博士 （生 命科 学）石塚太一
学 位 論 文 題 名

肺血管内皮細胞標的型核酸デリバリーシステムの構築
学位論文内容の要旨【背景】
近年、従来の薬物治療法では根治が困難な疾患に対する次世代の医薬品として核酸が注目され、実用化に向けた研究が活発に行われている。核酸単独を静脈内投与した場合、血中で速やかに分解・代謝されてしまうことから、核酸を医薬品として実用化するためには、デリパリーシステムの開発が必要となる。これまでに、癌組織や肝臓など特殊な血管構造を有し．、受動的な集積を可能とする組織を標的としたシステムは報告されている。しかしながら、能動的な集積を必要とする組織での報告は多くない。そこで、癌組織、肝臓以外の正常組織を標的化するためには、血管内皮細胞を標的化可能なりガンドを搭載したシステムが必要となる。一方、受動的な集積が期待できる組織においても臨床応用ヘ展開するためには十分な効果が得られていないのが現状であり、組織集積後の細胞内動態を制御する必要があると考えられる。以上のことより、核酸デリパリーシステムの開発を行う上で、体 内動 態制 御と細胞 内動態制 御の両方 の観点から の開発・ 改良が必 須となる 。
当研 究室では、独自の核酸キャ1」アとして多機能性工ンベロープ型ナノ構造体(MEND)の 開 発 に 取り 組 ん でき た 。 M
ENDはポ リ カ チオ ン に より 凝 縮 化 した プ ラ スミ ド DN
AやsiRN
Aなどの機能性核酸を脂質二重膜で封入した構造を有しており、脂質膜を介して様々な機能性素子を修飾することで、体内動態・細胞内動態の制御が可能である。そのため、
この M
EN
Dに組織標 的化素 子を修飾 することにより、能動的な組織集積、効率的な核酸の機能発現が可能になると期待される。
本研究では、能動的な集積を必要とするモデル組織として連続性毛細血管を有する肺血管内皮細胞を選択し、肺血管内皮細胞を標的とした核酸デリバリーシステムの構築を試みたので、以下に報告する。
【結果および考察】！ ！ IRQ垈2チドを基 盤と土 を駐血箜 鹵處趨 胞擾的型 遺伝壬デ リパル ーシステ ム＠捲 基
本研究では、肺血管内皮細胞に高発現しているカベオラに着目し、本工ンドサイトーシ
ス 経路を認 識するI
RQペプチドを用いて、肺血管内皮細胞を標的とした遺伝子デリパルー
シ ステムの 構築を試みた。まず、IRQ
ベプチドが肺血管内皮細胞を標的可能であるかを評価 するため に、中性脂質から構成されたりポソームにIRQベプチドを修飾し体内動態を評価 した。ま た、I
RQ
ベプチドはりポソーム膜状に効率的に提示することを目的として水溶性 高 分 子である P
EGをス ベーサ ーとした べプチ ド脂質誘 導体(IRQ‑PEG‑lipid)を合 成し− 1473ー

