公益財団法人 寺岡記念育英会
2018 年度 研究活動費助成事業 研究活動報告書一覧
去勢抵抗性前立腺癌における新規 Androgen シグナル制御機構の解明
岡山大学病院 泌尿器科 助教 定平卓也

・・・ 1

ヒトフィラリア症関連リンパ浮腫の超早期画像診断法の確立
岡山大学大学院 医歯薬学総合研究科 人体構成学分野 助教 品岡玲・・・ 3腎臓成体幹細胞由来エキソソームの腎臓再生機序の解明
岡山大学大学院 医歯薬学総合研究科 腎・免疫・内分泌代謝内科学 助教 辻憲二

・・・ 7

血液・血球-血管内皮細胞インターフェイスの恒常性維持機構と網羅的新規創薬
岡山大学大学院 医歯薬学総合研究科 薬理学 講師 和氣秀徳・・・11

エピスタシス効果による新型インフルエンザウイルスの出現予測
川崎医科大学 微生物学教室 助教 内藤忠相

・・・15

糖代謝阻害剤封入 PLGA ナノ粒子による新規腫瘍免疫活性化機序解明
川崎医科大学 肝胆膵内科学 講師 仁科惣治
※対象者の所属・職位は、本助成事業への応募当時のものです。

・・・20

去勢抵抗性前立腺癌における新規 Androgen シグナル制御機構の解明
岡山大学病院 泌尿器科
定平 卓也
研究成果の概要
我々は近年、癌抑制遺伝子REIC/Dkk-3の発現そのものが癌化を根源的に抑制する機能を有し、特に発癌の過程においてその発現低下が極めて重要な因子になることに着目してきた。REIC/Dkk-3の発現そのものが生体内において直接的にRasシグナリングを介した発癌を抑制している。一方で、REIC/Dkk-3に結合するタンパク質としてSGTAとTCTX-1を発見し、それらの相互作用が未熟なAR複合体の成熟および核内輸送を制御している可能性を見出した。これらの知見を踏まえ、本研究では前立腺癌における悪性形質およびAndrogen不応性の一元的制御機構の実態を明らかにし、その分子メカニズムに焦点を当てて研究を行った。

1. 研究開始当初の背景いる。また、SGTAとは別のREIC/Dkk-3相互作用分

我々は、正常線維芽細胞に比較して不死化ヒト線維子として、分子モーターDynein複合体の軽鎖サブユ

芽細胞おいて発現が消失ないし著しく低下している

ニットであるTctex-1を同定した。一方で、ヒト前立遺伝子群を網羅的に検索し、世界に先駆けて癌抑制

腺癌細胞PC3を用いた先行研究により、REIC/Dkk-

遺伝子REIC/Dkk-3 を同定した。我々は近年、3がSGTAによるARシグナル抑制を完全に回復させ

REIC/Dkk-3の発現そのものが癌化を根源的に抑制ることを証明した。REIC/Dkk-3とSGTAおよびする機能を有し、特に発癌の過程においてその発現

Tctex-1との相互作用が、未成熟なAR複合体の成熟低下が極めて重要な因子となりうることに着目し、および核内への輸送を制御している可能性が極めて

強 い 癌 化 作 用 を 有 す る 活 性 化 Ras タ ン パ ク 質高い。加えてTctex-1が輸送分子adaptorとして機能（Oncogenic Ras）に対してREIC/Dkk-3の発現動態

するDyneinモーターは、Ras活性化因子であるRas-

がどのように影響するのかを解析し、REIC/Dkk-3

GRPをEndoplasmic Reticulum周囲にリクルートの発現そのものが、生体内において直接的にRasシ

し、Oncogenic RasであるRas-GTPを誘導すること

グナリングを介した発癌を抑制している可能性を見が示唆されている。このことからREIC/Dkk-3、出している。こういった背景の中、近年、ヒト前立

SGTA、Tctex-1間の結合は、Dyneinモーターを介し腺 癌 cDNA ラ イ ブ ラ リ ー を 用 い た Yeast two-

たRas制御因子の輸送に直接的に作用し、細胞内のhybrid assayを実施し、REIC/Dkk-3に結合するタ

Oncogenic Rasレベルを制御していると考えられる。

ンパク質として、SGTAを発見した。SGTAは細胞質

また、これらの３分子の相互作用はDyneinモーター

内で未成熟なAndrogen Receptor（AR）複合体と結機能のみでなく、各種Heat shock proteinの機能に合し、ARの核内移行を抑制する。また、SGTAは自も影響を与える可能性が高い。これらの知見を踏ま

身のN末端で2量体を形成し、AR複合体の一部としえ本研究においては、前立腺癌における悪性形質おてARを細胞質内で安定化させ核内移行を抑制してよびAndrogen不応性の一元的制御機構の実態を明いる。実際にAndrogen除去療法抵抗性前立腺癌でらかにし、その分子メカニズムに焦点を当てて研究

は、SGTAの活性が亢進していることも報告されて

を進めた。

－1－

2. 研究の目的の癌抑制遺伝子としての重要性を指摘する論文が相癌抑制遺伝子であるREIC/Dkk-3の細胞内発現の減次いで報告されてはいるものの、今回の新知見につ少により、AR シグナルへの不応性が誘導され、かいての報告は一切存在せず、本研究の成果は国際的つ、Oncogenic Ras が活性化された、Androgen 除に大きな 注目を 浴びる可 能性が 高い。 従 来、

去療法抵抗性の前立腺癌細胞（去勢抵抗性前立腺癌）

Androgen 除去療法に抵抗性を獲得した前立腺癌にが出現するかどうか、について検証を行った。さら対する新規治療法の開発は喫緊の課題であり、そのに、REIC/Dkk-3 による AR シグナルの制御機構お発生に関しても未だ明らかになっていない点が多い。

よび REIC/Dkk-3 による Ras 活性化の制御機構の本研究では、Androgen 除去療法抵抗性前立腺癌のそれぞれについて分子メカニズムを解析した。

発生抑止因子としてのREIC/Dkk-3の基盤解析がな

3. 研究の方法される。これら基礎研究・臨床研究の両サイドから去勢抵抗性の前立腺癌細胞が如何に発生・出現する得られる知見は、難治性前立腺癌に対する新規治療のかを、REIC/Dkk-3 と SGTA および Tctex-1 との法開発の展開基盤となるものであり、本研究の重要相互作用の観点から解析した。具体的には、これら性と意義は計り知れない。

３つのタンパク質の発現状態および結合状態が、AR

5. 主な発表論文等

シグナルの制御機構および Ras 活性化の制御機構① 原著論文にどのように影響するか、その分子メカニズムを inTumor suppressor REIC/DKK-3 and its interacting

vitro 細胞実験系で検討した。さらに、我々が樹立しprotein SGTA inhibit glucocorticoid receptor

た REIC/Dkk-3 ノックアウト（KO）マウスを用い

nuclear transport. Iwata T, Sadahira T, Ochiai

る実験系において、様々な生体内 Androgen の状態

K, Ueki H, Sasaki T, Haung P, Araki M, Watanabe（正常、過剰、欠如）下に発癌誘導実験およびマウ

T, Nasu Y, Waranabe M. Exp Ther Med. 2020. In

ス前立腺癌細胞の移植を行い、得られた腫瘍およびpress.

癌細胞について悪性形質および Androgen 不応性の（雑誌論文：１件）

状態を分析した。また、これらの結果を踏まえ去勢② 学会発表抵抗性前立腺癌の発生抑止機構の実態を明らかにし

Tumor

た。

chaperone SGTA: Their interaction and role to4. 研究成果

control castration-resistant prostate cancer by

REIC/Dkk-3 を中心とした SGTA および Txtex-1 の 3

the release from androgen independence and

分子に基づく、去勢抵抗性前立腺癌の発生抑制機構

malignancy. Sadahira T, Maruyama Y, Mitsui Y,の実態を明らかにすることが可能となった。右図にWada K, Edamura K, Kobayashi Y, Araki M,

示した仮説の通り、REIC/Dkk-3 の細胞内発現の減少

Watanabe M, Watanabe T, Nasu Y. European

により、AR シグナルへの不応性が誘導され、かつ、

Urology Supplements. 2019;18:e68-e69.

