福岡県保健環境研究所年報第28号，72−76，2001

原著論文
新しい試験菌株を用いたエームス試験の有用性について−255化学物質についての検討−
世良暢之・塚谷裕子・志水信弘・田中義人＊1・北森成治・内海英雄＊2
多種多様で有害な化学物質の人への曝露量の解明及び低減を目的とするがん予防対策では，高価で長期間を要する動物実験の代用法として簡便で安価なスクリーニングアッセイの開発が求められている．
何千もの有害な化学物質に人が曝露されているなかで，広範囲な化学物質の変異原性を系統的に検討している例は少ない．そこで255化学物質に対して，従来から用いられている TA98，TA100株に加え，新しく開発された YG1041，YG1042，YG3003及び YG7108株を併用したエームス試験を実施し，その有用性を検討した．またラット及びヒト肝臓 S9を用いた代謝活性化系による試験の検討，環境試料への応用が可能かどうかについても検討した．その結果，83化学物質(32.5%)に変異原性が確認され，環境試料である河川水のブルーレーヨン抽出物に対しても変異原性を測定することができた．また，代謝活性化を受けてはじめて変異原性を示す10種類の間接型変異原に対して，ラット及びヒト肝臓 S9を用いた変異原性は，ほぼ同様の傾向を示した．これらの結果から，新しい試験菌株を用いたエームス試験は全体の約 3 割の化学物質に変異原性を検出できるにとどまったものの，実施可能な簡便で安価なバイオアッセイであると考えられた．
〔キーワード：エームス試験，変異原性，S.Typhimurium YG1041，YG1042〕１

代謝活性化過程において使用されるラット肝臓 S9 mix

はじめに
エームス試験は，化学物質の発がん性を予測するため，1975年カリフォルニア大学のエームス教授（細菌学）にとヒト肝臓 S9 mix の有用性についても併せて検討を行ったので，報告する．

1)

よって開発されたものである ．この試験は，ネズミチフス菌（Salmonella Typhimurium， S.Typhimurium） の突

２

然変異誘発能を利用して様々な化学物質の変異原性を検

２・１

材料及び方法
試料

出する簡便な試験法である．当初，この試験において変化学物質は，生体影響（変異原性，発がん性，内分泌異原性を示した化学物質は，急性，慢性毒性などの毒性

攪乱，水生生物毒性，生殖毒性，生体への刺激性及び神と高い相関が得られた 2)．しかしながら何千もの化学物経毒性など），環境影響の観点から重要と思われる255化

質についてその開発段階にエームス試験が導入されたこ

学物質を選択した．これらの化学物質は，農薬（殺虫剤，とから，強い変異原性を示す化学物質は供給されなくな除草剤，燻煙剤等 ），多環性芳香族炭化水素類，アリルってきた．1993年から国立医薬品食品衛生研究所の能美炭化水素，重金属，無機化合物等などに分類され，すべ健美博士らは弱い変異原性でも検出できるエームス試験て和光純薬工業(株)から購入した．これらの試料をジメ3-5)用の新しい高感受性の試験菌株を開発してきた ．

チルスルホキシド(DMSO)あるいは蒸留水に溶解させ，ここでは新しい高感受性株の中から 4 菌株（YG1041，被検試料とした．また，河川水試料はブルーレーヨン

YG1042， YG3003及び YG7108）を選び，生体影響，環（採取地点 1 カ所につき 3 g）を24時間河川水中に懸垂境影響の観点から重要と思われる255化学物質についてし，蒸留水で洗った後，メタノール -濃アンモニア(50:1,変異原性を検討すると同時に，環境試料への応用が可能160ml/g ブルーレーヨン)混合液で超音波抽出した．得かどうかについて検討を行った．また，エームス試験のられた抽出液を減圧濃縮して DMSO に溶解させ，0.45

