フッ素原子を導入した DNA プローブの合成と 19F NMR を用いた核酸高次構
造解析への応用
1.

緒言

DNA はプログラム可能な自己集合特性を持ち、２次元、３次元の高次構造を形成する機能性分子である。DNA が形作る高次構造は、DNA が遺伝子の担い手としてあるいは治療薬として駆動するために、生体内で非常に重要な役割を果たしている。しかし、DNA の構造を検出し同定する方法は少なく、UV スペクトル、CD スペクトル、ゲル電気泳動など、高次構造が混在すると明確な識別が困難で定量性をもたない既存手法に頼っているのが現状である。

O

NMR は様々な生体高分子の構造を定量的にR

N
H

HN検出し得る有用な手法として知られる。1,2 とりO

わけ、19F NMR は、①生体内にフッ素原子が存在しない

NdR

O②感度がプロトンの約 83%と高いといった特長を持ち、複雑な組成をもつ生体内

CF3
Fd T
for ODN F1R=Oでも高感度に調べたい物質を検出できることから、幅広く活用されている。本研究では、DNA高次構造形成を19F NMR で追跡する分子シス

CF3OdBFTfor ODN F2CF3N
HR=CF3テムの確立を目的として、 19F でラベルしたDNA を合成し、その機能を解析した。

Figure 1. The structure of DNA probes for monitoring of the f ormation of DNA
higher order structures.

2. 結果及び考察
2.1. DNA プローブの分子設計と合成
RODNA オリゴマー(ODN F1)を高次構造検出用プロOOーブとして設計した(Figure 1)。剛直性をもつ三重OH結合を介して F 含有ユニットをチミジン上に配R=H19

敏に応答することを期待した。合成ルートをScheme 1 に示す。2’-デオキシ-5-ヨードウリジンの 5’位をジメトキシトリチル基で保護した後、薗頭カップリング反応によりトリフルオロアセチOIHN

本研究ではまず、等価な 6 個の 19F 原子をもつ置することで 19F NMR シグナルが周辺環境に鋭O

OHNbNDMTrO

CF3NOOOHaO

R = DMTrNH2HNcOdOOODN F1NOO P OO

CF3-ル基で保護したプロパルギルアミン 1 と縮合さONHせた。続いて、アミダイト化した後に DNA 合成機により DNA オリゴマーへと導いた。アンモニNH1O
CF3NO

CF3O

O

2

イミジルエステル 2 をカップリングさせること

Scheme 1. Reagents (a) DMTrCl, DMAP, Pyridine, 53% (b) 1, CuI,Pd(PPh3)4, DMF, 54% (c) N,N-Diisopropylmethylphosphonamidic chloride,DIEA and then DNA auto synthesizer (d) 2, NaHCO3.

により目的とする DNA オリゴマーODN F1 を合Table 1. Oligodeoxynucleotides f or the detection of DNA structures using ODN F1成 し た (Table 1) 。 な お 、 ODN F1 の 生 成 は

ODN F1: 5'-ACGAGTF TCGCAT-3'

ODN 1: 5'-ATGCGAACTCGT-3'

ESI-MASS により確認した。

ODN 2: 5'-ATGCGAAACTCGT-3'

ODN 3: 5'-ATGCGGACTCGT-3'

ア処理により生成する鎖内アミノ基とスクシン

2.2.

19

F NMR による DNA の二重鎖形成追跡

Single strandedODN F1(A)

合成した ODN F1 を用いて DNA の二重鎖形成を 19F NMR で追跡した(Figure 2)。まず、ODN F1(B)

一本鎖の 19F NMR を測定したところ、-63.7 ppmにシグナルが生じた。続いて、ODN F1 と完全相(C)補的な塩基配列を持つ DNA 鎖(ODN 1)を加えて19F NMR を測定したところ、0.4 ppm 低磁場側に新たなシグナルが生じた。シグナルの強度は添加(D)ODN F1/ODN 1duplex

した ODN 1 の物質量に対応して変化したことから、新たに生じたシグナルは DNA 二重鎖構造の-63-64

/ppm形成に由来するシグナルであることが分かった。 Figure 2. 19F NMR spectra of ODN F1 in the presence of ODN 1. (A) 50 M
ODN F1 (B) 50 M ODN F1 + 17 M ODN 1 (C) 50 M ODN F1 + 34 M
ODN 1 (D) 50 M ODN F1 + 50 M ODN 1.

2.3.

分子モデリングによる構造の推定

生体分子の構造シュミレーションに広く用いられる分子動力学法 AMBER(Assisted Model
Building with Energy Refinement)を用いて ODN F1 が形成する二重鎖構造を推定した。Figure 3 に示したように、完全相補的な二重鎖(ODN F1/ODN 1)の場合、FT と相補鎖上のアデニン塩基が対を形成するため、19F 含有ユニットは DNA 二重鎖中の Major Groove に沿う形で配置された。ODN F1
一本鎖は水素結合等の分子間相互作用の影響がなく自由な構造を取り得る一方で、相補鎖との塩基対形成が進む二重鎖
では構造が固定される。
その結果、19F 含有ユニット周辺の磁気的環境が大きく変わり、一本鎖構造と二重鎖構造間で 19F NMR ケミカルシ
フトが異なったものと考えられる。

2.4.

