2022.9.28 エーエムアール株式会社

難分解性細菌核酸精製キット（5tests）
ジルコニアビーズ法を使って煮沸法で分解しにくい細菌や高濃度細菌懸濁液（5ｘ109cfu/ml未満）200ul から菌体を破砕し、遠心機や吸引器を使わず、SyringeとSilicaColumnで核酸を抽出精製するキットです。約15分で抽出精製が完了します。難分解性
細菌核酸精製キット(50tests)のお試しキットとしてお使いください。5x109cfu/ml以上の菌液を使用すると、カラムの目詰まりがおきてSyringeを使った精製が難しくなりますのでご注意ください。
キットに含まれるもの
EZ-Beads

BacteriaBindSol

1回使用量

備 考

EZ-Beads（5tubes)

1本

細菌破砕用のジルコニア
ビーズが入ったTubes

Bacteria-BindSol(15ml) 1本

3ml

細菌吸着に最適化した
Silica-Column1000専用の結合液

WashSol(20ml)1本

4ml

結合液、脂質、多糖体をカラムから洗い流す洗浄液

Silica Column 1000
5本

1本

核酸を吸着させるためのチップカラムで Feed Syringeに装着して使用（１mlのPipetteにも装着できる）

10ml Feed Syringe
5本

1本

Column1000に装着

ElutSol(500ul）
１本

40～50ulカラムから核酸を溶出させる

5ml Eppen Tube
5本

１本

検体処理容器DNA Stock Tube
5本

１本

カラムから溶出した核酸の保存容器

ProKSol（100ul）
1本

20ul

蛋白分解酵素、4～８℃保存し、５０－６０℃で使用

WashSol

Feed Syringe/
Column 1000

5ml EppenTube

Elute DNAtube

Proteinase K

5ml Heat blockheater(50-60℃）

DisruptoGenie

その他必要なもの:① 5ml Eppen tube用のHeatblock（50～60℃）② ジルコニアビーズでの細胞破砕機はDisruptor Genie（M＆S Instrument社）を使用。あるいは、VortexMixer(破砕力は弱い）。
難分解細菌や菌類の破砕により強力なBeads shaker が必要な場合はM＆S 社や安井機器のBeadsShakerをお試しください。その際は、Beads入り容器が破損することがあるのでBeads容器を専用のものに入れ替える必要があります。

2022.9.28 エーエムアール株式会社

難分解性細菌核酸精製キット（50tests）
ジルコニアビーズ法を使って、煮沸法では分解しにくい細菌検体液や高濃度細菌懸濁液（5ｘ109cfu/ml未満）200ul から菌体を破砕し、遠心機や吸引器を使わず、SyringeとSilica Columnで核酸を抽出精製するキットです。約１５分で抽出精製が完了します。まずは5テストだけの難分解性細菌核酸精製キット(5tests)でお試しください。5x109cfu/ml以上の菌液を使用するとカラムの目詰まりがおきてSyringeを使った精製が難しくなりますのでご注意ください。

キット（50tests）に含まれる標準品目EZ beads
1箱(50本）EZ-Beads 1箱（50本）

細菌を壊すためのジルコニアビーズ入りのtubes

ProkSol

ProKSol（1ｍｌ）
１本破壊した菌液のたんぱくを分解するProteinaseK液（20ul/回）

BacteriaBindSol（150ml）

Bacteria-BindSol（150ml）
１本

難分解細菌をBeadsで分解後、Silica Columnに結合させるために最適化した結合液（3ml/回）

WashSol （200ml）
1本

カラムに付着した結合液、多糖体、脂質を洗浄するための試薬(4ml/回）

ElutSol（2.5ml）
1本カラムに吸着した核酸を溶出させる試薬（40～50ul/回）

Silica Column1000（50本）

核酸を吸着させるための
Silica Column。FeedSyringeを装着させて使用。
1ml Pipetteにも装着できる。

WashSol（200ml）

ElutSol（2.5ml）

Silica Column1000

別途購入が必要な品目
Feed Syringe
10ml

EppenTube
5ｍｌ

5ml Heatblockheater(50-60℃）

DisruptorGenie

10ml Feed Syringe（100本/1箱）

Silica Column 1000を装着して核酸を精製するために使用

5ｍｌ EppenTube（250本/1箱)

