常識を超えた新規C18カラム：
すべてのピークをシャープに！
クロマニック テクノロジーズ
長江徳和
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp
Jaima2009 新技術説明会9月2日

1

【緒言】
カークランドによりHPLCが発明されて以来40年近く経過するが，この間充填剤は日々改良が進められてきた。
 表面多孔性（ペリキュラー）充填剤から全多孔性に，さらに近年再び粒子径を3μm以下にした表面多孔性へと，シリカ系充填基材も変化している。
 またシリカ系逆相充填剤はシラノール基の影響を防ぐため，様々なエンドキャッピング技法が開発されてきた。
 演者らは従来のエンドキャッピング方法の概念を変え，エンドキャッピング試薬をあらかじめオクタデシルシリル化試薬に結合させたシリル化試薬を開発した。
 アミトリプチリンのピーク形状を比較することにより，この試薬で調製した充填剤の残存シラノール基の評価を行った。
Jaima2009 新技術説明会9月2日

2

新規C18試薬A（HMODTS) 特許出願中
ヘキサメチルオクタデシルテトラシラン

Step 2

Step 1toluene＋ H2O＋80℃，4h

MeO

Si

OMe
OMe

HOSiOMe
OMe

HOMeClMeMe MeMe MeSiOSiO

SiCltoluene30℃，2h

Si

OMe
OMe

MeCl

Jaima2009 新技術説明会9月2日

MeMe
SiO

MeMe
SiO

MeSi

O

Si

OMe
OMe

3推定されるシリカ表面での結合状態（Sunniest C18）

Final TMS

HO
Si
O
Si
Si
Si

O

Si

Si
O
Si
O

OO

O

Si

Si

Si
Si O
Si O
O O

Si

OOOO

O

SiOO

SiOOO

SiOOSi

SiOOO
SiOOO

SiOSiSi
HOOOSiOSiOOSi

O O

Si

OSi

O OH
OSiOO
Si
Si
Si
O O
O O O
OO
Si O
O Si OSiOOJaima2009 新技術説明会9月2日

OSiOOO429Si CP-MAS NMR
Si

OシリカゲルOSiOQ3

OH
Si

OH

O

Si
Si

Si

OSi

Si

O

Si

OO

Si

O

Si

Si

OH

Q2

Q4
RSi

Monofunctional C18

OR

M1

OH
Si

Difunctional C18

Si R

O

Si

O

Si R
Si

RO

Trifunctional C18

Si+ TMS

O

Si
Si

O

Si R
OH

T1
Jaima2009 新技術説明会9月2日

RD2

D1OH

R
Si

OH
Si

SiORT2SiSiOSiOROT35Sunniest C18充填剤の物性用いたシリカゲル: 12nm, 340 m2/g, 5 μm
C18試薬結合後の炭素含有量：16.1%
最終エンドキャッピング後の炭素含有量：16.3%

Jaima2009 新技術説明会9月2日

6アミトリプチリンのピーク比較Ⅰ
メタノール CH3OH, pH7.5, 40 ºC
Sunniest C18 （HMODTS)
1４

３

N(4)=11,000
TF(4)=1.06

2Sunniest RP-AQUA
1４３
2

N(4)=10,500
TF(4)=1.07

Column size: 4.6x150 mm
Particle size: 5μm
Mobile phase:
CH3OH/20mM Phosphate buffer pH7.5=80/20
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Propranolol
CH3ONHCH3OH

1４

A社C18321N(4)=8,950
TF(4)=1.76
４

B社C18
３

2N(4)=10,000
TF(4)=1.50

3 = Nortriptyline
NHCH34 = Amitriptyline
CH3NCH30246810Retention time/min

121416Jaima2009 新技術説明会9月2日

7アミトリプチリンのピーク比較Ⅱ
メタノール CH3OH, pH6.0, 22 ºCSunniest C18 (HMODTS)
1４

N(4)=9,000
TF(4)=1.08

３2４Sunniest RP-AQUA
1N(4)=8,000
TF(4)=1.10

３21

A社C18

４N(4)=3,900
TF(4)=2.92

321Column size: 4.6x150 mmParticle size: 5μm
Mobile phase:
CH3OH/20mM Phosphate buffer pH6.0=80/20
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 22 ºC
Sample: 1 = Uracil
CHONHCH
2 = Propranolol

B社C18 ３N(4)=5,800
TF(4)=2.86

４233OH3 = Nortriptyline
NHCH34 = Amitriptyline
CH3NCH302468101214Retention time/min

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8アミトリプチリンのピーク比較Ⅲ-A
アセトニトリル CH3CN, pH7.0, 40 ºC
Sunniest C18 (HMODTS)
４1３

