研究用試薬

文書番号： IM-KHL120120J

ヘキサノイルリジン（HEL）測定キット使用説明書
本キットは、ヘキサノイルリジン（Hexanoyl­Lysine：ＨＥＬ）に特異的なモノクローナル抗体を使用する ELISA（enzyme­linkedimmunosorbent assay）キットで、ＨＥＬの簡便な測定を可能にするものです。
本キットは研究用試薬です。研究目的にのみご使用ください。

１．キットの構成①反応プレート②１次抗体試薬③２次抗体試薬④２次抗体溶解液⑤発色試薬原液⑥発色試薬希釈液⑦洗浄濃縮液⑧反応停止液⑨ＨＥＬ標準液⑩プレートシール：ＨＥＬ固相化プレート(8×12 ウェル、分割式)
1枚：抗ＨＥＬモノクローナル抗体溶液
1 瓶（約 7ml）
：ＨＲＰ標識­抗マウス IgG（凍結乾燥品）
1瓶：0.05% Tween­20/リン酸緩衝生理食塩液
1 瓶（約 12ml）：3,3',5,5'－テトラメチルベンジジン
1 瓶（約 250μl）：過酸化水素/クエン酸リン酸緩衝液
1 瓶（約 12ml）：0.05% Tween­20/リン酸緩衝生理食塩液（５倍濃縮） 2 瓶（約 25ml/瓶）：1M リン酸
1 瓶（約 12ml）：Bz­Gly­Hexanoyl­Lys /リン酸緩衝生理食塩水
各 1 瓶（各約 500μl）（A:2.6, B:7.7, C:22.7, D:69.7, E:207, F:624 nmol/L）
2枚※貯蔵‥‥‥‥‥‥冷蔵（2～8℃。凍結させないこと）※有効期間‥‥‥‥製造後 2 年※測定範囲‥‥‥‥2～700 nmol/L

２．必要な主要機器および器具①蒸留水②10～50µl 用マイクロピペット及びチップ③8 チャンネルマイクロピペット及びチップ（50～250µl）④8 チャンネルマイクロピペット用トレイ⑤低温インキュベーター（4～7℃）または冷蔵庫⑥マイクロプレートリーダー（測定波長 450nm）：希釈洗浄液の調製：試薬の分注：試薬の分注：試薬の分注：１次抗体反応用

３．測定原理（図 1）① ＨＥＬを固相化したマイクロプレートを用意します。

①② 測定対象となるサンプルまたはＨＥＬ標準液と１次抗体溶試薬を分注します。この抗体は、ＨＥＬを特異的に認識するため、固相化ＨＥＬとサンプル中のＨＥＬとが競争的に結合します。その結果、サンプル中のＨＥＬ濃度が高いと１次抗体がより多くサンプル中のＨＥＬに結合し、その分固相化ＨＥＬに結合する１次抗体量が減少します。

②③ 洗浄によりサンプル中のＨＥＬと結合した１次抗体が除去され、固相化ＨＥＬに結合した１次抗体のみがマイクロプレート中に残ります。

④③④ 続いて２次抗体標識抗体を加えます。この２次抗体は固相化ＨＥＬと結合した１次抗体を認識します。
⑤ 洗浄により、余剰な酵素標識抗体を除去します。

⑥⑤⑥ 発色試薬を加えると、２次抗体のＨＲＰ酵素活性により青色の発色が起こります。
⑦ 反応停止試薬を加えることで発色反応を停止させ、450nm の波長で吸光度を測定します(反応液は黄色になります)。サンプル中のＨＥＬ濃度が高いほど、吸光度は低く（黄色が薄く）なります。この黄色の濃さからサンプル中のＨＥＬ濃度を算出します。