検体処理の工程で使用する。

その他必要なもの:① 5ml Eppen tube用のHeatblock heater（50～60℃）② ジルコニアビーズでの細胞破砕機はDisruptor Genie（M＆S Instrument社）を使用。あるいは、
Vortex Mixer(破砕力は弱い）。
難分解細菌や菌類の破砕により強力なBeads shaker が必要な場合はM＆S 社や安井機器のBeadsShakerをお試しください。その際は、Beads入り容器が破損することがあるのでBeads容器を専用のものに入れ替える必要があります。

2022.9.28 エーエムアール株式会社難分解細菌核酸精製手順
１．菌液（5x109cfu/ml未満）200ulをBeads入りtubeにいれ、100℃で3分間煮沸する。その後、1～2分間Disruptor Genieで撹拌して菌体を破砕する。
菌体破砕

２．1mlの生食塩水をチューブに加え攪拌後、1mlを5mlEppenTubeに移し,ProKSol20ulを添加し、50～60℃で3分間かけてたんぱくを消化。その後、BacteriaBindSolをTubeの4mlのメモリまで3ml追加する。
3． 10ml Feed SyringeにColumn1000を装着し、Step2の混合液4mlを全量カラムのSilica面の上まで吸い上げ、次に全量をゆっくりと押し出してカラムのSilicaに核酸を吸着させる。吐出液は廃棄する。

たんぱく分砕＊カラムの先端から水滴が独立して落ちる程度の力で押し出す。強く押し出し、水滴が連結して出るような強い力で押し出すと核酸のカラムへの結合効率率が悪くなる 。

4． WashSol 4mlをEppentubeに加え、全量を吸い上げたのち、強く吐出してカラムを洗浄する。押し出した洗浄液は廃棄する。

核酸吸着

5． Feed Syringe内に10ｍlの空気を取り込み、強く押し出す。この工程を5-10回連続して繰り返し、カラムに付着した洗浄液を押し出してカラムを乾燥させる。
６．ElutSol 40～50ulを空のDNA回収用のTubeに移す。シリンジに装着されたカラムの先端をTissueでふき取り、シリンジでElutSolをカラムのSilica面の上まで、バブルをつくらないようにゆっくりと吸い上げる。Silicaから核酸が遊離するまで約2分待つ。
７.

ElutSolを押し出して核酸を添付の容器に回収する。回収率が悪い場合は吸引・吐出を数回繰り返すと回収率が上がることがある。

細菌の処理液をカラムへ吸着させるには溶菌を確実に行い、さらに 細胞壁成分などの不純物を取り除く必要がある。煮沸とProKSolで十分な溶菌ができない場合は、物理的に細胞壁を破砕する本法（ジルコニアビーズ法）が適している。

実施例
難分解性のLegionella pneumophilaGTC745株（5x109cfu/ml）200ulをBoil 法とBeads法で破砕し、タンパク処理したあとに蒸留水で１mlに増量し、3mlのBindSolを添加した。カラムを通過前後の液の蛍光強度を測定して蛍光強度の減少率を比較した。核酸濃度はdouble Stranded DNA HSキット(Invitrogen社)とQubid4を使用して計測した。
L.ｐneumophilaGTC745 処理法

ProK処理のみ

煮沸/ProK 処理

煮沸/Beads/ProK処理

ProK処理後の検体液濁度の変化

変化なし

変化なし

減少

カラム通過後の蛍光量67～73%

64 ～70%53～61%

カラム吸着率27～33%

30～36%

39～47%

一方、分解しやすいEscherichia coli GTC503株はビーズ処理や、加熱処理しなくても、Proteinasek処理だけで約8割の核酸がカラムに吸着した。
E.ｃoli GTC503菌液処理法

ProK処理のみ

煮沸/ProK処理

煮沸/Beads/ProK処理ProK処理後の検体液濁度の変化

透明化

透明化

透明化

カラム通過後の蛍光量19-24%

10～16%

8～13％

カラム吸着率76～81%

84～90％

87～92％＊ビーズ破砕にはM&S instrument社のDisruptor Genieを使用した。

洗浄

核酸溶出