課題番号	  	
 ：25指110

研究課題名	
 ：膵β細胞の量・機能を制御する新規メカニズムの解明

主任研究者名 ：西村	
  渉
分担研究者名 ：西村	
  渉
キーワード

：膵β細胞、糖尿病、転写因子、分化、インスリン

研究成果：膵β細胞障害における細胞分化状態の解析(1) 緒言：膵内分泌細胞の分化可塑性と糖尿病に対するその意義	  近年、生体の様々な臓器において、細胞分化は可逆で動的な状態あることが、実験的に示されている。細胞の分化可塑性は、膵内分泌細胞で詳細に解析されてきている。細胞系譜追跡実験（lineage tracing
study）の結果、様々な状況において、膵臓の細胞から異なった系譜の細胞への分化転換が生じる事が明らかになっている。その際、膵内分泌細胞分化に重要な転写因子の発現が変動する。また、それら
転写因子の強制発現により、膵臓の細胞に分化転換が生じる事も示されている。一方、ごく最近の研究により、糖尿病状態でのβ細胞の恒常性の破綻が、β細胞の脱分化と分化転換を引き起こす事が示されているが、その分子メカニズムは不明である。
	  膵内分泌細胞においてだけでなく、哺乳類の気管粘膜分泌細胞、B リンパ球、そして核移植による初期化プロセスなどにおいても、細胞分化は成熟細胞の形質維持に関与する因子によって動的に制御されており、それら因子の発現低下による細胞の恒常性の破綻が、体細胞の脱分化を引き起こす事が、示されている。我々はこれまでに、インスリンの発現に重要な転写因子 v-Maf musculoaponeurotic
fibrosarcoma oncogene family, protein A (MafA)が、成熟β細胞に発現し、また胎生期の膵内分泌細胞分化には関与しない事を明らかにしてきた。MafA と転写因子の Pdx1、Neurog3 を強制発現すると、膵外分
泌細胞をインスリン陽性細胞に分化転換する。MafA は、ヒトの 2 型糖尿病のβ細胞障害において、他の因子に先行して発現が低下する。そこで本研究では、マウスにおける膵β細胞の恒常性維持と可塑性における MafA の機能を解析した。
(2) 方法	  MafA ノックアウト(KO)マウス、糖尿病モデルマウスとして db/db マウス、低容量ストレプトゾトシン（STZ）を投与したマウスのβ細胞につき、細胞系譜追跡実験を含む組織学的解析や、遺伝子発現解析などにより詳細に検討した。
(3) 結果1. MafA は膵β細胞の恒常性維持に重要である
	
  野生型マウス膵臓を対照として、免疫組織染色により MafA KO マウス膵臓を経時的に解析した。
MafA KO マウス膵島は、生直後は正常であったが、 4 週齢頃より膵島内部にα細胞が出現し始め、8
週齢ではインスリンの発現が低下するとともに、相対的にα細胞数が増加していた。10-12 週齢では、様々なインスリン発現レベルの細胞が認められ、またインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵
ポリペプチドのいずれも発現しない細胞が出現した。このような膵島の形態学的変化にもかかわらず、
MafA KO マウスでは、耐糖能異常を認めたものの、空腹時血糖が糖尿病レベルには達しなかった。MafA
KO マウスの単離膵島は、ジチゾン染色性が障害され、インスリン含量が低下していた。MafA KO マ
ウスの膵島には、TUNEL アッセイ陽性のβ細胞は、野生型と同様ほとんど認められなかった。12 週齢において、MafA KO マウス膵島のほとんどの細胞は内分泌細胞マーカーの synaptophysin、chromogranin
A 陽性であったが、インスリンの発現は減弱あるいは消失していた。電顕では、MafA KO マウス膵島
細胞に多数のインスリン顆粒を持たない小胞を認めた。このようなインスリン陰性の『empty β細胞』とβ細胞／α細胞比の減少は、4 週齢より 12 週齢まで高脂肪食を給餌した、MafA KO マウスと同様かそれ以上の血糖レベルを持つマウスの膵島には認められなかった。これら高脂肪食給餌マウスの膵島では、MafA の発現レベルに異常を認めなかった。以上より、MafA KO マウス膵島に認められる形態
学的な異常は、血糖値の上昇によるものではなく、MafA の発現低下によるものと考えられ、β細胞の恒常性維持における MafA の重要性が明らかになった。

