酵素活性で見た嫌気性微生物による固形性デンプンの加水分解
Alpha-Amylase Activity of Starch Degrading Bacteria in Digested Sludge
水圏土壌環境研究室 樋口義丈（Yoshitake Higuchi）
指導教官 大橋 晶良、井町 寛之、原田 秀樹
１．はじめに嫌気性処理法は下水汚泥などの固形性有機物の処理技術として広く普及しているが、下・廃水の嫌気性処理に比べ処理速度が遅く、その原因は加水分解過程にあると言われている。加水分解については、純菌レベルでの研究は進んでいるものの、消化汚泥などの嫌気性微生物群集に関する研究は数少なく、固形性有機物にアタックする加水分解酵素は、バルク液中に溶解しているものと細菌の細胞膜表層に固着のものに分けられるが、消化汚泥内ではどちらの酵素が加水分解に大きく寄与しているのか、また加水分解細菌は基質によって加水分解酵素能が変わるのか、など不明な点が多い。このため、固形性有機物に対する嫌気性処理能力の向上には、微生物による加水分解メカニズムの解明が重要である。
そこで、本研究では、加水分解酵素としてよく知られ、酵素活性を容易に測定できるαアミラーゼに注目し、バッチ実験を通して消化汚泥における固形性有機物の加水分解の実態をつかむとともに、基質の違いによる消化汚泥のαアミラーゼ活性の影響ついて検討した。また、固形性デンプン分解優占嫌気性細菌を単離し、fluorescence in situ hybridization (FISH)法によりバッチ実
験における単離菌のモニタリングを行い、消化汚泥内のデンプン加水分解細菌とαアミラーゼ活性の関係について調査した。

消化汚泥より単離したデンプン加水分解細菌（SDB）による固形性デンプンの加水分解
２．実験方法αアミラーゼ活性評価：
バッチ実験は、下水消化汚泥(4000 mg VSS/L)を培地に加え、セルムバイアルにて 35℃で振とう培養を行った。幾つかの基質条件で実験を行った結果、固形性デンプンを優占的に加水分解している菌に注目した実験系をたてる必要性があった。そこで、基質として固形性デンプン(トウモロコシ抽出、COD 2000 mg/L)を用い、固形性デンプン加水分解菌(starch degrading bacteria : SDB)が優占するよう集積培養し、投入デンプンが消費された時点で、異なる４種類の基質(①固形性デンプン、②マルトース、③グルコース、④デンプンとグルコースの混合１：１)を各 2000 mg COD/L 再投入した。マルトースはαアミラーゼによるデンプンの加水分解代謝産物でありさらに加水分解を必要とする基質として、グルコースはαアミラーゼによる加水分解の最終代謝産物でありαアミラーゼ遺伝子のカタボライト抑制基質と考えられているため、それぞれ実験条件に組み入れた。バッチ実験期間中、適時サンプリングして、αアミラーゼ活性、マルトース、グルコース、全糖、s-COD および VFA 濃度を測定した。デンプン濃度は汚泥の全糖濃度がデンプン、マルトースおよびグルコースから成るとして、計算より評価した。
αアミラーゼ活性は、汚泥混合液(gross)、バルク液(filtrate)、細胞表層(net)の 3 形態別に評価した。汚泥細胞表層のαアミラーゼ活性は、汚泥混合液とフィルター濾過によるバルク液の酵素活性測定値の差から算出した。その酵素活性の測定はαアミラー
ゼ測定試薬（日本バイオコン）を用いて行い、活性値は CU 単位で示され、一般的な酵素単位(U)と比例関係にある。
固形性デンプン加水分解菌の単離：
消化汚泥から固形性デンプン加水分解菌SDBを固形性デンプンによる集積培養とロールチューブ法にて単離し、その16S rDNA配列より分子系統解析を行ったのち、バッチ実験における汚泥中の単離菌を FISH でモニタリングするために、単離菌を特異的に検出するプローブを作成した。
３．実験結果および考察
αアミラーゼ活性評価：
