課題番号：27指1302

研究課題名：B型慢性肝炎完治に向けた核酸アナログ製剤の新規効能効果の発見とその基礎的・臨床的検討

主任研究者名 ：青木孝彦
分担研究者名 ：村田一素
キーワード：B 型慢性肝炎、IFN-3、免疫賦活

研究成果

：

(1) B 型肝炎治療薬の核酸アナログ製剤のうち、アデフォビル (ADV)、テノフォビル (TDF)には、腸管細胞において IFN-3 を誘導することを世界で初めて証明した。
我々は C 型慢性肝炎治療におけるペグインターフェロン＋リバビリン療法において、Genome-wide
association study (GWAS)によって、interleukin (IL)-28B が治療効果予測として重要であることを報告した（NatGenet 2009）。
そこで、B 型肝炎患者血清を用いて、その蛋白である IFN-3 を測定したところ、nucleotide analogue製剤である ADV および TDF 服用中の患者のみで血清 IFN-3 値が高値を示すことを発見した。経時血清を用いても同薬剤の服用後に血清 IFN-3 値上昇は上昇したため、薬剤そのものが IFN-3 を誘導しているものと考えた。次に各種細胞株を用いて ADV, TDF の IFN-3 誘導能を検討すると、唯一大腸癌細胞株において、血清で得られたように ADV, TDF で IFN-3 が誘導され、容量依存性を示した。
一方、同効果は nucleoside analogue製剤であるラミブジン (LAM)やエンテカビル (ETV)では認めなかった。また、mRNA レベル、免疫化学組織染色でも同様所見が得られたことから、ADV・TDF は腸管細胞にて IFN-3 を誘導すると結論付けた。

(2) ADV・TDF で誘導された IFN-3 は直接あるいは ISG を介して間接的に HBs 抗原低下作用を示す
ADV・TDF は核酸アナログ製剤であり、B 型肝炎ウイルス (HBV)の逆転写酵素を阻害し、抗 HBV 効果を示すが、HBs 抗原産生には理論的に関与しない。しかし、最近の臨床研究で TDF 内服中の B 型慢性肝炎患者
で HBs 抗原が低下することが報告されている。そこで、recombinant IFN-3 を HBs 抗原産生肝癌細胞に投与したところ、その容量依存性に HBs 抗原低下が確認された。大腸癌細胞を ADV で処理した際の上清を肝癌細胞に投与したところ、肝癌細胞内の interferon stimulated genes (ISG)が誘導され、さらに同上清を HBs 抗原
産生肝癌細胞に投与すると HBs 抗原が低下した。これらのことから、経口投与された ADV・TDF が腸管細胞で IFN-3 を誘導し、誘導された IFN-3 は門脈を介して肝に至るため、TDF 投与患者で HBs 抗原が低下したものと考えられた。以上をまとめて Gut に報告した。本発見は新たな HBV 治療戦略として重要である。

(3) ADV・TDF による IFN-3 誘導機序の解明
上記のように ADV・TDF が IFN-3 誘導という新たな追加効果があったとしても、それらの単独療法では
HBV の排除は難しいことは今までの臨床研究で証明されている。そこで、さらに強力な IFN-3 誘導剤を開発できれば治療に貢献できるかもしれないと考えた。そこで、まず、ADV・TDF の IFN-3 誘導機序について検討した。我々は ADV・TDF の構造より XX 蛋白（論文投稿前であるため仮称）に注目した。5 種類の大腸癌細胞株を用いて検討すると、その ADV による IFN-3 誘導能と XX 蛋白の発現量はきれいに相関した。さらに、XX 蛋白発現大腸癌細胞から XX を knock-out した細胞を樹立し、その細胞を用いて核酸アナログ製剤を投与すると見事に IFN-3 誘導能は消失した。IFN-によって、それらの細胞で IFN-3 は誘導されるが、その誘導能は XX knock-out にて変化なかった。一方、XX 非発現細胞に XX を knock-in した細胞も樹立した。それらの細胞では XX の knock-in そのもので非常に強力に IFN-3 が誘導され、ADV・TDF による IFN-3 誘導

