D-アスパラギン酸酸化酵素変異体の構築
アスパラギン酸酸化酵素変異体の構築

環境生物化学研究室

若泉 綾香

指導教官

山田 良平
解良 芳夫
高橋 祥司

緒言
我々の研究室では、生体内における遊離 D-アスパラギン酸の D-アスパラギン酸酸化酵素（DDO）による検出法を着想し、DDO の調製が容易な微生物にその供給源を求め、
酵母 Cryptococcus humicola UJ1 を土壌から単離した。そして、当研究室の氏家・有本が、1995 年に微生物由来としては初めて本酵素（ChDDO）の完全精製に成功した。さらに当研究室の氏家・有本・高橋・新野・岩崎・山下らにより、ChDDO のいくつかの酵素学的な諸特性が明らかにされた。また ChDDO をコードする遺伝子の単離にも成功した。
しかし他生物由来のDDOと同様、ChDDOの構造面に関する知見は乏しいままである。
ChDDOの構造面に関する知見を得ることができれば、既に多くが明らかになっている
D-アミノ酸酸化酵素の構造と比較することにより、それぞれの基質特異性の違いを決定しているアミノ酸残基の特定が期待できる。これが明らかになれば幅広い基質特異性を持つ、または逆に特定の D-アミノ酸に対してのみ特異性を示す D-アミノ酸酸化酵素の創出が可能になると考えられる。この研究を行うため、現在までに大腸菌を宿主とした組換えChDDOの大量発現系の構築が行われ、組換えChDDOの諸性質が酵母 C. humicola
UJ1 から精製したChDDOと同様の性質を示す事が明らかになっている。そこで、本研
究では、D-アスパラギン酸酸化酵素において酸性 D-アミノ酸に対する特異性を付与しているアミノ酸残基を決定する事を目的とし、酵母 C. humicola UJ1 由来 D-アスパラギン酸酸化酵素の変異体を構築した。

実験と結果
1.

部位特異的変異導入

1.1

ChDDO の基質特異性に関与するアミノ酸残基の推定

酵母Rhodotorula gracilis由来 D‑アミノ酸酸化酵素（以下DAOと省略する）の結晶構造
解 析 (ProteinDataBank,1C0K) の デ ー タ を も と に SWISS-MODEL(http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html) によってChDDO活性部位の三次元構造モデルを作成した (Fig. 1)。R. gracilis DAO の研究報告では213番目のメチオニン残基をアルギニン残基に変換することによりDDO活性を示すようになるという報告がある (Fig. 1)。R. gracilis DAOの213番目のメチオニン残基に相当する位置に、ChDDOでは243番目のアルギニン残基が存在する事が、モデリング解析により推定されたことか
ら、ChDDOの243番目のアルギニン残基がChDDO活性に関与することが示唆された。
そして、この推定されたChDDOの243番目のアルギニン残基の側鎖とD‑アスパラギン酸の側鎖のカルボキシル基がChDDOの243番目のアルギニン残基の正電荷と相互作用すると考えられた (Fig. 2)。
また別のアプローチとしてChDDOの基質結合部位付近のアミノ酸配列とヒト・ウシDDO（Human DDO-1, Bovine DDO）とブタ（Pig DAO)・R. gracilis DAOの基質結合部位付近のアミノ酸配列をアライメントし、基質特異性に関与するアミノ酸残基の推定を行った。その結果、R. gracilis DAOの213番目のメチオニン残基に相当する位置に存在する
ChDDOのアミノ酸残基は230番目のアルギニン残基であることが示唆された (Fig. 3)。
また、ヒト・ウシDDOにおいても同様の位置にアルギニン残基が存在していた。
これらの解析結果から、230 番目と 243 番目のアルギニン残基が ChDDO の基質特異性に関与することが推定されたため、230 と 243 番目のアルギニン残基を中性アミノ酸であるアラニン残基へと変異させた ChDDO 変異体の構築を検討した。
ChDDO の活性部位モデル
Met260R. gracillis DAO の活性部位
Tyr238

Arg243

Met213:O
Tyr245

L-Lactate:S

Arg306

Tyr223

Arg285:NSer335

Gly344 Gln 348

Fig. 1 ChDDO 活性部位のモデリング解析
Met260CH2 S

CH3HOTyr245

O

H3+CNH
2H2NCNH
Arg306

H3C

D-アスパラギン酸
アスパラギン酸
HNArg243

FAD

O

HNNH OCC CH2 CCNN
O +NH2OO
H2N
NH+CH23H?
OO
H
NH2OCC
Gly344Gln348Fig. 2ChDDO 活性部位における D-アスパラギン酸の相互作用モデル
アスパラギン酸の相互作用モデル

