別刷り

全反射照明蛍光顕微鏡
東京大学

飯野亮太

「先端バイオマテリアルハンドブック」（2012年6月15日

株式会社エヌ・ティー・エス 刊）

第4編

バイオマテリアルの評価_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/_/

第 2 章 表面・界面の計測法

14 節

全反射照明蛍光顕微鏡

1 はじめに

ここで，I0 は界面におけるエバネッセント光の強度，z は界面からの距離，d はエバネッセント光の しみだしの深さ（到達距離） である。d は媒質の屈折

全反射照明蛍光顕微鏡は，観察試料の表面近傍のみを照らすエバネッセント光を局所的な励起光とし率，光の波長 λ，および入射角 θ（ ただし θ＞θc）によって決まる。て用いた蛍光顕微鏡である1）。空間的に限定された
d=励起光で背景光を大幅に低減することで，蛍光色素
1 分子からの微弱光の観察が容易にできる。本稿でλ（3）4 π ( n1 sin θ )2 − n22は，全反射照明蛍光顕微鏡の原理を解説し，筆者ら

例えば入射光の波長を 532 nm（2 倍波 YAG レーが行ったタンパク質の 1 分子計測への適用例を紹介

ザ），入射角を 66°とすると，ガラスと水の界面でする。

発生するエバネッセント光の水側へのしみだしの深さは d＝106 nm となる。

2 界面における光の全反射とエバネッセント光

3 エバネッセント光による照明法：プリズ
ム型と対物レンズ型

屈折率の高い媒質から低い媒質に向け光を入射する。このとき，入射角がある角度以上（臨界角）になエバネッセント光を蛍光顕微鏡の励起光として用ると光は両媒質の界面で全反射する。両媒質の屈折いると，ガラス表面から 100 nm 程度の距離に存在とすると臨界角 θc は（1）式で表さ率を n1, n（n21＞n2）れる。
sin θ c = n2 / n1（1）（a）

界面からの距離 z
エバネッセント光（d〜100 nm）

これはスネルの法則で低屈折媒質側の屈折角が90°であるのに相当する。全反射照明蛍光顕微鏡では，屈折率の高い媒質にはガラス（n1＝1.52），低い光強度 I媒質（生体試料）には水（n2＝1.33）が用いられ，ガラI0/eI0

入射光

スと水の界面の臨界角は 61.0°となる。

試料（水）n2＝1.33
ガラス
n1＝1.52d

反射光

入射角θ

高屈折率側から入射された光が界面で全反射する
際，界面の低屈折率媒質側の表面に光が しみだす 。
このしみだした光をエバネッセント光または近接場

エバネッセント光（b）s 偏光

光という2）。エバネッセント光は遠距離には伝播でp 偏光

きず，その強度 I は界面から離れるに従い指数関数

s 偏光的に減衰する（図 1（a））。
 z
I = I 0 exp  −  d（2）図 1 （a）エバネッセント光のしみこみの深さ（到達距離）（b）エバネッセント光の偏光特性（口絵❹参照）

─ 132 ─第2章

表面・界面の計測法て，最近は対物レンズ型が頻繁に使用されている（図（a）
プリズム

反射光3）
。対物レンズ型では，高い開口数（NA）をも2（b））

入射光

つ油浸対物レンズ（NA＝1.4 以上，最近は 1.45 ～ 1.49のものが主流）の辺縁部からレーザ光を入射しカバーガラスと試料の界面にエバネッセント光を形成スライドガラスさせる。高開口数の対物レンズは高倍率（60 倍以上）

試料エバネッセント光であるため広い視野の観察は難しいが，顕微鏡の落カバーガラス

射照明用ポートからレーザ光を導入するだけで構築できる。また最近は市販のシステムも購入可能である。

4 対物レンズ型全反射照明蛍光顕微鏡の構築

対物レンズ

蛍光対物レンズの開口数 NA は，焦点位置にある点光（b）

源から発せられる光をどのくらいの角度まで集めら

試料

エバネッセント光れるかの尺度であり，（4）式であらわされる。
カバーガラスNA = n1 sin θ NA

油浸オイル
θc

対物レンズ

θNA

入射光

後焦点面

蛍光（4）

ここで θNA はレンズが光を集めうる最大の角度であり，n1 はガラス（油浸オイル）の屈折率である（図2（b））。NA が 1.45 の対物レンズの θNA は 72.5°である。またガラスと水の界面の臨界角 61.0°は NA＝1.33 に相当する。対物レンズ型全反射照明蛍光顕微

