生物工学会誌 第94巻 第2号〔生物工学会誌第 94 巻第2号

63–69．2016〕2015 年度 生物工学技術賞 受賞

生酛乳酸菌のバイオジェニックス効果に着目した
米乳酸発酵飲料の開発
高橋俊成 1*・増田康之 1・吉田和利 2・水野雅史 3

Development of fermented rice drink
using lactic acid bacteria isolated from kimoto
Toshinari Takahashi1*, Yasuyuki Masuda1, Kazutoshi Yoshida2,Masashi Mizuno3 (1General Research Laboratory, Kiku-Masamune
Sake Brewing Co. Ltd., 1-8-6 Uozaki-nishimachi, Higashinada-ku,
Kobe, Hyogo 658-0026, 2Hyogo Prefectural Institute of Technology,
3-1-12 Yukihira-cho, Suma-ku, Kobe, Hyogo 654-0037, 3Departmentof Agrobioscience, Graduate School of Agricultural Science, Kobe
University, 1-1 Rokkodai-cho, Nada-ku, Kobe, Hyogo 657-8501)
Seibutsu-kogaku 94: 63–69, 2016.
はじめにう点である．死滅菌体においても生体調節機能があれば，乳酸菌を生きたまま摂取する必要がない，言い換えれば，近年，高齢化社会の進展，生活習慣病の予防や美容に乳酸菌で発酵させた食品を殺菌しても効果が期待でき，対する意識の高まりを背景に健康食品市場は拡大を続け流通面での障壁が低くなることから，乳酸菌を用いた発ている．健康食品の素材としてはアミノ酸やコラーゲン酵食品の多様化につながると考えられる．などさまざまな成分が知られているが，最近，乳酸菌のこのように乳酸菌を利用した食品が注目を集めている

注目度が高く，機能性食品市場で順調な伸びを示していが，昔から日本人と乳酸菌のつながりは深く，日本酒，る．
乳酸菌の機能性といえば，真っ先に思いつくのがヨー

味噌，醤油，漬物など伝統的な発酵食品の製造において，グルトに代表されるプロバイオティクス効果である．プ乳酸菌は重要な役割を果たしてきた．日本酒と乳酸菌のロバイオティクスとは，「腸内フローラバランスを改善つながりといえば，乳酸菌が生産する乳酸酸性環境下ですることにより宿主に有益に働く生菌添加物」と定義さ

アルコール発酵を担う酵母を純粋培養する工程「生酛」

1)

れている が，最近では生菌という考え方にとらわれながあげられる．生酛では，蒸米，米麹，水を半切桶に仕い「宿主の健康維持に有益に働く微生物」という広い定込んだ翌日，物量を櫂棒ですり潰す作業（山卸作業）を義のプロバイオティクスが用いられることも多くなって行う．この工程は生酛独特の工程であり，山廃酛とは，

2)きた ．他方，光岡知足先生は「直接あるいは腸内フローこの山卸し作業を廃止した酛のことである．山卸し作業

ラを介して，免疫賦活，コレステロール低下作用，血圧が終了すると，半切桶の物量を一つのタンクに集め，3降下作用，整腸作用，抗腫瘍効果，抗血栓・造血作用な〜 4 日間，6 〜 7°C の低温に保つことにより野生酵母な

どの生体調節，生体防御，疾病予防・回復，老化制御等

どの汚染微生物の活動を抑える．この期間が打瀬である．に働く食品成分」というバイオジェニックスという考え

打瀬期間にはまず硝酸還元菌が生育し，硝酸を還元して3)方を提唱している ．乳酸菌体や乳酸菌生産物質はこの亜硝酸を生成する．一方，低温増殖性の乳酸菌も活動をバイオジェニックスの代表格である．この学説がプロバ開始する．まず，球菌である Leuconostoc mesenteroides

イオティクスと明らかに異なる点は，バイオジェニックが生育を始め，その後，桿菌である Lactobacillus sakei

スとしての乳酸菌は必ずしも生菌である必要がないといが増殖することにより優占菌の遷移が起こることが知ら* 著者紹介 菊正宗酒造（株）総合研究所 E-mail: t-takahasi@kikumasamune.co.jp

