プロトコル

細胞内塩化物イオンを測定したい

細 胞
増殖 / 毒性酸化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内蛍光プローブ
細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極解析装置

使用製品
MQAE[M024]CH3O

I はじめに細胞膜を介する塩化物イオンの輸送は、細胞の生理機能に関係し、生物学的に重要な研究課題である。従来、細胞内の塩化物イオン濃度の測定には同位体をトレーサーとする方法や、イ1,2)
オン選択性電極を用いる方法等が知られているが、応答速度や使いやすさに問題があった。
3-7)
6-9)
これらの問題を解決するため、SPQや MQAEのような蛍光試薬を用いる方法が開発され、さまざまな細胞中の塩化物イオン濃度の測定に利用されている。SPQ や MQAE
は塩化物イオン濃度の増加とともに蛍光強度が減少する。蛍光強度と塩化物イオン濃度との関係は Stern-Volmer 則に従い、次式により示される。
F0/F=1 ＋ Kq[Cl ]F0 : 試薬の蛍光強度
F : Cl 存在下の蛍光強度-1Kq : 消光係数 (mol )塩化物イオンによる SPQ や MQAE の蛍光強度の減少速度は1 msec 以下であり、十分な応答速度である。また、塩化物イオンのない場合の蛍光強度は SPQ と MQAE はほぼ同じである
7)が、
MQAE の消光係数は SPQ の約 1.5 倍である (図 1)。従って、塩化物イオンの濃度変化に対する感度は MQAE の方が優れている。SPQ や MQAE の蛍光強度は、塩化物イオンだけでなく
7)
Br , I や SCN イオンにより大きく減少する 。また、クエン酸のような有機酸によってもやや減少するが、生体内のアニオン
237)(NO3 , SO4 , HCO3 や PO4 ) による影響はない (表 1)。
SPQ や MQAE は高い水溶性と膜透過性を持っているが、これらの蛍光試薬を細胞内に導入する際には、細胞の種類によって導入方法を工夫する必要がある。一般に、神経細胞の場合には、これらの蛍光試薬を含む緩衝液中で培養するだけで細胞内に蛍光試薬が導入できる。一方、腎細胞の場合には導入が難し
7,10,11)
く、界面活性剤や低張液ショックを用いたり、マイクロ12)
インジェクションにより導入する必要がある 。ここでは、ラット培養海馬神経細胞への導入及び細胞内塩化物イオン濃度の8)測定例について述べる 。
表 1 MQAE の蛍光強度に対する陰イオンの影響
励起波長 蛍光波長(nm)
(nm)
MQAE

355458-1Cl-200

消光係数 (M )BrI
SCN citrate
293456410121041BrNOOF0/F6MQAE4SPQ2002040[Cl-] (mmol/l)

図 1 Stern-Volmer Plot6080MQAE
M.W.: 326.19

II 試 薬●分別用培地 -1
DME 基礎培地 (pH7.4 ± 0.05)
10 mmol
TES(Code: GB18)
10 mmol
HEPES(Code: GB10)
2 mmolL- グルタミン
100 μg/ml
ストレプトマイシン
100 IU/ml
ペニシリン G
10%
ウマ血清
10%
ウシ胎児血清
●増殖用培地DME 基礎培地 (pH7.4 ± 0.05)
10 mmol
TES
10 mmol
HEPES
2 mmolL- グルタミン
100 μg/ml
ストレプトマイシン
100 IU/ml
ペニシリン G
10%
ウマ血清

その他
機能性有機材料●分別用培地 -2
DME 基礎培地 (pH7.4 ± 0.05)
10 mmol
TES
10 mmol
HEPES
2 mmolL- グルタミン
20 μmolL-arabinoside
100 μg/ml
ストレプトマイシン
100 IU/ml
ペニシリン G10%ウマ血清●蛍光試薬導入用緩衝液
Krebs-HEPES 緩衝液 (pH7.3 ± 0.05)
20 mmol
HEPES128 mmol
NaCl
2.5 mmol
KCl2.7 mmol
CaCl21 mmol
MgSO416 mmol
グルコース5 mmol
MQAE (Code: M024)●検量線作成用緩衝液

8CH2CH34)

Krebs-HEPES 緩衝液 (pH7.3±0.05)
20 mmol
HEPES+0 mmol
Na+135 mmol
K1～135 mmol
Cl135～1 mmol
NO35 μmol
nigericin
10 μmolvalinomycin
10 μmol
トリブチルすず※塩化物イオン濃度と硝酸イオン濃度の和を 135 mmol/l となるように調製する。また、ナトリウム塩は用いない。

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88プロトコル

その他
機能性有機材料●洗浄・測定用緩衝液
Krebs-HEPES 緩衝液 (pH7.3±0.05)
20 mmol
HEPES
128 mmolNaCl
2.5 mmolKCl
2.7 mmol
CaCl2
1 mmolMgSO416 mmol
グルコース

