オルトフェニレンジアミンの皮膚蓄積性とDNA 損傷性に関する検討
豊岡達士*1 , 祁 永剛*2, 王 瑞生*1
オルトフェニレンジアミン（OPDA: ortho-Phenylenediamine）は染毛剤の成分として使用される重要な芳香族アミンの一つである．これまでに染毛剤を使用する美容師に膀胱がんの発生が多いことは知られていたが，近年，首や頭皮における皮膚がんのリスクが高くなるという疫学研究が報告されている．一方で，OPDA の皮膚に対する毒性影響を検討した研究はない．本研究では，三次元ヒト表皮培養モデル細胞（3D 皮膚）を用いて，OPDA の皮膚に与える毒性影響を検討した．3D 皮膚における OPDA の皮膚吸収性を検討したところ，OPDAは 3D 皮膚に吸収された後, 3D 皮膚内に高蓄積することを見出した．また，皮膚内に蓄積した OPDA は 3D 皮膚細胞に DNA 損傷を誘導することが，リン酸化ヒストン H2AX（g-H2AX）を指標にした検討により確認された．さらに，この DNA 損傷型は OPDA と DNA が結合する付加体損傷であることを明らかにした．本研究で得られた知見は，美容師の皮膚がん増加を報告する疫学研究の解釈に重要な情報を提供するものと考えられる．

キーワード: オルトフェニレンジアミン，皮膚がん，DNA 損傷性，g-H2AX，皮膚蓄積性1.

本研究では，染毛剤にばく露する機会が多い美容師のはじめに美容師は，職業上の染毛剤の取り扱いに加え，私的使間で，皮膚がんのリスクが増加していることを示唆する

用により，染毛剤へのばく露が一般に比べて高いことが疫学研究の結果を，実験的に検証することを目的に，染知られている．染毛剤の成分には，芳香族アミン類等が毛剤に含まれることがある OPDA をモデルとして，3D含まれており，染毛剤へのばく露機会が高い美容師の間皮膚に対する DNA 損傷性をリン酸化ヒストン H2AX（gで，膀胱がんリスクが高いことが国際がん研究機関-H2AX）を指標に検討した．

（IARC）より指摘されてきた 1, 2) ．しかしながら，近年の疫学研究においては，美容師の膀胱癌リスクは減少し2.ているが，染毛剤に直接ばく露される頭皮，及び首にお1)

実験材料及び方法
3D 皮膚
3D 皮膚には LabCyte EPI-MODEL（J-TEC, Fuji

ける皮膚がんのリスクが増加しているという報告がなさFilm）を用いた．LabCyte は，直径 10.5mm の培養カッれている 3, 4) ．
オ ル ト フ ェ ニ レ ン ジ ア ミ ン （ OPDA: ortho-プ（Culture Insert, Corning）にヒト正常表皮細胞を重Phenylenediamine）は，染毛剤の成分として使用される層培養したものであり，培養 14 日目のものを使用した．

重要な芳香族アミンの 1 つである 5, 6) OPDA のヒトに対使用した 3D 皮膚は，表皮を構成する角質層，顆粒層，する発がん性の証拠は不足しているが，動物においては，有棘層，基底層を有し，角層に特有の構造体，及び各種マウス，及びラットで肝がん，及び膀胱がんの発生率を代謝酵素や炎症関連酵素の保持が確認されている 8) ．

有意に上昇させることが認められており，2020 年のIARC の再評価で OPDA は，発がん性物質グループ 2B2)

3D 皮膚における OPDA の皮膚吸収性評価（ヒトに対して発がんの可能性がある）に分類された 7) ．

3D 皮膚が入った培養カップを PBS（52 mL）が満た

DNA 損傷性の有無は，化学物質の発がん性を評価するされたガラス瓶に装着し，培養カップに，0.1mCi（3700上で，重要なポイントになる．これまでに OPDA の DNABq）の[14C]OPDA（American Radiolabeled Chemicals）損傷性に関するいくつかの研究が行われてきており，そを含む PBS を 200mL 添加した．培養カップの底面は網の結果は概ね OPDA は DNA 損傷性を有するという見解

目状のポリエチレンメンブレンであり，添加したで一致している．しかしながら，皮膚に着目した OPDA

[14C]OPDA が 3D 皮膚を透過するとガラス瓶の PBS 内の DNA 損傷性評価，及び，OPDA が生成する DNA 損で[14C]OPDA が検出される．既定時間ごとに，「添加溶傷の種類については情報がない．

液」，「3D 皮膚」，「ボトル内の溶液」を回収し，[14C]OPDAの放射能を液体シンチレーションカウンター（Perkinelmer: Tri-Carb 5110R）で測定した．

*1 労働安全衛生総合研究所 化学物質情報管理研究センター 有害性評価研究部

3)*2 Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an, China.

