平成5年虔 研究報告 大分県工業試験場

7 有用性微生物の育種、応用に関する研究（有用耐塩性徴生物の造成）
化学部 工 藤 智 子
古 江 国 昭要 旨

本研究では、香味良好な優良味噌から分離した耐塩性酵母について生理特性を試験し、それらの中から発酵刀匠盛な5株を選んだ。さらに、5抹それぞれを添加した小規模味噌仕込み試験を実施し、その結果スクリ こソグしたO
M−1と香り豊かな清酒酵母との細胞融合を試みた。

育）15ppm

1．緒 言

高塩分食品である味噌￠醤油等の醸造技術の改善を図。倍額発酵性（Glu。Ga巨Suc・MaトLac■Raf）

るうえで、醸造微生物の育種改良は今日的課題の一つと∞糖質資化性（Glu。GaトSuc・Mai・Lac。Raf）言える。特に、県産品の中でも蒙昧噌の生産高は、本県が全国第1位を誇っている。

麦味噌中の多種多様な耐塩性教生物の中でも、特に酵c）官能試験

液体培養、個体培養（味噌添加MY培地、塩分10％）により、官能試験を実施。

母の働きが新製品開発の鍵を握る。製品の味・香り・色等は、主発酵酵母であるSaccharomyces rouxiiや、後熟発酵に関与するCandida versatiユまs、C▲etChellsi主など

2）分離酵母による味噌小仕込試験

蓑1のとおり麦粒味噌を仕込み、その3kgずつにの働きに微妙に影響を受けるため、これら耐塩性酵母の分離した耐塩性酵母5株を添加。併せて、無添加区と違いが製品の品質を大きく左右する。

標準株添加区も仕込み、計8試験区を実施（表3）。

そこで、優良耐塩性酵母をスクリーニングし、清酒酵母協会13号との細胞融合を試み、若干の知見を得たので報告する。

表瑠麦粒味噌仕込配合原料

重 量（kg）
10．0
4．8
1L7
3−2

原料麦（裸麦）

原料大豆（内地大豆）2。実験方法1）優良耐塩性酵母の分離

出麹重量
食塩重量
蒸大豆重量
種水重量10。0こ∋．（1①供試菌抹
香味良好な味噌7撞から分限した優良耐塩性酵
母140昧を供試。

なお、S．rouxii、C．versatiiis、C．etchellsiiについても対照として供託した。
②形態観察、生理特性試験
a）形態観察コロニ…成育状況、色、形の観察。顕微鏡下における酵母の形、大きさの観察。
b）生理特性試験。塩分耐性（0〜25％）。TTC染色（野生酵母の判別）￠オルソバニリソ耐性（S．rouxii属酵母のみ生−70−①熟成途中の成分分析〔a）〜d）は基準みそ分析法による〕＼ T＝T ． aノp rユ ￠b）滴定酸度：c）蛋白分解率：
郎蛋白溶解率：e）糖額：・装 置；Jasco‡てigh‡）ressure Liquid
Chromatograph TR‡ROTAR

Teinperature ControIUnit
UT…100
Shodex RISE−11平成5年虔 研究報告 大分県工業試験場。条 件；カ ラ ム：Shodex S−801b）官能試験：

プレカラム：Shodex S−801
溶媒：超純水

温度：35℃

流量：1．Oml／min。前処理；各試料10gに20％スルホサリチル酸

全試験区における最終製品の味。香り・色について官能試験を実施（表3）。

3）味噌酵母と清酒酵母との細胞融合①選択培地（生理的相補性マーカー）の確認

2滴を加え、水で計20gにする。十

融合成功株を抽出する際決め手となる、親株の生分に携拝した後その浸出液をDISMIC

理的相補性マーカーを決定するために、各種培地で−13cp（0．45pm ADVANTEC）でK…13、OM−1の生育試験を実施。
YEPD培地でK−13を、味噌添加MY培地でろ過したものをサソプルとした。
・項 目；グルコース、マルトース、キシロー