Oncogenic Ras が活性化された、去勢抵抗性前立腺（国際学会発表：１件）

癌が出現することが明らかとなった。REIC/Dkk-3の癌治療遺伝子としての臨床応用は近年脚光を浴びており、現在、岡山大学を中心としたグループにより、複数の難治性固形癌（前立腺癌、悪性胸膜中皮腫、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、悪性グリオーマ等）への癌遺伝子治療への応用が進められている。国際的にみてREIC/Dkk-3に関連する一連の研究は岡山大学での独創的研究である。これまでに REIC/Dkk-3－2－

suppressor

REIC/Dkk-3

and

its

co-

ヒトフィラリア症関連リンパ浮腫の超早期画像診断法の確立

岡山大学大学院 医歯薬学総合研究科 人体構成学分野
品岡 玲（研究成果の概要）
本研究は岡山大学ががん関連リンパ浮腫診療で培った診断技術と、本邦発のリンパ管造影機器(PDE カメラ)
をフィラリア症関連リンパ浮腫の診断に応用する試みである。
本研究はフィラリアが蔓延しているミャンマーの地方にて疫学研究をする必要があるため、本年度はその準備に費やした。まず、ミャンマー国側のカウンターパートナーを決定し、研究の実行の同意と大まかな研究のデザインを決定した。また研究場所である地方を訪問し、現地の状況確認と研究実施の協力の同意を得た。現
在、双方の倫理委員会申請準備中である。

（本文）患である。そのため WHO は 2000 年から撲滅を目指

１．研究開始当初の背景

し感染域の住民に対する集団投薬を中心とした MDA

ヒトフィラリア症は全世界で 1 億人以上
（2000 年）

プログラム(Mass Drug Administration Program)をが感染し 9.4 億人が感染リスクに曝される寄生虫感

進行させており、2016 年時点、10 カ国以上で撲滅が染症である(WHO report 2016)。感染者は東南アジ

確認、2020 年までに世界での撲滅が目指されている。

ア、インド、アフリカ、南米など熱帯・亜熱帯地域

また、MDA プログラムと同時に、撲滅後に残されるに広がっており、発展途上国に多い。著明な症状はリンパ浮腫患者の現状評価とケアシステムの構築を少ないが、感染が長期にわたると、四肢や陰部など行い、悪化防止を目指す MMDP プログラム(Morbidityのリンパ浮腫をきたす。これは、関節の動きを制限

management and disability prevention Program)

し、醜悪な見た目など社会的な問題を引き起こす。

も行われている。
MDA による集団投薬は、血中にいるミクロフィラ
リアを減少させ、蚊を媒体とした感染が広がらないようにすることを目的としている。しかし、すでに感染している場合は、投薬されても、成体は数年間患者の中で生き延びる。これは徐々にリンパ系にダ
メージを与え、撲滅後も残されたリンパ浮腫患者を発生させる。そのため MMDP プログラムにて、撲滅後に残された患者群を継続的にケアしていくことは、
真にフィラリア症を撲滅していくという意味で重要である。

戦後、本邦でも撲滅されたように撲滅が可能な疾またリンパ浮腫の発症機序は十分解明されておら－3－

ず、一度失われたリンパ機能を取り戻すことが難し

ラリア症が多いのは東南アジアであり、岡山大学病

い。
そのため、
リンパ浮腫を悪化させないためには、院は 10 年以上にわたってミャンマーで医療活動しリンパ浮腫を超早期に発見し、治療を開始すること、ているため、そこで本研究を行うこととした。

継続的にケアを行うことが最も基本である。これはフィラリア関連リンパ浮腫だけでなく、本邦で問題になっている癌関連リンパ浮腫でも同様である。
我々は症状がない超早期リンパ浮腫を発見すべく、
近赤外線イメージングによるリンパ管造影法を行っている。そのために、新規リンパ系解剖技術を開発
し(Shinaoka et al. 2018)、正常人のリンパ系解剖
詳細を微細なパターンまで明らかにした(Shinaoka
et al. in press)。またそれをコンスタントに造影する方法を独自に標準化した (米国特許出願済み)。

２．研究の目的

この方法はリンパ系の微小な変化を四肢全体で明ら本研究の主な目的は本格的なサーベイを行う前のかにできるので、癌関連リンパ浮腫患者の早期発見

プレサーベイを行うこととする。具体的には以下のと治療に福音をもたらしている。

２つである。
・フィラリア症関連リンパ浮腫が癌関連リンパ浮腫の検査所見と何が同様であり、異なるか明らかにすること。
・他検査法（抗体検査やメジャー法）との優位性をあきらかにすること。
本研究により、安価でポータブル可能な近赤外イ
メージング法のフィラリア症への応用は、世界で 1
億人を超える患者へ福音をもたらす。また、癌関連
リンパ浮腫とは発症機序が異なるリンパ浮腫を検査・診断することで、リンパ浮腫発症機序解明につながり、本邦のリンパ浮腫患者へ還元されることも期待する。
近赤外イメージングは本邦発の技術であり、国内

世界では発展途上国を中心にフィラリア症関連リでは広く使われているが、海外では普及は進んでいンパ浮腫で苦しむ患者が多く存在している。それもない。対象疾患を広げることで、本邦のイメージン

早期診断し、治療を開始することで症状進行を食いグ技術と我々の検査テクニックを世界に広げること

止めることができることがわかっている。ただ、ポを目指す。

ータブルの機器で早期診断するための技術がなく、十分に対応できていない。

３．研究の方法

そこで我々は、本邦発でポータブル可能な近赤外サーベイを円滑に行うために以下のように段階的リンパ系イメージング装置と我々が標準化した検査に研究を進めていった。

法をフィラリア症に応用することとした。特にフィ①カウンターパートナーの決定－4－

ミャンマー国内で円滑に研究を進めるため、政府

Disease of Poverty 2018)を参考に、候補地はの公衆衛生機関(Department of Public Health)とYaysagyo township ( Antigenicity 11.58 ) と教育研究機関の Department of Medical Research

Chauk township (Antigenicity 6)に絞り現地を訪の２つのグループをミャンマー側のカウンターパー

れインフラ、検査環境などを視察した。

トナーにお願いした。また、現地における情報は WHOが把握しているため、WHO Myanmar Office のメンバーも補助的に参加していただいた。
②ミャンマーにおける現状把握
現地の状況、
カウンターパートナーの考え方など、状況によって研究計画が大きく変わるので、まずは現地にてカンファレンスを行い、次に実際の研究を行う local field にて現地調査を行った。
③研究デザインの決定と倫理申請
調査後、オンライン上にてカウンターパートナー

両候補地ともに、MDA は進行しているが、ミャンと研究デザインについて討議を行った。

マーの中ではフィラリアの駆逐は遅れており、村の中で 100 名抗体検査をすると、陽性率は Chauk は４．研究の成果

７％、Yasagyo は 20％であった。

①現地研究協力者との打ち合わせ

両候補地ともに、研究は可能であり、最低限の医・現地研究協力者たちと面談した。岡山大学側の技療施設しかないが、ICG 蛍光リンパ管造影の撮影環術、浜松ホトニクス社の技術など説明し、ミャンマ境は可能であった。重症患者は病院では認識できてー側からは現地の状況を説明していただいた。我々

いないが、地域に隠れているとのことであった。

が提案する研究計画は可能であること、研究の目的に同意を頂いた。本研究はミャンマー側が first で日本側は補助的に進めていくことに同意した。

③研究デザインの決定と倫理申請
先行研究と現地の有病率より研究をデザインした。
以下のように決定した。有病率の高さより Yasagyo
地区において研究することを決定した。
②現地の状況確認

・現地にボランティア 100～200 名を募集する。そ

現地の状況を視察した。インフラ・研究環境などのうち浮腫の症状がある群 10 名を抽出する。またを調査した。

浮腫がない群のうち ICT カードによる抗原抗体検査

現地の研究協力者 Nay が報告しているフィラリア

により感染がある群を 10 名、感染がない群 10 名を症の有病率地図(Nay Yi Yi et al, Infectious

抽出し、計３群を登録する。

－5－

・３群に ICG 蛍光リンパ管造影法、indurometer に

2019;144:634-642. (7 人中 1 番目)

よる浮腫検出、血液検査、エコー検査を施行する。

3. Matsumoto H, Shinaoka A, et al. Detailed

・endpoints は ICG 蛍光リンパ管造影法によるリン

Vascular Anatomy and Flap Harvest Technique of

パ系画像変化所見の抽出、ICG 蛍光リンパ管造影法

the Serratus Anterior/Rib Composite Flap. Plastと他検査の感度得意度の比較、その地域におけるリReconstr Surg. 2019;143:115-124. (4 人中 2 番目)

ンパ浮腫保有率の疫学的結果とする。

4. Matsumoto K, Shinaoka A, et al. Exercise-

リンパシンチグラフィの先行研究により、フィラ

LoadedIndocyanine

Green

Fluorescence

リア症感染者のうち 70％にリンパ機能低下の所見

Lymphangiography for Diagnosing Lymphedema. Jが見られることなどよりパワー計算(power: 80%,

Reconstr Microsurg. 2019;35:138-144. (4 人中 2

α: 5%, mean value: 17.9, and番目)

SD: 9)を行なったところ Positive case が最低 10 症例必要となっ②学会発表（国際学会 3 件 国内学会 3 件）た。また共同研究者の Nay Yi Yi の報告により流行

1. Shinaoka A. Correlations between Lymphatics

地の ICT カードによる陽性率は 20％であり、100-in the Lower Extremity and Tracer Injections

200 症例が必要と計算した。

Sites for Lymphography Refinement:a Near-Infrared Fluorescence Lymphography Study in a
これらの内容で倫理申請を進めているが、コロナ

multi-Cadaver Model. ISL2019(Buenos Aires)の影響で研究が中断している。コロナ終息後に速や

2. 品岡玲. ICG-LG より始まる最新リンパ系マクロ

かに再開する予定である。

解剖とリンパ障害の評価, リンパ浮腫治療学会
2019(兵庫)

５．2019 年度の発表論文等③図書（1 件）

①雑誌論文（英文査読あり 7 件）

1. Suami H, Shinaoka A. Anatomy and Structural

1. Shinaoka A, et al. Lower limb lymphatic

Physiology of the Lymphatic System. Principles

drainage pathways and lymph nodes: a three-and Practice of Lymphedema Surgery 2nd Edition.

dimensional CT lymphangiography cadaver study.