福岡県保健環境研究所（〒818-0135 太宰府市大字向佐野39）*1

現：福岡県環境部環境政策課（〒812-8577 福岡市博多区東公園7-7）*2

九州大学大学院薬学研究院機能分子解析学（〒813-8582 福岡市東区馬出3-1-1）- 72 -

μ m フィルターで濾過した．

ロサイクリックアミンやベンツピレンのような多環性芳

２・２

香族炭化水素に対してはほとんど変異原性に差が認めら

試験方法

エームス試験はプレインキュベーション法で実施し，れなかった（0.2‑8.4倍 ）．これらのことから YG1041，

ラット肝臓 S9mix(オリエンタル酵母工業(株))またはヒYG1042株を用いたエームス試験は， TA98， TA100株をト肝臓 S9mix(フナコシ(株))による代謝活性化法を併せ用いた場合よりも数倍‑数千倍高感度に測定できること

1)て実施した ．試験菌株は S.Typhimurium TA9 8，TA100，が示唆された．

YG1041, YG1 042, YG3003及び YG7 108株である． YG

３．２

YG株による255化学物質の変異原性

1041及び YG1042株は，ニトロ還元酵素及び O-アセチル

YG1041， YG1042株を用いたエームス試験を生体影響転移酵素高産生性株であり，多環性芳香族炭化水素のニ及び環境影響の観点から重要と思われる255化学物質にトロ誘導体またはアミノ誘導体に高感受性である 3)． YGついて実施した．強い変異原性を示した上位10化学物質

3003株は，8‑ヒドロキシグアニン修復酵素欠損株であり，を表 2 に示した．YG1041，YG1042株のいずれの場合も4)6酸化型変異原に高感受性である ． YG7108株は， O -メ代謝活性化を必要とする系( +S9）において高い変異原チルグアニンメチル転移酵素欠損株であり，アルキル化性を示したのは， MeIQx， Trp-P-2 ， PhIP な どのヘテロ5)剤に高感受性である ．

サイクリックアミン，あるいはアフラトキシン B1，3 メチルコランスレン，2-アミノアントラセン，ベンツピ

３

結果及び考察レンなどの多環性芳香族炭化水素であった．一方，代謝YG1041， YG1042株は，エームス試験の標準株である活性化を必要としない系(-S9）において高い変異原性をTA98， TA100株にニトロ還元酵素及び O-アセチル転移示したのは，1,8 -及び1,6 -ジニトロピレン，3 -ニトロフ酵素に関与する遺伝子を導入した菌株である．従って

ルオランテン，1-ニトロピレンなどの多環性芳香族炭化YG 株は TA 株より高感受性であることが期待される．

水素のニトロ誘導体であった．特に石油製品の不完全燃

ここでは，まず両菌株の比較，高感受性株の有用性につ焼生成物中に含まれる1,8 -及び1,6 -ジニトロピレンはいて検討した．さらに S.Typhimurium を 用いたエームス

YG1041 株 ( -S9 ） に お い て ， 4550000 ， 2450000

試験でラット肝臓 S9による代謝活性化が必要な化学物

revertants/nmol（ rev. /nmol） と非常に高い変異原性を示

質について，ヒト由来肝臓 S9の有用性についても併せした 6)．また， YG1041， YG1042株を含めた YG4株を用て検討した．

いたエームス試験において変異原性を示したのは，255３．１

化学物質中83化学物質（32.5 %）で，残りの172化学物

TA株とYG株による変異原性の比較代表的な10変異原物質に対する YG 株の変異原性はそ質（67.5 %）は変異原性を示さなかった（図 1 ）． 4 株

れぞれ対応する TA 株での変異原性を1.0として比較しのうち活性酸素に感受性な YG3003株，アルキル化剤にた（表 1 ）． YG 株は，2‑ニトロフルオレン，2‑ニトロ高感受性な YG7108株は，それぞれ255化学物質中 8 ，ナフタレンを始めとした多環性芳香族炭化水素のニトロ12化学物質に対して変異原性を示すにとどまり，他の誘導体に対しては TA 株と比べて23.5‑1746倍と高い変2 株に比べると限定された化学物質にのみ変異原性を異原性を示した．一方， Glu-P‑1， Trp-P‑2のようなヘテ示した．