2. MafA KO マウスの膵β細胞は脱分化している	  MafA KO マウス膵島における synaptophysin 陽性インスリン陰性細胞、あるいは chromogranin A 陽性
インスリン陰性細胞が膵β細胞由来かどうかを解析するため、インスリン陽性細胞の系譜追跡実験を施行した。RIPCreER;Rosa-YFP マウスでは、タモキシフェンの投与により Cre がインスリン陽性細胞
特異的に発現し、YFP の発現が恒久的に誘導される。本研究では、90%以上のβ細胞に YFP の発現が認められた。MafAKO;RIPCreER;Rosa-YFP マウスと、対照として野生型の RIPCreER;Rosa-YFP マウスに、4 週齢でタモキシフェンを投与し、12 週齢で膵臓を解析した。MafAKO;RIPCreER;Rosa-YFP マウス膵臓では、β細胞において YFP の発現が明瞭に認められた。つまり 4 週齢においては、MafA の発
現がなくても、インスリンプロモーターは作動することが明らかになった。これらの結果、胎生期と新生児期におけるインスリン陽性細胞の形成過程に、MafA は不要である事が明らかになった。
	  12 週齢の MafAKO;RIPCreER;Rosa-YFP マウスは糖尿病を発症しなかったが、膵臓において多数のイ
ンスリン陰性 YFP 陽性細胞を認めた。また興味深い事に、MafAKO;RIPCreER;Rosa-YFP マウス膵臓では少数ではあるが、 β細胞由来の YFP 陽性細胞に、グルカゴンの発現を認めた。定量的解析では、2.6%(n=991)のグルカゴン陽性細胞に YFP の発現を認めた一方、対照ではそのような細胞を認めなかった(n=361)。これらの結果は、MafA KO マウスのβ細胞では 4 週齢から 12 週齢の間に、大多数にインス
リン発現の減弱あるいは消失を認め、そのうちのごく少数がグルカゴンを発現するという事を示唆する。4 週齢から 12 週齢にかけて、MafA KO マウスのグルカゴン陽性細胞／膵島細胞比は高いままであったが、グルカゴン陽性細胞の増殖には促進を認めなかった。よって MafA KO 膵島におけるβ細胞／
α細胞比の低下は、β細胞からα細胞への分化転換に加えて、β細胞増殖の低下（分担研究報告参照、
Eto K et al, PLos One. 2014）が関与していると考えられた。
	  MafA KO マウス膵島における遺伝子発現変動を、野生型を対照として解析した。MafA KO マウス膵
島では、Ins1、Ins2、Slc2a2、Slc30a8、Psck1、Vdr、Sytl4、Ucn3、Maob など、β細胞機能に重要な遺伝子群の発現が低下していた。しかし、グルコース応答性インスリン分泌に重要な Gck、Kcnj11、Abcc8の発現は低下していなかった。β細胞の形質維持に重要な転写因子 Pdx1、Neurod1、Pax6、Foxo1、Nkx6-1の発現は、軽度低下していた。一方、ほとんどの組織で発現が認められるが、β細胞でのみ発現が抑制され、『β細胞特異的発現抑制遺伝子（“β-cell disallowed gene”）』とも呼ばれている遺伝子群の１つである Slc16A1 の発現が増強していた。また、胎生期膵臓の内分泌前駆細胞で一過性に発現が増強
する転写因子 MafB、Pax4、Neurog3、Sox9 の発現が増強していた。これらの膵内分泌細胞分化に関連した転写因子に加えて、Sox2、Nanog、Mycl の発現が増強していた。以上より、MafA の発現低下によるβ細胞の脱分化は、『β細胞特異的発現抑制遺伝子』をはじめとするいくつかの遺伝子群の発現増強と、β細胞機能に重要な分子群の発現低下を誘導し、それらがβ細胞の機能を低下させると推察された。また、MafA KO 膵島では、Dnmt1 と Dnmt3a の発現が低下し、Dnmt3l の発現が増強していた。
Dnmt1、Dnmt3a の KO マウスでは、β細胞からα細胞への分化転換を認める事が報告されている。
3. 糖尿病モデルマウスの膵β細胞の脱分化	  MafA の発現は、糖尿病モデルマウスのβ細胞で、Pdx1 など他の分子に先行して低下する。そこで
RIPCreER;Rosa-YFP システムを利用して、db/db マウス、低容量 STZ マウスのβ細胞の運命を同様に解析した。 これらのマウス膵島でも、β細胞／α細胞比が低下し、インスリン、グルカゴン、ソマトス
タチン、膵ポリペプチドのいずれも発現しない膵島細胞が存在していた。8 週齢から 12 週齢までの db/db
マウス膵β細胞の系譜追跡実験においても、MafA KO マウスと同様に、インスリンの発現が低下・消失したβ細胞が多数観察された。これらの膵島において、12 週齢のα細胞の 2.1% (n=1165)がβ細胞由来であったのに対し、対照群では 0.6% (n=486)であった。低容量 STZ マウスにおいては、α細胞の 2.8%
(n=696)がβ細胞由来であったのに対し、対照群では 0.2% (n=424)であった。MafA KO マウスに低容量
STZ を投与した群としない群では、β細胞系譜追跡実験の結果は同様であった事から、この現象における MafA の重要性が示唆された。
	  転写因子 MafB は、発生過程のβ前駆細胞に発現する。糖尿病モデルマウスにおけるβ細胞の脱分化をさらに解析するため、MafBGFP/+レポーターマウスを用いて膵島における MafB の発現を観察した。

