〔生物工学会誌

第 97 巻第3号

115–121．2019〕2018 年度 生物工学奨励賞（斎藤賞） 受賞

好熱性酵素を用いた
細胞外人工代謝経路の構築と利用に関する先駆的研究
本田孝祐

In vitro reconstitution of synthetic metabolic pathways using thermophilic enzymes
Kohsuke Honda (Department of Biotechnology, Graduate School of Engineering, Osaka
University, 2-1 Yamadaoka, Suita, Osaka 565-0871) Seibutsu-kogaku 97: 115–121, 2019.

はじめに優れた位置・立体選択性など，生体触媒を用いた化学品
製造プロセス（バイオプロセス）には，化学プロセスに

1897 年，Buchner は，酵母の無細胞抽出液によってはないアドバンテージがあるとされる．これらに勝るともエタノール発酵が生じることを見いだし，微生物発酵

も劣らぬバイオプロセス特有のアドバンテージとして筆に生きた細胞は必ずしも必要とされないことを示した．

者は，多ステップからなる逐次反応をワンポットで実施

この発見は，生気論（vitalism，生命には非生物にはな可能な点をあげたい 1)．

い特別な機能が備わるとする学説）をめぐる論争に終止符を打ち，酵素学，代謝学という新たな学問分野の扉を開いた．1907 年，この業績により，ノーベル化学賞を

好熱性酵素を用いた in vitro 代謝工学
た と え ば， デ ン プ ン 分 解 酵 素（Į-amylase，受賞した Buchner は，授賞講演でこう述べた．

glucoamylase）と glucose isomerase を組み合わせた異性

We are seeing the cells of plants and animals more
and more clearly as chemical factories.

化糖の製造は，現在までに産業利用されている生体触媒

数多くの化学反応が同調的に進行し，多種多彩な物質

ワンポットでの多段階反応の実施という上述のアドバンが生み出される生物の代謝のありさまは，確かに化学工

テージを活用した好例でもある．このように，2 〜 4 ス

場における化成品生産を見るようでもある．しかし，生テップ程度の酵素反応を組み合わせた有用化学品生産に物と化学工場の間には，そのサイズの違いに加え，もうはすでに多くの実用例が存在し，デンプン加工だけでも一つ決定的な物理的差異がある．それは多数の化学反応

異性化糖のほか，シクロデキストリン製造やトレハローを履行するために必要とされるコンパートメント（反応ス製造などがあげられる．

利用技術のうち，もっとも大規模なものであると同時に，容器などの仕切られた反応場）の数である．有機化学的同様のコンセプトに則り，さらに多数の酵素を組み合な合成反応では多くの場合，1 ステップの反応に一つのわせた逐次反応を設計・実施すれば，より多彩な化学品

反応容器が要され，ステップごとに生産物の分離・精製が製造可能となろうことは想像に難くない．しかし，こが必要となる．これに対し，生物の細胞は，オルガネラれを実現するためには，数多くの酵素を単離・精製するという限られた数のコンパートメント内で数千に及ぶ反必要があり，この操作の煩雑さをいかにして軽減するか

応をパラレルに履行可能であり，原核生物に至ってはもという課題に直面する．この課題を解決するための方策

はや細胞という単一のコンパートメントしか存在しなとして筆者らは，好熱菌に由来する酵素の優れた熱安定い．常温・常圧に近い温和な条件下での高い反応速度や性に注目した．好熱性酵素が示す耐熱性はこれらの酵素

著者紹介

大阪大学大学院工学研究科（准教授） E-mail: honda@bio.eng.osaka-u.ac.jp

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図 1．好熱性酵素を用いた in vitro 人工代謝経路構築のスキーム

