静電気学会誌，46, 1（2022）14-19

J. Inst. Electrostat. Jpn.

論文

低周波交流電界印加によるタンパク質固定のリアルタイム解析
高橋 俊介 ，侭田 陽平 ，岸 一希＊＊＊大重 真彦＊＊,平賀 諒太 ，＊＊，桂 進司＊＊, ＊＊＊＊＊, ＊＊＊, 1（2021年9月21日受付；2021年11月29日受理）

Real-time Analysis of Protein Immobilization Processby Applying Low-frequency AC Electric Field
＊

＊＊

＊＊

＊＊

Shunsuke TAKAHASHI , Youhei MAMADA , Kazuki KISHI , Ryota HIRAGA ,＊＊, ＊＊＊＊＊, ＊＊＊, 1Masahiko OSHIGEand Shinji KATSURA（Received September 21, 2021; Accepted November 29, 2021）
Here, we report the development of real-time monitoring system for protein immobilization, based on a Quartz Crystal
Microbalance (QCM) device. In our previous report, the protein immobilization was significantly promoted by application oflow frequency AC electric field, however the dynamic process of protein immobilization has not been elucidated sufficiently.
To analyze the process of protein immobilization, the modification processes of the QCM surface were analyzed in real time.
In measurements of immobilization process of His-DsRed and His-GFP by applying a low-frequency AC electric field, themaximum immobilization amount of protein was obtained by applying the 80 Vpp at 20 Hz. As a result of thesemeasurements, we demonstrate that His-DsRed and His-GFP were sufficiently immobilized by applying the low-frequency
AC electric field for first 300 and 400 sec.

1．はじめにパク質の固定化量を増やす必要がある．これまでのタン固相表面へのタンパク質の固定化は，タンパク質アレパク質固定技術では，標的のタンパク質は物理吸着や化イやバイオセンサなどの生体分子計測技術の重要な要素学吸着（共有結合や架橋）によって固定化されてきたとなっている．これらの生体分子計測技術では，固相表これらの固定化技術によって，タンパク質の固定化量を面に固定化されているタンパク質と試料中の目的物質と増加することができるが，固相表面にタンパク質の溶液の相互作用が検出されている．高感度かつ広いダイナミを滴下することで実施されているため，滴下されたタンックレンジの測定を可能にするためには，活性が保たれパク質は配向性が制御されずに固定化されてしまう．そているタンパク質の固相表面の固定化量を増やす必要がの際，固相表面に対してタンパク質の活性部位が固定化ある ．この目標を達成するためには，固相表面へのタンされてしまうと，その結合活性が失われてしまうことか

1）

．

2-5）

ら，標的分子と相互作用するタンパク質の分子数が減っ
キーワード：表面処理，QCM，タンパク質固定，移動現象＊
東京電機大学理工学部理工学科生命科学系（〒350-0394 埼玉県比企郡鳩山町石坂）
Division of Life Science, School of Science andEngineering, Tokyo Denki University, Hatoyama, Hikigun, Saitama 350-0394, Japan＊＊
群馬大学大学院理工学府環境創生部門（〒376-8515 群馬県桐生市天神町 1-5-1）
Department of Environmental Engineering Science,
Graduate School of Science and Technology, Gunma
University, 1-5-1 Tenjin-cho, Kiryu-shi, Gunma 376-8515,
Japan
＊＊＊
群馬大学食健康科学教育研究センター
Gunma University Center for Food Science and Wellness
1
katsura@gunma-u.ac.jp
DOI：https://doi.org/10.34342/iesj.2022.46.1.14

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14てしまい，高い検出感度が得られない原因の１つとなっている．したがって，タンパク質固定化技術を生体分子計測技術として適用するためには，固定化タンパク質の活性を維持するため，配向性を制御しながら，タンパク質を固相表面に効率的に固定化することが重要である

．

6, 7）

これまで筆者らは，固相表面へのタンパク質の配向性を制御する技術として，Ni-NTA（ nickel-nitrilotriacetic acid ）修飾基板と His タグ（6 個程度の連続するヒスチジン残基からなるペプチド）融合タンパク質間の特異的結合に基づいたタンパク質固定化技術を開発してきた．このタン8, 9）

パク質固定化技術を用いることにより，標的タンパク質に融合させた His タグと Ni-NTA との特異的な結合によって，配向性を制御した状態での標的タンパク質の固定

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低周波交流電界印加によるタンパク質固定のリアルタイム解析（高橋 俊介ら）

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図 1 低周波交流電界によるタンパク質分子の輸送モデル
Fig.1 A immobilization model combining electrostatic transport and subsequent molecular diffusionof protein molecules.

