課題番号：24指111
研究課題名：糖尿病網膜症の新規治療開発に向けた基盤研究
主任研究者名 ：奥村彰規
分担研究者名 ：なし
キーワード ：糖尿病網膜症、網膜周皮細胞、プロテオーム、ペプチドーム
研究成果：
糖尿病網膜症は大多数の国で働く世代における最も多い失明原因である。我が国でも、糖尿病網膜症は年間 3000 人もの患者から光を奪っている。さらに、増え続ける糖尿病患者のうち約 15％は糖尿病網膜症を発症しており、ごく初期から網膜毛細血管の障害に伴う神経変性が起こっている。視神経を不可逆的な神経変性から保護する観点からも、単純網膜症の病期から使用可能である血管新生阻害剤および血管透過性亢進抑制剤の開発は急務である。網膜毛細血管は、網膜毛細血管内皮細胞と、周皮細胞、それから基底膜より構成されている。網膜周皮細胞は、血管新生、血管の安定性、内皮細胞の調節、血液網膜関門の保全など、幅広い重要な役割がある。この網膜周皮細胞が糖尿病の高血糖により細胞障害を受けたり、網膜毛細血管から脱落したりした結果、周皮細胞由来因子が欠乏して引き起こされる血管新生および血管透過性亢進のメカニズムを解明することは重要視されているが、詳細は明らかにされていない。そこで、本研究では、ヒト網膜由来の周皮細胞を用いて、糖尿病網膜症の進展抑制や寛解に関連する新規因子の同定を行うことで、糖尿病網膜症の疾患メカニズムの解明および新規治療法開発ための標的分子の探索を目的として研究を行った。
まず、培養細胞レベルで網膜周皮細胞が分泌するペプチドの探索を遂行した。ヒト網膜周皮細胞の初代培養を行い、培養上清から生理活性ペプチド群の網羅的同定を行った。ヒト初代培養細胞は Cell
Systems より市販のものを入手して解析用の培養までは無血清のメーカー推奨培地で行った。推奨培地の基礎培地である DMEM/HamF12 で培地を洗浄、交換して 24 時間後に回収した。得られた培地を逆相 C18カラムでバッチ法により濃縮・粗精製を行い、粗ペプチド画分とした。この画分をゲルろ過カラムで分離を行い、おおよそ分子量 1,000 から 10,000 となる溶出時間の画分を回収した。続いて色素類の除去のため強陽イオン交換カラムで精製し、ペプチド画分とした。このペプチドサンプルを還元アルキル化の処理ののち、ナノフロー液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（nano LC-MS/MS）でマススペクトルデータを取得し、タンパク質同定ソフトウエア ProteinPilot で、デコイを含めたヒトデータベースに対して検索、ペプチド同定を行った。この結果、培養上清から 5,137 種類のペプチドを同定することに成功した。このうち、質量分析による同定の信用度が 95%以上と非常に高いペプチドは、128 種類の遺伝子由来よりなる 276 ペプチドであった。同様の操作を 1 日間または 7 日間培養した培養上清で行ったが類似した結果を得ている。
同定されたペプチドのうちには、血管内皮細胞に作用する報告があるペプチドホルモンも含まれており、網膜周皮細胞ではこれまでに一切報告は無いものであった。また、興味あることとして、血管内皮細胞に対して作用するタンパク質だけでなく、神経細胞やグリア細胞に作用することが知られているタンパク質についても部分ペプチドが多数同定された。この結果は、周皮細胞が網膜毛細血管の外側に存在するため、網膜内の各種視神経細胞やグリア細胞とも相互作用している可能性を示している。以上のように、多数のペプチドの同定に成功したが、一つ一つ詳細に人工ペプチドを作製して網膜毛細血管内皮細胞に対する機能を検証するのは多すぎて非常に困難である。そこで、UniProt データーベース上で分泌タンパク質としてカテゴリー化されているタンパク質由来のペプチドのみに注目することとした。その結果、下に示す２４遺伝子由来のペプチドに絞り込まれ、大多数がコラーゲン類であった。
ADM (adrenomedullin)