対照群では、MafB-GFP の発現はα細胞に限局していた。低容量 STZ マウスでは、MafB-GFP の発現はβ細胞の 36.1% (n=1016)に見られたが、対照マウスのβ細胞では 0.5%であった (n=1907)。db/db マウ
スでは、MafB-GFP の発現はβ細胞の 39.6% (n=1522)に認められたが、対象マウスでは 1.5% (n=1158)であった。これらの結果は、MafB プロモーターが障害β細胞において活性化した事を示唆している。
β細胞における MafB-GFP の発現は、4 週齢から 24 週齢まで高脂肪食を給餌したマウスでは認められなかった事から、β細胞における MafB プロモーターの活性化は、脱分化に関連している事が示唆された。
(4) 考察	  本研究で我々は、膵β細胞の分化可塑性制御に対する転写因子 MafA の機能を解析した。その結果、
MafA は成熟β細胞の形質維持に重要である事が明らかになった。MafA の発現消失により、膵β細胞は脱分化し、『β細胞特異的発現抑制遺伝子』の発現が増強した。MafA はヒト 2 型糖尿病患者の多くのβ細胞で発現が低下する事から、上記の結果はヒトの糖尿病の病態メカニズムに直接関連する。
	  本研究で我々は、MafA KO マウス、db/db マウス、低容量 STZ マウスのβ細胞で脱分化が起こっている事を、細胞系譜追跡実験などに基づいて、実験的に示した。β細胞の脱分化は、本研究の遂行中にもマウス膵臓において発表されており（Talchai et al, Cell. 2012; Wang et al, Cell Metab. 2014; Gao et al,
Cell Metab. 2014）、注目されているβ細胞障害メカニズムである。
	  近年の網羅的遺伝子発現解析の結果から、膵β細胞で特異的に発現が抑制されている遺伝子群が同定されている。これら遺伝子の発現抑制は、β細胞がグルコース刺激に対応して効率的に、適切な量のインスリンを分泌する事に貢献している。これらの遺伝子発現抑制は細胞分化度（成熟度）依存性
で、新生児期の間に確立する。分化過程の、いわゆる「未熟なβ細胞」は、これらの遺伝子群を発現している（Pullen et al, Diabetes Obes Metab. 2013; Thorrez et al, Genome Res. 2011）。Slc16A1 はこれら『β細胞特異的発現抑制遺伝子』の１つであるが、MafA KO マウス膵島で発現が増強していた。さらに
MafB などの、胎生期膵臓の内分泌前駆細胞で一過性に発現が増強する転写因子の発現も、増強していた。MafB は高齢や多産後のβ細胞特異的 FoxO1 KO マウスや Pdx1 KO マウスの膵島でも発現が増強しており、またゲノムワイドに DNA メチル化の変化を誘導する（Vicente-Dueñas et al, EMBO J. 2012）。
よって MafB は、『β細胞特異的発現抑制遺伝子』の発現制御領域のエピゲノム変化を誘導する事により、それら分子の発現を増強させているのかもしれない。前述の Slc16A1 のβ細胞における発現増強にも、エピゲノム変化が関与している事が報告されている。
	  脱分化したインスリン陰性β細胞を、高血糖の治療により再分化させる事で、β細胞機能が回復する事から、障害によるβ細胞脱分化はある段階までは可塑である事が示されている（Laybutt et al,Diabetologia. 2007; Wang et al, Cell Metab. 2014）。本研究により MafA は、障害β細胞の再分化の分子標的になり得る事が示された。また、障害β細胞における『β細胞特異的発現抑制遺伝子』群の発現を解析する事で、糖尿病におけるβ細胞機能低下の新しいメカニズムが明らかになる可能性が見出された。
	  このような解析には、レポーターマウスが有用である。我々は、β細胞機能の解析に有用なレポー
ターマウスを作製してきた（Nishimura et al, Endocrinology. 2013、22 指 103 報告書参照）。また最近我々は、マウスの BAC を用いた MafA のレポーターマウスである MafA-Kusabira Orange、さらに MafA とMafB のダブルレポーターマウスである MafA-Kusabira Orange;MafBGFP/+マウスを作製し、これらのマウスから単離した膵島のライブモニタリングにより、MafA と MafB の発現の可視化に成功している（Nishimura et al, Endocr J. Published on line, DOI: 10.1507/endocrj.）。今後は、これらの研究ツールとフ
ローサイトメトリー、経時的なイメージングによる解析などにより、純粋β細胞集団の遺伝子発現をダイナミックに解析し、β細胞の脱分化メカニズムを分子レベルで効率的に解明して、糖尿病の病態解明と新規治療法の開発に貢献していく。
	  以上の研究結果の主要な部分は、Diabetologia（Published on line, DOI: 10.1007/s00125-014-3464-9）に発表した。

課題番号	
  	 ：25指110

研究課題名	
 ：膵β細胞の量・機能を制御する新規メカニズムの解明

主任研究者名 ：西村	
  渉
分担研究者名 ：西村	
  渉
キーワード

：膵β細胞、糖尿病、転写因子、分化、インスリン

研究成果：膵β細胞増殖・機能成熟におけるプロラクチンシグナルの機能解析(1) 緒言：新生児期のβ細胞増殖を研究する意義	  新生児期、幼児期の器官発生や成熟過程は、その後の健康、特に生体代謝に重要である。膵β細胞
は生後に激しく増殖し、生体から要求されるインスリン分泌能に見合った量を確保する。インスリン抵抗性の増大に対応したβ細胞の代償性増殖については、多くの研究結果が報告されているが、生後の膵β細胞増殖を制御するシグナルについては、よく分かっていない。この過程を解明する事は、生体におけるβ細胞量の制御メカニズムを明らかにするだけでなく、幹細胞より分化誘導されたインス
リン陽性細胞の増殖能獲得にも貢献する可能性がある。
	  妊娠中の母体における膵β細胞増殖には、プロラクチンシグナルが関与している。一般的に、胎盤性ラクトゲンあるいはプロラクチンがプロラクチン受容体 (Prlr) に結合すると、下流の Janus kinase 2(Jak2)と Signal transducer and activator of transcription 5B (Stat5B)をリン酸化する。リン酸化 Stat5B は核内に移行し、DNA 結合配列である GAS モチーフに結合し標的遺伝子の発現を誘導する。β細胞における Prlr/Jak2/Stat5B シグナルの下流として、Ins1、Ins2、Slc2a2、Gck、Tph1、Ccnd2、そして Prlr 自身が報告されている。また、Prlr ノックアウト（KO）マウスの解析からは、プロラクチンシグナルは生後のβ細胞増殖にも関与する可能性が示唆されている。
	
