課題番号：28指001
研究課題名：革新的技術を応用したB型肝炎に対する新規創薬研究主任研究者名 ：溝上雅史
キーワード ：B 型肝炎ウイルス、 創薬、ゲノム編集、逆転写酵素、核酸アナログ製剤
研究成果：昨年度から引き続き、HBV の POL 蛋白の研究では、その機能解析と大量発現系の確立を行った。また、ゲノム編集創薬では、個別化医療に対応したゲノム編集遺伝子の設計プログラムを確立した。
「POL 活性化の分子機構の解析」HBV-POL が持つ 4 つの酵素機能（プライミング、逆転写、DNA 合成、RNaseH）に関わる重要アミノ酸部位の決定を行った。機能とは少し関係するが、POL 蛋白は 4 つのドメイン（TP、SP、RT、RNaseH）に分けられている。これら 4 領域を外来遺伝子で置き換えた場合に、いずれの領域でも RT 活性が減少した。このことは、RT ドメイン以外でも RT 活性に関わることを示しており、RT の活性中心は、4 ドメインのアミノ酸で複合的に構成されていると考えられた。
「POL と相互作用するヒト因子の探索」初年の HBV-POL とホスト因子の網羅的解析の結果で、ヒト因子としていくつかの分子を同定した。その中には、POL との関連が示されている既報の分子も含まれており、評価系の妥当性が確認できた。加えて、新規の分子も検出できており、これらの機能解析を進め、POL が機能発現する際に必要な分子を複数確認した。
「ハイスループットスクリーニング（HTS）の確立と薬剤評価」初年に引き続き、POL 蛋白を用いた高感度な HTS 系の確立を進めた。ヒト無細胞系での発現をスケールアップさせ、一度に得られる POL 蛋
白の量を増加させた。それにより、小スケールでの評価系で多数の化合物を評価できる環境を整えた。
現在のところ、比色法による定量であるが、蛍光か化学発光法による定量を検討中である。
「結晶構造解析と抗体取得に向けた大量発現系の確立」結晶構造解析や抗体取得に必要な蛋白量を得るためは、mg レベルでの精製タンパク質が必要であるが、ヒト無細胞系の改良ではそれに至らなかった。そこで、新たしい蛋白発現系の構築を行った。POL を大腸菌で発現させると、POL の毒性で菌体が死滅することが知られている。そこで、発現プラスミドの改良を実施した。蛋白発現誘導をかける前に強力に発現を抑制できるように 3 つのロック機構を導入したものを構築した。これにより、トランスフォーメーションをした大腸菌では死滅することがなくなった。続いて、発現誘導をかけた際にプラスミドを保持しながらも死滅せず、かつ蛋白発現を可能とする大腸菌株の選抜を行った。10000 コロニーを選抜することで 14 株の継代可能な大腸菌を獲得した。これにより、POL 発現の量的な問題は解決した。現在、可溶性の最大化と精製に関する最適化を実施している。
「ゲノム編集遺伝子の最適化」ゲノム編集遺伝子を用いた治療を実現するために、共同研究先から肝組織や iPS 細胞から誘導した肝細胞と非実質細胞の共培養系の提供を受けた（北海道大学：武冨紹信教授、東京大学：宮島篤教授）。複数種類のゲノム編集遺伝子を用意し、数人のヒト由来肝組織に投与して、ex vivo での非特異的反応の有無を検討した。また、iPS 技術を利用した肝細胞誘導とそこへの HBV 感染によって、in vitro での感染モデルでゲノム編集遺伝子の評価を行った。そこに様々な配列のゲノム編集遺伝子を作用させることで、HBV 特異的な切断の有無を事前に検討するワークフローを確立し、実用に備えた。
「個別化医療に向けたゲノム編集遺伝子の設計プログラムの開発」ゲノム編集遺伝子の非特異的作用を限りなく減らすために、患者のヒトゲノムとその患者のもつウイルスゲノムを NGS で解読し、データベース化した。それを元に、HBV に対するゲノム編集遺伝子の設計を自動で実施するプログラムを開発した。これにより、ヒトゲノムの僅かな個人差で生まれる非特異的なゲノム編集反応を抑制できる。
「ナノミセル DDS の開発」現在のナノミセル DDS の改良を進め、肝臓指向性を向上させた。肝細胞での取り込みを向上させる分子を表面に付加することでその機能を向上させた。
「非臨床試験の準備と実施」GLP 製造と非臨床試験の実施（薬理試験、毒性試験、薬物動態試験、薬剤学試験）に億単位での費用が必要となるために、NCGM 特許担当部門と相談し、将来的な企業との連携を模索した。

