評価報告書

ヒト表皮モデルを用いた皮膚腐食性試験代替法

皮膚腐食性試験資料編纂委員会

令和 3 年（2021 年）12 月 7 日

17

皮膚腐食性試験資料編纂委員会

髙橋

祐次 （委員長：国立医薬品食品衛生研究所 毒性部）

中村るりこ （独立行政法人 製品評価技術基盤機構
山城
小島

朋子 （株式会社資生堂

品質・安全性評価室／日本化学工業協会）

肇 （国立医薬品食品衛生研究所 安全性予測評価部）

28

化学物質管理センター）

List of Abbreviations（（略語一覧）
ANOVA：

Analysis of Variance Software（分散分析）

ESAC:

ECVAM Scientific Advisory Committee（ECVAM 科学諮問会議）

EURL ECVAM: European Union Reference Laboratory for alternatives to animal testing（欧州代替法評価センター）
GHS：

Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals（化学品の分類および表示に関する世界調和システム）

ICCVAM：

Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods（米国の代替法に関する省庁間連絡会議）

JaCVAM：

Japanese Center for the Validation of Alternative Methods（日本動物実験代替法評価センター）

MTT：

3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium BromideOECD：

Organisation for Economic Co-operation and Development（経済協力開発機構）

OD：

Optical densities（吸光度）PBS：

Phosphate buffered saline（リン酸緩衝液）

SCT：

Skin Corrosive Test（皮膚腐食性試験）

SDS：

Sodium dodecylsulphate

TER：

Transcutaneous electrical resistance assay（経皮電気抵抗性試験）

TG：

Test Guideline（試験法ガイドライン）

UN：

United Nations（国際連合）

4
9

要旨
ウサギを用いる皮膚腐食性試験の動物実験代替法（以下、代替法と記す）として、経済協力開発機構（OECD: Organisation for Economic Co-operation and Development）にて試験法ガイドライン（TG: Test Guideline）431 として承認されたヒト表皮モデルを用いる試験法の有用性を評価した。当該 TG は 2019 年の改定において、LabCyte EPI-MODEL24 が追加されたことから、他のヒト表皮モデルと信頼性と妥当性という視点において、比較、評価した結果、
TG431 に掲載されているモデルの中で、EpiSkin™、EpiDerm™と同様に、LabCyte EPIMODEL24 が腐食性の有無を評価できるモデルとして推奨できると考えられた。また、国際連合化学品の分類および表示に関する世界調和システム（UN GHS: United Nations Globally
Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals）分類の細区分を考慮した評価においても、LabCyte EPI-MODEL24 SCT（Skin Corrosive Test）は、EpiSkin™、EpiDerm™ SCT と同様に評価できる試験法である。当該モデルは、日本国内で製造されていることから、海外生産のモデルに比較してコスト、入手が容易である点で有用であると考えられた。

510

1. 試験法の科学的および規制面からの妥当性
皮膚腐食性試験は皮膚刺激性試験の一環として行われ、種々のガイドラインでは Draize
らにより提唱されたウサギを用いる方法が推奨されてきた 1)。この方法は被験物質の刺激性や腐食性を検出する試験として長く使用されてきたものの、判定を肉眼で行うため客観性に乏しく実験間や施設間での再現性が乏しい。更に動物に激しい痛みとストレスを与えることが社会的に問題となり、以前より動物を使用しない動物実験代替法（以下、代替法と記す）の開発が切望されていた。
この代替法として、経済協力開発機構（OECD: Organisation for Economic Co-operation andDevelopment）で試験法ガイドライン（TG: Test Guideline）431 には、皮膚腐食性試験として角質層を有し 3 次元的に再構築されたヒト表皮モデルを使用した評価方法が記載されている 2)。
この試験法は、腐食性物質が角質層の傷害または角質層に吸収された後拡散することにより、下層の細胞に到達して細胞毒性を示すという仮説に基づき、被験物質曝露後の細胞生存率を指標に皮膚腐食性を評価している。EpiSkin™や EpiDerm™等のヒト表皮モデルは欧米では既にバリデーション研究が実施され、欧州では化学物質の皮膚腐食性評価を目的として承認され、化学物質のリスク表示識別等に利用されていることや、昨今、国際連合 「化学品の分類および表示に関する世界調和システム（UN GHS: United Nations Globally Harmonized
System of Classification and Labelling of Chemicals）」 分類に従って評価されるケースが増えていることから、我が国においても腐食性試験の代替法として TG431 の 2016 年改訂版 3)について、JaCVAM 皮膚腐食性試験資料編纂委員会が信頼性と妥当性という視点から評価を行った。その結果、EpiSkin™、EpiDerm™、SkinEthics™および epiCS®が被験物質の皮膚腐食性を評価する試験法として推奨できるモデルであり、UN GHS 分類の細区分を考慮する場合
は EpiSkin™がもっとも有用であるとした評価報告書を作成した 4)。これはその後、JaCVAM
評価会議においても評価され、適用範囲を十分に配慮した上で使用されるべきであるとされた 4)。
さらに、UN GHS の最新の改訂版である 8 版（2019 年発行）5) においては、皮膚腐食性／刺激性の評価に対し、TG430、431 または 435 に従って実施された試験について一定の判定基準が設けられ、これらが腐食性区分 1（場合によっては細区分にも）に適用可能であることが示されたことから、代替法の行政利用の加速化が期待されているところである。
本評価書では、OECD TG431 の 2019 年改訂版 6) で新たに追加掲載されたヒト表皮モデル
LabCyte EPI-MODEL24 SCT（Skin Corrosive Test）についての腐食性試験法としての有用性を評価した。なお、本評価方法を用いる際の利便性を考慮して、既に評価済みである EpiSkin ™
および EpiDerm™ SCT を用いる腐食性試験法の情報についても併記した。

