中村学園大学・中村学園大学短期大学部研究紀要

第 46 号177

2014

還元型 CoQ10のラット肝における細胞内分布と抗酸化因子としての役割
松

井

美智代

竹

嶋

美夏子

脇

本

麗

原

孝

之

Subcellular Distribution of Reduced Coenzyme Q10 in Rat Liverand Its Role as an Antioxidant
Michiyo Matsui

要

Mikako Takeshima
Rei Wakimoto（2013年11月27日受理）

旨

コエンザイム Q10（CoQ10）はミトコンドリアの電子伝達系の必須成分であり，唯一の内因的に生産された脂質可溶性の酸化防止剤である。
本研究では，酸化型 CoQ10（CoQ10），還元型
CoQ10（CoQ10H）をラットに与え，肝蔵における還元型 CoQ10の細胞内分布動態を調べた。また，
還元型 CoQ10の抗酸化能を評価し，抗酸化因子として CoQ10が細胞内に分配されることを検討した。
ラットは Control 群，CoQ10投与群，CoQ10H 投
与群の３群に分け，CoQ10，CoQ10H をそれぞれ
７日間２g/kg の割合で餌に混ぜて経口投与し，肝細胞のどの分画に取り込まれるか調べた。肝臓の細胞分画の分離の妥当性について各種マーカー酵素活性を指標に評価した。
CoQ10H の含量は Control 群ではミトコンドリ
アに高かったが，核や細胞質などにも分布していた。CoQ10投 与 群 及 び CoQ10H 投 与 群 に お い て
CoQ10H 含量は，Control 群のミトコンドリアや核に比べて1.5～２倍増加しており，Control 群のリソソームに比べて，８倍及び19倍に著しく有意に増加した。
次 に CoQ10H の 抗 酸 化 性 を 確 認 す る た め に
DPPH ラジカル消去活性を調べた。CoQ10に DPPH
ラジカル消去活性はみられなかったが，CoQ10Hには標準物質として用いた Trolox やα - トコフェ
ロールと同等なラジカル消去活性がみられた。その IC50は15μ M で あ り，Trolox（13.5μM），αTakayuki Hara

- トコフェロール（14μ M）とほぼ同等であった。
Control 群，CoQ10投 与 群，CoQ10H 投 与 群 の 肝
臓の Total CoQ10H 濃度は，それぞれ183 nmol/g
liver，364 nmol/g liver，573 nmol/g liver であり，また，卵巣での値はそれぞれ，33.9～109 nmol/g
ovary，204～265 nmol/g ovary，221～258nmol/g ovary であった。いずれも IC50の15μM を上回っていたことから，CoQ10はラットの臓器において，抗酸化性を十分発揮する濃度にまで蓄積，濃縮されていることを示唆するものと考えられる。

目的

1978年に世界で初の体外受精児が誕生した。以来，体外受精による新生児の誕生は，日本でもすでに15万人にのぼっている。生殖補助医療技術の向上は高い妊娠率に結びつき，先端生殖医療技術自体への抵抗感も次第に和らぎ，2009年に日本で誕生した体外受精児の割合は，新生児の40人に１人にまでなっている。しかし今日における女性の社会進
出は著しい晩婚化を招来し，またキャリア女性の妊娠を許容しにくい社会環境もあり，結果的に今までの不妊治療とは異なる，高齢女性への治療が求められるようになってきた。高齢での妊娠を希望する女
性は増加しているが，加齢に伴い妊娠率は低くなっていく［１］。このことは，加齢に伴う抗酸化能の低下に起因する配偶子の酸化ストレス亢進，つまりミトコンドリアの活性酸素生成が卵子の質と深く関わっていると考えられる［２］。生涯排卵する卵子は別刷請求先：原孝之，中村学園大学大学院 栄養科学研究科，〒814-0198 福岡市城南区別府5-7-1
E-mail：thara@nakamura-u.ac.jp［１］
Forman EJ, Treff NR, Scott RT Jr. Fertility after age 45: From natural conception to assisted reproductive technology
and beyond. Maturitas 70: 216-221 (2011).
［２］
Bentov Y, Esfandiari N, Burstein E, Casper RF. The use of mitochondrial nutrients to improve the outcome ofinfertility treatment in older patients. Fertil Steril 93: 272-275 (2010).

