バイオ医薬品の製造技術研究開発：
国際基準に適合した次世代抗体医薬等の製造技術プロジェクト（前編）spERtTM 技術による翻訳装置の高機能化とその応用
後藤希代子
粒子（SRP）と SRP 受容体による古典的経路として，はじめに

spERtTM

いわゆるシグナル仮説が解明されている．しかし最近で技術は，バイオ医薬品生産に使用される動物

はこのシグナル仮説以外の経路，すなわちSRP非依存的，細胞などの培養において，小胞体の翻訳装置の高機能化

翻訳非依存的な小胞体への mRNA 輸送も多数報告されにより 1 細胞あたりの生産性を高める新規技術である．ている 4–6)．またシグナル仮説では説明できない事象とChinese Hamster Ovary（CHO）細胞などの動物細胞をして，小胞体上のリボソームが膜タンパク質，分泌タン用いて外来性の組換えタンパク質を発現，分泌させる際パク質のみならず細胞質タンパク質も効率良く合成し，に遭遇する問題の一つとして，目的遺伝子の転写産物量小胞体がタンパク質合成のための高効率プラットフォーの増加とそのタンパク質発現量が必ずしも相関しないとムを担うという機能を提唱する興味深い知見も蓄積されいう問題がある．しかし，小胞体膜上の翻訳過程やそのている 6–8)．このように小胞体での翻訳過程には未解決分子機構に関する理解が不十分であり，この問題解決はな問題が多く残されており，近年，主流となっている動困難であった．筆者らは線維芽細胞がコラーゲンを分泌物細胞によるバイオ医薬品製造における生産性向上のたする際に重要な役割を担う小胞体膜タンパク質 p180 をめには，これらの分子機構の詳細を明らかにし科学的根見いだし，そのユニークな分泌活性化機構を明らかにし拠に基づいた問題解決を図ることが有効であろうと思わてきた

1,2)．この分泌活性化機構を応用して小胞体を高れる．

機能化できれば，mRNA の翻訳効率を改善して分泌をspERtTM 技術の原理大幅に増強させうると予想し，さまざまな検討を行った．
その結果，p180 と協同的に働き，かつ mRNA の選択性に関わる因子として SF3b4 を新たに同定し，spERt

TM

spERtTM 技術は，小胞体上の翻訳装置の活性化を担うタンパク質 p180 とその補助因子 SF3b4 を利用して，小（Selective Polyribosome assembly on the ER with Three

胞体上のポリリボソーム形成を促進させ，分泌タンパクfactors）技術を開発した 3)．

質の生合成能を高めている（図 1）．まず，これら因子の本稿では分泌タンパク質の合成の場である小胞体上での翻訳の特徴と spERtTM 技術の各要素について概説し，本技術導入により期待される効果，さらに，バイオ医薬品製造への応用に向けて抗体産生細胞へ適用した取組みのうち，次世代バイオ医薬品製造技術研究組合での成果例について紹介する．
小胞体上での翻訳の特徴
分泌タンパク質は小胞体膜上で翻訳されると，ただちに小胞体内腔へと輸送され，シャペロンなどによる品質管理，翻訳後修飾などが施される．小胞体膜の通過は分泌経路へ入る最初の重要な関門であり，この過程はトランスロコンと呼ばれるタンパク質膜透過装置を介して行われる．すなわち，小胞体膜上で効率良く分泌タンパク質を合成するためには，翻訳装置の本体であるリボソームとトランスロコンが同調して機能し，さらには内腔側のシャペロンなどとも協働可能なことが求められる．また，目的の mRNA のみならず，翻訳因子，アミノアシ
ル tRNA などが小胞体へ十分に供給されることも必要である．小胞体への mRNA 輸送に関してはシグナル認識
著者紹介

株式会社ニッピ

生物工学

第97巻

バイオマトリックス研究所

第6号（2019）

図 1．spERtTM 技術によるポリリボソーム形成の促進機構のモデル．（A）小胞体における p180 依存的なポリリボソーム形成による高効率生合成のモデル図，（a-1）SRP 依存的および（a-2）
SRP 非依存的な経路の例を示した．（B）p180- 非存在下で，ポリリボソームの発達程度が弱い場合の例を示した（文献 3，
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (in press) より改変）．

