学術奨励賞受賞論文

多重リン酸化を基盤とした時間情報制御
大出 晃士✉
東京大学 大学院医学系研究科 システムズ薬理
1.

えていた。しかし 3 回生の専門実習で行った染色体複体幹
中学から大学までテニスに勤しんだ。テニスのトレー製・修復の遺伝学では、遺伝学特有の方法論・理論立て

ニングには、腰にゴムチューブを巻き、負荷をかけながの切れ味に心惹かれた。ところが、腑に落ちないこともら様々な動作を行う方法がある。何も無いかのように普あった。例えば、DNA 損傷修復に関わる酵素群（これ通に動ければよし、もしバランスを崩すとチューブに引っ張られ身動きが取れなくなる。こうして体幹を鍛えよらの多くは遺伝学的解析から見いだされたものである）．．． ．
は、「損傷 DNA を認識して DNA 上に集積する」と解うというのだ。学術奨励賞は、授賞者にとってゴムチュ説される。なるほど、イメージングのデータを見ると、ーブのようなものかもしれない。奨励賞を頂けた喜びと、確かに損傷 DNA に修復タンパク質が集積していく。あこれから授賞者として歩もうというそこはかとないプ

たかも修復タンパク質が、あそこに損傷 DNA がある

レッシャーは、私の体幹を鍛え、バランスを崩しそうなぞ！と認識して、損傷部位に寄ってたかっているようでときに、それをいち早く教えてくれると思う。

ある。

本稿ではこれまで私を鍛えてくれた様々な出会いや修復タンパク質には目も耳もないので、DNA に結合環境を述べ、典型的な時間生物学研究者とは言い難い背するまでそれが損傷 DNA かどうかは解らない。それで景をもつ私が、どのようにして受賞論文の執筆に至るのも「認識して」という表現がしっくりくるほどに、見事か、必ずしも合理的でないその時々の選択を、出来るだな、あるいは合目的な振る舞いをタンパク質はみせていけ合理的に解説する。この試みを通して、時間生物学とる。これがどういった生化学的・反応日本時間生物学会の幅広さを描き出すことができればク質の特性に基づくのだろうか。そこで卒業研究では、嬉しい。

視覚でも、ミオシンでも、遺伝学でもない、染色体複製度論的なタンパや損傷応答機構を生化学的に研究している滝澤温彦先
2.

生・久保田弓子先生の研究室を志望した。正式な配属先

志望順位
自分がこれからやりたいことに順位をつける、ということはいつも難しい。やってみなければ解らないからだ。

希望調査まで、私は滝澤研究室を第一志望として挙げたことがなかったので、同級生からは驚かれた。

電子や原子のような単純な要素から、なぜ私のいるこの豊かな世界が出来ているのだろう。この種のナイーブ

3.

全か無かな疑問を胸に、世界を成り立たせている法則の一端を知近頃、色々なことに並行して取り組むことが好まれる

りたいと、大学では数学をやろうと思った。あるいは、らしい。しかし、ときには白黒をはっきりつけて、一つ世界＝私、と思うのならば、生物学もよいかもしれない。のことに集中してみるのもよいだろう。卒業研究から博そこで大阪大学理学部の入試出願では、数学科と生物学士課程まで、一貫して染色体複製開始の制御機構を研究科を選択した。内心は数学科が第一志望だったが、願書した。

提出直前に生物学科を第一志望、数学科を第二志望とし染色体は、一回の細胞周期でちょうど二倍に複製された。生物学科のほうが倍率が高かったためである。結果る必要がある。従って、複製の開始は一回の細胞周期にとして、“第一志望の生物学科に合格した。

一度だけ生じる。これは、Mcm2-7 タンパク質複合体の2 回生までは、視覚のシグナル伝達やミオシンのエネ染色体結合を時間的に制御することで保証されている。

度論や生物物理学的な定式

Mcm2-7 は主に細胞周期の G1 期において、ORC-Cdc6-化が盛んに行われている分野で卒業研究をしようと考Cdt1 タンパク質複合体依存的に染色体上の複数領域にルギー変換など、化学反応✉ kojiode@m.u-tokyo.ac.jp
時間生物学 Vol. 27, No. 1 (2021)32結合する。S 期においては、染色体複製は Mcm2-7 結とは幸運であった。こうした環境を巧みに整備し、誘導合領域から、リン酸化酵素である CDK/DDK に依存ししてくださった滝澤先生には心から感謝している。て開始する一方、新たな Mcm2-7 複合体の形成は阻害