Subject No.

：28-shi-001

Title： Drug discovery for hepatitis B virus infection by the innovative andknowledge-based technology
Researchers ：Masashi Mizokami
Key word： Hepatitis B virus, Genome editing technology, Nucleotide analogue, Drugdiscovery, Reverse transcriptase
Abstract：

1. Molecular basis of HBV-POL activity
To assess the functional domain of reverse transcriptase (RT) activity, each part of 4 domains,which was constructed by terminal protein, spacer protein, RT, and RNaseH domain, wereexchanged by a foreign gene. As expected, the RT activity was decreased by inactivity of RT
domain. However, inactivity of the other domains also induced the decrease of RT activity. Thesedata suggested that active center of RT was constructed by all domain of POL.
To obtain host factors interacting with HBV-POL, protein-protein complex was analyzed byLC/MS-MS. Then, we had a list of several factors interacting with POL. The list contains thefactors previously reported on the interaction between POL and human factors. These datasuggested that our assay system is consistent and new factors we observed could show secureinteraction with POL.
2. Development of HTS for drug discovery
To get larger volume of POL solution, we scaled up in house assay. We add the dialysis step toremove the inhibitory factors produced during protein production. The scale-up method enables us
to assess huge number of chemical drugs.
3. Large scale production of purification of POL protein for analysis of crystal structure
Last year, the large scale production and the stable storage of HBV-POL was very difficult in inhouse system. Therefore, we developed new protein production system using E. coli.. First, weconstructed new plasmid construction with strong suppressor sequences of protein production,
which had no protein production before induction stimulation. Next, we prepared the selection of Ecoli. clone free from POL toxicity. Then, we obtained 14 clones, which was able to produce fulllength POL protein in large scale.
4. Improvement of gene-editing therapy
To adapt personalized medicine of gene-editing therapy, we developed new program to design
gene-editing enzyme. When we add the sequence of human and virus genome obtained from apatient, the program produces the sequence of gene-editing enzyme matched with HBV sequence
and without the human genome of the patient.
2. Improvement of DDS molecule
A specific molecule targeting hepatocyte is selected and added on the surface of DDS molecule. The
physical characteristics was assessed by in vitro and in vivo assay.
3. Preparation of pre-clinical trial
To produce our gene-editing drug in GLP grade, we consult the patent office. A supporting
company from Japan or foreign area could be selected as soon as possible.

Accession

VC: vector control
PC: positive control

Score emPAIA_HUMAN

949

3.51

B_HUMAN828

2.43

C_HUMAN662

2.54

D_HUMAN639

2.82

E_HUMAN566

1.73

F_HUMAN514

1.85

G_HUMAN496

2.49

H_HUMAN308

0.46

I_HUMAN302

0.25

J_HUMAN

241

0.45

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：28指001
研究課題名：革新的技術を応用したB型肝炎に対する新規創薬研究主任研究者名：溝上雅史
論文発表
論文タイトル

著者

Hoshino K, Sugiyama M, Date T,
Maruwaka S, Arakaki S, Shibata D,
Phylogenetic and phylodynamic analysis ofhepatitis C virus subtype 1a in Okinawa, Japan. Maeshiro T, Hokama A, Sakugawa H,Kanto T, Fujita J, Mizokami M.

