課題番号：26指106
研究課題名：肝臓における代謝シグナルの解明と創薬標的の探索
主任研究者名 ：酒井 真志人
分担研究者名 ：キーワード
研究成果

：糖尿病
：脂肪肝 インスリン抵抗性 転写エピジェネティクス① 肝臓における脂肪酸・中性脂肪合成経路の役割の解明
脂肪酸合成酵素（fatty acid synthase: FAS）は、グルコースからパルミチン酸を合成するリポジェニック酵素であり、インスリンによって発現が誘導される。FAS は脂肪酸・中性脂肪合成経路の鍵となる酵素であり、肥満・２型糖尿病の肝臓ではその発現が亢進していることが知られている。しかし、脂肪肝を合併する 2 型糖尿病の病態における FAS の発現亢進の病態生理学的意義は明らかにされていなかった。脂肪肝合併２型糖尿病の病態における FAS の関与を検討するために ob/ob マウス（以下ob/ob）を対照として肝臓特異的 FAS 欠損 ob/ob マウス（以下 KO）の代謝表現型解析を行った。KO では ob/ob に比べ、著明な脂肪肝の抑制とグルコース負荷試験における耐糖能の劇的な改善を認める一方、随時の高血糖を示した。肝臓のメタボローム・遺伝子発現・インスリンシグナルの解析から、ob/obマウスにおける肝臓特異的な FAS の欠損により、① 絶食時には脂肪酸酸化の抑制による ATP 量の減少
および G6Pase 発現の減少による糖新生の抑制、Glucokinase の増加によって肝糖取り込み量が増加し、② 摂食時には解糖系・脂肪酸合成経路での糖利用の低下により、グルコースは主にグリコーゲン合成経路に流入するが、グリコーゲン蓄積が飽和すると糖取り込みが低下し、随時高血糖を呈することが明らかとなった。本研究より、肥満・糖尿病における肝臓の FAS の発現亢進は、単なるインスリン抵抗性の増悪因子ではなく、脂肪酸合成・糖新生・脂肪酸酸化経路に多面的に作用し、絶食-摂食サイクルにおける血糖値の変動を軽減し、血糖の恒常性維持に寄与していることが示唆された。

② 肝臓における摂食依存的な遺伝子発現調節メカニズムの解明
転写調節因子 CITED2 および CITED2 と相互作用する分子であるヒストンアセチル基転移酵素 GCN5、CITED2 のターゲット遺伝子である SetU が摂食依存的な遺伝子発現調節メカニズムに果たす役割を明らかにするために、モデル動物の作製、遺伝子発現解析、分子メカニズムの解析を並行して進めている。
ヒストンアセチル化酵素 GCN5 の肝臓の摂食依存的な遺伝子発現調節メカニズムにおける役割を明らかにするために、肝臓特異的 GCN5 欠損マウスを作製した。
SetU はリジンメチル化酵素ドメインである SET ドメインを有し、メチル化酵素だと考えられていたが、その酵素活性は不明であった。我々は、SetU および SET ドメインに変異を入れた不活性型変異体
SetUΔSET を用いて In Vitro Methyltransferase assay をおこなうことで、SetU がメチル化酵素活性を持つことを明らかにした。そこで、次に SetU の代謝調節作用に必要な相互作用因子、基質の同定を試みた。これまでに SetU 結合蛋白の網羅的探索や共沈実験から SetU と相互作用する転写共役因子およびサーチュインファミリーの脱アセチル化酵素の１つである分子 X を同定した。さらには、SetU の標的遺伝子を明らかにするために、SetU をノックダウンした初代培養肝細胞および肝臓特異的 SetU欠損マウスの肝臓で cDNA Microarray をおこない、発現変動遺伝子を網羅的に同定した。これらの結果に基づき、SetU の肝糖脂質代謝における役割を解析していく予定である。

Subject No.

