ト ピ ック ス

マウス in vitro 精子形成法の開発
横浜市立大学学術院医学群泌尿器病態学小川 毅彦!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

はじめにによる in vitro 精子形成の研究が，その後は全くと言ってよいほど行われなくなったことである．器官培養法を哺乳類の精子形成は，精子幹細胞から始まり精子産生用いた培養実験自体が，時代遅れの技術として顧みられに至るまでに，マウスでは３５日間，ヒトでは６４日間の長なくなっていた事情はあるが，もう１つは１９６０年代に期間を要する．細胞分裂と減数分裂，そして運動能をもSteinberger 夫妻の完璧なまでの研究結果から，その限つ精子完成への細胞形態の特徴的な変化は謎に満ちてお界が判明していたともいえる．すなわち，器官培養法をり，そのメカニズムの解明のためにも培養下での実験系用いた場合は，精子幹細胞から減数分裂中期（パキテンが求められてきた．その歴史はおよそ１世紀前に始まり，期）の精母細胞までの分化は進むが，それ以上はけっし多くの研究者がこの課題に挑戦してきた．しかしこれまて進行しないという結論である．それはある意味，定説での成果はいずれも，部分的な成功に留まっていた．昨のようにそびえる壁にも思えたが，ちょうどその時に私年，著者らのグループは新生仔マウス精巣組織を培養下たちは非常に有用な実験マテリアルをもっていた．

で成熟させ，精子産生させることに成功した［１］．まHaspin-GFP トランスジェニックマウス（Tg）である．

た体外移植培養法という手法を開発し，培養精子幹細胞

この Tg の精子形成細胞は円形精子細胞（半数体）になからの精子産生にも成功した［２］．それらの成果につると GFP を発現するという特徴をもっており，それゆいて概説する．

え精子形成の進行を簡便に判定できる点で非常に有利で精子幹細胞の培養あった［５］．そこで，われわれは，Steinberger 達の研究成果をその Tg マウスを用いて再検討してみるという精子形成は精子幹細胞が精子になる細胞分化の過程で研究を開始することとした．その培養法は気層液層境界あるが，生涯にわたって維持される精子形成の根幹には，部培養法というもので，原法は１９５９年に報告されており，精子幹細胞の存在がある．精子幹細胞が自己複製増殖す器官培養におけるゴールデン・スタンダード で あ るることにより精子産生の元が維持されるからだ．精子幹［６］．その方法に多少の工夫を加えて，より単純な培養細胞の実態は長く謎に包まれていたが，１９９４年に精子幹法を開発した．１．
５％のアガロースゲルの台を作り，培細胞の移植法が開発されたことから［３］，その研究は養液に半分だけ浸し，その上に新生仔マウスの精巣組織進歩し，２００
３年にはマウス精子幹細胞を培養下で殖やす片（直径２〜３mm）を乗せるのである．培養液は，αMEMことが可能となった［４］．この培養下で自己複製増殖というもっとも標準的なものを用いた．それに牛胎仔血する精子幹細胞は GS 細胞と名付けられた．当初，私は，清（FBS）を１０％加えて使用したが，結局のところ，そGS 細胞を培養することにより，培養下での精子産生もれでは数分裂途中で精子形成は止まってしまい，先人の可能になると考えていた．たとえその効率がよくなくて成果を超えることはできなかった［７］．

も，殖やした GS 細胞を実験材料として豊富に用いるこ

FBS を含む培地での培養実験に限界を感じ，ようやとができる強みがあるからだ．しかしながら，GS 細胞

くわれわれは，無血清培地での実験に着手した．その手は培養皿のなかで減数分裂を起こすことも，精子になる始めは血清代替物の検討であったが，そこで使用したこともなかった．GS 細胞から精子を造るためには，生Knockout Serum Replacement（KSRÑ）という血清代替体マウスの精巣内精細管への移植が必要であった．

物に意外な効果があることを発見した．KSR は ES 細胞器官培養法による in vitro 精子形成や iPS 細胞の培養に用いられる血清代替物であり，その効用は，ES 細胞・iPS 細胞の分化を抑えて，未分化状GS 細胞からの in vitro 精子形成に限界を感じた私た態のままの増殖を助けるというものである．その KSR

ちは，過去の文献を調べるなかで，１つの疑問を抱いた．

を精巣の器官培養に用いたところ，それまでみられなそれは１９７
０年代初期まで盛んに行われていた器官培養法かった完全な精子形成が in vitro で完成したのである