化が可能となった．しかし，タンパク質などの生体高分

2．実験方法・手順

子では拡散係数が小さいために単なる分子拡散では固相

2.1 His-DsRed及びHis-GFPの調製

表面への分子輸送速度が低くなり，固定化には長時間のHis-DsRed と His-GFP は既往の研究に従い調製した ．

静置が必要となる．これらの問題を解決するために，静得られた His-DsRed と His-GFP の濃度は，ウシ血清アル電輸送とそれに伴うタンパク質の分子拡散を組合せた新ブミン（ BSA；Bio-Rad，500-0206）を標品としてタンたなタンパク質の固定化技術を開発した ．この技術のパク質アッセイキット（ Bio-Rad，500-0205）を用いて，モデルを以下に示す．低周波交流電界の印加によってタBradford 法10）10）に従って決定した．

11）

ンパク質分子にクーロン力を働かせることで，タンパク2.2 QCMセンサの金薄膜表面への修飾処理

質分子はその極性により基板表面またはその対極に引きQCM センサは水晶振動子表面に付着した物質により寄せられる．その後，極性が反転すると，タンパク質溶発振周波数が減少する性質を利用するセンサであり，液に対して高い濃度勾配が形成される．これよりタンパ

Sauerbrey 式に従って周波数の減少値は付着する物質量ク質分子の拡散速度が増大するため，分子拡散によってに比例する ．His-DsRed 及び His-GFP を固定化するたタンパク質が速やかに基板表面側に移動する．その後，めの前処理として , QCM センサ（サンライズ工業株式

もう一度，極性が反転すると，タンパク質が金基板側に会社 QBS-01，φ2.6 mm, 検出感度 53 pg/-1Hz ）の金薄膜引き寄せられる際に，タンパク質が輸送・固定化される．

表面の表面処理を行った．まず QCM センサの金薄膜表

このサイクルを繰り返すことで，タンパク質の固定化量面を洗浄するため，1 N の濃硝酸（ナカライテスク，10）の増加が可能となる（図 1） ．モデルタンパク質として，24412-25）の溶液に室温で 1 時間浸漬した．その後，金His タグ融合 Discosoma sp. Red Fluorescent Protein（ His-

薄膜表面を脱イオン蒸留水で洗浄し，窒素ガス下で乾燥

DsRed；EX：558 nm, EM：583 nm ）と His タグ融合 Greenさせた．QCM センサを発振回路へと接続し，その発振

Fluorescence Protein（ His-GFP；EX：505 nm，EM：511

周波数を周波数カウンターにより記録した．QCM センnm ）を用いて，タンパク質の固定化量を評価した結果，サの金薄膜表面への修飾として，金と結合を形成するチ20 Hz，80 Vpp の低周波交流電圧の印加によって最大のオール基を持つ 3-Mercaptopropionic Acid（ MPA；東京化

タンパク質固定化量が得られること，その最大固定化量

成工業，M0061）を用いた．QCM センサの金薄膜表面は，交流電界の非印加時の固定化量よりも 7 倍程度高いに MPA を電着させるため，電圧印加装置の正極側に高ことが示された ．

周波チョークコイル（ RFC, 39 mH ）を介して QCM セ10）12）

以上のように，筆者らは低周波交流電界の印加によるンサを接続し，陰極側に金箔基板を接続した．そして，タンパク質の固定化技術の開発を進めてきたが，その固0.3 M の MPA 溶液中に QCM センサの金薄膜表面を浸漬定化プロセスの詳細はいまだに不明なままである．そこした後，1.5 V の直流電圧で MPA を電着させながら，発で，本研究では，ng オーダーの質量変化の解析が可能振周波数を測定した．電着した MPA のカルボキシル基な水晶振動子マイクロバランス（ QCM；Quartz Crystalとニッケルイオンとの錯体を形成させることで，His タ

Microbalance ）を用いて，低周波交流電界を印加させなグ融合タンパク質への特異的な結合部位を形成することがら，QCM センサの金薄膜表面の表面処理やタンパクが可能となる．このため，0.15 M の塩化ニッケル水溶質固定化のリアルタイム計測技術を開発し，タンパク質液（和光純薬工業，148-01055）に対して，QCM センサ固定化プロセスの詳細を明らかにした．の MPA 修飾表面を 37℃で１晩浸漬した．