230 番目アルギニン残基

ŹŹC. humicola DDO
Bovine DDO
Human DDO‑1Pig DAO
R. gracilis DAO

216‑VVVVRAPWMRAGFTR QVGSLGGGEGGT R TYIIPRCNGEVVLGGT‑259
R DS‑‑‑‑‑‑‑‑‑SGLTYIYPG‑VSNVTLGGT‑236
203‑VLKVQAPWVKHFI
203‑VLQVQAPWVEHFIR DG‑‑‑‑‑‑‑‑‑SGLTYIYPG‑TSHVTLGGT‑236
202‑IIKVDAPWLKNFIITHDLERGI‑‑‑YNSPYIIPG‑LQAVTLGGT‑241
200‑TVLVKSPCKRC‑‑‑‑‑‑‑T
M DSSDPASPAYIIPRPGGEVICGGT‑237: * :* .
.** ** ***様々な DDO と DAO の基質結合部位付近のアライメントの基質結合部位付近のアライメント

Fig. 3

1.2

243 番目アルギニン残基

ワンデイミュータジェネシスによる部位特異的遺伝子変異導入法

遺伝子変異導入法に、最も容易に短時間で変異がかけられるワンデイミュータジェネ
シス法を用いたが、変異 ChDDO 遺伝子の構築を確認することができなかった。

1.3

メガプライマー法を用いた部位特異的遺伝子変異導入法
ワンデイミュータジェネシスによる変異 ChDDO 遺伝子の構築がうまくいかなかったため、メガプライマー法による変異導入を検討した。
メガプライマー法で変異を導入した R230AChDDO 遺伝子 (230 番目のアルギニン残基をアラニン残基に変換、レーン 1) と R243AChDDO 遺伝子 (243 番目のアルギニン残基をアラニン残基へ変換、レーン 2) をアガロースゲル電気泳動で解析したところ、レーン 1, 2 に ChDDO 遺伝子の全長である 1.1 kbp 付近にバンドが検出された (Fig. 4)。この結果より、R230AChDDO と R243AChDDO 遺伝子の増幅が確認できた。
Fig. 4 で確認できた変異 ChDDO 遺伝子を pBluescript II KS(＋)の Eco RV サイトへクローニングし、Nde I/ Hin dⅢ切断によりベクターへのクローニングを確認した (Fig. 5)。
アガロースゲル電気泳動解析の結果、レーン 1-5 (R230AChDDO) 及びレーン b, d, e(R243AChDDO) に 1.1 kbp と 3.0 kbp のバンドが検出されたことから、変異 ChDDO 遺伝子のベクターへのクローニングが確認できた (Fig. 5)。
M

12kbp

レーン：

4.371
2.322
2.027

M：DNAサイズマーカー
1.1 kbp0.564

1：230番目を変異させたChDDO 遺伝子(R230AChDDO)
2：243 番目を変異させた ChDDO 遺伝子(R243AChDDO)

Fig. 4

メガプライマー法による変異
メガプライマー法による変異ChDDO遺伝子増幅の遺伝子増幅の変異12345

Mabcdeレーン：
M：DNA サイズマーカー
4.371 kbp

1-5：pKS DDO R230A プラスミド

4.0 kbp
3.0 kbp2.027 kbp
2.322 kbp

a-e：pKS DDO R243A プラスミド

1.0 kbp(すべて Nde I と Hin dⅢで切断）

Fig. 5 変異 ChDDO 遺伝子のクローニングの確認
遺伝子のクローニングの確認

1.4

R230A ChDDO と R243A ChDDO 遺伝子の塩基配列決定

PCR により増幅した R230A ChDDO と R243A ChDDO 遺伝子の塩基配列を解析し、目的以外場所に変異が生じていない事を確認した。

2.

ChDDO 変異体の大腸菌における発現

2.1

ChDDO 変異体発現ベクターの構築

Hin dⅢ
Ⅲ
NdeI

Ampr His-tag

大腸菌発現用ベクターである pET25b (Fig. 6)を NdeT7 promoter

Ⅰと Hin dⅢで切断し、そこへ PCR により増幅した変pET25b
5.54 kb

異 ChDDO 遺伝子断片を挿入した。これにより、C 末lacIori

端に His-tag が付加された ChDDO 変異体を発現するベクター (pETCD2R230A, pETCD2R243A) を構築した

Fig. 6大腸菌発現用ベクター(Fig. 7)。

2.2

発現用大腸菌 E. coli Rosetta (DE3) へのHin dⅢ
Ⅲ

pETCD2R230A および pETCD2R234A の導入

Amp r

His-tag
変異ChDDO遺伝子
変異組 換 え 蛋 白 質 の 大 量 発 現 に 必 要 な T7 RNApolymerase を生産し、かつ真核生物に多く使われoriているコドンに対応している発現用大腸菌 E. colipECDR230A
pECDR243A
6.54 kb

NdeI
T7 promoter

lacI

Rosetta (DE3) に、構築した ChDDO 変異体発現ベクターpETCD2R230A および pETCD2R234A を導Fig.