611

2. 試験プロトコル構成の妥当性
被験物質が角質層を通過して表皮細胞に曝露され、MTT〔3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5Diphenyltetrazolium Bromide〕の還元量から求めた細胞生存率の割合から皮膚腐食性を判定する。それらの概要を表１にまとめた。被験物質としては、液体、粘性物、半固体、固体、ロ
ウ様物、粘着性物質を対象にしている。実験操作上の違いは、前培養法および染色液の用量、組織からの抽出法等であり、基本的な曝露時間と判定基準については表 2 を参照されたい。
試験プロトコルとして、EpiSkin™、EpiDerm™ SCT および LabCyte EPI-MODEL24 SCT を例に説明する 6)。

1）EpiSkin™
12well プレートの各 well に培養液 2 mL を加えた後にヒト表皮モデルを置き、被験物質が液状の場合はピペッターで 50 µL 適用、粉末など固形の場合は 20mg を 100µL の NaCl 溶液（9 g/L）と合わせて適用する。被験物質を 3 分間、60 分間、および 240 分間曝露後、25 mLの PBS で被験物質を洗い流す。洗浄後、ペーパータオル等の上にて水分を切るか、表皮の破損に注意しながらピペッターを用い表面に残った PBS を吸い取った後、MTT 色素を含む培養液（0.3 mg/mL）を表皮モデルの下方に 2 mL 添加する。37℃、CO2 インキュベータ中に
180 分間培養した後、以下の手順にて抽出を行う。MTT 色素を含む培養液を除去後、パン
チ生検（biopsy punch）を用いて表皮モデルをくり抜き、酸性化イソプロパノール 0.5 mL 添加
したガラスチューブに浸漬し、一晩室温放置する。96 well プレートに抽出液を 200 µL ずつ
移し、マイクロプレートリーダーを用いて 545 nm-594 nm の領域での吸光度を測定する。酸性化イソプロパノールのみを加えた well をブランクとし、実測値とブランク値の差を求める。陰性対照である 240 分間曝露の NaCl 溶液（9 g/L）の吸光度を 100％とし、各検体の 3 分間、60 分間および 240 分間曝露時の吸光度を％として算出し細胞の生存率とする。
3 分間曝露したときの生存率が 35％未満を示す物質は“腐食性”と判定する。一方、240 分
間曝露したときに 35％以上の結果を示す物質は“非腐食性”と判定する。さらに、腐食性の区分として、3 分間処理したときの生存率が 35%未満の場合は区分１A とし、3 分間曝露したときの生存率が 35％以上で、かつ 60 分間曝露したときの生存率が 35％未満の結果を示
す物質、あるいは 60 分間曝露したときの生存率が 35％以上で、かつ 240 分間処理したときの生存率が 35％未満の結果を示す物質は、区分 1B/C とする。
2）EpiDerm™ SCT
6 well プレートの各 well に培養液 1 mL を加えた後にヒト表皮モデルを置き、被験物質が液状の場合はピペッターで 50 µL、粉末など固形の場合は 25 mg を 25 µL の水と合わせ、モデル上層に適用する 。被験物質を 3 分間および 60 分間曝露後、プレートから被験物質をデカンテーションにより除去した後、一定の弱流の PBS を用いて 20 回程度洗浄を行う。洗7
12

浄後、ペーパータオル等で水分を切り、破損に注意しながら新たな 24 well プレートに表皮モデルを移動する。MTT 色素を含む培養液（1.0 mg/mL）をヒト表皮モデルの下方に 0.3 mL添加する。37℃、CO2 インキュベータ中に 180 分間培養した後、MTT 色素を含む培養液を吸引し PBS を添加、吸引を 2 回程度繰り返すことで、余剰な色素を取り除く。インサートにイソプロパノールを 2 mL 添加し、一晩室温放置後、96 well プレートに抽出液を 200 µL
ずつ移し、マイクロプレートリーダーを用いて 540 nm あるいは 570 nm の領域での吸光度を測定する。イソプロパノールのみを加えた well をブランクとし、実測値とブランク値の差を求める。陰性対照である水の吸光度を 100％とし、各検体の 3 分間または 60 分間曝露
時の吸光度を％として算出し細胞の生存率とする。
3 分間曝露したときの生存率が 50％未満、あるいは 3 分間では生存率が 50％以上である
が 60 分間曝露したときに 15％未満の結果を示す物質を“腐食性”と判定する。一方、3 分間曝露したときに生存率が 50％以上で、かつ 60 分間曝露したときに 15％以上の物質は“非腐食性”と判定する。さらに、腐食性の区分として、3 分間曝露したときの生存率が 25%未満の場合は、区分１A、25%以上の場合は区分１B/C とする。

