Press Release2023 年 9 ⽉ 20 ⽇

中性⼦結晶構造解析によって酵素ラジカル反応中間体の詳細構造を初めて解明―酵素を効率的に働かせるための“⼿品のタネ明かし”―

研究のポイント◆ 酵素反応で⽣じるラジカル中間体の中性⼦結晶構造解析に世界に先駆けて成功◆ ⽔素原⼦の精確な位置情報をもとに、酵素が常温常圧で効率的に機能するための仕組みの⼀端を解明◆ ラジカル中間体を持つ新しい有⽤酵素開発への応⽤に期待

概 要
⼤阪医科薬科⼤学、⼤阪⼤学、量⼦科学技術研究開発機構、筑波⼤学、茨城⼤学、理化学研
究所らの研究グループは、⼤強度陽⼦加速器施設(J-PARC)※1 内に設置された、物質・⽣命科学実験施設(MLF)の茨城県⽣命物質構造解析装置(iBIX) ※2 を⽤いた実験により、銅アミン酸化酵素の触媒反応途上に形成されるセミキノンラジカル中間体の中性⼦結晶構造解析※3 に成功しました。これはラジカルタンパク質として初めての成果であり、活性中⼼の⽔素原⼦の位置を明らかにすることにより、酵素タンパク質内でラジカル中間体が安定に存在できる仕組みの⼀端を解明しました。同時に活性中⼼にアミン基質が結合していることも発⾒し、この基質が、補酵素の構造変化を助けるために反応途中で⽣成物と⼊れ替わったものであることを明らかにしました。本研究は、酵素を効率的に働かせるために仕込まれている”⼿品のタネ”を明かしたといえます。
今回の研究は酵素の精緻な反応メカニズムの⼀端を原⼦レベルで明らかにしたものであり、またこれにより、ラジカルを反応中間体とする各種の有⽤酵素の開発にも⼤きな進展をもたらすことも期待されます。
本研究成果は、⽶国科学誌「ACS Catalysis」に、9 ⽉ 7 ⽇（⽊）19 時（⽇本時間）に公開されました。

発表者
村川武志︓⼤阪医科薬科⼤学 医学部 助教
栗原和男︓量⼦科学技術研究開発機構 量⼦⽣命・医学部⾨ 量⼦⽣命科学研究所
上席研究員
庄司光男︓筑波⼤学 計算科学研究センター 助教
⽮野直峰︓茨城⼤学 フロンティア応⽤原⼦科学研究センター 助教（現︓⾼輝度光科学研究センター）
⽇下勝弘︓茨城⼤学 フロンティア応⽤原⼦科学研究センター 教授（現︓総合科学研究機構）
河野能顕︓理化学研究所 放射光科学研究センター 専任技師
鈴⽊ 守︓⼤阪⼤学 蛋⽩質研究所 准教授
重⽥育照︓筑波⼤学 計算科学研究センター 教授
⽮野貴⼈︓⼤阪医科薬科⼤学 医学部 教授
安達基泰︓量⼦科学技術研究開発機構 量⼦⽣命・医学部⾨ 量⼦⽣命科学研究所
チームリーダー
⾕澤克⾏︓⼤阪⼤学 産業科学研究所 招へい教授
岡島俊英︓⼤阪⼤学 産業科学研究所 准教授

研究の内容
銅アミン酸化酵素は様々な⽣物種に広く存在し、アミン類をアルデヒドとアンモニアに分解する活性を持っています。活性中⼼には、銅イオンと補酵素トパキノン（TPQ）を含んでおり、ヒトの⾎清中の本酵素は、糖尿病の発症にも関与しています。これまで、本酵素は複数の反応中間体を経て効率的に反応を触媒することがわかっており、その過程で、補酵素 TPQ が⼤きく構造変化してセミキノンラジカル反応中間体が形成されることが知られていました（図 1）。しかし、どのような仕組みで構造変化が起きるのか、その駆動⼒は何なのかなど、多くの未解明な点が残されていました。また、有機ラジカルは⼀般に⾼い反応性を有することが知られていますが、酵素がどのような仕組みでそ