Collagen, type XVII, α1

Annexin A2Collagen, type XVIII, α1

BPI fold-containing family B member 4Collagen, type XXI, α1

Collagen, type I, α1

DecorinCollagen, type I, α2Elastin

Collagen, type IV, α6

Fibronectin 1Collagen, type V, α1Heparanase

Collagen, type V, α2Laminin, β4Collagen, type V, α3Matrix metallopeptidase 1Collagen, type VI, α3Sulfhydryl oxidase 1Collagen, type XI, α1

Glia-derived nexin

Collagen, type XIX, α1

Vasorin

網膜毛細血管内皮細胞を調節する新規ペプチドの探索という観点から、特筆するペプチドとして、我々は内皮細胞の調節因子と報告がある ADM 遺伝子由来のペプチドに着目した。この ADM 遺伝子より作られる 185 残基のプリプレホルモンは、21 残基のシグナルペプチド以降、翻訳後修飾を受け、酵素によって 4 つのペプチドが産生されると考えられている。それぞれ N 末側より PAMP (ADM22-41),
MR-proADM (ADM45-92), adrenomedullin (ADM95-146), adrenotensin (ADM153-185)であり、adrenomedullinが初めにヒト褐色細胞腫から同定された降圧作用を示すペプチドである。その他のペプチドは合成ペプチドにて活性の検証が行われており、adrenotensin は adrenomedullin の血管内皮細胞内の一酸化窒素産生をアンタゴナイズする報告がある。しかしながら、これまでヒト由来の試料で adrenotensin が同定された報告はない。本研究において、我々は、ヒト初代培養網膜周皮細胞の培養上清中にはこのadrenotensin が部分ペプチド状になって存在していることを見出した。
我々はこのペプチドを ΔADT と命名し、ヒト網膜毛細血管内皮細胞（HRMVEC）に対して処理を行い、細胞増殖、走化性、管腔形成について活性を調査した。まず、細胞増殖について検討すると、HRMVECの細胞増殖は濃度依存的に高くなることが明らかとなった。さらに、adrenotensin と比べるとより低濃度でも細胞増殖能がみられており、より高い細胞増殖活性を持つことが示された。次に、HRMVEC の走化性活性に対する影響を測定するため、早期の創傷治癒アッセイを採用した。この測定にはリアルタイムで細胞の変動が観察できる利点があるため、ECIS を使って行うこととした。創傷治癒アッセイ
では、金電極上にコンフルエントとなるように HRMVEC を播種し、測定するペプチドを添加した。インキュベーションを行った後、一過的に強い電圧をかけ、細胞を死亡させる。その後もモニタリングを行い、金電極が元通り細胞によって覆い被るまでの時間を計測する。この創傷治癒アッセイでは、ΔADTは adrenotensin や未添加コントロールに比べて早く被覆される結果となった。これらの結果より、
ΔADT は、adrenotensin より強い血管作動性作用があることが示された。これに加えて、HRMVEC に対して管腔形成アッセイを行い、ΔADT 刺激により分岐点数の増加など、管腔形成も促進されている結果となった。また我々は、これまでにヒト尿検体よりペプチドーム解析を行っており、尿中にも ΔADTが検出・同定されることがわかった。以上をまとめると、生体内に存在する新規の血管作動性ペプチ
ド ΔADT を発見したが、HRMVEC に対するメカニズムを調べたり、糖尿病網膜症への役割・機能解析についてはさらなる研究が必要であると考えられる。
並行して、分画操作により生理活性ペプチド候補をヒト初代網膜周皮細胞より段階的に精製することとした。網膜周皮細胞の培養上清から、上述の通りにペプチド粗画分を調製し、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにて分画した。得られた各画分を濃縮して、ヒト網膜毛細血管内皮細胞に対する生理活性を測定した。測定手法は、細胞増殖・管腔形成・血管透過性・血管新生について検討を行ったが、微細な変化をとらえることができるリアルタイム細胞解析装置（ECIS）を使った細胞間バリア機能の解析がより効果的であることが判明し、以降、ECIS を使って活性測定を行うこととした。逆相カ
ラムクロマトグラフィーにより細胞間バリア機能を強める作用のある生理活性ペプチドを含む画分の調製に成功したが、アミノ酸配列の決定までには至らなかった。

