第10回学術奨励賞受賞者論文

外界刺激による概日時計の調節機構
羽鳥恵✉

Salk Institute for Biological Studies

遺伝子の光応答は、E4bp4遺伝子の光応答パターン

はじめに哺乳類は全身のほぼすべての細胞に概日時計が備と類似していた。E4BP4は時計遺伝子Per2を抑制わっている。中でも行動を支配する概日時計は視床して概日時計の時刻合わせをする［１、５］。コレ

下 部 の 視 交 叉 上 核（suprachiasmatic nucleus；

ステロール生合成系の遺伝子群を誘導する転写因子

SCN）に存在し、中枢時計と呼ばれる。SCNの時計

SREBPが 主 観 的 夜 の 前 半 の 光 に よ っ て 活 性 化 さは外界の光周期に同調する。一方、全身に存在する

れ、E4bp4はSREBPの新規標的遺伝子であることを末梢時計は食餌に強く影響される。種々の時計遺伝見出した［４］。

子破壊マウスにおいて肥満やメタボリックシンド

主観的夜の前半の光でコレステロール生合成系のロームが報告されてきた。逆に、代謝分子を破壊し遺伝子群が活性化される生理的意義は何であろうた場合に時計の出力に影響が見られることも知られか？ 松 果 体 は コ レ ス テ ロ ー ル を も と に7αている。

-hydroxypregnenoloneというニューロステロイド

まず概日時計の光による調節機構に関して、次にを合成・分泌することを見出した。松果体からの7食餌と末梢時計の関係について、私共の最近の研究

α-hydroxypregnenoloneの分泌量は主観的夜の前成果を中心に紹介させて頂く。

半 の 光 照 射 に よ っ て 上 昇 し、 脳 内 に7αhydroxypregnenoloneを投与すると行動量が大きくニワトリの松果体において時刻特異的に活性化され上昇した。さらに、主観的夜の前半の光照射によるる遺伝子群およびニューロステロイド行動量の上昇は、松果体の摘出によって抑制され主観的夜の前半の光刺激によって概日時計の位相た。

は後退し、一方、主観的夜の後半の光では位相が前以上の研究から、時刻に依存して光で活性化され進する。この時刻依存的な光位相シフトは生物種をる経路を明らかにしただけでなく、遺伝子発現が行超えて保存されており、概日時計の重要な特性の一動の変化を導く過程を示すことが出来た。メラトニつである。ニワトリの松果体は概日時計機能と共ンを介して睡眠を促進すると考えられてきた松果体に、位相シフトに必要な内在性の光受容能を持つ。

が、7α- hydroxypregnenoloneを介して覚醒にも寄私共はこの特徴を生かし、ニワトリ松果体において与することを見出した［４］。

時刻特異的に光誘導される松果体遺伝子群を単離し［１、２］、夜の後半に光誘導される新規の遺伝子を光受容体メラノプシン

Lcg（Light- inducible and clock- controlled gene）

鳥類の松果体は直接光を感じるのに対し、哺乳類と命名した［３］。
LCGタンパク質の性状解析から、の唯一の光受容感覚器は網膜である。網膜には桿中心体に局在する初の概日時計関連分子であること体・錐体に加え、第三の光受容細胞がごく一部（約を見出した。

１％） の 網 膜 神 経 節 細 胞（retinal ganglion cell;さらにニワトリ松果体を用いたDNAマイクロアRGC）に存在する［６］。この細胞は光受容タンパ

