課題番号：25指102
研究課題名：「第三世代シークエンサーPacBio RSを活用した糖尿病・代謝疾患の病態解析」
主任研究者名 ：安田和基
分担研究者名 ：南茂隆生
キーワード ：ロングリード、ハプロタイプ決定、選択的スプライシング、DNA 修飾
研究成果：「第三世代シークエンサー」である PacBioRS は、A. 数 kb にわたる長いリード配列、B.高い GC 含量の領域も解析可能、C.Kinetics 情報（特に波形間の inter-pulse duration：
IPD）の取得により塩基修飾情報も得られる可能性、など、これまでの次世代シークエンサー（NGS）にない特徴がある。そこで、A によりハプロタイプの決定や allelic expression の解析、ゲノム
構造異常の解析、B によりプロモーター領域や繰り返し配列を含めたゲノム解析、C により細胞分化や糖尿病の病態や合併症に関する DNA 修飾検出、などを試みる計画を立案した。本技術はまだ発展途上の部分が大きく、特に哺乳類ゲノム・RNA についての報告はきわめて限定的であるため、本研究は既存の解析方法と比較する「feasibility study」と、新たなアプリケーションの開発を行う「potential の開拓」という、2 つの方向性を目指した。
［1］

本システムの性能を検証するために、ラムダファージ DNA からテンプレートを作成して、シークエンスを行った。10kb のサイズで DNA を断片化し、バイオアナライザーで断片化したサイズを確認したのち、テンプレートを作成し、ロングリードの特性を活かした「Continuous Long
Reads(CLR)」モードで解析を行なった。データは、1 次解析（ベースコール）の後、SMRT Portal
上で 2 次解析を行い、「BLASR（Basic Local Alignment with Successive Refinement）」というツールを用いてレファランス配列へマッピングを行った。その結果、「リード長」は 10〜15kbpまで分布しており、両端の adaptor にはさまれた「サブリード」長は 2〜5kbp 程度が多く、「ロングリード」の特性が確かめられた。マップされたサブリードについては、
平均 accuracy が 81.6％と、本システムの特徴として知られている通り、第二世代 NGS よりやや低い。しかし、ケミスト
リーの特性に依存して特定の塩基でエラーを生じる他の NGS と異なり、いわゆるエラーはランダ
ムに生じることから、50x 以上の depth を得られれば解決できると考えられた。実際この実験では、ほぼ例外なく 2000x 以上となっており、特定の配列でカバー率が下がることはないことが確かめられた。
以上より、第三世代 NGS としての PacBioRS の特性および有用性を確認することができた。
［2］

他の方法（第二世代 NGS など）に対する優位性を軸とした研究計画の再吟味

本機器の有効性と限界について、共同研究者であるトミーデジタルバイオロジーズ（以下 TDB）
社（実験部門、解析部門）と情報交換を行った。その結果、本テクノロジーに適した DNA 領域濃縮法は、まだ開発途上であること、定量性が求められるプロジェクト（定量的発現解析のためのRNA-Seq など）については、現時点で第二世代 NGS に対する優位性は乏しいこと、真核生物の DNA
修飾（特にメチル化）の IPD パターンは複雑でまだレファランスデータ収集が必要な段階である
こと、が判明した。以上をうけて、予定していた各サブテーマについて再吟味を行った結果、定量を目的とした RNA-Seq を中止し、目的ゲノム領域の濃縮方法についての検討を開始した。
［3］

PacBioRS に適した標的ゲノム領域の濃縮法の検討：① 既存のプロトコールの検討：
本テクノロジーでは、特徴的な「SMRTbell テンプレート」を作らせるため、既存の DNA 濃
縮法はそのままでは使えないが、既存の試薬のプロトコールをベースに本テクノロジーの特性に合わせてカスタマイズ可能かどうかの検討を行った。PacBioRS の「long read」あるいは

「 DNA 修 飾 」 の 利 点 を 活 か す た め 、 ま ず 相 補 的 プ ロ ー ブ の ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン（hybridization）による方法のカスタマイズを試みたが、やはり各プロトコールはショート
リード用フラグメントの濃縮に最適化されており、PacBio 用には問題があることがわかった。
一方、PCR 増幅により大量のアンプリコン（amplicon）を得る方法は、PCR による長いフラグ
メントの増幅効率やエラーの問題、さらに DNA 修飾情報の消失など、そのままではやはり
PacBioRS の特徴を活かしきれない可能性が高いと考えられた。
② NimbleGen プロトコールを用いた検討：
平成 27 年度になり、目的ゲノム領域について、長鎖 DNA シークエンス用のテンプレートを全ゲノムからエンリッチする方法が報告された（BMC Genomics 16: 214, 2015）。この方法をベースに SeqCap システム（ロシュ）のプロトコールを改良して、PacBio に適用できる方法が発表された。具体的には、ゲノム全体から 5〜9kb のフラグメントにアダプターを付加後、PCR で増幅し、目的領域に応じて作成したプローブの mixture と液相でハイブリダイズさせ、
ビーズキャプチャーを行った後に PacBio 用のアダプターを付加してシークエンスを行う、というもので、DNA 濃縮については、NimbleGen プラットフォームをベースとしている。これまでも類似のアイデアはあったが、従来プロトコールと比べ、①ゲノム断片化に、短いフラグ
メント（〜200kb）用の Covaris でなく、g-TUBE を用いる、②断片化後、フラグメントの回収には、AMPure Beads でなく、Blue Pippin を用いて電気泳動の原理で長いサイズのフラグメ
ントを選択的に回収する、③末端にアダプター付加後の PCR 増幅では、酵素や反応時間、サ
イクルをフラグメントから変えて最適化する、の 3 点が大きな変化であり、これにより
PacBioRS に適した 6〜7kb 前後のフラグメントが得られるという。
プライマーは NimbleDesign を用いてヒトゲノムからプライマーデザインを行う本法では、ゲノム DNA の断片が大きいため、プローブをエクソン領域中心にデザインしてもイントロンを含んだ遺伝子領域全体を広くカバーできる可能性がある。
この方法の検証のため、標的領域の選定を行った。ターゲット領域は、MODY など単一遺伝
子病タイプの原因遺伝子領域約 10、KCNQ1 や TCF7L2 など GWAS で 2 型糖尿病に関連した SNP
関連の領域約 15、などを中心とした。現在、プローブデザインが進行中であり、作成次第
validation を行う段階である。
［4］

