課題番号：２９指１００３

研究課題名：HIV-1潜伏感染病態の理解とバイオマーカーの導出

主任研究者名 ：石坂幸人
分担研究者名 ：志村まり
キーワード：HIV-1、潜伏感染、HAND、悪性リンパ腫、ウイルス蛋白質

研究成果：抗エイズ薬（cART）によって、ヒト１型免疫不全ウイルス（以下 HIV）感染者の予後は著しく改善したが、cART を中断すると速やかにウイルス産生が再開することから、cART 下でもウイルス産生が継続的に生じている「聖域」の存在が提唱されるようになっている。また、近年、HIV 感
染者は、健常人と比較して、老化が 5 年ほど進んでいることや（Boulias et al., 2016）、HIV患者における心血管障害（Cardiovascular Disease : CVD）も依然、臨床上の課題になっている。
即ち、血中ウイルス価が検出限界以下を示す一見、臨床的に良くコントロールされている症例でも、ウイルス産生に伴う炎症やウイルス蛋白質による影響を持続的に受けている可能性が考えられる。以上を背景として、本課題では、潜伏感染状態を把握するための客観的な情報を得ることを目的として、患者血中に存在するサイトカインを網羅的に解析し、潜伏感染病態と関連する分子を把握する。研究代表者は先行研究で、患者血中にアクセサリー蛋白質である Vpr が検出され血中 Vpr 蛋白質が機能性を示すことも明らかにした。そこで、本課題の第二の課題として、Vpr蛋白質をマウスに投与した際に惹起される生体反応を明らかにし、検出されるサイトカインル産生との関連性の有無を明らかにする。
a. ルミネックス法を用いた抗エイズ薬を服用中の患者血中のサイトカインの把握
ルミネックス（=マルチプレックス）によるサイトカインの網羅的解析を応用し、ACC バイオバン
クで保管されている血清検体を用いて行う。ルミネックスは、抗体を使用したサンドイッチ法で、基本的には ELISA と同様な原理であるが、検体 25uL で最大 100 種まで解析可能である点が特徴である（スライド-1 参照）。これまでルミネックスを用いて得た解析データが複数報告されているが、使用したキット間でどの様なバラツキがあるかに関しては、解析されて来なかった。そこで、初期段階の解析として、ルミネックスを扱う３社の IL8,IL12p40,Mip1beta を含む検出系について、同血清検体(HIV 感染者 10 名、健常人 10 名)を用いて得られるデータについて、比較した。その結果、得られた定量値や検量線は、会社により様々に異なることが分かった（スライド-2 参照）。
今後、最適な解析キットを用いて、患者血中サイトカインの網羅的解析を行う。
b. 患者血中に検出される Vpr による病態の誘発
血中 Vpr の生体に与える影響を調べるため、マウスに組み換え Vpr 蛋白質（rVpr）を長期間投与し、各臓器や組織について調べた。組み換え rVpr 蛋白質は、コムギ胚芽無細胞システムで発現した後、Vpr に対する単クローン抗体を用いたアフィニテイーカラムで精製した。rVpr を 15μg/ kgの用量でマウスに隔日 1 回、計 34 回腹腔内投与し、採取した各臓器・組織を用いて、老化関連マーカーである SMP30 (Senescence Marker Protein-30) mRNA の発現解析を行った。その結果、心臓組織において、発現量が低下することが分かった。また、心臓組織切片への SA-β-gal（senescence-associated beta-galactosidase）染色を行ったところ、rVpr 投与群でシグナルの増加が確認された。以上の結果から、rVpr の長期投与は、マウス心臓での老化を促進させることが示唆されル。今後、心血管組織の損傷マーカーである p53 の発現を調べるとともに、その分子機序を明らかにする予定である。

Subject No.