分子の堅牢な構造，すなわちアミノ酸配列に起因する．
したがって，遺伝子組換え技術を用いて，これらの酵素を中温菌（あるいは好冷菌）内で産生させたとしても，得られる組換え酵素は，好熱菌から取得されたそれと同等の耐熱性を示す．好熱性酵素を中温性宿主（大腸菌など）内で発現させた後，これらの無細胞抽出液を 70 〜

90°C 程度の熱処理に供することで，宿主由来の夾雑酵
素を変性させ，所望の好熱性酵素を高い純度で得ることができる．熱処理による組換え好熱性酵素の簡易精製は，
これらの酵素を扱う研究者らの間で古くから利用されてきた手法である．同様に筆者らは，（i）目的とする好熱性酵素を大腸菌内で発現させ，（ii）これらを熱精製に供した後に，（iii）同一の反応容器内で混合することで，多数の酵素を簡便に精製，これらを用いた多段階反応を
ワンポットで実施することに取り組んだ（図 1）．さまざ
まな酵素を人為的に組み合わせ，天然にはないカスケー
ド反応を構築する本法は，生きた微生物の代謝経路を改

図 2．細菌・真核生物における一般的な EM 経路（左），一部のアーキアに見られる変形 EM 経路（中），および本研究で構築した ATP 非生産性キメラ型 EM 経路（右）．変形 EM 経路に特徴的な酵素反応を白抜き矢印で示す．変形 EM 経路には，
GAPN のほかフェレドキシン依存的に GAP の酸化を触媒する
GAP ferredoxin oxidoreductase（GAPOR）が存在する．

変する代謝工学のアナロジーとしても理解できる．そこで本稿では，上記スキームによる多段階酵素反応のデザある NAD(P)+，NAD(P)H を必要とする酵素は 2000 種

イン・構築と，それを用いた化学品製造技術を「in vitro

類以上にも及ぶ．これら補酵素類はいずれも高価な物質

代謝工学」と称することとする．

であることから，有用化学品の商業生産を目的に in

ATP を作らない解糖系

vitro 人工代謝経路を構築する場合には，補酵素要求性の酵素反応を含まない経路を設計する，あるいは経路内

生きた微生物の代謝経路を改変する既存の代謝工学ででの補酵素の消費と再生をバランスさせ，少量の補酵素

は，微生物が自身の生育・生存のために生産したい代謝をリサイクルしながら継続的に利用可能な経路をデザイ

物と，我々が商業目的で生産したい代謝物との間に齟齬ンすることが重要である．

が生じるケースが少なくない．これに対し，生きた細胞

たとえば，解糖系（Embden-Meyerhof 経路，EM 経路）

を反応場としない in vitro 代謝工学では，宿主の生理活の場合，グルコース 1 分子がピルビン酸 2 分子にまで酸性に左右されることなく，物質生産のみに特化した人工化を受ける過程で，2 分子の ADP から 2 分子の ATP が経路を構築することが可能となる．一方，in vitro 代謝．すなわち，天然の解糖系を in vitro
生産される（図 2 左）工学を含め，細胞から取り出した酵素を物質生産に利用で再構築し，これを用いてグルコースからのピルビン酸

する際にしばしば問題となるのは，補欠因子類の供給で製造を行おうとすれば，ピルビン酸 1 mol（約 1 万 5 千円）

ある．多くの酵素はその触媒活性を発揮するにあたり，

あたり 1 mol の ADP（約 500 万円）を損失することとな

補酵素などの補欠因子を要求する．代謝反応データベー

り，本製造法が経済的に成立しないものであることは自スである KEGG に登録された約 1 万種の反応のうち，明である（価格はいずれも Sigma Aldrich Japan オンライ

700 種類を超える反応が，ATP，ADP，AMP の少なく．解糖系が担う重要な生理的ンカタログ 2018 より概算）

ともいずれか一つを要求する．また，酸化還元補酵素で役割の一つは，グルコースの自由生成エネルギーを生体

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内のエネルギー通貨である ATP の形で抽出することであ成する好熱性酵素を個別に調製，これらを任意の割合でる．したがって，天然に存在する解糖系酵素群を用いて，混合することで in vitro 代謝経路を構築してきた．個別