N(4)=14,000TF(4)=1.16

2Sunniest RP-AQUA
1４３21

A社C18321N(4)=13,800
TF(4)=1.24

４33OH

3 = Nortriptyline

N(4)=4,000
TF(4)=4.33

B社C18４３2

Column size: 4.6x150 mmParticle size: 5μm
Mobile phase:
CH3CN/20mM Phosphate buffer pH7.0=60/40
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
CH
2 = Propranolol
ONH
CH

NH
CH3

N(4)=4,300
TF(4)=5.24

4 = Amitriptyline
CH3N
CH3024681012141618

202224

Retention time/min

Jaima2009 新技術説明会9月2日

9アミトリプチリンのピーク比較Ⅲ-B
ColumnTFN

ColumnTF

NSunniest C18(HMODTS)

1.16 14,000

Japanese company C1 C182.148,700

Sunniest RP-AQUA

1.24 13,800

P11.099,500

D15.19

M12.01 11,200

D2

2.19 14,200

Japanese company D1 C18

1.30 12,000

AT3.255,300

Japanese company D2 C18

2.928,000

S11.74

8,300

Japanese company D3 C18

2.70

6,100

W1

1.97 10,600

Japanese company E1 C18

0.99 11,400

WS2

1.59 10,100

Japanese company F1 C18

3.44

W3

1.33 10,000

Japanese company G1 C18

1.71 10,000

3,300

6,700

Japanese company A1 C18 3.078,500

Japanese company G2 C18

2.15 11,500

Japanese company A2 C18 2.529,200

Japanese company H1 C18

11.12,100

Japanese company B1 C18 2.2350Japanese company I1 C183.777,400

A13.285,900

Japanese company B2 C18 2.01 10,900
Japanese company B3 C18 7,75Column size: 150 X 4.6 mm
Particle size: 5 μm
Mobile phase:
CH3CN/20mM Phosphatebuffer pH7.0=60/40
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: Amitriptyline

CH3N
CH33,600

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10溶質の水和状態の変化
塩基性化合物のカチオンの周りの水和量は

H

H
O
H
CH3OH+ H
N
CH3

カラム温度が下がるほど下がり，メタノールよりもアセトニトリルの方が下がる
HHO
H
CH3OH+ HN
CH3H OH

H OH

メタノール 22℃

O HHH

CH3+ H O H
NCH3

メタノール 40℃

O H
H

塩基性化合物のカチオンの周りの水和量が少ない

アセトニトリル 40℃

シラノール基とのイオン交換吸着相互作用が強く働く

テーリング

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11シラノール基を残したC18固定相
Sunrise C18-SAC

シロキサン結合に変換

高吸着性
シラノール

OO

O

H

Si

Si

H

H

H

H

H

H

O

O

O

O

O

Si

Si

Si

Si

SiO
Si

H

O

O
Si

Si

水和したシラノール基はアミトリプチリン（塩基性）をイオン交換相互作用で保持増大させるが，アミトリプチリンをテーリングさせない。
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12酢酸アンモニウムを用いた塩基性化合物の分離：pHの影響
ホフマイスター系列の上位に位置するアンモ1

ニウムイオンが安定な水和層を形成

2

pH 2.743

酢酸のみ
1

pH 3.53

移動相：アセトニトリル/100mM 酢酸アンモニウム (70:30)
流速：1.0 mL/min
温度：40 ºC
試料：1=ウラシル，2=トルエン, 3=プロプラノロール，
4=ノルトリプチリン，5=アミトリプチリン

N=13,0004

1 2531カラム：Sunrise C18-SAC 4.6 x 150 mm

52pH 4.1

5

N=12,500

42pH 5.0354

N=11,500

1 2pH 5.91434

5N=11,500

2

pH 6.803510152025
保持時間(min)530

N=11,50035

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4013耐久性の評価

耐酸性加速試験

耐久性試験条件
Column size: 4.6x150 mm
Mobile phase:
CH3CN/1.0% TFA,pH1=10/90
Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 80 ºC

保持時間測定条件
Column size: 4.6x150 mm
Mobile phase:
CH3CN/H2O=60/40
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Ethylbenzene
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14耐久性の評価

アルカリ性試験

Sunniest C18はpH10，50℃の条件で700時間の耐久性
耐久性試験条件
Column: Sunniest C18, 5μm
4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/20mM Sodium
borate /10mM NaOH=30/21/49 (pH10)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 50 ºC
理論段数測定条件
Column: Sunniest C18, 5μm
4.6x150 mm
Mobile phase: CH3CN/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Butylbenzene

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15耐久性の評価

アルカリ性試験

Sunniest C8はpH9.2，40℃の条件で600時間の耐久性耐久性試験条件
Column: Sunniest C18, 5mm
4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/20mM Sodium
borate /10mM NaOH=30/21/49 (pH10)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 50 ºC
理論段数測定条件
Column: Sunniest C18, 5mm
4.6x150 mm
Mobile phase: CH3CN/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Butylbenzene

