担子菌類によるダイオキシン汚染された環境の修復に関する研究
研究期間(平成 13 年度～14 年度)
高田**

智 ,飯田隆雄 ,須田隆一*,石橋哲也*2,堀川和美*,世良暢之*,村上光一*，
中山宏*,石黒靖尚*,松枝隆彦*,黒川陽一*,飛石和大*

要

旨

担子菌によるダイオキシン類の環境汚染修復法を確立するため,化学物質の分解能が優れ,保存安定性の高い担子菌類の探査・検索を行った.森林地帯から腐朽材を採取し,分解活性,保存法及び分解活性の長期安定化法を検討した.採取した 557 の腐朽材から 206 株のリグニン分解性担子菌類が得られた.それらをブナ木粉培地とポテトデキストロース寒天(PDA)培地に植え培養した.生育後,前者はダイオキシン分解の一次スクリーニングに供するとともに冷蔵保存,後者は冷凍保存した.一次スクリーニングの結果,30％以上の分解率を示す株が 24 株得られ,そのうち 50％以上の分解率を示す株は 7 株であった.それらについてダイオキシン分解能の再現性及び保存による劣化をみるため二次スクリーニングを行った.
冷蔵保存株を用いた二次スクリーニングでは,ほとんどの株で一次スクリーニングよりも低かったが,2,3 の株では分解率は 20－30％と低いが一次スクリーニングと同程度の分解率が得られた.さらに，冷蔵及び冷凍保存株の両方を用い,活性の回復とその維持を図るため,木粉,米ぬか等の種々の培地を米成し保存性を調べた．しかし,冷凍保存株では活性の回復がみられる株はなかった.一方,木粉生育株において No.264 だけが木粉を含む培地で植え継ぎ,生分解を行った場合,分解能が維持できることが判明した.この株は冷蔵及び冷凍保存でも活性は保たれた.この株を用いて,大牟田川のダイオキシン調査で汚染の原因となった油状物質中のクロロベンゼン類及びダイオキシン類の分解を試みた.その結果,クロロ
ベンゼン類については塩素数の多いペンタ及びヘキサクロロベンゼンはほとんど分解されなかったが,その他は 20％以上分解され,そのなかでも 1,3,5-トリクロロベンゼンが最も高く 73.4%分解された.ダイ
オキシン類については含有量の多かった七及び八塩素化体について測定した.八塩素化体の分解率は 10%程度と低かったが七塩素化体は 30 から 40％分解された.本研究では,①木粉を含む培地で生育させ,冷蔵又は冷凍保存すると分解活性を維持することができること及び②多種類の化学物質に汚染された水環境の修復に応用が可能であることを実験的に示した.

[キーワード:担子菌類,ダイオキシン類，環境汚染修復]

１．はじめにディエーション）には最適な微生物であると期待されていリグニンは微生物による分解を受け難く，自然界に存在る．

する有機物のなかで最も分解され難い物質とされている担子菌類を環イオ復（ディエーションに応用するためが，担子菌類はこのリグニンを分解する優れた能力を備えには，その分解活性が，長期間維持され且つ安定であるこている．なかでも白色腐朽菌の 1 種 Phanerochaeteとが必須条件である.今までの研究で P.chrysosprium とchrysosporium は種々の化学物質の分解能力が報告されてP.sordida はダイオキシンの分解能を示したが分解活性を1)-2).しかし，他の担子菌類に関する研究は非常に限維持し長期間保存することが難しかった.そこで，新たにられている．著者らは白色腐朽菌 P.chrysosporium 及び森林地帯より担子菌類を採取し，ダイオキシン分解能をもP.sordida によってダイオキシン類や PCBs が分解されるった菌類をスクリーニングし，保存法，活性回復法についいることを明らかにした

3)-5).担子菌類は多くの化学物質を同て調査した．

時に分解する能力があることから,環境修復（環イオ復（福岡県保健環境研究所*2* 福岡県リサイクル総合研究センター（〒818-0135 福岡県太宰府市大字向佐野 39）（〒808-0135 福岡県北九州市若松区ひびきの 2-1）

