動物生命機能学実験

性染色体による性決定は動物種で異なるウズラの性染色体はZW型であり、 ZZが雄♂、ZWが雌♀ である。

Genotyping (遺伝子型判定) とは目的：
PCR による genotyping によって、ウズラの雌雄を鑑別する。
Genotyping (遺伝子型判定) とは、ゲノムDNAの配列を識別し、ある個体と別の個体の遺伝子型の違いを検出することである。
方法：• PCR（ゲノムDNAのある領域の長さの違いを識別する）
PCR: polymerase chain reaction (ポリメラーゼ連鎖反応)

PCR: polymerase chain reaction
センスプライマーとアンチセンスプライマーで挟まれた領域の長さが雌雄で異なれば、PCR によって（PCR産物の長さを調べることで）雌雄を鑑別することができる。
ウズラの性染色体にあるCHD1 (chromodomain helicase DNA binding protein 1)
遺伝子の第16イントロンの長さは、Z染色体とW染色体で異なる。

Z染色体

Exon 16Intron 16Exon 17

Exon 16
センスプライマー

W染色体

Exon 17
アンチセンスプライマー

Exon 16 Intron 16 Exon 17
Exon 16
センスプライマー

Exon 17
アンチセンスプライマー

NaOH (強アルカリ塩) による細胞破壊
NaOH などの強アルカリ塩は強力な脱脂作用やタンパク質変性作用を示す。
これらは、NaOH による炭化水素の加水分解反応である。

DNA の方向性

ヌクレオチドのデオキシリボースは5’ の位置でリン酸と結合している。
また、3’ の位置で隣のヌクレオチドとリン酸結合している。
G と C は3つの水素結合で対合している。
A と T は2つの水素結合で対合している。

PCR: polymerase chain reaction

5’3’
5’

センス鎖

3’
3’ 5’
アンチセンスプライマー

鋳型DNA

5’
3’

5’

5’

3’

5’
3’
3’

3’

3’

5’

3’
5’
3’

5’
3’

5’5’3’
5’

5’
3’

3’
5’

5’

3’
5’

3’

3’
5’

5’
3’5’
3’
センスプライマー
5’ 3’
3’
5’
アンチセンス鎖

3’5’

5’

3’

3’
5’

3’

5’

3’
5’
3’

5’
3’

5’

5’
3’

3’
5’

5’
3’

5’

5’

3’

3’
3’
5’

プライマー (primer): 鋳型DNAと相補的に結合する短い1本鎖DNA
DNA (RNAも) は常に 5’ から 3’ に向かって合成される。
センスプライマーとアンチセンスプライマーで挟まれた領域が複製される。

3’5’

PCR: polymerase chain reaction
deoxynucleotide triphosphate
デオキシヌクレオチド三リン酸(dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
C

プライマーT AA T

鋳型DNA

G G C TC C G AC AG A

C A G A
T

DNA合成酵素

GG T

PCR: polymerase chain reaction

伸長：DNAポリメラーゼがDNAを合成する

変性：二本鎖DNAを一本鎖に解離する

アニーリング：鋳型DNAにプライマーを対合させる

Taq DNA ポリメラーゼ

好熱菌 Thermus aquaticus が産生するDNAポリメラーゼ。
90℃以上の高温でも比較的安定。
90℃以上で変性を繰り返すPCRでも使える！

PCR反応液の組成

ゲノムDNA:
AとBの2種類
プライマーペア：
F0/R0~F6/R6の7種類
2 x 7 = 14本のチューブが必要

8連PCRチューブ
ウズラゲノムDNA+グループ番号

プライマー番号+ウズラゲノムDNA

グループ番号（サンプルは入れない）

サーマルサイクラー

2018/10/26 動物生命機能学実験 高谷 智英

0. マイクロピペッターの操作

0.1. 目的
マイクロピペッターの機構を理解し、正しく操作することで、正確な容量の溶液を計量できるようにする。

1. ウズラゲノム DNA の調整

1.1. 目的アルカリ抽出法により、ウズラの血液サンプル（A と B の二種類）から、ゲノム DNA を調整する。強アルカリ性の溶液で血球細胞を破壊し、細胞核内のゲノム DNA を溶出させ、PCR に用いることが可能なゲノム DNA 溶液を調整する。
1.2. 材料

ウズラ血液サンプル（「A」と「B」の 2 種類）



1.5 ml サンプルチューブ（「A」と「B」の 2 種類）



0.2 N NaOH



0.04 M Tris-HCl 緩衝液 (pH 8.0)

1.3. 方法1.