一方でタンパク質の探索については、分画分子量 3,000 のメンブレンフィルターにて濃縮した培養上清をイオン交換カラムクロマトグラフィーにより分画操作を行った後に、ECIS でヒト網膜毛細血管内皮細胞に対するタンパク質試料の影響を観察した。その結果、細胞間バリア機能を弱める働きのあるタンパク質画分の調製に成功した。当ラボの質量分析装置では同定に至らなかったため、共同研究として外部研究機関に解析を依頼している。
以上のとおり、糖尿病網膜症の治療法に向けた研究成果としてペプチドは投与、タンパク質は抗体療法で、網膜周皮細胞が障害を受けた際に効果的である可能性を見出しているため、さらなる研究を行い、合成ペプチドや組換えタンパク質を使った検証を行いたい。

Subject No. ：24 指 111
Title：Basic studies on the novel treatment of diabetic retinopathy
Researchers ：Akinori Okumura
Key word：Diabetic retinopathy, Retinal pericyte, Proteome, Peptidome
Abstract：
Diabetic retinopathy (DR) is a leading cause of blindness in the working-age population of mostcountries. More than 3,000 new cases of blindness related to diabetic retinopathy occur in Japaneach year. The number of diabetes patients continues to increase and approximately 15% ofdiabetes patients suffer from DR, in which nerve degeneration associated with microvasculardisease begins from a very early stage. From the standpoint of protecting the optic nerve fromirreversible degeneration, there is an urgent need to develop angiogenesis and vascular
hyperpermeability inhibitors that can be used from the simple DR stage. Retinal capillaries arecomposed of microvascular endothelial cells, pericytes and basement membrane. Retinal pericytes
have important roles in a range of functions, including angiogenesis, vessel stabilization,
endothelial cell regulation and maintenance of the blood-retinal barrier. The retinal pericytes are
susceptible to damage by hyperglycemia in diabetes. There has been particular focus on
elucidating the mechanism by which pericyte-derived factor deficiency, caused by the detachmentof retinal pericytes from retinal capillaries, results in angiogenesis and microvascular
hyperpermeability. However, this mechanism remains poorly understood. Therefore, this study
aimed to use the primary culture of human retinal pericytes to identify new factors relating to theprogression of DR in order to elucidate the mechanism of DR and investigate target molecules forthe development of novel treatments.
We investigated the identification of peptides secreted by retinal pericytes. We performed
shotgun peptidomics experiments to investigate the bioactive peptides in the conditioned mediumof the cells. Primary human retinal pericytes were purchased from Cell Systems Corporation. By
culturing the retinal pericytes in a serum-free medium and filling the recovered medium in areverse-phase column cartridge, we concentrated the crude peptide fraction. The crude peptide
fraction was applied to a gel filtration column. Peptides containing fractions corresponding tomolecular masses between approximately 1,000 and 10,000 were collected. We then used a strong
cation exchange ion exchange column chromatography to remove the pigment composition andobtain the peptide fraction. After reductive alkylation treatment of the fraction, we employed ananoscale liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (nano LC-MS/MS) for
comprehensive peptide identification. The nano LC-MS/MS data were submitted through theProteinPilot software and searched against human database with a decoy database. Using thistechnique, we successfully identified 5,137 peptides in the conditioned medium. Of these, the 276
peptides originating from 128 genes could be identified with a confidence level at least 95%.
Similar results were obtained when the cells were cultured for 1 day or for 7 days.
These peptides included functional peptides that have been reported to act on vascularendothelial cells; it is noteworthy that these have never before been reported in retinal pericytes.
In addition to some of proteins that act on vascular endothelial cells, it is interesting that we also
identified many partial peptides of proteins that have been reported to act on neurons and glialcells. This finding indicates that since retinal pericytes are located outside retinal capillaries, they
may interact with optic nerve cells and glial cells. Despite successfully identifying many peptides,
the large quantity meant that it would have been difficult to verify all of these peptides bysynthesis. Therefore, we selected 24 genes encoding a extracellular protein that categorized as"Secreted protein" in the UniProt database (see below).
ADM (adrenomedullin)

