博 士 論 文

成分既知培地を用いたブタ卵母細胞と胚盤胞の発生能および品質向上に関する研究中村 友美
岡山大学環境生命科学研究科

2017 年 9 月

目次
要旨 ...................................................................................................................................... iii
宣言および署名 .......................................................................................................................v
謝辞 ...................................................................................................................................... vi
論文業績および学会発表リスト .............................................................................................. vii
受賞リスト.............................................................................................................................. ix
略語リスト................................................................................................................................x

第1章

総説 ...................................................................................................................... 1

第2章

TGF-がブタ卵成熟と初期胚に及ぼす影響............................................................. 7

1.

緒言............................................................................................................................. 72.

材料および方法 ............................................................................................................ 93.

結果............................................................................................................................13

4.

考察............................................................................................................................15

5.

小括............................................................................................................................19

第3章

TGF-および FSH がブタ卵成熟と初期胚に及ぼす影響 .........................................29

1.

緒言............................................................................................................................292.

材料および方法 ...........................................................................................................31

3.

結果............................................................................................................................35

4.

考察............................................................................................................................38

5.

小括............................................................................................................................43

第4章

グルコースおよびグリシンがブタ胚盤胞の発生に及ぼす影響 ..................................54

1.

緒言............................................................................................................................542.

材料および方法 ...........................................................................................................56

3.

結果............................................................................................................................59

4.

考察............................................................................................................................61i

5.

小括............................................................................................................................65

第5章

成分既知ガラス化保存液を用いたブタ胚のガラス化保存.........................................71

1.

緒言............................................................................................................................712.

材料および方法 ...........................................................................................................73

3.

結果............................................................................................................................76

4.

考察............................................................................................................................78

5.

小括............................................................................................................................81

第6章

総合考察 ..............................................................................................................88

引用文献 ...............................................................................................................................91

ii

要旨

胚の体外生産技術は、卵成熟や受精、胚発生における生理機構の解明のほか、胚移植や発生工学的手法を用いた繁殖技術の基盤技術においても重要である。しかし、体外で培養した卵子や胚の発生能および品質は、体内で発育した卵子や胚に比べて劣っており、耐凍性や胚移植後の産子への発生率も低い。本研究では、ブタ卵母細胞と胚の発生能および品質の向上を図り、動物由来成分を使用しない成分既知培地を用いた培養技術を確立するため、卵母細胞の成熟培養および胚盤胞の発生培養について検討を行った。
まず、成熟培地への transforming growth factor (TGF)-の添加が卵成熟と胚発生に及
ぼす影響ついて検討した。成熟培地に 10 ng/ml TGF-を添加すると卵母細胞の核成熟を促進したが、equine chorionic gonadotropin (eCG)と human chorionic gonadotropin (hCG)を添加した場合に比べて促進作用は弱かった。成熟培地に eCG と hCG が存在する場合、
TGF-は第二減数分裂中期（MII）卵の割合、媒精後の受精率および卵割率には影響しなかったが、胚盤胞への発生を促進した。TGF-を添加あるいは無添加で成熟培養した卵母細胞
およびそれに由来する胚盤胞の電顕観察を行ったところ、細胞内微細構造に形態的違いが認められ、微細構造の変化が胚盤胞への発生能に関与する可能性が示唆された。
次に、TGF-と生殖腺刺激ホルモンの作用の関連性を明確にし、動物由来成分を含まない
成熟培地を開発するため、成熟培地への TGF-と卵胞刺激ホルモン（FSH）が卵成熟および体外受精後の胚発生に及ぼす影響について検討した。MII 卵の割合は、FSH を 0.01～0.1
IU/ml の濃度で添加すると無添加に比べて増加し、FSH と TGF-を両方添加するとさらに増加した。また、受精率および胚盤胞への発生率は、TGF-を含む成熟培地に FSH を 0.05
IU/ml 以上添加すると FSH 無添加に比べて増加した。一方、TGF-と FSH は裸化卵母細胞の核成熟を促進しなかった。EGF レセプター阻害剤である AG1478 は、TGF-による卵母細胞の核成熟促進作用を完全に阻害したが、FSH による作用は完全には阻害しなかった。さらに、TGF-と FSH が誘導する卵丘膨化の関連遺伝子の発現動態は異なっていた。したがって、

iii

TGF-と FSH は卵丘細胞を介して卵成熟を促進するが、一部は異なる経路により相乗的に作用していることが示唆された。
ついで、胚の品質を改善するため、グルコースとグリシンが胚盤胞の生存性および孵化に及ぼす影響を検討した。成分既知の胚発生培地（PZM-5）に 2.5～10 mM グルコースを添加して胚盤胞を培養したところ、胚盤胞の生存率および ATP 含量は、無添加で培養した胚盤胞に比べて増加した。また、PZM-5 に 5 mM グルコースと 10 mM グリシンを添加すると、胚盤胞の孵化率、直径および総細胞数が増加し、アポトーシス細胞の出現頻度は低下した。このことから、グルコースとグリシンはブタ胚盤胞の発生を相乗的に促進することが判明し、胚盤胞における生存細胞数を指標とした胚の品質を改善することが示唆された。
さらに、これらの結果を動物繁殖技術へ応用するため、開発した発生培地（PBM：グルコー
スとグリシンを添加した PZM-5）をガラス化保存液および加温液の基本液として用いるとともに、体外生産胚の耐凍性を向上させる至適培養条件（胚の発生培地、発生ステージ、および培養日数の違い）について検討した。拡張胚盤胞のガラス化・融解後の生存率および孵 化率は、胚の発生日齢や培養培地の違いに関わらず、胚盤胞に比べて有意に高かった。媒精後 5 日
目から 1 日間 PBM で培養した胚のガラス化・融解後の生存率および孵化率は、PZM-5 で培養した胚に比べて高かった。また、媒精後 4 日目ないしは 5 日目から PBM で培養した胚を、5日目あるいは 6 日目にガラス化したところ、胚日齢間で融解後の生存性に差は認められなかった。さらに、成分既知ガラス化保存液でガラス化した拡張胚盤胞を受胚豚の子宮に移植することで正常な産子が得られた。これらの結果から、ブタ胚では胚盤胞に比べて拡張胚盤胞で耐凍性が高く、媒精後 5 日目から 1 日間 PBM で培養すると耐凍性が向上し、発生ステージ
や培養培地が胚の生存性に大きく影響することが示唆された。
以上のように、成分既知培地を用いて、卵母細胞の成熟と体外受精後の初期胚発生能を改善する成熟培養技術、および胚盤胞の発生を促進し品質と耐凍性を向上させる発生培養技術を開発することができた。本研究成果は、動物由来成分を使用せずにブタ卵母細胞や胚の発生能および品質を向上させることができ、畜産分野のみならず、クローン動物あるいはトランスジェニック動物作出など医学の基盤技術にも寄与すると期待される。
iv

宣言および署名

本論文に含まれる研究内容は、他の研究機関および他の大学で学位や報告のために受理されたものを含んでいないこと、および、本論文内に引用文献として引用したものを除いて、他人がすでに公表または執筆中の内容を含んでいないことを宣誓します。

v

謝辞

本論文を執筆するにあたり、御指導と御鞭撻を賜りました岡山大学大学院環境生命科学研究科
教授 齋藤昇博士、舟橋弘晃博士ならびに木村康二博士に心より厚く御礼申し上げます。また、本研究の遂行および論文作成にあたり、終始御指導と御助言をいただきました株式会社機能性ペプ
チド研究所取締役所長 星宏良博士ならびに国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機
構 動物衛生研究部門 吉岡耕治博士に深謝致します。
また、実験に御協力いただくとともに、有益な御助言をいただきました北海道大学大学院獣医学研究科准教授 永野昌志博士、日本大学生物資源科学部准教授 三角浩司博士、動物衛生研究部門 鈴木千恵博士、麻布大学獣医学部講師 野口倫子博士に心より感謝申し上げます。さらに、本論文を作成するにあたり、的確な御助言をいただきました山形大学理学部教授 渡辺明彦博士に深く感謝申し上げます。
加えて、本研究に多大なる御協力をいただきました株式会社機能性ペプチド研究所 山下祥子氏、星翼氏、株式会社機能性ペプチド研究所ならびに日東ベスト株式会社の皆様に厚く御礼申し上げます。
最後に、本研究の遂行および論文の作成にあたり、支えてくれた家族に心から感謝します。

vi

論文業績および学会発表リスト＜論文リスト＞
1.

Mito T, Yoshioka K, Nagano M, Suzuki C, Yamashita S, Hoshi H 2009 Transforming
growth factor- in a defined medium during in vitro maturation of porcine oocytes
improves

theirdevelopmental

competence

andintracellularultrastructure.

Theriogenology 72 841–850.
2.

Mito T, Yoshioka K, Yamashita S, Suzuki C, Noguchi M, Hoshi H 2012 Glucose andglycine synergistically enhance the in vitro development of porcine blastocysts in achemically defined medium. Reproduction, Fertility and Development 24 443–450.

3.

Mito T, Yoshioka K, Noguchi M, Yamashita S, Hoshi H 2013 Recombinant humanfollicle-stimulating hormone and transforming growth factor-alpha enhance in vitro
maturation of porcine oocytes. Molecular Reproduction and Development 80 549–560.

4.

Mito T, Yoshioka K, Noguchi M, Yamashita S, Misumi K, Hoshi T, Hoshi H 2015 Birthof piglets from in vitro-produced porcine blastocysts vitrified and warmed in a chemicallydefined medium. Theriogenology 84 1314–1320.

＜学会発表リスト＞
1.

Mito T, Yoshioka K, Suzuki C, Yamashita S, Ozawa T, Hoshi H 2006 Effect oftransforming growth factor (TGF)- on porcine oocyte maturation in a defined medium.
XIIth AAAP Animal Science Congress, Asian-Australasian Association of Animal
Production Societies, Busan. (9.18–22) Abstract 187.

2. Mito T, Yoshioka K, Suzuki C, Yamashita S, Hoshi H 2007 Transforming growth factor(TGF)- during in vitro maturation of porcine oocytes in a defined medium improves theirdevelopmental competence. Tsukuba Meeting for Animal Biotechnology (TMAB),
Tsukuba. (1.12–13) Abstract 52.
vii

3.

水戸友美，吉岡耕治，永野昌志，鈴木千恵，山下祥子，星宏良 2007 成分既知体外成熟培
地への TGF-添加によるブタの胚発生への影響と卵子の超微形態学的観察．日本繁殖生物
学会．東京（10 月 20～22 日）．The Journal of Reproduction and Development 53
Supplement j133.

4.

水戸友美，吉岡耕治，鈴木千恵，山下祥子，星宏良 2008 グルコースとグリシンがブタ胚盤胞の発生に 及ぼす影響 ． 日本繁殖生物学会 ．福 岡 （9 月 18～20 日）． The Journal of
Reproduction and Development 54 Supplement j122.

5.

水戸友美，吉岡耕治，鈴木千恵，山下祥子，星宏良 2010 ブタ卵子の成熟におけるリコンビナ
ントヒト卵胞刺激ホルモン（rhFSH）および TGF-の影響と作用機構の解明．日本繁殖生物学会．十和田（9 月 2～4 日）．The Journal of Reproduction and Development 56 Supplement
j121.

6.

水戸友美，吉岡耕治，三角浩司，野口倫子，鈴木千恵，山下祥子，星宏良 2011 ブタ体外生
産胚の耐凍性に対する発生ステージ，日齢および後期胚培養培地の影響．日本繁殖生物学会 ． 盛 岡 （ 9 月 15 ～ 17 日 ） ． The Journal of Reproduction and Development 57
Supplement j198.

7.

水戸友美，吉岡耕治，三角浩司，山下祥子，星翼，星宏良 2012 MVAC 法を用いたブタ体外生産胚のガラス化保存における平衡時間と融解温度が胚生存性に及ぼす影響．日本繁殖生物学会．つくば（9 月 6～8 日）．The Journal of Reproduction and Development 58
Supplement j173.

8.

水戸友美，吉岡耕治，星翼，山下祥子，星宏良 2015 リコンビナントヒト血清アルブミン（rHSA）
がブタ胚盤胞の発生およびガラス化保存後の生存性に及ぼす影響．日本動物細胞工学会．仙台（7 月 9～10 日）．PROGRAM&ABSTRACTS 84.

viii

受賞リスト

第 12 回山形県科学技術奨励賞（2013）．山形県．山形県庁（10 月 1 日）．

ix

略語リストcAMP

cyclic adenosine 3’,5’-monophosphatecGMP

cyclic guanosine 5’-monophosphate

COCs

cumulus-oocyte complexes

dbcAMP

dibutyryl cyclic adenosine monophosphateDOs

denuded oocytes

EGF

epidermal growth factor

FSH

follicle-stimulating hormone

GV

germinal vesicle

GVBD

germinal vesicle breakdown

HAPLN1hyaluronan and proteoglycan link protein 1

HAS2

hyaluronan synthase 2

LH

luteinizing hormone

MAPK

mitogen-activated protein kinase

MII

metaphase II

PBM

porcine blastocyst medium

PBS

phosphate buffered saline

PFM

porcine fertilization medium

PKA

protein kinase A

PKC

protein kinase C

PKG

cGMP-dependent protein kinase

POE-CM

porcine oocyte, embryo-collection medium

POM

porcine oocyte medium

PVA

polyvinyl alcohol

PZM-5

porcine zygote medium-5
xTGF-

transforming growth factor-alphaTNFAIP6

tumor necrosis factor alpha induced protein 6

TUNEL

terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP–digoxigeninnick end-labelling

UBB

ubiquitin

VCAN

versicanxi

第1章 総説

多くの哺乳動物の雌では、胎生期において始原生殖細胞が生殖巣原基に移動して卵原細胞となって増殖し、一部が卵母細胞へと分化する。卵母細胞は出生前後に減数分裂を開始し、第一分裂
前期で細胞分裂を停止する。卵母細胞は一層の卵胞上皮細胞により取り囲まれ、原始卵胞（一次卵胞）が作られる。一次卵胞内の卵胞上皮細胞は活発に増殖し、卵母細胞と卵胞上皮細胞の間に透明帯が出現する。このような卵胞を二次卵胞と呼び、重層化した卵胞上皮細胞を顆粒膜細胞という。さらに、顆粒膜細胞間の所々に間隙が出現して卵胞腔が形成され、胞状卵胞（三次卵胞）となる。その後、それぞれの卵胞腔は合併して一つの大きな腔を有するグラーフ卵胞へと発育する。グラーフ卵胞の成熟につれて、卵母細胞は何層もの顆粒膜細胞に囲まれた状態で卵胞の一方に押しやられ、卵胞腔に突出する。この部分を卵丘と称し、その部分の顆粒膜細胞を卵丘細胞という。最初の第一分裂前期で停止した卵母細胞は、密着した卵丘細胞に囲まれてコンパクトな卵丘卵母細胞複合体（cumulus-oocyte complexes: COCs）を形成している。この時期の卵母細胞は卵核胞（germinal vesicle: GV）と呼ばれる大型の核を有している。個体の性成熟後、卵母細胞は生殖腺
刺激ホルモンなどの刺激によって卵核胞崩壊（germinal vesicle breakdown: GVBD）といわれる核膜の消失を起こして減数分裂を再開する。その後、第一極体を放出して第二分裂中期（metaphase
II: MII 期）に進行し、減数分裂を再び停止する。GV をもつ卵母細胞（GV 卵）が MII 期の卵母細胞（MII 卵）へと移行する過程を卵成熟と呼ぶ。MII 卵は卵巣から排卵されて卵管に輸送され、卵管膨大部で受精する。卵母細胞と精子の細胞膜の融合によって精子核が卵細胞質に入ると、精子頭部の核膜が壊れて膨化精子となり、雄性前核が形成される。これと並行して、第二分裂中期で停止していた卵母細胞は減数分裂を再開し、第二極体を放出して、雌性前核を形成する。両前核は受精卵の中央へ移動し、互いに合一する。受精が完了すると、受精卵は卵管から子宮へ移動しながら卵割を繰り返し、子宮に到達する。受精卵は 2 細胞、4 細胞、8 細胞と分割を繰り返し、桑実胚になる。桑実胚期に入ると割球同士が密着し凝集する。そして、割球同士の間に胚盤胞腔を形成し胚盤胞になる。この時期の胚では、将来胎児になる内部細胞塊と、胎盤を形成する栄養膜細胞層が顕在化する。胚盤胞腔は拡張を続け、やがて胚が透明帯を押し広げた状態の拡張胚盤胞となり、透1

明帯を破って孵化する。孵化によって胚盤胞は子宮内膜上皮と直接接触することが可能になり、栄養膜細胞と子宮内膜上皮細胞が互いに結合して着床する。
雌の生殖機能は、視床下部、下垂体、および卵巣間でのホルモン伝達によって調節されている。
視床下部から分泌される生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（gonadotropin releasing hormone:
GnRH）は下垂体前葉に作用し、卵胞刺激ホルモン（follicle-stimulating hormone: FSH）と黄体形
成ホルモン（luteinizing hormone: LH）の合成および分泌を促進する。FSH と LH は共同して卵巣での卵胞形成を促進し、LH の一過性の大量放出（LH サージ）により卵母細胞の減数分裂の再開、卵丘細胞の体積の著しい増加（卵丘膨化）、および排卵が誘起される。FSH と LH による COCs の卵丘膨化や卵成熟の促進は培養下においても観察することができる（Kobayashi et al., 1994;
Mattioli et al., 1991）。FSH レセプターは顆粒膜細胞と卵母細胞に、LH レセプターは莢膜細胞と顆粒膜細胞に発現している（Méduri et al., 2002; Yuan et al., 1996）が、FSH と LH による減数分裂
は、卵母細胞を取り囲む体細胞を介して刺激される（Amsterdam et al., 1975; Dekel et al., 1988）。
FSH と LH は、卵丘・顆粒膜細胞でのサイクリックアデノシン 3’, 5’-一リン酸（cAMP）産生量の増加と（Downs et al., 1988）、それに続いて起こる mitogen-activated protein kinase（MAPK）の活性化（Su et al., 2002; Liang et al., 2005）に関与し、卵母細胞の減数分裂の再開を誘起すると考えられている。cAMP は直接 MAPK を活性化せず（Wu et al., 1993）、近年、生殖腺刺激ホルモンによって発現が誘導される epidermal growth factor（EGF）様成長因子（Park et al., 2004; Chen et al.,2008）、meiosis activating sterol（MAS）、および性腺ステロイドホルモン（Byskov et al., 1995;
Yamashita et al., 2005）がプロテインキナーゼ A II（PKA II）やプロテインキナーゼ C（PKC）経路を介して MAPK を活性化している可能性が示唆された。しかし、卵丘細胞での MAPK の活性化後、卵母細胞の減数分裂の再開を誘導するメカニズムは解明されていない（Liang et al., 2007）。
哺乳動物の卵成熟においては、生殖腺刺激ホルモンのほかに、卵巣の体細胞で発現する細胞成長因子もまた重要な役割を果たしている。培養下でのマウスの卵成熟において、EGF ファミリーに属する成長因子は EGF, transforming growth factor-（TGF-）, platelet-derived growth factor,
nerve growth factor, insulin-like growth factor-I, -II, および fibroblast growth factor ファミリー等
多くの細胞成長因子ファミリーに属する成長因子の中で最も GVBD および卵丘膨化に高い促進効2

