フォトニクスニュース 第 6 巻第4号

2021 年

バイオフォトニクス

銀 , 金 , 銀金合金ナノ粒子の光散乱を利用した
マルチカラー生体 1 分子追跡

Multicolor tracking of single biomolecules with silver, gold and silver-gold alloy nanoparticles
安藤 潤 1，飯野 亮太 2 Jun Ando1, Ryota Iino2

理化学研究所，〒 351-0198 埼玉県和光市広沢 2-1, 2 分子科学研究所 , 〒 444-8787 愛知県岡崎市明大寺町字東山 5-1
RIKEN，2-1 Hirosawa, Wako, Saitama 351-0198, Japan, 2 Institute for Molecular Science, 5-1 Higashiyama, Myodaiji, Okazaki,
Aichi 444-8787, Japann1
1

Abstract：Multicolor high-speed tracking of single biomolecules was demonstrated with silver, gold, and silver-gold alloy
nanoparticles. This article describes the development of a multicolor dark-field imaging system with a spectrophotometer, andapplications for single-molecule imaging of diffusional motions of phospholipids and stepping motions of kinesins.
Keywords：multicolor imaging, silver-gold alloy nanoparticles, single-molecule imaging, spectrophotometer

はじめに
金ナノ粒子は，タンパク質や脂質，細胞小器官など，様々な生体分子や生体内の構造を光学顕微鏡で観察するためのプローブとして広く用いられてきた 1）．標的とする生体分子や細胞小器官の挙動は，金ナノ粒子の光学像，なかでも暗視野像に現れる輝点を追跡することで観察できる．光学像の空間分解能は光の回折のため，波長の半分程度に制限されるが，孤立した単一の金ナノ粒子の中心位置は，ナノメートルスケールの図 1 銀，銀金合金，金ナノ粒子の TEM 写真と粒径分布 6）

高い精度で決定できる 2）．これにより，細胞膜におけるリン脂質の区画化された拡散運動や，タンパク質分金ナノ粒子をプローブに用いた単色のイメージングに子モーターのステップ状の運動の詳細な観察などが可限られてきた．本稿では，金ナノ粒子に加えて，銀ナ能となった．光学像における輝点の中心位置決め

ノ粒子と銀金合金ナノ粒子を用い，マルチカラー，か精度（位置決定精度）は，得られるフォトン数の平方

つ高速・高精度に生体 1 分子の光計測を行った事例に根に反比例する ．露光量の減少に伴ってフォトン数ついて紹介する 6）．銀ナノ粒子のプラズモン共鳴波長が線形に減少するため，高速かつ高精度な測定を実現

は 400 nm 付近に見られ，530 nm 付近にピークを示するには，膨大なフォトン数が必要となる．金ナノ粒す金ナノ粒子のプラズモン共鳴波長よりも 100 nm 以

子は，プラズモン共鳴に起因する強い光散乱を示すこ上短い．さらに，銀金合金ナノ粒子は，両者の中間にとから，サブミリ秒の時間分解能とナノメートルスケプラズモン共鳴波長を示す．我々は，銀，金，銀金合ールの位置決定精度を達成できる．我々の研究グルー

金ナノ粒子のそれぞれのプラズモン共鳴波長と一致す

プにより近年では，直径 40 nm の金ナノ粒子を用い，る複数のレーザーを光源に有する全反射マルチカラー

オングストロームレベルの位置決定精度と，マイクロ暗視野顕微鏡システムを構築した．さらに，検出光学秒オーダーの時間分解能も達成されている 5）．

系にイメージング分光器を用いることで，単一の二次

1, 3）

4）

生体分子が発現する複雑な生体機能を理解するに

元検出器の異なる箇所に，各波長の散乱画像を同時には，複数の生体分子が連携して働く様子を，同時に，結像する，新たな計測系を開発した．本稿では，上記かつ単一分子レベルで分析する必要がある．しかしなの計測系の開発に加えて，銀，金，銀金合金ナノ粒子

