近畿大学次世代基盤技術研究所報告 Vol. 3（2012）39－46

生医学材料としての含フッ素ポリマーナノ粒子の調製
Preparation of Poly(methyl methacrylate-co-1H,1H,7H- dodecafluoroheptyl methacrylate)
Microspheres as Biomedical Materials
研究代表者 工学部生物化学工学科

特任教授 杉山 一男

共同研究者 工学部生物化学工学科

学生 三井

Kazuo Sugiyama

翔

Syo Mitsui

工学部生物化学工学科教授 白石 浩平

サンユレック株式会社

取締役 久永 直克

Kohei Shiraishi

Naokatu Hisanaga

Emulsion copolymerization of methyl methacrylate (MMA) and 1H,1H,7H- dodecafluoroheptyl methacrylate (DFHMA) yielded a series of copolymer microspheres, poly (MMA-co-DFHMA) with varying the molar ratio of the DFHMA moiety. Potassium peroxodisulfate(KPS) wasused as an initiator. The molar ratio in feed was varied as MMA : MFHMA =1.0 : 0.0, 0.95 :
0.05, 0.90 : 0.10, 0.85 :0.15 and 0.80 : 0.20. The resulting copolymer microspheres werecharacterized by scanning electron microscope (SEM). It was found that diameter ( d ) ofpoly(MMA-co-DFHMA)s increases from 90.0±104nm to 144.0±88nm with increasing theamount of DFHMA in feed, where d is determined by means of laser diffraction particle size
analyzer. Poly(MMA-co-DFHMA)s were found to increase the contact angle of water (θ= 106°)and colza-oil (θ= 89°) compared with poly(methyl methacrylate)(PMMA). It was also confirmed
from a cell culture test that the polymer films prepared from poly(MMA-co-DFHMA) showed aneffective suppression of adhesiveness of HeLa cell.

1. 緒言
ポリマーナノ粒子は極めて広い表面積を有するためバルク状のポリマー材料とは異なった物性や機能を示すことからナノ粒子の状態で機能材料として応用が拡がっており, エマルジョンとしてではなくポ
リマーナノ微粒子自体としても有用で医用・バイオ
・環境・エネルギー・情報通信などのさまざまな分
野で用いられている(1),(2)．我々もまた生体適合性材料の開発を目的とする研究で, 表面をホスファチジ
ルコリン基(3),(4)やグルコシド基(5)-(7)あるいはアミノ酸残基(8),(9)で表面修飾したポリマーナノ粒子を調製して血漿タンパクの吸着挙動を明らかにしている．
また，温度に応答してタンパク質の吸着－脱着できるポリマーナノ粒子の調製にも成功している (10) ．
川口らはポリマーナノ粒子をアフィニティ単体として用いバイオアッセイやバイオセパレーションに用いる研究を進めている(12)．
一方，フッ素樹脂コーティングに使用されるパーフ
ルオロポリマーにはポリテトラフルオロエチレン(PTF
E：θ=104°)，フッ素化エチレンプロピレンコポリマー(FEP：θ=114°)，ポリテトラフルオロエチレン・パー
フルオロアルキルビニルエーテル(PFA：θ=110°)などがある．ここに θ は水の接触角であり，フッ素樹脂は θ
値が大きく撥水性を示しているし，油の接触角も大きく撥油性も示す．このように表面自由エネルギーが小さい(12)こと，すなわち，分子間凝集力が低いことがフッ素樹脂コーティングの非接着性の原因となる．
近年，人工臓器の開発研究は機能補助から機能置換を可能にすることを目的としており，人工臓器用材料の優れた力学的特性と抗血栓性さらには生体適合性が求められている．人工臓器用材料に工業用材料であるポリマー材料を用いる場合，生体適合性，特に血液適合性を確保するために材料表面層の化学構造を制御してタンパク質の吸着および細胞の接着・増殖を制御することが重要である．表面特性の制御には 3つの方法が考えられている．一つはヘパリンを含むポリマー(13),(14)や 2-(メタクリロイルオキシ)エチルホスホ
リルコリン(MPC)を 1 成分とするコポリマー(15),(16)を塗布することである．この場合，材料の力学的性質の低下は見られず，血液成分と好ましい相互作用をするも－ 39 －