果を示す（Downs, 1989）。EGF は、EGF レセプターに結合してレセプターのチロシンキナーゼを活性化し、ウシ（Lonergan et al., 1996）やブタ（Singh et al., 1997; Abeydeera et al., 2000;
Procházka et al., 2000; Uhm et al., 2010）の卵母細胞の核成熟を促進する。さらに、EGF は、胚発生に必要な各種 mRNA やタンパク質、栄養成分の蓄積を伴う細胞質成熟や胚発生を促進することがマウス（Fuente et al., 1999）、ヒト（Goud et al., 1998）、ウシ（Kobayashi et al., 1994;
Lonergan et al., 1996）、ブタ（Singh et al., 1997; Abeydeera et al., 1998; Li et al., 2002）で明らかになっている。一方、卵胞形成に関しては、近年、顆粒膜細胞や卵丘細胞で発現する
amphiregulin、epiregulin、betacellulin を含む EGF ファミリー分子がパラクライン型信号伝達物質として LH の下流で働き、GVBD を誘起する可能性がマウスにおいて示されている（Park et al.,
2004; Hsieh et al., 2007）。また、FSH もラットの顆粒膜細胞やマウスの卵丘細胞で epiregulin あ
るいは amphiregulin の発現を誘導する（Sekiguchi et al., 2002; Shimada et al., 2006）。FSH お
よび LH により引き起こされる GVBD は、EGF レセプターの阻害剤である AG1478 によって阻害されることから（Park et al., 2004; Downs and Chen, 2008）、EGF ファミリー分子による EGF レセプ
ターの活性化が必要であることが示唆されている（Zhang et al., 2009）。一方、FSH と EGF ファミリー分子はどちらも卵丘細胞の MAPK 経路を活性化して減数分裂の再開を誘導するが、これらの 2つの経路は重複あるいは相互接続していない可能性も示唆されており、FSH と EGF ファミリー分子
が GVBD を誘起するシグナル伝達機構の関連性は明らかになっていない（Farin et al., 2007）。
一方、哺乳類の胚発生には糖質やアミノ酸が重要な役割を担う。培養下の卵割初期のブタ胚において、培地中に高濃度のグルコースが存在すると 4 細胞期で発生停止が引き起こされる（Floodand Wiebold, 1988; Ankrah and Appiah-Opong, 1999; Medvedev et al., 2004）。しかし、媒精後
2 日目以降に高濃度のグルコースが存在すると、胚盤胞への発生が促進され、胚の細胞数が増加する（Kikuchi et al., 2002b）。また、培地への各種アミノ酸の添加は、様々な動物種において胚発生を促進する（Gardner and Lane, 1993; Bavister and Arlotto, 1990; Lee et al., 2004; Suzuki
and Yoshioka, 2006）。ウシでは、培地へのグリシンの添加が培養下での胚の発生率と胚盤胞の細胞数を増加させる（Lee and Fukui, 1996; Takahashi and Kanagawa, 1998）。ブタでは、グリシンは卵管液と子宮液中で最も豊富に存在するアミノ酸であるが（Iritani et al., 1974; Li et al., 2007）、
3グリシンの胚発生への作用は報告されていない。
哺乳類における卵母細胞や胚の培養技術は、生体内で起こる現象を体外で再現できるため、卵成熟、受精、胚発生における生理機構の解明に貢献し、生物学的および生化学的な基礎知見を得るのに役立つ。また、卵母細胞や胚の培養技術は、クローン動物あるいはトランスジェニック動物作
出などの動物繁殖技術においても重要である（Day, 2000）。近年、ヒトの病態モデルや異種間臓器移植のドナーとして、ヒトとの類似性が高い大型動物であるブタが注目されており、トランスジェニッ
クブタ作出に関する研究が行われている。トランスジェニックブタ作出には核移植やクローン技術が用いられるが、これらの技術では初期胚や成熟卵子を大量に使用する。したがって、正常な卵子や胚を効率的に作出できる培養技術の確立は、生物学のみならず医学にも大きく貢献することが期待される。さらに、畜産分野では自然交配に代わり、胚移植による子豚の生産が注目されている。
胚移植は、新たな遺伝形質を持つ個体を導入する際に、生体の移動や生体同士の接触がないた
め感染症伝播の防除に有効であるほか、品種改良や優良家畜の増産にも貢献すると期待されている。しかし、現行の培養系で培養したブタの卵子や胚の発生能は体内で発育した卵子や胚に比べて劣っており、胚移植後の産子への発生率も低い。
ブタ卵母細胞の成熟培養や胚の発生培養では、一般にブタ卵胞液、血清、ウシ血清アルブミンなどの動物から採取した成分、または部分精製した成分（動物由来成分）が培地に含まれている（Vatzias and Hagen, 1999; Bijttebier et al., 2008; Suzuki et al., 2006）。卵胞液や血清には各種
ホルモンや細胞成長因子に加えて多くの未知成分が含まれている（Edwards, 1974）。また、卵胞液に含まれるホルモンや細胞成長因子の濃度は卵胞の発育段階によって変化し（Ainsworth et al.,
1980; Bridges et al., 2002）、血清や血清アルブミンも製造ロット間で純度の差が大きい。さらに、ブタ卵胞の細胞には豚繁殖・呼吸障害症候群（Porcine reproductive and respiratory syndrome:
PRRS）ウイルスが存在しており（Sur et al., 2001）、卵胞液や血清には細菌やウイルスが含まれている可能性がある（Galik et al., 2002; Devaux et al., 2003）。これらの問題により、動物由来成分を含む培地の使用は実験の再現性の低下を招き、卵成熟や胚発生における外的要因すなわちホルモン、細胞成長因子、糖質、アミノ酸、およびビタミン類などの生理作用の解析を困難にする。成分既知培地は、実験の再現性を高め、卵成熟や胚発生における外的要因の生理作用の解析に有4用であり、受精や着床率が高い、いわゆる高品質の成熟卵子や初期胚を安定して作出することが可能になると考えられている。また、ブタでは、2 つ以上の精子が卵細胞質と融合する多精子受精が他の動物種に比べて頻発し、正常な胚発生の妨げとなっている（Nagai and Moor, 1990; Wanget al., 1998）が、成熟培地中の卵胞液をポリビニルアルコール（PVA）に変更した成分既知培地を用いて卵母細胞を培養すると、体外受精後の多精子受精が減少することが示されている（Yoshioka et al., 2008）。近年、ブタ卵管液の無機塩類とエネルギー基質の組成に基づいた成分
既知培地で、卵母細胞の成熟基礎培地である porcine oocyte medium（POM）（Yoshioka et al.,2008）、体外受精培地である porcine fertilization medium（PFM）（Yoshioka et al., 2003）、および受精卵の発生培地である porcine zygote medium-5（PZM-5）（Suzuki and Yoshioka, 2006）が開発された。これらの成分既知培地を用いて、卵母細胞を成熟培養し、体外受精することで胚盤胞を作出できる培養システムが構築されたが、培養した胚の生存能力は体内発育胚に比べて依然として低く、胚盤胞の細胞数は少ない（Yoshioka et al., 2002）。また、培養した胚盤胞では透明帯からの孵化が起こることはほとんどない（Robl and Davis, 1981; Magli et al., 1998; Dobrinsky et al.,1996）。これらの原因の一つとして培養条件が不十分であることが考えられる。したがって、卵成熟や胚発生に必要な各種因子の同定やそれらの作用機構の解明、および高品質の成熟卵子や初期胚の作出のためには、成分既知培地を改良し、より再現性の高い安定した培養系の確立が必要である。
ブタ胚の超低温保存技術は、優良な遺伝子資源の長期保存のほか、胚移植における時間的・地理的制約を無くし、低コストで新規血統が導入可能になるなど利便性の向上にも有効である。しかし、ブタ胚は他の哺乳動物の胚に比べて低温感受性が高く（Wilmut, 1974; Polge et al., 1974;
Nagashima et al., 1995）、ウシ胚などで従来行われているような緩慢凍結では、ブタの桑実胚や初期胚盤胞の保存は困難である（Dobrinsky, 1997）。また、胚を培養液中で急速に凍結すると、細胞内外の水分が結晶化し、細胞膜や細胞内小器官などの細胞構造が物理的に損傷してしまう。そこで、高濃度の凍結保護物質とともに超急速に冷却することにより、細胞内外に氷晶を形成させる
ことなく超低温保存できるガラス化保存法が開発された（Rall and Fahy, 1985）。ブタ胚においても、
ガラス化保存法による超低温保存が可能になり、ガラス化・融解した胚を移植することで産子の作
5

出にも成功している（Kobayashi et al., 1998; Dobrinsky et al., 2000）。ブタの卵母細胞や胚は、マウス、ウシ、およびヒツジに比べて非常に多くの脂質を含んでいる（McEvoy et al., 2000; Sturmey
and Leese, 2003）。ブタの卵母細胞や胚に含まれる多量の脂質は、エネルギー源として卵成熟、受精、および胚発生に重要な役割を果たすと考えられている（Brown, 2001; Kikuchi et al., 2002a）
が、胚の高い低温感受性の原因であることも示唆されている（Nagashima et al., 1995）。体外受精
後に、遠心と顕微操作により機械的に脂肪顆粒を除去し、その後ガラス化保存した体外生産胚から子豚を作出することに成功したと報告されている（Nagashima et al., 2007）。しかし、脂肪顆粒除去
は透明体に傷をつけるため病原体伝播のリスクを増加させるうえ、大きな労力と手間を要する。最近、Maehara et al.（2012）は、体外成熟および体外受精により作出した桑実胚を脂肪顆粒除去す
ることなく、中空糸法でガラス化保存することに成功したと報告した。体外生産胚の非侵襲的で簡単な凍結保存技術は、研究および産業上、有用である。しかし、体外生産胚の超低温保存は、体内発育胚に比べると難しく（Greve and Callesen, 2004）、超低温保存に耐える品質の胚を作出する
培養技術を開発する必要がある。
本研究では、ブタ卵母細胞と胚の発生能および品質向上を図り、成分既知培地を用いた培養技術を確立するため、卵母細胞の成熟培養および胚の発生培養について検討を行った。第 2 章では、
TGF-がブタ卵成熟と胚発生に及ぼす影響について検討した。第 3 章では、TGF-と FSH のブタ
卵成熟および胚発生への作用を明らかにするとともに、それぞれの作用機構の関連性を検討した。
第 4 章では、グルコースとグリシンがブタ胚盤胞の生存性および孵化に及ぼす影響を検討した。さらに、第 5 章では、これらの結果を動物繁殖技術へ応用するために、開発した発生培地をガラス化
保存液および加温液の基本液として用いるとともに、体外生産胚の耐凍性を向上させる至適培養条件について検討した。

6

第2章 TGF-がブタ卵成熟と初期胚に及ぼす影響

1. 緒言

哺乳動物の卵成熟は生殖腺刺激ホルモンや細胞成長因子の刺激により引き起こされ、卵母細胞では減数分裂を再開し第一極体を放出して MII 期に達する核成熟と、受精や初期胚発生に関与する細胞質成熟が起こる。培養系において、FSH 様の作用を示すウマ血清性生殖腺刺激ホルモン（eCG）と LH 様の作用を示すヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン（hCG）を成熟培地に添加してブタのCOCs を培養すると、核成熟を促進する（Minato and Toyoda, 1982）。また、FSH 様の作用を示す
妊馬血清性生殖腺刺激ホルモン（PMSG）、hCG、およびエストラジオールを成熟培養 20 時間まで成熟培地に添加し、その後これらのホルモンとステロイドを除去してブタの COCs を培養すると、核成熟および細胞質成熟を促進する（Funahashi and Day, 1993）。しかし、ブタでは、体外成熟した卵母細胞を体外受精すると、雄性前核形成不全や多精子受精（Funahashi and Day, 1997; Niwa,
1993）といった異常受精が高率に起こることから、依然として細胞質成熟が不十分であると考えられる。
哺乳動物の卵母細胞においては、EGF、TGF-、amphiregulin、epiregulin、betacellulin 等を含む EGF ファミリー分子も核成熟および細胞質成熟を誘起する（Coskun and Lin, 1994; Singh et al.,
1997; Procházka et al., 2000; Akaki et al., 2009 ） 。 Amphiregulin 、 epiregulin 、 お よ びbetacellulin は LH の刺激により顆粒膜細胞で発現し、オートクラインあるいはパラクライン的に作用して、卵丘膨化や GVBD を誘起する（Park et al., 2004）。EGF および TGF-もブタ（Grupen et al.,1997b; Coskun and Lin, 1994）を始め、マウス（Downs et al., 1988; Brucker et al., 1991）、ラット（Dekel and Sherizly, 1985; Tsafriri et al., 1989）、ウシ（Lonergan et al., 1996; Kobayashi et al.,1994）の卵母細胞の核成熟を促進するが、LH（hCG）の刺激は EGF と TGF-の発現を誘起しない（Sekiguchi et al., 2004; Hsieh et al., 2009）。ブタにおいて、EGF は卵母細胞で強く発現している（Singh et al., 1995b）が、TGF-は GV 卵から MII 卵までの全ての成熟段階において卵母細胞では検出されない（Singh and Armstrong, 1995a; Yoshida et al., 1998）。TGF-は顆粒膜細胞と卵7丘細胞で発現しており、卵胞発達に際して起こる顆粒膜細胞の増殖にオートクライン様の作用機序
で働き、卵成熟を促進する可能性がある（Singh and Armstrong, 1995a）。TGF-は 50 個のアミノ酸からなるポリペプチドで、EGF と 30～40％の相同性を有する（Marquardt et al., 1983）。TGF-
は EGF レセプターに結合してレセプターのチロシンキナーゼを活性化し、EGF と同様の生理作用を示す（Massague, 1983; Pike et al., 1982）が、角化細胞のコロニー様増殖や血管新生において、TGF-は EGF よりも効果が高いことが報告されている（Barrandon and Green, 1987; Schreiber
et al., 1986）。ウシでは、成熟培地に TGF-を添加すると卵丘膨化を促進し、受精率と体外受精後の胚盤胞への発生を高める（Kobayashi et al., 1994）。ブタでは、成熟培地に TGF-を添加すると卵母細胞の核成熟を促進すると報告されている（Coskun and Lin, 1994）が、卵成熟におけるTGF-が、受精および胚発生に及ぼす作用については報告されていない。
卵母細胞の細胞質成熟には、胚発生に必要な各種 mRNA やタンパク質、栄養成分の蓄積（Watson, 2007）のほか、細胞内小器官の局在や構造の変化が関係する（Ferreira et al., 2009;
Cran, 1985）。ブタ卵母細胞では、体内成熟の間、ミトコンドリアの数が減少する（Cran, 1985）。また、小グループのミトコンドリアは GVBD 後に小胞体で包まれ、発達して伸長する（Cran, 1985）。さらに、電子顕微鏡により観察される脂肪滴の電子密度は、体内発育胚と体外生産胚では異なっている（Kikuchi et al., 2002a）。したがって、成熟培地への TGF-添加による卵母細胞や胚の微細構造の変化を明らかにすることは興味深い。
本章では、卵成熟における TGF-が核成熟、細胞内微細構造、受精、および胚発生に及ぼす影響について検討した。また TGF-添加培地で成熟培養後に発生した胚盤胞を移植し、産子への発生能を検討した。

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2. 材料および方法

1） 成熟培養食肉処理場で得られた春機発動前のブタの卵巣を、約 25℃のリン酸緩衝液（PBS）または生理食塩水（0.9% (w/v) NaCl）に入れて研究室に輸送した後、PBS または生理食塩水で 3 回洗浄した。
COCs を、18 ゲージの注射針を取り付けた 10 ml シリンジを用いて胞状卵胞（直径 3～6 mm）から吸引採取し、porcine oocyte, embryo-collection medium（POE-CM; Research Institute for the
Functional Peptides, Higashine, Japan, 表 2-1）で 2 回洗浄した。成熟培養には、卵丘細胞が密に付着した COCs を選択し、基礎培地として porcine oocyte medium（POM; Research Institutefor the Functional Peptides, 表 2-1）を用いた。選別した COCs を、10 IU/ml eCG（セロトロピン；
Aska Pharmaceutical Co., Tokyo, Japan ） お よ び 10 IU/ml hCG （ ゴ ナ ト ロ ピ ン ； Aska
Pharmaceutical Co.）を添加した POM、あるいは無添加の POM に、TGF-（PeproTech, London,
UK）を 0，1，10，または 100 ng/ml 添加した成熟培地で 2～3 回洗浄後、成熟培地 150 μl のドロップ中に 15～20 個ずつ移し、38.5～39℃、5% CO2、5% O2、90% N2 気相下で 44 時間培養した。
生殖腺刺激ホルモンは成熟培養開始後 20 時間まで、TGF-は 44 時間目まで POM に添加してCOCs を培養した。

2） 核成熟の評価
卵母細胞の核成熟の観察法は、Yoshioka et al.（2008）に従った。成熟培養後の COCs を、38℃に保温した 1 mg/ml ヒアルロニダーゼ（Sigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, USA）を含む POE-CM
中で処理し、ガラスキャピラリーピペットで卵丘細胞を除去した。得られた裸化卵母細胞（DOs）を、
パラフィンとワセリンを 1：12 で混合して溶解した小滴をカバーグラスの四隅に対応する位置に添付したスライドグラス上にのせ、カバーグラスで DOs を押さえて、アセトアルコール（エタノール：酢酸＝3：1）で 24～48 時間固定した。固定後、1% (w/v)アセトオルセインで染色し、アセトグリセロール（酢酸：グリセロール：蒸留水＝1：1：3）で脱色した。作製した標本を位相差顕微鏡（DMRE; Leica
Microsystems Wetzlar GmbH, Wetzlar, Germany, または BX50; OLYMPUS, Tokyo, Japan）を9

用いて観察し、卵母細胞の核相を調べて、減数分裂を再開した GVBD 卵、または、第一極体を放出した MII 卵に分類した。

3） 媒精
体外受精には同一ロットの凍結精液（動物衛生研究所 吉岡耕治博士、鈴木千恵博士より供与）と porcine fertilization medium（PFM; Research Institute for the Functional Peptides, 表 2-1）を用 い た 。 凍 結 融 解 精 液 は 、 40% お よ び 80% パ ー コ ー ル 溶 液 （ GE Healthcare UK,
Buckinghamshire, UK）に重層し、700 × g で 20 分間遠心した。最下層の精子に PFM を加えて懸濁し、500 × g、5 分間遠心して上清を除き、この操作を繰り返して精子を 2 回洗浄した。成熟培
養後の COCs は、精子を 1 × 106 個/ml に調整した 100 μl のドロップ中で、10 時間媒精した。媒精後の卵子は前項と同様の方法で標本を作製し、1 つ以上の膨化した頭部を有する精子あるいは雄性前核が卵子細胞質中に存在する場合を卵子が受精しているものとした。供試卵子数に対する、受精卵の割合を精子侵入率、受精卵の総数に対する、第二極体と 2 つの前核を有する卵子の割合
および雄性前核を有する卵子の割合を、正常受精率および雄性前核形成率として算出した。

4） 発生培養
媒精後の胚を POE-CM 中で 4 分間撹拌混合して卵丘細胞を除去し、POE-CM と porcine
zygote medium-5（PZM-5; Research Institute for the Functional Peptides, 表 2-1）でそれぞれ 2回ずつ洗浄後、50 μl の PZM-5 ドロップ中に約 25 個ずつ移し、5 日間、38.5～39℃、5% CO2、5%
O2、90% N2 気相下で培養した。媒精後 2 日目および 5 日目に実体顕微鏡を用いて胚を観察し、2細胞期以降の胚および胚盤胞の割合を、卵割率および胚盤胞への発生率とした。

5） 胚盤胞の細胞数計測
媒精後 5 日目に胚盤胞へ発生した胚については、Yoshioka et al.（2008）の方法により乾燥標本を作製して細胞数を計測した。胚盤胞を低張液（0.9% (w/v)クエン酸ナトリウム、1% (v/v)ウシ胎児血清（HyClone, South Logan, UT, USA））で 10～15 分間処理後、固定液 I（メタノール：酢酸：蒸留10水＝10：3：7）に移し、スライドグラスに少量の固定液 I とともに 1 つずつ乗せ、ガラスキャピラリーピ
ペットを用いて割球を分散させた。風乾後、カルノア液（メタノール：酢酸＝3：1）の滴下と乾燥を 3 回繰り返し、2% (v/v)ギムザ染色液で 30 分間染色し、顕微鏡下で細胞数を計測した。

6） 透過型電子顕微鏡観察
卵母細胞および胚盤胞の透過型電子顕微鏡観察法は、Nagano et al.（1999）に従った。生殖腺
刺激ホルモンを培養開始後 20 時間含み、10 ng/ml TGF-を添加あるいは添加しない POM で 44
時間成熟培養をした COCs の卵丘細胞を除去して第 1 極体の放出を確認した DOs、および媒精後
5 日目の胚盤胞を、2.5% (v/v)リン酸緩衝グルタルアルデヒド液（pH 7.3）で 1 時間前固定した後、0.1 M リン酸緩衝液で 3 回洗浄し、1% (w/v)オスミウム酸－リン酸緩衝液で 1 時間後固定した。これらの DOs および胚盤胞をエタノールで段階的に脱水してエポキシ樹脂に包埋し、ミクロトーム（REICHERT-NISSEI ULTRACUT S, Leica, Wetzlar, Germany）を用いて準超薄切片を作製して、0.5% (w/v)トルイジンブルー（pH 7.5）で染色した。その後、準超薄切片を用いてウルトラミクロトー
ムで超薄切片を作製して、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で電子染色し、透過型電子顕微鏡（JEM-1210; JEOL, Tokyo, Japan）を用いて観察した。微細構造の観察には、卵母細胞の赤道面
および胚盤胞の内部細胞塊と栄養膜細胞を含む面の切片を用いた。