レイ解析の結果、コレステロールの生合成に関係すク質であるメラノプシン（melanopsin 別名Opn4）る多数の遺伝子が主観的夜の前半の光で活性化されを発現しているため、他のRGCと区別してメラノることを見出した［４］。興味深いことにこれらのプシン発現網膜神経節細胞（melanopsin-expressing✉mhatori@salk.edu
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マウスを作製した［10］。ジフテリア毒素をマウスに注入すると血液脳関門を通って、免疫反応を引き起こすことなくジフテリア毒素受容体を持つ細胞のみを消失させることが可能である。このことから
mRGC特異的にジフテリア毒素受容体を発現させ、図１ 哺乳類の３種の光受容細胞 −桿体・錐体・メ
ラノプシン発現網膜神経節細胞−目の網膜において、光情報は電気信号に変換され、脳へと伝達される。網膜の細胞は秩序だった層構造を形成し、視細胞層の桿体・錐体が受け取った光情報は、双極細胞や水平細胞などを経て網膜神経節細胞（retinal ganglion cell; RGC）に伝わり、RGCから視神経を経て大脳視覚中枢に伝達され、視覚応答が起こる。130年以上に渡り、桿体・錐体が唯一の光受容細胞だと考えられてきたが、数％のRGCにメラノプシンという光受容タンパク質が発現していることが2000年に 見 出 さ れ た。 こ のRGCは メ ラ ノ プ シ ン 発 現RGC
（melanopsin-expressing RGC; mRGC）と呼ばれ、第三の光受容細胞として機能する。mRGCは光受容能を保 持 す る た めipRGC（intrinsically photosensitive
retinal ganglion cell） と も 呼 ば れ る。RPE（retinalpigment epithelium）; 網 膜 色 素 上 皮、OPL（outerplexiform layer）; 外 網 状 層、INL（inner nuclearlayer）; 内顆粒層、IPL（inner plexiform layer）; 内網状 層、GCL（ganglion cell layer）; 神 経 節 細 胞 層、Cone; 錐体、Rod; 桿体、H（horizontal cell）; 水平細胞、B（bipolar cell）; 双極細胞、A（amacrine cell）; アマクリン細胞、optic tract; 視索。

ジフテリア毒素の注入によってmRGCの消失を誘導することとした。具体的には、メラノプシン遺伝子座にCreを持つノックインマウスと、組織普遍的に発現する遺伝子であるROSA26遺伝子座に誘導性ジフテリア毒素受容体（iDTR）を持つマウスを掛け合わせた。Opn4Cre/+; R26iDTR/+マウスは正常に発生し、iDTRはCre-loxPシステムによってstopカセットが除去された時のみに発現する。８週齢マウスにジフテリア毒素を注射することにより、１週間以内にメラノプシン抗体陽性細胞が消失し、成体マウスの網膜の特定の細胞を迅速に消去することに初めて成功した。網膜の形態および網膜電図（ERG）は正常であった。さらに視覚認識能力への影響の有無を知るため視覚クリフ行動テストを行ったところ、ジフテリア毒素を注射されたOpn4Cre/+; R26iDTR/+マ
ウスは野生型マウスと同程度の視覚機能を保持しており、mRGCの消失は視覚伝達には影響を与えないことが判明した。

RGC; mRGC）と呼ばれる（図１）。mRGCは自身で次に非視覚情報へ与える影響を解析した。蛍光色

光 を 感 じ る と 共 に（ 故 にmRGCsはintrinsically

素で標識したコレラ毒素サブユニットBを目に注入

photosensitive retinal ganglion cells; ipRGCsとも呼して脳への投射を観察したところ、ジフテリア毒素ばれる）桿体・錐体からの投射も受ける。mRGCはを注射されたOpn4Cre/+; R26iDTR/+マウスではSCNへ視覚以外の光応答を担っており、概日時計の位相調の投射がほぼ全て消失していた。この結果と一致し節、睡眠、瞳孔収縮、光回避反応や片頭痛の光によて、概日時計の位相は24時間の明暗周期に同調される悪化などの非視覚応答に寄与する。メラノプシン

なくなり、23.5時間の周期でフリーランした。さらは無脊椎動物の光受容体に類似した情報伝達系を持に瞳孔反射や光による行動抑制などの非視覚応答もつと示唆されている。

完全に失っていたことから、mRGCが桿体・錐体か桿体・錐体を失ったマウスでも概日時計の光同調らの情報とメラノプシン情報伝達の両者を統合しては正常であるが、桿体・錐体の欠失に加えメラノプおり、非視覚情報はmRGCを経由して脳に伝達されシンをノックアウトしたマウスは光同調が不可能でることを明らかにした［10］。