２

研究方法

２－１

育させた株)を木粉培地に植え,培養した菌株を第一次ス

担子菌の採取クリーニングに使用した.木粉で生育させた菌株は木粉と平成 11 年 8 月から平成 12 年 11 月にかけて福岡県およ共に 4℃で保存した(以下,木粉生育冷蔵保存株という).実び屋久島の森林地帯から可能な限り多くの担子菌を採取

験はリグニン分解酵素が分泌される低窒素(LN)培地及びした．採取地点及び腐朽材数は表１に示す.福岡県森林林

分泌されないとされているポテトデキストロース(PD)培業技術センターから分与された株は Pleurotus

地の両方で行った.第一次スクリーニングにおいて,分解ostreatusが認められた菌株を PDA 培地に植え継ぎ,その生育度が（ヒラタケ）である．
表１グニン分解性担子菌類のスクリーニング結果
採取地点
英彦山系
五箇の荘
森林林業技術センター
背振山系
古処山系
屋久島
釈迦岳
三郡・宝満山系
岳滅鬼山
皿倉山
犬ヶ岳
合計(枚数)

採取日
H7.8.24
H7.9.16
H11.9
H7.10.4
H7.10.7
H11.10.13-15
H7.11.9H8.1.19
H8.3.20
H8.3.28
H8.11.28

腐朽材数682238521768265181440557

リグニン分解性株数
180216148035176018206

良好な株を第二次スクリーニングに供した.一次,二次ス
クリーニングとも菌類を培地に植種し,６日後にダイオキシン類標準品(ジベンゾ-p-ジオキシン及びジベンゾフランのそれぞれ 2,3,7,8 位が塩素置換された四から八塩素化体の 10 種類：図 5,p.7)を添加し,15 日間培養したのち,生分解を停止,クリーンアップ後,内部標準品を加え,ダイオキシンの濃度を高分解能ガスクロマトグラフ-質量分質計で測定した．
なお,対照試料として,同様な期間培養した菌をオート

２－２

リグニン分解性担子菌類のスクリーニング法

リグニン分解性能のスクリーニングは西田らの簡易法（担子菌類に存在するフェノールオキシダーゼの有無でク復ーブで滅菌し,ダイオキシンを加え,15 日間培養したものを用いた．
２－４生分解試験法判定）で行った．リグニン分解性を示した菌株はブナ木粉

第二次スクリーニングにおいて活性がみられた菌類のに植菌し,一定期間（最大 30 日）培養した.生育がみられなかから, PDA 生育冷凍保存株及び木粉生育冷蔵保存株

た菌株について,一次スクリーニングを行った.一次スクについて,ダイオキシン分解試験を行い,活性の低下がみ

リーニングに使用した菌株は木粉と共に４℃で保存した.

られない株を選択し優良株とし,環境試料に応用した.まダイオキシン分解の再現性及び保存による劣化の有無をた,活性の維持又は回復の可能性を探るため,種々の培地みるため,一定期間（6－12 ヶ月）保存後,ポテトデキストを調製し,検討した．

ロース寒天（PDA）培地に植え継ぎ,植種菌を調製し,ダイオキシン分解試験の二次スクリーニングを行った.二次ス

３

結果及び考察クリーニングにおいて,保存に対する安定性及び分解に再３－１

生分解試験法の検討

現性がみられる株の選択を行い,ダイオキシン類分解試験

菌株 No.264 を用いて分解試験後の検体の抽出方法に及を実施した.さらに,活性に再現性が認められた菌類につぼす回収率の影響を検討した.菌をそのままヘキサン又はいて保存法（4℃,-80℃），植継,培養法等を詳細に調査し酢酸エチルで抽出した場合,回収率はそれぞれ 20.5 及びた.採取した腐朽材には種々の微生物が寄生していると考20.1％であった.一方,菌を硫酸で溶解した後,ヘキサンでえられ,まず,着生した担子菌類を純化するため,ベノミル抽出すると回収率は平均 80.6％であった.この結果より生及びスト復プトマイシンを含む PDA 培地に植種した.生分解後,硫酸を添加し検体を抽出する必要があることが確育した菌についてリグニン分解性試験を行った.リグニン認された．