Collagen, type XVII, α1Annexin A2Collagen, type XVIII, α1

Researchers には、分担研究者を記載する。

BPI fold-containing family B member 4Collagen, type XXI, α1Collagen, type I, α1

Decorin

Collagen, type I, α2Elastin

Collagen, type IV, α6

Fibronectin 1Collagen, type V, α1

Heparanase

Collagen, type V, α2Laminin, β4Collagen, type V, α3Matrix metallopeptidase 1Collagen, type VI, α3Sulfhydryl oxidase 1Collagen, type XI, α1

Glia-derived nexinCollagen, type XIX, α1Vasorin

In a search for novel regulators of retinal microvascular endothelial cells, we focused on apeptide derived ADM gene, because ADM gene products are reported that the regulators ofendothelial cells. The ADM gene encodes for a preprohormone of 185 amino acid residues, which is
post-translationally modified to generate four peptides: PAMP (ADM22-41), MR-proADM (ADM45-92),
adrenomedullin (ADM95-146), adrenotensin (ADM153-185). Adrenotensin has been shown toantagonize the stimulatory effect of adrenomedullin on endothelial nitric oxide generation.
However, the adrenotensin on human samples has not been determined. In this study, we foundthat conditioned medium of human primary retinal pericytes contained a partial fragment ofadrenotensin.
We investigated whether the peptide (named ΔADT) could activate human retinal
microvascular endothelial cells (HRMVECs) proliferation, migration, and tube formation. To
investigate the effect of the ΔADT on HRMVEC growth, we assayed cell proliferation by cellcounting. The ΔADT increases HRMVEC proliferation in a dose-dependent manner. Moreover, thecells that were treated with the ΔADT showed increased cell growth compared with adrenotensin
treated cells. We measured HRMVEC migration assay by early wound healing using electric
cell-substrate impedance sensing (ECIS). ECIS could allow a real time monitoring of cellularbehaviour. For wound healing assays, confluent cells cultured on gold electrodes culture plates,
and the ΔADT was added. After incubation, cells were submitted to an elevated voltage, which led
to the death and detachment of cells present on the small active electrode, resulting in a woundnormally healed by cells surrounding the small active electrode that have not been submitted tothe elevated voltage pulse. Wound healing was then assessed by continuous impedance
measurements at 16 kHz for 12 hours. This assay showed that the ΔADT more effectively
stimulated HRMVEC migration than adrenotensin and solvent control. These results suggest thatthe ΔADT has a higher angiogenic activity than adrenotensin. Consistent with the cellproliferation and migration assay results, the ΔADT significantly stimulated HRMVEC tubeformation. Recently, we also identified the ΔADT in human urine samples by nano LC-MS/MSanalysis. Further clinical and experimental studies are required to elucidate the relationshipbetween diabetic retinopathy and the ΔADT expression in retinal preicytes.
We also opted to use fractionation to incrementally purify candidate bioactive peptides from theconditioned medium of human primary retinal pericytes. We then prepared the crude peptide
fraction from the conditioned medium as described above and used gel filtration column
chromatography to obtain the fractions. After concentrating each of the fractions, we measured
bioactivity on HRMVECs. We tried HRMVEC proliferation, migration tube formation, andvascular permeability, and established that intracellular barrier function analysis using electric
cell-substrate impedance sensing (ECIS) is more effective, and therefore, used ECIS to measure
Researchers には、分担研究者を記載する。

activity. We also used reversed-phase high-performance liquid chromatography to successfully
prepare a fraction comprising bioactive peptides that strengthen intracellular barrier function, butwere unable to complete amino acid sequence determination.
To investigate proteins, we used a membrane filter with a molecular weight cut off of 3,000 toconcentrate the conditioned medium before employing ECIS to observe the effects of sample
proteins on HRMVECs. As a result, we successfully obtained a protein fraction that acts to weaken
intracellular barrier function.
Within the context of DR therapy, the above findings suggest that administering peptides orusing antibodies against proteins may be efficacious for the treatment of damaged retinalpericytes. Further studies are required to identification and verification using synthetic peptides
and recombinant proteins.