ATP を作らない（ADP を消費しない）解糖系を設計するに調製した酵素を混合して用いる場合，各酵素の添加量ことは困難に思われるかもしれない．しかし，微生物のを実験的にチューニングし，目的物質の生産速度（＝ in

多様性はわれわれが思う以上に豊かである．たとえば，

vitro 代謝経路の流束）を最大化することが可能となる．

Sulfolobus 属，Thermoproteus 属などの超好熱性アーキ
アが有する変形 Entner-Doudoroff 経路では，ATP の生

その反面，多数の酵素を個別に調製するためには，相応成を伴うことなくグルコースからピルビン酸への酸化が応からなる人工経路を構築したければ，10 種類の組換

2)の手間と時間が要される．たとえば，10 ステップの反生じる ．同じく超好熱性アーキアである Thermococcus

え大腸菌を別々に培養，それぞれの菌体より酵素精製を属，Pyrococcus 属に見られる変形 EM 経路（図 2 中）は，行わなければならない．こうなると，ワンポットでの多通常の EM 経路と同様，2 分子の ADP を消費し 2 分子の段階反応が実施可能という冒頭に述べたバイオプロセス

ATP を生産する一方，ADP をリン酸基ドナーとする
kinase や，ホスホエノールピルビン酸からピルビン酸への変換に伴い AMP から ATP への 2 リン酸化を触媒する
pyruvate synthase などユニークな補酵素特異性を有した酵素から構成される 2)．このうち筆者らは，変形 EM 経路においてグリセルアルデヒド -3- リン酸（GAP）から
3- ホスホグリセリン酸（3PG）への変換を触媒する nonphosphorylated GAP dehydrogenase（GAPN）に注目した．通常の EM 経路において GAP は，リン酸依存型の GAP dehydrogenase（GAPDH）と phosphoglycerate
kinase（PGK）の 2 段階の酵素反応により 3PG へと変換され，この過程で GAP 1 分子あたり 1 分子の ATP が生産される（図 2 左）．これに対し，GAPN はリン酸非依存
的な酸化反応により ATP の生産を伴うことなく GAP を
3PG へ と 変 換 す る． し た が っ て， 通 常 型 EM 経 路 のGAPDH，PGK を変形 EM 経路由来の GAPN で置換することにより，ATP/ADP の消費と再生が釣り合った，
すなわち ATP を生産しないキメラ型解糖系が構築される（図 2 右）．筆者らは，本キメラ型解糖系に，NADH
依存的にピルビン酸を l- 乳酸へと還元する酵素（malate/lactate dehydrogenase）を組み合わせ，ATP/ADP 間のバランスに加え，NAD+/NADH 間の収支が釣り合ったin vitro 人工代謝経路を構築した 3)．本経路を用いた l- 乳酸生産試験では，各 0.2 mM の ATP，ADP を含む反応
液中で，6 mM のグルコースが 12 mM の l- 乳酸へと変換され，この際の ATP の回転数（リサイクルされた回数）
は 31 と求められた．さらに筆者らは，本キメラ型解糖の利点はなかば放棄されるに等しい．この問題を解決す
るには，経路を構成する一連の好熱性酵素を単一の大腸菌株内で共発現させ，一度の熱精製ですべての酵素をまとめて調製すれば良いことは容易に着想できる．しかし
この場合，大腸菌内（in vivo）での各酵素遺伝子の発現量と，in vitro で代謝流束を最大化させるための各酵素の最適量とをいかにして合致させるかという別の課題が生じる．筆者らはこの課題に対し，好熱性酵素遺伝子群
を単一プロモーター下に集積した人工オペロンを作製し，各遺伝子の in vivo での発現量を調整しつつ共発現させることで，その解決をはかった．一般に，単一プロ
モーター制御下でポリシストロニックに転写される遺伝
子は，プロモーターからの距離が遠ざかるにつれ（オペ
ロン中の配置順が後方に下がるにつれ），その発現量が低下する．筆者らは，ATP 非生産性キメラ型解糖系を構成する 9 つの好熱性酵素遺伝子を対象に，これらをmRNA の必要量に順じて集積した人工オペロンを作製した．このためにまず，（i）組換え大腸菌内で 1 ユニッ
ト当量の酵素を産生するために必要な mRNA 量（copies
mRNA/U enzyme）を各酵素について定量した．次に，（ii）in vitro 代謝経路の流束を最大化させるための酵素濃度（U enzyme/mL reaction mixture）を別の実験で求め，（iii）この値と（i）で求めた mRNA 量を乗じることで，
in vitro 経路構築に最適な各酵素の濃度を mRNA 濃度（copies mRNA/mL reaction mixture）へと換算した．
こうして求められた必要 mRNA 量に基づき，各酵素遺伝子のオペロン中での配置順を決定，これらを熱誘導型系を拡張，あるいはその一部を他の酵素に置き換えた