ハプロタイプフェイジング（haplotype phasing）に適した機能的 SNP 領域の探索：

ハプロタイプが機能的な意義を持つ領域は、プロモーター/エンハンサー活性をもつ等が考えられるが、ヒストン修飾（H3K27ac など）ほかエピゲノム解析が、その機能及び機能変化の手がかりとなる。そこまで、まず解析用サンプルとして、エピゲノム解析に耐えうるヒト組織の入手方法を検討したところ、米国の企業経由で市販されている初代培養ヒト肝細胞（1 バイアルあた
り 500 万～1,000 万細胞）が比較的均一な細胞集団が期待され、少なくとも 12 例分入手可能であることを確認し、購入した。
GWAS により報告された疾患感受性 SNP は、遺伝子発現調節の cis エレメントのマーカーとなる
ヒストン修飾が豊富なゲノム領域と重複することが多い。このため、入手した 5×106 ～ 1×107
細胞/バイアルの一検体からは、ゲノム DNA とトータル RNA に加えて、ヒストン修飾の ChIP（クロマチン免疫沈降）サンプルを得られるよう、分割して培養を行った。ヒストン修飾の H3K27ac
はアクティブなプロモーター・エンハンサーのマーカーとして有用であり、機能的ゲノム領域を検索するために特異抗体を用いて ChIP を行い、この目的に適したショートリード NGS（HiSeq2000、
イルミナ社）によるゲノム網羅的解析により同定を行った。
その結果、総計約 5 万か所（49,485）におよぶ cis 調節ドメインが決定された。NHGRI Catalog
データベースを参考に、様々な疾患の GWAS SNP（全 21,928）との重複の有無を検討したところ、
約 2,442 種類の GWAS SNP がヒト初代培養肝細胞の H3K27ac 領域中に見出され、機能性 SNP の可能性が高いと思われた。これら SNP は肥満関連形質、身長、血中代謝産物レベル（特に脂質）、
血小板数、そして 2 型糖尿病などと関連するものが高頻度に含まれており、肝臓の生理的意義とよく合致するものと考えられた。特に 2 型糖尿病関連 SNP のうち 30SNP が、この肝 H3K27ac 領域に存在し、うち 15SNP はリファランス配列で転写因子モチーフの構成塩基で、さらにそのうち12SNP（80％）は variant 配列で、モチーフが消失した。これらは cis に作用する機能的エレメントとしての解析が興味深いと思われた。
今後、発現レベルの高い遺伝子について、ハプロタイプブロック内に存在し、かつ H3K27ac 領域と重複する複数の common SNP についてヘテロ接合体のサンプルを用いてハプロタイプフェイ
ジングを行うことができれば、遺伝子発現との関連をアレル特異的に高精度に検討を行うこと（allelic expression、あるいは allelic imbalance）が可能となり、様々な疾患の遺伝素因に関する新たな知見が得られるものと期待される。
［5］

今後の見通し：上述した DNA 濃縮法によるターゲットリシークエンスでは、やはり PCR で増幅するため、DNA
修飾状態、特にメチル化状態に関する情報は、十分解析できない。DNA 修飾に関する情報については、やはり PCR を用いない方法により標的領域を濃縮する必要があるが、十分量の DNA からス
タートして生データ（波形データ）を保存しておけば、近い将来メチル化コールができた場合、過去にさかのぼって検出・同定することができる。
また、PacBio における「エラー」は、特定の chemical（塩基）に依存せずにランダムに生じるが、ターゲットリシークエンスの場合は、全領域にわたってかなりの depth が必要であり、特に heterozygous な SNP のハプロタイプ解析には、500x 以上の depth が望ましいと思われる。そのため、上述の方法をやはり通常のショートリードに比べるとスタートゲノムテンプレート量が圧倒的に必要である。さらに、長いフラグメントの PCR 増幅により、ランダムに入るエラーの判定、などが重要となり、これらの点は今後技術革新が必要となろう。
最近 PacBioRS を用いて ヒトゲノム配列の「gap」を埋めるのに成功したという報告が注目されている。また日本人標準ゲノム配列についても、ショートリード NGS と PacBio システムをく
みあわせて完成し報告された。このように、本システムのヒトゲノム科学における重要性・有用
性はますます高まりつつあり、今後も引き続き糖尿病関連病態の解明への応用を目指したい。

Subject No.

：25D02

Title：The application of the third generation sequencer, PacBioRS, to the researches on

diabetes mellitus and metabolic diseases.
Researchers ：Yasuda K, Nammo T, and others.
Key words：the third generation sequencer, long read, haplotype phasing, alternative splicing,

