はじめての酸化ストレスマーカー
測定プロトコル〜カスタマーサポートの視点から〜

目次

I. はじめに・・・・2

II. 活性酸素 (ROS) とは・・・・2

III. 酸化ストレスマーカー

・・・・3

スーパーオキシドジスムターゼ (SOD)
カタラーゼ
グルタチオンペルオキシダーゼ (GPx)
グルタチオンビリルビン
8- ヒドロキシデオキシグアノシン (8-OHdG)
8- ニトログアノシン
AP site
過酸化脂質 (LOOH)
一酸化窒素 (NO)
硫化水素 (H2S)

IV. 酸化ストレスマーカー測定試薬・・・・7

SOD Assay Kit -WSTGSSG/GSH Quantification Kit
Total Glutathione Quantification Kit
Anti-Nitroguanosine antibody-Nucleostain- DNA Damage Quantification Kit -AP Site Counting

Liperfluo
DPPP
NO2/NO3 Assay Kit

V. 関連製品紹介

・・・・20VI. 参考文献・・・・22

1

I. はじめに生命は酸素を利用することで、効率的にエネルギーを取り出すことが可能となり、大きく進化してきた。しかし、酸素の一部はその代謝過程で『活性酸素』と呼ばれる分子に変わる。この活性酸素はヒトの生命維持に重要な働きをしているが、過剰になると酸化ストレスに陥り細胞を傷つけ、疾病や老化の引き金になると考えられている。そのため、体内では活性酸素を消去するための様々な仕組み ( 抗酸化能 ) が働いている。

正常な状態では抗酸化能によって活性酸素は速やかに消去されるが、生体内の抗酸化機能で除去しきれない過剰な活性酸素が生じる場合、生体の構造や機能を担っている核酸、タンパク質や脂質を酸化して損傷を与え、構造や機能を障害する。このような、活性酸素が過剰に存在している状態、つまり、『活性酸素の生成と消去のバランスが崩れた状態』を【酸化ストレス】と呼ぶ。酸化ストレスはからだのサビつき度を表す指標と言われ、肥満や生活習慣病、認知症などの脳老化、疲労、白内障や肌老化など様々な疾病メカニズムに関与している。

小社ではこのような酸化ストレスの指標となる酸化ストレスマーカーを測定する製品をいくつか販売していることから、「自分が現在使用している酸化ストレスマーカー以外で、良い指標となるマーカーはないか」、「酸化ストレスマーカーを測定するサンプル ( 細胞・組織 ) の前処理をどうすればよいのか」などといった問い合わせが、多く寄せられる。本稿ではそのような方々のために、各酸化ストレスマーカーの説明や試料の前処理方法などをご紹介したい。

II. 活性酸素 (ROS:Reactive Oxygen Species) とは酸素分子 (O2) に由来し、反応性の高い酸素種を総称して活性酸素または活性酸素種と呼ぶ。

酸素分子が 1 電子還元されて生成するスーパーオキシドアニオンラジカル (O2・-) や 2 電子還元されて生じる過酸化水素 (H2O2)、H2O2 が Fe などによりさらに還元 (3 電子還元 ) されて生じるヒドロキシラジカル (・OH) など
2+が挙げられる。今挙げた O2・-、H2O2、・OH に加え、一重項酸素 ( O2) の 4 種類を狭義の活性酸素といい、広義に
1は一酸化窒素 (NO・)、二酸化窒素 (NO2・)、オゾン (O3)、過酸化脂質 (LOOH) も活性酸素に含まれる ( 表 1)。また、
放射線によって水から電子が放出される際にも活性酸素種が生成する。

O2・- は、NO・が存在するとパーオキシナイトライト (ONOO-) に変換される。また、O2・- は、自発的あるいはスーパー

オキシドジスムターゼ (SOD) の作用により、速やかに過酸化水素 (H2O2) と酸素 (O2) に不均化される。H2O2 はグ

ルタチオンペルオキシダーゼ (GPx) やカタラーゼの存在下で水 (H2O) と酸素 (O2) になり、無毒化される。

・

表 1 主な活性酸素

スーパーオキシド
アニオンラジカル
過酸化水素

OH
OH-

O2・-

e-

H2O2

ヒドロキシラジカル

・

OH

一重項酸素

1

一酸化窒素

NO・

二酸化窒素

NO2

・

オゾン

O3

過酸化脂質

LOOH

O2

SOD

酸化ストレス

O2

O2・-

酸素

カタラーゼ

H2O2

H 2O
GSH

NO

GPx
GSSG

ONOO図 1 活性酸素関連図

2

H 2O

III. 酸化ストレスマーカー
活性酸素 (ROS) の生体内での動きと酸化ストレスマーカーの関係を図 2 に沿って説明する。

高直接測定( スピントラップ法 )

低

ビリルビン
バイオピリン

図 2 活性酸素の生体内での動きと酸化ストレスマーカー

酸化ストレスマーカーは大きく分けて、①抗酸化酵素、②抗酸化物質、③活性酸素によって生じた生体内産物、の 3 つに分類される。抗酸化酵素とは『活性酸素を分解除去する酵素』を意味し、抗酸化物質とは『活性酸素を補足・中和して無毒化する物質』を示す。活性酸素によって生じた生体内産物とは『核酸やタンパク質などが酸化的障害を受け変異したもの、またはその代謝物』を示す。酸化ストレスの評価方法として、①②は抗酸化能の増減、代謝物量を確認、③は生体内産物そのもの、またはその代謝物量を確認する。

活性酸素は、放射線、喫煙、さらには日常生活における呼吸によっても生じる。この活性酸素を消去するために一番最初に立ち向かうのは①抗酸化酵素である。抗酸化酵素にはスーパーオキシドジスムターゼ (SOD)、カタ

ラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ (GPx) などが挙げられる。

もしこの抗酸化酵素が消去できる量以上の活性酸素が生体内で発生していた場合、次に活性酸素に立ち向かうのは②抗酸化物質である。抗酸化物質にはグルタチオン、ビリルビン、ビタミン類などが挙げられる。

この抗酸化物質でも活性酸素を消去しきれなかった場合、活性酸素は核酸 (DNA)、タンパク質、脂質などを攻撃して損傷を与える。DNA やタンパク質、脂質などの分子は細胞を構成しており、これらが活性酸素により酸化変性されることによって、細胞機能をも障害される③。

活性酸素量を直接測定することが可能であれば、生体内の状態を一早く知ることができる。電子スピン共鳴装置 (Electron Spin Resonance:ESR) によってフリーラジカルに類する一部の活性酸素は直接、DMPO や Carboxy-

PTIO などのスピントラップ剤の存在下で測定することが可能である。しかし、測定には高価な装置が必要であり、かつ、定量的な測定には技術を要することから簡単には測定ができない。一方、上記のような酸化ストレスマーカー
は比較的簡便に測定が可能であり、酸化ストレスを評価するためによく用いられる。また、抗酸化機能に関わる物質量 ( 活性 ) の変動を知ることで、酸化ストレスや病態の進行度合いを知ることができる。

3

スーパーオキシドジスムターゼ (SOD)
SOD は O2・- を酸素 (O2) と過酸化水素 (H2O2) に不均化する酵素で、活性中心に銅イオンと亜鉛イオン (Cu/Zn-

SOD)、またはマンガンイオン (Mn-SOD) のような金属イオンを持つ。

Cu/Zn-SOD は通常恒常的に発現し、すべての細胞質に大量に存在するが、とくに肝臓や赤血球などに多く存在する。Cu/Zn-SOD のノックアウトマウスで加齢に伴う難聴がひどくなり、若年から難聴をきたすようになる
ことから、Cu/Zn-SOD は難聴防止に働いていると言われている 。
1)

Mn-SOD はミトコンドリアに局在し、比較的安定なタンパク質である。また、腫瘍壊死因子 (TNF)-α、リポポ

リサッカライド (LPS) などで発現が誘導され、細胞保護に働くことが知られている 。Mn-SOD は様々な酸化2)

ストレスが増加する状態で誘導を受ける場合が多く、一種の酸化ストレスマーカーである。

その他、細胞外や細胞膜に結合した状態で存在するアイソザイムの extracellular-SOD(EC-SOD) は、血漿中や細胞表面に生じた O2・- を消去する。

カタラーゼ
カタラーゼは過酸化水素を水と酸素に不均化させる酵素である。(2H2O2 → 2H2O + O2)
肝臓・腎臓・血液などはカタラーゼ活性が高いと言われる。
表 2 マウス各組織のカタラーゼ活性

組織
肝臓
腎臓
脾臓

3)

活性
34,000 ~ 68,000(U/g 組織 )20,000 ~ 36,000
447 ~ 630

組織
心臓
脳
血液

活性
413 ~ 500(U/g 組織 )78 ~ 91
2,600(U/ml)※ 3 種のマウスそれぞれ 3 ~ 6 匹の平均値。マウスの系統によって活性にバラつきが見られる。
脳の活性は血液の残存活性によると思われ、カタラーゼ活性は事実上 0 と考えられる。

