モダンメディア 58 巻 4 号 2012［医学検査のあゆみ］ 113

医学検査のあゆみ ─ 18

質量分析技術を利用した細菌の新しい同定法

おお

くす

きよ

ふみ

大 楠 清 文Kiyofumi OHKUSU

高分子の質量分析法のための脱離イオン化法」であはじめにる。この成果を発端としているマトリックス支援
レーザー脱離イオン化質量分析計（MALDI-TOF

地球が誕生したのが約 45 億年前とされており、MS）を用いた微生物の新しい同定法が大きな注目

最古の細菌は約 35 億年前に現れたことが確認されを集めており、欧州ではすでに 500 施設以上で実用ている。すなわち、細菌は地球誕生から約 10 億年化されている。わが国でも 2011 年から臨床微生物

かけて自己複製能力を身につけた生命体として進化

検査の現場での使用が開始されており、今後急速にを遂げたことになる。
「細菌」（microbe）という語は、普及していくことが予想される。

1879 年に外科医セディヨーが医学アカデミー会員

本稿では、細菌の分類と同定の概念を再考しつつ、として「パスツール氏の研究が外科学の進歩に与え分類体系の変遷と最近の動向を概説しながら、質量た影響について」と題した講演のなかで初めて用い分析技術による細菌同定の原理や日常検査におけるられたようである。この 19 世紀末から 20 世紀初め

活用法と今後の展望について紹介したい。

は、細菌学の創始者パスツールとコッホの研究と貢献に引き続いて、病原細菌発見の黄金時代と呼ばれ

Ⅰ. 分類そして同定とはている。すなわち、炭疽（1876 年）、腸チフス（1880年）、結核（1882 年）、コレラ（1883 年）、ジフテリ

新たな技術が登場して、その技術が臨床微生物検

アおよび破傷風（1884 年）、ペスト（1894 年）、梅毒査に応用される際には、今一度「分類」や「同定」（1905 年）といった感染症の原因菌が短期間のうちの概念を見つめ直すことが大切である。分類学 tax-に次々と発見された。この頃の細菌の記載方法は、

onomy の語源はギリシャ語の taxis = 整理 arrange-

病原細菌を一般の細菌と区別するために、形態と生

ment と nimina = 配列 distribution に由来するとされ化学性状を中心としたものであった。その後、多数ている。分類学には歴史的にさまざまな見解があるの性状をコンピューター化した数値分類、細菌の細が、著名な分類学者である Cowan 博士は、分類学

胞構成成分を指標とした化学分類、さらに遺伝子増を次の 3 つの概念に分けた。すなわち、①分類 class-

幅法や自動塩基配列決定技術の急速な進歩の影響を

ification ：類似性に基づいてグループの中に細菌を受けながら、ゲノム細菌学とも呼ぶべき時代を迎え

秩序正しく配列すること、②命名 nomenclature ：①

た。そして、ポストゲノム時代の現在、ここでも基によって定義されたグループの単位に名前を付ける

礎的研究が新しい理論や技術を生み出し、社会や産こと、そして③同定 identification ：未知の細菌が①

業を一変させる成果へと進展した姿を見ることがでおよび②によって定義・命名されたグループのどれきる。それが 2002 年にノーベル化学賞を受賞したに属するかを決定するプロセスである。そして、こ

田中耕一博士（島津製作所）が開発した技術「生体の三位一体の総合が分類学であるとした。したがっ岐阜大学大学院医学系研究科
病原体制御学分野 准教授
0501 - 1194 岐阜市柳戸 1 - 1

Department of Microbiology, Gifu University Graduate School of Medicine(1-1 Yanagido, Gifu)（ 11 ）

114て、日常検査における「細菌の同定」は、未知の分うになった。ゲノム解析技術とその解析結果が分離菌株がすでに記載されたどの菌種にもっとも近い

類学の概念や分類体系の構築に影響を与えるかもしかを決定する作業である。いわば同定とは、分類とれない。

命名の実践的な応用なのである。同定を行う場合、未知の分離菌株の性状を調べてその特徴を類似した

Ⅲ. 細菌分類の変遷

菌種の記載と比較する。同定ではその菌種をお互いに効率よく識別するために重みづけされた性状を用細菌の分類は、20 世紀の前半には病原性菌種といる一方で、分類では性状に重みづけしないことがそのほかの菌種を識別することから始まった。その望ましい。この点で同定は分類とは大きく異なるの手段として、集落の性状、染色所見、菌の形態や配である。しばしば分類と同定が混同されているので列、血清型、そして少数の生化学的性状で病原性菌

