血管内皮幹細胞の分離法を確立―⾎管の修復と再⽣につながる研究成果―【研究成果のポイント】
u これまで⽣体内で⾎管を作る事は困難でしたが、⾎管には⾎管内⽪幹細胞（※1）と呼ばれる⾎管の幹細胞が存在していて、この幹細胞を利⽤すると、⽣体内で⾎管を再⽣できることを以前に報告しました。
u 今回、⾎管内⽪幹細胞を⾼効率かつ簡便に分離する⽅法を確⽴しました。
u 本分離法を⽤いると、特殊な実験機器を使⽤しなくとも、多くの研究者が⾼い再現性を持って容易に⾎管内⽪幹細胞を分離することができます。
u 本⽅法は幹細胞だけではなく、通常の⾎管内⽪細胞（※2）も分離もでき、今後様々な⾎管研究へ応⽤して、⾎管研究の発展に⼤きく寄与する事が期待できます。

概要
⼤阪⼤学微⽣物病研究所の内藤 尚道准教授と⾼倉 伸幸教授らの研究グループは、2018年に⾎管を作る源となる⾎管の幹細胞（⾎管内⽪幹細胞）を発⾒し、その解析を継続してきました。今回、⾎管内⽪幹細胞を⾼効率に分離できる⽅法を確⽴し論⽂発表しました。
⾎管は癌、虚⾎性疾患、慢性炎症性疾患などを始め、多くの疾患の発症機序や病態形成に深く関与しています。そのため、⾎管の機能や構築メカニズムを明らかにする事で、これらの疾患の病態の理解が進み、より良い治療法を確⽴できると考えられます。これまで、⽣体から⾎管内⽪細胞を⼤量に分離すことが困難であり、⾎管研究を⾏う上で⼤きな障害となっていました。今回、数種類の酵素反応と⼒学作⽤を組み合わせることで、従来よりも簡便に⾎管内⽪細胞と⾎管の幹細胞を分離する⽅法を確⽴し発表しました。本研究成果は、英国科学誌「Nature Protocols」2020年 3 ⽉号（1 ⽉ 31 ⽇オンライン）に掲載されました。

研究の背景
⾎管は全⾝に隈なく張り廻り、⾎液を体の隅々まで⾏き渡らせ、組織に酸素や栄養素を届け、⽼廃物を組織から受け取り除去します。ヒトでは⾎管の全表⾯積は 700m2 にも及び、その全ての内腔は必ず⼀層の扁平な形をした⾎管内⽪細胞によって覆われます。臓器が傷害を受け、傷害された場所が低酸素状態になると、⾎管内⽪細胞が増殖を開始して、⾎管新⽣（※3）が⽣じて新たな⾎管が作られます。⾎管新⽣は傷害された組織が修復されるために必須ですが、癌、炎症、線維化、動脈硬化巣の形成、さらには脂肪形成に⾄るまで、様々な病態にも深く関与しているため、⾎管新⽣を制御する分⼦メカニズムを解明することは、病態を理解して治療法を開発する上で重要です。そのため⾎管新⽣の制御メカニズムは、近年⾮常によく研究され、その結果、⾎管新⽣を誘導する増殖因⼦（⾎管内⽪増殖因⼦）の作⽤を阻害する薬（⾎管新⽣阻害剤）が開発され、癌などの治療薬として臨床治療に応⽤されています。
⾎管新⽣が⽣じるためには、⾎管を構築する⾎管内⽪細胞の増殖が必要です。これまで、⽣体内の⾎管内⽪細胞は全て同じで、増殖する能⼒も全ての内⽪細胞で等しいと考えられていました。
私たちは、この概念は正確ではなく、成体の⾎管内⽪細胞には増殖能⼒の「差」があることを明らかにしてきました。増殖能⼒の⾼い内⽪細胞は、たった⼀つの細胞から体の中で⼤きく太い⾎管を作る事ができることから、⾎管の幹細胞のような性質を持つ、特殊な細胞であることがわかっています。
これまで、このような細胞を⾒つける事が困難であったのは、内⽪細胞を体から分離して、⼀つ⼀つの内⽪細胞の性質を解析する事が困難であった事が⼀因と考えられます。これまでにも臓器から内⽪細胞を分離する⽅法はいくつか報告されていますが、⾎管内⽪幹細胞の分離に適した⽅法は確⽴されていませんでした。そこで私たちは、体の中の様々な臓器から内⽪細胞を分離して、その中に含まれる⾎管内⽪幹細胞を効率よく分離できる⽅法を確⽴するため、検討を重ねてきました。

