課題番号：２６指１０３
研究課題名 ：次世代シーケンサを活用した結核菌等の薬剤耐性菌の高度・迅速検査法の開発と臨床応用
主任研究者名 ：秋山 徹
分担研究者名 ：切替 照雄
キーワード ：結核菌、全ゲノム配列、次世代シーケンサ、オンライン解析システム、分子疫学、ゲノム疫学、ネットワーク構築
研究成果：
研究目的：結核菌は世界最大規模の感染症であり、さらに抗菌剤がほとんど奏功しない多剤耐性菌の出現が問題となっている。結核菌の疫学的検査や薬剤耐性検査は PCR や培養などの労力を要する手法で実施されている。これらの検査の基盤はすべて結核菌の持つ遺伝子情報であり、結核菌全ゲノム情報取得により、理論的にはそれらを網羅的に解析可能である。次世代シーケンサの出現は結核菌全ゲノム情報の短時間で安価な入手を可能とした。筆者等は国内随一の次世代シーケンサによる病原体ゲノム解析の実績を有しており、既に千例以上の結核菌などの臨床分離株の全ゲノム解析を実施している。これらの実績を元に、これまで個別実施されていた結核菌の薬剤耐性・疫学検査を、次世代シーケンサによる解析で包括的に実施可能な基盤を開発した。結核の専門家はもとより、それ以外の研究者なども、次世代シーケンサのデータのみで、結核菌の薬剤耐性情報と疫学情報を取得可能とし、さらに従来では事実上不可能だった SNP レベルでの比較を行う高精細な結核菌型別を可能とする Web サービスを構築し、一般公開した。本研究では、一般公開されたサービスの有用性を検証するため、地方衛研と協力して、地方衛研に保有される結核菌株の詳細な疫学解析を行っている。
必要性：結核菌治療の根幹である抗結核薬投与には、標的株の薬剤耐性情報獲得が必須である。これ
らの情報は従来、培養や PCR などの労力や時間を要する手法で個別実施されてきた。次世代シーケン
サのデータによりこれらの情報を統合的に扱える基盤が構築可能である。次世代シーケンスにより、従来の疫学解析では検討不可能だった、接触感染事例など類似性の高い菌株同士の関係を解析することも可能となる。そのため、本計画で構築される結核解析基盤は、高精度でより迅速な結核菌治療開始に極めて有用であり必須の基盤となる。これらの基盤を誰でも利用可能とするため、結核菌が収集されている地方衛研と協力して、保有株の詳細な疫学解析を行うことは、結核の全体像を把握するために極めて重要である。
期待される成果：本計画で構築される基盤は、結核菌臨床分離株のゲノム解析による薬剤耐性検出と疫学的情報を包括的に取得するための、検体採取からデータ出力までの徹底的に最適化されたワークフローを提供する。バイオインフォマティクスなどの高度な知識なしで利用可能な結核用 Web サーバーは、これまで存在しないため、結核菌の臨床と研究の両面に大きく貢献する。本研究では結核菌が収集されている地方衛研のネットワークを構築することで日本の結核の基本的な疫学情報が高精細に解明される。従来の結核の疫学解析は、大まかな菌の系統は把握可能であるが、集団感染事例など、元来、菌株同士が密接な関係にある事例を解析するのに足る解像力を持った系統解析法は、近年ようやく現実のものとなった全ゲノム配列解析を利用した SNP レベルの解析のみである。近年では、薬剤耐性になりやすい結核菌系統が報告されており、結核菌全体の疫学的動向を常に監視し、多剤耐性結核の出現などをモニターする必要がある。結核菌の薬剤耐性、疫学情報はすべて固有の遺伝子情報に基づいているため、対象菌株の全ゲノム解析により、理論的にはこれらの情報を取得可能である。本
研究では、自動化解析サーバーにより、これまで煩雑な手段で実施されてきた結核菌の薬剤耐性情報や疫学情報を誰でも簡単に解析可能とする。