博士課程では、OFF 状態がさらに OFF 状態を促進すされる。そのため染色体複製の開始は、各 Mcm2-7 結るフィードバックの存在を支持する現象として、スイッ合領域から一回の細胞周期で一度だけ生じる。

チ的なライセンス化阻害に対応して DNA 結合 geminin

geminin は多くの真核生物で保存されている Mcm2-が Foci 状に集積すること、ライセンス化阻害された7 染色体結合の阻害タンパク質である。面白いことに、DNA 領域の周囲は同様にライセンス化阻害される確率

geminin はある閾値濃度で、全か無のスイッチ的な様式が高いと想定されることを、蛍光観察や DNA 一分子観で Mcm2-7 の染色体結合を阻害する。Mcm2-7 染色体

察から見出した 5。

結合は G1 期に生じ、S 期以降は阻害されるという時間的な ON/OFF 切り替え制御である。従って、その阻害

4.

一寸先はタンパク質活性がある閾値濃度でスイッチ的に生じる一寸先は闇ということわざがある。しかし一寸後は闇のは、とても合目的である。ところが、geminin は Cdt1とは言わない。先のことは解らなくても、振り返ればそと直接結合するという活性しか知られておらず、全か無の時々の選択につながりを見出すことは容易である。学の非線形応答を感じさせる要素は見当たらない。一見す

位取得後、私は(A)タンパク質リン酸化に着目した(B)時ると単純な分子の相互作用から、いつの間に合目的な振間生物学研究を、(C)神戸理化学研究所の上田泰己研究る舞いが生じるのだろうか？

室で開始する。いずれも私の geminin 研究には登場しツメガエル卵を超遠心にかけて得られる卵抽出液は、染色体の正確な複製活性を有している。Mcm2-7 の染色ないこの三要素が、どのように関係するのかを振り返ってみたい。

体結合やその阻害の時間変化を追うために卵抽出液とA：私の geminin 研究にタンパク質のリン酸化修飾が基質 DNA を混和し、経時サンプリングしたが、基質主だって登場しないのは、CDK や DDK といったリンDNA を入れて 5~10 分後には Mcm2-7 の染色体結合が酸化酵素が極めて重要な役割を果たす染色体複製制御ほぼ完了してしまう。複数条件を調べようとすると、サを考えるとむしろ例外的なことであった。研究を始めてンプリングが忙しくて大変である。そこで、Mcm2-7 のしばらくは、「どの研究も皆、リン酸化ばかりで面白く染色体結合反応を遅らせようと、基質 DNA のインキュない」などと生意気を言っていたが、何年か経つうちに、ベーション温度を下げることにした。すると意外なこと

どうやらリン酸化はあらゆる局面で重要らしい、というに、低温下では Mcm2-7 の染色体結合は阻害された一気になってきた。なかでも印象的だったのは、CDK 基方、ORC-Cdc6-Cdt1 の染色体結合はむしろ増加した。

質タンパク質群のたかだか数か所に疑似リン酸化変異

どうやら私は、ORC-Cdc6-Cdt1（中間）複合体の染色を導入すると、染色体複製の CDK 要求性を概ねバイパ体結合ステップと、Mcm2-7 の染色体結合ステップとをスできるという報告であった 6,7。細胞の運命は、たった切り分けることに成功したらしかった。この発見自体は、数か所のリン酸化反応に委ねられることもあるらしい。

ほどなくして同様の結果が報告されたが 1、悔しいと同

B：力学系の数理モデルを学ぶ過程で、リミットサイ

時に、卒業研究での発見がそれほど間違いではなそうだ

クルと生命現象の関係に出会った。本学会の多くの方がと安心もした。

同意されると思うが、リミットサイクルの美しさには魔修士課程では、geminin とその結合相手である Cdt1力がある。しかも、慣れ親しんだツメガエル卵抽出液系が、この ORC-Cdc6-Cdt1 中間複合体のライセンス化活は、双安定性とリミットサイクルの関係を、細胞周期を性を ON/OFF 双方向に変換しているらしいことが解っ舞台に示した一連の研究に使われている 8,9。スイッチ