7） 胚盤胞の外科的移植
受胚豚として、ランドレース×大ヨークシャー交雑種 4 頭（6～7 ヶ月齢、体重 84～101 kg）を使用した。受胚豚の発情同期化法は、Yoshioka et al.（2003）に従った。黄体期のブタにジノプロストとして 15 mg のプロスタグランジン F2（PGF2）（パナセラン Hi; Meiji Seika Co. Ltd., Tokyo, Japan）
を 1 日 2 回、合計 5 回筋肉内注射して黄体退行を誘起した。5 回目の PGF2投与の 72 時間後、
hCG 1500 IU を筋肉内注射して排卵を誘起した。生殖腺刺激ホルモンと 10 ng/ml TGF-を添加して成熟培養した COCs を媒精し、5 日間の発生培養によって得られた胚盤胞を、1 頭あたり 20～
22 個ずつ、受胚豚の子宮へ外科的に移植した。移植後 20 日目に超音波診断装置（SSD-900;
Aloka Co. Ltd., Tokyo, Japan）により妊娠を確認した。妊娠したブタについて、妊娠期間、分娩率
11

および一腹あたりの産子数を記録した。

8） 統計処理
統計処理には、Statistical Analysis System（SAS Institute, Cary NC, USA）を使用した。多重比較検定としてTukey-KramerのHSD検定を行った。パーセント値および胚盤胞の総細胞数については、アークサイン変換および対数変換後、検定を行った。危険率5%未満の場合に、統計学的に有意な差があると判定した。

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3. 結果1） 卵成熟における生殖腺刺激ホルモンと TGF-の作用
生殖腺刺激ホルモンおよび TGF-が卵成熟に及ぼす作用を明らかにするため、eCG、hCG、および種々の濃度の TGF-を添加して COCs を成熟培養後、卵母細胞の核相を調べた。eCG と
hCG 無添加の場合、GVBD 卵および MII 卵の割合は、TGF-を 10 ng/ml 添加すると有意に増加した（P < 0.05）が、eCG と hCG を添加した場合では、GVBD 卵および MII 卵の割合に、TGF-添加による有意な変化は認められなかった（表 2-2）。また、eCG と hCG を添加した場合、eCG と
hCG 無添加の場合と比較して GVBD 卵および MII 卵の割合は有意に高かった（P < 0.05）。生殖腺刺激ホルモンが存在する場合、TGF-による卵母細胞の核成熟促進作用は見られなかったが、
TGF-を 10 ng/ml の濃度で添加すると他の濃度に比べて MII 卵の割合が最も高かった。したがって、以降の試験では TGF-を 10 ng/ml の濃度で使用した。

2） 成熟培養時の TGF-が受精および胚発生に及ぼす作用
eCG と hCG 存在下では、TGF-による卵母細胞の核成熟促進作用は見られなかったが、受精および胚発生に対する作用を調べるため、eCG と hCG、および 10 ng/ml TGF-を添加して成熟培養した COCs を媒精して発生培養した。その結果、精子侵入率、正常受精率および雄性前核形
成率、および卵割率に TGF-による影響は見られなかった（表 2-3、2-4）。しかし、胚盤胞の発生率
は、TGF-を添加すると無添加に比べて有意に高かった（P < 0.05）。胚盤胞の総細胞数は、
TGF-添加による差が見られなかった。

3） 成熟卵母細胞および胚盤胞の微細構造における TGF-の作用
eCG と hCG が存在する場合、TGF-を添加して成熟培養すると、卵母細胞の核成熟には影響しないが、受精後の胚盤胞への発生を促進した。TGF-が卵母細胞の細胞質成熟に関与し、微細構造にも影響している可能性が考えられることから、eCG と hCG を含む POM に 10 ng/ml TGF-を
添加あるいは無添加で成熟培養した成熟卵母細胞、および発生培養後の胚盤胞の電子顕微鏡観13

察を行った。その結果、TGF-無添加で成熟培養した卵母細胞では、不均質で電子密度の低い筋状の模様をもつ脂肪滴が見られた（図 2-1a）。これに対して、TGF-を添加して培養した卵母細胞
では、無添加に比べて均一な電子密度を有する脂肪滴が比較的多く存在していた（図 2-1b）。また、
TGF-を添加した場合、よく発達した小胞体に取り囲まれたミトコンドリアが、観察した 9 個中 3 個の卵母細胞で見られた（図 2-2b）。TGF-無添加の卵母細胞ではこのような像は観察されなかった（図 2-2a）。
TGF-無添加、または添加して成熟培養した COCs 由来の胚盤胞では、内細胞塊と栄養膜細胞に、円形、または楕円形のミトコンドリアが主に見られた。TGF-を添加して成熟培養した COCs 由来の胚盤胞の内細胞塊では、多数のクリステを有する伸長したミトコンドリアが観察した 10 個中 5個で見られた（図 2-3b）。これに対して、TGF-無添加で成熟培養した COCs 由来の胚盤胞の内細胞塊では、伸長したミトコンドリアは観察した 10 個中 2 個に見られたが、クリステは少数しか見られなかった（図 2-3a）。ミトコンドリアのヌアージュ（図 2-4）は、TGF-添加、または無添加で成熟培養した COCs 由来の胚盤胞の内細胞塊と栄養膜細胞で 10 個中 5 個、または 3 個に観察された。

4） 胚盤胞の産子への発生能
卵成熟時の TGF-は受精後の胚盤胞への発生を促進したが、この胚盤胞の正常性を確認する必要がある。そこで、eCG、hCG、および TGF-を添加して成熟培養後、発生培養して作出した胚
盤胞を、4 頭の受胚豚の子宮へ外科的に移植した。その結果、全頭が妊娠・分娩し、合計 29 頭の産子を得た（表 2-5）。一腹産子数の平均は 7.3±1.5 頭であった。妊娠期間および産子の平均生時
体重はいずれも正常範囲であり、全ての子豚は正常に成長した。

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4. 考察

本章において、成熟培地に生殖腺刺激ホルモンが存在しない場合、TGF-を添加すると卵母細胞の核成熟が促進されることを明らかにした。また、生殖腺刺激ホルモンを含む成熟培地に、
TGF-を添加すると、卵母細胞の核成熟率、媒精後の受精率および卵割率に差は認められなかっ
たが、胚盤胞への発生能が促進されることを明らかにした。
成熟培地に生殖腺刺激ホルモンが存在しない場合、10 ng/ml TGF-を添加すると卵母細胞の核成熟を促進した（表 2-2）。この結果は、TGF-がラット（Tsafriri et al., 1989）、マウス（Brucker etal., 1991）、ウシ（Kobayashi et al., 1994）、およびブタ（Coskun and Lin, 1994）の卵成熟を促進したという報告と一致していた。また、生殖腺刺激ホルモンも卵成熟を強力に促進したが、生殖腺刺激ホルモンが存在する場合、TGF-添加による更なる促進効果は認められなかった（表 2-2）。生体内において、卵成熟は生殖腺刺激ホルモンの刺激によって開始する。FSH 様の作用と LH 様の作用を併有する eCG と hCG は、培養下のブタの COCs において、卵母細胞の核成熟および卵丘膨化を促進する（Funahashi and Day, 1993）ことが示されており、本研究においても同様の結果が得られた。ブタ卵母細胞の体外成熟における生殖腺刺激ホルモン（LH および FSH）は、卵成熟、雄性
前核形成、および発生能の改良を指標として示される卵母細胞の品質を高める（Mattioli et al.,
1991; Sun et al., 2001）。LH は卵丘細胞と卵母細胞において顕著な応答を引き起こすが、これらの細胞にはほとんどあるいは全く LH レセプターが発現しておらず、直接は作用できない（Peng etal., 1991）。近年、EGF ファミリー分子が卵胞における LH 作用の潜在的なシグナル伝達物質であることが示された（Park et al., 2004; Conti et al., 2006）。特に、amphiregulin および epiregulin は、
LH あるいはその類似体である hCG によって急速に誘導され、排卵前の卵胞でオートクライン様およびパラクライン様に LH シグナルを伝達する作用をすると考えられている（Park et al., 2004;
Ashkenazi et al., 2005; Sekiguchi et al., 2004）。しかし、マウスやラットの卵巣において、LH の刺激は EGF と TGF-の発現を誘起しない（Sekiguchi et al., 2004; Hsieh et al., 2009）。このことは、マウスやラットにおいて EGF と TGF-は排卵時の卵胞における EGF レセプターの生理的な活性化因子ではないことを示唆している（Hsieh et al., 2009）。ブタの卵巣では LH の刺激が EGF や15

TGF-の発現を誘起するのかは明らかにされていない。一方、TGF-は卵成熟を誘起し、卵胞でのプロジェステロン産生を促進することから、LH の作用に類似しているという報告もある（Tsafriri etal., 1989）。したがって、本研究で成熟培地に添加した外因性の TGF-は、amphiregulin や
epiregulin のような EGF ファミリー分子の代わりに、LH のシグナル伝達物質として卵成熟を誘起する可能性も考えられた。また、eCG と hCG が存在する場合、卵成熟において TGF-添加による相加的あるいは相乗的な促進作用は認められなかったことから、TGF-は eCG と hCG と共通した機構で卵母細胞の核成熟を促進する可能性が示唆された。
一方、生殖腺刺激ホルモンの存在下で成熟培地に TGF-を添加すると、媒精後の胚盤胞への発生を促進した（表 2-4）。受精後の正常な胚発生には卵母細胞の核成熟だけでなく細胞質成熟が重要である（Eppig et al., 1994; Hyttel et al., 1997）。成熟培地への細胞成長因子の添加は、卵母細胞の細胞質成熟やその後の胚盤胞形成を促進することが、マウス（Fuente et al., 1999）、ネコ（Merlo et al., 2005）、ヒツジ（Guler et al., 2000）、ウシ（Kobayashi et al., 1994）、およびブタ（Abeydeera et al., 1998）で明らかになっている。ブタにおいて、EGF は卵母細胞や卵丘細胞におけるタンパク質合成のパターンを変え（Singh et al., 1997; Uhm et al., 2010）、卵母細胞の核成熟のみならず、雄性前核形成や胚盤胞への発生促進を指標とした細胞質成熟の両方を促進する（Ding and Foxcroft, 1994; Grupen et al., 1997b）ことから、TGF-もタンパク質合成に影響している可能性がある。また、EGF レセプターを介した経路により誘導されるステロイドホルモン（プロジェ
ステロン、テストステロン、およびエストラジオール）は、卵母細胞の成熟に重要な役割を果たす（Jamnongjit et al., 2005）。FSH の存在下で TGF-を添加して顆粒膜細胞を培養すると、プロジェ
ステロン産生が促進されると報告されている（Yeh et al., 1993）。プロジェステロンはブタ卵母細胞の細胞質成熟にも影響する（Yuan et al., 2016）ため、TGF-の添加によるステロイドホルモンの産
生が卵母細胞の細胞質成熟の促進に関与し、胚発生を促進した可能性も考えられた。
細胞質成熟には、胚発生に必要な各種 mRNA やタンパク質、栄養成分の蓄積（Watson, 2007）のほか、ミトコンドリア、脂肪滴、リボソーム、小胞体、表層顆粒、ゴルジ体などの細胞内小器官の局在や構造の変化も関与する（Ferreira et al., 2009; Cran, 1985）。本研究において、TGF-を添加して成熟培養した卵母細胞は、無添加で培養した卵母細胞に比べてより均一な電子密度の脂肪16滴を含んでいた（図 2-1）。脂肪滴はトリグリセリドやステロールエステルのような中性脂肪を蓄積しており（Brown, 2001）、エネルギー源として卵成熟、受精、および胚発生に重要な役割を果たすと考えられている（Brown, 2001; Kikuchi et al., 2002a）。電顕で観察される脂肪滴の電子密度は、ト
リグリセリドの不飽和度に応じて変化する（Abe et al., 1999）ため、脂肪滴の形態的な変化は、卵母細胞や胚のエネルギー状態に依存する可能性がある（Kikuchi et al., 2002a）。Cran（1985）は、
hCG 処理 0～20 時間後のブタ卵母細胞の脂肪滴は均一な電子密度であったが、50 時間後にはほとんどの脂肪滴が電子密度の低い筋状の模様を含む形態を呈したと報告している。一方、Kikuchi
et al.（2002a）は、体内あるいは培養下で成熟した卵母細胞では、均質な電子密度の脂肪滴とマー
ブル状の電子密度の脂肪滴が結合していたと報告している。卵母細胞の脂肪滴の高電子密度性は精子侵入直後に失われるが、前核形成後に回復する（Kikuchi et al., 2002a）。しかし、脂肪滴の電子密度は、体内で発生した前核形成卵子では完全に回復して均一であるのに対し、体外で発生した前核形成卵子では部分的にしか回復せず不均一であった（Kikuchi et al., 2002a）。このことか
ら、ブタ胚における不飽和脂肪酸の再蓄積は、その後の胚発生にとって重要なエネルギーとなることが推察される。本研究においては、TGF-を添加して体外成熟培養した卵母細胞は、TGF-無
添加で成熟培養した卵母細胞と比べてより均一な脂肪滴を含んでいた（図 2-1）。したがって、
TGF-を添加して成熟培養した卵母細胞における脂肪酸の蓄積が、媒精後の胚発生能に関与する可能性が考えられた。
また、TGF-を添加して成熟培養した卵母細胞において、一部のミトコンドリアは小胞体に囲まれていたが、この典型的な特徴は TGF-無添加で成熟培養した卵母細胞では観察されなかった（図2-2）。Cran（1985）は、体内で成熟したブタの卵母細胞では GVBD 後にミトコンドリアが小胞体に囲まれると報告しており、TGF-を添加して成熟培養した卵母細胞のミトコンドリア周囲の小胞体は、体内で成熟した卵母細胞の特徴に類似していた。このことから、TGF-が小胞体や脂肪滴といった細胞内小器官の構造を変化させ、卵母細胞の細胞質成熟を促進する可能性が推察された。
さらに、TGF-を添加して成熟培養した卵母細胞由来の胚盤胞では、TGF-無添加で培養した卵母細胞由来の胚盤胞に比べて、多数のクリステを含むミトコンドリア（図 2-3）とミトコンドリアのヌアージュ（図 2-4）が多く観察された。クリステの発達はミトコンドリアの活性を示す。Hyttel and17

Niemann（1990）は、体内で発生したブタの桑実胚と胚盤胞のミトコンドリアは糸状で、多くは管状のクリステを多数有すると報告している。TGF-を添加して成熟培養した卵母細胞由来の胚盤胞のミトコンドリアのクリステは平板状であったが、クリステが発達しているという点では、体内で発生した胚盤胞と類似していた。ミトコンドリアのヌアージュはリボ核タンパク質から成り、ミトコンドリアの複製に関与していると考えられている（Motta et al., 2000; Weakley, 1976）。このことから、TGF-
を添加して成熟培養した卵母細胞由来の胚では、ミトコンドリアの複製がより促進され、活性化していると推察された。これらの結果から、TGF-は卵母細胞の細胞内小器官の微細構造に影響し、細胞質成熟を促進することで、胚発生能を向上させる可能性が考えられた。
本研究では、受胚豚 1 頭あたり 20～22 個の胚を移植したところ、高い妊娠・分娩率（100%）が得られ、平均 7.3 頭の子豚を作出することに成功した。体外生産した胚の産子への発生能は、いくつかの研究グループによって報告されているが（Suzuki et al., 2006; Yoshioka et al., 2003;
Abeydeera et al., 2000; Marchal et al., 2001; Kikuchi et al., 2002b）、これらの既往研究では体外培養培地にブタ卵胞液、血清あるいは血清アルブミンのような未定義の動物由来成分が添加されている。本研究では、成分既知培地を用いた体外生産システムにより作出したブタ胚盤胞が、胚移植後に正常な産子への発生能を有することを明らかにした。
本章の結果から、TGF-は卵母細胞の核成熟およびその後の胚発生を促進することを明らかにした。また、TGF-は卵母細胞や胚の細胞内微細構造を変化させ、正常な胚発生に必要な卵母細胞の細胞質成熟を促進する可能性が推察された。

18

5. 小括

本章では、成分既知の成熟培地を用いて、TGF-がブタの卵成熟と胚発生に及ぼす影響について検討した。
成熟培地中に生殖腺刺激ホルモン（eCG, hCG）が存在しない場合、10 ng/ml TGF-を添加す
ると、無添加に比べて卵母細胞の核成熟率が増加した。成熟培地に生殖腺刺激ホルモンが存在す
る場合、TGF-を添加すると、卵母細胞の核成熟率、媒精後の受精率および卵割率に差は認められなかったが、胚盤胞への発生率は無添加に比べて増加した。電顕観察の結果、TGF-を添加して成熟培養した卵母細胞および媒精後の胚盤胞の細胞内小器官には形態的な変化が認められ、胚発生能に影響する可能性が示唆された。
以上の結果から、TGF-は卵母細胞の核成熟およびその後の胚発生を促進することを明らかにした。また、TGF-は卵母細胞や胚の細胞内微細構造を変化させ、卵母細胞の細胞質成熟を促進する可能性が推察された。

19

表 2-1 培地組成
組成
NaCl
KCl
KH2PO4MgSO4・7H2O
NaHCO3
Hepes
GlucoseNa-pyruvate
Ca-(lactate)2・5H2O
L-glutamine
Hypotaurine
L-Arginine・HCl
L-Cystine
L-Histidine
L-Isoleucine
L-Leucine
L-Lysine・HCl
L-Methionine
L-Phenylalanine
L-Threonine
L-Tryptophan
L-Tyrosine
L-Valine
L-Alanine
L-Asparagine・H2O
L-Aspartic Acid
L-Glutamic Acid
GlycineL-Proline
L-Serine
Theophylline
Adenosine
L-cysteine
Gentamicin
Polyvinyl alcohol
Phenol red
浸透圧(mOsm)*

POM
108.00 mM
10.00 mM
0.35 mM
0.40 mM
25.00 mM
4.00 mM
0.20 mM
2.00 mM
2.00 mM
5.00 mM
0.10 mM
0.05 mM
0.05 mM
0.20 mM
0.20 mM
0.20 mM
0.05 mM
0.10 mM
0.20 mM
0.02 mM
0.10 mM
0.20 mM
0.10 mM
0.10 mM
0.10 mM
0.10 mM
0.10 mM
0.10 mM
0.10 mM
0.60 mM
0.01 mg/ml
3.00 mg/ml
289 ± 1

PFM
108.00 mM
10.00 mM
0.35 mM
0.40 mM
25.00 mM
1.00 mM
0.20 mM
4.00 mM
2.50 mM
1.00 μM
0.25 μM
0.01 mg/ml
3.00 mg/ml
279 ± 1*

平均値±標準誤差を示す．

すべての培地は pH 7.3 に調整．

20

PZM-5
108.00 mM
10.00 mM
0.35 mM
0.40 mM
25.00 mM
0.20 mM
2.00 mM
2.00 mM
5.00 mM
0.10 mM
0.05 mM
0.05 mM
0.20 mM
0.20 mM
0.20 mM
0.05 mM
0.10 mM
0.20 mM
0.02 mM
0.10 mM
0.20 mM
0.10 mM
0.10 mM
0.10 mM
0.10 mM
0.10 mM
0.10 mM
0.10 mM
0.01 mg/ml
3.00 mg/ml
283 ± 1

POE-CM
108.00 mM
10.00 mM
0.35 mM
0.40 mM
5.00 mM
25.00 mM
0.20 mM
2.00 mM
0.01 mg/ml
3.00 mg/ml
2.00 μg/ml
268 ± 1

表 2-2 成熟培地への TGF-添加が卵母細胞の核成熟に及ぼす影響
生殖腺刺激ホルモン(eCG, hCG)
－

+

TGF-
(ng/ml)

卵母細胞数

GVBD (%)

MII (%)

084

15 (18.0 ± 2.5)a, A

5 (5.6 ± 3.0)a, A

1

101

28 (27.6 ± 4.5)ab, A

12 (12.0 ± 4.6)ab, A

1096

39 (40.2 ± 6.6)b, A

24 (24.2 ± 5.5)b, A

100

89

31 (33.9 ± 7.2)ab, A

9 (9.8 ± 3.1)ab, A

0106

89 (83.8 ± 4.3)B

80 (75.4 ± 3.9)B

1

106

96 (90.6 ± 3.0)B

89 (84.0 ± 3.6)B

10

106

94 (88.6 ± 3.7)B

90 (84.8 ± 4.0)B

100

106

93 (87.7 ± 2.9)B

85 (80.3 ± 6.0)B6回の繰り返し実験による平均値±標準誤差を示す．
a,b,A,B

同一列間の異なる文字間に有意差あり（P < 0.05）．

21

表 2-3 成熟培地への TGF-添加が受精率に及ぼす影響
卵子数

精子侵入
(%)

正常受精
(%)*

多精子受精
(%)*

雄性前核形成
(%)*

無添加

170

52
(30.4 ± 5.8)

46
(90.0 ± 4.8)

2
(4.1 ± 2.9)

47
(92.2 ± 4.8)

TGF-

172

81
(46.6 ± 6.2)

69
(86.8 ± 3.7)

4
(4.6 ± 2.8)

71
(89.2 ± 2.7)

9回の繰り返し実験による平均値±標準誤差を示す．
*

精子侵入卵子数あたりの割合．

22

表 2-4 成熟培地への TGF-添加が胚発生率に及ぼす影響
培養胚数

卵割胚数(%)

胚盤胞数(%)

胚盤胞の細胞数

無添加

299

148 (49.0 ± 4.8)

48 (15.9 ± 3.3)a54.8 ± 3.5

TGF-

293

162 (55.5 ± 3.5)

82 (28.1 ± 3.9)b58.4 ± 2.1

11回の繰り返し実験による平均値±標準誤差を示す．
a,b

同一列間の異なる文字間に有意差あり（P < 0.05）．

23

図 2-1 成熟培養後の卵母細胞における脂肪滴の電子顕微鏡写真
TGF-無添加(a)および添加(b)して成熟培養した卵母細胞．
矢印は脂肪滴を示す．スケールバー= 1 μm.

