研究報告2022 目次【研究開発部】

実用化実証事業「人工細胞膜システム」グループ◆ 総括･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 104◆ 微小気泡を用いる脂質二重膜の再形成技術････････････････････････････････････････････････ 106◆ 昆虫嗅覚受容体を発現したセンサ細胞の機能評価技術の開発････････････････････････････････ 109◆ DNAを用いた脂質二重膜接着・融合技術･･････････････････････････････････････････････････ 112◆ 業績･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 115

103

KISTEC研究報告2022

【研究開発部】人工細胞膜システム

人工細胞膜システムグループ
グループリーダー

竹内昌治【基本構想】
膜タンパク質は細胞膜中に存在し、細胞の内外への物質輸送・排出、シグナル伝達・変換などにおいて重要な役割を果たしており、１兆ドル余り(2011年)の医薬品の世界市場において、薬剤の標的の半数以上がこれら膜タンパク質や膜表在性物質だと言われている。リガンド同定済みのGタンパク質共役型受容体(GPCR)に関するだけでも約600億ドル(2009年)に上り、リガンド未同定のGPCRをはじめ、イオンチャネル
やトランスポータなどの膜タンパク質の機能や特性を一つ一つ解明することが、基礎研究のみならず創薬・医療分野における重要な課題である。しかし細胞膜中に存在する膜タンパク質は単離が困難なため、機能解析は難しいとされてきた。
創造展開プロジェクト(2009-2012年度)では、細胞膜のモデルとなる脂質二重膜を人工的に再構成した後、精製された膜タンパク質を導入することで、その膜タンパク質の特性を低ノイズで解析する戦略にもとづ
いて研究を行い、膜タンパク質を再構成するための２つの人工脂質二重膜システムを確立した。(1)電気的計測技術に適する平面膜システムでは、ヒト由来イオンチャネルの並列同時シグナル計測に適する自動化・集積化チップ、小型化チップをそれぞれ研究・開発した。(2)光学的計測技術に適するリポソーム膜シ
ステムでは、細胞サイズリポソームの形成手法を確立し、トランスポータの輸送現象やGPCRの基質結合を蛍光により観測することに成功している。
2013年度に実用化実証事業に移行後は、地域イノベーション戦略支援プログラムの支援も受けながら、創造展開プロジェクトで得られた研究成果を展開し、標的膜タンパク質の生体外での創薬解析支援システ
ムを確立すべく研究開発を行ってきた。具体的には、効率的膜システム要素技術の開発として、人工脂質
二重膜の集積化や薬剤スクリーニングに適したデバイスとするためのシステム全体の基盤研究開発を実施
し、膜タンパク質の調製・導入法の開発として、イオンチャネルやGPCR、トランスポータなどを人工脂質二重膜に効率的・体系的に導入できる手法の研究開発を実施している。最終的に、大学・研究機関などで使用できるシステムや製薬企業から薬剤候補化合物の評価を受託できる評価法の開発を目標とした。2021
年度、このイオンチャネルの機能評価技術を基盤とするベンチャーの起業に至った。一方で、NEDO事業(2015-2019年度)および地域イノベーション・エコシステム形成プログラム(2018年度開始)では、膜タンパク
質の機能利用による人工細胞膜センサに関わる研究開発を行っている。膜タンパク質である嗅覚受容体に代表されるように、生体のもつセンサは優れた感度・特異性をもつことが知られており、膜タンパク質をセンサ素子として活用するための研究開発を実施している。JST-CREST事業（2020年度開始）、科研費研究（2021年度開始）において、細胞をセンサ素子として用いる研究開発も企業と共同で進めている。周辺技術も含め、小型・高性能な次世代センサの実用化技術の開発を目標としている。

1.

2021 年度の研究目的
実用化実証事業 9 年目となる 2021 年度は、イオンチャ

響が避けられず、一つの標的タンパク質に限定して機能を探ることは難しかった。

ネル機能評価システムについて、事業化に向けた実用化研
究開発を推進し、起業への道筋を立てることを目標とした。

我々の目指す人工細胞膜プラットフォームは、細胞膜のモデルとなる脂質二重膜を簡便に再現良く形成し、その膜一方で、センサ開発に関しては、これまでの細胞膜センサ
研究の成果を応用・展開して、標的物質に応答する細胞をに再構成する標的膜タンパク質の活性を保持したまま機能解析を可能とするシステムである。実用化実証事業におセンサ素子とするバイオハイブリッドセンサの概念実証に向けた基盤研究を開始した。

いては、これらの人工脂質二重膜デバイスを膜タンパク質の機能解析や創薬スクリーニングといった場面において(1) イオンチャネル機能評価システムの開発

実用的なプラットフォームとして拡張していくための要
素技術、あるいは量産化に必要となる技術の実現を目標と

従来、膜タンパク質の機能解析は、培養細胞を用いた電気生理学的手法（パッチクランプ法）や蛍光イメージング

して研究開発を行ってきた。
2021 年度は、これまで継続してきたイオンチャネル機法によって行なわれるのが一般的である。しかしながらこれらの手法では、培養中の汚染対策や個体差の均一化処理

能評価システムについて、量産性や機能性向上に関する実用化研究開発を完遂し、ベンチャー企業の設立につなげるが煩雑であるほか、標的以外の雑多なタンパク質からの影ことを目標とした。

104

KISTEC研究報告2022

【研究開発部】人工細胞膜システム(2) バイオハイブリッドセンサの開発

生体機能と機械を融合したバイオハイブリッドセンサ

膜タンパク質は、匂いや味などの化学量センサとしての役割を生体内で担っており、その感度や特異性は人工的なに関しては、科研費研究（2021-2025 年度）による学術基
盤確立、JST-CREST 事業（情報担体；2020-2025 年度）にセンサに比べ非常に高いことが知られている。こうした膜タンパク質の機能を活用することができれば、小型で高性

よる実用性実証を目的とした研究開発を本格的に開始した。細胞上に発現させた受容体をセンサ素子とする細胞セ能の化学量センサを実現できると考えられる。
イオンチャネル機能評価システムの開発成果により、マンサに関して、東京大学、住友化学と共同で実施する。竹
内 G では、センサ細胞が標的物質に応答して発する微小イクロチップ上での脂質二重膜を再現良く形成し、そこに再構成したイオンチャネルの機能を活用できるようにな

シグナルをデバイスで検出するための計測基盤について研究を行い、概念実証のための計測システムを製作・開発

った。NEDO 事業（2015-2019 年度）では、昆虫嗅覚受容体を脂質二重膜に組み込んだ人工細胞膜センサのプラッする。
2021 年度は、微小シグナルの検出技術について、光学

トフォーム技術を確立し、地域イノベーション・エコシス
テム形成プログラムでも、この人工細胞膜センサの要素技

的技術および電気的技術それぞれの感度や応答性に関する比較検討を開始した。標的物質と細胞表面の受容体が結術の研究を行ってきた。その成果のデモンストレーション
として、ヒトの呼気中に混合したごく微量の疾患マーカの合すると、細胞内へのカルシウムイオンの流入が生じる。
光学的計測では、例えばこのカルシウムイオン濃度を蛍光検出を実証し、新聞・TV 等で取り上げられるなど注目された。その結果、生体機能と機械を融合したバイオハイブ

輝度に変換することで標的物質を検出する。電気的計測では、細胞内へのイオン流入（イオン電流）や膜電位変化をリッドセンサの基盤研究および概念実証を目的とする科
研費研究、JST 事業の採択につながった。

直接・間接的に検出する方法がある。こうした計測技術の感度や応答性能などの特長について、それぞれ検討を行っ

2021 年度は、標的物質に応答する細胞をセンサ素子とする細胞センサについて、その計測技術に関する基礎研究ている。また、こうした細胞や細胞膜機能を活用するバイオハイブリッドセンサに関する研究をまとめた総説がを開始した。光学的計測技術と電気的計測技術について、比較検討することを目的とした。

Lab on a Chip 誌に掲載された。
(3) 共同研究による成果
JST-CREST 事業（ゲノム合成：2018-2023 年度、東大白2. 2021 年度の研究成果(1) イオンチャネル機能評価システムの開発
JST 大学発新産業創出プログラム（START、2018-2021

