研究報告 2020（KISTEC Annual Research Report,2020）【研究開発部】
有望シーズ展開事業「腸内細菌叢」プロジェクト
解析ツール開発グループ◆ 総括･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

117

プロジェクトリーダー兼グループリーダー 大野 博司◆ 肥満者、または、耐糖能異常者に特有の腸内細菌と代謝物の探索･･･････････････････････････

中西

120

裕美子

◆ 業績･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

123

腸内環境制御グループ◆ 総括･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

125

グループリーダー 福田 真嗣◆ 腸内環境制御基盤技術の開発に向けた難培養性腸内細菌の培養法確立および生体に与える影響の評価･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････128

中藤 学、大縄 悟志◆ 腸内環境制御基盤技術の開発に向けた研究ツールの作成 ･･････････････････････････････････

131

大縄 悟志、中藤 学、井上 浄◆ 業績････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

134

【研究開発部】腸内細菌叢（解析ツール開発）「腸内細菌叢」プロジェクト
プロジェクトリーダー兼解析ツール開発グループリーダー 大野 博司【基本構想】
我が国において糖尿病患者は増加の一途をたどり、罹患者数は約 950 万人を数えるに到っている。糖尿病は高齢者における主要な疾患であり、糖尿病に肥満・高脂血症・高血圧が合併するメタボリックシンド
ロームは動脈硬化を促進し、心筋梗塞・脳卒中のリスク増大を介して日本人の健康寿命を短縮する最大の原因となっており、大きな社会的・経済的問題となっている。最近腸内細菌と肥満、2 型糖尿病といった
生活習慣病との関連が動物やヒトで報告され、このことが肥満や 2 型糖尿病の誘因の１つとなっているのではないかと考えられる。従って摂取する栄養素やエネルギー状態によって変化する腸内細菌叢を捉えることができれば、肥満や 2 型糖尿病発症といった生活習慣病の予測や治療に役立つと考えられる。本研究では、摂取する栄養素やエネルギー状態の把握とメタゲノム解析による腸内細菌の菌種や機能といった包括的な解析に加え、遺伝的背景を加味し、そのデータを横断的に解析することにより、食習慣、腸内細菌叢、生活習慣病発症の相互関係を明らかにすることを目的とする。方法は、これまでの欧米人の論文をもとに東京大学付属病院の検診受診者で 20 歳から 75 歳までの男女含む肥満者 100 名、耐糖能異常者 100 名、肥満も耐糖能異常もない者 計 100 名の合計 300 名を対象とした。解析項目は、(1) 簡易型自記式食事歴法
質問票(BDHQ)を用いた食事調査と活動量計を用いた身体活動量の測定、(2)腹部エコーを含む臨床データ(3)血中アディポカインの測定、(4)腸内細菌叢の 16S・メタゲノム解析、(5)血中・糞便中のメタボローム
解析、(6)単核球を用いたトランスクリプトーム解析、(7)全ゲノムシークエンスによる遺伝子多型解析、(8)統合データベースの作成と解析ツールの開発を行う。このことにより、どのような腸内細菌叢が生活習
慣病発症に重要な役割をしているかが明らかとなり、さらに新規バイオマーカーなどの開発や予防薬、個別化医療といった新しい予防法やリスク診断の実現を目指す。

１．

2019 年度の研究目的

２．

2019 年度の研究成果

解析ツール開発グループでは、食事・栄養摂取状況、身体活動量・エネルギー消費量などの生活習慣データ、炎症（1） 統合データベースの作成と解析ツールの開発
臨床情報、腸内細菌叢、代謝物の情報のデータベースを作

性サイトカインを含めた臨床データ、腸内細菌叢の 16S 解析・メタゲノム解析、水溶性や脂溶性のメタボローム解析、成し、被験者ごとに目的の情報を表示できるインターフェースを作成した。さらに、データ間の関連性を簡単に調べ

CAGE 手法を用いた RNAseq 解析を行うとともに、これらのデータを統合的・包括的に解析するためのデータベース

るため臨床情報と各データの相関解析を行うツールも実装した。

化を図り、新しい解析ツールをモジュールした解析ソフト
ウエアの開発を行っている。さらに、この統合データベー(2) 簡易型自記式食事歴法質問票(BDHQ)を用いた食事調

スと解析ソフトウエアを用いて、食習慣・身体活動量、腸内細菌叢、生活習慣病発症の相互関係を明らかにし、腸内査と活動量計を用いた身体活動量の測定
昨年度収集した 245 名分の BDHQ による食事調査につ細菌叢を介した未病改善やリスク診断の開発を行うことを目的としている。2019 年度は、下記の項目を重点的にいて、栄養素について 90 項目、食事の項目として 70 項目について一日当たりの摂取量を解析した。また活動量につ取り組み、前年度に引き続き統合データベースを作成する
ための元となるデータの取得と、統合データベースとデー

いては 600 時間以上計測できた 170 名について歩数と活動強度についてデータの抽出が完了した。

タベースを参照するインターフェースの作成を行った。
(3) 血中・糞便中のメタボローム解析(1） 統合データベースの作成と解析ツールの開発(2) 簡易型自記式食事歴法質問票(BDHQ)を用いた食事調

血液、及び、糞便から水溶性と脂溶性代謝物の抽出を行い、水溶性代謝物はガスクロマトグラフィー質量分析を用

査と活動量計を用いた身体活動量の測定(3) 血中・糞便中のメタボローム解析

いて分析を行い、306 検体から糞便中から 124 種類、血清中から 102 種類の代謝物を同定した。また、脂溶性代謝物(4) 各種データの相関解析(5) 腸内細菌叢のメタゲノム解析

は液体クロマトグラフィー質量分析を用いて分析を行い、3 糞便中から 1927 種類、血清中から 625 種類の物質を同(6) 全ゲノムシークエンスの解析

定した。

117

KISTEC研究報告2020（2020.8）

【研究開発部】腸内細菌叢（解析ツール開発）(4) 各種データの相関解析

た 271 検体の糞便から DNA を再抽出し、ショットガンシ

代謝物データは相互の相関係数に応じてクラスタリン
グを行い代謝物クラスター（Co-abundance group; CAG）をークエンシング法によるメタゲノム解析を行った。その結果、7G のシーケンシングリードが得られ、そこから約 6M作成した。次に、被験者の耐糖能異常や肥満の表現型とこれらの代謝物クラスターとの相関について解析した。本研の遺伝子を同定した（図２）。本研究のデータは過去に報告されていた日本人のメタゲノム解析から得られた遺伝

究では、健常者、肥満者、耐糖能異常者からそれぞれ血清
生化学検査、および血中のインスリン、アディポカインを子数（約 4.8M）[4]よりも多く、本研究から新規遺伝子を含むより多数の日本人の腸内細菌の遺伝子カタログを得測定している。これらの情報をもとに、糖尿病の指標として空腹時血糖（FBG）、HbA1c、HOMA-IR、肥満の指標とることができた。

して BMI などを臨床データとして組み込み、相関解析を行った。その結果、糞便中の水溶性代謝物に関していくつかの代謝物クラスターと臨床データと有意な相関（Spearman 偏相関）、もしくは Wilcoxon rank-sum test による有意な増減を認めた。同様に、糞便中の脂質代謝物に関しても解析を行い、有意に関連する代謝物クラスターを同定した。
次に、腸内細菌叢データと代謝物クラスターの結果との相関解析を行い、耐糖能異常と関連のある代謝物と細菌の同定を試みた。その結果、水溶性代謝物に関しては単糖や糖代謝物のクラスター（CAG 05, 06）がインスリン抵抗性（HOMA-IR）、脂肪肝（NAFLD）、メタボリック症候群

図２ メタゲノム解析から推定された糞便中の腸内細菌の遺伝子数（MetS）やその他のパラメーターと強い正の関連を示していたため、まずこれらの代謝物と腸内細菌との相関解析(6) 全ゲノムシークエンスの解析を行った。その結果、インスリン抵抗性を示す被験者（ HOMA-IR ≧ 2.5 ） の 検 体 で は イ ン ス リ ン 感 受 性

313 名分の DNA 抽出が終了し、疾患感受性遺伝子を同定するために約 150 人の全ゲノムシークエンス解析が終了（HOMA-IR<1.6）の被験者の検体と比較して単糖（水色）およびその他の糖代謝物（青、紫）が増加していることがした。

示された。また、これらの代謝物は Dorea 属、Coprococcus
属などの腸内細菌と正の相関を示す一方、Bacteroides 属、３．

Alistipes 属などの細菌と負の相関を示した。
特に Dorea 属と Coprococcus 属は Lachnospiraceae 科に属充実化と解析ツールの実装等を進める。
2. BDHQ で得られた栄養素や食事の項目について、腸内細する細菌種であり、過去の報告でも肥満や糖尿病との関連が示唆されている[1]。また、単糖や糖代謝物の増加は、腸菌叢や代謝産物との関連性について検討するとともに、活動量のデータについて解析を行う。

内環境において多糖の分解が亢進している可能性を示唆している。過去の報告ではマウスにおいて多糖の分解亢進

3.既に解析が終了している血清代謝物解析と前述の糞便
代謝物解析の統合解析を行い、糞便代謝物が実際に宿主のによる宿主への過剰なエネルギー供給が肥満に関与する可能性が指摘されているが[2]、ヒトにおいては未だ実証さ

代謝や肥満・高血糖などの表現型に影響を与えているかを検討する。

れておらず、今回の結果はその仮説を証明する重要な知見となる可能性がある。

4.2019 年度はメタゲノム解析のシーケンシングが終了したところであり、詳細な解析を 2020 年度行う。メタゲノ

同様の手法を用いて脂質代謝物クラスターと腸内細菌との関連も検討したところ、顕著な所見としてリゾホスフ

ム解析により、表現型と関連する種レベルのより細かい細菌種を同定が可能になるとともに、腸内細菌の機能的な側面の解析も可能になることが期待できる。
また、上記で表現型および代謝物との関連性が示された細菌種についていくつか選択し、高脂肪食誘発性糖尿病モデ
ルマウスに投与することで、細菌と肥満・高血糖・インス
リン
5.ヒトゲノムの全ゲノムシークエンス解析について順次ァチジルコリン（LPC）がインスリン抵抗性の高い被験者の検体で増加していたこと、またこれらの代謝物はAlistipes 属や Parabacteroides 属と負の相関を示すことがわかった。腸管内での LPC の増加と腸内細菌によって生成されるその代謝物は動脈硬化性疾患との関連が示唆されており[3]、今回の結果は糖尿病患者において動脈硬化性疾今後の研究計画
1.統合データベースについては、引き続きデータベースの患が増加する一つの機序を示唆している可能性がある。

行っていく。
6.解析したデータについては順次統合データベースに集(5) 腸内細菌叢のメタゲノム解析
上記で認めた代謝産物を産生する腸内細菌叢を明らか約し充実をはかるとともに、共分散構造分析や全ゲノムシークエンスなどを用いた層別化・個別化に向けた解析シス
テムを構築していく。

