常識を超えた新規C18カラム：
すべてのピークをシャープに！
クロマニック テクノロジーズ
長江徳和
日本薬学会第129年会

1

【緒言】
カークランドによりHPLCが発明されて以来40年近く経過するが，この間充填剤は日々改良が進められてきた。
 表面多孔性（ペリキュラー）充填剤から全多孔性に，さらに近年再び粒子径を3μm以下にした表面多孔性へと，シリカ系充填基材も変化している。
 またシリカ系逆相充填剤はシラノール基の影響を防ぐため，様々なエンドキャッピング技法が開発されてきた。
 演者らは従来のエンドキャッピング方法の概念を変え，エンドキャッピング試薬をあらかじめオクタデシルシリル化試薬に結合させたシリル化試薬を開発した。
 アミトリプチリンのピーク形状を比較することにより，この試薬で調製した充填剤の残存シラノール基の評価を行った。
日本薬学会第129年会

2

新規C18試薬A（HMODTS) 特許出願中
ヘキサメチルオクタデシルテトラシラン

Step 2

Step 1

toluene＋ H2O＋80℃，4h

MeO

Si

OMe
OMe

HO

Si

OMe
OMe

HOMeClMeMe MeMe MeSi

O

Si

OSiCl

toluene30℃，2h

SiOMe
OMe

MeCl

日本薬学会第129年会

MeMe
SiO

MeMe
SiOMeSi

OSi

OMe
OMe

3推定されるシリカ表面での結合状態（Sunniest C18）

Final TMS

HO
Si
O
Si
Si
Si

O

Si

Si
O
Si
OOO

O

Si

Si

Si
Si O
Si O
O O

SiO

OOO

O

Si
OO

Si
O

OO

Si

O

O

Si

Si
O

O
O
SiOOO

Si

O
Si
Si
HOOO

SiOSiOOSi

O O

SiOSi

O OHOSiOOSi
Si
Si
O OO O OOOSi O
O Si O
SiOO

日本薬学会第129年会

O
SiOOO

429Si CP-MAS NMR
Si

Oシリカゲル
OSi

OQ3OH
SiOH

OSi
Si

SiOSi

Si

OSiOO

Si

OSi

Si

OH

Q2

Q4
R
Si

Monofunctional C18OR

M1

OH
Si

Difunctional C18

Si R

O

Si

O

Si R
Si

R

O

Trifunctional C18

Si

O+ TMS

T1
日本薬学会第129年会

Si
Si

O

Si R
OH

R

D2

D1OH

R
Si

OH
Si

Si

O

R

T2

Si
Si

O
Si

O

R

O

T35Sunniest C18充填剤の物性用いたシリカゲル: 12nm, 340 m2/g, 5 μm
C18試薬結合後の炭素含有量：16.1%
最終エンドキャッピング後の炭素含有量：16.3%日本薬学会第129年会

6アミトリプチリンのピーク比較Ⅰ
メタノール CH3OH, pH7.5, 40 ºC
Sunniest C18 （HMODTS)
1４

３N(4)=11,000
TF(4)=1.06

2Sunniest RP-AQUA
1４３
2

N(4)=10,500
TF(4)=1.07

Column size: 4.6x150 mmParticle size: 5μm
Mobile phase:
CH3OH/20mM Phosphate buffer pH7.5=80/20
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Propranolol
CH3O

NHCH3OH

1４

A社C1832

1N(4)=8,950
TF(4)=1.76
４

B社C18３2N(4)=10,000
TF(4)=1.50

3 = NortriptylineNH
CH34 = Amitriptyline
CH3NCH30246810

Retention time/min

121416

日本薬学会第129年会

7アミトリプチリンのピーク比較Ⅱ
メタノール CH3OH, pH6.0, 22 ºC
Sunniest C18 (HMODTS)
1

４

N(4)=9,000
TF(4)=1.08

３
2

４Sunniest RP-AQUA
1

N(4)=8,000
TF(4)=1.10

３2

1

A社C18

４

N(4)=3,900
TF(4)=2.92

32
1Column size: 4.6x150 mm
Particle size: 5μm
Mobile phase:
CH3OH/20mM Phosphate buffer pH6.0=80/20
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 22 ºC
Sample: 1 = Uracil
CHONHCH
2 = Propranolol

B社C18 ３

N(4)=5,800
TF(4)=2.86

４233OH3 = Nortriptyline
NHCH34 = Amitriptyline
CH3NCH30246810Retention time/min1214