：26S106

Title：Elucidating hepatic metabolic signaling to identify novel therapeutic targets fortype 2 diabetes
Researchers ：Mashito Sakai
Key word：Diabetes mellitus, NAFLD, Insulin resistance, Transcription, Epigenetics

Abstract：

1. Understanding the role of fatty acid and triglyceride synthesis in the liver
Fatty acid synthase (FAS) catalyzes the first committed step in de novo lipogenesis to generatepalmitate. Hepatic FAS expression is increased in obese diabetic subjects, however, thepathophysiological role of FAS in type 2 diabetes with fatty liver is yet to be elucidated. We
examined the role of FAS in type 2 diabetes using liver-specific FAS knockout ob/ob mice (ob/obLKO).
While hepatic FAS deletion improved fatty liver and glucose tolerance, it aggravated fed
hyperglycemia. Therefore, we carried out metabolomic analysis to understand the mechanism bywhich hepatic FAS deletion leads to this phenotype. Our results suggest that during fasting,decreased ATP production (due to impaired fatty acid oxidation) and decreased G6Pase expression
in the liver of ob/ob LKO suppress hepatic gluconeogenesis. Down-regulation of gluconeogenesis
and up-regulation of Gck expression increases hepatic glucose uptake. During feeding, glucose
mainly enters the glycogen synthetic pathway as the glucose flux in the glycolytic pathway isdisturbed by hepatic FAS deletion. Hepatic glucose uptake is impaired after saturation of theglycogen synthetic pathway, resulting in fed hyperglycemia.
Increased expression of hepatic FAS in obese diabetic subjects may contribute in improving
glucose homeostasis by regulating de novo lipogenesis, gluconeogenesis, fatty acid oxidation, andhepatic glucose uptake.
2.

Elucidating feeding-dependent transcriptional regulation in the liver

As planned, we generated genetically modified mice and analyzed gene expression as well as
relevant molecular mechanisms to understand the role of transcriptional regulators CITED2,GCN5, and SetU in feeding-dependent transcriptional regulation in the liver.
We generated liver-specific GCN5 knockout mice to determine the role of histone
acetyltransferase GCN5 in transcriptional regulation of metabolic genes in the liver.
Although the enzymatic activity of SetU has not been determined, the presence of SET domainsuggests its activity as lysine methyltransferase. We performed in vitro methyltransferase assay
to confirm the methyltransferase activity using SetU WT and SetU ΔSET, which harbors
mutation in the SET domain. We also identified protein X, belonging to sirtuin family, as
SetU-interacting protein using co-immunoprecipitation assay. cDNA microarray analysis withSetU-depleted hepatocytes and liver-specific SetU knockout mice comprehensively revealed target
genes of SetU. Based on these findings, currently we are trying to elucidate the role of SetU in
glucose and lipid metabolism in the liver.

Researchers には、分担研究者を記載する。

肝臓における代謝シグナルの解明と創薬標的の探索

26指106① 肝臓における脂肪酸・中性脂肪合成経路の役割の解明
ob/ob LKOマウスの随時高血糖とそのメカニズム** P < 0.01
**

**

**

**

**

300
200
100

ob/ob
ob/ob LKO
4812 16 20 24Weeks

500

Glucose (mg dl–1)

Glucose (mg dl–1)

400

0ob/ob LKOマウスの耐糖能の改善とそのメカニズム* P < 0.05, ** P < 0.01400300***200**
ob/obob/ob LKO

10000306090**120

Time (min)ob/obマウスの遺伝的背景を導入した肝臓特異的FAS欠損マウス(ob/ob LKO)は、脂肪肝は軽減するものの、著明な随時高血糖を示す(左図)。

ob/ob LKOは絶食時にグルコース負荷後の血糖上昇が著明に抑制されており、耐糖能が大きく改善している(左図)。

ob/ob LKOではFASの欠損により解糖系・脂肪酸合成系による糖利用が低下しているため、摂食時にグルコー
スは主にグリコーゲン合成経路に流入するが、グリコーゲン蓄積が飽和すると糖取り込みが低下し、随時高血糖を呈する(右図)。

絶食時には脂肪酸酸化の抑制によるATP量の減少及びG6Paseの発現の減少による糖新生の抑制、Glucokinaseの増加によって肝糖取り込み量が増加する(右図)。

糖尿病・肥満における肝臓の脂肪酸・中性脂肪合成経路の病態生理学的意義を明らかにするために、肥満糖尿病モデルマウスであるob/obマウスの遺伝的背景を導入した肝臓特異的FAS欠損マウス(ob/ob LKO)を作製し解析をおこなった。ob/ob LKOは随時高血糖を呈する一方で、絶食時には著明な耐糖能の改善を示した。インスリン感受性はコントロールと同等であったことから、これらの代謝表現型が肝内代謝産物の変化に起因することを想定して肝組織メタボローム解析をおこない、その結果をもとにして上記のメカニズムを明らかにした。
これまでの結果から肥満・糖尿病における肝臓のFASの発現亢進は、単なるインスリン抵抗性の増悪因子ではなく、脂肪酸合成・糖新生・脂肪酸酸経路に多面的に作用し、絶食−摂食サイクルにおける血糖値の変動を軽減し、血糖の恒常性維持に寄与していることが示唆された。

肝臓における代謝シグナルの解明と創薬標的の探索

26指106② 肝臓における摂食依存的な遺伝子発現調節メカニズムの解明

Relative mRNA abundanceRelative mRNA abundance

肝臓特異的SetU欠損マウス(SetU)の肝臓における遺伝子発現変化 (qRT-PCR)
1.5

Rev-erbα

11.2

Rev-erbβ*p < 0.051*

0.501.5

Control

LKO

Srebf21.