にするため、メタゲノム解析に必要な DNA 量が採取でき

KISTEC研究報告2020（2020.8）

118

【研究開発部】腸内細菌叢（解析ツール開発）【参考文献】

1. K. H. Allin, V. Tremaroli, R. Caesar, B. A. H. Jensen,
M. T. F. Damgaard, M. I. Bahl, T. R. Licht, T. H. Hansen,
T. Nielsen, T. M. Dantoft, A. Linneberg, T. Jørgensen, H.
Vestergaard, K. Kristiansen, P. W. Franks, T. Hansen, F.
Bäckhed and O. Pedersen, Diabetologia, 61, 810-820,(2018)
2. P. J. Turnbaugh, R. E. Ley, M. A. Mahowald, V.
Magrini, E. R. Mardis and J. I. Gordon, Nature, 444,
1027-1031, (2006)
3. Z. Wang, E. Klipfell, B. J. Bennett, R. Koeth, B. S.
Levison, B. Dugar, A. E. Feldstein, E. B. Britt, X. Fu, Y.
M. Chung, Y. Wu, P. Schauer, J. D. Smith, H. Allayee, W.
H. Tang, J. A. DiDonato, A. J. Lusis and S. L. Hazen,
Nature, 472, 57-63, (2011)
4. S. Nishijima, W. Suda, K. Oshima, S. W. Kim, Y.
Hirose, H. Morita and M. Hattori, DNA Res, 23, 125-33,(2016)

119

KISTEC研究報告2020（2020.8）

【研究開発部】腸内細菌叢（解析ツール開発）

肥満者、または、耐糖能異常者に特有の腸内細菌と代謝物の探索
中西

１．

はじめに

裕美子

所に応じて作成する必要があると提唱されている。

近年、肥満や 2 型糖尿病（T2D）といった生活習慣病と腸内細菌との関連が動物やヒトで報告されている。肥満の１．２ 日本における肥満や T2D を対象とした腸内細菌研究

ヒトでは Firmicutes 門の細菌と Bacteroidetes 門の細菌の比（Firmicutes/Bacteroide[F/B]比）が高く、細菌種の多様性は前述のように、海外ではヒトを対象とした肥満や T2D

低いことなどが報告されている。さらに肥満や T2D の患者の腸内細菌を無菌マウスに移植すると同様の病態を生の対規模なコホート研究が行われているが、日本人における肥満や T2D の腸内細菌叢の研究例は少ない。肥満に関じることから、異常な菌の組成そのものが病態の原因の１つであることが証明されている。従って、肥満や T2D にしては 2015 年に発表された健常者 23 名と肥満者 33 名の
糞 便 中 の 腸 内 細 菌 叢 を T-RFLP （ Terminal Restriction

伴う異常な腸内細菌叢を改善することで病態の治療や予防に役立つことが期待されている。本研究では、肥満やFragment Length Polymorphism）法で比較した結果では、Bacteroidetes 門の細菌が肥満者で有意に低かったことを報T2D の発症に関連する腸内細菌やその代謝物を探索し、また、それらの機能解析を行うことで、肥満や T2D の発症告している[7]。また、T2D に関しては健常者 50 名と 2 型
糖尿病患者 50 名の糞便中の腸内細菌を RT(Real time)-PCRや悪化に関与する腸内細菌のメカニズムを解明する。

法 で 比 較し た 結 果、 T2D 患 者 で C. coccoides group 、Atopobium cluster 、 Prevotella 属 が 有 意 に 減 少 し 、

肥満や T2D と腸内細菌との関わり

近年、世界中で増加の一途をたどっている肥満や糖尿病

Lactobacillus 属が有意に増加していた。また、C. coccoides
group、Atopobium cluster は T2D 患者の血中でも検出されが腸内細菌と密接な関わりがあると多数報告されている。
まず、2006 年に Gordon らのグループが肥満の患者や肥満た。T2D 患者では糞便中の酢酸、プロピオン酸が有意に減少していたことも報告している[8]。これらの研究では、症

モ デ ル マ ウ ス に お い て 、 Firmicutes 門 が 増 加 し 、Bacteroidetes 門が減少することを報告した[1, 2]。その後、例数が少ないこと、また、腸内細菌叢を解析する手法として、T-RFLP 法や RT-PCR 法を用いているが、これらの方肥満のヒトや肥満モデルマウスにおいて、Verrucomicrobia
門の Akkermansia mucinphila の割合が減少していることが法では腸内細菌叢の一部分を解析することしかできないことが問題であり、症例数を増やし網羅的な解析法による明らかとなり、同菌をマウスに経口投与したところ、インスリン抵抗性や脂肪の蓄積といったメタボリックシンド

腸内細菌叢解析を行い、日本人における肥満や糖尿病の発症に関わる腸内細菌を探索することが重要である。

ロームの病態を改善できたことが報告された[3]。一方、
T2D の発症には遺伝的要因と環境要因が関与すると考え

１．３

られているが、これまでの研究から遺伝学的要因の寄与は小さく、環境要因の影響の方が大きいことが示唆されてい腸内細菌叢には性差があり[9]、腸内細菌叢の違いが性別特有の免疫システムに関与することが報告されている

る[4]。そのため、環境要因の１つとして近年、腸内細菌の重要性が注目されており、実際に、中国やヨーロッパにお[10]。また、日本人の男性では心筋梗塞の発症率が高く、心筋梗塞は糖尿病や高脂血症、高血圧などの結果として起

いて T2D 患者の大規模コホート研究が行われた[5, 6]。中国人の T2D 患者の腸内細菌叢のメタゲノム解析（細菌のこるため、男性に多い疾患は生活習慣と深い関係があることがわかる。そこで、肥満や T2D と腸内細菌叢との関係

ゲノム情報すべてを読み、どのような遺伝子を持つかを解析する手法）結果から、T2D 群に特徴的な腸内細菌の遺伝を調べる上で、性別による差異も調べ、性別特有の腸内細菌や代謝物が肥満や T2D の発症に関与するか解析を行う。

１．１

子群を用いて T2D 発症リスクを判別することが可能であることが報告されている[5]。また、ヨーロッパでも同様の

２．１ 実験方法
２．１．１ ヒト試験の概要

コホートが行われたが、２つコホート研究を比較するとヨーロッパ系コホートと中国人コホートでは T2D を識別す

本研究では、東京大学附属病院予防医学センターと共同で、健康診断の受診者うち、空腹時血糖が 110 mg/dL もし
くはヘモグロビン A1c が 6.0％以上の受診者を耐糖能異常

るメタゲノムマーカーが異なっていたことから、メタゲノ
ムによる T2D 予測法は、研究の対象集団の年齢や居住場

KISTEC研究報告2020（2020.8）

腸内細菌叢の性差について120

【研究開発部】腸内細菌叢（解析ツール開発）（Impaired glucose tolerance :IGT）群、また、BMI が 25 以
上で正常血糖の受診者を肥満群とし、これらの受診者に加Bacteroides 属が肥満群で有意に増加していることが分かった。また、性別の違いについても比較を行ったところ、

え、同数の非肥満で非 IGT の受診者を健常者群として本研
究にリクルートし、通常の検診項目に加えて便や血液を採α多様性は女性がやや低い傾向にあるものの、男女で有意な差は見られなかった。腸内細菌の構成を比較したところ、取した。リクルートした人数はそれぞれ約 100 名である。

Prevotella 属、Coprococcus 属が男性で多く、Veillonella 属、Feacalibacterium 属、Streptococcus 属は女性で多い特徴が見られた。さらに、健常者、肥満者、IGT について性別ごとに違いを調べたところ、女性では Collinsella 属が肥満群とIGT 群で有意に増加していたが男性で有意な差が見らなかった。また、Bacteroides 属についても、男性では肥満群で有意に増加しているが、女性ではその違いは見られなかった。以上のことから、性別ごとに肥満や IGT に特有な腸内細菌が異なることが考えられた。

２．２．２

昨年度報告したように、血漿と糞便のメタボローム解析

図 1. 分析の概要を行ったところ、血漿中代謝物は IGT 群が他の３群と比較し全体的に代謝物が異なる結果であった。一方で糞便中代

２．１．２ 腸内細菌叢解析
採取した糞便から DNA 抽出し、16S rRNA 遺伝子の V1-2

謝物については 3 群で全体的な傾向に違いは見られなかった。多群検定を行い 3 群間で有意に異なる代謝物を調べ領域を PCR で増幅した後、Miseq（llumina）によりシーケンスを行った（図 1）。得られた遺伝子配列から 97%以上た結果、血漿中代謝物では 64 化合物に有意差（P 値が 0.05以下）が見られた。血漿中ではアミノ酸や単糖が IGT 群での類似性をもつ配列を Operational taxonomic unit (OTU) と設定した。OTU の系統分類は、理化学研究所内で保有し多く、短鎖脂肪酸が健常者で多いことが分かった。糞便中
代謝物では 34 化合物に有意差が見られた。糞便中代謝物ている腸内細菌のゲノム DNA 情報をリファレンスとして
種レベルまで分類した。
２．１．２

メタボローム解析の結果

では肥満群でアミノ酸や単糖が多い傾向にあり、血漿中と糞便中では異なる傾向にある事が分かった。
性別の違いについても比較を行ったところ、プロピオン
酸やアミノ酸の一部が男女で有意に異なる事が分かった。

メタボローム解析

腸内細菌叢解析に用いた糞便検体から水溶性代謝物と短鎖脂肪酸を抽出し、それぞれの抽出サンプルを

さらに、健常者、肥満者、IGT について性別ごとに違いを調べたところ、多くの代謝物は男女の違いに関係なく、3GCMS-TQ8030（島津製作所）を用いて、測定を行った（図1）。水溶性代謝物の抽出と誘導体化は、糞便に水：MeOH：

群で有意に異なる代謝物が一致していた。しかし、IGT の女性では男性と比較し、糞便中の糖類がより増加している

クロロホルムを 5：5：2 の比率で加え、上層の水溶性画分を凍結乾燥した後に、Methoxyamine を加えオキシム化後ことが分かった。

に N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoroacetamide を加えトリ
メチルシリル化を行った。また、短鎖脂肪酸の抽出と誘導

２．２．３
構築

体は、水：HCl：ジエチルエーテルを 2：1：4 の比率で加え 、 上 層 の 脂 溶 性 画 分 を 採 取 し 、LC-MS を使用したメタボローム解析のこれまでガスクロマトグラフィー質量分析計（GC/MS）を使用したメタボローム解析を行ってきたが、一部の代謝

N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide を 加 え
誘導化を行った。それぞれの誘導体化したサンプルは

物は GC/MS での分析系では測定することが難しい。そこ
で、液体クロマトグラフィー質量分析計（LC-MS）を使用

BPX-5 カラムを用いて、GCMS-TQ8030 の MRM モードで測定を行った。

し計測する代謝物を増やし解析するため、新たな LC-MSの分析系を構築した。
LCMS-8040（島津製作所）を用いて、カラムは Discovery
HS F5（Sigma）を使用し移動相 A 液（0.1%ギ酸）、B 液（0.1%