Editors: Ming-Huei Cheng, David W. Chang, andRadiology. 2020 ;294:223-229.(8 人中 1 番目)

Ketan M. Pate. Elsevier. In press

2. Shinaoka A, et al. Correlations between④産業財産権（0 件）

tracer injection sites and lymphatic pathways
in

the

leg:

lymphographyanear-infrared

study.

Plast

fluorescence

Reconstr

Surg.
－6－

（表 題）腎臓成体幹細胞由来エキソソームの腎臓再生機序の解明（所 属）岡山大学大学院医歯薬学総合研究科 腎・免疫・内分泌代謝内科学（氏 名）辻 憲二（研究成果の概要）
急性腎障害は長期入院や高い致命率に相関し、新たな治療法の開発が急務である。近年、幹細胞から分泌される液性因子、特にエキソソームに含有される蛋白及び RNA が細胞相互作用の媒体として組織再生、免疫制
御、癌の発生・進行など多彩な役割を持つことが報告され注目されている。本研究では KS 細胞の細胞上清及びエキソソームを抽出し、虚血再灌流による急性腎障害ラット及び培養腎臓構成細胞に投与し、その効果を解析を行うことにより、腎臓幹細胞由来の液性因子並びにエキソソームによる腎臓再生誘導効果を解明した。
（本文）

報告は非常に少ない。

【研究開始当初の背景】

これまで我々はラット成体腎臓より増殖能・分化急性腎障害は長期入院や高い致命率に相関し、新能を持つ細胞株（成体腎臓幹/前駆細胞：KS 細胞）

たな治療法の開発が急務である。これまで間葉系幹を樹立し、急性腎障害モデルへの移植により生着・細胞による急性腎障害の改善効果が報告されてきた分化を伴った再生誘導を報告した（Kitamura S et al,が、その機序はいまだに不明な点も多い。近年、幹FASEBJ, 2005）。KS 細胞を左腎被膜下に投与した腎細胞から分泌される液性因子、特にエキソソームに障害モデルにおいて、右腎にも左腎と同様の保護的含有される蛋白及び RNA が細胞相互作用の媒体としな効果が観察されたことから、KS 細胞による液性因て組織再生、免疫制御、癌の発生・進行など多彩な子を介した間接的な腎保護効果があることが示唆さ役割を持つことが報告され注目されている。

れた。

腎疾患おける間葉系幹細胞(MSC)由来のエキソソ

以上より、本研究では、KS 細胞由来の液性因子そームによる治療効果は Bruno らによって最初に報告の中でも特にエキソソームの急性腎障害におけるされ、グリセオール誘発性急性腎障害マウスに対し腎臓再生誘導効果及び再生機序の解明を目指す。さてMSC 由来エキソソームのmRNA を介した腎上皮細胞

らに KS 細胞由来エキソソームに含有される ncRNAの増殖促進及びアポトーシス抑制を介した腎保護効の網羅的解析を行い、腎保護的な ncRNA の解明も目

果が報告された (Bruno et al, J. Am. Soc. Nephrol,

指す。

2009)。その後、虚血再灌流腎障害ラット、シスプラ
チン腎症マウス、5/6 腎摘ラット等の腎疾患におい【研究の目的】ても MSC 由来エキソソームによる急性及び慢性腎障

本研究では KS 細胞分泌の細胞上清及び、その中害の改善効果が報告されてきた。一方で、エキソソ

からエキソソームを抽出し、虚血再灌流による急性ームの網羅的解析による保護因子の特定に関する報腎障害ラット及び培養腎臓構成細胞に投与し効果告は少なく、
依然として治療応用には至っておらず、を解析することによって、腎臓幹細胞由来の液性因

エキソソーム内の保護的因子及び腎臓再生機序の解子並びにエキソソームによる腎臓再生誘導効果を評

析が臨床応用のためには重要と考えられるる。さら価し、さらにその機序の解明を行う。

に腎疾患におけるエキソソーム研究のほとんどはまた、腎臓幹/前駆細胞分泌エキソソーム含有 ncRNA

MSC を用いて行われており、実際の腎障害時においを含む small-RNA を次世代 RNA シークエンシングをて腎上皮細胞再生に重要であることが示唆されてい用いて網羅的に発現評価し、その結果を解析するこる腎臓組織幹細胞由来のエキソソームに関する研究とによって、腎臓再生誘導因子となる ncRNA の特定－7－を行い、さらに特定した ncRNA を阻害することによ【研究成果】り腎臓再生が阻害されるかについての検討も目指す。

（1）成体腎臓幹/前駆細胞の形質評価
KS 細胞の蛍光抗体染色によって、KS 細胞は Six2、【研究の方法】

Vimentin、Nestin などの幹細胞マーカーを強発現し、（1）

成体腎臓幹/前駆細胞の形質評価

さらに腎臓構成細胞に特異的な蛋白発現として、近ラット成体腎臓幹/前駆細胞（KS 細胞）及びマウ

位尿細管細胞の AQP1、集合管細胞特異的な AQP2、遠ス腎臓近位尿細管上皮細胞（mProx24 細胞）を用い

位尿細管細胞特異的な Tamm-Hosfall protein（THP）て、蛍光免疫染色法を行い細胞形質及び成長因子のを発現し、さらに SGLT2、NKCC1、URAT1 などの腎臓分泌の有無の評価を行う。

特異的な蛋白発現を認めた（Figure 1）。さらに成長（2）

成体腎臓幹/前駆細胞由来液性因子の抽出

因子として HGF,EGF,IGF1,エリスロポエチン（Epo）

ラット成体腎臓幹/前駆細胞及びラット腎臓構成の発現も認められており多彩な保護因子を分泌する細胞（NRK52E 細胞）の細胞上清を回収し、蛋白濃縮

ことが示された（data not shown）。

キットを用いて 40 倍に濃縮を行う。また、上記細胞の細胞上清を採取し、エキソソーム抽出キットを用いて抽出し、エキソソーム特異的マーカー（CD81、
CD9）
によるウエスタンブロッティング及び電子顕微鏡によるエキソソームの評価を行った。
（3）

成体腎臓幹/前駆細胞由来液性因子の急性

腎障害ラットモデルに対する治療効果解析
6 週齢雄性 SD ラットを用いて、腎臓虚血再灌流障
害
（I/R）
を誘発し、
150μg の KS 細胞あるいは NRK52E
細胞由来の濃縮細胞上清を単回投与を行う群と対象群に分け第 2 病日及び第 4 病日に屠殺し、腎機能・尿細管障害、尿細管上皮細胞のアポトーシス、細胞増殖、炎症細胞浸潤の程度を免疫染色・定量 RT-PCR
ならびにウエスタンブロッティングにより評価し、細胞由来の液性因子の治療効果及び機序を解析する。
（4）

成体腎臓幹/前駆細胞由来液性因子及びエ

キソソームの in vitro に対する治療効果の解析
リアルタイム細胞解析装置（ECIS）を用いてNRK52E 細胞培養及び KS 細胞培養を行い、KS 細胞由来の液性因子あるいはエキソソーム及び NRK52E 細胞由来液性因子あるいはエキソソームの治療効果を経時的に評価する。
さらに各細胞由来因子投与後の腎臓構成細胞の細胞形態及び形質評価を免疫染色及びウエスタンブロ
ッティングにて行い、保護的因子の細胞保護の機序解明を行う。

－8－

（2） 成体腎臓幹/前駆細胞由来液性因子の抽出

細胞上清投与群で有意に増加を認めた。以上より、ラット成体腎臓幹/前駆細胞及びラット腎臓構成細KS 細胞上清治療によって、多彩な液性因子を介して胞（NRK52E 細胞）の細胞上清を回収し、蛋白濃縮キ