  β細胞は、v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family, protein A (MafA)の発現増強に伴って成熟化する。MafA はインスリンプロモーターの C1-A2 領域に結合し、インスリンの発現を制御する転写因子である。膵臓では、MafA は成熟β細胞にのみ発現する。MafA を転写因子 Pdx1、Neurog3とともに膵外分泌細胞に発現させると、それらをインスリン陽性細胞に分化転換する。MafA は、糖尿病におけるβ細胞の機能障害早期に発現が低下する。MafA KO マウス膵島では、生直後には正常であるβ細胞／α細胞比が、新生児期に低下する事が知られている。そこで、本研究では生後のβ細胞増殖に対する MafA の機能を解析した。
(2) 方法	
  7 週齢の MafA KO マウス膵島における遺伝子発現を、野生型マウスを対照として網羅的に解析し、その結果得られた MafA の下流遺伝子の候補について、MafA KO マウスやβ細胞株などを用いて解析した。
(3) 結果1. 膵β細胞において、MafA は Prlr の発現に関与する
	  7 週齢の MafA KO マウス膵島において発現が低下している遺伝子として、Slc30a8、Vdr、Slc2a2、
Pcsk1、Cryl1、Sytl4、Ucn3、Prlr、Ccnd2 などを同定した。次に、MafA の siRNA を導入したマウス膵
β細胞株 MIN6 細胞における、これら分子ならびにβ細胞機能に重要な分子の発現を解析した。MafAの発現は、対照の 51.2±3.7%と低下していた（p<0.01）。この時、Prlr の発現は対照の 78.6±1.5%と、解析した分子の中で最も低下していた（p<0.05）。また、7 週齢の MafA KO マウス膵島の qRT-PCR による解析では、Prlr の発現は野生型の 31.5±4.9%（p<0.01）と低下していた。また、プロラクチンシグナ
ルの下流の Ccnd2 の発現も 25.2±3.6%（p<0.01）と低下していた。MafA KO マウス膵島では、Prlr とCcnd2 の蛋白発現も、野生型膵島と比較してそれぞれ、24.8±15.9%、50.3±15.9%に低下していた（p=0.04、0.05）。以上より、膵β細胞において MafA は、Prlr ならびに Ccnd2 の発現制御に関与している事が示唆された。Prlr KO マウスでは、新生児期にβ細胞量が減少する事が知られている。
2. Prlr 発現制御領域に対する MafA の機能	  In silico 解析では、マウス Prlr プロモーターの転写開始部位から-3000 bp 上流までに、MafA 結合部
位が 6 カ所同定され、これらはヒトならびにラットでも保存されていた。ルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイでは、MafA はヒトおよびマウス Prlr プロモーターを活性化した（それぞれ p<0.01、
p<0.05）。MafA の各結合部位を欠損したマウス Prlr プロモーターを用いたレポーターアッセイでは、-217 から-207 まで (p<0.01)、-2026 から-1409 まで (p<0.01) の領域が、MafA による Prlr プロモーターの活性化に重要である事が判明した。これらの結果、MafA は転写レベルで Prlr プロモーターの活性化を制御する事が明らかになった。
3. 膵β細胞においてプロラクチンシグナルは Ccnd2 の発現を制御する	  膵β細胞において、MafA と Prlr が Ccnd2 の発現に関与するかを解析するため、ラット膵β細胞株
INS-1 細胞におけるプロラクチンシグナルを解析した。MafA の siRNA を導入した INS-1 細胞において、
MafA の発現は対照群の 41.5±5.8%であった（p=0.09）。この時、Prlr、Insulin1、Insulin2 の発現はそれ
ぞれ 84.8±7.0%、83.7±7.3%、68.5±8.4%であった（p>0.05）。Prlr の siRNA を導入した INS-1 細胞では、
Prlr の発現は対照群の 55.7±2.3%であった（p=0.05）が、この時 MafA、Insulin1、Insulin2 の発現に変動は認められなかった。INS-1 細胞において、1 µg/ml のプロラクチン刺激による、プロラクチンシグナ
ル下流の Stat5B のチロシンリン酸化ならびに細胞質から核内への以降は、Prlr や Jak2 依存性であった。
これらのシステムを用いて、β細胞におけるプロラクチンシグナルの Ccnd2 の発現に対する機能を解析した。INS-1 細胞におけるプロラクチン刺激は、Stat5 のリン酸化とともに、核内の Ccnd2 の蛋白量を 139.2±10.6%に増加させた（p=0.01）。また INS-1 細胞において、siRNA により Prlr の発現を対照群の 15.3±0.5% (p<0.01) に抑制した時、Ccnd2 の mRNA 発現は 84.9±2.9%（p=0.01）と低下した。以上より、膵β細胞株におけるプロラクチンシグナルは、Ccnd2 の発現を制御する事が明らかになった。
4. 4 週齢の MafA KO マウスでは、β細胞の増殖が抑制されている
	  MafA KO マウスの膵β細胞における Prlr と Ccnd2 の発現低下の、生後のβ細胞増殖に対する影響を解析した。BrdU 取り込み実験では、β細胞のうち BrdU 陽性であったのは、4 週齢の MafA KO マウス
で 0.35±0.0%であったのに対し、野生型では 1.57±0.48%であった（p=0.06）。よって、MafA の発現低下により、4 週齢のマウス膵臓におけるβ細胞の増殖が低下する事が明らかになった。以上より、
MafA はプロラクチンシグナルの制御を通じて、生後のβ細胞増殖を制御する事が判明した。
(4) 考察	  本研究で我々は、MafA KO マウスより単離した膵島の網羅的遺伝子発現解析を施行した。その結果、
MafA は膵β細胞において Prlr の発現に重要であり、プロラクチンシグナルが Ccnd2 の発現を制御し、そして MafA がプロラクチンシグナルを介して、生後のβ細胞増殖を制御する可能性を明らかにした。
胎生期膵臓において、Prlr は胎生初期〜中期には膵外分泌細胞や膵管に発現するが、その後、胎生後期から生後にかけて、膵島に限局していく（Freemark et al, Clin Invest. 1997）。この時期は、MafA がβ細胞に発現する時期と一致している（Nishimura et al, Dev Biol. 2006）。よってプロラクチンシグナルは、妊娠期の母体膵臓だけでなく、新生児期膵臓においても、β細胞増殖に重要であると考えられた。
Ccnd2 発現に対する MafA の直接作用に関しては、β細胞株を用いた解析では困難であり、今後より詳細な解析が必要である。現在我々は、MafA KO マウスのβ細胞特異的に Ccnd2、Prlr を過剰発現するマウスを作製し、解析しようとしている。
	  生後のβ細胞におけるプロラクチンシグナルは、細胞増殖だけでなく、機能の成熟化にも重要である可能性がある。プロラクチンシグナルは、Slc2a2、Gck、Tph1、Foxm1、そして Prlr 自身の発現や、インスリン分泌・インスリン生合成に重要である事が報告されている（Weinhaus et al, J Endocrinol.
2007; Arumugam et al, Endocrinology. 2011; Nielsen et al, Endocrinology. 1982）。本研究により、プロラク
チンシグナルの活性化や、プロゲステロンシグナルの抑制が、幹細胞から分化したインスリン陽性細胞の増殖や機能成熟を促進する可能性が見出された。
	
  以上の研究結果の主要な部分は、PLos One に発表した（Eto K et al., 2013）。

Subject No.