Researchers には、分担研究者を記載する。

糖尿病網膜症の新規治療開発に向けた基盤研究
糖尿病により網膜毛細血管で起こる症状

網膜周皮細胞の分泌ペプチドーム解析
慢性的な高血糖
血流低下、血管壁肥厚血栓形成、低酸素
網膜周皮細胞の障害・脱落血流増加、血管の選択的透過性の喪失

血管新生
網膜周皮細胞から血管内皮細胞に作用するペプチドを見出して機能解析する

ヒト網膜周皮細胞の培養
培養上清回収多種類のカラムクロマトグラフィーを使ったペプチド画分の調製質量分析器（nanoLC-MS/MS）による網羅的解析
標的分子の探索・ヒト網膜毛細血管内皮細胞に対する機能解析ショットガンペプチドーム解析の結果
128種の遺伝子由来のペプチドが276種同定された
VIME_HUMAN

ARHGB_HUMAN

BCAT1_HUMANMEGF8_HUMAN

CO4A6_HUMAN

TTC19_HUMAN

ACTB_HUMANZZEF1_HUMAN

LPLC4_HUMAN

ZN546_HUMAN

PLEC_HUMAN

VASN_HUMAN

ACTG_HUMAN

BRD4_HUMAN

RAN_HUMAN

ABCAD_HUMANMPND_HUMAN

T132E_HUMAN

MMP1_HUMAN

CSTN1_HUMAN

EF1A1_HUMAN

MON1A_HUMAN

LAMB4_HUMANPHLB3_HUMANTYB10_HUMAN

PCDH8_HUMAN

MLL1_HUMAN

LRP11_HUMAN

GTPBA_HUMAN

CK061_HUMAN

UNIPROT_ID

GENE NAMEUNIPROT_ID

GENE NAMEANXA2_HUMANTACC2_HUMAN

ZO1_HUMAN

CC023_HUMAN

TMM8C_HUMAN

TRI67_HUMAN

MAP4_HUMAN

SODC_HUMAN

LRP1_HUMAN

NKAP_HUMAN

F157A_HUMAN

TBA1A_HUMAN

ADML_HUMANANXA2_HUMAN

Adrenomedullin
Annexin A2

COHA1_HUMAN
COIA1_HUMAN

Collagen, type XVII, alpha 1
Collagen, type XVIII, alpha 1

RTN4_HUMAN

CO1A1_HUMAN

GOGA3_HUMAN

O52B4_HUMAN

MA2B1_HUMAN

KI21A_HUMAN

LPLC4_HUMAN

BPI fold-containing family B member 4

COLA1_HUMAN

Collagen, type XXI, alpha 1

CO1A2_HUMAN

FINC_HUMAN

MZT1_HUMAN

FBF1_HUMAN

NCAN_HUMAN

HECW2_HUMAN

CD44_HUMAN

ALDOA_HUMAN

FOXC1_HUMANRPGF6_HUMAN

HGS_HUMANUBQL2_HUMAN

ADML_HUMAN

HSPB1_HUMAN

SPTA2_HUMAN

MAML1_HUMAN

JUND_HUMAN

PRR12_HUMAN

AHNK_HUMAN

CO5A2_HUMAN

ITPR2_HUMAN

COLA1_HUMANPTPRG_HUMAN

CAPS1_HUMANPTRF_HUMAN

GDN_HUMAN

COJA1_HUMAN

TEP1_HUMAN

COF1_HUMAN

COHA1_HUMANQSOX1_HUMAN

PGS2_HUMANPDIA6_HUMANANKR2_HUMANGATA2_HUMAN

BAIP2_HUMAN

SRGP2_HUMAN

CATL1_HUMAN

PLCL1_HUMAN

CLPB_HUMANPEBP1_HUMANHDAC5_HUMANANXA1_HUMAN

TSP1_HUMAN

PTN14_HUMAN

QRIC2_HUMAN

COIA1_HUMAN

HPSE_HUMAN

CO1A1_HUMAN
CO1A2_HUMAN
CO4A6_HUMAN
CO5A1_HUMAN
CO5A2_HUMAN
CO5A3_HUMAN
CO6A3_HUMAN
COBA1_HUMAN
COJA1_HUMAN

Collagen, type I, alpha 1Collagen, type I, alpha 2Collagen, type IV, alpha 6
Collagen, type V, alpha 1
Collagen, type V, alpha 2Collagen, type V, alpha 3Collagen, type VI, alpha 3Collagen, type XI, alpha 1
Collagen, type XIX, alpha 1

