2021/7/29 ⽂献セミナー質問回答 M2 藤吉
ASO の医薬品応⽤関連• LNP などの DDS は⽤いないのか？
セミナー中では、そのまま⽤いると答えましたが、DDS として siRNA と同様にbioconjugation と LNP を⽤いた⼿法が⽤いられているようです。個々の詳細は省きます
が、以下に⽰すようなものが⽤いられているようです。(T. Roverts et al., Snat. Rev. Drug.
Discov., 2020, 19, 673)

• RP, SP のどちらが良いか予測できる？
ASO のメカニズムに関してかなり詳細を省いた説明をしてしまったのですが、ASO のメカニズムの⼀つとして、ASO が標的 mRNA と結合し heteroduplex を形成することで
RNase H1 による mRNA の分解を引き起こすものがあります。この RNase H1 は「配列(塩基の種類)に寄らず」様々な ASO と mRNA の組み合わせの heteroduplex を認識するため、その認識部位の⽴体構造でリン酸ジエステルの P–O と相互作⽤する部位はある程度予測できます。そのため、より⼀般的な ASO におけるチオリン酸ジエステルの⽴体を考える上で、今回取り上げた Mipomersen で⽴体を変えた部分に対応する部分の⽴体を変えることが第⼀候補となるではないかと思います。
(T. Roverts et al., Snat. Rev. Drug. Discov., 2020, 19, 673., N. Iwamoto et al., Nat. Biotechnol.,
2017, 35, 845)

チオリン酸の性質関連• チオリン酸の S–S 結合はできないのか？
チオリン酸とチオール間(Miyamoto and Yamamoto Agr. Biol. Chem. 1980, 44, 2581.)やチオホスフィン酸間(Ueki, et al. Tetrahedron Letters 1986, 27, 4181.)との S–S 結合の例はありましたが、チオリン酸間での S–S 結合についての知⾒は⾒つけられませんでした。⾒つけられなかったのが、単純に調べられていないのか形成されないからかはわかりません
が、かなり電⼦引っ張られてるので、チオ酸より酸化されにくいような気もします。
• リンの不⻫はどのように決めているのか？
⽣成物であるチオリン酸ジエステルのリンの⽴体は UPLC での retention time で⽐較していました。原料と中間体に対応する 3’を azide に変換したチミン-P(V)に関しては、
X 線結晶構造解析で⽴体を同定しています。（Science, 2018, 361, 1234）• チオリン酸のプロトン化状態と⼆重結合は SH+P=O? or OH+P=S?
これは⾊々調べましたが、核酸のチオリン酸ジエステルのプロトン化状態と結合次数に関しての情報はわかりませんでした。下の 3, 4, 5 の様な cyclic なチオリン酸ジエステ
ルのモノアニオン種の場合、ammonium salt の結晶構造から endo の P-S, P-O の結合次数はそれぞれ 1.5 で電荷の局在は同じであると⽰されていました。ただ、14 の ADPanalogue では P=O と S–を持ったような構造が確からしいです。また、カウンターカチオンの種類によっても電荷の局在が変わるらしいです。もう少し調べて⾒て何かわかったら情報を共有させていただきます。(Science 1985, 228, 541)

チオリン酸化反応関連• Stec らの例ではなぜ⼤量合成が難しいのか？
Baran らの主張として、カップリング効率が低いこと、試薬のジアステレオマーでの精製が難しいこと、労⼒がかかることを⼤量合成に応⽤するには難しい点としてあげていました。元の Stec らの論⽂では、dodecamer の合成では、予測としてカップリングが 90%で進⾏するものの、ジアステレオマーを 95%の purity で⽤いると 0.9011×0.9511 =0.31 × 0.57 = 0.18 18%と⽬的のジアステレオマーの収率が⾮常に低くなってしまいます。Baran らの⽅法は、カップリング効率そのものについては Stec らの報告と⼤差ありませんが、試薬のジアステレオマーの単離しやすさという点で優れていると思われます。Stec らの報告では、ラボスケールではジアステレオマーの分離が可能ではあります
が、⼯業スケールとなると試薬のジアステレオマーの分離が難しく、95%収率が限界となると思われます。⼀⽅、Baran らのψ reagent は⼊⼿容易なキラル源を⽤い、⾮常に⾼いジアステレオ選択性で試薬の調製が可能です。カップリング段階でのジアステレオ選択性だけでなく、試薬そのものの調製という点でも今回の報告は評価されているのではないかと思います。ただ、やはりカップリングの収率が低いところは今後の課題だと思います。
•Stereoselectivity の計算に関して TSXP-O(緑)が TSSN(P)2(⻘)よりエネルギーが低くなるのはなぜか？また、TSnP-S(桃)が TSnP-O(⻩⾊)よりエネルギーが低くなるのはなぜか？

