研究用試薬

文書番号：IM­KOGHS080519J

高感度 8-OHdG Check 使用説明書
本キットは、8­OHdG（8­ヒドロキシデオキシグアノシン）に特異的なモノクローナル抗体を使用する ELISA（enzyme­linkedimmunosorbent assay）キットで、生体試料中の 8­OHdG を簡便に測定するものです。
本キットは研究用です。臨床検査／診断／治療など研究以外の用途に用いることはできません。

1. キットの構成①反応プレート②第一抗体③第一抗体溶解液④第二抗体⑤第二抗体溶解液⑥発色剤⑦発色剤希釈液⑧洗浄液⑨反応停止液⑩8­OHdG 標準液⑪プレートシール：8­OHdG 固相化プレート(8×12 ウェル、分割式)：モノクローナル抗体：1% BSA, 0.05% Tween­20/リン酸緩衝生理食塩液：酵素標識抗体：リン酸緩衝生理食塩液：3,3',5,5'－テトラメチルベンジジン：過酸化水素水/クエン酸リン酸緩衝生理食塩液：0.05% Tween­20/リン酸緩衝生理食塩液（5 倍濃縮）
：1M リン酸：0.125, 0.25, 0.5, 1, 4, 10 ng/ml

1枚1瓶
1 瓶（約 6ml）
1瓶
1 瓶（約 12ml）
1 瓶（約 0.25ml）
1 瓶（約 12ml）
2 瓶（約 26ml/瓶）
1 瓶（約 12ml）
各 1 瓶（各約 1ml）
２枚

＊保存方法‥‥‥‥冷蔵庫（2～8℃）に保管してください。
＊有効期間‥‥‥‥製造後 9 ヶ月（反応プレート及び瓶の開封後は 2 週間以内にご使用ください）。

2. 必要な機器①50µl 用マイクロピペット及びチップ②8 チャンネルマイクロピペット及びチップ（50～200µl）③8 チャンネルマイクロピペット用トレイ④冷蔵庫（4℃付近で温度が安定していること）⑤マイクロプレートリーダー（測定波長 450nm）⑥蒸留水

3. 測定原理：試薬およびサンプルの分注用：試薬の分注用：試薬の分注用：一次抗体反応用：吸光度測定用：洗浄液調製用① 8­OHdG を固相化しているマイクロプレートに、調製した試料または 8­OHdG 標準液①The8­OHdG monoclonal antibody and the sample or standardと特異的に反応するため、
are added to the microtiterとモノクローナル抗体を加えます。この抗体は、8­OHdG
plate
which
has beenprecoated with 8­OHdG
8­OHdG. に対し競争的に反応するので、試料中のThe 8­OHdG monoclonal antibody reacts
固相化8­OHdG
および試料中のcompetitivelywith
the8­OHdG
boundontheplateand the 8­OHdGin samples
solution.
8­OHdG 量が多いと、そこに結合する抗体が多くなり、固相化
8­OHdGと結合するモ
Therefore higher concentrations of 8­OHdG in the sample solution lead to a reduced
ノクローナル抗体量は減少します。
binding of the antibody to the 8­OHdG on the plate.
② 洗浄により、試料中の 8­OHdG と結合したモノクローナル抗体が除去されます。（よ②The antibodies which are bound to the 8­OHdG in the sample are washed away from theって、固相化 8­OHdG と結合した抗体のみがここで残ります。
）
antibodies that have bound to the 8­OHdG coated on the plate.
③ 酵素標識抗体を加えます。これは、固相化 8­OHdG と結合したモノクローナル抗体と③An enzyme­labeled secondary antibody, which is added to the plate, binds to the結合します。
monoclonal antibody which is bound to the 8­OHdG coated on the plate.
④ 洗浄により、結合しなかった酵素標識抗体が除去されます。
④Unbound enzyme­labeled secondary antibody is removed by a wash step.
⑤ 発色液を加えると、酵素標識抗体の酵素活性により呈色（青色）します。
⑤Addition of a chromatic substrate results in the development of color in proportion to theamountof antibody bound to the plate.
⑥
反応停止液を加え、発色反応を停止し、吸光度を測定します(反応液は黄色になります)。試料中の 8­OHdG 量が多いほど、吸光度は低くなります（色が薄くなります）。
⑥The color reaction is terminated and the absorbance is measured.