3）LabCyte EPI-MODEL24 SCT
24well プレートの各 well に培養液 0.5 mL を加えヒト表皮モデルを置き、被験物質が液状の場合はピペッターで 50 µL、粉末など固形の場合は 50 mg を 50 µL の水と合わせ、モデル上層に適用する 。被験物質を 3 分間および 60 分間曝露後、培養カップをピンセットで取り出し、タッピングすることで被験物質を除去した後、一定の強流の PBS を用いて 10 回程
度洗浄を行う。洗浄後、滅菌綿棒を用いて水分を取り除き、MTT 色素を含む培養液（0.5 mg/ml）
が 0.5 mL 入った新たなプレートにインサートを移動する。37℃、CO2 インキュベータ中に
180 分間培養した後、以下の手順にて抽出を行う。培養表皮をピンセットで取り出し、イソ
プロパノール 300 µL の入ったマイクロチューブに浸漬し、一晩冷暗所に放置後、96 well プレートに抽出液を 200 µL ずつ移す。マイクロプレートリーダーを用いて 570 nm および 650 nmの領域での吸光度を測定し、吸光度（570 nm）から吸光度（650 nm）を差し引いた値を測定値とする。イソプロパノールのみを加えた well をブランクとし、実測値とブランク値の差を求める。溶媒対照の水の吸光度を 100％とし各検体の 3 分間または 60 分間曝露時の吸光度を％として算出し細胞の生存率とする。
3 分間曝露したときの生存率が 50％未満、あるいは 3 分間では生存率が 50％以上である
が 60 分間曝露したときに 15％未満の結果を示す物質を“腐食性”と判定する。一方、3 分間処理したときに生存率が 50％以上、かつ 60 分間曝露したときに 15％以上の物質は“非腐食性”と判定する。さらに、腐食性の区分として、3 分間曝露したときの生存率が 15%未満の場合は、区分１A、15%以上の場合は区分１B/C とする。

8
13

14

曝露時間毎に 2 つ以上

液体および粘性物：50±3 µL(131.6µL/cm 2)

組織数

使用量と適用曝露時間毎に 2～3 つ

0.63 cm

2

EpiDerm™SCTを上に乗せる。

9

約 8 mm のフラットなディスク様の片ロウ様物：15 µL の水で湿らせた直径

液体：ナイロンメッシュを用いる場
合も用いない場合でも、50 µL (79.4µL/cm2)2
固体：20±2 mg (52.6 mg/cm )+ N
被験物質とナイロンメッシュとの親
塩化ナトリウム溶液(9 g/L）100 ±5 和性は予試験で確認する。
µL
半固体：50 µL (79.4 µL/cm2)
ロウ様/粘着性物質：ナイロンメッ
シュを用いて 50±2 mg (131.6
固体：25 mg (39.7 mg/cm2)＋25 µL の2
mg/cm )
水(必要であればそれ以上)

0.38cm2

EpiSkin™

モデル表面積テスト方法 要素

で示した数字は、ばらつきの許容範囲を示す。
±で

一部改 6)）

体および粘性物として処理する。

ロウ様物：容積式ピペットを用い、液固体：50±2 mg (166.7 mg/cm2)+50µLの水

液体および粘性物：50 µL(166.7µL/cm 2)

曝露時間毎に 2 つ以上

0.3cm2

LabCyte EPI-MODEL24 SCT

表１．皮膚腐食性試験のために確認された RhE 試験方法からなる主な試験方法（OECD TG431 補遺 2

15

曝露時間毎に曝露時間毎に

50 µL の水
曝露時間毎にPBS の一定の強流で 10 回以上のみ検討

露時のみで検討10

曝露時のみで検討

50 µL の氷酢酸で 240 分間曝露時 8 N 水酸化カリウム 50 µL で 60 分間曝 8N 水酸化カリウム 50 µL で 60 分間

50 µL の水

50 µL の NaCl 溶液（9g/L)

陰性対照

陽性対照

PBS を一定した弱流で 20 回

PBS 25 mL(すすぎ一回毎に 2 mL)

室温（18-28℃）で 3 分間、60 分間 室温で 3 分間、および 37℃、CO2 濃度 室温で 3 分間、および 37℃、CO2 濃度(±5 分間)および 240 分間（±10 分
5％、湿度 95％で 60 分間
5％、湿度 95％で 60 分間間）

PBS によるすすぎ

曝露時間と温度

着色障害の事前確認

10 µL(液体)もしくは 10 mg(固体)に 50 µL(液体)もしくは 25 mg(固体)に 300 50 µL(液体)もしくは 50 mg(固体)に90 µL の水を加えて室温で 15 分間 µL の水を加えて 37℃、CO2 濃度 5％、 500 µL の水を加えて 37°C、CO2 濃度
攪拌する。
湿度 95％で 60 分間攪拌する。
5%、湿度 95% で 60 分間攪拌する→溶液が着色した場合、MTT のみ →溶液が着色した場合、MTT のみを加 →溶液が着色した場合、MTT のみを加を加えない対照をとる。
えない対照をとる。
えない対照をとる。

