「SARS-CoV-2 核酸検出」PCR 反応系の比較検討
京都大学医学部附属病院 検査部・感染制御部
京都大学大学院医学研究科 臨床病態検査学
2020 年 3 月 24 日
１．目的
SARS-CoV-2（新型コロナウイルス）核酸検出検査（以下、PCR 検査）の各種反応系の性能を比較する。
２．結果

2.1.マスターミックスおよびプログラムの違いによる positive control RNA の反応性検討
A) LightCycler, 感染研 N/N2 アッセイ, 3 回測定の平均 Ct 値（範囲）
感染研 N2

RNA

感染研/German N

copies/reaction

TaqPath

LC 2-step

LC 3-step

TaqPath

LC 2-step

LC 3-step

5×10

4

24.5 (24.5-24.5)

26.3 (26.2-26.5)

28.3 (28.2-28.3)

27.3 (27.2-27.3)

28.9 (28.9-29.0)

29.4 (29.0-29.8)

5×103

27.9 (27.8-28.0)

29.9 (29.5-30.2)

31.8 (31.6-32.0)

30.7 (30.7-30.8)

32.3 (32.1-32.5)

33.0 (32.7-33.2)

5×102

31.2 (31.2-31.3)

33.8 (33.3-34.0)

35.1 (34.6-35.5)

34.0 (34.0-34.1)

35.6 (35.4-35.8)

36.4 (36.0-36.7)

5×101

34.3 (34.2-34.5)

37.7 (37.5-37.9)

NC (38.5->40)

37.6 (37.4-37.8)

38.2 (37.5-38.9)

NC (>40)

5×100

38.1 (36.9-39.6)

NC (>40)

NC (>40)

NC (38.5, >40,NCNCnegative)

negativeNC, not calculated.
B) StepOnePlus, 感染研 N/N2 アッセイ, 3 回測定の平均 Ct 値（範囲）RNA

感染研 N2

感染研/German N

copies/reaction

TaqPathTaqPath

5×104

25.7 (25.3-25.9)

30.2 (29.3-31.4)

5×103

28.4 (27.9-28.8)

33.6 (33.1-34.3)

5×102

31.1 (30.4-32.0)

36.7 (35.9-37.6)

5×10

1

33.7 (32.7-34.4)

38.5 (37.5-40.2)

5×100

36.9 (35.8-38.3)

NC (negative)(>40or(>40negativeor

2.2.アッセイ、マスターミックスおよびプログラムの違いによる臨床検体の反応性検討
A) 全て EAV control あり、LightCycler, Ct 値Roche
感染研 N2

感染研/German NLC

SampleGerman E

2-

TaqPath,LC

2-

Roche E

Roche NLCLC3-

RdRP

RNaseP

3-

TaqPath

LC 2-step

TaqPathstep

TaqPath

58℃

step

step

step

LC 3-step

TaqPath

スワブ 6

34.7

35.4

37.3

-

33.7

34.9

34.0

34.4

-

-

35.2

スワブ 2

35.6

35.7

-

-

36.1

36.2

35.5

35.8

-

-

28.3

スワブ 3

32.4

35.1

-

-

34.0

34.5

34.2

34.8

-

-

26.7

スワブ 7

23.4

24.7

27.9

29.6

23.7

26.8

23.8

23.1

30.6

35.9

29.0

スワブ 8

27.9

29.7

32.4

33.0

28.7

28.9

29.1

28.736.1-30.4

スワブ 9---------

25.9

スワブ 10---------

22.3

スワブ 11---------

27.5

スワブ 12---------

24.9

スワブ 13---------

25.0

B) EAV に対するプライマー・プローブなしで反応させた場合の Ct 値の差(プラスの値は EAV 検出反応追加により Ct 値が増大したことを示す)
感染研 N2

