組織微小環境における空間的シングルセル解析の最新技術

AkoyaBioScience社 PhenoCyclerシステム
PhenoCycler-Fusionシステム

PhenoCycler-Openシステム

バイオストリーム株式会社～66種類のタンパク質を標的に凍結切片、FFPE切片で空間的シングルセル解析を可能にするシステム

細野直哉

本日の内容• 空間的シングルセル解析の重要性• PhenoCyclerシステムの検出原理とワークフロー• PhenoCycler Openシステムの特徴• PhenoCycler Fusionシステムの特徴• 空間的シングルセルデータ解析• PhenoCyclerシステムの使用例• 今後の展開

空間的シングルセル解析の重要性
組織は個々の細胞の相互作用で成り立っており、サイトメトリーやscRNAseqに代表される細胞サスペンションの解析ではその情報が失われてしまう。
がんや様々な組織の微小環境の解析には空間情報（位置情報）を保持した切片でのシングルセル解析が重要。

しかし、現状の数マーカー免疫染色では、微小環境に存在する個々の細胞のセルタイプやその状態を把握することはできない。
細胞表面マーカーや機能マーカーも含め包括的に解析できる
高度な（～100）多重免疫染色の解析システムが必要。

Spatial Transcriptomics is Hot, Rapidly emerged field
Spatial Whole Transcriptome解析は微小環境解析の有力なディスカバリーツー
ルとして普及しつつあるが、解像度と検出力が問題（55um) 。高解像度で検出力の高いSpatial Proteomicsでのセルタイプの確認やデータ統合によるマルチオミックス解析がトレンドになりつつある。

Visium(55um)

PhenoCycler(0.37um)

vs4

PhenoCycler is the leading Spatial Phenotyping solution for
Global Cell Atlas Efforts
Global program to create
cell atlas

Top tier institute participation

Nearly 100 datasets contributed to public domain
Over 50 publications

PhenoCyclerシステムの検出原理とワークフロー
フィルターセット
凍結切片FFPE• 抗体にリンクしているDNAバーコードと蛍光プローブのハイブリによりタンパク質を検出• ハイブリと変性（室温）を繰り返し、3色の蛍光をサイクルで検出することで高度な多重染色を実現（3色X20サイクルで60ターゲットなど。35サイクル以上安定）• 切片の再ランも可能• バックグラウンド減算で自家蛍光の影響を最小化（PhotoBleachingで自家蛍光を実験的に減少させるプロトコールも公開）• 抗体はバーコード付きでready-to-useの117種類とカスタムコンジュゲーションが可能（400種類以上のバリデート済み抗体）

自家蛍光低減のプロトコール

PhenoCycler抗体リスト（バーコードコンジュゲート済み-117）
Anti-Hu ATM
Anti-Hu b-Catenin1
Anti-Hu Bcl-2
Anti-Hu Beta-actin'Anti-Hu Beta-actin
Anti-Hu Caveolin
Anti-Hu CD3e
Anti-Hu CD4
Anti-Hu CD8
Anti-Hu CD11c
Anti-Hu CD14
Anti-Hu CD20
Anti-Hu CD21
Anti-Hu CD31
Anti-Hu CD34Anti-Hu CD38
Anti-Hu CD39
Anti-Hu CD40
Anti-Hu CD44
Anti-Hu CD45
Anti-Hu CD45RO
Anti-Hu CD56
Anti-Hu CD66
Anti-Hu CD68
Anti-Hu CD79a

Human FFPE
Anti-Hu CD107a
Anti-Hu CD141
Anti-Hu CD163
Anti-Hu Collagen IV
Anti-Hu E-cadherin
Anti-Hu EpCAM
Anti-Hu ER
Anti-Hu FOXP3
Anti-Hu GATA3
Anti-Hu GP100
Anti-Hu Granzyme B
Anti-Hu HIF1A
Anti-Hu Histone H3 Phospho
Anti-Hu HLA-A
Anti-Hu HLA-DR'Anti-Hu HLA-DR
Anti-Hu HLA-E
Anti-Hu ICOS
Anti-Hu IDO1
Anti-Hu IFNG
Anti-Hu iNOS
Anti-Hu Keratin 5Anti-Hu Keratin 8/18
Anti-Hu Keratin 14
Anti-Hu/Mu Ki67

