ERATO 野村集団微生物制御プロジェクトについて〜細菌の集団形成と社会性の創発〜（後編）

微生物 1 細胞および集団のラマン分光イメージング
重藤
はじめに真介の姿を知ることができるのである．
本稿では，ラマン分光に基づいた微生物イメージング

生きた微生物の細胞およびその集団を非破壊的に観察の応用例として，筆者の研究室で行った糸状菌の菌糸細する手法として，「光」は欠かせないものとなっている．

胞2)および浴室バイオフィルム3)の研究を中心に紹介する．

Leeuwenhoek が自作の顕微鏡を用いて初めて微生物を観

微生物のラマンスペクトルを主要な生体分子ごとの指紋察して以来，「光」を用いた可視化技術の発展が微生物学に分解する手法である多変量波形分解 – 交互最小二乗の大きな推進力の 1 つであったことは論を俟たない．と（multivariate curve resolution–alternating least squares,

くに，蛍光タンパク質を特定の細胞あるいは細胞内の特MCR–ALS）について簡単に解説し，MCR–ALS と融合定の位置で発現させることで，標的とする細胞や生体分させたラマン分光イメージングにより初めて明らかと子を標識し観察する蛍光法は，微生物の機能や生態を時なった糸状菌菌糸内の多糖類やシトクロム，浴室バイオ間と空間を分解して詳細に調べることを可能にした．

フィルム内のポリエン化合物の不均一な分布を示すこと

近年，蛍光法にない特長を有する新たな「光」としてで，ラマン分光が導く微生物学の新展開について述べる．

ラ マ ン 分 光 法 が 注 目 さ れ て い る． ラ マ ン 分 光 法 は，なお，本稿ではいわゆる自発ラマン分光に焦点をあてる．

1928 年にインドの物理学者 Raman と Krishnan によってイメージングスピードの点で優れる非線形ラマン分光に初めて報告 された光の非弾性散乱現象を利用した分光ついては他の総説 4) を参照されたい．

1)

手法である．物質に光を照射した際に生じる散乱光の大部分は入射光と同じ振動数を持っているが，ごくわずか複雑なラマンスペクトルを解読するためには？に異なる振動数の散乱光が含まれている．これがラマン微生物に限らず細胞は DNA/RNA，タンパク質，脂質，散乱光である．入射光とラマン散乱光の振動数差（ラマ糖類など多種多様な生体分子から構成され，その結果とンシフトと呼び，通常 cm 単位で表す）は物質を構成すして細胞のラマンスペクトルはそれらの寄与が重なりる分子の振動状態に対応するものであるため，ラマン散あった複雑なパターンを示す．蛍光法と同じように，特乱光強度をラマンシフトに対してプロットしたグラフ

定の振動数のラマン散乱強度を選択してマッピングを行（ラマンスペクトル）から分子固有の情報が得られる．

うと 5)，きわめて近い振動数を持つ異なる分子種からの蛍光法と比較したラマン分光法の大きな利点は標識を一信号を分離できないことになる．実際，上記の生体分子切必要としない点である．これは，光照射以外に系へののラマンスペクトルは一般的によく類似しており，緑色摂動がないため，細胞をより「あるがまま」に近い状態

蛍光タンパク質と赤色蛍光タンパク質の発光のような明で観察できるだけでなく，既知の標的物質に限定されな瞭な違いは望めない．そこで，細胞が示す複雑なラマンい探索的な研究もラマン分光法であれば可能であることスペクトルを多変量解析の力を借りて解きほぐしてやるを意味している．もう 1 つの長所はラマンスペクトルに必要がある．

–1

含まれる情報量の豊富さである．分子振動は分子の種類

多変量解析には主成分分析などさまざまなタイプのもや幾何構造，物理的・化学的状態，周囲の環境との相互の が 存 在 す る が， 筆 者 ら は MCR–ALS を 用 い て い作用などに関するユニークかつ詳細な知見を与える．こる 6–8)．MCR–ALS は図 1 に示すように，空間内の各点の意味で個々の分子が示すラマンスペクトルはまさに分で測定したラマンスペクトルからなるデータ（ハイパー子の指紋 molecular ﬁngerprints であり，多種多様な生体スペクトルデータ）が少数の主要な成分の線形結合で表分子からなる微生物のそれは microbial ﬁngerprints とされると仮定し，ハイパースペクトルデータに対応する呼ぶべきものである．しかもその指紋は微生物の状態を非負行列 A を各成分のスペクトルを要素とする行列 W反映してダイナミックに変化し得る．我々は鑑識官のごと空間分布パターンを要素とする行列 H の積（A = WH）

