Journal of Fisheries Technology，11（1），15 − 19，2019

短水産技術，11（1），15 − 19，2019報

小型容器を用いた市販クロレラ給餌による淡水種輪虫ツボワムシの耐久卵生産とその利用
新関晃司＊ 1・佐藤太津真＊ 2・泉茂彦＊ 2

Resting egg production of the freshwater rotifer Brachionus calyciflorus using a smallscale culture equipment
Kouji NIIZEKI, Tatsuma SATO and Shigehiko IZUMIA method for producing the resting eggs of freshwater rotifers was investigated using freshwater rotifers hatched fromresting eggs as the parent generation for culture. The resting eggs preserved in a refrigerator for 16 months were hatchedin one day in groundwater at 25°C (hatching rate 12.3%). Sub culture of these freshwater rotifers at transfer intervals offour and seven days induced higher incidence of bisexual reproduction in the four-day transfer interval group than in theseven-day transfer interval group. Culture of freshwater rotifers with a four-day transfer interval or without transfers for
32 days led to average population densities of 462 rotifers/mL and 260 rotifers/mL in the transfer group and non-transfergroup, respectively; the transfer group exhibited a significantly higher population density. In the transfer group, population
density was maintained at over 100 rotifers/mL for 32 days. These results suggest that using our simple method, it may bepossible to culture freshwater rotifers using rotifers hatched from resting eggs as the parent generation for culture.
キーワード：ツボワムシ，耐久卵，人工培養，市販クロレラ
2016 年 2 月 24 日受付

2018 年 9 月 4 日受理

淡水産ワムシ類は，淡水魚類の初期餌料として有効で管理下でのツボワムシの培養に関して，田中（1983）ある（Sato 1950，鈴木 1971）が，なかでも日本全国のは 20 L 水槽を用い，油脂酵母と自ら培養したクロレラ給

湖沼に分布するツボワムシ Brachionus calyciflorus は，ワ餌による培養試験を実施し，9 日間の培養で最高密度ムシ耐久卵が堆積している池に肥料を投入する施肥法

569個体/mLまで増殖したことを報告した。さらに近年，（千葉ら 1970）によって培養され，古くから餌料に利用

太田ら（2014）によって 100 〜 4,000 L 規模水槽でのツボされてきた。しかしながら，施肥法は培養密度が不安定ワムシ連続培養手法が報告され，従来の施肥法の問題点で（中本ら 2007），さらに，動物プランクトン相をコンを解決するのに有効な手法の示唆となったが，用いたツトロールすることが困難であり（新関ら 2014），生産者

ボワムシ株は，個体群増殖率を低下させる両性生殖が起の意図したとおりに培養できないことが多い。このようこりにくい株で大量培養に適していた。しかし，そのこな課題を解決するためには，ツボワムシを集約的に安定とは，耐久卵が形成されないため周年にわたる継代培養培養する手法と，元種としての耐久卵を採取・保管するが必要なことも意味している。また，餌料にクラミドモ技術の開発が必要である。

ナス Chlamydomonas sp. を用いるため，その培養に労力＊1

福島県水産事務所相馬駐在〒 976-0022

福島県相馬市尾浜字追川 18-2

Fukushima Prefectural Fishery Office Soma Branch Office18-2 Oikawa, Obama, Soma, Fukushima 976-0022, Japanniizeki_kouji_01@pref.fukushima.lg.jp＊2

福島県内水面水産試験場– 15 –

を要する。

し，ツボワムシのみを約 3,000 個体分離した。分離後のツボワムシ培養に使用する容器に関して，田中（1983）

ツボワムシは以下の培養手法（図 1）により培養した。

は 20 L 水槽で実験した結果から，小型容器の方が管理し培養は，地下水を入れた計量カップ（5 L 容，ポリプやすく，好適環境を維持しやすいと考察している。そこ

ロ ピ レ ン 製 ） を，25°C に 調 温 し た 恒 温 器（MIR−152，

で本研究では，小型容器による，市販の濃縮淡水クロレSANYO）内に置いて行った。恒温器内には LED 電球（白ラを用いた，耐久卵作成手法の検討を行った。今回，野色，7.2 W，100 V）を設置し，照明は 12 L：12 D で調整

