博士 （ 生命科 学）浅田裕

学位論文題名Functional Studies on NSL2 Involved inP
lant Immunity of Ar
abidopsis（植物免疫に関与するシロイヌナズナNSL2に関する機能解析）

学位論文内容の要旨
抗体や免疫に特化した細胞を持たない植物は，哺乳類とは異なる免疫システムを発達させている。例えば，細菌やウイルスが植物体内に侵入した場合，病原体の侵食や増殖を抑制するた めに，植 物は感 染部位を 含んだ 周辺細胞 がプ口 グラム細胞死(PCD)を起こすことが 知 ら れて い る 。過 敏 感 細胞死 (HR)と呼ぱ れるこの P
CDの 詳細な分 子メカ ニズムは解明され ていない 。私の 研究室で は，このHRを恒常的に起こすシロイヌナズナの変異体ns彦（口e伽む印 〇fぬdん 轟m
窃 を単離しており，またこの原因遺伝子N＆己2の同定にも成功して いる（既報では旧名として飴dJ変異体とCHクJ遺伝子として報告している）。私は，この 変異体を 用いた 研究を通 して，HRを制御する分子機構の実体解明を目指し研究を行った。

i.i/pイヌナズナN
SL2
堕制御工！三ある転写国王ERF
堕鰹蚯
植物 免 疫 は植物 ホルモ ンである サリチル 酸(SA)，ジ ャスモ ン酸(JA)，エ チレン などによ って制御 されて いること が知ら れている 。過去の知見からns12の表現型にSAが関わっていることが報告されている。その一方で，JAおよびエチレンに関する検討がされていなかったことから，これらの植物ホルモンのシグナル伝達系に関わる変異体を用いた遺伝学 的 解 析 を 行 っ た 。そ の 結 果， エ チ レン の シ グナ ル 伝 達系 変 異 体で あ る e thyleneinse
nsitive2と 二重変異 体を作 製するこ とでnsロの表現型であるHRや加速する老化現象にお ける部分 的な復 帰が観察された。さらに，mlcroarray
解析の結果より皿s凹においてエ チ レ ン の シ グ ナ ル 伝 達 系 に 関 わ る 転 写 因 子 ERF（ ETHYLENERESPONSEFACTOR〕の発 現が亢進 してい ることが明らかとなった。そこで，最も発現が上昇していたE霞凡瑙の過剰発現体を作製して解析を進めた。結果，エチレンのシグナル伝達のマーカー遺伝子
PクF
Z．2の発現が上昇し，病原性灰色かび病菌上あ幻′ぬ血伽aに対する抵抗性が亢進した。
これ らの結果 から， NSL2はERF94を介して エチレン に制御 されてい る植物免疫を制御していることが示された。
一1435
一呈：2里iヌナズナにおける全皇獲得抵並蛙堕鰹盤
病原体の感染を受けた植物細胞は未感染の組織に情報を伝達し，植物個体全体で病原体に対 する 抵抗 性を 亢進させる。全身獲得抵抗性(SAR)と呼ばれるこの現象は， SAと関連して いる こと が知 られており，NSL2が不活性化あ るいは分解されることでSARを活性化していると考えられた。しかし，恒常的にHRを示して いるns12変異体を用いた解析では
任 意 の 生 育 ス テー ジや 任意 の組 織で の N
SL2の挙 動の 再現 は不 可能 であ る。 そこ で，
dexam
ethasone (DEX)‑誘導 型の kn
ock‑down
形 質転換植物体を作製することで 解決を試みた。局所的なDEXのシグ ナルが全身的に広がらなぃことを確認した後，処理葉と同じ個体内の非処理葉に分けて発現解析と感染実験を行った 。結果，非処理葉でもSAシグナルの活 性化 と抵 抗性 の亢 進が 確認 され た。 これ らの 結 果よ り， NSL2は， HRとともにSARの制御に関与していることが示された。