能は確認できなかった。以上より、ADV・TDF は XX 蛋白を介して IFN-3 を誘導することが証明された。本内容についての論文は現在、投稿中である。

(4) ADV・TDF と IFN-の併用は IFN-3 に関して相加効果を示す
核酸アナログ製剤の効果を増強させる治療法として IFN-を併用することが臨床的に提唱されている。そこで、大腸癌細胞株を ADV・TDF とともに IFN-を併用して刺激し、その上清中の IFN-3 を測定した。IFN-の単独投与は容量依存性に IFN-3 を誘導し、ADV・TDF の追加投与は IFN-3 誘導を相加的に増加させた。
この効果は LAM, ETV でも同様に認められた。

(5) B 型肝炎治療における Sequential 療法（核酸アナログ製剤を中止し、PEG-IFN-を投与する治療法）において核酸アナログ製剤中止時の HBs 抗原、HBV コア抗原および IFN-3 値が治療効果に関連する
核酸アナログ製剤投与中の B 型肝炎患者 95 名に対して、前向きに血液採取し、PEG-IFN-に変更した際の治療効果につき検討した（信州大学倫理委員会承認、当施設では IFN-3 測定を担当）。95 名中、26 名が効
果良好であり、多変量解析より、PEG-IFN-a 投与前の HBs 抗原および HBV コア関連抗原が低値、IFN-3 が高値であることが効果良好因子として抽出された。今まで、Sequential 療法において、効果良好群の選別が困難であり、かつ PEG-IFN-は副作用が多く問題であったが、上記 3 項目を満たした症例に限れば、効果良好が期待されるため、効率的な治療および副作用の軽減という意味において重要な知見と考えられる。結果は J
Gastroenterol に報告した。

(6) B 型慢性肝炎患者に対する ADV、TDF 投与は HBs 抗原低下作用があり、その効果は血清 IFN-3 値と相関する
核酸アナログ製剤投与中の B 型肝炎患者 176 名（ETV 投与 121 名、ADV または TDF 投与 55 名）の経過観察を行ったところ、ADV または TDF 投与群で有意に HBs 抗原値が低下した。同じ HBV 遺伝子型 C（遺伝子型により治療効果が異なるため）で、3 年以上の経過観察できた症例に限ると ADV・TDF による IFN-3
誘導量と HBs 抗原低下量は負の相関を示した。先述した recombinant IFN-3 の容量依存性に HBs 抗原産生肝
癌細胞株からの HBs 抗原産生が低下するという vitro 実験を臨床で証明できたことになる（投稿中）。なお、
本研究は北海道大学倫理委員会にて承認された臨床研究で、当施設では IFN-3 測定を担当した。

(7) B 型肝炎治療薬の核酸アナログ製剤のうち ADV、TDF は、免疫賦活効果がある
ADV ・ TDF が 経口投与さ れた場 合、それら は腸管にて吸収 され、門脈 に至る。また、 門脈内にはlipopolysaccharide (LPS)が存在するため、ADV・TDF は LPS 誘導サイトカインに何らかの影響がある可能性を仮定した。健常者より得られた末梢血リンパ球 (PBMC)と核酸アナログ製剤を培養し、LPS を投与した際のサイトカイン産生能の変化について、BioPlex cytokine assay を用いて、誘導サイトカインを網羅的に検討した
ところ、ADV・TDF は IL-10 産生を抑制し、IL-12p70, tumor necrosis factor (TNF)-産生を誘導した。その他のサイトカインに有意な変動を認めなかった。それらの反応は ADV・TDF 容量依存性であり、サイトカイン産
生量は個人差があるものの、そのパターンは実験を行ったすべての健常者で同様であった。また、B 型慢性肝炎、肝硬変患者からの得られた PBMC で実験を行っても、IL-10 抑制、IL-12p70・TNF-誘導のパターンは同様であった。唯一、肝硬変患者から得られた PBMC を用いた場合は、そのサイトカイン産生能は、他のステージの肝炎患者のものに比し低値であった。IL-10 は過剰な免疫反応を押さえ、B 型慢性肝炎患者において更新していることから、慢性化の一つの原因と考えられている。一方、IL-12p70 は、CD8+ T 細胞を活性化しウイルス感染細胞の破壊 (cytopathic killing)に、Natural killer 細胞を活性化し、サイトカインなどを誘導し、non-cytopathic killing に貢献する。以上より、ADV・TDF 投与により、これらのサイトカイン変動による免疫賦活が起こるので HBV 排除を期待できる。