DNA modification
Abstract：

PacBioRS, a new platform called “the third generation sequencer”, has several unique features
over other next-generation sequencers(NGS), including extra-long reads(over several kb), robustbase calls for GC-rich or repetitive sequences, and possible applications for the analysis of DNA
modification. However, this technology is still on the progress, and there have been only a limited
number of reports on its application to mammalian genomes and RNA. In this project, we planned
to utilize this unique system for the diabetes research. We tried to perform ‘feasibility studies’ forassessing the performance of PacBioRS compared with existing technologies using known
sequences, and ‘innovative studies’ towards new applications of this technology to the genomic andepigenomic studies of diabetes mellitus.
1) In order to assess the performance of PacBioRS, we sequenced lambda phage DNAs. Templates
were prepared from 10kb fragments on average, and run was done by Continuous Long Reads(CLR) modes. After base calling, data were analyzed on SMRT Portal, and mapped to the reference
sequence using of the lambda phage BLASR（Basic Local Alignment with Successive Refinement）
algorithm.
The read length was extended up to 10〜15kb, and most of the subread length was 2〜5kb, thus
the striking ‘long read’ feature was confirmed. The average base accuracy was 81.6%, which was
lower than commonly used short-read NGS ; however, since base call errors happened randomly
and were not dependent on chemical or structural features of some specific bases, we think we can
expect reliable base calls if the coverage was reasonably deep.
2) We made discussion several times with scientists from Tomy Digital Biology Ltd., over theadvantages and disadvantages of PacBioRS, and reached a couple of conclusions. Although DNA
enrichment of targeted regions is critical for the success of this technology when we deal with large
genomes such as human, there were no established methods for this step at the beginning of thisproject. Quantitative experiments such as tag counting of RNA-Seq would be better performed, atleast for the present, by other short-read NGS due to the overwhelming read counts. DNA
modification of mammalian genomes is more complicated than previously supposed and proves not
to exhibit consistent patterns of inter-pulse duration(IPD) by PacBio sequencing. Therefore, we
modified the whole plan, and started to develop efficient methods for DNA enrichment of targeted
regions.

Researchers には、分担研究者を記載する。

There are basically two strategies for DNA enrichment, namely, hybridization-based andamplicon-based methods. In general, hybridization-based DNA enrichment is more suitable forlong reads and analysis of DNA modification, but most of the enrichment kits available are
optimized only for short-read NGS. A great amount of DNA is also necessary as a starting material.
On the other hand, amplicon-based method has an advantage in sparing DNA, but also has
problems such as PCR errors, and loss of information on DNA modification.
We first tried to modify liquid-phase hybridization method for optimization, but were notsuccessful enough.
In 2015, a new method based on NimbleGen platform was made available. This method has
several unique features. 1) genome fragmentation is performed by g-TUBE rather than Covaris,
which enabled us to get longer fragments. 2) Selective recovery of long DNA fragments are donewith electrophoresis-based Blue Pippin system rather than AMPure Beads. 3) DNA fragments arecaptured by a mixture of NimbleGen probes designed by the specific software (NimbleDesign). 4)
PCR amplification is best optimized after adapter ligation. These features made enrichment oftargeted DNA fragments with the size of 6-7kb possible.
We can even expect to recover long fragments by this method using exon-centric probes, if thetargeted regions don’t have too large introns. Since we concluded this system is the mostpromising method of DNA enrichment for PacBioRS, we selected target genomic regions forverification of this method. We decided to focus on monogenic type of diabetes and regions
containing diabetes susceptibility SNPs. We picked up 13 genes including MODY genes ( HNF4A,

GCK, HNF1A, HNF1B, PDX1 etc) and others (INS, INSR, MC4R etc), and about 15 SNP lociincluding KCNQ1 and TCF7L2 which confer susceptibility for type 2 diabetes, and are now
designing the probes.
3) We also planned to perform genomic (haplotype phasing), epigenomic and transcriptomic (allelicexpression and alternative splicing) analyses in the tissues or cells important for energy
metabolism and decided to use human primary hepatocytes derived from Caucasian donors. In
order to obtain regulatory genomic regions, we performed a ChIP-seq analysis for H3K27ac, ahallmark of active promoters and enhancers. We used 5×106〜1×107 cells for RNA extraction and
ChIP-seq analysis for H3K27Ac, and identified more than 50,000 active marks for H3K27ac.
We also picked up more than 15,000 disease-associated SNPs from GWAS database for various
diseases including diabetes mellitus, as potential candidates of functional genetic variations.
Among them, ~2200 SNPs were localized in H3K27ac peaks in primary human hepatocytes, whichmeans susceptibility genes previously reported by various GWASs were significantly enriched inthese regions. These SNPs were related to obesity-related traits, height, blood metabolite levels(including lipids), platelet counts, and type 2 diabetes.
Some genes exhibited substantial variations in the signal peaks among different samples. We
hypothesized that SNP genotypes and/or haplotypes might have impact on the epigenetic status,
and are now in the process of validating the relationship between the haplotype phase revealed bytarget resequencing using long-read NGS and allelic imbalance of expression of the genes.
Researchers には、分担研究者を記載する。

4) Recently, the human genome re-annotation using PacBioRS was reported. The reference
Japanese genome sequence was also reported, which could not be achieved without the help of
PacBioRS. There have been increasing applications of the long read NGS to the genomic researchof human health, and it is highly expected that several remaining issues for this unique technology
would be solved in the near future.

Researchers には、分担研究者を記載する。

第三世代NGS：PacBio RSの特性とサブテーマの吟味（当初計画）

第二世代NGSにない特徴

Long read（数Kb以上）GC rich領域も解析可能

ヒトを中心とした
高等動物ゲノムへの応用（挑戦的分野）ハプロタイプ決定
ミトコンドリアDNAの多型配列決定
Allelic expression
新規RNA同定（splice variants含む）

プロモーター
領域を含めた
配列変化の解析糖尿病関連病態における未解決課題へのソリューション

塩基修飾
検出可能性
DNAメチル化
メチル化以外のDNA修飾（8-oxo-グアニンなど）

ヒト糖尿病遺伝因子の機能解明
エピゲノム制御の寄与の検証
糖尿病発症・進展における塩基修飾の解明

下線部分：本システムの特性を踏まえて、優先課題と位置づけたもの

PacBioRSの特性の検証（ラムダファージDNA、インサート10kbpで作成、CLRモード、「120」分でデータ取得）
図1：リード長分布

図2：サブリード長分布

図3：Read Quality（RQ）

図4：Accuracy

図5：カバー率分布（a）（b）

初代培養肝細胞サンプル間に認められたH3K27acと遺伝子型の相違（Referenceと異なる塩基に着色あり）

2.3

H3K27ac ChIP-Seq (Sample 1)