プロモーターの下流に集積した．なお，遺伝子の集積作

in vitro 経路を構築・駆動させることで，グルコースの業には，柘植らによって開発された OGAB（ordered

ほか，グリセロール，コロイド状キチンといった基質か

gene assembly in Bacillus subtilis）法 8) を用いた．構築ら，l- リンゴ酸，1- ブタノールなどの物質を生産するこ

した人工オペロンを導入した大腸菌内で各遺伝子の発現とにも成功している

4–7)．

好熱性酵素遺伝子の人工オペロン化と共発現
ここまでに紹介した研究事例ではいずれも，経路を構
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比率はおおむね予想どおりに調節されており，粗酵素抽
出液を熱精製の後，SDS-PAGE 解析に供したところ，目的の好熱性酵素群の発現を確認することができた（図3）．この熱精製粗酵素液を用いたグルコースからの l117

を見いだすにいたった 10)．しかし残念ながら，これらのアナログ物質を用いて得られる酵素反応速度（kcat/Km）
は，天然の補酵素を用いた場合の 1/10 〜 1/1000 程度と十分な値とは言いがたいものであった．
では，どうしたものかと思案するうちに，筆者は次のような着想に至った．
「任意の好熱性酵素反応を自在に組み合わせられる invitro 代謝工学では，原理上，好熱菌が産生するあらゆる代謝物を生産することが可能である．そしてニコチン
アミド補酵素もまた，好熱菌が産生する代謝物の一つで
図 3．キメラ型 EM 経路を構成する好熱性酵素を発現させた組換え大腸菌粗酵素液の SDS-PAGE 解析．図に示した各酵素，
およびこれらの遺伝子を人工オペロンに集積し共発現させた
大 腸 菌（ そ れ ぞ れ 約 1 mg wet weight） の 粗 酵 素 液 を 70°C，
30 分間の熱処理に供したのち，解析に供した．各酵素の略
称は以下のとおりとする；GAPN, non-phosphorylating GAP

dehydrogenase; PK, pyruvate kinase; PGI, glucose-6-phosphate
isomerase; ENO, enolase; PGM, phosphoglycerate mutase;
PFK, 6-phosphofructokinase; FBA, fructose-1,6-bisphosphate
aldolase; GK, glucokinase; TIM, triosephosphate isomerase.

