日補綴会誌 Ann Jpn Prosthodont Soc 8 : 342-345, 2016

依 頼 論 文◆企画：第 124 回学術大会／シンポジウム 3「幹細胞研究の現状と将来展望」

骨髄間葉系幹細胞と損傷組織のクロストーク
玉井克人

Cross-talk between bone marrow mesenchymal stem cells and injured tissue
Katsuto Tamai, MD, PhD

組織由来因子を介した損傷皮膚と骨髄内間葉系細胞のクロストークメカニズムが存在することを明らかにしつつある．

はじめに
生体骨髄組織内には，赤血球，白血球，血小板へと分化し血液細胞を供給する造血幹細胞（hematopoieticstem cell, HSC）に加えて，骨細胞，脂肪細胞，軟骨細胞などの間葉系細胞への分化能力を示す間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell, MSC）が存在すると考えられている．しかし，HSC はその特異的遺伝子が同定され，その発現を手掛かりとした分化系譜の追跡（lineage tracing）研究がすすめられた結果，生体内における HSC の役割については詳細が解明されている
一方，MSC については未だ特異的遺伝子が不明であるため，その生体内における役割については不明な点が多い．さらに，骨髄血から得られた付着性線維芽細胞様増殖細胞を間葉系間質細胞（mesenchymal stromalcell）と呼び，これも “MSC” と略記されているため（ここでは便宜的に間葉系幹細胞を MSC，間葉系間質細胞を MStroC と別記する），再生医学分野内でさえMSC と MStroC を混同して議論されていることが多く，生体内での MSC と MStroC の異同，生体内におけるこれら間葉系細胞の役割解明は再生医学領域における極めて重要なテーマの一つである．
我々は，皮膚基底膜領域の接着分子遺伝子異常により生直後から基底膜レベルで表皮剥離を繰り返し，全身熱傷様皮膚症状をきたす遺伝性水疱性皮膚疾患「表皮水疱症」の病態研究から，表皮水疱症皮膚の再生過程で骨髄由来細胞が表皮細胞及び線維芽細胞の再生に寄与していること，そのメカニズムに剥離表皮内壊死

1．表皮水疱症皮膚再生過程における骨髄由来間葉系細胞の寄与
表皮水疱症は，生直後から生涯，日常生活の軽微な外力で表皮が真皮から剥離して水疱・潰瘍を形成し，全身熱傷様皮膚症状が持続する極めて重篤な遺伝性水疱性皮膚疾患である 1, 2）．繰り返す表皮剥離とその結果生じる真皮の線維性瘢痕形成により，表皮水疱症患者皮膚では表皮幹細胞，真皮内毛包幹細胞を共に大量喪失することを余儀なくされる．にもかかわらず，皮膚の再生機序は維持されているという臨床的観察との矛盾から，我々は表皮水疱症患者皮膚の再生過程で皮膚外組織からの幹細胞補充メカニズムの存在を想起し，血流を介した骨髄由来幹細胞による皮膚再生メカニズム仮説を提唱してその証明研究を続けている．
皮膚基底膜と真皮を接着するⅦ型コラーゲン（Col7）の遺伝的欠損により，表皮水疱症の中でも重症病型である栄養障害型表皮水疱症が発症する．栄養障害型表皮水疱症は，経過中に皮膚や食道に瘢痕形成を繰り返す結果，手指の瘢痕性癒着，開口障害，食道狭窄など瘢痕形成に起因する重篤な合併症をきたし，重症例では 30 歳台以降に瘢痕癌を多発して致死性となる．現在有効な治療法は全く無く，有効な治療法の開発が切望されている．
我々は，Col7 ノックアウトマウスに対する GFP ト
ランスジェニック骨髄移植実験から，移植骨髄由来細大阪大学大学院医学系研究科再生誘導医学
Department of Stem Cell Therapy Science, Graduate School of Medicine, Osaka University342

骨髄間葉系幹細胞と損傷組織のクロストーク骨髄

PDGFRα +間葉系幹細胞

HMGB1
末梢循環343

損傷組織壊 死

低酸素

HMGB1

HIF-1α複合体形成

SDF-1α血管へ集積・血中動員

PDGFRα +/CXCR4+
間葉系幹細胞

抗炎症作用，線維化抑制作用，幹細胞活性化作用，組織再生誘導作用
図 1 組織損傷時に大量壊死が生じると，核内クロマチン蛋白 HMGB1 が細胞外に大量放出され，末梢循環を介して骨髄内 PDGFRα 陽性細胞を刺激して血中へと動員する．また，HMGB1 は末梢循環性 PDGFRα 陽性細胞表面にケモカイン SDF-1α の受容体 CXCR4 発現を誘導する．
一方，壊死組織周囲の低酸素環境では血管内皮細胞からの SDF-1α 放出が誘導される．SDF1a は壊死組織周囲で HMGB1 と結合すると安定化してケモカイン活性が増強し，その結果，末梢循環性 PDGFRα 陽性細胞は SDF-1α/CXCR4 の作用により壊死組織周囲特異的に集積し，その抗炎症作用，瘢痕抑制作用，幹細胞活性化作用などにより壊死組織の再生を誘導する．

