原核生物の菌叢経時変化。

屋 外 オ ー プ ン ポ ン ド 型 培 養 シ ス テ ム を用 い た F.
solaris の培養試験を実施した。培養中の培地 pH は、
微細藻類の光合成に呼応して顕著な低下が認められるが、pH 制御によって比較的安定的に推移できていることが確認された (図 2)。最終藻体濃度は 8.7×106 cells/mlに達し、培養 8 日目において窒素源の枯渇が確認された。これまでに行った福岡県における F. solaris 屋外培
養における細胞濃度は最大で 8.5×106 cells/ml であり、地域の違いによる細胞生育への影響なく屋外培養できることを実証した。

一方で、窒素源枯渇後においてもオイルの蓄積が誘導されず、オイル含有率は安定的に屋外でのオイル生産が行えた場合の約半分程度となった。遺伝子発現解析の結果、培養後期において中央代謝及びオイル蓄積関連遺伝子群の顕著な発現量低下が確認され、細胞機能の低下が示唆された。今後、細胞機能が低下した要因を解明することで、オイル蓄積機構を阻害しない培養プロセスの確立が期待される。

(A)

本研究では、生育の安定したオープンポンド型屋外培養技術を確立することができた。また、今回明らかとなった F. solaris の屋外培養における微生物叢及び遺伝子発現挙動は、屋外培養の安定性評価に向けた分子マーカーとなることが期待される。

(B)

今後 の 展望 

謝辞 
本研究成果は、国立研究開発法人新エネルギー・
産業技術総合開発機構 (NEDO)の委託業務で得られたものである。

文献 
図. 2 オープンポンド型屋外大量培養試験における(A)F. solaris の生育曲線及び培地中硝酸濃度、(B) pH 推移。

培養期間中の菌叢解析の結果、培地に混入した真核生物は培養藻体量と比べて極めて小さく、その種類も少ないことが示された。また、捕食生物の混入も殆ど確[1] Tanaka et al, Plant Cell, 27, 162-176 (2015)[2] Matsumoto et al, Mar Drugs, 15, 94 (2017)[3] Jee et al, Appl Environ Microbiol, 85 (2019)[4] Harmon et al, Algal Res, 55 (2021)[5] Maria et al, Arch Microbiol 150, 224-229 (1988)

59

第75
75回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 20232023
第乳製品加工残渣を栄養源とし緑藻を培養した際の細胞応答についての解析と評価
蓬田1

美紗樹 1・堀本

智仁 2・中西昭仁 1,3＊

東京工科大学大学院バイオ・情報メディア研究科，2 株式会社明治，3 東京工科大学応用生物学部〒192-0982

八王子市片倉町 1404-1

学校法人片柳学園 東京工科大学 片柳研究所棟 KW306
Tel: 042-637-2427

E-mail: nakanishiah@stf.teu.ac.jp

乳製品の製造工程で得られるホエイはタンパク質やミネラルなどの栄養素を豊富に含む残渣である。一般的に、フィルター濾過後の残渣はプロテインパウダー等の使用用途があるが一定数廃棄する成分があることから十分に活用しきれておらず、これの有効活用が期待されている。そこで物
質生産性の高い緑藻に濾物 WPC34 を与えて、バイオマス生産量とともに遺伝子転写量を解析し、WPC34 の利用有効性について細胞応答と物質生産の観点から論じた。

1. はじめにチーズの製造工程において、1 kg のチーズの作製には 10 L の生乳が必要であり、ここから 80%以上もの容量のホエイが副産物として得られる 1)。それゆえ、世界のチーズ製造産業では年間 180×106 トン以上ものホエイが生産されており、その半分は使用されずに廃棄されている 2)。そのため廃棄されるホエイに有効活用
方法を見出したいが、他国と比較して日本ではホエイのロット生産量が少ないため、その精製・加工にかかる費用コストを差し引いても利益を生むことのできる活用方法が求められる。従って、ホエイを高付加価値な物質に変換することが利用法の開拓に必須であった。
そこで本研究では、ホエイを加工した乳製品加工残渣
を栄養源として利用し、一般的な陸生植物より 10-50倍高い炭酸固定能を持つ緑藻にボタニカルな物質を生産させるための培養条件を検討した。

2. 材料・方法
緑藻細胞には Chlamydomonas reinhardtii を選んだ。
培養における栄養源には、乳製品加工残渣として、ホ60

エイを限外濾過に供した際の濾物である「WPC34」と、ホエイを乾燥させた「ホエイパウダー」を用いた。実際の培養では、従属栄養系の合成培地である TAP 培地
を基盤に単一窒素源である NH4Cl (400 mg·L−1) をWPC34 (1 g·L−1、3 g·L−1、6 g·L−1、10 g·L−1) とホエイパウダー (5 g·L−1、10 g·L−1、20 g·L−1、30 g·L−1) に置換した。C. reinhardtii の乳製品加工残渣の利用能
は、これの培養時の比増殖速度と最大細胞密度から、細胞増殖を解析することによって解析・評価された。
具体的には、培地に含まれる乳製品加工残渣の濃度とOD (濁度) で示される細胞密度が培養時間ごとにプロットされ、近似直線が求められることでそれらの相関性が解析・評価された。また、C. reinhardtii の生育に与える影響を調べるため、乳製品加工残渣に対して、
炭水化物、タンパク質、油脂、ミネラルの定量評価がなされた。その上で、濃縮されたタンパク質を指標に
ホエイから WPC34 への加工で変化のあった成分が解析され、細胞の増殖性と対比することで、それらの影響が評価された。

3. 結果・考察
WPC34 とホエイパウダーを栄養源にしたときの C.

reinhardtii の増殖能を解析したところ、ホエイパウ
ダーと WPC34 のどちらにおいても増殖が確認された。
このことから、ホエイパウダーと WPC34 は窒素源として培地成分に利用可能であることが明らかになった(図 1)。また、ホエイのタンパク質濃縮を目的とした
WPC34 ではタンパク質が 352 (mg∙g−1)、一方ホエイパウ
ダーでは 117 (mg∙g−1) であるのでおよそ 3 倍に濃縮されている (表 1)。そこで、6 g·L−1 WPC34 と 20 g·L⁻1 ホ
エイパウダーにおける細胞増殖を比較したところ、培養 72 時間から 96 時間の比増殖速度は 0.0119 と 0.0381、
最大細胞密度を示す OD700 が 0.220 と 0.678 であった。
ホエイパウダーの方が高い細胞増殖性が示されたので、濾過工程により、WPC34 はホエイパウダーと比較してC. reinhardtii の増殖に必要な栄養素が減少している、
もしくは、WPC34 の因子が増殖を抑えるレベルまで濃縮されている可能性が示唆された。