がら，これまで高速・高精度な生体 1 分子の光計測は，で標識したリン脂質分子の脂質膜中の挙動や，微小管

目次132マルチカラー全反射暗視野顕微鏡の構築
銀，金，銀金合金ナノ粒子を選択的に可視化するため，複数波長の光源を備えたマルチカラー全反射暗視野顕微鏡を構築した（図 3a）． 銀ナノ粒子の観察には 404 nm，銀金合金ナノ粒子の観察には 473 nm，金ナノ粒子の観察には 561 nm のレーザー光源を用いた．さらに，近接する金属ナノ粒子対のプラズモンカップリングを捉えるため，649 nm のレーザー光源も図 2 銀，銀金合金，金ナノ粒子の消失スペクトル追加した．これら 4 種のレーザー光源は，ダイクロイ6）

ックミラーによって同一の光軸に統合し，対物レン上を直進するキネシン分子の挙動を，ナノスケールのズ直下に配置した穴あきミラーを介して，開口数 1.40

位置決定精度とマイクロ秒の時間分解能で計測した結の油浸対物レンズに導いた．対物レンズの後ろ側焦点果についても紹介する．

面のエッジ部に各光源を集光してカバーガラス界面にエバネッセント場を形成し，ガラス上面の試料に対し銀，金，銀金合金ナノ粒子の粒径と光学特性て全反射照明を行った．試料から発生した散乱光は，穴あきミラーの中心部を透過させた後，イメージング本研究で光プローブとして用いた銀，金，及び金銀分光器の入射スリットへと導いた．イメージング分光

合金ナノ粒子について，透過電子顕微鏡（TEM）に器内部のグレーティングによって，波長毎に散乱光のよる観察を行った（図 1）．銀金合金ナノ粒子は，銀光路を分けることができる．さらに，イメージング分金の組成比が 1：1 のものを用いた．得られた TEM

光器のスリットを開くことで，各波長の散乱画像を，像から，金属ナノ粒子の断面積を計算し，形状が球体単一の 2 次元検出器（高速 CMOS カメラ）の異なるであると仮定した場合の粒子の直径を算出した．算出

部分にそれぞれ結像させることができる（図 3b）．マ

した金属ナノ粒子の直径の平均値（± 標準偏差）は，ルチカラーイメージングを行う検出光学系としては，銀ナノ粒子が 28.5（±4.4）nm，銀金合金ナノ粒子が31.5（±5.7） nm，金ナノ粒子が 39.9（±3.0）nm だった．
銀ナノ粒子と銀金合金ナノ粒子の粒径分布は，金ナノ粒子の粒径分布よりも広い傾向にあった．
次に，上記の銀，金，銀金合金ナノ粒子の分散液について，消失スペクトルを取得した（図 2）．本研究では，後述する生体１分子の計測において，金属ナノ粒子と生体分子を結合させるため，ストレプトアビジンで粒子表面を修飾している．このため，消失スペクトルの取得に際し，表面修飾なしの場合とありの場合について，それぞれ計測を行った．表面修飾なし，及び表面修飾ありの場合のプラズモン共鳴波長のピーク
位置は，銀ナノ粒子が 405 nm 及び 413 nm，銀金合金ナノ粒子が 455 nm 及び 463 nm，金ナノ粒子が 527nm 及び 530 nm に位置していた．表面修飾によって，金属表面の屈折率が変化し，いずれの金属ナノ粒子においても，共鳴波長のピーク位置が長波長シフトしている様子が見られた．表面修飾を行った銀ナノ粒子のピーク波長は，同じく表面修飾を施した金ナノ粒子よ図 3 マルチカラー全反射暗視野顕微鏡の模式図