注意が必要である。

種を識別する検査方法が採用された。その後、菌種が増加するにつれ、調べなければいけない性状が多くなり、コンピューターを使った数値分類法へと進

Ⅱ. 細菌の分類体系展し、これまで臨床微生物検査の現場で利用されて細菌は約 8,000 種類が記載されており、毎年約 100いる。すなわち、この数値分類の概念は日常検査で種類が新種として追加されている。細菌の分類は、頻用されている同定キットや自動同定機器の開発に

国際細菌命名規約（International Code of Nomen-

貢献したのである。1970 年代後半には、再現性のclature of Bacteria ; ICNB）
によって規定されている。

高い方法として細菌の基本構造の成分を利用する化細菌を分類する最も基本的な単位は株 strain であ学分類が発展した。細胞壁のペプチドグルカンの組る。しかし、分類学上の最小単位は、株ではなく菌

成、呼吸鎖酵素キノンの分子種、細胞壁の脂質や脂種 species である。実際、国際細菌命名規約では、

肪酸の種類、DNA の GC%などを分類指標としてい種（ときに亜種 subspecies）以上の細菌を取り扱い、る。1980 年代からは、16S rDNA の配列に基づく分種を細分する血清型 serovar、ファージ型 phagovar、子進化学的な系統分類が主流となった。16S rDNA

病原型 pathovar、生物型 biovar は規約の対象外でのほぼ全塩基配列（約 1,500 bp）を決定し、類似度ある。

が 98.7%以上の菌種がない場合は新しい菌種の可能
2）

菌種名は二命名法 binomial nomenclature により性が高い 。つまり、16S rRNA のシークエンスをラテン語で記載される。この命名法では、最初の名決定して系統解析を行えば、未知の菌株がどの属には属名 genus で、最初の文字は大文字で示される。

所属しているか、あるいはどの菌種と類縁関係にあ第 2 の名は、種形容語 specific epithet と呼ばれているかを推定できるようになったのである。そしてポる。属名と種形容語を一緒にすることにより 1 つのストゲノムの時代を迎えた今日、質量分析計を用い

種名を表している。よって、種形容語の部分のみて細菌に由来したタンパク質成分の分子量情報（マを指して種名というのは誤りなので注意が必要でススペクトル）のパターンから、わずか 5 分足らずある。

で分離菌株の同定をできるようになったのである。

種の定義は、「全染色体 DNA の定量的な DNA/

しかしながら、前述のように「同定」がすでに記載

DNA ハイブリッド形成が最適条件下で 70%以上あされたどの菌種にもっとも近いかを決定する作業でり、かつハイブリッドの熱安定度が 5 ℃以内におさあることに変わりはなく、今回の主題である「質量1）まる菌株の集まり」としている 。現在の分類学的分析法」を利用した最新の方法であっても、分離さなアプローチでは、上述の DNA/DNA ハイブリッ

れたすべての細菌を完全に同定することはできな

ド試験に基づいて菌株をグルーピングした後、これい。細菌が「生き物」である以上は今後も細菌の培に対応するようなキーとなる表現性状を探して、そ養と表現性状を解析する重要性はいささかも変わら

れらを菌種の識別指標として同定を行うことになる。

ないことを申し添えておきたい。

近年、次世代型シークエンサーの台頭により数日間で細菌の全ゲノムの配列を決定・比較できるよ（ 12 ）

115

り出すタイプとの組み合わせである。このタイプの質量分析装置は、MALDI-TOF MS（Matrix Assisted

Ⅳ. 質量分析法とはLaser Desorption/Ionization -Time of Flight Mass
タンパク質やペプチドなどの分子の重さ（質量）Spectrometer）と呼ばれており、日本語に訳すとを計ることが「質量分析（Mass Spectrometry）」で「マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型ある。英語の Mass Spectrometry の頭文字から MS

