培養細胞に対する紫外放射の殺細胞効果の作用スペクトル奥野勉*1 宇高結子*2 青木馨

代*2中西孝子*2

紫外放射は，角膜炎，結膜炎，白内障，翼状片，紅斑（日焼け），皮膚の老化，皮膚がんなど多くの障害を引き起こす．作業現場における紫外放射のリスクマネジメントの前提として，それぞれの障害に関して，紫外放射の許容基準を制定することが望まれる．紫外放射の許容基準では，紫外放射の波長によって有害性の強さが異なることを考慮に入れる必要がある．本研究では，培養ヒト表皮角化細胞および培養ヒト結膜上皮細胞に対する紫外放射の殺細胞効果の作用スペクトル（波長依存性）を求めた．培養細胞に異なった波長と量の紫外放射を照射し，その 2 日後に，細胞のクリスタルバイオレット染色の濃度，および，乳酸脱水素酵素の培地への放出量を測定し，細胞生存率を評価した．各波長について，細胞生存率と照射量の関係から，細胞生存率 50%に対応する照射量（50%致死量）を求めた．この 50%致死量が有害性の強さを表すとした．紫外放射の有害性の相対的な作用スペクトルは，ヒト表皮角化細胞とヒト結膜上皮細胞のどちらに対しても，また，どちらの測定指標を使用して求めた場合にも，ほぼ同じであった．紫外放射の有害性は，約 250 nm から約 280 nm までの波長域でもっとも高く，それより波長が長く，または，短くなるにつれて，急速に低下した．本研究の結果は，皮膚障害および結膜障害に関する紫外放射の許容基準を制定する際の基礎データになると思われる．

キーワード: 紫外放射，作用スペクトル，許容基準，50%致死量，波長依存性

1

はじめについては，関連する作用スペクトルのデータが十分にな作業現場では，多くの作業者が，アーク溶接，プラズいため，障害関数が決められていない．したがって，そマ切断，太陽，各種のアークランプ，殺菌灯などが発生

うした障害については，紫外放射の有害性を評価するこする紫外放射へばく露している．紫外放射は，角膜炎，とができない．

結膜炎，翼状片，紅斑（日焼け），皮膚がん，皮膚の老化

本研究では，培養ヒト表皮角化細胞および培養ヒト結など，多くの障害を引き起こす 1,2)．実際，アーク溶接が膜上皮細胞に異なった波長の紫外放射を照射し，その後行われている作業現場では，角膜炎 3-5)と紅斑 3)が，多くの細胞生存率を測定することによって，紫外放射の殺細発生している．また，太陽からの紫外放射へのばく露量胞作用の作用スペクトルを調べた．その目的は，皮膚障が多いと考えられる屋外作業者の間で，白内障 6,7)と皮膚害および結膜障害に関する紫外放射の許容基準を制定す

がん 8-11)が多く発生している．作業者をこれらの障害かる際の基礎データを提出することである．

ら保護するための第一歩として，作業現場における紫外2放射の有害性を評価する必要がある．

方法

一般に，異なった波長の紫外放射は，異なった作用のヒト表皮角化細胞は，Lonza（Walkersville，MD，強さをもつため，紫外放射の有害性の評価では，有害性USA）から，ヒト結膜上皮細胞は，DS ファーマバイオの波長依存性を考慮しなければならない．この波長依存メディカルから購入し，実験に使用した．

性は，作用スペクトルまたは障害関数によって表される．

ヒト表皮角化細胞の培地は，ウシ脳下垂体抽出物，ウ

一般に，作用スペクトルは，単一の波長の光学放射（紫シインスリン，コルチゾール，ウシトランスフェリン，外放射を含む）が，一定の光化学的または光生物学的効

ヒト表皮成長因子，ゲンタマイシン，アムホテシリンを果を引き起こすばく露量（または，その逆数）を，波長含むヒトケラチノサイト増殖サプリメント（HKGS Kit，の関数としてプロットしたものである．特に，ヒトの障Cascade Biologics）を添加した Epilife 培地（Cascade