掲載誌

掲載号

年

in press

2018

Nishida N, Sugiyama M, Sawai H, Nishina
Key HLADRB1DQB1 haplotypes and role of the S, Sakai A, Ohashi J, Khor SS, Kakisaka
Hepatology.
BTNL2 gene for response to a hepatitis B
K, Tsuchiura T, Hino K, Sumazaki R,Takikawa Y, Murata K, Kanda T,vaccine.
Yokosuka O, Tokunaga K, Mizokami M.

in press

2018

Treatment of hepatitis C virus leads toeconomic gains related to reduction in cases of Younossi ZM, Tanaka A, Eguchi Y, HenryJ Viral Hepat.
hepatocellular carcinoma and decompensatedL, Beckerman R, Mizokami M.
cirrhosis in Japan.

in press

2018

TIP60 Complex Inhibits Hepatitis B Virus
Transcription.

92(6).

2018

Mac2 binding protein glycan isomer (M2BPGi) is Shirabe K, Bekki Y, Gantumur D, Araki K,
a new serum biomarker for assessing liver
Ishii N, Kuno A, Narimatsu H, Mizokami J Gastroenterol.
fibrosis: more than a biomarker of liver fibrosis. M.

in press

2018

Reduced therapeutic effect of antiviral drugs inKimura M, Nishikawa K, Sakamaki H,patients with hepatitis B virus reactivation after
Mizokami M, Kimura K.
hematopoietic stem cell transplantation.

Hepatol Res.

in press

2017

Low incidence of hepatitis B virus reactivationand subsequent hepatitis in patients withchronic hepatitis C receiving directacting
antiviral therapy.

Tamori A, Abiru S, Enomoto H, Kioka K,Korenaga M, Tani J, Enomoto M,
J Viral Hepat.
Sugiyama M, Masaki T, Kawada N,
Yatsuhashi H, Nishiguchi S, Mizokami M.

in press

2017

Investigating the hepatitis B virus life cycle
using engineered reporter hepatitis B viruses.

Nishitsuji H, Harada K, Ujino S, Zhang J,Cancer Sci.
Kohara M, Sugiyama M, Mizokami M,Shimotohno K.

109(1)

2018

Serum Levels of M2BPGi as ShortTermPredictors of Hepatocellular Carcinoma in
Untreated Chronic Hepatitis B Patients.

Liu J, Hu HH, Lee MH, Korenaga M, Jen
CL, BatrlaUtermann R, Lu SN, Wang LY, Sci Rep.
Mizokami M, Chen CJ, Yang HI.

7(1)

2017

Interferonfree therapy with direct acting
antivirals for HCV/HIV1 coinfected Japanesepatients with inherited bleeding disorders.

Uemura H, Tsukada K, Mizushima D, AokiT, Watanabe K, Kinai E, Teruya K,PLoS One.
Gatanaga H, Kikuchi Y, Sugiyama M,Mizokami M, Oka S.

12(10)

2017

Clinical significance of BRAF nonV600E
mutations on the therapeutic effects ofantiEGFR monoclonal antibody treatment inpatients with pretreated metastatic colorectal
cancer: the Biomarker Research for antiEGFR
monoclonal Antibodies by Comprehensive
Cancer genomics (BREAC) study.

Shinozaki E, Yoshino T, Yamazaki K,
Muro K, Yamaguchi K, Nishina T, Yuki S,Shitara K, Bando H, Mimaki S, Nakai C,
Br J Cancer.
Matsushima K, Suzuki Y, Akagi K,Yamanaka T, Nomura S, Fujii S, Esumi H,Sugiyama M, Nishida N, Mizokami M, Koh
Y, et al.

117(10)2017

Human leukocyte antigen variants and risk ofhepatocellular carcinoma modified by hepatitis
C virus genotypes: A genomewide association
study.

Lee MH, Huang YH, Chen HY, Khor SS,
Chang YH, Lin YJ, Jen CL, Lu SN, Yang
HI, Nishida N, Sugiyama M, Mizokami M, Hepatology.
Yuan Y, L'Italien G, Tokunaga K, ChenCJ; REVEALHCV Cohort Study Group..

Nishitsuji H, Ujino S, Harada K,Shimotohno K.