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美智代・竹

嶋

美夏子・脇

胎生期につくられ，その後新たに作られることはな
い。１回目の減数分裂の途中で長期停止した卵母細胞の状態で成熟，排卵までの長期間を体内で生きる
特殊な細胞である。故に卵子は長年酸化ストレスにさらされていることになる。卵子には多くのミトコ
ンドリアが存在しているため，ミトコンドリアの質を保つことが卵子の質，次なる生命の安定，繁栄につながるのではないかと考えられている。
有気呼吸生物の呼吸代謝によって生じる活性酸素
種には H2O2，一重項酸素，スーパーオキシドラジ
カルアニオン，・OH ラジカル，ヒドロペルオキシドなどがあり，いずれも生体膜の傷害，たんぱく質の変性，酵素の失活，リポたんぱく質 LDL の酸化による変性，DNA 複製エラーなど様々な細胞の機能の低下を招く。その積み重ねが老化，ガン化，生活習慣病を引き起こすと考えられている［３］。活性酸素は，ストレス，過食，喫煙，薬物服用，大気汚染などによって増長され，生活習慣病と深く関わっている［４］。活性酸素は細胞内で ATP のエネルギー産生の場であるミトコンドリアにおいて副次的に生成される。
生体内には，活性酸素を消去するいろいろなシステムがある。１つは，カタラーゼ，スーパーオキシ
ドジスムターゼ，グルタチオンペルオキシダーゼなどに代表される酵素たんぱく質である。さらに，グルタチオンなどのペプチド，ビタミンＣなどの水溶性ビタミン，ビタミンＥなどの脂溶性ビタミンなどである。これらは酵素化学反応，あるいは化学反応によって活性酸素を消去する。特に化学物質については抗酸化剤と呼ばれている。最近，野菜や果実に

C59H90O4
Fig.1
［３］

本

麗・原

孝

之

含まれるポリフェノールの抗酸化性が注目されており，野菜や果実の摂取によって，抗酸化性のビタミ
ン補給だけでなく，ポリフェノールの摂取の重要性が指摘されている。しかし，一方でポリフェノールは一般的に脂溶性が低く，極性が比較的高いために，体内に吸収され難いという欠点がある。
コエンザイム Q（CoQ）はキノン骨格部分とイソ
プレノイド側鎖部分から成るベンゾキノン誘導体であり，広く生物界に存在することから「ユビキタスに存在するキノン」，ユビキノンと命名されている。
ユビキノンを２電子還元したヒドロキノン体がユビキノール（Ubiquinol）である。ユビキノンはイ
ソプレノイド側鎖部分が n=1～12の多数の同族体が天然に存在し，ヒトでは，n=10で，ラットでは，n=9が主ある（Fig.1）。CoQ10は分子量が863.34であり，ポリフェノールと比べると脂溶性がかなり高い化合物である。
CoQ10はコレステロールと同様にメバロン酸経由で合成された［４］，ミトコンドリア電子伝達系複合体Ⅱから複合体Ⅲへの電子の伝達を仲介する非タンパク質であり，電子伝達とそれに共役した ATP
産生に必要不可欠である［５］。すべての臓器，細胞に存在し，ミトコンドリア電子伝達系の複合体Ⅰ，
Ⅱと複合体Ⅲ間のキノン（酸化型）とキノール（還元型）の変換を行うことで，電子の受け渡しを行う（Fig. 2）。また，CoQ10は酸化還元成分と唯一の内因的に生産された脂溶性の酸化防止剤としても欠かせないため，すべての細胞内外にユビキタスに存在している［6-8］。CoQ10の還元型である Ubiquinol（Fig. 2）は強い抗酸化作用があり，活性酸素によ分子量863.34

CoQ10の構造式

Birben E, Sahiner UM, Sackesen C, Erzurum S, Kalayci O.Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy
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還元型 CoQ10のラット肝における細胞内分布と抗酸化因子としての役割

Fig.2

CoQ10の酸化型と還元型

る細胞の損傷を防ぐなどの老化防止に効果があるといわれている［９］。体内の CoQ10の60～80％が還元型で存在していることが明らかにされてきた［７］。
CoQ10の還元型である Ubiquinol（CoQ10H）は強い抗酸化作用があり，活性酸素による細胞の損傷を防ぐことにより，生活習慣病予防，免疫系の増強，抗がん作用，老化防止などに効果があると言われている［10］。
還元型の CoQ10H は再酸化されやすく，その安定化は困難であり抗酸化作用について明らかなデー
タが不足していた。例えば CoQ10H の DPPH ラジ
カル消去能について研究した例は1994年の研究の１例だけあり［11］，試薬として CoQ10H の入手が困難であったことが伺える。CoQ10は体内では主として抗酸化力を持つ還元型として存在している［６］。
還元型 CoQ10（CoQ10H）は空気中で簡単に酸化されるため，その製造には安定化技術の開発が不可欠であったが，2006年に株式会社カネカが30年
［７］

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以上の研究を経て CoQ10H のソフトカプセルにおける安定化技術開発に成功した［12］。日本で CoQ10は1974年に心筋代謝改善薬として，2001年からは食品成分としての利用が認可されている。従来のCoQ10は酸化型であった。摂取した後，体内で還元酵素により還元型に変換される。最近の研究で，加齢，病気等の酸化ストレスにより体内での還元能力は低下することが立証された［13,14］。
Takahashi ら［15］ は， ラ ッ ト に お け る CoQ10，
CoQ10H の臓器分布，細胞内分布について詳細に検 討 し て い る。 こ れ に よ れ ば，CoQ10は CoQ9の約1/5存在する。これは，ラットの餌の中に食品
由 来 の CoQ10が 少 な か ら ず 含 ま れ て い る こ と を意味している。肝臓では CoQ9も CoQ10も還元型
が約80％と多く存在する。細胞内における分布では，CoQ10は，ミトコンドリア内外膜に多く含まれる他，核，小胞体，リソソーム，ゴルジ体，細胞膜などすべての生体膜にも存在している。CoQ10