とく，その microbial ﬁngerprints を「採取」し「解読」すに分解する手法である．この分解に際して，W と H のることによって，微生物 1 細胞や集団の「あるがまま」要素がすべて非負であるという拘束条件を課す（そのた

著者紹介

生物工学

関西学院大学大学院理工学研究科化学専攻（准教授） E-mail: shigeto@kwansei.ac.jp
ERATO 野村集団微生物制御プロジェクト デバイス開発・イメージンググループ（サブグループリーダー）

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特集

図 1．MCR–ALS の概念図．ここではラマンハイパースペクト
ルデータ A が 3 つの主要な成分（赤，緑，青）の線形和で表せるとした場合について示す．

め MCR–ALS は非負行列因子分解 9,10) とも呼ばれる）．
非負行列因子分解は一意な分解ではなく，ある初期値からスタートして W と H の要素を ALS により最適解へと導く．筆者らがとくに MCR–ALS を用いている最大の理由は，非負拘束条件 W ≥ 0，H ≥ 0 のため，得られたW および H の成分を特定の分子種のラマンスペクトル

図 2．糸状菌 Aspergillus nidulans の菌糸先端を含む部分の MCR–ALS ラマンイメージングの結果．4 成分を仮定して解析を行った．（左）光学顕微鏡像および培地を除く 3 成分（多糖類，タンパク質 / 核酸，シトクロム）のラマンイメージ．（右）3 成分のラマンスペクトル．

負両方の値を取るため，このような直接の対応関係は得MCR–ALS の成分数を 4 と仮定して得られた菌糸先端を含む部分の結果を図 2 に示す．培地に由来する成分（図2 では省略）を除くと，多糖類，タンパク質 / 核酸（DNA/RNA），シトクロムの 3 つの分子種のラマンスペクトルられない．正しい molecular ﬁngerprints が得られて初めと菌糸内分布をハイパースペクトルデータから分離・抽て，そこから詳細な分子情報を読み解くことが可能とな出することに成功した．各成分がこのように帰属できるおよび相対濃度（どちらも物理的に負値は取り得ない）の空間分布にそれぞれ直接対応づけられるからである．
主成分分析などではアウトプット（ローディング）が正る．データを構成する成分の数は特異値分解の結果を用

根拠は 2 つある．1 つは得られた分布像（ラマンイメージ）いるなど何らかの方法で推定する必要があり，そこにはの生物学的な解釈に基づくものである．たとえば，黄色ユーザーの介入が必要となる．以下に紹介する例が示すで示した 1 番目の成分は菌糸の周縁部に局在しており，ようにラマンスペクトルの MCR–ALS 解析は，微生物細胞壁の構成成分の多糖類であると容易に判断できる．

細胞中の複数の生体物質のラベルフリー同時イメージン

しかしながら，この帰属法は特徴的な細胞内分布を示すグならびに他の手法では得難い化学情報の獲得にきわめ分子種に対してのみ有効で，汎用性に欠ける．もう 1 つて有力である．

―これがスペクトルの解読に他ならないのだが―は糸状菌菌糸の多成分同時イメージング

MCR–ALS により分離された各成分のラマンスペクトルから帰属を行う方法である．Raman による最初の報

糸状菌は発酵や抗生物質産生を行う生物工学的に有用

告以来，膨大な量のラマンスペクトルデータが蓄積されな微生物であるだけでなく，真菌感染症の原因として医ている．その知見と，MCR–ALS により得られたスペ学的にも非常に重要である．基礎微生物学の観点からは，クトルに現れているピーク（ラマンバンド）とを照合す

糸状菌は酵母などの他の真菌あるいは細菌と違って，菌ると，3 つの成分が多糖類（より具体的にはキチンのス

糸の先端を伸長させることで成長し，長く伸びた菌糸はペクトルパターンと一致），タンパク質 / 核酸，シトク

複数の核と隔壁を含む空間的・機能的に異なる区画からロムであると断定することができる．

成り立っている点に関心が持たれてきた．とくに菌糸先タンパク質の中でシトクロムという特定のタンパク質端成長の分子メカニズムは盛んに研究されており，超解のみ独立した成分として分離されているのは，シトクロ

像顕微鏡 11,12) を含む蛍光イメージングにより先端成長にムが共鳴ラマン効果を受けているためである．発色団と関わるアクチン，微小管，ベシクルなどの役割と動態がしてヘムを有するシトクロムは本実験の励起波長である明らかにされつつある．