1.5 ml サンプルチューブに、80 ul の 0.2 N NaOH を入れる。

2.

上のチューブに、2 ul のウズラ血液サンプルを加える。

3.

チューブをタッピングしてよく混ぜる。

4.

チューブを遠心機でスピンダウンする。

5.

75℃で 20 分間、チューブを反応させる。

6.

上のチューブに、720 ul の 0.04 M Tris-HCl (pH8.0) を加えて中和する。

7.

チューブをタッピングしてよく混ぜる。

8.

これを「ウズラゲノム DNA 溶液」とする。

1.4. 課題（最終レポートに、以下の設問に対する解答を盛り込むこと）
NaOH で溶出したゲノム DNA の溶液を Tris-HCl で中和するのはなぜか？

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2018/10/26 動物生命機能学実験 高谷 智英

2. PCR 反応液の調整

2.1. 目的ウズラゲノム DNA 溶液を鋳型とし、前回の実習で設計したプライマーで CHD1 遺伝子の、exon 16~intron16~exon 17 の領域を増幅する。PCR の原理を理解し、PCR 反応液を正しく調整する。
2.2. 材料


1.5 ml サンプルチューブ（「Mix」）



8 連 PCR チューブ 2 セット（「AX」と「BX」。X はグループ番号）

滅菌蒸留水（「H2O」）



10×PCR 緩衝液（「10×buf」）



2.5 mM dNTP 混合液DNA ポリメラーゼ（「ExTaq」）



ウズラゲノム DNA 溶液（「A」と「B」の 2 種類）

10 uM プライマー（F0~F6, R0~R6 の 14 種類）別紙参照
誰がどのプライマーを担当するか決める。

自分の担当プライマー：

2.3. PCR 反応液の組成
1 サンプル分

15 サンプル分（Mix）

滅菌蒸留水（H2O）

12.3 ulul

10×PCR 緩衝液（10×buf）

2.0 ulul

2.5 mM dNTP 混合液

1.6 ulul

DNA ポリメラーゼ（ExTaq）

0.1 ulul

ウズラゲノム DNA 溶液（A or B）

2.0 ul

10 uM プライマー（F）

1.0 ul

10 uM プライマー（R）

1.0 ul

合計

20.0 ul

2.4. PCR 反応液 Mix の作成
1.

1.5 ml サンプルチューブに、蒸留水、10×buf、2.5 mM dNTP、ExTaq を、この順番で加える。

2.

チューブをタッピングしてよく混ぜる。

3.

チューブを遠心機でスピンダウンする。

4.

チューブを氷上に置く。

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2018/10/26 動物生命機能学実験 高谷 智英

2.5. PCR 反応液の調整
8連A0A

1A

2A

3A

4A

5A

6A

Mix（＿＿＿ul）+++++++

ゲノム DNA 2 ul

AAA

A

A

A

A

プライマーF 1 ul

F0

F1F2F3F4F5F6プライマーR 1 ul

R0

R1R2R3R4R5R68連B

0B

1B

2B

3B

4B

5B

6B

Mix（＿＿＿ ul）+++++++

ゲノム DNA 2 ul

B

B

B

B

B

B

B

プライマーF 1 ul

F0

F1F2F3F4F5F6プライマーR 1 ulR0R1R2R3R4R5R61.

8 連 PCR チューブに、ul の PCR 反応液 Mix を入れる。

2.

上のチューブに、2 ul のウズラゲノム DNA 溶液を入れる。
＊チップの先を PCR 反応液 Mix の中に差し込み、ウズラゲノム DNA 溶液を確実に PCR 反応液 Mix に加える。

3.

上のチューブに、1 ul のプライマーCHD-Fを入れる。

＊ウズラゲノム DNA 溶液と同様に、確実にプライマーを加える。
4.

上のチューブに、1 ul のプライマーCHD-Rを入れる。

5.

全てのチューブに全ての溶液を加え終わったら、チューブキャップを取り付ける。

6.

チューブをタッピングしてよく混ぜる。

7.

チューブを遠心機でスピンダウンする。

8.