に比べ C. reinhardtii の増殖に必要な栄養素が減少していることが強く示唆された。

図 2 培地中 WPC34 濃度と細胞増殖の相関性
次に、WPC34 はホエイの濾過工程によりどういった
栄養素が流出したのかを解析した(表 2)。タンパク質が 3 倍に濃縮されているとしたときに同倍率で濃縮されているかを評価した結果、鉄や亜鉛、銅といった金属元素は濃縮維持率が 90%以上であった一方、存在量の多いカリウムやリンが 30%程度の濃縮維持率に留まるなど濾過による流出が窺われた。従って、これらのミネラル成分が増殖に影響を与えている可能性が示唆された。
表 2 ミネラルの濃縮維持率−1

sample図 1 乳製品加工残渣を栄養源として生育した
C. reinhardtii の細胞密度の変化

WPC34
ホエイパウダー
濃縮維持率 (%)

K
1,120
1,340
27.9

Mineral (mg·100mg )
Ca
P
Na
708
575
305
546
581
521
43.2
33.0
19.5

Fe
0.36
0.13
92.3

Zn
0.34
0.12
94.4

表 1 乳製品加工残渣の組成
Carbohydrate
sampleWPC34
ホエイパウダー−1(g·100g )
52.9
80.0

Protein

Lipid−1

Mineral−1

sample

Ash

−1

−1

(g·100g ) (g·100g ) (g·100g ) (g·100g )
35.2
11.7

3.8
1.5

2.8
3.1

2.0
2.2

そこでこれらの可能性のどちらが正しいかを明らかに す る た め 、 培 地 中 WPC34 の 濃 度 を 振 っ て C.
reinhardtii の細胞増殖性が評価された (図 2)。その結果、培養時間が長くなるにつれて近似直線の傾きが大きくなるともに、R 2 値は培養 72 時間で 0.9 を超え、培養 120 時間以降では 0.95 を超えたことが明らかになった。また、3 g·L⁻1 と 6 g·L⁻1 の WPC34 では、培養時間が長くなるほどプロットが詰まっているため、これらの濃度では細胞増殖に必要な栄養が不足していることが伺えた。10 g·L⁻1 WPC34 では培養時間が長いところでもプロットが詰まっていないため、細胞増殖に充分な栄養源が存在していたと考えた。以上のように、培地中 WPC34 の濃度と OD が示唆する細胞密度には相関 性 が 見 ら れ 、 同 じ 培 養 時間 に お け る 細 胞密 度 は
WPC34 の濃度依存的に変化することが示された。従って、濾過工程により、WPC34 の因子が増殖を抑えるレベルまで濃縮されているのではなく、ホエイパウダー

WPC34
ホエイパウダー
濃縮維持率 (%)

Mg
105
98.4
35.6

Mineral (mg·100mg−1)
Mo
Cu
Mn
0.080
0.03
N. D.
0.053
0.01
N. D.
50.3
100.0
-

Co
N. D.
N. D.
-

現在、流出が疑われたミネラルの中で、まずは一般
的に植物に必要とされる元素である「リン」「カリウム」
が細胞応答に関与するか評価するために、窒素源を
WPC34 に代替した TAP 培地にカリウムとリンを添加して緑藻を培養し細胞応答を評価するとともに、定量
PCR による代謝応答も併せて評価している。
本研究により乳製品加工残渣が緑藻の生育に利用できることを明らかにし、乳製品製造工場の製造プロセ
スと連続的に接続、乳製品加工残渣に加え廃熱を利用することで、生産プロセスのカーボンニュートラルに寄与し、クリーン・プロダクションの実現が望まれる。

4. 文献
1) Prazeres, A.R., et al.: Waste Manege., 110,48-68, Elsevier (2012)2) Ibarruri, J., Hernández, I.: Bioprocess
Biosyst. Eng., 42, 1285-1300, Springer (2019)61

第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023
第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023

光合成細菌の細胞成分による植物成長促進効果
林修平 1＊・岩本康成 1・平川山本
1

夕貴 1・森

康一 1・山田進二郎 1・宮坂直樹 2・牧孝昭 2・均1

崇城大学生物生命学部，2（株）松本微生物研究所〒860-0082

熊本市西区池田 4-22-1

Tel: 096-326-4176

崇城大学生物生命学部

Fax: 096-323-1331

E-mail: shayashi@bio.sojo-u.ac.jp

光合成細菌
水

生細胞

死細胞

中身

外身

リポ多糖

植物
30日後

＜

1 . 要旨光合成細菌（非紅色硫黄細菌）の植物成長促進効果を示す成分を探索するために、光合成細菌を超音波破砕・遠心分離を行い、上清とペレットに分けてコマツナに投与した。上清は高い濃度で成長促進効果を示したが、ペレットは低い濃度で成長促進効果を示した。
ペレットには、細胞膜成分であるリポ多糖（LPS）が含
まれていると考え、LPS のみをコマツナに投与した。
非常に低濃度（pg/mL）で成長促進効果を示すことがわかった。
2 . 緒言植物の成長を促進させる紅色非硫黄細菌（光合成細菌）は、植物の成長に有益な化合物を生産する能力により、植物生産において注目を集めている光合成微生物である。光合成細菌は光からエネルギーを得ることができる通性嫌気性細菌であり、その炭素源は有機炭素に由来しており、さまざまな環境(湿った土壌、淡水、海水など)に広く分布している 1,2)。さらに、光合成細菌は窒素(N2)固定 1)、リン酸可溶化 3)、植物成長促進物質(インドール-3-酢酸(IAA)および 5-アミノレブリン酸(ALA))の生成 2)など、有用な機能をもっている。

62

＜

≒

＜

＜

植物に使用する場合、光合成細菌は生細胞、死細胞、細胞由来物質の 3 つに区別される。これまでの研究は
主に生細胞の使用に焦点を当てており、死細胞や細胞由来の物質の使用にはあまり焦点を当てていなかった
4)。
本研究では、生細胞を超音波処理することによって死細胞を調製し、死細胞と生細胞による植物の成長促
進効果を比較した。さらに、死細胞成分に含まれる植物の成長促進に関わる物質について検討した。
3 . 方法3. 1 光 合 成 細 菌（株）松本微生物研究所が所有する Rhodobacter
sphaeroides を使用した。コロニー形成単位（cfu）については、660 nm での光学密度と cfu の相関関係を実験的に求め、OD660=1 の場合に 2×109 cfu mL−1 として標準化した。
3 . 2 不活化 細 胞 お よび 細 胞 成 分の 調 製
R. sphaeroides を GM 培地、30℃、光照射下で培養した。遠心分離して滅菌水に再懸濁したものを生細胞溶液とした。生細胞溶液を超音波破砕したものを死細胞溶液とした。死細胞溶液を遠心分離し、上清を可溶

