公益財団法人 寺岡記念育英会
2020 年度 海外留学滞在費助成事業 研究活動報告書一覧
腎移植における慢性拒絶メカニズムの解明
岡山医療センター 泌尿器科 腫瘍・腎移植 光井洋介

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バイオ３D プリンターを使用した人工心臓パッチによる心筋再生法の開発
川崎医科大学総合医療センター 外科 心臓外科 渡邊達也
※対象者の所属・職位は、本助成事業への応募当時のものです。

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(表題)
(所属)岡⼭⼤学病院医⻭薬総合研究科 泌尿器病態学(⽒名)光井洋介(概要)腎移植における慢性拒絶メカニズムの解明
１． 渡航先 Cleveland Clinic
２． ⽇程

2020 年 6 ⽉〜2021 年 5 ⽉現在研究継続中（2024 年まで予定）

３． 研究及びその成果の概要
研究の背景・⽬的腎移植の拒絶メカニズ
ムの解明にマウスを⽤いることは技術的にも難しく世界でも数か所しか⾏われていない。
当研究室はマウス腎移植を確⽴している数少ない研究施設であり、さらに抗体関連急性拒絶を引き起こすマウス
モ デ ル （ CCR5 knockout model）を確⽴している（図１）。この CCR5
KO マウスは急性拒絶を惹起するモデルであるが、過去の研究過程でさらなる遺伝⼦のノックアウトや薬剤の投与を⾏うことで、結果的に慢性的な抗体関連拒絶を引き起こすことを報告している（図２）。しかし結果的に慢性拒絶を引き起こすことはわかっているが、その過程や詳細なメカニズムはわかっていない。今回の留学ではマウスの腎移植⼿技の習得と抗体関連拒絶メカニズムの解明を⾏った。
研究⽅法
まずはマウスの腎移植の⼿技の確⽴を⾏う。腎移植と⽐べると⽐較的簡単な⼼臓移植で⾎管縫合を練習しその後腎移植の⼿技の確⽴へと移⾏した。実験としては上記の慢性拒絶モデルマウスへの腎移植を⾏い、腎移植後の採⾎・検尿・腎組織の採取を⾏い、採⾎からは Donor specific antibody(DSA)・⾃⼰抗体の測定、組織からは RNA の抽出、遺伝⼦解析、病理学的組織の検討を⾏った。
研究成果
実験１：anti CD20 ab を⽤いた慢性拒絶モデルを使⽤した。今回は Protocol A とＢと 2 通りの投与量を⽤いて実験を⾏った。Protocol A(過去の報告)で慢性拒絶を惹起し、Protocol B で慢性拒絶の改善する－1－

のではないかという仮説のもとに実験を⾏っている。実際に薬剤を追加投与した群では⽣存率が改善し、ナノストリングを⽤いた遺伝⼦解析でも 2 群に有意な差を認めている（未発表データのため特定の遺伝⼦は伏せている）。今後は２群における病理所⾒の検討や追加治療によるさらなる拒絶の抑制が可能かどうかを検討予定である。

実験２：CCR5 と Cathepsin G(CG)を Double Knock out したマウスモデルを使⽤した実験を並⾏して⾏っている。CG は好中球から放出される因⼦であり腎臓の虚⾎再灌流時の線維化に関連しているとされている。今回このダブルノックアウトマウスを⽤いることで慢性拒絶時の CG の線維化への関与、メカニズム、新しい治療戦略の開発を予定している。

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（表題）バイオ３D プリンターを使⽤した⼈⼯⼼臓パッチによる⼼筋再⽣法の開発（所属）川崎医科⼤学総合医療センター