た。では、ON/OFF の二状態を可逆的に行き来する反的な応答を研究していた私が、次は振動系を研究したい

応系からスイッチ阻害応答を生み出すにはどうすればと思うのは時間の問題であった。

よいだろうか。一つの方法は、OFF 状態がさらに OFF

C：私の修士論文には、幾分か数理モデルを用いてフ状態を促進するフィードバックを考えることである。つィードバック経路の存在を主張する内容が含まれていまり双安定性を有する系を考えるということだが、力学た。そこで、数理モデルの使い方やその限界について評系を全く知らない私がこの種の考え方をできるように価していただくため、当時阪大生物の客員教授でもあっなるには数年を要した。上質なレビュー2 や教科書 3,4 をた上田泰己さん（現・東大/理研）に修士論文の副査をお通して、時間をかけて新しい分野を学ぶ経験ができたこ願いした。この縁がきっかけとなり、上田研（当時神戸理研）の半年に１回のプログレスレポート大会

時間生物学 Vol. 27, No. 1 (2021)
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“PROFES”に参加させていただいた。ここで、上田研のる特定のパターンで生じる時に、振動子を構成すること梁山泊然とした雰囲気を体感して、ぼんやりとここで研を明確に示していた 12。この振動原理は KaiC モデルで究してみたいと思った。

提唱されていたものとも、非常によく似ていた 15。

これらの三条件が揃ったころ、上田さんから新設されその後、私たちは複数サイトの可逆的多重リン酸化モる理研の研究センター（QBiC）メンバーに応募してみデルの振る舞いを系統的に調べ、チューリングパターンないかと、声をかけていただいた。まだ、学位が取得での生成や 16、カオスダイナミクスの出現を示した 17。こきるかもはっきりしていない段階であったから、声をかれらの一連の仕事で、決定論的力学系が示す特徴的な力けてくださった上田さんにも、応援してくださった滝澤学系が示す代表的な振る舞いをカバーすることができ先生にも、感謝である。

たと考えている。振る舞いの複雑さは、生化学反応経路

上田研での船出は、まさに一寸先は闇であった。私はの複雑さを必ずしも意味しない。単純な生化学反応から動物実験の経験もなければ細胞培養の経験すらなかっでも、複雑な応答は生じうる。これらは力学系が十二分たのである。これは困ったことになった、と思うと同時に示してきたことではあるが、「ミカエリス・メンテンに、身軽にもなった。身軽さついでに、せっかく学んだ式のみによって記述される可逆的多重リン酸化システ

力学系を使って、何かできることはないかと考えた。当ムでも、それは成り立つ」という小さな注釈を書き加え

時上田研では、CKI による温度非依存的なリン酸化反ることはできただろう。その小さな注釈は、生化学者と応の発見

10 に続いて、詳細な酵素反応の測定やモデルしての私にとっては大事な言及である。

化が進められていた。一方、リン酸化反応を主眼とするモデルそれ自体は、自律振動を陽に記述するものではな

5.

進化の痕跡い。振動とは可逆的なサイクルであるから、自律振動ともし研究者の個性が研究に現れるとすると、それは実リン酸化の関係を調べるには、脱リン酸化反応も併せて験系の設計や結果の解釈に、研究者のそれまでの履歴が可逆的なリン酸化を考えることが必要である。

投影されるからだろう。あたかも、現在の生物の様式に可逆的リン酸化モデルと複雑な応答の関係を調べた進化の痕跡が見え隠れすることがあるように。

数理モデルの仕事に、Zero-order ultrasensitivity と呼数理モデルの仕事と並行して、CRY1 に着目して、多ばれるスイッチ的な応答の存在を示した論文がある 11。