反射光鏡の構築には，この臨界角以上の領域に相当する対

図 2 （a）プリズム型全反射照明法（b）対物レンズ型全反射照明法（口絵❹参照）

物レンズの辺縁部にレーザ光を入射する必要がある。対物レンズから出射された光を平行光にしてガラスと試料界面への入射角を一定にするため，レンする蛍光色素を選択的に励起することができる。光ズ（図 3 の L1）を用いて対物レンズの後焦点面に学顕微鏡上でエバネッセント光を形成させ照明光にレーザ光を集光させる。実際のレーザ光のビーム径用いる方法には，プリズム型と対物レンズ型の 2 種は無限小でなく有限な大きさをもつため，試料面上類がある（図 2）。プリズム型と対物レンズ型ともに，で形成できるエバネッセント光の面積は開口数が高励起光には平行性の高いレーザ光が用いられることいほど大きくなる。入射角の調整は，L1 の手前のが多い。

試料面と共役な位置にミラー（M1）を置きその角度

プリズム型では，試料プレパラートのスライドガをあおる方法（図 3（a）），および L1 の後に M1 を置ラス側に密着させたプリズムにレーザ光を入射してき平行移動させる方法の 2 種類が一般的である（図スライドガラス・試料界面で全反射させエバネッセ（3 b））。図 （3 c）
は前者（図 （3 a））の方法の設置例である。

1）。
ント光を形成させるのが一般的である（図 2（a））

対物レンズ型に限らず，全反射照明蛍光顕微鏡をプリズム型は広い視野を得られるという利点をも利用するうえで注意すべき点は，エバネッセント光

つ。一方，対物レンズが接するカバーガラスとは反の偏光特性である2）。全反射により形成されるエバ対側のスライドガラス面上にエバネッセント光を形

ネッセント光は，入射面に垂直な p 偏光方向の成分成するため，観察には試料の厚みを数 10 μm 程度はほとんど打ち消され，入射面に平行な s 偏光の成に非常に薄くするか，作動距離が長い対物レンズを分のみをもつ（図 1（b））。このため 1 方向のみから使用する必要がある。

光を入射して形成させたエバネッセント光は，ガラプリズム型のこのような欠点を解決する方法としス表面に平行な平面において大きく偏光している。

─ 133 ─第4編
（a）

バイオマテリアルの評価（b）

エバネッセント光（c）

エバネッセント光

倒立顕微鏡

後焦点面後焦点面L1DP

L1M1M1DM

BF

BEL2DP

L2ND
レーザ

レーザ

BEND

EMCCD

BEL1DP

BF

M1DM

EMCCD

ND

レーザ

図 3 プリズム型全反射照明蛍光顕微鏡の構築法（口絵❺参照）
ND：減光フィルター，BE：ビームエキスパンダー，DP：視野絞り，L1：レンズ，M1：ミラー，DM：ダイクロイックミ
ラー，BF：バリアフィルター，L2：第 2 対物レンズ。破線は顕微鏡内部の部品を示す。（a）L1 の前，試料面と共役な位置に M1 を置いて角度をあおる方法，（b）L1 の後に M1 を置いて平行移動する方法，（c）（a）の方式の構築例

よってガラス表面に強固に結合した個々の蛍光色素光学系の透過効率や検出器の感度等に基づいた計算

は，エバネッセント光の偏光方向に対して遷移モーから，蛍光色素 1 分子は十分検出可能な数の光子をメントがどちらを向いているかで励起効率が大きく発生していると指摘していた。問題は感度でなくむ異なり，蛍光強度に大きなばらつきが生じる。このしろ背景光の高さであった。昼間に星が見えないの問題を解決するため，直交する 2 方向から光を入射と同じ理屈である。1 分子蛍光観察のための背景光する方法や4），リング状の入射光を用いて試料面上の大幅な低減に適用されたのがプリズム型全反射照の蛍光色素の向きによらず一定の蛍光強度を得る輪