分解性を示した菌類は PDA 培地で生育させた後,木粉培一次スクリーニングでは菌を木粉とともに接種するが,地に植え継ぎ,培養すると共に，PDA 培地で生育させた菌

木粉は硫酸に溶解されない.木粉にダイオキシンが吸着さ株は－80℃で冷凍保存（以下，PDA 生育冷凍保存株といれ,回収率に影響することが考えられるが,木粉とともにう）した．

接種した実験と PDA ディスクを接種した実験では全く同２－３担子菌の保存方法の検討

じ結果が得られることから木粉に吸着されていたとして化学物質の分解においては,一般的に保存株から PDAもヘキサンでダイオキシンは完全に回収されることが分培地に植え継いで植種菌とする方法が用いられている．分

かり,実験結果には影響がないことが判明した．

解活性に関する当所における過去の調査では,木粉を含む３－２腐朽材の採取及びリグニン分解性試験

培地に戻すことによって活性の若干の回復がみられたこ

表１に示したように平成 11 年 8 月から平成 12 年 11 月とから,今回はリグニン分解活性がみられた株(PDA で生にかけて森林地帯から採取した 557 の腐朽材について，リグニン分解性試験を行った結果,206 株（37％）がリグニンの分解能力を示した．
３－３ダイオキシン分解菌の一次スクリーニング

この実験のうち,活性の維持及び回復が認められた菌株
No.264 についての結果を以下に示す．
木粉生育冷蔵保存株:

PDA 培地に植え継ぎ生分解を一次及び二次スクリーニング結果の一部を表 2 に示し行った場合,全く分解はみられなかった．しかし,木粉入りた.一次スクリーニング結果,30％以上の分解率を示した

PDA 培地（WPDA）に植え継ぎ実験を行った場合（表 3，菌類は 24 株であった. LN 及び PD 培地の両方で分解がみNo.1），LN 培地で 38.7％という分解率が得られ,一次スクられた株数は 5 株であり, LN 及び PD 培地のいずれかで分リーニングの結果（31.2％）よりも,分解率は高くかった．

解が認められた菌類はそれぞれ 11 株,8 株であった.また,

しかし, PD 培地では分解は見られなかった.分解の傾向は

LN 及び PD 培地の両方で 50％以上の分解率を示した菌類みられた.更に, WPDA に植え継いで行った場合,ほとんは No.6 の 1 株のみであり，それぞれ 65.0％及び 59.4％ど分解がみられなかった．

であった. LN 培地だけでは 3 株で, No.55（64.2％），No.77

木粉生育冷凍保存株：表 3 の No.3-6 は 4℃で保存され（51.7％）及び No.279（70.3％）, PD 培地においても 3ていた株を約 12 ヵ月後に冷凍保存したものである.実験株で No.5（50.9％）, No.201（87.0％）及び No.438（63.2％）は約 6 ヶ月冷凍保存後に PD 液体培地で 5 日間培養し,更であった．に表に示すような培地で培養し,生分解を行った. No.5 の３－４

木粉・米ぬか培地に植え継いだ場合, PD 培地で 38.8％のダイオキシン分解菌の二次スクリーニング

二次スクリーニングについては木粉生育冷蔵保存株を分解率が得られている．

PDA 培地に植え継ぎ,生分解試験を行った.一次スクリー

PDA 生育冷凍保存株：木粉株と同様 PDA 培地に植え継ニングにおいて 30％以上の分解が認められた 24 株のうちぎ生分解を行った場合,全く分解されなかった．しかし,3 株は LN 及び PD 培地において菌の生育が非常においか