：25-110

Title	
  	  	 ：Elucidation of novel mechanism regulating mass and function of pancreatic β-cells

Researchers：Wataru Nishimura

Key word：pancreatic β-cells, diabetes, transcription factor, differentiation, insulin

Abstract：

1. Specific Aim
Dysfunction of pancreatic β-cells is directly involved in the pathology of diabetes. However, mechanism of
reduced mass and impaired function of β-cells in diabetes is not fully understood. Thus, it is critical to elucidate
mechanism regulating mass and function of adult β-cells.
Function and mass of insulin-expressing cells differentiated from endocrine progenitors in embryonicpancreas are immature at birth, but these cells actively proliferate and acquire mature function as β-cells during
neonatal period. Molecular mechanism of these events is also not clear. Uncovering the mechanism regulating
mass and function of β-cells in neonates would contribute to studies analyzing proliferation and maturation of
immature insulin-expressing cells differentiated from stem cells.
Thus, the specific aims of this research project are below, to elucidate the molecular mechanism regulating
mass and function of adult and neonatal β-cells.
1. Elucidation of novel mechanism of β-cell dysfunction in diabetes
2. Analysis of mechanism regulating proliferation of neonatal β-cells

2. Background
1. Novel mechanism of β-cell dysfunction
Recent studies using genetic engineered diabetes model mice with overexpression or repression of aparticular molecule in β-cells show that compromised β-cells are not apoptotic, but there is large amount of
β-cells with reduced / lost expression of insulin, which are dedifferentiated and/or transdifferentiated into α-cells
in various conditions (Talchai et al., Cell. 2012). Although molecular mechanism regulating fate of thesecompromised β-cells in adult mice is not clear, changes in the expression of transcription factors critical fordifferentiation of pancreatic endocrine cells are observed. Conversely, forced expression of these factors
transdifferetiates pancreatic cells.

2. Neonatal β-cell proliferation
Regulation of β-cell replication during infancy plays a major role in β-cell mass in adult human (Meier et al.,Diabetes. 2008), suggesting molecules and signals involved in neonatal proliferation of β-cells need to beelucidated. Prolactin signaling has been reported to be critical for cell proliferation, although it is not fully
elucidated in β-cells. Neonatal β-cell mass is reduced in global knockout (KO) mice of prolactin receptor (Prlr)or cyclin D2 (Ccnd2), a downstream target of Prlr. Conversely, β-cell-specific overexpression of placental
lactogen, a ligand of Prlr, increases β-cell mass.

3. Transcription factor MafA is critical for maturation of β-cells
v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family, protein A (MafA) is a transcription factor thatbinds to C1-A2 element of insulin promoter. MafA forms ternary complex with Pdx1 and NeuroD1 to activate
Researchers には、分担研究者を記載する。

insulin promoter and is critical for the insulin gene expression. MafA is expressed in mature β-cells, while MafB,
another Maf family transcription factor, is expressed in immature insulin-expressing cells as well as mature
α-cells. MafB is essential for the expression of insulin in endocrine progenitor cells in the embryonic pancreas,
while MafA is dispensable for embryonic development of pancreas. Maturation of β-cells accompanies increasein the expression of MafA in neonatal pancreas. Thus, MafA may be a key molecule for neonatal maturation andproliferation of β-cells. In adult, the expression of MafA in β-cells is sensitive to glucotoxicity and rapidly
reduced in diabetes model mice. Pancreatic islets in MafA KO mice have reduced β-cell / α-cell ratio, which isalso observed in diabetes model mice such as db/db or mice that received low-dose streptozotocin (STZ).

3. Methods
1. Novel mechanism of β-cell dysfunction
The morphology of the islets in MafA KO mice was analyzed by immunohistochemistry and transmission
electron microscopy (TEM), and gene expression in the MafA KO islets was examined by qRT-PCR. In addition,
RIPCreER;ROSA-YFP mice were generated in the background of MafA KO mice, db/db mice and low-dose
STZ mice, and the fate of β-cells in these mice was analyzed by the lineage tracing studies.

2. Neonatal β-cell proliferation
The transcriptome analyses of the islets of MafA KO neonates were performed. The results of these analyses
were subsequently used for the elucidation of signaling pathway regulating β-cell proliferation and maturation.