ある［７］ことから、メラノプシン遺伝子は光同調

mRGCはSCN以外にどのような脳領域に投射するに必須であることがわかる。しかしながらメラノプのであろうか？ Opn4Cre/+; R26iDTR/+マウスのmRGC

シン遺伝子破壊マウスにおいては光同調が完全に消がほぼ完全に消失したことから、すべてのmRGCを滅するわけではなく、光感度が減少するのみであり標識できるOpn4Creマウスを作製することに成功し［８］、mRGCから生じる樹状突起の形態およびSCNたといえる。そこでこのOpn4Creマウスとアルカリへの投射も正常である［９］。したがって非視覚応

フォスファターゼ（AP）レポーターマウスを掛け答には桿体・錐体も関与していると考えられるが、合わた（Opn4Cre/+; Z/APマウス）。メラノプシン抗これらの細胞から脳への情報伝達経路は不明であっ体を用いた免疫染色とほぼ同数（97％一致）の陽性た。

細胞がRGC層に限局して観察され、Opn4Creマウス

視覚情報および非視覚情報の伝達におけるmRGCの特異性が確認できた。非視覚情報を担うSCNやの役割を解明すべく、私共はmRGCを後天的に失う

膝状体間小葉（Intergeniculate leaf ; IGL）、視蓋前

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Vo l . 19 , No . 1（ 2 0 1 3 ）域オリーブ核（olivary pretectal nucleus; OPN）にして、主に高脂肪食群（FA；自由摂食およびFT；

陽性シグナルが観察でき、これらの投射先は過去の時間制限摂食）に注目する。

知 見［11］ と 一 致 し た。 さ ら に、 外 側 膝 状 体

NA群はこれまでの報告通り、主に夜に食事を摂（lateral geniculate nucleus; LGN）や上丘（superior取し、呼吸交換比にも顕著な概日リズムが見られcolliculus; SC）へも投射していることを発見した。

た。FA群は摂食および呼吸交換比ともに日内変動

LGNやSCは視覚情報を受容することから、mRGCを示さず、つまり一日中食べ続けていた。一方、夜が視覚応答へ寄与している可能性を考えた。実際間に８時間のみ餌にアクセスできる個体群（NTおに、視覚を失っていると思われていた桿体・錐体のよびFT）において、呼吸交換比の概日リズムは自変異マウス（rd/rd clマウス）においてもLGNはメ由摂取群（NAおよびFA）と比べ顕著に改善されラノプシン情報伝達系によって活性化された。大脳ていた。それでは、食事の摂取量に差はあるのだろ皮質視覚野（visual cortex）までもが光依存的に活うか？時間制限摂食マウスは自由摂食マウスと同程性化され［12］、mRGCが光照度を認識して脳に伝度の食事量およびカロリーを摂取することをすぐに達することを明らかにした。

