28pmB-072

30nm細孔コアシェルシリカ粒子の開発とペプチド分析への適用
クロマニックテクノロジーズ
塚本友康 長江徳和
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp

理論段数を上げるために・粒子径を小さくすることでカラム性能を上げることが可能(HETP≒2.2 x 粒子径)・カラム背圧は粒子径の2乗に反比例する(性能が高いカラムほど高圧)

粒子径

5 μm

3 μm

2 μm

2.6 μm

理論段高さ

11.0 μm

6.6 μm

4.4 μm

4.4 μm(HETP)

粒子径が小さいほど理論段高さは低くなる

コアシェル粒子では・・？

2

市販されているコアシェルカラム
SunShell（クロマニックテクノロジーズ） : C18, PFP, C8, Phenyl, RP-Aqua: C18, PFP, CN, PentaHILIC, RP-AmideHalo（AMT）: C18, PFP, AQ, PC
Capcell Core（資生堂）: C18, PFP, C8, XB-C18, HILIC,Kinetex （フェノメネックス）
Kinetex Aeris（フェノメネックス）: C18, C8, C4 (タンパクペプチド分析用)
Ascentis Express（シグマアルドリッチ） : C18, F5(PFP), C8, OH5, RP-Amide: C18, C8, CN, Phenyl-Hexyl, SB-AQ
PoroShell（アジレントテクノロジ－）: C18, PFP, Phenyl-Hexyl, aQ, RP-MS
Accucore（サーモフィッシャー）: C18, PFP, Phenyl-Hexyl, HILIC
Nuculeoshell（ナーゲル）: C18, PFP, C8, Amide, HILIC
Brownlee SPP（パーキンエルマー）

上記のメーカーより様々な固定相のコアシェルカラムが販売されてる。
( 固定相は抜粋)

コアシェルカラムはHPLCにおいて広く使用されるようになってきている
3市販されているコアシェルシリカ
核の径は1～3.2μm
多孔質シリカ層の厚さ0.2～0.6μm

・粒子径は1.7～5 μm
・細孔径は9～30 nm(3μm以下の粒子径では8～20 nm)

粒子径2.6 μmで30 nmの細孔を持つ
コアシェル粒子はまだ販売されていない
粒子径2.6 μmで30 nmの細孔を持つ
コアシェル粒子の開発を試みた
4

Desorption Dv (log d) (cc/g)

作成したコアシェルシリカの細孔分布0.90.8Core shell 30nm

0.70.6

Core shell 16nm

0.5
0.40.30.20.101101001000

Pore Diameter (nm)5高分子分離用コアシェルカラム
作成した粒子径2.6 μmで30 nmの細孔を持つ
コアシェル粒子を用いて以下のカラムを作成した
P/N

PoreSurface
diameterarea

Carbonloading

C18EndSurface
capping
coverage

Amplus C18-30
4.6 x 150 mm

C46471

30 nm

40 m2/g

1.3%

1.2mmol/m2

Yes

Amplus C8-30
4.6 x 150 mm

C36471

30 nm

40 m2/g

1.2%

2.5mmol/m2

Yes

Amplus C4-30
4.6 x 150 mm

C26471

30 nm

40 m2/g

0.9%3mmol/m2

Yes

Particle diameter is 2.6 mm for all.

6

ペプチドの分離

SunShell HFC18-16

Amplus HFC18-30

Amplus C8-30

Column:SunShell HFC18-16, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm,
SunShell HFC18-30, 2.6 mm (30 nm) 150 x 4.6 mm,
SunShell C8-30, 2.6 mm (30 nm) 150 x 4.6 mm,
SunShell C4-30, 2.6 mm (30 nm) 150 x 4.6 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 3 min 40 min
%B 5%
5%
50%
Flow rate: 1.0 mL/min ,Temperature: Ambient
Detection: UV@210 nm,
Sample: Tryptic digest of cytochrome C

Amplus C4-30

7タンパクの分離

AmplusC18-30

AmplusC8-30

AmplusC4-30

Column:Amplus C18-30, 2.6 mm (30 nm) 150 x 4.6 mm,
Amplus C8-30, 2.6 mm (30 nm) 150 x 4.6 mm,
Amplus C4-30, 2.6 mm (30 nm) 150 x 4.6 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 15 min%B 20% 65%
Flow rate: 1.5 mL/min ,Temperature: Ambient
Detection: UV@210 nm,
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme,
3 = BSA, 4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin

8タンパクの分離(Amplus C4-30)
Column:Amplus C4-30, 2.6 mm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 25 min%B 22% 70.5%
Flow rate: 0.50 mL/min ,Temperature: 40 oC
Detection: UV@214 nm,Injection volume: 10 μL,
Concentration: 0.10 μg/μL each protein,Sample:1. Cytochrome C
2. Bovine Serum Albumin
3. Myoglobin
4. Carbonic Anhydrase
5. Phosphorylase B