グルタチオンペルオキシダーゼ (GPx)
GPx はグルタチオン存在下、生体内に生じた過酸化水素や過酸化物を消去する酵素である。活性部位にセレン (Se)を 21 番目のアミノ酸といわれる「セレノシステイン (Sec)」の形でもち、Se の高い求核性を利用して過酸化物

をアルコール体へ還元する。この際、活性部位 Sec の SeH は SeOH へ酸化される。この SeOH は 2 分子のグル

タチオン (GSH) から電子を受け取り、元の SeH へと還元される ( 図 3)。

また、GPx には 4 つのアイソザイムの存在が知られていて、それぞれ局在・役割が異なる。すなわち、各種臓

器の細胞質やミトコンドリアに豊富に存在する cGPx,GPx1、肝臓・消化管の細胞質に存在する GIGPx, GPx2、血漿などの細胞外過酸化物を消去する eGPx,GPx3、細胞膜中のリン脂質過酸化物を消去する PH-GPx, GPx4 の 4種類である。

なお、GPx と病態の関係としては、次のような報告がある。動脈硬化は低密度リポ蛋白質 (LDL) の酸化が引き金になると考えられているが、eGPx が LDL の酸化を抑制し、また、血中 Se 濃度と動脈硬化症発症に負の相関があるとされている 。
4)グルタチオンレダクターゼ

無毒化

図 3 グルタチオンサイクル

4

グルタチオン
グ ル タ チ オ ン は 細 胞 内 に 存 在 す る SH 基 を 有 す

る ト リ ペ プ チ ド で あ り、 還 元 型 GSH と 酸 化 型

総グルタチオン量の変化
通常

GSSG/GSH 比の変化

GSSG(Glutathione-S-S-Glutathione) が 存 在 す る。

GSH

能に関わっており、還元型 GSH は H2O2 を無毒化す

GSSG

GPx の項でも述べたように、H2O2 を除去する抗酸化るため酸化型 GSSG に変化する。GSSG はグルタチ

GSH
GSSG

GSH
GSSG

オンレダクターゼによって GSH へと再生される ( 図3)。健康な細胞と組織では還元型 GSH が大部分を占める。酸化ストレスによって総グルタチオン量やGSH キャパシティーの範囲内の酸化ストレス

GSH /GSSG 比は変化するため、酸化ストレスの程

図 4 酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンの関係

度を把握するために用いられる 。
5)

ビリルビン

GSH キャパシティーを超える酸化ストレス6)

一般にビリルビンは神経毒性が高く、黄疸の原因として排泄されるべき有害物質と考えられている。一方、ビリル

ビンは『抗酸化物質』として働くこともわかってきた。ビリルビンは活性酸素と直接反応し、自身が酸化分解されることで活性酸素を還元的に消去する。この働きによってビリルビンより生じる酸化生成物は「バイオピリン」と総称される。ビリルビンが活性酸素を消去するとバイオピリンの生成が増加する。そのため、バイオピリンは酸化ストレスマーカーになると考えられており、動脈硬化等の疾患のみならず、心理的・社会的ストレスの指標として適用できる可能性が示唆されている。また、体内で生成したバイオピリンは速やかに尿中に排泄されるため、尿中バイオピリンはリアルタイム型の酸化ストレスマーカーとなりうる。

8- ヒドロキシデオキシグアノシン (8-OHdG )7)
8-OHdG は DNA を構成する塩基の一つデオキシグアノシン (dG) の 8 位が活性酸素種によって酸化され、ヒドロキシル化した構造をもつ DNA 酸化損傷マーカーである。
O

O
N

N

NH

NH
HO

N
CH2OH

N

NH2

N

ROS
CH2OH

O

N

NH2

O

OH

OH

8-OHdG

deoxyguanosine

図 5 活性酸素による deoxyguanosine のヒドロキシル化

染色体 DNA 上に発生した 8-OHdG は修復酵素の作用により染色体 DNA より切り出され細胞外に放出、血液を通って最終的に尿中に排出される。また、8-OHdG は DNA 複製時に G → T 変異を引き起こすため、染色体における 8-OHdG の増加は発癌リスクの上昇に関連すると考えられている。糖尿病患者や糖尿病動物モデルの尿中には 8-OHdG が増加しているとの報告もある 。8-OHdG は化学的に安定な物質であり、2 次代謝などを受
8)

けずに尿中に排出されることから、酸化ストレスの度合いを定量的に反映する酸化ストレスマーカーとして利
用される。

5

8- ニトログアノシン
8- ニトログアノシンは NO・と O2・- との反応から生じる ONOO- や、ミエロペルオキシダーゼ / 亜硝酸イオン /過酸化水素、などによってグアノシンがニトロ化されて生成する修飾核酸である。これまでに、ウイルス感染、がん、喫煙、などでグアニンのニトロ化が亢進していることが明らかになり、酸化ストレスの新しいバイオマー

カーとして注目されている。また、8- ニトログアノシンの局在や量などを調べることにより、8- ニトログアノ

シン残基の役割や遺伝子損傷、発癌機構の解明に役立つことが期待されている。

AP SiteAP Site とは DNA 中の塩基損傷部位、apurinic/apyrimidinic site( 脱プリン / 脱ピリミジン部位 ) のことである。

AP Site は、8-OHdG などの損傷を受けた塩基が正常な状態に修復される過程で切れ出されて生じる ( 図 6)。正常な修復系では AP- エンドヌクレアーゼによって選択除去されるが、何らかの原因で AP Site が修復されなかった場合、突然変異や発癌、細胞死の原因となる。また、活性酸素である・OH が存在する系中に抗酸化能が期待される食品を添加すると AP Site 量が減少した、という報告もある 。
9)

そのため、AP Site を測定することは、酸化ストレス、抗酸化能測定の 1 つの目安になるといえる。

損傷塩基の脱離⇨AP Site の生成

核酸塩基の
損傷

AP

修復

図 6 DNA 酸化的損傷、AP Site ができる過程

DNA の酸化的損傷の指標として、8-OHdG、8- ニトログアノシン、AP Site などが用いられるが、AP Site は
8-OHdG 以外の塩基修飾損傷、複製エラー修復時にも生じるため、AP Site と 8-OHdG の測定値は一致しない

ことが多い。DNA という一つの生体高分子への酸化的損傷を確認したい場合でも、複数種類の指標を用いて多角的に確認することが望ましい。

過酸化脂質 (LOOH)
血漿中や生体膜中の脂質の構成成分である多価不飽和
脂 肪 酸 (Poly-unsaturated fatty acid:PUFA) は、 不 飽 和

連鎖的部が活性酸素による攻撃を受けやすく、活性酸素によOHり過酸化脂質になる。脂質 (LH) が・OH のような活性酸
素と反応し、水素原子を引き抜かれ、脂質ラジカル (L )・になる。この L は酸素分子と速やかに反応して、脂質・ペルオキシルラジカル (LOO ) となる。さらに LOO は
・

LH

( 脂質）

H2O

O2

L・

LOOH

LOO・

( 過酸化脂質）

・他の脂質の水素原子を引き抜き、LOOH に変わる。酸

LH

化ストレスによる過酸化脂質の生成は、連鎖的に行われる。

図 7 連鎖的な過酸化脂質生成6

一酸化窒素 (NO)NO は NO 合成酵素 (NOS) によってアルギニンから産生され、当初、血管平滑筋の弛緩因子として同定された。その後、生体内の様々な生理作用に深くかかわる重要なシグナル分子であることが分かってきた。NO はグアニル酸シクラー

ゼを活性化し、サイクリック GMP の産生を促し、この分子がさらに下流へと情報を伝達し、多彩な生理作用を引き起こす。

NO・は分子内に不対電子を一個もつフリーラジカルであり、ラジカルや金属イオンと高い反応性を示す。また、共存する活性酸素や金属と反応して、反応性に富む物質 (NO2 , ONOO ) へと変換され、それらが核酸、脂質、タンパク--質といった生体分子へ酸化損傷を与える。

硫化水素 (H2S)
生体内ではシステインから酵素シスタチオニン β- シンターゼ (CBS)、シスタチオニン γ- リアーゼ (CSE)、または 3-

メルカプトピルビン酸 サルファトランスフェラーゼ (3MST) によって産生されるシステインの最終代謝産物であり、一酸化窒素 (NO)、一酸化炭素 (CO) に続く第三のシグナルガス分子として近年注目されている。H2S は還元性なため抗酸化能を有し、この点が過酸化水素 (H2O2) を含め他のシグナル分子とは大きく異なる特徴である。インスリンの分泌抑制効果や神経伝達の調節、平滑筋の弛緩など多彩な生理作用が知られているが、詳細なメカニズムは不明な点が
多い

10)

。

H2S の pKa は 6.8-7.0 であり、生理的条件下では殆どが解離型アニオン (HS-) として存在する。容易に酸化され、

HSS- や HSSS- といったポリスルフィド (HSn-)、あるいはスルフェン スルファ (S0) になると考えられ 11)、これらがタ。チオール基はまた、NO や H2O2 とも反ンパク質チオール基をスルフヒドリル化しペルスルフィド (-SSH) となる

