廃水処理汚泥内 apsA mRNA 発現微生物群の高感度 FISH 法による検出

1. Introduction

水圏土壌環境制御研究室

大塚 勇輝

指導教員

山口 隆司

生 理 学 的 特 徴 のFluorescence

insitu複合微生物系内の微生物叢解析手法の一つ

hybridization (FISH) 法による同時解析を, 塩に, 微生物の 16S rRNA 遺伝子の塩基配列の基配列の選択制の高い手法により実施するこ違いから特定の微生物を検出する方法が用いとを目的とした. 本研究では, 標的として硫られている. しかし, この手法では, 微生物酸塩還元細菌や硫黄酸化脱窒菌等の保有する,の持つ生理学的特徴を把握することが難しい.

硫酸還元または硫黄呼吸に関連する apsA 遺そこで近年, 微生物の反応を触媒する酵素の伝子の mRNA を選定した.

遺伝情報である機能遺伝子の塩基配列から微の高い FISH 法として, オリゴヌクレオチド生物叢の解析が行われている. これまでに,プローブを用いた FISH 法を選択した. しか機能遺伝子の塩基配列情報を利用したクロー

し, mRNA は細胞内での存在数が極めて少な

ニング解析から, 同一機能を保有する微生物いため, 既存の方法では検出に十分な感度を群を機能遺伝子により網羅的に検出し, 更に得ることができない. そこで, 高感度 FISH 法

Real-time PCR 法により菌数の変遷をモニタである Catalyzed reporter deposition (CARD)リングする技術が報告されている. 微生物機-FISH 法により mRNA を検出した.

実験的な特異性能を利用した解析が行われる中, 機能遺伝子による解析結果と 16S rRNA 遺伝子による解2. Materials and Methods

析結果を一致させる試みが行われている. しモデルとする機能遺伝子には, 硫黄呼吸をかし, 両者の解析結果は一部において一致せ行う微生物群が共通して保有する apsA 遺伝ず, 同時に解析することが難しい. この微生子を選定した. サンプルには, 乳酸塩と硫酸物の系統分類学的情報と生理学的特徴を同時

塩を主要有機源とする培地に 30 ℃で 3 日間,解析する方法の一つとして, オリゴヌクレオプレ培養した嫌気性グラニュール汚泥と, 人チドプローブにより微生物の 16S rRNA を,工廃水 (COD/SO42- = 5) を処理する UASB

ポリヌクレオチドプローブにより機能遺伝子リアクターから採取したグラニュール汚泥のの mRNA を検出し, 顕微鏡の同一視野内で一二種類を用いた. サンプルは, 採取した後,致させる方法が報告された. しかし, ポリヌ直ちにパラホルムアルデヒドで固定した.

クレオチドプローブは, その塩基の長さから,apsA mRNA を 検 出 す る プ ロ ー ブ に は塩基配列のミスマッチを識別する為に, 厳し

APS8R (5ʼ-GCA CAT GTC GCG GAA GTC

い実験条件の設定が必要であり, 実験的な特TTC-3ʼ) を選定した. APS8R プローブの有効異性を得ることが難しい特徴を持つ. このた性 は Clone-FISH 法 に よ り 確 認 し た . ま た ,め, 廃水汚泥のような複雑な菌叢には対応がrRNA を 標 的 と す る プ ロ ー ブ に は , 主 に難しいと考えられ, より特異性の高い手法のDeltaproteobacteria 綱に属する硫酸塩還元細適用が望まれる. そこで本研究では, 廃水汚菌を検出する SRB385 (5ʼ-CGG CGT CGC

泥内に存在する微生物の系統分類学的情報とTGC GTC AGG-3ʼ) を選定した.

mRNA の検出には高感度 FISH 法である
CARD-FISH 法 (Fig.1) を 用 い た . rRNA は ,mRNA の検出後, 蛍光標識プローブを用いたFISH 法で検出した. 微生物の系統分類学的情報と生理学的特徴を同時に検出するために両シグナルを同一視野で観察した.

