課題番号：２６指１０９
研究課題名：C型肝炎ウイルス排除後の肝発がんに関与する血中エピゲノムマーカーの探索と臨床的有用性の検証－探索研究と全国肝疾患拠点病院共同前向き研究
主任研究者名 ：考藤達哉
分担研究者名 ：なし（研究協力者多数）
キーワード ：HCV、ゲノム、エピゲノム、肝がん、SVR
研究成果：

C 型慢性肝炎に対する治療の進歩は目覚ましく、DAA のみの治療では 90％以上の SVR が報告されている。しかし、世界的に C 型肝炎患者の高齢化は進み、SVR 後にも肝がんが発症する例が増加している。SVR 後肝がんに関連する因子として、高齢、肝脂肪化、線維化などが報告されているが詳細は明らかではない。HCV が感染すると、遺伝子にエピゲノム修飾が蓄積されることが報告されており、SVR 後も発がん素地の維持に関与している可能性がある。肝がんは血流の豊富な腫瘍であり、その発生、進展に血管新生が重要な役割を果たしている。申請者らは、ANG-2 の受容体である TIE-2 を発現する単球が肝がん患者の末梢血および肝組織中で増加しており、肝がんにおける血管新生に関与することを明らかにしている(Matsubara T, Kanto T, et al. Hepatology2013)。SVR 後発がんの過程にも血管新生の亢進が関与している可能性がある。
以上の観点から、本研究では SVR 後肝がんの病態の解明と、発がん高リスク群に関連する遺伝子マーカーの探索を行う。次に肝疾患拠点病院での治療症例を対象として、発がんリスク評価における遺伝子マーカーの有用性の検証を行う。発がんリスク評価を基にした SVR 後患者の効果的・効率的なフォローアップ方針の確立を目指す。
平成 26 年度成果：
肝がん患者における癌部、非癌部組織の線維芽細胞の機能解析
SVR 後肝がんの生物学的特性を明らかにするために、非 SVR 例での肝がんの切除標本を材料として、癌部、非癌部から線維芽細胞を分離した。C 型肝がん、B 型肝がん、非 B 非 C 型肝がん患者の肝癌部、肝硬変部、正常肝部それぞれから線維芽細胞培養系が樹立された。各線維芽細胞の培養上清を用いてヒト単球からマクロファージへの分化能、マトリゲルを用いた肝癌細胞の浸潤能を評価した。肝硬変部、肝癌部からの線維芽細胞培養上清には IL-6, IL-8, MCP-1 が高濃度に存在していた。肝硬変部、肝癌部
線維芽細胞上清は、M2 型マクロファージを誘導し、肝癌細胞株の浸潤能を亢進させた。これより、肝癌における線維芽細胞はサイトカイン、ケモカインなどの産生を介して免疫細胞の遊走、マクロファージへの分化、肝癌の悪性化に関与していることが明らかになった。現在、癌関連線維芽細胞の形質・機能形成に関与するランドマーク遺伝子の同定を進めている。（図１）
肝がん関連血管新生細胞の誘導因子の探索
肝癌患者の血液中では TIE2 陽性単球（TEM）が増加しており、TEM の頻度は肝臓での血管新生の程度と正相関することを明らかにしている。肝癌が産生する何らかの因子が TEM の誘導に関与すると仮定
し、肝がん患者血清中のサイトカイン、ケモカインを Multiplex 法を用いて網羅的に解析した。その結果、
TEM 高値群と低値群で比較すると、HGF、Osteopontin、M-CSF、Folistatin が TEM 高値群で有意に増加していた。これらの４因子を用いて、in vitro でのマクロファージ分化能を比較すると、M-CSF が単球からマクロファージへの分化を促進し、TIE2 発現が増加した。したがって、肝癌由来の M-CSF が TEM 誘導に関与することが示唆された。現在、肝がんの病態における M-CSF の意義を多数の検体で検証している。（図２）

Subject No.

