静電気学会誌，41, 3（2017）153-157

J. Inst. Electrostat. Jpn.

論文

微粒子誘電泳動を用いたDNA検出法による豚DNAの選択的検出
山﨑 達郎 ，丁 震昊 ，中野 道彦＊＊，末廣 純也＊＊, 1＊＊（2016年1月17日受付；2017年3月23日受理）

Selective Detection of Pig DNA Extracted from Mixed Meat Using DNA Detection
Method Based on Microbead Dielectrophoresis＊＊＊＊, 1

Tatsuro YAMASAKI , Zhenhao DING , Michihiko NAKANO＊＊

and Junya SUEHIRO（Received January 17, 2017; Accepted March 23, 2017）
We proposed a rapid electrical DNA detection method using dielectrophoresis（ DEP ）of microbeads for polymerase chain
reaction（ PCR ）amplified DNA． The amplified DNA is attached on the microbeads, then, the DNA-labeled microbeads arecollected and detected by dielectrophoretic impedance measurement method. In this study, it was investigated that detection ofpig DNA extracted from raw meat or one mixed with beef. Detection of impurity in not only processed foods but also raw one
by nucleic acid amplification test（ NAT ）such as PCR are increasingly demanded in food industry. Pork is one of theimportant detection targets because of religious demand. To show application of our method on that, DNA extraction from raw
meats, PCR and detection of the amplicon using microbeads DEP were carried out consecutively. At first, purified mtDNA5
was used to investigate detection limit of the method. It was showed the method detected 10 copies of pig mtDNA in the8
mixture of 10 copies of cow mtDNA. Then, the experiments using raw meats were carried out. As the results, 5 mg of pork in50 mg of meat mixed with beef was detected. These results suggest that the method can be used for NAT of food.

1．はじめにを考案した

筆者らは，迅速かつ簡便な細菌検出技術として，誘電増幅する手法であり，病原性細菌やウイルスの高感度検泳動インピーダンス計測（ DEPIM，Dielectrophoretic Im-出法として利用されている ．PCR は原理的に一分子のpedance Measurement ）法 を研究している．誘電泳動とDNA から増幅 DNA を得ることが可能な高感度 DNA 検は，不平等電界中の誘電体粒子に，誘電体及び溶媒の誘出法である．PCR により DNA を増幅した後，なんらか電率と導電率，電界分布と強度，誘電体の大きさ等に依の手法でその増副産物を検出しなければならない．PCR存する力が働く現象である．電界の強い方向に働く場合後に行われる一般的な DNA 検出法であるアガロースゲは正の誘電泳動，弱い方向に働く場合は負の誘電泳動とル電気泳動や DNA プローブ法には，1～3 時間程度が必呼ばれる．誘電泳動はマイクロ粒子だけでなく，DNA要である．一方，Real-time PCR 法は，PCR による DNAやカーボンナノチューブといったナノ材料の操作，集積増幅を光学的手法で逐次モニタリングし，反応終了と同技術としても活発な研究が行われている ．

時に結果がわかるが，装置および試薬が非常に高額であ1）

2）

我々は，DEPIM 法を応用し，PCR（ polymerase chainreaction ）後の DNA を迅速かつ低コストで検出する方法．PCR は DNA を特異的かつ指数関数的に3, 4）5）る．このような現状であるので，PCR 後の DNA を迅速かつ低コストで検出する方法が求められている．
筆者らが新しく考案した DNA 検出法は，誘電体微粒

キーワード：DNA 検出，誘電泳動，PCR，微粒子＊
九州大学大学院 システム情報科学府（〒819-0395 福岡県福岡市西区元岡 744）
Graduate school of information science and electricalengineering, Kyushu University. 744, Motooka, Nishi-ku,
Fukuoka-shi, Fukuoka 819-0395, Japan＊＊
九州大学大学院 システム情報科学研究院（〒 819-0395 福岡県福岡市西区元岡 744）
Faculty of information science and electrical engineering,
Kyushu University. 744, Motooka, Nishi-ku, Fukuoka-shi,
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子に PCR 増幅 DNA を結合させて，その DNA 結合粒子を誘電泳動捕集して，それを DEPIM で検出する．本3, 4）

