課題番号：26指105

研究課題名：糖尿病マーモセットを用いた前臨床試験システムの構築

主任研究者名 ：岡村匡史

国立国際医療研究センター研究所 室長

分担研究者名 ：佐々木えりか 実験動物中央研究所

センター長

キーワード

：糖尿病モデル、マーモセット、ゲノム編集、前臨床試験

研究成果：前臨床試験において齧歯類のデータだけでは不十分であり、特に、再生膵ベータ細胞あるいは異種移植膵島などの安全性・有効性を評価するためには、齧歯類以外の糖尿病モデルが必要不可欠である。コモンマーモセット（以下、マーモセット）は、ブラジル北東部原産の体長 25〜35cm、体重 200〜500g（ラットとほぼ同じ大きさ）の小型のサルで、霊長類として遺伝子導入技術が確立している実験動物として、マーモセットの利用価値は高い。
本研究の目的は、新しいゲノム編集技術を用いてマーモセットのゲノムを高効率に編集し、単一優性遺伝で若齢から糖尿病を発症する新たな糖尿病モデルを開発し、糖尿病マーモセットモデルを用いて、本センターの糖尿病研究における前臨床研究システムを構築する。
１．マウスにおける糖尿病遺伝子変異導入の検証（岡村 匡史）
マーモセットの妊娠期間は約 5 ヶ月であり、研究期間内に変異導入個体を得るためには、ゲノム編集コンストラクトの検証が非常に重要である。平成 26 年度に、Platinum TALEN ゲ
ノム編集技術を用いてマウス糖尿病関連遺伝子に変異を導入した系統を解析し、糖尿病を発症する変異の同定を試みた。糖尿病関連遺伝子にそれぞれ異なる変異が導入された 4 系統を解析した結果、すべての系統で若齢から高血糖を呈していた。糖尿病関連遺伝子に変異が導入された個体は、若齢から常染色体単一優性遺伝様式で高血糖を呈し、これらの高血糖マウスに、ヒトインスリンを腹腔内投与した結果、速やかに血糖値が下降した。
以上の結果から、マーモセットの糖尿病関連遺伝子に同様の変異を導入することで、マーモセットにおいても、若齢から常染色体単一優性遺伝様式で高血糖を呈し、外来性遺伝子に反応して、速やかに血糖値が低下するモデルが作製できることが示唆された。
２．ゲノム編集ツールによるマーモセット糖尿病関連遺伝子への変異導入（佐々木えりか）

マウスとは異なり、生まれた個体に変異が導入されていなくても、生命倫理上簡単に安楽死することはできない。そのため、今年度は標的としているマーモセット糖尿病関連遺伝子に対するゲノム編集ツールの切断活性評価をマーモセット受精卵で行った。
マーモセット糖尿病関連遺伝子を標的とした Platinum TALEN の mRNA をマーモセット受精卵の細胞質に注入し、後期胚に発生するまで培養した。得られた胚を直接 PCR 反応液に入れ PCR を行い、SURVEYOR assay により変異遺伝子検出試験を行った結果、6 個の胚でPCR が成功し、変異導入効率は約 33.3％であった。
以上の結果から、マーモセット糖尿病関連遺伝子は Platinum TALENs によって改変できること、さらに改変された後期胚が得られたことから遺伝子改変個体を作出可能であることが示唆された。