8 連チューブを氷上に置く。

2.6. 課題（最終レポートに、以下の設問に対する解答を盛り込むこと）


PCR 反応液 Mix を作成するとき、蒸留水、10×buf、2.5 mM dNTP、ExTaq の順番で加えるのはなぜか？

Taq が入っているチューブを氷上に置くのはなぜか？

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2018/10/26 動物生命機能学実験 高谷 智英

3. PCR 反応

サーマルサイクラーを用い、以下の条件で PCR 反応を行う。

予備変性

95℃, 2 分

変性

98℃, 10 秒

アニーリング（for F1-6/R1-6））

55℃, 30 秒

伸長（1 kb/min）

72℃, 30 秒

変性

98℃, 10 秒

アニーリング（for F0/R0）50℃, 30 秒

伸長（1 kb/min）

72℃, 30 秒

最終伸長

72℃, 2 分

冷却4℃

ゲノム DNA を完全に解離する
x15 サイクル

x15 サイクル

PCR 反応が終了したら、チューブを-20℃で保存する。

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プライマー名
CHD1-F0
CHD1-R0
CHD1-F1
CHD1-R1
CHD1-F2CHD1-R2
CHD1-F3
CHD1-R3
CHD1-F4
CHD1-R4
CHD1-F5CHD1-R5CHD1-F6CHD1-R6

配列 (5'-3')

GTTACTGATTCGTCTACGAGA
ATTGAAATGATCCAGTGCTTG
CATTTGATACGTAGCAGCGG
TCCAGTGCTTGTTTCCTCAGGAGGATGCTGGACATCCTAG
GTGCTTGTTTCCTCAGTTCC
AGTTTCCCGCTGCTACGTATCGAGGAAACAAGCACTGGATCAAGAACGTGGCAACAGAGTTC
CTCTGATCCTTCTGCATTGAGAACGTGGCAACAGAGTTCT
CTTGTTTCCTCAGTTCCCCTATTGATACGTAGCAGCGGG
GCATTGAAATGATCCAGTGC

長さ

GC含有量

Tm

PCR産物の長さ (bp)(base)(%)

(℃)

Z染色体

W染色体

2142.951.2

2138.151.3

6144462050.0

63.1

2050.063.06454772055.0

61.2

2050.061.3

5433752152.064.1

2148.0

64.1

643

475

20

50.0

61.9

2045.060.5

611

443

2050.061.9

2050.062.0578

410

1953.0

62.6

20

45.0

63.0656486

PCR
1. PCR の原理
PCR とは、Polymerase Chain Reaction の略である。文字通り DNA ポリメラーゼを用いて連鎖反応的に DNA を増幅する方法である。PCR 法の開発は、分子生物学のみならず、さまざまな分野に影響を与えた。
PCR の原理は、増幅したい DNA とその両端の配列に相補的な一対の DNA プライマーおよび耐熱性 DNA ポリメラーゼを用いて、3 段階の温度変化を n サイクル繰り返すことによって標的図DNA を 2n 倍に増幅することにある。温度変化の第 1 段階（94 〜96℃）で、標的二本鎖 DNA を熱変性して一本鎖とし、第 2 段階（55〜 60℃）でプライマーを一本鎖 DNA にアニーリングさせ、第 3段階（72 〜 74℃）で伸長反応を進める。1 サイクルで標的 DNAは 2 倍になる。従って理論的には n サイクルの反応で標的 DNAは 2n 倍に増幅されるので 20 サイクルでは約 100 万倍に増幅されることになる。実際には数 100 万倍まで増幅することができる。

PCR 法による DNA 増幅の原理

2. PCR に影響を与える因子

プライマーのアニーリング温度は、Tm 値より 5℃程低い温度がよく、通常 55 〜 60℃である。アニーリング温度が高いほど特異性は高くなる。0.2 mol/ のプライマーは数秒間でアニー

このように PCR は非常に簡単に DNA を増幅できるわけであるが、さまざまな反応条件によって影響を受けるので、行う実験によって反応条件の最適化を行った方がよい。
DNA ポリメ
ラーゼを用いた PCR に影響を与える因子について以下に簡単に解説する。

リングする。
伸長反応の温度は、72℃が多く用いられる。合成速度は、他の反応条件にもよるが、1 秒間で 35 〜 100 ヌクレオチドである。

酵素濃度

サイクル数

DNA ポリメラーゼは、通常 1 〜 2.5 units/100 反応液で使用される。一般に濃度が高すぎると非特異的産物が出現することがあり、逆に濃度が低すぎると増幅が不十分になる。