明蛍光顕微鏡であった9）。また木下らは，落射蛍光。またこの性顕微鏡でも背景光の要因を丁寧に取り除けば 1 分子質を逆手に取り，対物レンズ辺縁部に沿って入射位蛍 光観 察が可能 であ ること をほ ぼ同時 期に 示し置を周期的に回転させることでエバネッセント光のた10）。このように蛍光色素 1 分子の観察の実現には偏光の向きを一定周期で回転させ，タンパク質に強日本の研究者達の努力が大きく貢献した。筆者が学固に結合させた 1 分子の蛍光色素の向きからタンパ

生時代に化学専攻から生物物理学に転向したのは，ク質自身の構造変化を検出する方法も報告されてい彼らの成果に多大な感銘を受けたからである。

帯全反射照明法が開発されている

5）6）

る7）8）。

対物レンズ型全反射照明蛍光顕微鏡による蛍光色
素 Cy3 の観察例を図 4（a）に示す。白く光る個々の5

蛍光色素の 1 分子観察輝点が 1 分子の Cy3 に相当する。時間とともに輝点の数が減っているのは分子がなくなったのではな
く褪色しているからである。褪色は励起された蛍光最近は EMCCD カメラ等の検出器の高感度化や色素が活性酸素等のラジカル種と反応して蛍光を発顕微鏡内部の光学部品が発する背景光の低減によしない構造に不可逆的に変化することで起こる11）。

り，水溶液中の蛍光色素の 1 分子観察は比較的容易

褪色は確率的に起こり，水溶液中の酸素を除去するに達成できる。半ば観えて当然になっており，学生ことで褪色までの時間をある程度長くすることも可に画像を見せてもとくに感動しない。しかしながら能である。図 4（b）には別の蛍光色素，Atto647 の蛍

これが初めて達成された 1995 年以前には，可能だ光強度の時間変化を示す。矢印の点で突然，蛍光強と考えている研究者は多くはなかった。柳田は結像度が背景光のレベルまで落ちているのがわかる。こ─ 134 ─第2章

表面・界面の計測法のような不可逆的な 1 段階での褪色が 1 分子の蛍光にしたのは，細胞膜中のタンパク質の拡散運動は細色素の特徴であり，1 分子レベルで検出できている胞質中のタンパク質のそれに比べ格段に遅いので観かの簡便な指標としてよく用いられる。1 分子計測察しやすいと考えたからである。タンパク質を標識によく用いられる Cy3 やテトラメチルローダミン

する蛍光色素としては，標的タンパク質と遺伝子レといった蛍光色素は，褪色するまでに 107 ～ 108 個ベルで融合できる緑色蛍光タンパク質（GFP）を選ん程度の光子を放出する 。顕微鏡システム全体の光だ。細胞に発現させた GFP 融合タンパク質の 1 分子の検出効率は 1％程度なので，褪色までに放出さ子イメージングが可能になれば，どんなタンパク質れる 10 ～ 10 個程度の光子を用いて観察を行うこの 1 分子観察も原理的には可能になると考えたからとになる。励起光の強度を上げると励起の頻度が高である。他のグループとの競争もあり，Cy3 等で標くなり，単位時間あたりに放出される光子の数が増識した膜タンパク質の 1 分子観察は先を越されてい加するのでシグナルも増加するが，観察可能時間はたが 14）15），GFP はまだ精製された試料の 1 分子観短くなる。分子吸光係数と量子収率がともに高い上察が報告されていたのみであった16）～18）。

