京都⼤学北部キャンパス機器分析拠点セミナーシリーズ
第7回「LC-MSセミナー」
天然由来分⼦精密構造解析システムの活⽤例

1）宮下正弘：装置概要とペプチド配列解析
2）及川彰：⾼分解能低分⼦分析

3）村井正俊：タンパク質解析（化合物との相互作⽤）
4）渡邊祐三：タンパク質受託解析の概要

装置概要とペプチド配列解析
農学研究科応⽤⽣命科学専攻
宮下正弘

LC/MS 装置の概要

4

Orbitrap Exploris 240 (Thermo Scientific) の性能
質量範囲 m/z 40 – 6,000
分解能 240,000 at m/z 200 (TOF型は10,000程度)
スキャン速度 22 Hz (22 scan/s) at resolution 15,000 at m/z 200
質量精度 外部標準: < 3 ppm 、内部標準: < 1 ppm
MS/MS: レセルピン 200 fg (330 amol), S/N 100:1
感度SIM: レセルピン 200 fg (330 amol), S/N 250:1

質量分析計の概略イオン化+++

質量と電荷に基づく分離++++検出+m/z真空装置の制御
データの取り込み

ESI法によるイオン化
イオン化分⼦[M+nH]n+スプレーニードル

サンプル（溶液状）++++++ + + +++ +++ +++

テイラーコーン++++++++++ ++荷電液滴++++++++ +⾼電圧（数kV）

・イオン性、⾼極性（特に⽣体分⼦）物質を⼤気圧下でイオン化する
・溶液状のサンプルを気化しながらイオン化する
・主にプロトンが付加し、多価イオンも⽣じる（[M+nH]n+）・流速を低くする(1 µL/min以下)ことにより⾼感度化が可能（NanoLC）

カラムサイズと流速

https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/low_flow_rate_lc/

Aurora Ultimate (IonOpticks)
固定相：C18
粒径： 1.7 μm
内径：75 μm
流速：300 nL/min

https://ionopticks.com/resource-hub/9NanoESI プローブ

感度⽐

通常のLC/MSとNanoLC/MSの感度の⽐較

流速（µl/min）https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/low_flow_rate_lc/オービトラップの原理
横⽅向に往復運動

Timem/z

フーリエ変換• 電場によって起こるイオンの回転運動を利⽤• イオン塊の周期的運動をフーリエ変換（電場型FT）• 分解能・精度が⾮常に⾼い• 装置の⼩型化が可能• 主に定性分析に有⽤Orbitrap Exploris 240の構成

Orbitrap Exploris 240 mass spectrometer ion path

High-Field
Orbitrap Mass Analyzer

Transfer Tube

Advanced Active
Beam Guide (AABG)

EASY-IC InternalCalibrant Source

Advanced Quadrupole
Technology (AQT)

C-Trap
Independent
Charge Detector

OptaMax NG ElectrosprayIon Source
S-lensIon-Routing Multipole

Thermo Fisher Scientific社 資料より

精密質量を測定する意味
CO, N2, C2H4：整数質量はいずれも 28 Da
⼩数点第3位までを考慮すれば区別できる
1H :1.0078
12C : 12
14N : 14.0031
16O : 15.9949

CO : 27.9949 Da
N2 : 28.0062 Da
C2H4 : 28.0312 Da

a.i.

a.i.

分解能と同位体ピークの⾒え⽅
分解能 =1,000

分解能 =10,000

90

9060
60

30
30

801

807

810m/z

807

804

810

0801804

801

804

a.i.

801804

C33H59N10O11S分解能 =240,000

906030(シミュレーションのスペクトル)

0801

801

804

804

807

807

810m/z

810

807

807

810m/z810

a.i.

2番⽬の同位体ピークで区別できるもの
8C33H59N10O11S

C3313C2H59N10O11S
805.4151

76

C33H59N10O1134S
512.000000

13C

13.003354

32S

31.972071

34S

33.967866

1.003354

805.4044

a.i.

