藻類 Jpn.1.Phycol.(Sorui)44:1
09‑
114，July10，1996

島問術紹介
光合成における炭酸ガス固定と酸素発生量の相関および酸素電極測定法

和田野晃
大阪府立大学・農学部(593 堺市学関町 1‑I)

AkiraWa
血 no1
996百四 useofoxygene
lectrodei
nm回 S田沼田en
包ofphotos
ynthesis.Jpn.J.Phyco.
l(Sorui)44:
109‑
114.
百四 useofoxygene
lectrodei
sdescribedi
nm伺 surementso
fp
hotosyn
曲目is.Thestoic
hiometryoft
heoxygene
volv
edlIonofCÛ 2 • 百四 stoichiometry foroxygena
n
dcar
bo
nd
iox
i
dei
sc
hecke
dfor
i
sexpl
aine
dfort
hep
hotos
ynt
het
i
cf
i
x
ano
ton
l
yC
alv
in
‑
B
en
so
nc
ycleb
uta
ls
op
hotor
espir
ation.Fundame
nta
lwaystotr
eatt
heoxygenelectrodei
sshownforgettingaccur
ater
esu
ltso
fp
hotosyntheticmeasurements.

KeyInde
xWor
ds:o.
巧I
ge
ne
le
ctr
ode.s
toichiometry.。巧I
gen.carbondioxide
Akir
aWad
胡 0:u
sakaPrefectureUniversity，
Gakuencho1‑1.Sakai593，
Japan

はじめに光合成の測定は，炭酸ガスの減少を直接測定する赤のことは試料が必ずしも溶液状でなくてもこの電極による酸素濃度の測定が可能であることを示している。

raRedGasAnalysis:IRGA) .固外吸収ガス分析法(lnf

しかし，光合成を気体中の酸素濃度の変動により測定

定炭酸ガス量を放射性同位体を用い検出する方法，おする装置は多くはなく，英国の Walker教授が考案し，よび固定炭酸ガスの量に応じて放出される酸素を酸素

Hansa
肱 h社が販売している LDl/2はその典型的なもの

電極で検出する方法が主に用いられる。それぞれ一長である。その詳細は別の成書に示されているので一短があるが，ここではその中でも取り扱いが最も容(Walker1955). ここでは溶液中の酸素測定を主に記す易な酸素電極による方法を取り上げてみる。この電極ことにする。

による酸素の測定は. Heyrovskyと Shikataによる滴下水銀電極を用いるポーラログラフィーの創出に端を発1)固定炭酸ガスと放出酸素のストイキオメトリーしている。この電極でも酸素が分解されることは知ら

少し光合成の炭酸ガス閲定について復習をしながれていたが，大きな白金電極を緑葉にあてると酸素濃ら，放出される酸素の測定がどの程度固定された炭酸度の変化が観測出来ることが判明するまでに 10年余りガスを反映しているかを確認しておく。図 1は光化学の時間が必要であった。その後，コロジオンで白金面系 IとH を示す略図である。光化学系 H は水 2分子よを覆うと電極が安定化することが明らかにされ，さらり電子を 4個受け取り，光のエネルギーを用いて Q Aに1
956年には Clarkが画期的な電極系を考案するにに受け渡す。この 4個の電子は電子伝達体を流れ，光956)。彼は電極を膜で覆い試料から隔至った (Cl釘 k 1

化学系 Iで再度光エネルギーで高エネルギー状態にな離し，膜を通過する酸素のみを測定することが可能でり，フェレドキシンを経由し. 2分 子 の NADP をあることを示した。この電極は，直接試料と接しないNADPHに還元する。この間に電子伝達系により，スので汚染されず，さらに膜はイオンを透過させる必要トロマからチラコイド内腔へプロトンが運ばれ，そのがないので疎水性のものを使うことが可能である。こ濃度勾配により ATPが作られる。この ATPの生成のス

110

和田野

トイキオメトリーは，サイクリックな電子の流れでNADPHが生産されず(水から電子が光化学系 H流れない)に ATPの生産だけが起こる経路もあるので，炭酸ガスの固定と酸素の発生量のストイキオメトリーと無関係であると考えても間違いではない。ともあれ，水が 2分子酸化され酸素が 1分子発生すると 4等量の電子が光化学系に渡り，電子伝達系を経て， 2分子のNADPHが生成する。

一方，光合成の暗反応 (Calvin‑Benson回路)での
図1.光合成の電子伝達系 水 2分子が参加され 4電子が光化1に渡り，電子伝達系を通り，最後に 2分子の NADPが学系 1還元される。