図 2. 可溶成分または不溶成分溶液噴霧によるコ
マツナの新鮮重量。エラーバーは標準偏差を、**はt 検定による p<0.01 を示す。
12
Fresh biomass weight (g)成分、ペレットを滅菌水に懸濁した溶液を不溶成分とした。
3 . 3 植物栽 培 実 験
コマツナの種を蒔いたプランターに、各種溶液（生細胞、死細胞、可溶成分、不溶成分、リポ多糖（LPS））
を 3 日に 1 回噴霧した。播種から約 30 日後に収穫し、根を除いた植物体の新鮮重量を測定した。
4 . 結果 と 考察
生細胞あるいは死細胞を投与した植物は、それぞれ無投与の対照群に比べて新鮮重量が有意に増加し、死細胞は生細胞よりも高い成長促進効果を示した（図 1）。
生細胞では、植物の成長を促進させる物質が代謝されてしまう可能性が考えられる。
さらに、死細胞を遠心分離し、上清（可溶成分）とペレット（不溶成分）に分け、それぞれを植物に投与した。上清では、比較的高濃度で投与した場合に植物の成長が促進されたが（図 2A）、ペレットでは、比較的低濃度では植物の成長が促進されることがわかった（図 2B）。可溶成分には、インドール-3-酢酸(IAA)や5-アミノレブリン酸(ALA)が含まれていることが考えられ、それらの効果で成長が促進されたと考えられる。
紅色非硫黄細菌はグラム陰性菌であり、不溶成分であるペレットには、細胞壁成分であるペプチドグリカ
ンやリポ多糖（LPS）が含まれていることが考えられる。
その中でも生理活性が報告されている LPS が植物の成長を促進するのではないかと仮説を立て、光合成細菌
由来の LPS と大腸菌由来の LPS を植物に投与して比較した。10～100 pg/mL の濃度で光合成細菌由来 LPS を投与した植物は、無投与の対照群に比べて新鮮重量が有意に増加した。一方、100 pg/mL の濃度で大腸菌由来 LPS を投与した植物は、無投与の対照群とほぼ同等であった（図 3）。光合成細菌由来 LPS と大腸菌由来 LPS
では、構成するリピド A の構造が異なり、そのことが植物成長促進効果の差を生じさせていると考えられる。

8
6
4
2
0

Fresh biomass weight (g)

10.0

**

8.0

control

10

100

**

Concentration of LPS (pg mL-1)

100

LPSfrom
Escherichiacoli

図 3. LPS 溶液噴霧によるコマツナの新鮮重量。エラーバーは標準偏差を、**は t 検定による p<0.01
を示す。

**

4.0

文

2.0

control

1000

LPS from Rhodobactersphaeroides

6.0

0.0

**

**

10

live cellkilled cell6

図 1. 生細胞または死細胞（2×10 cfu mL-1）溶液
噴霧によるコマツナの新鮮重量。エラーバーは標準偏差を、**は t 検定による p<0.01 を示す。

献1) Kantachote, D. et al.: Appl. Soil. Ecol., 100,
154–161 (2016).
2) Sakpirom, J. et al.: Res. Microbiol., 168, 1–10
(2017).
3) Rana, G. et al.: J. Agric. Sci. Rev., 5, 109–
117 (2016).
4) Sakarika, M. et al.: Microb. Biotechnol., 13,
1336–1365 (2019).

63

第75
回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
7RSLFVRI
第of 2023&RU\QHEDFWHULXPJOXWDPLFXP を用いた
グルコースからの ピリジンジカルボン酸の生産
野中鏡士朗・長村達也・高橋史員＊・小山伸吾
花王株式会社 生物科学研究所
〒和歌山県和歌山市湊  番地
7HO
(PDLOWDNDKDVKLIXPLND]X#NDRFRP

要旨 
リグニン原料から微生物変換法によって得られる
ピリジンジカルボン酸 3'&$ は、テレフタル酸に類似した骨格を持つ植物由来樹脂原料として期待される。しかし、プロトカテク酸を経由する既知の代謝経路には中間体が不安定である点や外部からアンモニウム塩を添加する必要がある点などの課題がある。
本研究では、アミノヒドロキシ安息香酸 $+%$ の酸化開裂反応によって自発的に 3'&$ が形成される現象に着目し、グルコースから $+%$ を経由して 3'&$ を生産する新規代謝経路を設計した。本経路を導入したコリネ型細菌 &RU\QHEDFWHULXPJOXWDPLFXP の培養を行った結果、実際に 3'&$ が生産可能であることが示された。


背景  炭素循環型社会の構築に向けて、バイオマスなどの再生可能資源から化学品を生産する技術の開発が望まれる。芳香族ジカルボン酸の１種であるテレフタル酸
はポリエチレンテレフタレートなどに大量に使用される石化由来化学品原料であり、フランジカルボン
酸など類似した骨格を持つ再生可能資源由来の代替原料を生産する研究が盛んに行われている。

64

２

近年、テレフタル酸と類似したヘテロ芳香族ジカル
ボン酸である ピリジンジカルボン酸 3'&$
図  をバイオマスの一種であるリグニン原料から生産し、テレフタル酸代替素材として汎用樹脂材料に応用する試みが英国 :DUZLFN 大学と %LRPH %LRSODVWLFV社の研究グループによって報告された  。3'&$は農薬・医薬品の原料としても利用されるほか、ピリジン環に由来する水素結合形成能などを活かして金属
錯体型ガス分離剤  、エンジニアリングプラスチック
、燃料電池用高分子電解質  などのビルディングブロ
ックとしても研究されており、従来テレフタル酸が用いられてきた材料において 3'&$ を用いることで新たな機能を付与できる可能性も秘めている。


図１テレフタル酸と 3'&$ の分子構造
上 記 の 3'&$ 生 産 検 討  で は 、 5KRGRFRFFXVMRVWLL5+$ 株を宿主としてプロトカテク酸ジオ
キシゲナーゼ 3UD$ を異種発現させ、リグニンの分解によって微生物細胞内で生じるプロトカテク酸 3&$をさらに酸化開裂し塩化アンモニウムと反応させることで、 時間で  PJ/ の 3'&$ が得られている。しかし、カテコール型骨格の酸化開裂物にアンモニウム塩を作用させる本手法は、変換に別途アンモニ
ウム塩の添加を必要とする点や開裂物が不安定で夾雑物のアミン基とも反応し収率を低下させ得る点などに課題がある 図  。
図 3&$ の酸化開裂による 3'&$ の形成
一方、既報  にて アミノヒドロキシ安息香酸
$+%$ 資化性菌 %RUGHWHOOD VS G 株由来の 
アミノヒドロキシ安息香酸ジオキシゲナーゼ$KG$ が $+%$ を酸化的に開裂し、その開裂物は後続の分解酵素が存在しない条件下において非酵素的に
3'&$ へと自己変換されることが報告されている。
本反応を用いれば、別途アンモニウム塩を添加する必要がなく、また開裂物が自発的に 3'&$ へと変換されるため安定性に関する課題も解消されると期待される 図  。

用いてグルコース流加培養条件下で  P/ スケールのジャー培養を行い、培養上清中の成分濃度を高速液
体クロマトグラフィーにて分析した結果、 時間時点
で J/ の 3'&$ が検出された 図  。また、その際に検出された $+%$ の濃度はわずか  J/であった。これらのことから、$%$ の  位水酸化反応と $+%$ の酸化開裂反応を & JOXWDPLFXP の代
謝経路に導入することで、グルコースから 3'&$ を生産可能であることが示された。
本研究の結果は、微生物による化学品生産のための人工代謝経路のさらなる多様化と、再生可能資源由来の炭素源を活用した高機能材料の拡大に貢献するものと期待される。