髭教授代表、機能的人工染色体の設計と利用のための革新的研究）に参画している。同 CREST では東大大杉研と共年度）において、マイクロチップ上に細胞膜を簡便・再現
良く形成するコア技術を利用し、細胞内イオンチャネルに同で、人工細胞核を封入したリポソームを作製するためのデバイスを設計・開発している。カエル卵抽出液中で細胞対する薬剤候補物質の評価技術の実用化研究開発を進めてきた。計測チップに関しては、東レエンジニアリング社

核様構造が形成される機能を利用し、リポソーム中に細胞核を封入する。2021 年度は、細胞核封入リポソームの作と共同で性能向上を目指して改良を行った。特にチップベースとなるプラスチック部品については、設計変更した射製に関して進展があり、学術論文への投稿に向けて同成果をまとめているところである。

出成形品を完成させ、計測データの信頼性・再現性を向上できることが確認された。こうしたシステム開発成果に加上記のそれぞれの研究成果は、業績一覧に示す通り、国え、製薬企業との薬剤候補化合物評価の実証実験の結果を踏まえ、2021 年 8 月、同技術を活用し、イオンチャネル

際会議・国内学会での発表、学術論文、記者発表などとして積極的に公開している。また、コア技術・要素技術とし創薬支援の事業化を行う「株式会社 MAQsys」が KISTEC
発ベンチャーとして設立された。形質膜や細胞内イオンチて重要な成果については特許出願も行っている。

ャネルを標的とした薬剤候補化合物の評価を通して、新たな創薬市場の創出を目指す。KISTEC では、起業後もMAQsys 社の事業開始を支援するため、共同開発を継続する。
成果展開として、協力研究員による萌芽研究を実施し、その成果が Lab on a Chip 誌に掲載された。外部研究機関との共同研究も行っており、東大豊田研究室との成果はLangmuir 誌に採択された。国際医療福祉大相馬研究室との科研費研究や東工大松浦研究室との共同研究についても継続して実施している。

(2) バイオハイブリッドセンサの開発

105

KISTEC研究報告2022

【研究開発部】人工細胞膜システム

微小気泡を用いる脂質二重膜の再形成技術「人工細胞膜システム」グループ
大崎

寿久、橋本

和泉、三村

久敏、三木 則尚、竹内昌治

1. はじめに(1) 細胞膜モデルとしての平面脂質二重膜

我々の研究グループでは、一対の微小液滴の間に脂質二重膜を形成する人工膜法「液滴接触法」を発明し、その実細胞膜は、主に脂質二重膜と膜タンパク質から構成される。脂質二重膜は、両親媒性の脂質分子が疎水性相互作用用化を目指した研究を続けてきた。液滴接触法も脂質分子の両親媒性を利用した膜形成法である。デカンなどの油相により炭化水素鎖を内側に向かい合わせた構造をもつ。極性分子やイオン等の透過を抑制し、細胞内外を隔てる役割に脂質を分散しておき、そこに水滴を滴下するとその表面には自発的に脂質単分子膜が形成される。単分子膜が表面を主に果たす。一方、膜タンパク質は細胞内外への物質輸送や情報の伝達に関与している。膜タンパク質は、細胞のに形成されたこの油中水滴 2 つを接触させることで、その界面に脂質二重膜構造が形成される[4]。この方法は、液滴生理学的機能に対する寄与は大きく、その機能評価は創薬においても不可欠になっている。

の滴下操作のみで簡便・迅速に再現良く平面脂質二重膜を形成できる点で優れる。我々は、本方法をイオンチャネル

細胞膜モデルとしての平面脂質二重膜の研究は、
1960 年代から行われてきた。油水界面における脂質分子の単分子

機能評価システム[5]や細胞膜センサ[6,7]へと応用すべく、これまで研究開発を行ってきた。

膜形成を利用した刷毛塗り法や、気液界面に形成される単分子膜を貼り合わせる Montal Mueller 法など、脂質分子の(3) 脂質二重膜の不安定性

両親媒性の性質を使った親疎水界面における自発的な膜形成過程を利用する脂質二重膜形成原理が多く報告され平面脂質二重膜を工学利用する上での課題として、膜を作製する際の煩雑さや再現性に加えて、脂質二重膜の物理ている[1,2]。
平面脂質二重膜は、2 つのウェル間に設けられた高分子

的不安定性が挙げられている。脂質二重膜は厚さがわずか
5 nm ほどしかなく、また非共有結合性の疎水性相互作用

フィルムの微小な孔に作られることが多い。微小孔周縁部と脂質二重膜との界面は油相で保持され、ウェル間で電気により膜構造を維持している。そのため、わずかな衝撃や振動などの物理的外乱や電気的揺動が加わることで、容易的な絶縁が保たれた状況であることから、電気的な計測に適する。膜の静電容量など、電気的性質を明らかにする研に破壊される。こうした脂質二重膜の不安定性は、セパレータ微小孔の縮小による膜サイズの微細化や、微小孔周縁究や、膜タンパク質の中でイオンの透過制御に関わるイオ
ンチャネルの電気生理学的研究に至るまで、細胞膜モデル、部の表面物性を最適化することで改善できることが報告されている[8]。また、平面脂質二重膜に隣接しているウェ

細胞膜機能計測のプラットフォーム技術として平面脂質
二重膜は利用されている。一方で、これらの古典的な平面

ル水溶液が揺動し、外乱となって膜破壊が生じることもある。これを避けるため、我々のグループでは微小液滴のス

脂質二重膜技術は、手順の煩雑さや並列化の困難さから、実験室での利用にとどまっていた。

ロッシング現象に関する研究も行った[9]。しかしながら、こうした脂質二重膜の安定化にも限度はあり、膜の破壊をそうした中で、2000 年頃より、細胞膜モデルの作製やイオンチャネルをはじめ膜タンパク質の機能評価を細胞外未然に防ぐことは難しい。
そこで、破壊された脂質二重膜を簡便・迅速に再現性良でスループット良く行うための方法として、MEMS 技術の活用に着目が集まるようになった。MEMS 技術を使いく再形成する技術について検討を行っている。液滴接触法
デバイスでは、セパレータ微小孔において脂質二重膜が破作製するマイクロ流体デバイスは、微小流路や微小容器を設計することで、サンプル溶液などの希釈・混合といった壊されると液滴同士が融合した状況となる。これまでの研究により、融合した液滴同士を物理的に分断し、再度、接操作を迅速・効率的に行うことができる。また自動化や並列化といった特長も併せもつ。こうしたデバイス技術の研触させることで脂質二重膜を再形成できることが分かっている[10]。液滴の分断と再接触はモータ等を利用すれば究の進展により、細胞外での平面脂質二重膜の形成、すな
わち細胞膜を人工的に再現する「人工膜法」の研究が盛ん

自動化が可能である[11]。ただし、並列処理におけるデバ
イスの複雑化は避けられない。

に行われた。こうした成果を受けて、イオンチャネルをはじめとした膜タンパク質の機能評価や機能活用といった本研究では、破壊された脂質二重膜の再形成方法として、
微小気泡を用いて融合液滴を分断する技術について提案

成果展開が期待されている[3]。

した。

(2) 液滴接触法

106

KISTEC研究報告2022

【研究開発部】人工細胞膜システム

図 1：微小気泡による平面脂質二重膜の再形成のコンセプト図。
（左）デバイスのイメージ図。マイクロ流路を設け、外部のポンプから気泡を導入する。（1）～（4）膜が破壊された状態から、微小気泡により再形成されるまでの状態図。

2.実験方法(1) 微小気泡発生デバイスの作製

きたら、シリンジポンプを稼働させ、マイクロ流路を通してウェル底面より微小気泡を発生させた。平面脂質二重膜

脂質二重膜再形成のための微小気泡発生デバイスは、前述の液滴接触法を基盤とした[5]。8 字状に 2 つの円筒ウェの破壊や気泡の発生、その後の脂質二重膜再形成の成否といった一連の過程について、電気計測を行った。計測には

ル（直径 4 mm、深さ 3 mm）が接したダブルウェルを設け、その境界に直径 600 ミクロンの微小孔をもつセパレータ

パッチクランプ増幅器を用い、50 mV 定電圧印加下で、電流変化を観測した。観測時はアルミ箔で作製したファラデを配置している。ウェルは液滴の位置・接触圧力を制御しており、液滴は微小孔において接触して、面積が制御されーケージでデバイスを覆うことで、周囲の電磁波ノイズの影響を低減させた。

た平面脂質二重膜が形成される。微小気泡は、ウェル底面に設計した流路を介して発生させた。本研究では、気泡出

3.