手法は，微粒子の誘電泳動特性が DNA の結合によって大きく変化するという現象を利用している．すなわち，
DNA 結合前の微粒子は負の誘電泳動を示し，DNA 結合に伴って正の誘電泳動を示す．本手法によって 15 分程度で PCR 後の DNA を測定できる．従来の研究では合成DNA を用いており，実際の生体サンプルから抽出したDNA への適用性は未だ十分には検討していない．
本手法は，PCR 増幅後の増幅 DNA を検出する手法で

154（32）

静電気学会誌 第41巻 第 3 号（2017）あるが，その感度はアガロースゲル電気泳動による検出分で 0.01％の異種肉の混入を検出可能としている．本研とほぼ同程度である．Real-time PCR は高感度な蛍光検

究では，豚肉の混入を想定し，豚 DNA を PCR 増幅し，出システムを採用しているため，その感度は高い．しか微粒子誘電泳動を用いた手法でその増幅 DNA を検出でし，増幅 DNA を検出することから，結果として，PCRきるかどうかを検討した．実験にはまず，精製された豚＋電気泳動と Real-time PCR には，初期 DNA 量に対すミトコンドリア DNA を用い，次に，市販の食肉（豚肉，る 感 度 に 大 き な 差 は な い．Real-time PCR は， 通 常 の牛肉）から抽出した DNA を用いた．

PCR よりも広い範囲での定量性を有している点に特徴がある．アガロースゲル電気泳動による手法では，電気2．実験方法

泳動に 1 時間程度，蛍光染色に 1 時間程度必要であり，2.1 微粒子誘電泳動によるDNA検出法

測定後には有害な蛍光色素を含有する廃棄物が残される

DNA 結合に伴う微粒子の誘電泳動特性の変化を利用し（数百 ml ）．Real-time PCR は，反応後に直ちに結果が得た DNA 検出法を図 1 に示す．本手法では，ビオチン／られるが，最適な反応を設計するためにノウハウが必要

アビジン結合を利用し，PCR 後に DNA を粒子へと結合であり，かつ通常の PCR に比べて高価な蛍光色素を必させる．ビオチン修飾プライマーを用いて PCR を行い，要とすることから 1 回あたりの反応に必要なコストが大増幅 DNA の末端にビオチンを修飾し，そのビオチン修きい．本手法は，微量な誘電体微粒子を用いているため

飾 DNA とアビジン修飾微粒子を結合させる．DNA の結廃棄物の量は少なく（1 ml 以下），後述の通り，電極を合によって微粒子の誘電泳動特性が変化し，DNA 未結合使い捨てにしてもそのコストは高くない．

時には負の誘電泳動力が働き電極間から反発されていた

DNA 検出法には，従来のアガロースゲル電気泳動（蛍ものが，DNA 結合により正の誘電泳動力が働き，電極間光染色）や分光光度計による計測に加えて，最近では，に捕集される．これにより DNA 結合粒子のみを捕集し，固相へ対象 DNA を結合してからその DNA を化学発光，PCR で増幅された DNA を検出する．DEPIM は溶液中の表面プラズモン共鳴，電気化学，電流，蛍光，核酸クロ

細菌を検出する方法で，誘電泳動によって微細電極に細6-8）マトグラフィー等によって検出する手法が示されている ．

菌を捕集し，その捕集に伴う電極間のインピーダンス変微粒子誘電泳動を用いた DNA 検出法は，これらの手法化から細菌を 1 分以内に定量的に検出することができる．と比較して，操作が簡便であること，低コストであることに特徴がある．操作の簡便さは，試料調製が混合・静置によって行えること，測定を容易にプログラミングできることから，特別な訓練等がなくても結果を得ることができる点にある．また，測定時間が 1 分程度と非常に短いことと，本法に必要な消耗品は微粒子と電極であり，どちらも安価に準備できることから低コストであると言える．例えば，市販の DEPIM を用いた口腔内細菌検出
装置 は使い捨て電極を使用するが，そのランニングコ
9）

ストは 150 円／回程度である．
本研究では，微粒子誘電泳動を用いた DNA 検出法の図 1 微粒子の誘電泳動を用いた DNA 検出法
Fig.1 DNA detection method based on microbead dielectrophoresis.