図 ジャー培養における培養上清の各成分の濃度●：3'&$、〇：$+%$


図 $+%$ の酸化開裂による 3'&$ の形成

謝辞 


我々はこれまでに アミノ安息香酸 $%$ の  位
水酸化を触媒する独自の ヒドロキシ安息香酸  位水
酸 化 酵 素 変 異 体 &Y3+%+PXW を コ リ ネ 型 細 菌&RU\QHEDFWHULXPJOXWDPLFXP の代謝経路に導入することで安価な再生可能資源であるグルコースから $+%$ がグラムスケールで得られることを見出しており  、本代謝経路に対してさらに $+%$ の酸化開裂反応を導入することで、グルコースから 3'&$ を生産する新規代謝経路が構築できると考えられる。そこで本研究では、& JOXWDPLFXP を用いてグルコースから $+%$ を経由して 3'&$ を生産することを試みた。


結果 と 考 察 & JOXWDPLFXP  1%5& $7&& 株を親株として内在性の $%$ 生合成経路を強化し、さらに &
JOXWDPLFXP にコドン最適化された &Y3+%+PXW 遺伝子と$KG$ 遺伝子を含む発現カセットを染色体上に導入することで 3'&$ 生産株を作製した。得られた株を

 本研究の一部は 1('2 プロジェクト「カーボンリサ
イクル実現を加速するバイオ由来製品生産技術の開発」に参画して行われました。

文献 









0\FURIW= HWDO *UHHQ&KHP －  
3HOOLV $ HW DO 1DW &RPPXQ  
 
6SHQFH (0 HW DO 0LFURE &HOO )DFW   
特許第  号
特許第  号;LDR/HWDO)XHO&HOOV－  

7DNHQDND6HWDO(XU-%LRFKHP－  
1RQDND . HW DO 5HV 6T >SUHSULQW@：KWWSVGRLRUJUVUVY ３
65

第 75 回日本生物工学会大会

66

Topics of 2023

67

第75
回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
7RSLFVRI
第of 2023

カーボンマテリアルの生物学的な新規利用法の開発
山本 尚毅 ・的場 直樹 ・沖野 智也 ・中西 昭仁 ＊

東京工科大学大学院バイオ・情報メディア研究科， 関西熱化学株式会社， 東京工科大学応用生物学部〒八王子市片倉町  学校法人片柳学園東京工科大学片柳研究所棟.:
7HO
(PDLOQDNDQLVKLDK#VWIWHXDFMS


カーボンマテリアルは、カーボンブラックの成形加工によって調製された表面化学修飾性に富む新規素材である。カーボンマテリアルはその機能物性を有しながらも現在までにその生物学的な利用方法は殆ど開発されておらず、新たな利用方法の開発が望まれている。そこでカーボンマテリア
ルをタンパク質の担体として用いる生物学的利用方法として、カーボンマテリアルの多孔質性に基づく非特異的なタンパク質の吸着ではなく、カーボンマテリアルの化学修飾基を足場にする、ビオチンを介した選択的なタンパク質提示系を提案する。

はじ め に 
酵素は高い反応触媒性から、高付加価値化合物を生産するための触媒として幅広く利用されてきた。しかしその供給には一般的に費用コストが嵩むことから、再利用することで当該コストの低減が切望されている。
酵素の再利用は反応液相から分離し回収することで再利用が可能となる。現在までに、ガラスビーズ  や磁
気ビーズ  、酵母細胞  を担体として酵素を固定化し、担体の自重による自然沈降や遠心による分離・回収法が開発されてきた。しかし磁気ビーズやガラスビーズ
は非常に高価であり、酵母細胞は遺伝子操作を伴った組換え体であって使用法に問題がある。
カーボンブラックは導電性、化学修飾性、加工性に富んだ機能材である。特に化学修飾性は生命工学分野

68

で注目に値するが、現在までに生物学的に応用利用された例は乏しい。カーボンブラックの場合、カルボキ
シ基をはじめとした生命科学分野でなじみの深い官能基を任意に付与できることから、当該分野における利用可能性の拡充が期待された。この度、微粉体である
カーボンブラックを成形加工することで、取り扱いやすさの向上や反応相からの回収利便性を向上させることを目的に、カーボンブラックの導電性や化学修飾性をそのまま継承したカーボンマテリアルを作製した。
本研究ではカーボンブラックを成形加工し、更に酸処理によるカルボキシ基化を施されたカーボンマテリ
アルを用意し、酵素固定化のための担体に用いた。具体的には、カーボンマテリアルのカルボキシ基を足場にビオチンヒドラジドを介した酵素提示系を開発した。

材料 と 方法 
カーボンマテリアルにビオチン提示するために、カーボンマテリアルは '062 雰囲気下で調整された P0 ビオチンヒドラジドに添加された。その後、縮合材としてシアナミドが終濃度  PJP/ になるよう添加され、K、℃、USP の条件で反応に供せられた。
反応後、処理されたカーボンマテリアルはストレプト
アビジン融合 +53 KRUVHUDGLVKSHUR[LGDVH  と混和された。ここで得られたサンプルを、以下 +53 処理済
みカーボンマテリアル +53&0 と呼称する。なお、+53
&0 の +53 提示は、+53 が基質である 70%   
WHWUDPHWK\OEHQ]LGLQH  を酸化して得られる酸化 70%
吸光極大 QP の吸光度によって評価された。

図 㻝 㻚 㻌 㻴 㻾㻼 㻙 㻯 㻹 による 㼀 㻹 㻮 酸 化 を 示 す 㻌㻭 㼎㼟㻢 㻡 㻜 経 時 変 化 㻌 㻌結果 と 考察 
 +53&0 の +53 提示を確認するため、+53&0 の 70% の酸化活性が経時的に評価された 図  。その結果、ビオチンヒドラジドの添加有無、シアナミドの添加有無に関わらず、反応時間  分間において全ての条件で吸光度がプラトーに達し、有意差を確認できなかった。
ビオチンヒドラジドの有無で有意差が確認されなかったことは、ビオチンヒドラジドの介在で +53 提示ができたかどうかを判断できないことを意味した。そのため、カーボンマテリアルへ +53 が非特異的に吸着している可能性が考えられた。文献によれば +53 の孔内の保持に必要な孔径は  QP で十分あるとされていて）、今回のカーボンマテリアルの孔径が  QP であることから、+53 が孔内に格納されるのに十分な孔径であり、+53 の非特異吸着の可能性が考えられた。そこで +53&0 のビオチンヒドラジド介在による +53 提示を示すため、洗浄を挟んだ +53&0 の繰り返し利用
により、非特異吸着されている +53 の影響を除きながら +53 活性の残存率を解析することで、ビオチンヒド
ラジド介在による +53 提示が評価された 図  。その結果、すべての条件において繰り返し利用回数に応じて +53 活性が減少したこと、シアナミドの有無では有意差が確認されなかったこと、一方でビオチンヒドラ
ジド有無では有意差が確認されたことが明らかとなった。以上のことから、シアナミドの有無に関わらず、
ビオチンヒドラジドの有無で +53 の提示が左右されることが考えられ、カーボンマテリアル上のカルボキシ基とビオチンヒドラジドとの結合が間接的に強く示唆された。また、シアナミドがカーボンマテリアルのカ
ルボキシ基とビオチンヒドラジドとの結合形成に影響を及ぼさないことも併せて示唆された。