4. Results:
1. Novel mechanism of β-cell dysfunction
In MafA KO islets, cells with reduced / lost expression of insulin increased over time with decreased β-cell /α-cell ratio. These cells expressed chromogranin A or synaptophysin, the endocrine cell markers. TEM of MafA
KO islets showed numerous β-cells with empty granules. The lineage tracing study of β-cells in MafA KO micedemonstrated many β-cells that have reduced / lost expression of insulin, minority of which expressed glucagon.
qRT-PCR of MafA KO islets showed reduced expression of molecules critical for the function of β-cells such as
insulin, Slc2a2, Slc30a8, Pcsk1, Vdr, Sytl4, Ucn3 and Maob. It also showed increased expression of genes thatare specifically repressed in the conventional β-cells, such as Slc16A1 or that are transiently expressed in
endocrine progenitor cells such as MafB, Neurog3, Pax4 or Sox9. Meanwhile, TUNEL assay of β-cells in MafA
KO mice showed very few positive cells. Lineage tracing studies of other diabetes model mice such as db/db or
low-dose STZ mice also showed β-cells with reduced / lost expression of insulin and with the expression of
glucagon. These results suggest that MafA is important for the homeostasis of β-cells and regulates cell plasticity,and reduced expression of MafA in compromised β-cells of diabetes results in dedifferentiation of these cells.
Our results also indicate that MafA can be a target for redifferentiation of compromised β-cells into thefunctional cells in diabetes.
To search small compounds to induce the expression of MafA, or to analyze gene expression of mature
β-cells, MafA reporter mice were generated by the research project 22-103. In this project of 25-110, we
generated double reporter mice MafA-KOr;MafBGFP/+ for further analysis of dynamic change in the expressionof MafA and MafB in compromised β-cells. The islets isolated from MafA-KOr;MafBGFP/+ mice expressed KOr
Researchers には、分担研究者を記載する。

(Kusabira Orange) in β-cells and GFP in α-cells. After culturing of these islets for 3 days, majority of the islets
exhibited MafA-KOr-dominant expression, while few islets were MafB-GFP-dominant. These transgenic miceenable to track dedifferentiation (MafA to MafB transition) over time.

2. Neonatal β-cell proliferation
Transcriptome analyses revealed genes downregulated in MafA KO islets at 7 weeks of age, including
Slc30a8, Vdr, Slc2a2, Pcsk1, Cryl1, Sytl4, Ucn3, prolactin receptor (Prlr) and cyclin D2 (Ccnd2). The analysis
of mouse β-cell line MIN6 cells with transfection of siRNA-MafA also showed reduced expression of Prlr.
qRT-PCR analysis of MafA KO islets showed reduced expression of Prlr and Ccnd2. The protein expression ofPrlr and Ccnd2 in MafA KO islets was also impaired. Thus, the role of prolactin signaling in neonatal β-cellproliferation and maturation was focused in this study.
Reporter assay using mouse and human Prlr promoters in HeLa cells revealed MafA can activate Prlr
promoter via at least two MafA recognition elements (MARE). Prolacin stimulation of rat β-cell line INS-1 cells
induced phosphorylation and translocation into the nucleus of Stat5B through Prlr and Jak2, which increased theexpression of Ccnd2. In consistent with these results in vitro, BrdU incorporation assay revealed reduced
proliferation of β-cells in MafA KO mice at 4 weeks of age. These results suggest importance of prolactin
signaling for the proliferation of β-cells in neonatal as well as in pregnant mice.

5. Discussion
1. Novel mechanism of β-cell dysfunction
Our results suggest that MafA is critical for the homeostasis of β-cells and loss of MafA induces
dedifferentiated β-cells with reduced / lost expression of insulin. Our results demonstrate new mechanism of
β-cell dysfunction, which is consistent with recently published articles during the course of this study, showing
dedifferentiation of β-cells in diabetes (Talchai et al., Cell. 2012; Wang et al., Cell Metab. 2014; Gao et al., Cell
Metab. 2014).

2. Neonatal β-cell proliferation
In this study, we showed that MafA regulates β-cell proliferation through prolactin signaling. For moreinvestigation of this aspect, we are now studying if β-cell specific expression of Prlr or Ccnd2 can rescue
impaired proliferation of β-cell in MafA KO neonates. To this end, BAC-Ins1-Prlr mice and BAC-Ins1-Ccnd2
mice are being generated using BAC clone including mouse insulin1 promoter. Analysis of these mice may also
show another role of prolatin signaling to induce functional maturation of β-cells.

The results described above were published in the following journals.
1. Nishimura W, et al. Diabetologia, published on line. DOI: 10.1007/s00125-014-3464-9.
2. Nishimura W, et al. Endocr J, published on line. DOI: 10.1507/endocrj.
3. Eto K, et al. PLos One. 9: e104184, 2014.

Researchers には、分担研究者を記載する。

【研究報告書 25指110（西村班）：膵β細胞の量・機能を制御する新規メカニズムの解明①】 	

膵β細胞の成熟化メカニズムの解明	
  β細胞量と増殖"

新生児期β細胞の	  増殖メカニズムの解明	

新生児期β細胞の	
  機能成熟メカニズムの解明	
  

β細胞量	

幹細胞	
  

インスリン"陽性細胞	
  

成熟β細胞	
  β細胞増殖	
年齢	
新生児期特異的な"β細胞の増殖	生後の膵β細胞量に関与"

グルコース応答性"
インスリン分泌能"の獲得	

機能的β細胞"の分化誘導"
・再生法の確立"

【研究報告書 25指110（西村班）：膵β細胞の量・機能を制御する新規メカニズムの解明②】 	

生後のβ細胞増殖、機能成熟における転写因子MafAの機能"(in neonates)"
PRL" Placental lactogen"

Prlr"

MafA"
P	

Jak2	

AG490"

Stat5B	

P	

Stat5B	P	

Htr2b"
?"

Ins1	

Ins1	

Stat5B	

P	

Stat5B	P	
Ccnd2	

Ins2	

Ins2	

Slc2a2	

Slc2a2	

Pdx1	

Gck	

Slc30a8	

Prlr	

Neonatal proliferation"

Tph1	

GAS motifs	

G6pc2	
Styl4	

Neonatal maturation?"