食肉検査への応用を目的として，食肉から抽出した豚DNA を検出可能か検証した．安全衛生の観点以外にも

2.2 精製豚ミトコンドリアDNAの検出

宗教的な観点からも，原材料表示されているもの以外のPCR 増幅対象を豚ミトコンドリア DNA 上の 83 bp 領域ものが食品中に含まれていてはならない（例 : イスラムとした（以下，83 bp DNA と呼ぶ）
．まず，精製豚ミトコ圏における豚肉の忌避）．このような背景の下，種々のンドリア DNA に対してその検出感度を調査した．豚ミト

食品検査が行われているわけであるが，特に，生物由来コンドリア DNA（ MD-PIG 15000，Promega，約 16 kbp ）の混入物に関しては，その遺伝子を検出することが，最を用い，DNA 量を 10 ～10 copy の間で変化させた．PCRも感度が高く，信頼できる ．食品の迅速遺伝子検査法には，
豚ミトコンドリア特異プライマーセット （ PPA6-F

としては，例えば，倉敷紡績株式会社の核酸クロマトグ（20 μM ）：5’-Biotin-GAGATTGTGCGGTTATTAATG，ラフィー検査キット「 GeneFields-Meat 」がある ．こPPA6-R（20 μM ）：CTACCTATTGTCACCTTAGTT ），れは，PCR 後の DNA をクロマトグラフィーにより 40

AmpliTap Gold 360（ Thermo Fisher Science, 4398876） を

10）

11）

7412）

微粒子誘電泳動を用いたDNA検出法による豚DNAの選択的検出（山崎 達郎ら）

155（33）

用いた．PCR 後の DNA 濃度を Qubit 蛍光定量装置（ Life

肉 10 mg ＋牛肉 40 mg，
豚肉 5 mg ＋牛肉 45 mg，牛肉のみ，technologies ）で測定した．とした．

次に，PCR 増幅 DNA と微粒子の結合を以下の手順で行った．微粒子にはストレプトアビジン修飾粒子（ Dynabeads

3．実験結果M-280 Streptavidin，直径 2.8 μm，Life Technologies ）を用3.1 精製豚ミトコンドリアDNAの検出いた．PCR 溶液 10 μl と微粒子を結合溶液（5 mM Tris-

図 2 は精製豚ミトコンドリア DNA から PCR 増幅したHCl（ pH 7.5），0.5 mM EDTA，1 M NaCl ）に懸濁し，1583 bp DNA を結合させた微粒子の DEPIM 応答である．

分間結合させた．結合反応時の微粒子の濃度は 3.5 × 10

豚ミトコンドリア DNA 量を変化させた．初期 DNA 量個 /μl とした．結合反応後，微粒子を Milli-Q 水で 3 回洗10 copy 以上で応答が得られた．

4

浄し，50 μl Milli-Q 水に懸濁した．

5

豚ミトコンドリア DNA と牛ミトコンドリア DNA をDNA 結合微粒子の DEPIM 検出は以下のとおり行った．

混合したものに対して，83 bp DNA を対象に PCR を行微細電極にはガラス基板上に真空蒸着したクロム薄膜をった後，微粒子誘電泳動によって測定した結果を図 3 にフォトリソグラフィーによりパターニングして作製した示す．牛ミトコンドリア DNA の量を 10 copy に固定しキャッスルウォール型電極（最短ギャップ長 5 μm ）を用て，豚ミトコンドリア DNA 量を変化させた．図 2 の結いた ．この電極上に DNA で修飾した微粒子の懸濁液果と同様に，豚ミトコンドリア DNA が 10 copy 以上で50 μl を滴下し，1 分間静止した後，2 Vpp，100 kHz の正応 答 が 得 ら れ た． こ の 結 果 よ り， 牛 ミ ト コ ン ド リ ア