24図 2-2 成熟培養後の卵母細胞におけるミトコンドリアと小胞体の電子顕微鏡写真
TGF-無添加(a)および添加(b)して成熟培養した卵母細胞．
白矢印はミトコンドリア、黒矢印は小胞体を示す．スケールバー= 1 μm.

25図 2-3 胚盤胞におけるミトコンドリアの電子顕微鏡写真
TGF-無添加(a)および添加(b)して成熟培養した卵母細胞由来の胚盤胞．
白矢印は円形または楕円形のミトコンドリア、黒矢印は伸長したミトコンドリアを示す．スケールバー= 1 μm.

26図 2-4 胚盤胞におけるミトコンドリアヌアージュの電子顕微鏡写真
矢印はミトコンドリアヌアージュを示す．スケールバー= 1 μm.

27表 2-5 分娩成績
受胚豚

移植胚数

妊娠期間
（日）

産子数
（移植胚数あたり(%)）

性比
（雄：雌）

生時体重(kg)*
[範囲]

C39

22

114

5 (22.7)

3:2

1.05 ± 0.15
[0.75–1.50]

C40

20

116

6 (30.0)

3:3

1.01 ± 0.08
[0.90–1.25]

C43

21

115

8 (38.1)

7:1

1.03 ± 0.09
[0.70–1.35]

C44

20

115

10 (50.0)

6:4

1.15 ± 0.06
[0.80–1.50]

計*83

115.0 ± 0.5

29 (35.2 ± 6.7)

19:10

1.07 ± 0.04*

平均値±標準誤差を示す．

28

第3章 TGF-および FSH がブタ卵成熟と初期胚に及ぼす影響

1. 緒言

前章では、成熟培地に生殖腺刺激ホルモン（eCG、hCG）を添加してブタの COCs を培養すると、卵母細胞の核成熟を促進した。また、生殖腺刺激ホルモンが存在する場合、TGF-を添加すると、卵母細胞の核成熟、媒精後の受精率、および卵割率に差は認められなかったが、胚盤胞への発生能が促進されることを明らかにした。しかし、動物由来のホルモン製剤である eCG および hCG は、
FSH と LH が混在しており、純度にばらつきがあるため試験結果にも影響を及ぼす可能性がある（Zuelke and Brackett, 1990; Choi et al., 2001）うえ、FSH と LH、それぞれの作用が不明確である。
一方、リコンビナント生殖腺刺激ホルモン製剤は高純度でロット間の変動が少ない上、脳下垂体、血清、あるいは尿由来の製剤のように FSH と LH が相互混入することなく、個別の作用を調べることができる（Michle et al., 2003）。そこで、精製した FSH と LH を用いた卵成熟機構の解析が行われている。ブタの COCs は、LH 単独で添加した培地で培養しても卵丘細胞の cAMP 量は増加せず（Mattioli et al., 1994）、卵母細胞の核成熟を促進しない（Ye et al., 2005）。しかし、FSH 添加培地
で 20 時間培養後、LH を添加して培養すると COCs の cAMP 量が増加し、卵母細胞の核成熟やその後の胚発生を促進する（Shimada et al., 2003）。これは、FSH によって卵丘細胞の LH レセプターの発現が誘導されたためであることが示されている（Shimada et al., 2003）。
FSH は、卵丘・顆粒膜細胞での cAMP 産生量の増加と（Downs et al., 1988）、それに続いて起こる MAPK の活性化（Su et al., 2002; Liang et al., 2005）に関与し、卵母細胞の減数分裂の再開を誘起すると考えられているが、cAMP が MAPK を活性化するシグナル伝達機構の詳細はわかっていない（Zhang et al., 2009）。最近の知見で、FSH は PKA II や PKC 経路を介して MAPK を活性化している可能性が示唆された（Lu et al., 2001; Liang et al., 2005）。PKC は、EGF が誘導するブタの卵成熟にも関与している可能性が示されている（Coskun and Lin, 1995）が、EGF ファミリー
分子および FSH による卵成熟機構の関連性については明らかにされていない。
FSH や EGF は、COCs において卵成熟に加えて卵丘膨化を促進する（Downs, 1989）。卵丘膨29

化は、COCs の卵胞壁からの遊離と排卵、受精、胚発生において積極的な役割を担う（Chen et al.,1993）。膨化した卵丘細胞では、細胞外マトリックスの主成分であるヒアルロン酸（Salustri et al.,1989）が、hyaluronan and proteoglycan link protein 1（HAPLN1）（Neame and Barry, 1993）、
tumor necrosis factor alpha induced protein 6（TNFAIP6）（Mukhopadhyay et al., 2001）、および versican（VCAN）（Russell et al., 2003）といったヒアルロン酸結合タンパク質と結合し、特異的な機能的構造を組織化し、また安定化している。COCs の卵丘膨化に関わる hyaluronan synthase2（HAS2）（Eppig, 1979; Tirone et al., 1997）や TNFAIP6（Fȕlȍp et al., 1997; Yoshioka et al.,2000）等の細胞外マトリックスタンパク質遺伝子は、 FSH または amphiregulin、epiregulin、
betacellulin のような EGF ファミリー分子によって卵丘細胞で発現を誘導することができる。しかし、ブタの COCs において、ヒアルロン酸およびその結合タンパク質の遺伝子発現に及ぼす TGF-の影響についてはまだ報告がない。
本章では、TGF-および FSH が卵成熟に及ぼす影響とその作用機構の関連性を明らかにするとともに、動物由来成分を使用せずに効率良く卵成熟を誘起できる成分既知培地を開発するため、ブタ未成熟卵母細胞を成分既知培地である POM で培養し、卵成熟に対する TGF-の作用を、核
成熟、細胞質成熟、卵丘膨化、および胚発生のそれぞれについて調べ、卵成熟に対する FSH の作用と比較検討した。

30

2. 材料および方法

1） 成熟培養、媒精、および発生培養
COCs は、第 2 章 1）に準じて採取した。成熟培養の基礎培地には POM を用い、ホルモンおよびジブチリル cAMP（dbcAMP）を添加した場合は 20 時間まで、TGF-、EGF レセプター阻害剤、卵胞液を添加した場合は 44～48 時間まで添加して COCs を培養した。
凍結融解精液は 50%パーコール溶液に懸濁し、80%パーコール溶液に重層して、700 × g で
20 分間遠心した後、最下層の精子に PFM を加えて 500 × g で 5 分間の遠心による精子洗浄を2 回行った。成熟培養後の COCs は、精子濃度を 1 × 106 個/ml に調整した 100 μl のドロップに加えて 20 時間媒精した。媒精後の胚は、第 2 章 4）に記述した方法と同様に PZM-5 で 5 日間培養した。

2） 核成熟および受精の評価
卵母細胞の核成熟および媒精後の受精の評価は、第 2 章 2）および 3）に記述した方法で行った。

3） 卵丘膨化の評価
卵丘膨化の程度を評価するため、0，20，または 44 時間成熟培養をした COCs をそれぞれ 10
個ずつ位相差顕微鏡（BZ-8000; Keyence, Osaka, Japan）で観察し、それらの面積を ImageJ
1.46m（National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA）を用いて測定した。卵丘膨化の程度
は、成熟培養 0 時間の COCs の面積の平均に対するそれぞれの COCs の面積の割合により評価した。

4） RT-PCR
RNeasy mini kit（Qiagen, Valencia, CA, USA）を用いて 10 個の COCs から total RNA を抽出し、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit（Roche, Mannheim, Germany）およびランダムヘ31

キサマープライマーを用いて、total RNA 250 ng から一本鎖相補的 DNA（cDNA）を合成した。ネガ
ティブコントロールとして、total RNA または逆転写酵素を加えずに逆転写反応を行った。
リアルタイム定量 RT-PCR には、FastStart DNA Master SYBR Green I Kit（Roche）を用い、LightCycle® 2.0 system（Roche）で PCR を行った。PCR に用いたプライマー配列と予想される増幅産物のサイズ、および増幅した遺伝子の GenBank アセッション番号を表 3-1 に示す。逆転写された一本鎖 cDNA の一定量（2.5 μl）、3 mM MgCl2, 0.5 μM の各プライマーおよび 10%
LightCycler DNA master SYBR Green I（Roche）を含む 10 μl の反応液を調製し、PCR を行った。
PCR の反応条件を以下に示した：95℃10 分（1 cycle）；95℃10 秒、65℃5 秒（HAPLN1, ubiquitin[UBB]）、62℃10 秒（HAS2，TNFAIP6，VCAN）、72℃8 秒（HAPLN1）、または 72℃10 秒（HAS2，
VCAN，UBB）（45 cycle）。定量には、LightCycler ソフトウェア（Ver. 3; Roche）の 2nd derivative
maximum 法を用いた。目的遺伝子の mRNA 量は、UBB の増幅 DNA 量に対してノーマライズされた。各プライマーセットの特異性を、定量 PCR 反応後に 2%アガロースゲルを用いた PCR 産物の電気泳動と LightCycler ソフトウェアを用いた融解曲線の分析で確認した。

5） 実験デザイン（1） 卵母細胞の核成熟における TGF-および FSH の作用
COCs は、10 ng/ml TGF-を添加あるいは無添加の POM に、1 mM dbcAMP と 0，0.01，0.02，
0.05，および 0.1 IU/ml リコンビナントヒト FSH（Cat. No. IP-26-253P, RayBiotech Inc., Norcross,
GA, USA）を添加して 44 時間成熟培養した後、卵母細胞の核相を調べた。

（2） 卵成熟における TGF-および FSH が受精および胚発生に及ぼす作用
COCs は、dbcAMP と TGF-を添加した POM に、0，0.01，0.05，および 0.1 IU/ml FSH を添加
して 44 時間成熟培養した後、媒精を行い、一部の卵母細胞は受精状況を調べるとともに、残りはPZM-5 で培養し、胚盤胞への発生率および胚盤胞の細胞数を検討した。

（3） TGF-および FSH による卵母細胞の核成熟に及ぼす卵丘細胞の作用32

COCs、または COCs の卵丘細胞をガラスキャピラリーピペットで除去した DOs を、dbcAMP および、TGF-、0.05 IU/ml FSH の一方あるいは両方を添加した POM で 44 時間成熟培養した後、卵母細胞の核相を調べた。

（4） EGF 受容体阻害剤（AG1478）添加による卵母細胞の核成熟への影響
COCs は、dbcAMP および、TGF-、0.05 IU/ml FSH の一方あるいは両方を含む POM に、EGF
レセプター阻害剤（AG1478；Calbiochem, San Diego, CA, USA）を 10 μM の濃度で添加して 44
時間成熟培養した後、卵母細胞の核相を調べた。

（5） TGF-および FSH による卵母細胞の核成熟の経時的変化
COCs は、dbcAMP および TGF-を添加した POM に、0.05 IU/ml FSH を添加あるいは無添加
で 48 時間成熟培養した。培養開始後 20～48 時間目まで、4 時間間隔で卵母細胞の核相を調べた。

（6） COCs の卵丘膨化と関連遺伝子の発現における TGF-および FSH の作用
COCs は、dbcAMP および TGF-を添加した POM に、0.05 IU/ml FSH を添加あるいは無添加
で成熟培養し、培養開始後 0，20，および 44 時間目に卵丘膨化の面積を測定した。また、各培地で0，20，および 44 時間培養した COCs における HAS2，TNFAIP6，HAPLN1，および VCAN のmRNA 量は、定量 RT-PCR を用いて解析した。

（7） 成熟培養時の卵胞液の添加が卵成熟、受精、および胚発生に及ぼす作用
COCs は、dbcAMP、TGF-、および 0.05 IU/ml FSH を添加した POM に、10 %(v/v)ブタ卵胞液を添加あるいは無添加で培養した。卵胞液は胞状卵胞から吸引採取し、4℃で 1710 × g、30 分
間遠心して上清を回収し、実験に使用するまで-30℃で保存した。COCs は成熟培養あるいは体外受精後に、卵母細胞の核相および受精状況を調べるとともに、残りは PZM-5 で培養し、胚盤胞への発生率および胚盤胞の細胞数を検討した。
33

6） 統計処理
統計処理には、Statistical Analysis System（SAS Institute, Cary NC, USA）を使用した。多重比較検定としてTukey-KramerのHSD検定を行った。パーセント値および胚盤胞の総細胞数については、アークサイン変換および対数変換後、検定を行った。危険率5%未満の場合に、統計学的に有意な差があると判定した。

34

3. 結果1） 卵母細胞の核成熟における TGF-および FSH の作用
卵成熟に対する TGF-と FSH の作用を調べるため、種々の濃度の FSH を単独あるいはTGF-と同時に添加して COCs を成熟培養し、卵母細胞の核相を調べた。TGF-無添加の場合、
GVBD および MII 卵の割合は、0.01～0.1 IU/ml FSH を添加すると、FSH 無添加に比べて有意に高かった（P < 0.05; 表 3-2）。TGF-を 0.01～0.1 IU/ml FSH と共に添加すると、GVBD および MII
卵の割合は、TGF-を添加しなかった場合、または TGF-と FSH の両方を添加しなかった場合に比べて高かった（P < 0.05）。

2） 卵成熟における TGF-および FSH が受精および胚発生に及ぼす作用
成熟時の TGF-と FSH は卵母細胞の核成熟を相乗的に促進したが、受精および胚発生にも影響する可能性が考えられた。そこで、TGF-と種々の濃度の FSH を添加して成熟培養した COCs
を媒精して発生培養した。精子侵入率は、0.05 または 0.1 IU/ml FSH を添加して COCs を成熟培養すると、FSH 無添加の場合に比べて有意に高かった（P < 0.05; 表 3-3）。また、卵割率は、0.01～0.1 IU/ml FSH を添加して成熟培養すると、FSH 無添加の場合に比べて有意に高かった（P <0.05; 表 3-4）。胚盤胞の発生率は、0.05 および 0.1 IU/ml FSH を添加して COCs を成熟培養すると、FSH 無添加の場合に比べて有意に高かった（P < 0.05）。したがって、以降の試験では FSH を
0.05 IU/ml の濃度で使用した。

3） TGF-および FSH による卵母細胞の核成熟に及ぼす卵丘細胞の作用
TGF-と FSH は COCs の卵母細胞の核成熟を促進したが、これらの作用には卵丘細胞が関与している可能性が考えられた。そこで、TGF-および 0.05 IU/ml FSH を添加して COCs あるいはDOs を成熟培養し、卵母細胞の核相を調べた。TGF-あるいは FSH を添加して COCs を成熟培養すると、MII 卵の割合は、無添加の場合に比べて有意に高かった（P < 0.05; 図 3-1）。また、
TGF-と FSH の両方を添加して COCs を成熟培養すると、MII 卵の割合は、全ての処理区の中で35

最も高かった（P < 0.05）。しかし、DOs を成熟培養すると、TGF-および FSH は GVBD および MII卵の割合に影響を及ぼさなかった。

4） AG1478 添加による卵母細胞の核成熟への影響
TGF-と FSH は卵丘細胞を介して卵母細胞の核成熟を促進することを示したが、卵成熟における FSH の作用は、FSH によって発現が誘導される EGF ファミリー分子を介している可能性が考えられた。そこで、EGF レセプター阻害剤である AG1478 を添加して COCs を成熟培養した。
AG1478 は、TGF-のみ、FSH のみ、または TGF-と FSH の両方を添加して成熟培養した COCsの MII 卵の割合を低下させた（P < 0.05; 図 3-2）。しかし、FSH のみ、または TGF-と FSH の両方を添加して成熟培養した COCs の MII 卵の割合は、TGF-のみを添加して培養した場合に比べて高かった（P < 0.05）。

5） TGF-および FSH による卵母細胞の核成熟の経時的変化
AG1478 を添加すると、TGF-による卵母細胞の核成熟促進作用は完全に阻害されたが、FSHによる核成熟促進作用は完全には阻害されず、TGF-と FSH が一部は異なる経路で作用し、減数分裂の進行速度が異なる可能性が考えられた。そこで、TGF-および FSH により誘導される卵母細胞の核相の変化を、20～48 時間まで 4 時間毎に観察した。成熟培養後 24～48 時間の GVBD
卵の割合、および 36～48 時間の MII 卵の割合は、TGF-と FSH の両方を添加して培養すると、
TGF-のみを添加した場合に比べて高かった（P < 0.05; 図 3-3）。

6） COCs の卵丘膨化と関連遺伝子の発現における TGF-および FSH の作用
TGF-と FSH は、卵丘細胞を介して卵母細胞に作用することを示したが、卵丘細胞の膨化にも作用する可能性が考えられた。そこで、COCs の面積を計測するとともに、ヒアルロン酸やその結合タンパク質の mRNA 発現量の解析を行った。TGF-と FSH の添加は、成熟培養後 20 時間、および 44 時間では無添加で成熟培養した COCs に比べて、面積がそれぞれ 283%、および 916%に増加し、有意に卵丘膨化を促進した（P < 0.05; 図 3-4）。COCs における HAS2 mRNA の発現量は、
36

成熟培養後 20 時間で FSH、TGF-、あるいはその両方の添加により増加したが、培養 44 時間では低下した（P < 0.05; 図 3-5a）。TNFAIP6 mRNA の発現量は、変化は認められなかった（図3-5b）。COCs における HAPLN1 mRNA の発現量は、成熟培養後 20 時間で FSH と TGF-の両方を添加すると無添加に比べて増加し、培養 44 時間では 20 時間に比べてさらに増加した（P <0.05; 図 3-5c）。VCAN mRNA の発現は、成熟培養後 20 時間および 44 時間において、FSH を添加すると TGF-のみ添加した場合に比べて高かった（P < 0.05; 図 3-5d）。