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日本生殖内分泌学会雑誌（2012）17 : 52-53

TOPICS［１］．

なった．それでは KSR とは何なのか．その構成成分は器官培養法により確かに精子が産生されたが，その数何で，そのなかの何が重要な因子なのか．残念ながらはけっして多くはなかった．それは，精子形成が生じてKSR は企業製品であり，成分の詳細は不明である．たいるのが組織片の辺縁部のみであることが１つの原因でだし，その後の研究で１つのヒントを得た．AlbuMAXある．培養液からの栄養素の吸収と気層からの酸素の供というアルブミン製剤が，KSR とほぼ同様の効果をもっ給，さらに老廃物の排出という生体内と同様の代謝を維ていたのである．AlbuMAX は，クロマトグラフィー精持できる部位が組織片辺縁に限定されているためであろ製された牛血清アルブミンであり，lipid-rich albuminう．そうではあるが，in vitro で生体内に近似する微小とも紹介されている．となると，in vitro 精子形成の成環境を再現できたことが精子産生の秘訣であった．器官

功の鍵はアルブミンか，あるいは AlbuMAX に含有され培養法によって造られた精子細胞や精子の妊孕能を調べている脂質成分ということになるかもしれない．あいにる顕微授精実験も行った．産仔たちはすべて順調に成長

く AlbuMAX も同企業の製品であり，アルブミン以外のし，兄妹交配により次世代が誕生しており生殖能も正常構成成分については明らかにされていない．

であった．また，精巣組織を組織片のまま凍結し，液体器官培養法での in vitro 精子形成を完成させるために窒素内に保存する実験も行った．解凍して培養すると，は，KSR/AlbuMAX 内の重要因子を同定し，その効力の精子形成が再開した．

メカニズムを解明することが必要であろう．それにより，GS 細胞からの精子産生GS 細胞から精子を産生するためには，生体の精巣内への移植が必要であることは上述した．そこで，われわ
れは器官培養法を応用すれば，GS 細胞からの in vitro
精子形成が可能ではないかと考えた．まず GS 細胞を宿主マウスの精巣（精細管内）に注入移植し，その直後に精巣を摘出し，器官培養と同様に精巣を細切してアガロース上で培養した．ユビキタスに発現する GFP 遺伝子が組み込まれている GS 細胞を用いたので，その挙動を培養継続中に追跡することが可能であったが，培養開始数日後には，精細管の内腔から辺縁の基底膜上に移動し，そこで増殖する像が確認された．それは生体内への移植実験の結果と同様であった．その所見に勇気づけられたわれわれは，生体への GS 細胞移植後に精巣を取り出すのではなく，生体から精巣を取り出して，その後に移植して培養を開始するという体外移植培養法を開発した．それでも GS 細胞は同様の挙動を示し，最終的には培養組織内において精子産生が認められた．GS 細胞から in vitro で作られた精子細胞を用いた顕微授精実験では，健康な産仔が得られた［２］．

おわりにこれまで不可能だった in vitro での精子形成が，KSRin vitro でのヒト精子形成も可能となるはずである．

引用文献
１．Sato T, Katagiri K, Gohbara A, Inoue K, Ogonuki N,Ogura A, Kubota Y, Ogawa T（２０１１）In vitro productionof functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature ４７１, ５０４５-０７.
２．Sato T, Katagiri K, Yokonishi T, Kubota Y, Inoue K,Ogonuki N, Matoba S, Ogura A, Ogawa T（２０１１）In vitro
production of fertile sperm from murine spermatogonial
stem cell lines. Nat Commun １３, ４７２.
３．Brinster RL, Zimmermann JW（１９９４）Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proc Natl Acad Sci
USA ２２, １１２９８１-１
３０２.
４．Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki N, Inoue K, Miki H, OguraA, Toyokuni S, Shinohara T（２００３）Long-term proliferationin culture and germline transmission of mouse malegermline stem cells. Biol Reprod ６９, ６１２６- １６.
５．Kita K, Kita K, Watanabe T, Ohsaka K, Hayashi H,Kubota Y, Nagashima Y, Aoki I, Taniguchi H, Noce T,Inoue K, Miki H, Ogonuki N, Tanaka H, Ogura A, Ogawa
T（２００７）Production of Functional Spermatids from Mouse
Germline Stem Cells in Ectopically Reconstituted Seminiferous Tubules. Biol Reprod ７６, ２１１２-１
７.
６．Steinberger A, Steinberger E, Perloff WH（１９６４）Mammalian testes in organ culture. Exp Cell Res ３６, １９２- ７.
７．Gohbara A, Katagiri K, Sato T, Kubota Y, Kagechika H,Araki Y, Araki Y, Ogawa T（２０１０）In Vitro Murine Spermatogenesis in an Organ Culture System. Biol Reprod ８３, ２６１２６７.という血清代替物を培養液に添加することにより可能とトピックス

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