：26－109

Title：Exploration of genetic and epigenetic markers for the detection of hepatocellular

carcinoma occurring in patients who cleared HCV : Further multi-center validation study of theirclinical feasibility.
Researchers ：Key word：HCV, Genome, Epigenome, Hepatocellular carcinoma, SVR

Abstract：

Since the development of direct anti-viral agents against HCV, the sustained virological response(SVR) rate has been improved, which reaches more than 95% even in hard-to-treat populations.
However, the occurrence of HCC is reported to be not so uncommon in aged SVR patients.
Therefore, it is of clinical importance to explore some biomarkers or genetic markers that enable
us to assess the risk of HCC occurrence in patients with SVR. It is reported that epigenetic
modifications are accumulated on multiple genes in patients with HCV infection, the alteration ofwhich are sometimes irreversible. Alternatively, angiogenesis is a critical step in de novo
occurrence or the recurrence of HCC. We thus aimed to explore such markers of SVR-HCC andintend to validate its clinical usefulness in patients who are at high risk of future HCC.
#1: Cancer-associated fibroblast (CAF) as a modifier of microenvironment of HCC
Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are deemed to be essential constituents forming
cancer-surrounding niche. We established three types of fibroblasts, CAFs, liver cirrhotic
fibroblasts (LCFs) and non-cirrhotic fibroblasts (NFs). In the conditioned medium (CM) of CAFand LCF, the levels of IL-6, IL-8 and CCL2 were higher than those in the NF. The CAF and LCF
provided more invasiveness of HuH7, mobilized monocytes more significantly and polarized
macrophages into M2/TAM phenotype. Neutralization of IL-6, IL-8 and/or CCL2 in the CM
reduced the relevant functions on Huh7, monocytes and macrophages. Activated fibroblasts
recovered from the cirrhotic liver are primed to exert malignancy-prone functions on adjacentmacrophages and cancer cells, the capacity of which is as potent as CAF. Liver cirrhosis is adisease entity of carcinogenic microenvironment provided by CAF-like cirrhotic fibroblasts.
#2: TIE2-expresing monosytes (TEMs) as an angiogenesis marker of HCC
We reported that Tie2-expressing monocytes (TEMs) were increased in patients with HCC, thefrequency of which was correlated with the degree of angiogenesis in the liver. We sought toexamine the possibility of TEMs as the biomarker in patients with HCC. In patients with highTEMs frequency (>2.75% cut-off), the levels of M-CSF, HGF, Osteopontin, and Follistatin weresignificantly higher than those in patients with lesser TEMs (p<0.05). Among such factors,
TEMs/Tie2-expressing macrophages were generated from monocytes in the presence of M-CSF
instead of the others. Therefore, M-CSF is a potential inducer of TEMs, the feasibility of which asa surrogate biomarker needs to be verified in a larger cohort.
(Conclusion)We are currently screening some candidate genes involving in the phenotypes and functions ofCAFs or TEMs directly recovered from the HCC. Further study should be focused on thedevelopment of diagnostic modalities based on such candidate markers.
Researchers には、分担研究者を記載する。

肝癌微小環境における癌関連線維芽細胞（CAF）の役割
マクロファージ分化（TAM）と癌細胞悪性形質への関与

肝がんの血管新生前駆細胞の誘導機序の解明
Tie2発現単球（TEM)

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：２６指１０９
研究課題名：C型肝炎ウイルス排除後の肝発がんに関与する血中エピゲノムマーカーの探索と臨床的有用性の検証ー
探索研究と全国肝疾患拠点病院共同前向き研究
主任研究者名：考藤達哉
論文発表
論文タイトル著者

掲載誌

Aoki Y,Sugiyama M,
Murata K,
Yoshio S,
Kurosaki M,
Hashimoto S,
Yatsuhashi H,
Nomura H, Kang
Association of serum IFN-lambda withinflammatory and fibrosis markers in patients JH, Takeda T,
J. Gastroenterol
Naito S, Kimurawith chronic hepatitis C virus infection.
T, Yamagiwa Y,
Korenaga M,
Imamura M,
Masaki N, Izumi
N, Kage M,
Mizokami M,
Kanto T.

