博 士 （ 医 学 ） 大澤 昌 之
学 位 論 文 題 名

新しいりンパ系イメージング剤としてのインドシアニングリーン標識ヒアルロン酸誘導体の開発
学位論文内容の要旨【背 景と目 的】
イ ン ド シ ア ニ ン グ リ ー ン (ICG)は 人 体 へ の 投 与 が 認 め ら れ て い る 暗緑 青 色 の 化合 物 で あ り、
血 漿 中の 蛋 白 質 と結 合 し て 近赤 外 領 域 での 蛍 光 を 発す る こ と が知 ら れ て いる 。人 体の皮膚 は近赤 外 光を 通 し や すい 性 質 を 有し て お り 、臨 床 で は 近年 こ の 性 質を 応 用 し た特 殊な 赤外観察 カメ
ラ (PhotoDynamicEye： PDE浜 松 ホ ト ニ ク ス ， 日 本 ） に よ る り ン パ 管 造 影 法 や セ ン チ ネ ルリ ン パ 節 生 検な ど で 多 くの 臨 床 応 用例 が 報 告 され て い る ．し か し ， ICG自 体 は 少 なか ら ず 毒 性を も っ こ と ， 体 内 で は ICG絃 タ ン パ ク 質 と 非 特 異 的 に 相 互 作 用 し て しま う こ と ，そ の 結 果 とし て の螢 光 強 度 が比 較 的 低 いこ と な ど の問 題 点 が ある ． 本 研 究で は こ れ らの 問題 を解決す るた
め に ． ICGを ドラ ッ グ デ リバ リ ー シ ステ ム （ DDS）修 飾 す る こと を 考 え ，ICG‐ ゼ ラ チ ンー ヒ アル ロ ン酸 複 合 体 を作 製 し た ．用 い る 高 分子 材 料 と して 、 リ ン パ系 に 効 率 良く 分布 する可能 性の高 い ヒ ア ル ロン 酸 を 取 り上 げ た 。 また 、 ICGは タン パ ク 質 と相 互 作 用 する 性 質 が ある た め 、 臨
床 応 用が 可 能 な タン パ ク 質 とし て ゼ ラ チン を 取 り 上げ 、 ゼ ラ チン を ヒ ア ルロ ン酸 に導入す ること を 考え た 。 得 られ た 複 合 体の 物 性 と マウ ス 足 底 部皮 下 に 注 射し た 場 合 の下 肢に おけるり ンパ
移行 性につ いて，ICG単体と 比較検 討した，
【材 料と方 法】
1． ヒ ア ル ロ ン 酸の 熱 加 水 分解 ： ヒ ア ルロ ン 酸 を 熟加 水 分 解 する 際 に ， 加熱 時 間 を 変化 さ せ ること で平均 分子量が 18，000と 9，000のヒ アルロ ン酸を 得た，
2． ゼ ラ チン グ ラ フ ト化 ヒ ア ル 口ン 酸 の 合 成： ゼ ラ チ ンは ， 分 子 量3，100（ PI＝ 8）のも のを使用 し ，2ー（ Nー モ ル ホ リノ ） エ タ ンス ル ホ ン 酸（ MES） ， 1− エ チル ー 3― （ 3ージ メチル アミノプ ロ ピ ル ） カ ル ボ ジ イ ミ ド 塩 酸 塩 （ EDC） ， Nー ヒ ド ロ キ シ ス クシ ン イ ミ ド（ NHS） を 用い た
カ ル ボ キ シ ル 基 活性 化 法 によ り ， ゼラ チ ン をヒ ア ル ロ ン酸 に 導 入し 、 得 られ た 生 成物
（gelatinーRA（9） 韜よび gelatiIl‐HA（18））について、タンパク質定量キットをもちいてゼラチンの 導入率 を検討し た．
3． lCG― ゼ ラ チ ン ー ヒ ア ル ロ ン 酸 複 合 体 の 調 整 ： 各 ゼ ラ チ ン グ ラ フ ト 化 ヒ ア ル ロ ン 酸（gelatin‐HA（9） および gela
tin．HA（18））とインドシアニングリーン（ICG）混合し，ヒアノレ
ロ ン 酸 の 分 子 量 が 異 な る 2種 類 の ICG― ゼ ラ チ ン ー ヒ ア ル 口 ン 酸 複 合 体 溶 液 を 得 た（ICG― gelati亅1― nA（9冫お よぴICG． gelatin￣HA（ 18））．
4， ICG− ゼ ラ チ ン ―ヒ ア ル ロ ン酸 複 合 体 の粒 子 径 お よび 表 面 電 位の 測 定 ： 3． で得 ら れ た 各複合 体 につ い て 、 動的 光 散 乱 光度 計 に よ る粒 子 の 大 きさ の 測 定 と、 電 気 泳 動光 散乱 光度計に よる
表面 電位（ モ．potential）の測定 を行っ た，
5． 水 晶 発振 子 マ イ クロ パ ラ ン ス（ QuansCッ stalMic『0balance）法 に よ る 分子 間相互 作用の測定 と 解 離 定 数 の 解 析 ： ゼ ラ チ ン お よ びア ル ブ ミ ンと ， ICGと の 分子 間 相 互 作用 を I分 子 間 相互作 用 測 定 QCM装 置 を 用 い て 測 定 し た ． ま た ， ア ル ブ ミ ン に 対 す る ICG， ヒ ア ル ロ ン 酸 ，韜 よび 当 複 合 体 （ ICG￣ gelatin． 且 A（ 9） ） と の 分 子 間 相 互 作 用 の 測 定 も 行 っ た ．
6． 吸 光 ス ペ ク トル の 測 定 ：3． で得 ら れ た 各複 合 体 溶 液に つ い て ，分 光 光 度 計を 用 い て ，500〜 900nmの 範 囲 で 吸 光 ス ペ ク ト ル を 測 定 し た ． な お ， 比 較 対 象 と し て ICG溶 液 の 吸 光 ス ペ ク‑ 340―