本研究の内容今回確⽴したプロトコールの利点は、簡単で単純な操作により内⽪細胞と内⽪幹細胞を効率よく分離できるという点にあります。今回の論⽂ではマウスの肝臓から内⽪幹細胞を分離する⽅法を、具体的に細かな⼿順を説明しながら紹介しています。
まずマウスの肝臓を解剖⽤のハサミを使って細かく刻みます。次に細胞の周囲を囲む細胞間マトリックス（※4）を分解する酵素である、ジスパーゼ（※5）とコラゲナーゼ（※5）を⽤いて、刻まれた組織⽚をさらに細かく分解していきます。その際、刻まれた組織⽚と酵素が効率よく反応するために、1mm 以下の断⽚になるように、鋭利なハサミを⽤いて細かく刻んでおく事が⾮常に重要です。切った組織⽚をより細かく分解するために、細胞外マトリックスを分解する数種類の酵素を⽤いて、組織⽚を分散させていきます。この酵素と反応させる際に、通常は酵素液の中に組織⽚をつけて温めるだけですが、本法では、さらに⼒学的作⽤を加える事によって、より効率よく細胞分散を⾏います。
具体的には、組織⽚を浸した酵素液が⼊ったチューブを連続的に機械で振盪します。酵素液を充分に振盪させることで⾮常に効率よく、組織が分散されていきます。この⼯程を、酵素液を交換しながら数回繰り返すことにより、細胞外マトリックスが分解され、細胞同⼠が分離される事で最終的には単⼀の細胞に分散されます。
今回確⽴した⼿法を⽤いることで、従来の⽅法と⽐べ、より短時間で細胞を分離することが可能となりました。また、この処理時間の短縮が、⽣細胞の割合の増加と細胞表⾯マーカーの保持に繋がり、フローサイトメーターによる細胞分離が可能になります。さらに本論⽂では、得られた肝臓の内⽪幹細胞と内⽪細胞の培養実験や、RNA の発現解析、内⽪細胞の系統分類についても紹介しています。
本プロトコールを⽤いる事で、⾎管内⽪幹細胞を効率良く分離する事ができ、さらには内⽪細胞も⼤量に分離できることから、今後様々な⾎管研究への応⽤が期待されます。また本法は、酵素反応の時間を変更することで、肝臓のみならず、肺や⼼臓，⽪膚といった他の臓器からも同様に⾎管内⽪幹細胞を含む⾎管内⽪細胞を⼤量に分離することができるので、全⾝の⾎管研究の発展につながる事が期待されます。

今後の発展性ll

⾎管内⽪幹細胞の研究が進むと、組織に栄養を届ける⾎管の修復と再⽣が可能になり、組織や臓器の修復と再⽣の研究につながる事が期待できます。
⾎管は癌や⼼筋梗塞、脳梗塞、炎症性疾患など様々な疾患の病態と深く結びついているので、本⽅法を⽤いて、⾎管内⽪幹細胞と⾎管内⽪細胞の解析が可能になれば、これらの疾患に対する新たな治療法の開発につながる事が期待できます。