Anti-Hu LAG3
Anti-Hu LIF
Anti-Hu Mac2/Galectin-3
Anti-Hu MPO
Anti-Hu Pan-Cytokeratin'Anti-Hu Pan-Cytokeratin
Anti-Hu PCNA
Anti-Hu PD-1
Anti-Hu PD-L1
Anti-Hu Podoplanin
Anti-Hu SMA
Anti-Hu SOX2
Anti-Hu T-bet/TBX21
Anti-Hu TCF-1
Anti-Hu TFAM
Anti-Hu TOX
Anti-Hu TP63
Anti-Hu Vimentin
Anti-Hu VISTA

Human FF
Anti-Hu CD2
Anti-Hu CD3
Anti-Hu CD4
Anti-Hu CD8
Anti-Hu CD11c
Anti-Hu CD19
Anti-Hu CD21
Anti-Hu CD31
Anti-Hu CD34
Anti-Hu CD38
Anti-Hu CD45
Anti-Hu CD45RO
Anti-Hu/Mu CD49f
Anti-Hu CD69
Anti-Hu CD90
Anti-Hu CD104
Anti-Hu CD138
Anti-Hu CD278
Anti-Hu HLA-DR
Anti-Hu/Mu Ki67
Anti-Hu Pan-Cytokeratin
Anti-Hu PD-1
Anti-Hu Podoplanin

Mouse FF
Anti-Mu CD3
Anti-Mu CD4
Anti-Mu CD5
Anti-Mu CD8a
Anti-Mu CD11b
Anti-Mu CD11c
Anti-Mu CD19
Anti-Mu CD21/35
Anti-Mu CD24
Anti-Mu CD31
Anti-Mu CD38
Anti-Hu/Mu CD44
Anti-Mu CD45
Anti-Mu CD45R/B220
Anti-Hu/Mu CD49f
Anti-Mu CD71
Anti-Mu CD90.2
Anti-Mu CD169
Anti-Mu IgD
Anti-Mu IgM
Anti-Hu/Mu Ki67
Anti-Mu Ly6g
Anti-Mu MHC II
Anti-Mu TCRb
Anti-Mu Ter119

カスタムでのコンジュゲートも可能。カスタムコンジュゲートで確認されているものも含めると～400種類(HubMAPなどのプロジェクトで確認された抗体リストも順次アップデートされている）

PhenoCycler-Openシステムの特徴
PhenoCycler-Openシステム

22mm四方のカバースリップ、開放系のシステム•

キーエンスBZX-700シリーズ,Oberver7と組み合わせて使用

800シリーズまたはZEISS Axio•

凍結切片、FFPE切片を用いて～66種類のタンパク質をシングルセルの解像度でイメージングが可能 (解像度はそれぞれ0.37um, 0.33um)•専用のカバースリップに組織切片をマウント (切片の厚みは5-10um)(イメージエリア15 x 15 mm)•

開放系での反応システム•

イメージエリア内で領域を設定してイメージング（Zスタックを利用）•

イメージデータから個々の細胞をセグメント化し、次元削減、クラスタリング解析や細胞間距離を指標にした細胞間相互作用の解析が可能。

•通常の顕微鏡として利用する際に切り替えが容易•

システム価格：2698万円（PhenoCycler＋解析ソフト）(別途キーエンス社の顕微鏡（約930万円）と解析コンピュータ（約120万円）が必要になります）•

国内で20台の実績（トータルで約300台の実績）

Openシステム-イメージ領域と測定時間
22mm

イメージ可能エリア：
カバースリップの中央15.2㎜四方

15.2mm22mm

10

細胞の平均サイズが10umと仮定すると2mmx2mmで40000細胞、4mmx4mmで160000細胞

Openシステムでの留意点• カバースリップが割れやすく、取り扱いに注意が必要• PhenoCyclerでの反応・検出時間が長い（ 1cmを超える全面スキャンは困難）
例：1cm四方の切片で24マーカーを解析する際、ランの時間は約2日間• Zスタックデータの利用でデータ量が多く画像処理時間が長い
画像処理用にハイスペックのコンピュータを必要とする