ト ル を 測 定 し た ． 同 様 に ， ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン 存 在 下 で 測 定 を 行 っ た．
7.
マウス：8週齢のマウス(ddY，雄）を用いた。
8．近 赤外観 察カメラ による ，マウス 下肢に おける本 複合体の動態の観察：3.
で得られた本複合体溶液を，全身麻酔下にマウス右後肢足底皮下に注射し，右膝窩リンパ飾に韜ける螢光強度の経時的な変化を，近赤外観察カメラを用いて観察した．対照群には，ICG溶液を注射した．
9． マ ウ ス 膝 窩 リ ン パ 節 に お け る 病 理 組 織 学 的 検 討 ： 8． と 同 様 に 調 整 し た ICG，IC
G‑gelatin‑
HA(9)およぴICGーgelatin‑HA(18)の各溶液をマウス右後肢足底に注射し，30分後に安 楽 死 させ ， 右 膝 窩リ ン パ 飾を 摘 出 し、 切 片 標本を作 製して 蛍光顕微 鏡で観 察した．
10.
免 疫組織化 学染色： 8.で得た 膝窩リン パ飾の 一部を， 同様に切片標本を作製して，免疫組織化学染色を施行した，【結果韜よび考察】
ICGと ゼラチン グラフ ト化ヒア ルロン酸 による 複合体は ，水溶 液中では I
CGと ゼラチンとの相互 作用により，ICGを含むゼラチングラフト化ヒアルロン酸分子が複数本集まり，ある大きさをもった粒子を形成していると考えられる．本実験では，ICGに比べて，ICG―ゼラチン―ヒアルロン酸複合体のアルブミンに対する相互作用カが減少している．しかしながら，ヒアルロン酸 とアルブ ミンとの 場合に 比べてKd値は小さぃ，これらのことから，複合体粒子表面には少なからずヒアルロン酸が存在していると考えられる．複合体の表面電位が同じであることも，複合体表面にヒアルロン酸が存在することを示唆している．以上のことから，ゼラチング
ラフト 化ヒアル ロン酸は I
CGと ゼラチン 部分を 介して相 互作用 し，ICGを内部に 含み，表面にヒア ルロン酸 鎖の存在 するナ ノD
DSを 得るこ とができ る，こ れにより ，ICGの 体内でのタンパク質との非特異的相互作用が抑制され，かつ表面にヒアルロン酸が存在することで，前述したヒアルロン酸の特徴を活かせる投与形態となると考えられる．
ICG
水 溶液にお ける吸 光スペク トル曲線は，その濃度にもよるが一般に，ICG分子の二量体による 吸収に対 応する700 nm付近のピ ークと ，ICG分 子の単 量体によ る吸収に 対応する800nm付近の 2っピ ークをも っこと が知られ ている ．本実験 では， ICGのゼ ラチング ラフト化ヒアルロ ン酸によ る複合体 化によ り，700nm付近のピークがなくなり平坦化しつつ，900nmまでの長 波長域に またがる 吸収帯 が現れた ．この ことは， ICGが 複合体化 すること でIC
G分子が単量 体の状態で存在している割合が増えたことを示していると考える．また，ICGが血漿タンパク 等と結合 すること により 800 nm付近の 励起光に よる螢光強度が上昇するのは，ICGが血漿タ ンパク等 と結合す るとICG分子が単量体の状態で存在する割合が増え，励起されるI
CG単量体の量が増加することによるものと考えられる，これらのことから，本研究ではゼラチン
グラフ ト化ヒア ルロン酸 により 複合体化 するこ とでICGのもつ螢光強度を増大させることができたと考えられた．
体内動態の実験では，複合体投与群において，螢光強度のピーク値を示す時間とりンパ飾から消退 するまで の時間は ICG
単 体投与群 と変わ らないも のの， ピーク時 から注射 後2時間程度まで 最大で2倍程度の螢光強度の増加が得られた．全ての実験結果を考慮すると，本複合体の場合には，血漿タンパクと相互作用せず，複合体に取り込まれた状態でりンパ節に移動する
ICG
分 子の量が ，ICG単 体投与 群よりも多いことが理由であると考えられる．な韜，蛍光強度が最大 となる時 間変化パ ターン は変わら ないも のの，注 射後2時間ま ではIC
G単体投 与群の2倍近 くの蛍光強度が持続している．この結果はセンチネルリンパ節生検において臨床的には充分な 持続時間 である， また， 螢光強度 の増加 により， 将来的にはICGとしての投与量を減ら す こ と も 可 能 に な り ， DDS化 に よ る 利 点 は 得 ら れ て い る と 考 え ら れ る ，リンパ管内皮細胞は，LYVE．1をはじめとする数種類のヒアルロン酸レセプターを発現していることが明らかにされてきており，ヒアルロン酸との親和性が高いと考えられている．分子内にア ミノ基を 持ち，ICGと同 じく近赤外領域での螢光を発する，IC
G類似物質にヒアルロン酸をア ミH
吉 合により 修飾し たりンパ 系を標 的とした DDSの報 告では ，ヒアル ロン酸 のりンパ系への親和性を示しており，本複合体が効率よくりンパ系に分布する可能性が高いと考える，【結語】
本研究では，インドシアニングリーン（ICG）を，ゼラチンを化学導入したヒアルロン酸誘導体と ，ゼラチンを介して結合させることでICGを複合体化した，得られた複合体に関して，― 341―

