200407 版
新型コロナウイルス SARS-CoV-2 検査マニュアル version 3.5
東京慈恵会医科大学 熱帯医学講座（本プロトコールは、以下を参照・改変したものである）“Diagnostic detection of Wuhan coronavirus 2019 by real-time RT- PCR” (Protocol and preliminaryevaluation as of Jan 13, 2020) (by Victor Corman, Tobias Bleicker, Sebastian Brünink, Christian Drosten
Charité Virology, Berlin, Germany; Olfert Landt, Tib-Molbiol, Berlin, Germany; Marion Koopmans,Erasmus MC, Rotterdam, The Netherlands; Maria Zambon, Public Health England, London; Malik Peiris,
University of Hong Kong）
1. RNA 抽出（注意事項）＊咽頭拭い液が付着したチップ等は全てオートクレーブ処理後に、医療廃棄物として廃棄する＊RNA 抽出エリアと RT-qPCR 試薬調製エリアを分ける＊サンプルから発生したエアロゾルによるコンタミを防止するため、フィルターチップを用いる＊手袋への RNA の付着に十分注意し、適宜交換する＊チューブ立てや遠心機では、チューブ間の間隔を空ける＊チューブのフタを開ける際には、内側に触れないように、また飛沫が発生しないように注意する＊チップへのサンプル付着によるコンタミを防ぐため、試薬を加える際には、検体毎にチップを交換する＊慌てず、ゆっくりした動作で作業を行う
1.1 試薬・High pure viral RNA purification kit (Roche, #11 858 882 001)
（Working Solution の準備）
1) Inhibitor Removal Buffer（黒キャップ） 20 ml の 99.5% エタノール（RNA 用）を Inhibitor Removal Buffer のボトルに加え、室温で保存
2) Wash Buffer（青キャップ）
40 ml の 99.5% エタノール（RNA 用）を Wash Buffer のボトルに加え、室温で保存
3) Poly (A) Carrier RNA ストック
400 µL の Elution Buffer 中に Poly (A) Carrier RNA を溶解する。
次いで、50 µL ずつ分注し、-20°C で保存する（12 か月安定）
4) PBS 溶液
ー
1.2 プラスチック器具類等
・各サイズのフィルターチップ(RNA 用)・1.5 mL チューブ(RNA 用)・グローブ、オートクレーブバック、オートクレーブ可能な容器（廃棄物・廃液用）
1.3 手順・サンプルリストの準備（※サンプル番号は都度振り直し、少ない桁数で表記）
サンプル番号
患者氏名・ID 等
1ｼﾞｹｲﾀﾛｳ XXXXXX
2ｼﾞｹｲﾊﾅｺ YYYYYY…
…
N1
陰性対照（スワブ無し）
・使用する試薬を予め取り分ける
試薬名
Inhibitor Removal Buffer
Wash Buffer
Elution BufferµL ｻﾝﾌﾟﾙ数 x1.05500900
501200407 版・Binding Buffer を調整する
試薬名
Poly (A) Carrier RNA
PBS
Binding BufferµL ｻﾝﾌﾟﾙ数 x1.05
4200400（安全キャビネット内での作業）↓1.5 mL チューブにサンプル番号を記入して、並べる↓600 µL の Binding Buffer を加える
↓安全キャビネット内でスワブを袋から取り出す↓スワブの表記を確認し、チューブにイニシャルを記入する↓スワブを Binding Buffer 中で 20 秒間撹拌する（上下に 50 ストローク）（※注意）スワブはチューブの底に強く触れないこと。柄がたわむとチューブの口が汚染される可能性がある。
（※注意）一般的なプロトコールでは、スワブを一度 PBS などのバッファーに浸して、その溶液から RNA を抽出することが多い。比較検討した結果、本法ではスワブを直接 Binding Buffer に入れる方法を採用している。
↓10 分間室温でインキュベートする【安全キャビネット内でスワブとそのケース、グローブをオートクレーブバックに入れ結束バンドで封をし、オートクレーブで滅菌後、医療用廃棄物として廃棄する】（実験台での作業）※標準的な RNA の取扱いに準ずること↓キットから High Pure フィルターを取りだし、サンプル番号を書く↓High Pure フィルターを、同じくキット内の廃液用チューブにセットする↓サンプルの入ったチューブを 8000 x g で 30 秒間遠心する↓全量を、High Pure フィルターにアプライする↓High Pure フィルターとチューブごと、8000 x g で 15 秒間遠心する↓High Pure フィルターを、新しい廃液用チューブにセットする↓500 µL の Inhibitor Removal Buffer（黒キャップ）を、High Pure フィルターにアプライする↓High Pure フィルターとチューブごと、8000 x g で 1 分間遠心する↓High Pure フィルターを、新しい廃液用チューブにセットする↓（洗い 1 回目）450 µL の Wash Buffer（青キャップ）を、High Pure フィルターにアプライする↓High Pure フィルターとチューブごと、8000 x g で１分間遠心する↓High Pure フィルターを、新しい廃液用チューブにセットする↓（洗い 2 回目）450 µL の Wash Buffer（青キャップ）を、High Pure フィルターにアプライする↓High Pure フィルターとチューブごと、8000 x g で 1 分間遠心する↓High Pure フィルターを、新しい 1.5 mL チューブ（キット内包ではない）にセットする↓（液落とし）High Pure フィルターとチューブごと、15000 x g で 10 秒間遠心する↓High Pure フィルターを、新しい 1.5 mL チューブ（キット内包ではない）にセットする【あらかじめ、このチューブにサンプル番号とイニシャルを記入・用意しておく】↓50 µL の Elution Buffer を、High Pure フィルターにアプライする↓High Pure フィルターとチューブごと、8000 x g で 1 分間遠心する↓High Pure フィルターを捨て、RNA 溶液を含んだ 1.5 mL チューブを回収する↓以降の検査等に用いるまで時間がある場合には、-80°C にて冷凍保存する↓廃液・廃棄物等は、全てオートクレーブで滅菌後、医療用廃棄物として廃棄する

