唾液から「癌匂い」の解明

匂いによる新しい口腔癌診断技術の確立
2018年12月10日

公立大学法人北九州市立大学 国際環境工学部
教授 李 丞祐九州歯科大学 地域健康開発歯学分野
教授 安細 敏弘

研究背景

がん患者数の推移
世界の新規がん患者数

日本の主要死因別死亡率
国民の3人に1人ががんで死亡

アメリカがん協会(http://www.cancer.org/research/cancerfactsstatistics/)

国立がん研究センターがん対策情報センター2016

 世界における新規がん患者数は1750万人、死亡者数は880万人（2015年）
 日本でがんは30年以上に渡り死因第一位の疾患であり、年間死亡者数は37万人を超える

研究背景

口腔がん患者数の推移• 罹患者数• 死亡者数4倍

3倍

初期段階で無症候性、頸部リンパ節に転移しやすい、全身に血行性に広がりやすい

早期発見の遅れ

5年生存率が5割以下

 口腔がんは、罹患者数、死亡者数ともに増加し、2016年は7600人以上が死亡
 罹患者数は30年前の約4倍、死亡者数は約3倍以上に増加研究背景

がん早期発見の重要性
肺癌

The earlier, the better !!

大腸癌

https://www.owlstonemedical.com/science-technology/vocbiomarkers/

 肺がんの場合、ステージ1における5年以上の生存率は50％以上
 ステージ4では、生存率が10％未満と大幅に低下

研究背景

従来のがん診断方法

病理検査

腫瘍マーカー

 細胞診
 組織生検画像診断
 超音波検査
 X線
 CT
 MRI
国立がん研究センターがん情報サービス• 侵襲性• 診断に時間を要する• 採血が必要• がんの早期診断に不向き

研究背景

メタボローム（低分子代謝物）

バイオマーカー
正常な生物学的過程、病理学的過程、もしくは治療介入による薬理学的反応の指標

メタボローム (代謝物)4,000種

客観的に測定・評価される物質1）
1) Clin Pharmacol Ther. 69(3): 89-95, 2001.

揮発性有機化合物、• タンパク質

糖、アミノ酸、アミン、有機酸、ヌクレオチド、脂肪酸、脂質など• 酵素

プロテオーム（タンパク質、酵素）
約100,000種

トランスクリプトーム（RNA）
ゲノム (DNA)
約25,000種

メタボローム解析は、対象となる代謝物が約4,000種類程度
血液の他、汗や尿、唾液などの体液中からでも分析可能

複雑性• DNA, RNA

https://www.newtonpress.co.jp/separate/ba
ck_biology/mook_161025.html

分子量1,000以下の対象となる代謝物は、約4,000種

血液以外の体液からでも検出可能
がん関連因子を発見しやすい
分析機器により迅速に定性・定量が可能

揮発性有機化合物に注目

研究背景

揮発性低分子代謝物

Volatile Organic Compounds (VOCs)

 非侵襲性

揮発性有機化合物

 保存・輸送の簡便性
 情報の多様性• 分子量300以下、常温常圧で 大気中で容易に揮発する
有機化学物質 血液に比べ、成分が少ない• 呼気、唾液、血液、尿、糞便、汗、皮膚などから検出• 生体内の代謝変化を反映• VOC起源
 細胞分泌
 バクテリアによる分解
Shockco et al, NATURE REVIEWS. CANCER · AUGUST 2004.

体内の様々な代謝経路を介し細胞から分泌され、血液を介し、呼気の他唾液や尿などの体液中へ転送され、生体内の生化学的変化を反映

研究背景

VOC関連先行研究

関連する疾患

化合物名

サンプル

口腔がん
肺がん

Undecane1), Benzaldehyde1)
1-Butanol2)
2-Pentanone3)
Nonanal4)
Acetone5)

呼気
呼気
尿呼気
呼気

大腸がん
糖尿病

呼気中の揮発性有機化合物6)

唾液が用いられていない理由 1) Bouza M, et al, 2017.
 唾液中のVOCは血液の1000分の1と濃度が低い
 極微量の成分を高感度に検出するための分析手法が確立されていない

口腔がん

唾液中VOC

2) Schallschmidt K, et al, 2016.
3) Hanai Y, et al, 2012.
4) Altomare DF, et al, 2013.
5) Galassetti PR, et al, 2005.
6) https://pharmaceuticalintelligence.com
7) Pfaffe, T. et al, 2011.