腎保護あるいは腎臓再生能が促されることが示唆さットを用いて 40 倍に濃縮を行い、ウエスタンブロッ

れた。

ティングを行い、HGF,EGF,IGF1,Epo の発現を確認しさらに、KS 細胞上清投与群では、Nestin 陽性細胞

た（data not shown）。また、上記細胞の細胞上清をの有意な増加を認めたことより、近位尿細管上皮細採取し、エキソソーム抽出キットを用いて抽出し、胞の de-differentiation（脱分化）が誘導されるこ

エキソソーム特異的マーカー（CD81、CD9）によるウとにより腎臓再生が促される可能性が示唆された

エスタンブロッティング(data not shown)及び電子（data not shown）。

顕微鏡により評価を行い、エキソソームの存在を確証した。(Figure 2)。

(4) 成体腎臓幹/前駆細胞由来液性因子及びエキソ
ソームの in vitro に対する治療効果の解析
リアルタイム細胞解析装置（ECIS）を用いて近位尿細管上皮細胞（ｍProx24）に KS 細胞あるいは NRK52E
細胞由来のエキソソームの添付の有無で細胞増殖能
及び細胞接着能をリアルタイムで評価したところ、KS 細胞由来エキソソーム付加した細胞は他のグループと比較して細胞増殖及び細胞接着が誘導される傾向が認められ（Figure 3）、エキソソーム内に含有される何らかの因子が関与している可能性が示唆された。

(3) 成体腎臓幹/前駆細胞由来液性因子の急性腎障
害ラットモデルに対する治療効果解析
腎臓虚血再灌流障害（I/R）を誘発した群では、第2 病日で Control 群と比較して血清 Cr 及び BUN の上昇を認め、第 4 病日では改善を認めた。一方で KS
細胞由来上清投与群では、血清 Cr 値及び BUN の第 2
病日の上昇は有意に抑制され、尿細管障害マーカーの尿中 NAG も同様に有意な低下を認めた。免疫染色法にて評価したところ、KS 細胞上清投与群では、無投与群及び NRK52E 細胞由来細胞上清投与群と比較して、TUNEL 染色にて評価しうる尿細管上皮細胞のアポトーシスは、有意に減少し、F4/80 染色によるマクロファージ浸潤も有意に減少した。さらに
p-histone-H3 染色により評価される細胞増殖は KS－9－次に、上記のエキソソーム投与した細胞群を蛍光（今後の展望）免疫染色法にて評価したところ、KS 細胞由来のエキ本研究においては、
成体腎臓幹/前駆細胞由来エキ

ソソーム投与群（EV-KS）において Six2 陽性の未分

ソソーム内の何らかの因子が再生誘導に寄与するこ化細胞マーカーの有意な増加が認められ、NRK52E 細とが示されたが、特定の因子までは特定できておら胞由来のエキソソーム投与群（EV-NRK）では認めらず、今後は ncRNA 解析などを行い、保護因子の特定れなかったことから、KS 細胞中のエキソソームに含及びそれによる革新的治療法の開発を目指す。

有される何らかの因子が、近位尿細管細胞の脱分化に関与している可能性が示唆された（Figure 4）。

【主な発表論文等】① 雑誌論文：0 件.
② 学会発表：合計 4 件.
1

Yizhen Sang, Kenji Tsuji, Kazuhiko Fukushima,
Kensaku Takahashi, Shinji Kitamura, Jun Wada.
Semaphorin3A-inhibitor,
Ameliorates

SM-345431

Doxorubicin-induced

PodocyInjury.The 10th Chronic Kidney Disease
Frontier Meeting Feb 15th,2020, Nagoya,Japan.
2

辻憲二, Yizhen Sang, 福島和彦, 高橋謙作,
喜多村真治, 和田淳. Semaphorin3A を介したポドサイト障害機序の解明. 第 10 回腎不全研究会 2019 年 12 月 7 日, 東京

3

Yizhen Sang, Kenji Tsuji, Kazuhiko Fukushima,
Shinji Kitamura, Jun Wada. Semaphorin3A-inhibitor ameliorates renal fibrosis in（得られた成果の位置づけ）

unilateral ureter obstruction mice. Kidney

これまでの間葉系幹細胞エキソソームによる再生

week 2019, Nov 5-10, 2019, Washington DC,

誘導機序と類似の効果が期待されるとともに、腎臓

USA.

組織幹細胞に特異的な再生機序の可能性も期待され

4

Yizhen Sang, Kenji Tsuji, Akiko Inoue-Torii,

新たな腎臓再生機序の解明につながる可能性も考

Kazuhiko Fukushima, Shinji Kitamura, Jun

えられる。さらに今後 microRNA シークエンシング

Wada.Semaphorin3A-inhibitor

解析によって、再生誘導をおこす再生因子の特定を

podocytopathy in doxorubicin-induced renal

目指す。これまで明らかにされてこなかった腎臓組

injury. 第 63 回日本腎臓学会学術総会 6 月

織幹細胞によるエキソソーム含有の ncRNA を介した

26 日-28 日,2019, 横浜.

急性腎障害への新たな治療法の確立に大きな前進をもたらすものと考えられる。

③ 図書：0 件.

これらの再生因子が急性腎障害治療の新たな治療④ 産業財産権：0 件.

戦略と理解されれば、これまでの急性腎障害における対症保存的治療とは異なる、新たな治療戦略をもたらしうると考えられる。

－10－

ameliorates

血液・血球-血管内皮細胞インターフェイスの恒常性維持機構と網羅的新規創薬
岡山大学大学院医歯薬学総合研究科薬理学
和氣

秀徳

研究成果の概要
敗血症において、血中 HRG レベルの急激な低下により、HRG が通常担っている血球-血管
内皮恒常性維持作用が失われ、細胞の異常な活性化や障害が進行する。これまで、HRG の
血球-血管内皮恒常性維持作用機序はほとんど明らかになっていなかったが、本研究において、その作用機序として、HRG は様々な CLEC ファミリー分子を介して血球細胞や血管内皮細胞の活性を制御していることを明らかにした。この研究成果により、敗血症治療において、HRG の補充療法だけでなく、CLEC ファミリー分子を新たなターゲットとした創薬が可能となる。
1.研究開始当初の背景

明な低下は、敗血症モデルマウスのみならず

我々は、世界的に年間 2000～3000 万人が新ICU 内敗血症患者でも同程度低下が確認され規発症し、約 25％のヒトがそのために命を落(Kuroda et al. Crit Care Med,2018)、そのとしている敗血症の病態生理に関する研究を補充により救命率を向上できる可能性が示唆実施し、致死性の高い呼吸不全（ARDS）、循環

されている。

系ショック、
播種性血管内凝固症(DIC)に至る
生体反応の最上流のイベントとして、血漿タ2.研究の目的ンパク Histidine-rich glycoprotein(HRG)の

HRG によるヒト好中球の正球化活性は、典低下があることを突きとめた(Wake et al.

型的シグモイド形状の用量作用曲線を描き、EBioMedicine, 2016)。HRG は血中の生理的濃その効果が受容体介在性の反応であることが度で、好中球の正球形態を維持し、自発性活

強く示唆された。そこで、HRG の受容体探索・性酸素(ROS)産生の低い基底状態に保つ働き

同定を試み、候補分子を 2 種類同定した。同と、血管内皮細胞を保護する作用、さらに赤定された HRG 受容体候補分子の 1 つである

血 球 の 凝 集 抑 制 作 用 (Zhong et al. J

CLEC1A には、ファミリータンパクが存在し、Pharmacol Sci,2018)を合わせ持ち、血管外でそれらは正負の方向に細胞機能を変化させるの好中球による細菌貪食は促進する。敗血症と推定しているが、内因性リガンドを含め殆病態では、血漿中 HRG の急激な低下によってどその機能は明らかになっていない。そこで

上記の HRG 作用が失われるため、好中球の血本研究では、CLEC1A や、そのファミリー分子

管内皮細胞への強い接着をきっかけとする免を介した血球-血管内皮細胞インターフェイ

疫血栓が肺血管床で形成され、ARDS の病態とスの恒常性維持機構の解明を目的とし、以下なる。また、好中球と血管内皮細胞の強い相の研究を実施した。

互作用と好中球産生性 ROS のため、血管内皮細胞機能が障害され、細動脈血管緊張が維持

3.研究の方法

できずショックの病態となる。血漿 HRG の著

a)CLEC1A-Fc 融合タンパクの HRG 好中球正球－11－

化作用中和活性での濃度でヒト好中球の細胞形態にいかなるCLEC1A-Fc 融合タンパクを COS 発現系で作作用も及ぼさなかったが、0.25μM の HRG で製し、精製した。融合タンパクを HRG のヒト誘導された正球化を、この濃度範囲で濃度依