のの時間経過とともに塗布材料の剥離が起こる難点がある．二つ目はポリマー材料表面をグラフト重合により水溶性ポリマーで化学修飾してヒドロゲル層表面を創出する方法である(17)-(20)．杉山らは汎用のポリエチレ
ンテレフタレート(21)やポリプロピレンフィルム(22)表面を生体適合性に優れた MPC を含むビニルポリマーで化学修飾して生医学材料に変換している(12)．三つ目は，材料自体にミクロ相分離構造(海島構造ともいわれる)を導入する方法である．我々はフッ素系樹脂の非接着性と低毒性(15)に注目して新たに合成した生体適合性のある含フッ素ポリエーテルウレタンウレアのポリマー
フィルム表面には血清タンパク質は単層にしか接着しないことを明らかにしている(23)．
以上の研究の発展として，本報では抗血栓性と生体適合性の向上を目指し，新規な人工臓器用材料の開発研究を試みた．即ち，フッ素ポリマーの特性とナノ粒子の特性を合わせもった含フッ素コポリマー
ナノ粒子 poly(MMA-co-DFHMA) をメタクリル酸
メチル(MMA)と 1H，1H，7H-メタクリル酸ドデカ
フルオロヘプチル(DFHMA)の乳化共重合から得た．
含フッ素ポリマーナノ粒子およびポリマーフィルムの特性は粒径分布や接触角から確認するとともに血液適合性は HeLa 細胞の接着性から評価した．
2．実験
2.1 試薬2.1.1 合成試薬
1H，1H，7H-メタクリル酸ドデカフルオロヘプチル(DFHMA：関東化学)は市販品をそのまま用いた．
メタクリル酸メチル(MMA：和光純薬)は常法に従って精製したのち減圧下に蒸留して用いた．過硫酸カリウム(KPS：和光純薬)は市販品をそのまま用いた．
乳化剤には界面活性剤 18%，高級アルコール系陰イ
オンのアルキルエーテル硫酸エステルナトリウムの市販品をそのまま用いた．水は MILLIPORE 製
Milli-Q synthesisA10 で精製した超純水を用いた．
2.1.2 生化学的実験用試薬
Tris 緩衝液とリン酸緩衝液(PBS：SIGMA)は常法に従って所定の pH に調整して使用した．
Minimum Essential Medium (pH 7.2)は MEM
powder (GIBCO) 9.6 g を 950 mL の超純水に溶かし，2.2 g の NaHCO3 を加え， 塩酸で pH を 7.2 とした
後，1 L にメスアップして調製し，クリーンベンチ
内で 0.22 μm フィルターDURAPORE MEMBRANEFILTERS (MILLIPORE)を用いてフィルター滅菌
し，4℃で保存した．ウシ胎児血清(Fatal calf serum：
FCS)は解凍した FCS(Cell Culture Technologies)を容器ごと 56℃の温浴につけ，30 min 加温して血清の非働化を行って調製した．放冷後，ろ紙でろ過したのち，クリーンベンチ内でフィルター滅菌して－20℃で保存した．細胞培養培地(MEM)は Minimum
Essential Medium ： FCS ： Non essential aminoacid (NEAA)を 90：10：1 の割合で混合して調製した．MEM は細胞培養のための培地として調製した．
HeLa 細胞を培養するときは FCS を用いた．0.25%
トリプシン-0.02%EDTA はトリプシン (和光純薬)
0.25 g と EDTA 0.02 g を 100 mL の PBS(pH:7.4)に溶かし，クリーンベンチ内でフィルター滅菌して－20℃で保存した．トリパンブルー溶液は PBS(pH:7.4) 100 mL にトリパンブルー0.5 g を溶解して調製した．
2.2 乳化重合
2.2.1 MMA の乳化重合(24)
かきまぜ装置，温度計，玉付き冷却管，滴下漏斗およびガス導入管を備えた 500 mL セパラブルフラ
スコに乳化剤 1 g を含む超純水 300 mL を入れ，次いで MMA15 g 加える．反応系内に十分量の Ar ガスを導入しながら油浴を加温し，350 rpm でかきまぜる．油浴を 80℃にしてから KPS1.5 g を 25 mLの水に溶解した溶液を 1 mL 加える．しばらくの後，重合が開始して水相は白濁する．30 min 後，MMA
45 g を滴下漏斗から 2 h かけて滴下する．KPS 水溶
液はマイクロピペッターを使用し，1 mL を 12 min
毎に添加する操作を 10 回行う．MMA の滴下終了と同時に KPS 水溶液の添加を終える．反応終了後水浴で室温まで冷却する．反応混合物は 17G-2 のグラ
スフィルターで吸引濾過し，凝集物を除く．ラテックス(ポリマーミクロスフィア分散液)は，高速遠心分離機を用いて 13500 rpm，25 min 遠心分離を行い，上澄み液を捨て超純水を加えて再分散をする操作を 5 回繰り返して PMMA ナノ粒子を得た．得られたナノ粒子は真空乾燥して用いた．
2.2.2 MMA と DFHMA の乳化共重合(25)500 mL のセパラブルフラスコに乳化剤 1 g を含む超純水 300 mL を入れ，続いて所定量の MMA とDFHMA の混合液を加える．仕込みモル比は MMA：DFHMA＝0.95：0.05～0.80：0.20 と変化した．
反応系内に十分量の Ar ガスを導入しながら油浴を－ 40 －