：29A-1003

Title：Pathological conditions of latent HIV-1 infection and identification of its
biomarkers

Researchers ：Yukihito Ishizaka、Mari Shimura
Key word：HIV-1, Latent infection, HAND, malignant lymphomas, viral proteins

Abstract：

Combined antiretroviral therapy (cART) for human immunodeficiency virus-1 (HIV) cansuppress the viral replication to a non-detectable level in the HIV-positive patients, andprevent immunodeficiency caused by T-cell depletion. After interruption of the cART
regimen, however, viral replication can easily resume from the long lived reservoir cells.
Viral protein R (Vpr), an accessory gene of HIV, encodes a virion-associated nuclear proteinof 96 amino acids, and is proposed to facilitate viral infection into macrophages. Structural
analyses revealed that Vpr contains three α-helices with a self-dimerization/oligomerization
feature and a flexible carboxyl (C)-terminal region that has a basic amino acid stretch withDNA binding activity. Vpr possesses pleiotropic functions for stimulating the viral replicationin multiple steps. Notably, lines of evidence indicate that Vpr is found in blood of HIV
patients, although serum viral titers in those patients are non-detectable. Moreover, Vpr inpatients blood is biologically active for induction of retrotransposition of interspersed nuclear
element-1（L1-RTP）. Recently, it was reported that DNA methylation pattern of peripheral
blood cells indicate that aging of the patients is 5-year advanced, compared to healthy humans,and HIV patients suffer from cardiovascular diseases (CVD) , implying the possibility thatblood circulating viral proteins are involved in the pathogenesis of HIV patients especially
under latent infection phase. Based on these observations, we started to study the effects of
Vpr on tissues, especially on heart tissue.
A recombinant protein of Vpr (rVpr) was expressed by wheat germ extracts, and purified
by an affinity chromatography of monoclonal antibody to Vpr. After repetitive injections ofrVpr three times a week, we examined mRNA expression of SMP30, the marker gene ofsenescence by quantitative reverse transcription followed by PCR (qRT-PCR) analysis.
Interestingly, the expression of SMP30 mRNA was reduced in heart after 6 week of the initialrVpr injection (Figure1). Moreover, senescence associated-galactosidase expression wasincreased by rVpr administration. Additionally, copy numbers of L1 were increased after rVpradministration. Because L1-RTP induces expression of inflammatory cytokines, and can
induce tissue damage, our current observations suggest that rVpr induces tissue senescence
via the induction of L1-RTP. Further studies are ongoing to clarify the involvement ofL1-RTP associated inflammation signals are reputed to aging of heart.

Fold increase (SMP30 / b‐actin)

図１：Vprの⻑期間歇投与は、⽼化関連マーカーである
SMP30の⼼臓での発現を低下させる
2
1.8
1.6
1.4
1.2
10.8
0.6
0.4
0.20Con