Serotonin"
Eto K et al., PLoS One 2014	

【研究報告書 25指110（西村班）：膵β細胞の量・機能を制御する新規メカニズムの解明③】 	

転写因子MafAによる膵β細胞の恒常性維持メカニズムの解明"
再分化（インスリン治療）"

内分泌前駆細胞"

未熟β細胞"

成熟β細胞"Ins-"
MafA-"
MafB-"Syp+"
ChgA+"
Neurog3+"

MafA-"
MafB+"

MafA+"
MafB-"

MafB+"
β細胞"

Stress"

MafA-"
MafB+"“Empty β-Cells”"
脱分化β細胞"
分化転換"（β細胞障害早期）"
rare	

Ins-"
MafA-"Syp+"
ChgA+"
Slc2a2-"
Pdx1±"Ins-"
MafB+"
Neurog3+"

Gcg+"

Apoptosis"(rare?)"

増殖・機能獲得	

機能低下	
Nishimura W et al., Diabetologia, published on line	【研究報告書 25指110（西村班）：膵β細胞の量・機能を制御する新規メカニズムの解明④】 	

Pdx1/MafA プロモーターを活性化する低分子化合物による"
膵β細胞の増殖、機能成熟促進"

膵島"

Pdx1-Gaussia
Luciferase"
マウス"

膵β細胞の	
  機能改善	イメージング"Chemically	
  Induced	
  Reprogram	
  

膵外分泌"

肝臓"
MafA-Kusabira
Orange"マウス"

Small"
Molecule"
Screening	

繊維芽細胞"
レポーターアッセイ"

Nishimura W et al., Endocrinology 2013; Nishimura W et al., Endocr J, published on line	研究発表及び特許取得報告について

課題番号：２５指１１０
研究課題名：膵β細胞の量・機能を制御する新規メカニズムの解明
主任研究者名：西村

渉

論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

年

MafA	
 is	
 critical	
 for	
 maintenance	
 of	
 the
mature	 beta	 cell	 phenotype	 in	
 mice.

Wataru	 Nishimura
Satoru	 Takahashi
Kazuki	 YasudaDiabetologia

58巻3号

2015

Generation	
 and	
 characterization	
 of	
 MafAKusabira	
 Orange	 mice.

Wataru	 Nishimura
Hisashi	 OishiNobuaki	 Funahashi
Toshiyoshi	
 Fujiwara
Satoru	 Takahashi
Kazuki	 YasudaEndocrine	 Journal

62巻1号

2015

Paternal	
 allelic	 mutation	
 at	
 the	
 Kcnq1
locus	
 reduces	
 pancreatic	
 β	
 cell	 mass	
 via
epigenetic	
 modification	
 of	
 Cdkn1c.

Shun-ichiro	 Asahara
Hiroaki	 Etoh
Hiroyuki	
 InoueKyoko	 Teruyama
Yuki	
 Shibutani
Yuka	
 IharaAlberto	 Bartolome
Naoko	 Hashimoto
Tomokazu	
 Matsuda
Maki	
 Koyanagi-Kimura
Ayumi	 KannoYushi	 Hirota
Tetsuya	
 Hosooka
Kazuaki	 Nagashima
Wataru	 Nishimura
Hiroshi	
 InoueMichihiro	 Matsumoto
Michael	 J.	
 HigginsKarl	
 Pfeifer
Kazuki	 YasudaNobuya	 InagakiSusumu	 SeinoMasato	 Kasuga
Yoshiaki	
 Kido

Proc	
 Natl	 Acad	 Sci
In	
 Press
USA

2015

Int	
 J	
 Mol	
 Med

2015

Masaki	 HiramotoHaruhide	
 Udagawa
Atsushi	
 Watanabe
Allele	 comparative	
 analysis	
 of	
 type	
 2
Keisuke	
 Miyazawa
diabetes-associated	
 SNPs	
 identifies	 allele- Naoko	
 Ishibashi
specific	 DNA-binding	 proteins	
 for	
 the	
 KCNQ1 Miho	
 Kawaguchi
locus.
Takashi	 Uebanso
Wataru	 Nishimura
Takao	 NammoKazuki	 Yasuda

36巻1号

研究発表及び特許取得報告について

Hideyuki	 Ohzawa
Atsushi	 MikiYasuo	
 HozumiChieko	 Miyazaki
Yuka	
 SagaraComparison	
 between	 the	
 antiemetic	
 effects
Yumiko	 Tanakaof	
 palonosetron	
 and	
 granisetron	
 in	
 breastSatomi	 Shibacancer	 patients	
 treated	
 with	 anthracycline- Hiromi	 Joutoku
based	
 regimens.
Masako	 Sakuragi
Megumi	 Takehara
Yasunari	 SakumaWataru	 Nishimura
Hirofumi	
 Fujii
Yoshikazu	
 YasudaOncol	
 Lett.

9巻1号

2015

MafA	
 is	
 required	
 for	
 postnatal
proliferation	
 of	
 pancreatic	
 β-cells.

Koki	
 Eto
Wataru	 Nishimura
Hisashi	 OishiHaruhide	
 Udagawa
Miho	
 Kawaguchi
Masaki	 HiramotoToshiyoshi	
 Fujiwara
Satoru	 Takahashi
Kazuki	 Yasuda

PLoS	
 ONE

9:e104184

2014

Quantitative	 assessment	
 of	
 Pdx1	
 promoter
activity	 in	
 vivo	 using	 a	
 secretedluciferase	 reporter	 system.