好中球正球化アッセイ系に添加し、中和活性

存的に抑制した。このことから、CLEC1A の細を評価した。

胞外ドメインと HRG の結合が間接的に証明さb)CLEC1A 細胞内シグナル解析

れた。

CLEC1A 発現 HEK293T 細胞とそのドミナントb)CLEC1A 細胞内シグナル解析

ネガティブ(DN)細胞を作成し、細胞内シグナ

CLEC1A 発現細胞と DN 細胞では、ERK1/2,

ルを解析した。非刺激の培養条件から得られ

P38, AKT 等のリン酸化酵素の発現量に差がなた細胞から電気泳動サンプルを調製し、ウエ

く、また、それらの活性化リン酸化体のレベ

スタンブロットにより、代表的なリン酸化酵

ルにも変化がないことが分かった。これらの素とその活性化リン酸化フォームを検出した。

細胞を HRG により刺激すると複数のバンドの対照として、
Green Fluorescent Protein(GFP)

タンパクリン酸化の亢進が検出された。DN 細を発現する細胞を用いた。また、培養系に胞では一致するバンドサイズに変化は認めら

HRG(1μM)を添加し、その後に細胞内のタンパれなかったので、このようなリン酸化変化は

クリン酸化の変化をチロシン、セリン、スレ

CLEC1A 刺激特異的な反応と結論した。

オニン残基を認識する異なった抗体で検出しc)HRG の血管内皮細胞 HMGB1 トランスロケー

た。

ション抑制に対する CLEC1A 遮断抗体の効果

c) HRG の血管内皮細胞 HMGB1 トランスロケー

血管内皮細胞は、100ng/ml の LPS で刺激さション抑制に対する CLEC1A 遮断抗体の効果れると、核内 HMGB1 を細胞質内さらには細胞

HRG の効果を再現性よく検出する細胞系と外に放出し、放出された HMGB1 は炎症反応をして、培養血管内皮細胞(EA.hy926)を用いた惹起する。この LPS 誘発反応は 1μM の HRG

HMGB1 トランスロケーションのアッセイ系がの添加でほとんど完全に抑制されるが、HRGある。LPS による血管内皮細胞の核から細胞の効果は抗 CLEC1A 抗体(10μM/ml)の添加で外への HMGB1 トランスロケーションを HRG は

部分的に抑制された。このことから、血管内抑制するが、
そこにさらに CLEC1A 抗体を添加

皮細胞に対する HRG の作用には、少なくともすることで、その HRG 作用を遮断できるか検CLEC1A 受容体が関与すると考えられた。

討した。

d)HRG 活性に寄与する CLEC ファミリー分子のd)HRG 活性に寄与する CLEC ファミリー分子の同定

同定

これまでの予備的研究から、３つの作用(好膜1回貫通受容体型CLECタンパクに対する中球正球化、ROS 産生抑制、貪食能亢進)に関それぞれの特異的抗体(約 30 種類)を用いて、与する受容体は、それぞれ異なっていること

HRG の３つの作用(好中球正球化、ROS 産生抑が予想されていたので、抗体による遮断活性制、
貪食能亢進)に対する各抗体の遮断活性をのプロファイリングを実施した。例えば、抗調べた。

CLEC1A 抗体では HRG の 3 つすべての作用を遮断するが、抗 CLEC1B 抗体では HRG による貪食

4.研究成果亢進を強く抑制し、その他 2 つの活性遮断作a)CLEC1A-Fc 融合タンパクの HRG 好中球正球

用は弱かった。

化作用中和活性以上の結果より、HRG は CLEC1A を介して好CLEC1A-Fc 融合タンパクは、～30μg/ml ま

中球や血管内皮細胞にシグナルを入力し、細－12－胞障害や過剰な活性化を抑制していることがendothelial barrier dysfunction through

明らかとなった。また、CLEC ファミリー分子

regulation of NF-κB and MAPK signalは多数存在しており、CLEC1A だけでなく他のpathway. Br J Pharmacol. 176(15): 2808-24,

CLEC 分子もこれらの反応に関与しているこ2019.

とが示唆された(図 1)。

doi:10.1111/bph. 14711
学会発表(10 件)
1.Histidine-rich glycoprotein regulates
neutrophil condition in sepsis（学会中止による誌上発表）. Wake H, Mori S, Takahashi
H, Wang D, Teshigawara K, Nishibori M. 第
93 回日本薬理学会年会（横浜）. 2020/3, 国
内.
2.Novelrolesofhistidine-rich

glycoprotein in physiological placental
development

and

in

preventionofhypertensive disorders of pregnancy（学会
この研究成果により、HRG は血球-血管内皮中止による誌上発表）. Teshigawara K, Liu K,

細胞インターフェイスの恒常性維持機構にWake H, Wang D, Mori S, Takahashi H,

CLEC ファミリー分子を介して関与している

Nishibori M. 第 93 回日本薬理学会年会（横ことが明らかとなり、今後、CLEC をターゲッ

浜）. 2020/3, 国内.

トとした新たな敗血症治療薬の創出に寄与で3.Theきると考えられた。

glycoprotein

effectsofonhistidine-rich
neutrophil-like

differentiated cell lines（学会中止による
5.主な発表論文等

誌上発表）. Yoshii Y, Wake H, Teshigawara

論文(3 件)K, Wang D, Liu K, Takahashi Y, Nishibori M.

1.WakeH.Histidine-rich

Glycoprotein

第93 回日本薬理学会年会（横浜）. 2020/3, 国

Modulates the Blood-vascular System in内.

Septic Condition. Acta medica Okayama.

4.Functional Evaluation of Neutrophils

73(5):379-82,2019.

Spheroidized by HRG（学会中止による誌上発

doi: 10.18926/AMO/57366. Review.

表）. Takahashi Y, Wake H, Teshigawara K,

2.Nishimura Y, Wake H, Teshigawara K, Wang

Wang D, Nishibori M. 第 93 回日本薬理学会

D, Sakaguchi M, Otsuka F, Nishibori M.

年会（横浜）. 2020/3, 国内.

Histidine-richaugments

5.HRG の作用により球状化したヒト好中球のnatural killer cell function by modulating

機能評価（口頭）. 高橋陽平, 和氣秀徳, 吉

PD-1 expression via CLEC-1B. Pharmacol Res井將哲, 王登莉, 勅使川原匡, 西堀正洋. 第Perspect.

32 回 創薬・薬理フォーラム岡山（岡山）.

glycoprotein7(3):e00481,

2019.

doi:10.1002/prp2.481.

2019/12/21, 国内.

3.Gao S, Wake H, Gao Y, Wang D, Mori S, Liu

6.Histidine-rich glycoprotein inhibits

K, Teshigawara K, Takahashi H, Nishibori M.

high mobility group box 1-mediated pathway

Histidine-rich glycoprotein amelio rates

in vascular endothelial cells (Poster).

－13－

Gao S, Wake H, Sakaguchi M, Wang D, Mori S,
Liu K, Teshigawara K, Gao Y, Takahashi H,
Nishibori M. 第 9 回 国際 DAMPs と Alarmins
シンポジウム（岡山）. 2019/11/6-8, 国内.
7.HRG の作用により球状化したヒト好中球の
貪食能解析
（口頭）
. 高橋陽平, 和氣秀徳, 吉井將哲, 阪口政清, 劉克約, 勅使川原匡, 高
橋英夫, 森秀治, 西堀正洋. 第 135 回日本薬理学会近畿部会（岐阜）. 2019/6/21, 国内.
8. 好中球様細胞における Histidine-Rich
Glycoprotein(HRG)の影響（口頭）. 吉井将哲,和氣秀徳, 高橋陽平, 王登莉, 勅使川原匡,
西堀正洋. 第 135 回日本薬理学会近畿部会（岐阜）. 2019/6/21, 国内.
9.周産期における高ヒスチジン糖タンパク(HRG)の生理的役割の解析（口頭）. 勅使川原匡, 劉克約, 和氣秀徳, 王登莉, 髙橋英夫,
森秀治, 西堀正洋. 第 135 回日本薬理学会近畿部会（岐阜）. 2019/6/21, 国内.
10.高ヒスチジン糖タンパク遺伝子欠損マウスにおける妊娠高血圧、及び、胎盤形成異常の解析（口頭）. 勅使川原匡, 劉克約, 和氣
秀徳, 王登莉, 高橋英夫, 森秀治, 西堀正洋.
第 92 回日本内分泌学会学術総会（仙台）.
2019/5/9, 国内.