NADPHとA叩の消費は固定される炭酸ガス量とどのような相関があるだろうか。図 2には， 3分子の炭酸ガスが Calvin‑Benson回路で固定され，光合成産物として 3炭糖が l分子作られる場合の ATPとNADPHの消費が示しである。前述したように ATPの消費量は酸素発生に厳密な相関関係はないと考えられるので，NADPHの消費量に視点をあてると， 3分子の炭酸ガスが固定され， 3炭糖が 1分子固定されるのに 6分子のNADPHが 1，3‑ピスホスホグリセリン酸 (BPG) をグ・リン酸に還元するのに使われる。
リセルアルデヒド 3
従って， 1分子の炭酸ガスを固定するのに 2分子のNADPHが消費されることになる。上述の水の酸化による酸素の発生と生成される NADPHの量比と考え合
わすと， 1分子の炭酸ガスの固定は I分子の酸素の発生を伴うことになる。
光化学系による光のエネルギーの利用と酸素発生には，活性酸素の生成経路も関与している。しかし，光化学系に関与する電子伝逮系から酸素に電子がもれ，
図2.CaJvin‑BensonCycle 3分子の炭酸ガスが固定され， 3炭素化合物のトリオースが 1分子生成されると， 6分子のNADPHが酸化される。

過酸化水素ができても，最終的に水と酸素になれば，水が酸化され酸素が発生し，酸素が還元されさらに水と酸素に不均化される結果となり， netの酸素の出入りはないと考えられる。一方，光呼吸は時に光合成炭酸etの酸素出ガス固定の 50%に及ぶといわれており， n入りがありそうで，無視するわけにはいかないが，
Farquh訂と vonCammerer(1982) によると次のようになる(図 3)0RuBPにたいしてオキシゲネーションが5ATP，2NADPH，1.50
一度おこると， 3.
2が消費され，0.
5CO2が生成される。ところで ，2分子の NADPHは上述のように 1分子の酸素の発生に相当する。従って.
5ATP， 0.
5O2，の消費と 0.5C02の発生
上記結果は 3となる。彼らの考え方は以下のように理解される。光呼吸で 2分子の RuBPが酸素を受け取り， 2分子のグリコール酸を生成すると考える。生成したグリコール酸
関 3 光呼吸経路 2分子の RuBPに2回オキシゲネーションが生じると，合計 3分子の酸素が使われ， 1分子の炭酸ガスが生じる。その聞に，差し引き 4分子の NADPHが酸化される。

はもう 2分子の酸素を消費して，グリオキシル酸と過酸化水素を各 2分子生成する。過酸化水素はカタラー
ゼなどにより分解され 2分子の水と 1分子の酸素を生光合成の酸素電極測定法

111成する。その結果，この過程での酸素の消費は l分子となる。次にグリオキシル酸はアミノ基転移をうけグリシンになる。 2分子のグリシンよりセリン， NADH，炭酸ガス各 l分子が生じる。このセリンが l分子のPGAになるのに l分子の NADHを消費する。合計 3分

試料液

子の PGAが生成し，最終的に1.8分子の RuBPを再生するには 3分子の NADPHを必要とする(残りの 0.
2分0リング(ゴム)
陽極 (Ag)

電解液(KCI)子の RuBPは光合成炭酸ガス固定系により補給される

除極伊t)

テフロン膜と考える)。一方，グリシンから遊離したアンモニアを固定するのに l分子の NADPHを必要とする。これらを合計すると， 2分子の RuBPに対してオキシゲネーションが 2回生じると， 1.8分子の RuBPが再生されるまでに， 3分子の酸素が消費され， 1分子の炭酸ガスが

図4.Clark型複合酸素電極の基本構造

陽極と陰極を包埋する支持体には，ガラスや樹脂が用いられている。電解液には，KCIを含む緩衝液，保水剤としてグリゼロールを加えたものなどがある。テフロン膜と陰極・陽極の間は.レスポンスが悪くなるので出来るだけ隙聞を作らないようにする。

生じ， 4分子の NADPHが酸化される。光化学系はそのNADPを還元するために2分子の酸素を発生するので，結局ここでも 1分子の酸素の消費は l分子の炭酸ガスの生成に相当することになり，酸素 1分子の発生は炭循環本出口

酸ガス 1分子の固定と考えても問題ない。従って，光呼吸の有無にかかわらず，炭酸ガス固定量は酸素発生量を測定すれば良いことになる。

2) 酸素電極による酸素測定原理(萩原Oーリング

1977)