Sample 102.3

H3K27ac ChIP-Seq (Sample 2)0

RefSeq Genes

Sample 2
dbSNP 146 Found in >= 1% of Samples

NHGRI-EBI Catalog of Published Genome-Wide Association Studies

Transcription Factor ChIP-Seq (161 factors) from ENCODE

DNaseI Hypersensitivity in 125 cell types from ENCODE

http://genome.ucsc.edu/

http://www.broadinstitute.org/igv/home

破線内のゲノム領域では少なくとも４か所に遺伝子型の相違が認められており、ゲノムアクセシビリティと転写因子の結合部位によって特徴付けられている。

PacBio用に最適化したゲノム濃縮法（SeqCapシステムによる）＜標準プロトコール＞＜PacBio用＞

Covaris

ゲノム断片化g-TUBE

AMPure Beads
300〜500bp

サイズセレクション

Blue Pippin（電気泳動）
5〜9kb

PCR9サイクル

アダプター付加前増幅（PCR）

長いフラグメント増幅用
PCR7サイクル

標的領域の濃縮

標的領域のプローブデザイン

標的領域のプローブデザイン（NimbleDesign）
Short read
シークエンス（イルミナなど）（液相ハイブリダイゼーション
によるキャプチャー）

後増幅（PCR）（NimbleDesign）
PacBio用アダプターを付加して
PacBioRSへ課題番号：25指102

研究課題名：「第三世代シークエンサーPacBio RS を活用した糖尿病・代謝疾患の病態解析」

分担研究課題名：「研究の総括、及び PacBio RS の特性を活かしたアプリケーションの探索と 2 型糖尿病研究への応用」
分担研究者名 ：安田和基（協力研究者；西村渉、宇田川陽秀、舟橋伸昭、川口美穂、ほか）
キーワード ：ロングリード、DNA 濃縮、DNA 修飾
研究成果

［1］

：

第三世代シークエンサーPacBioRS の性能を検証するために、ラムダファージ DNA から

Template を作成して、シークエンスを行った。
PacBioRS で用いられる「SMRTbell テンプレート」については、「Continuous Long Reads(CLR)」、「Circular Consenseus Sequencing（CCS）」という 2 つのモードがあるが、我々は長いインサートを用いたロングリードの特性を検証するために前者を採用し、10kb のサイズで DNA を断片化して、バイオアナライザーにより断片化したサイズを確認したのち、テンプレートを作成した。データは、1 次解析（ベースコール）の後、SMRT Portal 上で 2 次解析を行い、レファ ラ ン ス配 列へ マ ッピ ン グを 行 う、 「 BLASR （ Basic Local Alignment with Successive
Refinement）」というツールを用いて解析した。
「リード長」は、10〜15kbp まで分布しており、「ロングリード」という本システムの有用性が示された。リードのうち、両端の adaptor にはさまれた「サブリード」も、2〜5kbp 程度
が多く、またリードごとの精度「Read Quality（RQ）」も良好であった。マップされたサブリ
ードの accuracy は平均 81.6％であったが、いわゆるエラーはケミストリーに依存せず、50x以上の depth で「コンセンサス配列」を作成すれば精度は 100％に近づくとされており、depthを十分得られれば課題である fidelty も解決可能と考えられた。今回はほぼどの領域も 2000x以上となっており、この点で全く問題はなかった。
［2］

他の方法（第二世代 NGS など）に対する優位性を軸とした研究計画の吟味
共同研究者であるトミーデジタルバイオロジーズ（以下 TDB）社の本機器担当者（実験部門、解析部門）と会合を重ねた結果、以下のことが明らかになった。
1） 他の NGS と比較してリード数が少ないため、単独でヒトゲノム全域を対象とするのは難しく、目的領域の十分な濃縮（エンチッリメント）が必要だが、本テクノロジーに適した DNA 領域
濃縮法は、まだ開発途上であり、プロジェクト開始時には公式にサポートされたキット・プ
ロトコールはなかった。
2） リード数が多くないこととも関連して、定量性が求められるプロジェクト（RNA-Seq による定量的発現解析など）については、現時点では第二世代 NGS に対する優位性は乏しい。
3） 真核生物では DNA 修飾がこれまでの予想以上に多彩であり、最も頻度が高くかつ機能的に重要と思われる「シトシンメチル化」だけをとっても、波形間の inter-pulse duration(IPD)
が単一のパターンを示さず、その原因も未解決で、まだ十分なデータが蓄積されていない。
［3］

PacBioRS に適した標的ゲノム領域の濃縮法の検討：

1） 既存のプロトコールの検討：
本テクノロジーでは特徴的な「SMRTbell テンプレート」を作らせるため、既存の DNA 濃縮
法はそのままでは使えず、カスタマイズ可能かどうかの検討を行った。
一般に目的のゲノム領域の濃縮法には、相補的プローブのハイブリダイゼーション（hybridization）による方法と、PCR 増幅により大量のアンプリコン（amplicon）を得る方