E-mail: kgoto@nippi-inc.co.jp

335

特集

特性と本技術導入により期待される効果，cis- エレメン

象は p180 依存的であり，C 末端領域（Ct）に責任領域

トの併用による効果について以下に述べる．

があることを報告した 1)．

高効率コラーゲン生合成に必須な因子 p180

SF3b4 の小胞体における新規機能

ヒト細胞の p180 は，全長 1540 アミノ酸からなり 9)，

上記のポリリボソーム形成促進能は，対象となるさまざまな機能ドメインを含み，その大部分を細胞質側mRNA に関して選択性が認められたが，その機構は不に突出させた配置をとる小胞体膜タンパク質である．図明であった．筆者らはこの選択性を未知の可溶性因子が2 にこれまで報告された p180 の機能ドメインについて図示した．N 末端領域は強塩基性を呈し，10 アミノ酸モチーフが 54 回連続したリピートが存在する 9,10)．このリピート領域を介して p180 はリボソームと結合すると考えられる 11)．一方で，p180 はリボソーム非依存的にSec61，TRAP などのトランスロコン関連分子とも相互担うと仮定して，Ct との結合能を指標にこの因子を検作用し，これは先に述べたリボソームとトランスロコンンを活発に分泌している線維芽細胞の小胞体では非常にの同調を制御し効率的翻訳に寄与しうる特性と考えら

重いポリリボソーム画分にコラーゲン mRNA と共局在1)

索し，SF3b4 を見いだした 3)．SF3b4 は SF3b というス
プライシング因子の構成成分であり，その分子内に二つの RNA 認識モチーフ（RRM）を持つことから mRNAの選択性を規定しうる分子である．SF3b4 は通常は核内に存在してスプライシングに従事しているが，コラーゲし，p180 と特異的に相互作用することが確認された 3)．

れる ．
9)

C 末端領域は酸性を呈しコイルドコイル構造をとる ．
In vitro 試験でのキネシンモーターとの結合性 12)，PDZ

CHO 細胞での実施可能性検証

ドメインへの結合に必要なコンセンサス配列の存在 13)以上に概説した通り，spERtTM 技術はコラーゲン分泌などが報告されている．最近，このコンセンサス配列がに特化した線維芽細胞の分泌機構を手本として，p180特異的に結合する相手としてミトコンドリア外膜タンパと SF3b4 の 2 種の因子（以下，2 因子）によりその基本ク質が同定された 14)．この報告はミトコンドリアと小胞効果が発揮される新規技術である（図 1）．本技術の応用体の機能的連携に p180 が関与する可能性を示す知見とを目指し，バイオ医薬品製造における宿主細胞として重して興味深い．

要な CHO 細胞を対象に実施可能性を検討した．その過筆者らは線維芽細胞におけるコラーゲンの分泌活性化程において，さらに，分泌を増強できる cis- エレメント機構に関する研究において，コラーゲンの生合成・分泌を新規に同定した 3)．CHO 細胞における 2 因子の導入と経路で重要な役割を担う分子として p180 に着目して研ル を 含 む 領 域（MTB-1） は 微 小 管 束 形 成 能 を 示 し，cis- エレメントの分泌活性への効果を併せて検証した例
を図 3 に示す．2 因子を単独，または共発現させた細胞株を用いて分泌マーカー（AP）の活性を比較すると，p180 が小胞体と微小管を直接結合させるリンカーとし期待通り共発現株でもっとも分泌活性が高く対照細胞のて機能すること 15)，トランスゴルジネットワークの発達約 3 倍へ増加した．さらに，cis- エレメントを併用する究を進めてきた．分子中央のリピートからコイルドコイ16)など，この分子が細胞骨格との相互作と約 9 倍に上昇するという顕しい効果を確認した．加え用を介して分泌経路全体へ影響する可能性を示した．特て，2 因子導入株では，（i）小胞体への mRNA 輸送が亢に，高効率なコラーゲンの翻訳促進にはポリリボソーム進する，（ii）ポリリボソーム解析により，cis- エレメン形成の亢進が必須である点に筆者らは注目した．この現トを挿入したリポーター mRNA は，さらに重い分画へ

図 2．p180 分子のドメイン構造とこれまで報告された各ドメ
イ ン の 機 能（ 出 典 は 本 文 を 参 照 ）．TM： 膜 貫 通 ド メ イ ン，MTB-1：微小管結合ドメイン．

図 3．CHO 細胞における 2 因子導入と cis- エレメントの分泌活性への効果（文献 3，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (in press) より改変）．にも寄与する336