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2.3 低周波交流電界印加によるHisタグ融合タンパク質の固定化

OFN25/MRH00041）を装着した倒立型蛍光顕微鏡（ Nikon，TE-2000U ）を使用した．His-DsRed の観察には，Nikon

ファンクションジェネレーター（ AS ONE，33210A ）にG-2A 蛍光フィルターセット（ Excitation filter：510-560 nm，

よって周波数と電圧を調節し，高電圧アンプ（ NF 回路ブ

Dichoric mirror：575 nm，Barrier filter：590 nm ），His-GFP

ロック，4005）を用いて，印加電圧を増幅した．この高電の観察には，Nikon B-2A 蛍光フィルターセット（ Excitation

圧アンプに QCM センサを接続させ，1 cm の電極間距離でfilter：450-490 nm，Dichroic mirror：505 nm，Barrier

接地側にアルミ板を接続させた（図 2）．そして，QCM セfilter：520 nm ）を使用した．撮影には顕微鏡備え付けのン サ の MPA 修 飾 基 板 を 70 µg/mL の His-GFP 及 び His-デジタルカメラ（ Nikon，D3200）を使用し 1 秒間の露DaRed 溶液中で浸漬させた後，次の 2 つの条件下で電界光時間で撮影された．撮影した画像は，Image J（ http://を印加した．第一の条件として，印加低周波の周波数の条

imagej.nih.gov/ij/ ）で解析した．

件を最適化するために，0，10，20，50 Hz の各周波数に設定し，80 Vpp に固定した電圧を 10 分間印加した．第二3．結果と考察の条件として，印加電圧条件を最適化するために，20 Hz

3.1 金薄膜表面修飾のリアルタイム測定の周波数に設定し，0，20，40，60，80 Vpp の各電圧を 10本研究では，電圧印加装置によって，50，200，300分間印加した．印加した電圧の波形は，プローブを介してmM の MPA 溶液を QCM センサの金薄膜表面に電着さPico Scope（ Pico Technology，4424）により計測した．また，せたときの発振周波数シフトをリアルタイムで計測した発振回路に QCM センサを接続し，その発振周波数を周波（図 3）．その結果，300 mM の MPA 溶液では，計測開始数カウンターによって記録することにより，各低周波交流から 60 秒程度で発振周波数が－ 550 Hz 程度まで急激に電圧印加条件下での修飾基板表面上へのタンパク質の固シフトした．この発振周波数の減少は，QCM センサの定化における発振周波数シフトをリアルタイムで測定した

金薄膜表面に MPA 分子が急速に結合されたことを意味（図 2）．電圧を印加後，基板を脱イオン蒸留水で洗浄し，している．一方，50 と 200 mM の MPA 溶液では，計測乾燥させないように，脱イオン蒸留水で飽和している容器

開始（印加開始）から 300 秒間程度かけて，発振周波数内に，37℃，遮光状態で 1時間静置した．

が－250 と－500 Hz 程度までシフトしたことから，MPA分子が金薄膜表面に徐々に結合したことが示された．
50，200，300 mM の MPA 溶液のときの QCM センサの金薄膜表面への MPA 分子の固定化量は，それぞれ 241，440，502 ng/cm であった．これらの結果から，MPA 溶2液の濃度増加に伴い，固定化量も増加することが示された．しかしながら，300 mM 以上の MPA 溶液では，QCMセンサの発振が不安定化し，計測できなかった．これは，
MPA 溶液の濃度の増加によって，QCM センサを構成する水晶振動子の等価直列抵抗の値が大きくなったために，発振が不安定になったと推察される．
図 2 実験装置の概要図
Fig.2 Schematic diagram of experimental equipment.

2.4 イミダゾール処理による発振周波数シフトの測定QCM センサの修飾基板表面へのタンパク質の固定化後，その基板表面上のニッケル錯体と His-DsRed もしくは HisGFP がタンパク質タグ特異的に結合されているかを評価するため，100 mM のイミダゾール溶液にタンパク質固定化基板を 15 分間浸漬させ，その間の発振周波数シフトを計測した．その後，2.5 節に従い蛍光観察を行った．

2.5 固定化タンパク質の蛍光観察
固定化タンパク質の観察には，対物レンズ 4 倍（ Nikon，28302685-1静電気学会誌46巻1号.indb

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図 3 MPA 固定化量の経時変化と濃度依存性
Fig.3 Time course and concentration dependence of the amount of
MPA immobilization.

