BioJapan2019, 2019年10月10日，パシフィコ横浜

有毒ガスでありながら生体内シグナルガスとしても注目される一酸化炭素の生体内除去およびデリバリーツール

北岸 宏亮
Doshisha University, Kyoto, Japan一酸化炭素
CO
有毒ガス，火災の死亡原因，排気ガス，タバコ，練炭自殺…etc.
生理活性ガス，ヘムタンパク質へのシグナル，抗炎症作用，臓器保存効果…etc.
有毒ガス ＝ 生体内で作用する＝ 微量は生物に必要内因性の一酸化炭素の産生について

heme metabolism

metabolic productsheme oxygenase+ Fe２+CObiliverdinheme(Fe3+ hemin)

CO-ヘモグロビンとして循環細胞内シグナルガスとして機能

Gaseous signaling molecules
NOH2S

Knockout/knockdown methods
are available.

COHO-1+ Fe2+ + CO

Knockout/knockdown cannot be available for CO.
COの生理機能には不明な点が多く，注目ターゲット

今回のトピック
生体内から一酸化炭素を除去する物質hemoCD
 内因性COの生理機能を追求する
 過剰のCOを体内から除去できる
生体内に一酸化炭素をとどける物質CORM

 COを除放する固体粉末試薬CORM
 細胞膜透過性の高いCORMの開発

一酸化炭素の捕捉物質hemoCDについて

An Hb/Mb functional model
hemoCD

oxy-hemoCD

CO-hemoCD

P50 (O2) / Torr

P50 (CO) / Torr

Hb (T-state)

22-

Hb (R-state)0.220.0013

hemoCD

100.000015

K. Kano, H. Kitagishi et al Inorg. Chem. 2006,
45, 4448–4460.

HemoCD is a useful CO receptor in aqueous media.

動物体内のCOを尿中へと強制的に追い出す
A CO-removal agent
in the living organisms
oxy-hemoCD

CO-hemoCD (in urine)
H. Kitagishi et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 1312–1315.

Administration ofhemoCD

Pseudo-knockdown
of CO in mice
Endogenous CO deleted stateAnimal: Wistar male rat; 250–350 g;anesthetized with urethane[oxy-hemoCD1] = 0.63 mM in PBS
rate: 1 mL/h

MALDI-TOF MS, UV-vis, and resonance Raman
spectroscopic analyses
Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 1312–1315.

Fe-Curine

Resonance Raman spectra
Ex: 413.1 nm (Kr+ laser, 1-2 mW power)

CO-hemoCD1
Fe-O

oxy-hemoCD1
480 cm-1 : Fe-C stretching mode

Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 1312–1315.

動物体内のCOを尿中へと強制的に追い出す
A CO-removal agent
in the living organisms
oxy-hemoCD

CO-hemoCD (in urine)
Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 1312–1315.

Administration ofhemoCD

Endogenous CO-depleted state

Pseudo-knockdown
of CO in mice

内在性COを欠乏した疑ノックダウンマウス

血中COヘモグロビンの定量
blood sampling
oxy-hemoCD

The CO-Hb content (%) in the blood
was measured by gas chromatography.

(1 mM, 0.15 mL)

0.2%

0.2%

CO-ヘモグロビンの量がほとんどゼロになった

0.03%

すぐに定常値へと回復した。すな
わちCOの産生が亢進された？
J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 5417-5425.

Hmox-1/b-actin

12

****

The expression of HO-1 strongly
increased in the hemoCD-treated mice.

9HO-1
induction

63******

0nnnPBSmimi
C D 0 mio00839m
1- heFb
Oxy-hemoCD

oxy$hemoCD
OO
NNFeN

HOOC

N

COOH

HO-1＋

NH HN
NHOOC

HN

Removal ofCO＋
CO$hemoCDendogenous CO.

3+＋＋ ＋＋ ＋Fe2+

COOH

hemin＋

induc on
CO恒常性維持のためのフィードバックシステムの発見！
J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 5417-5425.

HemoCDは微量COの検出試薬としても使える

CO / pmol per 106 cells

in PBS**cancer cells

normal cells

細胞内にある内在性COの定量に成功！
J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 5984.