覚え、18週に渡り同程度のカロリーを日々摂取し続け た（FA 群13.84±1.12 kcal/day、FT 群13.29±

時間制限給餌0.85 kcal/day）。

SCNの時計は外界の光周期に同調する一方、全肝臓の概日時計の機能は影響を受けるだろうか？

身に存在する末梢時計は食餌に強く影響される。私

ま ず、metabolic regulatorsと し て 知 ら れ て い る

共は食餌の時間が末梢時計の振幅および高脂肪食のCREB、mTORお よ びAMPKの 発 現 を 調 べ た と こ作用に与える影響を調べた。

ろ、FA群と比べFT群ではそれらの日内リズムの振よく知られていることであるが、高脂肪食を摂取幅が回復していた。次に肝臓でのPer2、Bmal1、し続けると肥満やメタボリックシンドロームになりRev- erbα などの時計遺伝子の日内発現リズムを調やすい。それは何故か？夜行性であるマウスに通常べた。過去に報告されている通り［13］、時計遺伝食を与えた場合は主に夜に餌を摂取するが、高脂肪子の日内振動の振幅はNA群およびNT群と比べFA食を与えた場合には昼夜の差なく食べ続ける。それ群において顕著に減弱していた。しかしながらFTに伴い、肝臓などにおいて時計遺伝子や代謝遺伝子群においてはそれらの遺伝子の振幅は通常食群と同の発現の日内変動が減弱する。つまり、高脂肪食に程度にまで回復していた。つまり、同じ種類の食事自由にアクセスできる環境におかれたマウスは「食を同じ量食べているにも関わらず、食事時間を変え事の種類」と「概日時計の振幅」の両方が変化する。そこで「高脂肪食が引き起こす肥満やメタボリックシンドロームは食事の種類に起因するのか、それとも概日リズムの振幅が減弱することに由来するのか？」という疑問を持った。
C57BL/6J野生型マウス（２−３ヶ月齢、雄）を以下の４群にわけた。
a. 通常食（normal chow; 13 % fat）へ一日中アクセスできる（ad libitum）個体群; NAb. 通常食へ夜の時間帯に８時間のみアクセスできる（time-restricted）個体群; NT
c. 高脂肪食（high-fat diet; 61% fat）へ一日中アクセスできる個体群; FA
d. 高脂肪食へ夜の時間帯に８時間のみアクセスできる個体群; FT
すべてのマウスは明期12時間−暗期12時間の環境下で飼育され、水へは一日中アクセスできる。この食事スケジュールを５ヶ月に渡って続け、食事を摂取する時間帯が与える影響を調べた。本稿では簡便化
時間生物学

図２ 高脂肪食を時間制限して摂取すると肥満を防ぐことができる
通常食に一日中アクセスできるマウスは主に夜に食事を摂取し、概日時計の振幅は大きく、健康である。一方、 高 脂 肪 食 に 一 日 中 ア ク セ ス で き る 場 合（ 左 Adlibitum）には昼夜を問わず食べ続け、時計の振幅は小さくなり、肥満やそれに伴う疾患を呈する。今回の研究で、高脂肪食を活動時間帯に限って与えた場合（右Time-restricted）、カロリー摂取量は高脂肪食の自由摂食群と同程度であるにも関わらず時計遺伝子の振幅は改善し、肥満にならないことを明らかにした［14］。

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るだけで概日時計の発振機能が改善されることを見ことなく、肥満や関連する病態を防ぐことができる出した（図２）［14］。

ことを、マウスを用いた研究より見出した（図２）18週に渡りマウスの体重を継続的に測定したとこ［14］。

ろ、4群いずれのマウスも実験開始時の体重は約

今回の研究により「何を食べるか」だけではな

25gで あ っ た が、18週 目 にNT群 は30.5±0.4g、NAく、「いつ食べるか」も重要であることを明らかに群は32.6±0.4gに増加していた。高脂肪食を一日中し、薬を用いることなく肥満や関連する疾患を防ぐ食べるマウス群（FA群）は47.4±0.7gにまで達して方法の糸口を見つけることができた。ただし本知見いた。しかしながら時間を制限して高脂肪食を摂取は齧歯類によって得られたものであり、ヒトでも同する（FT群）と34.2±0.6gにしかならなかった。

様の結果が得られるかの研究が今後の課題であろグルコース耐性テストを行ったところ、FA群でう。

見られた高血糖およびグルコース不耐性は、FT群で大幅に改善されていた。同様に、血中のインシュリンおよびコレステロール量もFA群のみ顕著に高く、FT群は通常食群と同程度の値を示した。

謝辞
第10回日本時間生物学会学術奨励賞・基礎科学部
門を受賞できました事を大変光栄に存じます。この

肝臓の重量を比較したところ、FA群で観察され場をお借りして東京大学の深田吉孝教授ならびにた肝肥大はFT群では見られなかった。電子顕微鏡

ソーク研究所のDr. Satchidananda Panda、両研究によって肝臓の組織切片像を詳細に解析したとこ室メンバーおよび共同研究者に深く感謝申し上げまろ、FT群では脂肪沈着が観察されず、それのみなす。

らず小胞体やミトコンドリアの占める割合が増加しており、時間制限摂食が細胞質小器官の構成を変化文献させることが示唆された。さらに、褐色脂肪細胞や

１）Doi M, Nakajima Y, Okano T, Fukada Y.