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3.2 印加低周波交流電圧を変化させたときのHisタグあった．これらの His-DsRed 及び His-GFP の固定化量は，融合タンパク質固定化のリアルタイム解析バイオセンサとして適用するために十分な量を確保してHis-DsRed 及び His-GFP の固定化における，低周波交いるが，His-DsRed と His-GFP との固定化量で 2 倍程度流電界印加の効果について検討した．低周波交流電界のの差が生じた．この固定化量の差は，GFP の N 末端に印 加 条 件 と し て は，20 Hz の 周 波 数，0，20，40，60，融合された His タグタンパク質が GFP の構造の表面に80 Vpp の印加電圧で実施した．図 4 および図 5 は，各近接して配置され，その His タグタンパク質と QCM セ印加電圧条件下での，QCM センサの発振周波数（修飾ンサの修飾基板表面のニッケル錯体との結合が阻害され基板表面への His-DsRed 及び His-GFP の結合量を反映）たことによるものと考えられる．の経時変化を示す．その結果，20 Hz，80 Vpp の低周波交流電圧の印加では，計測開始（印加開始）から 300 秒

3.3 印加低周波の各周波数におけるHisタグ融合タン
パク質固定化のリアルタイム解析

間程度で発振周波数は－250 Hz 程度までシフトした．

3.2 項の結果を受けて，次に，印加低周波の周波数を一方，20 Hz の周波数，0，20，40，60 Vpp の各低周波変化させたときの His-DsRed 及び His-GFP の固定化をリ交流電圧を印加したとき，計測開始から 600 秒間経過しアルタイムで計測した．その低周波交流電界の印加条件ても，その発振周波数は－100Hz 程度しかシフトしなかは，0，10，20，50 Hz の周波数，80 Vpp の印加電圧でった．これらの結果，20 Hz，80 Vpp の低周波交流電圧実施した．図 6 と図 7 は，各低周波交流電界の印加条件の印加によって，最も効率的に His-DsRed 及び His-GFP下での，QCM センサの発振周波数（修飾基板表面へのが固定化されたことが示された．これらの発振周波数シHis-DsRed 及び His-GFP の結合量を反映）の経時変化をフトから His-DsRed 及び His-GFP の固定化量を算出した示す．その結果，20 Hz，80 Vpp の低周波交流電圧の印

結果をまとめたグラフとその固定化タンパク質の蛍光画

加条件では，計測開始（印加開始）からおおよそ 300 秒像を図 4 および図 5 に示す．この結果から，20 Hz，80間程度で経過すると，発振周波数は－250 Hz 程度まで

Vpp の低周波交流電圧印加時の His-DsRed の固定化量はシフトした．しかしながら，10 Hz，80 Vpp の低周波交154 ng/cm であり，His-GFP の固定化量は 85.2 ng/cm で流電圧を印加した場合には，計測開始から 600 秒間程度

22

図 4 各印加電圧における QCM 発振周波数の経時変化（ His-DsRed の固定化量を反映）と最大固定化量
Fig.4 Time course of oscillation frequency shift reflecting immobilization amount of His-DsRed at each applied voltage.

図 5 各印加電圧における QCM 発振周波数の経時変化（ His-GFP の固定化量を反映）と最大固定化量
Fig.5 Time course of oscillation frequency shift reflecting immobilization amount of His-GFP at each applied voltage.

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図 6 印加低周波の各周波数における QCM 発振周波数の経時変化（ His-DsRed の固定化量を反映）と最大固定化量
Fig.6 Time course of oscillation frequency shift reflecting immobilization amount of His-DsRed at each frequency of applied low frequency AC.

図 7 印加低周波の各周波数における QCM 発振周波数の経時変化（ His-GFP の固定化量を反映）と最大固定化量
Fig.7 Time course of oscillation frequency shift reflecting immobilization amount of His-GFP at each frequency of applied low frequency AC.