7） 成熟培養時の卵胞液の添加が卵成熟、受精、および胚発生に及ぼす作用
成分既知成熟培地への TGF-と FSH の添加が、卵母細胞の核成熟、卵丘膨化、および胚発生の促進に有効であることを示したが、この培地への卵胞液添加の必要性を調べるため、成熟培地に卵胞液を添加して COCs を培養し、卵成熟、受精、および胚発生に及ぼす作用を検討した。成熟
培養時のブタ卵胞液の添加は、GVBD 卵および MII 卵の割合に影響を及ぼさなかった（図 3-6a）。
しかし、卵胞液を添加して成熟培養した卵母細胞では、卵胞液無添加に比べて正常受精率が低く、多精子受精率が高かった（P < 0.05; 図 3-6b）。また、卵胞液を添加して成熟培養した COCs 由来の胚では、卵胞液無添加で成熟培養した COCs 由来の胚と比較して、卵割率および胚盤胞の細胞数に差は認められなかったが、胚盤胞の発生率が減少した（P < 0.05; 図 3-6c）。

37

4. 考察

本章において、TGF-と FSH はブタ卵母細胞の核成熟および胚盤胞への発生を相乗的に促進することを明らかにした。TGF-と FSH による卵母細胞の核成熟促進作用は COCs に限られ、DOs では認められなかった。TGF-または FSH を添加して成熟培養した COCs では、AG1478 による卵母細胞の核成熟阻害作用、および卵丘膨化関連遺伝子の発現動態が異なることが判明した。
第 2 章において、eCG と hCG が存在しない場合、POM に TGF-を添加すると卵母細胞の核成熟を促進したが、eCG と hCG が存在する場合、卵母細胞の核成熟において TGF-添加による相加的あるいは相乗的な促進作用は認められなかったことから、TGF-は eCG と hCG と共通した機構で卵母細胞の核成熟を促進する可能性が推察された。そこで、TGF-と生殖腺刺激ホルモンの作用の関連性を明確にするため、卵母細胞の核成熟に対する TGF-と FSH の作用を調べたとこ
ろ、FSH は COCs の卵成熟を促進し、この効果は TGF-を添加するとさらに促進された（表 3-2）。
Uhm et al.（2010）は、ブタ卵母細胞の核成熟に関しては EGF と FSH の相乗効果は認められず、EGF と FSH の作用は機能的に類似していると報告している。一方、Ye et al.（2005）は、性成熟ブ
タ由来の卵母細胞では EGF あるいは FSH を単独で添加すると MII 卵の割合が約 80～90%であり、EGF と FSH による核成熟への相乗作用は認められないのに対し、春機発動前のブタ由来の卵母細胞では EGF あるいは FSH の単独の添加で MII 卵の割合は約 50%程度であり、EGF と FSH の両方を添加すると 90%以上が MII 期に達し、EGF と FSH が核成熟を相乗的に促進したと報告している。これは、春機発動前のブタ由来の卵母細胞は、性成熟ブタ由来の卵母細胞に比べて卵細胞質が発育途上で未熟であり（Ikeda and Takahashi, 2003）、核成熟に関しては FSH 等に対する反応性が低いためである可能性がある（Marchal et al., 2001）。本研究においても、春機発動前のブタ由来の卵母細胞を使用しており、TGF-と FSH は相乗的に卵母細胞の核成熟を促進した。したがって、ブタの卵母細胞の核成熟における TGF-と FSH の作用は完全に同じではないことが示された。
TGF-およびFSHは、COCsの卵母細胞の核成熟を促進したが、DOsの核成熟を促進しなかっ38

た（図3-1）。この結果は、TGF-（Coskun and Lin, 1994）およびFSH（Uhm et al., 2010）がCOCsにおいてのみ卵母細胞の核成熟を促進するという報告と一致していた。ブタでは、EGFレセプターは卵丘細胞に発現しており、卵母細胞には発現していない（Chen et al., 2008）ことから、EGFファミ
リー分子による卵母細胞の核成熟の促進には卵丘細胞が必須であると考えられた。一方、FSHレ
セプターは顆粒膜細胞と卵母細胞の両方に存在する（Méduri et al., 2002）。生殖腺刺激ホルモン
は、主に卵丘細胞におけるcAMP産生量の増加（Downs et al., 1988）と、それに続いて起こる
MAPKの活性化（Su et al., 2002; Liang et al., 2005）によって卵成熟を誘起する。MAPKキナーゼ
阻害剤は、COCsとDOsの卵母細胞のMAPKを阻害するが、COCsにおいてのみGVBDを阻害する（Fan et al., 2003）ことから、GVBDには卵母細胞ではなく卵丘細胞のMAPK活性が必要であると考えられている。これらの結果から、TGF-とFSHは卵丘細胞を介して卵母細胞の核成熟を促進することを明らかにした。
TGF-による卵母細胞の核成熟促進作用は、EGF レセプターのチロシンキナーゼ阻害剤である
AG1478 により完全に阻害された（図 3-2）。この結果から、TGF-も他の EGF ファミリー分子と同様に、EGF レセプターのチロシンキナーゼを活性化させることにより卵母細胞の核成熟を促進する
こ と が 確 認 で き た 。 マ ウ ス や ラ ッ ト の COCs に お い て 、 amphiregulin 、 epiregulin 、 お よ びbetacellulin を含む EGF ファミリー分子の発現は LH の刺激により誘導され（Park et al., 2004;
Ashkenazi et al., 2005; Sekiguchi et al., 2004）、LH の作用は AG1478 によって阻害されることか
ら、これらの EGF ファミリー分子は LH が誘起する卵成熟の仲介物質として作用すると考えられている（Park et al., 2004; Conti et al., 2006）。一方、FSH も卵丘・顆粒膜細胞で epiregulin（Sekiguchi et al., 2002）や amphiregulin（Shimada et al., 2006）の発現を誘導すると報告されており、これらの EGF ファミリー分子は FSH が誘起する卵成熟の仲介物質としても作用する可能性が示されている（Chen et al., 2008; Downs and Chen, 2008）。Uhm et al.（2010）と Chen et al.
（2008）は、ブタの COCs において、AG1478 が FSH により誘起される GVBD や卵丘膨化を完全に阻害することから、FSH が誘起する卵成熟には EGF ファミリー分子による EGF レセプターの活性化が関与すると報告している。しかし本研究において、AG1478 は FSH による卵成熟促進作用を抑制したものの、完全には阻害しなかった。この結果から、FSH は EGF レセプターのシグナル伝39

達経路とは別の経路にも作用することが示唆された。
成熟培地に TGF-と 0.05～0.1 IU/ml FSH を添加すると、TGF-のみを添加した場合に比べて、精子侵入率、胚盤胞形成率、および胚盤胞の総細胞数が増加した（表 3-3, 3-4）。また、成熟培地に TGF-と FSH を両方添加すると、TGF-のみを添加した場合に比べて、卵母細胞の減数分裂の進行は速かった（図 3-3）。卵母細胞が MII 期に達する時間は、媒精後の胚発生にも影響する。ブタにおいて、MII 期に達した直後の卵母細胞は、さらに 8 時間培養した卵母細胞に比べて、体外受精
後の胚発生能が低い（Grupen et al., 1997a）と報告されている。これは、MII 期に達した直後の卵母細胞では、紡錘体が未熟であり、細胞質成熟も不十分であるためと考えられる（Dominko andFirst, 1997）。FSH と EGF ファミリー分子が卵成熟を促進する細胞内メカニズムの関係は完全には明らかになっていない。たとえば、FSH および EGF は両方とも、結合したレセプターの下流のMAPK 経路を活性化する（Su et al., 2002; Conti et al., 2006）が、これらの経路が重複しているのか並行しているのかは特定されていない。FSH は卵丘細胞中の cAMP 量の増加により PKA I と
PKA II の両方を活性化する（Farin et al., 2007）。PKA I の活性化は卵母細胞の減数分裂の再開を抑制するが、卵丘細胞における PKA II の活性化は卵母細胞の GVBD を誘起するため、卵丘細胞における PKA II の活性化が FSH による卵母細胞の減数分裂再開の要因となる主要なサブタイプであると報告されている（Downs and Hunzicker-Dunn, 1995; Rodriguez et al., 2002; Newhall etal., 2006）。また、PKC の活性化も FSH が誘導する MAPK の活性化と卵成熟に関与している（Suet al., 1999; Lu et al., 2001）。PKA および PKC は、EGF レセプターのシグナル伝達経路を活性化することにより FSH の作用を調節している可能性がある（Zhang et al., 2009; Procházka et al.,2012）。一方、転写阻害剤は FSH による作用を阻害するが、EGF による作用は阻害しないことから、EGF ファミリー分子と FSH による MAPK 経路は直接相互接続していない可能性も示唆されている（Farin et al., 2007）。さらに、cAMP とは別のセカンドメッセンジャーであるサイクリックグアノシン 5’一リン酸（cGMP）もまた、生殖腺刺激ホルモンが誘起する哺乳類の卵成熟の調整に重要な役割を果たす（Lapolt et al., 2002; Zhang et al., 2007）。FSH は cGMP 依存性のプロテインキナーゼ（PKG）経路に関与し、MAPK 活性と卵成熟を調整している可能性もある。これらの結果から、
TGF-と FSH は部分的に異なるシグナル伝達経路を介して作用し、相乗的に減数分裂の進行速
40

度を速めて卵母細胞の成熟を促進することで、胚盤胞への発生や胚盤胞の総細胞数を向上させた可能性が示唆された。
TGF-とFSHは卵丘膨化を相乗的に促進した（図3-4）。生体内においてCOCsの卵丘膨化はLH
サージにより誘起されるが、培養下のブタCOCsにおいてはLHよりもFSHの方が卵丘膨化の促進効果が高いと報告されている（Singh et al., 1993）。卵丘に蓄積される細胞外マトリックスの主成分
はヒアルロン酸であり（Eppig, 1979）、FSHによる卵丘膨化は、卵丘細胞におけるcAMPの上昇と、HAS2の発現量の増加によるヒアルロン酸合成の増加により起こる（ Salustri, 2000）。また、
amphiregulinやepiregulinなどのEGFファミリー分子も卵丘膨化促進作用を示し、HAS2の発現を誘導する（Procházka et al., 2011; 2012）。本研究においても、TGF-あるいはFSHを添加するとHAS2の発現量が増加したが、TGF-とFSHによる相乗的な増加は認められなかった（図3-5a）。
卵丘膨化において細胞外マトリックスを組織化するためには、ヒアルロン酸がHAPLN1（Neameand Barry, 1993）、TNFAIP6（Fülöp et al., 1997）、あるいはVCAN（Russell et al., 2003）等のヒア
ルロン酸結合タンパク質と結合する必要がある。本研究では、HAPLN1の発現量はTGF-とFSHを両方添加すると相乗的に増加した（図3-5c）。一方、VCANの発現量はFSHが存在すると増加したが、TGF-の添加による増加は認められず（図3-5d）、TGF-とFSHによるVCANの発現動態は異なっていた。VCANは、N末端にリンクモジュールというヒアルロン酸結合ドメイン（LeBaron et al.,1992）を、C末端に細胞表面あるいはマトリックス分子に結合するレクチンリンクドメインを持つ（Miura et al., 1999; Olin et al., 2001）。HAPLN1とTNFAIP6は、ヒアルロン酸と、aggrecan（Neame and Barry, 1993; Parkar et al., 1998）、VCAN（Shi et al., 2004）、およびheavy chainsof inter--trypsin inhibitor（II）（Hirashima et al., 1997; Mukhopadhyay et al., 2001）のようなプ
ロテオグリカンの球状ドメインと相互作用し、細胞外マトリックスにおいて安定した三成分複合体を形成する。HAPLN1を成熟培地に添加すると、卵丘細胞外マトリックスにおいて、架橋結合したヒア
ルロン酸-II複合体を形成することによりCOCsの卵丘膨化を促進し、HAPLN1がCOCsのマトリックスの安定剤として重要な働きをすることが示唆されている（Sun et al., 2002）。これらの結果から、
TGF-とFSHはどちらもヒアルロン酸の合成を促進するが、TGF-とFSHにより発現が誘導された
ヒアルロン酸結合タンパク質とヒアルロン酸が結合することにより、細胞外マトリックスが組織化およ41

び安定化し、卵丘膨化が促進されたと推察される。
TGF-と FSH を含む POM への卵胞液を添加すると、多精子受精が増加し、胚盤胞への発生率が低下した（図 3-6）。ブタ卵母細胞の成熟培養においては、卵胞液を添加すると、核成熟、媒精後の正常受精率、および雄性前核形成（Naito et al., 1988; Yoshida et al., 1992）が促進されると報告されており、卵胞液は現行の体外成熟システムで一般に使用されている。卵胞液には細胞成長因子（Hammond, 1985; Hsu et al., 1987）、ステロイドホルモンおよび生殖腺刺激ホルモン（Ainsworth et al., 1980）のほか、様々な未知成分が含まれている。これらの濃度は卵胞の発育段
階によって変化する（Ainsworth et al., 1980; Bridges et al., 2002）ため、採取した卵胞のサイズによって卵成熟や胚発生における卵胞液の効果も変化する（Vatzias and Hagen, 1999; Algriany etal., 2004; Ito et al., 2008）。このように、卵胞液の使用は実験の再現性の低下を招くだけでなく、卵母細胞の栄養要求性の解明を困難にする（Petters and Wells, 1993）。本研究においては、TGF-
と FSH を含む成熟培地に卵胞液を添加すると、媒精後の胚発生においてむしろ悪影響を及ぼすことが明らかになり、細胞成長因子やホルモン濃度が過剰になった可能性も考えられた。この結果か
ら、新たに開発した成熟培地には卵胞液添加が必要ないことを示した。
本章では、成熟培地に TGF-と FSH を添加すると、COCs における卵母細胞の核成熟、卵丘膨化、および胚発生が相乗的に促進されることを明らかにした。一方、TGF-と FSH の核成熟促進効
果は、裸化卵子では認められなかった。また、COCs における AG1478 の影響とヒアルロン酸結合
タンパク質の mRNA 発現動態の違いから、FSH の卵成熟への作用は TGF-と異なることを明らかにした。したがって、TGF-と FSH は一部異なる作用機構により、卵丘細胞を介してブタ卵母細胞の成熟を促進することが示唆された。

42

5. 小括

本章では、成分既知の成熟培地を用いて、TGF-および FSH がブタの卵成熟と胚発生に及ぼす影響とそれぞれの作用機構の関連性について検討した。
TGF-と FSH は、卵母細胞の核成熟、卵丘膨化、および胚発生を相乗的に促進した。一方、
TGF-と FSH は、裸化卵母細胞の核成熟を促進しなかった。EGF レセプター阻害剤である
AG1478 は、TGF-による卵母細胞の核成熟促進作用を完全に阻害したが、FSH による作用を完
全には阻害しなかった。さらに、TGF-と FSH が誘導する卵丘膨化の関連遺伝子の発現動態は異なっていた。
以上の結果から、TGF-と FSH は卵丘細胞を介して、一部は異なる経路により卵母細胞の核成熟を促進することが示唆された。また、TGF-と FSH は卵母細胞の成熟および胚発生を相乗的に促進することを明らかにした。

43

表 3-1 定量 RT-PCR で用いられたプライマーの配列
遺伝子
HAS2

プライマーの配列(5’–3’)
F: ACCCAACTGGTCTTGTCCAA

増幅産物のサイズ(bp)

GenBank
アセッション番号260

AB050389

120

NM_001159607

163

NM_001004028

175

AB558520.1

248

NM_001105309

R: ACACTGCTGAGGAAGGAGATTNFAIP6

F: TACGACAGTTACGACGACGT
R: CACGGAAGCATCACTTAGGAHAPLN1

F: AGACCTTACCCTGGAGGATT
R: ACAAGCCTGCTGTGCTTCATVCAN

F: CTGCTACCCTACTGAAACGT
R: AAGTGCACCTACATAGCTCGUBBF: TGTTGGCGGTTTCGCTGTTG
R: AGTGCGGCCATCCTCCAGCT

44

表 3-2 成熟培地への TGF-および FSH 添加が卵母細胞の核成熟に及ぼす影響
TGF-
(ng/ml)

卵母細胞数

GVBD (%)

MII (%)0093

32 (34.4 ± 5.6)a21 (22.5 ± 5.5)a

0.01

0

91

69 (75.5 ± 3.3)b46 (50.4 ± 3.7)b

0.02

0

85

72 (84.1 ± 3.8)bc

50 (58.7 ± 2.6)b

0.05

0

89

79 (88.6 ± 3.5)bd

55 (61.5 ± 6.0)b

0.1

0

90

77 (85.5 ± 3.4)bc

56 (62.5 ± 5.7)b

0

10

87

65 (73.2 ± 5.3)b39 (43.7 ± 4.0)ab

0.01

10

86

82 (95.1 ± 2.4)cd

73 (84.5 ± 2.5)c

0.02

10

90

87 (96.6 ± 2.4)cd

81 (89.9 ± 1.5)c

0.05

10

85

84 (98.8 ± 1.2)d

73 (85.6 ± 2.7)c

0.1

10

87

83 (95.1 ± 2.7)cd

76 (86.6 ± 3.4)c

FSH (IU/ml)

6回の繰り返し実験による平均値±標準誤差を示す．
a-d

同一列間の異なる文字間に有意差あり（P < 0.05）．

45

表 3-3 成熟培地への TGF-および FSH 添加が受精率に及ぼす影響
FSH(IU/ml)

卵子
数

精子侵入
(%)

正常受精
(%)*

多精子受精
(%)*

雄性前核
形成(%)*

受精卵あたり
の精子数

0

131

86
(65.4 ± 4.9)a38(43.5 ± 6.8)

44
(51.8 ± 7.0)

78
(90.6 ± 3.1)

2.1 ± 0.3

0.01

130

106
(81.6 ± 3.4)ab64(59.1 ± 6.6)

40
(38.7 ± 6.2)

104
(97.8 ± 2.2)

1.6 ± 0.1

0.05

126

113
(89.7 ± 2.8)bc

69(60.5 ± 3.9)

43(38.4 ± 3.5)

110(97.1 ± 2.1)

1.5 ± 0.1

0.1

128

121
(94.4 ± 2.4)c74(60.8 ± 4.9)

47(39.2 ± 4.9)

119(98.2 ± 1.2)

1.6 ± 0.1

7回の繰り返し実験による平均値±標準誤差を示す．
*

精子侵入卵子数あたりの割合．

a-c

同一列間の異なる文字間に有意差あり（P < 0.05）．

46

表 3-4 成熟培地への TGF-および FSH 添加が胚発生率に及ぼす影響
培養胚数

卵割胚数(%)

胚盤胞数(%)

胚盤胞の細胞数0

175

68 (38.2 ± 5.0)a

12 (6.8 ± 2.4)a22.9 ± 2.4a

0.01

171

106 (62.0 ± 3.4)b28 (16.4 ± 3.0)ab

39.4 ± 3.2b

0.05

166

111 (66.9 ± 4.8)b

37 (22.5 ± 3.7)b36.4 ± 2.4b

0.1

168

115 (68.5 ± 4.3)b41 (24.4 ± 2.4)b

39.9 ± 2.5b

FSH (IU/ml)

7回の繰り返し実験による平均値±標準誤差を示す．
a,b

同一列間の異なる文字間に有意差あり（P < 0.05）．

47

d

100

c

c
b

80
MII

b
b

(%)

60

GVBD

40

20

a

a

a
a

a
a

a
a

0
None
無添加

FSH

TGF- FSH 無添加
None+
TGF-aa

FSH

TGF-  FSH+
TGF-

DOs

COCs

図 3-1 TGF-および FSH が卵丘-卵母細胞複合体（COCs）と裸化卵母細胞（DOs）の核成熟に及ぼす影響
8回の繰り返し実験による平均値±標準誤差を示す．
a-d

同一項目内の異なる文字間に有意差あり（P < 0.05）．

48

d

100

d
b
bc

80
MII

b

(%)

ac

ac

bc

60

c

a

c

GVBD

40
a
20

e

0
None
無添加

FSH

e

ae

TGF-  FSH 無添加
None+
TGF- e
FSH

TGF- FSH+
TGF- 

AG1478

図 3-2 AG1478 の添加が卵母細胞の核成熟に及ぼす影響
6回の繰り返し実験による平均値±標準誤差を示す．
a-e

同一項目内の異なる文字間に有意差あり（P < 0.05）．

49

a

*

100

*

*

*

*

*

(%)
GVBD
GVBD (%)

80
60
40

*

20
0
18202224262830323436384042444648
体外成熟時間(h)
IVM (h)

b
100

*

*

*

(%)
MII
MII (%)