重リン酸化と哺乳類概日時計、とりわけ周期長制御とのこの論文では、リン酸化酵素と脱リン酸化酵素が、基質関係を調べることにした。ここで CRY1 を選択した理の一箇所をミカエリス・メンテン型の反応スキームに従由は、多分に過去の履歴が影響している。上田研では蓼ってリン酸化・脱リン酸化する、最も基本的な可逆的リ沼さんらによって、Cry1/2 ノックアウト細胞に Cry1 をン酸化モデルが扱われている。しかし、リン酸化サイトレスキューして表現型を測定する系が確立されていたが 1 箇所であるこのモデルでは、振動は生じない 12。そ18。元々はれでは、PER や CRY のようにリン酸化サイトを複数目的の実験系として開発されたものだ。しかし、日々卵にしたらどうだろうか。実はそのモデルも既に検証され抽出液から内在性 geminin を免疫除去し、変異精製ており、双安定性や多安定性が生じることが示されていgeminin を戻して機能解析していた私には、これは変異た 13,14。しかし、振動解が存在する、あるいはしないとCry1 遺伝子を導入して時計表現型を測定するための実いうことを明示した論文を見つけることは出来なかっ験系に思えた。さらに、染色体複製研究者の目をもってた。そこで、ある基質の複数サイトがミカエリス・メン

哺乳類概日時計タンパク質を見ると、CRY はひときわテン型の反応スキームに従ってリン酸化・脱リン酸化さ魅力的に見える。TIM はショウジョウバエにおけるれる過程のみから構成される可逆的多重リン酸化モデ

PER の結合相手であるが、脊椎動物では（概日時計でルを数値計算することにした。しつこく手作業でパラメはなく）染色体複製制御に関係する因子である。一方、ーターを変えて試していたところ、帰宅する電車の中で哺乳類では PER は TIM ではなく CRY と複合体を形成振動解を得た。

する。さらに、哺乳類の CRY と配列上高い類似性を持

ここからの展開は

Cry1 の転写制御と概日振動の関係を調べるかった。物理出身の研究員である

つクリプトクロムスーパーファミリーの一つには、青色

Craig Jolley が、パラメーターを広範囲にランダムに振光依存的な DNA 修復酵素である(6-4) photolyase があった大規模計算を行い、リミットサイクルを示す膨大なる。光刺激が重要な意味を持つ概日時計と DNA 修復酵パラメータセットを集めた。得られたパラメータセット

素の間で、クリプトクロムの機能変化が生じたとすると、

は、「一方向性のリン酸化・脱リン酸化サイクル」と「酵まさに進化的な履歴を CRY は背負っている。

素遮蔽を介した修飾状態の同期」という二つの要素があ

時間生物学 Vol. 27, No. 1 (2021)
34さっそく質量分析のスペシャリストで阪大時代の先かった。P-loop 周辺の多重リン酸化が、安定性以外のタ輩でもある鳴海さん（現・医薬基盤研）と共に、新しくンパク質のどの性質を変化させているのか、その実体を上田研に導入された質量分析計を用いて CRY1 を解析捉えることが今後の課題である。また、この仕事では、し、多くのリン酸化サイトを発見することができた。こ植物ホルモンオーキシン依存的にタンパク質分解を誘こでどのリン酸化サイトに着目するかが問題である。が、導する AID 法を Cry1 レスキューに組み合わせること上田研ではそれはさしたる問題にはならず、「全部解析で、オーキシン濃度依存的に CRY1 を分解誘導すると、する」という一択になる。私には「たくさんやれば、一概日周期長が短くなることを示した。AID 法は、私と同か所くらいは面白いリン酸化サイトもあるだろう」とい時期に助教として滝澤研に所属した鐘巻さん（現・遺伝う打算もあったように思うが、ともかくも、全てのリン研）が開発した手法である 22。いつぞや、鐘巻さんに「驚酸化サイトに対して疑似リン酸化変異と疑似非リン酸

きはないかもしれないが、だれもがそう信じているが誰化変異を作製した。一つくらいは...という目論見は良いもきちんと示していないことを実験で示すことは価値意味で裏切られ、ノックアウト細胞の Cry1 レスキューがある」と言われたことがある。これまで主に相関関係系から、概日周期長が大幅に変わるリン酸化サイト変異として示されていた CRY1 の不安定化と短周期化（あを複数得ることができた 19。これらの変異は共通して、るいはその逆）の因果関係を、その AID 法によって、

CRY1 の Phosphate-binding loop (P-loop)と呼ばれる完全ではないにせよ示すことができた。私のお気に入り領域周辺のセリン・スレオニン多重リン酸化サイトに対のデータの一つである。

する、疑似リン酸化変異であった。P-loop は DNA 修復酵素である(6-4) photolyase では基質認識ポケットを構

6.