Measurement for biological CO
１) ガスセンサー/ガスクロマトグラフィー法
ヒトの場合：呼気のCOを測定し，血中CO量を推定する
血液/組織：COの結合したヘムを酸化し，遊離COの気相分析を行う

２) 赤外レーザー分光法
細胞内COを感度良くリアルタイム計測可能だが，特殊装置が必要(Y. Morimoto, et al., Am. J. Physiol. 2001, 280, H483)

３) ケミカルプローブの利用
CO選択的な蛍光プローブ (BODIPY-Pd錯体) 定量性には乏しい(C. J. Chang, et al., J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 15668)

HemoCD アッセイ
Hbなどの生体内のあらゆるヘムタンパク質からCOを奪い，吸光度測定により簡単かつ正確にCOを定量可能

外来性COの臓器分布計測
新生児黄疸の早期診断法への応用etc.

内在性COの欠乏は，体内時計のリズムを乱す

SO3–

N II N
FeNN–O S
3

SO3–N
S–O S
3

Sci. Rep. 2018, 8, 11996 (12 pages).

一酸化炭素徐放試薬CORMについて
hv, L

MX(CO)nMX(CO)n-1 + COk’

TRANSITION METAL CARBONYLS

金属カルボニル錯体
COを放出，意外に低毒性

M = Ru, Fe, Mn, Mo, Ni, Co, Rh
COOCOCCOMn
COCOMnOCCOCOCODimanganese decacarbonyl[Mn2(CO)10]
CORM-1

CO-releasing molecules as therapeutic agents
CO-RM2effective against…
• やけど• 失血性ショック

CO-RM3• 感染症• 臓器移植の副症状• 抗がん剤副作用… and more
R. Motterlini, L. E. Otterbein, Nat. Rev. Drug Discov. 2010, 9, 728.

CORM-401

水溶性，3CO/molecule放出

COの継続投与は，体重増加を効果的に抑制する＝ダイエットピル？

R. Motterlini

JCI Insight, 3, e123485 (2018).

Cellular uptake of CORM-401
CORM-401 (50 mM in D-MEM/10% or 1% FBS)
血清の成分はCORMの細胞導入を阻害
Incubation for 2 hSilva, T. S., et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 1192-1195.

wash by PBS
5 mM oxy-hemoCD1

HepG2 cells

disrupt cells bysonication

measurement byUV-vis spectrum

血清を減らすことで、細胞へのCO送達量が2.1倍増加した
細胞導入率
10% FBS : 0.4%
1% FBS : 0.8%
投与量に対して非常に少ない
Figure 2. Quantification of endogenous CO in cells after the additionof 50 mM CORM-401 by hemoCD. Cells were incubated in D-MEM/10% or 1% FBS.

CORMの細胞内取り込みを向上させる

CORM401

CORM401-E

3.5(b)1.63(a)2.5

1.2

deoxy-hemoCD1434 nm

Absorbance

1.0

CCO-hemoCD1 / µM

1.42
1.5
10.80.50.60050

100150200

Time / min

0.40.20300

350

400

450500550600650700

Wavelength / nm

CORM401-Eも，3CO/moleculeのCO放出能を示した。

D-10 1 mL
CORMs 50 µM
1 x 106 cell / mL

Removal of
mediumIncubation 2 h

PBS 1 mL
Oxy-hemoCD

Removal of
mediumCollection of cells
Cell countSonication
Filtration

Measured by UV-vis

大量合成できるCORM401から，簡便で後処理ほとんどなくメチルエステル化に成功

CORM401-E

従来のCORM401よりも5倍以上の高い胞内取り込み効率を示した
COの研究をするための研究用試薬としての需要は高い

北岸宏亮，高山実花子，R. Motterlini, 特許出願中

Acknowledgement

Functional Organic Chemistry Lab. 2018
Graduate Students
Aki Yumura
Ryo Kamiya
Fumihiko Chai
Shun Mizobata
Saika Minegishi Misa Jiromaru
Daiki Shimoji
Yasuhiro Kudo
Qiyue Mao…and more!

Collaborators
Prof. Koji Kano
Prof. Yukio Sugiura
Dr. Shigeru Negi
Dr. Roberto Motterlini
Dr. Roberta Foresti

Prof. Hidetoshi Arima
Prof. Ikuko Sagami
Prof. Shigeru Taketani
Prof. Takashi Hayashi…and more!