ボトムアップ生物工学

セルフリーシステムにおける人工リボスイッチの構築
横林洋平

量の調節や，計算による，より厳密なシミュレーションはじめにも可能である 5)．その実装においても，試験管（マイク近年，無細胞翻訳系（cell-free translation system, CFTS）ロチューブ）内の均一系バッチ反応はもちろん，リポソーを基盤としたボトムアップ的合成生物学の研究が盛んにムなどの微小区画，マイクロ流路系を用いたフロー型リなってきている．CFTS 自体は 1960 年代から研究されアクターなど，柔軟性が高い．ており，大腸菌をはじめとした細胞抽出液に，基質アミこのようなセルフリーシステムは，より複雑，かつ高ノ酸，エネルギー源などを加え，任意の鋳型 DNA もし度な機能を実現するため，生細胞を用いた合成生物学とくは mRNA にコードされるタンパク質を合成できる ．

同様，さまざまな部品（パーツ）を必要とする．中でもまた，清水・上田らは，個別に精製された翻訳因子から特定の化合物（化学シグナル）を検出して，任意の遺伝再構成された CFTS である「PURE system」を 2001 年に子発現を制御する「遺伝子スイッチ」は，セルフリーシ

1)発表した．

ステムを外部または内部の化学環境とつなぐ重要なパー

1,2)

基礎的には，細胞のさまざまな機能を再構成することツである．

により，その動作原理を明らかにすることはもちろん，天然，人工を問わず，望みの化合物に応答する遺伝子最終的には「生きている」とみなせる人工細胞をボトム

スイッチは，生細胞系・セルフリーシステム共に有用でアップに構築することを目指した研究がある 3)．一方で，ある．しかし，これまでセルフリーシステムにおいて細胞という生物学的制約を排しつつ，遺伝子情報の転写用いられてきた遺伝子スイッチの多くは，Lac リプレッや翻訳といった緻密な生体分子システムを活用した「セサー /IPTG など，大腸菌で一般的に使用されている転ルフリーシステム」の応用を志向した研究も盛んになっ

写因子を基盤とした誘導発現系を転用したものであるてきている 4)．

（図 2A）．

これらのセルフリーシステムは，CFTS 中に遺伝子回路や代謝回路をコードした DNA を保持し，必要に応じてシステム内部や外部からの化学的もしくは物理的シグナルに応答したり，別のセルフリーシステムと通信したりする（図 1）．セルフリーシステムにおいては，CFTSに投入する鋳型 DNA や精製タンパク質の量を自由に調整可能であり，複雑な遺伝子回路や代謝回路の最適化に適している．また PURE system では，各種翻訳因子の図 1．セルフリーシステムの概念図
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沖縄科学技術大学院大学

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図 2．遺伝子スイッチの動作原理．
（A）転写因子（リプレッサー）を基盤とした遺伝子スイッチ．低分子化合物が転写因子と結合して，DNA オペレーター配列から乖離し，転写が活性化される．
（B）リボスイッチによる遺伝子発現制御．低分子化合物が mRNA の非翻訳領域にあるアプタマーと結合することにより，リボソーム結合部位（RBS）を開放し，翻訳を活性化する．

核酸化学・工学ユニット（教授） E-mail: yohei.yokobayashi@oist.jp

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一般に，大腸菌などの生細胞で機能する遺伝子スイッチをセルフリーシステムで利用する際には，転写因子や鋳型 DNA の量などを最適化する必要がある．転写因子を新規化合物に応答するように改変することも容易ではをさまざまな化学シグナルに動的に応答させるために，非常に有用なインターフェースとなり得る．
セルフリー人工リボスイッチ

人工遺伝子スイッチを作製することはできない．
したがっCFTS で機能する人工リボスイッチは比較的古くから報告されている．2007 年に Ogawa および Maeda は PURE
system で機能するテオフィリン応答性リボスイッチを報告している 8)．筆者らも大腸菌 S30 抽出液系でチアミン二リン酸応答リボスイッチを作製した 9)．Ogawa はそのて，将来的にはセルフリーシステムに特化した人工遺伝

後，コムギ胚芽由来無細胞タンパク質合成系において動子スイッチやその他のパーツを設計する必要がある．

作するリボスイッチを精力的に研究しており，真核生物ない．また，セルフリーシステムの利点の一つとして，細胞膜を透過しなかったり，毒性があったりするため，生細胞では検出できないような化学シグナルに対応できる可能性がある．その場合，当然ながら大腸菌を用いてセルフリーシステムにおけるリボスイッチの利点