Aberg F, Appelkvist EL, Dallner G, Ernster L. Distribution and redox state of ubiquinones in rat and human tissues.
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180

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美智代・竹

嶋

美夏子・脇

は，これらの膜内で，脂質の過酸化を防ぎ，生体膜の安定性を保つ働きを持つと思われる。また，
Zhang ら［16］ は，酸化型 CoQ10をラットに与えた時の CoQ10の血清濃度，臓器分布，細胞内分布について検討している。これによれば，ラットに酸化型 CoQ10を12μ mol/100g（10.36mg/100g B.W）
体重の割合で８日間与えると，肝臓の CoQ10H は
180 nmol/g liver で，コントロールラットの約８倍増加していた。また，CoQ10は比含量としては，
リソソームに高く，次いでミトコンドリア，核，ミ
クロソームの順で存在した。CoQ10は脂溶性が高く，分子量も大きいので，経口で約40％と吸収が悪いことが知られており，還元型 CoQ10は極性が高まることから，吸収の改善が期待される。事実，
Hosoe ら［17］ はカネカの開発した CoQ10H をヒトに投与した場合，CoQ10を投与した時の血清中の濃度が２～３倍増加することを報告している。しかし，ラットにおける CoQ10H の細胞内分布についての研究は知られていない。CoQ10H の試薬は，１mg が50万円と，研究のハードルは高い。今回
はカネカの特別な支援で還元型 CoQ10供与を受け，還元型 CoQ10（Ubiquinol）をラットに与えた時の肝臓における還元型 CoQ10の細胞内分布動態と抗酸化因子としての役割について研究した。

実験方法

本

麗・原

孝

之

g/kg 添加した飼料を，Control 群には CoQ10を添加しない一般飼料を７日間与えた。ラットをエーテ
ル麻酔下に，大腿動脈より瀉血後，解剖し肝臓を摘出した。また，CoQ10経口投与の作用による卵巣の重量増加という報告がある雌については卵巣を摘出した。
３．肝臓細胞分画
すべての操作は，４℃以下で行った。新鮮な肝臓を氷冷した生理食塩水で灌流し，重量を測定した。
凍結保存用に１g 除いた肝臓に重量の４倍量のホモジナイズ溶液，10mM Tris-HCl（pH 7.5），１mM
EDTA を含む0.25M ショ糖を入れ，ハサミを用いて肝臓を細かく刻んだ後，ガラス－テフロンホモジナ
イザーを用いてホモジナイズした。その後，下記に示す遠心分離の条件で順に遠心分離（2,700rpm
10min，6,500rpm 15min，10,000rpm 20minのそれぞれ２回ずつ，40,000rpm 60min）を行
い，それぞれの遠心分離段階での沈殿を核（Nc）
画 分， ミ ト コ ン ド リ ア（Mt） 画 分， リ ソ ソ ー ム（Ls）画分，ミクロソーム（Ms）画分および上清（Sol）を可溶性画分とした。Sol を除く各画分はホモジナイズ溶液を加え，再びホモジナイズした。それぞれの容量を測定し，サンプルを評価するまで，－80℃で凍結保存した。細胞分画の純度はマー
カー酵素活性を測定することで確認した。

１．試薬
Coenzyme Q10H（CoQ10H）は，（株）カネカよ
り 供 与 さ れ た。CoQ6は Avanti Polar Lipids 社 製，Coenzyme Q10（CoQ10）， α -tocopherol，Trolox
は Calbiochem 社製，1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）は和光純薬製を用いた。NADPH はオリエンタル酵母社製を用いた。CoQ9は Sigma 社製，チトクロームｃは Sigma 社製のウマ心筋の Type Ⅲを用いた。その他の試薬は試薬特級を，メタノー
ル，ヘキサンは HPLC 特級試薬を用いた。

４．ミトコンドリア膜とマトリックスの分離
遠 心 分 離 に よ っ て 得 ら れ た Mt 画 分 ５ml に10mM K-Pi buffer（pH 7.4） ５ml を 加 え て ホ モ ジ
ナ イ ズ し た。30～60sec 超 音 波 破 砕 し， 次 い で
40,000rpm 60min 遠心分離を行い膜画分とマトリックス画分に分離を行った。

２．対象ラット
雌雄の Wistar 系ラット12匹を本研究に用いた。
ラ ッ ト を CoQ10投 与 群 CoQ10H 投 与 群，Control
群の３群に分け，CoQ10，CoQ10H をそれぞれ２

