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jPOST: 再解析プロトコルによる同定結果の質的向上○吉沢明康1)，田畑剛1)，守屋勇樹2)，河野信2)，奥田修二郎3)，渡辺由3)，山本格4)，松本雅記5)，高見知世5)，小林大樹6)，荒木令江6)，杉山直幸1)，田中聡7)，五斗進2)，石濱泰1)
1) 京都大学大学院薬学研究科，2) 情報・システム研究機構 ライフサイエンス統合データベースセンター (DBCLS)，3) 新潟大学大学院医歯学総合研究科，4) 新潟大学産学地域連携推進機構，
5) 九州大学生体防御医学研究所，6) 熊本大学大学院生命科学研究部，7) Trans-IT

概要
オミクス解析の結果は通常、FDR (False Discovery Rate) を用いてその品質が表されるが、これは「結果の中に一定比率でfalse positiveが混入している」ことを意味する。しかしtrue positiveが有限個であるのに対しfalse positiveは確率的に発生するものであるため、どのような配列に対してもヒットすると考えられる。この結果、「false positiveが混入している」結果を集積するとtrue positiveは重複して“真の値”に近づいていくのに対し、false positiveはいくらでも増加し続けることになり、結果的に集積データ中のFDRは上昇する。
そこでプロテオーム統合データベース『jPOST』計画では、タンパク質同定結果リストではなく、生データであるマススペクトルデータをjPOSTリポジトリから収集し、独自に再解析して、その結果をデータベースに収録することにしている。そのために、false negative 及びfalse positiveの両者を最大限抑制することが必要であり、我々はその手法の開発を行っている。
前者 (false negative) に対しては、「ピーク検出」と「データベース検索」の両方の段階で複数のアルゴリズムを併用する戦略を採用し、単一アルゴリズムに基づく場合と比べてタンパク質同定数を増加させることに成功した（昨年度発表）。
しかし当然、この結果には多くのfalse positiveが含まれる筈である。そこで次にfalse positive低減のための手法を開発し、サーチエンジンに依存しない形でマススペクトル解釈結果をスコア化して、これを用いて検索結果をソートし直す手法を考案した。この手法をtarget-decoy法によって検証した結果、同一のFDR値に於いて、通常の検索結果に比べてアサイン結果が1割以上増加することが確認できた。これは検索結果の質的向上を反映しており、今後は大規模データベース構築のためにパラメータの最適化を行う予定である。

 偽陰性（取りこぼし）の減少
この戦略のために，以下の 2 手法を用いた：ピーク検出 (peak picking) を複数の手法で行う
サーチエンジンを複数種類用いる（近年、 採用が増加している手法）

Search engine

ProteoWizard

Mascot18,163

ProteoWizard

MascotX!Tandem
Comet
ProteinPilot

23,657Whole Cell Proteome

ProteoWizard
MSconverter
ProteinPilot

Mascot26,688analyzed by AB SCIEX TripleTOF 5600
proteomeXchange ID: 000071

ProteoWizard
MSconverter
ProteinPilot

MascotX!Tandem
CometProteinPilot

34,175

Human Fibroblast_cell_aHDF1388-P9

MSconverter
27,085

(b)

戦略 1



928

（データベース検索で）探知可能な配列数を増加させる

1,182

 （結果数の増加、取りこぼし（第2種エラー）の減少）

偽陽性の結果(false positive assignment)を減少
させる

Whole
assignments：
34,175

5,566

1,281
971

249

534

828

649

Diﬀerence of search engines,
with multiple peak pickers(a) ピーク検出とデータベースサーチで複数ソフトを使うことでアサイン数は 2 倍近くになる(b) サーチエンジン共通の場合の、ピーク検出アルゴリズムの違いによるアサイン数の差(c) ピーク検出アルゴリズム共通の場合の、サーチエンジンの違いによるアサイン数の差 考案した新規プロトコルの概要
(a)

(a)

(b)
Assignment
Assignment
Assignment
Decoy Assignment
Assignment
Assignment
Decoy Assignment
Assignment
Decoy Assignment
Decoy Assignment
Assignment

6 targetassignments

Threshold724

Mascot 451 19,759 497
Comet26,688817 1,735
25,068

ProteinPilot
ProteoWizard
31,782
23,657
Diﬀerence of peak pickers,
with multiple search engines

 偽陽性（嘘ヒット）の減少
Assignment
Assignment
Decoy Assignment
Assignment
Decoy Assignment
Decoy Assignment
Assignment
Assignment
Assignment
Decoy Assignment
Assignment

ProteinPilot
26,037

2,123 1,975
1,582

4,024

1,884

X!Tandem
27,624

Figure 1.