12)

作用し、複雑で多様なチオール基修飾のネットワークを生みだしている。修飾のメカニズムや生物学的な役割は殆応し、それぞれニトロソチオール (-SNO) やスルフェン酸 (-SOH) を与える。これらの修飾はペルスルフィドとも相互13)

ど解明されておらず、研究を進めるためのツールが切望されている。小社では SulfoBiotics という一連の試薬・キットを開発している。

IV. 酸化ストレスマーカー測定試薬(1) SOD

S311 SOD Assay Kit-WST

SOD 活性を測定する方法としては、キサンチン / キサンチンオキシダーゼを O2・- 生成系とし、テトラゾリウム塩の還元反応を利用した NBT 法は操作が簡便であることから汎用されているが、生成するホルマザンが 不溶性の沈殿物であることや、NBT( ニトロブルーテトラゾリウム ) がキサンチンオキシダーゼと直接反応し 100％ SOD 阻害率を測定することができないなどの 問題をかかえている。小社の SOD Assay Kit-WST が基質として使用している

WST-1 は、キサンチンオキシダーゼと直接反応しないため、100% SOD 阻害率を測定可能である。
-

O2 N

H

O3 S

SO3-

N

N

xanthine
O2

2O2

N

xanthine oxidaseN

WST-1 formazan

I
-O S
3

O2 N

SO3-

N

uric acid
H 2O2

N

+
N N

2O2-

Na+

WST-1

I

SOD

inhibition reaction

O 2 + H 2 O2

図 8 SOD Assay Kit-WST の測定原理図

本キットの詳細な原理は、小社のプロトコル集 (http://www.dojindo.co.jp/technical/protocol.html) をご覧頂きたい。

SOD Assay Kit-WST は酸化ストレスマーカー測定としてだけでなく、食品の抗酸化能 (SOD 様活性 ) 測定にも用いられる。生体試料をはじめ、緑茶などの食品を測定する際の前処理方法を次に紹介する。
7

＜前処理例＞
・血漿、赤血球＜ サンプル実測例＞

3)

1) 最終濃度約 10 U/ml ヘパリン液となるように採取した血液 2 ~ 3 ml を遠心管に取る。
2) 0 ~ 4℃、600 ×g、10 分間遠心し、上清を希釈して血漿試料とする。
3) 沈殿に生理食塩水を加え元の量 (2 ~ 3 ml) とし、10ml 用ガラス遠心管に 0.4 ml 採取する。
生理食塩水で 10 ml とし、0 ~ 4℃、600 ×g、10 分間遠心する。
4) 上清を除去後、沈殿をほぐし、生理食塩水で 0 ~ 4℃、
600 ×g、10 分間遠心する。この洗浄操作を 2 回行う。
5) 上清を除去後、沈殿に 4.0 ml 蒸留水を加える。( 赤血球が溶血して中の SOD が流出する。)
6) エタノール 1 ml とクロロホルム 0.6 ml を加える。
7) 共栓をしてシェーカーで約 15 分間強く振る。
8) 0 ~ 4℃、600 ×g、10 分間遠心し、層を乱さぬように遠心管を静かに取り出す。
9) 水 / エタノール層 0.1 ml を試験管に取り、蒸留水 0.7
ml を加え、 赤血球試料とする。
※希釈の際には 0.25 % エタノールを使用してください。

本プロトコルで前処理したサンプルを SOD Assay
Kit -WST で測定し、WST 法でユニットを規定した場合の結果
表 3 Total-SOD 実測例

赤血球
血漿
ラット心臓
ラット肝臓
HeLa 細胞HL60 細胞9720 U/ml of blood
335 U/ml of blood
15712 U/g( 湿重量 )142907 U/g( 湿重量 )73 U/1 × 107 cells
226 U/1 × 108 cells※一測定例ですので、実際の測定値は異なることがあります。

・茶葉 (10 g)

14)1) 茶葉試料 10g に蒸留水 400ml を加えてホモジ
ナイズ処理する。
2) 5℃で 48 時間静置して抽出する。
3) 48 時 間 後、 ろ 過 (No.2: ア ド バ ン テ ッ ク 東 洋( 株 )) し、さらにメンブレンフィルター (poresize 0.45 μm: 富士フィルム ( 株 )) でろ過したろ液を測定試料とする。
※緑茶等はその物自体に着色がありますが、100 倍程度・細胞6に希釈すると測定に対する色の影響は回避可能です。

7（HeLa: 9×10 cells, または HL60：1.2×10 cells）

1) PBS(Phosphate Buffered Saline) 1 ml で 2 回洗浄する。
2) PBS を除去後、ホモジナイザーあるいは超音波破砕機などを用いて細胞膜を破壊する。
3) 新たに PBS 1 ml を加え、良く混合する。
4) 0 ~ 4℃、10,000 ×g で 15 分間遠心する。
5) 上清を測定試料とする。
※希釈前で阻害率が 50% を超えていない場合には更に細胞数

希釈はキットの Dilution buffer または生理食塩水で行って下さい。

・ワイン

15)1) 直接メンブランフィルターでろ過し、ろ液を測定試料とする。

※赤ワインなどはその物自体に着色がありますが、100倍程度に希釈すると測定に対する色の影響は回避可を増やして測定してください。

能です。希釈はキットの Dilution buffer または生理食塩水で行って下さい。

・組織

・植物、野菜類

3)1) 生理食塩水でよく洗い、できるだけ脱血する。
2) 水分を濾紙などで注意深くふき取り、湿重量を測る。
3) 湿重量に対し 4 ~ 9 倍のショ糖緩衝液 (0.25 mol/l ショ
糖 , 10 mmol/l ト リ ス 塩 酸 緩 衝 液 pH7.4、1 mmol/l
EDTA) を加え、組織をヒストコロンなどを用いて破砕する。
4) テフロン製ホモジナイザーなどでよくホモジナイズする。
5) 10,000 ×g、60 分間遠心し、上清を測定試料とする。

81) 蒸留水 ( 野菜の重量に対し 5 倍量程度 ) で 4℃、
1 分間ホモジナイズする。
2) ホモジネートをろ紙でろ過し、ろ液 ( 水による抽出物 ) を凍結乾燥する。
3) 凍 結 乾 燥 し た も の を 0.1mol/l リ ン 酸 緩 衝 液(pH7.4) に溶かし、これを測定試料とする。
※溶かしたものはなるべく早く使用してください。

※上記試料により得られた活性値は、水による抽出物の凍結乾燥後の重量もしくはホモジナイズ前の野菜重量当りの活性値とします。

本キット (WST 法 ) におけるユニット定義は次の通りである。

『WST 還元の 50% 阻害を示すサンプル溶液 20 μl ※に含まれる SOD 量が 1 単位 (U) である』
つまり、『1U = IC50 = WST の発色を 50% 阻害する時のサンプル濃度』となる。

※ 96 well プレート 1 well に 20 μl のサンプル試料を添加し、反応させて SOD 様活性を測定する。
本キットを使用してユニットを算出するためには、サンプル原液濃度が IC50 よりも高くなければならない。もし

サンプル原液濃度が IC50 に達しない場合にはユニット算出はできないが、全発色と比較した阻害率という形で SOD
活性を議論している報告もある。そのような報告の一例として、阻害率で SOD 活性を議論している論文報告を紹介させて頂く。サンプルはヒト唾液である。

S.-C. Kim et al., ” Antioxidant profile of whole saliva after scaling and root planing in periodontal disease”, J.
Periodontal Implant Sci., 2010, 40(4), 164–171.
次に、Mn-SOD のみの活性を選択的に測定したい場合の処理方法例を紹介する。

＜ Mn-SOD 活性の測定＞ 16)〇 KCN（シアン化カリウム）を使用する Mn-SOD 測定例(1) 血液 20 ml に、20 ml の血球分離溶液 Polymorphprep( 第一化学薬品株式会社 ) を加え、500 ×g で 35 分間遠心分離させる。

(2) 白血球を冷やした [0.25 mol/l ショ糖 , 10 mmol/l Tris–HCl; pH 7.4] 溶液 1.2 ml に再懸濁させ、ホモジナイズ後、900 ×g で 10 分間遠心分離させる。

(3) 上清を 5,000 ×g、10 分遠心分離させる。

(4) 得られたミトコンドリア画分を冷やした [0.25 mol/l ショ糖 , 10 mmol/l Tris–HCl; pH 7.4] 溶液 50 μl に再懸濁させ、100,000 ×g で 60 分間遠心分離させる。

(5) 得られた上清を細胞質画分とする。

(6) 各画分に 10 mmol/l シアン化カリウムを加える。(Cu/Zn SOD をマスキング )(7) SOD Assay Kit-WST の取扱い説明書に沿って測定する。
また、サンプル中にジエチルジチオカルバミン酸 (DDC; 終濃度 1 mmol/l) を添加することによっても Cu/Zn-

SOD と EC-SOD の活性が阻害され、Mn-SOD の活性を選択的に測定できる 17)。

＜小社製品使用の論文報告情報＞
SOD Assay Kit-WST
血液

ラット血漿

精漿

-

植物

M. Miyamura et al., "Difference between Deep Seawater and Surface Seawater in thePreventive Effect of Atherosclerosis", Biol. Pharm. Bull., 2004, 27(11), 1784-1787 .
Y. Sakamoto et al., "The assessment of oxidative stress in infertile patients withvaricocele",BJU Int., 2008, 101(12), 1547-1552.