質量分析計」である。

と略記されるので、慣用的に「マス」と読むことが多い。タンパク質は各々固有の重さを持っているの

Ⅴ. MALDI-TOF MS とはで、この重さの違いを利用すれば、分子量からタンパク質の名前やその濃度を知ることができる。また、

ここでは MALDI-TOF MS の原理をまとめてみた

未知の試料にどのようなタンパク質がどのくらい含い。この複雑な名前の原理を理解するために、まずまれているのかも解析できる。すなわち、質量分析

はこの「MALDI-TOF MS」という名前を構成する各法の最大の利点は、さまざまな物質を同時に検知し要素をキーワードとしてその概念を紹介する。つまて同定と定量の両方が可能なことである。実際、医り、①マトリックス支援（Matrix Assisted）、②

療領域では代謝疾患や悪性腫瘍の患者のタンパク質

レーザー脱離イオン化あるいはレーザーイオン化を探索して、その病態に関与するバイオマーカーの（Laser Desorption/Ionization）、③飛行時間型質量研究ですでに利用されている。病態に関与する既知分析計（Time of Flight Mass Spectrometer ; TOFのタンパク質を同定できるだけでなく、未知のタンMS）の 3 項目を順に概説する。

パク質の構造を決定するうえでも大きな役割を果た

1）マトリックス支援（Matrix Assisted）とはしているのである。
では、タンパク質の重さをどのようにして計るの「マトリックス」の明確な定義は定まっていないが、か。分子レベルで極めて微量であるため、試薬のよ

一般には「レーザー光を吸収して試料のイオン化を

うに天秤に載せて計るというわけにはいかない。質促進する有機化合物」である。MALDI では、窒素量分析計を用いて測定する。すなわち、質量分析はレーザー（波長 337nm）が頻用されている。また、微次の 3 つのステップからなる。①試料をイオン化す

生物同定に適したマトリックスとして、α-cyano - 4-る、②イオンを分離する（重さで分ける）、③そのhydroxy cinnamic acid（CHCA）や sinapinic acid（シイオンを検出する。つまり、質量分析を一言で表現

ナピン酸）などのベンゼン骨格を持つ有機化合物がすると「イオン化して飛ばした後、キャッチする」の使用されている。ベンゼン環がレーザー光を吸収しである。各々のステップにはいくつかの手法が開発て、- COOH（カルボキシル基）のような官能基が Hされている（表 1）。これらの組み合わせによって（プロトン）を試料へ供給することによってタンパク

質量分析計はさまざまなタイプの装置が存在する。

質がイオン化されるのである。マトリックスの働きは、

たとえば、後述するような細菌の同定に使用されて①レーザーのエネルギーを効率的に吸収する、②プいる装置は、マトリックスという試薬と試料を混合

ロトンを試料に供給してイオン化を促進する、③試して「レーザー」を照射することによってイオン化す

料が分解するのを防ぐことである。すなわち、マトるタイプと、真空中のある一定の距離をイオンがどリックスの支援（助け）を借りてタンパク質を壊さずのくらいの時間で飛んでいくかを計測して質量を割に効率的にイオン化するのが MALDI である（図 1）。

表 1 質量分析のステップと解析手法①試料のイオン化②イオンの分離③イオンの検出✓ 電子イオン化（EI）✓ 磁場型✓ 電子増倍管✓ 化学イオン化（CI）✓ 四重極型✓ マイクロチャネルプレート✓ 高速原子衝撃（FAB）✓ イオントラップ型✓ エレクトロスプレーイオン化（ESI）✓ サイクロトロン共鳴型✓ マトリックス支援レーザー✓ 飛行時間型（TOF）

