生物物理 54（6），318-320（2014）
DOI: 10.2142/biophys.54.318
受理日：2014 年 9 月 4 日

トピックス

1 分子計測からわかるエクソ型セルラーゼの分子機構
飯野亮太1,2，中村彰彦3，五十嵐圭日子3，鮫島正浩3

1.

1

自然科学研究機構岡崎統合バイオサイエンスセンター / 分子科学研究所

2

総合研究大学院大学物理科学研究科機能分子科学専攻

3

東京大学大学院農学生命科学研究科生物材料科学専攻

がセルロース Iα よりも分解されやすいのかは明らかではなかった．本研究では TrCel7A の生化学計測，蛍光1 分子計測，および高速 AFM による 1 分子計測を駆使し，セルロース Iα とセルロース IIII の加水分解反応のすべての素過程の速度パラメーターを求めて比較する
ことで，その分解性の違いの原因を明らかにした 5)．

はじめに植物の細胞壁から得られるセルロースは β-グルコー
スが直鎖状に重合した高分子であり，バイオエタノー
ルの原料として注目されている 1)．しかしながらセルロースは植物の強度を担保する結晶性の構造多糖であり，その物理的・化学的安定性からオリゴ糖や単糖への分解が容易でなく，利用の障害になっている．
一方，自然界では，セルロースはカビやキノコなどの糸状菌や細菌などの微生物によって分解，代謝される．これらの微生物はセルラーゼと呼ばれる加水分解酵素群を菌体外に分泌してセルロースを分解する．糸状菌に特異的なセルラーゼの中で，セルロースを還元末端から分解するエクソ型セルラーゼの Cel7 は，結晶性セルロースの分解活性が高いことが知られている．
Cel7 の中で最もよく研究されているのはカビの一種 Trichoderma reesei 由来の TrCel7A である．高速原子間力顕微鏡（AFM）による観察で，TrCel7A は結晶性セルロースを分解しながら連続的に運動するリニア分子モーターであることが最近明らかにされた 2), 3)．
TrCel7A の運動を駆動するのは ATP ではなく，レールとなる結晶性セルロースの加水分解エネルギーである．また TrCel7A は固液界面で化学反応を触媒しつつ固 体 の セ ル ロ ー ス 上 を 運 動 す る． こ れ ら の 点 で，TrCel7A はミオシンやキネシンとは作動機構が異なる新しいリニア分子モーターといえる．
結晶性セルロースにはいくつかの結晶形が存在する．自然界に存在するセルロース Iα を超臨界アンモニアで処理するとセルロース IIII に変化する．興味深いことに，Cel7 によるセルロース IIII の分解速度はセルロース Iα のそれに比べ 5 倍程度大きいことが報告されていた 4)．この成果はセルロース分解の効率を改善する手法として注目されていたが，何故セルロース IIII

2.

生化学計測：酵素濃度依存性

まず生化学計測により，TrCel7A によるセルロースIα とセルロース IIII の分解活性を比較した．その結果，既報と同様の高い酵素濃度（2 μM）では確かに，単位酵素あたりのセルロース IIII の分解速度が 3-4 倍大
き い こ と が 確 認 さ れ た． と こ ろ が， 酵 素 濃 度 を100 nM に下げてみたところ，単位酵素あたりセルロース Iα の分解速度は上昇しセルロース IIII との差がみられなくなった．酵素濃度で分解速度が変わるのは何故だろう？セルラーゼの反応は固液界面で起こることがポイントになりそうだ．また TrCel7A はセルロース上で渋滞を起こし運動が阻害されることが報告されている 3)．これもポイントになりそうだ．
3.

結合速度定数と解離速度定数の蛍光 1 分子計測

蛍光色素 Cy3 で標識した TrCel7A（Cy3-TrCel7A）を用い，結合速度定数と解離速度定数を 1 分子計測した．酵素濃度は 30 pM で行った．Cy3-TrCel7A のセルロース Iα および IIII への結合は非常に特異的で，ガラスへの結合はみられなかった（図 1）．尚，30 pM の低濃度ではセルロース上の Cy3-TrCel7A の密度は非常に低く（図 1B），渋滞は起こらない．
セルロース Iα および IIII への結合・解離のタイムコースから（図 1C），セルロース単位長さ当たりの結合速度定数（kon，図 2A），および解離速度定数（koﬀ，
図 2B）を計測した．興味深いことに，kon の分布にはMolecular Mechanism of an Exo-type Cellulase Revealed by Single-molecule Analysis
Ryota IINO1,2, Akihiko NAKAMURA3, Kiyohiko IGARASHI3 and Masahiro SAMEJIMA3
1Okazaki Institute for Integrative Bioscience/Institute for Molecular Science
2
SOKENDAI3The University of Tokyo318