(8) ADV・TDF と IFN-の併用は IFN-3 に関して相乗効果を示す
健常者より採取した PBMC と核酸アナログ製剤 (LAM, ADV, ETV, TDF)と同時に IFN-を投与し、その後
LPS を投与すると ADV・TDF を使用した場合に限り、その IL-12p70 誘導量は 4-5 倍になった。LAM, ETV では、その効果は全く認められなかった。一方、IL-10 産生能における IFN-の追加効果はなかった。最近、TDFと PEG-IFN-の併用療法にて、B 型慢性肝炎の治療が良好であったと報告されたが、我々の結果は、その機序として重要である。

(9) ADV、TDF は IL-10 産生を抑制する（免疫賦活機序の解明）
ADV・TDF により IL-10 産生が抑制され、IL-12p70, TNF-が誘導された。IL-10 と IL-12p70 はお互いに作用しあうため、どちらの反応が ADV・TDF による作用なのかが不明である。そこで、PBMC、核酸アナログ
製剤に IL-10 あるいは IL-12p70・TNF-の抗体や recombinant 蛋白を同時投与し、その後に LPS で刺激し、上清中のサイトカインの変動を検討した。すると IL-12p70・TNF-の抗体や recombinant 蛋白を用いた場合のサイトカイン変動は全く認めなかったが、IL-10 の抗体や recombinant 蛋白を用いた場合、IL-12p70 は、IL-10 抗体・recombinant 蛋白の容量依存性に上昇あるいは低下した。すなわち、ADV・TDF は本反応において IL-10
産生を抑制し、その変化に対応して IL-12p70・TNF-が誘導されることが判明した。

(10) ADV、TDF は単球からの IL-10 産生を抑制する（免疫賦活機序の解明）
PBMC から、T 細胞、NK 細胞、B 細胞、単球分画をそれぞれの抗体を用いて除去し、同様の実験を行った
ところ、単球の除去により LPS 刺激による IL-10 産生能は消失した。さらに単球のみに核酸アナログ製剤を投与し、その後に LPS で刺激したところ、ADV・TDF で有意に単球からの IL-10 産生は低下した。すなわち、
ADV・TDF は単球に作用し、LPS 誘導 IL-10 産生を抑制することが判明した。

(11) ADV、TDF は YY のリン酸化を抑制する
ADV・TDF による腸管細胞における IFN-3 の誘導、LPS による単球からの IL-10 産生抑制の他の効果を検討した。我々は、過去の様々な文献検索より、ADV・TDF が YY（特許のため仮称とする）のリン酸化を抑制するとの仮説を立てた。様々な細胞株に核酸アナログ製剤を投与し、YY のリン酸化を検討したところ、すべての細胞株で YY のリン酸化は抑制されていた。さらに、その機序を解析し、解明も終了しており、現在、
その内容を投稿中である。なお、YY は腫瘍増殖シグナルとして重要と考えられているため、ADV・TDF による抗腫瘍効果が期待される。

このように我々は、ADV・TDF の新規追加効果を発見し、その機序がある程度解明できた。これらの研究は、
平成 30 年度より、国立研究開発法人

日本医療研究開発機構による研究資金を得て、継続される（Nucleotide

analogue 製剤のサイトカイン誘導を利用して B 型肝炎のドラッグフリーを目指す治療法の開発及び創薬に関する研究）。今後、基礎研究とともに臨床応用に向けて発展させていきたい。3 年間の研究開発資金を提供いただき感
謝いたしております。

Subject No.