害の発生に関する作用スペクトルで，有害性の評価に使Biologics，Portland，OR，USA）を使用した．ヒト表用されるものは，障害関数と呼ばれる．障害関数は，障皮角化細胞の培地は，2 mM グルタミンと 10%ウシ胎児害によって異なるため，特定の障害に関する光学放射の血清を含む Medium199（HBSS）を使用した．
200μl/well の培地とともに 1×104 個/well の細胞を，有害性を評価するためには，その障害に対する障害関数が必要となる．

96 ウェルプレートの 24 個のウェルに播種した．炭酸ガ

動物の角膜炎に関する作用スペクトルとヒトの紅斑にス培養器（CPD-1700，ヒラサワ）を用い，温度 37℃，関する作用スペクトルから，障害関数が決められており炭酸ガス濃度 5%の条件化で，サブコンフルエントに達12)，これに基づき，紫外放射の許容基準が制定されていするまで数日間培養した後，紫外放射を照射した．

る 13-15)．これらの許容基準によって，作業現場における照射の際には，一時的に，培地を，試験波長の紫外放

紫外放射の，眼と皮膚の急性障害に関する有害性を評価

射を吸収しないリン酸緩衝生理食塩水に置換した．照射することができる．しかし，紫外放射による他の障害にした細胞を 2 日間培養した後に，その細胞生存率を調べた．
紫外放射の発生源としては，キセノンランプ光源装置*1 人間工学・リスク管理研究グループ*2 昭和大学医学部（MAX-302，朝日分光）に，特定の波長を取り出すバン– 63 –労働安全衛生総合研究所特別研究報告JNIOSH-SRR-NO. 44 (2014)

写真 2 クリスタルバイオレット染色の例のウェルを対照および陽性対照として使用した．陽性対照ウェルには，中心波長 269 nm，30 mJ/cm2 の紫外放(b)→射を照射した．

(a)→

細胞生存率の評価は，細胞のクリスタルバイオレット
染色の濃度，および，乳酸脱水素酵素の培地への放出量を測定することによって行なった．
紫外放射を照射した 96 ウェルプレートのウェルから

写真 1 紫外放射の照射系培地を取り除いた後，細胞を生理食塩水で洗い，軽く乾96 ウェルプレート（a）の，1 個おきに合計 24 個のウェルを使用燥させた．次に，0.1 %のクリスタルバイオレット（和光した．照射の際には，その 24 個のウェルに対応する位置に穴の純薬工業）と 0.1 %のメタノールを含むリン酸緩衝生理開いた蓋（b）をプレートにかぶせた．照射をしていないウェルの上の穴には，シリコンゴムの栓（蓋の上の白色のもの）をした．

食塩水を 50 μl/well 加え，室温で 15 分間保つことによ

この写真では，蓋の 1 か所の穴には，栓がされておらず，その下って，細胞を染色した（写真 2）．その後，細胞を水で洗のウェルに，紫外放射を照射している．

い，乾燥させた．ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬工業）をウェルに加えた後，マイクロプレートリーダー（Model 680 XR, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA,USA）で 570 nm における吸光度を測定した．この値が，ドパスフィルター（朝日分光）を装着して使用した（写真 1）．光源装置の光出力を，光ファイバーで導き，照射細胞生存率に比例するとした．

面における照度分布を一様にするロッドレンズを通して，培養細胞に照射した．照射した紫外放射の中心波長は，ヒト表皮角化細胞の場合には，235 nm，242 nm，250 nm，261 nm，269 nm，280 nm，292 nm，300 nm，306 nm，
310 nm の 10 種類，ヒト結膜上皮細胞の場合には，234nm，241 nm，250 nm，261 nm，269 nm，280 nm，291 nm，300 nm，306 nm，310 nm，315 nm の 11 種類である．半値幅は，8 nm から 12 nm である．紫外放射を照射する直前に，測定器（本体：IL1400A，International Light Technologies，シリコンフォトダイ
オードセンサー：SEL033, International LightTechnologies）を用いて，細胞の位置における紫外放射の放射照度を測定した．紫外放射の測定器は，波長ごと対照ウェルおよび陽性対照ウェルの測定値の平均が，それぞれ細胞生存率 100%および 0%に対応すると仮定し，個々のウェルについて，直線補間によって，測定値から細胞生存率を求めた．
乳酸脱水素酵素の測定には，微量毒性試験用試薬キット（MTX-LDH，極東製薬）を用いた．紫外放射を照射した 96 ウェルプレートのそれぞれのウェルから培地を50 μl/well 回収し，他の 96 ウェルプレートに入れ，試薬を加え，室温で 45 分間保った．その後，停止液を加え，マイクロプレートリーダー（Model 680 XR, Bio-RadLaboratories, Hercules, CA, USA）で 570 nm における吸光度を測定した．この値が，細胞死亡率に比例するとした．の感度の較正を行った後，その有効期間内に使用した．
各波長について，照射時間を調節することにより 4 種類の量（radiant exposure）の紫外放射を細胞に照射した．照射量は，予備実験で求めた 50%致死量の約 2 倍を最大とし，等間隔に設定した．96 ウェルプレートの中の4 個ずつのウェルを各照射量条件に，さらに，4 個ずつ対照ウェルおよび陽性対照ウェルの測定値の平均が，それぞれ細胞死亡率 0%および 100%に対応すると仮定し，個々のウェルについて，直線補間によって，測定値から細胞死亡率を求めた．最後に，1 から細胞死亡率を引くことによって，細胞生存率を求めた．