日本薬学会第129年会

8アミトリプチリンのピーク比較Ⅲ-A
アセトニトリル CH3CN, pH7.0, 40 ºC
Sunniest C18 (HMODTS)
４1

３

N(4)=14,000
TF(4)=1.16

2Sunniest RP-AQUA
1４３2

1

A社C1832

1N(4)=13,800
TF(4)=1.24

４33OH

3 = Nortriptyline

N(4)=4,000TF(4)=4.33

B社C18３2Column size: 4.6x150 mmParticle size: 5μm
Mobile phase:CH3CN/20mM Phosphate buffer pH7.0=60/40
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
CH2 = Propranolol
ONH
CH

４NH
CH34 = Amitriptyline

N(4)=4,300
TF(4)=5.24

CH3N
CH302468101214

Retention time/min

16182022

日本薬学会第129年会249

アミトリプチリンのピーク比較Ⅲ-B
ColumnTF

N

ColumnTF

N

Sunniest C18(HMODTS)

1.16 14,000

Japanese company C1 C18

2.148,700

Sunniest RP-AQUA

1.24 13,800

P11.099,500

D15.19M1

2.01 11,200

D2

2.19 14,200

Japanese company D1 C18

1.30 12,000AT3.255,300

Japanese company D2 C182.928,000

S11.748,300

Japanese company D3 C182.706,100

W11.97 10,600

Japanese company E1 C180.99 11,400

WS21.59 10,100

Japanese company F1 C183.44

W31.33 10,000

Japanese company G1 C18

1.71 10,000

3,300

6,700

Japanese company A1 C18 3.078,500

Japanese company G2 C182.15 11,500

Japanese company A2 C18 2.529,200

Japanese company H1 C1811.12,100

Japanese company B1 C18 2.2350

Japanese company I1 C18

3.777,400

A13.285,900

Japanese company B2 C18 2.01 10,900
Japanese company B3 C18 7,75

Column size: 150 X 4.6 mm
Particle size: 5 μm
Mobile phase:
CH3CN/20mM Phosphatebuffer pH7.0=60/40
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: Amitriptyline

CH3N
CH33,600

日本薬学会第129年会10溶質の水和状態の変化
塩基性化合物のカチオンの周りの水和量は

H

H
O
H
CH3OH+ H
N
CH3

カラム温度が下がるほど下がり，メタノールよりもアセトニトリルの方が下がる
H

H
O
H
CH3OH+ H
N
CH3H OH

H OH

メタノール 22℃

O H
H

H

CH3+ H O H
NCH3

メタノール 40℃

O H
H

塩基性化合物のカチオンの周りの水和量が少ない

アセトニトリル 40℃

シラノール基とのイオン交換吸着相互作用が強く働く

テーリング

日本薬学会第129年会

11シラノール基を残したC18固定相
Sunrise C18-SAC

シロキサン結合に変換

高吸着性
シラノール

OOO

H

SiSiH

H

H

H

H

H

O

O

O

O

O

Si

Si

Si

SiSiO
Si

H

OO
Si

Si

水和したシラノール基はアミトリプチリン（塩基性）をイオン交換相互作用で保持増大させるが，アミトリプチリンをテーリングさせない。
日本薬学会第129年会12酢酸アンモニウムを用いた塩基性化合物の分離：pHの影響
アンチカオトロピックイオンであるアンモニウム
1

イオンが安定な水和層を形成

2

pH 2.74

3

酢酸のみ
1

pH 3.53

移動相：
アセトニトリル/100mM 酢酸アンモニウム (70:30)
流速：1.0 mL/min
温度：40 ºC
試料：1=ウラシル，2=トルエン, 3=プロプラノロール，
4=ノルトリプチリン，5=アミトリプチリン

N=13,0004

1 253
1

カラム：Sunrise C18-SAC 4.6 x 150 mm

52pH 4.1

5N=12,500

42pH 5.0354

N=11,500

1 2pH 5.914345N=11,500

2pH 6.8035105152025
保持時間(min)30

日本薬学会第129年会

N=11,500354013

エチルベンゼンの相対保持時間 (%)

耐久性の評価耐酸性加速試験

100

耐久性試験条件
Column size: 4.6x150 mm
Mobile phase:
CH3CN/1.0% TFA,pH1=10/90
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 80 ºC

908070605040Sunniest C18 HNODTS

30

B社 C18D社 C1820E社 C18020406080100120

保持時間測定条件
Column size: 4.6x150 mmMobile phase:
CH3CN/H2O=60/40
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Ethylbenzene

通液時間（ｈ）
日本薬学会第129年会

14分離特性Ⅰ
金属配位性化合物の分離

標準試料の分離例
231540510151726202530

35

Retention time/min

Column: Sunniest C18 HMODTS, 5μm 4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Pressure: 5.4 MPa
Sample: 1 = Uracil,
2 = Caffeine,
3 = Phenol,
4 = Butylbenzene
5 = o-Terphenyl
6 = Amylbenzene
7 = Triphenylene
疎水性：分離係数（Amylbenzene/Butylbenzene） = 1.5802468Retention time/min