特有のさまざまな翻訳制御機構を巧みに利用した人工リボスイッチを多く報告している 10,11)．また最近になり，大腸菌など，バクテリアで用いられる人工遺伝子スイッ

セルフリー系のバイオセンサーとしての応用を目指した

チとしては，転写因子を基盤とする物の他に，mRNA の研究が盛り上がりつつあり，その一環として，Bacillus

5 UTR（非翻訳領域）に存在するリボスイッチがある．

cereus 由来のフッ素イオン応答性リボスイッチを地下水

リボスイッチは，そのアプタマー領域が低分子化合物とのフッ素イオン含有量測定に用いた例がある 12)．

結合し，それに伴う RNA の構造変化が mRNA の翻訳効

これまでの CFTS における人工リボスイッチの多く率や転写伸長に影響を与えることにより，遺伝子発現をは，大腸菌などの生細胞で最適化されたものを転用する制御する（図 2B）．

か，CFTS 内で試行錯誤することにより作製されてきた．

これまでランダム RNA 配列から，目的化合物に結合す

CFTS は均一溶液系であり，しかも高価であるため，大る配列を，選択・増幅操作を繰り返すことにより取得する腸菌で成功している，高スループットスクリーニングやSELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponentialenrichment）法 6,7) によって，さまざまな化合物を認識する RNA アプタマーが得られてきた．このような人工ア進化工学的手法が適用しにくい．

プタマーを用いることにより，より多くの化合物に応答に応答するリボスイッチを実際に作製した 13)．その中にする人工リボスイッチを作製できる可能性がある．実際，は大腸菌が有する制約を回避するため，CFTS を用いてバクテリアや真核細胞中で機能する人工リボスイッチは評価されたリボスイッチもあったが，その性能には大き数多く報告されてきたが，これらのリボスイッチが応答なばらつきがあった．モデルとしては非常に細部まで考2016 年に Salis らは，熱力学的パラメータを用いたリボスイッチの自動設計モデルを構築し，6 種類の化合物する化合物はきわめて限定されている．その理由は，1）えられているが，その前提として必要な熱力学的パラアプタマーのリガンドとなる化合物が細胞内に効率良くメータが必ずしも入手しやすいわけではないことなどか到達しない，2）化合物に毒性がある，3）化合物が細胞ら，広く利用されるには至っていない．

内要素と非特異的に相互作用する，4）細胞内の環境がアプタマー結合に適していない，などが考えられる．

人工細胞とリボスイッチ

セルフリーシステムにおいても同様の問題が起こり得

CFTS をリポソームなどの疑似細胞膜に内包した人工るが，生細胞よりも制約が少ない．たとえば，開放系で細胞は，近年基礎・応用の両面から国内外で研究が加速あれば化合物の細胞膜透過性に依存せず，また，翻訳機している 3)．人工細胞内での遺伝子発現をリボスイッチ構に影響を及ばさない毒性も許容される．さらに必要でで制御することができれば，アプタマーにより認識可能あれば金属イオンや転写・翻訳因子などの濃度も，リボな任意の化合物により，mRNA にコードされた任意のスイッチに合わせて最適化できる．また，転写因子などタンパク質の発現レベルを時間的に調節できる．このよのタンパク質が関与しないこと，制御機構と制御対象遺うな化学応答性は，人工細胞と外界との通信，人工細胞伝子が一つの mRNA にコードされること（シス制御）か内での代謝経路調節，ドラッグデリバリーなどさまざま

ら，パーツとしてシンプルであり，より複雑な回路へのな用途に役立つといえる．

予期しにくい影響が最小化できると期待できる．
このように人工リボスイッチは，セルフリーシステム

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しかしながら，人工細胞内でのリボスイッチの利用はきわめて限られてきた．Martini と Mansy が 2011 年に
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脂質ベシクル内で構成された PURE system を用いて，大CFTS に高濃度で存在するヒスチジン（図 3A）に対して腸菌中で最適化されたテオフィリンリボスイッチによる選択的でなければならないということである．幸い，ヒGFP 発現制御を蛍光顕微鏡で定性的に観測した 14)．その後，Lentini ら 15) と Adamala ら 16) が同じテオフィリンスチジンに対して 60 倍以上選択的なアプタマーを得ることができた．