EpiSkin™
EpiDerm™SCT
LabCyte EPI-MODEL24 SCT
50µL(液体)もしくは
25mg(固体)に
150µL（液体）もしくは 50 mg（固体）+50µL(液体)もしくは
20mg(固体)に
直接 MTT 還元性の事前
0.3 mg/mL MTT 溶液 2 mL を加え mg/mL MTT 溶液 1 mL を加えて、 0.5 mg/mL の MTT 溶液 500µL を加え
確認て、37℃、CO2 濃度 5％、湿度 95％ 37℃、CO2 濃度 5％、湿度 95％で 60 て 37°C、CO2 濃度 5%、湿度 95%でで 180±5 分間培養
分間培養
60 分間培養→溶液の色が青/紫に変わった場合、→溶液の色が青/紫に変わった場 →溶液の色が青/紫に変わった場合、凍凍結処理でモデル構成細胞を死滅さ
合、水処理でモデル構成細胞を死 結処理でモデル構成細胞を死滅させせたものに被験物質を処置する対照
滅させたものに被験物質を処置 たものに被験物質を処置する対照も もとる。
する対照もとる。
とる。

テスト方法 要素16
570nm (もしくは 540nm)
1％Triton X-100 で処理
4.08 時間≦ET50≦8.7 時間

570nm (545-595nm)

SDS で 18 時間処理

1.0 mg/mL≦IC50≦3.0 mg/mL

組織の品質確認

標準フィルターなしで標準フィルターなしでOD 測定条件

120 分間11

温で振とうした状態で（約 120rpm）

遮光し、室温で一晩抽出時間および温度
室温で振とうせずに一晩、もしくは室（分離組織を完全に浸漬）(インサート全体から抽出）(分離した組織を十分に浸漬）

300 µL のイソプロパノール

2 mL のイソプロパノール

500 µL の酸性化イソプロパノー
ル(0.04 N 塩酸を含むイソプロパノ
ール)

抽出溶媒

および温度

37℃、CO2 濃度 5％、湿度 95％で 180
分間

37℃、CO2 濃度 5％、湿度 95％で180 分間(±15 分間)

MTT 溶液での培養時間

1.4 mg/mL ≤ IC50 ≤ 4.0 mg/mL

SDS で 18 時間処理：

650 nm の標準フィルターにより 570 nm

遮光し、冷暗所で一晩分間（±15 分間）

37°C、CO2 濃度 5%、湿度 95% で 180

500 µL (0.5 mg/mL)

300 µL (1 mg/mL)

2 mL (0.3 mg/mL)

LabCyte EPI-MODEL24 SCT

MTT 溶液EpiDerm™SCT

EpiSkin™

テスト方法 要素

17

は2回た時は 2 回

30％を超えないこと。

の複製組織間の生存率の差は

1. 陰性対照(塩化ナトリウム溶液)で処理された複製組織の OD 値の平均は、いずれの曝露時間についても 0.6 以上 1.5 以下であること。
2. 陽性対照(氷酢酸)に 240 分間曝露された複製組織の生存率の平均値を、陰性対照に対する割合（％）で表した場合、20％以下であること。

1. 陰性対照(水)で処理された複製組
織の OD 値の平均は、全ての曝露時間において 0.8 以上 2.8 以下であること。
2. 陽性対照（8N 水酸化カリウム）に
60 分間曝露された複製組織の生存率の平均値陰性対照に対する割合（％）で表した場合、15％以下であること。
3. 生存率が 20-100％の場合におい3. 生存率の幅が 20~100％の範囲、 て、複製組織間の変動係数(CV）は30％を超えないこと。
かつ OD が 0.3 以上の場合、2 つ

1 回、明確な結果が得られなかった時

1 回、明確な結果が得られなかっ試験回数

適合判定基準EpiDerm™SCT

EpiSkin™

テスト方法 要素1. 陰性対照（水）で処理した複製組織の OD 値の平均は、いずれの曝露時間についても 0.7 以上 2.5 以下であること。
2. 陽性対照（8N 水酸化カリウム）に
60 分間曝露された複製組織の生存率の平均値陰性対照に対する割合（％）で表した場合、15％以下であること。
3. 生存率が 20～100％の範囲、かつOD が 0.3 以上の場合、2 つの複製
組織間の生存率の差は 30％を超え
ないこと。

は2回

1 回、明確な結果が得られなかった時

LabCyte EPI-MODEL24 SCT

表 2-1. EpiSkin™ の予測モデル

3 分間、60 分間および 240 分間曝露後の生存率

予測性の評価腐食性・UN GHS 細区分

3 分間曝露後の生存率が 35％未満

1A＊

3 分間曝露後の生存率が 35％以上で、かつ 60 分間曝露後の生存率が 35％未満の場合、もしくは 60 分間曝露後の生存率

腐食性・UN GHS 細区分 1B あるいは 1Cが 35％以上で、かつ 240 分間曝露後の生存率が 35％未満
240 分間曝露後の生存率が 35％以上

非腐食性*) 腐食性の細区分における RhE 試験法の有用性を評価するために作成したデータによると、EpiSkinTM 試験法により区分 1Aに分類された物質／混合物の約 22%が、実際には区分 1B または 1C に属するものである可能性がある（すなわち、過大評価）。