図1のようなラジカルを安定に保持しているのかもわか

触媒過程における補酵素 TPQ の構造変化。セミキノンラジカル反応中間体を形成するため、TPQ は off-Cu 型から on-Cu 型へと反転・スライドする。っていませんでした。
研究グループは、微⽣物由来の銅アミン酸化酵素結晶を、嫌気下で基質アミン溶液に浸漬することによりセミキノンラジカル反応中間体を作り出し、J-PARC※1/MLF の iBIX※2 にて中性⼦回折測定を⾏うことにより、⾼分解能の中性⼦結晶構造解析※3に成功しました。決定された構造では、補酵素TPQ は銅イオンに直接配位し、さらに 2 つの⽔酸基の⽔素原⼦が解離して、周囲のアミノ酸残基と強い⽔素結合を形成していました（図 2）。さらに TPQの芳⾹環は、周囲の残基と XH-π（X は C, N, O, S）相互作⽤と呼ばれる弱い相互作⽤をしていることが判明し、このような相互作⽤が総合的にラジカル中間体の安定化に寄与していることがわかりました。

図2

セミキノンラジカル中間体の構造。X 線結晶構造解析により得たマップを⾚紫⾊、中性⼦結晶構造解析により得たマップを灰⾊の網⽬で⽰している。

さらに、実験的に決定された構造に基づいて量⼦古典混合計算法※4 による解析も実施し、補酵素 TPQ を含めた活性中⼼解離基のプロトン化状態が正しいことも理論的に証明することができました。
また活性中⼼に、基質であるフェニルエチルアミンを検出しました。これまでの X 線結晶構
造解析による研究では、この分⼦は⽣成物のフェニルアセトアルデヒドであると考えられていたのですが、⽔素原⼦が検出できる中性⼦結晶構造解析により、アルデヒドではなくアミンであることが明確に⽰されました（図 3）。
これにより、触媒過程の途中で第⼆のアミン基質が⽣成物であるアルデヒドに置き換わり、それが引き⾦となって補酵素 TPQ が構造変化するという仕組みも明らかになりました。このような実にうまく仕組まれた酵素触媒反応のメカニズムは、酵素を効率的に働かせるための“⼿品のタネ”であり、今回の研究

図3

活性中⼼に検出されたアミン基質。（A）⽣成物であるフェニルアセトアルデヒド（左）と基質であるフェニルエチルアミン（右）の分⼦構造。（B）⽔素原⼦を検出することのできる中性⼦結晶構造解析により、検出された分⼦が、アルデヒドではなくアミンであることが判明した。測定により得た⽔素（正確には重⽔素）のマップを⽔⾊の網⽬で⽰す。

で明らかにされた⼤きな成果といえます。

本研究が社会に与える意義（社会的意義）
今回の研究では、酵素の精緻なメカニズムの⼀端を原⼦レベルで明らかにしています。酵素科学の分野の⼤きな研究テーマとして、新しい機能性を持つ酵素の分⼦設計を⾏うことが挙げられますが、今回の研究成果が⼤きく寄与する可能性があります。とりわけ、ラジカルを反応中間体とする各種の有⽤酵素の開発にも⼤きな進展をもたらすことが期待されます。

研究者のコメントタンパク質中を構成する原⼦のうち、およそ半分が⽔素原⼦であり、その⼀部は⽔素結合を介して、全体的な構造の安定化、あるいは基質などのリガンドとの相互作⽤に寄与しています。さらには、酸化還元酵素をはじめとする多くの酵素では、⽔素原⼦の移動や反応中間体における⽔素結合状態は、酵素反応メカニズムの解明に極めて重要な情報となります。そのため、本研究で⽤いた中性⼦構造解析によって、酵素構造中（特に反応中間体）において⽔素原⼦を可視化できれば、酵素科学の研究分野において、⼤きな進展につながるものと期待しています。

⽤語説明※1 ⼤強度陽⼦加速器施設 J-PARC
⾼エネルギー加速器研究機構と⽇本原⼦⼒研究開発機構が茨城県東海村で共同運営している⼤型研究施設で、素粒⼦物理学、原⼦核物理学、物性物理学、化学、材料科学、⽣物学などの学術的な研究から産業分野への応⽤研究まで、広範囲の分野での世界最先端の研究が⾏われている。J-PARC 内の物質・⽣命科学実験施設(MLF)では、世界最⾼強度のミュオン及び中性⼦ビームを⽤いた研究が⾏われており、世界中から研究者が集まっている。
※2 茨城県⽣命物質構造解析装置(iBIX)
茨城県が J-PARC/MLF に設置した２本の中性⼦ビームラインのうちの⼀つであり、JPARC/MLF の強⼒なパルス中性⼦源を利⽤して⾼分解能のタンパク質結晶構造解析が⾏える世界最⾼レベルのパルス中性⼦単結晶中性⼦回折装置である。
※3 中性⼦結晶構造解析
結晶に中性⼦を⼊射し、原⼦核との相互作⽤による散乱強度を調べることにより、結晶内に存在する分⼦の⽴体構造を得る解析法。同様の⼿法に X 線結晶構造解析があるが、こちらは電⼦との相互作⽤を検出するものであり、電⼦を１つしか持たない⽔素原⼦の位置を決定することは極めて難しい。さらに、電⼦を持たない⽔素陽イオン（プロトン）については位置情報を得ることが不可能である。中性⼦結晶構造解析では⽔素原⼦（あるいはプロトン）の詳細な観察が可能であり、これが特に⽣命科学分野で中性⼦結晶構造解析を⾏う最⼤の⽬的である。中性⼦実験の際には、データのバックグランドを抑えるため、あらかじめ、結晶を重⽔に浸すことが多く、⽔素（軽⽔素）の⼀部は重⽔素に置き換わる。この置換率を調べることにより、その⽔素原⼦がどれだけ分⼦に強く結合していたかがわかる。
※4 量⼦古典混合計算法
活性中⼼（ここでは TPQ セミキノンラジカル反応中間体を含む主要残基）は量⼦⼒学に基づく⽅法で記述し、周囲のタンパク質は古典⼒学に基づく⽅法（分⼦⼒場）で記述することで、計算コストを抑えつつ、タンパク質全体を精度良く取り扱う計算⽅法。