法とがある。PacBioRS の「ロングリード」あるいは「DNA 修飾解析可能」の利点を活かすた
めには、前者が、汎用されているキットはショートリード NGS 用に最適化されており、そのままでは PacBioRS のライブラリー作成に適さないことがわかった。一方、後者のアンプリコンによる方法は、スタート DNA を節約できるなどのメリットはあるが、PCR による増幅効率やエラーの問題、さらに DNA 候補情報の消失など、PacBioRS の特徴を活かしきれない可能性が高い。そのため前者にあたる某社のプロトコールを検討して、カスタマイズを試みたが、やはり問題があることがわかった。
なお、非常に多型の多いミトコンドリア DNA の「phasing」も本システムに適した検討テーマであるが、ヒトミトコンドリア DNA を特異的に濃縮するキットは市販されていないものの、細胞あたりのコピー数が多いため、エクソーム用の市販濃縮キットでもミトコンドリア
DNA の濃縮ができる可能性は残っていると考えている。
2） NimbleGen プロトコール：
平成 27 年度になり、目的ゲノム領域について、長鎖 DNA シークエンス用のテンプレート
を全ゲノムからエンリッチする方法が報告された（BMC Genomics 16: 214, 2015）。この方法をベースに、SeqCap システム（ロシュ）のプロトコールの改良により、ロングリード用のDNA 濃縮用のプロトコールとして発表された。具体的には、ゲノム全体を比較的大きく断片化してサイズセレクションを行い、5〜9kb のフラグメントにシーケンス用アダプターを付加
後、PCR で 7 サイクル増幅し、目的領域に応じて作成したプローブの mixture と液相でハイブリダイズさせ、ビーズキャプチャーを行った後に PacBio 用のアダプターを付加してシークエンスを行う、というもので、DNA 濃縮については、NimbleGen プラットフォームをベースとしている。これまでも類似のアイデアはあったが、従来プロトコールと比べ、①ゲノム断片化に、短いフラグメント（〜200kb）用の Covaris でなく、g-TUBE を用いる、②断片化
後、AMPure Beads でなく、Blue Pippin を用いて電気泳動の原理で長いサイズのフラグメン
トを選択的に回収する、③アダプター付加後の PCR 増幅では、酵素や反応時間、サイクルをフラグメントから変えて最適化する、の 3 点が大きな変化であり、これにより PacBioRS に適した 6〜7kb 前後のフラグメントが得られる。
この方法の検証のため、標的領域の選定を行った。プライマーは NimbleDesign を用いてヒトゲノムからプライマーデザインを行う。本法では、ゲノム DNA の断片が大きいため、イントロンが 1-2kb 程度であれば、プローブをエクソン領域中心にデザインしてもイントロンを含んで隣接エクソンをまたぐフラグメントも得られ、遺伝子領域全体を広くカバーできる。
その結果として、より大きな構造変異の検出、ハプロタイプフェージングなどが、期待される。実際この方法にて非常に多型性の高い、かつハプロタイプ構造が重要な意味をもつ HLA
領域の解析に成功したとの報告がある。
ターゲット領域は、MODY 遺伝子を含む単一遺伝子病タイプの原因遺伝子領域、GWAS で 2型糖尿病に関連した SNP 関連の領域（KCNQ1、TCF7L2 ほか）、などを中心に 25 領域を選択した。今後実サンプルも用いて検討予定である。
課題としては、やはり PacBio における「エラー」のため、リシークエンスの場合は、全領域にわたってかなりの depth が必要であり、特に heterozygous な SNP のハプロタイプ解
析には、500x 以上が望ましく、通常のショートリードに比べるとテンプレート量が圧倒的に多く必要である。今後この点でもさらに、技術革新が期待される。

課題番号：25指102研究課題名：2型糖尿病感受性座位におけるハプロタイプと組織特異的遺伝子発現変化の意義の検討主任研究者名 ：安田 和基
分担研究者名 ：南茂 隆生
キーワード ：2 型糖尿病、第三世代シークエンサー、ターゲットリシークエンシング、全長転写産物解析、疾患感受性多型、ヒト組織解析
研究成果：【背景・目的】
ゲノムワイド相関解析（GWAS）により、2 型糖尿病をはじめとした common disease の感受性一塩基
多型（SNP）の報告は 2007 年頃から増加したが、主任研究者の安田は国家プロジェクトとしての「ミレニアムゲノムプロジェクト」において東アジア人の強力な 2 型糖尿病関連遺伝因子 KCNQ1 の同定に成功した（Nat Genet. 40:1092-1097, 2008）。これら SNP のほとんどは非コード DNA 領域に認められたことから、遺伝子発現調節の変化が疾患感受性のメカニズムとして重要であると推察されたが、実際にヒト膵島を用いた検討によって、2 型糖尿病と最も関連の強い TCF7L2 遺伝子の SNP（rs7903146）
周辺のゲノム領域が、クロマチン構造の変化によってエンハンサー活性が変化することを私たちは明らかにした。ところで、疾患感受性座位には複数の cis 調節領域がしばしば存在し、このような領域にも SNP が認められる場合がある。よって、ハプロタイプ構造を明らかにした上で（Haplotype phasing）、
疾患感受性領域内における cis 調節作用の総和を考慮すれば、疾患感受性の要素である遺伝子発現変化をより正確に理解できるかもしれない。
第三世代シークエンサー「PacBio RS」は、長いリード配列（現在、平均～10kbp）を特徴とし、構成塩基（GC/AT 含量）の影響をほとんど受けることなく塩基配列決定が可能であることから、ゲノム
構造異常解析、ハプロタイプ決定、全長 mRNA 配列決定など、従来のテクノロジーでは困難であった解析に威力を発揮しつつある。最近になり、ヒト半数体細胞 CHM1 の全ゲノム解析結果が報告されるに至り（Nature 517:608-611,2015）、レファレンスゲノムに残されたギャップ領域の 50%以上が新たに判読可能となった。
本分担研究課題では、2 型糖尿病病態解明の一環として、GWAS（ゲノムワイド相関解析）によって同定された疾患感受性領域内における cis 調節作用が、ハプロタイプ構造によってどのような変化がもたらされるのかを明らかにすることを目的として開始した。
【方法】
1. 解析対象の 2 型糖尿病責任臓器としては、組織特異的ヒストン修飾様式と 2 型糖尿病 SNP との2.

3.