532 nm 付近に電子吸収を示す．電子吸収波長と一致し

筆 者 ら は 糸 状 菌 の モ デ ル 微 生 物 で あ る Aspergillus
nidulans の生きた菌糸の先端部，分岐部，基部（胞子に比較的近い，枝分かれのない部分）に対して MCR–ALS
ラ マ ン イ メ ー ジ ン グ（ 励 起 波 長 532 nm）を 行 っ た 2)．

た波長で励起した場合に，その吸収を示す分子のラマン

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散乱光が著しく増強される現象が共鳴ラマン効果であり，非共鳴の場合と比較して約 104 倍以上の強度増大が起こることが知られている 13)．シトクロム以外のタンパ
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ク質（および核酸）が核の部分で高い相対濃度を示してメージングを用いることで標的を限定することなく取得いるのに対して（図 2 左の緑のイメージ），シトクロム

可能な molecular ﬁngerprints が，菌糸成長を分子レベルはそれと相補的な分布を示しており（図 2 左の紫のイで理解するための新規な手がかりを与えてくれるものとメージ）ミトコンドリアの分布に対応している．

期待される．

このように，複数の分子種の細胞内分布を同時に可視化し，なおかつそれらの fingerprints たるラマンスペクトルが得られる点が MCR–ALS ラマンイメージングのポリエン化合物をプローブとした浴室バイオフィルム内の微生物分布の可視化強みである．ここでは，ラマンスペクトルから引き出せラマン分光法はバイオフィルムのような複合微生物のる，シトクロムの種類と酸化還元状態に関する in vivo で集合体の非破壊解析にも威力を発揮する 16,17)．本項では，の知見について解説する．MCR–ALS により分離され筆者らが最近行ったピンクバイオフィルムの MCR–

たシトクロムのラマンスペクトルを先端部，基部，分岐ALS ラマンイメージング（励起波長 532 nm）について部で比較すると，微細ながら有意な違いを見いだすこと紹介したい．ピンクバイオフィルムは浴室などの水回りができる（図 3a）．本研究の実験条件で共鳴ラマン効果に発生するピンク色をしたバイオフィルムで，多くの人による強度増大を受けるのはシトクロム b および c であが（たとえどんなにキレイ好きであっても）一度は目にり，どちらも酸化型あるいは還元型として存在する．Inしたことがあるのではなかろうか 18)．水道水のような貧vitro での実験からこれら 4 種類のシトクロムのマーカーとなるラマンバンドはよく確立されている 14,15)．図 3b栄養環境下でも増殖できる Methylobacterium 属細菌を含に示すように，マーカーバンドの詳細な解析を行うこと

いったん形成されると塩素系洗剤を用いても容易に除去

により，シトクロム c に対する b の相対濃度は分岐部でできない厄介な代物であるばかりか，日和見病原体の潜もっとも高く，先端部でもっとも低いことが明らかと在的なリザーバーであるとも考えられている 19)．そのたなった．また，酸化型シトクロム b/c のマーカーバンド

め，ピンクバイオフィルムのキャラクタリゼーションはは菌糸基部および分岐部のみでわずかに観測されたもの

衛生的な観点から意義が大きいが，ほとんど行われていの（図 3a の矢印），先端部では見られなかった．この結ないのが現状である．とくに，複数の微生物種がピンク

果は，MCR–ALS ラマンイメージングによりシトクロバイオフィルムの内部でどのように分布しているのかにムの酸化還元状態をプローブすることで，菌糸成長の解関する知見は乏しい 20)．

明にミトコンドリアの活性およびエネルギー消費の観点から迫れる可能性を示唆しており，大変興味深い．

む複数種の微生物から構成される複合微生物系であり，浴室の排水溝付近で採取したピンクバイオフィルムのMCR–ALS ラマンイメージング結果を図 4 に示す．ピン部位を問わず共通して見られるシトクロム，それ以外

クバイオフィルムから得られるラマンスペクトルの最大のタンパク質と核酸，多糖類の他に，分岐部においてはの特徴は，2 つないし 3 つのラマンバンドのみが支配的脂肪滴から脂質および菌類のステロールとして重要なエな，きわめて単純なパターンを示すことである．このス

ルゴステロールを検出し，そのラマンスペクトルを得る

ペクトルパターンはカロテノイドを含むポリエン化合物ことに成功している．筆者らの研究成果から，ラマンイに特有のものである17)．前項で述べたシトクロムと同様，長鎖ポリエンは可視域に吸収を持ち，共鳴ラマン効果に