7

変異 ChDDO 遺伝子発現ベクター

入した。

2.3

ChDDO 変異体の大腸菌 Rosetta (DE3)における発現における発現作成した形質転換体を培養し、ChDDO 変異体を発現させた。対照として、E. coli
Rosetta (DE3) / pET25b と E. coli Rosetta (DE3) / pECD25b（変異を有しない ChDDO 発現ベクター）も同様の条件で培養した。
ChDDO 変異体を発現させた大腸菌から調製した粗抽出液中の DDO 活性を Fig. 8 に示した。変異を有しない ChDDO を発現させた粗抽出液の比活性 (Wild) と ChDDO 変異体を発現させた粗抽出液の比活性 (R230A, R243A) を比較すると、230 番目のアルギニン残基をアラニン残基へと変異させることによりその活性は半減し (R230A)、243 番目のアルギニン残基をアラニン残基へと変異させると DDO 活性はほぼ無くなった(R243A)。この活性の減少が、ChDDO の発現量や不溶性画分に沈澱したこととは無関係であることが SDS-PAGE およびウエスタンブロット解析から明らかとなった (Fig. 9)。
したがってこれらの結果より、ChDDO の 243 番目のアルギニン残基が酵素活性におSpecific activity (U/mg of protein )いてもっとも重要な役割を果たしていることが示唆された。

3Control:ChDDO 遺伝子断片未挿入のベクター(pET25b) を用いたもの

Wild: 変異を導入していないChDDO 遺伝子を発現ベクターに挿入したもの

R230A： pET25b に R230AChDDO 遺伝子を導入したもの (Fig. 7)

R243A： pET25b に R243AChDDO 遺伝子を導入したもの (Fig. 7)

210Control

Wild

R230A

R243A

Fig. 8 ChDDO 変異体発現形質転換体の粗抽出液における変異体発現形質転換体の粗抽出液における DDO 活性Soluble fraction

SDS-PAGE

ControlWild

R230A

Insoluble fraction
R243A

Control Wild

R230A

R243AkDa

Control : ChDDO 遺伝子断片未挿入のベクター(pET25b) を用いたもの

97.4
66.3

Wild

42.4

: 変異を導入していない ChDDO 遺伝子を発現ベクターに挿入したもの

30.0

R230A： pET25b に R230AChDDO 遺伝子を導入したもの (Fig. 7)
R243A： pET25b に R243AChDDO 遺伝子を導入したもの (Fig. 7)： ChDDO-6×His の分子量である 42.2 kDa に検出したバンド

Western blotting

Fig. 9大腸菌粗抽出液中の ChDDO 変異体の SDS-PAGE および Westren blot 解析

粗抽出液はタンパク質 5.0 μg をアプライした。不溶性画分は粗抽出液の回収量と同じ体積の破砕バッファーに懸濁した後、粗抽出液と同体積アプライした。分離ゲルには 12 %のアクリルアミドゲルを用いた。

総括ChDDO 活性の部位のモデリング解析により ChDDO の Arg243 が酸性D‑アミノ酸の基質特異性に関与している可能性が示唆された。また、別のアプローチとして、様々な DDO と DAOの基質結合部位付近のアミノ酸配列のアライメントの結果から230番目のアルギニン残基が酸性D‑アミノ酸に対する基質特異性に関与する事が示唆された。これら、推測された 230 番目と243 番目のアルギニン残基を、容易に変異がかけられるワンデイミュータジェネシスを用いてアラニン残基に変換する事を試み、PCR産物をアガロースゲル電気泳動で確認したが、増幅を確認することができなかった。
次にメガプライマー法を用いてアラニン残基に変換する事を試み、PCR産物の増幅がアガロースゲル電気泳動で確認したところ、増幅が確認できた。よって、メガプライマー法を用いて変異体 ChDDO 遺伝子を構築した。
構築した変異体 ChDDO 遺伝子を塩基配列解析により目的部位に変異が導入された事を確認し、全配列の解析結果から目的部位以外に変異が導入されていないことを確認した。
変異体 ChDDO 遺伝子の大腸菌発現系を構築し、変異体 ChDDO 遺伝子の発現産物をDDO 活性、SDS-PAGE、ウエスタンブロット 解析した結果

ChDDO の 230 番目と243 番目のアルギニン残基が酵素活性に重要なアミノ酸残基であることが示唆された。
また、酵素活性において、243 番目のアルギニン残基に変異をかけたものが大幅に減少したことから、243 番目のアルギニン残基のほうが酵素活性に対する特異性に関与することが示唆された。