表1S . Typhimurium TA 9 8 , TA 1 0 0 株 と YG 1 0 4 1 ， 1 0 4 2 株 に お け る 感 受 性 の 相 違
S9変異原性( revertants / nmol)

化学物質名

mix

TA98株

YG1041株

TA100株YG1042株

2‑Nitrofluorene‑30(1.0)52,383(1,746.1)‑‑

1‑Nitropyrene‑453(1.0)

161,461(356.4)‑‑

1,8‑Dinitropyrene‑

213,343(1.0)

Glu‑P‑1+19,711(1.0)

8,436,283(39.5)‑‑

166,529(8.4)‑‑

Trp‑P‑2+10,493(1.0)

9,148(0.9)‑‑

2‑Nitronaphthalene

‑

‑

‑

4(1.0)

260(65.0)

2,4‑Dinitrotoluene

‑

‑

‑

134(1.0)

3,151(23.5)

4‑Nitroquinoline N‑oxide‑‑‑

1,002(1.0)

1,192( 1.2)

2‑Aminoanthracene+‑‑

84(1.0)3,927(46.8)

Benzo[a]pyrene+‑‑85(1.0)18( 0.2)- 73 -表2S . Typhimurium YG 1 0 4 1 株 ， 1 0 4 2 株 で 強 い 変 異 原 性 を 示 し た 上 位 1 0 化 学 物 質
変異原性菌株

化学物質名

変異原性

(revertants/

化学物質名nmol, +S9)

(revertants/nmol, ‑S9)YG

1 MeIQx

357,000

1

1,8‑Dinitropyrene

4,550,000

1041

2 Trp‑P‑2312,0002

1,6‑Dinitropyrene

2,450,000

3 Aflatoxin B1294,000

33‑Nitrofluoranthene

112,000

4 PhIP

120,000

4NIP

16,800

5 3‑Methylcholanthrene

43,40052‑Nitrofluorene

6,720

6 2‑Aminoanthracene

21,400

6MEP

4,700

7 Pyrene

19,800

7Benzo[b]fluoranthene

4,630

8 1,2‑Benzanthracene

4,750

82,4‑Dinitroaniline

3,640

9 NIP

4,380

9N‑Phenyl‑1‑naphthylamine

3,360

10 Benzo[a]pyrene

3,500

10Captans

3,220

YG

1 Aflatoxin B1

408,000

11,8‑Dinitropyrene

2,240,000

1042

2 MeIQx

116,000

21,6‑Dinitropyrene

1,870,000

3 PhIP

82,70031‑Nitropyrene203,000

4 Trp‑P‑258,800

4NIP

56,000

5 3‑Methylcholanthrene

47,04054‑Nitroquinoline‑N‑oxide

51,1006 NIP33,600

6Malathion

34,000

7 2‑Aminoanthracene

26,6007MEP20,500

8 Benzo[a]pyrene

17,5008Maneb

18,3009 MEP

16,1009Aniline

17,20010 Benzo[e]pyrene

15,700

10N,N‑Dimethylformamide

15,600試験の代謝活性化を補完する方法として，ヒト由来の肝臓 S9を用いて比較検討した．その結果，ベンツピレン，非変異原性
67.5%

3-メチルコランスレン，ピレンなどの多環性芳香族炭化水素， MeIQx， Trp‑ P‑2などのヘテロサイクリックアミンにおいては，ヒト由来の肝臓 S9を用いると変異原性は多少低くなるものの測定可能なことが示唆された（表3 ）．またアフラトキシン B1， PhIP のようにヒト由来
肝臓 S9によって変異原性が低くなる化学物質，2 -アミ32.5%
変異原性