感染研/German N

German E

TaqPath

LC 2-step

TaqPath

LC 2-step

TaqPath

LC 2-step

スワブ 60-0.3

0.1

--1.1

0.1

スワブ 2

0.4

0--0.1-0.1

スワブ 3-0.6

0.2--0.1

0.5

スワブ 7-0.5

0.1

-0.4

-0.5

0.3

0.3

スワブ 8-1.2

-0.2

-1.2

-0.3

-0.1

0.3

Sample陰性陽性判定は変わらなかった。
C) 表Ａにおける EAV control の平均 Ct 値（範囲）
Roche
感染研 N2

感染研/German N

German E

Roche E

Roche N

RdRP

TaqPath,TaqPath

LC 2-step

TaqPath

LC 2-step

TaqPath58℃

LC 2-step

LC 3-step

LC 3-step

LC 3-step

26.5

26.8 (26.4-27.2)

26.6

26.7 (26.3-26.4

27.1

26.6 (26.3-

27.6 (27.1-

28.5 (27.9-

27.9 (27.6-27.1)(26.2-(26.8-26.9)

28.0)

29.0)

28.2)

26.8)

27.5)

(26.1-27.7)(26.2-27.0)
全てのサンプルで EAV control は陽性と判定された。

３．考察
陽性コントロールを用いた検討では、N2 アッセイでは TaqPath, LC 2-step, LC 3-step 全てで 5 コピー/反応の検出が可能だったが、N アッセイでは 50 コピー/反応であり、N アッセイの感度が低いと考えられた。マスターミックス・プログラムの比較では、その増幅効率は TaqPath>LC 2-step > LC 3-step である可能性が示唆された。
臨床検体を用いた検討では、感染研 N2, German E, Roche E アッセイでは５サンプルが陽性と判定された。しかし、感染研/German N, Roche N, Roche RdRP では、それぞれ 2～３, 3, 4 サンプルが陰性と判定され、感度が低いことが示唆された。上記と異なる５サンプ
ルは全てのアッセイで陰性と判定され、偽陽性はないと考えられた。
German E アッセイでは Roche E アッセイと異なり 40 サイクル付近から非特異的蛍光増幅が認められることがあり、注意が必要と考えられた。なお、German アッセイではすべて58 度で増幅を行うが、60 度でも同等の性能であることが示唆された。同じプライマー・プローブを用いる Roche N, RdRP アッセイもアニーリングは 60 度に設定されている。
EAV control 反応の追加による Ct 値の変動や偽陽は認められず、今回検討したアッセイとの同時使用が可能であると考えられた。EAV control の説明書では、3-step プログラムが示されているが、LC 2-step、TaqPath (2-step)ともに陽性判定が可能であり、2-step の反応でも問題はないと考えられた。
RNaseP 遺伝子は全てのサンプルで陽性と判定され、外部 RNA コントロールがない場合のコントロール反応として使用可能であると考えられた。
結論TaqPath または LC (2-step)マスターミックスと EAV control を用いて実施する感染研
N2,N アッセイコントロールなしの反応と同様の臨床的反応性が見込まれ、臨床検査室での実施にふさわしい系であると考えられた。また、EAV control を用いて実施する Roche 社の E および N アッセイも同等であると考えられた。一方、感度の面からは感染研 N2,
German/Roche E が優れており、これらのうち２つと EAV control を用いる反応系も有用であろう。また、EAV control などの外部コントロールがない場合は RNaseP 遺伝子の検出反応が代替として考慮される。

４．方法
ＲＮＡ抽出
QIAamp® Viral RNA Mini Kit (Qiagen)・スピンプロトコール
・検体：140μl
・Buffer AVL にキャリア RNA と別途記載のコントロール RNA を添加

・溶出：AVE 50μl 1 回
LightMix Modular EAV RNA Extract. Control (Roche)
・抽出時に 10μl 添加
サーマルサイクラー・LightCycler® 480 System II (Roche Diagnostics)
Filter: 465-510, Max Integration time 1 sec; 618-660, Max Integration time 3 sec
Ct 値は Second Derivative Maximum method により算出
・StepOnePlus (Applied Biosystems)
マスターミックス
TaqPath™ 1-Step RT-qPCR Master Mix, CG (Thermo Fisher Scientific)
LightCycler® Multiplex RNA Virus Master (Roche Life Science)
反応系
トータル 20μl , template RNA 5μl
感染研 N(=German N), N2：FAM-TAMRA プローブ（国立感染症研究所より配布）。プラ
イマー・プローブ濃度は国立感染症研究所「病原体検出マニュアル 2019-nCoV」に従った。
German E：FAM-BHQ1 プローブ。プライマー・プローブ濃度は元論文 1)に従った。
Roche E, N, RdRP (LightMix® Modular SARS and Wuhan CoV N-gene, E-gene; LightMix®
Modular Wuhan CoV RdRP-gene)：メーカーの添付文書に従った。
Roche EAV control (LightMix® Modular EAV RNA Extraction Control 660)：メーカーの添付文書に従った。
CDC RNaseP ： CDC （ https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panelprimer-probes.html）、ただし RP-F, RP-R：1μM、RP-P：0.25μM, Cy5-BHQ2 プローブへ変更
ＰＣＲプログラム
TaqPath1