市販されている酸素電極には大別してガルパニー電池型と C
lark電極裂と呼ばれる 2種類ある。しかし光合lark電極成の測定に用いられるのは，一般に後者の C型であるので，ここでは前者については言及しないことにする。 C
lark型電極の基本構造は図 4に示したように，白金の陰極と電解液の KCI溶液，及び銀/塩化銀

図5. 専用のセルにつける電極

Hansatech社の電極アセンプ
リーは，試料セル部分と電極が別々になっており，ネジで絡め付け組み立てる。電極の管理が容易である。の陽極，電極膜よりなっている。両電極聞には， 0.6Vの電圧をかけて，流れる電流を測定する。陰極側では独自に設計したケモスタットに取り付け使用する時ながプラチナ表面で 2O2eを受け取り還元され， HP2と)。
どに便利である(図 620Hーを生じる。さらにHzeを電極より受け取り
02は 2電極も自作は可能であるが，筆者の周りでは購入し20Hーとなるので陰極付近の電解液は短時間でアルカリている。一方，電極に一定電圧を供給する電源及び電となる。そのため炭酸ガスがより溶けやすくなり電気流測定装置は少し価格が高いこともあり，工夫して自の出力が不安定になるので，電解液として炭酸イオン作することも珍しくはない。図 7はその装置の一例でと緩衝液を含む溶液を使う場合もある (Delieuandある。電池は以前は水銀電池を使用していたが，アルWalker1981}
0陽極側では， 4Agと4CIから 4AgC
Iを生カリ電池でも実用上差し支えない。ただ水銀電池は電じ，さらに 4eを電極に受け渡す。この 4eの電極での圧が最後まで一定しているが，アルカリ電池は長時間授受を電流として測定するので，測定される電流は陰使用し電力が無くなると少しづっ電圧が下がる傾向が極で消費される O2量と化学量論的に相闘がある。

あるので，テスターなどで電圧をチェックする方が無

実際に光合成測定で筆者の周りでよく使われている難ではある。スイッチはどんなものでも支障ない。抵， RankB
rothers社，及び酸素電極には ，Hansatech社

抗は低雑音のものが望ましいが，さほど神経質になる

YellowS
pring社のものがある。前 2者は構造的にも比必要もない。 1mV入力の記録計は，入力インピーダ較的類似しており，専用のセルにとりつけられているンスが lMQ以上のものでチャートスピードの変えれが(図 5)，3番目のものは専用のセルはなく，例えばるものであれば使用可能である。感度を上げたい時

和田野

112

は，記録計が接続している 2Knの抵抗を 20Knに換のは入力抵抗が一般に低いのできけた方が無難である

え， lOmV入力で 0・100合わせをした後， 1mVに感(これは杷憂?)。

度を上げて使用する。

b) 測定
酸素電極のアセンプルは少なくとも前日にしておい3)測定例たほうが測定値が安定する。まず酸素電極のキヤリプa)必要な装置
ans
atec
h社
酸素電極 HOW2{2 など肱 h社 CB1・02 など
電極制御器 Hansa

記録計
循環高温水槽レーションを行う。酸素の溶解度は表 1 (笹川・関根1955) に示したように，温度と分圧により定まり，例
えば l
気圧，摂氏 25度の空気と平衡になっている水溶液には約 250μMの酸素が溶解している。そこでまず窒素ボンベセルに緩衝液に懸濁した試料もしくは緩衝液を適当量空気用コンプレッサーもしくは代用品(金魚満たす。スターラーで撹枠しながら，空気を小さい気用ポンプなど)泡になるように通気する。測定電圧が一定になるまで光源放置し，その電圧値を空気に含まれる酸素と平衡にあスライドプロジェクターなどマグネティックスターラーとスターラーパーる溶液の酸素飽和値とする。次に窒素を通気し，電圧が一定になったときその値を酸素浪度 Oの時の出力電

これらの器具の中でスターラーとスターラーパー圧とする。この操作を 2，3度繰り返し，チャートに描は，比較的軽んじられがちであるが，ノイズを少なくかれた電圧の差を 250μMの酸素に相当すると考えるするためには非常に重要である。スターラーには低速(図4)。スターラーの回転速度は，パプリングを窒素で安定した回転が得られ，火花によるノイズを避けるから空気，もしくは逆の操作をしたとき平衡になるまためブラシレスのモーターを使用しであるものを選でにあまり長い時聞がかからない程度に設定する。次ぶ。スターラーパーは電極膜を傷つけない(普通は試にストッパーを挿入する。ストッパーには，あらかじ料室の構造上電極膜に援しないようになっている)