総合外科（⽒名）渡邊達也

（概要）
１．渡航先
The University of Chicago, Department of Surgery, Section of Cardiac Surgery
２．⽇程
2021 年 9 ⽉ 1 ⽇より研究開始。 2022 年 4 ⽉現在研究継続中。
３．研究及びその成果の概要
研究の背景
⼼不全は、⼼筋梗塞発症後の⽣存率の上昇、⽣存期間の延⻑から頻度が増加しており、より重要な疾患である。年間鬱⾎性⼼不全に関連する志望者は 53,000 ⼈にのぼる。現在⽶国では、重症⼼不全に対して第⼀選択となる治療は⼼移殖であるが、ドナー臓器の数の問題から年間約 2,000 件に限られる。
LVAD(left ventricular assist device)のような機械的補助技術は重症⼼不全に対する⼼移植の代替治療として発展してきている。しかし、LVAD は左⼼不全を治療するためにデザインされた治療であるため右⼼不全が重⼤な問題点となる。現在は右⼼不全に対する⻑期使⽤可能なデバイスは開発されていない。LVAD の有効性を⾼めるために右⼼機能を改善させる技術の開発が急務である。
⼼機能の改善や移植の代替療法となることを⽬指して⼼筋パッチ移植治療が多くの施設で取り組まれてきているが、⼤きな成果が出ているものは少ない。当ラボでは bFGF(basic fibroblast growth factor)を添加した ECM (extracellular matrix patch)を使⽤した右室移植実験で⼼機能の改善効果を報告している。しかし、⼗分な⼼機能改善効果が得られにくい原因として、scaffold を使⽤していることが細胞収縮を阻害している可能性、また scaffold を使⽤していない場合でも⾎管形成が不⼗分となるため⼗分な厚さ、強度のパッチが作成できないことにあると予想される。Scaffold を使⽤しない⼼筋パッチ内での⾎管形成の仕組みを明らかにし、内部での⾎管形成を改善する⽅法を確⽴することで、臨床使⽤可能で有⽤な⼼筋パッチ作成の開発につながると期待される。
研究の⽬的
本研究では、spheroid 間の⾎管形成について、spheroid を基とし、spheroid 間の⾎管形成の評価を、バイオ３D プリンターで作成したパッチを⽤いて明らかにすることを⽬的とした。
研究の⽅法
今回の実験では、spheroid を基とし作成したパッチ内での⾎管形成を評価するため、正確な間隔でspheroid を配列し、パッチを作成することが可能な３D バイオプリンターを使⽤した。また、⾎管形成の評価には⾎管内⽪細胞を使⽤した。
Cardiomyocyte に応⽤する前段階として、mMSC(mouse Mesenchymal stem cells)、HUVEC(humanumbilical vein endothelial cell)の spheroid を使⽤した。また、３D バイオプリンターの設定条件の検討を⾏った。また、バイオプリンターでのプリントと併⾏して 96well plate 内での spheroid 間の融合による⾎管形成の評価を⾏った。
－3－175ml flask を使⽤し、1.0x106cells/flask(mMSC), 2.0x106cells/flask(HUVEC)の細胞を播種し、70-80%confluence となった後、TrypLE を添加、遠⼼分離し、細胞を回収した。細胞数を計測し、⼀定数の細胞を96well plate に播種した。２⽇間の培養ののち spheroid を 96well plate から回収し、３D バイオプリンターにセットした（図１）。プリント後、needle 上で spheroid を培養し、needle から decannulate した（図２）。
Decannulate 後に 6well plate 内で数⽇間培養し、評価を⾏った。
96well 内での spheroid 融合実験では、３D バイオプリンターで使⽤した spheroid と同様の⽅法で作成し、mMSC spheroid と HUVEC spheroid を同⼀ well 内に混在させて培養し、融合させたのち 4,7,10 ⽇の培養を⾏い、免疫組織学的評価を⾏った。免疫組織学的染⾊を⾏ったサンプルは confocal microscope を使⽤して撮影を⾏った（図 3）。Confocal microscope を使⽤して得られた３次元データから、Fiji を使⽤して解析した。

研究の成果
３D バイオプリンターの機能異常や修理に時間を要したため、現在のところプリントして得られたサンプ
ルは限られているが、mMSC を使⽤した予備実験では、overlap を 10%-15%に設定することで spheroid 間の癒合が⼗分となり、decannulation の際にパッチが離開してしまうことがなくなった。現在は、mMSC で使⽤したデザイン、設定条件を⽤いて human cell 同⼠の spheroid を使⽤したパッチを作成し、評価を継続している。
Spheroid 融合実験においては、培養⽇数が⻑くなるにつれて、CD31(⾎管内⽪細胞)陽性となる範囲が有意に拡⼤することがわかった（図 4）。⼀⽅で CD31 陽性の領域に関しては培養期間が⻑いほど縮⼩していくことがわかった。陽性領域の縮⼩に関しては、培養期間が延⻑するほど、spheroid 間の結合が強くなり密度が濃くなり、パッチ全体のサイズが縮⼩していることを反映していると考えられる。この⾎管形成がspheroid 内の細胞の viability にどのように影響を与えるのか、また、培養⽅法の変更による⾎管形成の変化、viability の改善効果に関して、研究を進めていく予定である。

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