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図 3．RFLP-PFGE 法による生酛乳酸菌のクラスター解析．破
線は Tenover らが設定した PFGE 解析の疫学基準を示す．

図 1．生酛における微生物の遷移のではなく，酒造用具，原料，環境中から入ってくるものであり，その由来については不明な点が多い．そこで，これらの菌株に DNA レベルでの多様性があるのかを調べるため，院内感染や食中毒の原因特定に広く利用されており，分子疫学の解析において信頼されている

図 2．生酛乳酸菌を利用した米乳酸発酵飲料の開発

restriction fragment length polymorphism（RFLP）とSXOVH¿HOGJHOHOHFWURSKRUHVLV（PFGE）を用いた RFLPPFGE 解析を行うことにした．乳酸菌は約 200 万塩基対の環状ゲノム DNA を持つ．そこで，特定の DNA 配列を認識する制限酵素を用いて，保存菌株のゲノム DNAを断片化した後，PFGE 解析を行った．得られたバンドパターンの相同性から各菌株間の遺伝学的関連性を調べこのような背景のもと，生酛より分離した乳酸菌の発mesenteroides の保存菌株のゲノム DNAを Sma I により断片化後，PFGE 解析結果をもとにクラスター解析を行ったところ，図 3A に示すように 6 つの系統タイプ（A 〜 F）に分かれ，系統タイプ A のなかのサブタイプ A1 に 1992 年および 2010 年に生酛より分離した株および 2010 年に半切桶より分離した株が含まれていた．また，系統タイプ C のなかに，1992 年および2010 年に生酛より分離した株が含まれ，さらに系統タイプ D に 1992 年に生酛より分離した株と 2010 年に半切酵食品への応用を試みるため，バイオジェニックスとい桶より分離した株が含まれていた．これらの結果から，う観点から死滅乳酸菌体による免疫調節作用に着目する

複数の系統の菌株が酒造蔵内に広くハビタットを持ってとともに，機能性成分含量の多い米を原料とし，生酛製おり，多年にわたり生酛の L. mesenteroides の起源になっ造技術を利用した米乳酸発酵飲料を開発することにしたている可能性が考えられた．

れている．そして乳酸菌がつくり出す乳酸と亜硝酸により野生酵母は淘汰される．このような乳酸酸性環境下において，乳酸に強い清酒酵母が増殖するとともにエタノールをつくり出す．生酛で生育する乳酸菌はエタノールに弱いため死滅し，やがて清酒酵母のみが増殖することになる（図 1）．このように生酛乳酸菌は酵母を純粋培養するために尽力することが知られているが，これまで清酒醸造以外で利用されることはなかった．

たところ，L.

同様に L. sakei についてもゲノム DNA を Not I で断片（図 2）．
生酛乳酸菌とは 4)生酛乳酸菌とは生酛より分離した乳酸菌の総称であ化後，PFGE 解析結果をもとにクラスター解析を行った
ところ，L. mesenteroides とは異なり，1997 年に生酛より分離した株は系統タイプ F に，1998 年に生酛より分り，そこには L. sakei と L. mesenteroides が含まれる．菊

離した株は系統タイプ B，D，E に属し，2010 年に生酛正宗酒造（株）総合研究所では，1992 年から 2012 年により分離した株は系統タイプ A に属し，異なる年度に分かけて，清酒製造場である「嘉宝蔵」の生酛より乳酸菌離された株が同一の系統タイプに属することはなかった

株を分離してきた．これらの乳酸菌は人為的に添加する（図 3B）．また，半切桶から L. sakei の分離を試みたが，

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図 4．ナイーブ T 細胞の分化制御メカニズム

分離される株は L. mesenteroides であり，L. sakei を分離することはできなかった．このことから L. sakei が蔵

図 5．乳酸菌加熱死滅体がマクロファージ様細胞株 J774.1 のIL-12 産生に及ぼす影響．平均値±標準誤差（n = 3）

内に生息し，翌年も生酛に現れる可能性は低いと考えられる．この結果については環境によって凝集性や耐熱性が増大する L. mesenteroides5) と比較して L. sakei は複雑な栄養要求性 6) を持つことが関係していると思われる．
以上より，L. mesenteroides は，酒造蔵内の木製道具類などにハビタットを持つと推定され，酒造年度をまたいで同じ系統タイプの株が現れる，いわゆる蔵付き乳酸