口は直径 0.5 mm とした。また、電気計測のための銀－塩化銀電極もそれぞれのウェル底面に配置した。デバイスの再形成過程の模式図を図 1 に示す。前述の通り、液滴接触
法デバイスではセパレータ微小孔に脂質二重膜が形成さ

模式図を図 1 に示す。
微小気泡発生デバイスは CAD で構造設計を行い、小型れ、膜が破壊されると、この微小孔において各ウェルの 2
つの液滴が融合した状態となる（図 1-1）
。本研究では、セNC 切削機を用いて作製した。材料にはアクリル板（3 mm
厚、および 1 mm 厚）を用いた。切削したアクリル部品はパレータ近傍のウェル底面より微小気泡を発生させ、片側のウェル中に微小気泡を導入する（図 1-2）
。導入された気

ウェル、ウェル底部、マイクロ流路をそれぞれ設計した 3層からなる。これらは、アラインメントを施した上で熱圧

泡は、セパレータ微小孔に達すると融合した液滴を分断する（図 1-3）。その後、気泡はウェル底面より分離して液滴着により接合した。セパレータ部品は別途アクリルフィル
ムから切削し、2 つのウェル境界に挿入して接着した。気

表面から気中に解放される。これに伴い、セパレータ微小孔からも気泡が離れることで、液滴同士が再度接触し、脂泡導入流路は、テフロンチューブを介してシリンジに接続した。シリンジに空気を満たし、シリンジポンプによって質二重膜が再形成される（図 1-4）。
図 2 に、本デバイスを用いて微小気泡により平面脂質二気泡を吐出させた。ポンプを用いることで、吐出速度、および吐出時間を制御することができる。電極は銀線をウェ

重膜が再形成されたときの電流応答の結果を示す。図中
A-1 は、脂質二重膜が破壊された状況を示す。液滴同士がル裏面から挿入し、ウェル底部側の表面は銀－塩化銀ペー
ストを塗布・乾燥させた。

融合し、銀－塩化銀電極間が 1M KCl 溶液でショートした状態であるため、電流値はオーバーフローしている（図 1-(2) 微小気泡の発生による膜再形成

1 に対応）。A-2 において、微小気泡の発生のため、シリン
ジポンプを稼働させた（図 1-2 に対応）
。直後の A-3 では、

微小気泡発生デバイスを用いた脂質二重膜の破壊や再形成の検証は、ナノポア形成ペプチド（アルファ-ヘモリシ

気泡がセパレータに到達したことで、電極間が絶縁された状態となる。そのため、オーバーフローしていた電流値がン）の膜への再構成を電気生理学的に観測することで行った。まず、各ウェルに 20 mg/mL DPhPC 脂質/デカン溶液、ゼロとなっている（図 1-3 に対応）
。A-4 における鋭いピー
ク信号は、微小気泡がウェル底面を離れて気中に解放され、および 1 M KCl バッファ溶液を逐次滴下することで平面
脂質二重膜を作製した。次に、デバイスに物理的振動を外セパレータ微小孔において液滴同士が再接触した際に生じたものと考えられる。その後、一定の待ち時間の後、A-部から故意に加えて脂質二重膜を破壊した。破壊が確認で5 においてステップ状の電流値上昇が観測されている。こ107

結果と考察 微小気泡発生による平面脂質二重膜のKISTEC研究報告2022

【研究開発部】人工細胞膜システム

図 2：脂質二重膜の再形成プロセスにおける典型的な電流応答。

れは、アルファ-ヘモリシンが脂質二重膜に再構成し、ナノポアを形成した際に生じる信号である。本実験条件におけ

Plasma/Organelle Membranes Using an On-Chip Lipid
Bilayer System,” Sci. Rep. vol. 8, 17498, 2018.

るステップサイズ（コンダクタンス）も先行研究と一致しており、少なくとも A-5 の信号が観測されるまでに平面脂6. N. Misawa, S. Fujii, K. Kamiya, T. Osaki, T. Takaku, Y.
Takahashi, and S. Takeuchi, “Construction of a Biohybrid

質二重膜が再形成されたと考えられる（図 1-4 に対応）。
本研究では、微小気泡を利用した平面脂質二重膜の再形

Odorant Sensor Using Biological Olfactory Receptors
Embedded into Bilayer Lipid Membrane on a Chip,” ACS

成法について試作したデバイスによる実証を行った。電流
値変化の観測結果より、微小気泡により脂質二重膜が再形

Sens. vol. 4, no. 3, pp. 711-716, 2019.
7. T. Yamada, H. Sugiura, H. Mimura, K. Kamiya, T. Osaki, and成できることを示した。一方で、微小気泡による液滴分断などで課題があることも明らかとなり、気泡発生条件の検S. Takeuchi, “Highly Sensitive VOC Detectors Using Insect
Olfactory Receptors Reconstituted into Lipid Bilayers,” Sci.

討やデバイス構造の改良を進める予定である。本成果は、物理的に不安定な脂質二重膜の再形成を簡便・迅速に行え

Adv., vol. 7, eabd2013, 2021.
8. L. K. Bright, C. A. Baker, M. T. Agasid, L. Ma, and C. A.

ることを示したものであり、今後、自動化や複数の脂質二重膜への適用などに繋がるものと考えている。

Aspinwall, “Decreased aperture Surface Energy Enhances
Electrical, Mechanical, and Temporal Stability of Suspended【謝辞】

Lipid Membranes,” ACS Appl. Mater. Interface, vol. 5, pp.
11918–11926, 2013.

本研究内容の一部は、文部科学省地域イノベーション・
エコシステム形成プログラム、および国立研究開発法人科

9. Y. Izawa, T. Osaki, K. Kamiya, S. Fujii, N. Misawa, S.
Takeuchi, and N. Miki, “Suppression of Sloshing by Utilizing

学技術振興機構 大学発新産業創出プログラム（START）の支援により行われました。ここに感謝申し上げます。

Surface Energy and Geometry in Microliter Cylindrical Well,”Sens. Actuators B Chem., vol. 258, pp. 1036-1041, 2018.
10.Y. Tsuji, R. Kawano, T. Osaki, K. Kamiya, N. Miki, and S.
Takeuchi, “Droplet Split-and-Contact Method for High-【参考文献】
1. P. Mueller, D. O. Rudin, H. T. Tien, W. C. Wescott, “Methods
for the Formation of Single Biomolecular Lipid Membranes

Throughput Transmembrane Electrical Recording,” Anal.
Chem., vol. 85, pp. 10913-10919, 2013.

in Aqueous Solution,” J. Phys. Chem., vol. 67, pp. 534-535,
1963.

11.M. Gotanda, K. Kamiya, T. Osaki, N. Miki, and S. Takeuchi,“Automated Generation System of Cell-Sized Liposomes,”
Sens. Actuators B Chem., vol. 292, pp. 57-63, 2019.

2. M. Montal and P. Mueller, “Formation of Biomolecular
Membranes from Lipid Monolayers and a Study of Their
Electrical Properties,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 69,
pp. 3561-3566, 1972.
3. T. Osaki and S. Takeuchi, “Artificial Cell Membrane Systems
for Biosensing Applications,” Anal. Chem., vol. 89, pp. 216–
231, 2017.
4. K. Funakoshi, H. Suzuki, and S. Takeuchi, “Lipid Bilayer
Formation by Contacting Monolayers in a Microfluidic
Device for Membrane Protein Analysis,” Anal. Chem., vol.
78, no. 24, pp. 8169–8174, 2006.
5. K. Kamiya, T. Osaki, K. Nakao, R. Kawano, S. Fujii, N.
Misawa,M.
Hayakawa,
andS.
Takeuchi,“Electrophysiological Measurement of Ion Channels on

108

KISTEC研究報告2022

【研究開発部】人工細胞膜システム

昆虫嗅覚受容体を発現したセンサ細胞の機能評価技術の開発
三村

1.