２．２ 結果２．２．１ 腸内細菌叢解析の結果

ギ酸/アセトニトリル）をグラジエント溶出し代謝物の分離を行い、MRM モードで測定を行う系を構築した。この昨年度報告したように、腸内細菌叢の全体的な変化の指標であるβ多様性とα多様性は健常者、肥満者、IGT で有意差は見られなかった。細菌の系統的な種類ごとに比較を行ったところ、肥満群では Bacteroidetes 門の細菌が有意に減少していた。これは過去の研究の結果とも一致していた。
また、肥満群では Actinobacteria 門の細菌も有意に増加していた。細菌の分類を属レベルで比較を行ったところ、システムを使用し、アミノ酸系代謝物を 14 物質、ビタミ
ン 6 物質、また、腸内細菌由来の代謝物であり動脈硬化を誘 発 す る Trimethylamine oxide と そ の 代 謝 物 で あ る
Trimethylamine を新たに計測することが可能となった。
以上より、現在までに GC/MS のシステムで 310 物質、
LC-MS のシステムで 22 物質を計測することが可能となっCollinsella 属 が 肥 満 群 と IGT 群 で 有 意 に 増 加 し 、

121

KISTEC研究報告2020（2020.8）

【研究開発部】腸内細菌叢（解析ツール開発）

た。

３．

考察及び今後の展望

糞便中の腸内細菌叢と代謝物解析の結果から、性別ごとに肥満や IGT に特有な腸内細菌が存在する一方で、代謝物では量的な違いは見られたものの、多くの代謝物は男女の違いに関係なく、3 群で有意に異なる代謝物が一致していた。すなわち、健常者、肥満者、IGT に着目した場合、男女間で腸内細菌叢は異なるが代謝物は近いプロファイルを示す事から、男女間で異なる細菌種が近い代謝を行っている可能性が考えられた。本研究では、糞便中のメタゲノ
ム解析も行っているため、異なる細菌種でも近い代謝酵素の遺伝子を持つかどうかをメタゲノム解析の結果から調べる事ができる。今後はメタゲノムデータを用いて男女間の比較を行い、代謝物データとの関連性を調べ、健常者、
肥満者、IGT に特有の細菌種とその代謝遺伝子について明らかにする。
メタボローム解析については、今年度は LC-MS を使用
した新たな分析計を構築した。今後も LC-MS を活用して、計測できる代謝物を増やしていく予定である。

【参考文献】
1. R. E. Ley, P. J. Turnbaugh, S. Klein, J. I. Gordon, Human gut
microbes associated with obesity. Nature 444, 1022-1023(2006).
2. P. J. Turnbaugh et al., An obesity-associated gut microbiomewith increased capacity for energy harvest. Nature 444,
1027-1031 (2006).
3. H. Plovier et al., A purified membrane protein from
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improves metabolism in obese and diabetic mice. Nature
medicine 23, 107-113 (2017).
4. C. Fuchsberger et al., The genetic architecture of type 2
diabetes. Nature 536, 41 (2016).
5. J. Qin et al., A metagenome-wide association study of gut
microbiota in type 2 diabetes. Nature 490, 55-60 (2012).
6. H. K. Pedersen et al., Human gut microbes impact hostserum metabolome and insulin sensitivity. Nature 535, 376-381(2016).
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composition between obese and non-obese individuals in a
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fragment length polymorphism and next-generation sequencing.
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8. J. Sato et al., Gut dysbiosis and detection of "live gut
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9. Bolnick, D.I., et al., Individual diet has sex-dependent effects
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Gender-Specific Differences in Immunity. Frontiers in
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KISTEC研究報告2020（2020.8）

122【研究開発部】腸内細菌叢（解析ツール開発）

業績【原著論文】
1.

病

Miyauchi E, Kim S-W, Suda W, Kawasumi M,
Onawa S, Taguchi-Atarashi N, Morita M, Taylor

5.

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6.

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7.

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3.

Nat Commun. 2020;11(1):1922. (IF: 11.878)
Satoh-Takayama N, Kato T, Motomura

Y,

9.

KageyamT,
Taguchi-Atarashi
N,
Kinoshita-Daitoku K, Duroda E, Di Santo JP,

Matsuo Y, Kubota N, Kadowaki T, Iwatsubo T.
Differential
effectsof
dietandgenetically-induced brain insulin resistance on
amyloid pathology in a mouse model of5.

Neurodegener.

Hara S, Sasaki T, Satoh-Takayama N, Kanaya T,
Kato T, Takikawa Y, Takahashi M, Tachibana N,
Kim KS, Surh CD, Ohno H. Dietary Antigens
Induce Germinal Center Responses in Peyer's

6.

Patches and Antigen-Specific IgA Production.
Front Immunol. 2019;10:2432. (IF: 5.511)
Sasaki T, Moro K, Kubota T, Kubota N, Kato T,
Ohno H, Nakae S, Saito H, Koyasu S. Innate
Lymphoid Cells in the Induction of Obesity. Cell
Rep. 2019;28:202-217. (IF: 7.815)

【総説】
1.

2.
3.

4.

Ohno H. The impact of metabolites derived fromthe gut microbiota on immune regulation anddiseases. Int. Immun. in press (IF: 4.168)
對田 尚、大野博司 炎症性腸疾患と抗体医薬 臨床
免疫・アレルギー科 Vol.74 No.1 2020s
宮内栄治、大野博司 多発性硬化症における腸内細菌と免疫系の役割
ジェスト 2020

メディカル・サイエンス・ダイ

竹内直志、中西裕美子

中西裕美子、大野博司
学 Vol.57 No.8 2019

腸内細菌と健康長寿 老年医

窪田哲也、窪田直人、門脇孝：TLR4 は飽和脂肪酸に対する受容体ではないが、マクロファージの代謝

40-44, 2019, 01
窪田哲也、窪田直人、門脇孝：肥満に伴う高インスリン血症によるマクロファージの Irs2 低下は IL-4
誘導性の M2a-subtype マクロファージの活性化を障【招待講演】
1. 大野博司 出生コホートによる小児アトピー性皮膚炎と腸内細菌叢解析 第 119 回日本皮膚科学会総会 2020.6, 京都（Web 講演）
2. Hiroshi Ohno, Chikako Shimokawa, Eiji
Miyauchi, Hajime Hisaeda Gut microbiota andand host diseases, especially autoimmune
diseases. The 8th Global Network Forum on
Infection and Immunity 2020.1, Chiba, Japan
3. Hiroshi Ohno, Chikako Shimokawa, Eiji
Miyauchi, Hajime Hisaeda Gut microbiota andautoimmune diseases. 第 48 回日本免疫学会学術集会 2019.12, 浜松
4. 大野博司 腸内細菌と 2 型糖尿病 第 44 回日本比較内分泌学会及びシンポジウム 2019.11, さいたま市
5. 大野博司、柴田亮平、中西裕美子、加藤完、池田和貴、須田亙、Weng Sheng Kong、山出史也、中野泰至、服部正平、菅野雅元、有田誠、下条直樹 腸内細菌叢と小児アトピー性皮膚炎：出生コホートによ る 解 析 第 56 回 日 本 小 児 ア レ ル ギ ー 学 会2019.11, 千葉
6. Hiroshi Ohno Gut microbiota and autoimmune
diseases.
Block
Symposium:
MucosalImmunology and Microbiota KAI International
Meeting 2019 2019.10, Seoul, 大韓民国
7. 大野博司 腸内細菌叢研究と疾患、特に腸疾患に関し て 第 74 回 日 本 大 腸 肛 門 病 学 会 学 術 集 会
2019.10, 東京
8. 大野博司 知っていますか？腸内環境と免疫系・生体防御や病気との関わり 千葉県獣医師会市民公
開講座 2019.10, 千葉
9. 大野博司 宿主-腸内細菌叢相互作用 第 37 回日本
ヒト細胞学会学術集会 2019.10, 東京

Wakabayashi T, Yamaguchi K, Matsui K, Sano T,
Kubota T, Hashimoto T, Mano A, Yamada K,Mol

中西裕美子、大野博司 腸内細菌叢が宿主の生理機能へ及ぼす影響 感染症 Vol.49 No.4 2019

害する DIABETES UPDATE 8(2) 2-3、2019.4

Provide Immune Protection through Induction of
IgA. Immunity 2020;52(4):635-649. (IF: 21.522)

Alzheimer's
disease.
2019;14:15. (IF: 8.274)

実験医学をリプログラミングすることによって脂質誘導性の炎 症 を 惹 起 さ せ る Cardio-Renal Diabetes Vol.7

Mimuro H, Moro K, Ohno H. Bacteria-InducedGroup 2 Innate Lymphoid Cells in the Stomach

4.

ヒトマイクロバイオーム Vol.2 2020

中西裕美子、大野博司 老化と腸内細菌
増刊 Vol.37 No. 2 2019

腸内細菌叢と肥満・2 型糖尿123

KISTEC研究報告2020（2020.8）

【研究開発部】腸内細菌叢（解析ツール開発）

10. Hiroshi Ohno Gut microbiota and autoimmune
diseases. 17th International Congress of
Immunology 2019.10, 北京、中華人民共和国
11. 大野博司 宿主-腸内細菌叢相互作用：腸内細菌叢の解析手法と医療･産業への応用の可能性 情報機構
セミナー 2019.9, 東京
12. 大野博司 腸内細菌叢と疾患の発症･病態との関わり 第 84 回日本インターフェロン・サイトカイン
学会学術集会 2019.8, 神戸
13. 大野博司 腸内細菌叢と自己免疫疾患：多発性硬化症と 1 型糖尿病 動物共生科学の創生による、ヒト
健康社会の実現に関する国際シンポジウム
2019.7, 相模原
14. Hiroshi Ohno Impact of small intestinal bacteriaon the pathogenesis of experimental autoimmune
encephalomyelitis, an animal model of multiple
sclerosis. Korean Society for Biochemistry andMolecular Biology International Conference,
2019.6、済州、大韓民国
15. Hiroshi Ohno Impact of small intestinal bacteriaon the pathogenesis of experimental autoimmune
encephalomyelitis, an animal model of multiple
sclerosis. 3th International Scientific Conference
on Probiotics, Prebiotics, Gut Microbiota and
Health IPC2019, 2019.6、Prague, Czech Republic
16. 大野博司 宿主-腸内細菌叢相互作用：腸内細菌叢の解析手法と医療･産業への応用の可能性 情報機構
セミナー、2019.9, 東京
17. 窪田哲也 肥満に伴う M2a-subtype マクロファー
ジ活性化障害の分子機構 第 62 回日本糖尿病学会
2019. 5, 仙台
18. 窪田哲也 The novel mechanisms of adiponectin
secretion DESIRE Conference 2019, 2019.2.28,
東京【受賞講演】
1. 窪田哲也 病態発症における臓器内・臓器間のインス
リン作用失調メカニズムの解明-IRS-1/IRS-2 を中心とした解析- 第 22 回日本臨床分子医学会 学会賞 2019, 4,
名古屋【口頭発表】
1. Takashi Taida, Eiji Miyauchi, Yumiko Nakanishi,
Hiroshi Ohno
Cigarette smoking facilitates
intestinal colonization of oral bacteria in patientswith inflammatory bowel disease. 第 48 回日本
免疫学会学術集会 2019.12, 浜松
2. Naoko
Satoh-Takayama,
Hiroshi
Ohno
Identificationofstomach
ILC2-induciblecommensal bacteria belonging to S24-7 family oforder Bacteroidales. 第 48 回日本免疫学会学術集会 2019.12, 浜松
3. 竹内直志、宮内栄治、島本周、松山彰収、大野博司
腸内細菌代謝物酢酸は IgA の反応性を変化させ細菌叢を制御する 第 56 回日本消化器免疫学会総会
2019.8, 京都
4. 窪田哲也、窪田直人、林高則、相原允一、山内敏正、
門脇孝：血管内皮細胞の IRS-2 は動脈硬化抑制に働く、第 62 回日本糖尿病学会年次学術集会、
2019. 5、
仙台

KISTEC研究報告2020（2020.8）

5.