６．卵巣
ラ ッ ト の 卵 巣 ６ 例（0.106g ±0.021） は20
mg/ml となるように蒸留水を加え組織を破砕し，CoQ10の抽出に用いた。

［16］

５．血清の分離
血液が凝固した後，3000rpm
し，血清を採取した。

10min 遠心分離

Zhang Y, Aberg F, Appelkvist EL, Dallner G, Ernster L. Uptake of dietary coenzyme Q supplement is limited in rats. J
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［17］
Hosoe K, Kitano M, Kishida H, Kubo H, Fujii K, Kitahara M. Study on safety and bioavailability of ubiquinol (Kaneka
QH) after single and 4-week multiple oral administration to healthy volunteers. Regul Toxicol Pharmacol 47: 19-28(2006).

181

還元型 CoQ10のラット肝における細胞内分布と抗酸化因子としての役割

７．組織中の CoQ10の抽出方法
12ml の共栓付試験管に Nc，Mt，Ls，Ms の各画分は100mg の重量に相当するように分注し，0.1
M SDS 0.5ml， 内 部 標 準 液 と し て0.1 mM CoQ6
0.02 ml 加えた。ボルテックスミキサーで５秒間攪拌した後，メタノール４ml，n- ヘキサン６ml を加えて振とう機（240rpm/min）で５分間振とうし，抽出を行った。3000 rpm 10min 遠心分離し，ヘキサン層をパスツールピペットで採取し，20ml 試
験管に入れた。残渣に n- ヘキサン６ml を加え，再度振とう抽出し，遠心分離を行った。ヘキサン層を試験管に加え窒素ガス気流下で乾燥させた。Sol，血清，卵巣組織浮遊液は１ml を抽出に用いた。
８．HPLC による定量
Waters 社 製 の M600の HPLC 装 置 に 島 津 ShimPack CLC-ODS（M）カラム（4.6mmx250mm）を接 続 し， 移 動 相 と し て メ タ ノ ー ル： ヘ キ サ ン ＝
88：12，流速１ml/min で分析時間を40min とした。 検 出 は275nm で 行 っ た。 上 記 の 乾 燥 さ せ た
試験管に，移動相の溶媒を200μ l を加え，ボル
テックスミキサーで数秒間攪拌し，HPLC で50μl を分析した。各ピーク面積を求め，CoQ10及びCoQ10H 濃度をそれぞれの標準物質との比較から算出した。
９．酵素活性Nc，Mt，Ls，Ms，ならびに Sol のマーカーとして，それぞれ DNA，コハク酸－チトクロムｃレダ
クターゼ，酸性ホスファターゼ，NADPH- チトクロ
ムｃレダクターゼ，乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）
を Fleischer と Kervina の方法で測定した［18］Table 1［18］

統計解析
本研究で得られた結果は平均値±標準偏差（SD）で表した。Student の t-test により，有意差検定を行った。有意水準を５％とした。

結果

１．ラットの体重変化と CoQ10摂取量
Table1にラット体重の変化とラット１匹あたりの CoQ10摂 取 量 を 示 し た。Control 群，CoQ10H
投 与 群，CoQ10投 与 群 の ラ ッ ト の 体 重 に 差 は み
ら れ な か っ た（215±36g，242±47g，250±49g）。 ま た， 摂 取 し た 試 料 量 に も CoQ10H 投 与
群，CoQ10投与群に有意差は見られなかった（130±37g，130±42g）。摂取した飼料量より計算した CoQ10H 量，CoQ10量 も そ れ ぞ れ0.26±0.1g，0.26±0.1g と差はみられなかった。投与された総Control 群
（n=4）

還元型群
（n=4）

酸化型群
（n=4）

前

――――

205±35207±34

後215±36242±47250±49――――130±37130±42

還元型――――

0.26±0.1

――――

酸化型

――――

――――

0.26±0.1

飼料量（g）
摂取 CoQ10量（g）

11．DPPH ラジカル消去活性の測定
１mM CoQ10H を0.01，0.02，0.04，0.08，0.1
ml に メ タ ノ ー ル を 加 え て １ ml と し，0.08mM
DPPH を３ml 加え，ボルテックスミキサーで10秒撹拌し，室温・暗所で30分放置したのち，515nm（DPPH ラジカル）の吸光度を測定した。Trolox を標準試薬として用いた。α - トコフェロールについても同様に測定した。

ラット１匹あたりの CoQ10摂取量と体重の変化

Group
体重（g）

10．たんぱく質の定量
た ん ぱ く 質 の 定 量 は Bradford 法［19］ に 従 っ て行った。標準タンパク質としては，BSA（Bovine
serum albumin）を用いた。

Fleischer S, Kervina M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods Enzymol 31: 6-40 (1974).
Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing theprinciple of protein-dye binding, Anal Biochem 72: 248-254 (1976).