図 6．アレルギー発症メカニズム菌のような挙動を示すのに対し，L. sakei は酒造蔵内に安定したハビタットを持たず，米麹などの原材料を介して，酒造年度をごとに多様な菌株が生育してくるものと推察された．

IL-12 産生促進作用が高い乳酸菌株の選抜 7)
生酛乳酸菌のバイオジェニックスとしての評価を行う
ため，発酵食品由来の乳酸菌で多くの報告 8,9) がある免疫調節作用に着目することにした．生体内では，細胞性免疫を活性化する Th1 細胞と体液性免疫を活性化する Th2抜として，効果の高かった菌株の中から LK-103，LK117，LK-127，LK-133，LK-141 の 5 菌株を選抜した．
なお，LK-117 株を用いた詳細な解析から，IL-12 産生促進作用の一因は，菌体の加熱処理時の細胞膜の崩壊により外部へ漏出し，細胞壁に付着した一本鎖 RNA に因ることが明らかとなった 7)．

I 型アレルギー抑制効果 11)

る．花粉症などのアレルギー疾患を持つ人では，そのバ免疫調節機構を司る Th1 細胞と Th2 細胞のバランスがTh2 細胞側に傾くと，Th2 細胞は B 細胞を活性化してIgE 抗体の産生を促進する．IgE 抗体は肥満細胞に結合ランスが Th2 型に偏っていることが知られている．乳酸し，抗原が結合すると，肥満細胞からヒスタミンなどの菌は，マクロファージが産生するサイトカイン IL-12 の化学伝達物質が放出され，くしゃみ，鼻みず，鼻づまり産生量を増加させることにより，Th0 細胞（ナイーブ Tなどの I 型アレルギー症状が誘発される（図 6）．そこで，細胞）から Th1 細胞への分化を促進する．その結果，マウスを用いて I 型アレルギーモデルである受動性皮膚Th2 細胞に傾いた免疫バランスを Th1 細胞とバランスが取れる状態に改善することが知られている 10)（図 4）．
生酛より分離した乳酸菌は種レベルでは，L. sakei と L.
mesenteroides に限定されたが，菌株レベルでいくつかアナフィラキシー反応に対する抑制効果を調べることに細胞の相互のバランスにより免疫調節機構を維持していに分け，した．5 週齢の雌の BALB/c マウスを 6 群（n = 5）加熱処理した乳酸菌乾燥菌体 2 mg を含む PBS リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に懸濁し，1 日 1 回，4 日間強制のクラスターに分類されたので，各クラスターから乳酸経口投与を行った．なお，PBS のみを同様に投与した菌株を数株ずつ選び，その中からバイオジェニックス乳ものを対照とした．5 日目に尾静脈より抗トリニトロ酸菌として，免疫調節作用が高い菌株を選抜することとフェノール（TNP）IgE 抗体を注射し，30 分後にマウスした．マウス由来マクロファージ様細胞株 J774.1 の培の耳厚を測定した後，片耳にピクリルクロライド（PiCl）養液に乳酸菌加熱死滅菌体を添加し，3 時間後の培養上を塗布し，2 時間後の耳厚を測定した．PiCl 塗布前後の清中の IL-12 濃度を測定したところ，供した 17 菌株に耳厚差を評価したところ，LK-141 株を除いた 4 株におおいて IL-12 産生量の増加が認められた．その効果は菌いて有意に耳の腫れが抑制され，その効果は LK-117 株