胞の表皮水疱症皮膚への遊走・分化による表皮角化細胞や真皮線維芽細胞の生体内供給メカニズムを明らかにしつつある．その過程で，これら骨髄由来表皮角化細胞，骨髄由来真皮線維芽細胞の骨髄内起源を探索し，骨髄内 PDGFRα（platelet-derived growth factor
receptor alpha）陽性細胞集団内にその起源があることを明らかにした 3）．骨髄内 PDGFRα 陽性細胞集団には中胚葉由来 MSC に加えて，外胚葉由来 MSC が存在することが報告されており，表皮水疱症における剥離表皮由来因子が外胚葉由来 PDGFRα 陽性 MSC を活性化し，損傷組織へと誘導している可能性が示唆される．
また，末梢循環へと動員された骨髄由来 PDGFRα 陽性細胞はその表面にケモカイン CXCL12（別名 SDF-1α:stromal cell-derived factor 1α）の受容体 CXCR4 を発現しており，表皮水疱症皮膚内壊死組織周囲の阻血性血管内皮細胞から放出される SDF-1α との相互作用により，壊死組織周囲特異的に集積することが明らかとなった 4）．
2．表皮水疱症皮膚と骨髄内 PDGFRα陽性細胞のクロストークメカニズム
骨髄内 PDGFRα 陽性細胞集団の性質およびその生体内挙動を観察するために，PDGFRα プロモーター /GFP ノックインマウスを入手し，このマウス骨髄内における GFP 陽性細胞の分化能を培養系で検討した結果，骨，脂肪，軟骨への分化能に加えて，表皮細胞への分化能を持つ細胞が含まれることが明らかとなった．さらに，GFP トランスジェニックマウスから PDGFRα 陽性細胞を分離後，致死量放射線照射マ
ウスに野生型マウス由来骨髄細胞と共に移植して骨髄を置換し，さらにその背部に Col7 ノックアウトマウ
ス皮膚を移植することにより，表皮水疱症モデルマウ
ス皮膚の再生過程における骨髄由来 PDGFRα 陽性細胞の寄与および皮膚における分化系譜の追跡実験を実施した．その結果，移植骨髄由来 PDGFRα-GFP 陽性細胞の表皮水疱症マウス植皮片への特異的集積とケラチン 5 陽性表皮細胞への分化が確認された．これ
らの観察結果から，表皮水疱症皮膚内壊死組織からPDGFRα 陽性骨髄細胞を血中へと動員し，さらに損傷組織への集積を促進する因子が放出されている可能性を予想し，その因子の同定を試みた．その結果，すべての生体細胞が核内に持つ非ヒストン性クロマチン結合蛋白 high mobility group box 1（HMGB1）が壊死表皮から血中へ大量放出され，骨髄内 PDGFRα陽性細胞を活性化して血中動員すること，同時にHMGB1 は血中動員された骨髄由来 PDGFRα 陽性細344