４．サンプルの前処理測定するサンプルの種類によって希釈や前処理が必要な場合があります。
Ａ．尿サンプルの場合：
ＰＢＳにて４倍希釈をお勧めします。不溶物がある場合は遠心除去し、また蛋白質を含む尿や異常尿を測定する場合には、Ｂ．血清の場合）に準じた前処理をしてください。
Ｂ．血清サンプルの場合：
ＨＥＬが高分子蛋白質に含有された状態では、サンプル中のＨＥＬを正確に測定できない場合があります。このような場合には下記の手順を参考に蛋白質分解処理をご検討ください。
①前処理用酵素試薬（例：14mg/mL αキモトリプシン／ＰＢＳ）を用意する。
②血清サンプルを必要に応じて生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に希釈する。
③サンプル 300μL に対し前処理用酵素試薬 60μL を混合し、37℃一晩静置する。
④分画分子量 10000D の限外濾過フィルタを通過させ、濾液を ELISA での測定に用いる。
※これは一例です。ご使用になるサンプルの性質と目的に応じて処理条件をご検討ください。

５．実験操作以下の実験操作は、キットを常温に戻してから行ってください。分割使用する場合には、今回使用するウェル以外は予めフレームから取り外しておき、開封後は１週間以内にご使用ください。
検体数が多い場合には、各ウェルの反応時間が均一になるように準備の上、測定してください。
Ａ）①マイクロプレートを袋から取出します。
Ｂ）⑨ＨＥＬ標準液 A～F をウェルに 50μL 正確に分注します。同様にサンプル 50µl を分注します。ブランク用ウェルには蒸留水を 100μL 分注しておきます。ウェルの配置は右図２を参考にしてください。
Ｃ）続いてブランク用ウェル以外の全ウェルに②１次抗体試薬を 50µl ずつ分注し、液がウェル内で均一となるようプレート全体を軽く揺らしてください。プレートをシールして密閉したのち 4～7℃で 1 晩反応させます。
Ｄ）希釈洗浄液を調製します。⑦希釈洗浄濃縮液１瓶に対して 100ｍL の蒸留水を加え、希釈洗浄液とします。
Ｅ）２次抗体試薬を調製します。③２次抗体試薬に対し④２次抗体希釈液を全量混合し、２次抗体試薬とします。残った試薬は冷蔵にて保存し１週間以内に使用してください。
Ｆ）シールを剥がしウェル中の反応液を捨て洗浄液 250µl を分注します。プレート全体を軽く揺らしたのち、洗浄液を捨てます。プレートのウェル面を下にしてキムタオル等にたたき、ウェルに残った水分を除去してください。この洗浄操作を 3 回繰り返します。
Ｇ）２次抗体試薬を全ウェルに 100μL 分注し、プレート全体を軽く揺らしてよく混合します。プレートをシールし、室温（20～24℃）で 1 時間静置します。
Ｈ）発色試薬を調製します。⑥発色試薬希釈液全量に対し⑤発色試薬原液を 120μL 混合し、発色試薬とします。
尚、分割使用する場合には⑥発色試薬希釈液 1mL あたり⑤発色試薬原液を 10μL 混合してください。
発色試薬は使用直前に調製し、調整後 30 分以内に使用してください。
Ｉ）反応終了後、ウェル中の反応液を捨て、洗浄液 250µl を分注し、ステップ F と同様に洗浄を 3 回行います。
最後にプレートのウェル面を下にしてキムタオル等にたたき、ウェルに残った水分を除去してください。
Ｊ）発色試薬を全ウェルに 100μL 分注し、よく混合したのち、暗所室温にて 15 分間反応させます。
Ｋ）⑧反応停止液 100µl を全ウェルに加え、よく混合し反応を停止させます。
Ｌ）マイクロプレートリーダーを使用して 450nm における吸光度を測定します。

【図２・ウェル配置例】
下図はプレート使用の一例です。1 サンプルにつき 3 ウェルずつを使用し（n=3）
、A 行と H 行のウェルはエッジ効果を避けるため分析に使用していません（図中×印）。この方法では、96 穴のプレート 1 枚で 18 サンプルの分析ができます（n=1 では 54 サンプル）。
123456789101112A
ブランク用ウェル(n=3)
×××××××××⑨HEL 標準液­A(n=3)
サンプル (n=3)
サンプル (n=3)
サンプル (n=3)
B⑨HEL 標準液­B (〃)サンプル (〃)サンプル (〃)サンプル (〃)C
⑨HEL 標準液­C (〃)サンプル (〃)サンプル (〃)サンプル (〃)D
⑨HEL 標準液­D (〃)サンプル (〃)サンプル (〃)サンプル (〃)E
⑨HEL 標準液­E (〃)サンプル (〃)サンプル (〃)サンプル (〃)F
⑨HEL 標準液­F (〃)サンプル (〃)サンプル (〃)サンプル (〃)G
H××××××××××××６．測定法フローチャート
サンプル／⑨HEL標準液※最初にサンプル、続いて１次抗体試薬を分注。