研究成果：本研究では、構築される結核菌の自動解析 Web サービスについて、地方衛生研究所などと協力して、結核菌全ゲノム配列の次世代シーケンサによる解析を、ノウハウを有する当センターで実施し、臨床分離株を中心に解析支援を行うスキームを構築することで、構築されたサーバーの効率的運用を促進し、新規の高度感染症診断技術の均てん化を図った。地方衛研との共同研究で、過去数年間の分離菌株すべてについて、全ゲノム配列を解析し、各菌株の疫学的背景を明らかにすることで、当該地域における、結核菌の伝搬状況を分子レベルで初めて明らかにすることができた。加えて、当該地域で発生した、集団感染疑い事例について、全ゲノム解析により、実際にそれらの症例が集団感染であることを分子レベルで確認した。
これまで個別実施されていた結核菌の薬剤耐性・疫学検査を、次世代シーケンサによる解析に包括的に置き換える基盤を開発した。結核の専門家はもとより、それ以外の研究者なども、次世代シーケンサのデータのみで、結核菌の薬剤耐性情報と疫学情報（一般的に知られるものとしてスポリゴタイピ
ング、VNTR、Beijing 型別など）を取得可能とし、さらに従来では事実上不可能だった SNP レベルでの比較を行う高精細な結核菌型別を可能とする Web サービスを構築し、一般公開した。当該ホームペー
ジは国立国際医療研究センターホームページから直接アクセス可能である（http://castb.ri.ncgm.go.jp/CASTB/）。すでに当該サービスには 1381 株のデータが登録されており、日本・韓国・中国・南アフリカ・英国・米国・インド・シンガポール・ブラジル・ニュージーラ
ンド・ロシア・タイ・ドイツ・オランダのユーザにより広く利用されている。

Subject No.

：26A103

Title：Development and translational research for precise and rapid analyses for drug

resistance pathogens including Mycobacterium tuberculosis complex based on next generation
sequencing.
Researchers ： Tohru Miyoshi-Akiyama and Teruo Kirikae
Key word： Mycobacterium tuberculosis, whole genome sequence, next generation sequencer,

online analysis, molecular epidemiology, genome epidemiology, network establishment
Abstract：
We developed a server enabling online epidemiological analyses, prediction of drug

resistance, and phylogenetic analysis based on SNP concatemers for M. tuberculosis. This CASTB
consists of a bacterial isolate genome sequence database (BIGSdb), a velvet de novo assembler,
MUMmer utilities and custom scripts. This CASTB can analyze three types of data, NGS (gzippedfastq file), assembled contigs (Multi Fasta) and registered isolate sequences. After determining
whether the up-loaded sequences correspond to M. tuberculosis, CASTB performs spoligotyping,large sequence polymorphism (LSP) typing, Beijing typing and VNTR virtually, all of which areused to type these strains. These epidemiological data can be merged seamlessly with existingdata based on wet experiments. Furthermore, CASTB performs phylogenetic analysis based onSNP concatemers, allowing very high-resolution analysis of relationships among M. tuberculosis
isolates.
We analyzed the whole genome sequences of 18 laboratory strains obtained from the National
Center for Biotechnology Information database using CASTB. The performance of the CASTB
analysis to determine genotypings, including spoligotyping, VNTR, LSP and Beijing typing wassatisfactory and accorded with available published data. We also analyzed 259 clinical isolates,
including 36 drug-resistant isolates, which have been reported. The predictions of drug resistanceby CASTB were consistent with the results of drug susceptibility testing. We are currently
conducting an epidemiological study of M. tuberculosis clinical isolates in Tochigi prefecture,
Japan. The results of which will be reported elsewhere.
Currently, 1381 isolates have been registered in the service, and the service was utilized by users
from Japan, Korea China, South Africa, United Kingdom, United states, India, Singapore, Brazil,
New Zeeland Russia federation, Thailand, Germany and Netherland. Information in the database
to analyze isolates is constantly updated, and analysis speed has been improved improvement
dramatically by refinement of the algorism.
In conclusion, CASTB is a useful tool for identifying strains from WGS data, even whenbioinformatics knowledge is limited. User feedback may further improve CASTB, (email:CASTB@ri.ncgm.go.jp).
(modified from our publication (Iwai H, Kato-Miyazawa M, Kirikae T, Miyoshi-Akiyama T. CASTB(the comprehensive analysis server for the Mycobacterium tuberculosis complex): A publicly
accessible web server for epidemiological analyses, drug-resistance prediction and phylogenetic
comparisonofclinicalisolates.

Tuberculosis(Edinb).

2015

10.1016/j.tube.2015.09.002. Epub 2015 Oct 19. PubMed PMID: 26542225.0
Researchers には、分担研究者を記載する。

Dec;95(6):843-4.

doi:結核菌等の病原体の全ゲノムオンライン解析
・結核菌の薬剤耐性・疫学情報を、次世代シーケンサ(NGS)による全ゲノム解析に基づき、自動判定するソフトウェアとコンピュータを構築し、対外的な解析サービスを提供する。

結核検体

国立国際他機関（地方衛研など）

ゲノム抽出

特徴
・NGSデータに基づく結核菌の薬剤耐性・疫学情報解析の自動化サービスを提供
・NGSデータさえあれば、専門家でなくとも詳細な結核菌解析が可能。
・現時点で類似サービスは存在しない
・NGSデータ取得のためのNCGMを中心とした地方衛研などの機関ネットワークを構築既にWebサービス公開を完了(h-p://castb.ri.ncgm.go.jp/CASTB/）NGSで一気に全ゲノムデータを取得
Sequencing for all.