り 117 nm 短く，銀金合金ナノ粒子のピーク波長は両（a）光学系．（b）スリット幅の調整によるマルチカラー暗視野
観察 6）．

者のほぼ中央に位置していることが確認できた．

目次

133

図 4 銀，銀金合金，金ナノ粒子のマルチカラー暗視野像 6）

図 5 マルチカラー暗視野顕微鏡で観察した銀，銀金合金，金ナノ粒子の中心座標の 2 次元プロットと位置決定精度 6）我々が用いたグレーティングの代わりに，複数のダイクロイックミラーを使用することもできる．しかしな近いほど，クロストークも高い傾向が見られた．クロがら，ダイクロイックミラーを用いる手法の場合，観ストークは，共鳴波長に合致したチャネルにおける粒察に用いるチャネル数が増えるに従って，光学系が複子の散乱強度を 100％とした場合に，最大で約 30％だ雑になる．さらに，各カラーチャネルの位置，回転角，った．クロストークを抑制するため，ピクセル強度の倍率，焦点位置などを調整する必要があり，複数の光オフセットを設定した．設定値は，リファレンスとな学素子を精密に調整することが求められる．また，多る金属ナノ粒子の散乱像の最大ピクセル強度の 15％

くの場合，複数の検出器が必要となることから，検出と定めた．図 4 に，15％のピクセル強度オフセットを器間で撮像時の露光のタイミングを同期させる必要が設定した場合の，銀，金，及び銀金合金ナノ粒子の暗出てくる．我々が開発したイメージング分光器を用い視野像を示す．オフセットの設定により，クロストーたマルチカラーイメージング装置の場合，複数のダイクを 8％以下に抑えることができた．

クロイックミラーを用いた光学系と比較して，極めて次に，ガラス基板上に固定した銀，金，銀金合金ナシンプルな構成をとることができる．さらに，視野のノ粒子に対して，暗視野像の動画を取得し，位置決定大きさとのトレードオフにはなるものの，検出光学系精度の解析を行った．銀ナノ粒子は 404 nm，銀金合に追加の光学部品を導入することなく，カラーチャネ

金ナノ粒子は 473 nm，金ナノ粒子は 561 nm の各カル数を任意に増加できる点も利点として挙げられる．

ラーチャネルの暗視野像に対して，粒子の暗視野像の中心位置（重心）を解析した．位置決定精度は，X 軸，銀金合金ナノ粒子の暗視野像と位置精度

Y 軸に沿った金属ナノ粒子の中心位置の分布の標準偏開発したマルチカラー暗視野顕微鏡を用いて，銀，金属ナノ粒子の中心位置の 2 次元プロットの代表例を金，銀金合金ナノ粒子の観察を行った．レーザー光強図 5 に示す．ドリフトがなく安定して粒子の中心位置差として算出した．333 µs の時間分解能で取得した

度は 404 nm，473 nm，649 nm が 3.2 µW/µm ，561を決定できていることがわかる．時間分解能を 1,000nm が 2.3 µW/µm2 で，時間分解能は 333 µs で撮像をµs，333 µs，及び 100 µs に変えながら測定したとこ行った．各粒子の散乱像は，それぞれ共鳴波長に合致

ろ，銀ナノ粒子（404 nm チャネル）は 0.6 nm，0.9した 404 nm，473 nm，及び 561 nm のチャネルで最nm，及び 1.4 nm，銀金合金ナノ粒子（473 nm チャも強い散乱光を示した．一方，それぞれの金属ナノ粒

ネル）は 0.6 nm，1.0 nm，及び 2.4 nm，金ナノ粒子（561子の散乱光が他のチャネルでも観察されるクロストーnm チャネル）では 0.6 nm，1.1 nm，及び 2.7 nm のクが見られた．単一の金属ナノ粒子の散乱強度を 4 つ位置決定精度が得られた．位置決定精度の値は，各金のカラーチャネルでそれぞれ比較し，各チャネル間の属ナノ粒子で類似した値であり，時間分解能が増加す信号のクロストークを評価したところ，カラーチャネるにつれて値が増加した．

2ルの波長が粒子のプラズモン共鳴波長のピーク位置に目次

134を示す．位置ずれ量は，全てのカラーチャネルにおいカラーチャネル間の位置ずれ補正てアフィン変換によって改善され，100 箇所の測定点の平均位置ずれ量を 16.6 nm 以下に抑えることができカラーチャネル間の位置ずれについても検証を行った．ここで述べたアフィン変換によるカラーチャネルた．まず、カバーガラスに固定した単一の金ナノ粒子間の位置ずれ補正を利用して，後述する脂質やタンパを，二次元的にステージ走査しながら暗視野像を取得

