アラビノガラクタン–
アラビノガラクタン–プロテイン分解酵素
プロテイン分解酵素の分解酵素の基質特異性メカニズム
基質特異性メカニズムのメカニズムの解明
独立行政法人 農業・農業・食品産業技術総合研究機構
食品総合研究所
金子 哲
はじめに高等植物の細胞表層プロテオグリカンであるアラビノガラクタン－プロテイン（ＡＧＰ）は、植物の生長・分化に関わる重要な分子である。増粘多糖類であるガムアラビックやカラマツアラビノガラクタ
ンはＡＧＰの一種であり、これらは乳化剤、安定剤等として食品、医薬品、工業用途で広く利用されている。ＡＧＰは、アラビノースやガラクトースに富む糖鎖が、ヒドロキシプロリンに富んだコアペプチドに O－結合した構造を持つといわれており、糖鎖は分子量の９０％以上を占める。本シンポジウムでは、ＡＧＰ糖鎖に作用する糖質加水分解酵素について、これまでに獲得した種々の酵素の基質特異性メカニズム解明へ向けた取り組みについて紹介する。
ＡＧＰのＡＧＰの糖鎖構造
ＡＧＰの糖鎖構造の詳細は不明であるが、アラビノシドやタイプＩＩアラビノガラクタン（β－１，３－ガラクタンの主鎖にβ－１，６－ガラクタンの側鎖が結合し、さらにその末端にアラビノースが結合した構造を持つ多糖類）であるといわれている。全てに共通するのはガラクタン骨格であり、タイプ
ＩＩアラビノガラクタンを加水分解できる酵素は、ガラクタン骨格に作用できる酵素と、修飾糖に作用できる酵素に分けることができる。
ガラクタン骨格
ガラクタン骨格（骨格（主鎖）主鎖）に作用する作用する酵素する酵素
エキソ－β－１，３－ガラクタナーゼは、β－１，３－結合したガラクタン鎖のみに特異的に作用し、非還元末端側からガラクトースを遊離するエキソ型酵素であるが、ＡＧＰ糖鎖に作用する場合には、側鎖ガラクトースの結合した分岐点をバイパスして加水分解し、β－１，６－ガラクトオリゴ糖を遊離するという興味深い性質を持つ。筆者らは、Phanerochaete chrysosporium より本酵素遺伝子をクローニングし、本酵素が糖質加水分解酵素ファミリー４３（ＧＨ４３）に属することを明らかにした（文献１）。
酵母の組換えタンパク発現系により P. chrysosporium 由来の組換え酵素を作製し、特性解析を行った。
P. chrysosporium 由来の酵素には、β－１，３－ガラクタン結合モジュールが存在し、糖結合モジュー
ルファミリー３５（ＣＢＭ３５）に属するモジュールであることも明らかにした。ＧＨ４３にはエンド型エキソ型の両酵素、また、アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、キシロシダーゼなど複数の酵素が分類されている。エキソ－β－１，３－ガラクタナーゼは基質特異性の厳密な酵素であり、この基質認識のメカニズムを解明したいと考え、組換え酵素の結晶化を行い、両モジュールを含む形での立体構造を解明することに成功した。ガラクトトリオースとの基質複合体構造の解析を行ったところ、ＧＨ４３とＣＢＭ３５の各モジュールにガラクトースが一つずつ結合していた。基質認識に重要であると思われるアミノ酸の候補が判明し、これらアミノ酸残基の変異体を作製し、基質認識に重要なアミノ酸残基の特定を進めている。
ガラクタン骨格
ガラクタン骨格（骨格（側鎖）に作用する作用する酵素する酵素
エンド－β－１，6－ガラクタナーゼは、β－１，６－ガラクタンのみに特異的に作用し、β－１，６－ガラクトオリゴ糖を遊離するエンド型酵素である。本酵素は糖質加水分解酵素ファミリー５（ＧＨ５）に属する。Trichoderma viride 由来の酵素のアミノ酸配列情報を利用し、ゲノム配列が解明されている
放線菌 Streptomyces avermitilis にも本酵素様配列があることを見出した。S. avermitilis より本酵素様遺伝子をクローニングし、大腸菌の組換えタンパク発現系を用いて組換え酵素を作製し、特性解析を行った（文献２）。エンド－β－１，6－ガラクタナーゼが属するＧＨ５もまた複数の酵素を含むファミリーであり、本酵素は、非常に基質特異性の厳密な酵素である。そこで、基質認識メカニズムを明らかにするため、S. avermitilis 由来の組換え酵素の結晶化を行い、立体構造解析に成功した。変異体を作製し、基質認識に重要なアミノ酸残基の特定を進めている。

修飾糖に修飾糖に作用する作用する酵素する酵素
放線菌 S. avermitilis は、ＡＧＰ糖鎖の骨格を分解できる２種類の酵素、エキソ－β－１，３－ガラクタナーゼ（Biosci. Biotechnol. Biochem. 70, 2745-2750, 2006）、エンド－β－１，6－ガラクタナーゼ（文献２）を有しており、一連のＡＧＰ糖鎖分解酵素を有している可能性が高いと考えられた。そこで、ＡＧＰの一種であるガムアラビックを炭素源として本菌を培養したところ、これまで存在が知られていないβ－L－アラビノピラノシダーゼ活性を培養上清に見出した。そこで本酵素活性を示す酵素を精製し、N 末端アミノ酸配列を決定し、S. avermitilis より本酵素様遺伝子をクローニングした。放線菌の組換えタンパク発現系を用いて組換え酵素を作製することに成功し、特性解析を行って確かにβ－L－アラビノピラノシダーゼであることを明らかにした。本酵素は、糖質加水分解酵素ファミリー２７（ＧＨ２７）に属する酵素であり、S. avermitilis 由来の酵素は、触媒モジュールの他に、糖結合モジュールファミリー１３（ＣＢＭ１３）に含まれるモジュール、さらに、２つの機能未知のモジュールからなる酵素であることが判明した。