関連性から肝と膵島が有用であると考えられた（Nat Genet. 45:124-130,2012）。検体の入手・実験方法の簡便性や GWAS 結果の人種的背景から、市販されている男性 Caucasian 由来初代培養
ヒト肝細胞を用いた。
機能性をもつ GWAS SNP は cis エレメントのマーカーとなるヒストン修飾が豊富なゲノム領域と重複することが多い。入手した 5×106 ～ 1×107 細胞/バイアルの検体からは、ゲノム DNA とトータル RNA に加えて、ヒストン修飾の ChIP（クロマチン免疫沈降）サンプルを得られるよ
う、分割して培養を行った。ヒストン修飾の H3K27ac はアクティブなプロモーター・エンハン
サーのマーカーとして有用であり（Nat Genet. 46:136-143,2014）、検討候補の機能性 SNP を検索するために特異抗体を用いて ChIP を行い、次世代シークエンサー（HiSeq2000、イルミナ社）
によるゲノム網羅的解析により同定を行った。
様々な疾患や形質の GWAS SNP（NHGRI-EBI Catalog）を UCSC ゲノムブラウザー（hg19）からダウンロードした（～15,000 種類）。また、H3K27ac の ChIP-Seq ピーク領域に存在する GWASSNP を明らかにした。

4.

PacBioRS を用いたターゲットリシークエンシングのためのカスタムデザインツール（NimbleDesign）、および遺伝子濃縮方法（Roche NimbleGen’s SeqCap EZ システム）を確認した。

【結果】
初代培養肝細胞の H3K27ac ChIP-Seq 結果の再現性はサンプル間で良好であり、総計約 5 万か所の cis
調節領域が決定された。約 1 万 5 千種類の GWAS SNP のうち、約 2,200 種類の SNP が初代培養肝細胞の H3K27ac 領域内に見出され、機能性 SNP である可能性が考えられた。これら SNP が相関する形質・疾患としては頻度順に“肥満関連形質”、“身長”、“血中代謝産物レベル（特に脂質）”、“血小板数”、“2 型糖尿病”などが認められ、肝臓の生理的意義に矛盾しない所見と考えられた。
サンプル間で各 H3K27ac ピークのシグナルを比較すると、遺伝子によってはかなり大きな変化を示
すものが観察された（パワーポイント参照）。H3K27ac エンリッチメントと mRNA 発現の個人差は
H3K27ac 領域内の塩基多型が規定すると報告されているが（Nature 518:350-354,2015）、初代培養肝細胞を用いた本検討でも、H3K27ac が大きく変化しているサンプル間では遺伝子型に関しても多くの場
所で異なっていることが判明し、本研究のための詳細な検討に適していると考えられた。解析遺伝子のコーディング SNP にヘテロ接合体が認められるサンプルでは、Haplotype phasing によってアレル別に H3K27ac 領域の遺伝子型の違いも全て明らかにした上で、mRNA および各 H3K27ac の allelicimbalance の観察を行えば、疾患感受性に関与する SNP の詳細な検討が可能となるために、PacBioRS
によるターゲットリシークエンシングの検討を行っている。
【考察】
第三世代シークエンサーはその登場以来着実にパフォーマンスを伸ばしつつあり、100Mbp までのゲノムサイズであれば、ほぼ染色体全域にわたるアセンブリが可能となっている。ハプロタイプ情報も加味された構造多型の正確な把握は、遺伝子発現や疾患感受性の理解に不可欠であることが明らかとなりつつあり（Nat Genet. 47:921-925, 2015）、超ロングリードによる塩基配列決定が疾患研究を含めて生物学に与えるインパクトは重要である。
本研究で用いた初代培養肝細胞は、各サンプルの検討を同一条件下に行うことが可能であるために、
特に遺伝素因研究には適していると考えられた。最近になって、2 型糖尿病感受性座位のファインマッ
ピングが検討されるようになり（Nat Genet. 47:1415-1425, 2015）、臓器特異的クロマチン構造との関連性から、病態に関与する臓器の同定が具体化しつつある。第三世代シークエンサーを用いた様々な臓器の詳細な検討によって得られる知見は、新たな創薬標的の同定など広範な応用も期待できるであろう。技術進歩が現状のペースを維持できれば、数年以内にヒトゲノムのアセンブリが可能となるリード長が達成されるという試算もあるが（doi: http://dx.doi.org/10.1101/048603）、莫大な費用の問題からは容易な日常的使用は困難である。この点からは、SeqCap EZ システムを用いたターゲットリシークエ
ンシング（BMC Genomics 16:214,2015）の有効利用には期待が持てる。また、液滴バーコーディングシ
ステム（Nat Biotechnol. 34:303-311, 2016）や DNA クロスリンクとメイトペア法を組み合わせた手法（Genome Res 26:342-350, 2016）などの工夫によって、ショートリードシークエンスを活用する方法は費用や開始 DNA 量の点からも高い有用性が期待できる。しかし、真に正確なゲノムアセンブリを行うには安定した「シークエンスの超ロングリード化」が何事にも代えがたく、今後の技術発展には大きな期待が寄せられている。

研究発表及び特許取得報告について
課題番号：25指102

研究課題名： 「第三世代シークエンサーPacBio RSを活用した糖尿病・代謝疾患の病態解析」
主任研究者名：安田和基

論文発表
論文タイトルGenome-wide association studies in the Japanese
population identify seven novel loci for type 2
diabetes.

著者

掲載誌

掲載号

年

2. Imamura M, Takahashi A, Yamauchi T, Hara K,
Yasuda K, Grarup N, Zhao W, Wang X, Huerta-Chagoya
A, Hu C, Moon S, Long J, Kwak SH, Rasheed A,
Saxena R, Ma RCW, Okada Y, Iwata M, Hosoe J,
Shojima N, Iwasaki M, Fujita H, Suzuki K, Danesh
J, JФrgensen T, JФrgensen ME, Witte DR,
Brandslund I, Christensen C, Hansen T, Mercader
Nature Commun
JM, Flannick J, Moreno-Macias H, Burtt NP, Zhang
R, Kim YJ, Zheng W, Singh JR, Tam CHT, Hirose H,
Maegawa H, Ito C, Kaku K, Watada H, Tanaka Y, Tobe
K, Kawamori R, Kubo M, Cho YS, Chan JCN, Sanghera
D, Frossard P, Park KS, Shu X-O, Kim B-J, Florez
JC, Tusie-Luna T, Jia W, Tai ES, Pedersen O,
Saleheen D, Maeda S, Kadowaki T.