WPDA に植え継ぎ実験を行った場合の分解率は高くなか又は全く生育せず,二次スクリーニングを行うことはできったが分解の傾向はみられた.そこで,保存株を WPDA になかった．残りの 21 株とその他 20％以上の分解率を示し,植え継ぎ,さらにブナ木粉,スギ木粉,米ぬかを種々の割合保存状態がよく，また,生育のよい株 21 株についても二次に混合した培地を用いた生育させ,生分解を行ったところ,スクリーニングを行った.二次スクリーニングの結果は若干分解率は回復するものの,分解率は約 20％以下であり,No.43,266 及び 292 は一次スクリーニングと同等の結果が木粉生育株より分解率は PDA 培地で培養したものを冷凍得られたが,その他の株は一次スクリーニングよりも非常保存しても活性が低下することが判明した.に低い分解率であり,50％以上の分解率を示す株は得られ数多くの菌株について活性回復に関する実験を行ったなかった.このように保存（3 ヶ月から約 1 年）によってなかで, No.264 株は種々の植え継ぎ法によって唯一,分解急速に分解能力が落ちることが判明した．そのなかでも,活性が現れた株である.一次,二次スクリーニングでは LN,最も高い分解率は No.266 で LN, PD 培地でそれぞれPD 培地両方で分解がみられているが（表 2），分解性回復27.6％及び 37.1％であった.

法の実験では LN, PD 培地のいずれか一方でのみ分解がみ３－５られている．この理由は現時点では分からない．今後の調分解活性回復法の検討

二次スクリーニングで最高の分解率を示した No.266 は元来,他の菌類に比較して非常に生育速度が遅い株であっ査が必要である．
３－６環境試料への応用

た，この実験は菌株を保存後,２ヶ月半経過後行ったもの

平成 12 年,大牟田川で検出された黒色油状物質（クロロであった.その分解を再確認するために,保存 10 ヶ月後,ベンゼン類が主成分でダイオキシン類も含む）を対象に優同様な実験を行ったところ, PDA 培地での生育は初期の良株として選択した No.264 によるクロロベンゼン類の分速度より更に遅くなり,培地全体がワインカラーとなり,解とダイオキシン類の分解を試みた.表５にクロロベンゼ生分解に適さない株に変化した.また, PDA 生育冷凍保存ン類の分解結果を示す.ペンタクロ及びヘキサクロロベン株も PDA 培地上での生育状況は同様であった.このこと

ゼンはほとんど分解されずその他は 20％以上分解された.

から一次スクリーニングで分解活性がみられた株のうち,なかでも 1,3,5-トリクロロベンゼンが最も高く 73.4％分PDA 培地, LN 及び PD 培地での生育,更に保存状態のよか解された.ダイオキシン類は塩素数が多くても分解されるった 8 株（No.9610219,6,43,55,264,269,292，438）につが,クロロベンゼン類の場合は塩素数が多くなると分解さいて木粉生育冷蔵保存株と PDA 生育冷凍保存株を用いてれない.この違いは,ダイオキシン骨格に酸素原子が含ま活性維持及び回復法の検討を行った. No.201 についてはれているため,塩素数が多くても分解されやすくなってい冷凍保存株について行った．

るものと考えられる．

表２No

ダイオキシン類の分解試験結果

採取地点

菌株 No

1 次スクリーニング*
分解率(%)

2 次スクリーニング*
分解率(%)

LN 培地
PD 培地
LN 培地
PD 培地
35.6
42.9
7.910.2
1 犬が丘
961029
32.5
17.4
25.6
21.3
43 英彦山4324.0
19.1
16.9
15.8
89 背振89
23.7
41.3
2.3
10.3
44 古処128-3
28.5
14.3
6.2
14.9
81 屋久島
228-2
31.2
36.1
18.5
17.3
98 屋久島
264
35.9
41.8
27.6
37.1
99 屋久島
266
29.3
20.6
18.3
12.2
100 屋久島
269
70.3
12.0
15.8
11.5
104 屋久島
279
38.7
5.0
10.0
10.5
112 屋久島
291-3
28.8
32.3
26.9
17.1
113 屋久島292*スクリーニングにおける数値はダイオキシン類 10 種類の分解率の平均値