：27 指 1302

Title

：Basic and clinical study for complete elimination of HBV based on

additional effects of nucleotide analogues
Researchers ：Yoshihiko Aoki
Key word：chronic hepatitis B, IFN-3, immune-modulatory effects
Abstract：
We recently found that interleukin (IL)-28B polymorphisms (non-TT) were strong
predictive factors for non-responder of pegylated-interferon (IFN)/ribavirin (RBV) treatment
by genome-wide association study (GWAS) (Nat Genet 2009). We hypothesized that IL-28B(IFN-3) could be responsible for HBV treatment as well. Therefore, we measured serum
IFN-3 levels in patients with chronic hepatitis B. Unexpectedly, we found that high serum
IFN-3 levels were observed in patients who were treated with nucleotide analogues(adefovir; ADV or tenofovir; TDF), not nucleoside analogues (lamivudine; LAM or entecavir;
ETV). To confirm this, we measured serum IFN-3 levels using series of samples in patients
who were treated with nucleos(t)ide analogues, which revealed the elevation of serum IFN-3
levels on treatment with nucleotide analogues. These findings suggest that nucleotide
analogues themselves induced IFN-3. Next, we sought to demonstrate these findings in vitro.
We used cell lines originated from lungs, skin, gastrointestinal tract, liver and lymphocytes,
but only colon cancer cell lines induced IFN-3 by ADV or TDF. No induction of IFN-3
was observed by nucleoside analogues (LAM, ETV). ADV or TDF induced mRNA levels of
IL-28B and IFN-3 protein was observed in colon cancer cell lines by immunohistochemistry.
Nucleos(t)ide analogues inhibit replication of hepatitis B virus (HBV) by inhibiting its
reverse transcriptase, but theoretically do not affect production of HBV surface antigen(HBsAg). However, recent report showed decrease of serum HBsAg levels in patients who
were treated with TDF, not ETV. Therefore, we sought to confirm it in vitro. Hepatoma celllines that produce HBsAg were treated with recombinant IFN-3 and HBsAg levels in the
supernatant were measured. Recombinant IFN-3 decreased HBsAg levels in adose-dependent manner. Next, hepatoma cell lines were treated with the supernatant in theculture of colon cancer cell lines treated with ADV or ETV, and interferon (IFN)-stimulated
genes (ISG) in the hepatoma cell lines were analyzed. ISG levels in the hepatoma cell lines
were up-regulated when colon cancer cell lines were treated with ADV, not ETV. Thesefindings would have great clinical implication because orally treated ADV or TDF reached
gut where IFN-3 was induced, induced IFN-3 went into liver through portal vein. We
reported these findings together on Gut.
Monotherapy of ADV or TDF is not sufficient to eliminate HBV or stop treatment eventhough it shows such an additional effect. Then, we tried to find out stronger inducers of
IFN-3 as novel HBV therapies. To find those, we should understand its mechanism. First,
we focused on XX because of its structure. We used 5 colon cancer cell lines and compared
their expression levels of XX with ADV-induced IFN-3 levels. As we expected, they were
well-correlated each other. Next, we established cell lines that were knocked-out of XX. In