3D 皮膚における OPDA の DNA 損傷性評価

3D 皮膚に対する OPDA の DNA 損傷性は，g-H2AX

連絡先：〒214-8585 川崎市多摩区長尾 6-21-1を指標に Western blotting 法により評価した．3D 皮膚

労働安全衛生総合研究所 有害性評価研究部 豊岡 達士
E-mail: toyooka@h.jniosh.johas.go.jp—63—労働安全衛生総合研究所特別研究報告 JNIOSH-SRR-No.53 (2023)が入った培養カップに OPDA（非 RI：Tokyo Chemical

100%となっていないのは，培養カップ（スチレン性）

Industry）を 0.1-3 mM の範囲で 24 時間作用した．作用に OPDA が約 30%吸着しているためである．

終了後，3D 皮膚を培養カップから剥離回収し，Lysis
Buffer を加えた上で，超音波処理，及び熱処理等をし，

2)

3D 皮膚における OPDA の DNA 損傷性評価

Western blotting のサンプルを調整した．サンプルを

図 2 に 3D 皮膚に OPDA（非 RI）を 24 時間作用し12.5% SDS-PAGE GEL で 電 気 泳 動 分 離 ， PVDFた時のg-H2AX 誘導を示す．OPDA 0.3 mM の作用からmembrane に分離されたタンパク質を転写した上で，g-H2AX 誘導が検出され，1，3 mM の作用では，強くWestern blotting 法において，g-H2AX を認識する一次g-H2AX 誘導することが確認された（バンドの太さ，及抗体（ミリポア: clone JBW301），及び二次抗体を作用び濃さで判断される）．なお，アクチンはローディングし，g-H2AX の誘導を化学発光により検出した．ローデコントロールであり，Western blotting 法において，各ィングコントロールとして actin を利用した．

レーンのタンパク質量が均等であったことが示されている．これらの結果から，OPDA が 3D 皮膚に対して3D 皮膚における OPDA-DNA 付加体の検出DNA 損傷を誘導していることが示唆された．また，こ3D 皮膚に [14C]OPDA を 0.1 mCi 含む PBS 溶液をのg-H2AX は，3D 皮膚の基底細胞層で誘導されている

4)200mL 添加し，既定時間後に 3D 皮膚を剥離回収し，ことを，3D 皮膚切片における免疫組織染色法で確認しProteinase K を含む Lysis buffer で 3D 皮膚を完全に溶ている（データ示さず）．なお，3D 皮膚に OPDA を 3解した. 3D 皮膚溶解液から DNA をエタノール沈殿法にmM で 24 時間作用しても 3D 皮膚を構成する細胞の生より回収し，ドットブロット法でニトロセルロース膜に存率に影響がないことを確認しており（alamer Blue
assay：データ示さず），図 2 で観察されたg-H2AX 誘導から放出されるベータ線を液体シンチレーションカウンは，細胞死（アポトーシス）に伴い誘導されるg-H2AXターで計測した．

ではない．

3.

結果1)

3D 皮膚における OPDA の皮膚吸収性評価

untreated

DNA を転写した．DNA を転写したニトロセルロース膜

図 1 のグラフ縦軸は，3D 皮膚に添加した[14C]OPDAの量を 100%とし，添加後，既定時間における，添加溶OPDA (24 h)0.1 0.3 1 3 (mM)

γg-H2AX

液内，皮膚内，ボトル内に存在する[14C]OPDA の割合を示している．添加溶液内（●印）の[14C]OPDA の割合は，actin

時間経過とともに減少していることから，[14C]OPDA は速やかに 3D 皮膚に吸収（皮膚の中に入る）されること

図 2 3D 皮膚における OPDA の DNA 損傷性評価が明らかになった．一方で, 3D 皮膚を透過し，ボトルの差替用の図 2（No.53-2-2「オルトフェニレン・・・」）方へ移行した[14C]OPDA の割合は，24 時間後において3)

3D 皮膚における OPDA-DNA 付加体の検出もほとんど認めることができず（×印），[14C]OPDA は

図 1 より[14C]OPDA は 3D 皮膚の透過がほとんど認め

3D 皮膚内に蓄積したままの状態になっていることが判られなかったことから，[14C]OPDA は 3D 皮膚を構成す（◆印）．なお，[14C]OPDA の皮膚蓄積は 72 時る細胞構造物と結合している可能性が考えられた．表 1間後においても，24 時間後のデータと同様であった（デに，[14C]OPDA を 24 時間作用した 3D 皮膚の DNA とータ示さず）．また, 各時間における，添加溶液内，皮膚[14C]OPDA の結合を評価した結果を示す．表中 Control内，ボトル内に存在する[14C]OPDA の割合の総和がRI+は，未処理の 3D 皮膚を回収し，3D 皮膚を溶解した