－14－

研究題目

エピスタシス効果による新型インフルエンザウイルスの出現予測
所属：川崎医科大学

微生物学教室

氏名：内藤 忠相
研究成果の概要
インフルエンザ市中流行株である A（H1N1）pdm09 ウイルスから HA 遺伝子および NA 遺伝子をクローニングし、低忠実性 PB1 ポリメラーゼ実験室株に組込むことで、増殖活性が多様なウイルス集団である「流行株の主要抗原に由来する変異ウイルスライブラリー」を作製した。本ライブラリーから免疫逃避株（抗原変異株）の候補ウイルスを複数単離した。本研究結果から、低忠実性ポリメラーゼウ
イルスを利用することで、迅速かつ高率に抗原変異株を単離できるスクリーニングシステムの開発が可能であると考えられた。
本文
１．研究開始当初の背景

そこで、ワクチン株と市中流行株との間の抗原

インフルエンザウイルスのゲノムは 8 本に分節性を一致させるため、次シーズン以降の流行株に化された 1 本鎖 RNA であり、ウイルス由来の RNA

起きる抗原変異部位を予測する研究成果が報告さポリメラーゼである PB1 蛋白質により複製されるれている（Selection of antigenically advancedが、合成された RNA ゲノム内には 1 万塩基あたり

variants

約 1 個の頻度で変異が生じる。この高い変異導入

Nature Microbiology, 2016）。しかし、従来技術

効率により、季節性インフルエンザウイルスは頻で予想可能な変異部位は、全ウイルス抗原のうち

繁に抗原変異を起こし、流行予測から選定された

ヘマグルチニン（Hemagglutinin: HA）の主要抗原

ワクチン株と市中流行株との間で抗原性が一致せ領域に限定されており、全長の HA や他の主要抗原

ず、ワクチンによる重症化阻止効果が著しく低下であるノイラミニダーゼ（Neuraminidase: NA）をする場合がある（図１）。

含めた全ウイルス蛋白質について予測可能なシスofseasonal

influenza

図１ インフルエンザワクチン開発における問題点
今シーズンのウイルス株

次シーズンのウイルス株

抗原変異株の出現

流行期

11月

１月

流行期

3月

5月

7月

ワクチンの製造・供給

9月

11月

1月

3月

ワクチン接種
抗原変異株が出現すると、前シーズンの流行株を元株としたワクチン接種では免疫が獲得できないため、インフル
エンザの大規模流行が起こる。

今シーズンの流行株を用いたワクチンの製造－15－

viruses,テムではない。そのため、抗原決定基となりうる

ルエンザ診断キットの開発にも応用が期待できる。

「全ウイルス蛋白質」の「全領域」を対象にしたアミノ酸置換の多様性を把握できれば、抗原変異

２．研究の目的を伴う未来流行株を高精度に予測可能になる。

申請者は、野生株よりも変異が入りやすい低忠

また現在、臨床現場でインフルエンザ感染者を

実性ポリメラーゼ導入ウイルス PB1-Y82C 株（Tyr-

迅速に特定する手段として、インフルエンザウイ

82 残基を Cys に置換：Tyr82 amino acid mutation

ルス抗原診断キットが使用されている。診断キッin PB1 polymerase induces an influenza virus

トにはイムノクロマト法が採用されており、判定

mutator phenotype, Journal of Virology, 2019）

時間はわずか数分であり、有用な診断法である。

および PB1-K471H 株（Lys-471 残基を His に置換:

しかし、2009 年に出現した新型パンデミックウイ

特許出願中）を世界で初めて単離した。本研究でルス“A(H1N1)pdm09 株”の流行当時においては、は PB1-Y82C 株および PB1-K471H 株を用いて、次シ診断キットを用いた陽性検出率は約 50%であり、ーズン以降の流行株に起きる抗原変異部位を予めインフルエンザであっても陽性にならない「偽陰推測できるインフルエンザウイルス未来流行株予性」と判定された患者が数多く存在していた。イ

測システムを開発する。そして、新規抗原変異株

ムノクロマト診断キットでは、インフルエンザウの性状解析を行うことで、毎年の流行株と抗原性イルスが持つヌクレオプロテイン(NP)と呼ばれるが一致したワクチン株選定を可能にできる基盤情蛋白質を認識する抗 NP モノクロナール抗体が使報を蓄積する。

われている(図２)。

さらに本システムにより、従来のスクリーニン

将来流行するインフルエンザウイルスにおいて

グ系では単離が不可能であった多分節ゲノム間のNP 蛋白質に変異が起こり、既存診断キットの抗 NP

多塩基変異（エピスタシス効果）に由来する新型抗体では認識されない可能性があるため、感染しインフルエンザウイルスの出現を予測し、現流行ていても陰性と判定されて早期の治療機会を失う

株の進化方向性と遺伝的多様性を網羅的に解析す恐れがある。実際に 2009 年当時の診断キットを用

る（図３）
。

いた A(H1N1)pdm09 株の検出感度は、NP 蛋白質の変異による抗原部位の構造変化のため、抗体によ３．研究の方法

る認識感度が 100 倍ほど低下していた。

これまでに、遺伝子組換え技術を用いて人為的

未来流行株の予測が可能となれば、感染防御効に イ ン フル エ ンザ ウ イル ス 実 験室 株 (A/Puerto

果の高いワクチン開発研究に加えて、新規インフ

Rico/8/1934 株：PR8 株)を改変し、野生株と比較

図２ インフルエンザウイルスの構造とNP蛋白質

インフルエンザ
ウイルス粒子粒子内部のウイルスゲノム（黒色の紐状）にNP蛋白質（緑色）が一様に結合している診断キットにはNP蛋白質を認識する抗体が含まれている。

HA

NA

粒子表面にはHAとNA蛋白質が存在し、これらウイルス蛋白質の組み合わせによって亜型が決定する。

－16－

患者からウイルスを採取後、粒子の可溶処理により内部のNP蛋白質を溶出し、抗NP抗体と反応させることで陽性または陰性の判定を行う。

図３ 低忠実性ポリメラーゼによるエピスタシス効果と新型ウイルスの出現予測
低忠実性ポリメラーゼ導入ウイルス
置換または
第2分節ゲノムにコードされているPB1に置換を導入した組換えウイルスは、変異導入効率が野生株より倍高い
ウイルス蛋白質名

宿主細胞（培養細胞）に感染
PB2

PB1

PA

HA

2,341 nt

2,341 nt

2,233 nt

1,778 nt

NP

NA

M

NS

1,565 nt 1,413 nt 1,027 nt 890 nt

低忠実性ポリメラーゼによるウイルス遺伝子の複製

ゲノム複製中の変異導入効率 ＝ 2塩基置換/1万塩基

全ゲノムの全塩基領域に高頻度で変異が導入される

PB1-Y82C/K471H置換
ウイルスゲノムの集合と子孫粒子の生成多分節ゲノム変異がウイルス増殖に影響する 「エピスタシス効果」 による新型ウイルスの出現予測が期待できる
多種多様な変異株が作出される

して変異が入りやすい“低忠実性ウイルス株”のそこで、現在の市中流行株であるインフルエン

単離に成功している。低忠実性ウイルス株は、ゲザウイルス A(H1N1)pdm09 株から HA 遺伝子およびノム複製を担うウイルスポリメラーゼの PB1 蛋白

NA 遺伝子をクローニングし、PR8 株を母体とした質の 82 番目または 471 番目のアミノ酸を人為的

低忠実性ウイルスに組込むことで、流行株の主要に改変しており、野生株と比較して 2 倍の頻度で抗原に由来する変異ウイルスライブラリーを作製

ウイルス遺伝子に変異が挿入される。この低忠実する。そして、ウイルスライブラリーを用いたプ性ウイルス株を用いれば、現在のインフルエンザ

ラークアッセイ実験により、主要抗原である HA 蛋

流行株を元株とした変異ウイルスライブラリー

白質や NA 蛋白質に変異が導入された新規抗原変（変異ウイルスの集合体）が作製可能である。そ異株の単離を試みる。同様に、診断キットのウイのライブラリーの中には、将来流行する新規抗原

ルス抗原となる NP 蛋白質にアミノ酸置換が導入

変異株が含まれる可能性がある。

された新規変異株が単離できるかどうか検討する。

－17－

４．研究成果

PR8-低忠実性 PB1/pdm09（HA+NA）株を用いたプ

市中流行株である A（H1N1）pdm09 株から HA 遺

ラークアッセイ実験により 32 個の単一プラーク

伝子および NA 遺伝子をクローニングし、PR8-低忠を選択し、プラーク中に含まれるウイルスを単離

実性 PB1 ウイルスに組込むことで、流行株の主要後、培養細胞を用いてウイルス増幅を行なった。

抗原をコードした「PR8-低忠実性 PB1/pdm09（HA+NA）

その後、各分離株のウイルス遺伝子解析の結果、株」を作出した（図４）。続いて、PR8-野生型 PB1

免疫選択圧をかけない条件下において増幅させた/pdm09（HA+NA）株をコントロールとしてウイルスにも関わらず、変異ウイルスライブラリーの中にの増幅を行なった結果、低忠実性 PB1 株を種株とは多数の「HA 蛋白質の抗原領域にアミノ酸置換がすることで“増殖活性が多様なウイルス集団”、す生じた変異株」が含まれていた（図５）。この結果