め試料の容量が一定になるように印をつけておく。ケで，かっ回転むらなくスムーズに撹持出来るものを購

モスタットの場合，その容量はサンプリングの容量に入する。記録計は前述のように入力抵抗の高いものをより異なるが，光合成を測定する場合は，後で加える用意する。古くても差し支えないが，真空管時代のも重炭酸溶液や阻害剤の容量が問題にならない程度の試時Y
eUowS
prin
g社製型電極とケモスタットの組立b)担℃での電極のキャリプレーシ aン

反応漉添加孔空気パプリング

スターラーパー

過趨帯感などを加えておく

図6. ケモスタット組み込んだに Y
ellowSpring社製型電極と電極のキャリプレーション 窒素と空気をパプリングし，プンゼン係数より，記録音十のチャート幅がいくらの酸素に相当するかを求めておく。酸素光合成のタイムコースを追跡しながら，代謝中間体の濃度の変化を調べるためにはケモスタットを用いる。あらかじめ一定量の過塩素酸などをいれた注射筒に一定時間ごとにサンプルをとる。

光合成の酸素電極測定法

113

古くてハードディスクすら付いてないパソコンにRS232Cで接続できる A/
D コンパーターを付け，雑誌に掲載されたソフトを組み合わせてペンレコ ーダー用のソフトを作りデータの取り込みを行っていた 。その後の処理は，データをテキストファイルの形でセープし，アップル社 Ma
cintoshの表計算ソフトで行った 。その時 ，データの取得に用いていた NECのパソコンのフ巳手=640KB.2HD=1.2
l¥⑪のロッピーデ ィスクの容量 2DD仕様に随分面倒な思いをさせられた 。我々のところでは. Hanzatch社の光合成測定システムが稼働している1mV 入力の ベン レコーダー

カえそのコントロールは IBMのパソコンで行っている。この 3社のパソコンで共通に使えるフロッピーの

図 7簡易型の酸素電極電源

簡易型ではあるが，i[池を電源とするのでノイズは少なく. iJll
J
定精度は良い酸素電極電源である 。ただし，このままではゼロ点補償が記録計の機能に依存しているので感度の切り替えが困難である 。

フォーマットは.NECのパソコンでは例タト的とも思われる取り扱いを受けている 9セクターフォ ーマ ットの2DD(720KB)のみである 。例えばドライブ Bでその共通に使えるフロッピーディスクを初期化するには，
MS‑DOSのコマンドラインで料容量 とする 。例えば. 20μlの重炭酸溶液を加える場00倍の 2ml程度にする 。このス トッパーを合はその 1

FORM
ATB:/9と入力する 。 この /9(スラッシュ・ナインという ) を挿入するとき，試料の中に気泡を残さないように注意

初期 化のコマンド FORMATのスウイッチというが，する 。試料中の気泡はノイズや ，酸素発生測定の直線光合成を研究目的とする人て、それを知らない方は珍し性欠如などの原因になる 。測定中にも発生した酸素がくない(少なくとも筆者の身の回りでは 。
) 少し余談に飽和し，気泡を作る ことがあるので，最初に気泡がななるが， この 720KBフォーマットの 2DDは日本語のくてもノイズがではじめたら試料セルをチェックする。光はスライドプロジェクターなどを用い照射する。集光と熱線を取り除くために丸底フラスコに水をみたしたものを試応ヰセルと光源の問に置く 。光の強さを調整するには，白色フ ィルタ ーやオパールガラスなワープロ専用機で MS‑DOS変換する際にもよく使われcintoshや I
BM コン パチており，ワープロの文章を Maのパソコンで使うのに便利なフォーマットでもある 。
この 720
KBのフロ γ ピーは内容がテキストファイルであれば， MS‑DOSのファイルが読める多くのワープV， Ma
cintosh，NEC98なと のパソコンで読みロ， DOS/εどを用いるが，ガーゼを適当に重ねたもので代用でき書きが可能であり ，共通のソフトが存在する場合にはる。試ギ￨
セル内の光量を測定するには Hansatech社のそのソフトのファイルは共有できる 。例えば NEC98のQRTlQuantithennが便利である 。試料の波度はラン i梁LOTUS‑123のワークシートやグラフは Ma
cintoshでそを用いる場合で，最終 5μgChl/ml 程度にしている 。のまま読み込みが可能である 。ただその場合一点だけ測定値は濃度変化で現れるので，絶対値の変化に換算注意が必要で，そのディスクの全てのファイルの名前