高速コンピュータと新規開発ソフト
ウェアにより、必要な遺伝子情報を抽出・自動判定

薬剤耐性・疫学情報
高精細系統解析公開されているオンライン解析システム
トップ画面
The Comprehensive Analysis Server for the Mycobacterium tuberculosis complex -CASTB-

2015/03/03 13:26

配列アップロードと解析選択画面

The Comprehensive Analysis Server for theMycobacterium tuberculosis complex
Introduction

Introduction
Analysis
Site policy
Acknowledgment
Registration
Limitation

A total solution for
epidemiological and genomic
analysis of Mycobacterium
tuberculosis complex
Epidemiological and genomicanalysis of Mycobacterium
tuberculosis is crucial to control
tuberculosis (TB). Several methods
have been developed to date,

History

including variable numbers oftandem repeats (VNTR), spoligotyping, IS6110-based

Contactrestriction fragment length polymorphism (RFLP)
typing , lineage analysis based on Long Sequence
Polymorphism (LSP), and Beijing typing for
epidemiological analysis of TB. In addition,phylogenetic analysis based on Single Nucleotide
Polymorphism (SNP) concatamers is becoming a
powerful tool for higher resolution analysis in the era of
next-generation sequencing. Further detection of
mutations associated with drug resistance of TB is also

解析結果画面と結果のダウンロード先リンク

important due to the increasing number of cases ofdrug-resistant TB.
These analyses are based on genome sequence
information, and therefore the availability of whole-h-p://castb.ri.ncgm.go.jp/CASTB/

genome sequence data will facilitate analysis in silico
instead of individual wet lab experiments.
CASTB, a publicly accessible web
server, provides a total solution by
adapting to whole-genome
sequence data from any type ofnext-generation sequence. CASTB
http://castb.ri.ncgm.go.jp/CASTB/

1/2 ページ・すでに1381株のデータが登録されている。
・日本・韓国・中国・南アフリカ・英国・米国・インド・シンガポール・ブラジル・ニュージーラン
ド・ロシア・タイ・ドイツ・オランダのユーザによって広く利用されている。

課題番号：２６指１０３

研究課題名：次世代シーケンサを活用した結核菌等の薬剤耐性菌の高度・迅速検査法の Web サーバー開発
主任研究者名 ：秋山 徹
分担研究者名 ：秋山 徹

キーワード：結核菌、全ゲノム配列、次世代シーケンサ、オンライン解析システム

研究成果

：

研究目的：結核菌は世界最大規模の感染症であり、さらに抗菌剤がほとんど奏功しない多剤耐性菌の出現が問題となっている。結核菌の疫学的検査や薬剤耐性検査は PCR や培養などの労力を要する手法で実施されている。これらの検査の基盤はすべて結核菌の持つ遺伝子情報であり、結核菌全ゲノム情報取得により、理論的にはそれらを網羅的に解析可能である。次世代シーケンサの出現は結核菌全ゲノム情報の短時間で安価な入手を可能とした。筆者等は国内随一の次世代シーケンサによる病原体ゲノム解析の実績を有しており、既に数百に及ぶ結核菌などの臨床分離株の全ゲノム解析を実施している。これらの実績を元に、これまで個別実施されていた結核菌の薬剤耐性・疫学検査を、次世代シーケンサによる解析に包括的に置き換える基盤を開発する。結核の専門家はもとより、それ以外の研究者なども、次世代シーケンサのデータのみで、結核菌の薬剤耐性情報と疫学情報を取得可能とし、さらに従来では事実上不可能だった SNP レベルでの比較を行う高精細な結核菌型別を可能とする Web サービスを構築し、一般公開する。
研究結果：結核菌の疫学的検査や薬剤耐性検査は PCR や培養などの労力を要する手法で実施されている。これらの検査の基盤はすべて結核菌の持つ遺伝子情報であり、結核菌全ゲノム情報取得により、理論的にはそれらを網羅的に解析可能である。次世代シーケンサの出現は結核菌全ゲノム情報の短時間で安価な入手を可能とした。筆者等は国内随一の次世代シーケンサによる病原体ゲノム解析の実績を有しており、既に数百に及ぶ結核菌などの臨床分離株の全ゲノム解析を実施している。これらの実績を元に、これまで個別実施されていた結核菌の薬剤耐性・疫学検査を、次世代シーケンサによる解析に包括的に置き換える基盤を開発した。結核の専門家はもとより、それ以外の研究者なども、次世代シーケンサのデータのみで、結核菌の薬剤耐性情報と疫学情報（一般的に知られるものとしてスポリゴタイピング、VNTR、Beijing 型別など）を取得可能とし、さらに従来では事実上不可能だった SNPレベルでの比較を行う高精細な結核菌型別を可能とする Web サービスを構築し、一般公開した。当該
ホームページは国立国際医療研究センターホームページから直接アクセス可能である（http://castb.ri.ncgm.go.jp/CASTB/）。霜害サービスにはすでに 1381 株のデータが登録されており、日本・韓国・中国・南アフリカ・英国・米国・インド・シンガポール・ブラジル・ニュージーラ
ンド・ロシア・タイ・ドイツ・オランダのユーザにより広く利用されている。薬剤耐性変異などの情報は随時アップデートされている。また解析アルゴリズムの見直しにより、一部の解析の速度を劇的に向上させることができた。これらの成果を以下の査読有り論文にて公表した。