外から採取したツボワムシから耐久卵を得て，それからした。通気はエアポンプ（APN−057R，REI−SEA）で行ふ化したツボワムシを元種に培養試験を行った結果，ワムシ密度が 100 個体 /mL 以上で 32 日間にわたる培養が可能になった。これらの手法および培養結果について報告する。

材料および方法
福島県内水面水産試験場内のコンクリート屋外池（285m3）の水をポリバケツで 10 L 採水し，プランクトンネットで濾過し，動物プランクトンを採取した。採取した動物プランクトンは倒立顕微鏡（CKX31，OLYMPUS）
で検鏡しながら，ピペットで原生動物を出来る限り除去

図 1． ツボワムシ培養手法
エアポンプ以外の器具は全て恒温器内に設置

写真 1． ツボワムシ雌個体および雄個体の形状
A：未携卵雌（後向棘が伸長した変異型），B：雌卵携卵雌，C：雄卵携卵雌，D：耐久卵携卵雌，E：雄実線のスケールは 0.1 mm を示す– 16 –

小型容器によるツボワムシ耐久卵生産と利用

い，通気量は 15 mL/ 分とした。餌料には，市販の濃縮淡13 個体（個体密度 0.03 個体 /mL）が確認され，その後は水クロレラ（生クロレラ V12，クロレラ工業，以下，ク個体密度を増やし 12 日目には最大 657 個体 /mL に達しロレラ）を用い，水道水で 100 倍に希釈したものを 3 L 三たが，以後減少した（図 2A）。なお，耐久卵からのふ化ATTO）で 0.2 L/角フラスコに入れ，定量ポンプ（SJ−1211H，は 1 日目で終了し，ふ化率は 12.3％であった。雌卵携卵日量を連続給餌した。なお，クロレラの沈殿防止のため雌個体は開始 1 日目から認められ，雌卵携卵雌個体率はに，スターラー（MH−61，Yamato）で常時攪拌した。培

4 日目には最大 31％に達したが，その後徐々に減少し，養による沈殿物を除去して培養環境を維持するために，平均では 17％であった（図 2G）。両性生殖に関連する雄ツボワムシ個体を含む培養水を定期的に新しい容器に移卵携卵雌個体（図 2C）および雄個体（図 2E）は 6 日目し替えた（以下，植替え）。耐久卵の採取は，屋外池のから，耐久卵携卵雌個体（図 2D）は 8 日目からそれぞれ水から分離したツボワムシを 5 日間培養したところ，耐確認され，共に一時的に増加したものの，13 日目から久卵が認められたため，培養容器底面の沈殿物をプランは認められなくなった。平均日間増殖率は，192％であっクトンネット（目合い：58 μm）で濾過して行った。耐た（図 2F）。

久卵はビーカーに収容し，水を加えた状態で冷蔵庫内植替え間隔が 7 日間と 4 日間での培養結果の概要を図 3（4°C）に 16 ヶ月間保存した。培養試験は，耐久卵 106 個に示す。試験 1 においては，個体密度は植替えなし区がを 0.4 L の地下水を入れてふ化したものを用いて行った。

4 日目に最大 524 個体 /mL となり，その後減少した。7シオミズツボワムシ Brachionus plicatilis では，両性生殖の誘導要因は飼育に伴って水中に蓄積する何らかの物質であることが，換水率を高くすると両性生殖率が低下
し た 実 験 結 果 か ら 推 察 さ れ て い る（Hino and Hirano1977）。植替えによる環境維持と両性生殖誘導の両立が可能かを検討するため，植替え間隔が 7 日間と 4 日間で試験を行った。各試験とも耐久卵からふ化させたワムシを用い，試験 1 では，ワムシ密度が 10 個体 /mL 以上の培養水 0.5 L ずつを培養容器に入れて 11 日間培養した（試験区：植替えなし区，植替えあり 1 区，植替えあり 2 区）。
試験 2 では，ワムシ密度が 100 個体 /mL 以上の培養水 0.5 Lずつを培養容器に入れて 32 日間培養した（試験区：植替えなし区，植替えあり区）。試験 2 では，溶存酸素濃度（DO）および pH を水質測定器（550A，YSI/Nanotech，HM−60V，TOA）を用いて測定した。
培養期間中は，毎日 9：00 〜 11：00 の間に培養水をピペットで 1 mL 採水し，培養水中の雌個体（未携卵，雌卵携卵，雄卵携卵，耐久卵携卵）および雄個体を計数した（写真 1）。採水および計数は 2 回行い，個体密度を平均値で算出した。その際，計数値の総計に 20％以上の差があった場合，採水からやり直した。なお，本稿で述
べる個体密度は雌個体合計とする。雌個体については，次式により比増殖率を求めた。
比増殖率 (r) ＝ ln(Nt/N0)/t ＋ D，
ここで，t は培養日数，N0 は開始時の個体密度，Nt はt 日目の個体密度，D は培養水の希釈率を示す。さらに，比増殖率を求めた上で，次式により日間増殖率を求めた。
日間増殖率 (％ ) ＝ (er − 1) × 100
雌卵携卵雌個体率は，雌卵携卵雌個体密度を個体密度で除して求めた。