50μL②１次抗体試薬

１次抗体反応50μL

4～7℃ 1晩静置

２次抗体試薬の調製

希釈洗浄液の調製
洗浄③２次抗体試薬 ：1瓶④２次抗体希釈液：全量（250μL ｘ3回）

100μL

⑦希釈洗浄原液：１瓶
蒸留水：100ｍL

２次抗体反応室温 1時間静置

発色試薬の調製
洗浄⑤発色試薬原液 ：120μL⑥発色試薬希釈液：全量（250μL ｘ3回）

※使用直前に必要量を調製

100μL

発色反応
室温・暗所にて15分間静置⑧反応停止試薬

100μL

吸光度測定（450nm）

検量線作成・濃度算出

７．標準曲線の作成とＨＥＬ濃度の算出
片対数グラフに標準液の濃度（横軸・対数軸）と、測定した吸光度（縦軸）との関係をプロットし、ヘキサノイルリジンの標準曲線を作成します。検量線の近似関数には６点の曲線または折れ線を推奨。
作成した標準曲線を用い、サンプルの吸光度からヘキサノイルリジン濃度を計算します。尚、検量線は毎回必ず作成し、濃度計算にはサンプルと同一のプレートで測定した検量線データを使用してください。
【図３・典型的な検量線】
1.4

標準物質濃度（ｎmol/L）⑨HEL 標準液-A
2.6-B
7.7-C22.7-D69.7-E207-F624

吸光度測定値（450nm）

1.2
1.00.80.60.4

吸光度測定値
1.197
1.070
0.895
0.586
0.305
0.166

0.20.01101001000

HEL標準液濃度（nmol/L）

８．関連文献① Yoji Kato, Yoko Mori, Yuko Makino, Yasujiro Morimitsu, Sadayuki Hiroi, Toshitsugu Ishikawa, Toshihiko Osawa.
Formation of Nε­(hexanonyl) lysine in protein exposed to lipid hydroperoxide.
Journal of Biological Chemistry, Vol. 274, No. 29, pp. 20406 – 20414, 1999
② Yoji Kato, Yoshiaki Miyake, Kanefumi Yamamoto, Yoshiharu Shimomura, Hirotomo Ochi, Yoko Mori, Toshihiko
Osawa.
Preparation of a monoclonal antibody to Nε­(hexanonyl) lysine: applycation to the evaluation of protective effects offlavonoid supplementation against exercise­induced oxidative stress in rat skeletal muscle.
Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 274(2), pp389­393, 2000

９．トラブルシューティング
使用時に十分や試薬性能が得られなかった場合には、下記を参考に解決を試みてください。
① 測定値のばらつき：【考えられる原因と対処法】
・反応時の温度ムラ ⇒恒温槽や温度の安定性の高いインキュベーターをお試し下さい。
・洗浄時における洗浄液の不十分な除去 ⇒ペーパータオルに叩きつけるなどして確実に残液を除去してください（ウェル内壁には触れないでください）。
・分注精度が十分でない ⇒特に１次抗体液とサンプルの分注精度は測定結果に大きな影響を与えます。正確に 50μL を分注してください。
② 吸光度が全体に高い／低い：【考えられる原因と対処法】
・２次反応および発色反応時のインキュベーション温度と時間は吸光度に影響を与えます。
室温が高い（25℃以上）などの場合は、発色反応の時間を短縮／延長してみてください。
③ 測定値がマイナスを示す場合：【考えられる原因と対処法】
・高分子の蛋白質、高濃度の塩、極端なｐH 等は本測定系に影響を与えます。サンプルの性質に応じて希釈、血清サンプル用の前処理などを実施してください。

【開発・発売元】

日研ザイル㈱ 日本老化制御研究所
Japan Institute for the Control of Aging, Nikken SEIL Co. Ltd.

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静岡県袋井市春岡７１０－１

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