プロトコル

ニトログアノシンを検出したい
使用製品

解析装置

Anti-Nitroguanosine polyclonal antibody
Anti-Nitroguanosine monoclonal antibody(Clone#NO2G52)

1.4

I はじめに

1.2
1.0
O.D. 490 nm

8- ニトログアノシンは、一酸化窒素 (NO) とスーパーオキシドラジカルとの反応から生じる過酸化亜硝酸（パーオキシナイ
トライト）や、ミエロパーオキシダーゼ／亜硝酸イオン／過酸化水素、等によってグアノシンがニトロ化されて生成する修飾
1,2）
3,4）
核酸である。これまでに、ウイルス感染 、細菌感染 、炎
5）5）6）
症性疾患 、がん 、喫煙 、などでグアニンのニトロ化が亢進していることが明らかになり、酸化ストレスの新しいバイオマーカーとして注目されている。また最近では、シグナル伝達物質として知られているサイクリック GMP(cGMP) がニトロ化3）された 8 −ニトロ cGMP の生体内での生成が同定され 、活性酸素シグナルの新しいメディエーターとしての機能が示唆され
3, 7-9)ている。

0.80.60.4
0.200.010.1

HOH

II 性質NO2NHOOHNHHNHNNH2H

図 1 8- ニトログアノシンの構造

1. Anti-Nitroguanosine monoclonal antibody(Clone# NO2G52) (Code: AB02)• 動物種 : マウス (BALB/c)• モノクローナル抗体サブタイプ : IgG1
本抗体は、正常な核酸塩基は認識しないが、ニトロ化核酸に対しては、ニトログアノシンのみならずニトログアニン、ニトロキサンチンといったニトロ化塩基や、それらのヌクレオチドであるニトロ cGMP、ニトロ GMP、ニトロ GTP などに対して優れた反応性を示す。このため、本抗体は、グアニンの 8 位がニトロ化されたものを幅広く認識する、グアニンニトロ化のユニバーサルな抗体である。本抗体は、免疫組織染色法に加え、本抗体を樹脂へ固定化して、ニトログアニン誘導体のアフィニ3,6）ティー精製への利用も可能である。
本抗体は熊本大学医学部赤池孝章先生との共同開発によるものである。
• ELISA : 1 μ g/ml

43

10Br-Guanosine
GuanosineXanthinecGMPControl

2. Anti-Nitroguanosine polyclonal antibody(Code: AB01)• 動物種 : ウサギ(日本白色種)
ポリクローナル抗体も 8- ニトログアノシンと 8- ニトログアニンにのみ反応し、正常なグアノシン、グアニンには反応しない。また 8- ヒドロキシグアニンや、3- ニトロチロシンとも交差反応を示さない。ウサギ由来であるためマウスなどげっ歯類の組織染色に適用できる。
(1) 使用濃度例• ELISA : 5 μ g/ml
• 免疫組織染色 : 10 μ g/ml
(2) ポリクローナル抗体の反応性 (IC50(μ mol/l))• 強く反応する (1 μ mol/l)
8-NO2-guanosine, 8-NO2-guanine• 交差反応なし
guanosine, guanine, 8-OH-guanine, 3-NO2-tyrosine
図 3 に主な化合物の反応性の例を示す。
3.02.5• 免疫組織染色 : 10 μ g/ml

• 強く反応する (10 μ mol/l)
8-NO2-guanosine, 8-NO2-guanine, 8-NO2-cGMP, 8-NO2Xanthine• わずかに交差反応あり ( ＞ 1 mmol/l)
8-Br-guanosine, 8-Br-guanine, 8-Cl-guanine• 交差反応なし
guanosine, guanine, 8-OH-guanine, 8-OH-deoxyguanosine,xanthine, adenine, adenosine, thymine, deoxythymidine,uracil, uridine, 3-NO2-tyrosine, 2-NO2-imidazole, cytosine図 2 に主な化合物の反応性の例を示す。

210

図 2 モノクローナル抗体 NO2G52 の反応性

(1) 使用濃度例(2) モノクローナル抗体 NO2G52 の反応性 (IC50 (μ mol/l))

1Conc.(μ mol/l)

NO2-Guanine
NO2-cGMP
NO2-XanthineNO2-Guanosine
Br-cGMPO

その他
機能性
有機材料

[AB01][AB02]

2.0
O.D. 490nm

細 胞
増殖 / 毒性
酸化ストレス分 子
生物学
細 胞 内蛍光プローブ
細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極

1.5NO2-Guanine

1.0NO2-Guanosine
GuanineGuanosine

0.50OH-Guanine
NO2-Tyrosine

10-310-210-1110Conc.(μmol/l)