タンパクの分離(Amplus C18-30)
Column:Amplus C18-30, 2.6 mm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 20 min%B 22% 70.5%
Flow rate: 0.50 mL/min ,Temperature: 40 oC
Detection: UV@214 nm,
Injection volume: 10 μL,
Concentration: 0.10 μg/μL each protein,Sample:1. Angiotensin I
2. Ribonuclease A
3. Lysozyme
4. Transferrin
5. Bovine Serum Albumin

タンパクの分離(Amplus C8-30)
Column:Amplus C8-30, 2.6 mm (30 nm) 150 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 20 min%B 22% 70.5%
Flow rate: 0.35 mL/min ,Temperature: 40 oC
Detection: UV@214 nm,
Injection volume: 10 μL,
Concentration: 0.01 μg/μL each protein,Sample:1. Angiotensin I
2. Ribonuclease A
3. Cytochrome C
4. Lysozyme
5. Transferrin
6. Bovine Serum Albumin
7. Myoglobin
8. Carbonic Anhydrase

リパーゼの分離(Amplus C8-30)
Column:Amplus C8-30, 2.6 mm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% Formic acid in waterB) 0.1 % Formic acid in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 10 min%B 15% 60%
Flow rate: 0.50 mL/min ,Temperature: 60 oC
Detection: MS,
Injection volume: 10 μL,
Concentration: 0.10 μg/μL each protein,Sample:1. Lipase Impurity
2. Lipase選択性の異なるC18の比較

P/N

PoreSurface
diameterarea

Carbonloading

C18
EndSurface
capping
coverage

SunShell HFC18-16
CG6471
4.6 x 150 mm

16 nm

90 m2/g

2.5%

1.2mmol/m2

Yes

SunShell C18-WP
4.6 x 150 mm

16 nm

90 m2/g

5%2.5mmol/m2

Yes

CW6471

HFC18-WP は1対のシリル基によりC18を結合しますので，結合密度が低くなります。C18-WPに比べ約1/2です。
ペプチドやタンパク質はC18の結合密度により，分離が変化します。
13

HFC18とは
Hexa-Functional C18 は６個の官能基を持つ6カ所のシロキサン結合により耐酸性は高くなる

Sunniest
BondingTechnologyHexamethydichlorotrisiloxane+Trimethylchlorosilane (TMS)
X
X

X
SiSiX

X

SiSiX

（X: Cl, OCH3, OC2H5)

HFC18試薬の概略図

OOO

SiOSi

Si OOOSi
SiOOOOO
SiO O

SiOO

SiSiOSiO

Si O

Si
Si O O
Si
Si O
O O
OO
O

Si
HO O
OSiSi
SiSiOO

Si
OOO
SiSiO

OOO
O
Si O

O OO

シリカ表面への結合状態の概略図
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HFC18カラムのLC/MS移動相条件における耐酸性

Relative retention (%)

100
95% line

80
60400.1% formic acid, pH2.670 ºC

2000200400

600

Time (h)8001000

Durable test condition
Column : SunShell HFC18-162.6mm, 50 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3CN/0.1%
formic acid, pH2.6=40/60
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 70 ºC
Measurement condition
Mobile phase: CH3CN/H2O=60/40
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Butylbenzene

15結合密度の異なるC18のペプチドの分離比較
SunShell HFC18-16

SunShell C18-WP

Column: SunShell HFC18-16, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm,
SunShell C18-WP, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm
Mobile phase: A) 0.1% TFA in Acetonitrile/water(10:90)
B) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program:
Flow rate: 1.0 mL/min , Temperature: 25 ºC,Sample: Tryptic digest of cytochrome C

Detection: UV@210 nm,

16結合密度の異なるC18のペプチドの分離比較
SunShell HFC18-16

SunShell C18-WP

Column: SunShell HFC18-16, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm,
SunShell C18-WP, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm
Mobile phase: A) 0.1% TFA in Acetonitrile/water(10:90)
B) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program:
Flow rate: 1.0 mL/min , Temperature: 25 ºC,
Sample: Tryptic digest of myoglobin

Detection: UV@210 nm,

17ペプチドの分離(SunShell HFC18-16)
Column:Amplus C18-16, 2.6 mm (16 nm) 100 x 2.1 mm,Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 1 min 21 min%B 10% 10% 40%
Flow rate: 0.50 mL/min ,Temperature: 40 oC
Detection: UV@214 nm,
Injection volume: 10 μL,
Sample:1. Bovine Serum Albumin Digestまとめ• 30 nm細孔を持つコアシェルシリカの合成に成功した。
• そのコアシェルシリカを用いて合成したカラムをペプチド、タンパクの分離に適用した。
• 結合密度の低いHFC18-16カラムにおいて，いくつかのペプチドで分離の改善が見られた。
• HFC18-16のLCMSでの使用を想定した耐酸試験において，1000時間以上の耐酸性能を確認できた。
• 今後コアシェルカラムは、多くの固定相が開発されていくと考えられる。
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