博 士 （ 理学 ） 箕田 康 一
学 位 論 文 題 名Studies on Structure and Expressln of the Genes forsperm‑specific Nuclear Basic Protein SP4 in Xenopus laevls（アフリカツメガエル精子特異的塩基性核蛋白質S
P4遺伝子の構造と発現に関する研究）

学位論文内容の要旨

通常精子核クロマチンは体細胞型ヒストンの代わりに精子に特異的な塩基性核蛋白質(Sperm‑s
pecificnuclearbasi
cproteins，SBPs)を持ち、体細胞核のそれに普遍的なヌクレオソーム構造をとらないことが知られている。これらのS
BPsは成熟情子の核を強く凝縮させることによって核の転写活性を抑えるとともに、受精が成立するまでの間精子のDNAを物理的、化学的な傷害から保護するのに役立っと考えられている。このことは、横子形成過程で、いつ、いかなる仕組みで精子形成細胞のク口マチンが体細胞型から精子型への転換を遂げるのか、という興味深い問題を提起する。これまでの免疫組織化学的観察
及ぴ電気泳動法を利用した研究により、SB
Psは精子形成過程の最終陵階である核の凝縮期になって初めて合成され、体細胞型ヒストンの全部あるいは一部と置き換わることが明らかにされている。しかしS
B
Psのそれを含めて精子形成過程で発現する遺伝子に関する研究は一部の喃乳類で行われているのみであり、その過程での転写調節機構についてはほとん
ど不明である。ヒストンとは対照的にS
B
Psの組成が動物種により著しく異なって多様であることを考慮すれぱ、精子形成過程におけるSBP遺伝子の発現及び翻訳調節機構を分子生物学的な観点から解明することは童要だと思われる。
以上の観点から、本研究ではSBPsの構成が大きく異なる2種の無尾両生類アフリカツメガェル（ Xenopus´aevis)
およぴニホンヒキガェル（BufD/400nicus)を選び、これら精子に特異的な塩基性核蛋白質の合成の仕組みを遺伝子の発現調節の面から明らかにすることを目指して、SBP遺伝子の構造解析を行った。
1．精子形成過程におけるSBP
遺伝子の転写開始時期：SBPsは、ニホンヒキガェルではプ口タミンに属する2種類の低分子強塩基性蛋白質のみからなるのに対し、アフリカツメ
ガ ェル では 体細 胞型 のコ アヒスト ン（H3、H4および少量のH2八H2B）と横子核に特異的な蛋白質(SPsl‑6）からなる。これらのうち、最近cDNAが得られたヒキガェルのプ口タミン、アフリカツメガェルのSP4の遺伝子発現時期を調べた。各組織から抽出した
td aIRNAを電気泳動 後ブロットし32pで標識した cDNA（ヒキガェルpBP2；ツメガェルpXHP531）をプ口一ブに用いノーザンハイブリダイゼーションを行ったところ、両遺伝子は楕巣でのみ転写されていた。精巣組織をディスパーゼで解離し、セルセップ装置を用いて2‑5％B
S
A勾配中で精子形成細胞を大きさによって分画することにより得た第ー次精母細胞と精細胞から抽出したRNAを用いてノーザン解析をおこなった，ところ、ヒキガェル― 130一 ―のプロタミンの遺伝子は、典型的な哺乳類のプロタミン遺伝子と同じく精細胞（半数体）でのみ転写されていた。他方、アフリカツメガェルでは第ー次精母細胞と精細胞の両方か
ら SP4mRNAが 検 出 さ れ 、 mRNAの サ イズ は第 ー次 精 母細 胞期 (650‑ 710
ヌ クレ オ チド）では精細胞のそれ（5 60‑800ヌクレオチド）よりも長かった。転写開始時期をさらに詳しく決定するためins