7: 10531

2016

Comparable analysis of type 2 diabetes-associated Hiramoto M, Udagawa H, Watanabe A, Miyazawa K,
SNP alleles identifies allele-specific DNAIshibashi N, Kawaguchi M, Uebanso T, Nishimura W,
binding proteins for the KCNQ1 locus.
Nammo T, Yasuda K.

Int J Mol Med

36(1):
222-230

2015

Establishment of maturity-onset diabetes of the
Yabe S, Iwasaki N, Yasuda K, Hamazaki T, Konno M,
young (MODY)-induced pluripotent stem cells from
Fukuda S, Takeda F, Kasuga M, Okochi H.
a Japanese patient.

J Diabetes Invest

6(5): 543547

2015

9(11):
e1117152014

165(6):
836-8412014

53(12):
1018-1032

2014

A genome-wide association study for diabetic
retinopathy in a Japanese population: potential
association with a long intergenic non-coding
RNA.

Awata T, Yamashita H, Kurihara S, Morita-Ohkubo T,
Miyashita Y, Katayama S, Mori K, Yoneya S, Kohda
PLoS One
M, Okazaki Y, Maruyama T, Shimada A, Yasuda K,
Nishida N, Tokunaga K, Koike A.
Kobayashi K, Mitsui K, Ichikawa H, Nakabayashi K,
Matsuoka M, Kojima Y, Takahashi H, Iijima K,
ATF7IP as a novel PDGFRB fusion partner in acuteOhtubo K, Oboki K, Okita H, Yasuda K, Sakamoto H, J Haematol
lymphoblastic leukemia in children. Br.
Hata K, Yoshida T, Matsumoto K, Kiyokawa N, Ohara
A.
Comprehensive exploration of novel fusion genes Gotoh M, Ichikawa H, Arai E, Chiku S, Sakamoto H,
Genes Chromosome
in clear cell renal cell carcinomas using whole Fujimoto H, Hiramoto M, Nammo T, Yasuda K, YoshidaCanctranscriptome analysis.
T, Kanai Y.

Druggable oncogene fusions in invasive mucinouslung adenocarcinoma.

Nakaoku T, Tsuta K, Ichikawa H, Shiraishi K,
Sakamoto H, Enari M, Furuta K, Shimada Y, Ogiwara
H, Watanabe S, Nokihara H, Yasuda K, Hiramoto M,
Nammo T, Schetter AJ, Okayama H, Harris CC, Kim
YH, Mishima M, Yokota J, Yoshida T, Kohno T.

Clin Cancer Res

20(12)
3087-3093

2014

Genome-wide association study identifies threenovel loci for type 2 diabetes.

Hara K, Fujita H, Johnson TA, Yamauchi T, Yasuda
K, Horikoshi M, Peng C, Hu C, Ma RC, Imamura M,
Iwata M, Tsunoda T, Morizono T, Shojima N, So WY,
Leung TF, Kwan P, Zhang R, Wang J, Yu W, Maegawa
H, Hirose Hi DIAGRAM Consortim, Kaku K, Ito C,
Watada H, Tanaka Y, Tobe K, Kashiwagi A, Kawamori
R, Jia W, Chan JC, Teo YY, Shyong TE, Kamatani N,
Kubo M, Maeda S, Kadowaki T.

Hum Mol Genet

23(1):
239-246

2014

Masuzawa A, Kiyotani C, Osumi T, Shiota Y, Iijima
Poor responses to tyrosine kinase inhibitors in a
K, Tomita O, Nakabayashi K, Oboki K, Yasuda K,
child with precursor B-cell acute lymphoblastic
Sakamoto H, Ishikawa H, Hata K, Yoshida T,
leukemia with SNX2-ABL1 chimeric transcript.
Matsumoto K, Kiyokawa N, Mori T.

Eur J Haematol

92(3):
263-2672014

46(2):
163-143

2014

学会名

場所

年月

「2型糖尿病など代謝性疾患のゲノム解析等の現状と展
安田和基
望」

第18回ヒューマンサイ
エンス総合研究ワーク
ショップ:ゲノム解析
技術は創薬を変えるか

東京

平成28年
3月

「糖尿病にかかわる遺伝学・体質の基礎」

安田和基

第50回糖尿病学の進歩

東京「糖代謝異常の罹患体質を考える」

安田和基

第43回内科学の展望

岐阜

Pancreatic islet enhancer clusters enriched in
type 2 diabetes risk-associated variants.

Pasquali L, Gaulton KJ, Rodríguez-Seguí SA,
Mularoni L, Miguel-Escalada I, Akerman I, Tena JJ,
Morán I, Gómez-Marín C, van de Bunt M, Ponsa-Cobas
J, Castro N, Nammo T, Cebola I, García-Hurtado J, Nat Genet
Maestro MA, Pattou F, Piemonti L, Berney T, Gloyn
AL, Ravassard P, Gómez-Skarmeta JL, Müller F,
McCarthy MI, Ferrer J

学会発表
タイトル

発表者

平成28年
2月
平成27年
11月

研究発表及び特許取得報告について「A meta-analysis of Japanese genome-wide
association studies identified seven novel
susceptibility loci to type 2 diabetes.」

Imamura M, Maeda S, Yamauchi T, Hara K, Iwata M,
Hirose H, Yasuda K, Watada H, Maegawa H, Ito C,
Tanaka Y, Tobe K, Kaku K, Kawamori R, Kadowaki T.