*0.5010Control*

LKO

Cyp7a180.8*

GCN5はCITED2依存性に相互作用するPKAによってリン酸化され、PGC-1αからHistone H3に基質が換わることでPGC-1αコアクチベーター活性の増加とヒストンアセチル化が起こり、糖新生系酵素の発現を強く誘導する。摂食時にはインスリンによるCITED2とGCN5の相互作用の抑制と、cAMP量の減少によって、GCN5のリン酸化は減少し、糖新生が抑制される。

LKO

肝臓特異的GCN5欠損マウスを作製中であり、摂食時の遺伝子発現調節におけるGCN5の作用、糖尿病モデルマウスの肝臓におけるGCN5欠損の効果を解析予定である。

60.640.4

20.20.

GCN5機能の摂食サイクル依存的な調節機構

Control

LKO0Control

概日リズム、脂肪酸/コレステロール代謝に関与する遺伝子の発現の変化がみられた。

転写調節因子CITED2、及びCITED2と相互作用するヒストンアセチル基転移酵素であるGCN5、CITED2の標的遺伝子であるSetUによる摂食依存的な遺伝子発現調節メカニズムの解析から、糖尿病をはじめとする生活習慣病の新規創薬ターゲットを同定する。平成26年度
では、肝臓特異的GCN5欠損マウスの作製、肝臓特異的SetU欠損マウスの肝臓における網羅的な遺伝子発現解析、CITED2/PKA依存的なGCN5のHAT機能制御に対するインスリンの効果について検討をおこなった。今後、メチル化酵素SetUによる代謝調節の分子メカニズム、摂食依存的な遺伝子発現調節に対するCITED2/GCN5の作用の解析を進める。

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：26指106
研究課題名：肝臓における代謝シグナルの解明と創薬標的の探索
主任研究者名：酒井 真志人
論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

年

タイトル

発表者

学会名

場所

年月

該当なし
学会発表
酒井 真志人, 辻村-早川 知
ヒストンアセチル化酵素GCN5による肝第51回 日本臨床分子, 山地 大介, 八木 孝, 春臓の糖新生調節機構の解明
子医学会学術集会
日 雅人, 松本 道宏

東京2014年4月

八木 孝, 酒井 真志人, 辻村
肝臓の脂肪酸合成酵素は肥満・糖尿病-早川 知子, 山地 大介, 内 第51回 日本臨床分の病態において肝脂肪蓄積の促進と高田 亨, 楯谷 三四郎, 春日子医学会学術集会
血糖の抑制に寄与する
雅人, 南 史朗, 松本 道宏

東京2014年4月

CITED2-GCN5複合体による肝糖新生調節 酒井 真志人, 春日 雅人, 松 第87回 日本内分泌機構の解明
本 道宏
学会学術総会福岡

2014年4月

酒井 真志人,辻村 知子,山ヒストンアセチル化酵素GCN5による肝第57回日本糖尿病学
地 大介,八木 孝,春日 雅
大阪
臓の糖新生調節機構の解明
会年次学術集会
人,松本 道宏
八木 孝, 酒井 真志人, 辻
脂肪酸合成酵素FASの脂肪肝・インスリ 村-早川 知子, 山地 大介, 第57回日本糖尿病学
大阪
ン抵抗性における機能の解析
内田 亨, 楯谷 三四郎, 春日 会年次学術集会
雅人, 南 史朗, 松本 道宏

2014年5月

2014年5月

CITED2-GCN5複合体による肝糖新生調節 松本 道宏, 酒井 真志人, 春 第14回日本蛋白質科
横浜機構
日 雅人,学学会年会

2014年6月

八木 孝, 酒井 真志人, 辻村
過栄養による脂肪肝・糖尿病における-早川 知子, 山地 大介, 春 第1回 肝臓と糖尿肝臓のde novo lipogenesis亢進の病態
日 雅人, 南 史朗, 松本 道 病・代謝研究会
生理学的意義の検討宏東京2014年7月