脱離イオン化（MALDI）（ 13 ）＋

116

マトリックスと試料の混合レーザーによる
マトリックスの励起脱離およびイオン化；プロトン（H+）化

検出器

+

+

+

+

m1

相
対
強
度

レーザー光
H+

真
空
中
を
飛
行

✓ ソフトなイオン化✓ 多価イオンを生成しづらい

レーザーイオン化とは文字通り、試料にレーザー

t1

飛行時間の測定

+m

+

+

加
速

軽い分子の方が速く飛行する（飛行時間が短い）

t2 t3

飛行時間

+ m2

図 1 MALDI の基本原理

2）レーザー脱離 /イオン化とは

図3

図 4 マススペクトル；MS

3

相
対
強
度

+

電極

レーザー光
+

+

+

電場をかけるレーザー脱離/イオン化

m1 m2 m3

質量＊m/z

試料とマトリックス

光を照射することによってプロトンの受け渡しをしてイオンを生成させることである。一方、レーザー脱図 2 MALDI-TOF MS の基本原理

離は試料（固体あるいは液体）にレーザー光を照射すると急速に加熱されるので、試料が気相へガス化

早く、検出器に早く到達するが、質量の大きな分子（脱離）される方法である。この脱離は広義にはイオ

は飛行速度が遅くなり、検出器までの到達時間も遅ン化も含まれるので、Laser Desorption/Ionization

くなる。つまり、各々のイオンの検出器までの到達（レーザー脱離 /イオン化）と表現される。

時間を計測すれば、それぞれの質量（質量電荷比）

ところで、タンパク質は熱に弱いので、レーザーを割り出すことができるのである。

を直接当てると壊れてしまうため、タンパク質をう

軽い分子は早く走り、重い分子は遅れて走るのでまくイオン化することに 1985 年頃まで誰も成功し検出器には質量の軽いものから順に検出器で信号をていなかった。ここで田中耕一博士の登場である。

発生する。この現象を横軸に時間、縦軸に検出強度

田中博士はレーザーを当ててもタンパク質を壊さなとしてプロットしたのが図 3 である。さらに、このいようにするために、レーザーのエネルギーを弱め

飛行時間を質量（質量電荷比）に換算して作図をしる物質（補助剤）を日夜探していた。ある時、間違ったものが図 4 であり、この波形のパターンをマススた試薬を混合して補助剤を作製してしまい、普通な

ペクトルと呼ぶ。このマススペクトルは特定の分子

らばそのまま破棄してしまうところを、この補助剤

量（1 つのピーク）から試料に含まれる成分を推定

を試料に混ぜてレーザーを照射したところ、タンパ

することにも利用される一方で、この波形全体のパク質を壊さずに「ゆるやかな（ソフトな）イオン化」

ターン（ピーク分布）自体がその試料の特性を示し3）に成功したのだ。この成果 が 2002 年にノーベルているともいえる。そこで、ある細菌をまるごと飛化学賞の受賞に繋がったのである。

ばしたタンパク質のマススペクトルのピーク分布が特定の菌種のマススペクトルのパターンと同じであ3）飛行時間型（Time of Flight-Mass Spectrometer ; TOF-MS）
イオンを重さ（質量電荷比）で分離する手法の 1

れば、その細菌と同定できるのではないかとの発想が生まれたのであろう。次に、その原理と市販の細菌同定システムを紹介したい。

つである。サンプルプレート上でイオン化された試
料は電圧をかけると加速されて、真空中を検出器にⅥ. MALDI-TOF MS による

向かって走行する（図 2）。この時、イオンが受け

細菌同定の基本原理

取るエネルギーは電荷量が同じであれば一定なので、すべてのイオンは加速領域を出る段階で同じ運質量分析法による細菌同定の装置・システムとし1
mv 2 を持つ。エネルギー保存の法
動エネルギー K= −2て 2 種 類 が 販 売 さ れ て い る（ 図 5 ）。 1 つ は ブル則から質量（m）の小さい分子ほど飛行速度（v）がカー・ダルトニクス社（ドイツ）の「MALDI Biotyper」（ 14 ）

117

ブルカー・ダルトニクス社
MALDI Biotyper Ver.3.0「指紋」のようなものである。横軸が質量（質量電島津製作所：AXIMA微生物同定システム
シスメックス・ビオメリュー社：VITEK MS