12）

5

6

記の色素の観察可能時間は数十秒から長くて数分程

実は実験に取り組む前には，自家蛍光が高い（と度，達成可能な時間分解能は最高で 1 ミリ秒程度で考えられていた）細胞内で GFP1 分子を観察するのある。

は難しいだろうと，複数の方からコメントをいただいていた。しかしながら自作の対物レンズ型全反射6

応用例：生きた細胞内の緑色蛍光タンパク質の 1 分子観察

照明顕微鏡で実際に観てみると，初めてのトライであっけなく簡単に成功してしまった（図 5 左）。細胞膜上を多数の輝点が動き回っていた。あのときの感動は今でも覚えている。まさに案ずるより産むがちょっと古い話になるが，筆者が最初に取り組んやすしである。輝点の蛍光強度（分子の会合数）と運だ観察例を紹介する。ほ乳類培養細胞膜上の膜タン動性の相関を調べたところ，数分子が会合体を形成

パク質の 1 分子観察である13）。膜タンパク質を標的するだけで運動性が著しく低下することが明らかになり，膜タンパク質の新しい運動制御モデルを提案することができた。これが筆者の初めての原著論文（a）0s5sとなった。

10 s

単量体
単純拡散

1 µm（b）

褪色
蛍光強度（AU）

120

単量体
単純拡散8040

二量体
制限拡散

1 分子の蛍光強度

001020

三量体
制限拡散30時間（秒）図 4 蛍光色素の 1 分子観察（a）Cy3 の観察画像（30 μm×30 μm）。ICCD カメラを用い30 フ レ ー ム／ 秒 で 撮 影。 励 起 光 強 度：1 μW/μm2，（b）
Atto647 の蛍光強度の時間変化の例。15 秒付近（矢印）で褪色が起きている。

250 nm

図 5 生きた細胞での GFP 融合膜タンパク質の 1 分子観察例
輝点の軌跡から運動性が，蛍光強度から会合数が計測できる。数分子が会合すると膜上での運動性が大きく制限される。

─ 135 ─

第4編

バイオマテリアルの評価

細胞内での GFP 融合タンパク質の 1 分子観察に（a）（b）

成功したポイントは，発現量が非常に低い細胞を丁金コロイド（40 nm）寧にスクリーニングしたことであった。全反射照明
蛍光顕微鏡の横方向の空間分解能は通常の光学顕微鏡と変わらず，観察波長の 1/2 程度である。よって，細胞膜上での密度が高すぎると個々の分子を識別す

F1 モーター
2 µmることは困難となる。一方，密度が十分低く 1 分子

カバーガラスを識別できれば，その分子の像（点像分布関数）の中心位置は空間分解能よりも高い精度（数 nm ～数（c）10 nm）で決定することができ ，運動の軌跡を追19）

累積回転数跡することが可能である（図 5 右）。
筆者はその後もしばらくは細胞を対象とした 1 分子蛍光観察法の開発に携わり，波長特性の異なる 2種の蛍光色素 1 分子間の共鳴エネルギー移動（いわゆる FRET）や 2 色同時観察で異種分子間の複合体

64

重心の軌跡

220 nm0形成のダイナミクスを計測する方法を報告し0た20）21）。興味のある方は原著論文を参照されたい。

7 蛍光以外への応用例：全反射照明暗視野
顕微鏡

エバネッセント光は蛍光色素の励起以外にも用い4080時間（ms）

120160

図6全反射照明暗視野顕微鏡による F1 モーターの 1 分子回転観察（口絵❹参照）（a）直径 40 nm の金コロイドの観察像，（b）F1 モーターの回転実験の模式図，（c）累積回転数の時間変化。挿入図は金コロイドの重心の軌跡。120°離れた 3 ヵ所で停止しながら回転しているることができる。筆者らは最近，対物レンズ型照明法を適用した新しい暗視野顕微鏡を開発したので最22）。暗視野照明法は蛍光では後に紹介したい（図 6）

運動を 10 μs の時間分解能で観察した例である。1なく散乱光を検出する方法であり，直径数 10 nm

秒間に数百回転という高速回転中のステップと停止の金コロイドや数 100 nm のポリスチレンビーズをが明確に見えており，F1 ─ ATPase がステッピング高いシグナル／ノイズ比（S/N 比）で観察できる。