ある．であれば，ニコチンアミド補酵素をその熱分解物
より再合成（サルベージ合成）可能な in vitro 代謝経路を構築すれば，これらの濃度を高温でも一定に保てるのではないか？」
この着想に基づき，筆者らは NAD+ を対象にその熱分解物を同定，得られる熱分解物からの NAD+ サルベージ
合成に関わる酵素を調査した．同定試験の結果，NAD+は加熱により，ニコチンアミドと ADP リボースの間の乳酸生産試験では，個別に調製した酵素の混合液を用いた場合と同等以上の生産速度を得ることができている 9)．

NAD+ の in vitro サルベージ合成
好熱菌由来酵素を用いて人工代謝経路を構築する invitro 代謝工学では，好熱性酵素の最適反応温度に近しい高温条件（50 〜 70°C 程度）で変換反応を行うことがC-N 結合の切断を受け，これら 2 つの物質へと分解されることを確認した．次に，ニコチンアミドと ADP リボースからの NAD+ サルベージ合成経路に関わる酵素を文献，データベースより探索したところ，同経路は好熱菌
のみならず多くの生物に保存されているものであることが判明した．筆者らは，Thermus thermophilus，Bacillus

モニターすることで，反応停止の原因となった因子の究

stearothermophilus，Thermoplasma acidophilum といった好熱菌より各酵素遺伝子を取得，これら 6 つの好熱性．なお
酵素からなる in vitro 代謝経路を構築した（図 4）
本経路では 1 分子の NAD+ を再合成するため，3 分子のATP が消費され，3 分子の AMP が生じる．そのため経路には，上記の 6 酵素に加え，Thermus thermophilus 由
来 adenylate kinase，および polyphosphate kinase11) を組
み合わせた，ポリリン酸をリン酸基供与体とする AMP
から ATP への再生反応を組み込んだ．これらの好熱性
酵素群の存在 / 非存在下で 60°C における NAD+ の残存明を行った．この結果，酸化還元補酵素である NAD+，

濃度を経時的に定量したところ，酵素群の非存在下ではNADH の追添加を行った場合にのみ，反応速度の回復が見られ，in vitro 代謝反応の停止はこれらの物質の熱分

およそ 6 時間で NAD+ 濃度が半減したのに対し，酵素が解に起因することが明らかとなった．しかし，先にも述定に保つことが可能であった 12)．さらに筆者らは，これ

べたとおり，これらの補酵素は高額な物質であり，分解らのサルベージ酵素遺伝子群を前項に述べたスキームにするからといって容易く追添加できるものでもない．調則って人工オペロンに集積，共発現させた大腸菌株の構望ましい．多くの好熱性酵素はこのような高温条件下においても優れた安定性を示すことが知られているが，実際にこれらを組み合わせて変換反応を行ったところ，反応開始から数時間以内に目的生産物の蓄積が停止する
ケースがほとんどであった．生きた細胞の代謝反応とは異なり，in vitro 代謝経路は限定された数のコンポーネン
トのみから構成される．そこで筆者らは，反応停止後の溶液に各コンポーネントを追添加し，生産反応の回復を+べてみると，NAD ，NADH をはじめとするニコチン
アミド補酵素が高温で不安定であることはよく知られた事実であり，ならばこれらの安定性を高めるため，すで存在する場合，約 15 時間にわたって NAD+ の濃度を一築にも成功している 13)．

NAD+ サルベージ合成と好熱菌の生育温度域に何らかの方策が講じられているのではないかと文献調T. thermophilus は 1968 年 9 月，大島らによって伊豆査を続けたところ，化学合成した安定なアナログ物質にの峰温泉より採取された高度好熱性細菌であり 14)．本稿

より天然のニコチンアミド補酵素を代替するという報告

執筆中の 2018 年はその発見から 50 年を数える記念の年

118

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図 4．NAD+ サルベージ合成のために構築した in vitro 人工代謝経路．白抜き矢印は，枠内に示された酵素反応による AMP から
ATP への再生反応を示す．各酵素の略称に付した接頭語は，それぞれの酵素の由来となった好熱菌を表す；Ta, T. acidophilum；
Tt, T. thermophilus；Bs, B. stearothermophilus．各酵素の略称は以下のとおりとする；NAMase, nicotinamidase; PRT, nicotinate

phosphoribosyltransferase; NaMAT, nicotinate mononucleotide (NaMN) adenylyltransferase; NADS, NAD synthase; ADPRP, ADPribose pyrophosphatase; RPK, ribose-phosphate pyrophosphokinase; ADK, adenylate kinase; PPK, polyphosphate kinase.