株ごとに差があり，L. mesenteroides に比べ，L. sakeiでもっとも高かった（図 7）．のほうが高い傾向を示した（図 5）．この段階では一次選

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図 7．乳酸菌加熱死滅体投与が受動性皮膚アナフィラキシー反応に及ぼす影響．平均値±標準誤差（n = 5）．**: p < 0.01
図 9．乳酸菌加熱死滅菌体が腸管免疫応答に及ぼす影響．平均値±標準誤差（n = 3）．*: p < 0.05

するが，LK-141 株の接触による刺激は小腸上皮細胞を介した腸管免疫系を活性化しないと推察される．乳酸菌と腸管免疫の関係性を知る上で，両菌株の挙動の違いは大変興味の持たれるところである．
アトピー性皮膚炎発症抑制効果 11)
図 8．ヒト由来小腸上皮細胞 Caco2 とマウス由来マクロファージ細胞 RAW264.7 による腸管モデル

L. sakei LK-117 株の加熱死滅菌体が I 型アレルギー抑制効果を示す結果が得られたことから，I 型と IV 型のアレルギーが関与するアトピー性皮膚炎に対する効果を調共培養モデルを用いた腸管免疫応答の評価 11)
乳酸菌加熱死滅菌体がアレルギー抑制作用を示したことから，その作用は腸管での免疫応答に関連していると考え，腸管免疫への影響を調べることにした．

べることにした．自然発症皮膚炎モデル NC/Nga マウス（雄，8 週齢）を 2 群（n = 10）に分け，標準飼料またはLK-117 加熱処理乾燥菌体を 1％含む標準飼料を自由摂取させた．4 日目よりマウス背部にピクリルクロライドの塗布を開始し，5 つの評価項目（①掻痒症，②発赤・腸管での免疫応答は，小腸粘膜の直下に存在するパイ出血，③浮腫，④擦傷・組織欠損，⑤痂皮形成・乾燥）

エル板を代表とする腸管免疫が外来異物に対する初期応について，皮膚炎スコアを 4 段階（0–3 点）で評価した．

答には重要であり，そこからの情報伝達によってリンパ5 つの皮膚炎症状スコアのなかでもっとも顕著な差が球やマクロファージの活性化が起こり，生体防御機構が認められたのが，痂皮形成・乾燥であり，試験開始後 40発動されると考えられている．そこでヒト由来小腸上皮日以降で標準飼料投与群に比べ，LK-117 菌体含有飼料様細胞である Caco-2 とマウス由来マクロファージ様細投与群では皮膚炎スコアが有意に低い値を示し（図 10），胞 RAW264.7 を共培養し，実際の腸管状態を模した in

LK-117 加熱死滅菌体投与が NC/Nga マウスのアトピーvitro モデルを用いて乳酸菌加熱死滅菌体が腸管免疫に．
及ぼす影響について評価を行った（図 8）
Caco-2 と RAW264.7 を 半 透 膜 で 仕 切 っ た ト ラ ン ズ性皮膚炎の発症を抑制することが明らかとなった．LK-117 加熱死滅菌体投与が I 型アレルギーモデルである受動皮膚アナフィラキシー反応を抑制したことから，血中ウェルで共培養後，乳酸菌加熱死滅菌体を腸管空側に添の IgE 濃度の低下が認められると考え，試験開始後 47

加し，3 時間後に粘膜側の TNF-Į 濃度を測定したところ，日目の NC/Nga マウスの血中 IgE 濃度を測定したところ，

LK-117 株においては，濃度依存的に TNF-Į の産生量の増加が認められたが，LK-141 株では産生量の増加は認．なお，LK-117 株を直接マクロめられなかった（図 9）
ファージ様細胞に接触させても TNF-Į の産生量の増大は認められなかった．以上の結果より，LK-117 株の加LK-117 菌体含有飼料投与群と標準飼料投与群に有意な熱死滅菌体は小腸上皮細胞を刺激し，腸管免疫を活性化

