課題番号：２７指１１０２
研究課題名：世界規模で新興している多剤耐性病原細菌の耐性化の分子基盤と新規抗菌薬の開発
主任研究者名 ：切替照雄
分担研究者名 ：秋山徹、岡村匡史、舩渡川圭次、祝弘樹、多田達哉
キーワード ：カナマイシン耐性、リボソーム変異、病原性、リボソーム成熟
研究成果：結核菌は１つの rRNA オペロンを有しており、カナマイシンなどの抗結核薬の標的となっている。 現在まで、16S rRNA のカナマイシン結合部位の 4 つの突然変異が、カナマイシン耐性臨床分離株で報告されていた。我々は、rRNA オペロン領域のこれまでに報告かない突然変異が結核菌の生存能力と病原性を劇的に減少させるかもしれないと仮説を立てた。そこで、我々は rRNA 突然変異（U1406A）について記載する。この U1406A 変異した結核菌は試験管内で作られ、カナマイシンに抵抗性だけでなく、結核菌の病原性が非常に減少していた。この変異体は、代謝酵素、ミコール酸性生合成酵素と病原性要因（例えば Ag85 複合体と ESAT-6）を含む結核菌タンパク質の２０％（n = 361）の発現が減少していた。リボソーム突然変異は KsgA（Rv1010; 16S rRNA アデニン・ジメチル転移酵素）を含む 3 つのタンパク質の発現を誘導した。この３つのタンパク質はリボソームの上で U1406A 突然変
異と近接しており、リボソーム成熟と翻訳開始プロセスと関係していた。変異体は 17S rRNA（前駆 16SrRNA）の増加と３０S サブユニットと７０S のリボソームの比の減少を示した。そして、１６S rRNAの U1406A 突然変異がこれらのプロセスに影響を及ぼすことによって結核菌の病原性を減らしたことを示唆した。

Subject No.

：27S1102Title：A Mutation in the 16S rRNA Decoding Region Attenuates the Virulence ofMycobacterium tuberculosis
Researchers ：Teruo Kirikae, Tohru Miyoshi-Akiyama, Tadashi Okamura, Keiji Funatogawa,Hiroki Iwai, Tatsuya Tada
Key word：Kanamycin resistance; Ribosome mutation; Virulence; Ribosome maturation;

Mycobacterium tuberculosis
Abstract：Mycobacterium tuberculosis contains a single rRNA operon that encodes targets

for antituberculosis agents, including kanamycin. To date, only four mutations in the kanamycin
binding sites of 16S rRNA have been reported in kanamycin-resistant clinical isolates. We
hypothesized that another mutation(s) in the region may dramatically decrease M. tuberculosis
viability and virulence. Here, we describe an rRNA mutation, U1406A, which was generated invitro and confers resistance to kanamycin while highly attenuating M. tuberculosis virulence. Themutant showed decreased expression of 20% (n = 361) of mycobacterial proteins, including central
metabolic enzymes, mycolic acid biosynthesis enzymes, and virulence factors such as antigen 85
complexes and ESAT-6. The mutation also induced three proteins, including KsgA (Rv1010; 16S
rRNA adenine dimethyltransferase), which closely bind to the U1406A mutation site on theribosome; these proteins were associated with ribosome maturation and translation initiation
processes. The mutant showed an increase in 17S rRNA (precursor 16S rRNA) and a decrease in
the ratio of 30S subunits to the 70S ribosomes, suggesting that the U1406A mutation in 16S rRNA
attenuated M. tuberculosis virulence by affecting these processes. (Infect. Immun. Accepted
manuscript posted online 31 May 2016 , doi:10.1128/IAI.00417-16)

Researchers には、分担研究者を記載する。

２７指１１０２
研究課題名 ： 世界規模で新興している多剤耐性病原細菌の耐性化の分子基盤解析と新規抗菌薬の開発
主任研究者名 ： 切替 照雄
分担研究者名 ： 秋山 徹、岡村 匡史、舩渡川 圭次、祝 弘樹、多田達哉

・多剤耐性菌に対する抗菌薬の開発・基盤研究を実施
・分子疫学研究を駆使し多剤耐性菌の新たな薬剤耐性因子を同定

概要目 的アミノグリコシド高度耐性菌は日本を含むアジア諸国の医療安全を脅かしつつあるため、アミノグリコシド高度耐性菌に有効な新規抗菌薬を開発する
結核治療薬の探索・開発を行うための新規ターゲット分子を見つけるため、結核菌の病原因子や宿主防御因子を同定し、その機能を解析する

The U1406A mutation in NCGM2242.