­1­

4. 実験操作
以下の実験操作は、キットを常温に戻して行ってください。
① 第一抗体の瓶に第一抗体溶解液を全量加え、完全に溶かします。（※第一抗体溶解液は希釈せずにそのままご使用ください。
）② 8­OHdG 標準液（0.125, 0.25, 0.5, 1, 4, 10 ng/ml）50µl をウェルに分注します。同様に、調製した試料 50µl も分注します。
③ 続いて各ウェルに第一抗体溶液を 50µl ずつ分注し、プレートを左右に振動させ、よく混合します。プレートをシールし、4℃で 1 晩反応させます。
④ 反応終了後、ウェルの反応液を捨て、蒸留水で 5 倍希釈した洗浄液 250µl を分注します。プレートを左右に振動させ、よく洗浄し洗浄液を捨てます。これを 3 回繰り返します。反応液を捨てる際には、プレートを上下反転させ、手作業にて液を完全に切ってください。アスピレーターや自動洗浄装置は適用できません。
⑤ 第二抗体の瓶に、第二抗体溶解液を全量加え、完全に溶解します。
⑥ 第二抗体溶液 100µl を第一抗体と反応させたウェルに分注し、プレートを左右に振動させよく混合します。
プレートをシールし、常温で 1 時間反応させます。
⑦ 発色剤溶液を調製します。発色剤を発色剤希釈液で 100 倍希釈してください。
⑧ 反応終了後、ウェルの反応液を捨て、洗浄液 250µl を分注し、④と同様に洗浄を行います。洗浄液がウェルに残っていると発色反応を阻害するので、残らないように注意してください。
⑨ ⑦で調製した発色剤溶液 100µl を各ウェルに分注しよく混合します。プレートをシールし、常温で 15 分間反応させます。反応中はアルミホイル等でプレートを包み、遮光してください。
⑩ 反応停止液 100µl をウェルに加え、反応を停止させます。
⑪ 定量
反応停止後、プレートを時々振動させ、マイクロプレートリーダーを使用して 450nm における吸光度を測定します。
1)標準曲線作成
標準液の濃度と吸光度（または透過率）との関係を片対数グラフ用紙（濃度を対数にとる）にプロットし、8­OHdG の標準曲線を作成します。
2)上記の標準曲線を用い、各サンプルの吸光度（または透過率）から 8­OHdG の濃度を読み取り、試料中の 8­OHdG の濃度を計算します。