4312C

1.995795

9060

230

10801

804

807

810m/z0805.25805.30(シミュレーションのスペクトル)

805.35805.40805.45805.50805.55805.60m/z

研究でのOrbitrapの活⽤ポイント• ⾼精度が必要な実験– 低分⼦の構造確認（精密質量、組成式）• ⾼感度が必要な実験– タンパク質の同定（プロテオミクス）• 構造解析が必要な実験– ペプチドの配列解析（ペプチドミクス）

ペプチドの配列解析

質量分析計によるペプチドのアミノ酸配列決定
フラグメントの質量差からアミノ酸を同定

A−B−C−D−E

A−B

A−B−C

B

CA

A

断⽚化m/zA−B−C−D
A−B−C
A−B
A

A−B−C−D
A−B−C−D−E

DE

ペプチドの質量分析計での断⽚化
a b c

O
H 2N

R2N
H

R1H
N
O
xb イオン

O

R4OH

N
H

R3y z

Oy イオン

O
O

O
H 2N
R1N
H

R2

H 2N
R3R4N
HOHO

実際のフラグメントの帰属例
FFFLPSLIGGLVSAIK-amide

クモ毒液に含まれるペプチドの構造同定

1 cm
研究室の窓にも⽣息【和名】 ：クロガケジグモ【学名】 ：Badumna insignis【体⻑】 ：♀10〜15 mm ♂4.5〜10 mm【⽣息地】：オーストラリア原産であるが⽇本に近年移⼊（京都⼤学北部構内にも多数⽣息している）【毒液】 ：酵素活性について報告はあるが，ペプチド毒素の研究例は無い

クロガケジグモ毒液の毒素様ペプチドの探索⼿法

毒腺
毒液ｍRNA

MS 分析

RNA-seq 解析

質量・配列情報

配列情報
既知毒素ペプチドとの⽐較

毒素様ペプチド候補の配列同定

LC/MSによる毒液成分の質量分布の測定
MS：Orbitrap Exploris 240
Column ：Vydac Everest C18 250×1.0 mm
Flow：0.05 mL/min
Eluate ：(A) 0.1% HCOOH/H2O (B) CH3CN
Gradient：2-2-60%B/0-5-80 min
Oven：40℃

8-500

26501-1000

231001-2000

2010000

8000

4000

50m/z

6000

100

分⼦質量 (Da)

2001-3000
3001-4000

184001-5000

17425001-6000

176001-7000
7001-8000

198001-9000

19109001-10000

210001-11000

611001-12000

0102030Time(min)40020
検出ペプチド数

40Intensity

HPLCによる成分ペプチドの単離05101520253035Time (min)404550556065

25

Intensity

Intensity

実測質量5384.342 Da

3035Time (min)40101520
Time (min)25多価イオンから質量を求める[M+6H]6+[M+7H]7+[M+5H]5+[M+4H]4+

898.8983
899.0649
898.7318

898.3981 x 6 – 1.0078 x 6 = 5384.3418

899.2314
898.5650
899.3981

899.5646
898.3981

899.7316

0897.4

897.6

897.8

898.0

898.2

898.4

898.6

898.8

899.0m/z

899.2

899.4

899.6

899.8

900.0

900.2

900.4

900.6

酵素消化ペプチドのMS/MS分析による配列決定
酵素(Lys-C)による消化が必要（2000 Da以上のペプチドでは難しい)②①③⑤④510MS/MSデータ

152025303540Time (min)b2 b3 b4 b5 b6

LYRGYCKy y y y y y654321

酵素消化ペプチドのMS/MS分析による配列決定
酵素(Lys-C)による消化が必要（2000 Da以上のペプチドでは難しい)②①③⑤④510152025303540Time (min)b2 b3 b4 b5 b6③

LYRGYCKy y y y y yLYRGYCKb

Calcd.
Obsvd.
--277.1547 277.15506
433.2558
490.2772 490.27859
653.3406 653.34082
814.3552
---

654

3

2

1+2Calcd.
----217.1315
245.6423
327.1739
407.6813---+2ybObsvd.
1
L
2
Y
217.1321 3R
4G
5Y
6 C(Carboxymethyl)
7K

7
654
3
2
1

Calcd.
--847.3767
684.3134
528.2123471.1908
308.1275
147.1128

yObsvd.

