課題番号：２６指００１
研究課題名：幹細胞ニッチの低酸素制御の研究
主任研究者名 ：田久保 圭誉
キーワード ：造血幹細胞、幹細胞ニッチ、低酸素応答、メタボロミクス
研究成果：
臓器幹細胞は自己複製能と多分化能を持つ細胞集団で、多くの臓器の組織発生や恒常性維持のために機能する。また、再生医療に不可欠の細胞ソースとして人為的な操作・増殖技術の確立は重要である。
幹細胞性を規定する転写因子ネットワークは、幹細胞に特有の生物現象(自己複製、非対称分裂、静止期維持、分化、遊走、ニッチへのホーミングなど)を実行するためのエネルギーを供給する代謝プログラムを起動する。近年、主任研究者らは幹細胞特有の代謝特性とそれを維持する分子機構が存在していることを低酸素環境である骨髄に存在する造血幹細胞の解析から見出してきた。しかし、その全貌や、各種病態における寄与や機能、標的治療・診断技術開発の可能性は不明である。本研究課題においては定常状態とストレス下の造血幹細胞における代謝特性とそれを維持する分子機構を解明することでこれらの問題の解決を図り、新規の診断・治療法に寄与しうる知見を見出すことを目指すものである。本年度は主に下記の 2 つの研究成果を得た：
1) 全身性の細菌感染時に造血幹・前駆細胞とそのニッチが多様に障害されることを見出し、その分子機構を解明した。これらの造血変容を引き起こす分子機構として、原核生物が 2 分子の GTP から合成する代謝産物 cyclic-di-GMP の重要性を見出し、宿主側の受容体である STING を介したシグナルの活性化が中心的なシグナルであることを見出した。cyclic-di-GMP のマウスへの投与によって、下記に示す造血変容が引き起こされ、これらの変容は STING 欠損マウスにおいてキャンセルされた。まず、骨髄の造血幹細胞は定常状態における細胞周期が静止期から、細胞周期に進入して活発に増殖している状態となる。これらの cyclic-di-GMP に曝露された造血幹細胞を致死量放射線照射したレシピエントマウスへと移植すると、末梢血への寄与と骨髄を再構築する能力を失っていた。細胞内代謝特性に関しては cyclic-di-GMP は解糖系を亢進させて、その一方細胞内の ATP 量は減少していた。一方、骨髄の多能性前駆細胞は cyclic-di-GMP 投与によって活発に増殖し、骨髄から遊走して末梢血や脾臓に出現する。そして脾臓においては髄外造血を行う。前駆細胞においても幹細胞と同様の代謝変動を呈していた。血球分化能に目を向けると、多能性前駆細胞は骨髄球系への分化が亢進する一方、赤芽球・巨核球系への分化は抑制されており、自然免疫系の細胞を産生するのに好都合な分化能の変容が確認された。こうした血球側への影響だけでなく、ニッチ側にも STING 依存性の変容が誘導される。まず、骨髄の血管腔の拡張が認められる。さらに、骨髄の各種のニッチ細胞(間葉系前駆細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞)が減少する。これらのニッチ側の異常の中心は STING を高発現する間葉系前駆細胞(CD140a+CD51+CD45-Ter119-CD31-)分画であると考えられた。この分画で造血幹細胞ニッチ因子セットの発現が統一的に低下しており、造血幹・前駆細胞の骨髄における変容と髄外への移行の一因であると考えられた。トランスクリプトーム解析から、間葉系前駆細胞において TGF-シグナルの活性化と血清中の G-CSF 上昇を認めた。 実際、cyclic-di-GMP 投与の際に阻害剤による TGF-シグナルの遮断や、G-CSF 受容体欠損マウスの使用によって造血前駆細胞の髄外への移行は抑制された。以上の知見
は全身性細菌感染時における造血変容とその分子機構を明らかにする知見である。
2) これまで若年齢(10 週齢)の造血幹細胞と分化血球の代謝プロファイルをメタボローム解析から得てきた。これは現存する未分化幹細胞における唯一の統合的な代謝解析結果である。しかし、造血幹細胞が発生時期を通じて代謝動態の変動を起こすかは不明であった。また、造血幹細胞から分化していく過程で各血球系統に運命が決まった前駆細胞における代謝特性についてもリファレンスとなる代謝データは得られてこなかった。これらの問題を打開するために、本年度はキャピラリー電気泳動で代謝物を分離したうえで四重極型質量分析計を用いたメタボローム解析を行うことでマウス発生時期の造血幹細胞と各種造血前駆細胞のメタボロームデータの取得を行った。その結果、造血幹細胞は発生時期を通じてダイナミックに代謝プロファイルを変化させることが明らかになった。とりわけ、細胞周期が静止期化する 3 週齢から 4 週齢にかけて代謝プロファイルが変容することが明らかになった。