「人工細胞膜システム」グループ
久敏、大崎 寿久、高森 翔、竹内 昌治

生物における匂いの感知は、嗅覚器官に存在する細胞に容体を通して細胞外の Ca2+が細胞内に流入し、細胞質のCa2+濃度の上昇が起こり、GCaMP の蛍光強度も増加する。

よって行われ、細胞膜に局在する嗅覚受容体タンパク質を通して行われる。嗅覚受容のメカニズムは脊椎動物と無脊その結果、センサ細胞では、溶液中の匂い物質の有無を蛍
光強度の変化として検知することが可能となる。

椎動物では異なっており、昆虫の場合は、膜タンパク質である嗅覚受容体 OR（Olfactory receptor）と嗅覚受容体共受(3) センサ細胞を利用した匂いセンサ

容体 Orco（Olfactory receptor co-receptor）が相互作用する
ことによってその役割を果たしている［1,2］。OR は、匂生物の嗅覚受容体は、分子構造を認識することにより、匂い物質を特異的に結合する。そのため、センサ細胞を利い物質を識別する役割を担い、様々な匂い物質を受容する
必要から、蚊では 80 種類前後が存在することが知られて用した匂いセンサは、人工物である従来の酸化物半導体センサなどに比べ、高い選択性と感度を有すると考えられる。

いる ［3,4］。Orco は、膜を介してナトリウムイオン（Na+）
やカルシウムイオン（Ca2+）などの陽イオンを輸送するイ

細胞センサを利用した匂いセンサの用途としては、匂い診断による病気の早期発見など、将来的には健康医療分野でオンチャネルとしての役割を担い、OR と相互作用することにより、匂い物質に反応して活性化されるリガンド依存の応用が期待されている。生物の嗅覚を利用した最近の例
としては、匂いに対する線虫の化学走性を利用することに性陽イオンチャネルとして機能する。細胞表面に局在する
嗅覚受容体に匂い物質が結合すると、活性化された嗅覚受より、早期がんの検出法が実用化されている［8］。さらに、がんに関連すると考えられる匂い物質のデータベースの容体を通して、細胞内への陽イオンの流入が濃度勾配に従って起こり、細胞膜の脱分極が引き起こされる。細胞の脱整備も進められており［9］、匂い物質に対する蚊の嗅覚受容体の反応特異性も明らかにされていることから［3,4］、

分極は、信号として神経細胞系を伝達され、匂いの関知が行われる。現在では、匂い物質の検知を目的として昆虫なそれらを比較参照することにより、がんに関連した匂い物
質検出における昆虫嗅覚受容体の応用可能性についても

どの嗅覚受容体を発現させた培養細胞はセンサ細胞と呼ばれ、次世代の匂いセンサへの応用を目指した研究が盛ん議論されている［5］。このように、昆虫の嗅覚受容体を発現させたセンサ細胞は、次世代の匂いセンサにおける基盤に行われている［5］。

要素として大きな注目を集めており、前述の蛍光反応を利用した光学的方法による匂いセンサだけでなく、センサ細(2) センサ細胞
匂い物質に対するセンサ細胞の応答検出には、蛍光反応

胞の応答を電気的に検出する匂いセンサの開発も進められている［10,11］。その一方で、センサ細胞の応答検出法が利用されることが多い。この目的のため、センサ細胞を作製する際には、OR と Orco の遺伝子に加え、カルシウムには、光学的方法と電気的方法があることからも分かるよ
うに、これまでに作製された匂いセンサの設計思想は開発

センサタンパク質（GCaMP）の遺伝子が培養細胞に導入される［6］。GCaMP は、緑色蛍光タンパク質である GFP、グループごとに異なっている。そのため、光学的方法と電気的方法による応答性能の比較はもちろんのこと、異なっCa2+結合タンパク質であるカルモジュリン、ミオシン軽鎖
ペプチドフラグメントの 3 つを遺伝子工学的に融合したたデバイスを用いて行われたセンサ細胞自体の性能評価
も単純に比較できるものではなかった。本研究では、細胞タンパク質であり、Ca2+がカルモジュリンに結合すること
により、GFP の蛍光強度が変化する。これを利用すること

センサの応答強度や反応特性といった機能評価を同一条件下で行うため、光学的方法または電気的方法、あるいはにより、センサ細胞内の Ca2+濃度の変化を、GCaMP の蛍
光強度変化としてモニターすることが可能となっている

その両方でセンサ細胞の応答を検出するためのデバイス開発を行った。

はじめに(1) 昆虫の嗅覚受容体［7］。そのため、センサ細胞に発現させた嗅覚受容体にリガンドである匂い物質が結合すると、活性化された嗅覚受

109

KISTEC研究報告2022

【研究開発部】人工細胞膜システム

図 1：作製した機能評価デバイス。（A）光学的方法で用いるもの。
（B）電気的方法で用いるもの。

2. 実験方法(1) 機能評価デバイスの作製

金の順でスパッタすることによって作製した。銀－塩化銀
電極は、銀線に銀－塩化銀ペーストを塗布して作製した。

本研究で作製した機能評価デバイスは、匂い物質に対するセンサ細胞の応答を、同一条件下で光学的及び電気的にマイクロ流路の入口と出口には、匂い物質を含む溶液のウ
ェルへの送液と廃液を行うため、テフロンチューブ（φ0.5

検出することを目的としている。光学的方法では、匂い物質に応答したセンサ細胞中の GCaMP の蛍光変化を検出すmm）を接続し、接着剤を用いて固定した。

る。電気的方法では、固定化標本法により［12］、匂い物
質で活性化された嗅覚受容体を通して輸送される陽イオ(2) 光学的方法による検出

ンを、電荷移動に伴う容量性電流として検出する。機能評
価デバイスの構造は、センサ細胞を注入するためのウェル

覚受容体を一過性発現させたセンサ細胞を作製し、その匂い物質への応答を検出することによって行った。ヒトスジと、そこに匂い物質を含む溶液を送液するためのマイクロ流路で構成されている。ウェルの底面は、光学的方法と電シマカ（Aedes albopictus）の嗅覚受容体（AaOR8）と共受
容体（AaOrco）、カルシウムセンサタンパク質（GCaMP）

気的方法に応じて、スライドガラスまたは金電極をそれぞれ配置して固定する構造となっている。電気的方法で参照の 遺 伝 子 を 動 物 細 胞 （ HEK293） に 導 入 し 、 匂 い 物 質（1-octen-3-ol）に反応するセンサ細胞を作製した。センサ

電極として使用するため、マイクロ流路には、銀－塩化銀
電極も配置した。

細胞は、培養で用いた培地をハンクス平衡塩溶液（0.1%
BSA 含む）に置換し、機能評価デバイスのウェルに添加

機能評価デバイスは、CAD で構造設計を行い、小型 NC
切削機と熱圧着プレス機を用いて作製した。材料にはアクした。機能評価デバイスは、37℃の CO2 インキュベータ内に 30 分間静置することにより、ウェル底面のスライドガ

リル板 (4 mm 厚と、1 mm 厚) を用いた。切削したアクリ
ル部品は、マイクロ流路とウェルからなる上層部、スライ

ラスにセンサ細胞を接着させた。機能評価デバイスの入口
側テフロンチューブには、分岐したテフロンチューブを介

ドガラスまたは金電極を固定するための下層部からなる。
上層部のマイクロ流路とウェルは熱圧着により接合した。

して、2 台のシリンジポンプを接続した。機能評価デバイ
ス内のセンサ細胞の観察は、倒立顕微鏡を用いて行った。

上層部と下層部の固定にはネジを用いた。光学的方法で用いるスライドガラスには、ガラスカッターを用いて所定の匂い物質に対するセンサ細胞の応答は、匂い物質を含まないハンクス平衡塩溶液（0.1% BSA 含む）に続けて、匂い