エクソ型セルラーゼの 1 分子計測

図1Cy3-TrCel7A の 1 分子蛍光イメージング．A，セルロースの明視野像．B，セルロースに結合した Cy3-TrCel7A1 分子の蛍光像．スケールバー，2 μm．C，結合・解離のタイムコースの例．1 分子の輝点を含む 0.86 μm × 0.86 μm の領域の蛍光強度を計測．

図3
高速 AFM による運動速度 ktr の 1 分子計測．

スの還元末端に結合する必要がある．本研究で用いた緑藻類由来のセルロースの重合度は 103 程度であり，還元末端の密度は β-グルコース単位で 1/103 と非常に低い．運動・分解後の解離が約半分を占めるという結果は，TrCel7A は還元末端に非常に高い選択性で直接結合することを示唆している．
4.

高速 AFM による運動速度の 1 分子計測

我々の蛍光 1 分子イメージングにおける位置決定精度は 10 nm 程度であり，Cy3-TrCel7A の運動速度の定量計測には十分ではなかった．そこで，高速 AFM を用いてセルロース上の運動速度（ktr）を測定し比較した（図 3）．その結果，またもやセルロース Iα と IIIIでほとんど違いがないという結果が得られた．
今回得られた koﬀP と ktr を考慮すると，Cy3-TrCel7Aはセルロース Iα，IIII 上を約 40 nm（ktr/koﬀP）運動した後に解離すると予想される．実際に高速 AFM 観察では，TrCel7A はセルロース IIII 上を同程度の距離移動した後に解離することが最近報告されている 7)．

図2
1 分子蛍光イメージングによる結合速度定数 kon と解離速度定数 koffの計測．A，kon の分布．kon は等間隔の複数のピークを示した．B，結合持続時間の分布．分布から求めた koff には 2 つの成分が存在した．

5.

セルロース Iα と IIII の分解性の違いのモデル

上述のように，求めたすべての速度パラメーターはセルロース Iα と IIII で大きな違いはみられなかった．
では，高濃度の酵素で処理した時のセルロース Iα と IIIIの分解性の違いは何に由来するのだろう．セルラーゼの反応は固液界面で起こることを考慮し，セルロースIα と IIII の構造モデルの違いに着目すると 8), 9)，以下のように解釈できる．セルロース Iα は親水的な（100）面と（010）面に挟まれた，狭く疎水性の高い（110）面を持つ（図 4A 左）．一方，セルロース IIII は狭く疎水性の高い（110）面に加え，幅が広く中程度の疎水性を持つ（110）面を持っている（図 4A 右）．TrCel7Aは疎水性のセルロース結合ドメインを介しセルロースに結合する．すなわち，TrCel7A のセルロースへの結合にはセルロース表面は疎水性である必要がある．セルロース Iα は疎水性面の面積が小さいため，高濃度の等 間隔ずつ離れた 複 数 の ピ ー ク が み ら れ た．高 速
AFM と蛍光でセルロースを同時観察した結果 6)，複数のピークはセルロース微結晶の束の数に対応していることが明らかとなった．また，微結晶 1 本の太さはセルロース Iα，IIII ともに 20 nm 程度でほぼ同じであった．微結晶 1 本に対応する最も小さいピーク（図 2B矢印）を比較すると，セルロース Iα と IIII で kon に大きな違いはみられなかった．また koﬀ の測定ではセルロース Iα，IIII ともに，遅い解離と速い解離の 2 成分が観察された．遅い成分はセルロース上を運動・分解，速い成分は運動・分解を伴わしてからの解離（koﬀP）NPない解離（koﬀ ）に相当する．セルロース Iα と IIII でkoﬀP と koﬀNP の値や，運動・分解後の解離の割合（約50%）に大きな違いはみられなかった．
尚，Cel7 がセルロースを分解するためにはセルロー319

エクソ型セルラーゼの 1 分子計測

（金沢大学），野地博行教授（東京大学），安藤敏夫教授（金沢大学）に感謝します．また，セルロースを供給頂いた和田昌久准教授（京都大学）に感謝します．
文献1)

Himmel, M. E. et al. (2007) Science 315, 804-807. DOI: 10.1126/science.1137016.