ク質の挙動の詳細な観察を行っている．

し，視野内に粒子散乱像の 10 × 10 のアレイパターンを形成した．光源として用いた 4 波長のレーザー光強脂質二重膜中を拡散するリン脂質の多色観察度を調整し，いずれのカラーチャネルでも同一程度の散乱光強度が得られる条件で計測を行った．アレイ開発したマルチカラー計測システムを用い，支持脂の間隔は，X 軸と Y 軸に沿ってそれぞれ約 1.0 µm と質二重膜中のリン脂質の拡散運動の観察を 100 µs の約 1.5 µm とし，暗視野像は 1,000 µs の時間分解能で時間分解能で行った．1 mol％のビオチン化リン脂質取得した．図 6 に，10 × 10 のアレイパターンの金ナを含む脂質二重膜をカバーガラス表面に形成し，ストノ粒子の暗視野像を示す．473 nm のカラーチャネル

レプトアビジンで金属表面をコーティングした銀，金，の暗視野像を，リファレンスとして用いた 561 nm の及び銀金合金ナノ粒子でビオチン化リン脂質を標識しカラーチャネルの暗視野像に重ね合わせて表示していて観察を行った．同一視野において，膜中のリン脂る．アレイの各位置でステージ走査を数秒間停止し質と結合した銀，金，及び銀金合金ナノ粒子が，404て，金ナノ粒子の中心位置を解析した．0.5 秒間（500nm，473 nm，及び 561 nm の各カラーチャネルにおフレーム）の中心位置の平均値を，アレイ毎に計算しいて同時に観察できた（図 7）．図 7c に，連続撮像した．404 nm，649 nm のカラーチャネルについても，て得られた動画の各フレームで金属ナノ粒子の中心座同様に操作を行った．位置決定精度は，404 nm，473標を解析して得られた，0.18 秒間のリン脂質の軌跡を

nm，561 nm，及び 649 nm のカラーチャネルでそれ示す．同一視野内の異なる脂質分子の挙動を，同時に，ぞれ 0.7 nm，0.6 nm，0.7 nm，及び 0.6 nm の条件でかつ高速に計測することが可能である．リン脂質の拡解 析 し た．404 nm ／ 561 nm，473 nm ／ 561 nm，散運動に関し，得られた軌跡の平均二乗変位（MSD）

及び 649 nm ／ 561 nm チャネル間の同一粒子の中心の計算を行い，異常拡散モデルに基づき，拡散係数と位置のずれ量を，アレイごとに計算した．平均位置ず

異常拡散の指数を算出した 8）．いずれの金属ナノ粒子

れ量は最大で 84.0 nm であり，ずれ量は視野依存性をも，異常拡散の指数は1に近い値をとっていたことから，示していた．上記のチャネル間の位置ずれを補正す

金属ナノ粒子で標識したリン脂質の挙動は，単純なブるため，アフィン変換を利用した 7）．561 nm チャネ

ラウン運動であることが示唆された．拡散係数は約 0.5

ルの金ナノ粒子の暗視野像をリファレンスとして用いµm2/s であり，金ナノ粒子を用いて脂質の拡散運動をた．図 6 に，アフィン変換前後の 473 nm チャネルの解析した先行研究の値とよく一致していた 9）．

画像を，561 nm チャネルの画像と重ね合わせた画像

上記の脂質の拡散運動の解析中，膜上の複数の金属ナノ粒子が一過的に近接する様子が観察された．例

図 7 膜中を拡散運動するリン脂質の多色観察

図 6 473 nm と 561 nm のカラーチャネル間の位置ずれ量
アフィン変換の有無でそれぞれ表示 6）．

（a）金属ナノ粒子で標識した膜中の脂質分子の模式図．（b）マルチカラー暗視野像．（c）連続撮像から取得した粒子の軌跡 6）．

目次

135

図8

図 9 微小管に沿って直進するキネシンのマルチカラー観察

近接する金属ナノ粒子対のマルチカラー高速観察（a）膜中のリン脂質に結合した銀金合金ナノ粒子と金ナノ粒子が近接した際の暗視野像．
（b）粒子対のギャップ距離と 649 nmのチャネルの散乱強度の時間変化 6）．