大きさに切断した No.3 厚ガラス (0.25~0.35 mm) を使用した。電気的方法で用いる金電極は、所定の大きさに切断物質を含む同様液を連続して送液し、その際に起こる、青色光で励起され、緑色光で検出される GCaMP の蛍光変化

した No.3 厚ガラス基盤に、アクリル板を切削して作製したマスクをポリイミド耐熱テープで密着固定し、クロム、を記録した。

光学的方法で用いる機能評価デバイスの検証は、昆虫嗅

図 2：匂い物質に対するセンサ細胞及びセンサベシクルの応答。
（A）センサ細胞の蛍光顕微鏡観察像。
（B）光
学的方法によって検出したセンサ細胞の応答。
（C）電気的方法によって検出したセンサベシクルの応答。匂い物質（1-octen-3-ol）の濃度はいずれも 100 µM。

110

KISTEC研究報告2022

【研究開発部】人工細胞膜システム(3) 電気的方法による検出

物質に対するセンサベシクルの応答結果を示す。匂い物

電気的方法で用いる機能評価デバイスの検証は、検体応答の確実性を保証するため、昆虫嗅覚受容体を再構成した質を含まない溶液（コントロール）に比べ、匂い物質を含む溶液を送液した際には、計測された電流値が増加し脂質ベシクル（センサベシクルと呼ぶ）を用いて行った。
センサベシクルの合成には、無細胞合成系を利用した。まていることを示している。溶液中の匂い物質に対し、センサベシクルが反応していることが分かる。電流値の増ず、試験管内転写反応により、AaOR8 と AaOrco の DNAを鋳型として、それぞれの mRNA を合成した。次に、両加は、匂い物質によって昆虫嗅覚受容体が活性化され、これを通して運ばれる Ca2+が増加したためと考えられる。

方の mRNA を、脂質と一緒に無細胞翻訳系に加えること
により、匂い物質（1-octen-3-ol）に反応するセンサベシク

輸送される Ca2+が増加したことにより、それによって誘起される容量性電流も増加したと考えられる。

ルを試験管内で合成した。センサベシクルは、遠心操作によって簡易精製し、機能評価デバイスのウェルに添加した。

本研究では、次世代の匂いセンサ素子となり得るセンサ
細胞やセンサベシクルの検証や比較のため、これに利用

機能評価デバイスは、スイングロータのバケットの中心に置いて遠心することにより、センサベシクルをウェル底面できる機能評価デバイスを作製した。作製したデバイス
は、顕微鏡を利用した光学的方法と、パッチクランプアの金電極に吸着させた。センサベシクルの吸着と金電極の絶縁のため、金電極表面には、チオール層と脂質層からなンプを利用した電気的方法により、匂い物質に対するセンサ細胞やセンサベシクルの応答を検出することができる自己組織化単分子膜層を予め形成した。機能評価デバイ
スの入口側テフロンチューブには、分岐したテフロンチュる。昆虫嗅覚受容体を発現させたセンサ細胞とセンサベ
シクルを用いた実証試験により、前者は蛍光観察により、ーブを介し、3 台のシリンジポンプを接続した。電流計測を行うため、金電極と銀－塩化銀電極はパッチクランプア

後者は容量性電流計測によって、匂い物質に対する応答をそれぞれ検出できることを示した。今後は、電気的方ンプに接続した。匂い物質に対するセンサベシクルの応答
は、塩濃度と匂い物質の有無が異なる 3 種類の溶液を送液法によるセンサ細胞の応答検出や、光学的方法と電気的方法による同時検出についても検討する。本デバイスのすることにより検出した。① 低塩濃度溶液、② 高塩濃度
溶液、③ 匂い物質を含む高塩濃度溶液、を順番に送液す活用により、光学的方法と電気的方法の詳細な比較を行うと共に、匂い物質に対するセンサ細胞とセンサベシク

ることにより、昆虫嗅覚受容体は匂い物質によって塩濃度
勾配存在下で活性化される。その結果、活性化された昆虫

ルの応答特性を明らかにすることにより、昆虫嗅覚受容体を利用した次世代匂いセンサ素子の詳細な解析が可能

嗅覚受容体を通して陽イオンの輸送が起こり、これによって誘起されたと考えられる容量性電流を記録した。

になるものと考えられる。

【謝辞】
3.

結果と考察

本研究は、JST、CREST、JPMJCR18S5 の支援を受けたも作製した機能評価デバイスを図 1 に示す。同一のデバイ
ス構造を用いて、スライドガラスと金電極を交換するこのです。ここに記して感謝申し上げます。

とにより、匂い物質に対するセンサ細胞またはセンサベ
シクルの応答を検出することが可能である。
これにより、【参考文献】

光学的方法と電気的方法による検出手法の比較に加え、評価対象の匂いセンサ素子を同一条件下で直接に比較す

2. Wicher D, et al., Nature 2008, 452, 1007-1011
3. Carey AF, et al., Nature 2010, 464, 66-71

ることが可能になると考えられる。
図 2 に、本研究で作製した機能評価デバイスを用いて

4. Wang G, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 2010, 107,4418-4423

検出した、匂い物質に対するセンサ細胞またはセンサベ
シクルの応答結果を示す。図 2A は、機能評価デバイス

5. Hirata Y, et al., Lab Chip 2021, 21, 2643-2657
6. Mitsuno H, et al., Biosens. Bioelectron 2015, 65, 287-294のウェル中における、匂い物質の添加前後のセンサ細胞の蛍光観察像を示す。匂い物質の添加によって緑色蛍光7. Tian L, et al., Nat. Methods 2009, 6, 875-881
8. Hirotsu T, et al., PLOS ONE 2015, 10, e0118699の輝度が増し、センサ細胞が反応していることが分かる。
粒子状の構造体それぞれが一個のセンサ細胞に相当する。

9. Janfaza S, et al., Database 2017, bax055
10.Lee M, et al., ACS Nano 2015, 9, 11728-11736

緑色蛍光はセンサ細胞に発現している GCaMP に由来する。蛍光強度の増加は、匂い物質の添加によって活性化

11.Bazzone A, et al., Methods Enzymol 2017, 594, 31-83

1. Sato K, et al., Nature 2008, 452, 1002-1006

された昆虫嗅覚受容体を通し、細胞外から細胞内に Ca2+が輸送され、細胞質の Ca2+濃度の上昇を検知した GCaMPの蛍光強度が増加したことによる。図 2B は、匂い物質の添加によって起こった、センサ細胞の蛍光強度の時間変化を示す。匂い物質の添加から、およそ 2 分後に蛍光強度は最大に達している。
図 2C に、機能評価デバイスを用いて検出した、匂い

111

KISTEC研究報告2022

【研究開発部】人工細胞膜システム

DNA を用いた脂質二重膜接着・融合技術「人工細胞膜システム」グループ
高森

翔、三村

久敏、大崎 寿久、竹内昌治

1. はじめに(1) 脂質二重膜の融合

ンを形成することが難しいことも多い。さらに、過度な強度の電場は細胞を損傷させてしまうことも知られている。

脂質二重膜（脂質膜）は両親媒分子である脂質が水溶液中で炭化水素鎖間の疎水性相互作用を介して構成する構(3)造であり、原核細胞から真核細胞まであらゆる細胞膜の基本構造として知られている。

細胞内では SNARE と呼ばれるタンパク質複合体が膜融合を誘起することが知られている[3]。
そして、
この SNARE

脂質膜は細胞膜だけでなく、細胞内の様々な細胞小器官の基本構造でもある。核や葉緑体、ミトコンドリアは二層タンパク質は出芽酵母からヒトまで様々な真核細胞で見つかっている。近年、ペプチドの人工合成を用い、SNAREの脂質膜で、小胞体やゴルジ体などは一層の脂質膜で覆われている。これら脂質膜で分画された構造体は細胞内で物タンパク質の構造と融合メカニズムを模倣したペプチド
デバイスも開発されている[4]。これら SNARE タンパク質