前者に関して、Uchimaru らの報告では直接⽐較はしておらず、その理由も⾔及されていませんでした。apicophilicity について⽐較をすると、axial に S が equatrial に O が配置される⽅が、axial に O が equatrial に S が配置されるよりエネルギー的に不利なのだと思われます。詳しい説明の前に、電気陰性な配位⼦が apical に配位しやすい
apicophilicity について簡単に説明します。

TBP におけるリンは最外殻に 10 電⼦を共有しています。これは、equatrial ⽅向の sp2混成軌道を使ったσ結合で 6 電⼦、axial ⽅向の p 軌道を使った 3 中⼼ 4 電⼦の結合によって形成されています。この axial ⽅向はリンの p 軌道と配位⼦の 2 つの軌道の混成によって形成され、結合性、⾮結合性、反結合性の 3 つに分かれ、結合性、⾮結合性軌道に電⼦が収容されます。そして、HOMO は⾮結合性軌道となり、HOMO の電⼦はapical 配位⼦に局在することとなります。そのため、電気陰性度の⾼い配位⼦が apicalに配置されることでその負電荷を安定化することができ、⾼い apicophilicity を⽰します。(C. R. Chimie 2010, 13, 1249)

さて、ここで TSXP-O(緑)が TSSN(P)2(⻘) よりエネルギーが低くなる理由に戻ります。TBPにおいて HOMO は、MeOH 由来の酸素と TSXP-O(緑)では環の酸素、TSSN(P)2(⻘)では環の硫⻩に局在します。この時、O より S の⽅がその HOMO が⾼くなってしまい、S が apicalにくると脱離が⾮常に起きやすい不安定な状態となります。そのため、path C では TBP中間体を経由せず、apical からの S の脱離が MeOH の付加と同時に起こってしまい、TSXP-O(緑)より TSSN(P)2(⻘)のエネルギーが⾼くなっているのではないかと考えています。
この apicophilicity の議論は TSnP-S(桃)と TSnP-O(⻩⾊)の⽐較でも重要となってきます。
TBP 中間体に関して apical から付加して脱離するという Westheimer 則によれば、本来path A は ITBPA を経由する必要があります。しかし、ITBPA は上記の議論で S が apical に配置される⾮常に不安定な TBP となります。そのため、ITBPA は中間体として存在しえません。TBP 中間体は形成できないものの、擬回転は配位⼦によらず結合の bending によって起こるため、擬回転の遷移状態は取ることができます。その擬回転において、P–S 結合は axial になろうとしますが、先ほどの議論の通り P–S 結合は⾼い HOMO を持つ⾮結合性軌道に変化していきます。そのため、P–S の結合⻑が⼤きくなり結合を保てず、P–S 結合の切断にいたってしまいます。TSnP-O(⻩⾊)は apicophilicity の⼤きい酸素配位⼦のTBP 中間体からの脱離の遷移状態であるのに対し、TSnP-O(⻩⾊)は⼀般にエネルギー障壁の⼩さい擬回転の遷移状態で脱離が進⾏してしまうためこのようなエネルギー差が⽣じていると述べられています。このような TBP 中間体からの脱離過程は 1960 年代に提唱された Westheimer 則に沿っていないものではありますが、その後の他の研究でも擬回転の過程で TBP 中間体の脱離が起きうるという計算結果も出ているようです。
また、リンに結合する配位⼦の超共役が四⾯体リン酸の付加や TBP 中間体の脱離、擬回転に⼤きな影響を与えるらしいので、この超共役も今回の話に関係あると思いますが、現在勉強中です。
• DBU は⼀般的なアルコールの activator となるか？
現在 DBU と alcohol の組み合わせが良いのかどうか調査中ですが、以下にdinucleotide 合成でのカップリングにおける塩基の 31P NMR でのスクリーニング結果を載せました。この結果を⾒る限り、pKa の⾼い DBU と TMG (tetramethylguanidine)で反応が進⾏していることから、DBU だからというより alcohol の脱プロトンがギリギリできる塩基だからという説明の⽅が良いような気が個⼈的にはしています。おそらく完全⽔中だと DBU や TMG は容易にプロトン化し、alcohol を脱プロトン化できるほどの pKaは出せないはずです。そのため、Serine selective bioconjugation では DMF:H2O = 4:1 と有機溶媒増し増しの条件でしか alcohol を活性化できず、完全⽔中ではできなかったのではないかと考えています。逆に⾔えば、alcohol を適切に活性化できれば(ここが⼀番難しい)⽔中でもこのψ reagent はうまく機能するのではないかと思います。