た。その 結果、肺 に高い 集積を示し、IRQベプチドが肺血管内皮細胞標的化素子として機能してい ることが 示唆さ れた。次 に、IRQ‑PEG‑lipidをMENDの 脂質膜 に修飾す ることで肺血管内 皮細胞標 的型遺 伝子キャ リア(IRQ‑PEG‑MEND)の構築を試みた。しかしながら、
I
RQ‑PEG‑M
ENDは、 PEGが 及 ぽ す細 胞 内 動 態へ の 影 響に より、肺 での遺 伝子発現 活性をほとんど 示さなか った。 そこで、 細胞内 動態の観 点から 、IRQ‑PEG‑lipidのPEG
鎖長や脂肪鎖 、 DN
Aコ ア の凝 縮 化 剤で あ る ポリ カ チ オン 、 MEN
Dの 脂 質組 成 の 1
つ で あ るカ チオン陸脂質 の4点 を改良 した。そ の結果、段階的な遺伝子発現活性の上昇が認められ、最終的に肺で 高い遺伝 子発現 活性を獲 得する ことに成 功した 。
2． GA
LAベプチドの肺移位睦臺立二ズムQ鰹擾IRQ‑PEG‑ME
NDの 体内動 態解析か ら、こ れまでエ ンドソー ム脱出 促進を目 的とし て用しゝられてきたG
A
LAペプチドに肺移行性があることが明らかとなった。そこで、本研究では、 GALAベプチド で認め られた肺 移行性 メカニズムの解析を行った。まず、血液との相互作 用を評価 した結 果から、 GAL
Aベプチ ドによる肺移行性には凝集以外のメカニズムが関与していることが示唆された。そこで、血管内皮細胞および非血管内皮細胞に対する細胞取り込みを評価したところ、血管内皮細胞に高い特異性を有することが明らかとなり、また、血管内皮細胞間では取り込みに有意な差がないことが示された。このことから、GALA
ベプ チドによ る肺移 行性には 、GAL
Aベプ チドの血管内皮細胞標的能および静脈内投与後のファーストパス臓器・血管内皮細胞が豊富に存在する臓器という肺の特徴が関係していることが明らかとなった。また、細胞内取り込み経路や競合阻害の実験から、細胞膜上にGALAを認識するbindingsiteが存在する可能性が示唆された。
墨 ：GALA
釜 プチ ドを基盤 とした 肺血管内 塵趨胞 接的型siRN
Aiリバリー シス孟ム 堕撞基
本章で は、核酸 医薬として大きな期待が寄せられているsi
R
NAのデルバルーシステムとし て 、 GALAを 修 飾 し た MEND (GALA‑MEND)が 有用 で あ る かを 評 価 した 。 ま ず、 体 内動 態お よ び 肺での局 在を評 価した結 果から、 GAL
AーMENDが肺 血管内 皮細胞に 効率良 く
si
RNAを送 達 している ことが 示された 。次に 、血管内 皮細胞マ ーカー の1つ である C
D31を標的として肺でのノックダウン効果を評価したところ、投与量依存的なノックダウンが確認さ れ、ED50は0.5mg/kg以下と推定された。これは、血管内皮細胞を標的とし、現在
臨 床試 験 Plを 実施中の siRNAキ ャリアで あるAtuPLEX (Silence Therapeutics社 ）のノッ ク ダ ウ ン 効果 を 凌 駕 する 結 果 であ り 、 この こ と から も GA
LA‑M
ENDは 非常 に 優 れたsiRNA
キャリアであることが示唆された。
【まとめ】
1．肺血管内皮細胞標的素子としてIRQ
ベプチドを見出し、細胞内動態の観点からキャリアの改良を加えた結果、段階的な遺伝子発現活性の上昇が認められ、肺で高い遺伝子発現活性を有する遺伝子デルパリーシステム構築に成功した。
2． GALAの 肺 移 行性 メ カ ニズ ム を 明ら か に する と 共 に 、GALA‑MENDをsiRNAキャ ルアとし て応用し た結果、肺で効率的なノックダウンを可能とするsiRNA
デリバルーシステ
ムの構築に成功した。
ー 1474―