Iwai H, Kato-Miyazawa M, Kirikae T, Miyoshi-Akiyama T. CASTB (the comprehensive analysis server
for the Mycobacterium tuberculosis complex): A publicly accessible web server for
epidemiological analyses, drug-resistance prediction and phylogenetic comparison of clinicalisolates. Tuberculosis (Edinb). 2015 Dec;95(6):843-4. doi: 10.1016/j.tube.2015.09.002. Epub2015 Oct 19. PubMed PMID: 26542225.

課題番号：２６指１０３

研究課題名：次世代シーケンサを活用した結核菌等の薬剤耐性菌の高度・迅速検査法のネットワーク構築
主任研究者名 ：秋山 徹
分担研究者名 ：切替 照雄

キーワード：結核菌、分子疫学、ゲノム疫学、ネットワーク構築

研究成果

：

研究目的：結核菌は世界最大規模の感染症であり、さらに抗菌剤がほとんど奏功しない多剤耐性菌の出現が問題となっている。結核菌の疫学的検査や薬剤耐性検査は PCR や培養などの労力を要する手法で実施されている。これらの検査の基盤はすべて結核菌の持つ遺伝子情報であり、結核菌全ゲノム情報取得により、理論的にはそれらを網羅的に解析可能である。次世代シーケンサの出現は結核菌全ゲノム情報の短時間で安価な入手を可能とした。筆者等は国内随一の次世代シーケンサによる病原体ゲノム解析の実績を有しており、既に千例以上の結核菌などの臨床分離株の全ゲノム解析を実施している。これらの実績を元に、これまで個別実施されていた結核菌の薬剤耐性・疫学検査を、次世代シーケンサによる解析に包括的に置き換える基盤を開発する。結核の専門家はもとより、それ以外の研究者なども、次世代シーケンサのデータのみで、結核菌の薬剤耐性情報と疫学情報を取得可能とし、さらに従来では事実上不可能だった SNP レベルでの比較を行う高精細な結核菌型別を可能とする Web サービスを構築し、一般公開する。本研究では、一般公開されたサービスの有用性を検証するため、地方衛研と協力して、地方衛研に保有される結核菌株の詳細な疫学解析を行う。
必要性：結核菌治療の根幹である抗結核薬投与には、標的株の薬剤耐性情報獲得が必須である。これ
らの情報は従来、培養や PCR などの労力や時間を要する手法で個別実施されてきた。次世代シーケン
サのデータによりこれらの情報を統合的に扱える基盤が構築可能である。次世代シーケンスにより、従来の疫学解析では検討不可能だった、接触感染事例など類似性の高い菌株同士の関係を解析することも可能となる。そのため、本計画で構築される結核解析基盤は、高精度でより迅速な結核菌治療開始に極めて有用であり必須の基盤となる。これらの基盤を誰でも利用可能とするため、結核菌が収集されている地方衛研と協力して、保有株の詳細な疫学解析を行うことは、結核の全体像を把握するために極めて重要である。
期待される成果：本計画で構築される基盤は、結核菌臨床分離株のゲノム解析による薬剤耐性検出と疫学的情報を包括的に取得するための、検体採取からデータ出力までの徹底的に最適化されたワークフローを提供する。本研究では結核菌が収集されている地方衛研のネットワークを構築することで日本の結核の基本的な疫学情報が高精細に解明される。従来の結核の疫学解析は、大まかな菌の系統は把握可能であるが、集団感染事例など、元来、菌株同士が密接な関係にある事例を解析するのに足る解像力を持った系統解析法は、近年ようやく現実のものとなった全ゲノム配列解析を利用した SNP レベルの解析のみである。
研究成果：筆者等は国内随一の次世代シーケンサによる病原体ゲノム解析の実績を有しており、既に数百に及ぶ結核菌などの臨床分離株の全ゲノム解析を実施している。本研究では、構築される結核菌の自動解析 Web サービスについて、地方衛生研究所などと協力して、結核菌全ゲノム配列の次世代シーケンサによる解析を、ノウハウを有する当センターで実施し、臨床分離株を中心に解析支援を行うスキームを構築することで、構築されたサーバーの効率的運用を促進し、新規の高度感染症診断技術の均てん化を図った。地方衛研との共同研究で、過去数年間の分離菌株すべてについて、全ゲノム配列を解析し、各菌株の疫学的背景を明らかにすることで、当該地域における、結核菌の伝搬状況を分子レベルで初めて明らかにすることができた。加えて、当該地域で発生した、集団感染疑い事例について、全ゲノム解析により、実際にそれらの症例が集団感染であることを分子レベルで確認した。