荷比）で約 2,000 〜 20,000 ダルトン（Da）の分子量の範囲が解析に用いられる。縦軸はシグナルの強度である。どの分子量にどのくらいの強度でピークが観察されるか、またそのピークのパターンがどの菌種のマススペクトルのパターンと一致しているかが同定のポイントとなる。なお、ここで観察される波形のピークは菌体を構成しているタンパク質が主体であるが、とりわけ細菌のリボソームに由来するタ（ブルカー・ダルトニクス社の許可を得て転載） （シスメックス・ビオメリュー社の許可を得て転載）

ンパクが 50 〜 70%を占めている。リボソームは細図 5 MALDI-TOF MS を用いた微生物同定システム

菌の「タンパク合成の工場」であるため、発現量も多く、塩基性の成分が大半であるがゆえにイオン化である。国内ではブルカー・ダルトニクスの日本法人

されやすく、分子量も上述の範囲内に収まっていると日本 BD そしてシーメンスの 3 社が取り扱っていので、マススペクトルの主要なピークとして観測さる。もう 1 つは島津製作所の AXIMA 微生物同定シれるのである。

ステムである。本システムはシスメックス・ビオメ

ところで、このマススペクトルは菌種が異なればリュー社から「VITEK MS」としても販売されていパターンも違うのか（識別能力）。図 7 に 6 菌種のる。「MALDI Biotyper」と「VITEK MS」はともにマススペクトルを比較してみる。確かに菌種によっ

MALDI-TOF MS タイプの装置で、すでに医療機器てピークと強度のパターンが異なっている。次に、として認可されている。

同じ菌種であれば菌株の違いによる影響は受けない

微生物の同定に MALDI-TOF MS タイプの質量分のか（再現性）。これも図 8 に 2 菌種において各々 5

析計が利用される理由として次の 3 つがあげられ

株のマススペクトルで比較しているが、やはり同じ5る。①少ない菌量（約 10 個）で前処理が簡便である、菌種であれば同じパターンである。そこで、さまざ②精製されたタンパクでなくてもイオン化の効率がまな菌種のさまざまな菌株をデータベースに登録しそれほど低下しない、③ 1 価のイオン生成が主体でておき、コンピューターの力を借りて未知の菌株のあるためスペクトルの解析が容易である。

マススペクトルがどの菌種のパターンと一致していまるごと飛ばしてみよう！そのマススペクトルのパ

つまり、MALDI-TOF MS を用いた菌種の同定を一ターンが図 6 である。いわば、この波形が大腸菌の言で表現すれば、「データベースに登録されている

1000

0
4000

4500

5000

5500

6000

6500

7000

図 6 大腸菌のマススペクトル（ 15 ）

7500

8368.992000

m/z4364,33
5095,82
5380,396255,396315,19
6410,60
7157,74
7273,45
7871,06
8368,76

7870.626410.905096.013000

ribosomal Protein
RL36
RS32
RL34
RL33meth.
RL32
RL30
RL35
RL29
RL31
RS21

7157.657273.876315.494000

6254.645380.645000

4364.06

るかをデータベースの中から瞬時に探すのである。

Intens. [a.u.]

まずは MALDI-TOF MS を用いて実際に大腸菌を

8000

m/z

118

（シスメックス・ビオメリュー社の許可を得て転載）

図 7 マススペクトルのパターンは菌種によって異なる（シスメックス・ビオメリュー社の許可を得て転載）

図 8 同じ菌種であれば同じマススペクトルのパターン

菌種とのマススペクトルのパターンマッチング」でを複数回測定して、マススペクトルの各ピーク（分ある（図 9）。どの菌種の「指紋」と一致するかを探子量）とその強度の平均値を算出する。また、各すのである。となれば、精度の高い同定を達成する

ピークの検出頻度を考慮しながら、まれにしか検出カギを握るのが「データベース（ライブラリー）のされないピークはあらかじめノイズとして除去後、充実」と「パターンマッチングのロジック」であろ