表 2-2. EpiDerm™SCT の予測モデル

3 分間および 60 分間曝露後の生存率予測性の評価段階 1
3 分間曝露後の生存率が 50％未満

腐食性

3 分間曝露後の生存率が 50％以上で、かつ 60 分間曝露後の生存率が 15％未満

腐食性

3 分間曝露後の生存率が 50％以上で、かつ 60 分間曝露後の生存率が 15％以上

非腐食性

段階 2

段階 1 で腐食性と判断された物質／混合物

3 分間曝露後の生存率が 25％未満
3 分間曝露後の生存率が 25％以上

UN GHS 細区分

1A＊

UN GHS 細区分 1B あるいは 1C*) 腐食性の細区分における RhE 試験法の有用性を評価するために作成したデータによると、EpiDerm™SCT により区分 1Aに分類された物質／混合物の約 29％実際には区分 1B または 1C に属するものである可能性がある（すなわち、過大評
価）。

18

13

表 2-3. LabCyte EPI-MODEL24 SCT 予測モデル
3 分間および 60 分間曝露後の生存率予測性の評価段階 1
3 分間曝露後の生存率が 50％未満

腐食性

3 分間曝露後の生存率が 50％以上で、腐食性

かつ 60 分間曝露後の生存率が 15％未満
3 分間曝露後の生存率が 50％以上で、非腐食性

かつ 60 分間曝露後の生存率が 15％以上
段階 2

段階 1 で腐食性と判断された物質／混合物

3 分間曝露後の生存率が 15％未満
3 分間曝露後の生存率が 15％以上

UN GHS 細区分

1A＊

UN GHS 細区分 1B あるいは 1C*）細区分を裏付けるため、RhE 試験法の有用性評価の観点から生成されたデータによると、LabCyte EPI-MODEL24 SCT 試
験法での細区分 1A の結果 30%は、実際には細区分 1B または細区分 1C の物質／混合物（すなわち、過大分類）からなる可能性があると示された。

3．
．開発および評価に使われた物質の分類、選択理由の妥当性、in vitroおおよび参照データの有無
LabCyte EPI-MODEL24 SCT の再現性は、TG431 性能標準に定められた 30 被験物質により調べられている 7)。EpiSkin™との再現性は、60 の被験物質により調べられている 8)。EpiDerm™ SCT の再現性は、24 の被験物質により調べられている 9)。さらに、EpiSkin™と EpiDerm™ SCT の予測性
が 80 被験物質で調べられていて 10)、LabCyte EPI-MODEL24 SCT においては 79 被験物質で調べられている 11)。評価に使用された被験物質の多くは欧州代替法評価センター（EURL ECVAM：
European Union Reference Laboratory for alternatives to animal testing）主導の皮膚腐食性試験バリデー
ション研究で使用された物質である。

．試験法の正確性（再現性）
4．
LabCyte EPI-MODEL24 SCT においては、TG431 の性能標準に定められた 30 の被験物質を用いた 3 施設での 3 回の実験において、3 施設とも一致しなかった物質や偽陰性物質はなく、施設内再現性は 90％以上（表 3）、および施設間再現性 83.3％（表 4）と性能標準に定められた基準内（施設内一致率：80％、施設間一致率：70％）であった。
EpiSkin™においては、60 物質を用いた 3 施設での 2-way の ANOVA 解析を用い、施設内および施設間の変動については、それらの間に有意な差はないと判断された 8)。60 物質（27 腐食性物質
および 33 非腐食性物質）のうち、42 物質は 3 施設とも施設内および施設間再現性が良好であった。残る 18 物質ではいずれかの結果が異なっていたが、EURL ECVAM は本試験法の信頼性と再現性は高いと判断した 12) 。この結論は、 ECVAM 科学諮問会議（ESAC: ECVAM Scientific
Advisory Committee ） お よ び 米 国 の 代 替 法 に 関 す る 省 庁 間 連 絡 会 議 （ ICCVAM ： Interagency
14

19

Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods）13) での評価においても確認された。
EpiDerm™ SCT においては、24 物質を用いた 3 施設での 2 回の実験において、21 物質の腐食性を 3 施設すべてで正しく予測できた 9)。EURL ECVAM は本試験法の信頼性と再現性は高いと判断した。この結論は、ESAC の評価後 14)、ICCVAM においても確認された 13)。

表 3. LabCyte EPI-MODEL24 SCT の施設内再現性結果

2015

表 4. LabCyte EPI-MODEL24 SCT の施設間再現性結果

施設間再現性 83.3％（25/30）

1621

5. 試験法の信頼性 7, 10, 15)
LabCyte EPI-MODEL24 SCT の 3 施設における細区分の予測性を表 5 にまとめた。3 施設の予測性はほぼ同等であったが、1-B および 1-C を 1-A とする場合は多く、正確に評価できた値は表 5に示す LabCyte EPI-MODEL24 requirement の基準である 55%を 43.3％と下回った。一致しなかった物質は（表 3 または表 4 の No.9、12、16～20）であった。非腐食性物質を 1-A とする結果（表 3または表 4 の No.9）から、5%の上記基準を上回り、平均 6.7％であった。
なお、LabCyte EPI-MODEL24 SCT を含む既存のモデルとの比較として、細区分の予測性を表 6にまとめた。79 物質を 2、3 回実験して得られた値を見る限り、いずれの値も基準を満たしており、モデル間の予測性にほとんど差はなかった。
これらモデルは MTT 還元物質への対応方法も TG4316) に記載されている。適用できない物質
としてはガス、エアロゾールのみが記載されている（バリデーション未実施）。これらモデルは物
理状態（液体・固体等）および水溶性の有無にかかわらず適用可能であり、ガス、エアロゾールを除く混合物でも適用可能とされている。なお、特定の種類の物質や混合物においてこれらモデルの適用性を否定するような明確な根拠が得られた場合には、適用範囲から除外するべきであるとされている。