その物性とマウス足底部皮下に注射した場合の下肢におけるりンパ移行性を，ICG単体と比較検討した．その結果，得られた複合体はICG単体よりも高い蛍光強度を もち，効率よくりンパ系に分布する可能性が高いことが示唆さ れた．

‑ 342―

学位論文審査の要旨
主 査

教 授

山 本 有 平副 査

教 授

久 下 裕 司副 査

教 授

松 居 喜 郎学 位 論 文 題 名

新 し い 1フ ン パ 系 イ メ ー ジ ン グ 剤 と し て のインドシアニングリーン標識ヒアルロン酸誘導体の開発
イ ンドシア ニングリ ーン(ICG)
は人体への投与が認められている暗緑青色の化合物であり、血漿中の蛋白質と結合して近赤外領域での螢光を発することが知られている。人体の皮膚は近赤外光を通しやすい性質を有しており、臨床では近年この性質を応用した特殊な赤外観察カメラによるりンパ管造影法やセンチネルリンパ飾生検などで多くの臨床応用例が報告さ れてい る。しか し、ICG自体は 少なか らず毒性をもっこと、体内ではICGはタンパク質と非特異的に相互作用してしまうこと、その結果としての螢光強度が比較的低いことなどの問 題点が あげられ る。本研究ではこれらの問題を解決するために、ICGをドラッグデリバリーシステム(DDS)修飾することを考え、ICG―ゼラチン‐ヒアルロン酸複合体を作製した。用いる高分子材料として、リンパ系に効率良く分布する可能性の高いヒアルロン酸を取り上 げた。 また、ICGはタンパク質と相互作用する性質があるため、臨床応用が可能なタンパク質としてゼラチンを取り上げ、ゼラチンをヒアルロン酸に導入することを考えた。得られた複合体の物性と、マウス足底部皮下に注射した場合の下肢におけるりンパ移行性について、ICG単体と比較検討した。
ICGとゼラ チングラ フト化 ヒアルロ ン酸に よる複合体は、水溶液中ではI
CGとゼラチンとの 相互作 用により 、ICGを含むゼラチングラフト化ヒアルロン酸分子が複数本集まり、ある大きさをもった粒子を形成していると考えられる。そこで、得られた複合体粒子の物性について検討を行ったところ、複合体粒子の大きさと表面電位に、ヒアルロン酸の分子量による差は認めなかった。また、分子間相互作用に関する実験では、ICGに比べて，ICG―ゼラチン―ヒアルロン酸複合体のアルブミンに対する相互作用カが減少していたが、その現象の程度は、ヒアルロン酸とアルブミンとの場合までは低下していなかった。これらのことか
ら、複合体粒子表面には少なくともある程度のヒアルロン酸が存在していると考えられた。
すな わち、 ICGの体 内でのタンパク質との非特異的相互作用が抑制され、かっ表面にヒアルロン酸が存在することで，前述したヒアルロン酸の特徴を活かせる投与形態となると考えられ た。ま た、複合 体の吸 光スペク トル分 析では、ICGが複合体化によりICG分子が単量体の 状態で 存在して いる割合が増えたことを示唆する結果が得られた。ここで、ICGが血漿タンパク等と結合することにより800nm付近の励起光による螢光強度が上昇するのは、ICGが血漿 タンパク 等と結 合すると ICG分 子が単量 体の状態で存在する割合が増え、励起され るICG単量体の 量が増加することによるものと考えられることから、本研究ではゼラチン グラフ ト化ヒア ルロン酸により複合体化することでICGのもつ螢光強度を増大させることができたと考えられた。