OM−1を前培養し、各酵母の菌数を測定して、ほス、アラピノース、グリセリソ、エぼ同量の菌体をそれぞれ約15mlの選択培地（組タノ川ル

成は表4参照）に混釈し、TTC下層培地（1％グ
ルコース、1．2％ポリペプトン、0．15％酵母エキス、f）色度：。装 置；デジタル測色色差計 ND−504AA（日本電色工業株式会社）②最終製品の評価

0．04％MgSO。。7H20、0．1％KH。PO。、3％寒天、pH5。5）約10mlを重層する。35℃で培養し、成育状況を観察。
②プロトプラスト融合a）有校酸：。装 置；Jasco High Pressure Liquida）プロトプラスト化条件の検討

最適なプロトプラスト化の条件を把握するた

Chromatograph TR‡ROTAR

Temperature ControIUnit

め、表2のような溶菌試薬によりプロトプラスト化率を測定。

UT−100YEPD培地で1晩前培養済みのK−13及UVMSpectrometer

びOM−1それぞれを、0．6MKCiで洗浄後、UVmEC…100−ⅤⅠ

Kw13を試薬描、OM−1を試薬王、‡Ⅰで溶◎条 件；カラム：Shodex C−811 2本菌し、1時間ごとに検鏡して菌数計測を行う。

移動相：3mM過塩素酸（HCiO。）

プロトプラスト化率を算出するために、溶菌水溶液

途中の酵素液100mlにH201mlを加え、5分放反応相：0。2mM プロムチモー置した後、菌数計測を行う。

ルブルー（BTB）

15mM りん酸水素ナト
プロトプラスト化率（％）＝

リウム（Na2‡iPO。）水溶

最初の菌数一文時間後の菌数
最初の菌数

液温 度：60℃

表2 プロトナラスト化用溶菌試薬組成

流 量：1．Oml／mi‡1（移動相）

試薬No・∃

0．5ml／miri（反応相）

検 出：UV【445nm組成∃0．1％メルカプトエタノール（SET）

Ⅰ∃0．6MKC汁60mg／miF。。。elaseを含む
0−1M酢酸バッファー：1ml】0．1％メルカプトエタノ ル（SET）

0・6M′1aseを含む‥1ml

0．5mg／mlZym。iyase2000：1mi∃・前処理；①e）糖額に同じ・項 目；クエソ酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、ギ酸、酢酸、ピログルタミソ酸：1mi：1ml‡Ⅰ‡貰0 6M1aseを含む：2ml−71−平成5年虔 研究報告 大分県工業試験場