the XX knock-out cells, ADV did not induce IFN-3 whereas IFN- induced IFN-3 as seen
in wild cells. Meanwhile, XX-knock-in cells were also established in cells that had no XX
expression. XX-knock-in induced IFN-3 and IFN-3 induction by nucleotide analogues
were not detected. Taken together, ADV or TDF induced IFN-3 through XX, which are now
submitting to the journal.
Combination of nucleotide analogues with PEG-IFN- showed favorable effects inclinical studies. Therefore, colon cancer cells were treated with nucleos(t)ide analogues
together with IFN- and IFN-3 in the supernatant were measured, which showed additional
effect of IFN- in induction of IFN-3 by nucleos(t)ide analogues.
We analyzed the factors associated with favorable responses in patients with sequential
therapy (nucleos(t)ide analogues were switched to PEG-IFN-). Patients with chronic
hepatitis B (n = 95) who were treated with nucleos(t)ide analogues were prospectively
switched to PEG-IFN-. Serum samples were taken before switching. This study wasapproved by University of Shinshu and our laboratory measured serum IFN-3 levels.
Twenty-six out of 95 patients showed favorable responses. A multivariate analysis
demonstrated that low levels of HBsAg and HBV core related antigen (HBcrAg), and highlevels of serum IFN-3 before initiation of PEG-IFN- were significant factors for favorable
responses. There are no factors available to select patients with favorable responses insequential therapy. In addition, PEG-IFN- has significant side effects. Current findings
would be important, especially regarding to selection of patients with favorable responses.
In another clinical study, we retrospectively observed serum HBsAg levels in patients
who were treated with nucleoside analogues or nucleotide analogues. Serum HBsAg levels
were significantly decreased by nucleotide analogues, compared with nucleoside analogues.
Interestingly, serum IFN-3 levels were inversely correlated with decreased HBsAg levels,
which were consistent results with our vitro experiments that recombinant IFN-3 decreased
HBsAg levels in a dose-dependent manner. This study was approved in Hokkaido University
and our laboratory measured serum IFN-3 levels.
Orally administered nucleo(s)tide analogues absorbed from gastrointestinal tract and go
through portal vein. Since enteric lipopolysaccharide (LPS) can cross the intestine and spread
into portal vein, we hypothesized that orally administered nucleos(t)ide analogues influenced
LPS-induced cytokine production in peripheral blood mononuclear cells (PBMC). PBMC
from healthy volunteers were treated with nucleos(t)ide analogues, following stimulation withLPS and several cytokine production were measured by BioPlex cytokine assay, which
revealed that ADV or TDF inhibited IL-10 and enhanced IL-12p70 and tumor necrosis factor(TNF)-, not LAM or ETV These cytokines changes were dose-dependent on ADV or TDF.
When using PBMC from HBV patients, these patterns were similarly observed although all
cytokine production was impaired when PBMC from patients with liver cirrhosis were used.
It is well-known that IL-10 partially contributes to chronicity of HBV because IL-10 inhibits
sur-plus immune responses and IL-10 is up-regulated in patients with chronic hepatitis B.
Meanwhile, IL-12p70 activates CD8+ T cells to kill virus-infected cells (cytopathic killing)and natural killer cells to eliminate virus from virus-infected cells without cytotoxicity(non-cytopathic killing). Taken together, these cytokine changes induced by ADV or TDF
may contribute to HBV elimination.
PBMC from healthy volunteers were treated with nucleos(t)ide analogues together with
IFN-, following stimulation with LPS, and cytokine production was measured. ADV or TDF
induced IL-12p70 and combination of IFN- enhanced IL-12p70 production by 4 to 5 times.
There were no changed in IL-10 levels. Recent clinical study showed favorable effectresponses in patients treated with combination of TDF and PEG-IFN-, which our ex vivo
study may support.
IL-10 and IL-12 are important cytokines for host immune controls and are reciprocallyregulated by one another as anti-inflammatory and pro-inflammatory cytokines, respectively.
To clarify whether inhibition of IL-10 or induction of IL-12 is a primary reaction of ADV or
TDF, we treated PBMC with monoclonal antibodies or recombinant proteins of each cytokine
with NUC and LPS ex vivo for 2 h after stimulation with LPS, then measured cytokine
production in the supernatant. Recombinant proteins or antibodies of IL-12p70 and TNF-
did not change IL-10 production. In contrast, recombinant proteins or antibodies of IL-10
inhibited and enhanced IL-12p70 and TNF- in a dose-dependent manner, which suggest that
ADV or TDF inhibit IL-10 production that reciprocally induced IL-12p70 and TNF-.
Next, we sought to identify cells responsible for IL-10 production. We depleted T cells,
NK cells, B cells, and monocytes from PBMC by each antibody. These cells were stimulatedwith LPS and IL-10 in the supernatant was measured. IL-10 production was abrogated bydepletion of monocytes from PBMC. Monocytes were treated with nucleos(t)ide analogues,
following stimulation with LPS and IL-10 production was measured, which revealed that
ADV or TDF significantly inhibited IL-10 production. Taken together, monocytes contributed
to IL-10 production by LPS and ADV or TDF inhibited IL-10 production in monocytes.
Finally, we sought to determine other effects except for IFN-3 production in
gastrointestinal tract or IL-10 inhibition in monocytes. From the intensive search for previous
papers, we hypothesized that ADV or TDF could inhibit phosphorylation of YY protein. We
treated many cells from different origin with nucleos(t)ide analogues and analyzed
phosphorylation of YY, which revealed that YY phosphorylation was inhibited in all cells
tested. Since YY is one of key players of tumor growth, ADV or TDF could contribute toregression of tumor growth. We are now submitting about this.
We found, for the first time, these additional effects of ADV or TDF and theirmechanisms. These studies are now approved by AMED this year and we would like tofurther develop basic and clinical studies. We greatly appreciate your help.