課題番号：26指105

研究課題名：マウスにおける糖尿病遺伝子変異導入の検証

主任研究者名 ：岡村匡史

分担研究者名 ：岡村匡史

キーワード：ゲノム編集、糖尿病、マウス

研究成果

：

マーモセットのような霊長類の遺伝子改変を行う場合、生命倫理および動物福祉に十分配慮する必要がある。マウスとは異なり、生まれた個体に変異が導入されていなくても、生命倫理上簡単に安楽死することはできない。また、マーモセットの妊娠期間は約 5 ヶ月であり、研究期間内に変異導入個体を得るためには、ゲノム編集コンストラクトの検証が非常に重要である。平成 26 年度に、Platinum TALEN ゲノム編集技術を用いて、マウス糖尿病関連遺伝子に変異を導入し、糖尿病を発症する変異の同定を試みた。その結果、34 匹の変異導入マウスがえられ、平成 27 年度はこれらの中から、それぞれ異なる変異を有するファウンダーマウ
スから 4 系統樹立し、その表現型を解析した。
糖尿病関連遺伝子に変異が導入された系統は、変異１；アミノ産置換を伴う一塩基置換、
変異２；3 塩基欠損（1 アミノ酸欠損）、変異３；変異 2 とは異なる 3 塩基欠損（1 アミノ酸欠損）、および変異 4；6 塩基欠損（2 アミノ酸欠損）であり、それぞれの系統の 4 週齢雄の随時血糖値は、それぞれ 384.4mg/dl±20.6、475.4 mg/dl±21.6、470mg/dl±11 および 499.7 mg/dl±46.6 であった。それぞれの系統の 4 週齢雌の随時血糖値は 197.3mg/dl±37.5、412.4 mg/dl±8.6、420mg/dl±2 および 433.5 mg/dl±46.5 であり、野生型の雄 177.2 mg/dl±5.9 および雌139.2 mg/dl±5.3 に比べ、高血糖を呈していた。糖尿病関連遺伝子に変異が導入された個体は、若齢から常染色体単一優性遺伝様式で高血糖を呈し、特に、変異 2、3 および 4 に導入された
変異は、雌雄共に顕著な高血糖を引き起こすことが明らかとなった。これの高血糖マウスに、ヒトインスリン（0.75IU/Kg）を腹腔内投与した結果、速やかに血糖値が下降した。
以上の結果から、マーモセットの糖尿病関連遺伝子に同様の変異を導入することで、マーモセットにおいても、若齢から常染色体単一優性遺伝様式で高血糖を呈し、外来性遺伝子に反応して、速やかに血糖値が低下するモデルが作製できることが示唆された。

課題番号：26指105

研究課題名：ゲノム編集ツールによるマーモセット糖尿病関連遺伝子への変異導入

主任研究者名 ：岡村
分担研究者名 ：佐々木匡史
えりか

キーワード

：糖尿病、マーモセット、ゲノム編集

研究成果

：

小型霊長類コモンマーモセット（マーモセット）を用いたゲノム編集技術による標的遺伝
子ノックアウト個体の作製を目標とし、平成 26 年度までに、ゲノム編集ツールの効率、および、個体を作出した際の遺伝子改変の胚内モザイク率を、マーモセット受精卵で検討する技術を確立した。その技術を用いて平成 27 年度は、標的としているマーモセット糖尿病関連遺伝子に対するゲノム編集ツールの切断活性評価をマーモセット受精卵で行った。ゲノム編集
ツールは、DNA 結合タンパク質を利用した人工ヌクレアーゼの一つである transcription
activator-like effector nuclease(TALEN)を更に高活性型に改良した Platinum TALENs を使用した。
マーモセット糖尿病関連遺伝子を標的とした Platinum TALEN の mRNA を合成し、終濃度 4 ng/μl となるよう調整した混合液をマーモセット受精卵 8 個の細胞質に注入した。注入後はヒト用初期胚培地 Sequential Cleav（Origio, 83040010A）中で 5% CO2, 5% O2, 90%
N2,37℃条件下で約 4 日間、その後ヒト用後期胚培地 Sequential Blast（Origio, 83060010A）に移して後期胚に発生するまでさらに 5 日間培養した。得られた胚を直接 PCR 反応液に入れPCR を行い、PCR 増幅産物 10μl を SURVEYOR mutation detection kit (Transgenomic,706025)による CEL-1 酵素をもちいた変異遺伝子検出試験に供した。Platinum TALENs 注
入胚 8 個の注入後 8 日目（IVF 後 9 日目）における発生率は 1 細胞期胚が 4 個（50％）、2細胞期～4 細胞期胚が 2 個（25％）、8 細胞期～胚盤胞期胚が 2 個（25％）であった。発生胚をそれぞれ PCR 反応液に移し、PCR 反応および変異遺伝子検出試験を行った結果、6 個の胚で PCR が成功し、そのうち 32 細胞期胚および 4 細胞期胚において標的遺伝子の改変が認められたことから、改変効率は約 33.3％であった。これら PCR 産物をサブクローニングし、シークエンス解析を行った結果、標的遺伝子において 32 細胞期胚では 2bp の挿入、4 細胞期胚では 3bp の欠損が認められたが、いずれの胚も野生型配列も検出されたため、ヘテロ改変もしくはモザイク様の改変が起こっていたと考えられた。
以上の結果から、マーモセット糖尿病関連遺伝子は Platinum TALENs によって改変できること、さらに改変された後期胚が得られたことから遺伝子改変個体を作出可能であることが示唆された。

