課題番号：29-1025
研究課題名 ：唾液の細菌メタゲノム解析とメタボローム解析から膵癌予測マーカーを明らかにする
臨床研究主任研究者名 ：久田裕也
分担研究者名 ：西嶋傑 久田裕也
キーワード ：膵臓癌 腸内細菌 口腔内細菌 メタボローム メタゲノム解析
研究成果：

近年、腸内細菌だけでなく、口腔内細菌が疾患発症と関連しているといわれている。
欧米の研究では口腔内細菌と膵がん発生との関連が示唆されているが、症例数が少ない点、日本人と欧米人では細菌叢が異なる点などが問題である。そこで、今回膵癌患
者に特徴的な唾液中の微生物叢と microbiome が産生する代謝産物を明らかにする。
これまでの経過2017 年 4 月 研究費取得
2017 年 4 月 研究体制構築 （下記図）
2017 年 10 月 膵癌発生リスクを細菌ゲノムから解明する研究 多施設共同研究の倫理委員会承認 （承認番号 2083）
2018 年 4 月 口腔内細菌 DNA 抽出にかんして NCGM 解析プロトコールの構築
2018 年 6 月 目標症例数の半分で、膵癌症例、コントロールで腸内細菌、口腔内細菌の中間解析を予定臨床班でおこなったこと
これまで膵癌症例、コントロール症例の糞便、唾液サンプルを収集した。
臨床情報をデータベース化した（下記図）。膵癌症例とコントロール症例で臨床因子に有意差は認めてない。
膵癌コントロール
年齢74.2 歳
72.1 歳
性別（男）
50%
48%
身長159.8cm
160.2cm
体重55.8Kg
60.5Kgアルコール摂取
42.3%
39.4%
喫煙
13%
18%
解析班の進捗
唾液サンプルから口腔内細菌解析のための NCGM 解析プロトコールを構築した。
サンプル量、DNA 抽出量共に膵癌症例とコントロール症例に有意差を認めていない。
膵癌
コントロール
サンプル量319 ul269ul

DNA 抽出量119.6ng/ul

109.3 ng/ul

Subject No.

：29-1025

Title：Development of new predictive marker of pancreatic cancer using oral

microbiome and metabolome
Researchers ：Yuya Hisada, Suguru Nishijima
Key word：Oral micorbiome, Oral metabolome, pancreatic canecr, metagenome analysis

Abstract：Recent studies have shown that oral microbiome is associated with GI diseases,
as well as intestinal microbiome. A few studies from western countries havesuggested an association between oral bacteria analyzed by metagenomic sequenceand pancreatic cancer, but there are some issues with small number of cases,
methodology of sampling or DNA extraction, and not Japanese subjects. Therefore,
we included only Japanese subjects with pancreatic cancer and age, sex, andimportant risk factors matched controls. We aimed to identify the specific oral
microbiome and microbiota-generated metabolites that associated with pancreaticcancer.
Firstly, we constructed an analytics platform consisted of clinical team, sample
analytic team, and bioinformatics team.
In clinical team
Feces and saliva for microbiome and metabolome analysis were collected fromsubjects with pancreatic cancer and non-pancreatic cancer controls who underwent
abdominal CT. We created a database using CT information, questionnaire, medicalrecords. No significant difference of clinical factors was found between
pancreatic cancer and controls (Table 1).
Table 1.
Pancreatic cancer
Control
Age74.2 years
72.1 years
Male
50%
48%
Height159.8cm
160.2cm
Body Weight
55.8Kg60.5KgAlcohol
42.3%
39.4%
Smoking
13%
18%

In analytic and bioinframtics team
We constructed a protocol of DNA extraction for oral microbiome analysis in NCGM.
We found that amount of sample and DNA extraction were not significant difference
between pancreatic cancer and controls (Table 2).
Table 2
Pancreatic cancer
Control
Amount per sample

319 ul269ulDNA extraction amount

119.6ng/ul

109.3 ng/ul

Researchers には、分担研究者を記載する。

課題番号：29-1025
研究課題名：唾液の細菌メタゲノム解析とメタボローム解析から膵癌予測マーカーを明らかにする臨床研究主任研究者名 ：久田裕也 分担研究者名 ：久田裕也、西嶋傑
これまでの経過2017年4月 研究費取得
2017年4月 研究体制構築 （下記図）
2017年10月 膵癌発生リスクを細菌ゲノムから解明する研究 多施設共同研究の倫理委員会承認 （承認番号2083）
2018年4月 口腔内細菌DNA抽出にかんしてNCGM解析プロトコールの構築
2018年6月 目標症例数の半分で、膵癌症例、コントロールで腸内細菌、口腔内細菌の中間解析を予定