51th Annual Meetingof the European
Association for the
Study of Diabetes

Stockholm, September
Sweden2015「糖尿病の成因の解明にむけて―KCNQ1の同定から多層安田和基
的疾患オミックス研究まで〜」

第4回糖尿病トランス
レーションリサーチ研
究会

弘前

平成27年
7月

「網羅的cis調節領域の検討による、高脂肪食に続発す
南茂隆生、宇田川陽秀、舟橋伸昭、安田和基
る膵島代謝機序の解明」

第4回NGS現場の会

筑波

平成27年
7月

「なぜ糖尿病になる人とならない人がいるのか〜ゲノ
安田和基
ムからバイオバンクまで〜」

第3回国立国際医療研究センター（NCGM）市
民公開講座『糖尿病の明日を考える〜セン
ターが進める治す医療への第一歩〜』

東京

平成27年
6月

75th Scientific
Sessions, American
Diabetes
Association.

Boston,
USA

June
2016

第58回日本糖尿病学会
年次学術集会

下関

平成27年
5月

後藤温、山田晃一、宮地元彦、森田明美、後藤麻貴、出 第49回日本成人病（生「KCNQ1リスクアリルと生活習慣介入の耐糖能改善に及浦喜丈、竹澤純、村上晴香、佐々木敏、饗場直美、安田 活習慣病）学会学術集
ぼす影響」
和基、寺内康夫、野田光彦、渡邊昌
会

東京

平成27年
1月

「糖尿病と遺伝子—今、臨床でどこまで応用できるのか
安田和基―」

湖東糖尿病セミナー

彦根

平成27年
1月24日

50th Annual Meetingof the European
Association for the
Study of Diabetes.

Vienna,Austria.

September
2014

後藤温、山田晃一、宮地元彦、森田明美、後藤麻貴、「生活習慣介入とKCNQ1リスクアリルの耐糖能改善に及第64回日本体質医学会
佐々木敏、饗場直美、安田和基、寺内康夫、野田光彦、
ぼす影響」
講演会
渡邊昌

大阪

平成26年
9月

後藤温、山田晃一、宮地元彦、森田明美、後藤麻貴、出「生活習慣介入による耐機能改善に際してKCNQ1リスク
第57回日本糖尿病学会
浦喜丈、竹澤純、久保田恵理、村上晴香、安田和基、野アリルの及ぼす影響」
年次学術集会
田光彦、渡邊昌

大阪

平成26年
5月

「膵島のゲノム網羅的解析による糖尿病発症機序の考 南茂隆生、宇田川陽秀、川口美穂、舟橋伸昭、上番増察」
喬、平本正樹、西村渉、安田和基

第57回日本糖尿病学会
年次学術集会大阪

平成26年5月「次世代シークエンサーを用いたゲノム、エピゲノム
安田和基
研究」

第57回日本糖尿病学会
年次学術集会

大阪

平成26年
5月

「腎細胞がんに発現する新規融合遺伝子の同定」

後藤政広、市川仁、荒井恵吏、知久季倫、坂本裕美、藤 第103回日本病理学会
元博行、安田和基、吉田輝彦、金井弥栄
総会

広島

平成26年
4月

「教育講演：遺伝子異常と糖尿病」

安田和基

第57回日本糖尿病学会
年次学術集会

大阪

平成26年
5月

「糖尿病の遺伝子解析の現状と課題—遺伝・環境相互作
安田和基
用も含めて」

Scientific Exchange
Meeting糖尿病における遺伝・環境の相互作
用

宇都宮

平成26年
2月

「糖尿病の遺伝子と臨床」

安田和基

第28回糖尿病研修セミ
ナー

神戸

平成25年
12月

「2型糖尿病遺伝因子はどこまでわかったか」

安田和基

第24回新潟糖尿病臨床
研究会

新潟

平成25年
10月

「ゲノム網羅的解析を用いた高脂肪食摂取による膵島 南茂隆生、宇田川陽秀、川口美穂、衛藤弘城、上番増の代償機序の解明」
喬、平本正樹、西村渉、安田和基

第3回NGS現場の会

神戸

平成25年
9月

「教育講演：糖尿病診療に遺伝情報は役立つのか」

第13回糖尿病・情報学
会

徳島

平成25年
8月

「ゲノム網羅的解析を用いた、高脂肪食摂取による膵 南茂隆生、宇田川陽秀、川口美穂、衛藤弘城、上番増
島の代償機序の解明」
喬、平本正樹、西村渉、安田和基

第56回日本糖尿病学会
年次学術集会

熊本

平成25年
5月

「Type 2 diabetes-associated SNPs with in KCNQ1
Hiramoto M, Udagawa H, Watanabe A, Kawaguchi M,
gene modulate the affinity of the locus for DNANishimura W, Nammo T, Yasuda K.
binding factors」

Annual Scentific
Meeting, American
Diebtes Association

Chicago,USA

2013年6月

発表先

場所

年月日

「A meta-analysis of Japanese genome-wide
association studies identified seven novel
susceptibility loci to type 2 diabetes.」

Imamura M, Maeda S, Yamauchi T, Hara K, TakahashiA, Kubo M, Iwata M, Hirose H, Yasuda K, Watada H,
Maegawa H, Ito C, Tanaka Y, Tobe K, Kaku K,
Kawamori R, Kasuga M, Kadowaki T.

「膵島のゲノム網羅的解析による膵島代償機序/糖尿病 南茂隆生、宇田川陽秀、川口美穂、舟橋伸昭、上番増発症機序関連因子の同定」
喬、平本正樹、西村渉、安田和基「Paternal allelic mutation at the Kcnq1 locus
reduces pancreatic β-cell mass via epigenetic
modification」

Inoue H, Asahara S-i, Etoh H, Teruyama K,
Shibutani Y, Ihara Y, Bartolome A, Hashimoto N,
Matsuda T, Koyanagi-Kimura M, Kanno A, Nagashima
K, Nishimura W, Yasuda K, Inagaki N, Seino S,
Kasuga M, Kido T.

安田和基

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

研究発表及び特許取得報告について
特許取得状況について※出願申請中のものは()記載のこと。

発明名称※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

登録番号

特許権者(申請者）（共願は全記載）

登録日(申請日)

出願国