戦略 2 （結果品質の向上、誤った同定（第1種エラー）の減少）

3 targetassignments(c)

20,308# Assigned
peptidesPeak picker283

基本戦略(a)Decoy ヒットの順位がダウンするとforward・decoy 両データベースから同定されたペプチドに対して peptide sequence tags(PSTs) の概念を適用し、MS/MS スペクトルの品質を検証した。ペプチドスコアが同定に足るくらい高い場合には、decoy ヒットでは PSTが測定される頻度が極めて低かった。

Figure 3. プロトコル全体の説明図。

 jPOSTスコアによるFDRの低下

Result list
sorted byscore orexpect

FDR control

我々のプロトコル
DatabasesearchResult list
sorted byscore orexpect

Result list FDR control
re-sortedby
jPOST score

イオンピークと、 アサインされたペプチド中のアミノ酸の対応関係を利用する。
検索エンジンによるスコア ・ Expect (E-value) や元々の順位は用いない。

Figure 4. データベース検索結果中の順位と FDR の関係を、検索エンジンのオリジナルの(a) 同一検索エンジンを用いたデータセットの差スコアを用いた場合と jPOST スコアを用いた場合について示す。(a) はデータセットの差による結果の差を示し、(b) は検索エンジンの差による結果の差を示す。全てのグラフで、横軸はソート結果中の順位を示し、縦軸はその順位に於ける FDR の値を示す。「decoy ヒットの順位を下げる」という目的のためには、グラフが右にシフトしているのが望ましい。
全てのグラフで、jPOST スコアを用いた場合はオリジナルのスコアを用いた場合に比べてグラフが右にシフトしている。

FDR(%)
252015

Mascot (Ion Score)

10

jPOST Score5(b)(a) 従来のデータベース検索プロトコル(b) 我々のプロトコル。イオンとアミノ酸 (PST を含む ) の対応情報は検索エンジンの結果から得る。
jPOST スコアはどの検索エンジンを使用したかとは無関係に、この情報から計算可能である。

何らかの方法でダウンさせ、(b) のような結果になったとする。この場合、同一 FDR (false discovery rate) の条件では真陽性結果が増加する。即ち FDRを減少させることができる。この考えに基づき、サーチ結果を手作業で検証するときのプロセスを反映させることで、新規の指標 (jPOST Score)を考案した。

1%DatabasesearchThreshold

Figure 2. (a) に示されるようなサーチ結果中の decoy ヒットの順位を従来法プロトコル

1%

1%
00

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

 まとめ
イオン・ピークとアミノ酸の対応関係を手作業で確認するプロセスを基に、新しいスコア（jPOST スコア ) を定義した。

Rank of peptide assignment

HeLa tryptic peptides by Thermo
Q-Exactive with C18 silica
monolith LC column (200 cm, 8h)
proteomeXchange ID: PXD005159

Human Fibroblast_cell_aHDF1388-P9
by AB Sciex TripleTOF 5600
proteomeXchange ID: 000071

Mouse Hepa tryptic phosphopeptides
analyzed by Thermo Q-Exactive
proteomeXchange ID: 001792(b) 同一データセットを用いた検索エンジンの差

1%

1%

現在の実装では、データベース検索の結果のFDR を低下させることができている。このスコアは検索エンジンによるスコアとは独立に計算でき、従って複数の検索エンジンの結果を統合するのに用いることができる。

1%

sorted by jPOST score

Mouse Hepa tryptic phosphopeptides
analyzed by Thermo Q-Exactive
proteomeXchange ID: 001792

全てのグラフでfalse positive ヒットを ( 特に大規模データに於いて ) より効率よく減少させられるように、今後も最適化を継続する。

FDR(%)
各ペプチド・ヒットの順位

関連するポスターもご参照ください :57（jPOST 全体、リポジトリ）, 58（データのキュレーション）,60（データベース）,
61（絶対定量データベース）

 謝辞
本研究・開発は科学技術振興機構 (JST)・バイオサイエンスデータベースセンター (NBDC) による統合化推進プログラム予算を受けて進められた。

トーゴーの日シンポジウム 2017 2017 年 10 月 4-5 日 , 東京大学

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C 2017 Akiyasu C. Yoshizawa (Kyoto Univ.)/ jPOST Project