これまでとこれから成している 20。酵素としてのタンパク質機能は異なって

CRY1 で行った多数のリン酸化サイト変異体を網羅いても、DNA 修復酵素と概日時計制御の間で、共通し的に調べ挙げる手段は、結果としてリン酸化サイトを指た機能ドメインが用いられているとすれば、大変興味深標として、機能的に重要な領域（例えば P-loop）を効率い。構的に類似したタンパク質が異なる生化学反応でよく探索することに繋がった。得られた多数の変異タン用いられる場合、どういった要素が必然的に満たされる

パク質シリーズは、分子活性を様々に変化させたときにべき性質で、どういった要素が偶然の進化の産物だった

生理機能がどのように変化するかを（例えばタンパク質のか、興味深いところだ。

安定性と概日時計周期長の関係）探索する、数理モデル

この間、理研上田研では”個体レベルのシステム生物学”を展開するために研究室の主軸がマウス遺伝学へと大きく転換し、また、私自身も神戸理研からマウス個体解析におけるパラメータサーチのような役割を果たした。
多重リン酸化は、タンパク質の構や相互作用様式をの睡眠研究を主軸とする東大医学部の上田研へ異動し変化させる有力な翻訳後修飾である。また、その反応様た。生化学 解析で は、生 理学的意義 （physiological

式はスイッチや振動、カオスなど多様なダイナミクスのsignificance）を示せ、と良く言われる。ツメガエル卵源泉になりうる。これまでは、重要な生理機能あるいはを用いていた時代にも、何度もその指摘を受け、そのたタンパク質機能が解った後に、その制御に関わるリン酸びに苦しんできた。細胞の周期長変化を示して満足して化サイトを探索する研究が主流だったと思う。しかし、いたのも束の間、生理学的意義はマウス個体表現型まで多重リン酸化修飾がシンプルな生化学反応から複雑で確認しなければいけない環境になってしまった。鵜飼さ

合目的なタンパク質機能を生み出す一つの方法ならば、ん（現・東大）洲崎さん（現・順天堂大）によるマウス

むしろ多重リン酸化サイトや、網羅的疑似リン酸化変異個体の Cry1 レスキュー系を使うことで、P-loop 周辺の体シリーズを指標として、未知のタンパク質機能を探索

多重リン酸化サイト変異が、ことごとくマウスの行動周することができるのではないか。今後は、多重リン酸化期長を変化させることを示すことができた。今度こそ生を起点として、タンパク質機能を探るアプローチを模索

理学的意義を示せただろうか。

してみたい。

さて、多くの知見が CRY1 のタンパク質安定性（分数理モデルと CRY1 の経験から、一つのリン酸化で解活性）が、周期長制御に寄与することを示している 21。

は成立しない、複雑な振る舞いが複数のリン酸化では実

しかし周期長を変化させる多数の CRY1 変異体解析か現できるかもしれないと納得することができた。同時に、ら、どうやら多くの変異体では確かにタンパク質安定性

見た目の振る舞いが複雑だったとしても、それはたかだが変化しているが、P-loop 周辺の変異は、必ずしもか数個のリン酸化サイトで達成できるかもしれないと

CRY1 のタンパク質安定性の変化を伴わないことがわ期待もできるようになった（図 1）。受賞講演では予定

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図 1.

可逆的多重リン酸化は生物の時間情報を構成する実体の一つかもしれない。

外に、「それなりに長く研究して解ったことは、たったDifferential Equations, Dynamical Systems, and an

これだけか」という心の声が漏れてしまった。しかし私

Introduction to Chaos (Second Edition)

にとっては、滝澤先生、上田さんをはじめとする、ここMorris W. Hirsch, Stephen Smale, & Robert L.にはお名前を挙げられなかった多くの方々と家族の支Devaney) (Academic Press, 2003).

えで得た「されどこれだけ」である。2012 年にはじめ

5.

(edsOde, K. L., Fujimoto, K., Kubota, Y. & Takisawa, H.て時間生物学会に参加したとき、なんとオープンで温かInter-originいコミュニティなんだろうと思った。以来、歴代学術奨

establishes an all-or-none switch for replication

励賞受賞者の方々の背中を追ってきた。私もその背中のorigin licensing. Genes Cells 16, 380-396, (2011).

一つになれるだろうか。今後の研究を通して、そうなろ6.

cooperativityofgeminin

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