墨 ： NSL2と 担 亘 佐 用 す る タ ン パ ク 質 の 固 定 と ns12に お け る 童 iヒ 理 夐 堕 鰹 盤
NSL2の分 子的 機能 の解 明 を目 指し ，酵 母two‑hybridによる相互作用タンパク質のスクリーニング を進めた。その結果，シロイヌナズナの老化を制御するABC
タンパク質である AtNAPl (Arabidopsお 舶 amロ anon‐ intrin8icABC
proteinl） が同 定 され た。 NSL2と老化の関連 性を解析するため，田餾を暗処理しクロロフイルの分解の解析を行った。その結果，ロ地 変異体では野生型の植物体より早いクロロフィルの分解が確認され，同時に分解の中間体 であるpheophdrbideaが蓄積 していることが示された。発現解析によルクロロフィル結合 タンパク質群の減少，クロロフイル分解酵素の蓄積，pheophorbidea
分解酵素の減少が示された。さらに，イ小弭PZ変異体と田s凹の二重変異体を作製した。作出した二重変異体を 解析した結果，クロロフイルの内生量の減少およびイオン流出によルモニターされる老化 現象由来の細胞死は亢進したが，且sロで見られたHRは抑制された。これらの 結 果 ， NSL2と AtN
AP1の相 互作 用は 老化 現象 を制 御す るが ，HRは制 御 しな いこ とが示唆された。

上記の研究を通して，私は NSL2が1）エチレンのシグナ ル伝達系を制御していること，
2)
SARを制御していること，3）別々の制御を受けている植物の抵抗性と老化の共通因子であること，を明らかにした。特に，2）における誘導型形質転換体の作出は細胞死を誘導する他の遺伝子での応用が期待 される。さらに，植物抵抗性と老化が類似の制御を受けているという発現解析レベルに留まる既知の研究に対して，老化現象を詳細に解析した3）での知見はユニークなものである 。これらの結果を基に，不明な点が多い老化現象を含めた植物抵抗性制御のネットワーク の全容解明が期待される。

ー 1436一

学位 論文審査の要旨
主 査

教 授

山 口 淳 二副 査

教 授

加 藤 敦 之

副 査

教 授

田 中

副 査

歩特 任 助 教 千 葉 由 佳 子

学位論文題名FunctionalStudiesonN
SL2Involv
edin
Plant Immunity of Arabidopsis（ 植 物 免 疫 に 関 与 す る シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ NSL2に 関 す る 機 能 解 析 ）抗体や 免疫 に特化 した細 胞を持 たない 植物 は，哺 乳類と は異な る免 疫シス テムを発達させている。例
えば， 細菌や ウイル スが 植物体 内に侵 入した場合，病原体の侵食や増殖を抑制するために，植物は感染部
位を 含 ん だ 周 辺細 胞 が プ ロ グ ラム 細 胞 死 (PCD)を 起こ す こ と が 知ら れ て い る 。過 敏 感 細 胞 死(HR)と呼ぱ れ る こ の P
CDの 詳 細 な分 子 メ カ ニ ズム は 解 明さ れてい ない。 私の 研究室 では， このHRを恒常 的に起こす シロイ ヌナズ ナの変異体nsロ（口Pcr。ぬを叩口触イゐ轟珊カを単離しており，またこの原因遺伝子
N＆ 己2の 同定 にも成 功して いる（ 既報で は旧 名とし て飴ぬ 変具体 とD佃J遺伝子 として報告している）。
私は ， こ の 変 異体 を 用 い た研究 を通し て，HRを制御 する分 子機構 の実 体解明 を目指 し研究 を行 った。
1． シロイ ヌナズ ナNS
L2の JTにあ る転写 因子ERFo
鰹抵
植 物 免疫 は植 物ホル モンで あるサ リチ ル酸(SA)， ジャ スモン 酸(JA），エ チレン など によっ て制御 されてい ること が知ら れて いる。過去の知見からロsZ2の表現型にSAが関わっていることが報告されている。
その一 方で， JAおよ びエチ レンに 関する 検討 がされ ていな かった こと から， これら の植物ホルモンのシグナル 伝達系 に関わ る変 異体を 用いた 遺伝学 的解析を行った。その結果，エチレンのシグナル伝達系変異体で あ る e坦 皿ne血 ― 8樹憎 2と 二 重 変異 体 を 作 製 する こ と で 丑 8
ロ の 表 現 型で あるHRや加速 する老 化現象に おける 部分的 な復 帰が観 察され た。さ らに，Inlcroarray
解析の結果より皿sロにおいてエチレンのシ グ ナ ル 伝 達 系 に 関 わ る 転 写 因 子 ERF（ ETHYLENERESPONSEFACTOR） の 発 現 が 亢 進 し て い る ことが明 らかと なった 。そ こで， 最も発 現が上 昇し ていた 盈RF
舛の 過剰 発現体 を作製 して解析を進めた。
結果， エチレ ンのシ グナ ル伝達 のマー カー遺 伝子 P
口FZ，2の 発現 が上昇 し，病 原性灰 色かび菌め缸雌活
c． 面ereaに対 する 抵抗性 が亢進 した。 これ らの結 果から ，NSL2はERF94を 介し てエチ レンに制御されている植 物免疫 を制御 して いるこ とが示 された 。
2．シ ロイヌ ナズナ におけ る全 身獲得 抵抗性 の鰹析
病 原体 の感染 を受け た植物 細胞は 未感 染の組 織に情 報を伝 達し ，植物 個体全 体で病 原体に 対する抵抗性 を 亢 進 さ せる 。 全 身 獲 得抵 抗 性 (SAR)と 呼 ぱれ る こ の 現象 は，SAと 関連し てい ること が知ら れており ， NSL2が 不 活 性 化あ る い は 分 解さ れ る こ と でSARを 活 性化し ている と考え られ た。し かし， 恒常的に HRを 示し て い る ns
口 を 用 い た 解析 で は 任 意 の生 育 ス テ ー ジ や任 意 の 組 織 での N
SL2の挙 動の再 現は不 可能で ある。 そこ で，dexam
ethasoneくD
Eめ・ 誘導型 のknock．down形質転 換植物 体を作 製することで解 決 を 試 み た。局 所的な D
EXの シグナ ルが 全身的 に広が らない ことを 確認 した後 ，処理 葉と同 じ個 体内の 非処理 葉に分 けて 発現解 析と感 染実験 を行 った。 結果， 非処理 葉でも S
Aシグ ナルの 活性化 と抵抗性の亢 進 が 確 認 され た 。 こ れ らの 結 果 よ り ，NSL2は， HRと とも にSA
Rの制御 に関 与して いるこ とが示 された。