唾液分析の有用性7)

口腔がんと唾液中VOCに関する研究は報告されていない！！
唾液は血液を原料とする重要な体液の一つであり、非侵襲的に採取可能であることから検査試料としての可能性は大きい

研究目的• 健常者と口腔がん患者の唾液中VOCを比較
Oral cancer ranks sixth amongcancers in worldwide occurrence, and 90%
of all oral cancers are diagnosed as oral
squamous cell carcinoma (OSCC)• 口腔がん診断に有用な揮発性バイオマーカーの探索
揮発性バイオマーカーに基づく• 口腔がん診断プロファイルの提案・確立

バイオマーカーの特定：従来技術‘Odor-fingerprints’匂いの指紋

Metabolomic Profiles for Disease Diagnosis

m1m2

m3

m4m5m6m7m8m9 m10m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10Interpersonal/intersexual changes

Pharmacological therapy

m1m2

m3

m4

m5m6m7m8

Metabolite pattern

m9 m10***m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10m11*
m1m2

m3

m4

m5

m6

m7

m8

Lifestyle, diet, habits

健常者
問題点

m9 m10DISEASE

健常者とがん患者が示す臭気パターンに基づく診断技術

癌患者

生活タイル、薬物療法、人別・性別などによって代謝プロフィールが異なる

パターン認識に基づく従来技術にはバイオマーカーの特定に限界があるバイオマーカー特定のための仮説
健常者とがん患者の間で考えられるVOC群
VOC群A

VOC群C

癌患者から検出されない成分：バイオマーカーの可能性有癌患者から特異的に検出される成分：バイオマーカー最有力！

消失群 7A

B C
35
38 新生群
増減群
VOC群B

健常者

共通成分のうち、癌患者から著しく変化する成分：バイオマーカーの可能性有

癌患者

健常者およびがん患者から発生する揮発性代謝成分のVOC群から疾患に特異的な成分を効率よく抽出することができる

実験方法

ZSM-5/PDMS複合薄膜

抽出膜の走査型電子顕微鏡（SEM）イメージ

PDMS

(a)

ZSM-5 10%

大きな比表面積
多細孔構造ZSM-5 20%

高い分子選択性(b)と(c)のAFMイメージ(c) 断面
Journal of Chromatography B, 1041 (2017) 133–140親水性分子量が小さい化合物
ZSM-5ゼオライト

H3C CH3

H3C
H3C
H3C

SiCH3SiO

疎水性Si分子量が大きいCH3化合物
CH3O

nPDMS（ジメチルポリシロキサン）

高感度
VOC抽出

実験方法

唾液採取と分析の実験の流れ
GC-MS（ガスクロマトグラ
フ質量分析装置）

唾液2 mL+水3 mL

唾液採取

3時間振とうサンプル瓶(10 mL)

5040302010＜条件＞• 平均2ｍLを安静時に採取• 採取後、直ちに-80℃で保管• 被験者あたり複数回を採取 抽出瓶 (50 mL)• 唾採取1時間前の口腔清掃と喫煙を禁止
1086Cancer
Healthy

50403020
102010-28-46-6-8 -6 -4 -24024650
40302010

唾液中VOC抽出

注入1μL

4

膜の洗浄 &
乾燥

8 10

高分離能
安定で再現可能な測定定性・定量化可能豊富なライブラリ試料の前処理が必要
NIST Mass
Spectral Library
約30万件

504030201020Methanol
溶出

統計処理 & データ解析
•••

主成分分析
解析ソフト: Origin 9 softwareｔ 検定(P < 0.05)

GC–MS分析

http://www.chem-agilent.com/contents.php?id=1001015

結果および考察

GC-MS総イオンクロマトグラム（TIC）結果

健常者

口腔がん患者

健常者に比べ、がん患者は✔ 検出ピークが複雑✔ 多種のVOCが確認結果および考察

新生群VOC検出されたVOCのVenn図7342

口腔がん患者のみから検出された38成分中最も出現頻度が高いVOC10成分
Table 2
No. Compounds

73538

Oral cancer
group

出現頻度が0.25以上

Frequency of Appearance (FA)出現頻度
（検出された回数）

Selectedtime, minion, m/zClassification

FA(n = 24)

13-Heptanone

8:4757ketone0.382Acetaldehyde, methoxy-

11:16

45

aldehyde

11:35

43

ketone

0.25
0.25

3

Healthy control
group

Retention

5-Hepten-2-one, 6methyl-42-Butanol, 3-methyl-

14:59

45

alcohol

0.33

5Oxime, methoxy-phenyl-

16:31

77

imine

0.29

6

1,3-Butanediol

16:48

43

7

1,2-Pentanediol

17:15

55

alcoholalcohol

0.79
0.42

8

Butanoic acid, butyl ester

18:25

71

ester

0.25

91-Hexadecanol

21:26

55

101-Tetradecanol

23:31

69

alcoholalcohol

0.46
0.29

FA: frequency of appearance.