加温し，350 rpm でかきまぜる．油浴を 80℃にしてから KPS1.5 g を 25 mL の水に溶解した溶液を 1 mL
加える．しばらくの後，重合が開始し，水相は白濁する．30 min 後，MMA 45 g を滴下漏斗から 2 h か
けて滴下する．KPS 水溶液はマイクロピペッターを使用して 1 mL を 12 min 毎に添加する操作を 10 回行う．MMA 滴下終了と同時に KPS 水溶液の添加を終える．反応終了後，水浴で室温まで冷却する．得られた含フッ素コポリマーナノ粒子 poly(MMA-coDFHMA)の精製は 2.2.1 に準じて行った．
2.3 SEM-EDX の画像観察
poly(MMA-co-DFHMA)の形状と表面特性は高分解能電界放出形走査電子顕微鏡(Field Emission
Scanning Electron Microscope : SEM : Hitachi 製
S-4800)を用いて測定した．また，原子組成百分率(%)は X 線分析装置 (Energy Dispersive X-ray :EDX : HORIBA 製 EX-420)を用いて測定した．試料はカーボンテープを貼った試験台に乾燥したナノ粒
子粉末を付着し，真空蒸着法により試料表面に白金パラジウム(Pt-Pd)を 15 mA，90 sec で蒸着した．
加速電圧：5.0～10 kV， エミッション：10 μA，
倍率：8.0×104 倍とした．原子組成百分率(%)の理論
値は poly(MMA-co-DFHMA)の化学式と仕込みモル比から算出した．
2.4 粒度分布poly(MMA-co-DFHMA)の粒径は島津レーザー回
折式粒度分布測定装置 (Laser Diffraction Particle
Size Analyzer : SHIMADZU 製 SALD-2200)を用いて測定した．回分セルに少量のラテックスを入れ，分散媒として超純水を加える．粒子の沈降を防ぐために攪拌プレートを用いてかきまぜながら粒径を測定した．
2.5 TG-DSC の測定
poly(MMA-co-DFHMA)の熱的性質は，熱天秤(Thermo plus TG-DTA : Rigaku 製 TG-8120)と示差
走査熱量計(Thermo plus DSC : Rigaku 製 DSC-8230)を用いて評価した．TG 測定はアルミニウム製測定用パンに標準試薬 Al2O3 と測定試料のそれぞれ 5
mg を精秤し，昇温速度 5℃/min，温度範囲 35.0℃～500℃で測定した．DSC 測定はアルミニウム製測定用パンに標準試薬 Al2O3 と測定試料のそれぞれ 5
mg を精秤し，昇温速度 3℃/min，温度範囲 35.0℃～300℃で測定した．

