酵母における S‐アデノシルメチオニン(AdoMet)の生理機能に関する研究
水沼正樹（広島大学大学院先端物質科学研究科）
研究の目的
S－アデノシルメチオニン（AdoMet）は、生体内における様々なメチル化反応に使われる高エネルギー硫黄化合物である。AdoMetは、細胞増殖に様々な影響を及ぼす。以前、
我々は出芽酵母S－アデノシルホモシステイン(AdoHcy) 水解酵素をコードするSAH1 遺伝子における変異を、zds1 破壊株が示すCa2+が誘導するG2 期遅延および芽の異常極性成長を抑圧する変異株として取得した1,2）。興味深いことに、sah1-1 変異株はSah1 の基質であるAdoHcyのみならずAdoMetを細胞内に高蓄積することが分かった。ヒトのAdoHcy
水解酵素における患者の症例も報告され、酵母と同様、AdoHcyのみならずAdoMetが高蓄積することが分かった3）。このことから、細胞内AdoHcyやAdoMetの蓄積が引き起こす様々な現象を理解する上で、sah1-1 変異株をモデル系として解析することは有益と考えられた。本研究の目的は、sah1-1 変異株の解析を通して、細胞増殖におけるAdoHcyやAdoMetの役割を調べることである。

方法
出芽酵母 (野生株, sah1-1, または vps33∆) 株をYPD培地で培養した。特に記述がな
い限り培養は 25°Cで行った。細胞内AdoMet や AdoHcyの抽出は文献1)に従った。細胞内AdoMet およびAdoHcy 含量はWaters Capillary Ion Analyzer (Milford, MA, USA)を用いたキャピラリー電気泳動法により測定した1)。 RNA の抽出および DNAマイクロア
レイ実験は文献4)に従った。

結果
これまでに我々は、sah1-1 変異株のYPD培地、許容温度 25ºCにおける細胞内 AdoHcyおよび AdoMet 含量が高いことを見出した1)。 以前、液胞形態に重要な機能を持つVPS33
遺伝子の破壊株においてAdoMetの高蓄積は、細胞増殖に悪い影響を及ぼすことが報告された。そこで、 sah1-1 vps33∆二重変異株を構築し、その増殖を調べた。その結果、期待通りsah1-1 vps33∆ 二重変異株は致死性を示した。このことは、細胞内 AdoHcy およびAdoMetは液胞で蓄積されることを意味し、さらに細胞内AdoHcyおよびAdoMetの高蓄積は酵母の細胞増殖を阻害することが示唆された。
我々は、 sah1-1 変異株は14～37 ºCでは増殖遅延を示し、高温ではより顕著に増殖阻害が観察されることを見出した1)。sah1-1 変異株における細胞内AdoHcy および

AdoMet含量が 高温ではさらに増加すると予想した。そこで、sah1 変異株の制限温度である37ºC・YPD培地における細胞内AdoHcy および AdoMet含量を測定した。 AdoHcy およびAdoMet含量はキャピラリー電気泳動法により測定した。sah1-1 変異株におけるAdoHcy およびAdoMet 含量は25ºC・ YPD培地のときと比較して、それぞれ2.5および6倍に増加していた。 細胞内 AdoHcy のみならず AdoMetの高蓄積が観察された。以前、
シスタチオニンβ合成酵素変異株では、細胞内AdoMet/AdoHcy比が1.5以下になると増殖阻害を示すことが報告された5). 我々は以前25ºC・YPD培地でsah1-1 変異株におけるAdoMet/AdoHcy比が6.3であったことを見出した。37ºCにおいて、AdoMet/AdoHcy比は13.4であった。高温で観察されたAdoMet/AdoHcy 比の増加は、AdoHcy高蓄積による増殖阻害の解除のためAdoMet をさらに高蓄積させる未知の機構が作動したと予想された。さらに、sah1-1変異株を37ºCにシフトすると芽のない大きなG1 期の細胞が観察された。このことを確かめるためにFACS解析によりDNA含量を測定した。その結果、sah1-1変異株は G1 期遅延を示すことが確かめられた。
AdoHcy および AdoMet の高蓄積が遺伝子の発現に関与するか調べるため、DNA マイク
ロアレイを行った。その結果、sah1-1 に依存したいくつか特長的な遺伝子の発現が観察された。sah1-1 変異株で発現が 2 倍以上に増加した遺伝子を同定した。その結果、64 遺伝子が同定された。これらは脂質合成、リン酸・ポリリン酸合成およびメチオニン合成に関与するものであった。興味深いことに SAH1 遺伝子も高発現していた。さらに、37ºC においても同様な実験を行ったが、解析が出来なかった。

結論
本研究では、SAH1 遺伝子における変異を有するsah1-1 変異株の解析を行った。sah1-1変異株では、 Sah1 の基質であるAdoHcyのみならずAdoMetを細胞内に高蓄積することが高温(37ºC)で顕著に観察される。 高温では、sah1-1 細胞は、G1 期遅延する。DNAマイクロアレイの結果、sah1-1 変異株で観察される細胞内AdoHcy およびAdoMet の増加は、メチオニン合成関連遺伝子の高発現による影響と予想される。AdoHcyおよびAdoMetの生理機能を知るには、今後の更なる詳細な解析が必要である。

文献
1) Mizunuma M., Miyamura K., Hirata D., Yokoyama H., and Miyakawa T. Involvement ofS-adenosylmethionine in G1 cell-cycle regulation in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA,101: 6086-6091 (2004).
2) Miyakawa T., and Mizunuma M. Physiological roles of calcineurin in Saccharomyces
cerevisiae with special emphasis on its roles in G2/M cell-cycle regulation. Biosci
Biotechnol Biochem. 71: 633-645 (2007).

3) Baric I., Fumic K., Glenn B., Cuk M., Schulze A., Finkelstein J. D., James S. J.,
Mejaski-Bosnjak V., Pazanin L., Pogribny I. P., Rados M., Sarnavka V., Scukanec-Spoljar
M., Allen R. H., Stabler S., Uzelac L., Vugrek O., Wagner C., Zeisel S., and Mudd S.H.
S-adenosylhomocysteine hydrolase deficiency in a human: a genetic disorder of methionine
metabolism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 4234-4239 (2004).
4) Shobayashi M., Ukena E., Fujii T., Iefuji H. Genome-wide expression profile of sakebrewing yeast under shaking and static conditions. Biosci Biotechnol Biochem. 71: 323-335(2007).
5) Castro R., Rivera I ., Struys E. A., Jansen E. E., Ravasco P., Camilo M. E., Blom H. J.,Jakobs C., and Tavares de Almeida I. Increased homocysteine and S-adenosylhomocysteine
concentrations and DNA hypomethylation in vascular disease. Clin. Chem., 49: 1292-1296(2003).