生物工学

第97巻第6号（2019）バイオ医薬品の製造技術研究開発：
国際基準に適合した次世代抗体医薬等の製造技術プロジェクト（前編）
小胞体膜上のタンパク質翻訳装置を高効率型に改変できる spERtTM 技術を開発した．g/L 以上の高生産性 CHO細胞においても spERtTM 技術導入の効果が検証され，小胞体の翻訳装置活性化という手法により mRNA の利用効率を相加・相乗的に増強させ，高発現生産株の構築に利用可能であることが確認された．バイオ医薬品製造に資する高生産細胞株の構築技術として翻訳過程に焦点を当てた例はほとんどなく，高生産を誘導する既存の各種技術との併用も可能なため，今後更なる応用が期待できる．抗体製造のみならず，その他の生産困難なタンパク質への応用など，さまざまな開発を進める予定である．
謝辞

本研究開発は株式会社ニッピバイオマトリックス研究所
図 4．spERtTM 技術導入 CHO 細胞を用いた抗体産生細胞株の構築．
（A）spERtTM 技術導入 CHO 細胞と対照 CHO 細胞より樹立した抗体産生株の力価の分布を比較した．（B）力価が最大値を示した細胞株の小胞体ポリリボソーム解析結果．とシフトすることが示されており cis- エレメントによる更なる分泌促進の機序としては翻訳開始過程の活性化が予想されている 3)．
抗体生産 CHO 細胞への応用
次に，CHO 細胞を用いた抗体産生における本技術の効果を評価した．既存の抗体産生細胞へ 2 因子を導入した CHO 細胞株は，生産性の指標である比生産速度が対照株に比べて約 3.8 倍に増加した．また，本技術を導入した CHO 細胞株を宿主として，抗体発現ベクターを導入して，約 200 株のクローンを取得しその力価の分布を対照株と比較したところ，spERtTM 技術により高力価株を高頻度に取得できることが示された（図 4A）．さらに，2 因子と cis- エレメントの併用により，これらの増強効果をさらに高める結果も得られた（図 4A）．これら 2 因子導入細胞株では小胞体のポリリボソーム量が増加し（図 4B），期待通り小胞体の翻訳装置の活性化が誘導され，抗体生産量の増大に寄与していると推察された．
さらに，抗体医薬製造に必要な g/L 以上の高生産性

CHO 細胞株での実施可能性を検証するため，MAB 組合において第一三共（株）が開発したモデル細胞株へspERtTM 技術を導入し，比較検討した．Fed-Batch 培養において技術導入前と比べて生産性が顕著に向上し，さらに，（株）アイエスジャパンによる培地開発および培養条件の検討の結果，更なる生産性向上が達成された．

spERtTM チームメンバーによる努力の結果としてなされました．本研究開発の実施にあたり多大なご協力，ご助言を頂いた株式会社ニッピバイオマトリックス研究所の皆様，第一三共株式会社様，株式会社アイエスジャパン様をはじめとした関係各方面のすべての皆様に心より御礼申し上げます．
本研究の一部は，日本科学技術振興機構（JST）の「再生医療実現化ネットワークプログラム事業」，経済産業省の「平成26 年度次世代医療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業（国際基準に適合した次世代抗体医薬等製造技術）」，及び国立研究開発法人日本医療研究開発機構（AMED）の「次世代医療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業」の課題番号（JP17ae0101003）の支援によって行われた．

文

献1) Ueno, T. et al.: Nucleic Acids Res., 40, 3006 (2012).
2) Ueno, T. et al.: J. Biol. Chem., 285, 29941 (2010).
3) Ueno, T. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, DOI:10.1073/pnas.1901742116.
4) Hermesh, O. and Jansen, R. P.: Biochim. Biophys. Acta,1833, 2519 (2013).
5) Kraut-Cohen, J. and Gerst, J. E.: Trends Biochem. Sci.,
35, 459 (2010).
6) Jagannathan, S. et al.: J. Biol. Chem., 289, 25907 (2014).
7) Jagannathan, S. et al.: RNA, 20, 1489 (2014).
8) Reid, D. W. and Nicchitta, C. V.: J. Biol. Chem., 287,5518 (2012).
9) Langley, R. et al.: DNA Cell Biol., 17, 449 (1998).
10) Ogawa-Goto, K. et al.: J. Virol., 76, 2350 (2002).
11) Wanker, E. et al.: J. Cell Biol., 130, 29 (1995).
12) Diefenbach, R. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun.,
319, 987 (2004).
13) Kim, M. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 294,1151 (2002).
14) Hung, V. et al.: Elife, DOI 10.7554/eLife.24463.
15) Ogawa-Goto, K. et al.: Mol. Biol. Cell, 18, 3741 (2007).
16) Ueno, T. et al.: Exp. Cell Res., 316, 329 (2010).

まとめ
以上のように，線維芽細胞の分泌機構を手本として，
生物工学

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