［19］

182

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美智代・竹

Fig.3

嶋

美夏子・脇

本

麗・原

孝

之

HPLC による CoQ10のクロマトグラム

CoQ10H 量，総 CoQ10量は，およそ1g/kg 体重であると算出された。
２．HPLC による CoQ10の定量
Fig. 3に CoQ10のクロマトグラムを示した。内部 標 準 の CoQ6は 保 持 時 間 ８min に 検 出 さ れ た。
CoQ10H，CoQ9，CoQ10は， そ れ ぞ れ18.0min，
23.0min，33.0min に検出された。
３．血清 CoQ10の定量
CoQ10投与後の血清中の CoQ10を上記の HPLC法により定量した。CoQ10投与群，CoQ10H 投与
群，Control 群のラット血清の CoQ10濃度は非常に低く，CoQ10H 群で２例検出できないものがあった（Table 2）。
４．肝臓の細胞分画とマーカー酵素の分布
Fig. 4に，細胞分画した肝臓の Nc，Mt，Ls，Ms，
Sol の各マーカー酵素の測定結果を示した。Nc はDNA，Mt は，コハク酸－チトクロムｃレダクター
ゼ，Ls は，酸性ホスファターゼ，Ms は，NADPHチトクロムｃレダクターゼ，Sol は LDH により調べた。いずれの分画も，マーカーの比含量あるいは比Table 2ラット血清中の CoQ10濃度

Group

Total CoQ10nnmol/ml

Control 群

40.37±0.27

CoQ10投与群

40.54±0.20

CoQ10H 投与群

20.27～0.47

活性が明らかに高く，それぞれのオルガネラの分離が良好であることがわかった。また，たんぱく質の比率も，Sol 24％，Mt 15％，Ls ６％，Ms 10％，
Sol 45％と最適な割合であった。
５．肝臓の各分画における CoQ10の定量
Table 3に CoQ10投 与 群，CoQ10H 投 与 群，
Control 群のラット肝臓の CoQ10の定量結果を示した。データに示していないが，Control 群の雌雄
ラットの肝臓の総 CoQ10含量に差がみられなかったので，今回のデータは雌雄ラットを一緒にしてデータをまとめた Zhang ら［12］ の結果と同じく，
CoQ10H の比率は CoQ10に比べて明らかに高かった。Table 4に示すように，Control 群のラット肝臓

還元型 CoQ10のラット肝における細胞内分布と抗酸化因子としての役割

Fig.4
Table 3183

マーカー酵素の分布

CoQ10投与群別肝中 CoQ10濃度

nmol/g liver

Feeding

総 CoQ10

CoQ10H

CoQ10Control 群200±29183±3417±2.0

CoQ10投与群

545±35a364±42a181±15b

CoQ10H 投与群

849±54a573+63b275±16aa, vs control（p<0.01）
b, vs control（p<0.05）の CoQ10H は Mt と Nc に多く分布しているが，他の分画にも存在した。なお，データには示さない
が Mt を膜画分と可溶性画分に分けて，CoQ10を定量すると，90％以上が膜画分に回収された。しかし，肝臓分画では，生体膜を持たない Sol にも全体の10％以上の CoQ10が含まれていた。また，Ls では，CoQ10投与群で Control 群の約10倍，CoQ10H投与群で Control 群の約19倍の増加がみられた。肝臓 の 総 CoQ10H 含 量 は CoQ10投 与 群 で，Control
群の約2.7倍，CoQ10H 投与群で Control 群の約4.6倍，有意に増加した。
６．各分画の CoQ10の比含量の検討
Fig. 5は，Control 群，CoQ10投 与 群，CoQ10H
投与群の各分画における CoQ10の比含量を比べたものである。比較のために，内因性の CoQ9の比含量も示した。CoQ9の比含量は，Nc，Mt，Ls に高いことがわかった（Fig. 5-2）。CoQ10H 投与群
では，内因性の CoQ9の比含量の低下がみとめられた。CoQ10投与群，CoQ10H 投与群では，リソソームにおける CoQ10と CoQ10H の比含量の著しい増加がみられた。この効果を数値化するために，
CoQ10投与群，CoQ10H 投与群の総 CoQ10のリソソームの比含量をミトコンドリアの比含量との比率にした。Table 5に示すように，CoQ10投与群，CoQ10H 投与群でその比率が有意に増加しており，
特に CoQ10H 投与群でその比率が2.3±0.7と，約８倍増加した。CoQ10のような脂溶性化合物は，小腸で吸収されたのち，カイロミクロン経由でリ
ンパ管へと移行すると推察される。CoQ10投与群，