でもある．この間，T. thermophilus は好熱性細菌のモデが見いだされなかったため，大腸菌内での発現実績が報ル生物としてさまざまな研究に用いられ，標準株である

告されていた T. acidophilum 由来酵素を採用した．しかT. thermophilus HB8 では，そのゲノム（および 3 つのプラスミド）にコードされた約 2200 の遺伝子のうち，75％以上の遺伝子を網羅した 1 遺伝子発現ライブラリしながら，T. thermophilus HB8 のゲノム上，NAD+ サ
ルベージ合成に関わる一連の酵素遺伝子がほぼすべて完
備されている中で，NAMase だけが欠落しているとい（大腸菌内での発現プラスミドセット）が完備されていうのも合点がいかない．また仮に T. thermophilus HB8る 15)．本ライブラリは筆者らの研究にとっても欠かすこが NAMase を有さず，そのサルベージ経路が不完全なとのできないリソースとなっており，多くの場合，目的ものであるとすれば，本菌はいかにして高温環境下におの好熱性酵素遺伝子を探索する際のファーストチョイス

ける NAD+ のホメオスタシスを維持しているのだろう

としてこれを利用している．

か？このような疑問から，再度 T. thermophilus HB8 ゲ

さてここで，図 4 の NAD+ サルベージ合成経路を今一ノムを精査したところ，他の微生物由来の NAMase と度よくご覧いただきたい．サルベージ合成に関わる 6 種

高い相同性を示す遺伝子（ TTHA0328 ）を見いだすの酵素（ATP 再生に関わる酵素 2 種を除く）のうち，4に 至 っ た．TTHA0328 の 産 物 は デ ー タ ベ ー ス 上，

種類は T. thermophilus 由来であり，これらはいずれも

isochorismatase と呼ばれる別の加水分解酵素とアノテー

上述の 1 遺伝子発現ライブラリより取得されたものでションされていたが，本遺伝子を大腸菌で発現させ得らある．残る 2 つの酵素，すなわちニコチンアミドかられた組換え酵素は，ニコチンアミドに対する高い活性+の NAD サ ル ベ ー ジ 合 成 の 初 発 反 応 を 触 媒 す る（kcat/Km = 2900 s–1 mM–1）を示した．また TTHA0328 破

nicotinamidase（NAMase）および最終ステップを担う
NAD synthase（NADS）が他の好熱菌由来となっている．
このうち NADS に関しては，ライブラリ内にも該当す

壊株を作製し，細胞内の NAD+ および NADH の総量を定量したところ，その値は野生株に比べ有意に低く，まる酵素が含まれていたものの，その活性が十分ではな

培地に添加することで相補されたことから，TTHA0328

たこの差異は NAMase の反応産物であるニコチン酸をかったことから，探索試験により B. stearothermophilus

は，T. thermophilus HB8 内で NAMase 遺伝子として機由来のものを獲得するに至った．一方，NAMase につ能するものと結論づけられた．次に筆者らは，NAD+ サ