図 㻌 㻞 㻚 㻌 㻴 㻾㻼 㻙 㻯 㻹 の 繰 り 返 し 利 用 に よる 㻌㻴 㻾㻼 活 性 残 存 率 の 推 移 㻌文献  3DWL64XLQWR0HWDO$QDO&KHP$FWD    7DQJ :-LD % HW DO - 3KDUP %LRPHG$QDO
    1DNDQLVKL $ %DH -* HW DO $SSO
0LFURELRO%LRWHFKQRO
   &KHQ&&'R-6HWDO6HQVRUV
  


69 

第75
75回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 20232023
第高浸透圧下でセリシンを利用した、ハイブリドーマ細胞の抗体生産の増強
竹尾

将俊 1・藤田真杉1

雅也 1・中尾

遼 2・梅田匡志 1・寺田尚希 2・高橋聡 1＊

潤2

福井大学大学院工学研究科，2 セーレン株式会社〒910-8507

福井市文京 3-9-1

Tel: 0776-27-8645

Fax: 0776-27-8747

E-mail: terada@u-fukui.ac.jp

バイオロジクス⽣産量を増加するには・⽣産細胞ごとの、時間当たり⽣産量 を⾼める ⽐⽣産速度 の 向上
・⽣産細胞の総数 (IVC, 細胞数の時間積分値) を増やす
培養液の浸透圧を⾼めると、動物細胞の⽐⽣産速度が 1.5 倍に向上

しかし、細胞増殖・⽣存に悪影響し 細胞総数が減少、⽣産量は増加しない

本研究 の 着眼ピュアセリシンTM を⽤い、⾼浸透圧でも 細胞総数 を維持、⽣産量増加
ハイブリドーマ細胞の抗体⽣産系

6
4
2
0

セリ シ ン

－

－

浸透圧

標準

培養条
高件
圧

＋

動物細胞培養による有用物生産量の増加には、1 細胞当たりの有用物生産量である「比有用物生産速度(μ)」、または培養当たりの細胞数の合計である「細胞数の時間積分値(IVC)」の向上が有効である。これまで

２(1) 浸透圧上昇による⽐⽣産速度の向上、(2) セリシン添加による細胞総数の維持、の両⽅の効果で、

32

浸透圧上昇で、細胞総数 (IVC) が減1少する。
この IVC 減少は、0
セリシンにより、
セリ
シン －⽣理的浸透圧と同等以上に回復した。 浸透圧 標準

１. はじめに70

抗体生産量 （µg/well）

IVC （106 cells/well * h）

ピュアセリシンTM：セーレンと福井⼤が共同開発した、細胞保護に優れる シルクタンパク質

－
圧
培養高
条件

＋

有⽤物⽣産量は２倍以上に増加した。

に、浸透圧の上昇がμを加速することが報告されている。1)しかし浸透圧上昇が細胞増殖を阻害するため IVCが減少し、有用物生産量は改善されない。そこで細胞増殖促進効果に加えて細胞保護効果を持ち、IVC の増大が期待できる「ピュアセリシン TM」に着目した。
ピュアセリシン TM とは、セーレンと福井大が共同開発したシルクタンパク質である。絹の精練過程で生じるセリシン加水分解物から調製される。多様な細胞の増殖を促進する作用に加えて、細胞の凍結解凍で生じる傷害から細胞を保護できることから、ピュアセリシ
ン TM を主成分とする細胞凍結液「セルリザーバーワン」
がナカライテスク社から市販されている。
本研究では、浸透圧の上昇により生じる増殖阻害を
ピュアセリシン TM で緩和することで、ハイブリドーマ細胞によるモノクローナル抗体生産量の改善を目指した。

２. 材料と方法
ハイブリドーマ細胞 2E3-O 株を、ITS-X を添加した
RPMI 培地（富士フイルム和光純薬）で培養した。浸透圧は生理食塩水を標準とし、培地はこれと等張とみなした。モル濃度に基づいて NaCl を添加して浸透圧を調整した。ピュアセリシン TM（富士フイルム和光純薬）を培地に添加し、浸透圧からの細胞保護を目指した。
細胞密度は血球算定盤で計数し、抗体濃度は ELISA 法
で定量した。

３. 結果
高濃度の NaCl 溶液を培養 1 日目に追加し、浸透圧を生理的なレベルの 1.2 倍、1.3 倍、1.4 倍に高めて培養し、そこにピュアセリシン TM を添加して検討した。
図 1 に示すように、浸透圧の上昇によって IVC は減
少したが、セリシン添加で大きく改善した。例えば浸透圧 1.3 倍では、対照の 0.76 から 0.46 ×107 cells*hと 0.60 倍にまで大きく減少したが、この高浸透圧にピュアセリシン TM を添加すると 1.2 ×107 cells*h と、対照の 1.5 倍まで大きく増加した。

細胞数の時間積分値(10^7 cells*h)3

図１. 高浸透圧下の 1 g/L セリシンの IVC 増大効果
一方、抗体生産量については、対照の 1.49 に対して1.3 倍圧にすることで 1.94 µg/well に向上し、ここにセリシンを添加することで 2.49 µg/well へと 1.7 倍まで増大した。
セリシン添加は、それ自体が浸透圧を上昇し、増殖阻害の増大も懸念される。そこで、ピュアセリシン TM
濃度を低めて、培養に有効なピュアセリシン TM 濃度を探索することにした。従来の 1 g/L から、0.3、0.1 g/Lと低減し検討したところ、浸透圧 1.3 倍での IVC は、
ピュアセリシン TM 1 g/L と 0.3 g/L で同等な一方、抗体生産量は 0.3 g/L が 1 g/L より 2 割程、多かった。
そこでピュアセリシン TM 濃度濃度として、0.3 g/L を
これ以降の検討で用いることとした。
さらに、前節で有効であったアミノ酸の追加に加え、グルコースも追加することで高い抗体生産を目指した。
具体的には、培養 3 日目に浸透圧を 1.3 倍に上昇、同時にアミノ酸・グルコースをそれぞれ播種時の半量・1/4 量追加するという検討を行なった。その結果、栄養追加によって IVC はどの条件も増加した。抗体生産についても、浸透圧 1.3 倍への上昇・セリシン添加・栄養追加によって相加的に上昇し、対照の 2.1 倍と大きく改善した。

４. 展望
一層の抗体生産向上を図るため、ピュアセリシン TMに加えて、他の因子も合わせて併用することとする。
この目的で、浸透圧保護因子のベタインに着目する。
ベタインは、高浸透圧環境下で細胞内へ取り込まれ、細胞内の溶質濃度を上昇することで、細胞機能が保たれると考えられている。実際、複数の研究者らによって、高浸透圧条件下での IVC 維持に有効で、タンパク質生産量の向上に有効であると報告されている。3) 4) 5)
そこで、ベタインをピュアセリシン TM と併用し、一層の有用物生産の増加を実現する。