表 5. OECD で集計した全セットの化学物質を用いた予測性の計算結果（細区分：UN GHS 区分 1A、、1B/1C、、 非 腐 食性 ）Specificity (C vs NC)

2217

表 6. OECD で集計した全セットの 79 化学物質を用いた予測性の計算結果（細区分：UN GHS 区分 1A、、1B/1C、、非腐食性）

EpiSkin™

EpiDerm™

LabCyte EPI-

Criteria

Sensitivity (for predictions C

98.5%

100%

100%

≥ 95%

Correctly classified 1A

83.3%

83.3%

86.1%

≥ 80%

1A underclassified NC

0%

0%

0%

0%

1B-and-1C overclassified 1A

21.5%

29.0%

vs. NC)

1A underclassified 1B-and-1C
Correctly classified 1B-and-1C

16.7%

76.3%

SCT

16.7%

≥ 55%

0%

0%

≤ 5%

NC overclassified 1A

0%

2.7%

Accuracy (C vs. NC)

89.6%

87.9%

NC overclassified 1B-and-1C
Accuracy (1A vs. 1B-and-1Cvs. NC)

20.7%

78.8%

≤ 20%

70.0%

2.2%

79.3%

13.9%

requirements

71.0%

1B-and-1C underclassified NC
Specificity (C vs NC)

MODEL24 SCT

30.0%

73.9%

78.4%

23.4%

18.9%

74.2%

2.7%

89.9%

76.4%

≤ 45%
≥ 70%
≤ 5%

≤ 30%

≥ 87%

≥ 72%

6. 他の科学的な報告との比較の有無
OECD の腐食性試験代替法ガイドラインとして、TG431 の他に 「TG430 TER（Transcutaneous
Electrical Resistance）Test Methods: 経皮電気抵抗試験」16) および 「TG435 In Vitro Membrane Barrier
Test Method for Skin Corrosion: in vitro 膜バリア試験」17) が承認されている。これらはいずれも EURLECVAM にてバリデーション研究が実施され、ICCVAM はこれらの試験法（Rat Skin TER, EpiSkin™、
EpiDerm™ SCT および Corrositex®）の正確度、感度および特異度について比較している（表 7）10, 13)。
これらの比較においては同じ物質を用いて評価されておらず、試験物質の数量や選択物質の種類が異なっているため、結果の数値だけをもって単純にヒト表皮モデルの優越性を比較評価する
ことは困難であるが、いずれの試験法も同等の予測性を有すると思われる。 LabCyte EPIMODEL24 SCT は EpiSkin™並びに EpiDerm™ SCT と比較されており、ヒト皮膚三次元モデルとしては十分な予測性を有していると考えられる。

18

23

表 7．
．試験法の比較結果 18)
TER

EpiSkin™

EpiDerm™
SCT

LabCyte EPI-

Corrositex

物質数

122

79*

79*

MODEL24 SCT

79

163

正確度

81%

89.6%

87.9%

89.9%

79%

感度

94%

98.5%

100%

100%

85%

特異度

71%

79.3%

73.9%

78.4%

72%

*:OECD EWG によって選択された 80 化学物質から商業的に入手不可の 1 化合物を除外
7. 3Rs 原則との関係（動物福祉面からの妥当性）
LabCyte EPI-MODEL24 SCT は他の表皮モデルと同様に動物を使用しておらず、動物福祉面から代替法として妥当である。

8. 試験法の有用性と限界（コスト、時間からの妥当性など）
化学物質の皮膚腐食性は、その物理化学的性質に強く依存したものであり、強い酸性（pH 2.0 以下）またはアルカリ性（pH 11.5 以上）物質は、強い局所作用を有する可能性が高いことから、皮膚腐食性と判断しても良いことになっている 19)。しかしながら、これは腐食性についての情報が他にない場合に行われるワーストケースとしての判断であり、例えば酸や塩基の添加により pH が変わり易い物質や混合物の場合は偽陽性の判断となる可能性も考えられる 20)。このため、このよ
うな物質に対して動物を用いる必要のない TG431 で皮膚腐食性を評価することは有用である。
各試験実施施設で本モデルを導入する際には、正しく評価できることを予め確認する必要がある。TG431 には、習熟度確認物質を正しく分類できるか否か試験することにより、専門技術の習熟について確認することができるとの記載がある（表 8）。
LabCyte EPI-MODEL24 は、日本国内で製造されていることから海外で開発された製品に比較して入手が容易であり、試験計画への柔軟な対応が可能になると考えられる。例えば、EpiDerm™
が 2 回／月の発送であるのに対し LabCyte EPI-MODEL24 は 1 回／週、モデルの入手コストは
EpiDerm™の約半分である。

