課題番号：28指2401
研究課題名 ：腸内細菌ゲノムデータベース構築から疾患と腸内細菌との関連を解明する研究：Human
Microbiome Cohort Study
主任研究者名 ：永田尚義
分担研究者名 ：秋山徹、永田尚義
キーワード ：腸内細菌、メタゲノム解析、便サンプリング法、便保存法
研究成果：
便採取・保存法に関するプロトコール確立と生菌培養向上を目指した予備研究を行った（論文投稿中）多数の被験者から便試料を簡易的に収集でき、かつ腸内細菌叢の安定性が保証できるような便採取法、保存方法を確立するため予備研究を行った。
大腸内視鏡検査前の下剤直後の便は、病院で回収が可能であり、すぐに冷凍保存できる利点がある。
しかし、下剤による腸内細菌や代謝物質への影響は不明であった。下剤処置のないコントロールの細菌叢の経時変化と下剤投与前後の経時的変化を比較すると、コントロールよりも下剤直後の便はunifrac distance 値は高く菌叢が有意に異なっていた（図 1A）。下剤後、時間の経過と共に菌叢変化はコントロール近づく傾向があったが、28 日後でも下剤の影響が残っている事が分かった。Metabolome
解析でも同様であり、20 種類の代謝物質が下剤直後の便で変化した。以上から、腸管洗浄後直後の便は Microbiome・Metbolome 研究には適さず、便採取は腸管洗浄液内服前に行うことが望ましいと分かった。次に、自宅で排便した場合、便試料は室温保存または冷蔵保存いずれにすべきか？、排便後どのくらいの期間放置できるのか？を検証した。また、生菌の分離にも対応できる可能性のあるCary-Blair（CB）培地における保存法の有効性も検証した。CB 培地は、古くから細菌培養の保存・輸送で使用されてきたが、メタゲノム解析での有効性は証明されていなかった。冷蔵保存の検討（図 1B）：
保存液のない空容器では、コントロール（新鮮便と-80℃保存便の一致度）と比較し 3 日目から有意差を認めた。一方、CB 培地入り容器（青）では 7 日目まで有意差を認めなかった。室温保存の検討では、空容器ではコントロールと比較し、1 日目から有意差を認めたが、CB 培地入り容器では、3 日目から有意差を認めた。以上の結果から、保存液がない容器で便を採取する場合、冷蔵では 1 日、室温では排便当日に解析場所まで持参する必要性が判明した。一方、CB 培地容器は、保存過程による特定の細菌変化を抑制するため空容器と比較し長い保存が可能であり、低コスト（50 円/本）な点も踏まえると多くの施設で利用でき、大規模腸内細菌研究に使用できると考えられた。最後に、CB 培地と RNAlater
保存液において冷凍保存された糞便中の生菌数を調べたところ、好気・嫌気条件ともに CB 培地の方が生菌分離数が高かった（図 1C）。CB 培地は責任細菌種の分離培養ができる可能性があることを示唆しており、無菌マウスへの投与実験にも発展できると考えられた。申請者は、分離培養を想定し、後述する 4,000 例の糞便は、CB 培地の保存に加え、保存液なしでも凍結保存している。
「日本人の腸内・口腔内微生物叢データ構築」を開始しており。現在までに約 3700 例の臨床情報の付随した便試料があり、2,400 例のショットガンシークエンスが終了している。データベースから健常人の腸内細菌を解析したところ、優先属は、Bacteroides、Blautia、Bifidobacterium であった。年齢、性別、様々な食習慣、アルコール摂取が菌種組成に影響を及ぼすことも示した。