明した

後，その溶液に，[14C]OPDA を 0.1mCi 加え，残りの処理を 3D 皮膚に[14C]OPDA を作用したサンプルと同様に行なったものである．[14C]OPDA を作用した 3D 皮膚から抽出した DNA では，[14C]OPDA からのベータ線カウントが，Control RI+に比べて明らかに高いことがわかる．
このことより，OPDA は DNA と結合，すなわち付加体を形成することが示唆された．
表 1 3D 皮膚における OPDA-DNA 付加体の検出

図 1 3D 皮膚における OPDA の皮膚吸収性評価

—64—

条件

サンプル数

カウント範囲(DPM)

平均カウント数(DPM)

Background612-21

15.83±3.31

ControlRI+

6135-1051

543.00±428.05

OPDA (24 h)

61661-5415

3301.67±1772.31

オルトフェニレンジアミンの皮膚蓄積性と DNA 損傷性に関する検討積した OPDA は DNA 付加体損傷を形成し，この損傷から，
4.

二次的に DNA 二本鎖切断が生成することが明らかとなった．

考察
本研究では 3D 皮膚における，OPDA の皮膚吸収性，及本研究で得られた知見は，美容師の皮膚がん増加を報告

び，DNA 損傷性をg-H2AX を指標に検証し，OPDA は 3Dする疫学研究の解釈に重要な情報を提供するものと考え

皮膚に速やかに吸収され，皮膚内に蓄積し，DNA 損傷をられる．

誘導すること，また誘導される DNA 損傷の種類は DNA 付加体損傷であろうことを初めて明らかにした．

参1)

我々は，3D 皮膚に対する物質の吸収性・透過性・蓄積

考文

献IARC working group on the evaluation of carcinogenic

性について，別途研究を実施しており，これら皮膚吸収risks to humans: occupational exposures of

性等は物質のオクタノール/水分配係数（Log Ko/w）に

hairdressers and barbers and personal use of hair

よってある程度予測することができるという結果を得てcolourants; some hair dyes, cosmetic colourants,

いる．すなわち，Log Ko/w の値が 0 付近から 3 程度のindustrial dyestuffs and aromatic amines.

物質であれば，通常 3D 皮膚を透過するはずである．実

Proceedings. Lyon, France, 6-13 October 1992. IARC

際に，OPDA と構造異性体である p-phenylendiamine

Monogr Eval Carcinog Risks Hum. 1993; 57: 7-398.

（Log Ko/w: -0.25）や，化学構造が似た Aniline（LogPMID: 7911535; PMCID: PMC7681392.

Ko/w: 0.9），o-Toluidine（Log Ko/w: 1.3）では，3D 皮膚に対する透過性が認められている．OPDA の Log Ko/w
は 0.15 であることから，3D 皮膚に対する透過性があると予想されたが，実際には，図 1 に示すように皮膚透過性がほとんど認められなかった．この理由としては，表1 に示すように OPDA が DNA と結合したためであると考えられる．また，72 時間後においても，作用した OPDAがほぼ全量 3D 皮膚内に蓄積したままになっていることは注目すべきことである．すなわち一旦皮膚に吸収された OPDA は長時間皮膚内にとどまり，皮膚を構成する細胞を傷害し続ける可能性があることを示唆するものであり，OPDA の皮膚接触を防止することは労働衛生上重要であると考えられる．
図 2 に示す通り，OPDA はg-H2AX を誘導する．このgH2AX は，細胞内で DNA 二本鎖切断が生成された際に，その切断部位近傍に存在するヒストン H2AX のセリン 139 番が，主に ATM（ataxia-telangiectasia mutated）と呼ばれるセリン/スレオニンキナーゼによって迅速にリン酸化される現象である 9) ．すなわち，OPDA がg-H2AX を誘導したことは，細胞内における DNA 二本鎖切断の生成を意味している．表 1 より，OPDA は DNA 付加体損傷を形成していることが明らかになったが，OPDA 作用がg-H2AX を誘導したのは，以下の可能性によって，DNA 付加体損傷から二次的に DNA 二本鎖切断が生成したものと考えられる．①
OPDA-DNA 付加体損傷が存在する DNA 鎖上において，転写や複製が生じ，RNA ポリメラーゼ転写複合体またはDNA 複製フォークが DNA 損傷と衝突し，その衝突ストレスにより DNA 二本鎖切断が生じた．② OPDA-DNA
付加体損の修復の過程で一時的に DNA 二本鎖切断が生じた（損傷部を除去したり，DNA を組み替えたりする等，修復過程で必然的に生じるもの）．DNA 二本鎖切断は，DNA の中でも最も重篤な損傷と考えられており，発がんと密接な関係がある 10) ．特に DNA 二本鎖切断を修復する際の修復ミスが，細胞の変異（がん化していく過程）につながると考えられている．
本研究により，OPDA は 3D 皮膚に速やかに吸収され，皮膚内に蓄積することが明らかになった．また，皮膚内に蓄—65—2)

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