なわち「流行株の主要抗原に由来する変異ウイル

から、低忠実性ポリメラーゼウイルスを利用する

スライブラリー」が作製可能であることを明らかことで、迅速かつ高率に抗原変異株を単離できるにした。

スクリーニングシステムの開発が可能であると考えられた。

図６ 既存の診断キットを用いた新規NP
変異株の検出感度の測定

加えて、同時に他分節ゲノム（NA 遺伝子や NP 遺伝子）にアミノ酸変異が導入された変異ウイルス

A型インフルエンザ
ウイルス野生株も単離されており、具体的には、アミノ酸置換を伴う NP 変異株を 5 株単離した（R19H 変異株、E81G

NP-R19H変異株

変異株、T6A/S314G 変異株、Q20P/K470R 変異株および Q122K/A286S 変異株）
。市販のインフルエンザ

NP-E81G変異株

診断キットを用いて、それら NP 変異株の検出感度
が野生株より低下するかどうか検討した結果、検NP-T6A/S314G変異株

出感度は野生株とほぼ同程度であった（図６：全ての変異株において、A 型インフルエンザウイル

NP-Q20P/L470R変異株

スの検出を示す「赤いライン」が認められた）。
本研究によって得られた NP 変異株に見出され

NP-Q122K/A286S変異株

たアミノ酸変異部位は、既存の診断キットに含まNP変異株表記の説明（例：R19Hの意味）
NP蛋白質の19番目のアミノ酸残基であるアルギニン（一文字表記：R）が、ヒスチジン（一文字表記：H）に変異しているれる抗体の結合活性には影響しないことが示唆された。一方で、NP 蛋白質の三次元構造は解読されており、変異アミノ酸部位を構造上にプロットす－18－

図７ NP蛋白質の三次元構造および変異導入部位
野生型NP

NP-Q122K/A286S

NP変異体構造図において、変異した各アミノ酸部位をボール構造で示することが可能である（図７：例として Q122K/A286S

２．内藤 忠相

変異株を示す）。アミノ酸変異部位の構造情報から、新規インフルエンザウイルス Mutator 株を

NP 蛋白質において「変異が入りやすい領域」およ用いた変異ウイルスライブラリー作出技術

び「変異が入りにくい領域」を同定することがでの開発きた。本成果は、ウイルス生存において変異を許BioJapan2019

容するアミノ酸部位を網羅的に調べる新規システ

2019 年 10 月 10 日

ムとして応用が可能であり、ウイルス進化を予測する上で重要な基盤情報となる。

③図書（総件数：0）

また、今回単離した NP 変異株の中には、臨床分なし

離株データベースに報告されていない新規のアミノ酸変異も含まれていた。今後は、本研究成果を④知的財産権（総件数：0）

活用し、未来流行株に導入される変異部位の事前予測システムの確立に取り組む。
５．主な発表論文等①雑誌論文（総件数：0）なし②学会発表（総件数：2）
１．内藤 忠相、齊藤 峰輝
低忠実性インフルエンザ株の性状解析とワクチン開発研究への応用
9th Negative Strand Virus-Japan
2020 年 1 月 22 日

－19－

なし

（表 題）糖代謝阻害剤封入 PLGA ナノ粒子による新規腫瘍免疫活性化機序解明（所 属） 川崎医科大学 肝胆膵内科学（氏 名） 仁科 惣治（研究成果の概要）
申請者らはグルコース誘導体である 2-Deoxy-D-Glucose（2DG）を封入したナノ粒子である poly（lactic-coglycolic acid）（2DG-PLGA-NP）による、がん細胞特異的な解糖系阻害剤を開発した。本研究において 2DG-PLGANP は、がん微小環境での CD8+T 細胞の相対的グルコース取り込み亢進に加え、乳酸産生低下に伴う IFNγ/JAKSTAT シグナル経路、あるいは AMPK 活性化による epigenetic 経路を介したケモカイン（CXCL9, 10, 11）の発現
亢進を介した新規抗腫瘍免疫活性化機構を有することを明らかにした。さらに 2DG-PLGA-NP は、免疫チックポ
イント阻害剤との併用により抗腫瘍効果を増強し、同薬剤耐性がんマウスモデルに対しても抗腫瘍効果を発揮
した。

（本文）

がん組織に蓄積しやすい（Enhanced Permeability

１． 研究開始当初の背景

and Retention；EPR 効果）。粒子径 50-150nm 程度のナ ノ 粒 子 製 剤 は 、 enhanced permeability andがんは日本人の死亡原因の 30％を超えており、まretention（EPR）効果を介してがん組織選択的に送さにがん患者の予後改善は喫緊の課題である。免疫達されると言われている。そこで申請者らは、EPR 効

チェックポイント阻害剤の臨床応用はがん治療にお果を期待した腫瘍選択的集積性や徐放性に優れた生ける画期的な局面を切り開いたがその効果はいまだ

体適合性高分子である Poly（lacticco-glycolic

限定的であり、がんによる免疫抑制機構に焦点を当

acid）（PLGA）に 2DG を封入した 2DG-PLGA ナノ粒子てた新たな治療開発が急務である。解糖系に依存し製剤（2DG-PLGA-NP）を開発し、がん細胞特異的な糖たエネルギー産生（Warburg 効果）はがん細胞の低代謝阻害剤の drug delivery system（DDS）の開発

酸素環境への適応結果と考えられてきたが、近年がに着手した。

んによる免疫抑制機構としても注目されている。

既に申請者らは(株)先端医療開発との共同開発で、グルコース誘導体 2-Deoxy-D-Glucose（2DG）はが

2DG-PLGA-NP（平均径 150nm, 2DG 充填率 約 8%）のん細胞に蓄積すると、解糖系阻害による ATP 産生抑開発に成功した。肝癌細胞皮下移植ヌードマウスに制、小胞体ストレス亢進に伴う細胞死や細胞増殖抑対する 2DG-PLGA-NP 800mg/kg の週 1 回静注は、2DG制等を介して抗がん作用を発揮する。既に固形癌に100mg/kg の連日腹腔内注射と比べて、実質的 2DG 総

対する 2DG の抗腫瘍効果が報告されているが、申請

投与量が約 9%程度であったにも係らず、有害事象な者らもマウスを用いた実験で肝癌抑制効果を実証しく有意な抗腫瘍効果を発揮し、既存の肝癌治療薬とた。しかし、十分な抗腫瘍効果を得るのに必要な 2DGの併用でその抗腫瘍効果が増強した。その作用機序

用量では高血糖、意識障害等の有害事象が出現し、として、嫌気性解糖系抑制による ATP 産生低下に加通常の全身投与では安全にかつ十分な抗腫瘍効果をえて、小胞体ストレス亢進によるアポトーシスの誘得るのは困難である。

導が関与することは既に確認していた。

がん組織の血管は未熟で血管外に高分子を漏出しさらに注目すべき点として、免疫応答性肝発癌マ

やすく、また薬剤排出経路のリンパ管が未発達なたウス（STAMTM マウス）に対しては、免疫不全なヌード

めナノ粒子のような高分子化合物は血管外に漏出しマウス xenograft の結果と比べ更に低濃度（80mg/kg－20－

週 1 回）の 2DG-PLGA-NP を投与しても強い抗腫瘍効

２． 研究の方法果を認めたが（図 1）、その腫瘍組織で強い CD3 陽性
T 細胞浸潤所見を認め（図 2）、2DG-PLGA-NP による（１）2DG-PLGA による腫瘍免疫活性化作用および分腫瘍免疫活性化という新たながん進展抑制機序を見

子機序解明

出した。
1．肝癌細胞に対する解糖系抑制による T 細胞走化
性因子活性化および分子機序解明（in vitro）
ケモカインの一つである CXCL9, 10, 11 は、T 細胞受容体である CXCR3 に結合して T 細胞の走化性を促進する。一方で、がん細胞からの直接的な CXCL10分泌に対して、Warburg 効果に代表されるがん細胞の糖代謝亢進が抑制的に作用すると報告されている（Cell Metab 2018;27）。
そこで、IFNγ＋TNFα刺激による肝癌細胞（Huh7）
からの直接的な CXCL9, 10, 11 分泌に対して、2DGによる解糖系抑制が亢進させるか否かを検討した。
また、2DG による肝癌細胞からの CXCL9-11 分泌促進
作用機序として、① 肝癌細胞での乳酸産生低下に伴う IFNγ/JAK-STAT シグナル経路亢進、あるいは ②肝癌細胞での AMPK 活性亢進を介したヒストンメチ
ル化酵素 enhancer of zeste homolog 2（EZH2）のリン酸化による Histone H3 lysine 27 トリメチル化抑制（H3K27me3）による CXCL9,10,11 転写活性の亢進についての検討を行った。
2．2DG が T 細胞の走化性に及ぼす影響についての検討（ex vivo）