例: 1cm四方の切片で24マーカーデータの場合、生データ850Gb、処理されたイメージデータ73.4Gb
Zスタックデータを用いた合成イメージの作成、各種補正、スティッチング等に2日間大きなイメージエリアでは染色からデータを得るまでに1週間

PhenoCycler-Fusion System の特徴•

Akoya BioSicence社独自家発のFusionスシステムと組み合わせて使用•

凍結切片、FFPE切片を用いて～66種類のタンパク質をシングルセルの解像度でイメージングが可能---解像度は0.5um•

通常のスライドガラスでランを行える(切片の厚みは5-10um)
アーカイブされているスライドガラスも利用可能•

プロ―セル技術を利用した閉鎖系で反応を効率化•

全面スキャン(18 x 35mm)で領域の選択が必要ない•

Zスタックが不要で高速なスキャンスピードと画像処理を実現（10 x 10mm切片で24マーカーの場合、8スライド/week vs 1カバースリップ/週）（生データのサイズ：62Gb vs 850Gb, 処理後のデータサイズ：4.5Gb vs 73.4Gb)•

イメージデータから個々の細胞をセグメント化し、次元削減、クラスタリング解析や細胞間距離を指標にした細胞間相互作用の解析が可能。

•

チラミド蛍光増幅試薬Opalの系も利用可能（一度に4スライド）•RNAの検出も可能に（12pex RNAScope, 100plexのｍRNA検出）•システム価格：6400万円 （PhenoCycler+Fusion+解析ソフトInform）
12フローセル技術

組織切片の自動検出とFocus Mapping機能による高速化•••

24マーカー(10サイクル）のラン時間は約9時間
ランの終了と同時に解析も終了
8サンプル/週の解析が可能

Human Tonsil (24plex) 12.2mm x8.9mm, >1M cells空間的シングルセル解析の流れ
1次解析(QuPathなど）
イメージデータの取得

２次解析(CytoMAPなど）
細胞レベルの解析
次元削減（UMAPなど)

解析領域の指定
フェノタイプマッピング
Cell Segmentation

Cell Classification / Clustering
ー教師あり機械学習ベースの分類
ー教師無しクラスタリング

細胞間相互作用の解析
Cellular Neighborhood（CN)レベルの解析
CNの検出
CNの領域へのマッピング
CN間相互作用の解析

核シグナルによる細胞のセグメンテーション
Watershed Algorism

StarDist Algorism （HubMap）(https://github.com/stardist/stardist)

DAPI Image

Intensity Profile
極大値の探索と領域拡張

距離、近隣シグナルベースで細胞の境界を推定

Cells Outline

事前学習されたモデルを利用した深層学習で各ピクセ
ルのシグナル、バックグラ
ウンドを判別し核の境界をポリゴンで予測距離、近隣シグナルベースで細胞の境界を推定

QuPath (無償のツール）による細胞のセグメンテーションと分類
Cell Segmentation (QuPath original & StarDist)DAPIを利用したクラスタリング

Cell Classification(教師付き機械学習でトレーニングされた分類子でテストデータの予測を行う）

Commercial

核、細胞質、細胞膜のマーカーなどマルチパラメータ―を利用した
Cell Segmentation & Cell Classificationの解析ツール
Akoya Informソフトウェア＆PhenoptrReport

Public open source

Indicalabs HALOソフトウェア
VISIOPHARMソフトウェア

論文ではDeepCell、Cellposeのクオリティスコアが高くなっている

空間的シングルセル解析の流れ
1次解析(QuPathなど）
イメージデータの取得

２次解析 (CytoMAPなど）
細胞レベルの解析
次元削減（UMAPなど)