Subject No.

：26 指 105

Title

：Establishment of diabetic marmoset model for preclinical research

Researchers ：Tadashi Okamura, Erika Sasaki
Key word：Diabetic model, Marmoset, Preclinical research, Genome editing

Abstract：In biomedical researches, laboratory animals bridge the gap between in vitro studies and clinical medicine.
Although the most popular laboratory animal is rodents, rodent models are insufficient as diabetic models forpreclinical research to evaluate the efficacy and safety of autologous and xeno-islet cell transplantations.
Non-human primates (NHPs) also play important roles in preclinical research in the biomedical sciences. Theaim of our project is to establish diabetic marmoset model to introduce the mutation for diabetes-associated geneby genome-editing technique using Platinum TALEN.
1. Validation of diabetes-associated gene mutation in mice (Tadashi Okamura)
Given that the ethical concerns regarding use of NHPs, it is important to validate the modified gene using
other laboratory animals. Because NHPs must be maintained by non-sibling mating, dominant mutation of themodified gene would be suitable to generate NHPs genetically modified diabetic models to express phenotype.
To introduce mutation in diabetes-associated gene, in vitro synthesized Platinum TALEN mRNAs fordiabetes-associated gene and ssODN, were co-injected into the cytoplasm of pronuclear stage mouse embryos.
We have established four independent lines, which carried independent diabetes mutations. Blood glucose levelsof mice carrying heterozygous mutation for diabetes gene were markedly higher than those of control mice at
4weeks of age. Insulin tolerance test revealed that diabetic mice have a normal glycaemic response to exogenous
human insulin. These results indicated that the mutations in diabetes-associated gene caused hyperglycemia inmice, and suggested that the same mutations could also cause hyperglycemia in marmotset.
2. Validation of Platinum TALEN for diabetes-associated gene in marmoset embryo (Erika Sasaki)

To establish the genome editing technologies in common marmoset (marmoset), new estimation methods
for the efficiency of gene modification and mosaicism have been developed last year in our group. In thisyear, we carried out the validation of marmoset diabetes-associated gene modification by PlatinumTALENs in marmoset embryos. In vitro synthesized mRNA solution of the final concentration 4 ng/μl each
was injected into the cytoplasm of pronuclear stage embryos. The mRNA-injected embryos were cultured
up to the 8-cell stage in Sequential Cleav medium (Origio, 83040010A) under 5% CO2, 5% O2, and 90%
N2 at 37°C. Then 8-cell stage embryos were transferred to Sequential Blast medium (Origio, 83060010A),
and cultured until morula to blastocyst stage. Then each cultured embryos were performed PCR and CEL-1
assays were carried out by SURVEYOR mutation detection kit (Transgenomic, 706025).
As the results, the CEL-1 assays showed that the genetic modification rate estimated from the number ofmutant embryos was 33.3% (2/6 PCR samples). Furthermore, sequence analysis revealed that Platinum
TALENs-injected embryos contained two types of mutant diabetes-associated gene; however, these were
not biallelic mutations. These results suggested that marmoset diabetes-associated gene was able tomodified using Platinum TALENs, and this finding will facilitate the efficient production ofdiabetes-associated gene knock-out marmosets.