「B型慢性肝炎完治に向けた核酸アナログ製剤の新規効能効果の発見とその基礎的・臨床的検討」

国際医療研究開発費 （27指1302）（研究代表者：村田一素→青木孝彦）
H27-H29年度: 1,620万円

核酸アナログ製剤 (Nucleos(t)ide analogues; NUC)

患者血清

・ラミブジン (LAM)
・アデフォビル (ADV)・エンテカビル (ETV)・テノフォビル (TDF)

ADV・TDFのみが、腸管細胞でIFN-l3を誘導する
Liver

IFN-l3培養細胞（大腸癌細胞）
HT-29 cells

WiDr cells

p = 9.4×10-5

経口
ADV
TDF

p = 0.010

p = 6.5×10-6

p = 3.3×10-5

200

100

0
DMSO IFN
IFN
DMSO

LAM
LAM

ADV
ADV

ETV
ETV

TDF
TDF

p = 0.028 p = 0.001 p = 0.000430

p = 0.0013 p = 0.0012 p = 1.2×10-5

IFN-l3 (pg/ml)

IFN-l3 (pg/ml)

63.1

300

門脈を介して肝臓へ（経口投与で効果）

20

10

0

DMSO
DMSO IFN
IFN

LAM
LAM

ADV
ADV

ETV
ETV

TDF
TDF

腸管
Murata K, et al. Gut 2018

ADV・TDFは、腸管でIFN-l3を誘導し、抗HBV効果を示す
Recombinant
IFN-l3

・培養液 + DMSO
・上清 (ADV, ETV)

・ADV
・ETV

HBsAg

WiDr
WiDr

3 日間培養Huh7

PLC/PRF/5

MX1

20
HBsAg (IU/mL)

2日間培養

ISG

Huh7 or HepG2

HepG2

ADV

ETV
DMSO

15

**

**

10

***

5

OAS2
0
0

10
100
1000
10000
Recombinant IFN-l3 pg/mL

ISG: interferon stimulated genes

IFN-l3は肝細胞内でISGを誘導する

IFN-l3の直接的抗HBV効果
・Medium + DMSO
・The supernatant (ADV, ETV)

・ADV
・ETV

WiDr

PLC/PRF/5

2日間培養

***

**

16

HBsAg (IU/mL)

HBsAg

3日間培養

ADV・TDFが腸管でIFN-l3を誘導すると誘導されたIFN-l3は門脈を介して肝に至り、直接あるいはISGを介して間接的に抗HBV効果を示す

12
8
4

0
DMSO
DMSO

ADV
ADV

ETV
ETV

Supernatant

Murata K, et al. Gut 2018

IFN-l3誘導機序の解明
¥¥¥¥

IFN-a

ADVによるIFN-l3誘導能

ADV・TDF
ADV・TDF(viralmimetics?)
mimetics?)
Virus(viral

¥¥¥¥

IFN-l3 (pg/mL)

80
60Type I IFN-R

40

??
YY

ADV, TDFの認識には、両方必要

20

CaCo2

SW480

T-84

T-84

HT-29

HT-29

WiDr

WiDr

大腸癌細胞

CaCo2

0
SW480

XX
XX
intactXXb-actin

Kotenko SV, et al. Curr Opin Immunol 2011（改変）・ADV・TDFは、XXを介しIFN-l3を誘導させる・XXの発現だけでは不十分 (SW480)
上流に核酸認識機構が存在?
（検討中）

Wild KOXX
IFN-l3 (pg/ml)

150

150

Wild

100

100

50

50

0
DMSO

IFN

LAM

ADV

ETV

TDF

KO

強力なIFN-l3誘導剤の創出には機序の解明が重要

0
DMSO

IFN

LAM

ADV

ETV

TDF

Murata K, et al. Submitting

ADV・TDFは、IL-12を誘導する
ADV or TDF
ADV・TDF

IL-12 (pg/mL)

300

・LPS (Lipopolysaccharide)

ADV・TDFは、LPS存在下で、PBMCよりIL-12を誘導

200

100

0

経口投与された核酸アナログ製剤は腸管より吸収され、リンパ球とLPSに曝される

DMSO

LAM

ADV

リンパ球 (PBMC)を核酸アナログと共培養し、LPSで刺激

ETV

TDF

Murata K, et al. Submitting

ADV・TDFとIFN-aとの併用効果
大腸癌細胞 (WiDr)

200

IFN-a
+

IFN-l3
追加効果

末梢血リンパ球

IL-12
相乗効果

800

400

IFN-a

LPS (-)

Murata K, et al. Gut 2018

IFN-a

LPS 100 ng/mL

TDF

ETV

ADV

LAM

TDF

DMSO

DMSO LAM ADV ETV TDF
IFN-a

ETV

0

ADV

0

LAM

100

DMSO

IFN-l3 (pg/ml)