80
60

*

40
20
0
18202224262830323436384042444648
IVM (h) (h)
体外成熟時間

図 3-3 TGF-を含む POM に FSH を添加（●）あるいは無添加（○）で成熟培養した
ときの GVBD 卵(a)および MII 卵(b)の割合の経時的変化
4回の繰り返し実験による平均値±標準誤差を示す．
*

処理間に有意差あり（P < 0.05）．

50体外成熟時間
図無添加
3-4 卵丘膨化に及ぼす
FSH
TGF-および
TGF- FSH の影響
FSH+ TGF-
図3-4 6回の繰り返し実験による平均値±標準誤差を示す．
同一培養時間内（a–c）あるいは同一処理区内（A–C）の異なる文字間に有意差あり（P < 0.05）．

51

b

c

d

mRNA 相対量mRNA 相対量a

体外成熟時間無添加

体外成熟時間FSH

TGF-

FSH+ TGF-

図 3-5 卵丘膨化関連遺伝子(a) HAS2, (b) TNFAIP6, (c) HAPLN1, および(d) VCAN のmRNA 発現における TGF-および FSH の作用
4回の繰り返し実験による平均値±標準誤差を示す．
同一培養時間内（a–c）あるいは同一処理区内（A–C）の異なる文字間に有意差あり（P < 0.05）．

52

a

b

c

図 3-6 成熟培地へのブタ卵胞液の添加（■）あるいは無添加（□）が卵母細胞の成熟(a)、受精(b)、および胚発生(c)に及ぼす影響
6回の繰り返し実験による平均値±標準誤差を示す．
a,b

同一項目内の異なる文字間に有意差あり（P < 0.05）．

53

第4章 グルコースおよびグリシンがブタ胚盤胞の発生に及ぼす影響

1. 緒言

前章では、効率良く卵成熟を誘起できる成分既知の成熟培地を開発することに成功し、FSH と
TGF-が卵成熟および胚発生に相乗的に作用することを明らかにした。一方、一般に体外生産胚は同時期の体内発育胚に比べて生存能力が低く（Machaty et al., 1998）、胚の生存性を高めて発生を進める未知の因子の存在が示唆されている。そこで、本章では、アミノ酸と糖質に焦点をあてて、この因子の同定を行った。
胚の栄養およびエネルギー要求性の変化は、胚性遺伝子の活性化、桑実胚のコンパクション、
胚盤胞の形成および拡張を含む生理学的・形態学的変化に関連している。これまでに、ピルビン酸、乳酸、グルコースが、1 細胞期の受精卵から胚盤胞期に至るまでの着床前胚の必須栄養素、または主要なエネルギー源として同定されている（Brinster, 1974; Brown and Whittingham, 1992）。培
養下のブタ胚の卵割初期において、培地へのピルビン酸と乳酸の添加は胚盤胞への発生を促進することが示唆されている（Kikuchi et al., 2002b; Karja et al., 2006）。一方、卵割初期に高濃度のグルコースが存在すると、ハムスター（Schini and Bavister, 1988）、マウス（Chatot et al., 1989）、ヒト（Conaghan et al., 1993）、ウシ（Takahashi and First, 1992）、およびブタ（Flood and Wiebold,1988）の胚発生に抑制的な影響があり、ブタでは、4 細胞期で胚発生が停止する（Ankrah andAppiah-Opong, 1999; Medvedev et al., 2004）。一方、グルコース代謝は桑実胚期に活性化して胚盤胞期まで活性が上昇し（Sturmey and Leese, 2003）、4 細胞期以降の高濃度のグルコースの存在は、胚盤胞への発生と胚の総細胞数を増加させる（Kikuchi et al., 2002b）。しかし、グルコー
スが胚盤胞期以降における胚発生や孵化に及ぼす作用については明らかにされていない。
発生培地へのアミノ酸の添加は、様々な動物種の胚発生を促進する（Gardner and Lane, 1993;
Bavister and Arlotto, 1990; Lee et al., 2004; Suzuki and Yoshioka, 2006）。アミノ酸は、胚のエネ
ルギー基質（Rieger, 1992; Partridge and Leese, 1996）や、pH 調整媒体（Baltz, 1993; Edwards
et al., 1998）、タンパク質やヌクレオチドの前駆物質（Epstein and Smith, 1973）、細胞内浸透圧調
54

節物質（Van Winkle and Campione, 1996; Dawson et al., 1998; Steeves et al., 2003; Tartia etal., 2009）として作用する。一部のアミノ酸は、血漿に比べて雌性生殖器や胚に大量に存在している（Schultz et al., 1981; Guérin et al., 1995）。特に、グリシンはマウス（Harris et al., 2005）、ウシ（Elhassan et al., 2001）、およびブタ（Iritani et al., 1974; Li et al., 2007）の卵管液と子宮液中に最も豊富に含まれるアミノ酸である。PZM-5 は、ブタ卵管液の無機イオン、エネルギー基質の組成を基にした体外発生用の成分既知培地であり、グルタミン、ハイポタウリン、イーグル基礎培地の 12
種類の必須アミノ酸とイーグル最少必須培地の 7 種類の非必須アミノ酸を含む。しかし、卵管液のアミノ酸濃度は時期によって異なり、発情後 3～5 日のブタの子宮液中のグリシン濃度、3.8～5.4
mM は、PZM-5 のグリシン濃度、0.1 mM に比べて 40～50 倍も高い（Li et al., 2007; Suzuki and
Yoshioka, 2006）。このことは、卵管および子宮での高濃度のグリシンの存在が、胚発生において何らかの役割を担う可能性を示している。マウスの胚盤胞では、グリシンは、セリンとアラニンに変換され、タンパク質や核酸のような高分子合成のエネルギー基質や前駆物質として利用される可能性が示されている（Hobbs and Kaye, 1985）。培養下において、ウシでは、グリシンが胚の発生と胚盤胞の細胞数を増加させる（Lee and Fukui, 1996; Takahashi and Kanagawa, 1998）。しかし、ブタの胚発生における高濃度のグリシンの作用は明らかにされていない。
本章では、体外で受精および発生させたブタ胚盤胞の発生に及ぼすグルコースとグリシンの影
響について、胚盤胞の生存性と孵化率、ATP 含量、直径、総細胞数およびアポトーシス細胞出現頻度を、成分既知培地である PZM-5 を用いて検討した。

55

2. 材料および方法

1） 成熟培養、媒精、および発生培養
第 2 章 1）に準じて採取した COCs は、10 IU/ml eCG、10 IU/ml hCG、および 1 mM dbcAMP を添加した POM で成熟培養開始 20 時間目まで培養し、その後 24 時間はホルモンと dbcAMP を添加しない POM で培養した。成熟培養後の COCs は、第 3 章 1）と同様の方法で媒精し、PZM-5 で5 日間胚を培養した。

2） アポトーシス細胞の検出
胚盤胞のアポトーシス細胞は、核染色とTUNEL（terminal deoxyribonucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP–digoxigenin nick end-labelling）法の同時染色により検出した。TUNEL法にはIn Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein（Roche Diagnostic, Indianapolis, IN, USA）を用いた。胚盤胞を、3 mg/ml PVA添加PBS（PBS-PVA）で3回洗浄した後、4% (w/v)パラホルムア
ルデヒドに浸漬し、4℃で一晩固定した。固定後の胚はPBS-PVAで3回洗浄し、PBSに希釈した
0.1% (v/v) Triton X-100で60分間透過処理を行った後、ブロッキング剤（1% (w/v)ウシ血清アルブ
ミン添加PBS）に浸漬し、4℃で一晩静置した。50 U/ml デオキシリボヌクレアーゼI（Promega,
Madison, WI, USA）で37℃、60分間処理した胚をポジティブコントロールとして用いた。胚をPBS-PVAで洗浄後、TUNEL反応混合液に浸漬し、37℃、遮光下で1時間反応させた。フルオレセ
イン-dUTPと反応させた胚をネガティブコントロールとした。これらの胚を、10 μg/mlヘキスト33342
で20分間対比染色した後、PBS-PVAで洗浄し、スライドグラスに乗せて抗退色剤（Slow Fade
Antifade Reagent; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）で封入して、蛍光顕微鏡（BZ-8000; Keyence）
で観察した。核の総数とTUNEL法により標識された核の数を計数し、核の総数に対するTUNEL法により標識された核の割合をアポトーシス指数と定義した。

3） 胚盤胞の直径の計測
胚盤胞の直径は、画像処理プロセッサ（ARGUS-10; Hamamatsu Photonics, Hamamatsu,
56

Japan）を装着した倒立顕微鏡（IMT-2; Olympus）を用いて、垂直に交わる2ヶ所を計測した平均値から算出した。

4） ATP 含量の測定
胚 盤 胞 の ATP 含 量 は、 ル シ フ ェ リ ン ・ ル シ フ ェラ ー ゼ 反 応 を 用 い た 測定 キ ッ ト （ ATPlite;
PerkinElmer, Groningen, The Netherlands）により測定した。胚盤胞を、POE-CM 中で 3 回洗浄し、1.5 ml チューブに入れた 50 μl PBS 中に１個ずつ移し、測定まで-30℃で保存した。ATP 含量の測定は、細胞溶解剤をそれぞれのチューブに 25 μl ずつ加えて 5 分間混合した後、試料 30 μl と基質液（ルシフェラーゼ／ルシフェリン）10 μl を 384 穴プレートのウェルに加えた。プレートを 5 分間振盪後、室温遮光下で 10 分間静置した。発光強度をルミノメーター （Wallac 1420 ARVO MX;
PerkinElmer）を用いて測定し、0～1000 nM ATP の検量線から ATP 含量を算出した。全ての標準液および試料は 2 回ずつ測定を行った。

5） 実験デザイン（1） グルコースが胚盤胞の生存性と孵化に及ぼす影響
グルコースを 0，2.5，5，および 10 mM 添加した PZM-5、50 μl で、媒精後 5 日目の胚盤胞を 12～15 個ずつ 48 時間培養した。媒精後 7 日目に胚を実体顕微鏡下で観察し、生存、部分孵化、または完全孵化した胚盤胞数を計数した。明瞭な胚盤胞腔を有する胚盤胞を生存胚盤胞とし、透明帯から脱出途上、または脱出した胚盤胞をそれぞれ部分孵化、または完全孵化胚盤胞とした。

（2） グリシンが胚盤胞の生存性と孵化に及ぼす影響
5mM グルコース添加あるいは無添加の PZM-5 に、グリシンを 0，5，10，および 20 mM 添加した PZM-5、50 μl で、媒精後 5 日目の胚盤胞を 12～15 個ずつ 48 時間培養した。媒精後 7 日目に胚を実体顕微鏡下で観察し、生存、部分孵化、または完全孵化した胚盤胞数を計数した。

（3） 胚盤胞の生存性と孵化に及ぼすグルコースおよびグリシンの相乗作用
57

PZM-5 および 5 mM グルコース、10 mM グリシンの一方あるいは両方を添加した PZM-5 で、媒精後 5 日目の胚盤胞を 3 日間培養した。媒精後 6～8 日目に胚を実体顕微鏡下で観察し、生存、部
分孵化、または完全孵化した胚盤胞数を計数した。また、媒精後 8 日目の生存胚盤胞の総細胞数を、第 2 章 5）に記述した方法で計数した。

（4） 胚盤胞の直径と ATP 含量に及ぼすグルコースおよびグリシンの影響
PZM-5 および 5 mM グルコース、10 mM グリシンの一方あるいは両方を添加した PZM-5 で、媒精後 5 日目の胚盤胞を 24 時間培養した。媒精後 6 日目の胚盤胞は、直径を測定後、ATP 含量の測定に使用した。

（5） 胚盤胞の細胞数とアポトーシス指数に及ぼすグルコースおよびグリシンの影響
PZM-5 および 5 mM グルコース、10 mM グリシンの一方あるいは両方を添加した PZM-5 で、媒精後 5 日目の胚盤胞を 24 時間培養した。媒精後 6 日目の胚盤胞は、TUNEL 法を用いた同時染
色により総細胞数とアポトーシス細胞数を測定した。

6） 統計処理
統計処理にはStatView ver. 5.0（Abacus Concepts, Berkeley, CA, USA）を使用した。多重比較検定としてTukey-KramerのHSD検定を行った。パーセント値および胚盤胞の総細胞数は、アーク
サイン変換および対数変換して検定を行った。危険率5%未満の場合は、統計学的に有意な差があると判定した。

58

3.

結果

1） 受精率および胚発生率
本章における受精率は 60.6%であり、正常受精率は 44.8%、多精子受精率は 14.0%だった。計11169 個の胚を PZM-5 で培養したところ、媒精後 2 日目に卵割した胚数は 6029 個（54.0%）で、媒精後 5 日目に胚盤胞に達した胚数は、2294 個（20.5%）であった。

2） グルコースの濃度が胚盤胞の生存性と孵化に及ぼす影響
グルコース 2.5～10 mM を添加した PZM-5 で 2 日間培養した胚盤胞の生存率は、無添加で培養した胚盤胞に比べて有意に高かった（図 4-1）。特に、グルコースを 5 mM の濃度で添加した時に、胚盤胞の生存率が最も高くなった。しかし、部分孵化および完全孵化胚盤胞の割合（孵化率）にグルコース無添加で発生培養した胚盤胞との差は認められなかった。この結果から、胚盤胞の生存に有効なグルコースの濃度は 5 mM であると判断し、以降の試験でのグルコース添加濃度は 5 mM を用いた。

3） グリシンの濃度が胚盤胞の生存性と孵化に及ぼす影響
グルコース無添加の PZM-5 で発生培養した胚盤胞では、添加したグリシンの濃度によらず生存率および孵化率に差は認められなかった（図4-2a）。グルコースを添加した場合、5 mM または 10 mM グリシンを添加して発生培養した胚盤胞の孵化率は、グリシン無添加の場合に比べて有意に高かった（P < 0.05; 図4-2b）。特に、グリシンを 10 mM の濃度で添加した時に、胚盤胞の孵化率が最も高くなり、胚盤胞の孵化に有効なグリシンの濃度は 10 mM であると判断し、以降の試験でのグリシン添加濃度は 10 mM を用いた。

4） 胚盤胞の生存性と孵化におけるグルコースおよびグリシンの相乗作用
グルコースとグリシンの両方を添加した PZM-5 で培養した胚盤胞の孵化率は、無添加またはどちらか一方だけを添加した場合と比べて有意に高く（P < 0.05; 図 4-3）、媒精後 7 日目および 8 日目の胚盤胞の完全孵化率が有意に高かった（P < 0.05）。媒精後 8 日目の胚盤胞の生存率は、グルコースを添
59

加して培養すると、無添加に比べて有意に高かった（P < 0.05; 図 4-3d）が、グルコースとグリシンの相乗作用は認められなかった。媒精後8 日目の生存胚盤胞の総細胞数は、グルコースとグリシンの両方を添加して培養すると、無添加あるいはグリシンのみ添加して培養した胚盤胞に比べて有意に多かった（P <0.05）。

5） 胚盤胞の直径と ATP 含量に及ぼすグルコースおよびグリシンの影響
グルコースとグリシンの両方を添加した PZM-5で1日間発生培養した胚盤胞の直径は、無添加で培養した胚盤胞に比べて有意に大きかった（P < 0.05; 表 4-1）。グルコースを添加して培養した胚盤胞の ATP 含
量は、グリシンの有無に関わらず、グルコース無添加で培養した胚盤胞に比べて有意に多かった（P <0.05）。

6） 胚盤胞の細胞数とアポトーシス指数に及ぼすグルコースおよびグリシンの影響
グルコースとグリシンの両方を添加した PZM-5 で 1 日間発生培養した胚盤胞の総細胞数は、無添加あるいはグリシンのみ添加して培養した胚盤胞に比べて有意に多かった（P < 0.05; 表 4-2）。また、グルコー
スとグリシンの両方を添加して培養した胚盤胞のアポトーシス指数は、無添加あるいはグリシンのみの添加に比べて有意に低かった（P < 0.05）。

60

4. 考察本章では、PZM-5 にグルコースを添加すると、胚盤胞の生存性が向上することを明らかにした。
さらに、グルコースとグリシンは相乗的に胚盤胞の孵化を促進するとともに、胚盤胞の直径および総細胞数を増加させ、アポトーシス指数により評価される胚盤胞の品質を改善することを明らかにした。
PZM-5 にグルコースを添加して胚盤胞を培養すると胚盤胞の生存率および ATP 含量が増加したが、グリシンを添加して胚盤胞を培養しても胚盤胞の生存率および ATP 含量に変化は見られなかった（図 4-1, 4-2, 表 4-1）。PZM-5 にはエネルギー基質としてピルビン酸と乳酸が含まれており、グルコースは含まれていない（Yoshioka et al., 2008）。ピルビン酸と乳酸はブタの卵割初期胚において重要なエネルギー源であり（Wright, 1977; Davis and Day, 1978）、受精後の胚を PZM-5 で培養することで胚盤胞まで発生させることができる。しかし、ピルビン酸と乳酸を含む発生培地で終始ブタ胚を培養した場合に比べて、媒精後 2 日（4 細胞期）以降にグルコースを含む培地で培養すると、胚盤胞への発生および胚盤胞の総細胞数が増加する（Kikuchi et al., 2002b; Karja et al., 2004）。
逆に、媒精後 2 日まで発生培地中にグルコースが存在すると胚盤胞への発生が阻害され、胚盤胞の総細胞数が減少する（Karja et al., 2006）。ブタ胚では、グルコース代謝の最初の増加は、発生制御が母性因子から胚性遺伝子の活性化へと切り替わる 4 細胞期に起こるとされている（Telford
et al., 1990; Rieger, 1992）。一方、ブタ胚におけるグルコースの代謝量は、卵割初期では低く、桑実胚期で増加し、胚盤胞期にピークに達する（Flood and Wiebold, 1988; Sturmey and Leese,
2003）。8 細胞期から胚盤胞期のブタ胚におけるグルコース代謝は主に解糖系を通して行われる（Flood and Wiebold, 1988）。胚盤胞の内部細胞塊では、細胞内へグルコースを輸送するグルコーストランスポーター、Glut1 および Glut3 の発現が高いため、グルコースの取り込み能が高く、解糖系の代謝流束が高い（Leese and Barton, 1984; Pantaleon and Kaye, 1998）。また、胚盤胞では解糖系だけでなく、酸素消費量が増加し、ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化の活性が高まる（Brinster, 1974）。解糖系と酸化的リン酸化では、1 分子のグルコースからそれぞれ 2 分子と 36 分
子の ATP が生成される。ATP は活発に代謝を行っている細胞に存在し、その濃度は細胞がネクロ
61

ーシスまたはアポトーシスを起こした時に急速に減少するため、細胞の生存性の目印となる。また、
ATP 産生の増加は、エネルギー要求性の増加と一致しており（MacPhee et al., 1994）、胚盤胞形
成とその後の胚発生では、タンパク質合成量が増加し（Thompson et al., 1998）、胚盤胞腔を形成する Na+-K+ ATPase 活性が増加する（Watson, 1992）ため、多量のエネルギーを必要とすると考えられる。胚盤胞期においてグルコースの要求性および代謝能が高まったため、グルコースを添加して培養することで胚盤胞の生存性と ATP 含量が増加したと考えられる。一方、グリシンはグルタチオンの前駆体であり、酸化還元電位の維持やエネルギー代謝に関与するが、本研究においてグリシンの添加は ATP 含量には影響しなかった。したがって、ブタ胚盤胞の主要なエネルギー源はグル
コースであることが示された。
本研究では、PZM-5 にグルコースとグリシンを添加して胚盤胞を培養すると、無添加の場合と比較して、胚盤胞の直径、総細胞数、および孵化率が増加することを明らかにした（図 4-2, 4-3, 表
4-1, 4-2）。グリシンは、ブタの卵管液と子宮液中のアミノ酸で最も多く含まれており、発情後 3～5 日のブタの子宮液中には 3.8～5.4 mM の濃度で含まれている（Li et al., 2007）。ブタ胚を卵管細胞と共培養した場合、1 mM または 5 mM のグリシンを添加すると、卵割率および 8～16 細胞期への発生が向上する（Xia et al., 1995）。また、ウシでは、発生培地に 10 mM のグリシンを添加して胚を培養すると胚盤胞への発生を促進し（Moore and Bondioli, 1993; Lee and Fukui, 1996）、胚盤胞あたりの総細胞数が増加する（Takahashi and Kanagawa, 1998）と報告されている。本研究で使用した PZM-5 には、グルタミンの他、Eagle（1959）が考案した濃度の 12 種類の必須アミノ酸と 7 種類の非必須アミノ酸の全 20 種類の-アミノ酸が含まれているが、これらのアミノ酸濃度は線維芽細胞の培養に適した濃度であり、胚に適した濃度ではないと考えられる。実際に、PZM-5 中のグリシン
濃度は 0.1 mM（Suzuki and Yoshioka, 2006）と子宮液の濃度に比べて低い。これらの結果から、高濃度（10 mM）のグリシンを添加することによって、正常な胚発生や孵化に適したグリシン濃度になったと推察された。また、マウスの胚盤胞において、グリシンはセリン（5%）とアラニン（17%）に変換され、タンパク質や核酸といった高分子合成の前駆物質として利用される可能性が示されている（Hobbs and Kaye, 1985）。したがって、グリシンを添加することで、グリシン以外のアミノ酸濃度が適正化されるとともに、タンパク質や核酸などの合成に利用され、胚盤胞の細胞数が増加し、孵化62