臨床班の進捗
これまで膵癌症例、コントロール症例の糞便、唾液サンプルを収集した。
臨床情報をデータベース化した（下記図）。膵癌症例とコントロール症例で臨床因子に有意差は認めてない。
膵癌コントロール

年齢74.2歳

72.1歳

性別（男）

50%

48%

身長159.8cm

160.2cm

体重55.8Kg

60.5Kgアルコール摂取42.3%

39.4%

喫煙13%

18%

解析班の進捗
唾液サンプルから口腔内細菌解析のためのNCGM解析プロトコールを構築した。
サンプル量、DNA抽出量共に膵癌症例とコントロール症例に有意差を認めていない膵癌コントロール

サンプル量

319 ul269ul

DNA抽出量119.6ng/ul

109.3 ng/ul

課題番号：29-1025
研究課題
題名：唾液の細菌菌メタゲノ ム解析とメメタボローム解析からら膵癌予測測マーカーを明らかにするる臨床研究: バイオイ ンフォマテ
ティクス班
班
主任研究
究者名 ：久田裕也
分担研究
究者名 ：西嶋傑
キーワード：メタゲノム
ム解析、膵
膵臓癌
研究成果
果：
膵癌症例
例と非膵癌
癌コントロール症例ににおける唾唾液、糞便をを収集した
た。
糞便からの腸内細細菌の DNA 抽出や解析
析プロトコールはすででに当院でで構築していいるが、口腔内細細菌の解析析は初めてであり、NNCGM の DNA
A 抽出プロトコールをを構築した。
。
①まず、これまでで唾液検体から口腔内内 Microbio
ome の研究報告を多数数行っていいる共同
設の東京大大学服部研で口腔内細細菌の解析析を行った。
研究施設
膵癌症例
例とコントトロール症例からそれれぞれ唾液
液抽出量、DNA 抽出量をを測定した
た。
②次に、NCGM で DNA
D 抽出をを行った。
唾液検から DNA の抽出法はの以下の方法法で行った。
サンプル
ル採取保存
存
１．1ml 程度の以以上の唾液をを、15ml チチューブに採取
２．採取した唾液
液検体は、ただちに――80 度冷凍凍庫に保存
DNA 抽出出１．氷上でゆっくくり融解し、1ml を新新しい 5ml チューブにチに取り分けるる。
２．3ml の PBS を加えて良くをく混合し、 遠心し上清清を捨てるる。
３.チュ
ューブに 3mmlTE10 を加加えて遠心 し、上清をを捨てる。
４.ペレレットに 8000μlTE10 を入れて懸懸濁する。
５.Isozzyme を 50μl 添加しし、振盪しなながらインンキュベートする（377 度 1 時間間）
６．Achhromopetidase を 20μl 添加しし、振盪しなながらインンキュベー トする（377 度 30分）
７．20%%SDS を 50μlProteinaseK を 1 0μl 添加し、振盪ししながらインンキュベーートする（55 度 1 時間）
８.フェェノール/ク
クロロホルム/イソア ミルアルコ
コールを 1mml 添加しボボルテックスし、延伸し上層を新ししい 2ml チューブに回回収する。
９.３M 酢酸ナトリ
リウム 100μl、イソプ
プロパノーール 1ml を添添加し遠心心、上清を捨捨てる。
10.75%エタノール
ル 1ml を添加加し遠心、 上清を捨捨てる。
11.ペレ
レットを風乾させる
12. 1×TE を 500μL を入れれ、タッピピングしてよよく DNA を溶かした後を後 2ml チュューブに移す。
③膵癌症
症例とコンントロール
ル症例の間でで DNA 抽出出量は有意差差は認めななかった（下下記図）

この結果
果は、服部部研で行った
た DNA 抽出出量とも変わわらないこことが判明 し、NCGM の口腔内の細菌解析
析プロトココールを構築することとができた。
今後、ささらに症例例を増やしてて目標症例例数の半数にに達した段段階で中間解解析を行うう予定である。

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：29-1025

研究課題名： 唾液の細菌メタゲノム解析とメタボローム解析から膵癌予測マーカーを明らかにする臨床研究主任研究者名：久田裕也

論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

年

タイトル

発表者

学会名

場所

年月

発表者

発表先

場所

年月日

該当なし

学会発表

該当なし

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル
該当なし

特許取得状況について※出願申請中のものは(発明名称)記載のこと。
登録番号

該当なし

※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国