茶葉

森山洋憲 他 , " 高知県産茶および青果物に有するスーパーオキシドアニオン消去能の測定", 日本食品科学工学会誌 , 2002, 49(10), 679-682.

碁石茶

島村智子 他 , " 碁石茶製造工程におけるカテキン含量とスーパーオキシドアニオン消去活性の変化 ", 日本食品科学工学会誌 , 2008, 55(12), 640-644.

ワイン

受田浩之 他 , " スーパーオキシドアニオン消去活性新規測定法の食品への応用 ", 日本食品科学工学会誌 , 2002, 49(1), 25-31.

りんごポリフェノール

T. Matsui et al., "Apple procyanidins induced vascular relaxation in isolated rat aorta
through NO/cGMP pathway in combination with hyperpolarization by multiple K+ channel
activations.", Biosci. Biotechnol. Biochem., 2009, 73(10), 2246-2251.

キノコからの抽出物

K. Yoshikawa et al., "Novel Phthalide Compounds from Sparassis crispa (Hanabiratake),
Hanabiratakelide A-C, Exhibiting Anti-cancer Related Activity", Biol. Pharm. Bull., 2010,33(8), 1355-1359.

9イワシすり身のアルカリプロテアーゼ分解物

細胞

R. Iida et al., "M-LP, Mpv17-like Protein, Has a Peroxisomal Membrane Targeting Signal
Comprising a Transmembrane Domain and a Positively Charged Loop and Up-regulatesExpression of the Manganese Superoxide Dismutase Gene", J. Biol. Chem., 2003, 278(8),6301-6306.

tat/293mTat/293

K. Imai et al., "Induction of OGG1 Gene Expression by HIV-1 Tat", J. Biol. Chem., 2005,
280(29), 26701-26713.

正常ヒト表皮角化細胞
口腔扁平上皮癌細胞

T. Yamamoto et al., "Green Tea Polyphenol Causes Differential Oxidative Environments in
Tumor versus Normal Epithelial Cells", J. Pharmacol. Exp. Ther., 2003, 307(1), 230-236 .

SW620( ヒト結腸腺癌 )B. G. Heerdt et al., "The Intrinsic Mitochondrial Membrane Potential of Colonic Carcinoma
Cells Is Linked to the Probability of Tumor Progression", Cancer Res., 2005, 65 (21), 98619867.
H. R. Rezvani et al., "Hypoxia-inducible Factor-1 , a Key Factor in the Keratinocyte
Response to UVB Exposure", J. Biol. Chem., 2007, 282(22), 16413-16422.
H. R. Rezvani et al., "Protective Effects of Catalase Overexpression on UVB-induced
Apoptosis in Normal Human Keratinocytes", J. Biol. Chem., 2006, 281(26), 17999-18007.

granulosa( 顆粒細胞）K. E. Valdez et al., "Regulation of apoptosis in the atresia of dominant bovine follicles of thefirst follicular wave following ovulation", Reproduction, 2005, 130, 71-81.

PC12( 神経モデル細胞 )Z. Wei et al., "Olanzapine Protects PC12 Cells From Oxidative Stress Induced by Hydrogen
Peroxide", J. Neurosci. Res., 2003, 73, 364-368.

酵母

L. Xiang et al., "Anti-Aging Effects of Phloridzin, an Apple polyphenol, on Yeast via the SOD
and Sir2 Genes", Biosci. Biotechnol. Biochem., 2011, 75(5), 854-858.

クリプトコッカス

A. R. Siafakas et al., "Cell Wall-linked Cryptococcal Phospholipase B1 Is a Source ofSecreted Enzyme and a Determinant of Cell Wall Integrity", J. Biol. Chem., 2007, 282(52),37508-37514.

マウス腎臓

組織

消去活性 ", 日本食品科学工学会誌 , 2003, 50(9), 392-398.

COS7( アフリカミドリザル腎臓 )keratinacyte( 角化細胞 )真菌森山洋憲 他 , " イワシ筋肉アルカリプロテアーゼ加水分解物のスーパーオキシドアニオン

H. Fujita et al., "Reduction of Renal Superoxide Dismutase in Progressive Diabetic
Nephropathy", J. Am. Soc. Nephrol., 2009, 20(6), 1303–1313.
M. Kitada et al., "Resveratrol Improves Oxidative Stress and Protects Against Diabetic
Nephropathy Through Normalization of Mn-SOD Dysfunction in AMPK/SIRT1 Independent
Pathway", Diabetes , 2011, 60(2), 634-643.

マウス脳

L. Esposito et al., "Reduction in Mitochondrial Superoxide Dismutase Modulates
Alzheimer's Disease-Like Pathology and Accelerates the Onset of Behavioral Changes
in Human Amyloid Precursor Protein Transgenic Mice", J. Neurosci., 2006, 26(19), 51675179.

マウス膵臓

T. B. Mysore et al., "Overexpression of Glutathione Peroxidase With Two Isoforms ofSuperoxide Dismutase Protects Mouse Islets From Oxidative Injury and Improves Islet
Graft Function", Diabetes, 2005, 54(7),2109-2116.

マウス心臓移植片

T. Hasegawa et al., "Suppression of nitrosative and oxidative stress to reduce cardiac
allograft vasculopathy", Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol., 2009, 296, H1007–H1016.

ラット腎臓

A Hamada et al., "The Effect of Eriobotrya japonica Seed Extract on Oxidative Stress in
Adriamycin-Induced Nephropathy in Rats", Biol. Pharm. Bull., 2004, 27(12), 1961-1964.

ラット肝臓

J. Nishimura et al., "Effect of Fenofibrate on Oxidative DNA Damage and on Gene
Expression Related to Cell Proliferation and Apoptosis in Rats", Toxicol. Sci., 2007, 97(1),44-54.

ラット肝臓＆大脳＆小脳

N. Mori et al., "Comparative study of activities in reactive oxygen species production/
defense system in mitochondria of rat brain and liver, and their susceptibility tomethylmercury toxicity.", Arch. Toxicol., 2007, 81(11), 769-776.

ヒト結腸直腸癌

M. Seike et al., "Proteomic Analysis of Intestinal Epithelial Cells Expressing Stabilized
β-Catenin", Cancer Res., 2003, 63, 4641-4647.

10

(2) グルタチオン
G257 GSSG/GSH Quantification Kit(GGQK)
T419 Total Glutathione Quantification Kit(TGQK)

グルタチオン濃度の測定法として、次の方法が利用されている。

1. Ellman 試薬である DTNB(5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid) を使用して吸光度で測定
2. o- フタルアルデヒドを使用して蛍光光度法で測定

3. グルタチオンレダクターゼを用いて NADPH 減少量を吸光度で測定

この中で、小社では 1.Ellman 試薬を利用したグルタチオン
濃度定量キットを取り扱っている。

総 グ ル タ チ オ ン を 定 量 す る た め の Total Glutathione

Quantification Kit と、GSH と GSSG を 分 別 定 量 で き る

GSSG/GSH Quantification Kit は、酵素リサイクリング法を用いた DTNB の発色 (λmax = 412 nm) を測定することによってグルタチオン濃度を比色定量するキットである。キットの詳細な原理は、小社のプロトコル集 (http://www.dojindo.
co.jp/technical/protocol.html) をご覧頂きたい。

赤血球中の GSSG および GSH 濃度を、次に示す前処理例に従って操作後、本キットを用いた測定の結果、赤血球中の総グルタチオン濃度 433 μmol/l(GSSG 濃度 23 μmol/l;

GSH 濃度 387 μmol/l; GSSG/GSH=0.059) という値が得られた。一般的には赤血球中の GSSG 量は GSH 量の数％程

図 9 GSSG/GSH 分別定量の測定原理度である。

＜前処理例＞
・組織

7・細胞 (HL60 細胞：1×10 cells)

1) 5% SSA 0.5 ~ 1 ml 中で組織をホモジナイズする。
( 小社では、ドリル式のホモジナイザーを用いて、氷冷しながら 5 ~ 10 分間処理している )2) 8,000 ×g で 10 分間遠心する。
3) 上清を新しいチューブに移す。
4) 純水にて SSA 濃度が 0.5 ~ 1% になるように希釈したものを測定試料とする。

1) 200 ×g で 10 分間、4℃にて遠心し、上清を捨てる。
2) 300 μl の PBS で洗浄し、再度、200 ×g で 10 分間、4℃にて遠心し、上清を捨てる。
3) 10 mmol/l の HCl を 80 μl 加え、凍結と溶解を 2回繰り返し細胞膜を破壊する。
4) 5% スルホサリチル酸 (SSA) を 20 μl 加え、8,000×g で 10 分間遠心する。
5) 上清を新しいチューブに移す。
6) 純水にて SSA 濃度が 0.5 ~ 1% になるように希釈したものを測定試料とする。