Infect Immun. 2016 May 31. pii: IAI.00417-16. [Epub ahead of print]

課題番号：２７指１１０２
研究課題名：超多剤耐性結核菌に対する新規抗菌薬リード化合物の探索
主任研究者名 ：切替照雄
分担研究者名 ：切替照雄
キーワード：結核菌、多剤耐性結核菌（MDR-TB）、超多剤耐性結核菌（XDR-TB）、植物エキス
研究成果：

目的：結核は現在も年間 960 万人が新規に罹患し、150 万人が死亡している（WHO Tuberculosis
Report）疾患である。新規患者のうち 48 万人が多剤耐性結核菌（MDR-TB）であり、このうち 9％が超多剤耐性結核菌（XDR-TB）である。XDR-TB は稀ではあるが治療薬がなく、既に 77 ヵ国で出現が報告されており治療がほぼ不可能なため、XDR-TB を含む MDR-TB の治療薬の開発が必要とされている。本研究では高度耐性菌及び超多剤耐性結核菌に関する抗菌薬の開発研究を行う。
方法：
1 次スクリーニング：医薬基板研究所薬用植物資源研究センター所有の植物エキスライブラリを用い、我が国で分離された超多剤耐性結核菌臨床分離株 M. tuberculosis NCGM946K2 で抗結核効果を検定する。
この NCGM946K2 株は表に示す通り、ほぼすべての抗結核薬に耐性（R: Resistance）を示した。この菌株を 96 ウェルプレートで培養し、コントロールの菌が十分増殖した時点でアラマ・ブルーを添加する。増殖及び阻害は、2 日後のアラマーブルーの色の変化で判定する。

INH, isoniazid; RFP, rifampin; EB, ethambutol; SM, streptomycin; KM, kanamycin;
TH, Ethionamide; PAS, para-amino-salicylic acid; CS, cycloserine; EVM, ethionamide
2 次スクリーニング：1 次スクリーニングで得られたサンプルの M. tuberculosis NCGM946K2 に対する最小増殖阻止濃度（MIC）と細胞毒性試験をヒト乳腺ガン細胞（MCF-7）とヒト肺ガン細胞（A549）を用いて実施する。
結果：
医薬基板研究所薬用植物資源研究センター所有の約 5000 種類の植物エキスライブラリから、1次スクリーニングで、約 131 種類に結核菌の増殖抑制効果が認められた。2 次スクリーニングとしてこれらの植物エキスの結核菌最小増殖阻止濃度（MIC）を調べた結果、比較的強い抗結核菌作用を示した 38 サンプルを得た。この 38 サンプルについて細胞毒性有無を調べ、低毒性かつ抗結核菌作用を持つ抽出物を得た。今後はこれら抽出物の一つであるミツバ栽培品抽出物から化合物の精製を進め、超多剤耐性結核菌臨床分離株 M. tuberculosis NCGM946K2 で抗結核効果の検定を行う予定である。

課題番号：２７指１１０２
研究課題名：ゲノム疫学に基づく多剤耐性グラム陰性細菌の新規薬剤耐性因子の同定および機能解析
主任研究者名 ：切替照雄
分担研究者名 ：秋山徹
キーワード：ペルオキシレドキシン１、結核菌研究成果：
Peroxiredoxin 1 (PRDX1) is an antioxidant that detoxifies hydrogen peroxide and peroxinitrite.
Compared with wild-type (WT) mice, Prdx1-deficient (Prdx1-/-) mice showed increased
susceptibility to Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and lower levels of interferon (IFN)- andIFN--producing CD4+ T cells in the lungs after Mtb infection. Interleukin (IL)-12 production,c-Rel induction and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) activation levels were lower inPrdx1-/- than WT bone marrow-derived macrophages (BMDMs). IFN--activated Prdx1-/- BMDMs
did not kill Mtb effectively. Nitric oxide (NO) production levels were lower, and arginase activity
and arginase 1 (Arg1) expression levels were higher in IFN--activated Prdx1-/- than WT BMDMs
after Mtb infection. An arginase inhibitor, Nω-hydroxy-nor-arginine, restored antimicrobialactivity and NO production in IFN--activated Prdx1-/- BMDMs after Mtb infection. These results
suggest that PRDX1 contributes to host defenses against Mtb. PRDX1 positively regulates IL-12
production by inducing c-Rel and activating p38 MAPK, and positively regulates NO production by
suppressing Arg1 expression in macrophages infected with Mtb.
Peroxiredoxin 1 contributes to host defenses against Mycobacterium tuberculosis（投稿中）課題番号：２７指１１０２
研究課題名：マウスモデルを用いた結核菌の宿主防御因子の同定
主任研究者名 ：切替 照雄
分担研究者名 ：岡村 匡史
キーワード
研究成果