データベースに登録される。同定したい菌株がこのう。「MALDI Biotyper」と「VITEK MS」のデータ

データベースのどの菌株（菌種）と近縁であるか

ベースの基本概念を次に紹介する。最初に断ってお（系統樹解析を行い、独自のアルゴリズムで行うときたいことは、両方のシステムのデータベース（ラのことで詳細は未公開）をスコア値で表現され、こイブラリー）は毎年 1, 2 回の更新が予定されているのスコア値が高い順に候補の菌種名が表示されるので、現時点で登録されている菌種数や菌株数の比（図 10）。スコア値が 2.0 以上であれば菌種レベルで較を行うことは意味をなさない。ここでは両システ

信頼性が高く、1.7 以上 2.0 未満では属レベルでのムにおけるデータベースの基本的な構築理念を概説

一致と判断される。同じ菌種でも複数の株が登録さしたい。

れているので、株間にパターンの多様性があっても

MALDI Biotyper は「Main Spectra（MSP）」が基

正確な同定が可能とされている。

本のコンセプトである。各菌株（基本的には基準株）（ 16 ）TM

他方、VITEK MS の基本理念は「SuperSpectra 」

119（ブルカー・ダルトニクス社の許可を得て転載）

図 9 マススペクトルのパターンマッチング
ピークの質量と強度の分布から未知の菌株のパターン（上段）がデータベースの登録された菌株のパターン（下段）と一致した。
表示菌株の菌種と一致
属は一致
一致していると言えない（ブルカー・ダルトニクス社の許可を得て転載）

図 10 MALDI Biotyper による菌株の同定結果である。同一菌種の複数株（複数の施設で分離されらなる。①菌体とマトリックス試薬を混ぜて乾燥さた 15 株以上）を多重測定し、安定して検出される

せる、② MALDI-TOF MS でマススペクトルを取得

ピーク群のうち科、属、菌種に特徴的なピークに重する、そして③そのマススペクトルをデータベース

4）

み付けを行う 。つまり、菌種に特異的なピークをバに照合してパターンマッチングを行う。これらのワー

イオマーカーとして抽出後に重みづけを行ったデー

クフローを図 11 に示す。基本的には新鮮な集落をタ（スーパースペクトル）がデータベースに登録され直接サンプルプレートに載せて解析を行う（ダイレている。科、属、菌種レベルの順にスコア値を高く

クトスメア法あるいはセルスメア法と呼ぶ）。マト

設定しておき、一致したピークのスコア値をすべてリックス試薬を滴下して乾燥する時間を含めて、約加算する。この合計スコア値によって同定を行う。

10 分で同定結果が得られる（MALDI-TOF MS での測定自体は約 2 分）。もし、うまく解析ができなかった場合には、菌体からタンパクを抽出する操作（ギⅦ. MALDI-TOF MS システムによる酸溶液を使用；抽出法と呼ぶ）が必要なため、追加

細菌同定の実際

で 10 分ほどの時間が必要である。1 検体あたりのラ質量分析法による菌株の同定は 3 つのステップか

ンニングコストは 20 円から 50 円ほどである。なお、（ 17 ）

120

コロニーをピックアップ

ターゲットプレートに薄く塗布

マトリックスを添加

54mm

In ten s . [a .u .]36mm

乾燥後、装置に装填

ふたを閉めて・・・真空引き（3分以内）

マススペクトルを取得

ライブラリーとパターンマッチングし、同定

60 0

40 0

20 0

0
20 00

40 00

60 00

8 00 0

10 00 0

12 00 0

14 00 01 60 00

1 80 00

20 00 0m /z

（ブルカー・ダルトニクス社の許可を得て転載）

図 11 MALDI Biotyper による菌株同定のワークフロー

測定機器・システムの定価は、MALDI Biotyper が種の組み合わせとして、Escherichia coli（ 大腸菌）

2,800 万円、VITEK MS は 2,980 万円と公開されてと Shigella flexneri（赤痢菌）、Mycobacterium tuber-

いるが、データベースの更新料や窒素レーザー交換

culosis（ヒト型結核菌）と M. bovis（ウシ型結核菌）、などのメンテナンス料を含めて、詳細は各メーカー

Bacillus cereus（セレウス菌）と B. anthracis（炭疽菌）、にお問い合わせいただきたい。

Yersinia pestis（ペスト菌）と Y. pseudotuberculosis

所要時間やコストもそうではあるが、従来法の同（偽結核菌）などである。これらの組み合わせの菌定キットや自動同定機器による生化学的な手法と種は DNA/DNA 相同性が互いに 70%以上を示すの