Subject No.
：28-2401
Title：The gut microbiome and colorectal disease: A human microbiome cohortstudy
Researchers ：Nagata Naoyoshi, Tohru Miyoshi-Akiyama
Key word：Cary-Blair transport medium; RNAlater; fecal sampling; fecal storage;
bacterial survival rate; microbial diversity; room temperature; liquid nitrogen snap freezing;
freeze–thaw cycle
Abstract：Background: The proper transport and storage of feces is important in microbiome studies.
However, how long fecal samples can withstand a period of refrigeration or room temperature,and the appropriate preservative, are largely unknown. Cary–Blair transport medium has beenused for many years because it is inexpensive (less than US$0.50) and prevents bacterial
overgrowth. However, its effectiveness for metagenomic analyses has never been tested. To
facilitate hospital-based or epidemiological microbiome studies, we determined the effects ofthe storage time, storage temperature, and Cary–Blair medium on the stability of the humangut microbiota.
Methods: Gut microbial compositions were compared using a 16S rRNA sequence analysis
after storage with different methods. The effects of Cary–Blair medium on the microbiota
were also analyzed.
Results: The microbial compositions of samples left at 4 °C for 3 or 7 days or at 25 °C for 1,3, or 7 days differed significantly from the reference sample (−80 °C storage), whereas
samples stored in Cary–Blair remained unchanged for longer periods (7 days at 4 °C and 24 hat 25 °C). The relative abundances of phylum Bacteroidetes and Actinobacteria, and genera
Bacteroides and Bifidobacterium changed significantly at 25 °C, whereas Cary–Blair medium
inhibited the reduction in phylum Bacteroidetes and genera Bacteroides and the increase inphylum Actinobacteria and genera Bifidobacterium. The bacterial survival counts weresignificantly lower in the RNAlater samples than in the Cary–Blair samples under aerobic andanaerobic culture conditions.
Conclusions: Storage time and storage temperature significantly affect the gut microbial
composition in fecal samples. Given the low cost, inhibitory effect on bacterial changes, andpotential utility in bacterial isolation, Cary–Blair medium containers are suitable forlarge-scale or hospital-based microbiome studies, especially if direct freezing at −80 °C isunavailable.

課題番号：28‐2401
研究課題名：腸内細菌ゲノムデータベース構築から疾患と腸内細菌との関連を解明する研究：Human Microbiome Cohort Study
主任研究者名 ：永田尚義 分担研究者名 ：永田尚義、秋山徹
これまでにおこなったこと
1. DNA抽出法の違いによる腸内細菌叢の検討 DNA抽出法の確立 （2016）
2. 保存容器、保存方法による腸内細菌叢の影響 サンプリング法の確立 （2017）
3. 下剤内服による腸内細菌叢の影響 サンプル法の確立 （2017）
4. ショットガンメタゲノム解析による日本人健常人における腸内細菌叢（2017）

多数の被験者から便試料を簡易的に収集でき、かつ腸内細菌叢の安定性が保証できるような便採取法、保存方法を確立するため予備研究を行った。
大腸内視鏡検査前の下剤直後の便は、病院で回収が可能であり、すぐに冷凍保存できる利点がある。しかし、下剤による腸内細菌や代謝物質への影響は不明であった。下剤処置のないコントロールの細菌叢の経時変化と下剤投与前後の経時的変化を比較すると、コントロールよりも下剤直後の便はunifrac distance値は高く菌叢が有意に異なっていた（図1A）。下剤後、時間の経過と共に菌叢変化はコントロール近づく傾向があったが、28日後でも下剤の影響が残っている事が分かった。Metabolome解析でも同様であり、20種類の代謝物質が下剤直後の便で変化した。以上から、腸管洗浄後直後の便はMicrobiome・Metbolome研究には適さず、便採取は腸管洗浄液内服前に行うことが望ましいと分かった。
次に、自宅で排便した場合、便試料は室温保存または冷蔵保存いずれにすべきか？、排便後どのくらいの期間放置できるのか？を検証した。また、生菌の分離にも対応できる可能性のあるCary-Blair（CB）培地における保存法の有効性も検証した。CB培地は、古くから細菌培養の保存・輸送で使用されてきたが、メタゲノム解析での有効性は証明されていなかった。冷蔵保存の検討（図1B）：保存液のない空容器では、コントロール（新鮮便と-80℃保存便の一致度）と比較し3日目から有意差を認めた。一方、CB培地入り容器（青）では7日目まで有意差を認めなかった。室温保存の検討では、空容器ではコントロールと比較し、1日目から有意差を認めたが、CB培地入り容器では、3日目から有意差を認めた。以上の結果から、保存液がない容器で便を採取する場合、冷蔵では1日、室温では排便当日に解析場所まで持参する必要性が判明した。一方、CB培地容器は、保存過程による特定の細菌変化を抑制するため空容器と比較し長い保存が可能であり、低コスト（50円/本）な点も踏まえると多くの施設で利用でき、大規模腸内細菌研究に使用できると考えられた。
最後に、CB培地とRNAlater保存液において冷凍保存された糞便中の生菌数を調べたところ、好気・嫌気条件ともにCB培地の方が生菌分離数が高かった（図1C）。CB培地は責任細菌種の分離培養ができる可能性があることを示唆しており、無菌マウスへの投与実験にも発展できると考えられた。
日本人の腸内・口腔内微生物叢データ構築」を開始しており、現在までに約3,700例の臨床情報の付随した便試料、2,400例のショットガンシークエンスが終了している。
データベースから健常人の腸内細菌を解析したところ、優先属は、Bacteroides、Blautia、Bifidobacteriumであった。服部研から報告された106名の健常人データでは、平均年齢32歳であったが（DNA Res. 2016;23:125）、年齢層が異なる別集団で解析しても、優先属は一致していることを示した。また、年齢、性別、様々な食習慣、アルコール摂取が菌種組成に影響を及ぼすことも示した。