２．研究の目的

リアルタイム細胞動態解析装置（EZ-TAXIScanTM）

申請者らが既に免疫応答性肝発癌モデル（STAMTMを用いて、上記１．の実験にて得られた肝癌細胞培

マウス）
において証明した 2DG-PLGA による肝癌抑制

養上清に対する T 細胞走化性を観察した。
さらには、効果に対して、解糖系阻害剤 2DG-PLGA による新たなCXCR3（CXCL9,10,11 に対する T 細胞受容体）中和抗T 細胞性腫瘍免疫の活性化に関する分子機構を明ら

体投与を用いて、2DG による T 細胞走化性に対するかにし、がん微小環境での免疫機能強化を基軸とす

CXCL9,10,11-CXCR3 相互作用の影響を検討した。

る新たながん免疫制御のパラダイム創生を目的とした。

3．肝癌細胞と比較した T 細胞の 2DG-PLGA 取り込み

それとともに、既存の分子標的治療薬や現在腫瘍能についての検討（ex vivo）

免疫療法として脚光を浴びている免疫チェックポイ

Transwell を用いて、肝癌細胞（Huh7）±2DG-PLGA-

ント阻害剤との併用効果や同薬剤の不応例に対するNP に対して、健常人の末梢血由来の CD8 陽性 T 細胞

抗腫瘍効果を明らかにすることを目的とした。

を共培養した。共培養直前の肝癌細胞における乳酸
産生量（解糖系最終産物）を測定し、共培養後の CD8－21－

陽性 T 細胞における細胞走化性（EZ-TAXIScanTM）おzeste homolog 2（EZH2）のリン酸化による Histone

よび活性化能（IFNγ発現）を解析した。

H3 lysine 27 トリメチル化抑制（H3K27me3）による以上の実験により、肝癌細胞における解糖系抑制

CXCL9,10,11 転写活性の亢進が考えられた。

（それに随伴する相対的な T 細胞での解糖系亢進）

一方で、リアルタイム細胞動態解析装置（EZ-もしくは乳酸産生抑制が、T 細胞機能に及ぼす効果

TAXIScanTM）を用いた検討により、肝癌細胞と CD8+Tを解析した。

細胞共培養下において 2DG-PLGA-NP は、肝癌細胞での乳酸産生低下もしくは T 細胞への相対的な糖取り込み亢進により CD8+T 細胞走化性を亢進させた。

（２）2DG-PLGA-NP の抗 PD-1 抗体との併用効果および抗 PD-1 抗体抵抗性モデルに対する有効性解析（２）2DG-PLGA-NP の抗 PD-1 抗体との併用効果およ4．
免疫応答性肝発癌モデルに対する 2DG-PLGA-NP のび抗 PD-1 抗体抵抗性モデルに対する有効性解析

効果についての検討（in vivo）

免疫応答性肝発癌マウス（STAMTM マウス）におい

免疫応答性肝発癌モデル（STAMTM マウス）に対して、2DG-PLGA-NP は抗 PD-1 抗体による抗腫瘍効果をて、抗 PD-1 抗体による抗腫瘍効果に対する 2DG-増強させた。

PLGA-NP の併用効果を検討した。

その一方で、
抗 PD-1 抗体抵抗性がん細胞（B16F10）
移植したシンジェニックマウス（C57BL/6）に対する

5．
抗 PD-1 抗体不応性腫瘍モデルに対する 2DG-PLGA-

2DG-PLGA-NP の抗腫瘍効果も明らかにした（図 3）。

NP の効果についての検討（in vivo）

さらに、抗 PD-1 抗体単独群と比べて抗 PD-1 抗体＋

2DG-PLGA-NP が抗 PD-1 抗体不応性腫瘍モデル

2DG-PLGA-NP 併用群の腫瘍組織においては、
CD3 陽性（B16F10 皮下移植 C57BL/6 マウス）に対する 2DG-

T 細胞浸潤能が亢進しており、腫瘍免疫活性化機序

PLGA-NP の抗腫瘍効果を検討する。また、その作用関与が示唆された。同マウスに対して 2DG-PLGA-NP

機序として腫瘍免疫が亢進しているか否かをみるたに抗 CXCR3 中和抗体を併用したところ、
2DG-PLGA-NP

め、
CD3 陽性 T 細胞浸潤能を免疫染色にて確認した。

による抗腫瘍効果が部分的ながらキャンセルされた。

さらに、同マウスにおける 2DG-PLGA-NP による抗すなわち、抗 PD-1 抗体抵抗性モデルに対しても、腫瘍効果に対して CXCL9,10,11-CXCR3 相互作用を介CXCL9,10,11-CXCR3 相互作用を介した T 細胞性腫瘍した T 細胞性腫瘍免疫の関与を明らかにするため、免疫の関与が考えられた。

2DG-PLGA-NP に抗 CXCR3 中和抗体を併用し抗腫瘍効
果がキャンセルされるか否かを確認した。

４．研究成果（１）2DG-PLGA による腫瘍免疫活性化作用および分子機序解明
2DG-PLGA-NP は肝癌細胞から T 細胞走化性ケモカ
イン CXCL9,10,11 の産生を亢進させ、その結果肝癌細胞への CD8 陽性 T 細胞の走化性を亢進させた。

以上の検討結果より、2DG（原体）よりも強力で有また、2DG によるがん細胞の解糖系阻害は、① 肝害事象を伴わないがん特異的解糖系阻害剤封入ナノ

癌細胞での乳酸産生低下に伴う IFNγ/JAK-STAT シ粒子製剤である 2DG-PLGA-NP による抗腫瘍効果の作

グナル経路亢進、あるいは ② 肝癌細胞での AMPK 活

用機序として、既報の細胞死誘導効果等に加えて、性亢進を介したヒストンメチル化酵素 enhancer of

既存の肝細胞癌治療薬とは異なる作用機序による腫－22－

瘍免疫活性化を兼ね備えた作用機序を有することも明らかにした。また、2DG-PLGA-NP は既存の分子標④産業財産権（特許権、実用新案権、意匠権）など）;的薬や今後のがん治療で脚光を浴びている免疫チェックポイント阻害剤（抗 PD-1 抗体）との併用効果以発明の名称：「ケモカイン産生促進剤、免疫チェック外に、抗 PD-1 抗体抵抗性がんモデルにも抗腫瘍効

ポイント阻害剤抵抗性癌治療薬及び抗腫瘍免疫賦活

果を発揮した。

剤」

以上の結果を踏まえて、今後は解糖系亢進したが

出願特許：特願 2019-048743

出願日：平成 31 年 3 月 15 日ん（FDG-PET 陽性がん）を対象にした同治療薬の臨

出願人：学校法人 川崎学園、株式会社 先端医療

床応用を目指す。

開発
出願等の状況：審査未請求
本開発品との関係：開発予定の医薬組成物特許（用５．主な発表論文等

途特許）①雑誌論文; なし②学会発表；


佐々木恭、仁科惣治、日野啓輔、「Immuno
oncology からみた肝細胞癌に対する 2-deoxyDglucose 封入 PLGA ナノ粒子の抗腫傷効果」、第105 回 日本消化器病学会総会

佐々木恭、仁科惣治、日野啓輔、「肝癌細胞の糖代謝抑制によるがん微小環境での腫瘍免疫賦活化作用とその臨床応用」、第 55 回 日本肝臓
学会総会



Kyo

Sasaki,

Yamauchi,Yuichi

Sohiji

Nishina,

Akira

Hara,

KotaroFukuda,Keisuke Hino. 「 Specific inhibition ofcancer cell glycolysis enhances antitumor
immunity in hepatocellular carcinoma」, The
Asian Pacific Association for Study of theLiver (APASL) Single Topic Conference 2019.


Kyo

Sasaki,

Yamauchi,Yuichi

Sohiji

Nishina,

Akira

Hara,

KotaroFukuda,Keisuke Hino. 「Antitumor effects of 2deoxy-D-glucose
nanoparticles

encapsulated
against

PLGA

hepatocellular

carcinoma in terms of tumor immunity」，
American Association for the Study of Liver
Diseases (AASLD)-The Liver Meeting 2019.
③図書； なし－23－