MALDI-TOF MS による同定の比較・検討が一番興で、本来は同一の菌種であるという分類学上の問題

味のあるところである。事実、毎月のように欧米でに起因することを追記しておきたい。

の臨床微生物関連の学術雑誌に検討結果が掲載されている。誌面の都合上、これらのデータの詳細を紹介することはできないが、いくつかの文献

5 〜 7）

Ⅷ. MALDI-TOF MS システムのを活用と今後の展望

提示するので参照されたい。検討した医療施設の規模や菌種の分離頻度が異なるため、あくまで大まか

MALDI-TOF MS は一般細菌だけでなく、嫌気性な一致率ではあるが、菌種レベルで 70 〜 95%、属菌、抗酸菌、酵母様真菌、糸状菌の同定にも利用レベルで 80 〜 98%との報告が多い。腸内細菌群やできることが大きな利点である。すなわち、同定

Staphylococcus 属の同定では菌種レベルで 90%以上

キットの種類や自動同定機器のパネルを選択するの同定精度であるものの、Streptococcuss 属の同定はことなく、1 つのシステムで臨床的に重要なあらゆ

やや劣るようである。これは、S. pneumoniae（肺炎る菌種を取り扱うことができるのである。2012 年 1球菌）と S. mitis grroup の鑑別・同定は困難である

月現在、嫌気性菌、放線菌、抗酸菌は、データベーことが影響しているのであろう。前述のように、スに収載されている菌種がやや少ないが、今後ライ

MALDI-TOF MS は主にリボソーム由来のタンパクブラリーが充実してくれば利用できるであろう。実の違いで同定を行っているため、16S rDNA の配際、MALDI Biotyper には 2011 年末に約 100 菌種の列相同性が高い類縁菌種の同定は難しい傾向があ

Mycobacterium 属菌がライブラリーに追加されたのる。その他、MALDI-TOF MS で同定ができない菌で、臨床分離株を用いた検討結果に注目したい。

（ 18 ）

121

一方、酵母様真菌の特に Candida 属菌や Cryptococ8, 9）

パクを多く含むため、培養液を直接、MALDI-TOF。糸状

MS に塗布して解析することはできない。血液培養

菌は固定培地で発育した集落での同定は困難であ液の前処理用の試薬キット（MALDI Sepsityper ）るが、液体培養で撹拌培養した後、同定を行えばがブルカー・ダルトニクス社から販売されている。

再現性の高いマススペクトルが得られるとの情報が所要時間は約 5 分で操作も簡便である（図 12）。1ある。

検体あたり 800 円のコストがかかるため、今後、さcus 属菌は正確な菌種の同定が可能である

その他、MALDI-TOF MS の活用として最も臨床的に有用性が高いのが、血液培養陽性時の培養液かTM

まざまな前処理法の検討・評価が行われることに期待したい。

ら直接の菌種同定である。すでに多くの施設で検討

次にはおそらく臨床検体から直接に菌種の同定が10 〜 12）

できないかとの期待が大きく膨らむであろう。現在が多い。なお、血液培養液には血球ほかヒトのタンのシステムでは 10 個くらいの菌量を必要とするたされており、約 70 〜 80%の同定精度との報告

5

め、敗血症の診断に血液から直接に菌種の同定を行うことは困難である。一方、感染時の菌量が多い尿や髄液では検体直接の同定が可能との報告

血液培養陽性ボトル

13, 14）がある。とりわけ、細菌性髄膜炎では迅速な起炎菌の診断が患者の予後に大きく影響するため、MALDI-TOF
MS による髄液から直接の菌種同定は臨床への貢献