ノアントラセンのように逆に変異原性が高くなる化学物

YG1041(31chemicals), YG1042(61chemicals)
YG3003( 8chemicals), YG7108(12chemicals)

図1質も認められた．

エームス試験を用いた変異原性試験結果

今回のエームス試験において，ラットとヒトの肝臓S9を用いた変異原性には相違があることが明らかとなり，変異原物質のヒトへのリスク評価という観点から考３．３

ヒト由来肝臓S9を用いた変異原性えた場合，用いる代謝活性化系について考慮していく必

通常エームス試験における代謝活性化は， PCB など要があると思われた．

をマウス腹腔内投与してチトクローム P450系酵素を誘

さらに高感受性株である YG1041株を用いたエームス導した肝臓 S9を用いて実施する．ここでは，エームス試験を環境試料（河川水試料）に適用した．試料は，同- 74 -表3ラットまたはヒト由来の肝臓 S9mix を用いた活性化法として従来から用いられているラット肝臓 S9エームス試験の比較

mix に加えてヒト肝臓 S9mix を用いたエームス試験を併用することにより，化学物質の変異原性を両酵素による変異原性 ( revertants/nmol)

YG1041株

化学物質名

ラット

YG1042株

ヒト

相違を検討することが出来る．

ラット

ヒト

謝辞

Aflatoxin B1

294,000

8,150

408,000

10,4002‑Aminoanthracene

21,40048,50026,60056,200

本研究は，環境省未来創造型基礎研究推進制度プロジ

1,2‑Benzanthracene

4,750

250

1,990120

ェクト「化学物質による生物・環境負荷の総合評価手法

3,500

1,420

17,5003,850の開発に関する研究」（平成 9 −12年度，研究代表者 内MeIQx

357,000

113,000

116,000

86,400

海英雄教授）により実施した．

3‑Methylcholanthrene

43,40017,60047,00019,700

NIP

4,380

170

33,600220

PhIP120,000

8,630

82,7006,3801) Ames, B.N., McCann and Yamasaki, E. ： Methods for

Benzo[a]pyrene

文献

Pyrene19,70017,400

4,280

3,750

detecting

Trp‑P‑2

312,000

24,50058,8003,840

Salmonella/mammalian-microsome

carcinogens

andmutagens

witht hemutagenicity

test,

Mutation Res., 31, 347‑363, 1975.
一河川の 3 カ所において採取した（採取地点 1 と 2 の2) MaCann, J., Choi, E., Yamasaki, E. and Ames, B. N. ：間に処理水が放流されている）．YG1041株においては代Detection謝活性化を必要としない系(-S9）においてはいずれの採

Salmonella/microsome test ; assay of 300 chemicals, Proc.

取地点でも変異原性が認められたことから，処理水以外

Nat. Acad. Sci., 72(12), 5135‑5139, 1975.の汚染源によるものと考えられた．代謝活性化を必要と

3) Hagiwara, Y., Watanabe, M., Oda, Y., Sofuni, T. andする系( +S9）においては処理水放流の下流においてのNohmi, T. ： Specificity and sensitivity of Salmonella

み変異原性が認められた．このことは，処理水中に代謝typhimurium YG1041 and YG1042 strains possessing elevated

活性化を受けて変異原性を示す変異原物質が存在するこlevels of both nitroreductase and acetyltransferase activity,とを示唆している．同時に SS， BOD 及び COD などに

Mutatation Res., 2 61, 171‑180, 1993.