UNG incubation125℃

2 minutes

Reverse Transcrpition

50℃

15 minutes

Taq Enzyme Activation

95℃

2 minutes

Amplification

95℃3 seconds

45 cycles

60℃2

30 seconds

LightCycler では設定できないため実験台上で行う

258℃で実施した場合、「TaqPath, 58℃」と記載

StepOnePlus では fast モード
LightCycler での反応時間は 1h12m29s
LC 2-step: Multiplex RNA Virus Master, 2-step
Reverse Transcrpition

50℃

10 minutes

Taq Enzyme Activation

95℃

30 seconds

Amplification

95℃

5 seconds

45 cycles

60℃

30 seconds

LightCycler での反応時間は 1h10m47s
LC 3-step: Multiplex RNA Virus Master, 3-step
Reverse Transcrpition

50℃

10 minutes

Taq Enzyme Activation

95℃

30 seconds

Amplification

95℃

5 seconds

45 cycles

60℃

15 seconds

72℃

15 seconds

LightCycler での反応時間は 1h20m40s
結果判定・陽性判定基準
感染研Ｎ/N2：サンプルの Ct 値が 40 サイクル未満であること。感染研マニュアルでは、反応時間内に増幅曲線の立ち上がりが見られれば良く、また自動判定による Ct 値が陰性と判定されていても。ここではより厳しい基準を設定している。
German E：サンプルの Ct 値が 40 サイクル未満であること。
Roche E, N, RdRP：サンプルの Ct 値がメーカーの規定レンジに入っていること。
Roche EAV control：サンプルの Ct 値が 25～33 であること。
RNaseP：サンプルの Ct 値が 40 サイクル未満であること。
精度管理
・抽出/PCR 阻害
外部コントロールなし：内部コントロールであるサンプルの RNaseP 遺伝子が陽性判定されること。ただし、ターゲットが陽性判定されている場合は、内部コントロールの判定は陰性でもよい。
外部コントロールあり：サンプルの外部コントロール検出反応において陽性判定されること。ただし、ターゲットが陽性判定されている場合は、内部コントロールの判定は陰性でもよい。
・陽性コントロール
感染研Ｎ/N2：50 copies/reaction が陽性と判定されること。
※定量実験を行う場合は、5, 50, 500, 5000, 50000 copies/reaction の陽性コントロールを用いて検量線を作成し、直線性が確認された範囲のみで定量を行う。定量が目的でなければ、希釈系列の作成は必須ではない。
German E：Roche E キット付属の陽性コントロールの Ct 値がメーカーの規定レンジに入っていること。
Roche E, N, RdRP：キット付属の陽性コントロールの Ct 値がメーカーの規定レンジに入っていること。
Roche EAV control：外部コントロール用 RNA を 5 倍希釈した反応において陽性判定されること。希釈率は、抽出の際の添加量と、溶出液量とサンプル液量から理想的な 1 反応あたりのコピー数を計算し設定した。
RNaseP：陽性コントロールが陽性と判定されること。
・陰性コントロール
Water control の反応ウェルで、各ターゲットが陰性判定されること。
Roche 社キットの規定レンジ
Target gene/assay

サンプルの陽性判定を行う

陽性コントロールの Ct 値

Ct 値

a

Roche E<3628-31

Roche N<3728-32

Roche RdRP

<3928-32

EAV control>25 (27-33)a-27-33 となるよう抽出時の投入量を調節することが望ましい。

文献
1. Corman VM et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RTPCR. Euro Surveill. 2020 Jan;25(3). doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.
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yazblood＠kuhp.kyoto-u.ac.jp