684.3140
528.2123471.1910
308.1275
147.1128

Calcd.
--424.1920
342.6603
264.6098
236.0990
154.5674
74.0600

Obsvd.
424.1922

ペプチド全体の構造決定
ECIPKGKDCKGDEDNCCDPSNKLYRGYCKCINNDKECFCKDVLFGIGI①②③④② GKDCKGDEDNCCDPSNK① ECIPK⑤⑤ DVLFGIGI③ LYRGYCKIntensity④ CINNDKECFCK

51015202530Time (min)実測質量5384.342 Da

計算質量5384.337 Da

3540

質量分析によるペプチド配列決定の利点と問題点○ NanoLCによって微量サンプルでも構造決定が可能○ Orbitrapによって正確な配列決定が可能
× ⼤きなペプチドは酵素消化が必要
ü事前に精製が必要
× この装置だけではLeu/Ileの区別ができないüMALDI-TOF/TOF MSとの併⽤、遺伝⼦情報の活⽤× フラグメントの帰属が難しい
ü解析ソフトウェアはまだ不完全

⾼分解能低分⼦分析
及川彰

分解能

質量分解能（mass resolving power）：特定の質量分解度の値を得ることができる質量分析計の能⼒
質量分解度（mass resolution）：マススペクトル上の隣接したピークの分離状態を客観的に評価するための指標

Dmʼ

low

ピークの半値幅定義による分解度
Full width at half maximum: FWHM
RFWHM =mDm

Intensity

highSignal

50%幅

Dm

10%⾕定義による分解度
10% valley definition of resolution
R10% =mʼ
Dmʼ

10%⾕

Noise

Signalmmʼ

m/z

S/N⽐ =
Noise

分解能

Exploris 240
R = 240,000

質量分析計の種類と分解能（⽬安）

四重極型（Q）

⾶⾏時間型（TOF）

イオントラップ型

扇形磁場型

低オービトラップ型（Orbitrap）

分解能（FWHM）〜100〜1,000〜10,000

フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型（FT-ICR）
⾼〜100,000〜1,000,000（検出されるm/z値の例）
120120.1

120.10120.098

120.09784

オービトラップ型質量分析装置では⾼分解能分析が可能

120.097841

⾼分解能分析でできること

付属のソフトウェア
で簡単にできます！

⾼確度分析

Intensity（×105）

A社 single quadrupole MS
1.2

未知化合物の組成式推定264.2

1.00.80.60.4組成式の推定が可能

0.20.0260

262264

266

268

270

Hydroxy-α-sanshool（理論 m/z = 264.19581 ([M+H]+)）Intensity（×108）

Orbitrap Exploris 240
6.0Δm/z = 0.00098(3.71 ppm)

264.19679[M+H]+

5.0！⾼確度！

4.0
3.0
2.0
1.00.0
260

262

264

266m/z268

270⾼分解能分析でできること
147⾼確度分析（MSMS）

72246

107MSMS/MS

Δ m/z
理論値
実測値
246.18800 246.18579 0.00221
147.11642 147.11738 0.00096
107.08643 107.08608 0.00035
72.08135 72.08132 0.00003

組成式の推定が可能

未知化合物の構造推定

私⾒こんな⽅にオススメ
l 既にLC-qMSで分析を⾏っているØ 同じ条件をそのまま適⽤して⾼分解能解析ができる
l 未知物質を同定したい
Ø ⾼確度分析（MSMS）や同位体解析から推定できる（かも）l 安定同位体追跡試験による⽣合成・分解経路の特定をしたいØ 硫⻩など特異的な同位体組成を持つ元素を含む化合物を追跡できる（かも）気軽に使える⾼分解能質量分析装置
未知化合物の定性分析に最適私⾒

こんな⽅にはあまりオススメではない
l 他のLCMSやHPLCなどで定量分析を⾏っているØ tripleQやqTOFなどの⽅が定量性や検出感度で勝る場合もある？
l tripleQで⾏っているMRM（SRM）をしたいØ できません．SIM-likeな分析は可能です．
l スキャンスピード狂ですØ TOFでどうぞ．Orbitrapではスキャン速度と分解能が相殺します．

研究の⽬的によってはtripleQやTOFの⽅が適した⼿法となる

Q．植物ホルモンは分析できますか？
A．できます（できません）
Ø 既に植物ホルモンを分析している⽅ü 同じ条件で⾼分解能分析が可能ですü 定量性や検出感度はtripleQやqTOFと同等か低いですü 既に定量分析ができているならorbitrapにする必要性は低いですü 未知の植物ホルモン（様）化合物を同定したい（未知ピークがある）場合は有⽤かもしれませんØ これから植物ホルモンを分析する⽅ü Orbitrapだから検出できるという植物ホルモンはありませんü 他のLCMSで検出できている植物ホルモンは検出可能です（前処理，精製などのステップは必要です）