ついても測定したが明らかな相関は認められなかった

4) Suzuki, M., Matui, K., Yamada, M., Kasai, H.,（図 2 ）．このことから，高感受性株である YG1041株

Sofuni, T. and Nohmi, T. ： Construction of mutants ofを用いたエームス試験は代謝活性化法を併用することに

Salmonella typhimurium deficient in 8 -hydroxyguanine DNA

より環境試料の変異原性測定に利用可能なことが示唆さ

glycosylase and their sensitivities to oxidative mutagens anれた7)．

nitro compounds, Mutation Res. ,393, 233‑246, 1997.

ofcarcinogens

asmutagens

inthe5) Yamada, M., Sedgwick, B., Sofuni, T. and Nohmi,
15T. ： Construction

3,000
2,500

10

2,000
1,500
51,000

化学分析値（mg/l）

変異原性（revertants/g）

3,50021995.

3

河川水の採取地点

6) Tokiwa, H., Sera, N., Kai, M., Horikawa, K.

図２ 河川水の変異原性と化学分析との関連
YG1041(‑S9)

YG1041(+S9)

of mutants of-methylguanine, J.Bacteriology, 177( 6 ), 1511‑1519,

01characterization

Salmonella typhimurium deficient in DNA repair of O65000andSSBOD

andCOD

Ohnishi, Y. ： The roleof nitroarenes inthemutagenicity of airborne particles indoors and outdoors,
４まとめ

Genetic Toxicology of Complex Mixtures, 165‑172, 1990.

新しい試験菌株（YG 株）を用いたエームス試験は，

7) 後藤純雄，遠藤治，松本寛，酒井茂克，茶川智

従来から用いられている試験菌株（ TA 株）よりも多く子，麻野間正晴，平山晃久，渡辺徹志，世良暢之，塚谷の化学物質の変異原性を検出することが可能である．ま裕子，多田敦子，若林敬二：大気浮遊粒子，河川水およた， YG 株を用いたエームス試験は河川水などの環境試

び土砂の変異原性モニタリング，環境変異原研究，22料の変異原性測定にも応用可能であった．さらに，代謝( 2 )，45‑ 5 ，2000.

- 75 -

Sensitive Ames test using Salmonella Typhimurium YG1041, YG1042, YG3003 and YG7108
for the detection of mutagenic chemicalsNobuyuki SERA1, Hiroko TSUKATANI1, Nobuhiro SHIMIZU1,Yoshito TANAKA2, Shigeji KITAMORI1 and Hideo UTSUMI3
1Fukuoka Institute of Health and Environmental Sciences,

39 Mukaizano, Dazaifu, Fukuoka 818-0135, Japan
2

Environmental Policies Division, Environment Department, Fukuoka Prefectural Government,

7-7 Higashikouen, Hakata-ku, Fukuoka 812-8577, Japan
3

Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyushu University,

3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka 812-8582, Japan
Nearly 90% of carcinogens have been proved to be mutagenic by Ames test using Salmonella Typhimurium TA98 or TA100.
However, a recent analysis showed that the correlation between mutagenicity and carcinogenicity was lower than that derived
from earlier analyses, and some carcinogens were not mutagenic for both S. Typhimurium TA98 and TA100.

In order todetect the weak mutagens, therefore, we need new strains of S.Typhimurium that are more sensitive than TA98 and TA100
for detecting mutagenicity.

We used new strains YG1041, YG1042, YG3003 and YG7108 in Ames test, and found thatthe new strains detected mutagenicity in 83 of 255 chemicals (32.5%) while TA98 and TA100 succeeded in 21 chemicals(8.2%),indicating the higher sensitivity of the new strains. Further, we found that the new strains could efficiently detect themutagenicity of environmental chemicals such as condensates of river water. Many promutagens remain inactive until enzymatictransformation to electrophilic species binding to DNA, and Cytochrome P450 in rat liver S9 fraction plays an important role inactivating promutagens to ultimate mutagens in Ames test. Rat and human liver S9 fraction behave differently as an enzyme
source for metabolic activation, and we found that human liver S9 fraction may provide new information about the genotoxicity
of chemicals.
[Key words; Ames test，Mutagenicity，S.Typhimurium YG1041，YG1042]- 76 -