itu
ハイブリダイゼーションをおこなった結果、アフリカツメガ
エルSP4遺伝子は第ー次精母細胞の後期パキテン期（4倍体）に転写が始まることが明らかになった。SBP遺伝子が滅数分裂前期に転写されるというのは初めての発見である。
2．アフリカツメガエルSP
4遺伝子の構造解析：アフリカツメガエルSP
4遺伝子が第ー次楕母細胞期（減数分裂前期）に転写が開始されるのはどのような転写調節機構に基づくのかを知るため、上流域を含むSP4遺伝子の構造解析を行った。32pで標識したSP4cD
N
Aをプロ―ブに用いて純系アフリカツメガェルJ系統の肝臓より精製したゲノムD
N
Aのサザンハ｀イブリダイゼーションを行ったところ、12.
Okbp、4.
3kbp
およぴ2．OkbpのEcoR
I
断片にシグナルが検出された。そこで12．0 kbp‑E
coR
I断片のゲノムライブラリーを作成し、SP4cDN
Aをプローブにしてスクリーニングを行い、S
P
4遺伝子を含むゲノムクローン
入XL
SP4を得た。シーケシングの結果、この12．Okbp断片には約500bpのイントロンを持つ3個のSP4遺伝子がおよそ3kbpおきに存在していた。また、イメージアナライザーを用いてサザンハイブリダイゼーションで示されたシグナルの放射線量を測定した結果、
4.
3kbpと2.
Okbp
断片は いずれも12.
Okbp
断片の3分の1であり、それぞれ1個づっのS
P4遺伝子が存在していることが示唆された。そこでプライマーをSP4のコード領域の両端に設定して4.
3kbpと2.
OkbpのE
cc
RI
断片でPCRを行った結果、いずれからも738bpの断片が増幅され、それらは塩基配列からどちらもSP4遺伝子であることが確認された。ただし
2．Okbp‑EcoRI
断片にある遺伝子は翻訳領域の塩基に置換があり、N末端から69番目のアミノ酸が刋aからSerへと変異していた。この変異型のS
P4は成熟精子から抽出した蛋白質にも確かに存在することが確認されている。EcoRI、HindlI、PvulI
およぴそれらを組合せて行ったサザン解析の結果を総合して、2．Okb、12．Okb、4．3kbのEcoRI
断片はゲノム上で連続しており、5個のSP4遺伝子（うち轟も上流に位置するものは変異型）が互いにおよそ3kbpを隔ててタンデムに並んでいると結諭された。S
B
P遺伝子がこのように単純童複配列をとるという事実は今までに報告されておらず、ツメガェルS
P4遺伝子はユニークな構造をしているといえる。次に第2‑4番目のSP4遺伝子を含む領域10，165bpの全塩基配列を決定したところ、これらの遺伝子のいずれでも5．側上流域にCCAAT‑box（転写開始点 より 73bp上流 ）と TATA配列 （同13bp上流）およびTAW類似配列（ 同47または87bp上流）が、3．側下流域（終止コドンより135または137bp下流）にはポリA付加シグナルが存在しており互いに高い相同性を示した。ハープロット解析の結果、その他にもこれら3つの遺伝子の上流域にはおよそ200bpにわたり80％以上の相同性をもつ領域が2力所存在することが明らかとなった。しかし、これらの配列にはこれまでに精巣特異的あるいは構母細胞特異的発現をする遺伝子の転写調節エレメントとして候補に挙げられている配列と同一なものは見られない。本研究で見出されたこれらのよく保存されている領域は組織特異的かつ時期特異的なSP4遺伝子の転写調節に関わっている可能性があり、今後の詳しい機能的な解析が期待される。