：マウス、結核菌、感受性遺伝子、ゲノム編集：[目的]

結核は最も重要な国際的感染症のひとつである。結核は現在も年間で９００万人が新規に罹患し、１５０万人が死亡している（WHO Tuberculosis Report）。新規患者のうち４８万人が多剤耐性結核菌（MDR-TB）であり、このうち９％が超多剤耐性結核菌（XDR-TB）である。
XDR-TB は稀ではあるが治療薬がなく、既に７７ヵ国で出現が報告されており治療がほぼ不可能なため、XDR-TB を含む MDR-TB の治療薬の開発が必要とされている。本研究の目的は、結核治療薬の探索・開発を行うための新規ターゲット分子を見つけるために、新規宿主防御候補因子を同定し、ゲノム編集技術等を用いて、結核菌防御におけるこれらの遺伝子の機能を解明する。さらに、マウス近交系の結核菌に対する系統差に着目し、新たな宿主防御因子を同定する事で、創薬標的分子を明らかにする。
[研究成果]

1. ゲノム編集技術を用いた新規宿主防御候補遺伝子の検証
ゲノム編集技術の１つである CRISPR/Cas9 システムを用い、新規宿主防御候補遺伝子ノックアウトマウスを作製した。標的配列を認識する sgRNA と Cas9 をコードする mRNA マウス前核期受精卵に導入し、偽妊娠マウスへの移植により産仔を得た。生まれた産仔から DNAを抽出し、ゲノム DNA 配列を解読することにより、新規宿主防御候補因子遺伝子への変異導入を確認した。
2. マウス系統差を利用した結核菌の新規宿主防御遺伝子の同定
第 1 染色体上に存在する C57BL/6 の結核菌抵抗性遺伝子座を BALB/c に導入したコンジェニック系統および、Prdx1-/--BALB/c マウスのマクロファージに結核菌を感染させたところ、コンジェニック系統で結核菌生菌数が抑制されることを明らかにした。また、C57BL/6 および BALB/c のマクロファージを LPS で刺激し、培養上清中に含まれる NO を測定した結果、両系統間で差がなかった。

課題番号：２７指１１０２研究課題名：マウス結核モデルの作成
主任研究者名 ：切替照雄
分担研究者名 ：舩渡川圭次
キーワード：結核菌、マイクロ RNA

研究成果：
MicroRNAs (miRNAs) are short, conserved, non-coding RNA molecules that repress translation,
followed by the decay of miRNA-targeted mRNAs that encode molecules involved in celldifferentiation, development, immunity and apoptosis. At least six miRNAs, including
microRNA-155 (miR-155), were upregulated when born marrow-derived macrophages from
C57BL/6 mice were infected with Mycobacterium tuberculosis Erdman. C57BL/6 miceintravenously infected with Erdman showed up-regulation of miR-155 in livers and lungs.
Following infection, miR-155-deficient C57BL/6 mice died significantly earlier and hadsignificantly higher numbers of CFU in lungs than wild-type mice. Moreover, fewer CD4þ T cells,
but higher numbers of monocytes and neutrophils, were present in the lungs of Erdman-infected
miR-155 knockout (miR-155-/-) than of wild-type mice. These findings indicated that miR-155
plays a critical role in immune responses to M. tuberculosis.
MicroRNA-155 knockout mice are susceptible to Mycobacterium tuberculosis infection
Tuberculosis (Edinb) 95(3):246-50.2015

課題番号：２７指１１０２
研究課題名：結核菌の新規病原因子および宿主防御因子の機能解析
主任研究者名 ：切替照雄
分担研究者名 ：祝 弘樹
キーワード：結核菌、オートファジー