５ .参 考 文 献

2
1
0
－

＋

１倍

－

＋

－

＋

－

＋

１ .２ 倍 １ .３ 倍 １ .４ 倍

1) S. S. Ozturk et al., Biotechnol. and Bioeng.,
37, 989-993, 1991
2) 8. F. H. Christopher et al., Trends Biol. Sci.,
12, 339-344, 1987
3) T. Nakanishi et al., Am. J. Physiol., 258, 10611067, 1990
4) T. K. Kim et al., Biotechnol. Progress, 16, 775781, 2000
5) S. S. Nasseri et al., Biochemical Engineering
Journal, 91, 37-45, 201471３

第  回日本生物工学会大会 7RSLFVRI
第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023

低分子抗体生産に向けた枯草菌技術の開発
東條卓人＊・西口大貴・井上英俊・和田真由美・大浦智之
壺井雄一・川原彰人・小山伸吾・影山泰・瀧村靖
花王株式会社 生物科学研究所
〒和歌山県和歌山市湊 
7HO)D[
(PDLOWRXMRXWDNXWR#NDRFRP



タンパク質の効率的な合成のためのゲノムデザイン
栄養成分

低分子抗体
遺伝子

ゲノム'1$
の削減
不要な
代謝を
カット

強力に転写

P51$

分泌最適化

アミノ酸

枯草菌

%DFLOOXVVXEWLOLV

分解抑制

翻訳効率化

洗剤用酵素製造で培った知見・技術

低分子抗体・以上の発現成功率
・発現量  J/の達成
・培養上清からの直接精製
要旨
バイオ医薬素材として着目される低分子抗体$QWLERG\ )UDJPHQWV に 対 し て 、 我 々 は 枯 草 菌%DFLOOXV VXEWLOLV が配列種を問わず高い発現成功率と生産性を示すこと、およびこれまでに開発した枯草菌によるタンパク質高生産化技術の応用が大幅な生産性の向上に繋がるなど、低分子抗体の生産宿主として有利な形質を示すことを明らかとした。さらに低分子抗体を分泌生産できる特徴は精製工程の負荷低減や簡素化につながることが強く期待され、低分子抗体の活用普及を導く有望な細胞基材であると確信している。
  は じめ に 
近年微生物生産が可能な 9++ 抗体などの低分子抗体が着目されており、次世代のバイオ医薬品素材として盛んに研究開発が行われている。また ,J< をはじめとした完全長抗体のコンシューマー製品 &3 への活用がコロナ禍で加速し、抗体関連分子は医薬のみならず &3にとっても重要な分子となってきている。
一般的に低分子抗体の発現生産には大腸菌が採用されることが多いが、菌体内生産であることに起因して一般的に生産量が低いこと  、また細胞破砕工程や著２
72

量の夾雑タンパク質を除くための複雑な精製工程が必須であることが課題として挙げられる。
一方で我々が着目する枯草菌は細胞外へとタンパク質を分泌発現する特性を有し、目的タンパク質を培養
液中に著量蓄積可能である。この特徴を生かし、枯草菌は世界的にもタンパク質素材の工業生産に活用されており、花王でもこれまで洗剤用酵素生産に枯草菌を活用してきた。また枯草菌は大腸菌と同様にモデル細菌として世界中で学術研究がなされ、非常に多くの知見や技術が蓄積されている微生物でもある。
本発表では菌体外に目的タンパク質を蓄積する特徴を有する枯草菌について、低分子抗体の発現生産に対する有用性を検証するとともに、低分子抗体生産に最適な枯草菌株の開発検討結果について紹介する。
  結 果お よ び 考察 
枯草菌でこれまでに発現試験した多数の 9++ のうち
約 で明瞭な発現が確認され（図 ）、精製した 9++が抗原結合活性を示すことも確認している。なお枯草菌は  種類の細胞外プロテアーゼを有し、その多くが培養液中での 9++ の分解に寄与していることが確認されている（図  。このことから細胞外プロテアーゼを
すべて欠損させた株を利用することで効率的な 9++ 蓄積が可能となる。


図 枯草菌培養上清中に蓄積された 9++抗 +LVWDJ 抗体でのウエスタンブロッティング 図 各細胞外プロテアーゼ欠損が
培養液中の 9++ 蓄積に及ぼす影響
9++ の発現量の向上を目指し、発現コンストラクトの改良やタンパク質生産に不要な遺伝子を削除したゲノム縮小株 0*%  の 活 用 など に よ り 、 実験室株
 と比べ 9++ 発現量が  倍以上向上した事例も確認された。
また 6F)Y や医薬上市されている 9++ 多量体などのモダリティについても発現を確認でき、さらにはゲノム縮小株を用いることで発現量の向上が（図 $）、また 6F)Y については分解抑制がみられる場合があることも確認した（図 %）。


また細胞外プロテアーゼの欠失に伴い、培養上清中において 9++ は室温以上の温度でも分解されることなく長期間安定に保持されることが確認され、精製時に分解抑制のための低温操作などが不要となる可能性がある。加えて、ゲノム縮小株は上清中の夾雑タンパク質が低減する特徴を有しており、ゲノム縮小株を用いた低分子抗体生産を実施することにより精製工程の負荷低減や簡素化につながることが強く期待される（図 ）。さらには培地や培養条件を検討することにより、いくつかの 9++ において J/ 以上の生産性に達することも確認し、枯草菌は低分子抗体の工業生産に適合するポテンシャルを有していると考える。


図 9++ または 6F)Y を発現する実験室株  と
ゲノム縮小株 0*% の培養上清の 6'63$*(  今 後の 展 望 
本検討によって枯草菌は 9++9++ 多量体、6F)Y などの高効率な分泌生産が可能であり、またゲノム縮小株
では発現生産量の向上が見られた。さらにゲノム縮小
株では培養上清中の宿主タンパク質 +&3 が低減できること、および枯草菌で発現生産した低分子抗体は培養上清中でも高度に安定であったことから、精製工程の簡素化などのプロセスへの優位性が期待されることも示した。これらのことから枯草菌は低分子抗体に対する発現適性を有していると言える。枯草菌は研究・産業の両面で世界中で活用されていることから、低分子抗体活用の普及を導く有望な細胞基材として活用されることを期待する。

文   献 図  実験室株  とゲノム縮小株 0*% の
培養上清中に蓄積された $ 9++ 医薬
2]RUDOL]XPDE&DSODFL]XPDE および % 6F)Y
抗 +LVWDJ 抗体でのウエスタンブロッティング /LX<DQG+XDQJ+$SSOLHG0LFURELRORJ\DQG
%LRWHFKQRORJ\–  
0RULPRWR 7 HW DO '1$ 5HVHDUFK  – 

３

73

第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023
第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023

