博 士（ 生命 科 学） 増田智也
学 位 論 文 題 名

細胞内動態制御による遺伝子ナノキャリアの機能性亢進と肝臓を標的とした遺伝子デリバリーへの応用
学位論 文内容の要旨
序章
効率的な遺伝子キャリアを開発するためには、遺伝子を導入してから発現するまでの、細胞内取り込み、エンドソーム脱出、核移行、転写、翻訳といった様々な細胞内動態素過程を効率よく進むことのできる遺伝子キャリアを設計することが非常に重要であると考えられる。当研究室では、これまでに遺伝子キャリアとして多機能性エンベロープ型ナノ構造 体(MEND)の開 発に 取り 組んで きた。M
ENDはポリカチオンにより凝縮化されたプラスミドDNAやsiR
NAなどの機能性核酸を脂質二重膜が覆う構造をしており、脂質膜を介し て様 々な 機能 性素 子を 修飾す る事や、トポロジーを制御することが可能である。
本研 究で は、 機能 性素 子をMENDに修飾し、細胞内動態を改善することでME
NDの機能性 亢進を試みた。また、MENDを用いた面wvo＾の遺伝子デリバリーシステムの構築を試みたので、以下に報告する。
【結果および考察】
1．糖修飾MEN
Dを用いた遺伝子Q
擡整短性促進非ウイルスベクターにおける遺伝子導入効率の低さの大きな原因のーっとして、外来遺伝子の核移行性が極めて低いことが挙げられ、生体内の90％以上を占めている非分裂細胞を対象とした遺伝子送達において核膜は非常に大きな障壁となっている。この障壁を突破するための戦略として、核移行性シグナル(NLS)を遺伝子キャリアに修飾する方法が有用であると考えられる。本研究では、新規核移行性シグナルとして注目されている糖に着目した。糖修飾脂質(Sugar‑CholesteroDを合成し、MEND脂質膜への糖修飾を行うとともに、分裂細胞および非分裂細胞のモデルとして、ヒドロキシ尿素により細胞周期を同調した細胞を用いて糖修飾M
ENDの機能評価を行った。
ル′シフェラーゼ遺伝子をコードしたプラスミドDN
Aを塩基性タンパク質であるプロタミンで凝縮化したのち、膜融合性脂質であるDOP
E、膜安定化脂質であるCholesterol
およびSugar‑Cholesterol、さらにはりソソームによる分解からの回避が可能な経路であるマク
ロピノサイトーシスを誘起するためのステアリル化アルギニン8重合体(STR‑R8)から構成される脂質膜に封入することで 調製したMENDを用いて遺伝子を導入した。遺伝子導入6時間後の遺伝子発現活性を評価した結果、分裂細胞、同調細胞の両方において、糖の種類
お よ び 修 飾 密度 に 依 存 し た 遺 伝 子 発 現 の 有意 な 上 昇 が 認 め ら れ た 。
次に、その遺伝子発現の上昇が糖修飾による遺伝子の核移行性上昇によるかどうかを調べる た めに、MENDを用いて遺伝子導 入した細胞を回収後の細胞内プラスミドDN
A量および核内プラスミドDNA量をReal‑time PC
R法にて測定した結果、糖修飾による遺伝子の核移行量の有意な上昇が認められた。ー方、糖修飾により細胞内取り込み量はほとんど変化しなかったことから、糖により遺伝子の核移行過程が促進されたことが示唆された。
また 、 螢光標識したプラスミドDN
Aを用いて糖修飾ME
NDの細胞内 動態を共焦点レ←ザー顕微鏡で解析することで、個々の細胞の核内に局在するプラスミドDNA量を評価した。
取得した画像を基に核移行量を定量的に評価した結果、遺伝子定量の結果と同様に、糖修飾により遺伝子の核移行性が上昇することが示唆された。
以上の結果より、核移行性素子としての糖の有用性が示唆されるとともに、遺伝子の核移 行性 の促進 が、 高い遺 伝子 発現に っな がるこ とが 示唆された。
2． Tetraethyleneglycol箜 飽 に よ る 遺 伝 壬 主 iリ ア の 塑 二 ： 陸 ： 機 能 性 向 上本研 究では、水溶性ポリマーであるTetraethyleneglycol(TEG)
をME
N
Dの脂質膜に修飾 する こと で 、MENDの サイ ズ制 御お よび 均一 化を 試みた。まず、TEGをMENDに修飾するために、TE