（a）キネシンに結合した銀 , 金 , 銀金合金ナノ粒子のマルチカラー暗視野像．
（b-d）各金属ナノ粒子で標識したキネシンの直進運動の軌跡．時間分解能 100 µs で取得 6）．

として，図 8a に，銀金合金ナノ粒子（473 nm チャしている様子が明らかとなった．ステップサイズは，

ネル）と，金ナノ粒子（561 nm チャネル）が近接しいずれのカラーチャネルにおいても約 16 nm であり，た際の暗視野像を示す．さらに，同一視野における，後ろ足が前足を追い越すハンドオーバーハンドで直進

649 nm チャネルの暗視野像も示す．2 つの金属ナノするとする以前の報告とよく一致していた 11）．

粒子は，22.9 ms 及び 31.1 ms において一過的に近接し，649 nm チャネルの散乱強度が近接時に顕著に増謝辞加した．金属ナノ粒子対の近接はプラズモンカップリングを誘起し，プラズモン共鳴波長の長波長シフトを生じる

この研究は JSPS 科研費 JP18H05424, JP18H02418,JP18H04755, JP18H01904 の補助を受けて実施した研．実際に，粒子対のギャップ距離と 649 nm

10）究成果である．

チャネルの散乱強度は逆相関の関係にあったことから（図 8b），649 nm チャネルの散乱強度の増加はプラズ【参考文献】

モンカップリングに起因すると考えられた．本研究1）Iino, R., et al.: "Single-molecule imaging and manipulationof biomolecular machines and systems," BBA - General
Subjects, 1862（2018）241-252.
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3）Fujiwara, T., et al.: "Phospholipids undergo hop diffusion incompartmentalized cell membrane.," J. Cell biol., 157（2002）
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5）Ando, J., et al.: "Single-Nanoparticle Tracking with Angstrom
Localization Precision and Microsecond Time Resolution,"
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6）Ando, J., et al.: "Multicolor High-Speed Tracking of Single
Biomolecules with Silver, Gold, and Silver–Gold Alloy
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7）N i e k a m p , S . , e t a l . ; " N a n o m e t e r - a c c u r a c y d i s t a n c emeasurements between fluorophores at the single-molecule
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8）Saxton, M. J., et al,: "Single-particle tracking: Applications tomembrane dynamics," Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 26（1997）373-399.
9）Mascalchi, P., et al.: "Probing the influence of the particle inSingle Particle Tracking measurements of lipid diffusion,"
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10）Ye, W., et al.: "Conformational Dynamics of a Single Protein
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11）Yildiz, A., et al.: "Kinesin walks hand-over-hand," Science, ,303
（2004）676-678.

では，100 µs の時間分解能，かつ多色計測によって，数ミリ秒程度しか持続しない一過的な金属ナノ粒子対の近接時の挙動を詳細に捉えることを可能にした．

分子モーターキネシンの多色観察
直進型のモータータンパク質キネシンのマルチカラー１分子イメージングにも取り組んだ．キネシンは，細胞内の小胞輸送を担い，微小管に沿って直進する 11）．
また，キネシンは二量体のモータータンパク質であり，2 つのモータードメインが交互にアデノシン三リン酸（ATP）を加水分解しながら前進する．2 つのモータードメインの 1 つを銀 , 金 , 銀金合金ナノ粒子で標識して観察を行った．ATP 濃度を 1 mM とし，100 µsの時間分解能で 5.92 秒間計測を行った．視野内の金属ナノ粒子のいくつかが，微小管に沿って直進する様子が観察された．直進するキネシンの軌跡を解析した
結果を図 9 に示す．微小管の長軸方向に平行な向きと直交した向きに分けてそれぞれ解析したところ，キネシンが微小管の長軸方向に沿って，ステップ状に直進

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