2200407 版
2. RT-qPCR
2.1 試薬・機器
・M-MLV Reverse Transcriptase (Thermo Fisher, #28025013)
・TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems, #4444557)
・Thermal Cycler (Bio-Rad)・StepOnePlus (Applied Biosystems)
・MicroAmp Fas 96-well Reaction Plate (Applied Biosystems, #4346907)、または MicroAmp Optical 8-strip(Applied Biosystems, #4323032/4358293)
・ポジティブコントロール RNA (SARS-CoV-2 RNA, JPN/AI/I-004, 10E3 copies/µL)・プライマー/プローブ（E gene の検出をおこない、必要に応じて N または RdRP gene の遺伝子を検出する）
追記 N 遺伝子のプローブは E 遺伝子に比べて 2-3 桁感度が低く、使用にあたっては注意が必要である
ID
遺伝子配列
ストック濃度RdRP_SARSr-F2 GTGARATGGTCATGTGTGGCGG
15 µM
RdRP_SARSr-R1 CARATGTTAAASACACTATTAGCATA
20 µM
RdRP
RdRP_SARSr-P2 FAM-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC-IBFQ
10 µM
RdRP_SARSr-P1 FAM-CCAGGTGGWACRTCATCMGGTGATGC-IBFQ
10 µM
E_Sarbeco_F1
ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT
10 µM
E
E_Sarbeco_R2
ATATTGCAGCAGTACGCACACA
10 µM
E_Sarbeco_P1
FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-IBFQ
10 µM
N_Sarbeco_F1
CACATTGGCACCCGCAATC
15 µMN
N_Sarbeco_R1
GAGGAACGAGAAGAGGCTTG
20 µM
N_Sarbeco_P1
FAM-ACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCA-IBFQ
10 µM
2.2 手順（RT 反応）
・氷上で本数分のプレミックス A を作成する
N=検体数（N1（スワブ無し陰性対照も含む））＋2 個（陰性対照/陽性対照）µL 本数 x1.05
試薬名
RdRP_SARSr-R1 (20 µM)
0.5
E_Sarbeco_R2 (10 µM)
0.3
N_Sarbeco_R1 (100 µM)
0.2
10 mM dNTP Mix (2.5 mM each dATP,
0.5
dGTP, dCTP, dTTP at neutral pH)↓上記のプレミックス A を PCR 用チューブに 1.5 µL ずつ分注
↓各チューブに 5 µL のサンプルを加える
順番は以下を推奨する＊最初に陰性対照の RNase Free Water＊次にサンプル RNA＊最後に陽性対照↓蓋をして、スピンダウン↓ボルテックスして、スピンダウンする↓Thermal Cycler を用いて、65°C で 5 分間インキュベート↓速やかに氷上に戻す
・本数分のプレミックス B を作成するµL 本数 x1.05
試薬名
5x first strand buffer
2.0
100 mM DTT
1.0
M-MLV RTase
0.5↓上記のプレミックス B を、プレミックス A とサンプルが入った PCR 用チューブに 3.5 µL ずつ分注↓蓋をして、スピンダウン
3

200407 版↓ピペッティングで優しく撹拌して、スピンダウンする↓Thermal Cycler を用いて、37°C で 50 分間、続けて 70°C で 15 分間インキュベート↓速やかに氷上に戻す
2.3 手順（qPCR 反応）
・StepOnePlus で反応プログラムを設定する
温度
時間
サイクル数50°C
2分
１回
95°C
20 秒
１回
95°C
1秒
45 回
60°C
20 秒
・本数分のプレミックス C を作成する（E gene のプローブセットの場合）µL 本数 x1.05
試薬名
Nuclease free water
3.9
E_Sarbeco_F1
1.8
E_Sarbeco_R2
1.8
E_Sarbeco_P1
0.5
TaqMan Fast Advanced Master Mix (2x)10
↓上記のプレミックス C を、新しい PCR 用チューブまたはプレートに 18 µL ずつ分注
↓各チューブまたはウェルに、RT 反応済のサンプル溶液 2 µL を加える
↓ピペッティングで優しく撹拌する↓蓋またはシールをして、スピンダウンする↓StepOnePlus にセットし、反応を開始する
以上

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