研究成果

：

Mycobacterium tuberculosis interacts with the host defense system(s) for their survival inmacrophages. After phagocytosed by macrophages, M. tuberculosis escapes from autophagosomes
and translocates to cytosol using an ESX-1 secretion system within 24-48 hours post infection.
However, it has been not fully understood the inhibiting mechanisms of autophagy by M.
tuberculosis. Here we show that M. tuberculosis inhibits autophagy via mycobacterial
PE_PGRS62 protein after translocated to cytosol. To investigate function of PE_PGRS62, weconstructed a series of mutant strains with virulent M. tuberculosis Erdman;
ErdmanDPE_PGRS62, ErdmanDPE_PGRS62/PE_PGRS62-1-504 (Full length),ErdmanDPE_PGRS62/PE_PGRS62-1-350 and ErdmanDESX-1, DPE_PGRS62/PE_PGRS62-1-350.
To monitor autophagosome formation, we generated the J774 stably expressing GFP-LC3(J774/GFP-LC3) and infected with M. tuberculosis Erdman strains. After 72 h post infection,
ErdmanDPE_PGRS62/PE_PGRS62-1-350 induced significant LC3-puncta formation inJ774/GFP-LC3 compared to other strains. ATG5 plays essential role for localization of LC3 toautophagosomes. We observed induction of LC3-puncta formation by
ErdmanDPE_PGRS62/PE_PGRS62-1-350 was significantly reduced in ATG5 knocked-down
J774/GFP-LC3. These results suggest that M. tuberculosis inhibits autophagy by interferingfunction of ATG5 with PE_PGRS62 C-terminal domain in cytosol of macrophages.
A mycobacterial virulence protein, PE_PGRS62, inhibits autophagy in macrophages（投稿準備中）

課題番号：２７指１１０２
研究課題名 ：高度アミノグリコシド耐性緑膿菌・アシネトバクターに対する新規抗菌薬の開発研究主任研究者名 ：切替照雄
分担研究者名 ：多田達哉
キーワード：カルバペネム耐性、緑膿菌、カルバペネマーゼ遺伝子 bla IMP

研究成果：カルバペネム耐性の緑膿菌 NCGM1984 株が、2012 年に日本で入院していた患者から分離された。免疫クロマトグラフィー分析法は、この分離株は IMP 型メタロ-β-ラクタマーゼ陽性であることを示した。全ゲノム配列の解読により、NCGM1984 は染色体の異なる領域に別個に blaIMP-34 が存在しおり、ゲノムに合計２コピーの耐性遺伝子を有していることが明らかになった。各々のblaIMP-34 は、クラス 1 インテグロン（tnpA（ISPa7）-intI1-qacG-blaIMP-34-aac（6'）-Ib-qacEdelta1-sul1-orf5-tniBdelta-tniA）で同じ構造であった。分離株は、MLST 疫学解析によりST235 に属し、国際的にハイリスクなクローン株であった。IMP-34 は、IMP-1 の Glu126Gly 変異体で、β-ラクタマーゼに安定なモノバクタム系抗生剤アズトレオナム以外、テストされるすべてのβ-ラクタマーゼを加水分解した。その触媒活性は IMP-1 と類似していた。緑膿菌の染色体の上に、2 コピーのblaIMP-34 が存在している臨床分離株を初めて報告する。
（PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0149385 April 7, 2016）

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：27指1102

研究課題名：

世界規模で新興している多剤耐性病原細菌の耐性化の分子基盤解析と新規抗菌薬の開発

主任研究者名：切替照雄

論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

Development and evaluation of
immunochromatography to detect gramnegative bacteria producing ArmA 16SrRNA methylase responsible foraminoglycoside resistance.

9) Tada T,
Nhung PH,
MiyoshiAkiyama T,J Microbiol
Shimada K,Methods
Phuong DM, AnhNQ, Ohmagari
N, Kirikae T

Molecular epidemiology of multidrugresistant Acinetobacter baumannii
isolates in a university hospital in
Nepal reveals the emergence of a novel
epidemic clonal lineage.

10) Shrestha S,
Tada T, MiyoshiAkiyama T, OharaH, Shimada K,Satou K, TeruyaK, Nakano K,
Int J Antimicrob
Shiroma A,46(5): 526-531
AgentsSherchand JB,
Rijal BP, HiranoT, Kirikae T*,
PokhrelBM*correspondin
g author.,11) Tada T,
MiyoshiAkiyama T,
A novel 6′-N-aminoglycoside
Shimada K,
acetyltransferase, AAC(6′)-Ial, from a Dahal RK,
clinical isolate of Serratia marcescens. Mishra SK,
Ohara H,
Kirikae T*,
Pokhrel BM

Microb DrugResist

年

118: 159-163

2015

2015

59(9): 58475850

2015

学会発表
タイトル

発表者

学会名

場所

年月

Dissemination of CC2 multidrug-resistant 225) 多田達也,
第89回日本細菌学
Acinetobacter baumannii strains in秋山徹, 切替照
大阪不会総会
Vietnam.
雄

2016年3月221) 多田達哉,日本の医療施設で分離される IMP-type メタ 秋山 徹,島田佳 第88回日本細菌学
岐阜県
ロ -β-ラクタマーセ産生多剤耐性緑膿菌株 世, 霜島正浩, 会総会
切替照雄

2015年3月

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

発表先

場所

年月日

該当なし
特許取得状況について※出願申請中のものは(発明名称)記載のこと。
登録番号

該当なし
※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国