2.6 ポリマーナノフィルムの作成
ポリマーフィルムは poly(MMA-co-DFHMA)0.40
g をベンゼン 10 mL に溶解してテフロンシートをしいたシャーレ上に流し込み，自然乾燥して得た．
2.7 接触角の測定
poly(MMA-co-DFHMA)ナノ粒子から得たポリマーフィルムの接触角(θ)はフィルム表面に 15μL の水滴あるいはナタネ油(日清キャノーラ油)を置き，温度調節器付きのエルマ製ゴニオメーター式・接触角測定機 G-1 型を用いて測定した．5 回行った測定結果のうち，最大・最小を除く平均値から接触角を決定した．
2.8 細胞接着剥離試験
細胞の接着剥離試験には HeLa 細胞を用いた．
poly(MMA-co-DFHMA)から作成したポリマーフィ
ルムは，光学フィルム固定用透明両面テープ CS9611[日東電工(株)]をフィルムの裏面に貼り付け，4
ウェルマイクロプレート(ウェルサイズ 15 mm：
FALCON)に固定した．クリーンベンチ中，1 h，UV
照射して滅菌した．ポリマーフィルム表面をオート
クレーブ滅菌済のリン酸緩衝生理食塩水(PBS：7.3)
で 2 回洗浄した．HeLa 細胞は 10% ウシ胎児血清
含有 Modified Essential medium(MEM)培地で培養した．その後，1 mL のトリプシン溶液(0.25μg/mL)を添加して HeLa 細胞を剥離した．浮遊細胞濃度を3×104cells/mL に調整後，その 1 mL をポリマーフ
ィルムが固定されたウェル上に加え，インキュベー
ター中，5% CO2 雰囲気下，37℃，8 h 培養した．培
養後，倒立型ルーチン顕微鏡(CKX31：OLYMPUS)を用いてフィルム表面を観察した．その後，さらにPBS でポリマーフィルムを 1 回洗浄して顕微鏡で表面を観察した．
3．結果および考察
3.1 MMA と DFHMA の乳化共重合
乳化重合は水媒体不均一重合として工業的に最もよく用いられる方法である．MMA の乳化重合の場
合，乳化剤によってほとんどの MMA モノマーはミセル内に取り込まれるが，ミセル内に取り込まれな
い MMA モノマーが僅かに水中にも存在する．これ
らミセル外に存在する遊離の MMA モノマーが水溶性開始剤 KPS の攻撃を受けて重合が始まる．2～3量体に成長するとその成長ラジカルは水不溶となり，ミセル内に取り込まれる．成長ラジカルはミセル中－ 41 －

の MMA モノマーを攻撃してバルク状(塊状)で重合が続き，ポリ(メタクリル酸メチル)（PMMA）ナノ粒子ができる．即ち，MMA モノマーを内包したミセルは重合反応場であり，ほぼ初期のミセルの大きさのポリマーナノ粒子が得られる．このように乳化重合の開始反応は僅かに水中に存在する遊離モノマ
ーがオリゴマーの成長ラジカルになることから始まるのでビニルモノマーの水への親和性が重要である．
含フッ素コポリマーナノ粒子 poly(MMA-co-DFHMA)は，開始剤 KPS，乳化剤，Ar 気流下で MMAと DFHMA の乳化共重合を行って得た．共重合反応
式を Fig.1 に示し，重合結果を Table 1 にまとめる．
ナノ粒子の収率は PMMA の場合を除いていずれも70％台であった．

Fig.1 Emulsion copolymerization of MMA and
DFHMA initiated with KPS as an initiator.