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差は見られなかった．アトピー性皮膚炎の発症のメカニ
ズムは，遺伝的または何らかの原因で IgE 抗体をつくりやすいアレルギー体質になることによって発症すると考えられているが，新生児への乳酸菌 Lactobacillus

rhamnosus GG 株の投与によって，IgE レベルに変化が
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化性デンプンが多く含まれていること 14) や，タンニン系赤色色素を有する赤米やアントシアニン系色素を有す
る紫黒米には疾患予防や老化抑制効果が期待される抗酸化作用の強いポリフェノールが多く含まれていること 15)が知られている．このような機能性成分の多い米を原料とすることにより，乳酸菌によるバイオジェニックス効果だけでなく，原料に由来する機能性も引き出せるため，これまで以上に機能性の高い商品の開発が可能となる．
一般米や酒造好適米など特徴のある品種について精米歩合が約 85％となるように精米を行い，抗酸化作用の
図 10．乳酸菌加熱死滅体投与がアトピー性皮膚炎発症抑制に及ぼす影響．平均値±標準誤差（n=10）．*: p < 0.05, **: p < 0.01

指標として，総ポリフェノール量，DPPH ラジカル消去能および整腸作用が期待される難消化性デンプン量を測定したところ，表 1 に示すようにいずれの測定項目においても高アミロース米である夢十色やホシニシキが高いないにも関わらず，2 歳までにアトピー性皮膚炎を発症値を示し，今回の米乳酸発酵飲料の原料米として，ホシする頻度が半減するという報告 12) もあり，いまだに原ニシキを選抜することにした．ホシニシキは，農研機構因が特定できないのが現状である．今回の IgE レベルに作物研究所でホシユタカと黄金晴の交配で育成された耐依存せずにアトピー性皮膚炎の発症を抑制したという結倒伏性が強い高アミロース米．一般米のアミロース含量

17 〜 20％に対し，アミロース含量は約 25％．冷えると果については今後さらなる検討の余地がある．
機能性成分含量を多く含む米品種の選抜 13)
バイオジェニックス乳酸菌の選抜が完了したので，次に発酵基質となる米品種の選抜を行うことにした．米に硬くなるため一般の飯米には適さないが，さらっとした食感からピラフ，リゾットなどに利用されている．
米乳酸発酵飲料の開発

は多種多様な品種があり，アミロース含量が高い高アミ以上の乳酸菌および米の選抜結果をもとに L. sakei

ロース米にはプレバイオティクス効果が期待される難消LK-117 株と高アミロース米ホシニシキを用い，生酛製

表 1．各米品種の機能性成分含量の比較
総ポリフェノール量（mg/g） DPPH ラジカル消去能（％） 難消化性デンプン含量（％）

品種名

特徴プリンセスサリー

香り米（うるち）

1.54

14.8

0.04

兵庫牛若丸

高アミロース米1.16

9.00.51

北陸 207 号

高アミロース米

2.45

18.1

0.55

ホシユタカ

高アミロース米1.27

9.00.60

夢十色高アミロース米5.22

41.20.92

ホシニシキ

高アミロース米

5.69

51.6

0.67

兵系酒 18 号

酒造好適米

1.65

17.0

0.16

兵庫北錦

酒造好適米

2.22

19.90.10

兵庫夢錦

酒造好適米

3.23

32.30.10

山田錦

酒造好適米

1.46

16.1

0.15

五百万石

酒造好適米

2.08

19.7

0.14

日本晴

一般うるち米

3.21

23.0

0.16

きらら 397

一般うるち米1.81

14.40.06

コシヒカリ

一般うるち米1.96

22.30.06

ササニシキ

一般うるち米

1.72

14.5

0.09

ヒノヒカリ

一般うるち米1.58

15.80.06

ニシホマレ

一般うるち米

2.25

21.5

0.09

むらさきの舞一般うるち米4.26

38.00.21

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図 11．米乳酸発酵飲料の製造フロー

造技術を応用した米乳酸発酵を行うことにした．90％精米したホシニシキを食品用酵素剤により液化後，L.

sakei LK-117 株を接種し，プロテアーゼ剤，アミラーゼ剤共存下，25°C で乳酸発酵を行った（図 11）ところ，24 時間後には乳酸菌密度が生酛とほぼ同じレベルの約3.4 × 108 cfu/ml に達した．
乳酸発酵の条件が確立できたことから，最終の製品化