1ml 血液培養液をリアクション
チューブに入れる
1min

度がきわめて高い。尿や血液培養液に複数菌が 5：1 くらいであれば、双方の菌種を同定できる。
これ以上の比率になると多く存在する方の菌種のみ

13,000rpmで1分間遠心
上清を棄てる1min

Washing Buffer

サンプル前処理が存在する場合（混合感染）があるが、2 菌種の比率

200ulのLysis Bufferを加えて10秒ボルテックス
30sec

Lysis Buffer15）が同定されて、少量の方の菌名は候補にあがらないようである。

1mlのWashing Bufferを加えピペッティングで攪拌懸濁
1.5minその他、細菌が出す毒素の検出やウイルスの同定に適用した報告16, 17）がある。薬剤耐性菌の鑑別につ

13,000rpmで1分間遠心
上清を棄てる1min

いては、β-ラクタム薬やカルバペネム系薬での検300ul脱イオン水を加え懸濁
900ulエタノールを加えるを待つべきである。株レベルのタイピングは現状の討結果が報告18, 19）されているが、今後の詳細な検討システムではあまり期待できない（表 2）。すなわ

Brukerの「抽出法」で処理（エタノール、ギ酸抽出）

ち、MALDI-TOF MS の主要な用途はあくまでも菌種レベルの同定であり、株レベルの異同の判定は現

図 12 Bruker MALDI Sepsityper キットを用いた血液培養陽性ボトル液の前処理法

在のところ、困難であるとの見解

表 2 分類の代表的な方法とその適用範囲
科
Family分類・同定・タイピングの方法
DNA-DNA ハイブリダイゼーション
16S rRNA 遺伝子の配列相同性
G＋C mol %血清型、ファージ型
多型解析（PFGE）、リボタイピング
Multilocus sequence typing（MLST）
MALDI -TOF MS（ 19 ）

属
Genes

種
Species株
Strain

20）

である。

122

Gram-Negative Bacilli. J Clin Microbiol. 49 : 887-892,
2011.

おわりに

8 ）Marklein G, Josten M, Klanke U, et al.: Matrix-Assisted
Laser Desorption Ionization -Time of Flight Mass Spec-

近年の飛躍的な技術の進歩によって臨床微生物検

trometry for Fast and Reliable Identification of ClinicalYeast Isolates. J Clin Microbiol. 49 : 2912-2917, 2011.

査が大きな変貌を遂げようとしている。すなわち、

9 ）Dhiman N, Hall L, Wohlfiel S, et al.: Performance and臨床微生物検査における「三大技術革新」ともいえCost Analysis of Matrix-Assisted Laser Desorption Ioniza-

る自動同定感受性機器、遺伝子増幅技術、そして今

tion -Time of Flight Mass Spectrometry for Routine Identi-

回ご紹介した質量分析法が日常検査に導入されるよ

fication of Yeast. J Clin Microbiol. 49 : 1614 -1616, 2011.

うになったのである。しかしながら、これらの技術

10）Scola L, Raoult D : Direct identification of bacteria in positive blood culture bottles by matrix-assisted laser desorp-

はあくまでも感染症検査のためのツールにすぎなtion ionisation time-of-flight mass spectrometry. PLoS

い。検査の対象が細菌という生き物であるがゆえに、鏡検・培養・感受性試験の「三種の基本技術」が今One. 4 : e8041, 2009.
11）Kok J, Thomas L, Olma T, et al.: Identification of bacteriain blood culture broths using matrix-assisted laser des-後も大切であることは何ら変わらない。そして、患orption-ionization Sepsityper

者診療に直結するこれら検査の一つ一つが結局は、TM

and time of flight mass

spectrometry. PLoS One. 6 : e23285, 2011.

臨床微生物検査技師の「テクニック・ノウハウ・ス

12）Schmidt V, Jarosch A, Marz P, et al.: Positive blood cul-

キル」にすべて委ねられている以上、今後もわれわ

ture by matrix-assisted laser desorption ionization time-offlight mass spectrometry. Eur J Clin Microbiol Infect Dis.

れ自身がこれら「三種の実践的な智恵」に磨きをかけていくことが何より重要だと思うのである。

2011 [Epub ahead of print].
13）Ferreira L, Sanchez-Juanes F, Gonzalez-Avila M, et al.:Direct Identif ication of Urinary Tract Pathogens from

文

Urine Samples by Matrix-Assisted Laser Desorption Ion-

献

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（ 20 ）