結果

耐久卵からふ化させたツボワムシを 14 日間培養した結果の概要を図 2 に示す。ふ化ワムシは開始 1 日目には

図 2． 耐久卵からふ化したツボワムシ密度，日間増殖率，雌卵携卵雌個体率の推移
A：個体密度（雌個体の合計），B：雌卵携卵雌，C：雄卵携卵雌，D：耐久卵携卵雌，E：雄，F：日間増殖率，G：雌卵携卵雌個体率
日間増殖率 (％ )=(er −1) × 100
r：比増殖率雌卵携卵雌個体率 (％ )= 雌卵携卵雌個体密度 / 個体密度× 100– 17 –

図 3． 培養試験におけるツボワムシ密度，日間増殖率，雌卵携卵雌個体率の推移
試験 1，A：個体密度（雌個体の合計），B：雌卵携卵雌，C：雄卵携卵雌，D：耐久卵携卵雌，E：雄，●；植替えなし区，□：植替えあり 1 区，▲：植替えあり 2 区
試験 2，F：個体密度（雌個体の合計），G：雌卵携卵雌，H：雄卵携卵雌，I：耐久卵携卵雌，J：雄，K：日間増殖率，L：雌卵携卵雌個体率，●：植替えあり区，○：植替えなし区
図中の矢印は試験 1 の植替えあり 1 区，植替えあり 2 区および試験 2 の植替えあり区における植替え日を示す
試験 2 の植替えなし区では 25 日目に容器が満水になったため，1 L 分の培養水を廃棄
日間増殖率 (％ ) ＝ (er −1) × 100
r：比増殖率雌卵携卵雌個体率 (％ ) ＝雌卵携卵雌個体密度 / 個体密度× 100

日目に植替えした植替えあり 1 区および 2 区では植替え

試験 2 において，DO および pH は，それぞれ植替えな直後に密度は低下したが，その後は増殖し，11 日目にし 区 が 1.01 〜 3.20 mg/L，7.62 〜 7.98， 植 替 え あ り 区 がは共に 700 個体 /mL 以上となった（図 3A）。

2.03 〜 4.79 mg/L，7.49 〜 7.99 の範囲であった。試験 2 に– 18 –

小型容器によるツボワムシ耐久卵生産と利用おける平均個体密度（最小〜最大）は植替えなし区の本試験から，ツボワムシは耐久卵による保存が可能で260 個体 /mL（98 〜 422）に対して，植替えあり区ではあり，本手法を用いることで 1 ヶ月以上にわたりツボワ462 個体 /mL（131 〜 857）と有意に高かった（p ＜ 0.0001，

ムシを培養できることが明らかとなった。高密度で長期

Mann−Whitney U test，図 3 F）。平均日間増殖率は，植替間の培養を維持するためには，植替えを実施することがえ あ り 区 が 18.9 ％， 植 替 え な し 区 が 11.8 ％ で あ っ た効果的であると考えられた。今後は，本手法を基に，ツ（ 図 3 K）。 雄 卵 携 卵 雌 個 体（ 図 3 H） お よ び 雄 個 体

ボワムシの培養および利用に関して多方面の展開が期待（図 3 J）は，植替えあり区では培養 14 日後以降に頻繁にされる。

出現したが，植替えなし区における出現は少なかった。
耐久卵携卵雌個体は，両試験区ともに培養開始直後に多文献く出現し，植替えあり区では培養後半にかけても出現した（図 3 I）。なお，全ての培養において，ワムシ計数時

千葉健治・栗原伸夫・富永正雄（1970）養魚講座第 1 巻に少数の原生動物が観察される場合があったが，原生動泰雄・稲葉伝三郎編）. 緑書房 , 東京 , p. 166−179.