いては，ライブラリはもとより，T. thermophilus HB8

ルベージ合成能が T. thermophilus HB8 の生育温度に及のゲノムアノテーション情報にも当該酵素遺伝子の情報

ぼす影響を調査した．野生株と TTHA0328 破壊株のそ

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素群を精査していると，既知の代謝経路にはまだまだ数多くのミッシングリンクが残されていることに気づかされる．これらのミッシングリンクの穴埋め作業は，新規の酵素反応や代謝経路の発見に直結するものである．とりわけ好熱菌は，そのユニークな生態を支えるための独自の分子メカニズムを発達させており，新規酵素反応の宝庫となっている 17)．これらの酵素の探索と特性評価に関する研究は，基礎的知見の拡充に貢献するものであると同時に，人工代謝経路デザインの可塑性を高め，その利用可能性を押し広げるなど，応用的側面からも重要な役割を果たす．基礎研究と応用研究は，われわれの社会
図 5．T. thermophilus HB8 野生株（A，B）および TTHA0328
破壊株（C，D）の 70°C（A，C）および 80°C（B，D）における生育プロファイル．最少培地に 100 ȝM のニコチン酸を添加した場合（●），および非添加の場合（○）のそれぞれで培養を行った．データは独立した 3 回の試験結果の平均と標準誤差（エラーバー）で示す．

れぞれを T. thermophilus 野生株の最適生育温度付近である 70°C にて培養したところ，意外にも両者の生育プロファイルにほとんど違いは見られなかった．一方，培養温度を 80°C にまで高めた場合，TTHA0328 破壊株では顕著な生育阻害が認められ，またこの生育阻害は培地に
16)

ニコチン酸を添加することにより緩和された（図 5） ．
以上のことから，T. thermophilus HB8 は，最適生育温度付近では生育に必要なニコチンアミド補酵素を denovo 合成のみで調達可能である一方，これを上回る高温条件下では，サルベージ合成経路の駆動が重要となることが示された．少々大げさな表現をお許しいただくな
らば，本発見は高度好熱菌の生育温度の上限を決定する因子の一つを分子レベルで明らかにした成果ということもできよう．
おわりに以上のとおり筆者は，新規生体触媒利用技術としてのin vitro 代謝工学の確立と，本法を用いた有用物質生産研
究に取り組んできた．また，好熱性酵素遺伝子群の人工
オペロン集積と共発現や，in vitro 人工経路による NAD+のサルベージ合成など，本法のフィージビリティー向上に向けた要素技術開発にも努めてきた．幸いなことに本法に興味を持っていただける民間企業にも恵まれはじめ，有用物質の商業生産に向けた共同研究にも取り組みだしている．近い将来，in vitro 代謝経路を用いた有用物
質生産プロセスを商業スケールで稼働させることが現在の筆者の目標の一つである．
一方，最後に紹介したNAMaseの例に見られるように，
人工代謝経路デザインのため種々の微生物由来の代謝酵

120を豊かで実り多いものにするための両輪である．この事
実を忘れずに，両者のバランスを心掛けながら，今後の研究に取り組んでいきたい．

There is no such thing as a special category ofscience called applied science; there is science and its
applications, which are related to one another as the fruit
is related to the tree that has borne it.
- Louis Pasteur謝

辞本研究は，大阪大学大学院工学研究科生命先端工学専攻合成生物工学領域（旧称，生物化学工学領域）にて実施されたものです．本研究の実施にあたり，多大なご指導・ご鞭撻を賜りました大竹久夫先生（大阪大学名誉教授，早稲田大学客員教授），ならびに多くのご助言・ご協力をいただきました大政健史先生（大阪大学教授），岡野憲司先生（大阪大学助教）に心より御礼申し上げます．また，ともに研究に取り組んだ研究員，学生諸氏のハードワークに敬意を表するとともに深く感謝いたします．また，学生時代の恩師であり，筆者に酵
素化学の基礎とこれらを用いた物質生産の面白さをご教授いただきました清水昌先生（京都大学名誉教授，バイオインダ
ストリー協会会長），片岡道彦先生（大阪府立大学教授）に感謝申し上げます．このほかにも本研究の遂行にあたっては，数多くの皆様からさまざまなサポートをいただきました．ご協
力をいただいたすべての皆様に感謝申し上げるとともに，本研究のさらなる発展により，御恩に報いて参りたいと存じます．本研究の一部は，科学技術振興機構，日本学術振興会からの支援を得て行われたものです．

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