300

IL-12 (pg/mL)

1200

LPS 100 ng/mL+ IFN-a 100 U/mL

Murata K, et al. Submitting

「B型慢性肝炎完治に向けた核酸アナログ製剤の新規効能効果の発見とその基礎的・臨床的検討」

国際医療研究開発費 （27指1302）（分担研究者：村田一素）

分担研究課題名： ADV・TDFによるIL-10抑制機構の解明
PBMC + NUC + recombinant or antibodies + LPS → 上清中のサイトカインを測定
Recombinant protein
TNF-a
IL-12

300
300

IgG
400
400
0
200
2001

200
200
100
100

00

11

10

600
600

200
200

400
4000

00

1
200
200
10
00100

11

100
100
00

10
10

00
100

DMSO
DMSO
LAM
LAM
ADV
ADV
ETV
ETV
TDF
TDF

DMSO
DMSO
LAM
LAM
ADV
ADV
ETV
ETV
TDF
TDF

00

IgG
IgG

300
300

100
100

10
10
100
100

DMSO
DMSO
LAM
LAM
ADV
ADV
ETV
ETV
TDF
TDF

600
600

DMSO
DMSO
LAM
LAM
ADV
ADV
ETV
ETV
TDF
TDF

400
400

IL-10 (pg/mL)

Antibodies
TNF-a
IL-12

IL-12, TNF-aの抗体あるいは蛋白はIL-10誘導に影響しない
Recombinant IL-10

00

0
0

144

1
1

22
10

10
10

00
100

100
100
TDF

TDF
TDF

ETV
ETV

ADV
ADV

100

100
100

2525

66

ETV

10
00

10
10

5050

88

0

ADV

1

11

7575

LAM

44

TNF-a (ng/mL)

00

1010

DMSO
DMSO
LAM
LAM
ADV
ADV
ETV
ETV
TDF
TDF

0

IL-12p70 (pg/mL)

IgG
IgG

88

LAM
LAM

DMSO
DMSO
LAM
LAM
ADV
ADV
ETV
ETV
TDF
TDF

100
100

IgG

DMSO
DMSO

200
200

00

100
100

1212
TNF-a(ng/ml)(ng/mL)
TNF-a

IL-12p70 (pg/mL)

300
300

DMSO

Antibody of IL-10

IL-10の抗体あるいは蛋白の容量依存性にIL-12, TNF-aが変化

ADV・TDFは、IL-10の産生を阻害する

Murata K, et al. Submitting

分担研究課題名： 核酸アナログ製剤のIL-10産生抑制機序の解明（分担研究者：村田一素）
リンパ球 + LPS (+ NUC) → 上清中のサイトカインを測定
各種細胞除去

単球のみ
600

0
CD3

CD14

CD19

CD56

TDF

0

200

ETV

250

ADV

500

400

LAM

750

DMSO

IL-10 (pg/mL)

IL-10 (pg/mL)

1000

TDF

ETV

ADV

LAM

DMSO

No LPS

ADV・TDFは、CD14+ monocytes（単球）を介してIL-10産生を抑制

pYY
Total YY
b-actin

ADV・TDFは、YYのリン酸化を阻害する
YYは腫瘍増殖に係るシグナルなのでADV・TDFは腫瘍抑制効果があるかもしれない
最近の臨床研究でTDFがETVよりも発癌率が少ないと報告された(Zhang M, et al. Infect Agents and Cancer 2018)

Murata K, et al. Submitting

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：27指1302
研究課題名：B型慢性肝炎完治に向けた核酸アナログ製剤の新規効能効果の発見とその基礎的・臨床的検討
主任研究者名：青木孝彦
論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

年

Association of serum IFN-l3 with
inflammatory and fibrosis markers in
Aoki Y, Murata
patients with chronic hepatitis C virus K, et al
infection

J Gastroenterol

50

2015

Geographic distribution andcharacteristics of genotype A hepatitis Ito K, Murata
B virus infection in acute and chronic K, et al
hepatitis B patients in JapanJ Gastroenterol
Hepatol

31

2016

Hepatitis B virus vaccination-related
Yanase M,
seroprevalence among health-care
Murata K, etpersonnel in a Japanese tertiary medicalalcenterHepatol Res