図 12．米乳酸発酵飲料と市販乳酸菌飲料中の D- アミノ酸濃度の比較を行うことにしたが，ここで大きな問題が発生した．ホシニシキは全国での作付け実績がないため買い付けるこ菌株を用いて米乳酸発酵を行うことにより美容効果が期とができないという状況となった．2008 年には兵庫県待される飲料の開発につながる．

立農林水産技術総合センターの協力を得て 100 m2 の試
験栽培を行っていただいた．ホシニシキの背丈は一般米おわりにに比べ低く，収量は玄米で 67 kg と比較的収量が多かっ微生物の存在を知らない江戸時代に確立された清酒酵た．本格的に事業化するためには栽培面積をさらに増や母の純粋培養方法としての「生酛」．そこで活躍する乳酸し，安定的に生産する必要があったため，当社の酒米の菌については，これまで清酒製造以外に利用されること契約栽培農家の方に米乳酸発酵飲料のコンセプトを理解はほとんどなかった．筆者らは生酛乳酸菌をバイオジェして頂き，2009 年より兵庫県加東市で本格的なホシニニックスの観点から醸造以外の分野への展開を図るべシキの栽培を行うこととなった．

く，産学官連携のプロジェクトを組み，生酛製造技術をこのように原材料を安定的に確保できる体制が整った

応用することにより米乳酸発酵飲料の開発に成功した．

ことから，米乳酸発酵飲料を 2010 年 1 月に「酒蔵の乳酸本技術は，伝統的な発酵技術を応用しつつ，新たな価菌 米のしずく」として商品化することに成功した（http://値を創造するという生物工学の原点の発想であり，そのkomenoshizuku.jp/index.html）．また，2012 年 4 月から

応用範囲は食品だけでなく，さらに他の分野にも応用可

はタブレットタイプとしても商品化し，現在，年間延べ能である．たとえば，生酛より分離した L. mesenteroides

約 14,000 人の方々に定期購入いただいている．

を用いた米乳酸発酵液において保湿効果が認められ 16)，

米乳酸発酵技術の新展開
米をプロテアーゼ存在下で乳酸発酵を行うことにより，発酵液中には米タンパク質に由来する多種多様なペプチドが多量に含まれる．高血圧自然発症ラットを用いて，米乳酸発酵液の単回投与試験，長期投与試験を行ったところ，米乳酸発酵液摂取群では，有意に血圧上昇を抑制する結果が得られた16)ことから，米乳酸発酵液には血圧上昇抑制効果が期待される．
また，近年，医学，薬学分野だけでなく，食品分野においても，呈味性や美容効果などの機能性の面から注目を集める D- アミノ酸も豊富に含まれることがわかってきた（図 12）．D- アミノ酸は乳酸菌の細胞壁の構成成分であり，アミノ酸ラセマーゼの作用により乳酸菌体内で生合成される成分である．D- アミノ酸の生成能も菌株レベルで多様性があるため，D- アミノ酸を高生産する

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化粧品素材としての商品化にも成功した．今後も生酛の中に眠る有用微生物を探索し，長年培った発酵技術により，豊かで健やかな暮らしに貢献できる技術開発に励んでいきたいと思う次第である．
謝辞

本研究開発の遂行にあたり，多くの方々のご助言，ご指導を頂きました．特に PFGE 解析に関しては，神戸大学大学院農学研究科の大澤朗教授，ホシニシキの栽培に関しては，兵庫県立農林水産技術総合センターの岩井正志先生，池上勝先生，
D - アミノ酸の定量に関しては，関西大学化学生命工学部の老川典夫教授，血圧上昇抑制効果に関しては，沖縄県工業技術センターの丸山進先生，独立行政法人産業技術総合研究所の市村年昭先生に心より感謝申し上げます．また，ご支援を頂きました近畿経済産業局地域資源活用型研究開発事業ならびに全国中小企業団体中央会ものづくり中小企業製品開発等支援補助金事業にも心より感謝申し上げます．

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