平成9年度 研究報告 大分県産業科学技術センター

焼酎酵母のアルコール耐性に関与する遺伝子の解析
江藤 勧
食品工業部

ÅnalysISOfRelation重∋e知eenAIcohoトToleranceand馳odぴYeastGene
Sust汀nu ETO

FoodScienceandTechnologyDivision
要旨
鹿児島焼酎酵母をエタノール溶液［寺jで自己消化させてアルコール耐性株を得た．このアルコール耐性株と通常の鹿児島酵僅から，それぞれcDNAを調製し，PCR法を応用したSubtractionをかけてアルコール耐性の獲得に関与する遺伝子の検出を試みた．その結果，アルコール耐性が高くなった状態の細胞では，AIcoholdehydrogenasel等の遺伝戸が多く発現しており，これらがアルコール耐性に関与していると思われた。
1．緒 言ホルム（トi），クロロホルムで順次洗浄して，酢酸ナト

本センターでは，より麦焼酎の醸造に適した大分酵母

リウム溶液とエタノールを加え，■つ0℃で静置した後，の開凝を目指して，細胞融合を中心とした有用酵母の造遠心分離により沈殿を得た．

また調製したRNAより，PhamlaCiabiotech社のキッ成の研究を行ってきた1 2∴ 特に，蒸留粕自体の減量とそれに伴う製造工程の改善が期待される，高いアルコー

トを用いてmR．NAを精製した．

ル耐性を持つ融合酵母を開発し，焼酎の試醸をする段階

2、4 cDNAのSubtractionに至っている巳

CLONTEC‡i杜のPCR−Selectキットを用いて，mRNA

本研究では，将来的に実用可能となると思われる遺伝からのcDNAの合成及びSubtractionを行った．このサンF・組換えによる有用酵母開発の前段階として，アルコー

プルを5％のポリアクリルアミドゲル（PA）電気泳動にル耐性を獲得した酵母と通常の酵母を比較することによかけてSYBRGreen盲で染色してバンドを検出した．
Subtractionにより変化したバンドをゲルから切り旧し，り，アルコール耐性に関与する遺伝子の解析を試みた．

水を加えて細断したものをテンプレートとしてPCRを行い上目的のcDNAを増幅した．このcDNAをpCR罠

2．実験方法2．1 自己消化ベクター（Invまtr喝en杜）につなぎ，古co〟JMlO9を形質渡辺らの方法こ∃′に従い，YPD培地申で前培養した酵母転換させて，CDNAと結合したベクタドを増幅後，精製したを集菌し，20％エタノールと1％グルコースを含む0−1M酢酸緩衝液（P圭i42）中で15℃，7F1間自己消化を起こさ2．5 塩基配列の決定せた．この液をYPD寒天培地上で培養し，生存率の高Cy5AutoReadSequencingKit（Pharmaciabiotech社）中い株を選抜して同様の操作を3恒l繰り返す事により，アの蛍光プライマーとThermoSequenasecyclesequencingkit（Amersham社）を用いてやÅLFexpressシーケンサ←でルコール耐性株を分離した

ベクターと結合したcDNAの塩基配列の決定を行った．

2．2 アルコール耐性試験

2．6 ノーザンハイプリダイゼーション

試験棟をYpD液体培地中で前培養した後，各濃度の精製したcDNAを含むpCR‡ⅠベクターからD‡GRNA

エタノールを含むYPD液体培地に接待して，振漫培養

Label主ngKit（BoehdngerManmheim社）を用いてそれぞれ装置で増殖能を測定した

RNÅフローブを作成した

2．3 RNÅの調製

各細胞より調製したRNAをホルムアルデヒド法によ培養した細胞を0′5MNaCiliOmMEDTAを含む0．2Ⅸ4
Tds−HCl（pH7．5）緩衝液で洗浄衡 −80′ノCで凍結させたり， l％のアガロースゲル電気泳動にかけた後，ナイロ

この細胞に緩衝液とガラスビーズを加えた後，65＼ニCのン膜にブロツティングした．この膜に，各RNÅプロ・一

フェノ←ルを加えて激しく撥絆し，遠心分離Lて卜清をブを結介させて、DIG核酸検出キットによりフ亮一ブ回収した．二のf清をフェノール フェノールニタロ∵ロを検出した▼〇／ 仙平成9年度 研究報告 大分県産業科学技術センタ…

3．3 アルコ仙ル耐性回復時の遺伝子の変化

3．薬験結果及び考察

鹿児島酵母とアルコール耐性株を，それぞれェタノ岬3．1 自己消化によるアルコ岬ル耐性線の鰭成

ル処理をする前と処理直後の状態で9 速やかに諸0℃で自己消化と選抜を繰り返すことにより鹿児島酵母からアルコール耐性株を分離した．iO％エタノ岬ル存在下凍結させた．それぞれの凍結細胞からRNÅを調製し，での増殖能を見ると，元の鹿児島酵穂よりもかなり高い

そのm一部を用いてmRNAを精製して，さらにcDNAをアルコール耐性が認められた（Fig．i）．しかし，通常の合成した．エタノール処理をした後のcDNÅから処理

YPD寒天培地上で数週間保存しておくと，ニの株のア前のcDNÅを差し引くように，pCR−Selectキットを用いルコール耐性は通常の鹿児島酵母程度に低下した．て鹿児島酵母とアルコー′レ耐性株のサンプルをぅ それぞれ§ub甘aCぬ王1させた．5チもの㌘Å電気ミ泳動にかけてバン2．5ドを分離した結果，0−4kbpからiOkbpの間で各10本程度のバンドに変化が認められたげ庵一3）．

