タンパク質分子モーターの動きを高速・高精度に可視化する
飯野 亮太 岡崎統合バイオサイエンスセンター 教授
いいの・りょうた
1972 年埼玉県生まれ。2000 年名古屋大学大学院理学研究科単位取得退学。
2003 年博士（理学）取得。JST-ERATO 研究員、大阪大学産業科学研究所特任助手、助手、助教、東京大学工学系研究科講師、准教授を経て 2014 年 6 月より現職。総合研究大学院大学教授兼任。専門は１分子生物物理学。タンパク質分子モーターのダイナミクスや構造を調べるだけでなく、天然に存在しない分子を創ることでその作動原理と設計原理を徹底的に理解したいと考えています。

けでなく、超解像蛍光顕微鏡（2014 年する）。我々の計測では、波長 532 nm

タンパク質でできた分子モーター（図ノーベル化学賞）、次世代 DNA シークのレーザーで照明した粒径 40 nm の金1）は、化学エネルギーを力学エネルギーエンサーの基盤技術として産業応用にナノ粒子の散乱像で、位置決定精度 0.3に変換して一方向性運動を行う分子機も展開されている。

nm、時間分解能 100 s を達成していはじめに

生体 1 分子イメージングの可視化プる（未発表データ）。また、金ナノロッ。このエネルローブとしてよく用いられているのはドにはさらなる利点がある。金ナノロッ

ギー変換の仕組みや、分子モーターを蛍光色素である。この「小さな」プロー

ドは長軸と短軸でプラズモン共鳴の波構成する部品間の協調の仕組みを徹底

ブは分子モーターの機能を阻害するこ長のピークが大きく異なるため、1）散的に理解したい。我々はこの目的の一となく標識できるという利点を持つ。

乱光の偏光を直交する 2 成分に分けて環として、金ナノ粒子、金ナノロッド

一方、蛍光として得られるフォトン数検出する、2）焦点面から数 m デフォーといったプラズモニックナノプローブがそれほど多くないため、計測の位置カスした像を取得する、といった方法

を分子モーターの 1 分子イメージング

決定精度は数 nm 程度に限られ、時間分でその配向を決めることができる [7 ] 。に利用している。本稿では、プラズモ解能もサブ秒〜ミリ秒程度に限られる

特に後者では、ガラス基板に対する方ニックナノプローブの利点と欠点、おという欠点を有している。我々はこれ位角だけでなく極角も測定可能であり、よびプラズモニックナノプローブを用らの欠点を克服するため、大きさ数 103 次元的な配向を決めることができる。

いた 1 分子イメージングの例について

nm の金ナノ粒子や金ナノロッドといっさらに金ナノプローブは、褪色するこ紹介する。

たプラズモニックナノプローブを生体 1ともなくブリンキングも示さないので、械であり、高いエネルギー変換効率等、優れた性能を発現する[1]

分子イメージングに利用している[ 2- 7]。

安定したシグナルの長時間観察が可能

プラズモニックナノプローブの利点と欠点の利点は、光を強く散乱するので蛍光一方、蛍光色素よりもサイズが大き光学顕微鏡を用いた生体1分子イメー色素に比べて圧倒的に高いフォトン数

いのがプラズモニックナノプローブのプラズモニックナノプローブの最大[ 2]となる。

ジングは、生体分子機械、なかでも生が得られる点である。このため、高最大の欠点である。サイズを小さくす

体分子モーターの運動素過程の可視化

い位置決定精度と時間分解能での 1 分ることもできるのだが、我々の計測にを目的として 1990 年代半ばに勃興し、子イメージングが可能となる。例えば

よると散乱強度は粒径の 4 乗に比例す

我が国の研究者がその発展に大きく貢金ナノ粒子は、プラズモン共鳴のピーるので（未発表データ）、シグナルが大献してきた。生体 1 分子イメージング

クに近い波長 500-550 nm の光を強く幅に減少してしまう。尚、結合させるは分子モーターの作動機構やエネル散乱する（ピークの位置は粒子のサイ場所をきちんと選べば、大きなプローギー変換機構の解明に寄与してきただズや表面のコーティングの有無で変化