ー 131‑学位論文審査の要旨
主 査 教 授 片 桐 千 明
副 査 教 授 鈴 木 範 男
副 査 教 授 高 橋 孝 行

学 位 論 文 題 名Studies on Structure and Expressln of the Genes forspermーspecific Nuclear Ba
sic Protein SP4 in Xenopus laevlS（ ア フ リ カ ツ メ ガエ ル 精 子 特 異 的 塩 基性 核 蛋 白 質 SP4遺 伝 子 の構造と 発現 に関す る研 究）

動物の成熟精子核クロマチンは、プ口タミンに代表される特異な塩基性蛋白質(sperm‑
specIfiCbaSlCproteinS：SBP）を含んでいて、ヌクレオソ―ム構造を基本とする通常の体細胞核とは著しく異なる。このことは、精子形成および受精過程でSBPが何時、如何にして形成されまた除去されるのかという、精子核に固有のクロマチンリモデリングに関する興味深い問題を提起するが、もともとSBPがいちじるしく多様であることも起因してこれらの問題には不明な点が多い。箕田康一提出の学位論文は、無尾両生類を用いて第1のりモデリング、すなわち精子形成過程におけるSBP遺伝子の転写時期を特定し、また同遺伝子の詳細にわたる構造解析を通じてその特異な発現調節機構を論じたものである。論文は主論文と参考論文2篇から成る。
申請者は最近cD
NAが得られたニホンヒキガエルのブロタミンおよびアフリカツメガェルの主要なSBPであるSP4について、それらの遺伝子が転写される時期をノザン解析およびinsituハイブリダイゼーションにより調べ、ヒキガエルのプロタミン遺伝子が哺乳類や魚類で従来知られていたように精細胞（半数体）ではじめて転写されるのに対し、ツメガエルのSP4遺伝子は第ー次精母細胞の中期パキテン期（4倍体）に転写が始まることを見出した。この発見は、S
P4蛋白質そのものはプ口タミンと同じく精子形成過程の最終段階である核の凝縮期に合成されるという最近の知見に照らして、この遺伝子がきわめて特異な転写および翻訳の調節機構のもとにあることを示す興味ある問題提起である。そこで申請者はこのSP4遺伝子の転写調節機構を知るための手がかりを遺伝子の構造自体に求めるべく、この遺伝子の構 造 解 析 を 行 っ て い る 。 純 系 ツメ ガ エル J系統 か ら精 製 した ゲ ノム DNAを 用 いて種々 の 制限 酵 素に よ る切 断 と サザ ン ハイ ブ リダイゼ ーションの 結果を総合 した結
果 、 ゲ ノ ム 上 の 1 8kbに わ た る 領 域 に 5ケ の SP4
遺 伝 子 が 互 い に 約 3kbを 隔 て てタン デ ムに 並 んでいる という、こ れまでSB
P遺伝子とし ては報告の なかった単 純重複配 列 をと る こと が 明ら か と なっ た 。こ れ ら5ケの遺伝子 はいずれも 1ケのイ ン卜
ロ ン を も ち 、 最 も 5 側 に 位 置す る もの が 78ケ のア ミ ノ酸 中 1ケの 置 換を 示 す他は 互 い に き わ め て 相 同 で あ る のみ な らず 、 中央 部 12kbの 範 囲に 並 ぷ3つ の遺 伝子について行われた全塩基配列の決定結果は、各遺伝子が5 上流および3￣下流域に転写 開 始お よ びポリA付加シグ ナルをもつ とともに、 5￣上 流域200bpに わたって互
いに 80％ 以 上 の相同性を 示す箇所を もつことを 示した。こ れら5 領域の特徴 的な塩基配列は 、デー夕検 索および従 来の精子形 成過程にお ける遺伝子発現の研究では見いだされ ていない新 たな発見で 、精巣また は精母細胞 に特異的な発現調節にかかわるシスエ レメン卜で ある可能性 が高い。
以上の成果 は、塩基性 核蛋白質の 遺伝子に減 数分裂前期 に発現するものがあることを 発 見し た こと、複 数からなる SBP
遺伝子 の特異なゲ ノム構造を 明らかにし たこと、および その時期特 異的発現に 関わる可能 性の高い調 節エレメン卜を提示したことなど、精 子形成過程 における遺 伝子発現機 構の研究に 新たな問題提起をするものとし て 評価 さ れる。参 考論文2篇は主論文 の根幹をな す内容を含 み、いずれ も権威ある国際雑 誌に掲載さ れて、その 一部は最近 刊の「精子 形成の分子機構」に関するモノグラフ に引用され るなど国際 的に高い評 価を受けて いる。申請者に対する最終試験 は 、1月 30
日 に 多数 の 大学 院 担当 教 官の 出 席の も とに 論 文 の口 頭 発表 と 質疑応答の形で 行われ、満 足すべき結 果であった 。したがっ て審査員―同は、申請者が博 士 （ 理 学 ） の 学 位 を 受 け る に 十分 の資 格が ある も のと 認め る。