・植物 ( レタスの葉と根 )・赤血球

1) 抗凝固剤を加えた血液を、1,000 ×g で 10 分間 4℃にて遠心する。
2) 上清を捨てる。
3) 4 倍量の 5% SSA で溶血する。
4) 8,000 ×g で 10 分間 4℃にて遠心する。
5) 上清を新しいチューブに移す。
6) 純水にて SSA 濃度が 0.5 ~ 1% になるように希釈したものを測定試料とする。

18)1) サンプルを液体窒素により凍結後、乳鉢乳棒でホモジナイズする。
2) 5% SSA と 6.3 mmol/l diethylenetriaminepentaacetic
acid を添加する。
3) 12,000 ×g で 10 分間 4℃にて遠心する。
4) 上清を新しいチューブに移す
5) 純水にて SSA 濃度が 0.5 ~ 1% になるように希釈したものを測定試料とする。
※測定試料中の SSA の濃度が 1% を超えると測定に影響があるため、濃度が 0.5 ~ 1% になるよう、測定前に希釈してください。

11

＜小社製品使用の論文報告情報＞
グルタチオン測定キット
T. Tanaka et al., "Increased Glutathione Level Is not Involved in Enhanced
Bleomycin Sensitivity in Cisplatin-resistant 2780CP Cells", Anticancer Res.,
2008, 28, 2663-2668.

TGQK

A549
( ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞 )S. Homma et al., "Nrf2 Enhances Cell Proliferation and Resistance to Anticancer
Drugs in Human Lung Cancer",Clin. Cancer. Res., 2009, 15, 3423-3432.

TGQK

Dispersed parotid acinar cells( 耳下腺腺房細胞 )K. Okabayashi et al., "Effect of Oxidative Stress on Secretory Function in
Salivary Gland Cells", Oxidative Stress - Environmental Induction and Dietary
Antioxidants, 2012, 189-200.

GGQK

H-1 cell( 口腔扁平上皮癌由来細胞株 )K. Negoro et al., "Cross-resistance of platinum derivatives in H-1R, a cisplatinresistant cell line", Oncology Reports, 2009, 21, 443-449.

TGQK

HEK293( ヒト胎児腎細胞 )C. albicans( カンジダ）

E. Bornstein et al., "Near-infrared Photoinactivation of Bacteria and Fungi at
Physiologic Temperatures", Photochem. Photobiol., 2009, 85, 1364-1374.

TGQK

A2780
( ヒト卵巣癌 )細胞

HeLa( ヒト子宮癌細胞 )HepG2( ヒト肝癌細胞 )MNC( ヒト単核細胞 )初代ヒト肝細胞から取り出したミトコンドリア

J. Z.-Park et al., "Aldehydic DNA lesions in calf thymus DNA and HeLa S3cells produced by bacterial quinone metabolites of fluoranthene and pyrene",
Carcinogenesis, 2004, 25(9), 1727-1733.
K. Sugiyama et al., "Thioredoxin-1 contributes to protection against DONinduced oxidative damage in HepG2 cells", Mycotoxin Res., 2012, 28(3), 163168.
A. Oriya et al., "Individual Differences in the Radiosensitivity of Hematopoietic
Progenitor Cells Detected in Steady-State Human Peripheral Blood", J. Radiat.
Res., 2008, 49(2), 113-121.
M. Nomura et al., "Inhibition of hepatic Niemann-Pick C1-like 1 improves hepatic
insulin resistance ", Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 2009, 297, E1030–
E1038.

TGQK
TGQK
TGQK
TGQK

初代ラット肋軟骨細胞

L. Wang et al., "Glutamate Inhibits Chondral Mineralization through Apoptotic Cell
Death Mediated by Retrograde Operation of the Cystine/Glutamate Antiporter", J.
Biol. Chem., 2006, 281(34), 24553-24565.

TGQK

単細胞
緑藻

コナミドリムシY. Kabeya and S. Miyagishima, "Chloroplast DNA Replication Is Regulatedby the Redox State Independently of Chloroplast Division in Chlamydomonas
reinhardtii", Plant Physiology, 2013, 161(4), 2102-2112.

GGQK

植物

レタスの根と葉ラット肝臓＆胆汁

TGQK
TGQK

ラット腎臓＆血漿D. Ando et al., "Effects of Glutathione Depletion on Hypoxia-induced
Erythropoietin Production in Rats", J. Physiol. Anthropol., 2009, 28, 211–215.

TGQK

ラット肝臓＆大脳＆小脳

N. Mori et al., "Comparative study of activities in reactive oxygen species
production/defense system in mitochondria of rat brain and liver, and theirsusceptibility to methylmercury toxicity", Arch. Toxicol., 2007, 81(11), 769-776.

TGQK

マウス肝臓
組織

Z. He et al., "Different effects of calcium and lanthanum on the expression ofphytochelatin synthase gene and cadmium absorption in Lactuca sativa", Plant
Science, 2005, 168(2), 309-318.
X. Cui et al., "Arsenic Speciation in Bile and Urine Following Oral andIntravenous Exposure to Inorganic and Organic Arsenics in Rats", Toxicol. Sci.,
2004, 82(2), 478-487.

マウス脳
マウス肺
マウス腎臓
マウス気管支肺胞洗浄液(BALF)
ヒト脳

N. Miura et al., "Diurnal variation of cadmium-induced mortality in mice", J.
Toxicol. Sci., 2012, 37(1), 191-196.
M. Makinodan et al., "Yi-Gan San Restores Behavioral Alterations and a Decreaseof Brain Glutathione Level in a Mouse Model of Schizophrenia", J. Brain Dis.,
2009, 1, 1-6.
K. Nagata et al., "Overexpression of manganese superoxide dismutase by
N-acetylcysteine in hyperoxic lung injury", Respiratory Medicine, 2007, 101, 800807.
K. Yoh et al., "Hyperglycemia induces oxidative and nitrosative stress andincreases renal functional impairment in Nrf2-deficient mice", Genes to Cells,
2008, 13, 1159-1170.
T. Sato et al., "Senescence Marker Protein-30 Protects Mice Lungs from
Oxidative Stress, Aging, and Smoking", Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2006,
174, 530-537.
K. Murakami et al., "SOD1 (Copper/Zinc Superoxide Dismutase) Deficiency
Drives Amyloid Protein Oligomerization and Memory Loss in Mouse Model of
Alzheimer Disease", J. Biol. Chem., 2011, 286, 44557-44568.

12

GGQK
TGQK
TGQK
TGQK
TGQK

TGQK

(3) 8- ニトログアノシン
AB01 Anti-Nitroguanosine polyclonal antibody
抗 8- ニトログアノシンのポリクローナル抗体である。
・動物種：ウサギ ( 日本白色種 )AB02 Anti-Nitroguanosine monoclonal antibody(Clone#NO2G52)
抗 8- ニトログアノシンのモノクローナル抗体である。
・動物種：マウス (BALB/c)
・モノクローナル抗体サブタイプ：IgG1< 使用例 1 >19)1) 誘導型一酸化窒素合成酵素 (iNOS) を発現させたヒト結腸癌由来株化細胞 (iNOS-SW480 細胞 ) を 10% FBS
含有 DMEM 中で培養する。

2) 細胞をアルコールで固定し、ブロッキング剤 (BlockAce; DS ファーマバイオメディカル株式会社 ) で処理する。
3) 10 μg/ml の Anti-Nitoroguanosine antibody を一晩反応させ、その後 Cy3 を標識させた二次抗体を反応させ、蛍光顕微鏡で観察する。

< 使用例 2 >20)

1) インフルエンザ感染マウスの肺の凍結切片 (6 μm) を 2% 過ヨウ素酸 - リシン - パラホルムアルデヒドで固定する。
2) 10 μg/ml の Anti-Nitoroguanosine antibody を反応させる。

3) アルカリホスファターゼを標識させた二次抗体を反応させ、Vector red substrate kit Ⅰ (Vector Laboratories)
にて発色させる。

図 11 インフルエンザ感染マウスの肺上皮細胞の染色例＜小社製品使用の論文報告情報＞
Anti-Nitroguanosine antibody
ハムスター肝臓組織

細胞

S. Pinlaor et al., "8-Nitroguanine formation in the liver of hamsters infected with Opisthorchis
viverrini ",Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, 309(3), 567-571.

マウス脳F. Piao et al., "Abnormal Expression of 8-Nitroguanine in the Brain of Mice Exposed toArsenic Subchronically", Industrial Helth, 2011, 49, 151-157.

マウス腎臓

K. Yoh et al., "Hyperglycemia induces oxidative and nitrosative stress and increases renal
functional impairment in Nrf2-deficient mice", Genes to Cells, 2008, 13, 1159-1170.