DNA プローブの局所構造認識機能(A)

fullmatched duplex(B)

A bulged duplex(C)

G-T mismatched duplex

前々項に示したように DNA 二重鎖形成を19F NMR で追跡できることがわかったので、次にバルジ構造とミスマッチ構造の検出を試みた(Figure 4)。まず、アデニンの一塩基バルジ構造を形成する ODN 2 を ODN F1 に添加しG-T mismatch structureて NMR を測定したところ、ODN F1/ODN 1から成る二重鎖と比較して 0.05 ppm 低磁場に(D)Mixtureシグナルがシフトした。また、G-T ミスマッ
チを形成する ODN 3 を添加したところ、19F
NMR シグナルはさらに 0.15 ppm 低磁場シフトした。さらに、ODN 1、ODN 2、ODN 3 の混合物を ODN F1 に添加したところ、それぞれの構造に対応したシグナルが 3 本観測され

-63
19-64

/ppm

Figure 4. F NMR spectra of ODN F1 in the presence several oligonucleotides.
(A) fullmatched duplex (ODN F1 + ODN 1) (B) duplex with A bulge (ODN F1 +ODN 2) (C) duplex with G-T mismatch (ODN F1 + ODN 3) (D) Mixture ofduplexes (ODN F1 + ODN 1 + ODN 2 + ODN 3).

た。これらの結果から、ODN F1 は混在系であっても DNA がとる特定の構造を検出し得るプローブとなることが明らかとなった。続いて、他のミスマッチ構造(C-T)並びにバルジ構造(G, C, T バルジ)をもつ二重鎖についても同様の手法を用いて NMR による検出を試みた。しかしながら、これら高次構造中の FT の NMR シグナルは、完全相補的二重鎖 ODN F1/ODN 1 のシグナルと重なり、それぞれを識別することは困難であった。DNA 構造の識別能を向上させるためには、各構造に対応した高度なプローブ設計が必要であることがわかった。

2.5.

細胞 lysate 中における DNA の構造解析

フッ素原子は生体内においても明瞭なシグナルを与え得る。そこで、細胞内での DNA 高次構造検出のモデル実験として、細胞 lysate 中の ODN F1 の二重鎖形成を NMR で追跡した。ヒト肺がん細胞 A549 から細胞溶解試薬を用いて lysate を調製した後、ODN F1 および ODN 1 を加え、NMRを測定した。Figure 5 に示したように ODN F1 のみの場合と比べて ODN F1/ODN 1 二重鎖のシグナルは 0.4 ppm 低磁場にシフトした。これらのことから、ODN F1 を用いることにより、細胞内であっても核酸の高次構造形成を調べることが可能であることが示唆された。
ODN F1(A)(B)ODN F1ODN 1

CelLytic Buffer

ODN F1 + ODN 1Centrifugation

A549 cells-64-63

/ppm

NMR tubeFigure 5. (A) Experimental procedure f or detection of DNA structures in cell lysate. (B) 19F-NMR spectra of single stranded ODN F1 and ODN F1/ODN 1duplex in cell lysate.

2.6.

構造を改良した DNA プローブのデザインと合成

以上のように、ODN F1 は数種類の DNA 局所構造を 19F NMR で検出し得ることがわかった。しかし、検出可能な構造は、一本鎖、完全相補的二重鎖、A バルジ、G-T ミスマッチの 4 種に留まり、汎用性の高い DNA プローブとは言い難い。そこで、多様な構造を判別できる分子プローブへの改良を目指し、新たに 19F 含有ユニットとチミジン塩基間にベンゼン環を挿入した ODN F2 をデザインした。芳香環を挿入するこNH2とで、ミスマッチやバルジ構造が形成される場合でも芳香環と塩基間の-スタッキング効果により構造が安O

a, bN
H3F3C

HN
C ONHc, dるため

F 含有ユニットは塩基部近O

e

NHOCN
H

N

OCO

CF3CF3OOされる一方、ミスマッチやバルジ構

19CF3CF3有ユニットは Major Groove 内に配置れた芳香環と周辺塩基が相互作用すCF3O

完全相補鎖の存在下では BFT はアデ造を形成する場合は、新たに導入さOC

COOH定化することを期待した。すなわち、
ニンと塩基対を形成するため、19F 含OCOC OOONdBFT (ODN F2)

4Scheme 2. Reagents (a) H2SO4, MeOH, 88% (b) 3,5-bis(trifluoromethyl)benzoic acid, EDCI, HOBt, DMF,
57% (c) NaOH, THF, MeOH, 86% (d) NHS, EDCI, HOBt, DMF, 47% (e) amino modified ODN , NaHCO3.