24

19

表 8．
．習熟度確認物質

化学物質 1

OECD Test Guideline No 431 Table 16) 一部改

CASRN

化学物質
分類

UN GHSVRM(in vivo 試験) (in vitro 試験) 物理的
による
による
状態
区分
区分

区分 1A の in vivo 腐食性物質
79-08-3

有機酸

1A

1A

固体

13319-75-0

無機酸

1A

1A

液体

フェノール

108-95-2フェノール類

1A

1A

固体

ジクロロアセチ
ルクロリド

79-36-7

求電子剤

1A

1A

液体

ブロモ酢酸
3 フッ化ボロン
二水和物

区分 1B/1C の in vivo 腐食性物質
グリオキシル酸一水和物

563-96-2

有機酸

1B/1C

1B/1C

固体

乳酸

598-82-3

有機酸

1B/1C

1B/1C

液体

エタノールアミン

141-43-5

有機塩基

1B

1B/1C

粘稠性

塩酸（14.4%）

7647-01-0

無機酸

1B/1C

1B/1C

液体

in vivo 非腐食性物質
臭化フェネチル
4-アミノ-1,2,4トリアゾール
4-（メチルチオ）ベンズアルデヒド
ラウリン酸

103-63-9

求電子剤

NC

NC

液体

584-13-4

有機塩基

NC

NC

固体

3446-89-7

求電子剤

NC

NC

液体

143-07-7

有機酸

NC

NC

固体

＜略語＞
CASRN：CAS 登録番号UN GHS：国際連合「化学品の分類および表示に関する世界調和システム」
VRM：バリデーション済み標準試験法
NC：非腐食性

2025

9. その他
前回の皮膚腐食性試験代替法の評価後 4)、現在までの間に、UN GHS 専門家小委員会において、
動物実験代替法の導入に関する議論が進み、UN GHS の最新の改訂版である 8 版（2019 年発行）5)では、第 3.2 章 皮膚腐食性／刺激性に 「3.2.2.3 in vitro（試験管内）/ex vivo（生体外）のデータに基づく分類」 という項目が新たに追記された（Annex 1 参照）。
UN 文書においては商標登録された情報を記述することができないため、具体的なヒト表皮モ
デル名はないものの、それらの区分／細区分への判定基準が明記された。
これらが掲載された背景には JaCVAM をはじめ、EURL ECVAM や ICCVAM といった組織による動物実験代替法の検証結果が貢献するところが大きいと考えられる。

10. 結論
LabCyte EPI-MODEL24 を信頼性と妥当性という視点において評価した結果、他のヒト表皮モデ
ルを用いた皮膚腐食性試験（EpiSkin™、EpiDerm™ SCT）と同様に、被験物質の皮膚腐食性を評価する試験法として推奨できるモデルであると結論された。UN GHS 細区分を考慮した評価においても、LabCyte EPI-MODEL24 SCT は、EpiSkin™、EpiDerm™ SCT と同様に皮膚腐食性を評価できる試験法である。

26

21

11．
．参考文献
1)

OECD, Guideline for the testing of chemicals. 404, Acute Dermal Irritation/Corrosion 2015.

2)

OECD, Guideline for the testing of chemicals. 431, In Vitro Skin Corrosion: Human skin model test.
2004.

3)

OECD, Guideline for the testing of chemicals. 431, In Vitro Skin Corrosion: Human skin model test.
2016.

4)

JaCVAM 資料編纂委員会, 皮膚腐食性試験代替法

5)

GHS 関係省庁連絡会議仮訳, 化学品の分類および表示に関する世界調和システム（GHS）改訂
8 版. 化学工業日報社, 東京, 2020.

6)

OECD, Guideline for the testing of chemicals. 431, In Vitro Skin Corrosion: Reconstructed Human
Epidermis (RhE) Test Method. 2019.

7)

OECD, Series on Testing & Assessment No. 219 Performance Standards for the Assessment of
Proposed Similar or Modified In Vitro Reconstructed Human Epidermis (RhE) Test Methods for Skin
Corrosion Testing as Described in TG 431. 2015.

8)

Fentem, J. H. et al.: Toxicology In Vitro, 12: 483-524, 1998.

9)

Liebsch, M. et al.: Alternatives to laboratory animals : ATLA, 28: 371-401, 2000.

ヒト表皮モデル. 2017.

10) OECD, Series on Testing and Assessment No. 190 Summary Document on the Statistical Performanceof Methods in OECD Test Guideline 431 for Sub-Categorisation, in Series on Testing and Assessment.
2013.
11) JaCVAM Validation Management Team, Validation Study for in vitro skin corrosion test method using
reconstructed human epidermal tissue LabCyte EPI-MODEL24. 2019.
12) ECVAM, Statement on the scientific validity of the Episkin test (An in vitro test for skin corrosivity)
1998.
13) ICCVAM, NIH Publication No.02-4502 ICCVAM Evaluation of Episkin™, EpiDerm™ (EPI-200),
and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods forAssessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals 2002.
14) ECVAM, Statement on the Application of the Epidermtm Human Skin Model for Skin Corrosivity
Testing 2000.
15) Desprez, B. et al.: Toxicology In Vitro, 29: 2055-2080, 2015.
16) OECD, Guideline for the testing of chemicals. 430, In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical
Resistance Test Method (TER). 2015.
17) OECD, Guideline for the testing of chemicals. 435, In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin
Corrosion. 2015.
18) JaCVAM, Peer Review Panel Evaluation of the Performance-based Validation Study on the LabCyte
EPI-Model24 in vitro skin corrosion test method as a me-too test method according to OECD GD 219
and falling within the OECD TG 431, 2018.
19) OECD, Series on Testing & Assessment No. 203, Guidance Document on an Integrated Approach on
Testing and Assessment (IATA) for Skin Corrosion and Irritation. 2014.
20) Scheel, J. et al.: Toxicology In Vitro, 25: 1435-1447, 2011.