窪田哲也、窪田直人、井上真理子、林高則、相原允
一、山内敏正、門脇 孝：マクロファージ Irs2 を介した慢性炎症とインスリン抵抗性発症メカニズム、
第 92 回日本内分泌学会学術総会、2019. 5 仙台

【ポスター発表】
1. Takashi Ito, Yumiko Nakanishi, Tamotsu Kato,Toshi Jinnohara, Fumiya Yamaide, Naoki
Shimojo, Hiroshi Ohno Exploring asthma onset
factors in the intestinal environment with ahuman children birth cohort. 第 48 回日本免疫学会学術集会 2019.12, 浜松
2. Tadashi Takeuchi, Keishi Kameyama, Eiji
Miyauchi, Yumiko Nakanishi, Takashi Kanaya,
Hiroshi Ohno Lipid-reactive bacteria exacerbates
metabolic disorders via impairment of the gut
integrity.
第 48 回 日 本 免 疫 学 会 学 術 集 会
2019.12, 浜松
3. Eiji Miyauchi, Tomoyo Taniguchi,, Alex Olia , Eiji
Nagayasu, Katuro Osbert, Kazutomo Suzue,
Takashi Imai, Chikako Shimokawa, Risa Onishi,
E.I.
Odongo-Aginya,
Nirianne
Palacpac,
Haruhiko Maruyama, Eisaku Kimura, Toshihiro
Mita, Toshihiro Horii, Hajime Hisaeda, Hiroshi
Ohno. Altered gut microbiota composition inpatients with Plasmodium falciparum malaria.
第 42 回 日本分子生物学会年会 2019.12, 福岡
4. 中西裕美子、竹内直志、水野由子、山道信毅、須田亙、服部正平、窪田直人、窪田哲也、大野博司 2型糖尿病や肥満の発症に関わる腸内細菌と代謝物の探索 第 62 回日本糖尿病学会 2019 5, 仙台【特許】(1) 国内特許出願

0件(2) 国外特許出願

0件

124

【研究開発部】腸内細菌叢（腸内環境制御）「腸内細菌叢」プロジェクト
腸内環境制御グループリーダー

福田 真嗣【基本構想】
本プロジェクトは、様々な疾患との関連が示唆されている腸内細菌叢を含む腸内環境を適切に制御することにより、腸内環境のバランスの悪化が起因となる疾患の予防や治療につながる腸内環境制御システムの基盤構築を目的とする。
ヒトの腸管内にはおよそ 1,000 種類、40 兆個にも及ぶとされる腸内細菌が生息する。正常なバランスを保っている腸内細菌叢は外部から侵入する外来細菌の定着を防ぎ、宿主免疫系を活性化する。一方で、腸内細菌叢のバランスの乱れは大腸炎や大腸がんといった腸管関連疾患のみならず代謝疾患、自己免疫性疾患などの発症にも関連することが報告されている。遺伝子解析技術の進歩により、腸管内に生息する細菌叢の構成、種類に関しては多くの情報が得られているが、生息する個々の腸内細菌が果たす役割もしくはその培養方法に関しては研究途上である。また、腸内細菌叢由来の代謝物質が宿主の健康維持や疾患に深く関与していることが示されてきたが、それらがどのような腸内細菌により産生されているかは不明な点が多い。
腸内細菌叢をはじめとした、腸内環境を適切に制御するためには個々の腸内細菌の特性を理解し、腸内細菌叢由来の代謝物質や菌体自身が宿主へ与える影響を知ることが重要となる。腸内細菌が主に生息する
大腸は嫌気性環境であり、腸内細菌叢を構成する細菌のほとんどは偏性嫌気性細菌に区分されている。簡易的な嫌気環境下やグローブボックスなどの嫌気培養装置を使用した腸内細菌の単離培養法が構築され、腸内細菌の単離培養に使用する培地もいくつか市販されている。しかしながら、現段階の技術では培養できない難培養性腸内細菌も報告されるなど、腸内細菌の培養技術については改善の余地が数多く残されている。本プロジェクトの鍵となる腸内環境制御システムの構築を行うためには難培養性腸内細菌を含む腸内細菌を安定的に単離・培養する方法を構築し、標的とする腸内細菌の特性を理解し、自在に操るためのツールの開発が必要となる。そこで本研究では以下の研究課題に取り組む（１）難培養性腸内細菌の新規培養方法の確立（2）難培養性腸内細菌単独定着マウスを用いた表現型解析（3）標的となる腸内細菌を選択的に取得するためのツールの開発、の 3 つを実施する。これらの研究を遂行することで、腸内環境制御を行うためのツール、有用菌を利用したサプリメント、機能性食品の開発、病原性細菌に対する予防の検討、治療薬の開発など多方面へ応用可能とすることで、健康維持や疾患予防および新規治療方法開発に貢献できると考えている。

１．

平成 31 年/令和元年度の研究目的

け嫌気チャンバー内にて安定的かつ容易に培養する方法

プロジェクト三年目となる平成 31 年/令和元年度は以下の各項目を重点項目として定めた。

を模索した。

(1) 腸内細菌基準株の安定的培養技術の確立(2) ヒト由来腸内細菌の単離、培養技術の確立
ヒトやマウスの腸内細菌叢において主要な割合を占め

腸内細菌叢を構成する個々の腸内細菌を得るには二つの方法がある。一つ目は、腸内細菌叢が含まれているヒト

る菌は基準株として単離されているものが多い。一方で、腸内細菌叢の中における割合が低く、数が少ない菌の単離、やマウスの便試料懸濁液を直接培地プレート上に播種し、コロニーを形成させ、単離する方法である。二つ目は微生培養は困難であり、単離・培養するための培地の工夫や既存の方法とは異なった新たな培養法の開発が必要不可欠物バンクに登録されている腸内細菌基準株を入手し、培養する方法がある。日本国内において腸内細菌を含む微生物である。多くの腸内細菌は偏性嫌気性細菌に分類され、単離、培養中に少量の酸素が混入するだけで死滅することも基準株は理化学研究所バイオリソースセンター（以下理研
BRC とする）内の微生物材料開発室に保管、登録されていある。このような特徴を持つ腸内細菌を失うことなく単離、培養するには、培養環境中の酸素を可能な限り除去するこる(URL: http://jcm.brc.riken.jp/ja/)。
プロジェクト当初より蓄積してきたヒトおよびマウスとが必要となる。
また、我々の体内には食物に由来する多くの栄養素や未の腸内細菌叢の解析データから重要性が高いと考えられる細菌の中から、入手可能な腸内細菌基準株を理研 BRC よ

消化物が存在しており腸内細菌はそれらを栄養源として増殖している。そのため細菌の増殖に必要な栄養等を添加り購入した。入手した腸内細菌基準株は、今後の研究に向した新たな培地を作製することも重要となる。これらのこ

125

KISTEC研究報告2020（2020.8）

【研究開発部】腸内細菌叢（腸内環境制御）とを踏まえ、昨年度に引き続き慶應義塾大学先端生命科学

いて検討した腸内細菌基準株の現段階における培養状況

研究所や森下仁丹株式会社と協力し、新たな培地作製や昨年度構築した新規培養装置を使用した難培養性腸内細菌をまとめたものである。大半の腸内細菌基準株は GAM 培地を用いて安定培養することができた。その一方で、一部のの培養方法の改良を試みた。
また新規培地を用いて、健常人の便試料からの腸内細菌の腸内細菌基準株は GAM 培地のみでは培養できなかったが、GAM 培地に特定の基質を追加することで安定培養すること

単離、培養を試みた。

ができた。
しかしながら、6 種類の腸内細菌基準株に関してはこれ(3) 腸内細菌が生体に及ぼす影響の評価
単離、培養方法が確立した腸内細菌が生体に与える影響まで検討してきた培養方法では培養することができない
ことが明らかとなっており、これらに関しては、引き続きを評価するためには、(1)腸内細菌単独定着マウスを構築し、代謝物の網羅的解析や腸管上皮細胞、免疫細胞の組成

組成の異なる培地を用いて安定的な培養方法の確立を目指していく。

や数を検討する。
（2）安定培養した腸内細菌の投与による免疫系の変化や、薬剤マウス誘導腸炎モデルにおける炎症応答への感受性を評価する。本プロジェクトの拠点である
川崎生命科学・環境センター（LiSE）には実験動物の維持、グラム陽性菌
グラム陰性菌

基準株入手数

培養成功数

培養検討中

47
16

45
12

2
4

繁殖、実験を実施するための研究設備が備わっていない。
そこで隣接する公益財団法人 実験動物中央研究所（以下

表１ 本年度終了時の腸内細菌基準株の培養状況

CIEA とする）と連携し腸内細菌単独定着マウスの解析や腸内細菌投与実験を実施した。これまでに安定培養方法を(2) ヒト由来腸内細菌の単離、培養技術の確立
これまで構築してきた嫌気培養方法を用いて、ヒト便試確立した腸内細菌の数もプロジェクトの進捗とともに増加しており、腸内細菌単独定着マウスを構築するためのス

料からの腸内細菌を単離、培養を試みた。便試料に含まれる食物由来未消化物をフィルターにより除去し、残った腸ペースを確保が課題となっていた。そこで、一つでも多くの腸内細菌の機能を明らかにするため、大型実験動物施設

内細菌叢懸濁液を様々な非選択培地/選択培地に播種、嫌気チャンバー内にてコロニーを形成させた。プレート上にを有する筑波大学との共同研究を締結し、同施設において単独腸内細菌定着マウスに関連する研究を進めた。

形成されたコロニー群から単コロニーを分取し、液体培地
内にて培養を継続した。増幅が確認されたものは DNA を抽（4）標的腸内細菌を単離するためのツールの開発出し、その配列をシークエンス解析することで、菌種の同定を行った。本年度は本手法により 2 種類グラム陰性菌(2腸内細菌叢を構成する腸内細菌に中には、ビフィズス菌
や乳酸菌などを代表とする宿主の健康維持や免疫系の亢

名分、各個人から 1 株ずつ)をヒト便試料より単離した（表2）。

進にはたらく有用菌が存在する一方、病原性大腸菌などの腸管関連疾患や代謝疾患・自己免疫疾患に関与する腸内細グラム陽性菌

グラム陰性菌本年度-

2 種（4 菌株）

累計

2 種 (6 菌株)