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井

美智代・竹

嶋

Table 4Fraction

美夏子・脇

麗・原

孝

之

肝臓の各分画別 CoQ10濃度

Control 群（n=4）
CoQ10H本

CoQ10

CoQ10投与群（n=3）
CoQ10H

CoQ10

CoQ10H 投与群（n=3）
CoQ10H

CoQ10

nmol/g liver
Nuclei

65±22
（35％）

1.2±1.1（7％）

118±21b（32％）

38±18d（21％）

146±14a（26％）

51±24d（19％）

Mitochondria

79±12
（43％）

3.0±1.6（18％）

109±42（30％）

57±36d（31％）

199±107（35％）

73±37c（26％）

Lysosome

6.0±8.0（3％）

2.7±3.0（16％）

60±15a
（16％）

40±35
（22％）

111±59b（20％）

70±18c（25％）

Microsome6.0±6.0（3％）

4.3±6.3（25％）

15±8.0
（4％）

18±11
（10％）

30±13b（5％）

44±17d（16％）

Soluble

27±12
（14％）

5.4±6.0
（32％）

62±22
（17％）

28±7.0c（16％）

88±34b（15％）

38±7.0c（14％）

183±3417±2.0364±42a181±15c573±63a275±16c

Total

200±29545±35e849±54e

数値はすべて平均値±標準偏差a, vs control CoQ10H（p<0.01），b; vs control CoQ10H（p<0.05）
c, vs control CoQ10（p<0.01），d; vs control CoQ10（p<0.05）
e, vs control Total CoQ10H（p<0.01）

Fig. 5-2

Fig. 5-1

各細胞分画における CoQ10の比含量

各細胞分画における CoQ9の比含量

185

還元型 CoQ10のラット肝における細胞内分布と抗酸化因子としての役割

Table 5リソソームとミトコンドリアの比含量の比率

Specific Content
Ls/Mt

Control 群（n=4）

CoQ10投与群（n=3）

CoQ10H 投与群
（n=3）

Total

0.3±0.3

1.3±0.1a

2.3±0.7a,b

0.7±0.4

1.2±0.5

1.3±0.6

CoQ10

CoQ9
数値はすべて平均値±標準偏差a, vs control（p<0.01）
b, vs CoQ10（p<0.05）

CoQ10H 投与群で，リソソームの CoQ10の比含量が著しく増加したのは，肝臓への CoQ10の取り込
みに，エンドサイトーシスによる CoQ10の取り込
み，エンドソームへの移行，さらに，リソソームとの融合などの機構が考えられる。
７．CoQ10の抗酸化活性と肝臓における役割
Fig. 6に CoQ10H の DPPH ラ ジ カ ル 消 去 能 を 他の抗酸化剤と比較した。CoQ10H の DPPH ラジカ
ル消去能の IC50は，15μ M であり，Trolox の13.5
μ M，α - トコフェロールの14μ M とぼぼ同じ能力を有していると思われる。肝臓における CoQ10Hの 濃 度 は，Control 群，CoQ10投 与 群，CoQ10H

Fig. 6

投 与 群 で， そ れ ぞ れ183nmol/g liver，364nmol/g liver，573nmol/g liver であり，１g の肝臓を１ml の水と仮定すると，濃度はそれぞれ183μ M，364μ M，573μ M と な り，CoQ10H の DPPH ラ
ジカル消去能の IC50の15μ M よりもはるかに高い数値となる。したがって，ラット肝臓において，CoQ10H は十分な抗酸化性を発揮していることが示唆される。
卵巣の CoQ10についても定量を試みた。
Control 群，CoQ10投与群および CoQ10H 投与群の総 CoQ10は33.9～109 nmol/g ovary，204～265
nmol/g ovary お よ び221～258 nmol/g ovary であった。CoQ10H の IC50＝15μ M よりも高い濃度