論⽂情報
本研究成果は、2023 年 9 ⽉ 7 ⽇（⽊）19 時（⽇本時間）に⽶国科学誌「ACS Catalysis」（オンライン）に掲載されました。
＜タイトル＞“Neutron crystallography of a semiquinone radical intermediate of copper amineoxidase reveals a substrate-assisted conformational change of the peptidyl quinonecofactor”＜著者名＞
Takeshi Murakawa*, Kazuo Kurihara, Mitsuo Shoji, Naomine Yano, Katsuhiro Kusaka,
Yoshiaki Kawano, Mamoru Suzuki, Yasuteru Shigeta, Takato Yano, Motoyasu Adachi,Katsuyuki Tanizawa, and Toshihide Okajima*＜DOI＞
https︓//doi.org/10.1021/acscatal.3c02629

問い合わせ先＜研究内容全般について＞
⼤阪医科薬科⼤学 ⽣化学教室 助教 村川 武志（むらかわ たけし）*

⼤阪⼤学 産業科学研究所 准教授 岡島 俊英（おかじま としひで）*＜タンパク質の中性⼦結晶構造解析について＞
量⼦科学技術研究開発機構 量⼦⽣命・医学部⾨ 量⼦⽣命科学研究所
上席研究員 栗原 和男（くりはら かずお）

量⼦科学技術研究開発機構 量⼦⽣命・医学部⾨ 量⼦⽣命科学研究所
チームリーダー 安達 基泰（あだち もとやす）＜茨城県⽣命物質構造解析装置(iBIX)について＞
総合科学研究機構 中性⼦産業利⽤推進センター

BL03 グループリーダー（装置責任者） ⽇下 勝弘（くさか かつひろ）＜量⼦化学計算について＞
筑波⼤学 計算科学研究センター 助教 庄司 光男（しょうじ みつお）

＜リリースに関する問い合わせ先＞
⼤阪医科薬科⼤学 総務部 企画・広報課
Tel︓072-684-6817 FAX︓072-684-7100
E-mail︓hojin-koho[at]ompu.ac.jp

⼤阪⼤学 産業科学研究所 広報室
Tel︓06-6879-8524 FAX︓06-6879-8524
E-mail︓isir-kouhou[at]sanken.osaka-u.ac.jp

量⼦科学技術研究開発機構 経営企画部 広報課
Tel︓043-206-3026 FAX︓043-206-4062
E-mail︓info[at]qst.go.jp

筑波⼤学 計算科学研究センター 広報・戦略室
Tel︓029-853-6260 FAX︓029-853-6260
E-mail︓pr[at]ccs.tsukuba.ac.jp

茨城⼤学 広報室
Tel︓029-228-8008 FAX︓029-228-8019
E-mail︓koho-prg[at]ml.ibaraki.ac.jp

茨城県 産業戦略部技術振興局 科学技術振興課
Tel︓029-352-3301 FAX︓029-352-3309
E-mail︓info-neutron[at]pref.ibaraki.lg.jp

J-PARC センター 広報セクション
Tel︓029-287-9600 FAX︓029-284-4571
E-mail︓pr-section[at]j-parc.jp

総合科学研究機構 中性⼦科学センター 利⽤推進部
Tel︓029-219-5300 FAX︓029-219-5311
E-mail︓press[at]cross.or.jp

理化学研究所 広報室 報道担当
Tel︓050-3495-0247
E-mail︓ex-press[at]ml.riken.jp