組換え酵素の結晶化を行い、４つのモジュールを含む形での立体構造解析に成功した（文献３）。ＧＨ２７はα－D－ガラクトシダーゼが分類されるファミリーである。α－D－ガラクトースとβ－L－アラビノピラノースとの立体構造的な違いは、Ｃ６の有無のみであり、イネ由来のα－D－ガラクトシダーゼでＣ６の認識に関わっているアスパラギン酸が、β－L－アラビノピラノースではグルタミン酸に置換されていた。このグルタミン酸をアスパラギン酸に置換した変異体を作製したところ、変異体はα－D－ガラクトシダーゼ活性を優位に示すようになり、S. avermitilis 由来の酵素は、唯一つのアミノ酸変異により、β－L－アラビノピラノシダーゼ活性を示していることが明らかになった。また、糖複合体構造解析を行い、本酵素のＣＢＭ１３が、アラビノースに特異的に結合する新しいタイプのＣＢＭ１３であることが明らかになった。
ＡＧＰの糖鎖構造として、直鎖のα－L－１，5－アラビナン鎖の存在を示唆する報告がある。エキソ－１，5－α－L－アラビノフラノシダーゼは非常に基質特異性が高い酵素であり、この直鎖状のα－L－１，5－アラビナン鎖にのみ作用し、L－アラビノースを遊離するエキソ型の酵素であり、ＧＨ４３に属している。Streptomyces chartreusis 由来のエキソ－１，5－α－L－アラビノフラノシダーゼのアミノ酸配列情報より、放線菌 S. avermitilis に本酵素様配列があることを見出した。そこで、 S.
avermitilis より本酵素様遺伝子のクローニングし、大腸菌の組換えタンパク発現系を用いて組換え酵素を作製し、特性解析を行った。S. avermitilis 由来の酵素は、ＧＨ４３触媒モジュールとＣＢＭ１３を有しており、両モジュールを含む形での結晶化、立体構造解析に成功した（文献４）。基質複合体構造解析を行ったところ、ＧＨ４３には３つのサブサイトがあり、ＣＢＭ１３には３つのサブユニットにそれぞれ一つずつアラビノフラノースが結合することが分かった。種々の変異体の特性解析により、α－L－１，5－結合に特異的な性質は、サブサイト＋１を形成する Asn159, Tyr192, Leu289 によるものであると示された。
また、ＧＨ４３に属するエンド型酵素と比較すると、サブサイト−１周辺が異なっており、ループ構造とアミノ酸残基の側鎖によって、エンド型酵素に存在するクレフトにあたる部分が存在しないことにより、エキソ型の性質を示していることが明らかになった。
おわりに本研究は、ＡＧＰ糖鎖に作用する糖質加水分解酵素に着目し、酵素の獲得およびその基質特異性を立体構造的に解明することを目的としている。基質特異性の明らかな酵素は、ヘテロ多糖複合体であるＡＧＰ研究にとって有用な解析ツールとなる。また、増粘多糖類の物性改変、有用オリゴ糖調製などに応用可能である。
文献
１）Hitomi Ichinose, Makoto Yoshida, Toshihisa Kotake, Atsushi Kuno, Kiyohiko Igarashi, Yoichi Tsumuraya, Masahiro
Samejima, Jun Hirabayashi, Hideyuki Kobayashi, and Satoshi Kaneko: An exo-beta-1,3-galactanase having anovel beta-1,3-galactan-binding module from Phanerochaete chrysosporium. J. Biol. Chem. (2005) 280,25820-25829.
２ ） Hitomi Ichinose, Toshihisa Kotake, Yoichi Tsumuraya, and Satoshi Kaneko: Characterization of anendo-beta-1,6-galactanase from Streptomyces avermitilis NBRC14893. Appl. Environ. Microbiol. (2008) 74,2379-2383.
３）Hitomi Ichinose, Zui Fujimoto, Mariko Honda, Koichi Harazono, Atsuko Uzura, and Satoshi Kaneko: A
beta-L-arabinopyranosidase from Streptomyces avermitilis is a novel member of glycoside hydrolase family 27. J.
Biol. Chem. (2009) 284, 25097-25106.
４）Zui Fujimoto, Hitomi Ichinose, Tomoko Maehara, Mariko Honda, Motomitsu Kitaoka, and Satoshi Kaneko: Crystal
structure of an exo-1,5-alpha-L-arabinofuranosidase from Streptomyces avermitilis provides insights into themechanism of substrate discrimination between exo- and endo-type enzymes in glycoside hydrolase family 43. J.
Biol. Chem. (2010) 285, 34134-34143.