Q．メタボロミクスはできますか？
A．できます（できません）
Ø 分析は可能ですが，データ解析⽤のソフトウェアがありませんü ソフトウェアを買ってください（誰か）ü フリーソフト（MS-DIAL）などを頑張って使う

ご清聴，ありがとうございましたタンパク質解析（化合物との相互作⽤）
コレラ菌Na+-輸送型NADH-キノン酸還元酵素を例にして

京都⼤学⼤学院農学研究科

応⽤⽣命科学専攻

村井 正俊

⽣物機能制御化学分野

私たちの研究について
FoF1-ATP合成酵素
ATPNADH複合体-II

NAD+

コハク酸

複合体-I

複合体-III
H+

フマル酸

H+

ADP + Pi+H
複合体-IVマトリックス
内膜UQ
O2* UQ: ユビキノン

シトクロムc

呼吸鎖酵素（複合体I~IV）による基質の酸化還元と連動（共役）したプロトンの輸送

H2O

膜間スペースH+

プロトン輸送と連動（共役）したATP合成

NADH脱⽔素酵素の多様性
Complex I (NDH-1)

NDH-2 (Ndi1)

Na+-NQR

H+-Na+

Coupled ion
StructureNa+
H+ H+ H+

(45 subunits)(single subunit)(6 subunits)

Cofactor

FMN
2[2Fe-2S]
6 [4Fe-4S]

Distribution

Mammalia, plantand bacteria

Plant, yeast, andbacteria

Marine and pathogenic
bacteria

Inhibitor

Rotenone and bullatacin

Aurachin

Aurachin and korormicin

FAD

2 FMN
[2Fe-2S]
FAD and RF

研究対象（Na+-輸送型NADH-キノン酸化還元酵素, Na+-NQR）
ü Na+-NQR は病原性細菌（ex: コレラ菌、緑膿菌）におけるエネルギー代謝の基幹酵素
ü 哺乳類型の呼吸鎖複合体-Iとは進化的にも構造的にも異なる
ü 哺乳類には存在しないため、抗菌薬の創薬標的になり得る
Na+
NqrA

UQ

NqrB

NADH
NAD+NAD+
NqrF

UQH2Na+NADH

AcytoplasmNqrD/E

Q

Q

QH2RBF

B
periplasm
NqrC

FAD

F

DFeS

FeS

FMN
FMN

C

cytoplasm

Eperiplasm
FMN: flavin, RBF: riboflavin,
Q: quinone, QH2: quinol

コレラ菌Na+-NQRの特異的阻害剤
ü Na+-NQR は病原性細菌（ex: コレラ菌、緑膿菌）におけるエネルギー代謝の基幹酵素
ü 哺乳類型の呼吸鎖複合体-Iとは進化的にも構造的にも異なる
ü 哺乳類には存在しないため、抗菌薬の創薬標的になり得る
NqrA

AD-42 (IC50= 2.0 nM)

O

UQ

O

O
N
H

3'R OH

9'S

NADH
NAD+
NqrF

UQH25SNa+

cytoplasm

NqrD/E

C8H17periplasm

O 10'R
Korormicin (IC50 = 5.0 nM)
NqrB

Ito et al. (2017) J. Biol. Chem. 292, 7727-7742.

NqrC

Na+-NQRの特異的阻害剤はNqrBサブユニットに結合する

Kishikawa and Ishikawa et al. (2022) Nat. Commun. 13, 4082.

Na+-NQR阻害剤はNqrBサブユニットN末端に結合する■ AD-42 bound structure■ Korormicin bound structure

Kishikawa and Ishikawa et al. (2022) Nat. Commun. 13, 4082.

NqrBサブユニットのN末端は最もフレキシブルな領域である

Kishikawa and Ishikawa et al. (2022) Nat. Commun. 13, 4082.

Na+-NQRのピンポイント化学修飾の概略
⽬標：NqrBサブユニットのN末端に、化学プローブを導⼊する⾜場を作りたい■ コロルミシンリガンド（KBCp）の構造BrOOOONHOHHNO

リガンド部

Ligand directed (LD) chemistry

BrOOO

タグ部（⾜場）
シクロプロペン：CPY
脱離基（フェニルエステル）

Tsukiji et al. (2009)
Nat. Chem. Biol. 5, 341-343.