バイオプロセスによるカルノシン生産法の開発
倉本 歩 1,3＊・木野 邦器 1,2・佐藤 謙一郎 3・岡田 行夫 31

早稲田大学理工学術院総合研究所，2 早稲田大学先進理工学部 応用化学科，3 東海物産株式会社〒438-0012

静岡県袋井市国本 2391

東海物産株式会社

Tel: 0538-42-1410

Fax: 0538-44-3005

食品研究所

E-mail: kuramoto@tokaibsn.co.jp

要旨
カルノシンはβ-アラニンと L-ヒスチジンが結合したジペプチドであり，抗酸化作用や抗疲労効果など多様な生理機能を有する有用化合物である．我々はこれまでに，L-アミノ酸リガーゼを高発現させた大腸菌を用いる菌体反応法により，ラボレベルでのカルノシンの高収率生産を達成している．本研究では，カルノシンの実機生産を目指し，培養，反応，精製の諸条件をリットルスケールで検討した．低コストを可能とする
高収率生産プロセスを開発したので報告する．
背景
イミダゾールジペプチド（以下，IDPs）はアミノ酸のヒスチジンを構成成分とするジペプチドの総称であり，代表的なものとして，カルノシン，アンセリン，
バレニン，ホモカルノシンが知られている．これらは抗酸化作用 1)や抗疲労効果 2)，認知症予防効果 3)などの機能を有する機能性素材として注目され，サプリメ
ントや機能性食品素材として広く流通している．哺乳類や鳥類、魚類の筋肉組織中に存在するこれら IDPs は，その動物種によって存在比率や含量が異なっている
4),5)．国内外で使用される機能性食品のほとんどはカル
ノシンとアンセリンであり，それらの製造は専ら鶏や鮭などの天然資源からの抽出法に依存している．しか74

し，天然物からの抽出は，原料の供給や価格が不安定であり，養鶏時の二酸化炭素排出も課題となっている．
我々はこれらの課題を解決するため，バイオプロセスによる生産技術の開発を鋭意検討している．
イミダゾールジペプチド合成活性が向上した改変型
L - アミノ 酸 α- リガ ー ゼの 創 製
L-アミノ酸 α-リガーゼ（以下，Lal）は，ATP の加水分解反応と共役して無保護の L-アミノ酸同士を結合し，ジペプチドを生成する酵素の総称である．Lal の
うち Bacillus subtilis ATCC15245 が産生する YwfE
は，β-アラニンと L-ヒスチジンの 2 種類のアミノ酸からカルノシンを合成する活性を有することが報告されていたが，その合成活性は工業生産に用いるには低かった．そこで我々は YwfE の結晶構造情報などをもとに，本酵素の基質認識部位近傍のアミノ酸残基に部位特異的変異導入を施すことで，カルノシン合成活性の向上した数種類の変異型酵素を取得することに成功した 6)．また，本酵素はβ-アラニンとメチル-L-ヒスチジンを基質とすることで，他の IDPs であるアンセリン（β-アラニル-3-メチル-L-ヒスチジン）やバレニン（βアラニル-1-メチル-L-ヒスチジン）を効率的に合成する触媒活性を有することも明らかにしている．

菌 体法 を 用 いた 効 率 的 カル ノ シン 生 産 技術 の 開 発
Lal による合成反応に必要となる ATP は高コストであり，Lal を使用する酵素法を工業生産に移行することは現実的ではない．そこで，Lal を高発現させた大腸菌を反応触媒とする菌体反応法の開発に取り組んだ．
菌体反応法では，反応液へのグルコース添加によって菌体の糖代謝系と共役して ADP から ATP が再生される
ため，酵素法のように当量の ATP を外部添加する必要がない．また，微生物はペプチダーゼ活性を有するた
め，菌体を用いるプロセスではペプチドを直接生産することは難しいが，大腸菌のカルノシン分解活性は幸
いにも微弱であり，カルノシン生産において大腸菌を使用することに問題は無いと考えた．基質アミノ酸，
グルコースおよび Mg2+を含む反応液で菌体反応を行ったところ，効率的にカルノシンを合成することができた 7)（図 1）。

図 1. 菌体反応法によるカルノシン合成
本カルノシン生産プロセスを実用化するため，培地コストの削減と 1 バッチ反応あたりの生産量向上に向けて検討した。反応条件の検討において，反応液の菌体濃度とカルノシン生産量の相関性を確認しており，生産量向上のためには培養で得られる菌体量を増加させることが必要と考えた．そこで，これまでラボ試験
で大腸菌の培養に使用していた LB 培地から安価かつ食品利用可能な原料を主成分とする工業用の培地組成へ変更したところ，培養で得られる菌体量は増加したが，当該菌体にカルノシン合成活性は認められなかった．この原因として，Lal の発現においてラクトースを発現誘導剤とする pET システムを用いているため，炭素源のグルコースが培地中に含まれることにより
CRP-cAMP 系転写制御やラクトースの取り込み阻害が起こり，目的酵素の発現が抑制されたと推察した 8)．
この課題を解決するため，菌の生育に必要な炭素源をグルコースからグリセロールへと変更し，ラクトース
をあらかじめ培地に添加して培養した結果，改良培地による菌体量増を維持しながらカルノシン合成活性を改善できた．本培養菌体を用いてβ-アラニン，L-ヒス
チジン，グルコース，硫酸マグネシウムを含む反応液で 25 時間反応させたところ，LB 培地培養菌体を用いた時には 3.1 g/L だったカルノシン生産量は菌体量増の効果もあって 7.5 g/L に向上させることに成功した（図 2）．

図 2. LB 培地および改良培地で得られた培養菌体を用いた時のカルノシン生産比較
カ ルノ シ ン 精製 技 術 の 開発
東海物産㈱では鶏肉や鮭の抽出液から高純度のカ
ルノシンやアンセリンを得るために独自の分離精製技術を確立している（平成 30 年度文部科学大臣表彰 科学技術賞受賞）．本研究で得られたカルノシン合成後の反応液にこの分離精製技術を適用することで，98.3%の高純度カルノシン粉末の取得にも成功している．
最 後 に
我々は国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構（NEDO）の支援を受けて，菌体反応による
カルノシンやアンセリンの生産法の開発に取組んでいる．カルノシンについては，上述の通り，合成から精製まで一連の工程を確立した．またアンセリンについてはカルノシンをメチル化する菌体反応系を検討中である．今後は，ラボスケールから実機生産規模へのス
ケールアップを行ない，これら IDPs の商品化を達成
し，健康長寿の実現に貢献していきたい．
文献1) Boldyrev, A., A. et al.: Physiol Rev., 93(4),1803-1845(2013).
2) Nordsborg, N. et al.: Am. J. Physiol. Regul.
Integr. Comp. Physiol., 285(1), 143-148(2003).
3) Hisatsune, T. et al.: J Alzheimers Dis., 50(1),149-159(2016).
4) Abe, H.: Biochem. Physiol. B. Comp. Biochem.
76(1), 35-39(1983).
5) Sewell, D., A. et al.: J. Physiol., 455, 447453(1992).
6) Kino, K. et al.: Biosci. Biotechnol. Biochem.,
87(4), 389-394(2023).
7) 駒林ら，日本生物工学会 2018 年度大会講演要旨集，p.283, 3Ma03
8) 森田鉄兵， 饗場 弘二 ， 化学 と生 物: 43(4),222228(2005).