ブでも分子モーターの動きの邪魔には

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図 1 我々が研究対象とする様々な分子モーターの模型。3D プリンタを用い、分子研装置開発室で作製して頂いた。
分子模型は、分子モーターへのプラズモニックナノプローブの結合位置を検討する上で非常に有用である。

ならないことを強調しておく。分子モーよるランダム力となる。ランダム力にブの他の欠点としては、分子モーターターの運動に影響を与える外力には慣方向性はないが、分子モーターのブラとの1：1標識が容易でなく、1つのプロー性力、粘性力、弾性力、ランダム力がウン運動を引き起こす。プラズモニッ

ブに複数の分子が結合してしまう可能挙げられる。プラズモニックナノプロー

クナノプローブの結合によりブラウン性が挙げられる。また金ナノロッドは、ブの質量は十分に小さいので慣性力は運動の速度は数分の一に低下するが、分子モーターに対してどのような向き実質無視できる。分子モーターが働く

タンパク質分子モーターの直進運動やで結合させるかのコントロールが難し水中では慣性よりも粘性が支配的であ回転運動の律速にはならない。

いという欠点がある。この欠点についる。粘性力は速度に比例するが、分子他方、分子モーターのどこにプラズモーターの運動でプラズモニックナノモニックナノプローブを結合させるかプローブにかかる粘性力は微々たるもはとても重要である。よい場所につけのである。弾性力はゴムのような弾性ないと立体障害で動きを邪魔すること体に繋がれた場合には発生するが、水になる。我々は、分子モーターの様々中で自由に動く場合は考慮する必要はな位置に結合させて蛍光標識した試料

金ナノ粒子によるリニア分子モーターキネシン -1 の 1 分子イメージングない。結局、分子モーターの動きに最と比較し、良い位置をスクリーニング

キネシン-1は2本の足で歩く分子モーも影響するのは熱運動する水の衝突にしている。プラズモニックナノプロー

タ ー で あ る。 専 門 的 に は 2 つ の「 頭 」説明する。

図 2 リニア分子モーターキネシン -1 の直進A

Bては、後述する計測例でさらに詳しくC運動の１分子イメージング。直径 40nm の金ナノ粒子で標識。時間分解能55  s、位置決定精度 1 nm。A, 重心位 置 の 時 間 変 化。 キ ネ シ ン -1 の 足 が
微 小 管 に 結 合 し た 状 態（ 結 合 ） を 赤で、微小管から解離した状態（非結合）を青で示す。尚、片足のみを標識しており、非標識のもう片足の動きはみえないことに注意されたい。B, 重心位置の時間変化の 2 次元プロット。微小管からの解離状態（非結合、青）では、進行方向に対し右側で揺らいでいる。C,進行方向に対して後ろ側からみたキネ
シ ン -1 と 微 小 管（ ピ ン ク ） の 構 造 モデル。キネシン -1 の「脚」
（赤い波線）の付け根（赤い矢じり）は、微小管に結合した足（緑）の右側に位置する。
このため立体障害により、微小管から解 離 し た 足（ シ ア ン ） は 進 行 方 向 に対し右側で揺らぐ。

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が 正 し い が、 わ か り や す く す る た め

等方的ではなく進行方向に対し右側に（足踏み）するようになった。後ろだ「足」と表現する。キネシンは 2 本の足偏っていた。キネシンの構造モデルでけでなく左右のレールにも頻繁に着地を交互に前に踏みだしながら、まるでは、両足を繋ぐ「脚」（ネックリンカー）し（サイドステップ）、酔っ払いの千鳥