リボスイッチを，人工細胞間もしくは人工細胞とバクテ

次に，このアプタマーを用いて PURE system（PUREリア間の通信に用いたが，人工細胞内でのリボスイッチfrex® として市販されている）で機能する人工リボスイッ機能は直接測定されなかった．また，このテオフィリンチを作製した．この過程も半合理的設計と試行錯誤であ

リボスイッチのバルク CFTS 溶液中での性能も低く，るが，ヒスタミンが存在しない状態では，翻訳開始領域

Lentini らの測定ではテオフィリン添加時に発現量が 1.5が二次構造を作るような配列を設計し，ヒスタミンがア倍に増加したのみであった．

プタマーに結合した状態では，翻訳開始領域がオープン

このように，人工細胞およびセルフリーシステム一般．最終的に 5 mM という高になるように調節した（図 3C）において，「望みの化合物に応答する遺伝子スイッチ」

濃度ではあるが，ヒスタミン存在下でタンパク質発現がとして期待される人工リボスイッチが，いわば看板倒れ30 倍に増加するリボスイッチが得られた．

である現状を少しでも前進させるため，新規のアプタさらに，大阪大学の松浦グループとの共同研究により，マーを作製し，CFTS，人工細胞内で効率的に機能するヒスタミンリボスイッチの機能を人工細胞内で定量的に人工リボスイッチの構築を試みた．また，その過程で，解析した．人工細胞内での蛍光タンパク質の発現を，リセルフリーシステムで実用に耐えうるリボスイッチを作ボスイッチ機能を用いて制御し，人工細胞内の蛍光をフるための課題を洗い出すことも目的の一つであった．

ローサイトメトリーにより検出することで，初めて直接，今回筆者らはヒスタミンに応答する人工リボスイッチ定量的に解析することができた．これにより，リボスイッ．ヒスタミン（図 3A）はアレルギーチが個々の人工細胞内で機能していることが確認された．などに関連した炎症マーカー，神経伝達物質，食中毒原

さらに，ヒスタミンリボスイッチにより α- ヘモリシの開発を目指した

17)

因物質などとして重要な代謝物であるが，生物では細胞ンおよびホスホリパーゼ C の発現を人工細胞内で制御膜上の受容体で検出され，CFTS に容易に転用できる転し，それぞれ人工細胞内による低分子の選択的放出，お写因子は知られていない．したがって，まず SELEX 法

よび人工細胞膜の破壊，という現象を，ヒスタミンの有により，ヒスタミンに結合する RNA アプタマーを取得

無により制御することに成功した（図 3D）．

し た（ 図 3B）． 特 筆 す べ き 点 は， こ の ア プ タ マ ー は

図 3．ヒスタミン応答リボスイッチ．（A）ヒスタミンおよびヒスチジンの構造．（B）ヒスタミンアプタマー．（C）ヒスタミン応答リボスイッチの動作原理．（D）人工細胞におけるヒスタミンリボスイッチの応用．文献 17 をもとに改変．

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セルフリーシステムにおけるリボスイッチの課題
これらの実験から，ヒスタミンで人工細胞内におけるさまざまな遺伝子の発現を制御することにより，人工細胞に異なる機能を付与できることが示された．一方，その過程でいくつかの課題も明らかになった．セルフリーシステムで機能するリボスイッチをアプタマーから作製するプロセスは未だに効率が悪く，主に二次構造予測などを参考にした半合理的設計と試行錯誤に依存している．セルフリーシステムに特化した，効率的な人工リボスイッチ設計手法の確立もこれからの研究課題であるといえる．
今回得られたヒスタミンリボスイッチは，これまでの人工リボスイッチと比較しても非常に性能が良いが，リガンド濃度に対する感度は低い．単なるスイッチとしてだけでなく，応答感度の最適化も含めた設計手法の改良が必要である．また，人工細胞内で機能するリボスイッ
チは，対象化合物が細胞内に到達する必要がある．ヒスタミンは，ある程度拡散により脂質二重膜を透過したが，化合物によっては脂質膜の改変や膜タンパク質による受動的もしくは能動的な輸送が必要となるであろう．
人工細胞を含むセルフリーシステムは，「使い古された」パーツを組み合わせた proof of principle から，徐々に学術的もしくは産業的に意義のあるシステムの構築へ

ションに応じた多種多様な化学シグナルとセルフリーシステムとを仲介するインターフェースがより重要となる．人工リボスイッチがその役割の一端を担うことを期待する．
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