CoQ10H および CoQ10の DPPH ラジカル消去活性

186

松

井

美智代・竹

Table 6

嶋

美夏子・脇

本

麗・原

孝

之

卵巣破砕組織より抽出した CoQ10含有量
Control 群（n=2）

CoQ10投与群（n=2）

CoQ10H 投与群（n=2）（nmol/g）
Total CoQ10

33.9～109204～265

221～258

CoQ10H

10.6～99.0

153～173

193～244CoQ9

12.3～18.3

13.4～15.1

13.0～16.1

で存在した（Table 6）。

考察Fig. 3の HPLC ク ロ マ ト グ ラ ム に 示 し た よ うに，CoQ10誘導体の保持時間の差から，脂溶性の順 位 は，CoQ10（33min） ＞ CoQ9（23min） ＞
CoQ10H（18min） ＞ CoQ6（8min） の 順 と な り，
溶出の遅いものが，脂溶性が大きいと仮定される
ので，脂溶性の順位は，CoQ10＞ CoQ9＞ CoQ10H＞ CoQ6となり，CoQ10が還元されると，極性の増加がイソプレン単位１個の欠失よりもはるかに大きいことが示唆された。CoQ10H の極性は，CoQ10に比べてかなり高くなっており，そのバイオアベイ
ラビリティーがかなり高まることが期待された。事実，CoQ10H 投与群の肝臓への CoQ10の総取り込
み 量 は，849nmol/g liver で あ り，Control 群 の 約３倍に有意に増加し，CoQ10投与群（545nmol/g
liver）に比べても有意に高かった。しかし，今回の血清における分析では，CoQ10H 投与群，CoQ10
投与群ともに Control 群と有意な差を見出すことが出来なかった（Table 2）。その原因として，血清に存在する CoQ10が HPLC の定量の検出限界近くであることが考えられた。いずれにせよ，CoQ10が血清にわずかしか存在しないことは興味深いことである。肝臓の CoQ10濃度と血清の濃度との間に1000倍以上の開きがあるのは，おそらく CoQ10を肝臓に積極的に取り込む機構が存在すると考えられる。その１つは，カイロミクロンなどのリポたんぱく質による輸送であろうが，そのような報告は知られていない。
今回の肝細胞分画における CoQ10の定量から，
Control 群では，CoQ10は主にミトコンドリアに分布した。しかし，他の細胞内小器官の核やリソソー
ム，ミクロソームにも存在した。ミトコンドリアの分析から，それらは，外膜と内膜に90％以上が存在していた。おそらく他の小器官についても膜に存在しているものと思われる。また，可溶性の細胞質にも CoQ10の存在がみとめられた。脂溶性のCoQ10が水系の細胞質にどのようにして存在するのか興味深い。おそらく，たんぱく質に結合して存在するものと思われる。
CoQ10H 投 与 群，CoQ10投 与 群 で は， ミ ト コンドリア，核への増加が1.4～2.5倍程度みられたが（Table 4）， リ ソ ソ ー ム に お け る CoQ10H の
増 加 は，CoQ10H 投 与 群 で19倍（111±59nmol/g liver），CoQ10投 与 群 で10倍（60±15nmol/g liver）と有意に増加した。これは，前述したよ
うに，カイロミクロンなどのリポたんぱく質中のCoQ10がエンドサイトーシスによって，肝細胞内のエンドソームに取り込まれ，リソソームと融合して，さらにゴルジ体を経て，ミトコンドリアや核に運ばれることが起きていることを示唆している。
Fig. 7にエンドサイトーシスによるコレステロールの細胞内への取り込みの過程を示した。リポたん
ぱく質のアポたんぱく質が細胞のレセプターと結合し（Fig. 7A）。この時，細胞膜に裏打ちされたクラスリンが細胞膜の内部への陥入の引き金となる（Fig.7B，7C）。内部に取り込まれた小胞はエンド
ソ―ムと呼ばれている（Fig. 7D）。エンドソームからクラスリンが除かれ（Fig. 7E），エンドソームはリソソームと融合し，リソソームの加水分解酵素に
よって脂質の消化が起きる（Fig. 7F）。その後，脂質は，小胞輸送を介して，ゴルジ体へ移行し，小胞体，ミトコンドリア，あるいは核などへと輸送される。今回の Control 群のデータから，CoQ10H は，
最終的には活性酸素を主に発生するミトコンドリア
へ運ばれていくものと考えられるが，今回のデータ
はそのプロセスの途中を捕まえたものと思われる。
CoQ10H の薬理作用として，リソソームやゴルジ体における活性酸素過剰による傷害の疾患などに応用できるのではないかと考えられる。そのような，アイデアの研究はこれまでに知られていない。
今回の研究から，脂溶性の薬物やビタミン類の生体内動態の研究には，in vivo の研究が欠かせないことを痛感させられた。脂溶性の物質は，体内に吸187

還元型 CoQ10のラット肝における細胞内分布と抗酸化因子としての役割

A

B

C

D

E

F

7 エンドサイトーシスのプロセス
Fig.Fig.
7 エンドサイト－シスのプロセス
27

収されたのち，カイロミクロンや VLDL を介して，標的臓器へ運ばれる。最近，培養細胞を用いた研究も多くみられる。CoQ10においても，培養細胞による CoQ10の取り込みの研究がある。Saito ら［20］は，PC12細 胞 に お け る CoQ10及 び CoQ10H の 取
り込みを調べ，いずれもミトコンドリアに取り込まれるとしている。カイロミクロンや VLDL を介さない培養細胞系における取り込みは，あくまでも invitro 実験であることを考慮しなければならない。
今 回， カ ネ カ の CoQ10H を 用 い て，DPPH ラ
ジ カ ル 消 去 能 を， 標 準 物 質 で あ る Trolox や α-tocopherol と比較した。CoQ10には DPPH ラジカ
ル消去能は全くなかったが，CoQ10H には，Trolox
やα -tocopherol に匹敵する消去活性が認められた。 そ の IC50は，15μ M で，Trolox の13.5μM，
α‐トコフェロールの14μ M とぼぼ同じ能力を有していた（Fig. 6）。肝臓における CoQ10H の濃度
は，Control 群，CoQ10群，CoQ10H 群で，それぞれ183nmol/g liver，364 nmol/g liver，573 nmol/g liver であり（Table 4），１g の肝臓を１ml の水と仮定すると，濃度はそれぞれ183μ M，364μM，［20］