マウス肺

T. Akaike et al., "8-Nitroguanosine formation in viral pneumonia and its implication forpathogenesis", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100(2), 685-690.

ヒト結腸癌由来株化細胞(SW480 細胞 )J. Yoshitake et al., "Nitric Oxide as an Endogenous Mutagen for Sendai Virus without Antiviral
Activity", J. Virol., 2004, 78, 8709.

13

(4) AP site
DK02 -Nucleostain- DNA Damage Quantification Kit -AP Site Counting-AP site と特異的に結合する ARP(N '-Aminooxy methylcarbonylhydrazino-D-biotin)) を用いて DNA をビオチン化し、
96 穴マイクロプレートに固相化して試料 DNA 中の AP Site を簡便に定量できるキットである。
O
O

O

base

O

NH
S

O
-

O

HN

base

O P O
O

-O

O

-

OH

O
P O

O

O

base

H
N

O

O

O P O
O

ARP

-

OH

H

O

O

O P O
O

O

O

O

O
N
H

O

O

base

NH2

O

O
-

O P O
O
-

base

OH

O

O

N

O P O
O

O

O

AP site

H

HN

O

base

N
H

H
N

NH
S

O

O

図 12 AP Site と ARP との反応

Biotin-tagged abasic site

本キットには、AP Site 数が既定された標準 DNA が含まれており、既存のビオチン検出法を用いることによって AP

Site の定量ができる。キットの詳細な原理は、小社のプロトコル集 (http://www.dojindo.co.jp/technical/protocol.html)

をご覧頂いただきたい。

＜小社製品使用の論文報告情報＞-Nucleostain- DNA Damage Quantification Kit -AP Site CountingDNA の由来

論文趣旨

DNA 購入 ( サケ精巣由来）

R. Awatsuhara et al., "Antioxidative activity of the buckwheat polyphenol rutin in
combination with ovalbumin ", Mol. Med. Rep., 2010, 3(1), 121-125.

CHO 細胞( チャイニーズハムスター
卵巣細胞株 )

D. R. McNeill et al., "to Clinically Relevant Alkylators and Antimetabolites Impairmentof APE1 Function Enhances Cellular Sensitivity", Mol. Cancer Res., 2009, 7, 897-906.

HeLa 細胞（ヒト子宮頚癌細胞）

D. Dorjsuren et al., "Diverse Small Molecule Inhibitors of Human Apurinic/Apyrimidinic
Endonuclease APE1 Identified from a Screen of a Large Public Collection", PLOS
ONE, 2012, 7(10), e47974.

MEF 細胞（マウス胎児線維芽細胞 )C. Vascotto et al., "Functional regulation of the apurinic/apyrimidinic endonuclease 1
by nucleophosmin: impact on tumor biology", Oncogene, 2013, 1-12.

マウスから取り出した胸腺細胞とリンパ節細胞

M. Ono, "Influence of Self-Stimulation of the Parasympathetic Nervous System on
Lymphocyte Function and DNA Repair Function in Family Caregivers", J. Nurs. Care,
2013, 2(1), 1000127.

T98G 細胞（ヒトグリア芽細胞腫）

P. Iyer et al., "Synthesis and Characterization of DNA Minor Groove Binding 2
Alkylating Agents", Chem. Res. Toxicol., 2013, 26(1), 156-168.

マウスバフィーコート
（白血球層）S. A. Nankervis et al., "Consumption of a low glycaemic index diet in late life extends
lifespan of Balb/c mice wit differential effects on DNA damage", Longevity &Healthspan, 2013, 2(4), 1-13.

マウス肝臓K. Moriya et al., "Tacrolimus Ameliorates Metabolic Disturbance and Oxidative Stress
Caused by Hepatitis C Virus Core Protein", Am. J. Pathol., 2009, 175(4), 1515-1524.

マウス蝸牛殻、マウス脳 ( 新皮質 )S. Someya et al., "Sirt3 Mediates Reduction of Oxidative Damage and Prevention of
Age-Related Hearing Loss under Caloric Restriction", Cell, 2010, 143(5), 802-812.

ラット外筋層サンゴ
カキ（C. virginica）
細菌（Pseudoalteromonas
carrageenovora）

K. Choi et al., "Impaired Integrity of DNA After Recovery From Inflammation Causes
Persistent Dysfunction of Colonic Smooth Muscle", Gastroenterology, 2011, 141(4),1293-1301.
C. A. Downs et al., "Heat-Stress and Light-Stress Induce Different Cellular Pathologies
in the Symbiotic Dinoflagellate during Coral Bleaching", PLOS ONE, 2013, 8(12),e77173I. O. Kurochkin et al., "Cadmium affects metabolic responses to prolonged anoxia
and reoxygenation in eastern oysters (Crassostrea virginica)", Am. J. Physiol. Regul.
Integr. Comp. Physiol., 2009, 297, R1267-R1272.
K. Nandakumar et al., "Molecular level damages of low power pulsed laser radiation ina marine bacterium Pseudoalteromonas carrageenovora", Lett. Appl. Microbiol., 2006,
42(5), 521-526.

14

(5) 過酸化脂質
L248 Liperfluo

O

O

O

D350 DPPP

O

O

O

N

N

O

O

P

P

生成した過酸化脂質は不安定であり、分解して生じるマロンジアルデヒド (MDA) 等の物質が脂質過酸化の主要なマーカーとして広く用いられてきた。MDA は代表的な過酸化脂質分解生成物であり、古典的測定方法に『TBA 法』がある。サンプル中の MDA をチオバルビツール酸 (TBA) と反応させて生じた TBA 反応物質 (TBARS) を 532 nmの波長付近で検出・定量する。

TBA 法は簡便かつ高感度であるが、MDA に代表される酸化二次生成物を検出するものであるため、必ずしも脂質の酸化を正しく反映していないとも指摘されている。そこで、小社では過酸化脂質と直接反応し、蛍光を発する試薬を開発し、販売している。

表 4 過酸化脂質検出試薬、測定方法の各特性

製品名

Liperfluo

DPPP

TBA 法

測定対象物

過酸化脂質

過酸化脂質

酸化二次生成物

測定方法

蛍光イメージング

HPLC( マロンジアルデヒド）
分光光度計

検出方法 及び 波長

フローサイトメーター (FCM)
蛍光蛍光

プレートリーダー
吸光( 極大励起 / 蛍光波長 )(524 nm / 535 nm)(352 nm / 380 nm)

532 nm試薬溶解例*488 nm 励起可能
0.8 mg/ml DMSO

1 mg/ml クロロホルム-* 溶解性向上による生細胞染色備考

が容易 (Spy-LHP と比較 )蛍光顕微鏡 推奨フィルター

温和な条件下 ( メタノー マロンジアルデヒドとGFP フィルター

ル中、60℃ , 60 分 ) で過 チ オ バ ル ビ ツ ー ル 酸（励起：450-490nm,

酸化脂質と反応(TBA) との反応

蛍光 :500-545nm）
または
FITC フィルター（励起：467-498nm,
蛍光 :513-556nm）
推奨励起レーザー( 共焦点蛍光顕微鏡 /FCM )He-Ne レーザー (543 nm)
またはAr レーザー (488 nm)

Liperfluo は過酸化脂質によって特異的に酸化され、エタノールなどの有機溶媒中で強い蛍光を発する試薬である。蛍光顕微鏡による生細胞の過酸化脂質のイメージングや、フローサイトメトリーによる細胞の過酸化脂質量の定量に適
用できる。

15

< 使用例：Liperfluo >21)
①生細胞を用いた過酸化脂質のイメージング(1) SH-SY5Y 細胞を 6 well plate に播種 (6.0 × 105 cell/well) し、37℃で終夜インキュベート培養する。

(2) 1 mmol/l Liperfluo/DMSO 溶液を、終濃度 20 μmol/l になるように添加し、37℃、15 分インキュベートする。
(3) 細胞外の Liperfluo を洗浄し、新しい培地を加える。

(4) Cumen Hydroperoxide( 終濃度：100 μmol/l)、または、AIPH( 終濃度：6 mM) を添加後、37℃で 2 時間インキュベー
トし、酸化ストレス刺激を与え過酸化脂質を生成させる。

(5) 蛍光顕微鏡で観察する。

装置：Olympus Ⅸ -71 epifluorescent microscope

ミラーユニット：U-MNIBA3( 励起 488 nm, 蛍光 515/530nm バンドパスフィルター )露光時間：10 sec

Cumen

AIPH

Control

ISO 感度：800( データ提供：同志社大学生命医科学部

野口範子先生 )Cumene: Cumene Hydroperoxide

図 13 Liperfluo を使用した生細胞過酸化脂質イメージング②フローサイトメトリーを用いた細胞アッセイ

操作 (1) ～ (4) までは、①生細胞を用いた過酸化脂質のイメージングと同じ。
(5) PBS で細胞を洗浄後、PBS で細胞を回収する。
(6) フローサイトメトリーで測定する。

装置：BD FACSAriaTM II cell sorter.
(Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ)

レーザー：488 nm アルゴンレーザー

Count(×100)