質勾配を生じさせ、この物質の偏りが細胞小器官ごとに異なる生化学的な機能性を生み出している。

や SNARE 模倣ペプチドを用いた膜融合はその原理から選択性に優れている。また、電場の印加を必要としないとい

脂質膜は細胞外物質の細胞内への取り込み、細胞間情報伝達などにも関係している。神経細胞間の情報伝達は、神う点で電気融合よりも細胞への害も少ない。しかし、複数種類の膜融合を選択に誘導するための複数種類のペプチ

経伝達物質を内封したシナプス小胞膜が細胞膜に融合（膜融合）し、神経伝達物質を細胞外へ放出することで行われドデバイスの設計などは原理的に難しい。
近年、ペプチドデバイス設計の低い自由度を克服する方る。この膜融合現象は細胞外でも頻繁に見られ、筋芽細胞の多核筋管への分化、受精における卵と精子の融合などが法として DNA を用いた SNARE 模倣デバイスも開発されている[5]。DNA を用いた場合も、ペプチドと同じように有名である。
膜融合現象を人為的に誘導することで、細胞融合やリポ高い膜融合の選択性を実現することができる。さらに、ワトソン・クリック塩基対（A/T、G/C）の選択性に起因する、ソーム(脂質二重膜小胞)融合、細胞・リポソーム融合を起こすことができる。特に、リポソーム・細胞融合は新しい配列設計における高い自由度を利用することで、選択性の高い膜融合デバイスを同時に複数種類設計することがで

細胞内物質導入法として近年注目されている[1]。膜融合の分子メカニズムについては現在も活発に研究が行われきる。この自由度の高さは DNA のプログラマビリティと言われ、DNA ナノテクノロジーの分野では様々なデバイているが、図１のような流れだと考えられている。標的脂質膜が近接し、近接膜が同時局所破壊され、脂質膜の自発スが開発されている。しかし、これら SNARE 模倣デバイスを用いた膜融合は総じてデバイス単体では電気融合な的再形成の特性によって融合膜が形成される。

どに比較すると膜融合効率が低いことが知られている[6]。

(2) 電気融合(4) DNA と電気を組み合わせた膜融合

SNARE 模倣デバイスを用いた膜融合

人為的に膜融合を起こす技術には様々なものがあるが、前述した DNA のプログラマビリティを活かしつつ、融最も一般的な方法は電気融合だろう[2]。まず、リポソームや細胞などの標的サンプルに交流電場を印加し、誘電泳動

合効率を改善する方法として、DNA と電気融合を組み合わせた方法も提案されている。この方法は DNA-assisted

現象の一つであるパールチェーン形成が誘導される。形成されたパールチェーンにパルス電場を印加すると、近接しselective electrofusion（DASE）法と呼ばれ、DNA で脂質膜の選択的接着を実現し、そこへパルス電場を印加することたリポソーム膜や細胞膜に電気穿孔が誘起され、自発的な脂質膜の再形成を経て膜融合が起こる。電気融合は専用ので接着膜の融合だけを誘起する[7]。この DASE 法を用いればリポソームと培養細胞の膜融合を実現できる可能性

電場発生装置を用いることで比較的容易かつ短時間で行うことができる方法だが、パールチェーン形成による標的がある。前述したようにリポソームと培養細胞の融合法は注目を集めている技術であり、本研究では DASE 法を用

膜のペアリングが本質的にランダムなプロセスであり、狙った膜ペア以外の融合（膜 A と膜 B を融合させる際に膜いたリポソームと培養細胞の融合を目指し、DNA ナノデバイスを用いたリポソームと細胞の接着に関する実験をA 同士、膜 B 同士の融合も同時に起こってしまう）も頻繁に起こる（低い選択性）という欠点がある。また、リポソ行った。

ームや細胞の種類・組成に依存して交流電場への応答性に違いが生じるため、そもそも目的の膜ペアのパールチェー

112

KISTEC研究報告2022

【研究開発部】人工細胞膜システム

図１：脂質二重膜の融合手順．標的脂質二重膜を近接させ、同時局所破壊を行うことで、脂質二重膜の自己修復能を利用した膜融合を誘導することができる．

2. 実験方法(1) DNA ナノデバイスの設計と構築

図２ 本研究で作製した DNA ナノデバイスの構造と DNA を介した脂質二重膜接着のメカニズム.

SNARE 模倣 DNA デバイスとして図 2 のような構造のDNA を設計した。各々のデバイスは２本鎖 DNA のスペーサー（γ/γ*）を中心とし、一方の末端の鎖に脂質膜への用いた。DNA で機能化したリポソームと HEK293T 細胞
を 1.5 mL チューブで等体積混合し、室温で 4 時間培養しアンカー用コレステロールが修飾されている。反対末端には相補鎖と選択的結合を起こすための１本鎖 DNA（α/α*、た。その後、5 μM YOYO-1、5 μM SYTO17、5 μM WGACF405S を加えて蛍光染色を行い、共焦点顕微鏡で蛍光観

γ/γ*）が付与されている。コレステロール修飾された１本鎖 DNA を購入し、ハイブリダイゼーション用バッファー察を行った。

（100 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA）にそれぞれの１
本鎖 DNA を 6.4 μM となるように溶解した。このバッフ

3.

ァーに溶解した DNA を PCR チューブに 40 μL ずつ分注
し、サーマルサイクラーを用いて 75℃から 4℃まで９時間

結果と考察
DNA デバイスで機能化したリポソームを図３に示す。

リポソーム膜の機能化には前述の濃度条件の DNA を加え、室温で４時間培養した。リポソーム膜に挿入された DNA

かけてゆっくりと温度降下し、DNA ハイブリダイゼーシ
ョン反応を行った。

を YOYO-1 で染色して観察したところ、DNA 濃度の増加とともにリポソーム膜の YOYO-1 強度が上昇していく様(2) DNA を用いたリポソーム膜の機能化子が見られた。リポソーム膜上の YOYO-1 強度の平均値をプロットしたところ、機能家の際の DNA 濃度の増加とまず、リポソーム(POPC/ATTO565-DOPE=100/0.1 モル比)を界面通過法で作製した（リポソーム内液：340 mM のともに YOYO-1 強度の平均値が上昇する傾向が見られた。
なお、プロット各点の算出につき、40 個以上のリポソー

スクロース溶液を、外液：140 mM グルコース+100 mM
NaCl）。DNA による膜の機能化にはリポソーム内外の浸透ム膜上の YOYO-1 強度の平均値と、その SD をプロットした。先行研究より 100 nM 前後でリポソーム膜状に導入で圧を維持した上で DNA デバイスを加え(0/64/128/192/256nM)、室温で４時間培養した。脂質膜に固定されなかったきる類似の DNA デバイスの量が飽和することがわかっており、今回の実験でも同じ傾向を期待したが、エラーバー

遊離 DNA については、遠心分離（1000g, 5 min）と上清のリポソーム外液への置換を 2 回繰り返すことで除去した。

が大きく YOYO-1 強度の飽和の蛍光は見られなかった。
次に、DNA で細胞膜を機能化した HEK293T 細胞を図

その後、5 μM の YOYO-1 を加え、共焦点顕微鏡を用いた蛍光観察を行った。

４A に示す。
前述の DNA 濃度条件で機能化を行い、YOYO1 染色により DNA を可視化したが、DNA 濃度が 0 nM の

(3) DNA を用いた細胞膜の機能化

時点で細胞表面に YOYO-1 シグナルが観察された。さらに、DNA 濃度の増加させていったところ、YOYO-1 シグ

培養した HEK293T 細胞をトリプシン処理し、HBSS(-)に分散した。その後、DNA を加え(0/64/128/192/256 nM)、

ナル強度に明確な変化は見られなかった。また、すべてのDNA 濃度条件において細胞膜表面に YOYO-1 シグナルが氷上で 4 時間培養した。脂質膜に固定されなかった遊離DNA については、遠心分離(200g, 5 min)と上清の HBSS(-)