GのCholesterol
誘導体を用いた。DOPE、Cholesterol、TE
GーCholesterol、
STR‑R8を基本脂質組成として、TEG‑Cholesterol
を異なる密度（0％、20％、40％）で含有する脂 質フイルムを調製し、単純水和法にてDNAコア粒子を封入することによりMENDを調製 した。TEGをME
NDの脂質膜に 修飾したところ、修飾密度に依存して粒子サイズが減少し、また粒子の均一性の上昇も認められ、TEG修飾による小さくかっ均一性を有する粒子 の形成が確認された。また、これらのME
NDを用いてHeLa細胞に遺伝子導入を行ったと ころ、TEG含量に依存して遺 伝子発現が大きく上昇した。TE
G‑ME
NDの細胞内動態を解析し、この活性上昇を詳細に調べたところ、細胞内取り込み量および核内での転写効率の上昇が明らかとなり、これらの過程の促進により遺伝子発現効率が上昇したことが示唆された。
以上 の結果より、TEGは、粒子のサイズ制御や均一化に有用であるだけでなく、ME
NDの細胞内動態を改善し、遺伝子発現を促進する点からも、非常に有用な素子であることが明らかとなった。
！：8
王臓墾擾的と］ 童遣伝壬遣達2
ステム旦盟登肝臓は生体の維持に必要な多岐にわたる生理機能を営んでおり、肝硬変やC型肝炎など、従来の薬物治療では根治の困難な様々な疾患に対して、遺伝子治療は極めて有用な治療法となると考えられる。これまでに、肝臓を標的とした遺伝子送達研究は数多く行われていた。しかし、遺伝子キャリアを静脈内投与した場合、肝臓への送達は確認できるが、肝臓における遺伝子発現が低いことが問題であり、実用化に至るような遺伝子キャリアは皆無である。この原因として、肝臓における細胞内動態に問題があると考え、細胞内動態の改善の観点から肝臓において効率的な遺伝子発現を可能とする遺伝子送達システムの開発を試みた。マウスに尾静脈投与した後、肝臓におけるルシフェラーゼ活性を測定する事で遺伝子発 現を評価した。まず肝臓への遺伝子送達に適したM
EN
Dの基本脂質組成を検討した
ところ、カチオン性脂質(DO′rAP、DOTM
心とC
holes
ter01から構成される脂質組成が適している ことが示唆された。次に、MEN
Dに機能性素子を修飾し、細胞内動態の改善を試み
たとこ ろ、エンドソーム脱出促進素子であるGAII
Aおよぴ核移行性促進素子である糖（Maltotriose）の修飾により遺伝子発現活性が大きく上昇した。また、MENDの肝臓移行量を測定し、移行量あたりの発現活性を評価した結果、機能性素子の修飾により発現活性が上 昇す るこ と が明 らか になり、機能性素子によ る細胞内動態の改善が示唆された。
また、別の新たなアプローチとして、生体適合性を有するMPC
ポリマーを用いた肝臓マクロフ ァージによる認識からの回避戦略を試みた。その結果、 MENDにMPCおよびGALAを修飾 することで遺伝子発現活性が大きく向上した。また、MP
C／GAI」AMEN
Dによる遺伝子発現レベルは市販の血vivo遺伝子導入試薬G
nvivojetP
EI．GaDと比較してはるかに優れたものであった。また、血清虹』T値を測定し肝毒性を評価した結果、mviv
ojet
PEI・Galにおい ては基準値を超える値を示したのに対して、MEND
においては未投与の正常マウスと同等 であった。したがって、本研究において構築したMENDは肝臓において高効率かつ低毒性な遺伝子キャリアであることが示唆された。
【まとめ】
1．遺伝子の核移行性を促進する機能性素子として糖を見出し、遺伝子の核移行性の促進効果により遺伝子発現活性が上昇することが示唆された。
2． TEGをMENDの脂質膜に修飾することで、小さくかつ均一性の高い粒子設計を可能にす る と と も に 、 細胞 内 動 態 の 改 善 に 有 用 で ある こ とが示 唆さ れた 。
3．機能性素子をM
ENDの脂質膜に修飾することで、細胞内動態を改善し、肝臓における遺伝子発現活性を飛躍的に上昇させることに成功した。

