２０１４年度「プロジェクト未来」研究進捗状況報告書
研究課題名：がん細胞における機能性非翻訳 RNA を介したエピゲノム修飾制御に関する研究研究者：近藤 豊
所属：名古屋市立大学 大学院医学研究科 遺伝子制御学【研究成果の概要】
脳腫瘍（グリオブラストーマ：GBM）で腫瘍化に関与している長鎖非翻訳 RNA （longnon-coding RNA：lncRNA)の網羅的解析、およびその機能解析を行なった。さらに lncRNAに対する核酸医薬の可能性についての検討を行った。Notch シグナルの下流で制御されている lncRNA として網羅的解析および in silico 解析から TUG1 を同定した。また生物種を越えて進化学的に遺伝子配列が保存された lncRNA は重要な機能を持つ可能性が高いと考え、in silico 解析から LINCX を同定した。それぞれの lncRNA に対してアンチセンス核酸の有用性を検討した結果、高い抗腫瘍効果を示すことを見出した。
【研究の背景】
GBM は、悪性脳腫瘍のうち最も高頻度にみられる極めて予後不良な腫瘍である。浸潤性が強く化学療法や放射線治療が併用されるが必ずしも治療効果は高くない。そのため GBMに対する新たな有効な治療法の開発は急務であり、腫瘍細胞の維持に特異的で必須な分子・パスウェイを解明する必要である。
申請者らはこれまでタンパク質に翻訳されない lncRNA が、GBM 細胞特異的に発現し、複数のエピゲノム関連蛋白の”結合の場” となり、GBM 形成に関わることを見出した。
これまで lncRNA の発がんへの関与が着目されているが詳細なメカニズムは不明な点が少なくない。また lncRNA に対するがん核酸医薬およびそれら新規メカニズムを標的とする創薬はいまだ各製薬企業も取り組めておらず、実際の臨床検体における lncRNA の生物学的意義を解明できずにいる。
そこで本研究では、がん細胞の幹細胞性維持に重要な Notch シグナルの下流で制御される lncRNA (TUG1) の同定を行いそのメカニズムにつき詳細を明らかにすることを目的とした。さらに脳腫瘍の形成に関わる新規 lncRNA を同定しその機能解析を行なうことを目指した。これらの lncRNA を標的とすることで、新規がん治療法の開発の基盤となることができることから、核酸医薬の可能性について検討を行った。
【結果】① Notch シグナルに誘導される lncRNA の絞り込み脳腫瘍幹細胞（GSC）における Notch1 およびそのリガンド JAG1 の発現状態を免疫染色で確認した。Notch1 陽性細胞と JAG1 陽性細胞は排他的関係にあった（図１）。

脳腫瘍幹細胞の維持には、Notch シグナ
ルの重要性が報告されている。そこで

図1 脳腫瘍幹細胞におけるNotch1とJAG1の発現
GSC spheroid

Notch1 および JAG1 に対する siRNA、またDAPI

Notch1

100% positive cellsは、Notch シグナルの阻害として働くγセクレターゼ阻害薬（DAPT, RO4929097）でGSC を処理し、発現が減少する lncRNA をJAG1

Merge

lncRNA マイクロアレイを用いて解析した

Notch1
JAG1806040200（図２）。Notch シグナルの阻害により 48(Bars = 50um )の lncRNA の発現が低下した。 図2 脳腫瘍幹細胞でNotchシグナルで制御されるlncRNAの同定
これまでに GSC の 3 細胞株
γ -secretase
Inhibition ofinhibitorsを用いて RNA-seq を行った結JAG1 or NOTCH1DAPT vs DMSO
Down-regulated
514 lncRNAs

果、Notch 応答配列を有する
64 の lncRNA が 3 つの細胞株

si-JAG1 vs si-NC
Down-regulated
355 lncRNAsで共通して高発現であった。
lncRNA マ イ ク ロ ア レ イ とRNA-seq の結果を対比した結果、TUG1 のみが GSC で高発

RO49290 vs DMSO
Down-regulated
630 lncRNAs

現を示し、Notch の下流で制御させている lncRNA として同si-NOTCH1 vs si-NC
Down-regulated
316 lncRNAs定できた。

② 膠芽腫形成に関わる新規 long non-coding RNA の同定
生物種を越えて進化学的に遺伝子配列が保存された lncRNA は少なく重要な機能を持つ可能性が高い。公共のデータベース上に登録されている 15,876 の lncRNA から、ヒトとマウスで保存された

図３ 脳腫瘍におけるLINCXの発現塩基配列 (200bp 以上で 80％以上の相同性) を有する
177 の lncRNA を同定した。RNA sequencing の結果より、そのうち3

つのLINCX
1 .0lncRNA(LINCX,RP11-553L6.5,MEG3) は膠芽腫細胞株で高発現を示した (膠芽腫細胞 FPKM>10、Fold change (膠芽0 .5腫/正常脳神経細胞) >2)。膠芽腫形成マウスモデルを用いて 3 つの lncRNA の発現を解析した結果、LINCX は発がん早期より発現が上昇しており、特に腫瘍形成期

0 .0normal

GBMには正常の 10 倍以上の発現を示した。ヒト膠芽腫（n=23）では、3 つの lncRNA のうち LINCX は最も高FC (GBM/normal)>215/23 (65.2%)頻度に膠芽腫症例 (18 例;78.2%) で発現上昇が見られた(図３)。

図４ LINCXによるmiRNAとその標的遺伝子への効果
hsa-miR-411

TOP2A

＊

LINCX には miR-411-5p と共通のシ0.008ードシークエンスが存在し、siRNA を

0.007

0.70.006

0.60.005

0.5

miR-411-5p の発現増加と細胞増殖の0.004

0.4

抑制が観察された。
さらに miR-411-5p0.003

0.30.002

0.20.001

0.1

用 い た LINCX の 発 現 抑 制 に よ りの標的遺伝子である TOP2A の蛋白発現が抑制された（U251 脳腫瘍細胞株、*, P<0.01、図４）。

0si-NC

0.8

si-NC

si-LINC X

図５ LINCX阻害による細胞増殖能への影響③ TUG1 の阻害および LINCX の阻害は共に増殖抑10制に働く

8

脳腫瘍幹細胞（GSC）のマウス皮下移植モデルで0si-LINC X

U251

*

6*

4

TUG1 に対する siRNA 治療が腫瘍縮小に有効である2ことを見出した。さらに今回同定した LNCX に対し0て、siRNA 処理により細胞増殖能が顕著に抑制されることを見出した（MTT アッセイ、*, P<0.01、図５）。

0h24h： si-NC

48h72h： si-LINCX【考察】
がん細胞の幹細胞性の維持機構として重要な Notch シグナルに誘導される TUG1 を同定した。Notch シグナルはがん幹細胞ニッチでの機能が報告されており、その下流で発現調節される TUG1 は周囲環境に応じて細胞の性質を変化させる可能性が高い。特に TUG1 はエピゲノム修飾酵素との相互作用が報告されていることから、今後 TUG1 とエピジェネティック機構との関連につきより詳細に解析を行なう予定である。また今回、膠芽腫の形成に関わる LINCX を同定した。TOP2A は DNA 複製の役割を担い腫瘍形成に関わるタンパク質の一つであるが、LINCX は miR-411-5p の発現調節を介して TOP2A の発現亢進に寄与している可能性が示唆された。
このように次世代のがん治療の標的として lncRNA は有力な候補分子になり得ると考える。適切なドラッグデリバリーシステムと組み合わせることにより、今後脳腫瘍に対する核酸医療の開発に向けた研究を展開する予定である。