J Viral Hepat.

J Virol.

2017

研究発表及び特許取得報告について

Functional association of cellular microtubuleswith viral capsid assembly supports efficient
hepatitis B virus replication.

Iwamoto M, Cai D, Sugiyama M, Suzuki
R, Aizaki H, Ryo A, Ohtani N, Tanaka Y, Sci Rep.
Mizokami M, Wakita T, Guo H, Watashi K.

7(1)

2017

Safety, Tolerability, and Preliminary Efficacy ofthe AntiFibrotic Small Molecule PRI724, aCBP/ﾎｲCatenin Inhibitor, in Patients withHepatitis C Virusrelated Cirrhosis: A
SingleCenter, OpenLabel, Dose Escalation
Phase 1 Trial.

Kimura K, Ikoma A, Shibakawa M,Shimoda S, Harada K, Saio M, Imamura
J, Osawa Y, Kimura M, Nishikawa K,
Okusaka T, Morita S, Inoue K, Kanto T,
Todaka K, Nakanishi Y, Kohara M,
Mizokami M.

23

2017

Molecular characterization of AIDmediatedreduction of hepatitis B virus transcripts.

Que L, Liu G, Kitamura K, Wakae K, Li Y,Virology.
Nishitsuji H, Ujino S, Shimotohno K ,Muramatsu M.

510

2017

Erratum to: Virological and Clinical
Characteristics of Hepatitis B Virus Genotype
A.

Ito K, Yoneda M, Sakamoto K, Mizokami
M.

J Gastroenterol.

53(1)

2018

Suppression of HBV replication by theexpression of nickase and nuclease deadCas9.

Kurihara T, Fukuhara T, Ono C,
Yamamoto S, Uemura K, Okamoto T,
Sugiyama M, Motooka D, Nakamura S,Ikawa M, Mizokami M, Maehara Y,
Matsuura Y.

Sci Rep.

7(1)

2017

Virological and Clinical Characteristics ofHepatitis B Virus Genotype A.

Ito K, Yoneda M, Sakamoto K, Mizokami
M.

J Gastroenterol.

53(1)

2018

Identification of KX2391 as an inhibitor of HBVtranscription by a recombinant HBVbased
screening assay.

Harada K, Nishitsuji H, Ujino S,Shimotohno K.

Antiviral Res.

144

2017

Proangiogenic TIE2expressing
monocytes/TEMs as a biomarker of the effectof sorafenib in patients with advanced
hepatocellular carcinoma.

Shoji H, Yoshio S, Mano Y, Doi H,
Sugiyama M, Osawa Y, Kimura K, Arai T,
Int J Cancer.
Itokawa N, Atsukawa M, Aoki Y, Fukai M,Taketomi A, Mizokami M, Kanto T.

141(5)

2017

NS5A resistanceassociated substitutions inpatients with genotype 1 hepatitis C virus:
Prevalence and effect on treatment outcome.

Zeuzem S, Mizokami M, Pianko S,Mangia A, Han KH, Martin R, Svarovskaia
E, DvorySobol H, Doehle B, Hedskog C,
Yun C, Brainard DM, Knox S,
J Hepatol.
McHutchison JG, Miller MD, Mo H,
Chuang WL, Jacobson I, Dore GJ,
Sulkowski M.

66(5)

2017

GenomeWide Association Study Identifies Risk
Variants for Lichen Planus in Patients WithHepatitis C Virus Infection.

Nagao Y, Nishida N, ToyoOka L,Kawaguchi A, Amoroso A, Carrozzo M,Sata M, Mizokami M, Tokunaga K,Tanaka Y.

Clin Gastroenterol He15(6)2017

EBioMedicine.

Shimura S, Watashi K, Fukano K, Peel M,Sluder A, Kawai F, Iwamoto M, Tsukuda
Cyclosporin derivatives inhibit hepatitis B virus
S, Takeuchi JS, Miyake T, Sugiyama M,
entry without interfering with NTCP transporter
J Hepatol.
Ogasawara Y, Park SY, Tanaka Y,activity.
Kusuhara H, Mizokami M, Sureau C,Wakita T.