– 64 –

培養細胞に対する紫外放射の殺細胞効果の作用スペクトル
図 2 に示す．

各波長について，細胞生存率と照射量の関係に，最小

ヒト表 皮角化 細胞の 場合， 乳酸脱 水素酵 素放出 量自乗法によって，次の式を当てはめた．
V 112  log x   2 dxexp 2x2

D10（LDH）よりも，クリスタルバイオレット（CV）染色（1）濃度を指標として用いた方が，50%致死量の値は小さかった．ヒト結膜上皮細胞の場合には，逆に，クリスタルバイオレット染色濃度よりも，乳酸脱水素酵素放出量を

ここで，V は細胞生存率，D は照射量，μ と σ は，当指標として用いた方が，50%致死量の値は小さかった．てはめのパラメータである．この式の第 2 項は，プロビ

ヒト表皮角化細胞とヒト結膜上皮細胞のどちらの場合ット関数と呼ばれ，経験的に生体影響の量反応関係をよにも，また，クリスタルバイオレット染色濃度または乳く表すと言われている．当てはめを行った後の式（1）酸脱水素酵素放出量を指標としたどちらの評価でも，相から，細胞生存率 50%に対応する照射量（50%致死量，対的な作用スペクトルは，ほぼ同じであった．紫外放射LD50）を計算した．各波長の 50%致死量を元に，作用スの有害性は，約 250 nm から約 280 nm までの波長域でペクトルを構築した．

もっとも高く，それより波長が長く，または，短くなる

実験は，細胞と波長ごとに 3－7 回繰り返し，その結につれて，急速に低下した．

果を平均した．
43

考察

結果

本研究の結果は，皮膚の老化，皮膚がんなどの皮膚障

ヒト表皮角化細胞とヒト結膜上皮細胞のどちらの場合害，および，翼状片などの結膜障害に関する紫外放射のにも，また，クリスタルバイオレット染色濃度または乳許容基準を制定する際の基礎データになると思われる．

酸脱水素酵素放出量を指標としたどちらの評価でも，す著者らは，以前の研究において，ほぼ同じ方法を用いべての照射波長について，細胞生存率は，照射量の増加て，ブタ水晶体上皮細胞に対する紫外放射の殺細胞効果と共に減少した（図 1）．この量－影響関係から，50%致の作用スペクトルを求めている 16)．本研究で求めたヒト死量を求めることができた．

表皮角化細胞とヒト結膜上皮細胞に対する作用スペクト

各波長の 50%致死量を元に構築した作用スペクトルを

ルは，ブタ水晶体上皮細胞に対する作用スペクトルともよく一致している．これは，紫外放射の殺細胞効果の作用スペクトルは，細胞の種類には依らない可能性を示し

125%
100%
細胞生存率ている．

波長 310 nm
CV染色

本研究では，乳酸脱水素酵素放出量とクリスタルバイオレット染色濃度を指標とする 2 つの異なった方法を用75%

いて 50%致死量を求めた．しかし，得られた 50%致死量の値が異なっていた．さらに，ヒト表皮角化細胞とヒト50%結膜上皮細胞では、その高低の関係が逆であった．これ
25%