（全分析回数）検出された38成分のうち、出現頻度0.25以上のがん患者に特異的な最有力バイオマーカー候補10成分を抽出

結果および考察増減群VOC
Table 3.

両群に共通して検出されたVOC35成分

FA
Selected

No. Compounds

7342735

Healthy controlgroup38

Oral cancergroup

両群のVOC検出量に有意差を示し、口腔がんグループで減少傾向の20成分(P < 0.05）

and
口腔がんグループでVOC検出量が増加傾向の2成分*

共通35成分のうち、
 両グループ間で統計学的有意差を示した減少傾向の20成分
 増加傾向の特異性を示した2成分

ion, m/z

Classification

HealthyOralcontrol

cancerp-value↓ or ↑(in cancer)(n = 51)(n = 24)

1

Ethanol

31

alcohol

0.98

1.00

< 0.0122-Pentanone

43

ketone0.98

0.96< 0.01↓↓31-Propanol

31alcohol

0.960.75< 0.01↓

4Hexanal

56

aldehyde

0.100.25< 0.05↓*83

ketone0.100.17> 0.1↑

6Thiocyanic acid73

0.370.13< 0.05↓

7

Cyclohexanone

58
93-Penten-2-one, 4methyl-*2-Propanone, 1hydroxyPropanoic acid, 2hydroxy-inorganicacid

55

ketone

0.14

0.25

> 0.1

↑

43

ketone0.82

0.75< 0.01

↓

45

acid

0.61

0.17

< 0.01↓

10

Propylene glycol

45

alcohol

0.61

0.21

< 0.05111-Hexanol

56

alcohol

0.530.13< 0.0112

Ethanedioic acid

59

acid

0.390.17< 0.05

↓↓↓

59

acid

0.53

0.25

< 0.01↓↓↓
↓
↓↓
↓

13

Acetic acid,hydroxy-14

1-Octen-3-ol

57

alcohol

0.84

0.33

< 0.0115

Dimethyl sulfone

79

organosulfur

0.49

0.08

< 0.0516

Phenylethyl alcohol 91

alcohol

0.78

0.29

< 0.01

17

Phenol94

phenol

1.00

0.92< 0.0118

Phenol, 4-methyl-107

phenol0.37

0.08< 0.0119

2-Piperidinone

99

amide

0.82

0.33

< 0.0120

Hexadecanoic acid

74

acid

0.96

1.00

< 0.0121

Docosanoic acid

74

acid

0.47

0.21

< 0.0522

Indole117

heterocyclic0.780.29< 0.01

FA: frequency of appearance; ↓= decreased and↑= increased.

↓↓↓結果および考察

増減群VOC両群に共通して検出されたVOC35成分

Figure 47342735

Healthy control
group222038

Oral cancergroup

P < 0.01

出現頻度
2100

がん患者において検出量減少

結果および考察

統計解析：主成分分析

Principal Component Analysis (PCA), 主成分分析
7342a)

PCAスコアプロット

8Cancer
Healthy6735438

Healthy control
group

PC22
Oral cancer
group

-2

7 + 10 + 10 = 27 成分
消失減少-4

新生癌の進行に基づいたVOC代謝成分の分類
・健常者のみで見られる成分：消失成分
・健常者と癌患者に共通して著しく減少する成分：減少成分
・癌患者のみで見られる成分：新成成分

0-6Cancerous
Healthy-6Figure 5(a)b)-4-20PC12468

 27成分によって健常者Gと癌患者Gが区別結果および考察b)a)8PCAスコアプロット上の27 VOC挙動
CancerDecreased
Newly
produced
Healthy
Disappeared

0.4

60.3

PC2PC220.1
0.00

hexadecanoic acidphenylethyl alcohol

1-hydroxy-2-propanone

1-tetradecanol

1-propanol

1-hexadecanolbutanoic acid, butyl ester
acetaldehyde, methoxy
1,2-pentanediol
oxime,
methoxy-phenyl
5-hepten-2-one, 6-methyl