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：２６指１０３
研究課題名：次世代シーケンサを活用した結核菌等の薬剤耐性菌の高度・迅速検査法の開発と臨床応用
主任研究者名：秋山徹

論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

年

Watanabe S, Matsumura
K, Iwai H, Funatogawa
K, Haishima Y, Fukui
C, Okumura K,
A mutation in the decoding region of
Kato-Miyazawa M,
16S rRNA attenuates the virulence ofInfect Immun
Hashimoto M, Teramoto
Mycobacterium tuberculosis.
K, Kirikae F,
Miyoshi-Akiyama T,
KirikaeT.

IAI.00417-16.

2016

CASTB (the comprehensive analysis
server for the Mycobacterium
tuberculosis complex): A publicly
accessible web server for
epidemiological analyses, drugresistance prediction andphylogenetic comparison of clinicalisolates.

Iwai H, Kato-Miyazawa
M, Kirikae T,
Tuberculosis
Miyoshi-Akiyama T.

95(6):843-4

2015

Construction of avirtual Mycobacterium tuberculosis
Okumura K, Kato M,
consensus genome and its application Kirikae T, Kayano M, BMC Genomics.
to data from a next generation
Miyoshi-Akiyama T.
sequencer.

20;16:218.

2015

MicroRNA-155 knockout mice aresusceptible to Mycobacterium
tuberculosis infection.

Iwai H, Funatogawa K,
Matsumura K, KatoMiyazawa M, Kirikae
Tuberculosis
F, Kiga K,
Sasakawa C, MiyoshiAkiyama T, Kirikae T.

95(3):246-50.

2015

Genetic diversity of Mycobacterium
tuberculosis isolates from foreignborn andJapan-born residents in Tokyo.

Kato-Miyazawa M,
Miyoshi-Akiyama T,
Clin Microbiol
Kanno Y, Takasaki J,Infect.
Kirikae T, KobayashiN.

21(3):248.e1-8

2015

95(1):37-9.

2014

Miyoshi-Akiyama T,
Satou K, Kato M,
Complete annotated genome sequence
Shiroma A, Matsumura
of Mycobacterium tuberculosis (Zopf)
K, Tamotsu H, Iwai H, Tuberculosis
Lehmann and Neumann (ATCC35812)
Teruya K, Funatogawa(Kurono).
K, Hirano T, KirikaeT.

研究発表及び特許取得報告について

学会発表
タイトル

発表者

Construction of A Virtual
Okumura K, Kato M,
Mycobacterium Tuberculosis Consensus
Kirikae T, Kayano M,
Genome And Its Application To Data
Miyoshi-Akiyama T.
From A Next Generation Sequencer

学会名

場所

American societyof microbiology,Boston, USA
114th General
meeting,

年月May, 2014

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

結核菌：120種類のゲノム網羅
ベース運用開始
特許取得状況について
発明名称

データ

※出願申請中のものは(発表先

場所

毎日新聞

年月日
2015年3月7日)記載のこと。
登録番号

結核菌の菌株の同定方法及び遺伝子変異
特願2013-012546の検出方法※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）
株式会社ニプロ、
国立国際医療研究2014.1.25
センター、帯広畜産大学

出願国

日本・米国