Subject No.

：26-001(Project research)

Title：Elucidation of stem cell niche regulation by the hypoxia-response system

Researchers ：Keiyo Takubo (Project director, Department of Stem Cell Biology, ResearchInstitute, National Center for Global Health and Medicine)
Key word：hematopoietic stem cell, stem cell niche, hypoxia response, metabolomics

Abstract：Stem cells exhibit a number of characteristic features, including the capacity for self-renewal anddifferentiation into multiple cell types, stress resistance, and drug efflux activity. These specificbiological characteristics are supported by signals from the surrounding niche and the stem
cell-specific transcription factor set, including hypoxia and the machinery that senses low oxygenlevels. These properties are essential for normal stem cells, and when defective may induce
cellular senescence and tumorigenesis. In this project research, we will focus on the regulatory
mechanism of hematopoietic stem cell (HSC) system that maintain lifelong hematopoiesis. Weinvestigated the following topics in FY2014.
1) Upon systemic bacterial infection, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) migrate to
the periphery in order to supply a sufficient number of immune cells. Althoughpathogen-associated molecular patterns reportedly mediate HSPC activation, how HSPCs detect
pathogen invasion in vivo remains elusive. Bacteria use the second messenger bis-(3'-5')-cyclic
dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP) for a variety of activities. We found that c-di-GMP
comprehensively regulated both HSPCs and their niche cells through an innate immune sensor,
STING, thereby inducing entry into the cell cycle and mobilization of HSPCs while decreasing thenumber and repopulation capacity of long-term hematopoietic stem cells. Furthermore, weclarified that type I interferon acted as a downstream target of c-di-GMP to inhibit HSPC
expansion in the spleen, while transforming growth factor-β was required for c-di-GMP-dependent
splenic HSPC expansion. These results define machinery underlying the dynamic regulation ofHSPCs and their niches during bacterial infection through c-di-GMP/STING signaling.
2) Defining the metabolic programs that underlie stem cell maintenance will be essential fordeveloping strategies to manipulate stem cell capacity. We previously reported that glycolytic
metabolic status governed by Pdk acts as a cell cycle checkpoint that modulates HSC quiescenceand function in steady state. However, how metabolic features change during development is still
unclear. Also, how metabolome differs among HSPC fractions is totally unknown. We directly
investigated these issues using metabolomic analysis. We found that HSCs change their metabolicphenotype during ontogeny. In addition, HSCs and various progenitor cells showed different
metabolic profiles. Notably, proliferating HSCs in the fetus and neonates and proliferatingprogenitors showed different metabolic profiles, suggesting that cell cycle status is not the cause of
metabolic difference among fractions.

Researchers には、分担研究者を記載する。

26指001 幹細胞ニッチの低酸素制御の研究（主任研究者：田久保圭誉）

細菌由来の代謝物cyclic-di-GMPは造血幹・前駆細胞とニッチ細胞の動態を変化させる★cyclic-di-GMPによる造血幹・前駆細胞への影響の解析--細菌由来の代謝産物
cyclic-di-GMPは骨髄の造血幹細胞を減少させ、多能性前駆細胞を増加させる--造血幹細胞の骨髄移植能を低下させる。
--造血幹細胞ニッチ細胞の数と機能を低下させることで造血幹前駆細胞による髄外造血を亢進させる--これらの変容はホストのc-di-GMP受容体STING依存的である。
(Kobayashi et al. Cell Reports 2015)