4 種 (6 菌株)菌などのいわゆる病原性細菌が存在している。多種多様な腸内細菌により構成される腸内細菌叢から特定の腸内細菌を単離するには先に述べたように便試料懸濁液を直接培地プレート上に播種し、コロニーを形成させ、単離する

表 2 本年度終了時の腸内細菌単離株の状況方法である。選択培地や培地に特定の物質を添加することによりある程度の選択をすることは可能であるものの、標多くの腸内細菌の培養が難しい理由として考えられる
一つの要因は、腸内細菌同士の共生関係がお互いもしくは片方の生存に必須となる場合が想定される。腸内細菌叢を的となる細菌のみを単離する効率は高くない。そこで本年度は標的腸内細菌を効率よく単離するためのツールの開発に着手した。

構成する個々の腸内細菌同士は生存競争を繰り広げる一方で、互いに助け合い共生する細菌も存在していると考え２．

られている。すなわち、ある腸内細菌が産生する代謝産物
が他の腸内細菌の増殖に重要である可能性がある。このよ平成 31 年/令和元年度の研究成果

平成 31 年/令和元年度は以下に挙げる具体的な研究成うな状況を擬似的に再現するために、二槽式透析培養器を用いた腸内細菌の培養を試みた。本培養装置器は細菌を通果を得ることができた。実験方法、結果の詳細は各研究員
報告書に記載しており本項では要点のみを示す。

さずに特定の成分のみを通す特殊な膜を中央部に配置しており、腸内細菌叢を含む培地で産生された代謝産物など(1) 腸内細菌基準株の安定的培養方法の確立
独自に作成した腸内細菌株のリストを元に、本年度は理研 BRC から入手可能な腸内細菌基準株 16 種類を入手した。
はじめに嫌気性菌の一般的な培養に広く用いられている
GAM ブイヨンを用いて寒天培地、液体培地を作成し、腸内に培地と難培養性腸内細菌基準株を添加し、右側に腸内細菌叢を含む培地を加え、嫌気チャンバー内にて培養を試みた。その結果、本透析培養器を用いることで難培養性腸内細菌基準株を培養するができた。本年度はこれまで確立し

細菌基準株の培養を実施した。表１は本プロジェクトにおKISTEC研究報告2020（2020.8）の成分が膜を通して反対側に供給される仕組みとなっている。始めに本培養装置の有用性を検証するために、左側

126

【研究開発部】腸内細菌叢（腸内環境制御）てきた二槽式透析培養器の小型化や使用する腸内細菌叢を含む培地の至適条件の検証を行った。

培地による培養など経る必要がある。そこでより効率よく標的細菌のみを単離・濃縮する方法の検討を行った。そこで抗体に着目した。抗体は免疫細胞が賛成する糖タンパク
分子で特定の分子を認識して結合する働きを担う。実際に生体内に侵入した外来抗原を認識し、排除する機構にも抗体は関与している。一方で、腸内細菌を認識する抗体の作
製は過去にも報告はあるが、近い種族の腸内細菌も認識してしまうという課題がある。そこで本プロジェクトでは標的抗原に対する特異性の高い抗体の作製が可能な手法を用いて、特定の腸内細菌を標的とする抗体の作製を試みた。
グラム陽性腸内細菌の一つを標的とする抗体作製を行い、同種族の腸内細菌に対して様々な反応様式をとる抗体産生細胞が得られた。その中の一つは、標的となるグラム陽性細菌特異的な結合がありながら、同種族の腸内細菌には結合を示さなかった。また、標的細菌を含む複数の腸内細菌基準株を混合した擬似腸内細菌叢から本抗体を用いる
ことで効率よく標的細菌を単離・濃縮する系の構築に成功した。

図 2 二槽式透析培養器を用いた腸内細菌の培養(3) 腸内細菌が生体に及ぼす影響の評価
これまでにグラム陰性常在腸内細菌の一つを投与するとマウ３．

スの生存には影響しないものの、脾臓が肥大し、炎症に関する免疫応答が強く惹起されることを見出している。本年度は炎

本プロジェクトでは研究を円滑に進めていくために様々な研究機関との共同研究を実施している。そのため、症の応答を惹起する成分を特定するために細菌分画を投与した。その結果、グラム陰性常在腸内細菌膜画分を投与する

共同研究先との綿密な連携はプロジェクトを推進していく上で重要な項目となる。CIEA は隣接しているため、研究と投与後 12 時間で脾臓の重量の増加、免疫細胞の増加が認められた。一方で、骨髄の細胞を検討したところ造血幹細胞

ディスカッションも容易に行うことが可能である。一方で、慶應義塾大学の両研究施設、筑波大学は距離も離れており、や骨髄系前駆細胞の減少が見られた。これらの結果から、グ
ラム陰性常在腸内細菌の膜成分が炎症の引き金となり、造血互いの研究施設での打ち合わせをする機会が少なくなっ

研究協力体制に関して

幹細胞および多能性前駆細胞が脾臓に移行し、免疫細胞を増やしていることが示唆された。
さらにグラム陰性常在腸内細菌の定着が粘膜免疫系に及ぼす影響を評価するため無菌マウスおよび単独グラム陰性常在
腸内細菌定着マウスにおける脾臓での免疫細胞の検討を行なった。その結果、脾臓の重量や免疫細胞数に大きな変化は生じておらず、菌の定着のみでは脾臓における炎症を惹起しないことを明らかにした。

てしまう。そのため常時オンラインで互いの研究室を繋ぐことにより円滑にコミュニケーションを取れる環境を整備し活用している。また、森下仁丹株式会社および熊本大学とは定期的に進捗状況を報告する機会を設け、プロジェ
クトの成果や課題の共有を行い、共同研究の進め方を議論している。
図 4 本プロジェクトの研究協力体制
図 3 同週齢の無菌マウスとグラム陰性常在腸内細菌定着マウス

４．

（ノトバイオートマウス）の脾臓重量の検討

総括

プロジェクト 3 年目となる本年度は、研究計画に沿った研究項目に取り掛かり、概ね予定通り研究を進めることがで(4) 標的腸内細菌単離に向けたツールの開発
多種多様の腸内細菌から構成される腸内細菌叢から標きた。来年度以降も引き続き研究目標以上の成果を生み出せるように尽力する。

的となる細菌を単離するには選択培地や特定の基質した

127

KISTEC研究報告2020（2020.8）

【研究開発部】腸内細菌叢（腸内環境制御）

腸内環境制御基盤技術の開発に向けた難培養性腸内細菌の培養法確立および生体に与える影響の評価
中藤 学、大縄 悟志
１．

はじめに

１．２
と課題

ヒトを含む哺乳類は、生後すぐに外部の環境に曝される

個々の腸内細菌を対象とした研究の重要性ことにより微生物との共生関係が始まる。体内にありながら外界とも繋がる消化管内も例外ではない。ヒトの腸管に

これまでの研究から個人個人の腸内細菌叢の構成、種類
および経時的変化は明らかとなってきた。また、項目 1.1

はおよそ 1000 種類、40 兆個もの腸内細菌が生息しており、地球上のあらゆる環境の中で最も生息密度が高い場所ので述べてきたように腸内細菌叢由来の代謝物質は宿主の健康維持に重要な要素となってくるのみならず、疾患とも一つとなっている。腸内細菌同士は互いに生存競争を繰り広げたり、互いに支えあったりしながら一定のバランスを深く関わることが明らかとなってきた。そのため個々の腸内細菌の特性や代謝物質を理解することが重要である。し保つことで腸内細菌叢を形成している。食生活の変化が大
きい乳幼児期では腸内細菌叢の変動も大きくなるが、成人かしながら、それらの代謝物質が腸内細菌叢を構成するどの腸内細菌由来するものであるかについては、不明な点がになると日々の食事や生活様式により多少の変動はある
ものの腸内細菌叢は安定した状態となる（参考文献１）。

多い。また、これらに関する研究報告数が少ない一番の理由は、腸内細菌の培養方法が十分に確立されていないこと

１．１ 腸内細菌叢が宿主に与える影響が挙げられる。腸内細菌はその多くが偏性嫌気性細菌に分類されており、少量の酸素の混入により生育が阻害されて宿主と共存関係を構築している腸内細菌叢は宿主に有益な効果をもたらしている。我々は呼吸や飲食などにより、しまう。脱酸素剤などを利用した簡易的嫌気環境の構築やグローブボックスなどの嫌気培養装置を利用した腸内細常に外来抗原が体内へと侵入するリスクを抱えている。腸内細菌叢は消化管内に侵入してくるこれらの外来性抗原菌の培養も進んでいるものの、依然として単離、培養ができない腸内細菌も数多く残されているのが現状である。

の定着を防ぐ役割を果たしている。また、腸内細菌は食物由来の未消化物を栄養源として発酵分解し、その際に代謝１．３物質として低分子を菌体外に放出する。腸内細菌叢由来代
謝物質は腸管上皮細胞のエネルギー源となるだけではな

腸内細菌叢を含む腸内環境を適切に制御する基盤技術の構築は、我々の健康維持や疾患予防に有効な手段となる。

く物理的バリアの構築に寄与し腸管上皮細胞の恒常性維持にも重要な役割を果たしている（参考文献 2）。更に、

このような基盤技術を構築するためには、以下に示す 3 つの課題に取り組む必要がある。

腸内環境制御基盤技術の構築に向けて

一部の腸内細菌由来代謝物質は宿主の免疫機能を活性化する。例えば、腸内細菌叢を構成する主要な細菌群の一種

1. 腸内細菌の安定的な大量培養方法の確立
2. 難培養性腸内細菌の新規培養技術の開発であるクロストリジウム目細菌群が食物繊維を代謝発酵し産生する酪酸は、炎症やアレルギーの起因となる過剰な3. 腸内細菌単独定着マウスを作製や腸内細菌の投与が生体に与える影響の評価する免疫応答を抑制する T 細胞である制御性 T 細胞の分化誘導を促進するといった重要な役割を果たしている（参考文献

個々の腸内細菌に関する基礎データの蓄積は、腸内環境制御基盤技術に必要となる創薬、栄養補助食品、機能性食

3、4）。
その一方で、ストレスや生活習慣の乱れにより腸内細菌品の開発にも直結することが期待される。

叢のバランスが崩れることが疾患につながることも知られている。実際に腸内細菌叢の乱れが大腸がんや大腸炎な２．

どの腸管関連疾患のみならず、糖尿病、動脈硬化、自閉症、アレルギー疾患など多岐にわたる疾患の発症にも関連す

２．１

ることが報告されている（参考文献 5）。また、バランスの乱れた腸内細菌叢由来の代謝物質も、これらの疾患を引の一つである理化学研究所バイオリソースセンターより
腸内細菌基準株 16 種類を入手した。これらの腸内細菌基き起こす要因となっている（参考文献 6）。ゆえに、腸内細菌叢をはじめとする腸内環境を正常に保つことは健康