モーターであることが明確に観察できている。本手S/N 比が高いため 1 μs といった高い時間分解能で法はまた，リニアモータータンパク質である myo-の観察が可能であり，さらに蛍光色素と異なり褪色

sin VI のステップ型直進運動の詳細な解析にも適用は起こらないので長時間観察ができる。金コロイドされている23）。この手法はさらに，蛍光像と散乱像やポリスチレンビーズはタンパク質よりも大きいのの同時観察にも容易に適用できる。モータータンパで機能を阻害する可能性もあるが，これらの比較的ク質の運動の素過程と蛍光性基質の結合・解離のタ

大きなプローブをつけてもタンパク質で出来た生体イミングの同時計測にも活用できると期待してい分子機械は問題なく働く場合が意外と多い。

る24）25）。

我々の暗視野法は非常にシンプルで，図 3 の対物8 結語

レンズ型光学系のダイクロイックミラー（DM）を，中心に穴の開いたミラーに交換するだけである。金コロイドで散乱された光は中心の穴を通って検出器に到達する。穴を通ることで対物レンズの実効開口

全反射照明蛍光顕微鏡に限らず，顕微鏡を使った数が低下し，プローブの像（点像分布関数）は若干広

研究の醍醐味は，世界でまだ誰も観たことのない映がるが，高い精度で位置を決めることはできる。

像を初めて目の当たりにするチャンスに巡り合える

図 6 は回転モータータンパク質 F1 ─ ATPase の回転ことだと思う。皆さんにもこの喜びをぜひ体験して─ 136 ─第2章

いただきたい。また全反射照明蛍光顕微鏡を用いた
1 分子蛍光観察は最近，超解像蛍光顕微鏡や26）～28）

1 分子 DNA シークエンシング 29），1 分子プルダウンアッセイ30）などに発展しており，商業的にも大きな注目を集めている。しかしながらこれらの成果が日本でなく米国の研究グループから発信されているのは忸怩たる思いである。筆者自身も含め，日本の研究グループは 1 分子観察法の応用への展開をもっと真剣に考える必要があると考える。
●謝辞

本稿の図 4 のデータは榎佐和子博士，池田朋宏博士に提供していただいた。この場を借りて感謝する。
【引用・参考文献】
1）D. Axelrod : Methods Cell Biol., 30, 245 ─ 270（1989）．
2）D. Axelrod, T.P. Burghardt and N.L. Thompson : Ann.
Rev. Biophys. Bioeng., 13, 247 ─ 268（1984）．
3）M. Tokunaga, K. Kitamura, K. Saito, A.H. Iwane and T.
Yanagida : Biochem. Biophys. Res. Commun., 235, 47 ─53（1997）．
4）M.G. Bell, R.E. Dale, U.A. van der Heide and Y.E.
Goldman : Biophys. J., 83, 1050 ─ 1073（2002）．
5）H. Makyio, R. Iino, C. Ikeda, H. Imamura, M.
Tamakoshi, M. Iwata, D. Stock, R.A. Bernal, E.P.
Carpenter, M. Yoshida, K. Yokoyama and S. Iwata :EMBO J., 24, 3974 ─ 3983（2005）．
6）K. Adachi, K. Oiwa, T. Nishizaka, S. Furuike, H. Noji, H.
Itoh, M. Yoshida and K. Kinosita, Jr. : Cell, 130, 309 ─321（2007）．
7）T. Nishizaka, K. Oiwa, H. Noji, S. Kimura, E. Muneyuki,
M. Yoshida and K. Kinosita, Jr. : Nature Struct. Mol.
Biol., 11, 142 ─ 148（2004）．
8）T. Masaike, F. Koyama-Horibe, K. Oiwa, M. Yoshidaand T. Nishizaka : Nature Struct. Mol. Biol., 15, 1326 ─1333（2008）．
9）T. Funatsu, Y. Harada, M. Tokunaga, K. Saito and T.
Yanagida : Nature, 374, 555 ─ 559（1995）．
10）I. Sase, H. Miyata, J.E. Cor rie, J.S. Craik and K.
Kinosita, Jr. : Biophys. J., 69, 323 ─ 328（1995）．
11）T. Ha and P. Tinnefeld : Ann. Rev. Phys. Chem., 63,595 ─ 617（2012）．
12）X.S. Xie and J.K. Trautman : Ann. Rev. Phys. Chem., 49,441 ─ 480（1998）．
13）R. Iino, I. Koyama and A. Kusumi : Biophys. J., 80,2667 ─ 2677（2001）．