は，どちらか一方，または，両方の指標と細胞生存率とLD500%
0200

319 400600
照射量 (mJ/cm2)の関係が線形ではないこと，また，この関係が細胞の種800類に依存することを意味している．この 2 つの方法によ1000

る 50%致死量の測定値の差は，最大で 2 倍程度であるので，測定値と真の値との差も，同程度またはそれ以下で

図 1 量－影響関係と 50%致死量の求め方の例

1000.0ヒト表皮角化細胞(CV)ヒト表皮角化細胞(LDH)
ヒト結膜上皮細胞(CV)ヒト結膜上皮細胞(LDH)

100.0

50%致死量 (mJ/cm2)

50%致死量 (mJ/cm2)

1000.010.0

ヒト表皮角化細胞(CV)ヒト結膜上皮細胞(CV)ブタ水晶体上皮細胞(CV)

100.0

10.0

1.0

1.00.12300.1230

250270290波長 (nm)

310

330

250

270290波長 (nm)310

図 3 異なった細胞に対する作用スペクトルの比較

図 2 作用スペクトル– 65 –330

労働安全衛生総合研究所特別研究報告あることが予想される．許容基準を策定する際の不確定9)JNIOSH-SRR-NO. 44 (2014)
Beral V, Robinson N. The relationship of malignant性を考慮すると，十分な精度で作用スペクトルを求める

melanoma, basal and squamous skin cancers to indoor

ことができたと考えられる．

and outdoor work. Br. J. Cancer 1981; 44: 886-891.
10)

参1)
2)

考文

other tumours of the skin among office, other indoor

献WHO. Ultraviolet Radiation. Environmental healthand outdoor workers in Sweden 1961–1979. Br. J.

criteria. Geneva: WHO; 1994.

Cancer 1986; 53: 507-512.

Sliney DH, Wolbarsht M. Safety with lasers and other11)

optical sources. New York: Plenum Press; 1980.
3)Vågerö D, Ringbäck G, Kiviranta H. Melanoma andfor non-melanomatous skin cancer in Alexandria,

Emmett EA, Buncher CR, Suskind RB, Rowe KW. Skinand eye diseases among arc welders and those exposed

el Khwsky F, Bedwani R, D’Avanzo B, et al. Risk factors
Egypt. Int. J. Cancer 1994; 56: 375-378.

12)

Sliney DH. The merits of an envelope action spectrum

to welding operations. J. Occup. Med. 1981; 23: 85–90.

for ultraviolet radiation exposure criteria. Am. Ind. Hyg.

4)

日本溶接協会．溶接アークからの有害光線に関する調査研

Assoc. J. 1972; 33: 644-653.

5)

沼野雄志．溶接アークによる眼障害に関する調査結果．労radiation of wavelengths between 180 nm and 400 nm

働衛生工学. 1986; 25: 9-20.

(incoherent optical radiation). Health Phys. 2004; 87:

The Italian-American Cataract Study Group. Risk

171-186.

究6)

成果報告書．東京: 日本溶接協会; 1984.

factors for age-related cortical, nuclear and posterior

13)

14)

541-553.

8)

15)

Burton M, Fergusson E, Hart A, Knight K, Lary D, Liu
C. The prevalence of cataract in two villages of

許容濃度等の勧告（2013 年度）．日本産業衛生学会．産業衛生学会雑誌. 2013; 55: 182-208.

subcapsular cataracts. Am. J. Epidemiol. 1991; 133:7)

ICNIRP. Guidelines on limits of exposure to ultraviolet

ACGIH. Light and near infrared radiation. TLVs andBEIs, Cincinnati: ACGIH; 2013: CD-ROM.

16)

Tsutomu Okuno, Takako Nakanishi-Ueda, Toshihikonorthern Pakistan with different levels of ultraviolet

Ueda, Hajime Yasuhara, Ryohei Koide. Ultraviolet

radiation. Eye 1997; 11: 95-101.

action spectrum for cell killing of primary porcine lens

Atkin M, Fenning J, Heady JA, Kennaway EL,

epithelial cells. J. Occup. Health 2012; 54: 181-186.

Kennaway NM. The mortality from cancer of the skinand lip in certain occupations. Br. J. Cancer 1949; 3:
1-15.

– 66 –