準株に加え、これまで安定培養法が確立できていない 6 種
類の腸内細菌基準株を加えた合計 22 種類の基準株の安定維持にとって重要となる。

培養方法の確立を試みた。
はじめに嫌気性菌の培養に一般的に用いられている GAM

KISTEC研究報告2020（2020.8）

実験と結果
腸内細菌基準株の安定的培養方法の確立

個々の腸内細菌の特性を理解するために微生物バンク128

【研究開発部】腸内細菌叢（腸内環境制御）

ブイヨン（日水製薬株式会社）を用いて、寒天培地および液体培地を作製し、嫌気チャンバー内にて腸内細菌基準株に共生関係を持つ腸内細菌も存在している可能性が示唆されている。このような腸内細菌は互いの利益になるようの培養を試みた。本年度入手した腸内細菌基準株のうち12 種類に関しては安定培養方法を確立できた。残りの 4な代謝物質を産生、利用することで増殖していることが推察される。そこで微生物共生系を検討するために、二槽式

種類に関しては GAM 培地単独では培養できなかった。そこで、理化学研究所バイオリソースセンター（BRC）の情報

透析培養器を用いた培養方法を構築した。本年度は装置の小型化および栄養素供給側の使用培地の至適条件の検討をもとに特定の基質を GAM 培地に添加したものを使用して、培養を試みた。その結果、残りの 4 種類に関しても安を実施した。はじめに装置の小型化に関する検討を行なった。現在使用しているガラス製二槽式透析培養器は片側に定培養法を確立することに成功した。安定的な培養方法を確立したすべての腸内細菌基準株は、細菌類を染色する方12-15 ml の培地が必要となる。栄養素供給側の使用培地
する培地の量も多くなってしまう。近年、プラスチック製法の一つであるグラム染色を実施することで単一の細菌であることを確認した。単一菌であることが確認できた腸の類似した構造を有する培養器（Uniwells、図 2）が購入可能となった。本プラスチック製共培養器は最大容量が内細菌基準株については、今後の実験の際に他の菌が混入した際にも対処できるように予備の凍結ストックを作製

1.0-1.5 ml と少なく、使用する培地を減らすことが可能である。そこで Uniwells を用いて難培養性腸内細菌基準した。

株の培養を試みた。培養後 24 時間以降、菌の増殖が開始される様子が確認された。しかしながら 96 時間培養後に検討数

グラム陽性菌16 種

グラム染色により便懸濁溶液を用いて増幅された菌を確認したところ標的細菌以外にも複数の菌が増殖している

培養成功数

16 種

ことが確認された（図 2）。複数回実験を繰り返し実施したが目的の菌のみの培養することは出来なかった。これら(GAM12 種,改良型 GAM4 種)
表１２．２

本年度に実施した腸内細菌基準株の培養状況の結果から、装置を小型化するには現状使用しているガラス製培養機器自体を小型化する必要であると考えられる。

ヒト由来腸内細菌の単離、培養

これまでに確立してきた嫌気培養方法を用いて、ヒト便試料からの腸内細菌の単離、培養を試みた。本年度はビタ
ミンやミネラル成分が多く含まれる YCFA 培地に更に数種
類の栄養素添加した改良型 YCFA 培地(mYCFA)を用いてヒト便試料より腸内細菌の単離、培養を試みた。はじめに便試料から未消化物などを含む夾雑物をフィルターにて除去したのちに、mYCFA 液体培地で一晩培養した。次に培養液を mYCFA 寒天培地に播種し、培養プレート上から単コロ
ニーを分取、培養した後にコロニーPCR により目的となる

図 2 小型透析培養器の検証、左図はガラス器具との大きさの違い、コロニーを選択した。その後、シークエンス解析により菌株の同定を実施し、今後の研究のためグリセロールストッ

右図は小型装置で培養した後のグラム染色画像

クの作成を行った。本年度は、2 種類のグラム陰性菌を合計 4 株単離、培養することに成功した(図 1)。

次に、栄養供給側に使用する培地の検証を行なった、様々な物質を含む培地を用意し、難培養性腸内細菌基準株の培養を行なった。その結果、いくつかの培地で難培養性腸内細菌基準株を培養することが出来た。興味深いことに、培養した同じ腸内細菌基準株の形態が使用した培地により異なることを見出した(図 3)。これは供給培地側から入り込む栄養素が異なり、腸内細菌自体の増殖効率や環境スト
レスが変化することにより生じていることが示唆される。

図 1 健常人便試料より単離した腸内細菌のグラム染色

２．３ ヒト由来腸内細菌単離に向けた新規培養技術の確立

図 3 二槽式透析培養器を用いた難培養性腸内細菌基準株の培養検

腸内細菌同士は生存競争をすることにより宿主の消化討、培地 A の形態が BRC に掲載されているグラム染色像に近い。

管内の限られた生存領域を確保しているが、一方で、互い

129

KISTEC研究報告2020（2020.8）

【研究開発部】腸内細菌叢（腸内環境制御）

２．４

腸内細菌が生体に与える影響の評価

本プロジェクトはこれまでに 40 種類を超える腸内細菌

花望博士、森下仁丹株式会社の河野麻美子博士を始め多くの方々のご協力を賜りました。腸内細菌が生体に与える影基準株の安定培養方法を確立してきた。それらを用いることにより、昨年度にグラム陰性常在腸内細菌の一つが脾臓におい響の評価では熊本大学 滝澤仁教授、林慶和博士のご協力を賜りました。また動物実験に関しては公益財団法人 実て強い炎症応答を引き起こし、各種免疫細胞の増加を引き起こすことを明らかにしてきた。本年度はさらに詳細な機構を解験動物中央研究所の高橋利一氏、小倉智幸氏、何裕遥氏、
野津量子氏から腸内細菌単独定着マウス構築のためのご明するために炎症を引き起こすグラム陰性常在細菌側の因子および様々な組織に対する影響を検証した。その結果、細菌指導、ご協力を賜りました。厚く御礼申し上げます。

の膜画分を投与すると、細菌を投与した際と同様の炎症が引き起こされることを新たに見出した。また新たに、骨髄において【参考文献】
1 Odamaki, T., Kato, K., Sugahara, H., Hashikura, N.,

造血幹細胞や骨髄系前駆細胞の減少が見られた。これらの細胞サブセットの減少は脾臓やリンパ節などの全身に細胞がTakahashi, S., Xiao, J.Z., Abe, F., Osawa, R., Age-relatedchanges in gut microbiota composition from newborn to

移行したことによるものである推測される。これらの結果からグ
ラム陰性常在腸内細菌の膜成分が炎症の引き金となり、造centenarian: a cross-sectional study. BMC Microbiol. 25:16:90,
2016.

血幹細胞および多能性前駆細胞が脾臓に移行し、免疫細胞を増やしていることが示唆された。

2 Okada, T., Fukuda, S., Hase, K., Nishiumi, S., Izumi, Y.,
Yoshida, M., Hagiwara, T., Kawashima, R., Yamazaki, M.,
Oshio, T., Otsubo, T., Inagaki, O. K., Kakimoto, K., Higuchi,
K., Kawamura, Y. I., Ohno, H., Dohi, T. Microbiota-derived
lactate accelerates colon epithelial cell turnover instarvation-refed mice. Nat. Commun. 4: 1654, 2013.
††††
3 Furusawa, Y., Obata, Y., *Fukuda, S. ( co-first and*corresponding author), Endo, T. A., Nakato, G., Takahashi, D.,

図 4 細菌膜画分投与後 12 時間における脾臓の重さ（左図）およNakanishi, Y., Uetake, C., Kato, K., Kato, T., Takahashi, M.,
Fukuda, N.N., Murakami, S., Miyauchi, E., Hino, S., Atarashi,

び骨髄における各細胞数（右図）

K., Onawa, S., Fujimura, Y., Lockett, T., Clarke, J.M., Topping,
D.L., Tomita, M., Hori, S., Ohara, O., Morita, T., Koseki, H.,†
Kikuchi, J., Honda, K., * Hase, K., * Ohno, H. Commensal
microbe-derived butyrate induces the differentiation of colonic

グラム陰性常在腸内細菌の定着が生体に与える影響を評価するため無菌マウスおよび単独グラム陰性常在腸内細菌定着
マウスにおける脾臓での免疫細胞の検討を行なった。その結果、脾臓の重量や免疫細胞数に大きな変化は生じておらず、菌の定着のみでは脾臓における炎症を惹起しないことが明ら

regulatory T cells. Nature 504: 446-450, 2013.

かとなった。以上のことから、グラム陰性常在腸内細菌は恒常性が保たれた状態では生体内に侵入できないため炎症を惹

4 Atarashi, K., Tanoue, T., Suda, W., Oshima, K., Nagano, Y.,
Nishikawa, H., Fukuda, S., Saito, T., Narushima, S., Hase, K.,

起できないことを示唆するものであった。今後炎症時における本グラム常在腸内細菌が及ぼす影響を明らかにするには実験腸炎モデルによる検証が必要である。

Kim, S.W., Fritz, J.V., Wilmes, P., Ueha, S., Matsushima, K.,
Ohno, H., Olle, B., Sakaguchi, S., Taniguchi, T., Morita, H.,

３．

Hattori, M., Honda, K. Treg induction by a rationally selected
mixture of Clostridia strains from the human microbiota.

考察及び今後の展望

Nature 500: 232-236, 2013.
5 Sekirov, I., Russell, S.L., Antunes, L.C., Finlay, B.B. Gut

本年度は 16 種類の腸内細菌基準株の安定的培養法の確立に成功した。一方で、安定培養法の確立出来ていない腸内細菌基準株に関しては引き続き二槽式透析培養器を用

microbiota in health and disease. Physiol Rev. 2010
Jul;90(3):859-904.