3.2 SEM-EDX の画像観察
乳化共重合により得られたポリマーナノ粒子
PMMA と poly(MMA-co-DFHMA)の粒子の形状，
存在原子の定性分析，原子組成百分率(%)を SEMEDX から確認した．SEM の画像結果と存在原子の定性分析の結果をそれぞれ，Fig.2 と Fig.3 に示し，原子組成 % の結果を Table2 にまとめる．Fig.2 に示す SEM 写真からポリマーナノ粒子はほぼ真球状であることが分かる．
また，Fig.3 の存在原子の定性分析の結果から，ポリマーナノ粒子 PMMA の表面には炭素と酸素の存在が確認され，poly(MMA-co-DFHMA)-5 場合はフッ素も存在することが確認された．また，Table 2に示した定量分析の結果から，ポリマーナノ粒子
PMMA と poly(MMA-co-DFHMA)はともに C の％
存在率は理論値より増えており，O と F は減っていることを確認した．これは含フッ素コポリマーナノ

粒子の中心部に O と F が多く含まれているためと考えられる．
3.3 粒径分布
粒径分布の測定から含フッ素コポリマーナノ粒子の平均粒径を得た．ポリマーナノ粒子 PMMA とpoly(MMA-co-DFHMA)-4 の粒径分布を Fig.4 に示す．他のナノ粒子についても同様のベル型分布が見られた．粒径分布から得られたナノ粒子の粒径をTable 1 にまとめる．粒径は 90.0±104～144.0±88
nm であり，Fig.5 に示すように仕込み DFHMA 量の増大とともに大きくなっていることが分かった．
これは仕込み DFHMA 含量が増えると乳化重合系
における MMA モノマー油滴中に DFHMA モノマ
ーが取り込まれ，油滴が大きくなるためと考えられる．ここに乳化重合は開始剤 KPS から生成する開始種・OSŌ3K+が開始種となり水中に溶存する MMAを攻撃して重合を開始し，成長する MMA オリゴマーが水中に分散できずに，DFHMA を含む MMA の油滴中に取り込まれ重合が進行してナノ粒子となる．
したがって，DFHMA を多く含む MMA 油滴からはより大きなナノ粒子ができることになる．
3.4 TG-DSC の測定
成型加工の際の適正加工温度を知る目的でコポリ
マーナノ粒子 poly(MMA-co-DFHMA)の熱的性質をTG-DSC を用いて，ガラス転移温度(Tg)とともに熱分解温度(Tdec.)を測定した． Fig.6 に示す TG 測定
結果から DFHMA 量の増加とともに T dec.は上昇することが分かった．poly(MMA-co-DFHMA)(Fig.6 B)の場合，熱分解は Tdec. = 308.3℃で PMMA(A)のTdec. = 303.5℃より僅かではあるが高温側にあることから熱安定性が向上していることが分かる．このように Tdec.が DFHMA 量の増加とともに高温側にシフトするのは DFHMA がもつ C－F 結合の双極子－双極子相互作用が強いことによると考えられる．
また，Fig.7 に示す DSC の測定結果から，仕込み
DFHMA 量の増加とともに Tg は低温側にシフトした．Tg が DFHMA 量の増加とともに低下するのは融点降下に起因すると考えられる．poly(MMA-coDFHMA)と PMMA の Tg は，それぞれ Tg = 111.4℃と Tg = 121.8℃であったことから，フィルム形成は
Tg 以上の温度で行うことになる．Td と Tg に及ぼす仕込み DFHMA 量の影響は Fig.8 に示すように
DFHMA の量の変化に直線的に対応していることが分かる．

－ 42 －

－ 43 －

(A)poly(MMA-co-DFHMA)-1 (B)poly(MMA-co-DFHMA)-2

Table2 Quantitative analysis of PMMA andpoly(MMA-co-DFHMA).