PGS2_HUMAN
ELN_HUMAN
FINC_HUMAN
HPSE_HUMAN
LAMB4_HUMAN
MMP1_HUMANQSOX1_HUMAN
GDN_HUMAN
VASN_HUMAN

DecorinElastinFibronectin 1Heparanase
Laminin, beta 4
Matrix metallopeptidase 1
Sulfhydryl oxidase 1
Glia-derived nexin
Vasorin

CO5A1_HUMAN

4F2_HUMAN

TAF12_HUMAN

CE032_HUMAN

GPR12_HUMAN

STB5L_HUMAN

CO5A3_HUMAN

K2C3_HUMAN

DREB_HUMAN

PTN23_HUMAN

NEST_HUMAN

SIGL9_HUMAN

PERI_HUMAN

COBA1_HUMAN

ZN827_HUMAN

PKHA4_HUMAN

HNRPM_HUMAN

NP1L1_HUMAN

CO6A3_HUMAN

GRAP1_HUMAN

YS027_HUMAN

DPOG1_HUMAN

TYB4_HUMAN

ELN_HUMAN

GREB1_HUMAN

WDR26_HUMANTAF7L_HUMAN

MAP1A_HUMAN

HMGA1_HUMAN

H90B3_HUMANMRGBP_HUMANGARL3_HUMAN

UniProtにてSubcellular locationがsecreted proteinに注目すると24遺伝子由来のペプチドに絞り込まれたSignal
1peptide

PAMP
22

MR-proADM
41 45

Adrenomedullin
92 95

Adrenotensin
146 153185

ΔADT

Hypoxiaで誘導されるADM遺伝子の部分ペプチドΔADMに注目した

網膜周皮細胞より分泌されているΔADTがヒト網膜毛細血管内皮細胞にどのような生理活性を示すかを初代培養細胞で探索
リアルタイム細胞解析装置による初期創傷治
癒モニタリングによる走化性アッセイ

cell counts (vs.control)

細胞増殖アッセイ
ΔADT
Adrenotensin

*

**

*

*

ΔADT

*: p<0.05(vs.control)

Control

Adrenotensin

アドレノテンシンよりも低濃度で有意な細胞増殖活性を示した

アドレノテンシンよりも高い走化性活性を示した

管腔形成アッセイ
Control

ΔADT

分岐点数

*

ネットワーク長*ネットワーク面積*

ΔADTはヒト網膜毛細血管内皮細胞の管腔形成を促進する
ヒト尿検体ペプチドーム解析

まとめ

ヒト尿採取

ヒト網膜周皮細胞より新規鎖長生理活性ペプチドを見出すことに成功した。

多種類のカラムクロマトグラフィーを使ったペプチド画分の調製質量分析器（nanoLC-MS/MS）による網羅的解析
ΔADTをヒト尿中に確認できた

Hypoxiaで誘導される血管新生因子であり、VEGF同様、このペプチドも糖尿病網膜症の治療ターゲットとなりうる。
体内でも存在が示唆されており今後詳細に検討する必要がある。

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：24指111

研究課題名： 糖尿病網膜症の新規治療開発に向けた基盤研究
主任研究者名：奥村彰規

論文発表
論文タイトルIncreased serum leukocyte cell-derived
chemotaxin 2 (LECT2) levels in obesityand fatty liver

著者
奥村彰規
久保田浩之
松下由実
志賀智子
森吉百合子
山越智鏑木康志

掲載誌

掲載号

BioScience Trends Vol.7 No.6年

2013年

学会発表
タイトル

発表者

奥村彰規
網膜周皮細胞の分泌ペプチドーム解析と網膜 高橋枝里
毛細血管内皮細胞への役割解析
久保田浩之
鏑木康志

学会名

場所

第58回日本糖尿病
下関
学会年次学術集会年月2015年5月

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

発表先

場所

年月日

該当なし

特許取得状況について※出願申請中のものは(発明名称)記載のこと。
登録番号

該当なし

※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国