ヒトが歩くように直進運動する。しかが微小管に結合した足の右側に位置し足のような無駄な動きをみせた。さらし、ナノサイズのキネシンがどのようているため、立体障害によって浮いたに、アミノ酸残基を一つだけ削って脚に正確に一方向に歩くのか、その詳細足の揺らぎが右側に偏ると解釈された。

をちょっと短くすると、正確に一方向な仕組みはわかっていない。上述のよ尚、この結果は、キネシンは一方向にには歩けるが、浮いた足が前に着地す

うにナノの世界では質量は小さく慣性回転しながら直進運動をすることを示るまでに時間がかかるようになり、運は働かないので、ヒトが歩く時のよう唆する。ドイツのグループが最近、実動速度が野生型の 20% 程度に低下した。に浮かせた足を勢いに任せて前に着地際に回転していることを示す論文を出

これらの結果から、2 本の足を繋ぐ脚がさせることはできない。また、キネシ版し、回転の証明は先を越されてしまっ最適な長さであることが、エネルギーンは水中で歩くので、熱運動する周囲た。残念である。

を無駄に消費せずにキネシンが効率的の水分子が衝突し、浮いた足はふらふ

ま た、 片 足 が 浮 い た 状 態 の 持 続 時らとブラウン運動をする。よって、キ間の解析から、微小管に結合した足へネシンが歩く仕組みはヒトが歩く仕組

ATP が結合するのを待つ過程（ATP 濃みとは大きく異なると考えられる。

度に依存）、ATP 結合後にその足の構に歩くために重要であることが明らかとなった。

我々は、粒径 40 nm の金ナノ粒子を造が変化して浮いた足が前に着地するキネシンの片足に結合させ、その動き過程（ATP 濃度に非依存）の 2 つの素

金ナノロッドによる回転分子モーター F 1 -ATPase の 1 分子イメージングを 55 s の時間分解能と 1 nm の位置決過程があることが明らかとなった。ま

回転分子モーター F 1 -ATPase の回転定精度で可視化した（図 2） 。これた、両足を繋ぐ脚にグリシン残基を 7運動を金ナノロッドで観察した例を図 3

により、レールである微小管から解離個追加して人工的に長くすると、微小に示す [ 7]。この例では、F 1 -ATPase のした足は実際に、ブラウン運動で激し管に結合した足へ ATP が結合するまで固定子である  3  3 リングをガラス基板く揺らぐことが直接示された。しかし片足が浮いた状態を維持することがでに結合させ、回転子である  サブユニッ

予想外なことに、揺らぎは前後左右にきなくなり、前だけでなく後ろに着地

トに金ナノロッド（長軸 80 nm、短軸[8]ABC

図 3 回転分子モーター F 1 -ATPase の回転運動の 1 分子イメージング。長軸 80 nm、短軸 40 nm の金ナノロッドで標識。時間分解能 3.3 s、角度決定精度 1º。A, 金ナノロッドのデフォーカス像のシークエンス。

30 枚に 1 枚ずつ（100 s 間隔）、間引いて表示。B, 実験系の模式図。F 1 -ATPase の固定子  3  3 リング（緑と黄）をガラス基板に結合させ、回転子γサブユニット（赤）に金ナノロッドを結合させることで回転運動を観察。C, 方位角  、極角  の時間変化。右には方位角  、極角  の分布を示す。

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40 nm）を結合させることで回転運動るので、非平衡統計物理学の「揺らぎるマルチカラー 1 分子イメージングがを観察している。時間分解能は 3.3 s、の定理」に基づく手法を適用すること可能になると考えている。また、金属[ 9]角度決定精度は 1 º である。金ナノロッでトルクが計測できるドのデフォーカス像を取得することで、より得られたトルクは 44 pNnm であり、ズモンカップリングによって共鳴波長1 回転中（方位角  ）に 6 か所の停止位アクチン線維やポリスチレンビーズをが長波長シフトし、粒子間の距離がナ置があることが観察できている。また、プローブとして粘性係数と回転角速度ノメートルレベルで近接するほどシフ回転中の極角  の揺らぎも観察できてから求めた値と同程度であった。尚、