573μ M となり，CoQ10H の DPPH ラジカル消去
能の IC50の15μ M よりもはるかに大きい数値となる。したがって，ラット肝臓において，CoQ10H は十分な抗酸化性を発揮していることが示唆された。
何故，肝臓には，このように高濃度の CoQ10H が含まれているのか？今回の実験に用いた DPPH ラ
ジカルの濃度は60μ M である。肝臓には，もっと高濃度の活性酸素が存在するのかもしれない。事実，マロンジアルデヒドのラット肝臓における濃度 は， ６nmol/mg protein で あ り， 肝 臓 g あ た りにするとおよそ600nmol/g liver となる［21］。今回，Control 群においても，肝臓に CoQ10H が高濃度に存在するという結果は，肝臓における高濃度の活性酸素の発生のために存在が必要不可欠のものかもしれない。
最後に，CoQ10H の抗酸化剤としての有用性について議論したい。抗酸化剤には，水溶性のビタミ
ン C，やや脂溶性のポリフェノール，そして脂溶性の CoQ10やビタミンＥ（α - トコフェロール）などがある。ビタミンＣは，過酸化脂質のような脂溶性の物質とは反応しにくいし，生体膜で発生する活性Saito Y, Fukuhara A, Nishio K, Hayakawa M, Ogawa Y, Sakamoto H, Fujii K, Yoshida Y, Niki E. Characterization ofcellular uptake and distribution of coenzyme Q10 and vitamin E in PC12 cells. J Nutr Biochem 20: 350-357 (2009).
［21］
Babitha S, Banji D, Banji OJ. Antioxidant and hepatoprotective effects of flower extract of Millingtonia hortensis Linn.
on carbon tetrachloride induced hepatotoxicity. J Pharm Bioallied Sci 4: 307-312 (2012).

188

松

井

美智代・竹

嶋

美夏子・脇

本

麗・原

孝

之

酸素の消去には働きにくいと思われる。一方，食物から摂取するやや脂溶性のポリフェノールは吸収が悪く，抗酸化性を体内で十分に発揮しているのか？疑問が持たれている。Chen ら［22］ は，ラットにエピガロカテキンガレート，エピガロカテキ
ン，エピカテキンを25mg/kg 静脈注射して，その臓器濃度を測定している。投与後１時間でほとんどが肝臓から消失しており，その濃度は0.5μ g/g
liver 以下であると報告している。その濃度は，およそ２nmol/g liver となり，上記の DPPH ラジカル
消去能を発揮するには不足であることがわかる。次に，ビタミンＥについて，Ibrahim ら［23］は，ビタミンＥと CoQ10の同時投与で，肝臓のビタミンＥ，
CoQ10が最高3000nmol/g liver まで蓄積されること示している。ビタミンＥはヒトでは一日摂取の上限が600～800mg とされており［24］，CoQ10は一日
1200mg を与えても安全であることが知られている［25］。従って，CoQ10は安全な抗酸化剤であり，CoQ10H は吸収性が高まることから，最も推奨されうる抗酸化剤であると言えよう。卵巣においても，CoQ10H は本実験の DPPH ラジカル消去能のIC50を発揮する濃度を上回るほど高濃度に存在していることが本実験から示された。従って，CoQ10H
は卵巣機能の維持に安全かつ確実な抗酸化剤であると思われる。

謝辞

本稿は，平成24年度中村学園大学大学院に提出した修士論文の一部を加筆・修正したものである。
なお本研究の一部は，平成25年度日本生化学会九州支部会において報告された。本研究を遂行するにあたり，還元型コエンザイム Q10をご提供いただ
きました，株式会社カネカの藤井健志氏に深謝しま
す。

［22］

Chen L, Lee MJ, Li H, Yang CS. Absorption, distribution, elimination of tea polyphenols in rats. Drug Metab Dispos
25: 1045-1050 (1997).
［23］
Ibrahim WH, Bhagavan HN, Chopra RK, Chow CK. Dietary coenzyme Q10 and vitamin E alter the status of thesecompounds in rat tissues and mitochondria. J Nutr 130: 2343-2348 (2000).
［24］
Meydani SN, Meydani M, Blumberg JB, Leka LS, Pedrosa M, Diamond R, Schaefer EJ. Assessment of the safety ofsupplementation with different amounts of vitamin E in healthy older adults. Am J Clin Nutr 68: 311-318 (1998).
［25］
Ikematsu H, Nakamura K, Harashima S, Fujii K, Fukutomi N. Safety assessment of coenzyme Q10 (Kaneka Q10) in
healthy subjects: a double-blind, randomized, placebo-controlled trial. Regul Toxicol Pharmacol 44: 212-218 (2006).