Orbitrap Exploris240によるNqrBサブユニットの解析
ü NqrBサブユニットは極端に疎⽔性の⾼い膜貫通型のタンパク質である
ü MALDI-TOF MSによる解析での配列カバー率は10%以下(Ishikawa et al. (2021) BBA)ü Tripsin消化だけでなく、chymotrypsin, あるいはLys-C/Asp-Nによる消化を実施
1.

コレラ菌Na+-NQRを1~5等量のKBCpとインキュベート

2.

SDS-PAGEでサブユニットを分離

3.

NqrBサブユニットを切り出し

4.

In gel 酵素消化

5.

ナノLC-orbitrapによる消化物の解析

6.

Lys, Hisに対してCPY修飾を探索（Proteome Discoverer）

アミノ基が反応したと仮定
NH2HNOOHCPYがN-H間に⼊ったとして計算

CPYによる増加分（ C8H12O2, 138.07 ）をDynamic modificationとして設定

Proteome Discoverer によるデーター解析（トリプシン）■ トリプシン消化物，control, カバー率17%)Proteome Discoverer によるデーター解析（トリプシン消化）■ トリプシン消化物，CPY modified, カバー率15%)Proteome Discoverer によるデーター解析（キモトリプシン）■ キモトリプシン消化物，control，カバー率50%)

Proteome Discoverer によるデーター解析（キモトリプシン）■ キモトリプシン消化物，CPY modified，カバー率55%)

Proteome Discoverer によるデーター解析
controlA2b-ions

3478916 15 14 13 12 11 10 9y2+y4+b2+ 333.19199599.29364
243.13393
y3+ b4+100040200432b-ions

32b-ions

34567852000

9L E D I E H H F E P G G K H E K W
8432500

1000m/z

Lys16D2b-ions

3985432

14678

9 10

14 13 12 11 109b7+
874.40485
y4+, b6+
737.34796

60

b3+b2+358.16129
40 243.13365
y2+, b4+ y3+, b5+
20600.29108
y1+
05

11 12 13 14 15 16

85432

1y8+
1076.55054

802000

16L E D I E H H F E P G G K H E K Wy-ions

1001500

11 12 13b6++
737.34796 b7
y10+874.40485
60
b3++1352.66541
b8
358.16129
b2+
y11+1021.47211
b11+
40 243.13365
y122+ -H2
1489.71643+
b51304.60486
y13+
20
b4+ 600.29108
y9+b13+ 1755.82800
y1+
y4+
+
y2+
b10+
b12
0500
1000
1500
2000
m/z

120

b2+
243.13617
y8+b3+
1076.56311+
b8
358.16086 + +y3 , b51021.45776
600.29242 + +b9+
y4 , b6
b72+
1150.52087
737.35236
b82+

9 10

b9+
1150.51599

b162+
1011.47955

140
y205.09714

8y8+1076.55054

80

11+

714 13 12 11 10120

1500

6L E D I E H H F E P G G K H E K W
y-ions24140m/z

y-ions60

6

Lys13B

100

500

His14C

80

7y12+
b7+
1488.71448+
y10874.40521
b14+ -NH3
1214.59375
y8+b9+
1609.75574
b15+
b162+ 938.48291 1150.51514 y11+b13+1755.80896
942.45697
1489.70874
1351.65527
b132+y6+ y142+ y 162++y15+
b11+ b12

b5+
b3+ 600.29156
358.16061

200

100

8b6+737.34564

300

120

11 12 13 14 15 16y9+b8+1067.52991
1021.47198

40006

L E D I E H H F E P G G K H E K W
y-ions100

5500

b9+1150.51599
b162+
1011.47955

b8+
1021.47211
y5+ y142+
1000

y12+ -H2O, b 14+ -H2O
1608.76514

y11+, b13+1489.71643
y9+ b11+ y10+m/z

1500

b14+-NH3, y12+-NH3
1609.74939
y13+, b15+
1755.82800
2000

Orbitrap Exploris240によるタンパク質化学分析の特徴
1. MALDI-TOF MSと⽐べて圧倒的なカバー率の向上ü Orbitrapの威⼒
ü ナノLCによるペプチド分離も効いている！
2. シーケンスカバー率の低い膜貫通タンパク質の同定・解析にも威⼒を発揮
ü 親⽔性タンパク質なら7割以上（NqrBのカバー率50%は驚異的）ü Trypsin以外の消化酵素もトライすることが重要
ü Chymotrypsin, Lys-C, Asp-N消化物も解析可能
3. Proteome Discovererは、化学修飾されたペプチドも解析できるü 修飾ペプチドの構造を予測する必要あり（構造式を描いてみる！）
ü 解析はプログラムが⾏っている（有機化学系研究者は勘違いしがち！）ü ⽣化学的裏付けも必要（上位のジャーナル掲載には…）