66(4)

2017

Tsukuda S, Watashi K, Hojima T, Isogawa
A new class of hepatitis B and D virus entry
M, Iwamoto M, Omagari K, Suzuki R,inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that Aizaki H, Kojima S, Sugiyama M, Saito A, Hepatology.
directly act on the viral large surface proteins. Tanaka Y, Mizokami M, Sureau C, Wakita
T.

65(4)

2017

研究発表及び特許取得報告について

Induction of IFN lambda 3 as an additional
effect of nucleotide, not nucleoside, analogues:
a new potential target for HBV infection.

Murata K, Asano M, Matsumoto A,Sugiyama M, Nishida N, Tanaka E, InoueT, Sakamoto M, Enomoto N, Shirasaki T,Gut.
Honda M, Kaneko S, Gatanaga H, Oka S,Kawamura YI, Dohi T, Shuno Y, Yano H,Mizokami M.

67(2)

2018

Genome-wide association studies identify
PRKCB as a novel genetic susceptibility locus
for primary biliary cholangitis in the Japanese
population.

Kawashima M, Hitomi Y, Aiba Y, Nishida
N, Kojima K, Kawai Y, Nakamura H,
Tanaka A, Zeniya M, Hashimoto E, Ohira
H, Yamamoto K, Abe M, Nakao K,Yamagiwa S, Kaneko S, Honda M,Umemura T, Ichida T, Seike M, Sakisaka
S, Harada M, Yokosuka O, Ueno Y, Senju
M, Kanda T, Shibata H, Himoto T, Murata
K, Miyake Y, Ebinuma H, Taniai M,Joshita S, Nikami T, Ota H, Kouno H,Kouno H, Nakamuta M, Fukushima N,Kohjima M, Komatsu T, Komeda T, Ohara
Y, Muro T, Yamashita T, Yoshizawa K,Hum Mol Genet
Nakamura Y, Shimada M, Hirashima N,Sugi K, Ario K, Takesaki E, Naganuma A,Mano H, Yamashita H, Matsushita K,Yamauchi K, Makita F, Nishimura H,Furuta K, Takahashi N, Kikuchi M,Masaki N, Tanaka T, Tamura S, Mori A,
Yagi S, Shirabe K, Komori A, Migita K, Ito
M, Nagaoka S, Abiru S, Yatsuhashi H,
Yasunami M, Shimoda S, Harada K,
Egawa H, Maehara Y, Uemoto S, Kokudo
N, Takikawa H, Ishibashi H, Chayama K,
Mizokami M, Nagasaki M, Tokunaga K,
Nakamura M.

26(3):

2017

Clin Gastroenterol He15(6)2017

Nagao Y, Nishida N, Toyo-Oka L,
Genome-Wide Association Study Identifies Risk
Kawaguchi A, Amoroso A, Carrozzo M,Variants for Lichen Planus in Patients With
Sata M, Mizokami M, Tokunaga K,Hepatitis C Virus Infection.
Tanaka Y.

Trinks J, Nishida N, Hulaniuk ML, Caputo
M, Tsuchiura T, Marciano S, Haddad L,
Blejer J, Bartoli S, Ameigeiras B, Frías
SE, Vistarini C, Heinrich F, RemondeguiRole of HLA-DP and HLA-DQ on the clearance
C, Ceballos S, Echenique G, Charre
Liver Intof hepatitis B virus and the risk of chronic
Samman M, D'Amico C, Rojas A, Martíinfection in a multiethnic population.
nez A, Ridruejo E, Fernández RJ, Burgos
Pratx L, Salamone H, Nuñez F, Galdame
O, Gadano A, Corach D, Sugiyama M,Flichman D, Tokunaga K, Mizokami M.

37(10)

2017

Identification of the functional variant driving
ORMDL3 and GSDMB expression in humanchromosome 17q12-21 in primary biliary
cholangitis.