Column: Sunniest C18
HMODTS, 5μm 4.6x150 mm
Mobile phase:
CH3CN/20mM H3PO4=10/90
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = 8-Quinolinol
2 = Caffeine

水素結合性：分離係数（Caffeine/Phenol） = 0.4１立体選択性：分離係数（Triphenylene/o-Terphenyl） = 1.43

日本薬学会第129年会

15分離特性Ⅱ
酸性化合物の分離

ピリジンとフェノールの分離
分離係数（Pyridine/Phenol） = 0.37

31232102468Retention time/min

Column: Sunniest C18
HMODTS, 5μm 4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=30/70
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = Uracil
2 = Pyridine
3 = Phenol

02468Retention time/min

Column: Sunniest C18
HMODTS, 5μm 4.6x150 mm
Mobile phase: CH3CN/0.1% H3PO4=2/98
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@210nm
Sample: 1 = Formic acid
2 = Acetic acid
3 = Propionic Acid

日本薬学会第129年会16アセトニトリルと酢酸アンモニウムを用いたアミトリプチリンの分離例
4Column: Sunniest C18 HMODTS, 5μm 4.6x150 mm
Mobile phase:CH3CN/10mM Ammonium acetate pH6.8=40/60
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil，

13

2 = Propranolol，

CH 3ONHCH 3OH

23 = Nortriptyline，NH
CH 3

4 = Amitriptyline
CH 3N012347678910

CH 3Retention time/min

日本薬学会第129年会

17他社との比較
N=12,200
TF=1.30
1

N=12,100
TF=1.21

N=12,000
TF=1.28

Sunniest C18
Sunniest RP-AQUA
N=5,100
TF=2.4

Sunniest C8Column size: 4.6x150 mmParticle size: 5μm
Mobile phase: CH3CN/10mM
Ammonium acetate
pH6.8=40/60Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: Amitriptyline

N=8,500
TF=2.6

E社 C18N=5,500
TF=2.1F社 C18N=8,100
TF=2.0

G社 C18CH3NCH3H社 C1802468101214Retention time/min

日本薬学会第129年会

18

カラムからの溶出物の比較（ブリード現象）

Column size: 2.0x150 mm
Mobile phase:A) 0.1% acetic acidB) CH3CN
Gradient:
Time: 0min 3min 14.4min 18min 19min%B: 5% 5% 100% 100% 5%
Flow rate: 0.2 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: Corona CAD

F社 C18B社 C18Sunniest C18 HMODTS

Retention time/min

日本薬学会第129年会19MSを用いたブリードの比較
5.E+08

Column size: 150 x 2.0 mm
Mobile phase:A) 0.1% acetic acidB) CH3CN
Gradient:
Time: 0min 3min 14.4min 18min 19min%B: 5% 5% 100% 100% 5%
Flow rate: 0.2 mL/min
Temperature: 40 ºC
MS： ABI API-4000
Ionization: Turboionspray (cation)
Measurement mode:
Q1 Scan m/z 100-1000

5.E+084.E+08Company B C18
Intensity (cps)

4.E+083.E+083.E+082.E+082.E+081.E+08Sunniest C18 HMODTS

5.E+070.E+0005101520Time (min)日本薬学会第129年会

20オクチル基(C8,HMOTS)でも同様に合成
アミトリプチリンのピーク形状
4AColumn: Sunniest C8 HMOTS, 5μm 4.6x150 mm
N(4)=11,700 Mobile phase:A) CH3CN/20mM Phosphate buffer pH7.0=60/40
TF(4)=1.09B) CH3CN/10mM Ammonium acetate pH6.8=40/60
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil，

312

2 = Propranolol，

4B

1O

N(4)=11,200TF(4)=1.21

3CH 3NHCH 3OH

3 = Nortriptyline，

2NHCH 3

4 = Amitriptyline
CH 301234567NCH 3Retention time/min

日本薬学会第129年会

21【まとめ】Sunniest C18, RP-AUQA, C8
 エンドキャッピング試薬として用いられるヘキサメチルトリシロキサンをODSに結合させた新規C18試薬（HMODTS)を開発した
 HMODTSの官能基はシリカ表面の様々な位置のシラノール基と結合可能
 残存シラノール基を非常に少なくすることが可能
 移動相中の有機溶媒や緩衝液などの制限を受けることなく，塩基性化合物のテーリグを少なくできる
日本薬学会第129年会22