弦波電圧を印加し，ロックインアンプを用いて電極間コDNA が 10 copy 混在していても，10 copy 以上の豚ミトンダクタンスを測定することで DEPIM 応答を取得した．

コンドリア DNA を特異的に検出できることが示された．

4）

8585

また，精製豚ミトコンドリア DNA に精製牛ミトコン
ド リ ア DNA（ MD-COW 15000, Promega, 約 16 kbp ） を混合して，豚ミトコンドリア DNA を選択的に検出できるかどうか検討した．牛ミトコンドリア DNA（10 copy ）8と豚ミトコンドリア DNA（10 ～10 copy ）を混合した．
82

PCR 及び DNA 結合微粒子の測定は上記と同様に行った．

2.3 豚肉抽出DNAの選択的検出
生肉から DNA を抽出し，その DNA を検出できるかどうかを検討した．DNA 抽出から PCR まではミトコンド
リ ア DNA 抽 出 法13）

及び公定法

14）

を 参 考 に 行 っ た．

NucleoSpin Tissue（ TAKARA BIO INC.，U0952A ）を用いて，豚肉及び牛肉 100 mg からそれぞれのミトコンドリアDNA を抽出し，5 mM Tris-HCl（ pH8.5）100 μl に懸濁した．

図 2 精製豚ミトコンドリア DNA の検出
Fig.2 Detection of DNA amplified from purified pig mitochondrial
DNA.

ミトコンドリア DNA 懸濁液とその 10 倍及び 100 倍希釈液 1 μl を PCR（50 μl ）に用いた．PCR 後の DEPIM による DNA 結合微粒子の測定は，上記と同様に行った．

2.4 混合肉試料から豚DNAの選択的検出
豚肉と牛肉の混合肉試料から DNA を抽出し，そこから豚 DNA を検出できるか調査した．各生肉サンプル（ A：
豚肉 50 mg，B：牛肉 50 mg，C：豚肉 30 mg ＋牛肉 20mg，D：豚肉 25 mg ＋牛肉 25 mg ）から mtDNA エキス
トラクターキット（和光純薬）を用いてミトコンドリアDNA を抽出し，TE バッファー25 μl を加えた．抽出 DNA溶液 1 μl を PCR（50 μl ）し，2.3 節と同じ方法で DEPIM検出を行った．また，豚肉と牛肉の混合比を変化させて同様の実験を行った．混合比は DNA 抽出対象生肉量を50 mg として，豚肉のみ，豚肉 15 mg ＋牛肉 35 mg，豚

図 3 豚・牛ミトコンドリア混合 DNA 中の豚ミトコンドリ
ア DNA の検出
Fig.3 DEPIM of microbeads labeled with DNA amplified fromthe mixture of pig and cow mitochondrial DNA.

156（34）

静電気学会誌 第41巻 第 3 号（2017）

3.2 豚肉抽出DNAの検出
図 4 は豚肉と牛肉から抽出した DNA を用いて PCR を行った後の増幅産物のアガロースゲル電気泳動像を示す．豚肉から抽出した DNA からは目的の増幅産物が得られたが，牛肉の場合は得られなかった．また，豚肉抽出 DNA 溶液を 10 倍希釈すると増幅産物が得られなかった．豚肉と牛肉から抽出した DNA を用いて PCR を行った後で，DEPIM によって DNA 検出した結果を図 5 に示す．
アガロースゲル電気泳動で増幅産物が確認されたサンプ
ルでは DEPIM においても応答が得られた．これにより，生肉から抽出した DNA も検出できることが示された．
本実験では 100 mg 程度の生豚肉から抽出した DNA を

図 6 混合肉抽出 DNA の PCR 産物のアガロースゲル電気泳動
Fig.6 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified DNA using
DNA extracted from mixed meats.
Lane M: 100 bp DNA ladder marker, Lane A: Pork 50 mg, B: Beef50 mg, C: Pork 30 mg + Beef 20 mg, D: Pork 25 mg + Beef 25 mg.