解析領域の指定
フェノタイプマッピング
Cell Segmentation

Cell Classification / Clustering
ー教師あり機械学習ベースの分類
ー教師無しクラスタリング

細胞間相互作用の解析
Cellular Neighborhood（CN)レベルの解析
CNの検出
CNの領域へのマッピング
CN間相互作用の解析

細胞レベルの解析（無償の解析ツールCytoMAP)
フェノタイプマッピング
tSNE/UMAP(次元削減）

教師なしクラスタリング

細胞間相互作用の解析

アノテーション（マニュアル）Cellular Neighborhood解析（CytoMAP）
https://www.akoyabio.com/webinar/codex-with-seurat-a-high-dimensional-approach-to-unlocking-spatial-insights/

Cellular Neighborhood解析

Cellular Neighborhood Interaction

解析可能なツール
Neighborhood Coordination
CytoMAP,VisioPharm

MAV, QuPathの使い方はYoutubeにて公開しております。
https://www.youtube.com/channel/UCKgB6yUz-cVef-l-3U4siNQ/videos

使用例1：Cellular Neighborhood解析
組織マイクロアレイを用いた効率的な大腸がんの微小環境の解析

関連論文

Cell. 2020 Oct 29;183(3):838.

• PhenoCyclerシステムの原理、方法を詳述• 組織マイクロアレイとの組み合わせでハイスループット解析を実現• 2枚のカバースリップに140組織スポット（0.6mm)をマウントし、大腸がん35検体（17 CLR vs 18 Dll)を解析。
• 56タンパク質を同時に解析して28のセルタイプを同定し、シングルセルレベルの細胞間相互作用を解析。
• 細胞間相互作用だけでなく領域としての特徴づけを行い（CN: CellularNeighborhood) 、領域間の相互作用解析により予後に関連する微小環境の特徴を同定。

New Biomarkers are Needed to Better Predict Patient Response

Conventional Biomarkers Fail to Predict Outcomes in Lymphoma

25

Context Matters: Spatial Neighborhoods Predict Response
Discovery Uncovers Predictive Potential of Spatial Neighborhoods
CITN-10 Phase II Clinical Trial (Cutaneous T-Cell Lymphoma)• 56-plex IO Panel

38% response• Multiple spatial neighborhoods

CN10 = Tregenriched
CN5 = Tumor &dendritic cells

CN8 frequency

25% no-response

CN10 frequency

differentiate responders vs.
non-responders!

CN5 frequency

Spatial Neighborhood
Map Responder

Anti-PD-1
therapy

CN8 = Tumor &CD4+ T cells

Source: Philips, et al. Immune Cell Topography Predicts Response to PD-1 Blockade in Cutaneous T Cell Lymphoma Nat Commun. 2021 Nov 18;12(1):6726. PMID 34795254 doi:
10.1038/s41467-021-26974-6 This publication copyright is governed by a CC BY 4.0 License

26

Spatial Neighborhoods in Today’s Literature
Rapid Adoption of SNs as Potential Biomarkers Across the Biomedical Literature

Aaron Mayer, Derek Holman, Utkarsh Tandon, Salil Bhate, Sunil Bodapati, GrahamBarlow, Jeff Chang, Sarah Black, Erica Crenshaw, Brigid Boland, Sarah Streett, WilliamSandborn, John Chang, Sanjiv Gambhir, Garry Nolan, Christian Schürch, Stephan
Rogalla27

使用例２:セルタイプの同定によるSpatial Transcriptomeデータのバリデーション

Single-cell resolution is the key!
PhenoCycler image

Other systems••

組織の連続性がなく、シングルセルデータではないデータの49％が失われている（Visium)

PhenoCyclerによるValidationが有用••25検体の浸潤性膀胱がんのsnRNAseqで、ネオアジュバンント化学療法を伴う/伴わない術後の予後マーカー（予後不良）として、および癌免チェック
ポイント阻害剤の予後マーカ（予後良好）としてCDH12を同定
Validationの過程で初めにVisiumを使用し、CDH12が強く発現しているエリアに、疲弊CD8陽性T細胞マーカーであるPDCD1, LAG3, HAVCR2などの発現を確認•

