2022.9.28 エーエムアール株式会社

細菌核酸濃縮精製キット(５tests）
細菌検体(1ⅹ108CFU/ml以下）1mlを煮沸、たんぱく分解後変性剤処理したのち、Silica Column 1000に核酸を吸着させ、遠心機や吸引機を使わず、Syringeだけで洗浄後、40～50ulでカラムから核酸を溶出することで20～25倍に濃縮精製する。1キットで5検体の核酸精製ができ、全工程の所要時間は約12-15分。野外でもできる簡易使用を目指しています。細菌核酸濃縮精製キット（50tests）のトライアルとしても利用いただけます。

キットに含まれるもの

BacteriaBindSol

WashSol

5ml EppenTube

10mlFeedSyringe/Column1000

DNA
stocktube

Proteinase K

1回使用量

備 考

Bacteria-BindSol(15ml)x1本

3ml

核酸の結合液WashSol(20ml)x1本4ml

カラム洗浄液Column 1000ｘ5本

1本

核酸吸着用カラム

10ml Feed Syringe
ｘ5本

1本

Column1000に装着

ElutSol（500ul）
x1本

40～50ulカラムから核酸を溶出させる

Pro K（100ul）
x1本

20ul

蛋白分解酵素、4～8℃保存

5ml Eppen Tube
x5本

１本

検体処理容器DNA Stock Tubes
x5本１個精製した核酸保存容器
Ringless NA Stock

上記以外に
1．検体を煮沸、および50－60℃でProteinase K処理するための保温機器
2．１ml Pipette および20ul Pipette# 参考例 野外使用の場合は煮沸器と保温器(50-60℃）が必要

AC(100-240V)-DC12V
変圧器
野外用軽量チタン製煮沸カップとバーナー（キャンプ用品）

50－60℃保温用
5ml Tubeアルミブ
ロックヒーター50－60℃でたんぱく処理するための保温機器（車の１２Vの電源を使用して５５℃前後で保温）2022.9.28 エーエムアール株式会社細菌核酸濃縮精製キット（50tests）
細菌検体(1ⅹ108CFU/ml以下）1mlを煮沸、たんぱく分解後変性剤処理したのち、Silica
Column 1000に核酸を吸着させ、遠心機や吸引機を使わず、Syringeだけで洗浄後、40～50ulでカラムから核酸を溶出することで20～25倍に濃縮精製する。1キットで50検体の核酸精製ができ、全工程の所要時間は約12-15分。

キットに含まれる製品

BacteriaBindSol

Bacteria-BindSol(150ml) 1bottle

1回使用量

備 考3ml

納入後、特級ethanol100mlを添加し、working Bacteria-BindSol
150ml とする。検体と混合し核酸をカラムに結合させる液。

WashSol

WashSol(200ml)1bottle

４ｍｌ

納入後、特級ethanolを１６0ml加えて Working WashSolとする。カラ
ムを洗浄する液

ProkSol

ProKSol(1ml)１bottle20ul

検体の蛋白分解
長期保存には4-8℃

ElutSol

ElutSol （2.5ml）
1bottle40～50ul

4℃で保存。核酸をカラムから溶出させる.

SilicaColumn1000
（50本）

1本

核酸吸着用カラム購入が必要な個別販売品

1回使用量

備考

SilicaColumn

10ml
FeedSyringe
5ml
Tube

10ml Feed Syringe（100本/箱）

1本

カラムに装着して使用

5ml Eppen Tube
（250本/箱）

1本

検体の加熱処理に使用

2022.9.28 エーエムアール株式会社

細菌核酸濃縮精製キット操作手順
1．5mlEppenTubeに検体1mlを入れ、100℃で3分間煮沸する。
煮沸

2．ProKSol 20ulを添加し、50－60℃で3分間かけてたんぱくを消化したのち、Bacteria-BindSolを3ml追加し混合する。
(5ml Tubeの4mlの目盛りまで滴下もしくはscrew capをはずし1mlのPipetteで分注）

3．10ml Feed SyringeにColumn1000を装着し、Step2の混合液全量をSilica面の上まで吸い上げたのち、全量をゆっくりと押し出しSilicaに核酸を吸着させる。吐出液は廃棄する。

蛋白分解＊カラムの先端から水滴が独立して落ちる程度の力で押し出す。水滴が連結で出るような強い力で押し出すと核酸のカラムへの結合率が悪くなる。

4．WashSol4mlをBindSolが入っていた空のTubeの４mlの目盛りまでに滴下する（もしくはScrewcapをはずでしてPipetteで入れる）。WashSol4mlを全量吸い上げ、強く吐出してカラムを洗浄する。押し出した洗浄液は廃棄する。

吸着

5．シリンジ内に10mlの空気を取り込み、強く押し出す。この工程を5-10回繰り返し、カラムに付着した洗浄液を押し出し乾燥させる。
6． ElutSol40～50ulを空のDNA回収用のTubeに移す。シリンジに装着されたカラムの先端をTissueでふき取り、シリンジでElutSolをカラムのSilica面の上まで、バブルをつくらないようにゆっくりと吸い上げる。Silicaから核酸が遊離するまで約2分待ったあと、DNA回収Tubeに核酸が溶出した液を押しだす。

洗浄＊核酸の回収率が低い場合、押し出したEluteSolを再度吸引し押しだ操作を繰り返すと回収率が上がることがある。
核酸のカラムへの吸着率は多糖体、脂質、界面活性剤等に影響を受ける。 細胞壁成分などの不純物が多い細菌破砕液からより多くの不純物を取り除くようにデザインされた新しいBacteria-BindSolは従来のBindSolより細菌破壊液の核酸の回収率が高くなっている。煮沸後にProteinase Kを加えても検体の濁度が低下しない場合はBeads法の実施を推奨する。

溶出実施例
E.colioli GTC503株の菌液1.2x109cfu/mlの菌液1mlを検体として上記の手順で処理した。大腸菌の菌液の濁度はProK処理のみ、および加熱処理とProK処理のいずれも添加後に急激に低下し、溶菌が起きていることが確認できた。
カラムを通過前と通過後のDNAの蛍光強度はInvitrogen社のQubit 1xDouble Stranded DNA HS Assay kitを使用して測定し、蛍光の減少率から吸着率を計算した。

E.coliGTC503株1.2x109cfu/ｍｌ
処理方法

Boil＋ProK 処理

ProK 処理のみ

カラム吸着率84～90%

70～81％

難分解性Legionellaの菌液の濁度は煮沸処理、およびProKSol添加後も減少しなかったため充分な溶菌ができていなかったと判断した。
しかしBeads処理をくわえることで吸着率は10％ほど上昇した。
多糖体や脂質が多く十分な回収率が得られない菌種の場合はビーズ法で破砕した後、従来の強力なフェノール－クロロフォルム処理・エタノール沈殿したあとカラム処理すれば純度の高い核酸が得られる

L. pneumophilla GTC745株1.0x109cfu/ｍｌ
処理方法

Boil＋Beads＋ProK処理

Boil＋ProK処理

ProK処理後の濁度低下

変化なし

カラム吸着率37～47%

26～33％