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学 位論文審査の要旨
主査 教授 原島秀吉
副査 教授 松田 彰
副査 准教授 紙谷浩之
副査 准教授 南川典昭

学 位 論 文 題 名

細胞内動態制御による遺伝子ナノキャリアの機能性亢進と肝臓を標的とした遺伝子デリバリーへの応用
効率的な遺 伝子キャリ アを開発す るためには 、遺伝子を 導入してから発現するまでの 様々な細胞 内動態素過 程を効率よ く進むこと のできるキャリアの設計が非常に 重要である と考えられ る。
本 論文 は 、 機能 性 素子 で 多機 能 性エ ン ベロ ー プ型ナ ノ構造体（ 以下、MENDと略 ） を機 能 修飾 し 、細 胞 内 動態 を 改善 す るこ とで M
ENDの機能性亢 進を行なった 。 さら に 、MENDの 機 能を 拡 張し 、 わガ vo遺伝 子送達シス テムの構築 に成功した。
第 一章 で は 、外 来 遺伝 子 の核 移 行性 促 進を 目 指して 、糖修飾ME
NDの開 発を行った。非 ウイルス性 遺伝子キャ リアの遺伝 子導入効率 が低い原因のーっとして、外来遺 伝子の核移 行性が極め て低いこと が挙げられ る。この障壁を突破する戦 略 とし て 、核 移行 性シグナル (NLS)を遺伝 子キャリア に修飾する 方法が有用であると 考え、本研 究では、新 規NLSで ある糖に着 目した。糖 のcholesterol
誘導 体 を用 い るこ と で、 MENDの 糖修 飾 を行 っ た。 分裂細 胞、および 非分裂細胞のモデル としてヒド ロキシ尿素 により細胞 周期を同調 した細胞を用いて、糖修飾 ME
NDの 機能 評 価を 行 った 。 まず 、 遺伝 子 導入 効率を 評価した結 果、分裂細胞 、 同調 細 胞の 両 方に お い て、 ME
NDの糖 修 飾に より遺 伝子導入効 率が有意に上 昇 する こ とが 明 らか に な った 。 次に 、 糖修 飾MENDの 細胞内動態 を解析した結 果 、MENDを 糖 修飾 す るこ と によ り 遺伝 子 の核 移行性 が有意に上 昇することが示され た。以上の 結果より、 核移行性素 子としての 糖の有用性を示すと共に、遺伝子 の核移行性 の促進が高 い遺伝子導 入効率にっ ながることを明らかとした。
第 二 章で は 、水 溶 性ポ リ マー で あ るtet
raethyleneg
lycol (TEG)で MENDを修 飾 す る こ と で 、 MENDの サ イ ズ 制 御 お よび 均 ー化 を 試み た 。ま ず 、 MENDをTEGで 修 飾 す る た め に 、 TEGの cholesterol誘 導 体 を 用 い た 。 TEGで MENDを修飾したところ、サイズが小さくかつ均一性を有する粒子の形成を確認した。
そ れ に 加 えて 、 T
EG修飾 MEN
Dを 用い て H
eLa細胞 に 遺伝 子 導入 を 行っ た 結果 、ー 1372―

TEG含 量 に 依 存 し て 遺 伝 子 発 現 が 大 き く 上 昇 し た 。 さ ら に 、 TEG‑MENDの 細胞内動態を 解析し、こ の活性上昇 機構を詳細 に調べたと ころ、細胞 内取り込み効率 およ び 核内 転写 効 率の 上昇 に 起因 する ことが明らかとな った。
第三章およ び第四章で は、肝臓へ の遺伝子送 達システム の確立を目 指し、むぬレロ遺伝 子送達用ME
NDの 開発に取り 組んだ。肝 臓疾患に対 する遺伝子 治療は極めて有用 な治療法に なると考え られる。し かしながら 、遺伝子キ ャリアを静脈内投与し た場合に、 肝臓におけ る遺伝子発 現は極めて 低いのが現 状である。
この原因と して、肝臓 常在性マク ロファージ による貪食 や、肝実質 細胞による分解が考え られる。従 って、従来 の遺伝子キ ャリアは標 的部位であ る実質細胞核への送達 能カに乏し しゝものと 考えられる 。
第三章では 、．肝実質細胞における細胞内動態に問題があると考え、肝臓で効率的 な 遺伝 子 発現 を 可能 と する MEN
Dの 開発 を 試み た 。ま ず 、肝臓へ の遺伝子
送 達 に 適 し た MEN
Dの 基本 脂 質組 成 を検 討 し、 カ チオ ン 性 脂質 と cholesterolから 構 成さ れ る脂 質 組成 が 適し て い るこ と を見 出 した 。 次に 、MEN
Dに機能性素子を修飾 し、細胞内 動態の改善 を試みた結 果、エンド ソーム脱出 素子である
G
ALAおよ び 核移 行 性素 子 であ る 糖（ maltotriose)の修 飾 によ り遺伝子導 入効率を大きく 上昇させる ことに成功 した。
第四章では 、肝臓マク 口ファージ による認識 回避を目指 して、生体 適合性を有 す る MPCポ リ マ ー を 用 い た 戦 略 を 検 証 し た 。 そ の 結 果 、 MENDに MPCお よびGAL
Aを 修 飾す る こと で 遺伝 子 導入 効 率が 大 きく 向 上す る ことに成 功した。
第四 章 後半 で は、 本 研究 で 開発 さ れ たMENDの 遺伝 子 導入 効 率および 肝傷害を評価するこ とで遺伝子キャリアとしての有効性および安全性の両面を評価した。
その結果、 市販の遺伝子導入試薬を含む他のわぬvo
遺伝子キャリアと比較して、MENDは 高 効 率 か つ 低 毒 性 な 遺 伝 子 キ ャ ル ア で あ る こ と が 示 さ れ た 。
以上、著者 は、多機能 性エンベ口 ープ型ナノ 構造体(MEND)を細胞 内動態の観点か ら 、エ ン ドソ ー ム脱 出 、核移 行という2大パリ アーを突破 する革新的 技術の開 発 に成 功 した 。 本研 究 は、 遺 伝 子治 療 や再 生 医療 な ど21
世紀 にその実現が期 待 され てい る 革新 的 医療 の 実現 に 大きく貢 献するものと 確信する。
よって、著 者は、北海 道大学博士 （生命科学 ）の学位を 授与される 資格あるものと認め る。

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