傍に配置される。従って、BFT が受Table 2. Oligodeoxynucleotides f or detection of DNA structures using ODN F2

ける磁気的環境が各高次構造間でODN F2: 5'-ACGAGTBFTCGCAT-3'

ODN 4: 5'-ATGCGTACTCGT-3'

明瞭に変わり、より詳細に DNA 局

ODN 5: 5'-ATGCGAGACTCGT-3'ODN 6: 5'-ATGCGCACTCGT-3'

所構造を検出できると考えた。

ODN 7: 5'-ATGCGACACTCGT-3'

ODN 8: 5'-ATGCGATACTCGT-3'

ODN F2 の合成ルートを Scheme 2 に示す。

(A)

Single Strand ODN F2

p-アミノ安息香酸を出発原料とし、カルボン酸をメチルエステルに変換した後、ビストリ(B)TT mismatched duplex(C)

Fullmatched duplex

フルオロメチル安息香酸と縮合した。得られた 3 を加水分解した後、活性エステル 4 へと導いた。続いて、4 とアミノ基を持つ DNAオリゴマーをカップリングさせることによ(D)G bulged duplex

り目的の DNA プローブ（ODN F2）を得た。
なお、ODN F2 の生成は ESI-Mass によって確認した。

(E)

2.7. プローブ ODN F2 による DNA 高次構造の検出(F)得られた ODN F2 の 19F NMR を各種相補(G)A bulged duplex

GT mismatched duplex

Mixture鎖の共存下測定した。Figure 6 に示したように、一本鎖、完全相補的二重鎖、ミスマッチ(T-T, G-T)構造、さらにバルジ構造(G, A)の 6種類の高次構造をケミカルシフト変化によって識別できた。ODN F2 が形作る二重鎖構造を検証するために、二重鎖解離温度(Tm)を測定し、ODN F1 の Tm 値と比較した(Table3)。その結果、ODN F2 が形成する二重鎖は-64-63

Figure 6. F NMR spectra of ODN F2 in the presence several oligonucleotides.
(A) Single Strand ODN F2 (B) duplex with T-T mismatch (ODN F2 + ODN 4) (C)fullmatched duplex (ODN F2 + ODN 1) (D) duplex with G bulge (ODN F2 + ODN5) (E) duplex with A bulge (ODN F2 + ODN 2) (F) duplex with G-T mismatch(ODN F2 + ODN 3) (G) Mixture of duplexes (ODN F2 + ODN 1 + ODN 2 + ODN
3 + ODN 4 + ODN 5).

Table 3. Melting Temperatures (Tm) of ODN F1/ F2/ normal
DNA f or various local structures

全て、ODN F1 が形成する二重鎖より安定化した。とりわけ、ミスマッチ構造、バルジ構造を形成した場合は、最大 10 ˚C 程度の大幅な Tm の上昇がみられたことから、ODN F2に新たに導入されたベンゼン環は周辺塩基と-スタッキングし、二重鎖構造を安定化したことが示唆された。すなわち、各種二重鎖

/ppm

19

ODN F1(ODN 1)
f ullmatched
GT mismatched (ODN 3)
CT mismatched (ODN 6)
TT mismatched (ODN 4)(ODN 2)A bulged(ODN 5)G bulged(ODN 7)
C bulged(ODN 8)T bulged

51.5
39.5
31.2
31.2
34.5
39.6
41.1
41.5

ODN F2 normal DNA
56.1
44.8
41.6
41.6
45.4
41.6
42.7
42.1

54.1
47.5
42.0
42.0
43.9
39.642.642.5間で BFT の磁気的環境が明らかに変わり、詳細な構造識別が達成されたことがわかった。

3.

結言

本研究では、19F 原子でラベル化された DNA プローブを合成し、19F NMR によって DNA 構造を検出する分子システムを構築した。チミジン誘導体にアセチレン部を介して 19F 含有ユニットを導入した ODN F1 は、一本鎖、完全相補的二重鎖、A バルジ構造、G-T ミスマッチ構造においてそれぞれ異なるケミカルシフトをもつ 19F NMR シグナルを与えた。ODN F1 を改良し、ベンゼン環を構造内に挿入した ODN F2 は、上述の高次構造に加えて、G バルジおよび T-T ミスマッチ構造の計 6 種類の高次構造を識別できた。本分子プローブは、DNA 局所構造を混在系であっても容易に検出する。今後、生きた細胞内での核酸構造検出への応用が期待される。

参考文献
1) Tanabe, K.; Sugiura, M.; Nishimoto, S. Bioorg. Med. Chem. 2010, 18, 6690–6694.
2) Tanabe, K.; Nishimoto, S. et al. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 15982–15983.