ト量が増加する。この特性を用い、タいる。

金ナノロッドの長軸の末端に選択的にンパク質の構造変化を高感度に検出す

上記でも少し触れたが、金ナノロッ表面処理を行う方法が最近開発されてる「プラズモンルーラー」を開発した

ドには一つ、指摘しておかないといけおり、将来的には上記の欠点は改善でいと考えている。また最近の我々の計ない欠点がある。それは、分子モーターきると期待している。

測で、金ナノロッドはデフォーカス像。この手法にに対して金ナノロッドをどのような向きで結合させるかのコントロールが難ナノ粒子がダイマーを形成するとプラでなくフォーカス像でも点像分布関数

おわりにが若干歪み、この歪みから配向を決定しい点である。都合の悪い向きに結合

我 々 は 今 後、 金 や 銀 か ら な る プ ラできることが明らかとなった（未発表

した金ナノロッドはモーターの動きをズモニックナノプローブを用いた分子データ）。フォーカス像を用いると重心邪魔すると考えられ、都合の良い向きモーターの1分子イメージングをさらに位置と配向を同時に決めることができ、に結合してうまく動いている分子だけ発展させたいと考えている。例えば金分子モーターの運動と構造変化を同時が観察できていると考えられる。またナノ粒子と銀ナノ粒子では、プラズモに検出することができる。さらに、ナこの欠点があるため、プローブの粘性ン共鳴のピークの波長が大きく異なる。

ノ粒子やナノロッドを円偏光で照明す係数を正確に見積もることが困難であ

また、金と銀の合金を用いると、混合ることで一方向に強制回転させることり、回転の角速度から F 1 -ATPase が発比によりプラズモン共鳴のピークの波ができるという報告があり、分子モー生するトルクを計測することは容易で長をチューニングすることも可能であターの 1 分子操作に適用できる可能性はない。他方、高速イメージングによる。これらの特性を利用すれば、複数がある。今後の展開にご期待頂きたい。

り金ナノロッドの揺らぎが可視化でき種の金属ナノ粒子を識別して可視化す

参考文献[ 1 ] Iino, R., et al., Single-molecule imaging and manipulation of biomolecular machines and systems. Biochim Biophys Acta,
2018. 1862: p. 241-252.
[ 2 ] Ueno, H., et al., Simple dark-field microscopy with nanometer spatial precision and microsecond temporal resolution.
Biophysical Journal, 2010. 98 (9): p. 2014-23.
[ 3 ] Minagawa, Y., et al., Basic Properties of Rotary Dynamics of the Molecular Motor Enterococcus hirae V 1 -ATPase. J BiolChem, 2013. 288 (45): p. 32700-7.
[ 4 ] Watanabe, R., et al., Biased Brownian stepping rotation of FoF 1 -ATP synthase driven by proton motive force. NatCommun, 2013. 4: p. 1631.
[ 5 ] Ueno, H., et al., Torque generation of Enterococcus hirae V-ATPase. J Biol Chem, 2014. 289 (45): p. 31212-23.
[ 6 ] Iino, R., et al., Rotational mechanism of Enterococcus hirae V 1 -ATPase by crystal-structure and single-molecule analyses.
Curr Opin Struct Biol, 2015. 31: p. 49-56.
[ 7 ] Enoki, S., et al., High-speed angle-resolved imaging of a single gold nanorod with microsecond temporal resolution andone-degree angle precision. Anal Chem, 2015. 87 (4): p. 2079-86.
[ 8 ] Isojima, H., et al., Direct observation of intermediate states during the stepping motion of kinesin-1. Nat Chem Biol, 2016.
12 (4): p. 290-7.
[ 9 ] Hayashi, K., et al., Fluctuation theorem applied to F 1 -ATPase. Phys Rev Lett, 2010. 104 (21): p. 218103.

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