6

Control

5

AIPH

4

Cumene

3
2
1
0

102

103

1 04

Fluorescence( データ提供：同志社大学生命医科学部

1 05

野口範子先生 )Cumene: Cumene Hydroperoxide

図 14 フローサイトメトリーを用いた細胞アッセイ

16

< 使用例：DPPP >23)
① HPLC による血漿中過酸化物の定量(1) 採血した血液をヘパリン処理し、20 分以内に 3000 rpm、30 分間遠心分離して、ヒト血漿を得る。調製した血漿は 4℃で保存し、24 時間以内に脂質を抽出する。

(2) 上記血漿 0.5 ml にメタノール 0.5 ml、ジクロロメタン 2 ml、及び内部標準として PC-NBD(1-Hexadecanoyl-2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)aminohexanoyl]-sn-glycero-3-phosphochocholine) のクロロホルム溶液 50 μlを加えて激しく混和後、3000 rpm、5 分間遠心分離し、下層のジクロロメタン層を回収する。

(3) 上層に 2 ml のジクロロメタンを加えて抽出を繰り返し、同様に下層のジクロロメタン層を回収する。

(4) 得られたジクロロメタン層を合わせて、室温下、減圧濃縮し、窒素で常圧にもどし、クロロホルム - メタノール (2:1)
50 μl に溶解した後、-20℃以下に保存し、72 時間以内にその 25 μl を HPLC にかける。

※遠心分離は 4℃で行う。

※ジクロロメタンに抗酸化剤として BHT( ブチル化ヒドロキシトルエン ) を 0.5 mg/ml となるように添加する。
(5)HPLC 条件
HPLC システムは図 15 参照

・カラム：Develosil 60-3 (3 μm, 4.6 mmφ×50 mm)

・移動相：クロロホルム / 1- ブタノール / メタノール / 水 ＝ 50 / 50 / 200 / 15
・流速：0.6 ml/ min

・DPPP solution :3 mg / 400 ml in アセトン / メタノール = 1 / 3

・流速：0.3 ml/ min・Reaction coil：stainless-steel coil(0.5 mmφ×20 m)
・反応温度：70℃

・Cooling coil：stainless-steel coil(0.5 mmφ×0.5 m)

・検出：UV/Vis 475 nm ( 内部標準検出 )、蛍光 380 nm( 励起 352 nm)

a : mobile phasebb, g : pumpc : injectorcdd : columne : UV/ Vis detector
f : DPPP solution

g

a

e

h,i

h : reaction ovenfi : reaction coilj : water jacketj,kk : cooling soill : fluorometerlm : data processor

図 15 ポストカラム法、HPLC システム

17m

(6) NO・
NK05 NO2/NO3 Assay Kit-CII(Colorimetric) ～ Griess Reagent Kit ～NK08 NO2/NO3 Assay Kit-FX (Fluorometric) ～ 2,3-Diaminonaphthalene Kit ～NO・の代謝物は NO・と異なる生理活性を持ち、この代謝物が生体構成成分の過酸化を引き起こす。NO・量を測定することが、酸化ストレス状態を見ることに直接は繋がらないが、NO・の過剰な生成は酸化ストレス誘起への一原因となりうるため、NO・定量法を本項にて紹介する。

生体内で合成された NO・はすみやかに NO・の代謝物である NO2 や NO3 へと酸化される。NO・の定量はこの反応性--のため、NO・を直接検出することは特別な装置等を使用しないと難しい。そこで、現在 NO2 や NO3 を測定する方法--が一般的になっている。この方法は、還元酵素等により NO3 を NO2 に還元し、NO2 の定量法として良く知られて---いる Griess 法（NO2/NO3 Assay Kit-C II）や Diaminonaphthalene 法を (NO2/NO3 Assay Kit-FX) 用いて NO2 の総量を
-

定量する。

キットの詳細な原理は、小社のプロトコル集（http://www.dojindo.co.jp/technical/protocol.html）をご覧頂きたい。

NO2/NO3 Assay Kit-C II は 10 ～ 100 μmol/l、-FX は 1 ～ 10 μmol/l の濃度範囲の測定に適している。

NO2-

+

H2N

SO2NH2H+

N N+

SO2NH2

Sulfanilamide

NH2

HN

NH2

H2N
1-Naphthylethylenediamine

HN
H2N

N N

SO2NH2

2,3-Diaminonaphthalene

NO2N
H

N
N

Naphthalenetriazole

図 17 Diaminonaphthalene 法 (NO2/NO3 Assay Kit-FX)

Azo Dye (λmax = 540 nm)

図 16 Griess 法 (NO2/NO3 Assay Kit-C II)＜前処理例＞
・細胞培養液・血清、尿を検体とする。

membrane (UFC801008; Millipore 社 ) などで除タンパ

遠心分離 ( 例えば 1,000 ×g, 15 分間 , 室温 ) し、上澄み血清を添加している場合は、Amicon Ultra-4 Centrifugal

Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10

ク ( 例えば 7,000 ×g, 20 分間 , 4℃ ) して測定試料とす

Filter Unit with Ultracel-10 membrane (UFC801008;

る。

間 , 4℃）) して測定試料とする。

使用可能。ヘパリンは血液 1 ml 当り 0.01 mg の使用でMillipore 社 ) などで除タンパク ( 例えば 7,000 ×g, 20 分

※抗凝固剤に EDTA やクエン酸を使用しているものはあれば測定に影響を与えないが、この濃度より高濃度の場合は測定結果に影響がでることが確認されている。
※除タンパク前、-20℃であれば、2 ヶ月間保存可能で

・組織 24)ある。

ホ モ ジ ナ イ ズ 遠 心 後 ( 例 え ば 7,740 ×g) の 上 清 をUltrafree-MC centrifuge device(UFC3; Millipore 社 ) な ど
で除タンパクして測定試料とする。

18

＜小社製品使用の論文報告情報＞
NK05 NO2/NO3 Assay Kit-C II(Colorimetric) ～ Griess Reagent Kit ～

血漿

細胞培養液

組織

SHR
( 高血圧自然発症ラット）

S. Sekine et al., "Lowering Systolic Blood Pressure and Increases in Vasodilator
Levels in SHR with Oral α-Linolenic Acid Administration", J. Oleo Sci., 2007, 56(7),341-345.

ラット血液（凝固剤：EDTA)

P. E. Giriwono et al., "Fermented Barley Extract Supplementation Maintained
Antioxidative Defense Suppressing Lipopolysaccharide-Induced Inflammatory Liver
Injury in Rats", Biosci. Biotechnol. Biochem., 2011, 75(10), 1971-1976.

マクロファージ

O. Takeuchi et al., "Discrimination of bacterial lipoproteins by Toll-like receptor 6", Int.
Immunol., 2001, 13 (7), 933-940.

RAW 274.7( マウスマクロファージ )K. Shibata et al., "Effect of the release from mechanical stress on osteoclastogenesis
in RAW264.7 cells", Int. J. Mol. Med., 2011, 28(1), 73-79.

ラット肺胞
マクロファージ

F. Saito et al., "Inhibitory Action of Daunorubicin on Lipopolysaccharide-Stimulated
Inducible-Type Nitric Oxide Synthase Induction in Alveolar Macrophages", J.
Pharmacol. Sci., 2005, 99, 364-372.

BAECS( 正常ウシ大動脈内皮細胞 )J.-W. Xu et al., "C-Reactive Protein Suppresses Insulin Signaling in Endothelial
Cells: Role of Spleen Tyrosine Kinase", Mol. Endocrinol., 2007, 21(2), 564-573.

EPC( 血管内皮前駆細胞 )L. Yang et al., "Cyclosporin A Suppresses Proliferation of Endothelial Progenitor
Cells: Involvement of Nitric Oxide Synthase Inhibition", Inter. Med., 2008, 47, 14571464.

HUVEC( 正常ヒト臍帯静脈内皮細胞 )H.-M. Xu et al., "The Mechanism of (R,R) ZX-5 on Increasing NO Release", Int. J.
Mol. Sci., 2010, 11, 3323-3333.

RAW 264( 初代骨髄細胞 )R. Nakatsuka et al., "Dilazep Decreases Lipopolysaccharide-Induced Nitric Oxide
and TNF-α Synthesis in RAW 264 Cells", J. Pharmacol. Sci., 2010, 113, 271-275.

マウス皮膚K. Nakai et al., "Free radical production requires both inducible nitric oxide synthaseand xanthine oxidase in LPS-treated skin", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006,
103(12), 4616-4621.

NK08 NO2/NO3 Assay Kit-FX (Fluorometric) ～ 2,3-Diaminonaphthalene Kit ～血漿＆回腸（PBS を中に流し、漏れ出てきたもの）

細胞培養液

Y. Takizawa et al., "Changes in the Localization of Ileal P-Glycoprotein Induced by
Intestinal Ischemia/Reperfusion", Biol. Pharm. Bull., 2011, 34(3), 408-414.