経過しても，その発振周波数は－100 Hz 程度しかシフト示す．これらの結果から，20 Hz，80 Vpp の低周波交流電しなかった．また，電界未印加と 50 Hz，80 Vpp の低周波圧の印加で，His-DsRed 及び His-GFP の固定化量が最も交流電圧の印加の条件では，計測開始から 600 秒間程度高かった．この得られた結果は，既往の我々の研究経過しても，発振周波数のシフトは確認できなかった．こ同様の結果が得られており，低周波交流電界印加によるれらの結果から，20 Hz，80 Vpp の低周波交流電圧の印加タンパク質輸送機構に関する仮説モデルを支持している．

により最も効率的に His-DsRed 及び His-GFP の固定化が3.4 固定化されたHisタグ融合タンパク質のイミダゾー促進されたことが示された．これは 20 Hz の周波数条件

ル処理による発振周波数シフトのリアルタイム解析

下では，高い濃度勾配が形成されることで，タンパク質固定化 His-DsRed 及び His-GFP が，QCM センサの基と10）の移動速度が増大し，その後，分子拡散によってタンパ板 表 面 に 特 異 的 に 結 合 し て い る か を 評 価 し た．His-ク質が基板表面に向かって輸送されたことを示唆する．

DsRed 及び His-GFP 固定化基板を 100 mM のイミダゾー

本手法では固定化は各サイクルに 1回のみ生じるので，同ル溶液に 15 分間浸漬させ，その際の発振周波数シフト

様な分子拡散が生じたとしても，低周波では固定化量がをリアルタイムで計測した（図 8A ）．その結果，固定化少なくなることになる．これが 10 Hz 以下の印加低周波のHis-DsRed では，イミダゾール処理後，測定開始から 30条件下では，20 Hz の印加低周波の条件下よりもタンパク秒間以内で，発振周波数が＋130 Hz 程度までシフトした．

質の固定化量が減少した理由であると考えられる．一方

一方，固定化 His-GFP では，イミダゾール処理後，測定で，40 Hz 以上の印加低周波の条件下では，交流電界の開始から 800 秒間程度で，発振周波数が＋50 Hz 程度ま正負のサイクルが早くなるため，十分な濃度勾配が生までシフトした．これらの発振周波数のシフトから His-

れず，その結果としてタンパク質の拡散量が不十分とな

DsRed と His-GFP の解離量を算出した結果，固定化量のり，タンパク質分子が輸送されなかったと考えられる．こ60％程度の His-DsRed 及び His-GFP が解離したことが示

れらの QCM センサの周波数シフトから得られた His タグされた．この結果を裏付けるために，QCM センサの修融合タンパク質の固定化量を算出した結果をまとめたグ

飾基板表面から解離した His-DsRed 及び His-GFP の蛍光ラフとその固定化タンパク質の蛍光画像を図 6 と図 7 に画像を図 8B に示す．蛍光観察の結果，イミダゾール処

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能なことが示された．今後，本研究で開発した技術をタンパク質間相互作用の動的解析などが可能なバイオセン
サの基盤技術として活用していきたい．
参考文献

図 8 イミダゾール処理による固定化 His-DsRed 及び HisGFP の解離における周波数変化と画像
Fig.8 Oscillation Ffequency changes and images in dissociationof immobilized His-DsRed and His-GFP by imidazoletreatment.

理後には固定化された His-DsRed 及び His-GFP の蛍光はほとんど観察されなかった．His-DsRed や His-GFP の解離における発振周波数シフトと蛍光観察との差は，変性もしくは消光した His-DsRed や His-GFP が固定化されていたことを示唆している．これらの結果から，His-DsRedや His-GFP は QCM センサの基板表面のニッケルイオンに対して特異的に結合していたことが示された．しかしながら，イミダゾール処理では 40％程度の His-DsRedや His-GFP は修飾基板表面から解離しなかった．これはHis タグと DsRed や GFP との立体障害がイミダゾールによる His タグとニッケルとの結合の解離を阻害したことや QCM センサの基板表面への His-DsRed や His-GFP分子の非特異的な結合によって生じた可能性がある．

4．おわりにこれまでのタンパク質固定化技術に関する研究の多くはタンパク質の固定化量を増加させることに着目しており，タンパク質の固定化を拡散速度的側面から評価している研究はほとんどない．そこで本研究は，これまでの研究では覆い隠されていたタンパク質が固定化されるまでのプロセスをリアルタイムで解析可能な実験系を開発した．その結果，QCM センサの金薄膜表面への MPA の修飾をリアルタイム計測による MPA 分子の最適濃度や最大固定化量が明らかになった．さらに，20 Hz で 80
Vpp の低周波交流電圧の印加によって，His-DsRed 及びHis-GFP の最大固定化量が得られるまでの時間が明らかになった．以上の結果，低周波交流電界を用いることで，配向性を制御しながら，目的のタンパク質の固定化が可28302685-1静電気学会誌46巻1号.indb

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