処理場から採取した消化汚泥混合液は、常にほぼ一定のαアミラーゼ活性(約 0.05 CU/g-VSS)を有していた(Fig.1、control)。
バッチ実験の一例として、デンプンを添加した系のαアミラーゼ活性の推移を Fig.1 に示しているが、混合液のαアミラーゼ活性(gross)は、デンプンの消費と共に上昇し、デンプンが枯渇すると減少に転じた。2.5 日目にデンプンを添加すると、活性は再び急上昇し 0.37 CU/g VSS に達した。この時デンプンは素早く消費され、その後の活性は徐々に低下した。なお、代謝産物としてのグルコースおよびマルトースの濃度は検出限界以下であった。バッ
チ実験でのαアミラーゼ活性の推移は、他の基質条件下でも同様の傾向を示したが、グルコースを単独で添加した系では、他の条件に比較してαアミラーゼ活性のピーク値は極端に低かった。
一方、バルク液に溶存のαアミラーゼ活性(filtrate)は、すべての実験系で汚泥混合液のαアミラーゼ活性(gross）に比較して非常に低い値であった。このことは、αアミラーゼの大部分は細胞表層に存在していることを示し、加水分解は固形性有機物と細胞表層の接触が重要であり、バイオフィルムやグラニュールを用いた処理方法は有効ではないことが示唆された。
バッチ実験におけるデンプン消費量と細胞表層に固着したαアミラーゼ活性(net)の関係を明らかにするため、基質消費量(-ΔS)と汚泥 net の活性(CU)をグラフしたところ、強い正の直線関係が見られた(Fig.2)。このことは、菌体の増殖に伴ってαアミラーゼ活性が増加することを間接的に意味しており、この線形の傾き(-ΔCU/ΔS)は、固形性デンプン加水分解細菌 SDB の単位生物量当たりのαアミラーゼ活性能 SAP(specificalpha-amylase potential)と見なせる。デンプン以外の基質に対しても消費量とαアミラーゼ活性（net）は同様に比例関係にあった。SAP の値は基質の種類によって影響され(Fig.3)、デンプンあるいはマルトースを含む基質では同様な値を示したが、グルコース単独基質の場合は他の基質条件に比べて明らかに低く、ほぼ 1/4 であった。これより、デンプンやマルトースを含み加水分解を必要とする基質は、SDB に何らかの要求刺激を与え、αアミラーゼ遺伝子の発現を活発化させることで、SDB のαアミラーゼ活性を上昇すると推察される。また、αアミラーゼ遺伝子のカタボライト抑制基質と言われているグルコースでも SAP の値が正であることから、SDB は常時αアミラーゼ遺伝子を発現し、αアミラーゼ活性能を有していると考えられる。

固形性デンプン加水分解菌の単離：
消化汚泥より単離した 4 種の固形性デンプン加水分解細菌 SDB はAeromonas 属に近縁な、新規グループを形成する菌であった(Fig.4)。この SDB を特異的に検出可能な DNA プローブを作成した。この単離菌に特異的な DNA プローブを作成し、バッチ実験における消化汚泥中のデンプン加水分解細菌を FISH で計数測定しところ、デンプン加水分解細菌数は基質の消費量に比例して増加した。グルコース単独基質の場合にも他の基質条件と同様な菌数の増加が見られた。また、菌数当たりの net のαアミラーゼ活性は、グルコース単独基質において低い値を示した。これは、αアミラーゼがデンプンやマルトースといった加水分解を必要とする基質に発現誘導されることを支持する上述の結果と符合していた。
４．まとめ
消化汚泥中のαアミラーゼのほとんどは細胞表層に存在し、固形性有機物の嫌気性処理には細菌と基質との接触が極めて重要である。消化汚泥内では様々な微生物が加水分解反応に関わり、汚泥全体として反応を追うことは困難であった、そこで消化汚泥内の固形性デンプン加水分解菌 SDB に注目し単離に成功した。SDB は新規グループを形成する菌であった。SDB はαアミラーゼ分解が要求される基質に接すると、菌当たりのαアミラーゼ活性が高まると考えられる。