22

27

ANNEX 1: 化学品の分類および表示に関する世界調和システム（GHS））改訂 8 版より
3.2.2.3

in vitro（（試験管内）/ex vivo（（生体外）のデータに基づく分類

3.2.2.3.1

現在入手できるそれぞれの in vitro/ex vivo 試験方法は皮膚刺激性または皮膚腐食性のどちらかを評価するが、一つの試験で両方の影響は評価しない。従って in vitro/ex vivo 試験結果のみに基づいた分類は二つ以上の方法で得られたデータを必要とするであろう。区分 3 を導入する
所管官庁は、現在入手可能な国際的に検証され受け入れられている in vitro/ex vivo 試験方法では、
区分 3 と分類される物質を識別することはできないことを認識することが重要である。
3.2.2.3.2

可能な限り分類は国際的に検証され受け入れられている in vitro/ex vivo 試験方法を用いて取られたデータに基づくべきであり、これらの試験方法に記載されている分類判定基準が適用される必要がある。試験物質が用いられた試験方法の適用範囲内にある場合にのみ、in vitro/ex
vivo のデータは分類に使用することができる。公表された文献に記載されている追加的な制限も考慮されるべきである。

3.2.2.3.3

皮膚腐食性

3.2.2.3.3.1 OECD TG430、431 または 435 に従って試験が実施された場合、表 3.2.6 の判定基準に基づいて、物質は皮膚腐食性区分 1（また可能であり要求されていれば細区分 1A、1B または 1C）に分類される。
3.2.2.3.3.2 いくつかの in vitro/ex vivo 試験方法では細区分 1B および 1C（表 3.2.6 参照）を区別することはできない。細区分が所管官庁によって要求されており、既存の in vitro/ex vivo データが細区分を区別することができない場合には、これら二つの細区分を区別するための追加的な情報を考慮しなければならない。追加的な情報が無いまたは不十分である場合には、区分 1 が適用される。
3.2.2.3.3.3
3.2.2.3.4

腐食性とは同定されない物質は皮膚刺激性としての分類が検討されるべきである。

皮膚刺激性

3.2.2.3.4.1 腐食性に関する分類が除外され、しかも OECD TG439 に従った試験が実施された
場合には、物質は表 3.2.7 の判定基準に基づいて皮膚刺激性区分 2 としての分類が検討されるべきである。
3.2.2.3.4.2 所管官庁が区分 3 を採用している場合、現在入手可能な皮膚刺激性に関する in vitro/ex
vivo 試験方法（例えば OECD TG439）では、物質を区分 3 に分類することはできないことを認識することが重要である。このような場合、区分 1 または区分 2 に関するどちらの分類判定も実行されない場合、区分 3 または区分に該当しないを区別するために追加的な情報が必要とされる。
3.2.2.3.4.3 所管官庁が区分 3 を採用しない場合、皮膚刺激性に関して国際的に受け入れられ検証されている in vitro/ex vivo 試験、例えば OECD TG439 における陰性結果は皮膚刺激性の区分に28

23

該当しないと結論するために使用することができる。

表 3.2.6.

in vitro/ex vivo 方法に関する皮膚腐食性判定基準（TG431 部分のみ抜粋）
再構築ヒト表皮モデル試験： OECD TG431、区分

附属書 2、方法 1、2、3、4
試験化学品を、ヒトの皮膚の上層部に性質がよく似た 3 次元再構築ヒト表皮（RhE）に局所的に適用する 4 つの方法がある。試験方法は、腐食性化学品
は拡散または浸食により角質層を貫通し、かつ下層の細胞に対して毒性があるという前提に基づく。組織の生存率は、MTT 染料の酵素反応による青色ホ
ルマザン塩への変換を、青色ホルマザン塩を組織から抽出して定量することで評価する。腐食性化学品は、定められた閾値以下の組織の生存率を低下させる能力で決定される。
判定基準は、定義された曝露期間による組織の生存率に基づく。

1

方法 1

方法 2、3、4

3 分間、60 分間また 3 分間曝露後 50％未満；またはは 240 分間曝露後 3 分間曝露後 50％以上かつ 60 分間曝露後 15％未満
35％未満
1A

方法 1

方法 2

方法 3

方法 4

3 分間曝露後 35％未

3 分間曝露後

3 分間曝露後

3 分間曝露後 15％未

満

25％未満

18％未満

満

1B

3 分間曝露後 35％以

3 分間曝露後

3 分間曝露後 3 分間曝露後後 15％

1C

上かつ 60 分間曝露後

25％以上かつ区 18％以上かつ区 以上かつ区分 1 の判

35％未満または 60 分

分 1 の判定基準 分 1 の判定基準 定基準を満足

間曝露後 35％以上か

を満足

を満足

つ 240 分 間 曝 露 後
35％未満
皮膚腐食性と240 分間曝露後 35％は分類されない以上

3 分間曝露後 50％以上、かつ 60 分間曝露後 15％以上

2429