26指001 幹細胞ニッチの低酸素制御の研究（主任研究者：田久保圭誉）

造血幹・前駆細胞のメタボローム解析に基づいた代謝プロファイル取得とその変容同定★CE-QqQMS解析による造血幹・前駆細胞の解析--解析した細胞分画の増加することで統合的なデータセットを取得。
--高感度な手法の採用によって新規に検出された代謝産物が増加した。
--時期特異的な代謝産物プロファイル取得、時期ごとの造血幹細胞代謝特性変遷を同定した★ Fetal liver HSC (E14.5)★ BM HSC (3 week)★ BM HSC (4 week)★ BM LT-HSC (10 week)★ BM ST-HSC (10 week)★ BM MPP (10 week)★ BM CLP (10 week)★ BM CMP (10 week)★ BM GMP (10 week)★ BM MEP (10 week)

Metabolite extraction

CE-QqQMS analysis

研究発表及び特許取得報告について

課題番号： ２６指００１
研究課題名： 幹細胞ニッチの低酸素制御の研究
主任研究者名： 田久保 圭誉
論文発表
論文タイトルMegakaryocytes are essential for HSC
quiescence through the production ofthrombopoietin.

著者

掲載誌

#Nakamura-Ishizu A,#*Takubo K (#equal Biochem Biophys
contribution),
Res Commun.
Fujioka M, Suda T.

掲載号454(2):353-7.

年

2014

学会発表
タイトル

発表者

学会名

場所

年月

低酸素シグナルによる造血幹細胞の恒常性維
田久保圭誉
持機構

第103回日本病理学
広島国際会議場 2014年4月
会総会

造血器腫瘍による骨髄ニッチの変容制御

第87回日本内分泌福岡サンパレス 2014年4月
学会学術総会

田久保圭誉

ニッチによる造血幹細胞のエネルギー代謝特
田久保圭誉
性制御

日本生化学会平成26年度関東支部例 茨城大学会

造血幹・前駆細胞の解糖系代謝によるストレ
田久保圭誉
ス造血制御

第2回がんと代謝研 東京理科大学葛2014年7月
究会
飾キャンパス

巨核球ニッチによる造血幹細胞制御

田久保圭誉

新学術領域研究東京大学医科学「細胞運命制御」
2014年9月
研究所
領域会議

造血幹細胞ニッチによる造血恒常性制御

田久保圭誉

ANAクラウンプ
第13回熊本血液感
ラザホテル熊本 2014年9月
染免疫フォーラム
ニュースカイMegakaryocyte: a novel niche cell forhematopoietic stem cells

Keiyo Takubo

ニッチ-幹細胞相互作用による 造血系抗老化
田久保圭誉
システムの解明
Megakaryocyte: a novel niche cell forhematopoietic stem cells

Keiyo Takubo

2014年6月

第73回日本癌学会
パシフィコ横浜 2014年9月
学術総会
新学術領域｢幹細胞老化と疾患｣
千葉大学医学部 2014年10月
第1回領域班会議
第87回日本生化学
京都国際会館会大会

2014年10月

Stress response signaling in maintenanceKeiyo Takuboof hematopoietic stem cells

第76回日本血液学
大阪国際会議場 2014年11月
会学術集会

Roles of the hypoxia response system in
Keiyo Takubo
hematopoietic stem cells

第37回 日本分子生
パシフィコ横浜 2014年11月
物学会年会

造血幹細胞の恒常性維持とストレス応答

田久保圭誉

大学院特別セミナー

造血幹細胞とニッチの感染ストレス応答

田久保圭誉

慶應義塾大学医学
慶應義塾大学医部テニュアトラッ
2015年3月
学部
ク成果発表会

愛媛大学医学部 2015年2月

ニッチにある造血幹細胞のエネルギー代謝制第14回日本再生医田久保圭誉
パシフィコ横浜 2015年3月
御療学会総会
その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル
発表者
発表先
場所
年月日
該当なし
特許取得状況について※出願申請中のものは()記載のこと。
特許権者(申請者）
発明名称
登録番号
登録日(申請日)
出願国（共願は全記載）
該当なし※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。