いた培養による培養を検討していく。常在グラム陰性腸内細菌の免疫感作により引き起こされる強い炎症応答に関して

6 Schulz, M.D., Atay, C., Heringer, J., Romrig, F.K.,

も引き続き詳細なメカニズムの解明を進めていく。共同研究先とも連携しつつ、一つでも多くの腸内細菌単独定着マウスを構

Schwitalla, S., Aydin, B., Ziegler, P.K., Varga, J., Reindl, W.,
Pommerenke, C., Salinas-Riester, G., Böck, A., Alpert, C.,

築し、代謝物の網羅的解析、腸管上皮細胞や免疫細胞の変化を検討する。

4．

Blaut, M., Polson, S.C., Brandl, L., Kirchner, T., Greten, F.R.,
Polson, S.W., Arkan, M.C. High-fat-diet-mediated dysbiosis

謝辞

本実験の遂行にあたり、腸内細菌の分離、新規培養技術の構築では慶應義塾先端生命科学研究所の谷川直紀博士、楊佳約博士、筑波大学トランスボーダー医学センターの尾KISTEC研究報告2020（2020.8）

130promotes intestinal carcinogenesis independently of obesity.
Nature. 514(7523):508-12,2014

【研究開発部】腸内細菌叢（腸内環境制御）

腸内環境制御基盤技術の開発に向けた研究ツールの作成
大縄 悟志、中藤 学、井上 浄
１．

はじめに

ヒトの腸管内に共生する腸内細菌は食物由来の未消化物を発酵分解することで代謝物質を産生し、腸管上皮細胞の恒常性維持や粘膜免疫系の構築に寄与している。中には腸内環境改善効果を有する菌も存在しており、それらを含む製品や食品はプロバイオティクスと呼ばれ、腸内環境を整え、宿主に良い影響をもたらす。その一方で、生活習慣の乱れなどのストレスにより腸内細菌叢が撹乱されると、腸内細菌叢より産生される代謝物質が疾患の発症に関与することも知られている。機能性食品やプロバイオティクスの開発や、疾患に関連する腸内細菌を標的とした創薬を効率よく進めるには、標的となる腸内細菌を宿主の腸内細菌叢から効率よく分離するツールの開発が必要不可欠である。

１．１ 腸内環境を整える方法と課題も報告されている。例えば、有用菌の一つである
Bifidobacterium longum (B. longum)に対する抗体作製の報告がある。本抗体は B. longum を認識するものの、他のBifidobacterium 属細菌にも広く交差性を示すため腸内細菌叢などの集団から標的となる B. longum を特異的に単離・濃縮するために利用することは困難であることが示唆される（参考文献 5）。B. longum に対する抗体以外にも市販の細菌に対する抗体も多くのものが標的細菌以外の細菌に反応するという問題がある。そのため、腸内細菌叢を構成する多種多様な腸内細菌の中から標的となる細菌のみを単離するにはより特異性の高い抗体の使用が求められる。

１．３ 腸内環境制御基盤技術の構築のための研究
ツール作成
腸内細菌叢を含む腸内環境を適切に制御する基盤技術

腸内細菌叢を含む腸内環境を整える方法として、ヨーグの構築は、我々の健康維持や疾患予防に有効な手段となる。
プロバイオティクスのような基盤技術を構築するため以

ルトや発酵食品等の機能性食品の摂取が一般に浸透しており、これは日常的に実施可能という観点から予防的アプ下に示す 2 つの課題に取り組んだ
1. 特異性の高い腸内細菌特異的抗体の取得

ローチとして広く利用されている。しかしながら、機能性食品を摂取している間は便中から機能性食品に含まれる

2. 作製した腸内細菌特異的抗体を用いた標的細菌の分離・濃縮法の検討

有用菌が検出されるものの、摂取していない期間は体内か
ら有用菌は検出されなくなるため（参考文献 1）、機能性
食品の効果は一時的であることが示唆されている。一方で、人から分離した有用菌を人に摂取することで 200 日間経

２．

過しても摂取した有用菌が検出されるという報告もある（参考文献 2）。また、臨床的見知からは、潰瘍性大腸炎

２．１などの特定疾患に指定されている炎症性腸疾患治療において「便細菌叢移植療法」が一定の効果を示すことが報告されている（参考文献 3、4）
。しかしながら、これらの方法は同一個人由来の細菌叢ではなく他人の細菌叢のため、投与した腸内細菌群が患者の腸内に定着できないなどの問題も残る。そこで我々は腸内環境を調整する一つの手法
として、外来性細菌ではなく宿主由来の腸内細菌を利用し、再度体内に戻すことにより、持続的な腸内環境改善が期待

実験と結果
標的腸内細菌特異的抗体の作製

本研究室で安定培養方法を確立した菌の中から、腸内細菌 A（以後、菌 A）を選択し、菌 A に対する抗体の作製を試みた。はじめに従来の抗体の作製方法と本研究室で確立した免疫不全マウスを使用した新規抗体作製方法（以降、新規法と記載する）を比較し、抗原感作後における血清中の抗体価の確認を ELISA 法により検討した。最終抗原感作が終了した時点で、血清を採取し、抗体価を検討したところ従来法に比べ、新規法では有意な抗体価の上昇が確認された（図 1）。

できると考えた。このような腸内環境制御基盤技術の開発を行うには宿主由来の特定の腸内細菌を多種多様な腸内細菌が存在する腸内細菌叢の中から効率よく標的細菌のみを単離するツールの開発が重要となってくる。

１．２

標的細菌特異的抗体の作製意義

抗体は免疫細胞の一つである B 細胞から産生される糖タンパク質で、抗原と呼ばれる免疫応答を引き起こす物質に特異的に結合する能力を持っている。抗原の中には細菌も含まれており、特定の細菌を認識することのできる抗体

図 1 最終抗原感作後の血清中の菌 A に対する抗体価の比

131

KISTEC研究報告2020（2020.8）

【研究開発部】腸内細菌叢（腸内環境制御）

較、青は従来法、赤は新規法、グレーは未感作をそれぞれ示す。
* p<0.05

２．２

菌 A に対する特異的な抗体の選抜

抗体価の上昇が確認されたマウスの脾臓を用いて、抗体産生細胞（ハイブリドーマ）の構築を行なった。得られた 48 クローンのハイブリドーマの中から菌 A に対する反応性が高いものを選択し、以後の解析に用いた。はじめに、
菌 A に対する特異性を検証するために、菌 A および菌 Aと同属の腸内細菌に対する抗体の反応性の検証を行なった。フローサイトメータを用いて、各菌と抗体との反応を検討したところ菌 A 以外の同属の菌に対して反応性を示さなかった（図 2）。次に作製した抗体と腸内細菌叢を構成する代表的なグラム陰性菌、グラム陽性菌との反応性の検証を行なった。2 種類のグラム陰性菌、3 種類のグラム

図 3 フローサイトメータによる抗体と代表的な腸内細菌への結陽性菌に対する抗体の反応性を検証したところ全ての菌に対して結合は見られなかった(図 3)。
これらの結果から、ール抗体をそれぞれ示している。

新規法を用いた抗体作製方法は標的細菌に対して高い特異性を有する抗体を作製するための有効な手法であるこ

２．３とが明らかとなった。

合の検証。赤色は菌 A に対する抗体、青はアイソタイプコントロ

抗体を使用したアプリケーションの検討標的となる腸内細菌を特異的に認識する抗体が得られたため、次に腸内環境制御基盤技術へと応用するためのツールとしての有用性を検証した。まず、作製した抗体を用いて以下の点についての評価を行った。
1. 抗体が結合した標的細菌が再培養できるか
2. 複数の腸内細菌が存在する中から標的細菌のみを単離・濃縮することが可能か
一般的に抗体を用いた標的の分取方法としてはフロー
サイトメトリーを使用した分離方法が使用されている。しかしながら、酸素濃度に過敏な腸内細菌を扱うためには可能な限り嫌気環境下において作業をする必要が生じる。そこで、本プロジェクトでは抗体、磁気ナノ粒子、カラムを使用して標的を分離することが可能な、Magnetic-activatedcell sorting (MACS)を使用することとした。MACS 機材は嫌気チャンバーに入れ込むことが可能であり、嫌気環境下で作業をすることが可能である。
項目 1 の 検討 のため 標的 細菌 に特異 的抗 体およびMACS に必要な各種試薬を反応させたサンプルをカラムに通したのちに、標的分画を寒天培地上に撒種し、コロニーが形成されるかどうかの検討を行なった。未処理の状態と MACS 工程を経たサンプルの双方においてコロニー形
成が確認された。このことから MACS 試薬は標的細菌の生育を阻害しないことが明らかとなった(図 4)。

図 2 フローサイトメータによる抗体と菌 A および同属菌への結合の検証。赤色は菌 A に対する抗体、青はアイソタイプコントロー
ル抗体をそれぞれ示している。

図 4 未処理と MACS 処理した後の菌 A を寒天培地に播種したのち
24 時間後のコロニー形成の様子

KISTEC研究報告2020（2020.8）

132

【研究開発部】腸内細菌叢（腸内環境制御）

最後に菌 A および 5 種類の腸内細菌 B から F までを混る。また、これまでに蓄積した腸内細菌の基礎データの中合した、擬似腸内細菌叢から作製した抗体を用いた MACS
により菌 A の単離・濃縮を検討した。作製した抗体を擬から機能性食品への応用や創薬の標的になりうる腸内細菌に対する抗体の作製を進めていく予定である。

似腸内細菌叢に反応させたのち、MACS による分離・濃縮を検証した。MACS 前後の試料をそれぞれフローサイトメ

４．

ータにて解析したところ、標的細菌を含まない分画である
フロースルー分画では菌 A が含まれず、標的分画の方に

本実験の遂行にあたり、慶應義塾大学の井上ひかる氏、公益財団法人 実験動物中央研究所の高橋利一氏、小倉智幸

のみ菌 A のシグナルが観察された。より詳細な解析を実施するため MACS 後のフロースルー画分と標的画分から氏、何裕遥氏、野津量子氏にご協力を賜りました。厚く御礼申し上げます。

それぞれ DNA を抽出し、菌 A を検出するプライマーおよび腸内細菌 B を検出するプライマーを利用した定量 PCR【参考文献】を実施した。その結果、フローサイトメータの結果と同様の結果を得ることができた。これらの結果から本プロジェ

1 Kim, S., Suda, W., Kim, S., Oshima, K., Fukuda, S., Ohno, H.,
Morita, H., Hattori, M., Robustness of Gut Microbiota of

クトで作製した抗体を用いることで効率よく標的細菌を分離・濃縮するツールとして利用できる可能性を示せた

Healthy Adults in Response to Probiotic Intervention Revealedby High-Throughput Pyrosequencing. DNA Res.

（図 5）
。

Jun;20(3):241-53, 2013

謝辞

2 Maldonado-Gomez, M.X., Martinez, S., Bottacini, F.,
O’Callaghan, A., Ventura, M., van Sinderen, D., Hillmann, B.,
Vangay, P., Knights, D., Hutkins , R.W., Walter, J. Stable
Engraftment of Bifidobacterium Longum AH1206 in the
Human gut depends on individualized features of resident
microbiome. Cell Host Microbe. Oct 12; 20(4):515-526, 2016.
3 Ishikawa, D., Sasaki, T., Osada, T., Kuwahara-Arai, K., Haga,
K., Shibuya, T., Hiramatsu, K., Watanabe, S. Changes inintestinal microbiota following combination therapy with fecal
microbial transplantation and antibiotics for Ulcerative Colitis.
Inflamm Bowel Dis. Jan;23(1):116-125, 2017.
4 Paramsothy, S., Kamm, M.A., Kaakoush, N.O., Walsh, A.J.,
van den Bogaerde, J., Samuel, D., Leong, R.W.L., Connor, S.,
Ng, W., Paramsothy, R., Xuan, W., Lin, E., Mitchell, H.M.,
Borody, T.J. Multidonor intensive feacal microbiotatransplantation for active ulcerative colitis: a randomized
placebo-controlled trial. Lancet. Mar 25;389(10075):1218-1228
5 Amrouche, T., Boutin, Y., Moroni, O, Kheadr, E., Fliss, I.
Production and characterization of anti-bifidobacteria
monoclonal antibodies and their application in the developmentof an immune-culture detection method. J Microbiol Methods

図 5 MACS 前後におけるそれぞれの試料の FACS の結果（上段）、

Apr;65(1):159-70, 2006

菌 A 検出用プライマーおよび菌 B 検出用プライマーを用いた
q-PCR（下段）

３．

考察及び今後の展望

本年度は腸内環境制御基盤技術の構築に向けたツールの作成として腸内細菌特異的抗体の作製に着手し、新規法を利用することで標的細菌のみを認識する抗体の作製に成功した。それらの抗体を利用して、擬似腸内細菌叢からの標的細菌の分離・濃縮法を構築することができた。来年度以降の課題としては、多種多様な腸内細菌で構成される腸内細菌叢からの標的細菌の単離・濃縮法の検証が必要とな

133

KISTEC研究報告2020（2020.8）

【研究開発部】腸内細菌叢（腸内環境制御）業績Protective【原著論文】
1.