1-octen-3-ol

1,3-butanediol
2-butanol, 3-methyl

減少群

3-heptanonebenzeneacetaldehyde-0.1-2ethanol(E,E)-2,4-decadienal-0.2-42-pentanone
1-octanol

butyrolactone

消失群-0.3-6phenol

2-piperidinone

新生群

40.2

indole-0.3-6-0.2-4-0.1-21-heptanol
benzyl alcohol

0.00PC1
PC10.12undecane

0.2
40.3
60.48

結果および考察

27 VOCから12候補成分の抽出減少
OO

HOHO

Ethanol

2-Pentanone

HOPhenol

7Hexadecanoic acid

消失OHOO

4

HOUndecane

31-Octanol

Butyrolactone

Benzyl alcohol

新成OH

健常者

OHOOH
HO

3-Heptanone 1,3-Butanediol 1,2-Pentanediol

HO

71-Hexadecanol

癌患者

結果および考察

癌患者

健常者

12候補成分の病期との関連性

減少群
消失群
新生群

結果および考察

癌患者

健常者

12候補成分の病期との関連性

減少群
消失群
新生群

結果および考察

最も確率の高いマーカーの決定
減少OO

HOHOEthanol

2-Pentanone

HOPhenol

7Hexadecanoic acid

消失OHOO

4

HOUndecane

31-Octanol

Butyrolactone

Benzyl alcohol

新成OH

健常者

OHO

OH
HO

3-Heptanone 1,3-Butanediol 1,2-Pentanediol

HO

71-Hexadecanol

癌患者

結果および考察

最も確率の高いマーカーの決定

GCピーク面積情報に基づく

決定木分析

2-Pentanone < 2.11×10⁵

yesO

C: 24; H: 50

減少成分

Undecane < 5.10×10⁴
yesHO消失成分

1,3-Butanediol ≧ 1.28×10⁵

no

新生成分

7C減少成分
23H

95.8% sensitivity

CH

noCC
1

noyes

Hexadecanoic acid < 9.03×10⁵
yesOH
HO4O

noH

2

H

1CH

47

94.0% specificity

減少、消失、新生の群から選ばれる
最終4成分による口腔がん検知の感度及び特異性は、各々95.8%と94.0%

想定される用途

揮発性バイオマーカーによる口腔癌スクリーニング
癌診断匂い検知技術及び計測デバイスの開発
匂い情報に基づく総合ヘルスケア

想定される用途
Q. 今後、どのような応用が考えられるのか？

匂いを対象とする既存の研究開発・産業に明確な根拠と方向性を提示！！
1）動物を使ったがん検知

疾患VOC群の分子情報
細胞内の化学平衡に基づく癌化
健常者

増減
消失
新成回復

犬や線虫など匂いの再現疾患（癌）スクリーニング及び診断技術の開発

癌患者

がん早期発見予後の判定 癌診断匂い検知技術
匂い情報に基づく総合ヘルスケア

2）がん診断匂い計測機器開発

3）がんの薬物治療（化学療法）、食品などの評価

まとめ
健常者と口腔がん患者の唾液中のVOCを比較
口腔がん患者73成分、健常者42成分、共通35成分
口腔がん診断に有用なバイオマーカーの探索
27種のVOC口腔癌のバイオマーカーの抽出健常者およびがん患者の両者から検出されるVOC代謝成分が癌の進行に伴って「増減」、「消失」、「新生」の群を形成、高い疾患相関を示すことを世界で初めて証明

消失

増減
健常者

揮発性疾患
代謝成分

癌の進行

新成癌患者

まとめ
パターン分析に基づいた従来技術に比べ、・疾患の匂いを「増減」、「消失」、「新生」のVOC群の分類に成功
・複雑な生体臭気の分子情報をVOC群に単純化することで、バイオマーカーの決定までの時間を大幅に短縮
・感度・選択性の高い信頼性のある癌マーカーの抽出を実現
本手法は、疾患に関係する幅広いVOC分子情報を得ることができ、癌の代謝経路や生体代謝メカニズムの解明に寄与するものと期待
医（歯）工連携の成功事例として地域医療、産業活性化につながるものと期待

Early detection is the best way for complete cure of cancer !!

本技術に関する知的財産権

発明の名称:揮発性口腔癌バイオマーカー
出願番号:特願2018-205844
出願日:平成30年10月31日
出願人:北九州市立大学
発明者:李 丞祐（北九州市立大学）
安細 敏弘（九州歯科大学）

お問い合わせ先

北九州市立大学 環境技術研究所
知的財産・産学官連携コーディネーター 中村 邦彦
北九州市立大学 企画管理課 有薗 和子
TEL:093-695-3367 FAX:093-695-3368
E-mail:k-arizono@kitakyu-u.ac.jp