白色脂肪細胞においてFAマウスで観察された脂肪Light-induced phase-delay of the chicken細胞肥大やマクロファージの存在が、FTマウスでpineal circadian clock is associated with theは減少していた。

induction of cE4bp4, a potential transcriptional

上述の通り、FAマウスにみられる体重増加はFTマウスでは観察されなかった。この体重減少は、脂repressor of cPer2 gene. Proc Natl Acad Sci
U S A. 98（14）:8089-8094（2001）

肪の減少によるのであろうか、それとも筋肉量など

２）Doi M, Nakajima Y, Okano T, Fukada Y.

も失われているのであろうか？核磁気共鳴画像法にLight-dependent changes in the chick pineal

よって身体組成を計測したところ、FT群はFA群とtemperature and the expression of cHsp90

比べ脂肪量のみが著しく減少していた。両群のマウ

alpha gene: a potential contribution of in vivo

スを回転する輪の上にのせ、落ちることなく滞在す

temperature change to the photic-entrainment

ることができる時間を測定したところ、FA群と比of the chick pineal circadian clock. Zoolog Sci.

べFT群は顕著に長い時間、輪に滞在することがで

19（6）:633-641（2002）

き、さらにNA群やNT群と比べても優れた運動能

３）Hatori M, Okano T, Nakajima Y, Doi M,力を示した。上述した変化のみならず、FT群におFukada Y. Lcg is a light-inducible and clock-

いてはグルコース代謝、脂質代謝、胆汁酸産生、炎controlled gene expressed in the chicken症などにも著しい改善が見られた。

pineal gland. J Neurochem. 96（6）:1790-1800

以上まとめると、野生型マウスを使用して高脂肪（2006）

食に夜の時間帯の８時間のみアクセスできるように

４）Hatori M, Hirota T, Iitsuka M, Kurabayashi N,

した結果、高脂肪食を一日中自由に摂取できる個体

Haraguchi S, Kokame K, Sato R, Nakai A,と同程度の食事量およびカロリーを摂取しているに

Miyata T, Tsutsui K, Fukada Y. Light-

も関わらず、時計遺伝子発現の振幅が改善された。

dependent and circadian clock-regulated

さらに肥満、高インシュリン血症、肝脂肪変性、炎activation of sterol regulatory element-binding症などが通常食を与えたマウスと同程度にまで緩和

protein, X-box-binding protein 1, and heat

しただけでなく、運動能力が向上していた。つまり

shock factor pathways. Proc Natl Acad Sci U

食事時間を制限することによって、食事量を減らす（2011）S A. 108（12）:4864-4869

時間生物学─ 6 ─

Vo l . 19 , No . 1（ 2 0 1 3 ）５）Doi M, Okano T, Yujnovsky I, Sassone-Corsi P,Jegla T, Panda S. Inducible ablation ofFukada Y. Negative control of circadian clockmelanopsin-expressing retinal ganglion cells

regulator E4BP4 by casein kinase Iepsilon-reveals their central role in non-image formingmediated phosphorylation. Curr Biol. 14

visual responses. PLoS One. 3（6）:e2451（2008）（11）:975-980（2004）

11）Hattar S, Kumar M, Park A, Tong P, Tung J,

６）Hatori M, Panda S. The emerging roles of

Yau KW, Berson DM. Central projections ofmelanopsin in behavioral adaptation to light.

melanopsin-expressing retinal ganglion cells inTrends Mol. Med. 16（10）:435-446（2010）

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７）Panda S, Provencio I, Tu DC, Pires SS, Rollag（2006）

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時間生物学

Vo l . 19 , No . 1（ 2 0 1 3 ）─ 7 ─