102103図 3 ポリクロナール抗体の反応性

技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
在庫や価格(記載容量以外もしくはrequest)に関するお問い合わせ：マーケティング部 Tel:096-286-1515 Fax:096-286-1525(株)同仁化学研究所

プロトコル

III 使用例

H. Maeda, "Nitric oxide as an endogenous mutagen for Sendai virus
1)

インフルエンザ感染マウスの肺上皮細胞の染色例である(図 5) 。
1) インフルエンザ感染マウスの肺の凍結切片 (6 μ m) を 2％PLP(periodate-lysine-paraformaldehyde) で固定する。
2) 抗ニトログアノシン抗体 (10 μ g/ml) と反応させる。
3) Alkaline phosphatase 標識の 2 次抗体と反応させる。
4) Vector red substrate kit I にて発色させる。

without antiviral activity", J. Virol. , 2004, 78 , 8709.
3) T. Sawa, M. H. Zaki, T. Okamoto, T. Akuta, Y. Tokutomi, S. KimMitsuyama, H. Ihara, A. Kobayashi, M. Yamamoto, S. Fujii, H.
Arimoto and T. Akaike, "Protein S- guanylation by the biological signal
8-nitroguanosine 3',5'-cyclic monophosphate", Nat. Chem. Biol. ,2007, 3 , 727.
4) M. H. Zaki, S. Fujii, T. Okamoto, S. Islam, S. Khan, K. A. Ahmed, T.
Sawa and T. Akaike, "Cytoprotective function of heme oxygenase
1 induced by a nitrated cyclic nucleotide formed during murine

IV 注意事項
1) 抗体は冷凍品であるが、解凍後は冷蔵にて保管して下さい。
凍結－融解の繰り返しは品質の低下を招きます。
2) ポリクローナル抗体で染まった場合、下記のような確認を行なって下さい。
① 標準の 8- ニトログアニンと競合させて染色されなくなること② ジチオナイト (Sodium hydrosulﬁte) などの還元剤で試料切片を処理して染色性が消失すること。
また、ヒトのサンプルなどでは特異性、力価の高いモノクローナル抗体をご使用下さい。

salmonellosis", J. Immunol. , 2009, 182 , 3746.
5) Y. Terasaki, T. Akuta, M. Terasaki, T. Sawa, T. Mori, T. Okamoto,M.
Ozaki, M. Takeya and T. Akaike, "Guanine nitration in idiopathic
pulmonary fibrosis and its implication for carcinogenesis", Am. J.

Respir. Crit. Care. Med. , 2006, 174 , 665.
6) T. Sawa, M. Tatemichi, T. Akaike, A. Barbin and H. Ohshima,"Analysisof urinary 8-nitroguanine, a marker of nitrative nucleic aciddamage, by high-performance liquid chromatography-electrochemical
detection coupled with immunoafﬁnity puriﬁcation: association withcigarette smoking", Free Radic. Biol. Med. , 2006, 40 , 711.
7) M. Feelisch, "Nitrated cyclic GMP as a new cellular signal, Nat.Chem.

Biol. , 2007, 3 , 687.
8) K. A. Ahmed, T. Sawa, T. Akaike, "Protein cysteine S-guanylation and

参考文献

electrophilic signal transduction by endogeneous nitro-nucleotides",1) T. Akaike, S. Okamoto, T. Sawa, J. Yoshitake, F. Tamura, K.
Ichimori, K. Miyazaki, K. Sasamoto and H. Maeda, "8-nitroguanosine
formationin viral pneumonia and its implication for pathogenesis",

Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 2003, 100 , 685.

Amino Acids , 2011, 41 (1), 123.
9) T. Sawa, H. Arimoto and T. Akaike, "Regulation of redox
signalinginvolving chemical conjugation of protein thiols by nitricoxide and electrophiles", Bioconjugate Chem. , 2010, 21 (7), 1121.

細 胞
増殖 / 毒性酸化ストレス分 子生物学
細 胞 内蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル
化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極その他

2) J. Yoshitake, T. Akaike, T. Akuta, F. Tamura, T. Ogura, H. Esumi and

機能性有機材料

図 5 インフルエンザ感染マウスの肺上皮細胞の染色例
蛍光標識した Anti-Nitroguanosine polyclonal antibody にて検出
（データ提供：熊本大学医学部教授赤池孝章先生）

abc

図 6 RAW264.7 細胞 (murine macrophage cell line) における内因性のグアニンのニトロ化a) 無刺激b) LPS ＋ INF-γ 刺激c) L-NMMA 投与
蛍光標識した Anti-Nitroguanosine monoclonal antibody(clone#NO2G52) にて検出
（データ提供：熊本大学医学部教授赤池孝章先生）

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