3． NSL2と担亘佐屈するタ ン′！2質の同定とnsl2にお ける童化墨墓堕鰹 抵NS
L2の 分子 的機 能 の解 明を 目 指し ，酵 母 t
wo‑hybridによ る相 互 作用 タン パ ク質のスクリ ーニングを
進 め た 。 そ の 結 果 ， シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の 老 化 を 制 御 す る ABCタ ン パ ク 質で あ るAtNAPl (Arabid
opsお曲 a協田 anon・ intrin
sicABCprotein1）が同定 された。NS
L2と老 化の関連性を解析す るため，口sロを暗処理し クロロフィルの分解 の解析を行った。 その結果，ロめ変 異体では野生型の植 物体より早いクロロフ
ィ ルの 分 解が 確認 さ れ， 同時 に 分解 の中 間 体で ある pheophorbideaが蓄積 していることが示 された。発現 解析 に よル クロロフイル結 合タンパク質群の 減少，クロロフア ル分解酵素の蓄積， pheophorbidea分解酵 素の 減 少が 示さ れ た。 さら に ，4tA
鬩PZ変異 体とロ8凹 の二重変異体を作 製した。作出した 二重変異体を解析 した結果，クロロフ イルの内生量の減 少およぴイオン流 出によルモニターさ れる老化現象由来の細胞 死 は 亢 進 し た が ， ロ 齟 で 見 ら れ た HRは 抑 制 さ れ た 。 こ れ ら の 結 果 ，NSL2と AtN
AP1の相 互 作用 は老化現 象を制御するが，HRは制御しないこと が示唆された。
これ を 要す るに ， 著者 は， NSL2が，1）エチレン のシグナル伝達系 を制御していること ，2)SARを制御している こと，3） 別々の制御を受け ている植物の抵抗性と老化の共通因子であること，を明らかにした。特に，
2）における誘導 型形質転換体の作 出は細胞死を誘導す る他の遺伝子での 応用が期待される。さらに，植物抵抗性と 老化が類似の制御を 受けているという 発現解析レベルに 留まる既知の研究に 対して，老化現象を詳細に解析 した3）で の知見はユニーク なものである。これ らの結果を基に， 不明な点が多い老化現象を含めた植物抵抗 性制御のネットワー クの全容解明が期 待される。以上の ように，著者の研究 は植物抵抗性と老化現象の 関連 性 に関 する 新 知見 を得 た ものであ り，今後の植物免疫 研究に対して貢献 するところ大なる ものがある。
よ っ て 著 者 は ， 北 海道 大学 博 士（ 生命 科学 ） の学 位を 授与 され る 資格 ある もの と認 め る。