最終的にPhenCyclerでシングルセルレベルでのCDH12陽性腫瘍細胞と疲弊
CD8陽性T細胞の共在（細胞間相互作用）を確認•

CNを利用した相互作用解析

•

マウスの急性腎臓損傷モデルで空間的トランスクリプトーム解析を実施（Visium)•

セルタイプ情報をVisiumの各スポットにマップするするためにscRNAseq, snRNAseqのデータセットを使用••

Visiumのスポットサイズが55umとシングルセルサイズではなく、メジャーなセルタイプが各スポットにアサインされやすい傾向を観察
最終的にCODEXでセルタイプの分布と頻度を確認しているPhenoCyclerシステムの空間的シングルセルトランスクリプトーム解析への応用
Merger of CITE-Seq and PhenoCycler data
CITE-Seq produces multiplexed PROTEIN and mRNA expression data
CITE-Seq workflow

123456PROTEIN

1 2 3 4 5 6mRNA
123456

1 2 3 4 5 6

PhenoCycler (CODEX) results are multiplexed PROTEIN expression data
マウスの脾臓の凍結切片の解析データ

Cell. 2 018 Aug 9;174(4):968-981.e15. doi: 10.1016

31

使用例３：空間的シングルセルトランスクリプトーム解析への応用
CITE-Seq データと PhenoCycler データの統合

Science Advances 05 Mar 2021:
Vol. 7, no. 10, eabc5464
DOI: 10.1126/sciadv.abc5464• マウスの脾臓サンプルで33の細胞表面タンパク質をターゲットとしてCITEseqを実施（7097細胞）。
• 33の表面タンパク質データを相関解析ベースにした独自のアルゴリズム（STvEA)でCITE-seqのデータをPhenoCyclerのデータ（Cell. 2018)にマッピング。
• 73％のPhenoCyclerデータ（57819細胞）にマッピングされ、トランスクリプトームをベースにした空間的シングルセル解析が可能に。
• 解析ツールSTvEAがGitHubに公開されており、利用可能。
• Original Citation:
https://advances.sciencemag.org/content/7/10/eabc5464
共通するタンパク質のデータで相関解析→
mRNAデータを組織切片データにマッピングして空間的シングルセルトランスクリプトーム解析に応用

今後の展開① >100Plexのタンパク質検出の実現 (今年中の予定)
Industry’s First 103-plex Whole-Slide Dataset

今後の展開② 12plex RNAScopeの実現 (今年中の予定)

RNAscope Hiplex v234

今後の展開③ 独自開発の100plex RNA検出、タンパク質とRNAの同時検出の実現（来年前半の予定)

100plex RNA検出同一組織でのマルチオミックス
100plex RNA & 100plexタンパク質

同一組織切片での100plex マルチオミックス

https://www.akoyabio.com/PhenoCycler-Fusion-System/multiomics-grant/

Akoya PhenoCycler システムまとめ• ～66種類のタンパク質を標的にシングルセルの解像度での多重蛍光免疫染色が可能で、微小環境における細胞間および領域間相互作用解析、他の空間的トランスクリプトーム解析のバリデーション、scRNAseq(CITE-seq)との組み合わせによる空間的シングルセルマルチオミックス解析などに応用ができる• 広い領域やスライドの全面スキャン（18mmx35mm)、サンプルのスループットを高めたい場合はAkoya
Fusion システムとの組み合わせがおすすめ• PhenoCycler-OpenシステムではKeyence BZX-700/800, ZEISS Axio Observer7のいずれかとの組み合わせが可能• 無償（QuPath+CytoMAP)、有償（Inform, HALO, VisioPharmなど）のソフトウェアに対応しており、サポートも充実• RNA単独、またはRNAとタンパク質の同時検出も可能になる予定お問い合わせ先 ： バイオストリーム株式会社〒105-0021
東京都港区東新橋2-7-3 昭和アステック 1号館
Tel: 03-6869-4402
Email: info@biostream.co.jp
Web site: http://www.biostream.co.jp/37