3LL cell( ルイス肺がん由来細胞 )S. Igawa et al., "Nitric oxide generated by iNOS reduces deformability of Lewis lungcarcinoma cells", Cancer Sci., 2004, 95(4), 342-347.

HUVEC( 正常ヒト臍帯静脈内皮細胞 )T. Hirota et al., "Milk casein-derived tripeptides, VPP and IPP induced NO production
in cultured endothelial cells and endothelium-dependent relaxation of isolated aortic
rings", Heart and Vessels, 2011, 26(5), 549-556.

RAW 264( 初代骨髄細胞 )K. Yuasa et al., "Sudachitin, a polymethoxyflavone from Citrus sudachi, suppresses
lipopolysaccharide-induced inflammatory responses in mouse macrophage-like
RAW264 cells.", Biosci. Biotechnol. Biochem., 2012, 76(3), 598-600.

酵母をホモジナイズ

Y. Sasano et al., "Enhancement of the proline and nitric oxide synthetic pathway
improves fermentation ability under multiple baking-associated stress conditions inindustrial baker’s yeast", Microbial Cell Factories, 2012, 11, 40

19

V. 関連製品紹介＜ SOD 様活性測定キット＞
製品名

容量

品コード

備考
水溶性ホルマザンを用いた、100% SOD 阻害率測定が可能なキット

SOD Assay Kit-WST

500 tests

S311

製品名

容量

品コード

GSSG/GSH Quantification Kit

200 tests

G257

Total Glutathione Quantification Kit

100 tests

T419

全グルタチオン測定キット

容量

品コード

備考

50 μg

AB01

抗ニトログアノシンポリクローナル抗体

50 μg

AB02

抗ニトログアノシンモノクローナル抗体

容量

品コード

備考

20 samples

DK02

AP site を検出し、DNA 損傷部位を測定するキット

製品名

容量

品コード

備考

Liperfluo

50 μg x 5

L248

細胞内過酸化脂質イメージング試薬

DPPP

10 mg

D350

過酸化脂質検出試薬＜グルタチオン定量キット＞
備考

酸化型 / 還元型グルタチオン分別定量キット＜ 8- ニトログアノシン検出関連試薬＞
製品名
Anti-Nitroguanosine
polyclonal antibody
Anti-Nitroguanosine
monoclonal antibody(Clone# NO2G52)＜ AP site 定量キット関連製品＞
製品名-Nucleostain-

DNA Damage Quantification Kit-AP Site Counting＜過酸化脂質関連試薬＞

20

＜ NO2/NO3 定量キット＞
製品名
NO2/NO3 Assay Kit-C ⅠⅠ(Colorimetric)～ Griess Reagent Kit ～NO2/NO3 Assay Kit-FX(Fluorometric)～ 2,3-Diaminonaphthalene Kit ～＜ NO 測定関連＞

容量

品コード

備考

100 回用NK05

吸光度測定による NO 測定キット
10 ～ 100umol/l の濃度域に適している

200 tests

NK08

蛍光強度測定による NO 測定キット
1 ～ 10 umol/l の濃度域に適している

容量

品コード

備考

製品名
2,3-Diaminonaphthalene(for NO detection)
Carboxy-PTIO

10 mg

D418

蛍光での NO2 検出試薬

10 mg

C348

NO 消去剤DTCS Na

10 mg

D465

NOR3

10 mg

N390

NOC5

10 mg, 50 mg

N380

NOC7
NOC12
NOC18

10 mg, 50 mg
10 mg, 50 mg
10 mg, 50 mg

N377
N378
N379

SIN-1

25 mg

S264

L-NAME

1g

N412

製品名

容量

品コード

3-Deoxyglucosone

1 mg

D535

Peroxynitrite 溶液

1 ml ｘ 5

P332-

NO スピントラップ剤

NO 発生剤（酸性側で安定）、FK409 とも呼ばれる
NO 発生剤（アルカリ側で安定）

NO 発生剤（アルカリ側で安定）
NO 発生剤（アルカリ側で安定）
NO 発生剤（アルカリ側で安定）

45 mmol/l 以上の Peroxynitrite 溶液
Peroxynitrite 発生剤
NOS 阻害剤

＜その他＞

21

備考

グルコース由来糖化反応生成物 ( ジカルボニル化合物 )糖尿病合併症の指標として注目されている

VI. 参考文献

1) 朝日通雄 , 谷口直之 , “ スーパーオキシドジスムターゼ (SOD) とグルタチオンペルオキシダーゼ (GPx)”, 別冊医学のあゆみ 酸化ス
トレスと心血管疾患 , 筒井裕之

編集 , 医歯薬出版株式会社 , 2007, p19.

2) 鈴木敬一郎 , 他 , “CHAPTER3 生体の抗酸化システム (1) スーパーオキシドジスムターゼ系 ”, 酸化ストレスの医学 , 吉川敏一 監修 ,診断と治療社 , 2008, p23.
3) 浅田浩二 他 , ” 活性酸素測定マニュアル ”, 講談社サイエンティフィック , 1992.
4) 高橋和彦 , “CHAPTER4 生体の抗酸化システム (2) グルタチオンペルオキシダーゼ ”, 酸化ストレスの医学 ,吉川敏一 監修 , 診断と治療社 , 2008, p31.
5) M. Asensi et al., “Ratio of Reduced to Oxidized Glutathione as Indicator of Oxidative Stress Status and DNA Damage”, Methods
Enzymol., 1999, 299, 267-276.
6) 山口登喜夫 , 杉本昭子 , “ 低分子抗酸化物質（ビリルビンの抗酸化作用を主に）”, 生物試料分析 , 2009, 32(4), 281-288.
7) 西川武志 , “ 生体酸化ストレスマーカー ”, 月刊糖尿病 ,2010/11, 12(12), 90-99.
8) Y. hinokio et al., “Oxidative DNA damage in diabetes mellitus: its association with diabetic complications”, Diabetologia, 1999, 42(8),995-998.
9) K. Harada et al., "Efficacy of puffer fish (Takifugu rubripes) sauce in reducing hydroxyl radical damage to DNA assessed using the
apurinic/apyrimidinic site method", Int. J. Mol. Med., 2007, 20(3), 309-314.
10) 木村英雄 , ” 硫化水素 (H2S) の生理作用と医療応用 ”, 生化学 , 2013, 85, 63-75.
11) R. Greiner et al., “Polysulfides Link H2S to Protein Thiol Oxidation”, Antioxidants & Redox Signaling, 2013, 19, 1749-1765.
12) B. D. Paul and S. H. Snyder, “H2S signaling through protein sulfhydration and beyond”, Mol. Cell Biol., 2012, 13, 499-507.
13) Y. -M. Go and D. P. Jones, “The Redox Proteome”, J. Biol. Chem., 2013, 288, 26512-26520.
14) 森山洋憲 他 , " 高知県産茶および青果物に有するスーパーオキシドアニオン消去能の測定 ", 日本食品科学工学会誌 , 2002, 49(10),679-682.
15) 受田浩之 他 , " スーパーオキシドアニオン消去活性新規測定法の食品への応用 ", 日本食品科学工学会誌 ,2002, 49(1), 25-31.
16) H. Fujimoto et al.,"Manganese superoxide dismutase polymorphism affects the oxidized low-density lipoproteininduced apoptosisof macrophages and coronary artery disease",Eur. Heart J., 2008, 29, 1267-1274.
17) R. E. Heikkila et al., “In vivo inhibition of superoxide dismutase in mice by diethyldithiocarbamate”, J. Biol. Chem., 1976, 251(7),2182.
18) Z. He, J. Li, H. Zhang and M. Ma, "Different effects of calcium and lanthanum on the expression of phytochelatin synthase geneand cadmium absorption in Lactuca sativa", Plant Science, 2005, 168(2), 309-318.
19) J. Yoshitake et al., "Nitric Oxide as an Endogenous Mutagen for Sendai Virus without Antiviral Activity", J. Virol., 2004, 78, 8709.
20) T. Akaike et al., "8-Nitroguanosine formation in viral pneumonia and its implication for pathogenesis", Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2003, 100(2), 685-690.
21) K. Yamanaka et al., "A Novel Fluorescent Probe with High Sensitivity and Selective Detection of Lipid Hydroperoxides in Cells",
RSC Adv., 2012, 2 (20), 7894.
22) 真野純一 , Sergey Khorobrykh, 尼子克己 , "1. 代謝産物量の定量 d. 活性酸素種 , 抗酸化物 ", 低温科学 , 2009, 67, 17923) 赤坂和昭 他 , “ 高速液体クロマトグラフィーポストカラム法による血しょう及び血清中のホスファチジルコリンヒドロペルオキシドの定量 ”, 分析化学 , 1993, 42, 27.
24) K. Nakai et al., “Free radical production requires both inducible nitric oxide synthase and xanthine oxidase in LPS-treated skin”,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103(12), 4616-4621.

22

< 製品に関するお問い合わせ先 >株式会社同仁化学研究所 マーケティング部〒 861-2202
熊本県上益城郡益城町田原 2025-5
熊本テクノリサーチパーク
www.dojindo.co.jp/

2320240711