μgChl/mlの試料で 2mlのセルを用いて. 20μMする 。5は半角 8文字以下の英数字のみで記す必要がある 。漢の酸素が 5分間で発生したとすると，字や仮名を用いるとファイルそのものが表示されなかったり，そのファイルの後で書き込んだファイルが発生酸素量 =20x2/1000/ (5x2)/
5=40nmol/101= 0.8μmol/μgC
hl/minμgChl/5milとなる 。

全て表示されなくなる可能性がある 。
前述の自作のシステムは現在でも稼働してお り，自分でもやってみたいと思われる方には必要な情報とPASCALのソースは差し上げることは出来る 。しかし

4) コンビューターでのデータの取り扱い

現在ではすでに市販のものもあり，特殊な目的でない

3.4年前までは新しいパソコンは比較的貴重品でatech
限り自作はさして生産的で、はない 。例 え ば Hans

あり，ペンレコーダーの代わりにアナログ ・デジタル社の PC対応 2ペンレ コーダーエミュレーションソフ

コンパーター (A/Dコンパー ター)を付け，酸素測定

I
SA拡張スロット付き IBM コ
トQYSlとフル/ハーフ .

装置に常設しておくのは困難であった 。そこで我々はンノ Tチブルコンピューターインターフェ ースカード

和田野

114

表1.酸素のプンゼン係数と空気と平衡になっている水中濃度違えると，何のデータを取ったのか分からなくなる。
この解説ではスペースの都合上，書き忘れてしまっ

温度

プンゼン係数水中濃度(oC)

。

(凶1m!
)

(μM)

0.
04872474

100.
03793357150.
03441350

200.
030913
的250.
0282225130

0.
02612229ていることが多いと恩われる。 Walker教授の光合成測定に関する著書は，光合成の測定の原理から応用，蛍光の測定の生理的意味など教科書として非常に良くできていると思われる。一読をおすすめしたい。
最後に，この解説に関する感想，質問は以下のメイル宛にお願いします。
噌 center.
osakafu‑u.
ac.
jpwadan0C(笹川・関根 1955)水中濃度は 25，1気圧， 1モルの気体の体積を 22.
41としてプンゼン係数より計算した。

参考文献

，Jr.，
L.C.R. 1956. Monitorandcontrolbloodand
ClarkI
F2の組み合わせで使い易い 2ペンのレコーダをパソ

tissu
eoxygentension.T
rans.Am.Sci.A
rtificiallnternal

コン上で実現できる。その後の処理は上述の変換法をOrgans，2:41

用いればどの種のパソコンででも行うことが可能であ.andWalker，D.A. 1981
. PolarographicDelieu，Tmeasuremnto
fphotosyntheti
coxygenevolutionbyleafる。

discs.NewPhyto，.
l 89:165‑1785) おわりに酸素電極での光合成測定は，原理としてはそう新しいものではない。テフロンの薄い膜が電極膜として使われ初めてから電極自体に画期的な進歩があったわけ

Farquh紅，G.D.andvonCaemmerer，S.1
982.Modl巴lingofp.
photosyntheticresponsetoenv
iromentalconditions，549・587.In:O.L.Lange，
P.S.Nobel，C.B.OsmondandH.Ziegler(eds.
) Encycl句ediaofPlantP
hysiology，Vo112B，S
pringer‑Ver
lag，Berlin.

でもない。むしろ変わったところは，コンピューター

萩原文二(編) 1
977.電極法による酸素測定.講談社，を取り入れたシステムが作られ始めたことであろう。

東京

旬ch社のシス
筆者の学部でも共通の備品として Hansa

笹川泰治・関根隆光 1955. ワールブルグ検圧計の使いテムが導入されている。このシステムの便利さは，例
えば光の強さをコンピューターから制御できるので，方.p.5ω‑605.赤堀四郎(編)酵素研究法，朝倉書底，東京

光飽和曲線をとるのは非常に簡単である。しかし，原Walker，
D.A.1
995.光合成測定，上回悦範・平知明・竹田恵美・和田野晃(監訳)，旭光通商

理はやはり酸素電極であるから，電極の取り扱いを間告量う
44巻 l号掲載の「光合成研究法シリーズ」

三室 守「光合成色素および光化学系反応中心の定量法」中に以下の誤りがありました。訂正します。

‑ 咽 EA目 句 ︑d一勾︐︐‑ny‑ e且

O‑eb‑AU‑‑a一‑AU一個‑o一B

一泊出町

jehu

加m

Et‑‑dm

正一以 μd守︐

聞の︑︐
9 位d 単取呆
1 結町山
J 算制計!‑叫の18ページ，付録 2hm

誤一一︐

ι nI

14ページ右カラム. 7行目