75

第  回日本生物工学会大会 7RSLFVRI
第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023

糸状菌 Trichoderma reesei における新規誘導プロモーターの探索
一瀬 桜子＊・柴田 望・高橋 史員・小山 伸吾
花王株式会社 生物科学研究所
〒和歌山県和歌山市湊 
7HO)D[
(PDLONR\DPDVKLQJR#NDRFRP  背 景 

食糧危機や環境問題の解決へ向けて、非可食バイオマスからのバイオ燃料やグリーンケミカルスの製造が注目されているが、バイオマスを効率的に利用するた
めには、高効率にバイオマスを分解できる糖化酵素が必要とされる。糸状菌 Trichoderma reesei は、セルラー
ゼやヘミセルラーゼなどの糖化酵素を多量に菌体外に分泌生産することから、糖化酵素の生産宿主としての利用検討が進められている[1]。我々もこれまでに、T.
reesei を生産宿主として高性能な糖化酵素を安価・大量生産できる技術を開発してきた[2]。
さらに近年では、T. reesei の高いタンパク質生産能力を活かして、異種タンパク質の生産宿主としての利用が期待されている[3]。異種遺伝子を発現させるプロ
モーターには、高い発現量を示すセルラーゼ遺伝子
cbh1 のプロモーターが用いられてきた。しかし、cbh1
プロモーターはセルラーゼ生産条件下において活性化するため、目的タンパク質以外にも内在性のセルラー
ゼが同時に生産されるという課題があった。
そこで本研究では、目的タンパク質のみを高生産す76２るために、セルラーゼ生産に関与しない新規の誘導プ
ロモーターを探索することとした。
 2. 結果と考察(1)誘誘 導 剤添 加 に 応 答し た 網 羅 的な 遺 伝 子発 現 解 析セルラーゼ生産に関与しないプロモーターを獲得するために、セルラーゼ生産培養中に誘導剤を添加し、誘導剤添加時特異的に発現する遺伝子を探索した。
誘導剤には、0.2% 尿素、0.2% 硝酸塩、10 μM Co 塩、
10 μM Ni 塩、0.2% エリスリトール及び 0.2% デンプ
ンを用いた。T. reesei PC-3-7 株を 3%セルロース培地で72 時間培養したところに誘導剤を添加し、誘導 8 時間
目における遺伝子発現を RNA-seq にて解析した。その結果、誘導剤非添加条件と比較して、エリスリトール
添加条件において Tr68585、Tr68466、Tr122079 及びTr68606 の 4 遺伝子が、主要なセルラーゼである CBH1
や EG1 などに続いて高発現していた（図 1）。これら 4遺伝子は他の誘導剤添加条件では全く発現していなっ
かったことから、エリスリトールにのみ応答して発現log (RPKM) - with erythritol

12
10

8
6
4
2
0
0

5

10

15

log (RPKM) - without erythritol

図１エリスリトールの有無による遺伝子発現変動(A) Tr68585
0h

2h

0h

2h

150
100

50
0

(C) Tr122079
100
80
60
40
20
0

Relative amount of mRNA(/pgk1)200

Relative amount of mRNA(/pgk1)

Relative amount of mRNA(/pgk1)

Relative amount of mRNA(/pgk1)(2) リアルタイム PCR を用いた遺伝子発現解析
 エリスリトールにのみ応答して発現する可能性のある 4 遺伝子に関して、エリスリトール特異的な発現を示すかをリアルタイム PCR を用いて解析した。この際、エリスリトールに加えて、一般的に培地原料に利用されるグルコースや、エリスリトールと同じ糖アル
コールの一種であるソルビトールが遺伝子発現に関与するか検証した。
菌株には、PC-3-7 株に対して Aspergillus aculeatus 由来-グルコシダーゼを発現させた E1AB1 株を用いた[4]。E1AB1 株を 1%グルコース培地で 48 時間培養し、そこに各炭素源を終濃度 0.2%となるように添加し、添
加後 2 時間目での 4 遺伝子の発現量を内在性コントロール遺伝子 pgk1 との相対定量により解析した。その結果、4 遺伝子全てがグルコースやソルビトールには反応せず、エリスリトールにのみ応答して発現することが確認された（図 2）。以上の結果から、Tr68585、Tr68466、Tr122079 及び Tr68606 はエリトール特異的に発現する遺伝子ということが明らかになった。
120
100
80
60
40
20
0

1.2
1

(B) Tr68466
0h

2h

0h

2h

(D) Tr68606

0.8
0.6
0.4
0.2
0

図 2 リアルタイム PCR による遺伝子発現解析(3) エリスリトール誘導プロモーター としての利用
 エリスリトールに応答して発現する 4 つの遺伝子のプロモーター領域を用いて、目的タンパク質を誘導生産できるか確認した。
モデルタンパク質には T. reesei が生産するキシラナ
ーゼ XYN3 を選択し、各プロモーター領域の下流に

xyn3 遺伝子を連結させた DNA 断片を E1AB1 株に挿入した株を作製した。各株を 1%グルコース培地で 48 時
間培養したところに 0.2% エリスリトールを添加し、4 時間誘導した時点での培養上清中の XYN3 の活性を
p-nitrophenylxylobioside を用いて測定した。その結果、
Tr122079 プロモーター発現株（P122079）ではエリス
リトールの有無に関係なく誘導 0 時間目で XYN3 活性が確認され、Tr68606 プロモーター発現株（P68606）では発現量が低いことにより XYN3 の活性がほとんど認められなかった（図 3）。一方、Tr68466 プロモーター
発現株（P68466）及び Tr68585 プロモーター発現株（P68585）はエリスリトール添加後 4 時間目にのみ
XYN3 の活性が確認できた。以上の結果より、エリス
リトールに応答して遺伝子の発現を誘導し、目的タン
パク質を高生産できる誘導プロモーターとして、
Tr68466 プロモーターと Tr68585 プロモーターを獲得した。
2.5

XYN3 activity (U/mL)

る遺伝子である可能性が考えられた。

0h

4h

-

+ Ery

2
1.5
1
0.5
0

-

+ Ery
Host

-

+ Ery

P68585-+ Ery

P68466-+ Ery

P122079

P68606

図 3 誘導プロモーターによる XYN3 の誘導生産

3. 今後の展望
 本研究の結果より、T. reesei において機能するエリスリトール誘導性プロモーターを獲得した。今後は、誘導プロモーターを利用した異種タンパク質の生産検討を進めると共に、誘導プロモーターを用いた酵素生
産制御システムの構築など、新たな技術への応用利用も進めて行く予定である。
 さらに、エリスリトール生産菌である酵母 Yarrowia
lypolytica において報告されているエリスリトール代謝関連因子と、今回見出した 4 遺伝子が高い相同性を示すことが分かっている。今後これら 4 遺伝子について解析を進めることで、T. reesei におけるエリスリトール代謝経路が明らかになることが期待される。

4. 文献[1] Martinez D, et al.: Nature Biotechnol. 26:553–560.
(2008)[2] 柴田 望ら: 応用糖質科学, 9:249-253. (2019)[3] Arai T, et al.: Microb Cell Fact., 22:103. (2023)[4] Nakazawa H, et al.: Enzyme Microb Technol. 82:89-95.
(2016)

３
77

第 75 回（2023年）日本生物工学会大会
Topics of 2023

特別要旨集

2023 年 8 月 21 日発行
発行所 公益社団法人 日本生物工学会〒 565-0871 大阪府吹田市山田丘 2-1
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