Nanto-Hara F, Kanemitsu Y, *Fukuda S, Kikuchi K,
Asaji K, Saigusa D, Iwasaki T, Ho HJ, Mishima E,
Suzuki T, Suzuki C, Tsukimi T, Matsuhashi T,
Oikawa Y, Akiyama Y, Kure S, Owada Y, Tomioka Y,

2.

8.

4.

Yachida S, Mizutani S, Shiroma H, Shiba S,
Nakajima T, Sakamoto T, Watanabe H, Masuda K,

Iwasaki M, Yamaji T, Yachida T, Soga T, Kurokawa
K, Toyoda A, Ogura Y, Hayashi T, Hatakeyama M,

disease.
Nephrol. Dial. Transplant. 2020 Feb 1;35(2):250-264.

Nakagama H, Saito Y, Fukuda S, Shibata T, Yamada T.
Metagenomic and metabolomic analyses reveal

doi: 10.1093/ndt/gfz126.
Erawijantari PP, Mizutani S, Shiroma H, Shiba S,

distinct stage-specific phenotypes of the gut
microbiota in colorectal cancer.
9.

Nat Med. 2019Jun;25(6):968-976.
Kikuchi K, Saigusa D, Kanemitsu Y, Matsumoto Y,

Influence of gastrectomy for gastric cancer treatment
on faecal microbiome and metabolome profiles.

Thanai P, Suzuki N, Mise K, Yamaguchi H,
Nakamura T, Asaji K, Mukawa C, Tsukamoto H, SatoGut 2020 Jan 16. pii: gutjnl-2019-319188.doi:
10.1136/gutjnl-2019-319188. [Epub ahead of print]

T, Oikawa Y, Iwasaki T, Oe Y, Tsukimi T, Fukuda NN,
Ho HJ, Nanto-Hara F, Ogura J, Saito R,Nagao S,

Kitamoto S, Alteri CJ, Rodrigues M, Nagao-Kitamoto
H, Sugihara K, Himpsl SD, Bazzi M, Miyoshi M,

Ohsaki Y, Shimada S, Suzuki T, Toyohara T, Mishima
E, Shima H, AkiyamaY, Akiyama Y, Ichijo M,

Nishioka T, Hayashi A, Morhardt TL, Kuffa P,
Grasberger H, El-Zaatari M, Bishu S, Ishii C,

Matsuhashi T, Matsuo A, Ogata Y, Yang CC, Suzuki
C,Breeggemann MC, Heymann J, Shimizu M, Ogawa

Hirayama A, Eaton KA, Dogan B, Simpson KW,
Inohara N, Mobley HLT, Kao JY, Fukuda S, Barnich

S, Takahashi N, Suzuki T, Owada Y,Kure S, Mano N,
Soga T, Wada T, Kopp JB, Fukuda S, Hozawa A,

N, Kamada N.
Dietary L-serine confers a competitive fitness

Yamamoto M, Ito S,Wada J, Tomioka Y, Abe T.
Gut microbiome-derived phenyl sulfate contributes toadvantage to Enterobacteriaceae in the inflamed gut.
Nat. Microbiol. 5: 116-125, 2020.

albuminuria in diabetic kidney disease.
Nat Commun. 2019 Apr 23;10(1):1835.

Yang J, Tsukimi T, Yoshikawa M, Suzuki K, Takeda T,
Tomita M, *Fukuda S.

【口頭発表】（招待講演）
1.

Jo R, Nishimoto Y, Umezawa K, Yama K, Aita Y,
Ichiba Y, Murakami S, Kakizawa Y, Kumagai T,

福田真嗣
腸内環境に基づく層別化医療・ヘルスケアがもたらす未来
第 35 回日本臨床栄養代謝学会学術集会，京都府，

Yamada T, *Fukuda S.
Comparison of oral microbiome profiles in stimulated

7.

againstameliorates the gut-cardio-renal axis in an
adenine-induced mouse model of chronic kidney

possessions contributes to owner identification.
mSystems 4: e00594-19, 2019.

6.

bifidobacteria

Nishimoto Y, Kubo M, Hosoda F, Rokutan H,
Matsumoto M, Takamaru H, Yamada M, Matsuda T,

Cutibacterium acnes (Propionibacterium acnes) 16S
rRNA genotyping of microbial samples from

5.

ofSoga T, Ito S, *Abe T.
The guanylate cyclase C agonist linaclotide

Nakajima T, Sakamoto T, Saito Y, Fukuda S, Yachida
S, Yamada T.

3.

effects

enteropathogens.
Microb Biotechnol. 2019 Jul 8.

2.

2020 年 2 月 27 日
福田真嗣

and unstimulated saliva, tongue, and mouth-rinsed
water.

もう一つの臓器腸内細菌叢の機能に迫る 微生物の個・集団・共生が支える持続可能な社会

Sci. Rep. 9: 16124, 2019. (IF=4.122)
Tanaka K, Watabe T, Kato K, Tsukimi T, Sato MP,

茨城県つくば市，2020 年 2 月 10 日
田中一己，Aw Wanping，鈴木健大，尾花望，楊佳

3.

Odamaki T, Tomita M, *Fukuda S.
Draft genome sequences of Enterococcus faecalis

約，木村彰宏，冨田勝，福田真嗣．
米ぬか摂取による大腸炎抑制効果は腸内細菌叢由strains isolated from healthy Japanese individuals.
Microbiol.

来トリプトファン代謝物質がもたらす
第 42 回日本分子生物学会年会，福岡県博多市，

Resour. Announc. 8: e00832-19, 2019.
Aw W, *Fukuda S.

2019 年 12 月 6 日
福田真嗣

KISTEC研究報告2020（2020.8）

4.

134

【研究開発部】腸内細菌叢（腸内環境制御）

Mechanisms Linking the Microbiome and Human
Health, Miami, Florida, 2020 年 1 月 27 日

腸内環境を標的とした新たな疾患予防・治療基盤技術の創出
5.

第 23 回腸管出血性大腸菌感染症研究会，愛媛県
松山市，2019 年 12 月 6 日
5.

6.

7.

中藤学
私たちと腸内細菌:腸内環境を整えて、健康寿命を

米ぬか摂取による大腸炎抑制効果は腸内細菌叢
由来トリプトファン代謝物質がもたらす

延ばそう
健康に働くための腸内細菌セミナー 神奈川県川崎

日本農芸化学会 2019 年度関東支部例会，東京都世田谷区，2019 年 12 月 7 日

市, 2019 年 10 月 28 日
福田真嗣

6.

希少糖摂取がもたらす腸内細菌叢を介した抗肥満効果の分子機構の解明

第 3 回大型医療研究推進フォーラム 歯科医師会館（東京）、2019 年 5 月 25 日

第 42 回日本分子生物学会年会，福岡県博多市，
2019 年 12 月 6 日
7.

福田真嗣
第 3 の液性因子：腸内細菌叢由来代謝物質がもたら

アンドロゲン受容体欠損マウスにおける腸内細菌叢を介した肥満発症機構の解明

ー（宮城）、2019 年 5 月 10 日

第 42 回日本分子生物学会年会，福岡県博多市，
2019 年 12 月 6 日
8.

井上ひかる，中藤学，冨田勝，井上浄，福田真嗣．
腸内細菌標的抗体を用いた標的腸内細菌分離技術の開発
第 42 回日本子生物学会，2019 年 12 月 4 日

microbiota and obesity onset in androgen receptor
knockout mice9.

田中一己，Aw Wanping，鈴木健大，尾花望，楊佳
約，冨田勝，福田真嗣

Miami Winter Symposium 2020 Molecular
Mechanisms Linking the Microbiome and Human

米ぬか摂取による大腸炎抑制効果は腸内細菌由来トリプトファン代謝物質がもたらす

Health, Miami, Florida, 2020 年 1 月 27 日
Hikaru Inoue, Gaku Nakato, Masaru Tomita, Joe

第 23 回腸内細菌学会，東京都江戸川区, 2019 年
6 月 18 日 最優秀発表賞 受賞

Inoue, Shinji Fukuda
Development of target bacterial isolation method【共同研究成果】

using anti-bacterial species specific monoclonal
antibody（口頭発表）
1. Hayashi Y,Sezaki M, Sheoran S, Morishima T,

Miami Winter Symposium 2020 Molecular
Mechanisms Linking the Microbiome and Human

Nakato G, Fukuda S, Takizawa H.
Microbial signal instructs early hematopoiesis upon

Health, Miami, Florida, 2020 年 1 月 27 日
Kazuki Tanaka, Wanping Aw, Kenta Suzuki,

intestinal tissue damage
48th Annual Scientific Meeting of International

Nozomu Obana, Jiayue Yang, Akihiro Kimura,
Masaru Tomita, Shinji Fukuda

Society of Experimental Hematology ， Brisbane,
Australia, 2019 年 8 月 24 日

Gut microbiota-derived tryptophan metabolites fromrice bran dietary intervention ameliorate colonicinflammation
Miami Winter4.

髙橋春乃，田中一己，竹内奈穂，尾花望，冨田勝,
福田真嗣

す機能
第 92 回日本内分泌学会学術集会 仙台国際センタ

Nozomu Obana, Masaru Tomita, Shinji Fukuda
Investigating the relationships between gut

3.

竹内奈穂，田中一己，Aw Wanping，尾花望，冨田勝, 福田真嗣

微生物叢に基づく層別化医療・ヘルスケアがもたらす未来（口頭発表）
1. Haruno Takahashi, Kazuki Tanaka, Nao Takeuchi,

2.

田中一己，Aw Wanping，鈴木健大，尾花望，楊佳約，木村彰宏，冨田勝，福田真嗣

2.

Takizawa H, Hayashi Y, Sezaki M, Sheoran S,
Morishima T, Nakato G, Biswas S, Fukuda S.

Molecular

Early hematopoiesis translates microbial signals to
intestinal tissue repair

Mechanisms Linking the Microbiome and Human
Health, Miami, Florida, 2020 年 1 月 27 日

24th Congress of the European Hematology
Association，Amsterdam, Netherlands, 2019 年 6 月

Nao Takeuchi, Kazuki Tanaka, Wanping Aw,
Nozomu Obana, Masaru Tomita, Shinji Fukuda,

16 日

Symposium

2020

Understandingtheanti-obesity
molecular
mechanisms of rare sugar, D-psicose, intake via gut
microbiota modulation
Miami Winter Symposium

2020

【特許】
(1) 国内特許出願

1件(2) 国外特許出願

0件

Molecular

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KISTEC研究報告2020（2020.8）