3．実験結果及び考察−−−−−−−○−−1、Cl1）優良耐塩性酵母の分離−−一口・・−・・−No．20・−−く−−No．4＝＝●・・No．5

nU‥■・・N0．6・・盛‥No．7︵＝Uグし、その5株を味噌小仕込試験に供試した。

・・−「卜No．332−1

塩性酵母（OM−1〜OM】5）5株をスクリーニソ

CロlX之卜 ＼ Z S

形態観察、生理特性試験、官能試験の結果、優良耐‥◆‥No．8ハリ200402）分離酵母による味噌小仕込試験

6080100

熟成日数（日）①仕込味噌の熟成経過

図4 蜜自溶解率分析結果を図1〜6に示す。

試験区No．5〜8については、図1、2より仕込み初期の急激なpH低下、酸度上昇が認められた。

「こ・二 l
一■ トNo．2︵課︶また、図5によると試験区No．1、8の酵母でほ・−「卜・No．3一−）・・−−No，4竪暮

発酵力がやや劣っていることが推察される。

‥●・・No．5・ 囁・ No．6 ．慮‥N。．7 ＝． N。．8、・・・・−・・○−＼c．1
一−べ⊃・・・・・・・＼〇，：
トー☆−−No．8208

仕出406080100

熟成日数（日）‥¶‥No．6‥血‥N0．7

図5 アルコール生成能035〉・・ヰ‥No．85360800401005nU5A

図1 pH2一▼l︵訳︶

熟成日数（日）

22000lム︵盲︶莞至喜テ＼−

O 6 ︒凸﹁ りム 02 ︵U1エ l l l i00 20 40 60 80 100
熟成日数（日）十か￣No・3

図6 味噌熟成中の測色値の変化（試験区No．2）−小一No・4 い・○＝No．5㍉牒・・No．6②最終製品の評価

・・墟‥No．7：‥■∴・

分析結果を図7に示す。
0204060

試験区No．3、6では、味噌ではあまり好ましく80

熟成日数（日）ないギ酸が、若干多めに生成している。

図2 滴定酸度0箋至二苫0︵誉 □喜×芦r塞く−01hJ O

N01322110−72−20406080

日o2

†」0．3

㍍04

No．5h8．6

日o．7

試験区
1ロu

日敷

旨クエン酸皿リンゴ酸閻コノ＼ク難曲乳酸ロギ酸樋酢酸追［ロクールタミン澄

図3 蛋白分解率

図7 有機酸組成日o8平成5年度 研究報告 大分県工業試験場言える。

以上の結果と、表3に示す官能試験の結果を総合的

しかし、OM−1溶菌用試薬のⅠ、ⅠⅠについに判断すると、試験区No．2で用いたOM−1が味噌酵母としてもっとも良好な性質を有しているというこては、5時間経過後も顕著な現象が確認できず、とが判明した。

さらに溶菌酵素の検討が必要と思われた。
以上の結果から、耐塩性酵母は細胞壁が他のしたがって、清酒酵母との細胞融合にはOM−1を酵母に比べ強固な構造をしているため、通常の供試した。

溶菌酵素では効果が認められないことが考えら
表3 味噌仕込試験（官能試験結果）
試験区 添加酵母 官能結果

れる。

概 評

一般に、耐塩性酵母は清酒酵母等に比べ、増1 無添加△

2 0M−1◎

すっきり、発酵香有り

殖速度が遅く増殖菌体畳も少ないため、アルコー

3 0M−2△

重い

ル発酵能、増殖速度、芳香性に優れた清酒酵母

4 0M−305 0M【4△60M＋5△

プロトプラスト調製が思うように進まず、この7S。rOuXii0

条件を確立することが今後の最優先課題と考え

8C．versatilis

X

香り過多を融合の相手として選択したが、本研究では、発酵香なしられる。
また、細胞壁の溶解が困難であることから、融合後の細胞壁の再生も容易には行えないこと

3）味噌酵母と清酒酵母との細胞融合が想定されるため、融合法についてもPEG法①選択培地（生理的相補性マーカー）の確認や電気融合法等各種融合技術の検討が今後の課

2．3）①の生育試験の結果、選択培地には炭素源∩リ8であるラフイノースと食塩を両親株の生理的相補性

培 地 成 分培地NO．

K−13 OM−1

O．67％ × 】 ×iYNB∃NaClYNB
2O。67〝】ラフイノース

2・00〝

○ ×nU
︵U O O O O O
654321⊥

表4 K−13とOM−1の生育試験

彗〒二こご∵言こ

確認用選択培地とした。

07︵革マーカーに決定し、衰4の培地No．1を融合成功株

題である。

TTC】

4

図8 プロトブラス化率

1）中野政弘：味噌の醸造技術、（財）日本醸造協会

10・00〝R 1w「YNB：イースト ナイトロゲソ ベース W／0lTT。

3参考文献

弓○山

2

反応時間（h）

0．67〝 u ≧YN831

アミノ酸 pH 5。2
R＝red、W＝White

2）好井・金子。山口：食品教生物学、技報堂出版

3）石川辰夫：微生物遺伝学実験法、共立出版
4）永井進：酵母の細胞工学と育種、学会出版セソタ】
5）木村・河合：食品微生物学、培風館②プロトプラスト融合a）プロトプラスト化条件の検討

6）田口・永井：微生物培養工学、共立出版
7）今井。松本：醸協，70，（12）（1975）

プロトプラスト化率測定結果を図8に示す。

8）海老根英雄：醸凰 80，（3）（1985）

表2の試薬No．王Ⅰ‖こついては、K−13を1

9）西田・加藤・村田：醸協，86，（5）372（1991）

時間で半分以上に溶菌していることがわかる。

10）久寿米木。馬場・中原・小川：醸嵐 87，（9）645

したがって、K】13は、ⅠⅠⅠで十分溶菌可能と（1992）−73一