局在した箇所が多く見られた。一方、SYTO17 で可視化した核酸（SYTO は DNA と RNA の両方を染色することがへの置換を 2 回繰り返すことで除去した。その後、5 μMの YOYO-1 と 5 μM の SYTO17 を加え、共焦点顕微鏡を用いた蛍光観察を行った。

知られている）については、細胞内の大部分の細胞質が染色されており、かつ核と考えられる箇所がより強く染色さ(4) DNA を用いたリポソーム・培養細胞接着
リポソームと HEK293T 細胞を２．２－３の手順で DNAれている様子が見られた。この実験では YOYO-1 染色によって細胞膜上に挿入される DNA デバイスの量が変化する様子が観察されると予想されたが、その様子を観察することはできなかった。この結果の解釈として、一つには細を用いて機能化した（ただし、DNA 濃度は 512 nM とした）。この際、リポソーム膜の機能化には α と β を持つ胞膜に DNA がほとんど導入できていないということが考DNA を、HEK293T の機能化には α*と β*を持つ DNA を

113

KISTEC研究報告2022

【研究開発部】人工細胞膜システム

図４（A）DNA で細胞膜を機能化した HEK293T 細胞．緑：YOYO1、赤：SYTO17 赤．スケールバー：10 μm．（B）DNA で機能化したリポソームと HEK293T 細胞の接着．矢印はリポソーム．ス
ケールバー：10 μm．

【謝辞】
本研究内容の一部は、戦略的創造研究推進事業 CREST「機能的人工染色体の設計と利用のための革新的研究」

図３ DNA を用いたリポソーム膜の機能化. プロットはリポソーム膜上の YOYO-1 強度の平均値±SD（各平均値の算出に付き
40 以上のリポソームの平均を算出)．スケールバー：10 μm．

（JPMJCR18S5）の支援により行われました。ここに感謝申し上げます。

えられる。もう一つの可能性としては、氷上の HBSS(-)中で 4 時間培養している最中に細胞が劣化し、何らかの原因【参考文献】

で溶液中に流出した DNA が細胞表面に局在してしまったということが考えられる。より明確な結果を得るためには、蛍光色素が修飾された DNA がデバイスを用いて細胞膜の機能化の実験を行うことが必要だと考えている。

1. Saito, Akira C., et al. "Introducing micrometer-sized artificial
objects into live cells: A method for cell–giant unilamellar
vesicle electrofusion." PloS one 9.9 (2014): e106853.
2. Zimmermann, U. "Electric field-mediated fusion and related
electrical phenomena." Biochimica et Biophysica Acta
(BBA)-Reviews on Biomembranes 694. 3 (1982): 227-277.

図４B に DNA デバイスで機能化したリポソームとHEK293T 細胞の接着の様子を示す。図中の矢印はリポソ

3. Chen, Yu A., and Richard H. Scheller. "SNARE-mediatedmembrane fusion." Nature reviews Molecular cell biologyームを示しており、矢印のないものは HEK293T 細胞である。YOYO-1 強度より、リポソーム膜が DNA で強く機能

2.2 (2001): 98-106.
4. Robson Marsden, Hana, et al. "A reduced SNARE model for

化できていることがわかる。一方の HEK293T の膜上のYOYO-1 強度は非常に弱いこともわかる。これらのリポソ

membrane fusion." Angewandte Chemie 121.13 (2009):
2366-2369.

ーム膜と HEK293T 細胞膜の接着については界面のリポソーム膜が大きく湾曲していることから明らかだが、細胞膜

5. Löffler, Philipp MG, et al. "A DNA‐Programmed Liposome
Fusion Cascade." Angewandte Chemie International

を DNA で機能化する際の条件については検討が必要ある
ことが示唆される。

Edition 56.43 (2017): 13228-13231.
6. Stengel, Gudrun, Raphael Zahn, and Fredrik Höök. "DNA-

本研究では DASE 法を用いたリポソームと培養細胞の融合を実現するために、リポソーム膜と HEK293T 細胞膜

inducedprogrammablefusionofphospholipid
vesicles." Journal of the American Chemical Society 129.31

を DNA ナノデバイスで接着する実験を行った。
その結果、リポソーム膜を DNA で機能化できることがわかった。一(2007): 9584-9585.
7. Takamori, Sho. Electrofusion of Escherichia coli with Giant

方、DNA を用いた HEK293T 細胞膜の機能化にはリポソームのそれとは大きな違いがある可能性が示唆された。まLipid Vesicles and the Compaction of Escherichia coli
Nucleoid. Diss. University of Cambridge, 2021.

た、機能化したリポソームと HEK293T 細胞を接着させる
ことにも成功した。本成果を受け、今後は DASE 法を用いたリポソーム・培養細胞融合に取り組みたいと考えている。
具体的には細胞膜の機能化の条件検討・最適化を行い、DASE 法を用いてリポソーム・培養細胞融合実験に取り組む。その後、従来の融合方法と比較してどの程度選択的な融合が可能になるのか、細胞の生存率に対する変化について解析し、将来的には細胞内への物質導入に挑戦したい。

114

KISTEC研究報告2022

【研究開発部】人工細胞膜システム

業 績【原著論文】【口頭発表】

1. Hironori Sugiyama, Toshihisa Osaki, Shoji Takeuchi, andTaro Toyota

1. Shoji Takeuchi
Biohybrid Devices—Harnessing Biofunctional Materials inRole of negatively charged lipids achieving rapid
accumulation of water-soluble molecules andMicro-Devices
2021 Virtual MRS Spring Meeting & Exhibit, 2021 年 4 月，

macromolecules into cell-sized liposomes against a
concentration gradient

OnlineLangmuir, 38, 112-121 (2022).

2. 竹内昌治
生物×機械

2. Kazuto Ogishi, Toshihisa Osaki, Yuya Morimoto and Shoji
Takeuchi

第 13 回理研・未来戦略室フォーラム, 2021 年 5 月，
Online3D printed microfluidic devices for lipid bilayer recordings
Lab on a Chip, 22, 890-898 (2022).

3. 中根卓馬，大崎寿久，三村久敏，高森翔，三木則尚，

【総説】

竹内昌治
匂いガス検出のための高効率ガス導入流路を有するバ

1. 伊藤嘉玖，大崎寿久，三木則尚，竹内昌治
膜タンパク質を組み込んだ人工細胞膜センサ

イオハイブリッドセンサ
化学とマイクロ･ナノシステム学会第 43 回研究会

表面と真空, 64(4), 162-167 (2021).

（CHEMINAS43）, 2021 年 5 月，Online

2. 山田哲也，大崎寿久，竹内昌治
蚊の嗅覚受容体を組み込んだ高感度匂いセンサの開発

4. 竹内昌治
Think Hybrid! 生物と機械を融合する

AROMA RESEARCH 第 86 号, 22 (2), 37-42 (2021) .

関東高分子若手研究会 2021 春の講演会,2021 年 6 月，
Online3. 山田哲也，大崎寿久，竹内昌治
呼気に含まれる匂い分子を ppb レベルで検出！－ 蚊の5. Takuma Nakane, Toshihisa Osaki, Hisatoshi Mimura,
Norihisa Miki, and Shoji Takeuchi
Efficient gas-to-liquid partition using gas-flow channels for

嗅覚受容体を組み込んだ高感度匂いセンサーの開発
化学 6 月号，76 (6), 12-16 (2021).

cell-based gaseous odorant detection
The 21st International Conference on Solid-State Sensors,

4. Yusuke Hirata, Haruka Oda, Toshihisa Osaki, and Shoji
Takeuchi
Biohybrid sensor for odor detection

Actuators And Microsystems（TRANSDUCERS 2021) ,2021 年 6 月，Online

Lab on a Chip, 21, 2643-2657 (2021).
6. Kazuto Ogishi, Toshihisa Osaki, Yuya Morimoto, and Shoji
5. 山田哲也, 大崎寿久, 竹内昌治
蚊の嗅覚受容体を再構成した人工細胞膜センサ

TakeuchiMonolithic fabrication of a lipid bilayer device using
stereolithography
The 21st International Conference on Solid-State Sensors,におい・かおり環境学会誌 2022 年 1 月号, 53 (1), 17-24(2022).