⽤語説明※1 ⾎管内⽪幹細胞
⾎管内⽪細胞の中に含まれる増殖能⼒の⾮常に⾼い細胞。細胞膜表⾯に CD157 分⼦を発現している。体の中で⾎管を作る事ができ、⾎管の幹細胞としての働く細胞。
※2 ⾎管内⽪細胞
全⾝の⾎管の内腔を覆う扁平で薄い細胞。⾎液と周囲の組織との間の細胞移動や、栄養素や⽼廃物、酸素や⼆酸化炭素などの物質交換を担っている。加齢や糖尿病、⾼⾎圧などが様々な原因で機能低下をきたし、疾患の発症や病態に深く関与する。
※3 ⾎管新⽣
既存の⾎管から新たな⾎管が形成される現象。⾎管内⽪増殖因⼦(VEGF)が内⽪細胞に働き、細胞が活性化して増殖し、新たな⾎管が作られる。⼤⼈では特に癌、炎症性疾患、網膜症などの疾患の病態形成に密接に関わっている。
※4 細胞外マトリックス
⽣体を構成する体細胞の外側にある⾮細胞性の線維状や網⽬状の構造体。細胞にとって物理的な⾜場となるだけではなく、組織の形態形成や分化・維持に重要である。細胞外マトリックスの成分は、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、ラミニンなどの構造タンパク質と、プロテオグリカン、ヒアルロン酸などの複合多糖に⼤別することができる。
※5 ジスパーゼとコラゲナーゼ
細胞外マトリックスを構築するコラーゲンやフィブロネクチンなどの繊維を分解する酵素。細胞にはあまり傷害を与えず細胞分散を⾏う事ができる。

掲載論⽂・雑誌
論⽂タイトル︓“Isolation of tissue-resident vascular endothelial stem cells
from mouse liver”「マウス肝臓からの⾎管内⽪幹細胞の分離法」
掲載雑誌︓Nature Protocols 15, 1066-1081 (2020)

https://doi.org/10.1038/s41596-019-0276-x
著者︓Hisamichi Naito*, Taku Wakabayashi, Masako Ishida, Chang-Hyun Gil,
Tomohiro Iba, Fitriana Nur Rahmawati, Shota Shimizu, Mervin C. Yoder*,Nobuyuki Takakura*（*Corresponding authors）

特記事項
本研究は、インディアナ⼤学との共同研究チームによって実施されました。
本研究は⽇ 本医療研究 開発機構 （AMED）⾰ 新的先端研究開 発⽀援事 業ソロタ イプ（PRIME）「⽣体組織の適応・修復機構の時空間的解析による⽣命現象の理解と医療技術シーズの創出（研究開発総括︓吉村昭彦）」の研究課題「⾎管内⽪幹細胞システムを基軸とした⾎管の恒常性維持と修復機構の解明（研究代表者︓内藤尚道）」、⽼化メカニズムの解明・制御プロジェクト「個体・臓器⽼化研究拠点」（研究代表者︓⽚桐秀樹）の研究課題「⾎管⽼化の分⼦機構の解明とその制御（研究分担者︓⾼倉伸幸）」、次世代がん医療創⽣研究事業（P-CREATE）の研究課題「腫瘍⾎管正常化によりがん悪性化を制御する治療法の開発（研究代表者︓⾼倉伸幸）」、⽂部科学省科学研究費補助⾦、公益財団法⼈武⽥科学振興財団、公益財団法⼈⾼松宮妃癌研究基⾦、公益財団法⼈第⼀三共⽣命科学研究振興財団、および公益財団法⼈ SGH 財団の研究⽀援を受け実施されました。

本件に関する問い合わせ先＜研究内容に関するお問い合わせ先＞
⼤阪⼤学 微⽣物病研究所 情報伝達分野
教授 ⾼倉 伸幸（たかくら のぶゆき）
TEL︓06-6879-8316
FAX: 06-6879-8314
E-mail: ntakaku@biken.osaka-u.ac.jp
ホームページ: http://st.biken.osaka-u.ac.jp/
准教授 内藤 尚道（ないとう ひさみち）
TEL︓06-6879-8312
E-mail︓naitohi@biken.osaka-u.ac.jp＜取材に関する問い合わせ先＞
⼤阪⼤学微⽣物病研究所企画広報推進室
中込 咲綾（なかごみ さや）