注意事項

ホームページ（http://www.jaica.com/biotech）に最新の技術情報など掲載しております。

１）サンプルの前処理
下記のようなケースでは正しく測定できない場合がありますので、測定前に前処理を行ってください。またサンプルの凍結融解は避けてください。対象サンプルについて 8­OHdG 標準液を使用した添加回収試験を実施し、前処理を含む測定法の適正を確認されることをお奨めします。サンプル希釈は PBS で行ってください
a. 尿サンプル：濁り、沈殿物、析出物が見られる場合には 2000～5000G で 10 分程度遠心を行い、上清を測定してください。添加回収試験の結果、回収率が高い場合には PBS にて 3 倍程度希釈してみてください。
b. 血清サンプル：採血後はできるだけ速やかに血清を分離してください。血清中の高分子成分の影響を除去するため、分画分子量 10,000 の限外濾過膜による濾過処理を行ってください。濾過後のサンプルを PBSで 2 倍以上に希釈すると再現性が高まります。
c. 組織 DNA：組織から DNA を抽出し、加水分解処理を行ってから測定してください。
２）測定
a. サンプル（50μL）と一次抗体（50μL）の分注精度は測定値に大きな影響を与えます。
b. インキュベート時の温度は測定値の精度や再現性に大きな影響を与えます。温度と時間を厳密に管理してください。
c. サンプルのｐH は 6～8 が最適です。
d. プレート洗浄時に液がウェル内に残っていると測定値に影響を与える場合があります。洗浄後はペーパータオルに叩き付ける等して完全に除去してください。ウェル内には触れないでください。
e. 発色剤溶液を調製する際の攪拌は穏やかにおこなってください。
３）分割使用の際の注意点
a. キットを分割使用する場合には、今回使用しないウェルを予め取り外してから操作を開始してください。
b. 残った反応プレートは入っていた袋に入れ、残った試薬とともに冷蔵保存し２週間以内にご使用ください。
c. 調製した発色剤溶液は保存できません。分割使用される場合にはその都度必要量だけを調製してください。

­2­４）ウェルの配置
a. エッジ効果が見られる場合がありますので、最も外側のウェルの使用はご注意ください。各ウェルの温度を一定に保つため、分析に用いないウェルにも他のウェルと同様に分注を行ってください（溶液は試薬でなくてもかまいません）。
b. ブランクを用いる場合、実験操作③で第一抗体溶液の代わりにリン酸バッファー等を加えるとそのウェルは発色せず、ブランクウェルとなります。
c. 下図はプレート使用の一例です。1 サンプルにつき 3 ウェルずつを使用し、A、H 行のウェルは分析に使用していません（図では×印）。この方法では、プレート 1 枚で 18 サンプルの分析ができます。
123ABlank (×3)
B 標準 0.125ng/ml (×3)
C0.25ng/ml (〃)D
0.5ng/ml (〃)E1ng/ml (〃)F4ng/ml (〃)G10ng/ml (〃)H×××45××123456××678×××789101112×(×3)(〃)(〃)(〃)(〃)(〃)××91011×××131415161718×(×3)(〃)(〃)(〃)(〃)(〃)××12×(×3)(〃)(〃)(〃)(〃)(〃)×

5. 検量線
標準的な検量線
1.2

Abs. at 450nm

1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0.1

1108-OHdG (ng/ml)

6. 関連文献
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8.

S.Okamoto, and H.Ochi: Chemical Abst. 129859a (1992)
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MD.Evans, MS.Cooke, ID.Podmore, Q. Zheng, KE.Herbert, and J.Lunec: Discrepancies in the measurement ofUVC­induced 8­oxo­2'­deoxyguanosine: Implications for the analysis of oxidative DNA damage. Biochemical andBiophysical Research Communications 259, 374­378 (1999)
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WenYing Fan, Kazunori Ogusu, Katsuyasu Kouda, Harunobu Nakamura, Tomoaki Satoh, Hirotomo Ochi and Hiroichi
Takeuchi. Reduced oxidative DNA damage by vegetable juice intake: A controlled trial. J Physiol Anthropol 19(6)pp287­289 (2000)
蔵重 淳. 「DNA 酸化損傷バイオマーカー8­OHdG の測定」臨床検査 45(3) pp271­280 (2001)­3­7. 測定法フローチャート
試薬の調製

サンプルの調製

第一抗体

第一抗体反応反応プレートへの分注
サンプル又は標準液 50µl
第一抗体溶液 50µl
4℃ 1晩反応

第二抗体

洗浄

3回
洗浄液 250µl

第二抗体反応第二抗体溶液 100µl
常温 1時間反応

洗浄

3回

試薬の調製
洗浄液 250µl
発色剤溶液

発色反応
発色剤溶液 100µl
常温、遮光 15分間反応

反応停止
反応停止液 100µl

吸光度測定
波長450nm8­OHdGの定量【開発・製造元】日本老化制御研究所〒437­0122 静岡県袋井市春岡710­1
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