サイクル数は多いほど増幅度は高くなるが、同時に非特異的産物が増加する。40 サイクルを越えないことが望ましい。理論的には指数関数的に増幅するが、実際にはプラトーになる。プラトーになる条件は、反応条件により異なる。

dNTP 濃度dNTP 濃 度 は 通 常 そ れ ぞ れ 20 〜 200 mol/ で あ る。 各
dNTP の濃度は同一でないと誤った取り込みによるエラーが生じる原因になる。特異性と忠実度は、dNTP 濃度が低いほど高くなる。理論的には、100 反応液で 20 mol/ の各 dNTP が存在すれば、2.6 g の DNA が合成できる。

Mg2 ＋濃度

Basic Protocol

25

通常、総 dNTP 濃度より 0.5 〜 2.5 mmol/ 高い濃度が採用される。鋳型 DNA やプライマーから持ち込まれる EDTA などのキレート剤の濃度に注意しなければならない。

その他
pH も PCR に 影 響 を お よ ぼ す。 通 常 10 〜 50 mmol/ TrisHCI（ pH 8.3 〜 8.8 at 20℃）が用いられる。また、塩濃度、ゼラチンや非イオン性界面活性剤の存在によっても影響を受ける。
PCR は非常に高温で反応を行うため、反応液中の水分が蒸発し、組成が変わってしまう。反応液にミネラルオイルを重層することにより水分の蒸発を防ぐことができる（サーマルサイクラーの種類によってはミネラルオイルが必要ないものもある）。

3. PCR の実際
プライマーの設計

プライマー
プライマーは、通常 18 〜 28 ヌクレオチド長で、G＋C 含量が50 〜 60% で、Tm 値が 55 〜 80℃となるように設計する。2 つのプライマーはそれぞれ 0.1 〜 0.5 mol/ で使用する。

温度
変性温度は高いほど特異性や増幅度が高くなるが、逆にDNA ポリメラーゼの活性低下を早めるので、普通は 94 〜 96℃で 15 〜 30 秒間である。

プライマーの設計上のポイントは以下の通りである。
① 両プライマーの Tm 値が同程度であること。
② プライマーの 3′末端側の塩基配列が正確であること。
③ プライマーの 3′末端どうしが相補的でないこと。
④ G＋C 含量があまり高くないこと（50 〜 60％がよい）。特にプライマーの 3′末端側に G＋C リッチな領域がないようにする。
⑤ プライマー自身がヘアピンのような高次構造をとらないこと。

438http://www.wako-chem.co.jp

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マイクロピペッターの使い方■はじめに
マイクロピペッターは、1ml以下の微量の液体を測り採る器具である。ピストンを上下することにより空気を出し入れすることができる構造で、ピストンの上下する距離をダイヤルで細かく調整し、出し入れする空気の量を細かく調節できるため、計量する液体の量を正確に調節できる。種類によって、使うチップと計量可能な範囲が異なるので、ともに適したサイズのものを使用する。デリケートな器具である
ので、取り扱いに注意する。

■手順①計量する容量にあわせてマイクロピペッターとチップを選ぶ(図１)注１。

図１．マイクロピペッターとチップ
この機種の場合、奥の P1000 はブルーのチップを手前の p20 と p200 では、イエローチップを使用する。

②ダイヤルを回して、いったん、計量する容量より多めの数字に合わせ、ゆっくりとダイヤルを戻して、計量する量にあわせる(図２)。注２

図２．メモリ調整ダイヤル（右）とマイクロピペッターの目盛り(左)ここで表示されている目盛で、P20 の場合は、10μl
P200 の場合は、100μl
P1000 の場合は、1000μl 測りとることになる。

③マイクロピペッターは、図３のように片手でしっかり握りこむように持ち、親指でプッシュロッドを操作する。注３

図３．マイクロピペッターの持ち方④チップラックに入ったチップにマイクロピペッターを差し込み、軽くトントンと叩くようにして装着する（図４）。

図４．チップの装着⑤プッシュロッドを第１ストップまで押した状態で、チップの先端を液面につける。
（図５参照）⑥ゆっくりプッシュロッドを押さえていた指を離し、液体を吸い上げる。
⑦測りとる容器に移動し、ゆっくりと第１ストップまで押し、液を排出し、さらに第２ストップまでプッシュロッドを押し下げて、チップ内の液を完全に排出する。
（図５参照）⑧プッシュロッドを押さえていた指をゆっくりと離し、プッシュロッドを元の位置にもどす。
⑨チップ回収ボックスの中で、チップイジェクターボタンを押して、チップをはずす。（図５参照）

図５．プッシュロッドの位置