jPOST：再解析考え中です○吉沢明康1)，田畑剛2)，守屋勇樹3)，河野信3)，奥田修二郎4)，渡辺由4)，山本格5)，松本雅記6)，高見知代6)，
小林大樹7)，荒木令江7)，杉山直幸2)，五斗進1)，石濱泰2)
1) 京都大学化学研究所，2) 京都大学大学院薬学研究科，3) 情報・システム研究機構 ライフサイエンス統合データベースセンター (DBCLS)，4) 新潟大学大学院医歯学総合研究科，
5) 新潟大学産学地域連携推進機構，6) 九州大学生体防御医学研究所，7) 熊本大学大学院生命科学研究部

jPOSTと再解析プロトコル

43 jPOST: 今こんな感じです

46 プロテオーム
メタデータの RDF 化

関連ポスター
再解析プロトコル（開発中）

44 jPOST: リポ
ジトリ始めました[1] J.A.Vizcaino et al., Nat. Biotech., 32, 223-226 (2014).
[2] M-S.Kim et al., Nature, 509, 575-581 (2014).

再解析プロトコルの開発戦略
戦略 1Whole
検索エンジンの差
assignments:
ピーク検出ソフトは複数個
13,219MascotX!Tandem
7,896
10,008（データベース検索で）探知可能な配列数を増加させる

Peak picker

Search engine （結果数の増加、取りこぼし（第2種エラー）の減少）

Discoverer

Mascot6,623

Discoverer
MaxQuant (“midstream”)
ProteoWizard (customized)

Mascot7,896

Discoverer

MascotX!Tandem
Comet

10,631

Discoverer
MaxQuant (“midstream”)
ProteoWizard (customized)

MascotX!TandemComet

13,219MaxQuant

MaxQuant （結果品質の向上、誤った同定（第1種エラー）の減少）



戦略 2

一般的には…

複数の検索エンジンを用いるテクニック） Target-Decoy searchを行い、偽

陽性ヒットの個数を推定する（FDRの算出）

Assigned
peptides

Comet
8,715

445
178
364

106
797495ンのピークとアミノ酸の対応を精査する

296843319

584283ピーク検出ソフトの差
検索エンジンは複数個された(右下パネル参照)。

ピーク検出アルゴリズムも複数用いる

1,049 6,598
865

2775927

MS2 target monoisotopic peak

今回利用したテストデータセット （ピークリスト情報に戻り）イオ

MaxQuant
9,043
1,038

509

5,171

例：複数ソフトウェアの効果

これらに加えて、

1,791

MaxQuant
ProteoWizard(“midstream”)(customized)
9,774
11,010
今回のテストセットでは、上記のような結果が634309得られた。複数ソフトウェアの効果が得られている。 Discoverer
MaxQuant
67151
50
結果の内訳を右のVenn図に示す。
10,631
9,043
107 1,859 129 1,038
また、各検索エンジンの検索結果の“傾向”が観察 （最近、実施例が増加しつつある E-value （偽陽性ヒットの指標）

[3] M.Wilhelm et al., Nature, 509, 582-587 (2014).
[4] I.Ezkurdia et al., J.Proteome Res., 13, 3854-3855 (2014).

戦略1の検証結果

偽陽性の結果(false positive assignment)を減少させる



昨年度から JST NBDC 統合化推進プログラムのもとで構築が開始された、プロテオーム統合データベース『jPOST』(http://jpost.org/) は、論文投稿時に要求される「データの公開」のための「リポジトリ」と、そこに depositされた再利用可能なデータを用いて作成する「データベース」から成っている。
リポジトリ部分は本年 5 月 2 日に公開され、更に世界の 3 大（プロテオーム・データ）リポジトリで結成する ProteomeXchange[1] にも、7 月 6 日付で加盟した。これで jPOST は名実共に、アジア・オセアニア地区で唯一の国際プロテオーム・リポジトリとして稼働することになった。リポジトリの改良は今後も継続して行われるが、プロジェクトとして次に重点課題となっているのが、データベースの構築である。
2014 年に発表された、2 つのヒト・プロテオーム・データベース [2][3]ではデータの信頼性が厳しく問われた [4] が、同様の問題を生じないように、jPOST データベースでは既存の解析結果を収集することは行わない。上述のように、公開されて再利用可能な質量スペクトルのデータ、いわゆる実験の“生データ” を、独自に全て再解析することによって結果を得る予定である（左図参照）。この目的のために、現在構築中である「再解析プロトコル」の開発の現状について、以下に報告する。

Mouse Hepa tryptic phosphopeptides
analyzed by Q-Exactive
ProteomeXchange ID: PXD001792

検索エンジンの特徴(傾向)Mascot “保守的な”結果（確度の高いもののみ）



戦略2の検証結果
右図に示したのは、イオンピークとアミノ酸の対応を見る限り、“正解”だと思われる同定結果であるが、E-valueの値は悪い。
一方、下図に示したのは、Target-Decoy search
でDecoy配列が同定された例であるが、E-valueが非常に良いものが含まれている。
Reversed Sequence Decoy

Discovererが検出したピークはMascotでは同定できなかったが、ProteoWizard(自家改変版)が検出したピークは同定できた。このように、ピーク検出にも複数ソフトウェアを用いることで、効果が増大している。

PepExpt = 4.4e-10(by Mascot)

PepExpt = 2.8e-02(by Mascot)（スコア高）

Random Sequence Decoy

 プレカーサーイオンの判定をChosen byDiscoverer

Mascot could identify
Mascot could not
Chosen by ProteoWizard(Customized)

PepExpt = 6.4e-06(by Mascot)

右図のように同定結果をスコア(またはE-value）順にソートしたとき、「明らかにFalse Positiveである」Decoy同定結果が上位に、「明らかに正解と思われる」結果が下位に現れることになり、この中間のいわば“グレイゾーン”は、True PositiveかFalse Positiveかの判定が難しくなることが判った。

Assignment （陽性）
 (Highest) Decoy Assignment
 Assignment
 Assignment“グレイゾーン”
 Assignment
 Assignment
 Assignment
 (Lowest) Target Assignment
 Assignment（陰性）（スコア低）X!Tandem

誤った場合にも同定できる
工夫あり

Comet (Sequest)

 長い配列を高スコアで同定可能

MaxQuant 強度の低いフラグメントイオン

でも高スコアで同定可能

まとめ○○○

ピーク検出とデータベース検索の両方に複数のソフトウェアを用いる戦略は有効。
ソフトウェアの特徴を活かすことができれば、より効率的な同定が期待される。
イオンピークとアミノ酸の対応の精査はFalse Positiveの判定に有効と考えられ、今後この精査によって得られる情報を用いて、“グレイゾーン”を狭めていく戦略が必要になる。
○ 今回調査したようなデータで、同定の精度を検証できる可能性が高いことが確認できたので、大量のデータを用いて検証を行いつつ、再解析プロトコルを確立するために、データ処理の自動化環境を作成する予定である。

謝辞

jPOSTプロジェクトは、JST NBDC（科学技術振興機構・バイオサイエンスデータベースセンター）「統合化推進プログラム」予算を受けて進められている。
また計算リソースは、京都大学化学研究所スーパーコンピュータシステムから提供を受けた。

トーゴーの日シンポジウム2016

Oct. 5 & 6, 2016, Tokyo

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C 2016 Akiyasu C. Yoshizawa (BiC, ICR,Kyoto Univ.) / jPOST Project