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16分離特性Ⅰ
金属配位性化合物の分離

標準試料の分離例
23154051015172620253035

Retention time/min

Column: Sunniest C18 HMODTS, 5μm 4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Pressure: 5.4 MPa
Sample: 1 = Uracil,
2 = Caffeine,
3 = Phenol,
4 = Butylbenzene
5 = o-Terphenyl
6 = Amylbenzene
7 = Triphenylene
疎水性：分離係数（Amylbenzene/Butylbenzene） = 1.58

02468

Retention time/min

Column: Sunniest C18HMODTS, 5μm 4.6x150 mm
Mobile phase:
CH3CN/20mM H3PO4=10/90
Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = 8-Quinolinol
2 = Caffeine

水素結合性：分離係数（Caffeine/Phenol） = 0.4１立体選択性：分離係数（Triphenylene/o-Terphenyl） = 1.43

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17分離特性Ⅱ
酸性化合物の分離

ピリジンとフェノールの分離分離係数（Pyridine/Phenol） = 0.37

312321024680Retention time/min

2468Retention time/min

Column: Sunniest C18HMODTS, 5μm 4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=30/70
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = Uracil
2 = Pyridine
3 = PhenolColumn: Sunniest C18
HMODTS, 5μm 4.6x150 mm
Mobile phase: CH3CN/0.1% H3PO4=2/98
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@210nm
Sample: 1 = Formic acid
2 = Acetic acid
3 = Propionic Acid

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18移動相の異なる条件でのアミトリプチリンのピーク比較
A4
1

N(4) =11,000
TF(4) =1.03 Column: Sunniest C18, 5μm 150 x 4.6 mm
Mobile phase:A) CH3OH/20mM Phosphate buffer pH7.5 = 80/20
B) CH3OH/20mM Phosphate buffer pH6.0 = 80/20
C) CH3CN/20mM Phosphate buffer pH7.0 = 60/404N(4) =9,000 D) CH3CN/10mM Ammonium acetate pH6.8 = 40/60
TF(4) =1.06 Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC for A, C and D, 22 ºC for B
Sample: 1 = Uracil,
2 = Propranolol,
4 N(4) =12,500
3 = Nortriptyline,
4 = Amitriptyline,
TF(4) =1.04
5 = Toluene

32B

312C

123
5

D

0

1223

4

4

6N(4) =12,100
TF(4) =1.09

810Retention time (min)125141618

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2019

他社との比較
N=12,200
TF=1.30
1

N=12,100
TF=1.21

N=12,000
TF=1.28

Sunniest C18
Sunniest RP-AQUA
N=5,100
TF=2.4

Sunniest C8Column size: 4.6x150 mm
Particle size: 5μm
Mobile phase: CH3CN/10mM
Ammonium acetate
pH6.8=40/60
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: Amitriptyline

N=8,500
TF=2.6

E社 C18N=5,500
TF=2.1F社 C18N=8,100
TF=2.0

G社 C18CH3NCH3H社 C1802468101214

Retention time/min

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20カラムからの溶出物の比較（ブリード現象）
Column size: 2.0x150 mm
Mobile phase:A) 0.1% acetic acidB) CH3CN
Gradient:
Time: 0min 3min 14.4min 18min 19min%B: 5% 5% 100% 100% 5%
Flow rate: 0.2 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: Corona CAD

F社 C18

B社 C18Sunniest C18 HMODTS

Retention time/min

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21

MSを用いたブリードの比較

Company B C18

Sunniest C18 HMODTS

Column size: 150 x 2.0 mm
Mobile phase:A) 0.1% acetic acidB) CH3CN
Gradient:
Time: 0min 3min 14.4min 18min 19min%B: 5% 5% 100% 100% 5%
Flow rate: 0.2 mL/min
Temperature: 40 ºC
MS： ABI API-4000
Ionization: Turboionspray (cation)
Measurement mode:
Q1 Scan m/z 100-1000

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22オクチル基(C8,HMOTS)でも同様に合成
アミトリプチリンのピーク形状
4AColumn: Sunniest C8 HMOTS, 5μm 4.6x150 mm
N(4)=11,700 Mobile phase:A) CH3CN/20mM Phosphate buffer pH7.0=60/40
TF(4)=1.09
B) CH3CN/10mM Ammonium acetate pH6.8=40/60
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil，

312

2 = Propranolol，

4B

1O

N(4)=11,200
TF(4)=1.21

3CH 3NHCH 3OH

3 = Nortriptyline，

2NHCH 3

4 = Amitriptyline
CH 301234567NCH 3

Retention time/min

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23

【まとめ】Sunniest C18, RP-AUQA, C8
 エンドキャッピング試薬として用いられるヘキサメチルトリシロキサンをODSに結合させた新規C18試薬（HMODTS)を開発した
 HMODTSの官能基はシリカ表面の様々な位置のシラノール基と結合可能
 残存シラノール基を非常に少なくすることが可能
 移動相中の有機溶媒や緩衝液などの制限を受けることなく，塩基性化合物のテーリグを少なくできる
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