2024年2月29日
北部キャンパス機器分析拠点セミナーシリーズ（第7回）

４） タンパク質受託解析の概要

生命科学研究科 蛋白質解析室 渡邉祐三

1

生命科学研究科 蛋白質解析室

Q Exactive Plus （Thermo Fisher Scientific社製、orbitrap搭載）での事例を紹介します
今後はOrbitrap Exploris 240でも同様の解析が可能になります2

例1
タンパク質Aの変異型と野生型で相互作用する因子の違いを調べたい

HEK293T細胞に・Empty Vector（EV）・A（Mutant）
・A (WT)をそれぞれ過剰発現した細胞溶解液を用いて抗A抗体による共免疫沈降を行ったサンプル

通常のSDS-PAGEに用いるLaemmliバッファー（サンプルバッファー）中に溶解した状態でサンプルをご準備いただければ、SDS-PAGE、ゲルの染色・切り出し、トリプシンによるゲル内消化等のサンプル調製から測定・解析まで お受けいたします。

3

切り出し位置が決まればゲルの切り出し開始

WT

MutantEVmarker

泳動結果を切り出し位置の候補とともにお返し[kDa]

さらに細かく
（1mm角くらい）

245
180140100

脱色・脱水・乾燥

756050403530252015

タンパク質A10Silver staining
4-15% gradient gel

トリプシン処理（ゲル内消化）

切り出し案
[kDa]

12245

31801404100

6756050403530252015107891011

タンパク質

ペプチド断片化

5121314151617181920ペプチド抽出・濃縮

質量分析へ
4解析

[kDa]

12245

31801404100

675605040353025201578910111051213141516171819※データベースが充実していない生物種の解析はできません。
FASTA形式のファイルをご準備いただければ、そちらをDBとして解析することは可能
WTMutant

EVmarker

蛋白質同定ソフト Mascot Server （Matrix Science社）を用いたデータベース検索により解析を行います。

prot_acc
A00001B00002
C00003D00004タンパク質名ABCD

B00002E00005F00006
G00007

BEFG

分子量 プロテインスコア ペプチドヒット数
4687886645
1505320723980
80481589
2964
66573476
2436
52532072
2732542443532428295474353831152831

ゲル番号1111129826967

222220

各レーンのゲル1〜20で、それぞれでヒットしたタンパク質をMascot Server が算出したプロテインスコアとともにExcelファイルでリスト化
レーン内で重複しているタンパク質についてはスコアの高いもののみを抽出してまとめたものもお返しします。
5

例2
大腸菌で精製したタンパク質を同定したい

サンプルは・サンプルバッファーに溶解した状態
・CBB染色(銀染色)済みのゲルの状態
・染色済みのバンドを切り出した状態いずれの状態でも受け入れ可能です。

例1と同様のサンプル調製・解析を実施いたします※
依頼者様でSDS-PAGEを実施する場合は、マーカーや別サンプルのレーンとは1レーン以上空けて泳動することをお勧めします。
※
銀染色はグルタルアルデヒドを使用しないMS用のプロトコールで実施してください。

6

例3
翻訳後修飾（例えばリン酸化部位）を調べたい

サンプルは・サンプルバッファーに溶解した状態
・CBB染色(銀染色)済みのゲルの状態
・染色済みのバンドを切り出した状態
いずれの状態でも受け入れ可能です。

※
リン酸化ペプチドはイオン化されにくいので、タンパク量が必要です。
タンパク量が多くても必ずしも同定できるとは限りません。
※
トリプシン処理によって断片化されたペプチドが短すぎたり長すぎる場合は機器の測定レンジから外れてcoverageが十分でなくなる事があります。
解析可能かどうかはあらかじめアミノ酸配列を確認させていただくことになります。
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