が促進された可能性が考えられた。
本研究では、PZM-5 にグルコースとグリシンを添加して胚盤胞を培養すると、無添加と比較して、胚盤胞の総細胞数が増加し、アポトーシス細胞の出現頻度が減少することを明らかにした（表 4-2）。
アポトーシス細胞の出現頻度は、胚の品質の指標として役立つ（Opiela, 2009）。アポトーシスは、正常な胚発生の過程において自然に起こり、損傷細胞や異常細胞あるいは発生不能な細胞を除去することによって胚盤胞における細胞の品質を維持している。生体内で発生した胚盤胞におけるアポトーシス細胞の出現頻度は、体外生産胚より有意に少ないと報告されている（Long et al.,
1998; Bryla et al., 2009）。グリシンは、類洞内皮細胞においてアポトーシスによる細胞死から防御する働きをする（Zhang et al., 2000）ことから、本研究においてもグリシンが胚盤胞のアポトーシスを抑制した可能性がある。また、活性酸素種は脂質の過酸化による細胞膜への障害（Aitken et al.,1989 ） や DNA の 損 傷 （ Halliwell and Aruoma, 1991 ） を 引 き 起 こ し 、 胚 発 生 を 阻 害 す る（Nasr-Esfahani et al., 1990）が、グルタチオンが抗酸化作用により活性酸素種から細胞を保護する役割を担う（Kosower and Kosower, 1978）。グリシンはグルタチオンの前駆物質であり、グルタ
チオンの産生に関与する（Griffith, 1999）ことから、グリシンを添加することにより酸化ストレスから胚が保護された可能性も考えられた。
一方、グルコースが存在しない場合、グリシンはアポトーシス細胞の出現頻度を抑制せず、胚盤胞の発生も促進しなかった（図 4-2, 4-3, 表 4-2）。エネルギー源であるグルコースが培地中に存在する場合のみ、グリシンの効果が発揮された可能性がある。また、PZM-5 にグルコースとグリシンを添加すると、培地の浸透圧は約 300 mOsm となり、元の PZM-5 の浸透圧 283～284 mOsm（表2-1, Yoshioka et al., 2008）に比べて高くなった。培地の浸透圧は、胚発生において重要な要因の一つである。ブタ卵管液および子宮液の浸透圧は 293～321 mOsm（Li et al., 2007）で、PZM-5 と比較して高い。生体内において高浸透圧でも胚が生存できる理由として、グリシンやグルタミンのようなアミノ酸が浸透圧調節物質として作用し、胚を保護していると考えられている（Dawson andBaltz, 1997; Biggers et al., 1993）。マウスでは、1 細胞期および 2 細胞期胚をグリシン添加培地で培養すると、グリシンが外部の高浸透圧から胚を保護し、正常な細胞体積の維持に寄与する（Dawson et al., 1998; Steeves et al., 2003; Tartia et al., 2009）。これらの結果から、グルコース63

存在下の高濃度のグリシンは、胚盤胞の細胞内浸透圧調節物質として機能し、細胞の収縮を妨げるとともに、培地の高浸透圧ストレスから胚を保護している可能性が考えられた。
本章では、媒精後 5 日目以降、グルコースとグリシンを添加した PZM-5 で胚盤胞を培養すると、胚盤胞の発生および生存細胞数を指標とした胚の品質が相乗的に向上することを明らかにした。
PZM-5 に 5 mM グルコースと 10 mM グリシンを添加した発生培地は、porcine blastocyst medium（PBM）と命名した。

64

5.

小括

本章では、グルコースとグリシンがブタ胚盤胞の生存性と孵化、ATP 含量、直径、総細胞数、およびアポトーシス細胞の出現頻度に及ぼす影響を検討した。
成分既知の発生培地である PZM-5 にグルコースを添加して媒精後 5 日目の胚盤胞を培養したところ、胚盤胞の生存率および ATP 含量は、無添加に比べて増加した。また、PZM-5 にグルコースとグリシンを添加して胚盤胞を培養したところ、無添加で培養した胚盤胞に比べて、胚盤胞の孵化率、直径および総細胞数が増加し、アポトーシス出現頻度は低下した。
以上の結果から、グルコースとグリシンは相乗的にブタ胚盤胞の発生を促進し、胚盤胞における生存細胞数を指標とした胚の品質を改善することが示唆された。

65

孵化率 (%)

生存率 (%)

グルコース (mM)

図 4-1 胚盤胞の生存率および孵化率におけるグルコースの作用
データは 6 回の繰り返し実験による平均値と標準誤差を示す.
同一項目内の異なる文字間に有意差あり（P < 0.05）.

66

生存率 (%)

孵化率 (%)

グルコース無添加

グリシン (mM)

孵化率 (%)

生存率 (%)

グルコース添加グリシン (mM)

図 4-2 胚盤胞の生存率および孵化率におけるグリシンの作用(a) グルコース無添加，(b) グルコース添加 PZM-5
データは 6～7 回の繰り返し実験による平均値と標準誤差を示す.
同一項目内の異なる文字間に有意差あり（P < 0.05).

67

媒精後 6 日目

無添加

グルコース

グリシン

完全孵化率 (%)

孵化率 (%)

孵化率 (%)

完全孵化率 (%)

媒精後 7 日目

無添加

グルコース
+
グリシン

グルコース

グリシン

グルコース
+
グリシン

グルコース
+
グリシン

胚盤胞の総細胞数

生存率 (%)

孵化率 (%)

無添加

グリシン

媒精後 8 日目

完全孵化率 (%)

媒精後 8 日目

グルコース

無添加

グルコース

グリシン

グルコース
+
グリシン

図 4-3 胚盤胞の生存率および孵化率におけるグルコースおよびグリシンの作用
データは 7 回の繰り返し実験による平均値と標準誤差を示す．
同一項目内の異なる文字間に有意差あり（P < 0.05）．

68

表 4-1 胚盤胞の直径と ATP 含量におけるグルコースおよびグリシンの作用

処理区

供試胚数

胚盤胞の直径(μm)

胚盤胞の ATP 含量(pmol/embryo)

無添加

60

167.9 ± 32.2a

0.273 ± 0.260a

グルコース

60

171.6 ± 33.7ab

0.635 ± 0.375b

グリシン

60

180.6 ± 34.5ab

0.251 ± 0.185a

グルコース＋グリシン

60

187.7 ± 41.5b

0.680 ± 0.437b

4回の繰り返し実験による平均値±標準誤差を示す．
a,b

同一列間の異なる文字間に有意差あり（P < 0.05）．

69

表 4-2 胚盤胞の総細胞数とアポトーシス指数におけるグルコースおよびグリシンの作用
処理区

供試胚数

胚盤胞の細胞数

アポトーシス指数(%)

無添加

20

39.8 ± 19.0a

15.7 ± 8.4a

グルコース

20

48.0 ± 20.2ab

12.4 ± 9.2ab

グリシン

20

37.9 ± 18.6a

16.8 ± 10.4a

グルコース＋グリシン

2058.6 ± 21.2b

7.0 ± 4.2b

2回の繰り返し実験による平均値±標準誤差を示す．
a,b

同一列間の異なる文字間に有意差あり（P < 0.05）．

70

第5章 成分既知ガラス化保存液を用いたブタ胚のガラス化保存

1. 緒言

ブタ胚の有効利用には、胚移植における時間的・地理的制約を無くすことができる超低温保存技術が重要である。ブタ胚の超低温保存技術は、畜産現場への胚移植の普及に貢献し、種豚更新にかかる費用を大幅に削減できるうえ、感染症防止および清浄化に貢献するほか、優良な遺伝子資源の長期保存が可能となる。一方、体外生産胚の超低温保存は、体内発育胚に比べると難しく（Greve and Callesen, 2004）、これは培養条件が不適切であることが要因であると考えられる。超低 温 保 存 後 の ブ タ 胚 の 生 存 性 に は 、 胚 の 発 生 ス テ ー ジ （ Nagashima et al., 1989; 1992;
Dobrinsky, 2001）、胚日齢（Dobrinsky and Johnson, 1994）、培養培地（Men et al., 2005）、凍結保存液の組成（Berthelot et al., 2000; Dobrinsky, 1997）をはじめ、様々な要因が影響する。たとえば、発生培地に血清を添加してブタ胚を培養すると、胚盤胞の細胞数が増加し、ガラス化保存後の生存性が向上したと報告されている（Men et al., 2005）。また、孵化直前または孵化後の胚盤胞は耐凍性が比較的高く、緩慢凍結法による保存が可能である（Berthelot et al., 2003）が、桑実胚や初期胚盤胞は緩慢凍結では生存できない（Dobrinsky, 1997）。そこで現在、ブタ胚の有効な超低温保存法として高濃度の凍結保護物質とともに急速に凍結するガラス化保存法が利用されているが、依然として体外生産胚の耐凍性は低く、耐凍性を向上させる培養条件は明らかにされていない。
また、ブタ胚のガラス化保存および加温に用いる基本液は、一般に高濃度の血清あるいは血清成分を含んでおり、これらは凍結時の細胞膜を保護している可能性がある（Leibo, 1988）。しかし、総説でも述べたように、未知の因子を多く含み、病気の伝染を媒介する可能性が指摘されている（Thibier and Nibart, 1987; Wrathall, 1995; Guérin et al., 1997）。したがって、成分既知のガラス化保存液の使用は、これらの問題を軽減し、さらには結果の信頼性と再現性を改善するものと期待されている（Sanchez-Osorio et al., 2010）。Misumi et al.（2013）は最近、PZM-5 を基本液とした
凍結液を用いて胚をガラス化保存し、子豚の作出に初めて成功した。しかし、Misumi et al.（2013）
は、体内発育胚を用いており、体外生産胚を成分既知のガラス化液で保存後に子豚を得たという71

報告はない。
本章では、第 4 章で開発した成分既知の発生培地 PBM をガラス化保存および加温に用いる基本液とし、胚の発生培地（PZM-5 または PBM）、胚の発生ステージ（胚盤胞または拡張胚盤胞）、お
よび培養日数（媒精後 5 日または 6 日の発生培養）の違いが、胚のガラス化保存後の生存性に及ぼす影響について検討した。さらに、成分既知のガラス化保存液と加温液を用いて作製したガラス
化保存・加温胚の正常性を調べるため、胚移植を行い、産子への発育能を調べた。

72

2. 材料および方法

1） 成熟培養、媒精および発生培養
第 2 章 1）に準じて採取した COCs は、10 IU/ml eCG、10 IU/ml hCG、10 ng/ml TGF-、および
1 mM dbcAMP を添加した POM で成熟培養開始 20 時間目まで培養し、その後 24 時間はホルモンと dbcAMP を添加しない培地で培養した。成熟培養後の COCs は、第 3 章 1）と同様の方法で媒精し、PZM-5 で 4～5 日間培養した。

2） 胚のガラス化保存および融解
胚のガラス化は、クライオトップ法（Kuwayama et al., 2005）を用いて行った。ガラス化および加温の基本液には、20 mM Hepes 緩衝 PBM（pH 7.3）を使用した。平衡液とガラス化液は 38℃で使用した。胚盤胞を 7～11 個ずつ、1 次平衡液（1.8 M エチレングリコール（EG; Amresco, Solon, OH,USA））および 2 次平衡液（1.8 M EG、0.3 M トレハロース（Tre; Hayashibara, Okayama, Japan）、
1% (w/v)ポリエチレングリコール（PEG; Nacalai Tesque, Kyoto, Japan））で各 5 分間処理した後、1 分以内にガラス化液（6 M EG、0.6 M Tre、2% (w/v) PEG）で処理し、クライオトップ（Kitazato
BioPharma, Shizuoka, Japan）に乗せて液体窒素に浸漬しガラス化保存した。
ガラス化胚の融解は、38℃の加温・希釈液（1.8 M EG、0.3 M Tre）にクライオトップの先端を直接投入し、胚を遊離させて 3 分間処理することで行った。融解後の胚は、10% (v/v)ウシ胎児血清（Asahi Techno Glass, Shizuoka, Japan）を添加した PBM の 50 μl ドロップ中で 48 時間培養し、生存率および孵化率を実体顕微鏡下で観察し調べた。培養後、胚盤胞腔を再形成したものを生存胚とした。

3） 実験デザイン（1） 媒精後 5 日目胚の耐凍性における発生ステージおよび培地の影響
媒精後 4 日目から 1 日間 PZM-5 あるいは PBM（表 5-1）で培養した、媒精後 5 日目の胚盤胞あるいは拡張胚盤胞をガラス化保存した。ガラス化保存胚は融解後、培養 24 時間後と 48 時間後に73

生存率および孵化率を調べた。

（2） 媒精後 6 日目胚の耐凍性における発生ステージおよび培地の影響
媒精後 5 日目から 1 日間 PZM-5 あるいは PBM で培養した、媒精後 6 日目の胚盤胞あるいは
拡張胚盤胞をガラス化保存した。ガラス化保存胚は融解後、培養 24 時間後と 48 時間後に生存率
および孵化率を調べた。

（3） 胚の耐凍性に対する胚日齢の影響
媒精後 4 日目あるいは 5 日目から 1 日または 2 日間 PBM で培養した、媒精後 5 日目あるいは6 日目の胚盤胞と拡張胚盤胞をガラス化保存した。ガラス化保存胚は融解後、培養 24 時間後と 48
時間後に生存率および孵化率を調べた。

（4） 成分既知ガラス化保存液を用いてガラス化保存した胚の産子への発生能
受胚豚は、ランドレース種 6 頭（6.5 ヶ月齢、体重 113～130 kg）を使用した。受胚豚の黄体退行および排卵の誘起は、第 2 章 7）の方法に準じて行った。媒精後 4 日目あるいは 5 日目から 1 日間
PBM で培養した、媒精後 5 日目あるいは 6 日目の拡張胚盤胞をガラス化保存した。ガラス化保存
胚は融解後、1 頭あたり 30 個ずつ、hCG 投与後 5 日目あるいは 6 日目に、各 3 頭の受胚豚の子宮へ外科的に移植した。

4） 統計処理
統計処理には、Statistical Analysis System（SAS Institute, Cary NC, USA）の一般化線形モデル（GLM）を使用した。ガラス化融解胚の生存率および孵化率に対する胚の発生培地、発生ステー
ジおよび両要因の交互作用の影響は、二元配置分散分析により検定を行った。胚の耐凍性に対する胚日齢の影響は、一元配置分散分析により検定を行った。分散分析により有意な効果が認められた場合には、多重比較検定としてTukey-KramerのHSD検定を行った。ガラス化融解胚の生存率および孵化率は、アークサイン変換して検定を行った。移植胚数に対する産子数の割合（子豚生74産率）と妊娠率における差の解析は、Fisherの正確確率検定によって行った。子豚の生時体重の統計的比較は、等分散検定の後にStudentのt検定により行った。危険率5%未満の場合は、統計学的に有意な差があると判定した。

75

3. 結果1） 受精率および胚発生率
本章における受精率は 86.5%であり、正常受精率は 54.7%、多精子受精率は 30.9%だった。計8828 個の胚を PZM-5 で培養したところ、媒精後 2 日目に卵割した胚数は 5408 個（64.9%）で、媒精後 5 日目および 6 日目に胚盤胞あるいは拡張胚盤胞に達した胚（図 5-1a）の数は、それぞれ 868
個（20.2%）および 1189 個（25.7%）であった。

2） 媒精後 5 日目胚の耐凍性における発生ステージおよび培地の影響
ガラス化胚は融解直後に収縮したが（図 5-1b）、48 時間培養後には再拡張して発育した（図5-1c）。媒精後 5 日目に拡張胚盤胞をガラス化したところ、融解後 48 時間培養後の生存率（P <0.01）および孵化率（P < 0.001）は、胚盤胞をガラス化した場合に比べて高かった（表 5-2）。媒精後
4 日目から 1 日間 PZM-5 あるいは PBM で培養した胚盤胞と拡張胚盤胞をガラス化したところ、融解後 48 時間培養後の生存率および孵化率は、培地間で差を認めなかった。

3） 媒精後 6 日目胚の耐凍性における発生ステージおよび培地の影響
媒精後 6 日目に拡張胚盤胞をガラス化したところ、融解後 48 時間培養後の生存率および孵化率
は、胚盤胞をガラス化した場合に比べて高かった（P < 0.001; 表 5-3）。媒精後 5 日目から PZM-5あるいは PBM で 1 日間培養した胚盤胞と拡張胚盤胞をガラス化したところ、融解後 48 時間培養後の生存率および孵化率は、PBM で培養すると PZM-5 で培養した胚に比べて有意に高かった（P <0.001）。

4） 胚の耐凍性に対する胚日齢の影響
胚の耐凍性における培養日数の影響を明らかにするため、媒精後 4 日目から 1 日および 2 日間、あるいは 5 日目から 1 日間 PBM で培養した胚盤胞と拡張胚盤胞をガラス化したところ、融解後 48
時間培養後の生存率および孵化率は、培養日数と PBM での培養期間による差を認めなかった（表76

5-4）。

5） 成分既知ガラス化保存液を用いてガラス化保存した胚の産子への発生能
媒精後 5 日目の拡張胚盤胞をガラス化・融解し 3 頭の受胚豚へ移植したところ、全頭が妊娠・分娩し、合計 14 頭の子豚を得た（表 5-5）。一方、媒精後 6 日目の拡張胚盤胞をガラス化・融解し 3頭の受胚豚へ移植したところ、3 頭中 1 頭が妊娠・分娩し、4 頭の子豚を得た。媒精後 5 日目胚の移植による子豚生産率は、6 日目胚を移植した場合に比べて高かった（P < 0.05）。妊娠期間および産子の生時体重はいずれも正常範囲内であり、全ての子豚は正常に成長した。

77

4. 考察本章の結果から、体外生産したブタの拡張胚盤胞の耐凍性は胚盤胞より高いことを明らかにした。
また、媒精後 5 日目から 1 日間 PBM で培養すると、胚の耐凍性が向上した。さらに、体外生産した拡張胚盤胞を、成分既知の平衡液、ガラス化液、および加温液を用いてガラス化・融解し、受胚
豚の子宮に移植することにより、正常な子豚を得ることに成功した。
体外生産胚において、拡張胚盤胞のガラス化・融解後の生存率および孵化率は、胚盤胞に比べて高かった（表 5-2, 5-3）。同様の結果はブタの体内発育胚でも得られており、孵化前後の胚が最も高い耐凍性を示し（Nagashima et al., 1989; 1992）、桑実胚や初期胚盤胞は拡張胚盤胞に比べて耐凍性が低いと報告されている（Nagashima et al., 1992; Cuello et al., 2004）。ブタ胚は低温感受性がかなり高い（Wilmut, 1974; Polge et al., 1974）。Nagashima et al.（1994, 1995）は、遠心と顕微操作によって胚の脂肪顆粒を除去し脂質含量を減少させると、胚の低温感受性が低下し、凍結保存後の生存性が改善すると報告した。ブタの胚は他の哺乳動物種の胚に比べて細胞質に多量の脂質を含んでいる（McEvoy et al., 2000; Sturmey and Leese, 2003）。初期胚に存在する脂肪滴は多量で大きいが、胚盤胞期以降の胚は発生が進むのに伴い、脂肪滴の数とサイズは徐々に減少する（Norberg, 1973; Kikuchi et al., 2002a）。したがって、胚発生に伴って脂質含量が減少したため、胚盤胞に比べて拡張胚盤胞の耐凍性が高かったと考えられる。
媒精後 5 日目から 1 日間 PBM で胚を培養すると、胚の耐凍性が向上した（表 5-3）。一般に、体外生産胚は同時期の体内発育胚に比べて耐凍性が低いことが知られている（Pollard and Leibo,1994）。体外生産胚は体内発育胚と比較して、アクチンフィラメントの分布が異なることや、フラグメ
ンテーションを起こしている割球の割合が高いほか、胚盤胞の栄養膜細胞に対する内部細胞塊の割合が低く、胚盤胞の総細胞数が少ないなどの異常が認められ（Wang et al., 1999）、このような胚の異常が発生能だけでなく耐凍性にも影響している可能性が示唆されている（Men et al., 2005）。
体外生産胚の異常は、卵母細胞や胚の不適切な培養条件が原因の一つであると考えられている（Wang et al., 1999）。発生培地に血清を添加してブタ胚を培養すると、胚盤胞の細胞数が増加し、ガラス化保存後の生存性が向上したと報告されている（Men et al., 2005）。第 4 章において、78