図 3．MCR–ALS により得られた糸状菌 Aspergillus nidulans 菌
糸の先端部，基部，分岐部のラマンスペクトルの比較（a）および 1290–1370 cm–1 付近のシトクロム b，c のマーカーバンドのフィッティング解析結果（b）．cyt ＝シトクロム，red ＝還元型，ox ＝酸化型．

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図 4．ピンクバイオフィルムの MCR–ALS ラマンイメージン
グ結果．3 成分を仮定して解析を行った．（左）光学顕微鏡像および 3 種類のポリエンのラマンイメージ．（右）3 成分のラマン
スペクトル．

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特集よる増大を受けているため，他の細胞内物質やバイオおわりにフィルムのマトリックスである細胞外多糖などに由来するラマンバンドは相対的に見えなくなっていることに注

本稿では多変量解析と組み合わせたラマン分光イメー意されたい．筆者らは MCR–ALS を用いて，ピンクバジングを糸状菌の菌糸と複合微生物系バイオフィルムにイオフィルムを構成する微生物細胞中に主なポリエン化応用した成果について紹介してきた．ラマン分光法は多合物が 3 種類（図 4 中のポリエン 1–3）存在することを突

変量解析以外にもさまざまな技術との融合が可能であきとめた．スペクトルパターンからポリエン 1，3 は明る．たとえば，安定同位体（2H や 13C）標識と併せ用いらかにカロテノイドに帰属されるが，ポリエン 2 は一般ることにより，微生物細胞内の代謝ダイナミクスを可視的なカロテノイドでは説明できない 1128 cm のラマン化することも可能である 21)．最近，筆者らはこの方法をバンドを示す．種々の検討の結果，この成分は，カロテ駆使して，糸状菌と細菌の共生相互作用の分子レベル解ノイドとは異なりポリエン部に置換基を持たない直鎖ポ明に取り組み，これらの微生物間での物質のやりとりをリエンであることがわかった（有力候補としてフレキシ示す直接証拠を得つつある．今後，ラマン分光法に基づルビンが挙げられる）．

いた新技術が微生物学の革新に大きな貢献をなすことは–1

ピンクバイオフィルム中の微生物がカロテノイドを生疑いの余地がない．

産すること自体は驚くに当たらないが，注目すべきはポ謝

リエン 1 と 2 のラマンイメージがまったく重なりのない排他的なバイオフィルム内分布を示している点である（図 4 左の紫および緑のイメージを比較してみてほしい）．これはポリエン 1，2 が異なる微生物によって生産されたものであることを強く示唆している．逆に言えば，
図 4 のラマンイメージはピンクバイオフィルム中の異なる微生物の棲み分けの様子をポリエンのラマンスペクト

本稿で紹介した研究は科学技術振興機構 ERATO 野村集団微生物制御プロジェクト（JPMJER1502）の支援のもとに行われたものである．共同研究者の関西学院大学大学院理工学研究科・安田充博士（現 慶應義塾大学医学部），堀上裕登氏，佐々木舞氏，吉川友貴氏，筑波大学生命環境系・竹下典男准教授，豊福雅典准教授にこの場を借りて感謝の意を表したい．

文

ルに基づいて描き出しているのではないかと推測できる．筆者らはこの作業仮説が正しいことを，ピンクバイオフィルムから単離した個々の微生物のラマンスペクトルを測定することによって実証した．ポリエン 3 についても，1，2 とは異なる微生物がつくるカロテノイドであることが確認された．
カロテノイドは多くの微生物が生産する天然色素で，多様な役割を担っている．ピンクバイオフィルムにとってとくに関係の深いカロテノイドの役割は抗酸化作用であろう．カロテノイドは長い π 共役系を有するため，スーパーオキシドアニオンや過酸化水素，一重項酸素などの活性酸素種を捕捉する機能を示す．したがって，栄養源の欠乏，乾燥，塩素を含んだ薬剤への曝露などストレスフルな環境に対処するために，ピンクバイオフィルム中の微生物がそれぞれにカロテノイドをはじめとするポリエン化合物を利用していることが考えられる．MCR–

ALS ラマンイメージングはポリエンが示す特徴的なラマンバンドに基づいて，集団における微生物の性質や振る舞いを，バイオフィルムを壊すことなく調べることが可能な方法として有望であることが示されたと言えよう．

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