マウス下肢におけるりンパ移行性に関する実験では、複合体投与群において、螢光強度のピー ク値を 示す時間 とりンパ節から消退するまでの時間はICG
単体投与群と変わらないもー 343―

のの 、ピーク時から注射後2時間 程度まで最大で2倍程度の螢光強度の増加が得られた。この結果はセンチネルリンパ飾生検において臨床的には充分な持続時間であると考えられる。
リ ンパ管内皮細胞は、LYVE‑1をはじめとする数種類のヒアルロン酸レセプターを発現していることが明らかにされてきており、ヒアルロン酸との親和性が高いと考えられている。
分 子内 に アミ ノ基を持ち、ICGと同じく近赤外領域での螢光を発する、ICG類似物質にヒアル ロン酸をアミド結合により修飾したりンパ系を標的とし たDDSの報告では、ヒアルロン酸のりンパ系への親和性を示しており、本複合体が効率よくりンパ系に分布する可能性が高いと考える。
公 開発表にあたり、副査久下裕司教授から、1）粒子径とりンパ移行性に関する検討について 、2）対照群としてのゼラチ ン．I
CG複合体との比較実験の有無についての質問があった 。次 い で、 副査松居喜郎教授から、1）近赤外螢光観察装置の改良に対する、ICGの修
飾 によ る 螢光 強度の増大の必要性、2）他のヒアルロン酸を材料としたDD
Sの報告と本研
究と の相違点と優位性、3）リンパ系イメージング以外の分野への応用の可能性にっいて質問と コメントがあった。最後に、主査山本有平教授より、1）抗癌剤など他の薬剤への応用の可 能性について、2）臨床応用への今後の展望についての質問とコメントがあった。いずれ の 質 問 に 対 し て も 申 請 者 は 自 ら の 研 究内 容 と文 献を 引用 し、 妥当 な回 答を した 。
こ の論文は、ICGの持っタンパ ク質への非特異的相互作用を利用して、ICGをヒアルロン酸 でDDS修飾 することで複 合体を形成し、ICGのタンパ ク質への非特異的相互作用を減少させつつ、蛍光強度を増加させることに成功しており、また、生体内での螢光強度の増加と、持続時間の延長を可能にした点で高く評価できる。今後、リンパ系イメージング剤だけではな く 、 リ ン パ 系 を 標 的 と し た 新 た な DDSの 開 発 へ っ な が る こ と が 期 待 さ れ る 。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程に韜ける研鑽と取得単位なども併せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け るの に 充分 な資 格を 有す るも のと 判定 した 。

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