46

2016

Induction of IFN-l3 as an additional
effect of nucleotide, not nucleoside,analogues: a new potential target for
hepatitis B virus infection

Gut

67

2018

Association of des-g-carboxy prothrombin
production and Sonazoid-enhanced
Murata K, etultrasound findings in hepatocellularalcarcinoma of different histologic grades

J Med Ultrason

45

2018

Combinational use of hepatitis B viral
antigens predicts responses tonucleos(t)ide analogue/peg-interferon
sequential therapy

J Gastroenterol

53

2018

Murata K, etal

Matsumoto A,
Murata K, etal

Key HLA-DRB1-DQB1 haplotypes and role of Nishida N,
Murata K, etthe BTNL2 gene for response to aalhepatitis B vaccine

Hepatology

in press

学会発表
タイトル

発表者

核酸アナログ (NA)/Peg-IFN シークエンシャ
松本晶博、村田ル治療におけるHBs抗原量低下予測因子の検一素、田中榮司
討
核酸アナログ製剤投与による新規発見サイト
村田一素、松本
カインFactor Xの誘導とそれに伴うHBs抗原
晶博、溝上雅史
低下作用IFN-l3 induction by nucleotide, notnucleoside, analogs and its clinicalsignificance in HBV patients

Murata K,
Matsumoto A,
Inoue T,
Sakamoto M,
Sugiyama M,
Enomoto N,
Tanaka E,
Mizokami M

学会名

場所

年月

第51回日本肝臓学
熊本会総会

2015. 5

第19回日本肝臓学
東京会大会

2015.10The 66th annual
meeting of theAmericanassociation forthe study ofliver diseases

San Francisco,2015. 11
USA

研究発表及び特許取得報告について

Murata K,
Matsumoto A,
Sugiyama M,
Induction of IFN-l3 by ADV or TDF in HBV Inoue T,
Sakamoto M,
patients
Enomoto N,
Tanaka E, andMizokami M

The 25th Asian
Pacific
Association for Tokyo
the Study of theLiver2016. 2

Nucleotide analogsによるIFN-l3およびISG 村田一素、本多 第102回 日本消化東京
誘導とその臨床的意義
政夫、溝上雅史 器病学会

2016. 4

アデフォビル、テノフォビルによるIFN-l3誘 村田一素、本多 第52回 日本肝臓幕張
導とそのHBs抗原低下効果
政夫、溝上雅史 学会総会

2016. 5

アデフォビル、テノフォビルによるIFN-l3誘 村田一素、本多 第20回 日本肝臓神戸
導とそのIFN-a併用効果
政夫、溝上雅史 学会大会

2016. 11

IFN-l3 induction by nucleotide, notnucleoside, analogs and its clinicalsignificance in HBV patients

Murata K,
Matsumoto A,
Inoue T,
Sakamoto M,
Sugiyama M,
Enomoto N,
Tanaka E,
Mizokami M

The 67h annual
meeting of theAmericanassociation forthe study ofliver diseases

Boston, USA

2016. 11

Induction of IFN-l3 as an additional
Murata K,
pharmacological effect of ADV or TDF: A
Mizokami M
new potential target for HBV infection

APASL single
topic conference
Beijing, China 2016. 12(6th HBV
conference)

Induction of IFN-l3 as an additional
pharmacological effect of nucleotide,
Murata K,
not nucleoside, analogs: A new potential Mizokami M
target for HBV infection

The 26th Asian
Pacific
Shanghai,
Association for
China
the Study of the
Liver

IFN-lambdaを標的とした新規B型肝炎治療薬 村田一素、前仲 第53回 日本肝臓広島の探索
勝実、溝上雅史 学会総会

Induction of IFN-l3 by ADV or TDF as a
new potential target for HBV infection

Murata K,
Sugiyama M,
Otsuguro S,
Maenaka K,
Mizokami M

2017. 22017. 62017
Washington
International HBV
DC、USA
Meeting

TDF/Peg-IFN併用療法におけるHBsAg量低下の 松本晶博、村田 第21回 日本肝臓福岡
初期反応
一素、田中榮司 学会大会

2017. 92017. 10

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

発表先

場所

年月日

該当なし

特許取得状況について※出願申請中のものは(

発明名称

核酸アナログ製剤による抗腫瘍効果)記載のこと。
登録番号

申請中※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）
村田一素、溝上雅
申請中
史

出願国

日本