PZM-5 にグルコースとグリシンを添加して胚盤胞を培養すると、胚盤胞の生存率、孵化率、直径、および総細胞数が増加し、アポトーシス出現頻度が抑制されることを明らかにした。また、グリシン
は細胞内浸透圧調節作用により、ガラス化保存による脱水や融解による復水の浸透圧ストレスから卵子を保護する可能性が示されている（Cao et al., 2016）。したがって、グルコースとグリシンを添加して培養することで、胚盤胞における生存細胞数を指標とした胚の品質が改良されるとともに、グリシンの細胞内浸透圧調節作用により浸透圧ストレスから胚が保護され、耐凍性が向上したと推察される。一方、媒精後 4 日目から 1 日間 PBM で培養しても、胚の耐凍性は改善しなかった（表5-2）。PZM-5 は、ブタ胚の卵割初期におけるエネルギー基質として重要なピルビン酸と乳酸を含み、胚盤胞への発生を促進する（Suzuki and Yoshioka, 2006; Yoshioka et al., 2002）。ブタ胚のグルコースの消費量は、卵割初期では低く、桑実胚期でわずかに増加し、胚盤胞期にピークに達する（Sturmey and Leese, 2003）。本研究で用いた培養系では、主に媒精後 4 日目で桑実胚期、5 日目に胚盤胞期、6 日目に拡張胚盤胞へと発生する。したがって、媒精後 4 日目から 1 日間 PBM で培養しても、桑実胚におけるグルコースの代謝能が胚盤胞に比べて高くないため、耐凍性を改善しなかったと推察される。
本研究において、体外生産した胚拡張胚盤胞を、成分既知の平衡液、ガラス化液、および加温液を用いてガラス化保存・融解し、受胚豚の子宮に移植することで正常な産子が得られた（表 5-5）。
既往研究でも、体外生産胚をガラス化保存し移植することで、子豚が誕生したことが報告されている（Nagashima et al., 2007; Maehara et al., 2012; Men et al., 2011）。しかし、これらの既往研究
では、平衡液、ガラス化液、および加温液に高濃度（20%(v/v)）の血清が含まれている。したがって、体外生産胚において、成分既知のガラス化液および加温液を用いてガラス化保存・融解後に移植することにより、初めて子豚を得ることに成功した。胚のガラス化保存に成分既知液を使用すること
で、血清中の未知成分による影響を除外し、結果の信頼性と再現性を高めるうえ、疾病伝播のリスクを軽減させることができる（Sanchez-Osorio et al., 2010）。Misumi et al.（2013）は、ガラス化液の基本液として成分既知培地である PZM-5 を使用してガラス化保存した体内発育胚を移植した時の子豚生産率は、12.5～13.6 %であったと報告した。本章において、媒精後 5 日目の拡張胚盤胞をガラス化保存して移植した時の子豚生産率は 15.6 %で、Misumi et al.（2013）の報告と同等であ79った。一方、媒精後 6 日目の拡張胚盤胞をガラス化保存して移植した時の子豚生産率は 4.4 %で、媒精後 5 日目の胚を移植した場合よりも低かった。ガラス化・融解後の胚の体外培養での生存性には、媒精後 4 日目から PBM で培養した 5 日目胚と媒精後 5 日目から PBM で培養した 6 日目胚の間で有意差はなかった（表 5-4）。しかし、産子作出の検討は培養胚の正常性を調べるための最も明白な試験である（Bavister, 1995）。これらの結果から、媒精後 4～5 日目に PZM-5 で胚を培養した場合に比べて、PBM で培養すると胚の品質と産子までの生存性が高まると示唆された。さらに、胚の長期間の体外培養は、膜を構成する脂質の酸化のため、膜の流動性および透過性が妨げられる（Johnson and Nasr-Esfahani, 1994）。このような胚の生理的な変化により、凍結・融解後の生存性や移植後の胚発生能が低下すると考えられている（Kashiwazaki et al., 2001; Esaki et al.,2004）。したがって、媒精後 5 日目胚は 6 日目胚よりも培養期間が短く、胚の生理的変化が少ない
ため、産子への発生率が高かった可能性も考えられた。
本章では、胚の発生ステージおよび発生培地が耐凍性に影響することを明らかに した。胚をPBM で培養することで、胚盤胞における生存細胞数を指標とする胚品質が向上し、耐凍性を改善すると推察された。

80

5. 小括

本章では、ブタ胚の発生ステージ、発生培地、および培養日数の違いが、ガラス化・融解後の胚生存性に及ぼす影響を検討した。
拡張胚盤胞のガラス化・融解後の生存率および孵化率は、胚日齢や培養培地の違いに関わらず、胚盤胞に比べて有意に高かった。媒精後 5 日目から 1 日間 PBM で培養すると、胚のガラス化・融解後の生存率および孵化率は、PZM-5 で培養した胚に比べて高かった。また、媒精後 4 日目ないしは 5 日目から PBM で培養した胚を、5 日目あるいは 6 日目にガラス化保存したところ、培養期間および胚日齢間でガラス化・融解後の胚の生存性に差は認められなかった。さらに、媒精後 5 日目の拡張胚盤胞をガラス化・融解し 3 頭の受胚豚の子宮へ外科的に移植したところ全頭が妊娠したが、媒精後 6 日目の拡張胚盤胞をガラス化・融解し 3 頭の受胚豚へ移植すると 3 頭中 1 頭のみが妊娠した。
以上の結果から、ブタ胚では胚盤胞に比べて拡張胚盤胞で耐凍性が高く、PBM で培養すると胚の耐凍性が向上し、発生ステージや発生培地が胚の生存性に大きく影響することが示唆された。

81

表 5-1 PBM の組成
組成

濃度

NaCl

108.00 mM

KCl

10.00 mM

KH2PO40.35 mM

MgSO4・7H2O

0.40 mM

NaHCO325.00 mM

Glucose5.00 mM

Na-pyruvate

0.20 mM

Ca-(lactate)2・5H2O

2.00 mM

L-glutamine

2.00 mM

Hypotaurine

5.00 mM

L-Arginine・HCl

0.10 mM

L-Cystine

0.05 mM

L-Histidine

0.05 mM

L-Isoleucine

0.20 mM

L-Leucine

0.20 mM

L-Lysine・HCl

0.20 mM

L-Methionine

0.05 mM

L-Phenylalanine

0.10 mM

L-Threonine

0.20 mM

L-Tryptophan

0.02 mM

L-Tyrosine

0.10 mM

L-Valine

0.20 mM

L-Alanine0.10 mM

L-Asparagine・H2O

0.10 mM

L-Aspartic Acid

0.10 mM

L-Glutamic Acid

0.10 mM

Glycine10.10 mM

L-Proline

0.10 mM

L-Serine

0.10 mM

Gentamicin

0.01 mg/ml

Polyvinyl alcohol

3.00 mg/ml*

浸透圧 (mOsm)

300 ± 1

*平均値±標準誤差を示す．
pH 7.3 に調整．

82

a

b

c

図 5-1 ガラス化保存前後のブタ胚(a) ガラス化前の拡張胚盤胞(b) 融解直後の胚(c) 融解後 48 時間培養した胚スケールバー= 200 μm.

83

84

38 (88.1±5.7）

6 回の繰り返し実験による平均値±標準誤差を示す.

NS

43

拡張胚盤胞

48 (87.2±5.3）

培地＊発生ステージ55

胚盤胞

44 (91.1±2.8）

NS

48

拡張胚盤胞

44 (84.5±6.9）

NSP<0.01NS

35 (81.0±7.1）

36 (65.6±7.7）

39 (80.1±7.5）

27 (51.6±6.5）

48 時間後生存胚数(%)
24 時間後発生ステージ

PBM

PZM-5

52

胚盤胞

ガラス化胚数

NS

PZM-5

PZM-5

発生ステージ

培地

媒精後
4～5 日

媒精後
1～4 日

NS

P<0.001NS

24 (55.4±7.1）

15 (27.2±6.8）

23 (46.9±7.0）

10 (19.4±7.0）

48 時間後孵化胚数(%)

表 5-2 媒精後 5 日目胚の耐凍性に対する発生ステージと培養培地の影響

NS

P<0.05NS

7 (16.4±4.4）

3 (5.4±2.4）

8 (17.1±3.1）

5 (9.7±4.7）

48 時間後完全孵化胚数(%)

85

59
54

胚盤胞

拡張胚盤胞
50 (91.3±4.7）

43 (74.8±5.2）

35 (71.6±4.2）

6 回の繰り返し実験による平均値±標準誤差を示す.

培地＊発生ステージNS

P<0.00148

拡張胚盤胞

21 (44.6±5.2）

24 時間後

NS

P<0.001

P<0.00145 (82.7±4.5）

26 (46.1±7.1）

26 (53.5±5.4）

13 (27.7±6.0）

48 時間後生存胚数(%)

発生ステージ

PBM

PZM-5

47

胚盤胞

ガラス化胚数

P<0.001

PZM-5

PZM-5

発生ステージ

培地

媒精後
5～6 日

媒精後
1～5 日

NS

P<0.001

P<0.00128 (52.0±8.2）

6 (11.0±3.8）

5 (9.3±3.4）

2 (4.2±2.6）

48 時間後孵化胚数(%)

表 5-3 媒精後 6 日目胚の耐凍性に対する発生ステージと培養培地の影響

P<0.01

P<0.05

P<0.0512 (22.8±6.0）

2 (4.4±2.9）

3 (5.8±3.9）

1 (2.1±2.1）

48 時間後完全孵化胚数(%)

86

媒精後 4～5 日

媒精後 4～6 日

媒精後 5～6 日

媒精後 1～4 日

媒精後 1～4 日

媒精後 1～5 日

6日

6日

5日

59 (20:39)

72 (30:42)

59 (42:17)

ガラス化時
ガラス化胚数の胚日齢 （胚盤胞：拡張胚盤胞）

6 回または 7 回の繰り返し実験による平均値±標準誤差を示す.

PBM

PZM-5
48 時間後48 時間後孵化胚数(%)

48 (82.1±4.9） 33 (56.8±7.6） 16 (27.5±6.4）

52 (72.4±2.0） 38 (53.0±3.2） 22 (30.9±3.5）

45 (75.8±7.2） 27 (45.6±7.7） 13 (22.0±8.4）

24 時間後生存胚数(%)

表 5-4 ガラス化胚の耐凍性に対する胚日齢の影響

11 (18.8±7.1）

13 (18.8±5.8）

4 (6.7±3.4）

48 時間後完全孵化胚数(%)

表 5-5 成分既知のガラス化液でガラス化保存した胚の移植成績
胚日齢

媒精後 5 日目胚媒精後 6 日目胚

受胚豚

3

3

移植胚数（1 頭あたり）

30

30

妊娠頭数 (%)

3 (100)1 (33.3)

妊娠期間（日）115, 118, 119

116

産子数（一腹あたり）

14 (6, 1, 7)

4 (4)

6:8

3:1

性比（雄：雌）
子豚生産率§ (%)

15.6

4.4b

生時体重 (kg)*

1.4±0.1

1.4±0.0§

a

移植胚数に対する産子数の割合を示す.

*

平均値±標準誤差を示す.

87

第6章 総合考察

本研究では、ブタ卵母細胞と胚の発生能および品質向上を図り、成分既知培地を用いた培養技術を確立するため、卵母細胞の成熟培養および胚の発生培養について検討を行った。
第 2 章では、ブタ卵母細胞の成熟における TGF-の効果を調べたところ、eCG と hCG の存在下で、TGF-は体外受精後の胚盤胞への発生を促進することを明らかにした。ウシにおいても、成熟培地への TGF-の添加が胚盤胞への発生を促進する（Kobayashi et al., 1994）。また、ブタでは、
eCG と hCG を含む成熟培地に EGF を 10 ng/ml の濃度で添加して卵母細胞を培養すると、胚盤胞への発生を促進すると報告されている（Abeydeera et al., 1998）。EGF は体外成熟した卵母細
胞や卵丘細胞のタンパク質合成のパターンを変え、細胞質成熟の調節に生理的な役割を果たすことが示されている（Singh et al., 1997; Uhm et al., 2010）。本研究では、TGF-が卵母細胞や胚における脂肪滴や小胞体、ミトコンドリアなどの細胞小器官の微細構造に影響することを明らかにした。
細胞質成熟には細胞内小器官の局在や構造の変化も関与する（Ferreira et al., 2009; Cran, 1985）
ことから、TGF-は卵母細胞の細胞内微細構造を変化させることで細胞質成熟を改善し、胚発生能を促進する可能性が示唆された。
第 2 章において、eCG と hCG が存在しない場合、TGF-は卵母細胞の核成熟を促進したが、eCG と hCG が存在すると、TGF-による促進効果は認められなかった。そこで、TGF-と生殖腺
刺激ホルモンの作用の関連性を明確にするとともに、動物由来成分を使用せずに効率良く卵成熟を誘起できる成分既知培地を開発するため、第 3 章では、卵母細胞の成熟に対する TGF-の作用を、FSH の作用と比較した。その結果、TGF-と FSH は相乗的に卵母細胞の核成熟を促進し、
TGF-と FSH が核成熟を促進する作用機構は完全に同じではないことを明らかにした。FSH はラットの顆粒膜細胞やマウスの卵丘細胞で epiregulin あるいは amphiregulin の発現を誘導し（Sekiguchi et al., 2002; Shimada et al., 2006）、FSH が誘起する GVBD は EGF レセプターのチ
ロシンキナーゼ阻害剤である AG1478 により阻害されることから、これらの EGF ファミリー分子はFSH が誘起する卵成熟の仲介物質として作用する可能性が示されている（Chen et al., 2008;
Downs and Chen, 2008）。しかし、本研究において、AG1478 は TGF-が誘起する卵母細胞の核88

成熟を完全に阻害したが、FSH が誘起する核成熟を完全には阻害しなかった。また、成熟培地にTGF-と FSH を両方添加すると、TGF-のみを添加した場合に比べて、卵母細胞の減数分裂の進行が速かった。これらの結果から、FSH は EGF レセプターを介したシグナル伝達経路以外にも関与し、TGF-と FSH は一部異なる作用機構により卵成熟を促進すると推察された。Tsafriri et al.
（1989）は、ラットの排卵前の卵胞において TGF-が卵母細胞の核成熟を誘起し、プロジェステロン
産生を促進することから、TGF-は LH の作用に類似していると報告している。また、amphiregulin、
epiregulin、betacellulin を含む EGF ファミリー分子は、LH が誘起する卵成熟の仲介物質としても作用する可能性がある（Park et al., 2004; Conti et al., 2006）。本研究で成熟培地に添加した
TGF-は、体内における他の EGF ファミリー分子の代わりに、LH のシグナル伝達物質として作用している可能性も考えられた。本研究により、成熟培地に TGF-と FSH を添加すると、卵母細胞の核成熟、卵丘膨化、および胚発生を相乗的に促進することを明らかにし、動物由来成分を使用せずに効率良く卵成熟を誘起できる成熟培地を開発することに成功した。
第 4 章では、PZM-5 に 5 mM グルコースと 10 mM グリシンを添加すると、相乗的に胚盤胞の孵化を促進し、胚盤胞の総細胞数を増加させるとともに、アポトーシス細胞の出現頻度を低下させることを明らかにした。グルコースは 4 細胞期以降の胚発生のエネルギー基質として重要であることが示されており（Kikuchi et al., 2002b; Karja et al., 2004）、本研究でもグルコースを添加すると胚盤胞の生存率および ATP 含量が増加し、胚盤胞においても重要なエネルギー源であることが示された。ウシ胚において、グリシンは胚盤胞への発生と胚盤胞の細胞数を増加させる（ Lee andFukui, 1996; Takahashi and Kanagawa, 1998）と報告されている。一方、本研究において、グリシンのみの添加ではブタ胚の発生促進効果は認められず、グルコースとグリシンを両方添加すると胚盤胞の孵化率や細胞数が増加した。グリシンは浸透圧調節物質（Dawson and Baltz, 1997）や
GSH の合成（Griffith, 1999）に関与している可能性もあるが、エネルギー源としてグルコースが存在する場合に効果が発揮されると推察された。また、第 5 章では、PZM-5 にグルコースとグリシンを添加した発生培地（PBM）で媒精後 5 日目の胚盤胞を 1 日間培養すると、ガラス化・融解後の胚の生存率や孵化率も増加することを明らかにした。一般に、体外で発生した胚は、体内で発生した胚に比べて胚盤胞の栄養膜細胞に対する内部細胞塊の割合が低く、胚盤胞の総細胞数が少ないな
89

どの異常が認められ（Wang et al., 1999）、このような胚の異常が耐凍性にも影響している可能性が示唆されている（Men et al., 2005）。これらのことから、生存細胞数を指標とした胚品質の向上が耐凍性を改善したと推察される。本研究では、発生培地にグルコースとグリシンを添加して胚盤胞を培養すると胚発生が促進されるとともに胚品質が向上することを明らかにし、胚盤胞期以降の発生に適した成分既知発生培地を開発することに成功した。また、作出した胚をガラス化保存後に移植すると正常な子豚が得られることを明らかにした。
農林水産省畜産統計（2016）によると、日本国内におけるブタの飼養戸数は、1996 年の 16,000
戸から 2016 年の 4,830 戸まで減少している。一方、ブタの飼養頭数は 1996 年の 990 万頭に対し、2016 年の 931.3 万頭とほぼ横ばいで推移しており、一戸あたりの飼養頭数が増加し、年々大規模化が進んでいる。そのため、郡単位での繁殖管理や生産性の向上、感染症の伝播防止が必要になっている。現在、交配に用いる種豚は主に他の養豚場から生体で導入するため、種豚価格のほか運搬費などの経済的負担が大きいうえ、病気が侵入するリスクがある。そこで、畜産現場では、疾病を伝播する可能性が極めて低い胚移植技術が注目されている。特に、開腹せず経腟的に胚を移植する非外科的移植は、低コストかつ省労力で新たな遺伝形質を持つブタを導入することが可能になると考えられる。胚移植は疾病伝播リスクを極力低減することが可能であり、種豚の導入だけ
でなく、品種改良や優良家畜の増産にも有用であると期待される。本研究で開発した成分既知の成熟培地と発生培地を用いた培養系により、屠畜由来の卵母細胞から低コストで効率良く、安定して高品質の移植胚を作出することが可能になると考えられる。
以上のように、本研究において開発した成分既知の卵母細胞成熟培地および胚発生培地を用いた培養技術は、養豚業に貢献するだけでなく、卵成熟や胚発生機構の解明といった生物学や、クローン動物あるいはトランスジェニック動物作出など医学の基盤技術としても役立つと思われる。また、成分既知のガラス化保存液を用いた胚のガラス化保存技術は、胚移植における時間的・地理的制
約を無くすことができるため利便性が向上し、畜産現場への胚移植の普及に貢献するほか、病原体混入の可能性が極めて低い胚を半永久的に保存できるため、希少品種や優良血統のブタの遺伝子資源の保存にも大きく寄与するものと期待される。

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