課題番号：先２６指２０２

研究課題名：医師主導治験マラリアワクチンＦＩＨに向けた開発研究

主任研究者名 ：狩野繁之
キーワード：AD22, enolase, plasminogen, merozoite, gametocyte, ookinete

研究成果：原虫の生活史の 3 つのステージにおけるワクチン効果を検証し、それぞれで POC を得ることを目標とする。以下、それぞれのステージ毎に、初年度（平成 26 年 11 月 28 日採択、12 月 1 日開始）の実績を報告する。
1) メロゾイト（merozoite）期a) 抗 AD22 モノクローナル抗体の作成
モノクローナル抗体は、既製の抗 AD22 の 8 クローンを用いた。このうち 2 クローンは、新たにハイブリドーマをヌードマウスに接種し増殖させ（NCGM では動物実験倫理上、ハイブリドーマをマウスに投与出来ないので業者に委託）、得られた腹水よりプロテイン A カラムを用いて IgG を精製した。残りの 6 クローンは、ハイブリドーマを培養して上清よりIgG を精製した。
b) 抗 AD22 モノクローナル抗体を用いた in vitro 原虫増殖阻害試験
各クローンについて 5〜6ｍｇの IgG を調整し終わり、in vitro 原虫増殖阻害試験を開始した。培養上清中の抗体が、原虫が分裂体（schizont）に増殖するのを阻害する効果が顕微鏡下に観察された。今後、増殖阻害の定量化を図る。
c) plasminogen biding protein としての enolase の表面ペプチド配列
原虫表面 enolase とヒト plasminogen の結合を抗 AD22 抗体が阻害することにより、（プラスミン活性が得られず）原虫が宿主細胞に侵入するのが阻害されると考える。関連する研究から enolase の plasminogen 結合部位は、マラリア原虫の enolase のアミノ酸配列に換算して 260 番目から 285 番目のループ部分であると推定された。抗 AD22 抗体に反応する抗原エピトープである 8 残基の配列-NKTYDLDF-は、まさにこの部分に含まれる。そこでペプチドライブラリーを作成し、ELISA 法および Dot-blot 法で plasminogen が結合するアミノ酸配列の探索を行った（詳細はパワーポイント図を参照）。その結果、260 番目からの 5 残基-NKTYD-に強い結合性が認められた。
2) オーキネート（ookinete）期 （初年度内にスポロゾイトの調整が時間的につかないので、2 年度の計画を前倒した）マラリア原虫オーキネートに対する抗 AD22 抗体の結合能の解明を目的とし、共焦点レーザー走査顕微鏡観察で解析した。蚊体内に吸血によって取り込まれたマラリア原虫は、まず蚊の腸管内へと送られる。マラリア原虫はここでオーキネートとなり、吸血後約 20 時間後から中腸細胞に侵入し、24 時間後には中腸体腔側へと通過してオーシストを形成する。このような中腸ステージのマラリア原虫に対する AD22 特異的抗体の発育阻害効果を解析するに当たり、まずオーキネートに対する抗体の結合能の解析をおこなった。
ハマダラカ（Anopheles stephensi）に、マラリア原虫（Plasmodium berghei）ガメトサイトを含む血液をメンブレン・フィー
ディングにより吸血させ、20〜24 時間後にこれを回収した。マラリア原虫は、蚊中腸内での動態の観察を容易にするため、蛍光タンパク質 GFP を恒常的に発現する遺伝子組換えマラリア原虫を用いた。オーキネートが細胞内に侵入した状態の中腸を蚊から取り出し、抗 AD22 モノクローナル抗体 2 種、抗 AD22 ポリクローナル抗体 1 種、アクチンプローブ（Phalloidin）、核プローブ（TO-PRO-3）を用いて、免疫染色をおこなった。次に、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて中腸断面を観察し、中腸細胞内のオーキネートと抗 AD22 抗体の局在について、詳細な解析を行った。その結果、抗 AD22 ポリクローナル抗体を使用した染色により、中腸細胞内を通過中のオーキネートが部分的に染色される像が得られた。
初年度の結果から、抗 AD22 ポリクローナル抗体が蚊ステージのマラリア原虫に結合することが示された。これは、抗 AD22 抗体が中腸ステージのマラリア原虫に結合し、オーキネートの中腸侵入およびオーシストの形成を阻害する可能性を示唆している。また同様に、ヒトへの感染ステージであるスポロゾイトについても、抗体の結合による運動阻害効果が期待される。2 年度、蚊ステージのマラリア原虫に対する抗 AD22 抗体の発育阻害効果について、in vivo、invitro の両側面から、さらなる解析を実施する。
3) ガメトサイト（gametocyte）期a) ガメトサイト表面におけるエノラーゼの発現解析
現在上記の新たに精製した抗体を用いて、ガメトサイト表面におけるエノラーゼの発現解析の準備を進めている。

Subject No. ：26A202
Title：Research and development for malaria vaccine first-in-human investigator-initiated clinical trials

Researchers ：Shigeyuki Kano
Key word：AD22, enolase, plasminogen, merozoite, gametocyte, ookinete

Abstract：The purpose of this research is to obtain proof of concept (POC) on the effectiveness of the“AD22 vaccine” at 3 respective stages of the parasite life cycle.