表面・界面の計測法

14）Y. Sako, S. Minoghchi and T. Yanagida : Nature Cell
Biol., 2, 168 ─ 172（2000）．
15）M. Ueda, Y. Sako, T. Tanaka, P. Devreotes and T.
Yanagida : Science, 294, 864 ─ 867（2001）．
16）A.H. Iwane, T. Funatsu, Y. Harada, M. Tokunaga, O.
Ohara, S. Morimoto and T. Yanagida : FEBS Lett., 407,235 ─ 238（1997）．
17）D.W. Pierce, N. Hom-Booher and R.D. Vale : Nature,388, 338（1997）．
18）R.M. Dickson, A.B. Cubitt, R.Y. Tsien and W.E.
Moerner : Nature, 388, 355 ─ 358（1997）．
19）A. Yildiz, J.N. Forkey, S.A. McKinney, T. Ha, Y.E.
Goldman and P.R. Selvin : Science, 300, 2061 ─ 2065
（2003）．
20）H. Murakoshi, R. Iino, T. Kobayashi, T. Fujiwara, C.
Ohshima, A. Yoshimura and A. Kusumi : Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 101, 7317 ─ 7322（2004）．
21）I. Koyama-Honda, K. Ritchie, T. Fujiwara, R. Iino, H.
Murakoshi, R.S. Kasai and A. Kusumi : Biophys. J., 88,2126 ─ 2136（2005）．
22）H. Ueno, S. Nishikawa, R. Iino, K.V. Tabata, S.
Sakakihara, T. Yanagida and H. Noji : Biophys. J., 98,2014─ 2023（2010）．
23）S. Nishikawa, I. Arimoto, K. Ikezaki, M. Sugawa, H.
Ueno, T. Komori, A.H. Iwane and T. Yanagida : Cell,142, 879 ─ 888（2010）．
24）A. Ishijima, H. Kojima, T. Funatsu, M. Tokunaga, H.
Higuchi, H. Tanaka and T. Yanagida : Cell, 92, 161 ─ 171（1998）．
25）T. Sakamoto, M.R. Webb, E. Forgacs, H.D. White and
J.R. Sellers : Nature, 455, 128 ─ 132（2008）．
26）S.T. Hess, T.P. Girirajan and M.D. Mason : Biophys. J.,
91, 4258 ─ 4272（2006）．
27）E. Betzig, G.H. Patterson, R. Sougrat, O.W. Lindwasser,
S. Olenych, J.S. Bonifacino, M.W. Davidson, J.
Lippincott-Schwar tz and H.F. Hess : Science, 313,1642 ─ 1645（2006）．
28）M.J. Rust, M. Bates and X. Zhuang : Nature Methods, 3,793 ─ 795（2006）．
29）T.D. Harris, P.R. Buzby, H. Babcock, E. Beer, J. Bowers,I. Braslavsky, M. Causey, J. Colonell, J. Dimeo, J.W.
Efcavitch, E. Giladi, J. Gill, J. Healy, M. Jarosz, D.
Lapen, K. Moulton, S.R. Quake, K. Steinmann, E.
Thayer, A. Tyurina, R. Ward, H. Weiss and Z. Xie :Science, 320, 106 ─ 109（2008）．
30）A. Jain, R. Liu, B. Ramani, E. Arauz, Y. Ishitsuka, K.
Ragunathan, J. Park, J. Chen, Y.K. Xiang and T. Ha :Nature, 473, 484 ─ 488（2011）．

─ 137 ─＜飯野亮太＞