100 μl 溶液に懸濁して，そのうち 1 μl を反応に利用した
場合に，豚 DNA を検出した．これが本実験における検出下限であるが，図 4 の結果から，この検出下限は PCRの感度に依存するといえる．

図 4 豚肉および牛肉抽出 DNA の PCR 産物のアガロースゲル
電気泳動
Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified DNA using
DNA extracted from pork and beef.
Lane M: 100 bp DNA ladder marker, Lane 1, 2, 3: Pig（1: asextracted, 2: 1/10 dilution, 3: 1/100 dilution ）, Lane 4, 5, 6: Cow（4:as extracted, 5: 1/10 dilution, 6: 1/100 dilution ）図 7 混合肉中の豚 DNA の検出
Fig.7 DEPIM results of DNA amplified by using DNA extracted
from mixed meats.

副産物で修飾した微粒子の DEPIM 応答を図 7 に示す．
アガロースゲル電気泳動で増幅産物が確認された試料はDEPIM においても応答が得られた．サンプル A，C，Dの DEPIM 応答を比べると初期豚肉量は A ＞ C ＞ D であったが，DEPIM 応答では D ＞ A ＞ C になった．この要因として，生肉からの DNA 抽出の再現性と PCR 増幅のプラトーの二つが考えられる．後者に関しては，一般に PCR では，そのサイクルごとに DNA が指数関数的に増幅されるが，あるサイクル後にはそれ以上は DNA が増幅されなくなる（プラトー（飽和））．そのため，プラ

図 5 豚肉および牛肉を用いた豚 DNA の検出
Fig.5 DEPIM results for amplified DNA using DNA extracted
from pork and beef.

トーに達したあとの増幅 DNA 量は初期 DNA 量にほとんど関係なく，ほぼ等しい．微粒子誘電泳動を用いた
DNA 検出法は定量的に対象 DNA を検出できる

15）

ため，プラトーを考慮した PCR サイクル数の最適化によって，3.3 混合肉試料から豚DNAの選択的検出定量的に豚 DNA を検出できるようになると考えている．

図 6 は豚と牛の生肉単体及びそれらを混合した試料か豚肉と牛肉の混合比を変化させた時の結果を図 8 に示ら抽出した DNA を PCR で増幅した後の増幅産物のアガす．牛肉のみの試料以外でコンダクタンスの上昇が計測

ロースゲル電気泳動を示す．試料に豚肉が含まれているされた．また，応答量は豚肉量が相対的に増大するほどときのみ目的の増幅産物が得られた．これらの PCR 増大きくなった．図 7 とは結果が異なっているのは，初期

微粒子誘電泳動を用いたDNA検出法による豚DNAの選択的検出（山崎 達郎ら）

157（35）

参考文献
1） J. Suehiro, R. Yatsunami, R. Hamada and M. Hara:
Quantitative estimation of biological cell concentrationsuspended in aqueous medium by using dielectrophoretic
impedance measurement method. J. Phys. D: Appl. Phys., 32（1999）2814
2） R. Hamada, J. Suehiro, M. Nakano, T. Kikutani and K.
Konishi: Development of rapid oral bacteria detection
apparatus based on dielectrophoretic impedance measurement
method. IET Nanobiotechnol., 5（2011）25
3） M. Nakano, Z. Ding, H. Kasahara and J. Suehiro: Rapid
図 8 混合比率を変化させた場合の混合肉中の豚 DNA の検出
Fig.8 DEPIM of DNA amplified by using DNA extracted fromdifferent ratio of mixed meats.

豚肉の量が少ないため，15 mg～5 mg の範囲では PCR

microbead-based DNA detection using dielectrophoresis andimpedance measurement. Europhys. Lett., 108（2014）28003
4） 中野道彦，丁震昊，笠原弘道，尾原稜司，末廣純也：

DNA 結合に伴う誘電体微粒子の誘電泳動特性変化の特性．静電気学会誌，40（2016）20

増幅がプラトーに達していなかったためであると考えて

5） D. N. Fredrickes and D. A. Relman: Application of polymerase

いる．以上の結果より，混合肉 50 mg 中に含まれる豚肉

chain reaction to the diagnosis of infectious diseases. Clin.