日補綴会誌

胞表面にケモカイン SDF-1α の受容体 CXCR4 の発現を誘導し，表皮水疱症皮膚内壊死組織周囲の血管内皮細胞が放出する SDF-1α との相互作用による末梢循環性 PDGFRα 陽性細胞の損傷皮膚特異的集積を誘導していることが明らかとなった 3, 4）．表皮水疱症皮膚に集積した骨髄由来 PDGFRα 陽性細胞は強い抗炎症分子 TNF-a stimulating gene-protein 6（TSG-6）を放出して表皮水疱症皮膚を炎症フェーズから再生フェーズへと転換させつつ，自身は真皮線維芽細胞や表皮角化細胞へと分化して機能的組織再生を促進していることが明らかとなった（図 1）．
3．HMGB1 による生体恒常性維持メカニズムをもとにした体内再生誘導医薬開発
HMGB1 は，二つの DNA 結合ドメイン（A-box および B-box）を介してクロマチン DNA と結合し，そのクロマチン構造を弛緩させることにより遺伝子発現や遺伝子修復を促進する核内シャペロンタンパクである 5–7）．近年，HMGB1 は壊死組織から受動的に，あるいはマクロファージや樹状細胞から能動的に細胞外へと放出され，DNA やヒストン等の壊死組織由来因子，あるいは LPS やウイルス RNA 等の病原体由来因子と結合した状態で壊死組織内免疫細胞表面の Tolllike receptor (TLR) と結合すると，これら壊死組織由来因子や病原体由来因子単独と比較して有意に強く自然免疫を活性化し，病変部への好中球やマクロファージ浸潤を強く誘導することにより壊死組織や感染組織除去反応を促進するという，いわゆる自然免疫強化機能が明らかにされている 8, 9）．一方，これら壊死性因子，感染性因子と結合しない遊離 HMGB1 はTLR 刺激を抑制的に制御し，炎症反応の周囲組織への波及をブロックする 10）．
上 述したように，我々は HMGB1 血中濃度が 上昇すると，骨髄内 PDGFRα 陽性細胞を活性化して血中へと動員し，さらに CXCR4 発現誘導を介してCXCR4/SDF-1α シス テムによる骨髄由来末梢循 環
PDGFRα 陽性細胞の炎症・壊死組織特異的集積を促進し，その抗炎症作用，多分化能により組織再生を促進するという，HMGB1 のあらたな生体内恒常性維持メカニズムを明らかにした 3, 4）．すなわち，HMGB1は核内レベル，局所レベル，全身レベルのそれぞれで生体組織の恒常性を維持する極めて重要な分子であり，その機能は表皮水疱症皮膚のみならず，あらゆる生体損傷組織の再生に寄与していると予想される．
一方で HMGB1 は，敗血症後期反応の喚起や脳梗塞炎症の遷延に関与していることが示されるなど，病8 巻 4 号（2016）

態によっては炎症反応と再生反応のバランスを炎症側に傾けることが知られている．最近我々は，骨髄PDGFRα 陽性細胞血中動員活性ドメイン（KOI2 ドメイン）が自然免疫活性化ドメイン（TLR あるいはRAGE 結合ドメイン）と異なることを見出した（特許出願中）．現在我々は，KOI2 ドメインペプチドを利用した骨髄間葉系幹細胞血中動員医薬開発を進行中である．

おわりに表皮水疱症患者皮膚の再生メカニズム解明研究から損傷組織と骨髄細胞のクロストークメカニズムが明らかとなり，さらに HMGB1 を利用した体内再生誘導医薬開発へと発展しつつある．HMGB1 医薬は，最初に表皮水疱症の治療薬として開発される予定である．
しかし，損傷組織と骨髄細胞のクロストークメカニズ
ムの詳細はいまだ不明な部分が多く，今後この領域研究の進展により，より有効かつ安全な体内再生誘導医療の開発が可能になると期待する．
文献1） Tamai K, Kaneda Y, Uitto J. Molecular therapies
for heritable blistering diseases. Trends in Molecular Medicine 2009; 15: 285–292.
2） 玉井克人．表皮水疱症．疾病対策研究会編，難病の診断と治療指針．東京：六法出版社；2001.
3） Tamai K, Yamazaki T, Chino T, Ishii M, Otsuru
S, Kikuchi Y et al. PDGFRα-positive cells in bonemarrow are mobilized by high mobility group box
1 (HMGB1) to regenerate injured epithelia. ProcNatl Acad Sci USA 2011; 108: 6609–6614.
4） Iinuma S, Aikawa E, Tamai K, Fujita R, Kikuchi
Y, Chino T et al. Transplanted bone marrowderived circulating PDGFRα+ cells restore type
VII collagen in recessive dystrophic epidermolysis
bullosa mouse skin graft. J Immunol 2015; 194:1996–2003.
5） Javaherian K, Liu JF, Wang JC. Nonhistone proteins HMG1 and HMG2 change the DNA helicalstructure. Science 1978; 199: 1345–1346.
6） Baxevanis AD, Landsman D. The HMG-1 box protein family: classification and functional relationships. Nucleic Acids Res 1995; 23: 1604–1613.
7） Lange SS, Mitchell DL, Vasquez KM. High mobility
group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage. Proc Natl
Acad Sci USA 2008; 105: 10320–10325.
8） Bianchi ME, Manfredi AA. High-mobility group骨髄間葉系幹細胞と損傷組織のクロストーク

box 1 (HMGB1) protein at the crossroads between
innate and adaptive immunity. Immunol Rev 2007;
220: 35–46.
9） Yanai H, Ban T, Wang Z, Choi MK, Kawamura T,
Negishi H et al. HMGB proteins function as universal sentinels for nucleic-acid mediated innate
immune responses. Nature 2009; 462: 99–103.
10） Chen GY, Tang J, Zheng P, Liu Y. CD24 andSiglec-10 selectively repress tissue damage-345induced immune responses. Science 2009; 323:1722–1725.

著者連絡先：玉井 克人〒 565-0871 大阪府吹田市山田丘 2-2
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