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第 75 回日本生物工学会大会 Topics of 2023

糸状菌 Trichoderma reesei における新規誘導プロモーターの探索
一瀬 桜子＊・柴田 望・高橋 史員・小山 伸吾
花王株式会社 生物科学研究所
〒和歌山県和歌山市湊 7HO)D[(PDLONR\DPDVKLQJR#NDRFRP  背 景 

食糧危機や環境問題の解決へ向けて、非可食バイオマスからのバイオ燃料やグリーンケミカルスの製造が注目されているが、バイオマスを効率的に利用するためには、高効率にバイオマスを分解できる糖化酵素が必要とされる。糸状菌 Trichoderma reesei は、セルラーゼやヘミセルラーゼなどの糖化酵素を多量に菌体外に分泌生産することから、糖化酵素の生産宿主としての利用検討が進められている[1]。我々もこれまでに、T.
reesei を生産宿主として高性能な糖化酵素を安価・大量生産できる技術を開発してきた[2]。
さらに近年では、T. reesei の高いタンパク質生産能力を活かして、異種タンパク質の生産宿主としての利用が期待されている[3]。異種遺伝子を発現させるプロモーターには、高い発現量を示すセルラーゼ遺伝子cbh1 のプロモーターが用いられてきた。しかし、cbh1
プロモーターはセルラーゼ生産条件下において活性化するため、目的タンパク質以外にも内在性のセルラーゼが同時に生産されるという課題があった。
そこで本研究では、目的タンパク質のみを高生産す76２

るために、セルラーゼ生産に関与しない新規の誘導プロモーターを探索することとした。
 2. 結果と考察(1)誘誘 導 剤添 加 に 応 答し た 網 羅 的な 遺 伝 子発 現 解 析セルラーゼ生産に関与しないプロモーターを獲得するために、セルラーゼ生産培養中に誘導剤を添加し、誘導剤添加時特異的に発現する遺伝子を探索した。
誘導剤には、0.2% 尿素、0.2% 硝酸塩、10 μM Co 塩、
10 μM Ni 塩、0.2% エリスリトール及び 0.2% デンプンを用いた。T. reesei PC-3-7 株を 3%セルロース培地で72 時間培養したところに誘導剤を添加し、誘導 8 時間目における遺伝子発現を RNA-seq にて解析した。その結果、誘導剤非添加条件と比較して、エリスリトール添加条件において Tr68585、Tr68466、Tr122079 及びTr68606 の 4 遺伝子が、主要なセルラーゼである CBH1や EG1 などに続いて高発現していた（図 1）。これら 4遺伝子は他の誘導剤添加条件では全く発現していなっかったことから、エリスリトールにのみ応答して発現log (RPKM) - with erythritol

121086420051015log (RPKM) - without erythritol

図１エリスリトールの有無による遺伝子発現変動(A) Tr685850h2h0h2h150100500(C) Tr122079
100806040200

Relative amount of mRNA(/pgk1)200

Relative amount of mRNA(/pgk1)

Relative amount of mRNA(/pgk1)

Relative amount of mRNA(/pgk1)(2) リアルタイム PCR を用いた遺伝子発現解析
 エリスリトールにのみ応答して発現する可能性のある 4 遺伝子に関して、エリスリトール特異的な発現を示すかをリアルタイム PCR を用いて解析した。この際、エリスリトールに加えて、一般的に培地原料に利用されるグルコースや、エリスリトールと同じ糖アルコールの一種であるソルビトールが遺伝子発現に関与するか検証した。
菌株には、PC-3-7 株に対して Aspergillus aculeatus 由来-グルコシダーゼを発現させた E1AB1 株を用いた[4]。E1AB1 株を 1%グルコース培地で 48 時間培養し、そこに各炭素源を終濃度 0.2%となるように添加し、添加後 2 時間目での 4 遺伝子の発現量を内在性コントロール遺伝子 pgk1 との相対定量により解析した。その結果、4 遺伝子全てがグルコースやソルビトールには反応せず、エリスリトールにのみ応答して発現することが確認された（図 2）。以上の結果から、Tr68585、Tr68466、Tr122079 及び Tr68606 はエリトール特異的に発現する遺伝子ということが明らかになった。
1201008060402001.21(B) Tr684660h2h0h2h(D) Tr686060.80.60.40.20

図 2 リアルタイム PCR による遺伝子発現解析(3) エリスリトール誘導プロモーター としての利用
 エリスリトールに応答して発現する 4 つの遺伝子のプロモーター領域を用いて、目的タンパク質を誘導生産できるか確認した。
モデルタンパク質には T. reesei が生産するキシラナーゼ XYN3 を選択し、各プロモーター領域の下流に

xyn3 遺伝子を連結させた DNA 断片を E1AB1 株に挿入した株を作製した。各株を 1%グルコース培地で 48 時間培養したところに 0.2% エリスリトールを添加し、4 時間誘導した時点での培養上清中の XYN3 の活性を
p-nitrophenylxylobioside を用いて測定した。その結果、
Tr122079 プロモーター発現株（P122079）ではエリスリトールの有無に関係なく誘導 0 時間目で XYN3 活性が確認され、Tr68606 プロモーター発現株（P68606）では発現量が低いことにより XYN3 の活性がほとんど認められなかった（図 3）。一方、Tr68466 プロモーター発現株（P68466）及び Tr68585 プロモーター発現株（P68585）はエリスリトール添加後 4 時間目にのみXYN3 の活性が確認できた。以上の結果より、エリスリトールに応答して遺伝子の発現を誘導し、目的タンパク質を高生産できる誘導プロモーターとして、
Tr68466 プロモーターと Tr68585 プロモーターを獲得した。
2.5XYN3 activity (U/mL)

る遺伝子である可能性が考えられた。

0h4h-+ Ery

21.5
10.50-+ Ery
Host-+ Ery

P68585-+ Ery

P68466-+ EryP122079

P68606

図 3 誘導プロモーターによる XYN3 の誘導生産

3. 今後の展望
 本研究の結果より、T. reesei において機能するエリスリトール誘導性プロモーターを獲得した。今後は、誘導プロモーターを利用した異種タンパク質の生産検討を進めると共に、誘導プロモーターを用いた酵素生産制御システムの構築など、新たな技術への応用利用も進めて行く予定である。
 さらに、エリスリトール生産菌である酵母 Yarrowia
lypolytica において報告されているエリスリトール代謝関連因子と、今回見出した 4 遺伝子が高い相同性を示すことが分かっている。今後これら 4 遺伝子について解析を進めることで、T. reesei におけるエリスリトール代謝経路が明らかになることが期待される。

4. 文献[1] Martinez D, et al.: Nature Biotechnol. 26:553–560.
(2008)[2] 柴田 望ら: 応用糖質科学, 9:249-253. (2019)[3] Arai T, et al.: Microb Cell Fact., 22:103. (2023)[4] Nakazawa H, et al.: Enzyme Microb Technol. 82:89-95.
(2016)

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