5 mg（重量比 10 ％）を本手法で検出可能であること，

Infect. Dis., 29（1999）475

混合肉中の豚肉量に応じた応答が得られることが示された．

6） J. Chao, D. Zhu, Y. Zhang, L. Wang and C. Fan: DNA
nanotechnology-enabled biosensors. Biosens. Bioelectron., 76（2016）68-79

4．まとめ
微粒子誘電泳動を用いた DNA 検出法を食品の遺伝子検査へと応用できるかどうか検討した．本研究は，本手法を利用し，豚と牛のミトコンドリア DNA 及び食肉（豚肉，牛肉）から抽出した DNA を用い，豚 DNA をターゲットとして検出を試みた．結果として，豚肉及び豚と牛の混合肉試料から豚 DNA を検出可能であることを示した．また，豚ミトコンドリア DNA が 10 copy 以上の場合5に本手法により検出可能であることを示した．豚ミトコ

7） X. Mao, Y. Ma, A. Zhang, L. Zhang, L. Zeng and G. Liu:
Disposable nucleic acid biosensors based on gold nanoparticle
probes and lateral flow strip. Anal. Chem., 81（2009）16601668
8） S. Hongo, J. Okada, K. Hashimoto, K. Tsuji, M. Nikaido andN. Gemma: Development of an automated DNA detection
system using an electrochemical DNA chip technology. SICEJCMSI, 1（2008）265-270
9） 細菌カウンタ，パナソニックヘルスケア株式会社，http://www.panasonic-healthcare.com/jp/dental/bacterial-counter

ンドリア DNA の他に牛ミトコンドリア DNA が混在して

10）F. Postollec, H. Falentin, S. Pavan, J. Combrisson and D.

いる場合においても豚ミトコンドリア DNA が 10 copy 以Sohier: Recent advances in quantitative PCR（ qPCR ）上の場合に検出可能であることを示した．食品表示の正applications in food microbiology. Food Microbiology, 285

確性に対する要求は年々高まっており，それを担保するための検査には，特異性が高く高感度でかつ迅速であることが求められる．本研究で示した PCR と微粒子誘電泳動を組み合わせた DNA 検出法は，特異性と感度を高感度な遺伝子増幅法である PCR によって担保し，その増幅（2011）84811） GeneFields-Meat，倉敷紡績株式会社，http://www.kurabo.
co.jp/bio/product/products.php?M=D&PID=17112）T. Yoshida, T. Nomura, N. Shinoda, T. Kusama, K. Kadowaki
and K. Sugiura: Development of PCR Primers for theDetection of Porcine DNA in Feed Using mtATP6 as the

DNA を高速 DNA 検出法である微粒子誘電泳動による方Target Sequence. J. Food Hyg. Soc. Japan, 50（2009）89

法で検出することで検査全体の迅速性を達成している．

13）Sutarno, J. M. Cummins, J. Greeff and A. J. Lymbery:

このことから本手法が食品分野における遺伝子検査に貢Mitochondrial DNA polymorphisms and fertility in beef.

献できる可能性は高いと考えている．
謝辞
本 研 究 の 一 部 は， 科 研 費 26289125 及 び 15K06111，
JST マッチングプランナー「探索試験」（ MP27215668071）の援助で行われた．記して謝意を示す．

Theriogenology, 57（2002）1603
14）試料分析基準

第 16 章動物由来 DNA（2008-4-1・19 消

安第 14729 号）
15）Z. Ding, H. Kasahara, M. Nakano and J. Suehiro: Bacterial
detection based on polymerase chain reaction and microbead
dielectrophoresis characteristics. IET Nanobiotechnol.,
accepted, DOI: 10.1049/iet-nbt.2016.0186