3. Result3-1. プ ロ ー ブ の 有 効 性 の 確 認
apsA mRNA を FISH 法により検出する為に,プライマーAPS8R を選定した. APS8R のプローブとしての有効性を確認する為に,Clone-FISH 法を適用した. 標的は, APSdelta-F(5ʼ-TGG CAG ATC ATG ATC AA-3ʼ) と APS
D.vulgaris 1620R (5ʼ-GCA TCA TGA AGT TCTTG-3ʼ) のプライマーペア により増幅させた
apsA 遺伝子を順方向に組み込んだプラスミドを有 す る大腸 菌である . apsA RNA は T7RNA ポリメラーゼにより発現させた. ネガテ
ィブコントロールには, プラスミドを組み込んでいない大腸菌を用いた. 実験の結果, ク
ローン内の apsA 遺伝子から転写された RNAを 検 出 す る こ と が で き た (Fig.2) . ま た , ネ
ガティブコントロールからはシグナルが検出されなかった (Data not shown) . このことから, APS8R は apsA 遺伝子の塩基配列を特異的に検出することが確認された.
3-2. Desulfovibrio vulgaris の apsA mRNAの検出
Clone-FISH 法により, APS8R プローブの有効性を確認した. 次に, モデル微生物として硫酸塩還元細菌の純粋菌株である D.vulgarisを選択し, 細胞内の apsA mRNA が検出可能であるかを検討した. ネガティブコントロー
ルには Escherichia coli を用いた. 実験の結果,
D.vulgaris から apsA mRNA 由来のシグナルが検出された (Fig.3) . また E.coli からはシグナ
ルは検出されなかった. このことから,
APS8R は apsA mRNA に対して適用が可能であると判断した.
3-3. 系 統 分 類 学 的 情 報 と 生 理 学 的 特 徴 のFISH 法による同時検出
プレ培養を行った嫌気性グラニュール汚泥を, 複合微生物系を有する環境サンプルのモデルとして用い, apsA mRNA と 16S rRNA の同時検出を試みた. 実験の結果, サンプル内の多くの細胞から APS8R 由来のシグナルを検出することができた(Fig.4B). 更 に ,APS8R 由来のシグナルは, SRB385 由来のシグナルの一部と完全に一致していた (Fig.4B,C). この結果から, シングルセルレベルで系統分類学的情報と生理学的特徴の同時検出が可能であると確認できた. SRB385 は, 主にDeltaproteobacteria 綱に属する硫酸塩還元細菌を検出することから, 培養したグラニュール汚泥では, これら微生物が優先して硫酸還元反応を行っていることが示唆された. これにより, 環境中の複合微生物系に存在する微生物群の系統分類学的情報と生理学的特徴を

FISH 法により同時に検出することが可能であることを証明できた.
3-4. 汚 泥 サ ン プ ル へ の 系 統 分 類 学 的 情 報と 生 理 学 的 特 徴 の FISH 法 に よ る 同 時
検出複合微生物系に存在する微生物群の系統分類学的情報と生理学的特徴を FISH 法により同時検出できることが確認された. 続いて,実際の汚泥サンプルへ本手法を適用したときの知見を得るために, 人工廃水を処理するリアクターのグラニュール汚泥に対して, apsAmRNA と rRNA の同時検出することを試みた.
実験の結果, グラニュール汚泥の多くの細胞から APS8R 由来のシグナルを検出することができた (Fig.5B). しかし, SRB385 由来のシグナルと比較したところ, 両者のシグナルは全て一致していたなかった (Fig.5B, C). 従って対象サンプルの反応槽内では SRB385 では検出することのできない硫酸塩還元細菌もし
くは硫黄呼吸を行う微生物が高い活性を保持していることが示唆された.
続いて, 我々が検出している apsA 遺伝子を保有する微生物を特定するために apsA 遺伝子を標的とした Cloning 解析を行った. APS7F(5ʼ-GGG YCT KTC CGC YAT CAA YAC-3ʼ)-APS8R プライマーセットを用い, ランダム

APS8R 由来のシグナルは, T. denitrificans に近に 31 クローン採取したところ, Desulfovibrio縁な菌種から得られていた可能性が高い. しburkinensis

Desulfomicrobium

かし, T. denitrificans は, 硫黄酸化脱窒菌であbaculatum (3/31), Desulfovibrio sulfodismutans

るため, 硝酸塩を添加してない同リアターで(3/31) に 近 縁 な ク ロ ー ン な ど が 検 出 さ れ た .

硝酸呼吸により代謝を行っているとは考え難

これら硫酸塩還元細菌については近縁種がい. このため, 硫黄呼吸を行う新規の微生物

SRB385 で検出可能であることが分かっておである可能性も考えられた.

(14/31),

り, FISH 法の結果と一致するものであった.

また, apsA 遺伝子の Cloning 解析で多くのこれら菌体の他にも, Thiobacillus denitrificans

硫酸塩還元細菌群に近縁なクローンが検出さ(9/31) に 近 縁 な ク ロ ー ン も 検 出 さ れ た . T.

れたが, 本手法ではこれらの微生物から apsA

denitrificans に近縁なクローンは Cloning 解析

mRNA を検出できなかった. しかし, 同リアにおける優占率が高く, 更に SRB385 で検出

クターでは硫酸還元反応が行われていることされない. このことから, 本実験で得られたを確認されている. このため, 同リアクター

に存在する硫酸塩還元細菌群は, 活性の低い状態であるが硫酸塩還元反応を行っていると考えられた. これを確認するには, より高感度 な FISH 法 を 利 用 し て , 機 能 遺 伝 子 のmRNA を検出する必要があると考えられる.
4. Conclusions
FISH 法を用いた系統分類学的情報と生理学的特徴の同時解析を実施するにあたって,以下の知見が得られた.
1) 培 養 し た グ ラ ニ ュ ー ル 汚 泥 か ら , apsA
mRNA と硫酸塩還元細菌群の 16S rRNA を同時に検出することに成功し, 系統分類学的情報と生理学的特徴の同時把握が可能であることを示唆できた.
2) 培養 し ていな いグラニュ ール汚 泥へ同手法 を 適 用 し た と こ ろ ,Thiobacillus

denitrificans に近縁な菌種の apsA mRNA が検出された.