(C)poly(MMA-co-DFHMA)-3 (D)poly(MMA-co-DFHMA)-4(E)poly(MMA-co-DFHMA)-5

Fig.2 SEM image of polymer microspheres poly
(MMA-co-DFHMA)-1～5, 8×104.

Fig.4 Comparison of particle size of PMMA with(A)

poly(MMA-co-DFHMA)-4.

(B)

Fig.5 The effect of molar ratio of DFHMA on the
average particle diameter of poly(MMA-co-

Fig.3 Qualitative analysis of (A) : PMMA and

DFHMA).

(B) : poly(MMA-co-DFHMA)-5.

－ 44 －

3.5 接触角の測定
poly(MMA-co-DFHMA)フィルムの水とナタネ油の接触角の測定結果を Table1 にまとめる．DFHMAの仕込みモル比率の増加とともに水の接触角は 55～92°に大きくなり，ナタネ油の接触角も 30.5～
46.5°に上昇した．仕込み DFHMA 量を増加すると
水，油ともに接触角が上昇することは DFHMA セグ
メントのもつ高い疎水性による．このことからポリマーナノ粒子 poly(MMA-co-DFHMA)から調製したポリマーフィルムは高い疎水能力があるため，細胞非接着表面であることが期待できる．すなわち，血液細胞である血小板の非接着→非粘着表面→抗血栓性表面であることが期待できる．
3.6 細胞接着剥離試験
poly(MMA-co-DFHMA)フィルムの抗血栓性を調べるため，HeLa 細胞の接着(粘着)⇔剥離試験を行った．ここに，HeLa 細胞は接着性が高いため血液細胞である血小板の代替として用いた．poly(MMAco-DFHMA)フィルムに HeLa 細胞を 3.0×104cell/mL
播種し，1 回洗浄を行った. PMMA および poly
(MMA-co-DFHMA)フィルム上への HeLa 細胞の接着状況の顕微鏡写真を Fig.9 に示す．左が細胞培養
後，右が洗浄後である．PMMA フィルムと poly
(MMA-co-DFHMA)フィルム剥離率は，それぞれ62.9％と 84％であった．後者の場合，HeLa 細胞が接着し難いことから抗血栓性が期待でき，生医学材料としての応用が期待できる．

Fig.6 The thermal decomposition temperature(Tdec.) of poly(MMA-co-DFHMA).(A):PMMA,(B) : poly(MMA-co-DFHMA)-2,(C) : -3,(D) :-4,(E) : -5.

Fig.7 The glass transition temperature(Tg) of

PMMA

poly(MMA-co-DFHMA).(A):PMMA,(B):poly(MMA-co-DFHMA)-2,(C):-3,(D):-4,(E):-5.

poly(MMA-co-DFHMA)-5

Fig.8 The effect of molar ratio of DFHMA on Tdec
and Tg.

Fig.9 The results of HeLa cell adhesion-desqumation
test on PMMA and poly(MMA-co-DFHMA)-5 films.

－ 45 －

4．まとめ1)粒度分布から，フッ素系ビニルモノマーDFHMAの仕込みモル比を変化することによってコポリマ
ーナノ粒子 poly(MMA-co-DFHMA)の粒径が調節可能であることを確認した．
2)接触角(θ)測定から， poly(MMA-co-DFHMA)フィルムの高い疎水性を確認した．
3)血小板の代替としての HeLa 細胞を用いた細胞接着剥離試験の結果から，poly(MMA-co-DFHMA)
フィルムにはほとんど細胞が接着していないことを認めた．
以上の結果から，乳化共重合で得た含フッ素コ
ポリマーナノ粒子 poly(MMA-co-DFHMA)から作成したポリマーフィルムは血液細胞に非接着性を示す表面であることがわかった．
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