Hitomi Y, Kojima K, Kawashima M, Kawai
Sci Rep
Y, Nishida N, Aiba Y, Yasunami M,Nagasaki M, Nakamura M, Tokunaga K.

7(1)

2017

Discerning the Origins of the Negritos, First
Sundaland People: Deep Divergence andArchaic Admixture.

Jinam TA, Phipps ME, Aghakhanian F,Majumder PP, Datar F, Stoneking M,
Sawai H, Nishida N, Tokunaga K,
Kawamura S, Omoto K, Saitou N.

Genome Biol Evol.

9(8)

2017

Principal contribution of HLA-DQ alleles,
DQB1*06:04 and DQB1*03:01, to disease
resistance against primary biliary cholangitis ina Japanese population.

Yasunami M, Nakamura H, Tokunaga K,
Kawashima M, Nishida N, Hitomi Y,Nakamura M.

Sci Rep.

11;7(1)

2017

研究発表及び特許取得報告について

学会発表
タイトル

発表者

GWAS identified associations of HLA-DRB1DQB1 haplotypes and BTNL2 gene withresponse to a hepatitis B vaccine

Nao Nishida, Masaya Sugiyama, Hiromi
Sawai, Jun Ohashi, Seik-Soon Khor,
Takayo Tsuchiura, Katsushi Tokunaga,Masashi Mizokami

学会名場所

ASHG 2017 Annual M ORLANDONao Nishida, Masaya Sugiyama, Hiromi
Sawai, Sohji Nishina, Aiko Sakai, Keisuke
HLA-DRB1-DQB1 haplotypes and BTNL2 gene Kakisaka, Keisuke Hino, Ryo Sumazaki,
associate with response to a hepatitis B
Yasuhiro Takikawa, Kazumoto Murata,
American Association Washington DCvaccine
Tatsuo Kanda, Osamu Yokosuka,
Katsushi Tokunaga, and Masashi
Mizokami

Variation in the preS/S gene in HBVassociated HCC patients with the HLADPB1*0201 allele

Yumi Hakozaki, Masaya Sugiyama, NaoNishida, Takaji Wakita, Tatsuya Kanto,
Katsushi Tokunaga, and Masashi
Mizokami

Unique peptide chain of PreS-S protein
Masaya Sugiyama, Nao Nishida, Takaji
associated with HBV-related HCC patients with Wakita, Katsushi Tokunaga and Masashi
HLA-DPB1*0201allele
Mizokami

肝発がん抵抗性HLA遺伝子型を有する症例におけるHBV-DNA変異解析

APASL SHCNagasaki

International HBV me Washington DC年月2017年10月

2017年10月

2017年4月

2017年9月

西田奈央、杉山真也、土浦貴代、徳永勝
第26回 日本組織適合広島士、溝上雅史

2017年10月

西田奈央、杉山真也、澤井裕美、SeikB型肝炎ワクチンの効果に関連する宿主因子の神戸
Soon Khor、土浦貴代、徳永勝士、溝上 日本人類遺伝学会 第同定雅史

2017年11月

遺伝子解析が肝疾患の理解を深める

平成29年度肝炎等克東京

2017年3月

星野訓一、杉山真也、伊達朋子、正司裕
沖縄本島におけるHCV遺伝子型1aの感染経路
隆、間野洋平、土肥弘義、由雄祥代、前 第53回日本肝臓学会広島の推定
城達次、考藤達哉、溝上雅史

2017年6月

ヒトとHBVゲノムの統合解析によるB型肝発がん
杉山真也、西田奈央、溝上雅史のリスク予測

第53回日本肝臓学会広島2017年6月

国立国際医療研究センター国府台病院消化器 榊原綾乃、高野ゆかり、小海川いづみ、
神戸
内科 におけるバイオバンクの実施状況と患者意 丸山晴美、加賀朋子、考藤達哉、杉山真 日本人類遺伝学会 第識調査也

2017年11月

西田奈央

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

発表先

場所

年月日

該当なし

特許取得状況について※出願申請中のものは()記載のこと。

発明名称

該当なし

※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

登録番号

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国