学位論文審査の要旨
主 査

教 授

原 島 秀 吉副 査

教 授

井 関

副 査

准 教 授

秋 田 英 万副 査

准 教 授

山 口 浩 明健学 位 論 文 題 名

肺血管内皮細胞標的型核酸デリバリーシステムの構築
分子生物 学の飛躍的な発展に伴い、ヒ トゲノムの全貌のみならずその変異と疾患の関連が次々に明らかとな る中で、遺伝子の本体である 「核酸」が次世代の医薬品として注目を浴び、臨床応用に向け活発な 研究が行われている。しかし 、核酸単独を静脈内投与した場合、血中で速やかに分解・代謝されや すく、分子量が大きいため細 胞膜透過性も低い。そのため、核酸を医薬品として実用化するために は、核酸を標的となる細胞に 送り届け、効率良く機能させるためのデリパリーシステム
カ泌要とな る。これまでに、癌組織や肝 臓といった特殊な血管構造を有し受動的な集積が可能となる組織を標 的としたシステムの報告は数 多くなされているものの、能動的な集積を必要とする組織への報告例 は少ない。よって、核酸の臨 床応用範囲の拡大を目指す上でもこのような細織へのデリパリーシス テムが必要不可欠となる。
石塚太一 君は、能動的な集積を必要と するモデル組織として連続性毛細血管を有する肺血管内皮細胞を選択し、肺血管内皮細胞を標的とした核酸デリバリーシステムの構築を目指し研究を行った。
第一章では 、肺血管内皮細胞に高発現し ているカベオラに着目し、本工ンドサイトーシス経路を認
識 可 能 な IRQベ プ チ ド (IRQRRRRR)を 基盤 と した デリ バリ ーシ ス テム の構 築を 行っ た 。ま ず、IRQベプチド が肺血管内皮細胞を標的可 能であるかについて評価を行 った。IRQベプチドを効率的に Liposome表面 に 提示 する こと を 目的 とし てPEG脂 質誘 導体 を 用い て評 価を 行っ た 結果 、IRQベプチドに 肺への特異性が高いことが明 らかとし、本ベプチドが肺血管内皮細胞標的化素子として機 能し てい る可 能 性が示唆している。 次に、IRQペプチドを多機能 性エンベロープ型ナノ構造 体(MEND)に 修 飾 す る こ と で 、 肺 血 管 内 皮 細 胞 標 的 型 MEND (IRQ‑PEG‑MEND)の 構 築 を 試 み てい る。 しか しな が ら、トポロジーコン トロールを目的としたPEGカ 源因となり、IRQ‑PEG‑MENDは十分な遺 伝子発現活性を示さないこと が明らかとなっている。そこで、この問題を解決すべく、
細 胞 内 動 態 の 観 点 か ら IRQ‑PEG‑MENDに 4点 の改 良を 加え た結 果 、段 階的 な遺 伝子 発 現活 性の上 昇が 確認 され 最 終的 に肺 で非 常 に高 い遺 伝子発現活性を有する 凪Q．PEG一MENDを構築する ことに成功し ている。
第 二 章 で は 、 皿 Qペ プ チ ドに 代わ る新 規 肺血 管内 皮細 胞標 的 化素 子と して GAIAを 見出 し、
GAIAの肺血 管内皮細胞標的メカニズムの 解析を行っている。まず、 血液成分との相互作用を評価した結果、 凝集以外のメカニズムの関与 が示唆されたが、血管内皮細胞、非血管内皮細胞を用いて細胞への取 り込みを評価した結果、GAIAの取り込みは血管内皮細胞 に特巽陸が高く、また血管内皮細胞間に は有意な差カ瀞められないこ とが示されている。以上の 結果より、GAIAによる肺血管内皮細胞標 的能は、GALAの血管内皮細胞 標的能および血中投与後の ファーストバス臓器・血管内皮細胞が豊 富に存在する臓器という肺の 特徴が関係していることを明らかとしている。さらに、細胞 内動 態解 析や 競 合阻害の実験の結果 丶細胞膜上にGAIAを認識す るb血d血g8iteが存在するこ とが示唆して おり、本結果は、GAIAにエン ドソーム脱出促進以外の機 能が存在することが示したはじめての研 究である。
第三 章で は、 本 GAIA修飾 粒子 を 核酸 医薬 とし て大 き な期 待が 寄せ られているsiRNAのデリ パル ーシ ステ ムに 応 用し てい る。 ま ず、 体内 動態や肺での局在を評 価した結果、GALA‐MENDが 効率良く肺血 管内皮細胞にsiRNAを送達できていることが示してし〕る。そこで、血管内皮細胞に発現― 1475 ‑し てい る CD31を標的 として ノック ダウン 効果を 評価し 結果、 肺におい て投与 量闘字 的な(ED50は0.5 mg/kg以下）ノックダウンを見出すことに成功している。これは、血管内皮細胞を標的として現在 臨床試 験を実 施して いるsiRNAキャルアであるAtuPI EXを凌駕する結果であり、このこと
か ら も GALA‑MENDの 非 常 に 優 れ た s派 NAキ ャ ル ア で あ る こ と を 実 証 し て い る 。
以上、 石塚太一君は、遺伝子、siRNAの双方で有用な肺血管内皮細胞標的型のデリバリーシステムの構築に成功しており、本研究は、遺伝子治療や核酸医薬など21世紀にその実現が期待されている革新的医療の実現に大きく貢献するものと確信する。よって、彼憾、北海道大学博士（生命科齣の学位を授与される資格あるものと認める。

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