掲載号

年in press

2014

High-throughput and sensitive nextgeneration droplet digital PCR assay for thequantitation of the hepatitis C virus mutation
at core amino acid 70.

Mukaide M,
Sugiyama M,
Journal of
Korenaga M,
Virological
Murata K, Kanto
MethodsT, Masaki N,
Mizokami M.

207

2014

Using early viral kinetics to predict antiviraloutcome in response-guided pegylated
interferon plus ribavirin therapy among
patients with hepatitis C virus genotype 1.

Oze T,
Hiramatsu N,
Yakushijin T,
Miyazaki M, Iio
S, Oshita M,
Hagiwara H,
Mita E, Inui Y,
Hijioka T, InadaM, Tamura S,
J Gastroenterol
Yoshihara H,
Inoue A, Imai Y,
Miyagi T,
Yoshida Y,
Tatsumi T,
Kanto T,
Kasahara A,
Hayashi N,
Takehara T.

49(4)

2014

研究発表及び特許取得報告について

Risk factors for hepatocellular carcinoma inhepatitis C patients with normal alanine
aminotransferase treated with pegylated
interferon and ribavirin.

Harada N,
Hiramatsu N,
Oze T, Morishita
N, Yamada R,
Hikita H,
Miyazaki M,
Yakushijin T,
Miyagi T,
Yoshida Y,
Tatsumi T,
Journal of Viral
Kanto T,
Hepatitis
Kasahara A,
Oshita M, Mita
E, Hagiwara H,
Inui Y,
Katayama K,
Tamura S,
Yoshihara H,
Imai Y, Inoue A,
Hayashi N,
Takehara T.

21(5)

2014

学会発表タイトル

Human BDCA3+ dendritic cells enhance
NK/pDC cell-mediated inhibition of HBVreplication and protect liver from NK cellmediated damage

発表者

学会名

Yoshio S, Kanto
65th AnnualT, Sugiyama M,
Meeting of theShoji H, Mano Y,
AmericanAoki Y, Nishida
Association-forN, Korenaga M,
the-Study-of-LiverMurata K,
Diseases
Mizokami M.

場所

年月Boston, U.S.A. 2014.11.07-11

肝疾患における自然免疫の役割 最新知見と今考藤達哉, 由雄
後の展開 HBV・HCVの複製抑制機構における祥代, 溝上雅史.
自然免疫細胞 IFNの重要性

第50回日本肝臓学
東京会総会

2014.05.29-30

由雄祥代, 考藤
HBV複製抑制機構におけるインターフェロン
達哉, 杉山真也,(IFN-α/γ/λ)の役割-樹状細胞とNK細胞のクロス
是永匡紹, 村田トーク
一素, 溝上雅史.

第50回日本肝臓学
東京会総会

2014.05.29-30

由雄祥代, 考藤達哉, 杉山真也,
NK細胞と樹状細胞の相互作用によるHBV複製 青木孝彦, 西田奈央, 是永匡紹,抑制効果
村田一素, 溝上雅史.

第18回日本肝臓学
神戸会大会

2014.10.23-24

肝疾患のゲノム・免疫研究を治療に繋ぐ NK細胞と樹状細胞の相互作用によるHBV複製の抑制効果

第40回日本肝臓学
東京会東部会2014.11.27-28

由雄祥代, 考藤達哉, 溝上雅史.

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

NCGMメディアセミナー（世界肝炎デー関連セミナー）B型肝炎、C型肝炎の最新治療に関する講演

考藤達哉, 溝上雅史

発表先雑誌メディア場所
センター病院年月日
2014.7.23

研究発表及び特許取得報告について

AASLD TV（英国映像会社：WebsEdge）肝 考藤達哉, 溝上雅史, 杉山真也
疾患研究部プロモーションビデオ

特許取得状況について※出願申請中のものは(発明名称ウェブ（WebsEdge）

撮影：肝炎・免疫2014.10.14
研究センター)記載のこと。
登録番号

該当なし

※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国