物によりワムシの増殖や活性が阻害される状態は認めら鯉（大島Hagiwara A and Hino A (1989) Effect of incubation and preservation on

れなかった。

resting egg hatching and mixis in the derived clones of the rotifer
Brachionus plicatilis. Hydrobiologia, 186/187, 415−421.

考察

Hagiwara A, Kadota Y, Hino A (2005) Maternal effect by stem females
in Brachionus plicatilis: effect of starvation on mixis induction inoffspring. Hydrobiologia, 546, 275−279.

Pourriot and Snell（1983）は，若い個体ほど減数分裂を伴う両性生殖雌個体を産みやすいと報告している。培Hino A and Hirano R (1977) Ecological studies on the mechanism of

養試験において，耐久卵の形成頻度が新規に培養を開始

bisexual reproduction in the rotifer Brachionus plicatilis-ii effects of

した直後に高かったことは，培養直後の個体群組成に若cumulative parthenogenetic generation on the frequency of bisexual

齢個体が多く含まれていた可能性がある。シオミズツボ

reproduction. Nippon Suisan Gakkaishi, 43, 1147−1155.

ワムシの場合，水温 25°C 以下で形成された耐久卵から

Hino A and Hirano R (1985) Relationship between the temperature given

ふ化した系群は，両性生殖頻度が高まることが報告され

at the time of fertilized egg formation and bisexual reproductionている（Hino and Hirano 1985，日野 1997）。今回実施しpattern in the deriving strain of the rotifer Brachionus plicatilis.

た複数の培養試験では，いずれにおいても耐久卵形成がNippon Suisan Gakkaishi, 51, 511 −514.

確認された。シオミズツボワムシの条件がツボワムシに日野明徳（1997）ワムシ生活史の人為的制御 . 月刊海洋号外 , 12,

直接当てはまるとは限らないが，本手法は培養装置を25°C に調整しており，両性生殖誘導に適した環境であっ62−66.
中本た可能性がある。

崇・稲田善和・牛嶋敏夫・萩原篤志（2007）通気装置の改良によるタマミジンコ Moina macrocopa の高密度大量培養 . 水産

耐久卵の形成条件として，シオミズツボワムシの場合増殖 , 55, 423−429.

では，耐久卵保存時の水温と光により，ふ化したクロー

新関晃司・渡邉昌人・泉茂彦（2014）施肥法による動物プランク

ン の 両 性 生 殖 頻 度 が 異 な る こ と（Hagiwara and Hino

トン出現動向およびウグイ仔魚放養時期の検討 . 水産増殖 , 62,1989），耐久卵からふ化した個体は，飢餓状態を経験す

445−452.

ると，以降の世代の両性生殖頻度が高まること（Hagiwara

太田滋規・幡野真隆・三枝仁・久米弘人・臼杵崇広・根本守仁・

et al. 2005）が報告されている。これらのことから，耐関 慎介・礒田能年（2014）淡水ワムシ（ツボワムシ Brachionus

久卵の形成には，培養時と耐久卵保存時における，水温calyciflorus PALLAS）大量培養マニュアル . 滋賀水試研報 , 55,や照明（強度，波長，時間）等の環境条件および餌料条153−197.

件が大きく関与していると考えられる。また，試験 1 お

Pourriot R and Snell T W (1983) Resting eggs in rotifers. Hydrobiologia,

よび 2 の結果では，植替えを 4 日間隔で実施した方が 7日目に 1 度植替えを実施するより両性生殖頻度が高く

104, 213−224.
Sato R (1950) On feeding habits of the larva of pond smelt, Hypomesus

なっている。植替えすることで，培養環境が良好な状態

olidus (PALLAS). Tohoku Jour. Agri. Res., 1, 215−222.

で維持され，かつ両性生殖誘導要因を阻害することなく鈴木俊一（1971）ドジョウの種苗生産に関する研究−V

天然初期ツボワムシ活性が維持された可能性がある。今後，より餌料としてのツボワムシの効果 . 滋賀水試研報 , 23, 11−18.

集約的に耐久卵を収穫するため，前述した環境条件，餌田中寿雄（1983）淡水産ツボワムシ Brachionus calyciflorus, の大量料条件，植替えの頻度を踏まえて，詳細な検討を加える必要がある。

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培養の可能性 . 水産増殖 , 31, 72−77.