再生医療研究領域での前臨床試験に非齧歯類の動物モデルでの評価は必須である
ssODNPlutinum TALEN mRNA

コモンマーモセット

バイオ人工膵島 マイクロカプセル

栄養ブドウ糖糖尿病遺伝子変異導入コンストラクトをマーモセット
前核期受精卵細胞質にマイクロインジェクション

移植

インスリン再生/異種膵島

免疫細胞

１型糖尿病
マーモセットモデル
QOLの改善Sasaki, E. et al, 2009
・遺伝子導入技術が確立している霊長類
・代謝経路、薬物感受性がヒトに近い・ラットとほぼ同じ大きさであるため、薬剤の投与量や移植細胞数が少なくてすむ。
・STZによる糖尿病誘発に抵抗性。

糖尿病遺伝子変異を導入することにより、若齢から高血糖を呈する。

膵島移植の適応症例
・劇症型１型糖尿病
・１型糖尿病・慢性膵炎H27年度の成果 １．マウスにおける糖尿病遺伝子変異導入の検証
糖尿病遺伝子変異導入マウスの随時血糖値
Female, 4wks of age

Blood Glucose [mg/dl]

Platinum TALENを用いて、糖尿病遺伝子に変異を導入

野生型

変異1（1塩基置換）

変異2（3塩基欠損）

変異3（3塩基欠損）

雄 雌雄 雌変異4（6塩基欠損）

随時
血糖値
雄 雌

雄 雌

糖尿病関連遺伝子に、変異を導入することで雌雄共に若齢から高血糖を呈する。

変異1

変異2

変異3

変異4

Male, 4wks of age

Blood Glucose [mg/dl]

糖尿病関連遺伝子に別々の変異を導入した4系統を樹立

野生型

変異1

変異2

変異3

変異4

糖尿病関連遺伝子に変異を導入することで、マーモセットでも同様に若齢から高血糖を呈することが予想される

H27年度の成果 2．ゲノム編集ツールによるマーモセット糖尿病関連遺伝子への変異導入
Platinum TALEN
mRNA

人工培養

FokI

PCR反応液チューブへうつし、PCR, CEL-1アッセイを実施

FokI

マーモセット受精卵へ
injection

後期胚まで発生+Wild-type PCR product samples

Original PCR product samples
Platinum TALENmRNA conc.
(F/R [ng/ul])

Injectionsite

No. ofinjected
embryos

dead

1cell

2-4cell8cell - Blast

4/4cyto80 (0)

4 (50)

2 (25)

2 (25)Development at Day9 (%)

PCR(+)
SampleNo. ofIndel

Indel (%)

62

33.3

33.3%の胚で改変が確認されたが、ヘテロもしくはモザイク様の改変であったことが示唆された

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：２６指１０５
研究課題名： 糖尿病マーモセットを用いた前臨床試験システムの構築
主任研究者名：岡村匡史

論文発表
論文タイトル

著者

Marusugi K1,Nakano K,
Sasaki H,
Functional validation of tensin2 SH2-PTB
Kimura J,
domain by CRISPR/Cas9-mediated genome
Yanobuediting.
Takanashi R,
Okamura T,
Sasaki N.

掲載誌

掲載号J Vet Med Sci.

年

in press

学会発表
タイトル

発表者

ゲノム編集技術を用いた効率的遺伝子改変マ
岡村
ウスの作製

匡史

学会名

場所

本糖尿病・肥満動物学会年次学術集
大宮会（スポンサード
シンポジウム2）

年月2016年3月

岡村匡史、高梨CRISPR/Casシステムを用いた遺伝子改変マウ 理絵子、中野堅 第158回日本獣医学
十和田スの作製とその応用
太、清水有紀会学術集会
子、新田剛

2015年9月

中野堅太、高梨
新規エレクトロポレーション法を用いた遺伝 理絵子、清水有 第158回日本獣医学
十和田子改変マウス作製効率の検討
紀子、金子武会学術集会人、岡村匡史

2015年9月

中野堅太、高梨
電気穿孔法を用いた効率的マウスゲノム編集 理絵子、清水有 第62回日本実験動
京都法紀子、金子武
物学会総会人、岡村匡史

2015年5月

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

発表先

場所

年月日

該当無し

特許取得状況について※出願申請中のものは(発明名称)記載のこと。
登録番号

該当無し

※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国