八木 孝,酒井 真志人,内田
肝臓特異的な脂肪酸合成酵素の欠損は 亨, 辻村-早川 知子, 山地
第19回アディポサイ
ob/obマウスの脂肪肝と耐糖能を改善す 大介, 矢野 宏行, 満島エンス・シンポジウ 大阪
るが随時高血糖を惹起する
勝, 長嶋 洋治, 南 史朗,
ム
春日 雅人, 松本 道宏

2014年8月

Histone acetyltransferase GCN5
Mashito Sakai, Masato
regulates hepatic gluconeogenesis
Kasuga, Michihiro
through CITED2-dependent substrate
Matsumotoswitch

9th Metabolic
Syndrome, Type 2
Diabetes andAtherosclerosis
Congress(MSDA)

京都

2014年9月

酒井 真志人,辻村-早川 知
ヒストンアセチル化酵素GCN5による肝 子,山地 大介,八木 孝,矢臓の糖新生調節機構の解明
野 宏行, 満島 勝, 春日雅人,松本 道宏

第29回日本糖尿病合東京併症学会

2014年10月

八木 孝, 酒井 真志人,
肝臓特異的な脂肪酸合成酵素の欠損は 内田 亨, 辻村-早川 知子,
第29回日本糖尿病合ob/obマウスの脂肪肝と耐糖能を改善す 山地 大介, 矢野 宏行, 満東京併症学会
るが随時高血糖を惹起する
島 勝, 長嶋 洋治, 南 史朗, 春日 雅人, 松本 道宏

2014年10月

八木 孝, 酒井 真志人,内肝臓特異的な脂肪酸合成酵素の欠損は 田 亨, 辻村-早川 知子, 山ob/obマウスの脂肪肝と耐糖能を改善す 地 大介, 矢野 宏行, 満島 第35回日本肥満学会 宮崎るが随時高血糖を惹起する
勝, 長嶋 洋治, 南 史朗,
春日 雅人,松本 道宏

2014年10月

ヒストンアセチル化酵素GCN5はCITED2依存的に基質指向性を変化させ肝臓の 松本 道宏, 酒井 真志人
糖新生を制御する

2014年11月

第37回日本分子生物
横浜学会

研究発表及び特許取得報告について

酒井 真志人,辻村 知子,山CITED2-GCN5 複合体による肝糖新生調 地 大介,八木 孝,満島節機構の解明
勝,矢野 宏行, 春日 雅人,松本 道宏

第26回分子糖尿病学
高知シンポジウム

2014年12月

八木 孝, 酒井 真志人, 内
肝臓特異的な脂肪酸合成酵素の欠損は 田 亨,辻村（早川）知子, 山
第18回日本病態栄養ob/obマウスの脂肪肝と耐糖能を改善す 地 大介, 矢野 宏行, 満島
京都
学年次学術集会
るが随時高血糖を惹起する
勝, 長嶋 洋治, 南 史朗,
春日 雅人, 松本 道宏

2015年1月

酒井 真志人,辻村-早川 知
CITED2-GCN5複合体による肝糖新生制御 子,山地 大介,八木 孝,満 冬の若手ワーク
機構の解明
島 勝,矢野 宏行, 春日 雅 ショップ2015
人,松本 道宏

2015年2月

伊香保

酒井 真志人,辻村-早川 知
第29回日本糖尿病・
CITED2-GCN5複合体による肝糖新生調節 子,山地 大介,八木 孝,満肥満動物学会年次学 京都
機構の解明
島 勝,矢野 宏行, 春日 雅術集会
人,松本 道宏

2015年2月

八木 孝, 酒井 真志人, 辻
肝臓特異的な脂肪酸合成酵素の欠損は 村-早川 知子, 山地 大介, 第29回日本糖尿病・ob/obマウスの脂肪肝と耐糖能を改善す 矢野 宏行, 満島 勝, 内 肥満動物学会年次学 京都
るが随時高血糖を惹起する
田 亨, 長嶋 洋治, 南 史術集会朗, 春日 雅人, 松本 道宏

2015年2月

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル
インスリン・グルカゴンと飢餓応答
特許取得状況について
発明名称

発表者
松本 道宏, 酒井 真志人※出願申請中のものは(発表先
The Lipid Vol.26
NO.1, 14-21, 2015

場所

年月日
2015年1月10日)記載のこと。
登録番号

該当なし
※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者） 登録日（共願は全記載） (申請日)

出願国