2)

Igarashi, K. et al. (2009) J. Biol. Chem. 284, 36186-36190. DOI:
10.1074/jbc.M109.034611.

3)

Igarashi, K. et al. (2011) Science 333, 1279-1282. DOI: 10.1126/
science.1208386.

4)

Igarashi, K. et al. (2007) FEBS J. 274, 1785-1792. DOI: 10.1111/
j.1742-4658.2007.05727.x.

5)

Shibafuji, Y. et al. (2014) J. Biol. Chem. 289, 14056-14065. DOI:
10.1074/jbc.M113.546085.

6)

Fukuda, S. et al. (2013) Rev. Sci. Instrum. 84, 073706. DOI:
10.1063/1.4813280.

7)

Nakamura, A. et al. (2014) J. Am. Chem. Soc. 136, 4584-4592.
DOI: 10.1021/ja4119994.

8)

Nishiyama, Y. et al. (2003) J. Am. Chem. Soc. 125, 14300-14306.
DOI: 10.1021/ja037055Z.

図4
A，セルロース Iα と IIII の構造モデル．B，セルロース Iα と IIII の分解性の違いを説明するモデル．

9)

Wada, M. et al. (2006) Macromolecules 39, 2947-2952. DOI:
10.1021/ma060228s.

10)

Ueno, H. et al. (2010) Biophys. J. 98, 2014-2023. DOI: 10.1016/j.bpj.2010.01.011.

酵素では結合可能な表面が飽和し，さらにセルロース表面で容易に渋滞を起こすと考えられる（図 4B 左）．
これらの原因で分解性が低下する．一方，セルロース
IIII は広い疎水性面を持つため，高濃度の酵素でも結合可能な表面の飽和や渋滞が起こることなく高い分解性を保持できる（図 4B 右）
．
おわりに

6.

飯野亮太

冒頭で述べたように，TrCel7A は新しいタイプの分子モーターである．今後は高精度な 1 分子計測により 10)，運動のステップやポーズといった素過程を明らかにしたい．TrCel7A は二糖単位でセルロースを分解するので予想されるステップサイズは 1 nm であり，計測は十分可能だと考えている．また運動の負荷依存性や化学力学共役の可逆性（後ろに引っ張ると合成するか？）も興味深い課題である．さらには，セルロースを非還元末端から分解するエクソ型セルラーゼのTrCel6A と TrCel7A を同時に作用させると，結晶性セルロースの分解効率が大幅に向上するという「シナジー効果」が報告されている 3)．1 分子多色同時イ
メージングや 1 分子 FRET 等の手法を駆使し，この異種分子間の協調作用の仕組みを明らかにしたい．
謝飯野亮太（いいの りょうた）
自然科学研究機構岡崎統合バイオサイエンスセン
ター / 分子科学研究所．博士（理学）
研究内容：分子機械の作動メカニズム
連絡先：〒 444-8787 愛知県岡崎市明大寺町字東山
5-1
E-mail: iino@ims.ac.jp
URL: http://groups.ims.ac.jp/organization/iino_g/index.html
中村彰彦（なかむら あきひこ）
東京大学大学院農学生命科学研究科
JSPS 特別研究員 PD．博士（農学）
研究内容：セルラーゼの分子機構
連絡先：〒 193-0843 東京都文京区弥生 1-1-1
E-mail: aki-naka@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp

中村彰彦

五十嵐圭日子（いがらし きよひこ）
東京大学大学院農学生命科学研究科准教授．博士（農学）
研究内容：セルロース分解に関わる酵素学および微生物学
連絡先：同上E-mail: kiyoigrs@kb3.so-net.ne.jp
五十嵐圭日子

鮫島正浩（さめじま まさひろ）
東京大学大学院農学生命科学研究科教授．農学博士
研究内容：林産学・森林生物化学
連絡先：同上E-mail: amsam@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp

辞本研究は柴藤祐介氏（2014 年修士号取得）が中心となり行ったものです．共同研究者の内橋貴之准教授

鮫島正浩

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