CREST - Ko team

ヒトES細胞における網羅的な転写因子誘導株の樹立とその発現解析
中武悠樹1)、若林俊一1)、Martin Jakt1)、合田徳夫1)、細川淳一2)、伊藤紀子3)、
西村邦裕4)、洪繁1)、的場亮3)、小原収2)、洪実1)
1) 慶應義塾大学 医学部、 2)かずさDNA 研究所、 3) 株式会社DNAチップ研究所、 4) 株式会社テンクー

Abstract
網羅的な遺伝子摂動は、転写ネットワークを解析するうえで、大腸菌や酵母などで用いられてきた手法である。我々は、哺乳類ではあまり行われていない本アプローチにより、マウスembryonic stem（ES）細胞において網羅的に転写因子誘導をおこない、その解析を行ってきた。
我々は、これまでのマウスでの解析を踏まえ、新たにヒトES 細胞での遺伝子誘導系を810遺伝子について構築し、そのうち510遺伝子について、誘導後のトランスクリプトームをデータベース化したので、本シンポジウムで報告する。本データベースは、遺伝子誘導後48時間のトランスクリプトームを、RNA-Seq（434遺伝子）およびマイクロアレイ（76遺伝子）により網羅的に解析しており、40遺伝子については同一サンプルをRNA－Seqとマイクロアレイ両方で解析した。この我々の構築したデータベースは、同一プラットフォームで遺伝子誘導後のダイナミックなトランスクリプトームを捉えており、摂動元が遺伝子誘導で明確であるため、ネットワーク構造を解析しやすい。また、ES 細胞なので様々な細胞系譜へと分化できることから、様々な角度で解析することが可能である。本シンポジウムでは構築したデータベースのみならず、構築中のバーコーディングシーケンスを用いた時系列データセットについても、広く議論したい。現在、寄託・公開するべく手続き中であるが、本プロジェクトで得られたバイオリソースおよびデータリソースは、遺伝子摂動の入力が明確であり、アウトプットも定量的かつ網羅的に利用できることから、統合的に利用できる新しいデータベースとなるにちがいない。

Materials & Methods
ヒトES細胞SEES3株

TET-ON遺伝子誘導システム

510遺伝子分のトランスクリプトームデータ

TransgenicヒトES細胞株

・Karyotype：XY
・Feeder free
(StemFit medium)
遺伝子誘導株の親株となる細胞株（SEES3株）は、成育医療センター阿久津英憲教授より分与頂いた。核型はXYでフィーダーフリー培地にて培養し、TET-ONシステムのコンポーネントであるrtTA3Gを恒常的に発現する細胞株を樹立し、１V株と命名した。
１V株の多能性については、テラトーマ形成実験にて、三胚葉への分化能を確認しており、核型も正常で、典型的な未分化状態マーカー遺伝子の発現も正常である。
1V株の発現プロファイルもRNA-Seqおよびマイクロアレイデータを取得しており、ネガティブコントロールとして使用できる。

・718遺伝子を誘導可能

810遺伝子の発現ベクター

標的となるORF発現カセットは、 PiggyBac（PB）レトロトランスポゾンを配し、ゲノム中にランダムに挿入される。PBとTET-ON system を組み合わせた既報のシステムに薬剤耐性遺伝子カセットを挿入した(Woltjen et al, Nature,2009; Vol.458 (7239): p766-770)。
ORFはKazusa DNA Institute, RIKEN BRC,
NITE/NBRC、DNASU、慶應義塾内研究室（岡野栄之教授）などで作成されたGatewayクローンを使用し、迅速クローニングをおこなった。
ORFの内、561が転写因子、40がクロマチン関連因子、55がコファクターと分類される。

・RNA-seq…..434遺伝子

・各遺伝子独立3株

上図は遺伝子誘導後3日後の細胞細胞形態である。ヒトES細胞は多能性幹細胞であるため、全ての細胞系譜に分化し得る。細胞形態として、顕著に分化したものについては、経時的に観察を行い、時系列に沿ったRNA発現解析のためのサンプルを取得した。
ORFが誘導されるとIRES配列で連結したLacZ遺伝子が発現するため、Xgal染色で陽性となる。ク
ローン樹立の際は、培養中のほぼ100％の細胞がLacZ陽性となるクローンを選別し、独立３株を樹立した。これらはRIKEN BRCに寄託されており、一般に入手できるよう、整備中である。
一部の遺伝子については、H9ヒトES細胞株においても、細胞分化が再現することを確認している。