表３

クロロベンゼン類の分解試験結果

クロロベンゼン類
油状物質中の濃度(mg/g)
モノクロロベンゼン
25.8
1,3-ジクロロベンゼン
3.6
1,4-ジクロロベンゼン
162.7
1,2-ジクロロベンゼン
106.7
1,2,4-トリクロロベンゼン
71.5
1,3,5-トリクロロベンゼン
17.0
1,2,4,5-テトラクロロベンゼン
18.9
1,2,3,4-テトラクロロベンゼン
81.9
ペンタクロロベンゼン
27.4
ヘキサクロロベンゼン
7.7
油状物質 0.5085g/20ml のアセトン溶液を 10μl を加え分解実験を行った

４を踏まえ，今後，より分解率の高い菌類を採取することが可能ならば実用化に向けて更に前進すると考えられる．

５行政的意義，貢献

ダイオキシン類対策の中でも土壌汚染の低減化は行政上重要な課題となっている.現在,ダイオキシン類による汚染土壌の修復法として熱分解法が主に研究されているが,コストが高く，二次汚染の可能性もある.本法は環境の自然回復力を活用しようとするものであるため,二次汚染の少ない環境にやさしい方法と考えられ今後の発展が期待される．

分解率(%)
21.6
46.3
37.3
54.2
47.1
73.4
28.1
23.0
13.5
5.2

結論と今後の課題

256 種の担子菌を採取し，リグニン分解能の一次スクリーニング,ダイオキシン類分解能のスクリーニング,保存方法を検討した結果,以下のことが明らかにした．
①PDA 培地上で生育させた菌類の冷凍保存はダイオキシン分解を目的とする場合,長期間の保存には適切ではない.
②冷凍保存法としてグリセリン溶液で保存した菌類は全
く PDA 培地上では生育がみられず,グリセリン保存は担

謝辞
この研究にご理解を賜り,終始ご指導,ご支援を頂いた
当所

加藤元博所長,北森成治副所長,保健福祉部薬務課

今地政美課長技術補佐,保健福祉部企画課

井尻潤企画主幹,田村聡技術主査に深謝します.この調査で用いたブナ及びスギ木粉,米ぬか等は福岡県森林林業技術センターから,快く提供して頂いた.特に資源開発課金子周平課長からきのこについてご指導・ご教授頂いた.ここに深く感謝いたします.この調査で用いた培地の調製についてご協力頂いた佐伯かおり氏に深く感謝するとともに,この調査の遂行にご理解,ご協力を賜った当所病理細菌課

長野英俊

主任技師,濱崎光宏主任技師,環境部環境政策課

田中義人技術主査及び当所水質課

志水信弘主任技師に感謝致します．

子菌類には適さない.
③木粉で生育させた菌類を冷蔵又は冷凍保存する.市販品の 3ml 程度のチューブに入れ,乾燥を防ぐために,滅菌水を加えて保存する.
④保存株で活性が回復しない場合,腐朽材から分離することによって,以前と同じ活性が得られる場合があった．できれば腐朽材そのものを一次スクリーニングが終わるまで③の方法で保存する.
⑤植え継ぎに用いる培地は PDA 寒天培地よりも 0.2％木粉入り PDA 寒天培地の方が菌の生育がよい場合があり，その上ダイオキシン分解能も保持されると考えられる.
⑥菌類採取後はスクリーニングを 3 ヶ月以内に終了すること.
No.264 の分解率は 30％程度と低いが,比較的保存に耐え分解能が安定した株であった. No.264 を多種類の化学物質を含む環境汚染試料に応用したところ,分解できることが分かり,実用化への可能性が示唆された．
以上，提案したダイオキシン分解活性維持法及び保存法

参考文献
1）B. W. Bogan and R. T. Lamar: Appl. Environ. Microbiol.,
61,2631（1995）.
2）J．A．Bumpus，M．Tien，D．WrightandS．D.

Aust:Science,228,1434（1985）.
3）S.Takada,M.Nakamura,T.Matsueda,R.Kondo and K.
Sakai: ApplI. Environ. Microbiol.,62,4323（1996）.
4）高田智:環境管理，35,562（1999）.
（2002）.
5）特許，福岡県,特開平 10-323646.
6）高田智他:担子菌類によるダイオキシン類の分解研究報
告書,福岡県保健環境研究所（2003）.