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Carna Newsletter
BRAF 阻害剤の創薬では化合物の����.��.��

RAF 二量体化促進活性を理解することが重要

RAF キ ナ ー ゼ（ARAF, BRAF 及 び CRAF ）は
RAS-RAF-MEK-ERK シグナリングカスケードの重要な因子であり、受容体型チロシンキナーゼなどの上流シグナルを受けて GTP 結合型に変換された RAS との結合により二量体化が誘導され、下流の MEK-ERK シグナル伝達を活性化します �)(Fig.�)。

Fig.1. Raf dimerisation in normal and oncogenic signalling. (A, B) Ras-dependent Raf dimerisation is requiredfor Raf kinase activation mediated by normal growth factor-induced signalling (A) and by oncogenic signalling
driven by mutant RTK or Ras proteins (B). In these cases, B-Raf/C-Raf heterodimers predominate. (C) Constitutive
Ras-independent self-dimerisation is required for oncogenic signalling mediated by non-V600 B-Raf mutants. (D)In contrast, V600 B-Raf mutants can signal as Ras-independent monomers. RBD=Ras-binding domain.

中でも BRAF は、活性型 RAS 変異体の下流分子であり、またヒトでの腫瘍の �%、特に黒色腫の~��% で変異が見られることから、治療標的として大きな注目を集めています。BRAF[V���E] はBRAF 変異腫瘍の ��% 以上で検出されており、上流分子の活性化に依存することなく単量体として機能します。現在、�つの ATP競合型 RAF阻害剤、vemurafenib、dabrafenib及びencorafenib
が、BRAF [V���E/K] 黒色腫の患者に対して顕著な臨床効果を示し、FDA からこの疾患の治療薬として承認を受けておりますが、これらの薬剤の継続的な投与は薬剤耐性及び腫瘍の再発を起こします。加えて、vemurafenib及びdabrafenibについては皮膚扁平上皮癌などの重篤な副作用をしばしば引き起こすことが報告されています�)。最近の研究から、薬剤耐性や副作用を含むこれらの望ましくない現象の原因は、薬剤投与後の RAF 二量体化促進による ERK の活性化であることが分かってきました �)。
Vemurafenib、dabrafenib 及び encorafenib などの typeⅠ�/� RAF 阻害剤は BRAF V��� 変異単量体の活性を効果的に阻害するのですが、RAF二量体に対しては � つのプロトマーのうちひとつへ結合すると、もう一方のプロトマーに対する次の阻害剤の結合親和性を低下させてしまう
ため (negative cooperativity) 、RAF 二量体の活性を効果的に阻害することができません �)。そのため、typeⅠ�/� RAF 阻害剤の投与を継続した患者では、RAS 変異や上流の受容体型チロシンキナーゼの発現上昇による RAS の活性化 �)、または RAS の 活 性 化 非 依 存 的 に 二 量 体 化 で き る
BRAF[V���E] のスプライスバリアントの発現 �)などによる RAF 二量体化の増加を原因とした、薬剤耐性が生じてしまいます。また vemurafenibやdabrafenib は RAF の二量体化を誘導するため、RAS が活性化している野生型 BRAF 細胞で投与後に皮膚扁平上皮癌等を引き起こすことがありま
す (paradoxical activation)�)�)。
この様な状況から、より高い安全性と持続的な効果を備えた新しい次世代の阻害剤の開発において、如何に RAF の二量体化を防ぐかということ は 有 効 な 戦 略 で あ る と い え、こ の こ と か ら
RAF 二量体形成を同定できる適切な細胞アッセイの必要性が高まっています。

現 在 typeⅡ pan-RAF 阻 害 剤 及 び paradoxbreaker を含む次世代の BRAF 阻害剤の臨床試験が進められています。TypeⅡ pan-RAF 阻害剤はRAF 二量体と RAF 単量体の両方を同程度に標的とすることができますが、RAF をα-C helix IN 構造に固定化してしまい、その結果 RAF の二量体化を強く誘導します。そのため低度ではありますが paradoxical activation 引き起こしてしまいます。一方、paradox-breaker である PLX���� は、
BRAF 又は CRAF のα-C helix の C 末端を外側に押 し 出 す こ と で BRAF ホ モ 二 量 体 及 び
BRAF/CRAF ヘテロ二量体の形成を妨害することから paradoxical activation を非常に低く抑えます �)�)。

カルナバイオサイエンスでは相補型スプリット
ル シ フ ェ ラ ー ゼ ア ッ セ イ 技 術 を 用 い て RAF

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Vol.��

Carna NewsletterProtein X

Protein Y

Luciferase
fragment

Luciferase
fragmentlight

Possible combination of X and Y
1. BRAF/BRAF
2. BRAF/BRAF(V600E)
3. CRAF/BRAF
4. CRAF/BRAF(V600E)
5. CRAF/CRAF

Fig.2. Assay Principle

たアッセイを用いて、その二量体化を化合物が阻害するかどうかを定量的に測定することも出来ます (Fig.�)BRAF/CRAF

BRAF/BRAF
25000

8000

20000

600015000

RLU

RLU

dimerization assay を開発し (Fig.�)、� つの異なるRAFアイソフォームの組み合わせ (BRAF/BRAF,BRAF/BRAF[V���E], CRAF/BRAF, CRAF/BRAF[V���E], CRAF/CRAF) に つ い て、typeⅠ�/� RAF
阻 害 剤 (dabrafenib, vemurafenib, PLX����)、typeⅡ pan-RAF 阻 害 剤 (LY�������, MLN����,TAK-���) 並びに paradox-breaker (PLX����) を含む RAF 阻害剤の RAF 二量体化促進活性を測定し、結果がこれまでの知見と一致していることを確認しました �)(Fig.�)。この結果は ScientiﬁcReports で発表されています。

����.��.��

10000
04000
2000

50000Ligand (-)

Ligand (+)

Ref cpd
PLX7904

Ligand (-)

Ligand (+)

Ref cpd
PLX7904

Fig.4. Signal attenuation by PLX7904

さらに BRAF, BRAF[V���E] 及び CRAF(RAF�) をターゲットとした ELISA kit も販売しており、お客様ご自身で簡易にデータを取得していただけます。
RAF Dimerization カスタムアッセイサービス

QuickScout Screening Assist® ELISA ア ッ セ イキット

弊社提供製品・サービスについてのご相談、ご質問等ございましたら、お気軽にお問い合わせください。
引用：�) Br J Cancer. ����; ���(�):�-�. Durrant DE.
�) Sci Rep. ����; �(�): ���. Miyamoto K.

�) Nat Rev Cancer. ����; ��(��): ���-���. Karoulia Z.
�) Nature. ����; ���(����): ���-�. Nazarian R.

�) Nature. ����; ���(����): ���-��. Poulikakos PI.

�) Biochem Soc Trans. ����; ��(�): ���-���. Cook FA.
�) Nat Med. ����; ��(�): ���-���. Yao Z.
Fig.3. Quantitative analysis of RAF dimer induction by RAF inhibitors using split luciferase probes

弊社ではこの RAF dimerization assay の受託試験を提供しております。このシンプル、迅速そして定量的なアッセイでは、化合物による RAF二量体化誘導を評価することが可能で、RAF 二量体化並びに paradoxical activation や薬剤耐性といった有害事象の発生を抑えた RAF 阻害剤を開発するための薬物スクリーニングに有用な評価ツールとしてご利用頂けます。また、同 Assay
では予め LY������� によって二量体化を誘導しこのニュースレターの中で論文から引用した情報の日本語翻訳文はカルナバイオサイエンス社が作成しました。

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