1) merozoite stagea) Anti-AD22 monoclonal antibody
Eight monoclonal antibodies against AD22 amino acids were obtained as affinity-purified IgGs using
hybridoma cells.
b) In vitro growth inhibition test using anti-AD22 monoclonal antibodies
From each clone, 5 to 6mg of IgGs were purified and added to the supernatant of the parasite culture dishes.
Inhibition of the parasites’ growth from ring stage to schizont stage was microscopically observed. Growth
inhibition curve is now being obtained.
c) Enolase as a plasminogen biding protein
Plasminogen is believed to bind to the enolase, which is located on the surface of the parasite, and is
subsequently activated to the serine protease plasmin by host-derived tissue plasminogen activator or urokinase,recruiting potential proteolytic activity to encourage parasites to invade into the host cells.
Lorena et al. reported that the DKSLVK sequence of enolase located between amino acids 277-282 werebinding sites of plasmin(ogen). In this study, we identified more plamin(ogen) binding sites of enolase by usingsynthetic peptide libraries. The ELISA and Dot-Blot analyses of synthetic peptides representing a part of enolasesequences identified a 10-residue sequence NKTYDLDFKT located between amino acids 264-273 as a strongest
binding epitope mediating binding of plasminogen to enolase. Interestingly, the 10-residues were located within
an exposed surface-loop in each of the monomers of the quaternary structure of the enolase, which would besuitable target for inhibitory antibody, such as anti-AD22 antibody.
2) ookinate stage
Plasmodium gametocytes are taken up into mosquito midgut, where they develop into ookinetes, and theyinvade into the mosquito midgut cells. Within 24 h after mosquito blood meal, ookinetes reach basal lamina anddevelop into oocysts. Prior to analyzing capacity of anti-AD22 antibody to hinder midgut-stage ookinetes,
binding ability of it to ookinete was examined microscopically.
Anopheles stephensi, ingested P. berghei-infected mouse blood, was collected 20~24 h after blood meal.
GFP-expressing Plasmodium was used to facilitate microscopic observation. Midgut containing Plasmodium
ookinetes in its cells were dissected out and provided to the immunostaining with anti-AD22 antibodies (2monoclonal and 1 polyclonal antibodies), phalloidin (probe for actin), and TO-PRO-3 (probe for nucleus). The
longitudinal sections of ookinetes-containing midgut were analyzed with confocal laser-scan microscope for thelocalization of ookinetes and of anti-AD22 antibody.

The longitudinal images revealed the co-localization ofGFP-ookinete and anti-AD22 polyclonal antibody, indicating the binding capacity of anti-AD22 antibody to
midgut-stage ookinetes.
This finding suggests potential utility of anti-AD22 antibody to thwart parasites crossing midgut cells anddeveloping into oocysts. Further analysis in vivo and in vitro will characterize potential of anti-AD22 antibody tohinder Plasmodium development and its transmission capacity in mosquito.
3) gametocyte stage
Using the affinity-purified monoclonal antibodies, localization of AD22, part of enolase, on the surface ofgametocyte is to be elucidated.

Researchers には、分担研究者を記載する。

（先２６指２０２）医師主導治験マラリアワクチンＦＩＨに向けた開発研究 (1) （狩野・主任）
Figure 1. 原虫enolaseの各部分peptideによるplasminogen結合の比較(a) 設計したSeq1-Seq8部分peptideの配列

下記2法の解析結果より、Seq2, 3, 6, 7, 8に対してpeptide鎖とplasminogenの強い結合が観察された。
NKTYDの5残基が共通しており、特にSeq 3に強い結合が見られており、plasminogen結合部位と考えられた。
(b)ニトロセルロース膜を用いたDot-Blot法（DAB発色） (c) ELISAプレートを用いたELISA法（TMB発色）（先２６指２０２）医師主導治験マラリアワクチンＦＩＨに向けた開発研究 (2) （狩野・主任）
P.berghei GFP +Phalloidin

anti-AD22 polyclonal

TO-PRO-3

Merge

（方法）
1) 吸血20-24時間後のAn.stephesiを解剖し、中腸内のオーキネートを検出
2) 使用したP.berghei株はGFPを発現している
3) 中腸自体を可視化するために、ファロイジン（緑）も併用
4) 筋繊維の間に見えるバナナ型がオーキネート5) マゼンダ色が抗AD22ポリクローナル抗体染色6) 青色が核染色（TO-PRO-3）になります
7) 共焦点レーザー顕微鏡で観察したZ軸方向の重ね合わせ画像（結果）
1) 1/100希釈ポリクロでオーキネートが染め出された（右上）（生データに近く、シグナル強度は調整していない）
2) ポジのオーキネートの核部分は抜けているようだが、それ以外の部分での局在ははっきりしない
3) 一部、片側先端だけ染まっているように見えるオーキネートがある。
（結論）
オーキネートの表面にエノラーゼが発現している

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：先26指202
研究課題名：医師主導治験マラリアワクチンＦＩＨに向けた開発研究
主任研究者名：狩野繁之
論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

該当なし

学会発表
タイトル

発表者
Hiroyuki Oku, RisaEpitope mapping of inhibitory antibodies
Onishi, Utako Arai,targeting the loop region of Plasmodium
Yudai Kimoto, Keiichi
falciparum enolase using synthetic
Yamada, Kazuhiko Yano,
peptide libraries.
Shigeyuki Kano

学会名

場所
Centara Grand &Joint
Bangkok Convention
International
Centre atTropical Medicine
CentralWorld, Bangkok,
meeting 2014Thailand

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

発表先

場所

マラリアワクチン開発、治療効果も期待
国際医療センター、多国籍企業へ導出目指す

狩野繁之、助永義和

日刊薬業

じほう社

Govt-Backed Research Center Looks toLicense Malaria Vaccine to Mega Pharma

Kano S, Sukenaga Y

PHARMA JAPAN WEB

JIHO, Inc.

特許権者(申請者）（共願は全記載）

登録日(申請日)

特許取得状況について※出願申請中のものは(発明名称)記載のこと。
登録番号

該当なし

※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

研究発表及び特許取得報告について

年年月December,
2014

年月日
2015年2月18日

2015年2月27日

出願国