Resultトランスクリプトームデータから様々なアウトプットが得られる

・Microarray…76遺伝子

上図は遺伝子誘導後2日後の遺伝子誘導後のScatter Plotである。X軸は全ての非誘導サンプル群の中央値（median）で、Y軸が遺伝子誘導したサンプルである。サンプルは独立２株から取得しており、非誘導群と遺伝子誘導群は並行してサンプル調整され、解析されている。また、いくつかの遺伝子では、時系列の異なるサンプルも取得されており、解析されている（0、6、12、24、48、96時間後）。遺伝子誘導後48時間のトラ
ンスクリプトームに関しては、RNA-Seq（434遺伝子）およびマイクロアレイ（76遺伝子）により網羅的に解析しており、40遺伝子については同一サンプルをRNA－Seqとマイクロアレイ両方で解析した。RNAシーケンスデータは2180ファイル、Microarrayは448ファイル生成した。
RNAシーケンスデータは１サン
プルあたり10M reads以上を取得し、おおよその平均Readは20M readsであった（右図）。

On Goings

得られたトランスクリプトームデータは、数理的に様々な解析が可能である。我々は網羅的に転写因子を誘導したため、下流の遺伝子がどれほど遺伝子ネットワークに影響を与えた等、相対的なスコアが算出できる。

左上図は、Y軸に遺伝子誘導後に２倍以上の発現変化があった遺伝子数、X軸に遺伝子をランキング順に並べたグラフである。抑制
された遺伝子数（青）と活性化された遺伝子数（橙）の比率は遺伝子によって異なり、それらは変化した総数に依存しない。右上図は一般的なPCA解析を示しており、遺伝子誘導したトランスクリプトームが異なる方向へと細胞分化していることが分かる。左下図はこ
れらのデータと公的DB上の組織由来のトランスクリプトームデータの相関係数をテーブルにし、組織との相関を産出した。データベースから遺伝子誘導後の細胞運命を大まかに予測できる。右下図は神経細胞分化したと予想されるヒトES細胞の機能評価で、電気生理的に成熟した神経細胞を誘導できることが明らかとなった。

ヒト組織由来のトランスクリプトームデータ

遺伝子誘導したヒトES細胞由来のトランスクリプトーム

細胞形態上に表現型があった遺伝子はトランスクリプトームに有意な変化があったと考えられる
ため、時系列（0、6、12、24、48、96時間）に沿ってRNAを取得した。独立株かつ非誘導対照を含めると1遺伝子あたり24サンプルが生じた。時系列解析する対象遺伝子は144遺伝子に上ったため、定法のRNA-seqでは予算面でも解析が困難であった（左上図）。そこで、定量する標的遺伝子を、800程度まで絞り、MolecularBarcodingにより絶対定量をおこなうことで、コスト効果を最大限に引き上げることを試みた（右上図および左下図）。なお、実験目的としては転写ネットワークの遷移に着目しており、選出した800遺伝子は転写因子に集中している。
これらのBarcodingデータは、遺伝子誘導後48時間のRNAシーケンスデータを保有しているた
め、Nomalizeすることで定量性を担保できると考えている。

Achieved Dataset
データベースから細胞系譜を予測

Biochem Biophys Res Commun. 2017 Aug 19;490(2):296301. doi: 10.1016/j.bbrc.2017.06.039. Epub 2017 Jun 10.

・510遺伝子を強制発現したヒトES細胞のトランスクリプトームデータセット（RNA-seq:434, array:76）
・718遺伝子を強制発現したヒトES細胞
・810遺伝子の発現ベクターLicensed under a Creative Commons表示4.0国際ライセンス(c)2017 Yuhki Nakatake（Department of Systems Medicine, Mitsunada SakaguchiLaboratory, Keio University School of Medicine）