Wataru	 Nishimura
Koki	
 Eto
Atsushi	
 MikiMotohito	
 Goto
Miho	
 Kawaguchi
Takao	 NammoHaruhide	
 Udagawa
Masaki	 Hiramoto
Yukiko	 Shimizu
Tadashi	 Okamura
Toshiyoshi	
 Fujiwara
Yoshikazu	
 YasudaKazuki	 YasudaEndocrinology

154巻11号

2013

Hirotaka	 Yokouchi
Koki	
 Eto
Wataru	 Nishimura
Norio	 TakedaYasushi	 Kaburagi
Shuichi	 YamamotoKazuki	 YasudaActa	
 Ophthalmol

91巻4号

2013

西村 渉
衛藤弘城
安田和基

内分泌・糖尿病・代
36巻3号
謝内科

2013

Angiopoietin-like	
 protein	 4	
 (ANGPTL4)	
 is
induced	 by	 high	 glucose	 in	
 retinal	
 pigment
epithelial	
 cells	 and	
 exhibits	
 potent
angiogenic	
 activity	
 on	
 retinal	
 endothelial
cells.

膵β細胞の成熟化機構.

学会発表
タイトル

MafA	
 is	
 important	 for	
 maintenance	
 of	
 the
mature	 beta-cell	 phenotype.

発表者
Wataru	 Nishimura
Miho	
 Kawaguchi
Haruhide	
 Udagawa
Nobuaki	 Funahashi
Takao	 NammoKazuki	 YasudaWataru	 Nishimura
Nobuaki	 Funahashi
Haruhide	
 Udagawa
Generation	
 and	
 Characterization	
 of	
 ReporterMiho	
 Kawaguchi
Mice	
 to	
 Monitor	
 Pdx1	 and	
 Mafa	
 Promoter
Takao	 NammoActivity.
Hisashi	 Oishi
Satoru	 Takahashi
Kazuki	 Yasuda

学会名9th	
 Metabolic
Syndrome,	 Type	
 2
Diabetes	 andAtherosclerosis
Congress	
 (MSDA)

場所

京都

16th	
 International
Congress	
 ofEndocrinology	
 &the	
 Endocrine
シカゴ（米国）Society’s	
 96thAnnual	
 Meeting	
 &
Expo

年月

2014年9月

2014年6月

研究発表及び特許取得報告について

西村 渉
川口美穂
宇田川陽秀
衛藤弘城
転写因子MafAによる膵β細胞の分化可塑性制御.
舟橋伸昭
南茂隆生
平本正樹
安田和基

第57回日本糖尿病学
大阪
会年次学術集会

2014年5月

西村 渉
川口美穂
宇田川陽秀
衛藤弘城
舟橋伸昭
南茂隆生
平本正樹
安田和基

第51回日本臨床分子
東京
医学会学術集会

2014年4月

西村 渉
川口美穂
MafA	
 KOマウスβ細胞のlineage	 tracing	
 study. 宇田川陽秀
南茂隆生
安田和基

第25回分子糖尿病学
大阪
シンポジウム2013年12月

分泌型ルシフェラーゼによる膵島の評価.

西村 渉
衛藤弘城
三木 厚
南茂隆生
川口美穂
宇田川陽秀
平本正樹
佐久間康成
安田是和
安田和基

第56回日本糖尿病学
熊本会年次学術集会

2013年5月

Assessment	
 of	
 pancreatic	
 islets	
 by	
 Pdx1Gaussia	
 luciferase	 reporter	 system.

Wataru	 Nishimura
Koki	
 Eto
Miho	
 Kawaguchi
Takao	 NammoHaruhide	
 Udagawa
Masaki	 HiramotoKazuki	 YasudaBeta	
 Cell	 Workshop
京都
2013	
 Kyoto2013年4月

第57回日本糖尿病学
大阪
会年次学術集会

2014年5月

膵島のゲノム網羅的解析による糖尿病発症機序
の考察.

南茂隆生
宇田川陽秀
川口美穂
舟橋伸昭
上番増喬
平本正樹
西村 渉
安田和基

第57回日本糖尿病学
大阪
会年次学術集会

2014年5月

脂肪細胞由来液成因子による新規インスリン分泌調節因子の発現誘導と膵β細胞機能変化.

宇田川陽秀
平本正樹
舟橋伸昭
川口美穂
南茂隆生
西村 渉
安田和基

第57回日本糖尿病学
大阪
会年次学術集会

2014年5月

ゲノム網羅的解析を用いた,	
 高脂肪食摂取による膵島の代償機序の解明.

南茂隆生
宇田川陽秀
川口美穂
衛藤弘城
上番増喬
平本正樹
西村 渉
安田和基

NGS現場の回第３回
研究会

2013年9月

細胞系譜追跡実験による膵β細胞障害の時間経
過の解析.

安田和基
次世代シークエンサーを用いたゲノム,エピゲノ
西村 渉
ム研究.
南茂隆生

神戸

研究発表及び特許取得報告について

前駆・成熟脂肪細胞からの分泌因子が引き起こす膵β細胞機能変化.

宇田川陽秀
平本正樹
川口美穂
衛藤弘城
西村 渉
南茂隆生
安田和基

第56回日本糖尿病学
熊本会年次学術集会

2013年5月

マウス新生仔膵由来の長期継代可能な細胞の解
析.

川口美穂
西村 渉
尾山和信
宇田川陽秀
衛藤弘城
南茂隆生
平本正樹
安田和基

第56回日本糖尿病学
熊本会年次学術集会

2013年5月

平本正樹
西村 渉
川口美穂
宇田川陽秀
高橋枝里
ニコチナミドはRNA結合タンパク質を介して膵β 加納圭子
細胞における遺伝子発現制御に関与する.
鏑木康志
石橋奈緒子
衛藤弘城
上番増喬
南茂隆生
安田和基

第56回日本糖尿病学
熊本会年次学術集会

2013年5月

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル
Lineage	 Tracingによる膵β細胞障害の解析.

特許取得状況について	
 ※出願申請中のものは(

発表者
西村

渉

発表先

場所

第5回北海道若手糖
尿病研究会

札幌

特許権者(申請者）（共願は全記載）

登録日(申請日)

年月日
2013年10月5日)記載のこと。

発明名称
該当なし※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

登録番号

出願国