髄彊昏・・−・Ko C（〕∩てrO∃

一−KoEtOHlOOも．・．・・‥・・・・・‥−‥‥−‥∵∴二．J
一 −0 612182430364248546（き6672
時間（h）▼Fig．呈 自己消化によるアルコげル耐性の変化

1■、−−3．2 エタノ血ル前処理によるアルコール耐性の回復
アルコ岬ル耐性が低「した株を10％エタノールを含むYpD培地中で2時間振塗する前処理を行った。このエタノ岬ル前処理Lた株について，改めて増殖試験を子うったところ，YpD培地中では変化は認められなかったが，iO％エタノ←ル存在下での増殖は耐性妹分離直後と同程度であり，アルコール耐性の回復が認められた
叶 し遽 【へ∴∵︑によるアルコ｝ル耐性の向上は認められなかった。

︑し㍉︑t︸

芦定（F主g−2）．また，元の鹿児島酵母では，エタノール前処理

メノFig．3 SubtracもionによるcDNÅの変化の検出
一﹁︶ヽ

これらのバンドをゲルから切り挫して抽出し，増幅，・・・−Ko Co〔てrO【▲﹁︶髄求沓ヽ−−−Ko EtOHlOO〇
咄・Ko＋2hr Con七r0、−か＞Ko†2hr EtOHlOO′c・一鉢Aさc Contr〔〉貞車A【c EtOHlO〇七一サ▲Å【c＋2hr Contro【、−AIc＋2hr 巨tOHlOこも精製した後，塩基配列を決定したところ，いわゆるストレス掛■偶に関連しと遺伝子廿多く検糾されたほか，糖やアルコーール代謝系ジ）酵素ク）遺伝子ヰ凋紺〜された（Tab壬el）．こげ）両，HeatshockproteinやP脱3protein等の遺伝
r・は鹿児島酵母とアルコ脚′レ耐性株（研・l∫りナで検出された−

また，Enolase呈（ENOりとC）rtOChromeCi（CYi）の遺伝f一0 61218243036424854606672
時間 （h）

は鹿児島酵母でのみ板戸まうされ，A呈coho！deh）rdrogenasei
摘心服刃及び60S鼠ibosomalproteimL2ま終L2ほ）の遺伝子はアルコール耐性株でのみ検出された．

F主g．2 エタノ」一項肛処理によるアルコール耐性出回複58 ¶平成9年度 研究報告 大分県産業糾学技術センタ山

Tab首e呈 検出された正路俵
AIc山Suヒ〉乞raCted

Ko−Subtracてed

34 ノーーナンハイプリダイセ叩−ション［＼いTab王elで検出されたcDNAについてそれぞれ民NAプ＝ニー−ブを作成し，ノーザンハイプリダーゼーションを子j￣
うことにより9 各細胞の鼠NAレベルの変化を検討した．

Subtrac盲ionにより挺児島酵母とアルコ一項酢性株の両方で検出されたストレス蛋自質をコードする遺伝子等は，
ェタノ岬ル処理により扱者に増加していた．また，鹿児島酵桂でのみ検出されたENOiとCYiはエタノ←ル処

理により若1号針加Lていた，アルニ三−−ル耐性株でのみ検出された遺伝f一の内ÅかHiは，エタノール処理後の鹿児島酵母では減少憤裾こあったがぅ アルコ岬ル耐性株ではむしろ増加していた。RL2ほは両ブナの細胞で減少し（「卜 し1［ていたが，アルコ〝ル耐性株での減少率のカ■が小さいたKo Å琶G

め検侶されたと考えられた（F盲g4）。

．▲Uう‖
ヰ． まとめ
酵母の遺伝子と細胞機能の関連を解明する巨摘勺で，蔓∠】己消化により，高し、アルコール耐性を持つ酵母を作成し，ニの酵母と通常の鹿児島酵腎から調製したcI）NAを比較して，アルコール耐憫圭牒㍑・すな遺伝子の検骨を試みたところ，次の結果を得た．

（1津己消化と選抜を繰り返すことによ畑鹿児島酵墨サらアルコール耐性株を分離できた．
（2）数週間経適するとち この株のアルコール耐性は適ノ精の鹿児島酵母程度に憤汗したが，エタノ岬ル前処啓Hこよりアルコール耐性の回復が認められた．

（3）それぞれげ）細胞よりcDNAを調製して，Subtract血を行い，ユタノ←ル処理により変化」たcかNÅを検圧し、〔二 し、巨し 巨 （二；二こ監0 Å重訂

Ko A苫cF主g4 ノ←ザンハイプリグイセ←一ン≡；ンによる鹿児島したところiO前後の遺伝上汁検糾された．

汚苧桝Ko）とアルコr一項相性株け此け）掛兢変化の検−〜C ∴エタノール処刑揃，E ＝エタノドル処理後（4）Subtracてionに上りA工）Hiと随L三ほしり遺伝イーソ〕変化がアルコール耐性株でのみ検出された．
を5）これらの遺伝イ・の射ヒ乱

ノーザンハイプリダイゼ

参考文献ーションでも確認されヲ アルコール耐性王牒ハ・Lている呈）江藤 軌‥大分県産業瀾守明雄頼ンタ町中成㌣隼度‖r能件があると思われたメ研究撞7j，二，72（i995）2）汗蒔 勧：k分県藻業科て技術センター骨成8年度
研究邦書∵堀γ鞘）59 一