Actuators And Microsystems（TRANSDUCERS 2021) ,2021 年 6 月，Online【書籍】
1. 杉浦広峻, 大崎寿久, 竹内昌治
脂質二重膜による膜タンパク機能計測デバイス

7. 竹内昌治

マイクロ・ナノ熱工学の進展, 587-592 (2021).

異分野融合研究で近づく SF の世界
東進トップリーダーと学ぶワークショップ, 2021 年 7

2. 山田哲也, 大崎寿久, 竹内昌治
昆虫の嗅覚受容体センサとは？

月，東京及び Online
8. 竹内昌治
バイオハイブリッドが拓く新たなセンシングにおい分析評価・対策事例と頻出 Q&A 集，393-398(2022).

第 4 回デジタルバイオ分析研究会, 2021 年 8 月，Online

115

KISTEC研究報告2022

【研究開発部】人工細胞膜システム

10 月，アメリカ及び Online
9. 竹内昌治
三次元組織を作って使うバイオハイブリッド技術

17.竹内昌治

第 9 回 Chem-Bio Joint Seminar 2021, 2021 年 8 月，
Online“バイオハイブリッド”が拓く次世代センシング
第 11 回 CSJ 化学フェスタ 2021, 2021 年 10 月，Online

10.竹内昌治

18.Sho Takamori, Hisatoshi Mimura, Toshihisa Osaki,

バイオハイブリッドが拓く超高機能デバイス
第 82 回応用物理学会秋季学術講演会,2021 年 9 月，

Shoji Takeuchi
脂質共役型 DNA を用いた油中水滴界面上での脂質膜形

Online成「細胞を創る」研究会 14.0, 2021 年 11 月，Online

11.竹内昌治
バイオハイブリッド技術が切り拓く未来 ～体内埋め19.三村久敏，大崎寿久，高森翔，竹内昌治

込みデバイスから培養肉まで～先端技術セミナー（ソニーグループ(株)R&D センター）,

匂いセンサ開発に向けた昆虫嗅覚受容体ベシクルを用いた電気生理学的検出技術の開発

2021 年 9 月，Online

化学とマイクロ・ナノシステム学会第 44 回研究会
(CHEMINAS44), 2021 年 11 月，Online

12.Shoji Takeuchi
Emerging technology for Biohybrid devices

20.田中葵，高森翔，三村久敏，大崎寿久，三木則尚，竹NTT Research Upgrade 2021 Summit, 2021 年 9 月，アメリカ及び Online

内昌治
毛細管を有する複数センサ細胞作製カセットの開発
第 12 回マイクロ・ナノ工学シンポジウム, 2021 年 11
月，Online

13.Izumi Hashimoto, Toshihisa Osaki, Hirotaka Sugiura,
Hisatoshi Mimura, Norihisa Miki, and Shoji Takeuchi
Reliable re-formation of a lipid bilayer using a geometrically

21.竹内昌治

guided air bubble
The 25th International Conference on Miniaturized Systems

バイオハイブリッド技術が切り拓く未来～体内埋め込
みデバイスから培養肉まで～

for Chemistry and Life Sciences (MicroTAS 2021), 2021 年
10 月，アメリカ及び Online

第 37 回けいはんな「エジソンの会」, 2021 年 11 月，
Online22.竹内昌治

14.Kazuto Ogishi, Toshihisa Osaki, Yuya Morimoto, and Shoji
TakeuchiRapid fabrication of arrayed lipid bilayer devices using

バイオハイブリッドが拓く高感度センシング
第 9 回 iSyMs 全体会議, 2021 年 11 月，Online

stereolithography
The 25th International Conference on Miniaturized Systems

23.Hironori Sugiyama, Toshihisa Osaki, Shoji Takeuchi, Tarofor Chemistry and Life Sciences (MicroTAS 2021), 2021 年
10 月，アメリカ及び Online

ToyotaAbiotic molecular transport against a concentration gradientcaused by flow-induced membrane asymmetry between the
inner/outer leaflets of cell-sized liposomes

15.Sho Takamori, Hisatoshi Mimura, Toshihisa Osaki, and第 59 回日本生物物理学会年会, 2021 年 11 月，Online

Shoji Takeuchi
DNA-mediated adhesion of giant liposomes with cells
towards the transplantation of artificial organelles
The 25th International Conference on Miniaturized Systems

24.Sho Takamori, Hisatoshi Mimura，Toshihisa Osaki, Shoji
Takeuchifor Chemistry and Life Sciences (MicroTAS 2021), 2021 年
10 月，アメリカ及び Online

Adhesion of giant liposomes with cells using
lipid-conjugated DNA towards DNA-mediated fusion
第 59 回日本生物物理学会年会, 2021 年 11 月，Online

16.Hisatoshi Mimura, Toshihisa Osaki, Sho Takamori, andShoji Takeuchi
Dual-function device for detection of insect olfactory

25. 大崎寿久

receptor activity
The 25th International Conference on Miniaturized Systems

昆虫嗅覚受容体を用いた高感度匂いセンサの開発
日本技術士会神奈川県支部講演会（第 104 回 CPD 講

for Chemistry and Life Sciences (MicroTAS 2021), 2021 年座）,2021 年 11 月，横浜及び Online

116

KISTEC研究報告2022

【研究開発部】人工細胞膜システム【記者発表、取材】
1. 竹内昌治，大崎寿久
薬開発からバイオマシンまで!“タンパク質”人工合26.竹内昌治SF の世界に近づく先端工学～筋肉をまとうバイオハイ
ブリッドロボットから培養肉まで～
第 17 回日立財団科学技術セミナー, 2021 年 11 月，

成の世界
日本放送協会（NHK），サイエンス ZERO，2021 年 6 月 27

Online日
2. 竹内昌治
Growing Steak Meat in the Lab

27.高森翔，三村久敏，大崎寿久，竹内昌治
細胞小器官スケールリポソームの細胞内導入へ向けた
マイクロスケールリポソーム内包ジャイアントリポソームと培養細胞の脂質共役型 DNA を用いた接着

日本放送協会（NHK）、NHK World-JAPAN Science View，2021 年 8 月 10 日

第 44 回日本分子生物学会年会, 2021 年 12 月，横浜及び Online

番組 HP 上で 2022 年 8 月 10 日まで閲覧可能【特許】
28.橋本和泉，大崎寿久，三村久敏，三木則尚，竹内昌治(1) 国内特許出願

3件

微小気泡による脂質二重膜の再形成
令和 3 年度生体膜デザインコンファレンス・ミニ研究(2) 国外特許出願

0件

会, 2021 年 12 月，Online
29.大崎寿久
人工細胞膜技術を用いた創薬支援と次世代センサ開発
日本海水学会電気透析および膜技術研究会第 50 回荷電膜コロキウム, 2021 年 12 月，Online
30.Aoi Tanaka, Sho Takamori, Hisatoshi Mimura, Toshihisa
Osaki, Norihisa Miki, and Shoji Takeuchi
Cartridge device capable of spontaneous solution exchange
for sensor cell production
The 35th International Conference on Micro Electro

Mechanical Systems (IEEE MEMS 2022) , 2022 年 1 月，東京及び Online
31.Kazuto Ogishi, Toshihisa Osaki, Yuya Morimoto, and Shoji
TakeuchiOn-site formation of lipid bilayer arrays with an air/liquidinterface
The 35th International Conference on Micro Electro

Mechanical Systems (IEEE MEMS 2022) , 2022 年 1 月，東京及び Online
32.Shoji Takeuchi
3D tissue fabrication for biohybrid robots
MaP Distinguished Lecture Series ‘Additive Manufacturing’,
2022 年 3 月，Online
33.杉山博紀，大崎寿久，竹内昌治，豊田太郎
膜タンパク質なしにリポソーム内部に分子が濃縮される：リン脂質二分子膜が生命起源に果たしうる役割
第 46 回生命の起原および進化学会 学術講演会, 2022
年 3 月，Online

117

KISTEC研究報告2022