2. 検量線の作成と細胞内の塩化物イオンの濃度の定量

III 方法
1. 細胞内塩化物イオン濃度の蛍光測定法
13)1) ラット海馬神経細胞の取得
Wistar ラットの 18 日齢の胚から Banker と Cowan の報文に記載の方法により取得する。
2) 細胞培養
ポリ -L- リジンをコートしたカバーグラス上に細胞を播種し、培養ディッシュのなかで分別用培地 -1 中で、4 日間培養する (37℃、5％ 炭酸ガス)。
3) 細胞培養
増殖用培地中で 7～14 日間培養する。(37℃、5％炭酸ガス)。
培養開始 4 日目に分別用培地 -2 に変更し、24 時間培養する。
(37℃、5% 炭酸ガス)。次に、増殖用培地中で培養を継続する。
4) 洗浄用緩衝液で 3 回洗浄する。
5) 蛍光試薬の細胞内への導入
蛍光試薬導入用緩衝液中で 37℃、1 時間培養する。
6) 洗浄用緩衝液で 5 回以上洗浄する。
7) 蛍光測定
32℃の測定用培地にて蛍光顕微鏡 ( 励起波長 360 nm、蛍光波長 510 nm) により蛍光測定を行う。
8) 蛍光測定／刺激物質
例：終濃度 0.3 mmol/l ethacrynic acid 添加。
32℃の測定用培地中にて蛍光顕微鏡 ( 励起波長 360nm、蛍光波長 510 nm) により蛍光測定を行う。
150% Fluorescence ᳨㔞⥺ࢧࣥࣉࣝ  ᐇࢧࣥࣉࣝ

細 胞
増殖 / 毒性酸化ストレス分 子生物学
細 胞 内
蛍光プローブ細胞染色ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極

1005001

図28910[Cl-]0 (mmol/l)-

Cl 濃度による MQAE の蛍光強度の変化

1001) 1．の 1)～7) までと同様の処理を行う。
2) 蛍光測定
種々の塩化物イオンを含む検量線作成用培地を調製し、1．の 6) で洗浄した細胞に添加する。32℃にて蛍光顕微鏡 ( 励
起波長 360 nm、蛍光波長 510 nm) で蛍光測定を行う。
3) 検量線 ( 図 2)
1．の 7) の蛍光強度に対する種々の塩化物イオンを含む検※量線作成用培地 中の蛍光強度の比と塩化物イオン濃度をプロットする。この検量線から 32℃における細胞内の塩化物イオン濃度を求める。
※検量線作成用緩衝液中の nigericin、valinomycin により細胞内へ強制的に CI イオンを取り込ませる。

参考文献
1) K. Ishibashi, S. Sasaki and N. Yoshiyama, "Intracellular chloride
activity of rabbit proximal straight tubule", Am. J. Physiol. , 1988,255 (Renal Fluid Electrolyte Physiol. 24), F49.
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3) N. P. lllsley and A. S. Verkman, "Membrane chloride transportmeasured using a chloride-sensitive ﬂuorescent probe", Biochemistry,
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chloride activity in isolated perfused rabbit proximal convoluted
tubules using a ﬂuorescent indicator", Biophys. J. , 1988, 53 , 955.
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fluorescent indicators for biological applications", Anal. Biochem. ,1989, 178, 355.
8) M. Inoue, M. Hara, X.-T. Zeng, T. Hirose, S.Ohnishi, T. Yasukura, T.
Uriu, K. Omori, A. Minato and C. Inagaki, "An ATP-driven Cl pumpregulates Cl concentrations in rat hippocampal neurons", Neurosci.
Lett. , 1991, 134 , 75.
9) A . C . E n g b l o m a n d K . E . O . A k e r m a n , " D e t e r m i n a t i o n o f
the intracellular free chloride concentration in rat brain
synaptoneurosomes using a chloride-sensitive ﬂuorescent indicator",
Biochim. Biophys. Acta , 1993, 1153 , 262.
10) A. C. Chao, J. A. Dix, M. Sellers and A. S. Verkman, "Fluorescencemeasurement of chloride transport in monolayer cultured cells:
mechanisms of chloride transport in ﬁbroblasts", Biophys. J. , 1989,56 , 1071.
11) A. C. Chao, J. H. Widdicombe and A. S. Verkman, "Chloride
transport mechanisms in cultured canine tracheal epithelial cells
measured by an entrapped ﬂuorescent indicator", J. Membr. Biol. ,1990, 113, 193 .
12) P. L. McNeil, "Incorporation of macromolecules into living cells".
Methods in Cell Biology, edited by Y. -L. Wang and D. L. Taylor, San
Diego CA : Academic, 1989, 29 , 153.
13) G. A. Banker and W. M. Cowan, "Rat hippocampal neurons indispersed cell culture", Brain Res. , 1977,126 , 397.

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