Vpr

Hippocampus

Con

Vpr

HeartCon

Vpr

Kidny

Con

Vpr

LiverCon

Vpr

LungConVpr

TestisCon

VprThymus図２：rVprはマウス⼼の⽼化を誘導するとともにレトロトランスポジションを惹起する
SA‐β‐Gal staining

L1 copy numbers
P=0.006
21.81.6

Fold increase

1.4

対照1.210.80.60.4
0.2010um

Vpr 18 回投与

Con

Vpr18times課題番号：２９指１００３

研究課題名：Non-AIDS症例を用いた網羅的サイトカインの検出

主任研究者名 : 石坂幸人
分担研究者名 ：志村まり
キーワード
研究成果

：網羅的サイトカイン,multiplex, HIV, cART：

近年 HIV 感染者の多くが抗エイズ治療(cART)を施され Non-AIDS 症状を示す中、依然、心血管障害や発癌率が高いなどの報告が多く、感染者の慢性炎症は否定できないと考える。本研究ではサイトカインを網羅的に測定し、cART 治療下の感染者の免疫状態を明らかにすることを目的とする。
測定は、ルミネックス（=マルチプレックス）によるサイトカインの網羅的解析を応用し、ACC バイオバンクで保管されている血清検体を用いて行うこととした。ルミネックスは、抗体を使用したサンドイッチ法であることから、基本的には ELISA と同様な原理であるが、検体 25uL で最大 100 種まで解析可能な点が、希少検体では有用である（スライド参照）。一方、どの程度正確にそれぞれのサイトカインが定量できているのかは、論文報告でも明言されていない。リコンビナントタンパク質を用いた報告は各社より公開されているが、臨床検体では不明である。そこで、３社の IL8,IL12p40,Mip1betaを含むルミネックスについて、同血清検体(HIV 感染者 10 名、健常人 10 名)を用いて比較検討してみた。
供給された定量値や検量線は、会社により様々であった（スライド参照）。そこで、検量線の直線域外で定量値を除外すると、IL8 においては、どの会社のルミネックスも近しい値を示していた。ELISA同様、ルミネックスで得られた値は、検量線直線域からの定量値が肝要と考える。一方、直線域を離れても相対関係は保たれている場合もあり、定量には不向きでも、相対比較には可能なサイトカインも存在した。
以上より、本研究では、検量線の直線域がより広域で、測定値の範囲内にあったサイトカイン、AAT,A2Macro, B2M, BDMF, C3, Eotaxin-1, Haptoglobin, Factor VII, FRTN, ICAM-1, IL-1ra, IL-8, IL-10,IL-12p40, IL-18, IL-23, CRP, MIP-1beta, MMP3, MCP1, SCF, RANTES, TMP-1, TNFR2, VCAM-1, VEGF,vWF の 27 種を選択し、HIV 感染者 130 名(cART 未治療 10 名を含む)、年齢性別が合致している健常コン
トロール 20 名の血清について測定した。測定値について、多変量解析のうち主成分分析を施行した。
健常者のサイトカインのばらつきは小さいが、HIV 感染者のばらつきは、より大きい結果となった。結果は、健常者はホメオスタシスにより、比較的安定な免疫状態にあることを示唆している。今後、感染者のばらつきが何に依存しているのかについて、対応する臨床情報を調べ明らかにし報告する。

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：29A-1003

研究課題名： HIV-1潜伏感染病態の理解とバイオマーカーの導出
主任研究者名：石坂幸人

論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

年

Takashina T,
Koyama T,
Nohara S,
Identification of a cell-penetrating peptide
Hasegawa M,
applicable to a protein-based transcription
Ishiguro A, Iijima
Biomaterials
activator-like effector expression system for cell K, Jun L, Shimuraengineering.
M, Okamoto T,
Sakuma T,
Yamamoto T,
Ishizaka Y173

2018

Structural alterations of DNA induced by viralprotein R of HIV-1 trigger the DNA damage
response.

Iijima K,Kobayashi J,Ishizaka Y

15

2018

Thioacetamide-induced hepatic fibrosis in thecommon marmoset.

Inoue T*, Ishizaka
Y*, Sasaki E, Ro
G, Mineshige T, Exp. Anim.
Yanase M, Sasaki
E, Shimoda M

Retrovirology

in press

学会発表
タイトル

発表者

HIVアクセサリータンパクVpr投与によって誘 上野 美華子、導されるマウス心臓老化とレトロトランスポ 石黒 亮、石坂
ゾンlong interspersed nuclear element-1 幸人

学会名場所

年月

第40回日本分子生
神戸物学会年会

2017年12月

松永章弘、岡雅子、柳川泰明、
栂野富輝、今留HIV関連リンパ腫発症前にみられる末梢血細第19回 白馬シンポ健一、潟永博
仙台胞の早期エピゲノム変化
ジウム之、岡慎一、萩原槳太郎、石坂幸人、志村まり2017年7月

Early epigenetic alterations ofperipheral blood lymphocytes of HIVpositive individuals before thelymphomagenesis

松永章弘、石坂 第76回 日本癌学
幸人、志村まり 会学術総会

横浜

2017年9月

松永章弘、岡雅子、柳川泰明、
栂野富輝、今留HIV関連リンパ腫の早期診断を目指した発症
第40回 日本分子
健一、潟永博前DNAメチル化変動の解析
生物学会年会之、岡慎一、萩原槳太郎、石坂幸人、志村まり横浜

2017年10月

研究発表及び特許取得報告について

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

発表先

場所

年月日

該当なし

特許取得状況について※出願申請中のものは()記載のこと。
特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国

転写調節融合ポリペプチド

N1601NCGM、広島大学、2017年12月11日
PCT(PCT/JP2017
アステラス製薬/044266)

日本細胞膜透過性ポリペプチド

N1703（特願2017-236660）

NCGM、広島大学、2017年12月11日
アステラス製薬日本

細胞のダイレクトリプログラミング方法

特願2018069936

NCGM、広島大学

平成30年3月30日

日本

発明名称

登録番号

※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。