課題番号：28指2401
研究課題名 ：腸内細菌ゲノムデータベース構築から疾患と腸内細菌との関連を解明する研究：HumanMicrobiome Cohort Study（臨床班）
主任研究者名 ：永田尚義
分担研究者名 ：永田尚義
キーワード
研究成果

：腸内細菌、メタゲノム解析、健常日本人腸内細菌叢：

健常日本人の腸内細菌ショットガンメタゲノム解析による予備研究を行った。

「日本人の腸内微生物叢データ構築」を開始してから現在までに約 3,700 例の臨床情報の付随した便試料が存在し、2,400 例のショットガンシークエンスが終了している。
データベースから健常人の腸内細菌を解析したところ、優先属は、Bacteroides、Blautia、Bifidobacterium であった（図 3A）。服部研から報告された 106 名の健常人データでは、平均年齢 32 歳であったが（DNA Res. 2016;23:125）、年齢層が異なる別集団で解析しても、優先属は一致していることを示した。また、年齢、性別、様々な食習慣、アルコール摂取が菌種組成に影響を及ぼすことも示した（図 3B）。
今後
2018 年度は 3000 例のショットガンメタゲノムデータから臨床因子とくに疾患や薬剤使用と腸内微生物叢との関連を明らかにしていく。
ヒト腸内の菌種組成や機能組成は個人間の多様性が高いため、十分な被験者数が必要である。2016 年、ヨーロッパ在住被験者の糞便試料（N=1,135）を用いて、臨床因子と腸内細菌遺伝子との関連が報告されているが（Science 2016;352:565）、1,000 例以上のメタゲノム解析はこの他にはない。本研究では、過去の研究と比較し、症例数も倍以上であり、消化管の内視鏡診断が付随している点、微生物叢に影響を及ぼす抗生剤、抗真菌薬、抗ウイルス薬など詳細な薬剤情報を収集している点、過敏性腸症候群などの消化器症状や便性状の評価をしている点が特色である。一方、大規模メタゲ
ノム解析から薬剤使用と腸内細菌叢変化を検証した報告は国内外をみても皆無である。

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：28-2401

研究課題名： 腸内細菌ゲノムデータベース構築から疾患と腸内細菌との関連を解明する研究：Human Microbiome Cohort Study

主任研究者名：永田尚義
論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

年タイトル

発表者学会名

場所

年月

該当なし

学会発表

遠矢 真理, 西嶋 傑, 永田 尚義, 須田 亙,メタゲノムデータを用いた日本人腸内細菌叢
秋山 徹, 秋山 日本細菌学会と食・生活習慣の関連解析
純一, 大杉 満,上村 直実, 服部 正平

福岡2018年3月

永田尚義,遠矢真理,秋山徹,ショットガンメタゲノム解析による腸内細菌 西嶋傑, 須田
第62回日本人類遺神戸と消化器疾患との関連
亙, 秋山純一、 伝学会
上村直実, 服部正平

2017年11月

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル
腸内細菌大規模データベース化

特許取得状況について

発表者
永田尚義

※出願申請中のものは(発明名称発表先
毎日新聞

場所
新聞誌年月日2016年9月23日)記載のこと。
登録番号

該当なし

※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこ

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国